(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｅｔＹによってコードされるＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリン（ＯＡＨＳ）を基質として直接スルフヒドリル化(direct sulfhydrylation)活性を有するポリペプチドもしくはｍｅｔＺによってコードされるＯ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン（ＯＳＨＳ）を基質として直接スルフヒドリル化(direct sulfhydrylation)活性を有するポリペプチドまたはこれらの組み合わせである、一つ以上の第１ポリペプチド（ＥＣ  ２．５．１．４９または４．２．９９．−）と、
ｍｅｔＢによってコードされる含硫基転移(transsulfuration)活性を有するポリペプチドもしくはｍｅｔＣによってコードされる含硫基転移(transsulfuration)活性を有するポリペプチドまたはこれらの組み合わせである、一つ以上の第２ポリペプチド（ＥＣ ２．５．１．４８または４．４．１．８）と、
配列番号２、４、６、８または１０のアミノ酸配列を含んでなる、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有する第３ポリペプチドとを含む、検出可能な量のメチオニンを生産するための分離された大腸菌(E.coli)であって、
前記直接スルフヒドリル化活性はｍｅｔＹもしくはｍｅｔＺまたはこれらの組み合わせの外因性核酸配列の発現に起因することを特徴とする、分離された大腸菌。
【請求項２】
前記生産されたメチオニンの少なくとも１０％は前記含硫基転移活性から得ることを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項３】
前記生産されたメチオニンの少なくとも１０％は前記直接スルフヒドリル化活性から得ることを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項４】
アデニリル硫酸還元酵素（ＥＣ １．８．９９．２）をコードする外因性核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項５】
ｍｅｔＤ、ｍｅｔＫ、ｍｅｔＪ、ｔｈｒＢ、ｓｅｒＡまたはこれらの組み合わせから選ばれた少なくとも一つの遺伝子が減衰した、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項６】
ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＺ、ｍｅｔＸ、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＷＵＡ、ｃｙｓＤ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＣ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＧ、ｃｓｙＫ、ｃｓｙＭ、およびこれらの組み合わせから選ばれた少なくとも一つの遺伝子が過発現されることを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項７】
メチオニンの生産が可能な条件の下で請求項１の分離された大腸菌を培養する段階、および前記メチオニンを分離する段階を含むことを特徴とする、メチオニンの生産方法。
【請求項８】
配列番号４１、４２または４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるＭｅｔＸペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項９】
前記第１ポリペプチドは、配列番号３６、３７、３８または３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項７に記載のメチオニンの生産方法。
【請求項１０】
前記第１ポリペプチドは、配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項７に記載のメチオニンの生産方法。
【請求項１１】
前記分離された大腸菌は、ｍｅｔＤ、ｍｅｔＫ、ｍｅｔＪ、ｔｈｒＢ、ｓｅｒＡまたはこれらの組み合わせから選ばれた少なくとも一つの減衰した遺伝子、および遺伝的に操作された生産菌株をもたらす追加的な遺伝的に操作された核酸配列変化をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のメチオニンの生産方法。
【請求項１２】
前記第２ポリペプチドは、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣまたはこれらの組み合わせの内因性核酸配列から発現されることを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項１３】
前記第１ポリペプチドは、配列番号４４、４５、４６または４７の核酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有する核酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項１４】
前記第１ポリペプチドは、配列番号４４、４５、４６および４７の核酸配列から選ばれる核酸配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の分離された大腸菌。
【請求項１５】
前記分離された大腸菌は、アデニリル硫酸還元酵素（ＥＣ １．８．９９．２）ペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のメチオニンの生産方法。
【請求項１６】
ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ活性を有し、配列番号１、３、５、７または９から選ばれる核酸配列によってコードされるペプチドを含むことを特徴とする、分離されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌株、酵素および化学物質などの組成物と、メチオニンおよびこれに関連した産物の生産のために前記組成物を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニンは、動物の消化において必須的なアミノ酸である。メチオニンは、長い間、アクロレイン、メチルメルカプタンおよびシアン化物を出発物質として用いた多様な多段階化学合成によって化学的に合成されてきた。２つの生成物形態がある：Ｄ．Ｌメチオニンおよびそのヒドロキシ類似体(hydroxyanalog)。Ｄ−メチオニンは、他の全てのアミノ酸とは異なり、生体内(in vivo)で要求されるＬ−異性体に転換される。飼料等級のメチオニン市場は、家禽類に対する需要と最近の豚飼料補充剤に対する需要が増えることにより増加していると報告されたことがある。市場の需要に応えるための主要メチオニン生産会社（Ｄｅｇｕｓｓａ ＡＧ、Ａｄｉｓｓｅｏ、およびＮｏｖｕｓ）の能力は原資材の供給に左右される。中間代謝物質としてのアクロレインとメチルメルカプタンは、３−メチルチオプロピオンアルデヒド（ＭＭＰ）に転換され、さらにシアン化水素を用いてメチオニンに転換されなければならない。前記３つの生産会社は、全てメチオニン生産設備の拡張計画および原資材生産との統合計画を持っている(Chem. Marketing Reporter April 7, 2003)。
【０００３】
メチオニン（アミノ酸のアスパラギン酸塩群に属する）に対する生合成経路は、多くの有機体で研究されてきたが、差異点のみならず、類似点も示す。第１段階であるホモセリンのアシル化は、ホモセリンアシルトランスフェラーゼによって触媒され、転移されたアシル基の差異にも拘らず全ての有機体で起る。ｍｅｔＡの触媒作用の産物はアセチルホモセリンまたはスクシニルホモセリンである。その後、アシルホモセリンは、硫黄転移反応(transsulfuration)または直接硫黄水和反応(direct sulfhydrylation)経路を経てホモシステインに転換される。両経路とも酵母、カビ、緑色植物およびバクテリアコリネバクテリウムグルタミカムに存在し、機能していると報告された。大腸菌(E.coli)は硫黄転移反応経路のみを持っている。前記硫黄転移反応経路は、中間物質としてシスタチオニンを経由し、硫黄供与体(sulfur donor)としてシステインを用いる。前記直接硫黄水和反応経路は、アシルホモセリンに硫化物(sulfide)を直接結合させるのと関連する。前記経路の最後の段階は、ｍｅｔＥまたはｍｅｔＨ遺伝子によってコードされるホモシステインメチルトランスフェラーゼによって触媒される、ホモシステインからメチオニンへの転換に関連する。
【０００４】
リシン、トレオニンおよびトリプトファンなどの他の重要アミノ酸は、発酵過程を経て動物飼料用として生産される。よって、これらのアミノ酸は、出発物質としてグルコースおよび他の再生可能な資源を用いて作ることができる。残念ながら、発酵過程を経るメチオニン生産は成功的ではないため、依然としてメチオニンの化学的合成が用いられているのが現状である。これは部分的に、メチオニン生産に効率的な操作された生合成経路の不足および適切な生産宿主の不足に起因する。下記では、向上したメチオニン生合成経路および生産宿主について開示する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chem. Marketing Reporter April 7, 2003
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、発酵によるメチオニン生産およびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭe）などの関連産物の生産に関する。また、本発明は、組み換えＤＮＡ分子を含み、メチオニンを生産するように遺伝的に操作された微生物について開示している。
【０００７】
直接硫黄水和反応活性を有するペプチド（ＥＣ ２．５．１．４９、ＥＣ ４．２．９９−）をコードする外因性核酸配列、および硫黄転移反応活性（ＥＣ ２．５．１．４８および４．４．１．８）を有するペプチドをコードする内因性核酸配列を含む微生物が開示される。前記微生物は、メチオニンおよびその関連産物を生産することができる。一つの例として、前記微生物は、細胞外のメチオニンまたはＳＡＭｅの濃度を少なくとも０．１、１、２、５、１０、５０、７５、９０または少なくとも１００ｇ／Ｌで持つことができる。
【０００８】
他の例として、一つ以上のメチオニン生合成経路が存在すると、有機体は、直接硫黄水和反応活性を有するペプチドをコードする外因性核酸配列がない場合よりさらに多くのメチオニンを生産することができる。
【０００９】
別の例として、２つ以上のメチオニン生合成経路が有機体内で活性化できる。これらの例において、一つ以上の外因性核酸配列は、直接硫黄水和反応活性を有するペプチドをコードすることができる。これらのペプチドの中でも、前記方法はメチオニンを生産するのに使用される微生物と共に使用することができる。前記方法は一つのペプチドはＯ−スクシニルホモセリンを基質として使用することができ、他のペプチドはＯ−アセチルホモセリンを基質として使用することができる。
【００１０】
別の例として、メチオニンおよびＳＡＭｅなどの関連産物を生産するように操作された微生物は硫黄転移反応生合成経路活性から前記メチオニンの少なくとも１０％を生産する。また別の例として、前記微生物は硫黄転移反応生合成経路活性から生成物の少なくとも２０、３０、４０または少なくとも５０％を生産する。
【００１１】
別の例として、メチオニンおよびＳＡＭｅなどの関連産物を生産するように操作された前記微生物は、直接硫黄水和反応生合成経路活性から前記メチオニンの少なくとも１０％を生産する。また別の例として、前記微生物は直接硫黄水和反応生合成経路活性から生成物の少なくとも２０、３０、４０または少なくとも５０％を生産する。
【００１２】
別の例として、メチオニンおよび関連産物を生産するように操作された微生物は、ｍｅｔＤ、ｍｅｔＫ、ｍｅｔＪ、ｔｈｒＢ、ｓｅｒＡ遺伝子またはこれらの組み合わせによってコードされるペプチドの活性を減衰させるために追加的に操作されてきた。また別の例として、前記微生物は、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＺ、ｍｅｔＸ、ｍｅｔＨ、ｃｙｓＰＷＵＡ、ｃｙｓＤ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＣ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＧ、ｃｓｙＫおよびｃｙｓＭなどの遺伝子を一つ以上過発現させるために追加的に操作される。
【００１３】
本発明は、メチオニンおよびＳＡＭｅを生産する方法を提供する。前記方法は、メチオニンおよび関連産物を生産するために操作された前記微生物を培養する段階、および生成物を分離する段階を含む。一つの例として、前記微生物は大腸菌(E.coli)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはコリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)でありうる。
【００１４】
また、本発明は、新規の核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列（配列番号１および２）について開示する。このような核酸配列、その断片および変異体は、組み換え微生物でペプチドを生産するのに有用である。前記ペプチドは、特にメチオニンおよびＳＡＭｅを生産するのに有用である。また、前記ペプチド、その断片および変異体は、抗体などの特異的結合物質を生産するのにも有用である。
【００１５】
また、本発明は、ＰＡＰＳ(phosphoadenylylsulfate)中間代謝物質を回避することにより硫黄同化作用を向上させる方法について開示する。前記方法は、メチオニンを生産するのに使用される微生物と共に使用することができる。前記方法は、一つ以上のアデニリル硫酸還元酵素（ＥＣ １．８．９．９２または１．８．４．９）の過発現のための組み換え核酸配列を微生物に導入することにより行われ得る。過発現は、プロモーターまたはエンハンサーなどの新しい調節因子を導入または変形する組み換え核酸配列を導入して内因性アデニリル硫酸還元酵素の生産を増加させることにより、或いはアデニリル硫酸還元酵素をコードする組み換え核酸配列を導入することにより起こり得る。
【００１６】
前記開示した技術の内容は以下の詳細な説明および図面によって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はメチオニンを生産するために多様な微生物によって用いられる３つの一般な経路を示す。前記経路はいずれも、メチオニン生産のための前駆体として部分的にアスパラギン酸塩を用いる。アスパラギン酸塩は様々な段階を経てホモセリンに転換され、ホモセリンはＭｅｔＡまたはＭｅｔＸによってＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリンに転換される。大腸菌(E.coli)とシュードモナス属(Pseudomonas sp.)などの一部微生物はＭｅｔＡポリペプチドを用いてＯ−スクシニルホモセリンを作り、コリネバクテリウム(Corynebacterium)とレプトスピラ属(Leptospira sp.)などの他の微生物はＭｅｔＸを用いてＯ−アセチルホモセリンを作る。その後、Ｏ−スクシニルホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンは、硫黄水和反応によって直ちにホモシステインに転換され、或いは硫黄転移反応によってホモシステインに転換され得る（前記２つの反応については詳細に後述する）。硫黄転移反応と関連のある酵素は２つの星印（＊＊）で表示され、硫黄水和反応と関連のある酵素は１つの星印（＊）で表示される。
【図２】図２は硫黄転移反応活性のみを有するもの（ＴＦ４０７６ＢＪＦ）、硫黄水和反応活性のみを有するもの（ＴＦ４０７６ＢＪＦ−Ａ）、或いは２つの活性を同時に有するもの（ＴＦ４０７６ＢＪＦ ｍｅｔＹＸ（Ｌｍ））など、ＴＦ４０７６ＢＪＦにおけるメチオニン蓄積を示すグラフである。
【図３】図３はフィードバック阻害に対する抵抗性のあるｍｅｔＡ突然変異体を同定するために用いられたスクリーニング方法に対する概略図である（各場合の蓄積された生成物は楕円形陰影で表示されている）。
【図４】図４はフィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子を発現させた菌株によって生産されたメチオニン蓄積の経時変化を示す。
【図５】図５は大腸菌におけるメチオニン輸送モデルを示す。
【図６】図６は天然の硫黄同化作用経路および新規の代替経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
｛配列目録｝
配列目的に記載された核酸およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に対する標準略字およびアミノ酸に対する３文字コードを用いて表示した。各核酸配列は一本鎖のみが表示されたが、相補的な鎖は開示された鎖から理解できるであろう。
配列番号１〜１０は、大腸菌由来の多様なｍｅｔＡ遺伝子突然変異の核酸配列およびこれに対応するアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号１１〜３４は、実施例で使用した多様なプライマー配列を示す。
【００２０】
｛略語および用語｝
