(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ１Ａタンパク質からなる群から選択される第２のタンパク質に先立って、Ｅ１Ｂ５５ｋＤタンパク質およびＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせである第１のタンパク質を発現する組換えアデノウイルスであって、アデノウイルスが、Ｅ１Ａタンパク質をコードする少なくとも一つの核酸を含み、Ｅ１Ａタンパク質の発現が、Ｅ１Ａプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあり、アデノウイルスが、調節解除されたＹＢ−１を含むか又は核内にＹＢ−１を有する細胞中で複製をすることができ、かつ、アデノウイルスが、ＲＧＤペプチドをコードする、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
ＲＧＤペプチドが、ファイバーノブドメインのＨＩループ内に発現されている、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
Ｅ１Ａタンパク質が、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
アデノウイルスが、野生型アデノウイルスにおけるタンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあるＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
アデノウイルスが、野生型アデノウイルスにおけるタンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあるＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
アデノウイルスが、野生型アデノウイルスにおけるタンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあるＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質及びＥ４ｏｒｆ６タンパク質の組み合わせをコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
Ｅ１Ｂ５５ｋＤタンパク質の発現が、プロモーターにより制御され、プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、かつ、アデノウイルスプロモーターが、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質の発現が、プロモーターにより制御され、プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、かつ、アデノウイルスプロモーターが、Ｅ４プロモーターとは異なることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項９】
アデノウイルスプロモーターが、Ｅ１Ａプロモーターである、請求項７又は８に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
Ｅ１Ａタンパク質の発現が、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択されるプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
Ｅ１Ａタンパク質の発現を制御するプロモーターが、ＹＢ１により制御されるか、又はＹＢ−１によって調節されることができることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
Ｅ１Ａタンパク質の発現を調節するプロモーターが、アデノウイルスＥ２後期プロモーターであることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質及びＥ１Ｂ５５ｋｄタンパク質が、同一のか又は共通するプロモーターの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
アデノウイルスが、少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質を介して核にＹＢ−１を提供するか、又は核内のＹＢ−１の提供には、少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質が介在し、アデノウイルスタンパク質が、Ｅ１Ａとは異なることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
アデノウイルスが、少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質を介してアデノウイルスの複製のためのＹＢ−１を提供するか、又は少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質を介してアデノウイルス複製のためのＹＢ−１の提供を介在し、アデノウイルスタンパク質が、Ｅ１Ａとは異なることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１６】
アデノウイルスタンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６とＥ１Ｂ５５ｋＤとの複合体であることを特徴とする、請求項１４又は１５に記載のアデノウイルス。
【請求項１７】
アデノウイルスの核酸が、少なくとも一つの機能的に不活性なアデノウイルス領域を含み、領域が、Ｅ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域及びそれらの組み合わせを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１８】
領域が、Ｅ１領域であることを特徴とする、請求項１７に記載のアデノウイルス。
【請求項１９】
領域が、Ｅ３領域であることを特徴とする、請求項１７又は１８に記載のアデノウイルス。
【請求項２０】
領域が、Ｅ４領域であることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２１】
領域が、Ｅ１領域、Ｅ３領域及びＥ４領域を含むことを特徴とする、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２２】
アデノウイルスが、核酸を含み、該核酸が、ＹＢ−１をコードすることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２３】
ＹＢ−１をコードする核酸が、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターが、Ｅ２後期プロモーターであることを特徴とする、請求項２２に記載のアデノウイルス。
【請求項２４】
ＹＢ−１をコードする核酸が、プロモーターの制御下にあり、該プロモーターがＹＢ−１依存性及びＹＢ−１制御性であることを特徴とする、請求項２２又は２３に記載のアデノウイルス。
【請求項２５】
アデノウイルスが、プロモーター及び核酸配列を含む発現カセットを含み、核酸配列が、アプタマー、リボザイム、アプタザイム、アンチセンス分子及びｓｉＲＮＡを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２６】
アデノウイルスが、プロモーター及び核酸配列を含む発現カセットを含み、核酸配列が、コーディング核酸であり、核酸が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アンチカリン、抗体及び抗体断片を含む群から選択される分子をコードすることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２７】
アデノウイルスが、発現カセットを含み、発現カセットが、プロモーター及び核酸配列を含み、核酸配列が、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ遺伝子、プロテアーゼ阻害剤をコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子及び血管形成阻害剤をコードする遺伝子を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２８】
アデノウイルスが、アデノウイルス突然変異体であることを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２９】
細胞周期とは無関係に、細胞が核内にＹＢ−１を含有することを特徴とする、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルスをコードする核酸。
【請求項３１】
アデノウイルスのインビトロでの複製のための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス又は請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３２】
アデノウイルスのインビトロでの製造のための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス又は請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３３】
アデノウイルスの複製中の細胞溶解を促進する遺伝子、及び／又はアデノウイルスが介在する細胞溶解を促進する遺伝子のインビトロでの発現のための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス又は請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３４】
医薬の製造のための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス又は請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３５】
アデノウイルスが複製している細胞が、細胞周期とは無関係に、核内にＹＢ−１を有することを特徴とする、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
アデノウイルスが複製している細胞が、調節解除されたＹＢ−１を含むことを特徴とする、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
医薬が、腫瘍性疾患の治療のためであることを特徴とする、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
腫瘍性疾患が、悪性疾患、癌、癌性疾患及び腫瘍を含む群から選択されることを特徴とする、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
腫瘍が、固形腫瘍、非固形腫瘍、悪性腫瘍及び良性腫瘍を含む群から選択されることを
特徴とする、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有することを特徴とする、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４１】
腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、調節解除されたＹＢ−１を含むことを特徴とする、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、Ｒｂ陽性又はＲｂ陰性であることを特徴とする、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、医薬的に活性な薬剤に対して耐性、好ましく
は多剤耐性を有することを特徴とする、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
耐性が多剤耐性であることを特徴とする、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
耐性が、細胞増殖抑制剤に対するものであり、及び／又は耐性は照射により誘発されることを特徴とする、請求項４３又は４４に記載の使用。
【請求項４６】
医薬を意図する患者が、複数の細胞を含み、細胞が請求項３９〜４３のいずれか１項に記載したような細胞であることを特徴とする、請求項３７〜４５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４７】
医薬が、少なくとの１つのさらなる医薬的に活性な薬剤を含むことを特徴とする、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４８】
薬物がさらなる医薬的に活性な薬剤と一緒に投与されるか又はそれを意図することを特徴とする、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
さらなる医薬的に活性な薬剤が、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、細胞増殖抑止剤、チロシンキナーゼ阻害剤及び細胞周期阻害剤を含む群より選択されることを特徴とする、請求項４６又は４８に記載の使用。
【請求項５０】
照射の前、その間、その後に医薬が投与されることを特徴とする、請求項３７〜４６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５１】
腫瘍を治療する目的で、放射線が投与されることを特徴とする、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
処置されるべき細胞又は生物が手段の対象とされ、手段が、照射、細胞増殖抑制剤の投与及び温熱療法を含む群から選択されることを特徴とする、請求項３７〜５１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５３】
手段が局所的にか、又は全身的に適用されることを特徴とする、請求項３７〜５２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５４】
照射が、腫瘍性疾患の治療で使用されるいかなる照射も使用することを特徴とする、請求項５０〜５１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５５】
腫瘍性疾患が、乳腫瘍、骨腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、肝腫瘍、腎臓腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、皮膚付属器の腫瘍、頭頚部腫瘍、子宮腫瘍、滑膜腫瘍、咽頭腫瘍、食道腫瘍、舌腫瘍、前立腺腫瘍を含む群から選択されることを特徴とする、腫瘍性疾患を治療するための医薬を製造するための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス又は請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項５６】
腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有し、腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、調節解除されたＹＢ−１を含み、腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、Ｒｂ陽性又はＲｂ陰性であり、及び／又は、腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が、医薬的に活性な薬剤に対して多剤耐性を有することを特徴とする、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
腫瘍特異的プロモーターが、医薬が使用される腫瘍に特異的であるプロモーターである、腫瘍性疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス又は請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項５８】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス又は請求項３０に記載の核酸、及び場合により医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、腫瘍を治療するために薬物を製造するための、アデノウイルス、それをコードする核酸及びその使用に関する。
【０００２】
現在、腫瘍の治療において多数の治療概念が使用されている。外科手術の使用はともかく、化学療法及び放射線療法が主流である。しかしながら、これらの技法はすべて相当な副作用を伴う。複製選択性の腫瘍退縮性ウイルスは、腫瘍の治療に新しい基盤を提供している。それに関連して、ウイルス剤の選択的な腫瘍内複製が開始され、それは、ウイルスの増殖、感染した腫瘍細胞の溶解及び隣接する腫瘍細胞へのウイルスの拡散を生じる。ウイルスの複製能力が腫瘍細胞に限定されているので、正常細胞は複製から免れ、ウイルスによる溶解から免れる。
【０００３】
今のところ、腫瘍の溶解を目標として、幾つかのウイルスシステムが臨床試験の対象となっている。そのようなアデノウイルスの一例は、ｄｌ１５２０（Onyx-015）であり、それは、臨床試験のフェーズＩ及びＩＩで上手く使用されている（Khuri, F. et al., Nature Medicine 6: 879-885, 2000）。Ｏｎｙｘ−０１５は、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ遺伝子を完全に欠失したアデノウイルスである。アデノウイルスのＥ１Ｂ５５ｋＤａタンパク質の完全な欠失は、複製、従って細胞の溶解が、ｐ５３欠損（Kim, D. et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 17: 391a, 1998）を有するアデノウイルスベクターにより可能であり、そのために正常細胞は悪影響を受けないという発見に基づく。さらに詳しくは、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａの遺伝子産物は、ｐ５３の阻害、ウイルスｍＲＮＡの輸送及び宿主細胞のタンパク質合成のスイッチオフに関与する。ｐ５３の阻害は、ｐ５３とアデノウイルスがコードするＥ１Ｂ−５５ｋＤａタンパク質とから成る複合体及び／又はＥ１Ｂ−５５ｋＤａとＥ４ｏｒｆ６とから成る複合体の形成を介して生じる。ＴＰ５３にコードされるｐ５３は、複合体が調節するメカニズム（Zambetti, G. P., et al., FASEB J., 7: 855-865, 1993）の出発点であり、それによって、とりわけ、アデノウイルスのようなウイルスの細胞性複製の効率的な阻害を生じる。遺伝子ＴＰ５３は、ヒトの全腫瘍の約５０％で欠失又は変異しており、それは、化学療法や放射線療法による所望の、アポトーシスの欠如を生じ、通常、腫瘍治療は不成功に終わる。
【０００４】
腫瘍退縮性性アデノウイルスのさらなる概念は、Ｅ１Ａタンパク質が、Ｒｂ／Ｅ２Ｆ及び／又はｐ１０７／Ｅ２Ｆ及び又はｐ１３０／Ｅ２Ｆの結合に影響を与えない、特定の欠失形態で存在すれば、又は１又は数個の突然変異を含んでいれば、そのようなアデノウイルスは感染細胞のＳ期への進行を誘導せず、機能的Ｒｂタンパク質を有さない腫瘍細胞で複製することが可能であるという発見に基づく。さらに、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｎ末端で欠失させることができ、Ｅ１Ａのｐ３００への結合を阻害するためにＥ１Ａタンパク質のアミノ酸１位〜７６位の領域で１又は数個の突然変異を含むことができるので、腫瘍細胞においてさらに選択的な複製を提供することができる。これらのアプローチは、欧州特許ＥＰ０９３１８３０号に例示的に記載されている。そのようなウイルスの例は、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２〜９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７及びＣＢ０１６（Howe, J. A. et al., Molecular Therapy 2: 485-495, 2000; Fueyo, J. et al., Oncogene 19: 2-12, 2000; Heise, C. et al., Nature Medicine 6: 1134-1139, 2001; Balague, C. et al., J. Virol., 75: 7602-7611, 2001）である。従来技術で既知のこれらのアデノウイルスのシステムは、従って、Ｅ１Ａタンパク質において識別可能な欠失を含み、それによって、それぞれ、機能的なＲｂタンパク質及び不活性のＲｂとＥ２Ｆから成る複合体が生体内での効率的な複製を阻止するという前提で、かつ、Ｒｂ−陰性／変異した細胞でのみアデノウイルスの生体内での複製を提供するために、そのような欠失を行っている。従来技術に係るこれらのアデノウイルスシステムは、早期Ｅ２プロモーター（Ｅ２早期プロモーター）及び遊離のＥ２Ｆ（Dyson N, Genes & Development 12: 2245-2262, 1998）によって生体内の複製を制御するためのＥ１Ａに基づく。
【０００５】
腫瘍退縮性性アデノウイルスシステムのさらなる形態は、ウイルス腫瘍遺伝子Ｅ１Ａを特異的に発現する選択的なプロモーターの使用に基づき、それは、腫瘍細胞における選択的複製を提供する（Rodriguez, R. et al., Cancer Res., 57: 2559-2563, 1997）。
【０００６】
上述のように、根底に作用機序がある各概念に適当である細胞のバックグラウンドを選択することはアデノウイルスの腫瘍退縮性ウイルスの種々の概念にとって重要である。言い換えれば、現在既知の種々のアデノウイルスシステムは、はっきりした分子生物学的必要条件が実現される場合においてのみ使用してもよい。このことは、そのようなシステムの使用を特定の患者群に限定する。
【０００７】
いったん患者が、細胞増殖抑制剤に対する腫瘍の耐性の特によく研究された形態を表す、いわゆる多剤耐性（複数の薬剤に対する耐性、ＭＤＲ）を発生させると、腫瘍性疾患の治療には特別の問題が生じる（Gottesman and Oastan, Annu. Rev. Biochem., 62: 385-427, 1993）。それは、いわゆるＡＢＣトランスポータ（Stein, U. et al., JBC 276: 28562-69, 2001; J. Wijnholds, Novartis Found Symp., 243: 69-79, 2002）に属する膜結合型輸送タンパク質、Ｐ−糖タンパク質の過剰発現に基づく。Bargou, R. C.ら及びOda, Y.ら（Bargou, R. C. et al., Nature Medicine 3: 447-450, 1997; Clin. Cancer Res., 4: 2273-2277, 1998）は、ヒトの転写因子、ＹＢ−１はＰ−糖タンパク質の発現の活性化に直接関与することを示すことができた。さらなる研究によって、ＹＢ−１は、たとえば、ＵＶ照射、細胞増殖抑制剤の投与（Koike, K. et al., FEBS Lett., 17: 390-394, 1997）及び温熱（Stein, U. et al., JRC 276: 28562-69, 2001）のような種々のストレス条件によって核に輸送されることが確認された。さらなる研究によって、ＹＢ−１の核への局在化は、１つのさらなるＡＢＣトランスポータに影響を有することが確認された。このＡＢＣトランスポータは、ＭＲＰ（多剤耐性関連タンパク質）と呼ばれ、いわゆる非定型の、非Ｐ−糖タンパク質依存性の多剤耐性の形成に関与する（Stein, U. et al., JRC 276: 28562-69, 2001）。
【０００８】
本発明の課題は、生物、特にヒト、及び患者群を特に腫瘍的に活性のある作用剤で治療することができる技術的教示及び手段を提供することである。細胞増殖抑制剤に耐性である腫瘍性疾患を有する患者、特に多剤耐性を有するものにおいて腫瘍溶解を生じるのに好適な手段を提供することは、本発明のさらなる課題である。最終的に、本発明の課題は、細胞溶解に好適であるアデノウイルスを提供することである。
【０００９】
第１の態様では、Ｅ１Ａタンパク質を含む群から選択される第２のタンパク質に先立って、Ｅ１Ｂタンパク質及びＥ４タンパク質を含む群から選択される第１のタンパク質を発現するアデノウイルスによって、本発明の課題を解決する。
【００１０】
実施態様では、第１のタンパク質はＥ１Ｂタンパク質であり、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質である。
【００１１】
さらなる実施態様では、第１のタンパク質はＥ４タンパク質であり、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。
【００１２】
好ましい実施態様では、第１のタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質とＥ４タンパク質との組み合わせであり、好ましくは、Ｅ１Ｂ５５ｋＤタンパク質とＥ４ｏｒｆ６タンパク質との組み合わせである。
【００１３】
好ましい実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質である。別の実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質は、野生型アデノウイルスの、好ましくはＡｄ５の、Ｅ１Ａタンパク質、又はアデノウイルスデルタ２４のＥＡ１である。
【００１４】
第２の態様では、アデノウイルスが、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質及びＥ１Ａタンパク質を含む群から選択されるタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含み、その際、少なくとも１つのタンパク質が野生型アデノウイルスにおけるタンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にある、アデノウイルスによって、本発明の課題を解決する。
【００１５】
第２の態様の実施態様では、アデノウイルスは、本発明の第１の態様に係るアデノウイルスである。
【００１６】
第２の態様の実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質であり、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質である。
【００１７】
第２の態様の実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ４タンパク質であり、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。
【００１８】
第２の態様の実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ａタンパク質であり、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質である。特に好ましい実施態様では、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質は、Ａｄ５の、好ましくは野生型Ａｄ５のＥ１Ａ１２Ｓタンパク質、又はアデノウイルスデルタ２４のＥ１Ａ１２Ｓタンパク質である。
【００１９】
第２の態様の好ましい実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質とＥ４タンパク質との組み合わせであり、好ましくは、Ｅ１Ｂ５５ｋＤタンパク質とＥ４ｏｒｆ６タンパク質との組み合わせである。
【００２０】
第２の態様の実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質とＥ１Ａタンパク質との組み合わせであり、好ましくは、Ｅ１Ｂ５５ｋＤタンパク質とＥ１Ａ１２Ｓタンパク質との組み合わせである。
【００２１】
第２の態様の好ましい実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ４タンパク質とＥ１Ａタンパク質との組み合わせであり、好ましくは、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質とＥ１Ａ１２Ｓタンパク質との組み合わせであり、より好ましくはここに定義したとおりである。
【００２２】
第２の態様の実施態様では、少なくとも１つのタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質とＥ４タンパク質とＥ１Ａタンパク質との組み合わせであり、好ましくは、Ｅ１Ｂ５５ｋＤタンパク質とＥ４ｏｒｆ６タンパク質とＥ１Ａ１２Ｓタンパク質との組み合わせである。
【００２３】
第２の態様の実施態様では、Ｅ１Ｂタンパク質の発現はプロモーターにより制御され、その際、プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターは、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なる。
【００２４】
第２の態様の実施態様では、Ｅ４タンパク質の発現はプロモーターにより制御され、その際、プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターは、Ｅ４プロモーターとは異なる。
【００２５】
第２の態様の好ましい実施態様では、アデノウイルスのプロモーターはＥ１Ａプロモーターである。
【００２６】
第２の態様の実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質の発現がプロモーターによって制御され、その際、プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターとは異なる。
【００２７】
第２の態様の好ましい実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質の発現を制御するプロモーターはＹＢ−１により制御されるか、又はＹＢ−１によって調節されうる。
【００２８】
第２の態様の好ましい実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質の発現を制御するプロモーターは、アデノウイルスＥ２後期プロモーターである。
【００２９】
第１及び第２の態様の実施態様では、Ｅ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質及びＥ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質は、同一の又は共通のプロモーターの制御下にある。
【００３０】
第３の態様では、アデノウイルスが少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質を介して核にＹＢ−１を提供する、又は核におけるＹＢ−１の提供には、少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質が介在し、その際、好ましくは、アデノウイルスタンパク質はＥ１Ａとは異なる、アデノウイルスによって本発明の課題を解決する。
【００３１】
第３の態様の実施態様では、アデノウイルスは本発明の第１の態様及び／又は第２の態様に係るアデノウイルスである。
【００３２】
第４の態様では、アデノウイルスが、少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質を介してアデノウイルスの複製にＹＢ−１を提供する、又は少なくとも１つのアデノウイルスタンパク質がアデノウイルスの複製へのＹＢ−１の提供に介在し、その際、好ましくは、アデノウイルスタンパク質はＥ１Ａとは異なる、アデノウイルスによって本発明の課題を解決する。
【００３３】
第３の態様の実施態様では、アデノウイルスは本発明の第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様に係るアデノウイルスである。
【００３４】
第３及び第４の態様の実施態様では、アデノウイルスタンパク質は、Ｅ４ｏｒｆ６とＥ１Ｂ５５ｋＤとの複合体である。
【００３５】
第５の態様では、アデノウイルスの核酸が、少なくとも１つの機能的に不活性なアデノウイルスの領域を含み、その際、領域がＥ１領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域及びこれらの組み合わせを含む群から選択される、アデノウイルスによって、本発明の課題を解決する。
【００３６】
第５の態様の実施態様では、アデノウイルスが、本発明の第１及び／又は第２及び／又は第３及び／又は第４の態様によるアデノウイルスであると考えられる。
【００３７】
第５の態様の実施態様では、該領域は、Ｅ１領域である。
【００３８】
第５の態様の実施態様では、該領域は、Ｅ３領域である。
【００３９】
第５の態様の実施態様では、該領域は、Ｅ４領域である。
【００４０】
第５の態様の実施態様では、該領域はＥ１領域、Ｅ３領域、及びＥ４領域を含む。
【００４１】
第６の態様では、アデノウイルスが少なくとも１つの発現カセットを含み、その際、発現カセットが少なくとも１つのプロモーター及びアデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含み、アデノウイルスタンパク質がＥ１Ｂタンパク質であり、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質である、アデノウイルスによって、本発明の課題を解決する。
【００４２】
第６の態様の実施態様では、アデノウイルスは本発明の第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様に係るアデノウイルスである。
【００４３】
第６の態様の実施態様では、プロモーターはＥ１Ｂプロモーターとは異なる。
【００４４】
第６の態様の実施態様では、プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、プロモーターは、Ｅ１Ｂプロモーターとは異なる。
【００４５】
第７の態様では、アデノウイルスが少なくとも１つの発現カセットを含み、その際、発現カセットが少なくとも１つのプロモーター及びアデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含み、その際、アデノウイルスタンパク質がＥ４タンパク質であり、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である、アデノウイルスによって、本発明の課題を解決する。
【００４６】
第７の態様の実施態様では、アデノウイルスは、本発明の第１及び／又は第２及び／又は第３及び／又は第４及び／又は第５及び／又は第６の態様によるアデノウイルスである。
【００４７】
第７の態様の実施態様では、プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターは、Ｅ４プロモーターとは異なる。
【００４８】
第７の態様の実施態様では、プロモーターはＥ１Ａプロモーターである。
【００４９】
第８の態様では、アデノウイルスが少なくとも１つの発現カセットを含み、その際、発現カセットが少なくとも１つのプロモーター及びアデノウイルスタンパク質をコードする核酸を含み、その際、アデノウイルスタンパク質がＥ１Ａタンパク質であり、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質である、アデノウイルスによって、本発明の課題を解決する。
【００５０】
第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは本発明の第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様に係るアデノウイルスである。
【００５１】
第８の態様の実施態様では、プロモーターはＥ１Ａプロモーターとは異なる。
【００５２】
第８の態様の実施態様では、プロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択される。
【００５３】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは核酸を含み、核酸はＹＢ−１をコードする。
【００５４】
第８の態様の好ましい実施態様では、ＹＢ−１をコードする核酸はプロモーターの制御下にあり、その際、プロモーターは好ましくはＥ２後期プロモーターである。
【００５５】
第８の態様の実施態様では、ＹＢ−１をコードする核酸はプロモーターの制御下にあり、その際、プロモーターは、ＹＢ−１依存性及びＹＢ−１に制御される。
【００５６】
第８の態様の実施態様では、ＹＢ−１をコードする核酸は、Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする核酸を含む発現カセットの一部である。
【００５７】
第８の態様の実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質をコードする核酸は、ＩＲＥＳ配列を介してＹＢ−１をコードする核酸から分離される。
【００５８】
第６及び／又は第７及び／又は第８の態様の実施態様では、Ｅ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードする核酸及びＥ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤをコードする核酸は発現カセットに含有され、その際、好ましくは、２つのコーディング配列はＩＲＥＳ配列を介して分離される。
【００５９】
第８の態様の好ましい実施態様では、発現カセットのプロモーターは、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、その際、アデノウイルスプロモーターは、Ｅ４プロモーターとは異なり、かつＥ１Ｂプロモーターとは異なり、好ましくは、野生型Ｅ４プロモーターとは異なり、かつ野生型Ｅ１Ｂプロモーターとは異なる。
【００６０】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは、プロモーター及び核酸配列を含む発現カセットを含み、その際、核酸は、アプタマー、リボザイム、アプタザイム、アンチセンス分子及びｓｉＲＮＡを含む群から選択される。
【００６１】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは、プロモーター及び核酸配列を含む発現カセットを含み、その際、核酸配列はコーディング核酸であり、その際、核酸は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、アンチカリン、抗体及び抗体断片を含む群から選択される分子をコードする。
【００６２】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは、プロモーター及び核酸配列を含む発現カセットを含み、その際、核酸配列は、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ遺伝子、プロテアーゼ阻害剤、腫瘍抑制遺伝子、サイトカイン及び血管形成阻害剤を含む群から選択される。
【００６３】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは、組換えアデノウイルスである。
【００６４】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは、アデノウイルス変異体である。
【００６５】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは、アデノウイルスは複製欠損性である。
【００６６】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスは、調節解除されたＹＢ−１を含む又は核にＹＢ−１を有する細胞内で複製が可能である。
【００６７】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、細胞は、細胞周期とは無関係に、核にＹＢ−１を含有する。
【００６８】
第１の態様及び／又は第２の態様及び／又は第３の態様及び／又は第４の態様及び／又は第５の態様及び／又は第６の態様及び／又は第７の態様及び／又は第８の態様の実施態様では、アデノウイルスはいかなるＥ１Ａ１３Ｓタンパク質を含まない、及び／又はアデノウイルスはＥ１Ａ１３Ｓタンパク質をコードするいかなる核酸も含まない。
【００６９】
第９の態様では、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルスをコードする核酸によって本発明の課題を解決する。
【００７０】
第１０の態様では、ヘルパーウイルスの核酸が、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルスの１以上の発現カセットを含む、第９に記載の核酸及びヘルパーウイルスの核酸を含む複製システムによって本発明の課題を解決する。
【００７１】
第１０の態様の実施態様では、アデノウイルス又はそれをコードする核酸がヘルパーウイルスが含む発現カセットを欠いている。
【００７２】
