(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1種の非凝集生体分子を含む不純調製物から、該生体分子を精製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）不純調製物を、カルシウム誘導体化形態としたアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させる段階、ならびに
（b）スルファート、ボラート、モノカルボキシラート、およびモノカルボキシル両性イオンからなる群より選択されるイオン種の存在下で、溶出を実施する段階。
【請求項２】
イオン種が、ボラートまたはスルファートである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
イオン種が、ラクテート、ピルバート、およびグルコナートからなる群より選択されるモノカルボキシラートである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
モノカルボキシラートが、乳酸ナトリウムまたは乳酸カリウムである、請求項3記載の方法。
【請求項５】
イオン種が、グリシン、プロリン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されるモノカルボキシル両性イオンである、請求項1記載の方法。
【請求項６】
モノカルボキシル両性イオンが、特定の精製のために選択されるpH範囲における緩衝に適したpKaを有し、主要な緩衝種として使用され、かつ50 mMより高い濃度で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
イオン種がボラートであり、かつボラートが有意な緩衝能を欠如するpHでボラートが存在する、請求項2記載の方法。
【請求項８】
イオン種がボラートであり、かつボラートが、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸カリウムとして供給され、pH 8.7以下で存在する、請求項7記載の方法。
【請求項９】
イオン種がボラートであり、かつボラートが有意な緩衝能を有するpHでボラートが供給され、かつボラートが50 mMより高い濃度で存在する、請求項2記載の方法。
【請求項１０】
ボラートが、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸カリウムであり、かつpH 8.7以上で存在する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
イオン種がボラートであり、かつボラートが主要な溶出イオンである、請求項2記載の方法。
【請求項１２】
イオン種がスルファートであり、かつスルファートが主要な溶出イオンである、請求項2記載の方法。
【請求項１３】
モノカルボキシラートが、主要な溶出イオンである、請求項3記載の方法。
【請求項１４】
モノカルボキシル両性イオンが、主要な溶出イオンである、請求項5記載の方法。
【請求項１５】
アパタイトクロマトグラフィー担体が、ヒドロキシアパタイトである、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
アパタイトクロマトグラフィー担体が、フルオロアパタイトである、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
溶出が、イオン種であるグリシン、アルギニン、尿素および非イオン性有機ポリマーを含まない1種または複数種のさらなる塩の存在下で実施される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
生体分子が、抗体または免疫反応性抗体断片である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
関心対象の生体分子が、15,000ダルトンより大きい分子量を有し、かつ9.5未満の等電点を有する、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
生体分子が、非リン酸化生体分子から精製されるリン酸化生体分子である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
生体分子が、ポリヌクレオチド、ワクチンまたは脂質エンベロープウイルスである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
生体分子が、核酸である、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1種の非凝集生体分子を含む不純調製物から、該生体分子を精製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）不純調製物をアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させる段階であって、生体分子と接触する際に、アパタイトクロマトグラフィー担体がカルシウム誘導体化形態である段階、および
（b）生体分子の溶出に先立ち、カルシウム誘導体化アパタイトクロマトグラフィー担体を、その天然形態に実質的に変換させる段階。
【請求項２４】
変換された天然形態のアパタイトクロマトグラフィー担体が、主要な溶出イオンとしてホスフェートを用いて溶出される、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
生体分子が、抗体または免疫反応性抗体断片である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも1種の非凝集生体分子を含む不純調製物から、該生体分子を精製するための方法であって、該生体分子がFabであり、以下の段階を含む方法：
（a）不純調製物をアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させる段階であって、生体分子と接触する際に、アパタイトクロマトグラフィー担体が天然形態である段階、および
（b）生体分子の溶出に先立ち、天然形態のアパタイトクロマトグラフィー担体をカルシウム誘導体化形態に実質的に変換させる段階。
【請求項２７】
アパタイトクロマトグラフィー担体をカルシウム誘導体化形態へと変換することが、関心対象の生体分子の溶出を引き起こす、請求項26記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、各々の全体が参照により本明細書に明確に組み入れられる、2008年1月18日出願の米国特許仮出願第61/011,513号；2008年1月28日出願の第61/062,663号；2008年3月19日出願の第61/069,859号；2008年3月27日出願の第61/070,841号；2008年7月24日出願の第61/135,787号；2008年8月20日出願の第61/189,467号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、特定の態様において、ボラート化合物、スルファート化合物、モノカルボキシラート化合物の一つもしくは複数の存在下で、および/またはカルシウム化合物の存在下で、アパタイトクロマトグラフィーによるリン酸化生体分子ならびに非リン酸化生体分子の分画または精製を向上させるための方法に関連する。特定の態様において、本発明は、非リン酸化産物からリン酸化混入物をより効果的に除去することを可能にし得る。他の態様において、本発明は、リン酸化産物から非リン酸化混入物をより効果的に除去することを可能にし得る。これらの態様または他の態様において、本発明は、分画している間のpH制御を改善する可能性がある。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ヒドロキシアパタイト［HA］は、Ca10(PO4)6(OH)2の構造式を有するリン酸カルシウムの結晶性無機物である。フルオロアパタイトは、ヒドロキシアパタイトをフッ素化してCa10(PO4)6F2の構造式を有する無機物を生成することによって、調製され得る。双方の無機物のタンパク質反応部位は、正に荷電した一対のカルシウムイオン（C部位）、および負に荷電した三つ組みのリン酸基（P部位）を包含する。C部位は、HAのカルシウムキレート化を通して、タンパク質のカルボキシルクラスターによって、タンパク質と相互作用する。C部位は、HAのカルシウム配位を通して、溶質のリン酸残基によって、DNA、エンドトキシン、リンタンパク質および脂質エンベロープウイルス等のリン酸化溶質と相互作用する。カルシウムキレート化および配位は、時にカルシウム親和性と呼ばれる。P部位は、ホスホリルの、正に荷電したタンパク質のアミノ酸残基との陽イオン交換を通して、タンパク質と相互作用する（Gorbunoff, Analytical Biochemistry 136 425 (1984)（非特許文献1）；Kawasaki, J. Chromatography 152 361 (1985)（非特許文献2））。ヒドロキシアパタイトは、最も一般的には、ホスフェート勾配を用いて溶出される。ホスフェートの強固なカルシウム親和性によって、カルシウムキレート化およびカルシウム配位の相互作用が中断され、一方ホスフェートのイオン特性によって、ホスホリルの陽イオン交換相互作用が中断される。一部の適用においては、ホスフェートおよび塩化物塩の組み合わせを用いてヒドロキシアパタイトを溶出する。クロライドは、カルシウム親和性相互作用に対して比較的小さい効果を有する一方で、ホスホリルの陽イオン交換相互作用を優先的に溶離する（Gagnon et al, Bioprocess International, 4(2) 50 (2006)（非特許文献3））。
【０００４】
