(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析物濃度を決定するためのセンサーシステムであって：
光ファイバーの末端領域に沿って配置された、平衡非消費化学指示剤システムを具備する光ファイバーセンサーを有し、該化学指示剤システムは：
被分析物に可逆的に結合できるよう構成された部分と結合する被分析物；および
該被分析物結合部分と会合し、励起光を吸収して発光できるＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡ蛍光色素体とを具備し、ただし、該蛍光色素体による発光が被分析物濃度に関連するように、該蛍光色素体と被分析物結合部分との会合が、被分析物結合により変えられ；
励起光源と；
発光検出器と；および
制御器と
を具備するセンサーシステム。
【請求項２】
該被分析物はグルコースである、請求項１に記載のセンサーシステム。
【請求項３】
該被分析物結合部分が、消光体と被分析物に可逆的に結合する１以上の結合部位を有する、請求項１に記載のセンサーシステム。
【請求項４】
該消光体が、ビオロゲンである請求項３に記載のセンサーシステム。
【請求項５】
該１以上の結合部位が、ベンジルボロン酸基である、請求項３に記載のセンサーシステム。
【請求項６】
該被分析物結合部分が、ビオロゲン−ボロン酸付加体である、請求項１に記載のセンサーシステム。
【請求項７】
該被分析物結合部分が、３，３’−ｏＢＢＶまたはその誘導体ある、請求項１に記載のセンサーシステム。
【請求項８】
該励起光源が発光ダイオードである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサーシステム。
【請求項９】
該発光の蛍光寿命が被分析物濃度と関連する、請求項１に記載のセンサーシステム。
【請求項１０】
該励起光源がレーザーである、請求項９に記載のセンサーシステム。
【請求項１１】
該励起光が周波数変調された励起光である、請求項９に記載のセンサーシステム。
【請求項１２】
該指示剤システムが、被分析物結合部分および蛍光色素体を実質的に固定し、被分析物を透過できるヒドロゲルを更に具備する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセンサーシステム。
【請求項１３】
膜を更に具備し、該被分析物結合分子および蛍光色素体が、該膜に少なくとも部分的に囲まれる体積で実質的に保持されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のセンサーシステム。
【請求項１４】
該制御器が、発光検出信号を監視し、時間の経過による該蛍光発光の減衰を測定するようプログラムされた、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のセンサーシステム。
【請求項１５】
該制御器が、さらに発光の蛍光寿命を計算するようプログラムされた、請求項１４に記載のセンサーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２００７年５月１０日付け出願の米国仮出願第６０／９１７，３０７号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が本明細書で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の実施形態は被分析物センサーに関する。特に、本発明の好ましい実施形態は蛍光化学を基礎とする非消費血管内グルコースセンサーに関する。
【背景技術】
【０００３】
体液中のポリヒドロキシ化合物（例えば、グルコース）濃度を測定するために、蛍光技術を使用する努力が長年進行してきた。しかしながら、その努力に関わらず、生体内における監視のための実用的なシステムは開発および商業化されていなかった。ボロン酸基と会合した色素を使用して蛍光によりグルコースを検出する試みが幾度もなされてきた。ボロン酸部分構造はグルコースに可逆的に結合する。ボロン酸で機能化された蛍光色素がグルコースに結合すると、グルコースの濃度と関係のある信号が生成および検出できるように色素の特性が影響を受ける。従来、グルコースの濃度測定には、これらの変化を使用してきた。
【０００４】
Ｒｕｓｓｅｌｌ（米国特許第５，１３７，８３３（特許文献１）および５，５１２，２４６号明細書（特許文献２））は、グルコースに結合しグルコース濃度と関係のある信号を生成するボロン酸で機能化された色素を使用した。Ｊａｍｅｓら（米国特許第５，５０３，７７０号明細書（特許文献３））は同様の原理を利用しているが、単一の複合体において、蛍光色素、アミンの消光性機能およびボロン酸を組み合わせた。その複合体からの蛍光発光は結合しているグルコースの量により変化した。Ｖａｎ  Ａｎｔｗｅｒｐら（米国特許第６，００２，９５４（特許文献４）および６，０１１，９８４号明細書（特許文献５））は先に引用した文献の態様を組み合わせ、また、埋め込み可能なことを目的とした装置を開示した。また、Ａ．Ｅ．Ｃｏｌｖｉｎ、Ｊｒ．（米国特許第６，３０４，７６６号明細書（特許文献６））は、ボロン酸機能化色素を利用し、人体中でその場において検知するための光学系検知装置を開示した。
【０００５】
ｐＨおよびＯ２、ＣＯ２、Ｎａ＋、Ｋ＋およびグルコースなどのポリヒドロキシル化合物の濃度などの血液または体液を使用して測定できる特定のパラメータが生体内で決定されてきた。患者を監視する際には、それらの被分析物を頻繁に決定する必要があるため、これらの測定を生体内で行えることは重要である。典型的には、それぞれの被分析物に対して１つのセンサーが患者の血管（１つまたは複数）中に配置されてきた。数種類の被分析物の測定が望ましい場合、複数のセンサーがしばしば必要となり、患者に対して付帯する不快を生じることがあり、電子的監視設備が複雑となることがある。
【０００６】
生体内での監視は物理的な大きさが限られることによる設計上の問題を解決する努力において、２つのパラメータを同時に読み取るために、他者は１つの装置に異なる色素を組み込んできた。例えば、Ａｌｄｅｒら（米国特許第５，９２２，６１２号明細書（特許文献７））は、１つのセンサー上において２種類の異なる色素を使用することで、水性試料のｐＨおよびイオン強度を光学的に決定する方法を開示した。Ｇｒａｙら（米国特許第５，１７６，８８２号明細書（特許文献８））は、ｐＨと共に被分析物濃度を測定するために、ｐＨ検知性色素およびカリウムまたはカルシウム検知性蛍光色素が固定化された親水性ポリマーを組み込む光ファイバー装置の使用を教示した。また、米国特許第４，７８５，８１４号明細書（特許文献９）において、Ｋａｎｅは、血液中のｐＨおよび酸素含有量を同時に測定するために、複合体膜中に埋め込まれた２種類の色素を使用することを開示した。しかしながら、単一のセンサーに複数の色素を組み込むと、そのようなセンサーの製造が複雑となる。
【０００７】
監視されるそれぞれの被分析物に対する別体の留置センサーに伴う先の問題に加えて、特に集中治療においておよび複数の色素センサーで、多くの色素系被分析物センサーに伴うもう一つの問題はｐＨ感受性である。ｐＨの僅かな変化により蛍光発光が変わることや減衰することがあり、読み取りが不正確となることがある。この問題は、血液ｐＨが急速に変動することがある糖尿病患者において血液グルコースレベルを監視する場合に、特に深刻である。これらの患者の治療には正確な血液グルコースレベルの測定が不可欠であるため、別体の留置ｐＨおよび被分析物センサーまたは複数の色素を有するセンサーを必要とせずにｐＨによる影響の即時修正が容易なグルコースセンサーに対するかなりの要求がある。
【０００８】
蛍光色素（１種類または多種類）を使用してｐＨをレシオメトリックに決定することは既知である。酸性および塩基性型を有する蛍光色素体があるとすると、蛍光色素体濃度に関係なく、２つの型の発光強度の比をｐＨの測定として使用できる。例えば、ＨＰＴＳ−誘導ｐＨ感受性色素（参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）を記載している米国特許出願公開第２００５／００９００１４号公報（特許文献１０）；蛍光のレシオメトリックな測定のための指示剤としてｐＨ−感受性色素メソ−５，１０，１５，２０−テトラ−（４−アリルオキシフェニル）ポルフィリン（ＴＡＰＰ）および参照としてｐＨ−非感受性ベンゾチオキサンテン誘導体を記載するＮｉｕ  Ｃ．Ｇ．ら  ２００５年  Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３８３巻（２号）：３４９〜３５７頁（非特許文献１）；蛍光色素体の発光スペクトルのｐＨに依存したシフトを示し、蛍光色素体であるカルボキシセミナフトローダフルオル−１を使用する二重発光のレシオメトリックな画像化が開示されているＴｕｒｎｅｒ  Ｎ．Ｇ．ら  １９９８年  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．８月  ３巻（２号）：１１０〜３頁（非特許文献２）；および波長にレシオメトリックな様式でｐＨによってスペクトルのシフトおよび強度の変化を示す６−アミノキノリニウムボロン酸色素を使用することが記載されているＢａｄｕｇｕ  Ｒ．ら  ２００５年  Ｔａｌａｎｔａ  ６６巻：５６９〜５７４頁（非特許文献３）を参照。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，１３７，８３３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５１２，２４６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５０３，７７０号明細書
【特許文献４】米国特許第６，００２，９５４号明細書
【特許文献５】米国特許第６，０１１，９８４号明細書
【特許文献６】米国特許第６，３０４，７６６号明細書
【特許文献７】米国特許第５，９２２，６１２号明細書
【特許文献８】米国特許第５，１７６，８８２号明細書
【特許文献９】米国特許第４，７８５，８１４号明細書
【特許文献１０】米国特許出願公開第２００５／００９００１４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎｉｕ  Ｃ．Ｇ．ら  ２００５年  Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３８３巻（２号）：３４９〜３５７頁
【非特許文献２】Ｔｕｒｎｅｒ  Ｎ．Ｇ．ら  １９９８年  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｙｍｐ．Ｐｒｏｃ．８月  ３巻（２号）：１１０〜３頁
【非特許文献３】Ｂａｄｕｇｕ  Ｒ．ら  ２００５年  Ｔａｌａｎｔａ  ６６巻：５６９〜５７４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ｐＨの影響によりグルコースの測定を修正でき、ｐＨおよびグルコースを連続して血管内で監視することを提供することに適用されたセンサーに対する要求は実質的には満たされていないとの本発明者らの認識にも関わらず、同一の蛍光色素体がグルコースに結合するよう機能化されておりグルコース濃度と関連した強度の信号が生成され、蛍光色素体の濃度に依存することなくレシオメトリックなｐＨ測定を行うことに適している特性を示す単一の蛍光色素体を具備するセンサーを使用することは開示または示唆すらされていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の好ましい実施形態によれば、血液中の被分析物濃度を決定するために血管内センサーが開示される。センサーは被分析物結合分子と、ただし、被分析物結合分子は蛍光色素体と会合しており；被分析物アナログと、ただし、被分析物アナログは受容体と会合しており、ただし、受容体により少なくとも部分的に吸収される波長において蛍光色素体は照射を発することができ、ただし、蛍光色素体が受容体の近傍にある場合、蛍光共鳴エネルギー移動を介して蛍光色素体は受容体にエネルギーを移動でき；光源と；および検出器とを具備する。
【００１３】
実施形態によっては、センサーはヒドロゲルを更に具備し、ただし、被分析物結合分子および被分析物アナログはヒドロゲル中に実質的に固定され、ただし、ヒドロゲルは被分析物を透過できる。
【００１４】
実施形態によっては、光源はレーザーである。
【００１５】
実施形態によっては、レーザーは周波数変調された励起信号を供給できる。
【００１６】
実施形態によっては、レーザーは光パルスを供給できる。
【００１７】
実施形態によっては、センサーは光ファイバーを更に具備する。
【００１８】
実施形態によっては、被分析物はグルコースである。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、血液中のグルコース濃度を決定する方法が開示される。その方法は上述の通りのセンサーを提供し；センサーを血管中に挿入し；蛍光色素体に励起信号を照射し；蛍光色素体からの蛍光発光を検出し；および、グルコースの濃度を決定することを含む。
【００２０】
実施形態によっては、励起信号は光パルスである。
【００２１】
実施形態によっては、時間の経過による蛍光発光の減衰を測定し、蛍光寿命を計算することを方法は更に含む。
