(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換えられたことを特徴とするＩｇＧ１抗体。
【請求項２】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられたことを特徴とするＩｇＧ１抗体。
【請求項３】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸が、システイン残基に置き換えられたＩｇＧ１抗体であって、Ｆｃ領域に結合しているN-グリコシド結合糖鎖において還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないＩｇＧ１抗体。
【請求項４】
ヒト細胞表層存在分子を認識する部位を有する、請求項１から３の何れかの項に記載のＩｇＧ１抗体。
【請求項５】
サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、請求項１から４の何れかの項に記載のＩｇＧ１抗体。
【請求項６】
抗原ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、請求項１から５の何れかの項に記載のＩｇＧ１抗体。
【請求項７】
請求項１から６の何れかの項に記載のＩｇＧ１抗体をコードする単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを有する宿主細胞又は非ヒト宿主生物。
【請求項１０】
請求項９に記載の宿主細胞又は非ヒト宿主生物を、核酸がコードするＩｇＧ１抗体を発現するように培養することを特徴とするＩｇＧ１抗体の製造方法。
【請求項１１】
請求項１から６の何れかの項に記載のＩｇＧ１抗体を含む治療用組成物。
【請求項１２】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたエフェクター機能を有するＩｇＧ１抗体を発現する細胞であって、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した細胞。
【請求項１３】
以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上したＩｇＧ１抗体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有するＩｇＧ１抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置換されたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は非ヒト宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
【請求項１４】
以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上したＩｇＧ１抗体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有するＩｇＧ１抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は非ヒト宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
【請求項１５】
以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上したＩｇＧ１抗体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有するＩｇＧ１抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した宿主細胞又は非ヒト宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
【請求項１６】
エフェクター機能を有するＩｇＧ１抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換える工程を含む、ＩｇＧ１抗体のエフェクター機能を向上さ
せる方法。
【請求項１７】
エフェクター機能を有するＩｇＧ１抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換える工程を含む、ＩｇＧ１抗体のエフェクター機能を向上させる方法。
【請求項１８】
下記（１）から（３）の工程を含むＩｇＧ１抗体のエフェクター機能を向上させる方法；
（１）エフェクター機能を有するＩｇＧ１抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した宿主細胞又は非ヒト宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エフェクター機能が向上した抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、抗原に対する認識能の特異性が高く、また抗原との相互作用も強いので医薬治療用途や診断薬用途、検査試薬等に広く利用されており、今後もその利用は拡大していくものと期待されている。
【０００３】
抗体の構造は、２つの重鎖と２つの軽鎖からなるポリペプチド四量体であって、重鎖と軽鎖とはジスルフィド結合により結合されている。抗体は、抗原結合部位に相当する可変部位と定常部位とを有しており、重鎖定常部位のＣ末端側はCH2及びCH3からなるＦｃ領域で構成されている。Ｆｃ領域は、抗原への結合に直接関わらないが、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）との結合を介して同分子を表面に有する細胞に種々のエフェクター機能を発現させることができる。具体的には、Ｆｃ領域上のＦｃレセプター結合部位が、エフェクター細胞表面に存在するＦｃＲに結合することにより、抗体被覆粒子の食作用および破壊、免疫複合体の浄化、活性化されたエフェクター細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解［抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）と称される］、炎症メディエーターの放出、胎盤トランスファーおよび免疫グロブリン生産の制御等を含むいくつかの重要で多様な生物学的反応が引き起こされる。
【０００４】
ＩｇＧのＡＤＣＣ活性の発現には、Ｆｃ領域と、エフェクター細胞の表面上に存在するＦｃＲとの結合が必要であり、その結合については、抗体のヒンジ領域及び定常部位の第２番目のドメイン（以下、CH2ドメインと表記する）内のいくつかのアミノ酸残基の重要性が示唆されている［Eur.J.Immunol.,23,1098(1993)/非特許文献１、Immunology,86,319(1995)/非特許文献２、Chemical Immunology,65,88(1997)/非特許文献３］。また、Ｆｃ領域とＦｃＲとの結合には、CH2ドメインに結合している糖鎖の重要性も示されており［Chemical Immunology,65,88(1997)、第３回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム講演抄録ｐ３０（２００５）/非特許文献４］、糖鎖構造の最適化により高いエフェクター機能を有する抗体の作成も報告されている［特開２００５−２２４２４０号公報/特許文献１］。これらの報告は、ヒトＩｇＧのエフェクター機能に糖鎖を含むＦｃ領域のCH2ドメインが極めて重要で、その部分のアミノ酸あるいは糖鎖構造の最適化により高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能であることを示している。
【０００５】
これまでにＦｃのアミノ酸置換に関する研究が盛んに行われてきた。ＰｒｅｓｔａらはＦｃアミノ酸のアラニン置換を網羅的に行い、適当なアミノ酸置換（Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ）がＦｃγＲＩＩＩａに対する結合能を上昇させ、ＡＤＣＣ活性が上昇することを見いだした［国際公開第ＷＯ００／４２０７２号パンフレット/特許文献２］。さらにＬａｚａｒらによると、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅの同時置換により、異なる抗体のＡＤＣＣ活性が共に上昇するというデータが示されている［ＵＳ２００５／００５４８３２Ａ１/特許文献３］。
【０００６】
このような抗体を生産する際には、目的の抗原を認識する抗体を産生する細胞の作成に時間と労力を要し、しかも必要な抗体活性を確保する為に動物細胞を用いる産生方法を行う必要があるため、抗体産生のコストを押し上げ、今後の抗体医療の大きな問題ともなっている。抗体の効率的な展開の為には、コスト削減の為の安価な抗体製造方法や高活性な抗体の製造方法が求められている。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２２４２４０号公報
【特許文献２】国際公開第００／４２０７２号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号明細書
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１０９８（１９９３）
【非特許文献２】Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６，３１９（１９９５）
【非特許文献３】Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７）
【非特許文献４】第３回糖鎖科学コンソーシアムシンポジウム講演抄録ｐ30(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、エフェクター機能が増強された抗体、該抗体を簡易に製造する方法、抗体のエフェクター機能を向上させる方法、及び該抗体を含み、薬理活性が高く投与量を低減でき、しかも副作用が少なく、広範な用途に利用可能な治療用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意検討を行ったところ、Ｆｃ領域の特定部位を特定のアミノ酸残基に置換することにより、エフェクター機能を著しく向上しうることを見出した。また、Ｆｃ領域の特定のアミノ酸残基を置換し、該抗体の糖鎖結合部位に結合する糖鎖のフコースを低減させることにより、エフェクター機能が著しく向上しうることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下[１]から[２０]を提供するものである。
[１]  ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられた抗体であって、以下の（a）及び／又は（b）に記載の特徴を有する抗体；
（a）定常領域において295番目以外の３つのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられた抗体、及び／又は
（b）Ｆｃ領域に結合しているN-グリコシド結合糖鎖において還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体。
[２]  ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換えられたことを特徴とする抗体。
[３]  ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられたことを特徴とする抗体。
[４]  ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸が、システイン残基に置き換えられた抗体であって、Ｆｃ領域に結合しているN-グリコシド結合糖鎖において還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体。
[５]  定常領域がヒトＩｇＧの定常領域である[１]から[４]の何れかの項に記載の抗体。
[６]  ヒト細胞表層存在分子を認識する部位を有する、[１]から[５]の何れかの項に記載の抗体。
[７]  サイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、ウイルス感染細胞表層分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、[１]から[６]の何れかの項に記載の抗体。
[８]  抗原ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、インテグリン分子からなる群から選択される少なくとも一つを認識する、[１]から[７]の何れかの項に記載の抗体。
[９]  [１]から[８]の何れかの項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
[１０]  [９]に記載の核酸を含むベクター。
[１１]  [１０]に記載のベクターを有する宿主細胞又は宿主生物。
[１２]  [１１]に記載の宿主細胞又は宿主生物を、核酸がコードする抗体を発現するように培養することを特徴とする抗体の製造方法。
[１３]  [１]から[８]の何れかの項に記載の抗体を含む治療用組成物。
[１４]  ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたエフェクター機能を有する抗体を発現する細胞であって、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した細胞。
[１５]  以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置換されたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
[１６]  以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
[１７]  以下（１）から（３）の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の製造方法；
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
[１８]  エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換える工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法。
[１９]  エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換える工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法。
[２０]  下記（１）から（３）の工程を含む抗体のエフェクター機能を向上させる方法；
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
[発明の実施の形態]
【００１１】
本明細書中、「Ｆｃ領域」は、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は、重鎖定常部位のＣ末端側に位置するＣＨ２及びＣＨ３から構成される。
【００１２】
本発明の一部として、以下（I）から（IＶ）に記載の抗体を提供する。
（Ｉ）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸がシステイン残基に置き換えられた抗体であって、以下の（a）及び／又は（b）に記載の特徴を有する抗体；
（a）定常領域において295番目以外の３つのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられた抗体、及び／又は
（b）Ｆｃ領域に結合しているN-グリコシド結合糖鎖において還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体。
（II）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換えられたことを特徴とする抗体（以下298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型抗体と表すこともある）。
（III）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられたことを特徴とする抗体（以下239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型抗体と表すこともある）。
（IV）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸が、システイン残基に置き換えられた抗体であって、Ｆｃ領域に結合しているN-グリコシド結合糖鎖において還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体（以下フコース低減295Cys型抗体と表すこともある）。
【００１３】
298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型抗体
(a)ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号：１４（Ｈ鎖）の303、338、339、300番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸をコードする塩基は、それぞれ配列番号：１３（Ｈ鎖）の907-909、1012-1014、1015-1017、898-900番目の塩基に対応する。
(b) ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号：１６（Ｈ鎖定常領域）の181、216、217、178番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸をコードする塩基は、それぞれ配列番号：１５（Ｈ鎖定常領域）の541-543、646-648、649-651、532-534番目の塩基に対応する。
(c) ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号：１８（Ｈ鎖Fc領域）の68、103、104、65番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸をコードする塩基は、それぞれ配列番号：１７（H鎖Fc領域）の202-204、307-309、310-312、193-195番目の塩基に対応する。
239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型抗体
(a)ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号：２４（Ｈ鎖）の244、335、337、300番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸をコードする塩基は、それぞれ配列番号：２３（H鎖）の730-732、1003-1005、1009-1011、898-900番目の塩基に対応する。
(b)ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号：２６（Ｈ鎖定常領域）の122、213、215、178番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸をコードする塩基は、それぞれ配列番号：２５（H鎖定常領域）の364-366、637-639、643-645、532-534番目の塩基に対応する。
(c)ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸は、それぞれ配列番号：２８（Ｈ鎖Fc領域）の9、100、102、65番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸をコードする塩基は、それぞれ配列番号：２７（H鎖Fc領域）の25-27、298-300、304-306、193-195番目の塩基に対応する。
フコース低減295Cys型抗体
(a)ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸は、配列番号：３０（Ｈ鎖）の300番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸をコードする塩基は、配列番号：２９（H鎖）の898-900番目の塩基に対応する。
(b)ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸は、配列番号：３２（Ｈ鎖定常領域）の178番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸をコードする塩基は、配列番号：３１（H鎖定常領域）の532-534番目の塩基に対応する。
(c)ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸は、配列番号：３４（Ｈ鎖Fc領域）の65番目のアミノ酸に対応する。
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸をコードする塩基は、配列番号：３３（H鎖Fc領域）の193-195番目の塩基に対応する。
【００１４】
本発明の抗体は、上記構成を有するため、エフェクター機能を著しく向上することができる。エフェクター機能には、例えば抗体被覆粒子の食作用および破壊、免疫複合体の浄化、活性化されたエフェクター細胞による抗体被覆された標的細胞の溶解［抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）］、補体タンパク質による細胞膜破壊［補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）］、炎症メディエーターの放出、胎盤トランスファーおよび免疫グロブリン生産の制御等が含まれる。なかでも、本発明の抗体はＡＤＣＣ及びＣＤＣの向上に適しており、特にＡＤＣＣ活性の向上に好適である。
【００１５】
本発明の抗体は、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣをより効果的に媒介することができる。ＡＤＣＣは、細胞が媒介する反応を意味しており、エフェクター細胞が標的細胞を認識し、標的細胞の溶解を引き起こす反応である。前記エフェクター細胞には、例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、マクロファージなどが挙げられる。これらのエフェクター細胞は、通常、細胞表層にＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現しており、Ｆｃ領域の構造に応じて、結合可能な種類のＦｃＲを発現する細胞が認識され、細胞障害活性を発現することができる。
本発明の抗体は、少なくともADCC活性が上昇していればよく、その安定性、溶解性、Fc受容体への結合親和性、又はCDC活性が減少している抗体も、本発明の抗体に含まれる。なお、Ｆｃ受容体としては、FcγRＩ、FcγRII、FcγRIII、ＦｃＲｎ、等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の抗体は、Ｆｃ領域を介してエフェクター細胞を認識することにより、ＡＤＣＣを誘導、促進することができる。本発明においては、変異が導入されたまたは変異が導入されかつ抗体に結合する糖鎖のフコースが低減されたＦｃ領域がエフェクター細胞の表層分子［ＦｃγＲ等］と容易に結合して効率よく活性化できるためか、少量の抗体で高いＡＤＣＣ活性を速やかに誘導することができる。
【００１７】
ＣＤＣは、補体タンパク質が媒介する反応を意味しており、補体タンパク質が標的細胞を認識し、標的細胞の細胞膜の破壊を引き起こす反応である。前記補体タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合することにより活性化される。本発明においては、変異が導入されたまたは変異が導入されかつ抗体に結合する糖鎖のフコースが低減されたＦｃ領域が補体タンパク質［Ｃ１ｑ等］と容易に結合して効率よく活性化できるためか、少量の抗体で高いＣＤＣ活性を速やかに誘導することができる。
【００１８】
本発明におけるＦｃ領域は、エフェクター機能（特にＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を効果的に媒介できる構造であることが好ましい。このような観点から、改変を加える前の定常領域（親定常領域）としては、ＩｇＧの定常領域を用いる場合が多い。なかでも、ヒトＩｇＧの定常領域が好ましく、より好ましくはヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４の各定常領域等が用いられる。本発明においては、元来ＡＤＣＣ活性を有しているヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ３の定常領域が好適に用いられる。また、ＣＤＣ活性はサブクラスに応じて殺効果が異なり、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ４等の定常領域を用いることができる。
なお、定常領域の配列としては、［Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)］に開示されている配列を例示できるが、これに限定されるものではない。
【００１９】
親定常領域としては、天然に存在する抗体の定常領域に限定されず、（II）の抗体を製造する場合はＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目、（III）の抗体を製造する場合はＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目、（IV）の抗体を製造する場合はＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸以外のアミノ酸配列の一部に欠失、付加、置換等の修飾がなされたものであってもよく、対応するアミノ酸配列からなる合成ポリペプチドであってもよい。親定常領域におけるアミノ酸の置換は、遺伝子組換え技術を用いた公知の方法を用いて行うことができる。
