(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：６６）またはＡｃｅ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α（Ｍｅ）Ｐｈｅ−ＮＨ２（配列番号：５５）の配列を有するペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の１種のペプチドが、媒体または賦形剤とともに含む医薬組成物。
【請求項３】
変更された細胞遊走に関連する障害の予防または治療のための、請求項１に記載ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが１回分あたり０．１μｇから１ｇの有効量を含むことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが１回分あたり０．１ｍｇから１００ｍｇの有効量を含むことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
悪性腫瘍による局所または転移性の浸潤の予防または治療用の請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
血管新生に関連する障害の予防または治療用の請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記血管新生に関連する障害が、網膜血管障害、網膜症、黄斑変性および水腫ならびカポジ肉腫からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
細胞遊走に支持され、慢性炎症に関連する障害の予防または治療用の、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記慢性炎症に関連する障害が、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎、乾癬および慢性肉芽腫性障害からなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ヘルペスウイルス感染に関連する疾患の予防または治療用の請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４または５アミノ酸残基を含み、少なくとも１個が疎水性であり、かつ少なくとも２個が塩基性である、塩化または非塩化の直鎖状ペプチド（以下、「ＰＩＣＭ」（細胞運動性のペプチド阻害物質）とよぶ）、およびその機能的に等価な誘導体、ならびにそれらを有効成分として含有する医薬組成物に関する。本発明による化合物は、腫瘍、特に高度に浸潤性であり、かつ／または転移しやすい腫瘍の治療および予防、ならびに血管新生および血管形成に連結する障害、ならびにリウマチ性関節炎および乾癬のような自己免疫疾患および慢性炎症性障害、慢性肉芽腫性障害、網膜症、黄斑変性および水腫、カポジ肉腫のような変更された細胞運動性に関連する障害、およびヘルペスウイルス感染に関連する疾患の治療に有効である。
【背景技術】
【０００２】
現在の腫瘍の治療は、通常の治療に本質的に応答できない高度に悪性の細胞種（神経膠腫、肉腫など）の存在、または治療の間に耐性腫瘍クローンの選択および結果的にその増殖を促進する選択的優位性の開始により制限される（Woodhouse, E. C.ら、Cancer 80：1529〜9537、1997）。通常の治療は、腫瘍の転移による拡散を防止するよりもむしろ、腫瘍の成長を阻害するように主に設計されており、このことが今だに治療の失敗の主な原因である（Shevde LAらCancer Lett、198：1〜20、2003）。
【０００３】
現在の腫瘍の治療の全般的な特徴は、悪性細胞に対して選択的に作用するが、体に対して破壊的な全身性の影響を必然的に有する細胞毒性が高い化合物の使用である。その結果、現在の治療は、通常、非常に高い社会的、人的および財政的な費用を伴う。
【０００４】
この全体的な現状は、ａ）現在治療できない腫瘍に対する有効な治療を開発することへの緊急の必要性が存在すること、ｂ）現在の抗腫瘍剤で治療されたときに患者の生活の質を受け入れ難いものにし、かつ衰弱した患者では死さえも引き起こし得る副作用を低減させることへの強い必要性が存在すること、ｃ）治療効率は、腫瘍の成長プロセスおよび転移による拡散の両方を妨げる薬剤を用いることにより改善される必要があること、ｄ）腫瘍治療の費用は、より許容され得るものにされる必要があることを示す。
【０００５】
最近、ヒトおよびマウスにもたらされる、ペプチドメタスチン（例えば特許文献１から３）の多数の生物学的作用が、癌の予防または治療における効果を含むことが報告された。メタスチンおよびその誘導体に関する特許文献４は、１０10を超える異なる構造を有すると見積もられる、４〜５４アミノ酸残基を含有する、天然および非天然の、転移による拡散および腫瘍の成長、膵臓機能の制御および急性および慢性膵炎の予防、胎盤機能の制御および胎児発育不全の治療における使用、異常グルコース代謝、脂質代謝の異常、不妊、子宮内膜症、思春期早発、アルツハイマー病、認識野に影響する障害、肥満、高脂血症、ＩＩ型糖尿病、高血糖、高血圧、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、水腫、排尿障害、インスリン抵抗性、不安定型糖尿病、脂肪萎縮、インスリンアレルギー、アテローム性動脈硬化症、血栓症、脂肪毒性、ならびに生殖腺の機能を改善しかつ排卵を刺激する治療における使用のような非常に広い多様な生物学的活性が報告されている非常に広い一連の化合物を請求している。これらの化合物のそれぞれについてこのような異なる生物学的作用が同時に存在することは、このクラスの分子の治療上の使用の観点から、利点ではなく、大きな制限であることは確かである。生物学的機能の広い多様性は、Ｋｉｓｓ−１Ｒ、キスペプチン受容体、メタスチン受容体、低ゴナドトロピン１またはｈＯＴ７Ｔ１７５としても知られる特異的細胞受容体ＧＰＲ５４とのメタスチンおよびその誘導体の相互作用と密接に関連する（Ohtaki T.