(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
株中のｐｈａＣ遺伝子を選択的に変異させて、ｐｈａＣタンパク質を発現せず、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を産生することなく清澄化したネイティブの高アシルジェランを産生する変異株とした、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属エロデア（ｅｌｏｄｅａ）種の変異株。
【請求項２】
前記変異はｐｈａＣ遺伝子の欠失である、請求項１に記載の変異株。
【請求項３】
株中のｐｈａＣ遺伝子を選択的に変異させて、ｐｈａＣタンパク質を発現せず、ポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）を産生することなくジウタンを産生する変異株とした、スフィンゴモナス属（細菌）ＡＴＣＣ５３１５９の変異株。
【請求項４】
前記変異はｐｈａＣ遺伝子の欠失である、請求項３に記載の変異株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、無発現変異により内部の貯蔵高分子であるポリヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」
）の産生に欠陥があるが、一般にスフィンガン（ｓｐｈｉｎｇａｎ）と呼ばれる正常な質
のカプセル（ｃａｐｕｌａｒ）多糖を産生する、スフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏ
ｎａｓ）属の細菌変異株に関する。本発明はまた、ＰＨＢの産生を欠失するスフィンゴモ
ナスの変異株によって産生されたスフィンガンを清澄化する方法に関する。本発明は、さ
らに、ＰＨＢ欠失スフィンガンおよび／または清澄化されたスフィンガンを含む、食品ま
たは工業製品に関する。
【０００２】
関連技術の考察
スフィンガンは、スフィンゴモナス属の細菌から分泌されるカプセル多糖である。スフ
ィンガン同士は、構造的に関連があるが、まったく同じではない。スフィンゴモナス属の
通常のメンバーと、それらが産生するスフィンガンには、ゲラン（ｇｅｌｌａｎ）（Ｓ−
６０）を産生するスフィンゴモナス・エロデア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅ
ａ）ＡＴＣＣ  ３１４６１、ウェラン（ｗｅｌａｎ）（Ｓ−１３０）を産生するスフィン
ゴモナス種  ＡＴＣＣ  ３１５５５、ラムサン（ｒｈａｍｓａｎ）（Ｓ−１９４）を産生
するスフィンゴモナス種ＡＴＣＣ  ３１９６１、ジウタン（ｄｉｕｔａｎ）（Ｓ−６５７
）を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ５３１５９、まだ無名の多糖（Ｓ−８８）
を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ３１５５４、まだ無名の多糖（Ｓ−１９８）
を産生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ３１８５３、まだ無名の多糖（Ｓ−７）を産
生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ２１４２３、まだ無名の多糖（ＮＷ−１１）を産
生するスフィンゴモナス種  ＡＴＣＣ  ５３２７２、アルカラン（バイオポリマーＢ−１
６）を産生するスフィンゴモナス種  ＦＥＲＭ−ＢＰ２０１５（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ  ｌａｔｕｓ  Ｂ−１６）、などがある。スフィンゴモナスおよびそれらが産生する
多糖についての記載は、米国特許第４，３７７，６３６号、第４，３２６，０５３号、第
４，３２６，０５２号、および第４，３８５，１２３号（ＡＴＣＣ  ３１４６１およびそ
のＳ−６０多糖について）；米国特許第４，３４２，８６６号（ＡＴＣＣ  ３１５５５お
よびＳ−１３０について）；米国特許第４，４０１，７６０号（ＡＴＣＣ  ３１９６１お
よびＳ−１９４について）；米国特許第５，１７５，２７８号（ＡＴＣＣ  ５３１５９お
よびＳ−６５７について）；米国特許第４，３３１，４４０号および第４，５３５，１５
３号（ＡＴＣＣ  ３１５５４およびＳ−８８について）；米国特許第４，５２９，７９７
（ＡＴＣＣ  ３１８５３およびＳ−１９８について）；米国特許第３，９６０，８３２号
（ＡＴＣＣ  ２１４２３およびＳ−７について）；米国特許第４，８７４，０４４号（Ａ
ＴＣＣ  ５３２７２およびＮＷ−１１について）；米国特許第５，１７５，２７９号（Ｆ
ＥＲＭ  ＢＰ−２０１５およびＢ−１６について）に出ており、これらのすべてを参照に
より本明細書に組み込む。
【０００３】
スフィンガン多糖同士は、糖類であるＤ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、およびＬ−
ラムノース（またはＬ−マンノース）を含む骨格の一次構造が構造的に関連している。例
えば、ゲランＳ−６０の一次構造は、糖類であるＤ−グルコース、Ｄ−グルクロン酸、お
よびＬ−ラムノースを、モル比２：１：１で含み、これらの糖類はグルコース、グルクロ
ン酸、グルコース、ラムノースの順序で互いに結合し、四糖リピートユニットを形成して
いる。天然の形では、ゲランの同じグルコース残基が、アセチルおよびグリセリル置換基
で修飾される。概して、ゲランは、四糖リピートユニットあたり１つのグリセリン酸置換
基、および２つの四糖リピートユニットあたり１つの酢酸置換基を有する。別のスフィン
ガン、ジウタンＳ−６５７の一次構造は、１つのグルコース残基にＬ−ラムノースの二糖
側鎖が結合し、その結果六糖リピートユニットを形成する点でゲランとは異なる。Ｓ−６
５７は、前記以外のグルコース残基の２位および／または６位にアセチル基を含む。
【０００４】
スフィンガン多糖は、ゴムとも呼ばれ、水溶液を濃化あるいはゲル化するために最初に
使用され、しばしば増粘剤、ゲル化剤という２つのグループに分類される。通常の増粘剤
には、デンプン、グアーガム、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、メチルセル
ロース、キサンタン、カラヤゴム、トウガカントゴムがある。通常のゲル化剤には、ゲラ
ン、ゼラチン、デンプン、アルギン酸塩、ペクチン、カラギーナン、寒天、メチルセルロ
ースがある。
【０００５】
ゲル化剤は、食品工業で、菓子のゼリー、ジャム、デザートのゼリー、アイシング、乳
製品、飲料などを含めた様々な用途で使用される。さらに、ゲル化剤は、微生物学的な培
地の成分としても使用することができる。ゲル化剤は、使用する条件、および形成するゲ
ルの感触に応じて異なる。ゲルにはそれぞれ特有の特徴があるので、特定の製品に、ある
種のゲル化剤が限定的に使用されている（例えば、菓子のゼリーにはデンプン、デザート
のゼリーにはゼラチン、アイシングには寒天、ピメントストリップ（ｐｉｍｅｎｔｏ  ｓ
ｔｒｉｐｓ）にはアルギン酸塩）。
【０００６】
特定の製品にある種のゲル化剤を使用するにもかかわらず、従来の食品への配合には不
都合がある。例えば、デザートのゼリーへの配合にしばしば使用されるゼラチンは、動物
由来であり、固めるためには冷却する必要があり、熱に対して不安定なために用途が限ら
れる。デザートのゼリー、菓子類、およびジャム／ゼリーへの配合にしばしば使用される
カラギーナン、カラギーナンとローカストビーンガムのブレンド、およびペクチンは、一
般に感触がもろくぼろぼろとして（ｂｒｉｔｔｌｅ）弾力がない配合物に限られ、保管安
定性が乏しく、地理的に日本などのいくつかの国では、使用が制限される可能性がある。
菓子への配合でしばしば使用されるデンプンは、透明度が低く、香料の放出性が低い。し
たがって、食品への配合で使用するための、従来のゲル化剤に伴っていた問題のない、ゲ
ル化剤を開発することが望まれている。
【０００７】
特に有用なゲル化剤の１つは、ゲラン（Ｓ−６０）であり、これは、細菌スフィンゴモ
ナス・エロデアＡＴＣＣ  ３１４６１によって産生されるカプセル多糖である。商業的に
は、好気条件下で、発酵培地にスフィンゴモナス・エロデア細菌を接種することによって
、ゴムが形成される。発酵培地は、炭素源、リン酸塩、有機および無機窒素源、および適
切な微量元素を含む。通気、攪拌、温度、およびｐＨを厳密に制御しながら、無菌条件下
で発酵を行う。発酵完了と同時に、粘性のブロスを低温殺菌して、生細胞を殺し、その後
ゴムを回収する。しかし、ゲランを産生する発酵の最適条件は、ゲランの最終的な清澄化
および回収を妨げる内部の貯蔵高分子であるポリヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」）の産生も
促進する。発酵中、ＰＨＢ合成とゲラン合成は、使用可能な炭素源に対して競合するので
、ＰＨＢ合成は、ゲラン合成と競合する可能性がある。
【０００８】
ゲランは、発酵ブロスからの回収方法に応じて、異なる特徴を示す。発酵ブロスから直
接回収することにより、天然または高アシル型のゲランが生じ、Ｓ．ｅｌｏｄｅａによっ
てその１つのグルコース残基がアセチルおよびグリセリル置換基で修飾される。この天然
または高アシル型のゲランを単離すると、軟らかく、柔軟性があり、弾力があるゲルがも
たらされる。ゲランは熱アルカリで処理することによって脱アシル化することができ、そ
れによって低アシル型のゲランがもたらされる。この脱アシル型ゲランを単離すると、硬
質で、堅く、もろい（ｂｒｉｔｔｌｅ）ゲルがもたらされるが、これはその商業用途が限
られている。天然のゲランと脱アシル化ゲランをブレンドすると、中間の感触のゲルが生
成する。
【０００９】
ある種の用途では、透明なゲランが必要である。しかし、現在、清澄化することができ
るのは、脱アシル化ゲランのみである。脱アシル化プロセス中に、ゲランを高温でアルカ
リ処理すると、ゲランからアシル置換基が除去され、かつＳ．エロデア細胞が溶解する。
次いで、固形物および細胞片を、濾過によって取り除き、透明かつアシル化していないゲ
ランを得る。現在は、固まるために必要な温度（冷却したときゴムがゲルを形成する温度
）が高く、また、この生物のカプセルの性質により、Ｓ．エロデア細胞からゲランを分離
することは容易ではないために、天然または高アシル型のゲランを濾過で清澄化すること
はできない。天然のゲランが必要な用途では、Ｓ．エロデア細胞を化学的または酵素的に
溶解できるが、最終生成物中に、残留ＰＨＢが存在し、得られる溶液は透明ではなく濁る
こととなる。
【００１０】
ゲル化剤としてのゲランの使用以外に、他のスフィンガン多糖についても、有用な商業
用途が発見されている。Ｓ−６５７多糖は、水などの極性溶媒に、著しい擬似塑性を与え
、その結果Ｓ−６５７は、粒子の懸濁、摩擦の減少、エマルジョンおよび泡の安定化、濾
過ケークの処分、ならびに濾過の制御が可能な流体力学的モディファイアーとして作用で
きるようになる。したがって、参照によって本明細書に組み込む米国特許第６，１１０，
２７１号に開示されるように、Ｓ−６５７は、様々なセメントシステム（ｃｅｍｅｎｔｉ
ｔｉｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）において、流体力学的モディファイアーとしての産業的有用
性が見出されている。
【００１１】
透明度を損なう以外に、スフィンガン中にみられるＰＨＢは、それらのゴムのレオロジ
ー特性に影響を与える。特に、Ｓ−６５７ゴム中のＰＨＢは、レオロジーが、油井を掘る
際に完成および改修用流体の重要な役目を果たしている油田などの多孔質の内部流動（ｍ
ｅｄｉａｌ  ｆｌｏｗ）環境で、多糖がレオロジーを変更する能力に影響を与える。さら
に、Ｓ−６５７中のＰＨＢ残留物は、貯水池形成中に障害を引き起こす可能性があり、ま
た、油井の生産性を低下させる可能性もある。さらに、ＰＨＢの存在は、外観が消費者に
受け入れられることが不可欠である家庭用製品およびパーソナルケア製品において、Ｓ−
６５７ゴムの応用性を制限する。
【００１２】
したがって、スフィンガン中のＰＨＢ産生を失わせることが試みられてきた。スフィン
ゴモナス種におけるＰＨＢ産生を妨げる問題を解決するための１つの方法は、米国特許第
５，３００，４２９号に記載されるように、ランダム変異を化学的に誘発させて、ＰＨＢ
の産生を阻害する株にすることであった。米国特許第５，３００，４２９号は、ＰＨＢの
産生を阻害するが、ゲランを産生する能力はそのままである、ＬＰＧ−２、スフィンゴモ
ナス・エロデアの変異株を開示している。スフィンゴモナス・エロデアは、以前はシュー
ドモナス・エロデア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）として知られており、同
じ生物である。ＬＰＧ−２株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、ＡＴＣＣ  ５３９６７と名付けられている。ＬＰＧ−２株は
