(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
三価の二重特異性抗体であって、以下の：
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；
ｂ）ポリペプチドであって、以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）；
から成り、ここで、ＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されている前記ポリペプチド、
ｃ）ポリペプチドであって、以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；から成り、ここで、ＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されている前記ポリペプチド、
を含んでなり；そして、ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する前記三価の二重特異性抗体。
【請求項２】
一方の重鎖のＣＨ３ドメインともう片方の重鎖のＣＨ３ドメインが、抗体ＣＨ３ドメイン間に本来の界面を含んでなる界面で各々接触することを特徴とする、請求項１に記載の三価の二重特異性抗体であって；
ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が、以下の：
ｉ）二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔に配置可能な、一方の重鎖ＣＨ３ドメインの界面内に隆起部を生じるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更され、そして
ｉｉ）三価の二重特異性抗体内の第１ＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、第２ＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第１ＣＨ３ドメインの界面内の隆起部が配置可能な、第２ＣＨ３ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されることを特徴とする、前記三価の二重特異性抗体。
【請求項３】
以下の：
ｉ）より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）から成る群から選択され；且つ
ｉｉ）より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）から成る群から選択される、
を特徴とする、請求項２に記載の三価の二重特異性抗体。
【請求項４】
両ＣＨ３ドメインが、その両ＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋を形成できるように、各々のＣＨ３ドメインの対応する位置のアミノ酸としてのシステイン（C）の導入によりさらに変更されることを特徴とする、請求項２又は３に記載の三価の二重特異性抗体。
【請求項５】
以下の：
前記ｉ）のＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含んでなり；且つ
前記ｉｉ）のＣＨ３ドメインが、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる、
を特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載の三価の二重特異性抗体。
【請求項６】
以下の：
前記ｉ）のＣＨ３ドメインが、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗに突然変異を含んでなり；且つ
前記ｉｉ）のＣＨ３ドメインが、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる、
を特徴とする、請求項４に記載の三価の二重特異性抗体。
【請求項７】
前記ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と前記ｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が連結され、そして下記の位置：
ｉ）重鎖可変ドメインの第４４位〜軽鎖可変ドメインの第１００位
ｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０５位〜軽鎖可変ドメインの第４３位、又は、
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０１位〜軽鎖可変ドメインの第１００位、
の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド架橋によって安定化させることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の三価の二重特異性抗体。
【請求項８】
前記ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と前記ｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が連結され、そして下記の位置：
ｉ）重鎖可変ドメインの第４４位と軽鎖可変ドメインの第１００位、
の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド架橋によって安定化させることを特徴とする、請求項７に記載の三価の二重特異性抗体。
【請求項９】
前記ｂ）とｃ）のペプチドコネクタが、２５〜５０アミノ酸の長さを有する同一のペプチドであることを特徴とする、請求項６に記載の三価の二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三価の二重特異性抗体、それらの製造方法、前述の抗体を含む医薬組成物、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
広範な種類の組換え多特異性抗体フォーマットが最近開発されてきている、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと一本鎖ドメインの融合による、例えば、四価二重特異性抗体が開発された（例えば、Coloma M. J. et al., Nature Biotech. 15（1997）159-163; WO 2001077342; 及びMorrison S. L. Nature Biotech. 25（2007）1233-1234を参照のこと）。
【０００３】
また、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）がもはや保持されていないいくつかの新しいフォーマット、例えば、２つ以上の抗原に結合できる、ジ抗体、トリ抗体又はテトラ抗体、ミニ抗体、いくつかの一本鎖フォーマット（ｓｃＦｖ、ビス‐ｓｃＦｖ）が開発された（Holliger P. et al., Nature Biotech. 23（2005）1126-1136; Fischer N. and Leger O. Pathobiology 74（2007）3-14; Shen J. et al., J. Immunol. Methods 318（2007）65-74; Wu C. et al., Nature Biotech. 25（2007）1290-1297）。
【０００４】
すべてのこのようなフォーマットはリンカーを使用して抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を更なる結合性タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）に融合するか、あるいは、例えば、２つのＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖを融合する（Fischer N. and Leger O. Pathobiology 74（2007）3-14）。天然に存在するものに対して高度の類似性を維持することによって、Ｆｃ受容体結合を通して介在される、エフェクター機能、例えば、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を保持することが望まれることもあり得ることに留意すべきである。
【０００５】
WO2007/024715では、改変多価及び多特異性結合タンパク質として二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物学的に活性な抗体二量体の調製方法は、US6,897,044に報告されている。ペプチド・リンカーを介して互いに連結されている少なくとも４つの可変ドメインを持つ多価性Ｆｖ抗体構築物が、US7,129,330で報告されている。二量体及び多量体の抗原結合構築物は、US2005/0079170で報告されている。（天然の免疫グロブリンでない）結合構造によって互いに共有結合した３つ又は４つのＦａｂフラグメントを含んでなる三又は四価の単一特異性抗原結合性タンパク質が、US6,511,663で報告されている。WO2006/020258では、原核生物及び真核生物細胞で効率的に発現され、治療薬や診断法に有用である四価の二重特異性抗体が報告されている。
２つのタイプのポリペプチド二量体を含んでなる混合物からの少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結されず二量体からの少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される二量体を分離するか、又は優先的には合成する方法が、US 2005/0163782で報告されている。二重特異性の四価の受容体が、US 5,959,083で報告されている。三重機能性以上の抗原結合部位を持つ改変抗体が、WO 2001/077342で報告されている。
【０００６】
多特異性、且つ、多価の抗原結合性ポリペプチドが、WO1997/001580で報告されている。WO1992/004053では、通常、同じ抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から調製されたホモ接合体が合成架橋によって共有結合で連結されていることが報告されている。抗原に対して高い親和性を有するオリゴマーモノクローナル抗体が、WO1991/06305で報告され、それによれば２つ以上の免疫グロブリンモノマーが一緒になって四価又は六価のＩｇＧ分子を形成する通常ＩｇＧクラスのオリゴマーが分泌されている。ヒツジ由来抗体及び改変抗体構築物が、US6,350,860で報告されていて、それは、インターフェロンγ活性が病因である疾患を治療するのに使用される。US2005/0100543では、二重特異性抗体の多価担体である標的を設定可能な、すなわち、標的を設定可能な構築物の各分子が２以上の二重特異性抗体の担体として機能することができる、構築物が報告されている。遺伝的に改変された二重特異性四価抗体は、WO1995/009917で報告されている。安定しているWO2007/109254には、安定化ｓｃＦｖから成るか、又はそれを含んでなる安定化結合分子が報告されている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の第１の態様は、以下の：
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）；
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されている、
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されている、
を含んでなり；そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
【０００８】
本発明の更なる態様は、本発明による三価の二重特異性抗体をコードする核酸分子である。
本発明のより更なる態様は、前記三価の二重特異性抗体を含んでなる医薬組成物である。
本発明による三価の二重特異性抗体は、一方で、異なった抗原へのそれらの結合により新しい特性を示し、その一方で、それらの安定性、低凝集、並びに薬物動力学的及び生物的性質により製品及び医薬製剤に好適である。それらのＩｇコアのため、それらは、ＡＤＣＣやＣＤＣのような天然抗体の特性を保有し続けている。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の１つの態様は、以下の：
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）；
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されている、
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されている、
を含んでなり；そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
【００１０】
任意には、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、連結され、そして下記の位置の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド架橋によって安定化させる：
ｉ）重鎖可変ドメインの第４４位〜軽鎖可変ドメインの第１００位
ｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０５位〜軽鎖可変ドメインの第４３位、又は、
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０１位〜軽鎖可変ドメインの第１００位（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。
【００１１】
安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入する技術は、例えば、WO94/029350、Rajagopal, V., et al., Prot Engin.（1997）1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25,（1998）387-393;又はSchmidt, M., et al., Oncogene（1999）18 1711-1721に記載されている。１つの実施形態では、ｂ）とｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第４４位と軽鎖可変ドメインの第１００位の間にある。１つの実施形態では、ｂ）とｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第１０５位と軽鎖可変ドメインの第４３位の間にある（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。１つの実施形態では、一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬの間の前記任意のジスルフィド安定化のない、三価の二重特異性抗体が好まれる。
