(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられる患者用のナノ粒子の薬学的組成物において、各ナノ粒子が、少なくとも１の生物活性剤である第１成分と、負に帯電している第２成分と、分子量が８０ｋＤａ以下の正に帯電したキトサンである第３成分とを含み、前記ナノ粒子の表面が当該表面での過剰量の前記正に帯電したキトサンによって、正の表面電荷を呈示し、前記第１成分がインスリンであることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記第２成分がポリグルタミン酸であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記第２成分が、ポリ−γ−グルタミン酸であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の薬学的組成物において、ナノ粒子中のポリ−γ−グルタミン酸に対する前記キトサンの重量比が０．７５ないし０．１６７又はそれ以上であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記第２成分がポリ−γ−グルタミン酸であり、前記第１成分、前記第２成分、及び前記第３成分の重量比が０．０８３：０．１６７：０．７５であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記インスリンの負荷容量が前記ナノ粒子の少なくとも８ｗ／ｗ％であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記インスリンの負荷容量が前記ナノ粒子の少なくとも１４ｗ／ｗ％であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記ナノ粒子のゼータ電位が１５ないし４０ｍＶであることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記ナノ粒子のゼータ電位が２５ないし４０ｍＶであることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記第２成分が、ヘパリン又はアルギン酸塩であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記ナノ粒子がカプセル内に更にカプセル化されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の薬学的組成物において、前記カプセルの表面がグリセリンを含むことを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の薬学的組成物において、前記カプセルの表面が親水性であることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記第３成分が架橋されていることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記第３成分が５０％未満の架橋度で架橋されていることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記第３成分がゲニピン、その立体異性体、及びそれらの混合物からなる群から選択される架橋剤で架橋されていることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記キトサンが、さらに、ポリアクリル酸でグラフト化されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記キトサンが４０ｋＤａ未満の分子量を有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記ナノ粒子が１００から３００ナノメータの平均粒子径を有することを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記ナノ粒子がイオンゲル化法を介して形成されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記ナノ粒子が経口投与により患者に送達されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載の薬学的組成物において、前記ナノ粒子が、血管投与を介して患者に送達されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項２３】
生物活性剤としてのインスリンと、分子量が８０ｋＤａ以下の正に帯電したキトサンと、負に帯電したポリグルタミン酸とを含む腸管内傍細胞輸送を増強するナノ粒子の経口用薬学的組成物であって、前記ナノ粒子の表面が当該表面での過剰量の前記正に帯電したキトサンによって、正の表面電荷を呈示し、負に帯電したポリグルタミン酸が、ナノ粒子の中心部において、正に帯電したキトサンにより中和されることを特徴とする経口用薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の経口用薬学的組成物において、ポリグルタミン酸に対する前記キトサンの重量比が、０．７５から０．１６７又はそれ以上であることを特徴とする経口用薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項２３に記載の経口用薬学的組成物において、前記ナノ粒子のゼータ電位が１５から４０ｍＶであることを特徴とする経口用薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項２３に記載の経口用薬学的組成物において、前記ナノ粒子のゼータ電位が２５から４０ｍＶであることを特徴とする経口用薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項２３に記載の経口用薬学的組成物において、前記ナノ粒子が、さらに、カプセルにカプセル化されていることを特徴とする経口用薬学的組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の経口用薬学的組成物において、前記カプセルの表面がグリセリンを含むことを特徴とする経口用薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項２７に記載の経口用薬学的組成物において、前記カプセルの表面が親水性であることを特徴とする経口用薬学的組成物。
【請求項３０】
被験動物における少なくとも１つの生物活性剤の傍細胞輸送を強化するのに有用な薬剤の調製におけるナノ粒子の使用であって、１回投与量のナノ粒子を投与するステップを具え、各ナノ粒子が、前記少なくとも１つの生物活性剤である第１成分と、負に荷電した第２成分と、分子量が８０ｋＤａ以下の正に帯電したキトサンである第３成分とを含み、前記ナノ粒子の表面が当該表面での過剰量の前記正に帯電したキトサンによって、正の表面電荷を呈示し、前記第１成分がインスリンであることを特徴とする使用。
【請求項３１】
請求項３０に記載の使用において、ナノ粒子の前記用量を投与するステップが、傍細胞輸送を増強するために経口投与を介していることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」と題した、２００５年１月４日に出願された、米国特許出願第１１／０２９，０８２号の優先権を主張するものであり、この全ての内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、強化傍細胞ドラッグデリバリ能力を有するドラッグデリバリシステムとして、タンパク質薬剤を伴うキトサン／ポリ−γ−グルタミン酸で成るナノ粒子の医学的使用に関する。
【０００３】
本発明の背景
薬学的に活性であるペプチドとタンパク質の大量生産が実行可能になった（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４；５：１９１７−１９２５）。経口経路は、患者への薬物投与の最も都合の良い方法であると考えられている。それにも関わらず、腸管上皮は、ペプチドやタンパク質等の親水性薬剤の吸収に対する主要な障壁である（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９６；３９：１３１−１３８）。これは、親水性薬剤が、脂質二分子細胞膜を通って細胞に容易に拡散することができないからである。親水性薬剤の傍細胞輸送の改良に関心が寄せられた（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８；５１：３５−４６）。傍細胞経路を介した親水性分子の輸送は、隣接する上皮細胞の内腔面に位置している密着結合の存在によって、厳しく制限されている（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９９５；１５：３５−５５）。これらの密着結合は、親水性分子の傍細胞拡散を制限する障壁を形成する。密着結合の構造及び機能は、とりわけ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９８；６０：１２１−１６０、及びＢａｌｌａｒｄ  ＴＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．１９９５；１５：３５−５５に記載されている。密着結合は、硬い障壁は形成しないが、内腔から血流に、及びその逆に腸管内上皮を通る拡散に重要な役割を果たす。
【０００４】