天然ヒドロキシアパタイトおよび天然フルオロアパタイトは、ホスフェート非存在下での可溶性カルシウムへの曝露によって、カルシウム誘導体化形態に変換され得る（Gorbunoff, Anal. Biochem., 136 425 (1984)（非特許文献1））。これは、P部位を第二のC部位に変換し、ホスホリルの陽イオン交換相互作用を消失させ、C部位の数を増加させて、根本的にアパタイト担体の選択性を改変させる。リゾチーム（13.7〜14.7 Kda、pI 10.7）およびリボヌクレアーゼ（14.7 KDa、pI 9.5〜9.8）に代表される小型アルカリ性タンパク質は、カルシウム誘導体化アパタイトに結合することができないが、大部分の他のタンパク質は極めて強固に結合するため、3 M塩化カルシウムでさえも溶出を達成するのには不十分である（Gorbunoff（非特許文献1））。他の塩化物塩も、溶出を達成することができない。カルシウム誘導体化アパタイトはリン酸緩衝液への曝露によってその天然形態へと戻され、その時点では、天然アパタイト担体からの溶出のために一般に適用される方法によってこれらを溶出することが可能である。
【０００５】
所定のアパタイトの選択性に対する様々な塩の効果は、予測不可能である。例えば、ホスフェートの非存在下で、塩化ナトリウムは、1リットル当たり4モルを超える濃度であっても、天然ヒドロキシアパタイトからほとんどのIgGモノクローナル抗体を溶出することができない（Gagnon et al, 2006, Bioprocess International, 4(2)50（非特許文献3））。これは、極めて強固な結合であることを意味する。IgGは一般に、ホスフェート勾配のみにおいて、最後に溶出するタンパク質の一つであり、通常100〜150 mMのホスフェートが必要である。これも、強固な結合であることを意味する。しかしながら、より低い濃度の双方の塩の組み合わせ、例えば0.25 M塩化ナトリウムと50 mMホスフェートを用いて溶出する場合、IgGは、最も早く溶出するタンパク質の一つである。他のパラドックスによって以下の点が強まっている：ホスフェートの存在下で塩化ナトリウム濃度を増加させることは、IgGの結合を弱めるが、DNAに対しては逆の効果を有する（Gagnon et al, 2005, Bioprocess International, 3(7) 52-55（非特許文献4））。さらに、ウシ血清アルブミン（BSA）は、塩化ナトリウム濃度に関係なく約100 mMホスフェートで溶出し；かつ、リゾチームは、塩化ナトリウムの非存在下でBSAよりもより高いホスフェート濃度で溶出するが、1 M塩化ナトリウムの存在下では結合することができない。
【０００６】
硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムおよび他の硫酸塩は、タンパク質の沈降のため、または疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質にタンパク質を結合させるために、一般に使用される。それらはまた、プロテインA等の生物学的アフィニティークロマトグラフィー媒質との結合を増強するためにも使用可能であり、かつイオン交換体にタンパク質を結合させることまでも報告されている（Gagnon, 1996, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, ISBN 0-9653515-9-9（非特許文献5）；Mevarech et al, 1976, Biochemistry, 15, 2383-2387（非特許文献6）；Leicht et al, 1981, Anal. Biochem., 114, 186-192（非特許文献7）；Arakawa et al, 2007, J. Biochem. Biophys. Met., 70, 493-498（非特許文献8））。スルファートは、研究適用のための、低い濃度でのイオン交換体からの溶出に関して時折報告されているが、タンパク質沈降に関する懸念のため、調製適用においてはほとんど利用されていない（Kopaciewicz et al, 1983, J. Chromatogr., 266 3-21（非特許文献9）；Gooding et al, 1984, J. Chromatogr., 296, 321-328（非特許文献10）；Rounds et al, 1984, J. Chromatogr., 283 37-45（非特許文献11））。これらの方法はいずれも結合のためにカルシウム親和性を利用しないため、アパタイトに関する適切なモデルではない。
【０００７】
幾人かの著者は、「(NH4)2SO4・・の存在は、［ヒドロキシアパタイトからの］溶出に影響を及ぼさないように見受けられる」ことを結論付けている（Karlsson et al, 1989, in Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Chapter 4, ISBN 0-89573-122-3（非特許文献12））。この参考文献でさえも、あくまでホスフェート勾配の文脈において、スルファートの適用に言及している。主要な溶出塩としてホスフェートの代替物が文献中で考察されている稀な場合において、塩化カルシウム、クエン酸塩およびフッ化塩を含める示唆がなされているが、スルファートについては言及されていない（Gagnon, 1996（非特許文献5）；Karlsson et al, 1989（非特許文献12）；Gorbunoff（非特許文献1））。他の刊行物では、「・・SO3Hは、カルシウムと錯体を形成しない」ため、特に硫酸塩は、ヒドロキシアパタイトに対する主要な溶出剤として不適切であろうと述べられている（Gorbunoff（非特許文献1））。
【０００８】
ホウ酸塩も、同様に見落とされている。ボラートは、約8.8〜9.8のpH値（pK約9.24）で緩衝液として、クロマトグラフィーの分野において時折使用される。ボラートはまた、陰イオン交換体上でのシス−ジオール化合物の保持を選択的に増強させるように該シス−ジオール化合物の電荷特性を改変するために、アルカリ性pHでも稀に使用される。全てが約90 mS/cmのモル伝導率を呈するホスフェート、クロライドおよびスルファートとは異なり、pH 7での1 Mボラート溶液は、約9 mSのモル伝導率を有する。
【０００９】
アセテートは、凝集体からのIgGのヒドロキシアパタイト分離に関してクロライドと対比されており、低質の分画を与えることが見出されている（Gagnon et al, Practical issues in the industrial use of hydroxyapatite for purification of monoclonal antibodies, Poster, 22nd national meeting of the American Chemical Society, San Francisco, Sept 10-14, 2006 <http://www.validated.com/revalbio/pdffiles/ACS_CHT_02.pdf>（非特許文献13））。モノカルボン酸塩は他の点では無視されており、モノカルボキシル両性イオンの溶出能は、完全に見逃されてきている。
【００１０】
ヒドロキシアパタイトは、タンパク質、リンタンパク質、糖質、ポリヌクレオチドおよびウイルス粒子を含む、広範な種類の生体分子の精製のために使用される。カラムは通常平衡化され、試料は、低濃度のホスフェートを含む緩衝液中に適用される。吸着した生体分子は、通常、リン酸塩の漸増勾配で溶出される。あるいは、一部の生体分子は、塩化物塩の漸増勾配で溶出されうるが、どちらの溶出様式も、精製手法に対して不都合をもたらす。抗体がホスフェート勾配で溶出するような高いホスフェート濃度は、後に続く精製段階を妨げ得る強力な緩衝能を有する。一部の生体分子がクロライド勾配で溶出するような高い伝導率もまた、下流の段階を妨げ得る。後に続く精製段階への適用に適した調製物となるよう状態を改変するため、どちらの状況でも、溶出された生体分子を徹底的に希釈するか、または例えばダイアフィルトレーションによって緩衝液を交換するかのいずれかが必要となる。希釈および緩衝液交換は、プロセスの経済的側面に対して負影響を及ぼす。結果として、アパタイトクロマトグラフィー段階は、精製過程の末端に位置付けられることが多い。これにより、アパタイトクロマトグラフィー段階は、捕捉段階として考慮されない傾向にある。上記のことはまた、中間段階としてのHAの使用を妨げる。クロライド勾配のさらなるデメリットは、ヒドロキシアパタイトへのクロライドの適用によって、制御不可能なpH低下が引き起こされることである。酸性pHは、ヒドロキシアパタイトの破壊を引き起こし、かつそれに結合した生体分子に対して悪影響を与えるおそれがある。
【００１１】
生体分子の精製に伴うヒドロキシアパタイトの別の制限は、一部の生体分子に対する結合能が、高い伝導率値において低下することである。細胞培養上清の塩濃度、ならびにイオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー等の精製方法由来の生体分子含有画分の塩濃度は、特定の適用に関して有用でない可能性がある程度にまでヒドロキシアパタイトの結合能を低下させるのに十分な伝導率を与えるため、このことは、ヒドロキシアパタイトの汎用性を切に減少させる。ヒドロキシアパタイトカラムへ試料を適用する前に試料をダイアフィルトレーションまたは希釈することによって、このデメリットは解消され得るが、上述のように、これらの操作は、精製プロセス全体のコストを増大させる。あるいは、より大量のヒドロキシアパタイトを使用することによって、このデメリットは改善され得るが、これは、より大きなカラムおよびより大量の緩衝液を要することによって処理コストを増大させる。またこれにより、より大量の緩衝液中に抗体が溶出し、後に続く精製段階における全処理時間を増加させる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gorbunoff, Analytical Biochemistry 136 425 (1984)
