(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺腫瘍または卵巣癌を有する患者を治療するための医薬組成物であって、アデノシン・デアミナーゼを有効量で含み、該アデノシン・デアミナーゼが、アデノシン・デアミナーゼのＬｙｓ残基のε−アミノ基にそれぞれ結合する１１〜１８のポリエチレングリコール鎖を有する複合アデノシン・デアミナーゼであることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
前記前立腺腫瘍または卵巣癌が悪性であることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
投与される複合アデノシン・デアミナーゼの量が、前記患者におけるアデノシンまたはデオキシアデノシンの組織内濃度を低減させるのに有効であり、前立腺腫瘍または卵巣癌の増殖または拡散が、前記患者におけるアデノシンの組織内濃度の低減によって阻害されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
前立腺腫瘍を有する患者を治療するためのものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
卵巣癌を有する患者を治療するためのものである請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールが、４，０００〜４５，０００ダルトンの範囲の分子量を有することを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記複合アデノシン・デアミナーゼが、１ｋｇあたり１０Ｕ〜３０Ｕの用量で投与されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記複合アデノシン・デアミナーゼが、前立腺腫瘍または卵巣癌の阻害を維持するのに十分な期間、投与されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記複合アデノシン・デアミナーゼが、１〜２０日間の期間、投与されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記アデノシン・デアミナーゼが、ウレタン結合を介してポリエチレングリコールに結合していることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記複合アデノシン・デアミナーゼが、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、腹腔内、吸入、および経尿道からなる群より選択される経路によって投与されることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記アデノシン・デアミナーゼが、ウシ起源から精製されたアデノシン・デアミナーゼ、または組換えウシアデノシン・デアミナーゼであることを特徴とする請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組換えウシアデノシン・デアミナーゼが、配列番号１または５の配列を含むか、あるいは、Ｌｙｓ198に代えてＧｌｎ、Ｔｈｒ245に代えてＡｌａ、Ｇｌｙ351に代えてＡｒｇおよびそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸置換を有する配列番号１または５の配列を含むことを特徴とする請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記配列番号５を含む組換えウシアデノシン・デアミナーゼが、水媒体中での酸化を防ぐためにキャップ化されたＣｙｓ７４を含むことを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
哺乳動物において前立腺腫瘍または卵巣癌の増殖を阻害するための医薬組成物であって、アデノシン・デアミナーゼを有効量で含み、該アデノシン・デアミナーゼが、アデノシン・デアミナーゼのＬｙｓ残基のε−アミノ基にそれぞれ結合する１１〜１８のポリエチレングリコール鎖を有する複合アデノシン・デアミナーゼであることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項１６】
前記ポリエチレングリコールが、５，０００ダルトンの大きさであることを特徴とする請求項６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本願は、参照することにより本明細書に援用される、２００７年４月２０日に出願の米国仮特許出願第６０／９１３，０３９号の優先権の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アデノシンおよびデオキシアデノシンの組織内濃度を低減させるため、アデノシン・デアミナーゼを投与することにより、腫瘍、特に悪性固形腫瘍を治療および抑制する新規方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍は、無制限の細胞増殖から生じる、細胞または組織における良性または悪性の異常な増殖である。悪性腫瘍はその出現部位から拡散するものであり、当技術分野では癌としても知られている。よって、腫瘍および癌は、無制限または不適切な細胞増殖という一般的性質を共有する一群である。悪性腫瘍は、白血病などの血液に由来する腫瘍または固形腫瘍のいずれかに大別される。血液に由来する悪性腫瘍は一般に血中を循環するが、固形の悪性腫瘍は原発腫瘍から全身に広がる。分散型の腫瘍細胞は、その後、転移の過程において多発性の二次性腫瘍に発展する可能性を有している。固形腫瘍が転移拡散などを生じるためには、固形腫瘍細胞は、原発腫瘍または原腫瘍から抜け出して、血流またはリンパ系に入り込み、そこから別の臓器組織に侵入し、そこで増殖し、新しい腫瘍を形成しなければならない。転移は、腫瘍細胞の粘着性および運動性；タンパク質分解酵素、化学誘導物質（chemoattractants）、およびプロテオグリカンの分泌；および／または他の要因における変化を伴う、複雑な多段階プロセスである。加えて、血管形成、すなわち新しい血管の形成もまた、転移過程における重要なステップである（非特許文献１）。
【０００４】
免疫系もまた、このような悪性の腫瘍細胞の転移を抑制することが示されており、アデノシンもこのような免疫防衛反応を抑制しうることが報告されている。例えば、Ｌｏｓｈｋｉｎら（非特許文献２）は、アデノシンがキラーＴ細胞における活性化およびサイトカインの生成を抑制することが報告されている。アデノシンは、細胞要素および炎症性機能の両方を含む他の免疫機能にマイナスの影響を与える（例えば、Ｓｐｙｃｈａｌａ（非特許文献３）およびＳｉｔｋｏｖｅｓｋｙら（非特許文献４）の研究記事を参照のこと）。Ｓｉｔｋｏｖｅｓｋｙらは、２００３年６月１９日に公開された特許文献１において、アデノシン・デアミナーゼを含みうるアデノシン受容体拮抗薬を投与することにより、抗原に対する免疫反応の増大方法、および腫瘍の治療方法についても述べている。
【０００５】
アデノシンが腫瘍細胞の転移および血管形成を促進すること（非特許文献５および６）、および、アデノシンが大腸癌細胞の増殖を刺激すること（非特許文献７）も判明している。ＡＤＡの注入により、特定の腫瘍細胞の増殖が、腹水症モデルマウスにおいて５０％を上回って阻害されたことも、Ａｓｍａｒらの非特許文献８によって報告されている。これらは、リンパ性白血病Ｌ１２１０およびＬ４９４６、リンパ肉腫６Ｃ３ＨＥＤ、乳腺腺癌ＴＡ３、およびエールリッヒ癌Ｅ２である。同一の要約書には、上記の効果に対して腺癌７５５は２倍の耐性があることが報告されており、肉腫１８０は完全に耐性であった。特許文献１には、Ｂ１６メラノーマ細胞上のアデノシン受容体の阻害剤の効果について記載されている。特許文献１はアデノシンの阻害剤としてのＡＤＡについて記載しているが、ＡＤＡを特定の癌、特に卵巣癌および前立腺癌の治療に適用することについては、具体的な記載はない。
【０００６】
よって、一部の腫瘍にとっては、アデノシンの存在が、腫瘍増殖および血管形成への「開始」信号、および、通常はこれらの腫瘍を死滅させるであろうキラーＴ細胞への「停止」信号を提供すると考えられる。
【０００７】
上述の発見とは対照的に、Ｌｉｎｄら（特許文献３）は、アデノシンが、アデノシン・デアミナーゼ酵素の阻害剤、および／または、コホルマイシンなどの抗癌剤との組合せでは、上皮由来の新生細胞における細胞死を促進する方法に有用であることを報告している。よって、この参考文献は、癌におけるアデノシンの役割がさらに複雑で不安定であることを示唆している。
【０００８】
上述の通り、内生のアデノシン濃度を低減させる薬剤は、アデノシン・デアミナーゼ酵素である。ＥＣ３．５．４．４として指定されているアデノシン・デアミナーゼ（「ＡＤＡ」）は、プリンサルベージ回路の重要な酵素である。ＡＤＡはアデノシンまたはデオキシアデノシンのいずれかを、水の存在下、イノシンまたはデオキシイノシンおよびアンモニアに転換する。ＡＤＡ遺伝子に有害な突然変異を有する個人は、軽度から重度に至るさまざまな進行度の免疫不全疾患、すなわち、重症複合型免疫不全症（「ＳＣＩＤ」）を発症しうることが知られている。ＳＣＩＤは、成熟リンパ球様細胞において、酵素基質であるアデノシンおよびデオキシアデノシンの毒性の蓄積の結果として生じることが確認されている。疾患の発症は、遺伝した突然変異に応じて、幼児期から成人まで多岐にわたる。ＡＤＡ欠損症は、子供におけるＳＣＩＤの主な原因の１つであり、遺伝子の治療法にとって主な対象の１つでもある（非特許文献９）。
【０００９】
これまで、ＡＤＡはウシ起源から工業的に単離され、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）ポリマー結合型のウシＡＤＡの形態で、多くの疾患の治療に用いられてきた。医療用途のＰＥＧ化ＡＤＡは、アダジェン（ＡＤＡＧＥＮ（登録商標））という銘柄のＰＥＧ化ＡＤＡとして、Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から市販されている。免疫原性の反応の可能性を最小限にするため、ＰＥＧ部分をＡＤＡに結合させると、循環期間（circulating life）が増大し、ＡＤＡを実質的に非抗原性になることにより、酵素の最大の治療効果が達成できる。参照することにより、それぞれ、全体を本明細書に援用する、「タンパク質の安定化（Stabilized Proteins）」という発明の名称で共同出願された特許文献４および「安定な組換えアデノシン・デアミナーゼ（Stable Recombinant Adenosine Deaminase）」という発明の名称で本願と同日に共同出願された、特許文献５の優先権の利益を主張する米国特許出願に記載されるように、結合形態で用いるための組換えヒトまたはウシＡＤＡ酵素の生産も可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第０３／０５０２４１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０３／０５０２４１号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６，５７９，８５７号明細書
【特許文献４】米国特許出願第１１／７３８，０１２号明細書
【特許文献５】米国仮特許出願第６０／９１３，００９号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Folkman, 1995, Nature Medicine 1:27-31
【非特許文献２】Loshkin et al., 2006, Cancer Res. 66: 7758-7765
【非特許文献３】Spychala, 2000, Pharmacology & Therapeutics 87: 161-173
【非特許文献４】Sitkovesky et al., 2005 Nature Reviews Immunology 5: 713-721
【非特許文献５】Barcz et al., 2000, Oncol. Rep. 7(6): 1285-91
【非特許文献６】Adair, 2005, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 289: R283-R296
【非特許文献７】Mujoomdar et al. 2003, Biochemical Pharmacology 66 1737-1747
【非特許文献８】Asmar et al., 1966, Proc. Am. Assoc. Cancer Res.  (Abstract No. 73)
【非特許文献９】R. Parkman et al., 2000, "Gene therapy for adenosine deaminase deficiency", Ann. Rev. Med., 51:33-47
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、当技術分野では、長年にわたり、癌の増殖、拡散、および進行を治療または抑制する新規の改良方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は、ＡＤＡを有効量で、それを必要とする患者に投与することを含む、腫瘍を有する患者を治療する方法を提供する。有効量は、患者におけるアデノシンまたはデオキシアデノシンの組織内濃度を低減させることを目的として、当業者によって簡単に決定される量であり、患者におけるアデノシンの組織内濃度を実質的に低減させることによって腫瘍の増殖または拡散を抑制する。投与経路は、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、腹腔内、吸入、および経尿道などである。
【００１４】
腫瘍は、悪性または良性であり、固形腫瘍であることが好ましく、例えば、前立腺癌、卵巣癌、および／または結腸直腸癌などの腫瘍である。
【００１５】
アデノシン・デアミナーゼは、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）などの実質的に非抗原性のポリマーと結合することが好ましい。ＰＡＯは、約４，０００〜約４５，０００ダルトンの範囲の大きさであることが好ましい。ＰＡＯは、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）であることが好ましい。ＡＤＡのポリマーに対するモル比は１：１であるか、または、ポリマー当たり２モル以上のＡＤＡであって差し支えなく、あるいは、ＡＤＡ１モルあたり約１〜約２０のポリマー分子（すなわち、１１〜１８本のＰＥＧ鎖）を提供することがさらに好ましい。
