(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ Ｉ−３８５６の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託されたSaccharomyces cerevisiae株または受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ Ｉ−３７９９の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託されたSaccharomyces cerevisiae var. boulardii株。
【請求項２】
請求項１に記載された株の培養物であるSaccharomyces cerevisiae酵母またはSaccharomyces cerevisiae var. boulardii 酵母。
【請求項３】
請求項１に記載された株の培養物であり、疼痛に対する抵抗性を高めることができるSaccharomyces cerevisiae酵母またはSaccharomyces cerevisiae var. boulardii 酵母。
【請求項４】
請求項２または３における酵母；および／または酵母抽出物、酵母細胞壁誘導体、酵母細胞壁グルカン、酵母細胞壁マンノプロテイン、脂質酵母画分、酵母核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）画分から選択される少なくとも１つの前記酵母誘導体；を含有することを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項４において、前記酵母が乾燥形態または新鮮形態であることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項５において、前記酵母が瞬間乾燥形態または活性乾燥形態であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項において、請求項２または３における酵母を１０７〜６×１０１０ＣＦＵで、含有することを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか一項において、１ｍｇ〜１０ｇの請求項２または３における酵母；および／または酵母抽出物、酵母細胞壁誘導体、酵母細胞壁グルカン、酵母細胞壁マンノプロテイン、脂質酵母画分、および酵母核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）画分から選択される少なくとも１つの前記酵母誘導体；を含有することを特徴とする組成物。
【請求項９】
ヒトおよび／または動物用の、補助食品および／またはプロバイオティックおよび／または医療食品および／または栄養補助食品および／または機能性成分および／または薬用化粧品および／または医薬有効成分を調製するための、請求項４〜８のいずれか一項における組成物の使用。
【請求項１０】
胃腸の快適性を改善するおよび／または腸内菌叢を改善することを目的とした食品組成物を調製するための、請求項４〜８のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項１１】
腸の障害、腸の機能障害または胃腸疾患を治療および／または予防することを目的とした薬剤を調製するための、請求項４〜８のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項１２】
痛覚過敏の状態によって示される腸の病変または障害を治療および／または予防することを目的とした薬剤を調製するための、請求項４〜８のいずれか一項の組成物の使用。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項において、前記酵母が乾燥形態または新鮮形態である組成物の使用。
【請求項１４】
請求項１３において、前記酵母が瞬間乾燥形態または活性乾燥形態である組成物の使用。
【請求項１５】
請求項９〜１２のいずれか一項において、１日用量で前記酵母が１０７〜６×１０１０ＣＦＵ含有される組成物の使用。
【請求項１６】
請求項９〜１２のいずれか一項において、１日用量で前記酵母および／または酵母誘導体が１ｍｇ〜１０ｇ含有される組成物の使用。
【請求項１７】
経口投与に適した形態で、請求項２または３における酵母；および／または酵母抽出物、酵母細胞壁誘導体、酵母細胞壁グルカン、酵母細胞壁マンノプロテイン、脂質酵母画分、および酵母核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）画分から選択される少なくとも１つの前記酵母誘導体；を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび／または動物の栄養と健康の分野に関する。
【０００２】
本発明は、より詳細には、新規酵母株および新規株から得られる新規酵母に関する。これらの酵母は、消化管の恒常性のためおよび／またはヒトまたは動物の消化管の障害を予防するおよび／または治療するために特に有用である。
【背景技術】
【０００３】
たとえば国際公開広報第WO 2006/021965号に記載されているように、多くの微生物に関して、ヒトの消化管への有益な適用およびそれらの栄養面での恩恵に関して、既に文献で記載されている。
【０００４】
これらの微生物は、プロバイオティックという用語で一般に表され、この用語は、このような作用によって、十分な量で投与された場合宿主に健康上の恩恵を提供することが可能な生きている微生物に対応している(joint FAO/WHO Expert Cunsultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr85, ISBN 92-5-105513-0)。
【０００５】
微生物の経口投与から生じる恩恵は、使用される微生物株に極めて大きく依存するが、同時にその投与形態にも依存する。同じ種内で、使用される株によって、認められる作用は実際非常に変動的であり、たとえば病原性株（たとえば腸管毒素原性型または腸管出血性型）とNissle 1917 株のような有益な株との両方が認められるEscherichia coli種内のように(M. de Vrese ; P. R. Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137(3 Suppl. 2), 803S-811S)、同じ種でも、ときには有益であり、ときには有害または中立的である。それゆえ現在のところ、所与の菌株に関して、その株の投与によりヒトの健康についての恩恵が与えられるかどうかを予測することは不可能であり、それどころかその可能性のある恩恵の性質またはその強さを予測することすら不可能である。
【０００６】
いくつかの株の微生物は、特に酵母および乳酸菌において、胃腸管へのある種の有益な作用に関して既に認められている。しかしながら、胃腸管への完全な有益作用を得るためには、異なる性質のいくつかの株の同時投与を必要とするが多い(I. Goktepe ; V.K. Juneja ; M. Ahmedna (eds).Probiotics in Food Safety and Human Health 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN I-57444-514-6)。
【０００７】
さらに、多数の微生物、特に乳酸菌は、プロ炎症作用を有することが認められている。このプロ炎症作用は、たとえば自己免疫疾患または免疫不全において特に有害であり、望ましくないことが実証され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開広報第WO 2006/021965号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】joint FAO/WHO Expert Cunsultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr85, ISBN 92-5-105513-0
【非特許文献２】M. de Vrese ; P. R. Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137(3 Suppl. 2), 803S-811S
【非特許文献３】I. Goktepe ; V.K. Juneja ; M. Ahmedna (eds). Probiotics in Food Safety and Human Health 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN I-57444-514-6
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
酵母および/または酵母誘導体のある種の画分(fraction)が、消化管へ有益な作用を及ぼすことに関して知られている。
【００１１】
たとえば、酵母由来のマンノプロテインは、病原体の接着を阻害するそれらの作用について記述されている。また、酵母の細胞壁はそれらの繊維作用について記述されている。しかし、Saccharomyces cerevisiae酵母には多くの株が存在しているが、それらのすべてが有益な作用または同じ作用を有するとは限らない。
【００１２】
さらに、使用される株および投与される酵母形態によっても、作用は非常に変動的であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
そこで、健康面に対して予防的におよび/または特定病変もしくは機能不全に対して治療的に、または身体的および精神的な全般的健康状態に対して有益な作用を及ぼし得る微生物の新規株を得る必要性がある。
【００１４】
本発明の態様は、それゆえ、受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５６の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託されたSaccharomyces cerevisiaeの新規株、および受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３７９９の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託されたSaccharomyces cerevisiae  var. boulardiiの新規株である。
【００１５】
本発明の態様はまた、受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５６の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された株から得られるSaccharomyces cerevisiae酵母、および受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３７９９の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された株から得られるSaccharomyces cerevisiae  var. boulardii 酵母である。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５６の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された株から得られるSaccharomyces cerevisiae酵母；および/または受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３７９９の下にCollection Nationale de Cultures de Microorganismesに寄託された株から得られるSaccharomyces cerevisiae  var. boulardii 酵母；および／または酵母抽出物、酵母細胞壁誘導体、酵母細胞壁グルカン、酵母細胞壁マンノプロテイン、酵母脂質画分、酵母核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）画分から選択される少なくとも１つのSaccharomyces cerevisiae酵母誘導体；を含有する組成物である。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、ヒトおよび／または動物用の、補助食品および／またはプロバイオティックおよび／または機能性食品および／または栄養補助食品および／または機能性成分および／または薬用化粧品および／または医薬有効成分を調製するための前記組成物の使用である。
【００１８】
さらに、本発明は、胃腸の快適性を改善することおよび／または腸内菌叢を改善することを目的とした食品組成物を調製するための、前記で定義した組成物の使用に関する。
【００１９】
本発明の態様はまた、腸の障害、腸の機能障害、または胃腸疾患を治療および／または予防することを目的とした薬剤を調製するための、前記で定義した組成物の使用である。
【００２０】
本発明の１つの態様は、痛覚過敏の状態によって示される腸の病変または障害を治療および／または予防することを目的とした薬剤を調製するための、前記で定義した組成物の使用である。
【００２１】
最後に、本発明の最後の態様は、経口投与に適した形態で、前記で定義した少なくとも１つの酵母および／または少なくとも１つの酵母誘導体を含むキットである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明による組成物は以下の利点を有する：
−特にその乾燥形態で、胃腸管へのその作用を最適化することを可能にする、胃壁を通過するときに耐えて、生存する能力；
−抗炎症作用；
−プロ炎症作用が完全に消滅しているまたは非常にわずかしかないこと；
−腸の痛みを軽減する能力、および最後に
