(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを溶媒に溶解させたポリペプチドの溶液であって、
前記溶媒は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とするポリペプチドの溶液。
（ｉ）  ジメチルスルホキシド
（ｉｉ）  ジメチルスルホキシドに無機塩を加えたもの
（ｉｉｉ）  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに無機塩を加えたもの
【請求項２】
前記ポリペプチドの溶液を１００質量％としたとき、ポリペプチドの割合が３〜４５質量％の範囲である請求項１に記載のポリペプチドの溶液。
【請求項３】
前記溶媒を１００質量％としたとき、無機塩の割合が０．１〜２０質量％の範囲である請求項１又は２に記載のポリペプチドの溶液。
【請求項４】
前記溶媒を１００質量％としたとき、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれる物質の割合が２２質量％以上１００質量％以下であり、残余はアルコールを含む請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの溶液。
【請求項５】
前記溶媒を１００質量％としたとき、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選ばれる物質の割合が１０質量％以上１００質量％以下であり、残余は水を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドの溶液。
【請求項６】
前記無機塩が、アルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩及びチオシアン酸塩から選ばれる少なくとも一つである請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドの溶液。
【請求項７】
前記ポリペプチドの溶液は、ドープ液である請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの溶液。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの溶液を使用した人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、
前記ポリペプチドの溶液をドープ液とし、
前記ドープ液を口金から脱溶媒槽の凝固液に押し出し、前記ドープ液から溶媒を脱離させるとともに繊維形成して未延伸糸とし、人造ポリペプチド繊維を得ることを特徴とする人造ポリペプチド繊維の製造方法。
【請求項９】
さらに前記未延伸糸を延伸する工程を含む請求項８に記載の人造ポリペプチド繊維の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの溶液を使用したポリペプチドの精製方法であって、
前記ポリペプチドの溶液を熱処理した後、不溶物を除去することを特徴とするポリペプチドの精製方法。
【請求項１１】
前記天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドは、不溶性である請求項１０に記載のポリペプチドの精製方法。
【請求項１２】
前記熱処理は、４５〜１００℃で行う請求項１０又は１１に記載のポリペプチドの精製方法。
【請求項１３】
前記不溶物の除去は、濾過による分離又は遠心分離により行う請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のポリペプチドの精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリペプチドを特定の溶媒に溶解したポリペプチドの溶液とこれを用いた人造ポリペプチド繊維の製造方法及びポリペプチドの精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クモ糸繊維は、強度と伸縮性を兼ね備えた繊維であり、高張力鋼、ナイロン（登録商標）６繊維などよりも高いタフネスを有することが知られている。加えて、石油を原料とせず、原料をバイオマス化できる利点もある。人工クモ糸繊維もいくつか提案されており、例えば特許文献１には天然クモ糸タンパク質を由来とする合成タンパク質をヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）で溶解させた溶液を紡糸液とし、これを湿式紡糸することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００４−５０３２０４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の天然クモ糸タンパク質を由来とする人造ポリペプチドに使用する溶媒は、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）のように高価であったり、安全性に問題があった。【０００５】
本発明は、前記従来の問題を解決するため、媒質の溶解性が高く、沸点が水よりも高くて高温溶解が可能であり、安全性も高く、溶媒自体のコストが安いポリペプチドの溶液とこれを用いた人造ポリペプチド繊維の製造方法及びポリペプチドの精製方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明のポリペプチドの溶液は、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを溶媒に溶解させたポリペプチドの溶液であって、前記溶媒は、下記(i)〜(iii)から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とする。
(i) ジメチルスルホキシド
(ii) ジメチルスルホキシドに無機塩を加えたもの
(iii) Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに無機塩を加えたもの【０００７】
本発明の人造ポリペプチド繊維の製造方法は、前記のポリペプチドの溶液を使用した人造ポリペプチド繊維の製造方法であって、前記ポリペプチドの溶液をドープ液とし、前記ドープ液を口金から脱溶媒槽の凝固液に押し出し、前記ドープ液から溶媒を脱離させるとともに繊維形成して未延伸糸とし、人造ポリペプチド繊維を得ることを特徴とする。【０００８】
本発明のポリペプチドの精製方法は、前記のポリペプチドの溶液を使用したポリペプチドの精製方法であって、ポリペプチドの溶液を熱処理した後、不溶物を除去することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のポリペプチドの溶液は、天然クモ糸タンパク質(spider silk proteins)由来のポリペプチド（以下「媒質」ともいう。）を溶媒に溶解させた溶液であって、溶媒は、前記(i)〜(iii)から選ばれる少なくとも一つを含むことにより、媒質の溶解性が高く、沸点が高くて高温溶解が可能であり、安全性も高く、溶媒自体のコストを安くすることができる。媒質の溶解性が高く、高い濃度で溶解できれば、このポリペプチドの溶液をドープ液として用いることにより繊維やフィルムの生産効率を上げることができる。高温溶解が可能であると、ドープ液調整作業を効率化でき、さらに、沸点が水より高ければ、脱水縮合反応をする際の重合溶媒としても使用できる。安全性が高いと、生産作業性を上げられるほか、用途展開も広げられる。さらに可紡性もあり、湿式紡糸、キャストフィルム等にも有用である。また、ポリペプチドの溶液を用いて、簡便にポリペプチドを精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は本発明の一実施例における製造装置を示す説明図である。
【図２】図２Ａ−Ｂは本発明の別の実施例における製造装置を示す説明図であり、図２Ａは紡糸装置−１段目延伸装置、図２Ｂは２段目延伸装置を示す。
【図３】図３は本発明のさらに別の実施例における製造装置を示す説明図である。
【図４】図４Ａ−Ｂは本発明のさらに別の実施例における製造装置を示す説明図であり、図４Ａは紡糸装置、図４Ｂは延伸装置を示す。
【図５】図５は本発明の実施例２で得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図６】図６は本発明の実施例３で得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図７】図７は本発明の実施例４で得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図８】図８は本発明の実施例５で得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図９】図９は本発明の実施例６で得られた延伸糸の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図１０】図１０は本発明の実施例７で得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図１１】図１１は本発明の実施例８で得られた一次延伸糸における単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図１２】図１２は本発明の実施例８で得られた二次延伸糸における単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線である。
