(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オーロラキナーゼＢ阻害剤治療に対する適格性に関して患者を分類するためのデータを提供する方法であって、
ａ）患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
ｃ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無に基づき、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療を受けるのに適格であると分類するためにｂ）で得られたデータを提供するステップであって、染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加が存在するときは、癌治療のためのオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に適格ではないと分類するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
オーロラキナーゼＢ阻害剤により治療されている癌患者をモニターするためのデータを提供する方法であって、
ａ）現在少なくとも１種類のオーロラキナーゼＢ阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
ｃ）試験サンプルにおけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップであって、前記ベースラインレベルはオーロラキナーゼＢ阻害剤治療の開始時に患者から採取したサンプル中のＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数を参照し、前記所定のレベルは癌の進行に関連するアッセイのカットオフ値を参照するステップ、および
ｄ）ステップｃ）における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療を継続すべきかどうかを決定するためにステップｃ）で得られたデータを提供するステップであって、前記試験サンプルが前記ベースラインレベルもしくは前記所定のレベルより低い染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数の増加を有するときまたはコピー数が検出されないときは、オーロラキナーゼＢ阻害剤による患者の治療を継続し、前記試験サンプルが前記ベースラインレベルもしくは前記所定のレベルと同等または前記ベースラインレベルもしくは前記所定のレベルより高い染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数の増加を有するときは、オーロラキナーゼＢ阻害剤による患者の治療を中止するか、または併用療法として少なくとも一つの第２の治療を組合せるステップ
を含む、方法。
【請求項３】
オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に耐性である癌を有する患者を分類するためのデータを提供する方法であって、
ａ）患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
ｃ）試験サンプルにおけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップであって、前記ベースラインレベルはオーロラキナーゼＢ阻害剤治療の開始時に患者から採取したサンプル中においてＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数を参照し、前記所定のレベルは癌の進行に関連するアッセイのカットオフ値を参照するステップ、および
ｄ）（ｉ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の存在および（ｉｉ）試験サンプルにおけるコピー数増加がベースラインレベルまたは所定のレベルよりも高いかどうかに基づき、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤治療に耐性である癌を有すると分類するためにステップｃ）において得られたデータを提供するステップ
を含む、方法。
【請求項４】
オーロラキナーゼＢ阻害剤がＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７またはヘスペラジンである、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
試験サンプルが組織サンプルを含む、請求項１、２または３の方法。
【請求項６】
組織サンプルが、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、または末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルの内のいずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む、請求項５の方法。
【請求項７】
決定ステップ（ｂ）がｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより行われる、請求項１、２または３の方法。
【請求項８】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが、（ａ）蛍光標識した核酸プローブ、（ｂ）少なくとも２種の核酸プローブまたは（ｃ）ペプチド核酸プローブを用いて行われる、請求項７の方法。
【請求項９】
決定ステップ（ｂ）が、ポリメラーゼ連鎖反応または核酸マイクロアレイアッセイにより行われる、請求項１、２または３の方法。
【請求項１０】
癌が結腸直腸癌または膵癌である、請求項１、２または３の方法。
【請求項１１】
ＡＢＣＢ１遺伝子におけるコピー数増加の存在がＭＤＲ１ポリペプチドの発現増加と相関する、請求項１、２または３の方法。
【請求項１２】
患者が、化学療法、放射線照射またはそれらの組み合わせによっても治療されている、請求項１、２または３の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願情報）
本願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、２００９年１月３１日に出願された米国特許出願第６１／１４８，９５７号明細書の利益を主張するものである。
【０００２】
（配列表）
本願は、これによってその全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＥＦＳ−Ｗｅｂを経由して提出された配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは９７００．ｔｘｔと命名され、そのサイズは７９キロバイトである。
【０００３】
本発明は、１種以上のオーロラキナーゼＢ阻害剤を用いた癌治療法の選択のための患者の分類に有用な診断検査に関する。本発明は、特に、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＢ４遺伝子またはそれらの組み合わせにおける１つ以上のコピー数増加の有無の同定、オーロラキナーゼ阻害剤治療を単独療法か併用療法の一部のいずれかとして受けるのに適格である患者の同定およびこのような治療に対する患者の応答性のモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００４】
オーロラキナーゼファミリーは、一群の有糸分裂の主要制御因子として機能する高度に近縁のセリン／スレオニンキナーゼである。哺乳動物細胞において、３種のオーロラキナーゼが発現する。これらオーロラキナーゼは、オーロラＡ、オーロラＢおよびオーロラＣである。これらオーロラキナーゼはそれぞれが異なる細胞内局在を示し、異なる役割を果たす（Ｃａｒｍｅｎａ  Ｍ．Ｅ．Ｗ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４：８４２−８５４（２００３）およびＤｕｃａｔ、Ｄ．Ｚ．Ｙ．、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、３０１：６０−６７（２００４）を参照）。具体的には、オーロラＡは、紡錘体極に局在し、二極性の紡錘体形成において重要な役割を有する（Ｍａｒｕｍｏｔｏ、Ｔ．Ｚ．Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、５：４２−５０（２００５）を参照）。染色体パッセンジャータンパク質であるオーロラＢは、有糸分裂初期にはセントロメアに、続いて後期には紡錘体中間帯に局在する。オーロラＢは、有糸分裂におけるヒストンＨ３リン酸化、染色体の二極配向、紡錘体アセンブリーチェックポイントおよび細胞質分裂に必要とされる（Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｐ．Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１５：６７２−６８３（２００３））。オーロラＣもまた染色体パッセンジャータンパク質であり、正常細胞におけるその発現は、主に雄性配偶子形成に機能する精巣に限定される。オーロラキナーゼは有糸分裂に必須の機能を果たすため、このキナーゼファミリーは癌治療の標的として大いに注目されてきた。ヘスペラジン、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７、ＡＺＤ１１５２およびＭＬＮ８０５４等、数種の小分子阻害剤が開発された（Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｃ、Ｊ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１６１：２６７−２８０（２００３）、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０：２６２−２６７（２００４）、Ｈａｕｆ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１６１：２８１−２９４（２００３）、Ｍａｎｆｒｅｄｉ、Ｍ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１０４：４１０６−４１１１（２００７）を参照）。
【０００５】
ＡＺＤ１１５２は、ヒト血漿において活性薬剤であるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡへと速やかに変換される、新規のアセトアニリド置換ピラゾール−アミノキナゾリンプロドラッグである（Ｍｏｒｔｌｏｃｋ、Ａ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５０：２２１３−２２２４（２００７）を参照）。ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡは、オーロラＡ（Ｋｉは１３６９ｎＭ）と比べてオーロラＢ（Ｋｉは０．３６ｎＭ）の非常に強力で選択的な阻害剤であり、他の５０種のキナーゼパネルに対して不活性である。ＡＺＤ１１５２は、免疫不全マウスにおけるヒト結腸、肺および血液腫瘍異種移植片の成長を強力に阻害する。ＡＺＤ１１５２を静脈内に処置したＳＷ６２０直腸結腸腫瘍を有する無胸腺ラットにおける詳細な薬力学的解析は、腫瘍における表現型事象の時系列を明らかにした。すなわち、ヒストンＨ３リン酸化の一過的抑制、４ｎ  ＤＮＡを有する細胞の蓄積、続いて倍数体（＞４ｎ  ＤＮＡ）細胞の割合の増加である。組織学的解析は、ＡＺＤ１１５２処置腫瘍におけるアポトーシス増加と同時発生する異常細胞分裂、すなわち骨髄増殖阻害に二次的な一過性骨髄抑制が観察されたが、この効果はＡＺＤ１１５２処置の休止後では完全に可逆的であったことを示した（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｒ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１３：３６８３−３６８８（２００７）を参照）。
【０００６】
癌化学療法において直面する重大な障壁は、腫瘍が細胞毒（腫瘍細胞が暴露されたことのない薬剤であっても）に対して交差耐性を生じることである。多剤耐性（ＭＤＲ）として知られるこの表現型は、抗癌剤治療後に頻繁に観察される。ＭＤＲの分子基盤は多くの場合複雑であるが、第１選択および第２選択の標準的治療で普及している化学療法剤の活性を回避するために腫瘍細胞が利用する中核的な細胞自律的メカニズムとして、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）トランスポータースーパーファミリーメンバーの上方制御が浮上してきた。以前の化学療法が不成功であった個体はより最新の実験的な薬剤を受ける可能性が非常に高いため、ＭＤＲ感受性は腫瘍学における創薬における重要なハードルを表す。ＡＢＣトランスポーターのプロトタイプである多剤耐性１（ＭＤＲ１；Ｐ−糖タンパク質すなわちＰ−ｇｐとしても知られ、ＡＢＣＢ１遺伝子にコードされる）は、２個の膜貫通ドメインおよび２個のヌクレオチド結合ドメインからなり、ＡＴＰの加水分解により濃度勾配に逆らい溶質を細胞外間隙に輸送する。乳癌耐性タンパク質（ＢＲＣＰ；ＡＢＣＧ２遺伝子にコードされる）等、他のＡＢＣトランスポーターは半分のトランスポーターとして発現し、二量体化して成熟した機能ユニットを生じる。ＢＲＣＰの化学療法耐性への貢献はまだ明らかではないが、ＭＤＲ１の上方制御は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または骨髄異形成症候群の個体の化学療法の不成功および生存率低下の一貫した徴候であった（Ｐａｌｌｉｓ、Ｍ．Ｒ．Ｎ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１８：１９２７−１９３０（２００４）およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｌｔ、Ｂ．Ｌ．Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０６：２６４６−２６５４（２００５））。さらに、ＭＤＲ１は、３１例の乳癌治験のメタ分析において化学療法に対する応答性低下を伴った（Ｔｒｏｃｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８９：９１７−９３１（１９９７）参照）。その結果、１種以上のＡＢＣトランスポーターを阻害または調節する物質の開発に多くの労力が投入された。実際に、この種の第２および第三世代の阻害剤が、臨床試験において化学療法増感剤として評価されている（Ｂａｔｅｓ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、８３−９６（２００２））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｒｍｅｎａ  Ｍ．Ｅ．Ｗ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、４：８４２−８５４（２００３）
【非特許文献２】Ｄｕｃａｔ、Ｄ．Ｚ．Ｙ．、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、３０１：６０−６７（２００４）
【非特許文献３】Ｍａｒｕｍｏｔｏ、Ｔ．Ｚ．Ｄ．ら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、５：４２−５０（２００５）
【非特許文献４】Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｐ．Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１５：６７２−６８３（２００３）
【非特許文献５】Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｃ、Ｊ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１６１：２６７−２８０（２００３）
【非特許文献６】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ、Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１０：２６２−２６７（２００４）
【非特許文献７】Ｈａｕｆ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１６１：２８１−２９４（２００３）
【非特許文献８】Ｍａｎｆｒｅｄｉ、Ｍ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、１０４：４１０６−４１１１（２００７）
【非特許文献９】Ｍｏｒｔｌｏｃｋ、Ａ．Ａ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５０：２２１３−２２２４（２００７）
【非特許文献１０】Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ、Ｒ．Ｗ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１３：３６８３−３６８８（２００７）
【非特許文献１１】Ｐａｌｌｉｓ、Ｍ．Ｒ．Ｎ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、１８：１９２７−１９３０（２００４）
【非特許文献１２】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｌｔ、Ｂ．Ｌ．Ｂ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１０６：２６４６−２６５４（２００５）
【非特許文献１３】Ｔｒｏｃｋ、Ｂ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８９：９１７−９３１（１９９７）
【非特許文献１４】Ｂａｔｅｓ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．、８３−９６（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＡＺＤ１１５２は、望ましい前臨床での有効性を示し、ＡＭＬおよび固形腫瘍の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において評価されているが、ＡＺＤ１１５２に対する耐性を発現する可能性については調査されていない。したがって、本技術分野において、オーロラキナーゼＢ阻害剤で治療されている対象に対して腫瘍細胞耐性を付与する遺伝子を同定し、これら遺伝子に包含されるタンパク質の上方制御または下方制御等、これら遺伝子から得られた情報を使用し、オーロラキナーゼＢ阻害剤を用いた治療に患者が適格であるかどうかを決定または分類するための診断法および１種以上のオーロラキナーゼＢ阻害剤で治療されている癌患者を薬剤耐性の発現に関してモニターするための方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