【非特許文献２】Kawasaki, J. Chromatography 152 361 (1985)
【非特許文献３】Gagnon et al, Bioprocess International, 4(2) 50 (2006)
【非特許文献４】Gagnon et al, 2005, Bioprocess International, 3(7) 52-55
【非特許文献５】Gagnon, 1996, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, ISBN 0-9653515-9-9
【非特許文献６】Mevarech et al, 1976, Biochemistry, 15, 2383-2387
【非特許文献７】Leicht et al, 1981, Anal. Biochem., 114, 186-192
【非特許文献８】Arakawa et al, 2007, J. Biochem. Biophys. Met., 70, 493-498
【非特許文献９】Kopaciewicz et al, 1983, J. Chromatogr., 266 3-21
【非特許文献１０】Gooding et al, 1984, J. Chromatogr., 296, 321-328
【非特許文献１１】Rounds et al, 1984, J. Chromatogr., 283 37-45
【非特許文献１２】Karlsson et al, 1989, in Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Chapter 4, ISBN 0-89573-122-3
【非特許文献１３】Gagnon et al, Practical issues in the industrial use of hydroxyapatite for purification of monoclonal antibodies, Poster, 22nd national meeting of the American Chemical Society, San Francisco, Sept 10-14, 2006 <http://www.validated.com/revalbio/pdffiles/ACS_CHT_02.pdf>
【発明の概要】
【００１３】
特定の態様における本発明は、天然アパタイトクロマトグラフィー担体またはカルシウム誘導体化アパタイトクロマトグラフィー担体に不純調製物を接触させ、続いてスルファート、ボラート、モノカルボキシル有機酸塩、またはモノカルボキシル両性イオンであるイオン種の存在下で該担体を溶出することによって、不純調製物から所望の生体分子を分画または精製する方法に関する。特定の態様において、該イオン種は、溶出剤中の主要な溶出イオンである。特定の態様において、溶出剤は、溶出イオンとして実質的にホスフェートを含まない。
【００１４】
本発明の特定の態様において、不純調製物を、カルシウム誘導体化形態または天然形態のいずれかの状態であるアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させ、かつ生体分子の溶出に先立ち、アパタイト担体を他方の形態に変換する、不純調製物から生体分子を精製するための方法が提供される。
【００１５】
本発明の特定の態様において、分画または精製される所望の生体分子は、抗体でも抗体断片でもない生体分子である。
[本発明1001]
少なくとも1種の非凝集生体分子を含む不純調製物から、該生体分子を精製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）不純調製物をアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させる段階、ならびに
（b）ボラート、スルファート、モノカルボキシラート、およびモノカルボキシル両性イオンからなる群より選択されるイオン種の存在下で、溶出を実施する段階。
[本発明1002]
イオン種が、ボラートまたはスルファートである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
イオン種が、アセテート、プロピオナート、ラクテート、ピルバート、グルコナート、およびグルクロナートからなる群より選択されるモノカルボキシラートである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
モノカルボキシラートが、乳酸ナトリウムまたは乳酸カリウムである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
イオン種が、グリシン、プロリン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されるモノカルボキシル両性イオンである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
モノカルボキシル両性イオンが、特定の精製のために選択されるpH範囲における緩衝に適したpKaを有し、主要な緩衝種として使用され、かつ50 mMより高い濃度で存在する、本発明1001の方法。
[本発明1007]
イオン種がボラートであり、かつボラートが有意な緩衝能を欠如するpHでボラートが存在する、本発明1002の方法。
[本発明1008]
イオン種がボラートであり、かつボラートが、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸カリウムとして供給され、pH 8.7以下で存在する、本発明1007の方法。
[本発明1009]
イオン種がボラートであり、かつボラートが有意な緩衝能を有するpHでボラートが供給され、かつボラートが50 mMより高い濃度で存在する、本発明1002の方法。
[本発明1010]
ボラートが、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸カリウムであり、かつpH 8.7以上で存在する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
イオン種がボラートであり、かつボラートが主要な溶出イオンである、本発明1002の方法。
[本発明1012]
イオン種がスルファートであり、かつスルファートが主要な溶出イオンである、本発明1002の方法。
[本発明1013]
モノカルボキシラートが、主要な溶出イオンである、本発明1003の方法。
[本発明1014]
モノカルボキシル両性イオンが、主要な溶出イオンである、本発明1005の方法。
[本発明1015]
アパタイトクロマトグラフィー担体が、ヒドロキシアパタイトである、本発明1001の方法。
[本発明1016]
アパタイトクロマトグラフィー担体が、フルオロアパタイトである、本発明1001の方法。
[本発明1017]
アパタイトクロマトグラフィー担体が、天然形態である、本発明1001の方法。
[本発明1018]
アパタイトクロマトグラフィー担体が、カルシウム誘導体化形態である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
不純調製物をアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させる段階の後に、アパタイトクロマトグラフィー担体をカルシウム誘導体化形態に変換させる、本発明1001の方法。
[本発明1020]
アパタイトクロマトグラフィー担体が、天然形態とカルシウム誘導体化形態との間で平衡状態にある、本発明1001の方法。
[本発明1021]
溶出が、イオン種であるグリシン、アルギニン、尿素および非イオン性有機ポリマーを含まない1種または複数種のさらなる塩の存在下で実施される、本発明1001の方法。
[本発明1022]
生体分子が、抗体および免疫反応性抗体断片でない、本発明1001の方法。
[本発明1023]
生体分子が、アパタイトクロマトグラフィー担体のカルシウム誘導体化形態に結合しない、本発明1001の方法。
[本発明1024]
関心対象の生体分子が、15,000ダルトンより大きい分子量を有し、かつ9.5未満の等電点を有する、本発明1023の方法。
[本発明1025]
生体分子が、非リン酸化生体分子から精製されるリン酸化生体分子である、本発明1001の方法。
[本発明1026]
生体分子が、ポリヌクレオチド、ワクチンまたは脂質エンベロープウイルスである、本発明1025の方法。
[本発明1027]
生体分子が、核酸である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
少なくとも1種の非凝集生体分子を含む不純調製物から、該生体分子を精製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）不純調製物をアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させる段階であって、生体分子と接触する際に、アパタイトクロマトグラフィー担体がカルシウム誘導体化形態である段階、および
（b）生体分子の溶出に先立ち、カルシウム誘導体化アパタイトクロマトグラフィー担体を、その天然形態に実質的に変換させる段階。
[本発明1029]
変換された天然形態のアパタイトクロマトグラフィー担体が、主要な溶出イオンとしてホスフェートを用いて溶出される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
生体分子が、抗体および免疫反応性抗体断片でない、本発明1029の方法。
[本発明1031]
少なくとも1種の非凝集生体分子を含む不純調製物から、該生体分子を精製するための方法であって、以下の段階を含む方法：