【図１３】図１３は本発明の実施例９で得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す写真である。
【図１４】図１４は本発明の実施例１０で得られたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．溶媒
（１）極性溶媒の選択
本発明者らは、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを溶解させてポリペプチドの溶液を得るには、どのような溶媒が適切かを検討した。主として極性溶媒を選んで溶解実験を行った結果、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示す物質を含む溶媒であれば、選択的に溶解度が高く、高温溶解が可能であることがわかった。ポリペプチドの溶液を１００質量％としたとき、媒質の濃度（溶解度）は３質量％（ｗ／ｖ％）以上であることが好ましく、より好ましくは１５質量％以上であり、さらに好ましくは４０質量％以上である。また、媒質の濃度は４５質量％以下であることが好ましい。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は融点１８．４℃、沸点１８９℃、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は融点−６１℃、沸点１５３℃であり、従来法で使用されているヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の沸点５９℃、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）の沸点−２６．５℃に比べると、ＤＭＳＯ及びＤＭＦの沸点ははるかに高い。また、ＤＭＳＯ及びＤＭＦは、一般産業分野においてもアクリル繊維の重合、紡糸液などに使用され、ポリイミドの重合溶媒としても使用されていることから、コストも安く安全性も確認されている物質である。
【００１２】
（２）溶解促進剤
ＤＭＳＯ又はＤＭＦに無機塩を加えると、さらに媒質の溶解度が上がるため好ましい。無機塩は、好ましくは、アルカリ金属ハロゲン化物（例えばＬｉＣｌ，ＬｉＢｒなど）、アルカリ土類金属ハロゲン化物（例えばＣａＣｌ２など）、アルカリ土類金属硝酸塩（例えばＣａ（ＮＯ３）２など）、チオシアン酸塩（例えばＮａＳＣＮなど）から選ばれる少なくとも一つである。溶媒を１００質量％としたとき、無機塩の割合は０．１〜２０質量％の範囲が好ましい。
【００１３】
（３）溶媒の純度、添加物
溶媒は、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示す物質に加えて、アルコール及び／又は水を含んでもよい。
【００１４】
溶媒を１００質量％としたとき、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示す物質の割合が２２質量％以上１００質量％以下であり、残余はアルコールを含んでもよい。前記においてアルコールとは炭素数１〜６の低級アルコールが好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール及び２−プロパノールからなる群から選ばれる一種以上である。水を含む場合は、溶媒を１００質量％としたとき、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示す物質の割合が１０質量％以上１００質量％以下であり、残余は水でもよい。水とアルコールを混合してもよい。
【００１５】
２．ポリペプチド
本発明においては、ポリペプチドとしては例えば天然型クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドを用いる。前記ポリペプチドは、天然型クモ糸タンパク質に由来するものであればよく、特に限定されず、天然型クモ糸タンパク質や組換えクモ糸タンパク質、例えば天然型クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。前記ポリペプチドは、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状線で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状線スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大吐糸管しおり糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などを含む。また、前記ポリペプチドは、クモの鞭毛状線（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質に由来するポリペプチドであっても良い。前記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ）などが挙げられる。
【００１６】
前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上含むポリペプチドが挙げられる。或いは、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。なお、前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドにおいて、式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。上記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。
【００１７】
前記式１において、ＲＥＰ１は、ポリアラニンを意味している。前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１２残基以下であり、特に好ましくは１０残基以下である。前記式１において、ＲＥＰ２は、１０〜２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上である。
【００１８】
大吐糸管しおり糸において、前記ＲＥＰ１は、繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、前記ＲＥＰ２は、繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、前記［ＲＥＰ１−ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
【００１９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。
【００２０】
前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、例えば、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Human rhinovirus 3Cプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）において、第１〜１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、Ｃ末端配列は、配列番号３に示すアミノ酸配列と同一である。
【００２１】
また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１〜３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、配列番号８に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するタンパク質を用いることができる。本発明において、「１若しくは複数個」とは、例えば、１〜４０個、１〜３５個、１〜３０個、１〜２５個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、又は１若しくは数個を意味する。また、本発明において、「１若しくは数個」は、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個を意味する。
【００２２】
また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１５に示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ４由来の組換えタンパク質が挙げられる。配列番号１５に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したものである。また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１５に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１７に示されているアミノ酸配列を有するＭａＳｐ２由来の組換えタンパク質が挙げられる。配列番号１７に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＭａＳｐ２の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＴ７５３１３、ＧＩ：５０３６３１４７）のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したものである。また、前記式１：ＲＥＰ１−ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むポリペプチドとしては、配列番号１７に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。