第１の態様において、本発明は、オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に対する適格性に関して患者を分類する方法に関する。方法は、
ａ）患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
ｃ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無に基づき、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療を受けるのに適格であると分類するステップ
を含む。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に対する適格性に関して患者を分類する方法に関する。方法は、
ａ）患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
ｃ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無に基づき、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療を受けるのに適格であると分類するステップ
を含む。
【００１１】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、オーロラキナーゼＢ阻害剤は、ＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７またはヘスペラジンとすることができる。
【００１２】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、試験サンプルは、組織サンプルを含むことができる。具体的には、組織サンプルは、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、または末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルの内いずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む。
【００１３】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、決定ステップ（ｂ）は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって行われてよい。具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、蛍光標識した核酸プローブを用いて行われてよい。より具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、少なくとも２種の核酸プローブを用いて行われてよい。あるいは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ペプチド核酸プローブを用いて行われる。
【００１４】
あるいは、上の２つの態様のそれぞれにおいて、決定ステップ（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応によって行われてよい。
【００１５】
さらにあるいは、決定ステップ（ｂ）は、核酸マイクロアレイアッセイによって行われてよい。
【００１６】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、癌は結腸直腸癌または膵癌とすることができる。
【００１７】
第１の態様において、ＡＢＣＢ１遺伝子におけるコピー数増加の存在は、ＭＤＲ１ポリペプチドの発現増加と相関する。第２の態様において、ＡＢＣＢ４遺伝子におけるコピー数増加の存在は、ＭＤＲ３ポリペプチドの発現増加と相関する。
【００１８】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、患者は、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＢ４遺伝子またはＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の組み合わせの内の少なくとも１種と結合するよう設計されたアンチセンス薬によって治療されている。
【００１９】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、患者は、任意に化学療法、放射線照射またはそれらの組み合わせによって治療されてもよい。
【００２０】
第三の態様において、本発明は、オーロラキナーゼＢ阻害剤により治療されている癌患者をモニターする方法に関する。方法は、
ａ）現在少なくとも１種類のオーロラキナーゼＢ阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
ｃ）試験サンプルにおけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
ｄ）ステップｃ）における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療を継続するべきかどうかを決定するステップ
を含む。
【００２１】
第四の態様において、本発明は、オーロラキナーゼＢ阻害剤により治療されている癌患者をモニターする方法に関する。方法は、
ａ）現在少なくとも１種類のオーロラキナーゼＢ阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
ｃ）試験サンプルにおけるＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
ｄ）ステップｃ）における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療を継続するべきかどうかを決定するステップ
を含む。
【００２２】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、オーロラキナーゼＢ阻害剤は、ＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７またはヘスペラジンとすることができる。
【００２３】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、試験サンプルは、組織サンプルを含むことができる。具体的には、組織サンプルは、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、または末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルの内いずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む。
【００２４】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、決定ステップ（ｂ）は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって行われてよい。具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、蛍光標識した核酸プローブを用いて行われてよい。より具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、少なくとも２種の核酸プローブを用いて行われてよい。あるいは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ペプチド核酸プローブを用いて行われる。
【００２５】
あるいは、上の２つの態様のそれぞれにおいて、決定ステップ（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応によって行われてよい。
【００２６】
さらにあるいは、決定ステップ（ｂ）は、核酸マイクロアレイアッセイによって行われてよい。
【００２７】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、癌は、結腸直腸癌または膵癌とすることができる。
【００２８】
第三の態様において、ＡＢＣＢ１遺伝子におけるコピー数増加の存在は、ＭＤＲ１ポリペプチドの発現増加と相関する。第四の態様において、ＡＢＣＢ４遺伝子におけるコピー数増加の存在は、ＭＤＲ３ポリペプチドの発現増加と相関する。
【００２９】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、患者は、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＢ４遺伝子またはＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の組み合わせの内の少なくとも１種と結合するよう設計されたアンチセンス薬により治療されている。
【００３０】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、患者は、任意に化学療法、放射線照射またはそれらの組み合わせによって治療されてもよい。
【００３１】
第五の態様において、本発明は、オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に耐性である癌を有する患者を分類する方法に関する。方法は、
ａ）患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
ｃ）試験サンプルにおけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
ｄ）（ｉ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の存在および（ｉｉ）試験サンプルにおけるコピー数増加がベースラインレベルまたは所定のレベルよりも高いかどうかに基づき、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤治療に耐性を有する癌であると分類するステップ
を含む。
【００３２】
第六の態様において、本発明は、オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に耐性である癌を有する患者を分類する方法に関する。方法は、
ａ）患者から得られた試験サンプルを準備するステップ、
ｂ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
ｃ）試験サンプルにおけるＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップおよび
ｄ）（ｉ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の存在および（ｉｉ）試験サンプルにおけるコピー数増加がベースラインレベルまたは所定のレベルよりも高いかに基づき、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤治療に耐性を有する癌であると分類するステップ
を含む。
【００３３】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、オーロラキナーゼＢ阻害剤は、ＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７またはヘスペラジンとすることができる。
【００３４】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、試験サンプルは、組織サンプルを含むことができる。具体的には、組織サンプルは、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、または末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルの内いずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプルを含む。
【００３５】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、決定ステップ（ｂ）は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって行われてよい。具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、蛍光標識した核酸プローブを用いて行われてよい。より具体的には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、少なくとも２種の核酸プローブを用いて行われてよい。あるいは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ペプチド核酸プローブを用いて行われる。
【００３６】
あるいは、上の２つの態様のそれぞれにおいて、決定ステップ（ｂ）は、ポリメラーゼ連鎖反応によって行われてよい。
【００３７】
さらにあるいは、決定ステップ（ｂ）は、核酸マイクロアレイアッセイによって行われてよい。
【００３８】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、癌は結腸直腸癌または膵癌とすることができる。
【００３９】
第五の態様において、ＡＢＣＢ１遺伝子におけるコピー数増加の存在は、ＭＤＲ１ポリペプチドの発現増加と相関する。第六の態様において、ＡＢＣＢ４遺伝子におけるコピー数増加の存在は、ＭＤＲ３ポリペプチドの発現増加と相関する。
【００４０】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、患者は、ＡＢＣＢ１遺伝子、ＡＢＣＢ４遺伝子またはＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の組み合わせの内の少なくとも１種と結合するよう設計されたアンチセンス薬により治療されている。
【００４１】
上の２つの態様のそれぞれにおいて、患者は、任意に化学療法、放射線照射またはそれらの組み合わせによって治療されてもよい。
【００４２】
第七の態様において、本発明は、
（ａ）ＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加の有無を決定するための試薬、
（ｂ）試験を行うための取扱説明書
を含むキットに関する。
【００４３】
上のキットにおいて、コピー数増加の有無を決定するための試薬は、ＡＢＣＢ１遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする検出可能に標識したポリヌクレオチドを含む。
【００４４】
第八の実施形態において、本発明は、
（ａ）ＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定するための試薬、
（ｂ）試験を行うための取扱説明書
を含むキットに関する。
【００４５】
上のキットにおいて、コピー数増加の有無を決定するための試薬は、ＡＢＣＢ４遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする検出可能に標識したポリヌクレオチドを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１Ａ】図１は実施例に記載されている通りＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ耐性に対して選択されたＳＷ６２０派生体において増幅および過剰発現された遺伝子としての、ＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４の同定を示す図である。具体的には、親系統ＳＷ６２０細胞、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞および薬剤を含まない培地で３ヵ月間培養した後のＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞における、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  １００Ｋ  ＳＮＰチップを用いたＣＧＨによって決定されたＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４のコピー数を示す図である。縦線はＡＢＣＢ１遺伝子座の位置を示し、横線は正常なＤＮＡコピー数（２コピー）を示す。
【図１Ｂ】他の溶質トランスポーターと比べたＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４のｍＲＮＡ発現値を示す図である。ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３におけるＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１をコード）およびＡＢＣＢ４（ＭＤＲ３をコード）の発現レベルは矢印で示す。
【図１Ｃ】Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを用いて決定した、１４，０００遺伝子＋ＥＳＴ（約２２，０００プローブセット）のｍＲＮＡ発現値を示す図である。データは、親系統ＳＷ６２０細胞と比べてＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞においてその発現が１０倍以上増加した全遺伝子と比較した、遺伝子発現の倍数的変化として表されている。
【図１Ｄ】ＭＤＲ１タンパク質の相対的発現がイムノブロット解析によって決定されたことを示す図である。β−アクチンは添加対照として用いた。
【図２Ａ】図２はＡＢＣＢ１の抑制がＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３派生体においてＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ耐性を逆行させることを示す図である。ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡで用量反応的に９０分間処理した、ＳＷ６２０細胞、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞および薬剤を含まない培地で３ヶ月間培養した後のＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を示す図である。ヒストンＨ３のＳｅｒ１０リン酸化をイムノブロット解析により決定した。
