(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性薬物を２種の界面活性剤１及び界面活性剤２で内外二重に被覆してなる薬物輸送キャリアであって、
１）水溶性薬物を含む水相と、界面活性剤１を含む油相を撹拌混合して、前記水溶性薬物を含む水相を油相中に分散させたW/Oエマルションを形成する工程、
２）前記W/Oエマルションから内水相とともに外油相を除いてから、前記水溶性薬物-界面活性剤１複合体を油相中に分散させたS/Oを形成する工程、
３）前記S/Oと、界面活性剤２を含む水相を撹拌混合して、前記S/Oを水相中に分散させたS/O/Wエマルションを形成する工程、
４）前記S/O/Wエマルションから内油相とともに外水相を除いてから、水溶性薬物-界面活性剤１-界面活性剤２複合体を水相中に分散させたS/Wを形成する工程、
によって得られることを特徴とする薬物輸送キャリア。
【請求項２】
請求項１記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記水溶性薬物はタンパク、遺伝子、オリゴ核酸、多糖類、合成高分子、ペプチド、小分子、ナノ粒子（超構造体）の何れかであることを特徴とする薬物輸送キャリア。
【請求項３】
請求項２記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記遺伝子がpDNAで、前記タンパクがEGFPであることを特徴とする薬物輸送キャリア。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記内側の界面活性剤１は、ショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステルの何れかであることを特徴する薬物輸送キャリア。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記外側の界面前活性剤２は、PC、ショ糖ラウリン酸エステル、PEG（2K）-MS、PEG（2K）-DSPE、PEG（5K）-DSPE、PEG（comb）-DSPE、Tween 80、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステルの少なくとも何れかであることを特徴とする薬物輸送キャリア。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記薬物輸送キャリアは、疎水性の分子、カチオン性高分子の少なくとも何れかを含むことを特徴とする薬物輸送キャリア。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記薬物輸送キャリアの外周をアルキル化膜透過性ペプチド、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、N-マレイミド-PEG（2K）-DSPE、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、細胞膜タンパク質結合ドメインの何れかで修飾したことを特徴とする薬物輸送キャリア。
【請求項８】
水溶性薬物を２種の界面活性剤１及び界面活性剤２で内外二重に被覆してなる薬物輸送キャリアの製造方法であって、
１）水溶性薬物を含む水相と、界面活性剤１を含む油相を撹拌混合して、前記水溶性薬物を含む水相を油相中に分散させたW/Oエマルションを形成する工程、
２）前記W/Oエマルションから内水相とともに外油相を除いてから、前記水溶性薬物-界面活性剤１複合体を油相中に分散させたS/Oを形成する工程、
３）前記S/Oと、界面活性剤２を含む水相を撹拌混合して、前記S/Oを水相中に分散させたS/O/Wエマルションを形成する工程、
４）前記S/O/Wエマルションから内油相とともに外水相を除いてから、水溶性薬物-界面活性剤１-界面活性剤２複合体を水相中に分散させたS/Wを形成する工程、
とからなることを特徴とする薬物輸送キャリアの製造方法。
【請求項９】
請求項８記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記内水相及び内油相を凍結乾燥によって取り除くことを特徴とする薬物輸送キャリアの製造方法。
【請求項１０】
請求項８または９記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記S/O/Wエマルションはグリセリン、ソルビトールトレハロースの何れかを添加または添加されていない状態で形成することを特徴とする薬物輸送キャリアの製造方法。
【請求項１１】
請求項８乃至１０の何れかに記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記S/Oを形成する工程においてS/Wエマルション内に疎水性の分子、カチオン性高分子の少なくとも何れかが含まれているようにすることを特徴とする薬物輸送キャリアの製造方法。
【請求項１２】
請求項８乃至１１の何れかに記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記S/Wを形成する工程においてS/O/Wエマルション内にアルキル化膜透過性ペプチド、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、N-マレイミド-PEG（2K）-DSPE、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、細胞膜タンパク質結合ドメインの何れかが含まれているようにすることを特徴とする薬物輸送キャリアの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子や、タンパク質等の水溶性薬物を輸送することができる薬物輸送キャリアに関し、固体分散させた水溶性薬物の周りを異なる両親媒性分子（２種の界面活性剤）で二重に覆った新規の薬物輸送キャリアとその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００９年７月９日に出願の米国の仮出願第６１／２２４，１７１号の優先権を主張し、その内容を本願発明に引用している。
一般的に水溶性薬物を輸送するキャリアとして、リポソームやWater-in-Oil-in-Water（W/O/W）エマルション等が知られているが、 薬物漏洩や粒径制御が困難であるといった問題がある。
また、バイオテクノロジーの発展に伴い、細胞内のシグナル伝達系に関与するペプチド、細胞内で生理的に重要な役割を果たすタンパク質、あるいはその発現遺伝子を標的細胞内へデリバリーするという試みが盛んに行われている。ここで細胞内へデリバリーするにはタンパク質よりもその発現遺伝子のほうが適している場合がある。その理由は、構造が単純であること（遺伝子は発現させるタンパク質が異なっても、全体の構造や性質はタンパク質程には変わらない）、細胞導入後の効能の持続性が期待できること、発現させるタンパク質に危険性や病原性があったとしてもその発現遺伝子自体には危険性は無い等である。このとき利用される遺伝子は、病変細胞で欠損しているタンパク質を発現させる目的で投与される遺伝子以外にも、カスパーゼやチミジンキナーゼ発現遺伝子のように細胞死へ誘導できる遺伝子も挙げられ、遺伝子そのものを薬として利用する試みも行われている。したがって発現効率の高い遺伝子ベクター（細胞への高い遺伝子導入性と発現性をもつ遺伝子キャリア）あるいはその制御システムの開発は、今後の医療分野発展において重要な役割を果たすと考えられる（非特許文献１）。
ここで遺伝子を単独で細胞へ投与しても、その発現効率は非常に低い。この主な原因は、プロテオグリカン等の糖鎖の存在によって細胞膜はアニオン性が高い構造であることが知られている。その一方で遺伝子の本体であるDNAもアニオン性の高分子であるということである。現在最も効率のよい遺伝子ベクターは、アデノウイルスやレトロウイルス等の遺伝子配列に、治療用の遺伝子を挿入あるいは置換して作成されるウイルスベクターである。ウイルスベクターは細胞へ自身の遺伝子を運ぶというウイルス本来の特性を利用したもので、高効率な遺伝子発現を達成できるが、その安全性や生産性を考えるとその発展には限界がある（非特許文献２）。そこで現在、非ウイルス性の遺伝子ベクター創出に関する研究が盛んに行われており、その代表例はカチオン性リポソームである。中でも既に市販されているLipofectamineやLipofectinは、多くの種類の細胞に対して、高い遺伝子導入効率を示し、利便性や再現性が高いことから現在最も主流な非ウイルス性遺伝子ベクターである（非特許文献３）。この他にもポリエチレンイミン（非特許文献４）やキトサン（非特許文献５）等のカチオン性ポリマーや、アミノ酸デンドリマー（非特許文献６）等でも遺伝子発現ができることが分かっている。以上の例は全てアニオン性の遺伝子がカチオン性の分子と複合化し、負電荷の細胞膜を突破するというコンセプトで作られているが、そのままでは血清耐性・血中安定性がなくin vivoでの利用が困難である場合や、さらなる機能化に限界がある場合が多い。また多機能性エンベロープ型ナノ構造体（Multifunctional Envelope-type Nano Device, MEND）（非特許文献７）や高分子ミセル（非特許文献８，９）等、将来的な機能化を目指してDNAを封入するカプセル状キャリアの構築を試みた例があるが、これらはいずれも遺伝子の封入にはカチオン性分子を利用しており、細胞に導入した後の遺伝子の発現制御が難しいといった欠点や、高いアニオン性をもつ物質の封入以外には応用できないといった欠点が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】I. J. van Dillen, N. H. Mulder, W. Vaalburg, E. F. de Vries, G. A. Hospers, Curr. Opin. Mol. Ther. 2, 307-322 (2002).
