(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明を行う高分解能系であって、
コンデンサの環状の入射スリットに集光される光源を有し、さらに、光線、コリメーティングレンズ、鏡及びコンデンサを含んだ照明系と、下面にアイリスが設けられた対物レンズと、を備え、
前記照明系は、試料上に前記光源を集光させるように全体が上下に調節され、
前記アイリスは、前記対物レンズに光がダイレクトに入射でき、前記対物レンズの前レンズが、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射されるように開かれるものであり、また、前記対物レンズに光が直接入らないように閉じられるものであって、
前記照明系は、狭められた点広がり関数（ＰＳＦ）を有していることを特徴とする高分解能系。
【請求項２】
照明を行う高分解能系であって、
コンデンサの環状の入射スリットに集光される光源を有し、さらに、光線、コリメーティングレンズ、鏡及びコンデンサを含んだ照明系と、下面にアイリスが設けられた対物レンズと、を備え、
前記照明系は、試料上に前記光源を集光させるように全体が上下に調節され、
前記アイリスは、前記対物レンズに光がダイレクトに入射でき、前記対物レンズの前レンズが、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射されるように開かれるものであり、また、前記対物レンズに光が直接入らないように閉じられるものであって、
前記照明系は、回折縞を生じさせることを特徴とする高分解能系。
【請求項３】
前記コンデンサの前記入射スリットを照射するためのアダプタをさらに備えている、ことを特徴とする請求項１又は２記載の高分解能系。
【請求項４】
前記コンデンサの前記入射スリットを照射するためのアキシコンレンズをさらに備えている、ことを特徴とする請求項１又は２記載の高分解能系。
【請求項５】
前記コンデンサは、前記光源の入射ポート及び前記コリメーティングレンズに予め整合されている、ことを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の高分解能系。 
【請求項６】
前記光源及び前記コリメーティングレンズの間に連結されているライトガイドをさらに備えている、ことを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の高分解能系。
【請求項７】
前記光源からの光を前記コンデンサの前記入射スリットまで反射させるための平面鏡を備えている、ことを特徴とする請求項１、２、３、４、５又は６記載の高分解能系。
【請求項８】
光源を有し、さらに、光線、コレメーティングレンズ、鏡及びコンデンサを含んだ照明系と、下面にアイリスが設けられた対物レンズと、を備えた高分解能系で照明を行う方法であって、
前記光源を前記コンデンサの環状の入射スリットに集光させる工程と、
前記照明系を、試料上に前記光源を集光させるように全体を上下に調節する工程と、
前記アイリスを、前記対物レンズに光がダイレクトに入射でき、前記対物レンズの前レンズが、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射されるように開き、又は前記対物レンズに光が直接入らないように閉じる工程と、を備え、
前記照明系は、狭められた点広がり関数（ＰＳＦ）を有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡法（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の分野に関する。より具体的には、本発明は、高分解能光学顕微鏡法の分野に関する。  
【発明の背景】
【０００２】
図１ａ及び１ｂは２種類の照明方法（ｌｉｇｈｔ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎｓ）を示している。図１ａは明視野照明１０を示す。（顕微鏡の）対物レンズ１２のアパーチャ（ａｐｅｒｔｕｒｅ）が、コンデンサ（図示せず）のアパーチャ以下である場合に、明視野照明となる（ｐｒｅｓｅｎｔ）。明視野照明１０の主な特徴は、全ての光１４が対物レンズに入らなくてはならない、ということである。
【０００３】
図１ｂは暗視野照明１６を示す。対物レンズ１２のアパーチャがコンデンサのアパーチャより小さい場合に、暗視野照明１６となる（ｐｒｅｓｅｎｔ）。コンデンサからのダイレクト光（ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｇｈｔ  ｃｏｍｉｎｇ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）は、暗視野照明１６では対物レンズ１２には入らない。しかしながら、コンデンサが不整合であると、例えば、背景の光又はノイズを系に取り込んでしまい、コントラストを弱めるおそれがある。したがって、照明系の円対称性（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）は、暗視野照明１６に必要である。  
【０００４】
暗視野照明１６には、明視野照明１０に対していくつかの顕著な利点がある。暗視野照明１６は、明視野照明１０より、かなりコントラストが強く、光が少なくてすむ（ｂｅｔｔｅｒ  ｌｉｇｈｔ  ｅｃｏｎｏｍｙ）。 
【０００５】
図１ｃは、図１ｂの暗視野顕微鏡にかかわる整合の問題を示している。光源１８、コンデンサ２０及びアキシコンレンズ２２は、ここでさらに詳細に説明するが、光路１４の傾角（ａｎｇｌｅ）が交差し、試料を適切に照射するように完全に整合されなければならない。図１ａ及び１ｂには、光源１８とともに、コンデンサ、アキシコンレンズも示されていないという点で、図１ｂ及び１ｃは、図１ａからは簡略化されているが、図１ａ及び１ｂの明視野及び暗視野顕微鏡はそれぞれ、このような要素を含むことができることに留意されたい。  
【０００６】
