(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的物質を定量する方法であって、
前記標的物質と特異的に結合するアプタマーが、センサの検出表面に固定化され、
前記センサの検出原理は表面プラズモン共鳴原理であり、
前記アプタマーはステムループ構造を有し、
前記アプタマーと相補的な塩基配列を１５塩基以上有し、かつ前記塩基配列に前記アプタマーの非ステム部分の塩基配列と相補的な塩基配列を４塩基以上含み、ステムループ構造を有していない核酸鎖と、前記標的物質と、を競争的に結合させた条件で、
前記アプタマーと前記核酸鎖とが結合することによって生じる誘電率変化を前記センサによって検出し、得られた検出結果に基づいて前記標的物質を定量する方法。
【請求項２】
前記アプタマーの前記核酸鎖に相補的な塩基配列には、前記アプタマーの前記標的物質と結合する部分が含まれる
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記アプタマー及び前記核酸鎖の少なくともいずれかは、前記アプタマーと前記核酸鎖とが結合することによって生じる誘電率変化を増大せしめる置換基により修飾されていることを特徴とし、
前記置換基は、誘電体である
請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記標的物質は、コール酸メチルである
請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記アプタマーは、配列番号１記載の塩基配列からなり、前記核酸鎖は、配列番号３記載の塩基配列からなる
請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子の定量方法に関する。より詳しくは、アプタマーを用いた分子の定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサは分子識別機能を持つ材料と、それらと化学物質間の相互作用の物理・化学的シグナルを検出するトランスデューサーからなる。これまで分子識別機能を持つ材料として酵素、抗体、レセプター等のたんぱく質が用いられてきた。
【０００３】
非特許文献１では、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサを用いた内分泌撹乱物質高速スクリーニング法として、ＳＰＲセンサチップ上にエストロゲン応答遺伝子のプロモーター領域のホルモン応答配列ＤＮＡ（ＥＲＥ）を固定化し、精製したエストロゲンレセプターα（ＥＲ）を添加することで、ＥＲとＥＲＥの相互作用を非修飾でリアルタイムに測定する方法が開示されている。
【０００４】
しかしながら、たんぱく質は、化学的・熱的に不安定であるために短寿命である点、それ自身非特異吸着を起こす点等から、長期にわたって使用する用途には不向きであった。
【０００５】
これに対し、低分子化合物からたんぱく質に至るまでを抗原として、抗体のように特異的結合を起こす核酸配列（アプタマー）が注目されている。アプタマーは素材がたんぱく質ではないため安定性や寿命の面で利点がある。また、比較的温和な条件で再生が可能であることや、化学合成により安価に大量生産が可能であること、相補鎖とも可逆的に結合・解離する等、核酸特有の性質を併せ持つことから、バイオセンサへの応用が期待されている。
【０００６】
非特許文献２では、アプタマーの末端にメチレンブルーを修飾することによって、標的物質であるコカインが存在することによるアプタマーの構造の変化を電気化学的手法により観測している。
【０００７】
【非特許文献１】ＢＵＮＳＥＫＩ  ＫＡＧＡＫＵ  Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．６，（２００２）３８９−３９６
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８，（２００６）３１３８−３１３９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、非特許文献２に記載の発明では、アプタマーが標的物質と結合することによる構造の変化と、アプタマーが分子内で二重鎖を形成（以下、自己アニールと称する）することによる構造の変化とを区別することができず、自己アニールしたアプタマーの分だけノイズレベルが高くなり検出限界が高くなってしまう場合があった。
【０００９】
