(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備え、基板上で担体に固定された核酸を検出する核酸分析用反応デバイスであって、
基板上には規則的に突起状の微細構造体が配置されており、
各微細構造体は、第１の微細構造体と、第１の微細構造体よりも基板から突出する高さが高い複数の第２の微細構造体から構成されており、
各微細構造体において、複数の第２の微細構造体は、第１の微細構造体の周囲に設けられている、ことを特徴とする核酸分析用デバイス。
【請求項２】
微細構造体によって担体は下部が基板と接触しないように固定される請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
【請求項３】
微細構造体は格子状に配置されている請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
【請求項４】
各担体を、第１の微細構造体と該第１の微細構造体の周囲に設けられている複数の第２の微細構造体に接触するように固定することができる請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
【請求項５】
基板には、担体を補足するための官能基が導入されている請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
【請求項６】
担体が磁性材料から成る請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
【請求項７】
担体は微粒子である請求項１に記載の核酸分析用反応デバイス。
【請求項８】
担体に固定された核酸を検出するために用いられる核酸分析用反応デバイス用基板であって、基板上には規則的に突起状の微細構造体が配置されており、
各微細構造体は、第１の微細構造体と、第１の微細構造体よりも基板から突出する高さが高い複数の第２の微細構造体から構成されており、
各微細構造体において、複数の第２の微細構造体は、第１の微細構造体の周囲に設けられている、ことを特徴とする核酸分析用反応デバイス用基板。
【請求項９】
微細構造体は格子状に配置されている請求項８に記載の核酸分析用反応デバイス用基板。
【請求項１０】
第１の微細構造体と該第１の微細構造体の周囲に設けられている複数の第２の微細構造体に囲われて担体を固定することができることを特徴とする請求項９に記載の核酸分析用反応デバイス用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析装置，核酸分析反応デバイス、および核酸分析用反応デバイス用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。
【０００５】
非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担時する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
【０００６】
また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する担体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
【０００７】
さらに、非特許文献３では、基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を起こない、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。
【０００８】
以上のように、基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380.
【非特許文献２】Science 2005, VOL. 309, pp.1728-1732
【非特許文献３】Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109.
【非特許文献４】P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640
【非特許文献５】P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181
【非特許文献６】Anal.Biochem. 2003, vol. 320, pp 55-65