ら、Nature 411：613〜617、2001；Clements M.K.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 284：1189〜1193、2001；Muir A. I.ら、J. Biol. Chem. 276：28969〜28975；2001；Kotani M.ら、J. Biol. Chem. 276：34631〜34636、2001；Seminara S. B.ら、N. Engl. J. Med. 349：1614〜1627、2003；Grimwood J.ら、Nature 428：529〜535、2004；Colledge W. H.、Trends Endocrinol. Metab. 15：448〜453、2004；Hori A.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 286：958〜963、2001；Janneau J.-L.ら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 87：5336〜5339、2002；Ringel M. D.ら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 87：2399〜2399、2002；de Roux N.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100：10972〜10976、2003；Ikeguchi M.ら、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 129：531〜535、2003；Ikeguchi M.ら、Clin. Cancer Res. 10：1379〜1383、2004；Bilban M.ら、J. Cell Sci. 117：1319〜1328、2004；Becker J.A.J.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 326：677〜686、2005；Semple R.K.ら、J. Clin. Endocrinol. Metab. 90：1849〜1855、2005）。
【０００６】
メタスチンおよびその誘導体の抗腫瘍活性について、特許文献４は、腫瘍量を２０％以下低減させる、７０〜１４０μｇ／ｋｇの用量での実験動物モデルに限定された穏やかな活性を報告している。メタスチンの類縁体の１種であるキスペプチン−５４の長期投与が、ラットにおいて生殖腺の萎縮の有害反応を引き起こすことも示されている（E.L.Thomsonら、Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 291、1074〜1082、2006）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第００／０２４８９０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／０７５１０４号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０２／０８５３９９号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０６／００１４９９号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ohtaki T.ら、Nature 411：613〜617、2001
【非特許文献２】Clements M.K.ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 284：1189〜1193、2001
【非特許文献３】Muir A. I.ら、J. Biol. Chem. 276：28969〜28975；2001
【非特許文献４】Kotani M.ら、J. Biol. Chem. 276：34631〜34636、2001
【非特許文献５】Seminara S. B.ら、N. Engl. J. Med. 349：1614〜1627、2003
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の説明
本発明は、ａＭ濃度（１０-18Ｍ）でｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞遊走を阻害し、１５μｇ／ｋｇほどの低用量で腫瘍量を３０〜７０％低減させるｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な抗腫瘍作用を有する少なくとも２つの塩基性アミノ酸と少なくとも１種の疎水性アミノ酸とを含有する塩化形または非塩化形のテトラペプチドおよびペンタペプチドならびにそれらの機能的に等価な誘導体（以下、ＰＩＣＭのコードで示す）に関する。これらは、血管新生および血管形成に関連する全ての障害に有効であり、治療用量の約１０００倍を超える用量まで、いずれの急性または亜急性の毒性を示さない。
【００１０】
メタスチンおよびその誘導体と異なり、本発明によるペプチドの活性は、細胞受容体ＧＰＲ５４に関連しないが、ＦＰＲ細胞受容体とのそれらの特異的相互作用に厳密に関連する。
【００１１】
いくつかのＦＰＲ受容体拮抗剤が知られており(EdwardsらMol Pharmacol. 68：1301〜10、2005；KarissonらBiochem Pharmacol. 71：1488〜96、2006）、これらの全てはＰＩＣＭとは化学的に異なる。
【００１２】
ＰＩＣＭは、よって、メタスチンおよびその誘導体ならびにＦＰＲ受容体拮抗剤よりもはるかに効力があり、それらとは異なる生物学的および薬理学的活性を有する活性成分の新しいクラスである。
【００１３】
臨床実施において、ＰＩＣＭは、多数の腫瘍に対して効果があり、低用量で作用し、いずれの全身性毒性または有害事象を示さない。
【００１４】