ゲランを産生するが、その質は安定していない。おそらく、化学的変異誘発で引き起こさ
れる付加的な変異のためである。
【００１３】
遺伝子操作は、ＰＨＢ産生に欠陥があるスフィンゴモナスの無発現変異株を産み出すた
めの、より選択的な変異誘発手法である。遺伝子操作により、ＰＨＢ合成経路内の遺伝子
の選択的な変異または欠失が可能になり、また、ゴムの産生の質に影響を与えることなく
、ＰＨＢの産生を完全に阻害することが可能になる。
【００１４】
したがって、ＰＨＢ合成能力に欠陥があるが、スフィンガン産生を最大にし、かつスフ
ィンガンからＰＨＢを除去するのに必要な労力を軽減する、スフィンゴモナスの変異株を
開発することが非常に望まれている。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、ポリヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」）合成に必要とされるタンパク質をコード
する少なくとも１つの遺伝子を、選択的に変異させるあるいは欠失させることにより、ス
フィンガンは産生するがＰＨＢは産生しないようにした、スフィンゴモナス属の変異株に
関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＬａｓｅｒＧｅｎｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＤＮＡ  ｓｔａｒ  ＭｅｇＡｌｉｇｎｓ（登録商標）というソフトウェアを使用して並べた、Ｒｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｕ１７２２７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｊ０５００３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ種  ＲＡ３８４９株（Ｌ３７７６１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｌ１７０４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、およびＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（Ｌ０７８９３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）からのＰＨＢ合成酵素タンパク質の配列を示す。
【図２】プラスミドｐＥＢＩ中の４０８ｂｐ挿入断片の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。
【図３】スフィンゴモナス・エロデアのｐｈａＣ遺伝子中の内部欠失をクローン化し、構築するために使用するステップの模式図である。
【図４】ｐｈａＣ領域の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）。
【図５】変異させたｐｈａＣ遺伝子の、スフィンゴモナス・エロデア染色体への相同的組換え、および染色体中に無処置のまたは変異させたｐｈａＣ遺伝子を残すようにした、組み込まれたベクターの切除の概略図である。
【図６】プラスミドｐＬＯ２の説明図である。
【図７】ｐｈａＣ欠失を含むベクターの、スフィンゴモナス・エロデア染色体への組込みを説明する概略図である。
【図８】１０Ｌ発酵物からのブロスサンプルを培養することによって求められた、細胞数のグラフ表示である。
【図９】ＥｃｏＲＩを用いて消化させ、ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子に対するプローブとハイブリダイズさせたスフィンゴモナスゲノムＤＮＡ調製物のサザンハイブリダイゼーションを示す。
【図１０】ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子、および隣接領域のＤＮＡ配列である（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）。
【図１１】ｐｈａＣ領域の遺伝子地図およびＰＣＲ増幅のためのプライマーを示す。
【図１２】ＰＣＲを用いて、ｐｈａＣに隣接する領域のみを含み、ｐｈａＣ遺伝子全体を欠く生成物を構築するクローニング戦略を示す。
【図１３】透過率に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
【図１４】ゲル強度に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
【図１５】透過率に対するカルゴン（Ｃａｒｇｏｎ）濃度の効果のグラフである。
【図１６】ゲル強度に対するカルゴン濃度の効果のグラフである。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、複数のスフィンゴモナス種のＤＮＡから、すなわちＡＴＣＣ
３１４６１および５３１５９から単離した、ＰＨＢ合成酵素のタンパク質をコードする
単離されたＤＮＡ配列を対象とする。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、スフィンゴモナス属の変異株を発酵させるステップと、発酵
ブロスから得たＰＨＢ欠失スフィンガンを清澄化するステップとを含む、ＰＨＢ欠失清澄
化されたスフィンガンを調製する方法を対象とする。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態は、スフィンガン発酵ブロスを約３０℃から約７０℃の清
澄化温度に加熱するステップと、スフィンガン発酵ブロスを清澄化剤で処理し、次いでこ
の発酵ブロスを酵素で処理するステップとを含む、清澄化されたスフィンガン溶液を調製
する方法を対象とする。本発明のいっそうさらなる別の実施形態は、スフィンガン発酵ブ
ロスを約３０℃から約７０℃の清澄化温度に加熱するステップ、この発酵ブロスをキレー
ト剤で処理するステップ、この発酵ブロスをリゾチーム酵素で処理するステップ、この発
酵ブロスを苛性剤または酸化剤で処理するステップ、およびこの発酵ブロスをプロテアー
ゼ酵素で処理するステップを含む、清澄化されたスフィンガン溶液を調製する方法を対象
とする。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、清澄化された、ＰＨＢ欠失、高ゲル強度の（天然の）高アシ
ルゲランの調製を可能にする、スフィンゴモナス・エロデアの変異株を対象とする。
【００２１】
本発明のさらに別の実施形態は、ＰＨＢ欠失および／または清澄化されたスフィンガン
を含む食品または工業製品を対象とする。
【００２２】
図１は、ＬａｓｅｒＧｅｎｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によるＤＮＡ  ｓｔａｒ  Ｍｅ
ｇＡｌｉｇｎｓ（登録商標）というソフトウェアを使用して並べた、Ｒｉｚｏｂｉｕｍ  
ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｕ１７２２７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｊ０５００３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、Ａｃｉｎｅｔｏ
ｂａｃｔｅｒ種  ＲＡ３８４９株（Ｌ３７７６１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、Ｒｈｏ
ｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ（Ｌ１７０４９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
、およびＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（Ｌ０７８９３）（
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）からのＰＨＢ合成酵素タンパク質の配列を示す。中程度の（ｍ
ｏｄｅｒａｔｅ）縮重がある保存領域として領域ＩおよびＩＩを選んだが、それは約４０
０塩基対（「ｂｐ」）のポリメラーゼ連鎖反応法（「ＰＣＲ」）産物をもたらす位置にあ
った。
図２は、プラスミドｐＥＢＩ中の４０８ｂｐ挿入断片の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６）。
図３は、スフィンゴモナス・エロデアのｐｈａＣ遺伝子中の内部欠失をクローン化し、
構築するために使用するステップの模式図である。
図４は、ｐｈａＣ領域の配列を示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）。ＰｓｔＩに対する制
限酵素部位（ＣＴＧＣＡＧ）には下線を引いてある。プライマー結合部位を、矢印で示す
。ｐｈａＣ遺伝子の部分は、最初のＰｓｔＩ部位からＴＧＡ終止コドンまで延びている（
太字）。変異株で欠失している塩基は、字間をあけて並べてある。ＸｂａＩ部位（ＴＣＴ
ＡＧＡ、二重下線）を、本文中で述べたように、変異株の欠失領域と置換する。
図５は、変異させたｐｈａＣ遺伝子の、スフィンゴモナス・エロデア染色体への相同的
組換え、および染色体中に無処置のまたは変異させたｐｈａＣ遺伝子を残すようにした、
組み込まれたベクターの切除の概略図である。
図６は、プラスミドｐＬＯ２の説明図である。
図７は、ｐｈａＣ欠失を含むベクターの、スフィンゴモナス・エロデア染色体への組込
みを説明する概略図である。
図８は、１０Ｌ発酵物からのブロスサンプルを培養することによって求められた、細胞
数のグラフ表示である。
図９は、ＥｃｏＲＩを用いて消化させ、ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子に対す
るプローブとハイブリダイズさせたスフィンゴモナスゲノムＤＮＡ調製物のサザンハイブ
リダイゼーションを示す。レーン１および２は、サイズマーカーを含む（それぞれ、λ  
ＨｉｎｄＩＩＩ、λ  ＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩ）。レーン３〜６は、スフィンゴモナ
ス種のＡＴＣＣ  ５３１５９、３１４６１、３１５５５、および３１９６１株からのゲノ
ムＤＮＡ消化物を含む。
図１０は、ＡＴＣＣ  ５３１５９のｐｈａＣ遺伝子、および隣接領域のＤＮＡ配列であ
る（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）。ＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃ）、ＥｃｏＲＩ（ｇａａｔｔ
ｃ）、およびＮｏｔＩ（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）に対する制限酵素部位には下線、プライマー
重複部位には二重下線を引いてある。プライマー部位を矢印で示す。ｐｈａＣ遺伝子は、
太字で強調してある。
図１１は、ｐｈａＣ領域の遺伝子地図およびＰＣＲ増幅のためのプライマーを示す。
図１２は、ＰＣＲを用いて、ｐｈａＣに隣接する領域のみを含み、ｐｈａＣ遺伝子全体
を欠く生成物を構築するクローニング戦略を示す。
図１３は、透過率に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
図１４は、ゲル強度に対する水酸化カリウム濃度の効果のグラフである。
図１５は、透過率に対するカルゴン（Ｃａｒｇｏｎ）濃度の効果のグラフである。
図１６は、ゲル強度に対するカルゴン濃度の効果のグラフである。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、ＰＨＢ合成を不活性化させる無発現変異により内部の貯蔵高分子であるポリ
ヒドロキシ酪酸（「ＰＨＢ」）を合成する能力に欠失があるスフィンゴモナス属の、遺伝
子操作株に関する。本発明によるＰＨＢ欠陥性のスフィンゴモナス変異株は、当分野でよ
く知られた比濁法によって定性的に決定されるところの、ＰＨＢを含まない、商業的に有
用なスフィンガンの合成が可能である（以下の実施例４、および米国特許第５，３００，
４２９号（その内容を参照により組み込む）を参照のこと）。ＰＨＢは、スフィンゴモナ
スにおいて、最適濃度のスフィンガンを産生する条件と同様の、高炭素および低窒素の条
件下で細胞内に蓄積する貯蔵高分子である。
【００２４】
ＰＨＢの合成は、いくつかの生物で研究されており、少なくとも３種のＰＨＢ合成遺伝
子が同定されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ，Ｊ．およびＥ．Ａ．Ｄａｗｅｓ、Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ  ５４：４５０〜７２（１９９０年））。ＰＨＢは、アセチル補酵素
