(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなる、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ´）及び（ｈ）のいずれか１つのＤＮＡ：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号１の塩基配列の連続する一部であって、配列番号４の塩基配列を含む２００塩基長から４００塩基長の塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ´）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）のいずれか１つのＤＮＡにおいて１個から９個の塩基が欠失、置換又は付加されたＤＮＡ、
（ｈ）配列番号１の２６７〜２８９番目の塩基が欠失された塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項３】
請求項１に記載のＤＮＡがプロモーターと構造遺伝子との間に挿入されている請求項２に記載の組換えベクター。
【請求項４】
請求項２又は請求項３に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項５】
前記形質転換体は、植物細胞、植物組織、植物器官、植物体及び種子から選択されるいずれか１つである請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡとタンパク質をコードするＲＮＡとを含む翻訳用ＲＮＡを用いて、前記タンパク質を合成するタンパク質合成方法。
【請求項７】
請求項１に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む組換えベクターを用いて形質転換体を得ること、前記形質転換体を培養すること、を含む請求項６に記載のタンパク質合成方法。
【請求項８】
前記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液とを接触させること、を含む請求項６に記載のタンパク質合成方法。
【請求項９】
更に、請求項１に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む鋳型ＤＮＡから前記翻訳用ＲＮＡを合成すること、を含む請求項８に記載のタンパク質合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、翻訳エンハンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現の制御は、転写、転写後、翻訳、翻訳後の４つの段階において行われている。近年、翻訳の段階での制御（翻訳制御）についての研究が進み、構造遺伝子の翻訳効率を高める翻訳エンハンサーとして、５’非翻訳領域に由来する塩基配列が植物から単離されている（例えば、特許文献１及び２参照）。そして、遺伝子組換え技術を用いて細菌、培養細胞、及び植物などに有用物質を生産させる技術が注目を浴び、有用物質の発現効率を向上させる技術の開発が待たれるなか、翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなるＤＮＡを搭載したベクターが植物形質転換用ベクターとして上市されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平８−２５６７７７号公報
【特許文献２】特開２００３−７９３７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、翻訳エンハンサーの単離例はまだわずかである。翻訳エンハンサーは、生物種、細胞種、及び遺伝子の種類によって翻訳効率が異なることが予想されるため、翻訳エンハンサーに対する需要に充分に応じきれていないのが現状である。したがって、翻訳エンハンサーとして使用可能な候補塩基配列、及び当該塩基配列からなるＤＮＡを数多く開発することは重要である。
よって、本発明は、新規の翻訳エンハンサーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を達成するための具体的手段は以下の通りである。
［１］翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなる、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ´）及び（ｈ）のいずれか１つのＤＮＡである：（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１の塩基配列の連続する一部であって、配列番号４の塩基配列を含む２００塩基長から４００塩基長の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｆ´）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）のいずれか１つのＤＮＡにおいて１個から９個の塩基が欠失、置換又は付加されたＤＮＡ、（ｈ）配列番号１の２６７〜２８９番目の塩基が欠失された塩基配列からなるＤＮＡ。
［２］［１］に記載のＤＮＡを含む組換えベクターである。
［３］［１］に記載のＤＮＡがプロモーターと構造遺伝子との間に挿入されている［２］に記載の組換えベクターである。
［４］［２］又は［３］に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体である。
［５］前記形質転換体は、植物細胞、植物組織、植物器官、植物体及び種子から選択されるいずれか１つである［４］に記載の形質転換体である。
［６］［１］に記載のＤＮＡに対応するＲＮＡとタンパク質をコードするＲＮＡとを含む翻訳用ＲＮＡを用いて、前記タンパク質を合成するタンパク質合成方法である。
［７］［１］に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む組換えベクターを用いて形質転換体を得ること、前記形質転換体を培養すること、を含む［６］に記載のタンパク質合成方法である。
［８］前記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液とを接触させること、を含む［６］に記載のタンパク質合成方法である。
［９］更に、［１］に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含む鋳型ＤＮＡから前記翻訳用ＲＮＡを合成すること、を含む［８］に記載のタンパク質合成方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、新規の翻訳エンハンサーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の実施例３で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図２】本発明の実施例３で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図３】本発明の実施例３で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図４】本発明の実施例３で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図５】本発明の実施例３で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図６】本発明の実施例３で得られた形質転換体の翻訳効率を示す図である。
【図７】本発明の実施例４で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図８】本発明の実施例４で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図９】本発明の実施例４で用いた形質転換用プラスミドの構築図である。
【図１０】本発明の実施例４で得られた形質転換体の翻訳効率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
≪ＤＮＡ≫