【００１２】
用語「全長抗体」は、２つの「全長抗体重鎖」と２つの「全長抗体軽鎖」から成る抗体を意味する（図１を参照のこと）。「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ部（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成り、ＶＨ‐ＣＨ１‐ＨＲ‐ＣＨ２‐ＣＨ３と略記される、ポリペプチドであり、さらに任意に、ＩｇＥサブクラスの抗体の場合には、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）から成るポリペプチドである。好ましくは「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３から成るポリペプチドである。「全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成り、ＶＬ‐ＣＬと略記される、ポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）であり得る。２つの全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間、及び全長抗体重鎖のヒンジ部の間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒につながっている。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、並びにＩｇＥのような天然抗体である。本発明による全長抗体は、単一種、例えばヒトからのものであることができるし、又はそれらは、キメラ化若しくはヒト化抗体であることもできる。本発明による全長抗体は、一対のＶＨとＶＬによってそれぞれ形成された抗原結合部位を２つ含んでなるが、それらは、ともに同じ抗原に特異的に結合する。前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＣ末端で最後のアミノ酸を意味する。
【００１３】
ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のＮ末端は、ＶＨ又はＶＬドメインのＮ末端で最後のアミノ酸を意味する。
【００１４】
本発明による前記全長抗体のＣＨ３ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway, J.B., et al, Protein Eng 9（1996）617-621;及びMerchant, A.M., et al, Nat Biotechnol 16（1998）677-681において、いくつかの例により詳細に説明されている「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」技術により変更され得る。この方法では、２種のＣＨ３ドメインの相互作用表面が、それらの２種のＣＨ３ドメインを含む両重鎖のヘテロダイマー化を高めるために変更される。（２種の重鎖の）２種のＣＨ３ドメインの個々が「ｋｎｏｂ」であり、そして他が「ｈｏｌｅ」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマーを安定化し（Merchant, A..M., et al, Nature Biotech 16（1998）677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、そして収率を高める。
【００１５】
従って、本発明の１つの態様では、前記三価の二重特異性抗体は、全長抗体の１つの重鎖のＣＨ３ドメイン及び全長抗体の他の重鎖のＣＨ３ドメインが、抗体ＣＨ３ドメイン間に本来の界面を含んでなる界面で各々接触し；
ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が：
ａ）二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔に配置可能な、一方の重鎖ＣＨ３ドメインの界面内に隆起部を生じるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更され、そして
ｂ）三価の二重特異性抗体内の第１ＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、第２ＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第１ＣＨ３ドメインの界面内の隆起部が配置可能な第２ＣＨ３ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されることによりさらに特徴づけられる。
【００１６】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）から成る群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）から成る群から選択される。
【００１７】
本発明の１つの態様においては、両ＣＨ３ドメインはさらに、それらの両ＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るよう、各々のＣＨ３ドメインのその対応する位置のアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により変更される。
【００１８】
好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、「ｋｎｏｂｓ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＴ３６６Ｗ突然変異、及び「ｈｏｌｅ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる。例えば、「ｋｎｏｂｓ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＹ３４９Ｃ突然変異、及び「ｈｏｌｅ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＥ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を導入することによって、ＣＨ３ドメイン間の追加的な鎖間ジスルフィド架橋もまた使用できる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16（1998）677-681）。よって、別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなるか、又は前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる（鎖間ジスルフィド架橋を形成する、一方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＹ３４９Ｃ突然変異ともう片方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異）（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。しかし、EP1870459A1によって記載される他のｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術もまた代替的に又は追加的に使用できる。前記三価の二重特異性抗体の好ましい例は、「ｋｎｏｂｓ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ｈｏｌｅ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異である（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、「ｋｎｏｂｓ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｗ突然変異及び「ｈｏｌｅ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異、そして追加的に「ｋｎｏｂｓ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異及び「ｈｏｌｅ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７ＫＥ突然変異を含んでなる。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなるか、又は前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなり、そして追加的に「ｋｎｏｂｓ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ｈｏｌｅ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含んでなる。
【００２１】
本発明による二重特異性抗体は、３つの抗原結合部位（Ａ）第１の抗原に特異的に結合する２つの同一の抗原結合部位を含んでなる全長抗体、並びにＢ）第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒になって形成する、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなる。用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、本明細書中で使用される場合、それぞれの抗原が実際にその領域に特異的に結合する、本発明による前記二重特異性抗体の（単数若しくは複数の）領域を意味する。全長抗体内、又はｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）による、抗原結合部位は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）から成る対によってそれぞれ形成される。
【００２２】
所望の抗原に特異的に結合する抗原結合部位は、ａ）抗原に対して公知の抗体に由来するか、あるいは、ｂ）とりわけ抗原タンパク質又は核酸若しくはその断片のいずれかを使用したデノボ免疫法によって、又はファージ・ディスプレイによって得られた新しい抗体又は抗体フラグメントに由来することができる。
【００２３】
本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に多かれ少なかれ貢献する６つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含んでいる。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）と３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）の程度は、配列内での可変性によってそれらの領域が規定されたコンパイルされたアミノ酸配列のデータベースとの比較によって決定される。
【００２４】
抗体の特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば、天然抗体は単一特異性である。本発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なった抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が２以上の特異性を有する場合には、認識されたエピトープは単一の抗原又は２以上の抗原と結合することもできる。用語「単一特異性」抗体は、本明細書中で使用される場合、そのそれぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する１以上の結合部位を持つ抗体を意味する。用語「価」は、本明細書中で使用される場合、抗体分子内に存在している一定数の結合部位を意味する。例えば、天然抗体又は本発明による全長抗体は、２つの結合部位を持っているので、二価である。同様に、用語「三価」は、抗体分子内の３つの結合部位の存在を意味する。本発明による二重特異性抗体は「三価」である。用語「三価の二重特異性」抗体は、本明細書中で使用される場合、その２つが同じ抗原（若しくは抗原の同じエピトープ）に結合し、且つ、３番目のものが異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに結合する３つの抗原結合部位を持つ抗体を意味する。本発明の抗体は、３つの結合部位を持っているので、二重特異性である。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、以下の：
ａ）第１の抗原に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ部（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの抗体軽鎖；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されていて、ここで、前記ペプチドコネクタが５つのアミノ酸、好ましくは２５〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、
【００２６】
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されていて、
ここで、前記ペプチドコネクタがｂ）のペプチドコネクタと同一である、
を含んでなり；そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
【００２７】
この実施形態の中で、好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＴ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなり、より好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのなかのもう片方にＤ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる（一方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＹ３４９Ｃ突然変異ともう片方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＤ３５６Ｃ突然変異は鎖間ジスルフィド架橋を形成する）。
