(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清または血漿試料中の
a)  s-ErbB-3
b)  任意に、癌の1つ以上の他のマーカー
の濃度を測定する工程、ならびに
c)  乳癌の評価において工程(a)および任意に工程(b)の測定結果を使用する工程を含み、ここで、s-ErbB-3の濃度の増大は乳癌を示す、
インビトロで乳癌を評価するための方法。
【請求項２】
血清または血漿試料中の
a)  s-ErbB-3
b)  任意に、癌の1つ以上の他のマーカー
の濃度を測定する工程、ならびに
c)  結腸直腸癌の評価において工程(a)および任意に工程(b)の測定結果を使用する工程を含み、ここで、s-ErbB-3の濃度の増大は結腸直腸癌を示す、
インビトロで結腸直腸癌を評価するための方法。
【請求項３】
さらに、工程(b)の前記1つ以上の他のマーカーが、CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
さらに、濃度が免疫学的方法によって測定されることを特徴とする、請求項１〜３いずれか記載の方法。
【請求項５】
乳癌および結腸直腸癌からなる群より選択される癌のインビトロ評価におけるs-ErbB-3の使用。
【請求項６】
乳癌の評価における請求項５記載の使用。
【請求項７】
結腸直腸癌の評価における請求項５記載の使用。
【請求項８】
s-ErbB-3の濃度の増大が乳癌または結腸直腸癌を示す、乳房または結腸直腸の癌のインビトロ評価におけるs-ErbB-3に対する抗体の使用。
【請求項９】
s-ErbB-3の濃度の増大が乳房または結腸直腸の癌を示す、乳房または結腸直腸の癌のインビトロ評価におけるs-ErbB-3および任意に癌の1つ以上の他のマーカーを含むマーカーパネルの使用。
【請求項１０】
さらに、任意の1つ以上の他のマーカーが、CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2からなる群より選択されることを特徴とする、請求項９記載のマーカーパネルの使用。
【請求項１１】
乳癌の評価における請求項９または１０記載のマーカーパネルの使用。
【請求項１２】
結腸直腸癌の評価における請求項９または１０記載のマーカーパネルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の評価を補助する方法に関する。本発明は、異なる種類の癌のユニバーサルマーカーとしてのs-ErbB-3の使用を開示する。s-ErbB-3の測定は、例えば癌の早期検出もしくは診断、または手術を受けている患者のサーベイランスに使用することができる。
【０００２】
検出および治療の進歩にも関わらず、癌は主要な公衆衛生課題のままである。癌細胞は、癌関連マーカータンパク質の産生を特徴とする。癌関連タンパク質は、癌細胞を有する個体の組織内および体液中の両方に見られ得る。そのレベルは、通常、発癌性進行の初期の病期では低く、疾患の進行中に増大し、稀な症例では、疾患進行過程でレベルの減少を示す癌関連タンパク質が観察される。これらのタンパク質の感度のよい検出は、癌の診断、特に癌の早期病期の診断において有利で有望なアプローチである。最も罹病率が高い癌の型は、乳癌(BC)、肺癌(LC)および結腸直腸癌(CRC)である。
【０００３】
固形腫瘍のための最も重要な治療アプローチは、
a)腫瘍の外科切除、
b)化学療法、
c)放射線療法、
d)生物製剤、例えば抗腫瘍抗体または抗脈管形成抗体を用いた治療、および
e)上記方法の組み合わせ
である。
【０００４】
腫瘍の外科切除は、初期病期の固形腫瘍の第一線治療として広く受け入れられている。しかし、ほとんどの癌は、症状が出た場合、即ち患者が既に疾患進行のかなり後期病期にある場合にのみ検出される。
【０００５】
癌の病期分類は、程度、進行、および重症度の点での疾患の分類である。これは、一般化が予後および治療の選択について行われ得るように、癌患者を分類する。
【０００６】
異なる病期のBCまたはCRCは、デュークスの病期A〜Dに従って分類されている。今日、TNMシステムは、癌の解剖学的程度の最も広く使用される分類である。これは、国際的に受け入れられた統一病期分類システムを表す。3つの基本変数：T(原発性腫瘍の程度)、N(限局的リンパ節の状態)およびM(遠位転移の存在または非存在)がある。TNM基準は、UICC(国際対癌連合), Sobin, L.H., Wittekind, Ch. (編)：TNM Classification of Malignant Tumours, 第6版, 2002)によって公表されている。TNM状態が決定されると、患者は、I〜IVのローマ数字で示される病期に分類され、IVが最も進行した病期となる。TNM病期分類およびUICC病期は、Sobin L.H. and Wittekind (編)上掲から得られる以下の表に示されるように互いに対応する。
【０００７】
0005384672.tif 000002
【０００８】
特に重要なことは、癌、例えばBCまたはCRCの早期診断が非常に良好な予後に解釈されることである。CRCにおいて、結腸直腸の悪性腫瘍は、良性腫瘍、即ち腺腫から生じる。従って、最良の予後は腺腫病期で診断される患者にある。病期Tis、N0、M0またはT1〜3；N0；M0ほどの早期で診断された患者は、適切に治療されると、遠位転移が既に存在するときに診断された患者のわずか10％の5年生存率と比べて、診断後の90％を超える5年の生存機会を有する。
【０００９】
現在の検出方法、例えば、X線または核共鳴画像化などの画像化方法は、理論的に、一般的なスクリーニングツールとしての使用に少なくとも部分的に適切であり得る。しかし、これらは、非常に費用がかかり、多数の被験体、特になにも腫瘍症状がない被験体のマススクリーニングにおける一般的で広範な使用のための健康管理システムには価格が手頃ではない。
【００１０】
従って、本発明の課題は、腫瘍評価の単純で費用効率的な手順を提供すること、例えば癌を有すると疑われる個体を同定することである。この目的のために、組織試料または体液、例えば血液または血清または血漿で検出可能な一般腫瘍マーカーあるいはかかるマーカーのパネルが望ましい。
【００１１】
多くの血清腫瘍マーカーが既に臨床使用にある。例えば、サイトケラチン19(CYFRA 21-1)の可溶性30kDa断片、癌胎児性抗原(CEA)、神経特異的エノラーゼ(NSE)および扁平上皮癌抗原(SCC)が最も顕著なLCマーカーである。しかし、これらのいずれもがスクリーニングツールに必要な感度および特異性の基準を満たさない(Thomas, L., Labor und Diagnose, TH Books Verlagsgesellschaft, Frankfurt/Main, Germany (2000))。
【００１２】
臨床で有用であるために、単一マーカーとしての新規診断マーカーが、当該技術分野で公知の他のマーカーに匹敵すべきであるか、または該マーカーよりも優れているべきである。即ち、それぞれ単独でまたは1つ以上の他のマーカーと組み合わせて使用される場合のいずれかで、新規マーカーが診断感度および／または特異性における進歩をもたらすべきである。試験の診断感度および／または特異性は受信者動作特性によって最も評価され、これを以下で詳細に記載する。
【００１３】
全血、血清または血漿は、臨床ルーチンで最も広く使用される試料の供給源である。信頼性の高い癌検出を補助し、または初期予後情報を提供する初期腫瘍マーカーの同定によって、この疾患の診断および管理を大いに補助する方法がもたらされる。従って、癌、特にBCのインビトロ評価を改善するための緊急の臨床必要性が存在する。早期に診断される患者の生存機会が疾患の進行した段階で診断される患者と比べて非常に高いために、癌、例えばBCの早期診断を改善することが特に重要である。
【００１４】
公共衛生課題としてのBCに関して、BCのより効果的なスクリーニングおよび予防的測定が開発されることが不可欠である。
【００１５】
乳癌について現在利用可能な最も早期の検出手順は、臨床的な乳房検査およびマンモグラフィーを使用することを伴う。しかしながら、典型的に、腫瘍が明白になるか、またはマンモグラムにより検出され得る前に、有意な腫瘍サイズが存在している必要がある。乳房組織の密度および年齢は、スクリーニングマンモグラフィーの精度の重要な予測変数である。その感度は、非常に高密度の乳房を有する女性において63%から、ほぼ完全な脂肪性乳房を有する女性において87%の範囲である。感度は、約40歳の女性において69%から、80歳以上の女性において83%へと、年齢に伴い増加する(Carney, P.A. et al., Ann. Intern. Med. 138 (2003) 168-175)。生検実施されるわずか20〜25%のマンモグラフィーで検出された異常は、悪性であることを示す。前癌性および癌性の病変は、早期検出の最も良好なアプローチであるが、マンモグラフィーは、実施および結果の解釈に高度な注意および熟練の両方を要する高額な試験である(WHO, Screening for Breast Cancer, May 10, 2002; Esserman, L. et al., J. Natl. Cancer Inst. 94 (2002) 369-375)。
【００１６】
近年、膨大な量のいわゆる乳房特異的、さらには、いわゆるBC特異的遺伝子が報告されている。ほとんどの対応研究論文および特許出願は、癌組織対異なる組織または隣接する組織のそれぞれにおけるRNA発現パターンの解析により得られたデータに基づいている。かかるアプローチは、差違的mRNAディスプレイ技術として要約され得る。
【００１７】
mRNAディスプレイ技術から入手可能なデータの例としては、WO 00/60076が挙げられ、記載されている。この出願には、200より多くの単離されたポリヌクレオチドおよび対応するポリペプチドなど、ならびにBCの検出におけるそれらの使用が記載され、特許請求されている。しかしながら、mRNAレベルの差は対応するタンパク質のレベルを反映していないことは一般常識である。希少なmRNAにコードされるタンパク質が非常に多量に見られることがあり、豊富なmRNAにコードされるタンパク質が検出されにくく全く見られないことがある(Chen, G. et al., Molecular and Cellular Proteomics 1 (2002) 304-313)。このmRNAレベルとタンパク質レベルの間の相関の欠如は、mRNAの安定性、転写の効率、タンパク質の安定性などによる。
【００１８】
最近では、BCの診断に使用され得る候補マーカー分子を同定するために、異なる組織間または健常と疾患組織間の差を調べるアプローチがある。Wulfkuhle, J.D. et al., Cancer Research 62 (2002) 6740-6749では、BC組織と隣接する正常組織間で差違的に発現される57個のタンパク質が同定されている。個体から得られた液体試料由来のデータは報告されていない。
【００１９】
WO 02/23200には、表面増強レーザー離脱イオン化(SELDI)により見出された、約12個の乳癌関連スポットが報告されている。これらのスポットは、健常対象から得られた血清と比較して、BCを有する患者から得られた結成においてより高頻度で見られる。しかしながら、かかるスポットに含まれる分子（1つ以上）の実体、例えば配列は、知られていない。
【００２０】