【００２０】
本発明におけるＦｃ領域は糖鎖結合部位を含んでいる。上記（II）、（III）に記載の抗体においては、前記糖鎖結合部位には、必ずしも糖鎖が結合している必要はないが、ＡＤＣＣ活性を促す点で少なくとも一つの糖鎖が結合していることが好ましい。前記糖鎖としては、一以上の単糖からなる糖鎖であれば特に限定されず、例えば抗体重鎖のＦｃ領域に結合している糖鎖やそのグライコフォーム、合成糖鎖のいずれであってもよい。例えば、下記式で表される糖鎖は、IgG1抗体重鎖のＦｃ領域における糖鎖結合部位に結合している糖鎖の例である。
【化１】
0005427348.tif 000002
【００２１】
一般に、Ｆｃ領域に結合する糖鎖の構造は、エフェクター機能に密接に関連することが知られており、上記（II）、（III）に記載の抗体においては、同機能の向上を目的として、天然型糖鎖に適宜修飾が施された糖鎖を用いることも好ましい。天然型糖鎖に修飾が施された糖鎖の例としては、例えば、上記式中、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合しているフコースに対し、付加、欠失、置換等の修飾を施した構造の糖鎖などが挙げられる。糖鎖修飾部位に結合する糖鎖は、Ｏ−結合型、Ｎ−結合型の何れであってもよいが、好ましくはＮ−結合型糖鎖からなる糖鎖が用いられる。
【００２２】
上記（IV）に記載の抗体においては、Fc領域の糖鎖結合部位に少なくとも一つの糖鎖が結合している。結合する糖鎖は還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合してないＮ-グリコシド結合糖鎖である。一般に、Ｎ-グリコシド結合糖鎖は、下記のコア構造を含む。下記構造において、アスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、反対側を非還元末端という。
【化２】
0005427348.tif 000003
Ｎ-グリコシド結合糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合するハイマンノース型、コア構造の非還元末端側にガラクトース-Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Gal-GlnNAcと称す）の枝を平行して１ないし複数本有し、更にGal-GlnNAcの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型、コア構造の非還元末端にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイブリッド型などがあげられる。
上記（IV）の抗体が含むＮ-グリコシド結合糖鎖は、様々な構造を有しているが、好ましくは上記[化2]の構造において、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖を含む糖鎖である。
【００２３】
IgGは2本のH鎖から構成されている。上記（IV）の抗体は、Ｈ鎖Fc領域の少なくとも一つの糖鎖修飾部位にＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないN-グリコシド結合糖鎖が付加された抗体である。より好ましくは、H鎖Fc領域の全ての糖鎖修飾部位においてＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しないＮ-グリコシド結合糖鎖が付加された抗体である。
上記（IV）の抗体を含む組成物とは、組成物中の抗体のN−グリコシド結合糖鎖のうち、20％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70%以上、さらに好ましくは90％以上のN−グリコシド結合糖鎖においてフコースが欠損している組成物をいう。
【００２４】
一般に、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域の糖鎖は、ＩｇＧ抗体のＡＤＣＣ活性にきわめて重要であり、糖鎖の存在そのものや、その糖鎖構造がＡＤＣＣ活性に密接に関与していることが知られている。また、糖鎖修飾部位への糖鎖の結合（特にＮ型糖鎖の発現）には、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは任意のアミノ酸残基）というアミノ酸配列が必要である。本発明の抗体は、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にある糖鎖修飾部位を含むＣ末端側に存在するアミノ酸配列（例えば、２９７番及び２９９番のアミノ酸Ａｓｎ及びＴｈｒ）が保存され、糖鎖結合部位においてＮ型糖鎖等の糖鎖の発現が損われることがなく、より優れたＡＤＣＣ活性の向上効果を得ることができる。例えば、システイン残基の置換部位が、IgGにおけるKabat  EU indexで２９６番目で有る場合にも、糖鎖修飾部位へ糖鎖が結合しにくいか、または結合しても糖鎖の立体構造が保持されないためか、ＡＤＣＣ活性の向上効果を十分に得ることができない。
【００２５】
本発明の抗体は、細胞表層存在分子を認識することが好ましい。より好ましくは、本発明の抗体が認識する細胞表層存在分子はヒト細胞表層存在分子である。
【００２６】
前記ヒト細胞表層存在分子には、例えばサイトカイン受容体、細胞接着分子、がん細胞表層分子、がん幹細胞表層分子、血液細胞表層分子、及びウィルス感染細胞表層分子等が含まれる。このようなヒト細胞表層存在分子の具体例としては、例えばＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦａｌｐｈａ受容体、ＶＥＧＦ受容体、ＣＴＬＡ−４、ＡＩＬＩＭ／ＩＣＯＳ、及びインテグリン分子等が挙げられる。
本発明の抗体は、野生型と比較して、エフェクター機能が向上している。
【００２７】
本発明における抗体とは、抗原結合部位を有し、エフェクター機能（特にＡＤＣＣ）を誘導可能な分子であれば特に限定されず、例えばヒト抗体、マウス抗体等の非ヒト抗体などの天然型抗体及びこれらの誘導体；キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体等の抗原抗体反応を誘導可能な組換え抗体等が含まれる。これらは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体の何れであってもよく、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。前記天然型抗体の誘導体とは、天然型抗体のアミノ酸配列の一部に、欠失、付加、置換等の変異が導入された抗体を意味しており、これらの変異は自然に生じたものでもよく、人為的であってもよい。前記抗原結合部位には、天然型抗体のＦａｂ領域における可変部位ＶＨ及びＶＬ（特に超可変部位ＣＤＲ１〜３）及びこれらと相同な配列からなる領域等が含まれる。
【００２８】
なかでも、良好なＡＤＣＣ活性を発揮でき、抗体医薬に適用しやすい点で、組換え抗体、特にキメラ抗体、ヒト化抗体などが好ましく用いられる。前記キメラ抗体とは、２以上の異種又は同種の融合タンパクからなる抗体を意味しており、例えばヒトＩｇＧのＦｃ領域と非ヒトＩｇＧ（マウスＩｇＧ等）のＦａｂ領域とで構成される抗体等が挙げられる。前記ヒト化抗体としては、例えば非ヒトＩｇＧ（マウスＩｇＧ等）の超可変部領域を、ヒトＩｇＧ由来のＦｃ領域を含む残りの領域に融合させた抗体等が挙げられる。  例えば、Fab領域が非ヒト抗体由来のFab領域であり、かつFc領域がヒト抗体由来のFc領域であることを特徴とするキメラ抗体、可変領域が非ヒト抗体由来の可変領域であり、かつ定常領域がヒト抗体由来の定常領域であることを特徴とするキメラ抗体、CDRが非ヒト抗体由来のCDRであり、ＦＲがヒト抗体由来のＦＲであり、かつ定常領域がヒト抗体由来の定常領域であることを特徴とするヒト化抗体が挙げられる。
【００２９】
抗体としては、種々の抗原に対する抗体を用いることができる。これらの抗体が認識する抗原には、膜貫通分子などのレセプター、成長因子などのリガンド等のポリペプチド；腫瘍関連糖脂質抗原などの米国特許第５０９１１７８号に記載の非ポリペプチド抗原等が含まれる。具体的な抗原としては、例えば、レニン；ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；α-１-アンチトリプシン；インシュリンＡ-鎖；インシュリンＢ-鎖；プロインシュリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びvon Willebrands因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化剤；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子-α及び-β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；ヒトマクロファージ炎症タンパク質(ＭＩＰ-１-α)；ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ-鎖；リラキシンＢ-鎖；プロレラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のような細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原(ＣＴＬＡ)；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳誘導神経向性因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６）、又はＮＧＦ-β等の神経成長因子等の神経成長因子；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の繊維芽成長因子；表皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ−β（ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４、及びＴＧＦ-β５等）等のトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インシュリン様成長因子-Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；ｄｅｓ(１-３)-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０等のＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質(ＢＭＰ)；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＧ−ＣＳＦ等のコロニー刺激因子（ＣＳＦｓ）；ＩＬ-１からＩＬ-１０等のインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン(addressin)；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ-４及びＶＣＡＭ等のインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等の腫瘍関連抗原；及びこれらのポリペプチドの断片等が含まれる。
【００３０】
本発明の抗体に対する好適な分子標的には、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３４等のＣＤタンパク質；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプター等のＥｒｂＢレセプターファミリー；ＬＦＡ-１、Ｍａｃ１、ｐ１５０.９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びそのα又はβサブユニットを何れか含むαｖ／β３インテグリン(例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体)等の細胞接着分子；ＶＥＧＦ等の成長因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満(ＯＢ)レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等が含まれる。
【００３１】
上記に例示の抗原の中でも、可溶型抗原及びその断片は、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。例えばレセプターのような膜貫通分子に対しては、例えば、レセプターの細胞外ドメイン等の断片を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞を免疫原として使用することもできる。そのような細胞は、天然源（例えば、癌株化細胞）から取り出すことができ、又は組換えベクターを用いて膜貫通分子等の抗原認識領域を発現するように形質転換された細胞であってもよい。
【００３２】
これらの抗体は、抗原結合部位以外に、細胞表層存在分子を結合可能な部位を有していてもよい。このような構成を有する抗体によれば、標的細胞の認識効率を向上できるため、少量の抗体で高いエフェクター機能を発揮することが可能である。
【００３３】
また本発明の抗体は、その一部に他のペプチド又はポリペプチドを有するものであっても良い。他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 ）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
【００３４】
本発明においては、例えば下記（１）から（４）のいずれかに記載の298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型抗ＣＤ２０抗体を提供する。
（１）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２）配列番号：１４に記載のアミノ酸配列（Ｈ鎖全長のアミノ酸配列）を有するＨ鎖を含む抗体、
（３）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（４）上記（１）、（２）または（３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体、
（ｉ）ＣＤＲ１として配列番号：８に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：１０に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列、およびＣＬとして配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：２０に記載のアミノ酸配列（Ｌ鎖全長のアミノ酸配列）を有するL鎖。
【００３５】
本発明は、例えば下記（５）から（８）のいずれかに記載の298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型抗ＣＤ２０抗体を提供する。
（５）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１５に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（６）配列番号：１３に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（７）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：１７に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（８）上記（５）、（６）または（７）のいずれかに記載のＨ鎖、および、下記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＬ鎖の対を有する抗体、
（ｉ）配列番号：７に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：９に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：１１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：２１に記載の塩基配列からコードされるＣＬを有するＬ鎖、
（ｉｉ）配列番号：１９に記載の塩基配列からコードされるＬ鎖。
【００３６】
本発明においては、例えば下記（９）から（１２）のいずれかに記載の239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型抗ＣＤ２０抗体を提供する。
（９）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１０）配列番号：２４に記載のアミノ酸配列（Ｈ鎖全長のアミノ酸配列）を有するＨ鎖を含む抗体、
（１１）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１２）上記（９）、（１０）または（１１）のいずれかに記載のＨ鎖、および、上記（４）の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体。
【００３７】
本発明は、例えば下記（１３）から（１６）のいずれかに記載の239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型抗ＣＤ２０抗体を提供する。
（１３）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：２５に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（１４）配列番号：２３に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（１５）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号２７に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（１６）上記（１３）、（１４）または（１５）のいずれかに記載のＨ鎖、および、上記（８）の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＬ鎖の対を有する抗体。
【００３８】
本発明においては、例えば下記（１７）から（２０）のいずれかに記載のフコース低減型295Cys型抗ＣＤ２０抗体を提供する。
（１７）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＣＨとして配列番号：３２に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（１８）配列番号：３０に記載のアミノ酸配列（Ｈ鎖全長のアミノ酸配列）を有するＨ鎖を含む抗体、
（１９）ＣＤＲ１として配列番号：２に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ２として配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＣＤＲ３として配列番号：６に記載のアミノ酸配列、およびＦｃ領域として配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を有するＨ鎖を含む抗体、
（２０）上記（１７）、（１８）または（１９）のいずれかに記載のＨ鎖、および、上記４の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のL鎖の対を有する抗体。
【００３９】
本発明は、例えば下記（２１）から（２４）のいずれかに記載のフコース低減型295Cys型抗ＣＤ２０抗体を提供する。
（２１）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：３１に記載の塩基配列からコードされるＣＨを有するＨ鎖を含む抗体、
（２２）配列番号：２９に記載の塩基配列からコードされるＨ鎖を含む抗体、
（２３）配列番号：１に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ１、配列番号：３に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ２、配列番号：５に記載の塩基配列からコードされるＣＤＲ３、および配列番号：３３に記載の塩基配列からコードされるＦｃ領域を有するＨ鎖を含む抗体、
（２４）上記（２１）、（２２）または（２３）のいずれかに記載のＨ鎖、および、上記（８）の（ｉ）または（ｉｉ）に記載のＬ鎖の対を有する抗体。
【００４０】
本発明の抗体は、遺伝子組換え技術等を用いた公知の方法で製造することができる。本発明の抗体は、本発明の抗体をコードする単離された核酸を用い、該核酸を含むベクターを作成し、該ベクターを有する宿主細胞又は宿主生物を得、これらの宿主細胞又は宿主生物を核酸がコードするポリペプチドを発現するように培養する方法を用いて製造することができる。
【００４１】
本発明の抗体は、一般的な抗体の製造方法用いて製造することができる。抗体の製造方法は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988、Monoclonal Antibodies:principles and practice,Third Edition,Acad.Press,1993、Antibody Engineering,A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,1996等に記載された方法を用いることができ、例えば、以下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。
【００４２】
抗体の製造は、例えば親Ｆｃ領域を含むポリペプチドをコードする核酸において、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にあるアミノ酸を目的のアミノ酸をコードするように置換された配列からなる核酸を単離する工程；抗体をコードする単離された核酸を、適当なプロモーターを含む発現ベクターに組み込んで複製可能な組換えベクターを生産する工程；得られた組換えベクターを用いて宿主細胞又は宿主生物を形質転換する工程；及び形質転換した宿主細胞又は宿主生物を培養し抗体を生産する工程を含んでいる。
【００４３】
親Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、ＩｇＧにおけるＦｃ領域にあるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、295、298、330、及び332-334番目のアミノ酸以外のアミノ酸に欠失、付加、置換等の修飾がなされたものであってもよい。
【００４４】
本発明抗体をコードする核酸は、塩基配列に変異を導入する慣用の方法で得ることができ、例えば、親Ｆｃ領域における被置換アミノ酸残基をコードする核酸配列を「ＴＧＣ」又は「ＴＣＴ」、「GAT」又は「GAC」、「CTT」又は「CTC」又は「CTA」又は「CTG」、「GAA」又は「GAG」、「GCT」又は「GCC」又は「GCA」又は「GCG」、「TCT」又は「TCC」又は「TCA」又は「TCG」に置き換えた核酸配列を含む合成オリゴヌクレオチドを用い、親Ｆｃ領域を含むｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより調製することができる。
上記（II）、（III）に記載の抗体においては、エフェクター機能を阻害しない範囲で、親Fc領域のアミノ酸配列に（II）、（III）に記載に記載した変異を導入する工程中または導入後に、さらに他の修飾が施されてもよく、例えばアミノ酸配列や糖鎖結合部位に結合する糖鎖の一部に欠失、付加、置換等の修飾が施されてもよい。特に本発明においては、Ｆｃ領域の糖鎖結合部位に結合する糖鎖に公知の修飾を加えることにより、エフェクター機能の向上効果を得ることができ好ましい。
【００４５】
複製可能な組換えベクターは、本発明の抗体をコードする核酸（ＤＮＡ断片又は全長cDNA）を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより作製できる。発現ベクターとしては、導入する宿主細胞又は宿主生物の種類に応じて適宜選択することができ、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、目的とする抗体をコードする核酸を転写可能なプロモーターを含有しているものが用いられる。これらの組換えベクターは、単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４６】
本発明においては、２以上の組換えベクターを併用してもよい。併用する組換えベクターとしては、例えば、相補的抗体軽鎖または重鎖、あるいは所望のレセプターやリガンドの結合ドメインをコードする核酸、所望の糖鎖修飾酵素をコードする核酸等を適当なプロモーターを含む発現ベクターを用いることができる。これらの組換えベクターを併用することにより、より高いエフェクター機能を発現可能な抗体を得ることができる。２以上の組換えベクターを用いる場合には、宿主細胞又は宿主生物は同一でも異なってもよい。
【００４７】
宿主細胞としては、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。また、本発明においては、宿主細胞として、エフェクター機能に影響を及ぼす糖鎖結合部位に結合する糖鎖に対する修飾酵素の活性が低下又は欠失した細胞を選択するか、人為的手法により同活性を低下又は欠失させた細胞を用いることができる。このような酵素には、Ｎ−グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素等が含まれ、例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素等が挙げられる。宿主生物としては、例えば動物個体、植物個体等が挙げられる。