【００２８】
本発明の１つの実施形態では、本発明による三価の二重特異性抗体は、以下の：
ａ）前記全長抗体は、ＥｒｂＢ‐３に特異的に結合し、配列番号１の配列を重鎖可変ドメインとして、及び配列番号２の配列を軽鎖可変ドメインとして含んでなり；
ｂ）ｂ）の前記ポリペプチドが重鎖可変ドメインとして配列番号３の配列を含んでなり；そして
ｃ）ｃ）の前記ポリペプチドが軽鎖可変ドメインとして配列番号４の配列を含んでなること、を特徴とする。
本発明の別の態様では、本発明による三価の二重特異性抗体は、以下の：
ａ）第１の抗原に結合し、２つの抗体重鎖、ＶＨ‐ＣＨ１‐ＨＲ‐ＣＨ２‐ＣＨ３及び２つの抗体軽鎖ＶＬ‐ＣＬから成る全長抗体；
（ここで、好ましくは２つのＣＨ３ドメインのうちの一方がＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含んでなり、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方がＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる）；
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、
から成るポリペプチド；
ここで、前記ポリペプチドはＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されている；
【００２９】
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、から成るポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドはＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されている；
を含んでなり、そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、第２の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する。
【００３０】
本発明の他の実施形態は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ‐３に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ部（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの抗体軽鎖（ＶＬ‐ＣＬ）；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ‐Ｍｅｔに特異的に結合する１つの一本鎖Ｆｖフラグメント、
を含んでなり、
ここで、ｂ）の前記一本鎖Ｆｖフラグメントは、ａ）の前記全長抗体に、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端（好ましくは重鎖のＣ末端）のペプチドコネクタを介して融合されていて；
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも５つのアミノ酸、好ましくは２５〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、三価の二重特異性抗体である。
【００３１】
好ましくは、そういった三価の二重特異性抗体は、全長抗体の２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗに突然変異、そして全長抗体の２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ（又はＥ３５６Ｃ）、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異をさらに含んでなる。
本発明の他の実施形態は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ‐３に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ部（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの抗体軽鎖；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されていて、ここで、前記ペプチドコネクタが５つのアミノ酸、好ましくは２５〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、
【００３２】
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されていて、
ここで、前記ペプチドコネクタがｂ）のペプチドコネクタと同一である、
を含んでなり；そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、ヒトｃ‐Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
【００３３】
本発明の全長抗体は、１以上の免疫グロブリン・クラスの免疫グロブリン定常領域を含んでなる。免疫グロブリン・クラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプが含まれ、そしてＩｇＧ及びＩｇＡの場合には、それらのサブタイプが含まれる。好ましい実施形態では、本発明の全長抗体は、ＩｇＧタイプ抗体の定常ドメイン構造を持つ。
【００３４】
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を意味する。
【００３５】
用語「キメラ抗体」とは、通常組換えＤＮＡ技術により調製される、可変領域、すなわち１つの源又は種からの結合領域、及び異なった源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部を含んでなる抗体を意味する。ネズミ可変領域及びヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される他の好ましい形の「キメラ抗体」は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明の性質を生じるように、修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されているそれらの抗体である。そのようなキメラ抗体はまた、「クラス‐スイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント、及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含んでなる免疫グロブリン遺伝子が発現された生成物である。キメラ抗体を生成するための方法は、当業界において現在良く知られている、従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を包含する。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81（1984）6851-6855; US 5,202,238及びＵＳ 5,204,244を参照のこと。
【００３６】
用語「ヒト化抗体」とは、そのフレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親イムノグロブリンのＣＤＲに比較して、異なった特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含んでなるよう修飾されている抗体を意味する。好ましい実施形態では、ネズミＣＤＲは、「ヒト化抗体」を調製するために、ヒト抗体のフレームワーク領域中に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332（1988）323-327;及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314（1985）268-270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して上記に示される抗原を認識する配列を表すものに対応する。本発明により包含される他の形の「ヒト化抗体」とは、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明の性質を生じるように、さらに修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されている抗体である。
【００３７】
用語「ヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を包含することを意図する。ヒト抗体は技術的に良く知られている（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5（2001）368-374）。ヒト抗体はまた、免疫化に基づいて、内因性免疫グロブリン生成の不在下でヒト抗体の全レパートリー又は選択物を生成できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においても生成され得る。そのような生殖系変異マウス内へのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原攻撃に基づくヒト抗体の生成をもたらすであろう（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362（1993）255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7（1993）33-40を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリーにおいても生成され得る（Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222（1991）581-597）。Cole, S.P.C.ら及びBoerner, Pらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用できる（Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77-96（1985）;及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147（1991）86-95）。本発明のキメラ及びヒト化抗体についてすでに言及されたように、用語「ヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、また、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えばＦｃ部分の「クラススイッチ」、すなわち変更又は突然変異誘発（ＩｇＧ１からＩｇＧ４への及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、本発明の性質を生じるように定常領域において修飾されているそのような抗体も含んでなる。
【００３８】
用語「組換えヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製され、発現され、作出され、又は単離されるすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞、例えばＮＳ０又はＣＨＯ細胞から又はヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を意味する。そのような組換えヒト抗体は、再配置された形で、可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、生体内における体細胞超突然変異にゆだねられている。従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＨ及びＶＬ領域に由来し、そしてその配列に関連しているが、天然においては、ヒト抗体生殖系レパートリー内で生体内には存在することができない配列である。
【００３９】
「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の結合において直接関与する軽鎖及び重鎖の対の各々を示す。ヒト可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、そして各々のドメインは４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含んで成り、それらの配列は広く保存され、３個の「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により結合される。フレームワーク領域は、β‐シートコンホメーションを採用し、そしてＣＤＲはβ‐シート構造体を結合するループを形成することができる。各々の鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりそれらの立体構造を保持され、そして他の鎖からのＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ3領域は、本発明の抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を演じ、従って、本発明のさらなる目的を提供する。
【００４０】
用語「超可変領域」又は「抗体の抗原‐結合部分」とは、本明細書において使用される場合、抗原結合を担当できる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されるように超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖は、N末端からC末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含んでなる。各々の鎖上のＣＤＲはそのようなフレームワークアミノ酸により分離される。特に、重鎖のＣＤＲ３は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）の標準的な定義に従って決定される。
【００４１】