ＰＩＣＭは、血管新生および血管形成に連結する障害、ならびにリウマチ性関節炎および乾癬のような自己免疫疾患ならびに慢性炎症性障害、慢性肉芽腫性障害、網膜症、黄斑変性および水腫、カポジ肉腫のような変更された細胞運動性に関連する障害、ならびにヘルペスウイルス感染に関連する疾患の治療においても効果がある。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
塩化または非塩化形の本発明によるペプチドおよびそれらの機能的に等価な誘導体は、一般式Ｌ1−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4
（式中：Ｌ1は、Ｈ、またはアシル、またはＮ−アシル化もしくはＮ−アルキル化および／またはＣα−アルキル化されていてもよい任意の天然もしくは非天然のアミノ酸であり；好ましくは、Ｌ1は、Ｈ、またはアシル、またはＮ−アシル化もしくはＮ−アルキル化および／またはＣα−アルキル化されていてもよいＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｎ−アシル化および／またはＣα−アルキル化されていてもよいＰｒｏ、ヒドロキシ−Ｐｒｏ、チオＰｒｏ、Ａｚｔ、Ｐｉｐ、ｐＧｌｕ、Ｎ−アシル化またはＮ−アルキル化されていてもよいＡｉｂ、Ａｃ３ｃ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃ、Ａｃ６ｃであり；さらにより好ましくは、Ｌ1は、Ｈ、またはアシル、Ｎ−アシル化またはＮ−アルキル化されていてもよいＡｉｂ、Ａｃ３ｃ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃまたはＡｃ６ｃであり；
Ｘ1およびＸ3は、同一であるかまたは異なり、Ｎ−アルキル化および／またはＣα−アルキル化されていてもよい任意の天然もしくは非天然の塩基性アミノ酸であり；好ましくは、Ｘ1およびＸ3は、同一であるかまたは異なり、Ｎ−アルキル化および／またはＣα−アルキル化されていてもよく、グアジニル化されていてもよいＡｒｇ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、およびメタまたはパラ位でアミンまたはグアニジン基で置換されたフェニルアラニンから選択され；
Ｘ2は、Ｎ−アルキル化および／またはＣα−アルキル化されていてもよい任意の天然もしくは非天然のグリシンでないアミノ酸、および直鎖状もしくは環状のアルキル基でα炭素上で一置換された炭素原子数１〜１０のアミノ酸、または４〜１０個の炭素原子を含有する直鎖状もしくは環状のアルキル基でα炭素上で一置換されたアミノ酸、またはカルバモイル、ヒドロキシルもしくは芳香族基で置換されていてもよい、１〜８個の炭素原子を含有するアルキル基でα炭素上で一置換されたアミノ酸であり；Ｘ2は、好ましくは、Ｎ−アルキル化および／またはＣα−アルキル化されていてもよいＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｎ−アルキル化されていてもよいＡｉｂ、Ａｃ３ｃ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃおよびＡｃ６ｃから選択され；より好ましくは、Ｘ2は、Ｎ−アルキル化されていてもよいＡｉｂ、Ａｃ３ｃ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃおよびＡｃ６ｃから選択され；
Ｘ4は、Ｃα−アルキル化および／またはＣ末端でアミド化されていてもよい任意の疎水性アミノ酸、または任意の疎水性アミノアルコール、またはＮ’−アルキル化もしくはＮ’−アシル化されていてもよい任意の疎水性ジェムジアミンであり；Ｘ4は、好ましくは、Ｃα−アルキル化および／またはＣ末端でアミド化されていてもよいＰｈｅ、ｈ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、ｈ−１−Ｎａｌ、ｈ−２−Ｎａｌ、Ｃｈａ、ＣｈｇおよびＰｈｇから選択される）を有する。
【００１６】
「天然アミノ酸」とは、生体のタンパク質を構成するアミノ酸のことである。
【００１７】
「非天然アミノ酸」とは、Ｄ体のα−アミノ酸またはβ−アミノ酸；デヒドロアミノ酸；α炭素原子上で１１個までの炭素原子を含有するアルキルまたはアリール基で二置換されたアミノ酸；１〜１１個の炭素原子を含有するアルキル、アシル、アリールまたはアシルアリールで官能化されたヒドロキシ、アミノまたはチオ基を側鎖上に含有する、上記で定義される天然アミノ酸；第１級もしくは第２級アミン、または１１個までの炭素原子を含有する脂肪族もしくは芳香族のアルコールで官能化されたカルボキシ基を側鎖上に含有する、上記で定義される天然アミノ酸；Ａｚｔ、チオ−Ｐｒｏ、Ａｃ３ｃ、Ａｃ４ｃ、Ａｃ５ｃ、Ａｃ６ｃおよびｐＧｌｕ酸のような環状アミノ酸；ホモアミノ酸；β−１−ナフチル−アラニン、β−２−ナフチル−アラニン、ホモ−β−１−ナフチル−アラニン、ホモ−β−２−ナフチル−アラニン、シクロヘキシル−アラニン、シクロヘキシル−グリシン、およびフェニルグリシンのようなシクロアルキルもしくはアリール基で置換されたアミノ酸のことである。その他の非天然アミノ酸は、"Diversity of synthetic peptides"、Konishiら、First International Peptide Symposium、Kyoto、Japan、1997に報告されるものである。
【００１８】
「任意の塩基性アミノ酸」の用語は、少なくとも１種のイミダゾール、アミノ、グアニジノ、ピリジウニムまたは尿素基を側鎖に含有する、上記で定義される任意の天然または非天然アミノ酸のことである。
【００１９】