【００２３】
前記横糸タンパク質に由来するポリペプチドとしては、式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上、好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上含むポリペプチドが挙げられる。前記横糸タンパク質に由来するポリペプチドは、大腸菌等の微生物を宿主とした組み換えタンパク質生産を行う場合、生産性の観点から、分子量が５００ｋＤａ以下であることが好ましく、より好ましくは３００ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは２００ｋＤａ以下である。
【００２４】
前記式（２）において、ＲＥＰ３はＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｘから構成されるアミノ酸配列を意味し、ＸはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸を意味する。
【００２５】
クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。
【００２６】
前記式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上含むポリペプチドとしては、例えば、配列番号１９に示されているアミノ酸配列を有する鞭毛状絹タンパク質に由来の組換えタンパク質が挙げられる。配列番号１９に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分的な配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）のリピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）と、ＮＣＢＩデータベースから入手したアメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）のＣ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列を結合し、結合した配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したアミノ酸配列である。また、前記式２：ＲＥＰ３（２）で示されるアミノ酸配列の単位を１０以上含むポリペプチドとしては、配列番号１９に示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、無定形領域からなる繰り返し領域を有するポリペプチドを用いてもよい。
【００２７】
前記ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  ｐｌｕｓ  １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。
【００２８】
上記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。上記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。上記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
【００２９】
本発明で使用するポリペプチドは、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３由来のポリペプチドであることが好ましい。このポリペプチドは強伸度及びタフネスが基本的に高く、合成し易いことも利点として挙げられる。
【００３０】
３．ポリペプチドの溶液
（１）ポリペプチドの溶液の調製
ポリペプチドの溶液は、前記ポリペプチドに溶媒を加えて調製する。溶媒は、前記(i)〜(iii)に示す物質を含む。或いは、溶媒は、前記(i)〜(iii)に示す物質に加え、水及び／又はアルコールを含む。前記ポリペプチドの溶液は、ドープ液として用いることができる。ドープ液は湿式紡糸、キャストフィルム液などに有用である。ドープ液は、ポリペプチドの溶液の粘度を、紡糸できる粘度に調整して作製する。例えばポリペプチドの溶液の粘度を１００〜１０，０００ｃＰ（センチポイズ）とし、ドープ液を得る。ポリペプチドの溶液の粘度の調整は、例えば溶液中のポリペプチドの濃度を調整することで行うことができる。ポリペプチドの溶液の粘度は、例えば京都電子工業社製の商品名“ＥＭＳ粘度計”を使用して測定する。なお、本発明のポリペプチドの溶液は、不可避的な含有成分、例えばポリペプチドに含まれている夾雑物などを含んでも良い。
【００３１】
（２）ポリペプチドの溶液を用いたポリペプチドの重合
本発明のドープ液の沸点は、水よりも高温であるため、溶液中で脱水縮合反応を行なうことに適している。例えば、湿式紡糸、キャストフィルム等に使用する前に、ポリペプチドの溶液に溶解しているポリペプチドを脱水縮合により重合することで、ポリペプチドを高分子化することが可能であり、得られる繊維やフィルムを高強力化、高タフネス化することもできる。前記ポリペプチドに前記(i)〜(iii)に示す物質を含む溶媒を加え、１００℃以上に加熱することで、ポリペプチド同士の脱水縮合が起こり、重合することができる。その際、還流条件、減圧条件、真空条件等で反応を行なうことで、重合効率を高めることもできる。また、公知の脱水縮合触媒を併用することで、重合効率を飛躍的に高めることもできる。ポリペプチドの溶液を用いて脱水縮合反応による重合を行なう場合、ポリペプチド分子末端のＮＨ２基と、別のポリペプチド分子末端のＣＯＯＨ基が脱水縮合し、ポリペプチド主鎖が伸長することが望ましいため、使用するポリペプチドの側鎖に官能基（ＮＨ２基、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基、ＳＨ基）が少なければ少ない方が良く、使用するポリペプチドの側鎖に官能基が無いことが最も好ましい。これら官能基の数は、使用するアミノ酸の割合を調整することで行なうことができる。このように重合反応を行なったポリペプチドの溶液は、そのまま、若しくは、適宜前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）に示す物質、エチルアルコール、メチルアルコール、水等を加えて希釈を行い、湿式紡糸、キャストフィルムの作製に用いることができる。
【００３２】
４．湿式紡糸−延伸
（１）湿式紡糸
紡糸は湿式紡糸を採用する。これにより、ドープ液からポリマーを溶解させた溶媒を除去し（脱溶媒又は凝固ともいう）、繊維形成して未延伸糸を得る。湿式紡糸に使用する凝固液は、脱溶媒できる溶液であればどのようなものでも良い。溶媒を脱離し、繊維形成させるための凝固液はメタノール、エタノール、２−プロパノールなどの炭素数１〜５の低級アルコール又はアセトンを使用するのが好ましい。適宜水を加えても良い。凝固液の温度は５〜３０℃が好ましい。前記の範囲であれば紡糸は安定する。前記紡糸液を紡糸口金（口金）から脱溶媒槽の凝固液に押し出すことにより、未延伸糸が得られる。直径０．１〜０．６ｍｍのノズルを有するシリンジポンプの場合、押し出し速度は１ホール当たり、０．２〜６．０ｍｌ／ｈが好ましい。さらに好ましい押し出し速度は１ホール当たり、１．４〜４．０ｍｌ／ｈである。この範囲であれば紡糸は安定する。脱溶媒槽（凝固液槽）の長さは２００〜５００ｍｍ、未延伸糸の引き取り速度は１〜１４ｍ／ｍｉｎ、滞留時間は０．０１〜０．１５ｍｉｎが好ましい。より好ましい未延伸糸の引き取り速度は、１〜３ｍ／ｍｉｎである。この範囲であれば脱溶媒が効率よくできる。凝固液において延伸（前延伸）をしても良いが、低級アルコールの蒸発を考えると凝固液を低温に維持し、未延伸糸の状態で引き取るのが好ましい。
【００３３】
（２）延伸
延伸は一段延伸でもよいし、２段以上の多段延伸でもよい。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、どちらかというと分子が配向し難いため、多段で延伸すると、分子を多段で配向させ、トータル延伸倍率も高くすることができるため、結果としてタフネスの高い繊維が得られる。
【００３４】
図１〜２は多段延伸の例であり、図１は紡糸と延伸の連続工程を示している。紡糸延伸装置１０は、押し出し装置１と、未延伸糸製造装置２と、湿熱延伸装置３と、乾熱延伸装置４を含む。紡糸液６は貯槽７に貯蔵され、ギアポンプ８により口金９から押し出す。ラボスケールにおいては、紡糸液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出しても良い。押し出された紡糸液は、エアギャップ１９を有するか又は直接、凝固液槽２０の凝固液１１内に供給し、溶媒を除去する。次いで延伸浴槽２１内の温水１２内に供給し、１段目延伸する。延伸倍率は供給ニップローラ１３と引き取りニップローラ１４との速度比によって決まる。次いで乾熱延伸装置１７に供給し、糸道２２内で２段目延伸し、巻糸体５とする。延伸倍率は供給ニップローラ１５と引き取りニップローラ１６との速度比によって決まる。１８ａ〜１８ｆは糸ガイドである。