【図２Ｂ】１μＭ  ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡで４時間処理したＳＷ６２０またはＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を示す図である。細胞を分画し、ＬＣ−ＭＳ分析により各サンプル画分におけるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ濃度を決定した。
【図２Ｃ】ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡで用量反応的に９０分間処理する前に、ＤＭＳＯか１μＭ  ＰＳＣ−８３３のいずれかで２時間処理したＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を示す図である。その後、ヒストンＨ３のリン酸化をイムノブロッティングにより決定した。
【図２Ｄ】ルシフェラーゼ（ｓｉルシフェラーゼ）かＡＢＣＢ１（ｓｉＡＢＣＢ１）ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、次にトランスフェクトした細胞をＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡで９０分間処理することにより、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３派生体におけるＡＢＣＢ１ノックダウンの効果が評価されたことを示す図である。ＡＢＣＢ１のイムノブロット解析は、ｓｉＡＢＣＢ１におけるタンパク質レベルがｓｉルシフェラーゼと比べて約７５％減少したことを示した。
【図３Ａ】図３はＳＷ６２０対ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３異種移植片におけるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの薬物動態学、薬力学および有効性の関係を示す図である。（上パネル）ヒストンＨ３リン酸化アッセイにおけるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの固有の効力と５０％（ｖｖ−１）マウス血漿の存在下でアッセイしたＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ効力の倍数的減少の積を計算することによって評価された、異種移植片のヒストンＨ３リン酸化阻害に必要とされる予想閾値腫瘍内濃度を示す図である。下パネルは、１００ｍｇｋｇ―１を１回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した後、投薬後０、２、８および２４時間に決定されたＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの腫瘍内薬物動態を示す。
【図３Ｂ】ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ（１００ｍｇｋｇ―１、ｉ．ｐ．）を単回投与された、確立したＳＷ６２０およびＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３腫瘍異種移植片を有するマウスを示す図であり、各時点につき３個の腫瘍が回収された。ＡＺＤ１１５２で処置した後、腫瘍を摘出し、ＳＷ６２０腫瘍（水色）およびＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３腫瘍（紺青色）におけるリン酸化ヒストンＨ３レベルをイムノブロッティングにより決定した。イムノブロットを定量化し、データを曲線下面積として表した。個々の時点から得られた平均値は±ｓ．ｅ．ｍ．で表す。
【図３Ｃ】実施例１に記載されている通りにｓｃｉｄ−ｂｇマウスに皮下注射されたＳＷ６２０およびＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を示す図である。腫瘍を約５００ｍｍ３にサイズ適合させ、接種７日後にＡＺＤ１１５２による処置を開始した。５０または１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量でｑ２ｄスケジュールにおいて２週間、ｉ．ｐ．注射することによりＡＺＤ１１５２を投与した。各点は、１０個の腫瘍の平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図３Ｄ】実施例１に記載されている通りにｓｃｉｄ−ｂｇマウスに皮下注射されたＳＷ６２０およびＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を示す図である。腫瘍を約５００ｍｍ３にサイズ適合させ、接種７日後にＡＺＤ１１５２による処置を開始した。５０または１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量でｑ２ｄスケジュールにおいて２週間ｉ．ｐ．注射することによりＡＺＤ１１５２を投与した。各点は、１０個の腫瘍の平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図４Ａ】図４はＡＢＣＢ１を過剰発現する細胞系が、インビトロにおいてＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡおよびＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７に耐性を有することを示す図である。ＡＢＣＢ１の相対的発現を示す、異種移植片実験に用いた細胞系のイムノブロッティングを表す図である。
【図４Ｂ】７日間のコロニー形成（付着系統：ＳＷ６２０、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３、ＨＣＴ−１５、ＡｓＰＣ１）または生存能力（非付着系統：ＲＳ；４１１およびＤｏＨＨ−２）において、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７、ＭＬＮ８０５４およびパクリタキセルに対する相対的感受性を評価した細胞系パネルを示す図である。細胞を用量反応的に処理して、ＩＣ５０を決定した。
【図４Ｃ】表示の濃度でＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡを追加的な時間添加する前に、ＤＭＳＯまたは１μＭ  ＰＳＣ−８３３で１時間処理したＨＣＴ−１５細胞を示す図である。全ヒストンＨ３およびリン酸化（Ｓｅｒ１０）ヒストンＨ３をイムノブロッティングにより決定した。
【図４Ｄ】図４Ｃに記載されている通り、ＤＭＳＯまたは１０μＭフミトレモルギンＣで１時間、次にＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡで処理したＡｓＰＣ１細胞を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
（詳細な記述）
本発明は、癌および腫瘍細胞のオーロラキナーゼＢ阻害剤治療耐性をモニターするための方法および組成物を提供する。本発明者らは、（ｉ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）染色体座７ｑ２１．１におけるＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子それぞれのコピー数増加の存在が、オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に対する耐性を伴うことを発見した。
【００４８】
本発明者らは、全ゲノムスケールで遺伝子コピー数異常（例えば、コピー数増加およびコピー数減少）を検出するためのマイクロアレイに基づく比較ゲノムハイブリダイゼーション技法を用いて、したがってＤＮＡコピー数変化を伴う染色体異常の全ゲノム的観点を提供して、上述のコピー数増加を発見した。この方法は、その内容がその全体により本明細書に組み込まれている、２００８年１０月３１日に出願されて米国特許出願第６１／１１０，２８１号を付与された「ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＡＳＳＥＭＢＬＩＮＧ  ＰＡＮＥＬＳ  ＯＦ  ＣＡＮＣＥＲ  ＣＥＬＬ  ＬＩＮＥＳ  ＦＯＲ  ＵＳＥ  ＩＮ  ＴＥＳＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＦＦＩＣＡＣＹ  ＯＦ  ＯＮＥ  ＯＲ  ＭＯＲＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ」において十分に開示されている。
【００４９】
本発明は、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子それぞれのコピー数増加の有無に関して試験サンプルを評価するステップを含む、癌患者を同定、分類およびモニターするための診断検査を提供する。発明に関するアッセイは、オーロラキナーゼＢ治療（単独療法か、併用療法の一部（例えば、化学療法、放射線照射またはそれらの組み合わせ等と共に）のいずれかとして）を受けるのに適格である患者を同定するためおよびこのような治療に対する患者の応答性をモニターするためのアッセイ法を含む。例えば、本発明は、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子それぞれのコピー数増加の有無を蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定するステップを含む。（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子それぞれのコピー数増加を有すると分類された患者は、この治療に効果を示す可能性が低いため、オーロラキナーゼＢ治療を少なくとも単独療法として受けるのに適格ではない。さらに、この増幅を有する患者は他の癌治療法に耐性を有する可能性がある。したがって、癌および腫瘍細胞における（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子それぞれのコピー数増加の存在の決定は、一般的治療の分類マーカーとして有用である。
【００５０】
本発明はその一実施形態において、
（ａ）患者から得られた組織サンプルを準備するステップ、
（ｂ）（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
（ｃ）（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の欠如に基づいて、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に適格であると分類するステップ
を含む、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療（単独療法か、併用療法の一部のいずれかとして）に適格であると同定または分類するための方法を含む。上の方法において、患者は、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の存在に基づき、オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に（少なくとも単独療法としては）適格ではない可能性がある。試験サンプルを採取する患者は、癌と疑われるまたは癌と診断された患者とすることができる。さらに、本発明者らは、ＡＢＣＢ１遺伝子のコピー数増加が、ＭＤＲ１ポリペプチドの発現増加と相関し、ＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加がＭＤＲ３ポリペプチドの発現増加と相関することを見出した。
【００５１】
この実施形態において、癌は結腸直腸癌や膵癌等、どの種類の癌であってもよい。さらに、この実施形態において、遺伝子増幅は、例えば肺癌腫瘍生検サンプルのマルチカラー蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイによって決定されてよい。他の実施形態において、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）法が用いられる。
【００５２】
さらに別の一実施形態において、本発明は、
（ａ）患者から得られた試験サンプル（例えば、組織サンプル等）を準備するステップ、
（ｂ）（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、および
（ｃ）（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の存在に基づき、患者をオーロラキナーゼＢ阻害剤に耐性を有する癌であると分類するステップ
を含む、オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療に耐性である癌を有する患者を同定または分類するための方法を含む。
【００５３】
この実施形態において、癌は結腸直腸癌や膵癌等、どの種類の癌であってもよい。さらに、この実施形態において、遺伝子増幅は、例えば肺癌腫瘍生検サンプルのマルチカラー蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイによって決定されてよい。他の実施形態において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が用いられる。
【００５４】
さらにまた別の一実施形態において、本発明は、
（ａ）少なくとも１種類のオーロラキナーゼ阻害剤により治療されている癌患者から得られた試験サンプル（任意に、組織サンプルから得られた腫瘍または癌細胞が同定または抽出されてよい）を準備するステップ、
（ｂ）試験サンプル（例えば、腫瘍または癌細胞における）における（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定するステップ、
（ｃ）試験サンプル（腫瘍または癌細胞における等）から得られた（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加をベースラインレベルまたは所定のレベルと比較するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）における比較に基づき、患者がオーロラキナーゼＢ阻害剤による治療を継続するべきかどうかを決定するステップ
を含む、オーロラキナーゼＢ阻害剤により治療されている患者をモニターするための方法を対象とする。具体的には、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数が増加した試験サンプル（例えば、腫瘍または癌細胞）がベースラインレベルまたは所定のレベルと同一またはより高い場合、その後オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療は、（単独療法として単一で用いられていれば）中断、中止または終了されてよい。あるいは、治療医は、オーロラキナーゼＢ阻害剤を併用療法として、少なくとも第２の治療（例えば、第２の小分子による治療）と組み合わせることを決定できる。しかし、試験サンプル（例えば、腫瘍または癌細胞）から得られた（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子もしくは（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加がベースラインレベルもしくは所定のレベルより少ない場合、または（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子もしくは（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加が検出されない場合、その後オーロラキナーゼＢ阻害剤による治療は継続されてよい。また一方、前記治療により得られた結果次第で、治療医は、オーロラキナーゼＢ阻害剤を併用療法として少なくとも第２の治療（例えば、第２の小分子による治療）と組み合わせることを決定できる。
【００５５】
また一方、ＦＩＳＨ法およびＰＣＲ法が、患者から得られた試験サンプルにおける（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無の検出に用いられてよい。
【００５６】
本発明は、例えば、ＰＣＲプライマー、ＦＩＳＨプローブ等として用いられるよう設計されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを包装したキットも対象とする。
【００５７】
本発明は、癌治療、特にオーロラキナーゼＢ阻害剤治療のための患者分類の改善を提供する重要な能力を有する。本発明によるこれらバイオマーカーの評価は、個々の患者の治療に対する応答性を追跡することもできる。
【００５８】
Ａ．定義
本節に用いられているような節の表題および本明細書における開示全体は、限定を目的としない。
【００５９】
本明細書において、文脈が明らかに別のことを示さない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形を含む。本明細書における数値範囲の記述において、その間に介在する同程度の精度の各数値が明確に企図される。例えば、６−９の範囲において、６および９に加えて７および８の数値が企図され、６．０−７．０の範囲において、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０の数値が明確に企図される。
【００６０】
ａ）オーロラキナーゼＢ阻害剤
「オーロラキナーゼＢ阻害剤」は、オーロラキナーゼＢまたはオーロラＢの少なくとも１種と結合し、オーロラキナーゼＢまたはオーロラＢに関連する核酸またはタンパク質の活性と拮抗する、小分子、抗体、アンチセンス、低分子干渉ＲＮＡまたはマイクロＲＮＡに基づく化合物を含む、あらゆる種類（例えば、非選択的または選択的）の治療用化合物を意味する。例えば、多くのオーロラキナーゼＢ阻害剤は、ヒストンＨ３リン酸化または細胞分裂の少なくとも一方を阻害することが知られている。さらに、多くのオーロラキナーゼＢ阻害剤は、少なくとも１種類の細胞系（急性骨髄性白血病細胞系、原発性急性骨髄性白血病培養物等）におけるアポトーシスを誘導することが知られている。本発明の方法は、どの公知のまたは将来的に開発されるオーロラキナーゼＢ阻害剤にも有用である。オーロラキナーゼＢ阻害剤の例として、ＡＺＤ１１５２、ＺＭ４４７４３９、ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７およびヘスペラジンが挙げられる。
