(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個の免疫原をコードする導入遺伝子を送達し支配するための複製欠損アデノウイルスベクターであって、
配列番号５７または配列番号９６に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むアデノウイルスゲノムを含み、ここでＥ１、Ｅ２及びＥ４からなる群から選択される少なくとも１個の遺伝子が機能的に欠失するよう改変されている、前記複製欠損アデノウイルスベクター。
【請求項２】
アデノウイルスゲノムが、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の複製欠損アデノウイルスベクター。
【請求項３】
アデノウイルスゲノムが、配列番号２５に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載の複製欠損アデノウイルスベクター。
【請求項４】
Ｅ１ヌクレオチド配列の機能的欠失により特徴付けられる、請求項１〜３のいずれかに
記載の複製欠損アデノウイルスベクター。
【請求項５】
Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ４、ｏｒｆｓ  １，２、３、４、５、６、６／７、ｐＩＸ、ＩＶａ２、領域Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５からなる群から選択される１以上のアデノウイルス領域を発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
ａ）配列番号２５に記載のヌクレオチド配列を含むヘキソン遺伝子配列；及び
ｂ）配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む繊維遺伝子配列
を含む、単離された組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項７】
その投与により増強された反応が誘発される、請求項１〜４のいずれかに記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、前記複製欠損アデノウイルスベクターの十分量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における抗原特異的免疫反応を増強する方法において使用するための組成物。
【請求項８】
前記ベクターが、そのＥ１遺伝子を完全に欠失され、さらにそのＥ３遺伝子を任意選択的に欠失されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記免疫反応が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な増強免疫反応である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
前記増強された免疫反応が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を含む、請求項７または請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
その投与により一次免疫反応が誘発される、請求項１〜４のいずれかに記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、少なくともそのＥ１遺伝子の機能的欠損を含有する前記複製欠損アデノウイルスベクターの十分量を哺乳動物に投与することを含む、未処置哺乳動物において免疫反応を誘発する方法において使用するための、組成物。
【請求項１２】
前記増強された反応又は一次免疫反応はそれぞれ、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ（リーシュマニア・メジャー）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（四日熱マラリア原虫）、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＣＭＶ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｏｌｏｓｉｓ（マイコバクテリウム・テュバキュローシス）からなる群から選択される感染物質由来の抗原に特異的である、請求項７または請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記免疫反応が、前記哺乳動物が寛容性を有する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な一次免疫反応である、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
感染物質由来の抗原に対して、免疫反応を誘導する方法において使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、ここで前記方法は、（ａ）抗原特異的免疫反応が望まれる感染物質抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一のワクチン組成物を投与することによって、感染物質抗原に反応させるために宿主に初回刺激を行うステップと、（ｂ）少なくともそのＥ１遺伝子が機能的に欠失され、該Ｅ１遺伝子が欠失した部位において、該初回刺激ステップで送達されるものと同じ感染物質抗原をコードするＤＮＡの発現を支配することが可能であるプロモーターを含む配列を含有する、請求項４に記載のアデノウイルスベクターを含む第二のワクチン組成物を投与することによって、ステップ（ａ）の免疫反応を増強するステップとを含み、 前記第二のワクチン組成物の投与が、防御的免疫を付与する効果を有する免疫反応を誘発する、前記組成物。
【請求項１５】