−病原性細菌および／または胃腸管、特に小腸および結腸の侵襲性を有する細菌による接着およびコロニー形成を予防し、低減する能力。
【００２３】
この組合せの特徴を有する、そのような新規組成物は、これまで全く記述されていないかまたはまだ同定されていない。
【００２４】
前記組成物は、それゆえ、極めて興味深い。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例２において、ヒト大腸を模倣した人工消化系におけるＳｃＰｒｏ１酵母の生存量のモニタリングを示す。
【図２】図２は、実施例２において、大腸微生物叢へのＳｃＰｒｏ１酵母の作用を示す。
【図３】図３は、予防的モデルに対応する実施例５の実験１および２についてのマウス糞便中のCandida albicansの細胞数の推移を示す。
【図４】図４は、治療的モデルに対応する実施例５の実験１および２についてのマウス糞便中のCandida albicansの細胞数の推移を示す。
【図５】図５は、プレインキュベーションを伴うＳｃＰｒｏ１の量に依存したヒト腸上皮細胞へのEscherichia coli  ＡＩＥＣ  ＬＦ８２細胞の残存接着のパーセンテージを示しており、酵母細胞を腸上皮細胞と共に１時間インキュベートした。実施例６に従ってＡＩＥＣ  ＬＦ８２株による細胞の感染をＳｃＰｒｏ１酵母の存在下で実施した。
【図６】図６は、共インキュベーションを伴うＳｃＰｒｏ１酵母の量に依存したヒト腸上皮細胞へのEscherichia coli  ＡＩＥＣ  ＬＦ８２細胞の残存接着のパーセンテージを示しており、実施例６に従って、酵母細胞およびEscherichia coli細胞を腸上皮細胞と共に同時に１時間インキュベートした。
【図７】図７は、実施例４において、ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の投与後の肉眼的Ｗａｌｌａｃｅスコアによるマウス腸の炎症の強さの評価を示す。
【図８】図８は、実施例４において、ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の投与後の組織学的Ａｍｅｈｏスコアによるマウスの腸上皮の炎症の強さの評価を示す。
【図９】図９は、実施例４において、単独でまたは組合せて投与されたＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の投与後の肉眼的Ｗａｌｌａｃｅスコアによるマウス腸の炎症の強さの評価を示す。
【図１０】図１０は、実施例４において、単独でまたは組合せて投与されたＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の投与後の組織学的Ａｍｅｈｏスコアによるマウス腸上皮の炎症の強さの評価を示す。
【図１１】図１１は、実施例７において、本発明による酵母または誘導体をヒト腸上皮細胞と接触させて、１時間後および３時間後のＩＬ−１０タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図１２】図１２は、実施例７において本発明による酵母または誘導体をヒト腸上皮細胞と接触させて、１時間後および３時間後の核受容体ＰＰＡＲαをコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図１３】図１３は、実施例７において本発明による酵母および／または誘導体をヒト腸上皮細胞と接触させて、１時間後および３時間後のＩＬ−１０タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現制御を示す。
【図１４】図１４は、本発明による酵母および／または誘導体の投与後のマウス腸上皮細胞における、ＩＬ−１０タンパク質をコードする遺伝子の発現を示す（実施例４）。
【図１５】図１５は、本発明による酵母および／または誘導体の投与後のマウス腸上皮細胞における、核受容体ＰＰＡＲαをコードする遺伝子の発現を示す（実施例４）。
【図１６】図１６は、クローン病に罹患しているまたは罹患していない被験者の生検からの腸細胞を本発明による酵母および誘導体と接触させた後の、前記腸細胞による、ｐｇ／ｍｌで測定したサイトカインＩＬ−１０の分泌量を示す（実施例８）。
【図１７】図１７は、クローン病に罹患しているまたは罹患していない被験者の生検からの腸細胞を本発明による酵母および／または誘導体と接触させた後の、前記腸細胞によって分泌される、ｐｇ／ｍｌで測定したＴＮＦ−αサイトカインの量を示す（実施例８）。
【図１８】図１８は、ＳｃＰｒｏ１酵母のマンノプロテイン画分（ＥＬ  ０５およびＥＬ  ０６）への１型線毛の結合能力を測定するための試験の結果を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、酵母濃度を漸増して共インキュベーションした際のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存接着パーセンテージを示す（実施例６）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、それぞれ、酵母濃度を漸増して共インキュベーションした際のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存侵襲を示す（実施例６）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２０Ａ】図２０Ａは、それぞれ、漸増濃度のＥＬ０５酵母マンノプロテインとの共インキュベーションの間のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存接着（％）を示す（実施例６）。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、それぞれ、漸増濃度のＥＬ０５酵母マンノプロテインとの共インキュベーションの間のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存侵襲（％）を示す（実施例６）。
【図２１Ａ】図２１Ａは、それぞれ、漸増濃度の酵母とのプレインキュベーションの間のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存接着（％）を示す（実施例６）。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、それぞれ、漸増濃度の酵母とのプレインキュベーションの間のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存侵襲（％）を示す（実施例６）。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図２２Ａ】図２２Ａは、それぞれ、漸増濃度のＥＬ０５酵母マンノプロテインとのプレインキュベーションの間のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存接着（％）を示す（実施例６）。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、それぞれ、漸増濃度のＥＬ０５酵母マンノプロテインとのプレインキュベーションの間のＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の平均残存侵襲（％）を示す（実施例６）。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図２３】図２３は、漸増濃度の瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母とのプレインキュベーションの間の、ＣＨＯ−Ｋ１およびＣＨＯ−Ｋ１／ＣＥＡＣＡＭ６細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の残存接着（％）を示す（実施例６）。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図２４】図２４は、クローン病に罹患している細胞の３つの試料の腸細胞の刷子縁へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株または無線毛ＬＦ８２−δｆｉｍＨ突然変異株の接着を示す（実施例６）。
【図２５】図２５は、健常ラットでの種々の酵母に関する痛覚閾値の測定（ｍｍＨｇで測定）を示す（実施例９）。
【図２６】図２６は、内臓過敏症を有するラットでの種々の酵母に関する痛覚閾値の測定（ｍｍＨｇで測定）を示す（実施例９）。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ブタペスト条約の下で、受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３８５６の下に出願人によりCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（Institut Pasteur Paris）に寄託された株は、単に「ＳｃＰｒｏ１」と称する。
【００２７】
同じくブタペスト条約の下で、受託番号Ｎｏ．ＣＮＣＭ  Ｉ−３７９９の下に出願人によりCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（Institut Pasteur Paris）に寄託された株は、単に「ＳＣＢ１」と称する。
【００２８】
また、酵母抽出物、酵母細胞壁誘導体、酵母細胞壁グルカン、酵母細胞壁マンノプロテイン、酵母脂質画分、酵母核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）画分およびそれらの混合物から選択されるSaccharomyces cerevisiae酵母誘導体は、単に「誘導体」と称する。
【００２９】
プロバイオティックは、それらが十分な量で組み込まれた場合、伝統的な栄養効果を超えて健康、快適性および健全性に有益な作用を及ぼす生微生物を表すことが意図されている。
【００３０】
栄養食品または栄養補助食品または機能性食品または薬用化粧品により、健康のために有益な作用を有するまたは生理的機能を改善することができる成分を含有する食品が意味される。
【００３１】
補助食品により、正常な食事を完成させる目的を有する食品が意味される。補助食品は、単独でまたは少量ずつの組合せとして摂取された場合、栄養的または生理的効果を有する栄養素または他の物質の濃縮供給源である。
【００３２】
特定の栄養供給を目的とした食品（ＤＤＡＰ（特定栄養補助食品））により、小児、幼児、スポーツマンのような十分に定義された集団グループを対象とする、特定の栄養上の目標を有する食品が意味される。
【００３３】
本発明において言及する食品組成物は、補助食品またはＤＤＡＰであり得る。
【００３４】
本発明の株は、出願人により、それらの多くの利点に関して、とりわけヒト消化管、特に小腸および結腸に対して、のみならず身体全般に対して有益な作用を誘導するそれらの能力に関して同定された。
【００３５】
実際に、驚くべきことに酵母ＳｃＰｒｏ１および／またはＳＣＢ１および／または誘導体は、数多くの酵母株と異なり、抗炎症作用を誘導することができ、しかもこれはいかなるプロ炎症作用も伴わないことが認められた。
【００３６】
実際に、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、抗炎症性シグナルに関与するインターロイキンＩＬ−１０の分泌上昇を生じさせる。さらに、乳酸菌型のプロバイオティック菌の作用とは異なり、ＳｃＰｒｏ１および／またはＳＣＢ１株および／または誘導体は、プロ炎症性サイトカインＩＬ−１２の合成を誘導しない。また、ＴＮＦαおよびＩＦＮγプロ炎症性サイトカインの産生は、細菌プロバイオティックと比較して著明に低い。試験により、さらに、この酵母ＳｃＰｒｏ１のインビボでの抗炎症作用、特に大腸の炎症の半減および腸壊死の３分の１の低減が明らかにされた。
【００３７】
さらに、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、その乾燥形態で、その生存または完全性へのいかなるマイナスの影響も伴わずに胃障壁を横断することができ、そしてこの酵母は大腸環境に定住しない。
【００３８】
出願人は、初めてそして特に驚くべきことに、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体が、特にインビボでのラットモデルで、疼痛に対する抵抗性を高めることができることを明らかにした。
【００３９】
これらの有益な作用に加えて、このＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、腸における病原性微生物および／または侵襲性を有する微生物のコロニー形成および／または侵襲を阻害することができる。このような酵母の投与により、大腸における腸内細菌の減少および抗生物質に対して耐性の腸内菌叢の減少が生じる。
【００４０】
特に、Candida albicansによる腸内コロニー形成およびこの病原体によって引き起こされ、維持される炎症に対する予防および治療能力を示した。さらに、この酵母は、クローン病に罹患している患者からの回腸生検から単離されるEscherichia coli病原型の病原性株および／または侵襲性を有する株の接着力および侵襲力に対する阻害作用を有する。
【００４１】
本発明によれば、このＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、生菌形態または生存可能形態で、好ましくは経口的に投与され得る。
【００４２】
「生菌形態」または「生存状態」により、本発明では、その代謝が活性であるか、もしくは再活性化可能であるかまたは増殖することができる酵母が意味される。このような酵母は特に乾燥形態または新鮮形態の酵母である。
【００４３】