【００２２】
実施形態によっては、励起信号は周波数変調されている。
【００２３】
実施形態によっては、発光および励起信号の間の位相シフトを測定することを方法は更に含む。
【００２４】
実施形態によっては、蛍光寿命を計算することを方法は更に含む。
【００２５】
実施形態によっては、変調比を測定し、蛍光寿命を計算することを方法は更に含む。
【００２６】
ある好ましい実施形態においては、血液中の被分析物濃度を決定するために血管内センサーが開示される。センサーは光ファイバーの末端領域に沿って配置されたセンサーの化学的部分を具備する光ファイバーを具備し、ただし、センサーの化学的部分は血管中に存在する大きさで生理学的に適合しており、ただし、センサーの化学的部分は平衡蛍光化学的なものまたは寿命化学的なものより選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明のある実施形態の検知機構を示す流れ図である。
【図２】本発明のある好ましい実施形態による２個の励起光源および２個の検出器を具備するグルコースおよびｐＨセンサーおよび光学系を示す。
【図３】異なるｐＨにおけるＨＰＴＳの吸収スペクトルを示す。
【図４】ＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４を使用し、Ｉ（塩基性型）／Ｉ（等吸収点）比を使用するレシオメトリックなｐＨ検知がグルコース濃度に依存しないことを示す。４５４ｎｍ（塩基性型）および４２２ｎｍ（等吸収点）における励起に対応するための蛍光発光の比を種々のグルコース濃度におけるｐＨに対してデータがプロットされている。
【図５】異なるｐＨで４２２ｎｍ（等吸収点）において励起されたＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４に対するグルコース応答曲線を示す。
【図６】溶液中で異なるｐＨにおけるＳＮＡＲＦ−１の吸収スペクトルを示す。
【図７】５１４ｎｍ励起／５８７ｎｍ発光で異なるｐＨにおける溶液中でのＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶに対するグルコース応答曲線を示す。
【図８】５１４ｎｍ励起／６２５ｎｍ発光で異なるｐＨにおける溶液中でのＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶに対するグルコース応答曲線を示す。
【図９】Ｉ（塩基性型）／Ｉ（酸性型）比を使用し、溶液中においてＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶによる異なるグルコース濃度におけるｐＨのレシオメトリックな検知を示す。
【図１０】異なるｐＨにおけるＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡに対するグルコース応答曲線を示す。
【図１１】Ｉ（塩基性型）／Ｉ（酸性型）比を使用し、ＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡを使用して異なるグルコース濃度におけるｐＨのレシオメトリックな検知を示す。
【図１２】Ｉ（塩基性型）／Ｉ（酸性型）比を使用し光ファイバーの末端に指示システムが固定化されているＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＭＡを使用して異なるグルコース濃度におけるｐＨのレシオメトリックな検知を示す。
【図１３】蛍光色素体が励起光のパルスを受けた後の時間の経過による蛍光強度の減衰のグラフを示す。
【図１４】周波数変調された励起信号の結果生じる発光信号のグラフを示す。
【図１５Ａ】蛍光色素体に結合したグルコース結合分子、受容体に結合したグルコースアナログおよびグルコース分子の相互作用を示す。
【図１５Ｂ】蛍光色素体に結合したグルコース結合分子、受容体に結合したグルコースアナログおよびグルコース分子の相互作用を示す。
【図１５Ｃ】蛍光色素体に結合したグルコース結合分子、受容体に結合したグルコースアナログおよびグルコース分子の相互作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
好ましい実施形態において、単一の指示システムにより２種類の被分析物を測定できる光学的センサーを本発明は指向している。より特には、好ましいセンサーは単一の蛍光色素体（例えば、蛍光色素）を利用しており：（１）レシオメトリックな方法により第１の被分析物、例えば、Ｈ＋（ｐＨ）の濃度を決定するためで、ただし、そのような決定は蛍光色素体の濃度には依存しておらず；および（２）見掛けの蛍光色素体濃度（例えば、励起の際の蛍光色素体の発光強度）を測定することで第２の被分析物、例えば、ポリヒドロキシル化合物（例えば、好ましくは、グルコース）の濃度を決定するためで、ただし、見掛けの蛍光色素体濃度は第２の被分析物の濃度に依存している。更には、第２の被分析物濃度の測定が第１の被分析物濃度に依存する場合（例えば、この分野における一般的な問題である、グルコースの測定がｐＨによって変化する光学系において）、本発明の好ましい実施形態によれば、測定された第２の被分析物濃度を第１の被分析物濃度の寄与のために修正できる。センサーは、好ましくは、水性媒体（例えば、生理学的媒体、血液、間質液など）において安定であり、より好ましくは、センサーは血管中に挿入され、そこで、ある期間、留置できるように構成されている。よって、本発明の好ましい実施形態によれば、血管内配置用に構成された光学的センサーが開示され、そのセンサーは単一の指示システムで２種類の被分析物（好ましくは、ｐＨおよびグルコース）を測定でき、ｐＨの任意の寄与のためにグルコースの測定を修正できる。
【００２９】
センサーの好ましい実施形態は、とりわけ、レシオメトリックなｐＨ検知を指向しているが、第１の被分析物の濃度および発光比に関連しており、蛍光色素体濃度に依存しない濃度を少なくとも２種類の形態で示す蛍光色素体を指示システムが含む限り、本発明のより広い範囲によって他の第１の被分析物濃度を決定することもできる。同様に、本明細書においては第２の被分析物の例としてグルコースを使用しているが、第２の被分析物に結合する結合部分構造と動作可能にカップルしており、ただし、蛍光色素体の信号強度は第２の被分析物の濃度によって変化する蛍光色素体を指示システムが含む限り、本発明の実施形態を使用して溶液中の他のポリヒドロキシル含有有機化合物（炭水化物、１，２−ジオール、１，３−ジオールなど）の濃度も決定できると理解される。実施形態によっては、第２の被分析物の濃度として非炭水化物も含まれる。
【００３０】
＜指示システム＞
本発明の好ましい実施形態に従って使用される指示システムは被分析物結合部分構造に動作可能にカップルされた蛍光色素体を含み、ただし、被分析物が結合することで蛍光色素体濃度における明らかな光学的変化（例えば、発光強度）が生じる。更に、蛍光色素体は異なる酸および塩基型の形態を有し、レシオメトリックにｐＨを検知できるようにスペクトル特性において検出可能な差異を示すことが望ましい。例えば、ＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ（下に詳細に記載する）などの蛍光色素に動作可能にカップルされた３，３’−ｏＢＢＶ（下に詳細に記載する）などのグルコース結合部分構造は、蛍光色素の発光強度を消光するはずで、グルコースが結合すると消光の程度が減少し、結果として、グルコース濃度に関連して発光強度が増加する。好ましい実施形態において、少なくとも２個のアニオン性基を有する色素と、少なくとも２個のボロン酸を有する消光体とを指示システムは含む。また、更に好ましい実施形態において、指示システムは、検知部分構造が互いに反応（消光）するために物理的に十分近くにとどまるように検知部分構造（例えば、色素−消光体）を固定化するための部材も含む。生体内検知が望まれる場合、そのような固定化部材は、好ましくは、水性環境（例えば、血管内）において不溶性であり、標的の被分析物を透過でき、検知部分構造を透過できない。典型的には、固定化部材は非水溶性の有機ポリマーマトリクスを含む。例えば、ＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ色素および３，３’−ｏＢＢＶ消光体をＤＭＡＡ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）ヒドロゲルマトリクス（下に詳細に記載する）中に効率よく固定化でき、生体内でｐＨおよびグルコースを検知できる。
【００３１】
幾つかの例示的で好ましい蛍光色素体、被分析物結合部分構造および固定化部材を下により詳細に述べる。
【００３２】
＜蛍光色素体＞
「蛍光色素体」は、特定の波長で光により照らされると、より長い波長で光を発する、即ち、蛍光を発する物質を言う。蛍光色素体としては、制限することなく、有機色素、有機金属化合物、金属キレート、蛍光共役ポリマー、量子ドットまたはナノ粒子および上のものの組み合わせが挙げられる。蛍光色素体は、ポリマーに接続され離散した部分構造または置換基でもよい。
【００３３】
好ましい実施形態において使用できる蛍光色素体は約４００ｎｍ以上の波長の光で励起でき、励起および発光波長を少なくとも１０ｎｍ分離できるのに十分な大きさのストークスシフトを有する。実施形態によっては、励起および発光波長の間の分離は約３０ｎｍ以上でよい。これらの蛍光色素体は、好ましくは、ビオロゲンなどの電子受容体分子によって消光され易く、光退色に対して耐性がある。また、それらは、好ましくは、光酸化、加水分解および微生物分解に対して安定である。
【００３４】
実施形態によっては、蛍光色素体は離散した化合物でよい。
【００３５】
実施形態によっては、蛍光色素体は約１０，０００ダルトン以上の分子量を有する水溶性または水分散性ポリマーのペンダント基または鎖単位でよく、色素−ポリマー単位を形成している。また、ある実施形態においては、そのような色素−ポリマー単位は非共有的に非水溶性ポリマーマトリクスＭ１と会合していてもよく、ポリマーマトリクスＭ１に物理的に固定化されており、ただし、Ｍ１は被分析物溶液を透過できるか接触している。もう一つの実施形態においては色素−ポリマー単位上の色素は負に帯電していてもよく、色素−ポリマー単位はカチオン性の水溶性ポリマーとの複合体として固定化されていてもよく、ただし、前記複合体は被分析物溶液を透過できるか接触している。ある実施形態においては、色素はヒドロキシピレントリスルホン酸の重合体誘導体の１つでよい。重合体色素は、水溶性、水膨潤性または水中分散性でよい。また、実施形態によっては、重合体色素は架橋されていてもよい。好ましい実施形態において、色素は負に帯電している。
【００３６】
他の実施形態においては、色素分子は非水溶性ポリマーマトリクスＭ１に共有結合されていてもよく、ただし前記Ｍ１は被分析物溶液を透過できるか接触している。Ｍ１に結合されている色素分子は、Ｍ１−Ｌ１−色素なる構造を形成していてもよい。Ｌ１は、検知部分構造をポリマーまたはマトリクスに共有的に連結する加水分解に安定な共有結合体である。Ｌ１の例としては、低級アルキレン（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン）が挙げられ、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）など、またはそれらの組合せより選択される１個以上の２価の連結基でもよい。ある実施形態においては、スルホンアミド官能基を介してポリマーマトリクスに色素が結合されている。
【００３７】
実施形態によっては、有用な色素としてピラニン誘導体（例えば、ヒドロキシピレントリスルホンアミド誘導体など）が挙げられ、以下の式を有する：
【００３８】
【化１】
0005517919.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ、−ＮＨＲ４であり、Ｒ４は−ＣＨ２ＣＨ２（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）ｎＸ１であり、ただし、Ｘ１は、−ＯＨ、−ＯＣＨ３ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２またはＯＭｅであり、ｎは約７０および１０，０００の間である。ある実施形態においては、スルホンアミド官能基を介してポリマーに色素が結合されてもよい。他の実施形態においては、色素はヒドロキシピレントリスルホン酸の重合体誘導体の１つでよい。
【００３９】
実施形態によっては、蛍光色素は８−ヒドロキシピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＨＰＴＳ）でよい。対イオンはＨ＋または任意の他のカチオンでよい。ＨＰＴＳは約４５０ｎｍおよび約４０５ｎｍにおいて２つの励起波長を示し、酸およびそれの共役塩基の吸収波長に対応する。ＨＰＴＳ上の水酸基のｐＨに依存するイオン化のために、励起波長がシフトする。ｐＨが上昇すると、約４５０ｎｍにおける吸収の増加をＨＰＴＳは示し、約４２０ｎｍ未満の吸収は減少する。吸収最大がｐＨに依存してシフトするため、生理学的範囲における二重励起のレシオメトリックな検出が可能となる。この色素は５００ダルトン未満の分子量を有するので、ポリマーマトリクスがなければ残留しないが、アニオン排除膜により使用できる。