「任意の疎水性アミノ酸」の用語は、一連のα−、β−およびデヒドロ−アミノ酸：Ｌｅｕ、ｎ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、アロ−Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ｎ−Ｖａｌ、Ｐｈｅ、ｈ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、１−Ｎａｌ、２−Ｎａｌ、ｈ−１−Ｎａｌ、ｈ−２−Ｎａｌ、Ｃｈａ、ＣｈｇおよびＰｈｇ；１〜１１個の炭素原子を含有するアルキル、アシル、アリールまたはアシルアリールで官能化されたヒドロキシ、アミノまたはチオ基を側鎖上に含有する、上記で定義される天然および非天然アミノ酸；第１級もしくは第２級アミンまたは１１個までの炭素原子を含有する脂肪族もしくは芳香族のアルコールで官能化されたカルボキシ基を側鎖上に含有する、上記で定義される天然および非天然アミノ酸；芳香環のオルト、メタおよびパラ位で、ハロゲンまたはアルキル、Ｏ−アルキルもしくはＳ−アルキル基で１または二置換されたフェニルアラニン；β−２−およびβ−３−チエニルアラニン、β−２−およびβ−３−フラニルアラニン；１１個までの炭素原子を含有するアルキル、アシル、アリールまたはアシルアリールで官能化された２，３ジ−アミノプロピオン酸および２，４ジ−アミノ酪酸の誘導体である。
【００２０】
「任意の疎水性アミノアルコール」の用語は、カルボキシル官能基がＯＨ基で置換された、上記で定義される「任意の疎水性アミノ酸」のことである。
【００２１】
「任意の疎水性ジェムジアミン」の用語は、カルボキシル官能基がＮＨ2基で置換された、上記で定義される「任意の疎水性アミノ酸」のことである。
【００２２】
「アシル」の用語は、１〜９個の炭素原子を含有するアシル基を意味する。
【００２３】
「Ｎ−アシル化された」の用語は、末端アミノ窒素への上記で定義されるアシルの導入を意味する。
【００２４】
「Ｎ−アルキル化された」の用語は、アミド窒素への、１〜９個の炭素原子を含有するアルキル残基の導入を意味する。
【００２５】
「アミド化された」の用語は、合計で０〜１４個の炭素原子を含有する第１級または第２級アミンでのＣ末端カルボキシルのアミド化を意味する。
【００２６】
「Ｃα−アルキル化された」の用語は、１〜９個の炭素原子を含有するアルキル残基の、α炭素原子への導入を意味する。
【００２７】
「機能的に等価な誘導体」の用語は、薬力学または薬物動力学的特性を調節するためにペプチド化学において通常用いられる構造的改変を特徴とする、一般式Ｉの化合物の誘導体を意味する。これらは、１または複数のペプチド結合が−ＣＨ2−ＮＨ−で置換された偽ペプチド(Guichard G,ら、J Biol Chem.；270：26057〜9 1995）、１または複数の逆方向ペプチド結合を有する誘導体(Carotti A.らBiopolymers 60、322〜332、2001；Chorev, M.らScience 204、1210〜1212 1979；Pallai, P.ら、Biochemistry 24、1933〜1941. 1985；Rodriguez M. E.らJ. Med. Chem. 30、758〜763 1987）、１または複数のペプチド結合が少なくとも１種のβ−アミノ酸で形成されているβ−ペプチド誘導体（Horne W. S.らJ. Am. Chem. Soc. 129 4178〜4180 2007）、および１または複数のデヒドロアミノ酸を含有する誘導体(Busetti V.らInt. J. Biol. Macromol. 14、23〜28 1992)を含む。Ｎ末端側からの鎖の伸長を有する誘導体も、機能的に等価な誘導体である。
【００２８】
以下のものは、本発明によるペプチドの式に含まれ得るいくつかの非天然アミノ酸に用いられる通常の略称である。
Ａｚｔ＝アゼチジン酸、Ｐｉｐ＝ピペコリン酸、Ａｉｂ＝α−アミノ−イソ酪酸、Ａｃ３ｃ＝１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸、Ａｃ４ｃ＝１−アミノシクロブタン−１−カルボン酸、Ａｃ５ｃ＝１−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸、Ａｃ６ｃ＝１−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸、Ａｂｕ＝α−アミノ−ｎ−酪酸、ｎ−Ｌｅｕ＝ノルロイシン、ｎ−Ｖａｌ＝ノルバリン、ｈ−Ｐｈｅ＝ホモフェニルアラニン、１−Ｎａｌ＝β−１−ナフチル−アラニン、２−Ｎａｌ＝β−２−ナフチル−アラニン、ｈ−１−Ｎａｌ＝ホモ−β−１−ナフチル−アラニン、ｈ−２−Ｎａｌ＝ホモ−β−２−ナフチル−アラニン、Ｃｈａ＝シクロヘキシルアラニン、Ｃｈｇ＝シクロヘキシルグリシン、Ｐｈｇ＝フェニルグリシン、ｐＧｌｕ＝ピログルタミン酸、Ｄａｐ＝２，３ジ−アミノ−プロピオン酸、Ｄａｂ＝２，４ジアミノ酪酸、Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ＝Ｎ−メチル−アルギニン、α(Ｍｅ)Ｐｈｅ＝Ｃ−アルファ−メチル−フェニルアラニン。
【００２９】
好ましくは、Ｌ１がアセチル、Ｇｌｕ、ｐＧｌｕ、アセチル−Ａｉｂであり、Ｘ１がＡｒｇまたはＮ(Ｍｅ)Ａｒｇであり、Ｘ２がＧｌｕ、Ａｉｂ、Ａｃ５ｃであり、Ｘ３がＡｒｇ、Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇであり、Ｘ４がＰｈｅ−ＮＨ2、Ｔｙｒ−ＮＨ2、Ｔｒｐ−ＮＨ2、α(Ｍｅ)Ｐｈｅ−ＮＨ2、Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｔｙｒ−ＯＨ、Ｔｒｐ−ＯＨである。
【００３０】
本発明による特に好ましいペプチドは、Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ａｃ５ｃ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α(Ｍｅ)Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ａｒｇ−α(Ｍｅ)Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−α(Ｍｅ)Ｐｈｅ−ＮＨ2；Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ａｉｂ−Ｎ(Ｍｅ)Ａｒｇ−α(Ｍｅ)Ｐｈｅ−ＮＨ2から選択される。
【００３１】