本発明のＤＮＡは、翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列からなる下記（ａ）から（ｇ）のいずれか１つのＤＮＡである：（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）配列番号２の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｃ）配列番号３の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｅ）配列番号１の塩基配列の連続する一部であって、配列番号４の塩基配列を含む２００塩基長から４００塩基長の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｆ）上記（ａ）から（ｅ）のいずれか１つのＤＮＡにおいて１個又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたＤＮＡ、（ｇ）上記（ａ）から（ｅ）のいずれか１つのＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
本発明において、塩基配列が有する「翻訳エンハンサー活性」とは、当該塩基配列からなるポリヌクレオチドが構造遺伝子の発現系に存在した場合、この構造遺伝子の転写産物からタンパク質が翻訳される際に、翻訳により形成されるタンパク質の量を増大させる活性をいう。翻訳エンハンサー活性を有する塩基配列は、構造遺伝子の発現系において、転写産物の塩基配列の中に存在し、タンパク質には翻訳されない塩基配列であり、例えば翻訳開始コドンより上流に存在する。
【０００９】
本発明における配列番号１〜４の塩基配列（表１参照）からなるＤＮＡは、いずれもイネ（Oryza sativa）の第６染色体に座乗するＯｓＭａｃ１遺伝子（accession no. AK111844）の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から見出された。表１中の下線部は、配列番号４の塩基配列を示す。
【００１０】
【表１】
0005598899.tif 000002
【００１１】
配列番号１の塩基配列は最も長く、配列番号２〜４の塩基配列をその一部として有している。配列番号２は、配列番号１の１００番目の塩基以降に相当する配列であり、配列番号３は、配列番号１の２００番目の塩基以降に相当する配列である。配列番号４は、配列番号１〜３のいずれにも共通して含まれる５４塩基長の配列である。
【００１２】
本発明のＤＮＡは、前記（ａ）から（ｅ）のいずれでもよい。
前記（ｅ）のＤＮＡの塩基配列中、配列番号４の塩基配列の位置は、特に制限されないが、転写産物が適切な立体構造を形成できる観点、及び翻訳エンハンサー活性の強さの観点からは、全長の真ん中よりも５’末端側にあることが好ましく、５’末端側の領域であって全長の３分の１の領域内にあることがより好ましい。また、前記（ｅ）のＤＮＡは２００塩基長から４００塩基長の塩基配列からなり、取扱い性の点では、塩基長は短いことが好ましく、２００〜３５０塩基長が好ましく、２００〜３００塩基長がより好ましい。転写産物が適切な立体構造を形成できる観点、及び翻訳エンハンサー活性の強さの観点からは、２５０塩基長から４００塩基長が好ましく、３００塩基長から４００塩基長がより好ましく、３５０塩基長から４００塩基長が更に好ましい。前記（ｅ）のＤＮＡとしては、取扱い性の観点、転写産物が適切な立体構造を形成できる観点、及び翻訳エンハンサー活性の強さの観点から、配列番号３の塩基配列の連続する一部であって、配列番号４の塩基配列を含む２００塩基長から３００塩基長の塩基配列からなるＤＮＡが好ましい。
【００１３】
また本発明のＤＮＡは、前記（ｆ）又は（ｇ）として記載された等価物であってもよい。
本発明で「１個又は数個の塩基が欠失、置換又は付加された」というときの欠失等される塩基の個数は、その塩基配列が翻訳エンハンサー活性を有する範囲であればよく、例えば、１〜９個程度であり、翻訳エンハンサー活性の観点からは少ない方がよく、好ましくは１〜６個程度、より好ましくは１〜４個程度である。
【００１４】
本発明における「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高いＤＮＡ同士、すなわち６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６５℃、好ましくは６５℃での条件をいう。
本発明において「相同性」を具体的な数値として示す場合、例えば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（ＮＣＢＩ、又はAltschul, S. F. et al. J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）を用いた配列比較で決定することができる。
【００１５】
本発明のＤＮＡが、前記（ｆ）又は（ｇ）として記載された等価物である場合には、配列番号４に相当する領域の塩基配列、その５’末端側の領域の塩基配列、及びその３’末端側の領域の塩基配列とで、配列番号１の塩基配列中の対応する領域との相同性に差があってもよい。転写産物が適切な立体構造を形成できる観点、及び翻訳エンハンサー活性の強さの観点からは、配列番号４に相当する領域の塩基配列の相同性が、その５’末端側の領域の塩基配列の相同性、及びその３’末端側の領域の塩基配列の相同性に比し、高いことが好ましく、その３’末端側の領域の塩基配列の相同性が、その５’末端側の領域の塩基配列の相同性に比し、高いことが好ましい。
【００１６】
本発明のＤＮＡが、前記（ｆ）又は（ｇ）として記載された等価物である場合には、ＤＮＡの長さは、例えば５０〜６００塩基長程度であり、取扱い性の観点からは短いことが好ましく、例えば５０〜４００塩基長が好ましく、例えば５０〜３００塩基長がより好ましい。転写産物が適切な立体構造を形成できる観点、及び翻訳エンハンサー活性の強さの観点からは、ＤＮＡの長さは、１００塩基長から４００塩基長が好ましく、１５０塩基長から４００塩基長がより好ましく、２００塩基長から４００塩基長がより好ましく、２５０塩基長から４００塩基長がより好ましく、３００塩基長から４００塩基長がより好ましく、３５０塩基長から４００塩基長が更に好ましい。
【００１７】
本発明のＤＮＡは、通常のＤＮＡ合成の方法に従ってＤＮＡ鎖を化学合成することで得ることができる。また、本発明のＤＮＡは、本発明のＤＮＡを有する生物のｃＤＮＡライブラリーから単離することで得ることができる。前記生物としては、特に制限されないが、例えば、イネ科植物が挙げられ、その中でもイネが挙げられる。
【００１８】
塩基配列が翻訳エンハンサー活性を有するか否かを確認する方法は、特に制限されず、当該塩基配列が構造遺伝子の発現系に共存する場合と共存しない場合とについて、当該構造遺伝子にコードされるタンパク質の合成量を比較できる方法であればよい。例えば、任意のプロモーターとレポーター遺伝子との間に当該塩基配列からなるＤＮＡを挿入したトランジェントアッセイにより確認することができる。プロモーター及びレポーター遺伝子の具体例としては、後述する組換えベクターの構築に用いられるものと同様のものが挙げられる。
【００１９】
≪組換えベクター≫
本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを含むものである。本発明の組換えベクターは、任意のベクターに本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。
【００２０】
本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド（例えば、YEp13、YEp24、YCp50等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージＤＮＡ（例えば、Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス由来のベクターを用いることもできる。植物形質転換用ベクターとしては、例えば、pCAMBIA1301等のpCAMBIAベクター（オーストラリアＣＡＭＢＩＡ）、pGWB2等のpGWBベクター（島根大学総合科学研究支援センター中川研究室）、MATベクター（日本製紙）、pBI121等が挙げられる。
【００２１】
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製された前記ＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明において前記ＤＮＡは、その塩基配列が有する翻訳エンハンサー活性が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明の組換えベクターは、前記ＤＮＡが、任意のプロモーターと発現の目的となる構造遺伝子の翻訳開始コドンとの間に挿入されていることが好ましい。
【００２２】