暗視野照明１６においては、さまざまな照明方法が採用されている。一般的に使用されている２つの方法は、クリティカル照明法及びケーラー照明法である。図２ａは、クリティカル照明２４を示す。この照明系は、一様に光る光源（ｕｎｉｆｏｒｍｌｙ  ｂｒｉｇｈｔ  ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ）１８、ダイアフラム２８、コンデンサ絞り（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ  ａｐｅｒｔｕｒｅ）２６、コンデンサ２０、スライド３０、スライド３０に載せられた（ｃｏｕｐｌｅｄ）試料３２及び顕微鏡対物レンズ１２を有する。この照明方法では、一様に光る光源１８は、ダイアフラムのすぐ後に配置され、顕微鏡対物レンズ１２における物体面（ｏｂｊｅｃｔ  ｐｌａｎｅ）に、コンデンサ２０によって結像される。コンデンサ２０によるその結像がちょうどフィールド（ｆｉｅｌｄ）を覆うように、視野絞り（ｆｉｅｌｄ  ｓｔｏｐ  ａｐｅｒｔｕｒｅ）の大きさが調整される。対物レンズ１２のオブジェクトランス（ｏｂｊｅｃｔ  ｌａｎｃｅ）における任意の一対の点でのコヒーレンス（ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）の複雑さの度合いは、コンデンサ絞り２６を満たすインコヒーレント光源（ｉｎｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｓｏｕｒｃｅ）によるものと同様であり、さらに、それはコンデンサ２０の収差とは無関係である。光源１８は試料３２に集光する。分解能は、物体（ｏｂｊｅｃｔ）への光の入射のコヒーレンスの程度、及び顕微鏡対物レンズ１２の性能にのみ依存する。コンデンサ２０の収差は、顕微鏡の分解能に影響を及ぼさない。  
【０００７】
図２ｂは、ケーラー照明３４に適している従来技術顕微鏡系内の、ケーラー照明３４の方法を示している。この照明系は、光源１８、補正レンズ３６、ダイアフラム２８、コンデンサ絞り２６、コンデンサ２０、スライド３０、このスライド３０に載せられた試料３２、及び顕微鏡対物レンズ１２を有している。この方法では、補正レンズ３６は、ダイアフラム２８の近くに配置されていて、ここではコンデンサダイアフラム２８を含むコンデンサ２０の焦点面（ｆｏｃａｌ  ｐｌａｎｅ）に光源の光の像を結んでいる。光源１８のそれぞれのポイントからの光線は、それから、平行光線としてコンデンサ２０から出てくる。光源１８は、コンデンサ２０の絞りで集光する。光源の光の明るさの不規則な分布によって、フィールド照射（ｆｉｅｌｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）の強度が不規則になることはない。
【０００８】
さらに、高分解能光学顕微鏡法における最近の進歩は、細胞生物学及びナノサイエンスの需要によって加速された。蛍光顕微鏡法では、数十ｎｍの解像が示されている（ｉｍａｇｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｗ  ｔｅｎｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｍｅｔｅｒｓ  ｈａｓ  ｂｅｅｎ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ）。しかしながら、透過及び反射顕微鏡法では、最新の共焦点機器用であっても可視光照明を備えたものは、横方向の像分解能は、１８０ｎｍを超えないと報告されている。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、照明を行う高分解能系であって、コンデンサの環状の入射スリットに集光される光源を有し、さらに、光線、コリメーティングレンズ、鏡及びコンデンサを含んだ照明系と、下面にアイリスが設けられた対物レンズと、を備え、前記照明系は、試料上に前記光源を集光させるように全体が上下に調節され、前記アイリスは、前記対物レンズに光がダイレクトに入射でき、前記対物レンズの前レンズが、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射されるように開かれるものであり、また、前記対物レンズに光が直接入らないように閉じられるものであって、前記照明系は、狭められた点広がり関数（ＰＳＦ）を有しているものとして構成できる。
また、本発明は、照明を行う高分解能系であって、コンデンサの環状の入射スリットに集光される光源を有し、さらに、光線、コリメーティングレンズ、鏡及びコンデンサを含んだ照明系と、下面にアイリスが設けられた対物レンズと、を備え、前記照明系は、試料上に前記光源を集光させるように全体が上下に調節され、前記アイリスは、前記対物レンズに光がダイレクトに入射でき、前記対物レンズの前レンズが、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射されるように開かれるものであり、また、前記対物レンズに光が直接入らないように閉じられるものであって、前記照明系は、回折縞を生じさせるものとして構成できる。
さらに、本発明は、光源を有し、さらに、光線、コレメーティングレンズ、鏡及びコンデンサを含んだ照明系と、下面にアイリスが設けられた対物レンズと、を備えた高分解能系で照明を行う方法であって、前記光源を前記コンデンサの環状の入射スリットに集光させる工程と、前記照明系を、試料上に前記光源を集光させるように全体を上下に調節する工程と、前記アイリスを、前記対物レンズに光がダイレクトに入射でき、前記対物レンズの前レンズが、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射されるように開き、又は前記対物レンズに光が直接入らないように閉じる工程と、を備え、前記照明系は、狭められた点広がり関数（ＰＳＦ）を有するものとして構成できる。
