(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式：
【化１】
0005618335.tif 000009
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物を含有する、nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬。
【請求項２】
nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母において、前記目的遺伝子の発現量を随意に調節するものである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
目的遺伝子の発現量の随意調節は、前記化合物又はその製薬上許容される塩の濃度を調節することにより行うものである、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
次式：
【化２】
0005618335.tif 000010
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物の存在下で、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を培養することを特徴とする、nmt1プロモーターの転写活性の調節方法。
【請求項５】
前記化合物又はその製薬上許容される塩の濃度を調節することにより、前記目的遺伝子の発現量を当該濃度依存的に調節することができる、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分裂酵母において遺伝子発現を調節することができる化合物及び該化合物を含有する転写活性調節用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
分裂酵母（シゾサッカロミセス・ポンベ；Schizosaccharomyces pombe)は、生命科学の研究材料として長年用いられてきたモデル生物である。特に近年は、分裂酵母に外部から遺伝子を導入し、その外来遺伝子の効果を評価する実験が広く行われている。
外来遺伝子の発現レベルを調節する方法としては、nmt1プロモーターを用いた方法が知られている。nmt1プロモーターは、チアミン（ビタミンB1）により不活性化し、チアミンを培地から除去することで活性化されるため、目的遺伝子のon/off型の発現調節には有用である（非特許文献１）。
しかしながら、nmt1プロモーターは低濃度のチアミンにも感受性を示し、転写活性がoffとなるため、チアミン濃度を調節することにより、目的遺伝子の発現量を随意に（例えば30%、60%というように）調節することは実質上不可能であった。この問題の解決を試みた技術として、チアミン非存在下での転写活性が減弱するような変異型nmt1プロモーターの構築例がある（非特許文献２、３）。しかし、この技術では、nmt1プロモーターの変異領域を変化させることにより外来遺伝子の発現量を段階的に調節することはできるものの、変異のタイプごとにプロモーターの活性レベルが決まっているため、随意に調節することはできない。また、この技術を用いて目的遺伝子を所望の量発現させるためには、個々の目的遺伝子ごとに複数のベクターを構築する必要があるため、操作が煩雑となる。
従って、変異型nmt1プロモーターを用いて発現量を調節する技術は、広く普及するには至っていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Maundrell K., Gene, 1993, 123:127-130
【非特許文献２】Basi G. et al., Gene, 1993, 123:131-136
【非特許文献３】Moreno MB. et al., Yeast, 2000, 16:861-872
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、酵母において、単なるon/off型の遺伝子発現調節だけではなく、目的遺伝子の発現量を随意に調節できる試薬及び方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐な化合物であって、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を抑制する化合物を見出した。そして、当該化合物の存在下でnmt1プロモーターにより制御される外来遺伝子を発現させることにより、当該遺伝子の発現量を随意に調節できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）  次式（I）：
【化５】
0005618335.tif 000002
｛式中、R1及びR2は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよいC2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいC2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいC3-12シクロアルキル基、置換基を有していてもよいC6-12アリール基、置換基を有していてもよいC7-13アラルキル基、置換基を有していてもよいC1-6アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいC1-6ヒドロキシルアルキル基、-NO2、-SH、-NH2又は=Oを表し、Xは、-CO-、-CONH-、-(PO3H)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(OPO2)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(CH2)n-（nは1〜5の整数を表す）又は-(CH2CH2O)n-（nは1〜5の整数を表す）を表し、部分構造 ---- は単結合又は二重結合を表す｝