典型的には、新鮮形態の酵母は、圧搾酵母または粉砕酵母として存在する。また、水相に懸濁した酵母としても存在でき、その場合は液体酵母と称される。この場合、酵母は、好ましくはカプセル化される。カプセル化方法および種々のタイプのカプセルが当業者に周知である。
【００４４】
乾燥酵母形態の中で、瞬間乾燥形態または活性乾燥形態で存在し得る酵母が挙げられ得る。乾燥酵母により、約９０％以上、好ましくは約９２％〜９６％の乾燥物質量を有するあらゆる酵母が意味される。
【００４５】
乾燥酵母としては、冷凍または非冷凍であって、中間的な湿度を有する酵母がさらに挙げられ得る。
【００４６】
瞬間乾燥酵母（すなわちインスタント乾燥酵母）は、主として産業従事者およびパン製造販売者向けである。他の適用および販路は、食品関連システム（薬学、アルコール発酵）に基づいて可能である。この乾燥酵母の特殊性は、粉に混ぜられる前に再水和を必要としない点にある。
【００４７】
乾燥酵母は、ペースト状生成物（圧搾酵母または液体酵母）を活性なままで薄い乾燥バーミセリに変換することを可能にする、ホットエア勾配の作用による酵母の脱水によって得られる。この生成物は、ついで、安定化するために、無酸素状態に置かれる。
【００４８】
活性乾燥酵母は、その発酵力を保持するために低温で乾燥された生存状態の酵母であり、非常に長く保存できる。活性乾燥酵母は小球として存在する。
【００４９】
この酵母は、その生存能を保持しながらペースト状形態の酵母を乾燥生成物に変換することを可能にする、熱と機械的運動の共同作用による酵母の脱水から生じる。
【００５０】
選択された活性酵母は、バイオマス（生存状態の酵母細胞）の押出および流動床での乾燥によって得られる。この活性乾燥酵母、すなわち生存状態の酵母細胞の高い含量を有する乾燥酵母は、一般に０．１μｍ〜２．５ｍｍの直径および４〜８質量％の含水量を有する顆粒として存在する。
【００５１】
これらの乾燥形態は、新鮮形態と比較してより良好な胃抵抗性を提供し、本発明による酵母の有益な作用を最適化するという利点を備える。本発明によれば、本発明による酵母は、好ましくは活性乾燥酵母の形態である。
【００５２】
プロ炎症性サイトカインが炎症機構を刺激し、次にその炎症機構が、特に自己免疫疾患または免疫不全の症例において、数多くの臨床上の問題の原因となり得ることは一般に認識されている。
【００５３】
そこで、本発明による酵母は、慢性または急性にかかわらず、また下痢または便秘に関連してもよく、関連しなくともよい、腸の疾患または炎症性障害を予防および／または治療するために使用され得る。
【００５４】
最初の実施形態では、障害および疾患は下痢に関連してもよいし、関連しなくともよい。
【００５５】
第二の実施形態では、障害および疾患は下痢に関連しない。特にＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、基本的に大腸の炎症によって特徴づけられる大腸炎を予防または治療するために有用であり得る。
【００５６】
特に、この酵母は、慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）、特に潰瘍性大腸炎、出血性直腸結腸炎、セリアック病またはクローン病を予防および／または治療することに良好に適合される。
【００５７】
これらの疾患は、特に、多発炎症カスケードに関与する免疫応答の増悪によって特徴づけられる。それゆえ、プロバイオティックおよび／または医療食品および／または機能性食品および／または栄養補助食品および／または薬用化粧品で、これらの疾患を予防または治療することの範囲内で、自身によって引き起こすプロ炎症作用ができる限り弱いことが重要である。
【００５８】
本発明によるＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、それゆえ、これらの用途に特に適する。この酵母はいくつかの付加的な利点を有する。
【００５９】
第一の利点は、疼痛に対する抵抗性を高める能力を有することである。第二は、特にクローン病に関して、この酵母が特に、この疾患に罹患している患者からのE. coli病原性株および／または侵襲性を有する株の接着力および侵襲力を阻害できることである。
【００６０】
炎症性応答は、特にすべての病原性微生物の侵襲に起因し得る。
【００６１】
それゆえ、本発明によるＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、病原性微生物および／または侵襲性を有する微生物、細菌のような原核生物、または真菌のような真核生物による腸のコロニー形成に起因する胃腸障害または疾患を予防または治療するのに優れた有効性を示す。
【００６２】
胃腸障害または疾患は、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病および出血性直腸結腸炎のような腸の慢性炎症性疾患であり得る。
【００６３】
さらに、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、疼痛に対する抵抗性を高めることを可能にし、痛覚過敏の状態によって特徴づけられる腸病変または障害の予防的または治療的処置においても利点を有する。これらの病変または障害は、特に、慢性内臓痛を特徴とする機能性腸障害、慢性炎症性腸疾患（ＣＩＢＤ）または食物への不適応（食物アレルギー、食物不耐症等）であり得る。
【００６４】
ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、痛覚過敏の予防的または治療的処置に特に適合しており、特に、その形態（便秘、下痢または両者の組合せ）にかかわりなく過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、またＩＢＳの範囲に入らない慢性内臓痛［例えば、排便障害を伴わない機能性腹痛（ＦＡＰＳ：機能性腹痛）および食物不耐症およびセリアック病に関連する疼痛]の、予防的または治療的処置に特に適合される。
【００６５】
ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体またはそれを含有する何らかの組成物は、それゆえ、この種の障害もしくは疾患に対する素因もしくは感受性を有する対象者において、予防的に、または治療的に（たとえば発作の間もしくはより長期間にわたって）使用され得る。本発明の組成物および方法は、このような対象者の苦痛を軽減し、これらの障害の症状または原因を緩和し得る。
【００６６】
本発明によるこの酵母および／または誘導体が、疼痛、炎症、ならびに病原性微生物および／または侵襲性を有する微生物に対して起こす作用により、ヒトまたは動物の胃腸管では、健全性、健康および／または快適性が確実に改善する。
【００６７】
本発明による組成物は、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または、酵母抽出物、酵母細胞壁誘導体、酵母細胞壁グルカン、酵母細胞壁マンノプロテイン、酵母脂質画分、酵母核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）画分から選択されるSaccharomyces cerevisiae酵母の少なくとも１つの誘導体を、１０７〜６×１０１０ＣＦＵ、好ましくは１０８〜２×１０１０ＣＦＵ、または１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１ｇの範囲にわたる量で含有し得る。この量は、１回でまたは１日の間に数回に分けて摂取される１日量であり得る。
【００６８】
好ましくは、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、１０７〜６×１０１０ＣＦＵ（コロニー形成単位）、好ましくは１０８〜２×１０１０ＣＦＵの１日用量で治療用または非治療用として使用される。
【００６９】
酵母および／または誘導体が、生菌形態であるが非成長状態（non-viable）である場合、治療用または非治療用における有用な１日用量は、１ｍｇ〜１０ｇ、好ましくは１ｍｇ〜１ｇから成る。１日有効用量は、１回、２回、３回または４回の摂取で投与され得る。
【００７０】
本発明による酵母および／または誘導体またはそれを含有する組成物は、好ましくは経口的に投与される。前記酵母および／または誘導体またはそれを含有する組成物は、治療有効量で投与されてもよく、治療有効量とは、症状の少なくとも１つが軽減されるまたは抑制される量であることを意味する。
【００７１】
ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体は、ヒトまたは動物の食品組成物に含有されてもよく、および／または経口投与に適した賦形剤または担体と共に投与されてもよい。
【００７２】
ヒトの食品用の組成物は、液体、ペーストまたは固体であり得る。特に、前記組成物は、チーズ、バター、ヨーグルトまたはクリームのような乳製品、果汁、コンポートまたはフルーツゼリーのような果実ベースの製品、飲料または固形食料（たとえばスナック食品、ビスケット）または他の食品であり得る。この場合、組成物は、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体、ならびに食料または飲料の成分を含有する。
【００７３】
ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体はまた、医薬組成物に含有され得る。医薬組成物は経口投与に適合している。この場合、医薬組成物は、ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体ならびに医薬製剤の製造のための認可された賦形剤群から選択される適切な担体を含有する。医薬組成物は、シロップもしくはバイアルのような液体として、または錠剤、軟カプセル、顆粒（包装物）、硬カプセルまたは粉末または他の適切な生薬形態として製剤され得る。
【００７４】
ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体はさらに、特により一層完全な予防作用のために、他のプロバイオティックおよび／または他の機能性成分、特にプロバイオティック細菌と共に投与され得る。
【００７５】
一例として、乳酸杆菌属、ビフィドバクテリウム属、ペディオコッカス属、プロピオン酸菌属またはロイコノストック属の乳酸菌が挙げられ得る。
【００７６】
ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母および／または誘導体はまた、抗生物質、鎮痛薬、下痢止め薬、緩下剤およびそれらの混合物のような他の有効成分と共に投与され得る。
【実施例】
【００７７】
本発明を、ここで、以下の実施例および図面を用いて説明するが、これらは例示として提供されるものであり、いかなる意味においても限定ではない。
【００７８】
（実施例１）
［ヒト腸を模倣した人工消化環境におけるＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母の生存］
（胃腸通過の間のＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母の生存性の検討）
ＳｃＰｒｏ１酵母および／またはＳＣＢ１酵母を、ヒトの消化を模倣した人工消化環境において、特に胃腸通過の間の被験生存可能酵母の生存を調べることにより、インビボで試験し、検討した。
【００７９】
活性乾燥酵母形態のＳｃＰｒｏ１の２つの試料および活性乾燥酵母形態のＳＣＢ１の２つの試料を試験した。
【００８０】
両方の試料を、減圧下にて室温での保存期間によって区別する：６か月未満の経年化（aging）または２年間の経年化（aging）。
【００８１】
・実験条件：
文献からのデータによって確立された実験条件に従い、透析と吸収によって消化生成物を除去して、胃が空の状態の健常ヒト成人における液体食料（水）の消化を再現する、ＴＩＭ１（胃＋小腸）と呼ばれる系において消化を実施した。各々の消化を５時間にわたって実施した。すべての消化を同じ一般的操作条件下で実施した。すなわち：
温度：
温度は３７℃であった。
胃内容排出パラメータ：
胃内容排出は、以下のように表されるElashoff et al. (1982)によって定義された法則に従う：
Ｆ＝ｔ×２ｅ｛−（１／Ｔ）ｂ｝
［式中、Ｆは送達された食事画分を示し、ｔは時間であり、Ｔは食物を半分排出するための時間であり、ｂは曲線の様相を表すパラメータである。パラメータは、Ｔ＝１５分；ｂ＝１である］。回腸内容排出パラメータ：回腸内容排出は、修正Elashoffの法則
（消化の最後に排出が抑制されることを可能にするパラメータｄの導入：
Ｆｍ＝Ｆ＋ｄ＊ｔ３）
に従う。パラメータは、Ｔ＝１５０分；ｂ＝２．４；ｄ＝−１０−７（図２参照）。
ｐＨ設定値：
胃（分／ｐＨ）：０／６．０；１０／３．２；２０／２．４；４０／１．８；６０／１．６；９０／１．５；３００／１．５
十二指腸：６．４
空腸：６．９
回腸：７．２
胃液分泌：
ＨＣｌ
ペプシン
リパーゼ
腸液分泌：
小腸の３つの部分におけるＮａＨＣＯ３
十二指腸中の胆汁抽出物
十二指腸中の膵液抽出物
透析／吸収：
腸キームスの「低分子量」分子の除去を、血液透析器を用いてＴＩＭ１の２つのレベル（空腸および回腸）で実施した。腸キームスの透析は、血漿に近い組成の塩類溶液に対して継続的に実施した。透析物を透析バッグに収集した。被験酵母の生存を観測するため、消化の間に消化管の種々のレベルで試料を採取した。
【００８２】
酵母の計数は、標準的な微生物学的方法に従って実施し、１０、２０、３０および４５分目に胃で採取した試料、１時間にわたって蓄積された回腸出口で採取した試料、および最終残留物中で採取した試料に関して計数を実施した。
【００８３】
計数の方法は以下の通りであった：
【００８４】
各々の試料を速やかに滅菌生理食塩水（ＮａＣｌ  ８．５ｇ／Ｌ）中で１：１０の連続希釈に供した。次に各々の希釈溶液０．１ｍｌを、ペトリ皿に分配したゲロース培地の表面に置いて広げた（一希釈あたり皿２枚）。ペトリ皿を３５℃で４８時間インキュベートした後、「コロニー形成単位（ＣＦＵ）」の計数へと進んだ。