本明細書において使用される場合、用語「結合」又は「特異的に結合」とは、試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore、GE-Healthcare Uppsala, Sweden）における抗体の抗原のエピトープへの結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋD（解離定数）、及びＫD（ｋD／ｋａ）によって規定される。結合又は特異的に結合は、１０-8ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫD）を意味する。よって、本発明による三価の二重特異性抗体は、各抗原に対して１０-8ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫD）を有する特異性をもって特異的に結合する。
ＦｃγＲＩＩＩへの抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（GE-Healthcare Uppsala, Sweden）により調査され得る。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋD（解離定数）、及びＫD（ｋD／ｋａ）により規定される。
【００４２】
用語「エピトープ」とは、抗体に対して特異的に結合できるいずれかのポリペプチド決定基を包含する。ある実施形態においては、エピートープ決定基は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリン又はスルホニルなどの化学的活性表面群を包含し、そしてある実施形態においては、特定の立体構造特性及び／又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
ある実施形態においては、抗体は、それがタンパク質及び／又は高分子の複合混合物中でその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【００４３】
用語「ペプチドコネクタ」は、本発明の中で使用される場合、アミノ酸配列を有するペプチドを意味し、それは、好ましくは合成起源のものである。本発明によるこれらのペプチドコネクタは、本発明による三価の二重特異性抗体を形成するために、ｂ）及びｃ）のポリペプチドを全長抗体の重鎖Ｃ末端に融合するのに使用される。好ましくは、前記ペプチドコネクタは、少なくとも５つのアミノ酸の長さを有する、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸の長さを有する、より好ましくはで２５〜５０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を持つペプチドである。好ましくは、前記のｂ）及びｃ）のペプチドコネクタは、少なくとも２５個のアミノ酸の長さを有する、好ましくは２５〜５０個のアミノ酸の長さを有するペプチドと同一であり、そしてより好ましくは、前記ペプチドコネクタは、（ＧｘＳ）ｎあるいは（ＧｘＳ）ｎＧｍであって、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、並びに（ｘ＝３、ｎ＝６、７又は８、及びｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝３、４、５、６、又は７及びｍ＝０、１、２又は３）、好ましくはｘ＝４及びｎ＝５、６、又７を示す。
【００４４】
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものか、又は突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを持つヒトＩｇＧ１サブクラスであることを特徴とする。
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ２サブクラスのものであることを特徴とする。
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ３サブクラスのものであることを特徴とする。
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ４サブクラスのものであるか、又は追加的な突然変異Ｓ２２８Ｐを持つヒトＩｇＧ４はサブクラスのものであることを特徴とする。
【００４５】
好ましくは、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトＩｇＧ１サブクラスのものであるか、又は追加的な突然変異Ｓ２２８Ｐを持つヒトＩｇＧ４サブクラスのものであることを特徴とする。
【００４６】
本発明による三価の二重特異性抗体が、改善された特徴、例えば、生物学的若しくは薬理学的活性、薬物動態学的特性又は毒性などを有することをここで見つけた。それらは、例えば、癌などの疾患の処置に使用できる。
【００４７】
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ３とｃ‐Ｍｅｔに特異的に結合することを特徴とする。用語「定常領域」は、本明細書中で使用される場合、可変領域以外の抗体のドメインの集合を意味する。定常領域は、抗原の結合に直接的にかかわらないが、様々なエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体は以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、そしてそのいくつか、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などは、サブクラスに更に分類されることもできる。異なった抗体クラスに該当する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。全部で５つの抗体クラスで見ることができる軽鎖定常領域（ＣＬ）は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。
【００４８】
用語「ヒト起源由来の定常領域」は、本願で使用される場合、ヒト抗体のサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、及び／又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域を規定する。そのような定常領域は、当技術分野の現状において周知であり、例えば、Kabat, E.A.によって説明されている（例えばJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28（2000）214-218; Kabat, E.A., et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 72（1975）2785-2788を参照のこと）。
【００４９】
ＩｇＧ４サブクラスの抗体がＦｃ受容体（ＦｃｙＲＩＩＩａ）結合の低減を示している一方で、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示している。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の欠如）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、及びＨｉｓ４３５は、変更された場合には、同様に低減されたＦｃ受容体結合性を示す残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9（1995）115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86（1995）319-324; EP 0 307 434）。
【００５０】
１つの実施形態では、本発明による抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較してＦｃＲ結合が低減されているので、全長親抗体は、ＦｃＲ結合に関して、ＩｇＧ４サブクラスのもの、あるいはＳ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５及び／又はＤ２６５に突然変異を伴う、及び／又はＰＶＡ２３６突然変異を含むＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスのものである。１つの実施形態では、全長親抗体内の突然変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、及び／又は、ＰＶＡ２３６である。他の実施形態では、全長親抗体内の突然変異は、ＩｇＧ４ではＳ２２８ＰそしてとＩｇＧ１ではＬ２３４ＡとＬ２３５Ａにある。
【００５１】
抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域への補体Ｃ１ｑ因子の結合により開始する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質‐タンパク質相互作用により起きる。そのような定常領域の結合部位は、当技術分野の現状において公知であり、例えばLukas, T.J., et al., J. Immunol. 127（1981）2555-2560；Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16（1979）907-917；Burton, D.R., et al., Nature 288（1980）338-344；Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37（2000）995-1004；Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164（2000）4178-4184；Hezareh, M., et al., J. Virol. 75（2001）12161-12168；Morgan, A., et al., Immunology 86（1995）319-324；及びEP 0 307 434により記載されている。そのような定常領域の結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）を特徴とする。
【００５２】
用語「抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下での、本発明よる抗体によるヒト標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、好ましくは、新たに単離されたＰＢＭＣ、又は単球若しくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は恒久的に増殖しているＮＫ細胞株のような精製された軟膜由来エフェクター細胞等のエフェクター細胞の存在下で、本発明よる抗体を用いて、抗原を発現細胞の調製物を処理することにより測定される。
用語「補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）」は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部への補体Ｃ１ｑ因子の結合により開始する過程と規定される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質‐タンパク質相互作用により起きる。そのようなＦｃ部の結合部位は、当技術分野の現状において公知である（前記を参照のこと）。そのようなＦｃ部の結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）を特徴とする。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、通常はＣ１ｑ及びＣ３の結合を含めた補体活性化を示し、一方でＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３と結合しない。
【００５３】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17（1999）176-180及びUS 6,602,684に記載されているように、それらのオリゴ糖構成要素を操作することによって増強することができる。癌免疫療法において最もよく使用される抗体であるＩｇＧ１型抗体は、保存されたＮ結合型グリコシル化部位を各ＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７において有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合型二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋もれて、ポリペプチド骨格との広範囲の接触面を形成し、それらの存在は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のようなエフェクター機能を抗体が媒介するために不可欠である（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5（1995）813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163（1998）59-76; Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15（1997）26-32）。Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17（1999）176-180及びWO 99/54342は、２つに分岐したオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）‐Ｎ‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において過剰発現されると、抗体の生体内でのＡＤＣＣ活性が有意に増大することを示した。また、Ａｓｎ２９７炭水化物の組成の改変又はその除去も、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合に影響を及ぼす（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17（1999）176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74（2001）288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277（2002）26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263（2002）133-147）。
【００５４】
モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を増強するための方法は、例えば、WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、及びWO 2000/061739に記載されている。
【００５５】
