(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  ｒｈｉｚｏｍａ）抽出物とアイビーの葉抽出物との組合せを含み、黄蓮とアイビーの葉の混合抽出物の形態である鎮咳または去痰用組成物。
【請求項２】
前記混合抽出物内のアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の含量比が、重量基準で０．１：１乃至１０：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記混合抽出物内のアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の含量比が、重量基準で０．２：１乃至５：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
有効成分として黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  ｒｈｉｚｏｍａ）抽出物とアイビーの葉抽出物との組み合わせを含み、黄蓮とアイビーの葉の混合抽出物の形態である、肺気腫、気管支炎、喘息、慢性または急性気管支収縮、喘鳴性乳児症候群（stridulus infant syndrome）、慢性閉塞性肺疾患、気管支腺腫、孤立性肺結節、肺結核、膿胸、肺膿瘍、風邪、インフルエンザ、及び肺の組織球増殖症（pulmonary histiocytosis）からなる群より選択された１種以上の呼吸器疾患の予防または治療用組成物。
【請求項５】
前記混合抽出物内のアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の含量比が、重量基準で０．１：１乃至１０：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記混合抽出物内のアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の含量比が、重量基準で０．２：１乃至５：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記抽出物は、水及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒を抽出溶媒として用いることで得られた粗抽出物、または前記粗抽出物に炭素数１乃至６個の直鎖または分枝型アルコール水溶液を加えて得られた溶媒可溶抽出物である、請求項１乃至６のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、経皮剤、座剤または滅菌注射溶液（sterile injection solution）に剤型化されたものである、請求項１乃至６のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  ｒｈｉｚｏｍａ）抽出物またはアイビー（ｉｖｙ）の葉と黄蓮の混合抽出物の去痰活性、鎮咳活性、及び抗ヒスタミン活性における有用性が提供される。より具体的に、黄蓮抽出物、または黄蓮抽出物とアイビーの葉抽出物の混合物を有効性分として含有する鎮咳、去痰剤及び／または呼吸器疾患の予防及び治療に有用な組成物及びその製造方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
咳と痰は冷たい空気、病原性微生物を含む外部異物、大気汚染物質、アレルギー誘発物質などのような物理・化学的要因などによって発生すると知られており、これを発生要因別に分ければ次の通りである。
【０００３】
第一に、物理・化学的要因によって喉頭、気管、気管支、咽頭、副鼻腔、横隔膜などの咳受容体を刺激すれば脳の延髄部位の咳中枢に刺激が伝達され、咳反射が起こる。
【０００４】
第二に、物理・化学的要因によって副交感神経系が活性化されれば気管支平滑筋が収縮し、そのために気管支痙攣や気管支収縮などの症状が発生することがある。
【０００５】
第三に、物理・化学的要因によって肥満細胞から炎症媒介物質などが放出される。
【０００６】
したがって、前記の要因を除去すれば咳と痰を抑制することができるが、従来にこれと関連して開発された薬品はほとんど合成化学物質であるために多様な副作用を起こす短所があり、このような短所を補完して開発された天然薬品からは優れた痰及び咳抑制効果が得られていない。
【０００７】
一方、代表的な呼吸器疾患である喘息（ａｓｔｈｍａ）は、呼吸困難、咳、ゼイゼイする荒い息の音（喘鳴）などの症状が反復的かつ発作的に現れる病症であって、心臓喘息と気管支喘息がある。喘息の発病率は国、人種、年令などによって差があるが、２００７年英国の報告によれば成人の約７．９％、小児年齢層の１３．７％、老人層の９．４％が喘息に罹患していると報告されており、我が国でも生活環境の変化、公害、ストレスなどの増加に伴って次第に増加する傾向にある。このような喘息はその原因によって違うが、公害などの環境汚染が深刻になる現代においては発病の年齢層が低くなりその症状も長期化するなど、喘息の深刻性が極大化されている実情にある。
【０００８】
喘息の特徴的な気道閉鎖は３段階過程によって起こる。つまり、気管支平滑筋の収縮、肺粘膜の肥厚化、そして気管支と細気管支にねばっこい粘液が溜まることによって気道が詰まる。この中で気管支平滑筋の収縮のみは容易に回復される。
【０００９】
外因性（アレルギー性）喘息発作機序ではＩｇＥが特に重要であり、一部にＩｇＧが関連している。ＩｇＥが、肥満細胞を活性化して過敏反応を起こすメディエーター（例えばヒスタミン、ＳＲＳ−Ａ、ＥＣＦ−Ａ、ＮＣＦ、ＰＡＦ、Ｋｉｎｉｎ、ＰＧｓ）を放出する。内因性（Ｎｏｎ−ａｌｌｅｒｇｙ）喘息発作の機序は不明ではあるが、自律神経によって媒介されるようである。内因性患者におけるコリン性刺激は直接的に末端気管を通して肥満細胞からヒスタミンなどのメディエーターを遊離するだけでなく、杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌ）分泌が増加し、肺の血管が拡張され、気管、気管支、及び巨大細気管支が収縮して、気管支痙攣及び粘液分泌が増加する。
【００１０】
現在、喘息の根本的な治療法はなく、発作を予防し、合併症を防止するための多様な方法と薬品が開発されているが、単に症状のみを緩和させるだけであって根本的な治療ができなかったり、激しい副作用を起こすなどの問題がある。
【００１１】
このような現薬品治療剤の限界点を克服して、原因を根本的に治療し症状を効果的に改善することができる新たな治療剤の開発が必要である。しかしながら、呼吸器疾患は、各種白血球細胞とこれから遊離される多様なサイトカイン及び炎症メディエーターが関与するため、単一成分の化合物では効果的な治療が難しく、多様な成分と機序を有する天然抽出物が効果的な治療剤となれる。したがって、天然抽出物に基づいた治療剤の開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは鎮咳または去痰用組成物を開発するために研究した結果、黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物が鎮咳、去痰、及び抗ヒスタミン活性効果に優れていることを確認し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明の一実施形態は、黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  ｒｈｉｚｏｍａ）抽出物、またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物の、去痰、鎮咳、及び／または呼吸器疾患予防及び／または治療のための新規な用途を提供する。
【００１４】
本発明のまた他の実施形態は、黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を有効性分として含有する鎮咳剤、去痰剤及び／または呼吸器疾患の予防用及び／または治療用組成物、及びその製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一実施形態は、黄蓮抽出物または黄蓮とアイビーの葉の混合抽出物の、去痰、鎮咳、及び／または呼吸器疾患予防及び／または治療のための新規な用途に関する。
【００１７】
本発明のまた他の実施形態は、黄蓮抽出物または黄蓮とアイビーの葉の混合抽出物を有効性分として含有する鎮咳剤、去痰剤、及び／または呼吸器疾患の予防用及び／または治療用組成物に関する。
【００１８】
黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  Ｒｈｉｚｏｍａ）はキンポウゲ科（Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ）に属する多年生草本であって、根茎部位が主に使用される。主要薬理成分として、アルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）であるベルベリン（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、パルマチン（ｐａｌｍａｔｉｎｅ）、コプチシン（ｃｏｐｔｉｓｉｎｅ）、ベルベラスチン（ｂｅｒｂｅｒａｓｔｉｎｅ）、マグノフロリン（ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ）などを含有していることが知られている。
【００１９】
しかし、このような黄蓮抽出物及び含有成分などが鎮咳、去痰、及び抗ヒスタミン活性に及ぼす影響に関してはまだ研究されたことがない。
【００２０】
本発明者らは、黄蓮抽出物が鎮咳、去痰、及び抗ヒスタミン活性があり、呼吸器疾患の予防及び／または治療に効果があることを見出して本発明を完成した。
【００２１】
アイビーはウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）に属し、キズタ属（ｇｅｎｕｓ  Ｈｅｄｅｒａ）の植物（Ｈｅｄｅｒａ  ｓｐｐ．）を意味するものであって、例えば、アルジェニシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ａｌｇｅｒｉｅｎｓｉｓ）、アゾリカ種（Ｈｅｄｅｒａ  ａｚｏｒｉｃａ）、カナリエンシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、コルシカ種（Ｈｅｄｅｒａ  ｃｏｌｃｈｉｃａ）、ヘリックス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｈｅｌｉｘ）、イベリカ種（Ｈｅｄｅｒａ  ｈｉｂｅｒｎｉｃａ）、マデレンシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｍａｄｅｒｅｎｓｉｓ）、ネパレンシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、パスツチョヴィ種（Ｈｅｄｅｒａ  ｐａｓｔｕｃｈｏｗｉｉ）、ロンビア種（Ｈｅｄｅｒａ  ｒｈｏｍｂｅａ）などであるが、これに制限されるわけではない。乾燥アイビーの葉抽出物の鎮咳及び去痰効果は明らかにされているが、これを他の生薬抽出物と混合投与して、副作用なく著しい上昇効果を上げた例はまだ報告されていない。
【００２２】