本発明の照明を行う高分解能系は、複合（ｍｉｘｅｄ）照明を行う高分解能系を含み、ここでは、基本的に、コンデンサの環状の入射スリットに集光される光源と、例えばコンデンサと整合される対物レンズと、を備えていて、対物レンズに設けられたアイリスが、対物レンズに光がダイレクトに入射できるように開かれる。対物レンズの前レンズ（ｆｒｏｎｔ  ｌｅｎｓ）は、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射され、そしてこの対物レンズは例えば高開口度顕微鏡対物レンズである。この高分解能系は、コンデンサの入射スリットを照射するためのアダプタ、コンデンサの入射スリットを照射するためのアキシコンレンズをさらに備えることができる。コンデンサは、光源の入射ポート及びコリメーティングレンズに予め整合されていて、光源及びコリメーティングレンズの間に連結されているライトガイド、及び／又は、光源からの光をコンデンサの入射スリットまで反射させるための平面鏡をさらに備えることができる。さらに、照明系は、回折縞を生じさせ（ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｉｎｇｅｓ）、狭められた点広がり関数（ＰＳＦ）を有する（ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｎａｒｒｏｗｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＰＳＦ））。本発明の照明を行う高分解能系は、また、暗視野照明を行う高分解能系を含み、ここでは、基本的に、コンデンサの環状の入射スリットに集光される光源と、アイリスに連結され、例えばコンデンサと整合された対物レンズと、を備え、暗視野像のみ結像される（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）ようにアイリスは閉じられる。対物レンズの前レンズは、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射され、対物レンズは、例えば高開口度顕微鏡対物レンズである。この高分解能系は、コンデンサの入射スリットを照射するためのアダプタ、及び／又はコンデンサの入射スリットを照射するためのアキシコンレンズをさらに備えることができる。コンデンサは、例えば、光源の入射ポート及びコリメーティングレンズに予め整合されることができる。
本発明の高分解能系で照明を行う方法は、高分解能系で複合照明を行う方法を含み、基本的に、光源をコンデンサの環状の入射口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）に集光させる工程と、例えば対物レンズをコンデンサに整合させる工程と、対物レンズに光がダイレクトに入射できるように、対物レンズに設けられたアイリスを開く工程と、を含む。この方法は、対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって、対物レンズの前レンズを照射する工程をさらに含み、そして対物レンズは例えば高開口度顕微鏡対物レンズである。この方法は、コンデンサの入射スリットを、アダプタ又はアキシコンレンズで照射する工程をさらに含むことができる。この方法は、コンデンサを光源の入射ポート及びコリメーティングレンズに予め整合させる工程、光源及びコリメーティングレンズの間にライトガイドを連結する工程、光源からの光をコンデンサの入射スリットまで反射させるための平面鏡を備える工程と、を含むことができる。さらに、前記照明系は、回折縞を生じさせ（ｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｉｎｇｅｓ）、狭められた点広がり関数（ＰＳＦ）を有している（ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｎａｒｒｏｗｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ（ＰＳＦ））。
本発明の照明を行う高分解能系は、例えば複合照明を行う高分解能系であって、基本的に、コンデンサの環状の入射スリットに集光される光源と、アイリスに連結され、例えばコンデンサと整合された対物レンズと、を備え、アイリスが、対物レンズに光がダイレクトに入射できるように開かれると、実質的に明視野照明が行われ（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）、アイリスが閉じられると、暗視野照明のみが行われる（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）ものとして構成できる。アイリスが閉じられると、暗視野像のみが結像され（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）、アイリスが開かれると、光がダイレクトに対物レンズに入ることができて明視野照明が行われる（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）ように、対物レンズがアイリスに連結され、コンデンサと整合された照明系及び方法を含んでいる。対物レンズの前レンズは、この対物レンズに入射する中空円錐状の光で作られる環状光によって照射され、対物レンズは例えば高開口度顕微鏡対物レンズである。この高分解能系は、例えば、コンデンサの入射スリットを照射するためのアダプタ、及び／又はコンデンサの入射スリットを照射するためのアキシコンレンズをさらに備え、さらに、コンデンサは、光源の入射ポート及びコリメーティングレンズに予め整合されていてもよい。
本出願では、コンデンサの入射スリット（ｅｎｔｒａｎｃｅ  ｓｌｉｔ）に対して固定された（ｆｉｘｅｄ）光源と、対物レンズ及びコンデンサが、試料に焦点スポットを検出するために調節可能なように、コンデンサと整合している（ａｌｉｇｎｅｄ  ｗｉｔｈ）対物レンズと、を備えた暗視野照明系が開示されている。本出願では、基本的には、照明系を改良するために体系化された照明法（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を使用している。