本発明についてよく説明するために、且つ当御者が本発明を実施することを案内するために、下記の用語および方法についての説明が提供される。下記で明確に別途規定しない限り、「包含する(comprising)」は「含む(including)」を意味し、単数型の「一つ(a)」または「一つ(an)」または「前記(the)」は複数型を含む。たとえば、「一つの細胞を含む(comprising a cell)」は、そのような細胞の一つまたは多数を含むことを意味し、「前記ホモシステインシンターゼペプチドを含む(comprising the homocysteine synthase peptide)」は、一つ以上のホモシステインシンターゼペプチドおよび当業者に公知のそれと同等なものを意味する。「または(or)」は、明確に別途規定しない限り、列挙された代案的要素の一つの単一要素を意味し、或いは２つ以上の要素の組み合わせを意味する。例えば、「ホモシステインシンターゼ活性またはシスタチオニンガンマ−シンターゼ活性」は、ホモシステインシンターゼ活性、シスタチオニンガンマ−シンターゼ活性、またはこれらの組み合わせを意味する。
【００２１】
別途の言及がない限り、本発明に使用された全ての技術および科学的用語は、本発明の技術が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を持つ。下記開示されたものと類似または同等の方法および物質が本発明の実施または実験に利用できるとしても、適切な方法および物質が下記に開示される。物質、方法および実施例は、本発明を限定するためのものではなく、説明のためのものである。本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明および請求項から明らかになるであろう。
【００２２】
寄託番号(Accession Numbers)：本発明に開示された寄託番号は、米国国立保健院によって運営されるＮＣＢＩデータベース(National Center for Biotechnology Information)に由来したものである。前記寄託番号は２００７年２月２０日付で前記データベースに提供されたものである。
【００２３】
酵素分類番号(Enzyme Classification numbers．ＥＣ.)：本発明に開示されたＥＣ番号は、遺伝子およびゲノムの京都百科(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomics（ＫＥＧＧ）)によって運営され、東京大学から一部支援されるリガンドデータベースに由来したものである。前記ＥＣ番号は、２００７年２月２０日付で前記データベースに提供されたものである。
【００２４】
減衰(Attenuate)：いずれの影響、活性または強度を減らすことである。一つの例として、生成物または反応物ではない組成物によって引き起こされたフィードバック阻害または阻害に対する特定酵素の敏感度(sensitivity)が、酵素の活性が化合物の存在によって影響されない程度に減ることを意味する。例えば、前記ｍｅｔＡ遺伝子およびそれに対応するアミノ酸配列（配列番号２に示された代表的配列など）は、フィードバック阻害敏感度を減衰させる幾つかの突然変異を示す。前記ＭｅｔＡ敏感度の減衰については実施例３．Ｂ．でより詳述する。他の例として、活性の減少した酵素は減衰したと言える。
【００２５】
ｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）：内部の非コード部分（イントロン）および転写を決定する調節塩基配列が欠如したＤＮＡ断片。ｃＤＮＡは細胞から抽出されたメッセンジャーＲＮＡから逆転写によって合成できる。
【００２６】
欠失(Deletion)：一緒に結合しているいずれか一方の領域において、核酸分子からの一つ以上のヌクレオチドの除去、またはタンパク質からの一つ以上のアミノ酸の除去を意味する。
【００２７】
検出可能な(Detectable)：存在または現存を確信せしめる程度。例えば反応物からの生成物の生産、例えばＯ−スクシニルホモセリンまたはホモシステインの生産は、生成物または反応物から出る信号が、測定するのに十分なほど強ければ検出可能である。
【００２８】
直接硫黄水和反応活性(direct sulfhydrylation activity)：ホモシステインを生産するためにＯＳＨＳまたはＯＡＨＳをＳ２−と直接反応させる活性。このような活性を持つペプチドは、例えば、ｍｅｔＺおよびｍｅｔＹなどの遺伝子によってコードされるホモシステインシンターゼ（ＥＣ ４．２．９９．−，ＥＣ ２．５．１．４９）を含む。
【００２９】
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸。ＤＮＡは、大部分の生きている有機体の遺伝物質を含む長鎖ポリマーである（幾つかのウイルスはリボ核酸、ＲＮＡを含む遺伝子を有する）。ＤＮＡポリマーにおける繰返し単位は４つの異なるヌクレオチドであり、４つの塩基の一つ、すなわちアデニン、グアニン、シトシンまたはチミンを含むこれらのそれぞれはリン酸塩基の付いているデオキシリボース糖に結合する。ＤＮＡ分子においてコドンとして呼ばれるヌクレオチドのトリプレットは、ペプチドにあるアミノ酸をコードする。コドンという用語は、ＤＮＡ配列が転写されたｍＲＮＡにおいて３つのヌクレオチドの対応する（そして相補的な）配列に使用される。
【００３０】
内因性(endogenous)：本発明では、組み換え操作技術によって細胞に導入されたものではなく、細胞に存在する核酸配列またはペプチドを呼ぶ核酸分子および特定の細胞または微生物を意味する。例えば、自然から細胞が最初分離されるときに細胞に存在した遺伝子。もし転写または翻訳を活性化させるプロモーターまたはエンハンサー配列などの調節塩基配列が組み換え技術によって変形される場合ならば、遺伝子は依然として内因性と看做される。
【００３１】
外因性(exogenous)：自然状態で発見される特定の細胞に由来していない核酸分子を呼ぶ核酸分子および特定の細胞を意味する。よって、非自然発生的な核酸分子は、細胞に一応導入されると、細胞に対して外因性と看做される。自然発生的な核酸分子は特定の細胞に対して外因性でありうる。例えば、細胞ＸおよびＹが同じ細胞類型であっても、細胞Ｘから分離された全体コード配列は、一応細胞Ｙに導入されると、細胞Ｙに対して外因性の核酸である。
【００３２】
発現(Expression)：遺伝子のコードされた情報がタンパク質、運搬ＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡなどの細胞の構造または機能に転換される過程。発現された遺伝子は、ｍＲＮＡに転写され且つタンパク質に翻訳される遺伝子、およびＲＮＡには転写されるがタンパク質には翻訳されない遺伝子（例えば運搬ＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）を含む。
【００３３】
機能的欠失(Functional Deletion)：遺伝子産物の生産を減らし或いは阻害する遺伝子配列に作るか、或いは遺伝子産物を非機能的に作る突然変異、部分的または全体欠失、挿入、または他の変形。例えば、大腸菌におけるｍｅｔＪの機能的欠失はメチオニン生合成経路の抑制を減らす。他の例として、大腸菌におけるｔｈｒＢの機能的欠失はトレオニン生合成経路におけるホモセリンの利用を減らす。他の例として、機能的欠失はノックアウト突然変異として記述される。
【００３４】
分離された(Isolated)：「分離された」生物学的構成要素（核酸分子、タンパク質または細胞）は、例えば、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡやタンパク質などの自然発生的な構成要素であって、他の生物学的構成要素から実質的に分離または精製されたものである。分離された核酸分子およびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸分子およびタンパク質を含む。前記用語は、化学的に合成された核酸分子およびタンパク質だけでなく、宿主細胞で組み換え発現によって製造された核酸分子およびタンパク質を含む。
【００３５】
一例を挙げれば、用語「分離された」は、配列が由来した有機体の自然発生的なゲノム内で直ちに接触する２つの配列（５’末端にある一つと３’末端にある一つ）に直ちに接触しない自然発生的な核酸分子を意味する。
【００３６】
核酸分子：ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびｍＲＮＡなど、制限なく、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子の両方ともを含む。化学的に合成された或いは組み換え的に生産された合成核酸分子を含む。前記核酸分子は二本鎖でも一本鎖でもよい。一本鎖の場合、前記核酸分子はセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよい。また、前記核酸分子は円形でも線形でもよい。
【００３７】
作動可能に連結(Operably linked)：第１核酸配列が第２核酸配列と機能的関係にあれば、第１核酸配列は第２核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、前記プロモーターはコード配列と作動可能に連結されたものである。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、同一のリーディングフレームにおいて２つのタンパク質コード領域を連結するのに必要なところに隣接している。一つの単一メッセンジャーＲＮＡのように並んで転写および分離された遺伝子の立体培地(configuration)はオペロンで示される。よって、近接位置に置かれた遺伝子は、例えば、プラスミドベクターにおいて、一つの単一プロモーターの転写調節下に一つの合成オペロンを構成する。
【００３８】
ＯＲＦ(open reading frame)：終止コドンなしでペプチド、ポリペプチドまたはアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は通常一つのペプチドに翻訳できる。
【００３９】
精製された(Purified)：用語「精製された」は、絶対的純度をいうものではなく、相対的な用語である。よって、精製されたペプチドの製造、例えばスクシニルＣｏＡホモセリンアシルトランスフェラーゼまたはホモシステインシンターゼの製造などは、細胞内の環境にあるペプチドよりさらに濃縮されたペプチドをいう。例えば、精製されたペプチドは、一緒に在る細胞構成要素（核酸、脂質、炭水化物および他のペプチド）から実質的に分離されたものをいう。他の例として、精製されたペプチドの製造は、ペプチドの化学的合成に副次的に存在しうる汚染物質などが実質的にないことを意味する。
【００４０】
一例として、ペプチドは、サンプルの少なくとも約５０重量％が前記ペプチドから構成されるときに精製されたものであり、例えば、サンプルの少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％以上が前記ペプチドから構成されるときである。ペプチドを精製するために使用できる方法の具体例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch. 17）で開示された方法を含み、必ずしもこれに限定されるのではない。例えば、タンパク質純度は、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定でき、次いで前記ポリアクリルアミドゲルを染色して一つの単一ペプチドバンドを肉眼で確認すること；高圧液相クロマトグラフィー；シーケンシング；または他の通常の方法を行うことができる。
【００４１】
組み換え(recombinant)：組み換え核酸分子またはタンパク質は、自然発生的ではない配列を有し、２つの別個に分離された配列または断片の人工的な組み換えによって製造された配列を有することをいう。このような人工的な組み換えは、例えば、核酸分子またはタンパク質の分離された断片の化学合成または遺伝工学的技術などの人工的な操作によって行われる。組み換えはまた、人工的に操作されるが、核酸を分離した有機体から発見される同一の調節塩基配列およびコード領域を有する核酸分子を説明するときにも使用する。
【００４２】
配列相同性／類似性：２つ以上の核酸配列または２つ以上のアミノ酸配列間の相同性／類似性は、配列間の相同性または類似性の見地で表現される。配列相同性は、パーセント相同性の見地で測定でき、パーセントが高いほどさらに高い相同性を有し、前記配列はさらに多く同一であることを意味する。配列類似性は、パーセント類似性の見地で測定でき（保存的アミノ酸代替を説明する）、パーセントが高いほどさらに高い類似性を有し、前記配列はさらに多く類似であることを意味する。核酸またはアミノ酸配列のホモログ(homolog)またはオルソログ(ortholog)は、標準方法を用いて比較するときに相対的に高い程度の配列相同性／類似性を有するものである。
【００４３】
配列比較のためのアラインメント(alignment)方法は当業界に公知になっている。多様なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが開示される：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-3, 1989; Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90, 1988; Huang et al. Computer Appls. in the Biosciences 8, 155-65, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Bio. 24:307-31, 1994などで配列アラインメント方法および相同性の測定について詳細に取り扱っている。
【００４４】
ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)は、ＮＣＢＩ(National Center for Biological Information)(National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)を含むインターネットにおいて、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘの利用のために幾つかの出先から利用可能である。追加的な情報はＮＣＢＩウェブサイトで探し出すことができる。
【００４５】
ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために用いられるが、ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために用いられる。２つの核酸配列を比較するためのオプションは下記のようにセットできる：−ｉは比較される一番目の核酸配列を含むファイルにセットされ（Ｃ：＼ｓｅｑｌ．ｔｘｔのように）；−ｊは比較される２番目の核酸配列を含むファイルにセットされ（Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔのように）；−ｐはｂｌａｓｔｎにセットされ；−ｏは所望のファイル名にセットされ（Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔのように）；−ｑは−１にセットされ；−ｒは２にセットされ；そして全ての他のオプションはデフォルトセットに残される。例えば、下記命令は２つの配列間の比較を含む結果ファイルを作るように利用できる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ −ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂｌａｓｔｎ  −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ −ｑ −１−ｒ２。
【００４６】
２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは下記のようにセットできる：：−ｉは比較される一番目のアミノ酸配列を含むファイルにセットされ（Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔのように）；−ｊは比較される２番目のアミノ酸配列を含むファイルにセットされ（Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔのように）：−ｐはｂｌａｓｔｐにセットされ；−ｏは所望のファイル名にセットされ（Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔのように）；そして全ての他のオプションはデフォルトセットに残される。例えば、下記命令は２つのアミノ酸配列間の比較を含む結果ファイルを作るように利用できる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ −ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂａｌｓｔｐ −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。もし２つの比較された配列が相同性を有するならば、指定された結果ファイルは比較された配列における相同性のある部分を提示するであろう。もし２つの比較配列が相同性を有しなければ、指定された結果ファイルは比較された配列を提示しないであろう。
【００４７】
一応比較が行われると、両配列に存在する同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基位置の数をカウントすることにより、マッチ数値が決定される。パーセント配列相同性は、マッチ数値を、一致する配列に提示された配列長さまたは有機的に統合された長さ（一つの一致した配列に提示された配列から出た１００個の連続的なヌクレオチドまたはアミノ酸残基など）で割り、その結果値に１００を掛けて決定できる。例えば、１５５４ヌクレオチドを有するテスト配列と比較するとき、１１６６個のマッチを有する核酸配列はテスト配列に対して７５％の相同性を有する（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。パーセント配列相同性数値は四捨五入されるが、例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３および７５．１４は７５．１になり、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８および７５．１９は７５．２になる。長さ値は常に整数であろう。