ここで、プロモーター及び発現の目的となる構造遺伝子はそれぞれ、本発明では特に限定されず、構造遺伝子としては、例えば、各種生物に由来する遺伝子、あるいは一部又は全部を化学合成した遺伝子など、任意の構造遺伝子が挙げられる。なお、構造遺伝子は、通常のクローニング手法（例えば、J. Sambrook, et al., Molecular cloning, Cold spring Harbor Laboratory Press, 1989）を用いて調製することができる。
【００２３】
発現の目的となる構造遺伝子の例としては、遺伝子機能などの解析を目的として用いられるレポーター遺伝子が挙げられる。ベクターに、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子等のレポーター遺伝子と共に本発明のＤＮＡを搭載することで、遺伝子機能などの解析用の組換えベクターを構築することができる。当該組換えベクターは、従来の解析用組換えベクターに比し、レポーター遺伝子の発現量が増強される。
【００２４】
プロモーターとしては、本発明の組換えベクターを植物に適用する場合には、恒常的な発現をするものとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。また、緑葉特異的な発現をするものとして、例えばRuBisCOのSmall Subunit遺伝子のプロモーター、ＬＨＣＰ（集光タンパク質）等の光合成関連遺伝子のプロモーター等が挙げられ、貯蔵器官特異的な発現をするものとして、例えば貯蔵デンプンや貯蔵タンパク質の生合成に関わる遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
本発明の組換えベクターを大腸菌に適用する場合には、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーター、又はｔａｃプロモーター等のように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いることができる。本発明の組換えベクターを酵母に適用する場合には、例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。
【００２５】
また、本発明の組換えベクターは、必要に応じて、転写のエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＮＯＳなどのターミネーター、等を連結することができる。選択マーカーとしては、例えば、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシンの各耐性遺伝子）、除草剤耐性遺伝子（例えば、ビアラホス耐性遺伝子）、突然変異型アセト乳酸合成酵素遺伝子などが挙げられる。
【００２６】
本発明の組換えベクターは、植物の形質転換に用いられる場合、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、本発明のＤＮＡ、発現の目的となる構造遺伝子、及びＮＯＳターミネーターを適切な配向で搭載しているものが好ましい。
【００２７】
≪形質転換体≫
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターで形質転換されたものである。本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的の構造遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００２８】
宿主としては、本発明の組換えベクターに搭載された構造遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Escherichia coli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Rhizobium meliloti）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。またサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母も挙げられる。また、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞や、Ｓｆ９等の昆虫細胞、タバコのＢＹ２細胞、イネのＯＣ細胞などの植物の株化細胞も挙げられる。更に、宿主として、ラン藻類、クラミドモナス、ユーグレナ等の藻類、キノコ類も挙げられる。
【００２９】
宿主が植物である場合、宿主とは、植物体全体、果実、種子、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根、根茎、等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束、等）、培養細胞を含む植物細胞のいずれをも意味するものである。本発明の組換えベクターは、植物を宿主として好適に用いられる。
【００３０】
宿主として用いられる植物としては、特に制限されず、例えば、被子植物及び裸子植物のいずれでもよく、被子植物の場合、単子葉植物及び双子葉植物のいずれでもよい。
裸子植物としては、具体的には、ソテツ科のソテツ等、イチョウ科のイチョウ、マツ科のアカマツ、クロマツ、モミ、トウヒ等、スギ科のスギ等、イチイ科のイチイ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
単子葉植物としては、具体的には、イネ科のイネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、ヨシ、ススキ、アマランサス、ミスカンサス、スイッチグラス、ソルガム等、サトイモ科のサトイモ等、ヤシ科のヤシ、ナツメヤシ等、バショウ科のバナナ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
双子葉植物としては、具体的には、アブラナ科のシロイヌナズナ、ナタネ等、ナス科のタバコ、トマト、ジャガイモ等、ウリ科のメロン、カボチャ等、マメ科のダイズ等、アオイ科のワタ等、キク科のキク等、ツバキ科のチャ等、ブドウ科のブドウ等、トウダイグサ科のナンヨウアブラギリ、タイワンアブラギリ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。宿主としては、単子葉植物がより好適であり、イネ科の植物がさらに好適である。
【００３１】
宿主への組換えベクターの導入方法は、特に限定されるものではない。細菌を宿主として用いる場合の組換えベクターの導入方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法（Cohen, S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110(1972)）、エレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母を宿主として用いる場合の組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法（Becker, D.M. et al. Methods. Enzymol., 194：182(1990)）、スフェロプラスト法（Hinnen, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75：1929(1978)）、酢酸リチウム法（Itoh, H. J.Bacteriol., 153：163(1983)）等が挙げられる。
【００３２】
植物細胞を宿主として用いる場合の組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムのバイナリーベクター法、パーティクルガン法等が挙げられる。植物体、植物器官又は植物組織を宿主とする場合は、採取した植物切片にアグロバクテリウムのバイナリーベクター法又はパーティクルボンバードメント法で、あるいはプロトプラストにエレクトロポレーション法で、組換えベクターを導入することができる。
【００３３】