【００４０】
【化２】
0005517919.tif 000003
もう一つの実施形態において、蛍光色素は８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メタクリルプロピルアミドスルホンアミド）（アセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ）のポリマーでよい：
【００４１】
【化３】
0005517919.tif 000004
ビオロゲン消光体、特に単一のボロン酸部分構造のみを有するビオロゲン消光体に動作可能にカップルされている場合、アニオン性基を有さないアセトキシ−ＨＰＴＳ−ＭＡ（上）などの色素は非常に強いグルコース応答は与えないことがあると留意する。
【００４２】
もう一つの実施形態において、蛍光色素は８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（カルボキシプロピルスルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＣＯ２）でよい：
【００４３】
【化４】
0005517919.tif 000005
もう一つの実施形態において、蛍光色素は８−ヒドロキシ−ピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス−（メトキシポリエトキシエチル（約１２５）スルホンアミド）（ＨＰＴＳ−ＰＥＧ）でよい：
【００４４】
【化５】
0005517919.tif 000006
ビオロゲン消光体、特に単一のボロン酸部分構造のみを有するビオロゲン消光体に動作可能にカップルされている場合、アニオン性基を有さないＨＰＴＳ−ＰＥＧ（上）などの色素は非常に強いグルコース応答は与えないことがあると留意する。
【００４５】
離散している化合物として代表的な色素は、８−アセトキシピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリド（ＨＰＴＳ−Ｃｌ）をアミノブチル酸などのアミノ酸と反応させることにより形成されたトリス付加体である。ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡなどと、８−ヒドロキシピレン−１−Ｎ−（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）−Ｎ’，Ｎ”−３，６−ビス（カルボキシプロピルスルホンアミド）ＨＰＴＳ−ＣＯ２−ＭＡとの共重合体などの、ポリマーに結合され１個以上のアニオン性基を持つヒドロキシピレントリスルホンアミド色素が最も好ましい。
【００４６】
もう一つの実施形態において、蛍光色素はＨＰＴＳ−トリＣｙｓ−ＭＡでよい：
【００４７】
【化６】
0005517919.tif 000007
この色素は、３，３’−ｏＢＢＶなどのボロン酸を含む消光体で使用できる。
【００４８】
当然、実施形態によっては、ＨＰＴＳ核上のＣｙｓ−ＭＡ以外の置換も、その置換が負に帯電しており重合性基を有している限り、本発明の態様と整合する。システインのＬまたはＤ立体異性体のいずれかを使用できる。実施形態によっては、１個のみまたは２個のスルホン酸が置換されていてもよい。同様に、上で示されるＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡに対する変体において、ＮＢｕ４＋に加え他の対イオンも使用でき、正に帯電した金属が挙げられ、例えば、Ｎａ＋である。他の変体において、スルホン酸基は、例えば、リン酸、カルボン酸などの官能基で置き換えられていてもよい。
【００４９】
もう一つの適切な色素はＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡで、以下の通り下に描かれる。
【００５０】
【化７】
0005517919.tif 000008
他の例としては、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡまたは他の親水性共モノマーと、８−アセトオキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）の可溶性共重合体が挙げられる。色素におけるフェノール性の置換基は保護基によって重合中は保護されており、重合完了後に加水分解によって取り除くことができる。例えば、アセトキシ、トリフロロアセトキシなどの適切な保護基は当該技術でよく知られている。
【００５１】
ＨＰＴＳおよびその誘導体を含む蛍光色素は公知であり、多くが被分析物の検出で使用されてきた。例えば、米国特許第６，６５３，１４１、６，６２７，１７７、５，５１２，２４６、５，１３７，８３３、６，８００，４５１、６，７９４，１９５、６，８０４，５４４、６，００２，９５４、６，３１９，５４０、６，７６６，１８３、５，５０３，７７０および５，７６３，２３８号明細書；および同時係属中の米国特許出願公開第１１／２９６，８９８および６０／８３３，０８１号公報を参照；それぞれが、その全体において本明細書で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５２】
また、本発明の態様によれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製ＳＮＡＲＦおよびＳＮＡＦＬ色素も有用な蛍光色素体である。ＳＮＡＲＦ−１およびＳＮＡＦＬ−１の構造を下に示す。
【００５３】
【化８】
0005517919.tif 000009
加えて、本発明の実施形態によっては、６−アミノキノリニウムおよびボロン酸部分構造の両者を基礎とする一連の異性体水溶性蛍光プローブも有用な蛍光色素体で、それらは波長についてレシオメトリックおよび測色的な様式でｐＨによるスペクトルのシフトおよび強度の変化を示す（例えば、Ｂａｄｕｇｕ、Ｒ．ら  ２００５年  Ｔａｌａｎｔａ  ６５巻（３号）：７６２〜７６８頁；およびＢａｄｕｇｕ、Ｒ．ら  ２００５年  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１３巻（１号）：１１３〜１１９頁を参照）；その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５４】
ｐＨおよびサッカリドを感受できる蛍光色素のもう一つの例はテトラキス（４−スルホフェニル）ポルフィン（ＴＳＰＰ）であり、下に示す。ポルフィリン環は第二鉄などの特定の金属イオンと反応し非蛍光となることがあり、ＴＳＰＰは血液中では任意成分としては動作できない。
【００５５】
【化９】
0005517919.tif 000010
本発明のセンサーにおいてｐＨおよびグルコースを同時に決定するのに有用であり得るｐＨ感受性蛍光指示体の追加の例は、米国特許第２００５／０２３３４６５号明細書および米国特許第２００５／００９００１４号明細書に記載されており；それぞれが、その全体において参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００５６】
＜被分析物結合部分構造−消光体＞
本発明の広い態様によれば、被分析物結合部分構造は、被分析物を結合でき、被分析物の結合量に関連する様式で蛍光色素体の見掛けの濃度（例えば、発光信号強度の変化として）を変調できる二重の機能性を少なくとも提供する。好ましい実施形態によれば、被分析物結合部分構造は消光体と会合している。「消光体」とは、それが存在していると蛍光色素体の発光が減少する化合物を言う。消光体（Ｑ）は離散している化合物または第２の離散している化合物または重合性化合物に転化可能な反応性中間体より選択されるか、またはＱは前記の反応性中間体または重合性化合物より調製されたポリマー中のペンダント基または鎖単位であり、そのポリマーは水に可溶性または分散性であるか不溶性ポリマーであり、前記ポリマーは架橋されていてもよい。
【００５７】
ある例において、その実施形態においてグルコース認識をもたらす部分構造は芳香族ボロン酸である。そのボロン酸は、共役窒素含有ヘテロ環芳香族ビスオニウム構造（例えば、ビオロゲン）に共有結合されている。「ビオロゲン」は、一般的に、２，２’−、３，３’−または４，４’−Ｎ，Ｎ’ビス−（ベンジル）ビピリジウムジハロゲン化合物（即ち、ジクロリド、ブロミドクロリド）などの窒素含有共役Ｎ−置換ヘテロ環芳香族ビスオニウム塩の基本構造を有する化合物を言う。また、ビオロゲンは置換されたフェナントロリン化合物も含む。ボロン酸で置換された消光体は、好ましくは、約４および９の間のｐＫａを有し、約６．８〜７．８のｐＨにおいて水性媒体中でグルコースと可逆的に反応し、ボロン酸エステルを形成する。反応の程度は媒体中のグルコース濃度に関連している。ボロン酸エステルが形成されるとビオロゲンによって蛍光色素体の消光が低下し、結果として、グルコース濃度に依存して蛍光が増加する。有用なビスオニウム塩は被分析物溶液に適合しており、検出されるべき被分析物の存在下において色素の蛍光発光における検出可能な変化を生成できる。
【００５８】
本発明の実施形態におけるビスオニウム塩は、共役ヘテロ環芳香族二窒素化合物より調製される。共役ヘテロ環芳香族二窒素化合物は、ジピリジル、ジピリジルエチレン、ジピリジルフェニレン、フェナントロリンおよびジアザフルオレンより選択され、ただし、窒素原子は異なる芳香環にあり、オニウム塩を形成できる。両方の窒素を置換できる前記共役ヘテロ環芳香族二窒素化合物の全ての異性体が本発明において有用であると理解される。ある実施形態において、消光体は、３，３’−ジピリジル、４，４’−ジピリジルおよび４，７−フェナントロリンより誘導されるビスオニウム塩の１つでよい。
【００５９】
実施形態によっては、ビオロゲン−ボロン酸付加体は約４００ダルトン以上の分子量を有する離散している化合物でよい。他の実施形態において、また、それは約１０，０００ダルトンを超える分子量を有する水溶性または水分散性ポリマーのペンダント基または鎖単位でもよい。ある実施形態において、消光体ポリマー単位は非共有的にポリマーマトリクスと会合していてもよく、そこに物理的に固定化されている。更にもう一つの実施形態において、消光体ポリマー単位は負に帯電した水溶性ポリマーとの複合体として固定化されていてもよい。
【００６０】
他の実施形態において、ビオロゲン−ボロン酸部分構造は、平衡が成立するために被分析物（例えば、グルコース）を十分に透過できる架橋された親水性ポリマーまたはヒドロゲルにおけるペンダント基または鎖単位でもよい。
【００６１】
他の実施形態において、消光体は第２の非水溶性ポリマーマトリクスＭ２に共有結合されていてもよく、それはＭ２−Ｌ２−Ｑなる構造で表すことができる。Ｌ２は、低級アルキレン（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン）、スルホンアミド、アミド、４級アンモニウム、ピリジニウム、エステル、エーテル、スルフィド、スルホン、フェニレン、ウレア、チオウレア、ウレタン、アミンおよびそれらの組合せより選択される結合体である。実施形態によっては、消光体が１箇所または２箇所でＭ２に結合されていてもよい。
【００６２】
重合体消光体前駆体に関してはボロン酸部分構造および反応性基をつなぐために可能な複数の選択肢があり、中心に位置するヘテロ芳香族基中の２個の異なる窒素に対して重合性基またはカップリング基でよい。これらは：
ａ）第１の芳香族部分構造上の反応性基が１個の窒素につながっており、少なくとも１個の−Ｂ（ＯＨ）２基を連結する第２の芳香族基が第２の窒素につながっている；
ｂ）１個以上のボロン酸基が１個の窒素につながっている第１の芳香族部分構造につながっており、１個のボロン酸および反応性基が第２の芳香族基が第２の窒素につながっている第２の芳香族基につながっている；
ｃ）１個のボロン酸基および反応性基が第１の芳香族基が１個の窒素につながっている第１の芳香族部分構造につながっており、ボロン酸基および反応性基が第２の窒素につながっている第２の芳香族部分構造につながっている；および
ｄ）１個のボロン酸がそれぞれの窒素につながっており、反応性基はヘテロ芳香族環につながっている。
【００６３】
好ましい実施形態は２個のボロン酸部分構造および１個の重合性基またはカップリング基を含み、ただし、芳香族基は窒素に結合されたベンジル置換基で、ボロン酸基はベンジル環につながっており、オルト、メタまたはパラ位でよい。
【００６４】
実施形態によっては、生体外検知のために有用な離散した化合物としてボロン酸で置換されたビオロゲンを、以下の式の１つで表すことができる：
【００６５】
【化１０】
0005517919.tif 000011
式中、ｎは１〜３であり、Ｘはハロゲンであり、Ｙ１およびＹ２は、独立に、フェニルボロン酸（ｏ、ｍまたはｐ異性体）およびナフチルボロン酸より選択される。他の実施形態においては、ビオロゲンのヘテロ環式環上の置換基としてボロン酸基を消光体が含んでもよい。
【００６６】
ＴＳＰＰと使用される特定の例はｍ−ＢＢＶである：
【００６７】
【化１１】
0005517919.tif 000012
センサーを作製するために適切な消光体前駆体を以下より選択できる：
【００６８】
【化１２】
0005517919.tif 000013
【００６９】
【化１３】
0005517919.tif 000014