【非特許文献２】H. Akita, R. Ito, I.A. Khalil, S. Futaki, H Harashima, Mol Ther. 9, 443-451 (2004).
【非特許文献３】K. Kostarelos, A. D. Miller, Chem. Soc. Rev. 34, 970-994 (2005).
【非特許文献４】J. A. Hubbell, Gene Ther. 13, 1371-1372 (2006).
【非特許文献５】D. C. Liang, W. G. Liu, A.J. Zuo, S. J. Sun, N. Cheng, G. Guo, J. Y. Zhang, K. D. Yao, Int. J. Pharm. 314, 63-71 (2006).
【非特許文献６】M. Yamagata, T. Kawano, K. Shiba, T. Mori, Y. Katayama, T. Niidome, Bioorg. Med. Chem. 15, 526-532 (2007).
【非特許文献７】I. A. Khalil, K. Kogure, S. Futaki, S. Hama, H. Akita, M. Ueno, H. Kishida, M. Kudoh, Y. Mishina, K. Kataoka, M. Yamada, H. Harashima, Gene Ther. 14, 682-689 (2007).
【非特許文献８】S. Takae, K. Miyata, M. Oba, T. Ishii, N. Nishiyama, K. Itaka, Y. Yamasaki, H. Koyama, K. Kataoka, J. Am. Chem. Soc. 130, 6001-6009 (2008).
【非特許文献９】M. Oba, K. Aoyagi, K. Miyata, Y. Matsumoto, K. Itaka, N. Nishiyama, Y. Yamasaki, H. Koyama, K. Kataoka, Mol. Pharm. 5 1080-1092 (2008).
【非特許文献１０】Y. Tahara, S. Honda, N. Kamiya, H. Piao, A. Hirata, E. Hayakawa, T. Fujii, M. Goto, J. Control. Release 131, 14-18 (2008).
【非特許文献１１】N. Kanayama, S. Fukushima, N. Nishiyama, K. Itaka, W. D. Jang, K. Miyata, Y. Yamasaki, U. I. Chung, K. Kataoka, ChemMedChem 1, 439-444 (2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本願発明は、薬物漏洩等の問題がなく、粒径制御も容易で、高いアニオン性をもたない水溶性薬物以外にも広く適用可能で、遺伝子や、タンパク質等の水溶性薬物を輸送することができる薬物輸送キャリアとその製造方法を提供することを目的とするものである。
さらにまた、非ウイルス性遺伝子ベクターとして利用できる薬物輸送キャリアとその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するために、本発明者等は鋭意検討の結果、固体分散させた水溶性薬物の周りを異なる両親媒性分子で二重に覆うことで薬物漏洩等の問題がなく、粒径制御も容易で、高いアニオン性の有無に拘わらず、遺伝子や、タンパク質等の水溶性薬物を輸送することができる薬物輸送キャリアが得られることを知見した。
本発明はかかる知見に基づき成されたもので、本願発明の薬物輸送キャリアは請求項１記載の通り、水溶性薬物を２種の界面活性剤１及び界面活性剤２で内外二重に被覆してなる薬物輸送キャリアであって、
１）水溶性薬物を含む水相と、界面活性剤１を含む油相を撹拌混合して、前記水溶性薬物を含む水相を油相中に分散させたW/Oエマルションを形成する工程、
２）前記W/Oエマルションから内水相とともに外油相を除いてから、前記水溶性薬物-界面活性剤１複合体を油相中に分散させたS/Oを形成する工程、
３）前記S/Oと、界面活性剤２を含む水相を撹拌混合して、前記S/Oを水相中に分散させたS/O/Wエマルションを形成する工程、
４）前記S/O/Wエマルションから内油相とともに外水相を除いてから、水溶性薬物-界面活性剤１-界面活性剤２複合体を水相中に分散させたS/Wを形成する工程、
によって得られることを特徴とする。
また、請求項２記載の薬物輸送キャリアは、請求項１記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記水溶性薬物はタンパク、遺伝子、オリゴ核酸、多糖類、合成高分子、ペプチド、小分子、ナノ粒子（超構造体）の何れかであることを特徴とする。
また、請求項３記載の薬物輸送キャリアは、請求項２記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記遺伝子がプラスミドDNA（以下「pDNA」と称する）で、前記タンパクがEGFPであることを特徴とする。
また、請求項４記載の薬物輸送キャリアは、請求項１乃至３の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記内側の界面活性剤１は、ショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステルの何れかであることを特徴する。
また、請求項５記載の薬物輸送キャリアは、請求項１乃至４の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記外側の界面前活性剤２は、PC、ショ糖ラウリン酸エステル、PEG（2K）-MS、PEG（2K）-DSPE、PEG（5K）-DSPE、PEG（comb）-DSPE、Tween 80、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステルの少なくとも何れかであることを特徴とする。
また、請求項６記載の薬物輸送キャリアは、請求項１乃至５の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記薬物輸送キャリアは、疎水性の分子、カチオン性ポリマーの少なくとも何れかを含むことを特徴とする。
また、請求項７記載の薬物輸送キャリアは、請求項１乃至６の何れかに記載の薬物輸送キャリアにおいて、前記薬物輸送キャリアの外周をアルキル化膜透過性ペプチド、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、N-マレイミド-PEG（2K）-DSPE、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、各種細胞膜タンパク質結合ドメインの何れかで修飾したことを特徴とする。
また、本発明の薬物輸送キャリアの製造方法は、請求項８に記載の通り、水溶性薬物を２種の界面活性剤１及び界面活性剤２で内外二重に被覆してなる薬物輸送キャリアの製造方法であって、
１）水溶性薬物を含む水相と、界面活性剤１を含む油相を撹拌混合して、前記水溶性薬物を含む水相を油相中に分散させたW/Oエマルションを形成する工程、
２）前記W/Oエマルションから内水相とともに外油相を除いてから、前記水溶性薬物-界面活性剤１複合体を油相中に分散させたS/Oを形成する工程、
３）前記S/Oと、界面活性剤２を含む水相を撹拌混合して、前記S/Oを水相中に分散させたS/O/Wエマルションを形成する工程、
４）前記S/O/Wエマルションから内油相とともに外油相を除いてから、水溶性薬物-界面活性剤１-界面活性剤２複合体を水相中に分散させたS/Wを形成する工程、
とからなることを特徴とする。
また、請求項９記載の薬物輸送キャリアの製造方法は、請求項８記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記内水相及び内油相を凍結乾燥によって取り除くことを特徴とする。