前記感染物質由来の抗原が、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ（リーシュマニア・メジャー）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（四日熱マラリア原虫）、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＣＭＶ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｏｌｏｓｉｓ（マイコバクテリウム・テュバキュローシス）からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第二のワクチン組成物が、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ１、ＨＳＶ２、ＳＡＲＳ  ＣｏＶ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ（リーシュマニア・メジャー）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（四日熱マラリア原虫）、エボラウイルス、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、ＣＭＶ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｏｌｏｓｉｓ（マイコバクテリウム・テュバキュローシス）からなる群から選択される感染物質由来の抗原をコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫反応が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を含む、請求項１４に記載の組成物
。
【請求項１８】
自己抗原に対する宿主寛容性を打破する方法において使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載の複製欠損アデノウイルスベクターを含む組成物であって、ここで前記方法が、（ａ）抗原特異的免疫反応が望まれる自己抗原をコードするヌクレオチド配列を含む第一のワクチン組成物を投与することによって、自己抗原に対して反応させるために宿主に初回刺激を行い、それによって、一次免疫反応を誘発するステップと、（ｂ）少なくともそのＥ１遺伝子が機能的に欠失され、該Ｅ１遺伝子欠失の部位において、初回刺激ステップで送達される同じ自己抗原をコードするＤＮＡの発現を支配することが可能であるプロモーターを含む配列を含有する、組換えアデノウイルスベクターを含む第二のワクチン組成物を投与することによって、ステップ（ａ）の一次免疫反応を増強するステップとを含み、 前記第二のワクチン組成物の投与が、自己抗原に対する宿主の寛容性を打破する効果を有する免疫反応を誘発する、組成物。
【請求項１９】
前記第二のワクチン組成物が、ＨＥＲ２  ＮＥＵ、ＣＥＡ、ＨＥＰＣＡＭ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、テロメラーゼ、ＧＰ１００、ＭＥＬＡＮ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ストロメリシン  ３、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ３、ＣＭＬ６８、ＣＭＬ６６、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＳＸ−２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＮＹ−ＢＲ−６２、ＨＫＬＰ２、５Ｔ４及びＶＥＧＦＲ２からなる群から選択される、自己抗原をコードするＤＮＡを含むアデノウイルスベクターを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫反応が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記第一及び第二のワクチン組成物が相互に、異なる血清型により特徴付けられるアデノウイルスベクターである、請求項１９または２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書中に組み込む、２００４年１月２３日提出の、米国仮出願第６０／５３８，７９９の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、組み換えベクターの分野、とりわけ、哺乳動物宿主において免疫反応を誘発するための組み換え複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターの産生及び使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
アデノウイルス（Ａｄ）は、エンベロープのない２０面体のキャプシド構造を有する、両性類、鳥類及び哺乳動物において見出される２本鎖ＤＮＡウイルスの大きなファミリーを含む（Ｓｔｒａｕｓ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．４５１−４９８，１９８４；Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５８：８０４−８１３，１９９８；Ｓｃｈｎｕｒｒ及びＤｏｎｄｅｒｏ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ．，３６：７９−８３，１９９３；Ｊｏｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−３９４５：１９９９）。レトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、宿主細胞のゲノムに組み込まれることなく、分裂細胞及び非分裂細胞の両方を含む、いくつかの哺乳動物種の多数の細胞タイプに形質導入することができる。
【０００４】
一般に、アデノウイルスＤＮＡは、通常、非常に安定で、形質転換又は腫瘍形成が起こらない限り、エピソーム性のままである（例えば染色体外性）。さらに、アデノウイルスベクターは、臨床グレードの組成物の製薬規模の産生に容易に持って行くことができる、よく分かっている産生系において高収量に増殖させることができる。これらの特性及びそれらのよく調べられている分子遺伝学により、組み換えアデノウイルスベクターは、ワクチン担体としての使用のための優れた候補となっている。通常、組み換えアデノウイルスベクターの産生は、非機能的となるように欠失されている又は加工されているアデノウイルス遺伝子産物の機能を補完することができるパッケージング細胞株の使用に依存している。
【０００５】