【００１６】
ポリマー結合ＡＤＡは、１ｋｇあたり約１０Ｕ〜約３０Ｕ以上の用量で、腫瘍の阻害を維持するのに十分な期間、例えば約１〜約２０日以上の期間、投与されることが好ましい。
【００１７】
投与されるアデノシン・デアミナーゼの量は、患者におけるアデノシンまたはデオキシアデノシンの組成機内濃度を実質的に低減するのに有効であり、その患者におけるアデノシンの組成機内濃度を実質的に低減することにより、腫瘍の増殖または拡散が阻害される。これは、例えば、１ｋｇあたり約１０Ｕ〜約３０Ｕの用量のアデノシン・デアミナーゼである。用量は、腫瘍の阻害を維持するのに十分な期間、例えば約１〜約２０日間以上、繰り返される。用量は、皮下、静脈内、筋肉内、髄腔内、腹腔内、吸入、および経尿道などの任意の簡便な経路で投与される。
【００１８】
アデノシン・デアミナーゼは、ウシ起源から随意的に精製されるか、または組換えアデノシン・デアミナーゼである。組換えアデノシン・デアミナーゼは、例えば、配列番号：１を含む組換えウシ・アデノシン・デアミナーゼ（Ｓｅｒ７４−ｒｂＡＤＡ）、配列番号：３を含む組換えヒト・アデノシン・デアミナーゼ（Ｓｅｒ７４−ｒｈＡＤＡ）、および配列番号：５を含む組換えウシ・アデノシン・デアミナーゼおよび／またはそれらの異型または多型である。
【００１９】
組換え産生されたウシ・アデノシン・デアミナーゼ、例えば配列番号：５は、水媒体での安定性のため、Ｃｙｓ７４が随意的にキャップ化される。
【００２０】
本発明の目的では、「残基」という用語は、別の化合物との置換反応に供した後に残る、例えばＰＥＧ、ＡＤＡ、アミノ酸などのことを称する、化合物の部分を意味すると解されるものとする。
【００２１】
本発明の目的では、「ポリマー残基」、例えば「ＰＥＧ残基」という用語は、それぞれ、他の化合物、部分などとの反応に供した後に残るポリマーまたはＰＥＧの部分を意味すると解されるものとする。
【００２２】
本発明の目的では、本明細書で用いられる「アルキル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環状のアルキル基を含む、飽和脂肪族炭化水素のことをいう。「アルキル」という用語は、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、およびＣ1-6アルキルカルボニルアルキル基も含む。アルキル基は、１〜１２個の炭素を有することが好ましい。炭素数約１〜７の低級アルキルであることがさらに好ましく、炭素数約１〜４であることがさらになお好ましい。アルキル基は、飽和または不飽和でありうる。置換されている場合、その置換基としては、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が挙げられる。
【００２３】
本発明の目的では、本明細書で用いられる「置換された」という用語は、官能基または化合物に含まれる１つ以上の原子を、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6アルキルカルボニルアルキル、アリール、およびアミノ基からなる群に由来する部分の１つを加えるか、これらの部分の１つで置換することをいう。
【００２４】
本発明の目的では、「アルケニル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環式基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む基のことをいう。アルケニル基は約２〜１２の炭素を有することが好ましい。アルケニル基は炭素数約２〜７の低級アルケニルであることがさらに好ましく、炭素数約２〜４であることがさらになお好ましい。アルケニル基は、置換または非置換でありうる。置換される場合は、置換基には、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、へテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が含まれる。
【００２５】
本発明の目的では、「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖、および環式基を含む、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む基のことをいう。アルキニル基は約２〜１２の炭素を有することが好ましい。アルキニル基は炭素数約２〜７の低級アルキニルであることがさらに好ましく、炭素数約２〜４であることがさらになお好ましい。アルキニル基は、置換または非置換でありうる。置換される場合は、置換基には、好ましくは、ハロ、オキシ、アジド、ニトロ、シアノ、アルキル、アルコキシ、アルキル−チオ、アルキル−チオ−アルキル、アルコキシアルキル、アルキルアミノ、トリハロメチル、ヒドロキシル、メルカプト、ヒドロキシ、アルキルシリル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、へテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル、Ｃ1-6ヒドロカルボニル、アリール、およびアミノ基が含まれる。「アルキニル」の例としては、プロパギル、プロピン、および３−ヘキシンが挙げられる。
【００２６】
本発明の目的では、「アリール」という用語は、少なくとも１つの芳香族環を含む芳香族炭化水素環系のことをいう。芳香族環は、随意的に、他の芳香族炭化水素環または非芳香族炭化水素環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。アリール基の例としては、例えば、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、およびビフェニルが挙げられる。アリール基の好ましい例として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【００２７】
本発明の目的では、「シクロアルキル」という用語は、Ｃ3-8環状炭化水素のことをいう。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【００２８】
本発明の目的では、「シクロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む、Ｃ3-8環状炭化水素のことをいう。シクロアルケニルの例としては、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、１，３−シクロヘキサジエニル、シクロヘプテニル、シクロヘプタトリエニル、およびシクロオクテニルが挙げられる。 
本発明の目的では、「シクロアルキルアルキル」という用語は、Ｃ3-8シクロアルキル基で置換されたアルキル基のことをいう。シクロアルキルアルキル基の例としては、シクロプロピルメチルおよびシクロペンチルエチルが挙げられる。 
本発明の目的では、「アルコキシ」という用語は、酸素橋を通じて親分子部分に結合している、所望の炭素原子数のアルキル基のことをいう。アルコキシ基の例としては、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシが挙げられる。
【００２９】
本発明の目的では、「アルキルアリール」基とは、アルキル基で置換されたアリール基のことをいう。
【００３０】
本発明の目的では、「アラルキル」基とは、アリール基で置換されたアルキル基のことをいう。
【００３１】
本発明の目的では、「アルコキシアルキル」基という用語は、アルコキシ基で置換されたアルキル基のことをいう。
【００３２】
本発明の目的では、「アルキル−チオ−アルキル」という用語は、例えばメチルチオメチルまたはメチルチオエチルなどのアルキル−Ｓ−アルキルチオエーテルのことをいう。
【００３３】
本発明の目的では、「アミノ」という用語は、有機ラジカルによって１つ以上の水素ラジカルが置換されることにより、アンモニアから誘導される、当技術分野で既知の窒素含有基のことをいう。例えば、「アシルアミノ」および「アルキルアミノ」という用語は、それぞれ、アシルおよびアルキル置換基を有する特定のＮ−置換有機ラジカルのことをいう。
【００３４】
本発明の目的では、「アルキルカルボニル」という用語は、アルキル基で置換されたカルボニル基のことをいう。
【００３５】
本発明の目的では、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素のことをいう。
【００３６】
本発明の目的では、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含む、非芳香族環系のことをいう。ヘテロシクロアルキル環は、随意的に、他のヘテロシクロアルキル環および／または非芳香族炭化水素環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。ヘテロシクロアルキル基は、３〜７員環であることが好ましい。ヘテロシクロアルキル基の例として、例えば、ピペラジン、モルホリン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、ピロリジン、およびピラゾールが挙げられる。好ましいヘテロシクロアルキル基として、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、およびピロリジニルが挙げられる。
【００３７】
本発明の目的では、「ヘテロアリール」という用語は、窒素、酸素、および硫黄から選択される少なくとも１つのへテロ原子を含む、芳香族環系のことをいう。ヘテロアリール環は、１つ以上のヘテロアリール環、芳香族または非芳香族炭化水素環、またはヘテロシクロアルキル環と縮合するか、他の方法で結合していてもよい。ヘテロアリール基の例として、例えば、ピリジン、フラン、チオフェン、５，６，７，８−テトラヒドロイソキノリン、およびピリミジンが挙げられる。ヘテロアリール基の好ましい例として、チエニル、ベンゾチエニル、ピリジル、キノリル、ピラジニル、ピリミジル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソキサゾリル、オキサジアゾリル、イソチアゾリル、ベンズイソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピロリル、インドリル、ピラゾリル、およびベンゾピラゾリルが挙げられる。
【００３８】
本発明の目的では、「ヘテロ原子」という用語は、窒素、酸素、および硫黄のことをいう。
【００３９】
一部の実施の形態では、置換アルキルは、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、ヒドロキシアルキル、およびメルカプトアルキルを含み、置換アルケニルは、カルボキシアルケニル、アミノアルケニル、ジアルケニルアミノ、ヒドロキシアルケニル、およびメルカプトアルケニルを含み、置換アルキニルは、カルボキシアルキニル、アミノアルキニル、ジアルキニルアミノ、ヒドロキシアルキニル、およびメルカプトアルキニルを含み、置換シクロアルキルは、４−クロロシクロヘキシルなどの部分を含み、アリールは、ナフチルなどの部分を含み、置換アリールは、３−ブロモフェニルなどの部分を含み、アラルキルは、トリルなどの部分を含み、へテロアルキルはエチルチオフェンなどの部分を含み、置換へテロアルキルは、３−メトキシ−チオフェンなどの部分を含み、アルコキシは、メトキシなどの部分を含み、フェノキシは、３−ニトロフェノキシなどの部分を含む。ハロは、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素を含むものと解されるべきものとする。
【００４０】
本発明の目的では、「正の整数」は、１以上の整数を含み、当業者には当然のことながら、当業者における合理的範囲内であると解されるべきものとする。
【００４１】
本発明の目的では、「結合した（linked）」という用語は、１つの基が別の基に共有的に付加すること（好ましい）または非共有的に付加することを含むと解されるべきものとする。
【００４２】
「有効量」および「十分量」という用語は、本発明の目的では、当業者に理解されるような効果として、所望の効果または治療効果を達成する量を意味するものとする。
【００４３】
本発明の目的では、「アデノシン」という用語は、ヌクレオシドである、アデノシンおよびデオキシアデノシンを含むと解されるべきものとする。アデノシンには、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ、ｄＡＭＰ、ｄＡＤＰまたはｄＡＴＰの形態で存在するアデノシンおよびデオキシアデノシンも含まれる。
【００４４】
本発明の目的では、「アデノシン介在性の腫瘍」または「アデノシン・デアミナーゼ感受性の腫瘍」とは、投与経路に関わらず、ＡＤＡまたはその活性画分などの投与が有効である、任意の種類の腫瘍を幅広く含むものと解されるべきものとする。
【００４５】
本発明の目的では、「アデノシン介在性の腫瘍の治療」または「アデノシン・デアミナーゼ感受性の腫瘍の治療」、あるいは、「アデノシン介在性の腫瘍の抑制」または「アデノシン・デアミナーゼ感受性の腫瘍の抑制」とは、症状または病状が、ＡＤＡ治療をしない場合に観察される状態と比較した場合に、最小限に抑えられるか、弱小化されることを意味すると解されるべきものとする。病状の治療は、例えば、腫瘍の増殖の抑制、および／または癌細胞または組織におけるアデノシンレベルの減少によって確認することができる。
【００４６】
大まかに言えば、治療は、所望の臨床反応が得られた場合に、成功とみなされるべきものとする。例えば、治療の成功は、例えば１０％以上（すなわち、２０％、３０％、４０％）の腫瘍の増殖の抑制を得られることによって定義されうる。あるいは、治療の成功は、本明細書に記載されるＡＤＡ治療をせずに観察されるものと比較した場合に、当分野における技術者によって意図される他の臨床的指標を含む、癌細胞または組織におけるアデノシンレベルにおける、少なくとも２０％、または好ましくは３０％、さらに好ましくは４０％またはそれ以上（すなわち、５０％または８０％）の減少をもたらすことによって定義されうる。
【００４７】
