(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の何れかを含む、神経細胞が欠失又は損傷する神経系の疾患、障害、又は損傷を治療するための医薬、
i) 以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド:
a) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列;及び
b) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列の配列バリアントであって、前記SEQ ID NO. 7に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ、神経栄養性作用、神経保護作用、神経発生作用、神経再生作用、神経移動作用、及び、神経細胞の成長、増殖、生存、又は分化に対する作用からなる群から選択される生物学的活性を有する配列バリアント;
ii) 上記i)のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子、
iii) 上記ii)の単離された核酸分子を含む発現ベクター、
iv) 上記iii)の発現ベクターで形質転換又は形質導入された宿主細胞の組成物、又は、
v) 感染性ウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって、当該ウイルス粒子は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、上記i)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現できるように当該ポリヌクレオチド配列に連結されたプロモーター、DNA第2鎖合成のためのオリジン、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科由来ゲノムを含む、パッケージング細胞株。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、SEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、SEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも98％の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
【請求項４】
SEQ ID NO. 7と比較して変化している、前記配列バリアントのアミノ酸が、以下の化1又は化2において、星印を付されていないものの中から選択されたアミノ酸である、請求項1から3のいずれかに記載の医薬。
【化１】
0005616888.tif 000022
【化２】
0005616888.tif 000023
【請求項５】
前記ポリペプチドが、少なくとも1つの分子内シスチン架橋を形成することができる、請求項1から4のいずれかに記載の医薬。
【請求項６】
前記核酸分子が、SEQ ID No. 16の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
【請求項７】
前記核酸分子が、SEQ ID No. 16の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも98％の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬。
【請求項８】
前記ベクターが、レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV、又はレトロウイルス・ファミリーに由来するベクター、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピロマウイルス、及びMo-MLVからなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
【請求項９】
前記宿主細胞が、不死化網膜色素上皮細胞、ARPE-19細胞、ヒト不死化線維芽細胞、ヒト不死化星状膠細胞、ヒト神経性幹細胞又は前駆体細胞、ヒト・グリア性幹細胞又は前駆体細胞、及び胎児性の幹細胞からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬。
【請求項１０】
以下を含む、移植可能な生体適合性細胞装置:
(i) ポリペプチド及び/又はベクターの拡散を許容する半透膜;及び
(ii) 当該半透膜の中にカプセル化された、宿主細胞の組成物又はパッケージング細胞株を含む中心部;
ここで、当該ポリペプチドは、a) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列、及びb) SEQ ID NO. 7のアミノ酸配列の配列バリアントであって、前記SEQ ID NO. 7に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、かつ、神経栄養性作用、神経保護作用、神経発生作用、神経再生作用、神経移動作用、及び、神経細胞の成長、増殖、生存、又は分化に対する作用からなる群から選択される生物学的活性を有する配列バリアントからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであり、
当該ベクターは、レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIV、又はレトロウイルス・ファミリーに由来するベクター、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピロマウイルス、及びMo-MLVからなる群から選択されるベクターであり、
当該宿主細胞の組成物は、当該ポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含む発現ベクターで形質転換又は形質導入された宿主細胞の組成物であり、かつ、
当該パッケージング細胞株は、感染性ウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって、当該ウイルス粒子は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現できるように当該ポリヌクレオチド配列に連結されたプロモーター、DNA第2鎖合成のためのオリジン、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科由来ゲノムを含む、パッケージング細胞株である。
【請求項１１】
半透膜の内部に配置されたマトリックスをさらに含む、請求項10に記載の装置。
【請求項１２】
繋留アンカーをさらに含む、請求項10又は11に記載の装置。
【請求項１３】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経の受傷に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項１４】
前記疾患、障害、又は損傷が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、てんかん、神経障害、末梢神経障害、及び神経障害性疼痛である、請求項13に記載の医薬。
【請求項１５】
前記疾患が、末梢神経障害である、請求項14に記載の医薬。
【請求項１６】
前記疾患が、神経障害性疼痛である、請求項14に記載の医薬。
【請求項１７】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロン及びニューロンのプロセスの変性に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項１８】
前記疾患、障害、又は損傷が、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症に伴う神経損傷である、請求項16に記載の医薬。
【請求項１９】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロンの機能異常及び/又は欠失に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項２０】
前記疾患、障害、又は損傷が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷、悪性病変、及び/又は遺伝的な若しくは特発性の異常、糖尿病、腎機能不全、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、及び感染により引き起こされる状態である、請求項19に記載の医薬。
【請求項２１】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、神経根損傷、神経根裂離、上腕神経損傷、末梢神経障害、及び神経障害性疼痛である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項２２】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、脳、脳幹、脊髄、及び末梢神経系におけるグリアの変性又は硬化に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項２３】
前記グリアが、乏突起膠細胞、星状膠細胞、及びシュワン細胞である、請求項22に記載の医薬。
【請求項２４】
前記疾患、障害、又は損傷が、多発性硬化症、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎、及びてんかん、並びに付随の症状、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、及び小脳萎縮症である、請求項22に記載の医薬。
【請求項２５】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、網膜、光受容体、及び付随の神経に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項２６】
前記疾患、障害、又は損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び付随の症状である、請求項25に記載の医薬。
【請求項２７】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、前庭聴覚複合体の感覚上皮及び付随の神経節に関わる疾患、障害、又は損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項２８】
前記疾患、障害、又は損傷が、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、及びメニエール病である、請求項27に記載の医薬。
【請求項２９】
前記神経系の疾患、障害、又は損傷が、内耳手術及びインプラントの移植により引き起こされる損傷である、請求項1から9のいずれかに記載の医薬。
【請求項３０】
前記損傷が、アブミ骨摘出術、乳突削開術、及び鼓室形成術、並びに人工内耳又は中耳インプラントの移植により引き起こされる損傷である、請求項29に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、遺伝子及び細胞の治療的使用の分野に関連し、特に分泌性の治療用タンパク質(therapeutic protein)であるMETRNLの生物学的機能に基づく治療、特に神経系の障害の処置を目的とするもの、に関連する。METRNLは神経生存・成長因子であり、神経保護作用及び/又は神経発生作用を有する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、2008年7月24日に出願された米国出願US 61/083,316の利益を主張するものであり、当該米国出願はその全体が参照によってここに組み入れられる。本出願は、2008年7月24日に出願されたデンマーク特許出願PA 2008 01036を優先権の基礎とする。これらの出願及び本出願において引用された全ての参考文献は、その全体が参照によってここに組み入れられる。
【０００３】
細胞外タンパク質は、多細胞生物における形成、分化、維持その他のことにおいて重要な役割を果たす。数多くの個々の細胞の運命(例えば生存(survival)を含めた細胞の成長、増殖、移動(migration)、分化、又は他細胞との相互作用)は、他の細胞及び/又は隣接した環境から受け取られる情報により支配されるのが通常である。この情報は多くの場合、分泌されているポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞傷害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、そしてこれらのポリペプチドは多様な細胞受容体又は膜結合型のタンパク質によって受け取られ、解釈される。これらの分泌性ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞の分泌経路を経由し、細胞外環境にある作用部位に到達する。
【０００４】
パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中、統合失調症、てんかん、及び末梢神経障害のような障害、並びにそれに付随する痛みは、何百万人という人々に影響を与えている。これら異なる神経障害のそれぞれを特徴付ける行動上及び身体上の欠陥は、正常な神経機能の欠失により発生する。慢性型及び急性型の神経変性障害に加え、老化のプロセス、神経系の物理的な外傷、及び代謝障害も、行動上及び身体上の欠陥を伴うような神経細胞の欠失、機能異常、又は変性を引き起こし得る。これらの疾患の多くは今日において治療不可能であり、重度な衰弱を引き起こし、従来の薬物療法では効かないことがしばしばである。従って、疾患を改変するか、若しくは対症的に使用されるか、又はその両方である、新規の治療用タンパク質に対する大きな医学的ニーズがある。
【０００５】
神経機能の低下又は欠失を伴う様々な神経学的適応において、神経系又は付随のターゲット領域で発現されるいくつかの分泌性因子が重要な治療的有用性を持つ。例えば、NGFはアルツハイマー病の治療に用いられる可能性があり、ニューブラスチン(アルテミン)は末梢神経障害の治療に、GDNFはパーキンソン病の治療に用いられる可能性がある。
【０００６】
WO93/22437 (Innogenetics)は、METRNLと同一であるポリペプチドを開示している。当該タンパク質又はそのアンタゴニストは、抗腫瘍化合物として、抗炎症化合物として、T細胞及びB細胞の成長活性化因子として、骨修復化合物として、免疫抑制細胞の誘導因子として、抗コロニー刺激因子のインヒビターとして、又は殺トリパノソーマ薬として使用し得ることが示唆されている。
【０００７】
WO01/039786 (Innogenetics)は、抑制性マクロファージ活性化因子(SMAF's)と命名されたポリペプチドの特定の使用法を開示しており、その中のSMAF-1はMETRNLと100%同一である。具体的には、SMAF-1及び/又はSMAF-2が、Th1、Th2及び/又はTh3サイトカインの生成を調節することが開示され、また、後者の分子、それをコードする核酸、及びそれに対する抗体が、1型、2型、及び/又は3型応答で媒介される疾患(例えば炎症、感染、アレルギー、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病、悪性腫瘍、及び粘膜免疫に関わる疾患)の治療にいかに用いられ得るかが示されている。
【０００８】
METRNLのことを個別に記述した科学文献は無い。しかしながら、異なるラットの系統のいくつかの組織について調べた非常に大規模な遺伝子発現データ・セット(Walker et al (2004). Applications of a rat multiple tissue geneexpression data set. Genome Res. 14, 742-749)によれば、メテオリン・ライク(METRNL)はCNSには不在であり、角膜、脾臓、血管内皮細胞、及び腸においてのみ検出される(GEO, GDS589/rc_AI639012_at)。GNF SymAtlasv1.2.4においては、メテオリン・ライクは、調査された60のマウス組織のいずれにおいても確実には検出されていない(GFN1M, gnf1m08104_at)。
【０００９】
メダカ(Oryziaslatipes)において、METRNLはPax2によって制御されるいくつかの遺伝子の内の一つであり、それゆえに発生中の内耳において発現されることが示されている(Ramialison et al., Genome Biol. 2008 Oct 1;9(10):R145)。その論文の著者らは、Pax2により制御されるこれらの遺伝子群は「新規の耳胞(otic vesicle)特異的遺伝子群であり、さらなる機能解析に付することができる」と結論付けている。
【００１０】
WO2005/095450 (NsGene)は、メテオリン(METRN)としても知られるNsG33を開示しており、それを神経障害又は神経疾患の治療に使用することを開示している。METRNはMETRNLに関連しているが、それらの全長ポリペプチドは44%の配列同一性(sequence identity)しか共有していない。METRNの発現は主に中枢神経系に限られており、一次及び二次神経細胞型(primary and secondary neuronal cell types)を用いたいくつかのインビトロ・アッセイにおいてアクティブであることが示されている。Nishinoら(EMBO Journal (2004) 23, 1998-2008)もまたMETRNを開示しており、グリア細胞分化及び軸索伸長の制御に対するMETRNの作用を開示している。
【００１１】
先行技術はMETRNが神経栄養性(neurotrophic)因子であることを明確に示しているが、METRNLをそのように使用することは示唆されていない。WO 01/039786及びWO 93/22437において見られる機能性データに基づけば、METRNLが神経系になんらかの作用を有することは予測されない。当該技術分野において入手可能な発現データもまた、そのような方向性を指し示してはいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ramialison et al., Genome Biol. 2008 Oct 1;9(10):R145
【非特許文献２】Nishino et al., EMBO Journal (2004) 23, 1998-2008
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO 93/22437
【特許文献２】WO 01/039786
【特許文献３】WO 2005/095450
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者は、METRNLが成長因子の特性を有する分泌性タンパク質であり、神経系に作用することを見出した。まず第一に、最も重要なことに、本発明者はMETRNLが聴覚消失のインビボ・モデルにおいて機能することを見出した(実施例2A)。観察された作用には、神経再生作用、及び/又は神経保護、及び/又は生存作用が含まれ得る。これらの作用は、一般的な神経保護作用、より特定的には中枢神経系に対する作用を予見するものである。特に、内耳の感覚上皮及び付随の神経節に関わる疾患、障害、又は損傷の治療に関係する作用であり、それらは音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、並びに付随の症状群を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
それに加え、本発明者は、分離された(dissociated)ラットp5後根神経節の細胞培養においてMETRNLが軸索の伸長を促進することができることを見出した(実施例2)。観察された作用には、分化作用、神経再生作用、及び/又は神経保護、及び/又は生存作用が含まれ得る。これらの作用は、一般的な神経保護作用を予見し、より特定的には末梢神経系に対する作用、特に末梢神経障害及び/若しくは付随の痛みの治療、又は、脊髄の障害、例えば脊髄損傷、神経根裂離(rootavulsion)、神経根損傷、及び腕神経叢損傷のような末梢神経損傷の治療に関係した作用を予見するものである。
【００１６】
METRNLはまた、脳室下帯における神経芽細胞(ニューロン前駆体)の移動を刺激する作用も示した(実施例2)。この作用は神経移動作用(neuromigratoryeffect)と考えられるものであり、神経発生作用及び生存作用をも含み得る。観察された作用は、ニューロン及び/又はグリアの前駆体の生存、神経発生又は補充(recruitment)が望まれる神経システムにおける使用、例えば外傷、損傷、卒中、及び神経変性障害に関連した使用を一般的に予見するものである。
【００１７】
治療に関係する他の分泌性成長因子も、これらの機能アッセイの一つ以上において同様の作用を示しており、それらの因子としてはBDNF、ニューブラスチン(アルテミン)、GDNF、NGF、ニュールツリン、NT4/5、NT3及びSDF1aが含まれるがこれらに限定されない。アポトーシス細胞死のような細胞死は、成体の神経系において神経細胞の減少に貢献し、虚血性脳卒中、神経変性疾患、又は脳外傷のような様々な神経障害を引き起こす(Becker and Bonni, Prog Neurobiol. 2004 Jan;72(1):1-25)。
【００１８】
よって、本発明者は中枢神経系の障害の治療におけるMETRNLの使用、特に、聴覚消失、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病の治療、脳卒中、CNSの損傷や外傷の治療、パーキンソン病、ハンチントン病、末梢神経障害及び付随の痛みの治療、脊髄損傷、痛み、外傷のような脊髄の障害、神経根損傷、神経根裂離、及び腕神経叢損傷のような末梢神経損傷、及びALSの治療におけるMETRNLの使用について熟慮した。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、本発明の特定の実施態様においては、神経細胞が失われたり損傷したりしてい
る神経システムの疾患、障害、又は損傷の治療にMETRNLを使用し得る。
[実施態様1]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、単離されたポリペプチドであって、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド:
a) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び 12からなる群から選択されるアミノ酸配列;
b) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び 12からなる群から選択されるアミノ酸配列の配列バリアントであって、前記SEQ IDNo.に対して少なくとも70%の配列同一性を有するバリアント;
及びc) a)のいずれかの配列の少なくとも150の連続したアミノ酸である、生物学的活性を有する断片であって、選択された配列中に規定される任意のアミノ酸が、別のアミノ酸に変えられている断片;
ここで、変えられているアミノ酸の数は30以下であることを条件とする。
[実施態様2]
SEQID No. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び 12からなる群から選択される配列の、天然対立遺伝子バリアントである、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様3]
対立遺伝子バリアントが、SEQ ID No. 1, 3, 及び 5からなる群から選択される核酸配列と較べて単一ヌクレオチドにおいて異なっている核酸配列を翻訳したところのアミノ酸配列を含む、実施態様2に記載のポリペプチド。
[実施態様4]
選択された配列中で特定されるいずれかのアミノ酸が保存的置換となるように変えられたバリアント・ポリペプチドである、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様5]
シグナル・ペプチドが異種性シグナル・ペプチドに置き換えられた、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様6]
SEQID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様7]
SEQID No. 4, 8, 及び 11からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 4, 8, 及び 11からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様8]
SEQID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様9]
SEQID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様10]
SEQID No. 2の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2の配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様11]
SEQID No. 7の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様12]
SEQID No. 10の配列を有するタンパク質に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 10の配列を有するタンパク質である、実施態様1に記載のポリペプチド。
[実施態様13]
SEQID NOと比較して変化している、配列バリアント又は断片のアミノ酸が、図2において、より好ましくは図1において、非保存的であると規定されているものの中から選択されたアミノ酸である、実施態様1から12のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様14]
少なくとも1つの分子内シスチン架橋を形成することができる、実施態様1から13のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様15]
少なくとも1つの分子間シスチン架橋で連結された前記タンパク質のダイマーを含む、実施態様1から14のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様16]
ポリhisタグ、GSTタグ、HAタグ、Flagタグ、C-mycタグ、HSVタグ、V5タグ、マルトース結合タンパク質タグ、セルロース結合ドメイン・タグのような親和性タグをさらに含む、実施態様1から15のいずれかに記載のポリペプチド。
[実施態様17]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、単離された核酸分子であって、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、核酸分子:
a) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列;
b) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列の配列バリアント(ここで、当該バリアントは前記SEQ ID No.に対して少なくとも70%の配列同一性を有する);並びに
c) a)又はb)のいずれかの配列の少なくとも150の連続したアミノ酸である、生物学的活性を有する断片。
[実施態様18]
天然対立遺伝子核酸バリアントのヌクレオチド配列を含む、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様19]
天然のポリペプチド・バリアントのポリペプチド配列を有するバリアント・ポリペプチドをコードする、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様20]
SEQID No. 1, 3, 及び 5からなる群から選択される核酸配列と較べて単一ヌクレオチドにおいて異なっている、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様21]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2, 7, 及び 10からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様22]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 4, 8, 及び 11からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 4, 8及び 11からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様23]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 6, 9, 及び 12からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様24]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7, 8, 及び 9からなる群から選択される配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様25]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 2に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 2の配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様26]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 7に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 7の配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様27]
コードされたポリペプチドが、SEQ ID No. 10に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 10の配列を有するタンパク質である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様28]
以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、実施態様17に記載の核酸分子:
a) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び 18からなる群から選択されるヌクレオチド配列;
b) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び 18からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
c) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び 18からなる群から選択される配列の、少なくとも150の連続するヌクレオチドを有する核酸配列;
c) SEQ IDNo. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択される配列を有する核酸と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、核酸の相補鎖;並びに
d) 上記のいずれかものに相補的な核酸配列。
[実施態様29]
SEQID No. 1, 3 及び 5からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくはSEQ ID No.1, 3, 及び 5の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様30]
SEQID No. 13, 14 及び 15からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み、より好ましくはSEQ ID No.13, 14, 及び 15の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様31]
SEQID No. 16, 17, 及び 18からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様32]
SEQID No. 1の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 1の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様33]
SEQID No. 13の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 13の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様34]
SEQID No. 16の配列を有する核酸分子に対して、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくはSEQ ID No. 16の配列を有する核酸である、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様35]
大腸菌、チャイニーズハムスター、ベイビーハムスター、酵母、昆虫、及び/又は真菌類における発現のためにコドンが最適化された、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様36]
SEQID No 16と、SEQ ID NO 17 及び SEQID NO 18の少なくともいずれか1つとの間の組み混ぜバリアントである、実施態様17に記載の核酸分子。
[実施態様37]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、実施態様17から36のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
[実施態様38]
当該核酸分子が発現可能になるように連結されたプロモーターをさらに含む、実施態様37に記載のベクター。
[実施態様39]