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、上記のようなパラレル解析法を用いても、ヒトの全ての遺伝子を解析するには数日間必要であり、さらにスループットが高い解析方法が望まれている。非特許文献１に示されているプレート上の穴の直径は４４μｍ、微粒子の直径は２２μｍである。プレート上の粒子の密度が低く、一度に解析できるＤＮＡ断片数が少ない問題がある。非特許文献２の微粒子の直径は１μｍと小さく、基板上の微粒子の密度は高い。しかしながら、微粒子が基板上にランダムに固定化されているため、近接するビーズからの蛍光を切り分けて検出するために、画素数が多い２次元センサを用いる必要がある。解析当たりのデータ数が増えるため、データ転送時間が長くなり、解析のスループットが低くなる問題がある。また、開口数ＮＡの大きな集光レンズを使う必要があり、検出装置が高価になる問題もある。ライゲーション反応を行うために複数の反応溶液を送液するが、送液時の抵抗によりビーズが基板上よりはがれてしまう問題もある。非特許文献３においても、測定対象のＤＮＡ試料断片の配置はランダムである。非特許文献２と同様にスループットが低く、検出装置が高価な問題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の発明者らは、鋭意研究の結果、少ない画素数の２次元センサで検出可能なスループットが高い核酸分析用反応デバイスを完成させた。
【００１２】
この核酸分析用反応デバイスは、基板と、基板上に流路を形成する反応チャンバーを備え、基板上で担体に固定された核酸を検出する核酸分析用反応デバイスであって、基板上には規則的に微細構造体が配置されており、微細構造体によって各担体が固定される。
【００１３】
規則的に配置された微細構造体によって、担体が固定されることにより、固定される担体を規則的に配置させることが可能となる。
【００１４】
それゆえ、画素数が少ない２次元センサを用いても隣接する担体からの蛍光を切り分けて検出することができる。従って、解析当たりのデータ数が減るため、データ転送時間が短くなり、解析のスループットを高くすることができる。さらに、開口数ＮＡの大きな集光レンズを使う必要がなく、検出装置を安価にすることができる。
【００１５】
本発明は、検出対象の核酸が固定化された担体が基板上に規則的に配列した核酸分析用反応デバイス，照射光源，２次元センサを含む検出ユニットからなる核酸分析装置であって、前記基板上に微細構造体を含むことを特徴とする。この微細構造体の配置、あるいは形状に一定の規則性を持たせることにより、担体の位置を制御することが可能となる。
【００１６】
また、担体が微粒子であれば、粒子直径が小さいため高密度で配列できるとともに、粒子形状は表面面積が大きいため微粒子上の核酸固定量を高めることができる。
【００１７】
また、担体よりも微細構造体の方が上方から見た長手方向の長さが短くすることで、微粒子を高密度に配列することができる。
【００１８】
また、前記一つ一つの微粒子が、微細構造体に囲まれた状態で存在してもよい。微粒子が固定化された基板上に試薬を含む溶液を送液する際に、送液中の担体（例えばビーズ）のはがれを、微細構造体との接触により直接、あるいは水流の制御を介して間接的に防止することができる。
【００１９】
また、微細構造体を格子状に配列することにより、２次元センサの画素サイズに合わせて、微粒子を高密度に２次元に正方配列することができる。
【００２０】
また、微粒子が磁性材料からなるで、磁力を用いて、基板上に微粒子を固定化することができる。
【発明の効果】
【００２１】
２次元センサの画素に合わせて配列させた微細構造体を用いて、検出対象のＤＮＡが固定化された微粒子を基板上に固定化する。画素数が少ない２次元センサでの検出を可能とする。検出時のデータ数を低減することで、核酸配列を高スループットに分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図２】本発明の核酸分析用反応デバイスの構成の一例を説明するための図である。
【図３】本発明の核酸分析反応デバイスの製造方法の一例を説明するための図である。
【図４】本発明の拡散分析用デバイス上における微細構造体の他のバリエーションについて説明するための図である。
【図５】本発明の拡散分析用デバイス上における微細構造体の他のバリエーションについて説明するための図である。
【図６】本発明の拡散分析用デバイス上における微細構造体の他のバリエーションについて説明するための図である。
【図７】本発明の核酸分析用反応装置の構成の一例を説明するための図である。
【図８】本発明の核酸分析用反応装置の構成の一例を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一実施形態について、図を参照して説明する。
【００２４】
〔核酸分析用反応デバイスに用いる基板及び微粒子について〕
本発明の核酸分析用反応デバイス用基板について図１を用いて説明する。基板１０１の上に微細構造体１０２を格子状に配置する（図１左上図）。基板１０１上に検出対象である核酸が固定化された微粒子（担体，ビーズとも称す）１０３を含む溶液１０４（図１右上図）を送液する。微細構造体１０２と微粒子１０３を相互作用させることで微粒子１０３を基板上に格子状に配列する（図１下図）。
【００２５】