【００３５】
図２Ａ−Ｂは２段延伸の例である。図２Ａは紡糸装置３０及び１段目延伸装置４０、図２Ｂは２段目延伸装置５０を示す。それぞれの装置ごとに糸を巻き取るか又は巻き取らずに容器に溜めてもよい。紡糸装置３０においては、マイクロシリンジ３１内に紡糸液３２を入れておき、シリンジポンプを用いて矢印Ｐ方向に移動させ、ノズル３３から紡糸液３２を押し出し、凝固液槽３４内の凝固液３５に供給し、未延伸糸３６とする。続いて１段目延伸装置４０においては、未延伸糸３６を延伸浴槽３７内の温水３８内に供給し、１段目延伸し、１段目延伸糸の巻糸体３９とする。延伸倍率は供給ニップローラ４１と引き取りニップローラ４２との速度比によって決まる。次いで巻糸体３９から１段目延伸糸を引き出し、乾熱延伸装置４３に供給し、糸道４７内で２段目延伸する。延伸倍率は供給ニップローラ４５と引き取りニップローラ４６との速度比によって決まる。次いで延伸糸を巻糸体４４に巻き取る。
【００３６】
図３〜４は一段延伸の例であり、図３は紡糸と延伸の連続工程を示している。紡糸延伸装置６０は、押し出し装置６１と、未延伸糸製造装置６２と、乾熱延伸装置６３を含む。紡糸液６６は貯槽６７に貯蔵され、ギアポンプ６８により口金６９から押し出す。ラボスケールにおいては、紡糸液をシリンダーに充填し、シリンジポンプを用いてノズルから押し出しても良い。押し出された紡糸液は、エアギャップ７３を有するか又は直接、凝固液槽７２の凝固液７１内に供給し、溶媒を除去する。次いで乾熱延伸装置７７に供給し、糸道７８内で延伸し、巻糸体６４とする。延伸倍率は供給ニップローラ７５と引き取りニップローラ７６との速度比によって決まる。７４ａ〜７４ｆは糸ガイドである。
【００３７】
図４Ａ−Ｂは紡糸と延伸を分離した例の説明図である。図４Ａは紡糸装置８０、図４Ｂは延伸装置９０を示す。それぞれの装置ごとに糸を巻き取るか又は巻き取らずに容器に溜めてもよい。紡糸装置８０においては、マイクロシリンジ８１内に紡糸液８２を入れておき、シリンジポンプを用いて矢印Ｐ方向に移動させ、ノズル８３から紡糸液８２を押し出し、凝固液槽８４内の凝固液８５に供給し、未延伸糸の巻糸体８６とする。次に、延伸装置９０においては、巻糸体８６から未延伸糸を引き出し、乾熱延伸装置８９に供給し、糸道９１内で延伸する。延伸倍率は供給ニップローラ８７と引き取りニップローラ８８との速度比によって決まる。次いで延伸糸を巻糸体９２に巻き取る。これにより延伸糸を得る。
【００３８】
湿式紡糸−延伸で得られる人造ポリペプチド繊維は、直径が５〜１００μｍの範囲であることが好ましい。前記の範囲であれば安定して繊維を得ることができる。より好ましい繊維直径は８〜５０μｍの範囲、さらに好ましくは１０〜３０μｍの範囲である。湿式紡糸−延伸で得られる人造ポリペプチド繊維は、断面が円形とは限らず様々な形状を含むため、断面を円形と想定した場合の平均径をいう。
【００３９】
５．キャストフィルム
本発明のポリペプチドの溶液はドープ溶液としてキャストフィルムにすることもできる。例えばガラス板のようなドープ液中の溶媒に耐性のある平板にドープ液を所定の厚さにキャストし、前記キャスト膜から溶媒を脱離させて人造ポリペプチドフィルムを得る。ドープ液を所定の厚さにキャストするには、ドクターコート、ナイフコーターなどの冶具を用いて数ミクロン以上の厚さにキャストし、その後減圧乾燥又は脱溶媒槽への浸漬により溶媒を脱離することにより得る。
【００４０】
６．架橋
本発明の人造ポリペプチド繊維又はフィルムは、ポリペプチド分子間を化学的に架橋させてもよい。ポリペプチドの架橋に使える官能基は例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシ基等があるが、これに限定されるものではない。ポリペプチドに含まれるリジン側鎖のアミノ基は、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基と脱水縮合によりアミド結合で架橋できる。架橋は真空加熱下で脱水縮合反応を行なっても良いし、カルボジイミド等の脱水縮合剤により架橋させても良い。また、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いても良い。また、トランスグルタミナーゼ等の酵素により架橋することもできる。一例として、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、多官能エポキシ樹脂（一例としてナガゼケムテック社製、商品名「デナコール」）等の架橋剤で架橋反応させても良い。カルボジイミドは一般式Ｒ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ２（但し、Ｒ１，Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル基、シクロアルキル基を含む有機基を示す。）で示され、具体的化合物は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）などがある。この中でもＥＤＣ、ＤＩＣはペプチド鎖のアミド結合形成能が高く、架橋反応し易いことから好ましい。架橋処理は、ドープ液中に架橋剤を加えて架橋しても良いし、延伸糸に架橋剤を付与して真空熱乾燥で架橋しても良い。架橋剤は１００％品を繊維に付与しても良いし、炭素数１〜５の低級アルコールや緩衝液などで希釈して０．００５〜１０質量％の濃度で繊維に付与しても良い。処理条件は、温度２０〜４５℃で３〜４２時間が好ましい。架橋剤による架橋処理により、人造ポリペプチド延伸繊維の強度、タフネス、耐薬品性等を上げることができる。
【００４１】
７．ポリペプチドの精製方法
前記ポリペプチドの溶液を用いて、ポリペプチドを精製することができる。特にポリペプチドが不溶性のタンパク質である場合効果が高い。本発明において、「不溶性のタンパク質」とは、水不溶性のタンパク質即ち疎水性の高いタンパク質を意味する。具体的には、前記天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドに前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの物質を含む溶媒を添加し、熱処理して溶解させた後、上清を回収し、ポリペプチドの溶液とする。前記熱処理の条件は、不溶性のタンパク質を溶解できかつタンパク質を分解させない条件であればよく、特に限定されない。例えば、熱処理の温度は、溶解性の観点から、４５℃以上であることが好ましく、５０℃以上であることがより好ましい。また、分解を抑制するという観点から、熱処理の温度は、１００℃以下であることが好ましく、９５℃以下であることがより好ましい。また、熱処理の時間は、例えば、１５〜３００分間であることが好ましく、より好ましくは、３０〜１８０分間である。また、前記上清の回収は、沈降物を分離できればよく、特に限定されないが、取扱いの簡便性から、濾過による分離又は遠心分離により行うことが好ましい。濾過による分離は、例えば、ろ紙、ろ過膜などを用いて行うことができる。遠心分離の条件は、特に限定されず、例えば、１１０００×ｇで５分間行うことができる。
【００４２】
前記天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドが組換えクモ糸タンパク質である場合は、より精製度を高めるという観点から、前記溶媒を添加する前に、組換えクモ糸タンパク質を陰イオン界面活性剤、例えばＳＤＳで洗浄することが好ましい。具体的には、組換えクモ糸タンパク質を発現している宿主細胞を破砕して、組換えクモ糸タンパク質を含む不溶性のタンパク質画分を沈殿物として抽出し、抽出した組換えクモ糸タンパク質を含む不溶性のタンパク質を陰イオン界面活性剤で洗浄する。
【００４３】
上述したとおり、天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチドを前記溶媒に溶解させたポリペプチドの溶液は、ドープ液として用いることができるため、上記ポリペプチドの精製方法で精製して得られたポリペプチドの溶液は、凍結乾燥により粉末にする必要がなく、そのままドープ液として用いることができる。
【実施例】
【００４４】
以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。【００４５】
（組換えクモ糸タンパク質）
＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグおよびＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ  ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなる（配列番号５）を付加したアミノ酸配列（配列番号６）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成受託した。その結果、配列番号７で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。【００４６】