本発明者らは、黄蓮抽出物を単独で使用する場合だけでなく、これをアイビーの葉抽出物と混合して使用する場合、各々の抽出物が単独で存在する場合より著しく上昇した鎮咳効果、去痰効果、抗ヒスタミン効果、気管支収縮抑制効果、気道過敏性抑制効果、肺組織の気管支閉塞抑制、及び炎症細胞浸潤抑制効果を有することを確認した。また、本発明では、このような黄蓮抽出物とアイビーの葉抽出物との混合による薬理学的活性シナジー効果が最も大きく現れる最適の組み合わせ比率を提示する。
【００２３】
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合による鎮咳去痰、抗ヒスタミン、気管支収縮抑制、気道過敏性抑制、肺組織の気管支閉塞抑制、及び炎症細胞浸潤抑制作用の上昇效果を最大化するための、アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物内のアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の含量比は、固形分重量基準で０．１：１乃至１０：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量、以下で同一である）、好ましくは０．２：１乃至５：１、より好ましくは１：１乃至４：１、さらに好ましくは１．５：１乃至３．５：１、最も好ましくは２．５：１乃至３．５：１である。前記「固形分」とは抽出物製造に使用された溶媒を除去した状態を意味し、以下で同一である。
【００２４】
用語「抽出物」とは、黄蓮及び／またはアイビーの葉の粗抽出物または前記粗抽出物の特定溶媒可溶抽出物または分画物を意味するものであって、溶液、濃縮物または粉末状態であって良い。また、「アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物」という用語は、アイビーの葉と黄蓮を各々抽出して得られたアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物との混合物、及びアイビーの葉と黄蓮の混合物を抽出して得られた抽出物の、両方を意味する。
【００２５】
黄蓮抽出物は、黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  ｒｈｉｚｏｍａ）、好ましくは黄蓮根茎部位を、水、炭素数１乃至４の直鎖または分枝型アルコールまたはこれらの混合溶媒から選択された１種以上で抽出して得られた粗抽出物、または前記粗抽出物に炭素数１乃至６個の直鎖または分枝型アルコール水溶液、好ましくはプロピルアルコール水溶液及びイソプロピルアルコール水溶液、及び水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上を加えて得られた溶媒可溶抽出物であって良い。
【００２６】
また、アイビーの葉抽出物は、乾燥アイビーの葉を水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上で抽出して得られた粗抽出物、または前記粗抽出物に炭素数１乃至６個の直鎖または分枝型アルコール水溶液、好ましくはプロピルアルコール水溶液及びイソプロピルアルコール水溶液、並びに水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上を加えて得られた溶媒可溶抽出物であって良い。アイビーの葉抽出物の製造に使用されるアイビーはヘデラ（Ｈｅｄｅｒａ  ｓｐｐ．）、例えば、アルジェニシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ａｌｇｅｒｉｅｎｓｉｓ）、アゾリカ種（Ｈｅｄｅｒａ  ａｚｏｒｉｃａ）、カナリエンシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、コルシカ種（Ｈｅｄｅｒａ  ｃｏｌｃｈｉｃａ）、ヘリックス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｈｅｌｉｘ）、イベリカ種（Ｈｅｄｅｒａ  ｈｉｂｅｒｎｉｃａ）、マデレンシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｍａｄｅｒｅｎｓｉｓ）、ネパレンシス種（Ｈｅｄｅｒａ  ｎｅｐａｌｅｎｓｉｓ）、パスツチョヴィ種（Ｈｅｄｅｒａ  ｐａｓｔｕｃｈｏｗｉｉ）、ロンビア種（Ｈｅｄｅｒａ  ｒｈｏｍｂｅａ）などからなる群より選択された１種以上であって良いが、これに制限されるわけではない。
【００２７】
好ましい実施形態において、アイビーの葉または黄蓮の粗抽出物の製造に使用される溶媒は、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）の炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコール水溶液、好ましくはメタノール水溶液及びエタノール水溶液、及び水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上であって良い。
【００２８】
また、前記アイビーの葉または黄蓮の溶媒可溶抽出物の製造に使用される溶媒は、１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）の炭素数１乃至６個の直鎖または分枝型アルコール水溶液、好ましくはプロピルアルコール水溶液、イソプロピルアルコール水溶液、及び水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上であって良い。
【００２９】
黄蓮とアイビーの葉の混合抽出物は、このような黄蓮抽出物とアイビーの葉抽出物の混合物であってもよく、また他の具体例では、黄蓮とアイビーの葉の混合物の抽出物であっても良い。例えば、前記混合抽出物は、アイビーの葉と黄蓮を混合した後、前記混合物を水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上で抽出して得られた粗抽出物、または前記粗抽出物に炭素数１乃至６個の低級アルコール水溶液、好ましくはプロピルアルコール水溶液及びイソプロピルアルコール水溶液、並びに水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上を加えて得られた溶媒可溶抽出物であって良い。
【００３０】
好ましくは、アイビーの葉及び黄蓮混合物の粗抽出物の製造に使用される溶媒は、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、または水飽和ブチルアルコールであって良い。また、前記溶媒可溶抽出物の製造に使用される溶媒は、１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）の炭素数１乃至６個の低級アルコール水溶液、好ましくはプロピルアルコール水溶液及びイソプロピルアルコール水溶液、並びに水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上であって良い。
【００３１】
「分画物」は前記溶媒可溶抽出物を塩化メチレンとメタノール（３０：１乃至７：１（ｖ／ｖ））の混合溶媒でシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って収得されたものであって良い。
【００３２】
黄蓮抽出物、溶媒可溶抽出物または分画物は、ベルベリン、パルマチン、コプチシン、コルンバミン、及びジャトロリジンを含み、好ましくは、ベルベリン（０．５乃至４７．０重量部）：パルマチン（０．２乃至２１．４重量部）：コプチシン（０．１乃至１８．０重量部）：コルンバミン（０．１乃至３．２重量部）：ジャトロリジン（０．１乃至２．６重量部）である。
【００３３】
本発明の他の態様は、鎮咳、去痰、抗ヒスタミン、気管支収縮抑制、気道過敏性抑制、肺組織の気管支閉塞、炎症細胞浸潤抑制活性などを有するアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を製造する方法に関するものである。
【００３４】
前記黄蓮抽出物の製造方法は、
黄蓮、好ましくは黄蓮根茎部位を水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、または水飽和ブチルアルコールで抽出する段階を含むことができる。
【００３５】
前記アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物の製造方法は、
乾燥アイビーの葉を水及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、または水飽和ブチルアルコールで抽出してアイビーの葉抽出物を得る段階；
黄蓮、好ましくは黄蓮根茎部位を水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液、エタノール水溶液または水飽和ブチルアルコールで抽出する段階；及び
前記得られたアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物を、固形分重量基準に０．１：１乃至１０：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）、好ましくは０．２：１乃至５：１、より好ましくは１：１乃至４：１、さらに好ましくは１．５：１乃至３．５：１、最も好ましくは２．５：１乃至３．５：１に混合する段階を含むことができる。
【００３６】
この時、前記各々のアイビーの葉抽出物製造段階及び黄蓮抽出物製造段階は、各々の得られた抽出物に炭素数１乃至６個の直鎖または分枝型アルコール水溶液、好ましくは水飽和ブチルアルコール、プロピルアルコール、及びイソプロピルアルコールからなる群より選択された１種以上を加えて得られた溶媒可溶抽出物を収得する段階をさらに含むことができる。
【００３７】
前記アイビーの葉抽出物の製造過程をより詳細に説明すれば次の通りである：アイビーの葉を切断し、水で洗浄して不純物を除去し乾燥させた後、前記乾燥アイビーの葉の重量に対して約５乃至２０体積倍、好ましくは７乃至１５体積倍の水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、または水飽和ブチルアルコールで還流抽出する。抽出温度は４０乃至１１０℃、好ましくは５５乃至９０℃であることが好ましい。
【００３８】
抽出後、濾過して濾過液を集め、残渣に再び約５乃至１５体積倍、好ましくは８乃至１２体積倍の水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、または水飽和ブチルアルコールで還流抽出する。抽出温度は特別な制限はないが、４０乃至１１０℃、好ましくは５５乃至９０℃であることが好ましい。抽出後に濾過し、以前に得られた濾過液と合わせて減圧濃縮してアイビーの葉抽出物を製造する。このように２回の抽出及び各々の抽出後に得られた濾過液を混合することによって抽出効率を高めることができるが、前記抽出回数に限定されるわけではない。
【００３９】
