(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した糞便から核酸を回収するための糞便試料を調製処理する糞便処理容器において、
前記糞便を懸濁する懸濁液を保持する懸濁液保持部と、
前記懸濁液保持部に前記糞便を導入する導入機構と、
前記核酸を安定化させる糞便処理液を保持する処理液保持部と、
前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を開放する開放機構と、
を備え、
前記糞便処理液は、水溶性アルコールである糞便処理容器。
【請求項２】
前記開放機構は、前記懸濁液保持部と前記処理液保持部とを連通する連通孔と、
前記連通孔内に設けられて連通を封止する封止部と、を備え、
前記処理液保持部は伸縮自在な容器であり、該処理液保持容器を縮めることによる処理液の圧力増大によって封止部の封止を解除して、前記糞便処理液を前記懸濁液側に流入させる請求項１に記載の糞便処理容器。
【請求項３】
前記処理液保持部は、軸線方向に伸縮自在であり、全糞便処理液を前記懸濁液保持部側に流入させる請求項１または２に記載の糞便処理容器。
【請求項４】
前記開放機構は、前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を封止する封止部と、
前記封止部を穿って前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を開放する突起部と、
を備える請求項１に記載の糞便処理容器。
【請求項５】
前記開放機構は、前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を封止する封止部と、
前記封止部を押圧して前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を開放する突起部と、
を備える請求項１に記載の糞便処理容器。
【請求項６】
前記処理液保持部は、前記懸濁液保持部内部に形成されるとともに、その懸濁液保持部およびその処理液保持部は弾性材で形成され、
前記懸濁液保持部および前記処理液保持部の外部からの押圧によって前記処理液保持部を破断し、
前記糞便処理液を前記懸濁液側に流入させる請求項１に記載の糞便処理容器。
【請求項７】
前記処理液保持部は、前記懸濁液保持部の内部に形成されるとともに、その懸濁液保持部およびその処理液保持部は弾性材で形成され、さらに、前記処理液保持部の一部の抗張力が前記懸濁液保持部の抗張力に対して低く、前記懸濁液保持部および前記処理液保持部の外部からその懸濁液保持部およびその処理液保持部を折り曲げることによって、その処理液保持部の抗張力の低い一部が破断して、前記糞便処理液を前記懸濁液側に流入させる請求項１に記載の糞便処理容器。
【請求項８】
少なくとも前記懸濁保持部と前記処理液保持部とは別体であり、その懸濁液保持部とその処理液保持部とは互いに装着可能である請求項１に記載の糞便処理容器。
【請求項９】
前記懸濁液は、水、生理食塩水または、緩衝剤である請求項１に記載の糞便処理容器。
【請求項１０】
前記糞便試料は、前記水溶性アルコールを３０％以上含有する請求項１〜９のいずれか一つに記載の糞便処理容器。
【請求項１１】
前記水溶性アルコールは、エタノール、プロパノール及びメタノールからなる群から１つ以上選定される請求項１〜１０のいずれか一つに記載の糞便処理容器。
【請求項１２】
前記懸濁液及び／又は糞便処理液は、界面活性剤を含有する請求項１〜１１のいずれか一つに記載の糞便処理容器。
【請求項１３】
前記懸濁液及び／又は糞便処理液は、着色剤を含有する請求項１〜１２のいずれか一つに記載の糞便処理容器。
【請求項１４】
前記水溶性アルコールは、有機酸を含有する請求項８〜１１のいずれか一つに記載の糞便処理容器。
【請求項１５】
前記水溶性アルコールは、キレート剤、及び／又はポリカチオンを含む請求項８〜１１のいずれか一つに記載の糞便処理容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便中から核酸を効率よく回収するための糞便処理方法及び糞便処理容器に関する。
本願は、２００８年５月１２日に、日本に出願された特願２００８−１２５１４３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
現今、欧米と同様に日本においても、大腸がんの患者数は、年々急激に増加しており、大腸がんが、がん死亡率の上位を占めるようになっている。これは、日本人の食生活が欧米型の肉食中心となったことに原因があると考えられる。具体的には、毎年約６万人程度が大腸がんに罹患している。臓器別の死亡数については、胃がん、肺がんに続く３番目の多さであり、今後更なる増加も予想されている。一方で、大腸がんは、他のがんと異なり、発症の初期に治療することによって、１００％近く治癒可能である。したがって、大腸がんを早期がん検診の対象とすることは極めて有意義であり、大腸がんの早期発見のための検査方法の研究・開発が盛んに行われている。【０００３】
大腸がんの早期発見のための検査方法として、例えば、注腸検査、大腸内視鏡検査等が行われている。注腸検査とは、大腸にバリウムを注入し、大腸の粘膜面に付着させ、Ｘ線を照射しその表面の凹凸の撮影を行い、大腸の表面を観察する検査である。一方、大腸内視鏡検査とは、内視鏡により直接に大腸内部を観察する検査である。特に大腸内視鏡検査は、感度や特異性が高く、ポリープや早期がんの切除も同時に可能であるという利点も有している。【０００４】
しかしながら、これらの検査方法は、コストが高い上に被験者への負担が大きく、合併症のリスクを伴うという問題がある。例えば、注腸検査には、Ｘ線被爆や腸閉塞の危険性がある。また、大腸内視鏡検査は、内視鏡を直接大腸内に投入するため被験者へ侵襲的である。更に、内視鏡操作には熟練を要し、検査のできる施設が限られている。このため、これらの検査方法は、定期健診等の無症状の一般人を対象とした大腸がん検査に適していない。【０００５】
近年、大腸がんの一次スクリーニング法として、非侵襲的で低コストである便潜血検査が広く実施されている。便潜血検査は、糞便中に含まれる赤血球由来のヘモグロビンの有無を調べる検査であり、間接的に大腸がんの存在を予測する方法である。便潜血検査が広く利用される要因としては、便の採取や保存を常温で行うことができ、冷蔵・冷凍等の特別な保存条件も必要としないこと、及び、一般的な家庭で簡単に行うことができ、操作が非常に簡便であることが挙げられる。但し、便潜血検査では、感度が２５％程度と低く、大腸がんを見落とす確率が高いという問題がある。さらに、陽性的中率も低く、便潜血検査陽性の被験者の中で実際に大腸がん患者である割合は１０％以下であり、多くの偽陽性を含んでいる。このため、より信頼性の高い新たな検査法の開発が強く望まれている。【０００６】
定期健診等にも適した、非侵襲的で簡便であり、かつ信頼性の高い新たな検査方法として、糞便中のがん細胞の有無やがん細胞由来遺伝子の有無を調べる検査が注目されている。これらの検査方法は、直接的にがん細胞やがん細胞由来遺伝子の有無を調べるため、大腸がんの罹患に伴い間接的に生じる消化管からの出血の有無を調べる便潜血検査法に比べて、より信頼性の高い検査法になり得ると考えられる。【０００７】
糞便中のがん細胞等を精度よく検出するためには、糞便中のがん細胞由来核酸を効率よく回収することが重要である。特に、糞便中のがん細胞由来核酸は微量であり、かつ、糞便中には、消化残留物やバクテリアが大量に含まれているため、核酸は非常に分解され易い。このため、糞便試料から核酸、特にヒト等の哺乳細胞由来の核酸を効率よく回収するためには、糞便中の核酸の分解を防止し、検査操作時まで安定して保存し得るように糞便試料を調製することが重要である。このような糞便試料の糞便処理方法として、例えば、採取された糞便から、大腸等の消化管から剥離したがん細胞を分離する方法がある。糞便からがん細胞を分離することにより、バクテリア等由来のプロテアーゼやＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ等の分解酵素による影響を抑えることができる。糞便からがん細胞を分離する方法として、例えば、糞便から細胞を分離する方法であって、糞便をそのゲル氷点未満の温度に冷却して、糞便が実質的に完全な状態を残すようにゲル氷点未満の温度に維持しながら細胞を採取する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。また、通常周囲温度で、プロテアーゼ阻害物質、粘液溶解剤、殺細菌剤を有する輸送培地に糞便を分散させた後、大腸剥離細胞を単離する方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。【０００８】
