(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのカルシウム由来の凝固剤の溶液を含浸させたリン酸カルシウムベースの支持体からなる骨組織再生用の生体材料であって、該支持体はヒドロキシアパタイト及びＢＣＰから選択され、該凝固剤は１ｍＭｏｌ／ｌ〜５０ｍＭｏｌ／ｌの範囲の濃度を有する水溶液の形態であり、凝固剤溶液とＨＡ又はＢＣＰとの割合は体積／体積基準でＨＡ又はＢＣＰの体積に対して凝固剤溶液０．５〜５であり、
前記カルシウム由来の凝固剤が、ＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム２．５μｍｏｌ〜６０μｍｏｌの範囲の割合で存在する、
生体材料。
【請求項２】
少なくとも１つのカルシウム由来の凝固剤の溶液を含浸させたリン酸カルシウムベースの支持体、並びにセラミック粒子、薬学的分子、天然又は合成の成長因子、バイオマーカー、造影剤、及び組織又は細胞の調製物から選択される少なくとも１つ添加物からなる骨組織再生用の生体材料であって、該支持体はヒドロキシアパタイト及びＢＣＰから選択され、該凝固剤は１ｍＭｏｌ／ｌ〜５０ｍＭｏｌ／ｌの範囲の濃度を有する水溶液の形態であり、凝固剤溶液とＨＡ又はＢＣＰとの割合は体積／体積基準でＨＡ又はＢＣＰの体積に対して凝固剤溶液０．５〜５であり、
前記カルシウム由来の凝固剤が、ＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム２．５μｍｏｌ〜６０μｍｏｌの範囲の割合で存在する、
生体材料。
【請求項３】
前記カルシウム由来の凝固剤が、ＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム５μｍｏｌ〜４０μｍｏｌの範囲の割合で存在する、請求項１又は２に記載の生体材料。
【請求項４】
前記凝固剤がＣａＣｌ２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項５】
前記支持体がモノリス形態である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項６】
前記支持体が顆粒形態である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項７】
骨欠損を充填する方法におけるインプラントとしての使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の生体材料。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体材料と骨接合材料との骨組織再生用の組合せ材料。
【請求項９】
請求項１に記載の生体材料を製造する方法を実施するための骨組織再生用のキットであって、ＨＡベース又はＢＣＰベースの支持体と１ｍＭｏｌ／ｌ〜５０ｍＭｏｌ／ｌの範囲の濃度を有する水溶液の形態のカルシウム由来の凝固剤との組合せからなり、凝固剤溶液とＨＡ又はＢＣＰとの割合は体積／体積基準でＨＡ又はＢＣＰの体積に対して凝固剤溶液０．５〜５であり、
前記カルシウム由来の凝固剤がＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム２．５μｍｏｌ〜６０μｍｏｌの範囲の割合で存在する、
キット。
【請求項１０】
請求項２に記載の生体材料を製造する方法を実施するための骨組織再生用のキットであって、ＨＡベース又はＢＣＰベースの支持体、１ｍＭｏｌ／ｌ〜５０ｍＭｏｌ／ｌの範囲の濃度を有する水溶液の形態のカルシウム由来の凝固剤、並びにセラミック粒子、薬学的分子、天然又は合成の成長因子、バイオマーカー、造影剤、及び組織又は細胞の調製物から選択される少なくとも１つ添加物との組合せからなり、凝固剤溶液とＨＡ又はＢＣＰとの割合は体積／体積基準でＨＡ又はＢＣＰの体積に対して凝固剤溶液０．５〜５であり、
前記カルシウム由来の凝固剤がＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム２．５μｍｏｌ〜６０μｍｏｌの範囲の割合で存在する、
キット。
【請求項１１】
請求項１に記載の生体材料を製造する方法を実施するための骨組織再生用のキットであって、ＨＡベース又はＢＣＰベースの支持体と、乾燥及び／又は粉末形態のカルシウム由来の凝固剤との組合せからなり、前記カルシウム由来の凝固剤がＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム２．５μｍｏｌ〜６０μｍｏｌの範囲の割合で存在するキット。
【請求項１２】
請求項２に記載の生体材料を製造する方法を実施するための骨組織再生用のキットであって、ＨＡベース又はＢＣＰベースの支持体、乾燥及び／又は粉末形態のカルシウム由来の凝固剤、並びにセラミック粒子、薬学的分子、天然又は合成の成長因子、バイオマーカー、造影剤、及び組織又は細胞の調製物から選択される少なくとも１つ添加物との組合せからなり、前記カルシウム由来の凝固剤がＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム２．５μｍｏｌ〜６０μｍｏｌの範囲の割合で存在するキット。
【請求項１３】
前記カルシウム由来の凝固剤が、ＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム５μｍｏｌ〜４０μｍｏｌの範囲の割合で存在する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記凝固剤がＣａＣｌ２である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
（ａ）前記支持体が配置される無菌の内部空洞を含む無菌デバイス、
（ｂ）前記凝固剤を含む無菌リザーバ、
を含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
前記デバイス（ａ）が、骨欠損が認められた領域に前記生体材料を適用することを可能とする手段を含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
前記デバイス（ａ）がシリンジから成る、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