さらには、記載の便宜上の単数形の語句の使用は、そのように限定されることを全く意図していない。よって、例えば、１つの酵素を含む１つの化合物についての言及は、その酵素の１つまたはそれ以上の分子のことをいう。本発明はまた、本明細書に開示される特定の構造、工程段階、および材料に限定されるのではなく、そのような構造、工程段階、および材料は幾分変化しうるものと解されるものとする。
【００４８】
本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によって限定されるであろうことから、本明細書で用いられる技術用語についても、特定の実施形態を説明する目的でのみ用いられるのであって、限定されることは意図していないと解されるものとする。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
したがって、本発明は、ＡＤＡ酵素を、それを必要とする患者に有効量で、かつ患者の組織および／または体液に存在するアデノシンの量を低減するのに十分な期間、投与することにより、癌を含めた、腫瘍の新しい治療方法を提供する。ＡＤＡ酵素は、結合型のポリマーである。増殖、転移拡散、および／または患者の免疫システムからの保護をアデノシンの存在に依存している腫瘍では、内因性のアデノシンの十分な低減が、癌の増殖、転移拡散を抑えるか、または予防し、および／または患者の免疫システムによる抗腫瘍活性の正常な作用を可能にするであろう。
【００５０】
本発明に係る腫瘍のＡＤＡによる治療は、随意的に、以下に非常に詳細に論じる、１つ以上の他の適切な当技術分野で既知の抗癌治療方法および薬剤と組み合わせて、または、連携して行われる。本発明の併用療法は、本明細書に記載される化合物を有効量で、単独で、または第２の化学療法薬と同時にまたは連続して組み合わせて、投与することを含む。
【００５１】
このような併用療法のための典型的な当技術分野で既知の抗癌薬としては、例えば、タクソール（商標）、ベバシズマブ（アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ（商標登録））、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ネオマイシン、コンブレタスタチン、ポドフィロトキシン、ＴＮＦ−α、アンギオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン（vasculostatin）、αv−β3アンタゴニスト、カルシウムイオノフォア、カルシウム流誘発剤（calcium-flux inducing agents）、それらの任意の誘導体またはプロドラッグが挙げられる。
【００５２】
さらなる抗癌剤としては、化学療法薬、放射線治療薬、サイトカイン、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、または抗癌性の免疫毒素またはコアグリガンド（coaguligands）も挙げられる。このような免疫毒素の１つとして、例えば、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））（セツキシマブ）がある。「化学療法薬」とは、本明細書では、悪性腫瘍の治療に用いられる古典的な化学療法剤または薬のことをいう。この用語は、抗癌作用を発揮するという点では、他の化合物も技術的には化学療法薬とされうるのが現実であるものの、便宜上、単純化して用いられている。しかしながら「化学療法薬」は、当技術分野では明確に区別される意味を有するものとされており、この標準的な意味に従って用いられている。
【００５３】
したがって、本発明の方法は、癌の治療に有効であることが知られている１種類以上の化学療法薬の組合せを採用することができ、それらとしては、限定はしないが、５−アザシチジン、５−フルオロウラシルを、随意的に、ロイコボリン、５−フルオロデオキシウリジン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、ミトキサントロン、アジリジニルベンゾキノン（ＡＺＱ）、カルムスチン（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社製のＢＣＮＵまたはＢｉＣＮＵ（登録商標））、ブレオマイシン、カルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵまたはＭｅＣＣＮＵ、クロラムブシル、クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デオキシコホルマイシン、ドキソルビシン、デオキシコホルマイシン（doxycoformycin）、ＤＴＩＣ （ダカルバジン）、エピルビシン、エトポシド（ＶＰ−１６）、フルダラビン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イホスファミドおよびメスナ、レバミゾール（levamisol）、Ｎ−アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）、Ｌ−フェニルアラニン・マスタード、４'−（９−アクリジニルアミノ）メタンスルホン−ｍ−アニシジド（「ｍＡＭＳＡ」）、多剤耐性に対する当技術分野で既知の阻害剤（すなわち、ＭＤＲ阻害剤）、メルファラン、メトトレキサートと組み合わせて、随意的に、ロイコボリン、ミトラマイシン、マイトマイシン−ｃ、タンパク質に関連する多剤耐性の阻害剤（「ＭＲＰ」阻害剤）、パクリタキセル、プロカルバジン、ストレプトゾトシン、Ｎ，Ｎ'Ｎ'−トリエチレンチオホスホラミド（「チオＴＥＰＡ」）、トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩの阻害剤、タクソール、ビンブラスチン、ビンクリステイン（vincristein）、ビンクリスチン、ビンデシン、テニポシド（ＶＭ−２６（登録商標））、および他のものなど枚挙にいとまがないが、これらと組み合わせて用いることができる。
【００５４】
本発明の方法と組み合わせて用いられることが意図されている他の癌治療方法としては、Ｘ線、γ線の直接照射または標的の断層撮影を用いた照射、放射能を有するペレットまたは「シード」の埋め込みを用いた癌組織の治療、ホウ素化合物で準備刺激した組織への中性子ビームの放射、および／または他の種類の当技術分野で既知の粒子線治療が挙げられる。
【００５５】
本発明の方法と組み合わせて、または連携して随意的に投与される、さらなる抗腫瘍剤または抗癌剤（抗新生物薬）としては、参照することによりその全体が本明細書に援用される、“GOODMAN AND GILMAN'S, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS”, TENTH EDITION, Eds. Hardman and Limbirdに記載されるものが挙げられる。
【００５６】
本発明の認識をより深めるため、以下の用語を定義する。
【００５７】
本明細書では、「アデノシン」への言及は、他に特記しない限り、デオキシアデノシン、およびインビボで存在する当技術分野で知られているそれらの異型および誘導体もまた包含している。
【００５８】
アデノシン・デアミナーゼ、すなわちＡＤＡへの言及は、精製された天然酵素、例えば、精製天然ＡＤＡ、組換えヒトまたはウシＡＤＡ、ならびにそれらの異型、多型、および誘導体を含めた、任意の当技術分野で既知の酵素を含む。ウシ起源から精製されたＡＤＡ酵素は、Ｃｙｓ７４残基がシステインで天然にキャップ化または保護化された、配列番号５に従った配列を有し、配列番号５のＡＤＡをコードする遺伝子から予想される６Ｃ−末端残基が存在しない。しかしながら、本発明は、予測される６Ｃ−末端残基の有無にかかわらず、天然および組換えにより生じる、代替となる対立遺伝子および多型を含む、天然ウシＡＤＡにおける代替となる異型を用いて行なうことができることが意図されている。ウシＡＤＡの多型としては、例えば、１９８位のリジンに代わるグルタミン、２４５位のトレオニンに代わるアラニン、３５１位のグリシンに代わるアルギニンが挙げられる。
【００５９】
ＡＤＡ酵素の好ましい誘導体としては、変異していない組換えＡＤＡ酵素と比べて安定性を向上させるために変異させた、組換えにより産生させたＡＤＡ酵素を含む。これらには、例えば、溶媒に曝露させた酸化されうるＣｙｓ残基を、適切な酸化されないアミノ酸残基に置換するための、配列番号：５および／または上記多型を１つ以上含む配列番号：５から改変修飾された組換えＡＤＡ酵素がある。このような酸化されない残基には、任意の当技術分野で既知の天然アミノ酸残基および／またはそれらの任意の当技術分野で既知の誘導体が含まれる。例えば、ウシまたはヒト起源から最初に単離された遺伝子から発現させた成熟組換えＡＤＡは不安定なＣｙｓ74残基を有しており、例えばＳｅｒ74などの酸化されないアミノ酸残基と置換することが好ましい。このような組換えＡＤＡ酵素は、配列番号：１（ウシＡＤＡの構造）および配列番号：３（ヒトＡＤＡの構造）によって例証されている。配列番号：２および配列番号：４は、大腸菌（E. coli）の発現にとって最適化されたコドンである、同一の発現に有用なＤＮＡ分子を例証するものである。このような組換えＡＤＡの突然変異タンパク質、およびこれらタンパク質の生成および精製に関する更なる詳細は、参照することによりその全体が本明細書に援用される、本願と同日に出願された「安定な組換えアデノシン・デアミナーゼ（Stable Recombinant Adenosine Deaminase）」という発明の名称の米国仮特許出願第６０／９１３，００９号明細書の優先権の利益を主張する、共同出願された米国特許出願第１２／１０５，９１３号明細書に提供されている。ベクターおよび精製方法における具体的詳細は、その明細書の、特に実施例の部分、最も詳細には実施例１〜４に記載されている。
【００６０】
あるいは、ＡＤＡ酵素は、ＡＤＡタンパク質を実質的に不活性化させることなく、反応性のシステインをキャップするのに十分な反応条件下でＡＤＡ酵素を十分な量のキャッピング剤で処理することで、溶液に曝露させた酸化されうるＣｙｓ残基をキャップ化することにより、必要に応じて、安定化させることができる。この方法は、突然変異タンパク質または野生型のＡＤＡ酵素のいずれかである、組換えにより産生させたＡＤＡを用いて行なうことが好ましい。
【００６１】
例えば、キャッピング剤としては、限定はしないが、酸化型グルタチオン（好ましい）、ヨードアセトアミド、ヨード酢酸、シスチン、および当業者に知られている他のジチオール、およびそれらの混合物が挙げられる。本明細書に記載される方法の反応段階の間に含まれるキャッピング剤の量および濃度は、使用する具体的なキャッピング剤および技術者のニーズに応じて幾分異なるが、過度の実験は必要としないであろう。プロトタイプとして酸化型グルタチオンを使用して、ｒｈＡＤＡなどの組換えタンパク質と反応させる場合に用いられる濃度は、約２５μＭ〜約１００ｍＭの範囲でありうる。酸化型グルタチオンは、約５ｎＭ〜約２５ｍＭの濃度で組換えタンパク質と反応させることが好ましい。
【００６２】
キャッピング剤と組換えタンパク質との反応の際に用いられる反応条件は、約６．５〜約８．４のｐＨ、好ましくは約７．２〜約７．８のｐＨを有する水溶液を使用する工程をさらに有してなる。加えて、水溶液は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Ｔｒｉｓ、およびＨｅｐｅｓなどの適切な緩衝液、ならびにそれらの混合物を、約１０〜約１５０ｍＭの濃度で含むことが好ましい（随意的に、１０ｍＭ未満または１５０ｍＭよりも高い、この緩衝液の範囲外でもキャップ化を行なうことができる）。反応条件は、さらに、タンパク質の分解に影響を及ぼさないであろう温度、すなわち、約４〜３７℃で反応を進行させる工程を有してなる。随意的に、この温度の範囲外、例えば０〜４℃未満または３７℃より高い温度範囲でキャップ化を行なうことができる。反応は、反応性のシステインの所望される安定化を実現するのに十分な時間、行なわれる。単に一例を挙げれば、反応は約５秒〜約８時間（例えば、一晩）行われる。
【００６３】
キャップ化された、安定化された組換えＡＤＡについての更なる詳細は、参照することにより本明細書に援用される「安定化タンパク質（Stabilized Proteins）」という発明の名称で共同出願された特許文献４、特に、その実施例部分に提供されている。
【００６４】
さらには、記載の便宜上の単数形の語句の使用は、そのように限定されることを全く意図していない。よって、例えば、１つの酵素を含む１つの組成物についての言及は、その酵素の１つ以上の分子のことをいう。本発明はまた、本明細書に開示される特定の構造、工程段階、および材料に限定されるのではなく、そのような構造、工程段階、および材料は幾分変化しうると解されるものとする。
【００６５】
Ａ．ポリマー−ＡＤＡ複合体
ＡＤＡの好ましい形態は、ポリマー結合型の酵素の形態である。本発明のＡＤＡ−ポリマー複合体は、一般に、式（Ｉ）：
（Ｉ）    ［Ｒ−ＮＨ］z−（ＡＤＡ）
に相当し、式中、 
（ＡＤＡ）は、アデノシン・デアミナーゼ酵素、あるいは随意的にその誘導体または断片を表し、
ＮＨ−は、ポリマーに結合する、ＡＤＡ、その誘導体または断片に認められるアミノ酸のアミノ基であり、
（ｚ）は正の整数であり、約１〜約８０であることが好ましく、約５〜約８０がさらに好ましく、約１１〜約１８がさらになお好ましく、
Ｒは、放出可能な形態または放出できない形態でＡＤＡに結合する、実質的に非抗原性のポリマー残基を含む。
【００６６】
複合体の非抗原性のポリマー残基部分（Ｒ）は、ポリマー系のシステムの限定されないリストから選択することができ、例えば、次のものが挙げられる：
【化１−１】
0005595904.tif 000002
【化１−２】
0005595904.tif 000003
【００６７】
式中:
Ｒ10-11およびＲ22-23は、同一でも異なっていてもよく、独立して選択される非抗原性ポリマー残基であり、
Ｒ3-9、Ｒ12-21およびＲ24（下記参照）は、同一または異なっており、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ3-12分岐鎖アルキル、Ｃ3-8シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1−6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシ、およびＣ1−6ヘテロアルコキシの中からそれぞれ独立して選択され、
Ａｒは、 多置換の芳香族炭化水素または多置換の複素環基を形成する部分であり、
Ｙ1-11およびＹ13は、同一でも異なっていてもよく、Ｏ、Ｓ、およびＮＲ24から独立して選択され、