当該プロモーターが、CAG, CMV, ヒトUbiC, JeT, RSV, Tet-制御性プロモーター, Mo-MLV-LTR, Mx1, EF-1アルファからなる群から選択される、実施態様38に記載のベクター。
[実施態様40]
レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIVを含むレトロウイルス・ファミリーに由来するベクターからなる群から選択される、実施態様37又は38に記載のベクター。
[実施態様41]
アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピロマウイルス、Mo-MLVからなる群から選択され、好ましくはアデノ随伴ウイルスである、実施態様37又は38に記載のベクター。
[実施態様42]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、実施態様37から41のいずれかに記載のベクターで形質転換又は形質導入された、単離された宿主細胞。
[実施態様43]
大腸菌、酵母、サッカロマイセス・セレビシエ、アスペルギルス、Sf9昆虫細胞からなる群から選択される、実施態様42に記載の宿主細胞。
[実施態様44]
ヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、マウス、ラット、マウス、及びウサギのような哺乳類細胞からなる群から選択される、実施態様42に記載の宿主細胞。
[実施態様45]
ARPE-19細胞のような不死化網膜色素上皮細胞、ヒト不死化線維芽細胞、及びヒト不死化星状膠細胞からなる群から選択される、実施態様44に記載の宿主細胞。
[実施態様46]
マトリックスに付着した、実施態様45に記載の宿主細胞。
[実施態様47]
ヒト神経性幹細胞又は前駆体細胞、ヒト・グリア性幹細胞又は前駆体細胞、及び胎児性の幹細胞を含む幹細胞からなる群から選択される、実施態様44に記載の宿主細胞。
[実施態様48]
CHO,CHO-K1, HEI193T, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, BHK細胞からなる群から選択される、実施態様44に記載の宿主細胞。
[実施態様49]
神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、感染性ウイルス粒子を産生することができるパッケージング細胞株であって、当該ウイルス粒子は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現できるように当該ポリヌクレオチド配列に連結されたプロモーター、DNA第2鎖合成のためのオリジン、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科由来ゲノムを含む、パッケージング細胞株。
[実施態様50]
当該ゲノムがレンチウイルス由来のゲノムでありLTRがレンチウイルスのものである、実施態様49に記載のパッケージング細胞株。
[実施態様51]
移植可能な生体適合性細胞装置:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のタンパク質及び/又はウイルス・ベクターの拡散を許容する半透膜;及びii) 実施態様42から48のいずれかに記載の細胞、又は、実施態様49若しくは50に記載のパッケージング細胞株の組成物。
[実施態様52]
半透膜が免疫隔離性である、実施態様51に記載の装置。
[実施態様53]
半透膜が微多孔性である、実施態様51に記載の装置。
[実施態様54]
半透膜の内部に配置されたマトリックスをさらに含む、実施態様51に記載の装置。
[実施態様55]
繋留アンカーをさらに含む、実施態様51に記載の装置。
[実施態様56]
標的細胞を感染させるためのウイルス・ベクターを分泌する生きたパッケージング細胞を含む中心部、及び、前記中心部を囲う外部ジャケットを含み、当該ウイルス・ベクターがレトロウイルスであって、当該ベクターは、前記ポリペプチドを発現できるように標的細胞における当該ポリペプチドの発現を制御するプロモーターが連結された実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドをコードする異種性遺伝子を含み、前記ジャケットは透過性の生体適合性材料を含み、前記材料は直径約100 nmのレトロウイルス・ベクターの透過を許容させるために選択される多孔性を有し、前記カプセルからの前記ウイルス・ベクターの放出を可能にする、実施態様51に記載の装置。
[実施態様57]
中心部がさらにマトリックスを含み、パッケージング細胞が当該マトリックスにより固定されている、実施態様56に記載の装置。
[実施態様58]
ジャケットが、ハイドロゲル又は熱可塑性の素材を含む、実施態様56に記載の装置。
[実施態様59]
好ましくは神経細胞が欠失又は損傷している、神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法において使用するための、実施態様56に記載の装置。
[実施態様60]
神経系の疾患、障害、又は損傷の治療のための医薬の製造における、以下のものの使用:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチド;又は
ii) 実施態様17から36のいずれかに記載の単離された核酸配列;又は
iii) 実施態様37から41のいずれかに記載の発現ベクター;又は
iv) 実施態様42から48のいずれかに記載の宿主細胞の組成物;
v) 実施態様51から59のいずれかに記載の移植可能な生体適合性細胞装置;又は
vi) 実施態様49若しくは50に記載のパッケージング細胞株。
[実施態様61]
神経細胞が欠失又は損傷している、実施態様60に記載の使用。
[実施態様62]
前記医薬が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、てんかん、神経障害、末梢神経障害、並びに付随の痛み及びその他の症状を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経の受傷に関わる疾患、障害、又は損傷の治療のためのものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様63]
神経系障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症に伴う神経損傷、及び付随の症状を含むが、これらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロン及びニューロンのプロセスの変性に関わるものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様64]
神経変性疾患がパーキンソン病である、実施態様63に記載の使用。
[実施態様65]
神経変性疾患がハンチントン病である、実施態様63に記載の使用。
[実施態様66]
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、実施態様63に記載の使用。
[実施態様67]
神経系障害が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷、悪性病変、及び/又は遺伝的な若しくは特発性の異常(糖尿病を含むがこれに限定されない)、腎機能不全、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、及び感染により引き起こされる状態を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロンの機能異常及び/又は欠失に関わる、疾患、障害、又は損傷である、実施態様60に記載の使用。
[実施態様68]
疾患が、末梢神経障害及び付随の痛みである、実施態様61又は67に記載の使用。
[実施態様69]
神経系障害が、多発性硬化症、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎、及びてんかん、並びに付随の症状を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び末梢神経系における乏突起膠細胞、星状膠細胞、及びシュワン細胞のようなグリアの変性又は硬化に関わる疾患、障害、又は損傷である、実施態様60に記載の使用。
[実施態様70]
疾患又は障害が、多発性硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、及びアルコール依存症である、実施態様69に記載の使用。
[実施態様71]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、網膜、光受容体、及び付随の神経に関わるものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様72]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、前庭聴覚複合体の感覚上皮及び付随の神経節に関わるものである、実施態様60に記載の使用。
[実施態様73]
損傷が、アブミ骨摘出術、乳突削開術、及び鼓室形成術のような内耳手術、並びに人工内耳又は中耳インプラントのようなインプラントの移植により引き起こされるものである、実施態様72に記載の使用。
[実施態様74]
対象における神経系の疾患、障害、又は損傷を治療する方法であって、治療を必要とする個体に治療的に有効な量の以下のものを投与することを含む方法:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチド;又は
ii) 実施態様17から36のいずれかに記載の単離された核酸配列;又は
iii) 実施態様37から41のいずれかに記載の発現ベクター;又は
iv) 実施態様42から48のいずれかに記載の宿主細胞の組成物;又は
v) 実施態様51から59のいずれかに記載の移植可能な生体適合性細胞装置;又は
vi) 実施態様49若しくは50に記載のパッケージング細胞株。
[実施態様75]
前記病態が、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、てんかん、神経障害、末梢神経障害、並びに付随の痛み及びその他の症状等の状態を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経の受傷に関わる疾患、障害、又は損傷である、実施態様74に記載の方法。
[実施態様76]
神経系障害が、パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症に伴う神経損傷、及び付随の症状を含むが、これらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロン及びニューロンのプロセスの変性に関わるものである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様77]
神経変性疾患がパーキンソン病である、実施態様76に記載の方法。
[実施態様78]
神経変性疾患がハンチントン病である、実施態様76に記載の方法。
[実施態様79]
神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症である、実施態様76に記載の方法。
[実施態様80]
神経系障害が、代謝疾患、栄養障害、毒性傷、悪性病変、及び/又は遺伝的な若しくは特発性の異常(糖尿病を含むがこれに限定されない)、腎機能不全、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、及び感染により引き起こされる状態を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロンの機能異常及び/又は欠失に関わる、疾患、障害、又は損傷である、実施態様74に記載の方法。
[実施態様81]
疾患が、末梢神経障害及び/又は付随の痛みである、実施態様80に記載の方法。
[実施態様82]
神経系障害が、多発性硬化症、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎、及びてんかん、並びに付随の症状を含むがこれらに限定されない、脳、脳幹、脊髄、及び末梢神経系における乏突起膠細胞、星状膠細胞、及びシュワン細胞のようなグリアの変性又は硬化に関わる疾患、障害、又は損傷である、実施態様74に記載の方法。
[実施態様83]
疾患又は障害が、多発性硬化症、感覚性運動失調、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調、小脳萎縮症、及びアルコール依存症である、実施態様82に記載の方法。
[実施態様84]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、網膜、光受容体、及び付随の神経に関わるものである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様85]
神経系の障害、疾患、又は損傷が、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない、前庭聴覚複合体の感覚上皮及び付随の神経節に関わるものである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様86]
損傷が、アブミ骨摘出術、乳突削開術、及び鼓室形成術のような内耳手術、並びに人工内耳又は中耳インプラントのようなインプラントの移植により引き起こされるものである、実施態様85に記載の方法。
[実施態様87]
対象がヒトである、実施態様74に記載の方法。
[実施態様88]
哺乳類神経細胞のアポトーシスを防止する方法であって、前記神経細胞を、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに晒すことを含む方法。
[実施態様89]
哺乳類神経細胞の生存を増強させる方法であって、前記神経細胞を、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに晒すことを含む方法。
[実施態様90]
神経細胞を分化させる方法であって、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに神経細胞を晒すことを含む方法。
[実施態様91]
神経細胞の移動を刺激する方法であって、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに神経細胞を晒すことを含む方法。
[実施態様92]
ニューロンを発生させる方法であって、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに神経前駆体細胞又は神経幹細胞を晒すことを含む方法。
[実施態様93]
前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを前記細胞内で発現させることにより、前記ポリペプチドを前記細胞に送達する、実施態様88から92のいずれかに記載の方法。
[実施態様94]
神経系の疾患、障害、又は損傷の治療において使用するための、実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体。
[実施態様95]
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、リコンビナント抗体からなる群から選択される、実施態様94に記載の抗体。
[実施態様96]
神経系の疾患、障害、又は損傷の治療において使用するための、実施態様94に記載の抗体と以下のものからなる群から選択される接合物とを含む免疫結合体:
化学療法剤、毒素、又は放射性同位元素のような細胞毒性剤;
アビジン又はストレプトアビジン又は抗原のような特異的結合をなす対の一員;
検出可能な産物を産生することができる酵素。
[実施態様97]
以下のものからなる群から選択される、単離されたポリペプチド:
i) SEQ IDNo 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
ii) SEQ IDNo 11に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
iii) SEQID No 12に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;並びに
iv) 上記ポリペプチドのバリアントであって、選ばれた配列中のいずれかのアミノ酸が別のアミノ酸に変わっているが、当該配列中でそのように変わっているアミノ酸が20個以下であるバリアント。
[実施態様98]
変わったアミノ酸が、図2において、より好ましくは図1において、非保存的であると規定されているものの中から選択されたアミノ酸である、実施態様97に記載のポリペプチド。
[実施態様99]
以下のものを含む、単離されたポリペプチド:
-C-末端において次のものに連結された、Gln又はCysを除く天然アミノ酸からなる群から選択されるN-末端アミノ酸;
- SEQ IDNo 2、SEQ ID NO 4又はSEQ ID No 6のAA2からAA311において示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド及びそのバリアントからなる群から選択される、ポリペプチド;
ここで、当該バリアントでは、いずれかのアミノ酸が別のアミノ酸に変わっているが、当該配列中でそのように変わっているアミノ酸が20個以下である。
[実施態様100]
以下のものからなる群から選択される、単離されたポリペプチド:
i) SEQ IDNo 2、SEQ ID NO 4又はSEQ ID No 6に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、N-末端グルタミン残基の代わりにN-末端ピロリドンカルボン酸を有する、ポリペプチド;
ii)選ばれた配列中のN-末端ピロリドンカルボン酸を除くいずれかのアミノ酸が別のアミノ酸に変わっているが、当該配列中でそのように変わったアミノ酸残基が20個以下である、前記ポリペプチドのバリアント。
[実施態様101]
以下の工程を含む、リコンビナントMETRNLポリペプチドの製造方法:
i) 実施態様1から16のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸を細胞において発現させる工程;
ii) 前記ポリペプチドを精製する工程;
iii) 当該精製されたポリペプチドにおいてN-末端ピロリドンカルボン酸の存在を確認する工程。
[実施態様102]
表面の少なくとも一部分が、実施態様1から16のいずれかに記載のMETRNLタンパク質の組成物でコーティングされた、インプラント。
[実施態様103]
人工内耳、中耳インプラント、骨導補聴器、及び聴性脳幹インプラント、好ましくは人工内耳及び中耳インプラントからなる群から選択される、実施態様102に記載のインプラント。
【００２０】
METRNLの治療的効果は、標的細胞の移動、分化、成長、生存、再生、及び/又はその機能の回復若しくは改善に対する作用により媒介され得る。本発明者は、METRNLが聴覚消失のインビボ・モデルにおいて機能することを実証した(実施例2A)。本発明者は、METRNLが後根神経節(DRG)培養において神経発生、生存、及び/又は分化を刺激することができることを示した(実施例2)。本発明者はまた、マウス脳室下帯(SVZ)の外植片が、METRNLに晒された場合、ニューロン前駆体の移動の増進、神経発生の増進、及び/又は生存の増強を示すということを示した（実施例 2）。後者の作用は、神経細胞の移動の改善、神経細胞の生存の増強、及び/又は神経発生によって引き起こされ得る。
【００２１】
これらの生物学的なアッセイに基いて、本発明は神経細胞を分化させる方法に関わり、当該方法は本発明のポリペプチド又はコードするポリヌクレオチドに前記神経細胞を晒すことを含む。神経細胞とは、乏突起膠細胞、星状膠細胞、グリア細胞、シュワン細胞、ニューロン、及びそれらの前駆体を意味すると理解される。本発明は神経細胞の移動を刺激する方法にも関わり、当該方法は本発明のポリペプチド又はコードするポリヌクレオチドに前記神経細胞を晒すことを含む。本発明はまた、哺乳類の神経細胞においてアポトーシスを防止する方法にも関わり、当該方法は本発明のポリペプチド又はコードするポリヌクレオチドに前記神経細胞を晒すことを含む。本発明はまた、哺乳類の神経細胞の生存を増強する方法にも関わり、当該方法は本発明のポリペプチド又はコードするポリヌクレオチドに前記神経細胞を晒すことを含む。本発明はさらに、ニューロンを産生する方法にも関わり、当該方法は、本発明のポリペプチド又はコードするポリヌクレオチドに、神経前駆体、又は、幹細胞及び神経性幹細胞(neural stem cells)を含む神経幹細胞(neuronal stemcell)を晒すことを含む。好ましくは、前記哺乳類神経細胞及び/又は哺乳類神経前駆体又は幹細胞若しくは神経性幹細胞は、ヒトの細胞である。
【００２２】
本発明はさらなる態様において、神経系の疾患、障害又は損傷を治療する方法において使用するための、本発明による発現ベクターを含む単離(isolated)された宿主細胞に関わる。特に、本発明は、そのような方法に使用するための、細胞に基づく治療(裸の細胞に基づく治療(naked cell based therapy)又はカプセル化された細胞による治療(encapsulated cell therapy)のいずれか)に有用な宿主細胞に関わる。
【００２３】
本発明はさらなる態様において、神経系の疾患、障害又は損傷を治療する方法において使用するための感染性ウイルス粒子を産生できるパッケージング細胞株に関わり、前記ウイルス粒子は、5'レトロウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の発現ができるように連結されたプロモーター、DNA第2鎖合成のためのオリジン、及び3'レトロウイルスLTRを含むレトロウイルス科由来ゲノムを含む。
【００２４】
本発明はさらなる態様において、移植可能な(implantable)生体適合性細胞装置(biocompatible celldevice)に関わり、当該装置は以下のものを含む:
i) 本発明のタンパク質の拡散を許容する半透膜; 及び
ii) 本発明による細胞の組成物、又は本発明によるパッケージング細胞の組成物。
【００２５】
本発明はさらなる態様において、神経系の疾患、障害又は損傷を治療する方法において使用するための以下のものの使用に関わる:
i) 本発明のポリペプチド;又は
ii) 本発明の単離された核酸配列;又は
iii) 本発明の発現ベクター;又は
iv) 本発明による宿主細胞の組成物;又は
v) 本発明によるパッケージング細胞株;又は
vi) 本発明による移植可能な生体適合性カプセル。
【００２６】
本発明はさらなる態様において、対象における神経系の疾患、障害又は損傷を治療する方法に関わり、当該方法は、それを必要としている対象に治療上有効な量の以下のものを投与することを含む:
i) 本発明のポリペプチド;又は
ii) 本発明の単離された核酸配列;又は
iii) 本発明の発現ベクター;又は
iv) 本発明による宿主細胞の組成物;又は
v) 本発明によるパッケージング細胞株;又は
vi) 本発明による移植可能な生体適合性カプセル。
【００２７】
本発明はさらなる態様において、哺乳類神経性細胞培養における成長因子としての以下のものの使用に関わる:
i) 本発明のポリペプチド;又は
ii) 本発明の単離された核酸配列;又は
iii) 本発明の発現ベクター;又は
iv) 本発明による宿主細胞の組成物;又は
v) 本発明によるパッケージング細胞株。
【００２８】
本発明は一態様において、神経系の疾患、障害又は損傷を治療する方法において使用するための、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体の使用に関わる。
【００２９】
本発明はさらなる態様において、神経系の疾患、障害又は損傷を治療する方法において使用するための、本発明の抗体と以下のものから成る群から選択される接合物(conjugate)とを含む免疫結合体(immunoconjugate)に関わる:化学療法剤、毒素、又は放射性同位元素のような細胞毒性剤;アビジン又はストレプトアビジン又は抗原のような特異的結合をなす対の一員;検出可能な産物を産生することができる酵素。
【００３０】
本発明はさらなる態様において、METRNLの特定の切り詰め型(truncated forms)に関わる。これらのMETRNLの切り詰め型は、生理活性を有するコア配列(保存されたシステインのうち1番目のものから最後のものまで)を含む。好ましくは、これらMETRNLの切り詰め型は、1番目の保存されたシステインから少なくとも1アミノ酸延長したN-末端を有し、10番目の保存されたシステインから少なくとも1アミノ酸延長したC-末端を有する。これらの末端のアミノ酸はシステインでないことが好ましい。
【００３１】
本発明はさらなる態様において、Gln又はCysを除く天然(naturallyoccurring)アミノ酸からなる群から選択されるN-末端アミノ酸を有する単離されたポリペプチドに関わり、当該N-末端アミノ酸は、C-末端において以下のものからなる群から選択されるポリペプチドに連結されている:SEQ ID No 2、SEQ ID NO 4又はSEQ ID No 6のAA2からAA311において示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド及びそのバリアント(そこでは任意のアミノ酸が別のアミノ酸に変えられる。ただし当該配列中でそのように変えられるアミノ酸が20個を超えてはならない)。前記ポリペプチドはN-末端ピロリドンカルボン酸の存在を回避し、得られた産物のN-末端配列決定を促進する。
【００３２】
本発明は別の態様において、以下のものからなる群から選択される単離されたポリペプチドに関わる:SEQ ID No 2、SEQ ID NO 4又はSEQ ID No 6に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、N-末端グルタミン残基の代わりにN-末端ピロリドンカルボン酸を有するもの、及びそのポリペプチドのバリアント(そこでは、選ばれた配列中の任意のアミノ酸(規定されているN-末端ピロリドンカルボン酸は除く)が別のアミノ酸に変えられる。ただし当該配列中でそのように変えられるアミノ酸が20個を超えてはならない)。
【００３３】
本発明者は、リコンビナント発現に際してN末端Gln残基が定量的にピロリドンカルボン酸に変換されることを発見した。本発明者はさらに、前記残基の種を超えた保存を解析した。解析された全ての種が、シグナルペプチドの切断の後、完全に保存されたN-末端を有している。N-末端ピロリドンカルボン酸を持つMETRNLは生理活性を有することから、N-末端ピロリドンカルボン酸の存在が生物学的活性を維持するために重要であると考えられる。
【００３４】
関連した態様において本発明は、リコンビナントMETRNLポリペプチドを製造するための方法に関わり、当該方法は、本発明のMETRNLポリペプチドをコードする核酸を細胞において発現させること;前記ポリペプチドを精製すること;及び、当該精製ポリペプチドにおいてN-末端ピロリドンカルボン酸の存在を確認すること、を含む。
【００３５】
本発明はさらなる態様において、表面の少なくとも一部がMETRNLタンパク質製剤でコートされており、当該METRNLタンパク質が本発明のポリペプチドである、インプラントに関わる。好ましくは、当該インプラントは、人工内耳(cochlear implants)、中耳インプラント、骨導(Bone-anchored)補聴器、及び聴性脳幹インプラント、好ましくは人工内耳及び中耳インプラントからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
［図1］ヒト、マウス及びラットのメテオリン・ライク・タンパク質(SEQ ID NO 2、4、及び6)のアラインメント。推測されるシグナルペプチドは太字で示す。アラインメントは、CLUSTAL W (1.7) (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J.(1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties andweight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680.)を用いて作成された。BLOSUM 62をスコアリング・マトリックスとして用いた。
【００３７】
0005616888.tif 000002
［図2］ヒト、マウス、及びラットのメテオリン・ライク(SEQ ID NO 2、4、及び6)、並び
にヒト、マウス、及びラットのメテオリン(SEQ ID NO 23、24、及び25)のアラインメント。シグナルペプチドを太字で示す。保存されたCys残基は囲み線で示す。アラインメントにはClustal W (1.7)を用いた。
【００３８】
0005616888.tif 000003
［図3］ヒト(NP_001004431.1; SEQ ID NO 2)、マウス(NP_659046.1;SEQ ID NO 4)、ラッ
ト(NP_001014126; SEQ ID NO 6)、ウシ(XP_614019.3; SEQ ID NO 19)、ニワトリ(CR352488;SEQ ID NO 20)、ゼノパス・トロピカリス(xenopus tropicalis)(BX757299.1; SEQ ID NO 21)及びゼブラフィッシュ(NP_998150.1; SEQID NO 22)のMETRNLタンパク質配列のアラインメント。ヒト配列と同一の保存残基には陰をつけ、推測されるシグナルペプチドは太字で、10個の保存されたシステイン残基は囲み線で、成熟タンパク質配列の保存されたN-末端グルタミン(Q)は矢印にて示す。
［図4］ヒト及びマウスMETRNLは分泌性の分子である。6つの重複実験において、ヒスチジ
ン・タグをつけたヒト又はマウスMETRNLでHEK293細胞をトランスフェクトした。48時間後、馴化培地(conditioned media)を抗HISウェスタン・ブロッティングで解析した。どちらの成熟分子も推定分子量は31.2kDaである。hMETRNLは予測通りの泳動を示すが、mMETRNLはグリコシル化のためにより高い分子量に相当する泳動を示す。
［図5］リコンビナントmMETRNLの産生。A) 293F浮遊細胞をpNS1n-mMETRNL-HISでトランス
フェクトし、馴化培地を翌日回収した。抗HISウェスタン・ブロッティングは96時間に至るまで持続的な蓄積を示している。B) 精製後、リコンビナントmMETRNLをSDS-PAGEで解析し、続いて抗HISウェスタン・ブロッティング(左)及びゲルコード・ブルー染色(右)で解析した。C) 精製リコンビナントmMETRNLをさらに逆相クロマトグラフィーで分析したところ、高い純度を示した。フラクション≧31に見られる肩は、不均一にグリコシル化されたタンパク質において典型的である。D) 精製リコンビナントmMETRNLを、示されているように異なる脱グリコシル化酵素で処理し、抗HISウェスタン・ブロッティングで解析した。分子量の変化から、mMETRNLがN-グリコシル化されていることが明らかである。
［図6］ METRNLは分離された後根神経節(DRGs)からの神経突起伸長を誘導する。左は神経
突起の長さの定量化を示す。右は、神経栄養性サポートがない状態(ネガティブ)、又はNGF若しくはMETRNLの存在下で増殖させた後根神経節細胞のβ-III-チューブリン染色を示す。
［図7］ METRNLは、用量依存的に、SVZ由来神経芽細胞の神経細胞移動を増加させる。こ
のプロセスにおいてMETRNLに応答する細胞は、DCXマーカーの免疫反応性を有するため神経芽細胞と確認される。
［図8］ METRNLは、インビトロで、SVZ由来神経芽細胞の移動を刺激する。A) P2-P5の若
いラットからの外植片を、異なる濃度(0, 20, 200,2000ng/ml)のリコンビナントMETRNLと共にマトリゲルに包埋した。METRNLの存在は、用量依存的に、細胞の移動の有意な増加を引き起こした。B) 移動している細胞は、ダブルコルチン(DCX)陽性でありグリア線維酸性タンパク質(GFAP)陰性であることから、神経芽細胞である。
［図9］ METRNLはアクチン重合化を介して細胞移動を促進する。SVZの外植片及び単層培
養を、リコンビナントのマウスMETRNL又はSDF1a(ポジティブ・コントロール)で処理し、続いてアクチン結合性FITC-ファロイジンと共にインキュベートした。アクチン重合化の増加は、神経芽細胞移動促進においてMETRNLが役割を果たすことのさらなる証拠である。
［図10］ヒト・リコンビナントMETRNLは、SVZ由来神経芽細胞の移動を刺激する。
P2-P5の若いラットからの外植片を、25ng/mlのヒト・リコンビナントMETRNLと共にマトリゲルに包埋したところ、移動がコントロールと比較して2倍以上となった。A) ヒトMETRNLにより誘導された神経芽細胞移動(コントロールとの比較)の写真の例。典型的な神経芽細胞チェーン移動に注目のこと。B) 神経芽細胞の移動の定量化。
［図11］ METRNLは難聴化モルモットにおいて聴力を保護する。A) 実験の設定。詳細な記
述については「方法」欄を参照のこと。B) METRNLで処置された正常聴力モルモット(○)、人工外リンパで処置された難聴化モルモット(●)、及びリコンビナント・マウスMETRNLで処置された難聴化モルモット(△)において測定された、電気的聴性脳幹反応(eABR)閾値の平均値。垂直のバーは平均値の標準誤差(SEM)を示す。METRNLによる処置は、無処置コントロール・グループと比較して、eABR閾値を有意に低下させていることに注目(*p<0.05)。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
定義:
本明細書において、METRNLとは、天然、合成、半合成、又はリコンビナントに関わらず任意の供給源から得られ、任意の種、特に、チンパンジー、ウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類から得られる、実質的に精製されたMETRNLのアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指す。当該用語はまた、これらの種のいずれかから得られる、生物学的活性を有するMETRNLの断片をも指し、また、生物学的活性を有するそれらの配列バリアント、及び翻訳後修飾を受けたタンパク質も指す。生物学的活性を有するMETRNLの断片は、1つ以上の位置において野生型METRNL配列から異なっていてもよく、異なっている位置の数は好ましくは20まで、より好ましくは10まで、より好ましくは5までであり、例えば1つ、2つ、3つ、又は4つの位置において異なる。
【００４０】