植物細胞、植物体、植物器官又はカルスを宿主として用いる場合、組換えベクターを導入し、形質転換の結果得られたカルスやシュート、毛状根などを分離することにより、形質転換を実施する。得られたカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモンの投与などにより植物体に再生させることができる。例えば、イネではHieiらの方法（Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)）、Fujimuraらの方法（Fujimura, T. et al., Plant Tissue Culture Letter, 2, 74-75 (1985)）、及びShimamotoらの方法（Shimamoto, K. et al., Nature 338:274-276(1989)）、トウモロコシではShillitoらの方法（Shillito, R. D. et al. Bio/Technology, 7:581(1989)）、ジャガイモではVisserらの方法（Visser, et al. Theor. Appl. Genet., 78:589(1989)）、シロイヌナズナではAkamaらの方法（Akama, K. et al. Plant Cell Rep., 12:7(1992)）等が挙げられる。これらの方法により作出された形質転換体またはその繁殖媒体（例えば、種子、塊茎、切穂、等）から得た形質転換体は本発明の対象である。
【００３４】
目的ＤＮＡが宿主に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、通常用いられる条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００３５】
≪タンパク質合成方法≫
本発明のタンパク質合成方法は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡと目的とするタンパク質をコードするＲＮＡとを含む翻訳用ＲＮＡを用いて、当該タンパク質を合成するタンパク質合成方法である。
本発明のタンパク質合成方法によれば、前記翻訳用ＲＮＡから目的とするタンパク質への翻訳が促進されるので、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡを目的とするタンパク質をコードするＲＮＡと共存させない場合に比し、目的とするタンパク質の合成量を増加させることができる。
【００３６】
本発明において、「本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡ」とは、本発明のＤＮＡの塩基配列においてＴ（チミン）をＵ（ウラシル）に置き換えた塩基配列からなるＲＮＡをいう。本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡの具体例としては、例えば、本発明のＤＮＡに基づくｍＲＮＡが挙げられる。
【００３７】
目的とするタンパク質は、特に限定されず、例えば、各種生物に由来する構造遺伝子にコードされるタンパク質、あるいは一部又は全部を化学合成した遺伝子にコードされるタンパク質など、任意のタンパク質が挙げられる。具体例は、後述する通りである。
【００３８】
本発明のタンパク質合成方法は、前記翻訳用ＲＮＡからタンパク質の翻訳反応が行われる系を用いるものであれば特に制限されず、従来公知のタンパク質の合成方法を採用することができる。具体的には例えば、形質転換体におけるタンパク質合成方法、及びインビトロ無細胞系におけるタンパク質合成方法が挙げられる。
【００３９】
＜形質転換体におけるタンパク質合成方法＞
本発明のタンパク質合成方法は、本発明のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを含む組換えベクターを用いて形質転換体を得ること、前記形質転換体を培養すること、を含むタンパク質合成方法とすることができる。
【００４０】
前記形質転換体を得ることは、特に制限されず、前記組換えベクターを、発現の目的となる構造遺伝子が発現し得るように宿主に導入することからなる。前記形質転換体は、具体的には例えば、既述の本発明の形質転換体を得る方法と同様の方法により得ることができ、宿主、組換えベクターの導入方法などの好ましい態様も同様である。
【００４１】
前記組換えベクターは、本発明のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを連結することで得ることができる。この連結は、本発明のＤＮＡの塩基配列が有する翻訳エンハンサー活性が発揮されるように連結されればよく、例えば、構造遺伝子の５’上流側に本発明のＤＮＡが位置するように連結する。
上記の連結は、具体的には例えば、適当なベクターを選択し、そこに本発明のＤＮＡ及び発現の目的となる構造遺伝子を、適切な配向で挿入して組換えベクターを作製することにより容易に行うことができる。この組換えベクターは、本発明のＤＮＡの５’上流側に転写を促進させるためのプロモーター配列を有することが好ましく、構造遺伝子の３’下流側に転写を終結させるためのターミネーターを有することが好ましい。上記の連結に用いることができるベクター、プロモーター及びターミネーター、並びにベタクーへのＤＮＡの挿入の仕方は、既述の本発明の組換えベクターと同様であり、好ましい態様も同様である。
【００４２】
前記形質転換体を培養することは、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。本発明において「培養」とは、前記形質転換体を育てることをいい、前記形質転換体が少なくとも維持されればよく、前記形質転換体が植物体全体、種子、植物器官、植物組織の場合、栽培をも含む概念である。前記形質転換体を培養すれば、その培養物（前記形質転換体が植物体全体、種子、植物器官、植物組織の場合、「栽培物」ともいう。）から、発現の目的となる構造遺伝子の発現産物であるタンパク質を得ることができる。本発明において「培養物」又は「栽培物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、植物体全体、種子、植物器官、植物組織、及びこれらの破砕物のいずれをも意味するものである。
【００４３】
更に、前記タンパク質が酵素の場合には、当該酵素によって触媒される反応の産物、又は当該反応に続く一連の生合成反応経路上の中間体及び／又は最終生産物についても、前記形質転換体の培養物又は栽培物から得ることができる。これらの産物を、以下単に「代謝産物」という。
【００４４】
前記形質転換体が例えば大腸菌や動物培養細胞の場合、発現の目的となる構造遺伝子としては、具体的には、バイオ医薬品として用いられるインスリン、成長ホルモン、造血因子、抗体の各遺伝子、等が挙げられる。
前記形質転換体が植物の場合、発現の目的となる構造遺伝子としては、除草剤耐性遺伝子、ビタミン合成に関わる遺伝子、ポリフェノール（カテキン等）の合成に関わる遺伝子、花の色素の遺伝子、抗菌ペプチドの合成に関わる遺伝子、抗原ペプチド（アレルゲン、毒素）の低減に関わる遺伝子、等が挙げられる。
前記形質転換体が例えばイネ科植物（イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ等）や果実をつける植物などの食用植物の場合、前記形質転換体を栽培することで、種子（穀物）や果実、その他の可食部における、発現の目的となる構造遺伝子でコードされるタンパク質の含有量を増加させることができる。前記タンパク質が酵素の場合には、その酵素に関する代謝産物についても、種子（穀物）や果実、その他の可食部における含有量を増加させることができる。
【００４５】
前記形質転換体を培養する方法は、特に制限されず、宿主の培養に用いられる通常の方法を採用することができる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた前記形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、前記形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
前記微生物の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で行う。なお、培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００４６】
前記形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えば、ＭＳ基本培地（Murashige, T. & Skoog, F. Physiol. Plant. 15:473(1962)）、ＬＳ基本培地（Linsmaier, E. M. & Skoog,F. Physiol. Plant. 18:100(1965)）、プロトプラスト培養培地（ＬＳ培地を改変したもの）等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用することが好ましい。より具体的には、例えば、上記培地に細胞、組織又は器官を１０〜１００ｇ新鮮重／ｌ接種し、必要によりＮＡＡ、２，４−Ｄ、ＢＡ、カイネチン等を適宜添加して培養する。培養開始時の培地のｐＨは５〜７に調節し、培養は通常２０〜３０℃、好ましくは２５℃前後で、また、０．２〜１ｖｖｍ通気、５０〜２００ｒｐｍ攪拌で１〜６週間培養することができる。