本発明によるペプチドは、文献に報告されている種々の方法を用いて合成できる。例えば、Schroederら“The Peptides" 第1巻、Academic Press、1965；Bodanszkyら"Peptide Synthesis Interscience Publisher、1966；BaranyおよびMerrifield、“The peptides; Analysis, Synthesis, Biology"、2、第1章、Academic Press、1980を参照されたい。これらの技術は、固相ペプチド合成、溶液でのペプチド合成、有機化学合成法、またはこれらの任意の組み合わせを含む。選択される合成法は、特定のペプチドの組成に明らかに依存する。好ましくは、用いる方法は、特に工業的規模での製造経費が低い、固相技術と溶液での伝統的な方法との適切な組み合わせに基づく。詳細には、これらの方法は、ｉ）所望のペプチドが得られるまでの、中間体の単離を伴う、適切に活性化したＮ−保護アミノ酸の、アミノ酸またはＣ−保護ペプチド鎖への連続的カップリングによるペプチド鎖の断片の溶液での合成、該断片のＮおよびＣ末端ならびに必要により側鎖の、その後の選択的脱保護；ｉｉ）不溶性ポリマー媒体上でのＣ末端からＮ末端へのペプチド鎖の固相合成を伴う。ペプチドは、無水フッ化水素酸またはトリフルオロ酢酸を用いる適切な捕捉剤の存在下での加水分解により樹脂から回収される。
【００３２】
本発明によるペプチドは、ヒトおよび動物の多種の腫瘍に対して活性があり、それらの成長および転移による拡散を防止する。
【００３３】
本発明による化合物は、抗腫瘍効果および有効用量の点で、特に、メタスチンおよびＷＯ０６／００１４９９に報告される関連するペプチドに比較して有利である。本発明によるペプチドは、より低濃度で、腫瘍の減少についてはるかにより効果的な応答を誘導する（メタスチン誘導体による２０％の低減、本発明による生成物による７０％の低減）。
【００３４】
提案される治療上の使用について、本発明によるペプチドは、そのまま、または塩の形で、経口、非経口、局所、噴霧または経皮投与用の医薬組成物に、おそらくその他の活性成分と組み合わせて処方できる。ヒトでの単位用量は、広い範囲内、典型的には用量当たり０．１μｇ〜１ｇ、好ましくは０．１ｍｇと１００ｍｇの間で変動でき、これは、治療される障害、その重篤度、ならびに患者の体重、性別および年齢に応じて当業者が容易に決定できる。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明する。
【００３６】
実施例１
Ｌ１がＡｃｅであり、Ｘ1およびＸ３がＡｒｇであり、Ｘ2がＧｌｕであり、Ｘ4がＰｈｅ−ＮＨ2である式Ｉの化合物であるＰＩＣＭ１の調製。ＰＩＣＭ１の％式は、よって、Ａｃｅ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＮＨ2である。
【００３７】
０．５ｍｍｏｌのアミン基に等しい２．５ｇのＲｉｎｋアミド樹脂（０．２ｍｅｑ／ｇ）を用いて開始する自動ペプチド合成機を、合成に用いる。Ｆｍｏｃ基を、３分間および７分間の、ＤＭＦ中の３０％のピペリジンを用いる２連続段階で加水分解する。次いで、以下の化合物を、列挙する順序で反応させる：Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ（０．５８１ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ（０．９７４ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)−ＯＨ（０．６３８ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ(Ｐｂｆ)−ＯＨ（０．９７４ｇ）および酢酸（０．０９０ｇ）。
【００３８】
アシル化は１時間である。次いで、樹脂を洗浄し、反応物をカイザーニンヒドリンアッセイで試験する。応答が陰性であれば、Ｆｍｏｃ基を、次のアミノ酸をカップリングさせる前に上記のようにして加水分解する。全てのアミノ酸を、４ｍｌのＤＭＦ中に１．５ｍｍｏｌのアミノ酸を溶解することによりカップリングさせ、２ｍｌのＤＭＦ中の０．７８０ｇのＰｙＢｏｐ、２ｍｌのＤＭＦ中の０．２３０ｇのＨＯＢＴ、および２５０ｍｌのＤＩＥＡの溶液からなる活性化物質の混合物とともに、脱保護された樹脂に加える。樹脂からのペプチドの脱離および側鎖の付随的な脱保護のために、重量比で９：０．５：０．３：０．２のＴＦＡ、チオアニソール、メルカプトエタノールおよびアニソールの溶液２０ｍを入れた反応器に乾燥樹脂を入れる。反応混合物を撹拌下に２時間保つ。濾過物を低容量に減らし、ペプチドをエーテルでの沈殿により抽出する。沈殿物を水に溶解し凍結乾燥させる。最後に、ペプチドを逆相クロマトグラフィーで精製し、０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（相Ｂ）の０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液（相Ａ）に対する３５分間でＢ中に５〜７０％の直線勾配で、１ｍｌ／分の流速で溶出するＶｙｄａｃ  Ｃ１８  ０．４６×２５ｃｍカラムを用い、２１０ｎｍでのＵＶ検出を用いて、分析ＨＰＬＣにより特徴決定する。保持時間（Ｒｔ）＝１１．８分；クロマトグラフィーによる純度＞９９％。ＦＡＢ−ＭＳ：（ＭＨ）+＝６５０。
【００３９】
実施例２
Ｌ１がｐＧｌｕであり、Ｘ1およびＸ３がＡｒｇであり、Ｘ2がＧｌｕであり、Ｘ4がＴｙｒである式Ｉの化合物であるＰＩＣＭ２の調製。ＰＩＣＭ２の％式は、よって、ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−ＯＨである。
【００４０】
０．５ｍｍｏｌのアミン基に等しい２．５ｇのＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｎｏｖａｓｙｎ−ＴＧＡ樹脂（０．２ｍｅｑ／ｇ）を用いて開始する自動ペプチド合成機を、合成に用いる。Ｆｍｏｃ基を、３分間および７分間の、ＤＭＦ中の３０％のピペリジンを用いる２連続段階で加水分解する。次いで、以下のアミノ酸を列挙する順序で反応させる：Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（０．９７４ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（０．６３８ｇ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（０．９７４ｇ）およびＦｍｏｃ−ｐＧｌｕ−ＯＨ（０．６３８ｇ）。