本明細書において成長因子の特性とは、配列に関連する、古典的な成長因子の特性と同様な特徴を規定する。古典的な成長因子は、受容体を介して標的細胞に作用して当該標的細胞において下記の応答のうちの一つ以上を引き起こす分泌タンパク質である:増殖を含む成長、分化、生存、再生、移動、機能回復、機能改善。
【００４１】
「対立遺伝子(allele)」又は「対立遺伝子配列(allelic sequence)」とは、本明細書においては、METRNLをコードする遺伝子の別型のことである。対立遺伝子は核酸配列における少なくとも1つの突然変異の結果として発生し、改変されたmRNAやポリペプチドを生じ得るが、それらの構造や機能は変わる場合もあれば変わらない場合もある。天然又はリコンビナントの遺伝子はいずれも、対立遺伝子型を有しない場合もあり得れば、1つ有していたり、数多く有していたりする場合もあり得る。対立遺伝子を発生させる一般的な突然変異は、自然に起こるヌクレオチドの欠失、追加、又は置換に基づくことが普通である。一つの所与の配列の中において、これらの変化の種類のそれぞれが、単独で、又は他との組合せで、1回又は複数回起こり得る。
【００４２】
ここで言う「欠失」とは、アミノ酸又はヌクレオチド配列における変化を指し、1つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチドの欠如という結果を引き起こす。
【００４３】
ここで言う「挿入」又は「追加」とは、アミノ酸又はヌクレオチド配列における変化であり、天然の分子と比較してそれぞれ１つ以上のアミノ酸残基又はヌクレオチドが追加されるものを指す。
【００４４】
本明細書において、「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、タンパク質又はペプチドが、抗体及び受容体又はその断片等の結合分子と、高い親和性を伴って相互作用することを指す。当該相互作用は、当該結合分子により認識される、当該タンパク質の特定の構造(即ち、抗原決定基又はエピトープ)の存在に依存する。例えば、もしある抗体がエピトープ「A」に対して特異的であるならば、標識化された「A」と当該抗体との反応において抗体に結合する標識化Aの量は、エピトープAを含むタンパク質(又は標識されていないフリーのA)の存在下では低下させられる。
【００４５】
本明細書において、「実質的に精製された」という用語は、自然の環境から取り出され、単離又は分離され、自然の状態で付随する他成分の少なくとも60%、好ましくは75%、最も好ましくは90%が除去されている核酸又はアミノ酸配列のことを指す。
【００４６】
本明細書において、「置換」とは、1つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドが、それぞれ別のアミノ酸又はヌクレオチドと置き換わることを指す。
【００４７】
「治療」はいくつかの異なるやり方で行うことができ、治癒的、改善的、予防的なものを含む。治癒的な治療は一般的に、治療される個体に既に存在している臨床上の状態、例えば疾患又は障害を治癒することを目的とする。改善的な治療は一般的に、ある個体において存在する臨床上の状態を改善させるための処置を意味するが、必ずしもその疾患や障害を治癒することを意味するとは限らない。予防的な治療は一般的に、ある臨床上の状態が発生すること、又は悪化すること(即ち、より重症な段階に進展すること)を防ぐことを目的とする。
【００４８】
「配列同一性]:
2つの配列間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。2つの配列を比較するために使用される数学的アルゴリズムの好ましい例(これに限定はされないが)は、KarlinとAltschul(1990) によるもの(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)をKarlinとAltschul (1993)に従って修正したもの(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)である。そのようなアルゴリズムはAltschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTN及びBLASTPプログラムに組み入れられる。
【００４９】
同一性を解析するためには、最も高い相同性(homology)(一致(match))が得られるように対象の配列を整列させる。これらの一般的な原則に基づき、BLASTNアルゴリズム[Tatiana A. Tatusova, Thomas L.Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotidesequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250]を使用して、2つの核酸配列の「パーセント同一性」を決定することができる。BLASTNアルゴリズムはNational Center for Biotechnology Information (NCBI)のウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)から利用可能であり、そこで提示されているデフォルトの設定を使用する(即ち、Reward for a match = 1; Penalty for amismatch = -2; Strand option = both strands; Open gap = 5; Extension gap = 2;Penalties gap x_dropoff = 50; Expect = 10; Word size = 11; Filter on)。BLASTNアルゴリズムは、整列された2つのヌクレオチド配列間のオーバーラップした領域における%配列同一性を決定する。
【００５０】
配列比較に使用される数学的アルゴリズムのもう一つの好ましい例(これに限定されるわけではない)は、CLUSTALW (1.7) アラインメント・アルゴリズム(Thompson, J.D., Higgins, D.G.and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gappenalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680.)である。CLUSTAL Wは、好ましくはBLOSUM 62をスコアリング・マトリックスとして用いて、複数の配列のアラインメントに使用することができる。配列同一性を計算するに際し、CLUSTAL Wは、アラインメントにより作られたギャップを参照配列の長さに含ませる。従って、図2において、参照配列 (hMETRNL)は311アミノ酸長しかないにも関わらず、整列させた配列のギャップを含めた全長は322となっている。配列同一性は、一致の数を、整列させた配列のギャップを含めた長さで割ることにより計算する。
【００５１】
本発明は、METRNLとして認知されるポリペプチド及びポリヌクレオチドの医学的な使用に関する。METRNLタンパク質は、ヒト (SEQ ID No. 2)、マウス (SEQ ID No. 4)、及びラット (SEQ ID No. 6)、さらにはウシ (SEQ ID NO 19)、ニワトリ (SEQ ID NO 20)、ゼノパス・トロピカリス(SEQ ID NO 21)及びゼブラフィッシュ (SEQ ID NO 22)において見出されている(図3)。
【００５２】
ヒトMETRNLは311アミノ酸の前駆体として存在し、当該前駆体はプロセシングを受けて生物学的活性を有する少なくとも1つのペプチドを生じ得る。METRNLはいずれの組織においても高いレベルでは発現されていないようである。マウス(SEQ ID No 4)及びラット(SEQ ID No 6)のMETRNLポリペプチドは、同様に、それぞれ311アミノ酸から成り、ヒトのタンパク質に対する%同一性はそれぞれ77及び78である(全長配列についての計算)。
【００５３】
マウスMETRNLは45アミノ酸のN-末端シグナル・ペプチド配列を含み、当該シグナル・ペプチド配列はASA-QYという配列モチーフにおいて切断される。このシグナル・ペプチド切断部位はSignalP法で予測され、マス・スペクトメトリーにより実験的にも検証されいている。同一の切断部位がヒト及びラットのタンパク質においても予測されている。シグナル・ペプチドの切断の結果、ヒト、マウス、及びラットにおいてそれぞれSEQ ID No. 7、8、及び9の配列を有するポリペプチドが生じる。当該技術分野において知られているように、シグナル・ペプチドのプロセシングはいつも正確に予測通りに起こるわけではなく、実際の切断は場合によって変動し得る。従って、成熟METRNLのN-末端は、予測される切断部位から1、2又は3アミノ酸ずれ得ることが予想される。
【００５４】
METRNLは、WO 2005/095450 (NsGene)に記載されたMETRN (NsG33、メテオリン)タンパク質に構造上関連している。ヒト、マウス及びラットの全長タンパク質を図2に示す。METRNはヒトMETRNLタンパク質に対して42/43 %の同一性(標準設定によるClustalW (1.7)) を共有する。
【００５５】
METRNタンパク質に対するヒトMETRNLの全長アラインメントを図2に示す。10個の保存されたシステインは囲み線で示されている。当該2つのタンパク質は、当該保存システイン残基、及び、図2において明白に見られるように高度に保存された配列が続くことに基づき、1つのタンパク質ファミリーを共に形成する。当該2種類のタンパク質はいずれも、他のいかなる既知ヒト・タンパク質に対しても有意な配列相同性を示さない。当該2種類のタンパク質は、同じ小さなタンパク質ファミリーに属するものの、これら2種類のタンパク質は構造上区別される。
【００５６】
前記システインは高度に保存されていることから、生理活性を有するタンパク質の二次構造及び三次構造においてそれらの残基が重要な役割を果たすと予想される。当該システインの内の一つ又は複数は、分子内及び/又は分子間シスチン架橋の形成に関与し得る。
【００５７】
METRNLは、成長因子として働くタンパク質のカテゴリーに属する。この概念は、当該タンパク質は分泌されるという事実、当該タンパク質の構造的な特徴(保存されたシステインのパターンを有する比較的小さなタンパク質であること)、及び標的細胞に対して成長因子的作用を発揮するという事実から支持される。その上、METRNLは成長因子であるMETRNに構造上関連している。
【００５８】
構造タンパク質とは異なり、成長因子は、細胞のシグナル伝達、並びに、成長、増殖、分化、生存、再生、移動、機能回復、及び/又は機能改善のような、様々な機能に関与する。よって、成長因子は、投与して治療的効果を発揮させるために使用し得る。
【００５９】
らせん神経節(spiral ganglion)細胞の分化、再生、及び生存を誘導することができる因子には、CNTF、GDNF、NT-3及びBDNFが含まれる。これらの因子は末梢神経系及び中枢神経系の双方においても同様の活性を示すことから、らせん根神経節(spiral root ganglions)で発現される受容体及び応答システムは多くの他の神経細胞でも共有されていることが示唆される。
【００６０】
後根神経節外植片細胞において分化、再生、及び生存を誘導することができる因子には、ニューロトロフィンの一種(NGF)、セクレチン/グルカゴン/VIPファミリーの一員(PACAP)、ニューブラスチン(アルテミン)、メテオリン、GDNF、NT-3及びBDNFが含まれる。これらの因子は末梢神経系及び中枢神経系の双方においても同様の活性を示すことから、後根神経節で発現される受容体及び応答システムは多くの他の神経細胞でも共有されていることが示唆される。
【００６１】
NGFは、反応性(responsive)の交感神経性ニューロン及び感覚ニューロンさらには前脳基底核のコリン作動性ニューロンにとって重要な分化因子及び生存因子である。PACAPは、神経前駆細胞の増殖に影響を与えることなく神経性マーカーについて陽性である細胞の数及び軸索誘導(axonogenesis)の両方を増加させるという意味において、新生の後根神経節(DRG)ニューロンの分化を促進させるものである(Nielsen et al., Mol Cell Neurosci. 2004 Apr;25(4):629-41)。PACAPはまた、CNSの神経細胞群においても同様の活性を示す(Vaudry et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Apr30;99(9):6398-403; Dicicco-Bloom et al., Ann N Y Acad Sci. 1998 Dec11;865:274-89)。
【００６２】
アポトーシス細胞死のような細胞死は、成体の神経系において神経細胞の減少に貢献し、虚血性脳卒中、神経変性疾患、又は脳外傷のような様々な神経障害を引き起こす(Becker and Bonni, Prog Neurobiol. 2004 Jan;72(1):1-25)。アポトーシス細胞死から神経細胞を防御することができるような分泌性成長因子は、従って、神経系の障害一般、特に神経変性障害の治療に使用できる可能性がある。従って、ある分泌性因子が、神経突起伸長を誘導する能力、及び/又は細胞死を導く条件下で生存を促進する能力を有するならば、それは、当該因子が中枢神経系及び/又は末梢神経系の他の神経細胞の種類においても同様の効果を有すること、及び、当該因子は神経系の障害、特に神経変性障害の治療に使用できる可能性があることの示唆となる。
【００６３】
METRNLは分泌性の成長因子であり、神経細胞の移動、再生、及び分化を刺激し、また潜在的に生存増強活性、神経保護活性、及び/又は神経発生活性をも有する、という事実に基づき、METRNLを神経系の障害一般を治療することに使用すること、特に脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、びまん性軸索損傷、神経障害、神経根損傷、神経根裂離、及び、腕神経叢損傷のような末梢神経損傷(DRGアッセイにおける作用に基づく)、末梢神経障害及び付随の痛み(DRGアッセイにおける作用に基づく)、パーキンソン病(SVZアッセイにおける作用に基づく)、ハンチントン病(SVZアッセイにおける作用に基づく)、ALS(DRGアッセイにおいて見られる生物学的作用、及びSVZにおいて中心管に沿って神経前駆体を補充する能力に基づく)、神経障害性の痛み及び末梢神経障害(DRGアッセイにおいて見られる生物学的作用に基づく)を含む(しかしこれらに限定されない)脳、脳幹若しくは脊髄、及び/又は末梢神経の傷害に関わる疾患、障害、又は損傷の治療に使用すること、並びに、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、及び付随の症状群(実施例2Aの聴覚消失のインビボ・モデルにおける作用に基づく)を含む(しかしこれらに限定されない)、内耳の感覚上皮及び付随の神経節に関わる疾患、障害、又は損傷の治療に使用することが考慮される。これら様々な適応における効用は、実施例に記述されるように、インビトロ及びインビボのアッセイにより確認することができる。
【００６４】
METRNLの治療的効果は、標的細胞の増殖を含む成長、再生、機能回復、機能改善、生存、移動、及び/又は分化に対する作用で媒介され得る。
【００６５】
METRNLの確認されている生物学的機能の一つは、内耳の神経細胞に対する神経保護/再生/生存作用であり、それは聴覚消失からの保護、及び潜在的には聴覚消失に対する治癒的効果という結果をもたらす。
【００６６】
METRNLの確認されている生物学的機能の一つは、培養DRGに対して分化/再生/生存を誘導する作用である。
【００６７】
METRNLの確認されている生物学的機能のもう一つは、脳室下帯由来の神経前駆体の移動/生成/生存を刺激する作用である。
【００６８】
成体神経新生は、最近になってようやく科学界で一般的に受け入れられるようになった概念である。以前は、CNSにおけるニューロンの産生は胚期だけに限られていると考えられていた。ここ数十年の間で、神経新生は成体でも起こっていること、及び、それは進化の過程で保存されているらしいこと、が示されてきた。哺乳類では、成体神経新生は、側脳室のSVZや海馬の歯状回の顆粒細胞下層(SGZ)のような、CNSの特異的で明確に区別される領域にほぼ限定されている(Ming and Song,2005, Annu Rev Neurosci, 28, 223,250)。マウス脳の側脳室の側壁のSVZはよく研究されており、この領域で産生されるニューロンは通常、吻側移動経路(RMS)に沿って、嗅球へと移動し、そこで顆粒及び傍糸球体介在ニューロンに分化する(Doetschand Alvarez-Buylla, 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 14895-900; Lois andAlvarez-Buylla, 1994, Science, 264, 1145-1148)。出生後に産生されたニューロンは、SVZから最終的な目的地に至るまでの間、いくつかの発生段階を経ながら、識別を可能とする複数の特定のタンパク質マーカーを発現する。
【００６９】
ラットの脳卒中モデルにおけるCNS損傷後、SVZ領域が、損傷した組織に向かって移動する無数の新しいニューロンを産生して応答したことが報告され (Arvidsson et al., 2002, Nat Med, 8, 963-970)、SVZにおける成体神経新生が特に注目を集めた。これは、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病その他のような神経変性疾患に取組むための新たな治療学的展望を約束するものである。
【００７０】
治療的可能性を有する他の既知の栄養性因子は、神経細胞の脳室下帯からの移動を増加させることが示されてきた。これらにはSDF1a、BDNF、NT3及びNT4/5、並びに血小板由来成長因子(PDGF)が含まれる(Caldwell et al, Nature Biotechnology, 2001 May, 19(5):475-9. Growthfactors regulate the survival and fate of cells derived from humanneurospheres)。これらの結果は、従って、METRNLもまた神経系の障害、特に、ニューロンが消失又は損傷し新しい神経前駆体細胞の補充が望まれる障害、損傷、及び疾患(例えば外傷及び神経変性障害)を治療することに使用できる可能性のある因子であることを示唆している。
【００７１】
I.METRNLポリペプチド
全長METRNL、実質的に全長であるMETRNL、及び切り詰め型METRNLに加えて、本発明は生物学的活性を有するこれらのポリペプチドの断片及び配列バリアントを提供する。METRNLポリペプチド、配列バリアント、又は断片は、天然のMETRNLの生物学的活性を示すならば、生物学的活性を有する。METRNLの生物学的活性を有する断片は、野生型METRNL配列に対して1つ以上の位置において異なっていてもよく、20個までの位置において、より好ましくは10個までの位置において、より好ましくは5個までの位置において異なっていてもよく、例えば1つ、2つ、3つ、又は4つの位置において異なり得る。本発明は、ここで定義されるところの実質的に精製されたMETRNLに関わることが理解されるべきである。
【００７２】
生物学的活性の1つは、受容体結合アッセイにおいて天然のMETRNLと競合する能力である。
【００７３】
生物学的活性のもう1つは、天然のMETRNL上に存在するエピトープに対する抗体に結合する能力である。
【００７４】
生物学的活性を有するバリアントも、実施例に記述される1つまたは複数の生物学的アッセイを基準にして定義することができる。
【００７５】
好ましい生物学的活性の1つは、実施例2及び図6に記述されたDRGアッセイにおけるものと実質的に同じ応答を誘発する能力である。このアッセイでは、分離されたラットP5 DRGの培養組織を、C-末端hisタグ(SEQ ID NO 26)を付けたマウスMETRNLタンパク質(SEQ ID NO 8)に晒す。DRGアッセイにおける実質的に同じ応答とは、細胞あたりの神経突起の長さが、実施例2においてC-末端hisタグを付けたマウスMERTNLについて得られた数字の少なくとも10%であること、より好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%であることを意味するものとする。
【００７６】
図6の結果は、神経突起を有する細胞の数又は割合として計算することもできる。その場合は、DRGアッセイにおける実質的に同じ応答とは、神経突起を有する細胞の数が、実施例2で得られた数の少なくとも10%であること、より好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%であることを意味するものとする。METRNLの断片又はバリアントの生物学的活性は、天然のMETRNLのそれより高いこともあり得る。
【００７７】
好ましい生物学的活性のもう1つは、実施例2に示される移動作用を含む。このアッセイでは、脳室下帯(SVZ)からの外植片が、C-末端hisタグ(SEQ ID NO 26)を付けたマウスMETRNLタンパク質(SEQ ID NO 8)又はヒトMETRNLタンパク質(SEQ ID NO 7) に晒され、当該外植片からの神経細胞の移動が誘導される。SVZアッセイにおける実質的に同じ応答とは、平均の移動距離が、実施例2で得られた数字の少なくとも10%であること、より好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも50%、より好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%であることを意味するものとする。METRNLの断片又はバリアントの生物学的活性は、天然のMETRNLのそれより高いこともあり得る。
【００７８】
さらに好ましい生物学的活性は、実施例2Aに示される、聴覚消失に対する保護作用を含む。このアッセイでは、難聴化されたモルモットがC-末端hisタグ(SEQ ID NO26)を付けたマウスMETRNLタンパク質(SEQ ID NO8)に晒され、聴覚消失の悪化から保護される。聴覚消失アッセイにおける実質的に同じ応答とは、METRNLで処置した動物について得られた閾値に対して+/- 50 μAまでの閾値であることを意味するものとし、例えば、METRNLについて得られた閾値の+/- 40 μAまで、例えば+/- 30 μAまで、例えば+/- 20 μAまで、例えば+/-10 μAまでである。
【００７９】
特定の好ましい切り詰め型METRNLは、一態様において、以下のものからなる群から選択される:
i) SEQ IDNo 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
ii) SEQ IDNo 11に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;
iii) SEQID No 12に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、及び1から5個の追加のアミノ酸を有するポリペプチド;;並びに
iv) 上記ポリペプチドのバリアント(そこでは、選ばれた配列中の任意のアミノ酸が別のアミノ酸に変えられる。ただし当該配列中でそのように変えられるアミノ酸が20個を超えてはならない)。
これらのMETRNLの切り詰め型は、保存されたシステインのうち1番目のものから最後のものまでに至るコア配列を含む。好ましい一実施態様においては、変えられたアミノ酸の数は15未満であり、より好ましくは10未満であり、より好ましくは5未満であり、例えば1つまたは2つのアミノ酸が変えられており、さらに好ましくはアミノ酸が1つも変えられていない。
【００８０】
バリアントは、天然のMETRNLと較べて、アミノ酸配列において異なり得るし、配列とは無関係な点で異なり得るし、又はその両方でもあり得る。アミノ酸配列についてのバリアント(「配列バリアント」)は、天然のMETRNLのアミノ酸の1つ以上が、異なる天然アミノ酸、アミノ酸誘導体、又は非天然アミノ酸で置換されることにより産生される。特に好ましいバリアントとしては、天然のMETRNL又は生物学的活性を有するその断片であって、野生型METRNLと較べて1つ又は複数の保存的及び/又は半保存的アミノ酸置換(これらは通常、タンパク質又はペプチドの二次及び三次構造並びに疎水性には大きく影響しない)により配列が変わっているものが含まれる。バリアントはまた、METRNLの生物学的活性を壊さないような1つ又は複数の非保存的アミノ酸置換、欠失、又は挿入により配列が変わっているものでもあり得る。図1及び/又は図2のClustal Wアラインメントは、当該タンパク質の生物学的活性に実質的に影響を及ぼすことなく置換できるアミノ酸残基はどれであるかを予測することに使用することができる。
【００８１】
以下のグループ(Clustal W、「強」保存グループ)内での置換は、本発明が意味するところにおいて保存的置換とみなされる。
-STA,NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW。
以下のグループ(Clustal W、「弱」保存グループ)内での置換は、本発明が意味するところにおいて半保存的置換とみなされる。
-CSA, ATV,SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK, VLIM, HFY。
【００８２】
本発明における別のバリアントとしては、ペプチドの安定性を増加させる修飾を有するものがある。そのようなバリアントは、例えば、ペプチド配列中に1つ以上の非ペプチド結合(それがペプチド結合と置き換わっている)を含み得る。他には、天然L-アミノ酸以外の残基(例えばD-アミノ酸)又は非天然若しくは合成アミノ酸(例えばベータ又はガンマアミノ酸)を含むバリアント、及び環状バリアントが本発明に含まれる。L-アミノ酸の代わりにD-アミノ酸をポリペプチドに組み入れると、プロテアーゼに対する抵抗性が増加し得る。例えば米国特許5,219,990号を参照のこと。スプライスバリアントは特に本発明に含まれる。
【００８３】
特に好ましい変異(mutation)の1つは、全ての成熟METRNL配列に見られるN-末端Gln残基(例えば図3を参照のこと)が、Gln及びCysを除く天然アミノ酸からなる群から選択される別のアミノ酸で置換されたものである。当該残基が非疎水性残基に変異したものが好ましい。当該残基がAsn又はAlaに変異したものがさらに好ましい。これらのN-末端変異METRNLポリペプチドは、N-末端のGln残基が環化してピログルタミン酸になることを回避する。この環化は、当該ポリペプチドをルーチン的なN-末端配列決定に付すことができなくなるという結果を招く。
【００８４】
ある置換がどのような結果を引き起こすか確実に予測できない場合は、その産物を本明細書に開示する方法によって容易にアッセイでき、生物学的活性の有無を決定することができる。それはDRG及び/又はSVZアッセイによることが好ましい。
【００８５】
一実施態様においては、ポリペプチドは、SEQ ID No. 2、4、及び6から成る群から選択される配列の、天然対立遺伝子バリアントである。このポリペプチドは、SEQ ID No. 1、3、及び5から成る群から選択される核酸配列と較べて単一ヌクレオチドにおいて異なっている核酸配列を翻訳したところのアミノ酸配列を含み得る。
【００８６】
ここで記述されるバリアント・ポリペプチドは、一実施態様において、選択された配列中の任意のアミノ酸が保存的置換となるように変えられたものであるポリペプチドを含む。
【００８７】
シグナル・ペプチドは、異種(heterologous)のシグナル・ペプチドに置き換えられ得る。
【００８８】
本発明の範囲に含まれるバリアントは、一実施態様において、ヒト、マウス又はラットのMETRNL (SEQ ID NO: 2、4、及び6)に対して少なくとも60パーセントのアミノ酸配列同一性を有するタンパク質及びペプチドを含む。より好ましくは、当該配列同一性は少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98 %である。
【００８９】
本発明の範囲に含まれる好ましいバリアントは、一実施態様において、SEQ ID NO: 7、8、及び9の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも60パーセントのアミノ酸配列同一性を有するタンパク質及びペプチドを含む。より好ましくは、当該配列同一性は少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98 %である。SEQ ID No. 7、8、及び9は、シグナル・ペプチドが切断された後の成熟タンパク質に相当する。N-末端グルタミン残基がピロリドンカルボン酸に変換されていることが好ましい。
【００９０】
本発明の範囲に含まれるバリアントは、一実施態様において、SEQ ID NO: 10、11、及び12の配列を有するポリペプチドに対して少なくとも60パーセントのアミノ酸配列同一性を有するタンパク質及びペプチドを含む。より好ましくは、当該配列同一性は少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98 %である。
【００９１】
一つの好ましい実施態様においては、バリアントMETRNLの配列同一性はヒトMETRNLポリペプチド(SEQ ID No 2、7、又は10)を基準にして決められる。
【００９２】
相同性を決定するという目的において、比較される配列の最小の長さは一般的には少なくとも8アミノ酸残基であり、通常は少なくとも12アミノ酸残基である。本発明の目的においては、パーセント配列同一性は少なくとも25アミノ酸の重複範囲において計算されることが好ましく、より好ましくは少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少なくとも35、より好ましくは少なくとも40、より好ましくは少なくとも45、より好ましくは少なくとも50、より好ましくは少なくとも55、より好ましくは少なくとも60、例えば少なくとも70、例えば少なくとも80、例えば少なくとも90、例えば少なくとも100、例えば少なくとも110、例えば少なくとも120、例えば少なくとも130、例えば少なくとも150アミノ酸の重複範囲において計算されることが好ましく、当該範囲はデフォルト設定下のBLASTPにより決定される。
【００９３】
一実施態様においては、パーセント配列同一性はグローバル・アラインメント(GAP又はAlign)を使用して計算され、即ち、バリアントとSEQ ID配列とが整列され、同一のアミノ酸残基の総数が算出され、それがSEQ IDNOの長さで割られる。
【００９４】
一実施態様においては、バリアントMETRNLは、SEQ ID No. 2、4、及び6から成る群から選択される配列の天然対立遺伝子バリアントを含む。前記対立遺伝子バリアント配列は、SEQ ID No. 1、3、及び5から成る群から選択される核酸配列と較べて単一ヌクレオチドにおいて異なっている核酸配列を翻訳したところのアミノ酸配列であり得る。
【００９５】
一実施態様においては、バリアントは、SEQ ID NO 7に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、その配列同一性はより好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%である。
【００９６】
一実施態様においては、好ましいバリアントは、SEQ ID NO 8に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、その配列同一性はより好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%である。
【００９７】
一実施態様においては、バリアントは、SEQ ID NO 9に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、その配列同一性はより好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%である。
【００９８】
一実施態様においては、バリアントは、SEQ ID NO 2に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、その配列同一性はより好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%である。
【００９９】
一実施態様においては、バリアントは、SEQ ID NO 7に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、その配列同一性はより好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%である。
【０１００】
一実施態様においては、好ましいバリアントは、SEQ ID NO 10に対して少なくとも60%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、その配列同一性はより好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%である。
【０１０１】
一実施態様においては、バリアントMETRNLは、図1又は2において完全に保存されている(*)として示されている残基を、対応する位置において含んでおり、より好ましくは、バリアントMETRNLは、強く保存的な残基をも対応する位置において含んでおり(強く保存的なものの群は以下を含む:STA, NEQK, NHQK, NEDQ, QHRK, MILV, MILF, HY FYW)、より好ましくは、バリアントMETRNLは、より弱く保存的な残基をも対応する位置において含んでいる(より弱く保存的なものの群は以下を含む:CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHK, NEQHRK,VLIM, HFY)。特に、保存されたシステイン(図2)は、野生型METRNLで見られる間隔を維持しながら、バリアントMETRNLの対応するポジションに位置していなければならないことが考慮される。
【０１０２】
非配列的修飾は、例えば、天然METRNLの部位のインビボ又はインビトロにおける化学的誘導体化、及び、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、硫酸化、アミノ酸抱合(conjugation)、GSH抱合、酸化、還元、加水分解、PEG化、又はグリコシル化を含み得る。タンパク質の置換基を置き換えることができるのと同じように、タンパク質に結合した官能基もまた、同様の特性を有する基で置換することができる。そのような修飾は一次配列を改変しない。これらははじめは(initially)保存的なものであろう。即ち、置き換えられる基はもとの基とほぼ同じ大きさ、形、疎水性、及び電荷を有しているであろう。