また、請求項１０記載の薬物輸送キャリアの製造方法は、請求項８または９記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記S/O/Wエマルションはグリセリン、ソルビトール、トレハロースの何れかを添加または添加されていない状態で形成することを特徴とする。
また、請求項１１載の薬物輸送キャリアの製造方法は、請求項８乃至１０の何れかに記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記S/Oを形成する工程においてS/Wエマルション内に疎水性の分子、カチオン性高分子の少なくとも何れかが含まれているようにすることを特徴とする。
また、請求項１２載の薬物輸送キャリアの製造方法は、請求項８乃至１１の何れかに記載の薬物輸送キャリアの製造方法において、前記S/Wを形成する工程においてS/O/Wエマルション内にアルキル化膜透過性ペプチド、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、N-マレイミド-PEG（2K）-DSPE、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、細胞膜タンパク質結合ドメインの何れかが含まれているようにすることを特徴とする。
【０００６】
W/Oエマルションから内水相を取り除いて、キャリア内に封入した薬物を完全に固体分散させるSolid-in-Oil（S/O）化技術は、固体薬物の表面を界面活性剤によってコーティングすることで、水溶性薬物を油状基材への安定した分散を可能とする技術であるが、本発明では、前記S/O化技術の長所を活かし、別の界面活性剤によって水中にS/O製剤の溶解した油滴を分散させて得られるSolid-in-Oil-in-Water（S/O/W）エマルションから内油相を取り除き、水溶性薬物を2種類の界面活性剤によって水中に分散させるSolid-in-Water（S/W）化を利用したものである。S/Oとは界面活性剤によって水を油中に分散させたwater-in-oil（W/O）エマルションから内水相を取り除いた状態である。このS/Oの状態では、薬物はそのまわりを界面活性剤によって被覆された界面活性剤-薬物複合体（solid）の状態で油中に分散している。ここでさらに新たな界面活性剤によってS/Oを水中に分散させたものをsolid-in-oil-in-water（S/O/W）エマルションといい、S/WとはこのS/O/Wエマルションから内油相を取り除いた状態を指す。このとき中心の薬物は2種類の界面活性剤によって包まれた複合体（solid）の状態で水中に分散していると考えられる。このようにして調製されたS/Wはちょうど内水相のないリポソームのような会合体であると考えられ、水溶性薬剤の輸送キャリアとして利用でき、さらには、適切な機能性分子を封入あるいは修飾することで非ウイルス性遺伝子ベクターとして利用できるものである。【０００７】
本願発明の薬物輸送キャリアは、水溶性薬物を２種の界面活性剤１及び界面活性剤２で内外二重に被覆してなるものである。
前記水溶性薬剤は、薬理活性を有する狭義の薬剤に限定されるものでなく、蛍光タンパク等の各種標識試薬等も含まれるものである。具体的には、EGFP等の蛍光タンパク、サイトカイン、抗体、遺伝子の転写因子等の薬理活性を有するタンパク、pDNA等の遺伝子、siRNA等のオリゴ核酸、デキストランやヒアルロン酸等の多糖類、合成高分子、オクタアルギニン等のペプチド、ジクロフェナク等の小分子、金ナノロッド等のナノ粒子（または超構造体）等が挙げられる。
また、前記内側の界面活性剤１としては、ショ糖脂肪酸エステル、コレステロール、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。
また、前記外側の界面前活性剤２としては、PC、ショ糖ラウリン酸エステル（L-1695）、PEG（2K）-MS、PEG（2K）-DSPE、PEG（5K）-DSPE、PEG（comb）-DSPE、Tween 80、ドデシル硫酸ナトリウム、グリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。
また、前記薬物輸送キャリアには、DOPEやジニトロクロロベンゼン等の疎水性の分子、PEIやポリ-L-リジン等のカチオン性高分子の何れかを含ませることができる。
また、前記薬物輸送キャリアは、キャリアの外周をアルキル化膜透過性ペプチド（例えば、ステアリル化オクタアルギニンR8-str、ステアリル化テトラアルギニンR4-str等）、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、N-マレイミド-PEG（2K）-DSPE、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、これらによって修飾された抗体やサキナビル、ヒアルロン酸等の各種細胞膜タンパク質結合ドメインの何れかで修飾することができる。
本発明の薬物輸送キャリアの製造方法においては、前記内水相や内油相を取り除くには凍結乾燥によって取り除くことが好ましい。
また、前記S/O/Wエマルションはグリセリン、ソルビトールトレハロースの何れかを添加された状態で形成することが好ましい。
また、前記S/Oを形成する工程においてS/Wエマルション内にDOPEやジニトロクロロベンゼン等の疎水性の分子、PEIやポリ-L-リジン等のカチオン性高分子の少なくとも何れかが含まれているようにすれば、DOPE、PEI等を含ませた薬物輸送キャリアが簡単に得られる。
また、前記S/Wを形成する工程においてS/O/Wエマルション内にアルキル化膜透過性ペプチド（例えば、ステアリル化オクタアルギニンR8-str、ステアリル化テトラアルギニンR4-str等）、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、N-マレイミド-PEG（2K）-DSPE、N-ヒドロキシスクシンイミド-PEG（2K）-DSPE、これらによって修飾された抗体やサキナビル、ヒアルロン酸等の各種細胞膜タンパク質結合ドメインの何れかが含まれているようにすれば、その外周をR8-str、R4-str 等で修飾された薬物輸送キャリアが簡単に得られる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の薬物輸送キャリアによれば、他のドラッグキャリアと比較したときのS/Wの特徴として、(a)フィルター濾過を行う必要がない全量回収系であるため、薬物の回収性が非常に高く、(b)キャリアが固体として得られるため、最終薬物濃度の調整が可能であり、(c)エマルション調製時の有機溶媒との接触や攪拌、凍結乾燥に耐えられる薬物であれば封入でき、そして何より、(d)構成分子の自己集合力のみによって薬物を封入している他のキャリアに比べて、W/OエマルションやO/Wエマルションを用いて構成成分の空間的な位置関係を強制的に制御でき、キャリアのコア（中心）に薬物を確実に位置させることができるという効果を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】界面活性剤の細胞毒性を示すグラフ
【図２】界面活性剤の重量比の影響を示す写真
【図３】FITC-DEX封入S/Wの分散性の変化を示す写真
【図４】DOPE添加の影響を示す写真
【図５】pDNA封入S/OおよびS/Wの粒子径に関する特性図と電子顕微鏡写真
【図６】pDNA封入性を示すアガロース電気泳動写真
【図７】S/Wのゼータ電位に関するグラフ
【図８】遺伝子発現（ｎ＝２）を示すグラフ
【図９】S/Wの細胞毒性（ｎ＝３）を示すグラフ
【図１０】遺伝子の情報を示す図
【図１１】界面活性剤の構造式を示す図
【図１２】PEG修飾遺伝子の細胞活性を示すグラフ
【図１３】pDNA封入S/Wの細胞毒性と遺伝子発現性を示すグラフ
【図１４】遺伝子の情報を示す図
【図１５】界面活性剤の構造式を示す図
【図１６】アガロースゲル電気泳動を示す写真
【図１７】pDNA封入S/Wの遺伝子発現性を示すグラフ
【図１８】電気泳動を示す写真
【図１９】PEI添加したS/Wの遺伝子発現性を示すグラフ
【図２０】PEIの構造式を示す図
【図２１】アガロースゲル電気泳動を示す写真
【図２２】S/Wの粒子直径DLSを示すグラフ
【図２３】S/Wの蛍光顕微鏡写真
【実施例】