そこで、本発明は、アプタマーを用いて標的物質を定量する方法において、高感度に標的物質の定量を行う方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記技術的課題を解決するために、本発明は、標的物質を定量する方法であって、前記標的物質と特異的に結合するアプタマーが、センサの検出表面に固定化され、前記センサの検出原理は表面プラズモン共鳴原理であり、前記アプタマーはステムループ構造を有し、前記アプタマーと相補的な塩基配列を１５塩基以上有し、かつ前記塩基配列に前記アプタマーの非ステム部分の塩基配列と相補的な塩基配列を４塩基以上含み、ステムループ構造を有していない核酸鎖と、前記標的物質と、を競争的に結合させた条件で、前記アプタマーと前記核酸鎖とが結合することによって生じる誘電率変化を前記センサによって検出し、得られた検出結果に基づいて前記標的物質を定量する方法を提供する。
なお、本発明に係る標的物質は広義に解するものとし、分子のみならずイオン等をも含
むものとする。また、アプタマーとは、特定の分子と特異的に結合する核酸分子やペプチ
ドをいう。
また、本発明において「非ステム部分」とは、アプタマーが相補鎖を形成するステム構造以外の部分をいい、ループ構造を有するループ部分や、相補鎖を形成していないバルジ部分等を指す。
前記アプタマーの前記核酸鎖に相補的な塩基配列には、前記アプタマーの前記標的物質と結合する部分が含まれていてもよい。
前記アプタマー及び前記核酸鎖の少なくともいずれかは、前記アプタマーと前記核酸鎖とが結合することによって生じる誘電率変化を増大せしめる置換基によって置換されているものとすることもでき、前記置換基は、誘電体とすることもできる。
前記標的物質は、コール酸メチルであってもよく、前記アプタマーとして、配列番号１記載の塩基配列からなるアプタマーを採用し、前記核酸鎖として、配列番号３記載の塩基配列からなる核酸鎖を採用することもできる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、アプタマーを用いて標的物質を定量する方法において、高感度に標的物質の定量を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照としながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００１３】
図１は、本発明に係る標的物質を定量する方法の概念図である。Ｔは標的物質を、Ａは前記標的物質と特異的に結合するアプタマーを、Ｎは前記アプタマーＡの少なくとも一部と相補的な塩基配列を有する核酸鎖をそれぞれ表す。
【００１４】
本発明に係る方法では、標的物質Ｔを定量するに際して、前記標的物質Ｔと特異的に結合するアプタマーＡに対し、前記標的物質Ｔと、前記アプタマーＡの少なくとも一部と相補的な塩基配列を有する核酸鎖Ｎとを競争的に結合させる（図１（１）参照）。この状態において、前記アプタマーＡと前記核酸鎖Ｎとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出する（図１（２）参照）。そして、得られた検出結果に基づいて、前記標的物質Ｔを定量する。
【００１５】
前記アプタマーＡと前記核酸鎖Ｎとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出対象とすることにより、例えば、標的物質Ｔが低分子であって、前記アプタマーＡが前記標的物質Ｔと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出しようとしても充分な感度が得られない場合においても、前記標的物質Ｔを定量することができる。
また、前記アプタマーＡが自己アニールすることによる影響を排除することができるため、自己アニールした前記アプタマーＡによるノイズを低減することができる。
【００１６】
以下、本発明に係る方法の好適な第一の実施形態について、工程ごとに説明する。なお、図２は、本発明に係る方法の好適な第一の実施形態のフロー図であり、図３〜図６は、本発明に係る方法の好適な実施形態の各工程の概念図である。また、１はセンサの検出表面を、１１はリンカーをそれぞれ表す。
【００１７】
はじめに、検出表面１に所定量のアプタマーＡを導入し、前記検出表面１に前記アプタマーＡを固定化する。前記アプタマーＡは、前記検出表面１に固定化されるための官能基を末端に備えており、リンカー１１を介して連結されることによって、前記検出表面１に固定化される（第一工程、図３参照）。
【００１８】
次に、前記アプタマーＡが固定化された前記検出表面１に、前記標的物質Ｔを含有しうる試料と、前記核酸鎖Ｎとを導入する。そして、両者を前記アプタマーＡに競争的に結合させた状態において、前記アプタマーＡと前記核酸鎖Ｎとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出する（第二工程、図４参照）。
【００１９】