一方で、細胞の形態を組織学的及び細胞学的に観察する場合に、採取された細胞の形態を観察時まで維持するために、ホルマリン固定やアルコール固定等の多くの固定方法が従来から行われている。これらの固定方法を応用した方法であって、哺乳細胞試料の長期保存及び保存後の細胞観察を可能にするための保存溶液として、以下の特殊な細胞溶液保存剤を用いる試料処理方法が開示されている（例えば、特許文献３参照）。この細胞溶液保存剤は、哺乳細胞を定着するために充分な量の水と；混和可能なアルコールと；溶液内での哺乳細胞の凝集を防ぐために充分な量の抗凝集剤と；細胞を保存する間、溶液のｐＨを４から７の範囲に保つ緩衝剤と；を含有する。
また、細胞の組織学的及び細胞学的観察に加え、保存後の細胞中のタンパク質や核酸等に対する分子学的解析をも可能とする保存溶液として、例えば以下の保存溶液を用いた試料処理方法が挙げられる。特許文献４では、緩衝成分、少なくとも１つのアルコール成分、固定剤成分、並びにＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質からなる群の少なくとも１つの分解を抑制する薬剤を含む普遍的収集培地を用いる試料処理方法が開示され、特許文献５では、５〜２０％ポリエチレングリコール及び８０〜９５％メタノールを含有した非水溶液を用いる試料処理法が開示されている。【０００９】
その他、特許文献６では、膣スワブ中の細菌やウィルスの核酸を安定化するためにアルコール又はケトンを含有し、タンパク質を沈殿または変性させる物質と、細胞への注入を促進する促進物質とを含有する試料処理液が開示されている。
また、特許文献７では、便潜血検査の目的で、０．０３ｇ程度の極少量の採取された糞便を、保存液等を含有した懸濁液に混合させて懸濁を行う糞便処理容器が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表平１１−５１１９８２号公報
【特許文献２】特表２００４−５１９２０２号公報
【特許文献３】特開２００３−１５３６８８号公報
【特許文献４】特表２００４−５００８９７号公報
【特許文献５】特表２００５−５３２８２４号公報
【特許文献６】特開２００１−１２８６６２号公報
【特許文献７】特許第２６６８８１５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上述した特許文献１のような低温を維持して糞便を処理する糞便処理方法においては、採便直後から糞便の冷却を行うことが必要となる。そこで、検診等のように家庭において採便が行われる場合には、採取後速やかに糞便を冷却することは非常に困難である。また、糞便の変質を防ぐために、糞便を凍結することが考えられるが、凍結させた糞便は、検査前に融解しなければならない。糞便試料中の核酸の分解等を可能な限り防止するために、融解操作は短時間であることが好ましいため、凍結させた糞便は、通常、融解前に粉砕して用いられている。
しかしながら、凍結させた糞便は、硬度が高いため粉砕し難く、取り扱いが困難である。また、粉砕時に凍結片が飛び散るため、汚染や感染の危険がある。また、特許文献２に示した殺細菌剤等を添加する糞便処理方法においては、冷却操作を必要とせず、室温で糞便試料の調製や保存が可能であるものの、糞便から大腸剥離細胞を分離する作業は煩雑である。さらに、殺細菌剤等により破壊されたバクテリア由来の核酸分解酵素やタンパク質分解酵素により、大腸剥離細胞及び大腸剥離細胞由来の核酸等が分解されてしまう。その結果、大腸がん検出の精度が低下するおそれがある。その他、細胞を生存させた状態で保存しているために、大腸剥離細胞中の遺伝子発現等の分子学的プロファイリングが培地中の抗生物質等の成分の影響や、時間経過に伴う劣化・分解等により糞便中の細胞が変化してしまうという問題もある。【００１２】
また、上述した特許文献３〜５に示した各保存溶液を用いる試料処理方法は、細胞を室温で安定して保存することができるが、この保存溶液は、組織、細胞のような不純物のない単離された細胞に対して用いられるものであり、糞便のような多種多様な物質が含まれている生体試料に直接用いることは困難である。糞便から単離された大腸剥離細胞に、上述した保存溶液を用いた場合、糞便中の大腸剥離細胞は微量であるため、単離された細胞から解析に充分な量の核酸を抽出することは困難を要する。また、特許文献６に示した試料処理液は、主に膣スワブ試料中の、主にバクテリア由来の核酸を安定して保存する為に用いられる。糞便は、大量のバクテリアと、大量の消化残留物と、極少量の哺乳細胞由来の核酸とが混在した状態である。特許文献６には、バクテリアよりもはるかに微量である哺乳細胞由来の核酸も安定して保存できる試料処理液については一切記載されていない。【００１３】
さらに、特許文献７に示した便潜血検査を行う糞便処理容器において、処理ができる糞便量は０．０３ｇ程度の微量であり、かつ、容器中に収容する糞便処理液は実質的に１種類である。このため、保存液を使用して糞便から核酸を回収する場合、懸濁液に保存液を添加する必要があり、懸濁液中の保存液の作用によって懸濁効率が低下し、核酸の回収効率も低下してしまい、高精度に核酸を回収することができない。【００１４】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、核酸を高精度に回収することが可能な糞便処理方法及び糞便処理容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明は、以下の手段を採用した。
すなわち、
【００２８】
（１）本発明は、採取した糞便から核酸を回収するための糞便試料を調製処理する糞便処理容器において、前記糞便を懸濁する懸濁液を保持する懸濁液保持部と；前記懸濁液保持部に前記糞便を導入する導入機構と；前記核酸を安定化させる糞便処理液を保持する処理液保持部と；前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を開放する開放機構と；を備え、前記糞便処理液は、水溶性アルコールである。
【００２９】
（２）上記（１）に記載の糞便処理容器に備えられた前記開放機構は、前記懸濁液保持部と前記処理液保持部とを連通する連通孔と；前記連通孔内に設けられて連通を封止する封止部と；を備え、前記処理液保持部は伸縮自在な容器であり、該処理液保持容器を縮めることによる処理液の圧力増大によって封止部の封止を解除して、前記糞便処理液を前記懸濁液側に流入させることが好ましい。
【００３０】
（３）上記（１）または（２）に記載の糞便処理容器に備えられた前記処理液保持部は、軸線方向に伸縮自在であり、全糞便処理液を前記懸濁液保持部側に流入させることが好ましい。
【００３１】
（４）上記（１）に記載の糞便処理容器に備えられた前記開放機構は、前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を封止する封止部と；封止部を穿って前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を開放する突起部と；を備えることが好ましい。
【００３２】
（５）上記（１）に記載の糞便処理容器に備えられた前記開放機構は、前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を封止する封止部と；封止部を押圧して前記懸濁液保持部と前記処理液保持部との間を開放する突起部と；を備えることが好ましい。
【００３３】
（６）上記（１）に記載の糞便処理容器に備えられた前記処理液保持部は、前記懸濁液保持部内部に形成されるとともに、該懸濁液保持部および該処理液保持部は弾性材で形成され、前記懸濁液保持部および前記処理液保持部の外部からの押圧によって前記処理液保持部を破断し、前記糞便処理液を前記懸濁液側に流入させることが好ましい。
【００３４】
（７）上記（１）に記載の糞便処理容器に備えられた前記処理液保持部は、前記懸濁液保持部内部に形成されるとともに、該懸濁液保持部および該処理液保持部は弾性材で形成され、さらに、前記処理液保持部の一部の抗張力が前記懸濁液保持部の抗張力に対して低く、前記懸濁液保持部および前記処理液保持部の外部から該懸濁液保持部および該処理液保持部を折り曲げることによって、該処理液保持部の抗張力の弱い一部が破断し、前記糞便処理液を前記懸濁液側に流入させることが好ましい。
【００３５】
（８）上記（１）に記載の糞便処理容器では、少なくとも前記懸濁保持部と前記処理液保持部とは別体であり、該懸濁液保持部と該処理液保持部とは互いに装着可能であることが好ましい。
【００３６】
（９）上記（１）に記載の糞便処理容器において使用される前記懸濁液は、水、生理食塩水または、緩衝剤であることが好ましい。