【００４１】
アシル化は１時間である。次いで、樹脂を洗浄し、反応物をカイザーニンヒドリンアッセイで試験する。応答が陰性であれば、Ｆｍｏｃ基を、次のアミノ酸をカップリングさせる前に上記のようにして加水分解する。全てのアミノ酸を、４ｍｌのＤＭＦ中に１．５ｍｍｏｌのアミノ酸を溶解することによりカップリングさせ、２ｍｌのＤＭＦ中の０．７８０ｇのＰｙＢｏｐ、２ｍｌのＤＭＦ中の０．２３０ｇのＨＯＢＴ、および２５０ｍｌのＤＩＥＡの溶液からなる活性化物質の混合物とともに、脱保護された樹脂に加える。樹脂からのペプチドの脱離および側鎖の付随的な脱保護のために、重量比で９：０．５：０．３：０．２のＴＦＡ、チオアニソール、メルカプトエタノールおよびアニソールの溶液２０ｍを入れた反応器に、乾燥樹脂を入れる。反応混合物を撹拌下に２時間保つ。濾過物を低容量に減らし、ペプチドを、エーテルでの沈殿により抽出する。沈殿物を水に溶解させ、凍結乾燥させる。最後に、ペプチドを逆相クロマトグラフィーで精製し、０．１％（ｖ／ｖ）のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（相Ｂ）の０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液（相Ａ）に対する３５分間でＢ中に５〜７０％の直線勾配で、１ｍｌ／分の流速で溶出するＶｙｄａｃ  Ｃ１８  ０．４６×２５ｃｍカラムを用い、２１０ｎｍでのＵＶ検出を用いて、分析ＨＰＬＣにより特徴決定する。保持時間（Ｒｔ）＝１２．８分；クロマトグラフィーによる純度＞９９％。ＦＡＢ−ＭＳ：（ＭＨ）+＝５８９。
【００４２】
実施例３
実施例１および２に記載される方法を用いて合成したペプチドの配列および特徴のデータ
表１は、通常のペプチド合成法に従って特定の配列に適切に適合させた、ＰＩＣＭ３〜ＰＩＣＭ３９およびＰＩＣＭ５４〜ＰＩＣＭ６７からなる実施例１に記載される方法、ならびにＰＩＣＭ４０〜ＰＩＣＭ５３からなる実施例２に記載される方法を用いて合成された一連のペプチドの配列および特徴のデータを示す。
【００４３】
【表１−１】
0005384342.tif 000002
【００４４】
【表１−２】
0005384342.tif 000003
【００４５】
【表１−３】
0005384342.tif 000004
【００４６】
実施例４
ＰＩＣＭ５７により及ぼされる細胞遊走の用量依存性阻害
ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞の細胞遊走に対する実施例３に記載されるＰＩＣＭ５７の影響を試験した。ポリビニルピロリドンを含まず、ビトロネクチン５μｇ／ｍｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で被覆した直径８μｍの孔を有するポリカーボネートフィルタ（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）を備えたボイデンチャンバを、文献（Carrieroら、Cancer Res. 59、5307、1999）に報告されるようにして用いた。血清を含まないＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中の３×１０4細胞を、ボイデンチャンバの上部の区画に入れた。下部のチャンバに、漸増濃度のＰＩＣＭ５７の存在下で、走化作用の供給源として１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清）を含有するＤＭＥＭを入れた。細胞を、５％ＣＯ2を含有する加湿空気中に、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後に、フィルタの上表面に接着した細胞を機械的に除去し、フィルタの下表面に接着している遊走した細胞をエタノールで固定し、ヘマトキシリンで染色し、フィルタあたり無作為に選択した１０視野で２００×で計数した。ＰＩＣＭ５７の不在下でのＦＢＳに応答した定方向遊走を１００％とし、細胞遊走に対するＰＩＣＭ５７の影響を、百分率で評価した。データは、２重に行った３回の独立した実験の平均を表す。ＦＢＳに向かうＨＴ１０８０細胞の遊走に対するＰＩＣＭ５７の拮抗的効果は、用量依存的である（表２）。これは、１ａＭの濃度で開始し、１ｆＭの濃度でその最大値の５０％に到達し、１０ｆＭの濃度で最大の効果に到達する（６６％の阻害）。
【００４７】
メタスチン［４５−５４］の存在下でのＦＢＳにより誘発される運動性を、同じ実験条件下で評価した（表３）。データは、ＰＩＣＭ５７よりも１，０００倍大きいメタスチン［４５−５４］濃度（１０ｎＭのメタスチン［４５−５４］に対して１０ｆＭのＰＩＣＭ５７）が、ＦＢＳへの定方向遊走の阻害の同等のレベルを得るために必要とされることを示す。
【００４８】
【表２】
0005384342.tif 000005
【００４９】
【表３】
0005384342.tif 000006
【００５０】
実施例５
株化細胞の種または組織発生起源に依存しない、ＰＩＣＭ１により誘発される細胞運動性の阻害
種々の組織に由来するヒトまたはマウス起源の株化細胞を、１００ｐＭのＰＩＣＭ１の存在／不在下で、実施例４に記載されるようなボイデンチャンバを用い、１０％ＦＢＳを走化性の供給源として用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ定方向遊走試験に供した。ＰＩＣＭ１の不在下でのＦＢＳに応答する定方向遊走を１００％とし、細胞遊走に対するＰＩＣＭ１の影響を、その値の百分率として評価した。データは、２重に行った２回の独立した実験の平均を表す。試験した全ての株化細胞において、細胞遊走に対するＰＩＣＭ１の阻害効果が観察された（表４）。阻害の程度は、用いた株化細胞間で異なるが、５０％未満になることはなく、メタスチンには応答しない（Ohtaki, T.ら（2001） Nature 411、613〜617）マウス黒色腫Ｂ１６細胞においても観察された。