第１１の態様では、第９の態様に記載の核酸及び第１０の態様に記載の複製システムを含むベクターによって本発明の課題を解決する。
【００７３】
第１１の態様の実施態様では、ベクターは発現ベクターである。
【００７４】
第１２の態様では、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス及び／又は第９の態様に記載の核酸及び／又は第１０の態様に記載の複製システム及び／又は第１１の態様に記載のベクターを含むアデノウイルス細胞によって本発明の課題を解決する。
【００７５】
第１２の態様の実施態様では、細胞は真核細胞であり、好ましくは動物細胞であり、さらに好ましくは哺乳動物細胞である。
【００７６】
第１２の態様の好ましい実施態様では、哺乳動物細胞は、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ及びヒトを含む群から選択される。
【００７７】
第１３の態様では、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞を含む生物、好ましくは哺乳動物生物によって本発明の課題を解決するが、その際、生物は好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ及びヒトを含む群から選択される。
【００７８】
第１４の態様では、アデノウイルスの複製、好ましくはアデノウイルスのインビトロの複製のための第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞の使用によって本発明の課題を解決する。
【００７９】
第１５の態様では、アデノウイルスの製造、好ましくはアデノウイルスのインビトロの製造のための第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞の使用によって本発明の課題を解決する。
【００８０】
第１６の態様では、遺伝子の発現、好ましくは細胞溶解を促進する、好ましくはアデノウイルスの複製中、細胞溶解を促進する、及び／又はアデノウイルスが介在する細胞溶解を促進する遺伝子の発現のための、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞の使用によって本発明の課題を解決する。
【００８１】
第１６の態様の実施態様では、発現される遺伝子は、本明細書で開示される導入遺伝子である。
【００８２】
第１７の態様では、薬物の製造のための、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞の使用によって本発明の課題を解決する。
【００８３】
第１４〜第１７の態様の実施態様では、その中でアデノウイルスが複製する細胞は、核にＹＢ−１を有し、好ましくは細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有する。
【００８４】
第１４〜第１７の態様の実施態様では、その中でアデノウイルスが複製する細胞は、調節解除されたＹＢ−１を含む。
【００８５】
第１７の態様の実施態様では、薬物は腫瘍性疾患を治療するためのものである。
【００８６】
第１７の態様の使用の実施態様では、腫瘍性疾患は、悪性腫瘍疾患、癌、癌性疾患及び腫瘍を含む群から選択される。
【００８７】
第１７の態様の使用の実施態様では、腫瘍は、固形腫瘍、非固形腫瘍、悪性腫瘍及び良性腫瘍を含む群から選択される。
【００８８】
第１７の態様の使用の実施態様では、腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部は核にＹＢ−１を有し、好ましくは細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有する。
【００８９】
第１７の態様の使用の実施態様では、腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部は調節解除されたＹＢ−１を含む。
【００９０】
第１７の態様の使用の実施態様では、腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部はＲｂ陽性又はＲｂ陰性である。
【００９１】
第１７の態様の使用の実施態様では、腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部は、薬学上活性のある作用剤に耐性、好ましくは、複数の耐性を有する。
【００９２】
第１７の態様の使用の好ましい実施態様では、耐性は、複合耐性である。
【００９３】
第１７の態様の使用の実施態様では、耐性は、抗腫瘍剤、好ましくは細胞増殖抑制剤に対するものであり、及び／又は耐性は照射によって誘発される。
【００９４】
第１７の態様の使用の実施態様では、薬物が意図される患者は、複数の細胞を含み、その際、細胞は、本発明の第１７の態様に記載の種々の実施態様に記載されるような細胞である。
【００９５】
第１７の態様の使用の実施態様では、薬物は少なくとも１つのさらなる薬学上活性のある作用剤を含む。
【００９６】
第１７の態様の使用の実施態様では、薬物はさらなる薬学上活性のある作用剤と一緒に投与される、又はそのために意図される。
【００９７】
第１７の態様の使用の実施態様では、さらなる薬学上活性のある作用剤は、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成阻害剤、結腸直腸癌に対するイリノテカン及びＣＰＴ−１１並びに白血病に対するダウノルビシンなどの細胞増殖抑止剤、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ活性を抑制し結腸直腸腫瘍に対して用いることができるＣＹＣ２０２ (McClue S J, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468）及びＲａｆ−１を阻害し例えば乳癌に対して有効なＢＡＹ ４３−９００６ (Wilhelm SM et al., Cancer Res. 2004, 64, 7099-7109）のような細胞周期阻害剤、２６Ｓプロテアソーム活性を抑制し、扁平上皮癌に対して用いられるＰＳ−３４１(Fribley A et al., Mol Cell Biol 2004 Nov; 24(22):  9695- 704)のようなプロテオソーム阻害剤、ＥＧＦレセプターなどに対する組換え抗体 (乳癌及び前立腺腫瘍に対するハーセプチン; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; 頭部及び頚部腫瘍に対するエルビタックス; Bauman M et al., Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266)、及び特にｃ−ｋｉｔを抑制し、胃腸の腫瘍に対して用いることができる、ＳＴＩ５７１、のような信号伝達カスケードの阻害剤 (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、特に前立腺腫瘍に対して用いることのできるエンドセリン阻害剤であるＡＢＴ−６２７(H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、ＶＥＧＦチロシン・キナーゼ・レセプターのリン酸化を阻害し、特に膠芽腫及び前立腺癌に対して用いることができるＳＵ５４１６(Bischof M et al Int. J. Radiat, Oncol. Biol. Phys. 2004; 60 (4): 1220-32)、ＥＧＦＲチロシン活性を阻害し、特に前立腺腫瘍に対して用いることができるＺＤ１８３９(H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、ｍＴＯＲを阻害し、前立腺腫瘍に対して用いることができるＣＣＩ−７７９及びＲＡＤ００１のようなラパマイシン誘導体；を含む群より選択される。本明細書に記述した様々なアデノウイルス及び本発明に従って用いられるアデノウイルスを、それぞれ原則として、いずれの前述の化合物とも共に、本明細書において関連して上述したいずれの適応に対しても用いることができることは本発明の範囲内である。特に好ましい実施態様では、この適応は任意の以前に言及した薬学上活性のある化合物に対して記述される適応である。
【００９８】
第１７の態様の使用の実施態様では、薬物は、照射に先立って、照射中に又は照射後に投与される。
【００９９】
第１７の態様の使用の好ましい実施態様では、腫瘍を治療する目的で放射線が投与される。
【０１００】
第１７の態様の使用の実施態様では、治療されるべき細胞又は生物は、手段の対象とされ、その際、手段が、照射、細胞増殖抑制剤の投与及び温熱療法を含む群から選択される。
【０１０１】
第１７の態様の使用の実施態様では、手段は、局所的に又は全身性で適用される。
【０１０２】
第１７の態様の使用の実施態様では、照射は高エネルギーの放射線を使用し、好ましくは、腫瘍性疾患の治療で使用されるいかなる照射も使用する。
【０１０３】
第１８の態様では、腫瘍性疾患を治療するために薬物を製造するための、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞の使用によって、本発明の課題を解決するが、その際、腫瘍性疾患は、乳癌、骨腫瘍、胃癌、腸癌、胆嚢癌、膵臓癌、肝癌、腎臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、皮膚腫瘍、皮膚付属器の腫瘍、頭頚部癌、子宮癌、滑膜腫瘍、咽頭癌、食道癌、舌癌、前立腺癌を含む群から選択されることを特徴とする。
【０１０４】
第１９の態様では、腫瘍性疾患を治療するために薬物を製造するための、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞の使用によって、本発明の課題を解決するが、その際、腫瘍特異的プロモーターは薬物が使用される腫瘍に特異的なプロモーターである。
【０１０５】
第２０の態様では、第１〜第８の態様のいずれか１項に記載のアデノウイルス、第９の態様に記載の核酸、第１０の態様に記載の複製システム、第１１の態様に記載のベクター又は第１２の態様に記載の細胞及び場合により薬学上許容可能なキャリアを含む医薬組成物によって、本発明の課題を解決する。
【０１０６】
第２１の態様では、本発明の課題は、医薬の製造のための、ウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用により解決され、その際、ウイルスは、核内にＹＢ−１を含まない正常細胞、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含まない細胞、調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞のそれぞれにおいて複製欠損であり、そのウイルスは、癌遺伝子又は癌遺伝子産物、特に癌遺伝子タンパク質（ＹＢ−１核陽性細胞内で１つのウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子を少なくともトランス活性化する）をコードし、その際、その遺伝子は、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される。好ましくは、ウイルスは、ウイルスタンパク質であるＥ１Ｂ５５ｋＤ（本明細書ではＥ１Ｂ５５ｋＤａとも記載する）及びＥ４ｏｒｆ６を発現する。
【０１０７】
第２２の態様では、本発明の課題は、ＹＢ−１を核内に含む細胞における複製のための、ウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用により解決され、その際、ウイルスは、核内にＹＢ−１を含まない正常細胞、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含まない細胞、調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞のそれぞれにおいて複製欠損であり、そのウイルスは、癌遺伝子又は癌遺伝子産物、特に癌遺伝子タンパク質（少なくとも１つのウイルス性遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子をトランス活性化する）をコードし、その際、その遺伝子は、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される。
【０１０８】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスが、核内にＹＢ−１を有する細胞又は細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含まない細胞、又は調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞内で複製すると考えられる。
【０１０９】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質がＥ１Ａであるか／又は癌遺伝子がＥ１Ａをコードする遺伝子であるか、及び／又は癌遺伝子タンパク質がＥ１Ａであると考えられる。
【０１１０】
好ましい実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは、機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合することができると考えられる。
【０１１１】
代替的な実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは、機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合することができないと考えられる。
【０１１２】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは、ＹＢ−１の核局在化を誘導しないと考えられる。
【０１１３】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる態様では、医薬が、その細胞がＲｂ陽性又はＲｂ陰性のいずれかである患者のためのものであることが企図される。
【０１１４】
好ましい実施態様では、細胞は、その医薬に影響されることになる条件の形成に関与する細胞であることが企図される。
【０１１５】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、細胞は、核内がＲｂ陰性でＹＢ−１陽性であり、特に、細胞周期とは無関係に核内がＹＢ−１陽性であることが企図される。
【０１１６】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、医薬は腫瘍の処置用であることが企図される。
【０１１７】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、細胞、特に腫瘍又はその一部を形成する細胞が、薬物、好ましくは抗腫瘍薬及びより好ましくは細胞分裂停止薬に対して耐性、特に多剤耐性であることが企図される。
【０１１８】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の好ましい実施態様では、細胞が、膜結合輸送タンパク質であるＰ−糖タンパク質及び／又はＭＲＰを発現し、好ましくは過剰発現していることが企図される。
【０１１９】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、細胞は、ｐ５３陽性又はｐ５３陰性のいずれかであることが企図される。
【０１２０】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の実施態様では、癌遺伝子タンパク質は、野生型癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａと比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含むと考えられ、その際、欠失は、好ましくは、ＣＲ３領域の欠失及びＮ末端の欠失、及びＣ末端の欠失を含む群から選択される。Ｅ１Ａ癌遺伝子タンパク質は、Ｒｂに結合することができると考えられる。
【０１２１】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の実施態様では、癌遺伝子タンパク質は、野生型癌遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異または欠失を含み、その際、欠失は、好ましくは、ＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域内のものである。癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａは、Ｒｂに結合することができないと考えられる。
【０１２２】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａは、組織特異的及び／又は腫瘍特異的プロモーターの制御下にあると考えられる。
【０１２３】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスはＹＢ−１をコードしていることが企図される。
【０１２４】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、ＹＢ−１は、組織特異的及び／又は腫瘍特異的プロモーターの制御下にあることが企図される。
【０１２５】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の好ましい実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスは、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ１Ｂ５５ｋ及びアデノウイルスＥ３ＡＤＰタンパク質を含む群から選択される、少なくとも１種のタンパク質をコードすることが企図される。
【０１２６】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の代替的実施態様では、細胞は、核内にＹＢ−１を含み、特に腫瘍又はその一部を形成する細胞は、核内にＹＢ−１を含むことが企図される。
【０１２７】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の更なる実施態様では、腫瘍は、ＹＢ−１の核内への輸送の誘導後、核内にＹＢ−１を含むことが企図される。
【０１２８】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の好ましい実施態様では、ＹＢ−１の核内への輸送が、少なくとも１つの手段により惹起され、その際、その手段は、照射、細胞分裂停止剤の投与、及び温熱療法を含む群から選択されることが企図される。
【０１２９】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の好ましい実施態様では、手段は、細胞、器官又は生体に適用されることが企図される。
【０１３０】
本発明の第２１及び第２２の態様による使用の好ましい実施態様では、ウイルス、特にアデノウイルスが、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ｄｌ１１１９／１１３１、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０および、機能的Ｒｂ腫瘍抑制遺伝子産物に結合できるウイルス性Ｅ１Ａ癌遺伝子の発現を欠いているウイルスを含む群から選択されることが企図される。
【０１３１】
第２３の態様では、課題は、医薬の製造のためのウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用により解決され、この際、複製がＥ２後期プロモーターのＹＢ−１介在活性化を介して又はＹＢ−１により制御されるように、好ましくは大部分がＥ２後期プロモーターの活性化により制御されるように、ウイルス、特にアデノウイルスが適合されている。１つの実施態様では、ＹＢ−１は、導入遺伝子したＹＢ−１又は細胞性ＹＢ−１、特に細胞性の調節解除されたＹＢ−１、又は調節解除されたＹＢ−１である。導入遺伝子したＹＢ−１は好ましくは、細胞内でベクター、特にある種の又は特定のアデノウイルスにより発現されているＹＢ−１である。Ｅ２後期プロモーターは、好ましくは、野生型アデノウイルス内に含まれるようなアデノウイルスＥ２後期プロモーターであるか、又は本明細書に記載するような導入遺伝子の発現に関連して使用されるＥ２後期プロモーターである。
【０１３２】
第２４の態様では、課題は、核内にＹＢ−１を含む細胞における複製のための、ウイルス、特にアデノウイルスの使用により解決され、その際、複製がＥ２後期プロモーターの活性化を通じてＹＢ−１により制御されるように、好ましくは大部分がＥ２後期プロモーターの活性化により制御されるように、ウイルス、特にアデノウイルスが適合されている。実施態様では、ＹＢ−１は、遺伝子導入したＹＢ−１又は細胞性ＹＢ−１、特に細胞性の調節解除されたＹＢ−１、又は調節解除されたＹＢ−１である。遺伝子移入したＹＢ−１は、好ましくは細胞内でベクター、特にある種の又は特定のアデノウイルスにより発現されているＹＢ−１である。Ｅ２後期プロモーターは、野生型アデノウイルス内に存在するようなアデノウイルスＥ２後期プロモーターであるか、又は本明細書に記載するような導入遺伝子の発現に関連して使用されるＥ２後期プロモーターである。
【０１３３】
本発明の第２３及び／又は第２４の態様の好ましい実施態様では、アデノウイルスは、本明細書に開示されているように適合されており、特に、本発明に従って使用され得るように適合されている。
【０１３４】
第２５の態様では、課題は、ウイルス性癌遺伝子タンパク質、特に単離されたウイルス性癌遺伝子タンパク質により解決され、その際に、ウイルス性癌遺伝子タンパク質は、下記特徴を有する：
ａ）Ｅ１Ｂ５５ｋ、Ｅ３ＡＤＰならびにＥ４ｏｒｆ６及びＥ４ｏｒｆ４を含む群から選択される、ＹＢ−１核陽性細胞内の少なくとも１つのウイルス性遺伝子がトランス活性化される；そして
ｂ）細胞核内、特にウイルス性癌遺伝子タンパク質が存在する細胞の細胞核内で、ＹＢ−１が誘導されない。
【０１３５】
実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質はＥ１Ａである。
【０１３６】
更なる実施態様では、ウイルス性癌遺伝子たんぱく質は、野生型癌遺伝子タンパク質と比較して、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、その際、欠失は、ＣＲ３領域の欠失、Ｎ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から好ましくは選択されることが企図される。
【０１３７】
実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質を通じたＹＢ−１の誘導は、Ｅ４ｏｒｆ６及び／又はＥ１Ｂ５５ｋＤがその核を含む細胞内に存在しない条件では起こらない。
【０１３８】
ウイルス性癌遺伝子タンパク質がＲｂに結合することができることが企図される。
【０１３９】
代替的な実施態様では、ウイルス性癌遺伝子タンパク質は、１つ又は複数の突然変異又は欠失を含み、その際、欠失は、好ましくはＥ１Ａまたは癌遺伝子タンパク質のＣＲ１領域及び／又はＣＲ２領域内のものである。ウイルス性癌遺伝子タンパク質は、Ｒｂに結合しない。
【０１４０】
第２６の態様では、本発明は、ウイルス複製系、特に本発明に従って使用されるようなウイルス、特にアデノウイルスをコードする核酸を含み、ヘルペスウイルスの核酸を含むアデノウイルス複製系に関し、その際、ヘルペスウイルスの核酸は、ＹＢ−１をコードする核酸配列を含む。
【０１４１】
実施態様では、ウイルスの核酸、特にアデノウイルスの核酸、及び／又はヘルペスウイルスの核酸は、複製可能なベクターとして存在することを企図する。
【０１４２】
第２７の態様では、本発明は、医薬の製造、特に腫瘍の処置のための医薬の製造のための、本発明に従って使用されるようなウイルス、特にアデノウイルスをコードする核酸の使用に関する。
【０１４３】
好ましい実施態様では、細胞、特に腫瘍又はその一部を形成する細胞が、薬物、特に抗腫瘍剤及びより特に細胞分裂停止薬に対して耐性、特に多剤耐性であることを企図する。
【０１４４】
第２８の態様では、本発明は、核内にＹＢ−１を含む細胞における複製のための、本発明に従って使用されるような、ウイルス、特にアデノウイルスの核酸の使用に関し、その際、ウイルスは、核内にＹＢ−１を含まない細胞内、細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含まない細胞内、又は調節解除された調節ＹＢ−１を含まない細胞内では複製欠損であり、ウイルス遺伝子、好ましくはＹＢ−１核陽性細胞内のアデノウイルス遺伝子の１つを少なくともトランス活性化する癌遺伝子又は癌遺伝子タンパク質をウイルスがコードしており、遺伝子は、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択される。
【０１４５】
第２９の態様では、課題は、医薬の製造のための、本発明に従って使用されるような、ウイルス、特にアデノウイルスをコードする核酸の使用により解決され、その際、ウイルスは、複製がＥ２後期プロモーターの活性化を通じてＹＢ−１により、好ましくは大部分がＥ２後期プロモーターの活性化を通じて制御されるように、適合されている。１つの実施態様においては、YB-1は、遺伝子移入したＹＢ−１又は細胞性ＹＢ−１、特に細胞性の調節解除されたＹＢ−１又は調節解除されたＹＢ−１のいずれかである。遺伝子移入されたＹＢ−１は、好ましくは、ベクター、特にある種の又は特定のアデノウイルスにより発現されるＹＢ−１である。Ｅ２後期プロモーターは、野生型アデノウイルスに含まれるようなアデノウイルスＥ２後期プロモーターであり、又は本明細書に記載の導入遺伝子の発現との関係において使用されているようなＥ２後期プロモーターであることが好ましい。
【０１４６】
第３０の態様では、課題は、細胞内での複製のために、本願発明に従って使用されるような、ウイルス、特にアデノウイルスをコードする核酸の使用により解決され、その際、ウイルスは、複製が、Ｅ２後期プロモーターの活性化を通じたＹＢ−１により、好ましくは大部分がＥ２後期プロモーターの活性化を通じて制御されるように適合されている。１つの実施態様において、ＹＢ−１は、遺伝子移入したＹＢ−１であるか、又は細胞性、特に細胞性の調節解除されたＹＢ−１のいずれかである。遺伝子移入したＹＢ−１は、ベクター、好ましくはある種の又は特定のアデノウイルスにより細胞中で発現されるものであることが好ましい。Ｅ２後期プロモーターは、好ましくは野生型アデノウイルス中に存在するようなアデノウイルスＥ２後期プロモーターであるか、本明細書に記載の移入遺伝子の発現との関係において使用されるようなＥ２後期プロモーターであることが好ましい。
【０１４７】
第３１の態様では、上述の核酸のうちひとつを含むベクターの、本発明の第２１又は第２２の態様に従った使用のための使用により解決される。
【０１４８】
第３２の態様では、発明は、患者が、本発明に従って使用されるような、ウイルス、特にアデノウイルスと接触したか及び／又は処置されたかを決定することを目的とした細胞、腫瘍組織の細胞、又は患者の特徴付けのためのＹＢ−１と相互作用する作用剤の使用に関する。
【０１４９】
実施態様において、作用剤は、抗体、アンチカリン、アプタマー、アプタザイム及びスピーゲルマーを含む群から選択されることを企図する。
【０１５０】
第３２の態様において、課題は、本発明によるウイルス性癌遺伝子タンパク質、又はそれをコードする核酸の、本発明の第２１及び第２２の態様による使用との関係において使用されるような、ウイルス、特にアデノウイルスの製造のための使用により解決される。
【０１５１】
実施態様において、ウイルスは、移入遺伝子をコードする核酸を含むことを企図する。
【０１５２】
更なる実施態様において、ウイルスは、移入遺伝子の翻訳産物及び／又は転写産物を含むことを企図する。
【０１５３】
好ましい実施態様において、アデノウイルス複製系の核酸及び／又はヘルパーウイルスの核酸は、移入遺伝子又は移入遺伝子をコードする核酸を含むことを企図する。
【０１５４】
更なる実施態様において、核酸は、移入遺伝子又は移入遺伝子をコードする核酸を含むことを企図する。
【０１５５】
代替的実施態様において、移入遺伝子は、プロドラッグ、サイトカイン、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、メタロプロテイナーゼ阻害剤の遺伝子、血管新生阻害剤の遺伝子、チロシンキナーゼ阻害剤の遺伝子を含む群から選択されることを企図する。
【０１５６】
実施態様において、移入遺伝子は、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子及びリボザイムの核酸を含む群から選択され、この際ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子及び／又はリボザイムが、標的分子に対するものであることを特徴とすることを企図する。
【０１５７】
更なる実施態様において、標的分子は、耐性関連因子、抗アポトーシス因子、癌遺伝子、血管新生因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ複製酵素、増殖因子及びそのレセプター、転写因子、メタロプロテイナーゼ、特にマトリクスのメタロプロテイナーゼ、ならびにウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターを含む群から選択される。実施態様において、耐性関連因子は、好ましくはＰ−糖タンパク質、ＭＲＰ及びＧＳＴを含む群から選択され、これらをコードする核酸をも含む。実施態様において、抗アポトーシス因子は、ＢＣＬ２を含む群から選択され、それをコードする核酸をも含む。１つの実施態様において、癌遺伝子は、Ｒａｓ、特に突然変異しているＲａｓ、Ｒｂ及びＭＹＣを含む群から選択され、それらをコードする遺伝子をも含む。実施態様において、血管新生因子は、ＶＥＧＦ及びＨＭＧタンパク質を含む群から選択され、これらをコードする核酸をも含む。１つの実施態様において、ＤＮＡ合成酵素は、テロメラーゼを含む群から選択され、それをコードする核酸をも含む。実施態様において、ＤＮＡ修復酵素は、Ｋｕ−８０を含む群から選択され、それをコードする核酸をも含む。１つの実施態様において、増殖因子は、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ及びＭ−ＣＳＦを含む群から選択され、それらをコードする核酸をも含む。更なる実施態様において、レセプターは、好ましくは増殖因子のものであり、その際、増殖因子は、好ましくはＰＤＧＦ、ＥＧＦ、及びＭ−ＣＳＦから選択され、それをコードする核酸をも含む。１つの実施態様において、転写因子は、ＹＢ−１を含む群から選択され、それをコードする核酸をも含む。１つの実施態様において、メタロプロテイナーゼは、特にマトリックスのメタロプロテイナーゼである。好ましい実施態様において、マトリックスのメタロプロテイナーゼは、ＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２を含む群から選択され、それをコードする核酸をも含む。１つの実施態様において、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターは、ｕＰａ−Ｒを含む群から選択され、それをコードする核酸をも含む。
【０１５８】
更なる実施態様において、医薬は、少なくとも１つの医薬的に活性な化合物をさらに含むことを企図する。
【０１５９】
好ましい実施態様では、薬学上活性のある作用剤は、 サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、 血管形成阻害剤、結腸直腸癌に対するイリノテカン及びＣＰＴ−１１並びに白血病に対するダウノルビシンなどの細胞増殖抑止剤、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ活性を抑制し結腸直腸腫瘍に対して用いることができるＣＹＣ２０２（McClue S J, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468）及びＲａｆ−１を阻害し例えば乳癌に対して有効なＢＡＹ ４３−９００６（Wilhelm S M et al., Cancer Res. 2004, 64, 7099-7109）のような細胞周期阻害剤、２６Ｓプロテアソーム活性を抑制し、脳腫瘍に対して用いられるＰＳ−３４１のようなプロテオソーム阻害剤、ＥＧＦレセプターなどに対する組換え抗体 (乳癌及び前立腺腫瘍に対するハーセプチン; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; 頭部及び頚部腫瘍に対するエルビタックス; Bauman M et al., Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266)、及び特にｃ−ｋｉｔを抑制し、胃腸の腫瘍に対して用いることができる、ＳＴＩ５７１のような信号伝達カスケードの阻害剤 (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、特に前立腺腫瘍に対して用いることのできるエンドセリン阻害剤であるＡＢＴ−６２７ (H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、ＶＥＧＦチロシン・キナーゼ・レセプターのリン酸化を阻害し、特に首及び頭の腫瘍に対して用いることができるＳＵ５４１６ (Yin D. et al., Oncogene 2004)、ＥＧＦＲチロシン活性を阻害し、特に前立腺腫瘍に対して用いることができるＺＤ１８３９( H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17)、ｍＴＯＲを阻害し、前立腺腫瘍に対して用いることができるＣＣＩ−７７９及びＲＡＤ００１のようなラパマイシン誘導体；を含む群より選択される。本明細書に記述した様々なアデノウイルス及び本発明に従って用いられるアデノウイルスを、それぞれ原則として、いずれの前述の化合物とも共に、本明細書においてそれに関連して上述したいずれの適応に対しても用いることができることは、本発明内である。特に好ましい実施態様では、この適応は任意の以前に言及した薬学上活性のある化合物に対して記述されている適応である。
【０１６０】
実施態様では、薬物は少なくとも２つの作用剤の組合せを含む。その場合、任意の作用剤が、個々に及び独立して細胞増殖抑止剤を含む群より選択される。
【０１６１】
好ましい実施態様では、少なくとも２つの作用剤が異なる標的分子に作用する。
【０１６２】
別の実施態様では、少なくとも２つの作用剤が異なる作用機序によって活性を有する。
【０１６３】
実施態様では、少なくとも１つの作用剤が、ウイルスがその中で複製する細胞の感染される受容能力を増加させる。
【０１６４】
実施態様では、少なくとも１つの作用剤が、細胞内の成分の有効性に影響を及ぼし、好ましくは成分の有効性を増大させ、それによって成分はウイルスの取込みを媒介する。
【０１６５】
実施態様では、少なくとも１つの作用剤が、核の中へのＹＢ−Ｉの輸送を媒介し、好ましくは前記輸送を増加させる。
【０１６６】
実施態様では、少なくとも１つの作用剤がヒストンデアシラーゼ阻害剤である。
【０１６７】
好ましい実施態様では、ヒストンデアシラーゼ阻害剤が、トリコスタチン Ａ、ＦＲ ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、及びＰＸＤ１０１を含む群より選択される。
【０１６８】
実施態様では、少なくとも１つの作用剤が、トリコスタチン Ａ、ＦＲ ９０１２２８（膵臓腫瘍に対して、Sato N et al., Int. J. Oncol. 2004, 24, 679-685；ＭＳ−２７−２７５（前立腺腫瘍に対して、 Camphausen K et al., Clinical Canver Research 2004, 10, 6066- 6071)、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（白血病に対して、Nimmanapalli R et al., Cancer Res. 2003, 63, 5126- 5135；ＰＸＤ１０１（卵巣腫瘍に対して、Plumb JA et al, Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 721-728)、スクリプタイド（乳癌に対して、 Keen JC et al., Breast Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177- 186)、アピシジン（メラノーマに対して、Kim SH et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 315, 964-970)及びＣＩ−９９４（様々な腫瘍に対して、Nemunaitis JJ et al., Cancer J. 2003, 9, 58- 66）を含む群より選択される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の作用機序については、特に Lindemann RK et al., Cell Cycle 2004, 3, 77-86 に記述されている。本明細書に記述される様々なアデノウイルス及び本発明に従って用いられるアデノウイルスを、それぞれ原則として前述の化合物と共に、本明細書でそれに関連して上述したいずれの適応に対しても用いることができることは、本発明の範囲内である。特に好ましい実施態様では、この適応は以前に言及した薬学上活性のあるそれぞれの化合物に対して記述された適応である。
【０１６９】
実施態様では、少なくとも１つの作用剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。
【０１７０】
好ましい実施態様では、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、 イリノテカン、トポテカン、 ＤＸ−８９５１ｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、 ９−ニトロカンプトテシン、 エトポシド及びダウノルビシンを含む群より選択される。これらを様々な腫瘍、例えば結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣癌、前立腺癌に対して用いることができる。利用される分野については特に、Recchia F et al., British J. Cancer 2004, 91, 1442-1446; Cantore M et al., Oncology 2004, 67, 93-97; Maurel J. et al., Gynecol. Oncol 2004, 95, 114-119; Amin A. et al., Urol. Oncol. 2004, 22, 398-403; Kindler HL et al., Invest. New Drugs 2004, 22, 323-327, Ahmad T. et al., Expert Opin. Pharmacother. 2004, 5, 2333-2340; Azzariti A. et al., Biochem Pharmacol. 2004, 68, 135-144; Le QT et al., Clinical Cancer Res. 2004, 10, 5418-5424 に記述されている。ここに記述した様々なアデノウイルス及び本発明に従って用いられるアデノウイルスは、それぞれ、原則として、前述の化合物と共に、本明細書でそれに関連して上述したいずれの適応に対しても用いることができることは、本発明の範囲内である。特に好ましい実施態様では、この適応は、以前に言及した医薬的に活性を有する各々の化合物に対して記述された適応である。
【０１７１】
好ましい実施態様では、作用剤がトリコスタチンＡ及びイリノテカンを含む。
【０１７２】
実施態様では、ウイルス、特に本発明の態様の１つによるウイルス、が少なくとも２つの作用剤から分離されている。
【０１７３】
好ましい実施態様では、ウイルスの少なくとも１単位の投与量が、少なくとも２つの作用剤のうちの１つの少なくとも１単位の投与量から分離されている。  
【０１７４】
第３４の態様では、本発明は、ウイルス、特に本発明の任意の態様によるウイルス、及び少なくとも２つの作用剤を含むキットに関する。その場合、任意の作用剤が、個々に及び独立して細胞増殖抑止剤を含む群より選択される。
【０１７５】
本発明に従って上で開示されたアデノウイルス、特に、本発明の第１〜第８の態様に関連して開示されたものはまた本明細書ではグループＩのアデノウイルスと呼び、たとえばＥ１Ａのようなトランス活性化する癌遺伝子を有するアデノウイルス及び／又は本明細書でいうもの、特に上で本発明に従って使用されるべきものはまた、本明細書ではグループＩＩのアデノウイルスと呼ぶ。グループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスはまた、まとめて本明細書では、アデノウイルス、又は本発明に係るアデノウイルス又は本発明に係るウイルスと呼ぶ。
【０１７６】