前記黄蓮抽出物の製造過程をより詳しく説明すれば次の通りである：黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓｒｈｉｚｏｍａ）の根茎部位を細切した後、前記原料重量に対して３乃至２０体積倍、好ましくは５乃至１５体積倍の水、及び炭素数１乃至６個、好ましくは炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、または水飽和ブチルアルコールを加えて０．５乃至２０時間、好ましくは１乃至１０時間、より好ましくは２乃至５時間抽出して、抽出物を得ることができる。前記抽出温度は特別な制限はないが、４０乃至１１０℃、好ましくは５５乃至９０℃であることが好ましい。好ましい例において、前記得られた抽出物を濾過して濾過液を集め、再び残渣に原料重量の１乃至１０体積倍、好ましくは４乃至７体積倍の水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液、エタノール水溶液または水飽和ブチルアルコールを加えて加温して１乃至１０時間、好ましくは２乃至５時間の間再抽出した後、濾過し減圧濃縮して黄蓮抽出物を得ることができる。この時、前記得られた抽出物を以前の濾過液と混合することによって抽出効率を高めることができる。
【００４０】
このように２回の抽出及び各々の抽出後に得られた濾過液を混合することによって抽出効率を高めることができるが、このような抽出回数に限定されるわけではない。
【００４１】
前記黄蓮抽出物及び／またはアイビーの葉抽出物の製造時に使用される溶媒の量が過度に少ないと攪拌が難しく、抽出物の溶解度が低くなって抽出効率が低下するようになり、過度に多い場合は次の精製段階で使用される低級アルコールの使用量が多くなって経済的でなくて取り扱い上問題が発生することがあるので、溶媒の使用量は前記範囲とすることが良い。
【００４２】
本発明の一つの好ましい実施形態においては、１次抽出後に再び再抽出する方法を採択することができるが、これは、生薬抽出物を大量生産する場合に効果的に濾過するとしても生薬自体の抽出液含量が高いために損失が発生し、１次抽出のみでは抽出効率が低下するので、これを防止するためである。また、各段階別抽出効率を検証した結果、２次抽出によって全体抽出量の８０乃至９０％程度が抽出されると確認され、３次以上の多段階抽出は経済性がないと判断される。
【００４３】
溶媒可溶抽出物は、前記得られた粗抽出物を約２乃至１０倍、好ましくは約３乃至７倍体積の水で懸濁させた後、炭素数１乃至６個の直鎖または分枝型アルコール水溶液、好ましくはプロピルアルコール水溶液及びイソプロピルアルコール水溶液、及び水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上の溶媒を懸濁液の０．５乃至３倍、好ましくは同量乃至２倍加えて１回乃至５回、好ましくは２回乃至３回溶媒可溶層を抽出した後に減圧濃縮して製造することができる。
【００４４】
前記のような低級アルコールを利用した溶媒可溶抽出過程は、不要な蛋白質、多糖類、及び脂肪酸などの不純物を精製する段階であり、低級アルコールの使用量が濾過液に比べて少ない場合には、脂肪酸などの不要な成分による微粒子が形成されるため、層分離が円滑でないだけでなく、有効活性成分の抽出含量が低くなって効率的でないので、低級アルコールの使用量は前記範囲にすることが好ましい。
【００４５】
層分離後に得られた低級アルコール分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を５０乃至６０℃で減圧濃縮して、試料中に残存する溶媒を除去する。
【００４６】
このように得られた濃縮物に残存する低級アルコールの含量を医薬品原料用途に適合するように調節するために、この濃縮物を濃縮物総量の約１０乃至３０倍、好ましくは１５乃至２５倍、より好ましくは約２０重量倍の水で１乃至５回、好ましくは２乃至３回共沸濃縮し、再び同量の水を加えて均質に懸濁させた後、凍結乾燥させることによって、粉末状態の黄蓮抽出物及び／またはアイビーの葉抽出物を製造することができる。
【００４７】
好ましくは、前記混合抽出物内各々の抽出物が均質に混合されるようにするために、混合抽出物に約２乃至３重量倍の水を添加した後、５０乃至６０℃の温度下で減圧濃縮し、前記濃縮物に同量の水を再び加えて均質に懸濁させた後、凍結乾燥させることによって、粉末状態の組成物を製造することができる。
【００４８】
また、他の実施形態において、アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物の製造方法は、
乾燥アイビーの葉と黄蓮、好ましくは黄蓮根茎部位を重量基準に１：４乃至７：１（アイビーの葉重量：黄蓮重量）、好ましくは１：１乃至６：１、より好ましくは２：１乃至５：１に混合してアイビーの葉と黄蓮混合物を製造する段階；及び
前記混合物に水、及び炭素数１乃至４個の直鎖または分枝型アルコールからなる群より選択された１種以上、例えば、水、または１０乃至７０％（ｖ／ｖ）、好ましくは２０乃至６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２５乃至５５％（ｖ／ｖ）のメタノール水溶液若しくはエタノール水溶液、または水飽和ブチルアルコールを添加して抽出する段階を含むことができる。
【００４９】
前記方法は、アイビーの葉と黄蓮混合物の抽出物を得る段階以降に、炭素数１乃至６個の直鎖または分枝型低級アルコール水溶液、好ましくはプロピルアルコール、イソプロピルアルコール、及び水飽和ブチルアルコールからなる群より選択された１種以上を加えて得られた溶媒可溶抽出物を収得する段階をさらに含むことができる。
【００５０】
前記粗抽出物及び溶媒可溶抽出物製造段階の詳細は前記各々の生薬抽出物を製造する場合と同一である。
【００５１】
本発明において適用される抽出方法は通常使用される全ての方法であって良く、例えば、冷浸抽出、熱水抽出、超音波抽出、還流抽出または冷却抽出であって良いが、これに限定されるわけではない。
【００５２】
本発明の他の態様は、黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を有効性分として含有する鎮咳剤組成物を提供する。本発明の他の態様は、黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を有効性分として含有する去痰剤組成物を提供する。本発明の他の態様は、黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を有効性分として含有する呼吸器疾患の予防用及び／または治療用組成物を提供する。
【００５３】
本発明の他の態様は、患者に黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を治療的有効量で投与する段階を含む咳抑制方法を提供する。本発明の他の態様は、患者に黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を治療的有効量で投与する段階を含む痰除去方法を提供する。本発明の他の態様は、患者に黄蓮抽出物またはアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物を治療的有効量で投与する段階を含む呼吸器疾患の予防及び／または治療方法を提供する。前記患者は、咳抑制、痰除去または呼吸器疾患の予防及び／または治療を必要とする全ての哺乳類、好ましくは人間であることがある。
【００５４】
前記治療的有効量は所望の治療効果を得るために定められた投与量であって、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態、及び疾患程度により変わることができ、医師または薬剤師の判断により変わることができ、例えば、１日投与量は、有効成分含量を基準に０．５乃至５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１乃至３００ｍｇ／ｋｇであって良いが、これに制限されるわけではない。前記投与量は１日１回投与または１日数回分割投与も可能である。前記投与量は平均的な場合を例示したものであって、個人差によってその投与量が高かったり低かったりすることがある。本発明の混合抽出物含有組成物の１日投与量が前記投与量未満であれば有意性ある効果を得ることができず、それ以上を超える場合は非経済的であるだけでなく、常用量の範囲を超えるため好ましくない副作用が現れる恐れが発生するすることがあるので、前記範囲にすることが好ましい。
【００５５】
黄蓮抽出物及びアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物は、鎮咳作用、去痰作用、抗ヒスタミン作用、気管支収縮抑制作用、気道過敏性抑制作用、肺組織の気管支閉塞抑制、及び炎症細胞浸潤抑制作用を示すので、これに関わる呼吸器疾患の予防、治療または症状緩和により有用に使用できる。また、アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物の場合、各々の単独抽出物より上昇した効果を得ることができるのでより好ましい。
【００５６】
前記呼吸器疾患は咳と痰を伴う全ての疾患であることができ、例えば、一般的な咳または痰；咳または痰を伴う肺気腫；慢性気管支炎、急性気管支炎、カタール性気管支炎、閉鎖性または炎症性気管支の病気などの気管支炎；気管支喘息、アトピー性喘息、アトピー性気管支ＩｇＥ媒介喘息、非アトピー性喘息、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息などの喘息；慢性または急性気管支収縮；喘鳴性乳児症候群（stridulus infant syndrome）；慢性閉塞性肺疾患；気管支腺腫；孤立性肺結節；肺結核；膿胸；肺膿瘍；風邪；インフルエンザ；及び肺の組織球増殖症（pulmonary histiocytosis）などからなる群より選択された１種以上の疾患であることができる。
【００５７】
本発明による組成物は、人間を含むほ乳動物に多様な経路で投与できる。投与方式は通常使用される全ての方式が可能であり、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与できる。本発明の組成物は各々通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口型剤形、経皮剤、座剤、及び滅菌注射溶液形態の非経口剤形などに剤形化して使用できる。
【００５８】
本発明の組成物は、前記抽出物以外に薬剤学的に適し、生理学的に許容される担体、賦形剤、及び希釈剤などの補助剤をさらに含有するものであっても良い。
【００５９】
本発明の組成物を人間に適用する具体例において、本発明の組成物は単独で投与できるが、一般に投与方式と標準薬剤学的慣行（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を考慮して選択された薬剤学的担体と混合されて投与できる。例えば、本発明の混合抽出物含有組成物は澱粉またはラクトースを含有する錠剤形態に、または単独または賦形剤を含有するカプセル形態に、または味を出したり色を帯びるようにする化学薬品を含有するエリキシルまたは懸濁剤形態に、経口、口腔内または舌下投与が可能である。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、メチルセルロース、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）などの半合成グリセリド、または杏仁油（ａｐｒｉｃｏｔ  ｋｅｒｎｅｌ  ｏｉｌ）とＰＥＧ−６エステルの混合物またはＰＥＧ−８とカプリル酸／カプリン酸グリセリドの混合物などのグリセリド混合物）などの薬剤的に許容可能な添加剤と一緒に剤型化することができる。