試料中の標的物質Ｔの量は、検量線に基づいて推定する。検量線の作成方法は以下の通りである。前記アプタマーＡが固定化された前記検出表面１に、所定量の標的物質Ｔと、所定量の核酸鎖Ｎと、を導入し、競争的に結合させる。この条件において、前記アプタマーＡが前記核酸鎖と結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出する。前記核酸鎖Ｎの導入量を一定とし、前記標的物質Ｔの導入量を変化させて検出を行うことによって、前記標的物質Ｔの導入量と検出結果との相関関係を得て、検量線を作成する（第三工程、図５参照）。
【００２０】
前記第三工程で得られた相関関係に基づいて、前記第二工程の検出結果より前記試料中の標的物質Ｔの量を推定する（第四工程、図６参照）。
【００２１】
以下に、本発明の第一の実施形態の構成について詳細に説明する。
【００２２】
本発明に係る方法において検出対象となる、アプタマーＡと核酸鎖Ｎとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかは、特に限定されない。物理的変化の具体例として、例えば、誘電率変化や質量変化等が挙げられる。また、化学的変化の具体例としては、例えば、前記アプタマーＡの構造変化や前記アプタマーＡが分子内結合を有する際の結合強度の変化等が挙げられる。
【００２３】
本発明において、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかの検出手段は、本実施形態に限定されないが、前記アプタマーＡはセンサの検出表面１に固定化され、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを前記センサによって検出するのが好適である。このような手段で検出することにより、前記アプタマーＡや前記核酸鎖Ｎを色素等の不安定なラベルで修飾することなく検出することができるため望ましい。また、前記検出表面１を再生することができれば何度でも測定が可能であるため望ましい。
【００２４】
前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかをセンサによって検出する場合において、用いられる前記センサの検出原理は、固定化した前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出できるものであれば、特に限定されない。具体例として、例えば、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、以下ＳＰＲと称する）原理や、水晶発振子マイクロバランス（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ、以下ＱＣＭと称する）原理等が挙げられる。
【００２５】
検出原理としてＳＰＲ原理を用いる場合には、前記検出表面１に前記アプタマーＡを固定化し、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる誘電率変化を検出する。具体的には、前記検出表面１に固定化された前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる誘電率変化を、表面プラズモン共鳴現象による反射光強度の減衰ピーク角度の変化として観測する。従って、検出原理としてＳＰＲ原理を用いた場合の感度は、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる誘電率変化量に依存する。
【００２６】
検出原理としてＱＣＭ原理を用いる場合には、同様に前記検出表面１に前記アプタマーＡを固定化し、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる質量変化を検出する。具体的には、前記検出表面１に固定化された前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる質量変化を、水晶振動子の圧電効果による共振周波数の変化として観測する。従って、検出原理としてＱＣＭ原理を用いた場合の感度は、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる質量変化量に依存する。
【００２７】
本発明に係る方法で定量される標的物質Ｔは、特に限定されず、例えば、たんぱく質、核酸、ホルモン、環境ホルモン、薬剤等が挙げられるが、例えば、ホルモン、環境ホルモン、薬剤等の低分子が好適に定量される。ホルモン、環境ホルモン、薬剤等の低分子は、ＳＰＲセンサやＱＣＭセンサ等のバイオセンサで直接検出しようとしても、誘電率や質量の変化量が小さく、充分な検出感度が得られない場合がある。このような場合においても、本発明に係る方法によれば、ホルモン、環境ホルモン、薬剤等の低分子を高感度に検出することができる。
【００２８】
