(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養によって歯肉上皮細胞が産生したラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ＦＡＤ１０４（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３Ｂ）、フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）、ｎｅｕｇｒｉｎ、ニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、アグリン（ａｇｒｉｎ）、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）のいずれかひとつ以上の細胞外マトリックスがコートされた培養器を用いて歯肉上皮細胞を培養することを特徴とする歯肉上皮細胞の培養方法。
【請求項２】
培養によって歯肉上皮細胞が産生したラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ＦＡＤ１０４（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３Ｂ）、フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）、ｎｅｕｇｒｉｎ、ニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、アグリン（ａｇｒｉｎ）、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）のいずれかひとつ以上の細胞外マトリックスがコートされた培養器。
【請求項３】
請求項２に記載の培養器であって、歯肉上皮細胞を培養した後、該培養器を４℃で保存して得られる培養器または該培養器を凍結乾燥して得られる培養器。
【請求項４】
請求項２または３に記載の培養器を用いて凍結保存後の歯肉上皮細胞を再培養することを特徴とする歯肉上皮細胞の凍結保存方法。
【請求項５】
請求項１に記載の培養方法または請求項４に記載の凍結保存方法によって培養または凍結保存された歯肉上皮細胞。
【請求項６】
請求項２または３に記載の培養器または請求項５に記載の歯肉上皮細胞を１つ以上含む歯肉上皮細胞培養キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は歯肉上皮細胞の培養方法、凍結保存方法および当該方法によって培養され、保存された歯肉上皮細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病や口腔粘膜疾患などの発症には、歯肉上皮細胞が深く関与していることが知られており、従来から歯肉上皮細胞を用いた研究が数多く行われてきた。しかし、歯肉上皮細胞の初代培養は技術的に困難であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発症機序の解析が遅れていた。
また、歯肉上皮細胞の初代培養に成功した場合であっても継代培養が難しく、数代の継代で細胞が増殖しなくなってしまうことから、実験を終了せざるを得ないことが多かった。
そこで、株細胞を用いた研究が行われているが、株細胞は不死化しているため、生体と異なった反応を示すことが多く、より生体に近い性質を維持した歯肉上皮細胞の培養方法の提供が望まれてきた。
【０００３】
歯肉上皮細胞以外の上皮細胞の培養としては、ヒト表皮角化細胞を培養するキットなどが市販されているが、ｖｉａｌ購入時の細胞数の約１５０倍までの増殖しか保証されておらず、凍結保存後の増殖も補償されていないことから、継代培養によって十分な細胞数を得ることができるとはいえない。
また、基底膜細胞外基質でコートした培養皿上で羊膜由来の上皮細胞や間質細胞を培養する方法（特許文献１）や、インシュリン、トランスフェリン等を含む細胞培養基とラミニン等で皮膜された細胞基体等を用い、表皮細胞または表皮ケラチン細胞を連続継代培養する方法（特許文献２）等が開発されている。しかし、これらの培養方法では、培養後の細胞を一旦凍結保存した後、研究の進捗に応じて再度、凍結保存後の細胞を培養に用いるという、研究において必要とされる細胞の凍結保存方法については検討されていない。従って、凍結保存後であっても、増殖能を維持している上皮細胞を得ることができないという問題があった。
【０００４】
そこで、本発明者らは、より生体に近い性質を維持した歯肉上皮細胞を提供できる該細胞の培養方法と、凍結保存後も増殖能を維持している歯肉上皮細胞が提供できる該細胞の凍結保存方法の提供を試みた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−６２４９号公報