【００４８】
３０個を超えるアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ２配列関数がパラメータ(gap existence cost of 11, and a per residue gap cost of 1)をデフォールトさせるために、デフォールトＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスセットを用いて使用される。同族体(homolog)は、ｎｒまたはｓｗｉｓｓｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅなどのデータベースを有するＮＣＢＩ Ｂａｓｉｃ ２．０、ｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔｐを用いて、アミノ酸配列を有する全長アラインメントについて典型的に少なくとも７０％の配列相同性を有するものと特徴付けられる。ｂｌａｓｔｎプログラムで照会される質問はＤＵＳＴ(Hancock anc Armstrong, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:67-70)でフィルタリングされ、他のプログラムはＳＥＧを使用する。しかも、マニュアルアラインメントが行われ得る。さらに大きい類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価されるときに対象配列の活性を保有しながら、対象配列（寄託番号などによって明らかになった）と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９９％のさらに高いパーセント相同性を示すであろう。一部の例では対象配列は天然配列の活性よりさらに大きい活性を有し、他の例ではさらに低い活性を有するであろう。
【００４９】
短いペプチド（約３０個のアミノ酸未満）を比較するとき、アラインメント(alignment)は、パラメータ(open gap 9, extension gap 1 penalties)をデフォールトさせるためにＰＡＭ３０マトリクスセットを使用する、ブラスト２配列関数を用いて行わなければならない。リファレンス配列と一層さらに類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価されるとき、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％などの増加したパーセント相同性を示すであろう。配列相同性比較の際に全体配列以下に比較されるときは、同族体は典型的に１０〜２０アミノ酸の短いウィンドウに対して少なくとも７５％の配列相同性を有し、リファレンス配列に対する相同性に応じて、少なくとも８５％、９０％、９５％または９８％の配列相同性を有するであろう。そのような短いウィンドウに対する配列相同性を決定する方法は、ＮＣＢＩウェブサイトに記述されている。
【００５０】
高い程度の相同性を示さない核酸配列は、それにも拘らず、遺伝情報の縮退性のため、同一または類似（保存的）のアミノ酸配列をコードすることができる。核酸配列における変化は、実質的に同一のタンパク質をコードする多数の核酸分子を生産するために、このような縮退性を用いて作られ得る。例えば、そのような同族の核酸配列は対象配列（寄託番号などによって明らかになった）と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列相同性を持つことができる。
【００５１】
当業者であれば、これらの配列相同性の範囲は参考として提供されるものに過ぎず、前記範囲でなくても、相当類似の同族体を得ることができることを理解するであろう。
【００５２】
形質転換された細胞(Transformed cell)：例えば分子生物学技術によってスクシニルＣｏＡホモセリンアシルトランスフェラーゼ、ホモシステインシンターゼ核酸分子などの核酸分子が導入された細胞。形質転換は、核酸分子が細胞に導入できる全ての技術、ウイルスベクターによるトランスフェクション、コンジュゲーション、プラスミドベクターによる形質転換、およびエレクトロポレーション(electroporation)、リポフェクション(lipofection)およびパーティクルガンアクセラレイション(particle gun acceleration)によるヌードＤＮＡの導入など制限なく含む。
【００５３】
硫黄転移反応活性：中間代謝産物としてのシスタチオニンを介してメチオニンまたはＳＡＭｅを生産する活性。このような活性を持つペプチドは、シスタチオニンガンマシンターゼ（ＥＣ ２．５．１．４８）およびシスタチオニンベータリアーゼ（ＥＣ ４．４．１．８）を含み、これらのペプチドは、それぞれｍｅｔＢおよびｍｅｔＣ遺伝子によってコードされる。シスタチオニンガンマシンターゼ（ＥＣ ４．２．９９．９）およびシスタチオニンベータリアーゼ（ＥＣ ４．４．１．８）ペプチドのいずれの組み合わせも、微生物が硫黄転移反応活性を持つように利用できる。
【００５４】
生成物の生産を許容する条件の下に(Under conditions that permit product production)：微生物がメチオニンまたはＳＡＭｅなどの所望の産物を生産するようにするいずれの発酵条件。前記条件は、通常、温度、通気および培地を含む。前記培地はブロス(broth)またはゲルであり得る。一般に、前記培地はグルコース、フルクトース、セルロースなどの炭素源を含み、これらの炭素源は微生物によって直接代謝されるか、或いはこれらの炭素源代謝を促進させるために前記培地に酵素が利用され得る。培養条件が生成物の生産を許容するか否かを決定するために、前記微生物は２４、３６または４８時間培養でき、サンプルを取ることができる。その後、前記サンプルの細胞は所望の産物の存在有無を確認するためにテストできる。例えば、メチオニンまたはＳＡＭｅの存在有無を確認するために、実施例で提供された分析法が使用できる。
【００５５】
ベクター：細胞に導入されて形質転換された細胞を作る核酸分子。ベクターは、例えば複製起点など、細胞で複製を許容する核酸配列を含むことができる。ベクターはまた、一つ以上の選択マーカー遺伝子、および当業界に知られている他の遺伝的要素を含むことができる。
【００５６】
｛発明の詳細な説明｝
〔Ｉ．メチオニン生産経路〕
図１に示すように、多くの生合成経路がメチオニン、または例えばアスパルチルリン酸、アスパルギン酸セミアルデヒド、ホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン（ＯＳＨＳ）、Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨＳ）、シスタチニン、ホモシステイン、メチオニンおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）などの中間代謝産物を生産するために利用できる。本発明の開示では、一つの中間代謝産物が文脈に応じて反応物(reactant)または生成物(product)になれる。例えば、アスパラギン酸キナーゼを用いてアスパラギン酸塩をアスパルチルリン酸塩に転換することについて記述するときは、前記アスパラギン酸塩は反応物であり、前記アスパルチルリン酸塩は生成物である。同様に、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼを用いてアスパルチルリン酸塩をアスパラギン酸セミアルデヒドに転換することについて記述するときは、アスパルチルリン酸塩は反応物であり、アスパラギン酸セミアルデヒドは生成物である。一つの反応物が一つの生成物に転換されて一つの経路を作るために、それぞれの酵素類に属する多くの酵素が利用できるので、当業者は図１が多くの生合成経路を示すと理解するであろう。しかも、これらの反応は生体内(in vivo)、生体外(in vitro)で行われてもよく、生体内反応と、非酵素的化学反応を含む生体外反応との組み合わせによって行われてもよい。
【００５７】
また、宿主微生物が発酵フィードストック(feedstock)で中間代謝産物を含むことにより、前記経路の中間代謝産物を提供することができる。よって、もし生合成経路が与えられた中間代謝物の好適な量より少なく生産するならば、そのような中間代謝産物はフィードストックに追加できる。これは連続的な発酵セッティングまたはバッチ(batch)発酵セッティングで行われ得る。
【００５８】
当業者は、生産宿主がグルコースではない炭素源を用いることができると認識するであろう。例えば、代替水素源はスクロース、フルクトース、セルロース、ヘミセルロース、澱粉またはグリセロールである。代替炭素源が利用されるとき、発酵培地で炭素源を変形させることが可能な酵素を含むことが必要であり得る。
【００５９】
＜Ａ．グルコースからアスパラギン酸塩まで＞
一般に、微生物はグルコースからアスパラギン酸塩を生産する。当業者は、生産菌株でアスパラギン酸塩を増加させる多くの方法があることを認識するであろう。例えば、ピルビン酸カルボキシラーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ酵素の発現を増加させるか、グリオキシル酸塩転換を変更し或いはピルビン酸塩がアセテートまたはエタノールなどの他の生成物に消費されることを除去することなどである。
【００６０】
或いは、アスパラギン酸塩は、微生物により始まる発酵フィードストックに含有でき、メチオニン生合成経路で反応物として利用できる。
【００６１】
アスパラギン酸塩はまた、リシン、トレオニン、およびアスパラギン生合成経路で中間代謝産物として作用する。よって、これらの経路を減衰または除去（ノックアウト）してより多くのアスパラギン酸塩が前記メチオニン生産経路に利用できるようにすることが好ましい。
【００６２】
＜Ｂ．アスパラギン酸塩からアスパルチルリン酸塩まで＞
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてアスパルチルリン酸塩を生産するように操作できる。例えば、ＷＯ０４０６９９９６Ａ２に開示されたフィードバック抵抗性アスパラギン酸キナーゼが内因性アスパラギン酸キナーゼを代替することができ、或いは内因性アスパラギン酸キナーゼに加えてさらに利用できる。
【００６３】
本発明において、アスパラギン酸キナーゼは、アスパラギン酸塩をアスパルチルリン酸塩に転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、酵素分類番号（ＥＣ）２．７．２．４のペプチドを含む。また、当業者であれば、幾つかのアスパラギン酸キナーゼペプチドが他の反応も触媒し、例えば、幾つかのアスパラギン酸キナーゼペプチドはアスパラギン酸塩だけでなく他の基質も利用することができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的アスパラギン酸キナーゼペプチドも本発明に含まれる。アスパラギン酸キナーゼ配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＺ＿ＡＡＶＹ０１００００２２、ＮＣ＿００６９５８およびＮＺ＿ＡＡＷＷ０１００００５５はアスパラギン酸キナーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＮＰ＿４１８４４８、ＮＰ＿５９９５０４およびＺＰ＿０１６３８０９６はアスパラギン酸キナーゼペプチド配列を開示する。特定のペプチドのアスパラギン酸キナーゼ活性を特性化(characterizing)するための分析法は当業界に公知になっている。例えば、文献「Cohen, GN, Methods in Enzymology, 113:596:600, 1985」に開示された分析法が、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。
【００６４】
＜Ｃ．アスパルチルリン酸塩からアスパラギン酸セミアルデヒドまで＞
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてアスパラギン酸セミアルデヒドを生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼのより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００６５】
本発明において、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アスパルチルリン酸塩をアスパラギン酸セミアルデヒドに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼペプチド（ＥＣ １．２．１．１１）を含む。また、当業者であれば、幾つかのアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼペプチドは他の反応も触媒することを認識するであろう。例えば、幾つかのアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼペプチドは、アスパルチルリン酸塩だけでなく他の基質も利用することができるので、そのような非特異的アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼペプチドも本発明に含まれる。アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＣ＿００６９５８、ＮＺ＿ＡＡＶＹ０１００００１５およびＮＺ＿ＡＡＷＷ０１００００１０はアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＮＰ＿４１７８９１、ＮＰ＿５９９５０５およびＺＰ＿０１６４））７２は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Cohen, GN, Methods in Enzymology, 113:600-602, 1985」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。
【００６６】
＜Ｄ．アスパラギン酸セミアルデヒドからホモセリンまで＞
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてホモセリンを生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼのより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００６７】
本発明において、ホモセリンデヒドロゲナーゼは、アスパラギン酸セミアルデヒドをホモセリンに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、ホモセリンデヒドロゲナーゼペプチド（ＥＣ １．１．１．３）を含む。また、当業者であれば、幾つかのホモセリンデヒドロゲナーゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのホモセリンデヒドロゲナーゼペプチドはアスパラギン酸セミアルデヒドだけでなく他の基質も利用することができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的ホモセリンデヒドロゲナーゼペプチドも本発明に含まれる。ホモセリンデヒドロゲナーゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＣ＿００６９５８、ＮＺ＿ＡＡＶＹ０１００００１３およびＮＺ＿ＡＡＷＷ０１００００３３はホモセリンデヒドロゲナーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＮＰ＿４１４５４３、ＺＰ＿０１６３９８１９およびＮＰ＿６００４０９はホモセリンデヒドロゲナーゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのホモセリンデヒドロゲナーゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Patte et.al., Biochem. Biophys. Acta 128:426-439, 1966」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。
【００６８】
＜Ｅ．ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリン（ＯＳＨＳ）まで＞
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてＯ−スクシニルホモセリン（ＯＳＨＳ）を生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼペプチドのより活性化された形態を発現または過発現させ、或いはホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼペプチドのフィードバック阻害不感性形態(insensitive form)を用いる方法である。
【００６９】
本発明において、スクシニルＣｏＡホモセリンアシルトランスフェラーゼは、ホモセリンをＯＳＨＳに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ ２．３．１．４６）を含む。また、当業者であれば、幾つかのホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのスクシニルＣｏＡホモセリンアシルトランスフェラーゼペプチドはホモセリンだけでなく他の基質も利用することができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的スクシニルＣｏＡホモセリンアシルトランスフェラーゼペプチドも本発明に含まれる。ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＺ＿ＡＡＷＷ０１００００５５はホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＡＡＣ７６９８３はホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのスクシニルＣｏＡホモセリンアシルトランスフェラーゼの活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Lawrence, J. Bacteriol., 109:8-11, 1972」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、スクシニルＣｏＡホモセリンアシルトランスフェラーゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＡと指称される。