Ａは、アルキル基、標的部分、検査薬、および生物活性部分の中から選択され、
Ｘは、Ｏ、ＮＱ、Ｓ、ＳＯまたはＳＯ2であり、ここでＱはＨ、Ｃ1-8 アルキル、Ｃ1-8分岐鎖アルキル、Ｃ1-8置換アルキル、アリール、またはアラルキルであり、
ＺおよびＺ’は、標的細胞内に能動輸送される部分、疎水性部分、二官能性の結合部分およびそれらの組合せの中から独立して選択され、
Ｌ1-6およびＬ8は、同一でも異なっていてもよく、独立して選択される二官能性リンカー基であり、
（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｊ'）、（ｋ）、（ｌ）、（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）、（ｑ）および（ｔ）は、 同一でも異なっていてもよく、好ましくは、ほとんどの態様において、独立して０または正の整数であり、
（ｂ）、（ｅ）、（ｒ）、（ｒ'）、（ｓ）、（ｈ）、（ｈ'）および（ｍ）は、同一でも異なっていてもよく、独立して０または１であり、
ｍＰＥＧはメトキシＰＥＧであり、
（ｕ）は、約２，０００〜約１００，０００、 好ましくは約４，０００〜約４５，０００の総分子量を有するポリマーを提供する、正の整数である。
【００６８】
上記において、Ｙ1-11およびＹ13がＯであり、Ｒ3-8、Ｒ12-21およびＲ24が、それぞれ独立して水素またはＣ1-6 アルキルのいずれかであることが好ましく、メチルおよびエチルが最も好ましいアルキルであり、Ｒ7-9はＣＨ3であることが好ましい。
【００６９】
本発明の更なる態様では、複合体のポリマー部分は、ＡＤＡに、結合部分を複数提供するものでありうる。このような系の限定されない例としては下記のものが挙げられる：
【化２】
0005595904.tif 000004
【００７０】
ここで、すべての変数は、上記のものと同一である。
【００７１】
あるいは、および／または好ましくは、複数のＰＥＧ鎖がＡＤＡに付加している。これらの態様では、ＡＤＡポリマー複合体は、酵素上のＬｙｓのε−アミノ基に付加する、少なくとも５本から最大で８０本のポリエチレングリコール鎖を含みうるが、酵素上のＬｙｓのε−アミノ基に付加する約１１〜１８本のＰＥＧ鎖を含むことが好ましい。
【００７２】
ＡＤＡは、Ｌｙｓ結合を介して、酵素分子あたり約１１〜約１８のＰＥＧ分子と結合するが、ＰＥＧのＡＤＡに対する比は、特定の臨床的症状に適合させるため、一体となった複合体の物理的性質および力学的性質を改変する目的で、変化させることができる。
【００７３】
ＡＤＡ複合体を作るのに使用することのできる活性化ポリマーは、当然ながら、上記ポリマー部分と直接結合するであろう。重要な相違点は、本明細書で、Ｂ1として指定されることのある脱離基または活性化基の存在であり、これは、ＡＤＡに認められるアミン基（例えばリジンのε−アミン基）へのポリマー系の付加を促進する。したがって、化合物（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）は、下記のような脱離基または活性化基：
【化３】
0005595904.tif 000005
【００７４】
または、他の適切な脱離基または活性化基を含み、例えば、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾリル、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシフタルイミジル、イミダゾリル、Ｏ−アシル尿素、ペンタフルオロフェノールまたは２，４，６−トリ−クロロフェノール、または、複合体形成反応の後にＡＤＡが付加する場所に認められる、当業者にとって明らかな他の適切な脱離基などが挙げられる。
【００７５】
一部の好ましい活性化ＰＥＧとしては、参照することによりその内容が本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第５，１２２，６１４号、同第５，３２４，８４４号、同第５，６１２，４６０号、および同第５，８０８，０９６号（炭酸スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール（ＳＣ−ＰＥＧ）および関連する活性化ＰＥＧ類）、および米国特許第５，３４９，００１号（環状イミドチオン活性化ＰＥＧ類）の各明細書に開示されるものが挙げられる。当業者には明らかなように、これらの複合体形成反応は、典型的には、数倍モル過剰の活性化ＰＥＧを用いて、適切な緩衝液中で行なわれる。上述のＳＣ−ＰＥＧのような直線ＰＥＧを用いて調製される一部の好ましい複合体は、平均して、酵素あたり約１〜約８０のＰＥＧ鎖を含みうる。その結果として、これらには、数百倍、例えば、２００〜１０００倍のモル過剰を用いることができる。分岐鎖ポリマーおよび酵素に付加したポリマーに用いられるモル過剰はもっと小さく、以下に記載するのと同一のことが記載される特許および特許出願記載の技術を用いて決定することができる。
【００７６】
本発明の目的では、 活性化基は、ＡＤＡ、例えばＬｙｓに認められるアミン基（求核性）と反応することが可能な基と解されるべきものとする。
【００７７】
本発明の目的では、前述のものは、活性化ポリマーリンカーとも称される。ポリマー残基は、ポリアルキレンオキサイド系であることが好ましく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系であることがさらに好ましく、ここでＰＥＧは、直鎖、分岐鎖、またはマルチアームである。
【００７８】
上記ポリマーを参照すると、Ａｒは、多置換の芳香族炭化水素または多置換の複素環基を形成する部分であることがわかる。重要な特徴は、Ａｒ部分が事実上、芳香族化合物であることである。一般に、芳香族化合物となるには、π電子が、環状の分子の平面の上下両方の「雲」の中で共有されなければならない。さらには、π電子の数がヒュッケル則（４ｎ＋２）を満たさなければならない。当業者は、無数の部分が、芳香族化合物の部分についての要求を満たし、したがって本発明の用途に適していることを理解するであろう。
【００７９】
本発明の一部の好ましい態様では、ベンジル基の脱離またはトリメチルロックのラクトン化に基づくポリマー系の活性化ポリマーリンカーが、参照することによりその内容が本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第６，１８０，０９５号、同第６，７２０，３０６号、同第５，９６５，１１９号、同第６，６２４，１４２号、および同第６，３０３，５６９号の各明細書にしたがって調製される。本発明においては、次の活性化ポリマーリンカーが好ましい：
【化４】
0005595904.tif 000006
【００８０】
本発明の１つの代替となる態様では、ＡＤＡポリマー複合体は、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第７，１２２，１８９号および同第７，０８７，２２９号の各明細書、ならびに米国特許出願第１０／５５７，５２２号、同第１１／５０２，１０８号および同第１１／０１１，８１８の各明細書に記載されるものなど、特定のビシンポリマー残基を用いて調製される。これら特許出願のそれぞれの開示は、参照することにより本明細書に援用される。好ましい活性化ポリマーのいくつかとして、下記のものが挙げられる：
【化５】
0005595904.tif 000007
【００８１】
上記脱離基および活性化基は適切な基のうちの１つでしかなく、本明細書で言及する他のものもまた過度の実験をすることなく用いることができると解されるものとする。
【００８２】
別の態様では、活性化ポリマーリンカーは、参照することによりそれぞれの開示が本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第５，６８１，５６７号、同第５，７５６，５９３号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、同第６，１１３，９０６号、同第６，１５３，６５５号、同第６，３９５，２６６号、同第６，６３８，４９９号、同第６，２５１，３８２号および同第６，８２４，７６６号の各明細書に記載されるような分岐鎖ポリマーを使用して調製される。
【００８３】
このような活性化ポリマーとして、以下に代表されるポリマー系（ｉｖ）〜（ｉｘ）が挙げられる：
【化６】
0005595904.tif 000008
【００８４】
ここでＢ1は、活性化基であり、すべての変数は、先に定義したとおりである。
【００８５】
さらに別の態様では、活性化ポリマーにヒンダードエステル系リンカーを用いることができる。参照することによりその内容が本明細書に援用される、「ヒンダードエステル系の生体分解性リンカーを有するポリアルキレンオキサイド（Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers）」という発明の名称の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／７８５９３号パンフレットを参照のこと。例えば、このような化合物の限定されないリストとして、下記のものが挙げられる：
【化７】
0005595904.tif 000009
【００８６】
ここで、（ｕ）は約１０〜約２３００の範囲の整数であって、約４，０００〜約４５，０００の総分子量を有するポリマーを提供することが好ましい。
【００８７】
１つの好ましい実施の形態では、活性化ポリエチレングリコールは、タンパク質と共にウレタン結合またはアミド結合を提供するものである。
【００８８】
高純度の末端カルボン酸を有するポリマーの調製方法は、参照することによりその内容が本明細書に援用される、米国特許出願第１１／３２８，６６２号明細書に記載されている。その方法は、最初に、ポリアルキレンオキサイドの第３級アルキルエステルを調製し、続いてそのカルボン酸誘導体へと転換する。その方法のＰＡＯカルボン酸の調製の最初の工程は、ポリアルキレンオキサイド・カルボン酸のｔ−ブチルエステルなどの中間体を形成する工程を有してなる。この中間体は、カリウムｔ−ブトキシドなどの塩基の存在下で、ＰＡＯをｔ−ブチルハロ酢酸と反応させることにより形成される。ｔ−ブチルエステル中間体が形成されると、９２％を超える純度で、好ましくは９７％、さらに好ましくは９９％、最も好ましくは９９．５％を超える純度で、ポリアルキレンオキサイドのカルボン酸誘導体を容易に得ることができる。
【００８９】
さらに別の態様では、第３級アミン基を有するポリマーを用いてＡＤＡ複合体を調製することができる。高純度の、第３級アミンを含むポリマーの調製方法は、参照することによりそれぞれの内容が本明細書に援用される、米国特許出願第１１／５０８，５０７号および同第１１／５３７，１７２号の各明細書に記載されている。例えば、アジドを有するポリマーは、トリフェニルホスフィンなどのホスフィン系の還元剤、またはＮａＢＨ4などのアルカリ金属ホウ化水素還元剤と反応する。あるいは、脱離基を含むポリマーを、メチル−ｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＭｅＢｏｃ）またはジ−ｔ−ブチルイミドジカルボナートのカリウム塩（ＫＮＢｏｃ2）などの保護化されたアミン塩と反応させて、その後、保護化アミン基を脱保護する。これらの方法で形成される第３級アミンを含むポリマーの純度は、約９５％よりも高く、９９％よりも高いことが好ましい。
【００９０】
１．実質的に非抗原性のポリマー
上述のように、Ｒ10-11、およびＲ22-23は、それぞれ、好ましくは実質的に非抗原性の、ポリアルキレンオキサイド（ＰＡＯ）などの水溶性のポリマー残基であることが好ましく、ｍＰＥＧのようなポリエチレングリコールであることがさらに好ましい。説明のためであって限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の残基部分のＲ10-11およびＲ22-23は、次の中から選択されうる：
【化８】
0005595904.tif 000010
【００９１】
ここで、
（ｕ）は重合度、すなわち約１０〜約２，３００であり、
Ｒ25は、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-12分岐鎖アルキル、Ｃ3-8 シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6 置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、フェノキシ、およびＣ1-6ヘテロアルコキシの中から選択され、
Ｊはキャッピング基、すなわち、ポリマーの末端に認められる基であって、一部の態様では、ＮＨ2 （またはＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、Ｈ、ＳＨ（またはＣＨ2ＣＨ2ＳＨ）、ＣＯ2Ｈ（またはＣＨ2ＣＯ2Ｈ）、好ましくはメチルであるＣ1-6アルキル、または他のＰＥＧ末端活性化基のいずれかから選択することができ、そのような基は当業者に理解されている。
【００９２】
１つの特に好ましい実施の形態では、Ｒ10-11およびＲ22-23には以下のものが挙げられる：
【化９】
0005595904.tif 000011
【００９３】
ここで（ｕ）は正の整数であり、ポリマー部分の平均総分子量が約２，０００〜約１００，０００の範囲になるように選択されることが好ましい。Ｒ10-11およびＲ22-23が独立して、約４，０００〜約４５，０００の平均総分子量を有することがさらに好ましく、約５，０００の平均総分子量を有することが最も好ましい。技術者のニーズに合わせるため、他の分子量もまた意図されている。
【００９４】
ＰＥＧは、一般に、下記の構造で表すことができる：
【化１０】
0005595904.tif 000012
【００９５】
Ｒ10-11およびＲ22-23は、この構造式の残基を含むことが好ましい。ポリマーの重合度はポリマー鎖における繰り返し単位の数で表され、ポリマーの分子量によって決まる。
【００９６】
あるいは、本発明のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の残基部分は下記の構造で表すことができる：
【化１１】
0005595904.tif 000013
【００９７】
ここで、
Ｙ31およびＹ33は独立して、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、ＮＲ33または結合であり、
Ｙ32は、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ34であり、