【００３９】
（１０）上記（１）〜（９）のいずれか一つに記載の糞便処理容器において使用される前記糞便試料は、前記水溶性アルコールを３０％以上含有することが好ましい。
【００４０】
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれか一つに記載の糞便処理容器において使用される前記水溶性アルコールは、エタノール、プロパノール及びメタノールからなる群から１つ以上選定されることが好ましい。
【００４４】
（１２）上記（１）〜（１１）のいずれか一つに記載の糞便処理容器において使用される前記懸濁液及び／又は糞便処理液は、界面活性剤を含有することが好ましい。
【００４５】
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか一つに記載の糞便処理容器において使用される前記懸濁液及び／又は糞便処理液は、着色剤を含有することが好ましい。
【００４６】
（１４）上記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の糞便処理容器において使用される前記水溶性アルコールは、有機酸を含有することが好ましい。
【００４７】
（１５）上記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の糞便処理容器において使用される前記水溶性アルコールは、キレート剤、及び／又はポリカチオンを含有することが好ましい。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によれば、糞便を懸濁液と混合させて懸濁した後に、糞便処理液と混合させるため、懸濁効率の向上によって核酸の回収効率と回収精度とを向上させるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施の形態１にかかる糞便処理容器１を示す模式図である。
【図２】実施の形態１にかかる糞便処理容器１を示す模式図である。
【図３】懸濁液を使用して回収されたＲＮＡ（Ａ）と懸濁液を使用せずに回収されたＲＮＡ（Ｂ）とを電気泳動法によって確認した図である。
【図４】実施の形態２にかかる糞便処理容器２を示す模式図である。
【図５】実施の形態２にかかる糞便処理容器２の変形例１である糞便処理容器３を示す模式図である。
【図６】実施の形態２にかかる糞便処理容器２の変形例２である糞便処理容器４を示す模式図である。
【図７】実施の形態３にかかる糞便処理容器５を示す模式図である。
【図８】実施の形態３にかかる糞便処理容器５を示す模式図である。
【図９】実施の形態３にかかる糞便処理容器５の変形例である糞便処理容器６を示す模式図である。
【図１０】実施の形態３にかかる糞便処理容器５の変形例である糞便処理容器６を示す模式図である。
【図１１】実施の形態４にかかる糞便処理容器７を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
以下、図面を参照して、本発明の実施形態である糞便処理方法及び糞便処理容器について説明する。なお、各実施の形態によって本発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一符号を付している。
【００５１】
（実施の形態１）
図１は、本発明の実施の形態１にかかる糞便処理容器１の概要構成を示す模式図である。この糞便処理容器１は、採便治具１００と、懸濁液保持部１１０と、処理液保持部１２０とを備える。これらの部材は、それぞれが密閉された状態で糞便処理容器１中に存在し、それぞれ脱着可能となっている。また、糞便試料調製用溶液を構成する懸濁液Ｓと糞便処理液Ｐとが、それぞれ懸濁液保持容器１１１と処理液保持容器１２１とに収容されている。
【００５２】
図１に示す糞便処理容器１において、懸濁液保持容器１１１に収容される懸濁液Ｓの液面の高さは、採便棒１０２に採取されている糞便サンプルＥより高く収容することが好ましい。また、液面の高さに合わせて液漏れを防止する弁等を設置してもよい。また、懸濁液保持容器１１１にはスライダ１１２が設置されており、蓋１０１を懸濁液保持容器１１１と接合する場合に、採便棒１０２に付着した余分な糞便をスライダ１１２が擦り切ることで糞便サンプルＥの量を一定量にする。尚、本実施形態では、懸濁液保持容器１１１に糞便サンプルＥを導入する、蓋１０１及び採便棒１０２を導入機構と呼ぶ。採便棒１０２で糞便サンプルＥを採取後、蓋１０１と懸濁液保持容器１１１とが接合され、一定量に調整された糞便サンプルＥが懸濁液Ｓと混合して懸濁されることによって糞便懸濁液を生成する。
【００５３】
次に、懸濁液保持容器１１１内で懸濁された糞便懸濁液が、糞便処理液Ｐと混合される。図２に示すように、処理液保持容器１２１の下部を押圧することによって処理液保持容器１２１内部の体積が減少するとともに、処理液保持容器１２１の内部圧力が上昇する。このとき、封止剤１３１が封止剤支承部１２２から懸濁液保持容器１１１内に放出され、糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとが混合する。なお、本実施形態では、封止剤１３１と封止剤支承部１２２とを開放機構とする。この混合液が、糞便から核酸を回収するための糞便試料となる。なお、処理液保持容器１２１は、材質としてアルミホイルなどの金属箔、ゴムまたはプラスチックで形成されることが好ましい。また、処理液保持容器１２１下部は、処理液保持容器１２１上部まで伸縮可能であり、懸濁液保持容器１１１内にすべての糞便処理液を流入させることができる。さらに、処理液保持容器１２１の伸縮を繰り返すことで、糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとの混合を効率良く行うことができる。
【００５４】
本発明の糞便処理方法において用いられる懸濁液Ｓは、特に限定しないが、生理食塩水、水、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等が挙げられる。
【００５５】
また、糞便処理液Ｐは、核酸を安定化させる作用を持つ水溶性有機溶媒を含有している。糞便処理液Ｐに含まれる水溶性有機溶媒は、核酸安定化効果を奏することができる化合物であれば特に限定されないが、糞便懸濁液と反応して核酸安定効果を損なわないよう注意する必要がある。水溶性有機溶媒として、例えば、アルコール、ケトン類、アルデヒド類等がある。ケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン等があり、アルデヒド類としては、アセトアルデヒド(アセチルアルデヒド)、ホルムアルデヒド（ホルマリン）、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサール（ｇｌｙｏｘａｌ）等が挙げられる。本発明において用いられる水溶性有機溶媒としては、水溶性アルコール、アセトン、メチルエチルケトンが好ましく、水溶性アルコールがより好ましい。また、入手容易性、取り扱い性、安全性等の点から、エタノール、プロパノール、又はメタノールがさらに好ましい。プロパノールは、ｎ−プロパノールでよく、２−プロパノールでよい。特にエタノールは、最も安全性が高く、家庭内でも容易に扱うことが可能であるため、定期健診等のスクリーニング検査において特に有用である。
なお、筆者らの検討で、糞便中の大腸剥離細胞等の哺乳細胞由来の核酸等を効率よく回収できることが見出されている。その糞便処理方法は、採取された糞便を、水溶性有機溶媒を有効成分とする糞便試料調製用溶液に混合させ、糞便と糞便試料調整用溶液とを混合した糞便試料中から腸内常在菌由来の核酸と、腸内常在菌以外の生物由来の核酸とを同時に回収する方法である。
【００５６】
糞便処理液Ｐ中の水溶性有機溶媒濃度は、糞便懸濁液と混合した後、有効な水溶性有機溶媒の濃度であることが望まれるため、最適な最終濃度になるように、容量、濃度を任意に設定することが必要とされる。糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとの混合後の混合液中の水溶性有機溶媒の最終濃度は、核酸安定化効果を奏することができる濃度であれば、特に限定されなく、水溶性有機溶媒の種類等を考慮して、適宜決定することができる。例えば、有効成分として水溶性アルコールやケトン類を用いる場合には、糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとが混合された後の混合液中の水溶性有機溶媒の濃度が３０％以上であることが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度が高濃度となるに従って、糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとを混合した場合に、糞便中の哺乳細胞等や腸内常在菌に水溶性有機溶媒の成分が迅速に浸透し、核酸の安定を速やかに奏することができる。