本発明に係る方法に用いられるアプタマーＡは、前記標的物質Ｔと特異的に結合する核酸等の分子である。前記標的物質Ｔと特異的に結合するものであれば、その種類等は特に限定されず、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ペプチドアプタマー、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等を用いることができる。
【００２９】
本発明に係る方法では、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出するため、自己アニールした前記アプタマーＡのノイズを低減することができる。このため、本発明に係る方法に用いられる前記アプタマーＡの量を増加させることにより、ノイズを増加させることなく検出感度を向上させることができる。
【００３０】
前記アプタマーＡを検出表面１に固定化する場合において、前記アプタマーＡを前記検出表面１に固定化する方法は特に限定されず、例えば、アプタマーＡの末端にアビジンを修飾し、検出表面１にビオチン修飾を施して、アビジン−ビオチン結合を利用して固定化する方法、アプタマーＡの末端をアミノ化し、検出表面１にカルボン酸修飾を施して、アミド結合を利用して固定化する方法、アプタマーＡの末端をチオール化し、貴金属からなる検出表面１に、チオールと金属の結合を利用して固定化する方法、アプタマーＡの末端にタンパク質を修飾し、たんぱく質が吸着しやすい材質からなる検出表面１に、たんぱく質の物理吸着を利用して固定化する方法等が挙げられる。
【００３１】
本発明に係る方法に用いられる前記アプタマーＡの量は特に限定されず、定量する前記標的物質Ｔの種類、濃度等に応じて適宜設定することができる。前記アプタマーＡを前記検出表面１に固定化する場合においても、前記検出表面１に固定化する前記アプタマーＡの量は特に限定されない。
【００３２】
本発明に係る方法に用いられる核酸鎖Ｎは、前記アプタマーＡの少なくとも一部と相補的な塩基配列を有するものであり、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出し、得られた検出結果に基づいて標的物質Ｔを定量する。
【００３３】
前記核酸鎖Ｎが有する前記アプタマーＡと相補的な塩基配列の塩基数については特に限定されない。相補的な塩基配列の塩基数を変化させることにより、前記アプタマーＡと前記核酸鎖Ｎとの二重鎖結合の平衡定数を変化させることができる。これにより、感度を調整することができる。
【００３４】
前記核酸鎖Ｎが有する前記アプタマーＡと相補的な塩基配列については特に限定されないが、前記アプタマーＡがステムループ構造を有する場合において、前記核酸鎖Ｎは、前記アプタマーＡの非ステム部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有するものであることが望ましい。前記核酸鎖Ｎを、自己アニールし、ステム−ループ構造を有している前記アプタマーＡの非ステム部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有するものとすることにより、前記核酸鎖Ｎは自己アニールしている前記アプタマーＡの非ステム部分を起点として前記アプタマーＡに効率よく結合することができ、感度を向上させることができる。
【００３５】
すなわち、自己アニールし、ステム−ループ構造を有している前記アプタマーＡは、前記標的物質Ｔと結合せず、検出に寄与しないものとなる場合がある。また、このような前記アプタマーＡは、検出の際にノイズの原因となりうる。前記核酸鎖Ｎを、前記アプタマーＡの非ステム部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有するものとすることにより、自己アニールし、ステム−ループ構造を有している前記アプタマーＡの自己アニールを解き、検出に寄与するものとすることができる。また、自己アニールしている前記アプタマーＡを減少させることにより、ノイズをさらに減少させ、検出感度を向上させることができる（図８参照）。
【００３６】
前記核酸鎖Ｎが前記アプタマーＡの非ステム部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有する場合における、前記アプタマーＡの非ステム部分と相補的な塩基配列の塩基数は、特に限定されないが、４塩基以上とするのが好適である。相補的な塩基配列の塩基数を４塩基以上とすることにより、前記アプタマーＡの非ステム部分と効率よく結合することができるため望ましい。
【００３７】
また、前記核酸鎖Ｎは、前記アプタマーＡの塩基配列のうち、前記標的物質Ｔと結合したときに、前記標的物質Ｔが最も強く相互作用する部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有することが望ましい。前記アプタマーＡの塩基配列のうち標的物質Ｔと結合する部分は、標的物質Ｔと結合することによって安定化される。従って、前記核酸鎖Ｎがこの部分と相補的な塩基配列を有するものとすることにより、前記核酸鎖Ｎは、前記標的物質Ｔと結合していない前記アプタマーＡとは結合しやすく（図７（１）参照）、一旦前記標的物質Ｔと結合した前記アプタマーＡとは結合しにくいものとすることができる（図７（２）参照）。