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号１１）とＲｅｐ  Ｘｂａ  Ｉプライマー（配列番号１２）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ  Ｉ及びＸｂａ  Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ  Ｉ  Ｒｅｐプライマー（配列番号１４）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１３）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列にける３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６  ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号９に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号４で示すとおりである。【００４７】
（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号４）における第１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号１０に示すＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号８で示すとおりである。【００４８】
（４）ＡＤＦ４Ｋａｉの遺伝子の合成
ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ４の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベース（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１１、ＧＩ：１２６３２８９）より取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したアミノ酸配列（配列番号１５）からなるタンパク質ＡＤＦ４Ｋａｉをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１６に示す塩基配列からなるＡＤＦ４Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＡＤＦ４Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００４９】
（５）ＭａＳｐ２＿Ｎの遺伝子の合成
アメリカジョロウグモの大瓶状線スピドロイン（ＭａＳｐ２）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベース（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＴ７５３１３、ＧＩ：５０３６３１４７）より取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したアミノ酸配列（配列番号１７）からなるタンパク質ＭａＳｐ２_Ｎをコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号１８に示す塩基配列からなるＭａＳｐ２_Ｎの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、ＭａＳｐ２＿Ｎの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００５０】
（６）Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２の遺伝子の合成
アメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ３６０９０、ＧＩ：７１０６２２４）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、リピート部分及びモチーフに該当するＮ末端から１２２０残基目から１６５９残基目までのアミノ酸配列（ＰＲ１配列と記す。）を抽出した。また、アメリカジョロウグモの鞭毛状絹タンパク質の部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３８８４７、ＧＩ：２８３３６４９）をＮＣＢＩのウェブデータベースから入手し、Ｃ末端から８１６残基目から９０７残基目までのＣ末端アミノ酸配列（Ｃ末ＮＲと記す。）を抽出した。ＰＲ１配列とＣ末ＮＲを結合した配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したアミノ酸配列（配列番号１９）からなるタンパク質Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２をコードする遺伝子を合成した。その結果、配列番号２０に示す塩基配列からなるＦｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２の遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ  Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ  Ｉサイト有り）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ  Ｉ及びＥｃｏＲ  Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換え、Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２の遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを得た。【００５１】
＜タンパク質の発現＞
上記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター、ＡＤＦ４Ｋａｉの遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター、ＭａＳｐ２_Ｎの遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター、Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍＬのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍＬと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル−β−チオガラクトビラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１は約１０１．１ｋＤａ、ＡＤＦ４Ｋａｉは約３７．７ｋＤａ、ＭａＳｐ２_Ｎは約３１．７ｋＤａ、Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２は約４６．６ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌、ＡＤＦ４Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌、ＭａＳｐ２_Ｎのタンパク質発現している大腸菌、及びＦｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２のタンパク質を発現している大腸菌を冷凍庫（−２０℃）で保存した。【００５２】
（実施例１）
（１）使用タンパク質
（Ｉ）遠沈管（５０ｍｌ）にＡＤＦ３ＫａｉーＬａｒｇｅーＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍｌを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ−０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（II）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍｌ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。
（III）遠心分離で得られた沈殿物に緩衝液ＡＩを３０ｍＬ加え、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック  ウルトラタラックス」、レベル２）で３分間分散させた後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を除去した。
（IV）上清を捨てた遠沈管に７．５Ｍの尿素緩衝液Ｉ（７．５Ｍ  尿素、１０ｍＭ  リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を加え、上記ＳＭＴ社製の超音波破砕機（レベル７）で沈殿を良く分散させた。その後、上記タイテック社製のシェイカー（２００ｒｐｍ、６０℃）で１２０分間溶解させた。溶解後のタンパク質溶液を上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ３ＫａｉーＬａｒｇｅーＮＲＳＨ１（約１０１．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３ＫａｉーＬａｒｇｅーＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。【００５３】
２．溶媒
(1)極性溶媒
溶媒は、アクリル繊維の重合、紡糸液用、ポリイミドの重合溶媒として使用されている極性溶媒を中心に検討した。