基板１０１としては、ガラス基板，サファイア基板，シリコン基板などの無機物質からなる基板，ステンレスなどの金属からなる基板，ポリメタクリル酸メチル樹脂，ポリカーボネート樹脂，シクロオレフィン樹脂などの有機物質からなる基板を用いることができる。
【００２６】
微細構造体１０２の形状としては、円柱，円錐，三角柱，三角錐，四角柱など様々な形状を用いることができる。一般に、これら微細構造体１０２の形状や大きさは同一面内であっても製造時にばらつきが生じるものである。１つの微粒子１０３に接触する複数の微細構造体１０２の形状や大きさがばらついていても、いずれかの位置で微粒子１０３と接触することが可能なよう構造体にはテーパーがついていることが好ましい。なお、ここでのテーパーは微細構造体の基板に近い側から遠い側に向かって細くなるような傾斜という意味である。
【００２７】
微細構造体１０２の材質としては、微粒子１０３の直径以下の微細な加工ができれば特に制限はない。この様な材質と加工方法の組み合わせとしては、シリコンでのフォトリソグラフィとドライエッチングを組み合わせた加工やポリメタクリル酸メチル樹脂やシクロオレフィン樹脂でのナノインプリント加工などが上げられる。
【００２８】
微細構造体１０２と微粒子１０３は種々の結合を介して固定化される。この様な結合様式としては、疎水性結合，静電相互作用，共有結合などが用いることができる。静電相互作用であれば、微細構造体表面にアミノ基を導入することで、効率良くＤＮＡが吸着した微粒子１０３を固定化することができる。また、共有結合であれば、例えば、微粒子１０３の固定化されたＤＮＡの末端にアミノ基やスルフィド基を導入しておき、リンカー分子を介して基板１０１及び微細構造体１０２表面の官能基と反応することで強固に結合することができる。このような化学結合の利用により、洗浄などの送液時における微粒子１０３の剥離や脱落を防ぐことができる。
【００２９】
基板表面への官能基の導入に際しては、その材質を考慮したうえで適切な手法を選択する必要があるが、例えばその材質が有機樹脂であるならば、酸化処理による水酸基やカルボキシル基の導入，所望の官能基を有したモノマー分子のグラフト重合などが挙げられる。
【００３０】
リンカー分子としては、基板１０１とＤＮＡ末端の官能基の組み合わせを考えて選択せねばならないが、例えば、スルホヒドリル基，アミノ基，カルボキシル基，リン酸基，アルデヒド基等を持つ分子を用いることができる。またＤＮＡ末端の官能基以外にも微粒子表面上の官能基を利用することもできる。例えば、微粒子の表面は分散性向上のため表面にカルボキシル基を有することが多いが、このカルボキシル基と有機基板の酸化処理やグラフト重合により基板表面に生じたカルボキシル基を、ポリアミンに代表される複数のアミノ基を持った分子とカルボジイミドなどの試薬を用いて固定することができる。また、リンカーとして金属イオンを用いることもできる。例えば四価のＺｒイオンはカルボキシル基と一本鎖ＤＮＡとに相互作用を示すことが知られており、例えば有機基板表面の酸化処理、若しくはグラフト重合により表面に形成されたカルボキシル基を用い、四価Ｚｒイオンを固定し、そのＺｒイオンと一本鎖ＤＮＡの相互作用を利用して固定化することが可能である。
【００３１】
なお、このようなリンカーの利用は必須ではなく、例えば有機基板の酸化により生じたカルボキシル基と、微粒子表面上のＤＮＡ末端に導入されたアミノ基を介して、基板１０１と微粒子１０３を結合することも可能である。微粒子１０３としては、直径５ｎｍ〜１００ｎｍのものが市販されており、これらを活用することができる。微粒子を構成する材料としては、ポリスチレン、酸化鉄に代表される磁性材料，半導体微粒子などがあるが、配列に磁力が活用可能な、磁性材料が特に好ましい。
【００３２】
微細構造体１０２を基板１０１上に形成する方法としては、平滑材料が無機材料であれば半導体で既に実用化されている薄膜プロセスを活用することができる。例えば、マスクを通した蒸着・スパッタリング、あるいは蒸着・スパッタリングにより薄膜を形成した後、ドライあるいはウエットエッチングにより製造することができる。一方、基板１０１の材料がＰＭＭＡなどの有機材料であれば、ナノインプリントの様なモールド方式を用いても良い。
【００３３】
〔核酸分析用反応デバイスについて〕