胃腸管の上皮細胞を伴うような層内への細胞を互いに結合する密着結合を介した細胞間の溶質の動きは、傍細胞輸送と呼ばれている。傍細胞輸送は受動的である。傍細胞輸送は、細胞間輸送によって発生した電気化学的勾配と、密着結合による溶媒牽引に依存する。密着結合は、細胞層の先端部と基底部の体液区画を分離する細胞間障壁を形成する。先端部の体液区画から基底部の体液区画への密着結合を通る溶質の移動は、この溶質についての密着結合の「堅固さ」に依存する。
【０００５】
高分子ナノ粒子は、ドラッグデリバリ用の担体として広く研究されている（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００２；２３：３１９３−３２０１）。生体適合性が良好であるため、ポリ−ε−カプロラクトンやポリラクチド等の合成生分解性ポリマから作られるナノ粒子に多くの関心が寄せられている（Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ２０００；７：２１５−２３２；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９５；４１：１９−２５）。しかし、これらのナノ粒子は、これらの疎水性特性のために親水性薬剤用には理想的な担体ではない。本発明のいくつかの態様は、親水性キトサンと、単純なイオンゲル化法によって調製されたポリ−γ−グルタミン酸ハイドロゲルから成る新規のナノ粒子系に関する。このナノ粒子技術は、有害な溶媒を用いることなく緩やかな条件下で調製される。有機溶媒は、不安定で環境に敏感であるペプチド又はタンパク質薬剤の分解を引き起こすことが知られている（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００１；７３：２７９−２９１）。
【０００６】
経口ドラッグデリバリ経路に続いて、タンパク質薬剤は、胃の中の低ｐＨの胃媒質によって直ちに分解される。経口投与に続くタンパク質薬剤の吸収は、高分子量、親水性、及び酵素不活性化に対する感受性という欠点を有する。腸管内上皮でのタンパク質薬剤は、疎水性膜に区画できず、従って、傍細胞経路を介して上皮障壁を横断できるのみである。しかし、密着結合は、親水性分子の傍細胞拡散を制限する障壁を形成する。
【０００７】
キトサン（ＣＳ）、即ち、カチオン性多糖類は、一般的に、アルカリ性脱アセチルによってキチンから取り出される（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００４；９６：２８５−３００）。ＣＳが非毒性で軟部組織適合性であることがあり、文献に報告されている（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４；５：１９１７−１９２５；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４；５：８２８−８３３）。加えて、ＣＳが粘膜表面に付着し、上皮細胞間の密着結合を一時的に開くという特殊機能を有することが知られている（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９４；１１：１３５８−１３６１）。ほとんどの市販で入手できるＣＳは、非常に大きな分子量（ＭＷ）を有し、ときに非実用的であるほぼ４．０又はそれ以下のｐＨ値の酢酸溶液に溶かす必要がある。ＭＷが低いと、ＣＳのポリカチオン特性を、生理学的範囲に近いｐＨ値の良好な溶解度で用いることができる。生理学的ｐＨ範囲でペプチド又はタンパク質薬剤を添加することは、その生物活性を保存するであろう。これに基づいて、本発明のナノ粒子を調製するためにセルラーゼを用いて、市販で入手できるＣＳを解重合することによって得た低ＭＷ  ＣＳがここに開示されている。
【０００８】
γ−ＰＧＡ、即ち、アニオン性ペプチドは、莢膜物質として、又はバチルス属の員による粘液として製造される天然化合物である（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１；２１：２１９−２３２）。γ−ＰＧＡは、アミド結合によって結合した天然に存在するＬ−グルタミン酸から成る点でユニークである。この天然に存在するγ−ＰＧＡが水溶性であり、生分解性であり、非毒性ポリマであることは、文献に報告されている。α−ＰＧＡは、通常、臭化水素を用いてベンジル保護基を取り除くことによって、ポリ（γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸）から合成される。
【０００９】
Ｔｈａｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．は、腸管内吸収エンハンサとしてキトサン及びその誘導体を報告した（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ２００１；５０：Ｓ９１−Ｓ１０１）。酸性ｐＨでプロトン化した場合、キトサンは、粘膜上皮全体にペプチド薬剤の傍細胞浸透性を増加することが可能である。ペプチド薬剤とキトサン又は塩化トリメチルキトサンの共投与は、キトサン成分なしで投与した場合と比較すると、動物のペプチドの生物学的利用能を実質的に上げることが分かった。
【００１０】
本発明の概要
本発明の一の目的は、低分子量のキトサン（低ＭＷ  ＣＳ）溶液へのポリ−γ−グルタミン酸（γ−ＰＧＡ）溶液の添加時に、単純で緩やかなイオンゲル化法を用いて、傍細胞輸送ドラッグデリバリについての新規なナノ粒子系及び調製方法を提供することである。一の実施例では、本発明の低ＭＷ  ＣＳの分子量は約８０ｋＤａ又はそれ以下であり、好ましくは、約４０ｋＤａであり、タンパク質及びペプチド薬剤の生物活性を維持するｐＨで適切な溶解度に適応している。分子量約３０−５０ｋＤａのキトサン粒子が腎臓不活性であることが明記されている。調製したナノ粒子の粒径とゼータ電位値は、それを構成している組成によって制御される。ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）試験と、ＡＦＭ（原子間力顕微鏡）試験によって得られた結果は、調製したナノ粒子の形態が、一般的に球形であることを示した。腸管内傍細胞輸送の強化における調製したナノ粒子の評価は、Ｃａｃｏ−２細胞単層で、インビトロで研究された。本発明のいくつかの態様では、Ｃａｃｏ−２細胞単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を効果的に下げるために、表面上に占めるＣＳを有するナノ粒子を提供する。共焦点レーザ走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）による観察は、表面上に占めるＣＳを有するナノ粒子が、Ｃａｃｏ−２細胞間の密着結合が開くことを可能であり、傍細胞経路を介してナノ粒子を輸送できることを確認するものである。このことは、Ｓｕｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓによる論文に書かれている（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００５；６：１１０４−１１１２）。
【００１１】
本発明のいくつかの態様は、患者に少なくとも一の生物活性剤をデリバリするように構成した腸管内又は血液の脳傍細胞輸送の強化方法に関し、この方法は、γ−ＰＧＡとキトサンで構成されたナノ粒子を投与するステップを具える。ここで、ナノ粒子を投与するステップは、経口投与又は血管注射を介するものであっても良い。一の実施例では、キトサンは、ナノ粒子の表面を占める。別の実施例では、ナノ粒子の表面は、正の表面電荷で特徴付けられる。
【００１２】
更なる実施例では、ナノ粒子のキトサンは、低分子量のキトサンであり、この低分子量のキトサンは、約８０ｋＤａの分子量を有し、好ましくは、約５０ｋＤａ未満、最も好ましくは、約４０ｋＤａ又はそれ以下の分子量を有する。
【００１３】
更なる実施例では、ナノ粒子は、約５０から４００ナノメータ、好ましくは、約１００から３００ナノメータ、最も好ましくは、約１００から２００ナノメータの平均粒径を有する。
【００１４】
いくつかの実施例では、ナノ粒子は、治療上有効量の少なくとも一の生物活性剤が添加されており、この生物活性剤は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗生剤、及び抗炎症剤から成る群より選択される。更に、この生物活性剤は、カルシトニン、シクロスポリン、インスリン、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、バソプレシン及びバソプレシン類似体、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキンＩＩ、インターフェロン、コロニィ刺激因子、腫瘍壊死因子、及びメラニン細胞刺激ホルモンから成る群より選択することができる。一の好ましい実施例では、前記生物活性剤が、アルツハイマー拮抗剤である。
【００１５】
本発明のいくつかの態様は、γ−ＰＧＡ及び低分子量のキトサンを具える腸管内又は血管脳傍細胞輸送を効果的に強化するナノ粒子の経口投与に関する。このキトサンは、ナノ粒子の表面上を占める。本発明のいくつかの態様は、コアにγ−ＰＧＡやヘパリン等の負の成分を、及び低分子キトサンを具える腸管内又は血液脳傍細胞輸送を効果的に強化するナノ粒子の経口投与に関し、このキトサンは正電荷でナノ粒子の表面上を占める。更なる実施例では、ナノ粒子は、インスリン、インスリン類似体、アルツハイマー病拮抗剤、パーキンソン病拮抗剤、又はその他のタンパク質／ペプチド等の少なくとも一の生物活性剤を具える。アルツハイマー病の治療用生物活性剤は、塩酸メマンチン（Ｍｅｒｚ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社製Ａｘｕｒａ（登録商標））、塩酸ドネペジル（Ｅｉｓａｉ株式会社製Ａｒｉｃｅｐｔ（登録商標））、酒石酸リバスチグミン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社製Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標））、塩酸ガランタミン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ社製Ｒｅｍｉｎｙｌ（登録商標））、及び塩酸タクリン（Ｐａｒｋｅ  Ｄａｖｉｓ社製Ｃｏｇｎｅｘ（登録商標））を含んでいてもよい。インスリン又はインスリン類似体製品の例は、限定されないが、Ｈｕｍｕｌｉｎ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社製）、Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ社製）及びＬａｎｔｕｓ（登録商標）（Ａｖｅｎｔｉｓ社製）を含む。