【特許文献２】特許第２５７７１１４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、歯肉上皮細胞の培養方法および凍結保存方法の提供を課題とする。さらに当該方法によって培養され、保存された歯肉上皮細胞の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ラミニン、フィブロネクチン等の細胞外マトリックス（細胞外基質）がコートされた培養皿を使用することにより、歯肉上皮細胞の初期培養および長期的な継代培養が可能であることを見出した。本発明の培養方法では、より生体に近い性質を維持した歯肉上皮細胞を約１０，０００倍に増殖させることができる。また、本発明者らは、本発明の培養方法を用いて培養した歯肉上皮細胞が、液体窒素での凍結保存後も増殖能を維持し得る歯肉上皮細胞の凍結保存方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は次の（１）〜（７）の歯肉上皮細胞の培養方法や凍結保存方法等に関する。
（１）歯肉上皮細胞の培養において、細胞外マトリックスがコートされた培養器を用いることを特徴とする歯肉上皮細胞の培養方法。
（２）細胞外マトリックスが、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ＦＡＤ１０４（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３Ｂ）、フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）、ｎｅｕｇｒｉｎ、ニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、アグリン（ａｇｒｉｎ）、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）のいずれかひとつ以上である上記（１）に記載の歯肉上皮細胞の培養方法。
（３）細胞外マトリックスが、歯肉上皮細胞が産生する細胞外マトリックスである上記（１）または（２）に記載の歯肉上皮細胞の培養方法。
（４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の細胞外マトリックスがコートされた歯肉上皮細胞培養用の培養器。
（５）上記（４）に記載の培養器を用いて凍結保存後の歯肉上皮細胞を再培養することを特徴とする歯肉上皮細胞の凍結保存方法。
（６）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の培養方法または上記（４）に記載の凍結保存方法によって培養または凍結保存された歯肉上皮細胞。
（７）上記（４）に記載の培養器または上記（６）に記載の歯肉上皮細胞を１つ以上含む歯肉上皮細胞培養キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の歯肉上皮細胞の培養方法および凍結保存方法によって、大量の歯肉上皮細胞を長期間に亘って安定して入手できるため、研究の早期進展を図ることができる。また本発明の培養方法によって大量に培養される歯肉上皮細胞は、生体に近い性質を維持していることから、培養歯肉上皮シート等の原料として用いることができ、インプラントや歯周外科に応用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】歯肉上皮細胞が分泌した細胞外マトリックスを示した図である（試験例１）。
【図２】歯肉上皮細胞が発現した細胞外マトリックス遺伝子を示した図である（試験例１）。
【図３】歯肉上皮細胞の性質を確認した図である（試験例２）。
【図４】歯肉上皮細胞の増殖を確認した図である（試験例３）。
【図５】歯肉上皮細胞の細胞付着、増殖および形態の変化を確認した図である（試験例４）。
【図６】再々凍結保存後の歯肉上皮細胞の増殖能を確認した図である（試験例５）。
【図７】再々凍結保存後の歯肉上皮細胞の形態を確認した図である（試験例６）。
【図８】凍結乾燥後のフラスコによる歯肉上皮細胞の付着、増殖および形態の変化を確認した図である（試験例７）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の「歯肉上皮細胞の培養方法」は、細胞外マトリックスがコートされた培養器を用いて、歯肉上皮細胞の培養を行うことを特徴とする。ここで、「細胞外マトリックスがコートされた培養器」とは、培養器の歯肉上皮細胞が接着し、増殖する面に、細胞外マトリックスがコートされた培養器のことをいう。この細胞外マトリックスは、歯肉上皮細胞が増殖できる細胞外マトリックスであればいずれの細胞外マトリックスでもよい。
例えば、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ＦＡＤ１０４（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３Ｂ）、フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）、ｎｅｕｇｒｉｎ、ニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、アグリン（ａｇｒｉｎ）またはフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられ、これらのいずれかひとつ以上が、培養器の歯肉上皮細胞が接着し、増殖する面にコートされていればよい。