本発明の好ましい態様によるヒドロゲルを作製するために、消光体前駆体である３，３’−ｏＢＢＶをＨＰＴＳ−ＬｙｓＭＡまたはＨＰＴＳ−ＣｙｓＭＡと使用できる。
【００７０】
好ましい消光体は、ベンジルボロン酸基で窒素上に置換され重合性基またはカップリング基によりジピリジル環上において他の位置で３，３’−ジピリジルより誘導されたビオロゲンを含む前駆体より調製される。代表的なビオロゲンとして、下が挙げられる：
【００７１】
【化１４】
0005517919.tif 000015
式中、ＬはＬ１またはＬ２で結合基であり、
Ｚは反応性基であり；および
Ｒ’はベンジル環上のオルト、メタまたはパラ位における−Ｂ（ＯＨ）２であり、Ｒ”はＨ−であり；またはＲ”は本明細書において定義される通りのカップリング基またはフルオロ−またはメトキシ−などのボロン酸の酸の程度を変えるために特に使用される置換基でもよく、
Ｌは、ポリマーまたはマトリクスにビオロゲンを結合するために使用される反応性基に検知部分構造を共有的に連結する２価の部分構造である。Ｌの例としては、直接結合または１〜８個の炭素原子を有する低級アルキレンよりそれぞれ独立に選択されるものが挙げられ、末端または途中がスルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、アミド−（Ｃ＝Ｏ）Ｎ−、エステル−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、エーテル−Ｏ−、スルフィド−Ｓ−、スルホン（−ＳＯ２−）、フェニレン−Ｃ６Ｈ４−、ウレタン−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−、ウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、チオウレア−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）−ＮＨ−、アミド−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−、アミン−ＮＲ−（式中、Ｒは１〜６個の炭素原子を有するアルキルと定義される）などより選択される１個以上の２価の連結基でもよい。
【００７２】
Ｚは、メタクリルアミド−、アクリルアミド−、メタクリロイル−、アクリロイル−またはスチリル−より選択されるが限定されず、重合性でエチレン的に不飽和の基であるか、または、Ｚはポリマーまたはマトリクスと共有結合を形成できる反応性官能基でもよいかのいずれかである。その様な基としては、限定することなく、−Ｂｒ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＮＨ２が挙げられる。
【００７３】
ボロン酸で置換されたポリビオロゲンは好ましい消光体のもう一つの類である。用語ポリビオロゲンとしては：結合基により共有結合された２個以上のビオロゲンを含んでなる離散した化合物、鎖中にビオロゲン繰り返し単位を含んでなるポリマー、鎖に対してビオロゲン基ペンダントを備えるポリマー、好ましくはビオロゲン末端基を含むビオロゲン単位を含んでなるデンドリマー、好ましくはビオロゲン終端基を含むビオロゲン単位を含んでなるオリゴマーおよびそれらの組み合わせが挙げられる。モノビオロゲン基が少量成分を構成するポリマーは含まれない。好ましい消光体は、センサーの一部として機能するためにグルコースを十分に透過でき、水溶性または分散性ポリマーまたは架橋された親水性ポリマーまたはヒドロゲルである。あるいは、ポリビオロゲンボロン酸を不活性な基体に直接結合することもできる。
【００７４】
ビオロゲン繰り返し単位を含んでなるポリマーとしてポリビオロゲン消光体は下の式を有する。
【００７５】
【化１５】
0005517919.tif 000016
もう一つの実施形態において、２個以上のビオロゲン／ボロン酸中間体を共有的に結合することでポリビオロゲンボロン酸付加体を形成する。架橋基は、典型的には、それぞれのビオロゲンにおいて１個の窒素またはそれぞれのビオロゲンの芳香族環における炭素に結合している小さな２価の基であるか、または、１個の結合は一方のビオロゲンにおける環の炭素および他方のビオロゲンにおける窒素にでもよい。２個以上のボロン酸基がポリビオロゲンにつながっている。ポリビオロゲンボロン酸付加体は、ビオロゲンまたは架橋基に直接つながっている重合性基またはカップリング基で置換されていてもよい。好ましくは、ポリビオロゲン部分構造は、そのような基を１個のみ含む。好ましくは、ボロン酸のグルコースへの協同的結合を高めるために架橋基を選択する。
【００７６】
結合基がボロン酸、重合性基、追加のカップリング基で更に置換されていてもよいか、または、ビオロゲンが鎖単位、ペンダント基またはそれらの任意の組み合わせであるポリマーにおける断片でもよいとの前提で、カップリング部分構造は先に定義された通りの結合基である。
【００７７】
＜固定化部材＞
実施形態によっては、移動流に関与せず生体外において使用するために、検知構成要素を個別の（離散した）部品として使用する。色素および消光体を液体溶液中で共に混合し、被分析物を加え、蛍光強度の変化を測定し、部品を破棄する。検知構成要素を捕捉し浸出を防ぐために使用できる重合体マトリクスは存在する必要はない。場合によっては、検知構成要素を固定化し、移動流中で被分析物を測定するために検知構成要素を使用できる。
【００７８】
生体内での用途のために、センサーを１種類以上のポリヒドロキシル有機化合物を含有する生理的流体の移動流中で使用するか、または、前記化合物を含有する筋肉などの組織中に埋め込む。従って、センサー組立品より検知部分構造が逃避しないことが好ましい。よって、生体内で使用するためには、検知構成要素が、好ましくは、有機ポリマー検知組立品の一部である。被分析物を通過させるが検知部分構造の通過は阻害する半透膜により、可溶性色素および消光体を閉じ込めることができる。これは、被分析物分子より実質的に大きい（被分析物の分子量の少なくとも２倍の分子量または１０００より大きく、好ましくは５０００より大きい）可溶性分子を検知部分構造として使用し；および、検知部分構造が定量的に保持されるように２つの間で特定の分子量分画を有する透析または限外濾過膜などの選択的半透膜を利用することで実現できる。
【００７９】
好ましくは、検知部分構造を、グルコースを自由に透過する不溶性ポリマーマトリクス中に固定する。ポリマーマトリクスは、有機、無機またはそれらのポリマーの組み合わせを含んでなる。マトリクスは、生体適合性材料から成っていてもよい。あるいは、マトリクスは、興味ある被分析物を透過する第２の生体適合性ポリマーで被覆されている。
【００８０】
ポリマーマトリクスの機能は、同時に被分析物との接触を可能とし被分析物をボロン酸に結合しながら、蛍光色素体および消光体部分構造を共に保持し固定化することである。この効果を達成するためには、マトリクスは媒体中で不溶でなければならず、マトリクスおよび被分析物溶液間の高度な表面領域界面を確立することにより、それと密に会合している。例えば、超薄膜または微細孔支持マトリクスを使用する。あるいは、マトリクスは被分析物溶液中で膨潤性であり、例えば、ヒドロゲルマトリクスを水性系用に使用する。幾つかの例において、検知ポリマーはライトコンジットの表面などの表面に結合されているか、または、微細孔膜中に含浸されている。全ての場合において、２相間で平衡を成立できるように結合部位への被分析物の輸送をマトリクスが妨げてはならない。超薄膜、微細孔ポリマー、微細孔ゾルゲルおよびヒドロゲルを調製する技術は当該技術で確立されている。全ての有用な材料は被分析物透過性として定義される。
【００８１】
実施形態によっては、ヒドロゲルポリマーを使用する。本明細書で使用される場合、ヒドロゲルとの用語は水中で実質的に膨潤するが溶解しないポリマーを言う。そのようなヒドロゲルは、直線状、分岐状または網状ポリマーでよく、または、高分子電解質複合体が可溶性または浸出性の画分を含まないとの条件で高分子電解質複合体でもよい。典型的には、ヒドロゲルのネットワークを、水溶性ポリマーが水性媒体中で膨潤するが溶解しないように水溶性ポリマー上で行う架橋工程によって調製する。あるいは、ヒドロゲルポリマーを親水性および架橋性モノマーの混合物を共重合することで調製し、水膨潤性の網状ポリマーを得る。そのようなポリマーを、付加または縮合重合、または組み合わせの工程のいずれかで形成する。これらの場合、ネットワークを形成するモノマーと組み合わせてモノマー性の誘導体を使用する共重合により、検知構造単位がポリマー中に組み込まれる。あるいは、後の重合反応を使用して、反応性部分構造を既に調製されたマトリクスにカップルする。前記検知部分構造はポリマー鎖中の単位または鎖につながっているペンダント基である。
【００８２】
また、本発明において有用なヒドロゲルは、色素および消光体の両者が共有結合された単一のネットワークなどの単一体ポリマー、または複数の構成要素のヒドロゲルである。複数の構成要素のヒドロゲルとしては、相互貫入ネットワーク、高分子電解質複合体および水膨潤複合体を得るための２種類以上のポリマーの各種の他の混合物が挙げられ、ヒドロゲルマトリクス中の第２のポリマーの分散体および交互ミクロ層集合体が挙げられる。
【００８３】
単一体ヒドロゲルは、典型的には、親水性モノマーの混合物をフリーラジカル共重合することで形成し、限定することなく、ＨＥＭＡ、ＰＥＧＭＡ、メタクリル酸、アクリル酸ヒドロキシエチル、Ｎ−ビニルピロリドン、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド；メタクリロイルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド、スルホプロピルメタクリル酸ナトリウムなどが挙げられるイオン性モノマー；エチレンジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ、トリメチロールプロパントリアクリレートなどが挙げられる架橋体などが挙げられる。当該技術においてよく確立されている原理を使用し、透過性、膨潤指数およびゲル強度が含まれるネットワーク特性を最適化するために、モノマーの比率を選択する。ある実施形態においては、８−アセトキシピレン−１，３，６−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリス（メタクリルアミドプロピルスルホンアミド）などの色素分子のエチレン的に不飽和な誘導体より色素部分構造を誘導し、ジハロゲン化４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（ベンジル−４エテニル）−ジピリジニウム（ｍ−ＳＢＢＶ）などのエチレン的に不飽和なビオロゲンより消光体部分構造を誘導し、ＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡよりマトリクスを作製する。発光強度を最適化するために、色素の濃度を選択する。所望の測定可能な信号を生成し十分な消光を与えるために、色素に対する消光体の比を調節する。
【００８４】
実施形態によっては、縮合重合により単一体ヒドロゲルを形成する。例えば、アセトキシピレントリススルホニルクロリドを過剰のＰＥＧジアミンと反応させ、未反応のジアミン中に溶解するトリス−（アミノＰＥＧ）付加体を得る。過剰のトリメソイルクロリドおよび酸受容体の溶液をジハロゲン化４−Ｎ−（ベンジル−３−ボロン酸）−４’−Ｎ’−（２ヒドロキシエチル）ビピリジニウムと反応させ、ビオロゲンの酸塩化物官能性エステルを得る。例えば、一方の混合物の薄膜をキャストし、それを他方に浸漬することで、２つの反応性混合物を互いに接触させ、反応させ、ヒドロゲルを形成する。
【００８５】
他の実施形態においては、色素が一方の構成要素に、および消光体がもう一方に組み込まれている複数の構成要素のヒドロゲルが本発明のセンサーを作製するために好ましい。更に、構成要素間の相互作用を増加し、他のポリヒドロキシ被分析物に対してグルコースの選択性を与えるために、これらの系は分子インプリントされていてもよい。好ましくは、多構成要素系は相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）または準相互貫入ポリマーネットワーク（準ＩＰＮ）である。
【００８６】
ＩＰＮポリマーは、典型的には、逐次重合で作製される。第１に、消光体を含むネットワークを形成する。次いで、色素モノマーを含むモノマー混合物でネットワークを膨潤し、第２の重合を行い、ＩＰＮヒドロゲルを得る。
【００８７】
色素部分構造を含有する可溶性ポリマーを消光体モノマーを含有するモノマー混合物中に溶解し、混合物を重合することで、準ＩＰＮヒドロゲルを形成する。実施形態によっては、ポリヒドロキシル化合物を自由に透過する不溶性のポリマーマトリクスで検知部分構造を固定化する。ヒドロゲル系に関する追加の詳細は米国特許出願公開第２００４／００２８６１２および２００６／００８３６８８号公報に開示されており、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８８】