本出願では、試料を照射する照明系は、コンデンサの入射スリットに集光（ｆｏｃｕｓｅｄ）される光源と、コンデンサと整合された対物レンズと、を備え、対物レンズ及びコンデンサは、試料に焦点スポットを検出する（ｆｉｎｄ  ａ  ｆｏｃｕｓ  ｓｐｏｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ）ために調節されることが開示されている。この照明系は、光源をコンデンサの入射スリットに集光させる手段をさらに備え、この集光手段は、コリメーティングレンズ及びライドガイド及び／又は平面鏡を含む。
本出願では、試料を照射する方法は、光源をコンデンサの入射スリットに集光させる工程と、対物レンズをコンデンサに整合させる工程と、試料に焦点スポットを検出するために、対物レンズ及びコンデンサを調節する工程と、を含むことが開示されている。光源は、集光手段でコンデンサの入射スリットに集光され、集光手段は、コリメーティングレンズとライトガイド、及び／又は平面鏡を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１ａ】図１ａは、従来技術の明視野照明系のブロック図である。
【図１ｂ】図１ｂは、従来技術の暗視野照明系のブロック図である。
【図１ｃ】図１ｃは、従来技術の暗視野照明系のブロック図である。
【図２ａ】図２ａは、従来技術のクリティカル照明系をグラフィカルに説明する図である。
【図２ｂ】図２ｂは、従来技術のケーラー照明系をグラフィカルに説明する図である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態による暗視野アダプタをグラフィカルに説明する図である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による照明系のブロック図である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態による照明系のブロック図である。
【図６】図６は、本発明の一実施形態による、環状の照明系及びアイリスが設けられた対物レンズ、コンデンサを、グラフィカルに説明する図である。
【図７ａ】図７ａは、ＮＡ＝１．４のカージオイドコンデンサの半径５０ｎｍの不透明なディスクの像及び強度プロットを示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ＮＡ＝１．４の明視野コンデンサの半径５０ｎｍの不透明なディスクの像及び強度プロットを示す。
【図７ｃ】図７ｃは、ＮＡ＝１．１のカージオイドコンデンサの半径５０ｎｍの不透明なディスクの像及び強度プロットを示す。
【図７ｄ】図７ｄは、ＮＡ＝０．７のカージオイドコンデンサの半径５０ｎｍの不透明なディスクの像及び強度プロットを示す。
【発明の詳細な説明】
【００１１】
本発明は、アダプタ又はアキシコンレンズ、鏡及びコンデンサと結合することができる光源、ライトガイド、集光系を含む照明系を有する。この照明系は、ほぼ完全な光学的整合（ｏｐｔｉｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を有することができる。この照明系は、かなり光が少なくてすむ完全な円対称性（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を提供する。オプションのアダプタ及びオプションのアキシコンレンズは、光を節約（ｓａｖｅ）して、全ての利用できる光をコンデンサのスリットに送り込む。コンデンサは、球面収差（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ）が起こらないようにできる。オプティカルアダプタ及び／又はオプションのアキシコンレンズは、コンデンサの入射スリットに入射する環状光を提供する。  
【００１２】
本発明の照明系は、ケーラー照明法の主要原理及びクリティカル照明法の主要特性を特徴とする。ケーラー照明法が、照明系における光学設計によって予め確定され（ｐｒｅｓｅｔ  ａｎｄ  ｆｉｘｅｄ）、コンデンサの入射スリットに光源光（ｓｏｕｒｃｅ  ｌｉｇｈｔ）を集光させる。そしてこの照明系は、コンデンサから射出（ｃｏｍｉｎｇ  ｏｕｔ）される光源光を試料に集光させるために（上下に）調節できるが、これは、クリティカル照明法の主要特性のひとつである。したがって、ケーラー照明法がまず最初に確定され、それから、照射スポットの適切な位置及び大きさを検出する（ｆｉｎｄ  ｔｈｅ  ｐｒｏｐｅｒ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ａｎ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｅｄ  ｓｐｏｔ）ために、本発明の照明系を上下に調節することができるが、これはクリティカル照明法の主要特性である。 
【００１３】
上記の照明系のこの特徴は、現行の標準の暗視野、落射蛍光（ｅｐｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ）及びＴＩＲＦ顕微鏡法では達成できない、より強いコントラスト及びより高い分解能を提供する。ＴＩＲＦ（全反射照明蛍光（Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））顕微鏡は、一方向の照明（ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉｄｅｄ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）のみ提供する。本発明の照明系は、３６０°対称（３６０°ｓｙｍｍｅｔｒｙ）の円形の照明（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を提供する。 
