(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
記憶手段と演算手段とを有するコンピュータにおいて、所定の生物学的配列を同定するためのクエリー（query）へインプットするための生物学的サブ配列を選択するためのコンピュータ実施方法（computer-implemented method）であって、以下のステップ：
前記演算手段が、前記記憶手段中に記憶された生物学的配列データからサブ配列を選択するステップ；
前記演算手段が、該サブ配列をクエリーとして前記記憶手段内の配列データベースにサブミットするステップ；および、
前記演算手段が、該データベースから得られた第1所定信頼水準が選択された閾値を超えると判断する場合に、該第1所定信頼水準を有する配列を該所定の生物学的配列として同定するステップ
を含み、
前記選択ステップが、スライディングウィンドウアルゴリズムに基づいて、以下：
前記演算手段が、前記生物学的配列データ中の多数のベースコールに対応するウィンドウサイズパラメータ（window size parameter）を選択すること；
前記演算手段が、該生物学的配列データのビューイングウィンドウ（viewing window）中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算すること［該ウィンドウのサイズは、該選択ステップにおいて選択された該ウィンドウサイズパラメータに対応する］；
前記演算手段が、前記計算ステップにおいて計算された前記パーセンテージが所定の閾値を満足しないと判断する場合に、前記生物学的配列中の別の数のベースコールへ前記ビューイングウィンドウをスライドさせること；
前記演算手段が、該生物学的配列中の該別の数のベースコール中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算すること；および
前記演算手段が、前記計算されたパーセンテージが所定の閾値を満足すると判断する場合に、前記クエリーにサブミットされる（submit）前記サブ配列として、ビューウィンドウ中のベースコールのサブ配列を選択すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記演算手段が、ＦＡＳＴＡ、ＭＳＦ、ＧＣＧ、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＣ、ＰＩＲ、ＭＳＰ、ＰＦＡＭ、ＰＯＳＴＡＬおよびＪＮＥＴフォーマットのいずれか１つで、前記生物学的配列データを前記記憶手段に記憶することをさらに含む、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項３】
前記演算手段が、前記生物学的配列データが、生物学的配列またはコントロール配列の１つに対応するかどうかを決定することをさらに含む、請求項２に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項４】
前記選択されるサブ配列がサブミットステップにおいてサブミットされる前に、前記演算手段が、ベースコールの前記選択されたサブ配列から、無効なベースコールをトリミング（trimming）すること
をさらに含む、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項５】
前記演算手段が、前記サブ配列と複数の所定の配列とを比較すること；および
前記演算手段が、前記所定の配列の少なくとも１つに対応する比較結果を生成する（generate）こと
をさらに含む、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項６】
前記比較ステップからの比較結果が、前記サブ配列と前記所定の配列の少なくとも１つとの所定レベルの対応を示す統計値を含む、請求項５に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項７】
前記演算手段が、強度データを前記生物学的配列データに組み込む（incorporate）こと；および
前記演算手段が、少なくとも１つの標的配列の濃度を評価すること
をさらに含む、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項８】
前記演算手段が、少なくとも１つの選択パラメータに従う前記生物学的配列データから少なくとも２つのサブ配列を検出すること；および
前記演算手段が、混合物（mixture）および組換え事象（recombination event）の少なくとも１つを検出すること
をさらに含む、請求項７に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項９】
前記少なくとも２つのサブ配列が、マイクロアレイの異なる領域に対応する、請求項８に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１０】
前記演算手段が、類似配列の混合物と異なる配列間の組換えとを識別すること（ここで、該類似配列は、所定レベルの類似性を有する）
をさらに含む、請求項７に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１１】
前記演算手段が、マイクロアレイの第１領域からの第１シグナルおよび該マイクロアレイの第２領域からの第２シグナルを評価すること、ならびに
前記演算手段が、該第１シグナルを該第２シグナルと比較して、少なくとも１つの識別パラメータ（distinction parameter）を作成すること（該少なくとも１つの識別パラメータは、該第１シグナルおよび該第２シグナルが混合物および組換え事象の１つを表す可能性に対応する）
を含む、
前記演算手段が、混合物と組換え事象とを識別することをさらに含む、請求項７に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１２】
以下：
前記演算手段が、複数のテスト配列（test sequences）に対応する少なくとも１つのコンセンサス配列（consensus sequence）を同定すること；
前記演算手段が、該少なくとも１つのコンセンサス配列から前記サブ配列を選択すること；
前記演算手段が、該少なくとも１つのサブ配列と少なくとも所定の配列とを比較すること；
前記演算手段が、比較結果を作成すること；
前記演算手段が、該比較結果と該複数のテスト配列との間の差異を計算すること；および
前記演算手段が、少なくとも１つの候補コンセンサス配列（candidate consensus sequence）を作成すること
をさらに含む、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１３】
前記演算手段が、パッチパラメータ（patch parameter）に従って、少なくとも１つのコンセンサス配列を修飾すること（該パッチパラメータは、前記複数のテスト配列の少なくとも１つの少なくとも一部に対応する）
をさらに含む、請求項１２に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１４】
前記演算手段が、少なくとも１つのハイブリダイゼーションパラメータ（hybridization parameter）に従って、前記少なくとも１つの候補コンセンサス配列と前記複数のテスト配列との間のハイブリダイゼーションをシミュレートすること
をさらに含む、請求項１２に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１５】
前記生物学的配列データが、核酸、転写モノマー（transcriptional monomer）、転写産物、ＤＮＡ、およびＲＮＡの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１６】
前記生物学的配列データが、曖昧配列（ambiguous subsequence）とギャップ（gap）の少なくとも１つを含む、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１７】
前記演算手段が、前記生物学的配列データの相対位置を計算すること（ここで、該生物学的配列データは、蛋白質とアミノ酸の少なくとも１つを含む）
をさらに含む、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１８】
前記生物学的配列データが、手動Ｓａｎｇｅｒ配列決定（manual Sanger sequencing）、自動Ｓａｎｇｅｒ配列決定（automated Sanger sequencing）、ショットガン配列決定（shotgun sequencing）、従来のマイクロアレイ（conventional microarrays）、リシークエンシングマイクロアレイ（resequencing microarrays）、マイクロ電気泳動配列決定（microelectrophoretic sequencing）、ハイブリダイゼーションによる配列決定（sequencing by hybridization）（ＳＢＨ）、エドマン分解法（Edman degradation）、増幅分子についてのサイクリック−アレイ配列決定（Cyclic-array sequencing on amplified molecules）、単一分子についてのサイクリック−アレイ配列決定（Cyclic-array sequencing on amplified molecules）、およびナノポア配列決定（nanopore sequencing）の少なくとも１つによって得られたものである、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項１９】
前記生物学的配列データが、蛋白質配列とヌクレオチド配列の少なくとも１つである、請求項１に記載のコンピュータ実施方法。
【請求項２０】
コンピュータ可読命令（computer readable instructions）を記憶するように構成されたコンピュータ可読記憶媒体（computer readable storage medium）であって、該コンピュータ可読命令は、記憶手段と演算手段とを有するコンピュータにおいて、所定の生物学的配列を同定するためのクエリー（query）へインプットするための生物学的サブ配列を選択する方法を実施するように構成されており、該方法は、以下のステップ：
前記演算手段が、前記記憶手段中に記憶された生物学的配列データからサブ配列（subsequence）を選択するステップ；
前記演算手段が、該サブ配列をクエリーとして前記記憶手段内の配列データベースにサブミットするステップ；および、
前記演算手段が、該データベースから得られた第1所定信頼水準が選択された閾値を超えると判断する場合に、該第1所定信頼水準を有する配列を該所定の生物学的配列として同定するステップを含み、
前記選択ステップが、スライディングウィンドウアルゴリズムに基づいて、以下：
前記演算手段が、前記生物学的配列データ中の多数のベースコールに対応するウィンドウサイズパラメータ（window size parameter）を選択すること；
前記演算手段が、該生物学的配列データのビューイングウィンドウ（viewing window）中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算すること［該ウィンドウのサイズは、該選択ステップにおいて選択された該ウィンドウサイズパラメータに対応する］；
前記演算手段が、前記計算ステップにおいて計算された前記パーセンテージが所定の閾値を満足しないと判断する場合に、前記生物学的配列中の別の数のベースコールへ前記ビューイングウィンドウをスライドさせること；
前記演算手段が、該生物学的配列中の該別の数のベースコール中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算すること；および
前記演算手段が、前記計算されたパーセンテージが所定の閾値を満足すると判断する場合に、前記クエリーにサブミットされる（submit）前記サブ配列として、ビューウィンドウ中のベースコールのサブ配列を選択すること
を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２１】
記憶手段を備え、所定の生物学的配列を同定するためのクエリーへインプットするための生物学的サブ配列を選択するための装置であって、以下：
選択するための手段であって、前記記憶手段中に記憶された生物学的配列データからサブ配列を選択する手段；
サブミットするための手段であって、該サブ配列をクエリーとして前記記憶手段内の配列データベースにサブミットする手段；および、
同定するための手段であって、該データベースから得られた第1所定信頼水準が選択された閾値を超えると判断する場合に、該第1所定信頼水準を有する配列を該所定の生物学的配列として同定する手段
を備え、
前記選択するための手段が、スライディングウィンドウアルゴリズムに基づく、以下：
前記生物学的配列データ中の多数のベースコールに対応するウィンドウサイズパラメータ（window size parameter）を選択する手段；
該生物学的配列データのビューイングウィンドウ（viewing window）中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算する手段［該ウィンドウのサイズは、該選択ステップにおいて選択された該ウィンドウサイズパラメータに対応する］；
スライドさせる手段であって、前記計算する手段によって計算された前記パーセンテージが所定の閾値を満足しないと判断する場合に、前記生物学的配列中の別の数のベースコールへ前記ビューイングウィンドウをスライドさせる手段；
該生物学的配列中の該別の数のベースコール中に含まれる有効なベースコールのパーセンテージを計算する手段；および
選択する手段であって、前記計算されたパーセンテージが所定の閾値を満足すると判断する場合に、前記クエリーにサブミットされる（submit）前記サブ配列として、ビューウィンドウ中のベースコールのサブ配列を選択する手段
を含む、装置。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年７月２日に出願した米国仮出願シリアル番号第６０／５９０，９３１号、２００４年９月１５日に出願した米国仮出願シリアル番号第６０／６０９，９１８号、２００４年１１月２９日に出願した米国仮出願シリアル番号第６０／６３１，４３７号、２００４年１１月２９日に出願した米国仮出願シリアル番号第６０／６３１，４６０号、および２００５年６月１６日に出願した米国仮出願シリアル番号第６０／６９１，７６８号に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府資金によるプロジェクトに関する記述
アメリカ合衆国政府は、the Defense Threat Reduction Agency(DTRA;Interagency Cost Reimbursement Order (IACRO #02-4118),MIPRナンバー01-2817,02-2292,02-2219,およ
び02-2887)、the Office of the U.S. Air Force Surgeon General(HQ USAF SGR;MIPRナ
ンバーNMIPR035203650, NMIPRONMIPRO35203881, NMIPRONMIPRO35203881), the U.S. Army
Medical Research Acquisition Activity(Contract#DAMD17-03-2-0089), the Defense Advance Research Projects Agency(DARPA;MIPRナンバーM189/02), およびthe Office of Naval Research(NRL Work Unit 6456)からの財政的支援に従って、本願における権利を所有する。
【０００３】
著作権表示
本書類の開示の一部は、著作権保護の対象となる材料を含む。著作権所有者は、米国特許商標庁パテントファイルまたはレコードにおいてそれが現れるような特許書類または特許開示のいずれかによるファクシミリ複製に異議はなく、しかしそうでなければ、何であれ全ての著作権を留保する。
【０００４】
配列表
本願は、名称ＮＣ９７４１６．ｔｘｔ、作成日２００５年７月５日、サイズ６３９ＫＢの単一ファイルを含有しそしてさらに以下がラベルされた、添付のコンパクトディスクにおける配列表を含む：
出願人：ザ  ガバメント  オブ  ザ  ユナイテッド  ステイツ  オブ  アメリカ，
アズ  リプレゼンテッド  バイ  ザ  セクレタリー  オブ  ザ  ネイビー（The Government of the United States of America as Respresented by the Secretary of the Navy）
タイトル：リシークエンシング病原体マイクロアレイ
ファイル参照番号：ＮＣ  ９７，４１６
添付のコンパクトディスクの全内容物は、参照により本願に組み込まれる。
【０００５】
技術分野
本発明は、ＤＮＡリシークエンシングマイクロアレイの使用による病原体検出を提供する。好ましくは、本発明は、複数の病原体の同時検出を提供する。本発明はまた、生物学的サンプル中に存在する密接に関連する病原体間の鑑別診断（differential diagnosis）およびファインスケール識別（fine-scale discrimination）のためのリシークエンシン
グマイクロアレイおよびマイクロアレイチップを提供する。本発明はさらに、生物学的サンプル中に存在する病原体の存在およびアイデンティティーを検出する方法を提供する。本発明は、既知の病原体配列および予期しない配列変異に起因して同定され得る病原体、ならびにこのような病原体の混合物の診断およびサーベイランスを可能にする。リシークエンシングは、いくつかの増幅戦略と組み合わされると、血清型決定（serotyping）、抗
生物質耐性プロファイリング（antibiotic resistance profiling）、遺伝ドリフト／シ
フト分析（genetic drift/shift analysis）、法医学、および生物テロ事象の迅速な検出のための、同時臨床診断および伝統的なサーベイランスアッセイの実施を可能にする。
【０００６】
本発明はまた、代替法によって作製された核酸または蛋白質配列の任意の方法グループとの使用のための自動サブ配列選択システムを含む、種々の自動選択システム（automated selection systems）に関する。該システムは、１以上の類似性サーチアルゴリズム（similarity search algorithrn(s)）を使用して所定のデータベース配列のコレクションに対する比較に最適に好適である配列サブセットを選択するために、該システムによって予め決定された（predetermined）またはユーザーによって決定されたパラメータに従って
、リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイから得られる不完全なヌクレオチド配列データからサブ配列のセットを自動的に選択するように構成される。本発明の実施形態はまた、１以上のサブ配列のサブミッション（submissio）から得られる類似性サーチによって
リターンされる関連結果のさらなる分析およびプレゼンテーションを可能にする。本明細書中に記載される本発明の局面は、複数の配列標的（例えば、微生物）の混合物からまたは単一標的内での配列のリアレンジメント（rearrangement）から生じる、配列シグネチ
ャー（sequence signatures）の組み合わせを識別する。本方法の実施形態はまた、ＤＮ
Ａマイクロアレイ自体からの相対的シグナル強度値に基づいて、混合された標的配列の相対量（relative abundances）を評価することができる。さらに、本発明の局面は、関連
する標的配列（例えば、病原体）の範囲を示すために、“プロトタイプ”配列タイルを使用して、リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイを設計するための反復プロセス（iterative process）のインテグラルコンポーネント（integral component）である。
【背景技術】
【０００７】
ヒトゲノムプロジェクトによって促進されるバイオテクノロジー時代を我々は進んでいるので、配列情報を得てそして分析する高スループット法の開発にプレミアムが置かれている。この要求を満たすために、多機能ＤＮＡマイクロアレイプラットフォーム（multifunctional DNA microarray platform）は、これを使用する適用法の爆発的な増加へと至
る知名度を得ている。
【０００８】
より重要なことには、世界の出来事の発展（the evolution of world events）および
主流社会における生物テロの発生は、生物学的脅威同定および根絶のための新規、迅速、かつ正確な技術が開発されなければならないという、科学界および同様に素人の中での高まる感情へと導いた。広範囲の病原体同定のために使用されるマイクロアレイのコンセプトは、医療および国防の両方に対して相当かつ明白なアピールを有する。本発明者が努力したのは、この構想内である。
【０００９】
従来、病原体同定の目的について、アプローチは、特定のカテゴリーまたは特定の株の微生物病原体を一意的に同定する、相補ゲノム“標的”とハイブリダイズする、マイクロアレイの表面上に固定化された“プローブ”ＤＮＡ配列の能力に一般的に頼っている。種々のマイクロアレイ技術が、アッセイ完了に必要とされる時間範囲およびプローブの密度を変化させて、この目的のために開発されている。
【００１０】
マイクロアレイでの病原体検出のための１つの技術課題は、十分な量の病原体核酸を含むサンプルを得ることの困難性に起因して生じる。したがって、サンプルタイプの大半について、何らかの標的増幅が、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる検出について十分な病原体遺伝子マーカーのコピーを提供するために必要とされる傾向にある。残念なことに、この増幅のための従来法は、マイクロアレイチップ上に配置され得るプローブの数と比較して、あまり拡大しない（do not scale well）。しかし、ハイブリダイゼー
ションを検出するために十分な量のゲノム標的を提供するという最も一般的に使用される
手段は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような、分子生物学に基づく技術を使用する遺伝子型同定法に頼っている。このような技術は、従来の微生物学アプローチにいくつかの可能性のある利点を提供する。核酸増幅戦略は、生物を培養することが必要とされないように、生物に含まれる遺伝情報の検出に病原体同定の基礎を置く。
【００１１】
ＰＣＲに基づくアッセイは高感度、正確、かつ迅速であるが、これらの方法はまた、新しい一連の問題を招く。首尾良い同定は、適切に選択されるプライマーセットにほぼ全面的に依存するので、ＰＣＲに基づく試験は、標的生物の同定に関連する正確な配列についての想定を必要とする。したがって、想定される（assumed）病原体配列および予期され
ない（unanticipated）病原体配列の両方を検出し得る、進歩した診断システムについて
の決定的な必要性が存在する。数千の遺伝要素の同時インターロゲーション（simultaneous interrogation）を可能にする、ＤＮＡマイクロアレイは、この決定的な必要性に取り組む。ここで、用語“マイクロアレイ”は、標的（即ち、病原体または宿主）核酸の相補鎖を選択的に捕獲するように設計された核酸プローブを各々が提示する、高い多様性（high multiplicity）（１０２〜１０６）の個々の部位を示す任意のタイプの平面支持体ま
たは固体ビースをいう。
【００１２】
しかし、文献に記載される病原体同定マイクロアレイの大半は、誘導化（derivatized
）ガラス表面（典型的に、３×１インチ顕微鏡用スライド）上へロボットによりスポットされるオリゴヌクレオチドを使用して作製される。このアプローチは、２０量体から数千塩基対（base pairs）（ｂｐ）のｃＤＮＡ  ＰＣＲ産物に及ぶ、堆積されるオリゴヌクレオチドのサイズに関して最大の柔軟性を可能にする。僅かな例外があるが、検出事象は、フルオロフォア標識された標的核酸のハイブリダイゼーションに従うスポット由来の増加されたレベルの蛍光である。
【００１３】
アクリルアミドパッド内に固定化された、短い（１４〜２５量体）オリゴヌクレオチドが、Ａｎｄｒｅｉ  Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖのリーダーシップの下で、Argonne National Lab (DOE, USA)およびthe Engelhard Institute of Molecular Biology (Moscow, RU)との共同努力において、病原体同定に広く適用されている（Strizhkov et al., 2000; Vasiliskov et al., 1999）。さらに、低密度マイクロアレイ（３×１インチ顕微鏡用スライド
当たり数百フィーチャー（features））が、薬剤耐性決定因子（drug resistance determinants）の測定のために使用されてきた（Volokhov et al., 2003）。この研究（this body of work）の１つの顕著な局面は、この２次元平面表面の代わりに、プローブ固定のために３次元ポリマーマトリクスを使用することである。
【００１４】
より最近では、Ｃｈｅｒｋａｓｏｖａらは、重複する１４〜２５量体プローブをガラスに固定化された短いオリゴヌクレオチドがスポットされたマイクロアレイの使用を記載している（Cherkasova et al., 2003）。このアプローチの２つの変形が使用されている：
（１）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ（ＭＡＲＳＨ）アッセイ、および（２）Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（ＭＡＶＲ）アッセイ。ＭＡＲＳＨは、個々の遺伝子配列について重複する（半分の長さで）ヌクレオチドプローブのセットを使用する。ハイブリダイゼーションパターンは、半分のプローブ鎖長（例えば、７〜１０ｂｐ）の分解能までのシングルポイント変異または置換／欠失事象の検出を可能にするが、変異の性質または位置の正確な決定を可能にしない。したがって、これらの変化を測定するために、引き続いて従来のＤＮＡ配列決定技術が使用されなければならない。ＭＡＶＲは、約１５０ｎｔスペーシングで全ゲノムをカバーする生物特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用し、そして大規模な遺伝子組換えを検出するために使用される。
【００１５】
ＵＣＳＦでのＤｅＲｉｓｉグループは、広いスペクトルの（broad-spectrum）病原体同定のための長い（７０量体）オリゴヌクレオチドプローブマイクロアレイの使用を開拓した（Wang et al., 2002; Wang et al., 2003）。長い（７０ｎｔ）オリゴヌクレオチドの使用は、暗黙の利点および欠点を有する。１つの利点は、短いもの（例えば、２０〜２５量体）と比較して、７０量体プローブを用いると、より高い程度の感度が達成され得るということである。しかし、特異性は低下され、何故ならば７０量体標的／プローブハイブリダイゼーションはかなりの数（例えば、７〜１０）の単一塩基ミスマッチに感受性でないためであり、一方、より短いプローブは遥かに高い配列特異性を提供する。
【００１６】
ＤｅＲｉｓｉのグループは、一般的な呼吸器感染に関与する種々のウイルスを同定するための、１，６００の異なる７０量体オリゴヌクレオチドプローブを有するスポッテッドマイクロアレイ（spotted microarrays）の使用を記載する（Wang et al., 2002）。プローブは、既知のウイルスゲノムのリストから識別力のある配列を配置するアルゴリズムを使用して、各病原体について選択された。以前に記載された（Bohlander et al., 1992）方法および引き続いてのＰＣＲ／Ｋｌｅｎｏｗフラグメントに基づく増幅（PCR / Klenow
fragment-based amplification）の連続する組合せが、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡの
両方の偏りのない増幅（non-biased amplification）を達成するために使用され、首尾良いマイクロアレイハイブリダイゼーションおよび蛍光ラベルによる検出のために十分な量の標的アンプリコン（amplicons）の作製を可能にする。（注意：このプロトコルは、Ｄ
ｅＲｉｓｉ  ｌａｂウェブサイト（http://derisilab.ucsf.edu)）により公知にされた）。サンプル調製から獲得結果まで必要とされる時間は、約２４時間であった。正確な配列情報はこのようなアレイから達成可能でなかったので、病原体同定は、各病原体または株について実験的に測定され得るハイブリダイゼーションパターンに基づいて行われた。同一グループ（Wang et al., 2003）からの関連レポートにおいて、類似のマイクロアレイ
が、サンプルから出来る限り多くの微生物種を捕獲しようと努力して、高度に保存された配列を使用して作製された。該マイクロアレイからの病原体配列の物理的除去に続いて、該配列はクローン化され、そして従来のＤＮＡ配列決定技術を使用して配列決定される。臨床試料における病原体検出についての分析的／臨床的な感度または特異性の測定は、ＤｅＲｉｓｉグループからの研究において提供されなかった。
【００１７】
スポッテッドマイクロアレイ（spotted microarrays）を使用する上述のアプローチと
は対照的に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）は、高密度プローブ製造技術（uses high-density probe fabrication technology）を使用し、各ヌクレオチド塩基がリシークエンス（resequenced）される、センスおよびアンチセ
ンスの両方向において各々４プローブを使用する“タイルド”マイクロアレイ（tiled” microarrays）を構築する。したがって、単一塩基置換が、ハイブリダイゼーションパタ
ーンによって直接検出される（さらなる情報については、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑデザインマニュアルを参照のこと）。したがって、いくつかのグループは、病原体ジェノタイピング（pathogen genotyping）のためのタイルドマイクロアレイの使
用を記載した。（Kozal et al., 1996）は、ＨＩＶにおける変異ドリフト（mutational drift）を測定するためにこのタイプのマイクロアレイを使用し、一方、Ｇｉｎｇｅｒａｓら（Gingeras et al., 1998; Troesch et al., 1999）は、１５のリファンピン耐性Ｍ．
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株および２７のマイコバクテリア種の７０の臨床分離株をリシークエンスしそして正確に同定するために、６５，０００オリゴマープローブのタイルドアレイを使用した。より最近では、Ａｎｄｅｒｓｅｎら（Wilson et al., 2002b）は、生物戦争薬剤（biological warfare agents）の同定のためのタイルドＡｆｆｙｍｅｔｒｉ
ｘマイクロアレイの使用を記載した。彼らのアプローチは、マイクロアレイハイブリダイゼーションのために十分な病原体標的ＤＮＡを作製するために並行して行われる特異的ＰＣＲ反応の使用に完全に頼った。上記に列挙される全てのケースにおいて、保存されたプライマー部位の使用によって、あるいはＡｎｄｅｒｓｅｎら（Wilson et al., 2002a; Wi
lson et al., 2002b）の研究においては、マルチウエルフォーマットにおける約１５０までの異なるＰＣＲ反応を行いそしてアンプリコンをプールすることによって、特異的ＰＣＲプライマーが、マイクロアレイハイブリダイゼーションの前にＤＮＡ標的を増幅するために使用された。
【００１８】
米国特許６，２２８，５７５  Ｂ１は、Ｇｉｎｇｅｒａｓ（Gingeras et al., 1998）
およびＴｒｏｅｓｃｈ（Troesch et al., 1999）によって記載されるのと同一のデータを記載している。この特許において、標的病原体配列が、アレイ上へタイル張りされる（tiled）。病原体配列のいくつかのタイプの変形（特に、挿入／欠失または頻繁な複数置換
）はハイブリダイゼーションパターンを乱し（perturb）得るので、Ｇｉｎｇｅｒａｓら
は、個々のマイコバクテリア変異体を同定するために、特異的病原体ハイブリダイゼーションパターンのディファレンシャル測定（differential measures）を使用した。即ち、
同定は、グラウンドトゥルース実験（ground truth experiments）において実験的に測定されるディファレンシャルハイブリダイゼーションパターンの事前知識（priori knowledge）を必要とした。
【００１９】
上述されるように、公知かつ病原体ゲノム配列ならびにそれらの配列のバリエーションを検出し得る進歩した診断システムについて決定的な必要性が存在する。より詳細には、迅速かつ信頼性が高く、しかし今まで使用されてきた特異的ＰＣＲベース方法によってもたらされるシステム偏向（systemic bias）のない、ＤＮＡマイクロアレイ技術について
の決定的な要求が依然として存在する。
【００２０】
エンジニアリングおよびコンピュータサイエンスとの生物学の収束は、バイオテクノロジーおよびバイオインフォマティクスの出現へと導き、これは、多くの他の目的の中でも、疾患の診断のためのゲノムおよびプロテオミック配列情報を迅速に獲得および分析することを目的とする。このような方法論の実験的実行可能性（experimental viability）および普及は、少なからず、ＤＮＡマイクロアレイの出現に起因する（Stenger et al., 2002）。
【００２１】
一般的に、マイクロアレイ製造は、マイクロプロセッサ作製方法を適用し、生物学的サンプル中に存在するＤＮＡまたは蛋白質の配列を迅速かつ確実に同定し得る“遺伝子チップ”を作製する。ここで、用語“マイクロアレイ”は、溶液中の標的（即ち、遺伝子または遺伝子転写物）検体（analytes）の相補鎖を選択的に捕獲するように設計されたプローブ（固定化された核酸または抗体）を各々が示す、高い多様性（high multiplicity）（
１０２〜１０６）の個々の部位を提示する任意のタイプの平面支持体または代替的なマトリクスをいう。設計によって、ＤＮＡマイクロアレイは、数千の遺伝子または遺伝子転写物要素の同時インターロゲーション（simultaneous interrogation）を可能にする。
【００２２】
遺伝分析のためにリシークエンシングＤＮＡマイクロアレイを使用することにおいて、増幅されそして蛍光標識された（fluorescently-tagged）遺伝標的を含有する溶液は、“タイルド”フォーマット（“tiled” format）の複数のオリゴヌクレオチドプローブから構成されるマイクロアレイを通過させられる（Kozal et al., 1996）。該サンプル中の相補配列は、該マイクロアレイ上に含まれる対応のプローブへ結合する。次いで、該マイクロアレイが、例えば、該マイクロアレイのプローブからの光放射の強度を記録するレーザースキャナーを使用して、分析される。記録された強度は、次いで、“ベースコール”を作成するために使用されるアレイ特異的ソフトウエア（array-specific software）によ
って分析され、これは、問題の生物学的サンプル中に含有される核酸（アデニン；Ａ、チミン；Ｔ、シトシン；Ｃ、またはグアニン；Ｇ）の配列をある程度の確率的確実性（probabilistic certainty）まで同定するためのアルゴリズム的方法を記載する用語である。
より広いＩＵＰＡＣ定義コード（definition code）はまた、正確性のより低いベースコ
ール（less precise base calls）を記載するために使用される（“Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”というタイトルの、２００４年７月２日に出願された、米国仮出願シリアル番号第６０／５９０，９３１号、補足データ、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｊ  “ｇｄａｓ＿ｍａｎｕａｌ．ｐｄｆ”第２５５頁を参照のこと）。標的配列が、リシークエンシングマイクロアレイの好適なタイル領域に十分に相同である場合（２５塩基当たり１〜２塩基未満の置換）、該標的の完全なリシークエンスが可能である。しかし、標的配列が挿入、欠失、または標的配列の２５塩基当たり２を超える置換の頻度での塩基置換を含む場合、タイル領域へのハイブリダイゼーションは妨害される。これにより、マイクロアレイタイル領域上の対応する配列から“ノー［ベース］コール”（no [base] call）（Ｎ）が作成される結果となる。溶液中の標的核酸の濃度が低い場合、またはハイブリダイゼーション溶液中に妨害レベルの拮抗するバックグラウンド核酸が存在する場合、Ｎコール（N calls）がまた生じる。不完全な生物学的配列データはまた
、多数の他の核酸および蛋白質配列決定技術によって作成され得る。
【００２３】
リシークエンシングマイクロアレイの主な意図される適用は、低確率（low probability）一塩基多型（ＳＮＰ）または標的配列の限られた範囲内の変異を検出することである
。しかし、現在産業において慣用的には行われていないが、マイクロアレイの配列アウトプットはまた、標的配列の同定を可能にする配列データベースに対して比較され得る。現在使用されている配列データについての、最も普及している方法、または類似性サーチアルゴリズム（similarity search algorithm）は、“ＢＬＡＳＴ”として一般的に知られ
ておりそして本明細書中でそのように呼ばれる、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌである。以下を含む多数の変形物が存在する：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＢＬＡＳＴ（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ）、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＭＰｓｒｃｈ、ＳｃａｎｐｓおよびＢｅｓｔＦｉｔ（Korf,Yandell & Bedell, 2003）。このような比較は、テストされるサンプルがそれについての配列
が既知であるマッチした生物学的被検体を含むという確実性（certainty）（確率的に測
定される）の点で多数の可能性のあるマッチを一般的に生じる。マイクロアレイの強度分析による配列アウトプットは、次いで、しばしば、病原微生物（pathogenic microbes）
を含み得る生物学的被検体の既知の配列を含むデータベースと比較される。しかし、分子生物学の当業者は、種々の数のノーコール（Ｎ）（no-calls (N)）によって中断されそして場合によっては独占されるＡ、Ｃ、ＴおよびＧベースコールを含むタイルド領域から最良の配列セクション（best sequence sections）を視覚的に決定することができない。
【００２４】
遺伝子配列決定および同定の目的のためのマイクロアレイの使用は、一人の研究者でさえも、なおより多数の以前に配列決定された生物および生物学的物質に対する比較のために生物学的サンプルから大量の配列データを抽出する能力を急激に増加した。しかし、研究者は、時間−効率的様式で（in a time-effective manner）該情報を使用することができない。曖昧な結果はまた、曖昧な配列をマッチさせる試みと関連される乏しい（決定的でないまたは矛盾する）結果および過度の待ち時間に起因して、比較のためにサンプル配列を提供する研究者にとって問題がある。したがって、配列比較からより関係のある結果を得る広く実施される方法は、関連ある結果を戻すというより高い可能性を有するようである、サブ配列（subsequences）についての配列アウトプットを研究者がレビューすることである。特に、多くの研究者は、配列データベースにおけるものに対する比較のために、彼ら自身で、特定のサブ配列を、手動でかつ主観的に選択し、または視覚的に解析する（visually parsing）ことがしばしば見られる。結果として、研究者は、類似性サーチへのサブミッションのために配列データを比較的ゆっくりそして主観的に最適化するために、時間およびリソースを費やす。したがって、上述のリソース使用問題についての現在の解決法は、研究者の要求されるさらなる時間およびリソース要求をもたらす。その上、現在の解決法は主観的かつ時間集中的（time-intensive）であるので、ゲノムの研究の前進（および加速）を促進することに関しての正味の利益は、せいぜい曖昧である。
【００２５】
しかし、上述のように、既知の生物学的配列の莫大な蓄えはしばしば共有されるコンピューティングリソースに含まれる。これらの共有されるコンピューティングリソースは大量のデータ格納能力、並びにサブミットされた配列をデータベースに含まれる配列と比較する丈夫で強力なツールを必要とする。研究者により生み出され(そしてサブミットされ
る)配列データの量が一般的な研究用途についてのマイクロアレイの改良と利用の増加に
つれて、バンド幅とプロセッシング要求に関して共有されるデータベース(そして関連シ
ステム)にかかる負荷は劇的に増大している。換言すれば、マイクロアレイの広範な使用
により可能になるデータの増加は、共有されるバイオインフォマティクスコンピューティングリソースのより非効率な利用を導く。
【００２６】
例えば、曖昧な配列データ（Ｎｓ）を高い割合で含む配列がサブミットされる場合、配列データベースのコンピューティングリソースは、本質的に曖昧な配列についてのマッチ（matches）を見出そうとすることに費やし、低確実性値で全ての可能性のある類似性サ
ーチ結果を生じる。図１０（ａ）は、産業に利用可能な方法で現在行なわれ得るプロセスを例示する典型的なフローチャートである。この例において、問題の配列に対応するヌクレオチドまたはアミノ酸配列データ１０３は、類似性サーチ（similarity search）１０
９を使用して、既知の配列データベースに対する比較のためにサブミットされる。
【００２７】
サブミットされた配列１０３がデータベースレコードと比較した場合、１０９は、統計的に有意なまたは意味がある（meaningful）結果をリターンするかもしれないし、リターンしないかもしれない。本明細書中において、定義により、“比較する”ことは、類似性を決定するための多数のアルゴリズムのいずれか１つ（例えば、ＢＬＡＳＴ）を使用して、配列レコードのデータベースに対するクエリー配列（query sequence）の類似性サーチを行うことを意味する。“比較可能”であると言われる配列は、少なくとも１つの統計的に有意な（ユーザ規定される）結果のリターンを生じさせるに十分な程度の、データベースにおける少なくとも１つの配列に対する類似性を有する。エンドユーザが、比較可能であるかもしれないアミノ酸またはヌクレオチドベースコール（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ残基から構成される）の連続ストレッチ（contiguous stretches）を視覚的に同定しそして選択することは、直接的である。しかし、標的配列中に含まれる“Ｎｓ”の数または割合が増加するにつれ、エンドユーザが、その中の全配列またはサブ配列のいずれかの比較可能性を視覚的に決定することは急激により困難となる。
【００２８】
結果１１１は、高確率マッチ（high probability matches）１１１ａ、低確率マッチ（lower probability matches）１１１ｂ、およびかなり数の統計的に有意でない結果（significant number of statistically insignificant results）１１１ｃを含み、これは、データベースとのチャンスマッチ（chance match）に起因し得る。Ｎｓは、類似性サーチアルゴリズムによって“ａＮｙ”（ワイルドカード）文字として扱われ、デフォルトパラメータが使用される場合、Ｎは４つの塩基残基のいずれかまたはギャップであり得ることを意味する。リシークエンシングＤＮＡアウトプットの場合、Ｎは、リシークエンシングアルゴリズムがコールを解く（resolve）ことができないことを示し、そして４つの塩基
残基（Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）のいずれかまたは空間（empty space）に対応し得る（Korf et al., 2003）。非常に多くのノン−コール（non-calls）（Ｎｓ）がサブミットされる
配列中に含まれる場合、類似性サーチ（例えば、ＢＬＡＳＴ）は、受理可能なＥ（期待）値（例えば、１０ｅ−９）よりも高いＥ（期待）値を算出し、リターンされた配列はユニークではないという可能性がより高いことを示す。同様に、より短い配列は、高いＥ値を有し得、ユニークな（unique）ＤＮＡ物質の存在を決定することにおいてエンドユーザに対してそれらは使用できないこと（their lack of use）を示す。多数の曖昧な結果１１
１ｃを含む、結果１１１は、次いで、研究者によって分析される１１３に委ねられる。
【００２９】
図１０（ａ）の場合、他のユーザが示され、共有配列データベース１０９へ彼らのベースコール配列をサブミットし、これは、ローカルアラインメントサーチについてのこれらの更なるリクエストを処理する。上述されるように、共有配列アラインメントリソースへの複数のユーザによる曖昧な配列のサブミッションは、しばしば、少数の配列サブミッションだけに役立つように費やされている利用可能なコンピューティングリソースを生じさせる。
【００３０】
図１０（ｂ）は、研究者時間消費に関して問題である、産業において実際にしばしば見られるこの代替のケースを示す。前に示したケースとは対照的に、配列データ１０３は、ヒューマン研究者によって手動で行われる、カット・アンド・ペースト・オペレーション１１９において変化される。より詳細には、ヒューマン研究者は、しばしば、生データアウトプットを視覚的にスキャンし、そしてより少ない“Ｎｓ”を含むように見える生データアウトプット１１９のサブセットを主観的にコピー・アンド・ペーストし、そしてこれらの主観的な選択物１２１を比較１０９のためにサブミットする。しかし、サブセットの選択は、大量の生データについて主観的にかつ反復して行われるので、人間によって選択された提出物（submissions）１２１は、しばしば、比較可能１２１ａおよび比較不可能
１２１ｂデータを含む。したがって、ＢＬＡＳＴ比較１２３からの結果は、依然として、高確率マッチ（high probability matches）１２３ａから低確率マッチ（low probability matches）１２３ｂに及ぶ、可能性があるマッチの広範なアレイ（a wide array of possible matches）を依然として含み、このことは、類似性が低い配列マッチによって引き
起こされる低確率マッチの予想結果とは対照的に、多くの（to many）ノン−コール１２
３ｃが存在する選択物によってしばしば引き起こされる。
【００３１】
上記されるように、図１０（ｃ）は、有線または無線ネットワーク１２８上のコンピュータ端末によって配列データベースサーバとの相互作用についての一般的なシステム・レイアウトの概略図である。ある場合には、配列データベース（および関連するサーバ）１２７は、研究者の端末１２９から遠隔に配置されている。いくつか施設は、ローカル端末１３１を介してアクセス可能であるカスタム配列データベース（custom sequence databases）１３３を構築した。しかし、時間および共有リソース（shared resource）消費に伴う上述の問題は、公共データベースレベルの時間消費のより高い増加につれて、いずれの構成でも顕著である。
【００３２】
様々の異なる因子は、曖昧でない（non-ambiguous）ベースコールをリシークエンスＤ
ＮＡマクロアレイが作製することができないことに起因し得る。純粋な標的サンプルにおいて、ベースコーリング（base calling）（Cutler et al., 2001; Kozal et al., 1996
）に必要なハイブリダイゼーションパターンは、標的配列のストレッチ（a stretch of target sequence）がマイクロアレイ表面上にタイル張りされているプローブ配列とは十分に異なっている場合はいつでも、中断される（interrupted）。これは、リシークエンシ
ングマイクロアレイアウトプットファイルの中断位置（interrupted positions）へのＮ
コール（N calls）の導入を生じさせる。標的分子が低濃度で存在する場合、ならびに／
あるいは、標的サンプルが、純粋でなく、しかし低親和性でタイルドプローブへ非特異的に結合し得る種々の量の他の核酸分子を含有する場合、同一の効果が生じ、プローブセットに渡ってハイブリダイゼーション（蛍光）シグナルの低下したシグナル対ノイズ比（signal-to-noise ratio）を生じさせる。配列が比較可能データであるかあるいは比較不可
能データであるかをこれらの因子がどのように決定し得るかを例示するために、図１０（ｄ）は、不完全なハイブリダイゼーションが起こる場合に生じるリシークエンシングＤＮＡマイクロアレイアウトプットファイルの例を示す。示されるケースにおいて、配列１３５は、ＦＡＳＴＡフォーマットであるが、代替の配列データフォーマットも同様に好適であり、プレイン（plain）、ＥＭＢＬ、ＧＣＧ、ＧｅｎＢａｎｋ、およびＩＧが挙げられ
るが、これらに限定されない。見本配列（example sequence）１３６内に、配列サブセッ
ト（sequence subsets）１４０（サブ配列（subsequences））が存在する。見本サブ配列１４０は、過剰数のノン−コール（Ｎｓ）を有するサブ配列１３７、類似性サーチ（例えば、ＢＬＡＳＴ）から意味がある（meaningful）結果をリターンするには短すぎるサブ配列１３９、および意味がある結果を生じる傾向にあるサブ配列１４３を含む。さらに、複数の配列が、マイクロアレイ表面上に物理的に存在するプローブタイルセットを参照する、配列ヘッダー１３８に配置される、別名（aliases）によってセットオフ（set off）される。
【００３３】
全体として、産業プラクティス（industry practice）の現状に伴う上述の問題は、基
本的に、研究者時間消費（researcher time consumption）および共有リソース配分（shared resource allocation）に関連する。より詳細には、サンプルから得られるサブ配列
データの量が増加することは、共有リソース（例えば、配列比較データベース）の使用を急速に増加させる。このような急速な増加は、増大するコミュニティー（研究者およびデータの点で）をサポートするために、効率的な使用を必要とする。共有リソースをより効果的に使用する目的で、研究者は、現在、しばしば、比較のための配列サブセットを主観的かつ手動で選択することに時間およびリソースを捧げる必要性に直面する。
【００３４】
上述のように、既知の（known）配列および予期されない（unanticipated）配列の両方を迅速に検出し得る進歩した診断システムについての決定的な必要性が存在する。より詳細には、特に共有類似性サーチデータベースおよびシステム（shared similarity search
databases and systems）において、共有リソース使用の効率を増加させ、かつ、ヒューマンワークインプット（human work input）のための必要性を減少させる、ＤＮＡマイクロアレイ技術についての決定的な必要性が存在するままである。
【００３５】
研究者および共有コンピューティングリソースのより効率的な使用に関する産業における上記問題に加えて、世界の出来事の発展（the evolution of world events）ならびに
主流社会における生物テロおよび感染症の出現は、脅威同定および根絶のための新規、迅速、かつ正確な技術が開発されなければならないという、科学界および同様に素人の中での高まる感情へと導いた。広範囲の（broad-spectrum）病原体同定のコンセプトは、医療および国防の両方に対して相当かつ明白なアピールを有する。本発明者が努力したのは、この構想内である。さらに、配列データの供給源に関わらず、生物学的配列データからの、生物学的サンプル中の混合物（mixtures）および組換え物（recombinants）のより容易でありそして強力な（robust）決定についての必要性が存在するままである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３６】
発明の開示
本発明の目的は、以下の好ましい実施形態を提供することである：
本発明の実施形態において、固相支持体へ固定化された１３〜７０ヌクレオチドの範囲の長さのオリゴヌクレオチドプライマーの複数のグループのリシークエンシングＤＮＡマイクロアレイであり、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーの各グループは、参照配列（reference sequence）の特定の領域をスパンする（span）ように選択され、該アレイのディスクリート領域（discrete area）（例えば、タイル）を占有し、そして該チップ上
に平行に配置された少なくとも４セットのプライマーを含み：１）該参照配列に対して正確に相補性である第１セット；および２）３つのさらなるセットのプライマー（これらの各々は、中央の位置のヌクレオチド以外は該第１セットのプライマーと同一であり、これは、該３セットの各々において異なり、その結果、４つ全てのヌクレオチド塩基が該アレイ上に存在する）。
【００３７】
ａ．この実施形態の好ましい局面において、オリゴヌクレオチドプライマーの長さは、
２５ヌクレオチドである。
【００３８】
ｂ．この実施形態の好ましい局面において、前記オリゴヌクレオチドプライマーによってスパンされる前記参照配列の領域は、前記マイクロアレイ表面の各々の隣接するタイルド領域について、該参照配列を（ｎ＋１）ヌクレオチド移動する。
【００３９】
ｃ．この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイは、１８×１８ミクロンフィーチャー（micron features）を含む。
【００４０】
ｄ．この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイは、８×８ミクロンフィーチャーを含む。
【００４１】
ｅ．この実施形態の好ましい局面において、タイリング（tilling）のために選択され