【００１０】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実験例１）
＜界面活性剤の細胞毒性＞
水に分散可能な界面活性剤２として使用できる、細胞膜構成成分であるホスファチジルコリン（PC 日本油脂）および親水性界面活性剤であるショ糖ラウリン酸エステル（L-1695）の細胞毒性試験を行った。尚、細胞毒性試験については、同仁化学社製 Cell counting Kit-8 、Promega社製 Luciferase Assay Systemを用いた。
（1）D-MEM培地（和光純薬）中で培養後のB16メラノーマ細胞数をカウントし、96穴プレートに5x103 cells/wellとなるように播種し、一晩培養した。
（2）培地を除いた後、0.10、0.50、1.0、3.0 mg/mLのPCおよびL-1695を溶解させた培地をそれぞれ100 μL/well 添加し、6 時間培養した。このとき培地のみ（controlおよびblank）のwellも用意した。
（3）（2）から6 時間後、培地を除き、WST-8 溶液（1-Methoxy-PMSを含む）を加え、2時間呈色反応を行い、 450 nmの吸光度を測定し、コントロールとの比較により、次の計算式１で細胞の生存率を測定した。
Cell viability [%]=(Abs(450 nm)sample-Abs(450 nm)blank)/(Abs(450 nm)control-Abs(450 nm)blank)x100  （計算式１）【００１１】
図１の結果から、PCの細胞毒性は全く無いことが分かり、PCを用いれば細胞毒性の低いS/W製剤が調製できるということが確認できた。また、低濃度であれば、L-1695でも細胞毒性の低いS/W製剤が調製できるということが確認できた。【００１２】
（実験例２）
＜界面活性剤の重量比の影響＞
S/Oを作成できることが分かっている界面活性剤は一般的に疎水性であり、 S/O中の界面活性剤-薬物複合体も疎水性の高い物質となるため、この疎水性の高い複合体を水中に分散させることになる。そこで、疎水性界面活性剤である ER-290（ショ糖エルカ酸エステル 三菱化学フーズ）を含むシクロヘキサンと、PCを含む水からなるO/Wエマルションを調製し、ER-290の重量を一定とし、ER-290:PCの重量比を1:0,1:1,1:2,1:3,1:4,1:5と変化させて S/W化することで、 PCによって ER-290を水中に分散可能かどうかを確かめた。
（1）10 mg/mLのER-290シクロヘキサン溶液0.50 mLと、0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mg/mLのPC水溶液5.0mLから O/Wエマルションを調製後、 凍結乾燥することで PC-ER-290複合体の固体を得た。
（2）（1）の固体に水2.0mLを加えることで、それぞれの分散性を観察した。【００１３】
図２に得られたS/Wの様子を示す。ER-290: PCの重量比が1:0や1:1の写真で、上部に浮遊している白い固体が ER-290であるが、PC の増加に伴ってこのような相分離が小さくなり、ER-290:PCの重量比が1:4を超えると均一に分散することが分かった。この結果からPCによってER-290を水に分散可能であることが示され、その分散性は PCの量に依存するということが確認できた。【００１４】
（実験例３）
＜添加剤による微粒子化＞
S/W中の粒子径を小さくするために、S/W調製時の S/O/Wエマルションの水相に、添加剤として表１に示す添加剤を加え、それぞれの分散性を観察した。
（1）100 μg/mLのFITC-DEX（分子量約 2,000,000 Sigma 社）を含む0.1 Tris-HCl・EDTA緩衝液（TE緩衝液：1.0 mM Tris-HCl,0.10 mM EDTA,pH8.0）3.0 mLと、500 μg/mLのER-290を含むシクロヘキサン溶液30 mLを、50 mLのナスフラスコ中でホモジナイザーにて攪拌し（26,000 rpm、2分間）、W/Oエマルションを調製後、凍結乾燥することで ER-290-FITC-D EX 複合体の固体を得た。
（2）（1）にシクロヘキサン3.0 mLを加え、FITC-DEX封入S/Oを得た。
（3）（2）の溶液0.50 mLと、2.5 mg/mLのPCおよび125 mg/mLの濃度の各添加剤を含む水溶液5.0 mLを、12 mLのバイアル瓶中でホモジナイザーにて攪拌し、 S/O/W エマルションを調製後、凍結乾燥することでPC-ER-290-FITC-DEX 複合体の固体を得た。
（4）（3）に0.1 TE緩衝液5.0 mLを加え、FITC-DEX封入S/Wを得た。【００１５】
【表１】
0005618307.tif 000002
【００１６】
図３の結果から等重量で加えた場合は、糖アルコールや単糖類等低分子の糖類を用いた場合に分散性が向上するということが確認された。この中でもグリセリン、ソルビトール、トレハロースは比較的、粒子径の小さな S/W が得られた。【００１７】
（実験例４）
＜DOPE添加の影響＞
S/W を遺伝子ベクターとして応用する際には、細胞中でのエンドソーム脱出のために系中に DOPEを添加する必要があるが、DOPEは疎水性の高い脂質であるため、S/W調製時の S/O/Wエマルションの油相中に加えることで ER-290-薬物複合体とともに PC で水中に分散させることを試みた。 検討はFITC-DEXを封入したS/Wで行い、このときのDOPE:PCの重量比を1:10、1:2、1:1変化させた。
（1）前記実験例３の（1）に5.0または25 mg/mLのDOPE（dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine Avanti社）を含むシクロヘキサン3.0 mLを加え、FITC-DEX封入S/Oを得た。
（2）表２に示す組成の複合体が得られるように、（1）の溶液0.50 mLと、2.5または5.0 mg/mLのPCおよび50 mg/mLのソルビトールを含む水溶液5.0 mLから、S/O/Wエマルションを調製後、凍結乾燥することで PC-(DOPE)-ER-290-FITC-D EX 複合体の固体を得た。
（3）（2）に0.1 TE緩衝液5.0 mLを加え、FITC-DEX封入S/Wを得た。【００１８】
【表２】
0005618307.tif 000003
【００１９】
図４の結果より、PCに対するDOPEの比が上昇するにしたがって、粒子径の増大が見られたが、どのサンプルでも数日後もDOPEやER-290の析出は見られなかったことから、表２の組成でDOPEを含むS/Wが調製可能であることが確認できた。【００２０】
（実験例５）
＜DNA封入 S/Wの粒子径と封入性＞
以下のようにDOPE:PCの重量比を1:1とした10 μg/mLのpDNA封入S/Wを調製し、粒子径と封入性を評価した。
（1）100 μg/mLのpDNAを含む0.1 TE緩衝液0.50 mLと、500 μg/mLのER-290を含むシクロヘキサン溶液5.0 mLを、12 mLのバイアル瓶中でホモジナイザーにて攪拌し、W/Oエマルションを調製後、凍結乾燥することで ER-290-pDNA 複合体の固体を得た。
（2）（1）に5.0 mg/mLのDOPEを含むシクロヘキサン溶液5.0 mLを加え、pDNA封入S/O（DOPE含む）を調製した。また（1）にシクロヘキサン溶液 5.0 mLを加え、動的光散乱（dynamic light scattering, DLS）測定、TEM観察にて評価した。
（3）（2）の溶液0.50 mLと、0.50 mg/mLのPCおよび50 mg/mLのソルビトールを含む水溶液5.0 mLを、12 mLのバイアル瓶中でホモジナイザーにて攪拌し、S/O/Wエマルションを調製後、凍結乾燥することで PC-(DOPE)-ER-290-pDNA 複合体の固体を得た。
（4）（3）に0.1 TE緩衝液0.50 mLを加え、pDNA封入S/Wを得た。
（5）得られたS/Wの粒子径をDLS測定、TEM観察にて評価した。
（6）得られたS/W中のpDNAの封入性を1.5%アガロースゲル電気泳動（135 V、30分、臭化エチジウム染色）によって評価した。ここで1%Triton X-100を可溶化剤として添加したものや、（1）においてpDNA濃度を0として調製し、（4）で10 μg/mLのpDNAを含む0.1 TE緩衝液を加えたもの（物理混合物）の電気泳動も行った。