Ｒ31-34は、独立して、水素、Ｃ1-6アルキル、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、Ｃ3-19分岐鎖アルキル、Ｃ3-8 シクロアルキル、Ｃ1-6置換アルキル、Ｃ2-6 置換アルケニル、Ｃ2-6置換アルキニル、Ｃ3-8置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換へテロアリール、Ｃ1-6ヘテロアルキル、置換Ｃ1-6ヘテロアルキル、Ｃ1-6アルコキシ、アリールオキシ、Ｃ1-6ヘテロアルコキシ、ヘテロアリールオキシ、Ｃ2-6アルカノイル、アリールカルボニル、Ｃ2-6アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6アルカノイルオキシ、アリールカルボニルオキシ、Ｃ2-6置換アルカノイル、置換アリールカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、置換アリールオキシカルボニル、Ｃ2-6置換アルカノイルオキシ、および置換アリールカルボニルオキシの中から選択され、
（ａ１１）、（ａ１２）、および（ｂ１１）は、独立して、０または正の整数であり、０〜６が好ましく、０、１、または２がさらに好ましく、
（ｕ）は約１０〜約２３００の正の整数である。
【００９８】
例として、ＰＥＧは次の限定されない方式で官能化することができる：
【化１２】
0005595904.tif 000014
【００９９】
ここで、
Ｒ31、Ｒ35およびＲ36は、独立して、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、および置換Ｃ1-6アルキルの中から選択され、
（ｍ１１）は０または正の整数であり、１または２が好ましく、
Ｙ34はＯまたはＳであり、
（ｕ）は重合度を表す。
【０１００】
これらの態様では、メチルなどのキャッピング基（Ｊ）は、ＰＥＧの末端に付加している。
【０１０１】
例えば、本発明の複合体は、参照することによりその開示が本明細書に援用される、日油株式会社の薬物送達システムカタログ第８版（２００６年４月）に記載されるようなマルチアームＰＥＧ−ＯＨまたは「スター型ＰＥＧ」製品を、前述の米国特許第５，１２２，６１４号または同第５，８０８，０９６号の明細書に記載される活性化技術を使用して、適切な活性化ポリマーに転換する工程を有してなる方法によって調製することができる。参照することにより本明細書に援用される、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの２００１年のカタログ「生物医学的応用のためのポリエチレングリコールおよび誘導体（Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Application）」も参照のこと。
【０１０２】
マルチアームポリマーは、４本以上のポリマーアームを含み、４本または８本のアームが好ましい。説明のためであって限定はしないが、マルチアーム・ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は次の化学式でありうる：
【化１３】
0005595904.tif 000015
【０１０３】
ここで、
（ｘ）は０または正の整数、すなわち、約０〜約２８であり、
（ｎ）は重合度である。
【０１０４】
本発明の１つの特定の実施の形態では、マルチアームＰＥＧは次の構造を有する：
【化１４】
0005595904.tif 000016
【０１０５】
ここで（ｎ）は正の整数である。本発明の１つの好ましい実施の形態では、ポリマーは、約２，０００〜約１００，０００の総分子量を有し、４，０００〜４５，０００であることが好ましい。
【０１０６】
具体的には、ＰＥＧは、次の構造でありうる：
【化１５】
0005595904.tif 000017
【０１０７】
ここで、
（ｕ'）は約１０〜約５７０の整数であり、４，０００〜４５，０００の総分子量を有するポリマーを提供することが好ましく、残基の最大３つの末端部分がメチルまたは他の低級アルキルでキャップ化される。
【０１０８】
一部の好ましい実施の形態では、組換えタンパク質への付加を促進するため、ＰＥＧの４つのアームのすべてが、適切な官能基、すなわちＳＣなどに転換される。転換前のこのような化合物としては、下記のものが挙げられる：
【化１６−１】
0005595904.tif 000018
【化１６−２】
0005595904.tif 000019
【０１０９】
本明細書に含まれるポリマー物質は、室温で水溶性であることが好ましい。このようなポリマーの限定されないリストとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールなどのポリアルキレンオキサイド・ホモポリマー、それらの共重合体および、水溶性が保持されることを条件とした、それらのブロック共重合体が挙げられる。
【０１１０】
さらなる実施の形態では、および、ＰＡＯ系ポリマーの代用として、Ｒ10-11およびＲ22-23は、それぞれ、デキストラン、ポリビニル・アルコール、炭水化物系のポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキサイド、および／またはそれらの共重合体などの１つ以上の有効な非抗原性の材料の中から、それぞれ随意的に選択される。参照することによりその内容が本明細書に援用される、本願と同一の出願人に譲渡された、米国特許第６，１５３，６５５号明細書も参照されたい。同一タイプの活性化は、ＰＥＧなどのＰＡＯに関しては、当業者には、本明細書に記載されるように用いられるものと理解されよう。当業者は、前述のリストが単に説明のためであって、本明細書に記載される品質を有するすべてのポリマー材料が意図されており、ポリプロピレングリコールなどの他のポリアルキレンオキサイド誘導体も意図されているものと理解するであろう。
【０１１１】
２．二官能性リンカー基
本発明の多くの態様では、Ｌ1-6 およびＬ8は、例えばＲ10-11および／またはＲ22-23などのポリマー鎖の付加を促進する連結基である。結合（linkage）は、直接、または当業者に既知のさらなるカップリング基を介して提供されうる。本発明のこの態様では、Ｌ1-6 およびＬ8は、同一でも異なっていてもよく、二官能性およびヘテロ二官能性の脂肪族および芳香族−脂肪族基、アミノ酸など、当業者に既知のさまざまな基から選択することができる。よって、Ｌ1-6 およびＬ8は同一でも異なっていてもよく、下記のような基が挙げられる：
【化１７】
0005595904.tif 000020
【０１１２】
好ましくは、Ｌ1-6 およびＬ8は、下記の中から選択される：
【化１８】
0005595904.tif 000021
【０１１３】
あるいは、適切なアミノ酸残基は、既知の天然Ｌ−アミノ酸、いくつか例を挙げると、例えばアラニン、バリン、ロイシンなど、および／またはそれらの組合せから選択することができる。Ｌ1-6 およびＬ8は、例えば、約２〜約１０のアミノ酸残基の大きさのペプチドを含みうる。
【０１１４】
天然アミノ酸の誘導体および類似体、ならびに、疎水性または非疎水性にかかわらず、さまざまな当技術分野で既知の非天然アミノ酸（ＤまたはＬ型）もまた、本発明の範囲内にあることが意図されている。
【０１１５】
３．Ｚ部分およびその機能
本発明の１つの態様は、ＺおよびＺ'はＬ7−Ｃ(＝Ｙ12)であり、ここでＬ7は、Ｌ1-6を定義する基の中から選択される二官能性のリンカーであり、Ｙ12は、Ｙ1を定義する基と同一の基の中から選択される。本発明のこの態様では、Ｚ基はＡＤＡとポリマー送達システムの残りの部分との結合としての働きをする。本発明の他の態様では、Ｚは、標的細胞内に能動輸送される部分、疎水性部分、およびそれらの組合せである。Ｚ'が存在する場合は、Ｚ'は二官能性リンカー、標的細胞内に能動輸送される部分、疎水性部分、およびそれらの組合せとして機能しうる。
【０１１６】
本発明のこの態様では、放出可能なポリマー系は、インビボにおける加水分解によってＡＤＡからポリマーが切り離され、Ｚ部分に結合した状態のままの酵素を細胞外液へと放出するように調製される。例えば、一部の可能性のあるＺ−Ｂの組合せは、ロイシン−ＡＤＡおよびＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＡＤＡである。
【０１１７】
Ｂ．ＡＤＡ複合体の調製
説明のためであるが、適切な複合体形成反応は、ＡＤＡを本明細書に記載される適切な活性化ポリマー系と反応させる工程を有してなる。反応は、約６．５〜８．５のｐＨを用い、ＰＢＳ緩衝系などの利用を含めたタンパク質修飾の分野における当業者に周知の条件を使用して行うことが好ましい。大抵の場合、過剰の活性化ポリマーをＡＤＡと反応させることが意図されている。
【０１１８】
この種の反応は、ＡＤＡに付加する１つ以上のポリマーを含む複合体を形成する結果となることが多い。認識されるように、多くの場合、さまざまな画分を分離し、さらに均質な生成物を提供することが望ましいであろう。本発明のほとんどの態様では、反応混合物を回収し、適切なカラム樹脂に負荷し、緩衝液のレベルを上昇させるにつれ、所望する画分が連続的に溶出される。各画分を適切な分析用具によって分析し、さらなる処理をする前に結合タンパク質の純度を決定する。合成経路および選択される活性化ポリマーに関わらず、複合体は本明細書に定義される式（Ｉ）に一致するであろう。本明細書に記載される合成技術から得られる一部の好ましい複合体として、下記のものが挙げられ、
【化１９】
0005595904.tif 000022
【０１１９】
ここでＢはＡＤＡである。
【０１２０】
本発明に従って調製される更なる複合体としては、下記のものが挙げられ、
【化２０】
0005595904.tif 000023
【０１２１】
ここですべての変数は上記のものと同一であり、ＢはＡＤＡである。
【０１２２】
更なる複合体としては、下記のものが挙げられ、
【化２１】
0005595904.tif 000024
【０１２３】
ここでＢはＡＤＡである。
【０１２４】
特に好ましい複合体としては下記のものが挙げられ、
【化２２】
0005595904.tif 000025
【０１２５】
ここでｍＰＥＧの分子量は約４，０００〜約４５，０００である。
【０１２６】
ビシン系ポリマーシステムを用いる場合、２つの好ましい複合体として、下記のものが挙げられ、
【化２３】
0005595904.tif 000026
【０１２７】
ここでｍＰＥＧの分子量は上記のものと同一である。
【０１２８】
さらに好ましい複合体としては下記のものが挙げられる。
【化２４】
0005595904.tif 000027
【０１２９】
ＡＤＡのＰＥＧ化は、タンパク質あたりの全ＰＥＧ付加数、ＰＥＧポリマーの大きさ、およびＰＥＧリンカーの設計のため、経験的に最適化されるであろう。ＰＥＧ化の最適化の評価にとって重要なＰＥＧ化ＡＤＡの特徴付けには、インビトロ分析（例えば、酵素の活性および安定性）およびインビボ分析（例えば、薬物動態および薬力）の両方が含まれる。
【０１３０】
Ｃ．治療すべき腫瘍
本発明の方法は、治療されるべきヒトまたは動物の血液および／または組織のアデノシンまたはデオキシアデノシンのレベルを低減させる余地のある癌を含むすべての種類の腫瘍の治療に適用することができる。広範には、これらには血液の腫瘍および固形腫瘍が含まれる。固形腫瘍の中には、アデノシンのレベルの低下によって患者の免疫系が腫瘍および／または複数の腫瘍をさらに有効に抑制するようになる場合に抑制されるものが含まれ、それは、例えばすでに低酸素状態にある腫瘍など、血液の供給を阻害するアデノシンのレベルを低下させることによって抑制される。
【０１３１】
さらに好ましくは、本発明の方法による治療に感受性の腫瘍は固形腫瘍であり、これには、アデノシンの組織内濃度の低下を伴う、血管新生刺激の低減という追加的効果が有効に作用する。
【０１３２】
治療されるべき腫瘍としては、単なる例証として、免疫系、骨格系、筋肉および心臓、乳房、消化管、中枢および末梢神経系、腎臓系、生殖器系、呼吸器系、皮膚、関節を含む結合組織系、脂肪組織、血管壁を含む循環系などに由来するものが挙げられる。
【０１３３】
骨格系の腫瘍としては肉腫および芽細胞腫の両方が挙げられ、例えば骨肉腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫などである。筋肉および心臓の腫瘍には、骨格筋および平滑筋の両方が挙げられ、例えば、平滑筋腫（平滑筋の良性腫瘍）、平滑筋肉腫、横紋筋腫（骨格筋の良性腫瘍）、横紋筋肉腫、心臓肉腫などが挙げられる。消化管の腫瘍としては、例えば、口腔、食道、胃、小腸、結腸および結腸直腸の腫瘍、ならびに唾液腺、肝臓、膵臓、胆管などの消化系分泌器官が挙げられる。
【０１３４】
中枢神経系の腫瘍には、脳、網膜、および脊髄の腫瘍が挙げられ、関連する結合組織、骨、血管、または神経組織に由来しうる。末梢神経系の腫瘍もまた、治療することが意図されている。さらには、末梢神経系の腫瘍には悪性末梢神経鞘腫が含まれる。
【０１３５】
腎臓系の腫瘍には、例えば、腎細胞癌ならびに尿管および膀胱の腫瘍など、腎臓の腫瘍が含まれる。生殖器系の腫瘍には、子宮頚部、子宮、卵巣、前立腺、睾丸、および関連する分泌腺が挙げられる。免疫系の腫瘍には、血液系の腫瘍および固形腫瘍の両方があり、例えば、ホジキンおよび非ホジキンの両方のリンパ腫が挙げられる。
【０１３６】
呼吸器系の腫瘍としては、鼻腔、気管支および肺の腫瘍が挙げられる。乳房の腫瘍には、例えば、小葉癌および腺管癌の両方が挙げられる。
【０１３７】
治療すべき悪性腫瘍の特によく見られるタイプとしては、例証としてほんの数例を挙げれば、前立腺癌、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、膀胱癌、膵臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、皮膚黒色腫、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫（筋肉から生じる）、網膜芽腫、骨肉腫、およびユーイング肉腫などである。
【０１３８】
Ｄ．投与量の選択