【０１０３】
所与のポリペプチドにおいて、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は修飾を受けることができ、当該修飾はグリコシル化やその他の翻訳後修飾のような自然のプロセスによるものであってもよいし、あるいは、当該技術分野でよく知られる化学修飾技術によるものであってもよい。本発明のポリペプチド中に存在し得る既知の修飾としては、代表的なものだけを列挙すると、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、イノシトールリン脂質の共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合による架橋結合の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ-カルボキシル化、グリケーション、グリコシル化、GPIアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイレーション(selenoylation)、硫酸化、転移RNA媒介によるアミノ酸のタンパク質への付加(例えばアルギニル化)及びユビキチン化がある。
【０１０４】
そのような修飾は当業者にはよく知られており、科学文献に非常に詳細に記述されている。特に一般的ないくつかの修飾、例えばグリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、水酸化及びADPリボシル化は、ほとんどの基礎的な教科書、例えばI. E. Creighton, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2ndEd., W. H. Freeman and Company, New York, 1993に記述されている。この主題についての多くの詳細な総説が入手可能であり、例としては、Wold, F., in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pp 1-12, 1983、Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646, 1990、及びRattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modificationsand Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62, 1992がある。
【０１０５】
さらに、当該タンパク質は、後で精製することができるようにタンパク質タグを含んでいてもよいし、任意で、当該タグをエンドペプチダーゼを使用して除去してもよい。当該タグは後で除去しやすいようにプロテアーゼ切断部位を含んでいてもよい。アフィニティー・タグの非限定的な例は、ポリhisタグ、GSTタグ、HA タグ、Flagタグ、C-mycタグ、HSVタグ、V5タグ、マルトース結合タンパク質タグ、セルロース結合ドメインタグを含む。製造及び精製のためにはタグがポリhisタグであることが好ましい。好ましくは、タグはタンパク質のC-末端領域内、例えばC-末端のまさに最端にあることが好ましい。
【０１０６】
他の哺乳類細胞型でリコンビナント生成する際に当該タンパク質の分泌を増加させるために、METRNLの天然のシグナル配列を置き換えてもよい。
【０１０７】
よく知られているように、また上でも言及されたように、ポリペプチドは完全に直鎖状であるとは限らない、ということが理解されるはずである。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状になり得るし、また、一般的に翻訳後のイベント(自然のプロセシング現象及び自然には起こらないが人為的操作によりもたらされる現象を含む)の結果として環状にもなり得、その場合分枝を伴うことも伴わないこともあり得る。環状、分枝状、及び分枝環状ポリペプチドは、自然の非翻訳プロセス(non-translational natural processes)で合成され得るし、また、完全合成法によって合成してもよく、それらはすべて本発明の範囲に包含される。
【０１０８】
ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、並びにアミノ末端及びカルボキシル末端を含め、修飾はポリペプチドのどの部分でも起こり得る。事実、ポリペプチドのアミノ基又はカルボキシル基又はその両方が共有結合修飾によりブロックされること(blockage)は天然及び合成ポリペプチドにおいてよく見られることであり、そのような修飾は本発明のポリペプチドにも存在し得る。例えば、大腸菌(E. coli)で産生されるポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解プロセシングされる前にはほとんど例外なくN-ホルミルメチオニンとなる。
【０１０９】
ポリペプチドにおいて起こる修飾は、多くの場合、そのポリペプチドがどのように産生されるかによって決まる。例えば、クローン化した遺伝子を宿主中で発現させることにより産生されるポリペプチドにおいては、修飾の性質と程度は、宿主細胞の翻訳後修飾の能力及び当該ポリペプチドのアミノ酸配列中に存在する修飾シグナルによって大部分決定される。例えば、大腸菌のような細菌性宿主においてはグリコシル化は起こらないことがしばしばである。従って、もしグリコシル化が望まれるならば、ポリペプチドはグリコシル化宿主で発現されるべきであり、それは一般的には真核生物の細胞である。昆虫細胞は多くの場合哺乳類細胞と同じ翻訳後グリコシル化を行い、その理由で、特に天然のグリコシル化パターンを有する哺乳類タンパク質を効率良く発現するための昆虫細胞発現系が開発されてきた。同様の配慮が他の修飾にも適用される。
【０１１０】
一つのポリペプチド中において、同じ種類の修飾が、いくつかの部位において、同じ又は異なる程度で存在し得るということは理解されるであろう。また、一つのポリペプチドが多くの種類の修飾を含み得る。
【０１１１】
一般的に、本明細書においては、ポリペプチドという用語はそのような全ての修飾を包含するものであり、特に宿主細胞においてポリヌクレオチドを発現することにより合成されたポリペプチドに存在する修飾を包含する。
【０１１２】
本発明のタンパク質又はその断片に特異的に結合する薬剤(agents)も本発明に含まれる。これらの薬剤はIg融合タンパク質及び抗体(天然、ヒト化(humanized)、霊長類化(primatized)、キメラ化を問わず、単鎖、二重鎖、Fab断片、その他を含む)を含む。これらの薬剤のカテゴリーはWO 95/16709にさらに記述されており、当該文献の開示は参照によりここに組み入れられる。
【０１１３】
抗体と言うのは、エピトープ決定基に結合することができる完全な(intact)分子及びその断片(例えばFab、F(ab')、及びFv)を指す。METRNLポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチド又は目的となる小ペプチドを含む断片を免疫のための抗原として使用して調製することができる。動物を免疫するために使用されるポリペプチド又はオリゴペプチドは、RNAの翻訳に由来するものでも化学合成されたものでもよく、所望ならば担体タンパク質と複合体を形成させてもよい。ペプチドに化学的にカップリングさせることに通常使用される担体としては、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、及びスカシガイヘモシアニンが含まれる。カップリングされたペプチドはその後動物(例えばマウス、ラット、又はウサギ)を免疫するのに使用される。
【０１１４】
本明細書において、ヒト化抗体とは、もとの結合能を維持しながらよりヒト抗体に似るように、抗原結合領域ではない領域においてアミノ酸が置き換えられた抗体分子を指す。ヒト化抗体は、METRNLの作用を制限するか又は阻止することが望まれる状態を処置する上で治療的に使用される。
【０１１５】
本発明の範囲には、抗体と以下のものから成る群から選択される接合物とを含む免疫結合体も含まれる:化学療法剤、毒素、又は放射性同位元素のような細胞毒性剤;アビジン又はストレプトアビジン又は抗原のような特異的結合をなす対の一員;検出可能な産物を産生することができる酵素。これらの免疫結合体は、METRNL受容体を発現している細胞を標的として当該接合物を送り届けることに使用し得る。
【０１１６】
いかなるMETRNLに対する特異的抗体も、抗体が特異性を有する物質を定量化する免疫アッセイにおいて有用である。METRNLに対する特異的抗体は、固形支持体(例えばビーズ又はディッシュ)に結合させてもよく、また、溶液からリガンドを取り除くために使用してもよい(これは当該タンパク質を精製するための使用でもあり得るし、又は溶液からそれを除去するための使用でもあり得る)。これらの技術はそれぞれ、免疫学分野の当業者にとってはルーチン的なものである。
【０１１７】
METRNL融合タンパク質もまた本発明の範囲に含まれる。METRNL融合タンパク質は、METRNLの受容体を発現する組織の画像解析(imaging)をすることに使用できるし、上述したMETRNLに対する抗体についての免疫組織学的又は調製的方法において使用することができる。METRNLを包含する融合タンパク質は、METRNL受容体を発現する細胞を特異的な標的として医学的療法を送り届けることに使用できる。
【０１１８】
II. METRNLヌクレオチド配列
本発明はMETRNLをコードするcDNAの医学的使用を提供し、当該cDNAは、例えば、ヒト、マウス、及びラットのMETRNL cDNAの核酸配列(SEQ ID NO 1, 3, 及び5)、METRNLをコードする配列(SEQ ID NO 13, 14, 及び15)、並びにシグナル・ペプチドを除いたMETRNLをコードする配列(SEQ ID NO 16又はSEQ ID No 1のヌクレオチド136-936、SEQ ID NO 17又はSEQ ID No. 3のヌクレオチド136-936、及びSEQ ID NO 18又はSEQ ID No. 5のヌクレオチド136-936)を含む。
【０１１９】
これらの配列のバリアントもまた、本発明の範囲に含まれる。
【０１２０】
本発明は、ポリペプチドをコードする核酸配列又はその相補鎖配列を含む、医学的使用のための単離された核酸配列分子に関わり、前記ポリペプチドは以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む:
a) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列;
b) SEQ IDNo. 2, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列の配列バリアント(ここで、当該バリアントは前記SEQ ID No.に対して少なくとも70%の配列同一性を有する);並びに
c) 生物学的活性を有する、a)又はb)のいずれかのものの少なくとも50の連続したアミノ酸の断片。
d) 生物学的活性を有する、c)の断片の配列バリアント(ここで、当該配列バリアントは当該断片に対して少なくとも70%の配列同一性を有する)。
【０１２１】
当該核酸分子は、天然の対立遺伝子核酸バリアントのヌクレオチド配列を含み得る。
【０１２２】
本発明の核酸分子はバリアント・ポリペプチドをコードしていてもよく、ここで当該バリアント・ポリペプチドは、天然のポリペプチド・バリアントのポリペプチド配列を有している。
【０１２３】
一実施態様においては、当該核酸分子は、SEQ ID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択される核酸配列と較べて単一ヌクレオチドにおいて異なっている。
【０１２４】
好ましくは、コードされたポリペプチドはSEQ ID No. 2, 7, 及び10からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有し、当該配列同一性は好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98% であり、より好ましくは、当該ポリペプチドは前記SEQ ID No.からなる群から選択される配列を有する。前記配列はヒトMETRNLを構成する。
【０１２５】
好ましい一実施態様においては、コードされたポリペプチドはSEQ ID No. 4, 8, 及び11からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有し、当該配列同一性は好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98% であり、より好ましくは、当該ポリペプチドは前記SEQ ID No.からなる群から選択される配列を有する。前記配列はマウスMETRNLを構成する。
【０１２６】
好ましい一実施態様においては、コードされたポリペプチドはSEQ ID No. 6, 9, 及び12からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有し、当該配列同一性は好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98% であり、より好ましくは、当該ポリペプチドは前記SEQ ID No.からなる群から選択される配列を有する。前記配列はラットMETRNLを構成する。
【０１２７】
好ましい一実施態様においては、コードされたポリペプチドはSEQ ID No. 7, 8, 及び9からなる群から選択される配列に対して少なくとも60%の配列同一性を有し、当該配列同一性は好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98% であり、より好ましくは、当該ポリペプチドは前記SEQ ID No.からなる群から選択される配列を有する。前記配列は成熟METRNLを構成する。
【０１２８】
好ましい一実施態様においては、コードされたポリペプチドはSEQ ID No. 7に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくは、前記ポリペプチドはSEQ ID No. 7の配列を有する。
【０１２９】
好ましい一実施態様においては、コードされたポリペプチドはSEQ ID No. 2に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくは、前記ポリペプチドはSEQ ID No. 2の配列を有する。
【０１３０】
好ましい一実施態様においては、コードされたポリペプチドはSEQ ID No. 10に対して少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有し、より好ましくは、前記ポリペプチドはSEQ ID No. 10の配列を有する。
【０１３１】
一態様において、当該核酸分子は以下のものからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む:
a)      SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択されるヌクレオチド配列;
b)      SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%の配列同一性を有するヌクレオチド配列;
c)      SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択される配列の少なくとも150の連続したヌクレオチドである核酸配列;
c)      SEQID No. 1, 3, 5, 13, 14, 15, 16, 17, 及び18からなる群から選択される配列を有する核酸と、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができる、核酸の相補鎖;並びに
d)      上記のいずれかのものと相補的なものの核酸配列。
【０１３２】
SEQID No 7, 8 及び9は、ヒト、マウス及びラットの成熟METRNLポリペプチドをコードする配列を示す。真核生物の発現系でリコンビナント発現するためには、これらを適切なシグナル配列をコードする配列に連結させ、METRNLポリペプチドが確実に細胞から分泌されるようにしておくことが好ましい。同じことが、SEQ ID NO 10, 11, 及び12で定義されるポリペプチドのリコンビナント発現についてもあてはまる。
【０１３３】
一つの好ましい実施態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1, 3, 及び5からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１３４】
一つの好ましい実施態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 13, 14, 及び15からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１３５】
一つの好ましい実施態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 16, 17, 及び18からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１３６】
一実施態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1として示されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも60%、より好ましくは少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１３７】
一つの好ましい実施態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 13として示されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１３８】
一つの好ましい実施態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 16として示されるポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１３９】
単離されたポリヌクレオチドの好ましい群は、ヒトMETRNLポリヌクレオチドであるSEQ ID No 1, 13, 及び16を含む。単離されたポリヌクレオチドのもう一つの好ましい群は、cDNA配列を示すものであるSEQ ID No. 1, 3, 及び5を含む。
【０１４０】
加えて、本発明のヌクレオチド配列は、これらの配列から派生した配列も含む。本発明はまた、これらの配列のうちの一つ又はこれらの配列のうちの一つの派生物を包含するベクター、リポソーム、及びその他のキャリア媒体も含む。本発明はまた、METRNL cDNA(好ましくはヒトMETRNL cDNA)から転写され翻訳されたタンパク質を含み、それはヒトMETRNL並びに断片及びバリアントを含むがこれらに限定されない。
【０１４１】
別の実施態様においては、本発明は、他の遺伝子を単離するためのプローブをデザインするために本発明の核酸及びタンパク質を使用することに関わり、ここで当該他の遺伝子は、本発明のMETRNLタンパク質の構造的又は機能的特性を有するタンパク質をコードするものである。当該プローブは、様々なベースペアー長のものであり得る。例えば、核酸プローブは約10ベースペアーから約150ベースペアーの長さであり得る。
【０１４２】
あるいは、核酸プローブは約150ベースペアーを超える長さでもあり得る。実験方法はAusubel et al.,"Current Protocols in Molecular Biology", J. Wiley (ed.) (1999)に提示されており、当該文献の記述の全てが参照によってここに組み入れられる。
【０１４３】
オリゴヌクレオチド(本明細書では核酸と呼ぶこともある)プローブのデザインは、次のパラメータに従うことが好ましい:
i) 不明瞭な塩基（もしあったとしたら）が最も少ない配列領域においてデザインするべきである。また、
ii) 計算上のTmが約80℃であるようにデザインするべきである(A又はT一つあたり2℃、及び、G又はC一つあたり4℃と想定する)。
【０１４４】
当該オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの検出を促進するために、標識化することが好ましい。標識化は、γ-32P ATP(比放射能6000 Ci/mmole)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用い、オリゴヌクレオチド標識化のための一般的な技術を使用して、行い得る。他の標識化技術も使用し得る。取り込まれなかった標識は、ゲル濾過クロマトグラフィー又はその他の確立された方法により除去することが好ましい。プローブに取り込まれた放射活性の量は、シンチレーションカウンターでの測定により定量化するべきである。好ましくは、結果として得られるプローブの比放射能は約4 x 106 dpm/pmoleであるべきである。全長クローンのプールを含む細菌培養液は、好ましくは解凍し、100 μLのストックを使用して、100pg/mlのアンピシリンを含んだ無菌L-ブロスを含んだ25ml無菌培養フラスコに植えつける。
【０１４５】
培養液は飽和(saturation)するまで約37℃において増殖させるのが好ましく、飽和した培養液は新鮮なL-ブロスで希釈するのが好ましい。150 mmのペトリディッシュ中の、100 pg/mlのアンピシリン及び1.5%の寒天を含む細菌用固形培地上で約37℃で一晩培養したときに、明確(distinct)でありかつ互いによく離れて分散する(well-separated)約5000個のコロニーを生じるような希釈率及び液量を決定するために、これらの希釈液の一定分量を蒔くことが好ましい。明確でありかつ互いによく離れて分散するコロニーを得るためのほかの既知の方法を活用することもできる。
【０１４６】
その後、標準的なコロニー・ハイブリダイゼーションの手順を用い、当該コロニーをニトロセルロース・フィルターに移して、溶解させ、変性させ、ベーキングすることが好ましい。高度にストリンジェント(本明細書では「高ストリンジェンシー」とも呼ぶ)な条件とは、例えば、約65℃における1xSSC、又は約42℃における1xSSC及び50%ホルムアミドと少なくとも同程度にストリンジェントであることをいう。「中程度のストリンジェンシー」の条件とは、約65℃における4xSSC、又は約42℃における4xSSC及び50%ホルムアミドと少なくとも同程度にストリンジェントである条件をいう。「低ストリンジェンシー」な条件とは、約50℃における4x SSC、又は40℃における6x SSC及び50%ホルムアミドと少なくとも同程度にストリンジェントである条件をいう。
【０１４７】
続いて、当該フィルターを、0.5% SDS、100 g/ml 酵母RNA、及び10 mM EDTAを含む6X SSC (20x ストックは、リットルあたり175.3 gのNaCl、及びリットルあたり88.2 gのクエン酸ナトリウムを含有し、NaOHでpH 7.0に調節する)の中で約65℃で1時間、緩やかに攪拌しながらインキュベートすることが好ましい(150 mmのフィルターあたり約10 mL)。好ましくは、その後、前記プローブを、1 x 106 dpm/mL以上の濃度でハイブリダイゼーション混合物に加える。それから当該フィルターを約65℃で緩やかに攪拌しながら一晩インキュベートすることが好ましい。それから当該フィルターを室温で攪拌せずに500 mLの2x SSC/0.5% SDS中で洗浄することが好ましく、その後15分間室温で緩やかに振盪させながら500 mLの2x SSC/0.1% SDSでさらに洗浄することが好ましい。0.1x SSC/0.5%SDSを用いて約65℃において30分間から1時間の第三の洗浄をすることは任意である。それからフィルターを乾燥させ、X線フィルム上でポジティブなコロニーを可視化するために十分な時間オートラジオグラフィーに付すことが好ましい。他の既知のハイブリダイゼーション方法を使用することもできる。それからポジティブなコロニーを選択して培養し、標準的な手順によりプラスミドDNAを単離する。その後クローンを、制限酵素解析、ハイブリダイゼーション解析、又はDNA配列決定により確認することができる。
【０１４８】
あるいは、ヌクレオチド・プローブと相同的なDNA又はRNA配列との間のハイブリダイゼーションを決定することに適した実験条件は、ハイブルダイズさせるDNA断片又はRNAを含むフィルターを、5x SSC [塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム;Sambrook et al.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLab., Cold Spring Harbor, NY 1989を参照のこと]の中で10分間事前に浸すこと、当該フィルターを5 x SSC、5 x デンハーツ溶液[上述のSambrooket al.を参照のこと]、0.5 % SDS、及び100μg/mlの変性させソニケーションしたサケ精子DNA[上述のSambrook et al.を参照のこと]の溶液中でプレ・ハイブリダイズすること、続いて、ランダム・プライミング[FeinbergA P & Vogelstein B; Anal. Biochem. 1983 132 6-13]して32P-dCTPで標識した(比放射能 >1 x 109 cpm/μg)プローブを10 ng/mlの濃度で含んだ同液中で、12時間、約45℃においてハイブリダイズすること、を含む。フィルターをその後2回、各30分間、0.1 x SSC及び0.5 % SDS中で少なくとも60℃の温度において(中程度のストリンジェンシー条件)、好ましくは少なくとも65℃(中程度/高ストリンジェンシー条件)、より好ましくは少なくとも70℃(高ストリンジェンシー条件)、さらに好ましくは少なくとも75℃(非常に高いストリンジェンシー条件)の温度において、洗浄する。これらの条件下で当該オリゴヌクレオチド・プローブがハイブリダイズする分子は、X線フィルムを用いて検出し得る。
【０１４９】
さらに別の実施態様において、本発明は、METRNLの核酸にハイブリダイズする核酸配列(例えばDNA、RNA)に関わる。特に、上述した高ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、又は低いストリンジェンシーの条件下で、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No 16、SEQ ID No 17、又はSEQ ID No 18にハイブリダイズする核酸に関わる。
【０１５０】
さらに別の実施態様において、本発明は、METRNLの核酸に相補的な核酸に関わる。特に、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No 16、SEQ ID No 17、又はSEQ ID No 18に相補的な核酸に関わる。
【０１５１】
別の実施態様において、本発明は、METRNLのDNA核酸に対応するRNAに関わる。特に、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 13、SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15、SEQ ID No 16、SEQ ID No 17、又はSEQ ID No 18に対応するRNAに関わる。同様に、前記SEQ ID Noに対応するLNA又はPNAの使用も考慮される。
【０１５２】
選択された宿主細胞(大腸菌、酵母各種、チャイニーズハムスター、ベイビーハムスター、昆虫、及び真菌類を含むが、これらに限定されない)において発現を増強させるためにコドンを最適化した核酸分子も考慮される。
【０１５３】
バリアント核酸は技術水準にある変異誘発法により作ることができる。ヒト由来のコード配列をマウス、ラット、又はチンパンジーのものと組み混ぜる(shuffling)方法も考慮される。具体的には、組み混ぜたバリアントは、SEQ IDNo 1と3及び/又は5との間で作られるものであり得る。SEQ ID No 3と5との間の組み混ぜバリアントも含まれる。
【０１５４】
III. 神経系の障害の治療のための、METRNLポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びMETRNL分泌細胞の使用
一実施態様においては、天然及びバリアントのMETRNL、並びにそれらの断片、及び/又はMETRNLを含む融合タンパク質が、哺乳類神経系の障害の治療のために提供される。神経細胞が消失又は損傷した疾患の状況において、神経細胞の成長(増殖を含む)、神経の機能、神経の再生、神経の分化、神経の移動、及び/又は神経の生存を刺激することにMETRNLを使用し得る。
【０１５５】
一実施態様において、本発明のポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドは、増殖を含めた神経の成長、分化、機能、移動、生存、及び/又は再生が望まれる状態又は疾患を治療するために使用し得る。本発明のポリペプチドは、METRNLポリペプチドに応答する病理過程を治療するために、例えば注射、移植、又は経口摂取される医薬組成物を介して直接的に使用し得る。
【０１５６】
このことは、分泌性成長因子METRNLが、神経毒により誘発される聴覚消失からモルモットを守ることができるという事実(実施例2A)、ラットP5後根神経節において神経突起の成長(軸索伸長)を誘発でき、生存を刺激という事実(実施例2)、及び、脳室下帯外植片からの神経芽細胞の移動を刺激できるという事実(実施例2)、により支持される。生存、再生、神経発生、分化、それに特に神経移動の作用により、METRNLは、神経細胞の欠失又は損傷に関わる神経系障害の治療に使用できる可能性のあるタンパク質/遺伝子である。そのような障害は、脳卒中、外傷、及び神経変性障害、並びに、内耳の感覚上皮及び付随の神経節に関わる疾患、障害、又は損傷、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、及びメニエール病を含む。METRNLの神経保護及び/又は神経発生及び/又は神経移動作用は、ニューロン若しくはニューロンのプロセスの欠失、機能異常、又は変性により引き起こされる障害の治療における使用を支持する。
【０１５７】
METRNLは、神経系に存在する広く異なる細胞型に作用し得る。本発明の文脈においては、神経系とは、中枢神経系、末梢神経系、眼、及び内耳を含むことを意図する。
【０１５８】
一実施態様においては、METRNLポリペプチドは、運動ニューロン及び感覚ニューロンを含む(しかしこれらに限定されない)ニューロンに作用し得る。
【０１５９】
別の実施態様においては、METRNLポリペプチドの治療的効果は、乏突起膠細胞及び/又は星状膠細胞のようなシュワン細胞及びグリア細胞に対する作用を介し得る。シュワン細胞及びグリア細胞に対する作用を介して、METRNLポリペプチドは、ミエリン形成、並びに神経機能及び生存の維持に関与し得る。
【０１６０】
別の実施態様においては、METRNLポリペプチドは、網膜神経節細胞、光受容細胞、網膜上皮細胞のような支持組織、らせん神経節細胞、及び耳の有毛細胞を含む(しかしこれらに限定されない)感覚性細胞に作用し得る。
【０１６１】
さらなる実施態様においては、METRNLポリペプチドは、幹細胞及びその神経系の子孫(neural progeny)(神経系前駆体、ニューロン前駆体、及びグリア前駆体を含むがこれらに限定されない)に作用し得る。METRNLポリペプチドは、幹細胞及び/又はニューロン前駆体若しくはグリア前駆体に作用して、成長(増殖を含む)、分化、及び/又は移動を引き起こし得る。幹細胞治療(神経系子孫の治療を含む)は、インビボ若しくはエクスビボ遺伝子治療を通して行うことができ、又は、当該タンパク質を、内在性(endogenous)若しくは移植された幹細胞を有する箇所に投与してもよく、又は、患者から単離された幹細胞にエクスビボで投与してもよい。
【０１６２】
当該障害又は疾患又は損傷は、外傷、手術、虚血、感染、代謝疾患、栄養障害、悪性病変、又は毒性剤により引き起こされる神経系の損傷であり得、また、遺伝的プロセス又は特発性のプロセスでもあり得る。
【０１６３】
本発明の方法の一実施態様においては、当該疾患又は障害又は損傷は、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経の受傷であり、脳卒中、外傷性脳損傷(TBI)、脊髄損傷(SCI)、びまん性軸索損傷(DAI)、てんかん、神経障害、末梢神経障害、並びにこれらの症候群が引き起こし得る付随の痛み及びその他の症状等をもたらすものに関わる。
【０１６４】
別の実施態様においては、当該疾患、障害、又は損傷は、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロン及びそれらニューロンのプロセスの変性、例えば神経変性障害(パーキンソン病、アルツハイマー病、老年認知症、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症(MS)に伴うニューロン/軸索の損傷、及び付随の症状を含むが、これらに限定されない)に関わる。
【０１６５】
別の実施態様においては、当該疾患、障害、又は損傷は、脳、脳幹、脊髄、及び/又は末梢神経におけるニューロンの機能異常及び/又は欠失に関わり、例えば代謝疾患、栄養障害、毒性傷、悪性病変、及び/又は遺伝的な若しくは特発性の異常により引き起こされる機能異常及び/又は欠失(糖尿病、腎機能不全、アルコール依存症、化学療法、化学薬品、薬物乱用、ビタミン欠乏症、感染、及び付随の症状によるものを含むがこれらに限定されない)等がある。
【０１６６】
別の実施態様においては、当該疾患、障害、又は損傷は、脳、脳幹、脊髄、及び末梢神経系における乏突起膠細胞、星状膠細胞、及びシュワン細胞のようなグリアの変性又は硬化に関わり、多発性硬化症(MS)、視神経炎、大脳硬化症、感染後脳脊髄炎(encephalomyelitis)、及びてんかん、並びに付随の症状を含むがこれらに限定されない。
【０１６７】
別の実施態様においては、当該疾患、障害、又は損傷は、網膜、光受容体、及び付随の神経に関わり、網膜色素変性症、黄斑変性症、緑内障、及び付随の症状を含むがこれらに限定されない。
【０１６８】