（a）不純調製物をアパタイトクロマトグラフィー担体に接触させる段階であって、生体分子と接触する際に、アパタイトクロマトグラフィー担体が天然形態である段階、および
（b）生体分子の溶出に先立ち、天然形態のアパタイトクロマトグラフィー担体をカルシウム誘導体化形態に実質的に変換させる段階。
[本発明1032]
アパタイトクロマトグラフィー担体をカルシウム誘導体化形態へと変換することが、関心対象の生体分子の溶出を引き起こす、本発明1031の方法。
[本発明1033]
生体分子が、抗体および免疫反応性抗体断片でない、本発明1031の方法。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明のいくつかの態様の利点は、以下を包含する：（1）カルシウム誘導体化アパタイトは、高い伝導率値においてさえ、ほとんどの生体分子に対して天然ヒドロキシアパタイトよりも高い結合能を有し、これにより、捕捉方法として、または、イオン交換クロマトグラフィーもしくは疎水性相互作用クロマトグラフィー等の別の分画段階からの高塩溶出に続く中間分画段階として、アパタイトクロマトグラフィーがより効果的になる；（2）カルシウム誘導体化アパタイトはまた、天然アパタイトがそのように実施できない状況において、凝集体の除去を含む効果的な生体分子の分画を可能にし得る固有の選択性ももたらす；（3）生体分子は、溶出に対する特定の選択性を達成するために次にカルシウム誘導体化形態に変換される、天然アパタイト担体に結合され得る、または；（4）生体分子は、溶出のために次に天然形態に変換される、カルシウム誘導体化アパタイト担体に結合され得る。（5）スルファート、ボラート、および、特定のモノカルボン酸またはモノカルボキシル両性イオンは、ホスフェートの非存在下で、アパタイト担体から生体分子を溶出させることが可能である；（6）スルファート、ボラート、および、特定のモノカルボン酸またはモノカルボキシル両性イオンの存在下での溶出は、生体分子の効果的な分画を可能にする固有の選択性をもたらし、該分画は、ホスフェートを用いた溶出またはホスフェートおよびクロライドの組み合わせによる溶出によっては適切に機能し得ない；（7）ボラートは、低い伝導率値での生体分子の溶出を可能にし、かつ中性pHで著しい緩衝能を課すことなくそのようにし、それによってダイアフィルトレーション等の仲介段階の必要なくして、溶出した生体分子を後に続くイオン交換クロマトグラフィー段階において使用することを容易にする；（8）ボラートおよび、特定のモノカルボン酸またはモノカルボキシル両性イオンは、pHに対するクロライドの影響を相殺するために使用され得る、アパタイトとの接触によるpH上昇を生じ、それによって、そうでなければクロライドの導入に伴って生じるpH低下を緩和するか、または消失させる；（9）スルファートは、リン酸化生体分子の保持を差次的に向上させ、それによって、非リン酸化生体分子からのそれらの分離を増大させる。
【００１７】
特定の態様において、イオン種はボラートである。特定の態様において、ボラートは、ホウ酸ナトリウムまたはホウ酸カリウムである。特定のそのような態様において、主要な溶出イオンはボラートである。特定の態様において、ボラートは、自身が実質的な緩衝能を欠如するpHで存在する；特定のそのような態様において、pHは8.7未満である。特定の他の態様において、ボラートは、50 mMより多く、かつ自身が実質的な緩衝能を有するpHで存在する；特定のそのような態様において、pHは8.7かまたはそれ以上である。
【００１８】
特定の態様において、イオン種はスルファートである。特定の態様において、スルファートは、硫酸ナトリウムまたは硫酸カリウムである。特定の態様において、スルファートは、主要な溶出イオンである。
【００１９】
特定の態様において、イオン種はモノカルボン酸塩である。特定のそのような態様において、モノカルボン酸陰イオンは、ホルマート、アセテート、ラクテート、スクシナート、ピルバート、グルコナート、グルクロナートまたはプロピオナートである。特定の態様において、モノカルボキシラートは主要な溶出イオンである。
【００２０】
さらに他の態様において、イオン種は、モノカルボキシル両性イオンである。特定のそのような態様において、モノカルボキシラート（monocarboxylate）両性イオンはグリシン、プロリン、リジンまたはヒスチジンである。
【００２１】
いくつかの態様において、生体分子の調製物は、所望の生体分子および混入物の結合を可能にし、溶出勾配の適用によって次に精製が達成される条件下で、アパタイトクロマトグラフィー担体に適用されてもよい。このクロマトグラフィー様式は、結合−溶出様式と呼ばれることが多い。
【００２２】
いくつかの態様において、所望の生体分子の結合を妨げる一方で、混入物が結合する条件下で、不純な生体分子の調製物をアパタイトクロマトグラフィー担体に適用してもよい。この適用の様式は、フロースルー様式と呼ばれることが多い。結合した混入物はその後、清浄段階によってカラムから除去されてもよい。
【００２３】
適切なアパタイトクロマトグラフィー担体は、天然ヒドロキシアパタイト、カルシウム誘導体化ヒドロキシアパタイト、天然フルオロアパタイト、およびカルシウム誘導体化フルオロアパタイトを包含する。
【００２４】
特定の態様において、溶出は、ボラート、スルファートまたはモノカルボン酸もしくはモノカルボキシル両性イオン等のイオン種の濃度を増大させる手段のみによって達成されてもよい。特定のそのような態様において、そのような溶出は、溶出イオンとして例えばボラートまたはスルファート等の単一のイオン種を用いて達成される。
【００２５】
いくつかの態様において、溶出は、カルシウム、マグネシウム、ホスフェート、スルファート、クロライド、モノカルボン酸もしくはモノカルボキシル両性イオン、アルギニン、グリシン、尿素、または非イオン性有機ポリマーと組み合わせたボラートによって、達成されてもよい。
【００２６】
いくつかの態様において、溶出は、カルシウム、マグネシウム、ホスフェート、ボラート、クロライド、モノカルボン酸もしくはモノカルボキシル両性イオン、アルギニン、グリシン、尿素、または非イオン性有機ポリマーと組み合わせたスルファートによって、達成されてもよい。
【００２７】
いくつかの態様において、溶出は、カルシウム、マグネシウム、ホスフェート、ボラート、スルファート、クロライド、アルギニン、グリシン、尿素、もしくは非イオン性有機ポリマーと組み合わせたモノカルボン酸またはモノカルボキシル両性イオンによって、達成されてもよい。
【００２８】
特定の態様において、生体分子を含む不純調製物から該生体分子を精製するための方法は、（a）アパタイトクロマトグラフィー担体に、不純調製物を接触させる段階であって、アパタイトクロマトグラフィー担体が生体分子と接触する際にカルシウム誘導体化形態である段階、および（b）生体分子の溶出に先立ち、カルシウム誘導体化アパタイトクロマトグラフィー担体をその天然形態に実質的に変換させる段階、を包含する。特定のそのような態様において、生体分子は、主要な溶出イオンとしてのホスフェートと共に溶出される。
【００２９】
特定の態様において、非凝集生体分子を含む不純調製物から該生体分子を精製するための方法は、（a）アパタイトクロマトグラフィー担体に、不純調製物を接触させる段階であって、アパタイトクロマトグラフィー担体が生体分子と接触する際に天然形態である段階、および（b）生体分子の溶出に先立ち、天然形態のアパタイトクロマトグラフィー担体をカルシウム誘導体化形態に実質的に変換させる段階、を包含する。特定のそのような態様において、アパタイトクロマトグラフィー担体のカルシウム誘導体化形態への変換は、関心対象の生体分子の溶出を引き起こす。
【００３０】
特定の態様において、関心対象のリン酸化生体分子は、本発明の方法によって非リン酸化生体分子から分離される。他の態様において、関心対象の非リン酸化生体分子は、本発明の方法によってリン酸化生体分子から分離される。
【００３１】
本発明の態様は、限定はされないが、サイズ排除クロマトグラフィー、プロテインAおよび他の形態のアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合様式（mixed mode）クロマトグラフィーおよび様々な濾過方法を含む、一つまたは複数の他の精製方法と組み合わせて実施されてもよい。これらの方法に対して適切な条件を開発し、特定の抗体または抗体断片の精製を達成するために、それらを本明細書に記載される本発明と統合することは、当業者の能力の範囲内である。
【００３２】
本発明がより容易に理解され得るように、用語が定義される。さらなる定義は、本開示全体に渡って記載される。
【００３３】
「アパタイトクロマトグラフィー担体」とは、クロマトグラフィーの実施に適した物理的形態のリン酸カルシウム無機物を意味する。限定はされないが、例として、ヒドロキシアパタイトおよびフルオロアパタイトが挙げられる。この定義は、天然形態およびカルシウム誘導体化形態両方のアパタイトクロマトグラフィー担体を包含することが理解される。
【００３４】
「塩」とは、負に荷電した陰イオンと正に荷電した陽イオンとの組み合わせによって形成される、水溶性イオン化合物を意味する。陰イオンまたは陽イオンは、有機系または無機系であってもよい。有機系の陰イオンは、限定はされないが、アセテート、ラクテート、マレアート、およびスクシテートを包含する。無機系の陰イオンは、限定はされないが、クロライド、ボラート、スルファートおよびホスフェートを包含する。有機系の陽イオンは、限定はされないが、アルギニンおよびリジンを包含する。無機系の陽イオンは、限定はされないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよび鉄を包含する。
【００３５】
「ボラート」とは、限定はされないが、ホウ酸、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム等の、ホウ素と酸素のイオン性化合物を意味する。