本発明の核酸分析用反応デバイスの好ましい構成の一例について図２を参照して説明する。基板２０１の上に、微粒子（不図示）が格子状に配置されている領域２０２が複数搭載されている。領域２０２の間隔は、解析しようとする核酸試料，蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。複数の反応領域を基板２０１の上に設けるには、予め流路２０３を設けた反応チャンバー２０４を光透過性の基板２０１の上にかぶせることで達成できる。反応チャンバー２０４は、流路の形成には流路２０３の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体からなり、基板２０１上に貼り合わせて使用することになる。貼り合わせによって作製した核酸分析用反応デバイスは、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット２０５，反応液を送り出す分注ユニット２０６，液の流れを制御するバルブ２０７，廃液タンク２０８と共に用いることができる。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応終了時には、洗浄液が流路２０３を通じて供給され、廃液タンク２０９に収納される。
【００３４】
〔核酸分析用反応デバイス用基板の製造方法〕
核酸分析用反応デバイス用基板の製造方法を、図３を用いて説明する。シクロオレフィン樹脂（ゼオノア１０６０Ｒ、日本ゼオン社製）などの熱可塑性樹脂からなる基板５０１上にスタンパ５０２を用いて微細構造体５０３を作製する。ガラス転移温度以上に加熱した基板５０１に対してスタンパ５０２を押し付けるナノインプリント工法によって、微細構造体５０３を有した基板５０１を得る。この際、スタンパ５０２は、直接、若しくはその延長線が交差する形状の凹若しくは凸を有しており、微細構造体５０３を有した基板５０１にはマーカー５０４も同時に形成される。このマーカー５０４を作成することで、直接微細構造体５０３を観察できない低倍率の画像からでも、微細構造体５０３の配置位置や角度を推定し、最終的な微粒子の位置を推定することができる。
【００３５】
なお、図３では、微細構造体を格子状に配置させた例を説明した。しかしながら、配置方法はこれに限定されず、ＣＣＤ素子の配置に合わせる形で自由に変更することができる。例えば、ＣＣＤを構成する受光素子の配置間隔が縦方向と横方向とで異なる長方画素ＣＣＤを用いるのであれば、その受光素子の配置間隔にあわせ縦方向と横方向とで異なる間隔で微細構造を配置してもよい。また、例えば受光素子がハニカム構造のＣＣＤであればＣＣＤの配置角度から４５度傾けた正方格子状に配置させてもよい。
【００３６】
また、一定間隔で微細構造が並ぶだけでなく、たとえば一本目と二本目の間隔が短くその次の三本目との間隔が長い、そして四本目との間隔がまた短くなるような配置でもよい。
【００３７】
〔核酸分析用反応デバイス用基板の他のバリエーションについて〕
核酸分析用反応デバイスに用いる基板６０１に形成する微細構造体は、上述したものに限定されず、以下に説明するものでもよい。
【００３８】
微細構造体は、第一の微細構造体６０２と、その中心点が形成する四角形の内部に中心点を持つ第二の微細構造体６０３から成るものでもよい。この第二の微細構造体６０３は、基板６０１面からの高さが第一の微細構造体６０２に比べ低いことを特徴とする。このような第二の微細構造体６０３は、例えばアナログ型レジストであるＯＥＢＲやＺＥＰ２０００などを用い６０３の電子線描画時の照射線量を６０２に比べ少なくすることで作成できる。または、第一の微細構造体６０２を有する基板をマスタとしてスタンパを作成の上、図３のようにナノインプリント工法を用いて作成しても良い。このような高さの異なる二種類以上の微細構造体６０２，６０３を有する基板を用い微粒子６０４を基板から浮いた状態で固定することで、微粒子観察時に基板６０１からの自家蛍光の写りこみを低減することが可能となる。また、微粒子６０４下部に空間を設けることにより、反応の場である微粒子６０４の表面へ基質を均一に供給することができ、酵素反応効率の向上が可能となる。これにより、例えば後述する核酸分析方法に示すようなシーケンス反応であれば、位相のずれを防ぎ、より長い塩基長の読み取りが可能となる。また、基板面から微粒子６０４を浮かせることで、微粒子表面の洗浄の効率が向上するため短時間での洗浄時間の短縮が図れ、全体としてのスループットの向上に繋がる。また後述する核酸分析方法に示すような反応系では、前回反応サイクル時の試薬が一部残渣し次サイクルで反応する現象が起こりうるが、洗浄性を向上させることでサイクルごとの試薬残渣量を低減しデータの信頼性向上をもたらすことが可能となる。
【００３９】
なお、図４では、一番上の図が微粒子６０４を固定する前の基板６０１を示す平面図であり、上から二番目の図が微粒子６０４を固定する前の基板６０１の断面図であり、一番下の図は微粒子を配置させた後の基板６０１の断面図である。この点は、図５および図６についても同様である。
【００４０】
このような、微粒子６０４の下部に空間を設けるための構造としては、他には逆ピラミッド構造６０５（図５）やテーパーを有した四角柱構造６０６（図６）などがある。これらの構造はＳｉの異方性エッチングなどにより得ることができる。なお、逆ピラミッド構造は、基板に溝を形成することにより、作製している。
【００４１】
〔核酸分析装置について〕