る前記配列は、生物属、種および亜種の非常に広いクラスを表し得る単一遺伝子またはサブ配列（single gene or subsequence）である
ｆ．この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、病原体ファミリーの遺伝子型を表す“プロトタイプ（prototypes）”である。
【００４２】
ｇ．この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、アデノウイルスのファミリー（family）またはグループ（group）を示す“プロトタイ
プ”である。
【００４３】
ｈ．この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、インフルエンザウイルスのファミリー（family）またはグループ（group）を示す“プ
ロトタイプ”である。
【００４４】
ｉ．この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、個々の病原株（pathogenic strain）に特有の単一遺伝子またはサブ配列である。
【００４５】
ｊ．この実施形態の好ましい局面において、タイリングのために選択される前記配列は、薬剤耐性マーカー（drug-resistance marker）をコードする。
【００４６】
ｋ．この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイは、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＲＰＭＶｌ）である。
【００４７】
ｌ．この実施形態の好ましい局面において、前記リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイは、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＲＰＭＶ２）である。
【００４８】
ｍ．この実施形態の好ましい局面において、少なくとも１つの一般的な病原体および少なくとも１つの生物テロ薬剤（biological terrorism agent）が同一チップ上に提示される。
【００４９】
ｎ．この実施形態の好ましい局面において、リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイは、上述の局面の任意の組合せを包含する。
【００５０】
本発明の実施形態において、（ａ）上述のリシークエンシングＤＮＡマイクロアレイ、および（ｂ）該リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイ上に存在する前記プローブ配列への前記標的配列の特異的ハイブリダイゼーションに好適な試薬を含む、キットである。
【００５１】
本発明の実施形態において、微生物あるいは特定のクラスの生物種または亜種に属する微生物における薬剤耐性マーカー（drug-resistance marker）の存在を検出する方法であり、ここで該方法は、以下を含む：（１）上述のリシークエンシングＤＮＡマイクロアレイを提供すること；（２）未知のサンプル（unknown sample）を該リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイへ接触させること；（３）好適な条件下および好適な時間、該リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイ上に固定化された前記プローブ配列へ、該未知のサンプルの内容物をハイブリダイズすること；ならびに（４）該未知のサンプル中の微生物あるいは特定のクラスの生物種または亜種に属する微生物における薬剤耐性マーカーの存在および／またはアイデンティー（identity）を検出すること、ならびに（５）病原体の可能性のある供給源の法医学的評価（a forensic assessment of the possible source(s) of pathogens）を可能にするに十分な量の病原体配列を検出すること。
【００５２】
ａ．この実施形態の好ましい局面において、前記方法は、特定の病原体種の存在を検出するためである。
【００５３】
ｂ．この実施形態の好ましい局面において、前記方法は、薬剤耐性マーカーの存在を検出するためである。
【００５４】
ｃ．この実施形態の好ましい局面において、前記ハイブリダイゼーション時間は、１５分〜２４時間の範囲である。
【００５５】
ｄ．この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプルは、鼻洗浄試料（nasal wash specimen）、咽喉スワブ（throat swab）、血液サンプル、および痰サンプル（sputum sample）を含む生物学的サンプル、あるいは、土壌サンプル、空気サンプルおよび
水サンプルを含む環境サンプルである。
【００５６】
ｅ．この実施形態の好ましい局面において、前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルは、以下のステップの１以上に供される：（１）単離、（２）問題の標的配列についての濃縮（enrichment）、（３）増幅、（４）標識、および（５）ハイブリダイゼーション（例えば、サブトラクティブ）。
【００５７】
ｆ．この実施形態の好ましい局面において、前記ハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプル中の問題の１以上の標的核酸は、特異的逆転写（specific reverse transcription）（ＲＴ）、ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ（multiplex PCR）および／また
はランダムＰＣＲ（random PCR）によって増幅される。
【００５８】
ｇ．この実施形態の好ましい局面において、問題の標的核酸をハイブリダイズすることの前に、前記未知のサンプルは、ランダム増幅戦略（random amplification strategy）
（例えば、ランダムプライムド（random primed）、アイソサーマルＫｌｅｎｏｗポリメ
ラーゼベースト（isothermal Klenow polymerase-based）、Φ２９ＤＮＡポリメラーゼベースト（Φ29DNA polymerase-based）、タンデム増幅（tandem amplification）、マルチプレックスＰＣＲ（multiplex PCR）、およびトータル増幅（total amplification））へ供される。
【００５９】
ｈ．この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する遺伝物質は、濃縮されている。
【００６０】
ｉ．この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する問題の標的核酸は、該サンプルからのバックグラウンド核酸のサブトラクション（subtraction）
により濃縮される。
【００６１】
ｊ．この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する問題の標的核酸は、該未知のサンプルに存在する（presenting）核酸の混合物からの該標的核酸の選択的除去（selective removal）によって濃縮される。
【００６２】
ｋ．この実施形態の好ましい局面において、前記未知のサンプル中に存在する問題の標的核酸は、完全または部分配列相同性を有するプローブを使用しての選択的捕獲（selective capture）によって濃縮され、増幅および前記マイクロアレイへのハイブリダイゼー
ションが続く。
【００６３】
ｌ．この実施形態の好ましい局面において、前記存在および／またはアイデンティティーを検出することは、以下による：（ａ）前記未知のサンプル中の問題の核酸と前記リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイ上の前記プローブＤＮＡとの前記ハイブリダイゼーション応答に基づいてベースコール（base calls）を作製すること、ならびに（ｂ）該ハイブリダイズされた領域の配列を、配列データベース中に存在する配列と比較することによって、対応する全長遺伝子またはゲノムフラグメント（genomic fragment）の配列を決定すること。
【００６４】
ｉ．特に好ましい局面において、前記ベースコールは、“許容性（permissive）”セッティッング下でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＤＡＳソフトウエアによって作製される。
【００６５】
ｉｉ．特に好ましい局面において、配列決定は、Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＥＰＩ）ソフトウエアによる（２００４年９月１５日に出願された米国仮出願シリアル番号第６０／６０９，９１８号、および２００４年１１月２９日に出願された米国仮出願シリアル番号第６０／６３１，４６０号を参照のこと）。
【００６６】
ｉｉｉ．特に好ましい局面において、前記配列データベースはＧｅｎＢａｎｋである。
【００６７】
本発明の実施形態において、上記Ｃの方法を使用することによる、生物テロ薬剤（biological terrorism agent）および／または一般的な呼吸器病原体（respiratory pathogens）のルーチン診断（routine diagnosis）の方法である。
【００６８】
本発明の実施形態において、Ａｄ３、Ａｄ３ＦＳ＿ｎａｖｙ、Ａｄ４、Ａｄ４ｖａｃｃｉｎｅ、Ａｄ４ＦＳ＿ｎａｖｙ、Ａｄ４ＦＳ＿ＡＦ、Ａｄ５ＦＳ、Ａｄ７、Ａｄ７ＦＳ＿ｎａｖｙ、Ａｄ７ｖａｃｃｉｎｅ、Ａｄ１６、Ａｄ１、およびＡｄ２１、ならびにそれらのフラグメントを含む、本発明の日付で知られていなかった、１３アデノウイルス株のゲノム配列である。
【００６９】
本発明の実施形態において、上記Ｃの方法を使用することによる、生物テロ薬剤および／または一般的な呼吸器病原体のサーベイランス（surveillance）の方法である。
【００７０】
本発明の実施形態において、以下を含む、病原体を含有する生物学的サンプル中の病原体の相対量を評価する方法である：上述のリシークエンシングＤＮＡマイクロアレイを提供すること；（２）該生物学的サンプルを該リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイへ接触させること；（３）好適な条件下および好適な時間、該リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイ上に固定化された前記プローブ配列へ、該未知のサンプルの内容物をハイブリダイズすること；ならびに（４）該未知のサンプル中の微生物あるいは特定のクラスの
生物種または亜種に属する微生物における薬剤耐性マーカー（drug-resistance marker）の存在および／またはアイデンティティーを定量すること。
【００７１】
ａ．この実施形態の好ましい局面において、前記定量することは、前記チップ上のハイブリダイゼーションシグナルの絶対強度を測定することによる。
【００７２】
ｂ．この実施形態の好ましい局面において、前記定量することは、前記トータルタイル領域サイズのパーセンテージとして、およびスライディングウィンドウアルゴリズム（sliding window algorithm）（即ち、ＲＥＰＩ）を満足する選択されるサブ配列中のベースコールのパーセンテージとして、ベースコールのパーセンテージを測定することによる。
【００７３】
本発明の他の局面は、少なくとも１つの選択パラメータ（selection parameter）に従
って生物学的配列データからサブ配列を選択するための、コンピュータ−インプレメンティッド・バイオロジカル・シークエンス・アイデンティファイヤー（computer-implemented biological sequence identifier）（ＣＩＢＳＩ）システムを提供する。該少なくと
も１つの選択パラメータは、類似性サーチから意味がある結果をリターンする可能性に対応する。
【００７４】
本発明のさらなる実施形態において、所定のセットの既知の配列に対する比較のための最適な配列またはサブ配列の自動選択のためのシステムを提供する。必要に応じて、該システムは、Ｎｓが散在する高度にフラグメント化された配列を自動的に取り（take）、そして類似性サーチから“意味がある”結果（“meaningful” result）をリターンする傾
向にある比較可能なサブ配列を選択する。
【００７５】
必要に応じて、該システムは、サブ配列を選択するためにスライディングウィンドウタイプアルゴリズム（sliding window-type algorithm）を使用する。引き続いて、該シス
テムは、エンドユーザへ類似性サーチからのアウトプットを自動的にリターンし、これは、与えられるベースコールセットが特定の所定の配列に対応する可能性の確率的評価（probabilistic assignments）を可能にする。
【００７６】
本発明のさらなる実施形態において、ベースコーリングアルゴリズム（base-calling algorithm）から誘導される配列情報は、マイクロアレイハイブリダイゼーションパターンに適用される場合、テストサンプル中に存在する個々の生物学的エンティティー（biological entities）を同定するために使用される。必要に応じて、マイクロアレイのリシー
クエンシングプローブによって決定される標的配列の配列は、類似性サーチアルゴリズムを使用してデータベースにクエリーする（query）ために使用される。類似性サーチアル
ゴリズムとしては、与えられる標的配列がデータベース記録中の特定の配列に対応する可能性を統計的に測定するために、一般的に使用されるローカルアラインメント（local alignment）（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＢＬＡＳＴＮ）配列アラインメン
トアルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない（Korf et al., 2003）。
【００７７】
さらに、本発明のさらなる実施形態は、少なくとも１つの標的配列がサンプル中に存在するかどうかに関して、ユーザへ類似性サーチの結果を提示する。
【００７８】
本発明の別の実施形態において、シグナル強度データ（例えば、マイクロアレイから得られる）は、前記システムによって取り扱われ（handled）、そして前記配列データと関
連する。類似性サーチのアウトプットは、ユーザへの提示のためにアセンブル（assembled）またはディスティル（distilled）されて、生物学的エンティティー（病原体を含むが、これに限定されない）が存在するか否かを伝達する。さらに、強度データは、上記アウトプットと関連しており、存在する生物学的エンティティー（病原体を含むが、これに限
定されない）の相対存在量（relative abundances）を帰する（ascribe）。必要に応じて、該システムは、リシークエンシングマイクロアレイアッセイにおいて検出された病原体の相対量の推定値（量子化（quantization））をエンドユーザに与える。
【００７９】
本発明の別の局面は、配列の混合物と組換え事象を示す配列とを同定する。１つの実施形態において、前記システムは、マイクロアレイの異なるタイルド領域上のオーバーラップする（overlapping）または相同の（homologous）配列フラグメントを自動的に検出し
、配列の混合物の推測（inference）を可能にする。さらなる実施形態において、前記シ
ステムは、異なるタイルド領域からの配列アウトプットは重複するのではなく、遺伝子組換え事象を推測するために使用され得る連続配列に対応することを決定する。必要に応じて、前記システムは、異なる混合物間および異なる配列間の遺伝子組換えを識別する。
【００８０】
本発明の別の局面は、リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイの“プロトタイプ”領域（“prototype” regions）（米国仮出願シリアル番号第６０／５９０，９３１号を参
照のこと）を設計する方法を提供する。このケースにおいて、関連標的配列のセットは、マルチプル配列アラインメントアルゴリズム（multiple sequence alignment algorithm
）、例えばＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌ＿Ｘ（Thompson et al., 1997; Thompson, Higgins & Gibson, 1994）、あるいは部分的に保存された領域についての配列デー
タベースをサーチする別の方法、例えばＨＭＭｅｒ（Eddy, 1998）を使用して比較され、このアウトプットは、アラインメントカラムにおける所定の残基位置での最も頻度の高いヌクレオチドから構成されるコンセンサス配列を作製するために使用される。該コンセンサス配列（consensus sequence）は、コンセンサスベースコールおよびノー−コール（no-calls）（Ｎｓ）の混合物からなり、ここで、ノーコンセンサス（no consensus）は、該アラインメントカラムにおける残基位置の各々について達成され得る。
【００８１】
必要に応じて、本発明の実施形態は、リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイ上に候補領域を保存されたおよび可変のヌクレオチドの許容されるバランスを有するそれらの領域を決定することによってサーチし、リシークエンシングマイクロアレイタイル領域への標的のハイブリダイゼーションを可能にするが依然として十分な配列変動性を可能にする。これは、該コンセンサスを作製するために使用される該アラインメントを含む、配列類似性サーチに基づく標的配列の同定を可能にする。
【００８２】
代替の実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、(Shendure et al., 2004)に記載されるものを含む配列ジェネレータの代替形態とタンパク質配列を形成するよ
うにアセンブルされ得る部分アミノ酸配列に由来する。該システムの選択された実施形態は、相対位置が保存されたアミノ酸又はタンパク質配列を扱う。
【００８３】
他の選択された実施形態において、前記ヌクレオチド配列は、蛋白質合成をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）転写物を含む。標的核酸における混合物対組換え事象を決定するために記載されたのと類似の様式で、ＲＮＡ転写物の混合物は、タイルドマイクロアレイ上においてハイブリダイズされそしてしたがってリシークエンスされ得、本発明を使用して分析され得る生データを作成し、転写物の編集および代替スプライシングによる組換えと比較して異なるＲＮＡ転写物の相対量を測定する（Leipzig, Pevzner & Heber, 2004）。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態は、ヌクレオチド、転写産物、アミノ酸、またはそれらの任意の混合物に適用可能である。さらに、本発明はまた、当該分野において周知である程度まで、種々のタイプの配列データベースおよび類似性サーチアルゴリズムに適用可能である。さらに、本発明の実施形態は、配列データを作成する広範囲の方法および／またはデバイスについて適しておりまたは適応可能であり、以下が挙げられるが、これらに限定されない：手動または自動Ｓａｎｇｅｒ配列決定（manual or automated Sanger sequencin
g）、ショットガン配列決定（shotgun sequencing）、従来のマイクロアレイ（conventional microarrays）、リシークエンシングマイクロアレイ（resequencing microarrays）
、マイクロ電気泳動配列決定（microelectrophoretic sequencing）、ハイブリダイゼー
ションによる配列決定（sequencing by hybridization）（ＳＢＨ）、エドマン分解法お
よびその変形法（Edman degradation and variants thereof）、増幅分子についてのサイクリック−アレイ配列決定（Cyclic-array sequencing on amplified molecules）、増幅分子についてのサイクリック−アレイ配列決定（Cyclic-array sequencing on amplified
molecules）、およびノン−サイクリカル，シングル−モレキュール，リアルタイム法（non-cyclical, single-molecule, real-time methods）（Ｓｈｅｎｄｕｒｅら、２００４）。
【００８５】
上記目的は、本発明の特定の局面を強調する。本発明のさらなる目的、局面および実施形態は、本発明の以下の詳細な説明において見られる。本発明の他のシステム、方法、特徴、および利点は、以下の図面および詳細な説明の検討の際に当業者に明らかであるか明らかとなる。全てのこのようなさらなるシステム、方法、特徴、および利点は、本明細書中に含まれ、本発明の範囲中に含まれ、そして添付の特許請求の範囲によって保護されることが意図される。
【００８６】
本発明およびその付随する多くの利点のより完全な認識は、それが以下の詳細な説明と組み合わせて以下の図面を参照することによってより十分に理解されるようになるので、容易に得られる。
図面におけるコンポーネントは拡大する(scale)必要はなく、本発明の原理を明確に例
示する際に代わりに強調が置かれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８７】
本発明を実施する形態
特に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術および科学用語は、酵素学、生物化学、細胞生物学、分子生物学、バイオインフォマティクス、および医学における当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。
【００８８】
本明細書中に記載されるものと類似または等価の全ての方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得、好適な方法および材料が本明細書中に記載されている。コンフリクトの場合、定義を含む、本明細書は、コントロールする。さらに、材料、方法、および実施例は、特に明記されない限り、例示のみであり、そして限定的であるように意図されない。
【００８９】
ＤＮＡマイクロアレイが、診断またはサーベイランス目的のために、病原体由来の標的核酸の配列を分析するために使用され得ることは周知である。オリゴヌクレオチドプローブ配列選択、鎖長、表面上におけるポジショニング、結合の物理化学、および標識技術の効果は、過去１０年間、活発な研究のトピックスである。しかし、今まで、採用されたアプローチは、高特異性で単一の認識される病原体標的配列（１３〜２５量体）へ、あるいはより低い程度の特異性で病原体標的のより長いストレッチ（stretch）（７０量体）へ
、ハイブリダイズするように特異的に設計される単一オリゴヌクレオチドプローブ（１３〜７０量体）の使用を、ほぼ例外なく含んできた。これらのマイクロアレイは、スポッテッドマイクロアレイ（spotted microarrays）として一般的に知られており、しかし、ス
ポッテッドマイクロアレイの同一コンテント（content）はまた、２次元平面表面（two-dimensional planar surfaces）に加えて他の形態で具体化され得、１つの例は“ビーズアレイ（bead arrays）”である（Ferguson, Steemers & Walt, 200）。
【００９０】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシングマイクロアレイを使用する病原体同定およびキャラクタライゼーションの遥かに少ない説明が存在している。Ｋｏｚａｌ（Ｋｏｚａｌら，１９９６）は、ＨＩＶにおける突然変異ドリフト（mutational drift）を測定し、そしてＧｉｎｇｅｒａｓ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，１９９８；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，２００１）、およびＴｒｏｅｓｃｈ（Ｔｒｏｅｓｃｈら，１９９９）は、リシークエンシングアレイを使用して抗生物質耐性に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）およびマイコバクテリア種を同定した。Ｗｉｌｓｏｎら（Ｗｉｌｓｏｎら，２００２ａ）は、リボソームＲＮＡを使用しての細菌同定のために、および複数の生物戦争薬剤の検出のために、同一タイプのアレイを使用した（Ｗｉｌｓｏｎら，２００２ｂ）。
【００９１】
同時病原体同定およびサーベイランスのためのリシークエンシングマイクロアレイの使用は、単一オリゴヌクレオチドアプローチに優る基本的な利点を有し、何故ならば、詳細な標的配列情報が、生マイクロアレイデータの一部として直接利用可能であるからである。定義によれば、１０２〜１０４オリゴヌクレオチドプローブを有するスポッテッドマイクロアレイは、該アレイがタイリング戦略（tiling strategy）で設計されていたとして
も、１０〜１０００塩基対を超える総標的配列について、僅かな配列変化を解決する（resolve）ことができない。したがって、個々の株またはＳＮＰレベルでの広範囲の病原体
の同定を促進するスポッテッドオリゴヌクレオチドマイクロアレイは（Ｃｈｅｒｋａｓｏｖａら，２００３；Ｗａｎｇら，２００２；Ｗａｎｇら，２００３）、専門的な機材、人材、および数日の時間を必要とする、従来のＤＮＡ配列決定技術を使用して病原体標的配列が決定されることを必要とする。
【００９２】
したがって、本発明は、一般的に、ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用しての、細菌、ウイルスおよび原生動物病原体ならびにビルレンスマーカー（virulence markers）の検出
および同定に関する。本発明はまた、多数の特定の病原体遺伝子型および病原体の混合物について数的検出確率（numeric detection probabilities）を評価するために使用され
得る、所定の領域を有するリシークエンシングマイクロアレイの設計、試験、および分析に関する。さらに、それは、該マイクロアレイのための、シンプルおよびコンプレックス（例えば、臨床的および環境的）サンプルの両方の処理のために必要とされる方法に関する。
【００９３】
より詳細には、本発明は、感染症因子（infectious disease agents）の診断および病
原体サイベーランスを含む目的のための新規のクラスのデバイスとしてのハイプルーラリティ（high plurality）リシークエンシングマイクロアレイの使用に関する。特に、それは、標的ゲノム配列からの多数の（数百〜数千）の選択される“プロトタイプ”核酸配列領域（典型的に、各々、２５０〜２０００塩基対）を使用し、対数的により多数の（数千〜数万）の関係がないおよび密接に関係がある（株レベル）の両方の細菌病原体を検出および同定する、ＤＮＡマイクロアレイに関する。より詳細には、本発明は、“タイルド”プローブアプローチを使用して標的核酸のリシークエンシングを可能にするように作製されるマイクロアレイの設計に関する。なおより詳細には、本発明は、１０５〜１０６塩基対までの標的配列の分析を可能にする、タイルドプローブを使用するAffymetrixリシークエンシングマイクロアレイの設計に関する。
【００９４】
特定の実施形態において、本発明は、核酸配列を検出し、そして該検出された配列を公共および私有データベースに対しての自動類似性サーチへ供することによる、多数の病原体を同時に評価するための方法を提供する。この目的は、市販の技術（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭ）の非自明である適応によって達成される。使用されるプログラム、ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭは、標的ＤＮＡをリシークエンスすることによる一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のために設計された。このいわゆるＳＮＰ検出は、以下を要求する（calls for）：（１）突然変異の天然に生じる頻度（ヒトにおいて１０８塩基対当た
り約１）よりも遥かに低いベースコーリングのエラー率（an error rate in base calling）、（２）特異的ＰＣＲプライマーを使用してのマイクロアレイハイブリダイゼーショ
ンの前の、１０６ゲノムコピー／マイクロリットルの濃度の、精製した出発材料の増幅、ならびに（３）低頻度ＳＮＰｓの存在が推定される信頼度を有するものへベースコールを限定するアルゴリズムによる、複製サンプルについてのコンビネーションおよびプロセッシングマルチプルチップ。本発明者は、ポイント−オブ−ケア（point-of-care）診断適
用を可能にする、サンプル調製複雑性のレベルおよび時間スケールでの高多様性感染症診断および病原体サイベーランスのための総合システムへの挿入にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシング技術が適応され得ることを実証する。このシステムは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ技術の意図される用途とは実質的に異なり、そしてマイクロアレイ技術の典型的な当業者に自明でなはい。
【００９５】
現在、病原体同定へのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシング技術の適用のほとんどないが関連する文献記載が存在する。設計、実験、および分析観点から、本発明は、リシークエンシングを使用して、病原体キャラクタライゼーションにおける先行技術に優る実質的な利点を有する。Ｋｏｚａｌ（Ｋｏｚａｌら，１９９６）は、ＨＩＶにおける突然変異ドリフト（mutational drift）を測定し、そしてＧｉｎｇｅｒａｓ（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，１９９８；Ｇｉｎｇｅｒａｓら，２００１）、およびＴｒｏｅｓｃｈ（Ｔｒｏｅｓｃｈら，１９９９）は、リシークエンシングアレイを使用して抗生物質耐性に関連するＳＮＰｓおよびマイコバクテリア種を同定した。これらのケースの各々において、可能性のある標的配列のアラインメントに基づいて、最適化された配列が、タイルのために選択された。特異的なＰＣＲプライマーは、ハイブリダイゼーションのために標的を増幅するように設計された。未知の臨床分離株同定は、該アレイへの実験的に測定されるディファレンシャルハイブリダイゼーションパターンに基づく、パターン認識アルゴリズムを使用して行われた。したがって、このアプローチは、標的配列の全長の増幅およびハイブリダイゼーションに依存し、以下に敏感（amenable）ではない：（１）失われたベースコールを生じる混同非特異的結合の寄与、（２）低相同性によって引き起こされるギャップ（gaps）または低標的濃度に起因する標的の鎖長に渡る不完全なハイブリダイゼーション、ならびに（３）臨床または環境サンプル由来の未知の標的配列の偏りのない（non-biased）（トータル）増幅によって引き起こされる弱められたハイブリダイゼーション完全性。
【００９６】
本発明者によって提供される方法は、リシークエンシングマイクロアレイを使用する先行技術において開示されるものと同一の限定を共有しない。さらに、少なくとも１つの意図される用途のための技術実施可能性（technology enablements）、即ち多数の様々な病原体種の同時検出は、ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭＲＰＭＶ１チップについてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（１８×１８ミクロンフィーチャー）そしてＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２（ＲＰＭＶ２）についてより高密度（８×８ミクロンフィーチャー）の導入で最近になってやっと行われており、それぞれ２９．７ｋｂおよび３００ｋｂがリシークエンシングのためにタイル張りされることを可能にする。しかし、本発明によって提供される最も顕著な改良点は、配列鎖長独立類似性サーチ（sequence length-independent similarity searches）（ＢＬＡＳＴＮ）での高密度チ
ップ（the increased density chips）の使用であり、これは、タイリング（tiling）の
ために配列を選択する前に、遥かに少ない想定が成されなければならないことを提供する。さらに、鎖長独立類似性サーチ（ＢＬＡＳＴＮ）の使用は、特定の既知のサブ配列が完全にリシークエンスされるという制約を排除し、本アプローチを、標的濃度のバリエーションおよび欠けたベースコールへ導く非特異的結合からの寄与に対してより耐性（resistant）にする。
【００９７】
したがって、本発明において、タイリングのために選択される配列は、単一遺伝子またはサブ配列がより広範囲のクラスの生物種および亜種（あるいは、タイプ、株、変異体（
variants）、または突然変異体（mutants））を提示し（represent）得るという意味で、“プロトタイプ”である。得られる方法は、個々の病原体および株の遺伝子型の軽微な変更に関して強く（robust）、そしてタイルド領域を含む実験チップレイアウトの設計において明確には示されないかもしれない複数の候補病原体の中からの検出および有望な（probable）同定を可能にする。
【００９８】
チップレイアウトはまた、部分的に重複する（redundant）タイルセット（これらは、
設計の間に製造業者によっておよび製造業者設計ガイドラインによって阻止された）、単一病原体株内のおよび複数の類似のまたは異なる病原体タイプ間の遺伝子内および遺伝子間の両方のバリエーションを利用する。しかし、本発明者は、該重複（redundancy）が結果に対する信頼を上げるため、および偽陽性および偽陰性結果の可能性を最小限にするために重要であると結論した。この設計/分析アプローチの利点は、ゲノムの保存および超
可変領域の両方の組み込みを可能にし、グループ、タイプ、および株レベル同定を促進する。
【００９９】
ほんの少数の文献が、微生物病原体のマイクロアレイ分析用のための包括的な増幅戦略について記載する。Ｗａｎｇら（Ｗａｎｇら、２００２）は、７０量体オリゴヌクレオチドアレイ上におけるハイブリダイゼーションの前に、逐次（sequential）ＰＣＲおよびＫｌｅｎｏｗフラグメントベース増幅が続く、ＲＮＡ病原体標的の増幅のための複数ステッププロセスを記載する。この増幅のために必要とされる技術ステップの時間および数は、明記されていなかったが、同一グループからの引き続いての論文（Ｗａｎｇら、２００３）は、それは約２４時間であることを報告した。増幅ステップのどれが増加された検出効率を生じたかも明記されなかった。本発明者のグループからの最近の報告は（Ｖｏｒａら、２００４）、７０量体オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーションのための、個々でまたは組み合わせて、種々の非特異的核酸増幅技術を記載する。リシークエンシングマイクロアレイへのハイブリダイゼーションのための、精製されたまたは複雑な混合物（例えば、臨床サンプル）における、ＤＮＡ標的の非特異的増幅の分野における先行技術の公知の報告は、存在しない。
【０１００】
本発明は、一般的に、いくつかの方法で、マイクロアレイによる病原体検出のための包括的な増幅（generic amplification）の技術を発展させる：（１）それは、高密度ショ
ート（２５量体）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシングマイクロアレイへの提示のための精製されたまたは高度に濃縮された病原体核酸のトータル増幅の特別な方法を詳述し、これは、以前に記載されてもおらずまたは自明でもなく、何故ならば、本方法は、指示されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルから大きく逸脱しているからである、ならびに（２）それは、酵素的プロセス、競合ハイブリダイゼーション、およびマグネチックビーズベースサブトラクティブおよび濃縮ステップ（バックグラウンドを減少させるため）、および引き続いてのノンバイアスの（non-biased）（即ち、トータル）増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーションの使用への新規の代替アプローチを記載する。
【０１０１】
本発明は、リシークエンシングマイクロアレイを使用することによる、広範囲の病原体同定およびキャラクタライゼーションを可能にする設計およびプロセッシング方法の特定のセットによって具現化される。詳細には、本発明は、単一アッセイにおける、非常に多数の（large multiplicity）（数千）の病原体の正確、高感度、かつ高信頼性同定を可能にする。
【０１０２】
本発明の実施形態において、固相支持体に固定化された１３〜７０ヌクレオチド（この限定される範囲内の各整数値に対応するプライマー長さを使用することは可能でありそして本発明の範囲内であるが、好ましくは２５ヌクレオチド）の範囲の長さのオリゴヌクレオチドプライマーの複数のグループのリシークエンシングＤＮＡマイクロアレイチップで
あり、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーの各グループは、参照配列の特定の領域をスパンするように選択され、該アレイのディスクリート領域（discrete area）（例えば
、タイル）を占有し、そして該チップ上においての平行に配置された少なくとも４セットのプライマーを含む：１）該参照配列に対して正確に相補性である第１セット；および２）３つのさらなるプライマーのセット（これらの各々は、中央の位置のヌクレオチドについて以外は該第１プライマーと同一であり、これは、該３セットの各々において異なり、その結果、４つ全ての通常のヌクレオチド塩基が該アレイ上に存在する）。
【０１０３】
本発明は、さらに、最小限の核酸単離／増殖ステップを必要とする、複雑な臨床サンプル（complex clinical samples）（例えば、鼻洗浄物（nasal wash））を処理するための方法を提供する。
【０１０４】
本発明は、圧倒的多数のマイクロアレイに基づく病原体検出スキームとは異なっており、何故ならば、それは、病原体遺伝的標的の実際の配列を測定するために高密度“タイルド”マイクロアレイを使用するからである。それは、さらに、以下の組み込みを含む、多数の重要なエリアにおいて、他のリシークエンシング病原体同定戦略と比べて独特である：（１）ほとんど識別可能でないかかまたは全く識別可能でない互いとのクロスハイブリダイゼーションまたは干渉を示す、異なる病原体“プロトタイプ”標的領域の高い多様性（high multiplicity）、（２）特定の株のより信頼性の高い同定を可能にする、密接に
関連する病原体中の高い配列重複（high sequence redundancy）、（３）特定の病原体株の正確な同定を可能にする、あるクラスの病原体を代表する大きなタイルドセグメントの“プロトタイプ”領域、ならびに最も密接に関連する先行技術（米国特許第６，２２８，５７５号）において記載されるより制限的なタイル選択およびディファレンシャルアルゴリズムの代わりに、病原体間の組換え事象と病原体混合物との識別を可能にする、類似性サーチ（例えば、ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムへの提示のための配列フラグメントを解析（parse）およびアレンジ（arrange）するための特別に設計されたソフトウエアの使用、（４）有意な干渉（interference）またはクロスハイブリダイゼーション無しに、正確で高信頼性の病原体標的リシークエンシングを可能にする、最小限に偏った（minimally-biased）核酸増幅戦略、ならびに（５）該リシークエンシングアレイが、複雑な臨床サンプルについて最小限に偏った核酸増幅戦略と組み合わせて使用されることを可能にする、サンプルプロセッシング方法論。
【０１０５】
これらの方法の組合せは、２４時間以内、しかし好ましくは４時間以内、より好ましくは２時間以内、最も好ましくは３０分以内での１人の有資格技術者（qualified technician）による、臨床サンプル由来の非常に多様な（high multiplicity）病原体の同時検出
および同定を可能にする。
【０１０６】
したがって、その実施形態に起因して、本発明は以下をサポートする：（ａ）サンプルコレクションの数時間内の臨床セッティングにおける感染のルーチン診断、（ｂ）希少な感染事象（infectious event）（例えば、予期されない病原体、抗生物質耐性パターンまたは生物戦争薬剤（biological warfare agent））についての同定のための該サンプルの同時インタロゲーション（simultaneous interrogation）、（ｃ）ルーチン分子病原体サーベイランス、（ｄ）ワクチン品質管理、ならびに（ｅ）天然の遺伝的変異の結果として病原体の遺伝的変化、薬物治療、意図的操作（intentional manipulation）、または他の事象の、モニタリング。
【０１０７】
高密度リシークエンシングマイクロアレイ
高密度マイクロアレイ（High-density microarrays）（ＨＤＭ）は、ＤＮＡオリゴマーのライト−ディレクテッドコンビナトリアル合成（light-directed combinatorial synthesis）によって製造される（Ｋｏｚａｌら、１９９６）。これらの部位において合成され
るＤＮＡオリゴマーは、２０〜３０塩基の鎖長を有する。高分解能半導体フォトレジストを使用する方法への引き続いての改良を通じて、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘは、ＲＰＭＶ１において実証されるものよりも１０〜１００倍高いプローブフィーチャー密度を可能にする、１μｍ２に近づく分解能を有する個々のフィーチャーを有するＨＤＭの製造を実証した。今まで、病原体同定に関するＨＤＭ設計は、“タイリング”戦略に基づいてきた。したがって、等しい鎖長の４個のプローブが、センスおよびアンチセンスの両方向で、各塩基について合成され、合計で８個の２５量体プローブが所定の参照配列における各塩基対について使用されることを必要とする。各方向（センスおよびアンチセンス）における１個のプローブは、参照配列を正確に相補し、一方、残り３個は、インターロゲーションされる（interrogated）塩基の位置に単一塩基ミスマッチ（single base mismatch）を有する。したがって、タイルドＨＤＭ（tiled HDM）は、効率的に、標的核酸が“リシークエン
ス”されるのを可能にし得る。
【０１０８】
このように、未知の標的のベースコールは、４個の可能な塩基位置のうちの１個（タイルド２５量体プローブの第１３位で変化されたあらゆる４個の可能性のある塩基対のうちの１個）の各々でインターロゲートされ、該アレイを横断する対応の位置からの標的配列の直接読み出しを可能にする。ＣｕｓｔｏｍＳｅｑアレイの場合、ＧＣＯＳ（バージョン１．１）ソフトウエアは、生イメージ（．ＤＡＴ）ファイルを単純化したファイルフォーマット（．ＣＥＬファイル）へリデュースする（reduce）ために使用され、強度を対応するプローブ位置の各々へ帰属する。最後に、ＧＤＡＳ（バージョン２．０）ソフトウエアが、ＡＢＡＣＵＳ（Ｃｕｔｌｅｒら、２００１）アルゴリズムの埋め込みバージョン（embedded version）を適用するために使用され、センスおよびアンチセンスプローブセットについてのそれぞれの強度を比較して、正しいベースコールの推定値を作製する。ＧＤＡＳからの利用可能なエクスポートファイルタイプの１つは、リシークエンシングアレイの各タイルド領域について作製されるＦＡＳＴＡフォーマット化ベースコールである。
【０１０９】
上述のタイプのＨＤＭは、ＨＩＶを含む、培養微生物を使用する一連のインビトロ実験において、病原体種を同定しそして薬剤耐性付与突然変異（drug resistance-conferring
mutations）を検出するために使用されてきた（Ｋｏｚａｌら、１９９６）。Ｔｒｏｅｓｃｈら（Ｔｒｏｅｓｃｈら、１９９９）は、ＨＤＭを設計し、５４の異なるもの（54 different）を識別し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓリファンピン耐性を検出した。６５，０００オリゴマープローブのタイルドアレイが使用され、１５のリファンピン耐性Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ株および２７のマイコバクテリア種の７０の臨床分離株を正確にリシークエンスした。より最近では、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓおよびＹ．ｐｅｓｔｉｓの配列特異的同定が、タイルドＨＤＭを使用して環境サンプルにおいて実証された（Ｗｉｌｓｏｎら、２００２ｂ）。これらの一般的なアプローチは、両方とも、グラウンドトゥルース（ground-truth）（コントロール）測定に基づく特異的ハイブリダイゼーションパターンに依存する。さらに、これらの著者らは、６桁の大きさで変動し得る出発濃度について、密接に関連する（closely-related）かまたは予期されない（unanticipated）生物に対して、どのように定量比較が行われ得るかについて方向を提供していない。
【０１１０】
アレイタイプ
本発明は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑリシークエンシングマイクロアレイを使用して開発される。リシークエンシングマイクロアレイの議論については、当業者はＵ．Ｓ．６，２２８，５７５へ向けられる。しかし、本発明は、その特定の製造戦略を使用して作製されるマイクロアレイに概念的に限定されない。原理的には、リシークエンシングは、このアプローチを可能にするに十分なフィーチャー密度を有するマイクロアレイを製造することが出来るいかなる技術をも用いて記載される規模で行われ得る。理論的には、これは、オリゴヌクレオチド印刷技術を使用して達成され得るが、それは、フォ
トリソグラフィーアプローチを使用して達成される可能性がより高い。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシングチップは、各ステップに対応する別個のマスクを使用する逐次リソグラフィーステップに基づくが、代替アプローチは、マスクレスリソグラフィー（Ａｌｂｅｒｔら、２００３；Ｎｕｗａｙｓｉｒら、２００２）を使用し得るか、またはナノリソグラフィー法（Ｇｉｎｇｅｒ、ＺｈａｎｇおよびＭｉｒｋｉｎ、２００４）による。より一般的には、標的配列を測定する目的のために複数のオリゴヌクレオチドプローブを作製するいかなる方法も適用可能であり、２次元フォーマットでないビーズ“アレイ”（bead "arrays"）でさえ適用可能である（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、２０００）。
【０１１１】
プローブ自体は、ＤＮＡの変形物（variants）、即ちＲＮＡまたはオリゴマーペプチド−核酸（oligomeric peptide- nucleic acids）（ＰＮＡ）から構成され得る。プローブ
は、酵素消化に感受性にされ、次いで、引き続いての操作に従う（subject to）ようにされ得る。好ましい実施形態において、プローブは、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを組み込み、それらをウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼに感受性にする。これは、標的の捕獲に続く選択的分解にそれらを敏感にする（amenable to）。さらに、本発明の範囲内におい
て、ＲＮＡを固定化しそしてその相補配列認識を得ることも可能である。ＲＮＡの固定化は、ＲＮＡの化学的安定化を必要とする。より一般的な意味において、プローブは、引き続いての化学処理ステップに対してそれらを多少感受性にする化学的に修飾された核酸から作製され得る。
【０１１２】
アレイ設計
ＲＰＭＶ１マイクロアレイを使用して、本発明は、特定のハイブリダイゼーションパターンが特定の病原体同定のために必要とされることを想定することなく、多種多様の特定の病原体株を同定するタイルドプロトタイプ配列の能力を示す。現在の装置において、タイルド領域のためのプロトタイプ、特に、アデノウイルス４、５、および７についてのものが、それぞれ、アデノウイルス  サブグループＥ、Ｃ、およびＢを代表するために経験的に選択された。 
【０１１３】
該設計へのより好ましくそして体系的なアプローチは、コンセンサス配列を作製するために、複数の配列アラインメントの使用を含み、ここで、コンセンサス配列は、該アラインメント位置で最も頻度の高い塩基を提示するものと定義される。好ましい実施形態において、該アラインメントアルゴリズムは、個々の病原体株からの標的遺伝子配列または病原体のグループもしくはファミリーについて、階層的系統樹（hierarchical phylogenetic tree）を作製する。コンセンサス配列は、好適なアルゴリズム（Ｌｅｅ、２００３）を使用して、先ず、それらの距離指標が閾値内に入る、該系統樹における各節（node）または節のグループのメンバーについて形成される。次いで、実際の標的配列が、該コンセンサス配列と個々に比較され、そして該コンセンサス配列によって規定されるタイルドマイクロアレイ領域へのハイブリダイゼーションの効果が、シミュレートされる。塩基の挿入または欠失のような既知の効果、ならびにオリゴヌクレオチドプローブ領域内の複数の塩基置換の効果は、該シミュレートされるハイブリダイゼーションについてのルールを規定する。得られるハイブリダイゼーションおよびベースコールパターンの引き続いての分析は、次いで、所定の範囲の病原体についてのプロトタイプとして機能することについての提案されたタイルの適合性を示す。プロトタイプ領域の最も好適なセットが所定のセットの病原体の中で最も適切なセットが、病原体の与えられたセットのカバレージ（coverage）のために規定されるまで、このプロセスは反復される。1つの非常に好ましい実施形態
では、このプロセスは、リシークエンシングマイクロアレイの全体的な物理的次元の最大の縮小、そしてしたがって、マイクロアレイ当たりの製造コストの最大の削減を生じさせる、チップ上における空間使用の効率を最大限にするために使用される。
【０１１４】
１つの好ましい実施形態において、リシークエンシングマイクロアレイは、該リシーク
エンシングアレイをキューする（queue）ために最初に使用される別のそれほど複雑でな
い固相捕獲デバイス（アレイ、ゲル、またはその他）と組み合わせて設計される。例えば、多数の長いオリゴヌクレオチドプローブで構成されるアレイは、病原体のファミリーにおける保存配列を認識することによる、病原体の検出のために最初に使用される。次いで、該リシークエンシングアレイは、該初期アレイ上の保存プローブと結合された可変領域をインターロゲートするために使用され得、該病原体についての詳細な配列情報を提供する。非常に好ましい実施形態において、サンプル調製は、固相捕獲デバイスとリシークエンシングマイクロアレイの両方について共通である。なお別の好ましい実施形態において、前記初期アレイは、リシークエンシングマイクロアレイへの提示のために、単離され次いでノンバイアス増幅技術を使用して増幅される標的を捕獲するために使用される。
【０１１５】
意図される用途のための全体的な設計哲学
本発明は、有効な生物兵器防衛サーベイランスおよびオペレーショナルメディスンシステム（operational medicine system）の一部として、進歩した診断プラットフォーム（advanced diagnostics platform）を設計し、製造し、評価し、立証しそして一体化するために、種々の公共および／または私有ソースからの病原体ゲノム情報を利用する。感染症のルーチン診断、最も特に感染性呼吸器疾患の診断において有用性が見出された、広く流通した装置の採用により、該システムが最も効率的に行われることは、ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｏｕｔｂｒｅａｋ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ（ＥＯＳ）プログラム生物兵器防衛モデルの不可欠な面である（the Defense Sciences Board Summer 2000 Study Report およびthe Health Sciences Biodefense System (HSBS) 最終報告書を参照のこと）。
該デバイス（例えば、マイクロアレイ）が、感染症、最も特に呼吸器感染症の診断、管理およびサーベイランスへの従来のアプローチのコスト効率の良い代替案を提供することが重要である。同様に、該デバイスが設計および分析情報科学でサポートされること、ならびにそのデバイスからの決定品質情報（decision quality information）が、種々のケア提供者（care providers）、公衆衛生職員（public health officials）および意思決定
者（decision makers）によって伝達可能かつ解釈可能であることを確実にすることが、
等しく重要である。したがって、本発明の重要な目的は、該デバイス（例えば、マイクロアレイ）が、ヘルスケア提供者、公衆衛生職員および意思決定者間での自動双方向データ共有（automated, two-way data sharing）を提供するローカルポイント・オブ・ケア診
断デバイス（local point-of-care diagnostic device）から構成される一体化システム
の重要なコンポーネントとなることである（これは、キュー（queue）にあるビジネスモ
デル特許への相互参照であるかもしれない）。本明細書中で記載される本発明は、少なくとも２つの様式でこの役割を満たすかもしれない：（１）アレイサイズの減少（即ち、より低いコスト）、プロセス自動化、およびリシークエンシングアレイを処理するためのポータブルハードウエアの利用可能性により、本発明は、ポイント・オブ・ケアデバイス自体の目的となり得る、ならびに（２）より低いコストまたは容易に自動化されるマイクロアレイ代替物の場合において、該リシークエンシングアレイは、診断／サーベイランスパイプラインにおいてより高いエシュロンコンポーネント（echelon component）であり得