【００６０】
本発明の他の態様は、黄蓮抽出物またはアイビーの葉及び黄蓮の混合抽出物を含有する鎮咳、去痰、喘息など呼吸器疾患予防または改善用健康機能性食品を提供する。前記健康機能性食品は各種食品、飲料、食品添加剤などであることができる。
【００６１】
前記健康機能性食品に含まれている有効性分としての抽出物の含量は食品の形態、所望の用途などにより適切に調節することができ特別な制限がなく、例えば、全体食品重量の０．０１乃至１５重量％で加えることができ、健康飲料組成物は、１００ｍＬを基準に０．０２乃至１０ｇ、好ましくは０．３乃至１ｇの比率で加えることができる。
【００６２】
特に、本発明の生薬組成物を人体に投与する場合、天然抽出物の一般的特性に照らしてみれば、他の合成医薬品に比べて副作用の心配がないと思料され、実際に規格化された生薬組成物に対する毒性試験の結果、生体に何の影響もないことが判明された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】マウスモデルを利用したフェノールレッド排出法（ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）によって黄蓮抽出物と活性分画物及び代表的成分の喀痰排出効果を示したものである。
【図２】実施例２で製造された抽出物の去痰活性を示したものであって、マウスを利用したフェノールレッド法によって測定された結果を示したものである。
【図３】実施例２で製造された抽出物の鎮咳活性を示したものであって、モルモットを利用した咳抑制試験の結果を示したものである。
【図４】実施例２で製造された抽出物の気管支収縮抑制活性を示したものであって、モルモットから摘出した気管支を利用した収縮誘導剤に対する弛緩率（％）を示したものである。
【図５】ＯＶＡで感作されて試験されたマウスの肺組織における気管支閉塞及び気管支炎症細胞浸潤抑制活性に対する実施例２−７の抽出物の効果を示したものである（（ａ）正常群、（ｂ）誘発群、（ｃ）陽性対照群、（ｄ）実施例２−７）。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳しく説明する。
【００６５】
但し、下記の実施例及び実験例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例及び実験例に限定されるわけではない。
【００６６】
実施例１．黄蓮抽出物の製造
１−１．水を利用した黄蓮抽出物の製造
１−１−１．黄蓮粗抽出物（ＣＲ−ＧＡ）の製造
京東市場（Kyungdong market）で購入した黄蓮を水で洗浄して不純物を除去した後、乾燥された黄蓮２５０ｇを１．５Ｌの水で、８０℃で３時間ずつ２回熱水抽出した後、抽出液を濾過した後に減圧濃縮して粗抽出物６２．５ｇ（元生薬対比２５％収率）を得て、これを以下「ＣＲ−ＧＡ」と命名し、下記の実施例１−２で使用した。
【００６７】
１−１−２．黄蓮溶媒可溶抽出物（ＣＲ−ＧＡ−１）の製造
前記実施例１−１−１で得られたＣＲ−ＧＡ６２．５ｇに０．５Ｌの水を加えて懸濁させ、ここに水飽和ブチルアルコール１Ｌを加え、２回層分離した後、水飽和ブチルアルコール分画のみを集めて乾燥されるまで減圧濃縮した。大部分のブチルアルコールと水が蒸発したら、０．４Ｌの水を加えて共沸濃縮することを２回繰り返し、最終的に０．１Ｌの蒸溜水を加えて懸濁させた後、凍結乾燥して、粉末状態の黄蓮抽出物１９．８ｇ（元生薬対比７．９２％収率）を得て、これを以下「ＣＲ−ＧＡ−１」と命名し、下記実験例の試料として使用した。
【００６８】
１−２．５０％（ｖ／ｖ）エタノールを利用した黄蓮抽出物の製造
１−２−１．黄蓮粗抽出物（ＣＲ−ＧＢ）の製造
京東市場（Kyungdong market）で購入した黄蓮を水で洗浄して不純物を除去した後、乾燥された黄蓮２５０ｇを２．０Ｌの５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で、８０℃で３時間ずつ２回還流抽出した後、抽出液を濾過した後に減圧濃縮して粗抽出物５７．５ｇ（元生薬対比２３％収率）を得て、これを以下「ＣＲ−ＧＢ」と命名し、下記の実施例２−２で使用した。
【００６９】
１−２−２．黄蓮溶媒可溶抽出物（ＣＲ−ＧＢ−１）の製造
前記実施例１−２−１で得られたＣＲ−ＧＢ５７．５ｇに０．３Ｌの水を加えて懸濁させ、ここに水飽和ブチルアルコール０．６Ｌを加えて２回層分離した後、ブチルアルコール分画のみを集めて乾燥されるまで減圧濃縮した。大部分のブチルアルコールと水が蒸発したら、０．２Ｌの水を加えて共沸濃縮することを２回繰り返し、最終的に０．２Ｌの蒸溜水を加えて懸濁させた後、凍結乾燥して、粉末状態の黄蓮抽出物３１．８ｇ（元生薬対比１２．７％収率）を得て、これを以下「ＣＲ−ＧＢ−１」と命名し、下記実験例の試料として使用した。
【００７０】
１−３．水飽和ブチルアルコールを利用した黄蓮抽出物の製造
１−３−１．黄蓮抽出物（ＣＲ−ＧＣ）の製造
京東市場（Kyungdong market）で購入した黄蓮を水で洗浄して不純物を除去した後、乾燥された黄蓮２５０ｇを２．５Ｌの水飽和ｎ−ブチルアルコールで、８５℃で３時間ずつ２回還流抽出した後、抽出液を濾過した後に減圧濃縮し、大部分のブチルアルコールが蒸発したら、０．２Ｌの水を加えて共沸濃縮することを２回繰り返し、最終的に０．２Ｌの蒸溜水を加えて懸濁させた後、凍結乾燥して、粉末状態の抽出物３２．８ｇ（元生薬対比１３．１％）を得て、これを以下「ＣＲ−ＧＣ」と命名し、下記実験例で使用した。
【００７１】
１−４．黄蓮抽出物の分離
前記実施例１−２−２のＣＲ−ＧＢ−１の２０ｇを、塩化メチレンとメタノール（３０：１〜７：１（ｖ／ｖ））の混合溶媒を用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、５個の分画（ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）に分けた。Ｆｒ．１は０．８ｇ（以下、「Ｆｒ．１」という）、Ｆｒ．２は２．６ｇ（以下、「Ｆｒ．２」という）、Ｆｒ．３は５．５ｇ（以下、「Ｆｒ．３」という）、Ｆｒ．４は２．８ｇ（以下、「Ｆｒ．４」という）、Ｆｒ．５は６．５ｇ（以下、「Ｆｒ．５」という）であり、これらを下記実験例の試料として使用した。
【００７２】
実施例２．アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物の製造
アイビーの葉抽出物の製造
アイビー（ヘリックス種）の葉を水で洗浄して不純物を除去し、完全に乾燥させた。このように準備されたアイビーの葉２５０ｇに３０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液３Ｌを加え、６時間還流抽出し、そして抽出物を濾過して濾過液を集めた。残渣に対しては、３０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液２．５Ｌを加え、３時間の間８０℃で還流抽出し、得られた濾過液を以前に集めた濾過液と混合して減圧濃縮した。大部分の溶媒が蒸発したら、０．２Ｌの水を加えて共沸濃縮することを２回繰り返し、そして同量の水を加えて均質に懸濁させた後に、この懸濁液を凍結乾燥させ、粉末状態のアイビーの葉抽出物４２．４ｇを得た。このように得られたアイビーの葉抽出物を下記の実施例２−１乃至２−１１の混合抽出物製造に使用した。
【００７３】
黄蓮抽出物の製造
黄蓮（Ｃｏｐｔｉｄｉｓ  ｒｈｉｚｏｍａ）を水で洗浄して不純物を除去し、完全に乾燥させた。このように準備された黄蓮２５０ｇに、２．０Ｌの５０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液を加えて、８０℃で３時間還流抽出した。その後、抽出液を濾過した後に減圧濃縮して粗抽出物５７．５ｇを得た。これに０．３Ｌの水を加えて懸濁させ、更にこれに水飽和ブチルアルコール０．６Ｌを加えて２回層分離した。その後、ブチルアルコール分画のみを集めて乾燥されるまで減圧濃縮した。大部分のブチルアルコールと水が蒸発したら、水０．２Ｌを加えて共沸濃縮することを２回繰り返した。最終的にこれに同量の蒸溜水を加えて懸濁させた後、懸濁液を凍結乾燥して、粉末状態の黄蓮抽出物３１．８ｇを得た。このように得られた黄蓮抽出物を下記の実施例２−１乃至２−１１の混合抽出物製造に使用した。
【００７４】
２−１．混合抽出物（０．２：１）の製造
前記で製造されたアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物を重量基準で０．２：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）の比率で混合した。均質に混合させるために、混合抽出物に２乃至３重量倍ほどの水を添加した後、５０乃至６０℃の温度下で減圧濃縮した。得られた濃縮物に再び同量の水を加えて均質に懸濁させ、懸濁液を凍結乾燥させることによって、粉末状態の混合抽出物を製造した。
【００７５】
２−２．混合抽出物（０．４：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で０．４：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００７６】
２−３．混合抽出物（１：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で１：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００７７】
２−４．混合抽出物（１．５：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で１．５：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００７８】
２−５．混合抽出物（２：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で２：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００７９】
２−６．混合抽出物（２．５：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で２．５：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００８０】
２−７．混合抽出物（３：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で３：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００８１】
２−８．混合抽出物（３．５：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で３．５：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００８２】
２−９．混合抽出物（４：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で４：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００８３】