【００５７】
特に、有効成分として、水溶性アルコールを用いる場合には、糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとが混合された糞便試料の水溶性アルコールの濃度は３０％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５０〜８０％であることがさらに好ましく、６０〜７０％であることが特に好ましい。水溶性有機溶媒濃度が高い程、水分含量の多い糞便に対しても少量の糞便試料調製用溶液を用いることによって、核酸を安定するための十分な効果を得ることができる。
【００５８】
また、有効成分として、アセトン、メチルエチルケトンを用いる場合には、糞便試料のアセトン、メチルエチルケトンの濃度は３０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましい。その他、有効成分として、アセトアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド、グリオキサールを用いる場合には、糞便試料のこれらの有効成分の濃度は０．０１〜３０％の範囲が好ましく、０．０３〜１０％の範囲がより好ましく、３〜５％の範囲がさらに好ましい。
【００５９】
なお、糞便処理液Ｐに用いられる水溶性有機溶媒は、１種類の水溶性有機溶媒のみを含有していてもよく、２種類以上の水溶性有機溶媒の混合溶液でもよい。例えば、２種類以上のアルコールの混合溶液でもよく、アルコールと他種類の水溶性有機溶媒との混合溶液でもよい。核酸回収効率がより改善されるため、アルコールとアセトンの混合溶液でも好ましい。
【００６０】
なお、本発明の糞便処理方法に供される糞便は、動物のものであれば特に限定されないが、哺乳動物由来のものが好ましく、ヒト由来のものがより好ましい。例えば、定期健診や診断等のために採取されたヒトの糞便であることが好ましいが、家畜や野生動物等の糞便であってもよい。また、採取後一定期間保存されたものであってもよいが、採取直後のものが好ましい。さらに、採取された糞便は、排泄直後のものであることが好ましいが、排泄後時間を経たものであってもよい。
【００６１】
また、糞便サンプル量は、特に限定されないが、０．０５〜１ｇの範囲が好ましい。さらに、核酸回収の効果を高くするため、糞便サンプル量は、０．１〜１ｇの範囲が、特に好ましい。糞便サンプル量があまりに多くなってしまうと、採取作業に手間がかかり、採便容器も大きくなってしまうため、取り扱い性等が低下するおそれがある。逆に糞便サンプル量があまりに少量である場合には、糞便中に含まれる大腸剥離細胞等の哺乳細胞数が少なくなりすぎるため、必要な核酸量を回収できず、目的の核酸解析の精度が低下するおそれがある。また、糞便はヘテロジニアスである、つまり、多種多様な成分が不均一に存在しているため、哺乳細胞の局在の影響を避けるために、採糞時には、糞便の広範囲から採取することが好ましい。
【００６２】
また、懸濁液Ｓ、糞便処理液Ｐは界面活性剤を含有していても良い。糞便試料調製用溶液に含まれる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤であることが好ましい。その非イオン性界面活性剤として、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０、ＣＨＡＰＳ（３−［３−コラミドプロピルジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホネート）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０等がある。カオトロピック塩や界面活性剤の種類や濃度は、核酸を安定する効果が得られる濃度であれば、特に限定されなく、糞便量やその後の核酸回収・解析方法等を考慮して、適宜決定することができる。
【００６３】
その他、懸濁液Ｓ、糞便処理液Ｐには、適宜着色剤を添加してもよい。懸濁液Ｓ、糞便処理液Ｐを着色することにより、誤飲防止、糞便の色が緩和される等の効果が得られる。その着色剤としては、食品添加物として使用される着色料が好ましく、青色や緑色等が好ましい。例えば、ファストグリーンＦＣＦ（緑色３号）、ブリリアントブルーＦＣＦ（青色１号）、インジゴカルミン（青色２号）等が挙げられる。また、複数の着色剤を混合して添加してもよく、単独で添加しても良い。
【００６４】
また、懸濁液Ｓ、糞便処理液Ｐは、有機酸を含んでいてもよい。有機酸を添加することにより、糞便中に含まれる核酸の分解等による損失を最小限に抑えて、その水溶性有機溶媒中において核酸の安定性を向上させることができる。有機酸としては、直鎖脂肪酸、ジカルボン酸、アミノ酸、ヒドロキシ酸、及び芳香族又は複素環のポリカルボン酸、酢酸、アジピン酸、クエン酸、乳酸等が挙げられる。
特に、直鎖脂肪酸、ジカルボン酸、ヒドロキシ酸等が好ましく、酢酸、アジピン酸、クエン酸、乳酸がより好ましい。アジピン酸やクエン酸を用いることにより、特に優れた核酸高保存効果を得ることができる。その他、酢酸は、充分な核酸高保存効果を得ることができることに加えて、汎用されており、かつ経済的であることから好ましい。
【００６５】
なお、懸濁液Ｓ、糞便処理液Ｐは、１種類の有機酸のみを含有してもよく、２種類以上の有機酸を含有してもよい。また、本発明の糞便試料調製用溶液に添加される有機酸の量は、該糞便試料調製用溶液を酸性に維持することができる量であれば特に限定されなく、添加される有機酸の種類や、該糞便試料調製用溶液中の水溶性有機溶媒の種類や濃度等を考慮して適宜決定することができる。
【００６６】
また、懸濁液Ｓ、糞便処理液Ｐは、キレート剤、及び／又はポリカチオンを含んでいてもよい。キレート剤、及び／又はポリカチオンを添加することにより、糞便中に含まれている核酸解析に対する阻害物質を除去し、糞便から核酸を高純度に回収することができる。
【００６７】
キレート剤とは、キレート錯体を形成する配位子及び塩を意味する。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）等が挙げられる。なお、本発明の糞便試料調製用溶液は、１種類のキレート剤のみを含有してもよく、２種類以上のキレート剤を含有してもよい。
添加されるキレート剤の濃度は、糞便試料中の阻害物質を除去するために十分な濃度であれば、特に限定されなく、キレート剤の種類等を考慮して適宜決定することができる。好ましくは、本発明の糞便試料調製用溶液における最終濃度が０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲となるように、各キレート剤を添加する。
【００６８】
また、ポリカチオンとしては、陽イオン性官能基を含有して繰り返し構造を持つ高分子化合物およびその塩を意味する。陽イオンとしては、例えばアミノ基等がある。具体的には、ポリリジン又はポリアクリルアミドが好ましく、ポリリジンがより好ましい。更に、下記式（１）に示されるポリリジン等の側鎖に陽イオン性官能基を有するポリペプチドや、ポリアクリルアミド等の陽イオン性官能基を側鎖に含むモノマーを重合して得られるポリマー等が挙げられる。なお、これらのポリペプチドやポリマーは、分子全体として電気的に陽性であればよく、全ての繰り返し単位（アミノ酸やモノマー）の側鎖に陽イオン性官能基を有している必要はないが、全ての繰り返し単位の側鎖に陽イオン性官能基を有していることが好ましい。なお、本発明の試料調製用溶液は、１種類のポリカチオンのみを含有してもよく、２種類以上のポリカチオンを含有してもよい。
【００６９】
【化１】
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【００７０】
本発明の懸濁液Ｓ、糞便処理液Ｐに添加されるポリカチオンの濃度は、核酸含有試料中に含まれている阻害物質による阻害作用を低減させる効果（阻害作用低減効果）が得られるために十分な濃度であれば、特に限定されなく、ポリカチオンの種類や、核酸含有試料の種類、試料調製用溶液のｐＨ、試料調製用溶液と核酸含有試料との混合比等を考慮して適宜決定することができる。例えば、ポリカチオンとしてポリリジンを含有する場合には、試料調製用溶液のポリリジン濃度は、０．０１〜１．０ｍ重量％の範囲が好ましく、０．０１２５〜０．８ｍ重量％の範囲がより好ましく、０．０５〜０．４ｍ重量％の範囲がさらに好ましい。
【００７１】