【００３６】
「ホスフェート」とは、限定はされないが、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム等の、リン（V）オキソ酸ベースの塩を意味する。
【００３７】
「スルファート」とは、限定はされないが、硫酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウム等の、硫黄（VI）オキソ酸ベースの塩を意味する。
【００３８】
「クロライド」とは、限定はされないが、塩化ナトリウムおよび塩化カリウム等の塩を意味する。
【００３９】
「モノカルボン酸塩」または「モノカルボキシラート」とは、限定はされないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、ピルビン酸、グルコン酸、またはグルクロン酸のナトリウム塩またはカリウム塩を含む、単一のカルボン酸部分を有する有機酸塩を意味する。
【００４０】
「モノカルボキシル両性イオン」とは、単一のカルボキシル部分と、正電荷を有する少なくとも一つの部分とを含む分子を意味する。限定はされないが、適切な例は、アミノ酸であるグリシン、プロリン、リジンおよびヒスチジンを包含する。
【００４１】
「非イオン性有機ポリマー」とは、有機組成物の任意の非荷電性の線状ポリマーまたは分岐ポリマーを意味する。限定はされないが、例として、様々な分子量の、デキストラン、デンプン、セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコール、およびポリエチレングリコールが挙げられる。ポリエチレングリコールは、構造式HO-(CH2-CH2-0)n-Hを有する。限定はされないが、例として、100〜10,000ダルトンの範囲の平均ポリマー分子量を有する組成物が挙げられる。市販のPEG調製物の平均分子量は、一般的にハイフンで結んだ接尾部によって示される。例えばPEG−600とは、約600ダルトンの平均分子量を有する調製物を意味する。
【００４２】
「緩衝化合物」とは、水溶液のpHを特定の範囲内で安定化させる目的で利用される化学物質を意味する。ホスフェートは、緩衝化合物の一つの例である。他の一般的な例は、限定はされないが、アセテート、モルホリノエタンスルホン酸（MES）、トリス−ヒドロキシアミノメタン（Tris）、およびヒドロキシエチルピペラジンスルホン酸（HEPES）等の化合物を包含する。
【００４３】
「緩衝液」とは、クロマトグラフィー担体の制御を媒介する特定の一連の条件を確立するために必要とされる、緩衝化合物および他の成分を含む水性配合物を意味する。「平衡化緩衝液」という用語は、クロマトグラフィー操作のための初期の操作条件を作出するために配合された緩衝液を意味する。「洗浄緩衝液」とは、未結合の混入物をクロマトグラフィー担体から除くために配合された緩衝液を意味する。「溶出緩衝液」とは、一種または複数種の生体分子を、クロマトグラフィー担体から除くために配合された緩衝液を意味する。
【００４４】
「生体分子」とは、生物由来の任意の分子、それらの複合体またはそれらの断片的形態を意味する。
【００４５】
「リン酸化生体分子」とは、少なくとも一つのリン酸残基を包含する任意の生体分子、それらの複合体またはそれらの断片的形態を意味する。リン酸化は、天然のものであっても、または化学修飾によって誘導されてもよい。限定はされないが、例として、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、エンドトキシン、脂質エンベロープウイルス、リンタンパク質、リンペプチド、リン酸化アミノ酸、（脂質部分がリン酸化されている）リポタンパク質、リン脂質、グリコホスフェート、および糖リン脂質が挙げられる。
【００４６】
「非リン酸化生体分子」とは、リン酸残基がない任意の生体分子、それらの複合体またはそれらの断片的形態を意味する。限定はされないが、例として、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および糖質が挙げられる。タンパク質の例は、限定はされないが、抗体、酵素、増殖調節因子、および凝固因子を包含する。
【００４７】
「生体分子調製物」とは、混入物から分画されることが望まれる生体分子を含む、任意の組成物を意味する。
【００４８】
「抗体」とは、任意の免疫グロブリンまたはその複合体形態を意味する。該用語は、限定はされないが、天然形態または遺伝学的に改変された形態、例えばヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、変異型抗体、移植抗体およびインビトロで生成された抗体を含む、ヒトまたは他の哺乳動物細胞株由来の、クラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を包含してもよい。「抗体」はまた、限定はされないが、免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質を含む複合体形態も包含してもよい。
【００４９】
「抗体断片」とは、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、mAb、dAbまたは抗原結合機能を保持する他の組成物等の任意の抗体断片を意味する。抗体断片はヒトまたは他の哺乳動物細胞株に由来してもよく、天然形態または遺伝学的に改変された形態、例えばヒト化抗体断片、ヒト抗体断片、キメラ抗体断片、合成抗体断片、組換え抗体断片、ハイブリッド抗体断片、変異型抗体断片、移植抗体断片、および限定はされないが、細菌細胞株、昆虫細胞株、植物細胞株、酵母細胞株、または他の生物源の細胞株を含む供給源からインビトロで生成された抗体断片を含む。抗体断片はまた、限定はされないが、フィシン、パパイン、またはペプシン等の酵素を用いた、精製済み抗体の制御された溶解によって誘導されてもよい。
【００５０】
本明細書に記載の本発明に関連して、「結合−溶出様式」という用語は、適用時に所望の生体分子および混入物がカラムに結合し、続いて緩衝液条件の改変によって分画が達成されるように、緩衝液条件が確立される、クロマトグラフィーに対する操作アプローチを意味する。
【００５１】
本明細書における本発明に関連して、「フロースルー様式」という用語は、適用時に所望の生体分子はカラムを通過するが一方混入物は選択的に保持され、したがって混入物の除去が達成されるように、緩衝液条件が確立される、クロマトグラフィーに対する操作アプローチを意味する。
【００５２】
「分析的適用」とは、研究、診断もしくは治療に関連する情報を得るために特定の調製物における所望の分子の量を同定しかつ/または測定する目的で、本発明が実施される状況を意味する。
【００５３】
「調製的適用」とは、研究、診断または治療用途のために無傷の非凝集抗体を精製する目的で、本発明が実施される状況を意味する。そのような適用は、バッチ当たり、ミリグラム〜キログラムの抗体の範囲の、任意の規模で実施されてもよい。
【００５４】
材料
1．アパタイトクロマトグラフィー担体
様々なアパタイトクロマトグラフィー担体が市販されており、そのいずれもが本発明の実施において使用され得る。限定はされないが、これらは、ヒドロキシアパタイトおよびフルオロアパタイトを包含する。「セラミック」ヒドロキシアパタイト（CHT（商標））または「セラミック」フルオロアパタイト（CFT（商標））は、ナノ結晶を粒子へと凝集させ、高温で融合させて、クロマトグラフィー適用に適した安定なセラミック微小球を生成する、各々の無機塩の形態を意味する。セラミックヒドロキシアパタイトの市販の例は、限定はされないが、CHT I型およびCHT II型を包含する。フルオロアパタイトの市販の例は、限定はされないが、CFT II型を包含する。特定されない限り、CHTおよびCFTは、限定はされないが、10、20、40および80ミクロンを含む任意の直径のほぼ球状の粒子を意味する。HA Ultrogel（商標）は、孔質アガロース微小球中に埋め込まれた非セラミックヒドロキシアパタイトの微小断片を含む製品を意味する。
【００５５】
特定の分画に適した、ヒドロキシアパタイトまたはフルオロアパタイトの選択、型の選択、および平均粒子径の選択は、当業者によって実験を通して決定され得る。
【００５６】
本発明は、ヒドロキシアパタイトもしくはフルオロアパタイトを含む充填層カラム中で、ヒドロキシアパタイトもしくはフルオロアパタイトを含む流動層/膨張層（expanded bed）カラム中で、および/または、ヒドロキシアパタイトもしくはフルオロアパタイトが特定期間溶液と混合されるバッチ操作中に、実施され得る。
【００５７】
特定の態様において、カラム中に充填されたCHTまたはCFTを利用する。
【００５８】
特定の態様において、特定の抗体調製物または特定の抗体断片調製物の結合特性および溶出特性に対する様々な緩衝液条件の効果を評価するために、内径約5 mmおよび高さ約50 mmのカラム中に充填されたCHTまたはCFTを利用する。
【００５９】
特定の態様において、調製的適用を支援するために必要とされる任意の寸法のカラム中に充填されたCHTまたはCFTを利用する。特定の適用の必要性に応じて、カラムの直径は、1 cmから、1メートルを上回る範囲であってもよく、かつカラムの高さは、5 cmから、30 cmを上回る範囲であってもよい。
【００６０】
適切なカラムの寸法は、当業者によって決定され得る。
【００６１】
2．生体分子調製物