ポリマーマトリクスは、有機、無機またはそれらのポリマーの組み合わせを含んでなる。マトリクスは、生体適合性材料から成っていてもよい。あるいは、マトリクスは、興味ある被分析物を透過する第２の生体適合性ポリマーで被覆されている。ポリマーマトリクスの機能は、同時に被分析物（例えば、ポリヒドロキシル化合物、Ｈ＋およびＯＨ−）との接触を可能としポリヒドロキシル化合物をボロン酸に結合しながら、蛍光色素および消光体部分構造を共に保持し固定化することである。従って、マトリクスは媒体中で不溶であり、マトリクスおよび被分析物溶液間の高度な表面領域界面を確立することにより、それと密に会合している。また、２相間で平衡を成立できるように結合部位への被分析物の輸送をマトリクスは妨げない。ある実施形態においては、超薄膜または微細孔支持マトリクスを使用してもよい。もう一つの実施形態においては、被分析物溶液中で膨潤可能なマトリクス（例えば、ヒドロゲルマトリクス）を水性系用に使用できる。実施形態によっては、検知ポリマーはライトコンジットの表面などの表面に結合されているか、または、微細孔膜中に含浸されている。超薄膜、微細孔ポリマー、微細孔ゾルゲルおよびヒドロゲルを調製する技術は先行技術で確立されている。
【００８９】
ある実施形態において、ボロン酸で置換されたビオロゲンは蛍光色素に共有結合されていてもよい。付加体は重合性化合物またはポリマーの単位でよい。そのような付加体の１つは、例えば、ベンジル−３−ボロン酸基を一方の窒素と、アミノエチル基を他方の窒素原子とつなげることにより、４，４’−ジピリジルより非対称なビオロゲンを先ず形成することで調製できる。引き続いて、１：１のモル比でビオロゲンを８−アセトキシ−ピレン−１，３，６−トリスルホニルクロリドと先ず縮合し、続いてプレポリマー混合物を得るために過剰のＰＥＧダイマーと反応させる。酸受容体が、副生成物の酸を除去するために両方の工程に含まれる。プレポリマー混合物をポリイソシアネートと反応させて架橋し、ヒドロゲルを得る。生成物を塩基で処理し、アセトキシ保護基を除去する。更なる使用の前に脱イオン水で完全に抽出することにより、不完全な反応生成物および未反応の出発物質をヒドロゲルから浸出させる。生成物は、本明細書に記述される通り、検知構成要素として使用する場合、グルコースに応答できる。
【００９０】
あるいは、そのような付加体は、エチレン的に不飽和なモノマー誘導体である。例えば、ジメチルビス−ブロモメチルベンゼンボロネートを過剰の４，４’−ジピリジルと反応し、半ビオロゲン付加体を形成する。過剰のジピリジルを除去後、付加体を更に過剰のブロモエチルアミンヒドロクロライドと反応し、ビス−ビオロゲン付加体を形成する。この付加体を酸受容体の存在下で１：１のモル比において８−アセトキシピレン−トリススルホニルクロリドと反応し、続いて、過剰のアミノプロピルメタクリルアミドと反応することにより、ピラニン色素にカップルする。最後に、任意の残留アミノ基をメタクリルクロリドと反応してもよい。精製後、色素／ビオロゲンモノマーをＨＥＭＡおよびＰＥＧＤＭＡと共重合でき、ヒドロゲルを得る。
【００９１】
＜レシオメトリックなｐＨ検知＞
レシオメトリックなｐＨ検知は既知である。例えば、米国特許出願公開第２００６／０１０５１７４；２００５／００９００１４号公報を参照；それらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。２種類の形態（酸型および塩基型）で存在する蛍光色素体（例えば、蛍光指示色素）を含む指示システムがあるとすると、蛍光色素体濃度に関係なくｐＨを測定するために、２つの波長における発光強度の比を使用できる。レシオメトリックなｐＨ検知に適する蛍光指示色素は：（１）二重励起波長（酸およびそれの共役塩基型に対応）および単一発光波長を示す色素（例えば、ＨＰＴＳ色素）；（２）単一励起波長および二重発光波長（酸および塩基型）；または（３）二重励起−二重発光色素でよい。ＳＮＡＲＦまたはＳＮＡＦＬ色素などの幾つかの色素は、二重発光および二重励起特性の両者を有することができる。しかしながら、二重−二重色素、例えば、ＳＮＡＲＦを単一−二重または二重−単一として使用できる。
【００９２】
セミナフトフルオレセインおよびカルボキシナフトフルオレセインを基礎とする二重発光ファイバー光学センサーにより、強度比がｐＨに迅速および信頼性高く相関されることが記載された。例えば、それぞれ、Ｘｕ、Ｚ．、Ａ．Ｒｏｌｌｉｎｓら（１９９８年）「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｐＨ  ｓｅｎｓｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｃａｒｂｏｘｙ  ＳＮＡＦＬ−２  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９巻：９〜１５頁、およびＳｏｎｇ、Ａ．、Ｓ．Ｐａｒｕｓら（１９９７年）「Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｐＨ  ｍｉｃｒｏｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｕａｌ−ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｙｅ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６９巻：８６３〜８６７頁を参照。これらの色素で観察される重度の光退色をレシオメトリックな扱いで説明できるが、センサーの有用な寿命は依然として制限されるであろう。
【００９３】
蛍光色素である８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホン酸トリナトリウム塩（ＨＰＴＳ）は３個のスルホン酸基および水酸基のピレン核からなり、約７．３のｐＫａ付近にｐＨ感受性を付与する。（Ｗｏｌｆｂｅｉｓ、Ｏ．Ｓ．、Ｅ．Ｆｕｅｒｌｉｎｇｅｒら（１９８３年）「Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｉ．Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｎｅａｒ  ｎｅｕｔｒａｌ（「ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ」）ｐＨ  ｖａｌｕｅｓ」Ｆｒｅｓｎｅｉｕｓ’Ｚ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３１４巻（２号）：１１９〜１２４頁）；また、Ｗｏｌｆｂｅｉｓらは固定化ＨＰＴＳに関する幾つかの特許を有している。ＹａｆｕｓｏおよびＨｕｉは、米国特許第４，８８６，３３８号明細書において、もう一つの固定化蛍光色素ｐＨセンサーを記載している；それに参照することで、それの全体が本明細書に組み込まれる。ＨＰＴＳは２つの励起波長を示し、１つは４０５ｎｍにおいてであり１つは４５７ｎｍであり、酸およびそれの共役塩基に対応している（Ａｇａｙｎ、Ｖ．Ｉ．およびＤｒ．Ｒ．Ｗａｌｔ（１９９３年）「Ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐＨ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７２巻（６号）：６〜９頁）。ｐＫａ約７．３の最大励起が引き続いてｐＨに依存してシフトするため、生理学的範囲において、二重励起／単一発光のレシオメトリックな検出が可能となる。このため、毒性が低いこと（Ｌｕｔｔｙ、Ｇ．Ａ．（１９７８年）「Ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｔａｉｎｓ，  ｄｙｅｓ，  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ」Ｔｏｘｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４巻：２２５〜２２９頁）および酸素濃度に対して感受性がないこと（Ｚｈｕｊｕｎ、Ｚ．およびＷ．Ｒ．Ｓｅｉｔｚ（１９８４年）「Ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐＨ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｎｇｅ  ｆｒｏｍ  ６．５  ｔｏ  ８．５」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  １６０巻：４７〜５５頁）とも併せて、ＨＰＴＳは生理学的および生物学的工程でのｐＨ測定に適切なプローブである。
【００９４】
３個の強力なアニオン性スルホン酸基が存在するため、ＨＰＴＳをイオン結合によりカチオン性支持体に固定化できる。これまでは、スルホンアミドを介してＨＰＴＳの共役結合がカップリングされてきた（米国特許第４，７９８，７３８号明細書）。色素を効果的に固定しｐＨ感受性が保たれる一方で、ポリマー基体は１級アミンを含有するものに限定される。加えて、カップリング後に基体に残存するアミン基がポリマーマトリクス内部の局所的なｐＨに影響するであろう。中性および酸性環境下で動作し蛍光を基礎とするｐＨセンサー、ならびにｐＨおよびｐＣＯ２の両者を検出するために使用された血管内血液ガス監視システム（Ｇｅｈｒｉｃｈ、Ｊ．Ｌ．、Ｄ．Ｗ．Ｌｕｂｂｅｒｓら（１９８６年）「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｇａｓ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ」ＩＥＥ  ＴＢｉｏ−ｍｅｄ  Ｅｎｇ  ＢＭＥ−３３巻：１１７〜１３２頁）の開発において、色素は制御細孔ガラス（Ｏｆｆｅｎｂａｃｈｅｒ、Ｈ．、Ｏ．Ｓ．Ｗｏｌｆｂｅｉｓら（１９８６年）「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅａｒ−ｎｅｕｔｒａｌ  ｐＨ  ｖａｌｕｅｓ」Ｓｅｎｓｏｒ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  ９巻：７３〜８４頁）およびアミノエチルセルロース（Ｓｃｈｕｌｍａｎ、Ｓ．Ｇ．、Ｓ．Ｃｈｅｎら（１９９５年）「Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  １−ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｅｎｅ−３，６，８−ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ  ｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐＨ：ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｐＨ  ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒ」Ａｎａｌ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ３０４巻：１６５〜１７０頁）に共有的につながれてきた。アニオン交換膜（Ｚｈｕｊｕｎ、Ｚ．およびＷ．Ｒ．Ｓｅｉｔｚ（１９８４年））または樹脂（Ｚｈａｎｇ、Ｓ．、Ｓ．Ｔａｎａｋａら（１９９５年）「Ｆｉｂｒｅ−ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐＨ  ｖａｌｕｅｓ」Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｇ  Ｃｏｍｐｕｔ  ３３巻：１５２〜１５６頁）に結合されたＨＰＴＳにより、光ファイバーｐＨセンサーが記載され、光ファイバーのチップに固定されてきた。
【００９５】
例えば、米国特許第５，１１４，６７６号明細書（本明細書で参照することにより、その全体が組み込まれる）は蛍光指示体によるｐＨセンサーを提供しており、粒子または微結晶セルロースファイバーに共有的につなぐことができる。そのセンサーは、光学的に透明な基体、熱可塑性層およびヒドロゲルを具備する。指示体がつなげられている粒子の一部は、基体上に被覆され熱および圧力を使用して機械的に接着される熱可塑性層中に埋め込まれている。粒子／指示体の大部分は、熱可塑性層上に塗工されているヒドロゲル層に埋め込まれている。ｐＨセンサーは光導波路のチップに設置されている。
【００９６】
更に、最近、低コストのＵＶ  ＬＥＤが入手可能となり、ＵＶおよび青色ＬＥＤおよび光ダイオードモジュールを組み合わせた比較的安価な装置で色素を測定できる。発酵媒体に直接溶解されたＨＰＴＳを介して高処理能力ミクロ生物反応器システムのｐＨを検出するために、そのような装置一式が記載された（Ｋｏｓｔｏｖ、Ｙ．、Ｐ．Ｈａｒｍｓら（２００１年）「Ｌｏｗ−ｃｏｓｔ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７２巻：３４６〜３５２頁）。
【００９７】