Ａ（ＣｏＡ）から、３つのステップで誘導される。第１のステップは、３−ケトチオラー
ゼ（ｐｈａＡ）によって触媒され、アセトアセチルＣｏＡが形成される。第２のステップ
では、酵素アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ（ｐｈａＢ）が、アセトアセチルＣｏＡを
、β−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換し、それが最終的に、第３のステップでＰＨＢ合
成酵素（ｐｈａＣ）によって重合化され、ＰＨＢが形成される。ポリヒドロキシ酪酸合成
に必要とされるタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子、すなわち、ｐｈａＡ、
ｐｈａＢ、またはｐｈａＣを、選択的に変異させるあるいは欠失させる変異により、ＰＨ
Ｂ欠失スフィンゴモナス株を得ることが可能である。
【００２５】
例えば、本明細書に記載するスフィンゴモナス変異株は、少なくとも次の２種の変異の
結果である。（１）ＰＨＢの産生をブロックし、スフィンガン産生を減少させるという予
期せぬ結果を伴う、ＰＨＢ合成酵素をコードするｐｈａＣ遺伝子の欠失、または同遺伝子
内の欠失、（２）スフィンガン産生を回復させる自然突然変異。本発明はまた、スフィン
ゴモナス変異株の、プラスミドＤＮＡを取り込む能力を増進させる自然突然変異、すなわ
ちスフィンゴモナス・エロデアにおけるＳ−６０ｗｔｃ変異を含む、所望により行う事前
変異も提供する。
【００２６】
さらに、本発明は、キレート剤、苛性剤、または酸化剤、ならびに細胞溶解およびタン
パク質消化のための酵素を使用して、スフィンゴモナス変異株によって産生される、ＰＨ
Ｂ欠失ゲランおよび他のスフィンガンを清澄化する方法を開示する。本発明はまた、ＰＨ
Ｂ欠失および／または清澄化されたスフィンガンを含む食品または工業製品も開示する。
【００２７】
本発明の詳細を示すために、スフィンゴモナス・エロデアおよびスフィンゴモナス種  
ＡＴＣＣ  ５３１５９の遺伝子操作に関与するステップを説明する。しかし、以下に言及
するように、本発明は、スフィンゴモナス・エロデアおよびスフィンゴモナス種  ＡＴＣ
Ｃ  ５３１５９の操作に限定されず、またＰＨＢの合成に必要とされるタンパク質をコー
ドするいかなる特定の遺伝子の操作にも限定されない。
【００２８】
タンパク質をコードするｐｈａＣの２つの保存領域から設計された縮重プライマーを用
いるＰＣＲによって、Ｓ．エロデア株、ＡＴＣＣ  ３１４６１、ｐｈａＣ遺伝子の内部フ
ラグメントを得た。図２に示すこのフラグメントのヌクレオチド配列を利用して、ｐｈａ
Ｃ遺伝子および３’隣接配列の大きな部分の単離を可能にする逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ
ＰＣＲ）のためのプライマーを設計した。一般に、逆ＰＣＲの技術は、配向がその本来
の向きとは逆方向である、当該のヌクレオチドの隣接領域をクローン化する（図３参照）
。本来の配向の逆ＰＣＲフラグメントを配列するクローン化プロセスにより、２３２塩基
対（「ｂｐ」）の欠失がもたらされた。このフラグメントを染色体のｐｈａＣ遺伝子と対
立的に交換（ａｌｌｅｌｉｃ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）し、Ｓ．エロデアにおけるＰＨＢ産生
を失わせた。２３２ｂｐの内部欠失により、ゲラン産生を減少させるという予期せぬ効果
がもたらされた。
【００２９】
ゲラン産生の回復を伴う自然発生的誘導体を、大規模増殖させたＳ．ｅｌｏｄｅａ変異
株から単離した。本発明のＰＨＢ欠陥性誘導体は、外来ＤＮＡを含まず、および天然の染
色体からの２３２ｂｐの欠失、および特徴付けられていない自然突然変異を含む。ＰＤＧ
−１およびＰＤＧ−３株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎに寄託され、それぞれＡＴＣＣ  Ｎｏ．        、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．        
と名付けられている。
【００３０】
特定の分子生物学技術、すなわちスフィンゴモナス変異株を産生するために使用する逆
ＰＣＲおよび欠失変異は、ＰＨＢ産生では不可欠ではない。スフィンゴモナス変異株を産
生するために通常の分子生物学技術を使用することは、当分野の技術者の知るところであ
る。異なるスフィンゴモナス株においてｐｈａＣ類似の遺伝子を変異させるために使用で
きる他の有用な分子生物学技術には、これだけには限らないが、トランスポゾン変異誘発
、点変異、および挿入配列（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）変異がある。
【００３１】
ｐｈａＣ遺伝子は、ＰＨＢ合成経路における唯一の遺伝子である。したがって、ＰＨＢ
合成経路に関与する他の遺伝子を選択的に変異、または欠失させることによって、所望の
表現型をもつ、すなわちＰＨＢの産生に欠失があるスフィンゴモナス変異株を産生するこ
とが可能である。所望の表現型を得るために選択的に変異、または欠失させることができ
る当該の遺伝子には、これだけには限らないが、ｐｈａＡ（３−ケトチオラーゼ）および
ｐｈａＢ（アセトアセチルＣｏＡレダクターゼ）がある。
【００３２】
スフィンゴモナス変異株を作り出した後、それを発酵ブロスとして知られる水溶液中で
、増殖または発酵させて、スフィンガンがカプセル多糖として分泌されるようにする。変
異株としてのＰＨＢ欠失スフィンゴモナス変異株を発酵させた後、当分野でよく知られた
技術を用いて、このブロスを低温殺菌し、スフィンガンをイソプロパノールなどのアルコ
ールで沈殿させることによって、スフィンガンを調製することができる。
【００３３】
好ましくは、発酵後、スフィンガンを清澄化し、発酵ブロス環境の一部である懸濁した
固形物および細胞片から単離し、ＰＨＢ欠失清澄化されたスフィンガンを得ることができ
る。さらに、本発明の清澄化プロセスは、上記のＰＨＢ欠陥性スフィンガン以外にもいか
なるスフィンガン株にも適用することができる。本明細書に述べるように、清澄化プロセ
スは、発酵ブロスを加熱すること、および発酵ブロスを１種または複数のキレート剤、１
種または複数の苛性剤あるいは酸化剤、あるいはそれらの混合物で処理し、次いでリゾチ
ーム酵素および／またはいずれかのプロテアーゼ酵素で処理することを含む。
【００３４】
特にゲランについては、本発明の清澄化プロセスと組み合わせた、ＰＨＢ産生に欠失が
あるＳ．エロデア変異株は、高アシル型の清澄化ゲランを産生できるようになる。この変
異株およびプロセスから得られるゲランは、デザートのゼリー、菓子、飲料などを製造す
るのに有用な、高い透明度と、高いゲル強度を示す。
【００３５】
以下で「第１のプロトコル」と呼ぶ本発明の一実施形態では、スフィンガン溶液を所望
により１種または複数の界面活性剤、１種または複数のキレート剤、１種または複数の苛
性剤あるいは酸化剤、あるいはそれらの混合物で処理すること、およびそれに続いて１種
または複数のいずれかのリゾチーム酵素および／または１種または複数のいずれかのプロ
テアーゼ酵素で処理することを含むプロセスによって、スフィンガンの水溶液を清澄化す
ることができる。
【００３６】
以下で「第２のプロトコル」と呼ぶ本発明の別の実施形態では、スフィンガン溶液を１
種または複数のキレート剤、続いて１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素、続いて
１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤、続いて１種または複数のいずれかのプロテアー
ゼ酵素またはプロテアーゼ酵素の混合物で処理することを含むプロセスによって、スフィ
ンガンの水溶液を清澄化することができる。
【００３７】
第１のプロトコルでは、本発明のプロセスを、以下のように段階的に実施することがで
きる。スフィンガン溶液を、最初に１種または複数のキレート剤、所望により１種または
複数の界面活性剤、１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤あるいはそれらの混合物で処
理し、続いて１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素および／またはいずれかのプロ
テアーゼ酵素で処理する。第２のプロトコルでは、次の段階的プロセスを実施することが
できる。スフィンガン溶液を、最初に１種または複数のキレート剤、続いて１種または複
数のいずれかのリゾチーム酵素、続いて１種または複数の苛性剤あるいは酸化剤で処理し
、続いて１種または複数のいずれかのプロテアーゼ酵素で処理するという順序である。
【００３８】
有利には、本明細書に述べる清澄化されたスフィンガン溶液を生成する方法は、望むな
ら、適当な希釈の後に、さらに（低温殺菌および沈殿以外に）化学的または物理的処理を
することなく使用できるスフィンガン溶液を提供する。いくつかの用途では、通常の技術
に従って、ブロスを低温殺菌すること、ブロスを所望のｐＨに調整すること、およびスフ
ィンガンをアルコール（すなわちイソプロピルアルコール）で沈殿させることによって、
スフィンガンを、これら清澄化されたスフィンガンブロスから単離することができる。
【００３９】
このスフィンガンを水に再水和および溶解することによって、実質上透明なスフィンガ
ン溶液がもたらされる。本発明による実質上透明なスフィンガン溶液（１％  ｗ／ｗ）は
、光線透過率が６０％より高く、好ましくは７０％より高く、もっとも好ましくは８０％
より高い。光線透過率は、通常の技術および装置（例えば、市販品として利用できる分光
光度計）を用いて、可視スペクトルのいかなる波長でも測定することができる。光線透過
率は通常、約６００ｎｍ〜約６５０ｎｍの波長で測定する。光線透過率は、未処理のブロ
ス、部分的に処理したブロス（例えば、１種または複数のキレート剤、１種または複数の
苛性剤あるいは酸化剤、キレート剤／苛性剤あるいはキレート剤／酸化剤の混合物のみで
処理したブロス、あるいは、リゾチームおよび／またはプロテアーゼ酵素のみで処理した
ブロス）、処理したブロス、あるいは再構成したスフィンガン溶液など、いくつかのタイ
プのスフィンガン溶液について求めることができる。光線透過率が６０％より高い、本明
細書に述べる実質上透明な溶液は、本発明による方法で処理したブロスから単離した、ス
フィンガンを約１重量％含む水溶液である。
【００４０】
本発明のプロセスを用いて清澄化することができるスフィンガン溶液には、栄養培地で
スフィンガンを産生する微生物を発酵させることによって得られるスフィンガンを含む完
全な発酵ブロス、単離したスフィンガンを水性の溶媒に加えることによって得られる溶液
、および部分的に精製したスフィンガン溶液がある。本発明のプロセスで有用な、望まし
くない発酵固形物を含むスフィンガンの水溶液は、溶液の総重量に対して約０．０１重量
％〜約１０重量％のスフィンガンを含むことができる。本発明を実施する際には、いかな
る既知のスフィンガンを含むいかなる水溶液も使用することができる。
【００４１】
本発明のいずれかの清澄化プロセスの第１のステップは、ジャケット付きタンク中での
温度調節、直接蒸気噴射などの通常の技術によって、スフィンガン溶液を清澄化温度に加
熱することを含む。直接蒸気噴射は、加熱時間を最小限にするために好ましい。清澄化温
度は、約３０℃から約７０℃、好ましくは約５０℃から約６０℃の範囲である。スフィン
ガン溶液を所望の温度に加熱するために必要な時間の長さは、処理するスフィンガン溶液
のサイズおよび体積に応じてかなり変わってくる。例えば、体積が小さい（例えば５０ｍ
ｌ）のスフィンガン溶液の温度を室温から約６０℃まで上昇させるためには、数分しかか
からないのに対し、（例えば、バッチ処理で存在する可能性がある）４０，０００リット
ルの溶液の温度を同様に上昇させるためには、数時間かかる可能性がある。
【００４２】
本発明のプロセスの次のステップは、２つのプロトコルのうちの１つに従って、スフィ
ンガン水溶液を、少なくとも１種のキレート剤、少なくとも１種の苛性剤または酸化剤、
あるいはそれらの混合物から選択される清澄化剤で処理することを含む。あるいは、スフ
ィンガンブロスを上記の清澄化温度に加熱するのと同時に、清澄化剤を加えてもよい。
【００４３】
第１のプロトコルでは、次のステップは、１種または複数の苛性剤または酸化剤が存在
するスフィンガン溶液に１種または複数のキレート剤を加えることである。通常、１種ま
たは複数のキレート剤、および１種または複数の苛性／酸化剤への接触時間は、それぞれ
約０．５時間から約２時間ずつ、好ましくは１種または複数のキレート剤に１時間、１種
または複数の苛性または酸化剤に約０．５から約１．０時間の範囲である。通常、１種ま
たは複数の苛性剤または酸化剤を、約０ｇ／Ｌから約２ｇ／Ｌ、好ましくは約０．５ｇ／