本発明を適用可能な生体分子調製物は、天然供給源、合成供給源、または組換え供給源由来の、未精製の生体分子または部分的に精製された生体分子を包含してもよい。未精製の調製物は、限定はされないが、血漿、血清、腹水、乳汁、植物抽出物、細菌溶解物、酵母溶解物、または条件細胞培養培地を含む様々な供給源に由来し得る。部分的に精製された調製物は、クロマトグラフィー段階、沈降段階、他の分画段階または前記の任意の組み合わせのうち少なくとも一つによって処理された未精製の調製物に由来し得る。クロマトグラフィー段階では、限定はされないが、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、または混合様式クロマトグラフィーを含む任意の方法を利用してもよい。沈降段階は、塩沈降もしくはPEG沈降、または有機酸、有機塩基もしくは他の物質を用いた沈降を包含してもよい。他の分画段階は、限定はされないが、結晶化、液液分配、または膜濾過を包含してもよい。
【００６２】
B．方法の説明
生体分子調製物をアパタイト担体に接触させるための調製において、通常、カラム内部の化学環境を平衡化することが必要である。これは、適切なpH、伝導率、塩濃度；ならびに/または非イオン性有機ポリマーの同一性、分子量および濃度を確立するために平衡化緩衝液をカラムに流すことによって達成される。
【００６３】
結合−溶出様式において実施される適用のための平衡化緩衝液は、約5〜50 mMの濃度のリン酸塩または約2〜5 mMの濃度のカルシウム塩を包含してもよいが、ホスフェートとカルシウムの混合物は包含しない。約0.01〜50％の濃度の非イオン性有機ポリマー、および適切なpH制御をもたらす緩衝化合物を、任意で包含してもよい。緩衝化合物は、限定はされないが、MES、HEPES、BICINE、イミダゾールおよびTrisを包含してもよい。ヒドロキシアパタイトのための平衡化緩衝液のpHは、pH約6.5〜pH9.0の範囲であってもよい。フルオロアパタイトのための平衡化緩衝液のpHは、pH約5.0〜pH9.0の範囲であってもよい。
【００６４】
一つの態様において、平衡化緩衝液は、約20〜50 mMの濃度のMESまたはHepesの存在下または非存在下で、pH 6.7で約5 mMの濃度のリン酸ナトリウムを含む。
【００６５】
一つの態様において、平衡化緩衝液は、約20〜50 mMの濃度でpH約7.0のHepesの存在下で、約2.5 mMの濃度のカルシウム塩を含む。
【００６６】
生体分子調製物はまた、本発明が実施される前に、カラム平衡化緩衝液に適合する状態に平衡化されてもよい。これは、pHの調整、塩濃度および他の化合物の濃度の調整からなる。
【００６７】
カラムおよび生体分子調製物が平衡化された後、生体分子調製物をカラムと接触させてもよい。調製物は、限定はされないが、約50〜600 cm/ 時間の範囲の線流速で適用されてもよい。適切な流速は、当業者によって決定され得る。
【００６８】
結合−溶出様式の一つの態様において、カラムにロードされている間特定の結合選択性を得るためにホスフェート中で平衡化されたカラムを、特定の溶出選択性を得るためにカルシウムに交換してもよい。または、特定の結合選択性を得るためにカルシウムに対して平衡化され、続いて特定の溶出選択性を得るためにホスフェートに交換されるカラムを用いて、その逆を実施してもよい。
【００６９】
フロースルー様式の一つの態様において、非凝集生体分子はカラムを通過して収集されるが、一方で凝集生体分子はカラムに結合する。生体分子の調製に続いて、通常は平衡化緩衝液と同一組成である洗浄緩衝液が用いられる。これは、残留している非凝集生体分子を、収集可能となるようにカラムから移動させる。保持されている凝集体は、数ある清浄緩衝液の中でも約500 mMのリン酸ナトリウムの清浄緩衝液を用いて、任意でカラムから除去されてもよい。
【００７０】
結合−溶出様式において実施される適用の一つの態様において、望ましくない生体分子、無傷の非凝集生体分子、および凝集生体分子のいくつかの組み合わせが、カラムに結合する。生体分子の調製に続いて、通常は平衡化緩衝液と同一組成である洗浄緩衝液が用いられる。これによって、保持されていない混入物がカラムから除去される。望ましくない生体分子断片は、無傷の非凝集生体分子を除去することなく断片を除去する洗浄緩衝液によって選択的に除かれてもよい。続いて、無傷の非凝集生体分子は、凝集生体分子をカラムに結合させたままにする条件下で、カラムから溶出される。保持されている凝集体を、数ある清浄緩衝液の中でも約500 mMリン酸ナトリウムの清浄緩衝液を用いて、カラムから除去してもよい。
【００７１】
結合−溶出様式の一つの態様において、洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液とは異なる配合を有してもよい。
【００７２】
使用後、アパタイトカラムを任意で清浄し、無菌化し、適切な物質中に保管してもよい。
【００７３】
所望のレベルの生体分子純度を達成するために、本発明は、他の精製方法と組み合わせて実施されてもよい。本発明は、一連の2つ以上の精製法における任意の時点で実施されてもよい。
【実施例】
【００７４】
C．実施例
生体分子の調製物ごとに、クロマトグラフィーの挙動に相当な変動が生じる。これは、望ましくない生体分子混入物、無傷の生体分子、生体分子断片および生体分子凝集体の組成および割合の変動、ならびに様々な成分の個別の保持特性の変動を包含する。このため、各状況において本発明を最も効果的に適用するために、緩衝液条件をカスタマイズすることが必要になる。これは、pH、塩濃度、緩衝液成分の濃度、および非イオン性有機ポリマーの含有量の調整を包含し得る。様々なパラメーターおよび成分に対する適切なレベルは、様々なアプローチによって系統的に決定され得る。以下の実施例は、例示的な目的でのみ提供される。
【００７５】
実施例1．天然ヒドロキシアパタイトとカルシウム誘導体化ヒドロキシアパタイトの動的結合能の比較
CHT II型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、3 mM CaCl2、pH 6.7を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。プロテインA精製されたIgGモノクローナル抗体の試料を、抗体1に対して平衡化緩衝液4の割合でインライン希釈によって前記カラムに適用した。5％破過（breakthrough）での動的破過容量は、ヒドロキシアパタイト114 mg／mLであった。20 mM Hepes、3 mM CaCl2、1 M NaCl、pH 6.7の平衡化緩衝液を用いて前記実験を反復した。5％破過での動的容量は、43 mg／mLであった。5 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7の平衡化緩衝液を用いて、前記実験を反復した。5％破過での動的容量は、29 mg／mLであった。5 mMリン酸ナトリウム、1 M NaCl、pH 6.7の平衡化緩衝液を用いて、前記実験を反復した。5％破過での動的容量は、3 mg／mLであった。この実施例は、カルシウム誘導体化アパタイトによって達成される抗体結合能の劇的な向上を示す。カルシウムの代わりにマグネシウムを用いることによって類似の利点を得ることができることが、当業者によって認識されると考えられる。
【００７６】
実施例2．ボラート勾配を用いて溶出される、天然ヒドロキシアパタイト上での細胞培養上清からの生体分子の精製
CHT I型、40ミクロン、直径8 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、5 mMリン酸ナトリウム、20 mM Hepes、pH 7.0を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。約0.22μmの孔を有する膜を用いて事前に濾過され、平衡化緩衝液とほぼ同一条件にダイアフィルトレーションされた哺乳動物細胞培養上清からなるモノクローナル抗体調製物を、前記カラムに適用した。1Mホウ酸ナトリウム、5 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0まで、直線勾配でカラムを溶出した。混入タンパク質の大部分は、抗体より前に溶出した。非凝集抗体は、約5 mS／cmの平均伝導率で溶出した。凝集体は、より後に溶出した。カラムを500 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0を用いて清浄した。溶出された抗体はさらなる精製法によってさらに精製され得ること、ならびに、溶出された抗体画分の低い伝導率および低い緩衝能によってそのような方法が容易になるであろうことが、当業者によって認識されると考えられる。
【００７７】
実施例3．モノカルボン酸（ラクテート）勾配を用いて溶出される、天然ヒドロキシアパタイト上での細胞培養上清からの生体分子の精製
CHT I型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、5 mMリン酸ナトリウム、20 mM Hepes、pH 7.0を用いて、600 cm／時間の線流速で平衡化した。約0.22μmの孔を有する膜を用いて事前に濾過された、哺乳動物細胞培養上清からなる100マイクロリットルのモノクローナル抗体調製物を前記カラムに注入し、2カラム容量の平衡化緩衝液を用いてカラムを洗浄した。1 M乳酸ナトリウム、20 mM Hepes、pH 7.0まで、20カラム容量の直線勾配でカラムを溶出した。混入タンパク質の大部分は抗体より前に溶出し、かつ残留物の大部分はより後に溶出した。非凝集抗体は、約20 mS／cmの平均伝導率で溶出した。凝集体は、より後に溶出した。カラムを500 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0を用いて清浄した。
【００７８】
実施例4．ボラート勾配を用いて溶出される、天然ヒドロキシアパタイト上での細胞培養上清からの生体分子の精製