２−１０．混合抽出物（４．５：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で４．５：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００８４】
２−１１．混合抽出物（５：１）の製造
アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物の混合比率を重量基準で５：１（アイビーの葉抽出物重量：黄蓮抽出物重量）にすることを除いては、前記製造例１と同一の方法で混合抽出物を製造した。
【００８５】
実施例３．黄蓮抽出物の活性試験
３−１．黄蓮抽出物の去痰活性測定
［実験方法］
前記実施例１−１乃至実施例１−３の黄蓮抽出物の去痰活性を測定するために、Ｅｎｇｌｅｒらによる方法（Ｅｎｇｌｅｒ  Ｈ、Ｓｚｅｌｅｎｙｉ  Ｉ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｏｔｈ．１１、１５１〜１５７、１９８４、；Ｂａｏ−ｑｕｉｎ  Ｌｉｎ  ｅｔ．、Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２１、２５９〜２６３、２００８．）を利用して、下記の工程で実験を行った。
【００８６】
陽性対照薬物（アンブロキソール、Ｓｉｇｍａ）及び試験薬物（実施例１−１乃至実施例１−３の黄蓮抽出物）を雄マウス（８週齢、Ｓａｍ  ｔａｃｏ  ＢｉｏＫｏｒｅａ）に経口投与し、３０分後に５００ｍｇ／ｋｇのフェノールレッドを腹腔注射した（フェノールレッドは生理食塩水に溶解させた）。３０分後、マウスをジエチルエーテル（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｅｒ）を利用して麻酔させ、腹部大動脈を切断して放血させた後、気管（ｔｒａｃｈｅａ）全体を切除した。分離された気管を１ｍＬの生理食塩水に入れて３０分間洗浄し、１０，０００ｒｐｍで５分間常温で遠心分離して、上澄み液に１Ｎ苛性ソーダ（ＮａＯＨ）を添加（上澄み液１ｍＬ当り１Ｎ  ＮａＯＨ０．１ｍＬを添加）した後、５４６ｎｍで吸光度を測定して、フェノールレッドの濃度として去痰活性を測定した。
【００８７】
［実験結果］
このように得られた結果を下記表１に示した。
【００８８】
【表１】
0005411261.tif 000002
【００８９】
実験の結果、上記表１に示されているように、全般的に活性が優れていることが分かり、特に、実施例２のＣＲ−ＧＢ−１の喀痰排出能が最も優れた活性を示したことが確認された。
【００９０】
また、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の投与量別（５０、１００、１５０、２００、５００ｍｇ／ｋｇ）に活性を測定し、結果を下記表２に示した。
【００９１】
【表２】
0005411261.tif 000003
【００９２】
実験の結果、上記表２に示されているように、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の投与量が５００ｍｇ／ｋｇである時、喀痰排出能が最も優れた活性を示したことが確認された。
【００９３】
３−２．黄蓮抽出物の鎮咳活性測定
［実験方法］
前記実施例１−１乃至実施例１−３の黄蓮抽出物の鎮咳活性を測定するために、Ｔａｎａｋａらによる方法（Ｍｏｔｏｍｕ  Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｋｅｉ  Ｍａｒｕｙａｍａ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．９３、４６５〜４７０、２００３．、Ｄａｏｕｉ、Ｃｏｇｎｏｎ、Ｎａｌｉｎｅ  ｅｔ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．１５８、４２〜４８、１９９８．）を利用し、下記の工程によって実験を行った。
【００９４】
雄モルモット（６週齢、Ｓａｍ  ｔａｃｏ  ＢｉｏＫｏｒｅａ）に試験薬物を経口投与し、１時間後モルモットをプレチスモグラフチャンバー（Ｂｕｘｃｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）に入れた後、咳誘発剤であるクエン酸（Ｓｉｇｍａ）を噴霧して咳を誘発させた。陽性対照群としては鎮咳剤として使用されているテオブロミン（Ｓｉｇｍａ）を使用した。０．２Ｍのクエン酸にモルモットを１０分間露出させ、この時に発生する咳数を１５分間測定した。
【００９５】
［実験結果］
前記で得られた結果を下記表３に示した。
【００９６】
【表３】
0005411261.tif 000004
【００９７】
実験の結果、上記表３に示されているように、全般的に活性が優れていることが分かり、特に、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の咳抑制能が最も優れた活性を示したことが確認された。
【００９８】
また、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の投与量別（５０、１００、１５０、２００ｍｇ／ｋｇ）に活性を測定し、結果を下記表４に示した。
【００９９】
【表４】
0005411261.tif 000005
【０１００】
実験の結果、上記表４に示されているように、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の投与量が２００ｍｇ／ｋｇである時、咳抑制効果が最も優れた活性を示したことが確認された。
【０１０１】
３−３．黄蓮抽出物の抗ヒスタミン活性測定
［実験方法］
前記実施例１−１乃至実施例１−３の黄蓮抽出物の抗ヒスタミン活性を測定するために、Ｈｏｎｕｃｈｉらによる方法（Ｍａｓａｋｏ  Ｈｏｎｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｓｅｙａｍａ、Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉ．、５２（６）、７１１〜７１７、２００６．、Ｎａｏｋｉ  Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４（７）、８２９〜８３４、２００１．）を利用し、下記の工程によって実験を行った。
【０１０２】
卵白アルブミンで感作させた雄ラット（７週齢、Ｓａｍ  ｔａｃｏ  ＢｉｏＫｏｒｅａ）の腹膜脂肪細胞を利用して、抗ヒスタミン効果を測定した。陽性対照群としてはケトチフェン（Ｓｉｇｍａ）を使用した。卵白アルブミンで感作させたラットにケトチフェンを５ｍｇ／ｋｇ、試験薬物を各々２００ｍｇ／ｋｇ濃度で４日間経口投与した後、腹腔肥満細胞を分離した。分離された腹腔肥満細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度のケトチフェン、及び０．１ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬの濃度の試験薬物で処理した。最後に肥満細胞を、ヒスタミンを非免疫学的に遊離させる物質であるコンパウンド４８／８０（ｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０、Ｓｉｇｍａ）で１０μｇ／ｍＬの濃度で処理した。この時、肥満細胞から遊離したヒスタミンの量を定量して、試験物質が肥満細胞からヒスタミンの遊離を抑制させるか否かを調べた。ラットの肥満細胞から遊離したヒスタミンの、何の薬物も投与しなかった場合に対する相対的な量を測定し、結果を下記表５に示した。
【０１０３】
【表５】
0005411261.tif 000006
【０１０４】
実験の結果、上記表５に示されているように、全般的に活性が優れていることが分かり、特に、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の抗ヒスタミン効果が最も優れた活性を示したことが確認された。
【０１０５】
また、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の投与量別（１００、２００、４００ｍｇ／ｋｇ）に活性を測定し、結果を下記表６に示した。
【０１０６】
【表６】
0005411261.tif 000007
【０１０７】
実験の結果、上記表６に示されているように、実施例１−２のＣＲ−ＧＢ−１の投与量が４００ｍｇ／ｋｇである時、抗ヒスタミン効果が最も優れた活性を示したことが確認された。
【０１０８】
３−４．活性小分画（ａｃｔｉｖｅ  ｓｕｂ−ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）の鎮咳活性測定
前記実施例１−４で製造された５個の小分画（ｓｕｂ−ｆｒａｃｔｉｏｎｓ）に対する鎮咳活性を測定するために、前記実験例３−２と同一の方法で鎮咳活性に対する実験を行い、実験結果を下記表７に示した。
【０１０９】
【表７】
0005411261.tif 000008
【０１１０】
実験の結果、上記表７に示されているように、全般的に活性が優れていることが分かり、特に、Ｆｒ．３の鎮咳活性が優れていることが確認された。
【０１１１】
３−５．活性小分画の抗ヒスタミン活性測定
前記実施例１−４で製造された５個の小分画に対する鎮咳活性を測定するために前記実験例３−３と同一の実験を行い、実験結果を下記表８に示した。
【０１１２】
【表８】
0005411261.tif 000009
【０１１３】
実験の結果、上記表８に示されているように全般的に活性が優れていることが分かり、特に、Ｆｒ．３の抗ヒスタミン活性が優れていることが確認された。
【０１１４】
３−６．黄蓮抽出物の成分分析
前記実施例の黄蓮抽出物及び分画物に対する成分を分析するために、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＵＶ−スペクトロメータ、及びＦＴ−ＮＭＲなどの物理化学的分析を利用して、実験を行った。
【０１１５】
実験の結果、黄蓮抽出物にはベルベリン、パルマチン、コプチシン、コルンバミン、及びジャトロリジンが含まれていたことが確認された。前記実施例１−１乃至実施例１−４の黄蓮抽出物の成分含量を下記のように分析し、結果を表９に示した。
【０１１６】
高速液体クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ  ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５モデル、Ｗａｔｅｒｓ  ＰＤＡ  ２９９６を利用して測定した。カラムとしてＹＭＣ  Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８（Ｓ−５μｍ、１２０ｎｍ、４．６×２５０ｍｍＩ．Ｄ）を使用し、試料温度は２５℃±１、カラム温度は３０℃±１を維持した。試料濃度は１ｍｇ／ｍＬ、注入量は１０μＬ、流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとした。また、ベルベリン、パルマチン、及びコプチシンの測定のための標準物質は商品化されているものをシグマ社から購入して使用し、コルンバミンとジャトロリジンの測定のための標準物質は黄蓮から分離、精製して使用した。移動相の、０．２％燐酸溶液（溶媒Ａ）とメタノール（溶媒Ｂ）のグラジエント条件は、０分〜６０分（Ａ：Ｂ=９：１〜６：４）、６０分〜７０分（Ａ：Ｂ=６：４〜５：５）、７０分〜９０分（Ａ：Ｂ=５：５〜０：１０）とした。抽出物中の活性成分含量は、各々の標準物質に対する面積比を重量百分率で示した。
