(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＨＤ２に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、リボザイム及びそれらの発現ベクターからなる群より選ばれるＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質を有効成分として含有し、該ポリアニオン性物質とポリカチオン荷電性ポリマーとのポリイオンコンプレックスを含み、さらにグリコサミノグリカンを含んでなる医薬組成物であって、
該ポリカチオン荷電性ポリマーは、下記の一般式（ＩＩＩ）で表される荷電性ポリマー、下記の一般式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）で表されるブロック共重合体、又はそれらの塩である、医薬組成物。
【化１】
0005463531.tif 000009
（上記各式中、
Ｒ１０は、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−Ｒ１１基を表し、ここでＲ１１は置換されていてもよい直鎖又は分岐のＣ１−２０アルキル基を表し、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐のＣ１−１２アルキル基を表し、
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄは、それぞれ独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基、又は重合性基を表し、
Ｒ４は、水酸基、保護基、又は−Ｏ−Ｘ３、−Ｓ−Ｘ３、−ＮＨ−Ｘ３で表される基、又はポリペプチドの重合開始剤残基を表し、ここでＸ３は一級、二級、若しくは三級アミン化合物、若しくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ、及びＲ５ｄは、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して、一級、二級、若しくは三級アミン化合物、若しくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１〜５の整数である）であるものが少なくとも二つ以上存在し、
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基であり、ここで保護基はＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
Ｌ１及びＬ２は、連結基を表し、
ｍは５〜２０，０００の整数であり、
ｎは２〜５，０００の整数であり、
ｙは０〜５，０００の整数であり、
ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、
また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
【請求項２】
ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡ又はその発現ベクターである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ｘが、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び下記の式で表される基からなる群から選ばれるいずれかの基である、請求項１に記載の医薬組成物。
【化２】
0005463531.tif 000010
（上記各式中、
Ｘ２は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はアミノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、及びＲ７ｃは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、
ｄ１、ｄ２、及びｄ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し、
ｅ１、ｅ２、及びｅ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し、
ｆは０〜１５の整数を表し、
Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基を表し、ここで、保護基は、Ｚ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｇは０〜１５の整数を表す。）
【請求項４】
Ｌ１又はＬ２が、ジスルフィド結合を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸又はその塩である、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
虚血性疾患又は動脈疾患の治療又は予防用である、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
虚血性疾患又は動脈疾患が、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全、閉塞性動脈硬化症、Ｂｕｅｒｇｅｒ病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞、動脈瘤、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、及び腎梗塞からなる群より選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＨＤ２発現抑制物質搭載ポリイオンコンプレックスに関し、詳しくは、ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質とポリカチオン荷電性ポリマーを用いた、虚血性疾患等の治療分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性疾患の血管新生治療は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）や線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）のような血管新生因子、又はこれらのタンパク質をコードするＤＮＡベクターを虚血組織に送達させることによって、新血管形成を増進させることを目的とする（非特許文献１〜３）。ＶＥＧＦは、血管形成カスケードの初期段階で産生され、内皮細胞の初期の活性化に関与しており、このことから血管発達の重要な因子と言われている。ＶＥＧＦのトランスジェニックマウスの皮膚では、過剰な透過性を示す血管が非常に多く形成されることが報告されている（非特許文献４）。ＦＧＦ２は、内皮細胞及び壁細胞の両方に対する分裂促進因子として作用することが報告されており、その血管形成における役割も同定されている（非特許文献３，５）。このように、ＶＥＧＦ又はＦＧＦ２を単独で用いた血管新生治療に関しては、非常に多くの研究が行われている。
【０００３】
しかしながら、臨床試験においては、フェーズＩの段階ではＶＥＧＦやＦＧＦ２のデリバリーについての安全性は示されるものの、フェーズＩＩにおいては期待されるような有効性が示されていない（非特許文献６〜８）。その結果、機能的な血管を誘導させるためには、単一の血管新生因子を投与するだけでは不十分であることが示唆されている。
【０００４】
その後、血管新生治療の研究では血管新生因子を組み合わせて投与することに焦点が当てられるようになった。具体的には、ＶＥＧＦとＦＧＦ２との組み合わせ、又はＶＥＧＦ若しくはＦＧＦ２とアンジオポイエチン１（Ａｎｇ−１）若しくは血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）のような他の血管新生因子との組み合わせが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの実験において、新血管形成に有力な共働作用を有することが報告されている（非特許文献９〜１３）。これらの結果は、多数の血管新生因子の時間的および空間的に統合された発現を含む血管新生のメカニズムの複雑性を示している。機能的な血管の構築には、脈間形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、及び動脈形成（ａｒｔｅｒｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の３つの複雑な過程が必要であるが、これら全ての過程に一律に作用する血管新生因子は現状では存在しないために単一の血管新生因子では効果が不十分であり、数種の血管新生因子を組み合わせたとしても十分な効果が得られにくいと考えられる。さらに、血管新生因子遺伝子等を用いた現在の臨床試験では、筋肉内注射による投与方法が採用されているが、筋肉内注射は組織に対する侵襲性が大きく、遺伝子導入効果も限局的で導入効率が必ずしも十分とは言えないため、血管新生因子の投与方法の改善も必要であると考えられる。
【０００５】
全ての血管形成過程に作用する根本的な因子の発見並びにその対処が求められるが、この鍵となり得るものに低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＩＦ）がある。ＨＩＦファミリーには、ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２およびＨＩＦ−３等が知られている。ＨＩＦ−１は、αサブユニット及びβサブユニットからなるヘテロ二量体であり、酸素恒常性の中心的な調節因子として機能する。ＨＩＦ−１のαサブユニット（ＨＩＦ−１α）により直接的又は間接的にＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、及びＡｎｇ−１等の血管新生因子の産生が誘導されることが知られている。しかしながら、酸素の存在下では、ＨＩＦ−１αはプロリルヒドロキシラーゼドメイン−２（ＰＨＤ２）によってヒドロキシル化され、ヒドロキシル化されたＨＩＦ−１αは、その後、Ｅ３ユビキチンリガーゼ複合体によって分解される。ＰＨＤ２ヘテロ欠損マウスを用いた研究において、血管内皮の正常化を介して腫瘍の転移が抑制されることが示され、ＰＨＤ２を阻害することが癌の治療につながることが示唆されている（非特許文献１４）。
【０００６】
本発明者らは、ＰＨＤ２−ｓｉＲＮＡ発現プラスミドをマウス線維芽細胞に導入してＰＨＤ２遺伝子のサイレンシングを試みたところ、有意にＶＥＧＦやＦＧＦ２の発現が誘導されること、並びに導入した細胞をマウスの皮下に移植して血管新生が誘導されることを報告した（非特許文献１５）。
【０００７】
一方、本発明者らは、ＤＮＡ等の核酸のデリバリーシステムとして、核酸とブロック共重合体とのポリイオンコンプレックスが有用であることを報告している（特許文献１〜５）。しかし、虚血性疾患の治療に有効な核酸のデリバリーシステムは、知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平８−１８８５４１号公報
【特許文献２】特開２００４−３５２９７２号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／０７８０８４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００６／０８５６６４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００７／０９９６６０号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｏｌｓｓｏｎ  ＡＫ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：３５９−３７１，２００６
【非特許文献２】Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１２：５４９−５６０，２００６
【非特許文献３】Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１７：１５１３−１５２３，２００４
【非特許文献４】Ｄｅｔｍｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １１１：１−６，１９９８
【非特許文献５】Ｌｅｅ  ＳＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：３３６７９−３３６８７，２０００
【非特許文献６】Ｓｉｍｏｎｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：７８８−７９３，２００２
【非特許文献７】Ｈｅｎｒｙ  ＴＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：１３５９−１３６５，２００３
【非特許文献８】Ｌｅｄｅｒｍａｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：２０５３−２０５８，２００２
【非特許文献９】Ｐｅｐｐｅｒ  ＭＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １８９：８２４−８３１，１９９２
【非特許文献１０】Ａｓａｈａｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９２：１１３６５−１１３７１，１９９５
【非特許文献１１】Ｋａｎｏ  ＭＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１８：３７５９−３７６８，２００５
【非特許文献１２】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ＴＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１０２９−１０３４，２００１
【非特許文献１３】Ｃａｏ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：６０４−６１３，２００３
【非特許文献１４】Ｍａｚｚｏｎｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３６：８３９−８５１，２００９
【非特許文献１５】Ｗｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １６：１２２７−１２３４，２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、虚血性疾患等の治療に有効で、安全性及び持続性のより高い遺伝子のデリバリーシステム等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸を成分とするＰＨＤ２の発現抑制物質がポリアニオン性であることに着目し、該発現抑制物質と特定の構造を有するポリカチオン荷電性ポリマーとのポリイオンコンプレックス又は該ポリイオンコンプレックスとグリコサミノグリカンとの三元系コンプレックスを用いることにより、該発現抑制物質を安定した状態で標的組織に輸送できることを見出した。さらに、本発明者らは、前記ポリイオンコンプレックス又は三元系コンプレックスを用いることにより生体内で血管新生効果を投与組織の広範囲に及ばせ、且つ長時間にわたってその効果を持続させることに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質を有効成分として含有し、該ポリアニオン性物質とポリカチオン荷電性ポリマーとのポリイオンコンプレックスを含んでなる医薬組成物。
（２）ポリアニオン性物質が、ＰＨＤ２に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターである、（１）の医薬組成物。
（３）ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡ又はその発現ベクターである、（２）の医薬組成物。
（４）ポリカチオン荷電性ポリマーが、ポリペプチド、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン、又はビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、且つ側鎖として、該主鎖に直接又は連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して、１〜５の整数である）を含む荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマーである、（１）〜（３）のいずれかの医薬組成物。
（５）ポリカチオン荷電性ポリマーが、前記荷電性ポリマー由来のセグメント鎖と、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖とを有するブロック共重合体である、（４）の医薬組成物。
（６）非イオン性親水性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、及びポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）からなる群より選ばれる、（５）の医薬組成物。
（７）ポリカチオン荷電性ポリマーが、下記の一般式（ＩＩＩ）で表される荷電性ポリマー、下記の一般式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）で表されるブロック共重合体、又はそれらの塩である、（１）〜（６）のいずれかの医薬組成物。
【００１３】
【化１】
0005463531.tif 000002
【００１４】
（上記各式中、
Ｒ１０は、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−Ｒ１１基を表し、ここでＲ１１は置換されていてもよい直鎖又は分岐のＣ１−２０アルキル基を表し、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐のＣ１−１２アルキル基を表し、
Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄは、それぞれ独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ３は水素原子、保護基、疎水性基、又は重合性基を表し、
Ｒ４は、水酸基、保護基、又は−Ｏ−Ｘ３、−Ｓ−Ｘ３、−ＮＨ−Ｘ３で表される基、又はポリペプチドの重合開始剤残基を表し、ここでＸ３は一級、二級、若しくは三級アミン化合物、若しくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ、及びＲ５ｄは、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表し、ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して、一級、二級、若しくは三級アミン化合物、若しくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表し、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１〜５の整数である）であるものが少なくとも二つ以上存在し、
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基であり、ここで保護基はＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
Ｌ１及びＬ２は、連結基を表し、
ｍは５〜２０，０００の整数であり、
ｎは２〜５，０００の整数であり、
ｙは０〜５，０００の整数であり、
ｚは０〜５，０００の整数であるが、ｙ＋ｚはｎより大きくないものとし、
また、上記の一般式における各繰り返し単位は記載の便宜上特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。）
（８）Ｘが、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び下記の式で表される基からなる群から選ばれるいずれかの基である、（７）の医薬組成物。
【００１５】
【化２】
0005463531.tif 000003
【００１６】
（上記各式中、
Ｘ２は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はアミノＣ１−６アルキル基を表し、
Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、及びＲ７ｃは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、
ｄ１、ｄ２、及びｄ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し、
ｅ１、ｅ２、及びｅ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し、
ｆは０〜１５の整数を表し、
Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基を表し、ここで、保護基は、Ｚ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、
ｇは０〜１５の整数を表す。）
（９）Ｌ１又はＬ２が、ジスルフィド結合を有する、（７）又は（８）の医薬組成物。
（１０）さらにグリコサミノグリカンを含む、（１）〜（９）のいずれかの医薬組成物。
（１１）グリコサミノグリカンがコンドロイチン硫酸又はその塩である、（１０）の医薬組成物。
（１２）虚血性疾患又は動脈疾患の治療又は予防用である、（１）〜（１１）のいずれかの医薬組成物。
（１３）虚血性疾患又は動脈疾患が、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全、閉塞性動脈硬化症、Ｂｕｅｒｇｅｒ病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞、動脈瘤、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、及び腎梗塞からなる群より選択される、（１２）の医薬組成物。
（１４）（１）〜（１３）のいずれかの医薬組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、虚血性疾患又は動脈疾患の治療又は予防方法。
（１５）虚血性疾患又は動脈疾患が、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全、閉塞性動脈硬化症、Ｂｕｅｒｇｅｒ病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞、動脈瘤、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、及び腎梗塞からなる群より選択される、（１４）の治療又は予防方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の医薬組成物によれば、デリバリーされる組織又は細胞において、通常の酸素状態でＨＩＦ（ＨＩＦ−１又はＨＩＦ−２）のプロテアソーム分解を担うＰＨＤ２の発現を抑制することができ、これにより、ＨＩＦの安定化を介して、直接的又は間接的に種々のＨＩＦ誘発性血管新生因子（ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ２、Ａｎｇ−１等）の発現が上昇し、血管新生が促進される。このようにして形成された血管は、種々の血管新生因子の相互作用及び相乗作用により、優れた機能を有し、虚血に伴う組織の壊死を有意に抑制することができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質を安定な状態で組織内にデリバリーすることができ、これにより、血管新生効果を組織の広範囲にわたって及ぼすことが可能となる。さらに、本発明の医薬組成物は、一回の投与で長時間にわたってその血管新生効果を持続させることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１に基づいて虚血処置を行った後の２１日目におけるマウス下肢の状態を示す図である。（Ａ）は、ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））を用いて、コントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｂ）は、ポリカチオン荷電性ポリマーを用いずにＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｃ）は、ポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＬ）を用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｄ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態を示す図である。