Ｌから約１．５ｇ／Ｌの範囲の濃度で、スフィンガン溶液に加える。通常、１種または複
数のキレート剤を、約０ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ（「ｐｐｍ」）〜約３００
０ｐｐｍ、好ましくは約１０００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの範囲の濃度でスフィンガン
溶液に加える。
【００４４】
第１のプロトコルでは、清澄化剤で処理した後、スフィンガンブロスを、酵素処理のス
テップにかける。このステップでは、酵素リゾチームおよび／またはプロテアーゼを、ス
フィンガンブロスに、別々にまたは同時に加える。通常、これらの酵素は、スフィンガン
ブロスに、少なくともそれぞれ０．５時間から８時間ずつ、好ましくは少なくともそれぞ
れ１時間ずつ、最も好ましくは少なくともそれぞれ２時間ずつの範囲の時間接触させる。
通常のリゾチーム濃度は、約１１，０００ＭＣＧ単位／Ｌから約４４，０００ＭＣＧ単位
／Ｌ、好ましくは約２０，０００ＭＣＧ単位／Ｌから約２５，０００ＭＣＧ単位／Ｌの範
囲であり、通常のプロテアーゼ濃度は、約６５，０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌから約２６，
０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌ、好ましくは約１００，０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌから約１５
０，０００Ｄｅｌｆｔ単位／Ｌの範囲である。本出願では、「ＭＣＧ単位」とは、Ｇｅｎ
ｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．によって記載されるように、ｐＨ６
．６かつ３７℃で、参照基準と比較したＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉ
ｃｕｓの溶解率を意味し、同様に、用語「Ｄｅｌｆｔ単位」とは、販売元であるＧｅｎｅ
ｎｃｏｒによって提供される溶液中にある場合の吸光率（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｅｘｔｉｎｃ
ｔｉｏｎ）に関する特異的分析結果を意味する。
【００４５】
酵素処理ステップで使用するこれらの酵素は、固形状の細胞片を可溶性化合物に分解し
、その結果、スフィンガン溶液の透過率が向上し、清澄化プロセスの助けとなる。このプ
ロセスで使用するのに適したプロテアーゼ酵素は、細菌、真菌、または植物が起源の酸性
、中性、またはアルカリ性のプロテアーゼである。本発明のプロセスで有用な酸性のプロ
テアーゼ酵素の例には、これだけには限らないが、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などア
スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の微生物によって産生されるプロテアーゼが
ある。本発明のプロセスで有用な中性のプロテアーゼ酵素には、これだけには限らないが
、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ
）などのプロテアーゼがある。本発明のプロセスで有用なアルカリ性のプロテアーゼ酵素
には、これだけには限らないが、Ｂ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニ
ホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびＢ．プミリス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｉｓ
）などバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物、ならびにＳ．フラジア（Ｓ．ｆｒａｄ
ｉａｅ）、Ｓ．グリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ）およびＳ．レクツス（Ｓ．ｒｅｃｔｕ
ｓ）など、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によって合成されるプロテ
アーゼ、ならびにサブチロペプチダーゼ（ｓｕｂｔｉｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）Ａおよび
サブチロペプチダーゼＢなどのプロテアーゼを含めて、サブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ｉｎ）Ｎｏｖｏ、サブチリシンＣａｒｓｂｅｒｇなどサブチリシンから得られるプロテア
ーゼがある。このプロセスで使用するのに適したリゾチームには、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）からの
Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）リゾチーム、あるいは植物、動物、または微生物を起源
として得ることができるいずれかのリゾチームがある。本発明で使用するどのプロテアー
ゼ酵素またはリゾチームの起源も、重大ではない。これらの酵素およびこれらの酵素を得
る方法は、当技術分野でよく知られている。
【００４６】
上の第１のプロトコルで述べたように、酵素処理（リゾチーム酵素および／またはプロ
テアーゼ酵素による処理）を含む酵素は、同時に加えても別々に加えてもよい。同時処理
は、処理の間、両方の酵素がスフィンガン溶液に存在するという条件で、プロテアーゼ酵
素およびリゾチーム酵素をスフィンガン溶液にいかなる順序で、いかなる時間加えてもよ
いことを意味する。同時に加える場合、本発明の酵素処理プロセスは、リゾチーム酵素お
よびプロテアーゼ酵素の両方が活性であり、所望の酵素作用をもたらすような条件下で行
う。この実施形態の同時酵素処理プロセスは、約３０℃から約７０℃の温度、約５から約
９、好ましく約６から８のｐＨで行うことができる。この実施形態の特定の温度およびｐ
Ｈ範囲は、使用する酵素に応じて異なる可能性があるのに対し、この同時実施形態では、
リゾチーム酵素およびプロテアーゼ酵素（酸性、中性またはアルカリ性のプロテアーゼ）
が、スフィンガン溶液を清澄化するために許容できる活性レベルを示すように、本発明の
プロセスを比較的穏やかな温度で、ほぼ中性の条件で行う。
【００４７】
いずれかのリゾチームおよび／またはプロテアーゼ酵素をスフィンガン溶液に別々に加
えるようにして、酵素処理を行うことが好ましい。各酵素を、それぞれの最適ｐＨ条件下
、すなわちリゾチームでは酸性から中性ｐＨ範囲（約３から約７．５のｐＨ範囲）、プロ
テアーゼでは中性から塩基性ｐＨ範囲（約６．５から約９のｐＨ範囲）でスフィンガン溶
液に別々に加えることが最も好ましい。異なるリゾチームおよびプロテアーゼ酵素では、
最適清澄化活性を示す温度およびｐＨは、異なる可能性がある。さらに、酵素処理で使用
するリゾチーム酵素とプロテアーゼ酵素との選択をしなければならない場合、酵素処理が
１種または複数のプロテアーゼ酵素を含むことが好ましい。
【００４８】
第２のプロトコルでは、キレートステップの後、１種または複数のいずれかのリゾチー
ム酵素での酵素処理、それに続いて１種または複数の苛性または酸化剤処理、続いて１種
または複数のいずれかのプロテアーゼ酵素処理を行う。上で例示したように、酵素処理は
、１種または複数のリゾチーム酵素と１種または複数のプロテアーゼ酵素の２つに分かれ
る。二者択一的なこの順序づけは、１種または複数のいずれかのリゾチーム酵素をその好
ましい中性から酸性ｐＨ条件下で作用できることを可能にし、１種または複数のいずれか
のプロテアーゼ酵素をその好ましい中性から塩基性ｐＨ条件下で作用できることを可能に
する。第２のプロトコルを実施する際に、上記の第１のプロトコルと同様のリゾチーム酵
素およびプロテアーゼ酵素およびキレート剤、界面活性剤、ならびに苛性剤または酸化剤
を使用することができる。
【００４９】
スフィンガン溶液の攪拌は必須ではないが、ふさわしければ、固形物の不適切な沈殿を
防止し酵素との接触を促進するために、酵素のスフィンガン溶液を穏やかにまたは定期的
にかき回すまたはかき混ぜる。
【００５０】
本発明のプロセスで使用するのに適したキレート剤は、金属イオンとともに多歯状突起
を有する（ｐｏｌｙ−ｄｅｎｔａｔｅ）複合体を形成することによってスフィンガン溶液
中で多価の金属イオン（例えばＭｇ＋２、Ｃａ＋２など）を封鎖することができ、金属イ
オンとともに沈殿物を形成するあるいは金属イオンを吸着する化合物または組成物である
。キレート剤は、水または水−アルコールに溶ける化合物または組成物であり、アルカリ
金属またはアルカリ土類の有機酸および／または無機酸の塩、あるいは塩基性（アミンを
含有する）有機化合物の有機／無機酸塩、ならびに有機酸および／または無機酸自体ある
いは塩基性化合物自体であることが好ましい。本発明のプロセスで有用な他のキレート剤
は、陽イオン交換樹脂および炭酸塩および炭酸塩である。本発明のプロセスで特に有用な
、塩の化合物および組成物には、エチレンジアミン四酢酸、リン酸、メタリン酸、炭酸、
クエン酸、酒石酸、グルコン酸、グルタミン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、メタリン酸、
糖酸、エチレングリコール−ｂｉｓ−（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ
’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、エチレンジアミン、２，３−ジアミノブタン、１，２−ジアミ
ノシクロヘキサン、トリアミノトリエチルアミンなどの塩がある。有用な塩として、適当
な、上記の酸の一、二、三および／または四金属塩、ならびに上記の塩基の一、二、三酸
塩を挙げることができる。好ましくは、本発明のプロセスで使用するキレート剤には、エ
チレンジアミン四酢酸、クエン酸、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、炭酸、メタリン酸
、およびエチレンジアミンの塩を含む。有用なキレート剤の例には、これだけには限らな
いが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、エチ
レンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四カリウム、クエン酸三ナト
リウム、クエン酸三カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸カリウム
、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリ
ウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム
、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸
カリウム、重炭酸カリウム、陽イオン交換樹脂、エチレンジアミン二塩酸、エチレンジア
ミン二酢酸、エチレンジアミンリチウム塩、エチレンジアミンジヒドロヨウ素などの塩が
ある。キレート剤としてヘキサメタリン酸ナトリウムを使用することが、より好ましい。
【００５１】
上記のプロトコルで述べたように、最終ゲラン生成物の透過率をさらに向上させるため
に、苛性剤、酸化剤、およびキレート剤と組み合わせて、場合によっては界面活性剤を使
用することができる。本発明のプロセスで使用するのに適した界面活性剤は、親水性およ
び疎水性物質（固体または液体）の存在下で、水性のエマルジョンを形成することができ
る化合物または組成物である。界面活性剤は、水または水−アルコールに溶ける化合物ま
たは組成物が好ましい。有用な界面活性剤の例には、これだけには限らないが、ＳＤＳ、
モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標）、ＩＣＩ
Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、これだけには限ら
ないがＳＤＳ、レシチン、モノグリセリド、モノグリセリドの酒石酸エステル、（例えば
一ナトリウム塩としての）リン酸モノグリセリド、乳酸モノグリセリド、アセチル化モノ
グリセリド、コハク酸モノグリセリド、エトキシ化モノグリセリド、ソルビタンエステル
、ポリソルベート、ポリグリセリンエステル、ショ糖エステル、ステアロイル乳酸ナトリ
ウム、プロピレングリコールエステルなどがある。
【００５２】
所望により界面活性剤を、１種または複数のキレート剤、あるいは１種または複数の苛
性剤または酸化剤で処理する間のいずれかの時期に、スフィンガンブロスに加え、それぞ
れ約０．５時間から約８時間、好ましくは約２時間の時間接触させる。通常、界面活性剤