【００７０】
＜Ｆ．ホモセリンからＯ−アセチルホモセリン（ＯＡＨＳ）まで＞
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてＯ−アセチルホモセリン（ＯＡＨＳ）を生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ ２．３．１．３１）のより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００７１】
本発明において、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、ホモセリンをＯＡＨＳに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ ２．３．１．３１）を含む。また、当業者であれば、幾つかのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドはホモセリンだけでなく他の基質も利用することができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドも本発明に含まれる。ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号Ｙ１０７４４ ＲＥＧＩＯＮ：２８２２．．３９６１、ＮＺ＿ＡＡＡＨ０２０００００４ ＲＥＧＩＯＮ：１６６０５７．．１６７１９３およびＮＺ＿ＡＡＡＹ０２００００８１ ＲＥＧＩＯＮ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１１５３５．．１２６０５）はホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＣＡＡ７１７３３、ＺＰ＿００７６６３６７およびＺＰ＿００１０７２１８はホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Lawrence, J. Bacteriol., 109:8-11, 1972」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＸと指称される。
【００７２】
＜Ｇ．硫黄水和反応(sulfhydrylation)＞
直接硫黄水和反応によるホモシステインの生産はホモシステインシンターゼ酵素によって行われる。これらの酵素のうち、幾つかは基質としてＯＳＨＳを用い、幾つかは基質としてＯＡＨＳを用いる。また、これらの酵素の幾つかはＯＳＨＳまたはＯＡＨＳを基質として用いることができる。
【００７３】
（１．Ｏ−スクシニルホモセリン（ＯＳＨＳ）からホモシステインまで）
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてホモシステインを生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、ホモシステインシンターゼペプチド（ＥＣ ４．２．９９．−）のより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００７４】
本発明において、ホモシステインシンターゼは、Ｏ−スクシニルホモセリン（ＯＳＨＳ）をホモシステインに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、ホモシステインシンターゼペプチド（ＥＣ ４．２．９９．−）を含む。本発明では、硫化物(sulfide)との反応によるＯＳＨＳのホモシステインへの転換を直接硫黄水和反応と呼ぶ。また、当業者であれば、幾つかのホモシステインシンターゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのホモシステインシンターゼペプチドはＯＳＨＳだけでなく他の基質も用いることができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的ホモシステインシンターゼペプチドも本発明に含まれる。ホモシステインシンターゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＡＥ００４０９１はホモシステインシンターゼ（Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンスルフヒドリラーゼ）核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＡＡＧ０６４９５はホモシステインシンターゼ（Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンスルフヒドリラーゼ）アミノ酸配列を開示している。特定ペプチドのホモシステインシンターゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Yamagata, Methods in Enzymology, 143:478, 1987」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、ホモシステインシンターゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＺと指称される。
【００７５】
（２．Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨＳ）からホモシステインまで）
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてホモシステインを生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、ホモシステインシンターゼペプチド（ＥＣ ２．５．１．４９）のより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００７６】
本発明において、ホモシステインシンターゼは、Ｏ−スクシニルホモセリン（ＯＳＨＳ）をホモシステインに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、ホモシステインシンターゼペプチド（ＥＣ ２．５．１．４９）を含む。本発明では、硫化物(sulfide)との反応によるＯＡＨＳのホモシステインへの転換を直接硫黄水和反応と呼ぶ。また、当業者であれば、幾つかのホモシステインシンターゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのホモシステインシンターゼペプチドはＯＳＨＳだけでなく他の基質も用いることができることを認識するであろう。例えば、下記実施例２に開示されたホモシステインシンターゼはＯＡＨＳまたはＯＳＨＳを基質として用いる。よって、そのような非特異的ホモシステインシンターゼペプチドも本発明に含まれる。ホモシステインシンターゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＡＥ００４０９１ ＲＥＧＩＯＮ：５６５５６４８．．５６５６９２５、Ｙ１０７４４ ＲＥＧＩＯＮ：１４８５．．２８１３、ＮＺ＿ＡＡＡＨ０２０００００４ ＲＥＧＩＯＮ：１６４５３６．．１６５９９０およびＮＺ＿ＡＡＡＹ０２００００８１ ＲＥＧＩＯＮ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（１２７５０．．１４０５４）はホモシステインシンターゼ（Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンスルフヒドリラーゼ）核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＡＡＧ０８４１０、ＣＡＡ７１７３２、ＺＰ＿００７６６３６６およびＺＰ＿００１０７２１９はホモシステインシンターゼ（Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンスルフヒドリラーゼ）アミノ酸配列を開示している。特定ペプチドのホモシステインシンターゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Yamagata, Methods in Enzymology, 143:478, 1987」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、ホモシステインシンターゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＹと指称される。
【００７７】
＜Ｈ．硫黄転移反応＞
（１．Ｏ−スクシニルホモセリン（ＯＳＨＳ）またはＯ−アセチルホモセリン（ＯＡＨＳ）からシスタチオニンまで）
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてシスタチオニンを生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、シスタチオニンガンマ−シンターゼペプチド（ＥＣ ２．５．１．４８）のより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００７８】
本発明において、シスタチオニンガンマ−シンターゼは、ＯＳＨＳまたはＯＡＨＳをシスタチオニンに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、シスタチオニンガンマ−シンターゼペプチド（ＥＣ ２．５．１．４８）を含む。また、当業者であれば、幾つかのシスタチオニンガンマ−シンターゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのシスタチオニンガンマ−シンターゼペプチドはＯＳＨＳまたはＯＡＨＳだけでなく他の基質を用いることができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的シスタチオニンガンマ−シンターゼペプチドも本発明に含まれる。シスタチオニンガンマ−シンターゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＣ＿００６９５８、ＮＺ＿ＡＡＷＷ０１０００００６およびＮＣ＿００４１２９はシスタチオニンガンマ−シンターゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＮＰ＿４１８３７４、ＹＰ＿３４８９７８およびＮＰ＿６０１９７９はシスタチオニンガンマ−シンターゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのシスタチオニンガンマ−シンターゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Methods in Enzymology, 17:425-433, 1971」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、シスタチオニンガンマ−シンターゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＢと指称される。
【００７９】
（２．シスタチオニンからホモシステインまで）
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてホモシステインを生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、シスタチオニンベータ−リアーゼペプチド（ＥＣ ４．４．１．８）のより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００８０】
本発明において、シスタチオニンベータ−リアーゼは、シスタチオニンをホモシステインに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、シスタチオニンベータ−リアーゼペプチド（ＥＣ ４．４．１．８）を含む。また、当業者であれば、幾つかのシスタチオニンベータ−リアーゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのシスタチオニンベータ−リアーゼペプチドはシスタチオニンだけでなく他の基質を用いることができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的シスタチオニンベータ−リアーゼペプチドも本発明に含まれる。シスタチオニンベータ−リアーゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＺ＿ＡＡＷＷ０１０００００１、ＮＣ＿００６９５８およびＮＺ＿ＡＡＶＹ０１０００００４はシスタチオニンベータ−リアーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＮＰ＿７４６４６３、ＹＰ＿２２６５５２およびＮＰ＿４１７４８１はシスタチオニンベータ−リアーゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのシスタチオニンベータ−リアーゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Methods in Enzymology, 143:483-486, 1987」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、シスタチオニンベータ−リアーゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＣと指称される。
【００８１】
＜Ｉ．ホモシステインからメチオニンまで＞
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてメチオニンを生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路でメチオニンまたはＳＡＭｅなどの生成物の生産を増加させる一つの方法は、ホモシステインメチラーゼペプチド（ＥＣ ２．１．１．１４および２．１．１．１３）のより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。
【００８２】
本発明において、ホモシステインメチラーゼは、ホモシステインをメチオニンに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、ホモシステインメチラーゼペプチド（ＥＣ ２．１．１．１４および２．１．１．１３）を含む。また、当業者であれば、幾つかのホモシステインメチラーゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのホモシステインメチラーゼペプチドはホモシステインだけでなく他の基質を用いることができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的ホモシステインメチラーゼペプチドも本発明に含まれる。ホモシステインメチラーゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＣ＿００４１２９、ＮＣ＿００６９５８およびＮＣ＿０００９１３はホモシステインメチラーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＡＰ＿００４５２０、ＹＰ＿２２５７９１およびＣＡＫ１６１３３はホモシステインメチラーゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのホモシステインメチラーゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Analytical Biochemistry, 228, 323-329, 1995」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、ホモシステインメチラーゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＨまたはｍｅｔＥと指称される。
【００８３】
＜Ｊ．メチオニンからＳ−アデノシルメチオニンまで＞
生産宿主は、公知のポリペプチドを用いてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）を生産または過多生産するために操作できる。メチオニン生合成経路で生成物の生産を増加させる一つの方法は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ ２．５．１．６）のより活性化された形態を発現または過発現させることによる方法である。たとえば、当業者であれば、メチオニンが所望の生成物である場合、ｍｅｔＫによってコードされるメチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ ２．５．１．６）の活性または発現は減衰できることを認識するであろう。
【００８４】