前記支持体がモノリス形態である、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１９】
前記支持体が顆粒形態である、請求項９〜１７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
骨組織の産生のための支持体としての、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体材料のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用。
【請求項２１】
骨インプラントを製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の生体材料のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏでの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸カルシウムに基づく、特にヒドロキシアパタイトに基づく、又はヒドロキシアパタイトを含む材料、例えば二相性リン酸カルシウム及びリン酸カルシウムセメントに基づく新規な生体材料、それを調製する方法、並びに骨組織再生の目的でのインプラントの製造のための、又はプロテーゼを適合させるためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷、より稀に腫瘍により主に生じる骨質喪失の再構築は、整形外科医が直面する主要な困難の１つである。最も一般的には腸骨稜から採取した海綿状又は皮質海綿状の骨組織の自家移植片の対象となるのは骨喪失が最大５ｃｍ〜６ｃｍの「緊密な（tight）」偽関節（骨質喪失が実質的である骨折部の不完全な骨緻密化）由来の小さな欠損である（黄金律）。大きな欠損（≧６ｃｍ）は、はるかに煩雑な手順、血管付き骨移入（vascularized bone transfers）又はＭａｓｑｕｅｌｅｔ手順を必要とする。それでも、入手可能な自家骨の量は限られており、骨緻密化は依然として不規則であり、これらの様々な技法は移植片を採取する部位で術後の合併症を非常に多く引き起こすものである。
【０００３】
臨床業務において利用可能な様々な生体材料により、理論上は、自家移植の欠点を回避することが可能となる。残念なことに、それらのいずれも骨移植の結果に等しくなく、骨質の大きな喪失の再構築を可能とすることがない。
【０００４】
現在研究されている材料の大部分は、数週間のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択及び細胞培養後に骨髄から得られた間葉系幹細胞と生体材料とを組み合わせるものである。このアプローチは労力を要しかつ高価であり、そのことが臨床上の使用を制限している。
【０００５】
凝固した血液が骨の再構築を促進することが知られている。非特許文献１は、凝固した血液、又は脱石灰化した骨粉末に基づくインプラントを記載している。特許文献１は骨髄ベースの複合材料であって、多孔性の生体適合性を有する移植可能なマトリクス、及び凝固した材料、例えば骨髄、血液又は血漿の凝固物を含む、材料を記載している。
【０００６】
支持体と凝固した又は凝固していない血液との組合せにより得られるこのような材料は、骨緻密化の問題がそれほど重要でない顎顔面外科処置に現在まで使用されているが、骨幹骨の修復にはほとんど又は全く使用されていない。
【０００７】
これらのインプラントを製造する方法は、ドナー（最も一般的にはそのインプラントが目的とする個体）から採取される血液を必要とし、それから、支持体（脱石灰化した骨、又は合成ポリマー、セラミック）をハンドリングする工程、特に血液（生体材料の汚染源である）と混合する工程を必要とする。加えて、これらの方法では均一な生体材料を得ることは困難である。
【０００８】
したがって、合成的でありそれ故に容易に製造することができ一定かつ均一な特性を有する支持体から移植可能な生体材料を調製する方法であって、生体適合性の観点で優れた特性を得ることを可能とし、培養工程又はサンプリング工程を使用することを必要とせずに品質を有する骨組織の迅速な再構築を可能とする、方法に対する必要性が依然として存在する。
【０００９】
本発明は、従来技術の欠点を改善することを可能とし、得られる硬度及び血管新生の観点で卓越した品質を有する骨を可能とする。加えて、この生体材料を製造する方法は単純かつ実施が容易であり、治療対象の個体に対する多数の手順を必要とせず、従来技術の方法と比較して比較的安価である。
【００１０】
ヒドロキシアパタイトは、多くの骨再構築材料の組成の一部である。ヒドロキシアパタイトは、この用途において単独で、又は他の成分との混合物として、例えば二相性リン酸カルシウムにおける又はリン酸カルシウムセメントにおける場合と同様に、使用することができる。
【００１１】
二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）は、多くの医療用途及び歯科用途において使用される。二相性リン酸カルシウムは、非特許文献２により骨修復材料として初めて記載された。ＢＣＰは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）  Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２及びβ−リン酸三カルシウム  （Ｃａ３（ＰＯ４）２）（β−ＴＣＰ）の混合物から成る。その生物活性及びその生体吸収能は、ＢＣＰを形成するヒドロキシアパタイトとβ−ＴＣＰとの割合を通じて制御することができる。
【００１２】
特許文献２は、ヒドロキシアパタイトナノ粒子を製造する方法であって、カルシウムイオン及びリン酸イオンに基づく組成物を混合すること、並びにマイクロ波処理を含む、方法を記載している。この特許文献で使用される条件は、塩化カルシウム溶液を含浸させたヒドロキシアパタイト又はＢＣＰの形成をもたらさない。
【００１３】
ＢＣＰベースの生体材料は、他の合成生体材料と比較して、骨形成を促進する利点を有する。
【００１４】