【図２】虚血処置を行った後、各種被検試料を投与したマウス下肢の血流状態を示す図である。（Ａ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、コントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｂ）は、ポリカチオン荷電性ポリマーを用いずにＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｃ）は、ＰＥＧ−ＰＬＬを用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｄ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態を示す図である。
【図３ａ】虚血処置を行う前とその後の時間におけるマウス下肢の血流定量値を示す図である。血流定量値は、未処置下肢の血流測定値に対する処置下肢の血流測定値の比を示したもので、その平均値及び標準偏差を示す図である。被検試料として、菱形印は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にコントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用い、丸印は、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドのみを用い、三角印は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用いたことを示す図である。
【図３ｂ】図３ａと同様に、マウス下肢の血流定量値を示す図である。被検試料として、菱形印は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にコントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用い、四角印は、ＰＥＧ−ＰＬＬにＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用い、三角印は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）にＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを含有したポリイオンコンプレックスを用いたことを示す図である。
【図４】虚血処置を行った後の２１日目におけるマウス下肢の血管の状態を示す図である。（Ａ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、コントロールのｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｂ）は、ポリカチオン荷電性ポリマーを用いずにＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態であり、（Ｃ）は、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて、ＰＨＤ２のｓｈＲＮＡ発現プラスミドを投与した状態を示す図である。結紮した外腸骨動脈の位置をアステリスクで示し、新たに形成された側副血管を矢印で示す図である。
【図５】ＰＨＤ２及びＨＩＦ−１αの発現を調べた図である。（ａ）は、未処置のマウス及び虚血処置後に各種被検試料を投与したマウスにおけるＰＨＤ２のｍＲＮＡ発現量を示す図であり、（ｂ）は、これらのマウスに発現したＨＩＦ−１αに関するウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図６】ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、及びＡｎｇ−１の発現を調べた図である。（ａ）は、未処置のマウス及び虚血処置後に各種被検試料を投与したマウスにおけるＶＥＧＦのｍＲＮＡ発現量を示す図であり、（ｂ）は、これらのマウスにおけるＦＧＦ２のｍＲＮＡ発現量を示す図であり、（ｃ）は、これらのマウスにおけるＡｎｇ−１のｍＲＮＡ発現量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質を有効成分として含有し、該ポリアニオン性物質とポリカチオン荷電性ポリマーとのポリイオンコンプレックスを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００２１】
１．ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質（ＰＨＤ２発現抑制物質）
本発明において、ＰＨＤ２（プロリルヒドロキシラーゼドメイン−２）とは、プロリルヒドロキシラーゼファミリーに属するタンパク質である。ＰＨＤ２は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）プロリルヒドロキシラーゼ活性を有する酵素であり、特に、通常の酸素状態においてＨＩＦ−１α分子の特定のプロリン残基をヒドロキシル化する作用を有する。
【００２２】
本発明において、ＰＨＤ２は、任意の哺乳動物由来のタンパク質である。哺乳動物としては、ヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられ、ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類が挙げられる。ヒトの虚血性疾患又は動脈疾患等の治療に用いるためには、ヒト由来のＰＨＤ２であることが好ましい。ヒトＰＨＤ２の塩基配列及びアミノ酸配列は公知であり、例えば、ＰＨＤ２の塩基配列（配列番号１）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２２０５１）及びアミノ酸配列等がＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。また、マウスＰＨＤ２の塩基配列及びアミノ酸配列も公知であり、例えば、マウスＰＨＤ２の塩基配列（配列番号２）（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０５３２０７）及びアミノ酸配列等がＧｅｎＢａｎｋに登録され、公表されている。
【００２３】
本発明の医薬組成物に有効成分として含まれるＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質は、ＰＨＤ２の転写過程に作用してその発現を抑制する物質であれば特に限定されるものではない。かかる抑制物質としては、ＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターが挙げられる。
【００２４】
前記ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡとのキメラ分子である。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡと同一の塩基配列（又はその部分配列）を含む一本鎖又は二本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。このＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも１０の連続する標的ｍＲＮＡと同一の塩基配列（又はその部分配列）を有する二本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。ただし、ＰＨＤ２の発現抑制作用を有していれば数個の塩基が置換されているものであってもよく、１０塩基長よりも短いＲＮＡであってもよい。二本鎖構造は、センス鎖とアンチセンス鎖との異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのヘアピンループ（ステムループ）構造によって与えられる二本鎖（ｓｈＲＮＡ）であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡを含む）、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。
【００２５】
ＲＮＡｉ誘導性核酸は、転写抑制活性が強いという観点から、ｓｉＲＮＡが好ましい。ＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡは、ＰＨＤ２のｍＲＮＡの任意の部分を標的とすることができる。ＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉の効果を誘導できる限り特に制限されないが、例えば１０〜５０塩基長、好ましくは１５〜３０塩基長、より好ましくは２０〜２７塩基長である。ＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖である。具体的には、ＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡは、配列番号１又は２の塩基配列に対応するｍＲＮＡにおける１０〜５０個の連続する塩基配列を含むセンス鎖と、その相補配列を含むアンチセンス鎖からなるものである。ＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡは、センス鎖若しくはアンチセンス鎖の一方、又は双方の５’末端または３’末端においてオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の末端における１〜数個（例えば、１、２又は３個）の塩基の付加により形成されるものである。ｓｉＲＮＡの設計方法は、当業者に公知であり、ｓｉＲＮＡの様々な設計ソフトウエア又はアルゴリズムを用いて、上記塩基配列から適切なｓｉＲＮＡの塩基配列を選択することができる。
【００２６】
ＰＨＤ２に対するアンチセンス核酸とは、ＰＨＤ２の転写産物（ｍＲＮＡ又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該転写産物とハイブリダイズし得る塩基配列からなり、且つハイブリダイズした状態で該転写産物にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドをいう。アンチセンス核酸の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の長さは、ＰＨＤ２の転写産物（例えば、配列番号１又は２の塩基配列に対応するｍＲＮＡ）と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１５〜約３０塩基、より好ましくは約１８塩基〜約３０塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、ＰＨＤ２の転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。
【００２７】
本明細書において、「相補的である」とは、塩基配列間で約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは１００％の相補性を有することをいう。本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。
【００２８】
前記「リボザイム」とは核酸を切断する酵素活性を有するＲＮＡをいうが、最近では当該酵素活性部位の塩基配列を有するオリゴＤＮＡも同様に核酸切断活性を有することが明らかになっているので、本明細書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りＤＮＡをも包含する概念として用いる。具体的には、リボザイムは、ＰＨＤ２をコードするｍＲＮＡ又は初期転写産物を、コード領域の内部（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）で特異的に切断し得る。リボザイムとして最も汎用性の高いものとしては、ウイロイドやウイルソイド等の感染性ＲＮＡに見られるセルフスプライシングＲＮＡがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約４０塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約１０塩基程度）をｍＲＮＡの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的ｍＲＮＡのみを特異的に切断することが可能である。さらに、リボザイムを、それをコードするＤＮＡを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、ｔＲＮＡを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（１３）：２７８０−２７８８（２００１））。