【００３８】
前記核酸鎖Ｎが、前記アプタマーＡの塩基配列のうち前記標的物質Ｔと結合する部分の塩基配列と相補的な塩基配列を有する場合において、前記アプタマーＡの塩基配列のうち前記標的物質Ｔと結合する部分と相補的な塩基配列の塩基数は、特に限定されない。
【００３９】
また、本発明に係る方法に用いられる核酸鎖Ｎは、アプタマーＡの少なくとも一部と相補的な塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、前記アプタマーＡと非相補的な塩基配列を有するものとするのが好適である。非相補的な塩基配列を有するものとすることにより、前記核酸鎖Ｎの誘電率や質量を増加させることができ、前記アプタマーＡと結合した際の誘電率や質量の変化を増加させて感度を上げることができるため望ましい。
【００４０】
また、前記アプタマーＡと前記核酸鎖とが結合した際の誘電率や質量の変化を増加させて感度を上げるために、前記アプタマーＡ及び前記核酸鎖Ｎの少なくともいずれかは、前記アプタマーＡと前記核酸鎖Ｎとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを増大せしめる置換基によって修飾されていてもよい。前記置換基は特に限定されず、検出手段に応じて適宜選択することができる。例えば、前記アプタマーＡがＳＰＲ原理を検出原理とするセンサの表面に固定化されている場合には、前記核酸鎖の末端に誘電体を修飾することができる。
【００４１】
本発明に係る方法に用いられる前記核酸鎖Ｎの量は特に限定されず、前記アプタマーＡや前記核酸鎖Ｎ等の構造、導入する前記標的物質Ｔの量等に応じて、適宜設定することができる。
【００４２】
本発明に係る方法において、アプタマーＡに標的物質Ｔと核酸鎖Ｎとを競争的に結合させる際、前記標的物質Ｔと前記核酸鎖Ｎとを導入する順序は特に限定されず、例えば、前記標的物質Ｔと前記核酸鎖Ｎとを同時に導入することができる。また、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを、センサによって検出する場合においては、前記標的物質Ｔを前記相補鎖Ｎよりも先に導入することにより、前記アプタマーＡと前記核酸鎖Ｎとの結合が平衡に達する前に速やかにシグナルを得ることができる。
【００４３】
以下、本発明に係る方法の好適な第二の実施形態について、工程ごとに説明する。第一の実施形態と同様の点については記載を省略し、相違する点について説明する。なお、図９は、本発明に係る方法の好適な第二の実施形態のフロー図であり、図１０〜図１３は、本発明に係る方法の好適な実施形態の各工程の概念図である。また、２はセンサの検出表面を、２１はリンカーをそれぞれ表す。
【００４４】
はじめに、検出表面２に所定量の核酸鎖Ｎを導入し、前記検出表面２に前記核酸鎖Ｎを固定化する。前記核酸鎖Ｎは、前記検出表面２に固定化されるための官能基を末端に備えており、リンカー２１を介して連結されることによって、前記検出表面２に固定化される（第一工程、図１０参照）。
【００４５】
次に、前記核酸鎖Ｎが固定化された前記検出表面２に、前記標的物質Ｔを含有しうる試料と、前記アプタマーＡとを導入する。そして、前記核酸鎖Ｎと前記標的物質Ｔとを前記アプタマーＡに競争的に結合させた状態において、前記核酸鎖Ｎと前記アプタマーＡとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出する（第二工程、図１１参照）。
【００４６】
試料中の標的物質Ｔの量は、検量線に基づいて推定する。検量線の作成方法は以下の通りである。前記核酸鎖Ｎが固定化された前記検出表面２に、所定量のアプタマーＡと、所定量の標的物質Ｔと、を導入し、競争的に結合させる。この条件において、前記核酸鎖Ｎと前記アプタマーＡとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出する。前記アプタマーＡの導入量を一定とし、前記標的物質Ｔの導入量を変化させて検出を行うことによって、前記標的物質Ｔの導入量と検出結果との相関関係を得て、検量線を作成する（第三工程、図１２参照）。
【００４７】
前記第三工程で得られた相関関係に基づいて、前記第二工程の検出結果より前記試料中の標的物質Ｔの量を推定する（第四工程、図１３参照）。
【００４８】
以下に、本発明の第二の実施形態の構成について詳細に説明する。
【００４９】
