(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ａ）アデニル化ドメイン（Ａ*）、ここで当該アデニル化ドメインは配列番号１に示されるペプチド配列又は配列番号１に少なくとも９０％同一であるペプチド配列を含み、
ｂ）アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、
ｃ）以下の：
ｉ.ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、
ｉｉ.アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、
ｉｉｉ.アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ２）
を含むポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）の伸張モジュール（ＥＭ）、
ｄ）アミノトランスフェラーゼ、
ｅ）以下の：
ｉ.縮合ドメイン（Ｃ）、
ｉｉ.アデニル化ドメイン（Ａ）、
ｉｉｉ.チオール化ドメイン（Ｔ）
を含む非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）の３〜５の伸張モジュール（ＥＭ）、
ｆ）チオエステラーゼ（ＴＥ）
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸。
【請求項２】
以下の：
ａ）モノオキシゲナーゼ（ＭＯ）、
ｂ）ＮＲＰＳの１以上の伸張モジュール（ＥＭ）内の組込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼドメイン（ＭＴ）、
ｃ）非組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）、
ｄ）改変活性（ＭＡ）を有するタンパク質、ここで当該タンパク質は、ハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ-メチルトランスフェラーゼ、及びＣ-メチルトランスフェラーゼを含む群から選ばれ、
ｅ）ＭＯ及び/又は別のＭＡの上流及び下流に隣接して位置するグリシンリッチ又はプロリンとロイシンリッチのいずれかである１以上の繰り返しからなる２以上のペプチド繰り返しスペーサードメイン（ＳＰ）、
をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸が、以下のタンパク質配列：
ａ.配列番号１に示されるアデニル化ドメイン（Ａ＊）、
ｂ.配列番号２に示されるアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、
ｃ.ポリケチド合成の伸張モジュール：
ｉ.配列番号３に示されるケトアシルシンターゼドメイン（ＫＳ）、
ｉｉ.配列番号４に示されるアシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴ）、
ｉｉｉ.配列番号５に示されるアシルキャリアタンパク質ドメイン（ＡＣＰ２）
ｄ.配列番号６に示されるアミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
ｅ.非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号７に示される縮合ドメイン（Ｃ）、
ｉｉ.配列番号８に示されるアデニル化ドメイン（Ａ）、
ｉｉｉ.配列番号９に示されるチオール化ドメイン（Ｔ）
ｆ.ロイシンの活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号１０に示される縮合ドメイン（Ｃ２）、
ｉｉ.配列番号１１に示されるアデニル化ドメイン（Ａ２）、
ｉｉｉ.配列番号１２に示されるチオール化ドメイン（Ｔ２）
ｇ.チロシン２の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号１３に示される縮合ドメイン（Ｃ３）、
ｉｉ.配列番号１４に示されるアデニル化ドメイン（Ａ３）、
ｉｉｉ.配列番号１５に示されるチオール化ドメイン（Ｔ３）
ｈ.チロシン２の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号１６に示される縮合ドメイン（Ｃ４）、
ｉｉ.配列番号１７に示されるアデニル化ドメイン（Ａ４）、
ｉｉｉ.配列番号１８に示されるチオール化ドメイン（Ｔ４）
ｉ.配列番号１９に示されるチオエステラーゼ（ＴＥ）、
ｊ.配列番号２０に示されるモノオキシゲナーゼ（ＭＯ）、
ｋ.配列番号２１と２２に示される２以上のペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ１/ＳＰ２）、
ｌ.配列番号２３に示されるロイシンの活性化及び縮合に寄与するＮＲＰＳの伸張モジュール（ＥＭ）内の組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼドメイン（ＭＴ）、及び
ｍ.配列番号２４に示される非組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ２）
をコードする核酸配列を含む、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
以下の：
ａ）配列番号２５に示されるアデニル化ドメイン（Ａ*）、
ｂ）配列番号２６に示されるアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、
ｃ）アセテートの縮合をコードするポリケチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号２７に示されるケトアシルシンターゼドメイン（ＫＳ）、
ｉｉ.配列番号２８に示されるアシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴ）、
ｉｉｉ.配列番号２９に示されるアシルキャリアタンパク質ドメイン（ＡＣＰ２）
ｄ）配列番号３０に示されるアミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
ｅ）アラニンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号３１に示される縮合ドメイン（Ｃ）、
ｉｉ.配列番号３２に示されるアデニル化ドメイン（Ａ）、
ｉｉｉ.配列番号３３に示されるチオール化ドメイン（Ｔ）
ｆ）ロイシンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号３４に示される縮合ドメイン（Ｃ２）、
ｉｉ.配列番号３５に示されるアデニル化ドメイン（Ａ２）、
ｉｉｉ.配列番号３６に示されるチオール化ドメイン（Ｔ２）
ｇ）チロシン１の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号３７に示される縮合ドメイン（Ｃ３）、
ｉｉ.配列番号３８に示されるアデニル化ドメイン（Ａ３）、
ｉｉｉ.配列番号３９に示されるチオール化ドメイン（Ｔ３）
ｈ）チロシン２の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
ｉ.配列番号４０に示される縮合ドメイン（Ｃ４）、
ｉｉ.配列番号４１に示されるアデニル化ドメイン（Ａ４）、
ｉｉｉ.配列番号４２に示されるチオール化ドメイン（Ｔ４）
ｉ）配列番号４３に示されるチオエステラーゼ（ＴＥ）、
ｊ）配列番号４４に示されるモノオキシゲナーゼ（ＭＯ）、
ｋ）配列番号４５と４６に示される２以上のペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ１/ＳＰ２）、
ｌ）配列番号４７に示されるロイシンの活性化及び縮合をコードするＮＲＰＳの伸張モジュール（ＥＭ）内の組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼドメイン（ＭＴ）、及び
ｍ）配列番号４８に示される非組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ２）
を含む群から選ばれる核酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
前記マイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸の配列パーツが、上流から下流にかけて反応順に配置される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載される核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載される核酸又は請求項６に記載されるベクターで形質転換された微生物。