【００２９】
本発明におけるＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質は、発現ベクターとしても提供され得る。かかる発現ベクターは、ＰＨＤ２の発現抑制物質をコードするポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含む。
【００３０】
前記プロモーターは、その制御下にある発現対象の核酸の種類により適宜選択され得るが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例えば、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。
【００３１】
本発明における発現ベクターはさらに、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでいてもよい。
【００３２】
本発明における発現ベクターのバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）としては、ヒト等の哺乳動物細胞中でＰＨＤ２の発現抑制物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。当該ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のベクターが挙げられる。これらのうち、哺乳動物への投与に際しては、安全性の観点からプラスミドベクターを用いることが好ましい。ｓｉＲＮＡを発現させるベクターは、市販されており、市販品を好適に利用することもできる。 
【００３３】
２．ポリカチオン荷電性ポリマー
本発明に用いられるポリカチオン荷電性ポリマーは、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマー又はその塩である。またポリカチオン荷電性ポリマーは、荷電性のホモポリマーであってもよい。
【００３４】
また、本発明に用いられるポリカチオン荷電性ポリマーは、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖及び非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖を有するブロック共重合体、又はその塩であってもよい。
【００３５】
本発明におけるポリカチオン荷電性ポリマーは、ポリペプチド、多糖、ポリエステル、ポリエーテル、ポリウレタン、又はビニルポリマーをベースとする主鎖を有し、且つ側鎖として、当該主鎖に直接又は連結基を介して結合した式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して、１〜５の整数である）を含む荷電性ポリマー由来のセグメント鎖を有するポリマーとすることができる。
【００３６】
ここで、「ポリペプチドをベースとする主鎖を有し」とは、好ましくは、天然又は合成アミノ酸間のペプチド結合を介して形成されるポリペプチドをポリマーの主鎖として含むことを意味する。当該天然又は合成アミノ酸は、荷電性ポリマーをカチオン性とするために、カチオン性基を側鎖に有するアミノ酸であることが好ましい。なお、当該カチオン性基は、水素イオンが配位して既にカチオンとなっている基に限らず、水素イオンが配位すればカチオンとなる基も含まれる。カチオン性基を側鎖に有するポリペプチドは、塩基性側鎖を有する公知のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、及びアスパラギン酸等）がペプチド結合してなるもののほか、各種アミノ酸がペプチド結合し、その側鎖がカチオン性基を有するように置換されたものも含まれる。
【００３７】
また、「多糖をベースとする主鎖を有し」とは、例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン、キトサン、又はポリガラクトサミン等の糖連鎖をポリマーの主鎖として含むことを意味する。「ビニルポリマーをベースとする主鎖を有し」とは、不飽和エチレン性重合性モノマーの重合により形成される重合鎖をポリマーの主鎖として含むことを意味する。
【００３８】
ポリカチオン荷電性ポリマーに含まれる側鎖は、式−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２で表される基（ここで、ａ及びｅはそれぞれ独立して、１〜５の整数である）を含み、前記主鎖に直接又は連結基を介して結合することができる。
【００３９】
このような側鎖は、主鎖がポリペプチドをベースとする場合には、例えば、アミノ酸のβ若しくはγ位に存在するカルボキシル基やε位のアミノ基等を介して主鎖に結合することができる。主鎖が多糖をベースとする場合には、例えば、糖部分のヒドロキシ基、アミノ基、又はカルボキシル基を介して主鎖に結合し、主鎖がビニルポリマーをベースとする場合には、例えば、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、又はポリ（メタクリル酸）等のヒドロキシ基、又はアミド基若しくはカルボキシル基を介して主鎖に結合することができる。
【００４０】
主鎖と側鎖との結合反応としては、ハロゲンに対する置換反応、カルボキシル基若しくはアミノ基を利用した縮合反応、エステルに対するエステル交換反応、又はアミノリシス等を用いることができる。また、側鎖と主鎖との結合は、例えば、Ｃ１−２２アルキレン鎖を含む連結基を介してもよい。なお、本明細書において「Ｃ１−２２アルキレン鎖」とは、炭素数が１〜２２の直鎖又は分岐のアルキレン基であることを意味する。また、当該連結基は、例えば、１〜１０個の酸素又は硫黄原子で中断されていてもよい。当該連結基を介して側鎖と主鎖とが結合する場合、側鎖は、通常、高分子反応によりポリマーに導入されるが、それに特に限定されるものではない。
【００４１】
このようにして製造されるポリカチオン荷電性ポリマーの分子量は、本発明の目的を達成できるものであれは特に限定されないが、その下限は、通常１，０００以上、好ましくは１５，０００以上、より好ましくは１８，０００以上であり、例えば２３，０００以上、又は２８，０００以上とすることができる。
【００４２】
本発明のより具体的な態様において、ポリカチオン荷電性ポリマーは、下記の一般式（ＩＩＩ）で表されるポリマー又はその塩である。
【００４３】
【化３】
0005463531.tif 000004
【００４４】
上記式について、Ｒ１０は、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−Ｒ１１基を表し、Ｒ１１は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル基を表す。本発明において、Ｒ１１は置換されていない直鎖若しくは分岐のＣ１−２０アルキル基が好ましい。また、本発明において、Ｒ１１のＣ１−２０アルキル基は一つ以上の置換基で置換されていてもよい。例えば、Ｃ１−２０アルキル基は、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基（各アルキル基はそれぞれ同一又は異なっていてもよい）からなる群より選ばれる置換基で置換されていてもよい。
【００４５】
本明細書において、「Ｃ１−２０アルキル基」とは、炭素数が１〜２０の直鎖又は分岐のアルキル基を意味する。Ｃ１−２０アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル、ドデシル、オクタデシル、及びイコシル等が挙げられる。
【００４６】
本明細書において、「Ｃ１−６アルコキシ基」とは、直鎖又は分岐のＣ１−６アルキル基の末端に酸素原子が結合した基を意味し、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、及びｎ−ヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００４７】
本明細書において、「Ｃ１−６アルコキシカルボニル基」とは、上記の「Ｃ１−６アルコキシ基」が結合したカルボニル基を意味し、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、１−プロポキシカルボニル基、２−プロポキシカルボニル基、２−メチル−２−プロポキシカルボニル基等が挙げられる。
【００４８】
本明細書において、「Ｃ２−７アシル基」とは、直鎖又は分岐のＣ１−６アルキル基が結合したカルボニル基を意味し、例えば、アセチル基、プロピオニル基、イソプロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基等が挙げられる。
【００４９】
本明細書において、「Ｃ２−７アシルアミド基」とは、上記の「Ｃ２−７アシル基」が結合したアミノ基を意味する。なお、上記式（ＩＩＩ）に含まれるＲ１０以外の基については後述する。
【００５０】
上記式（ＩＩＩ）における各繰り返し単位は、記載の便宜上特定した順で示すが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。例えば、荷電性ポリマーは、上記式（ＩＩＩ）における各繰り返し単位がＮ末端から始まるポリペプチドをベースとする主鎖であってもよい。
【００５１】
また、上記式（ＩＩＩ）で表されるポリマーは、本発明の一態様として、上記式（ＩＩＩ）で表されるポリマーの塩であってもよい。当該塩は、特に限定されるものではないが、対イオンとして、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３−、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３−、又はＣＦ３ＳＯ３−等との塩が挙げられる。
【００５２】
本発明における非イオン性親水性ポリマーは、非イオン性であり、且つ親水性のポリマーであれば特に限定されない。当該非イオン性親水性ポリマーとしては、例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）、およびポリ（ヒドロキシエチルアクリレート）が挙げられる。これらのうち好ましい非イオン性親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。
【００５３】
非イオン性親水性ポリマーは、例えば、国際公開第ＷＯ９６／３２４３４号パンフレット、国際公開第ＷＯ９６／３３２３３号パンフレット、又は国際公開第ＷＯ９７／０６２０２号パンフレットに記載の方法を用いて調製することができる。
【００５４】
本発明の別の態様において、本発明で用いられるポリカチオン荷電性ポリマーは、上記荷電性ポリマー由来のセグメント鎖と、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖とを有するブロック共重合体、又はその塩とすることができる。また、このようなブロック共重合体の具体例として、一般式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）で表されるブロック共重合体、又はそれらの塩を挙げることができる。
【００５５】
【化４】
0005463531.tif 000005
【００５６】
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ１ａ及びＲ１ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は置換されていてもよい直鎖若しくは分岐のＣ１−１２アルキル基を表す。本明細書において、「Ｃ１−１２アルキル基」とは、炭素数が１〜１２の直鎖又は分岐のアルキル基を意味する。Ｃ１−１２アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、デシル、ウンデシル、及びドデシル等が挙げられる。
【００５７】