【００４８】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）等を利用できる。プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等をあげることができる。宿主細胞としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等をあげることができる。
【００４９】
組換えベクターの酵母への導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１５３，１６３（１９８３）］、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ），７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等をあげることができる。
【００５０】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐcDNAＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３［特開平２−２２７０７５］、ｐＣＤＭ８［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３２９，８４０，（１９８７）］、ｐcDNAＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。プロモーターとしては、動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等をあげることができる。
【００５１】
組換えベクターの動物細胞への導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法［特開平２−２２７０７５］、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３］、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４−遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法［マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版］等をあげることができる。
【００５２】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、タンパク質を発現することができる。即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）等をあげることができる。
【００５３】
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１［カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）］、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を用いることができる。
【００５４】
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。
【００５５】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
【００５６】
組換えベクターの植物細胞への導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法［特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７］、エレクトロポレーション法［特開昭６０−２５１８８７］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法［日本特許第２６０６８５６、日本特許第２５１７８１３］等をあげることができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、Ｆｃ領域と他のタンパク質との融合タンパク質発現等を行うことができる。
【００５７】
このように１又は２以上の組換えベクターが導入された形質転換体は、宿主に応じた培地を用いて、公知の方法に従って培養することにより、培養物中に抗体）を生成蓄積することができる。
【００５８】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００５９】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主とする形質転換体の培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調製は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００６０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［ザ・ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエイション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ），１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［ヴュウロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８，３９６（１９５９）］、１９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォア・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３，１（１９５０）］、Ｗｈｉｔｔｅｎ培地［発生工学実験マニュアル−トランスジェニック・マウスの作り方（講談社）勝木元也編（１９８７）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６１】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、Ｓｆ−９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６２】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００６３】
培養している形質転換体は、自然に又は誘導により抗体を発現し、培養物中に生成蓄積することができる。抗体の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。抗体の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させる抗体の構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【００６４】
抗体が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．），２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），８６，８２２７（１９８９）；ジーン・デベロップメント（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．），４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、特開平０６−８２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該抗体を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
【００６５】
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、発現ベクターに、抗体をコードするＤＮＡ、および抗体の発現に適切なシグナルペプチドをコードするＤＮＡを挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に抗体を発現させることにより、目的とする抗体を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。また、特開平２−２２７０７５号公報に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて抗体を製造することもできる。
【００６６】
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、抗体を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該抗体を採取することにより、該抗体を製造することができる。動物個体を用いて抗体を製造する方法としては、例えば公知の方法［アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６３９Ｓ（１９９６）；アメリカン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ），６３，６２７Ｓ（１９９６）；バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体を生産する方法があげられる。
【００６７】
動物個体の場合は、例えば、抗体をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、抗体を該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より抗体を採取することにより、抗体を製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【００６８】
植物個体を用いて抗体を製造する方法としては、例えば抗体分子をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；トレンド・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、抗体を該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該抗体を採取することにより、抗体を生産する方法があげられる。抗体をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体は、例えば抗体が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学（株）製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、抗体の精製標品を得ることができる。
【００６９】
また、抗体が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として抗体の不溶体を回収する。回収した抗体の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該抗体を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該抗体の精製標品を得ることができる。
【００７０】
抗体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該抗体あるいはその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、抗体の精製標品を得ることができる。
【００７１】
このようにして取得される抗体として、例えば、抗体の断片、抗体のＦｃ領域を有する融合タンパク質（キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体等の抗原抗体反応を誘導可能な組換え抗体）などを挙げることができる。
即ち本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換えられた工程を含む、エフェクター機能が向上した抗体の製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の製造方法を提供する。
（A-1）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換える工程
（A-2）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる工程
（A-3）発現産物を回収する工程。
上記（A-1）は、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換えられた抗体をコードするＤＮＡを製造する工程に置き換えてもよい。
【００７２】
また、本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられた工程を含む、エフェクター機能が向上した抗体の製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の製造方法を提供する。
（B-1）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換える工程
（B-2）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを宿主細胞又は宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる工程
（B-3）発現産物を回収する工程。
上記（B-1）は、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸が、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換えられた抗体をコードするＤＮＡを製造する工程に置き換えてもよい。
【００７３】
即ち本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換える工程、及び該抗体の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性を低減させる、または欠失させる工程を含む、エフェクター機能が向上した抗体の製造方法を提供する。より具体的には、本発明は、以下の工程を含むエフェクター機能が向上した抗体の製造方法を提供する。
（C-1）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換える工程、
（C-2）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（C-3）発現産物を回収する工程。
上記（C-1）は、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられた抗体をコードするＤＮＡを製造する工程に置き換えてもよい。
【００７４】
本発明の一つの態様としては、まず、当業者に公知のエフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で上記（A）〜（C）において置換部位としたアミノ酸残基を上記（A）〜（C）において目的とするアミノ酸残基に置換する。
本発明の別の態様としては、まず、エフェクター機能を有する抗体を製造し、次いで、製造された抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で上記（A）〜（C）において置換部位としたのアミノ酸残基を目的とするアミノ酸残基に置換する。例えば、まず、後述の方法によって所望の抗原に結合する抗体を得て、次いで、得られた抗体がエフェクター機能を有するか否かを当業者に周知の方法によって判定することで、エフェクター機能を有する抗体を製造することができる。エフェクター機能の判定方法としては、例えば実施例に記載の方法が挙げられる。
【００７５】
本発明において、アミノ酸残基をシステイン残基に置換する方法は特に限定されるものではないが、例えば、部位特異的変異誘発法（Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vector:an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA、Mark J. Zoller and Michael Smith、Nucleic Acids Research、Volume 10 Number 20, 6487-6500, 1982；Directed evolution of green fluorescent protein by a new versatile PCR strategy for site-directed and semi-random mutagenesis Asako Sawano and Atsushi Miyawaki、Nucleic Acids Research、Volume 28, Number 16, e78, 2000）によって行うことが出来る。
【００７６】
本発明においては、次いで、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で上記（A）〜（C）において置換部位としたアミノ酸残基が目的とするアミノ酸残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、当業者に周知な方法によって宿主細胞又は宿主生物に導入し、該ＤＮＡを発現させる。次いで、当業者に周知な方法を利用することにより、発現産物を回収することが出来る。
【００７７】
ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で上記（A）〜（C）において置換部位としたアミノ酸残基が目的とするアミノ酸残基に置換されたＦｃ領域を有するＨ鎖をコードするDNAは、部分DNAに分けて製造することができる。部分DNAの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA、あるいはFab領域をコードするDNAとＦｃ領域をコードするDNAが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。L鎖をコードするDNAもまた、同様に部分DNAに分けて製造することができる。
【００７８】
以下に所望の抗原に結合する抗体を得る方法に関して述べる。
抗体のH鎖又はL鎖をコードする遺伝子は既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8、Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97、Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6、Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14、及び特表平20−504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法(WO95/15393号パンフレット)やリボソーム提示法等の公知の方法を用いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388を参考にすることができる。
【００７９】
ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域(V領域)のcDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結することにより得ることができる。
【００８０】
より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、本発明のH鎖及びL鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウイルスを用いた方法(例えば、WO98/46777など)などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
【００８１】
抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をin vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56参照)。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1-59878号公報参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる(WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735参照)。
【００８２】
動物の免疫化は、例えば、感作抗原をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。
【００８３】
ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細胞と融合して作成することができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。
【００８４】
続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブ(例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等)を用いてクローニングすることができる。また、mRNAからRT-PCRによりクローニングすることも可能である。
【００８５】
構築された抗体遺伝子を公知の方法により発現させることで、抗体を取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター／エンハンサー、発現させる抗体遺伝子、及びその３’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させたDNAを含む発現ベクターにて、抗体遺伝子を発現させることができる。例えば、プロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサーが挙げられる。また、それ以外にも、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）などのウイルスプロモーター／エンハンサーやヒトエロンゲーションファクター−1αなどの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサーを用いることができる。例えば、SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合には、Mullingらの方法 (Mulling RC et al., Nature (1979) 277: 108-14)に従えば、容易に抗体遺伝子を発現することができる。ヒトエロンゲーションファクター−1αを用いる場合には、Mizushimaの方法 (Mizushima, Nucleic Acids Res (1990) 18: 5322) に従えば、容易に抗体遺伝子を発現することができる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させたDNAを含む発現ベクターにて、抗体遺伝子を発現させることができる。例えば、プロモーターとしてLacZプロモーター、araBプロモーターが挙げられる。
【００８６】
ハイブリドーマ培養・増殖又は遺伝子組換えにより得られた抗体は、均一になるまで精製することができる。抗体の分離、精製は、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、硫酸アンモニウム又は硫酸ナトリウム等による塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラム、プロテインLカラム等が挙げられる。このようにして取得された抗体がエフェクター機能を有するか否かは、当業者に周知な方法によって判定可能であり、例えば実施例に記載の方法によって判定することができる。
【００８７】
Ｎ−アセチルグルコサミンにフコースが結合しない、あるいは結合が低下しているＮ−グリコシド結合糖鎖を有する抗体を製造するための宿主細胞または動物個体あるいは植物個体としては、例えば、抗体のFc領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低いまたは酵素活性を有しない細胞または個体であればいかなるものでもよい。抗体のFc領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加させる酵素活性の低いまたは酵素活性を有しない細胞としては、ラットミエローマYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（YB2/0細胞と略される）(ATCC CRL 1662として保存されている)、FTVIIIノックアウトCHO細胞(WO 02/31140)、Lec13 細胞(WO03/035835)、フコーストランスポーター欠損細胞（WO2006/067847、WO2006/067913）などを挙げることができる。
【００８８】
また、当業者は公知の方法により、宿主細胞または動物個体あるいは植物個体のα1,6結合に関与する酵素の遺伝子を欠損させたり、該遺伝子への変異を与えて酵素活性を下げるか欠失させたりすることにより、α１,6結合に関与する酵素活性の少ない、または有しない細胞または個体を製造して宿主細胞または動物個体あるいは植物個体として用いることもできる。α1,6結合に関与する酵素としては、フコシルトランスフェラーゼ、好ましくはα1,6-フコシルトランスフェラーゼ（以下FUT8と表すこともある）があげられる。宿主細胞としては、細胞、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであれば、いずれも用いることができる。
【００８９】