長年、乳癌特異的マーカーを同定するために可能な非侵襲性方法として乳頭吸引液(NAF)が使用されている。Kuererらは、2Dゲル電気泳動により、片側に浸潤性の乳癌を有する女性から、両側の対の乳頭吸引液を比較した(Kuerer, H.M. et al., Cancer 95 (2002) 2276-2282)。乳癌罹患乳房のNAFにおいて30〜202の異なるタンパク質スポットが検出され、健常乳房の適合NAFには検出されなかった。これらのスポットを画像解析により検出した。しかしながら、タンパク質スポットの同定は分かっていない。
【００２１】
BCの分野において、多くの、現在増大中の候補タンパク質マーカーのリストにも関わらず、現在、これらの分子の臨床的/診断的有用性は分かっていない。臨床的に有用であるために、単一マーカーとして新規の診断マーカーは、当該技術分野において公知の最良の単一マーカーと少なくとも同程度に良好であるべきである。あるいは、新規のマーカーは、単一で使用されるか1つ以上の他のマーカーと組み合わせて使用される場合のそれぞれにおいて、診断感度および/または特異性のいずれかの進歩をもたらすべきである。試験の診断感度および/または特異性は、その受信者動作特性によって最も評価され、これを以下で詳細に記載する。
【００２２】
現在、癌抗原15-3（CA 15-3）、腫瘍関連ムチン、および癌胎児性抗原（CEA）、腫瘍関連糖タンパク質の検出に基づいた診断血液試験のみが、BCの分野において診断の補助に利用可能である。CA 15-3は通常、進行した乳癌を有する患者において増大する。CA 15-3レベルは稀に、早期病期の乳癌を有する女性において上昇する（Duffy, M.J., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 38 (2001) 225-262）。卵巣、肺および前立腺の癌も、CA 15-3レベルを上昇させることがある。上昇したレベルのCA 15-3は、療性乳房疾患または卵巣疾患、子宮内膜症、骨盤内炎症性疾患および肝炎などの非癌性状態に関連することがある。妊娠および乳汁分泌も、CA 15-3のレベルの上昇を引き起こし得る（国立がん研究所、Cancer Facts, Fact Sheet 5.18 (1998) 1-5）。CEAは主に、結腸直腸癌のモニタリング、特に疾患が転移した場合に使用される。しかしながら、乳癌を含む種々の癌がCEAのレベルの上昇をもたらし得る。
【００２３】
器官および腫瘍特異性の欠如のために、CA 15-3の測定もCEAの測定もBCのスクリーニングには推奨されていない。これらの腫瘍マーカーは、BC患者の追跡ケアに有用な診断ツールである（Untch, M. et al., J. Lab. Med. 25 (2001) 343-352）。
【００２４】
CYFRA 21-1は、肺癌について現在公知の肺癌の腫瘍マーカーのうちで最良のものであると現在みなされている。臓器特異的ではないが、これは主に肺組織で見られる。肺癌のためのCYFRA 21-1の感度は、他の良性肺疾患に対して95％の特異性で46〜61％であると記載されている。CYFRA 21-1の増大した血清レベルはまた、顕著な良性肝臓疾患、腎臓機能不全および浸潤性膀胱癌と関連している。CYFRA 21-1試験は、手術後治療サーベイランスに推奨される。
【００２５】
CEAは癌胎児抗原の群に属し、通常胚発生中に生成される。CEAは、臓器特異的ではなく結腸直腸癌のモニタリングに主に使用される。悪性疾患の他にも、いくつかの良性疾患、例えば肝硬変、気管支炎、膵臓炎および自己免疫疾患がCEA血清レベルの増大と関連している。良性肺疾患に対する95%特異性で、肺癌の感度は29〜44%であると報告されている。CEAの主な使用は、特に転移した場合の結腸癌のモニタリングにおいてである。しかしながら、乳癌などの種々の癌が高レベルのCEAを産生し得る。CEAの好ましい使用は、肺癌の治療サーベイランスである。
【００２６】
腫瘍関連ムチンであるCA 15-3（癌抗原15-3）は、BCの分野における診断の補助に利用可能である。CA 15-3は、通常、進行乳癌を有する患者において増大している。CA 15-3レベルは、稀に、初期の病期の乳癌を有する女性で上昇している(Duffy，M.J.，Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences 38(2001)225-262)。また、卵巣、肺および前立腺の癌でも、CA 15-3レベルが上昇し得る。CA 15-3の上昇レベルは、良性乳房または卵巣疾患、子宮内膜症、骨盤腹膜炎および肝炎などの非癌性状態と関連している可能性がある。また、妊娠および授乳期でも、CA 15-3レベルの上昇が引き起こされることがあり得る(National Cancer Institute、Cancer Facts、Fact Sheet 5.18(1998)1-5)。
【００２７】
糖脂質上のCA 19-9(糖鎖抗原19-9)、シアリル化ルイス(a)抗原)は、胃腸の癌の腫瘍マーカーである。これは、胎児の胃、腸および膵臓の上皮に生じる。また、肝臓、肺および膵臓の成人組織にも低濃度で見られ得る。腫瘍質量とCA 19-9アッセイ値との間に相関性はない。したがって、CA 19-9の測定を膵臓の癌腫の早期検出に使用することはできない。ムチンは主に肝臓で分泌されるため、場合によっては、わずかな胆汁欝滞でさえ、明白なCA 19-9血清レベルの上昇をもたらし得る。該マーカーは、主に、確認された膵臓の癌(感度70〜87%)を有する患者の疾患状態のモニタリングにおける補助として使用される。該集団の3〜7%は、ルイスa陰性/b陰性血液型構成を有し、決定基CA 19-9と反応性であるムチンを発現することができない。このことは、所見を解釈する際に考慮されなければならない。
【００２８】
ErbB-2 (HER-2)は、「ヒト上皮増殖因子受容体2（Human Epidermal growth factor Receptor 2）」を表し、ヒトc-erbB-2遺伝子の過剰発現は、乳癌における高い攻撃性に機能的に関連する。これは、より一般的には上皮増殖因子受容体ファミリーとして知られる、ErbBタンパク質ファミリーの構成員である(Peles, E. et al., Cell 69 (1992) 205-216)。ErbB-2 (HER-2)は、CD340（分化クラスター340）またはp185としても記されている。ErbB-2 (HER-2)は、乳癌の病理において治療の標的として、その役割が顕著である。これは、細胞膜結合受容体チロシンキナーゼであり、正常では細胞増殖および分化を誘導するシグナル伝達経路に関連している。ErbB-2は、オーファンレセプターであると考えられており、それを活性化し得るリガンドのEGFファミリーはまだない。しかしながら、ErbB受容体は、リガンド結合を二量体化し、ErbB-2はErbBファミリーの他の構成員の優先的な二量体化パートナーである。ヒトc-erbB-2遺伝子は、ヒト第17番染色体の長腕(17q11.2-q12)に位置する癌原遺伝子である。
【００２９】
本発明の意味において、BCの早期診断は、前癌性状態（DCIS）または転移が（近位も遠位も）全くない腫瘍病期すなわち、Tis、N0、M0またはT1〜4での診断のことをいい；N0；M0が存在する。Tisは、インサイチュでの癌を表す。好ましい態様において、ErbB-3の検出は、非転移病期におけるBCの診断に使用され、すなわち診断が病期Tis、N0、M0またはT1〜3；N0；M0 (=Tis-3；N0；M0)に行なわれる。
【００３０】
全血、血清または血漿は、臨床ルーチンで最も広く使用される試料の供給源である。信頼性の高い癌検出を補助し、または初期予後情報を提供する初期BC腫瘍マーカーの同定によって、この疾患の診断および管理を大いに補助する方法がもたらされる。従って、血液からのBCの診断を改善するための緊急の臨床必要性が存在する。早期に診断される患者の生存機会が疾患の進行した段階で診断される患者と比べて非常に高いために、BCの早期診断を改善することが特に重要である。
【００３１】
癌疾患の評価に使用され得る生化学マーカーを同定できるかどうかを調べることが本発明の目的であった。特に、本発明の発明者らは、組織試料または体液において、乳癌、結腸直腸癌および/または卵巣癌などの異なる癌型の評価のための生化学マーカーを同定できるかどうかを調査した。
【００３２】
驚くべきことに、(i) 分離されたヒト「c-erbB-3癌遺伝子」タンパク質の細胞外ドメインおよび(ii) ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライシングバリアントにコードされる分泌タンパク質アイソフォームを含む、s-ErbB-3のバイオマーカーとしての使用により、少なくとも部分的に、当該技術分野において現在公知のマーカーの課題が克服され得ることが見出された。
【発明の概要】
【００３３】
発明の概要
一態様において、本発明は、試料中の(a) s-ErbB-3、(b) 任意に癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を測定する工程、および(c) 工程(a)および任意に工程(b)の測定結果を癌の評価に使用する工程を含む、インビトロでの癌の評価方法に関するものであり、s-ErbB-3の濃度の増加は癌を示す。
【００３４】
さらに、本発明は、癌の評価におけるs-ErbB-3の使用に関する。
【００３５】
さらに、本発明は、癌の評価におけるs-ErbB-3タンパク質に対する抗体の使用に関するものであり、s-ErbB-3の濃度の増加は癌を示す。
【００３６】
さらに、本発明は、癌の評価におけるs-ErbB-3および任意に癌の1つ以上の他のマーカーを含むマーカーパネルの使用を開示し、s-ErbB-3の濃度の増加は癌を示す。
【００３７】
さらに、本発明は、s-ErbB-3を特異的に測定するのに必要な試薬、および任意に癌の1つ以上の他のマーカーを特異的に測定するのに必要な試薬を含む、試料中の(a) s-ErbB-3、(b) 任意に癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに工程(a)および任意に工程(b)の測定結果を癌の評価に使用する工程を含むインビトロで癌を評価する方法を実行するためのキットに関するものであり、s-ErbB-3の濃度の増加は癌を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図1は、異なる疾患群におけるs-ErbB-3 のBoxプロットを示す。BC = 乳癌；CRC = 結腸直腸癌；ctrl = 対照コホート。
【図２】図2は、明らかに健常な個体から得られた43個の対照試料と比較した、乳癌（BC）を有する患者から得られた39個の試料の評価について0.79のAUCを有するBC試料 におけるs-ErbB-3の受信者動作特性のプロット（ROC-プロット）を示す。
【図３】図3は、明らかに健常な個体から得られた43個の対照試料と比較した、BCを有する患者から得られた110個の試料の評価について0.79のAUCを有する結腸直腸癌（CRC）試料におけるs-ErbB-3の受信者動作特性のプロット（ROC-プロット）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
発明の詳細な説明
好ましい態様において、本発明は、試料中のs-ErbB-3の濃度を測定する工程、および測定結果、特に測定された濃度を癌の評価に使用する工程を含む、インビトロで癌を評価する方法に関する。
【００４０】