【００１２】
このような培養器としては、例えば、これらの細胞外マトリックスがコートされた市販の培養器や、市販のプラスチック等の培養器に市販の細胞外マトリックスをひとつまたは複数組み合わせ、従来知られている方法によって独自にコートした培養器等が挙げられる。
また、歯肉上皮細胞を培養した後の培養器にも、歯肉上皮細胞が自ら産生した細胞外マトリックスがコートされていることから、この培養器も「細胞外マトリックスがコートされた培養器」に含まれる。
ここで、「歯肉上皮細胞が産生する細胞外マトリックス」としては、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）としてラミニン−５およびラミニン−１０／１１、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）としてＴｙｐｅ  Ｖ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  ＸＩＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  ＸＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎおよびＴｙｐｅ  ＸＶＩＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）としてテネイシンＣ、フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）としてフィブリリン２、ｎｅｕｇｒｉｎ、ニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）としてニドジェン−１、アグリン（ａｇｒｉｎ）またはフィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）としてフィブロネクチン１等が本発明において示唆されている。
【００１３】
本発明の「細胞外マトリックスがコートされた培養器」のうち、この歯肉上皮細胞が自ら産生した細胞外マトリックスがコートされた培養器は、歯肉上皮細胞を培養して、細胞を剥がした後、すぐに使用することができる。また、細胞を剥がした日を０日目として５日目までのものは、４℃で保存しておけば使用することができる。
さらに、歯肉上皮細胞を培養した後の培養器は凍結乾燥して保存したものも用いることができる。雑菌汚染等を避け、使用できる状態で保存された培養器であればどのように凍結乾燥処理され、保存されたものでも良いが、例えば、次のような手順で歯肉上皮細胞を除き、凍結乾燥処理を行い、保存したものを用いることができる。
１）通常の継代と同様にトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥がした後、培地を入れ、細胞浮遊液を作り、細胞浮遊液をきれいに取り除いた。
２）培地にて洗浄した後、フラスコ内の培地を丁寧に取り除いた。
３）フラスコを−８０℃で３０分以上凍結後、凍結乾燥機にセットし、凍結乾燥した。
４）凍結乾燥が終了したら、乾燥機から取り外し、常温で保存した。
このように凍結乾燥した培養器は、凍結乾燥後、１ヶ月〜１年以上常温保存したものも使用することができる。
【００１４】
本発明の「歯肉上皮細胞の凍結保存方法」とは、歯肉上皮細胞を培養できる状態で維持できる凍結保存方法であればいずれの方法も含まれる。
例えば、本発明の「歯肉上皮細胞の培養方法」で培養し、増殖した歯肉上皮細胞を培養器０．０５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）等を加えて剥離した後、凍結保存液に懸濁し、凍結保存用のチューブに分注して、−８０℃でまたは液体窒素中で保存する方法などが挙げられる。ここで用いる凍結保存液とは、歯肉上皮細胞を培養できる状態で維持できる凍結保存液であればいずれの凍結保存液であってもよく、セルバンカー１（日本全薬工業株式会社）等の市販の凍結保存液であってもよい。
このように凍結保存した後、凍結保存後の歯肉上皮細胞を再培養する場合には、従来知られているいずれの方法でも再培養を行うことができるが、例えば、−８０℃で凍結保存していた歯肉上皮細胞であれば、手の体温でやや溶かした後、予め加温しておいた培養液を加えてピペッテイングしながら融解し、歯肉上皮細胞を培養した後の培養器に入れて再培養する方法等が挙げられる。
【００１５】
本発明の方法によって培養され、また凍結保存された歯肉上皮細胞は、より生体に近い性質を維持していることから、歯肉上皮細胞を用いた基礎研究や、培養歯肉上皮シート等の開発のための原料等として用いることができる。
「歯肉上皮細胞培養キット」は、本発明の細胞外マトリックスがコートされた歯肉上皮細胞培養用の培養器や、本発明の培養方法または凍結保存方法によって培養または凍結保存された歯肉上皮細胞を１つ以上含むものであればいずれのものでも良いが、例えば、凍結保存した歯肉上皮細胞と細胞外マトリックスがコートされた培養器を組み合わせたものや、これらにさらに、歯肉上皮細胞の培養において必要となる培養液、細胞を培養器から剥がす際に必要となるトリプシン等を組み合わせたもの等が挙げられる。