糖鎖の解析は当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、抗体にN-Glycosidase F(Roche)等を作用させ、糖鎖を抗体から遊離させる。その後、セルロースカートリッジを用いた固相抽出(Shimizu Y. et al., Carbohydrate Research 332(2001), 381-388)による脱塩後に濃縮乾固し、2-アミノピリジンによる蛍光標識を行う(Kondo A. et al., Agricultural and Biological Chemistry 54:8(1990), 2169-2170)。得られたPA化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製PA化糖鎖とする。その後、ODSカラムによる逆相HPLC分析を行うことにより測定することが可能である。また、ＰＡ化糖鎖の調製を行った後、ODSカラムによる逆相HPLC分析およびアミンカラムによる順相HPLC分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施することにより行うことも可能である。
【００９０】
フコースを付加する酵素の活性が低減または欠失した宿主細胞又は宿主生物を製造するには、酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAを用いることができる。
【００９１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する。
【００９２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNA の長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体または修飾産物もアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。このような修飾産物の例には、メチルホスホネート型またはエチルホスホネート型などの低級アルキルホスホネート修飾物、ホスホロチオエート修飾物、およびホスホロアミデート修飾物が含まれる。
【００９３】
フコースを付加する酵素の活性が低減または欠失した宿主細胞又は宿主生物を製造するには、酵素をコードするDNAの転写産物と相補的なdsRNAを用いることができる。また、RNAi技術を含む。RNAiは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNA（以下dsRNA）を細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象である。細胞に約40〜数百塩基対のdsRNAが導入されると、ヘリカーゼドメインを持つダイサー(Dicer)と呼ばれるRNaseIII様のヌクレアーゼがATP存在下で、dsRNAを3’末端から約21〜23塩基対ずつ切り出し、siRNA（short interference RNA）を生じる。このsiRNAに特異的なタンパク質が結合して、ヌクレアーゼ複合体（RISC：RNA-induced silencing complex）が形成される。この複合体はsiRNAと同じ配列を認識して結合し、RNaseIII様の酵素活性によってsiRNAの中央部で標的遺伝子のmRNAを切断する。また、この経路とは別にsiRNAのアンチセンス鎖がmRNAに結合してRNA依存性RNAポリメラーゼ(RsRP)のプライマーとして作用し、dsRNAが合成される。このdsRNAが再びダイサーの基質となって、新たなsiRNAを生じて作用を増幅する経路も考えられている。
【００９４】
フコースを付加する酵素の活性が低減または欠失した宿主細胞又は宿主生物を製造するには、標的とする酵素のmRNAのいずれかの領域に対するアンチセンスRNAをコードしたアンチセンスコードDNAと、標的とする酵素のmRNAのいずれかの領域のセンスRNAをコードしたセンスコードDNAより発現させて用いることができる。また、これらのアンチセンスRNAおよびセンスRNAよりdsRNAを用いることもできる。
【００９５】
上記アンチセンスRNA、dsRNAをベクター等に保持させる場合の構成としては、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合と、異なるベクターからそれぞれアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる場合がある。例えば、同一のベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれpolIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを同方向にあるいは逆方向にベクターに挿入することにより構成することができる。また、異なる鎖上に対向するようにアンチセンスコードDNAとセンスコードDNAとを逆向きに配置した発現システムを構成することもできる。この構成では、アンチセンスRNAコード鎖とセンスRNAコード鎖とが対となった一つの二本鎖DNA（siRNAコードDNA）が備えられ、その両側にそれぞれの鎖からアンチセンスRNA、センスRNAとを発現し得るようにプロモーターを対向して備えられる。この場合には、センスRNA、アンチセンスRNAの下流に余分な配列が付加されることを避けるために、それぞれの鎖（アンチセンスRNAコード鎖、センスRNAコード鎖）の３'末端にターミネーターをそれぞれ備えることが好ましい。このターミネーターは、A（アデニン）塩基を４つ以上連続させた配列などを用いることができる。また、このパリンドロームスタイルの発現システムでは、二つのプロモーターの種類を異ならせることが好ましい。
【００９６】
また、異なるベクターからアンチセンスRNA、センスRNAを発現させる構成としては、例えば、アンチセンスコードDNAおよびセンスコードDNAの上流にそれぞれ polIII系のような短いRNAを発現し得るプロモーターを連結させたアンチセンスRNA発現カセット、センスRNA発現カセットをそれぞれ構築し、これらカセットを異なるベクターに保持させることにより構成することができる。
【００９７】
フコースを付加する酵素の活性が低減または欠失した宿主細胞又は宿主生物を製造するためのdsRNAとしてsiRNAが使用されてもよい。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を指す。siRNAは、標的mRNAの翻訳を阻害する二本鎖RNA分子を意味する。DNAがRNA転写の鋳型となることを含む、siRNAを細胞に導入する標準的な技術が用いられる。siRNAには、センス核酸配列、あるいはアンチセンス核酸配列、またはその双方が含まれる。siRNAは、2つの相補的分子を含んでもよく、または、単一の転写産物が標的遺伝子由来のセンス配列および相補的アンチセンス配列の双方を有するように、すなわちいくつかの態様においてマイクロRNA（miRNA）の産生に至るヘアピンになるように構築してもよい。
【００９８】
siRNAを細胞に導入するためには、RNAを転写するための鋳型としてDNAを用いることを含む、標準的な技法が用いられる。siRNAの標的遺伝子との結合は、細胞によるタンパク質産生の低下をもたらす。オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも10ヌクレオチドであり、天然に存在する転写物と同じ長さであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約19〜約25ヌクレオチド長である。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約75、約50、約25ヌクレオチド長未満である。さらに、siRNAの阻害活性を増強するため、ヌクレオチド「u」が標的配列のアンチセンス鎖の3'末端に付加され得る。付加される「u」の数は、少なくとも2個、一般的には約2〜約10個、好ましくは約2〜約5個である。付加された「u」は、siRNAのアンチセンス鎖の3'末端で単鎖を形成する。siRNAは、mRNA転写物と結合することができる形態で細胞へ直接導入される。これらの態様において、本発明のsiRNA分子は、典型的には、アンチセンス分子について既に記載されたようにして修飾される。その他の修飾も可能であり、例えば、コレステロールと接合したsiRNAは、改良された薬理学的特性を示した（Song et al.Nature Med.9：347-351（2003））。又は、siRNAをコードするDNAは、ベクター内に存在する。
【００９９】
ベクターは、例えば、両鎖の（DNA分子の転写による）発現を可能にする様式で、機能的に連結された制御配列が、標的配列に隣接するよう、標的配列を発現ベクターへクローニングすることにより作製される（Lee,N.S.,Dohjima,T.,Bauer,G.,Li,H.,Li,M.-J.,Ehsani,A.,Salvaterra,P.,and Rossi,J.（2002）ヒト細胞におけるHIV-1 rev転写物を標的とした低分子干渉RNAの発現（Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells）Nature Biotechnology 20：500-505）。標的mRNAに対してアンチセンスのRNA分子は、第一のプロモーター（例えば、クローニングされたDNAの3'末端のプロモーター配列）により転写され、標的mRNAに対するセンス鎖であるRNA分子は、第二のプロモーター（例えば、クローニングされたDNAの5'末端のプロモーター配列）により転写される。センス鎖及びアンチセンス鎖は、インビボでハイブリダイズし、標的遺伝子のサイレンシングのためのsiRNA構築物を生成させる。又は、二つの構築物が、siRNA構築物のセンス鎖及びアンチセンス鎖を作出するために利用される。クローニングされた標的遺伝子は、単一の転写物が標的遺伝子からのセンス配列及び相補アンチセンス配列の両方を有している、二次構造、例えば、ヘアピンを有している構築物をコードし得る。
【０１００】
例えば、本発明のヘアピン構造を有する好ましいsiRNAにおけるループ配列は、CCC、UUCG、CCACC、CCACACC、及びUUCAAGAGAからなる群より選択され得る。
【０１０１】
発現は、標的配列に隣接する同一または異なる制御配列によって、時間的もしくは空間的に独立して調節され得る。siRNAは、例えば、低分子核RNA（snRNA）U6由来のRNAポリメラーゼIII転写単位又はヒトH1 RNAプロモーターを含有しているベクターへ標的遺伝子鋳型をクローニングすることにより細胞内で転写される。ベクターを細胞へ導入するため、トランスフェクション増強剤が使用され得る。FuGENE（Rochediagnostices）、リポフェクタミン（Lipofectamine）2000（Invitrogen）、オリゴフェクタミン（Oligofectamine）（Invitrogen）、及びヌクレオフェクター（Nucleofector）（Wako pure Chemical）が、トランスフェクション増強剤として有用である。
【０１０２】
siRNAのヌクレオチド配列は、アンビオン社（Ambion）のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から入手しうるsiRNA設計用のコンピュータプログラムを用いて設計することができる。siRNAに関するヌクレオチド配列は、コンピュータプログラムにより、以下のプロトコールに基づいて選択される。
【０１０３】
siRNA標的部位の選択：
1．目的の転写物のAUG開始コドンから開始して、AAジヌクレオチド配列に関して下流へとスキャンする。各AAおよび3'末端に隣接した19ヌクレオチドの出現率をsiRNA標的の可能性がある部位として記録する。Tuschlら((Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev 13(24): 3191-7(1999))は、siRNAを5'および3'非翻訳領域（UTR）ならびに開始コドン付近（75塩基内）の領域に対しては設計しないように推奨しており、これは、これらの領域には調節タンパク質の結合部位が多く含まれる可能性があるためである。UTR結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨げる可能性がある。
2．標的の可能性がある部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列と明らかな相同性を有するどの標的領域も検討から除外する。相同性検索はBLASTを用いて行うことができ、これはNCBIのサーバー：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上にある。
3．合成用の適格な標的配列を選択する。アンビオン社では、遺伝子の全長に沿っていくつかの標的配列を評価用に選択することができる。
【０１０４】
フコースを付加する酵素の活性が低減または欠失した宿主細胞又は宿主生物を製造するには、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある。
【０１０５】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA 配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である。例えば、阻害標的となる本発明の酵素のコード領域中には標的となりうる部位が複数存在する。
【０１０６】
また、ヘアピン型リボザイムも、フコースを付加する酵素の活性が低減または欠失した宿主細胞又は宿主生物を製造するにために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349,1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている。
【０１０７】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Taira et al. (1990) Protein Eng. 3:733、A.M.Dzianottand J.J.Bujarski (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823、 C.A.Grosshansand R.T.Cech (1991) Nucleic Acids Res. 19:3875、 K.Taira et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5125)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.Yuyama et al. Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1271,1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【０１０８】
以下に、本発明の抗体の取得のより具体的な例として、ヒト化抗体の製造方法について記すが、他の抗体を当該方法と同様にして取得することもできる。
【０１０９】
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で上記（A）〜（D）において置換部位としたアミノ酸残基が目的とするアミノ酸残基に置換されたヒト抗体の重鎖（Ｈ鎖）C領域及びヒト抗体の軽鎖（Ｌ鎖）Ｃ領域をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で上記（A）〜（D）において置換部位としたアミノ酸残基が目的とするアミノ酸残基に置換されたヒト抗体のＨ鎖C領域及びヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【０１１０】
ヒト抗体のＣ領域としては、任意のヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域であることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のIgG1サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と表記する）及びヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと表記する）等があげられる。
ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンから成る染色体ＤＮＡを用いることができ、また、cDNAを用いることもできる。
【０１１１】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］、ｐＡＧＥ１０３［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＨＳＧ２７４［ジーン（Ｇｅｎｅ），２７，２２３（１９８４）］、ｐＫＣＲ［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．），７８，１５２７（１９８１）］、ｐＳＧ１βｄ２−４［サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），４，１７３（１９９０）］等があげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１０１，１３０７（１９８７）］、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ［バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．），１４９，９６０（１９８７）］、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［セル（Ｃｅｌｌ），４１，４７９（１９８５）］とエンハンサー［セル（Ｃｅｌｌ），３３，７１７（１９８３）］等があげられる。
【０１１２】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡する等の点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい［ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ），１６７，２７１（１９９４）］。タンデム型のヒト化抗体発現ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３［モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．），３７，１０３５（２０００）］、ｐＥＥ１８［ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ），１７，５５９（１９９８）］などがあげられる。
【０１１３】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
【０１１４】
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするcDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAは以下のようにして取得することができる。
【０１１５】
目的のマウス抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージ或いはプラスミド等のベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、既存のマウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をプローブとして用い、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的のマウス抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全塩基配列を決定し、塩基配列よりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定する。
【０１１６】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【０１１７】
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．），１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。 cDNAの合成及びcDNAライブラリー作製法としては、常法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ cDNA Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−cDNA Ｓｙｎｔｂｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法などがあげられる。
【０１１８】
cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），１７，９４９４（１９８９）］、λｚａｐ ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ディーエヌエー・クローニング：ア・プラクティカル・アプローチ（ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ），Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．），３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
【０１１９】
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［ストラテジーズ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ），５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ），１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［ジーン（Ｇｅｎｅ），３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
【０１２０】
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したcDNA或いはcDNAライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］によりＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを調製することもできる。
【０１２１】
上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオキシ法［プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．），７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該cDNAの塩基配列を決定することができる。
【０１２２】
決定した塩基配列からＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０１２３】
さらに、抗体可変領域のアミノ酸配列または該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いて製造することができる。
【０１２４】
アミノ酸配列が公知である場合には、アミノ酸配列を、コドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うことによりＤＮＡを得ることができる。
【０１２５】
（３）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の全アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］と比較することによって見出すことができる。
【０１２６】
（４）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAを、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖Ｖ領域の３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域の５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１２７】
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするcDNAの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲを移植するヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖のＶ領域のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。
【０１２８】
次に、選択したヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［シーケンシズ・オブ・プロテインズ・オブ・イムノロジカル・インタレスト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ），ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さから成る数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも４〜６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
【０１２９】
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流に、（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域をコードするcDNAをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｖ領域を構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＨ鎖及びＬ鎖Ｃ領域をコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【０１３０】
