(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２〜１１のプライマーから選択される２種のプライマーセットを含む肌診断用のプライマーセットであって，
前記２種のプライマーセットは，
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号６及び配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号８及び配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーセット，及び
配列番号１０及び配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットである
肌診断用のプライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載の肌診断用のプライマーセットを用いて，対象物に含まれるＤＮＡ断片の増幅反応を行って増幅産物を得る工程と，
前記増幅産物を検出する工程と，
を含む，
肌の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，肌分析用プライマーセット及び肌分析方法に関する。より詳しく説明すると，本発明は，肌に悪影響を及ぼす特定の菌叢を効果的に検出するための肌分析用プライマーセット，肌分析キット及び肌分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特開２００９−６５９３９号公報には，動物識別用プライマーセット及びプライマーキットが開示されている。このプライマーセットは，ＰＣＲを用いて，食品中の異物に由来する動物種のＤＮＡを増幅し，これを測定することで，特定の動物種が混合しているか否かを検出するためのものである。このようにＰＣＲに用いられるプライマーを見出すことができれば特定の生物が存在するか否かを判別できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−６５９３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヒトの肌には，肌の状態を悪化させる菌が存在する場合がある。このため，特定の菌が肌に存在することがわかれば，肌の状態を分析できる。このため，肌を悪化させる菌が肌に生息しているか否かを解析するためのプライマーセットやそのようなプライマーセットを用いた肌の診断方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は，所定の菌叢が肌に悪影響を及ぼすことを突き止め，そしてその菌叢を特異的に検出するための特定のプライマーセットを見出したことに基づくものである。
【０００６】
本発明は，肌診断用のプライマーセットに関する。このプライマーセットは，配列番号２〜１１のプライマーから選択される２種のプライマーセットを含む。２種のプライマーセットのうち一方は，配列番号２，４，６，８又は１０で示される塩基配列を有するプライマーであり，残りは，配列番号３，５，７，９又は１１で示される塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。
【０００７】
本発明の好ましい態様は，
前記２種のプライマーセットが，
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号６及び配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号８及び配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーセット，及び
配列番号１０及び配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットのものである。
【０００８】
本発明は，肌の診断方法をも提供する。この方法は，上記したいずれかの肌診断用のプライマーセットを用いて，対象物に含まれるDNA断片の増幅反応を行って増幅産物を得る工程と，増幅産物を検出する工程とを含む。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のプライマーセットは，ＰＣＲにより，肌を悪化させる菌由来のＤＮＡを特異的に増幅させることができる。このため，本発明は，肌を悪化させる菌が肌に生息しているか否か分析するためのプライマーセットやそのようなプライマーセットを用いた肌の診断方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は，図１は，肌を悪化させる菌が生息していると考えられる肌由来のサンプルについて配列番号２及び配列番号３からなるプライマーセットを用いて分析を行った結果を示す図面に替わるゲル電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００１２】
本発明は，肌診断用のプライマーセットに関する。このプライマーセットは，ＰＣＲにより以下の表１に示される塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡ）を増幅できる。
【００１３】
【表１】
0005595612.tif 000002
【００１４】
本発明のプライマーセットは，配列番号２〜１１のプライマーから選択される２種のプライマーセットを含む。２種のプライマーセットのうち一方は，配列番号２，４，６，８又は１０で示される塩基配列を有するプライマーであり，残りは，配列番号３，５，７，９又は１１で示される塩基配列を有するプライマーであることが好ましい。
【００１５】
本発明の好ましい態様は，
２種のプライマーセットが，
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセット（配列番号２で示される塩基配列を有するプライマーと，配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーのセット，以下同様），