【００５１】
【表４】
0005384342.tif 000007
【００５２】
実施例６
ＰＩＣＭ５７と予備インキュベートした細胞の運動性の阻害
ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞を、ＤＭＥＭ、または１００ｐＭのＰＩＣＭ５７を含有するＤＭＥＭと、０、１５、３０、６０または１２０分間インキュベートした。細胞を、ａ）ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄し、ｂ）５分間、２３℃で、５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ３．０で洗浄して、細胞表面からペプチドを除去し（Carriero.らClin. Cancer Res. 8、1299〜1308、1997）、次いでＰＢＳで洗浄した。細胞を、ＤＭＥＭに再懸濁し、１０％ＦＢＳを化学遊走物質として用いる、実施例４に記載されるボイデンチャンバでの細胞遊走試験に供した。結果（表５）を、ＦＢＳの不在下で遊走した（基本遊走）細胞（１００％とする）の百分率として表す。データは、２重に行った２回の独立した実験の平均を表す。ＰＩＣＭ５７との細胞の単純な予備インキュベーションは、ＦＢＳに向かって遊走するそれらの能力を大きく低減させる。実施例４に記載される阻害と同等の阻害のためには、１５分の曝露で十分である。１００ｐＭのＰＩＣＭ５７に１５または３０分間細胞を曝露した後の酸処理は、細胞運動性に対するＰＩＣＭ５７の阻害効果を完全になくす。
【００５３】
【表５】
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【００５４】
実施例７
ＰＩＣＭ５７が細胞運動性に対して及ぼす阻害は、ｆＭＬＰに対する高い親和性を有する受容体であるＦＰＲにより媒介される。
【００５５】
細胞遊走に対するペプチドＰＩＣＭ５７の影響を、細菌起源のホルミル化ペプチドであるｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）に対する高親和性受容体を欠くラット好塩基球性白血病細胞ＲＢＬ−２Ｈ３（Le, Y.、Gong、W.、Tiffany, H.L.、Tumanov, A.、Nedospasov, S.、Shen, W.、Dunlop, N.M.、Gao, J.L.、Murphy, P.M.、Oppenheim, J.J.、Wang, J.M. Amyloid (beta)42 activates a G-protein-coupled chemoattractant receptor, FPR-like-1. J. Neurosci. 21、RC123、2001）を用い、５０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンまたは１０ｎＭのｆＭＬＰを化学遊走物質として用いて、実施例４に記載されるようにボイデンチャンバにおいて試験した。結果は、ＦＢＳの不在下で遊走した（基本遊走）細胞（１００％とする）の百分率として表す。データは、２重に行った２回の独立した実験の平均を表す。文献に報告される知見に一致して、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞はフィブロネクチンに向かって遊走するが、ｆＭＬＰに向かって遊走しない。走化作用勾配への１００ｐＭのＰＩＣＭ５７の添加は、フィブロネクチン依存性細胞遊走を低減させない（表６）。これとは逆に、ＦＰＲのｃＤＮＡで安定的にトランスフェクションされたＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ＲＢＬ−２Ｈ３／ＥＴＦＲ）は、１０ｎＭのｆＭＬＰで構成される勾配で遊走する能力を獲得する。走化作用勾配への１００ｐＭのＰＩＣＭ５７の添加は、フィブロネクチン依存性細胞遊走を低減させないが、ｆＭＬＰに向かう細胞遊走を基本レベルまで低減させる（表６）。ＰＩＣＭ５７の標的がＦＰＲであるという決定的な証明は、結合アッセイにおいて、フルオレセイン標識ペプチドであるホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の、ＲＢＬ−２Ｈ３／ＥＴＦＲ細胞表面への結合が、細胞を１０μＭのＰＩＣＭ５７と予備インキュベートすることにより、具体的に６０％低減するという観察により導かれる。１０μＭのメタスチン［４５−５４］との細胞の予備インキュベーションは、フルオレセイン標識誘導体であるホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−ＬｙｓペプチドのＲＢＬ−２Ｈ３／ＥＴＦＲ細胞表面への結合を改変しない。
【００５６】
【表６】
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【００５７】
実施例８
細胞増殖に対するＰＩＣＭ５７の影響
ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞（１×１０3細胞／ウェル）を、１００ｐＭまたは１００ｎＭのＰＩＣＭ５７の存在／不在下で、９６ウェルプレートを用いて、ＤＭＥＭ  １０％  ＦＢＳ中で培養した。２４、４８、７２または９６時間で、非接着細胞を除去し、ＰＢＳで繰り返しすすいだ後に、プレートに接着した細胞を固定し、次いで、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、Ｓｉｇｍａ）を含有する滅菌溶液を用いて、３７℃で４時間染色した。染料を、次いで、１００μｌのジメチルスルホキシドを用いて除き、該当する光学密度を、分光光度計で５４０ｎｍで読み取った。両方の濃度のＰＩＣＭ５７の存在は、調べた時間のいずれにおいても、ＨＴ１０８０細胞の増殖指数（約１８時間の倍加時間）を改変しなかった（表７）。培地を除去し、１０％ＦＢＳ／ＰＩＣＭ５７の新鮮な溶液を４日連続で毎日細胞に与えた場合の並行した実験において、同じ結果が得られた。
【００５８】
【表７】