【請求項８】
前記ベクターが、自立的に複製することができる、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の微生物がマイクロギニンを産生する条件下で、当該微生物を培養することを含むマイクロギニン産生方法であって、ここで当該微生物が、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸を含み、そして当該微生物が当該核酸が存在しない状態ではマイクロギニンを産生しない、前記方法。
【請求項１０】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むアデニル化ドメイン（Ａ＊）に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学、生物学、生化学、分子生物学の分野に関する。本発明は、マイクロギニン（microginin）及びマイクロギニンアナログの合成を可能にする新規の核酸分子を提供する。マイクロギニンの治療における適用が発見されている。こうして本発明は、哺乳動物治療分野及び薬剤開発の分野にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
シアノバクテリア及びマイクロギニン
シアノバクテリアはグラム陰性細菌である。光合成を行なう能力のため、植物界に属すると長らく考えられており、そして以前は藍藻（blue-green algae)に分類されていた。シアノバクテリアはほぼ全ての生態的地位に順応してきた。今日までに知られている多くの種は、淡水湖及び海で見つかっている。ここ数年の間に、シアノバクテリアは、生物学的に活性な天然化合物のソースとして認識されてきた。
【０００３】
シアノバクテリアは藻類と細菌の中間に位置する微生物の群であり、そして世界中の淡水域及び海域に見られる。科学的に、シアノバクテリアは細菌とみなされているが、シアノバクテリアは光合成を行なうことができるので、「藍藻」に分類されていた。
【０００４】
シアノバクテリアのペプチド（シアノペプチド）は、ヒトが使用する表層水において最も偏在的に発見される潜在的に有害な天然物である。これらの物質はもともと天然物質であるが、富栄養化（つまり、過剰な施肥）は、ヨーロッパ中で過剰なシアノバクテリアの増殖を引き起こした。こうしてシアノペプチドは、現在、不自然な頻度及び濃度で生じている。
【０００５】
多様なシアノペプチドの大部分は、オリゴペプチド（２ＫＤ未満の分子量のペプチド）である。しかし、特定のシアノペプチド、例えばミクロシスチン及びノジュラリン、は、よく研究され、そして多くの動物中毒及びヒトの病気の原因であると認識されている一方で、実質的かつ増大している一連の証拠は、急性及び慢性の両方のヒト疾患の原因における潜在的に毒性である他のシアノペプチドの確固たる役割を指し示す。
【０００６】
淡水及び海水のシアノバクテリアは、多様な生物活性化合物を産生することが知られており、その中には強力な肝臓毒及び神経毒を示すものがある。シアノバクテリアの毒性種の多くは、富栄養化した水中で過剰に増殖する傾向があり、そうして動物及びヒトの健康についてかなりの危害の原因となってきた。最も広範にブルーム形成するシアノバクテリアの一つは、マイクロシスチス（Microcystis）属であり、肝臓毒性ペプチドマイクロシスチンの周知の産生種である。マイクロシスチンは、共通構造を共有する密接に関連した環状ヘプタペプチドの群である。今までのところ、８０超のマイクロシスチンの誘導体が同定され、メチル化、ペプチド配列、及び毒性の程度の点で大きく異なっていた。
【０００７】
従来の植物コードは、マイクロシスチス（Microcystis）属を、（天然条件下で、株培養物は通常単細胞として増殖する一方）不規則に配置された細胞の粘性コロニーとして増殖する球菌単細胞シアノバクテリウムとして記載した。この従来法によると、個々の細胞のサイズ、コロニー形態、及び粘着性の性質などの形態学的基準は、マイクロシスチス（Microcystis）属内の種の区分（species delimination）に使用される（つまり、形態種）。マイクロシスチン産生株とマイクロシスチンを合成しない株は、マイクロシスチス属の全ての種について報告されてきた。しかしながら、今日まで研究された多くの現地標本及びマイクロシスチス・アエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）とマイクロシスチス・ビリジス(Microcystis viridis)の株が、マイクロシスチンを含むことが発見された一方、M.ウェセンベルギ(M. wesenbergii)、Ｍ.ノバセッキー（M. novaceckii）、及びＭ．イクチオブラーブ（M. ichthyoblabe)の株がマイクロシスチンを含むということは、弧発的に報告されたのみである。
【０００８】
マイクロシスチンとは別に、様々な他の直線状及び環状オリゴペプチド、例えばアナバエノペプチン（anabaenopeptin）、アエルギノシン(aeruginosin)、ミクロギニン(microginin)、及びシアノペプトリン（cyanopeptolin)は、マイクロシスチス属で発見された（Namikoshi, M., and K. L. Rinehart. 1996. Bioactive compounds produced by cyanobacteria. J. Ind. Microbiol. 17: 373-384)。
【０００９】
マイクロシスチンと同様に、これらのペプチドは、通常でないアミノ酸、例えばシアノペプトリン中の３-アミノ-６-ヒドロキシ-２-ピペリドン（Ａｈｐ）、アエルギノシン型分子中の２-カルボキシ-６-ヒドロキシオクタヒドロインドール（Ｃｈｏｉ）、又はマイクロギニン中の３-アミノ-２ヒドロキシ-デカン酸（Ａｈｄａ）を有し、そして多くの構造バリアントはまた、これらの群に存在する。これらのペプチドは、様々な生物活性を示し、プロテアーゼ阻害を頻繁に示す（Namikoshi, M., and K. L. Rinehart. 1996. Bioactive compounds produced by cyanobacteria. J. Ind. Microbiol. 17: 373-384）。
【００１０】
天然マイクロシスチス集合におけるマイクロシスチンと他のオリゴペプチド、例えばアナバエノペプチン（anabaenopeptins）、マイクロギニン、及びシアノペプトリンの発生が、近年示されてきた。天然マイクロシスチス集合中の種及び遺伝子型組成が異種性であるということは周知であり、そしてミクロシスチンと非ミクロシスチン含有株の両方が、同じサンプルから単離された。マイクロギニンを産生する株と同様に、マイクロギニンを産生しない株も発見された。これらの結果により、天然マイクロシスチス集合において異なるオリゴペプチドパターンを有するかなり多様な遺伝子型が示唆される。
【００１１】
マイクロシスチスの単一コロニーを分類することにより、この属の天然集合における実際のペプチド多様性が極めて高いということが１９９９年に初めて示された。検出された多くの物質は、マイクロシスチン、アナバエノペプチン、マイクロギニン、シアノペプトリン、及びアエルギノシンなどのシアノバクテリアペプチドの周知の群に属し、そのうちの多くが、マイクロシスチスspp.（Microcystis spp.）において発見された。さらに、多くの未知の成分が、このようなコロニーにおいて検出された。しかしながら、これらの未知の成分の起源は、いまだ調査されている。なぜなら、観察された着生シアノバクテリア及び藻類とは別に、従属栄養細菌がマイクロシスチス・コロニーに存在することが知られているからである。（現地標本及び培養株の両方から得た）シアノバクテリアサンプルの化学的スクリーニングは、多様な物質を示した。例えば、プランクトスリックス・アガルジー（Planktothrix agardhii)のほぼ単一特異的なブルームが、２５５もの異なる物質含み、その多くはオリゴペプチドであった。
【００１２】
こうして、マイクロギニン産生能力を特定の種及び株に割り当てることに関する状況、つまり、関与する遺伝子型及び種の真の理解、並びにその進化が、今日までに可能ではないということが結論付けられうる。実際、現在の情報により、１の種又は「形態型（morphotype)」（つまり、同じ形態的特徴を有する個々の種）が、種々の「化学型（chemotype）」（つまり、異なるシアノペプチドを含む形態的に区別できない個別の種）をコードする一定の範囲の遺伝子型を含みうるということが示されたと、ＰＥＰＣＹ、つまり欧州委員会により支援を受けた研究プロジェクトは結論付けた。
【００１３】