ＤＭＡ：Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
ＤＭＦ:Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＩ:１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン
ＮＭＰ：Ｎ−メチル−２−ピロリドン
ＨＦＩＰ：ヘキサフルオロイソプロパノール
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
蟻酸
炭酸ブチレン
炭酸プロピレン
γ−ブチロラクトン
ヘキサメチルホスホルアミド
(2) 溶解促進剤（無機塩）
下記の無機塩を検討した。
アルカリ金属ハロゲン化物：ＬｉＣｌ，ＬｉＢｒ
アルカリ土類金属ハロゲン化物：ＣａＣｌ２
アルカリ土類金属硝酸塩：Ｃａ（ＮＯ３）２
チオシアン酸ナトリウム：ＮａＳＣＮ【００５４】
＜実験１＞
表１に示すように、極性溶媒とこれに無機塩を加えた系で溶解性試験をした。温度は１００℃とした。天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチド（タンパク質）の濃度は４質量％とした。下記の表１以下の溶解性評価は次の基準に従った。なお、表１において、無機塩の質量％は、極性溶媒と無機塩の全体質量に対する無機塩の質量割合である。
［溶解性評価基準］
Ａ  溶解する。
Ｂ  大部分溶解するが一部不溶物が残る。
Ｃ  溶解しない。【００５５】
【表１】
0005427322.tif 000002
【００５６】
表１から明らかなとおり、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む溶媒が選択的に優れていることがわかった。
（ｉ）  ジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ
（ｉｉ）  ジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯに無機塩を加えたもの
（ｉｉｉ）  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド：ＤＭＦに無機塩を加えたもの【００５７】
また、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の物質にエチルアルコール、メチルアルコール、超純水を加えた系でも溶解性は高いことがわかった。【００５８】
次に、表１の溶解性評価基準がＡのものについて可紡性を調べた。可紡性は湿式紡糸を採用し、図４Ａに示す紡糸工程において、紡糸液をシリンダーに充填し、０．３ｍｍ径のノズルからシリンジポンプを用い、２．０ｍｌ／ｈの速度で押し出し、１００質量％メタノール凝固液中で溶媒を抽出して未延伸糸が作製できるか否かで判断した。凝固液槽の長さは２５０ｍｍ、巻き取り速度は２．１ｍ／ｍｉｎとした。その結果、表１の溶解性評価基準がＡのものはいずれも可紡性があった。【００５９】
＜実験２＞
天然クモ糸タンパク質由来のポリペプチド（タンパク質）の濃度を上げる実験をした。１００℃の溶媒にタンパク質４０，４５，５０質量％が溶解するかどうかを調べた。その結果を表２に示す。なお、ＤＭＦ（ＬｉＣｌ濃度１４．４質量％）、ＤＭＳＯ（ＬｉＣｌ濃度１０質量％）の溶解物は室温（２５℃）に下げても安定であり、溶解していた。【００６０】
【表２】
0005427322.tif 000003
【００６１】
表２からＤＭＳＯに無機塩を添加するとタンパク質を４０質量％までは十分に良好に溶解すること（溶解性の境界は４３質量％）、ＤＭＦに塩を添加するとタンパク質を４５質量％までは十分良好に溶解すること（溶解性の境界は４８質量％）がわかった。【００６２】
＜実験３＞
次に、ＤＭＳＯを使用して１００℃でタンパク質を溶解し、そのまま温度キープをするか又はポリペプチドの溶液の温度を低温に下げて３時間保持し、その安定性を観察した。結果を表３に示した。【００６３】
【表３】
0005427322.tif 000004
【００６４】
表３からLiCl濃度が１0質量%であると、タンパク質濃度４０質量％以下の場合２５〜１００℃の実用的温度範囲では安定であることが確認できた。【００６５】
（実施例２）
（１）紡糸液（ドープ液）
実施例１で使用したタンパク質を使用して紡糸液（ドープ液）を作成した。まず、凍結乾燥粉末（タンパク質）の濃度が２０質量％になるように、凍結乾燥粉末を１0質量%のＬｉＣｌを含むＤＭＳＯ（１００℃）に添加した。ローテーターで６時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。溶液粘度は１，２００ｃＰ（センチポイズ）であった。これを紡糸液（ドープ液）とした。【００６６】
（２）紡糸−延伸工程
紡糸工程から延伸工程は図２Ａに示す方法を用いた。紡糸液をシリンダーに充填し、０．３ｍｍ径のノズルからシリンジポンプを用い、２．０ｍｌ／ｈの速度で押し出し、１００質量％メタノール凝固液中で溶媒を抽出して未延伸糸を作製した。凝固液槽の長さは２５０ｍｍ、巻き取り速度は２．１ｍ／ｍｉｎとした。次いで延伸として、未延伸糸を５０℃の温水で４．５倍に延伸した。巻き取り速度は９．３５ｍ／ｍｉｎとした。【００６７】
（３）物性測定
（ａ）光学顕微鏡を用いて繊維の直径を求めた。
（ｂ）引張り試験
温度：２５℃、相対湿度６０％の雰囲気温度で引張り試験機（島津社製小型卓上試験機ＥＺ−Ｓ）を用いて繊維の強度、初期弾性率（２０点の最大傾きで測定。５０ｍｓｅｃ間隔で測定し、傾きの計算を２０点間隔で行ったときの最大傾きを初期弾性率とした。）、伸度を測定し、タフネスを算出した。サンプルは厚紙で型枠を作製したものに貼り付け、つかみ具間距離は２０ｍｍ、引張り速度は１０ｍｍ／ｍｉｎで行った。ロードセル容量１Ｎ、つかみ冶具はクリップ式とした。測定値はサンプル数ｎ＝５の平均値とした。タフネスの算出式は次のとおりとした。
［Ｅ／（ｒ２×π×Ｌ）×１０００］（単位：ＭＪ／ｍ３）
但し、
Ｅ  破壊エネルギー（単位：Ｊ）
ｒ  繊維の半径（単位：ｍｍ）
π  円周率
Ｌ  引張り試験測定時のつかみ具間距離【００６８】
各種物性値を表４にまとめて示した。また、得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線を図５に示した。【００６９】
（実施例３）
実施例２と同一の紡糸液をシリンダーに充填し、０．３ｍｍ径のノズルからシリンジポンプを用い、１．４ｍｌ／ｈの速度で押し出し、１００質量％メタノール凝固液中で溶媒を抽出して未延伸糸を作製した。凝固液槽の長さは２５０ｍｍ、巻き取り速度は２．２ｍ／ｍｉｎとした。次いで延伸として、未延伸糸を５０℃の温水で３．５倍に延伸した。巻き取り速度は７．７ｍ／ｍｉｎとした。その後、１６０℃の乾熱延伸で１．２５倍にした。紡糸工程から延伸工程は図２Ａ−Ｂに示す方法を用いた。【００７０】
得られた繊維の各種物性値を上記のとおり測定し、その結果を表４にまとめて示した。また、得られた繊維の応力−変位（ひずみ）曲線を図６に示した。【００７１】
【表４】
0005427322.tif 000005
【００７２】
（実施例４）
タンパク質の濃度を７質量％、溶媒はＤＭＳＯのみとした以外は、実施例２と同様にして紡糸液を作製した。図２Ａ−Ｂに示す紡糸装置を用いた。湿式紡糸における各条件は次のとおりであった。
（１）押し出し−凝固工程
押し出しノズル直径：０．３ｍｍ
押し出し速度：３．０ｍｌ／ｈ
凝固液槽の湯温：１０℃
（２）１段目の延伸
５０℃の温水中で、延伸倍率２．５倍、巻取速度５．５ｍ／ｍｉｎ（５５ｒｐｍ）で３．５分間巻取った。
（３）２段目の延伸
１９０℃の乾熱炉で、送り出し速度２０ｒｐｍ、巻取速度３１ｒｐｍ（１．５５倍延伸）で延伸を行った。
（４）得られた延伸糸の物性
得られた延伸糸の物性を上述したとおりに測定した。その結果、単繊維の平均直径は２２．０μｍ、最大点応力は９９．２ＭＰａ、初期弾性率は３．５ＧＰａ、破断点変位（伸度）は８．７％、タフネスは６．８ＭＪ／ｍ３であった。得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線は図７に示した。【００７３】
（実施例５）
タンパク質の濃度を１０質量％、溶媒はＤＭＳＯのみとした以外は、実施例２と同様にして紡糸液を作製した。溶媒が無機塩等の溶解促進剤を含んでいない場合、タンパク質を高濃度にするとゲル化してしまう。そのため、図２Ａに示すシリンジ３１をヒーターを用いて６０℃に加温し、ゲル化を防ぎながら紡糸を行った。湿式紡糸‐延伸は図２Ａ−Ｂに示す紡糸装置を用いた。湿式紡糸における各条件は次のとおりである。
（１）押し出し−凝固工程
シリンジヒーターの温度：６０℃
押し出しノズル直径：０．２ｍｍ
押し出し速度：４．０ｍｌ／ｈ
凝固液槽の湯温：１０℃
（２）１段目の延伸
５０℃の温水中で、延伸倍率３．５倍、巻取速度７．７ｍ／ｍｉｎ（７７ｒｐｍ）で４分間巻取った。
（３）２段目の延伸
１８０℃の乾熱炉で、送り出し速度２０ｒｐｍ、巻取速度２６ｒｐｍ（１．３倍延伸）で延伸を行った。
（４）得られた延伸糸の物性
得られた延伸糸の物性を上述したとおりに測定した。その結果、単繊維の平均直径は２２．０μｍ、最大点応力は２８５．９ＭＰａ、初期弾性率は７．６ＧＰａ、破断点変位（伸度）は１４．８％、タフネスは３５．５ＭＪ／ｍ３であった。得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線は図８に示した。【００７４】
（実施例６）
（１）使用タンパク質