現在、性質がよく調べられている２種類のヒトサブグループＣアデノウイルス血清型（つまりｈＡｄ２及びｈＡｄ５）が、遺伝子治療のために使用される殆どのアデノウイルスベクターに対するウイルス骨格のソースとして広く使用されている。複製欠損ヒトアデノウイルスベクターに対してまた、様々な感染物質（例えば、ウイルス、寄生生物又は細菌病原体）及び、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を含む腫瘍細胞由来の様々な免疫原送達のためのワクチン担体としての試験が行われている。
【０００６】
実験動物（例えば、げっ歯類、サル及び非ヒト哺乳動物）において行われた研究から、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ−１６）のＥ６及びＥ７癌タンパク質（Ｈｅ、Ｚら、（２００１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７０：３５８３−３５９０）、狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｘｉａｎｇ，Ｚら、（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１９：２２０−２２７）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（熱帯熱マラリア原虫）のスポロゾイト周囲タンパク質（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１２６８−１２７４）ならびにその他の異種抗原由来の免疫原をコードする導入遺伝子を担う組み換え複製欠損ヒトアデノウイルスベクターが、その導入遺伝子産物に対する液性及び細胞性免疫反応の両方を誘導することが示されている。一般には、研究者らは、免疫反応を誘発すると予想される組み換えアデノウイルスベクターの高用量を用いる免疫付与プロトコールを用いて、又は、追加免疫付与として、異なる血清型由来であるが同じ導入遺伝子産物を担うアデノウイルスベクターの連続投与を利用する免疫付与プロトコールを用いることのいずれかにより、非ヒト実験系においてワクチン担体としてヒトアデノウイルスベクターを使用して、成功を報告している（Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：７９−８７（１９９６））。
【０００７】
しかし、２型及び５型などの、遍在性ヒト血清型由来のワクチン担体は、ヒト集団において既存の液性及び細胞性免疫に直面すると予想されている。したがって、複製欠損組み換えヒトアデノウイルスが、成功裡にワクチン担体としてげっ歯類、サル及び非ヒト霊長類宿主を用いた実験系で利用されているにもかかわらず、ヒトの先天的及び適応的免疫により、ワクチン担体としてのこれらの血清型の利用が著しく制限されると予想される。この予想は、２型及び５型を含むサブグループＣのアデノウイルス感染が、ヒト集団において固有であるという事実に基づくものである。その結果、大部分のヒトで、自然感染の結果として、生まれてから最初の５年間のうちに血清転換が起こっている。したがって、ヒトにおいて自然に感染し複製するウイルス由来のベクターは、ワクチン担体としての使用に対して最適な候補ではない可能性がある。
【０００８】
ヒトアデノウイルス由来ベクターの使用に関する別の問題は、組み換えウイルスを増殖させるために使用される産生方法により、複製可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）が混入しているベクターストックを生じるというリスクである。これは、ヒト２９３細胞などのＥ１補完ヘルパー細胞株において存在する、組み換えベクターとアデノウイルス遺伝子との重複配列間の相同組み換えにより起こる（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）。臨床試験での使用のために調製されたベクターストックにおけるＲＣＡの存在は、複製欠損ウイルスの移行及び拡大を促進する可能性があるため、安全性リスクの一要素である。欠損ウイルスの拡大により、宿主免疫反応が拡大され、他の不都合な免疫病理学的結果を生じる可能性がある（Ｆａｌｌｕｘ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１９０９−１９１７（１９９８））。したがって、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（食品医薬品局）（ＦＤＡ）及びその他の規制機関は、臨床での使用を意図されるベクター調製物中に存在し得るＲＣＡのレベルにおける制限を確立するガイドラインを広めてきた。ＲＣＡ制限を課す意図は、臨床試験で使用される組成物中での複製するアデノウイルスへの患者の曝露を確実に制限することにある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｓｔｒａｕｓ，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．４５１−４９８，１９８４
【非特許文献２】Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５８：８０４−８１３，１９９８
【非特許文献３】Ｓｃｈｎｕｒｒ及びＤｏｎｄｅｒｏ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ．，３６：７９−８３，１９９３
【非特許文献４】Ｊｏｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７：３９４０−３９４５：１９９９
【非特許文献５】Ｈｅ、Ｚら、（２００１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２７０：３５８３−３５９０
【非特許文献６】Ｘｉａｎｇ，Ｚら、（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１９：２２０−２２７
【非特許文献７】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｅら、（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１２６８−１２７４
【非特許文献８】Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７：７９−８７（１９９６）
【非特許文献９】Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２