【００６１】
２−［［３−（｛４−［（５−｛２−［（３−フルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−キナゾリン−７−イル｝オキシ）プロピル］（エチル）アミノ］エチル二水素リン酸としても知られているＡＺＤ１１５２は、ピラゾロキナゾリンオーロラキナーゼ阻害剤（ＡＺＤ１１５２−ヒドロキシキナゾリンピラゾールアニリド（ＨＱＰＡ））のプロドラッグであり、血漿において活性型ＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡに速やかに変換される（Ｍｏｒｔｌｏｃｋ、ＡＡら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、５０：２２１３−２４（２００７）を参照）。ＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡは、オーロラＢの非常に強力で選択的な阻害剤である。
【００６２】
４−（４−（Ｎ−ベンゾイルアミノ）アニリノ）−６−メトキシ−７−（３−（１−モルホリノ）プロポキシ）キナゾリンとしても知られているＺＭ４４７４３９は、キナゾリン誘導体であり、オーロラＡおよびオーロラＢを阻害する。ＺＭ４４７４３９の化学構造は、Ｄｉｔｃｈｆｉｅｌｄ、Ｃら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、１６１（２）：２６７−２８０（２００３）およびＭｏｎｔｅｍｂａｕｌｔ、Ｅ．ら、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ、３０（１）：１−９（２００５）に提供されている。
【００６３】
ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７は、｛４−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−６−（５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）−ピリミジン−２−イルスルファニル］−フェニル｝−アミドのシクロプロパンカルボン酸であり、オーロラＡ、オーロラＢおよびオーロラＣを阻害する。ＶＸ−６８０／ＭＫ０４５７の化学構造は、Ｍｏｎｔｅｍｂａｕｌｔ、Ｅ．ら、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ、３０（１）：１−９（２００５）に提供されている。
【００６４】
インドリノンであるヘスペラジンは、オーロラＢを阻害する。ヘスペラジンの化学構造は、Ｈａｕｆ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．、１６１（２）：２８１−２９４（２００３）およびＭｏｎｔｅｍｂａｕｌｔ、Ｅ．ら、Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ、３０（１）：１−９（２００５）に提供されている。
【００６５】
ｂ）％配列同一性を有するポリヌクレオチドから実質的になる
「％配列同一性を有するポリヌクレオチドから実質的になる」は、ポリヌクレオチドの長さは実質的に変わらないが、配列が実質的に異なり得ることを意味する。したがって、１００ヌクレオチドの公知の配列「Ｂ」と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドから実質的になるポリヌクレオチド「Ａ」は、ポリヌクレオチド「Ａ」が約１００ヌクレオチド（ｎｔ）長であるが、最大２０ｎｔが「Ｂ」配列と異なり得ることを意味する。問題のポリヌクレオチド配列は、目的の二次構造を形成するように実質的な非同一配列が付加される場合等、例えば特定の種類のプローブ、プライマーおよびその他の分子ツール等を作製するための１−１５ヌクレオチドの付加等、末端の修飾のために長くなることも短くなることもできる。このような非同一ヌクレオチドは、配列が「から実質的になる」によって修飾される場合、配列同一性の計算に考慮されない。
【００６６】
ｃ）発現、アンチセンス阻害およびコサプレッション
「発現」は、機能的最終産物の生成を意味する。遺伝子の発現は、遺伝子の転写と、ｍＲＮＡの前駆または成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質発現を抑制することのできるアンチセンスＲＮＡ転写産物の生成を意味する。「コサプレッション」は、同一または実質的に同様の外来または内因性遺伝子の発現を抑制することのできるセンスＲＮＡ転写産物の生成を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。
【００６７】
ｄ）単離された
本明細書において、核酸分子またはポリヌクレオチドの文脈における用語「単離された」は、天然の核酸分子源またはポリヌクレオチド源に存在する他の核酸分子またはポリヌクレオチドから分離された核酸分子またはポリヌクレオチドを意味する。さらに、ｃＤＮＡ分子等、「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドは、組換え技法によって生成された場合は他の細胞性物質または培地を実質的に含まなくてよく、また化学的に合成された場合は前駆的化学物質または他の化学物質を実質的に含まなくてよい。一態様において、核酸分子またはポリヌクレオチドが単離される。
【００６８】
ｅ）遺伝子
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に存在する調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。
【００６９】
ｆ）天然の遺伝子およびキメラコンストラクト
「天然の遺伝子」は、それ自身の調節配列を備えた天然に存在する遺伝子を意味する。対照的に、「キメラコンストラクト」は、通常天然では一緒に存在しない核酸断片の組み合わせを意味する。したがって、キメラコンストラクトは、異なるソースに由来する調節配列およびコード配列を含むことも、同一ソースに由来する調節配列およびコード配列を含むこともできるが、通常天然に存在する配置とは異なる仕方で配置されている。
【００７０】
ｇ）パーセント（％）核酸配列同一性
核酸配列に関する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、候補配列における、目的配列におけるヌクレオチドと同一のヌクレオチドの比率として定義され、配列を整列し必要に応じてギャップを導入した後に最大のパーセント配列同一性を得る。％核酸配列同一性を決定するためのアライメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエア等、一般に利用できるコンピューターソフトウエアを用いた、当業者の技能範囲内の様々な方法により達成できる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたって最大限のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズム等、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００７１】
ヌクレオチド配列を整列させると、所与の核酸配列Ｃの、所与の核酸配列Ｄとの、Ｄに関するまたはＤに対する％核酸配列同一性（あるいは、所与の核酸配列Ｄと、Ｄに関してまたはＤに対して特定の％核酸配列同一性を有するまたは含む所与の核酸配列Ｃと表すこともできる）は、次の通り計算できる。
％核酸配列同一性＝Ｗ／Ｚ＊１００
ここで、
Ｗは、配列アライメントプログラムまたはアルゴリズムによるＣとＤのアライメントによって同一マッチとして計数されたヌクレオチド数であり、
Ｚは、Ｄにおけるヌクレオチドの総数である。
【００７２】
核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと等しくない場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性と等しくなくなる。
【００７３】
ｈ）ポリメラーゼ連鎖反応すなわちＰＣＲ
「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「ＰＣＲ」は、一連の反復サイクルからなる、大量の特定ＤＮＡセグメントの合成のための技法である（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ノーウォーク、コネチカット州）。通常、二本鎖ＤＮＡが熱変性され、標的セグメントの３’境界に相補的な２種のプライマーが低い温度でアニーリングし、続いて中間の温度で伸長する。これら連続した３ステップの１セットをサイクルと言う。
【００７４】
ＰＣＲは、短い時間でテンプレートを繰り返し複製することにより、ＤＮＡを何百万倍にも増幅するのに用いられる強力な技法である（（Ｍｕｌｌｉｓ、Ｋ．ら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｓｙｍｐ  Ｑｕａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５１  Ｐｔ  １：２６３−７３（１９８６））、欧州特許出願第５０，４２４号明細書、欧州特許出願第８４，７９６号明細書、欧州特許出願第２５８，０１７号明細書、欧州特許出願第２３７，３６２号明細書、欧州特許出願第２０１，１８４号明細書、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、米国特許第４，５８２，７８８号明細書および米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。このプロセスは、ＤＮＡ合成を準備するための特定のインビトロ合成オリゴヌクレオチドのセットを用いる。プライマーの設計は、解析されるべきＤＮＡの配列に依存する。この技法は、高温でのテンプレートメルティング、テンプレート内の相補配列へのプライマーのアニーリング、そしてＤＮＡポリメラーゼによるテンプレートの複製による、多くの（通常２０−５０）サイクルによって行われる。
【００７５】
ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲルで分離し、続いてエチジウムブロマイド染色してＵＶトランスイルミネーションで可視化することにより解析され得る。あるいは、標識が産物に取り込まれるよう、放射性ｄＮＴＰがＰＣＲに添加されてもよい。この場合、ゲルをＸ線フィルムに露光することによってＰＣＲ産物が可視化される。ＰＣＲ産物を放射標識する別の利点は、個々の増幅産物のレベルが定量化され得ることである。
【００７６】
ｉ）ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡもしくはＤＮＡ模倣体（ＰＮＡ等）ならびにそれらの誘導体およびホモログの核酸ポリマーである。したがって、ポリヌクレオチドは、天然の核酸塩基、糖およびヌクレオシド間共有結合（骨格）からなるポリマーと共に、同様に機能する非天然部分を有するポリマーを含む。このような修飾または置換された核酸ポリマーは本技術分野においてよく知られており、「アナログ」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドは一般に、約１０から最大約１６０または２００ヌクレオチド由来の短いポリヌクレオチドである。
【００７７】
ポリヌクレオチドは、核酸配列のアナログおよび／または誘導体ならびにそれらのホモログ等、標的配列と特異的にハイブリダイズするプライマーも含む。
【００７８】
ポリヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（フォスターシティー、カリフォルニア州、米国）、ＤｕＰｏｎｔ（ウィルミントン、デラウエア州、米国）またはＭｉｌｌｉｇｅｎ（ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）から入手できる機器等の市販の機器を用いた固相合成法等、従来の技法によって調製できる。ホスホロチオエートやアルキル化誘導体等、修飾ポリヌクレオチドもまた、本技術分野で公知の同様の方法によって容易に調製できる（米国特許第４，９４８，８８２号、第５，４６４，７４６号および第５，４２４，４１４号明細書を参照）。
【００７９】
ｊ）ポリヌクレオチドアナログ
本明細書において、用語「ポリヌクレオチドアナログ」は、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を有するポリマーを意味する。修飾された骨格は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート等、リン原子を骨格に保持する骨格ならびに短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルの混合ヌクレオシド間結合または１もしくは複数種の短鎖へテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって生成された骨格等、リン原子を持たない骨格を含む。修飾核酸ポリマー（アナログ）は、１種以上の修飾糖成分を含むことができる。
【００８０】
ヌクレオチドユニットの糖とヌクレオシド間結合の両方が新規の基で置換されている、ＲＮＡまたはＤＮＡ模倣体であるアナログも有用である。これら模倣体において、塩基ユニットは標的配列とのハイブリダイゼーションのため維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたこのような模倣体の例として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる（Ｂｕｃｈａｒｄｔ、Ｏ．、Ｐ．ＮｉｅｌｓｅｎおよびＲ．Ｂｅｒｇ．１９９２．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）。
【００８１】
ｋ）所定のレベル
本明細書において、用語「所定のレベル」は、アッセイ結果を所定のレベルに対して比較することによる診断結果の評価に用いられるアッセイのカットオフ値を一般に言い、所定のレベルは既に様々な臨床的パラメーター（例えば、リスク評価、疾病の重症度、進行／非進行／改善、試験サンプルの年齢決定、試験サンプル（例えば、血清または血漿）が溶血されたかの決定等）とリンクまたは関連している。本発明は、例示的な所定のレベルを提供し、本明細書に記載されている例示的なアッセイに関してこのようなレベルと臨床的パラメーターとの初期リンクまたは関連を説明する。しかし、カットオフ値がアッセイの性質に依存して変化し得ることはよく知られている。さらに、他のアッセイに本明細書における発明を適用して本明細書に基づきこれら他のアッセイに関するアッセイ特異的カットオフ値を得ることは、十分に当業者の通常の技能範囲内にある。
【００８２】
ｌ）プライマーまたはプローブ
本明細書における「プローブ」または「プライマー」は、少なくとも８ヌクレオチドの長さであり、標的領域内の配列とプローブまたはプライマーにおける少なくとも一配列の相補性のため、標的配列とハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドである。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡおよび／または合成ヌクレオチドアナログからなることができる。好ましくは、プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応において標的配列の準備に用いられる配列（単数または複数）と相補的な配列を含まない。
【００８３】
ｍ）組換え
「組換え」は、例えば、化学合成による、または遺伝子工学的技法による核酸の単離セグメントの操作による、本来は別個である２種の配列セグメントの人工的な組み合わせを意味する。
【００８４】
ｎ）特異的にハイブリダイズする
「特異的にハイブリダイズする」は、核酸が第２の核酸と検出可能および特異的に結合する能力を意味する。ポリヌクレオチドは、非特異的核酸による相当量の検出可能な結合を最低限に抑えるハイブリダイゼーション条件および洗浄条件下で、標的核酸鎖と特異的にハイブリダイズする。
【００８５】
ｏ）ストリンジェンシーまたはストリンジェントな条件
一本鎖ＤＮＡが相補断片とハイブリダイズする特異性は、反応条件のストリンジェンシーによって決定される。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ＤＮＡ二本鎖が形成される傾向が減少するに従って増加する。核酸ハイブリダイゼーション反応において、特異的ハイブリダイゼーション（高ストリンジェンシー）に有利なストリンジェンシーが選択され得る。関連するが厳密に同じではないＤＮＡ分子（相同であるが同一ではない）またはセグメントを同定するために、特異性の低いハイブリダイゼーション（低ストリンジェンシー）が用いられてよい。
【００８６】
ＤＮＡ二本鎖は、（１）相補的塩基対の数、（２）塩基対の種類、（３）反応混合液の塩濃度（イオン強度）、（４）反応温度および（５）ＤＮＡ二本鎖安定性を低減させるホルムアミド等、特定の有機溶媒の存在に応じて安定化される。一般的なアプローチとして温度を変化させる。よりストリンジェントな反応条件をもたらすより高い相対温度（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．、Ｒ．Ｂｒｅｎｔ、Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎら、１９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨークを参照）は、ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに説得力のある説明を提供する。
【００８７】
「ストリンジェントな条件」下のハイブリダイゼーションは、互いに少なくとも６０％の相同性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイゼーションを維持できるハイブリダイゼーションプロトコールを意味する。ポリヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞のレセプターを標的とするための）や、細胞膜を通じた輸送を容易にする薬剤等、他の追加群を含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性の切断剤（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．６：９５８−７６（１９８８）を参照）またはｉｎｔｅｒｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ（Ｚｏｎ、Ｇ．、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．５：５３９−４９（１９８８））によって修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、他の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性の架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性の切断剤等と結合されてよい。