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物を含有する、nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬。
（２）式（I）で示される化合物が、次式：
【化６】
0005618335.tif 000003
で示される化合物である、上記（１）に記載の試薬。
（３）nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母において、前記目的遺伝子の発現量を随意に調節するものである、上記（１）又は（２）に記載の試薬。
（４）目的遺伝子の発現量の随意調節は、前記化合物又はその製薬上許容される塩の濃度を調節することにより行うものである、上記（３）に記載の試薬。
（５）上記（１）又は（２）に記載の化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物の存在下で、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を培養することを特徴とする、nmt1プロモーターの転写活性の調節方法。
（６）前記化合物又はその製薬上許容される塩の濃度を調節することにより、前記目的遺伝子の発現量を当該濃度依存的に調節することができる、上記（５）に記載の方法。
（７）次式（I）：
【化７】
0005618335.tif 000004
｛式中、R1及びR2は、それぞれ独立して水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよいC2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいC2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいC3-12シクロアルキル基、置換基を有していてもよいC6-12アリール基、置換基を有していてもよいC7-13アラルキル基、置換基を有していてもよいC1-6アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいC1-6ヒドロキシルアルキル基、-NO2、-SH、-NH2又は=Oを表し、Xは、-CO-、-CONH-、-(PO3H)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(OPO2)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(CH2)n-（nは1〜5の整数を表す）又は-(CH2CH2O)n-（nは1〜5の整数を表す）を表し、部分構造 ---- は単結合又は二重結合を表す｝
で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物。
（８）式（I）で示される化合物が、次式：
【化８】
0005618335.tif 000005
で示される化合物である、上記（７）に記載の化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、分裂酵母に導入した外来遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明によるnmt1プロモーター制御の概念図である。（A）チアミンによるnmt1プロモーター制御を示す。（B）本発明の化合物によるnmt1プロモーター制御を示す。「T」はチアミンを表し、「Y」はYAM2を表す。黒丸は発現産物を表す。
【図２】nmt1プロモーターに対するチアミンとYAM2の効果の比較を示す図である。（A）顕微鏡観察による解析結果を示す。（B）フローサイトメトリーによる解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
【０００９】
１．概要
本発明者らは、ある外来タンパク質（HIV-1 Vpr）をnmt1プロモーターにより発現する分裂酵母株（Masuda et al., J. Virol., 2000, 74:2636-2646）を用いて、約20,000種類の化合物をスクリーニングした結果、nmt1プロモーターの転写活性を抑制する化合物を見出した。当該化合物は、チアミンがnmt1プロモーターの発現をon/off型で調節するのに対し、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐であり、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができる。従って、当該化合物の存在下で外来遺伝子を含む分裂酵母を培養することにより、当該遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
本発明により、式（I）で示される化合物の培地中の濃度を調節するという簡便な方法で外来性遺伝子の発現レベルを随意に調節することが可能となるため、タンパク質とその作用との関係などについて定量的な解析が容易に行うことができる。これにより、従来は技術的困難のために実施することができなかった実験、研究を積極的に行うことができる。
【００１０】
２．式（I）で示される化合物
本発明に用いられる化合物は、以下の式（I）で示される。