本発明において、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼは、メチオニンをＳＡＭｅに転換することを促進させることが可能な他のペプチドだけでなく、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ ２．５．１．６）を含む。また、当業者であれば、幾つかのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチドは他の反応も触媒し、例えば、幾つかのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチドはメチオニンだけでなく他の基質を用いることができることを認識するであろう。よって、そのような非特異的メチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチドも本発明に含まれる。メチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチド配列は公開されている。例えば、遺伝子銀行寄託番号ＮＣ＿０２５１６、ＮＣ＿００６９５８およびＮＣ＿０００９１３はメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ核酸配列を開示し、遺伝子銀行寄託番号ＮＰ＿７４７０７０、ＣＡＩ３７１８０およびＮＰ＿６００８１７はメチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチド配列を開示している。特定ペプチドのメチオニンアデノシルトランスフェラーゼ活性を特性化するための分析法は当業界によく知られている。例えば、文献「Methods in Enzymology, 94:219-222, 1983」に開示された分析法は、特定ペプチドの活性を特性化するために利用できる。また、本発明において、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼペプチドをコードする遺伝子はｍｅｔＫと指称される。
【００８５】
〔ＩＩ．メチオニン生産増加のための生産菌株の遺伝的操作〕
アスパラギン酸塩の生産は当業界に公知の方法を用いて増加させることができる。例えば、アスパラギン酸塩の生産は、幾つかの他の接近法で、細胞により生産されるオキサロ酢酸の量を増やすことにより増加させることができる(Gokarn et.al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:188-95, 2001; Sanchez et.al, Metabolic Eng., 8:209-226, 2006)。
【００８６】
また、生成物の生産は、Ｌ−メチオニン生合成経路で多様な遺伝子を過発現させることにより増加させることができる。例えば、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥおよびｍｅｔＨ、ｃｙｓＤ、ｃｙｓＮ、ｃｙｓＣ、ｃｙｓＨ、ｃｙｓＩ、ｃｙｓＪ、ｃｙｓＫおよびｃｙｓＭなどの遺伝子を多様なプロモーターの調節下に置くことにより、これらの酵素がさらに多く生産されるようにすることができる。
【００８７】
前記ｍｅｔＡ遺伝子は、ホモセリンからのメチオニン生合成経路で一番目の酵素であり且つメチオニン生産の調節ポイントであるホモセリンスクシニルトランスフェラーゼをコードする。前記ｍｅｔＡタンパク質は、３５．７ｋＤａの測定分子量を有する１８６個のアミノ酸残基からなる温度敏感性タンパク質である。前記ｍｅｔＡ活性は、最後の生成物である、メチオニンおよびＳ−アデノシルメチオニンによって阻害されるものと知られている(Lee et al., J. Biol. Chem. 241:5479-5780, 1966)。これらの２つの生成物によるフィードバック阻害は相乗効果がある。これは、各代謝産物のみの低濃度は弱い阻害活性を示すが、それらの組み合わせは強い阻害活性を示すことを意味する。よって、生産菌株はフィードバック阻害抵抗性ＭｅｔＡ活性から利得を得ることができる。
【００８８】
メチオニン生産菌株において減衰または欠失できる別の遺伝子はｍｅｔＪである。ｍｅｔＪによってコードされるペプチドは、メチオニン生合成経路に関連した幾つかの遺伝子の発現を調節する。ｍｅｔＪによりコードされるタンパク質はＳ−アデノシルメチオニンに結合してｍｅｔＡ、ｍｅｔＣおよびｍｅｔＦ遺伝子を抑制する。
【００８９】
ｍｅｔＦ遺伝子によりコードされるタンパク質、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素は、ホモシステインからＬ−メチオニンを生産するためのメチル基供与体であるＮ（５）−メチルテトラヒドロ葉酸の合成に関与する(Sheppard et al., J. Bacteriol. 181:718-25, 1999)。米国２００２／００４９３０５では、Ｌ−メチオニンの生産はコリネバクテリアから５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ｍｅｔＦ）の発現を増加させることにより向上できることを開示している。よって、本発明で記述する操作された微生物もｍｅｔＦの生産を増加させるように操作できる。
【００９０】
ｍｅｔＫ遺伝子の調節もメチオニンおよびＳＡＭｅの生産を増加させることができる。Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）は、全ての有機体において１次メチル基供与体であり、ポリアミンの生合成に関与する。ＳＡＭｅはまた、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＡＴまたはＭｅｔＫ、ＥＣ ２．５．１．６）として知られている。ＭｅｔＫは、唯一に知られている、ＳＡＭｅ生合成のルートを触媒する。完全なトリポリリン酸塩の鎖がＡＴＰによって開裂され、スルホニウム(sulfonium)化合物が形成される。
【００９１】
ＳＡＭｅの形成は、メチオニンの濃度を低下させ、ＭｅｔＡのフィードバック阻害によってメチオニン生合成経路の活性を減少させる。よって、ｍｅｔＫを機能的に欠失または減衰させると、メチオニン生産を増やすことができる。
【００９２】
当業者であれば、メチオニンを作っている細胞による硫黄の利用効率が重要であることを認識するであろう。これは、特に硫黄同化作用の過程においてホスホアデニリル硫酸（ＰＡＰＳ）を中間代謝産物として用いる微生物の場合にそうであるが、ＰＡＰＳの製造にＡＴＰ分子の消費を要するためである。
【００９３】
硫酸塩(sulfate)は、相当反応性が低いため、細胞で使用されるためにはより反応性のある形態に転換されなければならない。大腸菌において、硫酸塩は、周辺細胞質空間に位置した３つの細胞膜構成要素および基質特異的結合タンパク質から構成された周辺細胞質輸送系によって細胞に流入する。硫酸透過酵素(sulfate permease)の３つの膜構成要素はｃｙｓＴ、ｃｙｓＷ、およびｃｙｓＡ遺伝子（ｃｙｓＡ遺伝子座）によってコードされる。ｃｙｓＡ遺伝子座の産物はｃｙｓレギュロン(cys regulon)の一部であって、残りの硫酸塩（スルフェート）−同化作用経路と協力して調節される。その後、硫酸塩は、大部分の有機体において類似に見える経路によって高エネルギーヌクレオシドホスホ硫酸を作るためにヌクレオシドにカップリングされることにより活性化される。
【００９４】
図６に示すように、大腸菌などの微生物は、硫酸アデニリルトランスフェラーゼペプチド（ｃｙｓＮｃｙｓＤによってコードされるＥＣ ２．７．７．４）を用いて硫酸塩をアデニリル硫酸（ＡＰＳ）に転換する経路を用いる。そして、前記ＡＰＳはＡＰＳキナーゼ（ｃｙｓＣによってコードされるＥＣ ２．７．１．２５）によってＰＡＰＳに転換される。このような過程はＡＴＰを要求する。ＰＡＰＳはＰＡＰＳ還元酵素（ｃｙｓＨによってコードされたＥＣ １．８．４．８）によって亜硫酸塩(sulfite)に転換され、亜硫酸塩はＮＡＤＰＨ−亜硫酸還元酵素（ｃｙｓＩｃｙｓＪｃｙｓＧによってコードされるＥＣ  １．８．１．２）によって硫化物（スルフィド）に還元される。図６の右に示した代替経路は、アデニリル硫酸還元酵素（ＥＣ  １．８．９．９２または１．８．４．９）を用いてＡＰＳを直接亜硫酸塩に転換する。当業者は、ＡＰＳは亜硫酸塩に転換することが可能ないずれのアデニリル硫酸還元酵素も作用し得ることを認識するであろう。例えば、バチルスサブチリス（寄託番号ＣＡＡ０４４０９）由来またはシュードモナスアエルギノサ（寄託番号ＮＰ＿２５０４４７）由来のアデニリル硫酸還元酵素。
【００９５】
アデニリル硫酸還元酵素をコードする核酸配列は、メチオニンを生産するために用いられるいずれかの微生物属に導入できる。例えば、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ＥｘｐｌｏｒｅｒによってＷＯ２００５／１０８５６１およびＷＯ２００６１３８６８９に開示された菌株、および文献「Kumar and Gomes, Biotechnology Advances 23:41-61, 2005」に開示された菌株だけでなく、本発明に開示された菌株は、ＰＡＰＳをバイパスする、これにより硫酸同化作用にＡＴＰ分子が一つ少なく要求される、開示されたルートから利益を得るであろう。
【００９６】
｛実施例｝
〔実施例１．外因的に発現された核酸配列を使用する、直接硫黄水和反応を利用する多数のメチオニン生産経路〕
（Ａ．ｍｅｔＡＢＣ（硫黄転移反応）およびｍｅｔＡＺ（直接硫黄水和反応）を有する微生物の製造）
前述したように、大腸菌におけるメチオニンの内因的生産は主に硫黄転移反応によって起る。本実施例では、内因性ｍｅｔＡＢＣ経路は維持しながら、直接硫黄水和反応を増加させるために大腸菌を操作することについて記述する。
【００９７】
直接硫黄水和反応は、硫黄水素と反応させてＯ−スクシニルホモセリンをホモシステインに転換させるスクシニルスルフヒドリラーゼ（ＥＣ  ４．２．９９．−）をクローニングすることにより増加させることができた。前記酵素は、ｍｅｔＺによってコードされ、シュードモナス種で発見できる(Vermeij and Kertesz, J Bacteriol. 181:5833-5837, 1999 and Inoue et al., J. Bacteriol.179:3956-3962, 1997)。
【００９８】
より具体的に、シュードモナスアエルギノサ由来のｍｅｔＺは、トレオニン生産菌株ＴＦ４０７６に由来したＴＦ４０７６ＢＪＦ菌株のメチオニン栄養要求性株内にクローニングされた（ｐＴｒｃプロモーターの調節下にｔｈｒＢおよびｍｅｔＪを欠失させ、ｍｅｔＦを挿入することにより追加的に修飾されたものであり、より詳しくは下記実施例３で記述）。前記栄養要求性株ｍｅｔＢ遺伝子が欠失し、或いはｍｅｔＢおよびｍｅｔＣ遺伝子が欠失したものである。シュードモナスアエルギノサ由来のｍｅｔＺは最小培地でｍｅｔＢおよびｍｅｔＢＣ欠失突然変異体の成長を増加させた。フラスコ培養において、メチオニン生産は完全には回復していないが、表１に示すように、ｍｅｔＺ発現はｍｅｔＢＣ欠失突然変体からメチオニン生産を１００ｍｇ／Ｌまで誘導した。これはｍｅｔＺが細胞におけるホモシステインの生産に関与することを示す。
【００９９】
ｍｅｔＺで形質転換された前記欠失突然変異体のメチオニン生産が低調な理由は、細胞内部分における硫化物（スルフィド）の制限のためであろう（硫化物濃度増加方法については後述する）。これはｍｅｔＺで形質転換されたｍｅｔＢＣ欠失菌株の成長が２ｍＭの硫化ナトリウムの存在下にＭ９倍地で向上した結果によって裏付けられる。インビトロ分析法において、Ｏ−スクシニルスルフヒドリラーゼは低いスルフィド親和力を示した。誘導されたエボリューション (evolution)によって、高いスルフィド親和力および高い活性を有する向上したＯ−スクシニルスルフヒドリラーゼを開発することが可能である。非常に活性化されたＯ−スクシニルスルフヒドリラーゼはメチオニン経路でｍｅｔＢおよびｍｅｔＣを代替することができ、或いはメチオニンへの炭素流入を増加させる経路を補完することができる。
【０１００】
【表１】
0005497628.tif 000002
【０１０１】
ｐｃＬ−ｍｅｔＢ：ｐＣＬ１９２０に自体プロモーターを持っているｍｅｔＢ
ｐＣＬ−ｍｅｔＢ−ｍｅｔＣ：ｐＣＬ１９２０に自体プロモーターを持っているｍｅｔＢおよびｍｅｔＣ
ｐＰｒｏ−Ｚ：ｐＰｒｏＬａｒベクター（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）にあるシュードモナスアエルギノサ由来ｍｅｔＺ。
【０１０２】
（Ｂ．ｍｅｔＡＢＣ（硫黄転移反応）およびｍｅｔＸＹ（直接硫黄水和反応）を有する微生物の製造）
本実施例は、大腸菌において２つの経路から同時に生産されるメチオニンを示す。一つの経路は内因性ｍｅｔＡＢＣ経路であり、二番目の経路は多様な有機体由来のｍｅｔＹおよびｍｅｔＸの発現による直接硫黄水和反応を許容する経路である。
【０１０３】
図１に示すように、大腸菌は、硫黄転移反応経路遺伝子ｍｅｔＡ、ｍｅｔＢおよびｍｅｔＣを用い、ＯＳＨＳを経て内因的にメチオニンを生産する。大腸菌内にｍｅｔＸおよびｍｅｔＹ遺伝子をクローニングおよび発現させることにより大腸菌に追加的な経路を付加するのには遺伝工学的技術が用いられた。これにより、硫黄転移反応と直接硫黄水和反応を同時に行ってメチオニンを生産する宿主有機体が製造された。
【０１０４】
異種起源の経路を構築するために用いられたｍｅｔＹおよびｍｅｔＸ遺伝子が、後述したように、レプトスピラメエリ(Leptospira meyeri)、デイノコッカスラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)、クロロフレクサアウランティアクス(Chloroflexus aurantiacus)、ブレビバクテリウムリネンス (Brevibacterium linens)、ノストックパンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)、シュードモナスアエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)ＤＮＡからクローニングされ、幾つかの他の菌株がメチオニン生産に対するこれら遺伝子の付加による影響を分析するために製造された。また。コリネバクテリウムグリタミクム(Corynebacterium glutamicum)およびサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来のホモシステインシンターゼがクローニングされ、テストされた。両経路が同時に作用するように示範され、メチオニン生産はこのような付加によって増大した。
【０１０５】
Ｌ．メエリ(L. meyeri)ｍｅｔＸおよびｍｅｔＹ酵素が大腸菌メチオニン栄養要求性株の成長を補完することができるか否かを評価するために、Ｌ．メエリ ｍｅｔＹＸ遺伝子クラスターがプラスミドｍｅｔＸＹ−ｐＣＲ２．０−ＴＯＰＯから増幅され、ベクターｐＰＲＯ−Ｎｄｅ−ｄｅｌにクローニングされた。前記プラスミドにおけるｍｅｔＹＸ遺伝子の転写は、ベクター内に位置したプロモーターｌａｃ／ａｒａによって開始された。
【０１０６】
Ｗ３１１０ΔｍｅｔＡ（ＯＳＨＳの生産が中断される）、ＴＦ４０７６ＢＪＦ（ホモセリンの生産が増加される）、ＴＦ４０７６ＢＪＦΔｍｅｔＡ（ＯＳＨＳの生産が中断される）、およびＴＦ４０７６ＢＪＦΔｍｅｔＡｍｅｔＢ（ＯＳＨＳの生産およびＯＡＨＳまたはＯＳＨＳからシスタチオニンの生産が中断される）を含む４つの大腸菌菌株が評価された。ＴＦ４０７６ＢＪＦ菌株はトレオニン栄養要求性株であり、ホモセリンへの炭素流入を増加させることによりメチオニンを生産するために調節解除され、前記菌株は天然の大腸菌経路を経てメチオニンを生産することができる。
【０１０７】
前記菌株を、ｍｅｔＹＸを含んだプラスミドおよびクローニングベクターでそれぞれ形質転換した。その後、形質転換体を、グルコース（２ｇ／Ｌ）、イソロイシン（０．１５ｇ／Ｌ）、トレオニン（０．３ｇ／Ｌ）、カナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）およびＩＰＴＧを含むＭ９最小培地プレートに塗抹した。前記レプトスピラメエリ(Leptospira meyeri)由来のｍｅｔＹＸ遺伝子クラスターは、２４時間以内にＷ３１００ΔｍｅｔＡの成長を補完した。前記ｍｅｔＸのみを発現するＷ３１１０ΔｍｅｔＡ菌株は、Ｍ９最小プレートで成長することができなかった。よって、大腸菌Ｗ３１１０は、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンをメチオニン生合成の前駆体として使用するのに効率的な酵素を欠如している。ＷＯ２００６１１３８９７に開示されているように、対照区の空ベクターｐＰＲＯ−Ｎｄｅ−ｄｅｌで形質転換されたＷ３１１０ΔｍｅｔＡ菌株は４８時間以内に成長しなかった。ＴＦ４０７６ＢＦＪ菌株は、Ｌ．メエリ由来のｍｅｔＹＸを含むプラスミドまたはクローニングベクターで形質転換されるとき、最小培地プレートで成長した。
【０１０８】
また、最小培地における成長補完(growth complementation)に対してｍｅｔＹＸ代替遺伝子をテストした。Ｄ．ディオデュランス(D. radiodurans)、Ｃ．アウランティアクス(C.aurantiacus)、Ｂ．リネンス (B. linens)、Ｎ．パンクチフォルメ(N. punctiforme)由来のｍｅｔＹＸ遺伝子をクローニングするにおいて、ダウンストリーム遺伝子ｍｅｔＸに隣接した効率的な大腸菌リボソーム結合部位（ｒｂｓ）がないため、ｍｅｔＸ遺伝子の翻訳は前記ベクター内に位置したｒｂｓによって開始されたｍｅｔＹ遺伝子の翻訳と連結された。
【０１０９】
Ｌ．メエリ(L. meyeri)、Ｄ．ディオデュランス(D. radiodurans)およびＣ．アウランティアクス(C.aurantiacus)由来のｍｅｔＹＸ遺伝子クラスターは、メチオニン栄養要求性株菌株の成長を補完するのに最も効果的であった。前記成長の補完は、Ｌ．メエリ由来のｍｅｔＹＸ遺伝子クラスターにおいてｍｅｔＹ（Ｌ．メエリ）がｍｅｔＹ（Ｐ．アエルギノサ）で代替された場合のメチオニン栄養要求性株からも観察された。これらの細胞は、Ｌ．メエリ由来のｍｅｔＹＸを発現させる同一のメチオニン栄養要求性株に比べて相対的に減少した成長率を示した。
【０１１０】
メチオニン生産は、実施例３に記述された振とうフラスコプロトコールを用いて決定された。簡単に、培養物は、１５０ｍｇ／Ｌのメチオニンで補充された（初期成長を増進させるために）培地に３０℃で５０時間成長し、メチオニンはＨＰＬＣによって測定された。表２は、メチオニン生産が、硫黄転移反応または直接硫黄水和反応のみが可能な菌株と比較するとき、２つの経路を全て行った菌株でさらに高く現れたことを示す。
【０１１１】
【表２】
0005497628.tif 000003
【０１１２】
ｍｅｔＡおよびｍｅｔＢ遺伝子は、大腸菌菌株におけるメチオニンの合成のために必要である。２つの遺伝子のうちいずれか一つが不活性されると、大腸菌は初めからメチオニン生産能を失う。前記データは、ｍｅｔＹＸオペロンの追加によって、メチオニン原栄養体を有する菌株と類似の水準までメチオニン生産を回復することを示す。細胞において２つの経路ともが可能であるとき、メチオニン生産は２倍以上の場合もある。このような結果は、これらの経路が互いに排他的ではなく、ホモセリンは両経路によってメチオニンに転換できることを示す。