別の実施態様においては、当該疾患、障害、又は損傷は、内耳の感覚上皮及び付随の神経節に関わり、音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、並びに付随の症状群を含むがこれらに限定されない。難聴のモルモットにおけるインビボ作用は、実施例2Aにおいて本発明者により実証された。内耳の感覚上皮及び付随の神経節への損傷は、内耳に実施された手術(例えばインプラントの移植、アブミ骨摘出術、乳突削開術、及び鼓室形成術)の結果であり得る。前記インプラントは人工内耳、中耳インプラント、骨導補聴器、及び聴性脳幹インプラントであり得る。従って本発明者は、内耳における手術に関連したMETRNLの投与を考慮する。本発明者はさらに、神経を損傷から保護し、また、術後の回復を刺激するために、人工内耳、中耳インプラント、骨導補聴器、及び聴性脳幹インプラントのような耳インプラントをMETRNLタンパク質製剤でコーティングすることを考慮する。らせん神経節細胞に対するMETRNLの作用を確認するためのもう一つの関連したモデルは、Warnecke et al., “The biological effects of cell-deliveredbrain-derived neurotrophic factor on cultured spiral ganglion cells".Neuroreport. 2007 Oct 29;18(16):1683-6である。
【０１６９】
好ましい一実施態様においては、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセル、及び医薬組成物は、パーキンソン病の治療に使用される。この機能は、METRNLがSVZ外植片の神経細胞の神経発生及び/又は移動を引き起こすという事実に基づくものである。当該機能は、ドーパミン系神経栄養性活性のバイオアッセイを使用して(実施例6)、及び、線条体内(instrastriatal)6-OHDA病変モデルによってインビボで(実施例7)、立証することができる。
【０１７０】
ハンチントン病(HD)は、脳内の様々な神経細胞群、特に尾状核に位置するGABA性中型有棘ニューロン(GABA-ergic medium spiny neurons)の進行性変性をもたらす、常染色体優性遺伝疾患である。この変性に付随して、皮質のグルタミン性入力ニューロン(cortical glutaminergic input neurons)もまた変性し、これらの変性が合わさって、進行性運動障害及び認知症という特徴的な症状の殆どが説明される。
【０１７１】
好ましい一実施態様においては、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセル、及び医薬組成物は、ハンチントン病の治療に使用される。この機能は、METRNLがSVZ外植片の神経細胞の神経発生及び/又は移動を引き起こすという事実に基づくものである。ハンチントン病は、興奮毒性の疾患である。興奮毒性インビトロ・バイオアッセイは、本発明の実施例3に記述されているアッセイである。METRNLのこの神経保護性作用を実証するための、別の代表的なバイオアッセイとして、例えば、NMDAの興奮毒性作に対して海馬切片の初代(primary)培養物を保護する効果についてのバイオアッセイが含まれる(WO 03/004527、実施例5)。当該機能を実証するための好ましい動物モデルはAnderson et al, 1996. Proc Natl Acad Sci U S A.; 93(14): 7346-7351、又はPereira de Almeidab et al, 2001 Neurobiology of Disease. Volume 8,Issue 3, 433-446に記述されている。
【０１７２】
別の好ましい実施態様においては、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセル、及び医薬組成物は、末梢神経障害の治療に使用される。これは、ラットP5 DRGsに対する神経栄養性/分化/再生作用の発見に基づく(実施例2)。この発明の分子を用いた治療に関して考慮される末梢神経障害としては、外傷誘発性神経障害、例えば物理的な受傷又は疾患状態により引き起こされるもの、椎間板ヘルニア(hermited discs)のような、末梢神経への物理的な損傷、脳への物理的な損傷、脊髄への物理的な損傷、脳の損傷に付随する脳卒中、及び神経変性と関連した神経障害がある。我々はまた、化学療法で誘発される神経障害(例えば化学療法剤(例えばタキソール又はシスプラチン)の投与により引き起こされるようなもの);毒素で誘発される神経障害、薬剤で誘発される神経障害、ビタミン欠乏により誘発される神経障害;特発性ニューロパチー、疱疹症後神経痛(post-herpatic neuralgia)のような感染性神経障害、及び糖尿病性神経障害の治療も考慮する。当該効果はGardell et al, 2003 Nat Med.;9(11):1383-9に記述されている動物モデルにおいて実証することができる。
【０１７３】
別の好ましい実施態様においては、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセル、及び組成物は、神経根及び末梢神経に関連した疾患、損傷又は外傷(例えば神経根裂離、神経根損傷、及び腕神経叢損傷など)に関連する障害、疾患、又は損傷の治療に使用される。これは、ラットP5 DRG培養物に対する神経栄養性/分化/再生作用の発見に基づく(実施例2)。神経根裂離又は神経根損傷に対する効果は、Wang et al, 2008 Nat Neurosci. 11(4):488-96に記述された動物モデルを使用して実証することができる。もう一つ別の動物モデルが、Hanna-Mitchell et al, 2008. The impact of neurotrophin-3 on thedorsal root transitional zone following injury. Spinal Cord. 2008 Jun 10. Epubahead of printに記述されている。
【０１７４】
別の実施態様においては、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセル、及び組成物は、小脳に関連した障害、疾患、又は損傷の治療に使用され、それらは感覚性運動失調、多発性硬化症、神経変性脊髄小脳障害、遺伝性運動失調症、小脳萎縮症(例えばオリーブ橋小脳萎縮症(OPCA)、シャイ・ドレイガー症候群(多系統萎縮症))、及びアルコール依存症を含むがこれらに限定されない。この機能は、METRNLの全般的な神経栄養性作用により支持される(実施例2)。この機能の立証は、実施例3及び4に記述されたアッセイ(小脳顆粒細胞をグルタミン酸毒性及びカリウム欠乏症から保護する作用)により行い得る。
【０１７５】
別の好ましい実施態様においては、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセル、及び医薬組成物は、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、及び脊髄損傷(例えば虚血性又は外傷性)の治療に使用される。これは、METRNLの神経移動/神経栄養/神経保護/神経発生活性(実施例2のDRG及びSVZアッセイ)に基づく。この特定の治療的機能の立証は、実施例5に記述された運動ニューロンのアッセイにより行い得る。
【０１７６】
好ましい一実施態様においては、本発明のポリペプチド、核酸、発現ベクター、カプセル、及び組成物は、網膜に関わる疾患、障害、又は損傷の治療に使用され、それは網膜色素変性症、黄斑変性症及び緑内障を含むがこれらに限定されない。
【０１７７】
他の成長因子は、中枢神経系及び末梢神経系の両方、並びに、網膜及び/又は角膜における細胞の欠失に関わる様々な眼の適応において、重要な治療的用途を有している。例えばNGFは、アルツハイマー病、角膜潰瘍(US 6,063,757及びEP 0 973 872)、及び網膜症の治療に使用できる可能性がある。ニューブラスチン(アルテミン)は、末梢神経障害(WO 02/078730)及び角膜創傷治癒(EP 1 223 966)の両方について可能性を有する。GDNFは、パーキンソン病、ALS、脊髄損傷、及び創傷治癒(特に角膜におけるもの(EP 1 223 966))について可能性を有する。
【０１７８】
このような用途の実証は、様々な技術水準にあるインビトロ・アッセイ(網膜外植アッセイ、角膜培養)を用いて得ることができる。機能の実証は、角膜創傷(ウサギにおける角膜病変)及び網膜(マウス及びラットで使用可能な網膜色素変性症突然変異体モデル)についての技術水準にある動物モデルにおいても実施し得る。
【０１７９】
別の実施態様においては、当該神経変性疾患は以下のものからなる群から選択される興奮毒性疾患である:虚血、てんかん(特に海馬における焦点性てんかん)、及び、受傷、心停止、又は脳卒中による外傷。この機能もまた、METRNLの神経栄養/神経移動/神経保護/神経発生活性(実施例2)により支持される。上述の海馬切片培養アッセイ、及び本発明の実施例3のアッセイは、興奮毒性の疾患のための治療用途を示す生物学的作用を実証するために使用できるアッセイの(非限定的な)例である。
【０１８０】
本明細書において「対象(subject)」という用語は、METRNLポリペプチド若しくはポリヌクレオチド、治療用細胞、又は生体適合性カプセルを投与できるあらゆる哺乳類を意味するものとする。本発明の方法を用いた治療の対象として特に意図されるものとしては、ヒト、及び非ヒト霊長類、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ(gerbils)、ラット、及びマウス、並びに、これらの宿主に由来する、又はこれらの宿主から得られる、器官、腫瘍、及び細胞が含まれる。
【０１８１】
IV. ポリペプチドの投与及び製剤
METRNL治療の標的となる一つの組織は、METRNLに対する応答性を維持する点に基づき選択される脳の領域である。ヒトにおいて、成体になっても成長因子に対する応答性を維持するニューロンとしては、コリン作動性前脳基底核ニューロン、嗅内皮質ニューロン、視床ニューロン、青斑核ニューロン、脊髄感覚ニューロン、脊髄運動ニューロン、黒質のニューロン、交感神経性ニューロン、後根神経節、網膜ニューロン、耳ニューロン、小脳ニューロン、及び毛様体神経節が含まれる。脳室下帯の幹細胞のような幹細胞、並びに神経及びグリアの前駆細胞もまた、成体になっても成長因子に対する応答性を維持する。ミエリン形成乏突起膠細胞もまた、成体になっても成長因子に対する応答性を維持する。
【０１８２】
METRNLポリペプチドは、医学的に許容されるあらゆる方式で投与し得る。これは、例えば静脈内、血管内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜内(intraepidural)、気管間(intertracheal) くも膜下腔内、脳室内、大脳間(intercerebral)、肺間(interpulmonary)、その他のような、非経口的ルートの注射、及び、鼻、眼、直腸、又は局部投与を含み得る。徐放性投与も本発明に特に含まれ、それには持効性製剤(depot)注射又は浸食性(erodible)移植片のような手段によるものがある。当該タンパク質が胃の中での分解から保護されるという条件で、経口投与も考えられる。
【０１８３】
この発明によるMETRNLの投与は、任意の適切な送達(delivery)手段を使用して達成することができ、当該手段としては以下のものが含まれる:
ポンプ(例えば、Annals of Pharmacotherapy, 27:912(1993);  Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984)を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。)、
マイクロカプセル化(例えば、米国特許4,352,883; 4,353,888; 及び 5,084,350を参照のこと。これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる。)、
持続性放出ポリマー移植片(例えば、Sabelによる米国特許4,883,666を参照のこと。この文献は参照により本明細書に組み入れられる。)、
METRNLを発現するカプセル化細胞(セクションIXを参照のこと)、
METRNLを発現する、裸の又は非カプセル化細胞の、CNSへの移植(例えば、米国特許5,082,670及び5,618,531を参照のこと。これらの文献は各々参照により本明細書に組み入れられる。);
皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、又はその他の適切な部位への、注射;
坐薬;
吸引;及び
カプセル、液体、錠剤、ピル、又は長時間放出(prolonged release)製剤における経口投与。
【０１８４】
投与は、調製物の定期的なボーラス注射によってもよいし、又は、貯蔵源からの静脈内若しくは腹腔内投与という形でより連続的なものにしてもよく、当該貯蔵源は、外部的(例えばIVバッグ)又は内部的(例えば生体侵食性移植片、人工生体器官、METRNL産生細胞の生体適合性カプセル、若しくは移植されたMETRNL産生細胞のコロニー)であり得る。例として、米国特許4,407,957、5,798,113及び5,800,828を参照のこと。これらの文献は各々参照により本明細書に組み入れられる。肺内送達方法及び器具は、例えば、米国特許5,654,007、5,780,014、及び5,814,607に記述されており、これらの文献は各々参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８５】
全身送達の他に、血液脳関門又は血液網膜関門の後ろにあるCNS又は眼への直接的な送達も考慮される。
【０１８６】
局所的な送達は、カテーテルを介した1つ又は複数の動脈(例えば眼につながる眼動脈、及びCNSにつながる大脳動脈)への送達などの手段によるものであり得る。眼への局所的送達は、角膜への局所投与の形でもあり得るし、又は、タンパク質若しくはウイルスベクターの硝子体内への直接的な注射でもあり得る。タンパク質製剤のCNSへの局所的ポンプ送達の方法は、US 6,042,579 (Medtronic)に記述されている。本願のインビボ実験(実施例2A)は、局所的タンパク質送達の一例である(この場合は内耳への送達)。もう一種類の局所的送達は、カプセル化細胞を用いた送達を含む(セクションIXを参照のこと)。さらに別の種類の局所的送達は、遺伝子治療ベクターの局所的送達を含み、これは通常は注射によりなされる。
【０１８７】
眼の障害の治療については、送達は全身的であってもよいし、又は、眼動脈を介したような局所的なものであってもよい。別の実施態様においては、送達はカプセル化細胞治療を介したものであり、そこではカプセル化細胞が硝子体内に移植される。タンパク質製剤又は遺伝子治療ベクターの送達は、網膜下注射、硝子体内注射、又は経強膜(transcleral)注射によって行ってもよい。
【０１８８】
パーキンソン病の治療のためには、様々な送達ルートがとられ得る。ポンプを用いてタンパク質製剤を脳室内(intracerbroventricularly)又は実質組織内(intraparenchymally)に、好ましくは線条体及び/又は黒質に、より好ましくは被殻内に、投与することができる。しかしながら、より好ましい送達方法はカプセル化細胞治療を含み、そこでは、当該カプセルが、脳室内、又は実質組織内、好ましくは線条体及び/又は黒質、より好ましくは被殻に移植される。パーキンソン病の治療に関連した一実施態様においては、遺伝子治療ベクターが脳の線条体に投与される。線条体への注射により、脳の様々な遠隔領域における標的部位(例えば、淡蒼球、扁桃体、視床下核、又は黒質)が標識される。淡蒼球における細胞の形質導入(Transduction)は通常、視床における細胞の逆行的(retrograde)標識化を引き起こす。好ましい一実施態様においては、標的部位(またはその内の一つ)は、黒質である。
【０１８９】
HDを治療する一実施態様においては、ニューロンを変性から保護するために、METRNLが線条体、好ましくは尾状核に、適用され、尾状核ニューロン及び皮質の入力ニューロンの両方の保護をもたらす。好ましい一実施態様においては、当該適用は、主要な変性的変化が開始する前に起こるべきである。当該治療は、家族歴及び血液のDNA解析を通じた疾患の遺伝学的診断、及びそれに続いて、METRNLの局所的適用を含む。これは、医学的に活用できる注入ポンプ及びカテーテル(例えばメドトロニック・シンクロトロン・ポンプ)を用いて当該タンパク質をポンピングすることによりMETRNLを線条体に送達することによって達成される。第2の戦略においては、ウイルス性又は非ウイルス性ベクターを用いた直接的な遺伝子治療を活用して、線条体における宿主細胞又は影響を受ける他のニューロンを改変してMETRNLを分泌させるようにすることができる。第3の戦略においては、METRNLを産生し分泌するように遺伝的に改変された裸の又はカプセル化した細胞を局所的に適用し、血液脳関門の後ろかつ疾患領域に、好ましくは線条体に、さらに好ましくは尾状核に、METRNLを送達することができる。
【０１９０】
神経根裂離、神経根損傷、及び腕神経叢損傷を含む末梢神経損傷の治療のためには、METRNLを、全身的に、くも膜下腔内に、後根侵入帯(dorsal root entryzone)に直接的に、又は影響を受けた皮膚分節(dermatomes)に局所的に、投与し得る。
【０１９１】
ALSにおいては、上位及び下位運動ニューロンの両方が変性し、進行性の麻痺を引き起こし、最終的には(最も一般的には呼吸器の合併症により)死をもたらす。METRNLをコードしたAAVのようなウイルス性ベクターを使用して、皮質の脊髄路(cortical spinal tract)、脊髄小脳路(spinocerebellartract)、又は赤核小脳路(rubral cerebellar tract)に投射する運動皮質の細胞に投与することも考慮される。ALSを治療するためには、METRNLは、腰椎のくも膜下腔内空間への注入を通して、脊髄を含めたCNSに送達され、それにより、脊髄及び脳を浸す脳脊髄液(CSF)と混合される。当該送達は、ポンプ及びカテーテルの移植(例えばメドトロニック・シンクロトロン・ポンプ)により、又は、腰椎のくも膜下腔内空間に移植されたカプセル化細胞装置の使用により、達成することができる。DNAを運ぶベクターをCSFに注射することにより直接的な遺伝子治療を使用し、それにより、CSF空間を縁取る細胞に当該遺伝子を導入することができる。それに加えて、遺伝子導入ベクターを頸椎(cervical)若しくは腰椎(lumbar)の脊髄又は大脳内に注射し、それにより、運動麻痺及び呼吸器機能に関わる運動ニューロンの大部分を含む解剖学的領域においてMETRNLを分泌させることができる。これらの注射は外科的なナビゲーションの下に行われ、比較的安全に実施され得る。
【０１９２】
ADのような神経変性疾患を有する対象においては、神経成長因子(NGF)受容体を有するCh4領域(マイネルト基底核)のニューロンで、正常コントロールと比較して顕著な萎縮が起こる(例えば、Kobayashi, et al., Mol. Chem. Neuropathol., 15: 193-206 (1991)を参照のこと)。
【０１９３】
正常な対象においては、ニューロトロフィンが、発達中における交感神経及び感覚神経の死を防ぎ、成体ラット及び霊長類においてコリン作動性神経の変性を防ぐ(Tuszynski, et al., Gene Therapy, 3 : 305314 (1996))。ADのような神経変性状態の結果として起こる、前脳基底核のこの領域における機能性ニューロンの消失は、それを患う対象が経験する認知機能低下に因果的に関連していると考えられている(Tuszynski, et al., supra;  Lehericy, et al., J. Comp. Neurol.,330: 15-31 (1993))。
【０１９４】
一般的に、METRNLタンパク質製剤を脳室内、又は実質組織内に送達することによりADを治療することができるということが考慮される。実質組織内の範囲中、前脳基底核に、及び海馬に送達がなされることが好ましい。
【０１９５】
遺伝子治療ベクター、METRNLを分泌するカプセル化又は裸の細胞もまた、前脳基底核又は海馬に投与し得る。
【０１９６】
前庭聴覚(vestibuloacoustic)複合体の感覚上皮及び付随の神経節に関わる障害、疾患、又は損傷(音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病を含むがこれらに限定されない)の治療のために、タンパク質、遺伝子治療ベクター、又はMETRNLを分泌するカプセル化若しくは裸の細胞を内耳に投与することも考慮される。これの一例が実施例に記述される(実施例2A)。
【０１９７】
脊髄損傷の治療のためには、ALSの治療について上述したように、タンパク質、遺伝子治療ベクター、又はMETRNLを分泌するカプセル化若しくは裸の細胞を、くも膜下腔経由で損傷部位に送達することができる。
【０１９８】
末梢神経障害の治療については、送達は、全身性(タンパク質製剤を使用)、くも膜下腔内(タンパク質製剤、遺伝子治療ベクター、又はMETRNLを分泌するカプセル化若しくは裸の細胞を使用)、又は、脊髄への逆行性輸送(retrograde transport)に依存した筋肉内への送達である。
【０１９９】
てんかんの治療のためには、METRNLタンパク質を実質組織内経由でてんかん病巣(epilepsy focus)に送達することができる。これは、カプセル化若しくは裸の細胞、カテーテル若しくはポンプで投与されるタンパク質製剤、又は遺伝子治療ベクターを、当該部位に送達することにより行い得る。
【０２００】
脳卒中又は外傷の治療のためには、送達は、くも膜下腔内、脳室内、又は好ましくは損傷部内(intralessionar)への送達とする。
【０２０１】
「医薬的に許容される担体」という用語は、METRNLポリペプチドと組み合わされてその適用を促進する、一つ又は複数の有機又は無機成分を意味し、天然のものでも合成のものでもよい。適切な担体としては、無菌食塩水が含まれるが、医薬的に許容されることが知られる他の水性及び非水性等張無菌液並びに無菌懸濁液も当業者には知られている。「有効量」とは、疾患、変性、又は損傷状態を、改善することができる、又はその進行を遅延することができる量を指す。有効量は個々の場合に応じて決定することができ、部分的には、治療するべき症状及び求められる結果についての考慮に基づく。有効量は、そのような因子を活用する技術分野における当業者が、ルーチン的な実験法を使用するだけで決定することができる。
【０２０２】
リポソーム系は、いかなる種類の単層リポソーム(unilamellar vesicles)、多層リポソーム(multilamellarvesicles)、又は安定複層リポソーム(stable plurilamellar vesicles)でもよく、当業者には周知の方法により調製及び投与することができる(例えば、米国特許5,169,637、4,762,915、5,000,958又は5,185,154の教示による)。それに加えて、この発明の新規ポリペプチド、及びその他の選択されるポリペプチドを、リポソームへの結合を増強するために、リポタンパク質として発現することが望ましいことがあり得る。リコンビナントMETRNLは、例えばCHO細胞から免疫親和性クロマトグラフィー又はその他の任意の簡便な方法により精製され、それからリポソームと混合され、高効率でリポソームに取り込まれる。リポソームで被包されたタンパク質は、細胞の成長を刺激する効果について、インビトロで試験することができる。
【０２０３】
本発明のMETRNLポリペプチドはいずれも、医薬的に許容される塩の形で使用し得る。METRNLポリペプチドと塩を形成することができる適切な酸及び塩基は当業者には周知であり、無機及び有機の酸及び塩基を含む。
【０２０４】
医薬組成物は、活性成分の他にも、適切な成分を含み得る。製剤及び投与のための技術についてのさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton,PA)の最新版において見出すことができる。
【０２０５】
全身性投与のための様々な用量法(dosing regimes)が考慮される。一実施態様においては、METRNLポリペプチドを含む製剤を対象に投与する方法は、対象の体重kgあたり1から30,000 μgの量のMETRNLを1用量として投与することを含む。別の実施態様においては、当該用量は、対象の体重kgあたり10から30,000μgである。さらなる実施態様においては、当該用量は、対象の体重kgあたり10から10,000 μgである。異なる一実施態様においては、当該用量は、対象の体重kgあたり25から10,000 μgである。さらに別の実施態様においては、当該用量は、対象の体重kgあたり25から3,000 μgである。最も好ましい実施態様においては、当該用量は、対象の体重kgあたり50から3,000 μgである。
【０２０６】
特定の投与用量及び方法についての手引きは文献に記述されている。例えば、米国特許4,657,760、5,206,344、又は5,225,212を参照のこと。異なる治療化合物及び異なる障害に対しては異なる剤形が有効であること、例えばある器官や組織を標的にする投与においては、別の器官や組織を標的にする場合とは異なる送達の方法が必要となり得ること、が予測される。
【０２０７】
METRNLポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は障害の治療に適した放出特性を有する製剤において、METRNLポリペプチドの徐放性投与が望まれる場合は、METRNLポリペプチドのマイクロカプセル化が考慮される。徐放性投与のためのリコンビナント・タンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン-(rhIFN-)、インターロイキン2、及びMN rgp120について実施が成功している（Johnson et al., Nat. Med., 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther.,27:1221-1223 (1993); Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland,"Design and Production of Single Immunization Vaccines Using PolylactidePolyglycolide Microsphere Systems," in Vaccine Design: The Subunit andAdjuvant Approach, Powell and Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp.439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及び 米国特許第5,654,010号）。
【０２０８】
これらのタンパク質の徐放性製剤は、ポリ-乳酸-coグリコール酸(PLGA)ポリマーを使用して開発されたが、それは当該ポリマーが生体適合性及び広範な生分解特性を有するためである。PLGAの分解産物、乳酸及びグリコール酸は、ヒトの体内で迅速に除去され得る。さらに、このポリマーの分解は、その分子量及び組成によって数ヶ月から数年の間で調節できる（Lewis, "Controlled release of bioactive agents fromlactide/glycolide polymer," in: M. Chasin and R. Langer (Eds.),Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York,1990), pp. 1-41）。
【０２０９】
投与される用量は、治療される個体の年齢、体重、及び状態、さらには、投与ルート、剤形及び療法、並びに望まれる結果に応じて、注意深く調整しなければならず、正確な用量は医師によって決定されるべきである。
【０２１０】
V. 遺伝子治療のための医薬調製物
本発明における遺伝子治療用METRNL組成物を形成するために、METRNLをコードする発現ウイルス・ベクターを、医薬的に許容される懸濁液、溶液又は乳濁液中に入れることができる。適切な媒体としては、食塩水及びリポソーム調製物が含まれる。
【０２１１】
より具体的には、医薬的に許容される担体としては、無菌であり水性又は非水性である溶液、懸濁液、及び乳濁液が含まれ得る。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルがある。水性の担体としては、水、及びアルコール性/水性の溶液、懸濁液、又は乳濁液が含まれ、食塩水及び緩衝された媒体が含まれる。非経口的な媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖液、ブドウ糖と塩化ナトリウムの液、乳酸リンゲル、又は固定油(fixed oils)が含まれる。
【０２１２】
静脈内媒体としては、体液及び栄養素の補給液(fluid and nutrient replenishers)、電解質補給液(electrolytereplenishers)(例えばリンゲルのブドウ糖液に基づくもの)、及びこれらに類するものが含まれる。
【０２１３】
保存料及びその他の添加物が存在していてもよく、例としては、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス、及びこれらに類するものがある。さらに、METRNLトランスジーンの組成物を、当該技術分野では周知である手段により凍結乾燥し、後で再構成して本発明に従った使用ができるようにしてもよい。
【０２１４】
コロイド性分散系もまた、標的を定めて遺伝子を送達することに使用し得る。コロイド性分散系には、巨大分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、並びに、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質系が含まれる。リポソームは、人工の膜小胞であり、インビトロ及びインビボの送達媒体として有用である。大きな単層リポソーム (LUV)(大きさは0.2-4.0 μmの範囲に渡る)は、大きな巨大分子を含んだ水性緩衝液のかなりのパーセンテージを被包できることが示されている。水性の内部に、RNA、DNA及びウイルス粒子まるごとを封入し、生物学的な活性を有する形で細胞に送達することができる(Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6: 77,1981)。リポソームは、哺乳類細胞の他にも、発現可能なようにコードされたトランスジーンを植物、酵母、及び細菌細胞に送達することに使われてきた。リポソームが効率的な遺伝子導入媒体であるためには、以下の特性を有するべきである:(1)METRNLをコードする遺伝子を、生物学的活性を犠牲にすることなく高効率で封入できること;(2)非標的細胞と比較して、標的細胞に選択的かつ実質的に結合すること;(3)当該小胞中の水性内容物を、標的細胞の細胞質に高効率で送達できること;及び(4)遺伝情報を正確かつ効果的に発現できること(Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682,1988)。
【０２１５】
リポソームの組成は、通常は、リン脂質、特に相転移温度が高いリン脂質の組み合わせによるものであり、通常はステロイド、特にコレステロールと組み合わせられたものである。他のリン脂質又は他の脂質も使用し得る。リポソームの物理的特性は、pH、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
【０２１６】
リポソームの製造において有用な脂質としては、ホスファチジル化合物、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドが含まれる。特に有用なのは、ジアシルホスファチジルグリセロールであり、ここで、脂質部分は14から18個の炭素原子、特に16から18個の炭素原子を含み、 飽和している。代表的なリン脂質としては、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
【０２１７】
リポソームの標的は、解剖学的及び機構的要素に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベルに基づき、例えば器官特異的なもの、細胞特異的なもの、及びオルガネラ特異的なものがある。機構的な標的化の分類では、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別される。受動的な標的化は、類洞毛細血管(sinusoidal capillaries)を含む器官において細網内皮系(RES)の細胞に分配されるという、リポソームの自然な傾向を利用するものである。
【０２１８】
一方で、能動的な標的化は、リポソームを特異的なリガンド(例えばモノクローナル抗体、糖類、糖脂質、又はタンパク質)に結合させること、又は、リポソームの組成や大きさを変えることによって、リポソームを改変し、自然に起こる局在化の部位とは異なる器官及び細胞型への標的化を達成することに関わる。
【０２１９】
標的化された遺伝子送達系の表面は、様々な形で改変することができる。リポソームの標的化送達系の場合は、標的化用リガンドがリポソーム二重膜に安定して保持されるように、当該リポソームの脂質二重膜に脂質基を組み入れることができる。当該脂質鎖を当該標的化用リガンドにリンクさせるために、様々な連結基を使用し得る。
【０２２０】
送達系のさらなる例としては、本発明で記述されるように、ベクター粒子を産生することができるパッケージング細胞の組成物を、治療部位に移植することが含まれる。そのような細胞をカプセル化し移植する方法は当該技術分野において知られており、特にWO 97/44065 (Cytotherapeutics)に見出される。レンチウイルスの粒子を産生することができるパッケージング細胞株を選択することにより、治療部位の非分裂性細胞への形質導入が達成される。分裂性細胞のみに形質導入できるレトロウイルスを使用することにより、治療部位において新たに分化した細胞に形質導入が限定される。
【０２２１】
VI. 遺伝子治療についての投薬要件及び送達プロトコール
一つの重要なパラメータは、標的組織に送達されるMETRNL遺伝子治療ベクターの用量である。ウイルス・ベクターについては、当該濃度は、mlあたりの形質導入ユニットの数により定義され得る。ウイルス発現ベクターを使用した送達において、最適には、各ユニット用量は2.5から25 μLの組成物を含み、ここで、当該組成物は、医薬的に許容される液中のウイルス発現ベクターを含み、mlあたり108から1010までのMETRNL形質導入ユニットを提供する。
【０２２２】