【００１４】
この照明系では、生細胞やその起こるセルプロセスをユニークに視せてくれる。少ない照明（ｓｍａｌｌ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）で、走査することなく三次元の区分化（ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）を行うことができる。蛍光を選択的に励起することにより、光の焦点のずれを無くし、従来の落射蛍光に存在する退色を減らす。本発明の照明系は、従来の落射蛍光系と比較して、少なくとも４倍光を節約することができ、高い透過効率を有している。したがって、より小さいスポットサイズ（ｓｐｏｔ  ｓｉｚｅｓ）が、コントラクト（ｃｏｎｔｒａｃｔ）を強くし、試料の退色を減らす。 
【００１５】
本発明の照明系は、内蔵型（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）、携帯型であることが好ましい。この照明系は、容易に標準の透過光顕微鏡（ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ）に取り付けることができる。この装置では、簡単に位置決め、位置合わせ（ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ）及び焦点調節ができ、整合及び操作のために熟練したオペレータを必要としない。  
【００１６】
本発明の照明系は、医学分野、生物医学業界、製薬業界、血液学、法科学、食品業界、軍事その他の用途で用いることができる。  
【００１７】
図５は、本発明の照明系４０の一実施形態を示す。図５では、光源１８からの光が、ライトガイド（ｌｉｇｈｔ  ｇｕｉｄｅ）６０を介して、少なくとも一つのコリメーティング５８に通される。この光は、それからオプションの平面鏡６２によって反射されて、暗視野コンデンサ２０の入射スリット又は絞り２６で集光する（ｆｏｃｕｓｅｄ）。コンデンサ２０は、この光を、試料３２に向けて集光させる。図５に示されているように、この光は、入射スリット又は絞り２６のうちの少なくとも１つを介して、コンデンサ２０に向けられる。照明系４０のレンズのうちの１つを調節することによって、入ってくる光を、スリット２６の内縁、あるいはスリット２６の外縁の何れかに向かって移動させることができる。光をスリット（６）内縁の方へ動かすと、分解能は低くなるが、光の強度はより高くなる。光をスリット２６の外縁の方へ動かすと、分解能はより高くなるが、光の強度は低くなる。  
【００１８】
図４は、本発明の照明系４０の別の実施形態を示す。図４では、アダプタ４２が、ライトガイド６０及びコンデンサ２０の間に接続されている。アダプタ４２は、光をより節約し、暗視野コンデンサのキャビティ内に嵌まる寸法及び形状とされ、そして、このことにより、光源１８及びコンデンサ２０の間に嵌り込む（ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａ  ｆｉｔｔｉｎｇ）態様でコンデンサ２０と組み合わせて用いることができる。上記したように、アダプタ４２はアキシコンレンズ（図示せず）と置き換えることができる。 
【００１９】
図３は、照明系４０で用いられているアダプタを示す。このアダプタは、外側スペーサ４８、内側スペーサ５０、光ファイバ５２、第１の端部４４近くの平行光線ビーム５４、及び第２の端部４６近くの円筒状光線ビーム５６を含んでいる。中央軸線は、使用時のコンデンサ及び顕微鏡の向きとほぼ平行な方向に、アダプタ４２を通って延びている。 
【００２０】
照明の質を向上させて、暗視野顕微鏡で視ている試料の明瞭さを改良することに加えて、このアダプタ４２は、光源必要電力（ｐｏｗｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｏｕｒｃｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）を８０〜８７％減らすことができる。さらに、アダプタ４２は、既存の暗視野顕微鏡で容易に使用することができる。 
【００２１】
本発明の照明系は、１２０ｎｍ未満の分解能、及び５０ｎｍを下回る検出を達成する。
【００２２】
従来の光学顕微鏡法の分解能は、光の波動性により限界があり、従来より、レイリー基準によって定義されていて、これは、回折限界分解能（２４０ｎｍまでの限界）と一般的に呼ばれている。本発明の照明系４０では、非回折限界光学効果（ｎｏｎ−ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ）、及び改良された点広がり関数（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が得られ、これらは、回折限界をはるかに超えてその分解能を伸ばす。 
【００２３】
これらの光学的効果のいくつかは、定在エバネセント波、プラズモン共鳴及び蛍光を含む。照明系４０の形状及び高い開口数は、ＴＩＲＦと同様、定在エバネセント波の発生の理想的な条件をもたらす。また、試料の伝導率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）に従って、表面プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）が局所的に生じ、このことによって、カーボンナノチューブその他のナノ材料等の試料の観察が可能になり、空間分解能の損失なしに優れたコントラストがもたらされる。光子（ｐｈｏｔｏｎｓ）も分子のように動く（ｂｅｈａｖｅ）ので、非常に小さい物体によって偏向（ｄｅｆｌｅｃｔｅｄ）し、散在（ｓｃａｔｔｅｒｅｄ）することができる。したがって、非常に小さい物体（例えばウィルス分子）は、コントラストが高いため、この照明系４０を使用して直ちに観察することができる。  
【００２４】