【０１１３】
両経路の利点をさらに示すために、前記菌株は実施例３に記載された発酵プロトコールを用いて５Ｌの発酵容器で比較された。メチオニン蓄積は約２４時間後に始まり、フィード(feed)が中断されるまで続けられた。大部分の有機体由来のｍｅｔＹ遺伝子によってコードされた酵素は、メチオニンの高い濃度によってフィードバック阻害される。ある場合には、ｍｅｔＸ遺伝子によってコードされた酵素もフィードバック阻害される。その結果、これらの発酵ではホモセリンおよびＯＡＨＳが相当蓄積されていることが分かった。発酵器におけるメチオニン生産の比較は図２に示し、データは表３にまとめた。このような結果は、フラスコにおける観察内容を示すもので、メチオニンの生産は異種起源の直接硫黄水和反応経路の適切な発現によって顕著に向上させることができることを示し、酵素のみが適切に発現されるならば、前記経路がメチオニン生産の主流を担当することができることを示した。
【０１１４】
【表３】
0005497628.tif 000004
【０１１５】
メチオニンまでの生成物の供給量を増やすために、フィードバック阻害抵抗性のあるｍｅｔＹおよびｍｅｔＸが利用できる。また、ホモセリンからメチオニンまでさらに速く誘導するために、ｍｅｔＸの発現程度およびｍｅｔＨの発現程度を調節することが可能である。
【０１１６】
メチオニン生産における前記差異点は、ｍｅｔＸＹ経路が大腸菌で非常に効率的であることを示し、調節解除された菌株に追加されたｍｅｔＸＹ経路はメチオニン蓄積を２倍以上に増加させることができることを示す。
【０１１７】
〔実施例２．Ｏ−アセチルＬ−ホモセリン（ＯＡＨＳ）またはＯ−スクシニルＬ−ホモセリン（ＯＳＨＳ）を用いるホモシステインシンターゼ〕
本実施例では、シュードモナスアエルギノサ（ＡＴＣＣ４７０８５）由来のｍｅｔＹによってコードされたホモシステインシンターゼを分離するために用いられた方法について記述する。前記酵素はＬ−メチオニンおよびＳ−アデノシルＬ−メチオニンによって阻害される。前記酵素活性は文献「Yamagata, Methods in Enzymology, 143:478, 1987」によって分析された。前記方法は、多数のサンプルポイントが取られ、グアニジンが反応を阻止するために使用された点、およびホモシステインの形成が実施例３．Ｂ．に記載されたｍｅｔＡに対する分析での如く、ＤＴＮＢ((5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Sigma D8130)を用いて探知された点において、若干の修正が加えられた。一つの酵素単位（Ｕ）は常温で１分当たりホモシステイン１ｍｍｏｌｅの形成として定義された。
【０１１８】
Ｐ．アエルギノサ由来のＭｅｔＹが発現され、精製タンパク質（Ｎ−タグ付き）１７．５ｍｇを用いて分析された。Ｌ．メエリ由来のｍｅｔＹおよび大部分の他の公知のホモシステインシンターゼとは対照的に、前記酵素はアセチル−およびスクシニル−ホモセリンの両方に対して活性を持った。前記活性は２つの基質に対して類似であり、メチオニンおよびＳＡＭｅによってフィードバック阻害されたが、フィードバック阻害の程度はＯＳＨＳを基質としたときにやや低い方である。１ｍＭのメチオニンにおいて若干の阻害が観察された。ＯＡＨＳを基質とした場合、１０、５０および１００ｍＭにおいて、前記酵素はメチオニン不在の際に活性の約５０％、１９％および９％を保有した。５および１０ｍＭのＳＡＭｅが存在する場合、活性は元々の活性の約７２％および２１％であった。ＯＳＨＳを基質とした場合、活性は５０および１００ｎＭのメチオニン存在の際には５３％および３１％まで低下し、５および１０ｍＭのＳＡＭｅ存在の際には８６％および１９％まで低下した。
【０１１９】
〔実施例３．メチオニン生産を増加させるために宿主菌株を遺伝的に操作する方法〕
実施例１で記載したように、宿主有機体にメチオニン生合成経路を追加することに加えて、前記宿主有機体は、メチオニン生合成経路阻害を減らし、反応物の利用可能性を高め、および／または生成物の分解を減らすために遺伝的にさらに操作できる。
【０１２０】
（Ａ．メチオニン生産の増加のための５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸還元酵素の発現増加とメチオニン球状抑制因子およびトレオニンキナーゼの不活性）
メチオニン生産菌株を作る一つの方法は、トレオニンなどのアミノ酸を生産するように既に操作された菌株を変形させることである。たとえば、メチオニン栄養要求性株であるが、韓国公開公報第９２−８３６５号に開示されたトレオニン生産菌株ＴＦ４０７６（ＫＦＣＣ１０７１８）を用いることができる。追加的な例示菌株としてはトレオニン過多生産者として開示された、ＡＴＣＣ（１３０７０、１３０７１、２１１４８、２１１４９、２１１５０、２１１５１、２１２７２、２１２７７、２１２７８、２１３１８、２１３１９、２１３２０）に寄託された菌株を含む。
【０１２１】
出発点としてＴＦ４０７６菌株を用いて、トレオニン生産を回避するためにｔｈｒＢ遺伝子を欠失させ、メチオニン生合成経路発現抑制を解けるためにｍｅｔＪ遺伝子を欠失させてメチオニン生産を向上させた。また、前記菌株はｍｅｔＦ遺伝子を過発現するように変形させた。
【０１２２】
（ｔｈｒＢ欠失）
ｔｈｒＢは、ｌｏｘＰ−Ｃｍ(loxP-chloramphenicol)カセット(Gene 2000 vol.247, p255-264)を用いて欠失した。前記ｔｈｒＢ遺伝子は鋳型として大腸菌Ｋ１２由来の染色体を用い、プライマー配列１および２（配列番号５および６）を用いてＰＣＲによってクローニングされた。ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用した。ＰＣＲ産物はゲル分離でき、ｐＣＲ２．１−ｔｏｐｏクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）にクローニングされてｐＣｒ−ｔｈｒＢと命名した。ｐＣＲ−ｔｈｒＢはｐｆｌＭＩを用いてダイゼストされ、ｌｏｘＰ−Ｃｍカセットが挿入された。前記プラスミドからｌｏｘＰ−Ｃｍカセットを含んだｔｈｒＢ遺伝子がプライマー１および２（配列番号１１および１２）を用いてＰＣＲ増幅された。前記ＰＣＲ産物はゲル精製された。ＰＣＲ断片はＴＦ４０７６菌株内にエクレトロポレーションされ、クロラムフェニコールマーカーは同定されたコロニーから除去され、獲得された最終菌株はＴＦ４０７６Ｂと命名された。前記菌株はトレオニンのないＭ９最小培地（ＤＩＦＣＯ）で成長しなかったが、これは前記菌株がトレオニン栄養要求性株であることを示す。
【０１２３】
１．ｔｈｒＢ  配列番号：１１    
５’−ＧＣＴ ＡＧＣ ｃ ａｔｇ ｇｔｔ ａａａ ｇｔｔ ｔａｔ ｇｃｃ ｃｃｇ−３’
２．ｔｈｒＢ       配列番号：１２
５’−ＧＡＧ ＣＴＣ ｔｔａ ｇｔｔ ｔｔｃ ｃａｇ ｔａｃ ｔｃｇ ｔｇｃ ｇｃ−３’
（ｍｅｔＪ欠失）
メチオニン球状抑制因子ｍｅｔＪ遺伝子を欠失させるために、ＦＲＴワンステップ欠失方法が使用された(Datsenko and Wanner PNAS 97:6640-6645, 2000)。ＰＣＲ断片はプライマー３、４（配列番号１３および１４）およびｐＫＤ３鋳型を用いて増幅された(Datsenko and Wanner, PNAS 97:6640-6645, 2000参照)。使用されたＰＣＴ条件は、ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル、最後に７２℃で７分であった。クロラムフェニコール抵抗性コロニーが選択され、ｍｅｔＪ遺伝子欠失はＰＣＲプライマー配列５および６（配列番号１５および１６）を用いて確認された。ｐＣＰ２０プラスミド形質転換を用いて、クロラムフェニコールマーカー遺伝子は除去された。前記除去はＰＣＲを用いて確認された。ここで、獲得された菌株はＴＦ４０７６ＢＪと命名された。
【０１２４】
３．ｍｅｔＪ＋クロラムフェニコール  配列番号：１３
５’−ａｔｇｇｃｔｇａａｔ ｇｇａｇｃｇｇｃｇａ ａｔａｔａｔｃａｇｃ ｃｃａｔａｃｇｃｔｇ ａｇｃａｃｇｇｃａａ ｇｇｔｇｔａｇｇｃｔ ｇｇａｇｃｔｇｃｔｔ ｃ−３’
４．ｍｅｔＪ＋クロラムフェニコール  配列番号：１４
５’−ｇｔａｔｔｃｃｃａｃ ｇｔｃｔｃｃｇｇｇｔ ｔａａｔｃｃｃｃａｔ ｃｔｃａｃｇｃａｔｇ ａｔｃｔｃｃａｔａｔ ｇａａｔａｔｃｃｔｃｃｔｔａｇ−３’
５．ｍｅｔＪ  配列番号：１５
５’−ｇｇｇｃｔｔｔｇｔｃ ｇｇｔｇａａａｔｇ−３’
６．ｍｅｔＪ  配列番号：１６
５’−ａｃｔｔｔｇｃｇａｔ ｇａｇｃｇａｇａｇ−３’
（ｍｅｔＦ挿入(integration)）
ＴＦ４０７６ＢＪのメチオニン栄養要求性株を補完するために、ｍｅｔＦ遺伝子がＴＦ４０７６ＢＪ菌株内で発現された。ｍｅｔＦ遺伝子は、プライマー配列７および８（配列番号１７および１８）および鋳型として大腸菌Ｋ１２菌株の染色体を用いて増幅された。ＨＬ  ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用した。ＰＣＲ断片はゲル分離され、ｐＳＥ３８０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏ．）のＮｈｅＩおよびＳａｃＩ部位に挿入された。前記プラスミドはｐＳＥ３８０−ｍｅｔＦと命名された。ｐＳＥ３８０−ｍｅｔＦはＴＦ４０７６ＢＪ菌株内に形質転換された。前記形質転換体はトレオニンおよびイソロイシンの含まれたＭ９最小培地（Ｄｉｆｃｏ）で成長したが、これはメチオニン栄養要求性株を補完することを示す。
【０１２５】
２つの他のプロモーターの調節下にｍｅｔＦ遺伝子の発現程度が決定された。前記プロモーターはｐＣＪ１プロモーター（ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４３３８）とｐＴｈｒｅｏｎｉｎｅプロモーターであった。ｍｅｔＦ遺伝子は、プライマー配列９および１０（配列番号１９および２０）と鋳型としての大腸菌Ｋ１２菌株の染色体を用いて増幅された。ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用した。ＰＣＲ断片はゲル分離され、ｐＣＪ１プロモーターまたはｐＴｈｒｅｏｎｉｎｅプロモーターを含むｐＣＬ１９２０ベクター(Lerner and Inouye, Nucleic acids Research 18:4631, 1990)内のＰｖｕＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位で連結された。前記ｐＣＪ１プロモーターはプライマー配列１１および１２（配列番号２１および２２）を用いてＰＣＲ増幅された。前記ｐＴｈｒｅｏｎｉｎｅプロモーターはプライマー配列１３および１４（配列番号２３および２４）を用いて大腸菌Ｋ１２染色体から増幅された。前記ＰＣＲ断片はゲル分離され、ｐＣＬ１９２０ベクター内のＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＶ部位内に挿入された。ＰＣＲ条件は前記で開示されたものと同一であった。ｐＣＪ１プロモーターの調節下にｍｅｔＦ遺伝子を含むプラスミドはｐＣＬ−ｐＣＪ１−ｍｅｔＦと命名され、ｐＴｈｒｅｏｎｉｎｅプロモーターの調節下にｍｅｔＦ遺伝子を含むプラスミドはｐＣＬ−ｐＴｈｒ−ｍｅｔＦと命名された。それぞれのプラスミドはＴＦ４０７６ＢＪ菌株に形質転換され、メチオニン生産が測定された。
【０１２６】
前記菌株をテストするために振とうフラスコ培養プロトコールが下記のように用いられた：種培養(seed culture)が、（１Ｌ内）：１０ｇの酵母抽出物、６ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＮａＣｌ、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのグルコース、０．４９ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ2Ｏ、０．０１５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏからなる培地に３１℃で６時間インキュベートされた。その後、下記培地に接種するためにフラスコが用いられた：（１Ｌ内）：１７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇの酵母抽出物、０．３ｇのＬ−トレオニン、１０ｍｇのＭｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＺｎＳＯ４、３０ｇのＣａＣＯ３、４０ｇのグルコース、および２ｇのＫＨ２ＰＯ４ｐＨ７．２。前記フラスコは、２５０ｒｐｍ速度で振とうしながら３１℃で６４時間〜７２時間インキュベートされた。遠心分離を行った後、培養上澄み液は分離され、分離された培養上澄み液はメチオニン分析のために使用された。
【０１２７】
ｐＳＥ３８０−ｍｅｔＦプラスミドを含む細胞の培養のために、１００μＬ／Ｌのアンピシリンおよび０．５ｍＭのＩＰＴＧが培地に追加された。表４に示すように、ｐＣＪ１プロモーターの調節下に、ｍｅｔＦ遺伝子は大部分のメチオニンを生産した。
【０１２８】
【表４】
0005497628.tif 000005
【０１２９】
ｍｅｔＦ遺伝子をより安定的に発現させるために、ｐＴｒｃ、ｐＣＪ１およびｐＴｈｒｅｏｎｉｎｅプロモーター下に、ｍｅｔＦ遺伝子はＴＦ４０７６ＢＪ染色体のｌａｃＺ遺伝子座に挿入された。それぞれのｍｅｔＦ遺伝子はそれぞれのプラスミドからＰＣＲ増幅され、ｐＢｒｉｎｔベクター内のＮｓｉＩ部位に挿入された(Borgne et al., Gene 223:213-219, 1998)。前記ベクターは、ＴＦ４０７６ＢＪ菌株内に形質転換され、３７℃でクロラムフェニコールを含む培地で成長した形質転換体が選択され、ｍｅｔＦ遺伝子が染色体内のｌａｃＺ遺伝子座に挿入されたかを確認された。選択されたコロニーはｐＪＷ１６８によって形質転換され、クロラムフェニコールマーカーは除去された。前記ｐＣＪ１−ｍｅｔＦ遺伝子を持つ細胞は得ることができず、ｐＴｈｒ−ｍｅｔＦカセットを含む形質転換体はよく成長しなかった。ＬａｃＺ遺伝子座にｐＴｒｃ−ｍｅｔＦ遺伝子を含む細胞のみがよく成長した。前記菌株のフラスコ培養は０．５ｍＭ ＩＰＴＧ入りの培地で〜６００ｍｇ／Ｌのメチオニン生産結果を示した。ｐＴｒｃ−ｍｅｔＦ遺伝子を含んだ最後の菌株はＴＦ４０７６ＢＪＦと命名され、分析された。
【０１３０】
要するに、前記ＴＦ４０７６ＢＪＦ菌株はトレオニン−生産菌株ＴＦ４０７６に由来し、前記ＴＦ４０７６は、ｐＴｒｃプロモーターの調節下にｔｈｒＢおよびｍｅｔＪは欠失し、ｍｅｔＦは挿入される修飾を経た。表５は、ＴＦ４０７６ＢＪＦによるホモセリンおよびメチオニンの生産を示す。
【０１３１】
【表５】
0005497628.tif 000006
【０１３２】
７．ｍｅｔＦ  配列番号：１７
５’−ＧＣＴ ＡＧＣ ｃ ａｔｇａｇｃｔｔｔｔｔｔｃａｃｇｃｃａｇ−３’
８．ｍｅｔＦ  配列番号：１８
５’−ＧＡＧ ＣＴＣ ｔｔａｔａａａｃｃａｇｇｔｃｇａａｃｃｃ−３’
９．ｍｅｔＦ  配列番号：１９
５’−ＣＡＧＣＴＧａｔｇａｇｃｔｔｔｔｔｔｃａｃｇｃｃａｇ−３’
１０．ｍｅｔＦ  配列番号：２０
５’−ＡＡＧＣＴＴ ｔｔａｔａａａｃｃａｇｇｔｃｇａａｃｃｃ−３’
１１．ＣＪ１プロモーター  配列番号：２１
５’−ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ａｃｃ ｇｃｇ ｇｇｃ ｔｔａ ｔｔｃ ｃａｔ ｔａｃ  ａｔ−３’
１２．ＣＪ１プロモーター  配列番号：２２
５’−ａｃｇ ｃｇａ ｔａｔ ｃｔｔ ａａｔ ｃｔｃ ｃｔａ ｇａｔ  ｔｇｇ ｇｔｔ ｔｃ−３’
１３．ｔｈｒｅｏｎｉｎｅプロモーター  配列番号：２３
５’−ｃｇｇ ｇｇｔ ａｃｃ ｔｇｇ ｔｔａ ｃａａ ｃａａ ｃｇｃ ｃｔｇ  ｇ−３’
１４．トレオニンプロモーター  配列番号：２４
５’−ｃａｔ ｇａｔ ａｔｃ ｔａｃ ｃｔｃｇ ｔｔａ ｃｃ ｔｔｔ ｇｇｔ ｃｇ−３’
ＴＦ４０７６ＢＪＦ菌株は、後述のプロモーターに応じて５Ｌの発酵器で成長し、９６時間内に約２．２ｇ／Ｌのメチオニンを生産した。
【０１３３】
５Ｌの発酵は下記プロトコールを用いて行われた。大腸菌菌株内にクローニングされる他の遺伝子の影響を比較するために、５Ｌ容器用基本発酵プロトコールが用いられた。前記接種物は、１Ｌ当り１０．０ｇの酵母抽出物、４．４９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇのＮａＣｌ、３．０ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．４９ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、および２ｇ／Ｌのグルコースから構成された２５ｍＬの培地で培養された。５０ｍｇ／Ｌの適切な抗生物質はテストされた菌株の抵抗性に応じて用いられた。３１℃で８〜２４時間２５０ｒｐｍの速度で振とう培養した後、前記培養物は２００ｍＬの同一培地に移され、１６〜２０時間同一の条件で培養された。前記培養物は２．５Ｌの培地で発酵器を接種するために用いられた。
【０１３４】
発酵培地は、１７．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬのＬ−トレオニン、０．３ｇ／Ｌのイソロイシン、０．０１ｇ／ＬのＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ＬのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ/ＬのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／Ｌのピリドキサール、２ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、および４０ｇ／Ｌのグルコースから構成された。抗生物質およびＩＰＴＧは、菌株の成長程度に応じて追加された。発酵温度は３１℃に維持され、溶存酸素は３０％以上の飽和に、ｐＨは初期に２８％のＮＨ４ＯＨに調節された。グルコースが消費された後、ｐＨは上昇するであろう。その時点において、連続的に固定されたフィード(fixed feed)を始めるか、或いはｐＨの増加に応じて１回１００〜１５０ｍＬのアルコート(aliquot)のフィードが添加される。前記フィードは４．０ｇ／Ｌの酵母抽出物、３３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．５ｇ／ＬのＬ−トレオニン、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２、および４００ｇ／Ｌのグルコースから構成された。培地に若干の小さい変形およびフィードが菌株によって導入された。前記発酵は７２〜９６時間行われた。光学的密度による細胞成長およびグルコース利用だけでなく、メチオニン濃度も実験の間ずっと測定された。