ＡＣＥ阻害剤とマイクロギニン
ＡＣＥは、哺乳動物レニン-アンジオテンシン系で、アンジオテンシンＩのアンジオテンシンＩＩへの変換を触媒し、動脈狭窄を導き、動脈狭窄は次に血圧の増加を引き起こす。ＡＣＥ阻害剤はこのプロセスに反対に作用し、そしてその結果、血圧降下薬としてヒト医薬の役割を果たす。マイクロギニンは、ＡＣＥ阻害剤についての重要な薬剤候補である。これまでにマイクロギニンの３０の構造バリアントしか知られておらず、臨床開発が難しい。
【００１４】
マイクロギニンは、Ｎ末端でデカン酸誘導体、３-アミノ-２-ヒドロキシ-デカン酸（Ａｈｄａ）及びＣ末端で２個のチロシンユニットの支配により特徴付けられる。マイクロギニンは、Ｃ末端に生じる可変性を持った４〜６のアミノ酸の長さの点で変化する（Microginins, zinc metalloprotease inhibitors from the cyanobacterium Microcystis aeruginosa, 2000, Tetrahedron 56:8643-8656)。化学的にマイクロギニンバリアントを作成することは、３-アミノ-２-ヒドロキシ-デカン酸の合成によってのみ可能であった(J Org Chem. 1999 Apr 16;64(8):2852-2859. Acylnitrene Route to Vicinal Amino Alcohols. Application to the Synthesis of (-)-Bestatin and Analogues. Bergmeier SC, Stanchina DM.)。或いは、シアノバクテリウム株を、マイクロギニン活性についてスクリーニングしたが、これは煩わしくそして時間がかかるものであった。これまで、種の理解及びマイクロギニン産生株を非産生株から効率的に区別する方法を欠いていたため、効率的に株をスクリーニングすることができなかった（上の記載を参照のこと）。さらに、より優れたＡＣＥ阻害剤を開発する様々なリード化合物を提供するために、簡単かつ効率的にマイクロギニンを変化させ、そうして開発することができなかった。
【発明の開示】
【００１５】
マイクロシスチス・アエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）から、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）、及びテーラリング酵素（tailoring enzyme）から構成されるハイブリッド合成酵素をコードする約３０ｋｂｐにまたがる遺伝子クラスターを単離した。当該酵素がマイクロギニンの生合成に関与することが本発明者により示される。当該核酸の由来元の種は、G. C. Kurzinger from Lake Pehlitz 1977により最初に単離された。
【００１６】
本発明者は、マイクロギニンの産生、つまりマイクロギニンの異種発現を可能にする生物学的システムだけではなく、マイクロギニンを改変して、そうしてマイクロギニンのこれまで未知のバリアントを開発するためのシステムを提供も提供する。本発明はさらに、核酸、並びにマイクロギニンを産生する能力を有する種を同定する方法をさらに提供する。
【００１７】
特に、本発明は以下の活性：
アデニル化ドメイン(Ａ*)、ここで当該アデニル化ドメインは配列番号１に記載されるペプチド配列を含む、
アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、
以下の活性：（ｉ）ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、（ｉｉ）アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）（ｉｉｉ）アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ２）を含む、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）の伸張モジュール（ＥＭ）、
アミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
以下の活性（ｉ）縮合ドメイン（Ｃ）、（ｉｉ）アデニル化ドメイン（Ａ）、（ｉｉｉ）チオール化ドメイン（Ｔ）を含む、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）の３〜５の伸張モジュール（ＥＭ）及び、
チオエステラーゼ（ＴＥ）
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする１以上の核酸に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上に概説されたように、本発明は特に、以下の活性：
アデニル化ドメイン(Ａ*)、ここで、当該アデニル化ドメインは、配列番号１に記載されるペプチド配列を含む、
アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、
以下の活性：（ｉ）ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、（ｉｉ）アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、（ｉｉｉ）アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ２）を含むポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）の伸張モジュール（ＥＭ）、
アミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
以下の活性：（ｉ）縮合ドメイン（Ｃ）、（ｉｉ）アデニル化ドメイン（Ａ）、（ｉｉｉ）チオール化ドメイン（Ｔ）を含む、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）の３〜５の伸張モジュール（ＥＭ）、及び
チオエステラーゼ（ＴＥ）
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする１以上の核酸に関する。
【００１９】
本発明者は、マイクロギニンが、非リボソーム合成の産物であることを発見した。以前に自然界において同定されたマイクロギニンが、一部はリボソーム合成の産物であり、そしてさらに様々な酵素反応を介して処理された可能性があるということを理解することは重要である。
【００２０】
本明細書中で記載された核酸、つまりマイクロギニン合成酵素複合体が、マイクロシスチス種以外の他の生物、例えばノストック（Nostoc）、アナベナ（Anabaena）、プラクソトリックス（Plankthotrix）又はオシラトリア（Oscillatoria）にも存在しうるということをに留意することは重要である。マイクロギニンという用語は、こうして、公的に「マイクロギニン」と名づけられたペプチドをもたらす合成酵素複合体を産生するこのような核酸に本発明を制限するものではない。
ここで、アデニル化ドメイン(Ａ*)は、アシルアデニレートとしてオクタン酸を活性化することが理解され、そしてアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）は、チオエステルとしてオクタン酸アデニレートに結合することが理解される。
【００２１】
ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）の伸張モジュール（ＥＭ）は、例えば、リングビア マジュスクラ（Lyngbya majuscula）から単離されたジャマイクアミド（Jamaicamide）合成酵素遺伝子クラスターから知られている（Chem. Biol. Vol.11, 2004 pp 817-833）。ジャマイクアミド（海のシアノバクテリウムであるリングビア・マジュスクラ(Lyngbya majuscula)由来の新規の混合型ポリケチド・ペプチド・ニューロトキシン）の構造及び生合成は、少なくとも以下の活性：（i）ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、（ｉｉ）アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）及び（ｉｉｉ）アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ２）を含む。ＡＴは、マロニルＣｏＡの認識に関与し、ＫＳは、マロニルＣｏＡでの活性化されたオクタン酸アデニレートのクライゼン型縮合に関与し、そしてＡＣＰ２は、得られたデカン酸の結合に関与する。アミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）は、デカン酸のβアミノ化を行なう。