重要なことに、インビボにおける具体的な遺伝子送達部部位は、神経細胞、グリア細胞、網膜細胞、又は幹細胞の欠失、損傷、又は機能障害がある領域にクラスター化(cluster)するように選ばれる。そのような領域は、磁気共鳴画像法(MRI)及びバイオプシーを含む多くの既知技術を用いて臨床的に見出すことができる。ヒトにおいては、MRIのような非侵襲性のインビボ画像化法が好ましい。神経欠失の領域が見出されたら、定位的分布(stereotaxic distribution)のための送達部位を選択し、METRNLの各ユニット用量が脳内の一標的細胞に(又は該細胞から500 μm以内の位置に)送達され、かつ他の送達部位から約10 mm以内の位置に送達されるようにする。
【０２２３】
所与の標的部位内で、当該ベクター系が標的細胞に形質導入できる。当該標的細胞は、神経組織に見られる細胞、例えばニューロン、星状膠細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア、幹細胞、神経前駆体細胞、又は上衣細胞であり得る。
【０２２４】
ベクター系は好ましくは直接的な注射により投与される。脳への注射の方法は、当該技術分野においては周知である(Bilang-Bleuel et al (1997) Proc. Acad. Nati. Sci. USA 94:8818-8823;Choi-Lundberg et al (1998) Exp. Neurol.154:261-275; Choi-Lundberg et al (1997)Science 275:838-841; 及び Mandel et al (1997) ) Proc.Acad. Natl. Sci. USA 94:14083-14088)。定位的な注射を施すことができる。
【０２２５】
上述したように、脳のような組織において形質導入するためには、非常に小さな体積を使用する必要があり、従ってウイルス調製物は超遠心によって濃縮する。結果として得られる調製物は、少なくとも108 TU/ml、好ましくは108 から 1010 TU/ml、より好ましくは少なくとも109TU./mlの濃度を有するべきである。(タイターを、mlあたりの形質導入ユニット(TU./ml)として表す。)注射部位の数を増やし、注射の速度(rate)を減らすことにより、トランスジーンの発現の分散を改善できることが見出されている(Horellou and Mallet (1997)上記と同じ)。普通は1から10個の注射部位が用いられ、より一般的には2から6個である。一用量が1-5×109 TU./mlを含む場合には、注射の速度は一般的には0.1から10 μl/min、通常は約1 μl/minである。
【０２２６】
ウイルス組成物は、微量注入、注入、スクレイプ・ローディング(scrape loading)、エレクトロポレーション、又は外科的切開を通じて送達部位組織に直接的に組成物を送達することに適したその他の手段により、標的組織中の各送達細胞部位に送達される。当該送達は、例えば5から10分に渡る時間をかけて、ゆっくりと達成される(送達されるべきウイルス組成物の総体積に依存する)。
【０２２７】
VII. ウイルス・ベクター
大まかに言って、遺伝子治療は、新たな遺伝物質を患者の細胞に導入して当該患者に治療的な利益をもたらすことを目指す。そのような利益は、広範な疾患、障害、及びその他の状態を、治療又は予防することを含む。
【０２２８】
エクスビボ遺伝子治療のアプローチは、単離された細胞(幹細胞、神経及びグリア前駆体細胞、並びに胎児性(foetal)幹細胞を含むがこれらに限定されない)に係るものであり、これらはその後注入、移植、又はその他の方法で患者に導入される。例えば米国特許4,868,116、5,399,346 及び 5,460,959を参照のこと。インビボ遺伝子治療は、宿主である患者の組織を直接標的とすることを目指す。
【０２２９】
遺伝子導入ベクターとして有用なウイルスとしては、パポーバウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレトロウイルスが含まれる。適切なレトロウイルスには、HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLVからなる群が含まれる。適切なレトロウイルスのさらなる群は、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIVからなる群を含む。好ましいウイルス・ベクターのもう一つの群は、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシパピロマウイルス、Mo-MLVからなる群を含み、好ましくはアデノ随伴ウイルスである。
【０２３０】
神経系の障害の治療において好ましいウイルスは、レンチウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。これらの種類のウイルスは両方とも、細胞分裂がなくともゲノムに挿入することができ、どちらの種類も、神経系(特に中枢神経系)の適応についての前臨床的動物試験において試験されてきた。
【０２３１】
AAVの調製の方法は当該技術分野において記述されている(例えば、US 5,677,158)。US6,309,634 及び US 6,683,058は、中枢神経系へのAAVの送達の例を記述している。
【０２３２】
好ましくは、レンチウイルス・ベクターは複製欠損型のレンチウイルス粒子である。そのようなレンチウイルス粒子は、5'レンチウイルスLTR、tRNA結合部位、パッケージング・シグナル、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド・シグナルが発現されるように連結されたプロモーター、DNA第二鎖合成のオリジン、及び3'レンチウイルスLTRを含むレンチウイルス・ベクターから産生され得る。レンチウイルスの調製方法及び神経細胞へのインビボ投与の方法は、US 20020037281(レンチウイルス・ベクターを用いた神経細胞への形質導入法)に記述されている。
【０２３３】
レトロウイルス・ベクターは、7から8 kbを運搬でき、高効率で宿主細胞に感染し遺伝物質を安定的に挿入する能力を有することから、ヒトの臨床試験において最も一般的に使用されるベクターである。例えば WO 95/30761; WO 95/24929を参照のこと。オンコウイルスは、外来性の核酸配列を患者に導入し挿入するために、標的細胞が少なくとも1回分裂することを必要とする。レトロウイルス・ベクターは患者のゲノムにランダムに挿入する。レトロウイルスは、神経系の幹細胞を標的とする場合に使用できるが、これは、神経系(特にCNS)の他の細胞においてはほとんど細胞分裂が起こらないからである。
【０２３４】
3種類のレトロウイルス粒子が記述されている。エコトロピック(ecotropic)のものはマウス細胞に効率良く感染することができ、アンホトロピック(amphotropic)のものは多くの種の細胞に感染することができる。第三の種類は、ゼノトロピックのレトロウイルスを含み、これは、それを産生した種とは別の種に、より感染することができる。分裂する細胞のゲノムにのみ挿入できるという能力により、発生学的研究で細胞の系譜(lineages)をマーキングしたり、治療的又は自殺的遺伝子を癌や腫瘍に送達したりすることにおいて、レトロウイルスは魅力的なものとなる。
【０２３５】
ヒトの患者で使用するためには、レトロウイルス・ベクターは複製欠損型でなければならない。これにより、標的組織においてさらに次世代の感染性レトロウイルス粒子が生じることが防止される。複製欠損型ベクターは、その代わりに、標的細胞のゲノムに安定的に組み入れられた「捕われた(captive)」トランスジーンとなる。複製欠損型ベクターにおいては、典型的には、gag、env、及びpol遺伝子が(ウイルス・ゲノムの残りの大部分と共に)除去されている。削除されたウイルス遺伝子の代わりに、異種性(Heterologous)のDNAが挿入される。当該異種性遺伝子はそれに内在的な異種性プロモーターの制御下にあってもよいし、標的細胞において活性を有する別の異種性プロモーター、又は当該レトロウイルスの5' LTRの制御下に置かれてもよい(ウイルスLTR は多様な組織において活性を有する)。典型的には、レトロウイルス・ベクターは約7-8 kbのトランスジーンを収容できる。
【０２３６】
複製欠損型レトロウイルス・ベクターは、複製及びアセンブリーに必要なウイルス・タンパク質を別の所から(in trans)(例えば操作されたパッケージング細胞株から)提供されることを必要とする。重要なのは、パッケージング細胞が複製能のあるウイルス及び/又はヘルパー・ウイルスを放出しないことである。これは、ψシグナルを欠くRNAからウイルス・タンパク質を発現し、gag/pol遺伝子及びenv遺伝子を別個の転写ユニットから発現することにより、達成されてきた。さらに、第二、第三世代のレトロウイルスの中には、5' LTRがこれらの遺伝子の発現を制御する非ウイルス・プロモーターにより置き換えられ、3'プロモーターは最小限化されて近位(proximal)プロモーターのみを含むようにされたものもある。これらのデザインにより、複製能を有するベクター又はヘルパー・ウイルスの産生をもたらすような組換えが起こる可能性を最小限にとどめる。
【０２３７】
VIII. 発現ベクター
本発明に使用するMETRNLポリペプチドのリコンビナント発現のためのベクターの構築は、当業者には詳細に説明する必要の無い従来技術を使用して達成することができる。しかしながら、レビューが必要ならば、当業者はManiatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory, (NY 1982)を参照し得る。医学的用途でMETRNLポリペプチドをリコンビナント産生するための産生細胞を作ること、及び、裸細胞の又はカプセル化治療法のためのMETRNLポリペプチドを分泌する治療用細胞を作ることに、発現ベクターは使用され得る。
【０２３８】
手短に言えば、リコンビナント発現ベクターの構築は標準的なライゲーション技術を利用する。構築されたベクターにおいて配列が正しいことを確認するための解析においては、例えばMessing, et al., (Nucleic Acids Res., 9: 309-, 1981)の方法、Maxam, et al., (Methods in Enzymology, 65: 499, 1980)の方法、又は当業者に知られる他の適切な方法を用いて、遺伝子の配列決定を行う。
【０２３９】
切断された断片のサイズに基づく分離は、例えばManiatis, et al., (Molecular Cloning, pp. 133-134,1982)に記述された従来型のゲル電気泳動を用いて行われる。
【０２４０】
効率的な発現ベクターを作るためには、コードされた遺伝子が正しい読み枠で発現されるために必要な制御配列を含ませるべきである。遺伝子の発現は、転写、翻訳、又は翻訳後のレベルにおいて制御される。転写開始は、遺伝子発現の初期における決定的に重要なイベントである。これはプロモーター及びエンハンサー配列に依存し、これらの配列と相互作用する特定の細胞因子により影響される。多くの遺伝子の転写ユニットは、プロモーター、及び場合によってはエンハンサー又は制御エレメントから成る(Banerji et al. 1981, Cell 27: 299; Corden et al. 1980, Science 209:1406; 及び Breathnach and Chambon 1981, Ann. Rev.Biochem. 50: 349)。レトロウイルスにおいては、レトロウイルス・ゲノムの複製に関わるコントロール・エレメントが末端反復配列(LTR)中に存在する(Weiss et al., eds., Themolecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring HarborLaboratory, (NY 1982))。モロニーマウス白血病ウイルス(MLV)及びラウス肉腫ウイルス(RSV)のLTRはプロモーター及びエンハンサー配列を含む(Jolly et al. 1983, Nucleic Acids Res. 11: 1855; Capecchi et al., In: Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman and Shenk, eds., pp.101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991)。他の強力なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)由来のもの、及びその他の野生型ウイルス・プロモーターが含まれる。
【０２４１】
多くの非ウイルス・プロモーターのプロモーター及びエンハンサー領域も記述されている(Schmidt et al. 1985, Nature 314: 285 ; Rossi and deCrombrugghe 1987,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5590-5594)。静止状態(quiescent)の細胞においてトランスジーンの発現を維持し増加させるための方法としては、I型コラーゲン(1及び2) のプロモーター(Prockop and Kivirikko, 1984 N. Eng. J. Med. 311: 376 ; Smith and Niles 1980, Biochem. 19: 1820; de Wet et al. 1983, J. Biol. Chem., 258: 14385)、SV40プロモーター、及びLTRプロモーターの使用が含まれる。
【０２４２】
本発明の一実施態様によれば、プロモーターは以下のものからなる群から選択される恒常的プロモーターである:ユビキチン・プロモーター、CMVプロモーター、JeTプロモーター(US 6,555,674)、SV40プロモーター、ニワトリのベータ・アクチン・プロモーター、伸長因子1アルファ・プロモーター(EF1-アルファ)、RSV、Mo-MLV-LTR。誘導可能/抑圧可能プロモーターの例としては、以下のものが含まれる:Tet-On、Tet-Off、ラパマイシン誘導性プロモーター、Mx1。
【０２４３】
好ましいプロモーターの群は、ニワトリのベータ・アクチン・プロモーター、CMV、ヒトUbiC、JeT、RSV、Tet制御性プロモーター、Mo-MLV-LTR、Mx1、及びEF-1アルファを含む。
【０２４４】
トランスジーンの発現を駆動するためにウイルス及び非ウイルス・プロモーターを使用することに加え、トランスジーン発現のレベルを増加させるためにエンハンサー配列を使用し得る。エンハンサーは、天然の遺伝子だけでなく外来性の遺伝子の転写活性をも増加させることができる(Armelor 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 : 2702)。例えば、本発明において、トランスジーンの発現を増加させるために、コラーゲン・エンハンサー配列をコラーゲン・プロモーター2 (I)と共に使用し得る。さらに、SV40ウイルスに見出されるエンハンサー・エレメントを、トランスジーン発現の増加のために使用し得る。このエンハンサー配列はGruss et al. 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 943; Benoist andChambon 1981, Nature 290: 304, 及びFromm and Berg 1982,J. Mol. Appl. Genetics, 1 : 457により記述されているように72ベースペアー反復により構成されており、これらの文献の全てが参照により本明細書に組み入れられる。この反復配列は、連続して(in series)様々なプロモーターと共に存在すれば、多くの異なるウイルス遺伝子及び細胞遺伝子の転写を増加させることができる(Moreau et al. 1981, Nucleic Acids Res. 9 : 6047)。
【０２４５】
発現を増進する他の配列としては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント、WPRE、SP163、CMVエンハンサー、及びニワトリのベータ・グロビン・インシュレーター又はその他のインシュレーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４６】
サイトカインを用いてプロモーター活性を調節してトランスジーンの発現を増加させ、長期間安定な発現を得ることもできる。コラーゲン2 (I)及びLTRプロモーターからのトランスジーンの発現を調節するいくつかのサイトカインが報告されている(Chua et al., connective Tissue Res., 25: 161-170 (1990); Elias etal., Annals N. Y. Acad. Sci., 580 : 233-244 (1990)); Seliger et al., J.Immunol. 141: 2138-2144 (1988) 及び Seliger et al., J.Virology 62: 619-621 (1988))。例えば、形質転換成長因子 (TGF)、インターロイキン(IL)-l、及びインターフェロン(INF)は、LTRのような様々なプロモーターにより駆動されるトランスジーンの発現を下方制御する。腫瘍壊死因子(TNF)及びTGF 1は、プロモーターにより駆動されるトランスジーン発現を上方制御し、それをコントロールするために使用し得る。有用となり得る他のサイトカインとしては、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)及び上皮成長因子(EGF)が含まれる。
【０２４７】
コラーゲン・エンハンサー配列を伴ったコラーゲン・プロモーター(Coll (E))は、処置される脳において(その免疫保護状態に関わらず)起こり得るベクターに対する免疫応答をさらに抑制することによりトランスジーン発現を増加させることにも使用し得る。さらに、抗炎症剤(ステロイド、例えばデキサメタゾンを含む)を、ベクター組成物の送達の直後に、処置された宿主に投与し、好ましくはサイトカイン媒介性炎症反応が鎮静するまで継続させることができる。シクロスポリンのような免疫抑制剤を投与して、インターフェロンの産生を減少させることもできる(インターフェロンはLTRプロモーター及びColl (E)プロモーター‐エンハンサーを下方制御しトランスジーンの発現を低下させる)。
【０２４８】
当該ベクターは、例えばCreリコンビナーゼをコードする配列やLoxP配列のような追加の配列を含み得る。METRNLが一時的に発現することを確実にするさらなる方法は、Cre-LoxP系の使用を介したものであり、これによれば、Creリコンビナーゼを細胞に投与することにより(Daewoong et al,Nature Biotechnology 19:929-933)、又は当該リコンビナーゼをコードする遺伝子をウイルス・コンストラクトに組み入れることにより(Pluck, Int J Exp Path, 77:269-278)、挿入されたDNA配列の一部が切除されるという結果がもたらされる。リコンビナーゼの遺伝子を、LoxP部位及び構造遺伝子(今の例ではMETRNL)と共にウイルス・コンストラクトに組み入れると、多くの場合、当該構造遺伝子が約5日間発現される結果となる。
【０２４９】
IX. 生体適合性カプセル
カプセル化細胞治療法は、宿主への移植に先立って細胞を半透性の生体適合性材料で取り囲むことにより、レシピエント宿主の免疫系から当該細胞を隔離するという概念に基づく。本発明は、METRNLを発現及び分泌することができる細胞が免疫隔離性カプセル中に被包されている装置を含む。「免疫隔離性カプセル」とは、レシピエント宿主への移植に際して、当該装置の中心部にある細胞に対する宿主免疫系の有害作用がカプセルにより最小限化されることを意味する。細胞は、微多孔性の膜で形成された移植可能なポリマー・カプセルの中に封入されることにより、宿主から免疫的に隔離される。このアプローチにより、宿主と移植組織との間の細胞対細胞接触が防がれ、直接提示を通した抗原認識が排除される。使用される膜は、例えば抗体と補体(complement)のような分子の拡散を分子量に基づいてコントロールするように仕立ててもよい(Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 TrendsBiotechnol. 158 (1996))。カプセル化技術を使用することにより、免疫抑制剤の使用の有無に関わらず、免疫拒絶反応を受けることなく細胞を宿主に移植することができる。有用な生体適合性ポリマー・カプセルは、通常、細胞(液状媒体に懸濁されるか、又は固定化マトリックスに固定化される)を含む中心部、及び、隔離細胞を含まず、生体適合性を有し、かつ、有害な免疫的攻撃から中心部の細胞を保護するのに十分な、透過選択性マトリックス又は膜(「ジャケット」)の周囲(surrounding)又は周辺(peripheral)領域を含む。カプセル化により、免疫系の成分がカプセル内に入ることが阻止され、それによって、カプセル化された細胞を免疫的破壊から守る。当該カプセル膜の半透性の性質により、目的の生物学的活性分子が、カプセルから周囲の宿主組織へと容易に拡散することができる。
【０２５０】
当該カプセルは生体適合性材料から作ることができる。「生体適合性材料」とは、宿主に移植された後、当該カプセルの拒絶という結果をもたらしたり、例えば分解を通して当該カプセルを機能不可能にしたりするほどの、有害な宿主反応を誘発しない材料である。当該生体適合性材料は、大きな分子、例えば宿主の免疫系の成分に対しては比較的不透過性であるが、小さな分子、例えばインスリン、METRNLポリペプチドのような成長因子、及び栄養分に対しては透過性であり、代謝廃棄物の除去も許容される。様々な生体適合性材料が、本発明の組成物による成長因子の送達に適している。生体適合性材料は数多く知られており、それらは様々な外表面形状やその他の力学的及び構造的特性を有する。好ましくは、本発明のカプセルは、WO 92/19195若しくはWO 95/05452に記述されたもの、又は米国特許5,639,275; 5,653,975; 4,892,538; 5,156,844; 5,283,187; 若しくはU.S. Pat. No. 5,550,050に記述されたものに類似したものである(これらの文献は参照により組み入れられる)。そのようなカプセルは、代謝物、栄養素、及び治療用物質の透過を許しながら、宿主免疫系による有害作用を最小限にとどめる。当該生体適合性材料の成分としては、囲い込みの半透性膜、及び、内部で細胞を支持するスキャフォールドが含まれ得る。好ましくは、遺伝的に改変された細胞が当該スキャフォールド上に植えつけられ、それが透過選択性膜により被包される。繊維状の細胞支持スキャフォールドは、以下のものからなる群から選択される任意の生体適合性材料から作られ得る:アクリル、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン ポリアセトニトリル、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリアミド、ポリウレタン、ポリブトエステル(polybutester)、絹、綿、キチン、カーボン、又は生体適合性金属。また、接着された繊維構造(bonded fiber structures)も細胞移植に使用できる(米国特許5,512,600(この文献は引用によりここに組み入れられる))。生分解性のポリマーとしては、ポリ(乳酸)PLA、ポリ(乳酸-coグリコール酸)PLGA、及びポリ(グリコール酸)PGA、及びこれらと同等なものが含まれる。移植される細胞が付着できる表面を提供するものとして、泡状(Foam)スキャフォールドが使用されてきた(WO 98/05304(この文献は引用によりここに組み入れられる))。織られたメッシュのチューブが血管グラフトとして使用されてきた(WO99/52573(この文献は引用によりここに組み入れられる))。さらに、中心部は、細胞の位置を安定化させるハイドロゲルにより形成された固定化マトリックスで構成されていてもよい。ハイドロゲルは、クロスリンクされた親水性ポリマーの三次元的ネットワークであってゲル状であり、大部分は水から構成されている。
【０２５１】
囲い込み(surrounding)半透性膜を製造するために様々なポリマーやポリマー混合物を使用することができ、それらは、ポリアクリレート(アクリルコポリマーを含む)、ポリビニリデン、ポリ塩化ビニル・コポリマー、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリアミド、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリスルホン(ポリエーテルスルホンを含む)、ポリホスファゼン(polyphosphazenes)、ポリアクリロニトリル、ポリ(アクリロニトリル/コ塩化ビニル)、並びにこれらの誘導体、コポリマー、及び混合物を含む。好ましくは、囲い込み半透性膜は、生体適合性かつ半透性の中空(hollow)繊維膜である。そのような膜、及びそれらを作る方法は、米国特許5,284,761及び 5,158,881に開示されており、これらの文献は参照によりここに組み入れられる。囲い込み半透性膜は、例えば米国特許4,976,859 又は米国特許 4,968,733に記述されるような(これらの文献は参照によりここに組み入れられる)、ポリエーテルスルホン中空繊維から形成され得る。代用できるもう一つの囲い込み半透性膜材料は、ポリ(アクリロニトリル/コ塩化ビニル)である。
【０２５２】
当該カプセルは、当該産物又は機能の生物学的活性を保持し、送達のためのアクセス手段を提供する上で適切なものであればいかなる立体構造でもよく、例えば、円柱状、四角形、円盤形、パッチ形、卵形、星形、又は球状のものが含まれる。さらに、当該カプセルは、メッシュ様又は入れ子(nested)構造の中に巻きつかれたり(coiled)包まれたりしていてもよい。もし当該カプセルを移植後に回収するつもりあれば、移植部位から移動する傾向を有する立体構造(例えばレシピエント宿主の血管中を移動してしまうほど小さな球状カプセル)は好ましくない。四角形、パッチ、円盤、円筒、及び平らなシートのような特定の形状は、よりよい構造的な安定性(structural integrity)を提供するため、回収が望まれる場合には好ましい。
【０２５３】
マクロカプセルが使用される場合は、103から108の細胞を被包することが好ましく、最も好ましくは、装置あたり105から107の細胞が被包される。用量は、より少ない、又はより多い数のカプセルを移植することにより調節でき、好ましくは患者あたり1から10個のカプセルが移植される。
【０２５４】
スキャフォールドは細胞外マトリックス(ECM)分子でコーティングしてもよい。細胞外マトリックス分子の好適な例としては、例えば、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンが含まれる。スキャフォールドの表面はまた、細胞付着を強化するため、プラズマ照射処理により電荷を付与することで改変し得る。
【０２５５】
カプセルを封着するにはいずれの適切な方法を用いてもよく、それはポリマー接着剤の使用、又は、圧着、結びつけ、及び熱封着を含み得る。それらに加えて、例えば米国特許 5,653,687(参照によりここに組み入れられる)に記述されているような、適切な「ドライ」封着法を使用してもよい。
【０２５６】
カプセル化細胞装置は、既知の技術により移植される。この発明の装置及び方法においては、数多くの移植部位が考慮される。これらの移植部位としては、脳、脊髄を含む中枢神経系(米国特許5,106,627、5,156,844、及び5,554,148を参照のこと。これらの文献は参照によりここに組み入れられる)、並びに、眼の房水及び硝子体(WO 97/34586を参照のこと。この文献は参照によりここに組み入れられる)が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５７】
CNSにカプセルを移植するための方法及び器具はUS 5,487,739に記述されている。眼にカプセルを移植するための方法及び器具はUS5,904,144、US 6,299,895、US6,439,427、及びUS 20030031700に記述されている。
【０２５８】
本発明は一態様において、以下のものを含む生体適合性カプセルに関わる:標的細胞を感染させるためのウイルス・ベクターを分泌する生きたパッケージング細胞を含む中心部(ここで、当該ウイルス・ベクターは本発明によるベクターである);及び、前記中心部を囲い込む外部ジャケット(ここで、前記ジャケットは透過性の生体適合性材料を含み、前記材料は直径約100 nmのレトロウイルス・ベクターの透過を許容させるために選択される多孔性(porosity)を有し、前記カプセルからの前記ウイルス・ベクターの放出を可能にする)。
【０２５９】
好ましくは、当該中心部はさらにマトリックスを含み、当該パッケージング細胞は当該マトリックスにより固定されている。一実施態様によれば、当該ジャケットはハイドロゲル又は熱可塑性材料を含む。
【０２６０】
パッケージング細胞株として適切な細胞の例としては、HEK293、NIH3T3、PG13、及びARPE-19細胞が含まれる。好ましい細胞としてはPG13及び3T3細胞が含まれる。
【０２６１】
パッケージング細胞株は、US 6,027,721 及び WO 97/01357に開示されている方法及び組成物を使用してカプセル化及び投与することができる。これらの文献の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６２】
X. METRNL産生細胞のための支持マトリックス
本発明はさらに、哺乳類神経系への移植に先立って、METRNL産生細胞を支持マトリックス上でインビトロで培養することを含む。移植に先立って、細胞をマイクロキャリア(microcarriers)に事前に付着させることは、移植される細胞の長期的な生存を強化させ、長期的な機能的利益を提供させるためのデザインである。
【０２６３】
移植される細胞(即ち、移植されるMETRNL分泌性細胞)の長期的な生存を増加させるために、移植に先立って当該細胞をインビトロで支持マトリックスに付着させることができる。当該支持マトリックスを構成し得る材料としては、インビトロのインキュベーション後に細胞が付着し、そこで細胞が増殖でき、毒性反応又は炎症反応を生じることなく哺乳類の身体に移植できる素材が含まれる(これらの反応は移植細胞を破壊したり、そうでなくとも生物学的又は治療的活性を妨害したりする)。そのような材料は、合成又は天然化学物質であってもよく、又は生物に由来する物質であってもよい。
【０２６４】
当該マトリックス材料としては以下のものが含まれるがこれらに限定されない:ガラス及びその他のシリコン酸化物、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリウレタン、ポリアルギネート、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、アクリロニトリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリカーボネート、ポリペンテン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾ゼラチン、天然及びコードされた(codified)コラーゲン、天然及び修飾多糖類(デキストラン及びセルロース、例えばニトロセルロースを含む)、寒天、並びにマグネタイト。吸収性の、又は非吸収性の材料を使用し得る。当該技術分野では周知の細胞外マトリックス素材も意図される。細胞外マトリックス素材は市販のものを得ることもできるし、又は、そのようなマトリックスを分泌する細胞を増殖させ、当該分泌性細胞を除去し、移植する予定の細胞を当該マトリックスに接触させ付着させることにより調製することもできる。移植される予定の細胞がその上で増殖するような、又は移植される予定の細胞と混合されて使われるような、マトリックス材料は、RPE細胞に固有(indigenous)の産物であり得る。よって、例えば、当該マトリックス材料は、移植されるRPE細胞により産生され分泌される細胞外マトリックス又は基底膜素材であり得る。
【０２６５】
細胞の接着、生存、及び機能を改善させるためには、任意で、細胞の接着、成長、又は生存を促進させることが当該技術分野において知られる因子で固形マトリックスの外表面をコーティングし得る。そのような因子としては、細胞接着分子、細胞外マトリックス、例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカン、若しくはプロテオグリカン、又は成長因子が含まれる。
【０２６６】
あるいは、移植される細胞が付着する固形マトリックスがもし多孔性素材で構成されているならば、成長又は生存促進因子(複数可)を当該マトリックス素材に組み入れてもよく、その場合、当該因子はインビボでの移植後にゆっくりと放出されることになる。
【０２６７】
本発明に従って支持体に付着される場合、移植に使用する細胞は通常は支持体の「外表面」に位置する。当該支持体は中実でも多孔性でもあり得る。しかしながら、たとえ多孔性の支持体であっても、細胞は膜その他の障壁に妨げられることなく外部環境と直接的に接触している。従って、本発明においては、細胞が付着する多孔性支持体材料の表面が、たとえ内部に折れ込んだり入り組んだりした形であって粒子又はビーズそのものの外側になかったとしても、当該細胞は支持体の「外表面」にあると考える。
【０２６８】
当該支持体の立体構造は好ましくはビーズのように球状であるが、円筒形、楕円形、平らなシートやストリップ、ニードル型又はピン型、その他これらに類するものでもあり得る。支持マトリックスの一つの好ましい形態は、ガラスビーズである。もう一つの好ましいビーズはポリスチレンビーズである。
【０２６９】
ビーズのサイズは直径約10μm から 1 mmの範囲であり得、好ましくは約90 μmから約150 μmである。様々なマイクロキャリア・ビーズの記述に関しては、例えば、isherBiotech Source 87-88, Fisher Scientific Co., 1987, pp. 72-75; Sigma CellCulture Catalog, Sigma Chemical Co., St, Louis, 1991, pp. 162-163; VentrexProduct Catalog, Ventrex Laboratories, 1989を参照のこと(これらの引用文献は参照により本明細書に組み入れられる)。ビーズのサイズの上限は、ビーズが望ましくない宿主反応を刺激することにより決定付けられ、そのような反応は、移植された細胞の機能に干渉したり、周囲の組織の損傷を引き起こしたりし得る。ビーズのサイズの上限は、投与の方法によっても決定付けられ得る。そのような制限は、当業者ならば容易に決めることができる。
【０２７０】
XI. 宿主細胞
本発明は一態様において、本発明によるベクターで遺伝子改変された、単離宿主細胞に関する。
【０２７１】