本実施形態において、前記核酸鎖Ｎはセンサの検出表面２に固定化され、前記核酸鎖Ｎと前記アプタマーＡとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを前記センサによって検出する。このような手段で検出することにより、前記アプタマーＡや前記核酸鎖Ｎを色素等の不安定なラベルで修飾することなく検出することができるため望ましい。また、前記検出表面２を再生することができれば何度でも測定が可能であるため望ましい。
【００５０】
前記核酸鎖Ｎと前記アプタマーＡとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかをセンサによって検出する場合において、用いられる前記センサの検出原理は、固定化した前記核酸鎖Ｎと前記アプタマーＡとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出できるものであれば、特に限定されない。具体例として、例えば、ＳＰＲ原理や、ＱＣＭ原理等が挙げられる。
【００５１】
検出原理としてＳＰＲ原理を用いる場合には、前記検出表面２に前記核酸鎖Ｎを固定化し、前記核酸鎖Ｎと前記アプタマーＡとが結合することによって生じる誘電率変化を検出する。具体的には、前記検出表面２に固定化された前記核酸鎖Ｎが前記アプタマーＡと結合することによって生じる誘電率変化を、表面プラズモン共鳴現象による反射光強度の減衰ピーク角度の変化として観測する。従って、検出原理としてＳＰＲ原理を用いた場合の感度は、前記核酸鎖Ｎが前記アプタマーＡと結合することによって生じる誘電率変化量に依存する。
【００５２】
検出原理としてＱＣＭ原理を用いる場合には、同様に検出表面２に前記核酸鎖Ｎを固定化し、前記核酸鎖Ｎと前記アプタマーＡとが結合することによって生じる質量変化を検出する。具体的には、前記検出表面２に固定化された前記核酸鎖Ｎが前記アプタマーＡと結合することによって生じる質量変化を、水晶振動子の圧電効果による共振周波数の変化として観測する。従って、検出原理としてＱＣＭ原理を用いた場合の感度は、前記核酸鎖Ｎが前記アプタマーＡと結合することによって生じる質量変化量に依存する。
【００５３】
前記核酸鎖Ｎを検出表面２に固定化する場合において、前記核酸鎖Ｎを前記検出表面２に固定化する方法は特に限定されず、例えば、核酸鎖Ｎの末端にアビジンを修飾し、検出表面２にビオチン修飾を施して、アビジン−ビオチン結合を利用して固定化する方法、核酸鎖Ｎの末端をアミノ化し、検出表面２にカルボン酸修飾を施して、アミド結合を利用して固定化する方法、核酸鎖Ｎの末端をチオール化し、貴金属からなる検出表面２に、チオールと金属の結合を利用して固定化する方法、核酸鎖Ｎの末端にタンパク質を修飾し、たんぱく質が吸着しやすい材質からなる検出表面２に、たんぱく質の物理吸着を利用して固定化する方法等が挙げられる。
【００５４】
本発明に係る方法に用いられる前記アプタマーＡの量は特に限定されず、定量する前記標的物質Ｔの種類、濃度等に応じて適宜設定することができる。アプタマーＡの濃度を変化させることにより、標的物質Ｔに対するダイナミックレンジを変化させることができる。
【００５５】
また、前記アプタマーＡと前記核酸鎖とが結合した際の誘電率や質量の変化を増加させて感度を上げるために、前記アプタマーＡ及び前記核酸鎖Ｎの少なくともいずれかは、前記アプタマーＡと前記核酸鎖Ｎとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを増大せしめる置換基によって修飾されていてもよい。前記置換基は特に限定されず、検出手段に応じて適宜選択することができる。例えば、前記核酸鎖ＮがＳＰＲ原理を検出原理とするセンサの表面に固定化されている場合には、前記アプタマーＡの末端に誘電体を修飾することができる。
【００５６】
本発明に係る方法において、センサの検出表面２に固定化される前記核酸鎖Ｎの量は特に限定されず、前記アプタマーＡや前記核酸鎖Ｎ等の構造、導入する前記標的物質Ｔの量等に応じて、適宜設定することができる。
【００５７】
本実施形態において、前記標的物質Ｔと前記アプタマーＡとを前記検出表面２に導入する順序は特に限定されず、例えば、前記標的物質Ｔと前記前記アプタマーＡとを同時に導入することができる。また、予め前記標的物質Ｔを前記アプタマーＡと反応させ、これを前記核酸鎖Ｎに導入することにより、前記標的物質Ｔと前記アプタマーＡとの反応が平衡まで進んだ状態で検出を行うことができ、高感度で前記標的物質Ｔを定量することができる。
【００５８】
以下、本発明に係る方法の好適な第三の実施形態について説明する。第一及び第二の実施形態と同様の点については記載を省略し、相違する点について説明する。なお、図１４は本発明に係る方法の好適な第三の実施形態の概念図であり、Ｆは蛍光色素を、Ｑは該蛍光色素Ｆを消光するクエンチャーをそれぞれ表す。
【００５９】