ＢＣＰは、多くの研究の主題である（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。これらの様々な著者が、ＢＣＰ粒子の大きさの影響に関する観察を行っている。非特許文献５では、方法は、ＨＡ／ＴＣＰ粒子を、細胞それからフィブリノーゲン、及びＣａＣｌ２溶液中で再構成したトロンビンと混合することを含む。しかし、ＣａＣｌ２溶液は本発明において使用されるものより濃縮されており、ＣａＣｌ２／ＢＣＰのモル／重量比は本発明の生体材料において使用されるものより高い。
【００１５】
非特許文献６により、４０μｍ〜８０μｍのキャリブレートしたＢＣＰ粒子を用いて、骨髄細胞が添加されるＢＣＰ／Ｓｉ−ヒドロキシプロピルメチルセルロースハイドロゲル複合材料の移植に関して良好な骨誘導を得ることができることが示されている。しかし、後者の方法は、骨髄細胞の試料を採取する工程、及びまた上記骨髄細胞を培養することを必要とする。
【００１６】
特許文献３は、骨再生を増強する方法であって、リン酸カルシウムに基づく支持材料、多血小板血漿、カルシウム、及びトロンビン以外のＰＡＲ受容体活性化因子から成る組成物の調製を含む、方法を記載している。しかし、これらの組成物中のＣａＣｌ２濃度は非常に高く、このＣａＣｌ２は、本発明の条件下で使用した場合には抗凝固剤として働くだろう。
【００１７】
２つのＢＣＰ成分、ＨＡ及びβ−ＴＣＰは、骨及び歯科の外科処置に使用される２つの主要なタイプのリン酸カルシウムである。これらは顕著な生体適合性を有し、これらを組み合わせることにより、ＨＡ単独又はβ−ＴＣＰ単独よりも良好な生物活性、ひいてはより大きな有効性がもたらされると考えられる。これは、ＢＣＰにおいては２つの成分（ＨＡ及びβ−ＴＣＰ）が相乗的な作用を示すためである。
【００１８】
ヒドロキシアパタイトは、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植されるとすぐに、またその化学的性質に基づき、その表面で、エピタキシャル成長による多置換不定比性リン酸カルシウムアパタイト（「生物学的アパタイト」として知られる）の形成を促進することができる。骨マトリクスに存在する結晶と極めて類似する生物学的アパタイトのこの層は、細胞接着及び細胞活性を促進すると考えられる。
【００１９】
ＨＡよりはるかに可溶性が高いβ−ＴＣＰは、ＢＣＰインプラントを取り囲む生体液中のカルシウム及びホスフェートの過飽和を維持する。これにより、ＨＡ相上における生物学的アパタイトの沈殿の現象を維持することが可能となる。加えてこの相はＨＡよりもはるかに吸収性が高く、したがってＨＡ／β−ＴＣＰ比を変化させることによりインプラントの吸収能を調節することが可能である。
【００２０】
これらの化学的現象は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（非特許文献１０、非特許文献１１）で示されている。これらのメカニズムは、単一相のＨＡ材料又はＴＣＰ材料と比較したＢＣＰのより良好な臨床上の有効性に寄与するようである（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７）。
【００２１】
本発明は、或る特定のリン酸カルシウム、特にリン酸カルシウムアパタイト、例えばヒドロキシアパタイトが、接触させると全血の自発的凝固を抑制するとの観察結果に基づく。具体的には、ＨＡ、及びまたＨＡを含有するＢＣＰが、接触させると全血の自発的凝固を抑制することが観察された。これらの生体材料の使用に関する取扱説明書において推奨されているように、ヒドロキシアパタイト又はＢＣＰに生理食塩水（水相のＮａＣｌである）を予め含浸させた場合、その後接触させた血液が凝固しないことも観察された。
【００２２】
支持材料の抗凝固特性を確立することを可能とする実験条件は、実験の節で詳述する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】国際公開第０２／０６８０１０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２２６９３９号明細書
【特許文献３】国際公開第２００６／０１５２７５号
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】L. Okazaki et al., Clin. Oral Impl. Res., 16, 2005, 236-243
【非特許文献２】Nery et al., J Periodontol. 1992, Sep; 63(9): 729-35
【非特許文献３】Lerouxel et al., Biomaterials, 2006, Sept. 27(26): 4566-72, 18, 287-294
【非特許文献４】Malard O. et al., J. Biomed. Mater. Res., 46(1), 1999, 103
【非特許文献５】Mankani M.H. et al., Biotechnology and Bioengineering, 72(1), 2001, 96-107
【非特許文献６】Trojani C. et al., Biomaterials, 27, 2006, 3256-3264
【非特許文献７】J.M. Bouler, G. Daculsi, Key Engineering Materials 2001; 192-195: 119-122
【非特許文献８】Yamada S, et al., Biomaterials 1997; 18: 1037-41
【非特許文献９】S. Yamada et al., J. Biomed. Mater. Res 1997; 37: 346-52
【非特許文献１０】Daculsi G. et al., J. Biomed Mater Res 1989; 23: 883-94
【非特許文献１１】G. Daculsi et al., Int. Rev. Cytol 1997; 129-191
【非特許文献１２】Nery EB et al., J Periodontol 1992; 63: 729-35
【非特許文献１３】Ellinger RF et al., J Periodontics Restorative Dent 1986; 6:22-33