式（I）：
【化９】
0005618335.tif 000006
【００１１】
式（I）において、
R1及びR2で表される置換基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基、置換基を有していてもよいC2-6アルケニル基、置換基を有していてもよいC2-6アルキニル基、置換基を有していてもよいC1-6アルコキシ基、置換基を有していてもよいC3-12シクロアルキル基、置換基を有していてもよいC6-12アリール基、置換基を有していてもよいC7-13アラルキル基、置換基を有していてもよいC1-6アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいC1-6ヒドロキシルアルキル基、-NO2、-SH、-NH2、=Oが挙げられる。
また、Xとしては、例えば-CO-、-CONH-、-(PO3H)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(OPO2)n-（nは1〜2の整数を表す）、-(CH2)n-（nは1〜5の整数を表す）又は-(CH2CH2O)n-（nは1〜5の整数を表す）が含まれる。
部分構造 ---- は単結合又は二重結合を表す。
【００１２】
本発明において、「C1-6アルキル基」とは、炭素数が１〜６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。
「C2-6アルケニル基」とは、炭素数が２〜６個のアルケニル基を意味し、例えば、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基などが挙げられる。
「C2-6アルキニル基」とは、炭素数が２〜６個のアルキニル基を意味し、例えば、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基などが挙げられる。
「C1-6アルコキシ基」とは、炭素数１〜６のアルコキシ基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、iso-プロポキシ基、sec-プロポキシ基、n-ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、n-ヘキソキシ基などが挙げられる。
「C3-12シクロアルキル基」とは、炭素数３〜１２のシクロアルキル基を意味し、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基などが挙げられるが、中でもシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基などの炭素数３〜７のシクロアルキル基が好ましい。
【００１３】
「C6-12アリール基」とは、炭素数が6〜12個の芳香族炭化水素環式基を意味し、例えば、フェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基、インデニル基、アズレニル基、ヘプタレニル基、ビフェニル基などが挙げられる。
「C7-13アラルキル基」としては、例えば、ベンジル基、フェネチル基、1-フェニルエチル基、2-フェニルエチル基、1-フェニルプロピル基、2-フェニルプロピル基などが挙げられる。
「C1-6アルキルアミノ基」としては、例えば、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、n-ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、sec-ブチルアミノ基、tert-ブチルアミノ基、ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基などが挙げられる。
「C1-6ヒドロキシルアルキル基」としては、例えば、ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ヒドロキシブチル基、ヒドロキシペンチル基、ヒドロキシヘキシル基などが挙げられる。
「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、フッ素原子、塩素原子が好ましい。
なお、「置換基を有していてもよい」とは、置換基の置換可能な位置にさらに置換基を有していてもよいことを意味し、その置換基としては、例えば、水素原子、ハロゲン原子、C1-6アルキル基、C2-6アルケニル基、C2-6アルキニル基、C1-6アルコキシ基、C3-12シクロアルキル基、C6-12アリール基、C7-13アラルキル基などが挙げられる。各置換基の定義は上記と同じである。置換基の数は例えば１〜３個である。
【００１４】
式（I）で示される化合物は、nmt1プロモーターの転写活性を抑制することができる。当該化合物は、チアミンがnmt1プロモーターの発現をon/off型で調節するのに対し、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐であり、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができる。従って、当該化合物の存在下で外来遺伝子を含む分裂酵母を培養することにより、当該遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
【００１５】
本発明に使用される式（I）で示される化合物は、ENAMINE社（日本代理店：ナミキ商事株式会社）などから市販品として入手可能である。
【００１６】
本発明において、式（I）で示される化合物としては、限定されるものではないが、例えば、以下の化合物：