本実施形態において、アプタマーＡと核酸鎖Ｎとが結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかは、前記アプタマーＡの塩基配列中に修飾された蛍光色素Ｆと該蛍光色素Ｆを消光するクエンチャーＱとによって検出される。前記蛍光色素Ｆと前記クエンチャーＱとは、前記アプタマーＡが前記標的物質Ｔと結合している状態又は自己アニールしている状態においては互いの距離が近接し、かつ、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合している状態においては互いの距離が大きくなるように、前記アプタマーＡに修飾されている（図１４参照）。
【００６０】
前記アプタマーＡが前記標的物質Ｔと結合している状態又は自己アニールしている状態においては、前記蛍光色素Ｆは前記クエンチャーＱと近接しているため、前記蛍光色素Ｆは前記クエンチャーＱによって消光され、蛍光は観測されない（図１４（１）参照）。
【００６１】
一方、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合している状態においては、前記蛍光色素Ｆと前記クエンチャーＱとが離れているため、前記蛍光色素Ｆは前記クエンチャーＱによって消光されず、蛍光が観測されることとなる（図１４（２）参照）。
【００６２】
本実施形態に係る方法では、前記アプタマーＡが前記核酸鎖Ｎと結合することによって生じる構造変化を、前記アプタマーＡに修飾した前記蛍光色素Ｆの蛍光強度の変化として観測することとができる。
【００６３】
本発明に係る方法によれば、例えば、標的物質Ｔが低分子であって、前記アプタマーＡが前記標的物質Ｔと結合することによって生じる物理的変化及び化学的変化の少なくともいずれかを検出しようとしても充分な感度が得られない場合においても、前記標的物質Ｔを高感度で定量することができる。
また、前記アプタマーＡが自己アニールすることによる影響を排除することができるため、自己アニールした前記アプタマーＡによるノイズを低減することができる。
【００６４】
また、前記核酸鎖Ｎ−前記アプタマーＡ間の平衡状態及び前記核酸鎖Ｎ−前記標的物質ｔ−前記アプタマーＡ間の平衡状態から、前記アプタマーａ−前記標的物質Ｔの平衡定数を算出することもできる。
【００６５】
さらに、一定の前記アプタマーａに対し、標的物質ｔを変化させることにより、例えば、前記アプタマーａに対してどの標的物質ｔと親和力が高いかを簡便に測定することができる。本発明に係る方法によって、例えば、薬剤のスクリーニング等を簡便に行うことができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。  
【００６７】
＜実験条件＞
標的物質として、コール酸メチルを用い、アプタマーとしてコール酸に対して作製されたアプタマーを用いた。検出表面に結合させるため、５’をビオチン修飾した。アプタマー及び参照用ＤＮＡの塩基配列を表１に示す。
【００６８】
【表１】
0005463621.tif 000002
【００６９】
標的物質の競合分子として、アプタマーの一部と相補的な塩基配列を有する鎖長２０Ｍｅｒの核酸鎖を用いた。相補部分を５’から１５ｍｅｒ（核酸鎖１）、１０ｍｅｒ（核酸鎖２）とし、残りの部分はアプタマー及び核酸鎖自身に非特異的に結合しないよう配慮した配列とした。各核酸鎖を表２に示す。
【００７０】
【表２】
0005463621.tif 000003
【００７１】
ランニングバッファーとして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．６を用い、ＳＰＲ測定にはＢＩＡＣＯＲＥＸ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いた。
以下、特に記載のない場合は、各種溶液の溶媒は上記ランニングバッファーである。
【００７２】
＜アプタマー固定化方法＞
アプタマーのチップへの固定化は、以下のように行った。アプタマーを固定化するためにＳＡチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ社製）を用いた。ＳＡチップは、金表面がカルボキシル基を持つデキストランで修飾されており、カルボキシル基にストレプトアビジンが固定化されている。５０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液でＳＡチップを洗浄後、ビオチン修飾したアプタマー１０μＭを、５μＬ／ｍｉｎで４８０秒送液した。５０ｍＭ  ＮａＯＨ水溶液で更に洗浄した後、アプタマーがこれ以上反応しなくなるまで充分固定化した。アプタマーは１５００〜２５００Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ程度固定化できた。
参照用として、アプタマーの代わりに参照用ＤＮＡを用いた以外は同様の方法で、参照用セルに参照用ＤＮＡを固定化した。