を、スフィンガン溶液に、約０．０ｇ／Ｌから約３．０ｇ／Ｌ、好ましくは約０．１ｇ／
Ｌから約１．０ｇ／Ｌの範囲の濃度で加える。通常、１種または複数の界面活性剤を、約
０ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ（「ｐｐｍ」）から約３０００ｐｐｍ、好ましく
は約３００ｐｐｍから約１０００ｐｐｍの範囲の濃度でスフィンガン溶液に加える。
【００５３】
本発明のプロセスで使用するのに適した苛性剤には、これだけには限らないが、水酸化
カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸三ナトリウムなどがある。水酸化カリウムが好まし
い苛性剤である。あるいは、酸化剤を、苛性剤の代わりに使用することもできる。本発明
の清澄化プロセスで使用できる酸化剤には、次亜塩素酸ナトリウムまたは他の次亜塩素酸
塩、二酸化塩素、過酸化水素、過酢酸、オゾン、および他の当技術分野でよく知られた酸
化剤がある。本発明では、好ましい酸化剤は、次亜塩素酸ナトリウムである。
【００５４】
スフィンガン溶液を１種または複数のキレート剤、１種または複数の界面活性剤、１種
または複数の苛性剤または酸化剤あるいはそれらの混合物で処理することによってもたら
される清澄化の程度は、酵素濃度またはその後の酵素処理を完了させるために必要とされ
る時間に影響を与える可能性があることに留意すべきである。例えば、このプロセスで使
用する１種または複数のキレート剤、１種または複数の界面活性剤、１種または複数の苛
性剤または酸化剤あるいはそれらの混合物の量を増加させると、使用する酵素の量および
／またはスフィンガン溶液の清澄化をもたらすのに必要な時間を減少させることができる
。本明細書に記載する清澄化されたＰＨＢ欠失スフィンガンの産生を最適化するためには
、１種または複数のキレート剤、１種または複数の界面活性剤、１種または複数の苛性剤
または酸化剤あるいはそれらの混合物の濃度および処理時間、および／またはリゾチーム
および／またはプロテアーゼの濃度および処理時間とを調整し、またバランスをとって、
スフィンガン溶液を得ることが好ましい。
【００５５】
本明細書に記載するＰＨＢ欠失および／または清澄化されたスフィンガンを、様々な食
料または工業用途で使用することができる。例えば、ＰＨＢ欠失および／または清澄化さ
れた、天然の（高アシル）ゲランなどのスフィンガンを使用して、デザートのゼリー、菓
子、ジャム、およびゼリー、飲料、フィルム、コーティングなどの食品の、味、感触、安
定性および外観を向上させることができる。追加の例として、ＰＨＢ欠失および／または
清澄化された、Ｓ−６５７などのスフィンガンには、油田掘削またはセメントシステムな
どの工業用途における流動学的モディファイアーとしての向上された有効性を見出すこと
ができる。本発明の他のＰＨＢ欠失および／または清澄化されたスフィンガンにはまた、
食品および工業の両方におけるより広い範囲の用途も見出されることとなるであろう。
【００５６】
以下の実施例は、本発明の例示を提供するものであり、いずれにせよ本発明の範囲を限
定するものと誤解されるべきものではない。
【実施例１】
【００５７】
スフィンゴモナス・エロデアｐｈａＣフラグメントの作製
ＰＨＢ合成酵素遺伝子の高度に保存された領域を同定するため、別種の生物からのＰＨ
Ｂ合成酵素配列を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（「ＮＣＢＩ」）Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋから検索した。Ｒｈ
ｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（ｇｂ：Ｕ１７２２７）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐａｅｒｏｉｄｅｓ（ｇｂ：Ｌ１７０４９）（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：４）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（ｇｂ：０
７８９３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ
（ｇｂ：Ｊ０５００３）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、およびＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅ
ｒ種  ＲＡ３８４９株（ｇｂ：Ｌ３７７６１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）からの配列を
選択し、研究した。選択したＰＨＢ合成酵素遺伝子のタンパク質配列を、図１に並べて示
した。保存領域の中で、領域Ｉ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉのコドン４１１〜４１７）および
領域ＩＩ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉのコドン５３５〜５４１）をそれらの位置および比較的
低い縮重の程度に基づいて選択し、約４０８ｂｐのＰＣＲ生成物を得た。
【００５８】
縮重したＰＣＲプライマーを設計し、保存されるタンパク質配列およびスフィンゴモナ
ス・エロデア、ＡＴＣＣ  ３１４６１の明白なコドン選択に基づいた領域Ｉと領域ＩＩの
間の配列を増幅した。コドン選択は、Ｄｒ．Ｌｕｉｓ  Ｉｅｌｐｉ（未刊）によって配列
決定された、Ｓ．エロデア、ＡＴＣＣ  ３１４６１における細胞外多糖（ｅｘｏｐｏｌｙ
ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）生合成酵素をコードする領域からの、ならびにＳ−８８ゴムを産
生する（Ｙａｍａｚａｋｉ他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：２６７６〜２６８７（
１９９６年））密接に関連したスフィンゴモナスＡＴＣＣ  ３１５５４の細胞外多糖生合
成酵素の完全な遺伝子クラスターからの、５つの遺伝子におけるコドン使用頻度から推論
した。
【００５９】
ＰＨＡＤＧ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）と呼ばれるＮ−末端プライマーは、５’−Ａ
ＧＴＴクランプ領域（ｃｌａｍｐ  ｒｅｇｉｏｎ）、ＴＣＴＡＧＡ  ＸｂａＩ部位、およ
び領域Ｉを標的にするＴＴＣ  ＧＡＹ  ＣＴＳ  ＣＴＳ  ＴＡＹ  ＴＧＧ  ＡＡＹ３’縮
重ハイブリダイズ領域を含んだ。ＰＨＡＤＧ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）と呼ばれる
Ｃ−末端プライマーは、５’−ＧＴＡＴクランプ、ＡＣＴＡＧＴ  ＳｐｅＩ部位、および
領域ＩＩを標的にするＣＣＡ  ＩＩＩ  ＳＧＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＣＣ縮重ハ
イブリダイズ領域を含んだ。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０では、「Ｉ」はイノシン、すなわ
ち他のいかなる塩基、すなわちＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧとも適合性があるヌクレオチドを意
味する。
【００６０】
プライマーＰＨＡＤＧ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）およびＰＨＡＤＧ７（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：１０）を、鋳型の働きをする非ムコイド株であるＧｐｓ３１からの染色体ＤＮ
Ａと共に、ＰＣＲ反応で利用した。Ｇｐｓ３１は、Ｓ−６０ゲランを産生しない変異株で
ある。Ｔａｑポリメラーゼを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（
Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によるＴａｑ  Ｓｔａｒｔ（登録商標）抗体とともに使用す
ることにより、１００μｌの反応体積中に各ｄＮＴＰ  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ４ｍＭ
、および各プライマー５０ピコモルを用いるＰＣＲのホットスタートが提供された。温度
プログラムは、９６℃で５分、次いで９６℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分を３０
サイクル、次いで７２℃で５分であり、その後４℃に冷却することによって反応を停止さ
せた。このＰＣＲ反応により、予測された４１６ｂｐ（４０８ｂｐ＋クランプ）サイズの
単一のバンドが得られた。ＸｂａＩおよびＳｐｅＩを用いた消化の後、フラグメントをＸ
ｂａＩで消化させた、ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａ
ｌ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（「ＣＩＡＰ」）で処理したｐＵＣ１
９ベクターにクローン化し、プラスミドｐＥＢ１を得た。両方の株からの４０８ｂｐ挿入
断片のＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を、図２に示す。このフラグメントは、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、およびＰｖｕＩＩに対する制限部位を含む。他のＰＨＢ合成酵素タ
ンパク質を用いた翻訳されたクローン化フラグメントのアラインメントにより、ＰＨＢ合
成酵素がクローン化されていることが示された。
【実施例２】
【００６１】
逆ＰＣＲによるｐｈａＣ欠失の構築
サザンハイブリダイゼーションを使用して、スフィンゴモナスＳ−６０  ｐｈａＣ遺伝
子のより大きなフラグメント、ただし逆ＰＣＲによって容易に再生するのにあまり大きす
ぎないもの、をもたらす適切な制限酵素を決定した。ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）（Ｖａｌ
ｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）ＤＮＡ精製キットに記載された方法に従って、Ｇｐ
ｓ３１から染色体ＤＮＡを単離した。ｐＥＢ１でクローン化した４０８ｂｐ挿入断片（Ｓ
ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）から作成したプローブを用いたサザン分析では、Ｓ．エロデアＤ
ＮＡのＰｓｔＩ消化物において、４０８ｂｐ  ｐｈａＣフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ
Ｏ：６）は、約２ｋｂのフラグメント中にあることが示された。
【００６２】
図２に示すように、４０８ｂｐ  スフィンゴモナスＳ−６０  ｐｈａＣフラグメント（
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の配列を用いて、外側を読むＰＣＲプライマーを選択した。プ
ライマーＰＨＡＣ１２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）は、クランプ５’ＧＴＴＣ、Ｘｂａ
Ｉ部位ＴＣＴＡＧＡ、およびハイブリダイズ領域ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴ
Ｇ  ＴＴＧ  ＴＣ３’をもち、タンパク質をコードするｐｈａＣのＮ末端側（ｔｏｗａｒ
ｄ）を読む。プライマーＰＨＡＣ１１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、クランプ５’Ｇ
ＴＴＣ、ＸｂａＩ部位ＴＣＴＡＧＡ、およびハイブリダイズ領域ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＣＴＣ
ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＴＣ３’をもち、タンパク質をコードするｐｈａＣのＣ末
端側（ｔｏｗａｒｄ）を読む。Ｓ．ｅｌｏｄｅａ染色体ＤＮＡをＰｓｔＩで消化し、ＤＮ
Ａ０．５μｇを体積２００μｌ中で結合させ、環状にさせた。直鎖状のＤＮＡ分子を作成
するためにＫｐｎＩ消化物を逆ＰＣＲ反応において鋳型として使用して、図３に示すよう
に、４０８ｂｐ  ｐｈａＣフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を隣接する領域の１
．７ｋｂフラグメントを作成した。
【００６３】
この１．７ｋｂフラグメントは、ＰｓｔＩ末端では本来の配向と比較すると逆転した配