【非特許文献１４】Passuti N. et al., Clin Orthop Relat Res 1989; (248): 169-76
【非特許文献１５】Gouin F et al., Rev Chir Orthop Reparatrice Appar Mot 1995; 81: 59-65
【非特許文献１６】Ransford AO et al., J Bone Joint Surg Br 1998; 80: 13-8
【非特許文献１７】R. Cavagna et al., J. Long-Term effect of Med. Impl 1999; 9:403-412
【発明の概要】
【００２５】
本発明の第１の主題は、少なくとも１つのリン酸カルシウム、例えばヒドロキシアパタイト、又はヒドロキシアパタイトと少なくとも１つの他の材料との混合物に基づく支持体を含む移植可能な生体材料を調製する方法であって、支持体に少なくとも１つの凝固剤を含浸させる少なくとも１つの工程を含む、方法である。
【００２６】
「リン酸カルシウムに基づく支持体」という表現は、他のリン酸カルシウム生体材料と共に、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、多置換不定比性アパタイト（ｍｓ−ｎｓ−ＡＰ）及びまたその混合物から選択される少なくとも１つのリン酸カルシウムアパタイトタイプの構成要素を含む材料を意味することを意図する。このような支持体は、ヒドロキシアパタイト、ＢＣＰ、ｍｓ−ｎｓ−ＡＰ及びアパタイトリン酸カルシウムセメントから構成され得る。
【００２７】
そのようにして含浸させた支持体を、その後、骨欠損を充填しなければならない部位上に移植する。上記支持体の移植は、その後、生体材料と接触し、生体材料中に浸透する血液のｉｎ  ｓｉｔｕでの凝固を引き起こす。ＢＣＰを用いて実施された試験では、ＢＣＰが、凝固した血液と組み合わせると、良好な骨形成を得ることを可能とし、従来技術の方法と比較して非常に単純な方法により非常に満足のいく品質を有する骨組織をもたらすことが観察された。ＢＣＰに凝固剤の溶液を含浸させない場合、骨形成は得られない。
【００２８】
本発明の一変形形態によれば、リン酸カルシウムに基づく、特にヒドロキシアパタイト、又はヒドロキシアパタイトと別の材料との混合物に基づく支持体を、骨欠損を充填しなければならない部位に移植し、その後凝固剤の溶液をｉｎ  ｓｉｔｕで含浸させる。
【００２９】
好ましくは本発明において使用される支持体は、ヒドロキシアパタイト、フルオロアパタイト、多置換不定比性アパタイト（ｍｓ−ｎｓ−ＡＰ）、又はこれらの化合物の１つと少なくとも１つの他の生体材料、例えばα型及びβ型のリン酸三カルシウム（Ｃａ３（ＰＯ４）２）、リン酸二カルシウム（dicalcium phosphate）二水和物（ＣａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ）、無水リン酸二カルシウム（Ｃａ（ＨＰＯ４））、リン酸一カルシウム一水和物（Ｃａ（ＨＰＯ４）２・Ｈ２Ｏ）、リン酸テトラカルシウム（Ｃａ（ＰＯ４）２Ｏ）、及びリン酸オクタカルシウム（Ｃａ８Ｈ２（ＰＯ４）６）との混合物に基づく。有利には、支持体は、ヒドロキシアパタイト又はＢＣＰに基づき、好ましくはＢＣＰに基づく。
【００３０】
本発明において使用することができる支持体、特にアパタイト又はＢＣＰは、任意の形態：モノリスの形態、又はキャリブレートしている若しくはしていない顆粒の形態のいずれかであり得る。
【００３１】
本発明において使用することができるＢＣＰは、高温フリットから成る。ＢＣＰが顆粒形態である場合、ＢＣＰは粉砕され、例えば選択した直径によるふるい分けによりキャリブレートする。有利には、本発明において使用することができるＢＣＰは、ヒドロキシアパタイト及びβ−リン酸三カルシウムを、５／９５〜９５／５、好ましくは３０／７０〜８０／２０、有利には４０／６０〜６０／４０のＨＡ／β−ＴＣＰの重量／重量比で含む。
【００３２】
有利にはこれは、５０ｎｍ〜１０００μｍ、有利には５００ｎｍ〜１００μｍ、より有利には１μｍ〜５０μｍの範囲の孔径を有する多孔性の支持体、特に多孔性のＢＣＰを含む。
【００３３】
本発明において使用される支持体、特にＢＣＰが顆粒形態である場合、これは、有利には４０μｍ〜５００μｍ、好ましくは４０μｍ〜４００μｍ、さらにより好ましくは４０μｍ〜３００μｍ、有利には８０μｍ〜２００μｍの粒子径を有する。
【００３４】
ＢＣＰ顆粒又は粉末は、Bouler et al., J Biomed Mater Res, 1996, 32, 603-609、Bouler et al., J Biomed Mater Res, 2000, 51, 680-684、Obadia et al., J Biomed Mater Res, 2006, 80(B), 32-42により記載される方法に従って得ることができる。
【００３５】
ＢＣＰは、Graftys SARL社（Aix en Provence）から商業的に入手することができる。
【００３６】
本発明において使用することができるヒドロキシアパタイトは、好ましくは顆粒形態である。これは、Graftys SARL社から商業的に得られる。
【００３７】
より具体的には、本発明は、少なくとも１つのカルシウム由来の凝固剤の溶液を含浸させたリン酸カルシウムベースの支持体を含む生体材料であって、支持体はヒドロキシアパタイト及びＢＣＰから選択され、凝固剤は１ｍＭｏｌ／ｌ〜５０ｍＭｏｌ／ｌの範囲の濃度を有する水溶液の形態であり、凝固剤溶液とＨＡ又はＢＣＰとの割合は体積／体積基準でＨＡ又はＢＣＰの体積に対して凝固剤溶液０．５〜５である、生体材料に関する。
【００３８】
好ましくは本発明は、少なくとも１つのカルシウム由来の凝固剤の溶液を含浸させたリン酸カルシウムベースの支持体を含む生体材料であって、支持体はヒドロキシアパタイト及びＢＣＰから選択され、カルシウム由来の凝固剤はＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム２．５μｍｏｌ〜６０μｍｏｌ、好ましくはＨＡ又はＢＣＰ１ｇ当たりカルシウム５μｍｏｌ〜４０μｍｏｌの範囲の割合で存在する、生体材料に関する。
【００３９】