【００２１】
図５の結果より、今回の調製条件ではS/OやS/Wの粒子サイズはそれぞれ約100 nm、約180 nmであることが示唆された。これをもとにS/OとS/W中の粒子の体積を概算すると、それぞれ5.2x105 nm3、3.1x106 nm3であり、体積比は約1:5.8である。つまり計算上はS/Wの1個の粒子の中には平均で5.8 個の ER-290-pDNA 複合体が存在することになる。ここで S/W調製途中の S/O/Wエマルションの油滴中には多数のER-290-pDNA複合体が存在すると考えられるため、本来であればS/Wの1個の粒子の中には5.8個以上のER-290-pDNA複合体が存在してもおかしくない。またS/Wの粒径分布はDLS測定結果からも TEM観察の結果からも単分散ではないことも分かったため、ナノ粒子としての完成度は低い。ただしR8を用いたMENDの系では、1.0 μm程度の粒子でも細胞デリバリーできるということが確認されていることから、粒径分布には幅があるものの、遺伝子ベクターとして応用するには十分なサイズであると考えられる。
さらに調製直後の S/W の溶液についてアガロースゲル電気泳動を行い pDNA の封入性を評価した。ここで強力な非イオン性界面活性剤である Triton X-100を加えて、 S/W中の全ての成分を可溶化したものや、pDNAが100 %リリースされた状態を模倣して、空のS/Wを調製後、pDNA水溶液を添加したもの（物理混合物）についても電気泳動を行った。【００２２】
図６のLane 1がpDNA封入S/Wのアガロース電気泳動結果であるが、pDNAの位置（Lane 4と同じ位置）にバンドが見られないこと、Lane 2でS/W 中の成分を全て可溶化した（ S/Wを崩壊させた）場合はpDNAの位置にバンドが出現すること、さらにLane 1の電気泳動結果は、Lane 3で空の状態のS/Wを調製してDNAを加えたものとも異なることから、pDNAがS/W中で界面活性剤と複合体を形成し、ゲルのキャスト部分付近で泳動が止まっていることが示唆された。この結果はpDNAがS/Wの複合体内部に封入されていることを支持する結果であり、カチオン性の高い物質を利用せずにDNA をキャリアに封入することに成功したといえる。【００２３】
（実験例６）
＜遺伝子ベクターへの応用＞
R8-str（ステアリル化オクタアルギニン）を修飾し、DOPE:PCの重量比を1:10、1:2、1:1としたpDNA封入S/Wを調製し、以下のような条件でB16細胞に対するルシフェラーゼ発現能の評価を行った。またDOPE:PCの重量比を1:1 とした場合に合わせて、表３に示すDOPEやR8-strを含まないコントロールサンプルとLipofectamine についても検討を行った。
（1）100 μg/mLのpDNAを含む0.1 TE緩衝液0.50 mLと、500 μg/mLのER-290を含むシクロヘキサン溶液 5.0 mLを、12 mLのバイアル瓶中でホモジナイザーにて攪拌し、W/Oエマルションを調製後、凍結乾燥することで ER-290-pDNA 複合体の固体を得た。
（2）（1）に0.50,2.5,5.0 mg/mLのDOPEを含むシクロヘキサン溶液5.0 mLを加え、pDNA封入S/O（DOPE含む）を調製した。
（3）表３の組成の複合体が調製できるように、（2）の溶液0.50 mLと、0.50 mg/mLのPC、0.11,0.15,0.20 mg/mLのR8-strおよび30,40,50 mg/mLのソルビトールを含む水溶液5.0 mLを、12mLのバイアル瓶中でホモジナイザーにて攪拌し、S/O/W エマルションを調製後、凍結乾燥することでPC-(DOPE)-ER-290-pDN A 複合体の固体を得た。
（4）（1）〜（3）においてpDNA、 DOPE、R8-strの濃度を適宜0として、表３のコントロールサンプルをそれぞれ調製した。
（5）D-MEM 培地中で培養後のB16 細胞数をカウントし、24穴プレートおよび96穴プレートに5 x103 cells/wellとなるように播種し、一晩培養した。
（6）（3）と（4）で得られた固体に血清使用量低減培地（Opti-MEM  Invitrogen）を加え、（5）のプレートにpDNAが 1.0 μg/wellとなるように播種して 3時間培養した。
またLipofectamine（Lipofectamine 2000 Invitorogen社製）による遺伝子発現を同量のpDNAを用いて行った。このとき96穴プレートにはOpti-MEMのみ（controlおよびblank）のwellも用意した。
（7）（6）から 3時間後、96穴プレートは培地を除き、WST-8 溶液（1-Methoxy-PMSを含む）を加え、2時間呈色反応を行い、450 nmの吸光度を測定し、コントロールとの比較により、前記計算式１で細胞の生存率を測定した。
（8）（6）から3時間後、24穴プレートは培地を除き、D-MEM培地を加えて培養した。
（9）（7）から2日後、培地を除き、細胞溶解液（lysis buffer：20 mM Tris-HCl,2mM  EDTA,0.05 % TritonX-100, pH 7.5） を添加し遠心後、 ルシフェリンを加え、 ルシフェラーゼ活性を測定した。 またBradford法によって細胞溶解液中のタンパク質濃度を測定し規格化した。
（10）またサンプル(c)と(g)については（3）でPC-(DOPE)-ER-290-pDNAの複合体を調製後、0.1 TE緩衝液5.0 mLを加え、ゼータ電位の測定を行った。
最後にR8-str を修飾し、DOPE : PC の重量比を1 : 10 、1:2 、1:1 としたpDNA 封入S/W のルシフェラーゼ発現能を確かめる実験を行った。またDOPE : PC の重量比を1:1 とした場合に合わせて、表３に示す各成分を含まないコントロールサンプルとLipofectamine についても検討を行った。また表３のサンプル(c)と(g)についてはゼータ電位の測定を行った。
サンプル(c)と(g)のゼータ電位測定の結果を図７に示すが、この結果より、R8-str の存在によって粒子の表面電荷がカチオン性になっていることから、S/W の表面にオクタアルギニンが修飾されたことが確認された。ここで動物細胞の培養で一般的に用いられるD-MEM 培地にはウシ胎児血清が含まれており、表面がカチオン性であるS/W は血清中のアルブミンによって凝集が起こることが懸念される。そこで遺伝子発現実験は血清低減培地（Opti-MEM ）中で行った。ただしOpti-MEM 中では半日以上の培養ができないため、サンプル投与から3 時間後にD-MEM 培地に培地交換を行った。【００２４】
【表３】
0005618307.tif 000004
【００２５】
図８の結果よりルシフェラーゼ発現はpDNA 封入S/W とLipofectamine について起こり、他のコントロールサンプルでは起こらなかった。このことは発現に必要な要素であるpDNA 、DOPE 、R8-str 等が正しくS/W 中で複合化されていないと遺伝子発現は起こらないということを示している。さらにpDNA 封入S/W においてDOPE やR8-str の添加量が増加することによって、ルシフェラーゼの発現量も増加していることや、R8-str のみ（(f)）やDOPE のみ（(g)）では発現しないことからも、R8-str によるエンドサイトーシスの誘起やDOPE によるプロトンスポンジ効果等によって、遺伝子発現が起こっていることが確認できた。
またサンプル投与から3 時間後の細胞生存率を測定した結果を図９に示す。ここで生存率はOpti-MEM で3 時間培養した細胞の生存率を100 % として計算している。この結果からオクタアルギニンを含まないサンプル(g)、(h)やLipofectamine では、サンプル自体の細胞毒性はほとんど見られなかったが、オクタアルギニンが存在するサンプル(c)〜(f)では細胞生存率は40 % 程度であった。【００２６】