【００２２】
本発明に記載される核酸は、少なくとも以下の活性：（ｉ）縮合ドメイン（Ｃ）、（ｉｉ）アデニル化ドメイン（Ａ）、（iii）チオール化ドメイン（Ｔ）を含む非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）の３〜５の伸張モジュール（ＥＭ）を有しうる。Ａは、アミノ酸のカルボキシル基の活性化に関与し、Ｔは、活性化中間体の結合及び輸送に関与し、Ｃは、活性化アミノ酸を縮合して、ペプチド鎖を伸張させることに関与する。
【００２３】
最終的に、本発明に記載される核酸は、合成酵素複合体から最終生成物の切断を行なうチオエステラーゼ（ＴＥ）活性を含む。
【００２４】
本発明に記載される核酸が、ベクター中に存在するか、又は細菌染色体中に存在するということを想定することができる。この場合、上に記載された部分が、細胞内に存在するあいだに、１の分子中又は分子上に全てが存在する必要はないということを想定することができる。しかしながら、本発明に記載される酵素複合体を産生するために、マイクロギニン合成酵素複合体を産生することを意味する細胞が、上に記載された活性を含み、これが次にマイクロギニンを産生しうるということが必須である。こうして、本発明は、マイクロギニン合成酵素複合体の機能を有する上述の核酸分子の派生物も包含する。
【００２５】
当該分子は、非リボソーム酵素複合体をコードする他の分子、例えばマイクロシスチン合成酵素遺伝子クラスターにおいて見られる既知のアデニル化ドメインに類似しないという点で通常とは異なる特殊なアデニル化ドメイン(Ａ*)により特徴付けられる（Chem. Biol. Vol. 7 2000, pp 753-764: Structural organisation of microcystin synthesis in Microcystis aeruginosa PCC 7806: In integrated peptide-polyketide-synthetase system)。本明細書に包含される分子は、
配列番号１に示されるこのアデニル化ドメイン(Ａ*)、及び
少なくともＡＣＰ、ここで当該ＡＣＰは別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、
ＰＫＳの少なくとも１のＥＭ、ここで当該ＥＭは、以下の活性：（ｉ）ＫＳ、（ｉｉ）ＡＴ、（ｉｉｉ）ＡＣＰを含む既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、
ＡＭＴ、ここで当該ＡＭＴは、別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、
少なくとも以下の活性：（ｉ）Ｃ、（ｉｉ）Ａ、（ｉｉｉ）Ｔを含む３〜５のＥＭ、ここでこれらのＥＭは、別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよく、そして
ＴＥ、ここでこのＴＥは別の既知の非リボソーム酵素複合体に由来してもよい、
を有しうる。上記パーツが１以上のベクター上にあるか、及び/又は染色体に組み込まれているキメラは、全ての成分が１の細胞内に存在する限り、本発明により等しく包含される。
【００２６】
本発明は、配列番号１に８５％の同一性、より好ましくは配列番号１に９０％の同一性、最も好ましくは配列番号１に９５％の同一性を有するアデニル化ドメインを含むマイクロギニン合成酵素複合体をコードする単離核酸分子にも関する。本明細書の配列同一性は、慣用のヌクレオチド配列比較ソフトウェア、例えばthe best fit 及び／又はthe GCG package のpile up programsで配列比較した場合のアデニル化ドメインの全配列における割合（％）である。
【００２７】
本発明は、以下の活性：
アデニル化ドメイン(Ａ*)、ここで当該アデニル化ドメインは、配列番号１に記載されたペプチド配列を含み、
アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、
以下の活性：（ｉ）ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、（ｉｉ）アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、（ｉｉｉ）アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ２）を含むポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の伸張モジュール（ＥＭ）、
アミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
以下の活性（ｉ）縮合ドメイン（Ｃ）、（ｉｉ）アデニル化ドメイン（Ａ）、（ｉｉｉ）チオール化ドメイン（Ｔ）を含む非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）の３〜５の伸張モジュール（ＥＭ）、及び
チオエステラーゼ（ＴＥ）
を有するマイクロギニン合成酵素タンパク質複合体にも関する。
【００２８】
本発明は特に、アデニル化ドメイン(Ａ*)をコードする核酸分子にも関し、ここで当該アデニル化ドメインは、配列番号１に記載されるペプチド配列を含む。
【００２９】
本発明は、特に、ペプチド分子、アデニル化ドメイン(Ａ*)にも関し、ここで当該分子は、配列番号１に記載されるペプチド配列を含む。
【００３０】
本発明は、特に、アデニル化ドメイン(Ａ*)をコードする核酸分子にも関し、ここで当該分子は配列番号２５に記載される核酸配列を含む。
【００３１】
本発明の好ましい実施態様では、当該核酸は、以下の活性又はドメイン：
モノオキシゲナーゼ（ＭＯ）、
ＮＲＰＳの１以上の伸張モジュール（ＥＭ）内の組み込み型Ｎ−メチルトランスフェラーゼドメイン（ＭＴ）、
非組み込み型Ｎ−メチルトランスレフェラーゼ（ＭＴ）、
改変活性（ＭＡ）、ここで当該ＭＡは、以下の活性：ハロゲナーゼ、サルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、及びＣ−メチルトランスフェラーゼを含む群から選ばれ、
上記ＭＯ及び／又は他のＭＡの上流及び下流に隣接して位置するグリシンリッチ又はプロリン及びロイシンリッチのいずれかである１以上の繰り返しからなる２以上のペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）
をさらに、そして場合により含む。
【００３２】
ここで、ＭＯはデカン酸のヒドロキシル化を触媒する酵素であり、ＮＲＰＳの１以上の伸張モジュール（ＥＭ）内の組み込み型Ｎ−メチルトランスフェラーゼドメイン（ＭＴ）は、それぞれのモジュールによるアミド結合のメチル化を触媒し、そして非組み込み型のＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）はマイクロギニンのアミノ基のメチル化を触媒する。改変酵素という用語は、多くの酵素を表し、このような酵素は、基を付け加えるか又は結合を作成する。好ましい実施態様では、ＭＡは、以下の活性：ハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ、及びＣ−メチルトランスフェラーゼを含む群から選ばれる。
【００３３】
グリシンリッチ又はプロリンとロイシンリッチのいずれかである１以上の繰り返しからなる２以上のペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）をコードする核酸は、驚くべきことに、新規ＭＡの現存するマイクロギニン合成酵素複合体への組込みを助けることが、本発明者により発見された。このようなＳＰをＭＡの隣に配置することにより、発明者は、ＭＳＥＣにおいて以前に発見されない活性を含むマイクロギニン合成酵素複合体（ＭＳＥＣ）を作成することができる。これは次に、潜在的に新規の治療性質を有する新規のマイクロギニンの作成を可能にする。こうして、本発明は、非限定的に、ハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ−メチルトランスフェラーゼ又はＣ−メチルトランスフェラーゼなどのＭＡに隣接して配置されうるグリシンリッチ又はプロリンとロイシンリッチのいずれかである１以上の繰り返しからなる２以上のペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）をコードする核酸に関する。これらのＳＰは、「外来」活性が、酵素複合体中で「働く」ことを保証する手助けとなる。本発明者は、これがＳＰペプチド鎖の二次的構造を欠如していることによるということを発見した。
【００３４】