本発明は、アデノウイルス遺伝子の発現配列の反転が効率的な複製を生じ、場合により、アデノウイルスに感染した細胞の溶解を生じるという驚くべき知見に基づく。アデノウイルス遺伝子の経時的に変化する発現に関して、本明細書では個々に又はまとめて、第２のタンパク質に先立って発現される第１のタンパク質と呼ばれるＥ１Ｂタンパク質及びＥ４タンパク質が特に強調されるべきである。第２のタンパク質は、Ｅ１Ａタンパク質を含む群から選択される。先ずＥ１Ａタンパク質が発現し、順にＥ１Ｂタンパク質及びＥ４タンパク質が発現する野生型アデノウイルスに比べて、反転しているこの発現順は、転写因子が活性化され、たとえば感染した細胞の核に輸送され、そこでのさらなる複製活性に影響を与え、複製活性を制御することを保証している。野生型アデノウイルスにおけるアデノウイルス転写物の動態は、たとえば、Glenn G. M and Ricciardi R. P., Virus Research 9: 73-91, 1988に記載されており、彼らは、野生型のＥ１Ａ転写物では、すなわち、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５ｋの転写物及び翻訳産物に先立って、普通、Ｅ１Ａ１２Ｓ及びＥ１Ａ１３Ｓの転写物が検出可能であると報告している。本件の場合、Ｅ１Ｂタンパク質は、本明細書では一般に、他の表示がない限り、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質である。本件の場合、Ｅ４タンパク質は、本明細書では一般に、他の表示がない限り、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質である。本件の場合、Ｅ１Ａタンパク質は、本明細書では一般に、他の表示がない限り、好ましくはＥ１Ａ１２Ｓタンパク質又はＥ１Ａ改変アデノウイルスに関連して本明細書で記載されるようなＥ１Ａタンパク質である。
【０１７７】
Ｅ１Ａタンパク質、特にまたＥ１Ａ１２Ｓタンパク質が原則として置換されてもよいことは本発明の範囲内である。そのような置換されたＥ１Ａタンパク質及びＥ１Ａ１２Ｓタンパク質は、本明細書ではまた、Ｅ１Ａタンパク質及びＥ１Ａ１２Ｓタンパク質と呼び、又は他の表示がない限り、この用語によって含まれるように判断されるべきである。Ｅ１Ａ１２タンパク質の代わりに、たとえば、Dickopp A., Esche H., Swart G., Seeber S., Kirch H. C., Opalka B., Cancer Gene Ther., Jul;7(7): 1043-50, 2000によって記載されるように、腫瘍抑制機能を有するＥ１Ａタンパク質を使用してもよい。さらに、Ｅ１Ａタンパク質の誘導体、特にＥ１Ａ１２Ｓの誘導体は、本明細書で使用する及び／又は呼ばれるとき、一般に、Ｒｂ／Ｅ２Ｆ複合体から因子Ｅ２Ｆを放出することが可能であるタンパク質である。Chellappan S. et al., Proc. Natl. acad. Sci. USA 89: 4549-4533, 1992に記載されるように、とりわけ、シミアンウイルス４０腫瘍抗原（ＳＶ４０ラージＴ抗原）、パピローマウイルスＥ７タンパク質（ＨＰＶＥ７）がある。
【０１７８】
Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５ｋの誘導体を使用してもよいことは本発明の範囲内であり、本明細書で使用されるとき、用語Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５ｋはそのような誘導体を含む。誘導体は、たとえば、Shen Y. et al., J. of Virology 75: 4297-4307, 2001; Querido E. et al., J. of Virology 75: 699-709, 2001に記載されている。
【０１７９】
Ｅ１Ｂタンパク質が、Ｅ１Ａタンパク質に先立って発現されること、又はＥ４タンパク質がＥ１Ａタンパク質に先立って発現されること、又はＥ１Ｂタンパク質及びＥ４タンパク質が、それぞれ上述のようにＥ１Ａタンパク質に先立って発現されることは本発明の範囲内である。
【０１８０】
そのような方法で設計されたアデノウイルスは、核にＹＢ−１を発現する、好ましくは細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を発現するか、又は調節解除されたＹＢ−１を好ましくは細胞質に含む細胞の感染の際、特に高いレベルで複製することが可能である。以下においてそれらに束縛されることを望まないで、本発明者は、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４から成る複合体及びこれら２つのタンパク質の個々が調節解除されたＹＢ−１を細胞核に輸送でき、又は、Ｅ１Ａタンパク質に先立って発現しているＥ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質の影響下、そこでアデノウイルスの複製を開始できることを想定している。いったん、細胞核において、又は活性化形態でそこに存在すると、本明細書で記載するようにＹＢ−１は、特にＥ２後期プロモーターを用いて効率的に複製してもよい。従って、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質の時間的に早い発現は、Ｅ１Ａタンパク質の最初の発現と共に進む、野生型で認められるカスケードを回避する。好ましい実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質をもはやトランス活性化しない、又は極めて限定された程度にしかそれをトランス活性化しないＥ１Ａタンパク質である。好ましくは、このトランス活性化は、核にＹＢ−１を有さない細胞における効率的な複製を確保するにも十分でなければ、複製を確保するにも十分ではない。トランス活性化は、細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有さない細胞又は調節解除されたＹＢ−１を有さない細胞で生じないことが好ましい。
【０１８１】
さらに、本発明は、アデノウイルスは、少なくともタンパク質をコードする核酸を含めば特に効率的に複製することができ、その際、タンパク質は、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質およびＥ１Ａタンパク質を含む群から選択され、そのタンパク質の少なくとも１つが野生型アデノウイルスにおける各タンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下にあるという驚くべき知見に基づく。そのような複製は、特に効率的であり、普通、細胞が核にＹＢ−１を有する、特に細胞周期とは無関係にＹＢ−１を有する場合、又は細胞が調節解除されたＹＢ−１を有する、特に調節解除されたＹＢ−１を細胞質に有する場合、結果として腫瘍溶解を生じる。Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質及びＥ１Ａタンパク質について上で言ったことはここでも適用される。野生型アデノウイルスでは、Ｅ１Ｂタンパク質はＥ１Ｂプロモーターにより制御され、Ｅ４タンパク質はＥ４プロモーターにより制御され、Ｅ１Ａタンパク質はＥ１Ａプロモーターにより制御される。野生型アデノウイルスにおいて前述のタンパク質の発現を制御するものとは異なるプロモーターを選択することにより、前述のタンパク質の発現並びにアデノウイルスの核酸及びタンパク質の調節性相互作用が変化する。プロモーターを選択することによって、時間的に異なる発現パターンが創製され、以下においてそれに束縛されることを望まないで、それは、細胞で観察される複製を生じ、そのメカニズムは、アデノウイルスのタンパク質、Ｅ１Ｂ、Ｅ４及びＥ１Ａの時間的に異なる発現に関して前に記載されたようなものであってもよい。野生型アデノウイルスにおける各タンパク質の発現を制御するものとは異なるプロモーターを介した前記タンパク質の制御のための具体的設計の例は、従属クレーム及び実施例部分から選べばよく、特に、ＸＶｉｒＰＳＪＬ１及びＸＶｉｒＰＳＪＬ２と呼ばれるウイルスはその代表例である。好ましくは、Ｅ１Ｂタンパク質はＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質であり、Ｅ４タンパク質はＥ４ｏｒｆ６タンパク質であり、Ｅ１Ａタンパク質はＥ１Ａ１２Ｓタンパク質である。
【０１８２】
Ｅ４タンパク質同様にＥ１Ｂタンパク質を好ましく制御するプロモーターは、アデノウイルスプロモーターが使用されるとき、Ｅ１Ｂタンパク質の発現制御の場合、それらはＥ１Ｂプロモーターとは異なり、Ｅ４タンパク質の発現制御の場合、それらはＥ４プロモーターとは異なるという条件付きで、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択される。Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質の発現制御にはＥ１Ａプロモーターの使用が特に好ましい。Ｅ１Ａプロモーターは、たとえば、Boulanger P. A and Blair G. E, Biochemical J., 275: 281-299,1991に記載されている。さらに、各異種プロモーター及びそのほかのいかなる異種プロモーターの使用も可能であり、すなわち、野生型アデノウイルスにおける各タンパク質の発現を制御するものとは異なるプロモーター。代表的な例はＣＭＶプロモーターであり、そのほかのプロモーターも当業者には明らかであろう。
【０１８３】
Ｅ１Ａの制御のために使用されるプロモーターは、アデノウイルスのプロモーターがＥ１Ａプロモーターとは異なるという条件付きで、腫瘍特異的プロモーター、器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、異種プロモーター、及びアデノウイルスプロモーターを含む群から選択されてもよい。前述のタンパク質、すなわち、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質又はＥ１Ａタンパク質の１つ又は幾つかが同一プロモーターの制御下にあり、にもかかわらず、Ｅ１Ｂタンパク質及びＥ４タンパク質が同一プロモーターの制御下にあることが特に好ましいということは本発明の範囲内である。Ｅ１Ａタンパク質の発現は、ＹＢ−１が制御するプロモーター又はＹＢ−１が調節できるプロモーターにより制御されることが特に好ましい。そのようなプロモーターは、本発明の他の態様と併せて本明細書で開示される。アデノウイルスＥ２後期プロモーターの使用は、Ｅ１Ａプロモーターの発現の制御には特に好ましく、第１にＹＢ−１により調節することができ、第２に、事実上無視できるほど、ＹＢ−１の非存在下では転写をほとんど示さないので、Ｅ２後期プロモーターの制御下にある核酸の発現制御が確保される。このことは、特に医学分野に適用される場合、生物学的安全性を相当に高める。
【０１８４】
さらに、本発明は、ＹＢ−１が特に細胞核において直接的に又は間接的にのいずれかで複製に提供されれば、或いはＹＢ−１の提供に直接的に又は間接的にアデノウイルスのタンパク質が介在しており、その際、そのようなアデノウイルスがＥ１Ａと異なっていれば、アデノウイルスは、核にＹＢ−１を有する細胞、特に細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有する細胞及び／又は調節解除されたＹＢ−１を有する細胞、好ましくは、細胞質に調節解除されたＹＢ−１を有する細胞で特に複製することを見い出した。本発明の本態様は、本明細書でも開示される態様とは異なる、すなわち、トランス活性化するＥ１Ａ改変のアデノウイルス、好ましくは、グループＩＩのアデノウイルスの使用が、ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞、特に細胞周期とは無関係にＹＢ−１陽性であるＹＢ−１核陽性の細胞及び調節解除されたＹＢ−１を有する、特に細胞質にＹＢ−１を含む細胞で複製ができ、その程度において、Ｅ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１３Ｓタンパク質のトランス活性化の特性がここでは使用されず、すなわち、グループＩのアデノウイルスとの関連で、しかし、むしろ、好ましい実施態様において、Ｅ１Ａ１３Ｓは機能的に不活性であるので、もはやＥ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５ｋをトランス活性化することができず、それは、直接的に又は間接的にＹＢ−１の輸送及び提供にそれぞれ関与する。したがって、本発明の本態様に従うと、アデノウイルスの効率的な複製は可能ではない。核におけるＹＢ−１の提供及びアデノウイルスの複製に対するＹＢ−１の提供の場合は、もはやＥ１Ａタンパク質の直接的な又は間接的な関与の制御下ではないが、Ｅ１Ａによって制御されないＥ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤタンパク質及び／又はＥ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質の発現を介して生じる。
【０１８５】
アデノウイルスの本実施態様は、前述の手段の１つ、たとえば、Ｅ１Ａタンパク質の発現に比べて、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質の時間的発現を前に進めることによって、或いは、１又は数個のＥ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質及びＥ１Ａタンパク質を野生型アデノウイルスにおける各タンパク質の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターの制御下に置くことによって提供されてもよい。
【０１８６】
最終的に、本発明者は、効果的なアデノウイルスの複製は、特に核にＹＢ−１を有する、さらに特に細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有する細胞、又は調節解除されたＹＢ−１を好ましくは細胞質に有する細胞で生じてもよく、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質及びＥ１Ａタンパク質の少なくとも１つの場合、特にその好ましい形態はプロモーターの制御下の発現カセットにおいて発現されるという驚くべき知見から出発する。本発明の実施態様の１つでは、前記タンパク質の単一の１つをそれぞれ含む３種の発現カセットが基本的に提供される。別の実施態様では、２以上のタンパク質、Ｅ１Ｂ、Ｅ４及びＥ１Ａ及び特にＥ１Ａ１２Ｓの場合、その誘導体及び可能な置換基を含んでもよい。アデノウイルスがタンパク質、Ｅ１Ｂ、Ｅ４及びＥ１Ａに関する核酸を含むという態様に関連して前に述べたことは、種々のタンパク質及びそれぞれ使用するプロモーターの設計にも適用可能である。そのような発現カセットを使用する場合、タンパク質及び発現カセットの各タンパク質に相当する野生型アデノウイルスのゲノムにそれをコードする核酸は、完全に又は部分的にのいずれかで欠失されて、確実にウイルスを安定にし、少なくともさらに大きな程度への組換えを回避することが好ましい。
【０１８７】
原則として、発現カセットはアデノウイルスの各領域及び各部位にクローニングされ、好ましくは、１又は数個のカセットを個々に又は互いに組み合わせてウイルスのＥ１領域、Ｅ３領域及び／又はＥ４領域に挿入する。Ｅ１領域、Ｅ３領域及びＥ４領域が完全に欠失される、部分的に欠失される、又は全く欠失されないことが可能であり、本発明に係るアデノウイルスに関してはＥ１Ａ１３Ｓ遺伝子をコードする核酸は、ウイルスによってトランス活性化するいかなるＥ１Ａタンパク質も提供しないように不活化される又は欠失されることが好ましい。Ｅ１領域、Ｅ３領域及びＥ４領域の１又は数個におけるそのような欠失の程度は、使用される発現カセット、及び場合により、さらに導入されるが外来遺伝子又は導入遺伝子又はそれら、すなわち、アデノウイルス遺伝子とは異なる、少なくとも、野生型アデノウイルスで優勢であるアデノウイルス核酸の調節性の程度で提供されないセンスにおいて異なる、或いはそのような部位で野生型アデノウイルスのアデノウイルス核酸の配列で提供されない遺伝子を含むさらなる発現カセットにより決定される。Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質及び／又はＥ１Ａタンパク質をコードする１又は数個の発現カセットに含有される核酸がアデノウイルスのゲノムにおいて完全に又は部分的に欠失されることは本発明の範囲内である。本発明ＸｖｉｒＰＳＪＬ１又は２に係るアデノウイルスのような実施態様では、Ｅ４ｏｒｆ６をコードするアデノウイルス核酸は部分的に欠失又は完全に欠失されるが、それをコードする完全な核酸が発現カセットに含有される。好ましくは、これは、Ｅ１Ｂ５５ｋ（Ｅ１５５Ｋｄともいう）タンパク質及び／又はＥ１Ａ１２Ｓタンパク質についても実現される。欠失の程度は、野生型アデノウイルスの最大パッケージサイズの約１０３％の最大パッケージサイズに達するように好ましい実施態様で選択されるべきであるが、この限定は単に好ましい限定に過ぎない。アデノウイルスゲノムで行われる可能性のある欠失は、たとえば、さらなる感染性の濃縮粒子が確実に製造されうるような好ましい実施態様における限定の単なる対象である。欠失の正確な程度は、標準試験と共に本明細書で提供される開示に基づいて当業者によって決定されてもよい。
【０１８８】
本明細書で記載されるアデノウイルスの構築のための出発点として、いかなる野生型アデノウイルスを使用してもよいが、本発明の技術的教示に従ってそれらが構築されるという条件で、そのほかのアデノウイルスを使用してもよい。サブグループＣそして次にこのグループ内のアデノウイルス２及びアデノウイルス５に頼ることが特に好ましい。
【０１８９】
用語、Ｅ１Ｂタンパク質（単数）及びＥ１Ｂタンパク質（複数）、Ｅ４タンパク質（単数）及びＥ４タンパク質（複数）、並びにＥ１Ａタンパク質（単数）及びＥ１Ａタンパク質（複数）は、他の表示がない限り、同義的に本明細書で使用される。
【０１９０】
本明細書で使用するとき、用語「調節解除された」ＹＢ−１は、正常に存在する細胞、好ましくは非腫瘍細胞のＹＢ−１とは量的に及び／又は質的に異なる形態で存在する本明細書で記載されるＹＢ−１分子又はＹＢ−１タンパク質をいう。特定のウイルスがそのような調節解除されたＹＢ−１を含む細胞のバックグラウンドで調節解除されたＹＢ−１の存在下で複製できることによって、調節解除されたＹＢ−１を特徴づけ、同定することができる。それに関連した特定のウイルスは、そのＥ１Ａタンパク質に突然変異があり、トランス活性化する機能を呈するものである。特定のウイルスの例は、ＡＤデルタ２４、ｄｌ９２２−９４７、ＥｌＡｄ／０１／０７及びＣＢ１０６及び／又はHowe J. A. et al., Molecular Therapy 2: 485-495, 2000; Fueyo J. et al., Oncogene 19: 2-12, 2000; Heise C. et al., Nature Medicine 6: 1134-1139, 2001; Balague C., et al., J. Virol., 75: 7602-7611, 2001; Bautista D. S. et al., Virology 182: 578-596, 1991; Jelsma T. N. et al., Virology 163:  494-502, 1988; Wong H. K. and Ziff E. B. J. of Virology 68: 4910-4920, 1994に記載されるものである。そのような細胞及びそのようなバックグラウンドを有するそのような細胞は、グループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスの複製に使用することができる。さらに、そのような細胞を含む腫瘍を本発明に係るアデノウイルスによって溶解してもよい。
【０１９１】
さらに、本発明は、ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞におけるＥ１Ａ修飾のアデノウイルスのＤＮＡ複製がＥ２後期プロモーターの活性化に基づくという驚くべき知見に基づく。Ｅ１Ａ改変のアデノウイルスは、（ａ）ＹＢ−１核陰性の細胞では、野生型に比べて複製が少ない又は全く複製しない、（ｂ）少なくとも１つのウイルス遺伝子に対してトランス活性化活性を有し、その際、遺伝子は特にＥ１Ｂ−５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰを含む群から選択され、及び／又は（ｃ）アデノウイルスによって細胞のＹＢ−１を核に転移しないものとして理解されるべきである。場合により、本発明に係るアデノウイルスは、アデノウイルスにコードされるＥ１Ａタンパク質の結合がＥ２ＦのＲＢへの結合を妨害し、Ｅ２ＦとＲｂから成る各複合体を溶解することが可能であるというさらなる特性を有する。前述の特徴（ａ）〜（Ｃ）の１又は数個、好ましくは特徴（ａ）〜（Ｃ）のすべてを有するアデノウイルスは、ＹＢ−１を核に有さない細胞では複製欠損性である。
【０１９２】
実施態様では、ここで強く低下した複製は特に、野生型に比較して２の因子、好ましくは５の因子、さらに好ましくは１０の因子及び最も好ましくは１００の因子減少する複製を意味する。好ましい実施態様では、同一の又は類似の細胞株、同一の又は類似の、感染に対するウイルス力価（感染の複合性、ＭＯＩ又はプラーク形成単位、pfu）及び／又は同一の又は類似の一般的実験条件を用いて、複製の比較を行う。複製は特に粒子の形成を意味する。更なる実施態様では、複製の手段がウイルス核酸の合成程度であってもよい。ウイルス核酸の合成程度の決定方法及び粒子形成の測定方法は、双方共に当業者に既知である。
【０１９３】
知見、方法、使用又は核酸、タンパク質、複製システムなどは、必ずしもアデノウイルスに限定されない。基本的に、そのようなシステムは、本明細書にも含まれるそのほかのウイルスにも存在する。
【０１９４】
本発明に係るウイルスを使用すること又は本発明に従って本明細書に記載されるウイルスの使用が従来技術に従った１０〜１００pfu／細胞に比べて、１〜１０pfu／細胞を用いた場合、野生型に匹敵する複製を生じてもよい。
【０１９５】
細胞性ＹＢ−１はコードされた任意のＹＢ−１でなければならず、好ましくは、細胞によって発現され、ＹＢ−１は、特に、アデノウイルスによって、好ましくは本明細書で記載されるようにアデノウイルス及び／又はヘルパーウイルスによって各細胞に感染される前に特に細胞に存在する。しかしながら、細胞性ＹＢ−１が、ウイルス、好ましくはアデノウイルスによる感染のような外因性の手段が適用される場合にのみ、細胞に導入される又は細胞によって産生されるＹＢ−１であることも本発明の範囲内である。
【０１９６】
それに束縛されることを望まないで、本発明者は、Ｅ２早期プロモーター、すなわち、早期Ｅ２プロモーターは、本発明に従って使用されるウイルスの複製と関連した、かつ本発明のアデノウイルスの本発明に従った使用と関連したヒト細胞性Ｅ２Ｆ転写因子によってスイッチオンされないことを想定する。そのような状況下で、複製の開始は、細胞のＲｂの状態と無関係であり、すなわち、本明細書で開示されたウイルスを用いて感染させられ、かつ、好ましくは続いて溶解される腫瘍細胞は、機能的なＲｂタンパク質及び不活性のＲｂタンパク質のいずれかを含有してもよい。さらに、本明細書で開示されるアデノウイルスを用いた、又は本明細書で開示される条件を用いたアデノウイルスの複製は、いかなる機能的なｐ５３タンパク質も要求しないが、その存在によって否定的な影響を受けることもない。その程度において、無傷のＲｂタンパク質は生体内での効率的な複製を妨害するので、Ｒｂ陰性及びＲｂ変異の細胞でのみ生体内のアデノウイルスの複製が提供されるという前提でＥ１Ａタンパク質における１又は数個の欠失の対象とされてきた、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６又はたとえば、欧州特許ＥＰ０９３１８３０に記載されるようなアデノウイルスの癌溶解又は腫瘍溶解のアデノウイルスの使用の原理から、技術的教示は離れる。従来技術のアデノウイルスのシステムは、早期Ｅ２プロモーター（Ｅ２早期プロモーター）及び「遊離のＥ２Ｆ」によるアデノウイルスの生体内複製を制御するためにＥ１Ａに基づく。それにもかかわらず、従来技術のこれら既知のウイルスを、本発明に従って、細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を含有する細胞又は調節解除されたＹＢ−１を含む細胞における複製に使用してもよい。
【０１９７】
前記欧州特許ＥＰ０９３１８３０号で記載されたウイルス、特にアデノウイルスは、本発明に従って使用してもよい。さらに具体的には、前記特許に記載されたウイルスは、複製欠損性であり、機能的なＲｂ腫瘍抑制遺伝子産物を結合することが可能であるウイルス性の癌タンパク質の発現を欠くウイルスである。アデノウイルスは、機能的な腫瘍抑制遺伝子産物、さらに詳しくはＲｂを結合することが可能であるウイルス性のＥ１Ａ癌タンパク質の発現を欠くいかなるアデノウイルスであることもできる。ウイルス性のＥ１Ａ癌タンパク質は、たとえば、ｐ１０５Ｒｂタンパク質、ｐ１３０及びｐ１０７タンパク質の結合に関与する、本明細書ではＡｄ５、ヌクレオチド６７９〜７９０位と呼ばれるアデノウイルスＡｄ５におけるアミノ酸３０位〜８５位でのＣＲ１ドメイン及び／又はＡｄ５におけるアミノ酸１２０位〜１３０位、ヌクレオチド９２０〜９６７位でのＣＲ２ドメインにて不活性化突然変異を示すことができる。しかしながら、アデノウイルスが２ｄｌ３１２型又は５Ｎｔｄｌ１０１０型であることは本発明の範囲内である。
【０１９８】
薬物の製造、特に本明細書で開示される腫瘍性疾患及びそのほかの疾患を治療するための薬物の製造のための本発明に従ったアデノウイルスの使用に関連して、かつ、核にＹＢ−１を有する、好ましくは、細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有する細胞又は調節解除されたＹＢ−１を好ましくは細胞質に有する細胞での複製への本発明に従ったアデノウイルスの使用と同様に本発明のアデノウイルスの使用に関連して、複製は最終的には、核に、好ましくは細胞周期とは無関係にＹＢ−１を有する、言い換えればＹＢ−１の核陽性の細胞、又は調節解除されたＹＢ−１を含む細胞で生じる。核にＹＢ−１を有さないが細胞質にのみＹＢ−１を含有する細胞又はいかなる調節解除されたＹＢ−１も含有しない細胞ではアデノウイルスはそのままでは複製しないか、又は極めて低レベルでしか複製しないことを特に認識すべきである。その程度において、これらウイルスの成功的複製には、ＹＢ−１が核に好ましくは細胞周期とは無関係に存在すること、又は調節解除されたＹＢ−１が存在することが必要である。以下でも説明するように、たとえば、好ましくは細胞周期とは無関係にＹＢ−１の発現又は存在を生じる、又は核に調節解除されたＹＢ−１を生じる又は調節解除されたＹＢ−１の発現を生じる条件を細胞に適用することによってこれを達成することができる。各手段は、たとえば、本発明に従って使用される又は本発明の対象とされる、アデノウイルス遺伝子に加えてＹＢ−１をコードする、特にその発現をコードする遺伝情報を運んでいるアデノウイルスによるＹＢ−１のコーディング及び発現である。細胞の核へのＹＢ−１の輸送、核でのその誘導及び発現を生じるそのほかの手段は、細胞及びそのような細胞を含有する生物への細胞増殖抑制剤、照射、温熱などのような投与のようなストレスの適用である。好ましい実施態様では、照射は、たとえば、腫瘍性疾患の治療で使用されている任意の放射線である。
【０１９９】
本発明に従って特に腫瘍溶解に使用されるアデノウイルス並びに本発明に係るアデノウイルスは、好ましい実施態様では、細胞周期とは無関係で核にＹＢ−１を有さないのでＹＢ−核陰性である細胞、又は調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞では複製しないという事実を特徴とする。
【０２００】
本発明のアデノウイルスとは異なる本発明に従って使用されるべきアデノウイルスの一部のさらなる特徴は、それらが、本明細書では癌遺伝子タンパク質と呼ぶウイルス性癌遺伝子をコードしており、癌遺伝子タンパク質は好ましくはＥ１Ａであり、癌遺伝子タンパク質はウイルスの複製及び／又は前記ウイルスが感染した細胞の細胞溶解に影響を有する少なくとも1つのウイルス性遺伝子である。好ましくは、複製への影響は、ウイルスの癌遺伝子タンパク質が存在しない場合に比べて癌遺伝子タンパク質が存在する場合においてウイルスの複製がさらに良好であるようにする。この過程は本明細書では、トランス活性化、特にトランス活性化にＥ１Ａが介在している場合はＥ１Ａトランス活性化と呼ぶ。用語「トランス活性化の」又は「トランス活性化」は、好ましくは、ウイルスの癌遺伝子タンパク質自体をコードする遺伝子とは異なる１又は数個のそのほかの遺伝子の発現及び／又は転写に、ウイルスの癌遺伝子タンパク質が影響を有すること、すなわち、その発現及び／又は翻訳を制御する、及びそれを活性化する過程を記載する。そのようなウイルス遺伝子は、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰ並びに前述の遺伝子及び遺伝子産物の組み合わせである。
【０２０１】
本発明に従って使用されるアデノウイルスの、並びに本発明のアデノウイルスの、さらなる、が任意にすぎない特徴は、その結合特性であり、それにコードされるタンパク質の特定のものの腫瘍サプレッサーＲｂへの結合特性である。基本的に、本発明に従って使用されるアデノウイルスがＲｂに結合してもよく又はしなくてもよいことは本発明の範囲内である。アデノウイルスの２つの別の実施態様のいずれかの使用は、処理された細胞又は処理されるべき細胞のＲｂの状況に無関係である。
【０２０２】
Ｒｂに結合しない能力をＥ１Ａに付与するために、以下の欠失をＥ１Ａ癌タンパク質に行うことができる：ＣＲ１領域（Ａｄ５におけるアミノ酸３０〜８５位）における欠失及びＣＲ２領域（Ａｄ５におけるアミノ酸１２０〜１３９位）の欠失。そのように行うには、ＣＲ３領域が保存され、そのほかの早期ウイルス遺伝子に対してトランス活性化機能を用いることができる。
【０２０３】
Ｒｂに結合する能力をＥ１Ａに付与するために、Ｅ１Ａ癌タンパク質への以下の欠失が基本的には可能である：ＣＲ３領域（アミノ酸１４０〜１８５位）の欠失；Ｎ末端（アミノ酸１〜２９位）の欠失；アミノ酸８５〜１１９位の欠失；Ｃ末端（アミノ酸１８６〜２８９位）の欠失。上に列記した領域は、Ｅ２ＦのＲｂへの結合を妨害しない。トランス活性化機能もそのまま残るが、野生型Ａｄ５に比べると低下する。
【０２０４】
Ｅ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１２Ｓタンパク質を、ある実施態様ではＲｂに結合できるように設計し、別の実施態様ではＲｂに結合できないように設計して、そのようなＥ１Ａ１２Ｓが、従来技術では改変Ｅ１Ａ１２Ｓと呼ばれることもあるにもかかわらず、本発明の意味では、Ｅ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ１２Ｓタンパク質であることは、特に本発明のアデノウイルスに関して、本発明の範囲内である。Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質の各設計は、特に本明細書では単純にＥ１Ａとも呼ぶＥ１Ａタンパク質の前述の欠失に関して、当業者の範囲内である。
【０２０５】
従来技術で基本的にすでに既知であり、いかなるトランス活性化も示さないそのようなアデノウイルスは一般に複製欠損性とみなす。しかしながら、にもかかわらず、それらが好適なバックグラウンド、特に細胞のバックグラウンドで複製可能であることを認識するのは本発明のメリットである。そのような好適な細胞のバックグラウンドは、核におけるＹＢ−１の存在、好ましくは細胞周期とは無関係の核におけるＹＢ−１の存在、又は調節解除されたＹＢ−１によって誘発されるか又は提供される。用語、細胞又は細胞系は、本明細書で本発明のそのほかの態様と関連して使用されるとき、インビトロ、生体内又は生体外に存在する細胞と同様に細胞抽出物の断片又は区画を含む。その程度において、用語、細胞系又は細胞は、細胞培養、組織培養、器官培養或いは生体内及び生体外の組織又は生物に存在する細胞も含むが、それは好ましくは生体にそのまま存在してもよい。生物は好ましくは脊椎動物であり、さらに好ましくは哺乳動物である。さらに好ましくは、生物はヒトである。そのほかの好ましい生物は、本発明の種々の態様に関連して開示されるものである。
【０２０６】
さらに、本明細書で提供される技術的教示に基づいて、本明細書及び従来技術で記載されたアデノウイルスの複製挙動をＹＢ−１核陽性の、好ましくは細胞周期とは無関係でのＹＢ−１核陽性の細胞又は調節解除されたＹＢ−１を含む細胞で示す新しいウイルスを生成することは本発明の範囲内である。言い換えれば、特に、好ましくはすでに既知のアデノウイルスから出発して、本発明に従った使用に関連する、本明細書で定義される特徴を呈するさらなるウイルスを構築することができる。
【０２０７】
本発明に関連して、本発明に従って使用されるべき種々のアデノウイルスの改変されたＥ１Ａ癌タンパク質は、本発明のウイルスとは対照的に、ＹＢ−１核陽性の細胞又は調節解除されたＹＢ−１を含む細胞におけるＥ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ３ＡＤＰのような早期ウイルス遺伝子をトランス活性化することができる。好ましくは、ウイルスゲノムに行われるそのほかの変更はなく、アデノウイルスは、その程度においてさもなければ、野生型アデノウイルス又はその誘導体に相当してもよい。
【０２０８】
本発明の意味でトランス活性化する癌遺伝子タンパク質をコードする又は含む、本明細書で開示されるウイルスは、それぞれ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３及び／又はＥ４のような早期遺伝子をトランス活性化することができ、かつ、野生型のアデノウイルス、特に野生型Ａｄ５に匹敵する、たとえば、アデノウイルス、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−８４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６及び／又は欧州特許ＥＰ０９３１８３０に記載されるアデノウイルスを含む。これらの場合、Ｅ１Ａタンパク質の識別可能な領域がトランス活性化に関与する。種々のアデノウイルスの血清型の中で、Ｅ１Ａタンパク質のなかに３つの高度に保存された領域がある。アミノ酸４１〜８０位の領域ＣＲ１、アミノ酸１２０〜１３９位の領域ＣＲ２，及びアミノ酸１４０〜１８８位の領域ＣＲ３。トランス活性化の機能は、Ｅ１Ａタンパク質の中のＣＲ３領域の存在に主として基づく。ＣＲ３のアミノ酸配列は上記アデノウイルスにおいて不変な様態で存在する。これによって、ＹＢ−１が核に存在するか細胞質に存在するかとは無関係に、早期遺伝子、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４のトランス活性化を生じる。
【０２０９】
それとは対照的に、組換えアデノウイルスｄｌ５２０ではＣＲ３領域が欠失している。従って、ｄｌ５２０は、ＣＲ３領域のアミノ酸配列を含まないいわゆるＥ１Ａ１２Ｓタンパク質を発現する。その結果、ｄｌ５２０は、特にＥ２領域に対して非常に弱いトランス活性化機能しか行使できないので、ＹＢ−１核陰性細胞では複製しない。ＹＢ−１核陽性の細胞では、ＹＢ−１がＥ２領域のトランス活性化に関与するので、ｄｌ５２０の十分な複製が得られる。ｄｌ５２０のようなシステムの使用又は本明細書で開示される目的でのそれを起源とするシステムの使用は、それに基づく。たとえば、デルタ２４（本明細書ではＡｄΔ２４とも呼ぶ）及びたとえばｄｌ５２０のようなアデノウイルスの２つの上述の群の間のさらに重要な差異は、早期遺伝子、Ｅ１Ｂ、Ｅ３及びＥ４が、ＹＢ−１核陰性の細胞又は調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞に比べて、細胞周期とは無関係でＹＢ−１核陽性の細胞又は調節解除されたＹＢ−１を含有する細胞でさらに包括的にトランス活性化されるという事実に存在する。これとは対照的に、デルタ２４には差異はないか、わずかな差異があるにすぎない。しかしながら、ｄｌ５２０のさらに具体的にはＥ１Ａ１２Ｓのトランス活性化は野生型アデノウイルスに比べて有意に低下している。しかしながら、このトランス活性化は、実施例１０にも示すようにＹＢ−１核陽性細胞において十分な複製を提供するのに十分である。特に、好ましくは、ｄｌ５２０又はＡｄΔ２４、ｄｌ９２２〜９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６及び／又は欧州特許ＥＰ０９３１８３０に記載されたアデノウイルスと関連したＥＩＡタンパク質の設計を含む、本明細書で記載するような、特にこの関連で記載するようなＥ１Ａタンパク質の設計並びに、野生型癌遺伝子タンパク質Ｅ１Ａに比べて、Ｅ１Ａタンパク質が１又は数個の欠失及び／又は突然変異を有するような、それをコードする核酸の設計は、ウイルス、特にアデノウイルス、制御された、好ましくはＥ２後期プロモーターに優先的に制御された複製の実施態様である。好ましくは、欠失は、ＣＲ３領域の欠失及びＮ末端の欠失及びＣ末端の欠失を含む群から選択されるようにする。アデノウイルスのこの種の複製ができるＥ１Ａタンパク質のさらなる実施態様は、本明細書で提供される開示に基づいて当業者が生成することができる。前に記載したＥ１Ａタンパク質の実施態様は、本明細書で本発明のアデノウイルス又はグループＩのアデノウイルスとも呼ばれる本発明のアデノウイルスに関連しても使用されてもよい実施態様である。
【０２１０】
本明細書では誘導体とも呼ばれ、本発明に従って使用してもよい、本発明のアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルスは通常、Ｅ１欠失、Ｅ１／Ｅ３欠失及び／又はＥ４欠失を含む、すなわち、相当するアデノウイルスは、機能的に活性のあるＥ１及び／又はＥ３及び／又はＥ４の発現産物及びそれぞれ相当する産物を生成することができない。又は、言い換えれば、これらのアデノウイルスは機能的に不活性のＥ１、Ｅ３及び／又はＥ４の発現産物を生成することができ、機能的に不活性のＥ１、Ｅ３及び／又はＥ４の発現産物は、転写レベル及び／又は翻訳レベルでは発現産物として全く存在しない、或いは、野生型アデノウイルスにおいてそれに起因する機能の1つを少なくとも有さない形態で存在する発現産物である。野生型アデノウイルスにおける発現産物に固有のこの／これらの機能は、当業者に既知であり、Russell W. C. Journal of Virology 81: 2573-2604, 2000に記載されている。Russell（上記）はまた、参考として本明細書に組み入れるアデノウイルス及びアデノウイルスベクターの設計原理を記載している。改変されたＥ１Ａ癌遺伝子タンパク質、すなわち、もはやトランス活性化しないＥ１Ａタンパク質及びＥ１Ａ１２Ｓ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ６及び／又はＥ３ＡＤＰ（アデノウイルス死亡タンパク質）（Tollefson A. et al., J. Virology 70: 2296-2306, 1996）のようなそのほかのタンパク質がそのようなベクターにおいて単独で又は組み合わせで発現されていることも本発明の範囲内である。本明細書で開示される導入遺伝子と同様に、個々に言及される遺伝子も互いに独立して、Ｅ１及び／又はＥ３及び／又はＥ４の領域にクローニングされてもよく、好適なプロモーターを用いて、又は好適なプロモーターの制御のもとで発現させてもよい。基本的に、Ｅ１、Ｅ３及びＥ４の各領域は、アデノウイルスの核酸の中で好適なクローニング部位であり、クローニングに用いられない領域は、個々に又は全体として、部分的に及び／又は完全に欠失して存在することができる。これらの領域が存在する場合は、特にそれらの全体が存在する場合は、それらが完全で、好ましくは翻訳生成物及び／又は転写生成物を提供する、及び／又は完全ではなく、好ましくは翻訳生成物及び／転写生成物を提供しない、のいずれかであるのは本発明の範囲内である。幾つかの実施態様では、好適なプロモーターは、Ｅ１Ａ、好ましくは改変されたＥ１Ａの制御及び発現との関連で本明細書で開示されるものである。
【０２１１】
最後に、実施態様では、本発明に従って使用されるグループＩＩのアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ欠損性であり、好ましくはＥ１Ｂ１９ｋＤａ欠損性である。本明細書で一般的に使用されるとき、用語、欠損性は、Ｅ１Ｂが野生型Ｅ１Ｂの特性をすべて示すわけではなく、これら特性の少なくとも1つを欠く状態をいう。
【０２１２】
アデノウイルスＢＣＬ２のホモログＥ１Ｂ１９ｋが、前アポプトーシスタンパク質Ｂａｋ及びＢａｘとの相互作用により、Ｅ１Ａが誘導するアポトーシスを回避する。これにより、最大限の複製及び／又は粒子形成が感染細胞において可能である (Ramya Sundararajan and Eileen White, Journal of Virology 2001, 75, 7506-7516)。Ｅ１Ｂ１９ｋが欠失すると（もし存在する場合はそれがアデノウイルスの細胞死タンパク質の機能を、最小限にすることになるので）、ウイルスがより良好に放出される結果となる。そのような欠失によって、ウイルスが誘導する細胞変性効果が増大し (Ta-Chiang Liu et al., Molecular Therapy, 2004 )、したがって感染腫瘍細胞がより著しく溶解する結果となる。さらに、Ｅ１Ｂｌ９ｋの欠失は、腫瘍細胞中においてはＴＮＦαがそのような組換えアデノウイルスの複製に影響を及ぼさなくなる原因となり、一方で正常細胞では、治療によって伝染性ウイルスの複製及び放出が減少する結果になる。その限りにおいて、選択性と特異性が増加する (Ta-Chiang Liu et al., Molecular Therapy 2004, 9, 786-803)。
【０２１３】