（Ｉ）遠沈管（５０ｍｌ）にＡＤＦ４Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍｌを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ−０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（II）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍｌ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ    ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。
（III）遠心分離で得られた沈殿物（不溶性画分のタンパク質）に、３ｗ／ｖ％のＳＤＳを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３０ｍＬを加え、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック  ウルトラタラックス」、レベル２）で３分間分散させた後、シェイカー（タイテック社製のバイオシェイカー「ＢＲ−４３ＦＬ」、２００ｒｐｍ、３７℃）で６０分間攪拌した。その後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上澄みを除去した。
（IV）上澄みを除去し沈殿物を８０℃のＤＭＳＯ（２Ｍ  ＬｉＣｌを含む）で溶解し、スターラーで撹拌した後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ４Ｋａｉ（約３７．７ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｂｉｏ−ＲＡＤ製のＯｒｉｏｌｅ蛍光ゲルステインによるＯｒｉｏｌｅ染色）の結果をＩｍａｇｅＬａｂ（ＢｉｏーＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ４Ｋａｉの精製度は約７５．５％であった。【００７５】
（２）紡糸液（ドープ液）
上記で得られたＡＤＦ４Ｋａｉのタンパク質を使用して紡糸液を作製した。凍結乾燥粉末を濃度が１０．２質量％になるように、８０℃に加熱したＤＭＳＯに添加した。ローテーターで６時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。溶液粘度は１，２００ｃＰ（センチポイズ）であった。これを紡糸液とした。【００７６】
（３）紡糸−延伸工程
上記で得られた紡糸液を用いて湿式紡糸を行った。押し出し−凝固工程は、図４Ａに示す紡糸装置を用いた。湿式紡糸における各条件は下記のとおりである。
（Ｉ）押し出し−凝固工程
押し出しノズル直径：０．３ｍｍ
押し出し速度：６．０ｍｌ／ｈ
凝固液槽の湯温：４℃
巻き取り速度：１３．６ｍ／ｍｉｎ
（II）１段目の延伸
５０℃の温水中で、延伸倍率１．５倍で延伸を行った。
（III）２段目の延伸
１８０℃の乾熱炉で、延伸倍率１．３倍で延伸を行った。
（IV）得られた延伸糸の物性
得られた延伸糸の物性を上述したとおりに測定した。その結果、単繊維の平均直径は８３．８μｍ、最大点応力は１９６．４ＭＰａ、初期弾性率は６．０ＧＰａ、破断点変位（伸度）は１４．６％、タフネスは２４．６ＭＪ／ｍ３であった。得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線は図９に示した。【００７７】
（実施例７）
（１）使用タンパク質
（Ｉ）遠沈管（５０ｍｌ）にＭａＳｐ２_Ｎのタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍｌを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ−０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（II）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍｌ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ    ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。
（III）遠心分離で得られた沈殿物（不溶性画分のタンパク質）に、３ｗ／ｖ％のＳＤＳを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３０ｍＬを加え、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック  ウルトラタラックス」、レベル２）で３分間分散させた後、シェイカー（タイテック社製のバイオシェイカー「ＢＲ−４３ＦＬ」、２００ｒｐｍ、３７℃）で６０分間攪拌した。その後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上澄みを除去した。
（IV）上澄みを除去し沈殿物を８０℃のＤＭＳＯ（２Ｍ  ＬｉＣｌを含む）で溶解し、スターラーで撹拌した後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分、室温）し、上清を透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分をのぞき、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＭａＳｐ２_Ｎ（約３１．７ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｏｒｉｏｌｅ染色）の結果をＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＭａＳｐ２_Ｎの精製度は約６８．１％であった。【００７８】
（２）紡糸液（ドープ液）
上記で得られたＭａＳｐ２_Ｎのタンパク質を使用して紡糸液を作製した。凍結乾燥粉末を濃度が１８質量％になるように、４０℃に加熱したＤＭＳＯに添加した。ローテーターで６時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。溶液粘度は１，２００ｃＰ（センチポイズ）であった。これを紡糸液とした。【００７９】
（３）紡糸−延伸工程
上記で得られた紡糸液を用いて湿式紡糸を行った。押し出し−凝固工程は、図４Ａに示す紡糸装置を用いた。湿式紡糸における各条件は下記のとおりである。
（Ｉ）押し出し−凝固工程
押し出しノズル直径：０．２ｍｍ
押し出し速度：２．０ｍｌ／ｈ
凝固液槽の湯温：１０℃
巻き取り速度：２．５ｍ／ｍｉｎ
（II）１段目の延伸
５０℃の温水中で、延伸倍率２．５倍で延伸を行った。
（III）２段目の延伸
８０℃の乾熱炉で、延伸倍率１．８５倍で延伸を行った。
（IV）得られた延伸糸の物性
得られた延伸糸の物性を上述したとおりに測定した。その結果、単繊維の平均直径は３５μｍ、最大点応力は２３６．７ＭＰａ、初期弾性率は５．７ＧＰａ、破断点変位（伸度）は１４．９％、タフネスは２６．５ＭＪ／ｍ３であった。得られた単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線は図１０に示した。【００８０】
（実施例８）
（１）使用タンパク質
（Ｉ）遠沈管（５０ｍｌ）にＦｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍｌを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ−０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（II）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍｌ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ    ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕した。超音波破砕は、２０秒間処理と５秒間停止を繰り返し、合計８分間行った。
（III）超音波破砕した菌体を遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１１，０００×ｇ、３０分、室温）した。
（IV）遠心分離で得られた上澄み（可溶性画分のタンパク質）に、Ｎｉセファロース（５０％スラリ、ＧＥヘルスケア社製、品番「１７ー５３１８ー０２」）を添加し、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック  ウルトラタラックス」、レベル２）で３分間分散させた後、スターラーで６０分間攪拌した。その後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（５００×ｇ、５分、室温）し、上清を除去した。上記Ｎｉセファロースを空のカラム（ＧＥヘルスケア社製、品番「１７ー０４３５ー０１」）に充填して、緩衝液ＡＩで洗浄し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５）を用いて、Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２のタンパク質を溶出した。