なお、本発明の懸濁液Ｓ、糞便処理液ＰのｐＨは、酸性であることが好ましい。核酸の加水分解をより効果的に抑制できるためである。本発明の糞便試料調製用溶液としては、ｐＨが２〜６．５の範囲が好ましく、３〜６の範囲がより好ましく、４．５〜５．５の範囲がさらに好ましい。
【００７２】
また、糞便と懸濁液Ｓとの混合は、速やかに行われることが好ましい。糞便サンプルＥを懸濁液Ｓに混合させて懸濁した後に水溶性有機溶媒と混合することにより、水溶性有機溶媒の成分の浸透を迅速に行うことができる。その結果、核酸安定化効果が速やかに得られる。なお、糞便サンプルＥと懸濁液Ｓを混合させて懸濁する場合、または懸濁液Ｓと糞便処理液Ｐとを混合する場合に、物理的手法を用いて混合を行ってもよい。例えば、糞便処理容器を上下に転倒させて混合してもよく、ボルテックス等の振とう機にかけることにより混合してもよい。また、混合用粒子の存在下で混合してもよい。混合用粒子の種類・材質は、特に限定されなく、１種類の材質からなる粒子であってもよく、２種類以上の材質からなる粒子であってもよい。このような混合用粒子として、例えば、ガラス、セラミックス、プラスチック、ラテックス、金属等からなる粒子がある。その他、混合用粒子は、磁性粒子であってもよく、非磁性粒子であってもよい。
【００７３】
本発明の糞便処理方法において、特に、腸内常在菌以外の生物由来の核酸、すなわち、糞便試料中に大量に含まれている腸内常在菌由来の核酸よりも少量しか含まれていない核酸を標的核酸として解析する場合に、本発明の糞便試料調製用溶液を用いて糞便を調製することが好ましい。排泄後、時間の経過とともに糞便中の核酸は分解等により徐々に損なわれていく。このため、標的核酸が糞便中に少量しか存在していない核酸である場合には、核酸の分解が進行した糞便試料を用いて解析を行うと、解析に充分な量の標的核酸を回収することができない。また、排泄直後の糞便中には該標的核酸が存在していた場合であっても、核酸の分解が進行した糞便試料では、陰性（糞便中に標的核酸は存在していない）と判断されるおそれがある。すなわち、本発明の糞便試料調製用溶液を用いて糞便を調製することにより、糞便中の核酸を安定して保存することができる為、糞便中に少量しか存在していない核酸であっても、解析に充分な量の標的核酸を効率よく回収することができ、核酸解析の信頼性を向上させることができる。
【００７４】
上述した腸内常在菌以外の生物由来の核酸として、例えば、がん細胞由来の核酸等の哺乳細胞由来の核酸や、肝炎ウィルス等の感染症の初期または後期における該感染症の原因菌由来の核酸等がある。その他、寄生虫由来の核酸であってもよい。
【００７５】
なお、本発明において、腸内常在菌とは、糞便中に比較的大量に存在するバクテリア細胞であり、通常ヒト等の動物の腸内に生息する常在菌を意味する。その腸内常在菌としては、例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属等の偏性嫌気性菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属等の通性嫌気性菌等がある。
【００７６】
また、水溶性有機溶媒成分による核酸の安定化効果は、充分な水溶性有機溶媒の量が存在する限り、特に温度条件の影響は受けない。したがって、本発明の糞便処理方法によれば、通常糞便の採取が行われる温度下において、すなわち、室温において糞便の採取を行う場合であっても、糞便中の核酸の損失を抑えることができる。また、本発明の糞便処理方法によって調製された糞便試料は、室温で保存又は輸送した場合であっても、糞便試料中の核酸を安定して保持できる。但し、該糞便試料の保存は、５０℃以下で行うことが好ましい。この理由は、高温条件下で長期間保存することにより、該糞便試料中の水溶性有機溶媒の濃度が、揮発等により、核酸安定化効果を奏するに充分な濃度よりも低下するおそれがある。
【００７７】
本発明の糞便処理方法により調製された糞便試料は、水溶性有機溶媒の脱水作用やタンパク質変性作用によって、糞便中の核酸、特に哺乳細胞等由来の糞便中に比較的少量しか存在していない核酸を、より安定して維持することができる。このため、糞便試料を本発明の糞便処理方法によって調製した場合には、調製直後の糞便試料のみならず、長期保存後又は輸送後の糞便試料を用いて核酸解析を行った場合であっても、信頼性の高い解析結果を得ることが期待できる。特に、糞便に含まれている大腸剥離細胞等の哺乳細胞の分子学的プロファイリングに対する経時的な（時間の経過に対する）変化を最小限に抑えつつ、糞便中の核酸、特に哺乳細胞由来の核酸を長期間室温で安定して保存することができる。このため、採取された糞便を本発明の糞便処理方法を用いて調製することによって、検診等のスクリーニング検査のように、糞便採取後から核酸解析時まで間がある場合や、糞便採取場所が核酸解析場所から離れているような場合であっても、核酸、特に壊れやすいＲＮＡの分解を抑制しつつ、糞便試料を保存又は輸送することが可能である。また、冷蔵や冷凍のための特別な機器や保存温度条件を設定する必要がなく、簡便かつ低コストで糞便試料を保存又は輸送できる。
【００７８】
本発明の糞便試料は、核酸を含有するその他の生体試料と同様に、様々な核酸解析に供することができる。特に、早期発見の要請の強い、がんの発症や感染症の罹患の有無を調べるための核酸解析に供されることが好ましい。また、大腸炎、小腸炎、胃炎、膵炎等の炎症性疾患の発症の有無を調べるための核酸解析に供されることも好ましい。その他、ポリープ等の隆起性病変の検査や胃潰瘍等の様々な大腸、小腸、胃、肝臓、胆嚢、胆管の疾患の検査に供されてもよい。
【００７９】
例えば、糞便試料から、がん細胞由来の核酸、すなわち、変異等が起こっている核酸を検出し解析することにより、大腸がんや膵臓がん等のがんの発症の有無を検査できる。また、糞便試料から、感染症等の原因である病原菌由来の核酸、例えばウィルス由来の核酸や寄生虫由来の核酸等が検出されるかどうかを調べることにより、感染症の罹患の有無や寄生虫の存在の有無を調べることができる。特に、Ａ型・Ｅ型肝炎ウィルス等の糞便中に排出される病原菌の検出に糞便試料を用いることにより、非侵襲的かつ簡便に感染症検査を行うことができる。その他、腸内常在菌以外の病原バクテリア、例えば腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７等の食中毒菌や病原菌由来の核酸が検出されるかどうかを調べることにより、細菌感染症の罹患の有無を調べることもできる。
【００８０】
特に、核酸解析により、新生物性転化を示すマーカーや炎症性消化器疾患を示すマーカーを検出することが好ましい。該新生物性転化を示すマーカーとして、例えば、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、シアリルＴｎ抗原（ＳＴＮ）等の公知のがんマーカーや、ＡＰＣ遺伝子、ｐ５３遺伝子、Ｋ−ｒａｓ遺伝子等の変異の有無等がある。また、ｐ１６、ｈＭＬＨＩ、ＭＧＭＴ、ｐ１４、ＡＰＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＥＳＲ１、ＳＦＲＰ２等の遺伝子のメチル化の検出も、大腸疾患の診断マーカーとして有用である（例えば、Ｌｉｎｄ  ｅｔ ａｌ．、「Ａ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄ ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ、２００４年、第３巻第２８章参照）。その他、糞便試料中のヘリコバクターピロリ菌由来のＤＮＡが、胃がんマーカーとして用いられることが既に報告されている（例えばＮｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００４年、第４２巻第８号、第３７８１〜８ページ参照）。一方、炎症性消化器疾患を示すマーカーとして、例えば、Ｃｏｘ−２遺伝子由来の核酸等がある。
【００８１】
本発明の糞便処理方法によって調製された糞便試料からは、核酸を非常に効率よく回収することができる。よって、この糞便試料は、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸のみならず、微量に存在する哺乳細胞由来の核酸の解析に非常に好適に使用できる。特に糞便であることから、大腸、小腸、胃等の消化管細胞由来の核酸を解析することが好ましく、大腸剥離細胞由来の核酸を解析することが特に好ましい。
【００８２】