【化１０】
0005618335.tif 000007
が挙げられる（この化合物を以下「YAM2」と称する）。
YAM2は、チアミンの構造類似体であるが、チアミンがピリミジンとチアゾールが結合した構造であるのに対し、YAM2のチアゾール部位には、さらにアダマンタン基がエステル結合している。このような構造を有することから、YAM2は化学合成による量産が可能である。
YAM2は、分裂酵母（シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe））において、nmt1プロモーターやその変異型誘導体を用いて外来遺伝子の発現を行う際に、プロモーターの転写活性、すなわち遺伝子の発現レベルを随意に調節するために有用である。
また、YAM2はnmt1プロモーターの転写活性をoffにするのに必要な高濃度においても、分裂酵母の増殖能には明らかな影響を与えない。従って、nmt1プロモーターにより制御される外来遺伝子を持つ分裂酵母を、培地中に適量のYAM2 を添加するという簡単な操作により培養することで、必要十分量の遺伝子発現レベルを得ることができる。
【００１７】
本発明において使用される化合物は、製薬上許容される塩や水和物を形成してもよい。
製薬上許容される塩は、本発明の効果を有する限り特に限定されるものではなく、酸との塩を形成しても塩基との塩を形成してもよい。
酸との塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸との塩、蟻酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸との塩などを挙げることができる。
塩基との塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン等の有機塩基との塩（有機アミン塩）、あるいはアンモニウム塩などを挙げることができる。
また、本発明において使用される化合物は、その使用形態によっては、塩を形成しない、いわゆるフリー体を選択することもできる。
【００１８】
３．nmt1プロモーター
nmt1プロモーターは、分裂酵母への遺伝子導入に際し、外来遺伝子を発現するためによく用いられる。nmt1プロモーターは、チアミンの添加、不添加により、転写活性をonとoffの二段階で切り替えることができる。しかし、これまでnmt1プロモーターの転写活性レベルを随意に調節することは容易ではなかった。本発明は、簡便な方法によりnmt1プロモーター活性の随意調節を可能にするものである。
nmt1プロモーターの塩基配列を配列番号１に示す。nmt1プロモーターの塩基配列は、所定のデータベースから入手可能であり、例えばGenbankアクセッション番号J05493が利用可能である。
また、本発明のnmt1プロモーターとしては、上記配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドだけでなく、変異型nmt1プロモーターも用いることもできる。変異型nmt1プロモーターとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドがあげられる。このようなポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００１９】
ここで、配列番号１で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列としては、例えば、
(a) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が欠失した塩基配列、
(b) 配列番号１で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が他の核酸で置換された塩基配列、
(c) 配列番号１で示される塩基配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が付加した塩基配列、
(d)上記(a)〜(c)の組合せにより変異された塩基配列
などが挙げられる。
【００２０】
このようなポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発法を利用して得ることができる。詳細については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））等を参照することができる。
【００２１】
上記ハイブリダイゼーションにおいてストリンジェントな条件としては、たとえば、1×SSC〜２×SSC、0.1％〜0.5％SDS及び42℃〜68℃の条件が挙げられ、より詳細には、60〜68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で5〜15分の洗浄を4〜6回行う条件が挙げられる。ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58）等を参照することができる。
【００２２】
４．nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬
本発明の試薬は、式(I)で示される化合物、その製薬上許容される塩又はそれらの水和物（以下「式(I)で示される化合物等」）を含むものである。上記の通り、式(I)で示される化合物は、nmt1プロモーターの転写活性を抑制することができる。当該化合物は、チアミンがnmt1プロモーターの発現をon/off型で調節するのに対し、nmt1プロモーターに対する抑制作用が緩徐であるため、幅広い濃度にわたって濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができる。