（V）得られた溶出液を、透析チューブ（三光純薬株式会社セルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。凍結乾燥機を用いて、透析後に得られた液体の水分を除去し、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２（約４６．６ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｏｒｉｏｌｅ染色）の結果をＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、Ｆｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２の精製度は約６９．１％であった。【００８１】
（２）紡糸液（ドープ液）
上記で得られたＦｌａｇ_９２_ｓｈｏｒｔ２のタンパク質を使用して紡糸液を作製した。凍結乾燥粉末を濃度が２３質量％になるように、４５℃に加熱したＤＭＳＯに添加した。ローテーターで６時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。溶液粘度は１，２００ｃＰ（センチポイズ）であった。これを紡糸液とした。【００８２】
（３）紡糸−延伸工程
上記で得られた紡糸液を用いて湿式紡糸を行った。押し出し−凝固工程は、図４Ａに示す紡糸装置を用いた。湿式紡糸における各条件は下記のとおりである。
（Ｉ）押し出し−凝固工程
押し出しノズル直径：０．２ｍｍ
押し出し速度：１．０ｍｌ／ｈ
凝固液槽の湯温：１０℃
巻き取り速度：１．６５ｍ／ｍｉｎ
（II）１段目の延伸
室温の空気中で、延伸倍率１．５倍で延伸を行った。この段階で得られた繊維を一次延伸糸と記す。
（III）２段目の延伸
１６０℃の乾熱炉で、延伸倍率１．３４倍で延伸を行った。この段階で得られた繊維を二次延伸糸と記す。
（IV）得られた延伸糸の物性
得られた一次延伸糸及び二次延伸糸の物性を上述したとおりに測定した。その結果を下記表５に示した。また、得られた一次延伸糸及び二次延伸糸の単繊維の応力−変位（ひずみ）曲線は、それぞれ、図１１及び図１２に示した。【００８３】
【表５】
0005427322.tif 000006
【００８４】
（実施例９）
＜タンパク質の抽出＞
（１）遠沈管（５０ｍｌ）にＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約４．５ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３０ｍｌを添加し、ミキサー（ＧＥ社製「ＳＩ−０２８６」、レベル１０）で菌体を分散させた後、遠心分離機（トミー精工製の「ＭＸ−３０５」）で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（２）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３０ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を０．３ｍｌ添加し、上記ＧＥ社製のミキサー（レベル１０）で３分間分散させた。その後、超音波破砕機（ＳＯＮＩＣ＆ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ    ＩＮＣ製「ＶＣＸ５００」）を用いて菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）した。上清を捨てた後、氷水に約１０分程度放置することで熱を取った。同様の菌体の破砕と遠心分離を再度繰り返した。
＜タンパク質の洗浄＞
遠心分離で得られた沈殿物（不溶性画分のタンパク質）に、３ｗ／ｖ％のＳＤＳを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３０ｍＬを加え、上記ＳＭＴ社製の超音波破砕機（レベル７）で良く分散させた後、シェイカー（タイテック社製、２００ｒｐｍ、３７℃）で６０分間攪拌した。その後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１０分、室温）し、上清を捨て、ＳＤＳ洗浄顆粒（沈殿物）を得た。
＜タンパク質の精製＞
ＳＤＳ洗浄顆粒を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう下記表６に示す各溶媒で懸濁し、８０℃で１時間熱処理した。その後、上記トミー精工製の遠心分離機で遠心分離（１１０００×ｇ、５分間）し、上清を回収した。上清におけるタンパク質の濃度をＢＣＡ法にて測定した。なお、ＢＣＡ法によるタンパク質の測定には、タカラバイオ社製のＰｉｅｒｃｅ  （登録商標）  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いた。【００８５】
（実施例１０）
ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌に替えて、ＡＤＦ４Ｋａｉのタンパク質を発現している大腸菌を用いた以外は、実施例９と同様にしてＡＤＦ４Ｋａｉのタンパク質を精製した。【００８６】
実施例９〜１０で得られたタンパク質を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、Ｏｒｉｏｌｅ染色によりバンドを確認し、解析ソフトＩｍａｇｅＬａｂ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ）を用いて画像解析することで、目的タンパク質の純度（精製率）を求め、その結果を下記表  に示した。なお、実施例９で得られたタンパク質（ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１を含む）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図１３に示し、実施例１０で得られたタンパク質（ＡＤＦ４Ｋａｉを含む）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を図１４に示した。また、溶媒として７．５Ｍの尿素緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた際のタンパク質の純度を基準とした相対値の結果を下記表６に示した。【００８７】
【表６】
0005427322.tif 000007
【００８８】
図１３には、ＡＤＦ３Ｋａｉ−Ｌａｒｇｅ−ＮＲＳＨ１のタンパク質を各種溶媒に溶解させたポリペプチドの溶液を用いた電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）結果を示し、図１４には、ＡＤＦ４Ｋａｉのタンパク質を各種溶媒に溶解させたポリペプチドの溶液を用いた電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）結果を示した。図１３及び１４において、レーンＭは分子量マーカー、レーン１〜４は、それぞれ、溶媒が７．５Ｍの尿素緩衝液（ｐＨ９．０）、ＤＭＳＯ（１ＭのＬｉＣｌを含む）、ＤＭＳＯ（２Ｍ  ＬｉＣｌを含む）、ＤＭＳＯ（３ＭのＬｉＣｌを含む）である場合のサンプルである。図１３及び１４から明らかなように、ＤＭＳＯに無機塩を加えたものを溶媒として用いた方が、７．５Ｍの尿素緩衝液（ｐＨ９．０）を溶媒とした場合と比較して、夾雑タンパク質が少なく、溶解性も向上していた。また溶媒における無機塩の濃度の上昇に伴い、精製率が増加していた。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明のポリペプチドの溶液はドープ液とポリペプチドの精製に用いることができる。また、本発明のポリペプチドの溶液をドープ液として用いて製造した人造ポリペプチド繊維は、樹脂や金属の強化繊維、複合材料、射出成形等に好適に使用できる。その用途は、自動車等の輸送機器部材、タイヤの補強繊維等に適用できる。さらに手術用糸、マスク、フィルター、創傷被覆材、再生医療シート、バイオシート等にも適用できる。形態としては織物、編物、組み物、不織布などに応用できる。
【符号の説明】
【００９０】
１，３１，６１，８１  押し出し装置
２，３０，６２，８０  未延伸糸製造装置
３，４０  湿熱延伸装置（１段目延伸装置）
４，５０，６３，９０  乾熱延伸装置（２段目延伸装置）
５，３９，４４，６４，８６，９２  巻糸体
６，３２，６６，８２  紡糸液
７  貯槽
８  ギアポンプ
９，６９，８３  口金
１０，６０  紡糸延伸装置
１１，３５，７１，８５  凝固液
３６  未延伸糸
１２，３８  温水
１３，１５，４１，４５  供給ニップローラ
１４，１６，４２，４６  引き取りニップローラ
１７，４３，７７，８９  乾熱延伸装置
１８ａ〜１８ｆ  糸ガイド
１９，７３  エアギャップ
２０，３４，７２，８４  凝固液槽
２１，３７  延伸浴槽
２２，４７，７８，９１  糸道
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１〜６、８、１５、１７、１９  アミノ酸配列
配列番号７、９、１０、１６、１８、２０    塩基配列
配列番号１１〜１４  プライマーシーケンス
【図１】
0005427322.tif 000008
【図２】
0005427322.tif 000009
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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