また、本発明におけるアルキル基は一つ以上の置換基で置換されていてもよい。置換された場合の置換基としては、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルキルシロキシ基、Ｃ２−７アシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基（各アルキル基はそれぞれ同一又は異なっていてもよい）等が挙げられる。なお、アセタール化は、ホルミル基のカルボニルの保護方法の一つであり、ホルミル基のカルボニルと、例えば、炭素数１〜６のアルカノール２分子又は炭素数２〜６の分岐していてもよいアルキレンジオールとの反応によりアセタール部が形成されることを意味する。また、置換基は、適切な条件下で別の基に転化することができる。例えば、置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基（アルデヒド基等）に転化することができる。また、置換基がホルミル基、又はカルボキシル基若しくはアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体若しくはその特異結合性を有する断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）等）等と結合することにより、機能性若しくは標的指向性をキャリアに付与するのに利用することができる。なお、本発明において、好ましいＲ１ａ及びＲ１ｂは、メチル基である。
【００５８】
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）において、Ｒ２ａ、Ｒ２ｂ、Ｒ２ｃ、及びＲ２ｄは、それぞれ独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、好ましくはメチレン基である。Ｒ２ａ及びＲ２ｂのいずれもがメチレン基の場合は、反復単位の主鎖は、ポリ（アスパラギン酸誘導体）に相当し、エチレン基の場合はポリ（グルタミン酸誘導体）に相当する。これらの一般式において、Ｒ２ａ及びＲ２ｂ、又はＲ２ｂ及びＲ２ａがそれぞれメチレン基及びエチレン基を表す場合、及びＲ２ｃ及びＲ２ｄ、又はＲ２ｄ及びＲ２ｃがそれぞれメチレン基及びエチレン基を表す場合、アスパラギン酸誘導体及びグルタミン酸誘導体の反復単位は、それぞれブロックを形成して存在するか、或いはランダムに存在できる。
【００５９】
上記式（Ｉ）におけるＲ３は、水素原子、保護基、疎水性基、又は重合性基を表す。ここで、「保護基」は、通常アミノ基の保護基として用いられている基であれば特に限定されない。例えば保護基としては、Ｚ基（ベンジルオキシカルボニル基）、Ｂｏｃ基（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基等が挙げられる。また、疎水性基としては、特に限定されないが、例えば、アルキル基、シクロアルキル基、又はアリール基を挙げることができる。また、重合性基は、重合反応を起こす官能基であればよく、例えば、不飽和炭化水素基が挙げられるがこれに限定されない。より具体的には、重合性基は、ビニル基、アリル基、アクリル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、プロペニル基、ビニリデン基、ビニレン基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、アミノ基、アルコキシ基等である。これらの中でも、Ｒ３は、アセチル基、アクリロイル基、又はメタクリロイル基であることが好ましい。また、本発明の別の態様においては、Ｒ３は、水素原子であることが好ましい。
【００６０】
上記式（ＩＩ）におけるＲ４は、水酸基、保護基、又は−Ｏ−Ｘ３、−Ｓ−Ｘ３、若しくは−ＮＨ−Ｘ３で表される基、又はポリペプチドの重合開始剤残基を表す。ここで、当該保護基は、末端カルボキシル基の保護基として用いられる基であればよく、例えばカルボキシル基と共にアルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、ｔｅｒｔ−ブチルエステル等）又はベンジルエステルを形成する基が挙げられるが、特にこれに限定されるものではない。また、Ｘ３は、特に限定されるものではないが、好ましくは目的のポリマー合成の一連の反応を妨害しない化合物残基である。例えば、Ｘ３は、一級、二級、若しくは三級アミン化合物、若しくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を挙げることができる。また、「開始剤」とは、ポリペプチドの重合反応を開始させる際に使用する物質を意味し、例えば、ブチルアミンを挙げることができる。また、「開始剤残基」は、重合反応の結果としてポリマーに含まれる開始剤由来の残基を意味する。本発明において、好ましいＲ４は、−ＮＨ−Ｒ９であり、Ｒ９は、置換されていてもよい直鎖又は分岐のＣ１−２０アルキル基である。
【００６１】
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＲ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ、及びＲ５ｄは、それぞれ独立して、水酸基、オキシベンジル基、又はＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基を表す。ここでａは１〜５の整数であり、Ｘはそれぞれ独立して、一級、二級、若しくは三級アミン化合物、若しくは四級アンモニウム塩由来の基を一つ以上含むアミン化合物残基、又は非アミン化合物残基を表す。さらに、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち少なくとも二つ以上は、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１〜５の整数である）である。当該総数とは、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるブロック共重合体、又は上記式（ＩＩＩ）で表されるポリカチオン荷電性ポリマーに含まれる全ての「Ｒ５ａとＲ５ｂ」の数又は「Ｒ５ｃとＲ５ｄ」の数を意味する。
【００６２】
本発明の別の態様においては、Ｒ５ａとＲ５ｂの総数又はＲ５ｃとＲ５ｄの総数のうち、これらの基が−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ｅは１〜５の整数である）であるものが５０％以上、さらには８５％以上存在するブロック共重合体を使用するのが好ましい。
【００６３】
また、本発明の別の態様においては、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表されるポリカチオン荷電性ポリマーに含まれるＲ５ａとＲ５ｂの全て、又はＲ５ｃとＲ５ｄの全てが、−ＮＨ−（ＣＨ２）ａ−Ｘ基（ここで、Ｘは（ＮＨ（ＣＨ２）２）ｅ−ＮＨ２であり、ａが２又は３であり、ｅは１〜３の整数、特に好ましくはｅが１である）であることが好ましい。
【００６４】
また、本発明においては、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ５ｃ、及びＲ５ｄは、−ＮＨ−ＮＨ２又は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２が特に好ましく、中でも、ジエチレントリアミンユニットを含む−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２が最も好ましい。
【００６５】
また、本発明において、Ｘは、−ＮＨ２、−ＮＨ−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、及び下記の式で表される基からなる群から選ばれるいずれかの基とすることができる。
【００６６】
【化５】
0005463531.tif 000006
【００６７】
上記各式中、Ｘ２は水素原子、Ｃ１−６アルキル基、又はアミノＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、及びＲ７ｃは、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を表し、ｄ１、ｄ２、及びｄ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し、ｅ１、ｅ２、及びｅ３は、それぞれ独立して、１〜５の整数を表し、ｆは０〜１５の整数を表し、Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基を表し、ここで、保護基は、Ｚ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれ、ｇは０〜１５の整数を表す。
【００６８】
上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）におけるＲ６ａ及びＲ６ｂは、それぞれ独立して、水素原子又は保護基である。ここで、保護基は、通常アミノ基の保護基として用いられているＺ基、Ｂｏｃ基、アセチル基、及びトリフルオロアセチル基からなる群より選ばれる。
【００６９】
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）におけるＬ１及びＬ２は、連結基を表す。
【００７０】
上記式（Ｉ）におけるリンカー部分となるＬ１は、−Ｓ−Ｓ−、−ＮＨ−、又は式：−（ＣＨ２）ｂ−ＮＨ−（ここでｂは１〜５の整数である）で表される基が好ましく、上記式（ＩＩ）におけるリンカー部分となるＬ２は、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−、又は式：−（ＣＨ２）ｃ−ＣＯ−（ここでｃは１〜５の整数である）で表される基が好ましい。また、Ｌ１及びＬ２は、ＯＣＯ、ＯＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ＮＨＣＯＯ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ、又はＣＯＯ等をさらに有していてもよい。
【００７１】
上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）におけるｍ、ｎ、ｙ、及びｚは、各ブロック部分の繰り返し単位の数（重合度）を表す。具体的には、ｍは、５〜２０，０００の整数であり、ｎは、２〜５，０００の整数であり、ｙは、０〜５，０００の整数であり、ｚは、０〜５，０００の整数である。なお、ｎは、ｙ＋ｚより大きくないものとする。好ましくは、ｚは０である。本発明において、例えば、ｚが０（ゼロ）である場合、Ｒ３がアセチル基、アクリロイル基、又はメタクリロイル基であるポリカチオン荷電性ポリマーを例示することができる。なお、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において、各繰り返し単位は記載の便宜上、特定した順で示しているが、各繰り返し単位はランダムに存在することができる。
【００７２】
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるポリマーは、上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるポリマーの塩であってもよい。当該塩は、特に限定されるものではないが、対イオンとして、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、（１／２ＳＯ４）−、ＮＯ３−、（１／２ＣＯ３）−、（１／３ＰＯ４）−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯＯ−、ＣＨ３ＳＯ３−、又はＣＦ３ＳＯ３−等との塩が挙げられる。
【００７３】
本発明におけるブロック共重合体の製造方法は限定されないが、例えば、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖を予め合成しておき、この非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖の片末端（Ｒ１ａ又はＲ１ｂと反対の末端）に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖がカチオン性基を含むように側鎖を置換又は変換する方法、或いは、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖と、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法等が挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し、適宜選択又は設定することができる。例えば、特開２００４−３５２９７２号公報に製造方法の一例が記載されており、記載された方法又はそれらの改変方法に従って製造することができる。