驚くべきことに、試験試料中のs-ErbB-3の濃度の増大が癌の発生と関連することが見出された。s-ErbB-3は、単一型の癌に特異的なマーカーではなく、異なる型の癌のマーカー、即ち一般腫瘍マーカーであることが示され得る。s-ErbB-3は腫瘍形成プロセスにかなり特異的であるように思われるため、新規腫瘍マーカーs-ErbB-3は、様々なクラスの腫瘍型について臨床で有用である可能性が高い。
【００４１】
さらに、本発明の方法は、多くの種々の型の癌の評価に適切である。正常対照と比べて試料中のs-ErbB-3タンパク質の濃度の増大は、特定の型の癌、例えば、乳房、結腸直腸および/または卵巣のそれぞれで見られた。
【００４２】
本発明の好ましい態様によれば、s-ErbB-3の濃度は、乳癌、結腸直腸癌および/または卵巣癌などの特定の型の癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様によれば、s-ErbB-3の濃度は、乳癌、結腸直腸癌および/または卵巣癌などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００４４】
本発明の別の好ましい態様によれば、s-ErbB-3の濃度は、乳房および/または結腸直腸の癌などの癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００４５】
本発明の別の好ましい態様によれば、s-ErbB-3の濃度は、乳癌をインビトロで評価するために試料中で測定される。
【００４６】
本発明の一態様は、おそらく癌のない個体と、「疑いのある」症例として分類され得る個体とを区別するための集団のマススクリーニングに関する。後者の群の個体は、次に例えば画像化方法または他の適切な手段により、さらなる診断手順に供され得る。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、一般的な癌の診断に適切な腫瘍マーカーパネルまたは特定の腫瘍型、例えば乳癌の診断に適切な腫瘍マーカーパネルの改善に関する。
【００４８】
本発明はまた、s-ErbB-3ならびに癌に特異的な１つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された測定結果、特に測定された濃度を癌の評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌の評価方法に関する。s-ErbB-3と組み合わせた使用に好ましいマーカーは、一方で、一般腫瘍マーカー(即ち、単一腫瘍型に特異的ではないマーカー)または他方で特異的腫瘍マーカー(単一腫瘍型に特異的なマーカー)のマーカーである。例えば、乳癌または結腸直腸癌などの癌の評価に好ましいマーカーは、Cyfra 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2 (HER-2)である。これらのマーカーは、個々にそれぞれまたはs-ErbB-3と共に任意の組み合わせで使用され得る。
【００４９】
本発明のこの方法により癌が評価される場合、それぞれの癌の1つ以上の他のマーカーは、好ましくはCyfra 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2からなる群より選択される。
【００５０】
したがって、本発明は、好ましい態様において、癌、例えば乳癌、卵巣癌および/または結腸直腸癌の評価における、少なくともマーカーs-ErbB-3ならびに少なくとも1つの他の腫瘍マーカーを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５１】
本発明はまた、癌の評価におけるs-ErbB-3に対する抗体の使用に関するものであり、s-ErbB-3の濃度の増加は癌を示す。
【００５２】
さらに、本発明は、癌の評価におけるヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライシングバリアントによりコードされる分泌タンパク質アイソフォームに対する抗体の使用に関するものであり、ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライシングバリアントにコードされる分泌タンパク質アイソフォームの濃度の増加は癌を示す。
【００５３】
さらに、本発明は、癌の評価におけるヒト「c-erbB-3癌遺伝子」タンパク質の分離されたタンパク質の細胞外ドメインに対する抗体の使用に関するものであり、ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」タンパク質の分離された細胞外ドメインの濃度の増加は癌を示す。
【００５４】
好ましくは、本発明は、試料中のs-ErbB-3ならびに１つ以上の他の癌マーカー、例えば乳癌または結腸直腸癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された測定結果、特に測定された濃度を癌の評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌、例えば肺癌または結腸癌の評価方法に関する。１つ以上の他のマーカーは、CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2からなる群より選択されることが好ましい。
【００５５】
本発明はまた、好ましい態様において、癌、特に乳癌または結腸直腸癌、より詳しくは結腸直腸癌の評価における、少なくともs-ErbB-3およびCYFRA 21-1を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５６】
本発明はまた、好ましい態様において、癌、特に乳癌または結腸直腸癌、より詳しくは結腸直腸癌の評価における、少なくともs-ErbB-3およびCEAを含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５７】
本発明はまた、好ましい態様において、癌、特に乳癌または結腸直腸癌、より詳しくは結腸直腸癌の評価における、少なくともs-ErbB-3およびCA 15-3を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５８】
本発明はまた、好ましい態様において、癌、特に乳癌または結腸直腸癌、より詳しくは結腸直腸癌の評価における、少なくともs-ErbB-3およびCA 19-9を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００５９】
本発明はまた、好ましい態様において、癌、特に乳癌または結腸直腸癌、より詳しくは結腸直腸癌の評価における、少なくともs-ErbB-3およびErbB-2を含むマーカーパネルの使用に関する。
【００６０】
本発明はまた、癌の評価におけるs-ErbB-3タンパク質の使用に関するものであり、s-ErbB-3の濃度の増加は癌を示す。
【００６１】
本発明はまた、いくつかの特異的な型の癌、特に乳癌、結腸直腸癌および/または卵巣癌の評価におけるs-ErbB-3の使用に関する。
【００６２】
本発明はまた、少なくともs-ErbB-3および癌の1つ以上の他のマーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００６３】
本発明はまた、上述のような、少なくともs-ErbB-3および任意に癌の1つ以上のマーカー、例えば乳癌、結腸直腸癌および/または卵巣癌のマーカーを特異的に測定するために必要な試薬を含み、該他のマーカーは、各々、個々に、またはその任意の組合せで使用される、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００６４】
本発明はまた、少なくともs-ErbB-3およびCYFRA 21-1のそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに該測定を実施するための任意の補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００６５】
本発明はまた、少なくともs-ErbB-3およびCEAのそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに該測定を実施するための任意の補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００６６】
本発明はまた、少なくともs-ErbB-3およびCA 15-3のそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに該測定を実施するための任意の補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００６７】
本発明はまた、少なくともs-ErbB-3およびCA 19-9のそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに該測定を実施するための任意の補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００６８】
本発明はまた、少なくともs-ErbB-3およびErbB-2のそれぞれを特異的に測定するために必要な試薬、ならびに該測定を実施するための任意の補助試薬を含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。
【００６９】
好ましい態様において、本発明は、試料中のa) s-ErbB-3、b) 任意に癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を測定する工程、ならびに(c) 工程(a)の測定結果および任意に工程(b)の測定結果を癌の評価において使用する工程を含む、インビトロで癌を評価するための方法に関するものであり、s-ErbB-3の濃度の増加は癌を示す。
【００７０】
用語「測定」は、好ましくは、試料中の定性的、半定性的または定量的なs-ErbB-3の測定を含む。好ましい態様において、測定は、半定量的測定であり、即ち、s-ErbB-3の濃度がカットオフ値より上か下にあるかどうかを測定する。当業者に認識されるように、はい(存在)またはいいえ(非存在)アッセイで、アッセイ感度は、通常、カットオフ値に適合するように設定される。例えばカットオフ値は、健常個体の群の試験から決定され得る。好ましくは、カットオフは90％の特異性をもたらすように設定され、また好ましくはカットオフは95％の特異性をもたらすように設定され、あるいはまた好ましくはカットオフは98％の特異性をもたらすように設定される。カットオフ値より上の値は、例えば癌の存在を示し得る。特に、カットオフ値より上の値は、例えば乳癌、結腸直腸癌および/または卵巣癌の存在を示し得る。さらに好ましい態様において、s-ErbB-3の測定は、定量的測定である。さらなる態様において、s-ErbB-3の濃度は、基礎にある診断問題、例えば疾患の病期、疾患進行、または治療への応答などに相関させられる。
【００７１】
特定の他の好ましい態様において、例えば治療または追跡のモニタリングにおいて、カットオフは90％の感度をもたらすように設定され、また好ましくはカットオフは95％の感度をもたらすように設定され、あるいはまた好ましくはカットオフは98％の感度をもたらすように設定される。
【００７２】
カットオフ値より下の値は、例えば、癌がないことを示すものであり得る。特に、カットオフ値より下の値は、例えば、乳癌、結腸直腸癌および/または卵巣癌がないことを示すものであり得る。
【００７３】
さらに好ましい態様では、s-ErbB-3の測定は定量的測定である。さらなる態様において、s-ErbB-3の濃度は、基礎にある診断問題、例えば疾患の病期、疾患進行、または治療への応答などに相関させられる。