凝固剤は、カルシウムベースの凝固剤、例えば生体適合性を有するカルシウム塩、例えばＣａＣｌ２、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｃａ（ＥｔＯＡｃ）２又はＣａＳＯ４である。
【００４０】
有利には、凝固剤はカルシウムベースのものであり、生体適合性を有するカルシウム塩、有利にはＣａＣｌ２から選択される。支持体、特にＨＡ又はＢＣＰに凝固剤を含浸させるために、後者は、水溶液中で、有利には１ｍＭｏｌ／ｌ〜５０ｍＭｏｌ／ｌ、好ましくは３ｍＭｏｌ／ｌ〜４０ｍＭｏｌ／ｌ、有利には５ｍＭｏｌ／ｌ〜２０ｍＭｏｌ／ｌの範囲の濃度を有する水溶液中で使用される。これらの値は、凝固剤がカルシウム塩、特にＣａＣｌ２である場合には特に好ましい。
【００４１】
本発明の方法において使用される凝固剤溶液とＨＡ又はＢＣＰとの割合は、体積／体積基準でＨＡ又はＢＣＰの重量に対して凝固剤溶液０．５〜５、好ましくは１〜３、有利にはおよそ２である。
【００４２】
本発明の別の変形形態によれば、その移植直前にリン酸カルシウムベースの支持体に凝固剤溶液を含浸させることにより、生体材料を即座に調製する。
【００４３】
以下の手順を適用することにより本発明の生体材料を調製することを想定することも可能である：リン酸カルシウムベースの支持体に凝固剤溶液を含浸させること、その後支持体を乾燥又は凍結乾燥させること、及びその後無菌条件下で支持体をパッケージングすること、並びにその移植まで支持体を保存すること。
【００４４】
有利には含浸時間は、１分〜１時間、好ましくは１分〜３０分、有利には５分〜１５分である。
【００４５】
本発明の別の変形形態によれば、本発明の生体材料を、リン酸カルシウムベースの支持体に凝固剤溶液を含浸させることにより調製することができ、その後この生体材料を無菌条件下でパッケージングし、そうしてその移植まで保存する。
【００４６】
本発明の一変形形態によれば、（リン酸カルシウムベースの）支持生体材料を粉末形態の凝固剤と組み合わせることを想定することが可能である。特に、粉末形態又は顆粒形態の生体材料、例えばＢＣＰ又はＨＡを、固体粉末形態のカルシウム塩と混合することができる。したがってこの生体材料をその使用まで保存することができ、その使用時にはその移植の直前に即座に水溶液、例えば生理食塩水を含浸させることができる。したがって生体材料を、含浸させていない乾燥形態で移植することができる。
【００４７】
本発明によれば、支持体、特にＢＣＰに、１つ又は複数の任意の添加物、例えばポリマー、セラミック粒子、薬学的分子、生物活性剤を添加することを想定することが可能であり、これらの材料を使用するための条件は、それらの生体適合性、血液凝固反応に対する負の効果がないことである。これらの添加物の１つが血液凝固に対して好ましくない効果を有する場合、このことは、使用する凝固剤の量において考慮すべきである。例えば、このような添加物又は活性剤は、支持体、ＢＣＰ等の移植により、混合若しくは含浸により、又はコーティングにより、使用することができる。当業者には既知であるこのような添加物は、生体材料のレオロジー、若しくはそのｉｎ  ｖｉｖｏでの挙動（硬度、吸収、骨形成）を変化させること、又は感染若しくは炎症性の現象の発生に対して作用すること（抗生物質、抗感染薬、抗炎症薬）を意図する。
【００４８】
１つ又は複数の治療用分子、例えば、例えば癌及び骨粗しょう症から選択される病的状態を予防又は治療することを目的とする分子を本発明の生体材料中に導入することを想定することも可能である。
【００４９】
生体材料が目的とする患者から採取した脂肪組織、又は任意の他の組織若しくは細胞の調製物を本発明の生体材料中に導入することを想定することも可能であり、この脂肪組織又はこの調製物は、血液又は血漿又は生理食塩水中に事前に懸濁されている。
【００５０】
天然又は合成の成長因子も、本発明の生体材料中に導入することができる。生体材料の吸収及び生物中でのその後の動態（fate）の医療用画像による可視化を促進するバイオマーカー又は造影剤の存在を想定することも可能である。
【００５１】
本発明の方法によれば、支持体、特にＨＡ又はＢＣＰを、閉鎖無菌容器の空洞中に配置する。支持体が顆粒形態である場合、支持体は例えば、シリンジの内部空洞中に配置することができる。例えばこのようなデバイスを使用する場合シリンジを使用して引き上げることにより、適当量の凝固剤をこの容器中に導入する。
【００５２】
支持体、特にＨＡ又はＢＣＰがモノリスの形態である場合、後者は適当な形状及び大きさの容器中に配置される。
【００５３】
全ての場合において、容器の体積は、所望量の凝固剤溶液の導入を可能とするようなものである。
【００５４】
支持体、特にＨＡ又はＢＣＰと凝固剤とを含有する閉鎖容器を、生体材料の均一な含浸が可能となるように撹拌することができる。しかし、凝固剤による支持体の受動的な含浸も想定することができる。
【００５５】
この工程の終了時に、生体材料は、
−  支持体が顆粒形態で使用された場合、均一な液体ペースト、
−  支持体がモノリスの形態で使用された場合、その空洞が液体で満たされたモノリス
の形態である。
【００５６】
本発明の一変形形態によれば、必要に応じて粉末形態の凝固剤との混合物として、満たすべき空間中に直接支持材料を移植すること、その後材料に凝固剤溶液、又は既に凝固剤との混合物中にある場合には好適な水溶液、例えば生理食塩水のいずれかをｉｎ  ｓｉｔｕで含浸させることを想定することが可能である。材料が凝固剤との乾燥混合物の形態である場合にはそれに含浸させることなく材料を移植すること、及び周囲組織から血液を含浸させるように材料を静置することを想定することも可能である。
【００５７】
本発明の別の主題は、上で記載されるように、少なくとも１つの凝固剤の溶液を含浸させた、リン酸カルシウム、例えばヒドロキシアパタイト又はＢＣＰに基づく支持体を含む生体材料である。
【００５８】
本発明の生体材料を調製するために使用された支持体、ＨＡ又はＢＣＰの物理的形態、及びデバイスのタイプに応じて、骨欠損を充填しなければならない位置に最も好適な手段を使用して上記材料をその後適用することができる。
【００５９】