向で結合した２つの隣接領域を含む。ＰｓｔＩ部位の切断により、これらの隣接領域がほ
ぼ同じサイズ、８５０ｂｐと９８０ｂｐであることが示された。このフラグメントを本来
の配向に配向し直し、同時に、欠失した元の４０８ｂｐクローンの大部分を有するフラグ
メントを作成するため、この１．７ｋｂフラグメントをＸｂａＩで消化させ、環状にさせ
るための希釈条件下でそれを結合させ、次いでＰｓｔＩで消化させた。得られたフラグメ
ントを、ＰｓｔＩで消化し、ＣＩＡＰ処理したｐＵＣ１９でクローン化し、ｐＥＢ４と名
付けた。
【実施例３】
【００６４】
ｐｈａＣクローンの配列決定
ｐＥＢ４中の１．７ｋｂ挿入断片を配列決定し、４０８ｂｐフラグメント（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：６）の配列と結合させた。結合させた１９２０ｂｐ  ＤＮＡ配列（ＳＥＱ  Ｉ
Ｄ  ＮＯ：７）を、図４に示す。この配列のＰｓｔＩ部位からＴＧＡ終止コドンまでの部
分（塩基１〜２０００）は、他のｐｈａＣ遺伝子のカルボキシ側２／３と相同なタンパク
質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）をコードする。配列アラインメントで、正確な遺伝子がク
ローン化されたことを確認した。
【００６５】
このｐｈａＣクローンは、４０８ｂｐセグメント内の２３２ｂｐの欠失、およびＸｂａ
Ｉ部位に相当する６ｂｐ、ＴＣＴＡＧＡの挿入があった。この欠失および挿入により、カ
ルボキシ末端を改変し、塩基対１１０２に新規の終止コドンを導入する、フレームシフト
変異が引き起こされた。
【実施例４】
【００６６】
組込みベクターの構築および相同的組換えによるスフィンゴモナスへの導入
ｐｈａＣ欠失変異を、スフィンゴモナス・エロデアに移送するために、プラスミドの構
築に適した宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中では複製することができるが、スフィ
ンゴモナス中では複製することができない「自殺」プラスミドを使用した。スフィンゴモ
ナスにおいて、このプラスミドによってコードされる抗生物質耐性について選択すること
により、相同的組換えの結果としてプラスミドが染色体に組み込まれているコロニーが同
定される。抗生物質耐性の喪失について選択することにより、図５に図示される、変異の
保持（すなわち、欠失）または野生型の遺伝子をもたらす可能性がある、複製された領域
が完全に再結合したコロニーが同定される。欠失を有するクローンと野生型ＤＮＡをもつ
クローンの区別は、形質発現（ＰＨＢ合成）によって決定することができる。ＰＨＢの形
質発現を測定するため、定性的な比濁法を用いた。ブロスのアリコート約１ｍｌをＣｌｏ
ｒｏｘ（登録商標）（Ｃｌｏｒｏｘ  Ｃｏ．，Ｏａｋｌａｎｄ，ＣＡ）９体積に加え、３
７℃で少なくとも４時間または終夜インキュベートした。白色沈殿の出現が、ＰＨＢの存
在を示す。
【００６７】
第２の交叉型組換え事象の検出を容易にするため、ポジティブ選択システム（ｐｏｓｉ
ｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）をＳ．エロデア用に適合させた。レバン
スクローゼをコードする枯草菌遺伝子であるｓａｃＢは、グラム陰性細菌に導入すること
ができる（Ｋａｍｏｕｎ．Ｓ．他、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：８０９〜８１６（
１９９２年）；Ｇａｙ，Ｐ．他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：９１８〜９２１（１
９８５年））。スクロース中でこうした細菌を増殖させると、細菌に対して毒性があるレ
バンの合成が促進される。したがって、ｓａｃＢ遺伝子がベクター中に存在すれば、スク
ロース中での成長を使用して、ベクターを失った分離株を同定することができる。
【００６８】
ｐＬＯ２プラスミドは、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｓｌａｔｅｒ  ａｔ  Ｃｅｒｅｏｎ，Ｍｏｎｓ
ａｎｔｏから入手した。ｐＬＯ２プラスミドは、図６に示されるように、カナマイシン耐
性のベクター上のｓａｃＢ遺伝子と、複製のＣｏＩＥＩ起点および導入のＲＰ４起点を含
む（Ｌｅｎｚ，Ｏ．他、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６：４３８５〜４３９３（１９９
４年）。ｐＬＯ２プラスミドを使用し、接合の自然のプロセスを通じて、遺伝子を導入す
ることができる。このプラスミドは、大腸菌中で複製することができるが、スフィンゴモ
ナス中では複製できず、また、プラスミドの可動化のための部位を含むが、導入機能は含
まない。つまり、ｐＬＯ２プラスミドは、移動可能であるが自己伝染可能ではない。接合
導入（ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）機能のための遺伝子は、第２のプラスミド
およびトランス機能によって与えられる。この実施例ではｐＬＯ２プラスミドを使用した
が、ｐＬＯ２プラスミドを使用することは重要ではない。当分野の技術者であれば、適当
な別のプラスミドを設計し、操作する方法や、エレクトロポレーション、形質転換などの
通常の技術を用いて、そのプラスミドをスフィンゴモナスに導入する方法は分かるであろ
う。同様に、選択マーカーとしてカナマイシンを使用することも、重要ではない。当分野
の技術者であれば、適切な別の選択マーカーを選ぶ方法は分かるであろう。
【００６９】
ｐｈａＣ欠失を含む１．７ｋｂ  ＰｓｔＩフラグメントを、ＰｓｔＩ消化ｐＬＯ２に結
合させ、ｐＬＯ２−ｐｈａＣｖまたはｐＥＢ１１と命名し、エレクトロポレーションを用
いる形質転換によって、大腸菌ＹＭＣ９（Ｆ−ΔｌａｃＵ１６９  ｔｈｉ  ｅｎｄＡ  ｈ
ｓｄＲ）に導入した。この大腸菌株を精製し、接合導入の機能を与える（Ｄｉｔｔａ他、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：７３４７〜７３５１（１９８０
年））プラスミドｐＲＫ２０１３を保有する大腸菌株ＪＺ２７９と一緒に、スフィンゴモ
ナス・エロデア株Ｓ−６０ｗｔｃと混合した。Ｓ−６０ｗｔｃは、Ｓ．エロデア、ＡＴＣ
Ｃ３１４６１株の誘導体であり、プラスミドＤＮＡの取り込みを増進させる能力をもつ自
然発生的分離株として選択された。定常期（終夜）培養株、すなわちＹＭＣ９／ｐＬＯ２
−ｐｈａＣΔ  １ｍｌ、ＪＺ２７９／ｐＲＫ２０１３  １ｍｌ、およびスフィンゴモナス
・エロデア２〜３ｍｌを用いて、接合導入を行った。培養株を混合し、フィルタ上で濃縮
し、続いてそれをＴＹＥペトリ皿（８ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母エキス、およ
び５ｇ／ｌ  塩化ナトリウム）に入れて３７℃で７時間インキュベートした。その後細胞
を脱イオン水に懸濁し、選択培地で培養した。約７時間インキュベートした後、Ｓ−６０
ｗｔｃのカナマイシン耐性組換え接合体を、ストレプトマイシン（大腸菌の逆選別のため
）２５μｇ／ｍｌおよびプラスミドを選択するためのカナマイシン  ７．５μｇ／ｍｌを
添加したＹＭ培地（酵母エキス３ｇ／Ｌ、麦芽エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン  ５ｇ／Ｌ、お
よびグルコース  １０ｇ／Ｌ）上で選択した。カナマイシン耐性によって測定されるよう
に、組込みは、１．５×１０−６の頻度で起こっていた。
【実施例５】
【００７０】
第２の交叉型欠失株の選択
２種のカナマイシン耐性組込み体を精製し、非選択性ＹＥＭＥ培地（０．２５％  酵母
エキス、０．０２５％麦芽エキス）に３回通し、その後７．５％スクロースで培養し、交
叉体について選択した。７つのカナマイシン感受性交叉体が得られたが、全てＰＨＢ陽性
であった。ＰＣＲ試験を用いて、ベクターｐｈａＣｖが、染色体のｐｈａＣ領域に挿入さ
れていることを実証し、また、野生型のｐｈａＣと比較したときの挿入断片の位置を決定
した。欠失の側面領域およびベクターの端部に相同的なプライマーを設計した。図７に示
すように、組換えは、次の（１）または（２）をもたらす２つの配向で起こる可能性があ
る。（１）ベクターの左側に欠失があるｐｈａＣ遺伝子があり、およびベクターの右側に
ｐｈａＣ遺伝子のフラグメントがあり、ＰＨＢ陰性のクローンをもたらすこととなる配向
、または（２）ベクターの左側に無処置のｐｈａＣ遺伝子があり、およびベクターの右側
にｐｈａＣｖがあり、ＰＨＢ陽性のクローンをもたらすこととなる配向。
【００７１】
６種のｐＬＯ２ｐｈａＣｖ単一交叉組込み体の試験により、すべてが、第２の、好まし
い可能性がある、ＰＨＢ陽性の配向であることが示された。欠失の片側における組換えに
ついて優先度が高い、あるいは、ＰＨＢ陽性株は、ＰＨＢ陰性の組換え体より増殖が早い
可能性が大いにある。第１の、ＰＨＢ陰性の配向であるあまり好ましくない方式でプラス
ミドが組み込まれたコロニーは、おそらく、変異株の変異型を保持する二重交叉をもたら
す好ましい部位で、第２の組換え現象が起こる可能性がある。
【００７２】
組換え接合体をＰＣＲで選別し、ＰＨＢ発現について試験し、第１の、またはＰＨＢ陰
性の配向の組込み体を同定した。ＰＣＲの結果では、試験した２４コロニーのうち、２１
コロニーがＰＨＢ陽性であり、３コロニーがＰＨＢ陰性構成体であることが示された。Ｐ
ＨＢ試験により結果を確認した。３つのＰＨＢ陰性株（３、１５、および２２）を選択し
、精製し、非選択条件下で３代継代増殖させ、スクロース中で培養した。それぞれの親か
らの５つのカナマイシン感受性コロニーのうち、１つはＰＨＢ陰性であった。したがって
、３つのＰＨＢ欠失カナマイシン感受性変異株を単離し、ＮＰＧ−１、ＮＰＧ−２、およ
びＮＰＧ−３と名付けた。
【実施例６】
【００７３】
ゲラン生合成のための変異株の特徴付け
ＮＰＧ−１、ＮＰＧ−２、およびＮＰＧ−３を、１４Ｌの発酵槽に送り込んだ発酵液１
０Ｌ中で試験し、化学的変異原性剤（米国特許第５，３００，４２９号）によって単離し
たＰＨＢ欠失変異株であるＬＰＧ−２と比較した。使用する発酵液および培地のステージ
は、ステージ２の培地をすべての接種ステージで使用すること以外は、米国特許第５，３
００，４２９号に記載されるものとほぼ同じであった。最終の培地に接種する前に、３つ
の接種ステージを使用した。移送体積は、２．５〜５％であった。ｐｒｏｍｏｓｏｙ０．
５ｇ／Ｌの代わりに、異なる有機窒素（０．４１ｇ／Ｌ、Ｑｕｅｓｔ  Ｎｚａｍｉｎｅ  
ＥＫＣ，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用した。接種ステージにおけるコーン
シロップの濃度は３．７５％ではなく３％であった。最終の１０Ｌ発酵液は、接種培地と
ほぼ同じであったが、含まれるリン酸塩が少なく（０．５ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）、ｐＨ
を必要に応じてＫＯＨを加えることによって調節した。無機窒素、ＮａＮＯ３（１．５ｇ
／Ｌ）と同様、有機窒素は、より高濃度（１．１  ｇ／Ｌ）であった。消泡剤Ｈ−６０−
Ｋを０．６ｍｌ／Ｌに加えた。コーンシロップの濃度は、３．８５％であった。最終ステ
ージの培地にカルシウムおよびマグネシウムを補足した脱イオン水を補って完全にした。
【００７４】
表１に示すように、全沈殿性物質（「ＴＰＭ」）および粘度に基づくと、ＮＰＧ変異株
は、ＬＰＧ−２よりもゲランの生成がはるかに少なかった。ブロスの粘度は、Ｂｒｏｏｋ
ｆｉｅｌｄ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒで、ｎｕｍｂｅｒ  ４の軸（ｓｐｉｎｄｌｅ）を用い
て、６０ｒｐｍで求めた。全沈殿性物質は、ブロスをオートクレーブで１０分間加熱し、
次いで２倍体積のイソプロパノールで沈殿させ、乾燥させることによって求めた。これら
の結果は再現性があった。発酵中のブロスサンプルの分析により、大量の有機酸が産生さ
れることが示された。したがって、ＮＰＧ変異株についてゲランの産生量が低いことは、
ＰＨＢ合成をせず、炭素数２および３の中間体、ならびに二酸化炭素に加水分解する炭水
化物の量が多いことと相関関係がある。
【００７５】
【表１】
0005624664.tif 000002
【実施例７】
【００７６】
復活したゲラン（ｇｅｌｌａｎ）産生性を有する変異体の単離
ＰＨＢ合成遮断による代謝中間体（例えば、有機酸）の蓄積は、ゲラン合成に悪影響を
及ぼす可能性がある。ゲラン合成を促進する培地での増殖中、ゲラン合成を正常なレベル
で進行させる補償変異を生じ得ることが予想された。１０Ｌの発酵液から一定分割量の発
酵ブロス（実施例６）を塗布し、細胞数を測定した（図８）。発酵終了近くで（すなわち
、４４時間から６９時間で）、約０．５％から２％の間でコロニーがＮＰＧ株よりも大き