前記形質転換体が植物体である場合は、圃場やガラスハウスなどで栽培又は水耕培養することができる。
【００４７】
前記形質転換体の培養の終了後、培養物又は栽培物から目的とするタンパク質及び／又は代謝産物を採取するには、各物質の通常の精製手段を適用することができる。なお、培養物又は栽培物から目的とするタンパク質及び／又は代謝産物を採取することは、培地、圃場などから培養物又は栽培物自体を採取することであってもよい。
【００４８】
大腸菌や酵母菌等の微生物又は培養細胞を宿主として得られた前記形質転換体の場合、タンパク質が微生物内又は培養細胞内に生産される場合には、微生物又は培養細胞を破砕することにより、タンパク質を抽出することができる。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養物中からタンパク質を単離精製することができる。
【００４９】
前記形質転換体が植物細胞又は植物組織の場合、培養の終了後、例えば、以下のようにして目的のタンパク質及び／又は代謝産物を単離精製することができる。
まず、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、液体窒素で凍結させた後、液体窒素中で乳鉢等を用いて磨り潰す処理、等により細胞を破壊する。その後、適宜、抽出用溶液を加えて目的のタンパク質及び／又は代謝産物を含む溶液を抽出し、次いで、濾過又は遠心分離等を用いて不溶物を除去し、粗タンパク質溶液又は代謝産物を含む溶液を得る。上記粗タンパク質溶液からタンパク質をさらに精製するには、通常のタンパク質精製法を使用することができる。例えば、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。また、代謝産物を含む溶液から代謝産物をさらに精製するには、従来から知られている精製手法を使用することができる。例えば、溶媒抽出、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を、単独又は適宜組み合わせることにより行う。
【００５０】
植物器官又は植物体からタンパク質及び／又は代謝産物を採取するには、超音波破砕処理、磨砕処理等を行って上記粗タンパク質溶液又は代謝産物を含む溶液の抽出液を調製し、その後は上記の精製手法と同様にして行うことができる。
【００５１】
＜インビトロ無細胞系におけるタンパク質合成方法＞
本発明のタンパク質合成方法は、前記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液とを接触させること、を含むタンパク質合成方法（以下、「インビトロ無細胞系タンパク質合成方法」ともいう。）とすることができる。
前記インビトロ無細胞系タンパク質合成方法は、インビトロで、前記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液（以下、単に「反応液」ともいう。）とを接触させることで、前記翻訳用ＲＮＡからタンパク質の翻訳反応を行い、目的とするタンパク質を合成することができる。
【００５２】
前記インビトロ無細胞系タンパク質合成方法は、特に制限されず、例えば、特開２００９−１６５４２６号公報、特開２００７−１４３４３５号公報、特開２００４−３４４０１４号公報、特開２００３−２４５０９４号公報、等に記載の方法を適用することができる。具体的には、例えば、下記の構成とすることができる。
【００５３】
前記反応液としては、例えば、Ｗｈｅａｔ Ｇｅｒｍ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｌｕｓ（プロメガ社製）やＰＲＯＴＥＩＯＳ（東洋紡績社製）、ＲＴＳシステム（ロシュ）等の試薬キットを利用することができる。
前記翻訳用ＲＮＡと前記反応液とを接触させる方法としては、任意の方法で行えばよく、例えば、前記反応液に前記翻訳用ＲＮＡを添加してもよく、前記翻訳用ＲＮＡを含む溶液に前記反応液を投入してもよい。また、前記反応液に前記翻訳用ＲＮＡを連続的に添加してもよく、定期的に添加してもよい。
前記翻訳反応の終了後は、目的とするタンパク質を、常法により精製すればよい。具体的には、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、タンパク質を単離精製することができる。
【００５４】
前記翻訳用ＲＮＡを得る方法は特に制限されないが、本発明のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを含む鋳型ＤＮＡを用いて、インビトロで転写反応を行うことで転写産物として合成することができる。この転写反応は、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼやＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを利用する市販の試薬キット（ロシュ、ニッポンジーン等）等を利用して容易に行うことができる。転写反応により合成された前記翻訳用ＲＮＡは、常法により精製して前記の翻訳反応に用いてもよく、また、転写反応の処理に用いた溶液ごと前記の翻訳反応に用いてもよい。
【００５５】
前記鋳型ＤＮＡは、本発明のＤＮＡと発現の目的となる構造遺伝子とを連結することで得ることができる。この連結は、本発明のＤＮＡの塩基配列が有する翻訳エンハンサー活性が発揮されるように連結されればよく、例えば、構造遺伝子の５’上流側に本発明のＤＮＡが位置するように連結する。
上記の連結は、具体的には例えば、適当なベクターを選択し、そこに本発明のＤＮＡ及び発現の目的となる構造遺伝子を、適切な配向で挿入して組換えベクターを作製することにより容易に行うことができる。この組換えベクターは、本発明のＤＮＡの５’上流側に転写を促進させるためのプロモーター配列を有することが好ましく、構造遺伝子の３’下流側に転写を終結させるためのターミネーターを有することが好ましい。上記の連結に用いることができるベクター、プロモーター及びターミネーター、並びにベタクーへのＤＮＡの挿入の仕方は、既述の本発明の組換えベクターと同様であり、好ましい態様も同様である。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はその主旨を越えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。なお、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。実施例に用いたプライマーの塩基配列を以下の表２及び表３に示す。
【００５７】
【表２】
0005598899.tif 000003
【００５８】
【表３】
0005598899.tif 000004
【００５９】
（実施例１）
＜イネＯｓＭａｃ１遺伝子の構造解析＞
イネ（Oryza sativa）の第６染色体に座乗するデンプン枝つけ酵素の遺伝子（Ｓｂｅ１）（accession no. D10838）の近傍の塩基配列を調べる過程で、Ｓｂｅ１遺伝子の上流近傍に別個の遺伝子が存在し、当該遺伝子の転写が行われていることがわかった。この転写産物に対応する遺伝子を検索したところ、イネMap kinase activating proteinと相同性を有する機能未知のタンパク質をコードする遺伝子であることがわかった。
【００６０】
そこで、上記の遺伝子を、ＯｓＭａｃ１遺伝子と名付け、その構造を詳細に解析した。ＯｓＭａｃ１遺伝子は、イネの第６染色体に由来するＢＡＣクローン（AP004685）にクローニングされており、翻訳領域には９個のイントロンが含まれ、１０個のエクソンに分断されていることがわかった。
ＯｓＭａｃ１遺伝子の転写産物にあたる約２．４キロ塩基対のｃＤＮＡはデータベースに既に登録されていた（accession no. AK111844）。このｃＤＮＡには、４７９個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードする主たるＯＲＦ（open reading frame）の上流に、約５８０塩基長の非常に長い５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）が存在し、さらに、この５’ＵＴＲ内には３個のｕＯＲＦ（upstream ORF）が存在することがわかった。これらｕＯＲＦは、主たるＯＲＦの翻訳に影響を与えていることが推測された。
【００６１】