る。後者のケースにおいて、より低コストの代替デバイスは、初期サンプルプロセッシング、病原体標的濃縮、増幅、ポイント・オブ・ケアでの意思決定情報を与え、一方、リシークエンシング能力は、必要に応じてサンプルのより詳細なインターロゲーションを促進することによって、引き続いての試験能力を提供する。
【０１１６】
リシークエンシングマイクロアレイチップ設計のための一般的な戦略
本発明によれば、リシークエンシングマイクロアレイチップを設計するプロセスは、以下によって行われる：少数の（理想的には１つ）の病原体に対してそれらをユニーク（unique）にする、あるいは高度に保存されている［それらが科（family）または属（genus
）レベルの多くのタイプの微生物種を検出することを可能にさせる］、あるいは中程度に保存されそして“プロトタイプ”領域として選択される、配列特性を有する病原体ゲノム
配列を選択すること。
【０１１７】
プロトタイプ領域は、微生物の種のグループに渡って中間のレベルの配列相同性を有し、そして効率的なハイブリダイゼーションと、病原体種のサブタイプのほとんどまたはすべてのユニークな同定との両方を可能にする。リシークエンシングタイルのレイアウトについての設計戦略は、類似配列のアラインメントおよびチップへのタイリング用コンセンサスプローブ配列の適用を利用することを含む。コンセンサス配列は、選択される病原体のうちのどれとも同一でないかもしれないが、複数の類似の病原体ゲノムと相互作用する。実際の病原体ゲノム配列とコンセンサス配列の完全および不完全マッチングのパターンは、診断的識別力を提供する。
【０１１８】
本発明の特定の実施形態において、サンプル（例えば、部分的に精製されたサンプル、精製サンプル、濃縮サンプル、生物学的サンプルなど）中に存在する病原体の同定および命名（designation）を可能にするリシークエンシングマイクロアレイの設計のための一
般的なプロトコルが提供される。この設計および検証プロトコルの種々の局面は、下記の６“フェーズ”において具体化される。
【０１１９】
フェーズ１：病原体同定：
ａ．病原体リスト（例えば、アデノウイルス、インフルエンザ；化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））―病原体専門家またはパブリックドメインから提供される
ｂ．属／種（新規の病原体、即ち、コロナウイルスの重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）変異体）
ｃ．種／亜種（疫学的追跡；法医学）
ｄ．病原体ユニークセグメント（unique segments）（クロスハイブリダイゼーシ
ョン問題）
ｅ．遺伝シフト／ドリフト（genetic shift/drift）の問題（例えば、インフルエ
ンザ、ＨＩＶ）
ｆ．薬剤耐性マーカー
ｇ．病原性関連遺伝子またはビルレンスマーカー（virulence markers）（診断お
よび予後目的に有用）
ｈ．遺伝子工学形質（genetically engineered traits）についてのマーカー
ｉ．プラスミドＤＮＡ配列（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ＰＵＣなど）
ｉ．複数のクローニング部位
ｉｉ．薬剤耐性マーカー（アンピリシン、カナマイシン、ペニシリンなど）（またはＡｍｐ、Ｋａｎ、ＰＢＰなどとして列挙され得る）
ｉｉｉ．トキシン（ボツリヌス菌；リシンなど）
フェーズ２：サンプル供給源に関連する病原体同定
ａ．一般的な呼吸器病原体（および近親物（close relatives））
ｂ．生物脅威薬剤（Biothreat agents）：（疾病対策センター（Centers for Disease Control）によって同定される）
ｃ．以下のバックグラウンドまたは共生生物の考慮：
ｉ．臨床サンプル（鼻洗浄物、スワブ（swab）、糞など）
ｉｉ．媒介動物（Vectors）（例えば、蚊）
ｉｉｉ．環境（水、食物、土壌）
フェーズ３：遺伝子同定（病原体設計と関連する最も複雑な問題）
ａ．配列相同性（病原体同一性に対して）
ａ．新規または予期されないものの高度に保存された（属／種同定）同定
ｉ．新規／予期されない生物を同定する
１．キメラ（細菌遺伝子交換）
２．遺伝シフト／ドリフト（genetic shift/drift）変異体（即ち、
インフルエンザ）
３．人工
ｉｉ．複雑な病原体ファミリーを識別する
１．ライノウイルス（多くの異種（disparate）変異体）
ｂ．超可変領域に対してより保存されていない（Less conserved to hypervariable）（種／亜種）
ｃ．病原体特異的配列セグメント（Pathogen-unique sequence segments）（
クロスハイブリダイゼーション）
ｉ．トータル増幅アプローチについて潜在的に重要
ｂ．機能的配列（病原性および患者管理に対して）
ａ．共生微生物における薬剤耐性遺伝子
ｂ．病原性関連遺伝子
ｉ．トキシン遺伝子
ｉｉ．伝播性（感染性）関連遺伝子
ｉｉｉ．病原性島
ｉｖ．ビルレンス因子
ｃ．他の宿主−病原体相互作用遺伝子
ｉ．免疫応答
ｉｉ．腫瘍形成（Tumorogenesis）
ｉｉｉ．ＤＮＡ修復
フェーズ４：遺伝子選択（どの配列がチップ上に実際に配置されるべきか）
ａ．遺伝子アクセッション番号を同定する
ａ．コンプリート遺伝子（Complete gene）
ｂ．配列をフランキングするための（flanking）病原体ゲノム（コントロール）
ｃ．入手可能な最も最近／一般的な変異体
ｉ．迅速に進化する病原体（インフルエンザ）について特に重要
ｂ．ＢＬＡＳＴサーチ：（包含／除外基準）
ａ．ヒト配列相同性（除外基準）
ｂ．関連病原体配列
ｉ．可能性のある除外／アノテーション基準
ｉｉ．＞９０％相同性の場合、配列は一度だけデポジットされる必要がある
１．そのまま同定するおよび注釈をつけるためにコンセンサス配列を使用する
ｉｉｉ．病原体特異的遺伝子／配列を同定する
ａ．実際的な問題
ａ．細菌におけるホリゾンタル遺伝子トランスファー（Horizontal gene transfer）問題
ｂ．病原体の遺伝子のコピーの数
ｃ．ヒト配列との配列相同性（クロスハイブリダイゼーション）
ｄ．より少ない病原体種との配列相同性（即ち、Ｂａｃｉｌｌｕｓ；天然痘［ｐｏｘ］）
フェーズ５：ＲＰＭチップ優先順位付け
ａ．チップ“リアルエステート（real estate）”を規定する（提示されるトータ
ル配列）
ａ．標的遺伝子タイルサイズ
ｉ．タイルとアクセッション番号を関連付ける
ｉｉ．コンセンサス配列とアクセッション番号を関連付ける
ｂ．優先順位付け基準について主目的に言及する。重要な問題は以下を含む：
ａ．標的とされた集団（population）、地理的な位置、季節および他の疾患伝染因子に依存する病原体の普及
ｂ．臨床、オペレーショナル（operational）、および公衆衛生関連性
ｃ．チップ機能性問題：
ｉ．混合病原体
ｉｉ．エンドユーザへのデータアノテーションおよびプレゼンテーション
フェーズ６．マイクロアレイ検証：
ａ．コントロールを設計する
ａ．ネストティッド（Nested）プライマーセット：
ｉ．アウタープライマーセット：ディベロップコントロール（Develop controls）
ｉｉ．インナープライマーセット。アッセイポジティブコントロール
ｉｉｉ．コントロールおよびＲＰＭ配列は、１００％配列マッチであるべきである
ｂ．発現されるコントロールクローン（Control clones developed）
ｃ．マッチについて確認されたコントロールクローン配列（Control clones sequence validated for match）
ｂ．ディベロップ病原体チップアノテーションスキーマ（Develop pathogen chip annotation schema）：
ａ．乏しいハイブリダイゼーションの部位
ｉ．乏しいシグナル
ｉｉ．正しくないシグナル
ｂ．クロスハイブリダイゼーションの部位
ｉ．ヒトクロスハイブリダイゼーション
ｉｉ．他の病原体（特に、生物テロ薬剤およびトキシン）
ｃ．配列の特性のレベル
ｉ．亜種／変異体を同定し得るマーカー
１．法医学データベースからのベースを形成（Forms the basis of a
forensics database）
ｉｉ．属または種のみを同定し得るマーカー
ｉｉｉ．発見される場合、新規の変異体マーカーの同定（Identification
of new variant markers as discovered）
ｃ．チップ立証実験フレームワーク（Chip Validation Experimental Framework）：
ａ．クロスハイブリダイゼーション領域を検出するためのヒトハイブリダイゼーション
ｂ．プラスミドベースの立証スキーマ（Plasmid-based validation schema）
：
ｉ．ＰＣＲ感度についてのプラスミドを滴定する（Titrate plasmid for PCR sensitivity）
ｉｉ．ＲＰＭ検出感度について滴定する（Titrate for RPM detection sensitivity）
ｉｉｉ．変化される濃度でのベースコール精度を推定する（Estimate base-calling accuracy with varied concentrations）
１．エラーに注釈をつける（Annotate any errors）
ｃ．培養物ベースの立証スキーマ（Culture-based validation schema）
ｉ．ウイルスの滴定
１．核酸単離の効率
２．チップハイブリダイゼーション感度／特異性
ａ．トータル増幅感度／特異性
ｂ．ＰＣＲ比較
３．滴定された培養物からのチップハイブリダイゼーション感度
４．培養物配列の配列立証
ｄ．複雑な媒体へのスパイクされた病原体（Spiked pathogens into complex media）
ｉ．溶液へのウイルスの滴定（Titration of virus into solution）
ｉｉ．チップへのハイブリダイゼーション（バックグラウンド干渉）
ｉｉｉ．培養病原体とは異なる場合、ウイルスの配列立証
ｅ．コンプレックスマトリクス（complex matrices）からの標的濃度の推定
ｉ．鼻洗浄物
ｉｉ．綿棒（Cotton swab）
１．鼻スワブ（Nasal swab）
２．咽喉スワブ
ｉｉｉ．溶液中のウイルスの安定化
１．鼻洗浄物
２．スワブ
ｉｖ．ウイルス溶液の凍結／解凍効果
ｖ．標的病原体の配列立証。
【０１２０】
以下の表（表１）は、一般的な呼吸器病原体の検出および診断のために設計される場合に、本発明のコンテクスト内で使用され得る、病原体（ウイルスおよび細菌の両方）の好ましい（しかし限定的でない）セットを示す：
【０１２１】
【表１】
0005517996.tif 000002
【０１２２】
生物テロの薬剤のためのビルトインサーベイランス能力（built-in surveillance capability）を備える広く普及した呼吸器診断デバイスの意図される用途について、チップ上への包含のために選択される病原体のリストはまた、米国疾病対策センター（U.S. Centers for Disease Control）（ＣＤＣ）カテゴリーＡ、ＢおよびＣ生物テロ薬剤から選択されるものを含む。これらは最も顕著にあり、以下を含むが、これらに限定されない：
ＣＤＣカテゴリーＡ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ（標的：致死因子、防御抗原）
Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ
Ｓｍａｌｌｐｏｘ（小痘瘡）
Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ
Ｖｉｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒｓ（フィロウイルス［例えば、Ｅｂｏｌａ、Ｍａｒｂｕｒｇ］およびアレナウイルス［例えば、Ｌａｓｓａ，Ｍａｃｈｕｐｏ］）
ＣＤＣカテゴリーＢ
Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ（２３０８Ｂ３７），Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ  （Ｆ６１４５），Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｕｉｓ（Ａ４４）
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ（Ｇｌａｎｄｅｒｓ）
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ（Ｍｅｌｉｏｄｏｓｉｓ）
Ｐｓｉｔｔａｃｏｓｉｓ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）
Ｔｙｐｈｕｓ  ｆｅｖｅｒ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）
Ｖｉｒａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（アルファウイルス［例えば、ベネズエラウマ脳炎、東部ウマ脳炎、西部ウマ脳炎］）
ＣＤＣカテゴリーＣ
エマージング感染症，例えば、ニパウイルスおよびハンタウイルス。
【０１２３】
これらの因子（agents）の完全なかつ更新されたリストは、ＣＤＣウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／）において見られ得る。
【０１２４】
本発明の例示のために、２つのリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭＶ１およびＲＰＭＶ２）をここで下記に説明する：
【０１２５】
リシークエンシング呼吸器病原体マイクロアレイバージョン１（ＲＰＭＶ１チップ）
ＲＰＭＶ１は、１８×１８ミクロンの個々のプローブフィーチャーサイズを有する高密度Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ製造プロセスを使用して作製した。この密度で、２９．７ｋｂのトータル病原体標的配列を、リシークエンシングのためにタイリングした。配列の任意コレクションにおけるＳＮＰ検出のために意図された、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製品（ＣｕｓｔｏｍＳｅｑ）のプレプロダクションベータテスト（pre-production beta-test）の一部として、製造は行われた。
【０１２６】
以下の全体的設計戦略をＲＰＭＶ１のために使用した： 
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑ設計プロトコルに従った。マイクロアレイ分析のために標的を非特異的に増幅するためのプロジェクトコンソーシアム内で様々な進行中の努力があった間、本発明者は、従来の（特異的プライマーペア）ＰＣＲアンプリコンをインターロゲートし得るアレイ上へ配列をタイリングするためにあらゆる努力をした。可能な場合は常に、タイルドマイクロアレイプローブセットでインターロゲートされる可変領域をフランキングした（flanked）保存配列についてプライマーペアは開発または
適応された。これは、該能力が以下をすることを可能にした：（１）存在するハードウエアプラットフォーム（例えば、ＲＡＰＩＤ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ，Ｉｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で直接増幅すること、（２）イミーディエートホライズン（immediate horizon）上にある包括またはトータル増幅戦略での比較のためのコントロール
測定値を提供すること。一般的に、本発明者の戦略は、ハイブリダイゼーションパターンを生物の特定株とマッチさせ、そして病原性および薬剤耐性に対応する配列中の僅かな変化を検出することであった。
【０１２７】
アデノウイルス（二本鎖ＤＮＡウイルス）４、５および７型を、それぞれ、Ｅ、ＣおよびＢサブグループについての“プロトタイプ”と指定した。詳細には、本発明者は、プロ
トタイプがタイルされた領域上のリシークエンシングは、サブグループメンバー間での僅かな配列変化の検出および同定を可能にすると仮定した。３つの標的遺伝子領域を、具体的にはＥ１Ａ、ヘキソンおよびファイバー遺伝子から選択した。しかし、タイルのいずれのどの領域またはどのセクションがユニークな（unique）同定を可能にするかは、仮定も予想もされなかった。
【０１２８】
１３のアデノウイルスゲノムが、ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｃ  Ｏｕｔｂｒｅａｋ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅプログラムの一部として、完全に配列決定された。これらについての名称、アクセッション番号およびソースを、実施例セクションの表６に列挙する。複数配列アラインメントが行われ、縮重プライマーの単一セットで複数のアデノウイルスを増幅するために使用され得る保存領域によってフランキングされた（flanked）Ｅ１Ａ、ヘ
キソンおよびファイバー遺伝子の可変領域が決定された（Ｌｉｎら、２００４）。Ｅ１Ａ、ヘキソン、およびファイバー遺伝子についてのこれらの共通領域は、呼吸器疾患と関連する３プロトタイプアデノウイルスの各々について得られた：７（サブグループＢ）、５（サブグループＣ）、および４（サブグループＥ）を、ＲＰＭＶ１マイクロアレイ上のタイリングのために、２９．７ｋｂトータル病原体標的配列の一部としてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘへサブミットした。
【０１２９】
アデノウイルス分類学：
サブグループＢ：３，７，１１，１４，２１，３４，３５および５０
サブグループＣ：１，２，５，および６
サブグループＥ：４。
【０１３０】
本発明者は、それらがプロトタイプサブグループの代表、７型、５型および４型（それぞれ、サブグループＢ，Ｃ，およびＥ）について３つの遺伝子（Ｅ１Ａ，ファイバーおよびヘキソン）をアレイ上にタイルした場合、それらは、それらの配列差異へ位置するハイブリダイゼーションパターンの変化によって、完全に配列決定されたタイプ（上記に列挙）のいずれかを同定し得るという仮説を立てた。
【０１３１】
負−極性（negative-polarity）一本鎖ＲＮＡウイルス（ｓｓＲＮＡ）である、インフ
ルエンザＡおよびＢウィルスを、血球凝集素（ＨＡ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびマトリクス（Ｍ）についてのプロトタイプ領域で示された。これらの遺伝子は、インフルエンザＡの３タイプ（Ｈ１Ｎ１，Ｈ３Ｎ２およびＨ５Ｎ１）およびインフルエンザのＢについて表わされた。インフルエンザは、プロトタイプモデル系の最良の例の１つであり、何故ならば、数千とまではいかないまでも数百のインフルエンザ株が部分的に配列決定されており、そして大部分が血球凝集素およびノイラミニダーゼセグメントについて配列決定されているためである。
【０１３２】
プロトタイプインフルエンザＨＡ、ＮＡおよびＭ遺伝子を、世界保健機関（World Health Organization）によって北半球について推薦される３つのワクチン株に同一または密
接に関連する株から選択した：
・Ａ／ニューカレドニア／２０／９９／（Ｈ１Ｎ１）
・Ａ／モスクワ／１０／９９／（Ｈ３Ｎ２）
・Ｂ／香港／３３０／２００１。
【０１３３】
これらの配列は、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙインフルエンザインターネットデータベースから公に利用可能であった。本発明者は、プロトタイプタイル領域上において未知のインフルエンザＡまたはＢについて作製される配列コールは、それが類似性サーチベースクエリング（querying）を可能にするに十分に類似している場合、その標的の同定を可能にすると仮定した。
【０１３４】
ＲＰＭＶ１の残りは、種々の一般的な呼吸器病原体についてのタイルでポピュレートし（populated）、第１セットは以下のウイルスである：
ライノウイルスＡ（ｐｏｓ）ＳＳＲＮＡ
ライノウイルスＢ（ｐｏｓ）ＳＳＲＮＡ
コロナウイルス（ｐｏｓ）ＳＳＲＮＡ；ＤＮＡ段階無し（no DNA stage）
パラインフルエンザ（ｎｅｇ）ＳＳＲＮＡ
ＲＳＶ  （ｎｅｇ）ＳＳＲＮＡ。
【０１３５】
これらのウイルス病原体は、アデノウイルスおよびインフルエンザと比較して、比較的少ない利用可能な配列を有し、多数の関連株を同定するためのプロトタイプ配列の使用のための類似の試験を行う努力を複雑にした。
【０１３６】
一般的な細菌病原体もまた選択した：
化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）
肺炎マイコプラスマ（Mycoplasma pneumoniae）
百日咳菌（Bordetella pertussis）
クラミジア肺炎病原体（Chlamydia pneumoniae）
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）。
【０１３７】
さらに、以下のプラスミド付与（plasmid-conferred）抗生物質耐性遺伝子を、ＲＰＭ
Ｖ１チップ上に提示した：
ｅｒｍＡ
ｅｒｍＢ
ｅｒｍＴＲ
マクロライドーエフラックス決定基（macrolide-efflux determinant）（ｍｅｆ）Ａ。
【０１３８】
以下の生物脅威薬剤（biological threat agents）もまた、ＲＰＭＶ１チップ上に含ませた：
炭疽菌（Bacillus anthracis）（標的：致死因子、防御抗原）
ペスト菌（Yersinia pestis）
痘瘡（Smallpox）（小痘瘡）
野兎病菌（Francisella tularensis）
ウイルス性出血熱（Viral hemorrhagic fevers）（フィロウイルス［例えば、Ｅｂｏｌａ、Ｍａｒｂｕｒｇ］およびアレナウイルス［例えば、Ｌａｓｓａ，Ｍａｃｈｕｐｏ］）。
【０１３９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルを参照）によって規定されるハイブリダイゼーションコントロールに加えて、標的単離、逆転写（ＲＴ）およびｃＤＮＡ／ＤＮＡ増幅を確認するための内部プロセスコントロールを含めることが必要であると考えられた。したがって、本発明者は、植物シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の遺伝子挿入物を含有する特別なベクターを含ませ（Ｙａｎｇら、２００２）、そしてそのベクターからのいくつかの遺伝子挿入物についてアレイ上にタイル領域を提供した。
【０１４０】
アデノウイルスおよびインフルエンザ以外のすべての標的について、本発明者は、診断（ＰＣＲによって）領域を含む遺伝子について公開文献（例えばＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ）から標的を選択し、そしてその診断領域またはその領域を含むより大きなコード領域をタイルした。ＲＰＭＶ１のための全ての標的遺伝子、ＰＣＲプライマー部位、およびプ
ライマーについて全リストを、表８（下記）および添付の配列表に示す。タイリングおよびチップ作製のためにサブミットされた配列を、表7(下記)および添付の配列表に要約す
る。
【０１４１】
しかし、本発明は、上記に列挙される特定の配列および／または微生物（細菌またはウイルス）に限定されない。意図されるフィールドテストの特定の要件を満たすように前記”病原体チップ”を調製することは、十分に当業者の範囲内にある。明らかに、当業者は、上記の一般的なプロトコルによって努力が大いに助けられる。
【０１４２】
リシークエンシングマイクロアレイチップバージョン２（ＲＰＭＶ２チップ）
ＲＰＭＶ２は、８×８ミクロンの意図されるフィーチャーサイズを有する高密度Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイにおいて構築される。この密度で、約３００ｋｂの標的配列情報が、リシークエンシングのためにタイルされ得る。
【０１４３】
一般的なレイアウト戦略を表２〜４（下記）に記載する。ＲＰＭＶ２設計は、約１０倍のＲＰＭＶ１の配列内容物を可能にし、そしてしたがって、非常に多数の病原体の包含を可能にし、これは、ＲＰＭＶ１上に存在する全ての病原体、多数の他の呼吸器病原体、および実質的に全セットのＣＤＣカテゴリーＡ、ＢおよびＣ生物テロ薬剤の、拡張された提示を含んだ。ＲＰＭＶ２内容物の全リストを、実施例８に提供する。ＲＰＭＶ２設計は、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）についてｅｍｍタイプのような、プローブの包含を可能にすることによって、分子疫学能力を拡張した。この特徴は、疫学者/公衆衛
生専門家に、見込みのある指標疾患ケース（likely index disease case）を決定する能
力、および囲まれた集団（刑務所、寮、老人ホーム、兵舎など）におけるタイプされた病原体の伝播を研究する能力を提供する。これらのプローブはまた、該集団における病原体毒性および疾患の臨床提示を予測するかもしれない。
【０１４４】
表示された病原体の数はまた、マイクロアレイの単位領域当たり増加したプローブで拡張され得る。
本発明のチップは、高フィーチャー密度を利用し、単一臨床試料中に存在するかもしれない非常に多くの候補病原体を同時に調査（probe）および識別する。
【０１４５】
遺伝子発現マーカー（gene expression markers）が、ゲノムマーカー（genomic markers）と同一様式で該アレイ上に概念的にタイルされ得ることもまた、重要である。したがって、病原体転写物(タンパク質合成をコードするＲＮＡテンプレート）を示す配列は、
ゲノムマーカーのリシークエンシングを可能にするものと同時に配置され得る。これは、該マイクロアレイが病原体の存在を検出することを可能にするだけでなく、バイアビリティー（viability）の測定をも可能にし、何故ならば、転写マーカーは、インタクトな病
原体中にのみ存在するからである。
【０１４６】
【表２−１】
0005517996.tif 000003
【０１４７】
【表２−２】
0005517996.tif 000004
【０１４８】
【表２−３】
0005517996.tif 000005
【０１４９】
【表２−４】
0005517996.tif 000006
【０１５０】
【表２−５】
0005517996.tif 000007
【０１５１】
【表２−６】
0005517996.tif 000008
【０１５２】
【表３−１】
0005517996.tif 000009
【０１５３】
【表３−２】
0005517996.tif 000010
【０１５４】
【表３−３】
0005517996.tif 000011
【０１５５】
【表３−４】
0005517996.tif 000012
【０１５６】
【表３−５】
0005517996.tif 000013
【０１５７】
【表３−６】
0005517996.tif 000014
【０１５８】
【表４−１】
0005517996.tif 000015
【０１５９】
【表４−２】
0005517996.tif 000016
【０１６０】
【表４−３】
0005517996.tif 000017
【０１６１】
【表４−４】
0005517996.tif 000018
【０１６２】
【表４−５】
0005517996.tif 000019
【０１６３】
【表４−６】
0005517996.tif 000020
【０１６４】
ＲＰＭＶ２タイリングおよびチップ製造のためにサブミットされる配列は、表５に要約されるＡｆｆｙｍｅｔｉｒｘ命令に基づき、これらは、配列番号５９〜４２１として現れる配列に対応する。
【０１６５】
【表５−１】
0005517996.tif 000021
【０１６６】
【表５−２】
0005517996.tif 000022
【０１６７】
【表５−３】
0005517996.tif 000023
【０１６８】
【表５−４】
0005517996.tif 000024
【０１６９】
【表５−５】
0005517996.tif 000025
【０１７０】
【表５−６】
0005517996.tif 000026
【０１７１】
【表５−７】
0005517996.tif 000027
【０１７２】
【表５−８】
0005517996.tif 000028
【０１７３】
【表５−９】
0005517996.tif 000029
【０１７４】
【表５−１０】
0005517996.tif 000030
【０１７５】
【表５−１１】
0005517996.tif 000031
【０１７６】
【表５−１２】
0005517996.tif 000032
【０１７７】
【表５−１３】
0005517996.tif 000033
【０１７８】
サンプル調製
本発明のいずれかの実施形態において、標的核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）は、生物学的サンプル中に含有され得る。用語“生物学的サンプル（biological sample）”
は、本明細書中で使用される場合、生物または生物のコンポーネント（例えば、細胞）から得られるサンプルをいう。該サンプルは、生物学的組織または流体のものであり得る。あるいは、該サンプルは、環境（空気、土壌または水）から採取され得る。しばしば、サンプルは、患者から誘導されるサンプルである“臨床サンプル”である。このようなサンプルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：痰、鼻洗浄物（nasal wash）、鼻吸引物（nasal aspirate）、咽喉スワブ（throat swab）、血液、血液細胞（例え
ば、白血球）、組織または細針生検サンプル（fine needle biopsy sample）、尿、腹腔
液（peritoneal fluid）、内臓液（visceral fluid）、および胸膜腔液（pleural fluid
）、あるいはそれら由来の細胞。本発明の文脈内で、臨床サンプルは、鼻洗浄物、鼻吸引物または咽喉スワブであることが好ましい。特に好ましい実施形態において、臨床サンプルは鼻洗浄物である。生物学のサンプルはまた、非人間動物ソース、植物、または水、空気もしくは土壌のような環境ソース由来、あるいは組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を含み得る。
【０１７９】
マクロアレイを使用して検出するために、標的核酸は、ある程度の処理を必要とし得る。意図される目的のために、これは、以下の標的処理ステップの１以上を含む：（１）単離、（２）問題の標的配列の濃縮、（３）増幅、（４）標識、および（５）ハイブリダイゼーション。これらの処理戦略の各々に対応する好ましい実施形態を以下に記載する；しかし、本発明はこれらに限定されるように意図されない。この目的のために、当業者は、一般に使用されそして米国特許第６，６３８，７１７号、米国特許第６，３７６，１９１号、米国特許第５，７５９，７７８号、米国特許第６，２６８，１３３号、および米国特許第第６，６１３，５１６号において記載されるようなものの両方に基づく上述の処理戦略に対応する代替法を容易に理解する。
【０１８０】
標的核酸単離
本発明の実施形態において、評価される標的核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）は、これらの増幅前に単離される。核酸を単離する方法は、当業者に周知である。
【０１８１】
好ましい実施形態において、標的核酸単離は、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）エタノール精製法（製造業者の指示書による）を使用して行われ得る。別の好ましい実施形態において、標的核酸は、Ｘｔｒａ  Ａｍｐ  Ｋｉｔ（ＸＴＲＡＮＡ，Ｉｎｃ．Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ，ＣＯ）の使用におけるように、迅速マイクロ遠心分離（rapid microcentrifuge）技術を使用して単離される。なお別の好ましい実施
形態において、核酸は、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（Ｃｅｐｈｅｉｄ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）のような、上記目的のための自動装置を使用して、あるいはマグネチックビーズベース単離（magnetic bead-based isolation）用のロボット（例えば、Ｑｉａｇｅｎまたは
Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して、単離される。
【０１８２】
複雑なマトリクスからの核酸の精製および濃縮のために適合される種々の他の市販品が、利用可能である。上記および本発明において記載される方法に加えて、代替法としては以下が挙げられる：
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）−
（ゲノム、ミトコンドリア、細菌、寄生生物またはウイルスＤＮＡの精製のため）
ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔは、ファーストスピン−カラム（fast spin-column）または真空手順で、ヒト組織サンプルからのＤＮＡの単離を簡略化する。ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐシリカゲル膜に特異的に結合し、一方混入物質（contaminants）は通過する。二価カチオンおよび蛋白質のようなＰＣＲインヒビターは、２つの効率的な洗浄ステップにおいて完全に除去され、純粋なＤＮＡが残り、該キットに備えられる緩衝液または水のいずれかで溶出される。QIAampＤＮＡ技術は、ＰＣＲおよびブロッティング手順における使用に準備が出来た、ヒト組織サンプルからのゲノム、ミトコンドリア、細菌、寄生生物またはウイルスＤＮＡを生成する。
【０１８３】
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）−
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔは、非常に少量の組織または細胞からのトータルＲＮＡの効率的な精製を可能にする。トータルＲＮＡは、動物細胞または組織、グラム陽性またはグラム陰性細菌または酵母から容易に精製される。ＲＮｅａｓｙ技術は、グアニジン−イソチオシアネート溶解のストリンジェンシーとシリカゲル膜精製の速度および純度とを組み合わせることによって、トータルＲＮＡ単離を簡略化する。
【０１８４】
ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）−
新鮮なまたは凍結された組織サンプルを、ビーズビーティング（bead-beating）技術を使用してホモジナイズし、細胞を溶解する。溶解物をシリカスピンフィルター上にロード
する。短時間のスピンの間、ＤＮＡはシリカ膜へ選択的に結合し、一方、混入物質は通過する。残存する混入物質および酵素インヒビターは、洗浄ステップにより除去される。次いで、純粋なＤＮＡを、認証されたＤＮＡフリーＴｒｉｓ緩衝液中へ溶出する。
【０１８５】
ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）−
調製された新鮮なまたは凍結された組織を、溶解溶液の存在下で組織ホモジナイザーまたはモルタルおよび乳棒を使用して、ホモジナイズする。ＲＮＡはシリカ膜スピンフィルターへ捕獲され、一方、混入物質は遠心分離により該フィルターを通過する。該フィルターを洗浄して、残存する混入物質及び塩を除去する。次いで、ＲＮＡを、認証されたＲＮアーゼフリー水（提供される）へ溶出する。ＲＮＡは高純度であり、そしていずれの続いての適用に準備が出来ている。
【０１８６】
Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）−
Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットは、白血球、組織培養細胞ならびに動物組織、植物組織、酵母、グラム陽性およびグラム陰性細菌からのＤＮＡ単離のために設計されている。Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットは、４ステッププロセスに基づく。該精製手順における第１ステップは、細胞および核を溶解する。白血球からのＤＮＡの単離のために、このステップは、該細胞溶解溶液（Cell Lysis Solution）
中における赤血球の溶解、続いて核溶解溶液（Nuclei Lysis Solution）中における白血
球とその核の溶解を含む。ＲＮアーセ消化ステップはこの際に含まれ得、それはいくつかの適用について任意である。細胞性蛋白質は、次いで、塩沈殿ステップによって除去され、これは、該蛋白質を沈殿するが、高分子量のゲノムＤＮＡは溶液中に残す。最後に、ゲノムＤＮＡは濃縮され、そしてイソプロパノール沈殿により脱塩される。 
【０１８７】
ＳＶ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）−
ＳＶトータルＲＮＡ単離システムは、この膜ベース精製システム（membrane-based purification system）を使用しての、組織、培養細胞および白血球からの精製されたかつインタクトなトータルＲＮＡの調製のための迅速かつ簡便な技術を提供する。該システムは、ＤＮアーゼ処理ステップを直接ミニカラムの膜上に組み込む。精製は、フェノール：クロロホルム抽出またはエタノール沈殿を使用せずに達成され、そして最終ＲＮＡ調製においてＤＮアーゼキャリーオーバー（DNase carryover）は存在しない。
【０１８８】
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）−
ＲＮＡｑｕｅｏｕｓキットは、多くの異なる組織および細胞からトータルＲＮＡを精製するために使用され得る。細胞または組織はグアニジニウムチオシアネート溶液中で粉砕され；このカオトロピック剤は、効率的に細胞を溶解しそして内因性リボヌクレアーゼを不活性化する。次いで、該溶解物はエタノール溶液で希釈され、そしてＲＮＡ結合ガラス繊維フィルターへ適用される。蛋白質、ＤＮＡおよび他の混入物質は、３回の迅速な洗浄ステップにおいて除去され、そして結合されたＲＮＡは，次いで、濃縮形態で溶出される。
【０１８９】
核酸単離ロボット工学
上述の方法に加えて、いくつかの業者（例えば、ＰＳＳ  ＢＩＯ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｓｏｔｉｃｓ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃａｌｉｐｅｒ）は、上述の手動方法の代わりに使用され得る、小型（ベンチトップ）および／または高スループット液体ハンドリングロボットならびに関連する試薬の両方を製造する。好ましい実施形態において、１以上のこのようなロボットおよびそれらの関連する試薬が、引き続いての処理のために（バックグラウンド除去および増幅）、自動的に核酸を単離するために使用さ
れる。
【０１９０】
標的増幅
マイクロアレイでの病原体検出について１つのセットの技術課題が、十分な量の病原体核酸を有するサンプルを得ることにおける困難性のために生じる。したがって、大部分のサンプルタイプについて、何らかの増幅が、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる検出のために十分なコピーの病原体遺伝子マーカーを提供するために必要とされる傾向にある。マイクロアレイ調製ステップとしてのマルチプレックスＰＣＲは、数千ではなく、数十の異なるプライマーセットに実際には限定され、そしてプライマー対の増加する数は、種々の数の偽りのアンプリコン（amplicons）を生じさせる。しかし、標識されたア
ンプリコンが、アレイ表面上の特異的プローブへハイブリダイズすることが要求される場合に識別が生じ、そして思いがけなく、偽りのアンプリコンは、マイクロアレイアッセイによって検出され得ない（Ｃｈｉｚｈｉｋｏｖら、２００１）。
【０１９１】
マルチプレクッスＰＣＲ
保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲ（Conserved (degenerate) multiplex PCR）は、調査される（probed）遺伝子の保存領域フランキング種特異的可変領域（conserved regions flanking species-specific variable regions）を標的にするように選択された一連のプライマーを設計することによって、特異的ＰＣＲプロトコルで導入されるシステミックバイアス（systemic bias）を減少させるに役立つ。本出願の実施例において、Ｅ１Ａ
、ファイバーおよびヘキソン遺伝子についての戦略が示される；しかし、当業者は、広範囲の種にわたって保存されかつ依然として種特異的可変領域を有するいかなる遺伝子をも標的にするようにこの戦略を拡張し得る。このために、候補遺伝子および特異的領域（保存および可変）は、全体的または局所的相同性サーチ（即ち、配列アラインメント）によって容易に同定され得る。
【０１９２】
出願人は、標的およびプライマー設計の選択についての一般的な戦略を以下に記載する：
本明細書中で使用される場合、用語“プライマー”（そして当該分野において一般的に認識される）は、ポリヌクレオチドに相補的であるプライマー伸長産物（primer extension product）の合成が触媒される条件下に置かれると、相補鎖に沿ってポリヌクレオチド合成の開始点として機能し得るオリゴヌクレオチドをいう。典型的なポリヌクレオチド合成条件は、好適な緩衝液（“緩衝液”は、補因子であるか、またはｐＨ、イオン強度などに影響を与える代替物（substituents）を含む）中における４つの異なるヌクレオチド三リン酸またはヌクレオシドアナログおよび重合を触媒する１以上の酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）の存在、ならびに好適な温度を含む。
【０１９３】
特異的ＰＣＲを促進するために、増幅プライマーは、典型的に、１３〜３５ヌクレオチド、好ましくは２０〜２５ヌクレオチドの範囲である。プライマーのヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーションを促進するために、標的配列に対して十分な配列相補性を有さなければならない。相補性の程度は主にプライマーの長さに依存するが、相補性の程度は、一般的に、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％である。
【０１９４】
ランダムＰＣＲプロトコルについて、好ましいプライマー鎖長は、６〜１０ヌクレオチドである。配列は、理想的には、６量体（２６パーミューテーション）〜１０量体（２１０パーミューテーション）の全てのパーミューテーション（permutations）を含む。
【０１９５】
“プロトタイプ”領域設計の場合について、好ましいシナリオは、標的遺伝子の可変領域をフランキングする（flank）保存プライマーを有することである。これは、アデノウ
イルスについてのＲＰＭＶ１においてそうであり、そしてインフルエンザＡについて本発明者によって採用された（血液凝集素（ＨＡ）ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびマトリクス（Ｍ）についてインフルエンザＡセグメントの保存された３’および５’末端を使用して）。このコンセプトは、多数の病原体タイプのいずれにも拡張され得、何故ならば、高度に保存された領域は自然においてユビキタスであり、そして縮重プライマーは、それらの配列について設計され得る。
【０１９６】
標的が“プロトタイプ”として選択されない場合、チップ上のリアルエステート（real
estate）の量は、プロトタイプ領域と比較して大幅に減少され得る。これらの場合にお
ける目的は、特定の株または該種のサブ変異体（sub-variant）を同定することでは必ず
しも必要なく、しかしむしろ、該配列が問題の病原体に対応しそして密接に関連する種や無毒性株（non-virulent strain）に対応しないことを実証する明確な統計的推定のため
に十分なベースコールが作製されることを可能にすることである。複数の小さな標的のこのチップ設計で、必要とされる多数の特異的ＰＣＲ反応についての条件を設計および最適化することは実行可能でなく、そしてトータル増幅は最適な増幅戦略となる。
【０１９７】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性は、公知のソフトウエアまたはコンピュータプログラム、例えば、ＢｅｓｔＦｉｔまたはＧａｐペアワイズ比較プログラム（pairwise comparison programs）（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１１）を使用することによって決定され得る。ＢｅｓｔＦｉｔは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)のローカル相同性アルゴリズム（local homology algorithm）を使用し、２つの配列間の同一性または類似性のベストセグメント（best segment）を見つけ出す。Ｇａｐは、以前に記載される方法（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎ
ｓｃｈ，１９７０）を使用して、１つの配列の全てと別の類似配列の全てとの、グローバルアラインメント（global alignments）を行う。配列相同性、類似性または同一性の程
度を決定するために、ＢｅｓｔＦｉｔのような配列アラインメントプログラムを使用する場合、デフォルトセッティングが使用されてもよく、または好適なスコアリングマトリクスが、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択されてもよい。同様に、２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性または相同性を決定するためにＢｅｓｔＦｉｔのようなプログラムを使用する場合、デフォルトセッティングが使用されてもよく、または好適なスコアリングマトリクス（例えば、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０）が、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択されてもよい。
【０１９８】
標的はまた、“マルチプレックストＰＣＲ（multiplexed PCR）”と呼ばれる、特異的
ＰＣＲ反応物の組合せを使用して増幅され得る。この戦略において、ＲＰＭ上の全ての標的領域についてのＰＣＲプライマー対は、１つの反応混合物（miture）へ合わされる。これは、１以上の病原体が非常に低濃度で存在しランダム増幅戦略（以下に記載）だけを使用して検出されない場合において、好ましい方法である。
【０１９９】
ランダム増幅（Random Amplification）戦略
ＰＣＲ増幅に関連する感度および特異性に関わらず、このアプローチの固有のバイアスおよび限定されたスループットは、次のマイクロアレイベース適用の主な利点を限定する。首尾良い同定は、好適に選択されるプライマーセットにほぼ全面的に依存するので、全てのＰＣＲベーステストは、混入する生物のアイデンティティー（identity）に関連する事前知識（priori knowledge）を必要とする。したがって、具体的に予期される配列についての偏見無しに、臨床および環境サンプルを迅速にスクリーニングし得る進歩した診断システムについての決定的な必要性が存在するままである。マイクロアレイに基づく検出
の利点は、それが、偏っていない（unbiased）（例えばランダム）核酸増幅戦略と引き続いてのマイクロアレイの識別能力とを組み合わせて、高い感度、特異性およびスループット能力を生じさせ得るということである。
【０２００】
本発明者は、代替アプローチの使用により上述の問題に取り組み、そして４フロント−エンド増幅戦略を研究した：ランダムプライムド（random primed）、アイソサーマルＫ
ｌｅｎｏｗポリメラーゼベースト（isothermal Klenow polymerase-based）、φ２９ＤＮＡポリメラーゼベースト（Φ29DNA polymerase-based）およびマルチプレックスＰＣＲ（multiplex PCR）（Ｖｏｒａら、２００４）。
【０２０１】
Ｋｌｅｎｏｗベース増幅  −  ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントは、ランダム８量体オリゴヌクレオチドプライマーを用いての未知の配列の標的ＤＮＡのアイソサーマル・ランダム増幅のために使用され得る。本発明について、これは、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行われ得る。ビオチニル化アンプリコンが作製される（僅かな修飾を伴って製造業者の推奨する標識プロトコルに従う）。このプロセスは、典型的に、３７℃で４時間行われる。Ｋｌｅｎｏｗ増幅は、いくらかの高分子量増幅産物を生じさせるが、長さが圧倒的多数のアンプリコンは５０〜４５０塩基対（ｂｐ）である。したがって、これらのアンプリコンは、ＤＮＡマイクロアレイへの直接ハイブリダイゼーションに好適である。
【０２０２】
ランダムＰＣＲ増幅  −  ランダムＰＣＲ（ｒＰＣＲ）アンプリコンは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢｉｏＰｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ製の２．５Ｘ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎおよび１０Ｘ  ｄＮＴＰミックスを使用して作製され得る。反応成分は、典型的に以下を含む：１Ｘ  ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ），２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１Ｘ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（ビオチン−１４−ｄＣＴＰを含む），５μｌの２．５Ｘ  ランダムオクタマーおよび５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）。増幅反応は、３５サイクルについて以下の条件を使用して行われる：９４℃３０秒、２６℃２分、および７２℃１分。
【０２０３】
φ２９−ベース増幅  −  ランダムヘキサマーを用いてのアイソサーマルφ２９ＤＮＡポリメラーゼベース増幅は、ＴｅｍｐｌｉＰｈｉＴＭ  １００  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して行われ得る。ビオチニル化アンプリコンは、僅かな修飾を伴う製造業者の推薦プロトコルに従って作製される（１４．４μｌ増幅反応物は０．４μｌ酵素ミックスおよび３μｌの３５０μＭビオチン−１４−ｄＣＴＰを含み、そして３０℃で１６時間インキュベートされる）。
【０２０４】
ｒＰＣＲおよびφ２９ＤＮＡポリメラーゼ増幅産物の両方の大部分は、電気泳動ゲル（electophoretic gels）へ移すには大きすぎる（＞１５００ｂｐ）。大きな増幅産物は、
空間的および立体的拘束に起因して２次元表面上の固定化されたプローブへ弱く（poorly）ハイブリダイズする。したがって、ｒＰＣＲおよびφ２９ポリメラーゼ増幅産物は、ハイブリダイゼーション前に、Ｋｌｅｎｏｗおよびマルチプレックスアンプリコンに匹敵するアンプリコンサイズを達成するために、ＤＮアーゼＩフラグメント化緩衝液で消化される。
【０２０５】
タンデム増殖（Tandem Amplification）
病原体標的に対する増加された感度は、上述のランダム増幅戦略の組合せを使用して達成され得る。タンデム［Ｋｌｅｎｏｗ＋Ｋｌｅｎｏｗ］および［φ２９＋Ｋｌｅｎｏｗ］タンデムランダム増幅戦略は、マルチプレックスＰＣＲよりも濃縮病原体標的に対するより良好な感度を提供し得る。同一のランダム増幅戦略もまた、６３倍過剰の混入ＤＮＡを
含有するスパイクされた（spiked）環境水サンプル中の診断ゲノム標的を検出することができる（Ｖｏｒａら、２００４）。示される結果は、ランダム増幅アプローチを使用する実行可能性を強調し、そして環境ソースからの偏っていない（unbiased）病原体検出のためのこれらのアプローチの融通性に系統的に取り組み始める。
【０２０６】
標的濃縮（Target Enrichment）およびランダム増幅の組合せ
ランダム増幅方法は、非標的ＤＮＡならびに標的ＤＮＡの増幅を生じさせる。したがって、本発明者は、ここで、ランダム増幅ステップの前の、病原体診断標的配列の濃縮のための種々の方法を記載する。これは、臨床（例えば、鼻洗浄物または咽頭スワブ）あるいは環境（例えば、水、土壌、空気コレクター）サンプルのような、複雑なマトリクス中の検体の検出の感度および／または特異性を改善するために特に重要である。
【０２０７】
複雑なサンプル（complex sample）（臨床および環境）は、有意な、そして時には圧倒的な量の未知ゲノムおよび問題ではないゲノム（非特異的バックグラウンド）を含有する。非特異的バックグラウンドを減少させるための１つのアプローチは、バックグラウンドゲノム配列を選択的に消化する酵素プロセスへ該核酸を暴露することである。このプロセスは、実施例中で以下に記載される。
【０２０８】
非病原体ゲノム内容物を減少させるための別の戦略は、問題の生物について陰性であることが知られている比較可能な複雑なサンプルからのバックグラウンドゲノム配列を使用し、そしてそれを使用してバックグラウンドゲノム配列を直接除去することである。
【０２０９】
このような“サブトラクティブ”方法は、以下を含み得る：（１）ゲルまたはビーズのような固相表面上におけるバックグラウンドゲノムの固定化、続いてサンプルからバックグラウンドゲノムを吸収するためのテストサンプルとのハイブリダイゼーション。標識されたバックグラウンドゲノムに起因する非特異的結合の影響をブロックするために、マイクロアレイ上における標的のハイブリダイゼーションの間、標識されていないバックグラウンドゲノムを使用することも可能である。このブロッキングアプローチは、アッセイの間さらなるステップを必要としない点で、利点を有する。このような戦略は両方とも、実施例セクションにおいて記載される。
【０２１０】