糞便試料中には、多種多様な物質が存在しており、核酸解析において阻害要因となり得る物質も多数存在している。このため、糞便試料から核酸を回収し、回収された核酸を用いて核酸解析を行うことにより、解析の精度をより向上させることができる。糞便試料から核酸を回収する方法は、特に限定されるものではなく、試料から核酸を回収する場合に通常用いられる方法であれば、いずれの方法によっても行うことができる。本発明の糞便試料中には、主に哺乳細胞等の腸内常在菌以外の生物（以下、哺乳細胞等ということがある。）由来の核酸と、腸内常在菌由来の核酸が含まれている。糞便試料からの核酸回収においては、哺乳細胞等由来の核酸と腸内常在菌細胞由来の核酸を別々に回収してもよいが、同時に回収することが特に好ましい。哺乳細胞等由来の核酸と腸内常在菌由来の核酸を同時に回収することにより、糞便中に大量に存在する腸内常在菌由来の核酸がキャリアーとして機能する結果、少数である哺乳細胞等由来の核酸を、哺乳細胞等を予め糞便から単離した後に核酸を回収する場合よりも、より効率的に核酸を回収し得る。なお、糞便試料から回収する核酸は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡの両方であってもよい。
【００８３】
上述した処理によって得られた糞便試料は、公知の手法で用途にあった、さまざまな処理を行うことができる。例えば、糞便試料にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等の、通常タンパク質の変性剤として用いられている化合物を添加することにより、糞便試料中のタンパク質を変性させることができる。カオトロピック塩や界面活性剤は、本発明の糞便試料調製用溶液に添加し得るカオトロピック塩及び界面活性剤として挙げたものと同様のものを用いることができ、有機溶媒としては、フェノールであることが好ましい。フェノールは中性であってもよく、酸性であってもよい。酸性のフェノールを用いた場合には、ＤＮＡよりもＲＮＡを選択的に水層に抽出することができる。なお、糞便試料にカオトロピック塩、有機溶媒、界面活性剤等を添加する場合には、１種類の化合物を添加してもよく、２種類以上の化合物を添加してもよい。
【００８４】
ここで、糞便処理容器１から糞便試料を取り出す場合に、採便治具１００を取り外してフィルタ付の蓋等に付け替えることによって糞便試料から大きな繊維質等の除去を行ってもよい。また、処理液保持容器１２１下部に予めフィルタを設置しておき、シール材等で蓋をして使用する際にシール材を剥がすことによって糞便試料を濾過してもよい。
【００８５】
また、上述したタンパク質変性処理後、核酸を回収する前に変性させたタンパク質を除去してもよい。核酸を回収する前に、予め変性させたタンパク質を除去することによって、回収される核酸の品質を向上できる。変性タンパク質の除去は、公知の手法で行うことができる。例えば、遠心分離により、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することによって、変性タンパク質を除去できる。また、クロロホルムを添加し、ボルテックス等により充分に攪拌混合させた後に遠心分離を行い、変性タンパク質を沈殿させて上清のみを回収することによって、単に遠心分離を行う場合よりも、より完全に変性タンパク質を除去できる。
【００８６】
タンパク質変性処理後の核酸の回収は、エタノール沈殿法や塩化セシウム超遠心法等の公知の手法で行うことができる。また、タンパク質変性処理において溶出させた核酸を無機支持体に吸着させた後、吸着させた核酸を無機支持体から溶出することにより、核酸を回収できる。核酸を吸着する無機支持体は、核酸を吸着できる公知の無機支持体を用いることができる。また、無機支持体の形状も特に限定されなく、粒子状であってもよく、膜状であってもよい。無機支持体として、例えば、シリカゲル、シリカ質オキシド、ガラス、珪藻土等のシリカ含有粒子（ビーズ）や、ナイロン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ニトロセルロース等の多孔質膜等がある。吸着させた核酸を無機支持体から溶出させる溶媒は、回収する核酸の種類やその後の核酸解析方法等を考慮して、これらの公知の無機支持体から核酸を溶出するために通常用いられている溶媒を適宜用いることができる。溶出用溶媒として、特に精製水が好ましい。なお、核酸を無機支持体に吸着させた後、核酸を吸着させた無機支持体を適当な洗浄バッファーを用いて洗浄することが好ましい。
【００８７】
なお、糞便試料が、哺乳細胞等から核酸を溶出するために充分な濃度のカオトロピック塩や界面活性剤を含む糞便試料調製用溶液を用いて調製されている場合には、糞便試料からの核酸の回収において、タンパク質変性処理を省略することもできる。
【００８８】
糞便試料が、哺乳細胞等から核酸を溶出するために充分な濃度のカオトロピック塩や界面活性剤を含まない糞便試料調製用溶液を用いて調製されている場合には、タンパク質変性処理の前に、糞便試料から固形成分を回収することが好ましい。糞便試料は、糞便サンプルＥと糞便試料調製用溶液とを迅速に混合させるために、糞便中の固形成分に対する液体成分の比率が大きい。そこで、糞便試料から糞便試料調製用溶液を除去し、哺乳細胞等や腸内常在菌を含む固形成分のみを回収することにより、核酸の回収及び解析における試験者の負担・設備等に要するスケールを小さくできる。また、固形成分から水溶性有機溶媒を除去することによって、固形成分から核酸を回収する工程における水溶性有機溶媒の影響を抑えることもできる。例えば、糞便試料を遠心分離することにより、固形成分を沈殿させ、上清を除去することにより、固形成分のみを回収できる。その他、フィルタ濾過等によっても、固形成分のみを回収できる。さらに、回収された固形成分をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）等の適当なバッファーを用いて洗浄することも好ましい。
【００８９】
なお、回収された固形成分に、カオトロピック塩等のタンパク質変性剤を直接添加してもよいが、一度適当な溶出用薬剤に懸濁させた後にタンパク質変性剤を添加することが好ましい。ＤＮＡを回収する場合には、溶出用薬剤として、例えば、リン酸バッファーやトリスバッファー等を用いることができる。高圧蒸気滅菌等により、ＤＮａｓｅを失活させた薬剤が好ましく、さらにプロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有させた薬剤がより好ましい。一方、ＲＮＡを回収する場合には、溶出用薬剤として、例えば、クエン酸バッファー等を用いることができるが、ＲＮＡは非常に分解され易い物質であるため、チオシアン酸グアニジンや塩酸グアニジン等のＲＮａｓｅ阻害剤を含有したバッファーを用いることが好ましい。
【００９０】
その後の解析方法によっては、糞便試料から核酸を回収しなくてもよい。具体的には、糞便試料中の哺乳細胞等や腸内常在菌から核酸を溶出させた後、そのまま核酸解析に用いることができる。例えば、糞便試料中に病原菌等が大量に存在している場合であって、その病原菌由来の核酸を解析する場合には、糞便試料から固形成分のみを回収した後、その固形成分にプロテイナーゼＫ等のタンパク質分解酵素を含有するＰＢＳ等の溶出用薬剤を添加して混合する。これにより得た均一な糞便試料溶液を、そのまま核酸解析に用いることにより、病原菌由来の遺伝子等を検出することができる。その他、糞便試料からの核酸の回収は、核酸抽出キットやウィルス検出キット等の市販のキットを用いても良い。
【００９１】
糞便試料より回収された核酸は、公知の核酸解析方法を用いて解析することができる。核酸解析方法として、例えば、核酸を定量する方法や、ＰＣＲ等を用いて特定の塩基配列領域を検出する方法等がある。その他、ＲＮＡを回収した場合には、逆転写反応（ＲＴＰＣＲ：Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)によりｃＤＮＡを合成した後、そのｃＤＮＡを用いて、ＤＮＡと同様に解析に用いることができる。例えば、がん遺伝子等がコードされている塩基配列領域や、マイクロサテライトを含む塩基配列領域等の遺伝的変異の有無を検出することにより、がんの発症の有無を調べることができる。糞便試料から回収されたＤＮＡを用いた場合には、例えば、ＤＮＡ上のメチル化や、塩基の挿入、欠失、置換、重複、又は逆位等の変異を検出できる。また、回収されたＲＮＡを用いた場合には、例えば、ＲＮＡ上の塩基の挿入、欠失、置換、重複、逆位、又はスプライシングバリアント（アイソフォーム）等の変異を検出できる。また、ＲＮＡ発現量も検出できる。特に、ｍＲＮＡの発現解析、Ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異解析、及びＤＮＡのメチル化の解析等を行うことが好ましい。なお、これらの解析は、この分野において公知の方法により行うことができる。また、Ｋ−ｒａｓ遺伝子変異解析キット、メチル化検出キット等の市販の解析キットを用いてもよい。