【００８８】
ｐ）対象または患者
本明細書において、用語「対象」および「患者」は、対象が何らかの形の処置を受けたか現在受けているかに関わらず、互換的に用いられる。本明細書において、用語「単数の対象」および「複数の対象」は、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラットおよびマウス、非ヒト霊長目（例えば、カニクイザル、チンパンジー等、サル）ならびにヒト）を含むがこれらに限定されない任意の脊椎動物を意味する。好ましくは、対象はヒトである。対象または患者は、生きていても死んでいてもよい。
【００８９】
ｑ）標的配列または標的核酸配列
「標的配列」または「標的核酸配列」は、例えば、ポリヌクレオチドプライマーまたはプローブを用いて増幅、検出またはその両方がなされる、遺伝子もしくは相補体またはそれらの断片を包含する核酸配列を意味する。さらに、標的配列という用語は二本鎖核酸配列を意味する場合もあるが、標的配列は一本鎖であってもよい。標的が二本鎖である場合、ポリヌクレオチドプライマー配列は、好ましくは標的配列の両方の鎖を増幅する。特定の生物に多かれ少なかれ特異的な標的配列が選択され得る。例えば、標的配列は、属全体、２以上の属、種もしくは亜種、血清群、栄養要求型、血清型、株、分離株または他の生物サブセットに特異的とすることができる。
【００９０】
ｒ）試験サンプル
「試験サンプル」は、対象または体液から採取された、標的配列を含み得るサンプルを意味する。試験サンプルは、例えば、組織、血液、唾液、痰、粘液、汗、尿、尿道スワブ、子宮頸部スワブ、泌尿生殖器または肛門スワブ、結膜スワブ、眼球レンズ液、大脳脊髄液等、どのソースから採取されてもよい。試験サンプルは、（ｉ）ソースから得られたものとして直接的に、または（ｉｉ）サンプル特性を改変するための前処理の後に用いられてよい。したがって、試験サンプルは、例えば、血液から血漿または血清を調製し、細胞またはウイルス粒子を破壊し、固形材料から液体を調製し、粘性のある液体を希釈し、液体をろ過し、試薬を添加し、核酸を精製すること等によって、使用前に前処理されてよい。
【００９１】
ｓ）処理、処置または治療
本明細書に用いられている用語「処理」、「処置」または「治療」は、（ｉ）病態が発生するのを予防する（例えば、予防法）、（ｉｉ）病態を抑制またはその発症を妨げる、（ｉｉｉ）病態を緩和させるおよび／またはこのような病態を伴う１つ以上の症状を予防もしくは重症度を低減させる試みにおいて、項目（ｉ）から（ｉｉｉ）の内いずれが対象で成功するかに関係なく、１種以上の活性薬剤または化合物を対象に投与することを意味する。
【００９２】
ｔ）変異型ポリヌクレオチドまたは変異型核酸配列
「変異型ポリヌクレオチド」または「変異型核酸配列」は、所定の核酸配列と少なくとも約６０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の核酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有するポリヌクレオチドを意味する。変異型は、天然のヌクレオチド配列を包含しない。
【００９３】
通常、変異型ポリヌクレオチドは、少なくとも約８ヌクレオチドの長さ、多くの場合少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ヌクレオチドの長さ、またはさらには約７５−２００ヌクレオチド以上の長さである。
【００９４】
ヌクレオチドの範囲は、核酸分子が、置換、化学物質、酵素または他の適切な手段によって天然のヌクレオチド以外の部分で共有結合的に修飾された誘導体を含む。
【００９５】
Ｂ．ポリヌクレオチドアッセイ
本発明において有用な核酸アッセイ法は、（ｉ）無傷組織または細胞サンプルのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、（ｉｉ）組織サンプルから抽出された染色体ＤＮＡのマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイおよび（ｉｉｉ）組織サンプルから抽出された染色体ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の増幅アッセイによる、コピー数増加の有無の検出を含む。これらの様式の内いずれかにおいて、ペプチド核酸等、核酸の合成アナログを用いたアッセイが用いられてもよい。
【００９６】
本発明のアッセイは、オーロラキナーゼＢ阻害剤治療に対する治療応答性の予見と患者応答性のモニタリングの両方における使用のための、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の同定に用いられる。応答性予見のためのアッセイは治療開始前に行うことができ、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加を示さないまたは提示を呈さない患者は、オーロラキナーゼＢ阻害剤治療を受けるのに適格である。（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加は、化学療法や放射線照射治療等、他の癌治療への耐性を示し得る。患者応答性をモニターするために、治療開始においてアッセイが行われて、組織サンプルにおけるバイオマーカーのベースラインレベル、例えば、コピー数増加を示す細胞のサンプルにおける全細胞パーセントまたは細胞数を確定することができる。次に、同一組織がサンプリングされてアッセイされ、バイオマーカーのレベルがベースラインと比較される。レベルが同一のままか減少する場合、治療は効果的であると思われ、これを継続することができる。ベースラインレベルよりも有意な上昇が生じる場合、患者は応答していないまたは継続的オーロラキナーゼＢ阻害剤治療への耐性を発現した可能性がある。
【００９７】
本発明のアッセイは、固形腫瘍（例えば、肉腫または癌腫）または血液悪性腫瘍（例えば、血液、骨髄およびリンパ節に影響する癌）の標的療法等、標的癌治療法に用いられてよい。本発明のアッセイは、結腸直腸癌、膵癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、肝癌、胆管癌、口腔癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌または乳癌等、固形腫瘍に用いられてよい。本発明のアッセイは、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、フィラデルフィア染色体陽性の急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）等、血液悪性腫瘍に用いられてよい。アッセイは、オーロラキナーゼＢの増幅または過剰発現が関与する、どの種類の癌に関して行われてもよい。末梢血、腫瘍または疑わしい腫瘍組織（新鮮凍結および固定パラフィン包埋組織等）、血液サンプルにおいて分離または同定された循環上皮細胞等の細胞分離株、リンパ節組織、骨髄および細針生検サンプルを含む、任意の種類の患者の組織サンプル等、任意の種類の試験サンプルまたはそれらの派生体において、発明に関するアッセイが行われる。
【００９８】
本発明は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）プローブやタンパク質核酸（ＰＮＡ）プローブ等、検出可能に標識した核酸に基づくプローブまたは特定の染色体標的とハイブリダイズするよう設計／選択された非標識プライマーを用いたハイブリダイゼーションアッセイによるゲノムバイオマーカーの検出を含む。非標識プライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等による増幅アッセイで用いられ、プライマーが結合した後、続く検出のためにポリメラーゼが標的核酸配列を増幅する。ＰＣＲまたは他の増幅アッセイで用いられる検出プローブは、好ましくは蛍光であり、さらにより好ましくは「リアルタイムＰＣＲ」に有用な検出プローブである。蛍光標識もまた、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける使用に好ましいが、通常ハイブリダイゼーション技法に用いられる他の検出可能な標識、例えば、酵素、発色性および同位体標識が用いられてもよい。有用なプローブ標識技法が文献に記載されている（その内容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｆａｎ、Ｙ．−Ｓ．２００２．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ：ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ、ニュージャージー州、ｘｉｖ、ｐ．４１１）。マイクロアレイ解析によるゲノムバイオマーカーの検出において、これらのプローブ標識技法は患者サンプルから抽出された染色体ＤＮＡの標識に適用され、これは続いてマイクロアレイとハイブリダイズする。
【００９９】
ヒトＡＢＣＢ１遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００９２７）を表１に示す。
【０１００】
【表１】
0005616905.tif 000002
0005616905.tif 000003
【０１０１】
ヒトＡＢＣＢ４遺伝子のポリヌクレオチド配列（配列番号２；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１８８４９）を表１に示す。
【０１０２】
【表２】
0005616905.tif 000004
0005616905.tif 000005
0005616905.tif 000006
【０１０３】
好ましくは、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の染色体コピー数増加の存在を検出するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが用いられる。プライマーおよびプローブは、配列番号１および配列番号２の配列を用いることによって当業者により作製され得る。
【０１０４】
本発明のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法における使用のためのプローブは、大きく２つの群に分類される。染色体計数プローブ、すなわち通常反復配列領域である染色体領域とハイブリダイズして染色体全体の有無を示すプローブ、および遺伝子座特異的プローブ、すなわち染色体上の特定の遺伝子座とハイブリダイズし、特定の遺伝子座の有無を検出するプローブである。染色体腕プローブ、すなわち染色体領域とハイブリダイズして特定の染色体腕の有無を示すプローブが用いられてもよい。ＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４遺伝子座等、調査している遺伝子座における独自の染色体ＤＮＡ配列の変化を検出することのできる遺伝子座特異的プローブを用いることが好ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための独自の配列プローブを使用するための方法は、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，４４７，８４１号明細書に記載されている。
【０１０５】
染色体計数プローブは、セントロメア近傍または遠位のいずれかに位置する反復配列とハイブリダイズすることができる、または染色体上の任意の位置に存在する独自の配列とハイブリダイズすることができる。例えば、染色体計数プローブは、染色体のセントロメアに関連する反復ＤＮＡとハイブリダイズすることができる。霊長目の染色体セントロメアは、α−サテライトＤＮＡと呼ばれる約１７１塩基対のモノマー反復長からなる長いＤＮＡ縦列反復の複合ファミリーを含む。１４番および１８番染色体それぞれのセントロメアの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（デス・プレーンズ、イリノイ州）から市販されている。
【０１０６】
群を抜いて有用なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，４９１，２２４号明細書に記載されているプローブ等、直接標識蛍光プローブである。米国特許第５，４９１，２２４号明細書は、２種以上の蛍光標識プローブを用いた同時ＦＩＳＨアッセイについても説明する。
【０１０７】
有用な遺伝子座特異的プローブは、いずれの方法において作製されてもよく、一般に約１０，０００から約１，０００，０００塩基長の染色体ＤＮＡ標的配列とハイブリダイズする配列を含む。好ましくは、プローブは、少なくとも１００，０００塩基長から約５００，０００塩基長の標的遺伝子座における染色体ＤＮＡの標的鎖とハイブリダイズし、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７５６，６９６号明細書に開示されている通り、プローブの非特異的結合を防ぐためにプローブ混合液に非標識ブロッキング核酸を含む。非標識合成オリゴマー核酸またはペプチド核酸をブロッキング核酸として用いることもできる。特定の遺伝子座を標的化するために、プローブは、遺伝子に及ぶ核酸配列を含み、したがって全ゲノムコード遺伝子座の両サイドとハイブリダイズすることが好ましい。プローブは、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）その他等、ヒトＤＮＡ含有クローンを出発材料に作製されてよい。ヒトゲノムのＢＡＣライブラリーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）から入手でき、有用なクローンの同定のために研究することができる。カリフォルニア大学サンタクルーズ校のゲノムブラウザを用いて、標的遺伝子座におけるＤＮＡ配列を同定することが好ましい。次に、これらのＤＮＡ配列は、ＢＡＣライブリースクリーニングの使用のためのＰＣＲプライマーの合成に用いられ、有用なクローンを同定することができる。次に、クローンは従来のニックトランスレーション法によって標識され、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプローブとして試験され得る。
【０１０８】
本明細書に記載されているｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法に用いられ得る蛍光プローブの例として、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州）、５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチル−ローダミン−５−（および−６）−イソチオシアネート、５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシ−クマリン−３−カルボン酸、６−［フルオレセイン５−（および−６）−カルボキサミド］ヘキサン酸、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアネート、エリスロシン−５−イソチオシアネート、５−（および−６）−カルボキシローダミン６ＧおよびＣａｓｃａｄｅ（商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎブランド）が挙げられる。
【０１０９】
プローブは、蛍光顕微鏡および各蛍光プローブに適切なフィルターを用いて、または複数の蛍光プローブを観察するための二重もしくは三重バンドパスフィルターセットを用いることによって観察され得る。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，７７６，６８８号明細書を参照。ハイブリダイズしたプローブを可視化するために、自動デジタル画像システム等、任意の適切な顕微鏡イメージング法が用いられてよい。あるいは、染色体プローブのハイブリダイゼーションパターンを試験するために、フローサイトメトリー等の技法が用いられてよい。
【０１１０】
ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションによる細胞毎の遺伝子増幅解析が好ましいが、定量的ＰＣＲによりゲノムバイオマーカーが検出されてもよい。この実施形態において、組織サンプルから染色体ＤＮＡが抽出され、次に（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の内、少なくとも１種に特異的な一対のプライマーを用いたＰＣＲ、または複数対のプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲにより増幅される。バイオマーカーのための任意のプライマー配列が用いられてよい。用いられ得るプライマーの例を表３に示す。次に、参照増幅基準と比較することにより組織のコピー数が決定される。
【０１１１】
【表３】
0005616905.tif 000007
【０１１２】