【００８５】
胃内での酵母の生存率および小腸を出たときの酵母の生存率を測定するため、計数の結果をＣＦＵ／ｍｌ（生データ）および最初に導入した酵母の数に対する生存状態の酵母細胞のパーセンテージとして表した。
【００８６】
以下の表は、胃において、５時間の消化後に回腸出口全体で、および５時間の消化後に系全体で各々の株について得られた理論上の生存率（１００％の生存能である場合）および実際の生存率を要約する。
【００８７】
【表１】
0005497661.tif 000002
【００８８】
・結論：
これらの結果は、実際に、ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母についての卓越した胃腸生存率を明らかにする。
【００８９】
（実施例２）
［ヒトの腸を模倣した人工消化環境におけるＳｃＰｒｏ１酵母の生存］
（大腸発酵の間のＳｃＰｒｏ１酵母の生存および腸内微生物叢へのそれらの影響の検討）
活性乾燥形態のＳｃＰｒｏ１酵母を、ヒトの消化を模倣した人工消化環境において、特に大腸発酵の間の生存可能な被験酵母の運命と環境的影響を調べることにより、インビトロで試験し、検討した。
【００９０】
大腸発酵は、菌叢を維持するための順序づけられた培地供給による連続的な発酵に関する。この培地は、主として、消化管の上部では消化されない複雑な炭水化物化合物（デンプン、ペクチン、セルロースなど）、大なり小なり加水分解されたプロチド化合物およびムチンを含む。
【００９１】
大腸培地も発酵槽から順次除去される。培地は、可溶性発酵生成物の連続的な除去を可能にする透析システムによってカバーされる。
【００９２】
短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）を分析するために透析物を収集する。培地を、特殊な発酵ガスによって創製した嫌気生活に維持し、培地は−３００ｍＶ未満の酸化還元電位を有する。最後に、ｐＨを６の設定ポイント値で制御する。
【００９３】
各々の消化は以下を含んでいた：大腸に播種した後２〜３日間の、菌叢を安定化させるための期間、少なくとも毎日生成物を添加する処置期間（少なくとも３日間）、および３日間の処置停止期間。
【００９４】
各々の実験の際に、以下のパラメータを追跡および／または記録した：
−酵母の生存能、
−種々の好気性菌および嫌気性菌集団の経過、
−主要発酵生成物（ＳＣＦＡおよびガス）の経過、
−標準的な酵素活性の検出、ならびに
−温度、ｐＨおよび酸化還元電位。
【００９５】
発酵は、セプタム付クリンプキャップによって閉じた６０ｍｌのペニシリンフラスコ中、大腸培地（培養培地プラス新鮮糞便菌叢）３０ｍｌ上で実施した。酵母試料を培地３０ｍｌに添加した。
【００９６】
大腸培地は、一方ではリン酸緩衝液中の新鮮糞便から生じる細菌懸濁液からなり、また他方では、人工大腸において大腸菌叢を培養するために使用される典型的な食物から成った。
【００９７】
試験する生成物と大腸培地とを混合した後、フラスコに栓をし、クリンプした。
【００９８】
これらの操作はすべて嫌気的フード（酸素を含まないガスの混合物）中で実施した。フラスコを２４時間、回転インキュベーター（３７℃、２００ｒｐｍ）に入れた。
【００９９】
各々の生成物について、試験を２回実施した。さらに、４つの対照フラスコ（いかなる生成物も含まない）を同じ条件下で調製した。２つのフラスコは直ちに（初期時間）処理し、２つのフラスコは試験フラスコと同様にインキュベートした。
【０１００】
２４時間後に発酵を停止し、その後フラスコを処理した。
【０１０１】
発酵ガスの生成：発酵によって生成されるガスの容積をマリオットシステム（ペニシリンフラスコに含まれる加圧ガスによって推進される水の置換に基づく測定の原理）によって測定した。次にフラスコ中に存在するガスの分析をＧＰＣ（Ｈ２、ＣＯ２、ＣＨ４、Ｏ２）によって実施した。
【０１０２】
短鎖脂肪酸の生成：大腸内容物の最初の試料採取を実施した。その後、それを凍結するかまたは培養上清のＳＣＦＡ濃度（揮発性短鎖脂肪酸）を測定するために直接処理した。この分析はＧＰＣによって実施した。探索した代謝産物は、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、カプロン酸、イソカプロン酸およびヘプタン酸であった。
【０１０３】
微生物学的分析：大腸内容物の２回目の試料採取を実施し、総嫌気性菌叢、選択的好気性−嫌気性菌叢および真菌叢を計数するために直ちに処理した（還元希釈培地での１：１０の連続希釈）。
【０１０４】
ＳｃＰｒｏ１酵母の生存に関する結果を図１に示す。この図の中で、各々の垂直の矢印はＳｃＰｒｏ１酵母の投与を指示する。
【０１０５】
ＳｃＰｒｏ１酵母は投与後３日目には良好な生存を示し、投与期間中の４日目から７日目までの間に強い死亡率を示すことが認められた。これは、この酵母が大腸環境に定着しないことを示す。
【０１０６】
微生物学的分析の結果を図２に示す。図２の結果は、ＳｃＰｒｏ１酵母の存在下での腸細菌の減少と、酵母の投与を停止した後の細菌の増加を示す。ＳｃＰｒｏ１酵母の投与期間中、抗生物質（クロラムフェニコール、ゲンタマイシン）に抵抗性の菌叢が有意に減少することも認められた。
【０１０７】
揮発性短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の生成へのＳｃＰｒｏ１酵母の作用に関する結果を以下の表に要約する（大腸培地中のｍＭで表している）。
【０１０８】
【表２】
0005497661.tif 000003
【０１０９】
処理期間中、プロピオン酸塩に比べて酢酸塩の減少が幾分認められ、これは酢酸産生微生物叢の活性低下を示唆する。
【０１１０】
その他の観測したパラメータの中で、
ガス生成（量および割合）
総糖類および単糖類の濃度（長時間安定）；ならびに
酵素活性
に対する処理の影響は認められなかった。
【０１１１】
（実施例３）
［サイトカイン産生の誘導に対するＳｃＰｒｏ１、ＳＣＢ１酵母の影響の検討］
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのサイトカインの産生の誘導に対する生存状態のＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の影響を検討した。
【０１１２】
ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母を、ヒトＰＢＭＣにおいてＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＴＮＦδサイトカインの産生を誘導するそれらの能力に関して、瞬間乾燥形態および活性乾燥形態で試験した。
【０１１３】
ヒト末梢血単核細胞の調製
Transfusion Centreにおいて健常被験者から得た新鮮ヒト血液をＰＢＳ−Ｃａ（ＧＩＢＣＯ）で２倍に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（ＧＩＢＣＯ）で精製した。２０℃で４００×ｇにて３０分間遠心分離した後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は血清中で輪層を形成した。ＰＢＭＣを慎重に吸引し、ＰＢＳ−Ｃａを使用して５０ｍｌの最終容量で懸濁し、同じ緩衝液中で３回洗浄して、２０℃で３５０×ｇにて１０分間の遠心分離工程を実施した。次に、１０％ｗ／ｖのウシ胎仔血清（５６℃で３０分間不活性化）、１％ｗ／ｖのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ）およびゲンタマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）（ＧＩＢＣＯ）で富化した完全ＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ）を使用してＰＢＭＣを再懸濁した。ＰＢＭＣを顕微鏡で計数し、２×１０６細胞／ｍｌの濃度に調整して、２４穴細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）に分配した（アリコート溶液１ｍｌ）。
【０１１４】
微生物学的製剤
一晩で生成されたLactobacillus、LactococcusおよびEscherichia coli（対照株）の培養物をｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、２×１０９ＣＦＵ／ｍｌの濃度でＰＢＳに再懸濁した。
【０１１５】
最初の実験で使用した酵母濃度は２×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。初期用量比較試験のために、２×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、２×１０８ＣＦＵ／ｍｌおよび２×１０９ＣＦＵ／ｍｌの作用を比較するため１０：１０の連続希釈を実施してうる。
【０１１６】
ヒト末梢血単核細胞のインキュベーション
これらの作業懸濁液１０μＬを、５％ＣＯ２と９５％大気から成るガス混合物中で３７℃にてインキュベートするように設定した、ＰＢＭＣを含む皿のウェルに移した。２４時間のインキュベーション後、上清を吸引し、２，０００ｒｐｍで遠心分離して（エッペンドルフモデル）、取り出し、−２０℃に保持した。
【０１１７】
対照は、グラム陽性菌（LactobacillusおよびLactococcus）、グラム陰性菌（Escherichia coli）および酵母を含まない緩衝液から成る。
【０１１８】
サイトカインの定量
サイトカインの発現レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡプレートを抗体で被覆し（一晩）、抗体をＰＢＳ／１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で飽和させた。公知の濃度のサイトカインで検量線を作成し、検出閾値は１５．６２〜２０００ｐｇ／ｍｌであった（一晩のインキュベーション）。ＴＭＢ基質（テトラメチルベンジジン、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ２）でストレプトアビジン活性を測定することによって抗サイトカインの探索および定量を実施した。市販のＰｈａｒｍｉｎｇｅｎキットを製造者からの説明に従って使用した。４つのサイトカイン：３つのプロ炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１２）および１つの抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）を選択した。
【０１１９】
結果
５名の異なるドナーに関する４つのサイトカインの応答を１／１の酵母／ＰＢＭＣ比で評価した。
【０１２０】
培養上清中の４つの分泌サイトカインの定量の結果を以下の表Ａに要約する。データは５名のドナーの定量からの平均値（Ａｖｇ）として表している。表は、平均値の標準誤差の値（Ｓｅｍ）も示す。
【０１２１】
【表３】
0005497661.tif 000004
【０１２２】
１）酵母ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１に関しては、参照細菌と異なり、ＰＢＭＣによって誘導される非常に少量の、さらには検出不能の量のＩＬ−１２の産生が認められた。
２）実質的なレベルのＩＬ−１０が両方の生存状態の酵母について認められ、ＳＣＢ１がＳｃＰｒｏ１よりも良好な成績を有することを示唆した。
３）ＩＦＮγおよびＴＮＦαに関しては、ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の作用下で分泌される量は、種々の試験したプロバイオティック細菌と比較して明らかに少ない。
【０１２３】
結論：
−ＰＢＭＣの存在下でのＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母が、プロバイオティック乳酸杆菌に関して伝統的に認められるものとは異なり、プロ炎症性サイトカインＩＬ−１２を誘導しないことは明白である。
−ＰＢＭＣの存在下でＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母は実質的なレベルのＩＬ−１０（抗炎症性）を誘導する。
−ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の存在下でのＰＢＭＣによるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの分泌量はプロバイオティック細菌の存在下での分泌量よりも明らかに少ない。
【０１２４】
（実施例４）
［マウス化学物質誘発モデル（ＴＮＢＳ）により引き起こした大腸炎に対するＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の保護作用の評価］
提案される動物モデルは現在使用されており、酵母の抗炎症作用を測定するために適合させた。
【０１２５】
６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスをこの試験において使用した。マウスを実験の１週間前に実験室条件に順化させ、水と食餌は自由に摂取させた。各々の試料を１０匹のマウスの群に関して試験した。５％（ｗ／ｖ−１）のＴＮＢＳを含む自由摂取の飲料水を７日間与えるサイクルによって大腸炎を誘発させた。ＴＮＢＳによる大腸炎の誘発の開始前の３日間およびＴＮＢＳ処置の期間中（７日間）、１日１回強制給餌によって酵母を経口投与した。
【０１２６】
２つの試験群に加えて、生理食塩水だけを使用する対照群（陰性対照）を含めた。
【０１２７】
試験したパラメータは、処置後以下のとおりである：
【０１２８】
−腸炎症の肉眼的評価（Ｗａｌｌａｃｅスコア）。充血、結腸壁の肥厚および潰瘍形成の程度のような炎症の重症度を明らかにする評価基準に依存して、０〜１０の範囲でＷａｌｌａｃｅスコアシステムに従って肉眼的病変を評価するため、各々のマウスの結腸を解剖して顕微鏡下で検査した（倍率：×５）。