【００１６】
本発明のいくつかの態様は、γ−ＰＧＡ及び低分子量のキトサンを具える腸管内又は血脳傍細胞輸送を効果的に強化するナノ粒子の経口投与に関し、このナノ粒子は、架橋剤で、又は、紫外線の照射等の光で架橋される。
【００１７】
本発明のいくつかの態様は、腸管内又は脳血傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられるナノ粒子の投与を提供し、各ナノ粒子は、少なくとも一の生物活性剤でなる第１成分と、負に帯電している第２成分と、低分子量のキトサンでなる第３成分とを具え、この第３成分は、ナノ粒子の表面上を占めている。一の実施例では、第２成分は、γ−ＰＧＡ、ヘパリン、又はアルギニンである。別の実施例では、ナノ粒子調製溶液中に第１成分は、０．０７５から０．０９１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のインスリンを具え、第２成分は、０．１５０から０．１８４ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度のγ−ＰＧＡを具え、０．６７から０．８３ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の第３成分を具える。
【００１８】
本発明のいくつかの態様は、腸管内又は脳血傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられるナノ粒子の投与を提供し、各ナノ粒子は、少なくとも一の生物活性剤でなる第１成分と、負に帯電している第２成分と、低分子量のキトサンでなる第３成分とを具え、この第３成分は、ナノ粒子の表面上を占めており、少なくとも一の生物活性剤が、アルツハイマー病用拮抗剤であるか、又は、塩酸メマンチン、塩酸ドネペジル、酒石酸リバスチグミン、塩酸ガランタミン、塩酸タクリンから成る群より選択されたアルツハイマー病治療用の生物活性剤である。更なる実施例では、少なくとも一の生物活性剤が、インスリン又はインスリン類似体である。更なる別の実施例では、少なくとも一の生物活性剤が、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗生剤、及び抗炎症剤から成る群より選択される。
【００１９】
本発明のいくつかの態様は、腸管内傍細胞輸送、又は脳血傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられるナノ粒子の投与を提供し、このナノ粒子は、ゲルカプセル、ソフトゲル等で、更にカプセル化されている。
【００２０】
本発明のいくつかの態様は、腸管内、又は脳血傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられるナノ粒子の投与を提供し、各ナノ粒子は、少なくとも一の生物活性剤でなる第１成分と、負に帯電している第２成分と、低分子量のキトサンでなる第３成分とを具え、この第３成分はナノ粒子の表面上を占めており、この第３成分は、架橋されている。一の実施例では、架橋度は、５０％未満である。別の実施例では、架橋度は、１％から２０％の範囲である。
【００２１】
本発明のいくつかの態様は、腸管内又は脳血傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられるナノ粒子の投与を提供し、各ナノ粒子は、少なくとも一の生物活性剤でなる第１成分と、負に帯電している第２成分と、低分子量のキトサンでなる第３成分とを具え、この第３成分はナノ粒子の表面上を占めており、ここで、この第３成分は、ゲニピン、その誘導体、類似体、立体異性体、及びこれらの混合物から成る群より選択される架橋剤で架橋されている。一の実施例では、架橋剤は、エポキシ化合物、酸化デンプン（ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｔａｒｃｈ）、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、スベルイミノ酸ジメチル、カルボジイミド、スクシンイミジル類、ジイソシアナート類、アシルアジド、ロイテリン、紫外線の放射、デヒドロサーマル処理（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン、アスコルビン酸銅、グルコース−リシン、及び光酸化剤（ｐｈｏｔｏ−ｏｘｉｄｉｚｅｒｓ）から成る群より選択される。
【００２２】
本発明のいくつかの態様は、腸管内又は脳血傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられるナノ粒子の投与を提供し、低分子量のキトサンが、８０ｋＤａ又はそれ以下の分子量を有する。一の実施例では、低分子量のキトサンは、化学式：
0005384831.tif 000002
を有するポリマで更にグラフトされる。
【００２３】
本発明のいくつかの態様は、１回分のナノ粒子を投与するステップを具える腸管内又は脳血傍細胞輸送の強化方法を提供し、各ナノ粒子は、少なくとも一の生物活性剤でなる第１成分と、負に帯電している第２成分と、低分子量のキトサンでなる第３成分とを具え、この第３成分はナノ粒子の表面上を占めている。一の実施例では、前記投与量のナノ粒子の投与ステップが、前記腸管内傍細胞輸送を強化するために経口投与を介して行われる。別の実施例では、前記投与量のナノ粒子の投与ステップは、前記脳血傍細胞輸送を強化するために血管投与、又は静脈血管注射を介して行われる。
【００２４】
例示的実施例の詳細な説明
以下に記載されている本発明の好ましい実施例は、特に、キトサン／ポリ−γ−グルタミン酸／インスリンを具えるナノ粒子の調製、及び上皮細胞間の密着結合を開くことによって、腸管内又は血脳傍細胞透過を強化する透過性に関する。記載が種々の実施例の特定の詳細を説明しているが、この記載は例示のみであり、本発明を限定するような方法で解釈されるべきではないことは明らかである。更に、当業者が考えられる本発明の種々の用途、及びこれらへの変更も、以下に記載されている一般的な概念に包含されている。
【００２５】
γ−ＰＧＡは、α−アミノ酸とγ−カルボン酸基のアミド結合によって結合したＬ−グルタミン酸ユニットから作られる天然に存在するアニオン性ホモポリアミドである（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１；２１：２１９−２３２）。γ−ＰＧＡは、ＴＣＡサイクルを介して細胞内で生産されるある種のバチルス種の細胞外ポリマであり、醗酵培養液中に自由に排出される。環境ストレスに曝されると、生成している株の生存を増加するようにγ−ＰＧＡが結合される可能性があるが、その正確な生物学的役割は完全には知られていない。その水溶性、生分解性、可食性、及びヒト及び環境に対する非毒性から、食物、化粧品、医薬、及び水処理においていくつかの用途が、過去数年に研究されてきた。
【００２６】
例１
【００２７】
ナノ粒子調製の材料及び方法
【００２８】
ほぼ８５％の脱アセチル度を有するＣＳ（ＭＷ〜２．８×１０５）を、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社（台中、台湾所在）から入手した。酢酸、セルラーゼ（１．９２ユニット／ｍｇ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、過ヨウ素酸、酢酸ナトリウム、ホルムアルデヒド、次硝酸ビスマス、及びハンクス緩衝液（ＨＢＳＳ）を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ所在）から購入した。無水エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）、及び酒石酸カリウムナトリウムをＭｅｒｃｋ社（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ所在）から得た。非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）溶液、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ゲンタミシン及びトリプシン−ＥＤＴＡをＧｉｂｃｏ社（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ所在）から入手した。イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）をＢｉｏ  Ｗｅｓｔ社（Ｎｕａｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ所在）から購入した。その他の全ての化学物質及び試薬は、分析グレードであった。
【００２９】
例２
【００３０】
酵素加水分解によるＣＳの解重合
【００３１】