【００７４】
ErbB-3ならびにErbB1、ErbB2およびErbB4は、上皮増殖因子受容体(EGFR/ErbB)ファミリーに属する。
【００７５】
分化因子またはヘウレグリン（heuregulin）としても知られるニューレグリンへの結合の際に、ErbB-3は、ErbB1、ErbB2またはErbB4とのヘテロ二量体化により活性化される(Riese, D.J. et al., Mol. Cell Biol. 15 (1995) 5770-5776)。ErbB-3またはErbB4への結合により、ニューレグリンは上皮、グリアおよび筋肉細胞の増殖または分化を誘導する(Lee, H. et al., Oncogene 16 (1998) 3243-3252; Lee, H. et al, Cancer Res. 61 (2001) 4467-4473; Citri, A.  et al., Exp. Cell Res. 284 (2003) 54-65)。
【００７６】
p180 ErbB-3または「ヒト上皮増殖因子受容体3」としても知られるヒトErbB-3タンパク質は、ヒトc-erbB-3癌遺伝子にコードされる。ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来の完全長mRNAにコードされる前記p180 ErbB-3糖タンパク質(180kDa)は、細胞外ドメイン（リガンド結合ドメイン、ECD）膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼに相同性を有する細胞質ドメインからなる(Kraus, M.H. et al., PNAS 86 (1989) 9193-9197; Plowman, G.D. et al., PNAS 87 (1990) 4905-4909)。
【００７７】
用語「s-ErbB-3」は、(i) 分離された（shed）ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」タンパク質の細胞外ドメインおよび(ii) ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライシングバリアントによりコードされる分泌タンパク質アイソフォームに関する。
【００７８】
Lee, H. et al., Oncogene 16 (1998) 3243-3252には、卵巣癌由来細胞株から単離された4つの新規の選択的c-erbB-3癌遺伝子転写産物(mRNA)が報告されている。これらの選択的アイソフォーム（詳細については下記参照）の発現は、ノザンブロット解析を使用して試験されており、組織および細胞特異的局在が観察されている(Katoh, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 192 (1993) 1189-1197)。
【００７９】
分離されたヒトp180 ErbB-3タンパク質の細胞外ドメインを配列番号:1（野生型）に示す。今日知られているヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライシングバリアントにコードされる分泌タンパク質アイソフォームを配列番号:2 (p45 ErbB-3、アイソフォームR2)、配列番号:3 (p85 ErbB-3、アイソフォームR31)、配列番号:4 (p85 ErbB-3、アイソフォームR35)および配列番号:5 (アイソフォームR1/バリアント)に示す。
【００８０】
安定的にトランスフェクトされた線維芽細胞は、4種類の切断型形態が可溶性の分泌タンパク質であることを示す。培養培地中で、始原卵巣細胞株90kDa ErbB-3タンパク質アイソフォームは、ErbB-3のリガンド結合ドメインに対する抗体を使用することで検出可能であった（90kDa ErbB-3タンパク質アイソフォームは上述の85kDa ErbB-3タンパク質アイソフォームの高度にグリコシル化された形態である）。さらなる研究により、分泌p85 ErbB-3タンパク質アイソフォームは、ニューレグリンのErbB-3受容体への結合を阻害し、内因性リガンドが中和されることが示唆される。共に、この観察により、p85 ErbB-3タンパク質アイソフォームは、天然に存在するHRG-刺激シグナル伝達の負の調節因子であることが示唆される。最近、分泌p45 ErbB-3タンパク質アイソフォームが、前立腺癌を有する男性由来の骨髄上清試料において同定された。さらに、ヒト組織標本の免疫組織学的解析によると、分泌p45 ErbB-3タンパク質アイソフォームは骨中の転移前立腺癌細胞中に高度に発現されていた(Chen, N. et al., Cancer Res. 67 (2007) 6544-6548)。
【００８１】
当業者に明らかなように、本発明は、配列番号:1に示される完全長の分離されたErbB-3タンパク質の細胞外ドメインまたは配列番号:2〜5に示されるヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライシングバリアントによりコードされる分泌タンパク質アイソフォームに限定されないことが企図される。s-ErbB-3の生理学的または人工断片、s-ErbB-3の二次修飾物ならびにs-ErbB-3の対立遺伝子バリアントも本発明に包含される。ポリペプチドのバリアントは、同じ遺伝子によってコードされるが、例えば選択的mRNAまたはプレmRNAのプロセッシングの結果として等電点(=PI)または分子量(=MW)あるいは両方で異なり得る。バリアントのアミノ酸配列は、対応するマーカー配列に95％以上同一である。好ましくは、人工断片は、配列番号:1〜5に開示される配列由来の少なくとも6、7、8、9または10個の連続したアミノ酸からなる診断対象の1つのエピトープを少なくとも含む、合成または組み換え技術により作製されたペプチドを含む。かかる断片は、抗体の作製に有利に使用され得るか、またはイムノアッセイの標準として有利に使用され得る。より好ましい人工断片は、サンドイッチイムノアッセイに適した、少なくとも2つの目的のエピトープを含む。
【００８２】
R&D Systemにより、細胞培養上清中の天然および組み換えヒト上皮増殖因子受容体3を測定するためのErbB-3 ELISAアッセイが提供される。
【００８３】
Genentech Inc.により、ErbB-3タンパク質に結合し、ErbB2およびErbB-3を発現する細胞中のErbB2-ErbB-3タンパク質複合体のHRG誘導形成を低減する抗体が開示された。さらに、該抗体はヘレグリン（heregulin）のErbB-3タンパク質への結合親和性を増加させ、該特性はErbB2およびErbB-3を発現する細胞においてHRG誘導性のErbB2活性化を低減する。
【００８４】
本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれは、本項のものと関連する意味を有する。
【００８５】
冠詞「a」および「an」は、１つまたは1つより多く(即ち少なくとも１つ)の冠詞の文法的目的語を示すために本明細書で使用される。例として、「マーカー(aマーカー)」は、1つのマーカーまたは1つより多くのマーカーを意味する。用語「少なくとも」は、任意に1つ以上のさらなる目的語が存在し得ることを示すために使用される。例として、少なくとも(マーカー) s-ErbB-3およびCYFRA 21-1を含むマーカーパネルは、任意に１つ以上の他のマーカーを含み得る。
【００８６】
表現「1つ以上」は、1〜50、好ましくは1〜20、また好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、または15を示す。
【００８７】
用語「マーカー」または「生化学マーカー」は、本明細書で使用される場合、患者の試験試料を分析するための標的として使用される分子のことをいう。かかる分子標的の例は、タンパク質またはポリペプチドである。本発明でマーカーとして使用されるタンパク質またはポリペプチドは、前記タンパク質の天然バリアントおよび前記タンパク質または前記バリアントの断片、特に免疫学的に検出可能な断片を含むことが考えられる。免疫学的に検出可能な断片は、好ましくは前記マーカーポリペプチドの少なくとも6、7、8、10、12、15または20個の連続アミノ酸を含む。当業者は、細胞によって放出されるタンパク質または細胞外マトリックスに存在するタンパク質が、例えば炎症中に損傷され得、かかる断片に分解または切断され得ることを理解する。特定のマーカーは不活性化形態で合成され、次にタンパク質分解によって活性化され得る。当業者に認識されるように、タンパク質またはその断片が複合体の一部としても存在し得る。また、かかる複合体は、本発明の意味において、マーカーとして使用され得る。また、もしくはあるいは、マーカーポリペプチドまたはそのバリアントは、翻訳後修飾を有し得る。翻訳後修飾の非限定的な例は、グリコシル化、アシル化、および／またはリン酸化である。
【００８８】
s-ErbB-3タンパク質、特に(i) ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」タンパク質の分離された細胞外ドメインおよび(ii) ヒト「c-erbB-3癌遺伝子由来のmRNAのスプライシングバリアントによりコードされる分泌タンパク質アイソフォームは、適切な試料中で検出される。好ましい試料は、組織試料、または血液、血漿、血清、便（CRCが疑われる場合に好ましい）、乳頭吸引液（=NAF；BCが疑われる場合に好ましい）などの体液等である。好ましくは、該試料は、ヒト被験体、例えば腫瘍患者または腫瘍のリスクを有するヒトまたは腫瘍を有すると疑われるヒト由来である。また、好ましいs-ErbB-3は、血清または血漿試料中に検出される。
【００８９】
本発明の好ましい態様において、s-ErbB-3の濃度が測定される。一態様において、マーカーs-ErbB-3は、特異的結合剤を使用して試料から特異的に測定される。
【００９０】
特異的結合剤は、例えばs-ErbB-3のレセプター、s-ErbB-3に結合するレクチン、またはs-ErbB-3に対する抗体である。特異的結合剤は、その対応する標的分子に対して少なくとも107l/molの親和性を有する。特異的結合剤は、好ましくはその標的分子に対して108l/molあるいはまた好ましくは109l/molの親和性を有する。当業者に認識されるように、用語特異的は試料中に存在する他の生体分子がs-ErbB-3に特異的な結合剤に有意に結合しないことを示すために使用される。好ましくは、標的分子以外の生体分子に結合するレベルは、標的分子に対する結合親和性の最大わずか10％以下、わずか5％以下、わずか2％以下、またはわずか1％以下それぞれの結合親和性を生じる。好ましい特異的結合剤は、親和性および特異性の上記最低基準の両方を満たす。
【００９１】
特異的結合剤は、好ましくはs-ErbB-3と反応性である抗体である。用語抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、かかる抗体の抗原結合断片、単鎖抗体ならびに抗体の結合ドメインを含む遺伝子構築物のことをいう。
【００９２】
特異的結合剤の上記基準を満たす任意の抗体断片が使用され得る。抗体は、当該技術分野の水準の方法によって、例えばTijssen(Tijssen，P.，Practice and theory of enzyme immunoassays、11、Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam、本全体、特に43-78頁)に記載されるように作製される。また、当業者は、抗体の特異的単離に使用され得る免疫吸着剤に基づく方法を知っている。これらの手段によって、ポリクローナル抗体の質および従って免疫アッセイにおけるそれらの性能が高められ得る(Tijssen, P., 上掲、108-115頁)。