本発明の核酸分析装置について図７を用いて説明する。核酸分析装置は、核酸分析用反応デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマー及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析用反応デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析用反応デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。
【００４２】
より具体的には、予め流路を設けたカバープレート３０１と溶液交換用口である注入口３０３と排出口３０４から構成される反応チャンバーに基板３０５を設置する。なお、カバープレート３０１の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）３０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）３０７から発振するレーザ光３０８および３０９をダイクロイックミラー３１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ３１２によって集光し、その後、プリズム３１３を介して基板３０５へ臨界角以上で照射する。カバープレート３０１より出射される蛍光は、対物レンズ３１４により平行光束とされ、光学フィルタ３１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ３１６により２次元ＣＣＤカメラ３１７上に結像される。
【００４３】
図７に示した核酸分析装置の変形例を図８を用いて説明する。図７に示した核酸分析装置との違いは、反応デバイスの下に温調素子４１９が設置されている点と光源４０６，４０７から生じたレーザ光を光ファイバ４１８を介して照射する点である。反応デバイスが温調素子４１９と直接接しているため、温調素子４１９と反応デバイス上の溶液温度の間の温度差を小さくすることができ、シーケンス反応の効率を高めることができる。４０６，４０７はレーザ光源で４１８の光ファイバを介してその先端の四角（開口部）から反応デバイスに向かって照射している。
【００４４】
〔核酸分析用反応デバイスと核酸分析装置を用いた核酸分析方法について〕
非特許文献２に開示されている方法に従い、測定対象のＤＮＡを断片化，増幅した後、エマルジョンＰＣＲ法を用いて測定対象のＤＮＡ断片が固定化されたビーズを作製する。続いて、非特許文献６に開示されている方法に従い、アクリルゲルを用いて本発明の核酸分析用反応デバイス上にビーズを固定化する。次に、ビーズが固定化された核酸分析用反応デバイスを図８に示した核酸分析装置に設置する。最後に、非特許文献２に開示されている方法に従い、
（１）アンカープライマーのハイブリダイゼーション
（２）蛍光プライマーのライゲーション
（３）蛍光検出
（４）アンカープライマーと蛍光プライマーの除去
（５）（１）から（４）の繰り返し
を行い、塩基配列を決定する。
【００４５】
また、本発明は前述のライゲーションによる方法以外に逐次反応方式を用いることができる。蛍光色素付きヌクレオチドとして、非特許文献４に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【００４６】
さらに、本実施例では、非特許文献５に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。上記のように、本実施例の核酸分析用反応デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，反応デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【符号の説明】
【００４７】
１０１，２０１，３０５，５０１，６０１  基板
１０２，５０３  微細構造体
１０３，６０４  微粒子
１０４  溶液
２０２  微粒子が格子状に配置されている領域
２０３  流路
２０４  反応チャンバー
２０５  温調ユニット
２０６  分注ユニット
２０７  バルブ
２０８  廃液タンク
３０１  カバープレート
３０３  注入口
３０４  排出口
３０６，３０７  ＹＡＧレーザ光源
３０８，３０９  レーザ光
３１０  ダイクロイックミラー
３１２  レンズ
３１３  プリズム
３１４  対物レンズ
３１５  光学フィルタ
３１６  結像レンズ
３１７  ２次元ＣＣＤカメラ
４１８  光ファイバ
４１９  温調素子
５０２  スタンパ
５０４  マーカー
６０２  第一の微細構造体
６０３  第二の微細構造体
６０５  逆ピラミッド構造（微細構造体）
６０６  四角柱構造（微細構造体）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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