驚いたことに、本発明の１つの実施形態である二重特異性＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞抗体は、それらの親＜ＥｒｂＢ３＞及び／又は＜ｃ‐Ｍｅｔ＞抗体と比較して、標的抗原の下方制御の低下と内在化を示す。そのため、本発明の１つの好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、（それがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブクラス、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのＦｃ部を含んでなる場合）Ａｓｎ２９７にて糖鎖を用いてグリコシル化され、それによって、前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下になる（付番はKabatに準じる）。他の実施形態では、前記糖鎖内のフコースの量が、５％〜６５％、好ましくは２０％〜４０％である。本発明による「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域内の約２９７位に見られるアミノ酸であるアスパラギンを意味する。抗体のわずかな配列変化により、Ａｓｎ２９７はまた、２９７位の数アミノ酸（通常、±３アミノ酸以下）上流又は下流、すなわち、２９４位から３００位の間でも見られることがある。本発明によるグリコシル化抗体の１つの実施形態では、ＩｇＧサブクラスは、ヒトＩｇＧ１サブクラスのもの、突然変異Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａを伴うヒトＩｇＧ１サブクラスのもの又はＩｇＧ３サブクラスのものである。さらなる態様では、前記糖鎖内のＮ‐グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）の量が１％以下である、及び／又はＮ末端アルファ‐１，３‐ガラクトースの量が１％以下である。前記糖鎖は、好ましくは、ＣＨＯ細胞において遺伝子組み換えにより発現される抗体のＡｓｎ２９７に取り付けられたＮ結合型グリカンの特徴を示す。
【００５６】
用語「ＣＨＯ細胞において遺伝子組み換えにより発現される抗体のＡｓｎ２９７に取り付けられたＮ結合型グリカンの特徴を示す」は、本発明による全長親抗体のＡｓｎ２９７の糖鎖が、例えば、未改変のＣＨＯ細胞において発現された抗体、例えばWO2006/103100で報告された抗体と同じ抗体と同じ構造及びフコース残基以外の糖残基配列を持つことを意味する。
用語「ＮＧＮＡ」は、本明細書中で使用される場合、糖残基Ｎ‐グリコリルノイラミン酸を意味する。
【００５７】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、最大２つのＧａｌ残基で終わるコアフコシル化二本鎖複合型オリゴ糖グリコシル化としてＡｓｎ２９７で起こる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト重鎖定常領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.（1991）、及びBruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166（1987）1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178（1989）515-527によって詳細に説明されている。これらの構造は、終末のＧａｌ残基の量に依存して、Ｇ０、Ｇ１（α‐１，６‐若しくはα‐１，３‐）又はＧ２グリカン残基として指定される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1（2003）44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯタイプのグリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14（1997）201-207によって説明されている。非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞において組換え発現される抗体は、通常少なくとも８５％の量がＡｓｎ２９７においてフコシル化されている。全長親抗体の修飾オリゴ糖は、ハイブリッドであっても複合体であってもよい。好ましくは、分枝、還元／非フコシル化オリゴ糖がハイブリッドされる。他の実施形態において、分枝、還元又は非フコシル化オリゴ糖が複合体化される。
【００５８】
本発明による「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定し、平均値として算出した、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖残基（例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物、及び高マンノース構造物）の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの量を意味する。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって測定した、N-グリコシダーゼFで処理したサンプルにおいて同定された全糖構造物（例えば、それぞれ複合体構造物、ハイブリッド構造物、並びにオリゴマンノース構造物及び高マンノース構造物）に対するフコース含有構造物のパーセンテージである。
【００５９】
本発明に記載の抗体は、リコンビナント手段により産生される。よって、本発明の１つ態様は、本発明による抗体をコードする核酸であり、そして更なる態様は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含んでなる細胞である。リコンビナント産生のための方法は、当技術分野の現状において広く公知であり、抗体ポリペプチドのその後の単離及び通常は医薬として許容され得る純度への精製を伴う、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現を含む。宿主細胞における前述の抗体の発現のために、個別に改変した軽鎖及び重鎖をコードする核酸が、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又はＥ．コリ（E. coli）細胞などの適切な原核又は真核宿主細胞において行われ、そして抗体は、その細胞から回収される（上清又は細胞溶解後に）。抗体のリコンビナント産生のための一般的な方法は、当技術分野の現状において周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17（1999）183-202；Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8（1996）271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16（2000）151-160；Werner, R.G., Drug Res. 48（1998）870-880の総説に記載されている。
【００６０】
本発明による三価の二重特異性抗体は、例えばプロテインＡ‐セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製手順により培養液から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、通常の手順を使用して容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの起源として役立つことができる。いったん単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いでそれをＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、この宿主細胞におけるリコンビナントモノクローナル抗体の合成を達成することができ、この宿主細胞は、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない。
【００６１】
三価の二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体（突然変異体）は、抗体のＤＮＡ内に適切なヌクレオチドの変更を導入することによって、又はヌクレオチド合成によって調製される。しかし、そのような改変は、例えば上記のように非常に限られた範囲内でのみ行うことができる。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプ及び抗原の結合などの前述の抗体の特徴を変化させるのではなく、リコンビナント産生の収率又はタンパク質の安定性を改善することがあるし、精製を容易にすることもある。
【００６２】
用語「宿主細胞」は、本願で使用される場合、本発明による抗体を産生するために設計され得るあらゆる種類の細胞系を意味する。１つの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用される。本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培地」とは、互換的に使用され、そしてすべてのそのような名称は子孫も包含する。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」とは、トランスファーの数に関係なく、それらに由来する初代対象細胞及び培養物を包含する。すべての子孫は、故意の又は偶然な突然変異のために、ＤＮＡ含有において正確には同一でないこともまた理解されている。元の形質転換された細胞についてスクリーンされる場合、同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。
【００６３】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32（2000）109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73（2001）261-270により記載されている。一過性発現が、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30（2002）E9により記載される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289;及びNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204（1997）77-87により記載されている。好ましい一過性発現システム（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30（1999）71-83 及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194（1996）191-199により記載される。
【００６４】
原核生物のために適切である制御配列には、例えばプロモーター、任意にはオペレーター配列及びリボソームに結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。
【００６５】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関連性をもって配置されるとき、「操作可能な形で連結され」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチドに関してＤＮＡと操作可能な形で連結している；プロモーター又はエンハンサーは、それがその配列の転写に影響するとき、コード配列と操作可能な形で連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが転写を促進するように配置されているとき、コード配列に操作可能な形で連結されている。一般的に、「操作可能な形で連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接し、そして、分泌リーダーの場合は、隣接し、且つ、読み枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要は無い。連結は、都合の良い制限部位でライゲーションを行うことにより達成される。そのような部位が存在しなければ、確立された手段に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【００６６】
抗体の精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野において周知な他の方法を含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために実行される。Ausubel, F., et al. （ed.）, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）を参照のこと。別の方法、例えば、微生物タンパク質を用いた親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換性（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、thiophilic吸着（例えば、β‐メルカプトエタノールと他のＳＨリガンド類を用いて）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル‐セファロース、アザ‐アレノフィリック樹脂、又はｍ‐アミノフェニルボロン酸を用いて）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例えば、ニッケル（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料を用いて）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法（ゲル電気泳動、毛細管電気泳動など）などが、確立されており、そしてタンパク質精製のために幅広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 （1998） 93-102）。
【００６７】
本発明の１つの態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物の製造のための方法である。別の態様では、本発明は、医薬担体と一緒に処方される本発明による抗体を含んでなる組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【００６８】
本発明の１つの態様は、癌治療のための本発明による三価の二重特異性抗体である。