く、かつより粘液性であることが認められた。これらのコロニーを精製し、振とうフラス
コ発酵液におけるＰＨＢおよびゲラン生産について試験した。新たな単離物はＰＨＢが欠
乏しており、元のＮＰＧ変異体よりも高収量のゲランを有していた。最良の補償変異体は
、総計ＬＰＧ−２と同等で野生型の８０％以上（凡そ１０〜１５％のＴＰＭ減少が、ＰＨ
Ｂの重量損失のためと予想される）の沈殿性物質を有した。これらの株は、ＰＤＧ変異体
と名付けた：ＰＤＧ−１はＮＰＧ−１から誘導され、ＰＤＧ−３はＮＰＧ−３から誘導さ
れる。各々の株は、ＰＨＢとゲラン生産について振とうフラスコ発酵液において評価され
た。
【００７７】
【表２】
0005624664.tif 000003
さらに、第２のバッチのＳ６０−ｗｔｃ、ＬＰＧ−２、ＰＤＧ−１およびＰＤＧ−３の
ブロス粘度を、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計を用い、４号のスピンドルで６０ｒｐｍにて
測定した。ブロス粘度を下表３に示す。
【００７８】
【表３】
0005624664.tif 000004
【００７９】
振とうフラスコに用いられた培地は、米国特許第５，３００，４２９号に記載されたも
のと同様であった。最初の接種にはＹＭ培地を含有した。第２および最終段階では、緩衝
用の高濃度のリン酸塩（Ｋ２ＨＰＯ４、２．８ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｇ／Ｌ）と
１．０ｇ／Ｌの有機窒素をも有する前記の培地を含む、５００ｍｌフラスコにつき１００
ｍｌとした。
【００８０】
理論に拘束されないが、新規変異体は、グルコースの有機酸への分解を制限する自然突
然変異体と思われる。発酵漕からのサイクル内サンプル分析は、ＰＤＧ−１およびＰＤＧ
−３による有機酸の産生が、対照株であるＳ−６０ｗｔｃおよびＬＰＧ−２とほぼ同じで
あることを示した。
【００８１】
ＰＤＧ−１株は、一貫してＴＰＭ＞１４ｇ／Ｌで良好な収量の高粘度ゲランを生産した
。
【００８２】
株の安定性をチェックし、特に自然ＰＤＧ−１変異体と、ゲラン低収量の元のＮＰＧ株
とを比較するために、これら培養液のプレート上におけるコロニーの形態を評価した。約
３７℃で約６０時間ＹＭ寒天上で増殖後、ＰＤＧ−１は、その親株のＮＰＧ−１よりも明
らかに異なる形態を示した。ＮＰＧ−１型形態を有するコロニーはＰＤＧ−１発酵液のブ
ロスに認められず、この株の安定性を示している。
【実施例８】
【００８３】
Ｓ．エロデア以外のスフィンゴモナス株における相同性ｐｈａＣ遺伝子の存在
ｐｈａＣに相同な遺伝子が、スフィンゴモナス・エロデア以外のスフィンゴモナス株に
確認され、それによりスフィンゴモナス・エロデア以外のスフィンゴモナス株においてＰ
ＨＢ欠失変異体が生成する可能性を証明した。
【００８４】
サザンＤＮＡハイブリッド形成を、４種のスフィンゴモナス株：デュウタン（ｄｉｕｔ
ａｎ）（Ｓ−６５７）を産生するＡＴＣＣ５３１５９、ウェラン（ｗｅｌａｎ）（Ｓ−１
３０）を産生するＡＴＣＣ３１５５５、ラムサン（ｒｈａｍｓａｎ）（Ｓ−１９４）を産
生するＡＴＣＣ３１９６１、対照としてゲラン（Ｓ−６０）を産生するＡＴＣＣ３１４６
１で実施した。ゲノムＤＮＡを各株から単離し、酵素ＥｃｏＲＩで消化した。消化された
ゲノムＤＮＡ（１μｇ）のサンプルを１％アガロースゲル上で分離し、中性条件下でＳｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｔｕｒｂｏｂｌｏｔｔｅｒ（登録商標）（
Ｎｅｗ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ州、Ｋｅｅｎｅ）を用いてキャピラリ−操作によりナイロン
膜に移した。
【００８５】
変性プライマーのＰＨＡＤＧ５およびＰＨＡＤＧ７を用いて（実施例１を参照）、ジゴ
キシゲニン標識プローブを、製造元のＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ社（スイス国）のプロトコルに従ってジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰを有す
るスフィンゴモナスＳ−６５７ｐｈａＣ遺伝子の内部領域のＰＣＲ増幅により調製した。
ハイブリッド形成は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（ドイツ、マンハイム）の
ＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ（登録商標）を用いて、製造元のプロトコルに従って中性条件下で
実施した。フィルタは、計算値Ｔｏｐｔより１０℃低い４４℃でハイブリッド形成した。
これらの条件により、９０％を超えて同一であるＤＮＡ分子のハイブリッド形成が生じる
と予想された（Ｂｉｒｒｅｎ、Ｂ．ら、編集Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、実験室
マニュアル、１９９７年）。ここに用いられる用語のＴｏｐｔは、Ｔｍ−２０として定義
され、式中Ｔｍは、式５０＋０．４１（％ＧＣ）−６００／プローブ長として定義され、
式中％ＧＣは６５％であり、プローブ長は４００個のヌクレオチドである。該フィルタを
、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４４℃、１５分間２回洗浄し、製造元のプロトコル（Ｒ
ｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）に従って抗ジゴキシゲニ
ン−アルカリホスファターゼ接合体およびジゴキシゲニン検出キットを用いて展開した。
【００８６】
ハイブリッド形成結果を図９に示す。予想された大きさ（２．６ｋＢ）のＥｃｏＲＩ消
化バンドがスフィンゴモナス株のＡＴＣＣ３１４６１において検出された。スフィンゴモ
ナス株のＡＴＣＣ５３１５９およびＡＴＣＣ３１９６１は、全く同じ大きさのバンドを生
成した。スフィンゴモナスＡＴＣＣＡＴＣＣ３１５５５は、ｐｈａＣプローブにハイブリ
ッド形成した２．４ｋＢのフラグメントを有した。斯様に、サザンＤＮＡハイブリッド形
成により、これら３種の株がｐｈａＣ様遺伝子を含み、ＰＨＢ欠失株が、ここに記載され
た方法に従って生成できることが確認された。
【実施例９】
【００８７】
ｐｈａＣ欠失のＡＴＣＣ５３１５９変異株の構築
組換えＤＮＡ技術を用いて、ｐｈａＣ遺伝子を完全に失ったスフィンゴモナスＡＴＣＣ
５３１５９の変異株を構築した。変異株の構築は、以下のように実施された：ｐｈａＣ遺
伝子の側面ＤＮＡ領域をＰＣＲにより増幅して自殺ベクターにクローン化し、側面ＰＣＲ
産物を含有する該自殺ベクターは、ＡＴＣＣ５３１５９細胞への接合により導入され、次
いでスフィンゴモナスＡＴＣＣ５３１５９染色体におけるｐｈａＣの直接上流または下流
の相同座における全プラスミドの組込みを、カナマイシン耐性（ベクターによりコード化
された）に対する選択により達成した。該染色体からのｐｈａＣ座プラスベクターＤＮＡ
の切除は、ベクター上にコード化されたショ糖感受性により選択された続く第２の交叉事
象の結果、生じた。
【００８８】
ｐｈａＣ遺伝子および側面領域を含有するクローン類を単離するために、ゲノムＤＮＡ
ライブラリを作成し、ＰＨＡＤＧ５プライマーおよびＰＨＡＤＧ７プライマーを用いてＰ
ＣＲにより選別した（上記実施例１を参照）。２つのゲノムライブラリが作成され、その
１つは、ベクターｐＺＥＲＯ−２にＮｏｔＩ制限酵素フラグメントを有し（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）、２つ目はｐＬＡＦＲ３にＳａｕ３Ａの
部分消化フラグメントを有する（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
６９：５７８９〜９４（１９８７））。１つの陽性クローンを、各ライブラリから単離し
た。これらプラスミドのＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメントがサブクローン化され、適切
なフラグメントが配列決定されて、ｐｈａＣ遺伝子および５’および３’の側面領域ＤＮ
Ａ配列を決定した。プラスミドｐ２１−７およびｐＪＣＳ１０４−２には、それぞれｐｈ
ａＣ遺伝子および側面領域の５’および３’の末端を含有する。
【００８９】
ｐｈａＣ遺伝子および側面領域ＤＮＡ配列を図１０に示す。遺伝子マップを図１１に示
す。オープンリーディングフレームは、開始および終止コドンの存在、並びにＢｏｒｏｄ
ｏｖｓｋｙ解析（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＱｕｅｓｔモジュール）およびＧｅｎｅ
ＭａｒｋのＰ＿ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ＿３．ｍａｔマトリックスを用いて、予想コード化
領域と組み合わせたＢＬＡＳＴ解析により決定した。該配列を、クローンｐ２１−７およ
びｐＪＣＳ１０４−２における挿入配列と結びつける。２つの配列間の接合部はＮｏｔＩ
部位にある。
【００９０】
図１２は、ｐｈａＣの側面領域のみを含み、出発コドンの第１のヌクレオチドから終止
コドンの最終ヌクレオチドまでの全ｐｈａＣ遺伝子（１７３７ｂｐ）を失ったｐＪＣＳ１
０５  １１２−１産物を作製するＰＣＲの使用法を示している。２種の外側プライマー（
プライマー１Ｘｂａとプライマー４Ｘｂａ）を、ｐｈａＣの上流および下流領域の間の所
望の連結部に伸びているプライマー（重複１）と一緒にした。プライマー配列を表４に示
す。
【００９１】
【表４】
0005624664.tif 000005
【００９２】
プラスミドｐＪＣＳ１０４−２およびｐ２１−７（各々２００ｎｇ）を、製造元のプロ
トコルに従ってプライマー１Ｘｂａとプライマー４Ｘｂａ（各々５０ピコモル）、重複プ
ライマー１（２ピコモル）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（カリフォ
ルニア州パロアルト）のＡｄｖａｎｔａｇｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２ＰＣＲキ
ットのｄＮＴＰ類およびＴａｑポリメラーゼに混合した。次に増幅は、マトリックスサー
モサイクラー中、９５℃で１分、９５℃で３０秒の５サイクル、４４℃で３０秒、６８℃
で２分、次いで９５℃で３０秒の２０サイクル、５３〜６８℃で３０秒、６８℃で２分、
次いで６８℃で３分の１サイクルで実施した。増幅されたＤＮＡフラグメントを、ゲルか
ら精製し、さらに同じプライマーで増幅してより多くの産物を生成した。増幅条件は、９
５℃で１分、９５℃で３０秒の２５サイクル、６４℃で３０秒、６８℃で２分、次いで６
８℃で１サイクルであった。次に１．１ｋＢバンドを、ＳＮＡＰゲルＰｕｒｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ  Ｋｉｔ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてゲルから単離し、トポ
イソメラーゼ、３’Ｔオーバーハングを有するベクターおよび化学的にコンピテントＴＯ
Ｐ１０細胞を用いることによりベクターｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社
）に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコルに従ってクローン化し、図１２に示されるｐ
ＪＣ１０５−１１２−１を形成した。
【００９３】
ｐＪＣ１０５−１１２−１からのｐｈａＣ欠失構築物を含有する１．１ｋＢのＸｂａＩ
フラグメントをゲル精製し、ＸｂａＩ消化ｐＬＯ２にクローン化した。２種の配位の挿入
物を回収し、ｐＪＣＳ１０６−５およびｐＪＣ１０６−１６と名付けた。
【００９４】
トランス結合によりＡＴＣＣ５３１５９に導入されたＡＴＣＣ５３１５９プラスミドｐ
ＪＣ１０６−５およびｐＪＣＳ１０６−１６のＰＨＢ欠失株を作製するために、上記の実
施例４に従ってマーカー交換が使用された。第１および第２の交叉欠失株の選択は、上記
の実施例４および５のとおりに進行した。すなわち、最初にカナマイシン耐性によって示
される組込みについて選択し、次いでショ糖上で培養してカナマイシン感受性交叉体を選
択する。該欠失交叉体（野生型に対する）は、診断用ＰＣＲにより検出され、ＮＰＤ−３
（ｐＪＣＳ１０６−５から誘導）およびＮＰＤ−６（ｐＪＣＳ１０６−１６から誘導）と
名付けた。
【００９５】
生じたＮＰＤ−３およびＮＰＤ−６株には、外来ＤＮＡの残留はなく正確にｐｈａＣの
染色体欠失体である。これら欠失株のガム収量は大きく減少したが、しかしガム産生を復
活させたサプレッサーが発酵増殖時に続いて単離された。
【００９６】
ＮＰＤ−３およびＮＰＤ−６はＳ−６５７合成を促進する条件下で増殖され、大きな粘
液性コロニーを有するサプレッサー株が、上記実施例７のゲラン合成に関して行われたと