【００７４】
このように製造されるブロック共重合体の平均分子量（Ｍｗ）は、特に限定されないが、２３，０００〜４５，０００であることが好ましく、より好ましくは２８，０００〜３４，０００である。また、個々のブロック部分については、非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖の平均分子量（Ｍｗ）は、８，０００〜１５，０００であることが好ましく、より好ましくは１０，０００〜１２，０００であり、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖の平均分子量（Ｍｗ）は、１５，０００〜３０，０００であることが好ましく、より好ましくは１８，０００〜２２，０００である。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、さらにグリコサミノグリカンを含有していてもよい。グリコサミノグリカンは、別名としてムコ多糖ともいい、アミノ糖を含む一群の酸性多糖であって、生体内に普遍的に存在する生体適合性高分子である。そのため、グリコサミノグリカンは生体にとってはほぼ無毒、且つ無害な生体適合性高分子である。
【００７６】
本発明において、当該グリコサミノグリカンは、動物等の天然物から抽出されたもの、微生物の培養物から抽出されたもの、又は化学的若しくは酵素的に合成されたもの等のいずれをも使用することができる。また、本発明において、グリコサミノグリカンは市販品を使用してもよい。
【００７７】
本発明において、グリコサミノグリカンをＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質及びポリカチオン荷電性ポリマーと共にポリイオンコンプレックスの形成に用いる場合、該コンプレックスはさらに安定化を増し、また、更に組織を損傷しにくくさせることができる。このように形成されるポリイオンコンプレックスを、三元系コンプレックスとも称する。本発明で用いられるグリコサミノグリカンとしては、例えば、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸、キトサン、又はこれらの塩が挙げられる。これらの中でも、細胞外マトリックスに多く存在し、生体の主要構成成分の一つであるという観点から、コンドロイチン硫酸又はその塩が好ましく、その中でもコンドロイチン硫酸Ａ又はその塩がより好ましい。
【００７８】
３．医薬組成物
本発明の医薬組成物に用いられるポリイオンコンプレックスは、ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質及びポリカチオン荷電性ポリマー、また必要に応じてグリコサミノグリカンを、任意のバッファー（例えば、水性媒体、好ましくは、脱イオン水をベースとする媒体）中で混合し、通常、４〜２５℃で０．５〜２４時間、静置又は攪拌することにより容易に調製することができる。また、必要により、透析、攪拌、希釈、濃縮、超音波処理、温度制御、ｐＨ制御、イオン強度制御、有機溶媒の添加等の操作を適宜付加することができる。
【００７９】
ＰＨＤ２の発現抑制物質、ポリカチオン荷電性ポリマー、及びグリコサミノグリカンの混合方法は特に限定されず、例えば、１種ずつ混合してもよいし、３種全てを一度に混合してもよい。混合は、少量ずつ、例えば滴下により添加して各成分を接触させてもよいし、接触量を経時的に増量させてもよいし、さらに成分全量を一度に接触させてもよい。また、各成分の混合の順番は特に限定されず、ポリカチオン荷電性ポリマーにグリコサミノグリカンを予め混合させ、得られた混合物にＰＨＤ２発現抑制物質を混合させてもよいし、ポリカチオン荷電性ポリマーにＰＨＤ２発現抑制物質を予め混合させておき、当該混合物にグリコサミノグリカンをさらに混合させてもよいし、また、グリコサミノグリカンとＰＨＤ２発現抑制物質とを混合した後に、ポリカチオン荷電性ポリマーを混合させてもよい。
【００８０】
また、本発明におけるポリイオンコンプレックスは、ＰＨＤ２の発現抑制物質がポリアニオン性であることから、これをポリカチオン荷電性ポリマーと混合させた場合には、両者により静電結合が形成された状態をいう。つまり、ＰＨＤ２発現抑制物質とポリカチオン荷電性ポリマーとを混合すると、当該抑制物質の負電荷と当該荷電性ポリマーの正電荷とによって、静電結合したポリイオンコンプレックスを形成することができる。なお、ポリカチオン荷電性ポリマーが非イオン性親水性ポリマー由来のセグメント鎖を有する場合は、当該セグメント鎖がシェル部分を形成し、荷電性ポリマー由来のセグメント鎖及びＰＨＤ２発現抑制物質がコア部分を形成する、いわゆるコア−シェル型形態の高分子ミセルを構成することができる。
【００８１】
本発明の医薬組成物がグリコサミノグリカンをさらに含む場合、ＰＨＤ２発現抑制物質が有する負電荷とポリカチオン荷電性ポリマーが有する正電荷とで静電的な相互作用を生じ、これに基づいて三元系のコンプレックスが形成される。このとき、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等のような負に荷電したグリコサミノグリカンであっても、キトサン等のような正に荷電したグリコサミノグリカンであっても、ＰＨＤ２発現抑制物質とポリカチオン荷電性ポリマーの濃度に応じて使用することができる。なお、あらかじめＰＨＤ２発現抑制物質及びポリカチオン荷電性ポリマーからなるポリイオンコンプレックスを形成しておいて、次いでグリコサミノグリカンを付与した場合は、当該ポリイオンコンプレックスの表面をグリコサミノグリカンが覆うような三元系コンプレックスを構成することができ、ＰＨＤ２発現抑制物質の更なる安定化、及びポリカチオン荷電性ポリマー由来の細胞毒性を改善することができる。
【００８２】
本発明におけるポリイオンコンプレックスは、ＰＨＤ２の発現抑制物質及びポリカチオン荷電性ポリマー、また必要に応じてグリコサミノグリカンのそれぞれの溶液を適切な混合比で混合することにより調製することができる。例えば、ＰＨＤ２発現抑制物質として核酸を用いた場合は、当該核酸とポリカチオン荷電性ポリマーとの混合比は、ポリカチオン荷電性ポリマー中のカチオンの総数（Ｎ）と核酸に含まれるリン酸エステル結合又はそれと同等の結合の総数（Ｐ）との比率（Ｎ／Ｐ比）で表すことができる。ここで、リン酸エステル結合と同等の場合とは、リン酸エステル結合よりもヌクレアーゼ耐性であること等の生体内での安定性を目的として核酸の一部のヌクレオシド間に形成される結合をいい、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、ホスホロセレネート、又はメチルホスホロエート等が挙げられる。なお、前記同等の結合がリン酸エステル結合と同等の電荷を有する場合（−１）、両者の数を足してＰを求めることができるが、電荷を有しない場合（０）、正電荷を有する場合（＋１）又は負電荷を２個有する場合（−２）、リン酸エステル結合（−１）の総数から各電荷を加減することによって、Ｐを計算することができる。ポリカチオン荷電性ポリマー中のカチオンの総数（Ｎ）は、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれかにおけるカチオン性のアミノ基の総数である。
【００８３】
本発明において、前記Ｎ／Ｐ比は、ポリイオンコンプレックスを形成できる限り限定されず、ポリカチオン荷電性ポリマーに含まれる非荷電性セグメント又は荷電性セグメントの性質によって異なる。そのため、本発明におけるＮ／Ｐ比は、当業者であれば適宜選択することができる。
【００８４】
本発明におけるＮ／Ｐ比は、特に限定されないが、例えば０．５〜１６０とすることができ、好ましくは１〜１２０、より好ましくは２〜８０、さらに好ましくは１０〜８０とすることができる。特に、ポリカチオン荷電性ポリマーが上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）のブロック共重合体である場合は、当該Ｎ／Ｐ比は、特に限定されないが、好ましくは１〜１２０、より好ましくは２〜８０、さらに好ましくは１０〜８０とすることができる。
【００８５】
本発明におけるポリイオンコンプレックスにグリコサミノグリカンが用いられる場合は、その混合後の濃度として、０．００１〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５〜５ｍｇ／ｍｌとすることができる。
【００８６】
また、前記グリコサミノグリカンは、ポリカチオン荷電性ポリマーの容量若しくはポリカチオン荷電性ポリマーとＰＨＤ２発現抑制物質とのコンプレックスの容量又はそれらを含む溶液量に対して、１／５０〜１／２容量、好ましくは１／２０〜１／５容量、より好ましくは１／１０容量を添加することができる。
【００８７】
本発明におけるポリイオンコンプレックスの平均粒径は、通常、３０〜２００ｎｍ、好ましくは３０〜１５０ｎｍ、より好ましくは５０〜１００ｎｍである。また、粒度分布指数は、通常、０．１〜０．３である。平均粒径及び粒度分布指数の測定方法としては、例えば、動的光散乱光度計（例えば、大塚電子（株）社製、ＤＬＳ−７０００ＤＨ型）を用いる方法が挙げられる。平均粒子径が約５０〜２００ｎｍであるポリイオンコンプレックスは、注射剤（皮下注射用、静脈注射用、動脈注射用、筋肉注射用、腹腔内注射用等）の調製に際して使用される０．２２μｍのフィルターを用いて除菌濾過しても、極めて高収率で回収し得、注射剤が効率よく提供できる点で優れている。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体を含んでいてもよく、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下注射剤として非経口的に投与することができる。その際、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。必要により、自体公知の方法によって、凍結乾燥物とすることも可能である。薬学的に許容され得る担体としては、製剤素材として慣用の各種有機或いは無機担体物質が用いられ、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配合される。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤等の製剤添加物を用いることもできる。溶剤の好適な例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油等が挙げられる。溶解補助剤の公的な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。懸濁化剤の好適な例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。等張化剤の好適な例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。無痛化剤の好適な例としては、ベンジルアルコール等が挙げられる。防腐剤の好適な例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。抗酸化剤の好適な例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００８９】
本発明の医薬組成物の投与形態としては注射が挙げられ、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉、関節内、皮下、皮内等に投与することができ、送達箇所に応じてあらゆる投与法を用いることができる。静脈内投与であれば、点滴投与、ボーラス投与等をすることができ、骨格筋を標的とした場合は、筋肉注射又は止血帯を用いた局所静脈内投与を利用することができる。さらに、カテーテルを用いた投与形態を採用することも可能である。この場合、通常は単位投与量アンプル又は多投与量容器の形態で提供される。例えば、心臓に投与する場合、脚の付け根にある大腿動脈又は肘の上腕動脈よりカテーテルを挿入し、心臓の冠動脈まで到達させた上で冠動脈内に注入することができる。通常のカテーテルのみならず、低侵襲性カテーテルを用いて投与することもできる。バルーンやステント等の各種材料を用いる場合は、当該材料の表面に塗布し、目的部位への徐放性を備えた医療用具等の形態とすることもできる。また、下肢に投与する場合、弾力ストッキングとの併用で下肢を圧迫しながら投与することもでき、或いは、伏在静脈高位を結紮してから深部静脈に投与することもできる。
【００９０】