ＯｓＭａｃ１遺伝子と相同性を示す遺伝子をＢＬＡＳＴ(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) を用いて検索したところ、イネゲノムには、ＯｓＭａｃ１遺伝子と相同性を示す２つの遺伝子が存在することがわかった。これらを、ＯｓＭａｃ２遺伝子（Accession no. AK073148）及びＯｓＭａｃ３遺伝子（Accession no. AK069607）と名付けた。これらの遺伝子から予測される転写産物にも、ＯｓＭａｃ１遺伝子と同様に長い５’ＵＴＲがあり、この中に複数のｕＯＲＦが存在することがわかった。
【００６２】
（実施例２）
＜イネＯｓＭａｃ１遺伝子のｃＤＮＡの単離とその構造解析＞
開花後５日目のイネの未熟種子から以下の方法で全ＲＮＡの抽出を行った。
３粒の未熟種子を液体窒素で凍結した後、液体窒素を加えて冷却しながら冷却した乳鉢と乳棒を用いて破砕した。破砕した未熟種子サンプルは２ｍｌ用容のチューブに移し自動ＳＫミル (トッケンＩｎｃ．) を用いて粉砕した。粉砕物にSepasol RNA I Super (ナカライテスク) を１ｍｌ加え、転倒混和した後、室温で５分間静置することで細胞を破壊した。これに２００μｌのクロロホルムを加えて転倒混和した後、室温で１０分間静置し、これを遠心分離 (１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間) して５００μｌの上清を得た。これを新しいチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えて転倒混和した後、室温で１０分間静置してＲＮＡ画分を沈殿させた。沈殿物を遠心分離 (１５，０００ｒｐｍ、４℃、１０分間) して回収し、乾燥後、５０μｌのDEPC treated water（和光純薬）を加えて溶解した。これに５０μｌのＤＮａｓｅ反応液を加えて最終濃度で４０ｍＭ  Tris−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．０１Unit  RNase Inhibitor（ＴＯＹＯＢＯ）、０．１Unit  ＤＮａｓｅ（ＴａＫａＲａ）とし、３７℃で４５分間反応させて混入するＤＮＡを分解した。反応終了後、反応液と等量のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール (２５:２４:１) 混合物 〔フェノールにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)−１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加えて飽和させたもの：クロロホルム：イソアミルアルコールを２５:２４:１の割合で混合したもの 〕を加えてよく攪拌した。これを遠心分離 (１５，０００ｒｐｍ、室温、５分間) して、生じた上層から９０μｌを取り新しいチューブに入れた。これに９μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液 (ｐＨ４．８) と２５０μｌのエタノールを加えて転倒混和し、さらに−２０℃で３０分間静置してＲＮＡ画分を沈殿させた。これを遠心分離 (１５，０００ｒｐｍ、４℃、２０分間) し上清を捨てた後、沈殿に７０％エタノール水溶液を加えて遠心分離 (１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間) して、沈殿を洗浄した。沈殿を乾燥させた後、５０μｌのDEPC treated waterを加えて沈殿を溶解した。これをＲＮＡ溶液とした。ＲＮＡ溶液のＲＮＡ濃度を定量した後、１μｇ相当量のＲＮＡ溶液を取り、これにDEPC treated waterを加えて全量を２４μｌになるように調整した。このＲＮＡ溶液にOligo(dT)20プライマー（ＴＯＹＯＢＯ）と逆転写酵素（ReverTraAce（ＴＯＹＯＢＯ））及び反応バッファーを加えてｃＤＮＡの合成を行った。逆転写酵素の反応は、ReverTraAce（ＴＯＹＯＢＯ）に付属する説明書に従った。
【００６３】
上記で得られたｃＤＮＡからＯｓＭａｃ１遺伝子に対応するｃＤＮＡの単離を行った。ＯｓＭａｃ１遺伝子のｃＤＮＡの単離には、ＯｓＭａｃ１遺伝子の塩基配列をもとに合成したＰＣＲプライマー（配列番号７：Mac_c_１F、及び配列番号８：Mac_2422R）を用いた。ＰＣＲにはKOD plus DNA polymemrase（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。反応液の組成はKOD plus DNA polymemraseに付属する説明書に従った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で３分間の繰返しを３０サイクル行った後、６８℃で１０分間保持した。得られた増幅断片はアガロースゲル電気泳動で分離し、目的の増幅断片を抽出、精製した。断片の精製にはWizard SV Gel and PCR Clean-Up System（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。精製した断片はpENTR/D-TOPO cloning kit（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてpENTR/D-TOPO（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００６４】
上記で得られた挿入断片の塩基配列を調べたところ、増幅した断片はＯｓＭａｃ１遺伝子の転写産物に相当するｃＤＮＡであった。また、このｃＤＮＡ断片には長さの異なる３種類のｃＤＮＡが存在していた。この長さの相違は、ＯｓＭａｃ１遺伝子の転写産物の５’ＵＴＲにおいて、選択的スプライシングが生じていることに由来することがわかった。塩基配列が異なる３種類の５’ＵＴＲを、ＵＴＲａ、ＵＴＲｂ、ＵＴＲｃと命名した。ＵＴＲｃの塩基配列は前記表１の配列番号１の通りであり、ＵＴＲｂの塩基配列は下記表４の配列番号５の通りであり、ＵＴＲａの塩基配列は下記表４の配列番号６の通りである。
【００６５】
【表４】
0005598899.tif 000005
【００６６】
ＵＴＲｃは最も長く５８０塩基長あり、ＵＴＲａ及びＵＴＲｂをその一部として有している。ＵＴＲａ（５２６塩基長）の塩基配列は、ＵＴＲｃにおいて配列番号４の塩基配列が無いものである。ＵＴＲｂ（５４２塩基長）の塩基配列は、ＵＴＲｃにおいて配列番号４の塩基配列のうち５’末端側 の３８塩基長に相当する塩基配列が無く、３’末端側 の１６塩基長に相当する塩基配列を有している（表４の配列番号５の下線部分）。
【００６７】
配列番号４の塩基配列に関し、公開されている遺伝子データベースを用いて相同性検索を行った。データベースはＮＣＢＩ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用い、相同性検索にはＢＬＡＳＴプログラムを用いた。当該プログラムのデフォルトの条件で植物のゲノム配列を探索した結果、この塩基配列と相同性を示す塩基配列は見つからなかった。
【００６８】
（実施例３）
＜イネＯｓＭａｃ１遺伝子の５’ＵＴＲの塩基配列の差異がＯＲＦの翻訳に及ぼす影響の解析＞
前記ＵＴＲａ、ＵＴＲｂ及びＵＴＲｃの塩基配列の違いが、主たるＯＲＦの翻訳に対してどのような影響を与えているのかを調べた。そのために、上記の３種類の５’ＵＴＲの各下流にＧＵＳ（β-グルクロニダーゼ）遺伝子を連結したプラスミドを構築し、イネ培養細胞に導入し形質転換体を作製して翻訳効率の測定を行った。
【００６９】
［形質転換用プラスミドの構築］
プラスミドは、ＧＵＳ遺伝子が含まれるプラスミドｐＢＩ２２１（Jefferson, R. A., EMBO J., 6, 3901-3907(1987)）から調製した。このプラスミドＤＮＡに含まれるカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの５’末端領域とＮｏｓターミネーターの３’末端領域の配列を基に作製したＰＣＲプライマー（配列番号９：35s-Fw、及び配列番号１０：Nos-Rv）を用いてＰＣＲを行い、35Ｓ promoter-GUS-Nos terminator領域のＤＮＡ断片を増幅した。得られた断片はpENTR/D-TOPO cloning kit（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてpENTR/D-TOPO（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、EntryプラスミドであるpENTR-35S promoter-GUS-Nos terminatorを得た。