通常のＣＳを酵素（セルラーゼ）で処理し、いくつかの変更を有するＱｉｎ  ｅｔ  ａｌによって記載された方法によって、低ＭＷ  ＣＳを製造した（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００４；８４：１０７−１１５）。ＣＳの溶液（２０ｇ／ｌ）を２％酢酸のＣＳに溶解することによって調製した。ＣＳの総溶解度を保証するように注意が払われた。ＣＳの溶解度を確定するよう注意を払った。次いで、ＣＳ溶液を血管内に導入し、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液で所望のｐＨ５．０に調節した。次いで、セルラーゼ（０．１ｇ）をＣＳ溶液（１００ｍｌ）に加えて、３７℃で１２時間継続して攪拌した。その後、解重合したＣＳを、ｐＨ７．０−７．２でＮａＯＨ水溶液で沈殿させ、この沈殿したＣＳを脱イオン水で３回洗浄した。得られた低ＭＷ  ＣＳを、凍結乾燥器（東京、日本所在のＥｙｅｌａ社製）内で凍結乾燥した。
【００３２】
解重合ＣＳの平均分子量を、一連のＰＬアクアゲル−ＯＨカラム（英国所在のＰＬ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ｇｕａｒｄ  ８μｍ、５０×７．５ｍｍを１本と、ＭＩＸＥＤ  ８μｍ、３００×７．５ｍｍを２本）を具えたゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）システムと、屈折率（ＲＩ）検出器（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ所在のＳＦＤ社製ＲＩ２０００−Ｆ）によって決定した。多糖類標準（１８０から７８８，０００の範囲の分子量、英国所在のＰｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて、較正曲線を作成した。移動相は、０．０１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４と０．５Ｍ  ＮａＮＯ３を含有し、ｐＨ２．０にした。移動相の流量は１．０ｍｌ／分であり、カラムとＲＩ検出器セルを３０℃に維持した。
【００３３】
大抵の市販のＣＳの用途を制限する要因は、ＣＳの高分子量であり、従って、高粘度及び生理学的ｐＨ範囲で難溶性であることである。低ＭＷ  ＣＳは、これらの制限を克服し、それ故に、様々な分野で非常に広い用途を見出す。低ＭＷ低抗原効果であるため、ＣＳを親薬物担体として用いることが提案された（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００４；５７：１０１−１０５）。低ＭＷ  ＣＳを、非ウイルス遺伝子送出システムとして用い、有望な結果が得られた（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１９９９；１７８：２３１−２４３）。リゾチーム、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ブロメライン、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、パパイン等のいくつかの疎水性酵素を、解重合ＣＳに用いることができる（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９９６；１２９１：５−１５；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．２００１；７：８５−８８；Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９２；２３７：３２５−３３２）。標準ＭＷ  ＣＳ（通常ＭＷとしても知られている）と低ＭＷ  ＣＳの双方のＧＰＣクロマトグラムが、Ｓｕｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００５；６：ｌ１０４−１１１２）による論文に示されている。セルラーゼは、ＣＳ中のグリコシド結合の開裂を触媒することが知られている（Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２００４；８４：１０７−１１５）。この研究で用いられている低ＭＷ  ＣＳは、ｐＨ７．０−７．２でＮａＯＨ水溶液で解重合ＣＳ溶液を沈殿することによって得られた。このようにして得られた低ＭＷ  ＣＳは、約５０ｋＤａのＭＷを有する。好ましい実施例では、低分子量のキトサンは、約４０ｋＤａ又はそれ未満の分子量を有する。
【００３４】
このようにして得られた低ＭＷ  ＣＳは、ｐＨ６．０で水溶液に容易に溶解するが、解重合前にｐＨ約４．０の酢酸溶液に溶解させる必要があることが分かった。加えて、低ＭＷ  ＣＳで調製したナノ粒子は、その粘度が低いため、高ＭＷ（標準ＭＷとしても知られている）ＣＳで調製した対応するナノ粒子よりも狭い分布で（解重合前）、有意により小さいサイズを有する。例として、０．２０％高ＭＷ  ＣＳ溶液（粘度５．７３±０．０８ｃｐ、粘度計によって測定した）へ０．１０％γ−ＰＧＡ水溶液を添加したときの、調製したナノ粒子の平均粒径は、多拡散指数１．０の８７８．３±２８．４であったが、低ＭＷ  ＣＳ溶液（粘度１．２９±０．０２ｃｐ）へ０．１０％のγ−ＰＧＡ水溶液を添加すると、多拡散指数０．３で平均粒径２１８．１±４．１ｎｍのナノ粒子を形成した。
【００３５】
例３
【００３６】
γ−ＰＧＡの生成及び精製
【００３７】
γ−ＰＧＡは、Ｙｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．によって報告された方法に少し変更を加えるだけで、バチルスリケニホルミス（ＡＴＣＣ  ９９４５，新竹，台湾所在のＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ製）によって生成された（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０００；２２：５８５−５８８）。高粘液性のコロニィ（ＡＴＣＣ  ９９４５ａ）は、Ｅ培地（成分は、Ｌ−グルタミン酸、２０．０ｇ／ｌ；クエン酸、１２．０ｇ／ｌ；グリセロール、８０．０ｇ／ｌ；ＮＨ４Ｃｌ、７．０ｇ／ｌ；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ／ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ｌ；ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ／ｌ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１５ｇ／ｌ；ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．１０４ｇ／ｌ、ｐＨ６．５）寒天プレート上で３７℃で数回培養したバチルスリケニホルミス（ＡＴＣＣ  ９９４５）から選択した。次いで、若い粘液性コロニィを１０ｍｌＥ培地に移し、２４時間２５０ｒｐｍの振盪培養器内で３７℃で培養した。その後、５００μｌの培養液を、５０ｍｌのＥ培地と混合して、９５０ｍｌのＥ培地を含有する２．５リットルジャーファーメンタ（大阪，日本所在のＭｉｔｕｗａ社製ＫＭＪ−２Ｂ）に移した。細胞を３７℃で培養した。ｐＨを、２５％（ｖ／ｖ）のＮＨ４ＯＨ、及び／又は２Ｍ  ＨＣｌの自動給送によって６．５に調節した。溶解酸素濃度を、空気を供給し、撹拌速度を１０００ｒｐｍまで調節することによって、４０％の空気飽和に制御した。
【００３８】
４０時間後、４℃で、１２，０００×ｇで２０分間、遠心分離することによって、細胞を培養液から分離した。γ−ＰＧＡを含有する上澄み液を４ボリュームのメタノールに注ぎ、緩やかに撹拌をしながら一晩放置した。粗γ−ＰＧＡを含有する得られた沈殿は、４℃で、１２，０００×ｇで４０分間、遠心分離することによって回収し、次いで、脱イオン水に溶解して、４℃で、２４，０００×ｇで２０分間、遠心分離することによって、不溶性の不純物を除去した。γ−ＰＧＡ水溶液を、水を何回か交換しながら１２時間、蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００，０００，Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ所在のＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）をすることによって脱塩し、最後に凍結乾燥させて純粋なγ−ＰＧＡを得た。
【００３９】
例４
【００４０】
ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の調製
【００４１】
室温で磁気撹拌の下に、種々の濃度（０．０１ｗ／ｖ％，０．０５ｗ／ｖ％，０．１０ｗ／ｖ％，０．１５ｗ／ｖ％，又は０．２０ｗ／ｖ％）で、低ＭＷ  ＣＳ水溶液（ｐＨ６．０，１０ｍｌ）にピペット（０．５−５ｍｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ所在のＢｒａｎｄＴｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＰＬＡＳＴＩＢＲＡＮＤ）を用いてγ−ＰＧＡ水溶液（ｐＨ７．４，２ｍｌ）を添加して、ナノ粒子を得た。ナノ粒子を、１時間３８，０００ｒｐｍで超遠心分離法によって収集した。上澄み液を捨て、更なる実験用に、ナノ粒子を脱イオン水に再懸濁させた。ＦＴ−ＩＲを用いて、ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子中の低ＭＷ  ＣＳとγ−ＰＧＡのカルボン酸塩のアミノ基のピーク偏差を分析した。