あるいはまたは同時に、ランダム増幅前に病原体標的核酸を選択的に濃縮する戦略が使用され得る。サンプルからの直接選択（陽性選択（positive selection）としても公知）についての１つの可能性は、固相支持体（磁気ビーズまたはゲルマトリクス）上の固定化されたプローブを使用して、問題のゲノム標的を選択的に濃縮することである。理想的には、固相支持体上のプローブは、アレイ上で検出可能でないべきであり、何故ならば、それらは、該濃縮分子がキャリーオーバーされる（carried over）かあるいは不注意で増幅される場合に偽シグナルを生じるためである。
【０２１１】
したがって、ビーズ上のプローブは、マイクロアレイ上においてクエリーされる検体のゲノムの領域との僅かな重複または隣接する領域によって、標的ゲノムを選択すべきである。アレイ上において検出可能である検体配列（analytes’ sequences）とプローブ配列（probe sequences）との間に僅かな重複が存在する場合、このクエリーされる領域は、
インシリコ（in silico）分析の間マスクされるべきである。濃縮プローブがマイクロア
レイ上のそれと相同な配列を有することが望ましい場合、それらのプローブは、引き続いての増幅を受けないように構成されるべきであり、または増幅前に選択的酵素消化に感受性にされるべきである。サンプルの詳細および問題の適用に従って、必要に応じて、上記戦略と他の戦略との組合せが使用され得る。
【０２１２】
代替のサブトラクションまたは濃縮方法
免疫沈降は、病原体の核酸を濃縮するための別の方法である。問題の病原体の抗体は、臨床サンプルと混合され得、次いで抗ＩｇＧで沈降され病原体をプルダウンし（pull down）、それによってバックグランドゲノムＤＮＡが除去される。これは、抗生物質耐性マ
ーカー（antibiotic resistance markers）または意図的な遺伝操作の指標（indicators of intentional genetic manipulation）のような、特定のゲノム形質を単一病原体と相
互に関連付けることが望ましい場合に、特に重要である。
【０２１３】
サイズ排除（size exclusion）は、病原体ＤＮＡを濃縮またはサブトラクトするための別の方法である。例示的なサイズ排除方法としては以下が挙げられる：勾配遠心、カラム、または遠心分離フィルターユニット（centrifugal filter units）。勾配遠心またはカラム分離方法は、時間を必要とし、そして実験室における特別なセットアップを必要とする。低分子量化学種からの高分子量種の分離（separation of high- from low-molecular-weight species）のための“遠心分離フィルターユニット”の使用は、一貫性のない、
そしてしばしば、低回収率を被る。これらの方法の各々は、大量の出発材料を必要とする。他のサイズ排除方法としては、以下が挙げられる：フローサイトメトリーまたは電気泳動法、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（fluorescence-activated cell sorting）
（ＦＡＣＳ）、またはＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーにおいて使用される特別な電気泳動チップを用いる。
【０２１４】
一般的な標的濃縮および増幅戦略
本発明者は、鼻洗浄物試料からの“正常な”ヒトおよび細菌核酸のサブトラクションのための方法を記載した。この同一の原理はまた、任意の起源のサンプル（臨床または環境）に適用され得、ここで、核酸の代表的な“正常”混合物が、サブトラクティブ試薬として回収、プールおよび調製され得る。
【０２１５】
種々のアプローチが、トータル増幅戦略を行う前に、アレイにタイルされる病原体または特定の標的を濃縮するために適用され得る。このようなアプローチの１つは、アレイ上にタイルされる配列の固定化された変異体を使用することである。これらの変異体は、分離のために使用される固相コンポーネント（ビーズ、マトリクスなど）へ結合され、そして増幅される標的を濃縮するに役立ち、それら自体は増幅されない。酵素消化へ該濃縮プローブを感受性にすることは、これを行い得る、即ち、それらは、増幅可能でない修飾核酸から構成されるかもしれない。
【０２１６】
より好ましい実施形態は、標的遺伝子配列に隣接しかつチップのタイルド領域上に提示されない配列を認識するプローブを使用する。この様式において、ノンバイアス増幅戦略でのそれらの増幅は、人工産物（artifacts）を生じさせない。
【０２１７】
従来のＤＮＡ配列決定技術は、基礎研究における全体的情報回収プロセスの一部として考えられ得るので、記載されるリシークエンシングアプローチは、全体的病原体検出／キャラクタライゼーションスキームのコンポーネントと考えられ得る。Ｗａｎｇら（Ｗａｎｇら、２００３）は、病原体のファミリー内にある保存配列を認識する長いオリゴヌクレオチド（７０量体）から構成されるスポッテッド（spotted）ＤＮＡマイクロアレイを使
用する方法を記載する。これらの位置に結合された標的配列は、単離され、そして従来のＤＮＡ配列決定アプローチにおいて使用され、さらなるキャラクタライゼーションを可能にする。類似の方法において、非常に好ましい実施形態は、ＤＮＡ配列決定の代替フォームと関連するステップを置換するリシークエンシングマイクロアレイの使用を含み、したがって、数日内の代わりに数時間内での特異的病原体キャラクタライゼーションおよび効率的な生物兵器防衛システムの実施を提供する。
【０２１８】
本発明の方法は、好ましくは、増幅（ＰＣＲ）のために特異的配列を使用しない。本発
明は、例えば以下を使用しての、病原体核酸の濃縮のための代替方法が存在することを示す：減少されたバイアス、およびアイソサーマル（例えば、ランダムプライムドＫｌｅｎｏｗまたは鎖置換（strand displacement））増幅を適用する前に、固相支持体分離を使
用すること。好ましい実施形態において、当業者は、従来の実験室セッティングにおいて、マイクロアレイ実験を行う自動化ステップの最小セットを使用して、時間およびコスト効率的サンプル調製を行うことができる。非常に好ましい実施形態において、最小限に熟練した技術者（医療技術者または医学生）は、野外環境（医療水準１）において、手持ちサイズの機器を使用して、病原体標的核酸の手動分離および／または濃縮を行うことができ、そして少ない試薬および技術ステップで病原体標的のアイソサーマル増幅を行う。
【０２１９】
バックグラウンドサブトラクションに続く増幅（ampification）およびハイブリダイゼーション
プライマーＤ：ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣＮＮＮＮＮＮＮＮＮ（配列番号５７３）、およびプライマーＥ：ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＴＣ（配列番号５７４）（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４）、類似の、以前に記載されたプライマーセット（Ｗａｎｇら、２００２）を使用するランダムＲＴ−ＰＣＲに加えて、ＲＮＡウイルス（病原体）から第１鎖（first strand）ｃＤＮＡを合成するために、それらのプライマーセットの変形物、および／またはランダム（６〜９量体）が使用され得る。サブトラクティブハイブリダイゼーションプロトコルは、第１鎖ｃＤＮＡ合成が完了後に使用され得、臨床サンプル中のバックグラウンドＤＮＡの量を減少させ、その後、複雑な（即ち、臨床または環境）サンプルを１以上のＤＮＡ増幅ステップへ供する。
【０２２０】
１つの方法は、ＣＯＴ−１ヒトＤＮＡ［これは、迅速にアニーリングする反復エレメント（repetitive elements）から大部分がなる］を含むハイブリダイゼーション溶液中に
おける、増幅産物（第１鎖ｃＤＮＡ合成、次いでトータル増幅）からのバックグラウンドゲノムＤＮＡの直接サブトラクションである。別の方法は、第１鎖ｃＤＮＡ合成後かつＤＮＡ増幅ステップ前の、臨床サンプルからのバックグラウンドゲノムＤＮＡのビーズベースサブトラクションである。
【０２２１】
第３の方法は、上記方法の組合せである。このケースにおいて、コンプレックスサンプル（complex samples）由来のヒトゲノムバックグラウンドＤＮＡは、第１ｃＤＮＡ合成
後かつＤＮＡ増幅ステップ前に、ビーズベースサブトラクションを使用してサブトラクトされる。引き続いて、バックグラウンドＤＮＡは、選択的にヒトＤＮＡおよびＲＮＡを捕獲するように設計された配列を含むハイブリダイゼーション溶液中において、コンプレックスサンプルからさらにサブトラクトされ得る。ＤＮＡ増幅ステップ自体は、特異的プライマー部位標識化ＲＴ−ＰＣＲ産物（specific primer site-labeled RT-PCR products）ならびに病原体ゲノムＤＮＡ標的および他の非ｃＤＮＡ標的（これは、ランダムＲＴ−ＰＣＲステップから生じない）の両方を増幅するための方法の組合せによって、あるいは、特異的に、非特異的に、ランダムＲＴステップにおいて形成されるｃＤＮＡ産物を増幅することを目的とし得る。そのように行うための１つのアプローチは、病原体ＤＮＡゲノム標的へ特異的プライマー配列（これは、ｃＤＮＡ産物または別個のものへ結合されるために使用されるのと同一のプライマーであり得る）を結合することであり、単一のＰＣＲステップが全てのＲＮＡおよびＤＮＡ病原体標的を増幅することを可能にする。
【０２２２】
ＲＮＡサブトラクション
ＲＮＡおよびＤＮＡ病原体検出について別の処理経路が存在する場合、以下が使用され得る。ＲＮＡプロセッシング経路の開発のために、スパイクされ（spiked）そして臨床の（鼻洗浄物および咽頭スワブ）インフルエンザＡ陽性試料を、種々の方法（ランダム、ユニバーサル、およびマルチプレックストＰＣＲ）を使用して処理した。しかし、ランダム増幅アプローチを用いて受け入れ可能なレベルの感度を達成するために、ヒトメッセンジ
ャーおよびリボソームＲＮＡは、ＭＩＣＲＯＢＥｎｒｉｃｈＴＭキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して、製造業者の指示に従って、サブトラクトされるべきである。好ましいランダム増幅戦略は、以前に記載される方法（Ｗａｎｇら、２００２）から適応されて利用され得る。
【０２２３】
この方法を使用して、０．４５〜３．７５ｐｆｕ／１５０μＬサンプルアリコートほど低い濃度で、種々の培養物（陽性Ｆｌｕ  Ａ鼻洗浄物および咽頭スワブ試料）のうち１６／１９において、Ｈ３Ｎ２の陽性検出およびＨ１Ｎ１  Ｆｌｕ  Ａ検出が達成され得ることが、本発明者によって見出された。ヒトＲＮＡのサブトラクションに続いて、低濃度範囲で６／８試料中におけるＦｌｕ  Ａを検出することが可能であったことが、さらに測定された。
【０２２４】
バックグラウンドサブトラクション無しで、ランダム増幅アプローチを使用すると、ｆｌｕ感度は、スパイキング（spiking）鼻洗浄物中において約０．２５ｐｆｕ／μｌ（１
ｎｇ／μｌ）である。臨床サンプルにおいて、サブトラクション無しでの感度は、約１〜１０ｐｆｕ／μｌであると推定される。
【０２２５】
ＤＮＡサブトラクション
ＤＮＡサンプルについてのランダム増幅は、以前公開された論文（Ｗａｎｇら、２００２；Ｗａｎｇら、２００３）から修飾されたランダム増幅プロトコルまたはバクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼのいずれかで行われ得る。簡単に述べると、ランダムヘキサマー（random hexamers）を用いてのバクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ
を使用するＤＮＡ増幅は、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉＴＭ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）の指示に従って行われ得る。次いで、増幅産物は、製造業者が推奨するプロトコルに従ってエタノール沈降される。修飾ランダム増幅を使用してのＤＮＡ増幅は、プライマーＤを使用するＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ  バージョン２．０ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）でのＤＮＡ合成の初期ラウンド、続いてプライマーＥを用いたＰＣＲ増幅で行われ得る。ＲＮＡ増幅のために、ウイルスサンプルは、次いで、ランダムＰＣＲプロトコルの修飾バージョン（Ｗａｎｇら、２００２；Ｗａｎｇら、２００３；Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４）によって増幅される。簡単に述べると、１０μｌのトータルＲＮＡが、プライマーＤおよびｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して逆転写され得、そして次いでプライマーＥを用いたＰＣＲにより増幅された。
【０２２６】
ＲＮＡおよびＤＮＡ経路の集合（convergence）−
ＲＮＡおよびＤＮＡ経路の組合せを図９に記載する。本発明の実施形態において、ＲＮＡおよびＤＮＡについての経路は、合わせられる。このプロトコルは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＪｏｓｅｐｈ  ＤｅＲｉｓｉ研究室（http://derisilab.ucsf.edu/pdfs/Round_A_B_C.pdf）から適応され、そして全ての病原体ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子へ、シングル・フィックスト−シーケンスＰＣＲプライマー結合部位（a single, fixed-sequence PCR primer binding site）をランダムに組み込み、従来のＰＣＲ熱サイクリングプロトコルを使用する引き続いてのステップにおいてそれらが全て増幅されることを可能にする。
【０２２７】
データ獲得および処理−
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／マイクロアレイ装置
一般的に、“マイクロアレイ”は、固相支持体の表面上に形成された、各々が規定された領域を有する、好ましくはディスクリート領域（discrete regions）の線形または二次
元アレイである。マイクロアレイ上のディスクリート領域の密度は、単一固相支持体の該表面上で検出される異なる標的ポリヌクレオチドの総数によって決定され、好ましくは少なくとも約１０２／ｃｍ２、より好ましくは約１０４／ｃｍ２、なおより好ましくは少なくとも約１０６／ｃｍ２、そしてなおより好ましくは少なくとも約１０８／ｃｍ２である。本明細書中で使用される場合、ＤＮＡマイクロアレイは、標的ポリヌクレオチドを検出および／または単離するために使用されるチップまたは他の表面上に配置されたオリゴヌクレオチドプライマーのアレイである。アレイにおけるプライマーの各特定のグループの位置は既知であるので、標的ポリヌクレオチドのアイデンティティーは、マイクロアレイの特定の位置へのそれらの結合に基づいて決定され得る。
【０２２８】
本発明の１実施形態は、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘハードウエア（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ（廃止された（phased out））およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００ワークステーションおよびＦｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０を使用する。原則的に、記載された本発明は、この設備を必要としない。量的遺伝子発現プロファイリングおよび高信頼性ＳＮＰ検出のためのＧｅｎｅＣｈｉｐシステムの製造業者の意図する使用を考慮すると、既存の装置は、本発明に固有のシグナル強度またはバックグラウンド干渉のダイナミックレンジについて最適化されない。したがって、好ましい実施形態は、ノイズの多い画像のより良好なコントラストを可能にするフィルタリグアルゴリズム（例えば、輪郭強調、回旋など）を与えるフィーチャー次元の固有の規則性を利用する、空間周波数フィルタリングおよび画像増強の使用を含む、画像獲得方法の使用を組込む。
【０２２９】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコル
本発明の実施形態において、サンプル処理は、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルを使用することによって達成される。一般的に、この方法は、以下を必要とする：（ａ）ＤＮＡプローブ含有材料の増幅、（ｂ）増幅産物のプーリング（pooling）および定量、（ｃ）増幅産物のフラグメント化および標識、（ｄ）標的ハイブ
リダイゼーション、および（ｅ）洗浄、染色、およびハイブリダイズされた標的のスキャンニング。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルの詳細な説明は、製造業者から入手可能である製品マニュアルおよびプロトコルガイドに見られ得る。
【０２３０】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルにおいて、ステップ（ａ）はロングレンジＰＣＲまたはショートレンジＰＣＲのいずれかを必要とし、ロングレンジＰＣＲが好ましい増幅戦略である。これらの増幅戦略の各々について、製造業者が推奨するＰＣＲ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ変形物、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（ショートレンジＰＣＲ）およびＬＡ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロングレンジＰＣＲ）である。製造業者によって特に推奨されるわけではないが、使用されるＤＮＡポリメラーゼが高忠実度（high fidelity）ＤＮＡポリメラーゼである限り、ステ
ップ（ａ）について任意のＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。
【０２３１】
ＤＮＡ増幅ステップ（ａ）を促進するために、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルは、特異的ＰＣＲプライマーを使用する。しかし、特異的ＰＣＲプライマーの使用は、今まで使用されてきた特異的ＰＣＲに基づく方法からもたらされるシステム偏向（systemic bias）の組み込みに起因して、本発明の技術の広範囲の提供を
顕著に制限する。したがって、本発明の好ましい実施形態において、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルのステップ（ａ）は、マルチプレックスＰＣＲ、トータル増幅（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉＴＭ）、またはランダムＲＴ／ＰＣＲのような、代替の増幅戦略に置き換えられる。これらの代替戦略は、上記に記載する。製造業者が推奨するＰＣＲ戦略の各々、ならびに本発明の好ましい戦略についての最適なＰＣＲ増幅のための条件は、当業者の慣用実験によって決定され得る。
【０２３２】
ＰＣＲ反応間に変動性が存在するので、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルは、ハイブリダイゼーションのアンプリコン濃度が２倍超変動する場合、アッセイ性能は低下され得ると述べる。したがって、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルのステップ（ｂ）は、ＰＣＲ反応物をプールしそしてそれを分光測光法により定量して、マイクロアレイへの該サンプル等モル適用を確実にすることを必要とする。
【０２３３】
しかし、本発明は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭ法のＳＮＰ検出テーラードプロトコルに対していくつかの利点を有する。特に、本発明における配列鎖長独立類似性サーチ（sequence length-independent similarity searches）（ＢＬＡＳＴＮ
）での増加した密度チップの使用は、タイリングのための配列を選択する前に、より少ない想定がなされなければならないということを提供する。さらに、鎖長独立類似性サーチ（ＢＬＡＳＴＮ）は、特定の既知のサブ配列が首尾良くリシークエンスされるという制限を排除し、標的濃度のバリエーションとロストベースコールへ導く非特異的結合からの寄与とに対して、該アプローチをより耐性とする。したがって、本発明内で、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルのステップ（ｂ）は、任意でありそして省略されてもよい。
【０２３４】
ＤＮＡ増幅に続いて、それによって得られたＤＮＡ分子は、アレイ表面上の短いプローブへハイブリダイズするには長すぎる。したがって、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルのステップ（ｃ）は、フラグメント化および引き続いての蛍光基質での該フラグメントの標識を含む。フラグメント化および標識のための方法および試薬は、特に限定されず、しかし、標識は、リシークエンシングマイクロアレイのための検出装置と適合性でなければならない。このために、製造業者が推奨する試薬および条件が使用されてもよい。
【０２３５】
Affymetrixプロトコルの代替法（alternative variations）
本明細書中で記載される方法に有利となるに役立ち得る蛍光標識は、複数のサンプルの同時高スループット分析のための自動機器と共に慣用的に使用されるので、以下を含む：Ｃｙフルオロフォア（fluorophores）、ローダミンベースフルオロフォア：ＴＡＲＡＭ，ＲＯＸ，ＪＯＥ，およびＦＡＭ；ＢｉｇＤｙｅＴＭフルオロフォア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、ダンシル基、フルオレセインおよび置換フルオレセイン誘導体、アクリジン誘導体、クマリン誘導体、フタロシアニン（pthalocyanines）、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄＴＭ、９−（カルボキシエチル）−３−ヒドロキシ−６−オキソ−６Ｈ−キサンテン、ＤＡＢＣＹＬＴＭ、ＢＯＤＩＰＹＴＭおよびＡＬＥＸＡＴＭフルオロフォア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）。
【０２３６】
さらに、種々の状況に好適でありそして恐らく好ましい、フルオロフォア以外の種々の標識が存在する。これらの標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：共鳴光散乱（ＲＬＳ）粒子（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐ．）および他の所望の光学特性を有するナノ粒子。
【０２３７】
標的ハイブリダイゼーション（ステップ（ｄ））は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルに記載されるように行われ得る。このステップのハイライトは、フラグメント化されそして標識化されたＤＮＡを含有するサンプルを、高温（例えば、８５〜１００℃、好ましくは９５℃）インキュベーションによって変性させ、続いてハイブリダイゼーション温度（例えば４５℃）平衡を行う。ＤＮＡ含有サンプルが平衡化され
ると、該サンプルは、リシークエンシングアレイへ適用される。製造業者は、１６時間ハイブリダイゼーション反応を行うことを推奨する；しかし、上述のように、本発明の方法は、感度を増加させて好適なベースコールを作製するためにその手を結ばせない。したがって、より短いインキュベーション時間が、標的ハイブリダイゼーションに好適である。本発明の文脈内で、標的ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、１５分の短い時間から２４時間の長い時間まで及び得る。明らかなことに、この範囲の時間は、それらが明確に記載されているかのように、中間の時間の各々を具体化することが意図される。注目に値する好ましい時間は、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、１２時間、および１６時間である。
【０２３８】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコルの最終ステップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎを使用してハイブリダイズされたアレイを洗浄すること、およびＡｇｉｌｅｎｔ  ＧｅｎｅＡｒｒａｙＴＭ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用してスキャンすることを必要する。この機器は、そうでなければ手動で行われ得る標識およびリンスステップを簡単に自動化する。したがって、タイムドベースで（on a timed basis）ミリリットル量の標識化およびリンス媒体を送達および回収（withdrawing
）し得る任意の機器は、好適な代替物である。本明細書中に記載される本発明は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供される引き続いてのハードウエアバリエーションへ従う。さらに、本明細書中に記載されるリシークエンシングマイクロアレイからのデータ獲得は、マイクロアレイプロセッシングのための装置のいかなる製造業者から得てもよい。
【０２３９】
病原体検出に関連するバイオインフォマティクス問題−
病原体のマイクロアレイベース検出のために使用されるエンドポイント（endpoints）
に依存して、バイオインフォマティクス問題の重要性は非常に様々である。バイオインフォマティクスツールは、マイクロアレイ開発のための特異的相補核酸プローブ配列の効率的な設計および選択に不可欠である。例えば、標的病原体ゲノム核酸配列は、しばしば、マイクロアレイ分析の前に増幅され、そしてバイオインフォマティクスは、ある生物および株に対して特異的と考えられる遺伝子をアッセイするためのプライマーの設計における役割（Ｔｍ／Ｔａ、二次構造、自己相補性（self-complementarity）、および特異性問題を評価すること）を明らかに有する（Ｋａｍｐｋｅ，ＫｉｅｎｉｎｇｅｒおよびＭｅｃｋｌｅｎｂｕｒｇ、２００１）。これらの同一の評価もまた、マイクロアレイプローブ設計のために作製されなければならない。
【０２４０】
実験設計の初期段階の間、標的病原体と関連する遺伝的特徴に対するプライマーおよびプローブは、病原体または病原体のファミリーに特異的であると考えられる。それは、特異的に設計されたプライマーまたはプローブそれぞれを使用してのアンプリコンの生成または陽性ハイブリダイゼーション反応は、標的病原体由来の特定の分子形質の検出を示すということになるだろう；しかし、これは必ずしも真実ではない。細菌およびウイルスの“遺伝的乱交（genetic promiscuity’）”、微生物が遺伝物質を交換する傾向は、単一
の種または株特異的プローブを開発することにおいて困難を生じさせる（Ｏｃｈｍａｎ，ＬａｗｒｅｎｃｅおよびＧｒｏｉｓｍａｎ、２０００）。したがって、好ましいプライマーおよびプローブ設計方法は、以下のために、バイオインフォマティクスツールの使用を必要とする：（ａ）異なる生物または株間の複数配列アラインメントを行い、そして好適な生物化学的性質を有する好適なプライマーを設計すること、（ｂ）これらの配列と配列データベースに置かれたものとを比較し、特定の配列の現在の独自性（present uniqueness）および交差反応性の可能性を決定すること、ならびに（ｃ）遺伝的保存のレベルに基づく標的特異性の確率、ならびにその主要な遺伝配列が未だ解明されていない他の病原性および非病原性種との進化的関連性を推測すること。
【０２４１】
開示される本発明の非常に重要なバイオインフォマティクス局面は、マイクロアレイ設
計への組み込みのための、データベースへの病原体診断標的のアセンブリ（assembly）、アノテーション（annotation）および選択、ならびにマイクロアレイ上における検出事象をこのようなデータベースへ関連付けるという付随するタスクを含む。本発明の利点は、公共データベースに含まれる情報は増え続けており、したがってさらに本発明のロバスト性（robust nature）へ加えられるということである。本発明は、公開文献（例えば、Ｇ
ｅｎＢａｎｋ）からの病原体配列情報を手動で選択しおよび／または公開文献から経験的に決定される診断標的配列を解明するプロセスを記載する。記載されるアプローチは、多数の異なる病原体種の各々について十分な“分野専門知識”を各々が有する科学者のコンソーシアムが、特定のプローブ、試薬、増幅、およびサンプル調製法に特に関係なく、自動アレイ設計プロセスへ組み込まれ得る関連病原体診断配列情報を提供し得るという利点を有する。
【０２４２】
１つの非常に好ましい実施形態において、多数の無関係な病原体の各々について必要な分野専門知識は、ウェブ−ポータル可能化データベース（web-portal enabled database
）によって、最新の様式で維持される。したがって、特定の病原体の個々の研究者から構成される、拡張されたコンソーシアムは、Ａｌｌｉａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＡｆＣＳ）によって採用される“分子ページ”モデル（“molecular page” model）と類似の、“病原体ページ”フォーマット化ウェブポータル（“pathogen page” formatted web portal）を介して、最新の注釈付き（annotated）標的配列
情報を提供することができる。ＡｆＣＳデータベースは、次いで、細胞内シグナル伝達カスケード中に含まれる数千の分子について、そうでなければ理解不可能な量の特定の情報を維持する。このフォーマットにおいて、個々の研究者は、個々のシグナル伝達分子について特別な知識無しに、シグナル伝達事象の多数のシミュレーションにおいて使用され得る詳細なパラメータにアクセスし得る。したがって、別の非常に好ましい実施形態において、個々の病原体についての注釈付きの（annotated）標的配列データは、自動データパ
イプラインへ組織化され、ここで、病原体データベースの総情報コンテントに対して、ユーザ規定される設計制限（例えば、プローブフィーチャーの数、病原体標的の数、アレイ性能のために必要とされる感度および特異性のレベル、など）が課せられ（will impose
）、自動化された最適な標的の選択とマイクロアレイ製造に必要なフォーマットでの業者へのそれらの標的の提出とを可能にする。
【０２４３】
なお別の非常に好ましい実施形態において、以前のプロセスによって決定された前記選択標的配列は、マイクロアレイの実際の使用において回収されるデータと相互に関連され、その結果、確率およびクオリティーについてのマトリクスは、意志決定のために容易に使用され得る。データおよびアルゴリズムのこのような自動パイプライニング（automated pipelining）を行うための２つの好ましいアプローチは、ＶＩＢＥ（Ｖｉｓｕａｌ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）ソフトウエア（Ｉｎｃｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓｂｕｒｇ，ＶＡ）およびｉＮｑｕｉｒｙ（ＢｉｏＴｅａｍ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）であり、これらは、意図される目的についての効果を等しくするために使用され得る、統合されたバイオインフォマティクス環境のクラスの代表である。
【０２４４】
データ獲得−
リシークエンシングマイクロアレイチップからの生配列データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のマイクロアレイリーダーと共にパッケージされるＧｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０（ＧＤＡＳ）によって提供される。
【０２４５】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシングアレイは、所定の数のプローブセルまたはフィーチャーを含む。スキャンニングの間、該ソフトウエアは、各フィーチャーをサブユニットスクエアまたはピクセル（３×３μｍ）に分割する。各フィーチャーは、所定の配列
のユニーク２５塩基オリゴヌクレオチドプローブの多くのコピーを含み、一方、一連の８個のフィーチャーは、既知の参照配列における特定の部位をクエリーする（query）。４
個のフィーチャーは、センス鎖をインターロゲートし（interrogate）、中央の塩基（Ａ
、Ｃ、Ｇ、またはＴである）以外は同一であるプローブを含み、そして４個のフィーチャーは、アンチセンス鎖をインターロゲートし、そして中央の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）以外は同一であるプローブを含む。
【０２４６】
ＧＤＡＳは、セル強度データを使用して、リシークエンシングアレイ上に提示されるあらゆる塩基位置についてベースコールを作製する。ＧＤＡＳについての製造業者セッティング下で、アルゴリズムは、そのコーリング精度を改善するために複数のサンプルからの強度データを使用し、そして各コールについてクオリティースコア（quality score）を
付与する。
【０２４７】
ＧＤＡＳベースコーリングは、（Ｃｕｔｌｅｒら、２００１）において詳述される、以前記載されたベースコーリングアルゴリズム、ＡＢＡＣＵＳに基づく。該モデルは、フィーチャーのピクセル強度は独立および正規分布である（independently and normally distributed）と想定する。該アルゴリズムは、センスおよびアンチセンス鎖フィーチャーについての推定平均バックグラウンドおよび分散（estimated mean background and variance）を計算する。該ベースコーリングアルゴリズムはまた、サンプル（一倍体または二倍体）中の種々の遺伝子型の存在または非存在についてのモデルを特定する。種々のベースコーリングアルゴリズムパラメータが、ベースコーリングパーセンテージおよび精度間のトレード−オフ（trade-off）を得るために、ユーザによって規定され得る（ＧＤＡＳオ
ペレーターズマニュアル／ユーザズガイド、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）
ＧＤＡＳアルゴリズムおよび改変され得るパラメータに関するさらなる情報は、ＧＤＡＳユーザマニュアルにおいて入手可能である。パラメータの記載は、ＧＤＡＳバージョン２．０マニュアル第２０７〜２１７頁にある。ＧＤＡＳについて推奨される（デフォルト）セッティングは、最高レベルの精度に焦点を合わせる、“保守的（conservative）”セッティングである。対照的に、本発明の目的は、ベースコールのパーセンテージを増加させることである。この目的を達成するために、本発明者は、下記に列挙されるように、高度に許容性の（permissive）ベースコール（増加されたパーセンテージ）を許可するようにパラメータを調節した：
“許容性”ベースコーリングアルゴリズムセッティング−
−フィルター条件
・No Signal閾値＝0.500（デフォルト＝1.000000）
・Weak Signal Fold閾値＝20000.000（デフォルト＝20.000000）
・Large SNR閾値＝20.000000（デフォルト＝20.000000）
−アルゴリズムパラメータ
・Strand Quality閾値＝0.000（デフォルト＝0.000000）
・Total Quality閾値＝25.0000（デフォルト＝75.000000）
・Maximum Fraction of Heterozygote Calls＝0.99000（デフォルト＝0.900000）
・Model Type (0 = Heterozygote, 1 = Homozygote)＝0
・Perfect Call Quality閾値= 0.500（デフォルト＝2.000000）
−最終信頼性規則（Final Reliability Rules）
・Min Fraction of Calls in Neighboring Probes = 1.0000（フィルターを無効にする）
・Min Fraction of Calls of Samples＝1.0000（フィルターを無効にする）。
【０２４８】
上記のセッティングは、本願において重要であり、何故ならば、ベースコールアルゴリズムは、最も正確なコール（つまりＳＮＰ検出のため）を作製するために作製されるベースコールの数を犠牲にするようにデフォルトによって設定されるためである。本願におい
て、該技術は、ＳＮＰ検出のために要求されるのと同じ程度を達成することについてあまり関係がなく、しかしその代わり、作製されるコールの数を増加させ、その結果、必要な特異性を維持しつつ、連続配列の最長の可能性のあるストレッチがＧＤＡＳによって作製される。
【０２４９】
本発明の範囲内において、上記に列挙した許容性セッティングは、最適な感度／特異性合意（agreement）を得るように、実施者によって望まれるように、個々にまたは全体と
して変化され得ることが理解される。さらに、上記セッティングは例示的であること、および本発明の所望の結果を変化させることなく、各セッティングが１０％以上（パラメータ依存性）変化され得ることが理解される。
【０２５０】
Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＥＰＩ）および代替物、改変物、発達物
本発明によればまた、それは、個々の病原体を同定するために使用されるマイクロアレイハイブリダイゼーションパターンへ適用される場合、ベースコーリングアルゴリズムから誘導される配列情報である。好ましくは、リシークエンシングプローブによって決定される標的配列の配列は、類似性サーチアルゴリズムを使用してデータベースにクエリーするために使用される。より好ましくは、該アルゴリズムは、一般的に使用されるローカルアラインメント（local alignment）（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ、ＢＬＡ
ＳＴＮ）配列アラインメントアルゴリズムを使用して、所定の標的配列がデータベースレコードにおける特定の配列に対応する確率を統計的に決定する（Ｋｏｒｆ、ＹａｎｄｅｌｌおよびＢｅｄｅｌｌ、２００３）。なおより好ましくは、データベースレコードに対して意味がある類似性サーチを作製するために最も好適であるサブ配列を決定するカスタムアルゴリズムは、自動的に類似性サーチをについてサブミットされる配列のセットを決定する。なおより好ましくは、自動サブ配列解析アルゴリズム（automated subsequence-parsing algorithm）は、本発明において記載されるＲｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｈ
ｏｇｅｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＥＰＩ）であり、配列データベースは、パグリック（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）およびプライベートドメインの両方に存在する。意図される発明における使用に好適である核酸配列類似性サーチアルゴリズムの変形物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＢＬＡＳＴ（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ）、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ、ＦａｓｔＡ、ＭＰｓｒｃｈ、Ｓｃａｎｐｓ、およびＢｅｓｔＦｉｔ（Ｋｏｒｆら、２００３）。
【０２５１】
ＲＥＰＩ代替物および変形物
記載される本発明において、ＲＥＰＩ（Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）ソフトウエア（２００４年９月１５日に出願された米国出願シリアル番号第６０／６０９，９１８号および２００４年１１月２９日に出願された米国出願シリアル番号第６０／６３１，４６０号を参照のこと）を使用して、ＣｕｓｔｏｍＳｅｑ／ＧＣＯＳ／ＧＤＡＳプロセスからのどのベースコールサブ配列が、カスタム化スライディングウィンドウアルゴリズム（customized sliding window algorithm）の使用によ
り有意なＢＬＡＳＴ結果をリターンする可能性が高いかを確認した。引き続いて、ＲＥＰＩは、エンドユーザへＢＬＡＳＴアプトプットを自動的にリターンし、これは、所定のセットのベースコールが特定の細菌配列に対応する可能性に対する確率的評価（probabilistic assignments）を可能にする。この低レベルソフトウエアファンクショナリティー（low-level software functionality）は、全てのより高レベルのファンクションおよびユ
ーザインターフェースがリシークエンシングチップ分析のためにそれを通過（pass though it）しなければならない点で、ＵＮＩＸ（登録商標）またはＵＮＩＸ（登録商標）由来コンピュータオペレーティングシステムの“カーネル（kernel）”に類似している。
【０２５２】
ＲＥＰＩによって提供される低レベルファンクショナリティー（low-level functional
ity）は、核酸（またはアミノ酸配列さえも）の不連続セグメントを使用する、多数のよ
り高いバイオイフォマティクスタスクの中心である。以下の実施例において、本発明者は、配列フラグメントが自動的に個々の病原体へリンクされ得ることを示すデータを提供する。いくつかのより好ましい実施形態において、このアプローチは、病原体の混合物と病原体間の遺伝子組換えとのより良好な識別へリファインされ得る。１つの非常に好ましい実施形態において、該分析ソフトウエアは、アレイの異なるタイルド領域上における重複または相同配列フラグメントの自動検出を可能にし、病原体の混合物の推測を可能にする。なおよりリファインされた実施形態において、該分析ソフトウエアは、異なるタイルド領域からの配列アウトプットが、重複（overlapping）ではなく、しかし遺伝子組換え事
象を推定するために使用され得る連続配列に対応することを決定する。
【０２５３】
例えば、ウイルスの２つの株の共感染は、５’末端（これは、他方のウイルス株についての遺伝子の対応するセクションで置換されている）以外は一方のウイルス株と相同である遺伝子との組換え体を作製し得る。この新規の組換えウイルスゲノムがリシークエンシングマイクロアレイ上にハイブリダイズされると、それは、両方の領域の対応するピースからのシグナルを発生する。どの部分が一緒にフィットして全体標的（entire target）
を形成するのかを示す、病原体の“モデル”を構築するアセンブリアルゴリズム（assembly algorithm）を有する必要がある。該２つが有意な重複（significant overlap）を有
する場合、恐らく混合物が存在すると結論付けるかもしれない。しかし重複が存在しない場合、組換え体が存在する可能性は残ったままである。重複（または欠如（lack of））
の程度は、標的の低濃度によって影響され得、対応してより少量のタイルが埋められる（filled in）。この同一原理は、なおより容易に、そしてより大きな影響を伴って、ウイ
ルスに適用され得、ここで、組換えは、インフルエンザの場合のように、定常かつ反復する事象であり、ここで、ウイルスセグメント間の組換えは、新規のウイルス株を定期的に形成させる。実際に、ＲＥＰＩにおけるこの記載されるファンクショナリティー（functionality）は、病原体混合物と組換えとの識別に必須である。
【０２５４】
別の非常に好ましい実施形態において、ＲＥＰＩアルゴリズムは、（ＲＮＡまたは相補ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを介して）現在記載されるタイプのマイクロアレイを使用してリシークエンスされた転写マーカー（例えば、ＲＮＡ）の分析を可能にする。ゲノム組換え事象の推測について上述されるものに類似する方法において、転写配列はまた、アセンブリされ得、感染についてのマーカーとして役立ち得る転写編集事象（transcriptional editing events）および病原体バイアビリティー（pathogen viability）を決定する。
【０２５５】
別のＲＥＰＩ代替物（サンプル中の病原体標的の量を評価する）
本発明のアプローチは、病原体の混合物と所定の病原体内の組換え事象とを識別し得るだけでなく（本明細書中他の場所で記載される）、リシークエンシングマイクロアレイアッセイにおいて検出された病原体の相対量の評価（estimate）（定量化）をエンドユーザに提供することはまた、非常に価値がある。特に、これは、臨床医（技術者）が、複数の病原体ゲノムシグネチャー（signatures）が検出された場合に原因および作用を帰属しようとする際に、非常に有用である。
【０２５６】
２つのタイプのデータがこの目的のために使用され得る。第１のものは、チップ上におけるハイブリダイゼーションシグナルの絶対強度である。非線形関係が、溶液中の標的の量と実際にハイブリダイズする量（および得られるシグナル）との間に存在する。しかし、サンプル中の標的核酸の量の評価は、コントロール条件下で調製される標準曲線との比較によって行われ得る。シグナル強度データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータヒエラルキー（hierarchy）における．ＣＥＬファイルから容易に入手可能であり、そして該．ＣＥ
Ｌファイルの内容物は本開示において使用されなかったが、ＲＥＰＩのアプトプットは、
該．ＣＥＬファイルの強度値を含めるように容易に変換され得る。第二に、ベースコールのパーセンテージ［総タイル領域サイズのパーセンテージとして、およびスライディングウィンドウアルゴリズムを満足する選択されたサブ配列内のベースコールのパーセンテージとして、の両方］が、濃度の指標（measure）として使用され得る。本発明者の結果は
、これらのパーセンテージメトリクス（metrics）の両方ともが、標的濃度が減少するに
つれて減少し、しかし、正確な標的配列は依然として同定され得ることを示す。
【０２５７】
病原体検出のための一般的な有用性
好ましい実施形態において、本明細書中に記載される本発明は、臨床セッティングにおける（ポイント−オブ−ケア（point-of-care）でまたはその付近での）一般的な呼吸器
病原体（respiratory pathogens）ルーチン診断およびサーベイランスのために使用され
る。容易に得ることが出来るサンプル（例えば、鼻洗浄（nasal wash）、鼻スワブ（nasal swab）、咽喉スワブ（throat swab）、痰、または血液）を単純な様式で処理し、核酸
単離物（isolates）［これらは、吸着性プロセス（adsorptive process）を使用して得られる］を作製し、病原体特異的標的について濃縮し、偏りのない（non-biased）（例えばトータル）増幅法またはマルチプレックスト（multiplexed）ＰＣＲ法を使用して増幅し
、そして洗浄および画像化の前に短時間、リシークエンシングマイクロアレイ上でハイブリダイズさせる。全体的なプロセスは十分に単純であり、その結果、当業者（医療技術者レベル）は、彼らのルーチンワークパターンの顕著な妨害なしに、該アッセイを行うことができる。ベースコールは、カスタムアルゴリズムを使用して、または業者によって特定されるステップを使用して作製される。ＲＥＰＩ、またはその変形が使用され、マイクロアレイによって作製されるベースコールを自動的に解析し、そしてエンドユーザ（例えば、医師、ヘルスケア提供者（health care provider）、公衆衛生提供者（public health officer）、または他の意志決定者（decision-makers））に、疾患症状および合併症の原因である感染性病原体のマネージメント（例えば、診断、治療、予防および大発生制御／封じ込め指標（outbreak control/containment measures））についての決定−クオリテ
ィ情報（decision-quality information）を提供する。この分析は、ＲＥＰＩ（例えば、ローカル専用ＢＬＡＳＴサーバ）によってクエリーされる埋め込まれた配列データベースの使用によって、ローカル的に生じる。ルーチン診断機能性を提供することに加えて、該マイクロアレイはまた、他者、即ち、公衆衛生局（public health officials）の関与の
原因となる、非常に起こりそうもない（即ち、生物テロ）病原体についてのマーカーを有する。しかし、鼻洗浄物または咽頭スワブが生物テロ薬剤の診断のために最適なサンプルタイプでないかもしれないこと、および別個のサンプルタイプが必要とされるかもしれないことが理解される。
【０２５８】
本発明の範囲内でまた、以下に、本発明のマイクロアレイおよび方法の有用性をさらに実証する：
シナリオ１：
患者は、Ｔ＞１００．５および呼吸器症状を有して、医療機関に到着する。鼻洗浄物および／または咽頭スワブを採取する。このルートで同定され得る病原体としては、表１に列挙されるものを含む、一般的に存在する病原体が挙げられる。熱の存在が、培養により呼吸器病原体を単離することについての重要な基準であることが判明しており、そして文献は、病原体は典型的に発熱期間にピーク力価で存在することを実証する。
【０２５９】
生物テロ薬剤について、生物学的薬剤（biological agen）の故意の放出後の呼吸分泌
物中の感染性力価について情報は、文献においてほとんど入手可能でない。生物テロの薬剤のエアゾール放出は、暴露後の最初の２４時間で生物の検出可能な力価へ至ると考えられる。暴露後の最初の２４時間後に存在する個人において、該マイクロアレイは、そうでなければ誤ってＢＴ／ＢＷ因子由来のケースであると疑われるかもしれない、一般的な病原体を同定する目的に役立つ。顕著なエアゾール放出に暴露された個人の集団は、急速に
症状を進展させ、そして、検出のために鼻孔中のＢＴ／ＢＷ因子を保持する。痘瘡のような疾患について、症状の発症の潜伏期は、遥かにより長く、しかしウイルスは、数日間の咽喉培養物から単離され得る。
【０２６０】
シナリオ２：
個人は、数日間、病気であり、そして初期は病院に行かず、しかし自分で治療することを選択した。患者は、初期は熱に気付かないかもしれなかったが、現在、熱および呼吸器症状を有し、そして解決法が無いこと心配している。医療関係者（Health Care Practitioner）（ＨＣＰ）は患者を診て、適切な臨床サンプルを決定する。患者がより病気に見えるならば、胸部Ｘ線写真を撮ってもよい。より低い呼吸器感染症を引き起こす一般的な生物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：肺炎マイコプラスマ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、インフルエンザＡ／Ｂ、ＲＳＶ、パラインフルエンザ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＳＡＲＳ。問題のＢＴ／ＢＷ因子の中でも、炭疽菌（B. anthracis）、痘瘡（Smallpox）、ペスト菌（Y. pestis）、野兎病菌（F. tularensis）で、異常な胸部Ｘ線写真が見られ得る。一般的な呼吸性生物について、痰サンプルを送ることを選択する実施者（practitioner）もいるが、鼻洗浄物／咽頭スワブが依然として好適なサンプル技術であり得る。ＢＴ／ＢＷ因子について、痰および血液が好適なサンプル技術であり得る。
【０２６１】
シナリオ３：
既知の因子の進行中の発生。該マイクロアレイは、他の一般的な病原体の検出ケースに有用であり続け得け、しかし、任意のタイプの好適な試料を使用して既知のＢＴ／ＢＷ因子をスクリーニングするために使用されてもよい。他の分析がより安価であると判明するかもしれず、しかし、該マイクロアレイは、病原体同定の際に、法医学的情報（forensic
information）および抗生物質耐性データを提供し得る。
【０２６２】
全体的なビジネスモデル
リシークエンシングＤＮＡマイクロアレイおよび関連するデバイス（より低い含有量のマイクロアレイの他のタイプまたは代替の配列検出器を含む）は、一体化された病原体診断／サーベイランスシステムのエレメントの１クラスである。このシステムは、診断、情報および疫学コンポーネントから構成される。診断レベルで、ＲＰＭ（および付属のデバイス）は、感染性呼吸器疾患の診断、患者特異的治療情報および予後情報を提供するための、迅速かつ費用効率の高い方法を提供する。これは、１または数個の病原体の臨床的疑念（clinical suspicion）（例えば、肺炎マイコプラスマおよび“ウォーキング肺炎（walking pneumonia）”の提示を有する他の病原体は、細菌培養物を得ること、その病原体
に対する抗生物質の存在などによって試験される）から、症状および器官系または影響を与えられた系（organ system or systems effected）に基づくマルチプレックストＤＮＡマイクロアレイによる症状ベースかつ広範囲の鑑別試験への、提供者についての診断重視のシフトを示す。単一の高度に多重化されたＤＮＡアレイ（single highly multiplexed DNA arrays）は、どの病原体の群を治療するか（例えば、細菌、ウイルス、寄生生物、および真菌病原体）についての診断情報をさらに提供し、原因となる因子の疑念に基づく処方箋の数を減少させることによって（例えば、ウイルス性呼吸器疾患についての抗生物質を処方することは、効果を有さない）、投資に対して実質的なリターンを生じさせる。さらなる診断適用は、以下に影響を与える（effecting）全ての病原体をカバーするように
作製され得る：器官または器官系（例えば、呼吸器、尿生殖器、中枢神経系など）、症候群（例えば、原因を同定せずに、全ての可能性のある感染病原因を除外する、２週間病院において評価されて未知の起源の熱）、症状（例えば、痒いじんま疹または発疹、咳などを引き起こす全ての病原体）［地理的位置に存在する病原体または脅威のコレクションの周囲の］、または機能的カテゴリー（例えば、病院あるいは刑務所または老人ホームのような他の囲まれたセッティングにおいて抗菌剤耐性を有すると知られている全ての生物に
基づく分類）。この高度に多重化された鑑別診断試験は、感染の原因因子、該因子の抗菌剤感受性、および該因子の性質についてのゲノム配列特異的手掛かり（clues）を決定す
ることによってなされ、その結果、臨床管理の効果および効率を増加させるための最大数の機会が同定される。