本発明の別の態様は、癌治療のための前記医薬組成物である。
本発明の別の態様は、癌処置用の治療薬の製造のための本発明による抗体の使用である。
本発明の別の態様は、本発明による抗体をそういった処置を必要としている患者に投与することによる、癌に罹患している患者の処置方法である。
【００６９】
本明細書中で使用されるとき、「医薬担体」には、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、前記担体は、（例えば注射又は点滴による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与又は上皮投与に適切である。
【００７０】
本発明の組成物は、当該技術分野において知られる様々な方法により投与され得る。当業者に認識されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望される結果に依存して異なる。ある投与径路により本発明の組成物を投与するためには、その組成物を、その不活性化を防止する材料で被覆し、又はその組成物と共に同時に投与する必要がある。例えば、前記組成物は、例えばリポソーム、又は希釈剤などの適切な担体に加えられて対象に投与され得る。医薬として許容される希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝溶液が含まれる。医薬として許容される担体には、滅菌水性溶液又は分散剤、滅菌済みの注射可能な溶液又は分散剤を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。そのような医薬活性物質のための媒体及び薬剤は、当該技術分野において知られている。
【００７１】
「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、本明細書中で使用される場合、腸内投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射により、これだけに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴を含む。
【００７２】
用語「癌」は、本明細書中で使用される場合、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、細気管支肺胞細胞性肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃せん癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は輸尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞性癌、胆管癌、中枢神経系（CNS）の新生物、脊椎軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、脳下垂体腺腫及びユーイング肉腫、そして前記癌のうちのいずれかの難治性バーション、又は前記癌のうちの１つ若しくは複数の組合せを含めたものであり得る。
【００７３】
これらの組成物はさらに、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含むこともできる。微生物の存在の予防は、前掲の殺菌手段によって、及び様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有によって確保できる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましいこともある。加えて、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの吸収を遅らせる作用物質の含有によって引き起こすこともできる。
【００７４】
選択した投与経路にかかわらず、（好適な水和形態で使用することもできる）本発明の化合物、及び／又は本発明の医薬組成物を、当業者に知られている従来の方法によって医薬的に許容し得る剤形に処方する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与様式について、その患者にとって有毒であることなしに、所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分量を得るように変更することもできる。選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、身体状態、健康全般、及び前病歴、並びに医療分野で周知の要因など、を含めたさまざまな薬物動態学的要因に依存するであろう。
【００７５】
組成物は、それがシリンジによって提出できる程度に無菌であり、且つ、液状でなければならない。水に加えて、好ましくは、担体は等張緩衝生理食塩溶液である。
【００７６】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には所望の粒度の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが望ましい。
【００７７】
本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培地」とは、互換的に使用され、そしてすべてのそのような名称は子孫も包含する。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」とは、トランスファーの数に関係なく、それらに由来する初代対象細胞及び培養物を包含する。すべての子孫は、故意の又は偶然な突然変異のために、ＤＮＡ含有において正確には同一でないこともまた理解されている。元の形質転換された細胞についてスクリーンされる場合、同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。異なった命名法が意図される場合は、その内容から明白であろう。
【００７８】
用語「形質転換」とは、本明細書において使用される場合、宿主細胞中へのベクター／核酸のトランスファー工程を指す。強い細胞壁バリアを有さない細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションが、例えばGraham, F.L., and van der Ed, A.J. Virology 52（1973）456-467により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿方法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合による細胞中へのＤＮＡの導入のための他の方法がまた使用され得る。原核細胞、又は実質的な細胞壁構造を含む細胞が使用される場合、１つのトランスフェクション方法は、Cohen, S.N, et al, PNAS 69（1972）2110-2114により記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法である。
【００７９】
本明細書において使用される場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転換される方法、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（転写体とも呼ばれる）がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に連続的に翻訳される過程を指す。転写体及びコードされるポリペプチドは、集合的には、遺伝子生成物とも呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含む。
【００８０】
「ベクター」とは、挿入される核酸分子を、宿主細胞中に及び／又は宿主細胞間にトランスファーする、核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。この用語は、ＤＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。記載されるような機能のうちの２つ以上を提供するベクターもまた包含される。
【００８１】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入される場合、転写され、そしてポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現システム」とは、所望する発現生成物を生成するために機能することができる発現ベクターを含んでなる適切な宿主細胞を通常指す。
【００８２】
アミノ酸配列の説明
配列番号１  重鎖可変ドメイン＜ＥｒｂＢ３＞ＨＥＲ３クローン２９
配列番号２  軽鎖可変ドメイン＜ＥｒｂＢ３＞ＨＥＲ３クローン２９
配列番号３  重鎖可変ドメイン＜ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号４  軽鎖可変ドメイン＜ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号５  重鎖＜ＥｒｂＢ３＞ＨＥＲ３クローン２９
配列番号６  軽鎖＜ＥｒｂＢ３＞ＨＥＲ３クローン２９
配列番号７  重鎖＜ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号８  軽鎖＜ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号９  重鎖＜ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｆａｂ ５Ｄ５
配列番号１０  軽鎖＜ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｆａｂ ５Ｄ５
【００８３】
配列番号１１  重鎖１＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳ
配列番号１２  重鎖２＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳ
配列番号１３  軽鎖＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳ
配列番号１４  重鎖１＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＳＳＫＨ
配列番号１５  重鎖２＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＳＳＫＨ
配列番号１６  軽鎖＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＳＳＫＨ
配列番号１７  重鎖１＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＳＳＫＨＳＳ
配列番号１８  重鎖２＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＳＳＫＨＳＳ
配列番号１９  軽鎖＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿ＳＳＫＨＳＳ
配列番号２０  重鎖１＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿１Ｃ
【００８４】
配列番号２１  重鎖２＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿１Ｃ
配列番号２２  軽鎖＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿１Ｃ
配列番号２３  重鎖１＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿６Ｃ
配列番号２４  重鎖２＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿６Ｃ
配列番号２５  軽鎖＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ＿６Ｃ
配列番号２６  ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域
配列番号２７  ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域
配列番号２８  ヒト軽鎖カッパ定常領域
配列番号２９  ヒト軽鎖ラムダ定常領域
【００８５】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の要旨から逸脱することなしに、示された手順に改変を加えることができることが理解されている。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】典型的な順序で可変ドメインと定常ドメインを含んでなる２対の重鎖と軽鎖を持ち、第１の抗原１に特異的に結合するＣＨ４ドメインを含まない全長抗体の図式的構造。
【図２ａ】２つのポリペプチドＶＨとＶＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって、第２の抗原２に特異的に結合する抗原結合部位を形成する）、第１の抗原１に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。
【図２ｂ】２つのポリペプチドＶＨ‐ＣＨ１とＶＬ‐ＣＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって、第２の抗原２に特異的に結合する抗原結合部位を形成する）、第１の抗原１に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。
【図３】「ｋｎｏｂｓ ａｎｄ ｈｏｌｅｓ」を備えた２つのポリペプチドＶＨとＶＬがそこに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって第２の抗原２に特異的に結合する抗原結合部位を形成する）、第１の抗原１に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。
【図４】「ｋｎｏｂｓ ａｎｄ ｈｏｌｅｓ」を備えた２つのポリペプチドＶＨとＶＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって第２の抗原２に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、ここで、それらのＶＨドメイン及びＶＬドメインはＶＨ４４位とＶＬ１００位の間に鎖間ジスルフィド架橋を含んでなる）、第１の抗原１に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。
【図５】癌細胞の細胞表面への二重特異性抗体の結合。