高分解能光学顕微鏡法の最近の進歩は、細胞生物学及びナノ科学の要求によって加速されている。蛍光顕微鏡法では、数十ｎｍの像の分解能が示されている（ｉｍａｇｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｗ  ｔｅｎｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｍｅｔｅｒｓ  ｗａｓ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ）。しかしながら、透過及び反射顕微鏡法では、最新の共焦点機器用であっても可視光証明を備えたものは、横方向の像分解能は、１８０ｎｍを超えていないことが報告されている。
【００２５】
９０ｎｍ分解能
【００２６】
本発明の照明系４０では、高開口度カージオイド（Ｃａｒｄｉｏｉｄ）環状コンデンサ２０（以下、環状のＡ‐コンデンサ）を使用して得られた像で、９０ｎｍの分解能が報告されている。図６ａ及びｂを参照すると、この照明系では、大きく傾いた（ｈｉｇｈｌｙ  ｏｂｌｉｑｕｅ）中空円錐状の光が生じている。アイリス６５付きの高開口度顕微鏡対物レンズ１２と接続されて、照明系は、２つの異なる照明の型（ｒｅｇｉｍｅｓ）を提供する。試料３２を通過した後にダイレクトな光が対物レンズ１２に入らないようにアイリス６５を閉じると（図６ａ）、屈折、散在、あるいは回析された光のみが対物レンズ１２に入る（図６ａ）。対物レンズ１２に光が直接入ることができるように、アイリス６５が開いている場合、対物レンズ１２の前レンズは、対物レンズ１２に入る中空円錐状の光で生じた環状光によって照射される（図６ｂ）。この場合、暗視野照明と傾斜した中空円錐状の明視野照明を組み合わせた複合照明が生じる。このカージオイドコンデンサ２０は、この照明系が、光をコンデンサの環状の入射スリットに集光させるコリメーティングレンズ及び第１の表面鏡を備えるように、この照明系の一体の部分となっている。照明系の一部として、コンデンサは予め整合されていて、したがって、さらなる整合は不要である。
【００２７】
この照明系は、通常の明視野コンデンサ（以下、円形のＣ-コンデンサ）と置き換えて、ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１顕微鏡に配置される。この照明系は、液体ライトガイドによって光源に接続される。この装置（ｗｏｒｋ）のために使用される対物レンズは、無限遠補正対物レンズ、ＬｅｉｃａのＨＣＸ  ＰＬ  ＡＰＯ  １００×／１.４０−０.７０、オイル（ｏｉｌ）、アイリス付きである。像は、ズーム付き中間レンズ、自家製の４０×リレーレンズで拡大され、ペルチェ冷却式カメラ及びデルのコンピュータ、Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ８２００によって記録される。この顕微鏡は、防振プラットフォーム上に配置される。明視野像は、照明系をオリンパスの明視野コンデンサに置き換え、ＥＸＦＯ１２０光源をＯｌｙｍｐｕｓＸ−Ｃｉｔｅ１２０アダプタによって、顕微鏡後側照明ポート（ｒｅａｒ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｌｉｇｈｔ  ｐｏｒｔ）に接続することによって得られた。全ての像は、リチャードソンのテストスライド（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  Ｔｅｓｔ  Ｓｌｉｄｅｓ）を用いて作られた。
【００２８】
結像（ｉｍａｇｉｎｇ）用として選択された高倍率対象の幾何学模様（ｈｉｇｈ  ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌ  ｐａｔｔｅｒｎ）は、中心間隔２００ｎｍ、幅１００ｎｍの一連のラインを提供する垂直方向の格子アレイ、２５０ｎｍから５０ｎｍの範囲の垂直／水平の分解能バーセット、及び４ミクロンから６０ｎｍの範囲の塗りつぶされた丸を含む。リチャードソンスライドの模様（ｐａｔｔｅｒｎｓ）は、ＪＥＯＬ  ７０００Ｆ電界放射型走査電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）でテストされた。スケールは、ＮＩＳＴトレーサブルマスターシステム（ＮＩＳＴ  ｔｒｅａｓａｂｌｅ  ｍａｓｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）によって付けられた。テストスライド上の円の正確な直径が確立されているので、これらの円は、回折パターンと結像の分析に使われた。
【００２９】
分解能（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）が向上していることを理解するために、Ｃ-及びＡ-照明系（Ｃ-円状、Ａ-環状）の両方の場合に対する光学像結果（ｏｐｔｉｃａｌ  ｉｍａｇｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ）の回折理論が示される。簡単にするため、評価が容易なコンパクトな積分によって像が与えられる、半径ｒ＝５０ｎｍの不透明なディスクの軸対称の場合に対して計算が行われる（ｔｈｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｘｉａｌ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｏｐａｑｕｅ  ｄｉｓｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｄｉｕｓ  ｒ＝５０ｎｍ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅ  ｉｍａｇｅ  ｉｓ  ｇｉｖｅｎ  ｂｙ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｉｎｔｅｇｒａｌｓ  ｅａｓｙ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ）。加えて使用される光の波長λ０＝５４６ｎｍと比較して、物体の大きさが小さいと、全体的にコヒーレント照明の条件が確保される。実験的に、Ｎ＝０．７から１．４の範囲の異なる顕微鏡対物レンズの開口数に対して、半径５０ｎｍディスク（ガラス製のリチャードソンのスライドのクローム膜の円）の像が計測された。理論は、実験と見事に一致し、したがって、改良された分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）のメカニズムを明確に現している。