本発明のある実施形態において、好ましい検知装置は、少なくとも１個の光源、検出器および蛍光報告色素システムを具備するセンサーを具備する。ある実施形態において、蛍光報告色素システムは、被分析物結合消光体に動作可能にカップルしている蛍光色素を具備する。色素は消光体に共有結合していても、消光体と単に会合しているだけでもよい。色素および消光体は、好ましくは、動作可能にカップルされており、それは、動作の際には消光体が色素と反応し、色素の蛍光を変調するに十分に色素の近傍にあることを意味する。ある実施形態において、色素および消光体が被分析物透過性ヒドロゲルまたは他の重合体マトリクス中に共に束縛されていてもよい。適切な波長の光で励起された場合、蛍光色素は光を発する（例えば、蛍光）。光の強度は消光の程度に依存し、被分析物の結合量によって変化する。他の実施形態において、蛍光色素および消光体は、お互いの代わりにヒドロゲルまたは他の重合体マトリクスに共有的につながっていてもよい。
【００９８】
ある実施形態においては、２種類の色素システムがセンサーにおいて共に固定化（例えば、ヒドロゲル）されるように、別個のｐＨ指示体色素が、被分析物結合部分構造で機能化されている異なる色素と組み合わされている。
【００９９】
幾つかの蛍光ｐＨ指示体分子は特定の波長で光を吸収し、第２のより長い波長で光を発する。それらがｐＨを指示する機能には、典型的には、プロトン化および脱プロトン化が関与する。このことは、これらの蛍光ｐＨ指示体が水素原子（プロトン、Ｈ＋）を含み、一方のｐＨ範囲において分子の一部を形成（分子に結合）しているが、もう一つのｐＨ範囲において、プロトンは分子より解離していることを意味する。プロトンが分子より解離している場合、分子は負に帯電しており、指示体の溶液において正に帯電しているイオン（例えば、Ｎａ＋）によりバランスされている。この配置を式１
【０１００】
【化１６】
0005517919.tif 000017
で図解する。
【０１０１】
式中、Ｒは蛍光分子を表し、蛍光分子がＲ−Ｈ型であるかＲ−型であるかに基づき、一般に、蛍光分子は異なる波長において蛍光を示すであろう（非常に異なった色として可視であろう）。Ｒで表される殆どの分子において、この変化は非常に狭いｐＨ範囲において一般に極めて急激に生じ、Ｒは非常に単純および信頼性の高いｐＨ指示体として機能できる。溶液中にある場合、蛍光分子は一方で非常に特徴的な色（蛍光分子のＲ−Ｈ型に伴う色）を、もう一方で、蛍光分子のＲ−に伴う特徴的な色を示す。
【０１０２】
例えば、８−ヒドロキシル−１，３，６−ピレントリスルホネート（ＨＰＴＳ）は、その優れた光安定性、高い量子収率、二重励起、大きなストークスシフトおよび長い蛍光発光のため、ｐＨを決定するための最も見込みがある指示体だと考えられてきた。この指示体の望ましい特徴は、酸性（会合したＨＰＴＳ型）および塩基性（解離したＰＴＳ−）型が４０６および４６０ｎｍにおいて異なる励起波長を有し、４１８ｎｍにおいて等吸収点であるが、５１５ｎｍにおいて同様の蛍光発光最大を示すことである。二重励起および単一発光のため、ＨＰＴＳはｐＨのレシオメトリックな検出に適切である。ｐＨを上昇させると色素の酸性から塩基性型への転化を伴い、酸型による４０６ｎｍにおける蛍光強度は減少するが、塩基型による４６０ｎｍにおける強度は増加する。
【０１０３】
ＨＰＴＳおよびそれの誘導体などの色素上の水酸（−ＯＨ）基のため、これらの色素は環境におけるｐＨの変化に感受性である。ｐＨに依存して水酸基がイオン化されることで、これらのピラニン誘導体は、色素の酸性型および塩基性型における異なる吸収最大のｐＨに依存した吸収スペクトルを有することとなる。第１の吸収最大が第１の励起波長であり、第２の吸収最大が第２の励起波長である。第１の励起波長および第２の励起波長において蛍光色素により吸収される光量は、蛍光色素が接触している媒体のｐＨに依存するか関連する。励起波長を色素に照射した時に発光波長において色素より発せられる光（例えば、蛍光発光）の量は、光吸収の量に依存する。吸収は媒体のｐＨに影響されるため、蛍光発光もｐＨに影響される。このことが、ポリヒドロキシル化合物濃度を測定できると同時にｐＨを決定するための基礎を与える。
【０１０４】
本発明のある好ましい実施形態においては、光ファイバーの末端領域の近位へ動作可能にカップルされた少なくとも１個の励起光源を具備する光学的センサーを使用してレシオメトリックなｐＨの検知を達成し、ただし、ファイバーはファイバーの光路においてファイバーの末梢末端領域に沿って配置されており、指示体システムは励起光に応答して検出可能な発光信号を生成するよう構成されている。センサーの好ましい実施形態は、発光信号を検出器に送る光学的部材を更に具備する。そのような光学的部材は当該技術でよく知られており、例えば、光を返送する鏡、フィルター、レンズ、ビームスプリッターおよび光ファイバーの束および分割構造に関わるものでよい。
【０１０５】
好ましい実施形態において、指示体システムは、少なくとも２種類の異なる形態およびこれらの異なる形態間のｐＨに依存するシフトを示す蛍光色素体を具備し、ただし、このシフトは、単一の波長または２つの異なる波長における発光強度の変化として検出できる。例えば、レシオメトリックなｐＨの検知のための１つの指示体システムは蛍光色素（例えば、ＨＰＴＳ）を具備し、それは、色素がそれの酸または塩基型であるかに依存して２つの異なる波長最大（λ酸およびλ塩基）において光を吸収し、色素は単一のより長い発光波長で光を発する。より特には、ｐＨが増加すると、ＨＰＴＳはλ塩基に対応する吸収の増加およびλ酸に対応する吸収の減少を示す。これらの変化は水酸基のｐＨに依存したイオン化による。ＨＰＴＳの発光スペクトルはｐＨに依存せず、約５１１ｎｍのピーク発光波長であるが、発せられた光の強度は吸収された光量に依存する（ｐＨおよび励起波長によって変化する）。そのため、例えば、ある与えられたｐＨにおいて第１の波長（例えば、λ酸）の光でＨＰＴＳを励起すると、単一の発光波長で発光強度を測定できるが；強度は色素の形式に依存するであろう（即ち、イオン化の程度でｐＨに依存する）。また、第２の波長（例えば、λ塩基）でも励起でき、同一の与えられたｐＨにおいて発光強度を測定できる。発光強度の比はｐＨと関連し、色素の量ならびにシステムにおける特定の光学的加工に依存しない。レシオメトリック検知のためには任意の励起波長を使用できるが、本発明のある実施形態によればλ酸およびλ塩基が好ましい。色素の酸および塩基型で吸収が同一である波長を等吸収点と呼び、本発明の他の好ましい変形によれば、この波長（λ等吸収点）における励起もレシオメトリック検知で使用できる。発光強度の比（例えば、Ｉ塩基／Ｉ等吸収点またはＩ塩基／Ｉ酸）をｐＨに対してプロットすると、標準または較正曲線が生成される（例えば、図３、５および９を参照）。スペクトル特性において検出可能な変化を生じる形式でｐＨ感受性シフトを色素が受ける限り、レシオメトリックな方法は、同様に、使用される色素が二重励起体−単一発光体（ＨＰＴＳなど）または単一励起体−二重発光体または二重励起体−二重発光体のいずれであるかには関係ない。
【０１０６】
＜光学的グルコース検知＞
ＨＰＴＳおよびその誘導体を含む蛍光色素を具備する指示体システムは、被分析物の検出において使用されてきた。例えば、米国特許第６，６５３，１４１、６，６２７，１７７、５，５１２，２４６、５，１３７，８３３、６，８００，４５１、６，７９４，１９５、６，８０４，５４４、６，００２，９５４、６，３１９，５４０、６，７６６，１８３、５，５０３，７７０および５，７６３，２３８号明細書；および同時係属中の米国特許出願公開第１１／２９６，８９８および６０／８３３，０８１号公報を参照；それぞれが、それを参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。特に、幾つかの好ましい蛍光色素、消光体／被分析物結合部分構造、およびポリヒドロキシル化合物濃度を光学的に決定する方法に関する詳細が、米国特許第６，６５３，１４１および６，６２７，１７７号明細書、および米国特許出願公開第１１／２９６，８９８および６０／８３３，０８１号公報で開示されている。
【０１０７】
＜ｐＨおよびグルコースを血管内で決定する装置＞
ある実施形態において、方法およびセンサーは生体外において媒体のｐＨおよび被分析物の濃度を監視する。もう一つの実施形態において、方法およびセンサーは生体内において媒体のｐＨおよび被分析物の濃度を監視する。また、もう一つの実施形態においては、生体外または生体内においてグルコース濃度をより正確に決定するためにも、測定されたｐＨ値を使用できる。具体的には、ｐＨ値およびグルコース濃度を同時に測定することで、グルコース応答の信号を即時に修正できるようになるであろう。しかしながら、実施形態によっては、ｐＨまたは被分析物を決定するためのみ（従来の２つのセンサー技術によるか、または生体外で血液ｐＨを試験することでｐＨの修正を行える）に使用できるセンサーを装置は具備することが分かる。
【０１０８】
ある実施形態は、ｐＨおよびポリヒドロキシル化合物の濃度を同時に決定するためで、消光体に動作可能にカップルされている蛍光色素と；前記センサーに１つ以上の励起波長を送達するための部材と；前記センサーからの蛍光発光を検出するための部材とを具備するセンサーを具備する装置を提供する。
【０１０９】
もう一つの実施形態は、生理学的流体においてｐＨおよびポリヒドロキシル化合物濃度を決定するためで、非水溶性のポリマーマトリクスと、ただし、前記ポリマーマトリクスはポリヒドロキシル化合物を透過でき；前記ポリマーマトリクスと会合している蛍光色素と、ただし、蛍光色素は第１の励起波長および第２の励起波長において光を吸収し、発光波長において光を発するように構成されており；ポリヒドロキシル化合物濃度に依存してポリヒドロキシル化合物の量に可逆的に結合するよう適合され、芳香族ボロン酸で置換されたビオロゲンを含む消光体と、ただし、前記消光体は前記ポリマーマトリクスと会合しており、蛍光色素に動作可能にカップルされており、ただし、前記消光体は結合しているポリヒドロキシル化合物の量に関連して前記蛍光色素が発する光強度を減少させるよう構成されており；少なくとも１個の励起光源と；励起光検出器とを具備する装置を提供する。
【０１１０】
ある態様において、本発明は、生理学的ｐＨにおいてか近傍で水性媒体中のグルコースなどのポリヒドロキシル化合物の存在に応答する種類の蛍光消光化合物を含む。換言すれば、媒体中のこれらの化合物の濃度によって消光効率を制御する。好ましい消光体は少なくとも１個のボロン酸基で置換されたビオロゲンを含み、ただし、その付加体はポリマー中に固定化されているか共有結合されている。また、消光体、色素およびポリマーも、それぞれ互いに共有結合されていてもよい。他の態様において、本発明は、ビオロゲン／ボロン酸付加体による消光に感受性を有する種類の蛍光色素を含む。
【０１１１】
ポリヒドロキシル化合物を検知するために、蛍光色素および消光体は、それぞれ互いに動作可能にカップルされている。実施形態によっては、色素および消光体がポリマー骨格を介して結合されていてもよい。他の実施形態においては、蛍光色素の消光が起こり、よって色素の蛍光発光が減少するために、色素および消光体がそれぞれ互いに近傍にあることもできる。ポリヒドロキシル化合物（例えば、グルコース）がボロン酸に結合してボロン酸エステルを形成している場合、ボロン酸エステルはビオロゲンと相互作用し、ポリヒドロキシル化合物の結合の程度に従って、その消光効率が変化する。結果として、より多くのポリヒドロキシル化合物が消光体に結合するほど、蛍光発光の強度が増加する。
【０１１２】
ある好ましい実施形態において、そこに配置された空洞を具備し、上記の通り（例えば、グルコース結合部分構造／消光体および固定化ポリマーマトリクスに動作可能にカップルされた蛍光色素体）その空洞に指示体システムが固定化された光ファイバーを装置は具備する。装置は、光源および検出器を更に具備する。
【０１１３】
＜ｐＨおよびグルコースを同時に決定する方法＞
ある実施形態は１種類の蛍光色素によりｐＨおよびポリヒドロキシル化合物濃度を決定する方法を提供し、その方法は、消光体に動作可能にカップルされている蛍光色素を具備するセンサーを提供し；前記センサーを試料と接触させ；第１の励起波長において前記センサーを照射し；発光波長における前記センサーの第１の蛍光発光を検出し；第２の励起波長において前記センサーを照射し；前記発光波長における前記センサーの第２の蛍光発光を測定し；第１および第２の発光比をｐＨ較正曲線と比較して試料のｐＨを決定し；既知となったｐＨにおいて標準曲線より発光消光を相関して前記試料中のポリヒドロキシル化合物濃度を決定することを含む。当然、ｐＨをレシオメトリックに検知するための他のアルゴリズムも既知であり、本発明の実施形態によって使用できる。実施形態によっては、動作を制御するためにコンピューターまたは専用装置などの制御器も使用でき、励起光の印加、検出器信号の監視、比の決定、較正曲線による比の相関、標準曲線によるグルコース信号の相関、ｐＨ変化のための修正、所定のセンサー較正動作の作動、操作動作の指示、精度を保つためにプログラムされた通りの利用者のデータ入力の統合（例えば、指先穿刺グルコース測定）などが挙げられる。
【０１１４】
図１に関して、本発明のある実施形態によれば、センサー装置１００は、少なくとも１個の光源１１（例えば、励起光源）、検出器１５（例えば、発光検出器）、および消光体に動作可能にカップルされた蛍光色素および任意成分としてポリマーマトリクスを具備するセンサー１３を具備する。実施形態によっては、光源１１は蛍光色素を励起するために２つ以上の異なる波長を選択的に送達するよう適合されていてもよい。このタイプの光源は調節可能な光源でもよい。他の実施形態において、波長を減衰するために光学フィルター１２と併用して１個以上の光源を使用できる。他の実施形態において、異なる励起波長を送達するために１個より多い光源１１を使用できる。また、その様な光源は、第１および第２の励起波長をセンサーに送達するための部材でもある。