【００９２】
図３は、懸濁液Ｓを使用して糞便サンプルＥを処理した糞便試料から回収されたＲＮＡと、懸濁液Ｓを使用せずに糞便サンプルＥを処理した糞便試料から回収されたＲＮＡとを比較した電気泳動像である。
【００９３】
試料Ａは、糞便と４ｍｌのＰＢＳと混合させ１０秒間振とうして懸濁した後、６ｍｌの１００％エタノールを添加し、１０秒間振とうした後、公知の技術によりＲＮＡを抽出したサンプルである。試料Ｂは、糞便に１０ｍｌの７０％エタノールを添加して２０秒間振とうした後、公知の技術によりＲＮＡを抽出した試料である。両試料に用いられた糞便は、糞便採取から１時間以内に１ｇずつ採便治具で同糞便から採便されたものである。また、調製された試料Ａ，Ｂの最終的なエタノールの濃度は等しい。
【００９４】
上述した糞便処理方法によって調製された試料Ａ，Ｂを室温で２４時間放置した後ＲＮＡ抽出を行った。ＲＮＡの回収は、具体的には、次のようにして行った。まず、試料Ａ，Ｂの各チューブを遠心分離し、上清を除去して得られた固形成分に３ｍＬのフェノール混合物「ＩＳＯＧＥＮ」（ニッポンジーン社製）を添加して３０秒以上ホモジナイザーで十分に混合した。その後、３ｍＬのクロロホルムを試料Ａ，Ｂの各チューブへ添加し、ボルテックスを用いて十分に混合した後、１２，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理を行った。試料Ａ，Ｂの各チューブ中の遠心分離処理によって得られた上清（水層）を、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｄｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）のＲＮＡ回収用カラムに通し、そのｋｉｔに添付のプロトコールに従ってＲＮＡ回収用カラムの洗浄操作及びＲＮＡ溶出操作を行うことにより、試料Ａ，Ｂ由来のＲＮＡを回収した。
【００９５】
その後、試料Ａ，Ｂにおいて回収したＲＮＡをＲＮＡ６０００ Ｎａｎｏアッセイキット(Ａｇｉｌｅｎｔ社)で電気泳動を用い、アジレント２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）で試料Ａ，Ｂから回収した各ＲＮＡを検出した(手順はキットに付録されるマニュアルを参照）。図３のマーカーは、２５ｎｔ〜４０００ｎｔの各ヌクレオチド数を示す標準試料であり、試料を構成するＤＮＡまたはＲＮＡの構成単位の目安として用いている。
【００９６】
図３において試料Ａ，Ｂのバンドパターンを比較した結果は以下である。試料Ａのバンドパターンでは、矢印Ｌで表す３０００ｎｔ辺りと矢印Ｍで表す１５００ｎｔ辺りとにそれぞれ濃いバンドが確認された。試料Ｂのバンドパターンにおいては、矢印Ｌ，Ｍ付近に若干バンドが確認出来る程度となっている。この手法では、バンドの濃さが濃度と比例するため、矢印Ｌ，Ｍ付近の試料ＡのＲＮＡの濃度（すなわち試料ＡのＲＮＡの回収量）が試料ＢのＲＮＡの濃度（すなわち試料ＢのＲＮＡの回収量）を大きく上回っていることを示す。ここで、矢印Ｌは２３Ｓ、矢印Ｍは１６Ｓの質の良いバクテリア由来のＲＮＡのバンドを示している。この２３Ｓ，１６ＳＲＮＡの回収量を向上させることは、分析精度の向上にも繋がる。また、２５ｎｔ〜５００ｎｔにおいては試料Ｂの方がＲＮＡの回収量が全体的に濃くなっている。これは、本来矢印Ｌ，Ｍ付近に現れるＲＮＡが分解されたことを表している。この結果は、糞便を糞便処理液で処理する前に懸濁液Ｓで糞便を処理することによって、分解されていないＲＮＡが高精度で回収出来ていることを示している。
【００９７】
ここで、従来の糞便処理方法、例えば低温を維持して核酸の回収を行う方法では温度条件の設定が重要であり、殺細菌剤等を添加する方法では、糞便から大腸剥離細胞を分離する作業が煩雑であるという問題があった。また、保存溶液を用いる方法は、ほぼ単離された細胞に対してのみに効果的であり、糞便のような多種多様な物質が含まれている生体試料に直接用いることは処理が困難なうえ、回収効率も低い。従来の糞便処理容器では、容器内で懸濁可能であるが、処理液等も懸濁液Ｓ中に添加する必要があるため、核酸の回収効率が低下するという問題があった。
【００９８】
これに対して、実施の形態１にかかる糞便処理方法及び糞便処理容器は、予め本発明の糞便試料調製用の溶液を収容した採便容器に糞便を採取することによって、簡易に採取された糞便から糞便試料を調製し、かつ高精度に核酸の回収を行うことができる。また、常温において処理可能であり、懸濁液を用いることによって糞便を懸濁した後、糞便処理液によって試料中の核酸を安定な状態にして、その後のさまざまな処理を行うことが可能となる。また、本発明の処理容器の操作性（使用方法）も簡易であるため、家庭において使用することが可能である。さらに、本発明の処理容器では懸濁液と糞便処理液とが分かれて収容されるため、各溶液を選択的に収容することが可能となり、様々な処理を行う上で有用である。
【００９９】
（実施の形態２）
図４は、本発明の実施の形態２にかかる糞便処理容器２の概要構成を示す模式図である。この糞便処理容器２は、採便治具２００と、懸濁液保持部２１０と、処理液保持部２２０とを備え、それぞれが密閉された状態で糞便処理容器２中に存在し、それぞれ脱着可能となっている。また、糞便試料調製用の溶液を構成する懸濁液Ｓと糞便処理液Ｐとが、それぞれ懸濁液保持容器２１１と処理液保持容器２２１とに収容されている。
【０１００】
図４において、糞便は採便治具２００の採便棒２０３によって採便される。採便棒内部にはピストン２０２がはめ込まれており、このピストン２０２を調節することで採便量を一定量（調整）とすることができる。採便棒２０３によって採便した後、蓋２０１を懸濁液保持容器２１１と接合してピストン２０２を押すことによって、糞便サンプルＥが押し出され、懸濁液Ｓと混合させて懸濁し、糞便懸濁液となる。尚、本実施形態では、懸濁液保持容器２１１に糞便サンプルＥを導入する、蓋２０１、採便棒２０３、ピストン２０２とを合わせて導入機構と呼ぶ。その後、懸濁液保持容器２１１を処理液保持容器２２１に押し込むと、突起部２１２の突起が、処理液保持容器２２１を封止していた封止膜２２２を穿って、封止膜２２２が破断し、糞便処理液Ｐと糞便懸濁液が混合する。尚、本実施形態では、突起部２１２と封止膜２２２とを開放機構と呼ぶ。糞便処理液Ｐと糞便懸濁液とは、突起部２１２周囲の連通孔２１３によって流通可能であり、糞便処理容器２を上下に反転させることで容易に混合出来る。実施の形態１と同様に、糞便試料を取り出す機構は、蓋２０１を、フィルタを有した蓋と取り替えて濾過してもよく、処理液保持容器２２１下部にフィルタを形成させてもよい。
【０１０１】
ここで、図４に示す糞便処理容器２の変形例１である糞便処理容器３を、図５を参照して説明する。糞便処理容器３は、糞便処理容器２と同様に採便治具３００と、懸濁液保持部３１０と、処理液保持部３２０とで構成されている。更に、採便治具３００にはピストン３０２が設置されており、懸濁液保持容器３１１に懸濁液Ｓ、処理液保持容器３２１に糞便処理液Ｐが収容されている。尚、本実施形態では、懸濁液保持容器３１１に糞便サンプルＥを導入する、蓋３０１、採便治具３００、ピストン３０２とを含む部材を導入機構と呼ぶ。糞便処理容器３では、球状の封止剤３３１が封止剤支承部３２２に保持されて糞便処理液Ｐが懸濁液Ｓに流れ込まないようになっている。突起部３１２が、球状の封止剤３３１を処理液保持容器３２１内に押し込むことによって、糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとが互いに連通孔３１３を流通して混合する。尚、本実施形態では、封止剤３３１、封止剤支承部３２２と突起部３１２とを含む部材を開放機構と呼ぶ。
【０１０２】
また、糞便処理容器２の変形例２である糞便処理容器４を、図６を参照して説明する。図６に示す糞便処理容器４は、採便治具４００と、懸濁液保持部４１０と、処理液保持部４２０とで構成され、懸濁液保持容器４１１に懸濁液Ｓ、処理液保持容器４２１に糞便処理液Ｐが収容されている。さらに、懸濁液保持部４１０は、突起部４１２及び採便棒４０３に付着した余分な糞便を擦り切るスライダ４１４を備え、スライダ４１４の下部には網状のフィルタを有するサンプル裁断部４１５が形成されている。サンプル裁断部４１５によって、ピストン４０２から押し出された糞便サンプルＥは、糸状となって懸濁液Ｓ中に排出される。よって、粘度の高い糞便においても簡易に懸濁することが出来る。尚、本実施形態では、懸濁液保持容器４１１に糞便サンプルＥを導入する、蓋４０１、採便棒４０３、スライダ４１４、ピストン４０２、サンプル裁断部４１５とを含む部材を導入機構と呼ぶ。