【００３０】
コヒーレント光学系で結像された像の光の振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）Ｕ１（ｘ１，ｙ１）は、物体面のインプットＵ０（ｘ０，ｙ０）及び点広がり関数（ＰＳＦ）Ｐ（ｘ，ｙ）のコンボリューション（ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｐｕｔ  ｉｎ  ｏｂｊｅｃｔ’ｓ  ｐｌａｎｅ  Ｕ０（ｘ０，ｙ０）ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｏｉｎｔ  ｓｐｒｅａｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  （ＰＳＦ）Ｐ（ｘ，ｙ））として表わすことができる。
0005479733.tif 000002
【００３１】
第１に、物体の透明な部分を幾何学的に通過する光線束（ｌｉｇｈｔ  ｐｅｎｃｉｌ）が入射瞳（ｅｎｔｒａｎｃｅ  ｐｕｐｉｌ）に到達するときには、明視野態様が考慮される。Ｃ−コンデンサは、開口数Ｎ＝１．４で、この瞳全体を満たす円錐状の光を形成する。Ａ−コンデンサでは、Ｎが１．２から１．４で、中空円錐状の光が入射瞳の対応するリング状の周りのみを照射する（図６Ｂ）。例えば、開口度Ｎ＝１．４の、半径aである瞳において、照射されるリングの内側及び外側の半径は、εa及び aであり、ε＝１．２／１．４＝０．８６である（Ｎ＝１．２未満の入射絞り（ｅｎｔｒａｎｃｅ  ａｐｅｒｔｕｒｅ）は暗視野態様に相当し、別個に下記のように考慮される）。微分（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）を省略すると、方程式（１）から、不透明なスクリーン上の円形の穴の像は、
0005479733.tif 000003
となる。
【００３２】
ここで、ρ１は結像面（ｉｍａｇｅ  ｐｌａｎｅ）における半径であり、Ｊ０（ｘ）及びＪ１（ｘ）はベッセル関数、そしてＫ０＝２π／λ０である。そして、λ０は真空での光の波長である。この結果は、マーティンによってε = ０（Ｃ‐コンデンサ）に対して導き出され、ここでは明視野モード（０<ε≦１）におけるＡ‐コンデンサのために一般化される。予想どおり、ｒ→０の点状の穴の場合、方程式（２）は、環状の（εａ≦ρ≦ａ）入射瞳に対する既知のＰＳＦ関数まで減少する。入射絞りが無限に増加するａ→∞の場合、回折縞は消え、像は単純な明るい円となる。しかしながら、通常の場合には、方程式（２）の積分の明示公式はないが、それは市販ソフトを使用して計算することができる。最後にバビネの原理を使用して、不透明な円形のディスクの像は、
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である。
【００３３】
ここで、Ｕは、物体なし（ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｎｙ  ｏｂｊｅｃｔ）の振幅（ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）であり、この場合はｒ＝５０ｎｍのディスクの角サイズ（ａｎｇｕｌａｒ  ｓｉｚｅ）が小さいため定数となっている。実験では、強度は、Ｉｄ（ρ１） ＝|Ｕｄ（ρ１）|２で測定される。
【００３４】
次に、暗視野態様（図６Ａ）が考察される。Ａ−コンデンサ２０に対して、アイリス６５ダイアフラムで入射絞りをＮ＜１.２に下げるときに、これが起こる。クロムディスクによって散乱する光波を説明するために、我々は、導電性球（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ｓｐｈｅｒｅ）による回折についてのミー理論（Ｍｉｅ’ｓ  ｔｈｅｏｒｙ）に従う。その球の半径ｒ＜λ０に対して、入射光線に沿った最大値を有して散乱の曲線図は異方性が強く、
0005479733.tif 000005
である。
ｍが増加すると、光は前進方向ζ＝０周辺で集中する。
【００３５】
入射絞りにおける光の分布結果は、
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で表される。
【００３６】
ＰＳＦの一般的な公式を使用して、我々は暗視野態様を
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で表す。
【００３７】
最後に、方程式（１）に方程式（６）を代入して（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｑ．（６）  ｉｎ  Ｅｑ．（１））、暗視野の像が与えられる。
0005479733.tif 000008
ここでは、簡潔にするために、ベクトルρは、ポイント（ｘ，ｙ）を示す。
【００３８】
図７ａ及び７ｂは、像及び半径５０ｎｍの不透明なディスクの強度プロットを含む。図７ａでは、カージオイドコンデンサ、図７ｂではオリンパスの明視野コンデンサを使用して、ＮＡ＝１．４としている。図７ｃは、ＮＡ＝１．１のカージオイドコンデンサに対して、同様のものを示し、図７ｄは、ＮＡ＝０．７のカージオイドコンデンサに対して、同様のものを示す。図７ａ及び７ｂは、Ｃ‐コンデンサ及びＡ‐コンデンサ両方に対して、理論と実験がきわめて一致していることを証明している。特に、Ａ‐コンデンサに対する理論では、最初の回折リング（ｆｉｒｓｔ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｒｉｎｇ）（図７ａ）の位置及び高さだけでなく、中央の最小値の形状も正確に示されている。フィッティングでは、方程式（５）で唯一の未知のパラメータをｍ＝６と定めている。