【０２６３】
しかし、作製される多数の特異的分子クエリーのために、各々、以前では得られない詳細レベルで、多数の病原体が検出され得る。したがって、“サーベイランス”アクティビティーの一部として引き続いてそして稀に行われる多数のアッセイ（培養、血清型決定（serotyping）、およびＰＣＲ確認）は、今回、診断と同時に行われ、サーベイランスサポートのために臨床レベルで現在必要とされる煩わしくそして高価なタスクについての必要性を未然に防ぐ。これは、特異的なオリゴヌクレオチドプローブセットに依存する場合には法外に複雑である様式でのＲＮＡウィルス（例えば、インフルエンザおよびＳＡＲＳ）の変異体の診断およびサーベイランスに大いに関連している。
【０２６４】
本明細書中で記載される特定の実施形態において、その製造が多数の標的配列およびそれらを使用してアレイを製造する手段の利用可能性に依存しない、診断マイクロアレイを有することは非常に有利である。より重要なことには、標的配列が不変である（invariant）という仮定に制限されないことが、重要である。診断ＤＮＡマイクロアレイは、特異
的オリゴヌクレオチドプローブの再設計およびアレイ再製造を必要とすることなく、モデル病原体の特異的であってしかし予期されないゲノム変異体を同定する。これは、時間効率的（time-effective）様式で感染症発生の原因をキャラクタライズする能力にとって重要である。例えば、このようなマイクロアレイは、従来のアプローチ［病原体が容易に培養可能であるならば、数週間〜数ヶ月を必要とするプロセス］を使用して病原体を単離、培養および配列決定することを必要とせずに、インフルエンザまたはＳＡＲＳウイルスの新規の変異（variations）を迅速に検出するために使用され得る。
【０２６５】
本発明はまた、病原体の混合物を検出するための適用［特に、該混合物が特異的試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）によってインターロゲートされるかもしれないことを示唆する予備的証拠が存在しない場合］を含む。したがって、本発明は、疾患病因において相互作用する病原体の相補的役割（complementary roles）を測定する能力に衝撃を与える手
段を提供する。しかし、ウイルスまたはバクテリア在庫品質管理およびウイルスワクチン生産の評価のような適用において［十分に培養される組換え体を製造するための培養可能なウイルスおよび野外株の意図的な混合物を含む］。それによって、本発明は、ワクチン有効性のために正しくそして好適なエピトープの提示を可能にする。
【０２６６】
該システムのインフォマティクスコンポーネントは、ローカルの（ポイント−オブ−ケア）自動マイクロアレイ分析を可能にし、ならびに多方向情報多重方向情報転送を調整するための必要なコンポーネントを提供する。情報の“上方向の”フロー（“Upward” flow）は、局所的、地域的、国家的および国際的なレベルへの、好ましくはＦＡＳＴＡフォ
ーマットの、リシークエンシングチップからの特異的配列ベースコールおよび全ての関連するローカルプロセッシング結果の転送を必要とする。情報の“横方向の”フロー（“Lateral” flow）は、他のローカルポイント−オブ−ケア医療機関への、特異的配列ベースコールおよび関連するローカルプロセッシング結果の交換を含む。“下方向の”フロー（“Downward” flow）の情報は、地域的および局所的な衛生局（health officials）への
、国家的レベルデータ統合の提供と規定される。
【０２６７】
臨床サンプルと同様に、環境サンプルは、未知の起源の高いゲノムバックグラウンド中に少量の標的核酸を含み得る。しかし、所定のタイプの臨床サンプルとは異なり、環境サンプル(例えば、土、水、あるいはエアゾール粒子コレクターから回収される)中に見られるバックグラウンドは、地理的位置、季節および環境的条件に依存して、より不均一な組
成を示すかもしれない。したがって、上述の増幅、濃縮および／またはサブトラクション戦略が、信頼性の高いベースコーリングを得るために使用され得る。
【０２６８】
法医学および環境適用
ＲＰＭによって提供される詳細な配列情報の量は、医学診断およびサーベイランス以外の種々の適用を可能にする。したがって、該装置の能力は、特定の病原体株の法医学的フィンガープリント（forensic fingerprinting）にまで及ぶ。該能力は、確証診断分析の
従来のプラクティスの代替として、感染症の病因の先制（preemptive）診断を可能にする。意図的な感染、中毒または生物テロ事象の場合、該リシークエンシング病原体検出マイクロアレイは、発生調査プロセスの完了した第一ステップとして該株へ該病原体を同定させることに向けられる、標的にされる公衆衛生封じ込め手段を実施することによって、該事象の可能性のある起源元（originator）を決定するためおよび該事象の迅速な緩和（例えば、感染力の測定、抗菌剤耐性、または生物への操作された修飾）を可能にするために使用され得る詳細な株同定を可能にする。
【０２６９】
本発明は、さらに、誘導的（derivative）サブアレイを含む、アレイの反復的かつ適応的な設計、製造およ検証を自動化および最適化する方法およびプロセスを示唆する。非常に好ましい実施形態において、企業レベル、個々の病原体についての専門家のコンソーシアムは、ウェブポータル可能化データベース（web portal-enabled database）を維持す
る。該コンソーシアムは、ビルレンスおよび同定のために病原体標的配列を維持する。
【０２７０】
本発明に記載される同一の技術は、空気、水、土または表面スワブ（surface swabs）
を含む、非臨床サンプルについて使用され得る。サブトラクティブアプローチ続いての包括的増幅が望ましいアプローチである場合、本発明に記載されるものに対して必要なただ一つの修正は、核酸抽出およびバックグラウンド核酸除去に必要なものである。
【０２７１】
集団におけるマルチプル病原体サイベーランス（Multiple Pathogen Surveillance in a Population）
本発明は、さらに、リアルワールドオペレーショナルセッティング（real world operational setting）においてその能力を有効にする特定の実施を提供する。この実施は、一般的である病因およびあまり一般的でない病因を含む急性呼吸器疾患の集団発生に関係し、同時に、個々の遭遇における敵対的な病原性因子（あるとしても稀）の可能性のある提示を評価する。したがって、本発明は、感染性発生に関与する複数の感染性病原体のほぼリアルタイムのサーベイランスを行う手段を提供する。このようなサーベイランスは、有効にされそして最終的には“リアルワールドテストベッド（real world testbed）”において運用可能となり得る。好ましい実施形態において、該リアルワールドテストヘッドは、規則的に種々の呼吸器病原体に遭遇する人間集団である。好ましい実施形態において、該集団は、軍事施設または基地での軍人から構成される。非常に好ましい実施形態において、該集団は、現役の軍人から構成される。
【０２７２】
エンドユーザー特化適用（End user-specified applications）
マイクロアレイ設計およびアッセイの一体化されたプロセスは、配列がマイクロアレイ製造業者に提供されることのみを要求し、そして付随的な試薬（例えば、特異的ＰＣＲ用）の設計を含まない。したがって、ゲノミクスについての詳細な知識を有していないエンドユーザは、マイクロアレイに基づくアッセイの質的特質（qualitative attributes）を定義することができ、そして自動バイオインフォマティクスパイプラインは、リシークエンシングマイクロアレイ製造業者へのサブミッションに好適な標的遺伝子サブ配列を選択するために使用される。これは、特定の地理的ロケーション、戦域（theater of operations）のための、新規のマイクロアレイ設計の迅速な配備を可能にする。したがって、本
発明によって可能にされる一体化設計／分析能力は、本明細書中に列挙されるものに加え
て他の想定される適用に一般化される。
【０２７３】
アデノウイルス配列−
本発明のさらなる実施形態において、本発明の日付で知られていなかった、１３個のアデノウイルス株のゲノム配列である。該１３個のアデノウイルス株は、以下である：Ａｄ３、Ａｄ３ＦＳ＿ｎａｖｙ、Ａｄ４、Ａｄ４ｖａｃｃｉｎｅ、Ａｄ４ＦＳ＿ｎａｖｙ、Ａｄ４ＦＳ＿ＡＦ、Ａｄ５ＦＳ、Ａｄ７、Ａｄ７ＦＳ＿ｎａｖｙ、Ａｄ７  ｖａｃｃｉｎｅ、Ａｄ１６、Ａｄ１、およびＡｄ２１。これらのゲノム配列は、実施例中の表６に示されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号が付与されている。部分注釈（partial annotation）を含む、これらの配列の各々についての全ＧｅｎＢａｎｋ記録は、本明細書に添付の配列表において見られる。
【０２７４】
“ポリペプチド”は、本明細書中で使用される場合、ペプチド結合によって連結されたいくつかのアミノ酸残基の配列を意味することが理解される。このようなアミノ酸は当該分野において公知であり、そして修飾されていないおよび修飾されたアミノ酸を含む。さらに、当該分野において公知の１以上の修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化など）が、ポリペプチドを修飾するかもしれない。用語“単離される（isolated）”は、その天然環境からの分離される（separated）ことを意味する。この用語はまた、用語“精製され
る（purified）”（１００％純粋）および“実質的に精製される（substantially purified）”（少なくとも９０％純粋）を含むように意図される。
【０２７５】
用語“ポリヌクレオチド”は、一般的に、ポリリボヌクレオチドおよびポリデオキシリボヌクレオチドをいい、そして修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡを意味し得る。
【０２７６】
用語“相同な（homologous）”は、本明細書中で使用される場合、同一種由来または異なる種由来の、２以上のポリヌクレオチドまたは蛋白質の間の配列類似性を意味すると理解される。この用語の意味内で、候補配列の少なくとも７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％のヌクレオチド塩基（アミノ酸）組成が本発明の配列に対応する場合、前記２以上のポリヌクレオチド（または蛋白質）は相同である。本発明によれば、“相同な蛋白質（homologous protein）”は、本発明の配列の活性の活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％を保持することが理解される。本明細書中で使用される場合、“対応する（corresponds）”は、対応のアミノ酸が同一であるかまたは互いに相同なアミノ
酸であることを意味すると理解される。表現“相同なアミノ酸（homologous amino acids）”は、特にそれらの電荷、疎水性特性、立体的特性などに関して、対応の特性を有するものを意味する。同一の専門用語が、対応の蛋白質をコードする遺伝子配列についてのＤＮＡまたはＲＮＡ配列相同性を記載するために使用され得る。
【０２７７】
用語“相同なフラグメント（homologous fragment）”は、本明細書中で使用される場
合、同一種由来または異なる種由来の、２以上のポリヌクレオチドまたは蛋白質を意味すると理解される。この文脈において、少なくとも５０アミノ酸を有するフラグメントと少なくとも４０％同一性を共有する場合、フラグメントは相同であると考えられる。好ましくは、相同なフラグメントは、少なくとも５０アミノ酸を有するフラグメントに対して少なくとも５０％同一性を共有する。より好ましくは、相同なフラグメントは、少なくとも５０アミノ酸を有するフラグメントに対して少なくとも６０％同一性、少なくとも７０％同一性、少なくとも８０％同一性、少なくとも９０％同一性、または少なくとも９５％同一性を共有する。したがって、相同なフラグメントは、本発明の範囲内に含まれる。相同なポリヌクレオチドについて、同一の相同性範囲が本発明において想像されることが理解され、しかし、１０００ヌクレオチドまでの範囲に渡ってであって、全ての整数を含む（
即ち、１５０、２５０、３００、５００、７５０など）。
【０２７８】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同性、配列類似性または配列同一性は、公知のソフトウエアまたはコンピュータプログラム、例えば、ｔｈｅ  ＢｅｓｔＦｉｔ  ｏｒ  Ｇａｐ  ｐａｉｒｗｉｓｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍｓ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ５３７１１）を使用することによって慣用的に測定され得る。ＢｅｓｔＦｉｔは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)のローカルホモロジー
アルゴリズムを使用し、２つの配列間の同一性または類似性のベストセグメントを見つけ出す。Ｇａｐはグローバルアラインメント（global alignments）を行う：Needleman and
Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)の方法を使用する１つの配列の全ておよび別の類似の配列の全て。ＢｅｓｔＦｉｔのような配列アラインメントプログラムを使用する場合、配列相同性、類似性または同一性の程度を測定するために、デフォルトセッティングが使用され得、あるいは、好適なスコアリングマトリクス（scoring matrix）が、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択され得る。同様に、２つの異なるアミノ酸配列間の配列同一性、類似性または相同性を決定するためにＢｅｓｔＦｉｔのようなプログラムを使用する場合、デフォルトセッティングが使用され得るか、あるいは好適なスコアリングマトリクス（例えば、ｂｌｏｓｕｍ４５またはｂｌｏｓｕｍ８０）が、同一性、類似性または相同性スコアを最適化するために選択され得る。
【０２７９】
本発明はまた、オープンリーディングフレームによって同定される、完全な遺伝子（complete genes）を含むポリヌクレオチドに関する。本発明によって含まれる好ましい遺伝子の例としては、Ｅ１Ａ、ヘキソン、およびファイバー（fiber）が挙げられる。Ｅ１Ａ
、ヘキソン、およびファイバーの配列、ならびに本発明の範囲内の他の好ましいポリヌクレオチド配列は、添付の配列表中に見られる。本発明は、また、前記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの配列を含むプローブとの対応のジーンバンクのハイブリダイゼーション、および該ＤＮＡ配列の単離、の手段によってスクリーニングすることによって得られ得る、前記遺伝子のフラグメントおよびポリヌクレオチドおよびそのフラグメントを含む。
【０２８０】
本発明はまた、遺伝暗号の縮重から生じるコーディングＤＮＡ配列に関する。さらに、当業者はまた、該蛋白質の活性に何ら根本的な変化を生じさせない（即ち、機能的にニュートラルである）“センス突然変異（sense mutations）”として、蛋白質中のアラニン
によるグリシンの置換あるいはグルタミン酸によるアスパラギン酸の置換のような、保存的なアミノ酸置換を認識する。蛋白質のＮおよび／またはＣ末端での変化は、その機能を実質的に害さず、そして該機能を安定化さえし得ることも、知られている。
【０２８１】
本発明に従うポリヌクレオチド配列は、それらのｃＤＮＡまたは遺伝子を単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡについてのハイブリダイゼーションプローブとして好適であり、これは、該プローブ配列に対する高度の類似性を示す。
【０２８２】
本発明に従うポリヌクレオチド配列はまた、活性酵素をコードするＤＮＡの産生のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとしても好適である。
【０２８３】
プローブまたはプライマーとして役立つ、これらのようなオリゴヌクレオチドは、３０超、好ましくは３０まで、より好ましくは２０まで、なおより好ましくは少なくとも１５、そして最も好ましくは少なくとも１３の連続ヌクレオチドを含有し得る。少なくとも４０〜５０のヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオチドも好適である。
【０２８４】
ハイブリダイゼーションプロトコルは当該分野において公知であり、そして、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989)に開示されている。しかし、本明細書中で使用される場合、ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、従来の相同性プログラムを使用して測定した場合に、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％相同であるポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを可能にする条件であり、その例は、ウィスコンシン大学から入手可能なＵＷＧＣＧ配列分析プログラムである（Devereux, Haeberli &
Smithies, 1984）。典型的に、ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８
．３で、約１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、典型的に約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃そして長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチド超）について少なくとも６０℃であるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤（destabilizing agents）の添加で達成され得る。典型的な低ストリンジェンシー条件は、３７℃で１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、１Ｍ  ＮａＣｌ、３０〜３５％ホルムアミドの緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、ならびに５０〜５５℃での１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０  Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍ  クエン酸三ナトリウム）での洗浄を含む。典型的な中程度ストリンジェンシー条件は、３７℃での１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、４０〜４５％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、ならびに５５〜６０℃での０．５×〜１×ＳＳＣでの洗浄を含む。典型的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃での１％ＳＤＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション、ならびに６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣでの洗浄を含む。
【０２８５】
特異性は、典型的に、ポストハイブリダイゼーション洗浄に関係し、重要な因子は、最終洗浄溶液の温度およびイオン強度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔｍは、ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌの式（ＭｅｉｎｋｏｔｈおよびＷａｈｌ、１９８４）から概算され得る：Ｔｍ  ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ；式中、Ｍは一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは塩基対の該ハイブリッドの長さである。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブへハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨ下）である。Ｔｍは、ミスマッチングの各１％について約１℃低下され；したがって、Ｔｍ、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性の配列へハイブリダイズするように調節され得る。例えば、約９０％同一性を有する配列が求められる場合、Ｔｍは、１０℃低下され得る。一般的に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨで特定の配列およびその相補体についての熱融解点（thermal melting point）（Ｔ
ｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし、厳格にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得；中程度にストリンジェントな条件は、熱融解点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得；低ストリンジェンシー条件は、熱融解点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０ｏＣ低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を使用し得る。等式、ハイブリダイゼーションおよび洗浄組成物、および所望のＴｍを使用して、当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液のストリンジェンシーの変化は本質的に（inherently）記載されていると理解する。所望のミスマッチングが４５℃未満（水溶液）または３２℃未満（ホルムアルデヒド溶液）のＴｍを生じさせる場合、ＳＳＣ濃度を増加させることが好ましく、その結果、より高い温度が使用され得る。核酸のハイブリダイゼーションへの広いガイドは、Current Protocols in Molecular
Biology, Chapter 2, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (2000)において見られる。
【０２８６】
本発明において、“プライマー”または“プローブ”は、合成的にまたは生物学的に作製され、そして特定のヌクレオチド配列を含み、そして標的ヌクレオチド配列を含むセクションへのハイブリダイゼーションを可能にする、ポリヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドを意味する。
【０２８７】
規定されるプライマーまたはプローブ、ならびに本発明の他の全てのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、シアノエチル−ホスホルアミダイト前駆体を使用する自動固相化学合成を含む、いくつかの周知の方法のいずれによっても作製され得る。合成プライマー／オリゴヌクレオチドの構築のための他の周知の方法も、当然ながら、使用され得る。J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning 11 (2d ed. 1989)。
【０２８８】
サンプル核酸を増幅するために使用されるプラマーは、検出可能な部分へカップリングされ得る。このような検出可能な部分の好ましい例は、フルオレセインであり、これは、検出システムとしてレーザー光を使用する核酸配列決定システム中において使用される標準的な標識である。しかし、他の検出可能な標識もまた使用され得、他のフルオロフォア、放射標識、化学的カプラー（chemical couplers）（例えば、ストレプトアビジン結合
酵素で検出され得るビオチン）、およびエピトープタグ（例えば、抗体を使用して検出されるジゴキシゲニン）が挙げられる。プライマーは修飾され得、それによって、別のヌクレオチドが添加されるか、除去されるか、または該オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つのヌクレオチドについて置換される。オリゴヌクレオチドの合成後の、放射活性物質、酵素、蛍光物質などの公知の標識の導入もまた、そこに含まれる。
【０２８９】
同様に、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドとハイブリダイズするために使用されるプローブ／オリゴヌクレオチドは、例えばこのようなポリヌクレオチドの検出の目的のために、検出可能な部分へカップリングされ得る。
【０２９０】
本明細書中で使用される場合、用語“増強（enhancement）”は、対応するＤＮＡによ
ってコードされる、植物細胞および／または植物中の１以上の酵素の細胞内活性を増加することを意味する。増強は、細菌細胞の種々の操作の助けを借りて達成され得る。増強（特に、過剰発現）を達成するために、対応する遺伝子のコピーの数が増加され得、強力なプロモータが使用され得、あるいは構造遺伝子の上流に配置されるリボソーム結合部位またはプロモータおよび調節領域が変異され得る。構造遺伝子の上流に組み込まれる発現カセットは、同一の様式で機能する。さらに、誘導プロモータ（inducible promoters）を
使用することにより発現を増加させることが可能である。高活性を有する対応の酵素をコードする遺伝子もまた使用され得る。発現はまた、ｍＲＮＡの寿命を延長するための手段によって改善され得る。さらには、酵素の分解を防止することは、全体として酵素活性を増加する。さらに、これらの手段は、任意の所望の様式で、必要に応じて組合され得る。
【０２９１】
高活性を有する対応のまたはバリアント酵素をコードする遺伝子も使用され得る。好ましくは、対応の酵素は、該酵素の天然形態よりも高い活性を有し、より好ましくは、少なくとも５、１０、２５％または５０％超活性の範囲、最も好ましくは、天然酵素の活性の２倍超である。
【０２９２】
本発明の上記の記載は、当業者がそれを作製および使用することができるように、それを作製および使用する様式およびプロセスを提供し、この実施可能性は、特に、原記載の一部を形成する、添付の特許請求の範囲の要件について提供される。
【０２９３】
本明細書中で使用される場合、フレーズ“からなる群から選択される”、“から選択さ
れる”などは、特定の材料の混合物を含む。
【０２９４】
数値限定または範囲が本明細書中で述べられる場合、終点（endpoints）が含まれる。
また、数字限定または範囲内の全ての値およびサブ範囲（sub-ranges）は、明示的に書き出されるかのように、具体的に含まれる。
【０２９５】
上記の説明は、当業者が、本発明を作製および使用することを可能にするように提供されており、そして特定の適用およびその要件の意味で提供される。好ましい実施形態への種々の修飾は、当業者に容易に明らかであり、そして本明細書中で規定される一般的な原則は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の実施形態および適用へ適用され得る。したがって、本発明は、示される実施形態に限定されるように意図されず、しかし、本明細書中に開示される原則および特徴と一致する最も広い範囲に一致される。
【０２９６】
本発明は一般的に記載されたが、例示目的のみに本明細書中に与えられそして特に述べられない限り限定的であるように意図されない、特定の具体的な実施例を参照することによってさらに理解され得る。
【実施例】
【０２９７】
実施例
材料および方法−
表６（下記）は、以下の実施例において引用するアデノウイルス株を列挙する。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、各株に付与されたゲノム配列番号をいう。これらの配列は、発明時に公衆に利用可能ではなく、そして本発明の実施形態を形成し、これらのフラグメントも同様である。
【０２９８】
【表６】
0005517996.tif 000034
【０２９９】
部分注釈（partial annotation）を含む、これらの各々についての全ＧｅｎＢａｎｋ記録は、本明細書に添付の配列表において見られる。
【０３００】
インフルエンザ内容物（content）
ＲＰＭＶ１上のタイルにより表されるプロトタイプインフルエンザタイプは、以下である：
【０３０１】
【化１】
0005517996.tif 000035
【０３０２】
パブリックドメインおよびパーソナル通信から得られる、上述の配列、ならびに残りの病原体標的配列の各々についてのアクセッション番号を、表９に列挙する。
【０３０３】
調製例１：ＲＰＭバージョン１チップ設計
以下の実施例において使用されるリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭバージョン１チップ）の作製のために、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘへＤＮＡ配列を提供した。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘへへのＤＮＡ配列および命令ファイル（instruction files）の提出
は、製造業者使用説明書ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭ  Ａｒｒａｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌおよびプロダクトリテラチャー（product literature）に従った。プローブ長は、名目上２５ヌクレオチド長であり、そしてセンスおよびアンチセンスの両方向で、４個の可能性のあるバリアント（Ａ、Ｃ、ＴまたはＧ）の各々について可変（インターロゲーションポイント）中央ヌクレオチドを含んだ。
【０３０４】
上記に列挙されるＲＰＭＶ１病原体について選択される標的遺伝子は、それらの増幅のために使用されるそれぞれのＰＣＲプライマーと共に、配列表および表８において示されるバージョン１レイアウトで示される。タイリングおよびチップ製造のために提出される配列は、表７に概述されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ命令ファイルに基づき、これは、配列番号１〜５８に対応する。対応の“命令ファイル”は、各タイル領域について別名（alias designator）（例えば、ＦｌｕＡＨＡ５）を列挙し、そして“ＦＡＳＴＡ”フォーマットされた標的遺伝子配列（これは、完全標的遺伝子の全部または一部であり得る）を提供する。
【０３０５】
【表７−１】
0005517996.tif 000036
【０３０６】
【表７−２】
0005517996.tif 000037
【０３０７】
【表７−３】
0005517996.tif 000038
【０３０８】
【表８−１】
0005517996.tif 000039
【０３０９】
【表８−２】
0005517996.tif 000040
【０３１０】
【表８−３】
0005517996.tif 000041
【０３１１】
命令ファイルは同一の別名（alias designators）を参照し、しかしさらに、アレイ上
へ実際にタイル張りされる実際のサブ配列を特定する。大抵の場合、これは、配列ファイルからの全配列を示すが、他（例えば、ＦｌｕＢＭＡＴＲＩＸ）の場合において、総配列のヌクレオチド１〜３６２のみが、タイリングのために使用された。表９は、命令ファイルに示される情報を提供する。
【０３１２】
表９（下記）：ＲＰＭＶ１設計仕様の命令ファイル（スペシフィックファイル（specific file））。別名（alias designator）は、各々の分離した“タイル”領域（例えば、
病原体ゲノム配列のストレッチのリシークエンシングのために必要とされる全てのプロー
ブ組合せを含むマイクロアレイの幾何学的領域）へ帰属された名称である。病原体、配列アクセッション番号、および各タイル領域についてのタイルサイズが示される。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ提出フォーマットで処理された、命令は、表７に示される。命令ファイルは、添付の配列表に示される配列番号１〜５８において見られる完全標的遺伝子の完全または部分配列を参照する。
【０３１３】
【表９−１】
0005517996.tif 000042
【０３１４】
【表９−２】
0005517996.tif 000043
【０３１５】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘでのチップ設計チームは、上記情報および対応の配列ファイル情報の組合せを使用して、チップのレイアウトを作製した。図１は、任意の所与の病原体についての遺伝子配列が、下記の実施例において使用されるリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭバージョン１チップ）上のどこでクラスターされるかの関数としての、チップレイアウトの全体像を示す。この図およびチップレイアウトは、ＲＰＭＶ１についての種々の病原体への“リアルエステート”割り当て（“real estate” allocation）
の例示のためだけであり、そして決して限定的であると意図されない。当業者は、このチップ上の病原体クラスターの各々へ捧げられる配列の相対的な順番および量は、該チップのユーティリティに対して本質的悪影響を与えること無しに変化され得ることを理解する。
【０３１６】
各々の分離したタイル領域からの最初の１２および最後の１２配列がリシークエンシングマイクロアレイのタイリング戦略によってクエリーされないことをタイリング戦略が命令することに注意することが重要であり、何故ならば、それらは、第１３位で変化される最初および最後の２５量体プローブのコンポーネントとして使用されるからである。
【０３１７】
該チップのアデノウイルス領域（Ａｄ４，Ａｄ５，Ａｄ７およびＡｄ７ワクチン）に使用される配列は、全て、本発明者によって配列決定されたゲノムの初期ドラフト（early drafts）に由来した。タイルド領域のために使用されるゲノムに対応するＧｅｎＢａｎｋサブミッションファイルは、表６に列挙される。プロトタイプについてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘへサブミットされた配列は、該ゲノムの初期ドラフトに基づいたので、それらの初期配列とＧｅｎＢａｎｋへサブミットされた最終配列との間で不一致が観察された。それらの不一致のリストを表１０に提供する。
【０３１８】
【表１０−１】
0005517996.tif 000044
【０３１９】
【表１０−２】
0005517996.tif 000045
【０３２０】
【表１０−３】
0005517996.tif 000046
【０３２１】
この比較的少数の不一致は、実施例において記載される、アデノウイルス４型の１つの特別なケースを除いて、正確な生物と関連し得るベースコールを作成する該チップの能力を妨げなかった。全体的に、本発明のリシークエンシングマイクロアレイ技術は、塩基置換に関してタイルド遺伝子の正確な（リファインされた）最終配列を確認し、本発明の予期されないロバスト性（robustness）を検証する。
【０３２２】
調製例２：ＰＣＲプライマー設計および増幅プロトコル
縮重ＰＣＲプライマー設計−
保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲを支援する、プライマー選択の目的は、Ｅ１Ａ、ファイバーおよへクソン遺伝子の種特異的の可変領域をフランキングする保存された領域を標的にするプライマーを設計することである。一般に、種のうちの保存配列が天然においてユビキタスであるように、この方法は、任意の有機体に適用され得る。これらの標的遺伝子は、線形のアデノウイルスのゲノム内のそれらの機能および位置に基づいて選択された。Ｅ１Ａはアデノウイルスゲノムの５’末端に位置し、初期遺伝子の転写活性に必要なトランス活性化転写調節因子をコードする。アデノウイルスゲノムの中央および３’末端に配置される、へクソンおよびファイバー遺伝子は、ウイルス血清型を決定する、抗原決定基εおよびγをそれぞれコードする。したがって、ＡＲＤを引き起こすアデノウイルスの検出およびセロタイピングは、血清型を生じさせる核酸決定基を標的にすることにより有効にされ得る。そのために、プライマーは、アデノウイルス内の特異的増幅を提供し、一方、可変領域は、適切な種同定のためにセロタイプ特異的な特徴を供給した。
【０３２３】
以下の実施例の中で保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲのために使用されたプライマーは、ＧｅｎＢａｎｋ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号は括弧で与えられる）から利用可能で、Ｅ１Ａ、ファイバーおよびへクソン遺伝子配列の全体的なアラインメントにそれぞれ基づく。Ｅ１Ａ−ＡｄＢ（ＮＣ＿００４００１），ＡｄＣ（ＮＣ＿００１４０５），Ａｄ３（ＡＦ４９２３５２），Ａｄ４（Ｍ１４９１８），Ａｄ７（Ｘ０３０００）；ファイバー−Ａｄ２（ＡＪ２７８９２１），Ａｄ５（Ｍ１８３６９），Ａｄ３（Ｘ０１９９８），Ａｄ４（Ｘ７６５４７），Ａｄ７（Ｍ２３６９６），Ａｄ１６（Ｕ０６１０６），Ａｄ２１（Ｕ０６１０７）；へクソン−Ａｄ３（Ｘ７６５４９），Ａｄ４（Ｘ８４６４６），Ａｄ６（ＡＦ１６１５６０，Ｘ６７７１０，Ｙ１７２４５），Ａｄ７（ＡＦ０５３０８７，Ｘ７６５５１），Ａｄ１６（Ｘ７４６６２），Ａｄ２１（ＡＢ０５３１６６）。Ｅ１Ａ遺伝子のプライマー設計のための全体的な配列アラインメントは、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ７、Ａｄ２１、ＡｄＢおよびＡｄＣ血清型からのＥ１Ａ遺伝子配列を使用した。ファイバー遺伝子のプライマー設計のための全体的な配列アラインメントは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ５、Ａｄ７、Ａｄ１６およびＡｄ２１血清型からのファイバー遺伝子配列を使用した。へクソン遺伝子のプライマー設計のための全体的な配列アラインメントは、Ａｄ３、Ａｄ４、Ａｄ６、Ａｄ７、Ａｄ１６およびＡｄ２１血清型からへクソン遺伝子配列を使用した。
【０３２４】
全体な配列アライメントに続いて、プライマーペアは、血清型３、４、６、７、１６および２１のＥ１Ａ、ファイバーおよびへクソン遺伝子を増幅するそれらの能力に基づいて選択した（データは示さない）。表１１は、以下の実施例において使用されたプライマーペアを示す。
【０３２５】
【表１１】
0005517996.tif 000047
【０３２６】
マルチプレックス縮重プライマーＰＣＲプロトコル−
プライマーペア（Ｌｉｎら、２００４年）を、様々な複数のコンビネーションで評価し、アデノウイルス血清型３、４、６、７、１６および２１の増幅を得た。ＰＣＲを、以下を含有する５０μｌ容積中において行った：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４），５０ｍＭ  ＫＣｌ，各々２００iＭのｄＮＴＰｓ，２００ｎＭ  ＡｄＢ１，ＡｄＢ２プ
ライマー、３００ｎＭ  ＡｄＥ１Ａ−Ｆ，ＡｄＥ１Ａ−Ｒプライマー；４００  ｎＭ  Ａｄｆｉｂ−Ｆ３，Ａｄｆｉｂ−Ｒ３  プライマー；５００  ｎＭ  Ａｄｈｅｘ−Ｆ７，Ａｄｈｅｘ−Ｒ５プライマー、２ＵのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１０６コピーのＤＮＡテンプレート。増幅反応は、３分間９４℃での予備変性と共にＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＰＴＣ２２５（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して行ない、次いで３０秒間９４℃での変性、３０秒間５０℃でのアニーリング、４０秒間７２℃での伸長の４０サイクル、および１０分間７２℃での最終伸長を続けた。総括的なマルチプレックスＰＣＲ分析は、Ａｄ４のへクソン遺伝子がアガロースゲル上の非常に弱いバンドを示したとしても、アデノウイルスを引き起こす６つのすべてのＡＲＤの３つの遺伝子をすべて増幅することができた。
【０３２７】
トータル増幅プロトコル−
トータル増幅（Total amplification）を、市販のＧｅｎｏｍｉＰｈｉＴＭ  ＤＮＡ増
幅キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行い、象徴的に線形ゲノムＤＮＡを増幅した（本明細書以下で“ＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅”という）。ＧｅｎｏｍｉＰｈｉの完全な増幅方法の中で使用された増幅方法は、バクテリオファージＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ酵素を利用し、鎖置換増幅による、単一あるいは二本鎖の線形のＤＮＡテンプレートを指数関数的に増幅した。出発サンプルを定量せず、直接使用した。
【０３２８】
調製例３：ＲＥＰＩソフトウエア
リシークエンシングマイクロアレイチップからの生配列データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のマイクロアレイリーダと共にパッケージにされた、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０（ＧＤＡＳ）によって提供される。ＧＤＡＳベースコーリングは、以前に記述されたベースコーリングアルゴリズム（Ｃｕｔ
ｌｅｒ、２００１年ら）に基づく。ＧＤＡＳソフトウェアから得られたベースコールを含んでいるＦＡＳＴＡ出力ファイルの各々を、本発明者が開発した専門のソフトウェア（ＲＥＰＩ）を使用して分析した。
【０３２９】
本発明の場合において、ＧＤＡＳのシーケンス出力は、多くの場合、可変量の非コール（ｎ’ｓ）が分散されている連続配列コール（Ａ、Ｔ、ＣあるいはＧ）の散在した混合物であり、ここで、ＧＤＡＳソフトウェアは、増幅、チップ上の弱いハイブリダイゼーション信号および／または非特異的結合により引き起こされる高バックグラウンドハイブリダイゼーションに起因してベースコールを作製しない（Ｃｕｔｌｅｒら、２００１）。Ａｄ４ＦＩＢＥＲタイル領域についてのアデノウイルス４プロトタイプサンプルについてのＧＤＡＳアプトプットの例示的アプトプットを、以下に示す（配列番号４２９）：
【０３３０】
【化２】
0005517996.tif 000048
【０３３１】
ＢＬＡＳＴ（Ｋｏｒｆら、２００３）のような類似性サーチアルゴリズムは、ｎ’ｓ（ワイルドカードに類似）の使用を可能にするが、あまりにも多くのｎ’ｓの組み込みは、受理不可能な程度の曖昧さを生じさせる。その場合、意味があるＢＬＡＳＴ結果はリターンされない。
【０３３２】
ＲＥＰＩソフトウェアは、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して配列類似性サーチに好適なフォーマットへ配列データをモールド（mold）するために選択および編集して、ＦＡＳＴＡファイルのアウトプットを解析するように設計される。この目的を遂行するために、ＦＡＳＴＡファイルから有用な”ＢＬＡＳＴ可能な”データを抽出しながら、ＲＥＰＩは、できるだけ少なくデータを修飾する一連のフィルターを介して機能する。リシークエンシングマイクロアレイの性質により、配列は、しばしば、大量の非ベースコール（ｎ’ｓ）を含む。ＢＬＡＳＴは大量の非ベースコールを含む配列について有意な類
似性をリターンすることができない。したがって、有意な類似性をリターンする可能性が最も高い部分を抽出するために、オリジナルの配列は、フィルターされなければならない。
【０３３３】
見込みのある（prospective）配列が遭遇する第一フィルタは、コントロール・チェッ
クである。
マイクロアレイに組み入れられたコントロール配列は、無意味な配列であるように特に設計される；したがって、それは有意な類似性をリターンしない。次に、該配列は、”ＢＬＡＳＴ可能な（BLASTable）”データのために評価される。ここで、スライディングウィ
ンドウアルゴリズムが使用され、ウィンドウ・サイズ・パラメーターは、ユーザによって入力され、そしてアルゴリズムが一度に評価するベースコールの数を示す。該配列は第１ベースコールから出発して評価され、ウィンドウは、関連するデータを含む第１領域をサーチしながら該配列に沿ってスライドし、これはスコアリング方法を使用して評価され、ここで、全ての有効なベースは１のスコアが与えられ、そして全てのｎ’ｓはゼロのスコアが与えられる。スコアが所定の閾値（ここでは、２５％が使用される）に等しいかまたはそれを超える場合、プログラムは、使用可能なデータの開始としてこのウィンドウのスタートをマークする。一旦使用可能なデータのスタートが決定されると、プログラムは、そのパラメーターをリバースし、そして使用可能なデータのエンド（end）をサーチし始
め、ここで、スコアは閾値に等しいかそれ未満でなければならない。各配列について、ＲＥＰＩは、使用可能なデータの中で最大の連続的なストリングをサーチし、これは、その配列の最初のサブ配列を示す。
【０３３４】
次いで、このサブ配列は、ｎ’ｓに始まりそしてこれを引きずるために、トリミングされる。トリミングは必要であり、何故ならば、前のフィルターは、サブ配列の開始時にスターティングウィンドウのスタート位置を、そしてサブ配列の終結時にエンディングウィンドウのラスト位置を使用し、したがって、ウィンドウのスコアがそこで受理可能であったとしても、サブ配列を導くかまたはこれに続くｎ’ｓが存在するかもしれないからである。サブ配列が通り抜ける次のフィルタは長さ評価である。５０のヌクレオチドより長いサブ配列は、継続することを許され、２０のヌクレオチドより短いサブ配列は廃棄され、そして２０〜５０のヌクレオチド間のサブ配列は以下のように再評価される。これらのサブ配列の長さにより、それらは、以前に記述された同じスコアリングシステムを使用して再スコアリングされる。６０％を越える非ベースコールを備えたサブ配列は廃棄され；他のものはすべて、ＧｅｎＢａｎｋあるいは個人の修正データベースに対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてサーチされ続けることを許可される。
【０３３５】
類似性サーチが完了すると、ＲＥＰＩは、標的配列のサブ配列パーセンテージ、サブ配列長さ、サブ配列ベースコールの数、およびサブ配列ベースコールのパーセンテージを含む、サブ配列について多数の統計を計算する。標的配列のサブ配列パーセンテージおよびサブ配列長は、標的病原体遺伝子のどの部分が同定されたかを示す。サブ配列長およびサブ配列ベースコールのパーセンテージは、フィルタリングアルゴリズムフィルターならびにＧＤＡＳ閾値パラメータをモニタリングすることを可能にする。ＲＥＰＩは、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムからリターンされた統計結果を全てセーブし、どの結果をグラフィカルユーザインターフェースにディスプレイするかをユーザが操作することを可能にする。
【０３３６】
提供される実施例において、ＲＥＰＩは、ＣＧＩ（Ｐｅｒｌ）インターフェース経由で、ローカルＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ）データベース（４．５ＧＢのランダムアクセスメモリを備えたＡｐｐｌｅ  Ｇ５の単一プロセッサ（１．８のＧｈｚ）コンピューター上で含まれる）へインターフェースされた。表示された結果は、１．０ｅ−９の期待値（Ｅ−値）閾値の内の全てのデータベース配列を含んだ。Ｅ値は、サーチスペースのサイズ、スコアリングマトリクスおよびギャップペナルティーを与えられる場合の、ラ
ンダムに期待されるアラインメントの数を示し；Ｅ値が低いほど、データベース配列類似性マッチが実際にランダム同定である可能性が低くなる。定義によれば、ｅ＝２．７１８２８１８２８４５９０４５２３５３６０２８７４７１３５。
【０３３７】
ＲＥＰＩアウトプットは、（ＢＬＡＳＴ可能な）サブ配列名、長さ、Ｅ値から構成され、そしてビットスコアは、ビットスコアの降順で各サブ配列について表示される。該名称は、ＧｅｎＢａｎｋレコードのＦＡＳＴＡ同定ラインとして報告され、そして配列長を含む。該スコアは、スコアリングマトリクスおよびギャップペナルティーから計算される標準化されたスコアであり、スコアが高くなるほど、類似性は高くなる。
【０３３８】
上記に列挙される例のＲＥＰＩアウトプットを以下に示す。各“ＢＬＡＳＴ可能な”サブ配列について、ＲＥＰＩは、＜１０ｅ−９の期待値を有する全てのＧｅｎＢａｎｋデータレコードをリターンする（ビットスコアランキングの降順で）。最も高いビットスコアは、アデノウイルス４プロトタイプ（ＡＹ５９４２５３）について達成され、これは、このストレッチに渡ってＡｄ４ワクチン株（ＡＹ５９４２５４）と遺伝的に識別不可能であり、一方、より低いビットスコアは、空軍および海軍トレイニングサイト（Air Force and Navy training sites）からの野外株（field strains）（配列番号４３０）を適切に識別する。
【０３３９】
【化３−１】
0005517996.tif 000049
【０３４０】
【化３−２】
0005517996.tif 000050
【０３４１】
ＲＥＰＩプログラムのためのアプリケーションＪａｖａ（登録商標）  Ａｒｃｈｉｖｅ（．ｊａｒ）ファイルは、２００４年９月１５日に出願された米国出願シリアル番号第６０／６０９，９１８号、および２００４年１１月２９日に出願された米国出願シリアル番号第６０／６３１，４６０号に提供される説明に従って、作成および処理される。
【０３４２】
実施例１−保存（縮重）ＰＣＲプライマーおよびＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅を使用してのアデノウイルス４についてのベースコールのＢＬＡＳＴ分析およびベースコールセッティング
リシークエンシングマイクロアレイチップからの生配列データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のマイクロアレイリーダーと共にパッケージされたＧｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（ＧＤＡＳ）によって提供される。ＧＤＡＳベースコーリングは、以前に詳述された（Ｃｕｔｌｅｒら、２００１）、前述のベース−コーリングアルゴリズム、ＡＢＡＣＵＳに基づく。種々のベースコーリングアルゴリズムパラメータは、ユーザによって規定され得（ＧＤＡＳオペレータマニュアル）、ベースコーリングパーセンテージと精度との間のトレードオフ（trade-off）を得
る。
【０３４３】
前記パラメータの説明は、ＧＤＡＳマニュアル中、第２０７〜２１７頁に見られる。ＧＤＡＳについて推奨される（デフォルト）セッティングは、正確さの最高レベルに注目する、“保守的な（conservative）”セッティングである。対照的に、本発明の目的は、ベースコールのパーセンテージを増加させることである。この目的を達成するために、本発明者は、以下に列挙されるように、非常に許容性であるベースコール（増加されたパーセンテージ）を許可するようにパラメーターを調節した：
“許容性”ベースコーリングアルゴリズムセッティング−
−フィルター条件
・No Signal閾値＝0.500（デフォルト＝1.000000）
・Weak Signal Fold閾値＝20000.000（デフォルト＝20.000000）
・Large SNR閾値＝20.000000（デフォルト＝20.000000）
−アルゴリズムパラメータ
・Strand Quality閾値＝0.000（デフォルト＝0.000000）
・Total Quality閾値＝25.0000（デフォルト＝75.000000）
・Maximum Fraction of Heterozygote Calls＝0.99000（デフォルト＝0.900000）
・Model Type (0 = Heterozygote, 1 = Homozygote)＝0
・Perfect Call Quality閾値= 0.500（デフォルト＝2.000000）
−最終信頼性規則（Final Reliability Rules）
・Min Fraction of Calls in Neighboring Probes = 1.0000（フィルターを無効にする）
・Min Fraction of Calls of Samples＝1.0000（フィルターを無効にする）
上記のセッティングは、本願において重要であり、何故ならば、ベースコールアルゴリズムは、最も正確なコール（つまりＳＮＰ検出のため）を作製するために作製されるベースコールの数を犠牲にするためである。本願において、該技術は、ＳＮＰ検出のために要求されるのと同じ程度を達成することについてあまり関係がなく、しかしその代わり、コールの数を増加し、その結果、特異性を維持しつつ、連続配列の最長の可能性のあるストレッチがＧＤＡＳによって作製される。
【０３４４】
ＲＰＭ  Ｖ１マイクロアレイによる分析のためのサンプル製への比較アプローチにおいて、１マイクロリットル当たりのアデノウイルス４プロトタイプ（ＡＹ５９４２５３）の１０６のゲノムのコピーの出発濃度を、縮重アデノウイルスＰＣＲプライマー（Ｌｉｎら、２００４年）あるいはＧｅｎｏｍｉＰｈｉアイソサーマル法のいずれかを使用して増幅した。トータル増幅実験については、ＤＮＡを、培養アデノウイルスから単離し、１マイクロリットル当たり１０６のコピーの濃度でアリコートした。ＤＮＡを、トータル増幅戦略（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して増幅し、次いで、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑＴＭプロトコル（製造業者から入手可能）に従って処理した。
【０３４５】
ハイブリダイズされたマイクロアレイの画像を図２に示す。ＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅（GenomiPhi total amplification）は、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲか
らのより限定された領域と比較して、タイルド領域（増大した感度）がリシークエンスされることを可能にした。この結果は、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅はタイルドフラグメント内の特定のプライマー配列に依存しないという事実に起因して生じる。しかし、どの増幅戦略が使用されるか［即ち、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲまたはＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅］に関係なく、適切なＡｄ４コールが作製されたことに注意することも重要である。これらの方法間の一貫性は重要であり、何故ならば、保存プライマーが、選択的濃縮の必要性なしで、複雑なサンプルからの病原体の同一ファミリーのメンバーをセロタイプで分けることへのより直接的な適用を有しているかもしれないためである。
【０３４６】
対応するＧＤＡＳアプトプット（”許容性”セッティングを使用して）に基づいて、ＲＥＰＩは、Ｖ１  ＲＰＭ  マイクロアレイのＥ１Ａ、ファイバーおよびＨｅｘｏｎ−１タイル領域のための保存ＰＣＲ増幅戦略についてのトップランクのリターンの下記のリストを同定した（注：Ａｄ４プロトタイプおよびＡｄ４ワクチン株とほぼ同一の配列を有するいくつかのアデノウイルス４型ＧｅｎＢａｎｋレコードを、このリストから省略した）。
【０３４７】
【表１２】
0005517996.tif 000051
【０３４８】
【表１３】
0005517996.tif 000052
【０３４９】
【表１４】
0005517996.tif 000053
【０３５０】
上に示された各ケースにおいて、アデノウイルス４型プロトタイプ（ＡＹ５９４２５３）およびワクチン株（ＡＹ５９４２５４）は、保存ＰＣＲ増幅によって得られるアデノウイルス４型プロトタイプアンプリコンのハイブリダイゼーションについて、最も高い期待値およびビットスコアをリターンした。該プロトタイプ株がワクチン生産に使用されそして該配列は同一であると測定されたので、このことは予想される。各場合において、リタ
ーンは、類似性の順に、密接に関連する空軍（ＡＹ５９９８３７）および海軍（ＡＹ５９９８３５）アデノウイルス４野外種と識別された。
【０３５１】
保存ＰＣＲの代わりにアデノウイルス４型プロトタイプのＧｅｎｏｍｉＰｈｉ増幅に従う対応のアプトプットを、下記に列挙する（注：空軍および海軍野外株より高いスコアを有するいくつかの密接に関係するアデノウイルスは、示されない）：
【０３５２】
【表１５】
0005517996.tif 000054
【０３５３】
【表１６】
0005517996.tif 000055
【０３５４】
【表１７】
0005517996.tif 000056
【０３５５】
図２によって証拠づけられた結果に基づいて、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅は、全
タイルド領域（増加した感度）が、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲに起因する、もっと制限のある領域と比較して、リシークエンスされることを可能にした。この結果は、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅が、タイルドフラグメント内のプライマー配列に依存しないという事実により生じる。ＲＥＰＩは、Ａｄ４ＦＩＢＥＲを例外として、各タイル領域について最高スコアリングリターンとして適切なアデノウイルスタイプ（ＡＹ５９４２５４またはＡＹ５９４２５３）をリストした。この不一致は、アデノウイルス４型プロトタイプ（ＡＹ５９４２５３）の初期ドラフト配列がエラーを含んでいたことを観察することにより後に解決され、これは、異なるアデノウイルス４型株（ｇｉ｜１１６９３５０８｜ｇｂ｜ＡＦ０６５０６２．２｜ＡＦ０６５０６２）についてのＧｅｎＢａｎｋレコードとＡｄ４ＦＩＢＥＲを定義するために使用される配列との間で僅かに高い相同性を生じさせた。
【０３５６】
この１つの例外を除いて、どの増幅戦略、即ち、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲまたはＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅が使用されたかに関わらず、適切なＡｄ４コールが作製されたこと（タイル配列エラーに起因するＧｅｎｏｍｉＰｈｉでのＡｄ４ＦＩＢＥＲの場合以外）に注意することがまた重要である。これらの方法の一致は重要であり、何故ならば、該保存プライマーが、選択的濃縮の必要なしに、複雑なサンプルからの病原体の同一ファミリーをセロタイピングすることへのより直接的な適用を有するかもしれないアプリケーションを持っているかもしれないからである。
【０３５７】
実施例２−Ａｄ４希釈シリーズ
本実施例において、ハイブリダイゼーションおよびベースコーリングを、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲの後で、標的の初期濃度の関数として分析した。さらに、この実施例はまた、ＧＤＡＳソフトウェア内の２つの異なるベースコーリング戦略を比較する：（ａ）“許容性（permissive）”（明細書で記載される）および（ｂ）“保守的（conservative）”（デフォルト）セッティング。この実施例で使用した生物学的サンプルは、アデノウイルス４プロトタイプであった。
【０３５８】
ハイブリダイゼーションおよびベースコーリングは、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲの後に、標的の初期濃度の関数として分析した。１マイクロリットル当たり１０５、１０３のおよび１０１ゲノムのコピーを有するアデノウイルス４プロトタイプ（ＡＴＣＣ）の稀釈シリーズを調製した。この目的のために、前述の稀釈液からアリコートしたサンプルを、Ｅ１Ａ，ファイバー，およびヘキソン遺伝子について保存（縮重）マルチプレックスアデノウイルスプライマー戦略を使用して増幅した以外、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑに従った。
【０３５９】
表１８−２０は、“保守的”（デフォルトＧＤＡＳ）または“許容性”（実施例１から）ベースコールセッティングが使用されるかどうかに依存する、好適なアデノウイルス４型標的（株について特異的でない）を検出する、ＲＥＰＩ分析を備えたＲＰＭＶ１チップの能力を実証する。ＲＥＰＩが最も高いＢＬＡＳＴビットスコア値としてアデノウイルス４型標的について１以上のＧｅｎＢａｎｋ（あるいはローカル）データベースレコードをリターンする場合、陽性検出がカウントされた。
各場合において、”長さ”は、スライディングウィンドウアルゴリズムの条件を満たしたとしてＲＥＰＩによって選択されたサブ配列中の塩基対の数に相当する。
【０３６０】
【表１８】
0005517996.tif 000057
【０３６１】
【表１９】
0005517996.tif 000058
【０３６２】
【表２０】
0005517996.tif 000059
【０３６３】
稀釈液の範囲にわたって、“許容性”ベースコールセッティングは、ＲＥＰＩによって使用されるＧＤＡＳアプトプットを作製し、ＳＮＰ検出のためのデフォルトＧＤＡＳベースコールセッティングを使用してのアウトプットよりも高いサブ配列長およびビットスコアを一貫して生じた。いくつかの場合では、“許容性”ベースコールセッティングは、ＲＥＰＩが標的を検出するに十分な数のベースコールを生じ、一方、デフォルトセッティングは生じなかった。この実施例は、ＧＤＡＳによるベースコーリングに対する制限を低下させ、そして、該アウトプットをＲＥＰＩアルゴリズムにカップリングすることによって、病原体間のより高い感度および識別力（株同定）が達成されることを実証する。
【０３６４】
ここで特に注目すべきことは、いくつかのケースにおいて、イメージ、ＧＤＡＳアプトプットおよびＲＥＰＩ分析に、微量のアデノウイルス７およびアデノウイルス５（特異的リアルタイムＰＣＲによって確認された）を含む縮重プライマーカクテルの故意でない汚染の証拠があったことである。プロトタイプアデノウイルス用のタイル領域間に有意なクロスハイブリダイゼーションが存在しなかったので、この汚染はベースコーリングの摂動（perturbation）を生じさせず、またはアデノウイルス４タイル領域を生じる。これは、密接に関連する病原体の混合の量的分離を行なうに、本明細書中で記載される本方法のロバスト性（robustness）を実証する。
【０３６５】
Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｓｏｎら、２００２ｂ）でのＡｎｄｅｒｓｅｎグループが、特異的ＰＣＲ増幅に続いて、低濃度（約１０１コピー）を検出することができるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシングチップの使用について記述したことは注目すべきある。しかしながら、この感度はどのように定義されたか、あるいはどこの程度までそれらの結果は密接に関連する微生物種のハイブリダイゼーションによって影響を受けるかを、それは開示も示唆もしなかった。むしろ、その論文において、強調されることは、使用され得るプローブ対のパーセンテージであり、それらがチップによってコールされた実際の配列ではなかった。したがって、技術者は、該開示から何ら予期しない。また、当業者は、前の特許（米国特許第６，２２８，５７５号）または関連する刊行物（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，１９９８）からのこの可能性を推論せず、何故ならば、これらの参照文献は、濃度差、タイル領域配列の規定
におけるエラー、あるいは妨害の他の形式に対してパターン認識の本方法のロバスト性（robustness）を開示も示唆もしていないからである。
【０３６６】
実施例３−保存（縮重）ＰＣＲプライマーおよびGenomiPhiトータル増幅を使用しての
、アデノウイルス５野外株（Ａｄ５ＦＳ；ＡＹ６０１６３５）およびアデノウイルス７プロトタイプ（Ａｄ７；ＡＹ５９４２５５）についてのベースコーリングアルゴリズムセッティングおよびベースコールのＢＬＡＳＴ分析
調製実施例１において上述されたリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭＶ１）を、（ａ）保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲあるいは（ｂ）ＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅のいずれかを使用して、アデノウイルス５型野外株（Ａｄ５ＦＳ；ＡＹ６０１６３５）またはアデノウイルス７型プロトタイプ（ＡＹ５９４２５５）でプローブした以外、この実施例は、実施例１と同様である。ＧＤＡＳアプトプット（”許容性”セッティングを使用）に基づいて、ＲＥＰＩは、Ａｄ５プロトタイプおよびＡｄ７プロトタイプの各々で、保存ＰＣＲおよびトータル増幅戦略のための以下の３つのトップ”ヒット”を同定した。例外なしで、アデノウイルス５型タイル領域によってコールされた各サブ配列（Ａｄ５Ｅ１Ａ、Ａｄ５ＦＩＢＥＲ、Ａｄ５ＦＩＢＥＲ、Ａｄ５ＨＥＸＯＮ−１およびＡｄ５ＨＥＸＯＮ−２）は、保存ＰＣＲ増幅またはトータル（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ）増幅のいずれかを使用して、アデノウイルス５型（Ａｄ５ＦＳ；アクセッション番号  ＡＹ６０１６３５）について正しいプロトタイプ株としてトップ”“ヒット”（最高ＢＬＡＳＴビットスコア）をリストした。
【０３６７】
さらに、例外なしで、アデノウイルス７型タイル領域についての各サブ配列（Ａｄ７Ｅ１Ａ、Ａｄ７ＦＩＢＥＲ、Ａｄ５ＨＥＸＯＮ−１およびＡｄ５ＨＥＸＯＮ−２）は、保存ＰＣＲまたはトータル（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ）増幅のいずれかを使用した場合、アデノウイルス７型（Ａｄ７；アクセッション番号ＡＹ５９４２５５）について正しいプロトタイプ株として、トップ”ヒット”（最高ＢＬＡＳＴビットスコア）をリストした。さらに、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ増幅は、Ａｄ４Ｅ１Ａ領域およびＡｄ７ｖａｃｃｉｎｅ領域の両方からのベースコールへ導き、両方とも、正しいＡｄ７プロトタイプ株へ付与されるトップビットスコアを生じた。
【０３６８】
アデノウイルス５型およびアデノウイルス７型７プロトタイプについて得られた結果は、アデノウイルス４型についてのそれを確認した。詳細には、図３Ａ〜Ｄに示される結果は、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅は、全タイルド領域（増加した感度）が、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲに起因するより制限された領域と比較してリシークエンスされることを可能にしたことを示す。より重要なことには、これらの結果は、どの増幅戦略（即ち、保存（縮重）マルチプレックスＰＣＲまたはＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅）が使用されるかに関わらず、適切なＡｄ５またはＡｄ７コールが作製されることを確認する。
【０３６９】
実施例４−リシークエンシングマイクロアレイアッセイによって検出可能な混合感染のモデルとしてのＡｄ４−５ブレークスルー株
この実施例のためのサンプルは、Ｎａｖａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって提供された。保管されたサンプルは、アデノウイルスについて（Ａｄ４／Ａｄ７ワクチンを使用して）以前予防接種されており、そして引き続いてアデノウイルス伝染および熱性呼吸器疾患と診断された、基礎トレイニー（basic trainee）からの鼻洗浄物であった。前の予防接種にもかかわらず伝染に関連した
株は、広く、“ブレークスルー株（breakthrough strains）”と呼ばれる。このケースにおいて、仮定は、アデノウイルスの単一変異体が病原因子であるということであった。ここで記述されるサンプルはＡｄ４−５ブレークスルーと呼ばれ、何故ならば、決定的でない培養および血清学分析のためであり、これは、両方のアデノウイルス４型の性質を示し
、一方で、へクソン遺伝子（アデノウイルス血清型の抗原決定基のうちの１つ）の配列決定はアデノウイルス５型の性質を示した。
【０３７０】
サンプルを、調製実施例１に記載したマルチプレックス縮重プライマーＰＣＲプロトコルに従って処理した。このアプローチは、熱性呼吸器感染症に関連する全てのアデノウイルスについてのヘキソンおよびファイバー遺伝子における超可変領域（ならびに比較的に可変のＥ１Ａ領域）を首尾良く増幅するために、実証された。そうでなければ、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルを使用した。
【０３７１】
得られたハイブリダイゼーションパターンを、図４に示す。ＧＤＡＳアウトプット（”許容性”セッティングを使用）に基づいて、ＲＥＰＩは、マルチプレックスＰＣＲによるトータル増幅戦略について下記のの３つのトップ“ヒット”を同定した（表２１−２４を参照）。
【０３７２】
【表２１】
0005517996.tif 000060
【０３７３】
【表２２】
0005517996.tif 000061
【０３７４】
【表２３】
0005517996.tif 000062
【０３７５】
【表２４】
0005517996.tif 000063
【０３７６】
選択されたＲＥＰＩは、ＲＰＭＶ１においてアデノウイルス４，５ブレークスルー株についての値をリターンする。この“株”は、いくつかの独立した手段により、アデノウイルス５型およびＢサブサブグループメンバー（最も可能性が高いのはアデノウイルス２１型である）の混合物であると決定された。これは、組み合わされたハイブリダイゼーション結果およびＲＥＰＩ分析において証明され、全てのアデノウイルス５タイル上でアデノウイルス５型が確認され、一方、Ｂサブグループプロトタイプ（アデノウイルス７；ＡＹ５９４２５５）タイルは、アデノウイルス２１型、Ｂサブグループの異なるメンバーについて最も高いビット・スコアをリターンした。
【０３７７】
従来のDNA配列決定は、完全なアデノウイルス5ゲノムが回復されること、およびアデノウイルス５モデル仮定が必要とされるのでアセンブルできなかった他の配列が存在することを明らかにした。しかし、Ａｄ５／Ａｄ２１共感染の結果を支持するための有意な量の補強証拠が蓄積され、Ａｄ５／Ａｄ２１混合物または共感染の証拠を示す７０量体オリゴヌクレオチドアレイでのパラレル実験において得られた類似の結果（Ｌｉｎら２００４）を含み、そして従来のアプローチを使用してのアンプリコンの配列決定はＡｄ５およびＡｄ２１の両方の存在を支持する。アデノウイルスブレークスルー株の続いて行なわれた拡張研究（ＮＨＲＣ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏと共同で）は、種々のこのような株は、より少ないアデノウイルスの混合物から実際に構成されることを示した（調製におけるマニュスクリプト）。
【０３７８】
この発見において黙示的ないくつかの顕著な局面および利点が存在する：
１．プロトタイプ領域（ＢサブグループについてＡｄ７）は、サンプル中のＡｄ21を発見する特別の推測的（priori）設計あるいは予想なしで、異なるＢサブグループメンバー（Ａｄ２１）を首尾良く同定するために使用され得るという実証。
２．空間分解能により混合病原体を識別するマイクロアレイの実証。この混合物は、単一生物の仮定に基づいた連続フラグメントのアセンブリに依存した従来のＤＮＡ配列決定アプローチを混乱させた。
【０３７９】
実施例５−プロトタイプ領域を使用するインフルエンザＡ株同定
未知の血清型のインフルエンザＡ陽性臨床サンプルが、２００２−２００３および２００３−２００４のインフルエンザの季節の間に回収され、Ｄｒ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｗａｌｔｅｒによって凍結鼻洗浄物としてＤｒ．Ｚｈｅｎｇ  Ｗａｎｇへ提供された。
【０３８０】
サンプルを、病原体チップ分析のために、以下のように処理した：
ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を使用して、ＲＮアーゼ処理無しに、５０μｌの鼻洗浄物（サンプルＮＷ２００３１１１４−０５−０２）からトータル核酸を抽出した。サンプルＮＷ２００３１１１４−０５−０２は、Ｌａｃｋｌａｎｄ  Ａｉｒ  Ｆｏｒｃｅ  Ｂａｓｅ（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）にて２００３年１１月１４日に回収した。患者に２００３年１１月１０日に予防接種した。トータル核酸を２０μｌヌクレアーゼ無しＨ２Ｏ中に懸濁させた。ツーステップＲＴ−ＰＣＲを使用して、ウイルス遺伝子セグメントの各々を増幅した。
【０３８１】
簡潔に述べると、製造業者によって提供されるプロトコルに従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および２０μｌ中１００ｐｍｏｌ  Ｕｎｉ３プライマーを使用して、４μｌトータル核酸中のＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。ＲＴ（逆転写）反応を１時間４２℃で行い、そして次いで、１５分間７０℃で不活性化した。２μｌのＲＴ反応物をｃＤＮＡ増幅のために使用した。提供されるプロトコルに従いＴａｑＰｌｕｓ  Ｌｏｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、ｃＤＮＡを増幅した。２つの異なるＰＣＲ条件を増幅のために使用した。ユニバーサルＰＣＲについて、ユニバーサルプライマーｕｎｉ３およびｕｎｉ５を使用して、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）およびマトリクス（Ｍ）の８つ全てのセグメントを増幅した（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００１を参照のこと）。マルチプレックスＰＣＲについて、３つのセグメント特異的プライマー対（（Ｂｍ−ＨＡ−１／Ｂｍ−ＮＳ−８９０Ｒ、ＢＡ−Ｎａ−１／Ｂａ−Ｎａ−１４１３ＲおよびＢｍ−Ｍ−１／Ｂｍ−Ｍ−１０２７Ｒ）を混合することによって、セグメントを増幅した。Ｍｇ２＋イオンの最終濃度は２ｍＭであり、そして最終プライマー濃度は１μＭであった。ユニバーサル増幅のためのＰＣＲ条件は、以下であった：２分間９４℃、続いて１分間９４℃、２分間４０℃、３分間７２度の２９サイクル、および１０分間７２℃で最終伸長。マルチプレックスＰＣＲ条件は、アニーリング温度を５８℃へ上昇させたこと以外は、基本的に同一であった。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットによって精製した。５００ｎｇのユニバーサルに増幅されたＰＣＲ産物および１０００ｎｇのマルチプレックスＰＣＲ産物を、それぞれ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従うハイブリダイゼーションのための２つのＶ１病原体チップに適用した。
【０３８２】
【化４】
0005517996.tif 000064
【０３８３】
チップスキャン結果を、２つの増幅プロトコルの各々について示す：（ａ）ユニバーサルプライマーＰＣＲおよび（ｂ）マルチプレックスＰＣＲ（図５）。ＧＤＡＳアウトプット（“許容性”セッティングを使用する）に基づいて。ＲＥＰＩは、Ａｄ５プロトタイプおよび特異的マルチプレックスＰＣＲ方法の各々で、ユニバーサルプライマー（Ｈｏｆｆｍａｎら、２００１）増幅方法およびトータル増幅戦略について以下の３トップ“ヒット”を同定した（表２５を参照のこと）。
【０３８４】
この実験のために、本発明者は、２００３から２００４ワクチンを逃れそして広がった病気、即ちＦｕｊｉａｎ／４１１／２００２（注：ＨＡ配列のみがＦｕｊｉａｎ／４１１／２００２について利用可能であった）を生じたＦｌｕ株のＨＡ遺伝子についての配列を得、そしてそれをＲＥＰＩによってサーチされるデータベースへ入れた。２つの増幅方法の各々は、同一結果を効率的に作成し、しかしビッドスコアは僅かに異なった。詳細には、Ｆｕｊｉａｎ  ４１１／２００２は、ＲＥＰＩアウトプットファイルにおいてＦｌｕＡＨＡ３について最高ビットスコアをリターンした。Ｍｏｓｃｏｗ  １０／９９、２００３年の予防接種のために使用された株は、ＦｌｕＡＨＡ３についてＲＥＰＩアウトプットをリターンしなかった。
【０３８５】
【表２５】
0005517996.tif 000065
【０３８６】
ＨＡ３について最も高いＢＬＡＳＴビットスコアは、以下について達成された：（ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２＿Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ＿１０４）、予防接種による予防を回避した米国における２００３〜２００４インフルエンザアウトブレイクのＨ３Ｎ２病原因子。ＨＡ３についての識別不可能なウイルス配列もまた、同一ビッドスコアを達成した。５００を超えるＧｅｎＢａｎｋレコードが、ＨＡ３についてリターンされ、全ては、０．０の期待値を有し、そしてビットスコアは、上記に示されるものから９９５．６３６へ及んだ。ワクチン株（Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２））は、ＨＡ３領域においてリターンされるインフルエンザＡ株のリストに無かった。注：ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２＿Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ＿１０４についての配列は、ＨＡについてのみ利用可能であり、したがって他の領域は、ここで比較されない。
【０３８７】
示さないが、本発明者は、２００２から２００３インフルエンザシーズンからのＨ１Ｎ１アウトブレイク株を同定することができた。
【０３８８】
実施例６−短縮されたハイブリダイゼーション時間
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルは、ハイブリダイゼーションステップは、最大ハイブリダイゼーションを促進するために、少なくとも１６時間とすると明記している。診断可能性の意図される目的のために、これは、法外に長くなり得る。したがって、短いハイブリダイゼーション時間への本方法の適用可能性および効率を評価した。
【０３８９】
この実施例において、ハイブリダイゼーションおよびベースコーリングを行った。特異的ＰＣＲ試薬によって増幅したサンプルを使用し、次いで調製例１において記載されるリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭＶ１）上において１時間、３０分、または１５分のいずれかの期間ハイブリダイズさせた。この比較研究のために、ハイブリダイゼーション時間を変化させたこと以外は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従った。示される実施例データ（図６）において、エリスロマイシン耐性マーカーＳＰＹＥＲＭＢ，ＳＰＹＥＲＭＴＲ，およびＳＰＹＭＥＦＡＥをそれらのマーカーの各々についての特異的ＰＣＲへ供したこと以外、マイクロアレイによってプローブされた全ての標的について、鼻洗浄物は陰性であった。次いで、該アンプリコンを、１６時間または１５分間、別個のマイクロアレイへハイブリダイズさせ、そして次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルによって指示されるようにそうでなければ処理した。
【０３９０】
結果を図６Ａ［１６時間；ｅｘ−６ａ］および図６Ｂ［２時間；ｅｘ−６ｂ］に示す。
ＧＤＡＳアウトプット（“許容性”セッティングを使用する）に基づいて、ＲＥＰＩは、１６時間ハイブリダイゼーションおよび１５分間ハイブリダイゼーションそれぞれについて下記の３トップ“ヒット”を同定した。
【０３９１】
対応のＧＤＡＳおよびＲＥＰＩ分析は、得られるベースコールの数は、１６時間ハイブリダイゼーションについてのものと比較して１５分ハイブリダイゼーションの場合により少ないことを示す（表２６〜３１）。例えば、ＳＰＹＥＲＭＢタイル領域は、１６時間ハイブリダイゼーションについて２１９ｂｐ（該サブ配列内で作製された９５％ベースコール、９８％のタイル領域）のサブ配列長を作製し、一方、１５分ハイブリダイゼーションからのハイブリダイゼーションパターンにおける不連続（discontinuities）は、長さ１
００ｂｐ（サブ配列内で作製される９９％ベースコール、４５％のタイル領域）および８７ｂｐ（サブ配列内で作製される９９％ベースコール、３９％のタイル領域）の２つのサブ配列へのタイルのフラグメント化を生じさせた。
【０３９２】
【表２６】
0005517996.tif 000066
【０３９３】
【表２７】
0005517996.tif 000067
【０３９４】
【表２８】
0005517996.tif 000068
【０３９５】
【表２９】
0005517996.tif 000069
【０３９６】
【表３０】
0005517996.tif 000070
【０３９７】
【表３１】
0005517996.tif 000071
【０３９８】
上記表は、１６時間対１５分間ハイブリダイゼーション時間についての、実施例６において記載される３つの異なる抗生物質耐性マーカーについての比較トップランキングを示す。ＳＰＹＥＲＭＴＲタイル領域は、１５分ハイブリダイゼーションに続いて同定を可能にするに十分な数のベースコールを作製しなかったが、ＳＰＹＥＲＭＢおよびＳＰＹＭＥＦＡＥは、両方とも、タイル領域を含む抗生物質耐性マーカーの同一変異体について高いビットスコアをリターンした（表９に同定される）。
【０３９９】
しかし、該３つのタイル領域の各々のについてのＲＥＰＩアプトプットは、各領域における最も高いビットスコアが同一であることを示し（１５分間ハイブリダイゼーションについて十分なベースコールを欠いたＳＰＹＥＲＭＴＲ以外）、しかし、ビットスコアおよび期待値の両方は、各ケースにおいて異なっていた。同様の結果が、３０分間および１時間ハイブリダイゼーションについて得られ、ハイブリダイゼーション時間が増加するにつれてベースコールの数が増加した。さらに、この実施例は、異なるハイブリダイゼーションパターン範囲での標的間の微細スケール識別を可能にする本方法のロバスト性（robustness）を明確に示す。
【０４００】
実施例７―サブトラクティブハイブリダイゼーション
トータル増幅を使用する場合、臨床サンプル中のバックグラウンドヒトＤＮＡの量を減らすために、種々の方法が使用され得る。１つの方法は、迅速にアニーリングする反復エレメント（repetitive elements）から大部分なる、ＣＯＴ−１フラクションヒトゲノム
ＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション溶液中の増幅産物からのバックグラウンドゲノムＤＮＡの直接サブトラクションである。別の方法は、トータル増幅前における、臨床サンプルからのバックグラウンドゲノムＤＮＡのビースベースサブトラクション（bead-based
subtraction）である。第３の方法は、上記方法の組合せであり、臨床サンプルからゲノムバックグラウンドＤＮＡが、トータル増幅前にビースベースサブトラクションを使用してサブトラクトされ、引き続いて、バックグラウンドＤＮＡが、さらに、ＣＯＴ−１ヒトＤＮＡを用いたハイブリダイゼーション溶液中の臨床サンプルからサブトラクトされ得る。
【０４０１】
図７Ａおよび７Ｂについての方法
鼻洗浄物を、１臨床サンプルから回収し、そしてトータル核酸をＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭＤＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して単離した。該核酸を、１時間３７℃でＭｃｒＢｃ（一方または両方の鎖上にメチルシトシンを含有するＤＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ）で前消化し、そして次いで６５℃に加熱して、該酵素を変性させた
。引き続いて、該サンプルを２つのアリコートに分離し、そしてＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＤＮＡ増幅キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で増幅した。増幅された産物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従って、フラグメント化しそして標識した。
【０４０２】
この比較研究のために、下記の変更以外は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従う標準ハイブリダイゼーション溶液を用いて（図７Ａ）、あるいは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが推奨する２２μｇＨｅｒｒｉｎｇ精子ＤＮＡの代わりに、１２μｇＨｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡおよび１０μｇＣＯＴ−１ヒトＤＮＡ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有するハイブリダイゼーション混合液を用いて（図７Ｂ）、前記臨床サンプルをリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭＶ１）へハイブリダイズさせた。
【０４０３】
図７Ｃおよび７Ｄについての方法
本実施例は、トータル増幅を使用する場合、病原体特異的シグナル対ノイズ比を増加させるための、ビーズベースサブトラクションとサブトラクションハイブリダイゼーション法との組合せを記載する。
【０４０４】
迅速にアニーリングする反復エレメント（repetitive elements）から大部分なる、Ｃ
ＯＴ−１ヒトＤＮＡを、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）（ＮＥＢ）を使用して３’末端でビオチニル化し、ビオチニル化サブトラクションプローブ（Biotinylated Subtraction Probes）（ＢＳＰ）作製した。約４００ｎｇのＢＳＰのアリコートを、１時間
３７℃でＭｃｒＢＣで前消化された臨床鼻洗浄物（Ａｄ４陽性臨床サンプルと診断された）の核酸抽出物と共に、４×ＳＳＣおよび０．２％ＳＤＳ中、１０分間９５℃でインキュベートし、次いで徐々に６５℃へ冷却し、１時間ＨＭＢと共にコ−ハイブリダイゼーション（co-hybridization）させた。ハイブリダイゼーション後、ＢＳＰ−ＨＭＢ複合体を、ＢｃＭａｇ．Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ（ＳＭＢｓ，Ｂｉｏｃｌｏｎｅ）と共に１×ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡで３０分間室温でインキュベートした。該ビースをマグネチックセパレータを使用して上清から分離した。次いで、該上清を新しいチューブへ移し、次いで該マグネチックビーズを１ｘＰＢＳ、０．１％ＢＳＡで１回洗浄した。該上清を合わせ、そしてエタノールで沈殿させた。該ＤＮＡペレットをヌクレアーゼフリーの水（Ａｍｂｉｏｎ）で再懸濁させ、次いで２つのアリコートに分離し、製造業者が推奨するプロトコルに従ってＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＤＮＡ増幅キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で増幅した。簡潔に述べると、１ｍｌＤＮＡテンプレートを、３分間９５℃で９μｌのサンプル緩衝液で変性させ、次いで４℃に冷却した。別個のチューブにおいて、１μｌの酵素を９μｌの反応緩衝液と混合し、そして次いで該混合物を、前記変性ＤＮＡテンプレートへ添加した。次いで反応を、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ−ＰＴＣ２２５（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）で、３０℃で１８時間行った。
【０４０５】
この比較研究のために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従う標準ハイブリダイゼーション溶液を用いて（図７Ｃ）、あるいは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが推奨する２２μｇＨｅｒｒｉｎｇ精子ＤＮＡの代わりに、１２μｇＨｅｒｒｉｎｇ  Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡおよび１０μｇＣＯＴ−１ヒトＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション混合液を用いて（図７Ｄ）、前記増幅された産物をリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭＶ１）へハイブリダイズさせた。
【０４０６】
図７Ｅについての方法
ビーズベースサブトラクションおよびサブトラクティブハイブリダイゼーション手順の
組合せを、２倍量の初期材料を用いて繰り返し、そして図７Ｅに示される結果は、本発明者は、上記調製例１に記載されるリシークエンシングマイクロアレイチップ（ＲＰＭバージョン１チップ）について、臨床サンプルからヒトバックグラウンドをサブトラクトし、該臨床サンプル中のＡｄ４ヘキソンおよびファイバー遺伝子の存在および同定を解く（resolve）ことが出来たことを証明する。
【０４０７】
サブトラクティブハイブリダイゼーション結果
サブトラクティブハイブリダイゼーションアプローチの結果を図７に示す。図７Ａに示されるように、単離された核酸のトータル増幅は、ＲＰＭＶ１マイクロアレイへの有意なバックグラウンドハイブリダイゼーションを生じさせた。アデノウイルス４型領域は全体的バックグラウンドのそれより明らかに高いシグナルを示したが、ＧＤＡＳは、ＲＥＰＩにおけるスライディングウィンドウ条件を満たすに十分なベースコールを作製することができず、したがって、該データをＢＬＡＳＴする試みは行われなかった。ＣＯＴ−１ヒトゲノムＤＮＡと同一セットのトータルアンプリコンをコ−ハイブリダイズすることは、これをほとんど改善せず（図７Ｂ）、そしてベースコールは作製されなかった。図７Ｃは、トータル増幅前の、マグネチックビースベースサブトラクションのみの使用もまた、類似性サーチングを可能にするに十分な数のベースコールを生じなかったことを示す。
【０４０８】
しかし、増幅前のビーズベースサブトラクションとＣＯＴ−１ヒトＤＮＡとのコ−ハイブリダイゼーションと組み合わせた使用により、Ａｄ４ＨＥＸＯＮ−１タイル領域において同定される３つのサブ配列の各々において、ワクチンおよびプロトタイプアデノウイルス４株のそれよりも高い、アデノウイルス４野外株（区別なしで海軍（Navy）および空軍（Air Force））を同定および位置付ける（rank）ために十分なベースコールが作製され
得た（図７Ｄおよび表３２）。
【０４０９】
【表３２】
0005517996.tif 000072
【０４１０】
さらに、１マイクロリットルの代わりに２マイクロリットルの出発サンプル物質を使用して同一セットの組合せステップを行うことによって（図７Ｅ）、ベースコーリングは、Ａｄ４ＨＥＸＯＮ−１（表３４を参照のこと）に加えてＡｄ４ＦＩＢＥＲタイル領域（表３３を参照のこと）へ拡張され、いくつかのＡｄ４ＦＩＢＥＲサブ配列中のＡｄ４野外株（しかし空軍および海軍野外株間を区別しない）対プロトタイプ（ＡＹ５９４２５３）またはワクチン株（ＡＹ５９４２５４）についての曖昧でない高いビットスコアランキングを可能にした。しかし、Ａｄ４空軍野外株（アクセッション番号ＡＹ５９９８３７）は、Ａｄ４ＨＥＸＯＮ−１タイルにおいて海軍野外株（ＡＹ５９９８３５）と区別可能であり、何故ならば、増加した数のベースコールが、より完全な配列比較および増加したビットスコア分解能（resolution）を可能にしたからである。
【０４１１】
【表３３】
0005517996.tif 000073
【０４１２】
【表３４】
0005517996.tif 000074
【０４１３】
実施例８−ＲＰＭＶ２チップおよびその設計
ＲＰＭ  Ｖ２チップについての配列タイルのリストを、以下に列挙する（表３５）。これは、ＲＰＭ  Ｖ１チップの内容物の約１０倍増加を示した。
【０４１４】
【表３５−１】
0005517996.tif 000075
【０４１５】
【表３５−２】
0005517996.tif 000076
【０４１６】
【表３５−３】
0005517996.tif 000077
【０４１７】
【表３５−４】
0005517996.tif 000078
【０４１８】
【表３５−５】
0005517996.tif 000079
【０４１９】
【表３５−６】
0005517996.tif 000080
【０４２０】
【表３５−７】
0005517996.tif 000081
【０４２１】
【表３５−８】
0005517996.tif 000082
【０４２２】
【表３５−９】
0005517996.tif 000083
【０４２３】
【表３５−１０】
0005517996.tif 000084
【０４２４】
【表３５−１１】
0005517996.tif 000085
【０４２５】
実施例９−ランダムＲＴ−ＰＣＲアプローチでのインフルエンザＡ株同定
この実施例は、正常な鼻洗浄サンプルへスパイクされた（spiked）単離されたインフルエンザＡ（Ｆｕｊａｎ／４１１／２００２株）核酸についての新たに改変されたランダム
ＲＴ−ＰＣＲプロトコルの適用を示すためである。ランダムＲＴ−ＰＣＲプロトコルは、マイクロアレイインタロゲーションのためにウイルス病原体を増幅するために、ＤｅＲｉｓｉのラボによって適用された（Ｗａｎｇｅら、２００３）。このプロトコルへの改変は、培養インフルエンザウイルスを増幅するために報告された（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４）。しかし、改変されたプロトコルは、臨床サンプルにおいてウイルス標的を増幅するためには報告されなかった。
【０４２６】
インフルエンザＡウイルス培養物（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）は、Ａｉｒ  Ｆｏｒｃｅ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ（ＡＦＩＯＨ）によって提供され、そして研究前に、増幅および定量のためにＶｉｒａｐｕｒｅ，ＬＬＣへ送られた。該分析証書（Certificate of Analysis）によれば、該ウイルスは、このプ
ロジェクトのためにＡＴＣＣのみから購入される初期継代ＭＤＣＫ細胞（early passage MDCK cells）において２ラウンド増幅され、続いて、１μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫ処理トリプシンの存在下でのウイルス増幅が行われた。感染から４８時間で、該ウイルス上清が回収され、そして３％スクロース、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．１およびｐＨ安定剤を含有するように調節された。デリバリー前に、Ｃｏｒｎｉｎｇスクリュートップクライオバイアル（Corning screw top cryovials）を２００〜３００μｌアリコートの上清で充填
した。各サンプルバイアルの滴定を、手順ＡＭ１１０，Ｐｌａｑｕｅ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓに従って行った。１．２×１０７ＰＦＵ／ｍｌの力価が、インフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２，  Ｋ０７１７  ＳＶ５／ＳＶ４０  ＲＭＫについて得られ、そして５×１０６ＰＦＵ／ｍｌがインフルエンザＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／２９３５／０３／Ｈ１Ｎ１について得られた。
【０４２７】
臨床コレクションコントロール（clinical collection control）を作製するために、
鼻洗浄物（０．９％生理食塩水）をthe Clinical Division of the Advanced Diagnostic
Laboratory at Lackland AFBの無症候性メンバー（asymptomatic member）から得た。各Ｖｉｒａｐｕｒｅ前定量化した力価（Virapure pre-quantified titer）から、インフル
エンザ−スパイクした（influenza-spiked）鼻吸引物（nasal aspirate）の１０倍／６シリーズ希釈を作製し、各株のＶｉｒａｐｕｒｅストックで始まりそしてこれを含んだ。総量１００μｌの各インフルエンザスパクした鼻洗浄物を、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ製のＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを使用して該希釈から処理した。該プロトコルの間、プロテインキナーゼＫを含有する２×ＴａｎｄＣ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １５０μｌを、各１００μｌ希釈のスパイクした鼻洗浄物へ添加し、徹底的にボルテックスし、そして６５℃で１５分間インキュベートした。次に、該サンプルを５分間氷上に配置し、続いて１５０μｌのＭＰＣ蛋白質沈殿試薬（MPC Protein Precipitation Reagent）を添加した。サンプルを１０秒間激しくボル
テックスミックスした。次いで、該混合物を１０分間１０，０００×ｇでの遠心分離により沈殿させ、そして上清をマイクロ遠心分離チューブ（microcentrifuge tube）へ移した。回収された上清へ、５００μｌのイソプロパノールを添加し、そして該チューブを（３０〜４０）回ひっくり返した。
【０４２８】
前記混合物を４℃で１０分間遠心分離し、そしてペレットを除去しないでイソプロパノールをデカントした。続いて、該ペレットを７５％エタノールで２回リンスし、そして室温で乾燥させた。乾燥後、核酸ペレットを３５μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。各サンプルを適切にラベルし、そしてドライアイス中に配置し、その後、ｔｈｅ  Ｎａｖａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙヘ発送した。
【０４２９】
３つの１００μｌの正常鼻洗浄物アリコートの各々を、一連の希釈（１０５ｐｆｕ〜１０１の範囲）のインフルエンザＡ  Ｈ３Ｎ２ウイルス培養物でスパイクした。実施例５におけるように、トータル核酸をＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  ＤＮＡ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）で抽出し、そして４０μｌＨ２Ｏ中に懸濁した。ランダムＲＴ−ＰＣＲを、記載されるもの（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４）に従って以下のように適用した：
２μｌのトータル核酸を、２０μｌ中、１μｌ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩＩ逆転写酵素（５０ユニット／μｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および１μｌプライマーＤ（４０ｐｍｏｌ／μｌ；５’-ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  
ＣＧＡ  ＴＣＮ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＮＮ；配列番号５７３）を使用して逆転写した。ＲＴ（逆転写）反応を４２℃で１時間行い、そして次いで７０℃で１５分間不活性化した。次いで、１０μｌＲＴ産物を、５０μｌ中、２．５ユニットＴａｑＰｌｕｓ  Ｌｏｎｇポリメラーゼ（５ユニット／μｌ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および１μｌプライマーＥ（１００ｐｍｏｌ／μｌ；５’-ＧＴＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  
ＣＧＡ  ＴＣ；配列番号５７４）で増幅した。ＰＣＲを、９４℃３０秒、４０℃３０秒、５０℃３０秒、および７２℃１６０秒の３５サイクル、続いてさらに７２℃で７分行った。１０５、１０３および１０１ｐｆｕインフルエンザスパイキングサンプルからのＰＣＲ産物を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｃｕｓｔｏｍｓｅｑプロトコルに従うハイブリダイゼーションのために、３つの異なるＶ１ＲＰＭ病原体マイクロアレイへ適用した。
【０４３０】
このランダムＲＴ−ＰＣＲ法により増幅された、３つのスパクインサンプル（spike-in
samples）１０５，１０３，および１０１ｐｆｕについてのＶ１ＲＰＭチップスキャンを、それぞれ、図８Ａ〜Ｃに示す。全てのサンプルは、インフルエンザＡタイル領域の少なくともいくつかにおいて、明確な配列コールを生じ、ランダムＲＴ−ＰＣＲプロトコルが、ヒトゲノムＤＮＡの妨害がなくとも、前記スパイキングサンプル（spiking samples）
中のインフルエンザゲノムを首尾よく増幅したことを示す。ＧＤＡＳアウトプット（“許容性”セッティングを使用する）に基づいて、ＲＥＰＩは、各サンプルから下記の４トップ“ヒット”を同定した（表３６から３８）。１０５（表３６）および１０３ｐｆｕ（表３７）サンプルについての該トップ４ヒットは、正しいＦｕｊｉａｎ／４１１／２００２株に帰属されるトップランキングに対応し、そしてインフルエンザユニバーサルプライマーによって増幅された、Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２（＋）臨床サンプルＮＷ２００３１１１４−０５−０２ＡＣＩＤ０４−Ｂ２について得られたそれらと全く同一であった（表２５に示される）。この結果は、ランダムＲＴ−ＰＣＲは、該サンプル中のウイルスの比較的高い力価を伴って、インフルエンザＡ特異的ＰＣＲと類似の増幅力を有することを示している。低力価のインフルエンザウイルス（１０１ｐｆｕ）で、ハイブリダイズされるタイル領域のパーセンテージおよびベースコールのパーセンテージは減少した。これは該ランキングを少し歪めさせ、Fujian 411/2002を二番目に最も高いランキングの株に
ついてタイにした（tied）。しかし、Ｖ１ＲＰＭは、Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２株から元々誘導されそしてほぼこれと同一である、Ｈ３Ｎ２  Ｐｒｅｔｏｒｉａ株として該スパイクされたウイルスを依然として読むことができた。
【０４３１】
この実験におけるランダムＲＴ−ＰＣＲの成功のため、このプロトコルは、インフルエンザ臨床サンプルおよび他の病原性ウイルスにおいて機能すると考えられる。
【０４３２】
【表３６】
0005517996.tif 000086
【０４３３】
【表３７】
0005517996.tif 000087
【０４３４】
【表３８】
0005517996.tif 000088
【０４３５】
この実施例は有意であり、何故ならば、それが、２００１年６月パブリックドメインプロトコルから誘導された、完全に偏っていない（non-biased）増幅方法が、ＰＣＲレベル感度（１０１標的コピー）を生じる、リシークエンシングマイクロアレイのための準備ス
テップ（preparative step）として使用され得ることを示すからである。この増幅プロトコルは、長いオリゴマー（７０量体）マイクロアレイベースアッセイのいくつかの公開された例について使用されているが、それがリシークエンシングマイクロアレイアプローチのために十分であるかは自明ではない。本発明に対して多数の修飾および改変が、上記教示を考慮して可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、本明細書中で明記されたのとは異なる方法で、実施され得ることが理解される。
【０４３６】
実施例１０：他の病原体試験：
要約すれば、タイプ変異株間で相同配列を示す配列タイルの部分以外、１００％一致の同定およびインプットアイデンティティで、およびノータイプクロスハイブリダイゼーションで、（凝集物は＞試験された１８０チップを示す）、以下の病原体が、ＲＰＭＶ１において実験および／または臨床サンプルから検出／識別された：
【０４３７】
【化５】
0005517996.tif 000089
【０４３８】
Ｖａｒｉｏｌａ  Ｍａｊｏｒ（天然痘）、Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓおよびａｎｄＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓの調製された非感染性実験室サンプルについてのＲＰＭＶ１マイクロアレイ結果の選択された実施例を行ったが、ここには示さない。Ｖａｒｉｏｌａ  Ｍａｊｏｒ（天然痘），Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ，およびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓサンプルは、特異的ＰＣＲプライマーを使用して調製した。Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓおよびＹ．ｐｅｓｔｉｓサンプルは、ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ試薬（実施例３において記載されるように）を使用して増幅した。
【０４３９】
実施例１１：配列アデノウイルスの特徴
以下の表は、表６および配列番号５７５〜５８７に示される配列決定されたアデノウイルスについての配列特徴および推定（putatitve）遺伝子産物を示す。
【０４４０】
【表３９−１】
0005517996.tif 000090
【０４４１】
【表３９−２】
0005517996.tif 000091
【０４４２】
【表４０−１】
0005517996.tif 000092
【０４４３】
【表４０−２】
0005517996.tif 000093
【０４４４】
【表４１−１】
0005517996.tif 000094
【０４４５】
【表４１−２】
0005517996.tif 000095
【０４４６】
【表４１−３】
0005517996.tif 000096
【０４４７】
【表４１−４】
0005517996.tif 000097
【０４４８】
【表４２−１】
0005517996.tif 000098
【０４４９】
【表４２−２】
0005517996.tif 000099
【０４５０】
【表４２−３】
0005517996.tif 000100
【０４５１】
【表４２−４】
0005517996.tif 000101
【０４５２】
【表４３−１】
0005517996.tif 000102
【０４５３】
【表４３−２】
0005517996.tif 000103
【０４５４】
【表４３−３】
0005517996.tif 000104
【０４５５】
【表４４−１】
0005517996.tif 000105
【０４５６】
【表４４−２】
0005517996.tif 000106
【０４５７】
【表４４−３】
0005517996.tif 000107
【０４５８】
【表４５】
0005517996.tif 000108
【０４５９】
【表４６−１】
0005517996.tif 000109
【０４６０】
【表４６−２】
0005517996.tif 000110
【０４６１】
【表４６−３】
0005517996.tif 000111
【０４６２】
【表４７−１】
0005517996.tif 000112
【０４６３】
【表４７−２】
0005517996.tif 000113
【０４６４】
【表４８−１】
0005517996.tif 000114
【０４６５】
【表４８−２】
0005517996.tif 000115
【０４６６】
【表４９−１】
0005517996.tif 000116
【０４６７】
【表４９−２】
0005517996.tif 000117
【０４６８】