道具、例えばスパチュラを使用すること、又はシリンジ（その端部は本発明の生体材料の粒子のレオロジー及び大きさに好適な開口部を含む）を使用すること。それを、モノリスの形態で直接移植することもできる。後者の場合には、上記モノリスは、その形状及びその寸法が満たすべき空間の形状及び寸法に対応するように、設計又は調整されて（trimmed）いる。
【００６０】
本発明の主題はまた、骨欠損を充填する方法であって、上に列挙した工程を含み、骨欠損が認められた空間中に生体材料を挿入する工程も含む、方法である。この方法は、組織切開工程及び縫合工程も含み得る。
【００６１】
骨欠損の大きさ及び形状に応じて、本発明の生体材料による充填は、本発明の生体材料の移植部位上に骨の再構築が起こる間に必要な機械的強度を罹患組織にもたらす骨接合の一時的な適用と組み合わせることができる。
【００６２】
本発明者らが指摘したように、本発明の生体材料の移植は、短期間（数週間）で骨組織の形成を促進することを可能とし、この骨組織は非常に豊富に血管新生していた。
【００６３】
本発明の別の主題は、本発明の方法を実施するためのキットであって、リン酸カルシウム、例えばヒドロキシアパタイト、又はヒドロキシアパタイトと少なくとも１つの他の材料との混合物、例えば微小多孔性ＢＣＰに基づく支持体と、カルシウム由来の凝固剤との組合せを含む、キットから成る。有利には、凝固剤は、生体適合性を有するカルシウム塩、例えばＣａＣｌ２である。
【００６４】
凝固剤の量は、リン酸カルシウム、特にヒドロキシアパタイトの抗凝固効果を相殺し、周囲組織における血液凝固を促進するように算出される。
【００６５】
このような組合せは、
（ａ）支持体、例えばＢＣＰ又はＨＡが配置される無菌の内部空洞を含む無菌デバイス
（ｂ）凝固剤を含む無菌リザーバ
を含むキットの形態であり得る。
【００６６】
リザーバ（ｂ）は、デバイス（ａ）の一部であってもよく、又はデバイス（ａ）の内部空洞中に凝固剤を移すためにそこから凝固剤を採取することができるチューブ若しくはボトル、若しくは支持体が配置される空洞中に凝固剤を注入することを可能とするシリンジのような別個の実体であってもよい。デバイス（ａ）の内部空洞は、本発明の生体材料を製造するために必要な量の凝固剤、及びまた混合物の他の構成要素、例えば活性成分等をその中に導入することを可能とする大きさのものである。
【００６７】
また有利には、デバイス（ａ）は、骨欠損が認められた領域に生体材料を適用する手段を含む。
【００６８】
このようなデバイスは、シリンジから成り得る。
【００６９】
その内側に支持体（特にＢＣＰ）を保存し、その中に凝固剤を注入し、生体材料を放出するために、後者が形成された場合それに対してプランジャを装着することができるチューブを含む、特許文献１に記載されるもののようなデバイスを使用することを想定することも可能である。
【００７０】
本発明による生体材料は、それが骨折、外傷若しくは腫瘍由来の骨質の喪失、若しくは外科処置後の欠損を充填する、又はプロテーゼの適合を補助するのに重要であるか否かに関わらず、骨インプラントの製造のために使用することができる。
【００７１】
生体材料を、骨欠損を充填しなければならない領域における外科処置により導入することができる。切開後、生体材料を移植し、切開部を閉じる。
【００７２】
本発明の生体材料を、骨組織による欠損領域の安定化を待つ間、一時的な骨緻密化を可能とするように、骨接合と組み合わせることができる。
【００７３】
本発明の生体材料によるプロテーゼのコーティングにより、プロテーゼにおける又はプロテーゼの周囲における生きた骨組織の移植を促進することが可能となる。
【００７４】
本発明の生体材料は、骨組織の産生のための支持体としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで使用することもできる。
【００７５】
具体的には、この生体材料の周囲での骨細胞の培養により、その後移植可能である骨組織を産生することが可能となる。
【００７６】
本発明の別の主題は、骨インプラントを製造するための上で記載されるような生体材料のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの使用である。
【００７７】
本発明によれば、製造することが望まれるプロテーゼの形状を有する型において本発明の生体材料上で骨細胞を培養することができる。これらの条件下での細胞の培養により、好適な形状及び寸法の生体適合性を有するプロテーゼを得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】インプラントの調製、及び外科処置を示す図である。
【図１Ｂ】インプラントの調製、及び外科処置を示す図である。
【図１Ｃ】インプラントの調製、及び外科処置を示す図である。
【図１Ｄ】インプラントの調製、及び外科処置を示す図である。
【図２】リン酸カルシウム生体材料と接触させた血漿のカルシウム濃度を示す図である。
【図３Ａ】血液の添加前にＢＣＰ及びＨＡに塩化カルシウムの溶液を添加することにより得られた生成物の写真である。
【図３Ｂ】ＢＣＰに漸増濃度の塩化カルシウムの溶液を添加することにより得られた生成物の写真である。
【図４】抗凝固剤の非存在下で採取した全血とＢＣＰ微小粒子（８０μｍ〜２００μｍ）とから成るインプラント（Ａ、Ｃ）、又は通常のプロトコルに従って調製したインプラント（Ｂ、Ｄ）の走査型電子顕微鏡観察による解析結果を示す図である。カルシウムの非存在下で調製したインプラントでは、フィブリンのネットワーク、及び粒の周囲の血塊の形成がないことが認められる（Ａ、Ｃ）。（Ｃ）における白色の矢印は、粒上に堆積した幾つかの赤血球を示している。尺度Ａ、Ｂ：１００μｍ、Ｃ、Ｄ：１０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７９】
実験の節
Ｉ−凝固に対するＢＣＰ及びＨＡの効果
１．原理：
原理は、手術室で実施した即時的な手順を伴う。原理は、ポリプロピレンシリンジのボディにおいて、ＢＣＰ粒子及び凝固剤ＣａＣｌ２を混合することにある。骨欠損が認められた部位におけるこの生体材料の移植により、生体材料の周囲における凝固が促進される。
【００８０】
２．材料及び方法
２．１．二相性リン酸カルシウム粒子：