【００７０】
次に、ＵＴＲａ、ＵＴＲｂ及びＵＴＲｃのそれぞれをテンプレートとし、５’末端に制限酵素 Ｘｂａ Ｉによる切断部位を付加したＰＣＲプライマー（配列番号１１：Xba I-UTR-Fw、及び配列番号１２：Xba I-UTR-Rv）を用いて、ＯｓＭａｃ１遺伝子の５’ＵＴＲとＯＲＦ領域の末端部分(１２塩基対）とを含むＤＮＡ断片を増幅した。
得られた各ＤＮＡ断片をＸｂａ Ｉで切断した後、これをＸｂａ Ｉで切断したpENTR-35S promoter-GUS-Nos terminatorとLigation high (ＴＯＹＯＢＯ)を用いてライゲーションし、各ＤＮＡ断片を挿入したEntryプラスミド、pENTR-35S promoter-UTRa-GUS-Nos terminator、pENTR-35S promoter-UTRb-GUS-Nos terminator、及びpENTR-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminatorを得た。ライゲーション用反応液の組成は、付属の説明書に従った。反応条件は、１６℃、３０分間で行った。
【００７１】
また、pENTR-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminatorをテンプレートとし、ＰＣＲプライマーとして配列番号１１のXba I-UTR-Fw、及び配列番号１３のMac-I deletiom(267-289)-Rvを用いてＰＣＲ を行い、得られたＤＮＡ断片を精製した。
次に、このＤＮＡ断片を巨大なプライマーと見立て、pENTR-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminatorをテンプレートとし、ＰＣＲプライマーとして配列番号１２のXba I-UTR-Rvを用いてＰＣＲを行った。この結果、両末端にＸｂａ Ｉサイトが付加され、ＵＴＲｃの一部（ＵＴＲｃの５’末端から数えて２６７〜２８９番目）を欠損させたＵＴＲｃ（Ｉｄｅｌ）とＯＲＦ領域の末端部分(１２塩基対）とを含むＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片をＸｂａ Ｉで切断した。これをＸｂａ Ｉで切断した pENTR-35S promoter-GUS-Nos terminator とLigation high (ＴＯＹＯＢＯ)を用いてライゲーションし、Entryプラスミド、ENTR-35S promoter-UTRc(Idel)-GUS-Nos terminatorを作製した。ライゲーション用反応液の組成は、付属の説明書に従った。反応条件は、１６℃、３０分間で行った。
【００７２】
続いて、上記で得られたEntryプラスミドをGatewayプラスミドであるｐＧＷＢ１（Accession No. AB289764）と混合し、LR Clonas（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて組換え反応（ＬＲ反応）を行い、形質転換用プラスミド、pGWB1-35S promoter-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRa-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRb-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminator、及びpGWB1-35S promoter-UTRc(Idel)-GUS-Nos terminatorを得た。ＬＲ反応は付属の説明書に従って行った。
【００７３】
上記の形質転換用プラスミドの構築図を図１〜５に示す。四角で囲んだ塩基配列はＴＡＴＡボックスであり、記載されている塩基配列の３’末端に位置する「Ｍｅｔ」はＧＵＳ遺伝子の翻訳開始点であり、それよりも上流に位置する「Ｍｅｔ」はＯｓＭａｃ１遺伝子のＯＲＦ領域の翻訳開始点であり、大文字で示した塩基配列は配列番号４の塩基配列の全部又は一部である。
【００７４】
［イネ培養細胞の形質転換］
上記で得られた形質転換用プラスミドを用いて、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens EHA105）を用いてイネの形質転換を行った。形質転換は以下のHieiらの方法（Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)）に従った。形質転換用プラスミドを導入したアグロバクテリウムの菌体を懸濁し、これに３０μｌのアセトシリンゴン溶液 (１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、この懸濁液を用いてイネの培養細胞に感染させた。感染後の培養細胞は２８℃、暗所で３日間の共存培養を行った。共存培養後の培養細胞は滅菌水で洗浄後、N6D (＋Cla）プレート培地（Hiei, Y. et al., Plant J., 6, 271-282 (1994)）に置床し、２８℃、明条件で３〜７日間培養した。N6D (＋Cla) プレート培地で培養した培養細胞を、N6D (＋Cla、Hm) プレート培地（同）に移植し、２８℃、明条件で３〜４週間培養した。その後、MSR (＋Hm) プレート培地（同）に移植した。この培養細胞を２８℃、明条件で培養し、ハイグロマイシン耐性により培養細胞を選抜した。
【００７５】
［翻訳効率の測定］
上記で得られた培養細胞を４０ｍｌのＲ２液体培地（Fujimura, T. et al., Plant Tissue Culture Letter, 2, 74-75 (1985)）（２５０ｍｇ／ｌ  Claforan（Ｓａｎａｆｉ  Ａｖｅｎｔｉｓ）と５０ｍｇ／ｌ  ハイグロマイシン (和光純薬)を含む）に投入して２８℃で２週間の振とう培養を行った。Ｒ２液体培地を用いて培養した細胞（１００ｍｇ）を取り出し、１００μｌのＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭ リン酸緩衝役（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％  TritonX-100、０．１％  Salcosyl、５ｍＭ  ＤＴＴ、２０％  メタノール）を加え、自動ＳＫミル（トッケンＩｎｃ．）を用いて破砕した。これに９００μｌのＧＵＳ抽出緩衝液を加えて転倒混和した。これを遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分間) して上清を集め、これを酵素粗抽出液とした。
【００７６】
上記で得られた酵素粗抽出液を用いて、Jeffersonらの方法（Jefferson, R. A., EMBO J., 6, 3901-3907 (1987)）に従って以下の方法でＧＵＳ活性を測定した。８０μｌの酵素粗抽出液に、１７０μｌのＧＵＳ抽出緩衝液と２５０μｌの１ｍＭ  ４−メチル−ウンベリフェニル−Ｄ−グルクロニド (４−ＭＵＧ)（和光純薬）を含むＧＵＳ抽出緩衝液を順次加えた後、３７℃で３０分間反応を行った。その後、反応液のうちの１００μｌを取り、４ｍｌの０．２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液に加えてよく混合し（反応停止）、蛍光分光光度計を用いて、反応によって生じた３６５ｎｍの励起光によって発する４５０ｎｍの４−メチル−ウンベリフェロン（４−ＭＵ）による蛍光量を定量した。酵素粗抽出液に含まれるタンパク質はBradford の方法（Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)）で定量した。定量した４−ＭＵの濃度とタンパク質の濃度からＧＵＳ比活性（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ protein）を算出した。
【００７７】