【図６ａ】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ｃ‐Ｍｅｔ受容体リン酸化の阻害。
【図６ｂ】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ｃ‐Ｍｅｔ受容体リン酸化の阻害。
【図６ｃ】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ｃ‐Ｍｅｔ受容体リン酸化の阻害。
【図７ａ】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＲＧ誘発Ｈｅｒ３受容体リン酸化の阻害。
【図７ｂ】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＲＧ誘発Ｈｅｒ３受容体リン酸化の阻害。
【図８】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖の阻害。
【図９】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによる癌細胞株Ａ４３１における増殖の阻害。
【図１０】二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによる癌細胞株Ａ４３１におけるＨＧＦ誘発細胞‐細胞転移（分散）の阻害の分析。
【実施例】
【００８７】
実験手順
材料と方法
組み換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載の標準的な方法を、ＤＮＡを操作するために使用した。分子生物学的試薬を製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【００８８】
ＤＮＡとタンパク質の配列分析、及び配列データ・マネジメント
以下でヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する概説は：Kabat, E.A. et al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242にある。抗体鎖のアミノ酸には、ＥＵナンバリングに従って付番した（Edelman, G.M., et al., PNAS 63（1969）78-85; Kabat, E.A., et al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242）。ＧＣＧ（Genetics Computer Group、Madison, Wisconsin）のソフトウェアパッケージ バージョン１０．２及びInfomaxのVector NTI Advance suiteバージョン８．０を、配列新規作成、マッピング、分析、アノテーション及び図示に使用した。
【００８９】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を、SequiServe（Vaterstetten, Germany）及びGeneart AG（Regensburg, Germany）にて実施された二本鎖配列決定法によって決定した。
【００９０】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ産物からGeneart AG（Regensburg, Germany）で調製された。１つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接した遺伝子セグメントを、ｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミド内にクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、そしてＵＶ分光法によって濃度決定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定法で確認した。（Ｇ4Ｓ）nペプチドコネクタによって連結されているＣ末端５Ｄ５ ＶＨ領域を持つＣＨ３ドメイン内にＴ３６６Ｗ突然変異を保有する「ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅ」Ｈｅｒ３（クローン２９）抗体重鎖、並びに（Ｇ4Ｓ）nペプチドコネクタによって連結されているＣ末端５Ｄ５ ＶＬ領域を持ち、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ突然変異を保有する「ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅ」Ｈｅｒ３（クローン２９）抗体重鎖をコードする遺伝子セグメントを、５’‐ＢａｍＨＩ及び３’‐ＸｂａＩ制限部位を用いて合成した。同じように、（Ｇ4Ｓ）nペプチドコネクタで連結されているＣ末端５Ｄ５ ＶＨ領域を持つＣＨ３ドメイン内にＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗが突然変異を保有する「ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅ」Ｈｅｒ３（クローン２９）抗体重鎖、並びに（Ｇ4Ｓ）nペプチドコネクタで連結されているＣ末端５Ｄ５ ＶＬ領域を持ち、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を保有する「ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅ」Ｈｅｒ３（クローン２９）抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を、隣接するＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位を用いて遺伝子合成によって調製した。最後に、Ｈｅｒ３（クローン２９）及び５Ｄ５抗体の無改変重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、隣接するＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位によって合成した。すべての構築物をリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計し、そして真核細胞内での分泌のためのタンパク質を目的とした。
【００９１】
発現プラスミドの構築
発現プラスミドをコードしているRoche発現ベクターを、すべての重ＶＨ／ＶＬ融合タンパク質及び軽鎖タンパク質の構築に使用した。ベクターは、以下の要素：
−  選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン‐バールウイルス（ＥＢＶ）の複製開始点、ｏｒｉＰ、
−  Ｅ．コリ内でのこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製開始点、
−  Ｅ．コリ内でアンピシリン耐性を付与するβ‐ラクタマーゼ遺伝子、
−  ヒト・サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサ及びプロモーター
−  ヒト１‐免疫グロブリン・ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、及び
−  固有のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位、
から構成される。
【００９２】
Auftrage CSP=erl.; PCT wird am 30.03.10 per Fahrer beim EPA eingereicht --> Termin geloscht, mw
【００９３】
記載したように、重鎖又は軽鎖構築物、並びにＣ末端ＶＨ及びＶＬドメインを持つ「ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅ」構築物を含んでなる免疫グロブリン融合遺伝子を、遺伝子合成によって調製し、そしてｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミド内にクローン化した。合成ＤＮＡセグメントとRoche発現ベクターを保有するｐＧ１８（ａｍｐＲ）プラスミドを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素（Roche Molecular Biochemicals）によって消化し、そしてアガロースゲル電気泳動法にかけた。次いで、精製した、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡセグメントを、単離したRoche発現ベクターＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片に連結して、最終的な発現ベクターを得た。最終的な発現ベクターをＥ．コリ細胞内に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（Miniprep）、そして制限酵素分析とＤＮＡ配列決定にかけた。正しいクローンを、１５０ｍｌのＬＢ‐Ａｍｐ培地中で培養し、再びプラスミドＤＮＡを単離し（Maxiprep）、そして配列完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００９４】
ＨＥＫ２９３細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
遺伝子組み換え免疫グロブリン変異体を、製造業者の取扱説明書（Invitrogen, USA）に従ってFreeStyle（商標）２９３発現系を使用したヒト胎児腎臓２９３‐Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現した。簡単に言えば、懸濁液FreeStyle（商標）２９３‐Ｆ細胞を、３７℃／８％のＣＯ2にてFreeStyle（商標）２９３発現培地中で培養し、そしてその細胞をトランスフェクションの日に１〜２×ｌ０6生存細胞／ｍｌの密度で新しい培地中に播種した。ＤＮＡ‐２９３fectin（商標）複合体を、２５０ｍｌの最終的なトランスフェクション体積に対して１：１モル比で、３２５μｌの２９３fectin（商標）（Invitrogen, Germany）と２５０μｇの重鎖又は軽鎖プラスミドＤＮＡを使用したOpti-MEM（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, USA）中で調製した。「ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ｈｏｌｅ」ＤＮＡ‐２９３fectin複合体を、２５０ｍｌの最終的なトランスフェクション体積に対して１：１：２モル比で、３２５μｌの２９３fectin（商標）（Invitrogen, Germany）と、２５０μｇの「Ｋｎｏｂｓ‐ｉｎｔｏ‐ホール」重鎖１及び２と、軽鎖プラスミドＤＮＡを使用したOpti-MEM（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, USA）中で調製した。抗体を含有している細胞培養上清を、１４０００ｇで３０分間の遠心分離及び滅菌濾紙（０．２２μｍ）を通して濾過してトランスフェクションの７日後に採取した。上清を−２０℃にて精製まで保存した。
【００９５】
三価の二重特異性抗体と対照抗体の精製
三価の二重特異性抗体及び対照抗体を、Protein A-Sepharose（商標）（GE Healthcare、Sweden）を使用した親和性クロマトグラフィーとSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。簡単に言えば、滅菌濾過した細胞培養上清を、PBSバッファー（１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ、７．４）で平衡化したHiTrap ProteinA HP（５ｍｌ）カラムにかけた。非結合タンパク質を平衡化バッファーで洗い落とした。抗体と抗体変異体を、０．１Ｍのクエン酸バッファー、ｐＨ２．８で溶出し、そしてタンパク質含有画分を０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分を貯留し、Ａｍｉｃｏｎの超遠心濾過機デバイス（MWCO:30K、Millipore）を用いて３ｍｌの体積まで濃縮し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare、Sweden）に投入した。高分子量集合体が５％未満しかない、精製された二重特異性抗体と対照抗体を含有する画分を貯留し、そして１．０ｍｇ／ｍｌのアリコートとして−８０℃にて保存した。Ｆａｂフラグメントを、精製した５Ｄ５モノクローナル抗体のパパイン消化と、それに続くプロテインＡクロマトグラフィーによる夾雑Ｆｃドメインの除去によって作り出した。非結合Ｆａｂフラグメントを、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare、Sweden）でさらに精製し、貯留し、そして１．０ｍｇ／ｍｌのアリコートとして−８０℃にて保存した。
【００９６】
精製タンパク質の分析
精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用し、２８０ｎｍにて吸光度（ＯＤ）を計測することによって測定した。二重特異性抗体及び対照抗体の純度と分子量を、還元剤（５ｍＭの１，４‐ジチオスレイトール）の存在下と不存在下でのＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析、そしてクーマシーブリリアントブルーでの染色によって分析した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen, USA）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４‐２０％のトリスグリシン・ゲル）。二重特異性抗体及び対照抗体サンプルの凝集体量を、２００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０の泳動バッファー中、２５℃にてSuperdex200分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare、Sweden）を使用した高性能SECによって分析した。２５μｇのタンパク質を、０．５ｍｌ／分の流量にてカラム上に注入し、そして５０分間かけて定組成で溶出した。安定性分析のために、１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製タンパク質を、４℃と４０℃にて７日間インキュベートし、その後、高性能SECによって評価した。還元した二重特異性抗体軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、ペプチド‐Ｎ‐グリコシダーゼＦ（Roche Molecular Biochemicals）での酵素的処理によるＮ‐グリカンの除去後のNanoElectrospray Q-TOF質量分析によって確認した。