本明細書で開示される本発明に従って使用されるとき、グループＩＩのアデノウイルスの少なくとも幾つかの実施態様は、当該技術でそれ自体既知である。本発明に従って使用されるアデノウイルスは、特に、野生型に比べて、本明細書で提供される技術的教示という意味で変更が行われていれば、好ましくは組換えアデノウイルスである。本発明に関係のないアデノウイルスの核酸配列を欠失させること及び突然変異させることは当業者の範囲内である。そのような欠失は、たとえば、本明細書でも開示されるようなＥ３及びＥ４をコードする核酸の一部に関係してもよい。Ｅ４の欠失は、そのような欠失がタンパク質Ｅ４ｏｒｆ６まで及ばない、言い換えれば、本発明に従って使用されるべきアデノウイルスはＥ４ｏｒｆ６をコードするという条件で、特に好ましい。好ましい実施態様では、これらのアデノウイルスの核酸は、未だにウイルスのカプシドに詰められてもよいので、感染性の粒子を形成する。このことも、本発明に従った核酸の使用について真実である。一般に、単一又は幾つかの発現産物に関してアデノウイルスシステムが欠損してもよいことも認識される。それに関連して、このことは、グループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスの双方に関連して、発現産物をコードする核酸の突然変異又は欠失によって生じてもよく、そのような突然変異及び欠失が、完全なものであるか、又は発現産物がもはや形成されない程度に行われ、又はプロモーターや転写因子のような調節要素又は発現を制御する要素が失われるか又は野生型とは異なる方法で活性化されることにより行われ、核酸のレベル（プロモーター又はシス作用要素を欠く）又は翻訳及び転写系（トランス作用要素）のレベルで行われることを考慮に入れるべきである。特に、後者の態様は、それぞれの細胞のバックグラウンドに依存してもよい。
【０２１４】
それ自体既知のアデノウイルスの使用から離れて、本発明に従って、本明細書で記載されるそのほかのアデノウイルスについてすでに開示された目的に、グループＩＩのアデノウイルスのような新規のアデノウイルスも使用してもよい。本発明の新規のアデノウイルスは、本明細書で提供される技術的教示から生じる。特に好ましい代表例は、たとえば、図１６及び１７で描かれるウイルスＸｖｉｒ０３及びＸｖｉｒ０３／０１であり、実施例１１及び１２でさらに説明される設計原理である。
【０２１５】
ベクターＸｖｉｒ０３の場合、ＩＲＥＳ配列で分離されるＥ１Ｂ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６に対する核酸を制御するＥ１領域にＣＭＶプロモーターをクローニングした。これに関連して、Ｅ３及びＥ４領域は、欠失していても及び／又はインタクトな形で存在していてもよい。これら２つの遺伝子のウイルスへのクローニングにより、かつそれから生じる遺伝子産物のために、それぞれ、高い複製効率が生じ、それにより、複製が特にＹＢ−１核陽性細胞に、より特別には本発明の開示の意味において調節解除されたＹＢ−１を含む細胞に生じる限り、細胞における、好ましくは腫瘍細胞における選択的複製が維持される。調節解除されたＴＢ−１が存在する細胞は、実施態様では、ＹＢ−１の発現上昇を示す、好ましくは、正常細胞又は非腫瘍細胞に比べて、区画非依存性のＹＢ−１の発現を示す細胞である。Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６もまた、Ｅ４領域へクローニングすることができ、その場合Ｅ３領域はインタクトなままであるか、又は／及び、部分的に又は完全に欠失する。
【０２１６】
ウイルスＸｖｉｒ０３のさらなる開発は、好ましい実施態様では、特異的プロモーター、特に腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターの制御下で治療用遺伝子又は導入遺伝子がクローニングされているウイルスＸｖｉｒ０３／０１である。これに関連して、Ｅ３領域及びＥ４領域は欠失する、及び／又はインタクトなままであり得る。そのようなウイルスにも関連して、Ｅ４領域は機能的に不活性である。本明細書で記載される導入遺伝子もＥ４領域にクローニングされ、これは、もう１つの方法として行われるか、又は導入遺伝子のＥ３領域へのクローニングに加えて行われる。
【０２１７】
本明細書で記載される及び特に以下で記載される導入遺伝子は、本発明のアデノウイルス、すなわち、グループＩのアデノウイルス及びその核酸、又は本発明の複製システムに関連して、或いはそれによって発現されてもよく、従って、プロモーター及び核酸配列を含む発現カセットに含まれ、そのような核酸配列は、１又は数個の前記導入遺伝子をコードする。Ｅ１、Ｅ３及びＥ４の領域は、アデノウイルスのゲノムにおける特に好適なクローニング部位であるが、クローニング部位はこれに限定されない。本明細書で用いられる導入遺伝子は、ウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子、（それらは、好ましくはゲノム中に存在せず、またそれぞれ、それらが現在特定のウイルス中に存在している野生型ゲノムの部位には存在しない）、又は治療用遺伝子でよい。
【０２１８】
治療用遺伝子は、プロドラッグ遺伝子、サイトカインの遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、メタロプロテイナーゼ阻害剤及び／又は血管形成阻害剤の遺伝子及びチロシンキナーゼ阻害剤の遺伝子であってもよい。さらに、好ましくは、癌関連の標的を指向するｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子及びリボザイムが発現されてもよい。好ましくは、個々の又は数個の標的分子は、耐性関連の因子、抗アポトーシス因子、癌遺伝子、血管形成因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ修復酵素、成長因子及びその受容体、転写因子、メタロプロテイナーゼ、特にマトリクスのメタロプロテイナーゼ及びウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化剤を含む群から選択される。その好ましい実施態様は、本発明のそのほかの態様と関連して本明細書ですでに開示されているものである。
【０２１９】
好ましい実施態様で使用されてもよいような可能性のあるプロドラッグは、たとえば、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、又はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）である［Kim et al., Trends in Molecular Medicine, 8(4)(suppl.), 2002; Wybranietz W. A. et al., Gene Therapy 8: 1654-1664, 2001; Niculescu-Duvaz et al., Curr. Opin. Mol. Therapy 1: 480-486, 1999; Koyama et al., Cancer Gene Therapy 7: 1015-1022, 2000; Rogers et al., Human Gene Therapy 7: 2235-2245, 1996; Lockett et al., Clinical Cancer Res., 3: 2075-2080, 1997; Vijayakrishna et al., J. Pharmacol. and Exp. Therapeutics 304: 1280-1284, 2003］。
【０２２０】
好ましい実施態様で使用されてもよいような可能性のあるサイトカインは、たとえば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＣＳＦ又はインターフェロンγである［Gene Therapy, Advance in Pharmacology Vol.40, editor:  J. Thomas August, Academic Press; Zhang and Degroot, Endocrinology 144: 1393-1398, 2003; Descamps et al., J. Mol. Med., 74: 183-189, 1996; Majumdar et al., Cancer Gene Therapy 7: 1086-1099, 2000］。
【０２２１】
好ましい実施態様で使用されてもよいような可能性のあるアポトーシスを誘導する遺伝子は、たとえば、デコリン［Tralhao et al., FASEB J., 17: 464-466, 2003］、網膜芽腫９４［Zhang et al., Cancer Res., 63: 760-765, 2003］、Ｂａｘ及びＢａｄ［Zhang et al., Hum. Gene Ther., 20: 2051-2064, 2002］、アポプチン［Noreborn and Pietersen, Adv. Exp. Med. Biol., 465: 153-161, 2000］、ＡＤＰ［Toth et al., Cancer Gene Therapy 10: 193-200, 2003］、ｂｃｌ−ｘｓ［Sumantran et al., Cancer Res., 55: 2507-2512, 1995］、Ｅ４ｏｒｆ４［Braithwaite and Russell, Apoptosis 6: 359-370, 2001］、ＦａｓＬ、Ａｐｏ−１及びＴｒａｉｌ［Boehringer Manheim, Guide to Apoptosis Pathways, Arai et al., PNAC 94: 13862-13867, 1997］、Ｂｒｉｍｓ［Yamaguchi et al., Gene Therapy 10: 375-385, 2003; GNR 163:  Oncology News 17 June, 2000］である。
【０２２２】
好ましい実施態様で使用されてもよいような可能性のある腫瘍抑制遺伝子は、たとえば、Ｅ１Ａ、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７又はＭＤＡ−７である［Opalka et al., Cell Tissues organs 172: 126-132, 2002; Ji et al., Cancer Res., 59: 3333-3339, 1999; Su et al., Oncogene 22: 1164-1180, 2003］。
【０２２３】
好ましい実施態様で使用されてもよいような可能性のある血管形成阻害剤は、たとえば、エンドスタチン又はアンギオスタチン［Hajitou et al., FASEB J., 16: 1802-1804, 2002］、及びＶＥＧＦに対する抗体である［Ferrara N., Semin Oncol., Dec. 29 (6 suppl. 16): 10-4, 2002］。
【０２２４】
好ましい実施態様で使用されてもよいような可能性のあるメタロプロテイナーゼ阻害剤は、たとえば、Ｔｉｍｐ−３［Ahonen et al., Mol. Therapy 5: 705-715, 2002］、ＰＡＩ−１［Soff et al., J. Clin. Invest., 96: 2593-2600, 1995］、Ｔｉｍｐ−１［Brand K., Gene therapy 2: 255-271, 2002］である。
【０２２５】
グループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスの双方で発現されてもよい、本発明の意味でのさらなる導入遺伝子は、チロシンキナーゼ阻害剤である。チロシンキナーゼの例はＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）［Onkologie, Entstehung und Progression maligner Tumoren; Author:  Christoph Wagner, George Thieme Verlag, Struttgart, 1999］である。好ましいチロシンキナーゼ阻害剤は、ハーセプチン［Zhang H. et al., Cancer Biol. Ther., Jul-Aug;2 (4 suppl 11):  S122-6, 2003］である。
【０２２６】
本発明について使用することができるＳｉＲＮＡ（短い干渉ＲＮＡ）は、２つの、好ましくは、本質的には塩基対で存在することを意味する塩基相補性のために互いにハイブリッド形成する、５０ヌクレオチドまでの好ましくは１８〜３０ヌクレオチドの間の、さらに好ましくは２５ヌクレオチド未満の、最も好ましくは、２１、２２又は２３ヌクレオチドの長さを有する別個のＲＮＡ鎖から成り、これらの形状は、ｓｉＲＮＡの一本鎖を言い、特に、第２の一本鎖とハイブリッド形成する、又は塩基対を作る一本鎖の伸びの長さをいう。ｓｉＲＮＡはｍＲＮＡの分解を誘導する、又はそれに介在する。従って、必要とされる特異性には、ｓｉＲＮＡの配列、すなわち結合部位が介在する。分解されるべき標的配列は、第１又は第２のｓｉＲＮＡが形成する鎖に本質的に相補的である。正確な作用機序は未だはっきりとはしないが、ｓｉＲＮＡは、細胞が発生の間識別可能な対立遺伝子を抑制し、ウイルスからそれらを保護するための生物学的戦略であると想定されている。ｓｉＲＮＡが介在するＲＮＡの干渉は、二本鎖ＲＮＡに特異的な遺伝子の導入によるタンパク質の発現を特異的に抑制する又は完全に除去する方法として用いられる。高等生物にとって、１９〜２３のヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡは、その程度において、インターロイキン反応のような非特異的防御反応の活性化を生じない場合、特に好適である。対称の２−ｎｔ３’のオーバーハングを有する２１ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡの直接的な形質移入は、哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉に介在するのに好適であったし、リボザイムやアンチセンス分子のようなそのほかの技法に比べて効率が高い（Elbashir S., Harborth J., Lendeckel W., Yalvcin A., Weber K., Tuschl T: ２１ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡは培養哺乳動物細胞においてＲＮＡ干渉に介在する。Nature 411: 494-498, 2001）。標的遺伝子を抑制するにはわずかなｓｉＲＮＡ分子で十分である。干渉現象の一過性の性質に特に存在する外因性に添加されたｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ分子の特異的送達の限界を回避するために、内因性のｓｉＲＮＡを発現させるベクターが従来技術では使用される。そのような目的で、たとえば、センス及びアンチセンスの双方の方向で１９ヌクレオチドの長さの標的配列を含むベクターに、６４ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドを、たとえば９ヌクレオチドのスペーサー配列により分離して導入する。得られた転写物をたとえば１９塩基対の茎構造によりヘアピン構造に折り畳む。機能的ｓｉＲＮＡが生成されるようにループは急速に分解される（Brummekamp et al., Science 296: 550-553, 2002）。
【０２２７】
本発明に従って使用されるべきアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルス、しかしまた、本発明に係るアデノウイルス、すなわち、グループＩのアデノウイルスの実施態様におけるアデノウイルスの一部であるＹＢ−１をコードする核酸は、ＹＢ−１の核への輸送に介在する核酸配列を含んでもよい。本発明に係る核酸、アデノウイルス及びアデノウイルスシステム並びにたとえば、Ｏｎｙｘ−１５、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０のような従来技術で既知のアデノウイルス並びに特許ＥＰ０９３１８３０に記載されたアデノウイルスを、アデノウイルス及びアデノウイルスシステム及び相当する核酸として、本発明に従った核酸との組み合わせで使用してもよい。核への輸送に介在する好適な核酸配列は当業者に既知であり、たとえば、Whittaker G. R., et al., Virology 246: 1-23, 1998; Friedberg E. C., TIBS 17: 347, 1992; Jans D. A., et al., Bioassays Jun:  22(6):  532-44, 2000; Yoneda Y., J. Biochem., 3(3): 193-227, 1993; Lyons R. H., Mol. Cell Biol., 7: 2451-2456, 1987に記載されている。核への輸送に介在する核酸配列は異なった原理を実現してもよい。そのような原理の１つは、ＹＢ−１がシグナルペプチドと共に融合タンパク質を形成する、又はシグナルペプチドを提供され、本発明に従ったアデノウイルスの複製が起きる際のシグナルペプチドのために細胞核に移動されるということである。
【０２２８】
本発明に従って使用されるべきアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルス、しかしまた、本発明に係るアデノウイルス、すなわち、グループＩのアデノウイルスの設計において使用されてもよいさらなる原理は、好ましくは細胞質での合成から始まって、ＹＢ−１の細胞核への転移又は転座を生じ、そこでのウイルスの複製を促すＹＢ−１に転移配列を提供することである。核への輸送に介在する特に有効な核酸配列の例は、たとえば、Efthymiadis A., Briggs L. J., Jans D. A., JBC 273: 1623-1628, 1998にその種のそのほかの好適な核酸配列と共に記載されるＨＩＶのＴＡＴ配列である。本発明に従って使用されるべきアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルス、しかしまた、本発明に係るアデノウイルス、すなわち、グループＩのアデノウイルスが核への輸送に介在するペプチドをコードする核酸配列を含むことは本発明の範囲内である。
【０２２９】
ＹＢ−１が完全長で存在する、特に野生型ＹＢ−１に相当する形態で存在することは本発明の範囲内である。さらに、ＹＢ−１が、たとえば、縮めた形態又は切り詰めた形態で誘導体として使用される又は存在することは本発明の範囲内である。本発明と関連して使用されてもよい又は存在してもよいとき、ＹＢ−１誘導体は、好ましくはＥ２後期プロモーターへの結合が可能であり、従ってアデノウイルスのＥ２領域の遺伝子発現を活性化するＹＢ−１である。そのような誘導体は本明細書で開示されるＹＢ−１誘導体を特に含む。Ｎ末端で、Ｃ末端で又はアミノ酸配列の中で単一の又は数個のアミノ酸を欠失することによりさらなる誘導体を生成することができる。本発明の意味においてＹＢ−１タンパク質としてＹＢ−１断片を使用することは本発明の範囲内である。Jurchott K. et al., (JBC 278: 27988-27996, 2003)の論文では、Ｃ末端及びＮ末端での欠失を特徴とする種々のＹＢ−１断片が開示されている。種々のＹＢ−１断片の分布は、Ｃ末端と同様に冷却ショックドメイン（ＣＳＤ）もＹＢ−１の細胞核への細胞周期に調節された輸送に関係することを示している。従って、Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６の本発明の発現と関連した縮めたＹＢ−１（本明細書ではＹＢ−１タンパク質とも呼ぶ）がさらに良好に核に移動するので、天然のＹＢ−１に比べて、さらに良好なＥ２後期プロモーターとの結合を必要としないでさらに強いＣＰＥを誘導し、縮めたＹＢ−１がさらに良好に核に移動し、両方の効果、すなわち、ＣＰＥの誘導及びＥ２後期プロモーターへの結合を生じることも除外できないことは本発明の範囲内である。最後に、そのような縮めたＹＢ−１断片は、さらに良好に核に移動し、さらに良好なＣＰＥを誘導しないでＥ２後期プロモーターにさらに効率的に結合する可能性がある。縮めたＹＢ−１のタンパク質及び断片が完全長のＹＢ−１、特に細胞局在化シグナル配列（ＮＬＳ）と関連して本明細書で開示されるようなさらなる配列を含むことも本発明の範囲内である。
【０２３０】
アデノウイルスによりコードされ、発現される前述の種々のさらなる遺伝子及び遺伝子産物に関して、これらが組み合わせてコードされ、発現されることは原則として可能である。
【０２３１】
用語、アデノウイルス及びアデノウイルスシステムは本質的に同一の意味を有するとして理解されるべきであることは本発明の範囲内である。用語、アデノウイルスは、カプシド及び核酸を含む完全なウイルス粒子に関係するものとして特に理解されなければならない。用語、アデノウイルスシステムは特に、野生型と比べて核酸が変化しているという事実に焦点を置く。好ましくは、そのような変化は、プロモーター、調節配列、及び／又は読み取りフレームのようなコーディング配列を欠失させた及び又は付加させた及び／又は突然変異させた結果生じてもよいようなアデノウイルスのゲノムの設定における変化を含む。用語、アデノウイルスシステムは、加えてさらに好ましくは、それが、たとえば、遺伝子治療で使用されるベクターであるように使用される。
【０２３２】
アデノウイルス及びアデノウイルスシステムの使用及び設計を含む上のコメントはまた、それらのコードする核酸にも適用可能であり、逆も可能である。
【０２３３】
本発明と関連して、本発明に従って使用されるべきアデノウイルス、特にグループＩＩのアデノウイルス、しかしまた、グループＩのアデノウイルス及びそれらのコードする核酸は、そのままで又はさらなる核酸配列と組み合わせて複製事象を生じるアデノウイルス核酸であることが可能である。本明細書で説明するように、複製に必要な配列及び／又は遺伝子産物はヘルパーウイルスにより提供されることが可能である。それをコーディング核酸配列と言い、前記核酸配列が既知の核酸配列であるという範囲で、同一の配列だけでなく、それに由来する配列も使用するということは本発明の範囲内である。本明細書では、由来する配列は、特に、遺伝子産物、非由来の配列の機能に相当する機能を有する核酸又はポリペプチドを結果として生じるいかなる配列も意味しなければならない。当業者に既知の日常の試験によってこのことを調べることができる。そのような由来する配列の例は、同一遺伝子産物をコードする、特に同一のアミノ酸配列をコードするが、遺伝コードの変質によって異なった塩基配列を有する核酸配列である。
【０２３４】
グループＩＩの本発明に係るアデノウイルス及び／又は本発明に係る相当するアデノウイルスシステム及び本発明に係るその使用に関して、実施態様では、アデノウイルスの核酸は、癌遺伝子タンパク質の発現についての欠損性、特にＥ１Ａタンパク質欠損性であり、すなわち、１２ＳＥ１Ａタンパク質（本明細書ではＥ１Ａ１２Ｓタンパク質とも呼ぶ）又は１３ＳＥ１Ａ（本明細書ではＥ１Ａ１３Ｓタンパク質とも呼ぶ）のいずれかをコードしない、或いは１２ＳＥ１Ａタンパク質及び１３ＳＥ１Ａタンパク質の双方をコードしない、或いは、本明細書で記載されるように、他の表示がない限り修飾され、アデノウイルス複製システムはヘルパーウイルスの核酸をさらに含み、ヘルパーウイルスの核酸は癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質をコードする核酸配列を含み、それは以下の特徴を有しアデノウイルスに以下の特徴を付与する：それは、ＹＢ−１核陰性細胞では好ましくは非複製であるが、ＹＢ−１核陽性で細胞周期に無関係である細胞又は調節解除されたＴＢ−１を示す細胞では複製し、ＹＢ−１核陽性の細胞で少なくとも1つのウイルス遺伝子、特に、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及び／又はＥ３ＡＤＰをトランス活性化し、及び／又は細胞のＹＢ−１を核に転移しない。本明細書で記載される導入遺伝子がヘルパーウイルスに個々に又はまとめてコードされ、及び／又は発現されることは本発明の範囲内である。このことは、グループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスの双方のためのヘルパーウイルスに適用される。
【０２３５】
さらに、本発明に従ったそのようなアデノウイルス複製システムの実施態様では、アデノウイルスの核酸及び／又はヘルパーウイルスの核酸は、複製可能なベクターとして存在する。
【０２３６】
グループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスをコードする核酸が好ましくは発現ベクターに存在し、この発現ベクターが本発明に従って使用されるということは、さらに本発明の範囲内である。
【０２３７】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも２つのベクターを含むベクター群に関するものであり、ベクター群は、全体で、本明細書に記載されるようなグループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスのためのアデノウイルス複製システムを含み、ベクター群は本発明に従って使用される。実施態様では、アデノウイルス複製システムの各成分は個々のベクター、好ましくは発現ベクターに配置される。
【０２３８】
最後に、さらなる態様において、本発明は、本発明に従って好ましくは使用され、かつ、本発明に従って使用されるべきであるグループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスをコードする１又は数個の核酸を含有する細胞、及び／又は本発明に係る相当するアデノウイルス複製システム及び／又は相当するベクター及び／又はベクター群の、種々のアデノウイルスについて本明細書で記載されるような同一目的についての使用に関する。
【０２３９】
上述のアデノウイルスのコンストラクト及び特にその核酸及びそれをコードする核酸は、多くの部分に分かれた形態で細胞、好ましくは腫瘍細胞に導入されてもよく、種々の個々の成分の存在によって、それらは、まるで個々の成分が単一の核酸及び単一又は数個のアデノウイルスに由来するかのように一緒に作用する。
【０２４０】
本発明に従って使用され、グループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスをコードする核酸、相当するアデノウイルスシステム又はその一部はベクターとして存在してもよい。好ましくは、これらのベクターはウイルスベクターである。核酸がアデノウイルス核酸を含む場合、好ましくはウイルス粒子はベクターである。しかしながら、前記核酸がプラスミドベクターに存在することも本発明の範囲内である。各場合、ベクターは、挿入された核酸の増殖、すなわち、挿入された核酸の複製及び任意の発現を斟酌する及び制御する要素を含む。好適なベクターは好ましくは発現ベクターであり、各要素は当業者に既知であり、たとえば、Grunhaus A., Horwitz M. S., クローニングベクターとしてのアデノウイルス、In Rice C., editor, Seminars in Virology London:  Saunders Scientific Publicationsに記載されている。
【０２４１】
ベクター群に関する態様は、前記核酸の種々の要素が必ずしも単一のベクターのみに含有されるわけではない前述の実施態様を考慮に入れる。従って、ベクター群は少なくとも２つのベクターから成る。それから離れてベクターに関連して行われるいかなる記述もベクター及びベクター群にそれぞれ適用可能である。
【０２４２】
グループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスは、それぞれ、本明細書で開示される種々の核酸及び遺伝子産物を特徴とし、かつさもなければ、当業者に既知であり、野生型アデノウイルスに固有であるあらゆる要素を含んでもよい（Shenk T., Adenoviridae:  ウイルスとその複製、Fields Virology Vol. 3, editors:  Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M., et al., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 7）。
【０２４３】
本発明の説明のための目的であって、本発明を限定するのではない目的で、アデノウイルスの複製を以下で手短に議論するものとする。
【０２４４】
アデノウイルスの複製は非常に複雑な過程であり、通常、ヒトの転写因子Ｅ２Ｆに基づく。ウイルス感染の間、先ず、「早期遺伝子」Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４が発現される。「後期遺伝子」の群はウイルスの構造タンパク質の合成に関与する。２つの転写単位、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂから成り、異なったＥ１Ａタンパク質及びＥ１Ｂタンパク質をコードするＥ１領域は、それらが、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４の遺伝子を誘導するので、早期遺伝子及び後期遺伝子の双方の活性化に決定的な役割を担っている（Nevins J. R., Cell 26: 213-220, 1981）。さらに、Ｅ１Ａタンパク質は休止細胞のＤＮＡ合成を開始させてもよいので、Ｓ期への進入を誘発してもよい（Boulanger and Blair, 1991を参照のこと）。さらに、それらはＲｂクラスの腫瘍サプレッサーと相互作用する（Whyte T. et al., Nature 334: 124-127, 1988）。そうすることで、細胞の転写因子Ｅ２Ｆが放出される。Ｅ２Ｆ因子はそれに続いて細胞の遺伝子及びウイルスの遺伝子（特に、アデノウイルスのＥ２早期プロモーター）の相当するプロモーター領域に結合し、転写と複製を開始する（Nevins J. R., Science 258: 424-429, 1992）。リン酸化によりＲｂ及びＥ２Ｆの活性が調節される。リン酸化の足りない形態のｐＲｂは特にＧ１期及びＭ期に存在する。それと対照的に、過剰にリン酸化された形態のｐＲｂはＳ期及びＧ２期に存在する。ｐＲｂのリン酸化によって、Ｅ２Ｆは、Ｅ２Ｆと少なめにリン酸化されたｐＲｂから成る複合体から放出される。Ｅ２Ｆと少なめにリン酸化されたｐＲｂの複合体からのＥ２Ｆの放出は、Ｅ２Ｆ依存性の遺伝子の転写を生じる。Ｅ１Ａタンパク質は少なめにリン酸化されたｐＲｂにのみ結合し、それによって、Ｅ１ＡのｐＲｂへの結合がＥ１Ａ領域のＣＲ２領域を介して優先的に生じる。さらに、それはＣＲ１領域にも結合するが、親和性は低い（Ben-Israel and Kleiberger, Frontiers in Bioscience 7:  1369-1395, 2002; Helt and Galloway, Carcinogenesis 24: 159-169,2003）。
【０２４５】
Ｅ２領域の遺伝子産物は、それらが３つの本質的なタンパク質をコードしているので、複製の開始及び完了に特に必要とされる。Ｅ２タンパク質の転写は、２つのプロモーター、本明細書ではＥ２早期プロモーター又は早期Ｅ２プロモーターとも呼ばれる「Ｅ２早期Ｅ２Ｆ依存性」プロモーター及び「Ｅ２後期」プロモーターによって制御される（Swaminathan and Thimmapaya, アデノウイルスの分子レパートリーＩＩＩ、Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 119: 177-194, Springer Verlag, 1995）。さらに、Ｅ４の産物は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ５５ｋＤａのタンパク質と一緒に、Ｅ２Ｆの活性及びｐ５３の安定性に決定的な役割を担っている。たとえば、Ｅ２ＦとＤＰ１とから成るヘテロ二量体とＥ４にコードされるＥ４ｏｒｆ６タンパク質との直接的な相互作用によってＥ２プロモーターは一層さらにトランス活性化される（Swaminathan and Thimmapaya, JBC 258: 736-746, 1996）。さらに、溶解感染サイクルを上手く完了するために、ｐ５３によって（Steegennga W. T. et al., Oncogene 16: 349-357, 1998）Ｅ１Ｂ５５ｋＤａとＥ４ｏｒｆ６とから成る複合体が不活性化される。さらに、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａは、Ｅ４ｏｒｆ６と相互作用する場合、それが核からのウイルスＲＮＡの運び出しを促進する一方で細胞のＲＮＡは核に保持される範囲において、重要な機能を有する（Bridge and Ketner, Virology 174: 345-353, 1990）。さらに重要な観察は、Ｅ１Ｂ５５ｋＤａ／Ｅ４ｏｒｆ６から成るタンパク質複合体が、いわゆる「ウイルス封入体」に局在することである。これらの構造が複製及び転写の部位であると想定される（Ornelles and Shenk J., Virology 65:  424-429, 1991）。
【０２４６】
Ｅ３領域は複製にとって、特にアデノウイルスの放出にとって重要なもう１つの領域である。Ｅ３領域は、さらに正確には、インビトロ、すなわち、細胞培養でアデノウイルスの感染サイクルに本質的でない、相対的に小型の種々のタンパク質の遺伝情報を含有する。しかしながら、それらは、とりわけ、免疫調節機能及びアポトーシス機能を有するので急性感染及び／又は潜在感染の間でのウイルスの生き残りに決定的な役割を担っている（Marshall S., Horwitz, Virology 279: 1-8, 2001; Russell, 上記）。約１１．６ｋＤａのサイズを有するタンパク質は細胞死を誘導することが示されている。このタンパク質はその機能から、アデノウイルス死タンパク質、ＡＤＰと呼ばれている（Tollefson J., Virology 70: 2296-2306, 1996）。該タンパク質は、感染サイクルの後期段階で優勢に形成される。さらに、該タンパク質の過剰発現は、感染細胞のさらに良好な溶解を生じる（Doronin et al., Virology 74: 6147-6155, 2000）。
【０２４７】
さらに、Ｅ１Ａ欠失ウイルス、すなわち、特に、１２ＳＥ１Ａタンパク質も１３ＳＥ１Ａタンパク質も発現していないウイルスは、高いＭＯＩで非常に効率的に複製してもよいが（Nevins J. R., Cell 26: 213-220, 1981）、臨床応用では実現できないことは、本発明者に既知である。この現象は、文献では「Ｅ１Ａ様活性」と呼ばれる。さらに、Ｅ１Ａにコードされる５つのタンパク質のうち、２つのタンパク質、すなわち、１２Ｓ及び１３Ｓタンパク質がそれぞれ、そのほかのアデノウイルス遺伝子の発現を制御し、誘導することが知られていた（Nevins J. R., Cell 26: 213-220, 1981; Boulanger P and Blair E., Biochem. J., 275: 281-299, 1991）。特に１３Ｓタンパク質のＣＲ３領域がトランス活性化機能を呈することが明らかになった（Wong H. K., and Ziff F. B., J. Virol., 68: 4910-20, 1994）。１３Ｓタンパク質のＣＲ１及び／又はＣＲ２領域及び／又はＣＲ３領域に明瞭な欠失を有するアデノウイルスは、品質的に複製欠損性であるが、他の細胞株、ウイルス遺伝子及びプロモーター、並びに特にＥ２領域においてもなお、トランス活性化する（Wong H. K., and Ziff F. B., J. Virol., 68: 4910-20, 1994; Mymryk J. S. and Bayley S. T., Virus Research 33: 89-97, 1994）。
【０２４８】
細胞、通常、腫瘍細胞に野生型アデノウイルスを感染させた後、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６によって核にＹＢ−１が誘導され、核の中でのウイルス封入体内でＥ１Ｂ５５Ｋと同時局在し、それによってインビトロ及び生体内の双方での細胞核におけるウイルスの有効な複製を可能にする。Ｅ４ｏｒｆ６もＥ１Ｂ５５Ｋと結合するので（Weigel S. and Dobbelstein M. J., Virology 74: 764-772, 2000; Keith N. Leppard, Seminars in Virology 8: 301-307, 1998）、最適なウイルス産生及びアデノウイルスの複製を保証するＥ１Ｂ５５Ｋの核内への輸送及び分布に介在することが早くからすでに見い出されていた。核内で、いわゆるウイルス封入体の中でのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＹＢ−１の共同作用によって、Ｅ１Ｂ５５Ｋ／Ｅ４ｏｒｆ６とＹＢ−１から成る複合体及びＹＢ−１とＥ１Ｂ５５Ｋの同時局在によって、本発明に従ったウイルスの効率的な複製が可能なので、ＹＢ−１の核陽性である細胞、好ましくは細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を含有する細胞及び／又は調節解除されたＹＢ−１を含む又は呈する細胞における複製のために、及び／又はＹＢ−１の核陽性である細胞、好ましくは細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を含有する細胞及び／又は調節解除されたＹＢ−１を含む又は呈する細胞における疾患の治療のための薬剤製造のためにウイルスを使用することが含まれる。従って、この細胞のバックグラウンドで可能である複製は、腫瘍細胞及び腫瘍の感染の場合、最終的に腫瘍の溶解、すなわち腫瘍退縮性が起きるように細胞の溶解、ウイルスの放出並びに隣接細胞の感染及び溶解を生じる。
【０２４９】
ＹＢ−１は、Ｙ−ボックスと呼ばれる反転したＣＡＡＴ配列に結合する高度に保存された因子の群に属する。それらは、転写及び翻訳のレベルで調節的様式で作用してもよい（Wolffe A. P., Trends in Cell Biology 8: 318-323, 1998）。増殖やアポトーシスに関連した遺伝子の活性化だけでなく阻害においてもますます多くのＹボックス依存性の調節経路が見い出されている（Swamynathan S. K. et al., FASEB J., 12: 515-522, 1998）。たとえば、ＹＢ−１はｐ５３と直接相互作用し（Okamoto T. et al., Oncogene 19: 6194-6202, 2000）、Ｆａｓ遺伝子の発現（Lasham A. et al., Gene 252: 1-13, 2000）、ＭＤＲ及びＭＲＰの遺伝子発現（Stein U. et al., JBC 276: 28562-69, 2001; Bargou R. C. et al., Nature Medicine 3: 447-450, 1997）並びにトポイソメラーゼ及びメタロプロテイナーゼの活性化（Mertens P. R. et al., JBC 272: 22905-22912, 1997; Shibao K. et al., Int. J. Cancer 83: 732-737, 1999）に本質的な役割を担っている。また、ＹＢ−１は、ｍＲＮＡの安定性の調節（Chen C. Y. et al., Gene & Development 14: 1236-1248, 2000）及び修復過程（Ohga T. et al., Cancer Res., 56: 4224-4228, 1996; Izumi H. et al., Nucleic Acid Research 29: 1200-1207, 2001; Ise T. et al., Cancer Res., 59: 342-346, 1999）に関与している。
【０２５０】