【００１６】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
＜歯肉上皮細胞の培養方法＞
１．歯肉上皮細胞
歯周外科手術の際に切除され、不要となった歯肉片より、Ｏｈｓｈｉｍａらの方法（参考文献１）によって、ヒト歯肉上皮細胞を得た。
ヒト歯肉上皮細胞を得るにあたり歯肉片をディスパーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ、合同酒精）処理した後、上皮組織部分を結合組織部分から剥離した。上皮組織を細切後、組織片をプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）の底に静置し、組織片から外生した細胞を第１代として歯肉上皮細胞の培養に用いた。
参考文献１：Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ７９，  ９１２−９１８，  ２００８．
【００１８】
２．歯肉上皮細胞の培養方法
１）初代培養
Ｉ型コラーゲンがコートされたプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）を用い、細胞はＥｐｉ  Ｌｉｆｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に増殖添加剤（Ｓ７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％の抗生物質溶液（ＰＳＮ、Ｓｉｇｍａ）を加えた培地（ＥＬ＋）を用いて上記１．の歯肉上皮細胞を増殖させた。
【００１９】
２）歯肉上皮細胞の継代培養
上記１）でコンフルエントに増殖した歯肉上皮細胞を、トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ溶液を用いてプレートから剥がし、継代培養に用いた。
歯肉上皮細胞の培養に用いたプレートは、細胞を剥がした後、培養液でフラスコを洗浄し、アスピレーターで吸引することによりプレート中の水分を可及的に取り除いた。
水分を除去した後、５日以内にこのプレートを使用する場合は４℃で保存した。それ以上の期間保存する場合は、−８０℃で凍結保存、または凍結乾燥機（ＥＤＵ−８３０、東京理化学器械株式会社）にて凍結乾燥した後、室温にて保存した。
【００２０】
［試験例１］
マトリックス成分の分析
実施例１、１）で歯肉上皮細胞の培養に用いたプレートに付着したと考えられる細胞外マトリックス成分を次の１）〜３）の手順でＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により確認し、歯肉上皮細胞が培養時に分泌した物質を特定した。
【００２１】
１．培養上清に分泌された物質の特定
１）実施例１、１）でコンフルエントに増殖した歯肉上皮細胞について、プレートから培地（ＥＬ＋）を除去し、増殖添加剤フリーのＥｐｉ  Ｌｉｆｅ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（＋１％の抗生物質溶液（ＰＳＮ、Ｓｉｇｍａ）を含む）（以下ＥＬ−と略す）で洗浄した後、  ＥＬ−にてさらに４８〜７２時間培養を行った。
２）培養後の培養上清を取り出し、限外濾過で濃縮、蒸留水で透析して脱塩後、凍結乾燥機（ＥＤＵ−８３０、東京理化学器械株式会社）にて凍結乾燥したものを試料とした。
３）上記２）の試料を電気泳動用サンプルバッファー（８％ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ），０．００５％ブロモフェニルブルー（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ））に溶解した。
４）試料に含まれる培養上清中のタンパク（２０μｇ）を非還元条件下（−ＤＴＴ）で４％ポリアクリルアミドスラブゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｓｌａｂ  ｇｅｌ）で電気泳動を行った。その後，ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、試料に含まれるタンパクをＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にブロットし，ブロックエース（雪印乳業）でブロッキングを行った。