（７）ヒト化抗体の安定的生産
（４）及び（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体及びヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、併せてヒト化抗体と称す）を安定に生産する形質転換株を得ることができる。動物細胞へのヒト化抗体発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１；サイトテクノロジー（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），３，１３３（１９９０）］等があげられる。ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、ヒト化抗体を生産させることができる動物細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。
具体的には、マウスミエローマ細胞であるＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、ラットミエローマＹＢ２／０細胞等があげられる。
【０１３１】
ヒト化抗体発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に生産する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８ ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と表記する；ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＣＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の生産量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４，１９９８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ＤＨＦＲ遺伝子増幅系等を利用してヒト化抗体の生産量を上昇させることができる。
【０１３２】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］。また、その他に通常、タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する；ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［アンティボディズ：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １２，１９８８、モノクローナル・アンティボディズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６］等で測定することができる。
【０１３３】
以上、動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、上述したように、酵母、昆虫細胞、植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物細胞と同様の方法により抗体を製造することができる。
【０１３４】
すでに宿主細胞が、抗体を発現する能力を有する場合には、公知の方法を用いて本発明における、抗体を発現させる細胞を調製した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とする抗体を精製することにより、本発明の抗体を製造することができる。
【０１３５】
精製した抗体の蛋白量、抗原との結合活性あるいはエフェクター機能を測定する方法としては、Monoclonal Antibodies:principles and practice,Third Edition,Acad.Press,1993、あるいはAntibodies,A Laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988等に記載の公知の方法を用いることができる。具体的な例としては、抗体がヒト化抗体の場合、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる［キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．），３６，３７３（１９９３）］。また、抗体のヒトでの安全性、治療効果は、カニクイザル等のヒトに比較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。
【０１３６】
本発明の抗体は、上記方法により測定されるＡＤＣＣ活性について、アミノ酸置換、またはアミノ酸置換及びフコース低減前のポリペプチドと比べて向上している。このため、抗体療法に用いる場合には薬剤の使用量を低くすることができるため、経済的であり、副作用を少なくすることができる。
【０１３７】
本発明の抗体は、上記のようにエフェクター機能が極めて向上されるため、治療、診断、評価等の広範な用途に利用可能である。
【０１３８】
本発明の治療用組成物は、上記本発明の抗体を含んでいる。このため、ＡＤＣＣ活性が改善されており、少量の投与量で十分な薬理効果を得ることができ、優れた抗体治療用途に極めて有利である。治療用組成物には、上記抗体以外に、例えば核酸類、アミノ酸、ペプチド、蛋白質、その他の有機化合物、無機化合物、賦形剤などの製剤用添加物及びこれらの組み合わせなどが添加されていてもよい。本発明の治療用組成物は、必要に応じて成形手段を用いて製剤化し、経口又は非経口に投与することができる。本発明の治療用組成物は、特に注射剤、点滴剤、経皮吸収剤による非経口投与等の方法で好適に利用できる。
【０１３９】
より具体的には、本発明は、本発明の抗体および医薬的に許容し得る担体を含む、治療用組成物を提供する。また本発明は、本発明の抗体を投与することを含む、哺乳動物の治療方法を提供する。哺乳動物としては、ヒト、非ヒト哺乳動物（例えばマウス、ラット、サルなど）が挙げられる。
【０１４０】
本発明の治療用組成物は、抗体に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【０１４１】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
【０１４２】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【０１４３】
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
【０１４４】
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明の抗体を含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり、約1μgから100mg（例えば約1μgから15mg、約10μgから20mg、約0.1mgから20mg）の範囲で選ぶことが可能である。本発明の医薬組成物は、1箇所への投与又は複数の別々の部位への投与が可能である。また本発明の医薬組成物は連続投与をすることも可能である。数日間以上に渡る繰り返し投与については、状態応じて、望まれる疾患状態の抑制が起こるまで続ける。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１４５】
本発明の治療用組成物は、抗体療法を適用可能な広範な疾病の治療に用いることができる。抗体療法が適用される疾病・症状としては、例えば転移性乳ガン（抗ＨＥＲ２抗体）、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞非ホジキン性リンパ腫（抗ＣＤ２０抗体）、関節リウマチやクローン病（抗ＴＮＦα抗体）、腎臓移植後の急性拒絶正反応（抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２５抗体）等が挙げられる。括弧内は治療に用いる抗体を示している。これらの疾病等に対し、従来の抗体に代えて本発明の治療用組成物を利用することにより、治療効果を著しく向上でき、患者の経済的、身体的負担を軽減することができる。さらに、抗体療法に今後適用されうる抗体医薬としても好適に利用できる。
また、本発明の抗体は、上記治療用組成物を用いた治療方法に関する。あるいは、本発明は、上記治療剤の製造における使用に関する。
【０１４６】
また、本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で298、333、334、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アラニン、アラニン、アラニン、及びシステイン残基に置き換える工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
また、本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で239、330、332、及び295番目のアミノ酸を、それぞれ、アスパラギン酸、ロイシン、グルタミン酸、及びシステイン残基に置き換える工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
また本発明は、下記（１）から（３）の工程を含む抗体のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
（１）エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基をシステイン残基に置き換える工程、
（２）ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸残基がシステイン残基に置き換えられたＨ鎖をコードするDNA、及び、Ｌ鎖をコードするDNAを、還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加する酵素の活性が低減、または欠失した宿主細胞又は宿主生物に導入し、該DNAを発現させる工程、及び
（３）発現産物を回収する工程。
また本発明は、エフェクター機能を有する抗体におけるＫａｂａｔのＥＵインデックス番号で295番目のアミノ酸をアスパラギン酸、セリン、又はアラニン残基に置き換える工程を含む、抗体のエフェクター機能を向上させる方法を提供する。
上記方法においてアミノ酸を置換する工程、及びフコースを低減する工程は、上述の方法によって行うことが出来る。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１４７】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。
〔実施例１〕
298Ala/333Ala/334Ala型、298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体を作製し、これらのAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性を評価した。その結果、298Ala/333Ala/334Ala型のAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性と比較して、298Ala/333Ala/334Ala型に295Cysを加えた、298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体は高いADCC活性を示した。
以下に、Anti-CD20キメラ抗体の298Ala/333Ala/334Ala型、298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型の作製方法ならびにそのADCC活性測定とCD20分子に対する反応性を記載する。
【０１４８】
1）Anti-CD20キメラ抗体の作製
キメラ抗体は、以下のA)〜F)の工程を経て、精製キメラ抗体として得られる。
A)キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング、
B)クローニングされた遺伝子の変異導入、
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築、
D)キメラ抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とキメラ抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング、
E)キメラ抗体高発現CHO細胞の培養、
F)キメラ抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
以下にA)〜F)の工程を順に記載する。
【０１４９】
A) キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング
1種のAnti-CD20キメラ抗体を作製するためには、4種の遺伝子が必要になる。この4種の遺伝子は、Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子、Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子、Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子、Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子である。この遺伝子のクローニング実施例について、以下に記述する。
【０１５０】
（Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子）
本出願人が保有するAnti-CD20マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞からQuickPrep micro mRNA purification kit (Amersham Biosciences, code 27-9255-01)を用いてｍRNAを得た。そのｍRNAをFirst-Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Biosciences, code 27-9261-01)を用いてcDNAとした。このcDNAを鋳型としてPCR法で遺伝子を増幅させるのであるが、以下に示す11パターンのPrimerの組み合わせによりPCR反応を行った。
PCR反応条件は、
マウスハイブリドーマからのcDNA                4 μL
2.5 mM dNTPs                                  4 μL
MKV1〜MKV11 primer(20μM)の11種類中の1つ      2.5 μL
MKC primer(20μM)                             2.5 μL 
DMSO                                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                    5 μL 
pfu polymerase                                1 μL
滅菌水                                        28.5 μL 
total                                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
MKV1 primer：ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG（配列番号：３５）
MKV2 primer：ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG（配列番号：３６）
MKV3 primer：ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG（配列番号：３７）
MKV4 primer：ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG（配列番号：３８）
MKV5 primer：ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC（配列番号：３９）
MKV6 primer：ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG（配列番号：４０）
MKV7 primer：ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG（配列番号：４１）
MKV8 primer：ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG（配列番号：４２）
MKV9 primer：ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG（配列番号：４３）
MKV10 primer：ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT（配列番号：４４）
MKV11 primer：ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC（配列番号：４５）
MKC primer：ACTGGATGGTGGGAAGATGG（配列番号：４６）
（M=A or C, R=A orG, W=A orT, S=C or G, Y=C or T, K=G orT）
【０１５１】
PCR反応では、MKV5とMKC primerの組み合わせにより、Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子はpCR2.1ベクター（Invitogen）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子は挿入されたベクターをpCR2.1-MLVと名前を付けた。遺伝子クローニングされたAnti-CD20マウスL鎖可変領域のDNA配列を図１に添付する。
また、Anti-CD20マウスL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列をそれぞれ、配列番号：７、９、１１に示す。また、Anti-CD20マウスL鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：８、１０、１２に示す。
【０１５２】
（Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子）
Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子のクローニングと同様に、Anti-CD20マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から調整されたcDNAを鋳型として、以下に示す12パターンのPCR増幅を行った。
マウスハイブリドーマからのcDNA                4 μL
2.5 mM dNTPs                                  4 μL
MHV1〜MHV12 primer(20μM)の12種類中の1つ      2.5 μL
MHCG2b primer(20μM)                          2.5 μL 
DMSO                                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer                    5 μL 
pfu polymerase                                1 μL
滅菌水                                        28.5 μL 
total                                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
MHV1 primer：ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC（配列番号：４７）
MHV2 primer：ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT（配列番号：４８）
MHV3 primer：ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT（配列番号：４９）
MHV4 primer：ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT（配列番号：５０）
MHV5 primer：ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT（配列番号：５１）
MHV6 primer：ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC（配列番号：５２）
MHV7 primer：ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT（配列番号：５３）
MHV8 primer：ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG（配列番号：５４）
MHV9 primer：ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG（配列番号：５５）
MHV10 primer：ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG（配列番号：５６）
MHV11 primer：ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG（配列番号：５７）
MHV12 primer：ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG（配列番号：５８）
MHCG2b primer：CAGTGGATAGACTGATGGGGG（配列番号：５９）
（M=A or C, R=A orG, W=A orT, S=C or G, Y=C or T, K=G orT）
【０１５３】
PCR反応では、MHV7とMHCG2b primerの組み合わせにより、Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子が増幅され、この遺伝子はpCR2.1ベクター（Invitogen）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子が挿入されたベクターをpCR2.1-MHVと名前を付けた。遺伝子クローニングされたAnti-CD20マウスH鎖可変領域のDNA配列を図２に添付する。
また、Anti-CD20マウスH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3の塩基配列をそれぞれ、配列番号：１、３、５に示す。また、Anti-CD20マウスH鎖可変領域のCDR1、CDR2、CDR3のアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：２、４、６に示す。
【０１５４】
（Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子）
ヒトの血液からLymphoprep(Axis Shield)を用いてリンパ球を取り出した。このリンパ球からQuickPrep micro mRNA purification kit (Amersham Biosciences, code 27-9255-01)を用いてｍRNAを得た。そのｍRNAをFirst-Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Biosciences, code 27-9261-01)を用いてcDNAとした。このヒトリンパ球からのcDNAを鋳型にして、以下のPCR反応を行いHuman IgG1 L鎖定常領域遺伝子を得た。この遺伝子もpCR2.1ベクター（Invitogen）に一時的に挿入され保管された。また、この遺伝子が挿入されたベクターをpCR2.1-LCと名前を付けた。
PCRの反応条件は以下の通りである。
ヒトリンパ球cDNA              4 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
hIgG1 LCF primer(20μM)       2.5 μL
hIgG1 LCR primer(20μM)       2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        28.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
hIgG1 LCF primer：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTC（配列番号６０）
hIgG1 LCR primer：TTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT（配列番号：６１）
【０１５５】
（Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子）
Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子のクローニングと同様にして、ヒトリンパ球からのcDNAを鋳型にして、以下のPCR反応を行いHuman IgG1 H鎖定常領域遺伝子を得た。この遺伝子もpCR2.1ベクター（Invitrogen）に一時的に挿入され保管された。このベクターは、pCR2.1- HC (野生型)と名前を付けた。