【００３９】
Ｒ＝０．６１（λ０／Ｎ）＝２３８ｎｍを予測する有名なレイリーの基準の観点から図７ａ及びｂの結果を検討することは、興味深い。知られているように、Ｒは、等方的な点光源及び円形の入射絞りのエアリーパターン（Ａｉｒｙ  ｐａｔｔｅｒｎ）における最初の暗色リング（ｆｉｒｓｔ  ｄａｒｋ  ｒｉｎｇ）の半径である。実験的に、Ｃ‐コンデンサに対して、半径は２６０ｎｍ（図７ｂ）で、結像されたディスクサイズｒ＝５０ｎｍに限定されているため、予想通りＲ＝２３８ｎｍをやや超えている。意外なことに、Ａ‐コンデンサに対しては、観察された半径は１６５ｎｍで（図７ａ）、Ｒより（２３８／１６５）＝１．４４倍小さい。実際、これは驚くに値せず、明視野態様でＡ‐コンデンサは入射瞳のリング状の周囲のみを照射するので、入射絞りが環状である場合、知られているように回折パターンの中心スポットが狭まることと一致している。図７ｃ及び図７ｄの暗視野像では、同様の、しかし少し狭まることが観察されている。ここでは、暗さの測定された半径が、Ｎ＝１．１で２７０ｎｍ（図７ｃ）及びＮ＝０．７で４２０ｎｍ（図７ｄ）で、したがって、レイリー基準の値より１．１及び１．１５倍少ない（１．１  ａｎｄ  １．１５  ｔｉｍｅｓ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  Ｒａｙｌｅｉｇｈ‘ｓ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ｖａｌｕｅｓ）。また、これは入射瞳の光の散乱が環状に分布しているために生じる。任意の振幅の瞳フィルタ（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｐｕｐｉｌ  ｆｉｌｔｅｒ）に対する我々の数学的分析（示していない）は、ＰＳＦの上限を、ｘ１／ｘ０＝３．８３／２．４０＝１．６倍狭める。ここでは、ｘ０及びｘ１は、ベッセル関数Ｊ０（ｘ）及びＪ１（ｘ）の第１の正根である。
【００４０】
明視野の環状のＡ‐コンデンサの実際の分解能はλ０／５より良好である。これは、開口数Ｎ＝１．４を使用した、レイリーの基準Ｒ＝λ０／２．３の２．２倍を超えている（Ｔｈｉｓ  ｓｕｒｐａｓｓ  ２．２  ｔｉｍｅｓ  Ｒａｙｌｅｉｇｈ’ｓ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｒ＝λ０／２．３  ｆｏｒ  ｕｓｅｄ  ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  ａｐｅｒｔｕｒｅ  Ｎ＝１．４）。示された理論は、２つの理由から生じた結果として、向上した像分解能を説明している。第１に、ＰＳＦは、環状のＡ‐コンデンサに対して、より狭い（ＰＳＦ  ｉｓ  ｎａｒｒｏｗｅｒ  ｆｏｒ  ａｎｎｕｌａｒ  Ａ‐ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）。第２に、Ａ‐コンデンサに対して、ＰＳＦの回折縞は強く（図７ａ）、続いてπだけ位相を変えていることである（ｔｈｅ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｆｒｉｎｇｅｓ  ｏｆ  ＰＳＦ  ａｒｅ  ｓｔｒｏｎｇ  （Ｆｉｇ．７ａ）  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｔｈｅ  ｐｈａｓｅ  ｂｙ  π）。したがって、方程式（１）の物体の形状とのＰＳＦの畳み込みは、像の縁を不鮮明にしている;効果は、コヒーレント照明に対してのみのようである（ＰＳＦ  ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｂｊｅｃｔ’ｓ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  Ｅｑ．（１）  ｓｍｅａｒｓ  ｔｈｅ  ｉｍａｇｅ  ｅｄｇｅｓ  ｌｅｓｓ；  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ａｐｐｅａｒｓ  ｏｎｌｙ  ｆｏｒ  ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）。
【００４１】
ここで、我々は理論を実験と比較する。明視野において、計算は、方程式（２）の全ての値が知られ、上記テキストにリストされているため、いかなるフィッティングパラメータも含まない。
【００４２】
最後に、λ０／５又は９０ｎｍより良い分解能は、カージオイド環状コンデンサ２０（図６）を備える自家製の照明系のみを用いて変更された標準の研究用透過光学顕微鏡の結像において示される。この分解能は、いかなる像後処理もしないで、目視観察、又はＣＣＤカメラ録画で達成される。報告されたデータに加えて、生きた細胞のリアルタイムの結像における高い分解能が認められている。計算は、高められた分解能が、結像系の古典的な回折論、及び高開口度コヒーレント環状照明の結果と完全に一致することを示している。
【００４３】
本発明は、本発明の構造及び作動の原理を容易に理解できるように、詳細を盛り込んだ特定の実施形態に関して記載されている。具体的な実施形態及びその詳細のここでのこのような参照は、これはここに添付されたクレームの範囲を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、実施形態の選ばれた説明に、変更を行えることは、当業者にとっては明らかであろう。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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