５）４）でブロッキングしたＰＶＤＦ膜に、一次抗体として、特異抗体（抗ラミニンα３マウスモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  ａｌｐｈａ３  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（横浜市立大学木原生物学研究所  宮崎香教授から分与を受けた）、抗ラミニンα５マウスモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  ａｌｐｈａ５  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（大阪大学蛋白質研究所  関口清俊教授、藤原裕展先生、三千典子先生から分与を受けた）、抗ラミニンγ１またはγ２マウスモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｌａｍｉｎｉｎ  ｇａｍｍａ１  ｏｒ  ｇａｍｍａ２  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）および抗ヒロフィブロネクチンモノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））を加えインキュベートすることで抗原抗体反応を行った。
このＰＶＤＦ膜を洗浄した後、次に、二次抗体としてビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ），さらにＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＫＰＬ）を加えてインキュベートした後洗浄し，ＥＣＬ法（ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｗａｋｏ）でＸ線フィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上にバンドを検出することで、マトリックス成分を特定した。
【００２２】
その結果、歯肉上皮細胞が培養時に分泌した物質として、ラミニン−α３（ＬＭ−α３），ラミニン−α５（ＬＭ−α５），ラミニン−γ１（ＬＭ−γ１），ラミニン−γ２（ＬＭ−γ２）鎖およびフィブロネクチン（ＦＮ）が特定された（図１）。
ラミニンは通常３量体で分泌され、分子量が８０万Ｄａと非常に大きくなる。従って、非還元条件下のウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）において、高分子領域にα３とγ２が検出されたことから、上皮細胞が分泌する典型的なラミニンである、γ２も含んだ３量体のラミニン−５（ＬＭ３３２）が分泌されていると推定された。また、高分子領域にα５とγ１が検出されたことから、β１またはβ２を含むラミニン−１０／１１（ＬＭ５１１／ＬＭ５２１）が分泌されていると推定された。
【００２３】
２．上皮細胞中に発現が確認された物質の特定
１）実施例１、１）でコンフルエントに増殖した歯肉上皮細胞（プレート２つ）からトライゾール・リージェント（Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてそれぞれ全ＲＮＡを抽出した。
ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔTM  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、それぞれの歯肉上皮細胞のｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換した後，特異的プライマーおよび内部標準としてＧＡＰＤＨのプライマー（表１）（すべて終末濃度２００ｎＭ）と，ＳＹＢＲＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  ＴａｑTM  ＩＩ（ＴａＫａＲａ）とでＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘを作製した。
ここに２０倍希釈したｃＤＮＡを加え、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａＫａＲａ）を用いてリアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は，９５℃３０秒，その後９５℃５秒，６０℃３０秒のサイクルを４０回繰り返した。各遺伝子の発現レベルはΔΔＣＴ法により，ＧＡＰＤＨの発現レベルでノーマライズして求めた。
【００２４】
各プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂａｎｋ（表中には＊で示した）およびＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ（表中には＊＊で示した）により検索し、ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳにオリゴ合成を依頼した（番号を表中に記載した）。また、ラミニン−α３およびラミニン−γ２は、参考文献２（表中には＊＊＊で示した）より検索したものでオリゴ合成を依頼した。
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂａｎｋ： ｈｔｔｐ：／／ｐｇａ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ
ＲＴＰｒｉｍｅｒＤＢ： ｈｔｔｐ：／／ｍｅｄｇｅｎ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｒｔｐｒｉｍｅｒｄｂ／