PCRの反応条件は以下の通りである。
ヒトリンパ球cDNA              4 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
hIgG1 HCF primer(20μM)       2.5 μL
hIgG1 HCR primer(20μM)       2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        28.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (30サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
PrimerのDNA配列は以下を参照。
hIgG1 HCF primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC（配列番号：６２）
hIgG1 HCR primer：TTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCT（配列番号：６３）
【０１５６】
B)クローニングされた遺伝子の変異導入
298Ala/333Ala/334Alaキメラ抗体、298Ala/333Ala/334Ala/295Cysキメラ抗体を得るためには、クローニングされたHuman IgG1 H鎖定常領域の特定箇所に変異を導入しなければならない。Elvin A. KabatらがSequence of proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242, 1991) において示したHuman IgG1 H鎖定常領域の番号に従い、298番のSerをAlaに、333番 のGluをAlaに、334番 のLysをAlaに、295番 のGluをCysに変更するために、クローニングされたHunan IgG1 H鎖定常領域が挿入されたpCR2.1ベクター：pCR2.1-HC（野生型）を鋳型として、PCR法により順次変異導入した。この変異導入法の詳細を以下に記述する。
【０１５７】
298（Ser→Ala）変異
pCR2.1-HC (野生型)  (25 ng/μL)      2 μL
2.5 mM dNTPs                         4 μL
298 Ala1 primer (20 μM)             1.25 μL
298 Ala2 primer (20 μM)             1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer           5 μL
pfu DNA polymerase                   1 μL
滅菌水                               35.5 μL  
total                            50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec  55℃  1 min   68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
298 Ala1プライマー：GAGCAGTACAACGCTACGTACCGTGTG（配列番号：６４）
298 Ala2プライマー：CACACGGTACGTAGCGTTGTACTGCTC（配列番号：６５）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、298（Ser→Ala）変異導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクターpCR2.1-HC（298Ala）と名前を付けた。
【０１５８】
333（Glu→Ala）変異
pCR2.1-HC (298Ala)  (25 ng/μL)      2 μL
2.5 mM dNTPs                         4 μL
333 Ala1 primer (20 μM)             1.25 μL
333 Ala2 primer (20 μM)             1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer           5 μL
pfu DNA polymerase                   1 μL
滅菌水                               35.5 μL  
total                            50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec  55℃  1 min   68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
333 Ala1プライマー：CCAGCCCCCATCGCTAAAACCATCTCC（配列番号：６６）
333 Ala2プライマー：GGAGATGGTTTTAGCGATGGGGGCTGG（配列番号：６７）
【０１５９】
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、333（Glu→Ala）変異導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクターpCR2.1-HC（298Ala/333Ala）と名前を付けた。
334（Lys→Ala）変異
pCR2.1-HC (298Ala/333Ala)  (25 ng/μL)   2 μL
2.5 mM dNTPs                             4 μL
334 Ala1 primer (20 μM)                 1.25 μL
334 Ala2 primer (20 μM)                 1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer               5 μL
pfu DNA polymerase                       1 μL
滅菌水                                   35.5 μL  
total                                50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec  55℃  1 min   68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
334 Ala1プライマー：GCCCCCATCGCTGCTACCATCTCCAAA（配列番号：６８）
334 Ala2プライマー：TTTGGAGATGGTAGCAGCGATGGGGGC（配列番号：６９）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、334（Lys→Ala）変異導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクターpCR2.1-HC（298Ala/333Ala/334Ala）と名前を付けた。
【０１６０】
295（Glu→Cys）変異
pCR2.1-HC (298Ala/333Ala/334Ala)    (25 ng/μL)     2 μL
2.5 mM dNTPs                                        4 μL
295 Cys1 primer (20 μM)                            1.25 μL
295 Cys2 primer (20 μM)                            1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer                          5 μL
pfu DNA polymerase                                  1 μL
滅菌水                                              35.5 μL  
total                                           50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec  55℃  1 min   68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
295 Cys1プライマー：ACAAAGCCGCGTGAGGAGTGCTACAACGCTACGTACCGT（配列番号：７０）
295 Cys2プライマー：ACGGTACGTAGCGTTGTAGCACTCCTCACGCGGCTTTGT（配列番号：７１）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、295（Glu→Cys）変異導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクターpCR2.1-HC（298Ala/333Ala/334Ala/295Cys）と名前を付けた。
【０１６１】
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築
1種類のAnti-CD20キメラ抗体を発現させるために、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、Anti-CD20キメラ抗体のH鎖の発現ベクターとは、Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、298Ala/333Ala/334Ala型あるいは298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体を作製するにあたり、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖の発現ベクターは、これら3種のキメラ抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Anti-CD20キメラ抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型、298Ala/333Ala/334Ala型あるいは298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各キメラ抗体の発現に共通に使用できるAnti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に298Ala/333Ala/334Ala型あるいは298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体の発現に必要な専用のAnti-CD20キメラ抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。
【０１６２】
Anti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-MLVを鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。また、Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-LCを鋳型として以下のPCR反応により断片を得た。
【０１６３】
（Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-MLV (20 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
L1 primer(20μM)              2.5 μL
L2 primer(20μM)              2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        30.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4min
4℃    無制限時間
L1 primer：ACCGCTCGAGATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCAGC（配列番号：７２）
L2 primer：TTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACC (5’-リン酸化されている)（配列番号：７３）
【０１６４】
（Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-LC (20 ng/μL)         2 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
L3 primer(20μM)              2.5 μL
L4 primer(20μM)              2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        30.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
L3 primer：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC (5’-リン酸化されている)（配列番号：７４）
L4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGT（配列番号：７５）
【０１６５】
上記のPCR反応で得られたAnti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、PCR反応で得られたHuman IgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子断片と精製Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混同してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターは、pキメラLCと名前が付けられた。
【０１６６】
Anti-CD20キメラ抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、BCMG-neoベクターを使用し、このベクターのXhoIとNotIサイトにAnti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-MHVを鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。野生型、298Ala/333Ala/334Ala型あるいは298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種Human IgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。
【０１６７】
（Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-MHV (20 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
H1 primer(20μM)              2.5 μL
H2 primer(20μM)              2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        30.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H1 primer：ACCGCTCGAGATGGGATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTC（配列番号：７６）
H2 primer：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC (5’-リン酸化されている)（配列番号：７７）
【０１６８】
（Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
＃各種鋳型プラスミド (20 ng/μL)  2 μL
2.5 mM dNTPs                      4 μL
H3 primer(20μM)                  2.5 μL
H4 primer(20μM)                  2.5 μL 
DMSO                              2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer        5 μL 
pfu polymerase                    1 μL
滅菌水                            30.5 μL 
total                             50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：７８）
H4 primer：ATAGTTTAGCGGCCGCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTT（配列番号：７９）
【０１６９】
#：野生型のAnti-CD20キメラ抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。298Ala/333Ala/334Ala型のAnti-CD20キメラ抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(298Ala/333Ala/334Ala)を鋳型として用いた。298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(298Ala/333Ala/334Ala/295Cys)を鋳型として用いた。
【０１７０】
上記のPCR反応で得られたAnti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素XhoI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたHuman IgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。BCMG-neoベクターをXhoIとNotIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子断片と精製Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-CD20キメラ抗体H鎖の発現ベクターは、pキメラHC(野生型)、pキメラHC(298Ala/333Ala/334Ala型)あるいはpキメラHC(298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型)とそれぞれ名前が付けられた。
【０１７１】
D)キメラ抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とキメラ抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング
構築された各種発現ベクターは、以下の組み合わせでTransIT-CHO Transfection kit（Mirus, MIR2170）を使用してCHO細胞へ遺伝子導入された。
野生型キメラ抗体：pキメラLC+ pキメラHC（野生型）
298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体：ｐキメラLC+ｐキメラHC (298Ala/333Ala/334Ala型)
298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体：ｐキメラLC+ｐキメラHC (298Ala/333Ala/334Ala/295Cys)
【０１７２】
遺伝子導入されたCHO細胞は、10％Fetal Bovine Serum(EQITEC-BIO)と1 mg/mLのGeneticin(GIBCO, 10131-035)を補足したDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（Sigma, D5796）で37℃5％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖した。この増殖してコロニーを形成したCHO細胞の中からキメラ抗体を高発現しているCHO細胞を選択するのであるが、はじめに各コロニーの一部を96 wellプレートに移植して、さらに10日間培養した。その培養上清の一部を取り出し、以下に示すELISA測定をすることで高発現CHO細胞クローンを決定した。
（ELISA測定）
1)Anti-Human IgG (γ-chain) (MBL, 103AG)をコートした96Wellプレートに、TansfectionされたCHO細胞の培養上清を100 μL/wellで添加し、室温で1時間放置した。
2)培養上清液を96 wellプレートから捨てて、0.05%のTween20を含むPBS (PBS-0.05%Tween20)でwellを十分洗浄した。
3)Anti-Human IgG（γ-chain）Peroxidase conjugated (MBL, 208)をPBS-0.05％Tween20で2000倍希釈した溶液を100 μL/well添加して、室温で1時間放置した。
4)溶液を96 wellプレートから捨てて、PBS-0.05%Tween20でwellを十分洗浄した。
5)TMB Peroxidase Substrate (Moss, TMBE-1000ｓ)を100 μL/well添加して、発色反応させた。
6)10〜15分の発色反応後、1N硫酸を100 μL/well添加して、発色反応を停止させた。
7)450 nm吸光度を測定した。
このELISA測定で、高い発色値を示すコロニーが、キメラ抗体を高発現するクローンである。
【０１７３】
E)キメラ抗体高発現CHO細胞の培養
ELISA測定により選択されたキメラ抗体高発現CHO細胞は、10％Fetal Bovine Serumと0.1 mg/mLのGeneticinを補足したDulbecco’s Modified Eagle’s Mediumで37℃5％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖させた。十分に増殖したキメラ抗体の高発現CHO細胞は、0.1 mg/mLのGeneticinを補足した無血清培地であるCHO-S-SFMII（GIBCO,12052-098）での培養に置き換えられ、継続して1000ｍL程度培養された。
【０１７４】
F)キメラ抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製
無血清培地であるCHO-S-SFMIIで培養されたキメラ抗体高発現CHO細胞の培養上清は、回収された。野生型キメラ抗体の精製は、そのFc領域構造に変化を加えていないため、抗体精製に通常用いられるProtein Aカラム精製により実施された。しかしながら、298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体、298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体は、そのFc領域構造に変異を加えているために、Fc領域の構造変化を伴い、通常のProtein Aカラムへは、ほとんど吸着されない。この理由から、これら変異型キメラ抗体では、Protein Lカラムを使用して精製を実施した。今回作製されたAnti-CD20キメラ抗体は、その可変領域がκ鎖である。このProtein Lは、この可変領域κ鎖を認識して結合できるタンパク質である。以下に、野生型キメラ抗体のProtein Aカラム精製と変異型キメラ抗体のProtein Lカラム精製の詳細を記述する。
野生型キメラ抗体のProtein Aカラム精製
1)1000 ｍL のCHO-S-SFMIIで野生型キメラ抗体高発現CHO細胞を培養して得られた培養上清は、Amicon Ultrafiltration Membranes (Millipore, Code YM10)を取り付けたAmicon Stirred Uitrafiltration Cell (Millipore, Model 8400)を用いて、1000 ｍLから100 ｍLまで濃縮された。
2)培養上清濃縮液に、Protein A-SepharoseであるrProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Bioscience, 17-1279-03) 8ｍLを添加し、2日間4℃で攪拌させてProteinAに野生型キメラ抗体を吸着させた。
3)野生型キメラ抗体を吸着したProteinA-Sepharoseは、直径1.5 cm、長さ8 cmのカラムに充填させた。
4)ProteinA-Sepharoseが充填されたカラムは、PBS 100 mLで洗浄された後、Elution Buffer (0.17M Glycine-HCl, pH2.3) でカラムから野生型キメラ抗体を溶出した。
5)溶出された野生型キメラ抗体溶液は、すぐに1M Tris-HCl pH8.5を適量加えてｐHを中性にした。
6)野生型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるCell Sep T2 (Membrane filtration products Inc, 8030-23)に入れて4℃でPBS 5 Lに透析された。透析後に回収した野生型キメラ抗体を、精製品とした。
【０１７５】
変異型キメラ抗体のProtein Lカラム精製