【０１３５】
（Ｂ．メチオニン生産のためのフィードバック抵抗性ホモセリンスクシニルトランスフェラーゼの生成）
ｍｅｔＡおよびｍｅｔＢ遺伝子の除去された大腸菌菌株が製造された。前記菌株はＭｅｔＡ活性の喪失によるホモセリン蓄積を示した。前記菌株に野生型ｍｅｔＡカセットが発現されたとき、メチオニンのない状態でＯＳＨＳがＭｅｔＡ活性によって生産された。ところが、メチオニンが培地に追加されたとき、前記野生型ｍｅｔＡカセットを持つ菌株は、ＭｅｔＡ活性のフィードバック阻害によってさらにホモセリンを蓄積した。よって、フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子は、メチオニン存在下にＯ−スクシニルホモセリンの蓄積をテストすることにより同定された。培地に多量のメチオニンが存在するときにさらに多くのＯＳＨＳを生産する突然変異体が、最も多くのフィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡを含む。
【０１３６】
スクリーニング方法論に対する概略図は図３に提示される。
【０１３７】
（ｍｅｔＢ欠失突然変異体の製造）
ＴＦ４０７６ＢＪＦにｍｅｔＢ欠失突然変異を作るために、ＦＲＴワンステップ欠失方法が用いられた(Datsanko and Wanner, PNAS 97:6640-6645, 2000)。ＰＣＲ断片はプライマー配列１５および１６（配列番号２５および２６）を用いて増幅され、鋳型ｐＫＤ３はＴＦ４０７３ＢＪＦ細胞内にエレクトロポレーションされた。ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用した。クロラムフェニコール抵抗性コロニーが選択され、ＰＣＲを用いてｍｅｔＢ遺伝子欠失を確認した。クロラムフェニコールマーカー遺伝子はｐＣＰ２０プラスミド形質転換を用いて除去された。前記除去はＰＣＲによって確認された。このような過程によって除去された菌株はＴＦ４０７６ＢＪＦ−Ｂと命名された。
【０１３８】
１５．ｍｅｔＢ＋クロラムフェニコール  配列番号２５
５’−ＴＴＡＣＴＣＴＧＧＴ ＧＣＣＴＧＡＣＡＴＴ ＴＣＡＣＣＧＡＣＡ ＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧ ＡＡＣＴＴＣＡＴＣＡ Ｃｇｔｇｔａｇｇｃｔ ｇｇａｇｃｔｇｃｔｔ ｃ−３’
１６．ｍｅｔＢ＋クロラムフェニコール      配列番号２６
５’−ＴＴＡＣＣＣＣＴＴＧ ＴＴＴＧＣＡＧＣＣＣ ＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴ ＴＴＣＣＡＧＧＴＣＧ ＧＣＡＡＴＴＡＡＡ Ｔｃａｔａｔｇａａｔ ａｔｃｃｔｃｃｔｔａ ｇ−３’
（ｍｅｔＡ欠失突然変異体の製造）
ＴＦ４０７６ＢＪＦ−ＢにｍｅｔＡ欠失突然変異を作るために、ＦＲＴワンステップ欠失方法が用いられた(PNAS .97:6640-6645, 2000)。ＰＣＲ断片はプライマー配列１７および１８（配列番号２７および２８）を用いて増幅された。鋳型ｐＫＤ３はＴＦ４０７３ＢＪＦ−Ｂ細胞内にエレクトロポレーションされた。ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用した。クロラムフェニコール抵抗性コロニーが選択され、ＰＣＲを用いてｍｅｔＡ遺伝子欠失を確認した。クロラムフェニコールマーカー遺伝子はｐＣＰ２０プラスミド形質転換を用いて除去された。前記除去はＰＣＲによって確認された。このような過程によって製造された菌株はＴＦ４０７６ＢＪＦ−ＢＡと命名された。
【０１３９】
１７．ｍｅｔＡ＋クロラムフェニコール  配列番号２７
５’−ＣＡＡＴＴＴＣＴＴＧＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＴＣＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＡＣＴＴＣＴＣＧＴＧＣＧＴｇｔｇｔａｇｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｃｔｔｃｃ−３’
１８．ｍｅｔＡ＋クロラムフェニコール  配列番号２８
５’−ＡＡＴＣＣＡＧＣＧＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＧＴＧＣＣＧＴＡＧＡＴＣＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＴＡＧｃａｔａｔｇａａｔａｔｃｃｔｃｃｔｔａｇ−３’
（ｍｅｔＡ発現ベクターの製造）
ｍｅｔＡライブラリーを作るために、ｍｅｔＡ発現ベクターが製造された。ｍｅｔＡ遺伝子は鋳型として大腸菌Ｋ１２菌株由来の染色体およびプライマー配列１９および２０（配列番号２９および３０）を用いて増幅された。ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用した。ＰＣＲ断片はゲル分離され、ＳｍａＩ部位でｐＣＬ１９２０に連結された。前記プラスミドはｐＡ−ＣＬと命名された。前記ｐＡ−ＣＬプラスミドはＴＦ４０７６ＢＪＦ−ＡＢ菌株内に形質転換され、フラスコ培養はメチオニン存在下およびメチオニン不在下に行われた。ＯＳＨＳおよびホモセリンはメチオニンに対して前述した方法と同一の方法によって測定された。表６に示すように、メチオニンの不在下にｐＡ−ＣＬプラスミドを含む細胞は、０．２４ｇ／Ｌのホモセリンで３．８ｇ／ＬのＯＳＨＳを生産した。ところが、１ｇ／Ｌのメチオニン存在下に、前記細胞は４．９ｇ／Ｌのホモセリンで５．８ｇ／ＬのＯＳＨＳを生産した。ホモセリンの増加はメチオニンによるｍｅｔＡ活性のフィードバック阻害のためであるが、ＯＳＨＳ量の増加はメチオニンの追加による生産の増加のためである。
【０１４０】
【表６】
0005497628.tif 000007
【０１４１】
１９：ｍｅｔＡ  配列番号：２９
５’−ａａｔｇｇａｔｃｃＴＧＣＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＡＣ−３’
２０：ｍｅｔＡ  配列番号：３０
５’−ａｇｃｔｃｔａｇａＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴＡＣＧＴＴＴＣＧＧ−３’
（ｐＡ−ＣＬ突然変異体ライブラリーの製造）
ｐＡ−ＣＬ突然変異体ライブラリーを製造するために、エラー−プロン(error-prone)ＰＣＲが行われた。エラー−プロンＰＣＲは鋳型としてｐＡ−ＣＬプラスミドを有し、プライマー配列２１および２２（配列番号３１および３２）を用いて行われた。ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用し、ＢＤ ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ突然変異誘発キット（ＢＤ、米国）を使用した。ＰＣＲ断片はＢａｍＨＩおよびＸｂａＩによって切断され、ｐＣＬ１９２０に連結された。前記ライブラリーはＴＦ４０７６ＢＪＦ−ＡＢ菌株内に形質転換され、〜３０，０００の形質転換体が追っての分析のために収集された。
【０１４２】
２１：ｐＣＬ１９２０  配列番号：３１
５’−ＣＧＡＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＡＣＡＴＣＣＧ−３
２２：ｐＣＬ１９２０  配列番号：３２
５’−ＧＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＡＴＣ−３
（ＭｅｔＢ酵素粗抽出液の準備）
ＯＳＨＳを酵素的方法で測定するために、大腸菌由来のＭｅｔＢ酵素を用いた。前記Ｍｅｔ酵素は、ＯＳＨＳおよびシステインと１：１の比率で反応してシスタチオニンを生産する。ＤＴＮＢ（5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid、Ｓｉｇｍａ Ｄ８１３０）試薬は、システインの遊離ＳＨ基と反応し、４１５ｎｍで測定できる黄色を作る。ＭｅｔＢ反応の後、システインはＤＴＮＢに結合できないシスタチオニンに変わる。前記反応の後、４１５ｎｍにおけるＯＤの減少により、反応ミックスにあるＯＳＨＳの量を測定することができる。
【０１４３】
ＭｅｔＢ酵素の過発現のために、大腸菌Ｋ１２染色体由来のＰＣＲ増幅されたｍｅｔＢ遺伝子は、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって切断され、ｐＣＤＦ−Ｄｕｅｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎｅ、米国）内にクローニングされた。ＰＣＲ反応は、大腸菌Ｋ１２染色体を鋳型として、プライマー配列２３および２４（配列番号３３および３４）を用いて行われた。ＨＬ ＰＣＲプレミックス（Ｂｉｏｎｅｅ Ｃｏ、韓国）を用い、９４℃で３０秒、次いで９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を２５サイクル、最後に７２℃で７分のＰＣＲ条件を使用した。前記ｍｅｔＢ遺伝子を含むプラスミドは、チューナー細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、米国）を用いて大腸菌内に形質転換された。前記形質転換体を、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で一晩成長させた。一晩培養液は５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地で希釈され、３７℃で６００ｎｍで０．６のＯＤに到達するまで培養され、この時点でＩＰＴＧが０．２ｍＭの最終濃度を持つように添加され、前記培養液は３０℃で４時間培養された。前記細胞は１２，０００ｒｐｍで遠心分離によって収去され、０．１Ｍのリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．５）で再懸濁され、超音波分解された（５×３０秒）。細胞粗抽出液は１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離によって獲得された後、上澄み液は酵素分析法のために用いられた。
【０１４４】
２３：ｍｅｔＢ  配列番号：３３
５’−ｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇＡＴＧＡＣＧＣＧＴＡＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣ−３’
２４：ｍｅｔＢ  配列番号：３４
５’−ｃｃｇｃａａｇｃｔｔＴＴＴＡＣＣＣＣＴＴＧＴＴＴＧＣＡＧＣＣ−３’
（フィードバック抵抗性ｍｅｔＡのスクリーニング）
フィードバック抵抗性ｍｅｔＡ突然変異は、ｐＡ−ＣＬ突然変異体を含んだＴＦ４０７６ＢＪＦ−ＡＢ菌株を、微細発酵培地を含んだ９６ウェルプレートに接種し、振とうしながら３１℃で４８時間培養することにより同定された。微細発酵培地は、実施例３で記述されたように、振とうフラスコ培地の１ボリュームであり、５ｇ／ＬのＬ−メチオニンを含んだｐＨ６．５のリン酸カリウムバッファ０．０５Ｍの１ボリュームである。
【０１４５】
その後、９６ウェルプレートが３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、ＯＳＨＳが前述の酵素的方法（ＭｅｔＢ粗抽出液の製造）によって上澄み液で測定された。５０μＬの培養上澄み液は５０μＬの反応バッファと混合された（反応バッファ：０．１Ｍのリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．５）＋２．５ｍＭのシステイン＋１／５００の１０ｍＭ  ＰＬＰ（ピリドキサール５’−リン酸塩水和物、Ｓｉｇｍａ社のＰ９２５５）＋１／１００のＭｅｔＢ粗抽出液（５ｍｇ／ｍＬ））。前記反応は３７℃で１０分間行われた。１００μＬのＤＴＮＢ（４ｍｇ／１０ｍＬの０．１Ｍリン酸カリウムバッファ、ｐＨ７．５）が添加され、４１５ｎｍでＯＤが測定された。各９６ウェルプレートから４１５ｎｍで最も低い吸光度を示す１つまたは２つのコロニーを選択し、５０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含むＬＢ培地上に塗抹した。前記結果コロニーが、微細発酵培地を含む別の９６ウェルプレート上で培養され、２次スクリーニングが行われた。その後、培地に５ｇ／Ｌのメチオニンを追加し、Ｏ−スクシニルホモセリン生産を測定して前述の振とうフラスコ培養条件で選択菌株をテストした。
【０１４６】
１２，０００のコロニーから２４個の突然変異体がフラスコ培養のために選択され、１４個の突然変異体がシーケンシングのために選択された。それらから５つの新しい突然変異体が同定された。残りの１９個の突然変異体は前述したように同一の突然変異を持った。１４個の突然変異体に対する振とうフラスコ培養におけるＯ−ＳＨＳおよびホモセリンの蓄積は表７に示し、選択された突然変異体のｍｅｔＡ配列におけるアミノ酸の変化は図８に示した。
【０１４７】
【表７】
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【０１４８】
【表８】
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【０１４９】
（突然変異ｍｅｔＡのフィードバック抵抗性）
フラスコ培養で全てのフィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡが５ｇ／Ｌのメチオニンの存在下に類似のＯＳＨＳ量を生産したため、高濃度のメチオニンがフラスコ培養培地に追加され、ＯＳＨＳの生産が決定された。３０ｇ／ＬのＬ−メチオニンで６４時間培養した後、ＯＳＨＳの生産は＃３７突然変異サンプルでのみ減少し、残りは５ｇ／Ｌのメチオニン存在下に類似な程度のＯＳＨＳ生産を示した。表９に示した結果は、フィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡが３０ｇ／Ｌのメチオニンと同じ高濃度に抵抗性を示すことを示唆する。
【０１５０】
【表９】
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【０１５１】
（突然変異ｍｅｔＡタンパク質のインビトロ特性化）
ＰＣＲが増幅のために用いられた。ｐＣＬ−Ａ＃１０、ｐＣＬ−Ａ＃１１、ｐＣＬ−Ａ＃３２、ｐＣＬ−Ａ＃３７、およびｐＣＬ−Ａ＃４１で表記された５つのｍｅｔＡ突然変異遺伝子をｐＥＴ３０ベクターにクローニングした。突然変異の存在を確認するために、全ての製造物はＤＮＡ配列分析を行った。前記遺伝子は酵素精製のためにＣ−末端Ｈｉｓタグを持つようにクローニングされた。前記酵素は過発現され、精製され、文献「Lawrence, J. Bacteriol., 109:8-11, 1972」に記述されたとおり、活性が他のレベルのメチオニンおよびＳＡＭｅの存在下に測定された。前記分析法に対する唯一の変形は、多数のポイントが取られ、グアニジンが反応を阻止するために使用されたことである。表１０は多様な突然変異体由来の活性をまとめたもので、野生型酵素と比較するとき、全ての突然変異体がフィードバック阻害抵抗性であることを示し、突然変異体＃１０および＃１１はメチオニン阻害およびＳＡＭ阻害に最も抵抗性があることを示す。
【０１５２】
【表１０】
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【０１５３】
【表１１】
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【０１５４】
突然変異体ｍｅｔＡ＃１０およびｍｅｔＡ＃１１（それぞれ配列番号５および７）は追っての分析のために選択された。ｍｅｔＡ突然変異＃１０および＃１１は３００ｍＭのメチオニンを用いて実験で阻害欠如によって分析された。これは分析条件で取られる最も高い濃度に近接するものである。メチオニンの水溶性は３０℃で５．６ｇ／１００ｍＬである。これは濃度３７５ｍＭに対応する。３００ｍＭのメチオニン存在時、突然変異体ｍｅｔＡ＃１０は特異的活性の７０％を保有し、突然変異体ｍｅｔＡ＃１１は特異的活性の５５％を保有した。よって、ｍｅｔＡ＃１０および＃１１突然変異体がメチオニン生産微生物として利用できる。
【０１５５】
（フィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡでメチオニンを生産する）
ｍｅｔＡ＃１０およびｍｅｔＡ＃１１はメチオニン生産菌株ＴＦ４０７６ＢＪＦ内にクローニングされた。ＭｅｔＡ＃１０はＬ．メエリ由来のｍｅｔＹＸと共にクローニングされた。前記クローンは実施例３Ａに記述された発酵プロトコールに応じてテストされた。メチオニン濃度は発酵７８時間後に評価された。その結果は表１１に示した。他の発酵ではＯ−スクシニルホモセリンが無かった。メチオニン生産の時間コースは図４に示した。
【０１５６】
【表１２】
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【０１５７】
前記結果は、フィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡの発現がメチオニン生産を増加させ、直接硫黄水和反応経路およびフィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡＢＣ経路の組み合わせは天然型ＭｅｔＡの場合と比較してやや弱い相乗効果を示すことを示唆する。弱い相乗効果が観察されたのは、メチオニンの蓄積はＭｅｔＹを阻害することができることを示す。メチオニン生産をさらに増加させるために、フィードバック阻害抵抗性ＭｅｔＹが利用できる。