上記実験例で用いたモデルプラスミドDNA（pDNA）は、動物細胞中でルシフェラーゼを発現する約7.4 kbp （分子量：300〜400 万）のpDNA で、図１０A のluc2 遺伝子を図１０B の制限酵素サイトに組み込んだ遺伝子をもとにInvitrogen にて組換え、抽出、精製されたものを使用した。尚、前記ER-290 はショ糖とエルカ酸（22 : 1）のジエステルとトリエステルの混合物であり、PCはアルキル鎖の炭素数が12〜 22 で飽和炭化水素や不飽和炭化水素の混合物であり、前記DOPE 、R8-str とともに構図式を図１１に示した。【００２７】
（実験例７）
＜ＰＥＧ修飾界面活性剤の細胞毒性＞
（1）96穴プレートに5x103cells/wellとなるようにB16細胞を播種し、一晩培養した。
（2）（1）から溶液を除き、血清培地で調製した種々の濃度のPC、PEG（2K）-MS、PEG（2K）-DSPE、PEG（5K）-DSPE、PEG（comb）-DSPEを100 mLずつ添加して1日培養した。controlやblankとして血清培地のみのwellも用意した。なお、ここで、10 % FBSと抗生物質（何れもInvitorogen社製）を含むD-MEMを“血清培地”と表記するものとする。
（3)（2）から溶液を除き、Cell counting Kit-8に付属の2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium（WST-8）および1-methoxy-5-methyl-phenazinium methylsulfate（1- methoxy-PMS）を含む血清培地溶液を加え、4時間呈色反応を行い、450 nmの吸光度を測定し、controlとの比較により、計算式１で細胞の生存率を測定した。【００２８】
図１２の結果よりPEG（2K）-DSPEとPCはどんな濃度でもほぼ毒性がないことが分かった。PEG（2K）-DSPEやPCはキャリアへの封入性の向上が期待できる界面活性剤でああり、他の界面活性剤も一定の濃度以下では毒性を示さないことが分かった。【００２９】
（実験例８）
＜ＰＥＧ修飾界面活性剤の細胞毒性と遺伝子発現＞
（１）50 μg/mLのpDNAを含む0.1xTris-HCl EDTA緩衝液（TE緩衝液 : 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）0.5 mLと、0.5 mg/mLのER-290を含むシクロヘキサン溶液5.0 mLを攪拌し、W/O エマルションを調製後、凍結乾燥することでER-290-pDNA複合体の固体を得た。
（２）（１）に4.5 mg/mL（6.0 mM）のDOPEを含むシクロヘキサン溶液2.5 mLを加え、pDNA封入S/O（DOPE含む）を調製した。
（３）（２）の溶液0.50 mLと、0.9 mg/mL（1.2 mM）のPC、2.4 mg/mL（1.2 mM）のPEG（2K）-MS、3.6 mg/mL（1.2 mM）のPEG（2K）-DSPE、7.2 mg/mL（1.2 mM）のPEG（5K）-DSPE、28.8 mg/mL（1.2 mM）のPEG（comb）-DSPEをそれぞれ含む水溶液5.0 mLを攪拌し、S/O/Wエマルションを調製後、凍結乾燥することで表４に示す計5種類のSurfactant-（DOPE）-ER-290-pDNA複合体の固体を得た。
（４）（３）に血清培地5.0 mLを加え、1.0 mg/mLのpDNAを含む表４に示す計5種類のS/Wを得た。
（５）24穴プレートに5x104 cells/wellとなるように播種し、一晩培養後、（１）の血清培地溶液を1.0 mL添加した（pDNA 1.0 μg/well）。ここでコントロールとしてpDNAを含む血清培地溶液（naked pDNA）、naked pDNAにLipofectamineを適量（N/P = 1.5）加えたもの、pDNAを含む血清低減培地（Opti-MEM）にLipofectamineを適量（N/P = 1.5）加えたものを使用した。
（６）（５）から3時間後にOpti-MEMを利用したwellは、血清培地に培地交換を行った。
（７）（５）から1日後、培地を除き、Dulbecco's phosphate buffered saline（D-PBS）で洗浄後、0.05 % TritonX-100含むTE緩衝を添加し、細胞を溶解後、遠心分離し、上清にルシフェリンを加え、ルシフェラーゼの発光量（relative light unit, RLU）を測定した。またBradford法によって上清中のタンパク質濃度を測定し規格化した。
（８）96穴プレートに5x103 cells/wellとなるように播種し、一晩培養後、（５）〜（６）の操作を同様に行い、血清培地溶液をcontrolおよびblankとして実験例７と同様の操作によってそれぞれの細胞毒性を評価した。
なお、上記ＰＥＧ修飾界面活性剤は何れも日油株式会社製のものを使用した。
【００３０】
【表４】
0005618307.tif 000005
【００３１】
実験例７の結果から界面活性剤の濃度を全ての界面活性剤で細胞毒性の無くなる1.2 mM、添加するDOPEの濃度は0.6 mMとしたキャリアをそれぞれ調製し、ルシフェラーゼアッセイによってB16細胞添加24時間後の遺伝子発現効率を評価した。図１３（A）に遺伝子発現の結果、図１３（B）に細胞毒性の結果を示す。この結果よりPEG（2K）-DSPE、PEG（5K）-DSPEで調製したS/Wにおいて遺伝子発現がみられ、さらにそれぞれの細胞毒性はほぼ無いという結果が得られた。このときの細胞の様子を観察すると、PCおよびPEG（2K）-MSでは粒子の凝集が目に見えて観察され、血清によって沈殿することで遺伝子発現が起こらなかったと考えられる。またOpti-MEM中でLipofectamineを用いる場合より遺伝子発現効果は著しく低くかったが、細胞毒性については本実験例で調製したキャリアのほうが上回っているため、B16細胞より弱い細胞での発現においてはこのキャリアは有効である可能性があることが確認された。【００３２】
上記実験例８で用いたpDNAは、図１４（A）のluc+遺伝子を図１４（B）のHind IIIからXba Iに組み込んだものを使用し、この配列のpDNAが形質転換された大腸菌を培養、抽出、精製したミツワフロンテック株式会社のものを使用した。
ここで図１５に、PEG（2K）-MS、3種類のPEG-DSPE（ステアリン酸の炭素数：18）誘導体の構造式を示した。3種類のPEG-DSPE誘導体はそれぞれ、PEG（2K）-DSPE、EG（5K）-DSPE、PEG（comb）-DSPEとそれぞれ省略する。【００３３】
（実験例９）
＜ＰＥＧ（２Ｋ）ＤＳＰＥで修飾したＳ／Ｗの封入性と遺伝子発現＞
（1）20 μg/mLのpDNAを含むBuffer #1（0.25 mM Tris-HCl, 0.025 mM EDTA, pH 8.0）2.0 mLと、1.1 mg/mLのER-290を含むシクロヘキサン溶液4.0 mLを攪拌し、W/Oエマルションを調製後、凍結乾燥することでER-290-pDNA複合体の固体を得た。
（2）（1）に7.5, 15 mg/mL（10, 20 mM）のDOPEを含むシクロヘキサン溶液2.0 mLを加え、pDNA封入S/O（DOPE含む）を調製した。
（3）（2）の溶液0.50 mLと、0.75, 1.5 mg/mL（1.0, 2.0 mM）のPCや、3.0, 6.0, 12 mg/mL（1.0, 2.0, 4.0 mM）のPEG（2K）DSPEをそれぞれ組み合わせた水溶液5.0 mLを攪拌し、S/O/Wエマルションを調製後、凍結乾燥することで表５に示す計9種類のSurfactant-（DOPE）-ER-290-pDNA複合体の固体を得た。
（4）（3）に血清培地5.0 mLを加え、2.0 mg/mLのpDNAを含む表５に示す計9種類のS/Wを得た。
（5）（3）にミリQ水5.0 mLを加え、得られたS/W中のpDNAの封入性をアガロースゲル電気泳動によって評価した。ここで1 % Triton X-100によってキャリアを崩壊させたものの電気泳動も行った。
（6）24穴プレートにB16細胞を5x104 cells/wellとなるように播種し、一晩培養後、（4）の血清培地溶液を0.5 mL/wellで添加した（pDNA 1.0 μg/well）。ここでコントロールとしてpDNAを含む血清培地溶液にLipofectamineを適量（N/P = 1.5）加えたものを使用した。