1)1000 ｍL のCHO-S-SFMIIでCys型キメラ抗体高発現CHO細胞を培養して得られた培養上清は、Amicon Ultrafiltration Membranes (Millipore, Code YM10)を取り付けたAmicon Stirred Uitrafiltration Cell (Millipore, Model 8400)を用いて、1000ｍLから100ｍLまで濃縮された。
2)培養上清濃縮液100 ｍLは、ProteinL Binding Buffer (0.1M Phosphate, 0.15 M NaCl,pH 7.2) 100 mLを加えて混合された。
3)直径1.5 cm、長さ8 cmのカラムにProtein L-SepharoseであるImmunoPure Immobilized Protein L Plus (PIERCE, 20250) 2 mLを充填させた。
4) 2）で調整した液をカラム上端から加えて、カラム下端からゆっくり流し出した。この操作でProtein L-Sepharoseへ変異型キメラ抗体を吸着させた。その後、Protein L Binding Buffer 50 mLでカラムを洗浄し、カラムに吸着した余分な蛋白を除去した。
5)Elution Buffer (0.17M Glycine-HCl, pH2.3) でカラムから変異型キメラ抗体を溶出した。溶出された変異型キメラ抗体溶液は、すぐに1M Tris-HCl pH8.5を適量加えてpHを中性にした。
6)変異型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるCell Sep T2 (Membrane filtration products Inc, 8030-23)に入れて4℃でPBS 5 Lに透析された。透析後に回収した変異型キメラ抗体を、精製品とした。
以上のように、精製された野生型キメラ抗体あるいは変異型キメラ抗体は、12.5％SDS-PAGEで電気泳動されたのち、銀染色された。この電気泳動像を図３に添付する。
【０１７６】
<各種キメラ抗体のADCC活性評価>
各種キメラ抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価は、lactate dehydrogenase release assayにより行った。このAssayでは、Target細胞としてCD20分子を細胞膜表面に持つDaudi細胞を用い、Effector細胞として、Human peripheral blood mononuclear cells (PBMC)を用いた。このHuman PBMCは、Lymphoprep (Axis Shield)を使って、ヒトの血液から調整された。
Daudi細胞（1×104個/50 μL）は、96-well U-bottomedプレートの各wellに入れ、Effector細胞であるHuman PBMCが、E/T ratioが20/1となるように2×105個加えられた。この細胞液にさらに、各種Anti-CD20キメラ抗体を連続的な希釈系列となるように添加して、37℃で20時間保温された。保温後に、96-well U-bottomedプレートは、遠心分離され、その上清中のlactate dehydrogenase activityをCytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit (Promega, G1780)を用いて測定された。抗体依存的かつ特異的な細胞障害(Cytotoxicity)％は、以下の式と用いて算出された。
% Cytotoxicity = 100×（E−SE−ST）/(M−ST)
【０１７７】
ここで、EとはExperimental releaseを表し、抗体とEffctor細胞が、Target細胞と共に保温された時のTarget細胞からrelaeseされたlactate dehydrogenase活性である。SEとは、Effector細胞からの自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。STとは、Target細胞からも自然発生的に放出されたlactate dehydrogenase活性である。Mとは、Target細胞の最大に放出されるlactate dehydrogenase活性を表し、これはLysis Solution (9％ Triton X-100)の添加により、Target細胞から放出されたlactate dehydrogenase活性である。
以上のような評価方法により、野生型、298Ala/333Ala/334Ala、298Ala/333Ala/334Ala/295CysのAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性結果を図４に添付する。この図４から、野生型キメラ抗体のADCC活性と比較して、抗体の高濃度条件下（0.001〜10 μg/mL）で、298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体と298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体は非常に高いADCC活性を示した。298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体に295Cysを加えた298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体は、低濃度（0.001 μg/mL以下の濃度）で298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体よりも高いADCC活性を示した。
【０１７８】
さらに、298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体と298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した。その結果、添加した抗体の濃度が0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体の場合それぞれ5.8％、10.3％、20.7％、41.4％、52.2％、52.6％、55.3％、298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体の場合はそれぞれ10％、21.8％、26.6％、36.6％、51.1％、51.4％、58.6％であった。よって、ADCC活性の比（野生型抗体と変異型抗体が同一濃度である2点間における、298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体に対する298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ、1.7倍、2.1倍、1.3倍、0.9倍、1倍、1倍、1.1倍となることがわかった（表１）。
【表１】
0005427348.tif 000004
【０１７９】
また表１より、298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体と298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体は0.0001μg/mLで約20％、298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体は0.001μg/mLで約20％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が10分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約10倍上昇した（298Ala/333Ala/334Ala型キメラ抗体と298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型キメラ抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、野生型抗体に対する変異型抗体の濃度の比が10倍になった）と判断することが出来る。
このようなADCC活性の上昇（約10倍程度）は、他の濃度域でも確認された。当業者であれば、上記の方法に倣い、図４および表１よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。
【０１８０】
〔実施例２〕
実施例１と同様の方法で、239Asp/330Leu/332Glu型、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体を作製し、これら各種変異型のAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性を評価した。その結果、239Asp/330Leu/332Glu型のAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性と比較して、239Asp/330Leu/332Glu型に295Cysを加えた、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型Anti-CD20キメラ抗体は高いADCC活性を示した。
以下に、Anti-CD20キメラ抗体の239Asp/330Leu/332Glu型、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型の作製方法ならびにそのADCC活性測定とCD20分子に対する反応性を記載する。
【０１８１】
1）Anti-CD20キメラ抗体の作製
キメラ抗体は、以下のA)〜F)の工程を経て、精製キメラ抗体として得られる。
A)キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング、
B)クローニングされた遺伝子の変異導入、
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築、
D)キメラ抗体発現ベクターのCHO細胞への遺伝子導入とキメラ抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング、
E)キメラ抗体高発現CHO細胞の培養、
F)キメラ抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
これらの工程のうち、A)、C)〜F)は実施例１と同一である。従って本実施例では、工程B)について説明する。
【０１８２】
B)クローニングされた遺伝子の変異導入
239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体を得るためには、クローニングされたHuman IgG1 H鎖定常領域の特定箇所に変異を導入しなければならない。Elvin A.KabatらがSequence of proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242, 1991) において示したHuman IgG1 H鎖定常領域の番号に従い、239番のSerをAspに、330番 のAlaをLeuに、332番 のIleをGlu、295番目のGluをCysに変更するために、クローニングされたHunan IgG1 H鎖定常領域が挿入されたpCR2.1ベクター：pCR2.1-HC（野生型）を鋳型として、PCR法により変異導入した。この変異導入法の詳細を以下に記述する。
【０１８３】
（１）239（Ser→Asp）への変異導入
pCR2.1-HC (野生型)(25 ng/μL)      2 μL
2.5 mM dNTPs                       4 μL
239 Asp1 primer (20μM)            1.25 μL
239 Asp2 primer (20μM)            1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer         5 μL
pfu DNA polymerase                 1 μL
滅菌水                             35.5 μL 
total                              50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec 55℃ 1 min 68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
239 Asp1 primer : GAACTCCTGGGGGGACCGGATGTCTTCCTCTTCCCCCCA（配列番号：８０）
239 Asp2 primer : TGGGGGGAAGAGGAAGACATCCGGTCCCCCCAGGAGTTC（配列番号：８１）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、変異239（Ser→Asp）導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクター（239Asp）と名前を付けた。
【０１８４】
（２）332（Ile→Glu）への変異導入
pCR2.1-HC (239Asp)(25 ng/μL)     2 μL
2.5 mM dNTPs                      4 μL
332 Glu1 primer (20μM)           1.25 μL
332 Glu2 primer (20μM)           1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer        5 μL
pfu DNA polymerase                1 μL
滅菌水                            35.5 μL 
total                             50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec 55℃ 1 min 68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
332 Glu1 primer : AAAGCCCTCCCAGCCCCCGAAGAGAAAACCATCTCCAAA（配列番号：８２）
332 Glu2 primer : TTTGGAGATGGTTTTCTCTTCGGGGGCTGGGAGGGCTTT（配列番号：８３）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England  BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、変異332（Ile→Glu）導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクター（239Asp/332Glu）を得た。
【０１８５】
（３）330（Ala→Leu）への変異導入
pCR2.1-HC (239Asp/332Glu)(25 ng/μL)   2 μL
2.5 mM dNTPs                           4 μL
332 Glu1 primer (20μM)                1.25 μL
332 Glu2 primer (20μM)                1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer             5 μL
pfu DNA polymerase                     1 μL
滅菌水                                 35.5 μL 
total                                  50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec 55℃ 1 min 68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
330 Leu1 primer : TCCAACAAAGCCCTCCCACTCCCCGAAGAGAAAACCATC（配列番号：８４）
330 Leu2 primer : GATGGTTTTCTCTTCGGGGAGTGGGAGGGCTTTGTTGGA（配列番号：８５）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England  BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、変異330（Ala→Leu）導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクター（239Asp/330Leu/332Glu）を得た。
【０１８６】
（４）295（Glu→Cys）への変異導入
pCR2.1-HC (239Asp/330Leu/332Glu)(25 ng/μL)  2 μL
2.5 mM dNTPs                                 4 μL
295 Cys3 primer (20μM)                      1.25 μL
295 Cys4 primer (20μM)                      1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer                   5 μL
pfu DNA polymerase                           1 μL
滅菌水                                       35.5 μL 
total                                        50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec 55℃ 1 min 68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
295 Cys3 primer : ACAAAGCCGCGTGAGGAGTGCTACAACAGCACGTACCGT（配列番号：８６）
295 Cys4 primer : ACGGTACGTGCTGTTGTAGCACTCCTCACGCGGCTTTGT（配列番号：８７）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England  BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、変異295（Glu→Cys）導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクター（239Asp/330Leu/332Glu/295Cys）と名前を付けた。
【０１８７】
<精製された各種キメラ抗体の銀染色分析>
精製された各種キメラ抗体の銀染色分析は、実施例１に記載の方法と同様の方法に従って行った（図５）。
【０１８８】
<各種キメラ抗体のADCC活性評価>
各種キメラ抗体のAntibody-dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC)活性評価も、実施例１に記載の方法と同様の方法に従って行った。野生型、239Asp/330Leu/332Glu、239Asp/330Leu/332Glu/295CysのAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性結果を図６に示す。図から、239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体は、野生型と比べて高濃度条件下（0.001〜10 μg/mL）で、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体は、全濃度域で野生型と比べて、高いADCC活性を示した。また、239Asp/330Leu/332Glu/295Cysは、239Asp/330Leu/332Gluと比べ、低濃度（0.001 μg/mL以下の濃度）で高いADCC活性を示した。
【０１８９】
さらに、239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体と239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体の細胞障害の割合を、lactate dehydrogenase release assayによって比較した。その結果、添加した抗体の濃度が0.0000001、0.000001、0.00001、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10μg/mLの場合における細胞障害の割合は、239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体の場合それぞれ7.2％、7.3％、9.5％、15.1％、26％、39.5％、56.4％、52.5％、53.3％、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体の場合はそれぞれ23.4％、19.6％、22.9％、26.3％、30.1％、39.5％、53.2％、54.3％、52.5％であった。よって、ADCC活性の比（239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体と239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体が同一濃度である2点間における、239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体に対する239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体の細胞障害の割合の比）は、それぞれ、3.3倍、2.7倍、2.4倍、1.7倍、1.2倍、1倍、0.9倍、1倍、1倍となることがわかった（表２）。
【表２】
0005427348.tif 000005
【０１９０】
また表より、239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体と239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体との間で細胞障害の割合が同程度である2点を選択し、ADCC活性の比較を試みた。例えば、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体は0.01μg/mLで約40％、239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体は1μg/mLで約40％の細胞障害を示している。この2点を用いて比較した場合、同じADCC活性を得るために必要な抗体濃度が約100分の1に減少した。このことから、ADCC活性が約100倍上昇した（239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体と239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体が同一の細胞障害の割合を示す2点間における、239Asp/330Leu/332Glu型キメラ抗体に対する239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型キメラ抗体の濃度の比が100倍になった）と判断することが出来る。
当業者であれば、上記の方法に倣い、図６および表２よりADCC活性の上昇を算出することが可能である。
【０１９１】
〔実施例３〕
実施例１と同様の方法で、フコース低減野生型、フコース低減295CysのAnti-CD20キメラ抗体を作製し、これら各種のAnti-CD20キメラ抗体のADCC活性を評価した。
以下に、Anti-CD20キメラ抗体のフコース低減野生型、フコース低減295Cys型の作製方法ならびにそのADCC活性測定とCD20分子に対する反応性を記載する。
【０１９２】
1）Anti-CD20キメラ抗体の作製
キメラ抗体は、以下のA)〜G)の工程を経て、精製キメラ抗体として得られる。
A)キメラ抗体を作製する上で必要となる遺伝子のクローニング、
B)クローニングされた遺伝子の変異導入、
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築、
D)FUT8 Knock Down CHO細胞の作製、
E)キメラ抗体発現ベクターのフコースKnock Down CHO細胞への遺伝子導入とキメラ抗体を高発現するフコースKnock Down CHO細胞のスクリーニング、
F)キメラ抗体高発現フコースKnock Down CHO細胞の培養、
G)キメラ抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製。
これらの工程のうち、A)は実施例１と同一である。従って本実施例では、工程B)、C)、D)、E）、F)、G)について説明する。
【０１９３】
B)クローニングされた遺伝子の変異導入
フコース低減295Cys型キメラ抗体を得るためには、クローニングされたHuman IgG1 H鎖定常領域の特定箇所に変異を導入しなければならない。Elvin A.KabatらがSequence of proteins of Immunological Interest (NIH Publication No.91-3242, 1991) において示したHuman IgG1 H鎖定常領域の番号に従い、295番のGluをCysに変更するために、クローニングされたHunan IgG1 H鎖定常領域が挿入されたpCR2.1ベクター：pCR2.1-HC（野生型）を鋳型として、PCR法により変異導入した。この変異導入法の詳細を以下に記述する。
【０１９４】
（１）295（Glu→Cys）への変異導入
pCR2.1-HC (野生型)(25 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                         4 μL