【０１１７】
【表９】
0005411261.tif 000010
【０１１８】
実験の結果、上記表９に示されているように、主要成分の含量を抽出物及び分画物の製造方法別に比較した結果、ベルベリン０．５乃至４７．０重量部、パルマチン０．２乃至２１．４重量部、コプチシン０．１乃至１８．０重量部、コルンバミン０．１乃至３．２重量部、ジャトロリジン０．１乃至２．６重量部を含有していることが確認された。
【０１１９】
３−７．ベルベリンの去痰活性測定
前記実施例１−２及び実施例１−３の黄蓮抽出物、実施例１−４で製造された５個の小分画に対する去痰活性を測定するために、前記実験例１と同一の方法で去痰活性に対する実験を行い、実験結果を下記表１０に示し、この活性に対する棒グラフを図１に示した。
【０１２０】
【表１０】
0005411261.tif 000011
【０１２１】
実施例４：アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物の活性試験
４−１．去痰活性評価試験
前記実施例２（２−１乃至２−１１）で製造された混合抽出物と単独抽出物の去痰活性を評価するために、Ｅｎｇｌｅｒらによる方法（Ｅｎｇｌｅｒ  Ｈ、Ｓｚｅｌｅｎｙｉ  Ｉ、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｍｏｔｈ．１１、１５１〜１５７、１９８４．、Ｂａｏ−ｑｕｉｎ  Ｌｉｎ  ｅｔ．、Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２１、２５９〜２６３、２００８．）を利用して、前記実験例３−１の［実験方法］と同一の方法で実験を行い、その結果を図２に示した。図２において、陽性対照群（アンブロキソール）は２５０ｍｇ／ｋｇ、残りの試験薬物は５００ｍｇ／ｋｇを経口投与した。また、そのうちの最も活性が優れた実施例２−７の抽出物に対して投与量別に去痰活性を評価し、その結果を次の表１１に示した。
【０１２２】
【表１１】
0005411261.tif 000012
【０１２３】
図２から分かるように、実施例２−１乃至２−１１の全ての混合抽出物はアイビーの葉の単独抽出物より改善された去痰効果を示し、前記結果から、黄蓮抽出物とアイビーの葉抽出物の混合による薬理学的活性への相乗作用を確認することができる。
【０１２４】
特に、実施例２−３乃至２−９の場合には陽性対照群として使用された従来の去痰剤であるアンブロキソールより優れた去痰効果を示し、アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物が重量基準に１：１乃至４：１の混合比で混合された場合、より上昇した去痰効果を示すことが分かる。
【０１２５】
上記表１１は最も活性の高い実施例２−７を投与量別に評価したものであって、実施例２−７の物質は陽性対照薬物より優れた喀痰排出能を有することが示された。特に、実施例２−７の物質は投与量１００ｍｇ／ｋｇ以上で陽性対照群と同様の効果を示し、特に、１５０ｍｇ／ｋｇ以上では陽性対照群より優れた効果を示すことが分かる。
【０１２６】
４−２．鎮咳活性評価試験
実施例２で製造されたアイビーの葉抽出物、及びアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物（実施例２−１乃至２−１１）の鎮咳活性を測定するために、Ｔａｎａｋａらによる方法（Ｍｏｔｏｍｕ  Ｔａｎａｋａ  ａｎｄ  Ｋｅｉ  Ｍａｒｕｙａｍａ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．９３、４６５〜４７０、２００３．、Ｄａｏｕｉ、Ｃｏｇｎｏｎ、Ｎａｌｉｎｅ  ｅｔ．、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．１５８、４２〜４８、１９９８．）を利用して、前記実験例３−２の［実験方法］と同一の方法で実験を行い、その結果を図３に示した。
【０１２７】
図３において、陽性対照群（テオブロミン、Ｓｉｇｍａ）は５０ｍｇ／ｋｇ、残りの試験薬物は２００ｍｇ／ｋｇを経口投与した。そのうちの最も活性が優れた実施例２−７に対して投与量別に鎮咳活性を評価し、その結果を次の表１２に示した。
【０１２８】
【表１２】
0005411261.tif 000013
【０１２９】
図３から分かるように、実施例２−１乃至２−１１の全ての混合抽出はアイビーの葉の単独抽出物より改善された鎮咳効果を示し、前記結果から黄蓮抽出物とアイビーの葉抽出物の混合による薬理学的活性への相乗作用を確認することができる。特に、実施例２−３乃至２−９の場合には、陽性対照群に使用された従来の鎮咳剤テオブロミンより優れた鎮咳効果を示して、アイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物が重量基準に１：１乃至４：１の混合比で混合された場合、より優れた鎮咳効果を示すことが分かる。
【０１３０】
また、前記の表１２は、最も活性の高い実施例２−７を投与量別に評価したものであって、投与量１００ｍｇ／ｋｇ以上で陽性対照群と同様の効果を示し、特に、１５０ｍｇ／ｋｇ以上では陽性対照群より優れた効果を示すことが分かる。
【０１３１】
４−３．抗ヒスタミン効果試験
実施例２で製造されたアイビーの葉抽出物、及びアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物（実施例２−１乃至２−１１）の肥満細胞における抗ヒスタミン効能を測定するために、Ｈｏｎｕｃｈｉらによる方法（Ｍａｓａｋｏ  Ｈｏｎｕｃｈｉ  ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｓｅｙａｍａ、Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉ．、５２（６）、７１１〜７１７、２００６．、Ｎａｏｋｉ  Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４（７）、８２９〜８３４、２００１．）を利用して、前記実験例３−３の［実験方法］と同一の方法で実験を行い、その結果を次の表１３に示した。また、そのうちの活性が優れた実施例２−７に対して投与量別に抗ヒスタミン効能を評価し、その結果を次の表１４に示した。
【０１３２】
【表１３】
0005411261.tif 000014
【０１３３】
【表１４】
0005411261.tif 000015
【０１３４】
前記表１３に示されているように、アイビーの葉抽出物、及び本発明による実施例２−１乃至２−１１の混合抽出物は抗ヒスタミン効果があることが確認される。特に、各々抗ヒスタミン活性を示すアイビーの葉抽出物と黄蓮抽出物を混合する場合、相乗作用が生じることが分かる。また、前記表１４は、最も活性が優れた実施例２−７を投与量別に評価したものであって、これにより実施例２−７の物質が優れた抗ヒスタミン活性を示すことが分かる。
【０１３５】
４−４．気管支収縮抑制試験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
実施例２で製造されたアイビーの葉抽出物、及びアイビーの葉と黄蓮の混合抽出物（実施例２−１乃至２−１１）の気道収縮抑制効能を測定するために、Ｃａｓｏｎｉ  ＧＬらによる方法（Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．、３３、９９９−１００４、２００３、Ａｎｅｓｔｈ  Ａｎａｌｇ．、８９、１９１−１９６、１９９９、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１２８、５７７−５８４、１９９９）を利用して、下記の工程によって実験を行った。
【０１３６】
Ｈａｒｔｅｌｙ系雄モルモット（３５０〜４００ｇ、大韓バイオリンク）にペントバルビタールナトリウム（ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  ｓｏｄｉｕｍ、７５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔投与して麻酔させた後、気管支を摘出した。クレープス−ヘンゼライト（Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ）溶液内で摘出気管支を約３〜５ｍｍ程度に切断して分節に分けた後、オルガンバス（ｏｒｇａｎ  ｂａｔｈ）内で固定させ、１０−４Ｍ  ヒスタミンを潅流させて摘出気管支を収縮させた。その後、これに試験物質（０．５０ｍｇ／ｍＬ）を加えて、摘出気管支の緊張度変化を測定した。陽性対照薬物として、ニトロプルシドナトリウム二水和物（ｓｏｄｉｕｍ  ｎｉｔｒｏｐｒｕｓｓｉｄｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）を２．６×１０−５ｍｇ／ｍＬ濃度で使用した。１０−４Ｍ  ヒスタミンで誘発した収縮を１００％と仮定して、賦形剤対照群弛緩率（％）を同じ条件で得られた試験物質投与群及び陽性対照薬物投与群の弛緩率（relaxation rate）（％）から差し引くことで、試験物質投与群及び陽性対照薬物投与群の弛緩率（relaxation rate）（％）を算出した。このように得られた気管支弛緩率（気管支収縮抑制能）を図４に示し、活性が最も優れた実施例２−７に対して投与量別に気管支弛緩率を評価して、表１５に示した。
【０１３７】
【表１５】
0005411261.tif 000016
【０１３８】
図４に示されているように、アイビーの葉抽出物、及び実施例２−１乃至２−１１の混合抽出物は全て気管支収縮抑制効果があることを確認した。さらに、実施例２−１乃至２−１１の全ての混合抽出物がアイビーの葉の単独抽出物より増進された気管支収縮抑制効果を示した。前記表１５は最も活性が優れた実施例２−７を投与量別に評価したものであって、優れた気管支収縮抑制活性を示すことが分かる。
【０１３９】
４−５．マウス喘息モデルを利用した抗喘息効果試験
前記実験例４−１乃至４−４の結果において効果が最も優れていた実施例２−７の混合抽出物のマウス喘息モデルを利用した抗喘息効果を確認するために、Ｔａｎｇ  Ｍ．Ｌ．Ｋ．らによる方法（Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１４、２０３−２１０、２００１、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７９、１４１−１４４、２００１、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８９（１０）、１６２１−１６２９、１９９９）を利用して試験した。そして評価のために、メタコリンに対する気道過敏性（Ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ；ＡＨＲ）調査、血漿内のＩｇＥ数値調査、気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ；ＢＡＬＦ）における細胞数及び白血球細胞分布調査、肺組織観察、及びＲＴ−ＰＣＲ（ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−１３ｒ２ａ）をおこなった。