【００４２】
上記のように、室温で磁気撹拌の下に、低ＭＷ  ＣＳ水溶液（ｐＨ６．０）へγ−ＰＧＡ水溶液（ｐＨ７．４）を添加して、即時にナノ粒子を得た。低ＭＷ  ＣＳ水溶液及びＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子のＦＴ−ＩＲスペクトルは、Ｓｕｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓによる論文に示されている（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００５；６：１１０４−１１１２）。２つの高分子電解質（γ−ＰＧＡ及びＣＳ）間の静電相互作用は、長い疎水性セグメント（又は、高密度の中性イオン対を有するセグメント）の形成を即時に誘発し、従って、コロイド状のナノ粒子に分割された高い中性複合体に成る。
【００４３】
例５
【００４４】
ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の特性
【００４５】
ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の形態学的試験を、ＴＥＭ（透過電子顕微鏡法）及びＡＦＭ（原子間力顕微鏡法）によって実施した。炭素で被覆した４００メッシュの銅格子上に１滴のナノ粒子溶液を置いて、ＴＥＭサンプルを準備した。沈殿後約２分で、格子をろ過紙で軽くたたいて表面の水を除去し、アルカリ性ビスマス溶液を用いて確実に着色した（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８６；３０：１２０７−１２１１）。スライドガラス上に１滴のナノ粒子溶液を滴下することによって、ＡＦＭサンプルを準備し、次いで、真空中で乾燥させた。準備したナノ粒子のサイズ分布及びゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，英国所在のＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製３０００ＨＳ）を用いて測定した。
【００４６】
種々の濃度のγ−ＰＧＡ及びＣＳで調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の粒径及びゼータ電位値を決定し、この結果を表１ａ及び１ｂに示す。調製したナノ粒子の粒径及びゼータ電位値を、シンク溶液（ｓｉｎｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中のＣＳの周囲濃度に対する添加溶液中のγ−ＰＧＡの局所濃度の相対量によって主に決定される。ＣＳが固定濃度で、γ−ＰＧＡ濃度が増加することによって、γ−ＰＧＡ分子がより多くのＣＳ分子と相互作用することができ、従って、より大きなサイズのナノ粒子が形成された（表１ａ、ｐ＜０．０５）。
【００４７】
ＣＳ分子の量が、局所γ−ＰＧＡ分子の量を超過すると、過剰のＣＳ分子がいくつか、ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の表面上に絡む。従って、得られたナノ粒子は、正に帯電したＣＳ殻（表１ｂ）によって囲まれた中性高分子電解質複合体コアの構造を示し、コロイドの安定性を確実にする（Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２００４；２０：７７６６−７７７８）。これと対照的に、局所γ−ＰＧＡ分子の量が周囲のＣＳ分子の量を十分に超える場合は、形成したナノ粒子は、この表面上に露出したγ−ＰＧＡを有し、従って、ゼータ電位の負の電荷を有していた。従って、調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の粒径と、ゼータ電位値は、その構成された組成によって制御されることができる。ＴＥＭ及びＡＦＭ試験によって得られた結果は、調製したナノ粒子の形態が、滑らかな表面を有する球状であることを示した（図１ａ及び１ｂ）。本発明のいくつかの態様は、約５０から４００ナノメータ、好ましくは、約１００から３００ナノメータ、最も好ましくは、約１００から２００ナノメータの平均粒径を有するナノ粒子に関する。このナノ粒子の形態は、２．５から６．６のｐＨで滑らかな表面を有する球形を示す。一の実施例では、約２．５又はそれ以下の低いｐＨでの本発明のナノ粒子の安定性により、胃の中の酸性媒質に露出した場合、ナノ粒子を無傷のままとすることができる。
【００４８】
例６
【００４９】
Ｃａｃｏ−２細胞培養とＴＥＥＲ測定
【００５０】
Ｃａｃｏ−２細胞を、３×１０５ｃｅｌｌ／ｉｎｓｅｒｔの播種密度で、Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ６  ウエル／プレート（ＮＹ所在のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ社製）の組織培養表面処理ポリカーボネートフィルタ（直径２４．５ｍｍ、培養領域４．７ｃｍ２）上に播種した。２０％のＦＢＡ、１％のＮＥＡＡ、及び４０μｇ／ｍｌの抗生剤のゲンタマイシンを添加したＭＥＭ（ｐＨ７．４）を培養培地として用い、供与体及び受容体双方の区画に添加した。最初の６日間、４８時間毎に培地を交換し、その後は２４時間毎に培地を交換した。この培地を３７℃で９５％の空気と５％のＣＯ２の大気中に保存し、播種後、１８−２１日で傍細胞輸送実験に用いた（６００−８００Ωｃｍ２の範囲のＴＥＥＲ値）。
【００５１】
Ｃａｃｏ−２細胞単一層のＴＥＥＲ値を、一対のチョップスティック電極に接続したＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）−電気抵抗システム（マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ所在のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）でモニタした。輸送実験を開始するために、供与体及び受容体区画の培養培地を吸引し、予め暖めておいた輸送培地（２５ｍＭグルコース，ｐＨ６．０を添加したＨＢＳＳ）で２回洗浄処理した。３７℃の輸送培地を用いて３０分間平衡を保った後、この細胞を、３７℃で０．５ｍｌの試験ナノ粒子溶液（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの輸送培地で２時間インキュベートした。次いで、ナノ粒子の溶液を注意深く除去し、細胞をＨＢＳＳで３回洗浄し、新しい培養培地に取り替えた。ＴＥＥＲを別の２０時間測定し、Ｃａｃｏ−２細胞単一層上の試験ナノ粒子の効果の可逆性を実験した。
【００５２】
細胞間の密着結合は、巨大分子の傍細胞輸送に対する主要な障壁の１つである（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９６；３９：１３１−１３８；Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９８；５１：３５−４６）。経上皮イオン輸送は、細胞間の結合の密着性の良好な指標であると考えられており、この実験で、Ｃａｃｏ−２細胞単一層のＴＥＥＲを測定することによって評価された。ＴＥＥＲの測定を用いて、親水性分子の傍細胞輸送を予測することができることが報告された（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２００４；５８：２２５−２３５）。密着結合が開くと、ＴＥＥＲ値は、傍細胞経路を通る水及びイオン経路に起因して減少する。Ｃａｃｏ−２細胞単一層は、インビトロモデルとして巨大分子の腸管内傍細胞の浸透性を評価するのに広く用いられている。
【００５３】
Ｃａｃｏ−２細胞単一層のＴＥＥＲ値に関する調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の効果が図２に示されている。図のように、正の表面電荷で調製したナノ粒子は（表面上をＣＳが支配している、０．０１％γ−ＰＧＡ：０．０５％ＣＳ、０．１０％γ−ＰＧＡ：０．２％ＣＳ、及び０．２０％γ−ＰＧＡ：０．２０％ＣＳ）、Ｃａｃｏ−２細胞単一層のＴＥＥＲの値を有意に減少することができた（ｐ＜０．０５）。これらのナノ粒子を２時間インキュベートした後、Ｃａｃｏ−２細胞単一層のＴＥＥＲ値は、対照群（輸送培地中にナノ粒子の添加がないもの）と比較して、初期値の約５０％に減少した。このことは、表面を支配するＣＳを有するナノ粒子が、Ｃａｃｏ−２細胞間の密着結合を効果的に開いて、ＴＥＥＲ値の減少させることを表している。細胞表面上の負に帯電している部位とのＣＳの正に帯電したアミノ基の相互作用と密着結合が、Ｆ−アクチンと密着結合のタンパク質ＺＯ−１の再分布を誘発する。これは、増加した傍細胞透過性を伴う（Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００１；５０：Ｓ９１−Ｓ１０１）。キトサンと密着結合タンパク質ＺＯ−１間の相互作用が、細胞骨格に対する転位を導くことを示唆している。
【００５４】
表１ａ
調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の粒径へのγ−ＰＧＡ及びＣＳの濃度の影響
0005384831.tif 000003
ａ）Ｃｓの濃度（ｗ／ｖ）
ｂ）γ−ＰＧＡの濃度（ｗ／ｖ）
▲凝集塊の沈殿が観察された
【００５５】
表１ｂ
調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子のゼータ電位へのγ−ＰＧＡ及びＣＳの濃度の影響
0005384831.tif 000004
ａ）Ｃｓの濃度（ｗ／ｖ）
ｂ）γ−ＰＧＡの濃度（ｗ／ｖ）
▲凝集塊の沈殿が観察された
【００５６】