同一の緩衝液および異なるIgGモノクローナル抗体を用いて、同一のカラムを調製した。混入タンパク質の大部分は以前と同様に溶出したが、約70％の抗体のみが勾配の範囲内で溶出し、残りは、500 mMホスフェートによる清浄段階中に凝集体と共に溶出した。平衡化緩衝液および溶出緩衝液中のホスフェートを20 mMとして、前記操作を反復した。これらの条件下で、80％を上回る抗体が勾配の範囲内で溶出し、残りは500 mMホスフェートの清浄段階中に凝集体と共に溶出した。平衡化緩衝液および溶出緩衝液中のホスフェートを30 mMとして、前記操作を反復した。これらの条件下で、90％を上回る抗体が勾配の範囲内で溶出したが、一方で少量の抗体は500 mMのホスフェートによる清浄段階中に凝集体と共に溶出した。この実施例は、ホスフェートの非存在下でまたは低いホスフェート濃度では勾配の範囲内で全てが溶出しない可能性がある抗体に対して手法を適合化させる、一つの方法を示す。ホスフェート濃度は、必要に応じてより増加されてもよい。代替的にまたは追加的に、ボラートの濃度および／または溶出緩衝液のpHが増加されてもよい。ボラートで溶出された産物は伝導率および緩衝能が低いために、塩化ナトリウム勾配での溶出よりも、後に続く陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製により適していることが、当業者によって認識されると考えられる。ボラートを、塩化ナトリウムより低いモル伝導率を有するモノカルボン酸またはモノカルボキシル両性イオンで置き換えることによって、類似の利点がもたらされ得ることが、同等に認識されると考えられる。
【００７９】
実施例5．ボラート勾配を用いて溶出される、カルシウム誘導体化ヒドロキシアパタイト上での細胞培養上清からの生体分子の精製
CHT I型、40ミクロン、直径8 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、2.5 mM塩化カルシウム、20 mM Hepes、pH 7.0を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。約0.22μmの孔を有する膜を用いて事前に濾過され、平衡化緩衝液とほぼ同一条件にダイアフィルトレーションされた細胞培養上清からなるモノクローナル抗体調製物を、前記カラムに適用した。1 Mホウ酸ナトリウム、2.5 mM塩化カルシウム、10％ PEG−600、pH 7.0まで、直線勾配でカラムを溶出した。混入タンパク質の大部分は、抗体より前に溶出した。抗体凝集体は、非凝集抗体の後に溶出した。カラムを500 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0を用いて清浄した。PEGは、ヒドロキシアパタイト上での断片と無傷の抗体と凝集体との分離を向上させる一般的効果を有することが公知である。当業者は、結果を最適化するために、PEG濃度を調整する方法を認識すると考えられる。
【００８０】
実施例6．カルシウム誘導体化ヒドロキシアパタイト上での生体分子の捕捉およびスルファート勾配での溶出
CHT II型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、3 mM CaCl2、pH 6.7を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。およそ60 mgのモノクローナルIgGを含む細胞培養上清を、1 M塩化カルシウムを0.5％の割合で添加することによって5 mMカルシウムに平衡化し、続いて0.22ミクロンに対して濾過した。前記試料を前記カラムに適用した。フロースルー中には、いかなる抗体も検出されなかった。平衡化緩衝液を用いてカラムを洗浄し、続いて20 mM Hepes、3 mM CaCl2、0.5 M硫酸ナトリウム、pH 6.7まで、20カラム容量（CV）の直線勾配で溶出した。抗体は、約0.25 M硫酸ナトリウムでの単一ピーク中に溶出した。
【００８１】
実施例7．カルシウム誘導体化ヒドロキシアパタイト上での生体分子の捕捉、天然ヒドロキシアパタイトへの変換、およびホスフェート勾配での溶出
CHT II型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、3 mM CaCl2、pH 6.7を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。およそ40 mgのモノクローナルIgGを含む細胞培養上清を、1 M塩化カルシウムを0.5％の割合で添加することによって5 mMカルシウムに平衡化し、続いて0.22ミクロンに対して濾過した。前記試料を前記カラムに適用した。フロースルー中には、いかなる抗体も検出されなかった。5 mMリン酸ナトリウム、20 mM MES、pH 6.7を用いてカラムを洗浄し、続いて300 mMホスフェート、pH 6.7まで、20 CVの直線勾配で溶出した。抗体は、約165 mMリン酸ナトリウムでの単一ピーク中に溶出した。この実施例は、高い結合能を得るためのカルシウム誘導体化ヒドロキシアパタイトの使用、続く天然ヒドロキシアパタイトへの変換、およびそこからの溶出を示す。
【００８２】
実施例8．カルシウムの存在下での結合による生体分子の中間精製、天然アパタイトへの変換、および塩化ナトリウム勾配での溶出
CHT II型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、3 mM CaCl2、pH 6.7を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。およそ50 mgのプロテインA精製モノクローナルIgGを、1 M塩化カルシウムを0.5％の割合で添加することによって5 mMカルシウムに平衡化し、続いて0.22ミクロンに対して濾過した。前記試料を前記カラムに適用した。フロースルー中には、いかなる抗体も検出されなかった。20 mM Hepes、10 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7を用いてカラムを洗浄し、続いて20 mM Hepes、10 mMホスフェート、1 M塩化ナトリウム、pH 6.7まで、20 CVの直線勾配で溶出した。抗体は、0.6 M塩化ナトリウムでの単一ピーク中に溶出し、よく分離された凝集体ピークが続いた。
【００８３】
実施例9．ボラート勾配を用いて溶出される、天然ヒドロキシアパタイト上での、部分的に精製された生体分子からの、望ましくない断片および凝集体の除去
CHT I型、40ミクロン、直径8 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、5 mMリン酸ナトリウム、20 mM Hepes、pH 7.0を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって事前に精製されたモノクローナル抗体調製物を、前記カラムに適用した。1 Mホウ酸ナトリウム、5 mMリン酸ナトリウム、20 mM Hepes、pH 7.0まで、直線勾配でカラムを溶出した。大部分の断片は、抗体の前に溶出した。抗体凝集体および他の混入タンパク質は、非凝集抗体の後に溶出した。カラムを500 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0を用いて清浄した。
【００８４】
実施例10．結合−溶出様式、ホスフェート勾配とスルファート勾配における生体分子溶出の比較
CHT II型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、3 mM CaCl2、pH 6.7を用いて、200 cm／時間の線流速で平衡化した。モノクローナルIgM抗体を含む細胞上清を前記カラムに適用した。20 mM Hepes、3 mM CaCl2、1.0 M硫酸ナトリウム、pH 6.7まで、20 CVの直線勾配でカラムを溶出した。IgMピークの中心は、約415 mM硫酸ナトリウムで溶出した。DNAは、これらの条件下で855 mMスルファートで溶出した。IgM凝集体は、スルファート勾配の範囲内では溶出せず、後に続く500 mMホスフェートを用いた洗浄段階において除去された。10 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7を用いてカラムを平衡化し、500 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7まで、20 CV直線勾配で溶出したことを除き、前記実験を反復した。IgMピークの中心は、約207 mMホスフェートで溶出し、DNAの205 mMホスフェートでの溶出によって明らかなように、本質的にDNAと共溶出していた。IgM凝集体は、部分的にしか排除されなかった。この実施例は、スルファート勾配とホスフェート勾配との間の選択性の劇的な相違を再度示し、IgM調製物からのDNAの除去に関してスルファート勾配がどの程度より効果的であるかを具体的かつ劇的に強調し、かつスルファート勾配が凝集体を排除する優れた能力を具体的に示している。本方法がタンパク質等の非リン酸化混入物をDNA等のリン酸化生体分子の調製物から排除できることをこれらの結果が示していることも、当業者にとって明らかであると考えられる。
【００８５】
実施例11．ボラートの適用によるpH制御の向上
ヒドロキシアパタイトカラムを、5 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0に平衡化した。0.5 M塩化ナトリウム、5 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0の勾配段階を前記カラムに適用した。これにより、pHはpH約5.9にまで低下した。5 mMホスフェート、pH 7.0に、前記カラムを再平衡化した。0.5 mM塩化ナトリウム、5 mMリン酸ナトリウム、50 mMホウ酸ナトリウム、pH 7.0の勾配段階を前記カラムに適用した。カラムのpHは、pH.6.7までしか低下しなかった。溶出剤の導入により許容不可能なpH低下が起こる任意の状況においてpHを制御するために同アプローチを使用可能であること、および、所望のpH制御の程度を達成するためにボラートの濃度を調整可能であることが、当業者によって理解されると考えられる。ボラートと同様に、平衡化されたアパタイト担体へのラクテートの適用によりpHの上昇が起こり、これは、クロライドによって引き起こされる制御不能のpH低下を管理するために同様に利用可能である。当業者は、類似の効果を産生するために、他のモノカルボン酸またはモノカルボキシル両性イオンが代用され得ることを認識すると考えられる。