【００７３】
＜ＳＰＲ測定方法＞
０μＭ，０．１μＭ，１μＭ，１０μＭ，５０μＭ，１００μＭのコール酸メチル及び、２μＭ核酸鎖を調整し、両者を1:1で混合し、各サンプルを調製した。調製した前記サンプルを、アプタマーセルと参照用セルに同時に送液した。流速は５μＬ／ｍｉｎで４８０秒、１０μＬ／ｍｉｎで３００秒の二通りとした。なお、溶媒であるアセトニトリルの影響を除外するため、各サンプルについて、同組成のアセトニトリル含有ランニングバッファーを用いてブランクを測定し、補正を行った。
測定間のセル洗浄は、３ｍＭＮａＯＨ水溶液及び５００ｍＭＨＣｌ水溶液を送液することによって行った。
【００７４】
＜測定結果＞
核酸鎖１（５μＬ／ｍｉｎ）、核酸鎖２（１０μＬ／ｍｉｎ）のアプタマーセルと参照用セルのＳＰＲ角度シフト差を図１５に示す。サンプルが送液されている間はシグナルが増加し、基板表面に核酸鎖の結合が観測された。一方、サンプルの送液が終了し、ランニングバッファーを送液するとシグナルが減少し、核酸鎖の解離が観測された。核酸鎖１の方がサンプル送液終了後のシグナルの減少が緩やかであり、アプタマーとの解離速度がより遅いものと考えられる。本測定結果より、アプタマーが核酸鎖と結合することによって生じる誘電率変化を検出できることを確認した。
【００７５】
次に、核酸鎖１を用いた際の、各コール酸メチル濃度におけるピークシフトの値をブランクのピークシフト値から差し引いた値を図１６に示す。コール酸メチル濃度に依存したピークシフトが得られた。送液時間が長いと反応が進むためシグナルが大きく得られる傾向が見られた。本発明に係る方法で得られたコール酸メチルの最高検出限界は０．５μＭであり、非常に高感度で標的物質の検出を行うことができた。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に係る方法の概念図である。
【図２】本発明に係る方法の好適な第一の実施形態のフロー図である。
【図３】本発明に係る方法の好適な第一の実施形態の第一工程の概念図である。
【図４】本発明に係る方法の好適な第一の実施形態の第二工程の概念図である。
【図５】本発明に係る方法の好適な第一の実施形態の第三工程の概念図である。
【図６】本発明に係る方法の好適な第一の実施形態の第四工程の概念図である。
【図７】本発明に係る方法に用いられる好適な核酸鎖の一例の概念図である。
【図８】本発明に係る方法に用いられる好適な核酸鎖の他の一例の概念図である。
【図９】本発明に係る方法の好適な第二の実施形態のフロー図である。
【図１０】本発明に係る方法の好適な第二の実施形態の第一工程の概念図である。
【図１１】本発明に係る方法の好適な第二の実施形態の第二工程の概念図である。
【図１２】本発明に係る方法の好適な第二の実施形態の第三工程の概念図である。
【図１３】本発明に係る方法の好適な第二の実施形態の第四工程の概念図である。
【図１４】本発明に係る方法の好適な第三の実施形態の概念図である。
【図１５】本発明の実施例に係るアプタマーセルと参照用セルのＳＰＲ角度シフト差を示す図である。
【図１６】本発明の実施例に係る各コール酸メチル濃度におけるピークシフトの値をブランクのピークシフト値から差し引いた値を示す図である。
【符号の説明】
【００７７】
Ｔ                   標的物質
Ａ                   アプタマー
Ｎ                   核酸鎖
１，２               検出表面
１１，２１           リンカー
Ｓ１１，Ｓ２１              第一工程
Ｓ１２，Ｓ２２              第二工程
Ｓ１３，Ｓ２３              第三工程
Ｓ１４，Ｓ２４              第四工程
【図１】
0005463621.tif 000004
【図２】
0005463621.tif 000005
【図３】
0005463621.tif 000006
【図４】
0005463621.tif 000007
【図５】
0005463621.tif 000008
【図６】
0005463621.tif 000009
【図７】
0005463621.tif 000010
【図８】
0005463621.tif 000011
【図９】
0005463621.tif 000012
【図１０】
0005463621.tif 000013
【図１１】
0005463621.tif 000014
【図１２】
0005463621.tif 000015
【図１３】
0005463621.tif 000016
【図１４】
0005463621.tif 000017
【図１５】
0005463621.tif 000018
【図１６】
0005463621.tif 000019
【配列表】
0005463621000001.app