【００２３】
本発明の試薬は、式(I)で示される化合物等を単独で用いてもよいし、その他に添加剤を含んでいてもよい。当該添加剤としては、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味矯臭剤、乳化剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤などが挙げられる。これらを単独又は適宜組み合わせ、定法により本発明の試薬を製造することができる。
【００２４】
本発明の試薬は、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母において、当該目的遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
「発現の目的遺伝子」とは、nmt1プロモーターに制御され、遺伝子発現の目的となる所望の外来遺伝子を意味する（本明細書において、単に「外来遺伝子」とも称する）。このような遺伝子としては、例えば、宿主細胞の増殖、生存等に関わる遺伝子（例えば、癌遺伝子、癌抑制遺伝子等）、蛍光タンパク質（GFP、RFP、YFP等）をコードする遺伝子、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子、免疫調節機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、生体物質の代謝を司る酵素タンパク質をコードする遺伝子等が挙げられるが、当業者であればそれぞれの目的に応じて任意に選択することができ、限定されるものではない。
また、分裂酵母としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe)、シゾサッカロミセス・ジャポニクス（Schizosaccharomyces japonicus）、シゾサッカロミセス・オクトスポルス（Schizosaccharomyces octosporus）等が挙げられるが、好ましくはシゾサッカロミセス・ポンベである。
【００２５】
nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母（形質転換株）は、公知の方法、例えば以下の方法により調製することができる。
(１)組換えベクターの作製
目的遺伝子をクローニングしたプラスミドを制限酵素で切断し、目的遺伝子のDNA断片を調製する。あるいは、目的遺伝子をPCRで増幅し、DNA断片を調製する。nmt1プロモーターとleu1遺伝子を含むプラスミド（pREP1など）のnmt1プロモーター下流部位を制限酵素で切断したものと、上記により得られた目的遺伝子DNA断片とを混合し、DNAリガーゼにより結合する。形成された環状DNAを適当な宿主大腸菌（DH5αなど）に導入し、形質転換大腸菌を分離する。得られた大腸菌株を培養し、プラスミドを抽出、精製すれば、分裂酵母に導入可能な組換えベクターを調製することができる。
（２）形質転換株の作製
（１）により調製した組換えベクターを、酢酸リチウム法（Okazaki et al., Nucleic Acids Res., 1990, 18:6485-6489）や市販の酵母用DNA 導入試薬により、ロイシン要求性変異を有する分裂酵母に導入する。導入後の酵母細胞をロイシンを含まない寒天培地で培養し、形成された集落を単離することで、形質転換株を得ることができる。
【００２６】
本発明において、「随意に」とは、任意のレベル（例えば、転写活性レベル、発現量等）に、ということを意味する。例えば、転写活性について「随意に調節」とは、化合物の非存在下におけるnmt1プロモーターの転写活性を100％とした場合に、所望の転写活性レベルが60％であるときは、約60％の転写活性レベルに調節できるということを意味する。また、発現量について「随意に調節」とは、化合物の非存在下におけるnmt1プロモーターに制御された目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を100％とした場合に、所望の発現量が60％であるときは、約60％の発現量に調節できるということを意味する。但し、所望の転写活性レベル又は発現量と実際の転写活性レベル又は発現量とが完全に一致することを意味するものではなく、最大で±10％の差が生じたとしても、随意に調節できたといえる。
【００２７】
例えば、式(I)で示される化合物としてYAM2を使用した場合、培地中のYAM2濃度を10μMとしたときは、nmt1プロモーターの転写活性又は発現タンパク質の発現量は、化合物の非存在下における活性又は量を100％とした場合に、約80％に調節でき、培地中のYAM2濃度を30μMとしたときは、約40％に調節でき、培地中のYAM2濃度を100μMとしたときは、約0％に調節できる。
【００２８】
上記転写活性レベルや目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量等は、公知の測定方法を用いて測定することができる。そのような測定方法としては、例えば、PCR法、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、フローサイトメトリー法、ウエスタンブロッティング法、ELISA法、免疫染色法等が挙げられる。また、転写活性レベルやタンパク質の発現量を定量するため、レーザースキャニングサイトメーター（Compucyte社）、HSオールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス社）等の測定装置を使用することもできる。