【０１２９】
−炎症の組織学的評価（Ａｍｅｈｏスコア）。正確に肛門管から２ｃｍの位置で採取した結腸の切片を使用して、炎症の浸潤度、びらん、潰瘍形成または壊死の存在および病変の深さと表面突起物に依存して０〜６の範囲にわたるＡｍｅｈｏスコアに従って組織学的評価を実施した。分解および腸病変の数量化は、２名の独立したオペレーターによって実施された。
【０１３０】
−ＩＬ−１０およびＰＰＡＲαをコードする遺伝子の発現の定量。これを行うため、全ＲＮＡを、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙキット（Macherey Nagel,Hoerdt,France）を使用して結腸組織から単離した。メッセンジャーＲＮＡの定量は分光光度計を使用して実施した。２０〜５０単位のＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼＩ（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）により３７℃で３０分間処理した後、環状一本鎖ＤＮＡを合成するためにオリゴ−ＤＴプライマー（Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN, USA）を使用した。メッセンジャーＲＮＡを、インビトロでの試験のためにＳＹＢＲグリーンＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Applera, Courtaboeuf, France）および特異的ヒトオリゴヌクレオチドを使用して（以下の表Ｂ参照）、ＧｅｎｅＡｍｐ  Ａｂｉｐｒｉｓｍ  ７００装置（Applera, Courtaboeuf, France）によって定量した。検量および非検量対照（calibrated and non-calibrated controls）を各々の試験に含めた。各々の試料を３回測定した。グリーンＳＹＢＲの色強度をＡｂｉｐｒｉｓｍ  ７０００  ＳＤＳ（Applera, Courtaboeuf, France）ソフトウエアパッケージで分析した。すべての結果を、β−アクチンをコードする遺伝子に対して基準化する。
【０１３１】
【表４】
0005497661.tif 000005
【０１３２】
ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母を前述した標準的な予防モデルにおいて試験した。大腸菌を誘発する前の動物の体重の観測は、マウスに投与した酵母の製剤が非常に良好に耐容されることを示した。
【０１３３】
Ｗａｌｌａｃｅスコアによって評価した腸炎症は、陽性対照と比較してＳｃＰｒｏ１酵母（活性乾燥酵母、１ｍｇ／日）およびＳＣＢ１酵母により６０％低減した。ＳＣＢ１酵母も炎症の低減を誘導した。また、Ａｍｅｈｏスコアによって評価した腸壊死も、陽性対照と比較してＳｃＰｒｏ１酵母（瞬間乾燥酵母、１ｍｇまたは１００μｇ／日）により３分の１低減した。
【０１３４】
単独でまたは一緒に投与したＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母は、抗炎症性インターロイキンＩＬ−１０および核受容体ＰＰＡＲαをコードする遺伝子の発現のレベルを上昇させる。
【０１３５】
図７〜１０は、種々の１日用量のＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の優れた肉眼的ＷａｌｌａｃｅおよびＡｍｅｈｏスコア値を明らかに示す。
【０１３６】
１０μｇおよび１ｍｇの１日用量での、瞬間乾燥形態のＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の肉眼的Ｗａｌｌａｃｅおよび組織学的Ａｍｅｈｏスコアをそれぞれ図７および８に示した。
【０１３７】
図７および８のグラフの各々の柱の数字は以下の要素を表す：
１は、ＴＮＢＳ単独を表し、
２は、ＴＮＢＳ＋ＳｃＰｒｏ１（１ｍｇ）を表し、
３は、ＴＮＢＳ＋ＳｃＰｒｏ１（１００μｇ）を表し、
４は、ＴＮＢＳ＋ＳＣＢ１（１ｍｇ）を表し、
５は、ＴＮＢＳ＋ＳＣＢ１（１００μｇ）を表す。
【０１３８】
１００μｇ／日の用量で投与した瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母は、肉眼的および組織学的レベルで病変を有意に低減することが認められ得る。
【０１３９】
１００μｇおよび１ｍｇの１日用量で、瞬間乾燥形態または活性乾燥形態として単独でまたは組合せて摂取されたＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の肉眼的Ｗａｌｌａｃｅスコアおよび組織学的Ａｍｅｈｏスコアをそれぞれ図９および１０に示す。
【０１４０】
図１４および１５は、それぞれ、腸細胞における抗炎症性インターロイキンおよびＰＰＡＲα核受容体をコードする遺伝子の発現レベルを示す。
【０１４１】
図９、１０、１４および１５のグラフの各々の柱（ヒストグラム）の数字は以下の要素を表す：
１は、ＴＮＢＳ単独を表し、
２は、ＴＮＢＳ＋瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１（１００μｇ）を表し、
３は、ＴＮＢＳ＋活性乾燥ＳｃＰｒｏ１（１０μｇ）を表し、
４は、ＴＮＢＳ＋活性乾燥ＳＣＢ１（１００μｇ）を表し、
５は、ＴＮＢＳ＋活性乾燥ＳｃＰｒｏ１（１μｇ）を表し、
６は、ＴＮＢＳ＋活性乾燥ＳｃＰｒｏ１（１００μｇ）を表し、
７は、ＴＮＢＳ＋活性乾燥ＳｃＰｒｏ１（１００μｇ）＋ＳＣＢ１（１００μｇ）を表す。
【０１４２】
結論：
活性乾燥形態のＳｃＰｒｏ１は肉眼的レベルで病変を有意に低減すること、ならびにＳｃＰｒｏ１とＳＣＢ１の組合せにより、肉眼的および組織学的レベルの両方で相乗的抗炎症作用が存在することが認められ得る。
【０１４３】
ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１は、１００μｇの用量で、抗炎症性インターロイキンＩＬ−１０をコードする遺伝子の発現レベルをそれぞれ２．９倍および３．１倍に上昇させた。ＳｃＰｒｏ１＋ＳＣＢ１の組合せ（ヒストグラムＮｏ．７）はこの発現レベルを２．７倍に上昇させる（図１４）。
【０１４４】
ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１は、１００μｇの用量で、ＰＰＡＲα核受容体をコードする遺伝子の発現レベルをそれぞれ１．５倍および１．６倍に上昇させた。ＳｃＰｒｏ１＋ＳＣＢ１の組合せ（ヒストグラムＮｏ．７）はこの発現レベルを１．７倍に上昇させる（図１５）。
【０１４５】
（実施例５）
［化学物質誘発性炎症のマウスモデルでの腸におけるCandida albicansのコロニー形成へのＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の影響の検討］
この試験は、化学物質誘発性大腸炎のマウスモデルにおける病原性酵母Candida albicansの腸コロニー形成およびその炎症増強作用への、プロバイオティック型のＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母の投与の影響を測定することを目的とする。
【０１４６】
試験する酵母は瞬間乾燥形態である。
【０１４７】
・実験条件：
Ｂａｌｂ／ｃ株の雌性マウスは４〜６週齢である。０日目から１４日目まで、化学物質による炎症の誘発のため、動物に飲料水中１．５％のＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）を与えた。
【０１４８】
３つの実験を実施した。
【０１４９】
最初の実験では、５日目に、ＰＢＳ（リン酸緩衝液）２００μＬ中５×１０７のＳｃＰｒｏ１酵母細胞をカニューレによってマウスに強制給餌した。この操作を１９日間毎日反復した。０日目に、ＰＢＳ２００μＬ中５×１０７のC. albicans  ＳＣ５３１４株の酵母細胞をカニューレによってマウスに強制給餌した。
【０１５０】
２番目の実験では、０日目に、ＰＢＳ２００μＬ中５×１０７のC. albicans  ＳＣ５３１４株の酵母細胞をカニューレによってマウスに強制給餌した。４日後、マウスのバッチを、ＰＢＳ２００μＬ中５×１０７のＳｃＰｒｏ１酵母細胞の強制給餌に供した。この操作を１４日間毎日反復した。
【０１５１】
３番目の実験では、０日目に、ＰＢＳ２００μＬ中５×１０７のC. albicans  ＳＣ５３１４株の酵母細胞をカニューレによってマウスに強制給餌した。１時間後、マウスのバッチを、ＰＢＳ２００μＬ中５×１０７のＳｃＰｒｏ１酵母細胞の強制給餌に供した。この最後の操作を１４日間毎日反復した。
【０１５２】
動物（実験１、２および３から）を以下の点に関して毎日観測した：
−糞便の硬さ、肛門出血、体重（臨床スコア）、
−ＰＢＳ１ｍｌ中のホモジナイズした糞便１ｇの逆培養。各々１０μＬをＣａｎｄｉｄａ選択培地に播種した；３７℃で２４時間の培養後、C. albicans（青色に着色）およびS. cerevisiae（緑色に着色）のＣＦＵを計数した。
−試験の終了時に動物を犠死させた。直ちに心臓穿刺によって血液を採取し、室温で傾瀉して、遠心分離によって血清を回収し、−８０℃で保存した；結腸を採取し、４つの切片に分けて、そのうち３つを深凍結し、１つを組織学的試験のために固定液（４％ＰＦＡ）に入れた。
【０１５３】
・結果：
図３に見られるように、最初の実験（予防作用試験）では、化学物質誘発性大腸炎のこのモデルにおいて、ＤＳＳの投与は４日目からC. albicansによる腸粘膜のコロニー形成を有意に上昇させることが認められた（ＤＳＳ＋Ｃａ）。非常に興味深いことに、１９日間のＳｃＰｒｏ１プロバイオティック酵母の投与は、ＤＳＳによって誘発されるC. albicansのコロニー形成を有意に低減することが認められる。
【０１５４】
図４に示すように、２番目の実験（治療試験）では、ＳｃＰｒｏ１またはＳＣＢ１プロバイオティック酵母の投与はＤＳＳによって誘発されるコロニー形成を低減することが認められる。さらに、ＳｃＰｒｏ１酵母の作用は、１４日目にＤＳＳによる処置を停止した後も可視的である。
【０１５５】
・結論：
ＳｃＰｒｏ１酵母またはＳＣＢ１酵母の投与が、予防的条件下および治療条件下の両方で、C. albicansのコロニー形成を有意に低減することは明らかである。この保護作用は処置を停止した後も持続することに留意すべきである。
【０１５６】
（実施例６）
［クローン病に罹患している患者の回腸生検から単離されたE. coli病原性株の接着性および侵襲力に対するＳｃＰｒｏ１またはＳＣＢ１酵母または誘導体の阻害作用の検討］
生存状態の酵母ＳｃＰｒｏ１、ＳＣＢ１および誘導体の、クローン病に罹患している患者の回腸生検から単離されたE. coli病原性株の接着性および侵襲力へのその阻害作用に関して試験した。
【０１５７】
クローン病（ＣＤ）に罹患している患者の回腸生検から単離された、接着性−侵襲性E. coliの意味でＡＩＥＣと称される、E. coli株は、腸上皮細胞に接着し、侵襲することができる。
【０１５８】
クローン病に罹患している患者の慢性回腸病巣から単離されたＬＦ８２  E. coli株は、侵襲性細菌病原体のすべての特徴を有する。ＬＦ８２株の接着−侵襲表現型の特徴づけならびにE. coli、赤痢菌属およびサルモネラ属において既に決定されている侵襲の遺伝的決定基の不在により、ＡＩＥＣと称される、クローン病に関連し得るE. coliの新しい病原性群の存在が定義されるに至った。マウスまたはヒトマクロファージによる食作用後、ＡＩＥＣ  ＬＦ８２株は、宿主細胞の完全性を保存しながら、広い空胞内で生存し、増殖する。感染後、マクロファージは有意の割合のＴＮＦαを分泌する。ＡＩＥＣ株の有病率は、ＣＤに罹患している患者の回腸病巣において３６．４％である。
【０１５９】
真核細胞への細菌の接着工程は、アドヘシンと呼ばれる細菌の表面に存在するリガンドと、宿主の上皮細胞の表面で発現されるタンパク質、糖タンパク質または糖脂質性の受容体との間の特異的相互作用から生じる。細菌に関しては、１型線毛のＦｉｍＨ接着が腸上皮細胞へのＡＩＥＣ細菌の接着に関与することが示された。細菌性ＦｉｍＨアドヘシンは、マンノース残基に富み、ＣＤに罹患している患者の９０％において回腸レベルで異常に高発現される糖タンパク質であるＣＥＡＣＡＭ６腸細胞受容体（ＣＤ６６ｃまたはＮＣＡとも称される）を認識する。
【０１６０】
実験条件：
培養した腸上皮細胞へのその接着性および侵襲力に関して特徴づけられたＡＩＥＣ  ＬＦ８２株を原型株として使用した。
【０１６１】
ＡＩＥＣ  ＬＦ８２株で得られた結果を確認するため、この試験をＣＤに罹患している患者から単離された１０のＡＩＥＣ株に拡大した。
【０１６２】
マンノースとは独立した機構（Ａｆａ／Ｄｒアドヘシン）によって上皮細胞に接着するＤＡＥＣ（びまん付着性大腸菌）Ｃ１８４５  E. coli株を、陰性対照として使用する。
【０１６３】
凝集試験
生存状態のＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母を使用して、ＡＩＥＣ細菌の存在下で、またはBoudeau et al. (2001 Mol Microbiol. 39:1272-84)に述べられている手順に従ってＡＩＥＣ  ＬＦ８２株から調製した１型線毛の精製抽出物の存在下で、定量的凝集試験を実施した。規定酵母濃度および可変濃度の細菌または精製１型線毛を用いて凝集指数を決定した。
【０１６４】
凝集が認められないマンノプロテイン型の酵母画分の場合は、１型線毛の結合能力の測定をＥＬＩＳＡ手法によって実施した。
【０１６５】