【０１４０】
［実験方法］
Ｂａｌｂ／ｃマウス（１８〜２１ｇ、Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ  Ｉｎｃ．）に、腹腔注射用に調製したオボアルブミン（ＯＶＡ、Ｓｉｇｍａ）溶液を一匹当り５００μＬ（ＯＶＡとして２０μｇ）、Ｄａｙ０とＤａｙ７に腹腔投与し、ＯＶＡ吸入投与（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）用に調製した溶液でｎｕｂｕｌｉｚｅｒ（ＮＥ−Ｕ１７、ＯＭＲＯＮ  Ｃｏ．Ｌｔｄ、Ｊａｐａｎ）を利用して感作後、調製した５％ＯＶＡ溶液をＤａｙ１４からＤａｙ２０まで毎日３０分ずつ吸入投与した。陽性対照薬物としてはモンテルカストナトリウム（ｍｏｎｔｅｌｕｋａｓｔ  ｓｏｄｉｕｍ）を３０ｍｇ／ｋｇ、全ての試験物質は２００ｍｇ／ｋｇを使用した。陽性対照薬物及び試験物質は感作後にＤａｙ１４からＤａｙ２０までの７日間、ＯＶＡ吸入投与する１時間前に毎日経口投与し、そして次の評価項目による試験を行った。
【０１４１】
１）メタコリン（Ｍｅｔｈａｃｈｏｌｉｎｅ）に対する気道過敏性（Ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ；ＡＨＲ）調査
最後にＯＶＡ吸入投与してから２４時間後に（Ｄａｙ２１）、マウスを全身プレスチモグラフ（ｗｈｏｌｅ  ｂｏｄｙ  ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈ）（ＢＵＸＣＯ、ＵＳＡ）に入れ、メタコリン０、１０、及び２０ｍｇ／ｍＬ濃度の溶液を０．４ｍＬ取って、エアゾールに入れてマウスに各々３分間吸入投与し、投与時点から４分間Ｐｅｎｈを測定して、平均値を当該メタコリン投与量におけるＰｅｎｈ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ）とした。
【０１４２】
２）血漿内のＩｇＥ数値調査（Ｄａｙ２１）
１）の測定が終わった動物について、眼窩採血によって約０．０５ｍＬの血液を得た後、遠心分離して得られた血漿を二つに分けた後、１：１０に希釈してＩｇＥ  エライザ診断（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ；マウスＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、ＭＥ−１５１、ＳＨＩＢＡＹＡＧＩ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、ＪＡＰＡＮ）により血漿内の免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の数値を調査した。
【０１４３】
３）気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ；ＢＡＬＦ）における細胞数及び白血球細胞分布の調査（Ｄａｙ２２）
２）の採血が終わった動物にペントタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射して麻酔した後、左肺をニッパーで固定した状態でＰＢＳ溶液０．４ｍＬを気管支と肺に注入した後、抜き出して洗浄液を取り、これを３回繰り返した。この溶液１，５００ｇを遠心分離して上澄み液を捨て、沈殿物にＰＢＳ０．２ｍＬを加えて再び懸濁した。これを自動血球分析装置（Ａｄｖｉａ  １２０  ｃｏｕｌｔｅｒ  ｃｏｕｎｔｅｒ、ＢＡＹＥＲ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、全白血球細胞、好中球、好酸球、及びリンパ球細胞の数を測定した。
【０１４４】
４）肺組織の観察
ニッパーで固定した左肺を取って１０％ホルマリン溶液に一日間固定した後、ティッシュプロセッサー（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）でパラフィンを浸透させた組織をミクロトームを利用して３−４μｍの厚さに切断することで、組織切片を作製した。用意されたスライドをエオシン（Ｅｏｓｉｎ）染色し、バルサム（ｂａｌｓａｍ）でカバースライドを覆い、顕微鏡で観察して、細気管支の閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）と炎症細胞の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の程度を調査した。
【０１４５】
５）ＲＴ−ＰＣＲ
右肺組織を迅速に取って試験実施前に−８０℃で保管した。ＲＮＡ−Ｂｅｅ（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ  Ｉｎｃ．ＵＳＡ）を利用して組織よりＲＮＡを分離し、分離されたＲＮＡを分光光度計を利用して２６０ｎｍで定量した後、４μｇのＲＮＡとＯｌｉｇｏ  ｄＴ  ２μＬ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及びＤＥＰＣ  ｗａｔｅｒを加えることで１０μＬにし、６５℃で５分間反応させた。その後、５ｘ  反応バッファー（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）  ５μＬ＋ＲＴａｓｅ  ２μＬ＋ｄＮＴＰ  ５μＬ＋ＲＮａｓｅ抑制剤１μＬ＋ＤＥＰＣ  ｗａｔｅｒ  ２μＬを入れ、総量２５μＬの混合物を４２℃で１時間、１００℃で５分間反応させてｃＤＮＡを調製した。前記使用された試薬は全てＰｒｏｍｅｇａから購入して使用した。ＰＣＲは準備しておいたプライマー（ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−１３ｒ２ａ）を使用して行った。使用されたプライマーは次の通りである。
【０１４６】
ＩＬ−１β  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＣＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１）、
ＩＬ−１β  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＣＣＡＴＡＣＴＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＣＧＧＡＴＴ−３’（配列番号２）；
ＩＬ−４  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＧ−３’（配列番号３）、
ＩＬ−４  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＡＴＣＣＡＧＧＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＣ−３’（配列番号４）；
ＩＬ−１３ｒ２ａ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＴＴＡＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣＡＣＴＴＧＡＧ−３’（配列番号５）、
ＩＬ−１３ｒ２ａ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＴＧＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＣＡＴＡＴＣＡＧＡＴ−３’（配列番号６）。
【０１４７】
ＰＣＲ条件は９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃１分の３２サイクル（ｃｙｃｌｅ）であり、ＰＣＲ反応物を２％アガロースゲルに電気泳動させ、ＥｔＢｒ染色し、その後、ＵＶを照射し、密度を比較し、アクチンの密度値で分けてその値を分析した。
【０１４８】
［実験結果］
１）メタコリンに対する気道過敏性（Ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ；ＡＨＲ）調査
陽性対照薬物として使用されたモンテルカスト（ＤＲ．ＲＥＤＤＹ’Ｓ）とアイビーの葉抽出物、及び実施例２−７の混合抽出物の濃度によるメタコリンに対する気道過敏性は下記の表１６に示した。
【０１４９】
【表１６】
0005411261.tif 000017
【０１５０】
上記表１６に示されたように、実施例２−７の混合抽出物は、陽性対照薬物及びアイビーの葉抽出物を単独で使用した場合より優れた気道過敏性抑制活性を有することが明らかになった。
【０１５１】
２）血漿内のＩｇＥの数値調査
陽性対照薬物として使用されたモンテルカスト、アイビーの葉抽出物、及び実施例２−７で得られた混合抽出物の濃度による血漿内ＩｇＥの数値は下記の表１７に示した。
【０１５２】
【表１７】
0005411261.tif 000018
【０１５３】
上記表１７に示されたように、本発明による実施例２−７の物質を投与した群は、アイビーの葉抽出物を単独投与した群及び陽性対照薬物を投与した群より、炎症を媒介するＩｇＥの数値が少ないことが確認される。
【０１５４】
３）気管支肺胞洗浄液（Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ；ＢＡＬＦ）における細胞数
陽性対照薬物として使用されたモンテルカスト、アイビーの葉抽出物、及び実施例２−７で得られた混合抽出物の濃度による気管支肺胞洗浄液における好中球及び好酸球細胞数を下記の表１８に示した。
【０１５５】
【表１８】
0005411261.tif 000019
【０１５６】
上記表１８に示されたように、実施例２−７の物質を投与した群は、アイビーの葉抽出物を単独で投与した群及び陽性対照薬物を投与した群より炎症に関わる白血球（好中球、好酸球）の数値が低いことが分かる。
【０１５７】
４）肺組織の観察
陽性対照薬物として使用されたモンテルカスト、アイビーの葉抽出物、及び実施例２−７で得られた混合抽出物の濃度による細気管支の閉塞（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）と炎症細胞の浸潤（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の程度は下記の表１９に示し、Ｈ＆Ｅ染色を利用した染色された肺組織の写真は図５に示した（（ａ）正常群、（ｂ）誘発群、（ｃ）陽性対照群、（ｄ）実施例２−７）。下記の表１９においては、閉塞及び炎症細胞の浸潤の程度によって、１＝無し（Ｎｏ）、２＝軽微（ｓｌｉｇｈｔ）、３＝薄い（ｔｈｉｎ）、４＝中程度（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、５＝濃い（ｔｈｉｃｋ）を示す。
【０１５８】
【表１９】
0005411261.tif 000020
【０１５９】
上記表１９に示されたように、実施例２−７の混合抽出物は、アイビーの葉抽出物及び陽性対照薬物より優れた肺組織の気管支閉塞抑制及び炎症細胞浸潤抑制活性を有することが確認された。
【０１６０】
５）ＲＴ−ＰＣＲ