295 Cys3 primer (20μM)              1.25 μL
295 Cys4 primer (20μM)              1.25 μL
×10 pfu polymerase Buffer           5 μL
pfu DNA polymerase                   1 μL
滅菌水                               35.5 μL 
total                                50 μL
（PCR増幅反応）
95℃    30 sec
95℃    30 sec 55℃ 1 min 68℃  13 min (12サイクル)
68℃    4 min
4℃    無制限時間
Primerの塩基配列は以下の通りである。
295 Cys3 primer : ACAAAGCCGCGTGAGGAGTGCTACAACAGCACGTACCGT（配列番号：８６）
295 Cys4 primer : ACGGTACGTGCTGTTGTAGCACTCCTCACGCGGCTTTGT（配列番号：８７）
上記のPCR反応終了後、DpnI (New England BioLabs)を1 μL添加して、2時間37℃でインキュベーションした。インキュベーション終了した液を用いて、大腸菌JM109を形質転換し、形質転換された大腸菌からプラスミドを精製した。精製プラスミドのDNAシークエンスを確認することで、変異295（Glu→Cys）導入されたHuman IgG1 H鎖定常領域を挿入したｐCR2.1ベクター（295Cys）と名前を付けた。
【０１９５】
C)クローニングされた遺伝子及びその変異導入した遺伝子を組み合わせたキメラ抗体発現ベクターの構築
1種類のAnti-CD20キメラ抗体を発現させるために、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをCHO細胞にTransfectionさせることで達成される。ここで、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖の発現ベクターとは、Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものであり、Anti-CD20キメラ抗体のH鎖の発現ベクターとは、Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子を結合させたものを発現ベクターに組み込んだものである。野生型、295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体を作製するにあたり、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖の発現ベクターは、これら2種のキメラ抗体を発現させるために共通に使用するものであるが、Anti-CD20キメラ抗体のH鎖の発現ベクターは、野生型、295Cys型キメラ抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターを必要とする。ここでは、はじめに各フコース低減キメラ抗体の発現に共通に使用できるAnti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターの構築について詳細を記述し、その後に295Cys型キメラ抗体の発現に必要な専用のAnti-CD20キメラ抗体H鎖発現ベクターの構築について記述する。
【０１９６】
Anti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、pQCXIH（Clontech）ベクターを使用し、このベクターのNotIとEcoRIサイトにAnti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-MLVを鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。また、Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-LCを鋳型として以下のPCR反応により断片を得た。
【０１９７】
（Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-MLV (20 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
L5 primer(20μM)              2.5 μL
L2 primer(20μM)              2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        30.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4min
4℃    無制限時間
L5 primer：AATAGCGGCCGCATGGATTTTCAGGTGCAGATTATCA（配列番号：８８）
L2 primer：TTTCAGCTCCAGCTTGGTCCCAGCACC (5’-リン酸化されている)（配列番号：７３）
【０１９８】
（Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-LC (20 ng/μL)         2 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
L3 primer(20μM)              2.5 μL
L6 primer(20μM)              2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        30.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
L3 primer：ACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC (5’-リン酸化されている)（配列番号：７４）
L6 primer：CGGTAGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC（配列番号：８９）
【０１９９】
上記のPCR反応で得られたAnti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。また、PCR反応で得られたHuman IgG1 L鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素EcoRI（Takara）で切断されてから精製した。pQCXIHベクターをNotIとEcoRIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-CD20マウスL鎖可変領域遺伝子断片と精製Human IgG1 L鎖定常領域遺伝子断片を混同してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-CD20キメラ抗体L鎖の発現ベクターは、pKDキメラLCと名前が付けられた。
【０２００】
Anti-CD20キメラ抗体H鎖発現ベクターの構築
発現ベクターとしては、pQCXIPベクター（Clontech）を使用し、このベクターのNotIとEcoRIサイトにAnti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子+ Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子を挿入させる。Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子は、先に作製されたpCR2.1-MHVを鋳型に以下のPCR反応を行うことで断片を得た。野生型、295Cys型キメラ抗体の各々に対して専用のH鎖発現ベクターは、Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子をPCR増幅させる際の鋳型となるプラスミドは異なるが、操作自体は全く同様に行われて各種Human IgG1 H鎖遺伝子断片を得た。以下にPCR反応を含む詳細を記述する。
【０２０１】
（Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子の増幅反応）
pCR2.1-MHV (20 ng/μL)        2 μL
2.5 mM dNTPs                  4 μL
H5 primer(20μM)              2.5 μL
H2 primer(20μM)              2.5 μL 
DMSO                          2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer    5 μL 
pfu polymerase                1 μL
滅菌水                        30.5 μL 
total                         50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H5 primer：AATAGCGGCCGCATGGGATGGAGCTGGGTCTTTCTC（配列番号：９０）
H2 primer：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC (5’-リン酸化されている)（配列番号：７７）
【０２０２】
（Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子の増幅反応）
＃各種鋳型プラスミド (20 ng/μL)  2 μL
2.5 mM dNTPs                      4 μL
H3 primer(20μM)                  2.5 μL
H6 primer(20μM)                  2.5 μL 
DMSO                              2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer        5 μL 
pfu polymerase                    1 μL
滅菌水                            30.5 μL 
total                             50 μL
94℃  2 min
94℃  1 min 55℃  2min 72℃  2min (20サイクル)
72℃  4 min
4℃    無制限時間
H3 primer：GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC(5’-リン酸化されている)（配列番号：７８）
H6 primer：CGGTAGAATTCTTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC（配列番号：９１）
【０２０３】
#：野生型のAnti-CD20キメラ抗体用の遺伝子断片を調整するためには、pCR2.1-HC(野生型)を鋳型として用いた。295Cys型のAnti-CD20キメラ抗体用の遺伝子断片を調整するためにはpCR2.1-HC(295cys)を鋳型として用いた。
【０２０４】
上記のPCR反応で得られたAnti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子断片は、制限酵素NotI（Takara）で切断されてから精製した。また、鋳型の異なる各種PCR反応で得られたHuman IgG1 H鎖定常領域遺伝子断片は、制限酵素EcoRI（Takara）で切断されてから精製した。pQCXIPベクターをNotIとEcoRIで切断して精製した断片に、先の精製Anti-CD20マウスH鎖可変領域遺伝子断片と精製Human IgG1 H鎖定常領域遺伝子断片を混合してLigationした。このLigationで得られたベクターは、シークエンスにより目的の断片が挿入されていることを確認された。このAnti-CD20キメラ抗体H鎖の発現ベクターは、pKDキメラHC(野生型)、pKDキメラHC(295Cys)と名前が付けられた。
【０２０５】
D)FUT8 Knock Down CHO細胞の作製
フコース低減キメラ抗体は、α1.6フコース転移酵素（FUT8）をknock downしたCHO細胞に、Anti-CD20キメラ抗体のL鎖とH鎖の2種類の発現ベクターをTransfectionすることで作製できる（FUT8の塩基配列を配列番号：９６、アミノ酸配列を配列番号：９７に示す）。ここでは、フコース低減キメラ抗体の作製に必要なFUT8 Knock Down CHO細胞の作製方法について記述する。
FUT8cDNA配列（＋190〜＋208）を基に設計されたFUT8 siRNA Sense primer (5’-gatccccgctgagtctctccgaatacttcaagagagtattcggagagactcagcttttta-3’配列番号：９２)およびFUT8 siRNA Anti-Sense primer  (5’-tcgataaaaagctgagtctctccgaatactctcttgaagtattcggagagactcagcggg-3’配列番号：９３)を、常法に従いNaCl存在下99℃、2min加熱後、72℃から4℃まで2時間かけて冷却することによってアニーリングさせた。得られたDNA断片を、pSuper gfp+neo（Oligoengine）に挿入した。挿入されたDNA塩基配列はABI3100-Avant(Applied Biosystems社製)を用いて確認を行い、FUT-8 siRNA発現ベクター FUT-8 SiRNA/pSuper gfp+neoを構築した。
得られたFUT-8 siRNA発現ベクター FUT-8 siRNA/pSuper gfp+neo はFuGENE（Roche社製）を用い、取扱説明書に従ってCHO-K1細胞（ATCC Catalog No. CCL-61）に遺伝子導入した。遺伝子導入されたCHO-K1細胞は10% FCS  (Hyclone社製) -ペニシリン-ストレプトマイシン (SIGMA社製) 含有RPMI-1640 培地(SIGMA社製) にて培養し、さらにG418（和光純薬社製）0.6 mg/mlを添加して薬剤選択を行った。薬剤耐性を獲得した細胞はセルソーター（EPICS ALTRA、Beckman Coulter社製）を用いてGFP発現量を指標にソーティングを行った。ソーティング後の細胞は限界希釈を行い、GFP高発現細胞、すなわちFUT-8 siRNAを高発現する細胞を得た。同細胞におけるFUT-8 mRNA発現量は、FUT-8発現解析用sense primerおよび（5'-AATGAAGACTTGAGGCGAATGG-3'配列番号：９４）FUT-8発現解析用anti-sense primer（5'-ATTGACCAGGGGACAGCTACA-3'配列番号：９５）とABI PRISM 7000（Applied Biosystems社製）を用いたReal time PCR法を用いて定量し、mRNA発現量が遺伝子導入前の細胞の22.8%とFUT-8が発現抑制されていることを確認した。得られたFUT-8 siRNA発現量の高い細胞をFUT-8 knockdown CHO-K1細胞として実験に使用した。
【０２０６】
E)キメラ抗体発現ベクターのFUT8 Knock Down CHO細胞への遺伝子導入とキメラ抗体を高発現するCHO細胞のスクリーニング
構築された各種発現ベクターは、以下の組み合わせでTransIT-CHO Transfection kit（Mirus, MIR2170）を使用してFUT8 Knock Down CHO細胞へ遺伝子導入された。
野生型キメラ抗体：pKDキメラLC+ pKDキメラHC（野生型）
295Cys型キメラ抗体：ｐKDキメラLC+ｐKDキメラHC (295Cys型)
【０２０７】
遺伝子導入されたFUT8 Knock Down CHO細胞は、10％ Fetal Bovine Serum(EQITEC-BIO)と0.2 mg/mL Geneticin(GIBCO, 10131-035)、0.1mg/mL Hygromycin(Invitrogen, 10687-010)、2μg/mL Puromycin(メルクジャパン, 540411-25MG)を補足したRPMI1640（Sigma, R8758）で37℃5％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖した。この増殖してコロニーを形成したFUT8 Knock Down CHO細胞の中からキメラ抗体を高発現しているFUT8 Knock Down CHO細胞を選択するのであるが、はじめに各コロニーの一部を96 wellプレートに移植して、さらに10日間培養した。その培養上清の一部を取り出し、以下に示すELISA測定をすることで高発現FUT8 Knock Down CHO細胞クローンを決定した。
（ELISA測定）
1)Anti-Human IgG (γ-chain) (MBL, 103AG)をコートした96Wellプレートに、TansfectionされたCHO細胞の培養上清を100 μL/wellで添加し、室温で1時間放置した。
2)培養上清液を96 wellプレートから捨てて、0.05%のTween20を含むPBS (PBS-0.05%Tween20)でwellを十分洗浄した。
3)Anti-Human IgG（γ-chain）Peroxidase conjugated (MBL, 208)をPBS-0.05％Tween20で2000倍希釈した溶液を100 μL/well添加して、室温で1時間放置した。
4)溶液を96 wellプレートから捨てて、PBS-0.05%Tween20でwellを十分洗浄した。
5)TMB Peroxidase Substrate (Moss, TMBE-1000ｓ)を100 μL/well添加して、発色反応させた。
6)10〜15分の発色反応後、1N硫酸を100 μL/well添加して、発色反応を停止させた。
7)450 nm吸光度を測定した。
このELISA測定で、高い発色値を示すコロニーが、キメラ抗体を高発現するクローンである。
【０２０８】
E)キメラ抗体高発現FUT8 Knock Down CHO細胞の培養
ELISA測定により選択されたキメラ抗体高発現CHO細胞は、10％ Fetal Bovine Serumと0.2 mg/mL Geneticin、0.1mg/mL Hygromycin、2μg/mL Puromycinを補足したRPMI1640で37℃5％二酸化炭素の条件下で培養することで増殖させた。十分に増殖したキメラ抗体の高発現FUT8 Knock Down CHO細胞は、0.2 mg/mL Geneticin、0.1mg/mL Hygromycin、2μg/mL Puromycinを補足した無血清培地であるCHO-S-SFMII（GIBCO,12052-098）の培養に置き換えられ、継続して1000ｍL程度培養された。
【０２０９】
F)キメラ抗体高発現細胞の培養上清からのカラム精製
無血清培地であるCHO-S-SFMIIで培養されたキメラ抗体高発現FUT8 Knock Down CHO細胞の培養上清は、回収された。野生型キメラ抗体の精製は、そのFc領域構造に変化を加えていないため、抗体精製に通常用いられるProtein Aカラム精製により実施された。しかしながら、295Cys型キメラ抗体は、そのFc領域構造に変異を加えているために、Fc領域の構造変化を伴い、通常のProtein Aカラムへは、ほとんど吸着されない。この理由から、これら変異型キメラ抗体では、Protein Lカラムを使用して精製を実施した。今回作製されたAnti-CD20キメラ抗体は、その可変領域がκ鎖である。このProtein Lは、この可変領域κ鎖を認識して結合できるタンパク質である。以下に、野生型キメラ抗体のProtein Aカラム精製と変異型キメラ抗体のProtein Lカラム精製の詳細を記述する。
野生型キメラ抗体のProtein Aカラム精製
1)1000 ｍL のCHO-S-SFMIIで野生型キメラ抗体高発現FUT8 Knock Down CHO細胞を培養して得られた培養上清は、Amicon Ultrafiltration Membranes (Millipore, Code YM10)を取り付けたAmicon Stirred Uitrafiltration Cell (Millipore, Model 8400)を用いて、1000 ｍLから100 ｍLまで濃縮された。
2)培養上清濃縮液に、Protein A-SepharoseであるrProteinA Sepharose Fast Flow (Amersham Bioscience, 17-1279-03) 8ｍLを添加し、2日間4℃で攪拌させてProteinAに野生型キメラ抗体を吸着させた。
3)野生型キメラ抗体を吸着したProteinA-Sepharoseは、直径1.5 cm、長さ8 cmのカラムに充填させた。
4)ProteinA-Sepharoseが充填されたカラムは、PBS 100 mLで洗浄された後、Elution Buffer (0.17M Glycine-HCl, pH2.3) でカラムから野生型キメラ抗体を溶出した。
5)溶出された野生型キメラ抗体溶液は、すぐに1M Tris-HCl pH8.5を適量加えてｐHを中性にした。
6)野生型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるCell Sep T2 (Membrane filtration products Inc, 8030-23)に入れて4℃でPBS 5 Lに透析された。透析後に回収した野生型キメラ抗体を、精製品とした。
【０２１０】
変異型キメラ抗体のProtein Lカラム精製
1)1000 ｍL のCHO-S-SFMIIで295Cys型キメラ抗体高発現FUT8 Knock Down CHO細胞を培養して得られた培養上清は、Amicon Ultrafiltration Membranes (Millipore, Code YM10)を取り付けたAmicon Stirred Uitrafiltration Cell (Millipore, Model 8400)を用いて、1000ｍLから100ｍLまで濃縮された。
2)培養上清濃縮液100 ｍLは、ProteinL Binding Buffer (0.1M Phosphate, 0.15 M NaCl,pH 7.2) 100 mLを加えて混合された。
3)直径1.5 cm、長さ8 cmのカラムにProtein L-SepharoseであるImmunoPure Immobilized Protein L Plus (PIERCE, 20250) 2 mLを充填させた。
4) 2）で調整した液をカラム上端から加えて、カラム下端からゆっくり流し出した。この操作でProtein L-Sepharoseへ変異型キメラ抗体を吸着させた。その後、Protein L Binding Buffer 50 mLでカラムを洗浄し、カラムに吸着した余分な蛋白を除去した。
5)Elution Buffer (0.17M Glycine-HCl, pH2.3) でカラムから変異型キメラ抗体を溶出した。溶出された変異型キメラ抗体溶液は、すぐに1M Tris-HCl pH8.5を適量加えてpHを中性にした。
6)変異型キメラ抗体溶出液は、透析チューブであるCell Sep T2 (Membrane filtration products Inc, 8030-23)に入れて4℃でPBS 5 Lに透析された。透析後に回収した変異型キメラ抗体を、精製品とした。
以上のように、精製された野生型キメラ抗体あるいは変異型キメラ抗体は、12.5％SDS-PAGEで電気泳動されたのち、銀染色された。この電気泳動像を図に添付する（図７）。
【産業上の利用可能性】
【０２１１】
本発明の抗体によれば、抗体のＦｃ領域における特定のアミノ酸残基に変異を加える、または変異を加えた抗体に結合する糖鎖のフコースを低減させることにより、エフェクター機能を著しく向上することができる。このような抗体からなる治療用組成物は、少量で優れた薬理効果を得ることができるため、抗体医薬として極めて有用である。また、使用量の低減によりコストを抑えることができ、しかも特異性が高く副作用が少ないため、患者の経済的、身体的負担を極めて軽減することができる。また、抗体を用いた治療と併用されてきた化学療法や放射性同位元素標識抗体などの他の治療方法を控えることができ、これらの治療方法による副作用を回避することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】Anti-CD20マウスL鎖可変領域のDNA配列を示す図である。
【図２】Anti-CD20マウスH鎖可変領域のDNA配列を示す図である。
【図３】精製された野生型抗CD20キメラ抗体、298Ala/333Ala/334Ala型抗CD20キメラ抗体、及び298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型抗CD20キメラ抗体の電気泳動結果を示す写真である。
【図４】実施例１において、野生型抗CD20キメラ抗体、298Ala/333Ala/334Ala型抗CD20キメラ抗体、及び298Ala/333Ala/334Ala/295Cys型抗CD20キメラ抗体のADCC活性を測定した評価結果を示すグラフである。
【図５】精製された野生型CD20キメラ抗体、239Asp/330Leu/332Glu型CD20キメラ抗体、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型CD20キメラ抗体の電気泳動結果を示す写真である。
【図６】実施例２において、野生型CD20キメラ抗体、239Asp/330Leu/332Glu型CD20キメラ抗体、239Asp/330Leu/332Glu/295Cys型CD20キメラ抗体のADCC活性を測定した評価結果を示すグラフである。
【図７】精製された野生型抗CD20キメラ抗体、フコース低減野生型キメラ抗体、フコース低減295Cys型キメラ抗体の電気泳動結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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