マイクロアレイに基づくコピー数解析が用いられてもよい。この実施例において、基質表面１平方センチメートル当たり最大数百万プローブのプローブ密度で配置された複数の固定化非標識核酸プローブを有する基質を含むマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのため、抽出後の染色体ＤＮＡが標識される。複数のマイクロアレイ様式が存在するが、本発明においてそのいずれが用いられてもよい。用いられ得るマイクロアレイの例として、これらのそれぞれがＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、サンタクララ、カリフォルニア州）から市販されているＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ｓｅｔ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ、Ｈ．ら、「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｖｅｒ  １００，０００  ＳＮＰｓ  ｏｎ  ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１：１０９−１１（２００４）を参照）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ類（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ｎｓｐ  ＡｒｒａｙやＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ｓｔｙ  Ａｒｒａｙ等）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｒｒａｙ  Ｓｅｔや、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４４Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、サンタクララ、カリフォルニア州から市販）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、サンディエゴ、カリフォルニア州）、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  ａＣＧＨ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ、Ｉｎｃ．、マディソン、ウィスコンシン州）等が挙げられる。オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いて増幅を検出する場合、標的領域において４以上の離間した位置にプローブ配列を有するマイクロアレイを用いることが好ましい。マイクロアレイに用いられ得るプローブの例を下の表４および配列番号２３−３２１に示す。下の表４に列挙したプローブのフランキング配列を下の表５に示す。
【０１１３】
【表４】
0005616905.tif 000008
0005616905.tif 000009
0005616905.tif 000010
0005616905.tif 000011
0005616905.tif 000012
0005616905.tif 000013
0005616905.tif 000014
【０１１４】
【表５】
0005616905.tif 000015
【０１１５】
Ｃ．発現：ｍＲＮＡの検出
（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の遺伝子発現レベルは、試験サンプル中の１種以上のｍＲＮＡの量を評価することによって決定され得る。サンプル中のｍＲＮＡを測定する方法は、本技術分野で公知のものである。ｍＲＮＡレベルを測定するため、試験サンプル中の細胞が溶解され、本技術分野でよく知られている多様な方法によって、ライセートにおけるまたはライセートから精製もしくは粗精製されたＲＮＡにおけるｍＲＮＡレベルが測定され得る。このような方法は、検出可能に標識したＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ（すなわち、ノーザンブロッティング）または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いた定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲの手法を含む。あるいは、定量的または半定量的ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは、例えば組織切片または溶解されていない細胞懸濁液および検出可能な標識（例えば、蛍光または酵素標識）ＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて行われてよい。ｍＲＮＡを定量するための追加的な方法は、ＲＮＡプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ解析（ＲＤＡ）、ディファレンシャルディスプレイ、ＥＳＴ配列解析ならびに遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）を含む。
【０１１６】
適切な実施形態において、試験サンプルにおける（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子を検出するために、ＰＣＲ増幅が用いられる。すなわち、ＰＣＲにおいて、マーカー配列の向かい合った相補鎖における領域と相補的な、例えば（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の配列を含む２種のプライマー配列が調製される。ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼと共に過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸が反応混合液に添加される。サンプル中に標的配列が存在すれば、プライマーが配列と結合し、ヌクレオチドを添加することによってポリメラーゼがプライマーをマーカー配列に沿って伸長させることになる。反応混合液の温度を上下させることにより、伸長されたプライマーがマーカーから解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーがマーカーおよび反応産物に結合し、このプロセスが繰り返されることにより増幅産物を生成する。増幅されたｍＲＮＡ量を定量するため、逆転写ＰＣＲ増幅手順が行われてもよい。
【０１１７】
（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子の任意の適切な断片が増幅、検出されてよい。効率的なＰＣＲプライマーの設計は、当業者の通常の技能範囲内である。用いられ得るプライマーの例を表３に示す。通常、検出のための増幅断片は、約５０から３００ヌクレオチドの長さである。
【０１１８】
増幅産物は、数通りの方法で検出され得る。増幅産物は、サンプルをゲル電気泳動し、続いてＤＮＡ結合染色試薬、例えばエチジウムブロマイドで染色することによって可視化され得る。あるいは、増幅産物は、放射性または蛍光ヌクレオチドで一体的に標識され、次にＸ線フィルムを用いてまたは適切な励起スペクトル下で可視化されてもよい。
【０１１９】
増幅は、「リアルタイム」法を用いてモニターされてもよい。リアルタイムＰＣＲは、核酸標的の検出および定量を可能にする。通常、定量的ＰＣＲのこのアプローチは蛍光染色試薬を利用するが、これはＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）等、二本鎖特異的染色試薬とすることができる。あるいは、他の蛍光染色試薬（例えば、ＦＡＭまたはＨＥＸ）は、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーと結合することができる。リアルタイムＰＣＲを行うことのできる様々な装置は、本技術分野において公知のものであり、例えばＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ）を含む。ＰＣＲの各サイクルで生じた蛍光シグナルは、ＰＣＲ産物の量に比例する。蛍光対サイクル数のプロットは増幅反応速度の説明に用いられ、蛍光閾値は最初のテンプレート濃度に関連した分画サイクル数を画定するのに用いられる。増幅が行われ、熱サイクルの間に蛍光を読み取ることのできる装置で検出される場合、目的のＰＣＲ産物はメルティング解析により非特異的ＰＣＲ産物から識別され得る。増幅とシグナル生成の後に反応液の温度を徐々に上昇させつつ蛍光の変化を測定することによって、目的産物と非特異的産物のＴｍを決定することができる。
【０１２０】
方法は、「マルチプレックス検出」または「マルチプレックス」としても知られている、サンプル中の複数の核酸を増幅するステップを含むことができる。「マルチプレックスＰＣＲ」は、１種以上の標的遺伝子マーカー由来の核酸等、複数の核酸を検出および定量するために、２セット以上のＰＣＲプライマーを反応液に添加することに関するＰＣＲを意味する。さらに、内部標準（例えば、１８Ｓ  ｒＲＮＡ、ＧＡＤＰＨまたはアクチン）を用いたマルチプレックスは、反応なしでＰＣＲ対照を提供する。
【０１２１】
Ｄ．サンプル処理およびアッセイの実施
本明細書において前述した通り、本発明の試験サンプルは組織サンプルとすることができる。本発明の方法によってアッセイされるべき組織サンプルは、末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプル、パラフィン包埋組織サンプル、または末梢血サンプル、腫瘍組織もしくは疑わしい腫瘍組織、薄層細胞診サンプル、細針生検サンプル、骨髄サンプル、リンパ節サンプル、尿サンプル、腹水サンプル、洗浄サンプル、食道擦過サンプル、膀胱もしくは肺洗浄液サンプル、髄液サンプル、脳液サンプル、管吸引サンプル、乳頭分泌サンプル、胸水サンプル、新鮮凍結組織サンプルもしくはパラフィン包埋組織サンプルの内いずれかから作製された抽出液もしくは処理サンプル等、どの種類を含むこともできる。例えば、患者の末梢血サンプルは、最初に上皮細胞集団を抽出するよう処理されて、続いてこの抽出物がアッセイされてよい。疑わしい腫瘍細胞が濃縮された細胞サンプルを得るための組織サンプルのマイクロダイセクションが用いられてもよい。本明細書における使用に好ましい組織サンプルは、末梢血や、細針生検サンプル、新鮮凍結組織およびパラフィン包埋組織等、腫瘍組織または疑わしい腫瘍組織ならびに骨髄である。
【０１２２】
組織サンプルは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは他の核酸アッセイを行うための任意の所望の方法によって処理されてよい。好ましいｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイのため、パラフィン包埋した腫瘍組織サンプルまたは骨髄サンプルをガラス製顕微鏡スライド上に固定し、溶媒、通常はキシレンで脱パラフィンする。組織脱パラフィンおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの有用なプロトコールは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｃ．（デス・プレーンズ、イリノイ州）から入手できる。本発明に関するアッセイの実施において、任意の適切な器具使用または自動化が用いられてよい。ＰＣＲに基づくアッセイは、ｍ２０００装置システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ、デス・プレーンズ、イリノイ州）において行われてよい。好ましい蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイのために、自動イメージングが用いられてよい。
【０１２３】
一実施形態において、サンプルは患者から得られた末梢血サンプルを含み、これは循環血中の腫瘍または癌細胞の抽出液を作製するよう処理されて、（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を試験される。循環血中の腫瘍細胞は、Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ（ハンティンドンバレー、ペンシルベニア州）から市販されているもの等、免疫磁気分離技法によって分離できる。次に、循環血中の腫瘍細胞に対して決定されたコピー数は、治療開始等、前の時点で決定されたコピー数を有する循環血中の腫瘍細胞のベースラインレベルまたは所定のレベルと比較される。ベースラインレベルまたは所定のレベルと比べてのコピー数増加は、治療の失敗を示唆し得る。
【０１２４】
試験サンプルは、臨床診断に十分な任意の数の細胞を含むことができ、通常少なくとも約１００個の細胞を含む。通常のＦＩＳＨアッセイにおいて、約２５−１，０００個の細胞のハイブリダイゼーションパターンが評価される。サンプルに十分な比率で遺伝子増幅が含まれることが判明した場合、試験サンプルは通常「アッセイ陽性」であると考えられる。染色体コピー数により同定され、特定のサンプルの陽性としての分類に用いられた細胞数は一般に、サンプル中の細胞数によって変化する。陽性の分類に用いられた細胞数は、カットオフ値としても知られる。決定に用いられ得るカットオフ値の例として、細胞約５、２５、５０、１００および２５０個、またはサンプル集団における細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％および６０％が挙げられる。１個の細胞のような少なさであっても、サンプルを陽性と分類するのに十分となることができる。通常のパラフィン包埋組織サンプルにおいて、少なくとも３０個の細胞を陽性と同定することが好ましく、少なくとも２０個の細胞を染色体コピー数増加が陽性であると同定することがより好ましい。例えば、通常のパラフィン包埋結腸直腸癌の３０個の細胞における検出は、組織を陽性であり治療に適格であると分類するのに十分となる。
【０１２５】
Ｅ．キット
本発明は、試験サンプルにおける（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を検出するためのキットも企図する。このようなキットは、上述のコピー数増加の有無を決定するための１種以上の試薬を含むことができる。例えば、前記キットは、１種以上の核酸プローブを含むことができる。あるいは、またはプローブに加えて、キットは１種以上の核酸プライマーを含むことができる。
【０１２６】
したがって、本開示は、１種以上の核酸プライマー、核酸プローブまたは本明細書に記載されている核酸プライマーおよびプローブを含む、診断および品質管理のキットをさらに提供する。任意に、本発明のアッセイ、キットおよびキット構成要素は、市販のプラットフォーム（例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アボットパーク、イリノイ州のＰｒｉｓｍ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）およびＥＩＡ（ビーズ）プラットフォームにおけるイムノアッセイならびに他の市販および／またはインビトロ診断検査）における使用に最適化され得る。さらに、アッセイ、キットおよびキット構成要素は、他の様式、例えば電気化学的または他のハンドヘルドもしくはポイントオブケアアッセイシステムで用いられてよい。本開示は、例えばＴｎＩ、ＣＫＭＢおよびＢＮＰ等、数種類の心臓マーカーのサンドイッチ式イムノアッセイを行う、市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アボットパーク、イリノイ州）電気化学的イムノアッセイシステムに適用できる。使い捨て試験器具におけるイムノセンサーおよびこれを操作する方法は、例えば参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、第２００４／００１８５７７号、第２００５／００５４０７８号および第２００６／０１６０１６４号明細書に記載されている。電気化学的および他の種類のイムノセンサーの製造のさらなる背景は、それに関してその教示のために同様に参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，０６３，０８１号明細書に見出すことができる。
【０１２７】
任意に、キットは、品質管理試薬（例えば、感受性パネル、標準物質および陽性対照）を含む。品質管理試薬の調製は本技術分野でよく知られおり、例えば様々な免疫診断薬挿入シートに記載されている。
【０１２８】
キットは、蛍光プローブ、放射性部分、酵素、ビオチン／アビジン標識、発色団、化学発光標識その他等、検出可能な標識を組み込むことができる、またはキットは、核酸プライマー、核酸プローブまたは本明細書に記載されているコピー数増加の有無を検出するための核酸プライマーおよび核酸プローブを標識するための試薬を含むことができる。プライマーおよび／またはプローブ、標準物質および／または対照は、別々の容器に提供、または適切なアッセイ形式、例えばマイクロタイタープレートに前分注してよい。
【０１２９】
キットは、バッファー、塩、酵素、酵素補助因子、基質、検出試薬等、診断検査を行うまたは品質管理評価を容易にするのに必要とされる他の試薬を、任意に含むことができる。試験サンプルの単離および／または処理のためのバッファーや溶液（例えば、前処理試薬）等、他の構成要素がキットに含まれてもよい。キットは、１種以上の他の対照を追加的に含むことができる。１つ以上のキット構成要素は、凍結乾燥されてよく、キットは凍結乾燥された要素の再構成に適した試薬をさらに含むことができる。
【０１３０】
様々なキット構成要素は、任意に適切な容器に提供される。上に示す通り、１つ以上の容器は、マイクロタイタープレートとすることができる。キットは、サンプルを維持または保存するための容器（例えば、血液または尿サンプルのための容器またはカートリッジ）をさらに含むことができる。必要に応じて、キットは、反応槽、混合槽および試薬または試験サンプルの調製を容易にする他の構成要素を任意に含むこともできる。キットは、シリンジ、ピペット、ピンセット、メジャースプーンその他等、試験サンプル採取を補助するための１つ以上の器具を含むこともできる。
【０１３１】
キットはさらに、書面、またはディスク、ＣＤ、ＤＶＤその他等のコンピューター可読媒体に提供され得る、使用のための取扱説明書を任意に含むことができる。
【０１３２】
Ｆ．キットの適応
例えば、米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号明細書に記載されているように、また例えば、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（アボットパーク、イリノイ州）からＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）として市販されているように、構成要素および本明細書に記載されている方法を用いて（ｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子、（ｉｉ）ＡＢＣＢ４遺伝子または（ｉｉｉ）ＡＢＣＢ１遺伝子とＡＢＣＢ４遺伝子のコピー数増加の有無を決定する方法ならびにキット（またはその構成要素）は、様々な自動および半自動システム（固相が微粒子を含むシステム等）における使用に適応させることができる。
【０１３３】