【０１５８】
（Ｃ．大腸菌におけるＭｅｔＫ活性減衰のための戦略）
上述したように、ＳＡＭｅの形成は、メチオニンン濃度を低下させ、ｍｅｔＡのフィードバック阻害によってメチオニン生合成経路の活性を減少させる。
【０１５９】
ｍｅｔＫ遺伝子の突然変異体の同定は、エチオニン−抵抗性突然変異がｍｅｔＫの減少を示し、メチオニンを過多生産することを観察すれば容易になる。表１２は、ＭｅｔＫ活性において減少を引き起こすものと記述される多様なｍｅｔＫ突然変異をまとめたものである。これらの突然変異体は下記のとおり製造された。
【０１６０】
大腸菌由来ｍｅｔＫ遺伝子（寄託番号ＡＰ＿００３４９９またはＢＡＥ７７００５）は、ｐＥＴ２８ｂベクターにおいてＮ末端またはＣ末端Ｈｉｓタグでクローニングされ、過発現された。所望の突然変異を得るために、位置指定突然変異誘発がＣ末端Ｈｉｓタグ付きｍｅｔＫクローンを用いて行われた。突然変異ＭｅＫタンパク質の発現が確認された。
【０１６１】
ＭｅｔＫ突然変異体は精製され（Ｃ末端Ｈｉｓタグを用いて）、インビトロで分析された。野生型Ｃ末端Ｈｉｓタグ付ＭｅｔＫタンパク質が対照区として用いられた。前記突然変異体は放射能分析法によって分析された。前記分析条件は下記のとおりである。
【０１６２】
分析ミックス：
１．０ｍＬ ０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ８．０
０．５ｍＬ １．０Ｍ  ＫＣｌ
０．２ｍＬ １．０Ｍ  ＭｇＣｌ２
１．０ｍＬ １００ｍＭ ＡＴ（二ナトリウム塩、ｐＨ８．０ ｗｉｔｈ ＫＯＨ）
０．１ｍＬ ５０ｍＭ  メチオニン
０．１ｍＬ ＮＥＮ［メチル−１４Ｃ］メチオニン
６．６ｍＬ Ｈ２Ｏ
２５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ ｓｔｏｐ ｆｏｒ ａｓｓａｙｓ
４５μＬの分析ミックスが５μＬの酵素およびエペンドルフチューブに添加された。正常化されたデータは表１３に開示された。反応は所望の時間（１〜１０分）常温（または２５℃）で行われた。前記反応は１５０μＬの２５ｍＭ ＥＤＴＡを添加して中断した。１００μｍの反応物が直径２．５ｃｍのワットマンＰ−１８ホスホセルロースフィルターサークル（鉛筆でラベル付け）上に置かれた。前記フィルターは３Ｌの蒸留水で洗浄され、エアドライされてアクアソルのあるシンチレーションバイアル(scintillation vial)に置かれた。噴出は１４Ｃから約０まで延びるウィンドウを用いて計数された。分析効率および放電消滅の程度が純粋１４Ｃ−ＳＡＭの既知量のカウントを加え、全過程にわたってプロセスされることにより決定された。背景を典型的に<１００ｃｐｍ>である（反応当り総カウントｃａ．１０５（ｃｐｍ）。
【０１６３】
【表１３】
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【０１６４】
ＭｅｔＫ反応の産物であるＳＡＭｅは、ＭｅｔＫの非競争的阻害剤である。よって、分析のために反応速度が調節され、野生型と突然変異型の活性間の差異が一層高くなるだろうと予想される。多様なＭｅｔＫ酵素突然変異体の活性を理解すると、適切な生産宿主をデザインすることができる。
【０１６５】
（Ｄ．ＳＡＭｅ輸送体調節）
Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭｅ）は、全ての有機体で一次的メチル基供与体として作用し、ポリアミンの生合成に関与し、細胞成長に必須的である。大腸菌は、成長培地からＳＡＭｅを吸収することができないため、Ｓ−アデノシルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＫ、ＥＣ ２．５．１．６）は大腸菌において公知のＳＡＭｅ生合成ルートのみを触媒する。前述したように、ｍｅｔＫのダウンレギュレーションに対する代案はそのようなルートによるメチオニンの利用を減少または回避するために、大腸菌にＳＡＭｅを吸収することが可能な能力を提供すると同時に、ｍｅｔＫ遺伝子をノックアウトさせることである。すると、細胞成長は発酵培地にＳＡＭｅを追加することにより調節できる。
【０１６６】
リケッチア高親和性ＳＡＭｅ輸送システムが明らかになった(Tucker et al., J. Bact. 185: 3031-3035, 2003)。前記ＳＡＭｅ輸送体(transporter)は２〜８ｍＭのＫＴ値を有し、この値はＳ．セレビシエ（３．３ｍＭ）、Ｐ．カリニ(P.carinii)（４．５ｍＭ）、およびラット肝（８．９ｍＭ）由来の輸送体の値と比較される。しかも、リケッチアＳＡＭｅ輸送システムは、大腸菌ｍｅｔＫ欠失突然変異を補完することができる(Driskell et al., J. Bact. 187:5719-5722, 2005)。
【０１６７】
Ｗ３１１０およびＴＦ４０７６ＢＪＦ菌株は、前述したＳＡＭ輸送体を含むプラスミドで形質転換された。Ｗ３１１０由来のｍｅｔＫ遺伝子は、ノックアウトされ、ＰＣＲによって証明された。これらの修飾に応じて、新しい菌株はＳＡＭの存在下でのみ成長することができるが、ＳＡＭのない場合は成長することができない。ところが、外因性ＳＡＭの場合は存在および不在の両方の場合において成長を続けることができる。
【０１６８】
（Ｅ．発酵培地でメチオニンを増加させるためのメチオニン吸収輸送体のノックアウト）
２つのＬ−メチオニン輸送体が大腸菌で明らかになったが、一つは非常に高い親和力（Ｋｍ＝０．１〜０．１３μｍ）を持つものであり、もう一つは低い親和力（Ｋｍ＝２０〜４０μｍ）を持つものである。ｍｅｔＤ突然変異がＤ−メチオニンを輸送することができないため、それをメチオニンソースとして用いるために指定された高い親和力輸送体システムのための遺伝子座はｍｅｔＤである。前記ｍｅｔＤ遺伝子座は、Ｌ−メチオニンおよびＤ−メチオニンの吸収に必要なＡＢＣ輸送体をコードするａｂｃ（ｍｅｔＮ）、ｙａｅＥ（ｍｅｔＩ）およびｙａｅＣ（ｍｅｔＱ）遺伝子に対応する。ｍｅｔＮは推定的ＡＴＰ酵素をコードし、ｍｅｔＩはｍｅｔＤ ＡＢＣ輸送体の膜−回転部位をコードする。三番目の構成要素ｍｅｔＱは基質結合ドメインをコードするものと予想される。ｍｅｔＩ、ｍｅｔＮおよびｍｅｔＱ欠失突然変異はＬ−メチオニンの存在下に依然として成長することができるため、低い親和力ｍｅｔＰシステムの存在に対する間接的な証拠として思われる。
【０１６９】
図５に示すように、遺伝的に特性化されていない輸送体ｍｅｔＰはＬ−メチオニンのみを受け入れる反面、ｍｅｔＤはＤ−およびＬ−メチオニンを受け入れる。ＭｅｔＤは３つの構成要素を持つ典型的なＡＢＣ輸送体として思われる：Ａ、Ｅ、およびＣはそれぞれａｂｃ（ＡＴＰ酵素）、ｙａｅＥ（パーミアーゼ）、およびｙａｅＣ（Ｄ−メチオニン結合タンパク質）(Merlin et al., J. Bacteriol. 184: 5513-5517, 2002)。
【０１７０】
球状のメチオニン抑制因子タンパク質であるｍｅｔＪは、ｍｅｔＤ遺伝子座をコードするオペロンの発現を陰性的に調節するものと示された。ｍｅｔＤ遺伝子の転写はｍｅｔＪ共同抑制因子としてのメチオニンの不足状態に応じて増加する。ｍｅｔＪ欠失を持つ細胞において、輸送体はさらに高く発現され、メチオニンによって抑制されない(Merlin et al., J. Bacteriol. 184: 5513-5517, 2002)。メチオニン生産菌株は、生産を増大させるために一般に減衰したｍｅｔＪ配列またはｍｅｔＪ欠失を持つが、これはメチオニン流入活性を減らすために特に重要でありうる。前記菌株はｍｅｔＤメチオニン吸収システムをノックアウトして修飾できる。これはメチオニン吸収を防ぎ、吸収／分泌の潜在的にエネルギーを消費する無益なサイクルを回避することができる。
【０１７１】
ｍｅｔＤをノックアウトすると、実施例３で記述された振とうフラスコプロトコールによって測定するとき、発酵液におけるメチオニン蓄積が２５％上昇する。
【０１７２】
（Ｆ．ｍｅｔＨの過発現）
本発明で記述した菌株の修飾によってメチオニン経路への炭素流入が増加すると、細胞内部のホモシステインの蓄積をもたらすことができる。ホモシステインは細胞に強い毒性として作用する。ホモシステインの蓄積を防止し且つこれをメチオニンに転換させるために、非常に活性化されたホモシステインメチラーゼ活性（ＥＣ ２．１．１．１３および２．１．１．１４）が重要であるが、これらはそれぞれｍｅｔＥおよびｍｅｔＨによってコードされる。これを達成するための一つの方法はプラスミドシステムにおいてこれらの遺伝子を過発現させるか、或いは染色体を強いプロモーターの調節下に置く方法である。
【０１７３】
大腸菌由来の前記天然型ｍｅｔＨ遺伝子は、ｍｅｔＡＢＣおよびｍｅｔＸＹの二重経路を含む菌株において幾つかの他のプロモーター下に過多発現され、メチオニン生産は、振とうフラスコプロトコールによって測定された。ｍｅｔＨ過多発現に用いられる３つのベクターは、商業的に入手可能なプラスミドｐＣＬ１９２０を修飾して製造することができる。このために、Ｐｌａｃプロモーターをそれぞれ大腸菌ｃｙｓＫ遺伝子、商用ベクターｐＰＲＯＬａｒ由来のプロモーター、およびＣＪ第一製糖社所有のプロモーターＣＪ１で代替して製造した。これはｐＣＬ−ｐ（ｃｙｓＫ）、ｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）、およびｐＣＬ−Ｐ（ＣＪ−１）である。大腸菌ｍｅｔＨ遺伝子のＯＲＦは、プロモーターの下流(downstream)に位置した。獲得された結果は下記表１３に示した。振とうフラスコプロトコールにおいて、蓄積されたメチオニンが低い水準であっても、高濃度のホモシステインメチラーゼが存在すると、メチオニン生産に非常に肯定的な影響を及ぼすものと示された。前記影響は発酵器(fermentor)で一層さらに分明であろう。
【０１７４】
【表１４】
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【０１７５】
（Ｇ．メチオニン生産微生物における硫酸塩吸収の向上およびＡＰＳプールの増加）
本実施例では、大腸菌の内因性硫黄同化作用経路において中間代謝産物ＰＡＰＳをバイパスするように大腸菌を操作する方法について記述する。前記新しく生じた経路は、硫化物(sulfide)へ減少した各硫酸塩分子当り１個のＡＴＰ分子を少なく要求するので、よりエネルギー効率的である（図６参照）。
【０１７６】
上述したように、図６は硫黄同化作用代替経路を用いることが可能な２つの方法を示す。一つの方法は、バチルス由来またはＰ．アエルギノサ由来のアデニリル硫酸還元酵素ｃｙｓＨ（ＥＣ １．８．４．９）遺伝子をクローニングして、それを大腸菌ゲノムに挿入し或いはプラスミドから発現させる方法である。この方法は、一つの単一段階でＡＰＳを硫酸塩(sulfite)に転換させるので、大腸菌ＡＰＳキナーゼ（ｃｙｓＣ）によって触媒されるＡＰＳまたはＰＡＰＳへの転換を回避することができる。２番目の方法は、バクテリアｃｙｓＨ同族体に基づき、大腸菌ＰＡＰＳ還元酵素遺伝子を突然変異させてその基質特異性がＰＡＰＳからＡＰＳに変わるようにする方法である。
【０１７７】
バチルスサブチリス１６８由来のｃｙｓＨ遺伝子（寄託番号ＡＪ０００９７４ ＲＥＧＩＯＮ：５４８．．１２４９）およびシュードモナスアエルギノサＰＡＯ１由来のｃｙｓＨ遺伝子（寄託番号ＮＣ＿００２５１６ ＲＥＧＩＯＮ：１８９５６９２．．１８９６４９５）がプラスミド内にクローニングされ、大腸菌ｃｙｓＣまたはｃｙｓＨノックアウト突然変異を補完することができるかを調べるためにテストされた。前記菌株はシステインおよびメチオニンの両方ともの栄養要求性株である。
【０１７８】
補完をテストするために簡単に、バチルスサブチリス１６８およびシュードモナスアエルギノサＰＡ０１由来のｃｙｓＨ遺伝子は、ＢＬ２１（ＤＥ３）のｃｙｓＨノックアウトであるＢＬ２１（ＤＥ３）ＤｃｙｓＨ内に形質転換された。下記４つの菌株由来の単一コロニーが、ＮＯＶＡＧＥＮ社の一晩エクスプレス培地（ＯｎＥＸ：defined medium supplemented with amino acids but not cysteine or methionine）を含む５ｍＬの培地液を接種させるために用いられた。
【０１７９】
培地液は、連続振とうによって３０℃で４８時間接種された。表１４に示すように、その結果は、バチルスサブチリスおよびシュードモナスアエルギノサ由来の２つのｃｙｓＨ遺伝子が大腸菌でｃｙｓＨノックアウトを補完することができ、成長を維持することができることを示す。
【０１８０】
【表１５】
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【０１８１】
同様に、ノックアウトされたｃｙｓＣ遺伝子を有する菌株は、バチルスサブチリスおよびシュードモナスアエルギノサ由来のｃｙｓＨ遺伝子による補完をテストするために用いられた。ＢＬ２１（ＤＥ３）ＤｃｙｓＣ菌株はそれぞれｐＥＴ２３ａ、ｐＥＴ２３ａ＋ｃｙｓＨ（Ｂ．サブチリス）、およびｐＥＴ２３ａ＋ｃｙｓＨ（Ｐ．アエルギノサ）プラスミドで形質転換された。ＢＬ２１（ＤＥ３）を一緒に持つ前記３つの菌株の単一コロニーは、Ｌ−システインおよびＬ−メチオニンを除いたアミノ酸を含む５ｍＬのＯｎＥｘ培地で接種された。細胞は４８時間振とうによって３７℃で培養され、その成長はＯＤ６００ｎｍによって測定された。表１５に示すように、その結果によれば、バチルスサブチリスおよびシュードモナスアエルギノサ由来のｃｙｓＨ−ｃｏａｔｅｄ ＡＰＳ還元酵素は大腸菌においてＢＬ２１（ＤＥ３）にあるｃｙｓＣ突然変異を補完することができる。これはＰＡＰＳの形成をバイパスすることが可能であることを示唆する。
【０１８２】
【表１６】
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【０１８３】
（硫黄同化作用経路における酵素の過発現）
前述したように、メチオニン生産を増加させるためには非常に効率的な硫黄同化作用経路を有することが役に立つ。アシルホモセリン前駆体の直接硫黄水和反応を促進させるために、ＳＨ２の利用可能性が必須的である。前記硫黄同化作用経路の主要遺伝子は全てメチオニン生産菌株ＴＦ４０７６ＢＪＦ内にクローニングされて過発現された。前記過発現された遺伝子は次のとおりである：
ｃｙｓＰＵＷＡ：硫酸塩パーミアーゼ
ｃｙｓＤＮ：ＡＴＰスルフリラーゼ（ＥＣ ２．７．７．４）
ＣｙｓＣＣｙｓＨ：ＡＰＳキナーゼおよびＰＡＰＳスルホトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．７．１．２５およびＥＣ １．８．４．８）
ＣｙｓＩＪＣｙｓＧ：ＮＡＤＰＨ−亜硫酸還元酵素
ＣｙｓＢ：転写活性因子
これらの遺伝子はｍｅｔＡＢＣおよびｍｅｔＸＹの両経路を有する菌株内で過発現され、メチオニン生産は標準振とうフラスコプロトコールによって測定された。前述した硫酸同化作用遺伝子の５グループはプラスミドｐＣＬ１９２０のＰｌａｃプロモーターを大腸菌ｒｍｆ遺伝子のプロモーターで代替して製造されたベクターｐＣＬ−（Ｐｒｍｆ）内にそれぞれクローニングされた。その結果は下記表１６に示した。
【０１８４】
【表１７】
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【０１８５】
転写調節だけでなく、輸送酵素の過発現はメチオニンの低調な生産として現れ、細胞マスのユニット当りメチオニン量の急減をもたらした。スルフリラーゼ、ＡＰＳキナーゼおよびスルホトランスフェラーゼの活性増加は全て生産された総メチオニンだけでなく、細胞ユニット当り増加したメチオニン生産を示した。２つの異なるプラスミドを活用した菌株から観察されたこのような増加からみて、酵素の発現が調節されて最適化されると、前記結果は一層さらに増加するだろうと予想される。
【０１８６】
〔実施例４．例示的なメチオニン生産菌株〕
前述したように、本発明に記述された多様な遺伝的修飾が染色体と関係なく組み換えＤＮＡ配列の挿入を介して行われるか、或いは組み換えＤＮＡ配列が生産菌株染色体内に挿入できる。前記組み換えＤＮＡ配列は一つのコピーまたは多数コピーとして宿主細胞内に挿入できる。
【０１８７】
i）大腸菌ＡＴＣＣ＃１３０７０またはＴＦ４０７６などの微生物は、ｔｈｒＢおよびｍｅｔＪの機能的欠失を含んで前記遺伝子が減衰するように操作できる。前記微生物は、天然ｍｅｔＨ遺伝子の過発現を引き起こす組み換え核酸配列だけでなく、ｍｅｔＸおよびｍｅｔＹ遺伝子を発現する。ｍｅｔＸおよびｍｅｔＹの発現は大腸菌に追加的な経路を導入し、天然ｍｅｔＨ遺伝子の過発現はホモシステインのメチオニンへの増加した流入をもたらす。
【０１８８】
ii）他の生産菌株は、前記i）に記述された微生物に下記修飾を経て製造される。前記i）に記述された微生物は、シュードモナスアエルギノサ由来遺伝子などの活性ｍｅｔＺ遺伝子をコードする組み換えＤＮＡ分子で形質転換されることによりさらに修飾される。
【０１８９】
iii）別の生産菌株は、前記i）に記述された微生物に下記修飾を経て製造される。前記i）に記述された微生物は、天然ｍｅｔＡ遺伝子を実施例３に記述されたようなフィードバック阻害抵抗性ｍｅｔＡ遺伝子で代替するようにさらに修飾することができる。
【０１９０】
iv）別の生産菌株は、前記iii）に記述された微生物に下記修飾を経て製造される。iii）に記述された微生物は活性ｍｅｔＺ遺伝子で形質転換できる。
【０１９１】
v）別の生産菌株は、前記i）に記述された微生物に下記修飾を経て製造される。前記i）に記述された微生物は、天然ｍｅｔＦ遺伝子の産物を過発現して転写抑制因子遺伝子ｌａｃＩを減衰するようにさらに修飾できる。
【０１９２】
vi）追加的な生産菌株は、本発明に記述されたいずれの生産菌株でも下記の修飾を経て製造できる。生産菌株は、硫黄同化作用を向上させるために、ｃｙｓＤＮ、ｃｙｓＩＪ、またはｃｙｓＣＨ遺伝子またはその組み合わせを過発現させるように操作される。選択的に、これらの生産菌株は大腸菌由来の天然ｃｙｓＣおよびｃｙｓＨをＰ．アエルギノサまたはＢ．サブチリス由来の単一ｃｙｓＨ遺伝子で代替されるように追加的に修飾できる。
【０１９３】
vii）別の生産菌株は、メチオニン流入遺伝子ｍｅｔＤを減衰するように、本発明に記述された生産菌株を修飾することにより製造できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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