【０１１５】
色素が消光体に動作可能にカップルされている場合、センサー１３は媒体のｐＨおよびポリヒドロキシル化合物（例えば、糖またはグルコース）濃度の両者に感受性である蛍光色素を具備する。その様な蛍光色素は、蛍光色素の局所的な環境のｐＨにおける対応するシフトと共に励起波長最大におけるシフトを示す。局所的な環境のｐＨが変化すると、第１の励起波長における吸収が増加される一方で、第２の励起波長における吸収が減少し、逆もそうである。選択された波長における吸収の変化は蛍光発光のレベルに影響することができ、従って、最終的にｐＨを検出できる。ｐＨの検出は環境中のポリヒドロキシル化合物の濃度には依存しない。また、適切な蛍光色素はビオロゲンなどの分子による消光にも感受性を有する。蛍光色素が消光体（例えば、ビオロゲン）に動作可能にカップルされている場合、蛍光発光が減衰する。消光体は、グルコースを認識できる芳香族ボロン酸部分構造を有していてもよい。ボロン酸は水性媒体中でグルコースと可逆的に反応し、ボロン酸エステルを形成し、その様な反応の程度は媒体中のグルコース濃度に関連している。より多くのグルコースが消光体と反応できるようになると、消光体が色素より電子を受容する能力が低下する。結果として、消光体による蛍光発光の減衰は、検出されるべきポリヒドロキシル化合物（例えば、グルコース）の濃度に依存する。
【０１１６】
蛍光発光を検出するために検出器１５を使用し、好ましい実施形態において、分析のための電子制御２０につなげてもよい。波長を選択するために、光フィルター、例えば、１４をセンサー１３および検出器１５の間に配置できる。他の光学的部品も利用でき、例えば、鏡、光軸調整および／または焦点レンズ、ビームスプリッターなどである。選択された波長をセンサーに送達し、センサーからの蛍光発光を検出器に送達するために、光ファイバーを使用できる。光源および検出器を、コンピューターなどの電子制御２０で制御できる。
【０１１７】
本発明のある実施形態は、単一の蛍光色素でｐＨおよびポリヒドロキシル化合物濃度を測定する方法を提供する。測定は生体外または生体内で行える。最初の測定を行う前にセンサーを較正する必要があることがある。このことは、初めに種々のｐＨにおいてセンサーの吸収スペクトルを取得し、等吸収点および酸および塩基型の吸収最大が生じる波長を決定し、次いで少なくとも１つの既知のｐＨおよびグルコース濃度において少なくとも２つのこれらの波長からの発光信号を取得することで行える。
【０１１８】
ｐＨおよびポリヒドロキシル濃度を測定するために、最初にセンサー１３を試料と接触するよう配置する。次いでセンサー１３を第１の励起波長、続いて第２の励起波長で照射する。第１および第２の励起波長は、典型的には、蛍光色素の酸性型における吸収最大の波長（λ酸）、蛍光色素の塩基性型における吸収最大の波長（λ塩基）、等吸収点の波長（λ等吸収点）または他に選択された波長の近傍に選択される。第１および第２の励起波長からの発光比を使用して、試料のｐＨを決定する。ｐＨが修正されれば、第１または第２の発光のいずれかを使用して、試料のグルコース濃度を決定できる。
【０１１９】
図１に示される検知装置の変形において、検出器は標準的な光ダイオード検出器でよい。２個のダイオード検出器があってもよく、１つは参照用であり、１つは発光信号用である。ダイオード検出器の代わりに、センサーの出力（蛍光発光および／または反射された励起光）を輸送する光ファイバーが、分光光度計または微小分光計に入力を直接提供してもよい。好ましい実施形態において、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社によって製造されたＵＶ／ＶＩＳ  Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅなどの微小分光計を検出器は具備する。
【０１２０】
図２は、本発明の好ましい態様により使用できる光学システムのある実施形態を示す。図２を参照すれば、ある実施形態は少なくとも２個の光源３０１Ａおよび３０１Ｂを具備する。光源は、コリメータレンズ３０２Ａおよび３０２Ｂを介して伝送できる（図解される通り）励起光を生じる。ある実施形態においては、コリメータレンズより結果として生じる光を干渉フィルター３０３Ａおよび３０３Ｂに伝送できる（図解される通り）。ある実施形態においては、焦点レンズ３０４Ａおよび３０４Ｂによって、干渉フィルターより結果として生じる光の焦点を光ファイバー線３０５Ａおよび３０５Ｂに合わすことができる（図解される通り）。ある実施形態においては、光ファイバー線を、埋め込み指示体システム３０７Ａを有するセンサー３０７に接続する単一のファイバー３０６に統合する。ファイバーの横断面は、中心の光ファイバー３０６Ａを囲むファイバーの束から単一のファイバー３０７Ａまで（図解される通り）変えることができる。
【０１２１】
ある実施形態においては（図解される通り）、指示体システム３０７Ａにより生成される発光信号ならびに励起光信号は鏡３０８で反射され、センサー外で送出線３０９および３０９Ａに戻されて伝送される。図解されるシステムにおいて、送出線は、２個の干渉フィルター３１２Ａ、３１２Ｂおよび２個の検出器３１３Ａ、３１３Ｂを含むことで増強されている。好ましい実施形態において、干渉フィルター３１２Ａは励起光を遮断し、発光が検出される検出器３１３Ａに発光を通過させるように構成されている。ある実施形態において、検出器３１３Ａで生成された信号は増幅器３１４Ａで増幅され、アナログからデジタルへの変換器３１５Ａでデジタル信号に変換され、コンピューター３１６に伝送される。ある実施形態において、干渉フィルター３１２Ｂは発光を遮断し、励起光を測定する検出器３１３Ｂに励起光を通過させるように構成されている。ある実施形態において、検出器３１３Ｂで生成された信号は増幅器３１４Ｂで増幅され、アナログからデジタルへの変換器３１５Ｂでデジタル信号に変換され、コンピューター３１６に伝送される。発光強度に影響するグルコースに関係ない要因を実質的に除去または減少するためにレシオメトリックな計算を使用でき；これらの方法は、「Ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ  ｓｅｎｓｏｒｓ」と題し、本明細書と同日で出願され、同時係属中の米国特許仮出願第６０／８８８，４７７号で詳細に開示されており、本明細書へ参照することで、その全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１２２】
＜例１＞
図３は蛍光色素の励起／吸収スペクトルの例を示し、この場合、ＨＰＴＳである。異なるｐＨにおいて取得された蛍光色素の吸収スペクトルより、λ酸、λ塩基およびλ等吸収点を決定できる。より低いｐＨ（例えば、より酸性な条件）において４０５ｎｍ近傍におけるピークは４６０ｎｍ近傍におけるピークより高く、従って、蛍光色素の酸性型による吸収最大である。より高いｐＨ（例えば、より塩基性な条件）において４６０ｎｍ近傍におけるピークは４０５ｎｍ近傍におけるピークより高く、従って、蛍光色素の塩基性型による吸収最大である。λ等吸収点は吸収がｐＨに依存しない波長であり、例えば、ＨＰＴＳの場合、４２２ｎｍ近傍となる。
【０１２３】
次いで、第１の励起波長（例えば、λ酸、λ塩基またはλ等吸収点）における照射の結果生じる発光波長における第１の蛍光発光強度（Ｉｘで、Ｉ酸、Ｉ塩基またはＩ等吸収点でよい）を検出器で測定し、結果を電子的制御で貯える。次いで、第２の励起波長においてセンサーを再び照射する。第２の励起波長は第１の励起波長とは異なり、また、λ酸、λ塩基またはλ等吸収点より選択できる。次いで、第２の励起波長（例えば、λ酸、λ塩基またはλ等吸収点）における照射の結果生じる第２の蛍光発光強度（Ｉｙで、Ｉ酸、Ｉ塩基またはＩ等吸収点でよい）を検出器が検出／測定する。次いで、第１および第２の蛍光発光の比（Ｉｘ／Ｉｙ）を計算できる。Ｉｘ／Ｉｙはポリヒドロキシル濃度には依存しないため、ポリヒドロキシル濃度の効果を考慮せずｐＨ標準曲線（Ｉｘ／Ｉｙ対ｐＨ）をプロットできる。
【０１２４】
＜例２（ＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４）＞
図４は、ＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４を使用し、Ｉ（塩基）／Ｉ（等吸収点）比を使用して、グルコース濃度に依存しないレシオメトリックなｐＨ検知を示す。ＭＡＢＰ４の構造は下である：
【０１２５】
【化１７】
0005517919.tif 000018
種々のグルコース濃度において４５４ｎｍ（塩基）および４２２ｎｍ（等吸収点）における励起に対応する蛍光発光の比としてｐＨに対してデータをプロットする。それぞれ特定のｐＨにおいて、グルコース濃度の変化はＩ塩基／Ｉ等吸収点の値に認識できる効果を有していない。よって、試料中のポリヒドロキシル化合物濃度に関係なく、ｐＨに対するＩｘ／Ｉｙの標準曲線を使用して試料のｐＨを測定できる。測定されたＩｘ／Ｉｙを標準曲線に相関または比較することで、測定される試料のｐＨを決定できる。
【０１２６】
図５は、異なるｐＨにおいて４２２ｎｍ（等吸収点）で励起されたＨＰＴＳ／ＭＡＢＰ４に関するグルコース応答曲線を示す。種々のグルコースレベルにおけるＩｘ／Ｉｙ（Ｉ）のグルコース濃度が０のＩｘ／Ｉｙ（Ｉ０）に対する比をグルコース濃度に対してプロットすることにより、標準ポリヒドロキシル応答曲線を使用して、測定されたＩ／Ｉ０の値より試料中のグルコース濃度を決定できる。しかしながら、Ｉ／Ｉ０値は試料のｐＨには依存しないため、異なるｐＨによって標準グルコース応答曲線が影響を受け得る。これを回避するため、生理学的な範囲内の異なるｐＨにおいて幾つかの標準グルコース応答曲線をプロットでき、センサー装置の電子制御または操作のいずれかで選択できるようにする。試料のＩｘ／Ｉｙ測定が可能な場合、ｐＨに対する標準Ｉｘ／Ｉｙ曲線より電子制御または操作で試料のｐＨを知り、正確なグルコース濃度を決定するために修正された標準ポリヒドロキシル応答曲線（例えば、グルコース応答曲線）を使用できる。図中に示した例はグルコース濃度の決定に関わるものであるが、本発明の方法および装置の用途はグルコース濃度の検出に限定されない。蛍光システムはグルコースに応答するのと同一の様式でポリヒドロキシル化合物に応答するため、任意のポリヒドロキシル化合物濃度およびｐＨを同時に検出するために、センサー装置を使用できる。
【０１２７】
＜例３（ＳＮＡＲＦ−１）＞
図６は、溶液中における異なるｐＨでのＳＮＡＲＦ−１の吸収スペクトルを示す。ＳＮＡＲＦは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製の商業的なクラスの色素に対する商標である。これらの実験は、ＳＮＡＲＦ−１を使用して行った。図７および８は、５１４ｎｍ励起／５８７ｎｍ発光（図７）において、または５１４ｎｍ励起／６２５ｎｍ発光（図８）において決定された異なるｐＨにおける溶液中のＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶに関するグルコース応答曲線を示す。図９は、５１４ｎｍの単一励起波長および５８７および６２５ｎｍの発光波長において決定されたＩ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用し、溶液中のＳＮＡＲＦ−１／３，３’−ｏＢＢＶで異なるグルコース濃度におけるｐＨのレシオメトリックな検知を示す。よって、消光体３，３’−ｏＢＢＶに動作可能にカップルされた二重−二重色素ＳＮＡＲＦ−１（溶液中）を単一励起体−二重発光体蛍光色素体として使用でき、ｐＨをレシオメトリックにおよびグルコースの両方を決定する。
【０１２８】
＜例４（ＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡ）＞
図１０は、異なるｐＨにおいてＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡ指示体システムのグルコース応答を示す。図１１は、Ｉ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用し、ＨＰＴＳ−トリＬｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＡＡ指示体システムで異なるグルコース濃度におけるｐＨのレシオメトリックな検知を示す。この指示体システムは生理学的なｐＨ範囲にわたって線形なｐＨ曲線を与えることが見て取れる。
【０１２９】
＜例５（ＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＭＡ）＞
図１２は、Ｉ（塩基）／Ｉ（酸）比を使用し、ＨＰＴＳ−トリＣｙｓＭＡ／３，３’−ｏＢＢＶ／ＤＭＭＡ指示体システムで異なるグルコース濃度におけるｐＨのレシオメトリックな検知を示す。この指示体システムは生理学的なｐＨ範囲にわたって線形なｐＨ曲線を与えることが見て取れる。この例の場合、光ファイバーの末端に埋め込まれたヒドロゲル中に指示体システムを固定した。携帯用検出器を使用し、酸および塩基発光信号を測定した。
【０１３０】
＜寿命化学＞