技術者は、薬が使用される状況において、動物かヒトかに関わらず、「Ａｄａｇｅｎ」の用量が、腫瘍の臨床反応および個別の患者の副作用プロフィールに応じて個々に行われることを認識するであろう。以下に提供する研究例では、最大用量とは、許容される技術的に投与可能な最大用量である。「Ａｄａｇｅｎ」は、２５０Ｕ／ｍＬで市販されている。これは、０．２ｍｌの「Ａｄａｇｅｎ」を注射されたおよそ２５ｇのマウスにとって２０００Ｕ／ｋｇに相当する。以下に提供される研究例で用いられる最少用量は、ヒトの臨床用量に近い。ヒト重症複合型免疫不全症患者の治療における推奨される投薬スケジュールは、初回投与では１０Ｕ／ｋｇであり、２回目投与では１５Ｕ／ｋｇ、３回目投与では２０Ｕ／ｋｇである。最大単回投与量の３０Ｕ／ｋｇに至るまで、５Ｕ／ｋｇ／週ずつさらに増加させることが可能である。下記例示されるプロトコルにおける用量（１００Ｕ／ｋｇ）は、子供におけるおよそ１２Ｕ／ｋｇの臨床用量に等しい、マウスの投与量である。
【０１３９】
酵素の量に基づいた用量は、例えば、約０．１０Ｕ／ｋｇ〜約３０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であり、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約２０Ｕ／ｋｇが好ましく、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約５Ｕ／ｋｇなど、約０．５Ｕ／ｋｇ〜約１２Ｕ／ｋｇ（患者の体重のｋｇあたり）の範囲であることがさらに好ましい。１週間の総投与量は、服用者が許容できるように、最大４０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上でありうる。服用者が許容できるように、最大単回投与量の３０Ｕ／ｋｇまたはそれ以上に至るまで、５Ｕ／ｋｇ／週のさらなる増加が認められる。一般に、１５Ｕ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」を毎週注射した後の血漿におけるＡＤＡ活性の平均トラフレベルは２０〜２５μｍｏｌ／時間／ｍｌの範囲である。
【０１４０】
当然ながら、技術者は、ポリマー結合ＡＤＡの用量が、具体的ポリマーの大きさ、リンカー化学、および価数によって調整されうることを認識するであろう。例えば、ポリマーあたり２つまたは４つのＡＤＡ酵素を含むポリマー複合体の投与計画は、ＡＤＡの任意の具体的ポリマー複合体の溶液のｍｌあたりのＡＤＡの単位にしたがって調整されよう。
【０１４１】
注入により、ＡＤＡまたはＡＤＡのＰＥＧ複合体を提供する際、至適用量の範囲は、血漿のアデノシンレベルをモニターすることによって調整することができる。一般には、約１０〜１００μｍｏｌ／時間／ｍｌ、好ましくは約１５〜約３５μｍｏｌ／時間／ｍｌの範囲で血漿ＡＤＡ活性（トラフレベル）が維持されるであろう投与量（３７℃でアッセイ）を服用者に提供し、赤血球アデノシンの減少、すなわち、パック内の赤血球におけるｄＡＴＰが約０．００１〜０．０５７μｍｏｌ／ｍｌ以下、好ましくは約０．００５〜約０．０１５μｍｏｌ／ｍｌであるか、または、注入前サンプルで測定して、正常アデノシンレベルでのｄＡＴＰが、総赤血球アデノシン（すなわち、ＡＴＰ＋ｄＡＴＰ含量）の約１％以下であることを実証することが望ましい。ｄＡＴＰの正常値は約０．００１μｍｏｌ／ｍｌ未満である。
【０１４２】
ＡＤＡの投薬情報の詳細は、参照することによりその内容が援用される、「Ａｄａｇｅｎ」（Ｅｎｚｏｎ，Ｉｎｃ．社製）に挿入される処方箋に記載されている。
【実施例】
【０１４３】
以下の実施例は、本発明のさらなる認識を提供する役割をすることであり、本発明の効力範囲を多少なりとも制限することを意味するものではない。
【０１４４】
実施例１
ＤＵ１４５における「ＡＤＡＧＥＮ」の抗腫瘍効果
ヒト前立腺腫瘍異種移植モデル
Ａ）試験系
種類：      ネズミ、ハツカネズミ
系統：      胸腺欠損ヌードマウス
供給業者：  Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ社
性別：      雌
平均初期体重：     ２７．２ｇ
研究個体数：       ４０
順応期間：  到着後７日間
識別：      ケージ番号および耳パンチ
【０１４５】
Ｂ）方法
実験計画：
ＤＵ１４５ヒト前立腺腫瘍細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国バージニア州マナッサス所在）から入手した。腫瘍は、２．０×１０6 ＤＵの１４５細胞／マウスの右の脇腹への皮下注射によって、ヌードマウスに確立された。腫瘍増殖を週２回モニターし、触診で一度測定した。腫瘍が７８ｍｍ3の平均体積に達したときに、マウスを各実験群（８匹／群）に分けた。マウスを、２０００、５００、または１００ＩＵ／ｋｇのいずれかの量の「Ａｄａｇｅｎ」で、週２回、５週間治療した。陽性対照として、「Ａｖａｓｔｉｎ」（ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）を５ｍｇ／ｋｇ用量で、「Ａｄａｇｅｎ」と同一の頻度でマウスに与えた。下記の表１に示すように実験群を用意した。投薬の初日を第１日目とした。各マウスの腫瘍体積は、カリパスを用いて二次元で測定して決定し、次式を使用して計算した： 腫瘍体積＝（長さ×幅2）／２）。マウスの体重および腫瘍の大きさは、研究の開始時および８週間の間、週２回測定した。
【表１】
0005595904.tif 000028
【０１４６】
投与量の選択：
「Ａｄａｇｅｎ」または「Ａｖａｓｔｉｎ」 を、週２回、５週間にわたり、腹腔内（「ｉ．ｐ．」）経路によって投与された（合計１０回投与）。
【０１４７】
アダジェン：ロット番号：ＮＶ０６０４、濃度：２２９ＩＵ／ｍｌ
アバスチン：ロット番号：Ｍ６６７８１、濃度：２５ｍｇ／ｍｌ
用量計算は、第１日目の体重に基づいて行った。
【０１４８】
臨床検査：
到着時にマウスを視覚的に検査した。続いて最初の腫瘍の触診の後、臨床的症状、一般的な行動変化についてマウスを個別に週２回検査し、体重をモニターした。致死および臨床的症状を記録した。食物および水の消費についてはモニターしなかった。開いた壊死病斑を示す腫瘍を有するマウスを殺処分した。体重が２０％を超えて減少したマウスも、人道的に殺処分した。
【０１４９】
統計分析：
さまざまな処置による腫瘍体積の％変化の差異を、一元配置分散分析を用いて比較した。全対多重比較は、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ法を用いて行った。
【０１５０】
Ｃ）結果
用いられる用語の定義：
（ａ）最初の腫瘍体積の％：（任意の日における腫瘍体積／第１日目における腫瘍体積）×１００
（ｂ）腫瘍体積の％変化：［（任意の日における腫瘍体積−第１日目における腫瘍体積）／第１日目における腫瘍体積］×１００
（ｃ）％腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）：［（対照群の平均腫瘍体積−治療群の平均腫瘍体積）／対照群の平均腫瘍体積］×１００
（ｄ）腫瘍退縮は、第１日目と比較した負の腫瘍体積として定義される。  
（ｅ）治癒は、人の肉眼で観察される腫瘍の完全な欠如として定義される。
【０１５１】
実験開始時における平均の腫瘍の大きさは、７８ｍｍ3であった。実験開始時における平均体重は２７．２０ｇであった。マウスのすべての群で体重が増加し、実験の終わりまでに種々の群におけるマウスの体重は、治療開始前の体重の２０〜２５％増加した。実験は第５７日目に終了し、その時点では、動物の大部分は、潰瘍化した腫瘍を有するか、１５００ｍｍ3を超える腫瘍体積を有するかのいずれかであった。
【０１５２】
下記表２および３に、実験第４９日目に見られた最終結果をまとめ、「Ａｄａｇｅｎ」で治療した動物および「Ａｖａｓｔｉｎ」で治療した動物について群の生残率についての比較を提供する。対照群における腫瘍は実験期間全体を通じて、着実に増加した。第４９日目には、平均腫瘍体積の大きさは、７８３．１（±５５６．２）ｍｍ3であった。腫瘍増殖の％変化は８３３．３ ％（±６２２．７）であった。「Ａｄａｇｅｎ」での治療は、３種類の用量レベルのすべてにおいて、腫瘍増殖の阻害に有効であった。治療群のすべてにとって、投薬の最終日（第３３日目）まで、緩やかな速度で腫瘍が増殖し、その後、腫瘍の増殖速度は速まった（データ示さず）ことに注意すべきである。この観察は、「Ａｄａｇｅｎ」の３種類の用量レベルにおける腫瘍体積の％変化が第３６日目までの対照群のものとは顕著に異なる（Ｐ＜０．０５）（データ示さず）という事実と一致する。
【０１５３】
このことは、「Ａｄａｇｅｎ」が腫瘍増殖における細胞静止作用を有することを示唆している。第３６日目の後、実験の最終日まで、腫瘍体積における％変化は対照群のものと統計的な差異はないが、「Ａｄａｇｅｎ」での治療は、検出可能なほどの腫瘍増殖阻害に至る。特に、２０００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」で治療された腫瘍は第４９日目において３４３．０（±２４９．８）ｍｍ3の平均腫瘍体積を有していた。腫瘍体積における平均変化は４２４．２％（±３６０．６）であった。２０００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」では、５６％の腫瘍増殖阻害を示した。
【０１５４】
５００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」で治療した腫瘍は、第４９日目において６９６．３（±２９０．４）ｍｍ3の平均腫瘍体積を有していた。腫瘍体積における平均変化は７９７．６％（±４９２．７）であり、最初の腫瘍からの変化は８９７．６％（±４９２．７）であった。腫瘍増殖阻害は１１．１％であった。この群の腫瘍は、第４０日目までは他の「Ａｄａｇｅｎ」で治療された群と同様の腫瘍増殖速度を有しており、その後、非常に速い速度で増殖した。この相違の理由は不明である。
【０１５５】
１００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」で治療された腫瘍は、第４９日目において４１４．８（±２１９．０）ｍｍ3の平均腫瘍体積を有していた。腫瘍体積における平均変化は４８９．９％（±３０７．０）であり、最初の腫瘍からの平均％変化は５８９．９％（±３０７．０）であった。腫瘍増殖阻害、すなわちＴＧＩは４７．０％であった。
【０１５６】
「Ａｄａｇｅｎ」の治療効果は、１００ＩＵ／ｋｇの最低用量における最大効果に達した。１００ＩＵ／ｋｇの用量が、人における臨床用量（ＳＣＩＤの子供の治療に使用する用量）に近いことに注意すべきある。「Ａｖａｓｔｉｎ」は、９２．５％の腫瘍増殖阻害、すなわちＴＧＩという、最も有効な腫瘍の大きさの減少を示した。
【０１５７】
結論として、「Ａｄａｇｅｎ」での治療は、３種類の投薬量のすべてにおいて、インビボにおけるＤＵ１４５腫瘍の増殖阻害に有効であった。 
【表２】
0005595904.tif 000029
【表３】
0005595904.tif 000030
【０１５８】
実施例２
ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣腫瘍の異種移植モデルにおける「ＡＤＡＧＥＮ」の抗腫瘍効果
Ａ）試験系
種類：      ネズミ、ハツカネズミ
系統：      胸腺欠損ヌードマウス
供給業者：  Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ社
性別：      雌
平均初期体重：     ２２．１８ｇ
研究個体数：       ５４
順応期間：  到着後７日間
【０１５９】
Ｂ）方法
実験計画：
ＳＫ−ＯＶ−３ヒト卵巣腺癌腫瘍は、３×１０6 細胞／マウスの右の脇腹への皮下注射によって、ヌードマウスに確立された。腫瘍増殖を週２回モニターし、触診で一度測定した。各マウスの腫瘍体積は、カリパスを用いて二次元で測定して決定し、次式を使用して計算した： 腫瘍体積＝（長さ×幅2）／２）。腫瘍が９０ｍｍ3の平均体積に達したときに、マウスを各実験群（９匹／群）に分けた。下記表に示すように実験群を用意した。投薬の初日を第１日目とした。
【０１６０】
マウスの体重および腫瘍の大きさは、実験の開始時および実験の終了までの間、週２回測定した。実験は、およそ７週間後に終了し（５２日間）、その時点では、動物の大部分は、大きい腫瘍、または潰瘍化した腫瘍を有していた。
【表４】
0005595904.tif 000031
【０１６１】
投与計画：
「Ａｄａｇｅｎ」、「Ａｖａｓｔｉｎ」、または天然ＡＤＡを週２回、５週間、 静脈内投与した（合計：１０回投与）。
【０１６２】
試験物品：
「Ａｄａｇｅｎ」：ロット番号：ＮＶ０６０４、濃度：２２９ＩＵ／ｍｌ
「Ａｖａｓｔｉｎ」：ロット番号：Ｍ６６７８１、濃度：２５ｍｇ／ｍｌ
天然ＡＤＡ：ロット番号：０６−０３１５−１１１
用量計算：
第１日目の体重に基づく。
【０１６３】
臨床検査：
到着時にマウスを視覚的に検査した。続いて、最初の腫瘍の触診の後、臨床的症状、一般的な行動変化についてマウスを個別に週２回検査し、体重をモニターした。致死および臨床的症状を記録した。食物および水の消費についてはモニターしなかった。開いた壊死病斑を示す腫瘍を有するマウスを殺処分した。体重が２０％を超えて減少したマウスも、人道的に殺処分した。
【０１６４】
統計分析：
さまざまな治療による腫瘍体積における％変化の差異を、一元配置分散分析を用いて比較した。全対多重比較は、Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法を用いて行った。
【０１６５】
Ｃ）結果
用いられる用語の定義：
（ａ）最初の腫瘍体積の％：（任意の日における腫瘍体積／第１日目における腫瘍体積）×１００
（ｂ）腫瘍体積における％変化：［（任意の日における腫瘍体積−第１日目における腫瘍体積）／第１日目における腫瘍体積］×１００
（ｃ）％腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）：［（対照群の平均腫瘍体積−治療群の平均腫瘍体積）／対照群の平均腫瘍体積］×１００
（ｄ）腫瘍退縮は、第１日目と比較した負の腫瘍体積として定義される。  
（ｅ）治癒は、人の肉眼で観察される腫瘍の完全な欠如として定義される。
【０１６６】
実験開始時における平均の腫瘍の大きさは、９０ｍｍ3であった。実験開始時における平均体重は２２．２ｇであった。すべての群において、平均体重は、実験を通じて変化しなかった。実験は第５２日目に終了した。１５００ｍｍ3を超える腫瘍の増殖に起因して、４匹のマウスを殺処分した。
【０１６７】
下記表５に、実験第３２日目（対照動物の最終日の生残率６６％）の最終結果のまとめを示す。対照群における腫瘍は実験期間全体を通じて、着実に増加した。第３２日目には、平均腫瘍体積の大きさは、７５４．９（±７００．７）ｍｍ3であった。腫瘍増殖の％変化は６９３．２％（±６７３．６）であった。