【表５０−１】
0005517996.tif 000118
【０４６９】
【表５０−２】
0005517996.tif 000119
【０４７０】
【表５１−１】
0005517996.tif 000120
【０４７１】
【表５１−２】
0005517996.tif 000121
【０４７２】
表３９〜５１の中で上に指定されたプロダクトについては、本発明者は、それが、対応するアミノ酸配列への“ロケーション”カラムで識別された核酸配列を翻訳するために普遍的な遺伝暗号を参照することにより、当該分野においてルーチンと述べる。そのため、“プロダクト”カラムで指定されたアミノ酸配列は明示的に列挙されていない。
【０４７３】
ここで図面を参照するが、ここで、参照数字がいくつかの図の全体にわたって同一か対応する部分を指定する。ここに、“意味がある”は、結果の前もって定義した統計的有意水準か確実性に一般に関係がある。あるいは、意味があるは、特定の生物学的エンティティーの存在あるいはエンティティーのグループに関する結論を引き出すためのユーザーへの有用性の前もって定義したレベルを示す。例えば、ＢＬＡＳＴはＥ値（見込みに対応する）をリターンし、ここでは、データベース内の既知の配列（見込み時間機会）の数を備えたＥ値のプロダクトは、尋ねられた続きのために同じ類似性値（ビットスコア）をリターンすることができる配列データベースレコードの総数に相当する。サブミットされたテスト配列の再編成が同じＥ値をリターンする場合、オリジナルの結果は意味がない（not meaningful）。さらに、本明細書中で使用される用語“比較可能な”は、一般的に、類似性サーチから意味がある結果をリターンするという十分な量の（例えばシステムかユーザ定義閾値番号、あるいはパーセンテージ）実際のベースコール（非Ｎ）を含んでいるデータをいう。さらに、用語“比較可能な”は、データを使用して、類似性サーチからユーザーにリターンされる結果の有用性に関して交換可能にて使用することができる。反対に、用語“比較不可能な”は、一般的に、類似性サーチからのそれほど意味がないかより曖昧な結果を引き起こすという（数またはパーセンテージの中の）十分な量の非ベースコール（Ｎ）を含むデータをいう。
【０４７４】
ＲＥＰＩ（Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）を含むシステムは、配列類似性サーチにより好適なサブ配列へ配列データを選択および編集することによって、不完全なヌクレオチドかポリペプチド配列の出力を自動的におよびアルゴリズム的に解析するように設計される。この目的を遂行するために、システムは、配列データから比較可能なデータを抽出する間に、出来るだけ少なくデータを修正するいくつかの機能的なステップ（すなわちフィルタ）を含む。リークエンシングマイクロアレイの性質により、上に記述されるように、配列はしばしば大量の非ベース・コール（Ｎ）を含む。ＢＬＡＳＴのような類似性サーチは典型的には大量の非ベースコールを備えた配列について曖昧な結果をリターンする。曖昧な結果の例としては、ユニークな類似性マッチを予測しない低いビットスコアおよび期待（Ｅ）値が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本システムの実施形態は、類似性サーチから意味がある結果をリターンする傾向にあるオリジナル配列の部分、またはサブ配列を抽出する。
【０４７５】
図１１（ａ）は、本発明の実施形態の例示的な概略図である。まず、配列データ２０３は、システム２０８の自動サブ配列解析モジュール（Automated Subsequence Parsing module）（ＡＳＰ）２０９によって処理される。ＡＳＰ２０９は、配列データ２０３をフィルターし、そして所定の確率（例えば、＜１．０Ｅ−９のＢＬＡＳＴ期待値（expect value））マッチ２１１ａを生じる可能性が高いサブセットのみを選択する。これらのサブセットは、次いで、例えば、類似性サーチアルゴリズムを使用して、配列データベース１０９と比較され、そして結果は、さらなる分析およびサマライゼーション（summarization
）２１４のためにシステムにリターンされる。得られるサーチサマリー２１３は、次いで、より徹底的な分析（more in depth analysis）２１５のためにユーザへ提示される。統計的に関連のある（例えば、＜１．０ｅ−９のＢＬＡＳＴ期待値）サーチ結果をリターンする可能性が本質に低い配列サブセットはＡＳＰによって除去されるので、ユーザにリターンされる結果２１３は、一般的に、解析されない（unparsed）配列をサブミットする従来法よりも高い割合の有意な（例えば、＜１．０ｅ−９のＢＬＡＳＴ期待値）マッチ２１３ａを含む。ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ様類似性サーチアルゴリズムを使用する特定の実施形態において、１．０ｅ−１５０〜２の期待値が好ましい。より好ましくは、期待値は１．０ｅ−５〜０．５である。なおより好ましくは、ＢＬＡＳＴを含む実施形態は、単一病原体データベース記録の独特な同定を可能にするビットスコア（bit score）および
期待値を含む。必要に応じて、システム２０８は、該サマリーにおける結果をさらにフィルターし、ユーザによって設定されるまたは該システムによって予め設定される基準を満たすサブ配列マッチのみをディスプレイする。これらの基準としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ビットスコア（bit score）、期待値（別の配列が同一スコ
アを生じ得る可能性）、あるいはベースコールを作製するために使用される領域のマイクロアレイシグナル強度またはサブ配列の相対位置から誘導される別のスコア。ネットワーク接続２１７上の追加のユーザ２１９へ結果を提供する、共有配列データベースおよび比較リソース１０９の増強された能力も、図１１（ａ）に示される。
【０４７６】
図１１（ｂ）は、ＲＥＰＩの例示的な実施形態、該システムの実施形態自体である。まず、配列データ２０３’は、ＲＥＰＩ２０８’の自動サブ配列解析モジュール（ＡＳＰ）２０９’によって処理される。ＡＳＰ２０９’は、配列データ２０３’をフィルターし、そして高確率マッチ（high probability matches）２１１ａ’を生じる可能性が高いサブセットのみを選択する。次いで、これらのサブセットは、類似性サーチアルゴリズムを使用して、配列データベース１０９’と比較され、そして結果は、さらなる分析およびサマライゼーション（summarization）２１４’のためにＲＥＰＩにリターンされる。得られ
るサーチサマリー２１３’は、次いで、より徹底的な分析（more in depth analysis）２１５’のためにユーザへ提示される。統計的に関連のあるサーチ結果をリターンする可能性が本質的に低い配列サブセットはＡＳＰによって除去されるので、ユーザにリターンさ
れる結果２１３’は、一般的に、解析されない（unparsed）配列をサブミットする従来法よりも高い割合の有意なマッチ２１３ａ’を含む。必要に応じて、ＲＥＰＩ２０８’は、該サマリーにおける結果をさらにフィルターし、ユーザによって設定されるまたは該システムによって予め設定される基準を満たすサブ配列マッチのみをディスプレイする。ネットワーク接続２１７’上の追加のユーザ２１９’へ結果を提供する、共有配列データベースおよび比較リソース１０９’の増強された能力も、図１１（ｂ）に示される。
【０４７７】
図１１（ｃ）は、ソフトウエア形態の該システムの実施形態についてのインターフェース（この場合、グラフィカル・ユーザ・インターフェース）の例示的なスクリーンショットである。この特定の実施形態は、ネットワークおよびローカルＢＬＡＳＴサーバ（いずれかまたは両方）をインタフェースで接続し、そしていくつかの共通のＢＬＡＳＴパラメータ２５１の改変を可能にする。さらに、下記により詳細に説明されるように、解析アルゴリズム（parsing algorithm）２５３に特異的なパラメータ（例えば、ウィンドウサイ
ズ）は、必要に応じて、ユーザに利用可能とされる。
【０４７８】
図１２は、ＡＳＰを含む、ＣＩＢＳＩの一般的な機能性を説明するフローチャートである。ＣＩＢＳＩは、オペレーションＳ３０１のスタートで、“生”配列データを受ける。ＲＥＰＩは、ＦＡＳＴＡ、ＭＳＦ、ＧＣＧ、Ｃｌｕｓｔａｌ、ＢＬＣ、ＰＩＲ、ＭＳＰ、ＰＦＡＭ、ＰＯＳＴＡＬ、およびＪＮＥＴを含むがこれらに限定されない、種々のフォーマットの配列データを受け得る。従来およびリシークエンシングマイクロアレイの場合、配列データは、典型的に、ＦＡＳＴＡフォーマットのマイクロアレイの複数のタイルド領域に対応するベースコールの複数の配列の形態をとる。
【０４７９】
配列データフォーマットに関するその柔軟性に加えて、該システムは、種々の異なるソースタイプ由来の配列データを受け入れる。上述されるように、これらのタイプとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：手動または自動Ｓａｎｇｅｒ配列決定（manual or automated Sanger sequencing）、ショットガン配列決定（shotgun sequencing
）、従来のマイクロアレイ（conventional microarrays）、リシークエンシングマイクロアレイ（resequencing microarrays）、マイクロ電気泳動配列決定（microelectrophoretic sequencing）、ハイブリダイゼーションによる配列決定（sequencing by hybridization）（ＳＢＨ）、エドマン分解法およびその変形法（Edman degradation and variants thereof）、増幅分子についてのサイクリック−アレイ配列決定（Cyclic-array sequencing on amplified molecules）、単一分子についてのサイクリック−アレイ配列決定（Cyclic-array sequencing on single molecules）、およびノン−サイクリカル，シングル−
モレキュール，リアルタイム法（non-cyclical, single-molecule, real-time methods）（例えば、ナノポア配列決定（nanopore sequencing））。あるいは、生配列Ｓ３０１は
、転写物核酸（transcript nucleic acids）（メッセンジジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）またはウイルス転写および翻訳のために使用される中間相配列（intermediate phase sequences）から構成され得る。例えば、ＲＮＡ転写物に向けられる本発明の実施形態において、ＲＮＡは、それがフラグメント化された後に（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子発現アレイで行われるように）アレイへ直接ハイブリダイズされ得るか、あるいは逆転写酵素を使用してＤＮＡへ変換され得る。タイル領域は、ゲノムのエクソン（蛋白質をコードする配列）領域から構築され、そしてリシークエンシングアレイは、どの配列がそれを転写物にしたかを分析するために使用される。代替の実施形態において、図１２に記載されるプロセスは、アミノ酸配列に対応し、ここで、生配列Ｓ３０１のセットは、高分解能質量分析によって測定されるようなアミノ酸組成から推察されるアミノ酸または配列の直接読み取りを示し得る。必要に応じて、相対位置が保存されていない生アミノ酸または蛋白質データが、相対位置データを含めるために分析される。
【０４８０】
リシークエンシングマイクロアレイにおいて、全体遺伝子配列構造が、リシークエンシ
ングタイルの全体構造内の部分配列の位置によって示唆される。例えば、リシークエンシングアレイは、一度に５〜１０の連続した（consecutive）ベースコールの読み取りしか
与えないかもしれず、これらの各々は連続した一連のＮｓによって隔離される。図３３は、部分配列読み取りの任意のコレクションへ適用可能であるこのコンセプトのより一般的な説明を示す。したがって、互いに明確な関係を有さないヌクレオチドベースコールまたはアミン酸配列の任意のコレクションは、まず、より短い検出される配列が比較される“バーチャル配列（Virtual Sequence）”と比較され得る。連続ベースコール、または部分配列は、次いで、集合配列（collective sequence）の個々の部分として関連付けられる
。したがって、マイクロアレイまたは任意の他の配列作製プラットフォーム（sequence generation platform）からの部分配列データが、ＣＩＢＳＩによってより効果的かつ効率的に処理されるために、部分配列は、まず、集合アレンジメント（collective arrangement）、またはコンポジット配列（composite sequence）へアセンブルされる。どの部分配列がコンバインされそしてサブミットされるかを決定するために、各検出されたサブ配列は、類似性サーチを使用して、メモリ中に保存された参照配列のグループと比較される。参照配列の１つと比較した場合に満足なマッチを生じる部分配列は、次いで、分析のためにＣＩＢＳＩへサブミットされるコンボジット配列の部分として保存される。
【０４８１】
リシークエンシングマイクロアレイから抽出される配列データをフォーマットするプロセスが、図３３に示されるフローチャートにおいて示される。配列情報は、リシークエンシングマイクロアレイあるいは任意の他のヌクレオチドまたはポリペプチド配列決定プラットフォームから抽出されＳ２４０３、そして連続した一連のＮｓによって隔離される部分配列を検出するように処理されるＳ２４０５。部分配列を検出するステップは、ベースコールの検出時にビューイングウィンドウを開始しそして別の一連のＮｓが検出されると終了する、ウィンドウイング機能によって行われ得る。したがって、ウィンドウが部分配列データ周りに作成され、そして部分配列読み取りを隔離するＮｓはトリミングされる（trimmed away）。スキャニングオペレーションもまた、各連続した一連のＮｓを同定する配列データについて行われ得、それによって、部分配列に対応するベース−コールのグループを示す。
【０４８２】
各々の同定された部分配列は、次いで、保存された参照配列と比較されＳ２４０９、該部分配列が該保存された参照配列の１つと対応するかどうかを決定する。この比較は、該保存された参照配列と該部分データとの類似性を示す統計値（statistical value）を生
じさせる。次いで、該統計値が所定の閾値を超える場合、該部分配列は保存されＳ２４１３、他の部分配列とコンバインされるＳＳ２４１５。あるいは、該統計値が所定の閾値未満である場合、該部分配列は廃棄される。このプロセスは、全ての部分配列が比較されるまで継続し、以下に議論されるように、このようにして、ＣＩＢＳＩへサブミットされるデータのコンポジットセットを作製する。
【０４８３】
次いで、該システムは、コントロールチェック（Control Check）を行いＳ３０３、そ
の後、候補サブ配列を抽出するＳ３０５。候補サブ配列の抽出後、該システムは、次いで、該候補サブ配列の開始部（beginning）および終結部（end）からノン−コール（Ｎｓ）をトリミングするＳ３０７。次いで、該システムは、該トリミングされた候補サブ配列の鎖長をチェックしＳ３０９、代替の配列またはサブ配列が選択されるべきかどうかＳ３１１、該候補サブ配列は類似性サーチサーバへ行くか類似性サーチキュー（similarity search queue）へ加えられる準備ができているかＳ３１５、あるいは該サブ配列における適
切なベースコールまたはパーセンテージのさらなるチェックが、それを送って比較される（類似性サーチを使用する）ために受理可能な閾値を満たしているかどうかを決定する。代替の配列またはサブ配列の選択Ｓ３１１は、スライディングウィンドウアルゴリズムの使用による１つの実施形態において達成される。比較されるＳ３１５ために送られる配列について、該システムは、類似性サーチサーバからリターンされた結果を集め、これらの
結果について統計分析を行い、そしてユーザプリファレンスに従ってユーザのためにそれらをフィルターするＳ３１７。必要に応じて、該システムは、サブミットされたサブ配列についての類似性サーチ結果を単にリターンし得る。また、以下に記載される例示的な実施形態を与えられるとより明確にされるように、該アルゴリズムのステップは、代替の実施形態において再配置または改変され得る。さらに、より詳細に以下に説明されるように、該システムの挙動は、該システムによって予め設定されるかまたは必要に応じてユーザによって規定される。
【０４８４】
下記の段落は、図１２に示される主要機能ステップの各々をより詳細に説明する。
【０４８５】
図１３は、コントロールチェックステップ（Control Check step）Ｓ３０３を行うためのコントロールチェックモジュールの例示的なフローチャートである。ここで、配列は、まず、マイクロアレイによってしばしばアウトプットされるコントロール配列であるかどうかをみるためにチェックされＳ４０３、これは、生物学的サンプルに対応せず、しかし、代わりに、該マイクロアレイは適切に機能していることを確認する。該マイクロアレイに組み込まれたコントロール配列は、特に、意味のない、独自に同定可能でない、または天然に生じない配列であるように設計され；したがって、デフォルトによって、コントロール配列は、有意な類似性をリターンしない。配列がコントロールでない場合、該システムは、必要に応じて、該配列が代替カスタムパラメータフラッグ（alternative custom parameter flag）Ｓ４０７にマッチするかどうかをチェックし得、その後、次のステップ
へと続くＳ４０９。該配列がコントロールまたはカスタムパラメータ一致すると認識される場合、該システムは、必要に応じて、該カスタムパラメータに対応する補助機能（supplementary function）を行うかまたはつぎの配列へ動くＳ４０５。
【０４８６】
図１４は、抽出サブ配列ステップ（extract subsequence step）Ｓ３０５の例示的なフローチャートである。配列が事前に選択されるとＳ５０１、該システムは、サイズＺのウィンドウのコンテクスト内で該配列をビューイングしＳ５０３、ここで、Ｚは、リターンされたベースコールの数に対応するウィンドウサイズパラメータである。この“ビューイングウィンドウ（viewing window）”は、典型的に、典型的な配列のサイズよりも長さが短く、そして該配列における任意のポイントで開始し得る。次いで、該システムは、該ウィンドウ内に含まれる実際のベースコール（非Ｎｓ（non-Ns））のパーセンテージを算出するＳ５０５。示される例において、計算は、“１”を有効なベースとそして“０”を全てのＮｓと結びつけることによって行われる。１つの実施形態において、ウィンドウサイズＺは、好ましくは２つのベースコール間の範囲および最小の標的またはインプット配列の長さの半分から選択され得る。ウィンドウサイズＺが増大するにつれて、該モジュールは、候補サブ配列を選択することについてより許容性（permissive）となり、より多くの非ベースコールを含む。
【０４８７】
計算されたパーセンテージは、次いで、ファースト・ジャンプ・スレシュホールド・パラメータＡ（First Jump Threshold parameter, A）（例えば、２５％）と比較され、こ
れは、該システムによって予め設定されいるかまたはユーザによって選択され得るＳ５０７。ウィンドウ内の実際のベースコールの計算されたパーセンテージが、ファースト・ジャンプ・スレシュホールド，Ａによって規定される閾値を満足しない場合、該システムは、ファースト・ウィンドウ・ジャンプ・パラメータＸ（First Window Jump parameter, X）に従って該ウィンドウを多数のベースコール前進させＳ５０９、これはまた、該システムによって予め設定されていてもまたはユーザによって選択されてもよく、しかし、好ましくは１〜Ｚ（ウィンドウサイズパラメータ）である。このまたは任意の他のポイントでの該ウィンドウの前進は、任意の方向において生じ得る（例えば、該配列の終結部の方へ）。該ウィンドウ内の実際のベースコールの計算されたパーセンテージがファースト・ジャンプ・スレシュホールドＡによって規定される基準を満たす場合、該システムは、スラ
イディングウィンドウの開始部で、候補サブ配列の開始部をマークするＳ５１１。該ウィンドウは、次いで、セカンド・ウィンドウ・ジャンプ・パラメータＹに従って、インクリメント的に（incrementally）多数のベースコール移動されＳ５１３、そして各スライド
インクリメント（slide increment）で、該ウィンドウ内の実際のベースコールのパーセ
ンテージが計算されるＳ５１５。該候補サブセット内の実際のベースコールの計算されたパーセンテージが、セカンド・ジャンプ・スレシュホールドＢによって設定される閾値を満たさない場合、該システムは、該ウィンドウの終結部でのベースコールに対応する、該配列のベースコールでの候補サブ配列の終結部をマークするＳ５１９。各配列について、該システムは、使用可能なデータの最大の連続ストリング（string）をサーチする。ウィンドウ・ジャンプ・パラメータＸおよびＹが増加するについて、該モジュールは、より多数の非ベースコールを有する候補サブ配列を選択することについてより許容性となる。ジャンプ・スレシュホールドＡおよびＢが、他の条件が等しければ、増加するにつれて、該モジュールはより許容性は低くなる。
【０４８８】
図１４（ｂ）は、本発明の実施形態に従うスライディング・ウィンドウ・アルゴリズムの例である。スライディングウィンドウ５５１の開始部および終結部は、候補サブ配列５５３の鎖長および内容物（contents）を決定する。
【０４８９】
図１５は、該システムによって行われるトリミング機能（Trim function）Ｓ３０７を
より詳細に説明する例示的なフローチャートである。この特定の機能モジュールにおいて、該システムは、候補サブ配列の開始部Ｎｓを検出しＳ６０３、そして引き続いて該候補サブ配列から開始部ＮｓをトリミングするＳ６０５。該システムは、次いで、該候補サブ配列の実際のスタートが変更されたＳ６０７ことを認識し、そしてそれに応じて、該候補サブ配列のロケーションおよびコンテンツ（contents）を調節する。類似のアクションセットが行われ、該候補サブ配列の終結部でのＮｓが除去されるＳ６１３、Ｓ６１７。本明細書中で記載されるスライディングウィンドウ法は配列がＮｓで開始および終結することを可能にするので、トリミングは、該アルゴリズムの最適性を増加させる。あるいは、該スライディングウィンドウ機能は、候補サブ配列の開始部および／または終結部ならびにＮｓを回避および検出するように適応または置換され得、したがって、このステップの必要性を予め取り除く。
【０４９０】
該システムの次の機能は、鎖長評価（length evaluation）Ｓ３０９である。図１６は
、鎖長チェックステップ（Check Length step）Ｓ３０９を行うための方法を詳述する例
示的なフローチャートを示す。候補サブ配列の鎖長が計算されＳ７０３、そしてファースト・レングス・スレシュホールド・パラメータＥ（First Length Threshold parameter, E）と比較されるＳ７０５。該候補サブ配列の鎖長がＥ（例えば、２０ヌクレオチド）以
下である場合、該システムは、サブ配列抽出ステップ（extract subsequence step）Ｓ３０５へリターンする。ファースト・レングス・スレシュホールド・パラメータＥを満足する場合、該候補サブ配列の鎖長は、セカンド・レングス・スレシュホールド・パラメータＦ（Second Length Threshold parameter, F）（例えば、５０ヌクレオチド）と比較されるＳ７０９。該候補サブ配列の鎖長がＦを超える場合、該候補サブ配列は、該サーバによる選択サブ配列のバッチ処理のために、類似性サーチ（比較）サーバへ送られるかまたはキュー（queue）へ加えられるＳ７１１。該候補サブ配列がＥを超えるがＦを超えない場
合、該システムは、この中間鎖長（例えば、２０〜５０ヌクレオチドの鎖長を有するサブ配列）候補サブ配列内の実際のベースコールのパーセンテージをチェックするステップへ進むＳ７１３。ファーストおよびセカンド・レングス・スレシュホールド・パラメータＥおよびＦは、最大のサーチ可能なサブ配列ほど広い範囲に渡って変化し得る。さらに、該モジュールは、ＥおよびＦが減少するにつれてより許容性となる。
【０４９１】
図１７は、パーセンテージ計算機能（Calculate Percentage function）Ｓ３１３の例
示的なフローチャートを示す。この機能内で、実際のベースコールのパーセンテージは、中間鎖長候補サブ配列について計算されるＳ８０３。この計算されたパーセンテージは、ユーザによって選択されるかまたは該システムによって予め設定される、インターメディエイト・パーセンテージ・スレシュホールドＨ（Intermediate Percentage Threshold, H）と比較されるＳ８０５。実際のベースコールの計算されるパーセンテージがインターメディエイト・パーセンテージ・スレシュホールドＨ（例えば、６０％）未満である場合、該システムは、代替候補サブ配列をサーチするために、サブ配列抽出ステップへリターンするＳ８０７。計算されるパーセンテージがＨを超える場合、該中間鎖長候補サブ配列は、サブ配列のバッチ処理のためにキューへ送られるかまたは即座に類似性サーチサーバへ送られるＳ８０９。インターメディエイト・パーセンテージ・スコア・スレシュホールド・パラメータが増加するにつれて、該モジュールは、より多量の非ベースコールを有するサブ配列についてより許容性でなくなる。
【０４９２】
サブミットされるサブ配列に関する類似性サーチから結果を受けることに加えて、該システムは、必要に応じて、該サブミットされる配列の更なる分析を提供する。図１８（ａ）は、図１２のモジュール内のシステムのアクションＳ３１７をより詳細に説明する例示的なフローチャートである。このモジュールは、１つのサブ配列または一群のサブ配列が比較された後に開始するＳ９０１。このポイントで、該システムは、類似性サーチアウトプットを読み取りＳ９０３、そして該アウトプットを分析し、そしてユーザによって選択されるかまたは該システムによって予め設定される、サブミットされるサブ配列に関するさらなる記述統計（descriptive statistics）を計算するＳ９０５。
【０４９３】
該システムによって計算される統計および行われる分析としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：該配列のパーセンテージとしての選択されるサブ配列鎖長、およびベースコールにおけるサブ配列鎖長。これらは、標的生物学的エンティティー遺伝子のどの部分が同定されたかを示すために一緒に使用され得る。サブ配列鎖長およびサブ配列ベースコールのパーセンテージは、研究者が、該システムのアルゴリズムおよび機能ステップをモニタリングすることを可能にする。さらに、リシークエンシングマイクロアレイの場合、ＧＤＡＳを含むがこれらに限定されない、ベースコーリングアルゴリズムについての閾値パラメータが、モニタリングされ得る。代替の実施形態において、該システムは、類似性サーチからリターンされる統計結果をアクセプトおよびまたフォーマットし、ユーザが、提供されるグラフィカルユーザインタフェースを使用して、結果を操作および組織化することを可能にする。図１８（ｂ）は、本発明の実施形態に従うアウトプットデータの例である。
【０４９４】
必要に応じて、該システムは、例えば、ＢＬＡＳＴ結果を含む、上記の類似性サーチおよび分析によってリターンされるアウトプットの全てを保存し得るＳ９０７。該システムはまた、必要に応じて、類似性サーチによってリターンされるおよび／またはこのシステムによって計算される結果の全てまたは結果のサブセットをユーザにディスプレイするＳ９０９。本発明の特定の実施形態は、次いで、これらの結果が、アーカイビング（archiving）またはトランスファー（transfer）のために送信または保存されることを可能にす
るＳ９１１。
【０４９５】
以下の表は、上述のいくつかの例示的なパラメータおよび閾値についての、例示的な範囲および好ましいサブ範囲（subranges）を示す。
【０４９６】
好ましいサブ範囲：
【０４９７】
【表５２】
0005517996.tif 000122
【０４９８】
該システムのなお別の実施形態において、サーチ（比較）アウトプットは、最適化パラメータＪ（Optimization Parameters, J）について分析され得るＳ９１３。上述のように、該システムのパラメータおよび閾値（Ａ，Ｂ，Ｘ，Ｙ，Ｅ，Ｆ，およびＨを含むが、これらに限定されない）は、ユーザによって設定されるか、あるいは該システムによって予め設定される。あるいは、該システムの１実施形態は、該システム自体によってあるいは補助機能モジュール（complementary functional module）の使用を介して、これらの変
数のうちの１つまたはいくつかの最適化を可能にする。例えば、パラメータまたは閾値の最適化は、システムオペレーションの“パス（passes）”またはマルチプルユーズの過程において記録されたシステム性能を分析することによって、周知の最適化（例えば、ＳＩＭＰＬＥＸリニアプログラミング（SIMPLEX linear programming））または人工知能（ユニホームまたはヒューリスティックサーチのような状態空間サーチ（state space search）を含む）技術に従って行われ得る。対応の最適化パラメータＪは、例えば、前のステップにおいて使用される種々のパラメータおよび閾値を自動的に変更し、そしてこれらの新しい最適化パラメータを使用して該プロセスを再度実行するために使用され得るＳ９１７。あるいは、生データファイルから再度開始する代わりに、最適化パラメータＪが、使用され得、最適化パラメータＪを使用することにより、選択されたサブ配列のアウトプットをリファインしＳ９１５、例えば、該システムと組み合わせて使用される類似性サーチアルゴリズムの機能または挙動に関連するパラメータを変更する。最適化パラメータは、例えば、スピードまたは関連する／意味がある類似性サーチ結果に関する、システム性能を高めるために、ユーザまたは該システム自体によって調節され得る。
【０４９９】
図１９は、その拡張可能なカーネル様性質（extensible, kernel-like nature）を使用する、本発明のなお別の実施形態を記載する例示的なフローチャートである。特に、システム分析１０１７は、類似性サーチアルゴリズム１００９のオペレーションまたは挙動に対応するパラメータを最適化するかまたはそうでなければ変更するために使用される。例えば、この変更は、ＲＥＰＩの分析結果１０１７から計算されるかまたは内挿される上記の最適化パラメータＪに関連付けられ得る。類似性サーチパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴパラメータ）を変更することは、類似性サーチにおいて典型的に使用されるスコアリングシステムおよび該方法を変更する。特に、示される反復分析（iterative analysis）は、既知の配列へのテストサブ配列の可能性のあるマッチを示唆することについて、より厳
密なまたはより厳密でない閾値を生じさせ得、このようにして該システムのアウトプット１０１９を変更または最適化する。
【０５００】
本発明の説明は、さらに、以下の詳細な実施例によって助けられる。以下の詳細な実施例は、本発明の例示的な実施形態に対応し、そして、システムオペレーション、パラメータセッティング、配列データなどに関して、本発明に対する制限を記載するように意図されない。
【０５０１】
ＲＥＰＩの実施形態は、ＣｕｓｔｏｍＳｅｑ／ＧＣＯＳ／ＧＤＡＳプロセスからのどのベースコールサブ配列が、カスタマイズされたスライディングウィンドウアルゴリズムの使用を介して、有意なＢＬＡＳＴ結果を恐らくリターンするかどうかを確定するために使用した。引き続いて、ＲＥＰＩは、エンドユーザへＢＬＡＳＴアプトプットを自動的にリターンし、これは、所定のベースコールセットが特定の細菌配列に対応する可能性への確率的付与を可能にする。さらに、ＲＥＰＩは、個々の病原体へ配列フラグメントを自動的にリンクする。
【０５０２】
リシークエンシングマイクロアレイからの生配列データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ製のマイクロアレイリーダーと共にパッケージされたＧｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０（ＧＤＡＳ）によって提供される。ＧＤＡＳベースコーリングは、以前に記載されたベースコーリングアルゴリズム（Ｃｕｔｌｅｒら、２００１）に基づく。ＧＤＡＳソフトウエアから得られるベースコールを含むＦＡＳＴＡアウトプットファイルの各々を、本明細書中に記載される本発明の例示的な実施形態である専門ソフトウエア（ＲＥＰＩの実施形態）を使用して分析した。
【０５０３】
本実施例の場合、ＧＤＡＳの配列アウトプットは、ほとんどの場合、種々の量のノン−コール（Ｎｓ）が散在する連続配列コール（Ａ，Ｔ，ＣまたはＧ）の散在した混合物であり、ここで、ＧＤＡＳソフトウエアは、該チップ上における弱いハイブリダイゼーションシグナルおよび／または非特異的結合によって引き起こされる高いバックグラウンドハイブリダイゼーションに起因して、ベースコールを作製しない（Ｃｕｔｌｅｒら、２００１）。Ａｄ４ＦＩＢＥＲＧＤＡＳタイル領域についてのアデノウイルス４（＋）臨床サンプルについてのアウトプットの例示アウトプットを、以下に示す：
【０５０４】
【化６】
0005517996.tif 000123
【０５０５】
提供される例において、ＲＥＰＩは、ＣＧＩ（Ｐｅｒｌ）インターフェースを介して、ローカルＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ  ｎｔ）データベース（４．５ＧＢのランダムアクセスメモリを有するＡｐｐｌｅ  Ｇ５シングルプロセッサ（１．８ＧＨｚ）コンピュータに含まれる）へインタフェースされる。ディスプレイされた結果は、１．０ｅ−９の期待値（expect value）（Ｅ値）閾値内の全てのデータベース配列を含んだ。Ｅ値は、サーチスペースのサイズ、スコアリングマトリクス（scoring matrix）、およびギャップペナルティー（gap penalties）が与えられるとランダムに期待されるアラインメントの数を示す；Ｅ
値が低下すると、データベース配列類似性マッチが実際にランダム同定である可能性が低くなる。
【０５０６】
ＲＥＰＩアウトプットは、（比較可能な）サブ配列およびその名称から構成され、ビットスコアの降順で、そのサブ配列との各マッチについて、名称、長さ、Ｅ値が続く。該名称は、ＧｅｎＢａｎｋレコードのＦＡＳＴＡ  同定ラインとして報告され、そして配列鎖長を含む。該スコアは、スコアリングマトリクスおよびギャップペナルティーから計算される標準化されたスコアであり、スコアが高くなるほど、類似性は高くなる。
【０５０７】
上記に列挙される例のＲＥＰＩアウトプットを以下に示す。各々の比較可能なサブ配列について、ＲＥＰＩは、＜ｅ値閾値（the evalue threshold value）（現在、１．０Ｅ−９）の期待値を有する全てのＧｅｎＢａｎｋデータレコードをリターンする（ビットスコアランキングの降順で）。最も高いビットスコアは、アデノウイルス４プロトタイプについて達成され、一方、空軍および海軍トレイニングサイト（Air Force and Navy training sites）からの野外株（field strains）は、より低いビットスコアによって適切に識別される。
【０５０８】
【化７−１】
0005517996.tif 000124
【０５０９】
【化７−２】
0005517996.tif 000125
【０５１０】
この詳細な実施例において、ＲＥＰＩパラメータを以下のように設定した：
【０５１１】
【表５３】
0005517996.tif 000126
【０５１２】
上述の実施形態に加えて、該システムの拡張可能な性質は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の不連続なセグメントを使用する多数のより高いバイオインフォマティクスタスクへの即座の適応を可能にする。これらの補足的な適用のいくつかの例を、以下に記載する。
【０５１３】
前の例において、本発明は、配列フラグメントが個々の標的配列へ自動的にリンクされ得ることを示すデータを提供した。いくつかのより好ましい実施形態において、このアプローチは、オーソロガスな（orthologous）生物学的標的配列のセット内の組換え物（recombination）と混合物とを識別する。ここで、オーソログ（ortholog）は、一般的に、異なる種における同一遺伝子、通常、共通の遺伝的祖先のしるし（indication）として規定される。
【０５１４】
より詳細には、該システムは、リシークエンシングマイクロアレイの異なるタイル領域からの配列コールの自動アラインメントを行い、該アレイの異なるタイルド領域上の相同配列フラグメントの存在を検出することを試み、標的配列の混合物の推定を可能にする。必要に応じて、該システムは、さらに、オーソロガスな遺伝子を提示する異なるタイルド領域からの配列アウトプットが、オーソロガスな遺伝子の混合物ではなく、しかし２またはそれ以上のオーソロガスな遺伝子の異なる領域間の遺伝的組換え事象によって生じているかもしれない連続配列に対応することを決定する。
【０５１５】
このようなさらなる実施形態において、該システムは、該アレイの異なるタイルド領域上における高度に重複するまたは相同な配列フラグメントの自動検出を可能にし、標的配列の混合物の推定を可能にする。さらに、該システムは、必要に応じて、異なるタイルド領域からの配列アウトプットが、高度に重複しているのではなく、しかし既知の標的配列内の位置に登録されているかもしれない連続配列に対応することを決定し、遺伝的組換え事象を推定する。
【０５１６】
図２１は、本システムの実施形態に従って、テストサンプル中の標的間の組換え物と異なる標的の混合物とを識別するための例示的な実施形態の方法を示す。これらの実施例方
法は、図１２を参照して上述された方法へ統合されるかまたは補足され得、そしてまた、蛋白質混合物とハイブリッド蛋白質（hybrid proteins）とを区別するために適用可能で
ある。この実施例において、該システムは、蛋白質をコードする全ヌクレオチド配列に関して（初期類似性サーチ有りまたは無しで）リシークエンシングマイクロアレイによって検出される遺伝子サブ配列の相対位置を決定するＳ１２０１。該相対位置は、一般的に、全配列内のサブ配列のロケーションに対応する。全配列は、公共および／または個人的配列レコードから構成され得るデータベースにおいて入手可能である。例えば、サブ配列は、全配列の先端（例えば、５’）、中央、または末端（例えば、３’）に対応すると決定され得る。さらに、この位置決定は、候補サブ配列または選択されるサブ配列でなされ得る。次に、該システムは、アラインメント手順（alignment procedure）を行い、それら
の位置に従ってサブ配列を比較およびマッチするＳ１２０３。Ｓ１２０３を行うために使用されるアルゴリズムは、２つの配列間のローカル・ペアワイズ・アラインメントのために使用されるもの（例えば、ＢＬＡＳＴＮ，ＢＬＡＳＴＰ，またはＢＬＡＳＴＸ）、複数の配列間のアラインメントを同時に行うもの（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷまたはＣｌｕｓｔａｌ＿Ｘ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９７；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４））、あるいは、パブリックドメインからまたは個人的な開発によって得られる代替のものであり得る。１つの実施形態において、該システムは、同種配列（like sequences）の先端、中央、および末端位置に対応する配列をグループ化する。引き続いて、該システムは、互いとの該グループ化されたサブ配列のフィットを評価するＳ１２０５。
【０５１７】
サブ配列間のフィット（Fit among subsequences）は、例えば、該配列間の適切な量の重複の検出によって、評価され得る。１実施形態において、該フィットは、非重複配列に関連して相同重複領域の長さ（またはビットスコア）間の量的関係、および所定の蛋白質についての全遺伝子の全体配列への各々の関係である。重複する生物学的配列を評価する伝統的な方法に加えて、該システムは、必要に応じて、アナログおよびデジタル通信に適用可能なシンクロナイゼーションおよび検出方法を使用して配列重複を分析する。さらに、重複配列を同定する問題は、デジタル通信システムでの初期シンクロナイゼーション（initial synchronization）によって引き起こされる問題とは異なっていない。したがっ
て、本発明に従って使用されるかもれない１つの方法は、スライディングコリレーター（sliding correlator）の使用である。スライディングコリレーターにおいて、２つの配列（データ配列、および仮定配列（hypothesis sequence））は、該２つの配列を相互に関
連付けること（correlating）によって互いと比較される。該２つの配列は、互いに関し
て位置がシフトされ、そしてシフティングは、相互関係結果が所定レベルを超えると検出される場合にのみ停止する。実際に、スライディングコリレーターは、しばしば、シンクロナイゼーションプレアンブル（synchronization preamble）のトランスミッションのようなサーチ領域を縮小する何らかの他の方法によって先行される。同様に、本発明によれば、サブ配列間の既に検出された重複が、シンクロナイゼーションプロセスのために必要とされる時間量を制限するためにプレアンブルとして使用され得る。このタイプのシンクロナイゼーションは、Bhargva, et al. “Digital Communications By Satellite” John
Wiley and Sons, Chapter 9, pages 269-291において記載されている。同様に、§ 8.22
of Sklar, B. “Digital Communications Fundamentals and Applications”, Prentice
Hall, 1988, pages 453, 460において記載されるもののような、他のシンクロナイゼー
ションまたはアクイジション（acquisition）アルゴリズムが適用され得る。使用される
アクイジション基準は、十分に低い確率の偽アクイジション（false acquisition）に基
づいて選択される。この場合、アクイジション基準は、１０％の偽検出の確率であり得、しかし９％，８％，７％，６％を含んで０．１％までが使用され得る。
【０５１８】
該サブ配列がフィットの所定の閾値を超えない場合、該システムは、代替サブ配列の分析を開始するＳ１２０７。すなわち、２またはそれ以上の潜在的に相同なまたはオーソロガスなサブ配列は、混合物または組換えのいずれについてのモデルにフィットせず、該シ
ステムは、他のサブ配列をサーチするために進み得るＳ１２０１。グループ化されたサブ配列のコレクションは、類似性サーチアルゴリズムを使用して、全（標的）配列と比較され得るＳ１２１１。このような場合、該連結された（linked）サブ配列と標的配列との類似性のレベルＳ１２１３は、該検出される生物学的配列が異なる生物学的エンティティーの混合物由来であるのかどうか、あるいは該検出される配列が組換えを示しているのかどうかを示すデータを提供する。あるいは、該システムは、サブ配列の部分間の重複するハイブリダイゼーションを評価するチェックポイントの方法を使用する。該チェックポイント方法は、該サブ配列に沿った複数のポイントでのこのような評価を行うＳ１２０９。このアプローチにおいて、チェックポイントの数は閾値と比較されＳ１２１５、生物学的混合物と組換えとを識別する証拠を提供する。
【０５１９】
例えば、同一タイプの２つのウイルスの共感染は、同一蛋白質について第２のウイルス遺伝子の対応するセクションで置換されている、５’末端以外は一方のウイルスと同一である、単一遺伝子内で組換え体を作製し得る。この新規の組換えウイルスゲノムがリシークエンシングマイクロアレイ上にハイブリダイズされると、それは、該リシークエンシングタイル領域の対応するセクションからシグナルを発生し得る。本発明の実施形態は、どの部分が一緒にフィットして全体標的（entire target）を形成するのかを示す、標的配
列の“モデル”を構築するアセンブリアルゴリズム（assembly algorithm）を含む。該２つが有意な重複を有する場合（例えば、ある閾値を超える相同性を実証する）、恐らく混合物が存在すると結論付けるかもしれない。しかし、ほとんどあるいは全く重複が存在しない場合、組換え体が存在する可能性は残ったままである。重複（または欠如（lack of
））の程度は、標的の低濃度によって影響が与えられ得、対応してより少量のタイルが埋められる（filled in）。この同一原理は、なおより容易に、そしてより大きな影響を伴
って、ウイルスに適用され得、ここで、組換えは、レトロウイルスの場合のように、定常かつ反復する事象であり、ここで、ウイルス遺伝子間の組換えは、新規のウイルス株を形成させる。実際に、このような記載される機能性は、標的配列の混合物と標的配列間の組換えとの識別に必須である。さらに、このさらなる機能性はまた、検出される（および恐らく）新規の組換えにおける共通の領域をより容易に検出し、そしてデザインＰＣＲプライマーを助け、該システムによって検出される組換えのより広範な研究を助けるために、使用され得る。
【０５２０】
本発明のアプローチは、生物学的エンティティーの混合物と所定のエンティティー内の組換え事象とを識別することができるだけでなく（本明細書中の他の場所に記載される）、該システムのさらなる実施形態は、有利なことに、エンドユーザに、該リシークエンシングマイクロアレイアッセイにおいて検出された標的配列の相対量の量的評価を提供する。このような決定−クオリティ情報（decision-quality information）は、非常に有用であり、例えば、臨床医または臨床研究技術者が、複数の病原体ゲノムシグネチャー（signatures）が検出された場合に、原因および作用を与えようとする際にそうである。さらに、生物学的物質の（相対および絶対）量についてのデータと生物学的物質の存在に関する補足データは、エンドユーザによる意思決定のためのさらなるコンテクストを提供する。さらに、該システムの実施形態は、このような”存在（presence）”および“存在量（abundance）”データを自動的に分析および比較し、決定−クオリティ情報をエンドユーザ
に提供する。
【０５２１】
該システムの実施形態は、存在量情報（abundance information）を提供するために２
タイプのデータを使用するように構成される。第一のものは、チップ上におけるハイブリダイゼーションシグナルの絶対強度である。非線形関係が、溶液中の標的の量と実際にハイブリダイズする量（および得られるシグナル）との間に存在する。しかし、サンプル中の標的核酸の量の評価は、コントロール条件下で調製される標準曲線との比較によって行われ得る。例えば、シグナル強度データは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータヒエラルキー（
hierarchy）における．ＣＥＬファイルから容易に入手可能であり、そして遺伝子発現変
化の量的評価のために典型的に使用される。該システムの実施形態は、それが入力し、出力し、そして処理するデータ内における強度値の包含を提供する。第二に、ベースコールのパーセンテージ［総タイル領域サイズのパーセンテージとして、およびスライディングウィンドウアルゴリズムを満足する選択されたサブ配列内のベースコールのパーセンテージとして、の両方］が、濃度の指標（measure）として使用され得る。本発明者によって
行われた試験からの結果は、これらのパーセンテージメトリクス（metrics）の両方とも
が、標的濃度が減少するにつれて減少することを示し、しかし、正確な標的配列は依然として同定され得る。
【０５２２】
図２２は、決定−クオリティ情報（decision-quality information）をユーザに提供するための、強度データと類似性サーチの結果とを組み合わせる、ＣＩＢＳＩの実施形態の例示的な説明図である。強度データ１３１４は、例えば、マイクロアレイのスペクトル分析ツールからインプットされる。強度データは、類似性サーチの結果に照らして分析され、検出された配列のよりロバストな（robust）分析１３１９を行い、そしてその結果、ユーザへ決定−クオリティ情報１３２１を提供する。決定−クオリティ情報は、例えば、異なるまたは関連する生物学的エンティティーに対応する検出される配列またはサブ配列の相対存在量の指標を含む。さらなる実施形態は、前述のように混合物と組換え物とを識別することにおいて、強度データ１３１４を組み込む。強度データ１３１４は、このような場合、類似性サーチからリターンされた配列データを解釈するためにデジタル通信方法を適用する場合、さらなるディメンジョン（dimension）の情報を提供する。
【０５２３】
別の非常に好ましい実施形態において、該システムは、（ＲＮＡまたは相補ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを介して）現在記載されるタイプのマイクロアレイを使用してリシークエンスされた転写マーカー（例えば、ＲＮＡ）の分析を可能にする。ゲノム組換え事象について上述されるものに類似する方法において、転写配列はまた、アセンブリされ得、感染のためのマーカーとして役立ち得る転写編集事象（transcriptional editing events）および生物学的エンティティー生存率を決定する。
【０５２４】
さらに、該システムは、必要に応じて、核酸以外の生物学的配列およびそれらの関連する転写産物（例えば、蛋白質のアミノ酸配列）での使用のために適応可能である。一般的に、本発明のプロテオーム適用は、生物学的配列データを扱いそしてこのようなデータを既知の配列との比較のために最適化する該システムの能力と一致する。遺伝子発現および蛋白質発生の研究は、上述の遺伝子配列データベースとスケールおよびアクセス性（accessibility）が類似のアミノ酸配列データベース（および関連の類似性サーチアルゴリズ
ム）へと導いた。さらに、蛋白質を配列決定するための質量分析法からリターンされるスペクトルデータの分析は、好都合なことに、本発明のなおより精巧な実施形態に役立つ。例えば、蛋白質配列スペクトルデータは、マイクロアレイの分析において使用されるものと同様の強度データを含む。他のタイプの配列に関して上述されるように、本発明の進歩した実施形態は、このような強度データの扱いおよび使用を提供し、エンドユーザにより高品質の情報を提供する。
【０５２５】
診断適用における該システムの使用に加えて、該システムの代替の実施形態は、該システムの診断実施形態での使用のためのより効果的および効率的なリシークエンシングマイクロアレイの設計を促進することである。マイクロアレイ上の包含ためにプローブを選択および設計するためのより効果的なアプローチは、所定のマイクロアレイ上におけるリアルエステート（real estate）のより効率的な使用へと必然的に導く。したがって、マイ
クロアレイは、所定のサイズについてより大きい種々の生物学的配列を正確に検出するように作製され得、あるいは特定の適用のために仕立てられた（tailored）マイクロアレイは、マイクロアレイにおいて要求されるプローブの要求される数を減少させることによっ
て、より安価かつよりアクセス可能（accessible）になされ得、これは、サイズ縮小およびより高い製造収率についての機会を増加させる。マイクロアレイを設計するための１つの重要な要件（key driver）は、分解能（resolution）である。一般的に、分解能は、本明細書中で記載される場合、生物学的エンティティーの密接に関係する株を識別する識別力をいう。例えば、いくつかの適用は、アデノウイルスの空軍および海軍野外株（Air Force and Navy Field Strain of adenovirus）を識別する高分解能を要求し得、一方、他
の適用は、アデノウイルスの存在の同定のみを要求する。以下に記載の実施形態は、マイクロアレイ設計者が、分解能およびマイクロアレイサイズ／密度とを客観的にそして体系的に釣り合わせる（balance）ことを可能にさせることにおける、該システムの使用を記
載する。
【０５２６】
図２３は、リシークエンシングマイクロアレイまたは他のプローブまたはアレイベースアッセイの加速した設計および改良（refinement）のために該システムを使用する方法の例示的な実施形態を示す。まず、マイクロアレイによって検出されるように意図される、生物学的配列（これは、言い換えると、病原体を含む生物学的エンティティーに対応する）のタイプに対応する、テスト配列が選択されるＳ１４０３。好ましくは、密接に関連していてもしていなくてもよい、１を超える既知または評価可能な（estimable）生物学的
配列の組成物、該選択される配列は、系統樹およびＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ（Ｅｄｄｙ，１９９８）を含むがこれらに限定されない種々の方法によって選択され得る。これらの選択されるテスト配列は、次いで、ＣＬＵＳＴＡＬＷ  Ｓ１４０５のようなマルチプルアラインメントアルゴリズムを使用するマルチプルアラインメント（multiple alignment）を受けるＳ１４０５。マルチプルアラインメントを行うことは、典型的に該テスト配列の共通領域に対応する、コンセンサス配列へ導きＳ１４０７、ここで、共通点は、特定の類似性閾値への比較によって決定される（例えば、コンセンサスを決定するためのＣＬＵＳＴＡＬＷパラメータセッティングパーセンテージ、ＣＬＵＳＴＡＬＷウェイト）。得られるコンセンサス配列は、次いで、該システムの実施形態へインプットされ、類似性サーチから意味がある結果を生じる傾向にあると決定される、該コンセンサス配列の１以上のサブ配列を作製するＳ１４０９。１つのアプローチにおいて、該コンセンサス配列由来のサブ配列は、次いで、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘリシークエンシングマイクロアレイの挙動および限定（limitations）を模倣するシミュレーションを介して、
元々選択されたテスト配列と“ハイブリダイズ”されるＳ１４１３。ハイブリダイゼーションルールは、全配列内の種々の位置でのあるいは種々の数の塩基対の挿入、欠失、および置換の許容性（tolerance）および検出についてのルールを含むが、これらに限定され