本発明の一実施態様によれば、宿主細胞は、リコンビナント・タンパク質を大量に生成することができ工業的な規模に容易にスケールアップできる、大腸菌のような原核生物細胞である。原核生物の産生細胞を使用する場合は、生物学的に活性を有するタンパク質を得るために、METRNLを再フォールディング(refolding)しグリコシル化する必要があり得る。別の実施態様においては、宿主細胞は、非哺乳類真核生物由来の産生細胞であり、それは酵母(サッカロマイセス・セレビシエSaccharomyces cerevisiae)、アスペルギルスのような糸状菌、Sf9のような昆虫細胞、等の既知の産生細胞を含むがこれらに限定されない。
【０２７２】
別の実施態様によれば、当該細胞は、コードされたMETRNLを正しく分泌しプロセスする能力を有するという理由から、哺乳類宿主細胞であることが好ましい。好ましい種は、ヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、マウス(murine)、ラット、ウサギ、マウス(mouse)、及びハムスターからなる群を含む。
【０２７３】
本発明のベクターで形質導入又はトランスフェクションするのに好適であり得る初代培養及び細胞株の例としては、CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、神経細胞、胎児性細胞、ARPE-19、C2C12、MDX12、HeLa、HepG2、線条体細胞、ニューロン、星状膠細胞、及び介在ニューロンからなる群が含まれる。哺乳類リコンビナント産生において好ましい細胞株としては、CHO、CHO-1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、及びBHK細胞が含まれる。
【０２７４】
エクスビボ遺伝子治療においては、好ましい細胞の群として、神経細胞、神経前駆体(precursor)細胞、神経前駆(progenitor )細胞、幹細胞、及び胎児性細胞が含まれる。
【０２７５】
本発明はまた、裸の又はカプセル化された細胞を介したMETRNLの生物学的送達(biodelivery)に適した細胞にも関わり、当該細胞は、METRNLを過剰発現するように遺伝子改変され、生物学的に活性を有するMETRNLポリペプチドを局所的に送達するために患者に移植することができる。そのような細胞は大まかに治療用細胞と呼ばれ得る。
【０２７６】
本発明の好ましい一実施態様においては、治療用細胞株は、異種性の不死化遺伝子の挿入により不死化されてはいない。本発明は細胞移植に特に適した(裸の、又は好ましくはカプセル化された)細胞に関わり、そのように不死化された細胞株は人体の内部で制御されない状態で増殖を始め腫瘍を形成する可能性を有するという固有の危険性があるため、好ましくない。
【０２７７】
好ましくは、当該細胞株は接触阻止性の細胞株である。接触阻止性の細胞株とは、二次元平面で培養したときに互いに密着するまで(to confluency)増殖し、それから実質的に分裂を停止する細胞株のことを意図する。これは、限られた数の細胞が当該二次元層から逸脱するという可能性を排除するものではない。接触阻止性の細胞株は三次元の中、例えばカプセルの内部でも成長し得る。カプセルの内部にあっても、当該細胞は互いに密着するまで成長し、それから増殖率を大きく落とすか、又は完全に分裂を停止する。特に好ましい種類の細胞としては、本質的に接触阻止性であり培養中に安定した単細胞層を形成する上皮細胞が含まれる。
【０２７８】
さらに好ましいのは網膜色素上皮細胞(RPE細胞)である。RPE細胞の供給源は、哺乳類網膜からの初代細胞単離物である。RPE細胞を収穫するためのプロトコールはよく確立されており(Li and Turner,1988, Exp. Eye Res. 47:911-917; Lopez et al., 1989, Invest. Ophthalmol. Vis.Sci. 30:586-588)、ルーチン的な方法論であるとみなされる。RPE細胞の共移植(cotransplantation)について発表されている報告のほとんどは、ラット由来の細胞を用いたものである(Li and Turner, 1988; Lopez et al., 1989)。本発明によれば、RPE細胞はヒト由来のものである。初代単離RPE細胞に加えて、培養されたヒトRPE細胞株もまた本発明の実施に使用し得る。
【０２７９】
カプセル化においては、細胞はCNSの低酸素分圧レベルの下で生存し機能的なMETRNLの分泌を維持できる必要がある。好ましくは、本発明の細胞株は、5%未満の酸素分圧、より好ましくは2%未満、より好ましくは1%未満の酸素分圧の下で、生存することができる。1%の酸素分圧が、おおよそ脳内の酸素レベルに相当する。
【０２８０】
カプセル化細胞に基づく送達システムのためのプラットフォーム細胞株であるためには、細胞株は以下の特性のうちのできるだけ多くを有するべきである:(1)その細胞はストリンジェントな条件下で耐久性を有する(hardy)べきである(カプセル化細胞は、中枢神経系実質組織内又は脳室内又はくも膜下腔内液空間又は眼内、特に眼内環境のような、血管性又は無血管性の組織腔において機能性を有するべきである)。(2)その細胞は、METRNLを発現するように遺伝子改変できるものであるべきである。(3)その細胞は、比較的長い寿命を有するべきである(その細胞は、十分な数の子孫を生じ、貯蔵、解析、操作、安全試験、及び臨床用ロット製造ができるものであるべきである)。(4)その細胞は、ヒト由来のものでなければならない(それによりカプセル化細胞と宿主との間の適合性が増加する)。(5)その細胞は、インビボで装置の中で1ヶ月を超える期間に渡り80%を超える生存を示すべきである(それにより長期的な送達が保証される)。(6)カプセル化されたその細胞は、有効な量のMETRNLを送達できるべきである(それにより治療の有効性が保証される)。(7)その細胞は、カプセル化されたときに、顕著な宿主免疫反応を起こさないものであるべきである(それにより移植が長寿命のものとなる)。(8)その細胞は非腫瘍性であるべきである(これにより、万が一装置に漏れが生じた場合でも、宿主にとっての安全性が補足される)。
【０２８１】
カプセル化において好ましい細胞としては、網膜色素上皮細胞(ARPE-19を含む)、ヒト不死化線維芽細胞、及びヒト不死化星状膠細胞が含まれる。
【０２８２】
ARPE-19細胞株は、カプセル化細胞に基づく送達テクノロジーにおける優れたプラットフォーム細胞株であり、非カプセル化細胞に基づく送達テクノロジーにおいても有用である。ARPE-19細胞株は耐久性を有する(即ち、当該細胞株は、中枢神経系や眼内環境への移植のようなストリンジェントな条件下でも生存できる)。ARPE-19細胞は治療目的の物質を分泌するように遺伝子改変できる。ARPE-19細胞は比較的長い寿命を有する。ARPE-19細胞はヒト由来である。さらに、カプセル化されたARPE-19細胞はインビボ装置中でも優れた生存性を有する。ARPE-19細胞は有効な量の成長因子を送達することができる。ARPE-19細胞が誘発する宿主免疫反応は無視できるほどのものである。さらに、ARPE-19細胞は非腫瘍性である。ARPE-19細胞を培養及びカプセル化する方法はUS 6,361,771に記述されている。
【０２８３】
別の実施態様においては、当該治療用細胞株は以下のものからなる群から選択される:ヒト線維芽細胞株、ヒト星状膠細胞株、ヒト中脳細胞株、及びヒト内皮細胞株、好ましくはTERT、SV40T又はvmycで不死化されたもの。
【０２８４】
不死化ヒト星状膠細胞株を産生する方法は過去に記述されている(Price TN, Burke JF, Mayne LV. A novel human astrocyte cell line(A735) with astrocyte-specific neurotransmitter function. In Vitro Cell DevBiol Anim. 1999 May;35(5):279-88.)。このプロトコールを使って星状膠細胞株を産生し得る。
【０２８５】
追加のヒト星状膠細胞株を産生するためには、そのプロトコールに次の3つの修正を加えることが好ましい。
【０２８６】
12-16週組織の代わりに、5-12週の胎児から分離されたヒト胎児脳組織を使用し得る。
SV40T抗原の代わりに、v-myc、又はTERT (テロメラーゼ)を不死化遺伝子として使用し得る。
リン酸カルシウム沈殿技術によるプラスミド・トランスフェクションの代わりに、レトロウイルス遺伝子導入を使用し得る。
【０２８７】
XII. 本発明のMETRNLポリペプチドのリコンビナント産生及び精製
本発明のMETRNLポリペプチドは、技術水準にある原核生物又は真核生物発現系を使用して産生し得る。一つの真核生物発現系が実施例2に記述されており、実質的に精製されたhisタグMERTNLポリペプチドをもたらしている。
【０２８８】
典型的な方法はさらにWO 93/22437 (Innogenetics)にも記述されており、当該文献は参照により本明細書に組み入れられる。WO 93/22437のプロトコールは、予測分子量29 kDaのタンパク質の精製を記述している。METRNL断片の発現の場合は、それよりもかなり短い可能性があり、当該プロトコールは分子量の違いを考慮に入れて修正するべきである。
【０２８９】
これらの例は大腸菌における発現(WO 93/22437の実施例5)、COS1細胞における発現(WO 93/22437の実施例6)、バキュロウイルス発現系における発現(WO 93/22437の実施例7)、ワクシニアウイルスにおける発現 (WO 93/22437の実施例8)を含む。引用された発現系の各々が、WO 93/22437に記述されたポリペプチドを顕著な量において発現する結果をもたらした。
【０２９０】
METRNLタンパク質の精製は、WO 93/22437に記述された精製法を使用して実施し得る。手短に述べると、本発明のcDNAでトランスフェクトしたCOS1細胞の馴化培地を48時間後に回収し、0.22 μmのフィルターに通して細胞片を除去する。典型的な精製は、600から1000 ml のCOS1トランスフェクション培地から出発する。これに、MgCl2及び硫酸デキストラン500.000(ファルマシア社、ウプサラ、スウェーデン)を、それぞれ最終濃度60 mM及び0.02%で加える。4℃で1時間インキュベーションした後、遠心 (12.000 g, 30分, 4℃)により沈殿物をペレット化する。METRNLを含む上清フラクションを、50 mM Hepes pH 7.0, 4 mMEDTA, pH 8.0に対して透析し、50 mM Hepes pH 8.5で平衡化した4 mlのフェニルボロネート・アガロース(PBA 30, アミコン社, MA, USA)カラムに、フロー率 0.5 ml/分にて適用する。100 mMソルビトールでMETRNLを当該マトリックスから溶出する。
【０２９１】
ソルビトールで溶出したピーク画分を、Hepes pH 8.5で平衡化した1 mlのFPLC Mono Q陰イオン交換カラム(ファルマシア社)にフロー率0.5ml/分にて通し、0から1 M NaClの直線的塩勾配で溶出する。
【０２９２】
Centricon10.000(アミコン社)により溶出液を約40倍濃縮し、バッチごとに(batchwise)(3回、0.25 ml)、PBSで平衡化したSMART Superdex 75ゲル濾過カラム(ファルマシア社)に適用する。このプロトコールは高純度のタンパク質の溶出という結果をもたらすことができる。
【０２９３】
他の技術水準にあるタンパク質精製プロトコールも、実施例に記述されるインビトロ及びインビボアッセイを実施するための十分な純タンパク質を得るために使用し得る。
【０２９４】
XIII. インビトロにおけるMETRNLの使用
METRNLポリペプチド及び/又はMETRNLをコードするポリヌクレオチドを、インビトロで、成長因子又は栄養性因子として使用することができる。この使用は、METRNLは成長因子の構造的特性を有する分泌性タンパク質であるという発見、並びに、METRNLは異なるインビトロ・アッセイにおいて神経突起の成長(軸索伸長)、神経の生存、神経発生、及び神経前駆体の移動を引き起こすという本発明者による発見に基づく。当該神経栄養及び/又は神経移動及び/又は神経保護及び/又は神経発生作用は、後根神経節及び脳室下帯外植片において見出された。
【０２９５】
METRNLをタンパク質組成物として培養物に投与してもいいし、METRNLをコードするcDNAで細胞の形質導入又はトランスフェクションをしてもよい。特定の細胞型又は組織の治療においてMETRNLが有効であるかどうかは、当該技術分野で知られる様々なアッセイを使用して当業者が容易に決定することができる。例えば、細胞に栄養性サポート(trophic support)を提供することに関しては、栄養性因子は有益な生化学的及び形態的効果を生じることができ、またある状況においては、細胞の生存を促進することができる。ニューロンに関しては、ニューロンから栄養性サポートを奪うと、正常な機能及び成長に必要な代謝活性(即ち、グルコース取り込み、RNA合成及びタンパク質合成) が減少し得ることが当該技術分野において知られている(Deckwerth andJohnson 1993, J. Cell Biol. 123:1207-1222)。栄養性サポートの除去は、ニューロンの細胞体のサイズの減少も引き起こし得る。栄養性因子の欠乏は、おそらくは栄養性因子の代謝作用が失われることの結果として、突起伸長の減少又は停止、及び神経突起の退縮を引き起こし得る。神経生物学のこれらの側面において栄養性因子が必要とされるのに加え、ニューロンは生存を維持するためにも神経栄養性因子を必要とし得る。従って、神経栄養性因子の作用を検出又は定量化する上で、生存アッセイは頻繁に用いられる手段である。しかしながら、栄養性サポートは、神経の数や生存に対する効果とは独立して、形態的、生化学的、及び機能的変化としても表現され得る。
【０２９６】
METRNLタンパク質又はポリヌクレオチドは、幹細胞及びその神経性子孫、並びにニューロン、グリア細胞、シュワン細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞の、増殖、分化、再生又は生存のために使用され得る。インビトロの培養は、患者から単離された細胞を、刺激し又はエクスビボ遺伝子治療する手順の一部であり得、当該細胞は、エクスビボでの刺激又はトランスフェクション/形質導入の後に患者に投与することが意図される。
【０２９７】
XIV. 抗METRNL抗体
本発明のMETRNLポリペプチド又はポリペプチド断片は、METRNL特異的抗体を産生するために使用し得る。本明細書において、「METRNL特異的抗体」とは、METRNLポリペプチド又はポリペプチド断片に対して免疫的反応を示す、又は、METRNLポリペプチドのエピトープに特異性をもって結合する、抗体、例えばポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。
【０２９８】
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製法は当該技術分野においては周知である。特に、ポリクローナル抗体は、例えばGreen et al.,: “Production of Polyclonal Antisera" inImmunochemical Protocols (Manson, Ed.); Humana Press, 1992, 1-5頁、Coligan et al.,: “Production of Polyclonal Antisera in Rabbits,Rats, Mice and Hamsters" in Current Protocols in Immunology, 1992, Section2.4.1、及び Ed Harlow and David Lane (Eds.) in“Antibodies; A laboratory manual" Cold Spring Harbor Lab Press 1988に記述されたようにして得ることができる。モノクローナル抗体は特に、例えばKohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495、Coligan et al., in Current Protocols in Immunology, 1992, Sections2.5.1 - 2.6.7、及び Harlow et al., in Antibodies: ALaboratory Manual; Cold Spring Harbor, Pub., 1988, 726頁に記述されたようにして得ることができる。
【０２９９】
手短に述べると、モノクローナル抗体は、抗原を含む組成物を例えばマウスに注射し、血清サンプルを採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を取り出してBリンパ球を得て、当該Bリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生し、当該ハイブリドーマをクローン化し、前記抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、当該ハイブリドーマ培養物から抗体を単離すること、により得られる。
【０３００】
モノクローナル抗体は、よく確立されている様々な技術によりハイブリドーマ培養物から単離及び精製することができ、それらはプロテインAセファロースを用いた親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーを含む。例えばColigan et al. in Current Protocols in Immunology, 1992, Sections2.7.1 - 2.7.12及びSections 2.9.1 - 2.9.3、並びにBarnes et al.: “Purification of Immunoglobulin G (IgG)" inMethods in Molecular Biology; Humana Press, 1992, Vol. 10, 79-104頁を参照のこと。ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、任意で、さらに精製できる(例えば、その抗体の抗原として使ったポリペプチドが結合したマトリックスに結合させて溶出することによる)。
【０３０１】
本発明のMETRNLポリペプチドに結合する抗体は、完全長(intact)のポリペプチド又は目的とする小さなペプチドを含む断片を免疫用抗原として使用して調製することができる。動物を免疫するのに使用するポリペプチドは、リコンビナントDNA技術によって得てもよいし、又は化学合成によって得てもよく、任意で、担体タンパク質と結合体を形成させてもよい。一般的に使用される担体タンパク質でありペプチドと化学的にカップリングされるものとしては、スカシガイヘモシアニン(KLH)、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン(BSA)、及び破傷風トキソイドが含まれる。カップリングされたペプチドをその後動物を免疫することに使用でき、当該動物は特にマウス、ラット、ハムスター又はウサギであり得る。
【実施例】
【０３０２】
実施例1：METRNL配列
配列一覧番号。
SEQ ID NO1: ヒト メテオリン・ライクcDNA
SEQ ID NO2: ヒト メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO3: マウス メテオリン・ライクcDNA
SEQ ID NO4: マウス メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO5: ラット メテオリン・ライクcDNA
SEQ ID NO6: ラット メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO7: ヒト 成熟メテオリン・ライク タンパク質
SEQ ID NO8: マウス 成熟メテオリン・ライク タンパク質
SEQ ID NO9: ラット 成熟メテオリン・ライク タンパク質
SEQ ID NO10: ヒト メテオリン・ライク コア断片
SEQ ID NO11: マウス メテオリン・ライク コア断片
SEQ ID NO12: ラット メテオリン・ライク コア断片
SEQ ID NO13: hMTRNL オープンリーディングフレーム
SEQ ID NO14: mMTRNL オープンリーディングフレーム
SEQ ID NO15: rMTRNL オープンリーディングフレーム
SEQ ID NO16: ヒト CDS 成熟METRNL
SEQ ID NO17: マウス CDS 成熟METRNL
SEQ ID NO18: ラット CDS 成熟METRNL
SEQ ID NO19: ウシ メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO20: ニワトリ メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO21: カエル メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO22: ゼブラフィッシュ メテオリン・ライク タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO23: ヒト METRN タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO24: マウス METRN タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO25: ラット METRN タンパク質 (シグナル・ペプチドを含む)
SEQ ID NO26: METRNLのC-末端 His-タグ
【０３０３】
SEQ ID NO2: ヒト メテオリン・ライク タンパク質 (NP_001004431.1)
0005616888.tif 000004
【０３０４】
SEQ ID NO4: マウス メテオリン・ライク タンパク質 (NP_659046.1)
0005616888.tif 000005
【０３０５】
SEQ ID NO6: ラット メテオリン・ライク タンパク質 (NP_001014126)
0005616888.tif 000006
【０３０６】
SEQ ID NO7: ヒト 成熟メテオリン・ライク タンパク質
0005616888.tif 000007
【０３０７】
SEQ ID NO8: マウス 成熟メテオリン・ライク タンパク質
0005616888.tif 000008
【０３０８】
SEQ ID NO9: ラット 成熟メテオリン・ライク タンパク質
0005616888.tif 000009
【０３０９】
SEQ ID NO10: ヒト メテオリン・ライク コア断片
0005616888.tif 000010
【０３１０】
SEQ ID NO11: マウス メテオリン・ライク コア断片
0005616888.tif 000011
【０３１１】
SEQ ID NO12: ラット メテオリン・ライク コア断片
0005616888.tif 000012
【０３１２】
SEQ ID NO1: ヒト メテオリン・ライクcDNA (NM_001004431.1)
0005616888.tif 000013
ORFは太字
【０３１３】
SEQ ID NO3: マウス メテオリン・ライクcDNA (NM_144797.3)
0005616888.tif 000014
ORFは太字
【０３１４】
SEQ ID NO5: ラット メテオリン・ライクcDNA (NM_001014104.1)
0005616888.tif 000015
ORFは太字
【０３１５】
SEQ ID NO13, ヒト ORF
0005616888.tif 000016
【０３１６】
SEQ ID No14, マウス ORF
0005616888.tif 000017
【０３１７】
SEQ ID NO15, ラット ORF
0005616888.tif 000018
【０３１８】
SEQ ID NO16, ヒト CDS 成熟METRNL
0005616888.tif 000019
【０３１９】
SEQ ID NO17, マウス CDS 成熟METRNL
0005616888.tif 000020
【０３２０】
SEQ ID NO18, ラット CDS 成熟METRNL
0005616888.tif 000021
【０３２１】
実施例2： METRNLポリペプチドの取得及びMETRNLポリペプチドの機能試験
方法
配列解析
相同性検索は、BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast/)を用い、アンサンブル・ゲノム・ブラウザー(http://www.ensembl.org/index.html) を参照することにより、行った。アミノ酸配列のアラインメントは、サイ・エド・ソフトウェア社 (ケーリー, NC)のクローン・マネージャー9・プロフェッショナル・エディション・パッケージ中のCLUSTAL W(1.7)(Thompson et al (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680) を使用して行った。シグナル・ペプチド切断部位の予測はSignalPを使用して行った(Bendtsen et al (2004), J.Mol. Biol. 340, 783-795)  (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。
【０３２２】
クローニング
マウス(NM_144797)及びヒト(NM_001004431)のメテオリン・ライクのコード配列は、C-末端のヒスチジン・タグ(GSGSGSHHHHHH; SEQ ID NO 26)と共にGenScript社(NJ, USA)により合成され、pNS1nのBamHI/XhoIサイトにPCRクローニングした (Jensen et al., 2002)。全てのコンストラクトはDNA配列決定により確認された(MWGバイオテク AG, ドイツ)。
【０３２３】
細胞培養
HEK293細胞は、10% FCS (セロメッド社、S 0115)で補足されたDMEM (インビトロゲン社、41965-039)中で付着性培養として培養された。トランスフェクションは、LipofectAMINE 2000(ライフ・テクノロジーズ社、11668-027)を使用して、製造会社の説明書に従って行った。細胞は、5% CO2の加湿環境下で37℃でインキュベーションした。
【０３２４】
SDS-PAGE及びウェスタン・ブロッティング
細胞可溶化物及び馴化培地は過去に記述されたように調製された(Fjord-Larsen et al (2005), Exp. Neurol. 195, 49-60)。サンプルは15%均一のSDS PAGEゲル(アマシャム・ファルマシア社、スウェーデン)に適用し、電気泳動して、PVDFメンブレンに電気的にブロッティングした。HISタグを有するリコンビナント・メテオリン・ライクの検出は、0.2 μg/ml の抗HIS (C-末端) (インビトロゲン社, R930-25)を一次抗体として、HRP連結抗マウスAb(ダコ社, P0260, 1:2000)を二次抗体として使用して行った。又は、ゲルを、製造会社の説明書に従ってゲルコード・ブルー染色試薬(ピアース社, 24590)で染色した。
【０３２５】
リコンビナント・マウス・メテオリン・ライクの産生
フリースタイル(登録商標)293-F細胞(インビトロゲン社, K9000)を、LipofectAMINE 2000(ライフ・テクノロジーズ社, 11668-027)を使用してpNS1n-mMETRNL-HIS DNAでトランスフェクトした。培養物を、攪拌しながら、37℃、8% CO2の下で4日間インキュベートし、遠心分離により細胞ペレットと上清とに分けた。上清を滅菌濾過し、リコンビナントタンパク質をTALON メタル・アフィニティー・レジン(クローンテック社, 635502)で精製し、その後PD-10ゲル濾過(GEヘルスケア社, 17-0851-01)に付した。
【０３２６】
RP-HPLC
逆相クロマトグラフィーはC4カラム(1 x 150mm, フェノメネクス・ジュピター社, C4, 5μm, 300Å)を用いて行った。溶出は、0.1% TFA中のアセトニトリルの直線的勾配（60分で0-100%）によって、フロー率50μl/minにおいて行った。検出は214nmにおいて行った。
【０３２７】
マススペクトロメトリー
マトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間法(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーは過去に記述された通りである(Ylonen et al., 1999)。ペプチド質量フィンガープリント解析においては、解析に先立って、mMETRNLタンパク質を還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで消化した。
【０３２８】
DRG培養
1.2mg/mlのコラゲナーゼD(ロシュ社)及び4.8 mg/mlのディスパーゼ(ロシュ社)で補足したパパイン・ディソーシエーション・システム(ウォーシントン・バイオケミカル社, US)を用いてラットP5後根神経節を分離した。続いて、細胞を、5%熱不活性化ウマ血清(セロメッド社)を含んだDMEM/F12倍地(インビトロゲン社)中、1.5 x 104 細胞/cm2の密度で、ポリオルニチン/ラミニンでコーティングした24ウェル・プレートに蒔いた。1時間して細胞が付着したら、培地を、1%ゲンタマイシン(インビトロゲン社)を含み、リコンビナント・マウス・メテオリン・ライク又はラットNGF (R&Dシステムズ, 556-NG)を示されているように追加した、無血清DMEM/F12に置き換えた。細胞を37℃ 及び 5% CO2下で1日間インキュベートし、4% PFAで固定した。免疫細胞化学は、固定した培養物に対して、1% 正常ウマ血清及び0.1% Triton X-100を含んだPBS中で1:15,000に希釈されたβ-III-チューブリン抗体(シグマ社, T-8660)、続いてビオチン化二次抗体(ウシ抗マウス)、続いてABCエリート・キット (ベクター・ラボラトリー社)を使用して行い、その後、3'3'-ジアミノベンジジン(DAB)を色素原として呈色反応を起こさせた。細胞あたりの神経突起の長さはVisioMorph画像解析を用いて定量化した。3重実験(triplicate)のウェルからの少なくとも9個の画像を使用した。
【０３２９】
SVZ外植片
P2-P3の新生児ラットを断頭により犠牲にした。脳を摘出し、冷したニューロベーサル培地(ギブコ‐インビトロゲン社、カールスバード、CA)中に入れ、ビブラトームを使用することによって250μm厚の脳切片を得た。SVZは、側脳室の前角の側壁から摘出し、直径150 - 200μmの小片にカットした。SVZ外植片を1:5の比率でマトリゲル(ベクトン・ディキンソン社)と混ぜ、4個のマルチウェル・プレートで培養した。37℃(25分)で重合後、B-27 (ギブコ‐インビトロゲン社)、N2因子(ギブコ‐インビトロゲン社)、及びペニシリン/ストレプトマイシン(ギブコ‐インビトロゲン社)で補足したニューロベーサル培地をコントロール培養物に加えた。他の条件においては、同じ培地を用いたが、異なる濃度のマウスMETRNLを含ませた(20 ng/ml 及び 200 ng/ml)。培養物は、加湿された5% CO2、37℃インキュベーター中で維持された。
【０３３０】
免疫蛍光法
24時間後、SVZ外植片をPBSで洗浄し、PBS中の4% PFA、0.05% Triton-X 100で15分間固定した。PBS、2%ウマ血清、1% BSA、0.1%ゼラチン、0.1%Triton X-100、及び0.05% Tween 20を含むブロッキング・バッファーと共に1時間、外植片をインキュベートした。外植片を室温で1時間、ヤギ抗DCX (1:100, サンタクルーズ社)と共にインキュベートした。外植片をPBSでリンスし、室温で1時間、Cy3コンジュゲート抗ヤギ二次抗体(1:200, ジャクソン・イミュノリサーチ社)と共にインキュベートした。切片をPBSでリンスし、スライドグラスに載せてカバーグラスをかけた。
【０３３１】
細胞移動の定量化
24時間後、外植片をDIC顕微鏡でモニターし、各外植片からの移動チェーンの長さを、AxioVisionソフトウェア(ツァイス社)を使用することによって計測した。外植片の端から識別可能な移動先端までの距離の測定を行い、それを、コントロール測定で得られた値に対して標準化した。2つの独立したアッセイにおいて実験を行った。
【０３３２】
脳室下帯(SVZ)の外植片を用いたFITC-ファロイジン・アッセイ
SVZ組織をP2-P5仔ラットから単離し、前述のように培養した。外植片を20 ng/mlMETRNL又は10ng/ml SDF1aで24時間刺激し、4% PFA/0.05% Triton-Xで固定する前に1時間再び刺激した。固定後、外植片をPBSで洗浄し、1:50に希釈したFITC-ファロイジン(インビトロゲン社)で20分間染色した。染色した外植片をスライドグラスに載せ、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
【０３３３】
SVZ由来細胞単層を用いたFITC-ファロイジン・アッセイ
SVZ組織をP2-P5仔ラットから単離し、細胞を剥離するために、アキュターゼ(accutase)と共に15分間インキュベートした。アキュターゼ処理後、細胞をガラスのパスツール・ピペットで分離し、数を数え、オルニチン・フィブロネクチンでコーティングされたカバーグラス上に置いた。SVZ細胞は、B-27、N2サプリメント、グルタミン、及びペニシリン-ストレプトマイシンで補足したニューロベーサル培養培地中で維持した。24時間後、細胞を、20ng/ml METRNL 又は 10 ng/ml SDF1-aで1時間刺激し、その後4% PFA/0.05% Triton-Xで固定した。固定後、細胞をPBSで洗浄し、1:50に希釈したFITC-ファロイジン(インビトロゲン社)で20分間染色した。染色した細胞をスライドグラスに載せ、蛍光顕微鏡を使用して可視化した。
【０３３４】
リコンビナント・ヒトMETRNLの産生
フリースタイル293F細胞を、コドン最適化しHISタグを付けたヒトMETRNLを発現するpNS1nでトランスフェクトした。細胞培養及び精製は前に記述されたように行った。
【０３３５】
結果
メテオリン・ライク及びメテオリンは、分泌性タンパク質の新規のファミリーを構成する
ヒトMETRNL及びMETRNタンパク質は42%の同一性を有し、成熟配列中に10個存在するシステイン残基のうち10個全てが保存されている(図1及び3)。多様な生物からのEST及びゲノム配列の解析により、ゼブラフィッシュ及びカエルのゼノパス・トロピカリスを含む全ての脊椎動物にMETRNLのオーソログが存在することが示唆される一方、ショウジョウバエ(Drosophilamelanogaster)や線虫(Caenorhabditis elegans)のような無脊椎動物にはオーソログが見出されない(図3)。
【０３３６】
SignalPは、ヒト、マウス、ラットMETRNLにおいて、A45とQ46との間に予測切断部位を有するN-末端シグナル・ペプチドの存在を予測した。