配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号６及び配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーセット，
配列番号８及び配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーセット，及び
配列番号１０及び配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーセットから選択されるいずれかのプライマーセットのものである。これらプライマーの塩基配列は，以下の表２に示されるとおりである。
【００１６】
【表２】
0005595612.tif 000003
【００１７】
プライマーを用いて特定のＤＮＡ（ＤＮＡ断片）を増幅し，対象となる生物が検体に含まれるか否かまた対象となる生物の存在量を評価することは，公知である。本発明においても，公知の方法を適宜採用できる。
【００１８】
上記のプライマーは，ＤＮＡ自動合成器を用いて支持体上でヌクレオチドを伸長し，適宜脱保護や支持体からの切断を行い，カラムクロマトグラフィー等公知の方法を用いて分離生成することで得ることができる。
【００１９】
次に，上記したいずれかの肌診断用のプライマーセットを用いた肌の診断方法について説明する。
【００２０】
まず，検査対象者の皮膚に存在する菌を採取する。本発明の対象は，哺乳動物（例えばヒト）の肌である。肌の例は，顔の肌である。そして，例えば，湿らせた綿棒で対象部位である顔の皮膚をこすり，その綿棒で寒天培地をこする。そして，寒天培地を１時間〜１週間常温で保存する。
【００２１】
次に寒天培地に含まれる菌のゲノムに含まれるＤＮＡ断片を公知のキットを用いて取得する。この方法は，公知のキットを用いて，公知のキットの説明書に基づいて行えばよい。
【００２２】
ＰＣＲは，公知のＰＣＲ装置を用いてＰＣＲ装置の解説書に基づいて行えばよい。ＰＣＲを行う際に，プライマーセットは，例えば，最終濃度が０．１μＭ以上１μＭとなるように設定すればよく，０．２μＭ以上０．５μＭ以下でもよい。ＰＣＲにより，対象物に含まれるDNA断片が特異的に増幅する。ＰＣＲ反応の条件の例は，以下のとおりである。
【００２３】
二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性（ステップ１）
二本鎖ＤＮＡの一本鎖への熱変性は，例えば，摂氏９０度以上摂氏１００度以下（又は摂氏９４度以上摂氏９８度以下）で３秒以上１０秒以下（又は４秒以上７秒以下）により行う。
【００２４】
アニーリング（ステップ２）
アニーリングは，例えば，摂氏５０度以上摂氏７０度以下（又は摂氏５５度以上摂氏６５度以下）で３秒以上１０秒以下（又は４秒以上７秒以下）により行う。
【００２５】
ＤＮＡ伸長反応（ステップ３）
ＤＮＡ伸長反応は，通常，通常アニーリング工程より高温にて行う。ＤＮＡ伸長反応は，例えば，摂氏６０度以上摂氏８０度以下（又は摂氏６３度以上摂氏７３度以下）で５秒以上２０秒以下（又は６秒以上１２秒以下）により行う。
【００２６】
ＰＣＲは，上記のステップ１〜ステップ３を複数サイクル行う。サイクル数の例は，１０回以上１００回以下である。サイクル数は，対象となる菌由来の増幅物が検出できる程度に増幅するまで行えばよい。
【００２７】
次に，DNA断片の増幅産物を検出する。ＰＣＲで増幅されたDNA断片の検出方法は公知である。本発明においても公知の検出方法を適宜採用できる。DNA断片の増幅産物を検出する方法の例は，増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分離し，核酸染色を行って可視化するものである。後述の実施例により示されたとおり，プライマーセットにより増幅される対象の菌に含まれるＤＮＡ断片の長さが実施例により見出された。よって，検出対象に，所定の長さのＤＮＡ断片が含まれるか（所定の長さ領域の部位にバンドが見えるか）を判断することで，対象となる菌が被検者の皮膚に存在するか否かを判断することができる。
【実施例】
【００２８】
肌に悪影響を与える菌叢の調査
ヒトの肌の状態が悪化する原因となる菌叢についての知見を得るため，被験者の協力のもと肌に悪影響を及ぼす菌叢及びその菌叢のＤＮＡを調査した。
具体的には，被験者は，その顔の皮膚を綿棒でこすり，その綿棒で寒天培地をこすり，皮膚に存在する常在菌を増幅させた。さらに，各被験者について，肌の状況と肌の変化とを記録した。各サンプルについて，大規模配列解析を行った。配列解析には，イルミナ社のＨｉＳｅｑ２０００を用いた。
【００２９】
その結果，肌の状態が良かったものの短い期間で肌の状態が悪化したサンプルは，他のサンプルに比べて配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡが多く含まれることがわかった。このため，配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡを有する菌叢の有無や量を測定することで，肌の状態を診断できることがわかった。
【００３０】
［実施例１］
配列番号２，３の塩基配列を基に，フリーのヌクレオチドをＦｍｏｃ固相法によって結合し，次いでＯＰＣカラムにより精製することによって，２種類のプライマーを作製した。合成されたプライマーは，使用直前まで−８０℃にて保管し，融解後直ちに使用するようにし，凍結融解を３回以上繰り返さないようにした。
【００３１】
上記２種類のプライマーを，使用前に蒸留水にて溶解し，被験ＤＮＡ液を含む反応液に対し，それぞれの最終濃度が０．２５μＭとなるようにした。
【００３２】
被験者の肌を湿らせた綿棒で擦ったものから，動物組織からのトータルＤＮＡを精製するキットであるＤＮｅａｓｙ
Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてサンプルのＤＮＡを精製した。上記精製したサンプルのＤＮＡの濃度を測定し，滅菌水を加えて希釈し，被験ＤＮＡ液（１ｎｇ／μｌ）に希釈した。それぞれの被験ＤＮＡ液１μｌに滅菌水及びＰＣＲ酵素バッファー混合液およびプライマーを，ＱＩＡＧＥＮ
Ｆａｓｔ Ｃｙｃｌｉｎｇ ＰＣＲ
Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）のプロトコルに従って加え，総液量を２０μｌに調整してＰＣＲ反応を行った。
【００３３】
ＰＣＲ反応は，反応液が入った状態のチューブを９５℃で５分保持した後，熱変性反応を９６℃で５秒，アニーリング反応を６０℃で５秒，ＤＮＡ伸長反応を６８℃で９秒行い，以上の反応を４５サイクル繰り返し，最後に７２℃で１分ＤＮＡ伸長反応を行った。
【００３４】
ＰＣＲ反応終了後，得られたＰＣＲ産物を，４．０％アガロースゲル（インビトロジェン社製）を用いＭｕｐｉｄ−２（アドバンス社製）により，１００Ｖ４５分間電気泳動し，エチジウムブロマイド（１．０μｇ／ｍｌ）で５分間染色後，ＵＶランプ下でバンドを撮影した。その結果を図１に示す。図１は，肌を悪化させる菌が生息していると考えられる肌由来のサンプルについて配列番号２及び配列番号３からなるプライマーセットを用いて分析を行った結果を示すゲル電気泳動写真である。図１に示されるように，肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで，１５０ｂｐのバンドが確認できた。
【００３５】
このことから，配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて肌の状態を指弾する場合，１５０ｂｐ前後（例えば１４５ｂｐ以上１５５ｂｐ以下，又は１４８ｂｐ以上１５２ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。すなわち，１５０ｂｐ前後のバンドが観測される対象は，肌に悪影響を及ぼす菌叢が生息しているといえるし，１５０ｂｐ前後のバンドが強く観測される対象は，そのような菌叢が多く生息しているため，肌の状況が極めて悪化しやすいと判断される。
【００３６】
［実施例２］
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく肌の状況解析を行った。その結果，肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで，１１０ｂｐのバンドが確認できた。
【００３７】
このことから，配列番号４及び配列番号５で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて肌の状態を指弾する場合，１１０ｂｐ前後（例えば１０５ｂｐ以上１１５ｂｐ以下，又は１０８ｂｐ以上１１２ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
【００３８】
［実施例３］
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号６及び配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく肌の状況解析を行った。その結果，肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで，１０９ｂｐのバンドが確認できた。
【００３９】
このことから，配列番号６及び配列番号７で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて肌の状態を指弾する場合，１０９ｂｐ前後（例えば１０４ｂｐ以上１１４ｂｐ以下，又は１０７ｂｐ以上１１１ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
【００４０】
［実施例４］
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号８及び配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく肌の状況解析を行った。その結果，肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで，１０９ｂｐのバンドが確認できた。
【００４１】
このことから，配列番号８及び配列番号９で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて肌の状態を指弾する場合，１０９ｂｐ前後（例えば１０４ｂｐ以上１１４ｂｐ以下，又は１０７ｂｐ以上１１１ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
【００４２】
［実施例５］
配列番号２及び配列番号３で示される塩基配列を有するプライマーセットに代えて，配列番号１０及び配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いた以外は実施例１と同様にしてＰＣＲに基づく肌の状況解析を行った。その結果，肌の状態が良く後悪化するまでの時間が短いサンプルのみで，１０９ｂｐのバンドが確認できた。
【００４３】
このことから，配列番号１０及び配列番号１１で示される塩基配列を有するプライマーセットを用いたＰＣＲ法に基づいて肌の状態を指弾する場合，１０９ｂｐ前後（例えば１０４ｂｐ以上１１４ｂｐ以下，又は１０７ｂｐ以上１１１ｂｐ以下）のバンドの有無を用いればよいことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は，美容業や美容業のための機器を製造販売する製造業の分野で利用されうる。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：プライマー
配列番号３：プライマー
配列番号４：プライマー
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
【要約】      （修正有）【課題】肌を悪化させる菌が肌に生息しているか否か分析するためのプライマーセットやそのようなプライマーセットを用いた肌の診断方法の提供。【解決手段】特定の配列からなるプライマーから選択される２種のプライマーセットを含む肌診断用のプライマーセット。そのプライマーセットを用いて，対象物に含まれるDNA断片の増幅反応を行って増幅産物を得る工程と，増幅産物を検出する工程と，を含む肌の診断方法。【選択図】図１【図１】
0005595612.tif 000004
【配列表】
0005595612000001.app