自動または半自動システムの、非自動システム（例えば、ＥＬＩＳＡ）に対する相違の一部として、第１の特異的結合相手（例えば、捕集抗体）が結合する基質（これはサンドイッチ形成および分析物の反応性に影響を与える可能性がある）、捕集の長さとタイミング、検出および／または任意な何らかの洗浄ステップが挙げられる。ＥＬＩＳＡ等、非自動様式がサンプルと捕集試薬とのインキュベーションに比較的長い時間（例えば、約２時間）を必要とし得るのに対し、自動または半自動様式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）では約１８分間）でよい。同様に、ＥＬＩＳＡ等、非自動形式が比較的長いインキュベーション時間（例えば、約２時間）で結合試薬等、検出抗体をインキュベートし得るのに対し、自動または半自動様式（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標））は比較的短いインキュベーション時間（例えば、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）では約４分間）でよい。
【０１３４】
Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手できる他のプラットフォームは、ＡｘＳＹＭ（登録商標）、ＩＭｘ（登録商標）（例えば、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５，２９４，４０４号明細書を参照）、ＰＲＩＳＭ（登録商標）、ＥＩＡ（ビーズ）およびＱｕａｎｔｕｍ（商標）ＩＩならびに他のプラットフォームを含むが、これらに限定されるものではない。さらに、アッセイ、キットおよびキット構成要素は、他の様式、例えば電気化学的または他のハンドヘルドもしくはポイントオブケアアッセイシステムで用いられてよい。本開示は、例えば、サンドイッチイムノアッセイを行う市販のＡｂｂｏｔｔ  Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）電気化学的イムノアッセイシステムに適用できる。イムノセンサーならびにその製造方法および使い捨て試験器具における操作方法は、例えば、それに関する教示のためその全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，０６３，０８１号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１７０８８１号、第２００４／００１８５７７号、第２００５／００５４０７８号および第２００６／０１６０１６４号明細書に記載されている。
【０１３５】
さらに、言うまでもなく、本明細書に記載されている方法およびキットは、アッセイを行うための他の試薬および方法を必然的に包含する。例えば、本技術分野で公知のバッファーおよび／または容易に調製または使用に最適化され得るバッファー等、様々なバッファーが包含される。
【０１３６】
次に、本開示の実施例を示すが、これは具体例によるものであり、限定されるものではない。
【実施例】
【０１３７】
試薬
次の通り、提示のサプライヤーから抗体を購入した。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ，カリフォルニア州）からＭＤＲ１／Ｐ−糖タンパク質（カタログ番号５１７３１０）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（サンタクルーズ、カリフォルニア州）から抗ＢＲＣＰ抗体（カタログ番号ｓｃ−５８２２２）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ダンバース、マサチューセッツ州）から抗リン酸化ヒストンＨ３（Ｓｅｒ１０）（カタログ番号９７０１）および抗ヒストンＨ３（カタログ番号９７１５）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）からフィコエリトリン（ＰＥ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（カタログ番号５５０５８９）およびＰＥ結合抗ヒトＣＤ４４（カタログ番号５５５４７９）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）からβ−アクチン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州）からＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（カタログ番号Ａ２１１０９）ならびにＲｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（ギルバーツビル、ペンシルベニア州）からＩＲＤｙｅ８００結合ロバ抗マウス（カタログ番号６１０−７３２−１２４）。Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州）からパクリタキセルを購入し、Ｗｅｎｇｅｒ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ（リーエン、スイス）からＰＳＣ−８３３を購入し、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（サンディエゴ、カリフォルニア州）からフミトレモルギンＣを購入した。
【０１３８】
ＭＬＮ８０５４（４−｛［９−クロロ−７−（２，６−ジフルオロフェニル）−５Ｈ−ピリミド［５，４−Ｄ］［２］ベンザゼピン−２−イル］アミノ｝−安息香酸）（Ｍａｎｆｒｉｅｄｉ、ＭＧら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０４：４１０６−４１１１（２００７）を参照；ＭＬＮ８０７５はオーロラＡを阻害）、ＡＺＤ１１５２（２−［［３−（｛４−［（５−｛２−［（３−フルオロフェニル）アミノ］−２−オキソエチル｝−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）アミノ］−キナゾリン−７−イル｝オキシ）プロピル］（エチル）アミノ］エチル二水素リン酸）およびＶＸ−６８０／ＭＫ−０４５７（シクロロプロパンカルボン酸｛４−［４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−６−（５−メチル−２Ｈ−ピラゾール−３−イルアミノ）−ピリミジン−２−イルスルファニル］−フェニル｝−アミド）の化学構造は開示され、当業者に知られている。
【０１３９】
細胞培養およびＡＺＤ１１５２ＨＰＱＡ耐性細胞系の作製
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；マナサス、バージニア州）からＳＷ６２０、ＨＣＴ−１５およびＡｓＰＣ１細胞系を入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って増殖させた。
【０１４０】
１μＭ  ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの存在下（１週間に２回培地を交換しつつ）３ヶ月の期間にわたって培養することにより、ポリクローナルＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を選択した。１２週間後、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡに対する感受性を評価した。薬剤選択後に親／薬剤耐性ペア各系統の時間を倍にしても、顕著な変化はなかった。全細胞を３７℃、５％ＣＯ２において維持した。
【０１４１】
フローサイトメトリー
Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（カタログ番号５５４７１４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）を用いたフローサイトメトリーにより、ＢＣＲＰまたはヒトＣＤ４４の細胞表面発現の決定を行った。サンプルをＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターにかけ、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）を用いて解析した。
【０１４２】
コロニー形成アッセイ
ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３およびそれぞれの親細胞系を洗浄し、６ウェルプレート中の薬剤を含まない培地に５００個／ウェルの細胞を播種した。次いで、２４時間後、化合物をＤＭＥＭまたはＲＰＭＩで希釈し、細胞に添加し、これを３７℃で７−１０日間培養した。次いで、細胞を固定し、０．２％クリスタルバイオレットで染色して可視化し、コロニーを計数した。
【０１４３】
マイクロアレイ解析
全ＲＮＡを単離し、その５μｇをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．（サンタクララ、カリフォルニア州）による標準的なプロトコールを用いたマイクロアレイ解析に用いた。ＩＶＴ標識化キットを用いて断片化した標識ｃＲＮＡを合成し、高密度Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３Ａバージョン２．０）と４５℃で一晩ハイブリダイズさせた。スキャンした画像および強度ファイルをＲｏｓｅｔｔａ  Ｒｅｓｏｌｖｅｒ遺伝子発現解析ソフトウエア、バージョン６．０（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ、カークランド、ワシントン州）に取り込んだ。ＲｅｓｏｌｖｅｒのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘエラーモデルを適用し、反復を組み合わせた。発現プロファイルは、各細胞系の３種の独立したサンプルから得られたｍＲＮＡに由来する。
【０１４４】
イムノブロット解析
ＳＷ６２０およびＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を洗浄し、薬剤を含まない培地で一晩増殖させた。ヒストンＨ３のリン酸化をモニターするため、細胞をＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡで９０分間処理し、次に、ホスファターゼ阻害剤カクテル１および２ならびにプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ミズーリ州））を添加したＢｉｏｓｏｕｒｃｅ（カマリロ、カリフォルニア州）製の細胞抽出バッファー（カタログ番号ＦＮＮ００１１）中で速やかに抽出した。続いて、ライセートを１０秒間探触子（ｐｒｏｂｅ）で超音波処理し、次に１５，０００ｇ、１５分間、４℃の遠心分離により清澄化した。ＳＤＳサンプルバッファーで処理した後、タンパク質抽出物をＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ４−１２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州））で分離した。サンプルをＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、カリフォルニア州））へ電気的に転写させ、一次抗体と一晩インキュベートし、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｄｕｒａ−Ｓｉｇｎａｌ化学発光試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）またはＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（リンカーン、ネブラスカ州）製のＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステムを用いて撮像した。
【０１４５】
細胞内および細胞外薬剤濃度の測定
ＳＷ６２０およびＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を洗浄し、薬剤を含まない培地で一晩増殖させた。次に、細胞を１μＭ  ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡで４時間処理した。サイトゾルにおける薬剤蓄積をＬＣ−ＭＳ分析により決定した。すなわち、細胞をＰＢＳで１回リンスし、細胞溶解バッファー中で抽出した。培地、ＰＢＳ洗浄液および細胞ライセートを２容の酸性化ＭｅＯＨで処理した。次に、１５０００ｇ、１５分間、４℃で遠心分離することによって、粗全細胞ライセートを清澄化し、不溶性細胞ペレットとサイトゾルを得た。不溶性細胞ペレットを５０％アセトニトリルで１：１０希釈し、１１，０００ｇで５分間遠心分離した。純粋化合物から作成した検量線と比較して、各画分におけるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ濃度を決定した。
【０１４６】
ｓｉＲＮＡによるＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４のサイレンシング
４種それぞれのｓｉＲＮＡ（ＡＢＣＢ１；カタログ番号ＬＱ−００３８６８、ＡＢＣＢ４；カタログ番号ＬＱ−００７３０２−００）およびルシフェラーゼｓｉＲＮＡ陰性対照（５’−ＡＡＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３’（配列番号３）の解析されたＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  ＳＭＡＲＴｐｏｏｌをＤｈａｒｍａｃｏｎ、Ｉｎｃ．（ラファイエット、コロラド州）から購入した。ＳＷ６２０およびＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞を洗浄し、１ウェル当たり３０，０００細胞で２４ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて、メーカーの取扱説明書に従って細胞を１オリゴ当たり最終濃度２５ｎＭのｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後に細胞を回収した。
【０１４７】
ＤＮＡ配列解析のためのＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて細胞系から全細胞ＲＮＡを単離し、ＵＶ吸光度分光法により定量した。Ｑｉａｇｅｎ製の（ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット）を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。オーロラＢプライマー（フォワードプライマー：５’−ＧＧＡＧＡＧＴＡＧＣＡＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＣＣ−３’（配列番号４）およびリバースプライマー：５’−ＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＣ−３’（配列番号５））をＰＣＲ増幅に用いた。オーロラＢネステッドプライマー（フォワードプライマー：５’−ＡＧＴＧＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＣＡＧＣＴＣＴＣ−３’（配列番号６）およびリバースプライマー：５’−ＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧＡＴＣ−３’（配列番号７））をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１サイクル配列解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティー、カリフォルニア州）による直接配列解析に用いた。Ａｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＤＮＡ配列解析実験室がＤＮＡ配列解析を行った。すなわち、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒバージョン３．１サイクル配列解析試薬を用いて、メーカー推奨のプロトコール（Ｐ／Ｎ４３３７０３５）に従ってＲＴ−ＰＣＲ産物の直接配列解析を行った。配列解析用プライマーは、５プライムおよび３’プライム増幅プライマーとそれぞれ１０および１１塩基が内部で入れ子形成している。３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒにおいて５０ｃｍアレイおよびＰＯＰ−７（商標）ポリマーを用いて、蛍光標識配列解析産物の電気泳動を行った。ＫＢベースコーラーを用いたＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓバージョン５．２により、ベースコーリングを行った。
【０１４８】
比較ゲノムハイブリダイゼーション
ＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州）を用いてゲノムＤＮＡを単離し、１００Ｋ  ＳＮＰ遺伝子型決定アレイセット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カリフォルニア州）にかけた。メーカーのプロトコールに従ってアレイを行った。マイクロアレイ生データファイルをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（受託番号ＧＳＥ７０６８）（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓは、ＭＩＡＭＥ対応データ寄託を支持する遺伝子発現／分子存在量のレポジトリおよび遺伝子発現データの走査、問い合わせおよび検索の監督されたオンライン提供のことである）およびＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（受託番号Ｅ−ＭＥＸＰ−１００８）（ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓは、ＭＧＥＤ推奨に従ってＭＩＡＭＥおよびＭＩＮＳＥＱＥ対応データ保存を目的とする、トランスクリプトミクスデータの公共のレポジトリである。ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ  Ｗａｒｅｈｏｕｓｅは、レポジトリにおける実験の監督されたサブセット由来の遺伝子指標の発現プロファイルを保存する。）にロードした。ＧＴＹＰＥソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カリフォルニア州）を用いてデータ処理し、各プローブセット（ＳＮＰ）の推定コピー数の情報を含むコピー数（．ｃｎｔ）ファイルを作成した。この．ｃｎｔファイルは、セット内の両方のアレイから組み合わせた情報を含んでいた。社内開発されたＵＮＩＸ（登録商標）ベースのソフトウエアパッケージ（Ｏｌｅｊｎｉｃｚａｋら、Ｍｏｌ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．、５（４）：３３１−３３９（２００７）を参照）であるＧｅｎｅＷａｌｋｅｒを用いてファイルを解析した。