インキュベートしたナノ粒子の除去後に、ＴＥＥＲ値の段階的な増加に気付いた。この現象は、Ｃａｃｏ−２細胞単一層の細胞間密着結合が、徐々に回復し始めたことを示した；しかし、ＴＥＥＲ値は、初期値に回復しなかった（図２）。対照的に、負の表面電荷（表面上を占めるγ−ＰＧＡ、ＣＳ、０．１０％γ−ＰＧＡ：０．０１％ＣＳ、及び０．２０％γ−ＰＧＡ：０．０１％ＣＳ、及び０．２０％γ−ＰＧＡ：０．２０％ＣＳ、図２）を有するナノ粒子でインキュベートしたＣａｃｏ−２細胞単一層のＴＥＥＲ値は、対照群と比較して有意に大きな差を示さなかった（ｐ＞０．０５）。これは、γ−ＰＧＡが、細胞間密着結合を開くことについて効果を有さないことを示した。
【００５７】
例７
【００５８】
ｆＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子調製及びＣＬＳＭ視覚化
【００５９】
蛍光（ＦＩＴＣ）−標識化ＣＳ−γ−ＰＧＡ（ｆＣＳ−γ−ＰＧＡ）ナノ粒子を、共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）用に調製した。本発明のナノ粒子は、正に帯電したキトサンシェルによって囲まれた中性高分子電解質複合体コアの構造を示す。ＦＩＴＣ−標識化低ＭＷＣＳ（ｆＣＳ）は、文献（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００３；２０：１８１２−１８１９）で報告されているように、ＦＩＴＣのイソチオシアナート基と、ＣＳの第１級アミノ基との反応に基づいている。簡単に言えば、１５０ｍｌの無水メタノール中の１００ｍｇのＦＩＴＣを、０．１Ｍ酢酸中の１００ｍｌの１％低ＭＷ  ＣＳに加えた。周囲条件で、暗い中で３時間反応させた後に、０．５Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨを約８−９に上げることによって、ｆＣＳを沈殿させた。非結合ＦＩＴＣを取り除くために、蛍光が上澄み液に検出されなくなるまで、沈殿を洗浄して遠心分離すること（１０分間に４０，０００×ｇ）を繰り返し行った。次いで、８０ｍｌの０．１Ｍ酢酸に溶解させたｆＣＳを、毎日水を交換しながら、５リットルの蒸留水に対して暗い中で３日間透析した。結果として生じたｆＣＳを、凍結乾燥器で凍結乾燥させた。ｆＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子を、例４に記載されている手順に従って調製した。
【００６０】
次いで、ｆＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含有する輸送培地を、Ｃａｃｏ−２細胞の供与体区画内に導入した。この細胞は、１８−２１日間トランスウエルの上で前培養した。実験温度は、温度制御システム（Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ所在のＷａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製ＤＨ−３５  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ  Ｈｅａｔｅｒ）によって３７℃に維持した。特定の時間間隔でインキュベーションした後、試験サンプルを吸引した。次いで、３．７％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する前に、前洗浄ＰＢＳ溶液で２回洗浄した（Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００３；２０：１８１２−１８１９）。逆方向ＣＬＳＭ（ｉｎｖｅｒｓｅｄ  ＣＬＳＭ）（ＴＣＳ  ＳＬ，Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の下で細胞を試験した。アルゴンレーザ（４８８ｎｍで励起、５１０−５４０ｎｍの範囲で収集した発光）を用いて、蛍光画像を観察した。
【００６１】
ＣＬＳＭを用いて、Ｃａｃｏ−２細胞単一層の上へ蛍光標識化ＣＳ−γ−ＰＧＡ（ｆＣＳ−γ−ＰＧＡ）ナノ粒子の輸送を視覚化した。この非侵襲的方法によって、構造を破壊することなく、Ｃａｃｏ−２細胞単一層上へ輸送路の光学的切り出し及び画像化が可能になる（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  １９９６；３９：１３１−１３８）。
【００６２】
ナノ粒子を用いてインキュベーションした６０分後には、細胞間スペースで観察された蛍光強度はより強くなり、インキュベーション後２０分で、観察された蛍光強度より深いレベルで蛍光強度が出現した。ＴＥＥＲで確認したこれらの観察は、正の表面電荷を有するナノ粒子（表面上を占めるＣＳ）が、Ｃａｃｏ−２細胞間の密着結合を開くことができ、傍細胞経路を介した受動的拡散によってナノ粒子の輸送が可能であることを示す。より詳細なデータを、Ｓｕｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓによる論文に見出すことができる（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００５；６：１１０４−１１１２）。
【００６３】
例８
【００６４】
蛍光標識ナノ粒子でのインビボ実験
【００６５】
蛍光（ＦＩＴＣ）−標識化ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子を共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）用に調製した。ラットにｆＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子を与えた後、ラットを所定の時間に犠牲にして、腸をＣＬＳＭ試験用に取り出した。適切な時間に、ナノ粒子の蛍光画像を、十二指腸、空腸、及び回腸を含む腸管の外側面に対する内側面からの様々な深さで、マウスの腸管を貫通するＣＬＳＭによって明瞭に観察した。これは、例１２で議論される。
【００６６】
例９
【００６７】
ナノ粒子のインスリン負荷容量
【００６８】
蛍光（ＦＩＴＣ）−標識化γ−ＰＧＡを、キトサン溶液に加え、共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）評価及び生物活性分析を用いて、インビボ動物実験用の蛍光（ＦＩＴＣ）−標識、インスリン負荷ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子を調製した。ＣＳ溶液へインスリン／γ−ＰＧＡ溶液を加えて、イオンゲル化法を用いることによってインスリン負荷ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子を製造し、次いで、容器内で、磁気攪拌器で撹拌した。
【００６９】
２つのインスリン濃度を有するナノ粒子を、キトサンで０．７５ｍｇ／ｍｌから０．１６７ｍｇ／ｍｌのγ−ＰＧＡ率に対する調製する。これらの粒径及びゼータ電位を、以下の表２に示す。
【００７０】
表２
0005384831.tif 000005
（＊）インスリンのない対照参照
【００７１】
更に、インスリンの結合効率及びインスリンの負荷容量を分析して次式によって計算したものを図３及び図４に示す。
【００７２】
0005384831.tif 000006
【００７３】
0005384831.tif 000007
【００７４】
図３は、キトサンとγ−ＰＧＡのナノ粒子中の負荷容量及び結合効率を示し、図４は、参照として、キトサン単独（γ−ＰＧＡの入っていない）のナノ粒子中のインスリンの負荷容量及び結合効率を示す。このデータは、インスリン負荷容量とインスリン結合効率の双方が、コア中のγ−ＰＧＡを有するナノ粒子に対して統計的に高くなっていることを明確に示している。ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子に対するインスリンのＡＥ（４０〜５５％）とＬＣ（５．０〜１４．０％）は、γ−ＰＧＡ溶液と混合したインスリンをＣＳ溶液に加えたときに、イオンゲル化法を用いることによって得られ、次いで、ナノ粒子を分離するために磁気攪拌器で撹拌した。本発明のいくつかの態様は、コア中に負の成分（γ−ＰＧＡ、ヘパリン、又はアルギン酸等）と低分子量のキトサンを具える腸管又は血液脳傍細胞輸送を効果的に強化するナノ粒子の経口投与に関し、ここで、キトサンは、正に帯電したナノ粒子の表面上を占めている。アルギン酸は非生分解性であるが、約３０−５０ｋＤａの分子量を有するアルギン酸粒子は、腎臓不活性であることが規定されている。
【００７５】
Ｃａｌｃｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．は、経口インスリン−ＰＥＧデリバリシステムのインビボ評価を報告した（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ  ２００４；２２：３１５−３２３）。インスリン−ＰＥＧを、チオール化ポリマであるポリ（アクリル酸）−システインによって構成した粘膜接着タブレット内に形成した。治療薬は、５時間以内で、これらのタブレットから放出されるように維持された。インビボで、糖尿病のマウスに経口投与することによって、グルコースレベルが、時間が経つにつれて著しく減少することが分かった。更に、Ｋｒａｕｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．は、非糖尿病ラットについてのチオール化キトサン−インスリンタブレットの別の経口インスリンデリバリ実験を報告した（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００４，９５：５４７−５５５）。デリバリタブレットは、キトサンに共有結合した２−イミノチオランを用いて、キトサン−ＴＢＡ（キトサン−４−チオブチルアミジン）接合体を形成した。非糖尿病覚醒ラットへキトサン−ＴＢＡ−インスリンタブレットを経口投与した後、血液グルコースレベルが２４時間で著しく低下した。このことは、腸管内吸収による本明細書で現在開示されているナノ粒子の持続したインスリン放出の観察を支持するものである。Ｍｏｒｃｏｌ  ｅｔ  ａｌ．による更なる報告（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２００４；２７７：９１−９７）では、ＰＥＧ−インスリン−カゼイン−リン酸カルシウム粒子を具える経口デリバリシステムは、糖尿病ラットに経口投与後の長期の血糖低下作用を示す。