細胞周期とは無関係に核に存在するＹＢ−１による、又は細胞質に存在し、グループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスによって核に転座させられる調節解除されたＹＢ−１による腫瘍細胞におけるＹＢ−１の核局在は、特に１２ＳＥ１Ａタンパク質も１３ＳＥ１Ａタンパク質も発現されず、使用されない間、Ｅ１Ａに非依存性のウイルス複製を生じ（Holm P. S. et al., JBC 277: 10427-10434, 2002）、タンパク質ＹＢ−１が過剰発現した場合、多剤耐性を生じる。さらに、たとえば、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋのようなアデノウイルスのタンパク質はウイルス複製に陽性の効果を有し（Goodrum F. D. and Ornelles D. A., J. Virology 73: 7474-7488, 1999）、機能的なＥ１Ａタンパク質はそのほかの遺伝子産物（たとえば、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ３ＡＤＰ及びＥ１Ｂ５５Ｋ）の活性化に関与する（Nevins J. R., Cell 26: 213-220, 1981）ことが知られている。しかしながら、このことは、１３ＳＥ１Ａタンパク質が存在しない当該技術で既知のＥ１Ａマイナスのアデノウイルスでは起きない。ＹＢ−１を核に有する多剤耐性細胞におけるＹＢ−１の核への局在は、そのようなＥ１Ａマイナスのウイルスの複製及び粒子形成を促す。しかしながら、これに関連して、ウイルス複製及び粒子形成の効率は、倍数による野生型Ａｄ５に比べて低下する。これに比べて、ＹＢ−１の組み合わせは、ＹＢ−１が介在する非常に効率的なウイルス複製及び粒子形成を許容するので、ＹＢ−１が腫瘍細胞の核にすでに含有されている、ＹＢ−１が細胞周期とは無関係な様式で核に局在するＹＢ−１から生じてもよい、又は細胞質に存在する調節解除されたＹＢ−１がグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスによって核に転座されている又は外因性の因子（たとえば、細胞増殖抑制剤又は放射線照射又は温熱の適用）により細胞核に誘導される、腫瘍溶解は、すなわち、好ましくは細胞周期とは無関係に核に存在するように誘導され、又はＹＢ−１は、システム、好ましくはアデノウイルスシステムと共にベクターによって、アデノウイルス遺伝子のスイッチを入れるがウイルス複製は示さない導入遺伝子として導入される。これはまた、その特異的設計のために及びＥ１Ｂタンパク質、好ましくはＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質及び／又はＥ４タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ６タンパク質がＹＢ−１の好ましくは核への効果的な動員を提供するという効果を用いて、効率的に複製することが可能である、本発明に基づいたアデノウイルス、すなわち、グループＩのアデノウイルスにも適用される。本発明の種々の態様と関連して本明細書で開示されるアデノウイルスと共に使用されてもよい好適な細胞増殖抑制剤は、たとえば、以下の群：たとえば、ダウノマイシン及びアドリアマイシンのようなアントラサイクリン類；たとえば、シクロホスファミドのようなアルキル化剤；エトポシドのようなアルカロイド類、ビンクリスチン及びビンブラスチンのようなビンアルカロイド類；たとえば、５−フルオロウラシル及びメトロソレキサットのような抗代謝物；たとえば、シスプラチンのようなプラチン誘導体；たとえば、カンホテシン、ＣＰＴ１１のようなトポイソメラーゼ阻害剤；たとえば、タキソール、パクリタクセルのようなタキ���ン類；たとえば、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、トリクロスタチンのようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤；たとえば、ＭＳ−２０９、ＶＸ７１０のようなＭＤＲ調節剤並びにたとえば、１７−ＡＡＧのようなゲルダナマイシン誘導体に属するものである。ＹＢ−１核陽性の細胞及び好ましくは細胞質に調節されたＹＢ−１を含有する細胞で複製することだけが可能である本明細書で開示されるアデノウイルス、特に組換えアデノウイルスは、野生型アデノウイルス、特に野生型Ａｄ５のトランス活性化能に比べて、ウイルス遺伝子、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ４ｏｒｆ３及びＥ３ＡＤＰをトランス活性化する能力で限定される。本発明者は驚くべきことに、この限定された能力は、ＹＢ−１の核局在と組み合わせて、相当する遺伝子、特にＥ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６を発現させることにより克服できることを見い出した。本明細書における実施例で示すように、ウイルス複製及び粒子形成は、そのような条件下で、野生型アデノウイルスの複製活性及び粒子形成に匹敵するレベルまで増加する。
【０２５１】
本発明に従って使用される本明細書で開示されるアデノウイルスの、その製造に関連した又はその製造のための薬物は、局所的に適用する又は送達することも本発明の範囲内であるが、普通、全身性に適用されることが意図される。適用はアデノウイルスを特に細胞に感染させることが意図され、アデノウイルスの複製が、特に、関与する、好ましくは、因果関係を持って、条件、通常、疾患の形成において、本発明の薬物が使用される診断及び／又は予防及び／又は治療のために、その中で生じることが意図される。
【０２５２】
そのような薬物は好ましくは、悪性腫瘍疾患、腫瘍性疾患、癌性疾患、癌及び腫瘍の治療のためであり、これらの用語は、反対に指示されない限り、本質的に同義的に本明細書では使用される。腫瘍性疾患は好ましくは、ＹＢ−１が、腫瘍性疾患のメカニズムのために、特に病理メカニズムのために、すでに、好ましくは細胞周期とは無関係に核に局在する、或いは細胞核におけるＹＢ−１の存在が外因性の手段によって誘発されるものであり、その際、そのような外因性の手段はＹＢ−１を細胞核に転移させる、又はそれをそこで誘導する又は発現するのに好適である。用語、腫瘍又は腫瘍性疾患は、本明細書では、悪性腫瘍及び良性腫瘍の双方、固形腫瘍及びびまん性腫瘍の双方のそれぞれ及びそれぞれの疾患を含むべきである。実施態様では、薬物は少なくとも１つのさらなる薬学上有効な化合物を含む。そのようなさらなる薬学上有効な化合物の性質及び量は、薬物が使用される適応の種類に依存する。薬物が腫瘍性疾患の治療及び／又は予防に使用される場合、通常、たとえば、シスプラチン及びタキソール、ダウノブラスチン、ダウノルビシン、アドリアマイシン及び／又はミトキサントロンのような細胞増殖抑制剤又はそのほかの細胞増殖抑制剤又は本明細書に記載される細胞増殖抑制剤の群が使用され、好ましくは、記載されるようなものは、細胞増殖抑制剤が介在するＹＢ−１の核への局在化と関連して使用される。
【０２５３】
本発明に基づいた薬物は、種々の剤形、好ましくは液体形態で存在することができる。さらに、薬物は、剤形の当業者に既知の安定剤、緩衝液、防腐剤などのような補助剤を含有するであろう。
【０２５４】
本発明者は、さらに驚くべきことに、本明細書に記載するウイルス、特に本発明に従って用いられるウイルスの有効性を、少なくとも２つの作用剤と組み合わせて用いることにより増大させることができることを見出した。その場合、少なくとも２つの作用剤のそれぞれは、細胞増殖抑止剤を含む群より、個々に及び独立して選択される。
【０２５５】
本明細書の好ましい実施態様で用いられるように、細胞増殖抑止剤は特に化学的又は生物学的化合物であって、それは細胞又はそのような細胞を含む生物への投与中に又は投与後に、もはや成長していない及び／又はもはや分裂していない及び／又は細胞分裂及び／又は細胞増殖が遅くなった細胞をもたらす。細胞増殖抑止剤は、前述のような細胞中のみで又はそのような細胞を含む生物体中のみで細胞増殖抑止剤へ変化する化合物も含む。その限りにおいて、用語、細胞増殖抑止剤は、前・細胞増殖抑止剤も含む。
【０２５６】
細胞増殖抑止剤は作用機序により群に分けられる。原則としてすべて本発明において用いることができる次の群が区別される：
【０２５７】
−    アルキル化剤、すなわち核酸及びタンパク質のリン酸、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシ及び水酸基のアルキル化により、細胞傷害作用を引き起こす化合物。そのような化合物はしばしばそれ自身が発癌性である。細胞増殖抑止剤のこの群の代表例は、シス−プラチン及びプラチン誘導体、シクロホスファミド、ダカルバジン、マイトマイシン、プロカルバジンである。
【０２５８】
−    代謝拮抗剤、すなわち、その構造類似性又は結合能力により、代謝過程を妨害するか、代謝過程に影響する化合物。代謝拮抗剤の群の中で、構造上類似の代謝拮抗剤、構造を変化させる代謝拮抗剤、及び間接的に作用する代謝拮抗剤が区別される。構造上類似の代謝拮抗剤は、化学的な類似性により代謝物質と競合するが、代謝物質の機能は発揮しない。構造を変化させる代謝拮抗剤は代謝物質と結合してその機能又は再吸収を妨害するか、又は代謝物質を化学的に修飾する。間接的に作用する代謝拮抗剤は、例えばイオンの結合によって代謝物質の機能を妨害する。この群の代表例は、メトトレキサートなどの葉酸拮抗薬、フルオロウラシルなどのピリミジン類似物質、アザチオプリン及びメルカプトプリンなどのプリン類似物である。
【０２５９】
−    有糸分裂阻害剤、すなわち細胞分裂を阻害する化合物。有糸分裂阻害剤の群の中で、細胞分裂毒素と紡錘体毒素及び染色体毒素が区別される。この群の代表例は、タキサン及びビンカアルカロイドである。タキサンを次に、タキソール及びタキソテールの２つの主な群に分けることができる。特に好ましいタキソールはパクリタキセルであり、特に好ましいタキソテールはドセタキセルである。
【０２６０】
−    ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに阻害作用を有する抗生物質。代表例は、例えばブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン及びマイトマイシンなどの、アントラサイクリンである。
【０２６１】
−    トポイソメラーゼ阻害剤、特にトポイソメラーゼＩ阻害剤。トポイソメラーゼ阻害剤は、３段階の過程によりＤＮＡの撚り回数の変化を触媒することにより、ＤＮＡの三次構造を決定する化合物である。基本的に、トポイソメラーゼの２つの形が区別される。Ｉ型のトポイソメラーゼは１つのＤＮＡ鎖のみを切断し、ＡＴＰに依存しない、しかし、II型のトポイソメラーゼはＤＮＡの両方の鎖を切断し、その場合ＡＴＰに依存する。トポイソメラーゼＩ阻害剤の代表例は、イリノテカン及びトポテカンであり、そしてトポイソメラーゼ II 阻害剤の代表例はエトポシド及びダウノルビシンである。
【０２６２】
本発明の範囲内で、前述の群から少なくとも１つの、また好ましくは２つの作用剤が選択される。しかし、特に、３つ、４つ、又は５つの種々の作用剤が選択されるのもまた、本発明の範囲内である。ウイルスと共に２つの作用剤だけを用いる本発明の実施態様について次の意見を述べる。これらの考察は、２つを越える薬剤を用いる場合の実施態様にもまた、基本的に適用可能である。
【０２６３】
作用剤は、異なる標的分子を対象にする又は標的とする、あるいは異なる分子を標的とすると文献に記載されている、というように、互いに異なっていることが好ましい。作用剤が、同じ標的分子に結合する２つ以上の異なる作用剤を含むのもまた、本発明の範囲内である。さらに、１つの作用剤が標的分子の第１の部位へ結合し、第２の作用剤が標的分子の第２の部位へ結合するのも本発明の範囲内である。
【０２６４】
少なくとも作用剤の２つが異なる作用機序を用いて活性を及ぼすのもまた本発明の範囲内である。好ましい実施態様において、活性を及ぼすとは、化合物の細胞増殖及び／又は細胞分裂を阻害又は遅延する作用が異なる作用機構によって仲介されることを意味する。特に好ましい実施態様において、用語活性を及ぼすとは、ウイルス、特に、本発明に従うウイルス、本明細書に記述されているウイルス、及び本発明に従って用いられるウイルス、の複製効率が、作用剤の１つ及び／又は両方が使用されない場合と比較して増加していることを意味する。ウイルスの複製の効率の尺度として、好ましくは細胞溶解に必要なウイルスの数が用いられ、好ましくはpfu/細胞として表現される。
【０２６５】
特に好ましい実施態様では、少なくとも２つの作用剤の少なくとも１つが、ウイルスの複製が起きる細胞の、好ましくは選択的な方式で起きる細胞の、好ましくは本明細書に記述したウイルスによる及び／又は本発明に従って用いられるウイルスによる感染力を増加させる作用剤である。これは、例えば細胞によるウイルスの取り込みを増加させることにより行うことができる。ウイルスの取り込みは、特にアデノウイルスは、例えばコクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）によって媒介される (Mizuguchi and Hayakawa, GENE 285, 69-77, 2002)。ＣＡＲの増加した発現が、例えばトリコスタチンＡにより引き起こされる (Vigushin et al., Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001)。
【０２６６】
さらなる実施態様では、少なくとも２つの作用剤の１つは、細胞内の成分の利用可能性を増すものであり、その場合、成分はウイルス、好ましくは本明細書に記述したウイルス、及び／又は本発明に従って用いられるウイルス、の複製を増加させる成分である。
【０２６７】
さらなる実施態様では、少なくとも２つの薬剤のうちの１つは核の中へのＹＢ−Ｉの輸送を媒介するものである。そのような作用剤を、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、及び有糸分裂阻害剤を含む群より選択することができる。好ましいトポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、エトポシド、及びそれぞれの類似物質である。好ましい有糸分裂阻害剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル及びドセタセルである。好ましいアルキル化剤はシスプラチン及びそれらの類似物質である。好ましい代謝拮抗剤は、フルオロウラシル及びメトトレキサートである。
【０２６８】
特に好ましい実施態様では、少なくとも２つの作用剤の１つは細胞の感染力、特にＣＡＲの発現、を増加させるものであり、また少なくとも２つの作用剤の２番目は、核の中へのＹＢ−１の輸送を増加させるものであり、その場合好ましくは化合物として、好ましくは上述のようなそれぞれの必要な特性を示す化合物を用いる。
【０２６９】
さらなる実施態様では、少なくとも２つの作用剤の１つはヒストンデアシラーゼ阻害剤である。好ましいヒストンデアシラーゼ阻害剤は、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４及びＰＸＤ１０１を含む群より選択されるものである。トリコスタチンＡは、例えば Vigushin et al., Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001 に記載されている；ＦＲ９０１２２８は、例えば Kitazono et al., Cancer Res., 61, 6328-6330, 2001 に記載されている；ＭＳ−２７−２７５は、Jaboin et al., Cancer Res., 62, 6108-6115, 2002 に記載されている；ＰＸＤ１０１は、Plumb et al., Mol. Cancer Ther., 8, 721-728, 2003 に記載されている；ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４は、Atadja et al., Cancer Res., 64, 689-695, 2004 に記載されている。
【０２７０】
なお更なる実施態様では、少なくとも２つの作用剤の１つがトポイソメラーゼ阻害剤、好ましくはトポイソメラーゼＩ阻害剤である。好ましいトポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＤＸ−８９５Iｆ、及びダウノルビシンを含む群より選択されるものである。イリノテカン及びＳＮ−３８は、例えば Gilbert et al., Clinical Cancer Res., 9, 2940-2949, 2003 に記載されている；ＤＸ−８９５１ｆは、van Hattum et al., British Journal of Cancer, 87, 665-672, 2002 に記載されている；カンプトテシンは、Avemann et al., Mol. Cell. Biol., 8, 3026-3034, 1988 に記載されている；９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンは、Rajendra et al., Cancer Res., 63, 3228-3233, 2003 に記載されている；ダウノルビシンは、M. Binaschi et al., Mol. Pharmacol., 51, 1053- 1059 に記載されている。
【０２７１】
特に好ましい実施態様では、少なくとも２つの作用剤の１つはヒストンデアシラーゼ阻害剤であり、少なくとも２つの作用剤の他の１つはトポイソメラーゼ阻害剤である。
【０２７２】
ある実施態様では、本発明による手段及び／又は本発明によって準備される手段は、本発明に従ってウイルスと組み合わせた少なくとも２つの作用剤のうちの１つ又はいくつかから離れているウイルスを含む。ウイルスは、ウイルスと組み合わせたいずれの作用剤からも離れていることが好ましい。好ましくは、その分離は空間的分離である。空間的分離は、ウイルスが作用剤とは異なる包装中に存在するような状態であってよい。好ましくは、包装は１回投与単位である、すなわち、ウイルス及び作用剤を単一の用量又は１回量として包装する。単回投与単位は、次に包装を作るために組み合わせてもよい。しかし１つ又はいくつかの、ウイルスの単一用量が、１つ又はいくつか作用剤の１つ又はいくつかの単一容量と組み合わせられるか、それと一緒に包装されることは、本発明の範囲内である。
【０２７３】
包装の種類は、当業者に知られている投与の方法に依存する。好ましくは、ウイルスは、凍結乾燥された形で、又は適当な液相中に存在することになる。好ましくは、作用剤は、例えば錠剤又はカプセルとして固体の形で存在することになる。しかしそれに制限されない。あるいは、作用剤は液体の形でも存在することができる。
【０２７４】
全身的に又は局所的にウイルスを投与することは本発明の範囲内である。さらに、ウイルスと組み合わせた作用剤を全身に又は局所的に、個々に及び互いに独立して、又は一緒に投与することも本発明の範囲内である。投与の他の様式は当業者に公知である。
【０２７５】
ウイルス及びそれと組み合わせた作用剤を時間を隔てる方式で、又は同時に投与することもまた、本発明の範囲内である。時間を隔てる方式に関連して、作用剤はウイルスの投与に先立って投与することが好ましい。ウイルスにどれくらいの時間先立って作用剤を投与するかは、用いる作用剤の種類に依存し、当業者には使用する作用剤の作用機序から明白である。さらに少なくとも２つの作用剤の投与を、同時に又は異なる時に行うことができる。時間的に異なる投与に関しては、その時点は、再び作用剤の根底にある作用機序に起因するものであり、それに基づいて当業者によって決定される。
【０２７６】
上記の考察は、医薬組成物としても本明細書に開示され参照されている本発明による薬物に関連して示したが、ウイルスの複製に使用される、好ましくは本発明によるウイルスのインビトロの複製に使用される組成物を含む任意の組成物に、概して適用可能である。上記の考察はまた、本発明によるキット及び本発明に従って用いられるキットにそれぞれ適用可能であり、それは本明細書に記述したウイルス及び本発明に従って用いられるウイルスとは別に、本明細書に記述される１つの作用剤又は作用剤の組合せもさらに含む。そのようなキットは、ウイルス及び／又はすぐに使用できる形の１つ又はいくつかの作用剤及び好ましくは使用指示書を含む。更に、上記の実施態様は、さらに本明細書に開示される核酸及び本発明に従って用いられる核酸、ならびに本発明による複製システム及びそれをコードする核酸、ならびに、それぞれ本発明に従って用いられる複製システム及び本発明に従って用いられるそれをコードする核酸に当てはまる。
【０２７７】
本発明者は驚くべきことに、本明細書に記載されるウイルスの発明使用、好ましくは、グループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスの使用がそのような腫瘍と関連して極めて高い成功率で実施されうること、及び細胞周期とは無関係にＹＢ−１を細胞核に有するそのような腫瘍の治療のための薬物の製造のためにそれらを使用できることを見い出した。普通、ＹＢ−１は細胞質、特に核周辺の細胞質に局在する。細胞周期のＧ１／Ｓ期に、正常細胞及び腫瘍細胞の双方でＹＢ−１を核内で見い出すことができ、その際、ＹＢ−１の一部は細胞質に残る（Jurchott K. et al., JBC 278: 27988-27996, 2003）。しかしながら、そのような改変アデノウイルスを用いてウイルスの腫瘍溶解を提供するためには、これは十分ではない。従来技術で記載されるようなそのような減弱アデノウイルスの比較的低い有効性は、結局のところ、その誤った適用に基づく。言い換えれば、ウイルスの腫瘍溶解に対する分子生物学的必要条件が本明細書で記載されるようなこれら減弱した又は改変したアデノウイルス、好ましくはグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスを用いて提供される場合、高い効率と共に、そのようなアデノウイルスシステムを使用してもよい。本発明に従って使用されるべき本明細書に記載されるアデノウイルス、たとえば、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０及び欧州特許ＥＰ０９３１８３０号に記載された組換えアデノウイルスの場合、必要条件は、そのような腫瘍細胞で細胞周期とは無関係にＹＢ−１の核局在を示す細胞に与えられる。この種の核への局在化は、腫瘍自体の性質によって或いは本明細書に記載される本発明に係る手段又は発明剤によって誘発されてもよい。従って、本発明は、本発明に係るウイルス、好ましくはグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスを用いて、しかしまた従来技術ですでに記載された減弱した又は改変したアデノウイルスを用いてさらに効率的に治療されてもよい、腫瘍及び腫瘍性疾患の並びに患者の新しい群を定義する。
【０２７８】
グループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルス又はそのままで従来技術ですでに既知の本発明に従って使用されるべきアデノウイルスを用いて、或いは初めて本明細書で記載されるアデノウイルスを用いて、並びに好ましくはＲｂ／Ｅ２ｆの結合を妨害しない又はＹＢ−１核陰性の細胞では複製しない又は本明細書で定義するように強く低下した複製を示すＥ１Ａタンパク質で突然変異又は欠損を有する、及び／又は、特にＥ１Ａ、たとえばウイルスＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６及び欧州特許ＥＰ０９３１８３０号に記載されたアデノウイルスの場合、欠損癌タンパク質を有する、又は示すアデノウイルスを用いて本発明に従って治療されてもよい患者のさらなる群は、ＹＢ−１が核に移動する又はそこで誘導される又はそこに輸送される或いは調節解除されたＹＢ−１が存在するという特定の条件を適用する又は実現することによってそれが保証されるような患者である。この患者群と関連したグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスの使用は、ウイルス複製の誘導が、ＹＢ−１の核への局在化とそれに続くＹＢ−１のＥ２後期プロモーターへの結合に基づくという知見に基づく。本明細書で開示されたこの知見のために、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６及び／又は欧州特許ＥＰ０９３１８３０号に記載されたアデノウイルスのようなアデノウイルスも、本明細書の意味においてＹＢ−１が核陽性である細胞及び／又はＹＢ−１が調節解除された状態で存在する細胞で複製してもよい。その程度において、これらの特徴を有する細胞を含む、特に治療されるべき疾患の生成にこれらの細胞が関与していれば、本発明に従って疾患及び患者を治療するためにこれらのアデノウイルスを使用することができる。このことは、細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を含有する又は本発明の意味において調節解除されたＹＢ−１を含有する腫瘍細胞を本発明に従って治療することにおいて、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ０１６、欧州特許ＥＰ０９３１８３０号に記載されたアデノウイルス並びにグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスの成功の基礎である。本発明に従って使用されるべき本明細書に記載されたウイルスを用いて、及び初めて本明細書で記載されたウイルス、特にグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスを用いて、本発明に従って治療されてもよい患者のさらなる群は、ＹＢ−１核陽性のもの、及び／又は以下の任意の治療の結果ＹＢ−１核陽性であるもの、及び／又は、好ましくは治療の意味で、アデノウイルスの投与に先立って、ウイルスの適用に付随して、アデノウイルスの投与後に、以下の手段の１つを受ける患者である。ＹＢ−１核陽性の患者が、細胞周期とは無関係に多数の腫瘍形成細胞の中で特に核にＹＢ−１を有する、及び／又はそのような細胞で調節解除されたＹＢ−１を有する患者であるということは本発明の範囲内である。これらの手段の１つは、全体として及び／又は腫瘍治療に関連して使用される、本明細書で記載されるような細胞増殖抑制剤の投与である。さらに照射、特に腫瘍治療に適用される照射はこの群の手段に属する。照射は、特に高エネルギーの放射線による照射、好ましくは、腫瘍治療に使用される好ましくは放射線照射を意味する。さらなる手段は温熱及び温熱の適用、好ましくは腫瘍治療に使用される温熱である。特に好ましい実施態様では、温熱は局所に適用される。最終的に、さらなる手段は、ホルモン治療、特に腫瘍治療に適用されるホルモン治療である。そのようなホルモン治療の過程では、抗エストロゲン及び／又は抗アンドロゲンが使用される。それに関連して、たとえば、タモキシフェンのような抗エストロゲンは特に乳癌の治療に使用され、フルタミド又はシプロテロンアセテートのような抗アンドロゲンは特に前立腺癌の治療に使用される。
【０２７９】
本明細書で開示されるアデノウイルスは腫瘍の治療に使用されてもよく、その際、腫瘍は、原発腫瘍、二次腫瘍、三次腫瘍及び転移腫瘍を含む群から選択される。これに関連して、腫瘍は以下の特徴、すなわち、理由の如何にかかわらず、細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有すること及び／又は調節解除されたＹＢ−１を含有することの１つを示すことが好ましい。
【０２８０】
本発明に基づいたアデノウイルスがその中で複製する又は複製することが可能である細胞及び腫瘍は、本明細書で記載される１又は数個の特徴有する、好ましくは、理由にかかわりなく細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有する及び／又は調節解除されたＹＢ−１を有するという特徴を有するものであり、かつ、本発明に基づいたグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスを用いてこれらの細胞及び腫瘍を治療してもよく、かつ、それらの治療のための薬物を製造するためにアデノウイルスを使用してもよく、その際、アデノウイルスはＹＢ−１をコードする核酸を発現することは本発明の範囲内である。従って、好ましくは、本発明に基づいたグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスが複製してもよい、かつ、これらのアデノウイルスを用いて治療してもよい、好ましくは溶解してもよい細胞、従って腫瘍には３つのカテゴリーがある：
【０２８１】
Ａ群：細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を有する細胞；
Ｂ群：核にＹＢ−１を有さず、特に細胞周期とは無関係ではないが、調節解除されたＹＢ−１を含む細胞；及び
Ｃ群：核にＹＢ−１を有さず、特に細胞周期とは無関係ではなく、調節解除されたＹＢ−１を含まない細胞
【０２８２】
Ａ群については、本発明に基づいたアデノウイルス、特に、追加のＹＢ−１を発現しないグループＩのアデノウイルスを複製及び溶解に使用してもよい。しかしながら、本発明に基づいたアデノウイルス、特に、追加のＹＢ−１を発現するグループＩのアデノウイルスを複製及び溶解に用いることも可能である。これはＢ群にも適用される。それに束縛されることを望まないで、理由は、Ｅ１Ｂタンパク質、特にＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質及び／又はＥ４タンパク質、特にＥ４ｏｒｆ６タンパク質の効果のために、核におけるＹＢ−１の局在化及び核へのその転移によって効率的な複製が保証されることであると思われる。アデノウイルスにより追加的に発現されるＹＢ−１はこの過程を抑制する。
【０２８３】
Ｃ群の場合、本発明に基づいたアデノウイルス、特に、追加のＹＢ−１を発現するグループＩのアデノウイルスを複製及び溶解に使用されるであろう。これの理由は、再び、それに束縛されることを望まないで、ウイルス複製の上記過程は、効率的な複製が起きてもよいように、特定の細胞のバックグラウンドでは活発ではないことであると思われる。ＹＢ−１を提供し、ＹＢ−１を発現させることだけで、効率的な複製が起きてもよく、その際、メカニズムは、Bargou（Bargout R. C. et al., Nature Medicine 3: 447-450, 1997）及びJurchott（Jurchott K. et al., JBC 278: 27988-27966, 2003）により記載されたように、ＹＢ−１の過剰発現がＹＢ−１の核への局在化を招くようである。
【０２８４】
固有に核にＹＢ−１を含有する、又はそのようにする又は核への誘導及び積極的な核への導入ののち核にＹＢ−１を含有する、或いは本発明の意味で調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍を形成する細胞の一部も本発明の範囲内である。好ましくは、腫瘍形成細胞の約５％又はすなわち、６％、７％、８％などよりも高い比率がそのようなＹＢ−１核陽性細胞又は調節解除されたＹＢ−１が存在する細胞である。たとえば、乳癌、骨肉種、卵巣癌、滑膜癌又は肺癌のようなそのほかの腫瘍については、調節解除されたＹＢ−１を含む又は細胞周期とは無関係にＹＢ−１の核への局在化を示す腫瘍細胞の比率は、約３０〜５０％であってもよい（Kohno K. et al., BioEssays 25: 691-698, 2003）。本発明に基づくアデノウイルスを用いてそのような腫瘍を好ましく治療してもよい。ＹＢ−１の核への局在化は、外からのストレス及び局所に適用されたストレスによって誘導されてもよい。この誘導は、照射、特にＵＶ照射、とりわけ、本明細書で開示される細胞増殖抑制剤の適用及び温熱を介して生じてもよい。温熱に関連して、ＹＢ−１の核への特定の核輸送が誘発されてもよく、このために、アデノウイルスの複製並びに細胞及び腫瘍の溶解のための必要条件が与えられ、好ましくは局所的に限定されることが、特定の様式で、特に局所的に、実現されてもよいことが重要である（Stein U., Jurchott K., Walther W., Bergmann S., Schlag P. M., Royer H. D., J. Biol. Chem., 276(30): 28562-9, 2001; Hu Z., Jin S., Scotto K. W., J. Biol. Chem., 275(4): 2979-85, 2000; Ohga T., Uchiumi T., Makino Y., Koike, K., Wada M., Kuwano M., Kohno K., J. Biol. Chem., 273(11): 5997-6000, 1998）。
【０２８５】
従って、適当な前処理又は後処理又は付随した処理によって、ＹＢ−１の輸送が特に腫瘍細胞で誘発され、調節解除されたＹＢ−１が細胞で生成される患者及び患者群に本発明の薬物が投与され、彼らのために設計されるであろう。
【０２８６】
本明細書で提供される技術的教示に基づいて、本発明に基づいた使用に適用されてもよいアデノウイルスの異なった実施態様を生成するために、たとえば、欠失又は点突然変異を含んでもよい特にＥ１Ａを好適に改変することは当該技術の１つの技量の範囲内である。
【０２８７】
すでに言及したように、グループＩ及び／又はグループＩＩのアデノウイルスは、ＹＢ−１を核に有するそのような細胞及び細胞系で複製することが可能である。これらのアデノウイルスが本発明に従って複製することができ、従って腫瘍を溶解することができるかどうかという疑問については、Ｒｂ、すなわち、網膜芽腫腫瘍抑制産物の存在又は非存在に関する細胞の状況は、無関係である。さらに、本発明に従った前記アデノウイルスの使用について、ＹＢ−１核陽性細胞、すなわち、細胞の状況に無関係にＹＢ−１を有する細胞と関連して本明細書で開示されるアデノウイルスを使用する場合、感染細胞の、感染されるべき細胞の、又は治療されるべき細胞のｐ５３の状況を考慮に入れる必要はなく、Ｒｂの状況と同様にｐ５３の状況も本明細書で開示される技術的教示を実践するためのアデノウイルスの複製に何ら影響を有さない。
【０２８８】
好ましくは、グループＩＩのアデノウイルスのトランス活性化する癌遺伝子及び癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａは、独自の天然のアデノウイルスのプロモーターの制御下にあることができ、及び／又は腫瘍特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターを介して制御されることもできる。好適な非アデノウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉種ウイルス）プロモーター、アデノウイルスに基づいたプロモーターＶａＩ及び非ウイルスＹＢ−１プロモーターを含む群から選択される（Makino Y. et al., Nucleic Acids Res., 15: 1873-1878, 1996）。本明細書で開示される本発明の任意の態様と関連して使用してもよいさらなるプロモーターは、テロメラーゼプロモーター、α−フェトタンパク質（ＡＦＰ）プロモーター、癌胎児性抗原プロモーター（ＣＥＡ）（Cao G., Kuriyama S., Gao J., Mitoro A., Cui L., Nakatani T., Zhang X., Kikukawa M., Pan X., Fukui H., Qi Z., Int. J. Cancer 78: 242-247, 1998）、Ｌ−プラチンプロモーター（Chung I., Schwartz P. E., Crystal R. C., Pizzorno G., Leavitt J., Deisseroth A. B., Cancer Gene therapy 6: 99-106, 1999）、アルギニンバゾプレシンプロモーター（Coulson J. M., Staley J., Woll P. J., British J. Cancer 80: 1935-1944, 1999）、Ｅ２ｆプロモーター（Tsukada et al., Cancer Res., 62: 3428-3477, 2002）、ウロプラキンＩＩプロモーター（Zhang et al., Cancer Res., 62: 3743-3750, 2002）、及びＰＳＡプロモーター（Hallenbeck P. L., Chang Y. N., Hay C., Golightly D., Srewart D., Lin J., Phipps S., Chiang Y. L., Human Gene Therapy 10: 1721-1733, 1999）、チロシナーゼプロモーター（Nettelbeck D. M., Anti-Cancer Drugs 14: 577-584, 2003）、シクロオキシゲナーゼ２プロモーター（Nettelbeck D. M. et al., Melanoma Res., 13: 287-292, 2003）、並びにテトラサイクリンのような誘導系（Xu, X. L., Mizuguchi H., Mayumi T., Hayakawa T., Gene 309: 145-151, 2003）である。さらに、ドイツ特許出願ＤＥ１０１５０９８４．７号に記載されるようなアデノウイルスのＹＢ−１に依存したＥ２後期プロモーターは、本発明に関連して使用してもよいプロモーターである。
【０２８９】
テロメラーゼプロモーターについて、ヒト細胞ではそれは決定的に重要であることが知られている。従って、テロメラーゼ活性は、酵素の触媒サブユニットであるテロメラーゼ逆転写酵素遺伝子（ｈＴＥＲＴ）の転写制御を介して調節されている。テロメラーゼの発現は、ヒト腫瘍細胞の８５％で陽性である。これとは対照的に、ほとんどの正常細胞ではそれは不活性である。その例外は、生殖細胞及び胎児の組織である（Braunstain I. et al., Cancer Res., 61: 5529-5536, 2001; Majundar A. S. et al., Gene Therapy 8: 568-578, 2001）。ｈＴＥＲＴの詳細な研究によって、開始コドンそれぞれ２８３ｂｐ及び８２ｂｐから分離したプロモーターの断片は腫瘍細胞での特異的な発現に十分であることが示されている（Braunstain I. et al., Majundar A. S. et al.,上記）。従って、本プロモーター及び特異的断片はそれぞれ、遺伝子の、特に導入遺伝子の、好ましくは本明細書で開示される導入遺伝子の1つの腫瘍細胞における特異的な発現に好適である。プロモーターは、腫瘍細胞においてのみ、改変された癌遺伝子、好ましくはＥ１Ａ癌遺伝子タンパク質の発現を認めるべきである。また、実施態様では、これらのプロモーターの制御下でのアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現、好ましくはＥ４ｏｒｆ６、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ、ＡＤＰ及びＹＢ−１を含む群から選択される導入遺伝子の発現が企図される。トランス活性化する癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質の読み取りフレームが、アデノウイルスシステムの１又は数個の遺伝子産物と共にインフレームであることも本発明の範囲内である。しかしながら、トランス活性化するＥ１Ａタンパク質の読み取りフレームはそれらとは独立していてもよい。
【０２９０】
様々な導入遺伝子、したがってＥ１Ｂ５５ｋＤ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＡＤＰその他もまた、特にそれらがウイルス遺伝子である場合は、原則として任意のそれぞれのウイルス、好ましくはアデノウイルスからクローニングすることができる。さらに先行技術において多数のプラスミドが記述されており、それらはそれぞれの遺伝子を含んでおり、続いてそれらから遺伝子を得て本発明のアデノウイルスへならびに本発明に従って用いられるウイルスへ導入することができる。Ｅ１Ｂ５５ｋＤを発現するそのようなプラスミドの例については、例えば Dobbelstein, M. et al., EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997 に記載されている。Ｅ１Ｂ５５ＫＤ遺伝子のコーディング領域を例えば３’非翻訳領域と一緒にこの遺伝子から、プラスミドｐＤＣＲＥ１ＢからＢａｍ ＨＩにより切り取ることができる。Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子ならびに３’非コード領域を含む対応する断片が、アデノウイルス５型のヌクレオチド２０１９−４１０７に対応する。しかし、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子が制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＢｆｒＩによって前記プラスミドから切り取られ、続いてアデノウイルスへクローンニングされることもまた本発明の範囲内である。
【０２９１】
もし逆の言及がなければ、本発明のウイルスについて言及される場合は、それをコードする核酸ならびにアデノウイルス粒子（これは好ましくはそれぞれの核酸を含む）の両方について言及される、ということは本発明の範囲内である。それぞれの核酸はまた、異なるベクターに組み入られて存在してもよい。
【０２９２】
本発明に基づいたアデノウイルス、好ましくはグループＩのアデノウイルスの種々の実施態様と関連して、特に、野生型アデノウイルスにおけるタンパク質又は発現産物を制御するものとは異なるプロモーターが使用される場合、上述の種々のプロモーターも使用されることは本発明の範囲内である。従って、前述のプロモーターは本発明の意味では、異種プロモーターである。本発明に基づいたアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルスの好ましい実施態様では、上記で定義したＡ群及びＢ群の細胞にアデノウイルスを適用する場合、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質の発現がそのような異種プロモーターから開始し、その際、好ましくは、しかし排他的ではなくＥ１Ａタンパク質がＹＢ−１に制御されるように、これが生じることが企図される。この実施態様及びそのほかの実施態様では、Ｅ１Ａタンパク質の発現は、たとえば、Ｅ２後期プロモーターのようなＹＢ−１が制御可能なプロモーターの制御下にある。このことは、Ｅ１Ｂタンパク質及び／又はＥ４タンパク質が発現カセットで発現されている場合も真実である。
【０２９３】
本発明に基づいたアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルスの好ましい実施態様では、Ｃ群の細胞に関連してアデノウイルスを適用する場合、プロモーターはそれぞれ独立して、腫瘍特異的、器官特異的又は組織特異的なプロモーターであることが企図される。それに関連して、Ｅ１Ｂタンパク質、Ｅ４タンパク質及び／又はＥ１Ａタンパク質の発現を制御する少なくとも１つのプロモーターがそのような特異的なプロモーターである場合、それは十分である。この腫瘍、器官及び組織の特異性によって、本発明に基づいたアデノウイルスの複製は該当する腫瘍、器官又は組織の細胞にのみ生じ、それから離れて、さらなる組織がアデノウイルスの複製によってたとえば、溶解されるように損傷されることはないことが保証される。好ましくは、第２のタンパク質、及びさらに好ましくは３つすべてのタンパク質がそのような腫瘍特異的、器官特異的又は組織特異的なプロモーターによって制御される。そのようなアデノウイルスを用いて、腫瘍を形成しない又はそのような腫瘍を発生させることができないが、そのほかの理由、たとえば医学的理由で、たとえばそれらが望ましくない因子を産生する又は高すぎるレベルでそのような因子を産生するので、生物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトから破壊されるべきである又は除去されるべきであるものも溶解することが可能である。