本発明の医薬組成物の投与量は、治療目的、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができ、本発明の医薬組成物に含まれるＰＨＤ２発現抑制物質の量は、当業者であれば適宜設定することができ、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０，０００μｇであり、３日間から４週間間隔で投与される。
【００９１】
本発明の医薬組成物は、生体内での安定性、血中の滞留性に優れ、且つ毒性は低い。本発明の医薬組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、オランウータン、チンパンジー等）の疾患の治療又は予防剤として有用である。
【００９２】
本発明の医薬組成物が対象とする疾患は、ＰＨＤ２の発現抑制作用による治療を目的とする限り特に限定されるものではないが、本発明の医薬組成物による血管新生効果が優れていることから、虚血性疾患又は動脈疾患が好ましい。虚血性疾患又は動脈疾患としては、虚血性心疾患、心筋梗塞、心筋症、狭心症、不安定狭心症、冠動脈硬化、心不全、閉塞性動脈硬化症、Ｂｕｅｒｇｅｒ病、血管損傷、動脈塞栓症、動脈血栓症、臓器動脈閉塞、動脈瘤、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、腎梗塞等が挙げられる。
【実施例】
【００９３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９４】
１．ＲＮＡ発現プラスミドの調製
ＰＨＤ２の発現を抑制するポリアニオン性物質として、マウスＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡの発現プラスミドを構築した。下記塩基配列：
5’- GAACTCAAGCCCAATTCAG -3’（ｓｉＰＨＤ２−Ａ）（配列番号３）又は
5’- TGAGCGAGCGAGAGCTAAA -3’（ｓｉＰＨＤ２−Ｂ）（配列番号４）
からなるオリゴヌクレオチドを、マウスＰＨＤ２用ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖とした。また、マウス遺伝子とは相同性を持たない２１塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを、コントロール用ｓｉＲＮＡに対応するＤＮＡのセンス鎖とした。これらのオリゴヌクレオチドは、いずれも北海道システム社より購入した。そして、添付のプロトコールに従って、ヒトＵ６プロモーターが組み込まれた発現ベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２．１−Ｕ６（Ｎｏ．５７６２、Ａｍｂｉｏｎ社製）又はサイトメガロウイルスプロモーターが組み込まれた発現ベクターｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ｎｏ．５７７５、Ａｍｂｉｏｎ社製）にそれぞれのオリゴヌクレオチドを連結させて、マウスＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現プラスミド及びコントロールのｓｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現プラスミドを構築した。以下の実験は、ｓｉＰＨＤ２−Ａの発現ベクターを用いて行った。
【００９５】
２．ポリカチオン荷電性ポリマーの合成
２−１．ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）の合成
β−ベンジル−Ｌ−アスパアルテート−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）とジクロロメタンとの混合溶媒に溶解し、ブチルアミンを開始剤として４０℃で２日間重合反応を行った。Ｎ末端を無水酢酸によりアセチル化した後、ジエチルエーテルで再沈を行い、乾燥してポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパアルテート）（ＰＢＬＡ）ポリマーを得た。ＰＢＬＡをＤＭＦに溶解し、ベンジルエステルに対し５０倍当量に相当するジエチレントリアミンを加え、４０℃で１日間反応させた。反応液を酢酸水溶液中に滴下し、透析チューブに入れ、０．０１Ｎ塩酸を外液として透析を行った。エバポレートした後、凍結乾燥を行い、ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）の白色粉末を得た。得られたポリマー（以下、「ＰＡｓｐＤＥＴ」ともいう）は、下記の構造式で表すことのできるポリマーの塩酸塩であり、ｎ＝９８であった。
【００９６】
【化６】
0005463531.tif 000007
【００９７】
２−２．ポリエチレングリコール−ポリ（Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノエチルアスパルタミド）ブロック共重合体の合成
方末端がメトキシで、もう一方の方末端がアミノプロピルであり、平均分子量が１２，０００のポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」ともいう）をジクロロメタンに溶解し、ＢＬＡ−ＮＣＡをＤＭＦとジクロロメタンとの混合溶媒に溶解して加え、４０℃で２日間反応させ、さらに無水酢酸によりＮ末端のアセチル化を行い、ポリエチレングリコール−ｂｌｏｃｋ−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を得た。ＮＭＲによる解析からＰＢＬＡ部分の重合度は６８であった。以下、ＰＥＧの分子量が１２，０００、ＰＢＬＡ部分の重合度６８のブロック共重合体をＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）のように表記することがある（カッコ内の数字１２が分子量１２，０００を表し、６８が重合度を表している）。
【００９８】
こうして得られたＰＥＧ−ＰＢＬＡ（１２−６８）をベンゼンに溶解させ凍結乾燥を行った後、アルゴン雰囲気下でＤＭＦに溶解させた。この溶液に、蒸留により乾燥し精製したジエチレントリアミンをベンジルエステルに対して５０倍当量添加し、アルゴン雰囲気下４０℃で２４時間攪拌した。反応溶液を１０％酢酸に滴下し、分画分子量３５００の透析膜を用いて、０．１Ｎ−ＨＣｌに対して透析を行い、透析膜内液を回収、凍結乾燥することで下記式（Ｖ）に示す構造式で表すことのできるＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）ブロック共重合体（以下、「ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」ともいう）を塩酸塩の形で白色個体として得た。
【００９９】
【化７】
0005463531.tif 000008
【０１００】
２−３．ポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体の合成
Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンＮカルボン酸無水物を、片末端一級アミノ基のポリエチレングリコールを開始剤として重合した。反応溶液を、冷エーテル中に滴下し生じたポリエチレングリコール−ポリ（Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシン）ブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｚ））を濾過で回収した。ＰＥＧ−ＰＬＬ（Ｚ）をトリフルオロ酢酸に溶解させ、ＨＢｒ酢酸を用いて脱保護反応を行い、エーテル再沈、透析、凍結乾燥によりポリエチレングリコール−ポリリシンブロック共重合体（以下、「ＰＥＧ−ＰＬＬ」ともいう）を得た。
【０１０１】
３．ポリイオンコンプレックスの調製
上記の通り調製した、ＰＨＤ２に対するｓｉＲＮＡ発現プラスミド（以下、「ｓｈＰＨＤ２」ともいう）及びコントロールのｓｉＲＮＡ発現プラスミド（以下、「ｓｈＣｏｎｔ」ともいう）のそれぞれと、上記の各ポリカチオン荷電性ポリマーとのポリイオンコンプレックスは、投与の３０分から１時間前に、各プラスミド溶液と各ポリマー溶液とを混合することによって調製した。各ポリマー溶液は、固体の状態で製造されたポリマーを、濃度が、５５００μｇ／ｍｌ（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、２３０μｇ／ｍｌ（ＰＥＧ−ＰＬＬ）となるように１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）に溶解して調整したものである。各ポリマー溶液と各プラスミド溶液とは、２：１の体積混合比で混合し、得られたポリイオンコンプレックス中のポリマー濃度は前記濃度の１／３となっている。本実施例で用いたポリマーは、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（２０）及びＰＥＧ−ＰＬＬ（２）である。各ポリマーのカッコ内の数値はＮ／Ｐ比を示す。なお、ＤＮＡ最終濃度は、３３．３μｇ／ｍｌとした。
【０１０２】
コンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩：Ｓｉｇｍａ社製）を添加したポリイオンコンプレックスは、次のように調製した。まず、コンドロイチン硫酸を純水に溶解させ、５０ｍｇ／ｍｌの濃度のコンドロイチン硫酸溶解液を準備した。次に、上記の通り調製した、各プラスミドと各ポリマーとのポリイオンコンプレックスを含む溶液に、当該コンドロイチン硫酸溶解液を１／１０体積量加え、３０分放置して調製した。
【０１０３】
４．実験動物
８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスは、オリエンタル酵母工業社から購入した。全てのマウスは、高圧滅菌した飼料及び滅菌水を自由摂取させて飼育した。全ての動物研究は、東京大学の動物実験に関するガイドラインの原則に従って行った。
【０１０４】
［実施例１］虚血モデルマウスにおけるｓｈＰＨＤ２投与の影響
８週齢の雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、左下肢の大腿動脈起始部を結紮することにより左下肢虚血モデルマウスを作製した。これらのマウスを１群あたり５〜６匹ずつの４群に分け、大腿動脈結紮後の１日目に、（Ａ）ｓｈＣｏｎｔとＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）とのポリイオンコンプレックス（以下、「ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」とする）、（Ｂ）ｓｈＰＨＤ２のみ（以下、「ネイキッドｓｈＰＨＤ２」とする）、（Ｃ）ｓｈＰＨＤ２とＰＥＧ−ＰＬＬとのポリイオンコンプレックス（以下、「ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＬＬ」とする）、及び（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２、ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）及びコンドロイチン硫酸のポリイオンコンプレックス（以下、「ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）」とする）、をそれぞれ各群のマウスの左下肢大伏在静脈より注入した。なお、ｓｈＰＨＤ２及びｓｈＣｏｎｔの注入量は、それぞれ５０μｇ（溶液としては３００μＬ）とした。そして２１日目に、各群のマウスについて下肢の状態を目視により外観調査し、代表的なものについて写真撮影を行った。これらの代表写真を図１に示す。なお、矢印は、虚血処置を行ったマウス左下肢を示すものである。
【０１０５】
その結果、図１の写真に示された通り、（Ｂ）〜（Ｄ）のｓｈＰＨＤ２を投与した群では、全てのマウスにおいて外観上問題なく左下肢が温存されていた。これに対して、（Ａ）のｓｈＣｏｎｔを投与した群では、マウスの左下肢は温存されておらず、壊死して外観上消滅していた。
【０１０６】
［実施例２］虚血モデルマウスにおける血流状態の解析