【００９３】
本発明に開示される成果のために、ウサギにおいて惹起されたポリクローナル抗体が使用され得る。しかし、明らかに、異なる種、例えばヒツジまたはヤギのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体も使用され得る。モノクローナル抗体は任意の必要量で一定した性質で生成され得るために、これらは臨床ルーチンのアッセイの開発における理想的なツールを表す。本発明の方法におけるs-ErbB-3に対するモノクローナル抗体の作製および使用のそれぞれは、さらに他の好ましい態様を表す。
【００９４】
ここに、当業者は、s-ErbB-3が、癌、好ましくは乳癌または結腸直腸癌の評価において有用なマーカーとして同定されたことを認識するため、本発明の成果に匹敵する結果を達成するために様々な免疫診断方法が使用され得る。例えば、抗体を作製するための代替的戦略が使用され得る。かかる戦略は、中でも免疫化のためのs-ErbB-3のエピトープを表す合成ペプチドの使用を含む。あるいは、DNAワクチン接種としても公知のDNA免疫化が使用され得る。
【００９５】
測定のために、個体から得られた試料は、結合剤s-ErbB-3複合体の形成に適切な条件下でs-ErbB-3の特異的結合剤とインキュベートされる。当業者はいかなる発明の努力をすることなく、かかる適切なインキュベーション条件を容易に同定し得るために、かかる条件は特定される必要はない。結合剤s-ErbB-3複合体の量が測定され、癌、好ましくは肺癌の評価に使用される。当業者に認識されるように、特異的結合剤s-ErbB-3複合体の量を測定する多くの方法が存在し、全ては関連の教科書に詳細に記載されている(例えば、Tijssen, P., 上掲、またはDiamandis, E.P., and Christopoulos, T.K. (編), Immunoassay, Academic Press, Boston (1996)参照)。
【００９６】
好ましくは、s-ErbB-3は、サンドイッチ型アッセイ形式で検出される。かかるアッセイにおいて、一方でs-ErbB-3を捕捉するために第一特異的結合剤が使用され、他方で直接的または間接的に検出可能に標識される第二特異的結合剤が使用される。サンドイッチ型アッセイ形式で使用される特異的結合剤は、s-ErbB-3に対して特異的な抗体であり得る。検出は、異なる捕捉抗体および標識抗体、即ちs-ErbB-3タンパク質上の異なるエピトープを認識する抗体を使用することによって行われ得る。
【００９７】
本発明の意味において「癌のマーカー」、特に「BC、CRCおよびOCからなる群より選択される癌のマーカー」は、マーカーs-ErbB-3と組み合わせた場合に、一般的な癌の評価における癌疾患の評価において、または特定の癌の型の評価において、例えばBCの評価において関連する情報を付加する任意のマーカーである。癌の評価に対して、所定の特異性での感度または所定の感度での特異性それぞれが、マーカーs-ErbB-3を既に含むマーカー組み合わせに前記マーカーを含ませることによって改善され得る場合に、情報は関連するまたは付加的な価値とみなされる。癌評価の好ましい態様において、感度または特異性それぞれの改善は、p = .05、.02、.01以下の有意さのレベルで統計学的に有意である。好ましくは、1つ以上の他の腫瘍マーカーは、CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2からなる群より選択される。
【００９８】
用語「試料」は、本明細書で使用される場合、インビトロでの評価の目的で得られる生物学的試料のことをいう。本発明の方法において、試料または患者試料は、好ましくは任意の体液を含み得る。好ましい試料は、全血、血清、血漿、乳頭吸引液（= NAF；BCが疑われる場合に好ましい）、便（CRCが疑われる場合に好ましい）、組織溶解物または組織試料であり、血漿または血清が最も好ましい。
【００９９】
用語「組織試料」および／または「組織切片」は、本明細書において使用される場合、インビトロ評価目的のための細胞または組織の除去を伴う、手術中に患者から採取された生物学的試料、治療的切除物または生検材料(例えば、切開生検材料、切除生検材料、コア生検材料または穿刺吸引生検材料)をいう。本発明による解析を行なう場合、組織試料物質は、直接または「組織溶解物」としてのいずれかで使用される。また、「組織試料」は、本明細書で使用されるように、通常ミクロトームの使用によって得られる組織薄片をいう。生物学的試料を伴う任意の開示された方法の態様において、かかる生物学的試料は、(必ずしもそうでなくてよいが)顕微鏡スライド上に置かれ得る、組織切片(ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片など)である、および／または新生物形成性組織(肺癌、結腸直腸癌、頭頚部癌、胃癌もしくはグリア芽腫など)である。
【０１００】
「組織溶解物」、「細胞溶解物」、「溶解物」、「溶解試料」、「組織抽出物」または「細胞抽出物」は、本明細書において使用される場合、溶解された組織または細胞を含む、すなわち、組織または細胞の構造的完全性が破壊された試料および／または生物学的試料物質をいう。細胞または組織試料の内容物を放出させるため、該物質は、通常、かかる組織または細胞の細胞壁および細胞膜を溶解、分解または破壊するための酵素および／または化学薬品で処理される。当業者は、溶解物を得るための適切な方法に充分精通している。このプロセスは用語「溶解」に包含される。
【０１０１】
用語「癌の評価」、特に「BC、OCおよびCRCからなる群より選択される癌の評価」は、本発明の方法が（単独または他のマーカーもしくは変数、例えばUICC(上記参照)に示される基準と共に）、例えば医師が癌、特にBCの非存在または存在を確立または確認することを補助し、あるいは予後、再発の検出(手術後の患者の追跡)および／または治療のモニタリング、特に化学療法のモニタリングにおいて医師を補助することを示すために使用される。
【０１０２】
当業者に認識されるように、任意のかかる評価がインビトロで行われる。患者試料が後で廃棄される。患者試料は、本発明のインビトロ診断方法だけに使用され、患者試料の物質は、患者の体に戻されない。好ましくは、試料は、液体試料、例えば全血、血清、または血漿である。
【０１０３】
特に記載のない限り、技術用語は慣用的用法に従って使用される。細胞分子生物学における一般的な用語の定義は、Lewin，B.，Genes V、published by Oxford University Press(1994)、ISBN 0-19-854287 9)；Kendrew et al.(編)、The Encyclopedia of Molecular Biology、Blackwell Science Ltd.出版(1994)、ISBN 0-632-02182-9)；およびMeyers，R.A.(編)、Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference、VCH Publishers、Inc.出版(1995)、ISBN 1-56081-569 8に見られ得る。
【０１０４】
好ましい態様において、本発明は、s-ErbB-3の濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された濃度を癌、例えばBCの評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによるインビトロでの癌、例えばBCの評価方法に関する。
【０１０５】
別の好ましい態様において、本発明は、s-ErbB-3の濃度を試料中で測定する工程、ならびに測定された濃度をBCの評価において使用する工程を含む、生化学マーカーによってBCをインビトロで評価するための方法に関する。
【０１０６】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、癌、特に乳癌(BC)、結腸直腸癌 (CRC)または卵巣癌(OC)を有する患者に由来する試料から有意な割合でマーカーs-ErbB-3の濃度の増大を検出できた。さらにより驚くべきことに、発明者らは、個体から得られたかかる試料中のs-ErbB-3の濃度の増大が癌、特に上記癌疾患の評価において使用され得ることを示すことができた。
【０１０７】
診断の理想的なシナリオは、単一の事象またはプロセスがそれぞれの疾患例えば感染性疾患を引き起こす状況である。全ての他の症例において、正確な診断は、特に疾患の病因が、多くの癌の種類、例えばBC、CRCまたはOCについて当てはまるように十分に理解されていない場合に非常に困難であり得る。当業者が理解するように所定の多要因疾患例えばBCについて100％特異性および同時に100％感度で診断する生化学マーカーはない。むしろ、生化学マーカー、例えばCYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9、ErbB-2、または本明細書に示されるs-ErbB-3が、特定の可能性または予測値で、例えば疾患の存在、非存在または重症度を評価するために使用され得る。従って、日常業務の臨床診断では、一般的に様々な臨床症状および生物学的マーカーは、基礎にある疾患の診断、治療および管理において共に考慮される。
【０１０８】
生化学マーカーは、個々に測定され得るか、または本発明の好ましい態様においてこれらはチップまたはビーズ系アレイ技術の使用によって同時に測定され得るかのいずれかである。生物マーカーの濃度は、次に例えば各マーカーのそれぞれのカットオフを使用して独立して解釈されるか、またはこれらが解釈のために組み合わされるかのいずれかである。
【０１０９】
さらに好ましい態様において、本発明の癌の評価は、a)s-ErbB-3、b)癌の1つ以上の他のマーカーの濃度を試料中で測定する工程、ならびにc)癌の評価において工程(a)および工程(b)それぞれで測定された測定結果、例えば濃度を使用する工程を含む方法において行われる。
【０１１０】
癌の評価において、マーカーs-ErbB-3は以下の局面：スクリーニング；診断補助；予後；化学療法、放射線療法、および免疫療法などの療法のモニタリングの1つ以上で有利である。
【０１１１】
スクリーニング：
スクリーニングとは、疾患のインジケータ、例えば癌の存在について、個体、例えば危険性のある個体を同定するための試験の体系的な適用として規定される。好ましくは、スクリーニング集団は、癌のリスクが平均より高いことが知られている個体からなる。例えば、乳癌のスクリーニング集団は、癌のリスクが平均より高いことがわかっている個体から構成される。
【０１１２】
好ましい態様において、組織試料または全血、血漿、血清、便（CRCが疑われる場合、好ましい）もしくは乳頭吸引液（= NAF；BCが疑われる場合、好ましい）などの任意の体液が、癌、例えば、乳癌のスクリーニングに使用される。
【０１１３】
別の好ましい態様において、血漿、血清またはNAF（BCが疑われる場合、好ましい）が、乳癌のスクリーニングにおける試料として使用される。
【０１１４】
別の好ましい態様において、血漿、血清または便（CRCが疑われる場合、好ましい）が、結腸直腸癌のスクリーニングにおける試料として使用される。