好ましい実施態様において本発明に記載される核酸は、場合により以下の配列、以下のタンパク質配列をコードする核酸配列：
配列番号１に記載されるアデニル化ドメイン(Ａ*)、
配列番号２に記載されるアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）、
マロニル-ＣｏＡの活性化と縮合に寄与するポリケチド合成酵素の伸張モジュール：        （ｉ）配列番号３に記載されるケトアシル合成酵素ドメイン（ＫＳ）、
（ｉｉ）配列番号４に記載されるアシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴ）、
配列番号５に記載されるアシルキャリアタンパク質ドメイン（ＡＣＰ２）、
配列番号６に記載されるアミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
アラニンの活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号７に記載される縮合ドメイン（Ｃ）、
（ｉｉ）配列番号８に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ）、
（ｉｉｉ）配列番号９に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ）、
ロイシンの活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号１０に記載される縮合ドメイン（Ｃ２）、
（ｉｉ）配列番号１１に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ２）、
（ｉｉｉ）配列番号１２に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ２）、
チロシン１の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号１３に記載される縮合ドメイン（Ｃ３）、
（ｉｉ）配列番号１４に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ３）、
（ｉｉｉ）配列番号１５に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ３）、
チロシン２の活性化及び縮合に寄与する非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号１６に記載される縮合ドメイン（Ｃ４）、
（ｉｉ）配列番号１７に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ４）、
（ｉｉｉ）配列番号１８に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ４）、
配列番号１９に記載されるチオエステラーゼ（ＴＥ）、
配列番号２０に記載されるモノオキシゲナーゼ（ＭＯ）、
配列番号２１及び２２に記載される２以上のペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ１/ＳＰ２）、
配列番号２３に記載されるロイシンの活性化及び縮合に寄与するＮＲＰＳの伸張モジュール内の組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼドメイン（ＭＴ）、及び
配列番号２４に記載された非組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ２）
を場合により含む。
【００３５】
上に概説されるように、本発明に記載される最小必要条件は、以下の活性：
アデニル化ドメイン(Ａ*)、ここで当該アデニル化ドメインは、配列番号１に記載されるペプチド配列を含み、
配列番号２に記載されるＡＣＰ、
以下の活性：
（ｉ）配列番号３に記載されるケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、
（ｉｉ）配列番号４に記載されるアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、
（ｉｉｉ）配列番号５に記載されるアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ２）
を含むポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）の伸張モジュール（ＥＭ）、
配列番号６に記載されるアミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
以下の活性：
（ｉ）配列番号７に記載される縮合ドメイン（Ｃ）、
（ｉｉ）配列番号８に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ）、
（ｉｉｉ）配列番号９に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ）、
を含む非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）の３〜５の伸張モジュール（ＥＭ）、及び
配列番号１０に記載されるチオエステラーゼ（ＴＥ）
を有するマイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸である。
【００３６】
本発明は、例えば転写されているか及び転写されていない他の活性及び/又はスペーサー領域をさらに含む本明細書に記載されるアナログに明らかに関する。
必要とされる酵素活性を維持しながらアミノ酸が交換され得るといことが当業者に明らかである。こうして、本発明はまた、上に概説された分子と同一ではないが、所望される酵素活性が保持されるかぎりにおいて変更された配列を有する分子にも関する。
【００３７】
本発明に従った核酸は、以下の：
配列番号２５に記載のアデニル化ドメイン(Ａ*)、
配列番号２６に記載されるアシルキャリアタンパク質(ＡＣＰ)、
マロニル-ＣｏＡの活性化及び縮合をコードするポリケチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号２７に記載されるケトアシル合成酵素ドメイン（ＫＳ）
（ｉｉ）配列番号２８に記載されるアシルトランスフェラーゼドメイン（ＡＴ）、
（ｉｉｉ）配列番号２９に記載されるアシルキャリアタンパク質ドメイン（ＡＣＰ２）、
配列番号３０に記載されるアミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
アラニンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号３１に記載される縮合ドメイン（Ｃ）、
（ｉｉ）配列番号３２に記載されるアデニル化ドメイン、
（ｉｉｉ）配列番号３３に記載されるチオール化ドメイン、
ロイシンの活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号３４に記載される縮合ドメイン（Ｃ２）、
（ｉｉ）配列番号３５に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ２）、
（ｉｉｉ）配列番号３６に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ２）、
チロシン１の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号３７に記載される縮合ドメイン（Ｃ３）、
（ｉｉ）配列番号３８に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ３）、
（ｉｉｉ）配列番号３９に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ３）、
チロシン２の活性化及び縮合をコードする非リボソームペプチド合成酵素の伸張モジュール：
（ｉ）配列番号４０に記載される縮合ドメイン（Ｃ４）、
（ｉｉ）配列番号４１に記載されるアデニル化ドメイン（Ａ４）、
（ｉｉｉ）配列番号４２に記載されるチオール化ドメイン（Ｔ４）、
配列番号４３に記載されるチオエステラーゼ（ＴＥ）、
配列番号４４に記載されるモノオキシゲナーゼ（ＭＯ）、
配列番号４５及び４６に記載される２以上のペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ１/２）、
配列番号４７に記載されるロイシンの活性化及び縮合をコードするＮＲＰＳの伸張モジュール（ＥＭ）内の組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼドメイン（ＭＴ）、及び