実施例１の通り処置を行った（Ａ）ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、（Ｂ）ネイキッドｓｈＰＨＤ２、（Ｃ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＬＬ、及び（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の４群の左下肢虚血モデルマウスについて、レーザードップラー血流画像化装置（ｍｏｏｒＬＤＩ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｉｍａｇｅｒ，Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）及びソフトウェア（ＭＬＤＩ  ＶＳ．１  Ｓ／Ｎ  ５４０９，Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて血流状態の解析を行った。血流状態の解析については、施術前、施術後、３日目、７日目、１４日目、２１日目の状態を調べ、同時に各群の代表的なものについて同血流画像化装置を用いて写真撮影を行った。これらの代表写真を図２に示す。
【０１０７】
図２の写真の通り、（Ａ）群のマウスは、処置後から３日目まで左下肢に血流の存在が示されておらず、７日目以降は当該左下肢が壊死して消滅している状態が示された。これに対して（Ｂ）〜（Ｄ）群のマウスは、処置後２１日目においては全て左下肢に血流の存在が見られた。その中でも（Ｄ）群は、処置後３日目から左下肢に血液が流れ始めており、７日目では左下肢のほぼ全体にわたって血流が見られ、１４日目及び２１日目では未処置である右下肢と変わらない程度に血液が流れている状態が観察された。なお、（Ｂ）及び（Ｃ）群は、７日目から血液が流れ始めるものの、２１日目まで経過しても右下肢と同程度の血流までは回復していなかった。
【０１０８】
［実施例３］虚血モデルマウスにおける血流の定量
実施例１の通り処置を行った、（Ａ）ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、（Ｂ）ネイキッドｓｈＰＨＤ２、（Ｃ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＬＬ、及び（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の４群の左下肢虚血モデルマウスについて、レーザードップラーによる血流測定を行った。具体的にはレーザードップラー血流計（ｍｏｏｒＬＤＩ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｉｍａｇｅｒ，Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）及びソフトウェア（ＭＬＤＩ  ＶＳ．１  Ｓ／Ｎ  ５４０９，Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用い、施術前、施術後、３日目、７日目、１４日目、２１日目の状態について血流量を測定した。測定値については、同マウスの非手術の右下肢をコントロールとして、当該コントロールの下肢血流量に対する虚血下肢血流量の比率を求めて定量を行い、各群における血流量比の平均値及び標準偏差を算出した。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）の結果を図３ａのグラフに示し、（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）の結果を図３ｂのグラフに示す。
【０１０９】
図３ａの結果により、（Ｄ）群のマウスでは、処置後３日目において処置直後よりも多くの血流量が見られ、経時的にその量は増加して、２１日目では処置前と同程度の血流量であることが示された。これに対して、（Ｂ）群のマウスは経時的に血流量は増加したが、（Ｄ）群よりも少ない血流量であり、（Ａ）群においては、時間が経過しても血流量は増えなかった。また、図３ｂの結果からは、（Ｃ）群のマウスは（Ｄ）群ほどの多くの血流量ではないものの、（Ａ）群よりも多量の血流量が見られた。
【０１１０】
［実施例４］虚血モデルマウスにおける血管新生
実施例１の通り処置を行った、（Ａ）ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、（Ｂ）ネイキッドｓｈＰＨＤ２、及び（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の３群の左下肢虚血モデルマウスについて、処置後２１日目のマウス下肢の血管造影法による評価を行った。血管造影法としては、下行大動脈の起始部にカテーテルを挿入して造影剤（蒸留水５０ｍｌ、ゼラチン（和光純薬工業社）１．５ｇ、酸化鉛（和光純薬工業社）１００ｇ）を注入し、Ｘ線撮影装置（ＳＯＦＴＥＸ  ＣＭＢ−２、ソフテックス株式会社、撮影条件：５０Ｖ、２２ｋＶｐ、４０ｓｅｃ）を用いて写真撮影をして評価を行った。各群におけるマウス下肢の代表写真を図４に示す。なお、「アステリスク（＊）」は結紮した外腸骨動脈の位置を示し、矢印は新たに形成された側副血管を示す。
【０１１１】
図４の写真に示されたように、（Ａ）群のマウスでは側副血管は全く見られなかったのに対し、（Ｂ）群では２箇所の側副血管が見られ、（Ｄ）群では５箇所もの側副血管が見られた。
【０１１２】
［実施例５］ＰＨＤ２のｍＲＮＡ発現の定量
実施例１の通り処置を行った、（Ａ）ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）、（Ｂ）ネイキッドｓｈＰＨＤ２、及び（Ｄ）ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の３群の左下肢虚血モデルマウスについて、処置後３日目に、各群のマウス左下肢の筋肉を切除した。その切除した筋肉から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（２５０）（ＱＩＡＧＥＮ社製）及びＲＮｅａｓｙカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ添付のプロトコールに従い、全ＲＮＡサンプルを単離した。単離したＲＮＡサンプルについて、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ添付のプロトコールに従い、ＰＨＤ２のｍＲＮＡを対象に定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。各サンプルのｍＲＮＡ発現量については、１８Ｓ  ｒＲＮＡを内部コントロールとして、そのｍＲＮＡ発現量に対する相対値を算出した。この結果を図５（ａ）に示す。なお、定量ＲＴ−ＰＣＲについては、下記塩基配列： 
5’- GAAGCTGGGCAACTACAGGA -3’（mouse PHD2-Forward）（配列番号５）及び
5’- CATGTCACGCATCTTCCATC -3’（mouse PHD2-Reverse）（配列番号６）、
5’- CGGCGACGACCCATTCGAAC -3’（18S-Forward）（配列番号７）及び
5’- GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC -3’（18S-Reverse）（配列番号８）、
からなるプライマーを用いて、キャリーオーバーステップ（５０℃、２分間）、ＰＣＲ初期活性化ステップ（９５℃、１５分間）、サイクルステップ（［９４℃、１５秒間］、［６０℃、３０秒間］、［７２℃、３５秒間］、サイクル数：４０）の温度及び時間条件で行った。また図５（ａ）の「＊」は統計学的有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１１３】
また、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）の３群の左下肢虚血モデルマウスについて、処置後７日目に、各群のマウス左下肢の筋肉を同様に切除した。切除した筋肉にＲＩＰＡバッファー（１０μｇ／ｍＬ  アプロチニン、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１０ｍＭ  ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル）を加え、試料精密粉砕機（マルチビーズショッカー、安井器械社）を用いて２５００ｒｐｍで２０秒間ホモジナイズし、１４０００ｒｐｍで２０秒間超遠心を行い、細胞含有試料として上清を回収した。回収した細胞含有試料からＲＩＰＡバッファーを用いてタンパク質を抽出し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、ＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に転写し、常法によりウェスタンブロッティングを行った。このとき、抗体としては、抗マウスＨＩＦ−１α抗体（ＮＢ１００−４４９；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を用いた。またコントロールとしては、アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いた。この結果を図５（ｂ）に示す。なお、「＊」は統計学的有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１１４】
図５（ａ）の結果に示されるように、処置を行ったマウスについては、（Ｄ）群（ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））は、（Ａ）群（ｓｈＣｏｎｔ＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））及び（Ｂ）群（ネイキッドｓｈＰＨＤ２）よりもＰＨＤ２のｍＲＮＡ発現量が少なくなっており、（Ａ）群のｍＲＮＡ発現量とは統計学的有意差が見られた。
【０１１５】
また、図５（ｂ）の結果からは、処置を行ったマウスは全てＨＩＦ−１αの存在が見られた中で、（Ｄ）群（ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））のマウスにおけるＨＩＦ−１αが最も多く誘導されていることが示された。
【０１１６】
［実施例６］血管新生因子のｍＲＮＡ発現の定量
実施例５と同様に、処置後３日目の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｄ）の３群の左下肢虚血モデルマウスの左下肢筋肉からＲＮＡサンプルを単離し、（ａ）ＶＥＧＦ、（ｂ）ＦＧＦ２、及び（ｃ）Ａｎｇ−１を対象として定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。定量ＲＴ−ＰＣＲについては、下記塩基配列：
5’- GCAGAAGTCCCATGAAGTGAT -3’（VEGF-Forward）（配列番号９）及び
5’- GTCTCAATTGGACGGCAGTAG -3’（VEGF-Reverse）（配列番号１０）、
5’- GTCACGGAAATACTCCAGTTGGT -3’（FGF2-Forward）（配列番号１１）及び
5’- CCCGTTTTGGATCCGAGTT -3’（FGF2-Reverse）（配列番号１２）、
5’- TTGTGATTCTGGTGATTGTGG -3’（Ang1-Forward）（配列番号１３）及び
5’- CTTGTTTCGCTTTATTTTTGT -3’（Ang1-Reverse）（配列番号１４）、
からなるプライマーを用い、その他の条件は実施例５と同様として、内部コントロール１８Ｓ  ｒＲＮＡのｍＲＮＡ発現量に対する相対値を算出した。これらの結果を図６（ａ）〜（ｃ）に示す。なお、「＊」は統計学的有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
【０１１７】
図６（ａ）〜（ｃ）の結果に示されるように、処置を行ったマウスの中で、（ａ）ＶＥＧＦ、（ｂ）ＦＧＦ２、及び（ｃ）Ａｎｇ−１の全てについて、（Ｄ）群（ｓｈＰＨＤ２＋ＰＥＧ−ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））のマウスが最も多量のｍＲＮＡ発現量を示していた。また、（Ａ）群のマウスにおけるｍＲＮＡ発現量とは、（ａ）〜（ｃ）のいずれにおいても統計学的有意差が見られた。
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明によれば、ＨＩＦ（ＨＩＦ−１又はＨＩＦ−２）の安定化を介して直接的又は間接的に血管新生を誘導することができ、これにより、量的、且つ機能的に優れた血管の再生を実現することができ、虚血性疾患や動脈疾患等に対する効果的な治療又は予防用の医薬品を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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