【０２９４】
実施態様では、本発明に基づいたアデノウイルスの溶解のための細胞が使用され、細胞は耐性であり、好ましくは多剤耐性を示すことが企図される。
【０２９５】
本明細書でいう、かつ治療されるべき腫瘍及び患者の特徴である耐性は、以下の遺伝子：ＭＤＲ、ＭＲＰ、トポイソメラーゼ、ＢＣＬ２、グルタチオン−２−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）が介在するものであるが、これらに限定されない。細胞増殖抑制剤の効果がとりわけ、アポトーシスの誘導に基づいているので、アポトーシス関連遺伝子の発現は、以下の因子、すなわち、Ｆａｓ、ＢＣＬ２ファミリー、ＨＳＰ７０及びＥＧＦＲがそれに関連して関係するようにいかなる耐性の生成においても決定的な役割を担う（Kim et al., Cancer Chemother. Pharmacol., 50: 343-352, 2002）。
【０２９６】
ＹＢ−１の発現は、非耐性腫瘍細胞に比べて、耐性腫瘍細胞において強く増加することがLevenson et al（Levenson V. V. et al., Cancer Res., 60: 5027-5030, 2000）によって記載されている。
【０２９７】
本明細書で使用されるとき、耐性は、本明細書で記載される細胞増殖抑制剤に対する耐性をいう。この複合耐性は、マーカーを呈する腫瘍及び患者群の細胞を決定するためのマーカーとして使用してもよい膜結合型トランスポータタンパク質、Ｐ糖タンパク質の発現、好ましくは過剰発現に付随する。本明細書で使用されるとき、用語、耐性は、Ｐ糖タンパク質が介在する古典的な耐性をいう耐性、及びＭＲＰが介在する又はそのほかの非Ｐ糖タンパク質が介在する異型の耐性をいう耐性の双方も含む。ＹＢ−１の発現に相関するさらなるマーカーはトポイソメラーゼＩＩαである。その程度において、成功の期待を持ってアデノウイルスを用いて本発明に従って患者を治療してもよいかどうかを決定するために、核におけるＹＢ−１を決定する代わりに又はそれに加えて、スクリーニング法でトポイソメラーゼＩＩαを用いてもよい。原則としてＰ糖タンパク質と同様に使用してもよいマーカーはＭＲＰである。少なくとも、結腸直腸癌又は結腸直腸癌を有する患者が関係する範囲でのさらなるマーカーは、たとえばShibao K. et al（Shibao K. et al., Int. Cancer 83: 732-737, 1999）により記載されるようなＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）（Hasan S. et al., Nature 15: 387-391, 2001）である。最終的に、乳癌及び骨肉種の分野では、ＭＤＲ（多剤耐性）の発現が前述の意味でのマーカーである（Oda Y. et al., Clin. Cancer Res., 4: 2273-2277, 1998）。本発明に従って使用してもよいさらに可能性のあるマーカーは、ｐ７３である（Kamiya M., Nakazatp Y., Neurooncology 59: 143-149, 2002; Stiewe et al., J. Biol. Chem., 278: 14230-14236, 2003）。
【０２９８】
最後に、それは、本発明で使用してもよい乳癌における予後マーカーとしてＹＢ−１が言われるべきである。原発腫瘍においてＹＢ−１の発現が増加している患者においてのみ、手術及び化学療法の後で再発が起きる（Janz M. et al., Int. J. Cancer 97: 278-282, 2002）。
【０２９９】
さもなければ医学的臨床的な意味でもはや治療することができない、及び従来技術の方法を用いた腫瘍性疾患の治療が成功の期待を持ってはもはや可能ではない、特に、細胞増殖抑制剤及び照射の使用がもはや合理的に可能ではなく、腫瘍に影響を与える又は腫瘍を小さくするという意味でもはや上手く行うことができない患者を本発明に従って、本明細書で記載されるアデノウイルスを用いた治療の対象としてもよいということは本発明の特別の利点である。本明細書では、用語、腫瘍は、一般に、好ましくは細胞周期とは無関係に細胞核にＹＢ−１を固有に含有する、又は外因性の手段を適用してそのようにする、及び／又は調節解除されたＹＢ−１を含有するいかなる腫瘍又は癌性疾患をいう。
【０３００】
さらに、本明細書に記述されたウイルスを、原則として腫瘍の治療に用いることができる。
【０３０１】
特に本明細書に記述されるウイルスによって治療することができる腫瘍は、神経系の腫瘍、目の腫瘍、皮膚の腫瘍、軟組織の腫瘍、胃腸の腫瘍、呼吸器の腫瘍、骨格の腫瘍、内分泌系の腫瘍、女性生殖システムの腫瘍、乳腺の腫瘍、男性生殖システムの腫瘍、尿の排出系の腫瘍、造血系の腫瘍を含み、混合腫瘍及び胚の腫瘍を含む群より選択される腫瘍が好適である。これらの腫瘍が特にここに定義されたような特に耐性のある腫瘍であることは本発明の範囲内である。
【０３０２】
神経系の腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  頭蓋並びに脳（頭蓋内）の腫瘍、好ましくは星状細胞腫、オリゴデンドログリオーマ、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘膠腫、神経繊維腫、血管芽細胞腫、脂肪腫、クラニオファリンジオーマ、奇形腫、及び脊索腫；
２．  脊髄、及び脊柱管の腫瘍、好ましくは膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経繊維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、繊維肉腫及び多発性骨髄腫；及び
３．  末梢神経の腫瘍、好ましくは神経鞘膠腫、神経繊維腫、神経繊維肉腫、及び神経周囲の線維芽細胞腫。
【０３０３】
目の腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  眼瞼及び眼瞼腺の腫瘍、好ましくは腺腫、腺癌、乳頭腫、組織球腫、肥満細胞  腫、基底細胞腫瘍、メラノーマ、扁平上皮癌、繊維腫及び繊維肉腫；
２．  結膜、及び瞬膜の腫瘍、好ましくは扁平上皮細胞癌、血管腫、血管肉腫、腺腫、  腺癌、繊維肉腫、メラノーマ及び乳頭腫；及び
３．  眼窩、視神経、及び眼球の腫瘍、好ましくは網膜芽細胞腫、骨肉腫、肥満細胞  腫、髄膜腫、細網細胞腫瘍、神経膠腫、神経鞘膠腫、軟骨腫、腺癌、扁平上皮癌、形質細胞腫瘍、リンパ腫、横紋筋肉腫、及びメラノーマ。
【０３０４】
皮膚の腫瘍の群は好ましくは：
組織球腫、脂肪腫、繊維肉腫、繊維腫、肥満細胞腫、悪性メラノーマ、乳頭腫、基底細  胞腫瘍、角化棘細胞腫、血管周囲細胞腫、毛嚢腫瘍、汗腺腫瘍、皮脂腺の腫瘍、血管種、  血管肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、プラスマ細胞腫及びリンパ管腫、などの腫瘍を含む。
【０３０５】
軟組織の腫瘍の群は好ましくは、
歯槽の軟部組織肉腫、類上皮細胞肉腫、軟組織の軟骨肉腫、軟組織の骨肉腫、軟組織の  ユーイング肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）、繊維肉腫、繊維腫、平滑筋肉腫、平滑筋腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性血管周囲細胞腫、血管種、血管肉腫、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、悪性神経鞘膠腫、悪性メラノサイト性神経鞘膠腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、リンパ管腫、及びリンパ管肉腫、などの腫瘍を含む。
【０３０６】
胃腸の腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  口腔及び舌の腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、繊維肉腫、マーケル細胞腫瘍、誘導性繊維エナメル芽細胞腫、繊維腫、繊維肉腫、ウイルス性乳頭腫症、特発性乳頭腫症、鼻咽頭ポリープ、平滑筋肉腫、筋芽細胞腫、及び肥満細胞腫；
２．  唾液腺の腫瘍、好ましくは腺癌；
３．  食道の腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、平滑筋肉腫、繊維肉腫、骨肉腫、バレットの癌、及び食道周囲腫瘍；
４．  膵臓外分泌腺の腫瘍、好ましくは腺癌；及び
５．  胃の腫瘍、好ましくは腺癌、平滑筋腫、平滑筋肉腫及び繊維肉腫。
【０３０７】
呼吸器の腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  鼻及び鼻腔、喉頭及び気管の腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、繊維肉腫、繊維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管種、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、好酸性顆粒細胞腫（横紋筋腫）、腺癌及び筋芽細胞腫；及び
２．  肺の腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、繊維肉腫、繊維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管種、血管肉腫、メラノーマ、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、好酸性顆粒細胞腫（横紋筋腫）、腺癌、筋芽細胞腫、小細胞癌、非小細胞癌、気管支の腺癌、気管支肺胞腺癌、及び肺胞性腺癌。
【０３０８】
骨格の腫瘍の群は好ましくは：
骨肉腫、軟骨肉腫、傍骨性骨肉腫、血管肉腫、滑膜細胞肉腫、血管肉腫、繊維肉腫、悪性間葉腫、巨細胞腫、骨腫及び多小葉骨腫、を含む。
【０３０９】
内分泌系の腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  甲状腺／副甲状腺の腫瘍、好ましくは腺腫及び腺癌；
２．  腎上体の腫瘍、好ましくは腺腫、腺癌及びクロム親和性細胞腫（髄質副腎腫）；
３．  視床下部／下垂体の腫瘍、好ましくは腺腫及び腺癌；
４．  膵臓内分泌腺の腫瘍、好ましくはインスリノーマ（β細胞腫瘍、ＡＰＵＤｏｍ）及びゾリンジャー−エリソン症候群（膵臓デルタ細胞のガストリン分泌器官腫瘍）；ならびに、
５．  多発性内分泌腫瘍症（ＭＥＮ）及び非クロム親和性傍神経節腫。
【０３１０】
女性の生殖システムの腫瘍の群は、好ましくは次のものを含む：
１．  卵巣の腫瘍、好ましくは腺腫、腺癌、嚢腺腫及び未分化癌；
２．  子宮の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、腺腫、腺癌、繊維腫、繊維肉腫及び脂肪腫；
３．  頚部の腫瘍、好ましくは腺癌、腺腫、平滑筋肉腫及び平滑筋腫；
４．  膣及び陰門の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維平滑筋腫、繊維腫、繊維肉腫、ポリープ、及び扁平上皮癌。
【０３１１】
乳腺の腫瘍の群は好ましくは、
線維腺腫、腺腫、腺癌、間充織腫瘍、癌、癌肉腫を含む。
【０３１２】
男性の生殖システムの腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  睾丸の腫瘍、好ましくは精上皮腫、間細胞腫及びセルトリ細胞腫；
２．  前立腺の腫瘍、好ましくは腺癌、未分化癌、扁平上皮癌、平滑筋肉腫及び移行細胞癌；及び
３．  陰茎及び外部生殖器の腫瘍、好ましくは肥満細胞腫及び扁平上皮癌。
【０３１３】
尿の排出システムの腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  腎臓の腫瘍、好ましくは腺癌、移行細胞癌（上皮性腫瘍）、繊維肉腫、軟骨肉腫（間充織の腫瘍）、ウィルムス腫瘍、腎芽腫及び胚性腎腫（胚の多分化能芽細胞腫）；
２．  尿管の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維乳頭腫、移行細胞癌；
３．  膀胱の腫瘍、好ましくは移行細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、ブドウ房形（胚の横紋筋肉腫）、繊維腫、繊維肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、乳頭腫、及び血管肉腫；及び
４．  尿道の腫瘍、好ましくは移行細胞癌、扁平上皮癌、及び平滑筋肉腫。
【０３１４】
造血システムの腫瘍の群は好ましくは次のものを含む：
１．  リンパ腫、リンパ性白血病、非リンパ性白血病、骨髄増殖性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫。
【０３１５】
混合腫瘍及び胚性腫瘍の群は好ましくは、血管肉腫、胸腺腫及び中皮腫を含む。
【０３１６】
特に好ましい実施態様ではこれらの腫瘍が、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、膠芽腫、メラノーマ、小細胞肺癌、及び結腸直腸癌を含む群より選ばれる。さらなる腫瘍は、本明細書に記述された耐性の腫瘍、好ましくは複合耐性の腫瘍、さらに特に上述した群の腫瘍である。特に好ましい腫瘍は、さらに乳房腫瘍、骨腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚及び皮膚付属器の腫瘍、頭／首腫瘍、子宮腫瘍、滑膜腫瘍、喉頭腫瘍、食道の腫瘍、舌腫瘍、及び前立腺腫瘍を含む群より選ばれる腫瘍である。これらの腫瘍は、それらの症状発現に関して、本明細書にすべて開示されているものであることが好ましい。
【０３１７】
本発明のアデノウイルス、好ましくは、グループＩのアデノウイルス及び本発明に従って使用されるべきアデノウイルス、好ましくはグループＩＩのアデノウイルス。
【０３１８】
薬物としての、及び特に全身性投与に関連した、本明細書で開示されるアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスの使用は、アデノウイルスの好適なターゲティングによって改善することができる。アデノウイルスによる腫瘍細胞の感染は、とりわけ、ある程度まで、コクサッキーウイルス−アデノウイルスの受容体及び別個のインテグリンの存在に依存する。それらが細胞内、好ましくは腫瘍細胞内で強く発現するとまもなく、きわめて低い力価（pfu／細胞）で感染がすでに可能である。組換えアデノウイルスのいわゆるリターゲティングに到達するために、たとえば、ファイバーノブ領域に異種配列を挿入したり、二特異的抗体を用いたり、アデノウイルスをポリマーで被覆したり、Ａｄファイバーにリガンドを導入したり、血清型５のノブ及び血清型５のファイバーシャフトとノブを血清型３のノブ及びＡｄ３５のファイバーシャフトとノブで置き換えたり、ペントン塩基を修飾したりすることによって今日まで、種々の戦略が試みられてきた（Nicklin S. et al., Molecular Therapy 4: 534-542, 2001; Magnusson M. K. et al., J. of Virology 75: 7280-7289, 2001; Barnett B. G., et al., Biochemica et Biophysica Acta 1575: 1-14, 2002）。本発明に基づいたアデノウイルス及び本発明に従って使用されるアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルス及びグループＩＩのアデノウイルスにおいて、そのようなさらなる実施態様及び特徴の本発明の種々の態様に関連した実現は、本発明の範囲内である。
【０３１９】
本発明は、さらなる態様において、改変されたアデノウイルス、すなわち、本発明に従って使用されるアデノウイルス、たとえば、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−８４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７、ＣＢ１０６又は欧州特許ＥＰ０９３１８３０に記載されるアデノウイルス及び／又はグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスを用いて治療されてもよい患者をスクリーニングする方法に関するものであり、その際、該方法は以下の工程を含む。
【０３２０】
−腫瘍組織の試料を分析すること、及び
−ＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核に局在するかどうか又は細胞が調節解除されたＹＢ−１を含有するかどうかを決定すること。
【０３２１】
ＹＢ−１の代わりに、又はＹＢ−１に加えて、前述のマーカーの存在も評価される。
【０３２２】
腫瘍組織又はその一部が、好ましくは細胞周期とは無関係に核にＹＢ−１を含む又は調節解除されたＹＢ−１を含む場合、本明細書で開示されたアデノウイルス、特にグループＩのアデノウイルス及び／又はグループＩＩのアデノウイルスを、本発明に従って使用してもよい。
【０３２３】
本発明に係る方法の実施態様において、腫瘍組織の分析が、ＹＢ−１に対する抗体、ＹＢ−１に対するアプタマー、ＹＢ−１に対するスピーゲルマー、ＹＢ−１に対するアンチカリンを含む群から選択される作用剤によって行われることが企図される。原則として、各マーカーには、同一種類の作用剤を作成し使用することができる。抗体、特に、モノクローナル抗体の製造は当業者に既知である。ＹＢ−１の特異的な検出のためのさらなる作用剤又はマーカーは、本件ＹＢ−１又は前記マーカーにおける標的構造に高親和性で結合するペプチドである。従来技術では、そのようなペプチドを生成するために、たとえば、ファージディスプレイのような方法が知られている。そのような目的で、それはペプチドライブラリから出発するが、その際、個々のペプチドは約８〜２０のアミノ酸の長さを有し、ライブラリのサイズは、約１０2〜１０18、好ましくは１０8〜１０15の異なったペプチドである。標的分子を結合するポリペプチドの特定の形態はいわゆるアンチカリンであり、それは、たとえば、ドイツ特許出願ＤＥ１９７４２７０６号に記載されている。
【０３２４】
ＹＢ−１又は本明細書で開示される相当するマーカーに特異的に結合するための、従って、細胞周期とは無関係なＹＢ−１の核への局在化を検出するための、さらなる作用剤は、いわゆるアプタマー、すなわち、Ｄ−核酸であり、それは、ＲＮＡ又はＤＮＡを基にして一本鎖又は二本鎖として存在し、標的分子に特異的に結合する。アプタマーの生成は欧州特許ＥＰ０５３３８３８号に記載されている。アプタマーの特定の実施態様はいわゆるアプタザイムであり、たとえば、Piganeau N. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 39(29): 4369-4374, 2000に記載されている。それらが、アプタマー部分と離れてリボザイム部分を含み、アプタマー部分に結合する標的分子の結合及び放出に際して、リボザイム部分が触媒的に活性化されて核酸基質を切断し、それがシグナル生成を伴うという範囲で、それらはアプタマーの特定の実施態様である。
【０３２５】
アプタマーのさらなる形態は、いわゆるスピーゲルマー、すなわち、Ｌ−核酸から成る、標的分子を結合する核酸である。そのようなスピーゲルマーの生成方法は、たとえば、ＷＯ９８／０８８５６に記載されている。
【０３２６】
腫瘍組織の試料は穿刺又は手術によって得ることができる。ＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核に局在するかどうかの評価は、顕微鏡技法及び／又は抗体若しくは通常、上述のさらなる作用剤のいずれかを用いた免疫組織分析によって行われることが多い。核におけるＹＢ−１及び細胞周期とは無関係なその局在を検出する方法は当業者に既知である。たとえば、ＹＢ−１に対して染色した組織切片を走査すればＹＢ−１の局在化は容易に検出される。核に存在するＹＢ−１の頻度はすでに、核における局在化が細胞周期とは無関係であるという指標である。核における細胞周期とは無関係なＹＢ−１の検出のさらなる可能性は、ＹＢ−１に対して染色し、ＹＢ−１の核における局在を評価し、細胞周期を決定することである。しかしながら、このこと及びＹＢ−１の検出は、ＹＢ−１に向けられた前述の作用剤を用いて行うことができる。作用剤の検出は当業者に既知の手順で行われる。前記作用剤は特異的にＹＢ−１に向けられているので、その程度において、分析されるべき試料内の他の構造、特に細胞の他の構造に結合することはなく、作用剤の好適な標識による前記作用剤の局在化及びＹＢ−１に対する特異的な結合によるＹＢ−１の局在化の双方を、相応に検出でき、評価することができる。作用剤を標識する方法は当業者に既知である。試料の細胞が調節解除されたＹＢ−１を含有しているかどうか、含有していれば、どれくらいの細胞がそれを含有しているのかを確定するために、同じ技法を使用してもよい。調節解除されていないＹＢ−１に比べて、調節解除されたＹＢ−１も過剰発現を示すので、分析された細胞でＹＢ−１が調節解除されているかどうかを決定するために、参照試料と比べたＹＢ−１の相対発現を使用してもよい。
【０３２７】
本明細書に記述されているウイルスが、それらが本発明のウイルスであっても、又はそれらが本発明に従って用いられるウイルスであっても、疾病、好ましくは腫瘍疾病、より好ましくは腫瘍細胞の少なくとも一部が複合耐性を示す、特にＹＢ１が調節解除されている多剤耐性を示す腫瘍疾病に関連しても用いられることは、本発明の範囲内である。これは、ＹＢ１が好ましくは細胞周期と無関係に核の中に存在する細胞及び疾病を参照する範囲で、細胞及び腫瘍に関連して本明細書に記述されるいずれの他の態様にも当てはまる。
【図面の簡単な説明】
【０３２８】
今や図及び実施例を用いて本発明をさらに説明すべきであり、その際、本発明の新規の特徴、実施態様及び利点はそれらから選択され、それらに関連して
【図１】Ｅ１／Ｅ３を欠失したアデノウイルスであるＡｄＥ１／Ｅ３マイナスアデノウイルスベクター、野生型アデノウイルス及びアデノウイルスｄｌ５２０と呼ばれるアデノウイルスベクターの構造設計を示す。
【図２】ｐ３００、ｐ１０７及びｐ１０５の結合に関するＥ１Ａタンパク質の結合ドメインを示す。
【図３】Ｅ１／Ｅ３マイナスＡｄ５と呼ばれるＥ１／Ｅ３を欠失したアデノウイルスＡｄ５、及びｄｌ５２０で感染させた後の、核にＹＢ−１を有さないＵ２０Ｓ細胞を示す。
【図４】Ｅ１／Ｅ３マイナスＡｄ５と呼ばれるＥ１／Ｅ３を欠失したアデノウイルスＡｄ５、及びアデノウイルスｄｌ５２０で感染させた後の、核にＹＢ−１を有する２５７ＲＤＢ細胞を示す。
【図５】アデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１で感染させた後の２５７ＲＤＢ細胞及びＵ２０Ｓ細胞を示す。
【図６】ＹＢ−１が、多剤耐性細胞及び細胞株２５７ＲＤＢ、１８１ＲＤＢ、ＭＣＦ−７Ａｄの細胞核に存在するが、ＵＳ２０Ｓ及びＨｅｌａ細胞の核には存在しないことを確認するＥＭＳＡの分析結果を示す。
【図７】野生型アデノウイルス、アデノウイルスｄｌ５２０及びアデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１のＥ１Ａタンパク質の構造設計を示す。
【図８】追加的に発現させたウイルスタンパク質の存在下アデノウイルスの複製効率を絶対値で示す棒グラフを示す。
【図９】追加的に発現させたウイルスタンパク質の存在下アデノウイルスの複製効率の増加を示す棒グラフを示す。
【図１０】ダウノルビシンの投与なし及びダウノルビシン４０ng／mL投与した場合の１０及び３０pfu／細胞でｄｌ５２０を感染させた及び対照（Ｋ）のクリスタルバイオレットで染色したＵ２０Ｓ細胞のウェルを示す。
【図１１】ダウノルビシンの投与なし及びダウノルビシン４０ng／mL投与した場合の１０及び３０pfu／細胞でｄｌ５２０を感染させた及び対照（Ｋ）のクリスタルバイオレットで染色したＨｅｌａ細胞のウェルを示す。
【図１２】ＰＢＳ及びｄｌ５２０で処理した後の異なった起源（ＲＤＢ２５７及びＨｅｌａ）の腫瘍の時間の関数としての腫瘍容積の図示を示す。
【図１３】ＰＢＳ及び５ｘ１０8pfuのｄｌ５２０で処理した後ＲＤＢ２５７に基づく腫瘍を発育させ、屠殺されたマウスの写真を示す。
【図１４】ｄｌ５２０を感染させた後のＲＤＢ２５７細胞及びＨｅｌａ細胞（皮下で腫瘍を増殖させた）の細胞抽出物のサザンブロット分析の結果を示す。
【図１５】ＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞（２５７ＲＤＢ及び１８１ＲＤＢ）及びＹＢ−１核陰性の腫瘍細胞（Ｈｅｌａ、Ｕ２０Ｓ）におけるｄｌ５２０及び野生型アデノウイルスの複製効率及び粒子形成を示す棒グラフを示す。
【図１６】野生型アデノウイルス及びアデノウイルスベクターＡｄＸｖｉ０３の構造設計を示す。
【図１７】アデノウイルスベクターＡｄＸｖｉ０３／０１の構造設計を示す。
【図１８Ａ】Ａｄ３１２（２０pfu／細胞）、Ｘｖｉｒ０３（５pfu／細胞）で感染させた及び対照（非感染）の、クリスタルバイオレットで染色した１８ＲＤＢ細胞（図１８Ａ）及び２７２ＲＤＢ（図１８Ｂ）のウェルを示す。感染後５日目にクリスタルバイオレット染色を行った。
【図１８Ｂ】Ａｄ３１２（２０pfu／細胞）、Ｘｖｉｒ０３（５pfu／細胞）で感染させた及び対照（非感染）の、クリスタルバイオレットで染色した１８ＲＤＢ細胞（図１８Ａ）及び２７２ＲＤＢ（図１８Ｂ）のウェルを示す。感染後５日目にクリスタルバイオレット染色を行った。
【図１９】野生型アデノウイルスＡｄ５及びアデノウイルスＡｄ３１２で感染させた後のＡ５４９細胞及びＵ２０Ｓ細胞におけるＥ２遺伝子発現のノーザンブロットの結果を示す。
【図２０】野生型アデノウイルス及びアデノウイルスデルタ２４で感染させた１２時間後及び２４時間後のＵ２０Ｓ細胞におけるＥ２遺伝子発現のノーザンブロットの結果を示す。
【図２１】アデノウイルスベクターＸｖｉｒＰＳＪＬ１の構造設計を示す。
【図２２】アデノウイルスベクターＸｖｉｒＰＳＪＬ２の構造設計を示す。
【図２３】異なったpfu／細胞を用いてアデノウイルスｄｌ５２０で感染させ、クリスタルバイオレットで染色したＨｅｌａ細胞のウェルを示す。
【図２４】アデノウイルスＥ２後期プロモーターの異なったプロモーター断片の利用におけるＵ２０Ｓ細胞、Ｈｅｌａ細胞及び２５７ＲＤＢ細胞のルシフェラーゼ活性を示す棒グラフを示す。
【図２５】ＹＢ−１を発現するアデノウイルス及びウイルスＡｄ３１２で感染させた２日後及び５日後のＵ２０Ｓ細胞におけるウイルス粒子の数を示す棒グラフである。細胞内にとどまったウイルス粒子（黒で示す）と細胞外に放出されたウイルス粒子（斜線で示す）との間で区別した。
【図２６】イリノテカンによって細胞を処理された、及び細胞を処理されないＵ３７３細胞におけるアデノウイルスｄｌ ５２０の複製行動のサザンブロット解析の結果を示す。
【図２７】トリコスタチンＡによって細胞を処理された、及び細胞を処理されないＵ３７３細胞におけるアデノウイルスｄｌ ５２０の複製行動のサザンブロット解析の結果を示す。
【図２８】トリコスタチンで処理されたＵ３７３細胞の、コクサッキーウイルス・アデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現についてＦＡＣＳ解析を行った結果を、ＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージとして表示する。
【図２９】複製中のアデノウイルスｄｌ５２０及びイリノテカン及びトリコスタチンの種々の組合せの効果を表示するための、細胞層の４枚の異なるパネルを示す；
【図３０】Ｅ１Ｂ５５ＫのＯＲＦを、３’ＵＴＲ断片及び位置３５３２の制限部位ＢｆｒＩと共に、模式的に表現したものである；
【図３１】野生型Ａｄ５の配列位置３５０７〜４１０７に対応する、Ｅ１Ｂ５５ｋ−３’ＵＴＲ領域の配列を示す；及び、
【図３２】ＲＧＤモチーフを有するＥ３／Ｅ４の修飾された組換えアデノウイルスを生成するための汎用シャトルプラスミドを模式的に表現したものである。
【実施例１】
【０３２９】
発明により使用されるアデノウイルスが含むＥ１Ａ修飾のタイプ
図１はＡｄＥ１／Ｅ３マイナス、即ちＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスと野生型アデノウイルスおよびアデノウイルスｄｌ５２０の構造デザインを示している。
【０３３０】
アデノウイルスＡｄＥ１／Ｅ３マイナスは機能的Ｅ１Ａまたは機能的Ｅ１ＢもしくはＥ３をコードする領域を有しておらず、本実験では毒性に関するコントロールに用いられる。
【０３３１】
野生型Ｅ１Ａ遺伝子は、Ｅ１Ａ  ＲＮＡの異なる位置でのスプライシングから生じる合計で５種類のタンパク質をコードしている。とりわけ２種類のタンパク質、即ち２８９アミノ酸タンパク質および２４３アミノ酸タンパク質が生成される。ｄｌ５２０はＥ１Ａ遺伝子のＣＲ３ストレッチ内に欠失を持つために１３Ｓ遺伝子産物を欠いているため、２８９アミノ酸タンパク質をコードしていない。発明に用いられるアデノウイルスｄｌ５２０は当業者からは１２Ｓ−Ｅ１Ａウイルスと呼ばれる。先行技術周知のアデノウイルスｄｌ３４７（WongおよびZiff、J.Virol.、68、4910〜4920、1994年）はまた１２Ｓ−Ｅ１Ａでもあり、これは本発明に使用することができる。
【０３３２】
１３Ｓ−Ｅ１ＡのｍＲＮＡによりコードされる２８９アミノ酸タンパク質の中には、各種アデノウイルスサブタイプに保存されている３つの領域がある。これらはＣＲ１、ＣＲ２およびＣＲ３と呼ばれる。ＣＲ１およびＣＲ２は両Ｅ１Ａタンパク質（Ｅ１Ａ  １２ＳおよびＥ１Ａ  １３Ｓ）、即ち２８９アミノ酸および２４３アミノ酸タンパク質に存在するが、ＣＲ３領域は上記タンパク質のうちの大きい方だけに存在する。
【０３３３】
ＣＲ３領域はウイルス遺伝子、特にＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４の活性化に必要である。小型、即ち２４３アミノ酸タンパク質のみを含むウイルスは、極弱くしかウイルス遺伝子をトランス活性化できず、核内にＹＢ−１を持たない細胞でのアデノウイルス複製を促進しない。ＹＢ−１は腫瘍細胞でのみ核内に存在すること、そしてその中にのみ見出すことができることから、このベクターは腫瘍特異的複製の誘導に好適である。
【０３３４】
ｄｌ５２０はＣＲ３を欠失していることから、このアデノウイルスは本明細書で輸送とも呼ばれる細胞質ＹＢ−１の細胞核内への移動を行うことができず、それ故にＹＢ−１核陰性である細胞では複製できないことから、このウイルスは本発明で使用可能なウイルスであり、そしてこのウイルスは本発明に必要なトランス活性化に使用できる。
【実施例２】
【０３３５】
細胞のＲｂ状態に依存したアデノウイルスの作用様態
図２はｐ３００，ｐ１０７およびｐ１０５の結合に関係するＥ１Ａタンパク質の結合ドメインを示している。Ｐ３００およびＰ１０７は、細胞質結合タンパク質である。腫瘍抑制タンパク質である網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）の結合は、ＣＲ１およびＣＲ２を通じて媒介される。研究からｐＲｂおよびｐ１０７／ｐ３００は細胞転写因子Ｅ２Ｆと組み合わさり効率的に転写制御することが示されている。野生型Ｅ１Ａタンパク質はＥ２ＦのＲｂへの結合を妨害する。即ち放出されたＥ２ＦはＥ２初期プロモーターに結合して、アデノウイルスの複製を誘導する。
【０３３６】
Ｅ１Ａ発癌タンパク質内の特定の欠失がＲｂ−陰性細胞で優先的に複製することが可能であり、そして本発明に用いることができる以下に述べるような組換え体アデノウイルスベクターを生成することが従来知られていた。例えばアデノウイルスベクターｄｌ９２２−９４７は、ＣＲ２領域（アミノ酸位置１２２〜１２９）内に欠失を持ち、ベクターＣＢ０１６はＣＲ１（アミノ酸位置２７〜８０）およびＣＲ２領域（アミノ酸位置１２２〜１２９）に欠失がある。ベクターＥ１Ａｄｌ０１／０７はＣＲ２領域（アミノ酸位置１１１〜１２３）内に欠失を持つ。更に、Ｎ−末端（アミノ酸位置４〜２５）に追加の欠失があることから、タンパク質ｐ３００への結合は認められない。アデノウイルスベクターＡｄΔ２４はＣＲ２領域（アミノ酸位置１２０〜１２７）に欠失を持っている。欧州特許第ＥＰ０  ９３１  ８３０号に記載のアデノウイルスベクターはＣＲ１領域よびＣＲ２領域に欠失を含んでいる。
【０３３７】
Ｅ２Ｆ／ＲＢの結合メカニズムおよびＥ１Ａを媒介するＥ２Ｆの放出は、本発明の基礎を成すメカニズムとは基本的に異なるものである。先行技術での予想とは異なり、ウイルス複製にとって必須ではないが、重要であるのはＲｂタンパク質からのＥ２Ｆの放出ではなく、ヒト転写因子であるＹＢ−１が核内に局在することである。この転写因子は、正常細胞に於いては、細胞周期の大部分について細胞質内にのみに存在している。アデノウイルスが感染すると、特定の条件の下にＹＢ−１は核内に導かれるか、例えば乳ガン、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、神経芽腫、メラノーマ、小細胞肺癌および結腸直腸癌を含むが、もとよりこれらに限定されないある種の腫瘍疾患といったある種の細胞システムでは核内に既に存在している。
【実施例３】
【０３３８】
Ｕ２ＯＳ細胞の感染
１００，０００個のＵ２ＯＳ細胞をウェルに播いた。翌日細胞に図３に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清ＤＭＥＭ培地５００μl中で、３７℃で１時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）２mlと交換した。３日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。
【０３３９】
図３から分かるように核内にＹＢ−１を持たないＵ２ＯＳ細胞は、本発明に使用できる２種類のアデノウイルス、即ちＥ１／Ｅ３マイナスと呼ばれるＥ１／Ｅ３欠失ウイルスおよびアデノウイルスｄｌ５２０で感染させた後にクリスタルバイオレット染色を行ったところ、溶解を示していなかった。この場合、まず培地を取り除いた。続いて細胞にクリスタルバイオレット液（５０％ＥＴＯＨ、３％ホルムアルデヒド、５％酢酸、１％クリスタルバイオレット）を重層して室温で５〜１０分間インキュベーションした。続いて６ウェル型プレートを水でよく濯いでから室温で乾かした。これから、本発明で使用するウイルスを誘導し、感染細胞を溶解させるには、ＹＢ−１の存在が必要であるという、本発明の基礎を成す発見が確認された。
【実施例４】
【０３４０】
２５７ＲＤＢ細胞の感染
１００，０００個の２５７ＲＤＢ細胞をウェルに播いた。翌日細胞に図４に示すような各種アデノウイルスを感染させた。感染は無血清ＤＭＥＭ培地５００μl中で、３７℃で１時間行った。続いて感染培地を取り除き、完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）２mlと交換した。３日後にクリスタルバイオレット染色で分析を行った。
【０３４１】
この実験の結果を図４に示す。Ｅ１／Ｅ３を欠失したＥ１／Ｅ３マイナスと呼ばれるアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を持つ２５７ＲＤＢ細胞への感染については、低ＭＯＩ（pfu／細胞）では溶解を示さなかった。これに対し実施例３で示した、ＹＢ−１核陰性細胞では複製せず、同時に本発明に従い発癌遺伝子タンパク質をトランス活性化するＥ１Ａをコードしているｄｌ５２０は、４０pfu／細胞というＭＯＩ（感染多重度）で実質完全な溶解をおこし、１０pfu／細胞のＭＯＩでも顕著な溶解を起こした。このことから、ｄｌ５２０およびここに記したｄｌ１１１９／１１３１またはＡｄＸｖｉｒといった同様のウイルスが必要とするＭＯＩは、Ｅ１欠失またはＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスに比べ約１桁（１０倍）低く、臨床使用が可能であると結論される。
【０３４２】
図７に示すように、ｄｌ５２０のタンパク質Ｅ１ＡはそのＣＲ３領域を欠失することを特徴とし、その結果本発明による使用に求められるトランス活性化およびＹＢ−１核陽性細胞での複製を起こす。
【実施例５】
【０３４３】
ｄｌ１１１９／１１３１による２５７ＲＤＢおよびＵ２ＯＳ細胞の感染
図５に示すように、Ｅ１Ａタンパク質のアミノ酸４〜１３８およびそれをコードする核酸を欠失しており、さらにアミノ酸２１８の後に停止コドンを含むために発現する断頭型（truncate）Ｅ１Ａタンパク質が完全なＥ１Ａタンパク質のＣＲ３領域を含んでいるアデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１をＹＢ−１核陰性Ｕ２ＯＳ細胞に感染した場合、２０pfu／細胞のＭＯＩでは溶解は起きなかった。陰性コントロールには非感染細胞層を用いた。
【０３４４】
これに対し核内にＹＢ−１を含む、即ちＹＢ−１核陽性である、２５７ＲＤＢの様な細胞系では、アデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１の影響を受けて、２０pfu／細胞のＭＯＩで細胞層は実質的に完全に溶解した。この限りにおいて本実施例は、図７に示す様に例えばＣＲ３領域のみを含み、そしてＣＲ１領域およびＣＲ２領域を欠いている修飾型Ｅ１Ａ発癌遺伝子タンパク質が、発明によるアデノウイルスの複製に必要なＹＢ−１核陽性細胞でのトランス活性化を提供していることを示す別の証拠である。即ちアデノウイルスｄｌ１１１９／１１３１は、本発明に使用可能である別のアデノウイルスである。ＣＲ３領域に関してｄｌ１１１９／１１３１と同様にデザインされているが、それと異なりＣＲ１領域および／またはＣＲ２領域も含んでいるウイルスを使用できることも、本発明の範囲内である。
【実施例６】
【０３４５】
多剤耐性細胞での核内ＹＢ−１の検出
本実施例は核内ＹＢ−１が転写因子としてｍｄｒ１プロモーター（多剤耐性プロモーター）内にあるＹ−ボックス（ＣＡＡＴ配列）に結合しなければならないという考察に基づいている。これを検出するために、いわゆるＥＭＳＡ分析（電気泳動移動度シフトアッセイ）を行った。これに関連して、核タンパク質を単離し、続いてタンパク質１〜１０μｇを短いＤＮＡ鎖（オリゴ）と共の３７℃でインキュベーションした。核内ＹＢ−１を決定するために以下のオリゴヌクレオチドを使用した；Ｕ２Ｏ３と反対のｍｄｒ１プロモーター（位置−８６〜−６７）：ＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＧＧＣＡ（Ｘボックスには下線を付した）。
【０３４６】
その前にこのＤＮＡ断片の５’末端を32Ｐで放射線標識した。続いて未変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離した。タンパク質ＹＢ−１がオリゴヌクレオチド内の配列に結合すると、その結合は、結合したオリゴヌクレオチドに比べて非結合のオリゴヌクレオチドはゲル中をより早く移動することから検出できる（Holm, P.S.ら、JBC 277、10427〜10434、2002年; Bargou、R.C.ら、Nature Medicine 3、447〜450、1997年)。
【０３４７】
図６に示すように、ＥＭＳＡ分析よりＹＢ−１が多剤耐性細胞２５７ＲＤＢ、１８１ＲＤＢおよびＭＣＦ−７Ａｄ細胞の核内に存在すること、そして細胞株Ｕ２ＯＳおよびＨｅＬａ細胞には存在しないことが分かる。
【０３４８】
実施例４および５に示した結果は、アデノウイルスｄｌ５２０およびｄｌ１１１９／１１３１が２５７ＲＤＢの様なＹＢ−１核陽性細胞では複製してその溶解を誘導するが、Ｕ２０５では複製、溶解を誘導しないことを確認した。このことは、本発明のアデノウイルスの使用に関する所見が確認された。さらに結果は、野生型のアデノウイルスと比べて、修飾型または欠失型Ｅ１Ａ遺伝子産物を介したＹＢ−１核陽性細胞でのウイルス遺伝子の弱いトランス活性化が、例えば多剤耐性細胞を含む核内にＹＢ−１が存在する細胞での良好な複製および良好な細胞溶解をもたらすこと、そしてここに記したアデノウイルスがかかる腫瘍の溶解に利用できることを確認している。
【実施例７】
【０３４９】
Ｅ１−マイナスアデノウイルスの複製効率上昇
本実施例は初期ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６をプラスミドｐＥ４ｏｒｆ６によるトランスフェクションおよびＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄ−５５Ｋによる感染で置換えられることを示す。Ａｄ−５５ＫはＥ１Ｂ−５５ＫをＥ１にクローニングし、ＣＭＶの制御下に置いたＥ１／Ｅ３欠失ウイルスである。この置換は、ＡｄＹＢ−１、即ちＹＢ−１を発現するアデノウイルスがこれら初期遺伝子を発現していないという事実、および本発明者が核内にＹＢ−１を含む複製系でのこれら初期遺伝子を置換することで複製効率および粒子形成能率をそれぞれ野生型アデノウイルスであるＡｄ５型のそれと同程度まで上げることができることを認識していたという事実より必要であった。
【０３５０】
以下を実施した：