【００７６】
Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．は、２５０−４００ｎｍの粒径で、インスリン−キトサンナノ粒子を有し、０．１よりも小さい多拡散性を有し、正に帯電して安定したインビボインスリンの腸管内吸収を改善するキトサンナノ粒子（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａ  ２００２；２４９：１３９−１４７）を開示した。インスリン−キトサンナノ粒子の投与後、強化した薬理学的生物学的利用能で、低血糖が持続されることが分かった。これらのデータは、図３及び４に示されるような我々の観察を裏付けた；しかし、本発明のインスリン負荷容量及びインスリン結合効率は、コア中のγ−ＰＧＡを有するキトサン−インスリンナノ粒子に対して実質的により高い。
【００７７】
例１０
【００７８】
インスリンナノ粒子安定性
【００７９】
図５は、ＣＳ  ０．７５ｍｇ／ｍｌ、γ−ＰＧＡ  ０．１６７ｍｇ／ｍｌ、及びインスリン  ０．０８３ｍｇ／ｍｌの例示的な組成を有する本発明のインスリン負荷ナノ粒子の安定性を示す。脱イオン水に懸濁させた調製したインスリン負荷ナノ粒子は、４０日までの貯蔵期間、安定である。まず（図５に示すように）、ナノ粒子貯蔵溶液中のインスリン含有率は、およそ９．５％の一定レベルに維持する。ナノ粒子安定性は、更に、約４０日間、約２００ｎｍの実質的に一定の粒径と、約＋２８ｍＶの実質的に一定のゼータ電位から明らかである。日光、熱、大気条件等の環境効果からナノ粒子を更に分離するソフトジェル又はジェルキャップカプセル中で調製した場合、本発明のインスリン含有ナノ粒子は、その生物安定性を更に持続する。一の実施例では、容易な嚥下が可能となるように、ジェルキャップカプセルの表面に、グリセリンで、又は親水性に、更に処理されても良い。本発明のいくつかの態様は、糖尿病患者を治療又は管理するインスリンの有効量のインスリンナノ粒子の投与を含むジェルキャップピル又はカプセルを提供し、インスリン含有ナノ粒子の安定性は、少なくとも４０日間、好ましくは６月以上、最も好ましくは２年以上である。組成物が、単回投与形態で宿主に投与される場合、「有効量のインスリン」によって、十分な量のインスリンが、所望の治療的、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｔｉｃ）、又はその他の生物学的効果を与えるであろうことを意味する。
【００８０】
従って、簡便で効果的な経口投与のためには、本発明のナノ粒子の薬学的に有効な量は、ジェルカプセル等のカプセルに入れる、及び、液体溶液等に懸濁させる一又はそれ以上の賦形剤でタブレット化することができる。ナノ粒子は、非経口投与用の脱イオン溶液に懸濁させることができる。ナノ粒子を、従来の技術による摂取用のパック塊に形成することができる。例えば、ナノ粒子は、公知のカプセル化手順及び材料を用いて、「硬カプセル」又は軟カプセルとしてカプセル化することができる。カプセル化材料は、胃液内で高い溶解性を有するべきであり、その結果、カプセル摂取後に、粒子が、胃で即座に拡散する。好ましくは、カプセルやタブレットの各単位投与は、薬学的に有効な量のナノ粒子を提供する好適なサイズ及び量のナノ粒子を含む。一の実施例は、サイズＯのゼラチンカプセルである。
【００８１】
例１１
【００８２】
インビトロインスリン放出実験
【００８３】
図６は、ナノ粒子中、ＣＳ  ０．７５ｍｇ／ｍｌ、γ−ＰＧＡ  ０．１６７ｍｇ／ｍｌ、及びインスリン  ０．０８３ｍｇ／ｍｌの例示的組成を有するｐＨ感受性実験用のｐＨ調製溶液中の代表的なタンパク質薬剤（例えば、インスリン）放出プロファイルを示す。一の実施例では、例示の組成物は、次のような±１０％の濃度範囲で各成分を含む：ＣＳ  ０．７５ｍｇ／ｍｌ（０．６７から０．８３ｍｇ／ｍｌの濃度範囲）、γ−ＰＧＡ  ０．１６７ｍｇ／ｍｌ（０．１５０から０．１８４ｍｇ／ｍｌの濃度範囲）、及びインスリン  ０．０８３ｍｇ／ｍｌ（０．０７５から０．０９１ｍｇ／ｍｌの濃度範囲）。まず、インスリン負荷ナノ粒子の溶液をｐＨ２．５に調製し、３７℃、１００ｒｐｍでＤＩＳＴＥＫ−２２３０Ａ容器内で胃の環境をシミュレーションした。所定の特定の時間間隔で試料（ｎ＝５）を採取し、遊離粒子溶液（ｐａｒｔｉｃｌｅ−ｆｒｅｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、２２，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離することによって得、ＨＰＬＣによって、溶液中の遊離インスリン又は放出インスリンを分析した。試料溶液中の遊離インスリン内容物が、およそ２６％に一定するまで（図６に示す）、ｐＨを６．６に調製し、腸の入口部分をシミュレーションした。この特定の時間間隔の間の、正味放出インスリンは、約（２６％から３３％）７％である。言い換えれば、ｐＨ２．５とｐＨ６．６の双方で（溶液中の最小測定可能なインスリンによって明らかであるように）極めて安定である。
【００８４】
腸の出口部分を更にシミュレーションするために、インスリン含有ナノ粒子溶液は、ｐＨ７．４に調節される。残ったインスリン（約６７％）は、ナノ粒子から放出される。上記のように、ナノ粒子中のインスリンは、本発明のナノ粒子が外側表面のキトサン（腸壁上の選択的粘膜接着）と、正電荷（傍細胞密着結合輸送を強化する）を有するために、遊離インスリンよりも傍細胞輸送モードで腸壁に浸透するのにより効果的である。
【００８５】
本発明のいくつかの態様は、腸管内傍細胞輸送又は脳血傍細胞輸送を強化することによって特徴付けられるナノ粒子の患者への投与を提供し、各ナノ粒子は、少なくとも一の生物活性剤でできた第１成分と、負に帯電している第２成分と、低分子量のキトサンでできた第３成分とを具え、第１及び第２成分は中心部を占有し、第３成分は、ナノ粒子の表面を占めている。一の実施例では、第２成分は、γ−ＰＧＡであり、γ−ＰＧＡに対するキトサンの重量比は、０．７５から０．１６７、又はそれ以上である。γ−ＰＧＡに対して過剰のキトサンを有する調製溶液は、ナノ粒子の表面で安定化した正電荷を有するナノ粒子を生じるであろう。本発明のナノ粒子の表面電荷（ゼータ電位）は、約１５から４０ｍＶであり、好ましくは、約２５から４０ｍＶである。
【００８６】
例示の目的で、糖尿病治療用のナノ粒子の投与は、インスリンでできた第１成分、γ−ＰＧＡでできた第２成分、及び低分子量のキトサンでできた第３成分を具え、３つの成分の重量比（インスリン：γ−ＰＧＡ：ＣＳ）は、約０．０８３：０．１６７：０．７５である。図４に示すように、従来のキトサン−インスリン混合物のインスリン内容物（即ち、インスリン負荷容量）は、ＣＳ：インスリンの比０．７５：０．０４３で約７．１±０．１ｗ／ｗ％、又は、調製溶液中のＣＳ：インスリンの比０．７５：０．０４３で、約０．７±０．１ｗ／ｗ％のインスリン負荷容量である。本発明のいくつかの実施例では、インスリン負荷容量は、ナノ粒子の最小の８ｗ／ｗ％であり、好ましくは、ナノ粒子の少なくとも１４ｗ／ｗ％である。
【００８７】
例１２
【００８８】
インスリン負荷蛍光標識ナノ粒子でのインビボ実験
【００８９】
インビボ実験で、ラットに、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）のストレプトゾトシン（ＳＴＺ  ７５ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を注射して、糖尿病ラットを誘導した。ラットの尾から採取した血液を市販のグルコメータで分析して、血液グルコースを測定した。空腹時でない（ｎ＝５）通常のウィスターオスラット（Ｗｉｓｔａｒ  ｍａｌｅ  ｒａｔｓ）については、ラットの血液グルコースレベルは、１０７．２±８．１ｍｇ／ｄＬと測定されるが、糖尿病ラットの血液グルコースレベルは、４６９．７±３４．２ｍｇ／ｄＬである。この動物実験において、糖尿病ラットは、１２時間空腹にし、４つの異なる条件：（ａ）経口脱イオン水（ＤＩ）投与と；（ｂ）３０Ｕ／ｋｇの経口インスリン投与と；（ｃ）３０Ｕ／ｋｇの経口インスリン負荷粒子投与と；（ｄ）正の対照として、５Ｕ／ｋｇの皮下（ＳＣ）インスリン注射と；にした。実験中の時間中にラットの尾から血液グルコース濃度を測定した。
【００９０】
図７は、グルコース変化（低血糖指数）対インビボ動物実験の時間（ｎ＝５）を示す。８時間の時間間隔に渡って、経口ＤＩ投与と経口インスリン投与の双方についての、ベースラインの割合としてのグルコース変化は、実験測定誤差範囲内で、比較的一定である。経口投与経路からの実質的に全てのインスリンが、ラットの胃で分解されたことを示している。予想されたように、ＳＣインスリン注入経路についてのこのグルコースの減少は、非常に早い時間間隔でラットの血液中に見られ、この例示的な実験では３時間後に徐々に減り始める。この実験の最も重要な観察は、インスリン負荷ナノ粒子での経口投与経路によってもたらされる。血液グルコースは、投与後約２時間でベースラインから減り始め、実験から８時間以上で、より低いグルコースレベルで持続する。インスリン負荷ナノ粒子が、持続した、又は延期した有効モードで動物のグルコースレベルを調節することを示している。