参考文献２：Ｓ  ＡＭＡＮＯ，  Ｎ  ＡＫＵＴＳＵ，  Ｙ  ＯＧＵＲＡ，  Ｔ  ＮＩＳＨＩＹＡＭＡ：  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｌａｍｉｎｉｎ５  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ａｃｕｔｅ  ｗｏｕｎｄ  ｆｌｕｉｄ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ，  ａｎｄ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  （２００４）  １５１，  ９６１−９７０．
【００２５】
【表１】
0005598951.tif 000002
【００２６】
その結果、図２に示したように、各歯肉上皮細胞において、培養時に発現した物質として、ラミニン−α３（図２、ＬＡＭＡ３），ラミニン−α５（同ＬＡＭＡ５），ラミニン−β１（同ＬＡＭＢ１）、ラミニン−β２（同ＬＡＭＢ２）、ラミニン−γ１（同ＬＡＭＣ１）およびラミニン−γ２（同ＬＡＭＣ２）鎖の遺伝子発現が見られたことから、タンパクとしてラミニン−５およびラミニン−１０／１１が歯肉上皮細胞に発現されていると推定された。
また、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ１３Ａ１、ＣＯＬ１７Ａ１およびＣＯＬ１８Ａ１の遺伝子発現が見られたことから、タンパクとしてＴｙｐｅ  Ｖ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  ＸＩＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ、Ｔｙｐｅ  ＸＶＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎおよびＴｙｐｅ  ＸＶＩＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎが歯肉上皮細胞に発現していると推定された。
さらにパールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、テネイシンＣ（ｔｅｎａｓｃｉｎ  Ｃ）、フィブリリン２（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ  ２）、ｎｅｕｇｒｉｎ、ニドジェン−１（ｎｉｄｏｇｅｎ−１）、アグリン（ａｇｒｉｎ）、フィブロネクチン１（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  １）の遺伝子発現が見られたことから、タンパクとしてそれぞれが歯肉上皮細胞に発現していると推定された。また、ＦＡＤ１０４の遺伝子発現が見られたことからｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３Ｂも発現していると推定された。
【００２７】
［試験例２］
歯肉上皮細胞の性質の確認
実施例１、１）で歯肉上皮細胞の培養に用いたプレートを再利用して歯肉上皮細胞の継代培養に用いた（以下、ｒｅｕｓｅとする）。比較として、Ｉ型コラーゲンがコートされた新品のプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）を歯肉上皮細胞の継代培養に用いた（以下、ｎｅｗとする）。
これらの歯肉上皮細胞について、上皮系幹細胞マーカーとされているｐ７５ＮＴＲおよびＥＳ細胞の未分化能維持に重要な働きをしていることが知られている  Ｏｃｔ３／４の発現を調べ、歯肉上皮細胞としての性質および増殖能の維持を調べた。
それぞれコンフルエントに増殖した歯肉上皮細胞（ｒｅｕｓｅ（継代１３代目），ｎｅｗ（継代１２代目））から上記２．（１）と同様の方法でリアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲを行い、各歯肉上皮細胞中に発現が確認された物質を特定した。リアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列は表２に示した。各プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂａｎｋ（表中には＊で示した）により検索し、ＳＩＧＭＡ  ＧＥＮＯＳＹＳにオリゴ合成を依頼したものを用いた。また、ｐ７５ＮＴＲおよびＯｃｔ３／４は、参考文献３（表中には＊＊＊＊で示した）より検索したものでオリゴ合成を依頼した。
参考文献３：特開２００７−１９５５３３号公報
【００２８】
【表２】
0005598951.tif 000003
【００２９】
その結果、図３に示したように、ｐ７５ＮＴＲの発現が、ｎｅｗでは全く認められなかった。また、Ｏｃｔ３／４の発現量においても、ｒｅｕｓｅとｎｅｗで大きく差があった。これらの結果より、ｎｅｗを用いて培養した場合、ｒｅｕｓｅを用いた場合と比べて細胞の増殖能が早期に限界に達することが示唆された。
【００３０】
［試験例３］
細胞増殖の確認