二相性リン酸カルシウム（ＢＣＰ）生体材料は、６０％のヒドロキシアパタイト（ＨＡ；Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）、及び４０％のリン酸三カルシウム（ＴＣＰ；Ｃａ３（ＰＯ４）２）から構成される。４０ミクロン〜２００ミクロンの大きさのＢＣＰ粒子は、Graftys SARL社（Aix-en-Provence, France）により提供された。粒子を、１８０℃で２時間加熱することにより滅菌した。
【００８１】
２．２．マウス（murin）血漿中のカルシウム濃度の測定：
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Janvier, Le Genest-St-Isle, France）血漿中のカルシウム濃度を測定した。この血漿は、１８００ｇで１５分間の遠心分離により、ヘパリン上で採取した血液から調製した。ヘパリンは、血漿中カルシウム濃度を変化させない抗凝固剤として使用する。解析は、Hitachi製の自動デバイス（Orleans, France）において実施した。
【００８２】
２．３．インプラントの調製、及び外科処置：
図１Ａ〜図１Ｄに示したように、その中をプランジャ（３）が移動する中空の円筒形ボディ（２）を含むシリンジ（１）を使用する。プランジャにより閉止されていないボディ（２）の端部では、シリンジのボディはフィルタストッパ（４）により閉止される。プランジャの端部（５）とフィルタストッパ（４）との間のシリンジのボディ（２）には、ＢＣＰの顆粒（６）がある（図１Ａ）。その使用の前に全体を滅菌した。フィルタストッパ（４）を担持しているシリンジの端部を、１％の濃度のＣａＣｌ２の水溶液（８）を満たした容器（７）に配置する。プランジャ（３）の後方への動きにより溶液（８）がシリンジ（１）のボディ（２）中に引き上げられる（図１Ｂ）。ＢＣＰ粒子に溶液を含浸させるために全体を１０分間静置し、その後プランジャ（３）により、ＣａＣｌ２の過剰の溶液（８）をフィルタストッパ（４）により排出する（図１Ｃ）。フィルタ（９）をフィルタストッパ（４）から取り外し、プランジャ（３）に対して圧力をかけることにより、溶液（８）を含浸させたＢＣＰ顆粒（６）を手術部位（１０）上に堆積させることが可能となる（図１Ｄ）。その後移植部位を再び塞ぐ（工程は示していない）。
【００８３】
３．結果
３．１．凝固に対するヒドロキシアパタイト及びＴＣＰの効果：
１ｍｌ容シリンジのボディの中に、５０ｍｇのＨＡ粉末又はＴＣＰ粉末を配置した。ＨＡ又はＴＣＰのいずれかを含有する各シリンジに１００μｌの血液を加えた。この混合物をホイール（wheel）上に配置して、凝固時間（すなわち１０分）の間、血液における懸濁液中に粉末を留まらせた。各実験において、他と同様に（すなわちホイール上で１０分）処理した１００μｌの全血を含有する１つのシリンジが、凝固に関する陽性対照の役割を果たした。１０分後、ホイールを停止し、シリンジを回収し、それらの端部を切断し、シリンジプランジャを用いて押すことにより血液／粉末混合物を引き抜く。粉末の周囲における血液の凝固が、観察される又は観察されない。各実験を３回繰り返した。
【００８４】
５０ｍｇのＨＡ及び１００μｌの全血の存在下で凝固が抑制されることが観察された。血液は液体のままである。
対照：凝固に関する陽性対照。塊及び血清凝集物（serum extrudate）が観察された。
【００８５】
５０ｍｇのＴＣＰ＋１００μｌの血液の存在下で、凝固が起こった。これは、フィブリンネットワークが粉末を懸濁液中に均一に維持するインプラントの形成をもたらす。
【００８６】
同じ実験を、血液の導入の前にＨＡを含有するシリンジに加えた塩化カルシウムを用いて、実施した。凝固とインプラントの形成とが見出された。
【００８７】
３．２．凝固に対するＢＣＰの効果
抗凝固剤の非存在下で新たに採取し、直ぐにＢＣＰ粒子（５０ｍｇ）と混合した血液（１００μｌ）が凝固しないことが観察された。この抗凝固効果は、ＣａＣｌ２（２０μｌの１％ＣａＣｌ２溶液）の添加により消失し、ＢＣＰによる血漿中カルシウムの取り込みを示唆する。ＢＣＰとの接触前後における血漿中のカルシウム濃度を測定することによりこの仮説を確認した。これに関して、ヘパリン（血漿中カルシウム濃度を変化させない抗凝固剤）上で採取したＣ５７ＢＬ／６マウス血液から血漿を調製した。ＢＣＰの存在下で、２．０６±０．０６ｍｍｏｌ／ｌ（正常値）からＢＣＰの存在下における０．５９±０．０７ｍｍｏｌ／ｌまでの血漿中カルシウム濃度の減少が観察された。
【００８８】
ＩＩ−血漿中カルシウム濃度に対するリン酸カルシウムベースの生体材料の効果
１．原理：
５０ｍｇの一定分量のＢＣＰ（６０／４０）微小粒子、又は５０ｍｇの一定分量のＨＡ若しくはβ−ＴＣＰを、５０μｌのＨ２Ｏ又は５０μｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの２．５ｍＭの溶液のいずれかと接触させ、終夜５６℃で乾燥させた。これらの生体材料を、９６ウェルマイクロプレートのウェル中に堆積させた。ヘパリン（カルシウムレベルに干渉しない抗凝固剤）上で採取したＣ５７ＢＬ／６マウス血液から調製した１００μｌの血漿を、各ウェルに添加する。インキュベーションの１５分後、８００ｇで２分間プレートを遠心分離し、血漿のカルシウム濃度をアッセイするために上清を採取した。カルシウムアッセイは、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍカルシウムアッセイキット（Centaur, Brussels, Belgium）を使用して、また製造業者の取扱説明書に従って実施した。これに関して、５μｌの一定分量の上清を、２００μｌのフェノールスルホンフタレイン（遊離のカルシウムの存在下で青色の安定な錯体を形成する色素）の溶液と接触させた。３分間のインキュベーション後、試料中のカルシウム濃度に正比例する６１２ｎｍで測定した呈色強度を得る。各プレートにおいて、以下のカルシウム濃度（０ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ）を使用して較正範囲を調製する。
【００８９】
２．結果：