【０１１５】
別の好ましい態様において、血漿または血清が、卵巣癌のスクリーニングにおける試料として使用される。
【０１１６】
多くの疾患について、スクリーニング目的に必要な感度および特異性の基準を常に満たす、循環中の単一の生化学マーカーはない。このことは癌、特に乳癌についてもそうであると思われる。癌のスクリーニングには複数のマーカーを含むマーカーパネルが使用されなければならないと予測されよう。本発明において確立されたデータは、利点を伴って、マーカーs-ErbB-3がスクリーニング目的に適当なマーカーパネルの不可欠な部分を形成することを示す。したがって、本発明は、癌マーカーパネル、つまり、s-ErbB-3および癌スクリーニングのための1つ以上のさらなるマーカーを含むマーカーパネルのマーカーの1つとしてのs-ErbB-3の使用に関する。特に、本発明は、一般的な癌マーカーパネルの1つのマーカーとしてのs-ErbB-3の使用に関する。かかるマーカーパネルは、マーカーs-ErbB-3および1つ以上のさらなるマーカー、例えば一般的な癌マーカーおよび/または上記の種類の癌についてのマーカーを含む。
【０１１７】
s-ErbB-3はまた、特定の具体的な種類の癌、例えば乳癌、結腸直腸癌および／または卵巣癌についてのマーカーパネルに寄与し得る。
【０１１８】
s-ErbB-3を含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、乳癌、結腸直腸癌または卵巣癌である。
【０１１９】
s-ErbB-3を含むマーカーパネルで評価される癌の他の好ましい種類は、乳癌または結腸直腸癌である。
【０１２０】
s-ErbB-3を含むマーカーパネルで評価される癌の好ましい種類は、乳癌（BC）である。
【０１２１】
s-ErbB-3を含むマーカーパネルで評価される癌の好ましい種類は、結腸癌(CRC)である。
【０１２２】
本発明のデータは、マーカーの特定の組合せは、癌のスクリーニングに有利であることをさらに示す。例えば、BC、OCまたはCRCのスクリーニングの好ましい態様を参照して、本発明はまた、s-ErbB-3およびCYFRA 21-1を含むマーカーパネル、またはs-ErbB-3およびCEAを含むマーカーパネル、またはs-ErbB-3およびCA 15-3を含むマーカーパネル、またはs-ErbB-3およびCA 19-9を含むマーカーパネル、またはs-ErbB-3およびErbB-2を含むマーカーパネル、またはs-ErbB-3ならびにCYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2からなる群より選択される2つ以上のマーカーを含むマーカーパネルの使用に関する。
【０１２３】
診断補助:
マーカーは、特定の臓器における良性疾患対悪性疾患の鑑別診断を補助し得るか、異なる組織学的腫瘍型の識別を補助し得るか、もしくは手術前のベースラインマーカー値の確立を補助し得るかのいずれかである。
【０１２４】
今日、乳癌の検出に使用される重要な方法は、放射線学および／またはコンピュータ連動断層撮影(CT)スキャンである。小結節、すなわち、疑わしい組織の小領域は、これらの方法によって可視化され得る。しかしながら、これらの結節の多く-CTで90%より多く-は良性組織変化を示し、少数の結節のみが癌性組織を示す。マーカーs-ErbB-3の使用は、良性対悪性疾患の識別を補助し得る。
【０１２５】
好ましい態様において、マーカーs-ErbB-3は、BC、OCおよび／またはCRC、好ましくはBCの異なる組織学的型を確立または確認するために免疫組織学的方法に使用される。
【０１２６】
単独マーカーとしてのs-ErbB-3は他のマーカーよりも、例えばBCの場合はCEAまたはCYFRA 21-1などの他のマーカーより卓越し得るため、s-ErbB-3は、特に、手術前のベースライン値を確立することにより診断補助として使用されるものと期待されよう。したがって、本発明はまた、手術前の癌のベースライン値を確立するためのs-ErbB-3の使用に関する。
【０１２７】
予後:
予後インジケータは、一定の尤度で疾患結果を予測する癌患者およびその腫瘍の臨床的、病理学的または生化学的な特徴と定義され得る。その主な使用は、患者管理の合理的な計画を補助すること、すなわち、それぞれ急速進行性疾患の過少治療および無痛性疾患の過剰治療を回避することである。Molina R. et al.，Tumor Biol. 24 (2003) 209-218では、NSCLCにおけるCEA、CA 125、CYFRA21-1、SSCおよびNSEの予後値が評価された。彼らの研究では、マーカーNSE、CEA、およびLDH(乳酸デヒドロゲナーゼ)の異常血清レベルは、短い生存を示すように思われた。
【０１２８】
s-ErbB-3は単独で、癌患者、例えばBCまたはCRC患者と健常対照の識別に有意に寄与するため、s-ErbB-3は癌、好ましくはBCまたはCRCに苦しむ患者の予後の評価を補助するものと期待されよう。手術前のs-ErbB-3のレベルは、たいてい、癌の1種類以上の他のマーカーおよび／またはTNM病期分類システムと組み合わされる。好ましい態様において、s-ErbB-3はBC、CRCまたはOCを有する患者の予後に使用される。
【０１２９】
治療のモニタリング:
Merle，P. et al.，Int. J. of Biological Markers 19(2004) 310-315では、導入化学療法で治療された局所進行NSCLC(=非小細胞肺癌)を有する患者におけるCYFRA 21-1血清レベルの変化が評価された。彼らは、CYFRA 21-1血清レベルの早期モニタリングが病期III NSCLC患者の腫瘍応答および生存に有用な予後ツールであり得ると結論づけている。また、報告には、LCを有する患者の治療のモニタリングにおけるCEAの使用が記載されている(Fukasawa, T. et al., Gan to Kagku Ryoho 13 (1986) 1862-1867)。これらの研究のほとんどは遡及的で、無作為でなく、少数の患者を含んだ。CYFRA21-1での研究の場合と同様に、CEA研究は、a)化学療法を受けている間にCEAレベルが減少した患者は、一般的に、CEAレベルが減少しなかった患者よりも良好な結果を有し、(b)ほぼすべての患者で、CEAレベルの増加は疾患の進行と関連したことを示した。
【０１３０】
s-ErbB-3は、CYFRA21-1またはCEAそれぞれと少なくとも同程度に良好な化学療法のモニタリングのためのマーカーであることが期待されよう。したがって、本発明はまた、化学療法下の癌患者、好ましくは乳癌（BC）または結腸直腸癌（CRC）患者のモニタリングにおけるs-ErbB-3の使用に関する。好ましい一態様における治療モニタリングでは、s-ErbB-3の測定およびCYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9およびErbB-2からなる群より選択される少なくとも1つのマーカーの測定は、BCまたはCRCの評価に合わせて使用される。
【０１３１】
追跡:
癌性組織の完全な除去を目的として外科的切除を受けた患者（例えば、肺癌患者）の大部分は、後に再発性または転移性の疾患を発症する(Wagner，H.，Chest 117(2000) 110-118；Buccheri，G. et al.，Ann. Thorac. Surg. 75(2003) 973-980)。これらの再発のほとんどは、手術後2〜3年以内に起こる。再発性/転移性疾患は、検出が遅すぎた場合は常に致死的であるため、相当な研究が、初期ひいては潜在的に治療可能な段階での癌の再発に焦点を当てている。
【０１３２】
その結果、多くの癌患者、例えばBC患者は、多くの場合CEAでの定期的モニタリングを含む、術後のサーベイランスプログラムを受ける。外科的切除後1年間のCEAによる連続モニタリングにより、再発性/転移性疾患が、疑わしい症状または徴候がない場合であっても、早期の術後再発性/転移性疾患は、ほぼ97%の特異性でほぼ29%の感度で検出されることが示された(Buccheri，G. et al.，Ann. Thorac. Surg. 75(2003) 973-980)。したがって、BCを有する患者の手術後の追跡は、適切な生化学的マーカーの使用の最も重要な分野の1つである。調査したBC患者においてs-ErbB-3の感度が高いために、s-ErbB-3は単独でまたは1種類以上の他のマーカーと組合せて、BC患者の追跡、特に手術後のBC患者の追跡に非常に有用であろう。BC患者の追跡におけるs-ErbB-3および1種類以上のBCの他のマーカーを含むマーカーパネルの使用は、本発明のさらに好ましい態様を示す。
【０１３３】
好ましい態様において、本発明は、癌の診断の分野におけるs-ErbB-3の使用に関する。好ましくは、s-ErbB-3は、乳房、結腸直腸または卵巣のそれぞれの癌の評価に使用される。
【０１３４】
またさらに好ましい態様において、本発明は、癌、例えば一般的な癌または具体的な種類の癌、例えば乳癌、結腸直腸癌または卵巣癌のためのマーカー分子としての、癌のための1つ以上のさらなるマーカー分子と組み合わせたs-ErbB-3の使用に関する。さらなるマーカー分子は、癌型非特異的な、一般的なマーカー分子および/または癌型特異的なマーカー分子、例えば乳癌、結腸直腸癌または卵巣癌のためのマーカー分子であり得る。s-ErbB-3および少なくとも1つのさらなるマーカーは、個体から得られた液体試料中の癌、例えばBCまたはCRCの評価に使用される。s-ErbB-3の測定と合わされ得る選択された好ましい他の癌マーカーは、CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9および／またはErbB-2である。特に、s-ErbB-3の測定と合わされ得る選択された好ましい他の癌マーカーは、CYFRA 21-1、CEA、CA 15-3、CA 19-9および／またはErbB-2である。癌、例えばBCの評価に使用されるまたさらに好ましいマーカーパネルは、s-ErbB-3ならびにCYFRA 21-1およびCEAからなる群より選択される少なくとも1つの他のマーカー分子を含む。
【０１３５】
当業者が理解するように、調査中の診断的疑問を改善するために、2種類以上のマーカーの測定を使用するには多くの方法がある。全く単純に、しかしながら、しばしば効果的なアプローチにおいて、調査された少なくとも1種類のマーカーについて試料が陽性である場合、陽性の結果が仮定される。このことは、例えばAIDSのような感染性の疾患の診断の場合であり得る。
【０１３６】