これらの試験は通常マイクロプレートで実施される。酵母画分をマイクロプレート上に固定する。様々な希釈の精製１型線毛を酵母画分と接触させる。洗浄後、ウサギで得られた抗１型線毛抗体で１型線毛を検出する(Boudeau et al., 2001)。洗浄後、ペルオキシダーゼと結合した二次抗体を使用する。定量は、ペルオキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）および発色剤（テトラメチルベンジジン）の基質を用いて、４５０ナノメートルの光学密度でマイクロプレートを読み取ることによって実施される。
【０１６６】
［ＳｃＰｒｏ１またはＳＣＢ１酵母により、腸上皮細胞の表面で発現されるＣＥＡＣＡＭ６受容体とＡＩＥＣ細菌の相互作用を阻害するための試験］
使用する細胞：
インビトロ阻害試験（プレインキュベーションおよび共インキュベーション）のために、ＣＥＡＣＡＭ６受容体を強く発現する、未分化Ｔ８４腸上皮細胞を保持した。Ｔ８４細胞を、５０％Ｈａｍ−Ｆ１２（Life Technology）および熱によって脱補体化した１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）基礎培地中３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。この培地に、１％非必須アミノ酸（Life Technology）、１％グルタミン（Life Technology）、２００Ｕ／Ｌのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシン、０．２５ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢおよびＭＥＭ（最小必須培地）培地（Life Technology）用の１％のＸ−１００ビタミン混合物を添加した。細胞を４×１０５細胞／ウェル／ｍｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で４８時間インキュベートした。次にＴ８４細胞のカーペットをＰＢＳで洗浄し、その後感染培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＣＳ）１ｍｌを各々のウェルに添加した。ルリア−ベルタニブロス（ＬＢ）中３７℃でのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の一晩培養物から、ＰＢＳ中０．１のＯＤ６２０を有する細菌懸濁液を調製した。感染培地中０．１のＯＤ６２０の細菌懸濁液２５μＬを添加することにより、Ｔ８４細胞を１細胞につき１０細菌の感染多重度（ＭＯＩ）に感染させた。２４ウェルプレートを、ＣＯ２富化大気下にて３７℃で３時間インキュベートした。細菌の接着および残存侵襲が以下で述べるように達成される。
【０１６７】
ＣＥＡＣＡＭ６を発現しないＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＣＥＡＣＡＭ６を安定に発現するこれらの同じ遺伝的に修飾された細胞（ＣＨＯ−Ｋ１／ＣＥＡＣＡＭ６）による実験を行なった。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、５％ウシ胎仔細胞血清、１％Ｌ−グルタミン、２００Ｕ／Ｌのペニシリン、５０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンおよび０．２５ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢ中で培養した。ＣＨＯ−Ｋ１／ＣＥＡＣＡＭ６細胞は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、５％ウシ胎仔血清、１％Ｌ−グルタミンおよび６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン中で培養した。細胞を２×１０５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。３７℃で７〜８時間のインキュベーション後、培地を新しい培養培地と交換し、ＣＥＡＣＡＭ６の発現を誘導するために５ｍＭ酪酸ナトリウムを添加する。トランスフェクトした細胞によるＣＥＡＣＡＭ６タンパク質の発現を観測するためにウエスタンブロット法を実施した。
【０１６８】
３７℃で２０〜２４時間のインキュベーション後、細胞を漸増濃度の瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母株と共に１時間インキュベートし（プレインキュベーション実験）、次に、先にＴ８４細胞で実施した実験において使用した細菌／酵母比を観測するため、それらを２０のＭＯＩ（４×１０６細菌／ウェル）で感染させた。３７℃で３時間のインキュベーション後、以下で述べるように酵母の不在下または存在下で接着細菌を計数した。
【０１６９】
もう１つの実験は、疾病患者からの手術部分を使用した。クローン病に罹患している３名の患者の回腸生検からの腸細胞をＰＢＳ中で洗浄し、次に０、１．２５、２．５または５ｍｇ／ｍｌの瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母株の存在下に、ＤＭＥＭ培地１ｍｌ、２０％ウシ胎仔血清中で、２ｍｌのエッペンドルフ管においてプレインキュベートした。管を３７℃で１５分間、回転による撹拌下に置き、その後腸細胞を、酵母の存在下でＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の一晩ＬＢ培養物５０μＬに感染させた。撹拌しながら３時間のインキュベーションを実施した。腸細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、次にスライドガラスと薄板の間に置いて、位相差顕微鏡で観察した。腸細胞の刷子縁に付着している細菌の計数を酵母の存在下または不在下で実施した。ＣＥＡＣＡＭ６受容体における１型線毛の認識を利用しないＡＩＥＣ細菌の基礎接着レベルを測定するため、無線毛突然変異型ＬＦ８２−δｆｉｍＨに関しても実験を行った。また、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の存在下で接着阻害実験を実施した。
【０１７０】
腸上皮細胞Ｔ８４への細菌の接着および残存侵襲を測定するために使用した手順
細胞カーペットをＰＢＳ１ｍｌで４回洗浄し、次に蒸留水中の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ５００μＬと共に室温で５分間インキュベートすることによって細胞を溶解した。溶解産物を希釈し、その後、接着細菌数に対応するＣＦＵの数を測定するため、ＬＢ−寒天ゲロースに塗布した。
【０１７１】
侵襲性細菌を計数するため、３時間の感染後に細胞カーペットをＰＢＳで洗浄し、次に、細胞外細菌を破壊するため、１００μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む感染培地１ｍｌと共に１時間インキュベートした。細胞を溶解し、連続希釈して、ＬＢ−寒天ゲロースに塗布した後、侵襲性細菌を計数した。
【０１７２】
ＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着および侵襲レベルを、酵母または酵母誘導体による処理に供していないＡＩＥＣ  ＬＦ８２株に感染させた細胞と比較して分析した。
【０１７３】
すべての結果をＲ比によって表している：
Ｒ＝ＳｃＰｒｏ１酵母の存在下での接着または侵襲性細菌の数／処理していない接着または侵襲性細菌の数。
【０１７４】
手順１：共インキュベーションモデル
接着および侵襲試験において、Ｔ８４細胞および細菌懸濁液を前述したように調製した。酵母または酵母誘導体を定められた濃度でＰＢＳに懸濁し、次にこの懸濁液２５μＬをＴ８４細胞の感染培地（１ｍｌ）に添加した。その後直ちに細胞をＭＯＩ＝１０で細菌株に感染させた。細胞の存在下で、細菌／インキュベートした酵母の懸濁液をホモジナイズし、２４ウェルプレートを３７℃で３時間インキュベートした。細菌株の接着および侵襲レベルを、感染の間に酵母または酵母抽出物の不在下と存在下で前述したように測定した。酵母の不在下での細菌接着または侵襲レベル（１００％）と酵母の存在下での細菌接着または侵襲レベルとの比率は、細菌の残存接着および侵襲レベルを示す。
【０１７５】
手順２：プレインキュベーションモデル
接着および侵襲試験において、Ｔ８４細胞および細菌懸濁液を前述したように調製した。酵母または酵母誘導体の懸濁液を２５μＬの容量でＴ８４細胞の感染培地（１ｍｌ）に添加した。酵母懸濁液をホモジナイズし、細胞の２４ウェルプレートを３７℃で１時間インキュベートした。このインキュベーション後、酵母の存在下で、Ｔ８４細胞をＭＯＩ＝１０で細菌株に感染させ、これを３７℃で３時間実施した。酵母の不在下での接着または侵襲を１００％として、残存接着または侵襲パーセンテージを測定するため、酵母の存在下または不在下で接着および侵襲性細菌の計数を前述したように実施した。
【０１７６】
−ＣＥＡＣＡＭ６の発現の確認
ＣＥＡＣＡＭ６の存在を確認し、発現量を評価するため、培養細胞の各々のバッチに関して免疫細胞化学的標識化を実施した。細胞を滅菌ガラス薄板上で培養した。細胞カーペットをＰＢＳで洗浄し、次にｐＨ７．４の３％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した。細胞を、ＰＢＳ−５％ウマ血清で１／１００に希釈した抗ＣＥＡＣＡＭ６モノクローナル抗体（クローン９Ａ７、Ｇｅｎｏｖａｃ）と共に湿潤雰囲気中で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を、ＰＢＳ−５％ウマ血清で１／５００に希釈した蛍光色素（ＦＩＴＣ−抗マウス、Ｚｙｍｅｄ）結合二次抗体と、湿潤雰囲気中で１時間接触させた。ガラス薄板をＭｏｅｗｉｏｌでスライドガラス上に固定し、蛍光顕微鏡で観察した。
【０１７７】
−細胞傷害性の不在の確認
種々の用量の酵母によって誘導される細胞傷害性が存在しないことを、酵母／細胞またはＦＤＬ／細胞インキュベーション培地に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を添加することによって試験した(Glasser et al., 2001)。
【０１７８】
結果：
ＬＦ８２に関する凝集試験
培養ＳｃＰｒｏ１もしくはＳＣＢ１酵母（＝新鮮形態）または乾燥形態（瞬間乾燥もしくは凍結乾燥形態）の前記酵母の存在下でＬＦ８２に関して得られた凝集力価を以下の表に要約しており、これは３〜５回の独立した実験の結果である：
【０１７９】
【表５】
0005497661.tif 000006
【０１８０】
確実に、乾燥酵母、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１および瞬間乾燥ＳＣＢ１により、ＬＦ８２株に関する良好な凝集結果が得られる。
【０１８１】
これらの酵母に関して、方法、特に乾燥方法の、その凝集能に対する良好な影響の有意性が示された。
【０１８２】
精製線毛に関する凝集試験
培養ＳｃＰｒｏ１酵母（＝新鮮形態）または瞬間乾燥形態のＳｃＰｒｏ１酵母および（乾燥）ＳＣＢ１酵母の存在下で精製線毛に関して得られた凝集力価を以下の表に要約する：
【０１８３】
【表６】
0005497661.tif 000007
【０１８４】
この実験は、線毛−酵母相互作用が実際上凝集のために必要であることを確認する。線毛はマンノース構造を認識する性質を有するため、後者は、酵母上で認識され、観察された凝集現象に関与する構造である。最も良好な結果は、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母で得られる。
【０１８５】
ＳｃＰｒｏ１酵母のマンノプロテイン画分への１型線毛の結合能力を測定するための試験の結果
図１８は、ＡＩＥＣ  ＬＦ８２株からの精製１型線毛が酵母マンノプロテインに特異的に結合することを明らかに示す。これらのマンノプロテイン（ＥＬ０５およびＥＬ０６）の調製方法（熱的または酵素的方法）が、線毛の親和性定数にわずかに影響を及ぼすことが認められる。
【０１８６】
上皮細胞の表面で発現されるＣＥＡＣＡＭ６受容体とＡＩＥＣ細菌との相互作用の阻害の結果
（１）共インキュベーションモデルにおいてＴ８４腸上皮細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着および侵襲を阻害する能力についての酵母または酵母抽出物の試料のスクリーニングの結果
瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母（３．０９×１０７酵母／ｍｇ）、乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母（１．８６×１０７酵母／ｍｇ）および瞬間乾燥ＳＣＢ１酵母（５．８３×１０７酵母／ｍｇ）ならびにＥＬ０５酵母のマンノプロテイン（乾燥形態）を検討した。
【０１８７】
比較として、Ｕｌｔｒａ−ｌｅｖｕｒｅ（登録商標）（Ｂｉｏｃｏｄｅｘ、２．０５４×１０７酵母／ｍｇ）を追加した。
【０１８８】
共インキュベーションモデルにおいて同じ数の酵母を用いた酵母の阻害力の比較
ＰＢＳで洗浄し、７，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、酵母試料をＰＢＳ中４×１０８酵母／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＰＢＳ中での酵母の希釈は、１／２、１／１０、１／２０および１／１００で実施した。
【０１８９】
３つの独立した実験を、手順１を用いて実施した。図１９Ａおよび１９Ｂの結果（残存接着および残存侵襲）は、残存接着率および残存侵襲率の平均値として示しており、誤差バーは平均値の標準誤差に相当する。
【０１９０】
図１９Ａおよび１９Ｂは、以下の結果が得られたことを示す：
【０１９１】
接着：
−瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１および乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母は、Ｔ８４細胞へのＬＦ８２株の接着を用量依存的に強力に阻害する。阻害は、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母については５×１０５酵母／ｍｌから、乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母については５×１０６酵母／ｍｌから有意である。
−瞬間乾燥ＳＣＢ１酵母は、その他の２つの酵母試料ほど強力に接着を阻害せず、１×１０７酵母／ｍｌで４５．７％の残存接着であったのに対し、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母および乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母についての残存接着はそれぞれ１８．７％および８％である。
【０１９２】
侵襲：
−瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母は、１×１０５酵母／ｍｌからＡＩＥＣ  ＬＦ８２株によるＴ８４細胞の侵襲を有意に阻害する。１×１０７酵母／ｍｌで、残存侵襲率は１６．３％である。
−乾燥ＳｃＰｒｏ１および瞬間乾燥ＳＣＢ１酵母については、阻害作用はより遅延性であり、それぞれ１×１０６酵母／ｍｌおよび５×１０６酵母／ｍｌである。
【０１９３】
共インキュベーションモデルでのＥＬ０５マンノプロテインによる阻害試験
ＥＬ０５酵母マンノプロテインを１６０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁した。ＰＢＳ中で１／２、１／４、１／８、１／４０の連続希釈を実施し、マンノプロテインの各々の懸濁液２５μＬを、手順１を用いて感染培地に添加した。
【０１９４】
３つの独立した実験を実施した。図２０Ａおよび２０Ｂに示す結果（残存接着および残存侵襲）は、残存接着率および残存侵襲率の平均値として示しており、誤差バーは平均値の標準誤差に相当する。
【０１９５】
これらの図は、共インキュベーションモデルにおいてＥＬ０５酵母マンノプロテインがＴ８４細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着および侵襲を用量依存的に阻害する能力を有することを示す。
【０１９６】
（２）プレインキュベーションモデルにおいてＴ８４腸上皮細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着および侵襲を阻害する能力についての酵母または酵母生成物の試料のスクリーニング
共インキュベーションモデルについて使用したのと同じ酵母および画分の試料をこのプレインキュベーションモデルで使用した。
【０１９７】
プレインキュベーションモデルにおいて同じ数の酵母を用いた酵母の阻害力の比較
ＰＢＳで洗浄し、７，５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、酵母試料をＰＢＳ中４×１０８酵母／ｍｌの濃度で再懸濁した。ＰＢＳ中での酵母の希釈を１／２、１／１０、１／２０および１／１００で実施した。３つの独立した実験を、手順２を用いて実施した。
【０１９８】
図２１Ａおよび２１Ｂに示す結果（残存接着および残存侵襲）は、残存接着率および残存侵襲率の平均値として示しており、誤差バーは平均値の標準誤差に相当する。
【０１９９】
Ｔ８４細胞を酵母で前処理することにより、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１および乾燥ＳｃＰｒｏ１株については５×１０６酵母／ｍｌの用量からＬＦ８２株の接着の有意の阻害を得ることが可能である。しかし、この用量で、瞬間乾燥ＳＣＢ１酵母では有意の阻害が認められなかった。
【０２００】
Ｔ８４細胞を酵母で前処理することにより、乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母株に関して１×１０５酵母／ｍｌの用量からＬＦ８２株の侵襲の阻害を得ることが可能である。
【０２０１】
５×１０５酵母／ｍｌの用量から、３つの酵母試料はＬＦ８２株の侵襲の有意の低下を誘導する。
【０２０２】
プレインキュベーションモデルでのＥＬ０５マンノプロテインによる阻害試験
ＥＬ０５酵母のマンノプロテインを１６０ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁した。ＰＢＳ中で１／２、１／４、１／８および１／４０の連続希釈を実施し、マンノプロテインの各々の懸濁液２５μＬを、手順２を用いて感染培地に添加した。３つの独立した実験を実施した。図２２Ａおよび２２Ｂの結果（残存接着および残存侵襲）は、残存接着率および残存侵襲率の平均値として示しており、誤差バーは平均値の標準誤差に相当する。
【０２０３】
ＥＬ０５マンノプロテインは、２ｍｇ／ｍｌの濃度からＬＦ８２株の接着および侵襲の用量依存的阻害を可能にする。
【０２０４】
プレインキュベーションモデルでのＣＥＡＣＡＭ６受容体を発現するまたは発現しないＣＨＯ−Ｋ１細胞へのＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着に対する酵母による阻害試験の結果
先に記述した手順２を用いて５つの独立した実験を実施した。
【０２０５】
図２３は、２５μｇ／ｍｌの酵母とのプレインキュベーションから、ＣＥＡＣＡＭ６／ＣＨＯ細胞に関して認められたＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着の有意の阻害を示す。用量依存的阻害作用がこれらの細胞に関して認められる。
【０２０６】
ＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着はＣＨＯ−Ｋ１細胞に対しても認められ、これは確実に、これらの細胞の表面で発現されるマンノシル化タンパク質の発現に起因する。しかし、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母とＬＦ８２株のプレインキュベーションは、非トランスフェクト細胞への接着が極めて有意に阻害されることを可能にする。
【０２０７】
これは、すなわち、酵母が、細胞によって発現されるＣＥＡＣＡＭ６受容体へのＬＦ８２株の接着に干渉することを確認する。
【０２０８】
［プレインキュベーションモデルでの、クローン病に罹患している患者の腸細胞の刷子縁におけるＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の接着の阻害の結果］
図２４は、実験の間に得られた平均接着指数を示し、それらは、漸増濃度の瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母（ｍｇ／ｍｌ）の存在下もしくは不在下でまたは抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の存在下で算定した。この図の結果によれば、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母株が存在する場合、ＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の有意且つ用量依存的な減少が患者の腸細胞の刷子縁において報告される。酵母の５ｍｇ／ｍｌの用量で、ＡＩＥＣ  ＬＦ８２株の残存接着は、抗ＣＥＡＣＡＭ６抗体の存在下で認められたもの、または１型線毛を有さない突然変異株に関して認められたものと同様である。
【０２０９】
結論：
この試験から、以下のことが明らかになる：
−ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母は、特に瞬間乾燥形態で、ＬＦ８２株の凝集に対して強力な作用を有する；
−ＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母は、E. coliによる、ヒト上皮細胞（Ｔ８４、回腸生検腸細胞）およびヒトＣＥＡＣＡＭ６受容体を発現するＣＨＯ細胞の接着および侵襲をインビトロで用量依存的に阻害することができる；
−マンノプロテインは、E. coliによる、ヒト上皮細胞（Ｔ８４、回腸生検腸細胞）およびヒトＣＥＡＣＡＭ６受容体を発現するＣＨＯ細胞の接着および侵襲をインビトロで用量依存的に阻害することができる；
−インビトロで、ＳｃＰｒｏ１酵母は、強い勢力で、細胞の約８０％を細菌感染から部分的に保護することができる。
【０２１０】
（実施例７）
［インビトロで培養したヒト腸上皮細胞における、ＩＬ−１０およびＰＰＡＲαをコードする遺伝子の発現へのＳｃＰｒｏ１、ＳＣＢ１酵母および酵母誘導体の調節的役割の検討］
単独でまたは組み合わせて摂取されたＳｃＰｒｏ１およびＳＣＢ１酵母、および／または酵母画分のプロバイオティック性、ならびに特定腸受容体との相互作用によって炎症の誘発を阻害するそれらの能力を検討した。
【０２１１】
インビトロ試験
本発明による酵母および酵母誘導体の作用を、特に、２つの大腸癌細胞株ＣａＣｏ−２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３７）およびＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）に関するインビトロでの分析により、腸上皮細胞の種々の受容体に関して試験した。
【０２１２】
このために、以下の方法に従ってＲＮＡを抽出することにより転写分析を実施した。
【０２１３】
細胞をトリゾールに溶解する。可溶性画分に関して、１０Ｕのリボヌクレアーゼ阻害剤および１０Ｕのデオキシリボヌクレアーゼを含む溶液２００μＬを添加することによってデオキシリボヌクレアーゼ工程を実施する。
【０２１４】
ＲＮＡ１０μｇを、２００Ｕの逆転写酵素、ジチオトレイトール、オリゴ−ｄＴ１５およびデオキシリボヌクレオチドの存在下で逆転写した。
【０２１５】
ｃＤＮＡを、特に以下の遺伝子：ＩＬ−１０およびＰＰＡＲαに関して、特異的センスおよびアンチセンスプライマーを使用して競合物質と同時に公知のポリメラーゼ連鎖反応手法（ＰＣＲ）によって増幅する。
【０２１６】
１．２５ＵのＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ５０００の存在下で実施した４０サイクルの増幅および３％アガロースゲル上での種々の試料の移動後、バンドの強度を画像分析装置によって測定する。
【０２１７】
結果を、内部標準であるβ−アクチンの１０５分子についてのｍＲＮＡ分子の数で表す。
【０２１８】
図１１に分類した結果は、酵母または誘導体を抗炎症性タンパク質ＩＬ−１０をコードする遺伝子の腸上皮細胞と接触させた１時間後（参照番号Ａ）および３時間後（参照番号Ｂ）の、ｍＲＮＡ発現値を含む。
【０２１９】
この図１１において、以下の参照番号は、参照シグナルの４倍以上の初期発現レベルを示した被験酵母／酵母誘導体を表す：
３は、Saccharomyces cerevisiae酵母を表し、
５は、本発明のＳｃＰｒｏ１酵母を表し、
６は、Saccharomyces cerevisiae酵母の抽出物を表し、そして
１２は、Saccharomyces cerevisiae酵母のＲＮＡ画分を表す。
【０２２０】
これらの結果は、実際に、本発明によるSaccharomyces cerevisiae酵母および酵母の誘導体が、１時間後に、抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０をコードする遺伝子の早期発現を誘導することを示す。
【０２２１】
実際上、未処置対照と比較して、本発明による酵母および誘導体についてのｍＲＮＡ発現は縦座標の軸で４以上であり、この値は既に卓越した早期発現シグナルに対応する。
【０２２２】
他の結果を図１３に示す。この図は、酵母誘導体の与えられる量に依存した、ＩＬ−１０タンパク質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ発現の調節を示す。
【０２２３】
この図１３では、１時間後（１ｈ）と３時間後（３ｈ）に発現を測定した。以下の参照番号で表される、本発明による酵母およびSaccharomyces cerevisiae抽出物の発現が認められる：
５は、本発明によるＳｃＰｒｏ１酵母を表し、
６は、Saccharomyces cerevisiae酵母抽出物を表し、
８は、Saccharomyces cerevisiaeの壁β−グルカンを表し、
９は、Saccharomyces cerevisiae酵母の酵母細胞壁マンノプロテインを表し、
１１は、Saccharomyces cerevisiae酵母のＤＮＡ画分を表し、そして
１２は、Saccharomyces cerevisiae酵母のＲＮＡ画分を表す。
【０２２４】
種々の濃度の酵母および／または誘導体に関して発現を測定した。
【０２２５】
図１３における柱の色が濃いものほど、酵母／誘導体の濃度が高い。
【０２２６】
この図１３の結果は、本発明によるSaccharomyces cerevisiae酵母抽出が抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−１０）のｍＲＮＡを早期に誘導することを示す。
【０２２７】
図１２に分類した結果は、酵母または誘導体を、核受容体ＰＰＡＲαをコードする遺伝子の腸上皮細胞と接触させた１時間後（参照番号Ａ）および３時間後（参照番号Ｂ）のｍＲＮＡ発現値を含む。
【０２２８】
この図１２において、以下の参照番号は、参照シグナルの３倍以上の遅延発現レベルを示した被験酵母／酵母誘導体を表す：
１は、活性乾燥形態の本発明によるSaccharomyces cerevisiae  ＳｃＰｒｏ１酵母を表し、
４は、Saccharomyces cerevisiae酵母を表し、
５は、活性乾燥形態の本発明によるSaccharomyces cerevisiae  ＳｃＰｒｏ１酵母を表し、