配列番号４８に記載される非組み込み型Ｎ-メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ２）
を含む群から選ばれる核酸を含みうる。
【００３８】
上に概説されるように、本発明に記載される最小必要事項は、以下の活性：
アデニル化ドメイン（Ａ*）、ここで当該アデニル化ドメインは配列番号２５に記載される核酸配列であり、
配列番号２６に記載される核酸配列を有するＡＣＰ、
以下の活性：
（ｉ）配列番号２７に記載される核酸配列を有するケトアシルシンターゼ（ＫＳ）、
（ｉｉ）配列番号２８に記載される核酸配列を有するアシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）、
（ｉｉｉ）配列番号２９に記載される核酸を有するアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ２）
を含むポリケチド・シンターゼ（ＰＫＳ）の伸張モジュール（ＥＭ）、
配列番号３０に記載される核酸配列を有するアミノトランスフェラーゼ（ＡＭＴ）、
以下の活性：
（ｉ）配列番号３１に記載される核酸配列を有する縮合ドメイン（Ｃ）、
（ｉｉ）配列番号３２に記載される核酸配列を有するアデニル化ドメイン（Ａ）、
（ｉｉｉ）配列番号３３に記載される核酸配列を有するチオール化ドメイン
を含む、非リボソームペプチド合成酵素（ＮＲＰＳ）の３〜５の伸張モジュール（ＥＭ）、及び
配列番号４３に記載される核酸配列を有するチオエステラーゼ（ＴＥ）
を有するマイクロギニン合成酵素をコードする核酸である。上記配列を含む分子は本明細書に好ましい。
【００３９】
本発明は、上で概説された配列と同一でないが、所望される酵素活性が維持される限りにおいて改変された配列を有する核酸分子にも関する。特に、核酸トリプレットの位置が「揺らぎ」得るし、そしてこれらの位置が、こうしてペプチド配列について影響を与えないで変更され得るということが、当業者に知られているであろう。さらなる複数のアミノ酸が、１超のＤＮＡトリプレットによりコードされる。アミノ酸配列を維持するこのようなトリプレットを変化することができるということは当業者に知られていよう。こうして、当該配列は、本発明に等しく包含される。
【００４０】
本発明は、配列番号２５に８５％の同一性を有し、より好ましくは配列番号１に９０％の同一性、最も好ましくは配列番号１に９５％の同一性を有するアデニル化ドメインを含む、マイクロギニン合成酵素複合体をコードする単離核酸分子にも関する。本明細書に記載される配列同一性は、慣用のアミノ酸アライメントソフトウェア、例えばthe best fit 及び/又はＧＣＧｐａｃｋａｇｅのpileup programsで配列比較した場合にアデニル化ドメインの全配列に対する割合（％）である。
【００４１】
好ましい実施態様では、本発明に記載される１以上の核酸は、図１に記載されるように、上流から下流の様式でマイクロギニン合成酵素複合体をコードする配列パーツにまとめられる。特に好ましい実施態様では、示される様に、そして１の分子上に配置される。
核酸分子は、ベクターのパーツであってもよい。このようなベクターは、特に、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、コスミド又はホスミド、及びラムダベクターである。シアノバクテリアにおいて自立的に複製できる好ましいプラスミドベクターは、ｐＶＺベクターから派生される。シアノバクテリアにおいて自立的に複製できる好ましいホスミドベクターは、ｐＣＣ１ＦＯＳTM及びｐＣＣ２ＦＯＳTMベクター（Epicentre Biotechnologies)から派生される。本発明に記載される核酸のベクターへの組み込みは、当業者に知られている方法である（Molecular Cloning: A Laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbour Labaratory Press)か又は、ゲノムライブラリーの作成用のキット（Epicenter Biotechnologies）の製品マニュアルに記載されている。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明は、本発明に記載される核酸で形質転換された微生物に関する。本発明に記載される核酸は、宿主生物の染色体に組み込まれてもよいし、又は分離したベクター上に存在してもよい（実施例を参照のこと）。光合成シアノバクテリアの宿主生物が、シネコシスチス sp.（Synechocystis sp.）、シネココッカス sp.（Synechococcus sp.）、アナバエナsp.（Anabaena sp.）、ノストックsp.（Nostoc sp.）、スピルリナ sp.（Spirulina sp.）、マイクロシスチス sp.（Microcystis sp.）を含む群から選ばれるということが好ましい。細胞は、以下の条件：
培地：Ｂｇ１１（シアノバクテリアの培養用）
通気：０．３〜３．０％二酸化炭素を含む空気
光度：４０〜１００μＥ/ｍ2＊ｓ（照射された光バイオリアクターの培養管の直径ｄ＝４〜１２ｃｍ）
回収時の細胞密度：ＯＤ750nm１〜２
及び宿主がマイクロシスチス・アエルギノーサである場合：
光性質：回収前２４〜４８時間において２５μＥ/ｍ2の追加赤色光の照射
で培養する。
【００４３】
従属栄養宿主生物が、他の従属栄養細菌よりもより適切なＧＣ含量及びコドン利用のため、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.を含む群について選択される。
【００４４】
マイクロギニン合成酵素の異種発現についてＥ．ｃｏｌｉを用いる場合、ホスホパンテテイン・トランスフェラーゼ（Ｐｐｔ）は、マイクロギニンの合成を可能にするために共発現された。マイクロギニン産生種からのＰｐｔの共発現が好ましい。従属栄養生物、例えばバチルスｓｐ.（Bacillus sp.）などの従属栄養生物からの広い特異性を有する他のＰｐｔも適切である。
【００４５】
本発明の１の実施態様では、本発明は、マイクロギニンを産生する方法であって、当該細胞がマイクロギニンを産生する条件下で細胞を培養することを含み、ここで、当該細胞は、本発明に記載された組換えマイクロギニンをコードする核酸を含み、そしてここで当該細胞が、当該核酸が存在しない場合にマイクロギニンを産生できない、前記方法に関する。
【００４６】
本発明者は、マイクロギニン合成酵素複合体をコードする核酸を検出することができる核酸配列をはじめて同定した。これは、複合体を産生する非リボソームタンパク質をコードする他の遺伝子クラスターが、特許請求の範囲で特許請求される当該クラスターと配列類似性を共有するという事実のため、かなり難しかった。本発明に記載されるこのようなプライマー又はプローブは、ａ）配列番号４９に記載される核酸（プライマーＡ）、ｂ）配列番号５０に記載される核酸（プライマーＢ）、ｃ）配列番号５１に記載される核酸（プライマーＣ）、ｄ）配列番号５２に記載される核酸（プライマーＤ）、ｅ）配列番号５３に記載される核酸（プライマーＥ）、ｆ）配列番号５４に記載される核酸（プライマーF）、ｇ）配列番号５５に記載される核酸（プライマーG）、ｈ）配列番号５６に記載される核酸（プライマーH）、i）配列番号５７に記載される核酸（プライマーI）、及びｊ）配列番号５８に記載される核酸（プライマーJ）からなる群から選ばれる。このようなプライマー又はプローブは、少し変更することができ、そして所望される標的配列を特異的に検出するタスクを達成することができるということが当業者に知られている。配列におけるこのような変化は、本発明により等しく包含される。本発明に従った当該プライマー又はプローブは、ハイブリダイゼーション反応及び/又は増幅反応に適用することができる。このような反応は、当業者に知られている。
【００４７】
本発明はまた、サンプル中のマイクロギニン合成酵素遺伝子クラスターを検出する方法に関し、ここで本発明に記載される１以上の核酸は、増幅及び/又はハイブリダイゼーション反応に適用される。
【００４８】
本発明に従った方法の好ましい実施態様では、プライマーＤとＦ又はＨとＪ又はＥとＩ又はＥとＡがサンプルを含むＰＣＲ反応混合物へと加えられ、そしてここで、増幅産物の存在は、マイクロギニン合成酵素遺伝子クラスターが存在することを示し、そして増幅産物が存在しないことは、マイクロギニン合成酵素遺伝子クラスターが存在しないことを示す。実施例（以下の実施例３）に示されるように、ある組み合わせが好ましい。サンプルは、単離されたＤＮＡであってもよく、原核細胞は平板培養又は液体培養から生じる。
【００４９】