しかしながら、多くの場合、マーカーの組み合わせが評価される。好ましくは、マーカーパネルのマーカー、例えばs-ErbB-3およびCYFRA21-1についての測定値は、数学的に組み合わされ、組み合わされた値は診断的疑問の原因に相関される。マーカー値は、当該技術分野の技術水準の任意の適切な数学的方法により組み合わされ得る。マーカーの組み合わせと疾患を相関する周知の数学的方法には、識別分析（DA）（即ち、一次、二次、標準化DA)、カーネル法（即ちSVM）、ノンパラメトリック法（即ちk-最近接分類）、PLS（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ちロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング／バギング法）、一般化直線モデル（即ちロジスティック回帰）、主成分ベース法（即ちSIMCA）、一般化付加モデル、ファジーロジックベース法、ニューラルネットワークおよび遺伝的アルゴリズムベース法などの方法を用いる。当業者は、本発明のマーカーの組み合わせを評価するための適切な方法を問題なく選択する。好ましくは、本発明のマーカーの組み合わせを、例えばLCの有無と相関することに用いられる方法は、DA（即ち一次、二次、標準化識別分析）、カーネル法（即ちSVM）、ノンパラメトリック法（即ちk-最近接分類）、PLS（部分最小二乗）、ツリーベース法（即ちロジック回帰、CART、ランダムフォレスト法、ブースティング法）、または一般化線形モデル（即ちロジスティック回帰）から選ばれる。これらの統計的方法に関する詳細は、以下の参考文献：Ruczinski，I.，et al，J. of Computational and Graphical Statistics，12 (2003)475-511；Friedman，J. H.，J. of the American Statistical Association 84 (1989)165-175；Hastie，T.， et al., The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics (2001)；Breiman，L.， et al., Classification and regression trees，Wadsworth, Inc., California (1984)；Breiman，L.，Random Forests，Machine Learning, 45 (2001)5-32；Pepe，M. S.，The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction，Oxford Statistical Science Series 28 (2003)；およびDuda，R. O.，et al.，Pattern Classification，Wiley Interscience，第2版 (2001)に見られる。
【０１３７】
生物学的マーカーの基礎的な組合せに対して、最適化された多変量カットオフを使用し、状態Aと状態B、例えば、疾患状態と健常を区別することは、本発明の好ましい態様である。この型の解析では、マーカーは、もはや独立ではなくマーカーパネルを形成する。
【０１３８】
診断方法の精度は、その受信者動作特性(ROC)によって最もよく示される(特にZweig, M. H.およびCampbell, G., Clin. Chem. 39 (1993)561-577参照のこと)。ROCグラフは、観察されたデータの全範囲にわたって判定閾値を連続的に変えることにより得られる全ての感度／特異性ペアのプロットである。
【０１３９】
臨床試験の臨床性能は、その診断精度または被験体を臨床的に関連する亜群に正確に分類する能力に依存する。診断精度は、検査を受けた被験体の２つの異なる状態を正確に区別する試験の能力を測定する。かかる状態は、例えば健常と疾患または良性疾患対悪性疾患である。
【０１４０】
それぞれの場合において、ROCプロットは、判定閾値の全範囲で１−特異性に対して感度をプロットすることにより2つの分布間の重複を示す。Y軸上は感度、すなわち真陽性部分［(真陽性試験結果の数)/(真陽性の数＋偽陰性試験結果の数)として定義される］である。これは、疾患または状態の存在下の陽性度とも称される。これは、罹患亜群のみから算出される。X軸上は偽陽性部分、すなわち1-特異性［(偽陽性結果の数)/(真陰性の数＋偽陽性結果の数)として定義される］である。これは特異性の指標であり、罹患していない亜群全体から算出される。真陽性部分および偽陽性部分は、2つの異なる亜群由来の試験結果を用いて全く別々に算出されるため、ROCプロットは試料中の疾患の有病率とは独立している。ROCプロット上のそれぞれの点は、特定の判定閾値に対応する感度/1-特異性のペアを表す。完全識別を伴う試験(結果の2つの分布に重複がない)は、左上の角を通るROCプロットを有し、この場合、真陽性の割合は1.0または100％（完全な感度）であり、偽陽性部分は0（完全な特異性）である。識別のない試験の理論的プロット（2つの群の結果の分布が同一）は、左下の角から右上の角に向かう45°の対角線である。ほとんどのプロットはこれらの両極間に含まれる。（ROCプロットが45°の対角線の完全に下に含まれる場合、これは「陽性度」についての基準を「より大きい」から「より少ない」に入れ換えることにより容易に修正される。逆も同じ）。定性的には、プロットが左上の角に近づくにしたがって、試験の全体的な精度は高くなる。
【０１４１】
臨床試験の診断精度を定量化するための好ましい方法の１つは、単一の数によりその成績を表すことである。かかる全般的パラメータは、例えば、いわゆる「総エラー」あるいは「曲線下面積=AUC」である。最も一般的な世界的尺度はROCプロット下の面積である。慣例により、この面積は常に≧0.5である（もしそうでなければ、そうなるように決定基準を入れ換えることができる）。数値は1.0（２群の試験値の完全な分離）と0.5（２群間の試験値に明らかな分布の差が無い）の範囲にある。該面積は、対角線に最も近い点または90％特異性での感度などのプロットの特定の部分だけでなく、全プロットに依存する。これは、ROCプロットが完全なもの（面積＝1.0）にどれだけ近いかということの定量的で説明的な表現である。
【０１４２】
s-ErbB-3とCYFRA 21-1またはCEAなどの他のマーカー、またはまだ見出されていないBCの他のマーカーを組み合わせることで、s-ErbB-3は、BCの評価においてさらなる改善をもたらす。
【０１４３】
好ましい態様において、本発明は、試料中の少なくともs-ErbB-3およびCYFRA21-1の濃度、ならびに任意にCEA、CA 15-3、CA 19-9および／またはHER-2の濃度をそれぞれ測定し、測定された濃度を癌、例えばBCの有無と相関させることにより、癌、例えばBC対健常対照の診断精度を改善するための方法であって、改善により、調査されたいずれかの単一マーカー単独に基づいた分類と比べて、健常対照に対してより多くの患者が癌、例えばBCに苦しんでいると正確に分類される方法に関する。
【０１４４】
本発明の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3およびCYFRA21-1の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えばBCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４５】
本発明による別の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3およびCEAの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。  
【０１４６】
本発明による別の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3およびCA 15-3の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４７】
本発明による別の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3およびCA 19-9の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４８】
本発明による別の好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3およびErbB-2の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１４９】
本発明によるまたさらなる好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3、CYFRA 21-1およびCEAの濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５０】
本発明によるまた別のさらなる好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3、CYFRA 21-1およびCA 15-3の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５１】
本発明によるまた別のさらなる好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3、CYFRA 21-1およびCA 19-9の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５２】
本発明によるまた別のさらなる好ましい方法において、少なくともバイオマーカーs-ErbB-3、CYFRA 21-1およびErbB-2の濃度のそれぞれが測定され、癌、例えば、BCの評価に該マーカー組合せが使用される。
【０１５３】
以下の実施例、配列表および図面は、本発明の理解を補助するために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。記載の手順において、本発明の精神から逸脱することなく変更がなされ得ることが理解されよう。
【０１５４】
配列の説明
配列番号：1は、ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」（野生型）由来の完全長mRNAにコードされた流出(shedded）細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す；SwissProtデータベース受託番号：P21860。
配列番号：2は、ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライスバリアントにコードされたアミノ酸配列を示す；該アイソフォームは、文献において「p45 s-ErbB-3」または「アイソフォームR2」としても公知である。
配列番号：3は、ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライスバリアントにコードされたアミノ酸配列を示す；該アイソフォームは、文献において「p85 s-ErbB-3」または「アイソフォームR31」としても公知である。
配列番号：4は、ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライスバリアントにコードされたアミノ酸配列を示す；該アイソフォームは、文献において「p85 s-ErbB-3」または「アイソフォームR35」としても公知である。
配列番号：5は、ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のmRNAのスプライスバリアントにコードされたアミノ酸配列を示す；該アイソフォームは、文献において「アイソフォームR1/バリアントS」としても公知である。
配列番号：6は、ヒトp180 ErbB-3（HER-3）糖タンパク質の膜近傍（JM）領域のアミノ酸モチーフを示す。
配列番号：7は、ヒトErbB-2（HER-2）の膜近傍（JM）領域のアミノ酸モチーフを示す。
配列番号：8  プライマー1（センス）
配列番号：9  プライマー2（アンチセンス）
配列番号：10  プライマー3（アンチセンス）
配列番号：11  プライマー4（アンチセンス）
【実施例】
【０１５５】
実施例1
乳癌の潜在的マーカーとしてのs-ErbB-3の同定