実施例１、１）で歯肉上皮細胞の培養に用いたプレートを再利用して歯肉上皮細胞の継代培養に用いた（ｒｅｕｓｅ）。比較として、Ｉ型コラーゲンがコートされた新品のプレート（Ｉ型コラーゲンコート：住友ベークライト）を歯肉上皮細胞の継代培養に用いた（ｎｅｗ）。
各フラスコに３×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2ずつ歯肉上皮細胞（継代６代目）を播種し，播種時から４８時間経過後の細胞をトリプシン−ＥＤＴＡを用いて剥がし、細胞数を血球算定版にて計測することで、細胞増殖を比較した。
【００３１】
その結果、図４に示したように、３×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2として培養を開始した歯肉上皮細胞（継代６代目）が、ｒｅｕｓｅでは、３×１０5ｃｅｌｌが３×１０9ｃｅｌｌｓ，ｎｅｗでは、３×１０5ｃｅｌｌｓが１．５×１０8ｃｅｌｌｓまで増えたことから、ｎｅｗでは約５００倍に増殖したのに比べて、ｒｅｕｓｅだと約１０，０００倍まで増殖させることができることが確認された。
凍結融解後、ｒｅｕｓｅ、ｎｅｗともに培養開始時に３×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2となるように細胞を播種し、培養開始から４８時間後に細胞を剥がして細胞数を計測した。細胞数は、ｒｅｕｓｅでは５×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2であり、ｎｅｗでは２．８×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2であり、ｒｅｕｓｅの方が１．７８倍高かった。その後、ｎｅｗのフラスコを継代するたびに、ｎｅｗ  とｒｅｕｓｅにそれぞれ同じ数の細胞を播種し、細胞数を計測し、その差を算出した結果、ｒｅｕｓｅの方が１．４−１．６倍細胞付着率が高いことが確認された。また、再々凍結融解後の細胞を用いた場合でも、ｒｅｕｓｅの方が１．２７倍（ｒｅｕｓｅ；３．６８×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2  ｎｅｗ；２．８８×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2）高かったことから、ｒｅｕｓｅのフラスコを用いると効率的に歯肉上皮細胞の培養ができることが示された。
そして、このような継代培養を繰り返すと、計算上、コンフルエントのフラスコがｎｅｗでは９６０個，ｒｅｕｓｅでは２１６００個得られることになり、ｒｅｕｓｅ使用の効果はｎｅｗ使用時の約２３倍になることが示唆された。
【００３２】
［試験例４］
歯肉上皮細胞の細胞付着、増殖および形態の変化の確認
上皮細胞播種時（継代６代目（Ｐ−６）の凍結細胞融解時）をＴｉｍｅ０として，試験例３と同様に、ｒｅｕｓｅとｎｅｗの融解後６０分の細胞のフラスコへの付着状態を比較した。さらに、２４および４８時間後の歯肉上皮細胞の増殖状態を比較し、継代１２，１５，１８，２０代目（Ｐ−１２，Ｐ−１５，Ｐ−１８，Ｐ−２０）の細胞形態の比較も行った。
その結果、図５に示したように、ｒｅｕｓｅと比較してｎｅｗでは、６０分後の付着細胞数が明らかに少ないことが、また２４および４８時間後における細胞増殖が、明らかに劣っていることが観察された。
また、継代数と細胞形態との関係として、ｒｅｕｓｅでは１８継代目においても小型の増殖中の細胞が多く見られたのに対し、ｎｅｗでは１５継代目ですでに増殖しない大型の細胞が増え、増殖速度が落ちていることが観察された。
【実施例２】
【００３３】
＜歯肉上皮細胞の凍結保存方法＞
歯肉上皮細胞の凍結保存
実施例１において増殖させた歯肉上皮細胞を凍結保存した。
実施例１、１）で増殖した歯肉上皮細胞について、プレートから培地を除去した後、滅菌したＰＢＳ溶液で洗浄した後、０．０５％トリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を加えてプレートから歯肉上皮細胞を剥離した。その後、セルバンカー１（日本全薬工業株式会社）を用いて作成した凍結保存液に懸濁し、凍結保存用のチューブに分注して、−８０℃でまたは液体窒素中で保存した。
【００３４】
［試験例５］
凍結保存後の歯肉上皮細胞の増殖能の確認
上記１．の方法による凍結保存を繰り返し、再々凍結保存した歯肉上皮細胞を用いて凍結保存後の歯肉上皮細胞が増殖能を維持しているか否かを確認した。
継代１２代目（Ｐ−１２）で再々凍結保存（−８０℃）していた歯肉上皮細胞を、手の体温でやや溶かした後、予め加温しておいた培養液を加えてピペッテイングしながら融解し、実施例１に記載の培地をｒｅｕｓｅのフラスコに入れプレインキュベートし、これに融解した細胞を播種し、実施例１に記載の培養方法によって培養した。
その結果、図６．Ａに示したように、試験例４で用いた凍結保存をしていない歯肉上皮細胞（継代６代目（Ｐ−６））と同様に増殖することが確認された。また、図６．Ｂに融解後２４時間の歯肉上皮細胞（Ｐ−１２）と、これを培養し、次の代に継代する直前（Ｐ−１５，Ｐ−１８，Ｐ−２０）の歯肉上皮細胞の様子を示したが、いずれの代においても、ｒｅｕｓｅフラスコを使用することによって、再凍結細胞と同様に増殖できることが確認された。