プライマーＤとＦでの増幅反応を行なう場合、最も好ましい増幅条件は以下の通りである：ａ）変性、ｂ）４８℃のアニール、及びｃ）伸張（産物サイズ６７５ｂｐ）である。これらの温度は、２〜８℃の範囲で少しずつ変えられてもよい。プライマーＨとＪとの増幅反応を行なう場合、最も好ましい増幅条件は以下の通りである：ａ）変性、ｂ）５４℃のアニーリング、及びｃ）伸張（産物サイズ１１７４ｂｐ）。これらの温度は、２〜８℃で少しずつ変えられてもよい。プライマーＥとＩでの増幅反応を行なう場合、最も好ましい増幅条件は以下の通りである：ａ）変性、ｂ）５６℃のアニーリング、及びｃ）伸張（産物サイズ：１２７９ｂｐ）。これらの温度は２〜８℃の範囲で少しずつ変えられてもよい。
【００５０】
プライマーＥとＡで増幅反応を行なう場合、最も好ましい増幅条件は、以下の：ａ）変性、ｂ）５７℃のアニーリング、及びｃ）伸張（産物サイズ６２１ｂｐ）である。これらの温度は、２〜８℃で少しずつ変えられてもよい。プライマーについてモル濃度は、一般的に０．２〜１．０μＭである。緩衝液及び他の試薬は、使用されるポリメラーゼに左右される。
【００５１】
ハイブリダイゼーション反応を行なう場合、上記核酸は、通常標識される。このような標識は、放射活性であってもよいし、又は蛍光などの非放射活性であってもよい。核酸プライマー又はプローブは、例えば、ライブラリーのスクリーニングに適用されてもよい。
【００５２】
本発明は、配列番号１（Ａ＊）に記載されるペプチドに対する抗体にも関する。このような抗体の作成は、当業者に知られている。当該抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよい。このような抗体は、標識されるか又は非標識であってもよく、これらは他の形態、例えばヒト化抗体に変更されてもよい。
【００５３】
新たに同定されたペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）が、新規のハイブリッド遺伝子クラスターを製造するために、ＭＡｓＩに隣接して配置されうるということが本発明者により驚くべきことに発見された。これらのＳＰｓが、新規の活性又はドメインを配置することにより作用し、その結果、マイクロギニン合成酵素複合体において機能的に活性である。
【００５４】
こうして、本発明は、さらに、ペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）をコードする核酸に関する。ここで、当該ペプチド配列は、１の繰り返しユニット（ＳＲＵ）あたり少なくとも４個のグリシンアミノ酸を含み、又はＳＲＵあたり少なくとも５個のプロリン及び/又はロイシンアミノ酸を含む。ＳＰ内のＳＲＵは、７〜１５アミノ酸の長さであり、そしてＳＰは、２〜１０のＳＲＵを含む。本発明は、さらに、ペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）のペプチドに関する。ここで当該ペプチド配列はさらに、少なくとも４個のグリシンアミノ酸又は少なくとも５個のプロリン及び/又はロイシンアミノ酸を含み、ＳＰ内の単一繰り返しユニット（ＳＲＵ）は、７〜１５アミノ酸長であり、そしてＳＰは２〜１０ＳＲＵを含む。本発明の好ましい実施態様では、ＳＲＵは、９〜１３のアミノ酸長であり特に好ましい実施態様では、ＳＲＵは、１１のアミノ酸長である。好ましい実施態様では、ＳＰは３〜９のＳＲＵを含む。
【００５５】
好ましい実施態様では、本発明に従ったペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）をコードする核酸は、配列番号２０又は配列番号２１に示されるＳＲＵペプチドをコードする。さらなる実施態様では、本発明に従った当該ペプチド繰り返しスペーサー配列（ＳＰ）は、配列番号２０又は配列番号２１に示される配列を含むか又は有する。さらなる実施態様では、本発明に従った核酸は、配列番号４３又は配列番号４４に表された配列を有する。
【００５６】
上記ＳＰによるばかりではなく、特に当該ＳＰのため、本発明者は、天然において見られないマイクロギニンバリアントをもたらす酵素複合体を作成することができる。これは、本発明の必須の態様である。本発明は、組換えマイクロギニン・バリアントの単純な製造方法であって、本発明に記載される核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで改変し、マイクロギニンの合成を導く条件下で、マイクロギニン合成酵素をコードする組換え改変核酸を含む組換え細胞を増殖させ、そして合成されたマイクロギニンを回収する、を含む前記方法をはじめて提供する。
【００５７】
本発明に従った当該方法の好ましい実施態様では、当該核酸の改変は、以下の１以上の操作：
ａ）存在する１以上のＭＴを不活性化し、
ｂ）存在する１以上のＭＴを、ハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ-メチルトランスフェラーゼ又はＣ-メチルトランスフェラーゼで置換し、
ｃ）ＭＯを不活性化し、
ｄ）ＭＯをハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ-メチルトランスフェラーゼ又はＣ-メチルトランスフェラーゼでＭＯを置換し、
ｅ）ＡＭＴを不活性化し、
ｆ）ＡＭＴをハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ-メチルトランスフェラーゼ又はＣ-メチルトランスフェラーゼで置換し、
ｇ）ＰＫＳモジュールを不活性化し、
ｈ）全ＰＫＳモジュールを代わりのＰＫＳモジュールで置換するか、及び/又は１以上のドメイン（ＫＳ、ＡＴ、ＡＣＰ）を置換し、
ｉ）Ａ*ドメインを不活性化し、ｊ）Ａ*ドメインを代わりのＡドメインで置換し、
ｋ）１以上のＮＲＰＳモジュールを不活性化し、そして
ｌ）１以上のＮＲＰＳモジュールを代わりのＮＲＰＳモジュールで置換するか、及び/又は１以上のドメイン（Ｃ、Ａ、Ｔ）を置換する
の群から選ばれる操作でありうる。
【００５８】
ハロゲナーゼ、スルファターゼ、グリコシラーゼ、ラセマーゼ、Ｏ-メチルトランスフェラーゼ、又はＣ-メチルトランスフェラーゼは、原核生物から知られている。これらの酵素は、特にＮＲＰＳ/ＰＫＳシステムにおける二次代謝の遺伝子によりコードされる。
【００５９】
代わりのＰＫＳシステム、全モジュール、並びに単一のドメイン（ＫＳ、ＡＴ、ＡＣＰ）は、シアノバクテリア、並びにアクチノマイセート（Actinomycetes）、ミクソバクテリア(Myxobacteria)、細菌のバチルスにおいて見られた。
【００６０】
代わりのＮＲＰＳシステム、全モジュール、並びに単一のドメイン（Ｃ、Ａ、Ｔ）は、シアノバクテリア、並びにアクチノマイセート、ミクソバクテリア、細菌のバチルスにおいて見られた。
【００６１】
好ましい実施態様では、上記はシアノバクテリア由来である。
当該不活性化及び/又は置換が、多くの方法で行われるということに留意することは重要である。例えば不活性化は、完全な活性又はドメインの欠失を意味することがあり、又は１のヌクレオチド交換による不活性化を意味することもある。
当該方法は、当業者に知られており、そして基本的な分子生物学的方法、例えばＤＮＡ単離、制限酵素切断、ライゲーション、トランスフォーメーション、増幅などを含む。
【００６２】
好ましい実施態様では、元々のモジュール又はドメインを置換するために使用される代わりのモジュール又はドメインは、さらに置換に使用されるモジュール又はドメインの上流に隣接して位置する本発明に記載される１以上のＳＰ核酸、及び置換に使用されるモジュール又はドメインの下流に隣接して位置する本発明に記載される１以上のＳＰ核酸を含みうる。こうして、本発明の実施態様では、本発明に記載されるオリジナルの核酸に入ったドメインを含み、さらに上流及び下流の様式で隣接して位置する１以上のＳＰをさらに含むコンストラクトが作成される。このコンストラクトは次に、元々のマイクロギニン合成酵素をコードする核酸へとライゲーションされる。得られたコンストラクトは次に、ａ）宿主染色体中に組み込まれるか、又は自己複製ベクターのいずれかで形質転換することにより、宿主へと導入される。
【００６３】
ポリペプチド、つまりタンパク質は、上に記載されるタンパク質のいずれかであるが、１０を超えない（例えば、１０、９、８、７、６、５、４，３、２、又は１より大きくない）保存的置換を有さない任意のポリペプチドでありうる。保存的置換は、当該技術分野に知られており、そして典型的に、別の極性アミノ酸で１の極性アミノ酸を置換すること、及び他の酸性アミノ酸で１の酸性アミノ酸を置換することを含む。従って、保存的置換は、好ましくは、以下のアミノ酸の群：グリシン、アラニン、バリン、プロリン、イソロイシン、及びロイシン（非極性脂肪性側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（負に荷電された側鎖）；アスパラギン、グルタミン、メチオニン、システイン、セリン及びスレオニン（極性未荷電側鎖）；リジン、ヒスチジン、及びアルギニン；及びフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）；リジン、アルギニン、及びヒスチジン（正荷電側鎖）内での置換を含む。所定の置換の効果、例えばｐＫ1などの決定の仕方がよく知られている。１以上の保存的置換を有するポリペプチドを必要とする全ては、本発明に記載される未改変のタンパク質の能力の少なくとも５０％（例えば、少なくとも５５％；６０％、６５％、７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；９８％；９９％；９９．５％又は１００％、又はそれ以上）を有するということである。