【表５】
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【０１６８】
２０００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」で治療した腫瘍は、第３２日目において４３７．７（±１２２．２）ｍｍ3の平均腫瘍体積を有していた。腫瘍体積における平均変化は４０２．１％（±１７７．７）であった。２０００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」は、４２％の腫瘍増殖阻害を示した。
【０１６９】
５００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」で治療した腫瘍は、第３２日目において４７１．１（±６０．０）ｍｍ3の平均腫瘍体積を有していた。腫瘍体積における平均変化は４２１．３％（±１０２．２）であり、最初の腫瘍からの変化は５２１．３％（±１０２．２）であった。腫瘍増殖阻害は３７．６％であった。
【０１７０】
１００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」で治療された腫瘍は、第３２日目において４９７．７（±１５２．６）ｍｍ3の平均腫瘍体積を有していた。腫瘍体積における平均変化は４５０．７％（±１７２．７）であり、最初の腫瘍からの平均％変化は５５０．７％（±１７２．７）であった。腫瘍増殖阻害は３４．１％であった。
【０１７１】
２０００ＩＵ／ｋｇの天然ＡＤＡで治療した腫瘍は、第３２日目において３５６．６（±２１３．０）ｍｍ3の平均腫瘍体積を有していた。腫瘍体積における平均変化は３４０．１％（±２１０．０）であり、最初の腫瘍からの平均％変化は４４０．１％（±２３９．１）であった。腫瘍増殖阻害は５２．８％であった。
【０１７２】
アダジェンを用いた治療は、いずれの用量レベルにおいても、対照から得られる結果に相応していた。しかしながら、各用量レベルでのアダジェンを用いた治療は、上述のようなＴＧＩを生じた。
【０１７３】
「Ａｄａｇｅｎ」の治療効果は、１００ＩＵ／ｋｇの最も低い用量で最大効果に達した。１００ＩＵ／ｋｇの用量が、「Ａｄａｇｅｎ」の人における臨床用量（ＳＣＩＤの子供の治療に使用する用量）に近いことに注目すべきである。この実験における陽性対照として与えられた「Ａｖａｓｔｉｎ」は、７２％のＴＧＩという、腫瘍の大きさの最も有効な減少を示した。
【０１７４】
結論として、１００、５００、または２０００ＩＵ／ｋｇの「Ａｄａｇｅｎ」での治療は、結果的に、３４〜４２％の腫瘍の増殖阻害をもたらした。 
本発明の方法のための別の組換えＡＤＡ酵素について、以下に記載する。
【０１７５】
実施例３
成熟タンパク質の７４位のＣｙｓがＳｅｒに変化した、組換えヒトＡＤＡを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株の構築
ヒトのアデノシン・デアミナーゼの報告されているアミノ酸配列（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_００００１３）を、システインのコドンの存在について分析した。成熟（Ｎ−末端Ｍｅｔが開裂している）ポリペプチドの５つの位置が、システインをコードしていた（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。ヒトＡＤＡを発現する設計され、修飾された遺伝子では、これら５つのシステインのコドン（システイン７４、ＴＧＣ）の１つだけが、セリンのコドン（ＴＣＣ）に変化していた（これは、翻訳されたタンパク質における７５位である）。重複するオリゴヌクレオチド部分の標準的化学合成を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子の全合成のため、定義されたポリペプチド配列（配列番号：３参照）をＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ (米国ワシントン州ボセル所在)に提供した。要するに、配列を、細菌の発現用に最適化し、続いて、Grantham R.ら; 1981; "Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity," Nucleic Acid Res. 9:r43-r47、およびLathe, R.; 1985; "Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data, Theoretical and practical considerations." J. Mol Biol; 183:1-12に記載されるコドンデータを利用して、標準的な細菌コドンを大腸菌Ｋ１２に使用した。
【０１７６】
次に、対応するＲＮＡ配列をヘアピン構造の形成またはループ形成について分析し、自由エネルギーの計算を最小限に抑えるようにした。フランキングする制限酵素認識部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは、遺伝子の末端に含まれていた。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた合成ＤＮＡの切断の後、１．１キロベースの遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを介して、同じくこれら２種類の酵素で切断されたプラスミドベクターｐＥＴ−２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）内に結合させた。メーカーの使用説明書に従い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００を使用するエレクトロポレーションによって、組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。プラスミドｐＥＴ−２８ａ／ＡＤＡｃｙｓＳｅｒ（ＡＤＡｃ７５ｓ／ｐＥＴ２８ａ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＡＤＡｃ７５ｓ／ｐＥＴ２８ａ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を指定）を含むコロニーの選択を可能にするため、形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗沫した。ＡＤＡ変異体遺伝子ヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを使用したＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＡｎａｌｙｚｅｒでＤＮＡ配列分析することによって確認した。Ｓｅｒ74−ｒｈＡＤＡのオープン・リーディング・フレーム（コード領域と疑われる）をコードするＤＮＡ配列は、配列番号：４によるものである。
【０１７７】
単離したコロニーを塗沫し、参照することにより本明細書に援用されるＮｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシステムマニュアル第９版に記載されるような標準的方法によって、ＬＢ培地においてイソプロピル-β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を誘発可能な遺伝子の発現について分析することによって、さらに精製した。
【０１７８】
時間、温度、および誘発因子の濃度を含めた幾つかの誘発パラメータについて試験した。宿主細菌の細胞質内に、総細胞タンパク質の約２０％という高濃度でのＡＤＡの産生を可能にする、好ましい条件は、２５℃で１２時間、５０μＭのＩＰＴＧを用いた誘発であった。発現させたＡＤＡタンパク質は、およそ４０，０００という正確な分子量を示すことが、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認された（データ示さず）。
【０１７９】
実施例４
成熟タンパク質の７４位のＣｙｓがＳｅｒに変化した、組換えウシＡＤＡを発現する、Ｅ．ｃｏｌｉ発現株の構築
ウシの腸の処置から得られる精製された成熟ＡＤＡタンパク質は、Ｎ−末端のメチオニンが欠如し、ｃＤＮＡ配列から予想された最後の６つのＣ−末端の残基も欠如している、３５６アミノ酸タンパク質である（参照することにより本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋ ＮＰ_７７６３１２）。ウシＡＤＡアミノ酸配列を、システインのコドンの存在について分析した。成熟ポリペプチドの５つの位置は、システインをコードしている（Ｃ７４、Ｃ１５２、Ｃ１５３、Ｃ１６８、Ｃ２６１）。設計および修飾されたウシＡＤＡ合成遺伝子では、これら５つのシステイン位置の１つ（システイン７４）だけが、セリン残基に変化していた。これは、成熟タンパク質の７４位（または翻訳生成物の７５位）における通常のシステインのコドンの代わりにセリンのコドン（ＴＣＣ）を挿入することによって実現した。遺伝子はまた、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に最適化されたコドンであった。
【０１８０】
簡潔に述べると、重複するオリゴヌクレオチド部分の化学合成を含む方法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されたコドンを有する新しい遺伝子の全合成を目的として、確定したポリペプチド配列（配列番号：１参照）をＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．に提供した。ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ社の方法は、参照することによりその内容全体を本明細書に援用する、米国特許第６，３６６，８６０号明細書に詳細に記載されている。
【０１８１】
幾つかの発現系において、ウシＡＤＡの発現を研究した。フランキングする制限酵素認識部位、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩは、遺伝子の末端に含まれていた。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いた合成ＤＮＡの切断の後、１．１キロベースの遺伝子を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを介して、同じくこれら２種類の酵素で切断されたプラスミドベクターｐＥＴ−９ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）内に結合させた。メーカーの使用説明書に従い、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ ６００を使用するエレクトロポレーションによって、組換えプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）内に導入した。プラスミドｐＥＴ−９ｄ／ｂＡＤＡ（ｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＢＬＲ（ＤＥ３）またはｂＡＤＡ／ｐＥＴ９ｄ：ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を指定）を含むコロニーの選択を可能にするため、形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に塗沫した。ＡＤＡ変異体遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓを使用したＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ＡｎａｌｙｚｅｒでＤＮＡ配列分析することによって確認した。変異型ＡＤＡをコードするＤＮＡ分子は、配列番号：２によって示されている。
【０１８２】
単離したコロニーを塗沫し、Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシステムマニュアル第９版に記載されるような標準的方法によって、ＬＢ培地においてＩＰＴＧの誘発が可能な遺伝子の発現について分析することによってさらに精製した。時間、温度、および誘発因子の濃度を含めた幾つかの誘発パラメータについて研究した。宿主細菌の細胞質内に、総細胞タンパク質の約２０％という高濃度でＡＤＡを産生させる好ましい条件は、３７℃で１２時間、０．３％の乳糖を用いた誘発であった。ＡＤＡ生成物は、およそ４０，０００という正確な分子量を示すことが、ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析で確認された。
【０１８３】
実施例５
組換えヒト変異型ＡＤＡタンパク質の精製