８は、Saccharomyces cerevisiae酵母壁の画分を表し、
９は、Saccharomyces cerevisiae酵母の壁β−グルカンの画分を表し、
１０は、Saccharomyces cerevisiae酵母の酵母細胞壁マンノプロテインの画分を表し、
１１は、Saccharomyces cerevisiae酵母のＤＮＡ画分を表し、そして
１２は、Saccharomyces cerevisiae酵母のＲＮＡ画分を表す。
【０２２９】
これらの結果は、実際に、本発明によるSaccharomyces cerevisiae酵母および酵母の誘導体が、３時間後に、核受容体ＰＰＡＲαをコードする遺伝子の発現を遅延的に誘導することを示す。
【０２３０】
実際上、本発明による酵母および誘導体についてのｍＲＮＡ発現は、縦座標の軸で３以上であり、この値は既に卓越した遅延型発現シグナルに対応する。
【０２３１】
（実施例８）
［クローン病に罹患している患者の生検から単離されたヒト腸上皮細胞における、ＩＬ−１０およびＴＮＦ−αをコードする遺伝子の発現への酵母および酵母誘導体の調節的役割のエクスビボ試験］
サイトカイン、ＩＬ−１０（抗炎症性）およびＴＮＦ−α（プロ炎症性）の分泌への酵母および／または酵母誘導体の影響を、クローン病に罹患しているまたは罹患していない患者の生検に関してエクスビボで試験した。
【０２３２】
腸生検を、クローン病に罹患しているまたは罹患していない患者から採取し、５％ＣＯ２を含む大気中３７℃で、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＨＢＳＳ−ＣＭＦ培地中に２４時間置いた。洗浄後、生検をＲＰＭＩ  １６４０培地中で酵母または酵母誘導体と４時間接触させた。ＥＬＩＳＡによる分析のために上清を回収した。次にｍＲＮＡまたは全タンパク質を抽出するために生検を溶解した。
【０２３３】
サイトカインの分泌の確認を、細胞培養物の上清およびＥＬＩＳＡによって抽出したタンパク質の免疫学的分析によって実施した。沈降緩衝液（ｖ／ｖ；７５ｍＭトリス、ｐＨ６．８；５％グリセロール；０．２５％ブロモフェノールブルー；２％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール）中９５℃で５分間変性させたタンパク質を沈降させ（５０μｇ）、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分解した。移動後、セミドライエレクトロトランスファー（Hoefer TE77、Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, France）により１６Ｖで１時間かけて、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, France）に移した。ＰＰＡＲαおよびＩＬ−１０を、１／５００に希釈したヒト抗ＰＰＡＲαおよび抗ＩＬ−１０ウサギポリクローナル抗血清によって検出し、Ｇｅｌ  Ａｎａｌｙｓｔ（CLARA VISION,Paris,France）ソフトウエアパッケージを用いてＢｉｏｍａｘ−ＭＲフィルム（Ｋｏｄａｋ）での化学発光（E.C.L.Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, France）によって定量した。
【０２３４】
図１６および１７は、それぞれＩＬ−１０およびＴＮＦ−αに関して得られた結果を示す。縦座標の軸は、ｐｇ／ｍｌで測定したサイトカインの量を示す。各々の点は、急性期のクローン病に罹患している患者（黒い円）、クローン病の寛解期の患者（灰色の円）および健常被験者（白い円）に関する生検の測定に対応する。バーは測定の平均値を指示する。
【０２３５】
これらの図において：
−１は、活性乾燥形態の本発明によるSaccharomyces cerevisiae  ＳｃＰｒｏ１酵母を表し、
−３は、Saccharomyces cerevisiae酵母を表し、
−８は、Saccharomyces cerevisiae酵母壁の画分を表し、
−１１は、Saccharomyces cerevisiae酵母のＤＮＡ画分を表し、そして
−１２は、Saccharomyces cerevisiae酵母のＲＮＡ画分を表す。
【０２３６】
図１６において、本発明によるＳｃＰｒｏ１酵母は、健常患者および生理的食塩水だけの存在下で実施した測定に対応する陰性対照（−）と比較して、クローン病に罹患しているまたは寛解期の患者の上皮細胞による抗炎症性サイトカイン、ＩＬ−１０の分泌を２倍に増加させる。
【０２３７】
図１７は、本発明によるＳｃＰｒｏ１酵母が、クローン病に罹患しているまたは寛解期の患者の生検から単離された腸細胞によるプロ炎症性サイトカイン、ＴＮＦ−αの分泌の増加を生じさせないことを示す。ＳｃＰｒｏ１またはその他の試験した酵母または酵母誘導体はいずれも、ＴＮＦ−αの分泌を誘導しなかった。
【０２３８】
（実施例９）
［結腸直腸拡張のマウスモデルにおける酵母および酵母誘導体の鎮痛特性の検討］
（１）装置および方法
体重１７５〜２００ｇの雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Charles River,l’Arbresle,France）をこれらの試験において使用する。ラットを、実験の１週間前に動物飼育室条件に順化させる。１ケージにつき５匹の動物で飼育し、水と食餌は自由に摂取させる。すべての試験は、国際疼痛学会の研究および倫理的問題のための委員会（Committee for Research and Ethical Issues of the International Association for the Study of Pain）[6]の推奨に従って実施する。動物の不快を回避するまたは最小限に抑えるために注意を払う。
【０２３９】
（２）結腸の感受性の評価
動物の侵害受容を、行動応答を誘発するために必要とされる結腸内圧を測定することによって評価する。この圧は、結腸に導入されたバルーンの膨張による結腸直腸拡張によって生じる。行動応答は、動物の身体の後方部分の上昇および重症収縮に対応する明らかに目に見える腹部収縮によって特徴づけられる[7〜9]。ラットを揮発性麻酔薬（２％イソフルラン）で麻酔し、バルーン（Bourdu [8]によって述べられている手順に従って準備した）を、肛門から７ｃｍの位置で、できるだけ侵襲性の少ない方法で直腸内経路によって挿入する。カテーテルを接着テープで尾の基部に取り付ける。５分後、ラットをプレキシガラス箱の中央に置き、カテーテルを電子バロスタット（Distender Series IIRTM,G & J Electronics）に接続する。疼痛反射の誘発までまたは８０ｍｍＨｇの限界圧に達するまで、漸増圧を継続的に適用する。
【０２４０】
（３）投与化合物
酵母を１日１回１５日間、強制給餌によって投与した。
【０２４１】
結腸直腸拡張の３０分前に、１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射したモルヒネを陽性対照として使用する。
【０２４２】
８つの群のラットを検討した：
−ＰＢＳを摂取した１０匹の対照ラット、
−瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１（１００μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号１）、
−活性乾燥ＳｃＰｒｏ１株（１００μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号２）、
−ＳＣＢ１株（１００μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号３）、
−瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１株（５０μｇ／日）＋瞬間乾燥ＳＣＢ１株（５０μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号４）、
−モルヒネの１回注射（１ｍｇ／ｋｇ、拡張の３０分前）を受けた１０匹のラット（参照番号５）。
【０２４３】
（４）結果
図２６は、一方では、単独で（参照番号１）またはＳＣＢ１株と組み合わせて（参照番号４）摂取された瞬間乾燥形態のＳｃＰｒｏ１酵母、および他方では、活性乾燥形態のＳｃＰｒｏ１酵母（参照番号２）が痛覚閾値を上昇させ、それにより、何も投与しなかったラットと比較して内臓痛の知覚を有意に低下させることを示す。
【０２４４】
以下の結果は、対照と比較してｍｍＨｇで示している：
−７４．５±３．０７対５３．６±３．９、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１株（参照番号１）に対してｐ＝０．０７、
−６６．５±３．３６対５３．６±３．９、瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１株とＳＣＢ１株の組合せ（参照番号４）に対してｐ＝０．０４、
−７２±２．５９対５３．６±３．９、活性乾燥ＳｃＰｒｏ１株（参照番号２）に対してｐ＜０．０１。
【０２４５】
他方で、この作用は、７２±２．５９ｍｍＨｇの痛覚閾値を有する、ｌｍｇ／ｋｇの用量で使用したモルヒネ（参照番号５）によって誘導されるものと同等である。
【０２４６】
瞬間乾燥ＳＣＢ１株も、健常ラットにおいて７０．６±３．１０ｍｍＨｇ、ｐ＝０．０２６の鎮痛作用を誘導する。
【０２４７】
［内臓過敏症を有するラットにおいて］
（１）装置および方法
体重１７５〜２００ｇの雌性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Charles River,l’Arbresle,France）を使用した。ラットを、実験の１週間前に実験室条件に順化させた。１ケージにつき５匹の動物で飼育し、水と食餌は自由に摂取させた。すべての試験は、国際疼痛学会の研究および倫理的問題のための委員会（Committee for Research and Ethical Issues of the International Association for the Study of Pain）[6]の推奨に従って実施した。動物の不快を回避するまたは最小限に抑えるため生活環境に関して多大の注意を払った。
【０２４８】
（２）酪酸塩での洗浄による結腸の過敏症の誘導
各々の洗浄に関して、カテーテル（２ｍｍフォガーティ）を肛門から７ｃｍの位置で結腸に導入し、動物に、１日２回３日間にわたって中性ｐＨ（ｐＨ６．９）の２００ｍＭ酪酸ナトリウム溶液１ｍｌを投与した。「健常」動物には食塩水を与えた。
【０２４９】
（３）本発明による酵母を用いた動物の処置
内臓過敏症を有する動物の１０の群を使用した（各群につきｎ＝１０）。処置動物には、１日１回１５日間、胃内への強制給餌によって酵母１００μｇを投与した。対照動物には、前記と同じ手順に従ってＰＢＳを与えた。酵母はＰＢＳの溶液に懸濁する。酪酸塩または食塩水の点滴注入を、１回目の強制給餌の７日後に開始し、３日間実施する。結腸過敏症を、経口経路による処置の開始の１４日後、すなわち結腸点滴注入の７日前に測定した。
【０２５０】
（４）試験した動物の群
７つの群のラットを試験した。参照番号は図２６に対応する：
−ＰＢＳを摂取した１０匹のラット（対照）、
−瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１乾燥酵母（１００μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号１）、
−活性乾燥ＳｃＰｒｏ１乾燥酵母（１００μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号２）、
−瞬間乾燥ＳＣＢ１酵母（１００μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号３）、
−瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１（５０μｇ／日）および瞬間乾燥ＳＣＢ１（５０μｇ／日）を摂取した１０匹のラット（参照番号４）、
−モルヒネを摂取した１０匹のラット（参照番号５）、
−フィブラートを摂取した１０匹のラット（参照番号６）。
【０２５１】
（５）結果
まず最初に、対照ラットに関して、過敏症ラットに関する試験での痛覚閾値は健常ラットの閾値より下であることに留意すべきである。
【０２５２】
単独でまたはＳＣＢ１酵母と組み合わせて摂取された瞬間乾燥ＳｃＰｒｏ１酵母は、モデルにおいて興味深い鎮痛作用を示す。
【０２５３】
数値は以下のとおりである：
参照番号                      ｍｍＨｇ
１                  ５６．５±４．２７  ｐ＝０．０３
４                  ５９±４．３３  ｐ＝０．０２
【０２５４】
本発明による酵母は、健常ラットで認められるのと同じ痛覚レベルの回復を可能にする。酵母によって誘導される鎮痛作用は、モルヒネによって誘導されるものに等しい。
【０２５５】
図２６は、さらに、内臓過敏症を有するラットにおいて痛覚閾値を２倍に上昇させるフェノフィブラートの強力な鎮痛作用を示す（７０±４．４８  ｐ＝０．００１）。
【０２５６】
この結果は、内臓痛の調節におけるＰＰＡＲα受容体の役割を確認する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0005497661.tif 000025
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
0005497661.tif 000036
【図２６】
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【配列表】
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