【００２９】
上記目的遺伝子の発現量の随意調節は、式（I）で示される化合物の濃度を調節することによって行うことができる。
本発明の試薬を分裂酵母の培地に添加して使用する場合、当該培地中の式（I）で示される化合物の濃度は、各実験条件において異なるが、例えば、0〜約100μMの範囲である。当該化合物を培地に100μM添加すると、nmt1プロモーターの活性はほぼ完全に抑制される。そして、当該化合物を除去することで、nmt1プロモーターを100％活性化し、遺伝子発現を誘導することができる。さらに、培地中の化合物濃度を0〜100μMの範囲で調節することにより、濃度依存的にnmt1プロモーターの活性又は目的遺伝子の発現量を100〜0%の範囲（例えば、100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、0％）で任意に調節できる。従って、本発明の試薬を使用すれば、単にon/off型の遺伝子発現調節だけでなく、求めるレベルの転写活性及び遺伝子発現量を随意に調節することができる（図１）。図１は、式（I）で示される化合物によるnmt1プロモーター制御の概念図である。チアミン（T）を用いた従来の方法の場合、低濃度のチアミン存在下でもnmt1プロモーターの活性が強く抑えられるため、全か無かというon/off型の発現調節しかできない（図１A）。一方、式（I）で示される化合物の一つであるYAM2（Y）を用いた方法では、YAM2の濃度依存的にnmt1プロモーターの活性が徐々に変わるため、種々のレベルの遺伝子発現が得られる（図１B）。
具体的なnmt1プロモーターの転写活性等の調節方法については、以下の「５．nmt1プロモーターの転写活性調節方法」に記載する。
【００３０】
５．nmt1プロモーターの転写活性調節方法
本発明の方法は、式（I）で示される化合物等の存在下で、nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を培養することを特徴とするものであり、前記化合物等の濃度を調節することにより、前記目的遺伝子の発現量を当該濃度依存的に調節することができるものである。
【００３１】
本発明の方法は、例えば以下の工程のうち少なくとも一つを含むことができる。
(i)nmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母を調製する工程、
(ii)前記分裂酵母の培地に式（I）で示される化合物等を添加する工程、
(iii)前記分裂酵母を式（I）で示される化合物等の存在下で培養する工程、
(iv)nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を測定する工程、及び
(v)前記測定結果に基づいて、培地中の式（I）で示される化合物等の濃度を調節することにより、nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を当該濃度依存的に調節する工程。
【００３２】
上記工程(i)におけるnmt1プロモーター及び発現の目的遺伝子を含む分裂酵母の調製方法については、上記「４．nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬」に記載した通りである。
【００３３】
上記工程(ii)において、分裂酵母の培地としては、最小培地（MM）やMB培地等（Experiments with Fission Yeast: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993）が挙げられる。培地には、Geneticin、Aureobacidin等の抗生物質や、その他の添加物としてアデニン、ウラシル等を添加してもよい。また、式（I）で示される化合物の添加量は、各実験条件において異なるが、例えば、培地中の濃度が0〜約100μMとなるような範囲の量である。当該培地中の化合物濃度の範囲は、当業者であれば各実験条件により適宜変更することができる。
【００３４】
上記工程(iii)において、「式（I）で示される化合物等の存在下で培養する」とは、具体的には、式（I）で示される化合物等を含む培地中で培養することを意味する。
培養時間は、化合物を添加してから約10〜48時間であり、好ましくは約16〜24時間である。なお、化合物を添加する前に約16〜24時間プレインキュベーションをすることができる。
培養温度は、約20〜36℃であり、好ましくは約25〜30℃である。
【００３５】
工程(iv)において、nmt1プロモーターの転写活性を測定する方法、並びに発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量の測定方法については、上記「４．nmt1プロモーターの転写活性調節用試薬」に記載した通りである。
例えば、発現の目的遺伝子としてGFP遺伝子を使用した場合、フローサイトメトリー法を用いて、GFP発現細胞の数を測定することにより、nmt1プロモーターの転写活性及びGFPの発現量を測定することができる。
また、nmt1プロモーター依存的に発現したタンパク質を分裂酵母から抽出し、ウエスタンブロッティング法等により、当該タンパク質の発現量を測定することもできる。
【００３６】
工程(v)においては、上記工程(iv)において得られた測定結果に基づき、培地中の式（I）で示される化合物等の濃度と、nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量との関係について、標準曲線を作成することができる。
そして、標準曲線に基づき、所望の量のタンパク質発現に至適な化合物濃度を決定する。