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【００５９】
実施例９
ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞の浸潤性に対するＰＩＣＭ１およびＰＩＣＭ５７の影響
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞浸潤試験を、７０μｇ／フィルタのマトリゲルおよび化学遊走物質として１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで被覆された、直径８μｍの孔を有する、ポリビニルピロリドンを含まないフィルタ（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）を用いて、ボイデンチャンバで行った（SilvestriらInt. J. Cancer 102、562〜571、2002）。ヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞（２×１０5細胞／試料）を、血清を含まない培地中で、チャンバの上部の区画においた。チャンバの下部の区画は、走化作用の供給源として１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭと、記載する濃度で試験される、アッセイされるペプチドとを含有した。このように組み立てられたチャンバを、５％ＣＯ2を含有する加湿環境下に、３７℃に配置した。１８時間後に、マトリゲルを通過してフィルタの下表面に接着した細胞を固定し、染色して計数した。データは、２重に行った２回の独立した実験の平均を表す。表８に示す結果は、ＦＢＳの存在下であるが、ペプチドの不在下でマトリゲルに浸潤した細胞（１００％）の百分率として表す。ＨＴ１０８０細胞の浸潤性に対するＰＩＣＭ１およびＰＩＣＭ５７の阻害効果は、用量依存性である。
【００６０】
【表８】
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【００６１】
実施例１０
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するＰＩＣＭ１およびＰＩＣＭ５７の阻害効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生試験を、血管新生促進因子の存在下で、拡張して重合マトリゲルの層上に微小管のネットワークを形成する索を形成する内皮細胞の能力を用いることにより行った。この型のアッセイのために、ウェルあたり５×１０4のＨＵＶＥＣ細胞（ヒト臍帯静脈内皮細胞）を、血管新生促進因子として用いる４０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）と、異なる濃度の記載したペプチドとの存在下で３００μｌのマトリゲルを放置して重合させた２４ウェルプレート内で培養した。小管の形成を、倒立顕微鏡を用いて、無作為に選択した少なくとも５つの視野で管状構造を計数することにより、５％ＣＯ2の下３７℃で１８時間のインキュベーションの後に評価した。ＶＥＧＦ依存性小管形成活性に対するペプチドの影響を、ＶＥＧＦの存在下で計数された管状構造の数（１００％とする）の百分率として計数する。データ（表９）は、２重に行った２回の実験の平均を表す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血管新生に対するＰＩＣＭ１およびＰＩＣＭ５７の拮抗効果は、用量依存性である。この効果は、ａＭの濃度で開始され、ｐＭの濃度でピーク作用に達する（計数された管状構造の数の２０％）。最大効果の５０％に、ｆＭの濃度で到達する。５０ｎＭのエンドスタチンにより及ぼされる抗血管新生効果、ならびにメタスチン［４５−５４］により及ぼされる低い阻害効果は、比較として示す。
【００６２】
【表９】
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【００６３】
実施例１１
ＰＩＣＭ５７の毒性
マウスに対するＰＩＣＭ５７の急性毒性試験は、２８ｍｇ／Ｋｇ（全ての動物が生存）と３２ｍｇ／Ｋｇ（全ての動物が死亡）の間の間隔に集中する３０ｍｇ／ＫｇのＬＤ５０を示す。ラットに対するＰＩＣＭ５７の急性毒性試験は、５８ｍｇ／Ｋｇ（全ての動物が生存）と７０ｍｇ／Ｋｇ（全ての動物が死亡）の間の間隔に集中する６５ｍｇ／ＫｇのＬＤ５０を示す。
【００６４】
実施例１２
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗転移効果
ＰＩＣＭ１の抗転移能力を、動物モデルにおいて評価した。実験モデルにおいて肺転移を引き起こす（Schweinitz Aら、J. Biol. Chem. 279:33613、2004）２×１０6のヒト線維肉腫ＨＴ１０８０細胞を、塩水溶液に懸濁し、２０匹の７週齢ＣＤ１ヌードマウスの尾静脈に注射した。腫瘍細胞の接種の２４時間後に、１０匹の動物の群を、４８時間ごとの、１００μｌの塩水溶液に溶解した３ｍｇ／ＫｇのＰＩＣＭ１の緩徐注射で処理し、動物を固定した。１０匹の対照動物は、塩水溶液のみの同じ注射処理を受けた。それぞれの動物を秤量し、毎日、呼吸困難について調べた。対照動物は、２２日後に呼吸困難の明確な徴候を示した。処理動物および対照動物の全てを屠殺し、解剖を行った。肺、肝臓、腎臓、脾臓および心臓を巨視的および微視的な分析に供した。対照動物または処理動物の調べた器官のいずれも、肺以外は組織形態学的変化を全く示さなかった。しかし、肺の巨視的分析により、対照動物において、壊死性および出血性の特徴をしばしば伴う広範な胸膜下再生組織形成が示され、これは処理動物では観察されなかった。微視的レベルでは、対照動物の肺生検の一連の切片が、平均で４５％の実質領域が、しばしば血管周囲で、中央に壊死領域を有する転移性小結節で占められていることを示した。逆に、微視的観察では、３ｍｇ／ＫｇのＰＩＣＭ１で処理した動物は、転移の存在を示さなかった。
【配列表】
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