【００９７】
ｃ‐Ｍｅｔリン酸化アッセイ
６ウェルプレートの１ウェルあたり５ｘ１０ｅ５個のＡ５４９細胞を、０．５％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＲＰＭＩ中、ＨＧＦ刺激の前日に播種した。翌日に、成長培地を、０．２％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＲＰＭＩで一時間、置き換えた。次いで、５μｇ／ｍＬの二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、ＨＧＦを加えるまで１０分間インキュベートし、５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で更に１０分間インキュベートした。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を１ｍＭのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、そしてそれらを、１００μＬの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ‐Ｃｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％のＤＯＣ、アプロチニン、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム）を用いて細胞培養プレート内で溶解した。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で３０分間進めた。タンパク質濃度を、ＢＣＡ方法（Pierce）を使用して測定した。３０〜５０μｇの溶解物を、４‐１２％のBis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、５％のＢＳＡを含有するＴＢＳ‐Ｔで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Ｙ１２３０、１２３４、１２３５（44-888、Biosource）に対するリン酸化部位特異的ｃ‐Ｍｅｔ抗体を用いて現像した。免疫ブロットを、非リン酸化ｃ‐Ｍｅｔに結合する抗体（AF276、R&D）で再検出した。
【００９８】
Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ３）リン酸化アッセイ
１２ウェルプレートの１ウェルにつき２×１０ｅ５個のＭＣＦ７細胞を、完全成長培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ）中で播種した。細胞を、２日以内に９０％集密まで成長させた。次いで、培地を、０．５％のＦＣＳを含む飢餓培地で置き換えた。翌日、５００ｎｇ／ｍｌのヘレグリン（R&D）の添加の１時間前に、それぞれの抗体を表示した濃度にて補った。ヘレグリン細胞を添加すると、細胞を採集し、そして溶解するまでに更に１０分間培養した。タンパク質濃度をＢＣＡ法（Pierce）を使用することで測定した。３０〜５０μｇの溶解物を、４‐１２％のBis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、５％のＢＳＡを含むＴＢＳ‐Ｔで１時間ブロッキングし、そしてＴｙｒ１２８９（4791、Cell Signaling）を特異的に認識するリン酸化部位特異的Ｈｅｒ３／ＥｒｂＢ３抗体を用いて現像した。
【００９９】
分散アッセイ
化合物処置の前日に、Ａ５４９（１ウェルあたり４０００個の細胞）又はＡ４３１（１ウェルあたり８０００個の細胞）を、０．５％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ中、９６ウェルのE-Plate（Roche、05232368001）内の２００μＬの全容量の中に播種した。接着と細胞成長を、電気抵抗を観察する１５分毎のスイープによりReal Time Cell Analyzer機器で一晩観察した。翌日、細胞を、５分毎にスイープしながらＰＢＳ中のそれぞれの抗体希釈物５μＬと共にプレインキュベートした。３０分後に、２０ｎｇ／ｍＬの終濃度をもたらす２．５μＬのＨＧＦ溶液を加え、そして実験を更に７２時間続けた。急激な変化を、１８０分間の１分毎のスイープで観察し、続いて残りの期間、１５分毎のスイープで観察した。
【０１００】
ＦＡＣＳ
ａ）結合アッセイ
Ａ４３１を剥離し、そしてカウントした。９６ウェルのコニカルプレートの１ウェルあたり１．５×１０ｅ5個の細胞を播種した。細胞を、遠沈し（１５００ｒｐｍ、４℃、５分間）、そして２％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＰＢＳ中のそれぞれの二重特異性抗体の希釈系列５０μＬ中で、氷上において３０分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、そして２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ２００μＬで洗浄し、続いて２％のＦＣＳ（Jackson Immunoresearch、109116098）を含有するＰＢＳに希釈した、ヒトＦｃに対するフィコエリトリン結合抗体と一緒に３０分間の２回目のインキュベーションをおこなった。細胞を、２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ２００μＬで２回、遠沈洗浄し、BD CellFix溶液（BD Biosciences）で再懸濁し、そして氷上で少なくとも１０分間インキュベートした。細胞の平均蛍光強度（ｍｆｉ）を、フローサイトメトリー（FACS Canto、BD）によって測定した。Ｍｆｉを、少なくとも２つの独立した染色の二重反復試験で決定した。フローサイトメトリースペクトルを、FlowJoソフトウェア（TreeStar）を使用して更に加工した。最大半減結合を、XLFit4.0（IDBS）及び用量応答ワンサイトモデル205を使用して決定した。
【０１０１】
ｂ）内在化アッセイ
細胞は、剥離し、そしてカウントした。５×１０ｅ5個の細胞を、エッペンドルフチューブ内の５０μＬの完全培地中に入れ、５μｇ／ｍＬのそれぞれの二重特異性抗体と一緒に３７℃にてインキュベートした。表示した時点で細胞を氷上に保存し、タイムコースが完了するまで保存した。その後、細胞を、ＦＡＣＳチューブに移し、遠沈し（１５００ｒｐｍ、４℃、５分間）、ＰＢＳ＋２％のＦＣＳで洗浄し、そして２％のＦＣＳ（Jackson Immunoresearch、109116098）を含有したＰＢＳちゅに希釈した、ヒトＦｃに対するフィコエリトリン結合二次抗体５０μＬと一緒に３０分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、ＰＢＳ＋２％のＦＣＳで洗浄し、そして蛍光強度をフローサイトメトリー（FACS Canto、BD）によって測定した。
【０１０２】
ｃ）架橋試験
ＨＴ２９細胞を剥離し、カウントし、そして製造業者の取扱説明書に従ってＰＫＨ２６とＰＫＨ６７（Sigma）で個別に染色した２つの集団に分けた。それぞれの染色集団について、５×１０ｅ5個の細胞を採取し、合わせ、そして完全培地中で１０μｇ／ｍＬのそれぞれの二重特異性抗体と一緒に３０分間及び６０分間インキュベートした。表示した時点で細胞を氷上に保存し、タイムコースが完了するまで保存した。細胞を、遠沈し（１５００ｒｐｍ、４℃、５分間）、ＰＢＳ＋２％のＦＣＳで洗浄し、そして蛍光強度をフローサイトメトリー（FACS Canto、BD）によって測定した。
【０１０３】
Cell Titer Glowアッセイ
細胞生存率と増殖をcell titer glowアッセイ（Promega）を使用することで定量化した。製造業者の取扱説明書に従ってアッセイを実施した。簡単に言えば、細胞を、９６ウェルプレート内の１００μＬの全容量中で所望の期間、培養した。増殖アッセイのために、細胞を、インキュベータから取り出し、そして室温にて３０分間、静置した。１００μＬのcell titer glow試薬を加え、そしてマルチウェルプレートを２分間、オービタル振盪機にかけた。発光をマイクロプレートリーダー（Tecan）により１５分後に定量化した。
【０１０４】
Ｗｓｔ‐１アッセイ
Ｗｓｔ‐１生存率と細胞増殖アッセイをエンドポイント分析として実施し、代謝的に活性な細胞の数を検出した。簡単に言えば、２０μＬのＷｓｔ‐１試薬（Roche、1164480700）を２００μＬの培地に加えた。色素の完全な現像まで、９６ウェルプレートを更に３０分間〜１時間インキュベートした。染色強度を、４５０ｎｍの波長にてマイクロプレートリーダー（Tecan）により定量化した。
【０１０５】
三価の二重特異性＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞抗体の発現及び精製の設計
表１において：表１に示したそれぞれの特徴を有する、全長ＥｒｂＢ‐３抗体（Ｈｅｒ３ クローン２９）とＣ‐Ｍｅｔ抗体（ｃ‐Ｍｅｔ ５Ｄ５）からのＶＨ及びＶＬドメインに基づく三価の二重特異性＜ＥｒｂＢ３‐ｃ‐Ｍｅｔ＞抗体を、先に記載の一般的方法に従って発現させ、そして精製した。対応するＨＥＲ３クローン２９とｃ‐Ｍｅｔ ５Ｄ５のＶＨ及びＶＬを配列表に示した。
【０１０６】
【表１】
0005616428.tif 000002
【０１０７】
実施例１（図５）：
癌細胞の細胞表面への二重特異性抗体の結合
細胞表面のそれらの受容体それぞれに対する二重特異性抗体の結合特性を、フローサイトメトリーに基づくアッセイによりＡ４３１癌細胞上で分析した。細胞を、単一又は二重特異性一次抗体と一緒にインキュベートし、そしてこれらの抗体のそれらの同族受容体に対する結合を、一次抗体のＦｃに特異的に結合するフルオロフォアを結合させた二次抗体を用いて検出した。一次抗体の希釈系列の平均蛍光強度を、抗体の濃度に対してプロットして、シグモイド結合曲線を得た。ｃ‐ＭｅｔとＨｅｒ３の細胞表面発現を、二価の５Ｄ５及びＨｅｒ３クローン２９抗体だけでのインキュベーションによって実証した。Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳ抗体は、Ａ４３１の細胞表面に容易に結合する。これらの実験設定の下で、抗体はそのＨｅｒ３部分を介して結合するだけであるので、その結果、平均蛍光強度はＨｅｒ３クローン２９単独の染色を超えない。
【０１０８】
実施例２（図６）：
二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ｃ‐Ｍｅｔ受容体リン酸化の阻害
二重特異性抗体のｃ‐Ｍｅｔ部分の機能性を確認するために、ｃ‐Ｍｅｔリン酸化アッセイを実施した。この実験では、Ａ５４９肺癌細胞又はＨＴ２９大腸癌細胞を、二重特異性抗体又は対照抗体で前処理した後に、ＨＧＦにさらした。次いで、細胞を溶解し、そしてｃ‐Ｍｅｔ受容体のリン酸化を調べた。免疫ブロットにおけるリン酸化ｃ‐Ｍｅｔ特異的バンドの出現によって観察されるように、両細胞株ともＨＧＦで刺激できた。
【０１０９】
実施例３（図６）：
二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＲＧ誘発Ｈｅｒ３受容体リン酸化の阻害
二重特異性抗体のＨｅｒ３部分の機能性を確認するために、Ｈｅｒ３リン酸化アッセイを実施した。この実験では、ＭＣＦ７細胞を、二重特異性抗体又は対照抗体で前処理した後に、ＨＲＧ（Heregulin）にさらした。次いで、細胞を溶解し、そしてＨｅｒ３受容体のリン酸化を調べた。Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳは、親Ｈｅｒ３クローン２９と同程度にＨｅｒ３受容体のリン酸化を阻害したので、その抗体のＨｅｒ３結合及び機能性が三価抗体フォーマットによって損なわれないことを示した。
【０１１０】
実施例４（図８）：
二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖の阻害
ＨＧＦの細胞分裂効果を実証するために、ＨＵＶＥＣ増殖アッセイを実施した。ＨＵＶＥＣへのＨＧＦの添加は、増殖の２倍の増加をもたらす。二重特異性抗体と同じ濃度領域内でのヒトＩｇＧ対照抗体の添加は、細胞増殖に対して全く影響がなかったが、その一方で、５Ｄ５ Ｆａｂフラグメントは、ＨＧＦ誘発増殖を阻害した。Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳの滴定は、抗体のわずかな阻害効果を実証している（図８）。その効果は、Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ‐６Ｃ抗体に関してより明白であり、より長いコネクタが抗体の有効性を改善することを示している。これは三価抗体フォーマットにおけるｃ‐Ｍｅｔ成分の機能性を実証している。
【０１１１】
実施例５（図９）：
二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによる癌細胞株Ａ４３１における増殖阻害
Ａ４３１を血清減量培地に播種した場合、ＨＧＦ添加は、転移とは別に弱い細胞分裂効果を誘発する。これをＨＧＦ処理したＡ４３１の増殖に対するＨｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳの効果を分析するのに利用した。実際には、二重特異性抗体は、ＨＧＦ誘導性の増殖の増加を大幅に阻害できた（１５％）。対照ヒトＩｇＧ１抗体は、ＨＧＦによって促進したＡ４３１細胞の増殖に影響を与えなかった。
【０１１２】
実施例６（図１０）：
二重特異性Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ抗体フォーマットによる癌細胞株Ａ４３１におけるＨＧＦ誘発性細胞‐細胞転移（分散）の阻害の分析
ＨＧＦ誘導性分散は細胞の形態学的変化を伴うので、細胞の円形化、糸状仮足様前突起、紡錘形構造体、及び細胞の特定の運動性をもたらす。Real Time Cell Analyzer（Roche）は、所定の細胞培養ウェルの電気抵抗を計測するので、そのため細胞形態及び増殖における変化を間接的に観察できる。Ａ４３１及びＡ５４９細胞に対するＨＧＦの添加は、時間の関数として観察した電気抵抗の変化をもたらした。Ｈｅｒ３／ｃ‐Ｍｅｔ＿ＫＨＳＳ及びＨｅｒ３／Ｍｅｔ‐６Ｃは、ＨＧＦ誘導性分散を阻害し、Ｈｅｒ３／Ｍｅｔ‐６Ｃがより効果的であった（２０．７％及び４３．７％の分散阻害）（図１０）
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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