もう一つの好ましい実施形態においては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の現象を活用することでグルコース濃度を決定できる。ＦＲＥＴは供与体蛍光色素体から受容体分子へのエネルギーの移動である。受容体分子により少なくとも部分的に吸収される波長において供与体蛍光色素体が蛍光を発し、分子の相互作用を介して供与体蛍光色素体がエネルギーを受容体に移動できるように供与体蛍光色素体が受容体の近傍にある場合、ＦＲＥＴが生じる。蛍光寿命とは蛍光色素体が励起状態であり続ける時間であり、ＦＲＥＴにより蛍光色素体の蛍光寿命は変化する。よって、蛍光色素体の蛍光寿命を測定することで、蛍光色素体が受容体に結合しているかを決定できる。
【０１３１】
励起光の短いパルスで蛍光色素体が励起され、ある時間の間、蛍光強度を測定する時間領域法を使用して寿命を測定できる。励起パルスは、ピコ秒の範囲の継続時間から約数ナノ秒の継続時間までのレーザーからのパルスでよい。他の実施形態においては、パルスの継続時間が約数ナノ秒より長くてもよい。蛍光色素体の蛍光強度は、時間の関数として下の式で与えられる：
【０１３２】
【数１】
0005517919.tif 000019
Ｉ（ｔ）は時間（ｔ）における蛍光強度であり、Ｉ０は励起後の初期強度であり、τは蛍光寿命であり、Ｉ（ｔ）がＩ０／ｅに減衰するのに必要な時間として定義される。蛍光が単一の指数的に減少し、励起パルスよりも実質的に長い寿命を有する蛍光色素体に、式１を適用できる。図１３は、励起光４０２のパルス後の時間にわたる蛍光発光４００の減衰のグラフを示す。初期強度Ｉ０がＩ０／ｅに下がる時間が、寿命τに等しい。
【０１３３】
寿命を測定する代わりの方法は周波数領域法で、蛍光色素体は周波数変調された励起光で励起される。励起光に相対して蛍光色素体からの発光の位相シフトを測定し、以下の式を使用して変調比を測定することで、蛍光寿命τを決定できる。
【０１３４】
【数２】
0005517919.tif 000020
τφは、位相シフトφを測定して決定される寿命である。ωは周波数変調された励起光の角振動数であり、ｆは線形周波数である。τＭは変調比Ｍを測定して決定される寿命である。ＡＣは信号の交流部分の大きさ、または波の振幅である一方、ＤＣは信号の直流部分の振幅である。ＥＭは発光信号を指し、ＥＸは励起信号を指す。図１４は、発光信号５００および励起信号５０２の関係および式２〜５に記載される変数を示すグラフである。
【０１３５】
センサーで使用するために好ましい結合アッセイの構成としては可逆的に競争的で試薬限定的な結合アッセイが挙げられ、その成分は被分析物アナログと、興味ある被分析物および被分析物アナログの両者に可逆的に結合できる被分析物結合剤とを含む。興味ある被分析物および被分析物アナログは、被分析物結合剤上の同一結合部位への結合において競合する。その様な競争的結合アッセイの構成は臨床検査薬の技術において良く知られており、例として、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ社  １９９４年に記載されている。アッセイで使用するために適切な被分析物結合剤としては、抗体または被分析物結合部位が残っている抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）、レクチン（例えば、コンカナバリンＡ）、ホルモン受容体、薬物受容体、アプタマーおよび分子インプリントされたポリマーが挙げられる。好ましくは、被分析物がセンサー外に自由に拡散できるように、被分析物アナログは被分析物より分子量の高い物質でなければならない。例えば、グルコースのアッセイでは、被分析物アナログとしてデキストランなどの高分子量グルコースポリマーを使用できる。
【０１３６】
本発明によるアッセイの読み出しとして使用できる適切な光信号としては、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光、蛍光消光、燐光技法、発光増強、発光消光、回折またはプラズモン共鳴によって生成されるものなどの、近接アッセイによって生成できる任意の光信号が挙げられる。
【０１３７】
本発明のセンサーの好ましい実施形態によっては、蛍光共鳴エネルギー移動の技法を使用して光学的な読み出しを生成する競合的で試薬限定的な結合アッセイを取り入れている。このアッセイ形式において、被分析物アナログは第１の発色団でラベルされており、被分析物結合剤は第２の発色団でラベルされている。第１および第２の発色団の一方が供与体発色団として機能し、他方が受容体発色団として機能する。供与体および受容体発色団が結合剤によって近傍に近接させられている場合に、ＦＲＥＴとして当該技術で既知の工程で、供与体発色団によって発せられる蛍光信号のある割合が消光され、および場合によっては、受容体発色団が蛍光を発する結果、（供与体発色団によって吸収される波長の入射放射線で照射した後に）供与体発色団によって発せられた蛍光を通常は生成するエネルギーの割合が隣接する受容体発色団に放射的に移動しないように、供与体発色団の蛍光発光スペクトルが受容体発色団の吸収スペクトルと重なることがアッセイの重要な態様である。一般に、蛍光共鳴エネルギー移動は、被分析物アナログが被分析物結合剤と結合することによって供与体発色団と受容体発色団とが近傍に近接されている場合にのみ生じる。よって、被分析物結合剤へ結合するために被分析物アナログと競合する被分析物が存在すると、ラベルされた被分析物アナログが被分析物結合剤との結合から除外されるため、消光の量が低下する（供与体発色団によって発せられる蛍光信号の強度が測定可能に増加するか、または受容体発色団によって発せられる信号の強度が低下する結果となる）。よって、供与体発色団から発せられる蛍光信号の強度または寿命が、センサーが浸漬されている流体中の被分析物の濃度と相関する。
【０１３８】
蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ形式の追加の好都合な特徴は、受容体発色団の吸収スペクトル内の波長における入射放射線ビームでの励起に続いて受容体発色団によって発せられる任意の蛍光信号が、蛍光共鳴エネルギー移動の工程に影響されないという事実から生じる。従って、受容体発色団によって発せられる蛍光信号の強度を、例えば、センサーの連続的な較正において、またはセンサーの劣化の程度を監視し、よってセンサーを交換する必要を示すために、内部参照信号として使用することが可能となる。センサーが劣化すると、センサー内にある受容体発色団の量が減少し、よって受容体発色団が励起された際に検出される蛍光信号の強度も減少する。この信号が認容可能な基準レベルを下回って低下すると、新しいセンサーの埋め込みまたは注入の必要性が示される。本発明のセンサーにおいて使用するために適合することができる蛍光共鳴エネルギー移動の技法を使用する競争的結合アッセイは、当該技術で既知である。米国特許第３，９９６，３４５号明細書には、抗体と、蛍光体−消光体の発色団ペア間の蛍光共鳴エネルギー移動とを使用する免疫学的アッセイが記載されている。ＭｅａｄｏｗｓおよびＳｃｈｕｌｔｚ（Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ（１９９３年、２８０巻：２１〜３０頁）は、ラベルされたグルコースアナログ（ＦＩＴＣでラベルされたデキストラン）とラベルされたグルコース結合剤（ローダミンでラベルされたコンカナバリンＡ）との間の蛍光共鳴エネルギー移動を基礎としてグルコースを測定する均一アッセイ法を記載している。これらの構成の全てにおいて、受容体および供与体発色団／消光体を結合剤または被分析物アナログのいずれかに結び付けることができる。
【０１３９】
蛍光の寿命または蛍光強度の測定を行える。Ｌａｋｏｗｉｃｚら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２７１巻、（１９９３年）、１５５〜１６４頁に記載されているように、位相変調技法によって蛍光寿命を測定できる。
【０１４０】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃに示される通り好ましい実施形態によっては、ＦＲＥＴを使用するグルコースを測定するための競争的結合システムは、供与体蛍光色素体６０２に結合されているグルコース結合分子６００と、受容体分子６０６に結合されているグルコースアナログ６０４とを具備する。グルコース結合分子６００は、グルコース６０８およびグルコースアナログ６０４の両者と結合できる。図１５Ａに示す通り、グルコースアナログ６０４がグルコース結合分子６００と結合すると、蛍光色素体５０２が受容体６０６の近傍にあるため、蛍光色素体６０２からの蛍光発光５００の大きさが減少し、ＦＲＥＴ６１０によって位相および寿命がシフトする。他の実施形態においては、蛍光色素体６０２はグルコースアナログ６０４に結合されており、受容体６０６はグルコース結合分子６００に結合されている。
【０１４１】
図１５Ｂに示されている通り、グルコース結合分子６００上の結合部位に対してグルコース６０８はグルコースアナログ６０４と競合する。図１５Ｃに示されている通り、ＦＲＥＴ６１０を介して蛍光色素体６０２の発光寿命５００を受容体６０６が変えないように、グルコース分子６０８はグルコース結合分子６００よりグルコースアナログ６０４を除外できる。
【０１４２】
ある濃度のグルコース結合分子、グルコースアナログおよびグルコース分子が存在しているシステムにおいて、結合されているグルコースアナログの数に対して結合されているグルコース分子の数の間で平衡が存在するであろう。システム中のグルコース分子の数が変化すると、結合されているグルコースアナログに対する結合されているグルコース分子の間の平衡が変化する。これにより、次いで、蛍光色素体発光の平均寿命が変化する。
【０１４３】
好ましい実施形態によっては、約１ＭＨｚ未満、約１〜２００ＭＨＺの間、または約２００ＭＨｚより高い周波数変調励起光でシステムを励起する。実施形態によっては、周波数は、約０．０５、０．１、１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００ＭＨｚである。システムの位相シフトの角度を測定することでシステムに対してＦＲＥＴにより誘導された平均位相シフトを決定でき、それは上記の式２および３で定義される通り、システムに対する平均寿命の値に対応する。位相シフトおよび寿命の両方の値をグルコース濃度に相関できる。位相シフトの大きさは発光の振幅には依存しない。
【０１４４】
他の好ましい実施形態においては、システムをパルスで励起し、時間の経過で蛍光の減衰を測定する。上記の式１を使用して寿命を決定でき、グルコース濃度を寿命の値に相関できる。
【０１４５】
好ましい実施形態において、グルコース結合分子およびグルコースアナログがヒドロゲルの外側に拡散するのを実質的に減少するように、供与体蛍光色素体と共にグルコース結合分子と、受容体と共にグルコースアナログとを上記のヒドロゲル中に実質的に固定できる。加えて、上記の通り供与体蛍光色素体により吸収される波長において励起光を与えるようにセンサーを構成する。実施形態によっては、レーザーまたは発光ダイオード（ＬＥＤ）からの短いパルスとして励起光が与えられる。他の実施形態において、励起光は周波数変調されている。実施形態によっては、周波数変調励起光はレーザーによって与えられる。実施形態によっては、周波数変調励起光はＬＥＤによって与えられる。また、時間の経過にわたって発光の振幅および／または発光の位相シフトおよび／または発光および励起光の交流および直流部分の振幅を検出する検出器もセンサーは有している。検出器は１つの光検出器または複数の光検出器でよい。励起光および発光は、光ファイバーを介してセンサーを伝送できる。
【０１４６】
実施形態によっては、患者の血液中における被分析物の血管内濃度を測定するために、静脈、動脈または毛細血管などの患者の血管にセンサーを導入できる。実施形態によっては、被分析物の濃度を測定するために使用される化学は、より詳細に上で記載した通り、蛍光色素体の蛍光強度を被分析物濃度に相関させることを基礎とする。実施形態によっては、被分析物の濃度を測定するために使用される化学は、より詳細に上で記載した通り、蛍光色素体の蛍光寿命を被分析物濃度に相関させることを基礎とする。実施形態によっては、グルコースの濃度を測定するためにセンサーを使用する。
【０１４７】
本発明の好ましい多数の実施形態およびその変形を詳細に記載してきたが、他の改変および使用方法およびそれの医学的用途は当業者に明らかであろう。従って、本発明の精神および特許請求の範囲より逸脱しなければ、種々の用途、改変および代用を同等に行えると理解されるべきである。
【図１】
0005517919.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0005517919.tif 000031
【図１２】
0005517919.tif 000032
【図１３】
0005517919.tif 000033
【図１４】
0005517919.tif 000034
【図１５Ａ】
0005517919.tif 000035
【図１５Ｂ】
0005517919.tif 000036
【図１５Ｃ】
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