血漿と接触させた、微小粒子形態のＢＣＰ及びまたＨＡ粉末が、上記血漿のカルシウム濃度の相当のかつ有意な減少を誘導することが認められた（図２）。カルシウム濃度の減少はＢＣＰ及びＨＡに関しては類似しており、β−ＴＣＰに関しては観察されない。血漿単独に関して得られた値（１．９６０±０．０４４ｍＭ）、ＢＣＰの存在下における血漿に関して得られた値（０．８７１±０．１６０ｍＭ）、及びＨＡの存在下における血漿に関して得られた値（０．８４０±０．１２１ｍＭ）に基づいて、カルシウムの取り込みをＢＣＰ又はＨＡ５０ｍｇ当たりカルシウム０．１２５μｍｏｌと評価した。
【００９０】
血漿の添加前におけるＢＣＰ又はＨＡへの５０μｌの２．５ｍＭの溶液（すなわち０．１２５μｍｏｌ）の添加により、正常な血漿中カルシウム濃度を回復させることが可能となることも認められた（図２）。β−ＴＣＰに添加した同じ量の塩化カルシウムにより、初期血漿中カルシウムが増大し、これらの条件下でのこの生体材料による取り込みがないことが確認される。
【００９１】
さらに、カルシウムの取り込みが、試験した３つのＢＣＰ顆粒度（granulosities）に関して、すなわち４０μｍ〜８０μｍ、８０μｍ〜２００μｍの微小粒子、及び２００μｍ〜５００μｍの微小粒子に関して同一であることが観察された。
【００９２】
さらに、血漿の添加の直前に塩化カルシウム溶液を液体形態で即座に添加するか否かに関わらず、又は粒子との接触時にはこの溶液が最初は乾燥されているか否かに関わらず、カルシウムの添加による補償の同じ結果が、得られた。
【００９３】
ＩＩＩ−ＢＣＰ及びＨＡの抗凝固特性に対するカルシウムの添加の効果
１．原理：
ＢＣＰ及びＨＡにより誘導される凝固の抑制と血漿中カルシウムの減少との間の因果関係が存在することを実証するために、５０μｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ又は５０μｌの２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの添加後に、５０ｍｇの一定分量のＢＣＰ（６０／４０）微小粒子、及び５０ｍｇの一定分量のＨＡ粉末に対する凝固試験を実施した。
【００９４】
２．結果：
抗凝固剤で処理していない血液の添加、及び１５分間の回転の後で、ＢＣＰ及びＨＡへのカルシウムの事前添加によりこれら２つの生体材料と接触させた血液の凝固を再確立することが可能となることが認められた（図３Ａ）。
【００９５】
これらの結果により、ＢＣＰ及びＨＡの抗凝固効果がこれら２つの生体材料が誘導する血漿中カルシウム濃度の減少と確かに関連すること、並びにカルシウムの添加により凝固を再確立することが可能となることが実証される。
【００９６】
ＢＣＰと接触させた血液の凝固に対するカルシウム用量応答の効果を分析した（図３Ｂ）。０．０１％（０．６８ｍＭ）、０．０２％（１．３６ｍＭ）、０．０５％（３．４ｍＭ）、０．１％（６．８ｍＭ）、０．２％（１３．６ｍＭ）、０．５％（３４ｍＭ）、１％（６８ｍＭ）、１０％（６８０ｍＭ）の濃度に調製した固定体積５０μｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、又は同じ体積のＮａＣｌ（１５０ｍＭ）の存在下で、抗凝固剤を添加していない１００μｌの全血を５０ｍｇのＢＣＰ粒子に添加することにより、生体材料を調製した。ホイール上での１５分間のインキュベーション後、生体材料を型から取り出す（demolded）。低濃度（ここでは０．０１％及び０．０２％に対応する）では、添加したカルシウムによって凝固を再確立することが可能とならないことが認められた。０．０５％〜０．５％の間の濃度の存在下で凝固が観察された。驚くべきことに、１％以上にＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの濃度を増大させると再び凝固の抑制が誘導されることが認められた（図３Ｂ及び表１）。
【００９７】
これらの実験により、ＢＣＰ（６０／４０）の抗凝固効果を阻止することを可能とする最適なカルシウム濃度を決定することが可能となり、また、配慮すべき重要な濃度範囲が存在することが示された。
【００９８】
ＩＶ．走査型電子顕微鏡観察によるフィブリンネットワークの解析
上で記載した試験時に粘着性のゲル化インプラントの形成がないことにより可視化されるＢＣＰの抗凝固効果は、分子レベルでは、塊の枠組みを形成するフィブリンネットワークの形成の抑制に対応する。フィブリンネットワークの存在を走査型電子顕微鏡観察により解析した。これに関して、抗凝固剤を添加していない１００μｌの血液を、５０ｍｇのＢＣＰ、又はカルシウムの存在下でインキュベートしその後乾燥した５０ｍｇのＢＣＰと混合することにより、インプラントを調製した。ホイール上での１５分の回転後、混合物を型から取り出し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）中に１．６％のグルタルアルデヒドを含有する固定溶液中に直接浸漬した。試料をその後洗浄し、漸増濃度のアルコールのボウル（bowls）を使用して脱水し、ヘキサメチルジシラザン（Sigma-Aldrich, L'isle d'Abeau Chesnes, France）中に５分間浸漬し、常温で乾燥した。アルミニウム支持体上にマウントして金／パラジウムで４分間カバーした（Polaron、Ａ５１００、UK）後、走査型電子顕微鏡（日本電気株式会社、６７００Ｆ、日本）を使用して解析を実施する。
【００９９】
図４において明らかなように、ＢＣＰ条件下で、ＢＣＰ微小粒子の間にフィブリンネットワークは観察されなかった（図４Ａ、図４Ｃ）。粒上に堆積した数個の赤血球の存在は、粒子と血液との混合を示している。反対に、ＢＣＰ／カルシウムの存在下で、粒子を保持する塊の存在が観察され、上記塊は、フィブリンネットワークのメッシュ、及び非常に多数の赤血球により可視化される（図４Ｂ、図４Ｄ）。
【０１００】
【表１】
0005595388.tif 000002
【図１Ａ】
0005595388.tif 000003
【図１Ｂ】
0005595388.tif 000004
【図１Ｃ】
0005595388.tif 000005
【図１Ｄ】
0005595388.tif 000006
【図２】
0005595388.tif 000007
【図３Ａ】
0005595388.tif 000008
【図３Ｂ】
0005595388.tif 000009
【図４】
0005595388.tif 000010