【０１４９】
インビボ実験
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ウィルミントン、マサチューセッツ州、米国）から５−６週齢のＣ．Ｂ．−１７ｓｃｉｄ−ｂｇ（ｓｃｉｄ−ｂｇ）またはＣ．Ｂ．−１７ｓｃｉｄ（ｓｃｉｄ）マウスを入手し、８週齢を超えたおよび／またはサイズが約２０グラムを超えたときに実験に用いた。全動物実験は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ認定のＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に従って、米国農務省動物保護法による基準、動物実験の人道的管理と使用に関する公衆衛生局規範および実験動物の福祉に関するＮＩＨ指針を満たすまたはそれに勝る条件下で、特定の無病原体環境で行った。明らかな脱水の兆候、毛づくろいの不足、嗜眠、１５％を超える体重減少および体重の２０％を超える腫瘍体積は、腫瘍エンドポイントの決定に用いた。
【０１５０】
ＡＴＣＣ（マナサス、バージニア州）からＳＷ６２０細胞系を入手し、その推奨するところに従って抗生物質なしで培養し、インビボ接種前に定期的にマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）の試験をして感染性微生物ＰＣＲ増幅試験（ＩＭＰＡＣＴ；Ｍｉｓｓｏｕｒｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コロンビア、ミズーリ州）により微生物が存在しないことを確認した。１ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ基礎培地（ＤＭＥＭ）でＳＷ６２０細胞を培養し、３７℃で、５％ＣＯ２、９５％空気で平衡化した加湿雰囲気で維持し、対数期における腫瘍細胞接種の場合、継代３−７の間用いた。細胞（１−２×１０６）をマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）と１：１で混合し、雌マウスの剪毛した側腹部に皮下注射（０．２ｍｌ）した。投薬が始まる前に腫瘍をサイズ適合（４０８−６０５ｍｍ３）し、処置群に割り当てた。２本の交差する直径をノギスで測定し、腫瘍体積を式、（長さ×幅２）／２により概算した。腫瘍成長速度における処置効果は、［（Ｘ日目における処置群の平均腫瘍体積／Ｘ日目における対照賦形剤群の平均腫瘍体積）×１００］により計算される、９６Ｔ／Ｃｄａｙを決定することによって評価した。１００−算出した％Ｔ／Ｃｄａｙによって、％ＴＧＩを計算した。１０％Ｓｏｌｕｔｏｌ（ＢＡＳＦ、フローラム・パーク、ニュージャージー州）および９０％酒石酸（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を含む賦形剤において、ＶＸ−６８０を腹腔内投与した（ｉ．ｐ．、５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）を最後まで；エンドポイントに達して実験終了したときに依存して１７−２１日間）。２％エタノール、５％Ｔｗｅｅｎ２０、２０％ＰＥＧ−４００および７３％ＨＰＭＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を含む賦形剤において、ＡＺＤ１１５２を腹腔内投与した（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、ｂ．ｉ．ｄ．×３、４日間投与、３日間休止を１−２サイクル）。
【０１５１】
結果
オーロラキナーゼ阻害剤の活性を無効にするために癌細胞が細胞自律的に利用できる潜在的なメカニズムを明らかにするため、ＡＺＤ１１５２、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの活性アルコールに生来耐性を有する細胞系を作製する試みがなされた。１μＭ  ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ（約５０倍のＩＣ５０）の存在下、３ヶ月の期間ＳＷ６２０結腸癌細胞を増殖させた。５代継代後、０．０１％未満の細胞がこの処理で生存していた（データなし）。初期選別期に生存していた細胞は、１μＭ  ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの存在下さらに３ヶ月間維持するか、または薬剤なしで同じ期間増殖させた。次に、親細胞および薬剤耐性細胞の全ゲノムマイクロアレイ解析を行って、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ耐性と相関する可能性のある遺伝子発現の変化を同定した。薬剤耐性ＳＷ６２０派生体（以後、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３と呼ぶ）において、ＭＤＲ１をコードするＡＢＣＢ１はアレイにおいて最も高度に過剰発現した遺伝子であり、これは２種類の異なるプローブセットによって同定された（図１Ａ、挿入図）。ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３において、ＡＢＣＢ１ほどではないが、第２の遺伝子であるＭＤＲ３をコードするＡＢＣＢ４もまた上方制御されることも観察された。公知の小分子トランスポーターをコードする遺伝子セットの中で、高度にディファレンシャルな発現を示すのはＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４の２種だけであった（図１Ａ）。７番染色体長腕の共通ゲノム遺伝子座（７ｑ２１．１）内にこれらの遺伝子が並んで存在することを考慮すると、ＡＢＣＢ１とＡＢＣＢ４の明らかな同時上方制御は興味深い。このことは、ＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４を含むゲノム領域が、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ選択の間に増幅され、これらトランスポーター遺伝子のタンデムな過剰発現をもたらした可能性があることを示唆する。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）解析により、親系統ＳＷ６２０と比べてＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３においてＡＢＣＢ１（５コピー）とＡＢＣＢ４（３コピー）両方のＤＮＡコピー数の増加が観察された（図１Ｂ）。ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３において、両方の遺伝子のコピー数変化は、培地からＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡを退薬した後３ヶ月間維持され（図１Ｂ）、これは耐性の表現型が遺伝子増幅と一致する持続的な遺伝的事象を伴うことを示した。ＭＤＲ１は、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの存在下で増殖した細胞においてタンパク質レベルで高度に上方制御され、選択圧がなくなった後であっても持続した（図１Ｃ）。
【０１５２】
ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３派生体は、オーロラＢ基質であるヒストンＨ３のリン酸化阻害のために、親系統より約１００倍多いＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡを必要とした（図２Ａ）。ＭＤＲ１はＡＴＰ依存性の生体異物トランスポーターであるため、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３の細胞内区画からの流出によりＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡが除去される可能性があり、したがってヒストンＨ３リン酸化が残ることは合理的である。ＬＣ−ＭＳ分析により、親系統ＳＷ６２０細胞と比べて顕著に少ない薬剤が耐性系統のサイトゾルで測定された（図２Ｂ）。ＭＤＲ１（Ｇｉｒｄｌｅｒ、Ｆ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１５：５５２−５６２（２００８）、Ｔｗｅｎｔｙｍａｎ  ＰＲ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、２７：１６３９−１６４２（１９９１）を参照）およびＭＤＲ３（Ｂｏｅｓｃｈ、Ｄ．、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５１：４２２６−４２３３（１９９１）を参照）の小分子阻害剤であるＰＳＣ−８３３は、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３細胞のＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ耐性を後退させるのに効果的であった（図２Ｃ）。ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３において、ｓｉＲＮＡによるＡＢＣＢ１の部分ノックダウン（約７５％）は、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡによるヒストンＨ３リン酸化の阻害を部分的に回復させ（図２Ｄ）、これはこのモデルにおける完全なＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ耐性にＡＢＣＢ１が必要とされることを示唆した。
【０１５３】
５０％（ｖ／ｖ）マウス血漿の存在下でアッセイした場合、ＳＷ６２０またはＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３（それぞれ０．０２または２μＭ）におけるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの内因性効力の産物およびＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの効力の倍数的減少を計算することによって、オーロラＢの阻害に必要なＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの最小腫瘍内濃度を評価した（効力喪失は恐らく血漿タンパク質の結合が原因である；データなし）。この推測に基づくと、ヒストンＨ３リン酸化の阻害を生じるためには、それぞれＳＷ６２０またはＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３異種移植片において、０．１または１０μＭのＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ最小閾値濃度が達成されなければならない（図３Ａ、上パネル）。投薬後２４時間の期間にわたり、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡの１回のＩＰ投与後に腫瘍薬物動態を評価した。この解析は、親コホートと比較したＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３異種移植片における腫瘍ＡＵＣ全体の減少を示した。前述の推測に基づくと、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３腫瘍におけるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ濃度は、ほんの短い期間（約６時間）最小閾値濃度を超えた一方、ＳＷ６２０腫瘍において閾値を超える濃度が少なくとも２４時間達成された（図３Ａ、下パネル）。それに応じて、親系統の腫瘍と比べると、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３で一過性のヒストンＨ３リン酸化阻害だけが観察された。倍数体化は有糸分裂におけるオーロラＢ阻害の徴候であるため、腫瘍における増殖細胞が１回有糸分裂を試みるのに十分な長さ、またはほぼ１回の細胞周期に相当する期間（１５−２０時間）、最小閾値濃度でＡＺＤ１１５２が存在したに相違ないことが予見される。親系統ＳＷ６２０異種移植片におけるオーロラＢの持続した阻害は、このモデルで観察された非常に有効な活性に付随し、一方、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３腫瘍に観察された一過性阻害は、いずれの用量においても抗腫瘍効果をほとんど生じないまたは生じない（ｃｆ．図３Ｂ対図３Ｃ−Ｄ）。
【０１５４】
これらのモデルにおいて遺伝子ＡＢＣＢ１およびＡＢＣＢ４の上方制御がインビトロとインビボの両方でＡＺＤ１１５２の抗癌特性への耐性を付与するのであれば、次のステップは、これら推定オーロラ阻害剤耐性遺伝子の存在が内因性腫瘍耐性の確実な前兆となるか否かを解明することである。ヒト異種移植片パネルから得られた内部遺伝子発現データ（データなし）を問い合わせ、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ１）の上方制御を示した腫瘍モデルを同定した。これらのモデルの中で、ＨＣＴ−１５およびＡｓＰＣ１は、それぞれ高レベルのＭＤＲ１をタンパク質レベルで発現することが確認された（図４Ａ）。３種類の代表的なオーロラキナーゼ阻害剤および公知のＭＤＲ１基質であるパクリタキセル（Ｓｍｉｔｈ  ＡＪ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５：２３５３０−２３５３９（２０００）を参照）をＨＣＴ−１５およびＡｓＰＣ１を組み入れた細胞系パネルにおけるコロニー形成および細胞増殖アッセイにおいて評価した。一般に、大部分の細胞系は、低ナノモル濃度範囲内のＩＣ５０を示すＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡに非常に感受性があった（４−１５ｎＭ；図４Ｂ）。対照的に、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３、ＨＣＴ−１５およびＡｓＰＣ１は、この化合物に対して有意な耐性を有する（それぞれ２、１．４および２．２、．６３μＭのＩＣ５０）。興味深いことに、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３、ＨＣＴ−１５およびＡｓＰＣ１の耐性の程度は低かったが、全オーロラキナーゼ阻害剤のＶＸ−６８０は、細胞系パネルにおいて同様の活性プロファイルを示した。予想通り、ＳＷ６２０ＡＢＣＢ１／３およびＨＣＴ−１５（ＡｓＰＣ１は除く）は天然の産物であるパクリタキセルには比較的感受性がなかった。オーロラＡ選択的化合物であるＭＬＮ８０５４の明らかな効力減少は観察されなかった。重要なことに、ＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡに比較的感受性のあるＳＷ６２０細胞系は、イムノブロット解析で検出可能なＡＢＣＢ４（ＭＤＲ３）を発現しなかった（図４Ａおよびデータなし）。ＰＳＣ−８３３およびフミトレモルギンＣを用いて、それぞれＨＣＴ−１５およびＡｓＰＣ１におけるＡＺＤ１１５２ＨＱＰＡ耐性にＢＲＣＰが必要とされることを確認した（図４Ｃ−Ｄ）。
【０１５５】
ＨＣＴ−１５結腸癌異種移植片の増殖は、ＡＺＤ１１５２かＶＸ−６８０のいずれかによる処理によっても衰えなかった（図４Ｅ）が、一方両方の治療法は、代替的な結腸癌モデルであるＨＣＴ１１６において（図４Ｄ）またＤｏＨＨ−２  Ｂ細胞リンパ腫異種移植片において（図４Ｃ）顕著な腫瘍増殖阻害を誘導した。
【０１５６】
当業者であれば、本開示が、目的を実行して記載の目標および利点ならびにそれらに特有の目標および利点を得るように十分に構成されていることを容易に理解できる。本明細書に記載されている分子複合体、方法、手順、処置、分子および特異的化合物は、目下好ましい実施形態の代表的なものであり、例示的であり、本発明の範囲の限定を目的とするものではない。当業者であれば、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本明細書に開示されている発明に対し様々な置き換えや修正が行われてよいことを容易に理解できる。
【０１５７】
本明細書に記載されているあらゆる特許および刊行物は、本発明が属す当業者の水準を示す。あらゆる特許および刊行物は、各刊行物それぞれが特にまた個々に参照により本明細書に組み込まれていることを示すのと同程度で、参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５８】
本明細書に例示的に記載されている発明は、本明細書に特に開示されていないいかなる要素（単数または複数）や、限定（単数または複数）がなくても適切に実行できる。したがって、例えば、本明細書における各事例において、用語「を含む」、「から実質的になる」および「からなる」のいずれも、それ以外の２個の用語に置き換えられてよい。用いられている用語および表現は、限定のための用語ではなく説明のための用語として用いられ、このような用語および表現の使用において、示され記載されている特性またはその一部のどの均等物も排除する意図はなく、請求されている本発明の範囲内で様々な修正が可能であることが認識されている。したがって、本開示は好ましい実施形態および任意の特性により特に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修正および変更が当業者により行われてよいこと、またこのような修正および変更が、添付の特許請求の範囲により定義されている本発明の範囲内にあると考えられることを理解するべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
0005616905.tif 000024
【図３Ｂ】
0005616905.tif 000025
【図３Ｃ】
0005616905.tif 000026
【図３Ｄ】
0005616905.tif 000027
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005616905.tif 000029
【図４Ｃ】
0005616905.tif 000030
【図４Ｄ】
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【配列表】
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