185kDaの膜貫通タンパク質であるHER-2/neuの細胞外ドメインは、メタロプロテアーゼによるタンパク質分解性切断を受け、血中に循環抗原として流出されることが公知である。血清HER-2は、乳癌において予後的および予測的情報を有することが示されている。膜貫通受容体HER-2はHER-3とともに、強力なマイトジェン性トランスホーミングシグナルを誘発すると考えられている高親和性ヘレグリン共受容体を形成する（Sliwkowski，M.X. et al.，J. Biol. Chem. 269（1994）14661-14665）。
【０１５６】
また、EGF受容体ファミリーの膜近傍（JM）領域内のモチーフは、該領域に、切断位置が存在する11アミノ残基しか含まない部分が含まれていると考えられている。該切断位置のモチーフ は、間に5〜7アミノ酸残基を有するプロリン/グリシン残基のモチーフ（P/GX 5-7 P/G）によって規定される。プロリンおよびグリシン残基は、局所的に二次構造を破壊することが公知であり、既知の切断部位に見られる。ヒト完全長p180 ErbB-3タンパク質（HER-3wt）のタンパク質配列において、このモチーフは膜近傍領域にも見られ得る。
0005384672.tif 000003
【０１５７】
癌患者由来だけでなく明らかに健常な人（対照コホート）の血清試料を、s-ErbB-3タンパク質のレベルについて、ELISAを使用することにより測定した。他のEGFファミリー構成員との交差反応性は、HER-1、HER-2およびHER-4の組換え細胞外ドメインとの抗体特異性を試験することにより除外する。交差反応性は観察されない。
【０１５８】
ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来の完全長mRNAにコードされたヒトp180 ErbB-3タンパク質の細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号：1に示す。ヒト「c-erbB-3癌遺伝子」由来のスプライスバリアントmRNAの翻訳により、配列番号：2（p45 s-ErbB-3、アイソフォームR2）、配列番号：3（p85 s-ErbB-3、アイソフォームR31）、配列番号：4（p85 s-ErbB-3、アイソフォームR35）および配列番号：5（アイソフォームR1/バリアントS）に示されたタンパク質がもたらされる。すべてのタンパク質を哺乳動物細胞HEK 293Tにおいて発現させ、ウエスタンブロットおよびELISAによって試験した。
【０１５９】
実施例2
乳癌マーカータンパク質s-ErbB-3に対する抗体
癌マーカータンパク質s-ErbB-3に対するモノクローナル抗体を、免疫検出アッセイ、例えば、ウエスタンブロッティングおよびELISAによるs-ErbB-3の血清および血漿および血中レベルの測定のためにR&D Systems（カタログ番号DY348）から購入する。
【０１６０】
HEK 293 T細胞における組換えタンパク質の発現
s-ErbB-3タンパク質に対する較正物質を作製するため、野生型（wt）p180 ErbB-3およびErbB-3タンパク質の選択的転写物（mRNA）の組換え発現を行なう。発現は、哺乳動物細胞 HEK 293Tにおいて行なう。第1工程において、記載（Lee，H. et al.，Oncogene 16（1998）3243-3252）のヒトc-erbB-3遺伝子の公表されたオリゴヌクレオチド配列の一部分に特異的なオリゴオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行なう。合成プライマーのヌクレオチド配列を以下のとおりに選択する。
プライマー1（センス）配列番号：8
5’- gcaagctagccaccatgagggcgaacgacgctctgc -3’
プライマー2（アンチセンス）配列番号：9
5’- gcaagcggccgccccacctttgggacatagtcccccacaaggc -3’
プライマー3（アンチセンス）配列番号：10
5’- gcaagcggccgcttgtatgccacctgaacagttccattgcag -3’
プライマー4（アンチセンス）配列番号：11
5’- gcaagcggccgcacacccccttcctccttggttccatccctc -3’
【０１６１】
PCR産物を、タグ化哺乳動物発現ベクターpCMV-Fc（Clonetech）内にクローニングしてGeneartによって配列決定した。
【０１６２】
細胞株：ヒト胚性腎臓細胞株293を、10%ウシ胎仔血清を添加したDMEM中で培養した。
【０１６３】
s-ErbB-3タンパク質の精製：
すべてのs-ErbB-3タンパク質を、クローンアイソフォーム R2、アイソフォーム R35、アイソフォーム R31またはアイソフォーム R1/バリアントSで一過的にトランスフェクトした細胞の濃縮培地から単離し、一工程で精製した。プロテインAカラム（Amersham）を用いたHiTrapクロマトグラフィーを使用し、タンパク質を4℃でカラムに一晩負荷した。結合した物質をバッファーA（10mMリン酸塩、pH7.4、27mM KClおよび137mM NaCl）で洗浄し、PreScission プロテアーゼとともに4℃で一晩インキュベートし、次いで、0.1M クエン酸ナトリウム（pH3.5）を含有するバッファーBを用いて溶出した。GSTrap（1ml）カラムを使用することにより、 GSTタグ化PreScissionプロテアーゼを除去した。各工程で採取した試料をSDS-PAGEに供し、クーマシーブリリアントブルー染色およびs-ErbB-3の細胞外ドメインを認識する抗ErbB-3 抗体を用いたウエスタンブロットによって解析した。
【０１６４】
実施例3
ヒト血清および血漿試料または他の体液中のs-ErbB-3タンパク質の測定のためのELISA
ヒト血清または血漿中のs-ErbB-3タンパク質の検出のために、サンドイッチELISAを開発する。抗原の捕捉および検出のために、抗s-ErbB-3モノクローナル抗体（実施例2参照）のアリコートをビオチンとコンジュゲートする。
【０１６５】
ストレプトアビジン被覆した96ウェルマイクロタイタープレートを、100μlのビオチン化した抗s-ErbB-3ポリクローナル抗体とともに一晩、10mMリン酸塩、pH7.4、27mM KClおよび137mM NaCl中、2μg/mlでインキュベートする。インキュベーション後、プレートを10mMリン酸塩、pH7.4、27mM KClおよび137mM NaClで3回洗浄する。次いで、ウェルを、10mMリン酸塩、pH7.4、1%BSA、27mM KClおよび137mM NaClとともに2時間インキュベートし、非特異的結合をブロックする。3回の洗浄後、ウェルを、標準抗原としての組換えタンパク質(実施例2参照)の連続希釈物、または患者由来の希釈血漿試料のいずれかとともにインキュベートする。s-ErbB-3の結合後、プレートを10mMリン酸塩、pH7.4、27mM KClおよび137mM NaClで3回洗浄する。結合したs-ErbB-3の特異的検出のために、ウェルを100μlの抗s-ErbB-3モノクローナル抗体と、10mMリン酸、pH7.4、1%BSAおよび137mM NaCl中、4μg/mlで60分間インキュベートする。その後、プレートを3回洗浄して未結合抗体を除去する。次の工程では、ウェルを200μg/mlの抗マウスPODコンジュゲートと、10mMリン酸、pH7.4、1% BSA、0.9% NaClおよび0.1% Tween 20中で30分間インキュベートする。次いで、プレートを同バッファーで3回洗浄する。抗原-抗体複合体の検出のために、ウェルを100μlのABTS溶液(R&D Systems)とインキュベートし、30分後、ELISAリーダーを用いて495nmでODを測定する。
【０１６６】
実施例4
診断精度に関する臨床的有用性を評価するためのROC解析
精度は、充分特徴付けられた患者コホート、すなわち、マンモグラフィを受け、BCがないことがわかった50名の患者、各々、浸潤性腺管性および浸潤性小葉性T1〜3、N0、M0のBCと診断および病期分類された50名の患者、進行BCと診断され、少なくとも1つの近位リンパ節に少なくとも腫瘍浸潤またはより重度の形態の転移を有する50名の患者、各々、髄様、粘液性、管状または乳頭状乳癌と診断された50名の患者、ならびにDCISと診断された50名の患者のそれぞれの得られた個々の液体試料を解析することにより評価される。市販のアッセイ（Roche Diagnostics、CA 15-3-アッセイ（Elecsys(登録商標)Systemsのイムノアッセイ解析装置のカタログ番号0 304 5838）によって測定されるCA 15-3、および上記のようにして測定したs-ErbB-3タンパク質を、これらの個体のそれぞれから得られた血清において定量した。ROC-解析は、上記のZweig，M. H.，およびCampbellに従って行なう。曲線下面積によって測定される健常個体とT1〜3、N0、M0群の患者とを識別する識別力は、バイオマーカーs-ErbB-3では、確立されたマーカー CA 15-3と比べて少なくとも同等に良好であることがわかる。
【０１６７】
s-ErbB-3のアッセイ測定値：
ヒト血清中の癌マーカーs-ErbB-3濃度を、乳癌（BC）患者、結腸直腸癌（CRC）患者および明らかに健常な個体の対照コホート（Ctrl）の試料において測定する。表1は、値の平均およびメジアン、最小および最大値、ならびに第1および第3四分位（25%および75%パーセンタイル）を示すことにより、前記の群のヒト血清中のs-ErbB-3レベルの絶対測定値の分布を示す。表1のデータを表2に対数変換した形態で示し、図1のBoxプロットにおいて図表として示す。
【０１６８】
乳癌（BC）の血清マーカーとしてのs-ErbB-3：
試料は、データを表3に示す39名の充分特徴付けられた乳癌（BC）患者から得た。図2は、ヒト血清におけるs-ErbB-3 レベルの受信者動作特性曲線（ROC）を示す。マーカーは、BC集団（39名の患者）および明らかに健常な個体から得られた43個の対照試料（= 対照コホート）において測定し、AUCは0.79になった。
【０１６９】
結腸直腸癌（CRC）の血清マーカーとしてのs-ErbB-3：
試料を、データを表3に示す110名の充分特徴付けられた結腸直腸癌（CRC）患者から得た。図3は、ヒト血清におけるs-ErbB-3 レベルの受信者動作特性曲線（ROC）を示す。マーカーは、CRC集団（110患者）および明らかに健常な個体から得られた43個の対照試料（= 対照コホート）において測定し、AUCは0.79になった。
【０１７０】
まとめ：
0005384672.tif 000004
BC = 乳癌；CRC = 結腸直腸癌；Ctrl = 対照コホート；Min. = 最小値；1st Qu. = 第1四分位（値の25%パーセンタイル）；3rd Qu. = 第3四分位（値の75%パーセンタイル）；Max. = 最大値； n = 患者数
【０１７１】
0005384672.tif 000005
BC = 乳癌；CRC = 結腸直腸癌；Ctrl = 対照コホート；Min. = 最小値；1st Qu. = 第1四分位（値の25%パーセンタイル）；3rd Qu. = 第3四分位（値の75%パーセンタイル）；Max. = 最大値； n = 患者数
【０１７２】
以下のデータは、癌マーカーs-ErbB-3もまた、手術後の患者の追跡に有用であることを示す。
【０１７３】
0005384672.tif 000006
【図１】
0005384672.tif 000007
【図２】
0005384672.tif 000008
【図３】
0005384672.tif 000009
【配列表】
0005384672000001.app