ない。次いで、テスト配列とコンセンサス配列との間のアウトプットシミュレートされたハイブリダイゼーションパターンが得られＳ１４１５、そして引き続いて類似性サーチを使用する自動比較のために該システムへサブミットされるＳ１４１７。類似性サーチの結果は、次いで、元々選択されたテスト配列のセットと比較されるＳ１４１９。一般的に、類似性サーチは、少なくとも１つの既知の生物学的エンティティー、ならびにサブミットされた配列またはサブ配列がその既知のエンティティー由来であるという関連する確率をリターンする。したがって、類似性サーチ結果の比較は、コンセンサス配列の関連部分に基づくプローブが、ユーザにとって関心のあるテスト配列のコレクションへ、正確にハイブリダイズし、そしてその結果、これを同定することを確認または否定し得る。該結果がコンセンサス配列（またはそのサブセット）の有効性を確認する場合、その配列は、リシークエンシングマイクロアレイの領域において使用され得るＳ１４２１。あるいは、該比較結果が、問題のテスト配列は適切に検出されないことを示唆する場合、該システムは、新たなプローブのさらなる再設計において使用され得るＳ１４２３。このような再設計プロセスの１実施形態は、オリジナルの設計プロセス内のいくつかのステップの再評価を含み、これらのいくつかは図２３に示される。例えば、該結果は、選択されたテスト配列の範囲の多様性、および環境におけるそれらの普及率に従うそれらの重みづけ（weighting
）によって影響を受けるＳ１４２５。さらに、コンセンサスアルゴリズムの重みづけは、
調節可能でありＳ１４２７、該システムに関連する機能パラメータも同様であるＳ１４２９。さらに、ハイブリダイゼーションをシミュレートすることにおいて実施される種々の方法は調節可能であり、シグナル対ノイズ比閾値およびアルゴリズムのホールスケール変化（wholesale change）を含むＳ１４３１。
【０５２７】
したがって、該システムの機能性（functionality）は、プローブを主観的に選択する
従来の方法と比較して、リシークエンシングマイクロアレイの加速したそしてより効果的な設計を提供する。
【０５２８】
設計に関連する上記の局面は、さらに、本発明者によって行われた下記の実施例によって示される。この実施例において、それを作製するために使用されるテスト配列を同定することができる、マイクロアレイ上の標的配列として使用されるコンセンサス配列を作製するための方法が記載される。図２４は、以下に記載の方法の例示的な実施形態である。
【０５２９】
１５個のアデノウイルスヘキソン遺伝子配列から出発して、これらの配列は、デンドログラム（例えば、図２５を参照のこと）を使用する系統発生に従って配置される。デンドログラムは、選択されたテスト配列中の遺伝的関係を図示しそして評価するために使用される。Ａｄ１およびＡｄ５は、他の配列に関して最大のアウトライヤー（outliers）であるが、全ての１５の示されるアデノウイルスヘキソン遺伝子配列は、この実施例において、テスト配列の初期セットとして選択されるＳ１５０３。テスト配列の初期セットの選択Ｓ１５０３は、必要に応じて、予め設定されたまたはユーザ規定されたパラメータに従って該システムによって、自動的に提供される。例えば、デンドログラム中の配列間の距離は、候補コンセンサス配列において配列をコンバインするために必要とされる最小または最大距離を決定するために設定される数的閾値を提供する。
【０５３０】
次に、全ての選択されたテスト配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９４）のようなマルチプルアラインメント分析Ｓ１５０５へ供され、これらのサンプルアウトプットは図２６に示される。コンセンサス配列は、次いで、このアラインメントから計算されるＳ１５０７。該実施例は、図２７でＣｏｎｓ（ＣｌｕｓｔａｌＷへのＥＭＢＯＳＳインターフェース）によって行われるこのステップを示し、Ｃｏｎｓは低い“プルーラリティ”（low "plurality）［それ未満でコンセンサスが存在しないポジティブマッチ（positive matches）の数についてのカットオフをＣｏｎｓのユーザが設定することを可能にするパラメータ］で作動する。特に、より低いプルーラリティ（lower plurality）
は、より少ないマッチがコンセンサスを構築することを可能にし、したがって、より少ないギャップおよびＮｓを有するコンセンサスを作製する。
【０５３１】
候補コンセンサス配列が計算されると、それはＲＥＰＩ（または、あるいは、本発明の別の実施形態）へインプットされ、１ｅ−９の期待閾値を使用して標的配列としてのその潜在的な有効性を最初に評価しＳ１５０９、見込みのあるマッチ（prospective matches
）をリターンするＳ１５１１。この時点で、ＲＥＰＩ結果は、例えば、ＲＥＰＩ結果中に存在するテスト配列の初期セットのパーセンテージのような、テスト配列の初期セットと比較されるＳ１５１３。ＲＥＰＩ結果によって同定された初期テスト配列のこのパーセンテージが閾値（システムによって予め設定されるか、あるいはユーザによって規定される）を超える場合、該候補コンセンサス配列は、最も確率的に好ましい大規模な（most probabilistically favorable large-scale）標的配列であり、そして該プロセスは、シミュレーティングハイブリダイゼーションに移動するＳ１５２７。示される例において、上記比較閾値は１００％であり、該初期テスト配列の全てがＲＥＰＩによってリターンされなければならないという条件に対応し、期待閾値を超える。この比較閾値を低下させることは、テスト配列の所望のセットの特定数またはパーセンテージを誤って同定するかまたは同定し損ねるかもしれない、標的配列により許容なシステムを生じさせる。
【０５３２】
そうではなく、該テスト配列の初期セットの各々がＲＥＰＩ結果中に全く存在しない場合、欠けているテスト配列は、個々に、該候補コンセンサス配列と共に評価される。候補コンセンサス配列はまた、前のステップにおいて作製されたマルチプルアライメントと組み合わせて評価され、このコンセンサス内でのそれらの同定に重要である任意の欠けている配列セグメントを同定する。以下のステップの目的は、オリジナルのオリジナル配列一般性を失うことなく、オリジナルの候補コンセンサス配列へ必要な配列情報を徐々に（incrementally）加えることである。
【０５３３】
したがって、マルチプルアラインメントが再度行われるＳ１５１５。このとき、マルチプルアラインメントは、現在のコンセンサス配列を含む。引き続いて、候補コンセンサス配列におけるギャップが同定されるＳ１５１７。テスト配列および候補コンセンサス配列のアラインメントにおけるギャップは、欠けている配列データについて可能性のある位置であり、ここで、欠けている（missing）テスト配列から候補コンセンサス配列へインク
リメンタル配列情報を加えることは、有利であるかもしれない。
【０５３４】
図２８は、第２マルチプルアラインメントからの結果におけるギャップの例を示す。この例において、初期テスト配列選択プロセスの間に２つの最大の系統的アウトライヤー（phylogenic outliers）として前に述べられるように（図２５を参照のこと）、コンセン
サス配列がＡｄ１およびＡｄ５から配列データをスキップする（skips）２箇所が存在す
る。
【０５３５】
次いで、前記ギャップに対応する欠けている配列からのセグメントが、前記ギャップの代わりにオリジナルコンセンサス配列へ、加えられるか、または“スプライスされ（spliced）”Ｓ１５１９、“パッチされた（patched）”コンセンサス配列を形成させる。図２９は、パッチされた候補コンセンサス配列内の、スプライスされた配列データを示す。本発明の実施形態によれば、スプライシングは、ユーザによって手動で行われる。必要に応じて、該システムは、ギャップへのスプライシングのために、欠けているテスト配列からの配列データの選択およびギャップの同定に対応する、パラメータ（システムによって予め設定されるか、またはユーザによって設定される）に従って、自動スプライシングを提供する。
【０５３６】
スプライシングＳ１５１９後、パッチされた候補コンセンサス配列は、上記操作の効果を評価するために、再度、ＲＥＰＩへサブミットされるＳ１５２１。必要に応じて、システムまたはユーザは、今回正確に同定された欠けている試験配列の数（またはパーセンテージ）Ｓ１５２３あるいはＲＥＰＩ結果によって今回誤って同定された以前に同定されたテスト配列の数（またはパーセンテージ）Ｓ１５２５に対応するさらなる受容性閾値（acceptability thresholds）を決定する。このような閾値は、一般的に、初期候補コンセンサス配列に関して、パッチされたコンセンサス配列の有効性における改善または低下についての許容性（tolerance）に対応する。示される例において、２つの配列セグメントの
添加は、以前に同定されたテスト配列のいずれをも失うことなく、ＲＥＰＩヒットのリストへＡｄ１およびＡｄ５を加えるに十分である。
【０５３７】
他方、スプライシングオペレーションが、同定されたもののリストへ欠けているアデノウイルスタイプを加えない場合、あるいは他の配列ヒットが新たなコンセンサス配列が捨てられるプロセスにおいて失われている(lost)場合、Ａｄ１およびＡｄ５は分離され、そして残りの配列は再評価されるＳ１５２４。あるいは、スプライシングオペレーションが受容性閾値を満たさない場合、再評価が行われる。したがって、テスト配列の初期セットの間の配列差異が受容性閾値を満たさない場合（例えば、直前に記載されているもの）、２以上の候補コンセンサス配列は、テスト配列の初期セットの所望のパーセンテージを同
定し得る標的配列を適用するために必要かもしれない。必要に応じて、該システムは、並行して、このようなさらなる候補コンセンサス配列の検討（consideration）および評価
（evaluation）を提供する。
【０５３８】
オリジナル配列の全てがＲＥＰＩ結果において同定されると（図３０を参照のこと）、最終コンセンサス配列が形成され、そしてオリジナルテスト配列の各々について可能性のあるハイブリダイゼーションが決定され得る。図３１は、このステップを行うために使用されるハイブリダイゼーション／結合シミュレーションプログラムを示す。オリジナル配列の各々は、新たなコンセンサス配列と整列される。シミュレーションは、例えばｂｌ２ｓｅｑアラインメントプログラムによって作成されるアウトプットアラインメントファイルを採用し、そして２５量体当たりのトップスコアリングアラインメントにおける差異の数を評価する。必要に応じて、該プログラムは、より長いかまたはより短い間隔で、差異の数を評価する。該システムは、次いで、該２５量体が２ミスマッチ未満を有する位置のみに基づいて得られる配列（Ａｄ４について図３１に示されるように）を構築する。さらに、ミスマッチの許容性についての別個の閾値パラメータが、必要に応じて該システムによって提供される。
【０５３９】
図３１に示される配列は、現在のコンセンサス配列とハイブリダイズされるテスト配列のシミュレートされた表示である。最終のコンセンサス配列と該配列の各々とのハイブリダイゼーションポテンシャルが、次いで評価されるＳ１５２７。この例において、プログラムＨｙｂＢｉｎｄが使用され、各テスト配列についてハイブリダイゼーションシミュレーション配列を作製するＳ１５２９。ハイブリダイゼーションシミュレーション配列が全て作製されると、それらは、それらが実際のチップから得られるかのように、ＲＥＰＩによって各々実行されるＳ１５３１。
【０５４０】
全てのシミュレートされた配列が、トップスコアおよびトップ“ヒット”（ビットスコアおよび／または期待値に基づく類似性スコア）としてそれらのそれぞれの配列にマッチする場合、この可能性のあるコンセンサス配列は、評価プロセスに合格し、そして標的配列として使用され得、それを作製するために使用される配列を、タイプごとに、同定するＳ１５３５。あるいは、シミュレートされた配列の全てがトップスコアとしてそれらのそれぞれの配列とマッチしない場合Ｓ１５３５、またはトップスコアおよびＥ値が複数の配列にマッチする場合Ｓ１５３３、可能性のあるコンセンサスは該評価に不合格となり、該配列は、複数のグループに分割され、そして再評価のために送り戻されるＳ１５３４。
【０５４１】
それらのそれぞれの配列を正確に同定しない可能性のある配列（Ａｄ１，Ａｄ５０，Ａｄ３４，Ａｄ３）は、ステップ１へ送り戻され、１以上のコンセンサスについて再評価されるＳ１５３４。トップスコアおよびＥ値としてそれらのそれぞれの可能性のある配列を正確に同定した可能性のある配列Ａｄ４，Ａｄ２１，Ａｄ１６，Ａｄ７，Ａｄ５は、一緒にグループ化され、そしてマルチプルアライメントの作成で始まる上述のプロセスを介して送り戻され、不合格しそしてそれら自体を正確に同定しなかった配列を使用せずに、新たな候補コンセンサス配列を構築するＳ１５３６。新たな候補コンセンサス配列（例えば、図３２を参照のこと）は、再度、同一の閾値および評価、ｂｌ２ｓｅｑ，ＲＥＰＩ，ＨｙｂｂｉｎｄおよびＲＥＰＩを介して実行される。この場合、Ｈｙｂｂｉｎｄからの最終のシミュレートされる配列は、検証のためにＲＥＰＩを介して実行される場合、該配列の全ては、トップスコアおよびＥ値としてタイプごとにそれらのそれぞれの配列を同定することができ、したがって、この可能性のあるコンセンサス配列は、全ての評価に合格し、そして配列Ａｄ４，Ａｄ２１，Ａｄ１６，Ａｄ７，およびＡｄ５についての標的として使用され得る。
【０５４２】
なお別の実施形態において、該システムは、配列分析における時間的傾向の分析および
追跡を提供する。時間に渡って反復的にまたは継続的に上記に記載されるものと類似の分析を行いそして記録することによって、遺伝的またはプロテオミック進化および／または突然変異が、従来法を使用するよりも容易に追跡され得る。
【０５４３】
病原体検出に関連する特定の実施形態において、本明細書中で記載される本発明は、臨床セッティングにおける（ポイント−オブ−ケア（point-of-care）でまたはその付近で
の）一般的な呼吸器病原体（respiratory pathogens）ルーチン診断およびサーベイラン
スのために使用される。容易に得ることが出来るサンプル（例えば、鼻洗浄（nasal wash）、咽喉スワブ（throat swab）、痰、血液、食物、土壌、水、または空気）が単純な様
式で処理され、核酸単離物（isolates）を作製し、これらは、吸着性プロセス（adsorptive process）を使用して得られ、病原体特異的標的について濃縮され、偏りのない（non-biased）（例えばトータル）またはマルチプレックスト（multiplexed）ＰＣＲ増幅方法
を使用して増幅され、そして洗浄および画像化の前に所定の時間、リシークエンシングマイクロアレイ上でハイブリダイズさせる。全体的なプロセスは十分に単純であり、その結果、当業者（医療技術者レベル）は、彼らのルーチンワークパターンの顕著な妨害なしに、該アッセイを行うことができる。ベースコールは、カスタムアルゴリズムを使用して、または業者によって特定されるステップを使用して作製される。ＲＥＰＩ、またはその変形が使用され、マイクロアレイによって作製されるベースコールを自動的に解析し、そしてエンドユーザ（例えば、医師、ヘルスケア提供者（health care provider）、公衆衛生提供者（public health officer）、または他の意思決定者（decision-makers））に、疾患症状および合併症の原因である感染性病原体のマネージメント（例えば、診断、治療、予防および大発生制御／封じ込め指標（outbreak control/containment measures））に
ついての決定−クオリティ情報を提供する。この分析は、ＲＥＰＩ（例えば、ローカル専用ＢＬＡＳＴサーバ）によってクエリーされる埋め込まれた配列データベースの使用によって、ローカル的に生じる。ルーチン診断機能性を提供することに加えて、この実施形態と組み合わせて使用されるマイクロアレイはまた、他者、即ち、公衆衛生局（public health officials）の関与の原因となる、非常に起こりそうもない（例えば、トリインフル
エンザまたは生物テロ）病原体についてのマーカーを有する。
【０５４４】
本発明の選択される実施形態において、ＣＩＢＳＩアウトプットは、多層でアレンジされる。特定の実施形態において、ＣＩＢＳＩアウトプットは、ユーザまたはデータ解釈者（data interpreter）への提示のために３層でアレンジされる。アウトプットの第１層は、“種レベル”情報を提供し、アウトプットの第２層は、“血清型／株レベル”情報を提供し、そして第３層は“低レベル”情報を提供する。種の例としては、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、アデノウイルス、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、およびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓが挙げられるがこれらに限定されない。種レベル層がユーザまたはデータ解釈者へ先ず提示され、該ユーザまたはデータ解釈者は、例えば、ユーザインプット、予め設定されたディスプレイセッティング、資格のある個人によって規定されたプロトコルを介して、他の層を選択しそして見ることができる。代替の実施形態は、ルールとアルゴリズムを提供し、各層の内の詳細の予め設定されたレベルに対応するデータを検索し、組織し、そして示す。
【０５４５】
１実施形態において、第一レベルでポジティブについてのルールは、種についての複数のタイル領域のいずれか１つがポジティブを生じる場合（例えば、１．０ｅ−９未満のＢＬＡＳＴ期待値を有するサブ配列を生じるか、または単一病原体データベースレコードについて高いビットスコアを生じる）、結果は種レベルで陽性（ＰＯＳＩＴＩＶＥ）であるというものである。これは、詳細の完全に自律の第１層が確立されることを可能にする。ユーザは、より多くの情報を作成することができ、この第１層は、例えば、人が介在するステップを通して、第２または第３層の情報にアクセスする。“血清型／株レベル”情報を含むアウトプットの第２層は、ユーザが、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ
）レコードネームを見ることを可能にし、そして所定の閾値を超えるスコアで同定し、血清型および／または株を決定する。必要に応じて、テキストサーチアルゴリズムが、正確な命名規則無しに配列データベースに適用され得、自動的に血清型／株レベル情報を提供する（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータの検索および解析を介して）。あるいは、該システムは、ディスプレイフィールドの隣のオプションを選択することによってユーザまたはデータ解釈者によって第１層の情報へ作製される補遺（addenda）（例えば、アデノウイル
ス４、ＡＦ野外株またはインフルエンザＡ型、Ｈ３Ｎ２、Ｆｕｊｉａｎ４１１）を提供する。アウトプットの第３層は、生ＣＩＢＳＩアウトプットを含む。必要に応じて、アルゴリズムが、該生ＣＩＢＳＩアウトプットに適用され得る。本発明の他の実施形態は、アウトプットの第１層へさらなる情報を移動する。
【０５４６】
図２０は、コンピュータシステム（またはサーバ）２００１のブロック図であり、ここで、本発明の実施形態が実施され得る。しかし、本システムは、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）構成に基づく必要はなく、しかし汎用コンピュータの特徴を含まないカスタムプロセッサベースのシステムが同様に使用され得ることが注意されるべきである。にもかかわらず、本発明をサポートするために使用される実際のハードウエア構成は、それほど限定されないので、ＰＣベースのシステムの例が今回提供される。コンピュータシステム２００１は、バス２００２または情報を伝達するための他の通信メカニズム、および情報を処理するためのバス２００２と連結されたプロセッサ２００３を備える。コンピュータシステム２００１はまた、プロセッサ２００３によって実行される命令および情報を保存するために、バス２００２へ接続された、メインメモリ２００４、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）または他のダイナミックストレージデバイス（dynamic storage device）（例えば、ダイナミックＲＡＭ（ＤＲＡＭ）、スタティックＲＡＭ（ＳＲＡＭ）、およびシンクロナスＤＲＡＭ（ＳＤＲＡＭ））を備える。さらに、メインメモリ２００４は、プロセッサ２００３による命令の実行の間、一時的変数（temporary variables）また
は他の中間情報を保存するために使用され得る。コンピュータシステム２００１は、さらに、プロセッサ２００３についての命令およびスタティック情報を保存するために、バス２００２へ接続された、読出し専用記憶装置（ＲＯＭ）２００５または他のスタティックストレージデバイス（例えば、プログラマブルＲＯＭ（ＰＲＯＭ）、消去可能なＰＲＯＭ（ＥＰＲＯＭ）、および電気的消去可能なＰＲＯＭ（ＥＥＰＲＯＭ））を備える。
【０５４７】
コンピュータシステム２００１はまた、情報および命令を保存するための１以上の保存装置［例えば、磁気ハードディスク２００７、およびリムーバブルメディアドライブ２００８（例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、読み出し専用コンパクトディスクドライブ、読み込み／書き込みコンパクトディスクドライブ、コンパクトディスクジュークボックス、テープドライブ、およびリムーバブル磁気光学ドライブ）］を制御するためのバス２００２へ接続されたディスクコントローラ２００６を備える。保存装置は、好適なデバイスインターフェース（例えば、小型コンピュータ用周辺機器インターフェース（ＳＣＳＩ）、集積デバイスエレクトロニクス（integrated device electronics）（
ＩＤＥ）、エンハンストＩＤＥ（enhanced-IDE）（Ｅ−ＩＤＥ）、ダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）、またはウルトラ−ＤＭＡ（ultra-DMA））を使用して、コンピュータシ
ステム２００１へ加えられてもよい。
【０５４８】
コンピュータシステム２００１はまた、特殊用途ロジックデバイス（special purpose logic devices）（例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣｓ））または設定変更可能
なロジックデバイス（configurable logic devices）（例えば、シンプルプログラマブルロジックデバイス（ＳＰＬＤｓ）、コンプレックスプログラマブルロジックデバイス（ＣＰＬＤｓ）、およびフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡｓ））を備え得る。
【０５４９】
コンピュータシステム２００１はまた、コンピュータユーザへ情報をディスプレイするために、ディスプレイ２０１０（例えば、陰極線管（ＣＲＴ））を制御するためのバス２００２へ接続されたディスプレイコントローラ２００９を備え得る。コンピュータシステムは、コンピュータユーザとインタラクトしそしてプロセッサ２００３へ情報を提供するために、入力装置、例えば、キーボード２０１１およびポインティングデバイス２０１２を備える。ポインティングデバイス２０１２は、例えば、プロセッサ２００３へ方向情報およびコマンド選択を通信するため、およびディスプレイ２０１０上のカーソル移動を制御するための、マウス、トラックボール、またはポインティングスティックであり得る。さらに、プリンターは、コンピュータシステム２００１によって保存されるおよび／または作成されるデータのプリントされたリストを提供し得る。
【０５５０】
コンピュータシステム２００１は、プロセッサ２００３に応答して、本発明の処理ステップの全てまたは部分を行い、メモリ（例えば、メインメモリ２００４）に含まれる１以上の命令の１以上のシーケンス（sequences）を実行する。このような命令は、別のコン
ピュータ可読媒体、例えばハードディスク２００７またはリムーバブルメディアドライブ２００８からメインメモリ２００４へ読まれてもよい。マルチプロセッシングアレンジメントにおける１以上のプロセッサもまた、メインメモリ２００４に含まれる命令のシーケンスを実行するために使用され得る。代替の実施形態において、ハードワイヤード回路が、ソフトウエア命令の代わりにまたはこれと組み合わせて使用され得る。したがって、実施形態は、ハードウエア回路およびソフトウエアのいずれの特定の組合せにも限定されない。
【０５５１】
上述のように、コンピュータシステム２００１は、本発明の教示に従ってプログラムされた命令を保持するため、および本明細書中に記載されるデータ構造物、テーブル、レコード、または他のデータを含むために、少なくとも１つのコンピュータ可読媒体またはメモリを備える。コンピュータ可読媒体（computer readable media）の例は、コンパクト
ディスク、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、テープ、磁気光学ディスク、ＰＲＯＭ（ＥＰＲＯＭ，ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュＥＰＲＯＭ）、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＳＤＲＡＭ、または任意の他の磁気媒体、コンパクトディスク（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ）、または任意の他の光学媒体、パンチカード、ペーパーテープ、またはホールのパターンを有する他の物理的な媒体、搬送波（以下に記載）、あるいはコンピュータが読むことが出来る任意の他の媒体である。
【０５５２】
コンピュータ可読媒体のいずれか１つまたは組合せに保存される場合、本発明は、コンピュータシステム２００１を制御するため、本発明を実施するためのデバイスを駆動するため、およびコンピュータシステム２００１がヒューマンユーザ（例えば、印刷生産者（print production personnel））とインタラクト可能にするために、ソフトウェアを含む。このようなソフトウェアとしては、デバイスドライバ、オペレーティングシステム、ディベロップメントツール、およびアプリケーションソフトウエアが挙げられるが、これらに限定されない。このようなコンピュータ可読媒体は、本発明を実施することにおいて行われるプロセッシングの全てまたは部分（プロセッシングが分散される場合）を行うために、本発明のコンピュータプログラムプロダクトをさらに含む。
【０５５３】
本発明のコンピュータコードデバイスは、任意の解釈可能な（interpretable）または
実行可能な（executable）コードメカニズムであり得、スクリプト、解釈可能なプログラム（interpretable programs）、ダイナミックリンクライブラリ（ＤＬＬｓ）、ＪＡＶＡ（登録商標）クラス、および完全に実行可能なプログラム（complete executable programs）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明のプロセッシングの部分は、より良好なパフォーマンス、信頼性、および／またはコストのために、分散され得る。
【０５５４】
用語“コンピュータ可読媒体”は、本明細書中で使用される場合、実行のためにプロセッサ２００３へ命令を提供することに関与する任意の媒体をいう。コンピュータ可読媒体は、不揮発性媒体、揮発性媒体、および伝送媒体が挙げられるが、これらに限定されない、多くの形態をとり得る。不揮発性媒体（Non-volatile media）としては、例えば、光学、磁気ディスク、および磁気光学ディスク、例えばハードディスク２００７またはリムーバブルメディアドライブ２００８が挙げられる。揮発性ド媒体（Volatile media）としては、ダイナミックメモリ、例えばメインメモリ２００４が挙げられる。伝送媒体（Transmission media）としては、同軸ケーブル、銅ワイヤおよび光ファイバー（バス２００２を作製するワイヤを含む）が挙げられる。伝送媒体はまた、電波および赤外線データ通信の間に発生されるもののような、音波または光波の形態をとり得る。
【０５５５】
コンピュータ可読媒体の種々の形態は、実行のためにプロセッサ２００３へ１以上の命令の１以上のシーケンスを行うことに関与し得る。例えば、命令は、最初、リモートコンピュータの磁気ディスク上において行われ得る。リモートコンピュータは、ダイナミックメモリへ遠隔的に本発明の全てまたは部分を実行するための命令をロードし、そしてモデムを使用して電話回線上に命令を送信し得る。コンピュータシステム２００１に近いモデムは、電話回線上のデータを受信し、そして赤外線送信機を使用してデータを赤外線信号に変換し得る。バス２００２に接続された赤外線検出器は、赤外線信号で運搬されたデータを受信し、そして該データをバス２００２に置き得る。バス２００２は該データをメインメモリ２００４へ運搬し、ここからプロセッサ２００３は命令を取り出し（retrieve）および実行する。メインメモリ２００４によって受信された命令は、必要に応じて、プロセッサ２００３による実効の前または後のいずれかに、保存装置２００７または２００８に保存され得る。
【０５５６】
コンピュータシステム２００１はまた、バス２００２へ接続された通信インターフェース２０１３を備える。コンピュータインターフェース２０１３は、例えばローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）２０１５、または他の通信ネットワーク２０１６（例えば、インターネット）へ接続される、ネットワークリンク２０１４へ接続する２方向データ通信を提供する。例えば、通信インターフェース２０１３は、任意のパケット交換ＬＡＮへ取り付けるための、ネットワークインターフェースカードであり得る。別の例としては、通信インターフェース２０１３は、非対称型デジタル加入者回線（ＡＤＳＬ）カード、総合デジタル通信網（ＩＳＤＮ）カードまたはモデムであり得、対応タイプの通信回線へのデータ通信接続を提供する。ワイヤレスリンクもまた実施され得る。任意のこのような実施において、通信インターフェース２０１３は、種々のタイプの情報を示すデジタルデータストリームを運ぶ、電気、電磁気または光信号を送信および受信する。
【０５５７】
ネットワークリンク２０１４は、他のデータデバイスへの１以上のネットワークを介してのデータ通信を提供する。例えば、ネットワークリンク２０１４は、ローカルネットワーク２０１５（例えば、ＬＡＮ）を介してまたはサービスプロバイダによって操作される設備を介して（これは、通信ネットワーク２０１６を介して通信サービスを提供する）別のコンピュータへの接続を提供し得る。ローカルネットワーク２０１４および通信ネットワーク２０１６は、例えば、デジタルデータストリームを運ぶ電気信号、電磁気信号、あるいは光信号、ならびに関連する物理的層（例えば、ＣＡＴ５ケーブル、同軸ケーブル、光ファイバーなど）を使用する。種々のネットワークを介しての信号ならびにネットワークリンク２０１４上および通信インターフェース２０１３（これはコンピュータシステム２００１へおよびここからデジタルデータを運ぶ）を介しての信号は、ベースバンド信号、あるいは搬送波に基づいた信号で実行されるかもしれない。ベースバンド信号は、デジタルデータビットの流れを描写している未調節の電気パルスとしてデジタルデータを伝え、ここで、用語“ビット”は、シンボルを意味するために広く解釈され、ここで、各シンボルは、少なくとも１またはそれ以上の情報ビットを伝える。デジタルデータはまた、伝
導媒体上を伝播される、振幅、位相、周波数偏移変調信号（frequency shift keyed signals）などで、搬送波を調節するために使用され得、または伝播媒体を介して電磁波とし
て伝送され得る。したがって、デジタルデータは、“有線”通信チャネルを介して未調節ベースバンドデータとして送信されてもよく、および／または、搬送波を調節することにより、ベースバンドとは異なる所定の周波数帯内で送信されてもよい。コンピュータシステム２００１は、ネットワーク２０１５および２０１６、ネットワークリンク２０１４、ならびに通信インターフェース２０１３を介して、プログラムコードを含むデータを伝送および受信し得る。さらに、ネットワークリンク２０１４は、ＬＡＮ２０１５を介してモバイルデバイス２０１７、例えばパーソナル・デジタル・アシスタント（ＰＤＡ）ラップトップコンピュータ、または携帯電話へ、接続を提供し得る。
【０５５８】
本発明の特定の実施形態のシステムは、ハードウエア、ソフトウエア、ファームウエア、またはそれらの組合せで実施され得る。好ましい実施形態において、該システムは、メモリ中に保存されるおよび好適な命令実行システムによって実行されるソフトウエアにおいて実施される。ハードウエアにおいて実施される場合、代替の実施形態においてのように、該システムは、当該分野において全て周知である、任意の技術で実施され得る。
【０５５９】
フローチャート中のプロセス記載またはブロックは、該プロセスにおける特定の論理関数またはステップを実施するための１以上の実行可能な命令を含む、モジュール、セグメント、またはコードの一部を示すとして理解されるべきであり、そして代替の実施は本発明の好ましい実施形態の範囲内に含まれ、ここで、機能は、本発明の当業者によって理解されるように、含まれる機能性に依存して、実質的に同時にまたは逆の順序を含む、示されるまたは議論されるものと順序が異なって実行され得る。
【０５６０】
本発明の上述の実施形態、特に、任意の“好ましい”実施形態は、本発明の原理の明確な理解のために単に記載された、単に可能な実施の例であることが強調されるべきである。多くの改変および修飾が、本発明の精神および原則を実質的に逸脱することなく、本発明の上述の実施形態に対して行われ得る。このような修飾および改変の全てが、本開示および本発明の範囲内で本明細書中に含まれ、そして下記の特許請求の範囲によって記載されることが意図される。
【０５６１】
【数１−１】
0005517996.tif 000127
【０５６２】
【数１−２】
0005517996.tif 000128
【０５６３】
【数１−３】
0005517996.tif 000129
【図面の簡単な説明】
【０５６４】
【図１】図１は、バージョン１呼吸器病原体マイクロアレイ（Version 1 Respiratory Pathogen Microarray）（ＲＰＭＶ１）を示す。各病原体専用の全てのタイル領域（tile regions）の幾何学的分布は、割り当てられた色（右）によって示される。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘスパイク−イン  コントロール（Affymetrix spike-in controls）は、マイクロアレイの上部にある（白色）。タイル領域間の黒色領域は、プローブを含まなかった。
【図２】図２は、実施例１において示されるような、（Ａ）縮重プライマーＰＣＲ（degenerate primer PCR）（Lin et al., 2004）または（Ｂ）標的ＤＮＡのＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅（total amplification）のいずれかを使用しての、ＲＰＭＶ１への精製アデノウイルス４プロトタイプ（アクセッションナンバーＡＹ５９４２５３）ＤＮＡハイブリダイゼーション、続いての核酸単離および増幅を示す。縮重プライマーＰＣＲ（Ａ）は、保存されたプライマー部位（conserved primer sites）によってカバーされたそれらのタイルド領域内での標的のハイブリダイゼーションを生じさせた。トータル増幅（Ｂ）は、全Ａｄ４タイル領域を横断する標的ハイブリダイゼーションを生じさせた。いずれの方法も、マイクロアレイを横断する有意なクロスハイブリダイゼーション（cross- hybridization）を生じさせなかった。各ケースにおいて、ＲＥＰＩは、アデノウイルス４の正しい株（ＡＹ５９４２５３）を同定し、何故ならば、１ケースを除いて、アンプリコン（amplicons）がハイブリダイズした全てのＡｄ４タイル領域を横切る最高ＢＬＡＳＴ（“Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ”）ビットスコアを達成したからである（実施例１に記載される）。
【図３】図３は、実施例３において示されるような、（Ａ，Ｃ）縮重プライマーＰＣＲ（Lin et al., 2004）または（Ｂ，Ｄ）標的ＤＮＡのＧｅｎｏｍｉＰｈｉトータル増幅のいずれかを使用しての、ＲＰＭＶ１への精製アデノウイルス５フィールド株（field strain）（Ａｄ５ＦＳアクセッションナンバーＡＹ６０１６３５）（Ａ，Ｂ）およびアデノウイルス７プロトタイプ（アクセッションナンバーＡＹ５９４２５５）（Ｃ，Ｄ）ＤＮＡハイブリダイゼーション、続いての核酸単離および増幅を示す。縮重プライマーＰＣＲ（Ａ，Ｃ）は、Ａｄ５ＦＳおよびＡｄ７プロトタイプの両方について保存されたプライマー部位（conserved primer sites）を有するそれらのタイルド領域内での標的のハイブリダイゼーションを生じさせた。トータル増幅（Ｂ，Ｄ）は、全Ａｄ５およびＡｄ７タイル領域を横断する標的ハイブリダイゼーションを生じさせた。いずれの方法も、マイクロアレイを横断する有意なクロスハイブリダイゼーション（cross- hybridization）を生じさせなかった。各ケースにおいて、ＲＥＰＩは、アデノウイルス５（Ａｄ５ＦＳ，アクセッションナンバーＡＹ６０１６３５）またはアデノウイルス７（アクセッションナンバーＡＹ５９４２５５）の正しい株を同定し、何故ならば、アンプリコン（amplicons）がハイブリダイズした全てのそれぞれのタイル領域を横切る最高ＢＬＡＳＴビットスコアを達成したからである。アデノウイルス７について、正確な帰属がまた、Ａｄ７ワクチンタイル領域上においてＡｄ７プロトタイプについて行われ、該タイル領域が誘導されたＡｄ７ワクチン株（ＡＹ５９４２５６）とそれとを正確に区別する。また、全てのアデノウイルスの増幅のために使用された縮重プライマー溶液は、ここで少量のＡｄ４およびＡｄ７プロトタイプで意図的にではなく汚染された（リアルタイムＰＣＲによって汚染について陽性と考えられない）ことを述べることは、注目に値する。該汚染物質は、容易に識別可能なハイブリダイゼーションを生じさせないが（図３に示されるように）、ベースコール（base calls）が、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＤＡＳ）（Affymetrix, Santa Clara, CA製のマイクロアレイリーダーと共にパッケージされる）によって行われ、そしてＲｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＥＰＩ）は、全ての意図的でないベースコールを正確な汚染物質に帰属した。ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ溶液は汚染されず、そしてベースコールは、各実験において、Ａｄ５およびＡｄ７タイル領域の外側のアデノウイルスタイル領域について行われなかった。
【図４】図４は、実施例４に記載されるアデノウイルス４、５ブレイクスルー株の結果を示す。熱性呼吸器疾患を有する患者（以前に、アデノウイルスに対して予防接種した）の咽喉スワブの培養物からの精製核酸のアリコートを、記載されるように（Ｌｉｎら、２００４）保存／縮重プライマーを使用して増幅し、そしてそうでなければ、標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従って処理した。患者は、血清型抗体中和（serotypic antibody neutralization）によってＡＤ４陽性と診断され、そしてヘキソン配列を介してＡｄ５陽性と診断された。本発明者は、アデノウイルス５およびアデノウイルス７プロトタイプタイル領域上にベースコールを生じる、複数の標的ハイブリダイゼーションを得た。ＲＥＰＩ分析により、該アデノウイルスは、Ａｄ５（Ａｄ５ＦＳ，アクセッション番号ＡＹ６０１６３５）として高信頼性で同定され、一方、複数のＡｄ７プロトタイプ領域は、Ａｄ７ではないＢサブグループ種、即ちＡｄ２１の証拠を与えた。また、全てのアデノウイルスの増幅のために使用される、縮重プライマー溶液は、図３に示される場合のように、少量のＡｄ４およびＡｄ７プロトタイプで非意図的に汚染されていたことに注目することは、再度、特筆すべきである。汚染物質は、Ａｄ４タイルにおいて容易に識別可能なハイブリダイゼーションを生じなかったが（図４に示されるように）、ベースコールは、ＧＤＡＳによって作製され、そしてＲＥＰＩは、全ての故意ではない（unintentional）ベースコールを、基礎軍事教育現場（basic military training venues）において循環する野外株ではなく、正しい汚染物質（アデノウイルス４プロトタイプ；アクセッション番号ＡＹ５９４２５３）へ帰属した。さらに、Ａｄ７タイルにおいて達成された最も高いビットスコアは、Ａｄ７プロトタイプではなく（低レベル汚染に関わらず）、アデノウイルス２１型（Ａｄ２１；ＡＹ６０１６３３）、Ａｄ７プロトタイプ（ＡＹ５９４２５５）によって示されるアデノウイルスのＢサブグループの別のメンバーであった。このサンプル中のＡｄ５およびＡｄ２１の混合物の観察は、Ａｄ５について従来のＤＮＡ配列決定、Ａｄ２１についてアンプリコン配列決定、およびスポッテッドマイクロアレイ結果（Ｌｉｎら、２００４）を使用して確認された。なお、Ａｄ７プロトタイプの低レベル汚染は、単一タイル領域サブ配列における高いビットスコアによって、依然として検出および識別された。したがって、この実施例において、少量のＡｄ４およびＡｄ７プロトタイプ（野外サンプルにおいて見られない）で不注意に汚染された、Ａｄ５およびＡｄ２１から構成される予期しない混合されたアデノウイルスサンプルは、完全に解読された（resolve）。この詳細な解読は、このようなタイプの事象の予期および広範囲なプローブ設計努力無しで、他のタイプのマイクロアレイ（即ち、スポッテッド）を使用しては不可能である。
【図５】図５は、実施例５において記載されるインフルエンザＡ株同定の結果を示す。２００３〜２００４年のインフルエンザシーズンの間に以前に免疫化された（Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９（Ｈ３Ｎ２））ベースのワクチンを使用）、インフルエンザＡ（＋）熱性患者（標準細胞培養技術により確認された）由来の鼻洗浄物のアリコートを、（Ａ）ユニバーサル（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、２００１）または（Ｂ）マルチプレックス（Ｏｆｆｒｉｎｇａら、２０００）ＲＴ／ＰＣＲプライマーを使用して増幅し、そして標準Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従って処理した。両方の戦略は全ＨＡ，ＮＡ，およびＭ遺伝子のアンプリコンを作製するので、マイクロアレイ上のそれぞれのタイル領域は、両方のケースにおいてほぼ完全にハイブリダイズされた。両方のケースについてのＲＥＰＩアウトプットは、ＨＡ３について最も高いビットスコアが、２００３〜２００４年のインフルエンザシーズンの間にワクチン予防を逃れた、Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２インフルエンザ株（ＩＳＤＮ３８１５７＿ＩｎｆｌｕｅｎｚａＡ／Ｆｕｊｉａｎ／４１１／２００２＿Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ＿１０４２）について得られたことを示した。ＨＡ３タイル領域を規定するために使用されたプロトタイプインフルエンザＡ  ＨＡ配列、（Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９／Ｈ３Ｎ２）は、ＨＡタイル上のベースコールについてのＲＥＰＩアプトプットに存在しなかった。したがって、インフルエンザＡの予期される株についてのプロトタイプ領域は、予期されない株の同定を可能にした。
【図６】図６は、実施例６に記載される減少されたハイブリダイゼーション時間アッセイの結果を示す。この実施例において、エリスロマイシン耐性マーカーＳＰＹＥＲＭＢ，ＳＰＹＥＲＭＴＲ，およびＳＰＹＭＥＦＡＥ以外、マイクロアレイによってプローブされた全ての標的について陰性と確認された鼻洗浄物を、これら３マーカーの各々について特異的マルチプレックスＰＣＲへ供した。次いで、該アンプリコンを、１６時間（Ａ）または１５分間（Ｂ）、別個のマイクロアレイへハイブリダイズさせ、その他の点ではＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｕｓｔｏｍＳｅｑプロトコルに従って処理した。比較において、１５分ハイブリダイゼーションマイクロアレイ（Ｂ）についてのシグナル強度は、コントロール１６時間マイクロアレイ（Ａ）についてのそれよりも低かった（（Ｂ）におけるマイクロアレイのトップでＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘコントロールプローブへの不完全なハイブリダイゼーションに注意のこと）。しかし、前記３つのタイル領域についてのＲＥＰＩアウトプットは、各領域において最も高いビットスコアは、（Ａ）および（Ｂ）の両方について同一であったことを示し、ビットスコアおよび期待値は両方とも、短縮されたハイブリダイゼーション時間のケースにおいてより低かった。類似の結果が、３０分および１時間ハイブリダイゼーションについて得られ、ハイブリダイゼーション時間が増加するにつれ、ベースコールの数は増加した。しかし、この実施例は、異なるハイブリダイゼーションパターンの範囲内での標的間の詳細な識別を行う本方法のロバスト性(robustness)を明確に示す。
【図７】図７は、実施例７に記載されるサブトラクティブハイブリダイゼーションアプローチの効果を示す。（Ａ）は、Ｌａｃｋｌａｎｄ  ＡＦＢでの熱性呼吸器疾患を有する患者からの鼻洗浄物のアリコート由来の単離された核酸のトータル増幅に続いて得られたハイブリダイゼーションパターンを示す。このサンプルは、１マイクロリットル当たり１０４ゲノムコピーの推定力価（estimated titer）で、Ａｄ４について陽性であった。アデノウイルス４型領域は全バックグラウンドのそれよりも明らかに高いシグナルを示したにもかかわらず、マイクロアレイに渡る高いバックグラウンドハイブリダイゼーションは、ＧＤＡＳがベースコールを作製することを妨げる。ＣＯＴ−１フラクションヒトゲノムＤＮＡと共の（Ａ）において得られたトータルアンプリコンの同一セットのコ−ハイブリダイゼーションは（Ｂ）、ＧＤＡＳによってベースコールが再度作製されなかったように、これをほとんど改善しなかった。（Ｃ）は、トータル増幅前の、マグネチックビーズベースサブトラクションのみの使用は、類似性サーチングを可能にするに十分な数のベースコールを生じさせなかったことを示す。しかし、増幅前の、ビースベースサブトラクション（ビオチニル化ＣＯＴ−１ヒトＤＮＡと複合体化されたストレプトアビジンコーティングされたビーズ）と、溶液相ＣＯＴ−１ヒトＤＮＡとのコ−ハイブリダイゼーションとの組み合わされた使用によって（Ｄ）、十分なベースコールが作製され得、Ａｄ４ＨＥＸＯＮ−１タイル領域において同定された３つのサブ配列の各々において、アデノウイルス４空軍野外株（アクセッション番号ＡＹ５９９８３７）を最高に明確にランク付けした（Ｄ）。さらに、１マイクロリットルの代わりに２マイクロリットルの出発サンプル材料を使用しての組み合わされたステップの同一セットを行うことによって（Ｅ）、ベースコーリングは、Ａｄ４ＨＥＸＯＮ−１に加えてＡｄ４ＦＩＢＥＲタイル領域へ拡張され、Ａｄ４ＨＥＸＯＮ−１タイルおよびいくつかのＡｄ４ＦＩＢＥＲサブ配列における、Ａｄ４野外株についての明確な高ビットスコアランキングを可能にした。
【図８】図８は、ウイルスＲＮＡゲノム標的のノンバイアスの（non-biased）増幅のための以前の（Ｗａｎｇら、２００３）プロトコルの最近記載された修飾（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００４）を使用する増幅に続いての、正常鼻洗浄物にスパイクされた、インフルエンザＡ標的（Ｆｕｊｉａｎ  ４１１／２００２）のハイブリダイゼーションを示す。図８（Ａ〜Ｃ）は、ぞれぞれ、１０５，１０３，および１０１プラーク形成単位（ｐｆｕ）スパイクイン（spike-in）量についてのハイブリダイゼーションパターンを示す（実施例９を参照のこと）。これらの結果は、ノンバイアス増幅スキームが使用される場合であっても、本アプローチの効率は保持され得ることを実証する。これは、複数の未知のＲＮＡ標的の調製への全体的アプローチの拡張、ならびにリシークエンシングマイクロアレイについてのＲＮＡおよびＤＮＡ両方の病原体標的のユニバーサル増幅のための組み合わされた方法への、この特定のプロトコルの組み込みを可能にする。
【図９】図９は、ＲＮＡおよびＤＮＡ経路が集中される（converged）、本発明の実施形態のフローチャート表示を示す。
【図１０ａ】図１０（ａ）は、業界によって現在使用されるプロセスを示す例示的なフローチャートである。
【図１０ｂ】図１０（ｂ）は、業界において実際にしばしば見られる代替ケースを示す。
【図１０ｃ】図１０（ｃ）は、比較データベースおよびサーバとの相互作用のための一般的なシステムレイアウトの概略図である。
【図１０ｄ】図１０（ｄ）は、マイクロアレイを分析することからの配列アウトプットの例を示し、乏しい（poor）ハイブリダイゼーションを実証する。
【図１１ａ】図１１（ａ）は、該システムの実施形態の例示的な概略図である。
【図１１ｂ】図１１（ｂ）は、Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＲＥＰＩ）の実施形態の例示的な概略図である。
【図１１ｃ】図１１（ｃ）は、ＡＳＰのためのインターフェースの例示的なスクリーンショットである。
【図１２】図１２は、ＡＳＰの一般的な機能性を示すフローチャートである。
【図１３】図１３は、コントロールチェックステップ（control check step）の例示的なフローチャートである。
【図１４ａ】図１４（ａ）は、抽出サブシークエンスステップ（extract subsequence step）の例示的なフローチャートである。
【図１４ｂ】図１４（ｂ）は、該システムの１つの実施形態に従うスライディングウィンドウ（sliding window）の例である。
【図１５】図１５は、該システムによって行われるトリム機能（Trim function）をより詳細に示す例示的なフローチャートである。
【図１６】図１６は、鎖長チェックステップ（Check Length step）における動作を詳述する例示的なフローチャートを示す。
【図１７】図１７は、パーセンテージ計算ステップ（Calculate Percentage step）の例示的なフローチャートを示す。
【図１８ａ】図１８（ａ）は、分析ステップ（Analyze step）内の該システムの動作をより詳細に記載する例示的なフローチャートである。
【図１８ｂ】図１８（ｂ）は、本発明の実施形態の例示的なアウトプットを示す。
【図１９】図１９は、該システムのさらなる実施形態を示す例示的なフローチャートである。
【図２０】図２０は、本発明の実施形態が実行され得るコンピューターシステム（またはサーバ）のブロック図（block diagram）である。
【図２１】図２１は、混合物と組換え物（recombination）とを識別するための実施形態の例示的なフローチャートである。
【図２２】図２２は、ユーザへ決定−量情報（decision-quality information）を提供するために強度データを含む実施形態の様式化された例示的な概略図である。
【図２３】図２３は、リシークエンシングマイクロアレイを設計または最適化するための方法を示す例示的なフローチャートである。
【図２４】図２４は、リシークエンシングマイクロアレイを設計または最適化するための方法を示すさらなる例示的なフローチャートである。
【図２５】図２５は、デンドログラムの例である。
【図２６】図２６は、マルチプルアラインメント（multiple alignment）の例示的な図式表示である。
【図２７】図２７は、マルチプルアラインメントによって生成されるコンセンサス配列の例である。
【図２８】図２８は、コンセンサス配列を含むマルチプルアラインメントの別の例示的な図示である。
【図２９】図２９は、修飾されたコンセンサス配列（modified consensus sequence）の例を示す。
【図３０】図３０は、本発明の実施形態の例示的なアウトプットである。
【図３１】図３１は、本発明の実施形態に従うシミュレート（simulated）ハイブリダイゼーションアプトプットの例である。
【図３２】図３２は、コンセンサス配列の別の例を示す。
【図３３】図３３は、本発明の実施形態に従うリシークエンシングアレイデータをフォーマットするための例示的なフローチャートである。
【図１】
0005517996.tif 000130
【図２Ａ−Ｂ】
0005517996.tif 000131
【図３Ａ−Ｂ】
0005517996.tif 000132
【図３Ｃ−Ｄ】
0005517996.tif 000133
【図４】
0005517996.tif 000134
【図５Ａ−Ｂ】
0005517996.tif 000135
【図６Ａ−Ｂ】
0005517996.tif 000136
【図７Ａ−Ｂ】
0005517996.tif 000137
【図７Ｃ−Ｄ】
0005517996.tif 000138
【図７Ｅ】
0005517996.tif 000139
【図８Ａ−Ｂ】
0005517996.tif 000140
【図８Ｃ】
0005517996.tif 000141
【図９】
0005517996.tif 000142
【図１０ａ】
0005517996.tif 000143
【図１０ｂ】
0005517996.tif 000144
【図１０ｃ】
0005517996.tif 000145
【図１０ｄ】
0005517996.tif 000146
【図１１ａ】
0005517996.tif 000147
【図１１ｂ】
0005517996.tif 000148
【図１１ｃ】
0005517996.tif 000149
【図１２】
0005517996.tif 000150
【図１３】
0005517996.tif 000151
【図１４ａ】
0005517996.tif 000152
【図１４ｂ】
0005517996.tif 000153
【図１５】
0005517996.tif 000154
【図１６】
0005517996.tif 000155
【図１７】
0005517996.tif 000156
【図１８ａ】
0005517996.tif 000157
【図１８ｂ】
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【図１９】
0005517996.tif 000159
【図２０】
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【図２１】
0005517996.tif 000161
【図２２】
0005517996.tif 000162
【図２３】
0005517996.tif 000163
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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