変異型ｒｈＡＤＡの精製は、Ｅｎｚｏｎ社によって確立された３クロマトグラフィー・プロトコルで行った。宿主細胞ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）におけるプラスミドｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）上の合成遺伝子からｒｈＡＤＡを発現するＥ．ｃｏｌｉについて、細菌発酵を行った。リファンピシン（２００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を、酵母エキス（３０ｇ／ｌ）を補充したグリセロールの最少培地に含めて、細胞を２８℃で１１ＯＤ600まで増殖させ、５ｍＭの最終濃度に至るまで、誘発因子ＩＰＴＧを加えた。４０時間後（ＯＤ600〜１１０）、遠心分離によって細胞を回収し、−２０℃で冷凍した。簡潔に言えば、解凍した細胞ペースト（５０ｇ）を１０ｍＭのトリス緩衝液［トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン］、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０の１８００ｍｌ緩衝液に再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）社（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製のマイクロプロセッサ）を用いて１２００ＲＰＭで１０秒間、均質化した。この懸濁液をステンレス鋼のメッシュ（開口部のマイクロメーター２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ Ｔｙｌｅｒ社製）に通し、大きな粒子を除去した。３サイクルの間、１０３，４００ｋＰａ（１５，０００ｐｓｉ）で、均質な細胞懸濁液を微小流動化した（装置を氷浴した）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製、１１０Ｙモデル）。微小流動化の終わりに、上記と同一の緩衝液２００ｍｌを使用して装置一式をすすぎ、この溶液を上記懸濁液と合わせた。細胞溶解物から得られた可溶性タンパクを、４℃で４０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離することによって抽出した（Ｓｏｒｖａｌｌ（登録商標）社製のＲＣ ５Ｃ ｐｌｕｓ、ローターＳＬＡ−１０００）。無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。ｐＨを８．０に調整し、１ｍＭのＭｇＣｌ2および２０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を加え、室温で２時間インキュベートした。次に１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを６．５に合わせた。２回目の遠心分離を上記のようにして行い、上清を回収し、２ｍＭのＥＤＴＡに応じて調整し、その後、ナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標））の９０ｍｍのフィルター・ユニットでろ過した。ろ過した上清の体積は５００ｍｌであり、ＢＣＡ法による総タンパク質濃度は８．５ｍｇ／ｍｌであった。
【０１８４】
細胞抽出液（１００ｍｌ）をｐＨ７．２および４．５ｍＳ／ｃｍに調整し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、２０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５でＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ｆｆ上に負荷し、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５で溶離させた。ピーク画分を酵素アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4中の１．５Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５に調整し、ＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ｆｆカラムに負荷した。負荷する緩衝液の勾配、および２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、ｐＨ６．５を用いてタンパク質を溶出させた。ピーク画分（５５ｍｌ；０．４ｍｇ／ｍｌ）を、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５に対し、ダイアフィルター（diafiltered）を行ない、ＨｉＴｒａｐ ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆｆ上に負荷し、２０ｍＭのＮａＨＰＯ4、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．５で溶出させた。回収画分は、精製ＡＤＡタンパク質を含んでいた（７７ｍｌ；０．１ｍｇ．ｍｌ）。
【０１８５】
実施例６
組換えウシＡＤＡタンパク質の精製
実施例４のクローンによって発現させた変異型ｒｂＡＤＡの精製は、Ｅｎｚｏｎ社によって確立された３クロマトグラフィー・プロトコルで行った。簡潔に言えば、−８０℃で保管された、２００ｇの解凍した細胞ペースト（それぞれ、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｅｏｎ社またはＢｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｓ社から入手）を、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の緩衝液１８００ｍｌに再懸濁し、Ｔｅｍｐｅｓｔ Ｖｉｒｔｉｓ（Ｓｅｎｔｒｙ（商標）社（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製のマイクロプロセッサ）を用いて１２００ＲＰＭで５分間、均質化した。この懸濁液をステンレス鋼のメッシュ（開口部マイクロメーター２５０μ、Ｎｏ．６０、Ｗ．Ｓ Ｔｙｌｅｒ社製）に通し、大きな粒子を除去した。３サイクルの間、１０３，４００ｋＰａ（１５，０００ｐｓｉ）で、均質な細胞懸濁液を微小流動化した（装置一式を氷浴した）（Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．（米国マサチューセッツ州ボストン所在）製、１１０Ｙモデル）。微小流動化の終わりに、上記と同一の緩衝液２００ｍｌを使用して装置一式をすすぎ、この溶液を上記懸濁液と合わせた。細胞溶解物から得られた可溶性タンパク質を、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離することによって抽出した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。
【０１８６】
この細胞抽出液中のヌクレオチドを除去するため、トリエチレンイミン（ＰＥＩ）を上記上清に加え（最終的には０．１５％、ｗｔ／ｖ）、１０分間攪拌することにより完全に混合させた。次に、この細胞抽出液を４℃で一晩放置した。この一晩放置したサンプルから得られた沈殿を、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離することによって除去した（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。同様に、無用の混合を避けるため、上清を注意深く回収した。第１のカラムにＡＤＡが結合するのを補助するため、１０％のＰＥＧ４６００をこの細胞抽出液にゆっくりと加え、この細胞抽出液のｐＨを１ＮのＮａＯＨおよび１ＮのＨＣｌを用いてゆっくりと６．５に調整した。次のカラムに負荷する前に、この上清を再度、４℃で６０分間、７１００ｒｐｍ（１２０００×ｇ）で遠心分離にかけた（Ａｖａｎｔｉ Ｊ−２０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製；ローター番号ＪＬＡ８．１０００）。
【０１８７】
細胞抽出液を、予め平衡化したＣａｐｔｏ Ｑカラム（カタログ番号１７−５３１６−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製、総容積３５０ｍｌ、ＸＫ−５０に予め充填済み）に、２０ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５の緩衝液を用いて負荷した。ＡＤＡを、８０ｍＭのＮａＣｌを用いてカラムから平衡化した緩衝液中に溶出させる前に、まず、６０ｍＭおよび７０ｍＭのＮａＣｌでの溶出を行い、不純物を除去した。溶出液の特性を、ＡＤＡ活性、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロット、およびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて解析した。
【０１８８】
Ｃａｐｔｏ Ｑカラムにかけた後、２つの疎水性相互作用によるクロマトグラフィー（「ＨＩＣ」）精製を１つずつ行い、タンパク質の純度をさらに高めた。最初のＨＩＣはオクチルセファロース（Octyl Sepharose）４ＦＦ（カタログ番号１７−０９４６−０２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）であった。Ｃａｐｔｏ Ｑカラムから得られたＡＤＡ画分の貯留液を、硫酸アンモニウム粉末を用いて直接、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4に応じて調整し、ｐＨを６．５に調整した。ろ過したサンプル（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ社（米国ニューヨーク州ロチェスター所在）製、カタログ番号５４０８８７、ＭＥＭＢ０．２ＰＥＳ）を、１．５Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５を用いて予め平衡化した第１のＨＩＣカラムに負荷した（総容積１５０ｍｌ、ＸＫ−５０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）。ＡＤＡタンパク質を硫酸アンモニウムの勾配を用いて溶出させ、この溶出液の純度特性をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定した。第１のＨＩＣカラムの画分のＡＤＡタンパク質を貯留し、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4に応じて調整し、１Ｍの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのＫＨ2ＰＯ4−Ｋ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５を用いて予め平衡化した第２のＨＩＣカラム（総容積１５０ｍｌ、ＸＫ−５０、ＨＩＣ Ｐｈｅｎｙｌ ＨＰ、カタログ番号１７−１０８２−０１、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージ−州ピスカタウェイ所在）製）に直接負荷した。これらの画分のＡＤＡ純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて分析した。精製ｒｂＡＤＡまたはｒｈＡＤＡをさらに脱塩し、保存緩衝液（例えば、１００ｍＭのリン酸緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）についてＬａｂＳｃａｌｅ（商標）ＴＦＦシステム（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＢｉｏＭａｘ５（米国マサチューセッツ州ベッドフォード所在））で濃縮した。
【０１８９】
実施例７
ウレタン結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡの調製
ＳＣ−ＰＥＧ（炭酸Ｎ−スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール、０．０８４ｍｍｏｌ）を、穏やかに攪拌しながら、３ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）中Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を３０℃で３０分間攪拌する。ＧＰＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−４５０）を用いてＰＥＧ複合体をモニターした。 反応の終了時に（天然酵素の不存在によって分かる）、混合物を１２ｍｌの調製用緩衝液（０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．８５％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．３）を用いて希釈し、セントリプレップ（Centriprep）濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いてダイアフィルトレーションを行ない、未反応のＰＥＧを除去した。ダイアフィルトレーションは、等量の濾液と０．１％のＰＭＡ（０．１Ｍ ＨＣｌ中のポリメタクリル酸）を混合しても遊離のＰＥＧが検出されなくなるまで、４℃にて、必要に応じて引き続き行なった。
【０１９０】
実施例８
ウレタン結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｈＡＤＡの調製
実施例７に記載される条件と同一の条件を用いて、ＳＣ−ＰＥＧ（０．０８４ｍｍｏｌ）をＳｅｒ74−ｒｈＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）と反応させた。
【０１９１】
実施例９
アミド結合を介した、ＰＥＧ化Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡの調製
ＳＳ−ＰＥＧ（コハク酸Ｎ−スクシンイミジル−活性化ポリエチレングリコール、０．０８４ｍｍｏｌ）を、穏やかに攪拌しながら、３ｍｌのリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．８）中Ｓｅｒ74−ｒｂＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶液を３０℃で３０分間攪拌した。ＧＰＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ＧＦ−４５０）を用いてＰＥＧ複合体をモニターした。 反応の終了時に（天然酵素の不存在によって分かる）、混合物を１２ｍｌの調製用緩衝液（０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、０．８５％の塩化ナトリウム、ｐＨ７．３）を用いて希釈し、セントリプレップ濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ社製）を用いてダイアフィルトレーションを行ない、未反応のＰＥＧを除去した。ダイアフィルトレーションは、等量の濾液と０．１％のＰＭＡ（０．１Ｍ ＨＣｌ中のポリメタクリル酸）を混合しても遊離のＰＥＧが検出されなくなるまで、４℃にて必要に応じて引き続き行なった。
【０１９２】
実施例１０
アミド結合を介した、ＰＥＧ化突然変異タンパク質ｒｈＡＤＡの調製
ＳＳ−ＰＥＧ（０．０８４ｍｍｏｌ）を、実施例９に記載された条件と同一条件を用いて、突然変異タンパク質ｒｈＡＤＡ（０．０００２７ｍｍｏｌ）と反応させた。
【配列表】
0005595904000001.app