【００９１】
本発明のいくつかの態様は、密着結合を効果的に開くように構成されている表面を占めるＣＳを有する低ＭＷ  ＣＳ及びγ−ＰＧＡを具える新規なナノ粒子システムに関する。このナノ粒子の表面は、正の表面電荷で特徴付けられている。一の実施例では、本発明のナノ粒子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質薬剤、その他の親水性高分子等を含む生物活性剤を効果的に腸管内へ送出することを可能にする。このようなポリペプチド剤は、ヒトの患者に経口投与できるあらゆる天然又は合成ポリペプチドであってよい。例示の薬剤は、限定されないが、インスリン；上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子等の増殖因子；ソマトスタチン；ソマトレム；カルシトニン；副甲状腺ホルモン；コロニィ刺激因子（ＣＳＦ）；凝固因子；腫瘍因子；インターフェロン；インターロイキン；血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、コレサイトキニン（ＣＣＫ）、ガストリン、セクレチン、等の胃腸ペプチド；エリスロポエチン；成長ホルモン及びＧＲＦ；バソプレシン；オクトレオチド；膵酵素；スーパーオキシドジスムターゼ等のジスムターゼ；甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）；甲状腺刺激ホルモン；黄体形成ホルモン；ＬＨＲＨ；ＧＨＲＨ；組織プラスミノーゲン活性剤；マクロファージ活性剤；絨毛性ゴナドトロピン；ヘパリン；心房性ナトリウム利尿ペプチド；ヘモグロビン；レトロウイルスベクター；レラキシン；シクロスポリン；オキシトシン；ワクチン；モノクローナル抗体；等；及びこれらの化合物の類似物及び誘導体を含む。本発明の生物活性剤は、オキシトシン、バソプレシン、副腎皮質刺激ホルモン、プロラクチン、ルリベリン又は黄体形成ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、ソマトスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガストリン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン、エンドルフィン、アンジオテンシン、レニン、ブラジキニン、バシトラシン、ポリミキシン、コリスチン、チロシジン、グラミシジン、及びこれらの合成類似体、これらの修飾剤及び薬理活性フラグメント、モノクローナル抗体、及び可溶性ワクチンから成る群より選択されてよい。一の実施例では、生物活性剤は、幹細胞を具える。
【００９２】
別の実施例では、本発明のナノ粒子は、血脳障壁及び／又は胃腸障壁を越える生物活性剤の吸収が増加する。更なる別の実施例では、生物活性剤及びナノ粒子が２成分系で経口投与される、又は実質的に同時に経口投与される場合に、外側の層及び表面正電荷にキトサンを有するナノ粒子は、投与した生物活性剤の傍細胞薬物（生物活性剤）輸送を強化するエンハンサとして働く。
【００９３】
本発明のいくつかの態様は、γ−ＰＧＡ及びキトサンを具えるナノ粒子を投与するステップを具える患者に少なくとも一の生物活性剤をデリバリするように構成され、適合された背物活性剤の腸管内又は血脳傍細胞輸送を強化する方法に関し、このナノ粒子は、治療上有効な量又は投与量の少なくとも一の生物活性剤で満ちている。本発明のナノ粒子は、ペプチド及びタンパク質薬剤及びその他の大きな親水性分子用の効果的な腸管内デリバリシステムである。更なる実施例では、生物活性剤は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、抗生剤、及び抗炎症剤から成る群より選択される。更なる実施例では、生物活性剤は、カルシトニン、シクロスポリン、インスリン、オキシトシン、チロシン、エンケファリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、バソプレシン及びバソプレシン類似体、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、インターロイキン−ＩＩ（ＩＬ２）、インターフェロン、コロニィ刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、及びメラニン細胞刺激ホルモンから成る群より選択される。更なる実施例では、生物活性剤は、アルツハイマー拮抗剤である。
【００９４】
２００４年８月１１日に出願された米国特許出願第１０／９１６，１７０号である同時係属出願では、生物組織内のリシン、ヒドロキシリシン、又はアルギニン残渣の遊離アミノ基を有する生体材料が、架橋剤であるゲニピンと架橋することができることが開示されている（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９９；２０：１７５９−７２）。また、架橋可能な生体材料は、架橋剤で、又は紫外線の照射等の光で架橋することができ、この架橋可能な生体材料は、コラーゲン、ゼラチン、エラスチン、キトサン、ＮＯＣＣ（Ｎ，Ｏ，カルボキシルメチルキトサン）、フィブリン接着剤、生物学的シーラント等から成る群より選択される。更に、架橋剤は、ゲニピン、その誘導体、類似体（例えば、アグリコン型ゲニポシド酸）、立体異性体、及びこれらの混合物から成る群より選択することが開示されている。一の実施例では、架橋剤は、更に、エポキシ化合物、酸化デンプン（ｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｔａｒｃｈ）、グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、スベルイミノ酸ジメチル、カルボジイミド、スクシンイミジル類、ジイソシアナート類、アシルアジド、ロイテリン、紫外線の放射、デヒドロサーマル処理（ｄｅｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン、アスコルビン酸銅、グルコース−リシン、及び光酸化剤（ｐｈｏｔｏ−ｏｘｉｄｉｚｅｒｓ）等から成る群より選択される。一の実施例では、架橋可能な生体材料を具えるナノ粒子は、例えば、生体材料の架橋可能な成分の架橋の約５０％程又はそれ以上、好ましくは、約１から約２０％程まで架橋され、生体材料の持続性生分解、及び／又は持続性薬物放出を可能にする。
【００９５】
メチル、アルキル（例えば、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、等）を有するキトサン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はヘパリンをグラフトする等、キトサン構造を変性して、その電荷特性を変えることによって、ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子の表面電荷密度（ゼータ電位）は、ｐＨ耐性、又は親水性をより大きくすることができる。一の実施例では、このキトサンは、ポリアクリル酸、又は化学式：
0005384831.tif 000008
を有するポリマでグラフトされる。
【００９６】
例示の目的で、塩化トリメチルキトサンを用いて、ｐＨ２．５より低いｐＨ、好ましくは、１．０程度の低いｐＨで、その球形生物安定性を維持するために、ＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子を形成する。本発明のいくつかの態様は、ｐＨ２．５よりも低いｐＨ、好ましくは、１．０程度の低いｐＨで、生物安定性を強化する生体適合性薬物担体として、ゲニピン又はその他の架橋剤で架橋された薬物負荷キトサン含有生体材料を提供する。
【００９７】
本発明は、これらのいくつかの実施例の特定の詳細を参照して記載されているが、添付の特許請求の範囲に含まれることを除いて、及び含まれる程度まで、本発明の範囲の限定として見なされることを意図していない。多くの改良例及び変型例が、上記の開示を考慮して可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
本発明の追加の目的及び特徴は、添付の図を参照して読むとより明確になり、この開示自体が、次の例示の実施例の詳細な説明から最も良く理解されるであろう。
【００９９】
【図１ａ】図１ａは、調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子（０．１０％γ−ＰＧＡ：０．２０％ＣＳ）のＴＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子（０．０１％γ−ＰＧＡ：０．０１％ＣＳ）のＡＦＭ顕微鏡写真を示す。
【図２】図２は、調製したＣＳ−γ−ＰＧＡナノ粒子がＣａｃｏ−２細胞単一層のＴＥＥＲ値に及ぼす影響を示す。
【図３】図３は、キトサン及びγ−ＰＧＡのナノ粒子中のインスリンの負荷容量及び結合効率を示す。
【図４】図４は、参照としてキトサンのナノ粒子中のインスリンの負荷容量及び結合効率を示す。
【図５】図５は、インスリン負荷ナノ粒子の安定性を示す。
【図６】図６は、ｐＨ調製溶液のインスリン放出プロファイルを有する典型的なインビトロ実験を示す。
【図７】図７は、糖尿病ラットに経口投与したインスリン負荷ナノ粒子のインスリンの生物利用能を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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