これにより、培地中の式（I）で示される化合物等の濃度を調節することにより、nmt1プロモーターの転写活性又は発現の目的遺伝子がコードするタンパク質の発現量を当該濃度依存的に調節することができる。
【００３７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
１．式(I)で示される化合物の取得
本発明の化合物は、以下の方法により約20,000種類の低分子化合物群からスクリーニングすることにより取得した。
まず、ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）のアクセサリータンパクの一種であるVprにヒスチジン（His）標識したもの（His-Vpr）をnmt1プロモーター依存的に発現する分裂酵母株Sp-His-Vprを樹立した。この株は、チアミン存在下ではnmt1プロモーターの転写活性が抑制され、His-Vprを発現しないため、正常に増殖する。一方、チアミン非存在下では、nmt1プロモーターが活性化し、His-Vprが発現するため、Vprの効果によりSp-His-Vpr株の増殖は著しく阻害される。96穴プラスチックプレートの各穴にスクリーニング対象となる各化合物（1 mMのDMSO溶液）をあらかじめ2μl入れておき、これにSp-His-Vpr株細胞の細胞懸濁液（0.15% のBactoagarを含むMM培地にSp-His-Vpr株の細胞を3,000個／ml含む）を100μlずつ添加した。これを30℃で5日間培養し、Sp-His-Vpr株細胞の増殖を肉眼および実体顕微鏡で観察した。チアミンやスクリーニング対象化合物を添加していない対照サンプルと比較して、細胞増殖が明らかに促進している穴を見出すことでスクリーニングを行った。
【００３９】
上記スクリーニングの結果、式(I)で示される化合物を取得した。式（I）で示される化合物の代表例として、下記式で示す化合物（以下、「YAM2」と称する）を以下の実施例に用いた。
【化１１】
0005618335.tif 000008
【００４０】
２．形質転換体の作製
（１）組換ベクターの作製
組換えベクターは、以下のようにして作製した。
市販のプラスミドpEGFP-N1（CLONTECH社）を制限酵素により切断し、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする遺伝子断片を調製した。既知のプラスミドpREP1（Maundrell K.  Thiamine-repressible expression vectors pREP and pRIP for fission yeast. Gene. 123:127-130, 1993）のnmt1プロモーターの下流で制限酵素切断したものを調製し、上記のGFP遺伝子断片と混合し、DNAリガーゼ処理により環状DNAを作製した。これを、大腸菌DH5α株に導入し、アンピシリン含有寒天培地で培養することで形質転換株を選択し、この形質転換株からnmt1プロモーターの下流にGFP遺伝子が結合した組換えベクターを単離した。
【００４１】
（２）形質転換体の作製
上記（１）で作製した組換えベクターを分裂酵母に形質転換することにより、GFPを発現する形質転換体を取得した。形質転換は、市販の酵母用DNA導入試薬（Fast Yeast Transformation kit; G-Bioscience社）を用いて行った。
【００４２】
３．式（I）で示される化合物によるnmt1プロモーターの転写活性調節
上記２．で取得した形質転換株を0、0.3、1、3、10μMのチアミン、あるいは1、3、10、30、100μMのYAM2を含む液体培地で振盪培養したものを顕微鏡で観察した。
その結果、培地にチアミンを添加した場合、0.3μMの低濃度でも、GFPの発現は顕著に低下し、1μM以上では、ほぼ完全に発現が抑制された。一方、YAM2を培地に添加した場合は、0〜100μMの範囲で、濃度依存的にGFPの発現が調節（抑制）されることが確認された（図２A）。また、100μMのYAM2存在下で分裂酵母を培養しても、YAM2自体による細胞毒性や細胞増殖への影響は認められなかった。図２Aにおいて、上段は通常の白色光観察を示し、下段は蛍光観察を示す。
【００４３】
また、上記の細胞におけるGFPの発現についてフローサイトメーターFACS Caliber（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて解析した。顕微鏡観察の結果に合致して、チアミンでは低濃度でもGFPの発現強度や発現細胞数が激減するのに対し、YAM2では100μMまでの広い範囲でYAM2濃度依存的にGFP発現の変化が認められた（図２B）。
【００４４】
以上より、式（I）で示される化合物の濃度を調節することにより、当該濃度依存的にnmt1プロモーターの転写活性を調節することができ、また、発現の目的となる遺伝子の発現量を随意に調節できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、分裂酵母に導入した外来遺伝子の発現量を随意に調節することができる。
分裂酵母は研究用モデル生物として長年用いられているため、本発明は分裂酵母を用いた研究における試薬として有用である。また、分裂酵母を用いた組換えタンパク質の製造産業における応用も考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【００４６】
配列番号１：合成DNA
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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