【００８６】
実施例12．ボラート勾配を用いた生体分子の分画
CHT I型、40ミクロン、直径8 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、5 mMリン酸ナトリウム、20 mM Hepes、pH 7.0を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。IgGモノクローナル抗体のパパイン消化に由来するFab調製物を、前記カラムに適用した。カラムを1 Mホウ酸ナトリウム、5 mMリン酸ナトリウム、20 mM Hepes、pH 7.0まで、直線勾配で溶出した。混入Fc断片の大部分は、Fabより前に溶出した。無傷の抗体は、Fabより後に溶出した。カラムを500 mMリン酸ナトリウム、pH 7.0を用いて清浄した。
【００８７】
実施例13．カルシウム誘導体化アパタイト上での生体分子のフロースルー精製
CHT I型、20ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを10 mM Hepesナトリウム、2.5 mM塩化カルシウム、pH 7.0を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。Fab消化物に、塩化カルシウムを最終濃度2.5 mMになるまで添加し、続いてカラムにローディングした。Fabは保持されず、約95％の純度でカラムを通過した。
【００８８】
実施例14．カルシウム誘導体化アパタイトへの変換により溶出される、天然アパタイトへの適用による生体分子の精製
CHT I型、20ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、5 mM リン酸ナトリウム、10 mM Hepes、pH 7.0を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。Fab調製物を5 mMホスフェートに滴定し、ヒドロキシアパタイトカラムにローディングした。Fabは保持され、10 mM Hepes、2.5 mM塩化カルシウム、pH 7.0までの段階で溶出された。純度は95％より高かった。
【００８９】
実施例15．結合−溶出様式、ホスフェート勾配とスルファート勾配におけるリン酸化生体分子の溶出の比較
CHT II型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、3 mM CaCl2、pH 6.7を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。サケ精子から単離されたDNA試料を、前記カラムに適用した。20 mM Hepes、3 mM CaCl2、1.0 M硫酸ナトリウム、pH 6.7まで、20 CVの直線勾配でカラムを溶出した。DNAピークの中心は、約855 mM硫酸ナトリウムで溶出した。カラムを10 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7を用いて平衡化し、500 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7まで、20 CVの直線勾配で溶出したことを除き、前記実験を反復した。DNAピークの中心は、約205 mMリン酸ナトリウムで溶出した。この実施例は、スルファート勾配とホスフェート勾配との間の選択性の劇的な相違を示す。これらの結果は、スルファート勾配がホスフェート勾配よりも効果的なDNAの取り出しを達成できることも示していることが、当業者にとって明らかであると考えられる。
【００９０】
実施例16．結合−溶出様式、ホスフェート勾配とスルファート勾配におけるリン酸化生体分子の溶出の比較
CHT II型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、3 mM CaCl2、pH 6.7を用いて、300 cm／時間の線流速で平衡化した。ネズミチフス菌（Salmonella enterica serotype typhimurium）からフェノール抽出によって調製されたエンドトキシンの試料を、カラムに適用した。20 mM Hepes、3 mM CaCl2、1.0 M硫酸ナトリウム、pH 6.7まで、20カラム容量（CV）の直線勾配でカラムを溶出した。小量のエンドトキシンが勾配の初期に溶出し、次は855 mM硫酸ナトリウムでのDNA混入物のピークであった。大部分のエンドトキシンは溶出せず、500 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7で清浄することによって、カラムから取り出した。カラムを10 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7で平衡化し、500 mMリン酸ナトリウム、pH 6.7まで、20 CVの直線勾配で溶出したことを除き、前記実験を反復した。スルファート勾配における初期溶出群に対応する小量のエンドトキシンは、ホスフェート中で結合することができず、適用してすぐにカラムを通過した。主要なエンドトキシンピークの中心は、85 mMリン酸ナトリウムで溶出した。この実施例は、スルファート勾配とホスフェート勾配との選択性の劇的な相違を全体として示し、スルファート勾配の、差次的にリン酸化された生体分子内で独特の分離を達成する能力を具体的に示し、かつホスフェートの非存在下で実施されるスルファート勾配において一部のリン酸化生体分子は少なくとも一部のアパタイトクロマトグラフィー担体から溶出しないことを具体的に示す。これらの結果はまた、ホスフェート勾配よりもスルファート勾配がエンドトキシンをより効果的に取り出すことができることも示すことが、当業者にとって明らかであると考えられる。
【００９１】
実施例17．スルファート勾配におけるリン酸化タンパク質の差次的増大による、非リン酸化タンパク質からのリン酸化タンパク質の分画の向上
CHT I型、40ミクロン、直径5 mm、高さ50 mmのヒドロキシアパタイトカラムを、20 mM Hepes、pH 7.0を用いて、600 cm／時間の線流速で平衡化した。精製されたモノクローナル抗体（非リン酸化）および精製されたαカゼイン（ポリリン酸化）を適用し、500 mMホスフェートまで、20カラム容量の直線勾配でカラムを溶出した。抗体は、156 mMホスフェートで溶出した。αカゼインは、223 mMホスフェートで溶出した。1 M硫酸アンモニウム、20 mM Hepes、pH 7.0まで、20カラム容量の直線勾配でカラムを溶出したことを除き、前記実験を反復した。抗体は、308 mMスルファートで溶出した。αカゼインは、スルファート勾配の範囲内で溶出しなかった。これは、非リン酸化タンパク質の残留が約97％増加し、一方αカゼインの残留が少なくとも350％増加したことを示す。
【００９２】
上の実施例に記載された実験等の実験の結果を最適化およびスケールアップする方法は、当業者によって理解されると考えられる。限定はされないが高処理ロボットシステム等の、方法開発への他のアプローチを利用して、特定の抗体に関して本発明を最も効果的に体現する条件を決定できることも、当業者によって理解されると考えられる。
【００９３】
D．さらなる任意段階
本発明を、必要な場合、より高いレベルの精製を達成するために、他の精製方法と組み合わせてもよい。限定はされないが、例として、サイズ排除クロマトグラフィー、プロテインAおよび他の形態のアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、混合様式クロマトグラフィー、沈降、結晶化、液液分配ならびに様々な濾過方法等の、生体分子の精製のために一般的に使用される他の方法が挙げられる。様々な方法のための適切な条件を開発すること、および特定の抗体の必要な精製を達成するためにそれらを本明細書記載の本発明に組み入れることは、当業者の認識の範囲内である。
【００９４】
本明細書において引用される全ての参考文献は、個々の刊行物または特許または特許出願が全ての目的に関してその全体が参照により組み入れられることが具体的にかつ別個に示されているのと同程度に、その全体が全ての目的に関して、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示に矛盾する範囲では、本明細書は、任意のそのような矛盾資料に取って代わりかつ／または矛盾資料に優先することが意図される。
【００９５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される成分、クロマトグラフィー条件等の量を示す全ての数値は、全ての場合において、「約」という用語により改変されるものとして理解されるべきである。したがって、反証が示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において示される数値パラメーターは、本発明が得ることを目指す所望の成果に応じて変動し得る概数である。
【００９６】
当業者にとって明らかであるように、本発明の多数の改変および変動が、その精神および範囲から逸脱することなく成され得る。本明細書に記載される特定の態様は、ほんの一例として提供され、何らかの限定を意味しない。添付の特許請求の範囲によって示される本発明の真の範囲および精神と共に、本明細書および実施例は単なる例示として考慮されるべきであると意図される。