【００３５】
［試験例６］
再々凍結保存後の歯肉上皮細胞の形態の確認
再々凍結保存後の歯肉上皮細胞の継代培養後の細胞形態を調べた。
その結果、図７に示したように、Ａ．ｎｅｗ（継代１６代目（Ｐ−１６））の歯肉上皮細胞は，肥大し、細胞膜がギザギザして形が崩れ，細胞の接着力が弱く，剥がれかけている細胞が多数観察された。一方、Ｂ．ｒｅｕｓｅ（継代２０代目（Ｐ−２０））および試験例５で培養した再々凍結保存した歯肉上皮細胞を培養したものであるＣ．（継代１２代目（Ｐ−１２）における再々凍結融解ｒｅｕｓｅ）は、いずれも肥大した細胞も見られるものの、小型の増殖期にある細胞も多数観察され、まだ増殖が続くことが予想された。
【実施例３】
【００３６】
フラスコの凍結乾燥
歯肉上皮細胞を培養後のフラスコを次のような手順によって凍結乾燥した後、常温保存し、再度歯肉上皮細胞の培養に使用した。
１）通常の継代と同様にトリプシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）−ＥＤＴＡ溶液を用いて細胞を剥がした後、培地を入れ、細胞浮遊液を作り、細胞浮遊液をきれいに取り除いた。
２）培地にて洗浄した後、フラスコ内の培地を丁寧に取り除いた。
３）フラスコを−８０℃で３０分以上凍結後、凍結乾燥機にセットし、凍結乾燥した。
４）凍結乾燥が終了したら、乾燥機から取り外し、常温で保存した。
【００３７】
［試験例７］
凍結乾燥後の培養器による歯肉上皮細胞の増殖
実施例３の手順により凍結乾燥後保存した、歯肉上皮細胞自身が作る細胞外マトリックス成分が付着したフラスコを歯肉上皮細胞の培養に用い、歯肉上皮細胞が増殖するか否かを確認することで、常温保存した凍結乾燥後の培養器が歯肉上皮細胞の培養に向くかどうかを検討した。
【００３８】
１．凍結乾燥用培養器（ＦＤ）の作成
１）歯肉上皮細胞を培養したフラスコにトリプシンを作用させて細胞を剥離した後、ＦＤ１〜ＦＤ４のそれぞれの血清、凍結用細胞保存液または培養液を用いてフラスコを洗浄する以外が、実施例３と同様に凍結乾燥を行った。                                          
ＦＤ１〜ＦＤ４の組成
ＦＤ１：ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、
ＦＤ２：セルバンカー、
ＦＤ３：Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、
ＦＤ４：Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ１２：ＥＬ（１：１）、
ＦＤ３およびＦＤ４は、１０％ＦＢＳおよび増殖添加剤（Ｓ７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいた。
【００３９】
２）凍結乾燥したフラスコを３日間常温で保存した後、歯肉上皮細胞の培養に用いた。
歯肉上皮細胞は、継代１４代目（２００９年６月１３日に凍結）および継代１５代目（２００９年６月２６日に凍結）で凍結保存していた細胞を融解し、ひとまとめにしたものを用い、１．５×１０5ｃｅｌｌｓ／２５ｃｍ2となるように細胞を播種した。培養開始７２時間後の増殖した細胞数を計数し、歯肉上皮細胞の増殖における凍結保存したフラスコの有効性を確認した。
３）その結果、図８Ａ．に示したように、ＦＤ１〜４のいずれの培地で洗浄し、凍結乾燥したフラスコにおいても、−８０℃保存したｒｅｕｓｅフラスコ（ｒｅｕｓｅ（−８０℃））を上回る良好な細胞付着および増殖を得ることができることが確認された。
また、図８Ｂ．に示したように、ｒｅｕｓｅ（−８０℃）と比較するとＦＤは１．２〜１．３倍、ｎｅｗと比較すると１．６〜１．８倍という高い増殖率を示した。上記と同様に凍結乾燥し、７日間以上室温で保存したフラスコにおいても細胞接着や増殖は良好であったことから、歯肉上皮細胞が産生する細胞外マトリックスが付着された培養器は、凍結乾燥したものであっても歯肉上皮細胞の培養に使用できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
本発明の歯肉上皮細胞の培養方法および凍結保存方法によって、長期間に亘って安定して提供される歯肉上皮細胞は、さまざまな研究に用いることができる。また、本発明で得られる歯肉上皮細胞は生体に近い性質を維持していることから、培養歯肉上皮シート等の原料として、インプラントや歯周外科に用いることができる。
【図２】
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【図４】
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【図８Ｂ】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【配列表】
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