【０３３７】
C末端HIS-タグを有するバージョンのヒト及びマウスMETRNLをクローニングし、HEK293細胞で一過性トランスフェクションを行った。これらの分子が両方とも産生され分泌されていることが図4から明らかである。hMETRNLは予測される通り31.2 kDaの位置に泳動するが、mMETRNLはより高い分子量の位置に泳動する。
【０３３８】
リコンビナントmMETRNLの産生
METRNLの生化学的特性を研究することができるように、フリースタイル(登録商標)293-F細胞でリコンビナント・タンパク質を産生した。図5Aで明らかなように、mMETRNL-HISタンパク質は、トランスフェクション後96時間に至るまで馴化培地中に蓄積し続ける。従って、スケールアップ培養において、トランスフェクションの96時間後に馴化培地を回収し、リコンビナントmMETRNL-HISをTALONレジンへの結合により精製した。図5Bに示す精製タンパク質のSDS-PAGE解析において、抗HIS免疫反応性のバンドは一つだけであり、このバンドは、ゲルコード・ブルー染色で検出される単一バンドのサイズに相当する。ここでもやはり、mMETRNL-HISは予測される31.2 kDaよりも大きな分子量の位置で泳動する。精製されたタンパク質はさらに逆相クロマトグラフィーにより解析された。クロマトグラム(図5C)において、mMETRN-HISは単一の突出したピークとして溶出し不純物をほとんど含まないことが明らかである。フラクション≧31に見られる肩は、不均一にグリコシル化されたタンパク質においては典型的なものである。グリコシル化について調べるため、精製リコンビナント・タンパク質を異なる脱グリコシル化酵素及びそれらの組合せと共にインキュベートした。図5Dにおいて、N-グリカナーゼによる処理が分子量の低下を引き起こし、他の脱グリコシル化酵素を添加しても分子量はさらには減少しないことが明らかである。これは、mMETRNLがN結合型糖鎖のみを有する糖タンパク質であることを意味する。
【０３３９】
最後に、精製タンパク質のトリプシン・ペプチド質量フィンガープリントを、ヒスチジン‐タグmMETRNLの理論上インシリコ消化と比較した。このようにして、検出範囲(800-3500Da)において当該配列の主要な部分は確認されたが、シグナル配列が予測通りA45とQ46との間で切断される場合に生じるはずである1272.5 Daのトリプシン性ペプチドは見出されなかった。しかしながら、もしグルタミン残基がN-末端にあるならば、それが自発的に又は酵素の働きにより環化してピロリドンカルボン酸になることがあり得、その場合は17 Daの質量低下が起こるはずである。それは結果として1255.5 DaのN-末端トリプシン性ペプチドをもたらすはずであり、事実、得られたペプチド質量リストの中にはこの質量が見出される。従って、成熟mMETRNLは環化されたQ46で始まる。ヒト、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼノパス・トロピカリス及びゼブラフィッシュのMETRNLのアラインメントにおいて(図3)、成熟タンパク質におけるN-末端グルタミンは発生を通じて保存されていることが明らかである。
【０３４０】
METRNLは神経栄養性である
mMETRNLの神経栄養性作用を調べるために、精製されたリコンビナント・タンパク質を、ラットの分離されたP5後根神経節(DRGs)の培養物に加えた。メテオリン・ライクは確かに、NGFに匹敵する強度で、神経突起伸長を刺激する(図6)。栄養性サポートが無ければDRG細胞からの神経突起伸長はごく限られているが、NGF又はmMETRNLの存在下では、β-III-チューブリン陽性のニューロンから長い神経突起が形成される。観察された効果は、神経細胞の生存の増強、神経細胞の再生の増進、及び神経細胞の分化を含み得る。
【０３４１】
このアッセイにおける作用は、ALS、神経根損傷、神経根裂離、上腕神経損傷、末梢神経障害、及び神経障害性疼痛における治療的な可能性を示す。
【０３４２】
一般的に、神経栄養性因子は、発生中のニューロンの成長及び生存、並びに成体ニューロンの維持を担う。さらに、これらの因子は特定の損傷した神経群を修復する能力をも有し、従って、中枢神経系の障害を好転させるための治療的可能性を有し、これらの障害としてはアルツハイマー病、(Schindowski et al (2008) Genes Brain Behav. 7 Suppl 1, 43-56)、パーキンソン病 (Evans et al (2008), Expert. Opin. Ther. Targets. 12, 437-447)、及び筋萎縮性側索硬化症(Ekestern (2004) Neurodegener. Dis. 1, 88-100)が含まれる。
【０３４３】
METRNLは、ラットSVZ由来の神経芽細胞の神経移動を用量依存的に増加させる
後根神経節の神経突起伸長に対して起こるMETRNLの効果(図6)は、このタンパク質が細胞膜再構築のレベルで機能を有することを示唆する。もしそうであるならば、METRNLがSVZ由来の神経芽細胞のような移動性細胞の行動に影響を与えることも考えられる(もしこれらの細胞がMETRNLの存在により誘発される信号を伝達するための機構を発現しているのであれば)。神経芽細胞移動における機能の可能性を調べるために、精製したリコンビナントMETRNLを、三次元細胞外マトリックス(マトリゲル)中で培養されたラットSVZ外植片に加えた。METRNLの存在は、細胞移動の有意な増加を用量依存的に引き起こし、そこでは、200ng/mlの濃度のMETRNLが、コントロール条件と比較して移動距離を約50%増加させた（図7）。SVZ由来の外植片は不均一な組成を有するため、どの細胞がMETRNLに応答しているのかを確認することが重要である。従って、移動性神経芽細胞で発現されるマーカーであるダブルコルチン(DCX)に対して特異的な抗体を用いて、免疫染色を行った。その結果、移動増加を示した細胞は神経芽細胞であって星状膠細胞ではないことが明らかになった(図7)。
【０３４４】
METRNLはSVZ由来の神経芽細胞の神経移動を増加させる
METRNLの神経芽細胞移動に対する効果を確認するために、精製したリコンビナント・マウスMETRNLを、三次元細胞外マトリックス(マトリゲル)中で培養されたラットSVZ外植片に加えた。マウスMETRNLの存在は、用量依存的に、細胞の移動の有意な増加を引き起こした。200ng/mlのMETRNLは、コントロール条件と比較して、移動距離をほとんど2倍にした(図8A)。METRNL濃度を2000ng/mlに上げても移動はさらに増加しなかった。移動する細胞は、ダブルコルチン(DCX)陽性でグリア線維酸性タンパク質(GFAP)陰性であることから、神経芽細胞であることが確認された(図8B)。
【０３４５】
細胞移動のための基礎機構はアクチン重合化により提供される。このことは、アクチン結合性FITCコンジュゲート・ファロイジンとのインキュベーションに続く蛍光顕微鏡法により容易にモニターできる。外植片と単層培養の両方において、METRNLによる刺激が、ポジティブ・コントロールのSDF1aと同程度、SVZ神経芽細胞中のアクチン重合化を引き起こすことが、図9から明らかである。外植片培養においては、細胞がお互いを基質として使用しながら細胞の長い鎖を形成していることが非常に明白であるが、これは神経芽細胞の移動において典型的なことである(チェーン移動)。アクチン重合化の増加及び当該移動パターンは、METRNLが神経芽細胞移動を促進する役割を有することのさらなる証拠である。さらに、METRL及びSDF-1はどちらも、コントロールと較べて、培養物中のDCX陽性神経芽細胞の数を増加させたことから、神経発生の証拠が示された。神経発生におけるSDF-1の作用はよく研究されており、METRLで刺激した培養におけるDCX+ 神経芽細胞の数及び移動パターンはSDF-1の場合と区別がつかないほどであったことから、これらの実験では神経芽細胞の数を定量化する試みは行われなかったものの、METRLが神経発生及び神経芽細胞の移動の両方に対して正の作用を有することが結論付けられる。
【０３４６】
マウス及びヒト成熟METRNLは78%の同一性を有する。当該2分子が同様な生物学的活性を有することを実証するために、精製したヒト・リコンビナントMETRNLをラットSVZ外植片に加えた。図10で明らかなように、ヒトMETRNLもまた、神経芽細胞の移動を確かに促進する。
【０３４７】
これらの結果は、神経芽細胞の移動におけるMETRNLの刺激効果は有望なものであることを示す。観察された結果は、神経細胞の生存の増強、及び神経発生の増進を含み得る。
【０３４８】
このタンパク質を送達することは、脳卒中、PD、HD、ALS、及びアルツハイマー病のような神経変性障害の治療において適用の可能性を有し、これらの障害では新たなニューロンの損傷領域への補充が有益となり得る。
【０３４９】
分泌性因子は、細胞の増殖、移動、及び分化に影響を与えることができるのであれば、組織修復の高い潜在能力を有する移動性細胞に影響を与えることもあり得るため、治療用途のために研究することが特に有用だと思われる。ある因子が試験に付される場合、その機能を調べるためのアプローチとしていくつかの実験のセットを使用することができ、迅速にデータを得て確認を行うことを可能とする。現ケースにおいては、我々はWichterle (Wichterle et al (1997), Neuron 18, 779-791)により記述された方法を用いるが、これは、マウスSVZからの組織外植片を、コラーゲンIV、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチン-ナイドジェンを含む三次元細胞外マトリックスゲルの中に包埋して調製することを含む。いったんSVZ外植片をマトリゲルに包埋したら、試験する因子の存在下それを培養物として維持し、異なる経過時間において移動をモニターすることができる。標準的な条件下では、移動する神経芽細胞は外植片から放射状に移出してチェーンを形成するが、これはお互いを移動のための基質として利用するからである。測定までの経過時間に依存して、これらの移動チェーンは、1個から5個の細胞からなる幅を有し、最大600μmの長さを有し、122 μm/時間の平均スピードを有し得る(Wichterle et al., 1997)。因子、阻害剤、又はトランスジェニック組織を解析する場合には、これらのパラメータを考慮に入れて測定を行い、定量化及びコントロール条件との比較を行うことができる(Hack et al (2002) Nat. Neurosci. 5, 939-945; Alberti et al (2005),Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 102, 6148-6153; Chiaramello et al (2007), Eur.J. Neurosci. 26, 1780-1790)。これらの方法は、SVZにおける細胞移動の制御が示唆される神経変性疾患の治療において適用の可能性を有する因子のスクリーニングにおいては特に好都合であるが、これは、試験される細胞がまさにその領域に由来するものであり、同じ条件でも異なる振る舞いをし得るような、別の細胞型を有する領域に由来するものではないからである。
【０３５０】
実施例2A:METRNLは、難聴モルモットを聴覚消失から守る
材料及び方法
実験デザインの概要を図11Aに示す。初めに、クリック誘発聴性脳幹反応(ABR)を利用して、18匹のモルモット(アルビノ) を試験して正常な聴覚の有無を調べ、次の3つの実験グループに分けた:
1.METRNL処置を受ける、正常聴覚動物
2.METRNL処置を受ける、3週間難聴動物
3.人工外リンパ(AP)処置を受ける、3週間難聴動物
【０３５１】
グループ1: 経過時間0において、6匹の正常聴覚モルモットに、METRNLの内耳注入のためのミニ浸透圧ポンプ(mini-osmotic pump)に接続されたカニューレ、及び、らせん神経節ニューロンの電気的応答をモニターするための人工内耳を設置した(Maruyama et al., Neurobiol Dis. 25, 309-318, 2007)。動物を2日間APで処置し、続いて、0.5μl/hで送達されるAP中の1μg/mlのMETRNLで2週間、処置した。
【０３５２】
グループ2: 最初のABR測定の後(時間 = -21日)、動物の両方の耳に、鼓膜を通して、10%ネオマイシンを一回注射した。7日後及び14日後、クリック-ABRを測定して難聴化後の閾値を調べた。目標は、＞60 dBの閾値変化(非常に重症の聴覚消失を示す)を得ることであった。6匹のうち1匹の動物は＞60 dBの閾値を有していなかったため実験から除外された。難聴化の3週間後(時間=0)、5匹の動物に手術を施して、人工内耳及びミニ浸透圧ポンプに接続されたカニューレを設置した。上述したように、動物は2日間のAPを受け、続いて2週間のMETRNL処置を受けた。
【０３５３】
グループ3: 動物はグループ2と同様にして難聴化され、ここでもまた、難聴化が不十分だったため1匹が除外された。残りの5匹にはt=0において人工内耳が設置され、残りの実験全体を通じてAP処置が施された。
【０３５４】
全てのグループについて、手術の2、9及び16日後に電気誘発聴性脳幹反応(eABR)を測定した。
【０３５５】
結果
METRNLはらせん神経節の生存及び電気的応答性に対してインビボで正の作用を有する
内耳の感覚上皮及び付随の神経節の損傷(音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、並びに付随の症状群を含むがこれらに限定されない)の治療におけるMETRNLの効果を確認するために、難聴の動物モデルにおいてMETRNLを試験した。手短に言えば、モルモットを単一用量のネオマイシンで難聴化し、3週間後、タンパク質注入によりMETRNL処置を行った(図11A)。異なる処置に関係する閾値変化をモニターするために、手術の2、9及び16日後に電気的聴性脳幹反応(eABR)を記録した（図 11B）。METRNL処置された正常聴覚モルモットにおける閾値は実験全体を通して安定であり(〜50 μA)、METRNLは聴覚に対して有害な作用を有しないことが示された。難聴化された2つのグループにおいては、最初の記録時において閾値が上昇しており、重度の聴覚低下が示されていた。重要なことに、人工外リンパで処置したコントロール・グループにおいてはeABR閾値が上昇し続けたが、それと比較して、METRNLで処置したグループにおいては、16日間の処置後、統計学的に有意な(p < 0.05)、より低い閾値を示した。これは、らせん神経節ニューロンの生存及びその電気的応答性に対して、METRNLはインビボで正の作用を有することを示唆するものである。これは短期間についての実験であり、より長期に渡る処置ではさらに聴覚が改善されることが予測される(Maruyama et al., Neurobiol Dis. 2008 Jan;29(1):14-21)。従って、METRNLは、内耳の感覚上皮及び付随の神経節の損傷(音響性外傷、難聴、耳鳴、耳炎、迷路炎、遺伝性及び蝸牛前庭萎縮、メニエール病、並びに付随の症状群を含むがこれらに限定されない)を治療するために使用され得る。
【０３５６】
実施例3:グルタミン酸毒性に対する小脳顆粒細胞の保護
生存作用の試験は、小脳顆粒細胞の培養物をリコンビナントMETRNLで処理した後、本質的には記述されたように毒性濃度のグルタミン酸に晒すことによって行う(Daniels and Brown, 2001; J. Biol. Chem. 276: 22446-22452)。
【０３５７】
小脳顆粒ニューロン(CGN)を、7-8日齢の仔マウスから摘出する。摘出したばかりの小脳をトリプシン及びDNaseの存在下で酵素的に破壊して分離した細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎仔血清で補足したDMEM培地中で1-2×106 細胞/cm2の密度で、ポリ-D-リジンで事前にコーティングした24ウェル・プレート(ナンク社)に蒔く。細胞を37℃の加湿環境下で培養し、24時間後、シトシンアラビノシド(10μM)を培養培地に加え、非神経性細胞の成長を停止させる。
【０３５８】
DIV1において、培養物を段階希釈のリコンビナントMETRNLで処理し、平行する培養物はネガティブ・コントロールとしてPBSで処理する。培地は毎日交換する。DIV5において、グルタミン酸(0.1-1 mM)を培養物に加え、さらに2日後、MTTアッセイ法を使用して細胞の生存についてアッセイする。MTTのホルマザンへの還元の程度を、570 nmにおいて分光光度的に測定する。手短に述べれば、培養培地を除去し、細胞をナトリウム生理食塩水(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2.6H2O, 1 mMNaH2PO4, 1.5 mM CaCl2, 5.6 mM グルコース, 20 mM HEPES, pH 7.4)で洗浄する。その後、MTT(最終濃度0.5 mg/ml)(使用直前に調製し、暗所でナトリウム生理食塩水中で維持する)を細胞に加える。37℃で3時間インキュベーションした後、等量の酸-イソプロパノール(イソプロパノール中の0.04M HCl)を加え、ホルマザンの結晶が溶解するまで室温でよく混ぜる。細胞生存性は、コントロール細胞に対する吸光度のパーセンテージとして表される。平行する培養においては無処理とする。
【０３５９】
実施例4:カリウム欠乏で誘導されるアポトーシスに対する小脳顆粒細胞の保護
生存作用についての試験は、本質的には記述されたとおりに(Nomura et al., 2001; Dev. Neurosci. 23: 145-152)、カリウム欠乏状態の小脳顆粒細胞の培養物を段階希釈のリコンビナントMETRNLで処置することにより行われる。
【０３６０】
小脳顆粒ニューロン(CGN)を、P8 NMRI 仔マウスから摘出する。摘出したばかりの小脳をトリプシン及びDNaseの存在下で酵素的に破壊して分離した細胞を、10%の熱不活性化ウシ胎仔血清、2 mM グルタミン、及び100 μg/mlゲンタマイシンで補足され25 mM KCl を含むイーグルの基本培地(BME) 中で4.4×105 細胞/cm2 の密度で、ポリ-L-リジンでコーティングした48ウェル・プレート(ナンク社)に蒔く。細胞を37℃の加湿環境下で培養し、24時間後、シトシンアラビノシド(10μM)を培養培地に加え、非神経性細胞の成長を停止させる。
【０３６１】
DIV2において、2 mMグルタミン、100 μg/mlゲンタマイシン及びシトシンアラビノシドで補足され5 mM KClを含む無血清BME(低カリウム培地)に細胞を移すことにより、未成熟培養物(immature cultures)にアポトーシスを誘発させる。ウェルにリコンビナントMETRNLの段階希釈を加え、平行する培養物にはネガティブ・コントロールとしてPBSを、又はポジティブ・コントロールとして100 ng/mlのインスリン様成長因子-1 (IGF-1)を加える。カリウム欠乏により誘発される細胞死を判定するために、25 mM KClを含む培地にインキュベートした培養物も実験に含める。
DIV3において、MTSアッセイ法を用いて生存を測定する。
【０３６２】
DIV8において、5 mM KClを含む無血清低カリウム培地に細胞を移すことにより、分化(神経性)培養物にアポトーシスを誘発する。異なる濃度のMTRNLを加え、また、上述したのと同じようなコントロール培養物も含ませる。24-72時間後に、MTSアッセイを使用して生存を測定する。
【０３６３】
MTSアッセイは、CellTiter 96(登録商標)水性非放射性細胞増殖アッセイ(プロメガ社)を使用し、製造会社の説明書に従って行う。
【０３６４】
このアッセイは、神経保護作用についての一般的なアッセイ、及び、小脳の障害の治療において治療的可能性を有する因子を予測するためのアッセイとして考えることができる。
【０３６５】
実施例5:運動ニューロン培養物に対する作用
手短に述べると、胎生期12.5日目(E12.5)のマウス胚の脊髄を摘出して分離する。運動ニューロンは、ニューロトロフィン受容体p75の細胞外ドメインに対する抗体を用いて免疫親和性精製し、続いて磁気性マイクロビーズを使用した細胞ソーティングをすることに基づくプロトコールを使用して精製する(Arce et al. 1999 J Neurosci Res 55: 119-126)。精製した運動ニューロンを、ポリオルニチン/ラミニンでコーティングした4-ウェル組織培養ディッシュ(ナンク社)に、ウェルあたり1000細胞の密度で蒔く。培養培地は、B27サプリメント(ライフ・テクノロジー社)、ウマ血清(2% v/v)、L-グルタミン(0.5 mM)、及び2-メルカプトエタノール(25μM)で補足したニューロベーサル培養培地(ライフ・テクノロジー社)である。
【０３６６】
蒔く時点で、段階希釈したリコンビナントMETRNLを加え、平行する培養にはネガティブコントロールとしてPBSが加えられる。2日間の培養後、2つ組(duplicate)のディッシュの中央の事前に定められた1.5cm2の領域にある、長い軸索突起を有し位相差顕微鏡で明るく見える(phase-bright)大きなニューロンの数を数えることにより、運動ニューロンの生存を定量化する。
【０３６７】
このアッセイにおける保護性作用は、ALS、脊髄損傷、SMA (脊髄性筋萎縮症)、DMD (デュシェンヌ型筋ジストロフィー)を含む運動ニューロン疾患における治療的可能性を示す。
【０３６８】
実施例6:ドーパミン系神経栄養活性のバイオアッセイ
培養条件:
分離された中脳細胞の培養物は、微細な修正を加える他は過去に記述された通りに(Friedman and Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79:65-72)調製する。手短に述べると、妊娠13-16日目のスプラーグドーリー・ラット胚の脳からの吻側中脳被蓋(rostralmesencephalic tegmentum)を、無菌状態で顕微鏡下で摘出し、Ca2+及びMg2+ を含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水(ギブコ社、Gaithersburg, Md.)に回収し、穏やかな研和(trituration)により分離させる。細胞を、400 μlの培地を含む直径16-mmの組織培養ウェル(ファルコン社、Lincoln Park, N.J.、24-ウェル・プレート)にウェルあたり100μl蒔き、ウェルあたりの細胞数が2.5-3.5x105という密度となるようにする。当該培養ウェルは、事前に、10 mMホウ酸ナトリウム(pH 8.4)中の0.1 mg/mlのポリL-オルニチン溶液に37℃で3時間晒し、ミリ-Q水で3回洗浄し、アールの平衡塩類溶液(ギブコ社)で1回洗浄しておく。フィーディング培地(10/10)は、グルコース(33 mM)、炭酸水素ナトリウム(24.5 mM)、グルタミン(2 mM)、HEPES (15 mM)、ペニシリンG (5 U/ml)、ストレプトマイシン(5 μg/ml)、10% 熱不活性化ウシ胎児血清(ギブコ社)、及び10% 熱不活性化ウマ血清(ギブコ社)で補足した最少必須培地(MEM、ギブコ社)から成る。当該培養物は、37℃で、6.5%CO2を含む水飽和環境下に維持される。3時間後、殆どの細胞がウェルの底に付着したら、培地を500 μlの新鮮な培地と取り替える。この時点で、ドーパミン系神経栄養活性についてアッセイするためのサンプル(METRNLタンパク質の溶液)の段階希釈を、2ウェルずつ(in duplicate)に加え、プレートを37℃インキュベーター中でインキュベートする。1週間後、培養物をフルオロデオキシウリジン(13 μg/ml)及びウリジン (33μg/ml)で24時間処理してグリアの過剰な増殖を阻止し、その後、ウシ胎児血清を含まない上記培地で培養する。当該フィーディング培地を週ごとに取り替える。
【０３６９】
あるいは、化学的に規定された(即ち血清がタンパク質、ホルモン、及び塩の混合物により置き換えられた)無血清培地を使用する。当該規定培地(DM)は、グルコース(33 mM)、グルタミン (2 mM)、 NaHCO3 (24.5 mM)、HEPES (15 mM)を含み、トランスフェリン(100 μg/ml)、インスリン(25 μg/ml)、プトレシン(60 μM)、プロゲステロン(20nM)、亜セレン酸ナトリウム(30 nM)、ペニシリンG (5U/ml)及びストレプトマイシン(5 μg/ml)で補足されたMEMとF12栄養素混合物との混合物(どちらもギブコ社、1:1; vol/vol)から成る。DMのモル浸透圧濃度は、ミリ-Q H2Oの添加によって325に調節する(110-125 ml H2O/l)。
【０３７０】
ドーパミン系ニューロンの機能状態は、Karlsson et al, 2002, Brain Res. 2002 Nov 15;955(1-2):268-80に記述されたように、これらの培養物において、特異的な「スカベンジャー」トランスポーターを通したドーパミン作動性ニューロンにおけるドーパミン取り込みを測定すること、及び、免疫組織化学を使用してドーパミン合成酵素チロシンヒドロキシラーゼについて陽性であるニューロンの数を数えることによって、アッセイすることができる。
【０３７１】
サンプル調製:
中脳細胞培養においてドーパミン系神経栄養活性についてアッセイする前に、全ての馴化培地サンプルは次のように脱塩する。100μl の10/10倍地(担体として)をCentricon10(アミコン社)に加え、10分間静置する。アッセイするサンプルの一定分量をCentriconに加え、続いて1 mlのダルベッコ高グルコース修正イーグル培地(炭酸水素を含まないが10 mM HEPES, pH 7.2 を含む)(溶液A)を加え、5,000Xgで70分間、遠心する。残余分(約0.1ml)を、新鮮な溶液Aで1.1 mlに戻し、2回再濃縮化する。当該サンプルを、培養ウェルに加える前に、0.11 μmのウルトラフリーMC無菌デュラポア・ユニット(ミリポア社、マサチューセッツ州ベッドフォード)で濾過する。
【０３７２】
3H-ドーパミン取り込み:
微細な修正を加えたほかは過去に記述されたように(Friedman and Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79:65-72)、6又は7日目の培養物においてトリチウム標識ドーパミン(3H-DA)の取り込みを行い、全ての溶液は37℃に維持する。手短に述べると、培養培地を除去し、5.6 mMグルコース、1.3 mM EDTA、0.1 mM アスコルビン酸及び0.5 mMパージリン(モノアミン酸化酵素の阻害剤である)を含むクレブス-リンゲルのリン酸緩衝液(pH 7.4)から成る0.25 mlの取り込み用緩衝液で2回リンスする。当該培養物を0.25 ml の 50 nM 3H-DA(ニューイングランド・ヌクレアー社、マサチューセッツ州ボストン。比放射能36-37 Ci/mmol)と共に15分間、37℃においてインキュベートする。インキュベーション混合物を除去することにより3H-DA取り込みを停止させ、0.5 mlの取り込み用緩衝液で2回細胞を洗浄する。細胞から3H-DAを放出させるために、当該培養物を0.5 mlの95%エタノールと共に30分間、37℃でインキュベートし、それから10 mlのエコライト (ICN社、カリフォルニア州アーヴァイン)に加え、シンチレーションカウンター上でカウントを行う。ブランク値は、取り込み用緩衝液に0.5mMのGBR-12909 (RBI社)(ドーパミン系ニューロンの高親和性取り込みポンプの特異的阻害剤である)を加えることによって得る(Heikkila et al. 1984 Euro J.Pharmacol. 103:241-48)。
【０３７３】
コントロール処置と比較して、TH陽性のニューロンの数の増加、及び/又は3H-ドーパミン取り込みの増加が見られることは、パーキンソン病の治療においてMETRNLが機能を有する可能性を示すものである。
【０３７４】
実施例7:ラット線条体内6-OHDA病変モデルにおける黒質ドーパミン性ニューロンの神経保護の評価
VSV-G偽型(rLV)ベクターは、過去に記述されたように産生される(Zufferey et al.,1997, J. Virol, 73:2886-2892; Rosenblad et al. 2000 Mol Cell Neurosci.15(2):199-214)。手短に述べると、緑色蛍光タンパク質(GFP)又はMETRNLのcDNAを有する伝達プラスミドpHR'CMV-Wを、ヘルパー・プラスミドpMD.G及びpCMVDR8.91と共に、293T細胞に共トランスフェクトする。ウイルス粒子を含む上清を、トランスフェクションの2日後及び3日後に回収し、116 000gにおける超遠心により濃縮化する。293T細胞の濃縮化上清の段階希釈により、rLV-GFPベクター・ストックのタイターを決定する。過去に記述されたように (vonSchwedler et al. 1993 Virol. 67(8):4945-55)RNAスロット・ブロット技術を用いて、rLV-METRNL 及び rLV-GFPのウイルス・ストックについてウイルス粒子のタイターを決定し、TUとrLV-GFPについて得られたウイルス粒子タイターとの間の比から、rLV-METRNLベクターのタイターをTU/mlとして見積もる。
【０３７５】
実験動物に関わる全ての作業は、実験動物使用についての倫理委員会により定められた指針に従って行う。ラットは、12:12時間明/暗サイクル中、ラット用固形飼料及び水へのアクセスがある状態で飼育する。メスのスプラーグドーリー・ラット(手術の時点で約220g)を使用する。定位的な手術においては、イソフルラン(バクスター社)で動物を麻酔し、一匹あたり合計2 x105 TUのrLV-GFP (n=8)又はrLV-METRNL (n=8)のウイルス・ストックを、右線条体の2つのトラクト(1, 2)及び黒質(3)において、以下の座標において注射する:(1) AP = +1.4 mm, ML = -2.6 mm, DV = -5.0 及び -4.0 mm, Tb = -2.3, (2) AP = 0.0 mm, ML = -3.7 mm, DV = -5.0 及び -4.0 mm, Tb = -2.3 並びに (3) AP = -5.2 mm, ML= -2.0 mm, DV = -6.8 mm, Tb = -2.3。2週間後、動物を再び麻酔し、定位固定フレーム中に置く。6-ヒドロキシドーパミン(3 μlの媒体[0.2%アスコルビン酸を含む食塩水]あたり20 μg [フリーの塩基として計算])の注射を、右線条体において、次の座標にて行う:AP = +1.0 mm, ML = -3.0 mm, DV = -5.0 mm, Tb = -2.3。
【０３７６】
病変の4週間後に、動物をペントバルビタール(70 mg/kg、Apoteksbolaget社、スウェーデン)で深く麻酔し、心臓を介して50 mlの室温食塩水を、続いて200 mlの氷冷リン酸緩衝4%パラホルムアルデヒド(pH 7.2-7.4)を灌流適用する。脳を同じ固定液中で3-6時間、事後固定し、24時間30%スクロースに移し、氷点下のミクロトームで6シリーズの40 μm厚切片にカットする。
【０３７７】
黒質におけるドーパミン系ニューロン(チロシンヒドロキシラーゼ(TH)及び小胞モノアミン輸送体(VMAT)について免疫反応性である)を検出するための免疫組織化学は、過去に記述されたように行う(Rosenblad et al. 2000 Mol Cell Neurosci. 15(2):199-214)。各実験グループの動物について、コントロール側と較べた場合の病変におけるTH-IR及びVMAT-IRの黒質ニューロンの数を、立体解析学的な細胞カウンティングにより評価する。
【０３７８】
GFPコントロールに較べてMTRNL処置グループにおいて生存TH-IRニューロンの数が増加していることは、パーキンソン病の治療における機能性を強く示唆するものである。VMAT-IRの数の増加はその結論をさらに強化する。
【０３７９】
実施例8:ヒト神経性前駆細胞の分化に対するhMETRNLの作用
hNS1細胞における試験
hNS1(旧称HNSC.100)は、胚前脳由来、多分化能性の、神経幹細胞のクローン細胞株であり、過去に記述されている(Villa et al. 2000, Exp Neurol, 161(1):67-84、Villa et al 2004, Exp Cell Res. Apr 1; 294(2):559-70)。細胞は、Department of Molecular Biology, Centre of Molecular Biology SeveroOchoa, Autonomous University of Madrid-CSIC, Campus Cantoblanco, Madrid, 28049,SpainのAlberto Martinez Serrano氏から提供される。hNS1培養物は、20 ng/mlのEGF及びbFGFで補足した無血清HSC培地中で、5%CO2及び37℃の環境下で、ポリL-リジン・コートしたTCフラスコ内で増殖する。HSC培地は、N2及び1% BSAで補足したDMEM/F12 (1:1)から成る。分化実験においては、hNS1細胞は、無マイトジェンの0.5% FBS含有HSC培地中、105細胞/cm2の密度で、50 μg/mlポリ-リジンでコートしたカバーグラス上に播種する。播種の1日後、当該分化用培地を、METRNL含有培地に置き換える。コントロール培養物にはHSC培地を与える。次の日に培地の3分の2を取り替え、その後2,3日ごとに取り替える。播種の4日後、培養物を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、免疫組織化学で染色する。
【０３８０】
免疫組織化学
10%正常ウマ血清でブロッキングした後、培養物をGFAP(pAb ウサギ抗ウシ, 1:1000, DAKO社)及びβ-チューブリン(mAb クローンSCL:3D10, 1:1000, シグマ社)に対する一次抗体と共にインキュベートする。リンスした後、それぞれ二次抗体であるビオチン化ウマ抗マウス抗体(ベクターラボラトリー社、1:200)(ストレプ-Cy3(ジャクソン・イミュノリサーチ社、1/200)の使用を後に伴う)、及び、Alexa Fluor 488-標識ヤギ抗ウサギ抗体(モレキュラープローブズ社、1:200)と共に培養物をインキュベートする。細胞核を0.2 μg/mlのHoechst33258で対比染色する(Villa et al., 2004)。解析においては、細胞(核)の数、並びにGFAP及びβ-チューブリン陽性細胞の数を、63x対物レンズを用いた共焦点顕微鏡でカウントする。
【０３８１】
MTRNL存在下におけるニューロン数の増加は、培養物中に存在する神経前駆細胞の分化の増加、及び/又は、分化ニューロンに対する生存作用の結果であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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