陽性対照薬物として使用されたモンテルカスト及び実施例２−７で得られた試験物質の、濃度による炎症を媒介するサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−１３ｒ２ａ）の発現率を下記の表２０に示した。下記の表２０の数値は、各サイトカインのＵＶ照射による密度をアクチンの密度値で割ることで得られた値である。
【０１６１】
【表２０】
0005411261.tif 000021
【０１６２】
上記表２０に示されたように、実施例２−７の物質を投与した群は、アイビーの葉抽出物を単独投与した群及び陽性対照薬物を投与した群に比べて炎症を媒介するサイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−１３ｒ２ａ）の発現が抑制されることが確認される。
【０１６３】
実施例５．黄蓮抽出物の製剤化
５−１．散剤の製造
黄蓮抽出物（実施例１−１）              ２０ｍｇ
乳糖                                    １００ｍｇ
タルク                                  １０ｍｇ
前記の成分を混合して気密袋に充填することによって散剤を製造した。
【０１６４】
５−２．錠剤の製造
黄蓮抽出物（実施例１−２）              １０ｍｇ
とうもろこし澱粉                        １００ｍｇ
乳糖                                    １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法によって打錠して錠剤を製造した。
【０１６５】
５−３．カプセル剤の製造
黄蓮抽出物（実施例１−３）              １０ｍｇ
結晶性セルロース                        ３ｍｇ
ラクトース                              １４．８ｍｇ
マグネシウムステアレート                ０．２ｍｇ
通常のカプセル剤製造方法によって前記の成分を混合し、ゼラチンカプセルに充填することによってカプセル剤を製造した。
【０１６６】
５−４．注射剤の製造
黄蓮抽出物（実施例１−４）              １０ｍｇ
マンニトール                            １８０ｍｇ
注射用滅菌蒸溜水                        ２９７４ｍｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４、１２Ｈ２Ｏ                ２６ｍｇ
通常の注射剤の製造方法によって、１アンプル（２ｍＬ）当り前記の成分含量で製造した。
【０１６７】
５−５．液剤の製造
黄蓮抽出物（実施例１−１）              ２０ｍｇ
異性化糖                                １０ｇ
マンニトール                            ５ｇ
精製水                                  適量
通常の液剤の製造方法によって精製水に各々の成分を加えて溶解させ、レモンを適量加えて前記の成分を混合した後、精製水を加えて、総量を１００ｍＬに調節した後、茶色瓶に充填して滅菌させることによって液剤を製造した。
【０１６８】
５−６．健康食品の製造
黄蓮抽出物（実施例１−２）              １０００ｍｇ
ビタミンＡアセテート                    ７０μｇ
ビタミンＥ                              １．０ｍｇ
ビタミンＢ                              １０．１３ｍｇ
ビタミンＢ                              ２０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６                            ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２                          ０．２μｇ
ビタミンＣ                              １０ｍｇ
ビオチン                                １０μｇ
ニコチン酸アミド                        １．７ｍｇ
葉酸                                    ５０μｇ
パントテン酸カルシウム                  ０．５ｍｇ
無機質混合物                            適量
硫酸第１鉄                              １．７５ｍｇ
酸化亜鉛                                ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム                        ２５．３ｍｇ
第１燐酸カリウム                        １５ｍｇ
第２燐酸カルシウム                      ５５ｍｇ
クエン酸カリウム                        ９０ｍｇ
炭酸カルシウム                          １００ｍｇ
塩化マグネシウム                        ２４．８ｍｇ
前記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的に健康食品に適した好ましい混合組成の実施例を示すが、その配合比を任意に変更しても差し支えず、通常の健康食品の製造方法によって前記の成分を混合して顆粒を製造し、通常の方法によって健康食品組成物製造に使用することができる。
【０１６９】
５−７．健康飲料の製造
黄蓮抽出物（実施例１−３）              １０００ｍｇ
クエン酸                                １０００ｍｇ
オリゴ糖                                １００ｇ
梅濃縮液                                ２ｇ
タウリン                                １ｇ
精製水を加えて                          全体９００ｍＬ
通常の健康飲料の製造方法によって前記の成分を混合した後、約１時間の間８５℃で攪拌加熱した後、作られた溶液を濾過して滅菌された２Ｌ容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管した。
【０１７０】
前記組成比は比較的に嗜好飲料に適した好ましい混合組成の実施例を示すが、需要階層、需要国家、使用用途などの地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変更しても差し支えない。
【０１７１】
実施例６．アイビーの葉と黄蓮の混合抽出物の製剤化
６−１．錠剤の製造
前記実施例２−７の混合抽出物２００ｍｇ、軽質無水硅酸１０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム２ｍｇ、微細結晶セルロース５０ｍｇ、デンプングリコール酸ナトリウム（starch sodium glycolic acid）２５ｍｇ、コーンスターチ１１３ｍｇ、及び無水エタノール適量を混合して、通常の方法によって錠剤に打錠した。
【０１７２】
６−２．健康食品の製造
混合抽出物（実施例２−７）              １０００ｍｇ
ビタミンＡアセテート                    ７０μｇ
ビタミンＥ                              １．０ｍｇ
ビタミンＢ１                            ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２                            ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６                            ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２                          ０．２μｇ
ビタミンＣ                              １０ｍｇ
ビオチン                                １０μｇ
ニコチン酸アミド                        １．７ｍｇ
葉酸                                    ５０μｇ
パントテン酸カルシウム                  ０．５ｍｇ
無機質混合物                            適量
硫酸第１鉄                              １．７５ｍｇ
酸化亜鉛                                ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム                        ２５．３ｍｇ
第１燐酸カリウム                        １５ｍｇ
第２燐酸カルシウム                      ５５ｍｇ
クエン酸カリウム                        ９０ｍｇ
炭酸カルシウム                          １００ｍｇ
塩化マグネシウム                        ２４．８ｍｇ
前記のビタミン及びミネラル混合物の組成比は、比較的に健康食品に適した好ましい混合組成の実施例を示すが、その配合比を任意に変更しても差し支えず、通常の健康食品製造方法によって前記の成分を混合して顆粒を製造し、通常の方法によって健康食品組成物製造に使用することができる。
【０１７３】
６−３．健康飲料の製造
混合抽出物（実施例２−７）                   １０００ｍｇ
クエン酸                                １０００ｍｇ
オリゴ糖                                １００ｇ
梅濃縮液                                ２ｇ
タウリン                                １ｇ
精製水を加えて                          全体９００ｍＬ
通常の健康飲料の製造方法によって前記の成分を混合した後、約１時間の間８５℃で攪拌加熱した後、作られた溶液を濾過して滅菌された２Ｌ容器に取得して密封滅菌した後、冷蔵保管した。
【０１７４】
前記組成比は比較的に嗜好飲料に適した混合組成の好ましい実施例を示すが、需要階層、需要国家、使用用途などの地域的、民族的嗜好度によってその配合比を任意に変更しても差し支えない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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