その後、突起部４１２が、封止剤支承部４２２に保持されている封止剤４３１を処理液保持容器４２１内に放出することで得られた糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとが互いに連通孔４１３を流通して混合する。尚、本実施形態では、封止剤４３１、封止剤支承部４２２と突起部４１２とを含む部材を開放機構と呼ぶ。
【０１０３】
実施の形態２では、ピストン２０２，３０２，４０２を用いることによって、採便量を変更した場合でも対応可能となる。また、ピストン４０２を押し出すことによって糞便サンプルＥを、裁断部４１５によって糸状に裁断することで、粘度の高いサンプルにおいても懸濁によって細かく分散させることが可能となり、高精度に核酸の回収を行うことができる。
【０１０４】
（実施の形態３）
図７は、本発明の実施の形態３にかかる糞便処理容器５の概要構成を示す模式図である。図７に示す糞便処理容器５は、採便治具５００と、懸濁液保持部５１０と、処理液保持容器５２１とを備え、それぞれが密閉された状態で糞便処理容器５内に存在する。また、糞便試料調製用の溶液を構成する懸濁液Ｓと糞便処理液Ｐとが、それぞれ懸濁液保持容器５１１と処理液保持容器５２１とに収容されている。
【０１０５】
糞便処理容器５では、懸濁液保持容器５１１内に、処理液保持容器５２１が収容されている。懸濁液保持容器５１１および処理液保持容器５２１は、弾性材で形成されており、抗張力は処理液保持容器５２１の方が低くなっている。採便棒５０２によって糞便サンプルＥを採取し、懸濁液保持容器５１１と蓋５０１とを接合すると同時に、スライダ５１２によって採便棒５０２に付着する余分な糞便が擦り切られる。その後、懸濁液Ｓと糞便サンプルＥとを混合させて懸濁し、得られた糞便懸濁液を糞便処理液Ｐと混合する。
【０１０６】
糞便処理液Ｐを混合させる方法は、図８に示すように、懸濁液保持容器５１１の処理液保持容器５２１付近を押圧して処理液保持容器５２１の内部圧力を上昇させることによって、処理液保持容器５２１を破断して内部の糞便処理液Ｐを糞便懸濁液中に開放する。
なお、懸濁液保持容器５１１と処理液保持容器５２１とに抗張力の差異を設けることで、押圧によって処理液保持容器５２１のみが破断される。ここで混合されて得られた糞便試料が核酸の回収に用いられる。
【０１０７】
なお、処理液保持容器５２１は、シリコンゴム等の軟性樹脂を用いて形成することが好ましい。また、懸濁液保持容器５１１は、密閉性を保つため、蓋５０１との接合部を硬性の樹脂で形成することにより押圧によって変形し難くしてもよい。また、採便棒５０２先端を尖らせることによって、処理液保持容器５２１を破断させてもよい。
【０１０８】
また、糞便処理容器５の変形例である糞便処理容器６を、図９を参照して説明する。図９に示す糞便処理容器６は、採便治具６００と、懸濁液保持部６１０と、処理液保持容器６２１とで構成され、採便治具６００には採便棒６０２、懸濁液保持部６１０にはスライダ６１２が形成されている。また、懸濁液保持容器６１１および処理液保持容器６２１は弾性材等で形成されている。この為、処理液保持容器６２１の一部に懸濁液保持容器６１１より抗張力の低い部分を設け、懸濁液保持容器６１１および処理液保持容器６２１を折り曲げることで、処理液保持容器６２１の抗張力の低い部分が破断される。なお、少ない労力で破断出来るようにする為、容器をプラスチック等の硬性樹脂から成り、その容器の一部に折り目を形成して破断し易くしてもよい。また、糞便処理容器５と同様に、容器の密閉性を保つため、懸濁液保持容器６１１の蓋６０１との接合部を硬性の樹脂で形成してもよい。
【０１０９】
実施の形態３にかかる糞便処理容器５，６は、採便治具５００，６００と懸濁液保持容器５１１，６１１とを扱うのみであるため、糞便処理容器１〜４と比較して構造がより簡易である。また、分離した糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとを混合する方法と比較して、糞便懸濁液中で糞便処理液Ｐを放出するため、糞便懸濁液と糞便処理液Ｐとの混合に要する時間を短縮できる。なお、本実施形態では、懸濁液保持容器５１１に糞便サンプルＥを導入する、蓋５０１、６０１、採便棒５０２、６０２、スライダ５１２、６１２とを含む部材を導入機構と呼び、処理液保持容器５２１、６２１を含む部材を開放機構と呼ぶ。
【０１１０】
（実施の形態４）
図１１は、本発明の実施の形態４にかかる糞便処理容器７の概要構成を示す模式図である。この糞便処理容器７は、懸濁液保持部７００と、連結部７１０と、処理液保持部７２０とを備え、それぞれが密閉された状態で糞便処理容器７内に存在する。また、糞便試料調製用溶液を構成する懸濁液Ｓと糞便処理液Ｐとが、それぞれ懸濁液保持容器７０１と処理液保持容器７２１とに収容されている。
【０１１１】
先ず、採取した糞便サンプルＥを、懸濁液Ｓが予め収容されている懸濁液保持容器７０１内に導入し、懸濁液保持容器７０１と接合部７１２と、処理液保持容器７２１とをそれぞれ接合させる。なお、糞便サンプルＥと懸濁液Ｓが懸濁されるまで、糞便処理液Ｐが放出しないよう処理液保持部７２０と連結部７１０とには若干の空領域を保持しておく。糞便サンプルＥと懸濁液Ｓとを懸濁して糞便懸濁液が得られると、処理液保持容器７２１を押し込むことによって突起部７１１の突起部が封止膜７２２を穿って、封止膜７２２が破断する。その結果、糞便処理液Ｐと糞便懸濁液とが連通孔７１３を通過して混合する。そして上述した処理によって糞便試料を調製する。
なお、本実施形態では導入機構に該当する部材の説明はないが、従来の方法でも、上述した実施形態に記載の導入機構により糞便サンプルＥを懸濁液保持容器７０１内に導入しても良い。また、本実施形態では突起部７１１、封止膜７２２とを含む部材を開放機構と呼ぶ。
【０１１２】
実施の形態４にかかる糞便処理容器７は、それぞれが分離して存在しているため、操作時の選択肢が増える。例えば、懸濁液保持容器７０１にも封止膜を設置して懸濁液Ｓを密閉し、使用時に連結部７１０の突起部７１１によって懸濁液保持容器７０１を開放することで、懸濁液Ｓの酸化防止等、溶液の安定性の向上も期待出来る。その後、連結部７１０を反転させることにより上述した試料調製処理を行うことが可能となる。また、実施の形態２に記載したような球状の封止剤を用いることで、懸濁液Ｓ及び糞便処理液Ｐ中に放出された封止剤が撹拌ビーズにように働き、それぞれの撹拌を助長する効果を奏することが期待できる。
【０１１３】
なお、上述した実施の形態１〜４に限らず、ここでは記載していないさまざまな実施の形態等を含みうるものであり、特許請求の範囲により特定される技術的思想を逸脱しない範囲内において種々の設計変更等を施すことが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明の糞便処理方法及び糞便処理容器によれば、予め本発明の糞便試料調製用の溶液を収容した採便容器に糞便を採取することによって、簡易に採取された糞便から糞便試料を調製し、かつ高精度・安定な状態で核酸の回収・処理を行うことができる。また、本発明の処理容器の操作性（使用方法）も簡易であるため、家庭において使用することが可能である。さらに、本発明の処理容器では懸濁液と糞便処理液とが分かれて収容されるため、各溶液を選択的に収容することが可能となり、様々な処理を行う上で有用である。
【符号の説明】
【０１１５】
１〜７ 糞便処理容器
１００，２００，３００，４００，５００，６００，７００ 採便治具
１０１，２０１，３０１，４０１，５０１，６０１，７０１ 蓋
１０２，２０３，４０３，５０２，６０２ 採便棒
１１０，２１０，３１０，４１０，５１０，６１０，７００ 懸濁液保持部
１１１，２１１，３１１，４１１，５１１，６１１，７０１ 懸濁液保持容器
１１２，４１４，５１２，６１２ スライダ
１２０，２２０，３２０，４２０，７２０ 処理液保持部
１２１，２２１，３２１，４２１，５２１，６２１，７２１ 処理液保持容器
１２２，３２２ 封止剤支承部
１３１，３３１，４３１ 封止剤
２０２，３０２，４０２ ピストン
２１２，３１２，４１２，７１１ 突起部
２１３，３１３，４１３，７１３ 連通孔
２２２，７２２ 封止膜
４１５ サンプル裁断部
７１０ 連結部
７１２ 接合部
Ｅ 糞便サンプル
Ｐ 糞便処理液
Ｓ 懸濁液
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005616786.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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