【００６４】
好ましい実施態様では、ポリヌクレオチド、つまり本発明の核酸は、特許請求の範囲で請求されるポリヌクレオチドと、少なくとも８５％、好ましくは８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である核酸分子も含む。
【００６５】
２個の配列の間の同一性割合（％）の決定は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Scｉ USA 90: 5873-5877の数学的アルゴリズムを用いて達成される。このようなアルゴリズムは、Altschulら、(1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＢＬＡＳＴＮプログラムで、スコア＝１００、ワード長＝１２で行い、本発明に記載される核酸に相同なヌクレオチド配列を得た。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＢＬＡＳＴＰプログラムで、スコア＝５０、ワード長＝３で行なって、ＥＰＯバリアントポリペプチドに相同なアミノ酸配列をそれぞれ得た。比較の目的でギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐed  ＢＬＡＳＴがAltschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.に記載される様に利用される。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムが使用される場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターが使用される。
【００６６】
実施例１：本発明に記載される遺伝子クラスターの検出方法
マイクロギニン合成酵素複合体をコードする遺伝子を有する株を、ＭｇＣｌ２を含んだＲｅｄＴａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ及びプライマー対及び請求項１１〜１２に記載されるアニーリング温度を使用するＰＣＲ反応を行なうことにより、このような遺伝子クラスターなどを有する株を区別することができる。特に、ＰＣＲ条件は、以下の通りである：９５℃で１分間の初期変性、続いて３０秒間９５℃の変性、当該アニール温度で３０秒の伸張、そして１ｋｂの産物サイズにつき７２℃の伸張を３０サイクル行なった。
【００６７】
実施例２：マイクロシスチスｓｐｐ.株を産生するマイクロギニンの最適化培養法
培地：Ｂｇ１１（シアノバクテリアの培養用）
通気：０．３〜３．０％二酸化炭素を含む空気
光度：４０〜１００μＥ/ｍ2＊ｓ（照射された光バイオリアクターの培養管の直径ｄ＝４〜１２ｃｍ）
光性質：回収前２４〜４８時間において２５μＥ/ｍ2＊ｓでの追加赤色光の照射
回収時の細胞密度：ＯＤ750nm１〜２
【００６８】
【表１】
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【００６９】
【表２】
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【００７０】
【表３】
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【００７１】
【表４】
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【００７２】
【表５】
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【００７３】
【表６】
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【００７４】
【表７】
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【００７５】
【表８】
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【００７６】
【表９】
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【００７７】
【表１０】
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【００７８】
【表１１】
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【００７９】
【表１２】
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【００８０】
【表１３】
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【００８１】
【表１４】
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【００８２】
【表１５】
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【００８３】
【表１６】
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【００８４】
【表１７】
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【００８５】
【表１８】
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【００８６】
１の実施態様では、遺伝子クラスターの全体は、異種システムで形質転換され、そして発現される。配列番号６１は、当該クラスターの遺伝子を包含する。
【００８７】
【表１９】
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【００８８】
【表２０】
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【００８９】
【表２１】
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【００９０】
【表２２】
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【００９１】
【表２３】
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【００９２】
【表２４】
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【００９３】
【表２５】
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【００９４】
【表２６】
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【００９５】
【表２７】
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【００９６】
【表２８】
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【００９７】
【表２９】
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【００９８】
【表３０】
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【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、マイクロギニンの構造を示す。
【図２】図２は、マイクロギニン合成酵素遺伝子クラスター及びマイクロギニンの生合成経路を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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