（7）（6）から1日後、培地を除き、Dulbecco's phosphate buffered saline（D-PBS）で洗浄後、0.05 % TritonX-100含むTE緩衝液を添加し、細胞を溶解後、遠心分離し、上清にルシフェリンを加え、ルシフェラーゼの発光量（relative light unit, RLU）を測定した。またBradford法によって上清中のタンパク質濃度を測定し規格化した。
（8）96穴プレートにB16細胞を5x103 cells/wellとなるように播種し、一晩培養後、（4）の血清培地溶液を100 μL/wellで添加した。ここでcontrolやblankとして血清培地のみのwellも用意した。
（9）（8）から1日後、溶液を除き、Cell counting Kit-8に付属の2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5- (2, 4-disulfo-phenyl)-2H-tetrazolium（WST-8）および1-methoxy-5-methyl-phenazinium methylsulfate（1- methoxy-PMS）を含む血清培地溶液を加え、2時間呈色反応を行い、450 nmの吸光度を測定し、controlとの比較により、計算式１で細胞の生存率を測定した。【００３４】
【表５】
0005618307.tif 000006
【００３５】
PEG（2K）DSPEがS/Wの外側の界面活性剤として適していることが示唆されたため、アガロースゲル電気泳動によってpDNAのキャリアへの封入性の評価を行った。表５の(b)、(d)（DOPE : PEG（2K）DSPE = 1 : 1、1 : 2）のサンプルについての電気泳動を行いpDNAの封入性を評価した。ここでもしキャリア中にpDNAが封入されていればNaked DNAよりも高分子量側にバンドが見られるはずである。また強力な非イオン性界面活性剤Triton X-100を加えることによってキャリアを崩壊させ、pDNAの回収性の評価も同時に行った。図１６に結果を示す。図１６（B）の結果より、PEG（2K）DSPEで調製したS/WはほとんどpDNAを封入していないということが分かった。PEG（2K）DSPEはほとんどB16細胞に対する毒性はなく可溶化能力は低いと考えられたが、アガロースゲル電気泳動結果によるとTriton X-100を添加する場合とバンドの位置にほとんど変化が見られなかった。図１６（A）で(b)と同様のモル数で界面活性剤をPCとして調製したサンプル(a)の電気泳動結果を示すが、この場合はpDNAの漏洩も見られるがゲルのキャスト部分にもpDNAが見られ、Triton X-100で崩壊させた場合とは違う泳動結果が得られたことから、キャリアへの封入性は界面活性剤の種類による影響が大きいことが分かる。そこでPCとPEG（2K）DSPEを併用したS/W（(g)）を調製すると、図１６（C）のようにほんの僅かではあるがpDNA封入が確認された。これによって封入性向上による遺伝子発現効率の向上が期待されるが同時にPCによる凝集が起こる可能性もある。
表５の全てのサンプルについて遺伝子発現実験と細胞毒性実験を行った。全てのサンプルで細胞生存率は70 〜 96 %であり、細胞毒性はほとんど見られないことが分かった。また、遺伝子発現の結果を図１７に示す。外側の界面活性剤をPCのみで調製したサンプル(a)は遺伝子発現は全く起こらなかった。細胞の様子を観察すると粒子の凝集が起こっていた。外側の界面活性剤をPEG（2K）DSPEのみで調製したサンプル(b)、(d)、(f)、(h)（DOPE : PEG（2K）DSPE = 1 : 1、1 : 2、2 : 2、2 : 4）については、遺伝子発現が確認され、このときの粒子の凝集はサンプル(f)よりは明らかに減っていた。しかしDOPEによる遺伝子発現の上昇は確認されなかった。またPCによってpDNAの封入性向上を期待して調製したサンプル(c)、(e)、(g)、(i)（DOPE : PC : PEG（2K）DSPE = 1 : 1 : 1、1 : 2 : 2、2 : 2 : 2、2 : 2 : 4）については、細胞の観察では粒子の凝集はサンプル(a)よりは明らかに減っていた。したがって粒子表面がPEGによって被覆されたことでPCによる粒子の凝集が押さえられたことが示唆される。しかしながらそれぞれの遺伝子発現はPEG（2K）DSPEのみのサンプル(b)、(d)、(f)、(h)とほとんど変化が無いことが分かった。【００３６】
（実験例１０）
＜ＰＥＩ添加Ｓ／Ｗの封入性と遺伝子発現＞
（1）1 M HClによってPEIを10 mg /mLの濃度で溶かし、この溶液に1 M Tris-HCl（pH 9.0）を適量加えpHを調整後、TE緩衝液（10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH 8.0）を適量加えることで、最終的に20 μg/mLのpDNAを含むN/P = 10のPEI-pDNA複合体溶液2.0 mLを作るための10xPEI（1.07 mM PEI, 250 mM Tris-HCl, 0.25 mM EDTA, pH 6.0）を調製した。
（2）20 μg/mLのpDNAと0.107 mMのPEIを含むBuffer #2（25 mM Tris-HCl, 0.025 mM EDTA, pH 6.0）2.0 mLと、5.5, 11 mg/mLのER-290を含むシクロヘキサン溶液4.0 mLを攪拌し、W/Oエマルションを調製後、凍結乾燥することでER-290-pDNA複合体の固体を得た。
（3）(2)に3.75, 7.5, 15 mg/mL（5, 10, 20 mM）のDOPEを含むシクロヘキサン溶液2.0 mLを加え、pDNA封入S/O（DOPE含む）を調製した。
（4）(3)の溶液0.50 mLと、12, 24 mg/mL（4.0, 8.0 mM）のPEG（2K）DSPEをそれぞれ組み合わせた水溶液5.0 mLを攪拌し、S/O/Wエマルションを調製後、凍結乾燥することで表６に示す計4種類のPEG（2K）DSPE -（DOPE）-ER-290-pDNA複合体の固体を得た。
（5）(4)に血清培地5.0 mLを加え、2.0 μg/mLのpDNAを含むS/Wを調製後、3.2.と同様の方法で遺伝子発現実験および細胞毒性実験を行った。
（6）(4)にミリQ水5.0 mLを加え、得られたS/W中のpDNAの封入性をアガロースゲル電気泳動によって評価した。ここで1 % Triton X-100によってキャリアを崩壊させたものやPVSKによってPEIをはがしたものの電気泳動も行った。【００３７】
【表６】
0005618307.tif 000007
【００３８】
血清培地中におけるS/Wの遺伝子発現においては、（1）キャリアの粒子径、（2）封入性、（3）敘放性、（4）（5）DOPEの添加量、（6）血清耐性、（7）細胞毒性を考慮し、最適な調製条件を決定する必要があると考えられる。この中でPEG（2K）DSPEを用いたS/Wで遺伝子発現効率が上がらない原因としては、キャリアへの封入性の低さが最も影響していると考えられる。そこでpDNAの漏洩にDNAの静電反発が関与していると考え、ポリカチオンを添加することでpDNAを集合させ封入性に影響するかを検討した。本実験例ではポリカチオンとして最も遺伝子発現効率が高いことで知られている直鎖型ポリエチレンイミン（PEI）を用いた。