リポフェクタミンを用いた各１０5個のＵ２ＯＳ細胞へのプラスミドｐＥ４ｏｒｆ６のトランスフェクション。プラスミドｐＥｏｒｆ６はＣＭＶ制御下にある初期ウイルス遺伝子Ｅ４ｏｒｆ６をコードするＤＮＡ配列を保持している。プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６をトランスフェクションした２４時間後に、細胞にＹＢ−１発現Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスＡｄＹＢ−１（５０pfu／細胞）およびＥ１／Ｅ３欠失Ｅ１Ｂ−５５ＫアデノウイルスＡｄ−５５Ｋ（５０pfu／細胞）を感染させた。Ａｄ−５５ＫはＣＭＶ制御下にあるウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ−５５Ｋをトランス遺伝子として保持するＥ１／Ｅ３欠失ウイルスである。
【０３５１】
続いて感染５日後（＝トランスフェクション後）に細胞を培地（２ml）から取り出した。凍結と融解（凍結／融解）を交互に３回行って、単離細胞からのウイルス粒子を放出させた。次にプラークアッセイを２９３細胞を使って実施し、生成した感染粒子を決定した（プラーク形成単位／ml（pfu/ml））。結果は図８および９に示す。図８は絶対量で表した場合のプラークアッセイの結果である。ＡｄＹＢ−１単独感染例と最も大きな差は、プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６を感染させた例および２種類のウイルスＡｄＹＢ−１およびＡｄ−５５Ｋを同時感染させた例との間で観察された。図９は図８の結果を、ＡｄＹＢ−１の複製効率の倍率として複製効率の増加の形で表したものである。細胞にプラスミドｐＥ４ｏｒｆ６を感染させた後ＡｄＹＢ−１およびＥ１Ｂ−５５Ｋ（Ａｄ−５５Ｋ）を感染させると、最大２５倍高いpfu/mlを示した。
【０３５２】
これらの結果より、Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６による置換はＥ１／Ｅ３−欠失アデノウイルスＡｄＹＢ−１感染後に形成されるウイルス数（pfu/ml）を最大２５倍増加すると結論できる。プラーク形成単位（pfu）生成に及ぼすＥ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６の追加効果は、これら２遺伝子産物単独の効果に比べて有意に高かった。
【０３５３】
ＥＧＦＰを発現するプラスミドを使ったコントロール実験は、選択した実験方法では、プラスミドｐＥ４ｏｒｆ６でトランスフェクションされたのは僅かに細胞の１０％だけであることを明瞭に示した。Ｅ１Ｂ−５５ＫおよびＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する細胞で形成された粒子の数は、ヒトアデノウイルス５型（野生型）のそれに匹敵した。このことから、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ−５５Ｋの発現は、ＹＢ−１の核内局在と組み合わさると、アデノウイルス、特にＥ１Ａ−欠失アデノウイルスの複製および粒子形成を、野生型Ａｄ５のそれに匹敵する程度まで誘導できるという、本発明の基礎を成す発見が確認された。
【実施例８】
【０３５４】
細胞増殖抑制薬投与によるＹＢ−１核陰性細胞では複製しないアデノウイルスのＹＢ−１核陽性細胞での複製増加
各種細胞増殖抑制薬の添加がヒト転写因子ＹＢ−１の核内局在化を誘導することは、先行技術において知られていた。本発明者が見出したように、核内に局在したＹＢ−１は、アデノウイルスのＥ２−後期プロモーターの活性化によりアデノウイルスの複製をコントロールする。両効果の組み合わせを利用すれば特異的な腫瘍溶解を得ることができる。
【０３５５】
癌溶解アッセイを実施するに当たっては、以下の手順に従った：２００、０００個の細胞（それぞれＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ）を６ウェル型プレートの核ウェル内に接種した。翌日ダウノルビシン４０ng/ml（最終濃度）を加えた。３時間インキュベーションした後、それぞれの細胞をｄｌ５２０で、１０〜３０pfu／細胞の割合で感染させた。続いて細胞を、細胞増殖抑制薬を含まない培地でインキュベーションした。３〜５日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
【０３５６】
図１０および１１から分かるように、ダウノルビシンの添加はＹＢ−１の核内局在化を通じてｄｌ５２０の複製を誘導した。即ちｄｌ５２０は、細胞増殖抑制薬と組み合わさった状態で、ダウノルビシン単独例に比べてより大きな癌溶解作用を発揮した。
【実施例９】
【０３５７】
ｄｌ５２０によるインビボの癌溶解
本インビボ試験で使用したＨｅＬａ（ＹＢ−１核陰性）および２５７ＲＤＢ（ＹＢ−１核陽性）細胞は、無菌細胞培養条件にて拡大した。細胞をマウス（系統ＣＤ１ＮｕＮｕ）に注射して皮下腫瘍を形成させる前に、細胞をトリプシン処理して集め、ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ）に加え、細胞数を測定してからＰＢＳで１回洗浄した。続いて細胞を遠心分離してＰＢＳを除き、細胞を希望数する細胞数になるよう新鮮ＰＢＳ中に分配した。本研究で皮下注射した細胞の数は両細胞系統とも５×１０6細胞であった。注射は動物の一方の側腹部に行い、より区別し易いようにＨｅＬａ細胞は右側に、そして２５７ＲＤＢ細胞は左側に注射した。腫瘍の増殖を週２回調べ、ノギスを使って腫瘍の長さおよび幅を測定した。その結果を用い、次式より腫瘍の容積を計算した：
３／４π＊ａ／２＊（ｂ／２）2  ａ＝長さ、ｂ＝幅
【０３５８】
腫瘍の大きさが２００〜５２０mm3に達した時点で、ウイルスおよび陰性コントロールであるＰＢＳをそれぞれ腫瘍内に投与した。注射量は同一で、１回５０μlであった。この作業を３連続日繰り返した。投与したウイルスの総量は５×１０8pfuであった。次に腫瘍の増殖を毎週２回の割合で記録し続け、その容積を計算した。試験最終日にマウスを屠殺して、腫瘍を取り出し詳しく分析した。
【０３５９】
結果は図１２および１３に示した。
【０３６０】
図１２は、腫瘍容積の経時変化を処理の種類別に示したグラフである。腫瘍がＲＤＢ２５７により形成された例では、ＰＢＳ注射時に腫瘍は約４３８mm3から１４６６mm3へと有意に増大した。本発明に従い用いられるベクターｄｌ５２０を作用させると、腫瘍の成長は有意に低下した。平均腫瘍サイズ３４４mm3から総容積５４３mm3へと、腫瘍サイズは僅かに２１％増加しただけであった。
【０３６１】
本実施例では、ＲＤＢ２５７を基本とする腫瘍にＰＢＳを投与したのと同様にＰＢＳを投与したＨｅＬａ細胞より成る腫瘍をコントロールとして用いた。ＨｅＬａ細胞を基本とする、ｄｌ５２０で処理された腫瘍は、まだ有意な腫瘍成長の増加を示し、３１１mm3から１９５４mm3に増加した。
【０３６２】
図１３はＲＤＢ２５７を用いて増殖した腫瘍を持つ、屠殺したヌードマウスの像である。本発明のアデノウイルスｄｌ５２０を作用させた後に、腫瘍の顕著な縮小が起こったことが明瞭に分かる。本例では、腫瘍容積の減少も見られた（ウイルスｄｌ５２０投与１日後：５１５mm3；ウイルスｄｌ５２０投与３０日後：３５０mm3）。
【実施例１０】
【０３６３】
腫瘍ＤＮＡのサザンブロット
実施例９で発育させた腫瘍の中央部から取り出した腫瘍試料からＤＮＡを抽出した。単離のためにQiagenのDneasy Tissue Kitを用いた。製造元の指示書に従ってＤＮＡ抽出を行った。それに従って、アルカリ溶解を介して細胞からＤＮＡを取り出した。続いて、単離したＤＮＡをカラムで精製した。続いて、２６０nmの光度測定により単離したＤＮＡの濃度を決定した。制限酵素ＫｐｎＩ、１０単位で消化したＤＮＡ試料２μｇを用いて解析を行った。続いて、０．８％アガロースゲルで試料を電気泳動的に分離した。続いて、ＤＮＡをナイロン膜にブロットした（Schleicher & Schuellの系に従って）。膜にブロットさせたＤＮＡを特異的な１５０１ｂｐのＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。１５０１ｂｐのプローブは、Ｅ２ＡをコードするＡｄ５の配列の中で３３６９ｂｐのＫｐｎＩ断片に特異的に結合する。プローブはそれに先立ってＰＣＲで調製し（プライマー：５’−ＧＴＣＧＧＡＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣＧＣＧＴ（配列番号２）、５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＧＣＴＴ（配列番号３））、32Ｐを用いて放射性標識を行った。続いて、膜を洗浄し、フィルムに暴露した。
【０３６４】
腫瘍ＤＮＡのサザンブロットの結果は図１４に示した。分析より、レーン３、４および５が示すように、ｄｌ５２０だけが耐性細胞ＲＤＢ２５７でインビトロ複製することが確認された。レーン１は陽性コントロールのＡｄ−５ｄを、レーン６、７、および８はｄｌ５２０を感染したＨｅＬａ細胞由来のＤＮＡを示す。ＨｅＬａ細胞はＹＢ−１核陽性ではないため、ウイルスｄｌ５２０は複製せず、そのためＥ２Ａ配列は検出できなかった。
【０３６５】
ｄｌ５２０に関するさらなる結果を図１５に示した。プラークアッセイを利用して、ｄｌ５２０および野生型のアデノウイルスを感染させた後の粒子形成（pfu/ml）を調べた。各種ＹＢ−１核陽性（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）腫瘍細胞、ならびにＹＢ−１核陰性腫瘍細胞にｄｌ５２０および野生型アデノウイルスを感染させた。
【０３６６】
次の手順で実施した：
１００、０００〜２００、０００個の各細胞を６個のウェルを持つプレート（６ウェルプレート）、ＦＣＳを１０％含むＬ１５培地（耐性細胞）およびＤＭＥＭ（非耐性細胞）に接種した。２４時間後にｄｌ５２０および野生型アデノウイルスを感染させた（１０pfu／細胞）。感染３日後（インフェクション後）、凍結と融解を３回繰り返して細胞浮遊液よりウイルス粒子を放出させた。次に２９３細胞を使ってプラークアッセイを行い、形成した感染粒子（プラーク形成単位／ml（pfu/ml））を決定した。結果を図１５に示す。プラークアッセイの結果は、ｄｌ５２０がＹＢ−１核陽性細胞（２５７ＲＤＢおよび１８１ＲＤＢ）では野生型アデノウイルスの場合と同様に複製することを示した。この限りにおいて、本発明に従ってここに記載のアデノウイルスを使用する場合には、野生型アデノウイルスと同様の複製効率が観察できた。
【実施例１１】
【０３６７】
アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３の構造設計
図16はアデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３の構造設計を示す。アデノウイルス Ｘｖｉｒ０３は、いわゆるＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスである。このことは、アデノウ イルス複製に機能するＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ（Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＥ１Ｂ１９ｋタンパク質）及びＥ３タンパク質が生成されないことを意味する。Ｅ１領域の欠失は３４２〜３５２８の範囲に亘り；Ｅ３領域の欠失は塩基位置２７８６５〜３０９９５の欠失である。本明細書で用いられる用語「Ｅ１欠失ウイルス」とは、Ｅ１が もはや機能的に作用しないウイルスを意味する。これは、不活性である以外は核酸配列及びアミノ 酸配列をそれぞれが殆どインタクトなままで不活性化することにより達成することもできるが、しかし、Ｅ１領域がコードする様々なサイズを有するタンパク質の欠失を意味することもできる。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質及びそれらをコードする核酸を欠くことにより、Ｅ４ｏｒｆ６のようなＥ４領域は弱く発現されるのみであるか（野生型アデノウイルスの約１〜５％）、又は全く発現されない。ウイルス遺伝子ＥｌＢ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６はＸｖｉｒ０３内に導入された異種のＣＭＶプロモーター（Clontech：Plasmid pShuttle）によりＥ１領域内で発現される。ＣＭＶプロモーターに代わって、Ｅ１Ａの発現に関連して本明細書中に開示されたいずれのプロモーターでも用いることができる。両遺伝子のオープンリーディングフレームは、いわゆるＩＲＥＳ配列 （内部リボソーム進入部位）により互いに連結している（Pelletier，J．and Sonenberg，N．Nature,1988, 334, 320〜325）。このエレメント（Novagen：pCITE) は１種類のｍＲＮＡから２種類のタンパク質を発現させる
【０３６８】
ベクターを以下のように作製した：Clontech 社のシステムＡｄｅｎｏ−Ｘ
プラスミドＥ１Ｂ５５ｋ−ｐＳｈｕｔｔｌｅを、M．Dobelstein（マールブルグ大学）から得たｐＣＧＮＥ１Ｂから、ＸｂａＩ及びＢｆｒＩによってＥ１Ｂ５５ｋのオープンリーディングフレームをClontech 製のｐＳｈｕｔｔｌｅベクター内にクローニングすることによって作製した。あるいは、ｐＣＧＮＥｌＢベクターから得たＢａｍＨＩ断片を、末端を平滑化した後、対応して調製した ClontechのｐＳｈｕｔｔｌｅベクター中にクローニングした。続いてｐＳｈｕｔｔｌｅ中のＥ１Ｂ５５ｋをＡｐａＩを用いて直線化し、末端を、平滑末端化し、ＮｈｅＩを用いて切断した。
【０３６９】
第二のベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）中に、前後して、Novagen社製のｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）を鋳型に用いＰＣＲ産物であるＩＲＥＳエレメントをＴＡクローニング法によりＥｃｏＲＶ切断部位にクローニングし、そしてプラスミドｐＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６（M．Dobelstein、マールブルグ大学）より得たＥ４ｏｒｆ６を、ＢａｍＨＩによりクローニングした＝ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）。 ｐｃＤＮＡ３．ｌ（＋）中のＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６をＮｏｔＩを用いて直線化し、端部を平滑末端化した後に断片ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６をＮｈｅＩで切り出した。断片ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６をオープンベクターＥ１Ｂ５５ｋ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（平滑端、ＮｈｅＩ）と連結した。カセットを次に、Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅから、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ)−ポリＡと共に、ΔＥ１、ΔＥ３ Ａｄｅｎｏ−Ｘ−プラスミド（Clontech）内にＩ−Ｃｅｕ Ｉ及びＰＩ−ＳｃｅＩを用いてクローニングし、ＡｄｃｍｖＥ１Ｂ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６と名付けた。次にアデノウイルスをメーカー（Clontech）指示書に従い作製した。ＰａｃＩにより直線化した、発現エレメントＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６−ＢＧＨ ポリＡを有する、アデノプラスミドをＨＥＫ２９３細胞内にトランスフェクションし、トランスフェクション１１日後に融解させる細胞を培地と共に取り出して凍結融解サイクルを繰り返し、生成されたアデノウイルスを放出させた。
【０３７０】
QBIOGENE 及び MicrobixのシステムＡｄＥａｓｙなどの他のシステムを、本発明によるアデノウイルス、好ましくは組換えアデノウイルス、特にカセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓを個々に及び／又は共に含むものの製造に用いることができるということは、本発明の範囲内であり、また本明細書に提供される技術的な教示に関して当業者にとって実行可能である。さらに、個々の導入遺伝子をカセット間で交換してもよい。本発明により、カセットがＥ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ１の設計を有するようなアデノウイルスを製造し用いることができるのも、また本発明の範囲内である。
【０３７１】
本発明に関連して、カセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋを含む、いわゆるＥＩ／Ｅ３欠失組換えアデノウイルスを用いた。しかし、ウイルスがＥ１の欠失のみを含み、それはＥ３領域がインタクトなままに留まっていることを意味することは、実施態様の範囲内である。Ｅ４領域が部分的に及び／又は完全に欠失してもよい。
【０３７２】
様々なシステムを用いるベクターの作製では、以下のようにそれを進行させた。
【０３７３】
インタクトなＥ３領域を有するアデノウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ３’ＵＴＲの、Ｇｒａｈａｍ（Microbix社）のベクターシステムによる生成。
【０３７４】
ベクターＣＭＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡのｐＤｅｌｔａ Ｅ１ｓｐ１Ａ中へのクローニング
プラスミドＥ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）のために、３’ＵＴＲを有するオープンリーディングフレームを、アデノウイルス５型のＤＮＡからの増幅により調製して（Ｅ１Ｂ５５ｋの順方向プライマー＝５’−ＡＴＧＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣ−３’、及び、Ｅ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲの逆方向プライマー＝５’−ＣＡＣＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＡＣ−３’）、末端を平滑化したＮｈｅｌ制限部位 （それはＴ末端（ＴＡクローニング）を有しており、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドへクローニングされている）に導入した。したがって、導入遺伝子は、５’末端にｈＣＭＶ−プロモーター及び３’末端にウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを所持していた。
【０３７５】
ベクターＥ４ＯＲＦ６−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のクローニング
アデノウイルス５型ＤＮＡを鋳型として用いる（Ｅ４ｏｒｆ６の順方向プライマー：５’−ＣＴＴＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧ−３’、及び、Ｅ４ｏｒｆ６の逆方向プライマー：５’−ＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＡＡＴＣＧＴ−３’）、及びＢａｍ ＨＩにより切断されたプラスミドｐＣＭＶＥ４−３４ｋＤ (Dobbelstein et al., EMBO, 16, 4276- 4284,1997) からの、増幅物Ｅ４ｏｒｆ６、及び鋳型としてＮｏｖａｇｅｎ社のｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）を有するＩＲＥＳエレメント（ＩＲＥＳの順方向プライマー＝５’−ＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣ−３’及びＩＲＥＳの逆方向プライマー＝５’−ＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ−３’）、を続いてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのマルチクローニング部位へクローンニングした。そのような目的のために、Ｅ４ｏｒｆ６導入遺伝子に対して、オープンリーディングフレームの５’末端にＢａｍＨＩ切断部位を、及び３’末端にＥｃｏＲＩ切断部位を生成するプライマーを用いた。増幅物をそれぞれの制限酵素で消化し、またその末端を、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲｌを用いて開かれたベクター中への指向されたクローニングに適合するようにした。次に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のプラスミドＥ４ｏｒｆ６をＥｃｏＲＶにより直線状にして、Ｔ末端を加え、増幅物をＩＲＥＳエレメント中へクローニングした。ＩＲＥＳエレメントの正確な方向をチェックした後に、ベクターをさらなるクローニングに用いた。
【０３７６】
両方の導入遺伝子のＩＲＥＳエレメントとの連結は、ＮｏｔＩにより直線状にし、末端を平滑化し、続いてＸｂａｌにより切断した、以前に生成されたプラスミドＣＭＶ−ＥｌＢ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）中への、Ｅ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳカセットのクローニングの結果であった。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳをＮｏｔＩにより直線状にし、末端を平滑末端にして、さらにＮｈｅＩにより消化した。Ｅ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳインサートをＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５ｋ ３’ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）とライゲーションさせることによって、ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Clontech）中でＸＶＩＲ−３’ＵＴＲを生成した。
【０３７７】
使用するアデノウイルスのシャトルベクターの生成
現在 Microbix社のアデノウイルス生成システムに用いられているシャトルベクターｐΔＥ１ｓｐ１Ａは、ＣＭＶプロモーターも、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをｐΔＥ１ｓｐ１Ａへクローニングした。その目的のために、ＣｌａＩでｐΔＥ１ｓｐ１Ａを直線化し、末端を平滑化し、またＥｃｏＲＩによって切断した。エレメントＣＭＶ−ＭＣＳ（マルチクローニング部位）−ｐｏｌｙＡをＭｆｅＩでｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から直線化し、末端を平滑末端化し、さらにＥｃｏＲｌにより切断した。続いて、カセット（Clontechから得たＸｖｉｒ３’ＵＴＲ ｐＳｈｕｔｔｌｅ）を、さらにＰｍｅＩで切断されていて続いて脱リン酸化されたＣＭＶ−ＭＣＳポリＡ ｐΔＥ１ｓｐ１Ａベクター中へ、ＰｍｅＩによりクローニングした。クローニング生成物Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐΔＥ１ｓｐ１Ａをウイルス生成に用いた。
【０３７８】
ウイルスの生成
Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐΔＥ１ｓｐ１Ａ及びｐＢＨＧＥ３（Microbixから得た、野生型アデノウイルス５型に対応するＥ３領域を含む）をＨＥＫ２９３細胞へ共トランスフェクションした。それにより両方のベクターの相同配列の組換えによりウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲＥ３が生成された。
【０３７９】
ＡｄＥＡＳＹシステム（Qbiogene 社）を用いるアデノウイルスＡｄ−Ｘｖｉｒ３’ＵＴＲ−ＡｄＥＡＳＹ Ｅ３の生成
【０３８０】
使用するアデノウイルスのシャトルベクターの生成
ここで用いるシステムのためには、ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹは、ＣＭＶプロモーターもウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルも包含しないので、これらのエレメントをｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳへクローニングした。その目的のために、プラスミドをＥｃｏＲＩによって消化し、Ｔ４ポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓで末端を満たすことによって平滑化し、骨格を脱リン酸化し、また生成された両方の消化生成物を再びライゲーションした。そうすることによって、ＥｃｏＲＩの制限認識部位を除去した。このようにして得られたプラスミドをｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ)−ＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０３８１】
次に、ClontechのｐＳｈｕｔｔｌｅから得たカセットＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡをＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩにより切断し、末端を平滑末端化し、そしてベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲ１)−ＡｄＥＡＳＹ中へクローニングした。これはそのような目的のために、ＸｂａＩで直線化し、平滑末端化し、また脱リン酸化しておいたものである。このようにして、プラスミドＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹが生成された。カセットＥ４Ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ−３’ＵＴＲをこのプラスミドへ、ＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩを用いて、クローニングした。そうすることによって、ｐＳｈｕｔｔｌｅ ＡｄＥＡＳＹ中のプラスミドＸｖｉｒ３’ＵＴＲが生成された。これをＢｓｔ１１０７Ｉ及びＭｒｏＩで直線化し、エレクトロポレーションによってレスキュープラスミドｐＡｄＥＡＳＹと共にＢＪ５１８３（ＥＣ）バクテリアへ導入した。相同組換えによって、アデノウイルスのプラスミドＡｄ−Ｘｖｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐＡｄＥＡＳＹが生成され、ＨＥＫ２９３細胞へトランスフェクションされた後にウイルス産生をもたらした。
【０３８２】
野生型Ｅ３領域のｐＡｄＥＡＳＹへの導入
プラスミドｐＡｄＥＡＳＹでは実質的にＥ３領域が欠失しているので、Ｅ３領域をプラスミドｐＡｄＥＡＳＹからＳｐｅＩ及びＰａｃＩによってプラスミドＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡ ｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＡｄＥＡＳＹ）中へ再構成のためにクローニングして、プラスミドＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹが生成された。
【０３８３】
ＮｄｅＩによる制限切断、及び再ライゲ−ションにより２つのＮｄｅＩ制限部位のうちの１つの制限部位を欠失させ、したがって、プラスミドからマルチクローニングサイトを除いた。この手続きにより、プラスミドＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹが生成された。
【０３８４】
続いて、４００７ｂｐの野生型Ｅ３領域断片を野生型アデノウイルス５型からＳｐｅＩ及びＮｄｅＩにより切り出し、ＳｐｅＩとＮｄｅＩによって開かれたＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹへクローンニングした。このようにして生成されたベクターをｗｔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（Ｎｄｅｌ）−ＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０３８５】
次に、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−Ｎｄｅｌ）−ＡｄＥＡＳＹから野生型Ｅ３Ｅ４領域をＳｐｅＩ及びＰａｃＩによって切断して、ｐＡｄＥＡＳＹへクローニングし、またＳｐｅＩとＰａｃＩで切断した。それによってプラスミドｐＡｄＥＡＳＹ中で、Ｅ３領域が再確立された（ｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３）。ＢＪ５１８３（ＥＣ）バクテリアをプラスミドＸｖｉｒ−３’ＵＴＲによって形質転換する際の相同組換えにより、ｐＳｈｕｔｔｌｅ ＡｄＥＡＳＹ及びｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３中に、ＸＶｉｒ−３’ＵＴＲ−ｐＡｄＥＡＳＹ−Ｅ３が生成された。
【０３８６】
言及したシステムすべてのためのＥ４の操作
治療用遺伝子及び導入遺伝子のためのスペースを提供するために、及び望ましくない相同組換えを回避するために、プラスミドＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ中のＥ４領域を特別に欠失させることができる。その目的のためにＥ４ｏｒｆ６領域を、約０．６ kB、好ましくは６３４ｂｐ、ＰｓｔＩによる切断及び再ライゲ−ションによって短縮する。これは図１７に記述されているように、Ｘｖｉｒ０３／０１に関連して遂行することができる。それぞれの欠失は、組換えアデノウイルスを生成するための種々のシステムにおいて、当業者によって実現可能である。
【０３８７】
特にＡｄ−Ｘｖｉｒ ３’ＵＴＲ−ＡｄＥＡＳＹ Ｅ３中へのＲＧＤモチーフのクローニング（他のシステムにも適用可能）
感染力を増加させるために、ファイバーノブドメインのＨＩループを Dmitriev et al. 1998 （An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus and Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism）に従って修飾する：それぞれの領域をプライマーＲＧＤ−Ｈｐａ順方向（５’−ＧＡＧｇｔｔａａｃＣＴＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧ−３’）、ＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ逆方向（５’−ＣＡＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧ−３’）、及び ＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ順方向（５’−ＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ−３’）及びＲＧＤ−Ｂｆｒ逆方向（５’−ＣＡＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡｃｔｔａａｇＴＧＡＧＣＴＧＣ−３’）を用いて増幅し、これにより、ＥｃｏＲＶ制限部位が生成された。この制限部位に、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）−ペプチドをコードする対のオリゴヌクレオチド：ＲＧＤ−ｏｌｉｇｏ １（５’−ＣＡＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡ  ＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣ−３’）及びＲＧＤ−ｏｌｉｇｏ ２（５’−ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧ  ＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＡＧＴＣＡＣＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＧ−３’）をクローニングした。これにより、ＲＧＤモチーフがファイバーノブドメインのＨＩループ中に存在する。
【０３８８】
上記ベクターは、原則として本発明による使用に関して、本明細書に記載したその他ウイルスと同様に好適である。具体的には、上記ベクターは、YB−1核陽性細胞及びYB−1 が脱制御状態にある細胞、即ちYB−1が正常細胞及び非腫瘍細胞それぞれに比べて過剰発現している細胞での複製及びその限りにおいて溶解始動について好適である。このベクターの使用は、特に本発明に従って用いられるものとして本明細書に記載されている他のアデノウイルスならびに本明細書に開示されている本発明の他のアデノウイルスに関連し開示されている疾患、患者群、又は患者集団に適応する。
【実施例１２】
【０３８９】
アデノウイルスベクターＸｖｉｒ０３／０１の構造設計
図17からわかるように、Ｘｖｉｒ０３／０１はＸｖｉｒ０３を更に発展させたもので ある。例えば本明細書に記した遺伝子の様な治療目的の遺伝子や導入遺伝子をＥ３領域内にクローニングできる。さらに、Ｅ４領域内に欠失を導入してＸｖｉｒ０３の発現カセッ トに由来するＥ４ｏｒｆ６との間で相同組換えが起こるのを回避した。これによってより大型の導入遺伝子をこのコンストラクト中にクローニングすることが可能になった。欠失されたＥ３領域にはカセット導入に適したＳａｃＩ、ＮｄｅＩ及びＮｈｅＩ切断部位があり、ここに例えば治療用導入遺伝子をクローニングすることができる。しかし、Ｅ３領域はまたインタクトなままでよい。また、治療用遺伝子はＥ４領域中への連続体でありうる。これにより、特に、アデノウイルス細胞死タンパク質ＡＤＰの発現が保証される。
【０３９０】
Ｅ３領域内への治療用遺伝子クローニング及びＥ４領域内への欠失生成のためのプラスミドの調製：ClontechのシステムＡｄｅｎｏ−Ｘ
Clontech社製ｐＡｄｅｎｏＸ−Ｐｌａｓｍｉｄには３’ＩＴＲ領域の後に野生型アデノウイルスには無いＳｆｕＩ向けの制限部位がある。Ｅ３〜Ｅ４領域をＳｐｅＩ（位置23644）及びＳｆｕＩにより、ｐＡｄｅｎｏＸ（Clontech）から取り出し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）(Invitrogen）内に移入した＝ｐＣＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５−Ｅ４。Ｅ４０ＲＦ６の大きな部分、即ち３３２４１〜３３８７５、をＰｓｔＩを用いて取り除いた ＝ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５。Ｘｖｉｒ０３を更に進展させるために、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４△３３２４１−３３８７５由来の欠失Ｅ３／Ｅ４領域をＳｆｕＩ及びＳｐｅＩを用いてプラスミドｐＡｄｅｎｏＸ内にクローニングした＝ｐＡｄｎｏＸ Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５。 
【０３９１】
発現カセットを次に、Ｘｖｉｒ０３について記載したように、Ｉ−ＣeｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩにより、Ｅ１Ｂ５５ｋ−ＩＲＥＳ−Ｅ４０ｒｆ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅから、ＣＭＶプロモーター及びウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）−ポリＡと共にｐＡｄｅｎｏＸＥ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５内にクローニングし、ＡｄｃｍｖＥ１Ｂ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６−ΔＥ４と命名した。次にアデノウイルスをメーカー（Clontech）の指示書に従い作製した。
【０３９２】
QBIOGENE社及び Microbix社のシステムなどの他のシステムを、本発明に従うアデノウイルス、特に組換えアデノウイルスの製造に用いることができるということは、本発明の範囲内であり、また本明細書の開示に照らして当業者にとって実施可能である。
【０３９３】
上記ベクターは、原則として本明細書に記載され本発明に従って使用される他ウイルスと同様に有用である。特に上記ベクターはＹＢ−１核陽性細胞ならびにＹＢ−１が脱制御状態にある、即ちＹＢ−１が正常細胞及び非腫瘍細胞に比べ過剰発現している細胞での複製、及びその限りにおいて溶解の誘導に好適である。このベクターは、本発明に従って用いられる他アデノウイルス、及び本発明に従うアデノウイルスに対して本明細書に開示されている疾患、患者群、及び患者集団にも使用できる。
【実施例１３】
【０３９４】
２５７ＲＤＢ及び１８１ＲＤＢ細胞中のＸｖｉｒ０３の腫瘍溶解性作用
１００,０００個の細胞（２５７ＲＤＢ及び１８１ＲＤＢ）を６個のウェルを持つプレート（６ウェルプレート）の各ウェルに接種した。翌日細胞に、図１８に示すようにＡｄ３１２（２０pfu/細胞）及びＸｖｉｒ０３（５pfu/細胞）を感染させた。感染は５００μl無血清ＤＭＥＭ培地中で３７℃１時間実施した。次に感染培地を取り除き、２mlの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）と交換した。分析をクリスタルバイオレット染色により５日後に行った。結果を図１８Ａ及び１８Ｂに示す。
【０３９５】
図１８Ａ及び１８Ｂから明らかな様に、核内にＹＢ−１を持つ多剤耐性細胞では、Ａｄ３１２及びＸｖｉｒ０３を感染させた後、細胞のクリスタルバイオレット染色より示されるようにＸｖｉｒ０３感染例のみ溶解を示した。この場合まず培地を取り除いた。続いて細胞をクリスタルバイオレット液（５０％ＥＴＯＨ、３％ホルムアルデヒド、５％酢酸、１％クリスタルバイオレット）で覆い、室温で５〜１０分間インキュべ−ションした。次に６ウェルプレートを水でよく濯いでから室温で乾燥した。
【０３９６】
本発明者は、Ｅ１Ａ欠失ウイルス（例えばＡｄ３１２）は、本発明の意味においてトランス活性化アデノウイルスではないが、より高いＭＯＩでは極めて効率的に複製できる (Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981)、しかしこれは臨床応用では実現できないことを承知している。この現象は文献では「Ｅ１Ａ様活性」と呼ばれている。本明細書で用いるアデノウイルスＡｄ３１２はＥ１Ａ欠失ウイルスである。使用した力価（２０pfu／細胞）はまだ臨床応用には高すぎるが、この力価ではＥ１Ｂ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６などの初期アデノウイルス遺伝子は発現しないか、又は極少量しか発現しない（(Nevins J. R., Cell 26, 213-220, 1981）。本明細書に既に記した様に、これらの遺伝子及びタンパク質はウイルス複製において重要な役割をはたしている。これと対照的に、これらの遺伝子及びタンパク質はそれぞれアデノウイルスＸｖｉｒ０３により発現される（図１６）。図１８Ａ及び１８Ｂから分かるように、遺伝子Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＥ４ｏｒｆ６の発現は、効率的にウイルス複製及び細胞溶解を起こし、同時に必要な感染力価（pfu／細胞 で表される）が低下することになる。このことから、本発明の 基礎となる発見、即ちＥ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ−５５Ｋの発現（かつＥ１Ａが存在しない）は、ＹＢ−１の核内局在と組み合わさることにより、極めて効率的なアデノウイルスの複製を誘導できることが確認される。これに必要な力価は僅かに１〜５pfu／細胞 に過ぎず、今や臨床的応用が可能である。
【０３９７】
このことから、本発明の基礎となる発見、即ち核内にＹＢ−１が存在すること、特に細胞周期と無関係に存在することが、本発明に従い用いられるウイルスに感染細胞を溶解させるためには必要であることが確認される。
【実施例１４】
【０３９８】
アデノウイルスＡｄ３１２のＥ２遺伝子発現のノーザンブロット解析
各場合において、１００万個のＡ５４９細胞及びＵ２０Ｓ細胞を１０ｃｍのペトリ皿に入れた。翌日、Ａｄ３１２（５０pfu／細胞）及びＡｄｗｔ（対照として働く、５pfu／細胞）を細胞に感染させた。使用した高いウイルス力価のＡｄ３１２は結果として、腫瘍細胞でＥ１非依存性の複製を生じた。感染は、１〜２mLの無血清ＤＭＥＭ培地にて３７℃で１時間行った。続いて、感染培地を取り除き、１０mLの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）に取り替えた。３日後、ＲＮＡを単離した。続いて、２６０nmでの光度測定により単離したＲＮＡの濃度を測定した。次いで、０．８％ホルムアルデヒドアガロースゲルにてＲＮＡ試料を電気泳動的に分離した。続いて、ＲＮＡをナイロン膜にブロットした（Schleicher & Schuellの系に従って）。膜にブロットしたＲＮＡを「早期プローブ」Ｅ２及び「後期プローブ」Ｅ２に対してブロットした。１５０１ｂｐの「後期プローブ」はＥ２後期プロモーターの後に特異的に結合する。それに先立って、プローブをＰＣＲで調製し、