次に転写産物あたりのＧＵＳ活性を調べるために、培養細胞での導入遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）の発現量をrealtime ＰＣＲにより定量した。ｍＲＮＡ量の定量は既述の方法で培養細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写により調製したｃＤＮＡを用いた。ＧＵＳ転写産物の定量にはＧＵＳ検出用プライマー（配列番号１７：GUS(167-185)-Fw、及び配列番号１８：GUS(296-316)-Rv）を用いた。また、realtime ＰＣＲを行う際の内部標準にはイネＡｃｔｉｎ１転写産物を用いた。Ａｃｔｉｎ１転写産物の検出には、Ａｃｔｉｎ検出用プライマー（配列番号１９：RAc1RT-for4、及び配列番号２０：RAc1RT-rev3）を用いた。realtime ＰＣＲはＡＢＩ７０００システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用い、転写産物の検出にはSybrGreen Realtime PCR master mix（ＴＯＹＯＢＯ）を使用した。ＧＵＳ遺伝子の発現量は内部標準として定量したＡｃｔｉｎ１転写産物量との相対値（ＧＵＳ転写産物のコピー数／Ａｃｔｉｎ１転写産物のコピー数）を算出し、これをＧＵＳ遺伝子の発現量とした。ＧＵＳ遺伝子の発現量と前述のＧＵＳ比活性から翻訳効率（ＧＵＳ比活性／ＧＵＳ遺伝子の発現量）を算出した。
なお、上記の翻訳効率の測定は３回行った。結果を表５及び図６に示す。表５及び図６における35S-GUS、UTRa、UTRb、UTRc、Idelは、それぞれpGWB1-35S promoter-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRa-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRb-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRc(Idel)-GUS-Nos terminatorの各プラスミドで形質転換したイネ培養細胞を示す。
【００７８】
【表５】
0005598899.tif 000006
【００７９】
表５及び図６に示す通り、pGWB1-35S promoter-UTRa-GUS-Nos terminator、又はpGWB1-35S promoter-UTRb-GUS-Nos terminatorを導入して形質転換したイネ培養細胞では、pGWB1-35S promoter-GUS-Nos terminator（対照）を導入して形質転換したイネ培養細胞と同程度の翻訳効率が観察された。一方、pGWB1-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminatorを導入して形質転換したイネ培養細胞では、対照に比べて１５倍以上の翻訳効率が観察された。
ＵＴＲｃとＵＴＲａとの違いは、配列番号４の塩基配列の存在の有無だけである。また、ＵＴＲｃとＵＴＲｂとの違いは、配列番号４の塩基配列が全部保存されているか、約７０％が欠損しているかである。このことから、配列番号４の塩基配列が翻訳エンハンサー活性に重要な配列であることがわかった。
さらに、ＵＴＲｃの塩基配列の一部を欠損させたpGWB1-35S promoter-UTRc(Idel)-GUS-Nos terminatorを導入して形質転換したイネ培養細胞では、pGWB1-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminatorを導入して形質転換したイネ培養細胞に比べて約２分の１の翻訳効率が観察された。欠損させた塩基配列は、配列番号４の塩基配列の５’末端から数えて１４〜３６番目にあたる。このことから、配列番号４の塩基配列が保存されていることで、配列番号４の塩基配列を含む塩基配列が、より強い翻訳エンハンサー活性を示すことがわかった。  
【００８０】
（実施例４）
＜ＵＴＲｃを５’末端から欠損させたときのＯＲＦの翻訳に及ぼす影響の解析＞
ＵＴＲｃの５’末端から段階的に塩基対を欠損させた（９９塩基対、１９９塩基対、２９９塩基対を欠損させた）段階的欠損型の５’ＵＴＲであるＵＴＲｃ（ｄ９９）、ＵＴＲｃ（ｄ１９９）、及びＵＴＲｃ（ｄ２９９）を作製し、その下流にＧＵＳ遺伝子を連結させた形質転換用プラスミド、pGWB1-35S promoter-UTRc(d99)-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRc(d199)-GUS-Nos terminator、及びpGWB1-35S promoter-UTRc(d299)-GUS-Nos terminatorを構築し、イネ培養細胞に導入し形質転換体を作製して翻訳量（翻訳効率）の測定を行った。
形質転換用プラスミドの構築、及びイネ培養細胞の形質転換は、実施例３に準じて行った。形質転換用プラスミドの構築に際しては、表２に示した配列番号１２、１４〜１６のプライマーを用いた。
【００８１】
形質転換用プラスミドの構築図を図７〜９に示す。四角で囲んだ塩基配列はＴＡＴＡボックスであり、記載されている塩基配列の３’末端に位置する「Ｍｅｔ」はＧＵＳ遺伝子の翻訳開始点であり、それよりも上流に位置する「Ｍｅｔ」はＯｓＭａｃ１遺伝子のＯＲＦ領域の翻訳開始点であり、大文字で示した塩基配列は配列番号４の塩基配列の全部又は一部である。
【００８２】
翻訳効率は、ＧＵＳ比活性（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇ protein）で評価し、その算定方法は実施例３におけるＧＵＳ比活性の算定方法と同様である。翻訳効率の測定は３回行った。
翻訳効率の評価結果を表６及び図１０に示す。表６及び図１０におけるUTRc、d99、d199、d299は、それぞれpGWB1-35S promoter-UTRc-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRc(d99)-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRc(d199)-GUS-Nos terminator、pGWB1-35S promoter-UTRc(d299)-GUS-Nos terminatorの各プラスミドで形質転換したイネ培養細胞を示す。
【００８３】
【表６】
0005598899.tif 000007
【００８４】
表６及び図１０に示す通り、ＵＴＲｃ（ｄ９９）及びＵＴＲｃ（ｄ１９９）では、ＵＴＲｃと同程度の翻訳効率が観察された。一方、ＵＴＲｃ（ｄ２９９）では、非常に低い翻訳効率が観察された。ＵＴＲｃ（ｄ９９）及びＵＴＲｃ（ｄ１９９）においては、配列番号４の塩基配列が保存されているが、ＵＴＲｃ（ｄ２９９）においては、配列番号４の塩基配列の３’末端側の約１５％しか保存されていない。このことから、配列番号４の塩基配列が翻訳エンハンサー活性に重要な配列であることが確認された。
また、ＵＴＲｃ（ｄ１９９）で、ＵＴＲｃと同程度の翻訳効率が観察されたことから、配列番号４の塩基配列を含む４００塩基長以下の長さの塩基配列であっても、翻訳エンハンサー活性を有することがわかった。
【００８５】
したがって、本発明のＤＮＡと構造遺伝子とを含む組換えベクターで形質転換された形質転換体を用いることで、前記構造遺伝子にコードされるタンパク質の合成量を、本発明のＤＮＡを含まない組換えベクターで形質転換された形質転換体を用いる場合に比して、増加させることができる。
【００８６】
また、本発明のＤＮＡと構造遺伝子とを含む鋳型ＤＮＡから翻訳用ＲＮＡを合成し、前記翻訳用ＲＮＡとインビトロ無細胞系タンパク質合成用反応液とを接触させることにより、前記構造遺伝子にコードされるタンパク質を合成することができ、前記タンパク質の合成量を、本発明のＤＮＡを含まない鋳型ＤＮＡから翻訳用ＲＮＡを合成した場合に比して、増加させることができる。
【００８７】
したがって、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡとタンパク質をコードするＲＮＡとを含む翻訳用ＲＮＡを用いることで、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡを含まない翻訳用ＲＮＡを用いる場合に比して、前記タンパク質の合成量を増加させることができる。
【００８８】
よって、本発明によれば、新規の翻訳エンハンサー及びその利用方法を提供することができる。
【図６】
0005598899.tif 000008
【図１０】
0005598899.tif 000009
【図１】
0005598899.tif 000010
【図２】
0005598899.tif 000011
【図３】
0005598899.tif 000012
【図４】
0005598899.tif 000013
【図５】
0005598899.tif 000014
【図７】
0005598899.tif 000015
【図８】
0005598899.tif 000016
【図９】
0005598899.tif 000017
【配列表】
0005598899000001.app