図１８にS/W(k)の1, 6, 24時間後のサンプルと、PEIとpDNAをN/P = 10で混合したPEI-pDNA複合体のアガロース電気泳動結果を示す。ここでpDNAはPEIと複合化して電気泳動すると高分子量側にバンドが移動する。そこでポリアニオンであるPVSKを、PEIとpDNAの複合体からPEIをはがすために用いた。またPEIの濃度は全てN/P = 10として調製した。ここでN/P比とは、（PEIのN原子数）/（pDNAのP原子数）であり、N/P比が大きいほどpDNAの電気泳動結果は高分子量側にシフトする。N/P比はPEIのモノマー（分子量43）につき1個のN原子、pDNAのモノマー（A,T,G,Cのヌクレオチド1 bpの平均分子量640）につき2個のP原子として計算した。図１８（D）のN/P = 10のときのPEI-pDNA複合体の電気泳動結果から、前記N/P比ではPEI-pDNA複合体はnaked pDNAと比べて電気泳動結果はほとんど差が見られないことが分かった。さらにそれを2回凍結乾燥するとバンドがゲルのキャスト部分から動かなくなり、PVSKを加えてもpDNAのバンドが出て来ないことを確認した。詳細は不明だが、少なくともPEI-pDNA複合体にとって凍結乾燥という作業は複合体の状態に大きな影響を与えることが分かった。次に図１８（A）〜（C）のS/Wのアガロース電気泳動結果であるが、1 hから24 hと放置時間を長くするに従って特にPVSKを加えた場合にnaked pDNAとほぼ同じ位置にpDNAのバンドが現れる。またS/Wのみを電気泳動した場合を時間ごとに見てみると、徐々にpDNAのバンドが現れることが分かる。もともと今回のN/P比でPEI-pDNA複合体がほとんど高分子量シフトしないことから、24時間後でS/Wのみの場合に現れたpDNAのバンドがPEI-pDNA複合体のバンドだと解釈すれば、PEI-pDNA複合体がS/W中から徐々に漏洩している可能性は高い。またPVSKでpDNAのバンドが出現していることから、2回凍結乾燥を行ったPEI-pDNA複合体とも違う状態ができていると考えられ、遺伝子発現にも影響は少ないことが予想される。この結果は他のPEIを添加したS/W(j)、(l)、(m)でも同様の結果が得られることを確認した。【００３９】
次に、遺伝子発現実験を行った結果を図１９に示す。図１９より、S/W(k)（ER-290 : DOPE : PEG（2K）DSPE = 1 : 1 : 4）において、現時点で最高の遺伝子発現効率（48 h後で2.8 x 107［RLU/mg protein］）を達成した。これはD-MEM中でLipofectamine 2000を使用した場合に匹敵する発現効率である。また全てのサンプルで細胞生存率は70 〜 100 %であり、目立った毒性は見られなかったことから、本手法によって新しい遺伝子発現システムを構築できる可能性が示唆された。PEIを添加せずにPEG（2K）DSPE等の構成する界面活性剤は同じもので調製していたサンプル(d)については調製後すぐに漏洩していたために、48時間後に必ず遺伝子発現効率はバックグラウンドレベルに下がっていたが、48時間後でも継続的に遺伝子発現が確認された。【００４０】
pDNAは上記実験例８で用いたものと同じものを使用した。図２０に、今回用いたPEIの構造式を示した。【００４１】
（実験例１１）
＜緑色蛍光タンパク質（EGFP）の細胞内導入性を評価＞
封入するタンパク質性薬物のモデルとして、分子量約27 kDaの緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用いてS/Wを調製し、その細胞内導入性を評価した。
(1)それぞれ20,60,100,200,300 μg/ml（表7の(a)〜(e)に対応）のEGFP水溶液2.0 mlを、1.1 mg/mlのER-290シクロヘキサン溶液4.0 ml中に添加して、ホモジナイザーで高速攪拌（26,000 rpm,2 min）することでW/Oエマルションを調整した。
(2)得られた溶液を凍結乾燥することでER-290-EGFP複合体（S/O 複合体）を調製した。これにシクロヘキサン1.5 mlを添加して、EGFP含有S/Oを調整した。
(3)この溶液0.375 mlと60 mg/mlのDOPEシクロヘキサン溶液0.125 mlを、1.2 mg/mlのR4-strおよび36.4 mg/mlのソルビトール（SOR、凍結乾燥時の安定化剤10）を含む1.5 mg/mlのPC水溶液5 mlに添加し、ホモジナイザーで高速攪拌（22,000 rpm,2 min）することでS/O/W エマルションを調製した。
(4)得られた溶液を凍結乾燥することでEGFP 含有S/W 複合体を作製した。これに5 mlのMilli-Q水（実験1）または血清使用量低減培地（Opti-MEM）（実験2,3）を添加してEGFP 含有S/Wを調製した。 また、この溶液をそれぞれ2倍、4倍希釈したサンプルも用意した。【００４２】
【表７】
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【００４３】
得られたEGFP含有S/O、S/Wの状態を図２１に示す。ここでサンプル(f)とは、サンプル(e)を1日静置後の状態である。写真のように、作製したS/OではEGFPの浮遊および沈殿が生じたサンプル(e)、(f)を除いてEGFP由来の蛍光が観察されなかった。これは、EGFPが高濃度でキャリア内に封入されていることに由来する濃度消光によるものである。DLSによりS/Oの粒子径を測定したところEGFPに対するER-290量の減少とともに粒子径の増大が見られた（表８、図２２）。これは一つの粒子に占めるEGFP量が増大したためである。
また、最も多くのEGFPを封入できたサンプル(d)を用いて作製したS/Wでは若干懸濁しているもののDLS測定により粒子径を測定したところ1 μmをきる粒子を得ることに成功した（表８、図２２）。ここでS/Wでは2つのピークが観察されているがS/Oの粒子径からS/W 複合体は平均粒経325±21.8 nmのピークであると考えられ、小さいほうのピークはPCやDOPE、R4-str等の正ミセルであると考えられる。さらに、ゼータ電位の測定を行ったところζポテンシャルは35.1±1.1 mVとなり、粒子表面がかなりカチオン性に帯電していることが確認された。【００４４】
【表８】
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【００４５】
（実験例１２）
＜R4-str修飾によるEGFP含有S/Wの細胞導入性評価＞
細胞導入を高めるR4-str（ステアリル化テトラアルギニン）とエンドソーム内でプロトンスポンジ効果を示すDOPEを修飾したS/Wに対してB16細胞へのEGFP導入性を評価した。
実施例１２と同様にして、表９の組成のS/Wを調製した。但し、EGFP含有S/W 複合体に5 mlのMilli-Q水を添加することなく、血清使用量低減培地（Opti-MEM）を添加してEGFP含有S/Wを調製した。 
次に、B16メラノーマ細胞が培地中で5x105 cells/mlとなるように調製し、細胞用24穴プレートに1.0 ml/well（5x105 cells/well）ずつ添加して1晩培養した。培地を取り除いた後、PBS(-)1.0 mlで2回洗浄した。Opti-MEM1.0 mlで1回洗浄したあと、表９の組成のS/Wおよびこれを2倍、4倍希釈したものを用意してそれぞれ1.0 mlずつ加えCO2インキュベーターで2時間培養した。溶液を取り除いた後PBS(-)1.0 mlで2回洗浄し、D-MEMへと培地交換を行った。得られた細胞の状態を蛍光顕微鏡で観察し、EGFPの細胞内導入性を評価した。コントロールとしてR4-strを未修飾のものおよび未処理の細胞（non-treat）についても同様の実験を行い、R4-strの有用性を評価した。【００４６】
【表９】
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【００４７】
蛍光顕微鏡で観察した結果、希釈の有無にかかわらず全てのサンプルで同様の結果を示した。例として、2倍希釈したサンプルの蛍光顕微鏡観察結果を図２３に示す。この結果からEGFPの細胞内導入はR4-strが修飾されたS/Wのみで起こり、EGFPの細胞内導入のためにはR4-strが必要不可欠であることが確認された。この理由として細胞表面は一般的にアニオン性であることが知られており、キャリア表面をカチオン化するR4-strの影響により細胞導入が達成されたのではないかと思われる。
【図１】
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【図１１】
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【図１５】
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【図２０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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