おり選択された。これら大きな粘液性コロニーは、誘導されたコロニーによりＰＤＤ−３
およびＰＤＤ−６と名付け、ＰＨＢおよびＳ−６５７について分析した。ＰＤＤ−３株お
よびＰＤＤ−６株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎに保管が委託され、それぞれＡＴＣＣ番号  およびＡＴＣＣ番号  と名付けられてい
る。下表５は、ＰＤＤ−６が、その親株ＮＰＤ−６よりもより多くのガム生産を行うが、
また本質的にＰＨＢは生産しないことを示す。
【００９７】
【表５】
0005624664.tif 000006
【実施例１０】
【００９８】
透過度およびゲル強度に対する水酸化カリウム濃度の影響
苛性剤の水酸化カリウム（「ＫＯＨ」）濃度の影響が、最初のプロトコルとして上記に
概説したステップを含んで成る清澄プロセスで評価された。ＰＨＢ欠失変異体を含んで成
るゲラン発酵ブロスを前処理してＫＯＨの濃度を変えて１５分間混合し、次いでキレート
化剤として１０００ｐｐｍのカルゴン（Ｃａｌｇｏｎ）と１時間、引き続き２２ｐｐｍの
リゾチーム並びに２２０ｐｐｍのプロテアーゼ各々と５５℃で２時間混合した。ＫＯＨ濃
度を、約０．０ｇ／Ｌと約０．４５ｇ／Ｌとの間で変えて試験した。図１３に示すように
、透過度は、ＫＯＨの濃度を０．４５ｇ／Ｌに増すとほぼ２０％増加した（３１％の相対
的増加）。
【００９９】
ＴＡ−ＴＸ２  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）（Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ｔ
ｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州Ｓｃａｒｓｄａｌｅ）により、感圧プランジャ
ーによる調製ゲル表面割れに要する穿刺力量と距離という２つの指標の産物としてゲル強
度データを測定する。穿刺力は、負荷セルがゲル表面の割れ目を検出する場合に測定され
、また穿刺力は高さのパーセント変化として測定される。図１４に示されるように、穿刺
力に関するゲル強度は、被験ＫＯＨの同じ範囲よりも２８０ｇ、すなわち３２％減少した
が、これはゲランの部分脱アシル化に帰すると思われる。しかし、パーセント距離に関す
るゲル強度は、１．５％の変化にのみ反映し、大きく影響されなかったと思われた。
【０１００】
少量２×２の階乗試験は、第１のプロトコルの清澄プロセスに従って実施された。ＰＨ
Ｂ欠失変異体を含んで成るゲラン発酵ブロスを前処理し、ＫＯＨの濃度を変えて１５分間
混合し、次いでキレート化剤として２０００ｐｐｍのカルゴンと１時間、引き続き２２ｐ
ｐｍのリゾチーム並びに２２０ｐｐｍのプロテアーゼ各々と５５℃で２時間混合した。パ
ーセント透過度、穿刺力およびパーセント距離は、動力学的に相互に関連すると思われる
ので本試験においてそれらを試験した。ＫＯＨ濃度は約０．２２５ｇ／Ｌと約０．４５ｇ
／Ｌとの間で変え、温度は約５５℃と約６０℃との間で変えて以下の表に示される成績を
生じ、ゲラン清澄時のＫＯＨ濃度と温度の影響を評価するパーセント透過度、穿刺力およ
びパーセント距離の結果を示した。
【０１０１】
【表６】
0005624664.tif 000007
表に示されるように、透過度は、ＫＯＨ濃度または温度のいずれかを別々に増加しても
あまり変化しなかった。しかしながら、透過度は、ＫＯＨ濃度と温度の双方を増加させた
場合約６％まで増加するが、これは、透過度増加を達成させるためには両パラメータが重
要であり、また相加的であることを示している。同様にゲル強度は相加効果を示した。穿
刺力は、温度またはＫＯＨ濃度のいずれかを個々に増加すると約１３０ｇから約１９０ｇ
減少した。しかし、温度とＫＯＨ濃度の双方を増加させた場合、穿刺力は約３２６ｇ減少
し、したがって、ゲル強度は、温度とＫＯＨ濃度の双方の変化に鋭敏であることを示唆し
た。
【実施例１１】
【０１０２】
ゲランの性質に及ぼすヘキサメタリン酸ナトリウムの影響
カルゴンとしても知られているヘキサメタリン酸ナトリウム（「ＳＨＭＰ」）の透過度
、穿刺力およびパーセント距離に及ぼす影響を、上記実施例１０に記載された清澄化工程
に従って評価した。ＰＨＢ欠失変異体を含むゲラン発酵ブロスを前処理し、０．４５ｇ／
ＬのＫＯＨと１５分間混合し、次いでカルゴンの濃度を変えて１時間、引き続き２２ｐｐ
ｍのリゾチーム並びに２２０ｐｐｍのプロテアーゼ各々と５５℃で２時間混合した。ＳＨ
ＭＰ濃度を、約１０００ｐｐｍと約３０００ｐｐｍの間で変えると、この範囲に亘って線
形の相関関係が図１５に示したようにＳＨＭＰ濃度と透過度との間に存在した。ＳＨＭＰ
を約１０００ｐｐｍ増加すると、透過度が約５％増加する。図１６に示されるように、穿
刺力およびパーセント距離は、試験範囲でのＳＨＭＰ濃度の増加により比較的影響を受け
ないことから、ＳＨＭＰがゲル強度に影響するとは思われない。
【実施例１２】
【０１０３】
ＳＨＭＰによる他の清澄工程順序
清澄方法の２つの変法を、２Ｌスケールで天然のゲランブロスに対して実施した。製造
元のＧｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（ニューヨーク州ロチェスター）
により提供された情報によれば、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）リゾチームは、酸性か
ら中性ｐＨレベルで安定であり、アルカリ性ｐＨで短時間に不活化できる。清澄工程に従
って０．４５ｇ／ＬのＫＯＨ添加後、一般にこのｐＨはリゾチームにとって準最適である
ｐＨ８を超えるが、一方、プロテアーゼはこれらの条件下でよく作用するとのことである
。斯様に清澄化工程を第２のプロトコルに従って変更し、リゾチーム酵素による処理後に
ＫＯＨを加えた（工程順序の要約：リゾチーム、次にＫＯＨ、次にプロテアーゼ）。ＫＯ
Ｈをリゾチーム酵素処理の前に添加しても処理後に添加しても、以下の表に示されるよう
に５．５％の相対的標準偏差（「ＲＳＤ」）が観察された。
【０１０４】
【表７】
0005624664.tif 000008
【実施例１３】
【０１０５】
菓子配合物
本実施例は、優れた透明性および安定性を示す、伸縮弾性がある十分に噛む必要のある
菓子を製造するために使用し得る配合物を示す。
成分                                                            ％
Ａ部分
ぶどう糖シロップ                                          ４５．００
水                                                        ２１．６７
Ｂ部分
ショ糖                                                    ３０．００
清澄化高アシルゲラン                                        １．３３
Ｋｅｌｏｃｏｇｅｌ  Ｆ（登録商標）ゲラン                    ０．６７
（米国ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ社、カリフォルニア州サンディエゴ）
Ｃ部分
クエン酸溶液、５４％                                        ０．６７
クエン酸ナトリウム溶液、３３％                              ０．６７
【０１０６】
Ａ部分を含んで成る成分を加熱容器内で合わせ４０℃に加熱した。
Ｂ部分の成分を乾式混合し、混合加熱容器に速やかに加えて沸騰させる。該混合物を７
２％固体まで減量した。Ｃ部分の成分を合わせて、フレーバーおよび着色剤に加えて均一
になるまで混合する。
【０１０７】
材料をデポジッターに入れて、用意した澱粉鋳型に鋳込みする。次に詰められた澱粉鋳
型を、固体レベルが約８２％から８５％に達するまで３０℃、３５％相対湿度で３日間か
ら４日間保存した。材料を鋳型から外し、ワックスを塗り、密封バッグに密封した。
【０１０８】
Ａ部分の成分にさらに水を加えて、ヒドロコロイドの完全な水和を促進してもよい。
【実施例１４】
【０１０９】
デザートゲル配合物
この配合物は、優れた透明性および安定性を有する伸縮弾性のあるデザートゲルを製造
するために使用された。
成分                                                            ％
Ａ部分
ショ糖                                                      １３．２０
アジピン酸                                                    ０．４０
清澄化高アシルゲラン                                          ０．１６
クエン酸ナトリウム                                            ０．１３
リン酸二ナトリウム                                            ０．１３
フマール酸                                                    ０．１１
Ｋｅｌｏｃｏｇｅｌ  Ｆ（登録商標）ゲラン                      ０．０４
（米国ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ社、カリフォルニア州サンディエゴ）
Ｂ部分
水                                                          ８５．８３
Ａ部分の成分を乾燥フレーバーおよび着色剤に加えて乾式混合し、Ｂ部分に分散させて
混合し、９０℃に加熱した。次いで該混合物を好適な容器に注いで、室温で固めた。
【実施例１５】
【０１１０】
ゼリー配合物
本配合物は、優れた透明性、保存安定性、フレーバー放出および拡散性を有するゼリー
を提供した。
成分                                                            ％
Ａ部分
調和性グレープジュース                                      ４５．６９
高フルクトースコーンシロップ                                ３０．４６
水                                                          ２２．８５
Ｂ部分
清澄化高アシルゲラン                                          ０．１８
クエン酸ナトリウム                                            ０．１０
ＳＨＭＰ                                                      ０．１０
ソルビン酸カリウム                                            ０．０９
Ｃ部分
クエン酸、５０％溶液                                          ０．５３
【０１１１】
Ａ部分の成分を合わせた。Ｂ部分の成分を乾式混合し、攪拌しながらＡ部分の成分と分
散した。生じた混合物を混合しながら沸騰させ、約１分から約３分間沸騰を維持し、その
時点で、Ｃ部分の成分を攪拌しながら混合した。次に該混合物を滅菌ジャーに入れて密封
した。
【０１１２】
本発明は、現在好ましい実施形態と考えられているものに関して上に記述したが、本発
明は上記のものに限定されないことを解すべきであって、本発明は、添付の請求の範囲の
精神と範囲内に含まれる種々の修飾並びに同等の改変を包含することが意図されている。
【図１】
0005624664.tif 000009
【図２】
0005624664.tif 000010
【図３】
0005624664.tif 000011
【図４】
0005624664.tif 000012
【図５】
0005624664.tif 000013
【図６】
0005624664.tif 000014
【図７】
0005624664.tif 000015
【図８】
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【図９】
0005624664.tif 000017
【図１０】
0005624664.tif 000018
【図１１】
0005624664.tif 000019
【図１２】
0005624664.tif 000020
【図１３】
0005624664.tif 000021
【図１４】
0005624664.tif 000022
【図１５】
0005624664.tif 000023
【図１６】
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