【表１】
0005618896.tif 000002
32Ｐを用いて放射性標識を行った。対照的に、早期プローブはＥ２早期プロモーターとＥ２後期プロモーターの間（２２６７９１〜２２７００２位）に結合し、ＰＣＲ
【表２】
0005618896.tif 000003
によって生成した。続いて膜を洗浄し、フィルムに暴露した。
【０３９９】
結果を図１９に示す。野性型アデノウイルスによる対照の感染では、早期プローブも後期プローブも特異的なシグナルを提供したが、Ａｄ３１２で感染させた腫瘍細胞では、後期プローブが使用された場合のみ特異的なシグナルを提供した。このことは、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋの発現並びにＥ１Ａの非存在によって過剰発現した及び調節解除されたＹＢ−１が核に輸送されるので、効率的なアデノウイルスの複製の必要条件としてのＥ２遺伝子の発現が誘導されるという本発明の知見を裏付けている。
【実施例１５】
【０４００】
アデノウイルスＡｄデルタ２４のＥ２遺伝子発現のノーザンブロット解析
それぞれ１００万個のＵ２０Ｓ細胞を１０ｃｍのペトリ皿に入れた。翌日、アデノウイルスデルタ２４（Ａｄデルタ２４）（１０pfu／細胞）及び野生型アデノウイルス（Ａｄｗｔ）（対照として働く、１０pfu／細胞）を細胞に感染させた。使用した組換えアデノウイルスＡｄデルタ２４（Fueyo J. et al., Oncogene 19: 2-12, 2000）はＥ１Ａタンパク質のＣＲ２領域に特異的な欠失を有するので、Ｒｂ陰性の腫瘍でのみ複製可能である。さらに、ウイルスは、野生型アデノウイルスに匹敵する遺伝子Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６を発現している。感染は、１〜２mLの無血清培地にて３７℃で１時間行った。続いて、感染培地を取り除き、１０mLの完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）に取り替えた。１２時間後及び２４時間後、ＲＮＡを単離した。続いて、２６０nmでの光度測定により単離したＲＮＡの濃度を測定した。次いで、０．８％ホルムアルデヒドアガロースゲルにてＲＮＡ試料を電気泳動的に分離した。続いて、ＲＮＡをナイロン膜にブロットした（Schleicher & Schuellの系に従って）。膜にブロットしたＲＮＡを「早期プローブ」及び「後期プローブ」に対してハイブリッド形成させた。１５０１ｂｐを含む「後期プローブ」はＥ２後期プロモーターの後に特異的に結合する。それに先立って、プローブをＰＣＲで調製し、
【表３】
0005618896.tif 000004
32Ｐを用いて放射性標識を行った。対照的に、早期プローブはＥ２早期プロモーターとＥ２後期プロモーターの間に結合し、ＰＣＲ
【表４】
0005618896.tif 000005
によって生成した。続いて膜を洗浄し、フィルムに暴露した。
【０４０１】
結果を図２０に示す。１２時間後、後期プローブのみが特異的シグナルを提供した。２４時間後のみ、Ａｄデルタ２４で感染させた細胞で早期プローブはシグナルを提供した。しかしながら、野生型アデノウイルスに比べて、シグナルは有意に弱かった。この結果もまた、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋの発現が、過剰発現した及び調節解除されたＹＢ−１を核に輸送し、続いてそれがＥ２後期プロモーターに結合し、Ｅ２遺伝子の発現を誘導するという本発明の知見を裏付けている。
【実施例１６】
【０４０２】
アデノウイルスベクターＸｖｉｒＰＳＪＬ１及びＸｖｉｒＰＳＪＬ２の構造設計
ベクターの説明：本明細書でグループＩのアデノウイルスと呼ばれるウイルスの実施態様であり、アデノウイルスのベクター、ＸｖｉｒＰＳＪＬ１及びＸｖｉｒＰＳＪＬ２で例示されるＸｖｉｒＰＳＪＬ群のベクターは、アデノウイルスｄｌ５２０と同様に、ＹＢ−１核陽性の細胞、特に腫瘍細胞で複製可能であるばかりでなく、ＹＢ−１が過剰発現された及び調節解除された腫瘍細胞でも複製可能である。ウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６は、それぞれＥ１Ｂプロモーター及びＥ４プロモーターの影響下ｄｌ５２０を感染させたＹＢ−１核陽性細胞で発現されるが、ＸｖｉｒＰＳＪＬにおけるＥ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６の発現はサイトメガロウイルス（ｃｍｖ）プロモーターによって生じる。しかしながら、ｃｍｖプロモーターの代わりに、他のプロモーター、特に腫瘍特異的、組織特異的、及び器官特異的なプロモーター、並びに天然のＥ１Ａプロモーター、即ち好ましくは野生型アデノウイルス、好ましくはＡｄｓ中に存在するＥ１Ａプロモーターも使用してもよい。Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６の発現のために、過剰発現されたＹＢ−１及び調節解除されたＹＢ−１が核に輸送され、アデノウイルスの複製が開始される。本明細書で開示されるＸｖｉｒＰＳＪＬ群のアデノウイルスベクターは、種々の要素を組み合わせ、アデノウイルスベクターｄｌ５２０、Ｘｖｉｒ０３及びＡｄＹＢ−１の機能を単一のベクターで組み合わせる。ベクターｄｌ５２０と同様に、ＸｖｉｒＰＳＪＬウイルスはＥ１Ａ１２Ｓ遺伝子を含有する。この遺伝子及び相当する遺伝子産物は、感染細胞のＳ期誘導に関与し、ウイルスの複製並びに化学療法及び照射の効果を促進する。Ｘｖｉｒ０３と同様に、ＸｖｉｒＰＳＪＬウイルスは、発現カセットＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５Ｋ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６を含有し、それは、効率的な複製及び調節解除されたＹＢ−１の、好ましくは腫瘍細胞に含有される核への直接的又は間接的な輸送に必要とされる。従って、複製は、ＹＢ−１が過剰発現されている、又は調節解除されている細胞、特に腫瘍細胞においてのみ可能である。さらに、Ｅ１Ｂ５５Ｋ／Ｅ４ｏｒｆ６複合体によりｐ５３を分解の対象とする。ヒトの転写因子ＹＢ−１をコードする配列をウイルスＡｄＹＢ−１から選ぶ。内因性の、すなわち、細胞にすでに存在するＹＢ−１はウイルス複製を増幅する。Ｅ１Ａ１２Ｓ及びＹＢ−１双方の発現は、ＹＢ−１に依存したアデノウイルスＥ２後期プロモーターによって制御される。それに関連して、特異的プロモーター、特に腫瘍特異的プロモーター、組織特異的プロモーター又は器官特異的プロモーターを使用してもよい。これらウイルスのさらなる特徴はＥ４領域を欠失しているということである。ベクターはそこに制限部位を含有し、それによって、アデノウイルスベクターＸｖｉｒＰＳＪＬ１及びＸｖｉｒＰＳＪＬ２の場合、明細書で開示されるように、たとえば、リボザイム、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス誘導遺伝子、サイトカイン及びプロドラッグの遺伝子のような種々の導入遺伝子を発現してもよい。明細書で開示されるように、その発現は、腫瘍特異的プロモーター、組織特異的プロモーター又は器官特異的プロモーターに制御されてもよい。発現カセットの局在化は、特にＥ１、Ｅ３及びＥ４に関して又はその範囲内で固定されず、しかしいかなる方法でも配置することができる。これに関連して、必要でないものを欠失させることも、インタクトのままにしておくこともできる。ベクターは、腫瘍細胞のｐ５３又はＲｂの状況に無関係に複製する。
【０４０３】
組換えアデノウイルスＸｖｉｒＰＳＪＬ１及びＸｖｉｒＰＳＪＬ２の構造設計は、図２１及び２２に示す。Clontech社のシステムＡｄｅｎｏ−ＸによるベクターＸｖｉｒＰＳＪＬの生成。
【０４０４】
カセットＥ２後期−ＹＢ−１ＩＲＥＳ／１２Ｓの生成
本明細書で出発物質として使用されたClontech/BD BiosciencesのｐＡｄｅｎｏＸプラスミドは、アデノウイルスＡｄ５のゲノム核酸を含み、野生型アデノウイルスには存在しない３’ＩＴＲ領域の後にＳｆｕＩ制限部位を有する。ＳｐｅＩ（２３６４４位）及びｐＡｄｅｎｏＸ（Clontech）のＳｆｕＩによって、Ｅ３−Ｅ４領域をｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Invitrogen）に転移させ、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５−Ｅ４と呼んだ。Ｅ４ｏｒｆ６の大半、すなわち、塩基３３２４１〜３３８７５をＰｓｔＩにより除いた。そのように得た断片をｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５と呼んだ。
【０４０５】
Ｅ２後期プロモーターをｐＧＬ３−ＥＧＦＰ（Holm et al., JBC 277: 10427-10434, 2002）からＳｃａＩ及びＮｈｅＩにより切り出し、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７８６５−３０９９５、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５にクローニングした。そのように行う中で、塩基Δ２７５９３〜３１５０９の領域でＥ３領域をさらに欠失させた。そのように得られた断片をＥ２後期ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７５９３〜３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５と呼んだ。
【０４０６】
Ｅ１Ａ−２４３ＡＡ産物に対するｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって生成し、単離し、配列をチェックして、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを用いてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Invitrogen）にクローニングした。Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ｐｃＤＮＡ３．１をＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩにより線状化し、Ｔ４ポリメラーゼにより平滑末端を作成し、Ｔａｑポリメラーゼ及びｄＴＴＰによりＴオーバーハングを設けた。ＰＣＲ産物として（鋳型：ｐＣＩＴＥ、Novagen）ＩＲＥＳ要素をＥ１Ａ−１２Ｓ−ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした（ＴＡクローニング戦略）。
【０４０７】
ベクターｐＨＶａｄ２ｃ（Holm et al., JBC 277: 10427-10434, 2002）からＹＢ−１−ＥｃｏＲＩ断片を単離し、平滑末端を作成した。ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＢＤバイオサイエンスから市販されている）をＸｂａＩで線状化し、平滑末端を作成し、脱リン酸化して、あらかじめ作製したＹＢ−１をコードする核酸に連結した。従って、得られたベクターをＹＢ−１−ｐＳｈｕｔｔｌｅと呼んだ。ｐＳｈｕｔｔｌｅベクターへのクローニングはインフレームに停止コドンを持つＴＢ−１断片をコードする核酸を提供した。ＹＢ−１−ｐＳｈｕｔｔｌｅから、ＮｈｅＩ及びＢｆｒＩによってＹＢ−１をコードする核酸をｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のベクターＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ−１２Ｓにクローニングした。こうして得られた断片をＹＢ−１（停止コドンを持つＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）と呼んだ。
【０４０８】
続いて、カセットＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ−１２ＳをＰｍｅＩにより切り出し、ＮｈｅＩで線状化し、平滑末端を作成し、脱リン酸化したベクターＥ２後期−ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ３Δ２７５９３〜３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５にクローニングした。従って、第２のカセットは、Ｅ３領域の欠失領域にある。
【０４０９】
核酸コンストラクトＥ２後期−ＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓを含む導入遺伝子カセットを残りのアデノウイルス配列Ｅ３Δ２７５９３〜３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１〜３３８７５と共にＳｆｕＩ及びＳｐｅＩによって、ClontechのベクターｐＡｄｅｎｏＸにクローニングした（＝ＡｄｅｎｏＸ／Ｅ２後期−ＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓ／Ｅ３Δ２７５９３−３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５）。
【０４１０】
Ｘｖｉｒ０３に関連して上述したｐＳｈｕｔｔｌｅからＩ−ＣｅｕＩ及びＰＩ−ＳｃｅＩによってカセットＣＭＶ−Ｅ１Ｂ５５Ｋ／ＩＲＥＳ／Ｅ４ｏｒｆ６を切り出し、ベクター、ＡｄｅｎｏＸ／Ｅ２後期−ＹＢ−１−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ａ１２Ｓ／Ｅ３Δ２７５９３−３１５０９、Ｅ４Δ３３２４１−３３８７５に挿入した。
【０４１１】
続いて、ＰａｃＩによりベクターを線状化し、２９３細胞に形質移入し、製造元の指示書に従って、図に示す導入遺伝子なしで組換えアデノウイルスＸｖｉｒＰＳＪＬ１及びＸｖｉｒＰＳＪＬ２をそれぞれ単離した。
【０４１２】
QBIOGENE 及び Microbix社のシステムなどの他のシステムを、本発明によるアデノウイルス、好ましくは組換えアデノウイルス、特にカセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５ｋ及びＥ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１をそれぞれ、個々に及び／又は共に含むものの生成のために用いることができるということは本発明の範囲内であり、また本明細書の開示に照らして、当業者にとって実施可能である。さらに、個々の導入遺伝子を個々のカセット内で、及び特にそれぞれのカセットの間で交換することができる。さらに、カセットＥ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１は、Ｅ１Ａ１２Ｓのみから成っていても良く及び／又はＥ１Ａ１２ＳがＩＲＥＳを介して他の適切な遺伝子に連結することもできる。
【０４１３】
欠失したＥ３領域における、Ｅ１Ａ１２Ｓを有するアデノウイルスＡｄＰＳＪＬ−Ｅ２後期プロモーター１２Ｓ−ＡｄＥＡＳＹの、ＡｄＥＡＳＹシステム（Microbix社）による生成。
【０４１４】
ＰＳＪＬ １２Ｓのクローニング
先ず、Ｅ２後期プロモーターを、ｐＧＬ３−エンハンサー・プラスミド（ｐＧＬ３−Ｅ２後期）のＨｉｎｄIII及びＢｇｌII切断部位へ、対のオリゴヌクレオチド（上流プライマー５’−ＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＴＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡＣＣＴＡＡＴＣＴＣＧＴＧＧＧ  ＣＧＴＧＧＴＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴ−３’及び下流プライマー５’−ＡＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＴＴＡＧＧＴＴＣＴＡＣＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＡＧＣ−３’）として、クローニングした。
【０４１５】
次に、ルシフェラーゼ遺伝子をＮｃｏＩとＸｈａＩを用いて削除し、末端を平滑化末端とし、Ｔ末端を加えた。プライマーＥ１Ａ１２Ｓ順方向プライマー５’−ＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＴＧ−３’及びＥ１Ａ１２Ｓ逆方向プライマー５’−ＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＧＴＴＴＡＣ−３’により増幅された導入遺伝子Ｅ１Ａ１２Ｓが、このようにして開かれた部位へＴＡクローニングにより導入された。
【０４１６】
このカセットをＰｖｕＩとＣｌａＩを用いて切り出し、末端を平滑化末端とし、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹのＥ３領域中の平滑末端化され脱リン酸化されたＮｈｅＩ切断部位へクローニングした。このようにして、カセットはＥ２後期プロモーター、オープンリーディングフレームＥｌａ１２Ｓ及びＳＶ−４０後期ポリアデニル化シグナルを包含する。得られたコンストラクトは、Ｅ２−後期−Ｅｌａ１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−Ｎｄｅｌ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０４１７】
続いて、Ｅ２後期−Ｅｌａ１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４を、Ｅ２−後期−Ｅ１ａ１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹから、ＳｐｅＩ及びＰａｃＩを用いて切り出し、ＳｐｅＩ及びＰａｃＩによって切断されたｐＡｄＥＡＳＹへクローンニングした。このようにして得られたコンストラクトをＥ２−後期−Ｅ１ａ１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０４１８】
ＢＪ５１８３（ＥＣ）バクテリアをｐＳｈｕｔｔｌｅＡｄＥＡＳＹ及びＥ２−後期−Ｅ１ａ１２Ｓ−Ｅ３Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹ中のプラスミドＸｖｉｒ−３’ＵＴＲにより形質転換する際に起きる相同組換えによりＡｄＰＳＪＬ−１２Ｓ−ＡｄＥＡＳＹが生成された。
【０４１９】
欠失したＥ３領域における、Ｅ１Ａ１２Ｓ及びＹＢ−１を有するアデノウイルスＡｄＰＳＪＬ−Ｅ２−後期プロモーターｌ２Ｓ−ＹＢ−１−ＡｄＥＡＳＹの、ＡｄＥＡＳＹシステム（Microbix社）を用いる生成
【０４２０】
ベクターＥ４ＯＲＦｆ６−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のクローニング
増幅物Ｅ１ａ１２Ｓ（上記参照）及びＩＲＥＳエレメント（上記参照）を、続いて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのマルチクローニング部位へクローニングした。その目的のために、Ｅ１ａ１２Ｓ増幅物を、末端を平滑化したＢａｍＨＩ切断部位へＴＡクローニングにより導入した。次に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のプラスミドＥ１ａ１２ＳをＥｃｏＲＶで直線化し、Ｔ末端を加え、増幅物をＩＲＥＳエレメントへクローニングした。このようにして得られたプラスミドを、続いてＸｈｏＩにより直線化し、末端を平滑末端化し、そして停止コドンが欠けているＹＢ−１のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ切断生成物。  
【０４２１】
このようにして作成されたコンストラクトＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）をＮｏｔIを用いて直線化し、末端を平滑末端化した。ＹＢ−１のＥｃｏＲＩ切断生成物もまた、末端を平滑化して、脱リン酸化されたベクターＥｌＡ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）へ導入した。カセットＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１をＰｍｅＩを用いて取り出し、Ｎｃｏｌ及びＸｂａｌによってルシフェラーゼ遺伝子を除去し、平滑末端化し、脱リン酸化した後に、上述のプラスミドｐＧＬ３−Ｅ２後期へクローニングした。
【０４２２】
カセットＥ２−後期−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１を、ＰｖｕＩ及びＣｌａＩを用いて切り出し、末端を平滑末端化し、Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−Ｎｄｅｌ）−ＡｄＥＡＳＹのＥ３領域の平滑末端化され脱リン酸化されたＮｈｅｌ切断部位へ、クローニングした。このようにして得られたコンストラクトが、Ｅ２−後期プロモーターＥ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０４２３】
次に、Ｅ２後期プロモーター−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４カセットを、Ｅ２後期プロモーター−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹからＳｐｅＩ及びＰａｃＩにより切除し、ＳｐｅＩ及びＰａｃＩによって切断されたｐＡｄＥＡＳＹへクローニングした。生じたコンストラクトをＥ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹと呼んだ。
【０４２４】
ＡｄＰＳＪＬ−１２Ｓ−Ｙｂ−１−ＡｄＥＡＳＹが、ＢＪ５１８３（ＥＣ）バクテリアをｐＳｈｕｔｔｌｅ ＡｄＥＡＳＹ及びＥ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−Ｅ３Ｅ４−ｐＡｄＥＡＳＹ中のプラスミドＸｖｉｒ３’ＵＴＲにより形質転換する際に起こる相同組換えにより生成された。
【０４２５】
カセットＥ２−後期プロモーター−Ｅ１Ａ−１２Ｓ及び／又はＥ２−後期プロモーター−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１のＥ４領域へのクローニング
ＰｓｔＩを用いたＥ４領域の操作と欠失のそれぞれにより、６３４ｂｐを除去した。カセットＥ２−後期プロモーター−Ｅ１Ａ−１２Ｓ及び／又はＥ２−後期プロモーター−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１をＥ４領域へ導入することができる。あるいは、Ｅ２領域はそのような条件の下でインタクトのままに留まることもできる。
【０４２６】
ＲＧＤモチーフのクローニング
感染力の改善のために、ファイバーノブドメインのＨＩループをDmitriev et al. 1998 (An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus and Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism) により修飾した：それぞれの領域を、プライマーＲＧＤ−Ｈｐａ順方向（５’−ＧＡＧｇｔｔａａｃＣＴＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧ−３’）、ＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ逆方向（５’−ＣＡＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧ−３’）、及びＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ順方向（５’−ＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ−３’）及びＲＧＤ−Ｂｆｒ逆方向（５’−ＣＡＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡｃｔｔａａｇＴＧＡＧＣＴＧＣ−３’）、並びにこのようにして生成されたＥｃｏＲＶ切断部位を用いて増幅した。この切断部位へ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドをコードするＲＧＤオリゴ１（５’−ＣＡＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣ−３’）及びＲＧＤオリゴ２（５’−ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＡＧＴＣＡＣＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＧ−３’）の、対のオリゴヌクレオチドをクローニングした。したがって、ＲＧＤモチーフがファイバーノブドメインのＨＩループに含まれている。
【０４２７】
図３０及び３１に、クローニングされたＥ１Ｂ５５ｋ−３’ＵＴＲについてより詳細に記述し、ＡｄｅａｓｙシステムにおけるｐＥ３／Ｅ４シャトルプラスミドを図３２に表示する。このプラスミドは、領域Ｅ３及びＥ４に操作と欠失をそれぞれ施して、種々のカセットを、Ｅ３領域用のＮｈｅＩ及びＥ４領域用のＰｓｔＩなどの様々な制限部位によって、Ｅ４ｏｒｆ６及びＬ５以外のオープンリーディングフレームに悪影響を及ぼすことなくクローニングすることを可能にしたという点で特徴づけられる。さらに、ＲＧＤモチーフの配列をＨＩループの領域へ導入する。
【０４２８】
欠失の、野生型アデノウイルス配列に対応する位置。
Ｅ３欠失：２８１３８  −３０８１８
Ｅ４欠失：３３２４６  −３３８７５
ＲＧＤモチーフ：３２６７８（９つのアミノ酸が導入され、中央の３つのアミノ酸がＲＧＤである：ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ
【実施例１７】
【０４２９】
アデノウイルスｄｌ５２０によるＨｅｌａ細胞の感染
ディッシュ当たり１００，０００個のＨｅｌａ細胞を入れた。翌日、種々の力価のアデノウイルスｄｌ５２０を細胞に感染させた。感染は、５００μLの無血清ＤＭＥＭ培地にて３７℃で１時間行った。続いて、感染培地を除き、完全培地（１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ）２mLに取り替えた。クリスタルバイオレット染色を用いて、３〜５日後、分析を行った。
【０４３０】
この実験の結果を図２３に示す。アデノウイルスｄｌ５２０は、核にＹＢ−１を有さないＨｅｌａ細胞に感染させた場合、低いＭＯＩ（５〜１０pfu／細胞）でいかなる溶解も示さなかった。それとは対照的に、ｄｌ５２０は、細胞当たり１００〜２００pfuのＭＯＩ（感染の多重度）で実際、完全な溶解を示し、細胞当たり５０pfuのＭＯＩでも優勢な溶解を示した。これらのことから、高いＭＯＩでアデノウイルス遺伝子Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６のスイッチを入れることが可能であるｄｌ５２０及び類似のウイルスは、過剰発現されたＹＢ−１又は調節解除されたＹＢ−１を核に直接的に又は間接的に輸送し、従って細胞溶解するのに好適であると結論付けることができる。
【実施例１８】
【０４３１】
Ｅ２後期プロモーター活性を測定するためのルシフェラーゼアッセイ
ＹＢ−１が核においてアデノウイルスＥ２後期タンパク質に結合し（Holm et al., JBC 277: 10427-20434, 2002）、このプロモーターが核酸の発現によく適していることは既知である。アデノウイルスのＥ２後期プロモーターの使用は、それがＹＢ−１によって調節されることができ、その際、ＹＢ−１は陽性のエフェクターとして作用する、すなわち、該プロモーターは核におけるＹＢ−１の存在下でのみ活性があるという事実によって特に動機付けられる。その程度において、前記アデノウイルスＥ２後期プロモーターは、高度に選択的な様式で調節されることができるので、核にＹＢ−１が存在する系で使用され、実際、ＹＢ−１がエフェクター又はレギュレータとして核に存在しない場合、アデノウイルスＥ２後期プロモーターの制御下にある核酸のいかなる発現も回避する。Ｅ２後期プロモーターは、Ｅ２遺伝子の活性化に関連する３つのＹボックス（ＣＣＡＡＴ）を含む。様々なＥ２後期プロモーターの構築物が調製され、その特異性及び活性について調べられている。分析は以下のように行った。
【０４３２】
３種の異なった細胞濃度を用いて、６穴プレートに、核にＹＢ−１を有する細胞株ＥＰＧ−２５７ＲＤＢ（上皮性胃癌）、Ｈｅｌａ細胞（上皮性子宮頚癌）及びＵ２０Ｓ（骨肉種）を播いた。翌日７０％の集密度を示したウェルを形質移入に用いた。各ウェルについて、ルシフェラーゼベクター（Promegaから市販、出発プラスミド：ｐＧＬ３−エンハンサ）内の様々なＥ２後期プロモーター構築物のスピンミニプレップ（Qiagen）で精製したプラスミドＤＮＡ５００ngを、１．５mLの密栓付き反応容器内のＯｐｉＭＥＭ５００μL及び５００μLさらなる密栓付き反応容器内のＤＯＴＡＰ５μLに加えた。双方の溶液を合わせて混合した。複合体形成のために混合物を室温にて３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、形質移入用混合物の層で覆った。プレートを３７℃で５時間インキュベートし、続いて再びＰＢＳで３回洗浄し、完全培地を提供した。
【０４３３】
インキュベートの４８時間後、細胞をPromegaのルシフェラーゼアッセイシステムキット（カタログ番号Ｅ１５００）で処理した。各ウェルに溶解緩衝液５００μLを提供し、室温にて１０分後、１mLのピペットにてウェルプレートから細胞をすすぎ取り、１．５mLの密栓付き反応容器に移した。４℃にて１４，０００rpmで１５分間、細胞溶解物を遠心した。各５０μLの上清に、１００μLのルシフェラーゼ基質を加え、９６穴の黒色プレートにて９４５nmの波長で、トップカウント（Canberra-Packard GmBH 63303 Dreieich）マイクロプレートシンチレーション＆発光カウンタにて測定した。
【０４３４】
タンパク質は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット、カタログ番号２３２２７（Pierce, Rockford, Illinois, USA）により、５７０nmにてMolecular Dynamicsの生物照度計（Biolumin 960）動的蛍光／吸光プレートリーダーにおいて測定した。試料の相対的光シグナルをタンパク質量（ＲＬＵ／タンパク質μｇ）に変換した。
【０４３５】
以下のプラスミドを使用した：ＢａｍＨＩ（２２５０ｂｐ）及びＢｓａＢＩ（２００３ｂｐ）によりエンハンサを除いたｐＧＬ３−エンハンサ（Promega）、ブランクの読み取りとして働くもの。種々のＥ２プロモーターを、制限部位ＡｐａＩ及びＳａｃＩによってエンハンサを欠くｐＧＬ３ベクターでのＭＣＳにクローニングした。ｈＣＭＶプロモーターを、ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによってｐＧＬ３エンハンサにクローニングし、陽性対照として働かせた。陽性対照により形質移入効率を概算し、またそれは、ルシフェラーゼ活性の参照値として役立った。各細胞株についてＣＭＶ対照を１００％に設定し、Ｅ２プロモーター構築物により生じた酵素活性をそれと関係付け、図２４に棒グラフとして表した。
【０４３６】
種々のコンストラクトは以下のように引用した。
１．塩基２５９３２〜２６１７９に相当するＹボックスＩ、ＩＩ、及びＩＩＩを含む（野生型アデノウイルス配列をいう。後で提供されるアデノウイルスＥ２領域の部分も参照のこと）
２．塩基２５９３２〜２６１２７に相当するＹボックスＩＩ、及びＩＩＩを含む（野生型アデノウイルス配列をいう。後で提供されるアデノウイルスＥ２領域の部分も参照のこと）
３．塩基２５９３２〜２６００４に相当するＹボックスＩＩＩを含む（野生型アデノウイルス配列をいう。後で提供されるアデノウイルスＥ２領域の部分も参照のこと）
４．ブランクの読み取りとして作用するようにＹボックスを含まない。
【０４３７】
アデノウイルスＥ２領域の部分（Virology 186: 280-285, 1992から引用）
（ＹＢ−１結合部位は太字で印刷されている）
【表５】
0005618896.tif 000006
【０４３８】
図２４で提示された結果は、様々なＥ２後期／Ｙボックスを含有する個々のプロモーター断片はＹＢ−１核陽性の腫瘍細胞における治療用導入遺伝子の発現に好適であるので、本発明の意味でプロモーターとして使用してもよいことを印象的に裏付けている。
【実施例１９】
【０４３９】
アデノウイルスにより発現されたＹＢ−１の粒子形成における効果
Ｅ１／Ｅ３を欠失したアデノウイルスベクターＡｄＹＢ−１及びＥ１Ａのみの欠失を有するＡｄ３１２を、５０pfu／細胞のＭＯＩにてヒト骨肉種細胞（Ｕ２０Ｓ）に感染させた。ＡｄＹＢ−１は、ゲノムに、細胞性転写因子ＹＢ−１をコードする配列を含有するので、Ｙ−ボックス結合タンパク質１（ＹＢ−１）を発現する。感染後、「プラーク形成単位（pfu）」としてのウイルス粒子の放出を評価するために、培養培地の上清及び残りの細胞層をそれぞれ、感染後２日目及び５日目に単離した。細胞内の粒子は３回の凍結乾燥により放出させた。２９３細胞におけるプラークアッセイによって粒子数を分析した。
【０４４０】
結果は図２５に示すが、黒棒は細胞内に残っていたウイルス粒子を示し、斜線の棒は放出された細胞外のウイルス粒子を示す。
【０４４１】
図２５に示された結果は、ＡｄＹＢ−１は全体として、Ａｄ３１２よりも大きなpfuを生じ、多くの粒子を放出することを裏付けている。５日目では、ＡｄＹＢ−１に感染させた細胞は、Ａｄ３１２に感染させた細胞とは対照的に細胞変性効果（ＣＰＥ）を明瞭に示した。
【実施例２０】
【０４４２】
イリノテカン添加後の細胞中のアデノウイルス複製
アデノウイルスの複製に対するイリノテカンの影響を決定するために、１０6個のＵ３７３腫瘍細胞を１０cm2のペトリ皿にプレートした。最初の反応では、５μMイリノテカンを２４時間後に加えた。さらに２４時間の後、細胞に１０pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させた。イリノテカンなしで３日間インキュベーション後に、実施例１０に記述した手続きに従ってＤＮＡを分離した。
【０４４３】
並行した反応においては、このように準備したＵ３７３細胞を予めイリノテカンでインキュベーションしなかった。イリノテカンなしで４８時間細胞を培養した後に、それらに１０pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させ、さらに３日の間イリノテカンなしで続いてインキュベーションした。上述したようにＤＮＡを分離した。
【０４４４】
続いて２μg ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、サザンブロット解析を行なった。ＰＣＲによって生成されたアデノウイルスゲノムの一部（位置：２２７３４−２４２３５）をプローブとして用いた。
【０４４５】
結果を図２６に示す。図２６は、イリノテカンとのインキュベーション後に、イリノテカンとインキュベーションを行なわない無処理の対照（レーン１）と比較して、イリノテカン処理後に（レーン２）Ｕ３７３細胞中でアデノウイルスの複製が著しく増加することを示す。これは、イリノテカンの影響下でアデノウイルスの複製が増加することを意味する。
【実施例２１】
【０４４６】
トリコスタチンＡ投与後の細胞中のアデノウイルスの複製
アデノウイルスの複製に対するトリコスタチンＡの影響をテストするために、１０6個のＵ３７３腫物細胞を１０cm2のペトリ皿にプレートした。２４時間後に０．２５、０．５、及び０．７５μMのトリコスタチンＡを加えた。さらに２４時間後、細胞に１０pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させた。
【０４４７】
３日間トリコスタチンのない培地でインキュベーションした後、ＤＮＡを分離した。次に２μg ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで消化し、サザンブロット解析を行なった。ＰＣＲによって生成されたアデノウイルスのゲノムの一部（位置：２２７３４〜２４２３５）をプローブとして用いた。
【０４４８】
結果を図２７に示す。図２７は、トリコスタチンＡ濃度を増加させてインキュベーションした後（レーン２、３及び４）では、Ｕ３７３細胞中のアデノウイルス複製が、トリコスタチンＡとインキュベーションしなかった未処理の対照（レーン１）と比較して、著しく増加することを示す。これは、ウイルスの複製がトリコスタチンＡの影響下で増加することを意味する。
【実施例２２】
【０４４９】
トリコスタチンＡの添加に応答して、Ｕ３７３細胞のコクサッキーウイルスアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現に影響を及ぼす
２００,０００個のＵ３７３細胞を６ウェルプレートにプレートした。２４時間後、細胞を１μMトリコスタチンと共に２４時間培養した。さらに２４時間後、細胞を単離した。次にＣＡＲ発現の解析を、Ｆａｃｓ解析及び Upstate社から得た一次抗体、抗−ＣＡＲクローンＲｍｃＢ、及び二次抗体としてウサギ−抗−マウスＦＩＴＣ（DAKO社）を用いる標準プロトコルにより実施した。
【０４５０】
結果を図２８に示す。トリコスタチン処理をしない場合、細胞の１１．３％がＣＡＲ陽性であったが、細胞を１μＭトリコスタチンとインキュベーションした後は、細胞の５６．２％がＣＡＲ陽性であった。図はテストに用いた全細胞のパーセンテージである。
【０４５１】
図２８から、ヒストンデアシラーゼ阻害剤トリコスタチンＡの影響下で、アデノウイルスの結合の重要な因子であるＣＡＲがより高いレベルで、またより利用可能性が高く発現され、それはこのように処理した細胞のトランスフェクションの効率を増加させることが分かる。
【実施例２３】
【０４５２】
イリノテカン及びトリコスタチンＡによる細胞の併用処理後のアデノウイルスによるＵ３７３細胞の腫瘍崩壊。
２００,０００個のＵ３７３細胞を６ウェルプレートにプレートした。２４時間後に、２μMイリノテカン又は１μMトリコスタチンＡ、あるいは１μMイリノテカン＋０．５μMトリコスタチンを培地に加えた。２４時間のインキュベーションの後、細胞に１０、２０、及び３０pfu/細胞のｄｌ５２０を感染させた。３〜５日後に、クリスタルバイオレット染色を用いて、解析を行なった。分析を二重に行なった。
【０４５３】
結果を図２９に示す。パネル１中に表した６つのプレートは、クリスタルバイオレット染色によって示される、イリノテカン及びトリコスタチンＡの組合せとのインキュベーションに影響されなかった完全な細胞層を示す。パネル１の次の２つのウェルは、１０及び２０pfu/細胞のｄｌ５２０による感染後の細胞層をそれぞれ示す。そのような条件下でも、ｄｌ５２０の複製がないため、細胞崩壊がない。したがって、１０又は２０pfu/細胞のｄｌ５２０も、１μMイリノテカン＋０．５μMトリコスタチンＡのみも、細胞溶解を引き起こすには適当でないことを示す。
【０４５４】
本明細書でパネル２、３及び４とも呼ぶ、図２９中に示したさらなる６ウェルプレート２、３及び４を、基本的にこのスキームに従って処理した。個々のウェルに、前に記述したようにＵ３７３細胞を接種し、細胞をその中で培養した。正副２つのウェルに、１０、２０、又は３０pfu/細胞のｄｌ５２０を接種した。３枚の６ウェルプレート間には、用いた細胞増殖抑止剤の種類に差異が存在した。パネル２では２μMイリノテカン、パネル３では１μMトリコスタチンＡ、ならびにパネル４では１μMイリノテカン及び０．５μMトリコスタチンＡを、個々のウェルに加えた。
【０４５５】
２μMイリノテカンを加えた６ウェルプレート２（パネル２）では、３０pfu/細胞のｄｌ５２０により細胞が溶解された。１μMトリコスタチンＡを加えた６ウェルプレート３（パネル３）では、２０及び３０pfu/細胞のｄｌ５２０により細胞が溶解された。１μMイリノテカン＋０．５μMトリコスタチンＡを加えた６ウェルプレート４（パネル４）ではそれらと対照的に、すでに１０pfu/細胞のｄｌ５２０により細胞が溶解された。
【０４５６】
図２６〜２９に結果が表されているテストは、イリノテカン＋トリコスタチン＋ｄｌ５２０から成る組合せが、化合物単独のいずれよりも有効な腫瘍細胞の細胞溶解を引き起こすことを示す。これは一方では、ＣＡＲ発現を増加させ、従って細胞の感染可能性を著しく改善するトリコスタチンＡに起因する。他方では、イリノテカンがＹＢ−１を細胞核に移行させ、従ってアデノウイルス複製の増進を引き起こす。さらに、細胞のＹＢ−１はｄｌ５２０による感染の後にアデノウイルスの複製を支援しており、もはやＤＮＡ修復プロセスに利用できない。見方によって、これは、一方でｄｌ５２０の効率の改善をもたらし、また他方では細胞増殖抑止剤の効率の増加をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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