【非特許文献１０】Ｆａｌｌｕｘ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１９０９−１９１７（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、引き続き、操作しやすく、製薬スケールに持って行きやすく、長期保存でき、ヒトの補完的細胞株で高レベルで複製することができ、免疫原性が高く、ヒトアデノウイルスの共通血清型と交差反応する中和Ｂ細胞エピトープを欠いており、規制当局により広められている安全性ＲＣＡ基準に合致し、ヒトでの使用に適切な初回刺激／追加免疫に使用できる、ヒト宿主での使用に適したアデノウイルスワクチン担体の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、チンパンジーアデノウイルス由来の組み換え複製欠損アデノウイルスベクター及びヒトＥ１発現細胞株においてチンパンジーアデノウイルスベクターを生成させるための方法に関する。本発明はまた、ヒトにおける使用に適切な臨床グレードのベクターストックを生成させるための方法及び、防御的及び／又は治療的免疫反応を誘発するために、開示するベクターをワクチン担体として使用するための手段を提供する。本発明はさらに、免疫原をコードする導入遺伝子を送達し、発現を支配するように設計されたワクチン組成物を調製するための、本発明の組み換えアデノウイルスを使用するための方法を提供する。ある実施形態において、本発明は、感染物質由来の免疫原をコードする導入遺伝子を含有するワクチン投与のための、ワクチン担体としての、開示するベクターの使用をもくろむ。第二の実施形態において、本発明は、癌ワクチンを調製及び投与するための、開示するベクターの使用をもくろむ。特定の実施形態において、本発明は、ＴＡＡをコードする導入遺伝子を含有する癌ワクチンの調製及び投与をもくろむ。
【００１２】
ある局面において、本発明は、本明細書中で、ＣｈＡｄ３（配列番号１）（図５Ａ−５Ｋ）、ＣｈＡｄ６（配列番号２）（図６Ａ−６Ｋ、ＣＶ３２（配列番号３）（図７Ａ−７Ｋ）、ＣＶ３３（配列番号４）（図８Ａ−８Ｋ）及びＣＶ２３（配列番号５）（図９Ａ−９Ｊ）と呼ばれる、５種類のチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ）の完全ゲノム配列を開示する。
【００１３】
ＣｈＡｄ３及びＣｈＡｄ６は、本明細書中で開示する方法に従い単離された新規アデノウイルスを表す。ＣｈＡｄ３及びＣｈＡｄ６のゲノムは、それぞれ３７７４１及び３６６４８塩基対の長さである。このＣｈＡｄ３ヘキソン遺伝子（配列番号４１）は、配列番号１のヌクレオチド（ｎｔ）１９０８６から２１９６５（停止コドンを除く。）を含有し、ＣｈＡｄ３繊維遺伝子（配列番号４２）は、配列番号１のｎｔ３２８０５から３４４８７（停止コドンを除く。）を含有する。ＣｈＡｄ６ヘキソン遺伝子は、配列番号２のｎｔ１８２６６−２１１２４（配列番号４３）（停止コドンを除く。）を含有し、その繊維遺伝子（配列番号４４）は、配列番号２のｎｔ３２２１８から３３５５２（停止コドンを除く。）を含有する。全長ヘキソンペプチドの多配列アラインメントから推定される配列相同性に基づき、ＣｈＡｄ３は、ヒトサブグループＣに分類され、ＣｈＡｄ６は、ヒトサブグループＥに分類される。
【００１４】
ＣＶ３２、ＣＶ３３及びＣＶ２３アデノウイルスのゲノムは、それぞれ、３６，６０６、３６，５３５及び３２，０２０塩基対の長さである。ＣＶ３２（Ｐａｎ６）（ＡＴＣＣ  Ｎ．ＶＲ−５９２）、ＣＶ３３（Ｐａｎ７）（ＡＴＣＣ  Ｎ．ＶＲ−５９３）及びＣＶ２３（Ｐａｎ５）（Ｅｓｏｔｅｒｉｘ  Ｉｎｃ．，）は、全て、ヒトＡｄ４（ｈＡｄ４）に関連することが分かっている（サブグループＥ）（Ｗｉｇａｎｄ，Ｒら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９８９，３０：１−９）。しかし、ヘキソン配列アラインメントに基づいて、ＣＶ３２は、その後、ｈＡｄ４よりも、ヒトサブグループＤメンバーに密接に類似するものとして特徴付けられた。
【００１５】
第二の局面において、本発明は、本明細書中で開示する方法に従い単離された２１種類のさらなるチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２）の繊維及びヘキソン遺伝子に対するヌクレオチド配列を提供する。
【００１６】
ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９に対する繊維遺伝子ヌクレオチド配列は、それぞれ図１０から図１９に記載されており、本明細書中で、配列番号６から１５（配列番号６、ＣｈＡｄ２０）；（配列番号７、ＣｈＡｄ４）；（配列番号８、ＣｈＡｄ５）；（配列番号９、ＣｈＡｄ７）；（配列番号１０、ＣｈＡｄ９）；（配列番号１１、ＣｈＡｄ１０）；（配列番号１２、ＣｈＡｄ１１）；（配列番号１３、ＣｈＡｄ１６）（配列番号１４、ＣｈＡｄ１７）及び（配列番号１５、ＣｈＡｄ１９）と呼ばれる。
【００１７】
ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２に対する繊維遺伝子ヌクレオチド配列は、本明細書中で（配列番号５８、ＣｈＡｄ８）、（配列番号６０、ＣｈＡｄ２２）、（配列番号６２、ＣｈＡｄ２４）、（配列番号６４、ＣｈＡｄ２６）、（配列番号６６、ＣｈＡｄ３０）、（配列番号６８、ＣｈＡｄ３１）、（配列番号７０、ＣｈＡｄ３７）、（配列番号７２、ＣｈＡｄ３８）、（配列番号７４、ＣｈＡｄ４４）、（配列番号７６、ＣｈＡｄ６３）及び（配列番号７８、ＣｈＡｄ８２）と呼び、配列リストに記載する。
【００１８】
ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９に対するヘキソン遺伝子ヌクレオチド配列は、図２１−３０にそれぞれ記載され、本明細書中で、配列番号１６から２５：（配列番号１６、ＣｈＡｄ２０）；（配列番号１７、ＣｈＡｄ４）；（配列番号１８、ＣｈＡｄ５）；（配列番号１９、ＣｈＡｄ７）；（配列番号２０、ＣｈＡｄ９）；（配列番号２１、ＣｈＡｄ１０）；（配列番号２２、ＣｈＡｄ１１）；（配列番号２３、ＣｈＡｄ１６）；（配列番号２４、ＣｈＡｄ１７）及び（配列番号２５、ＣｈＡｄ１９）と呼ぶ。
【００１９】
ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２に対するヘキソン遺伝子ヌクレオチド配列は、本明細書中で、（配列番号９７、−ＣｈＡｄ８）、（配列番号９９、ＣｈＡｄ２２）、（配列番号１０１、ＣｈＡｄ２４）、（配列番号１０３、ＣｈＡｄ２６）、（配列番号１０５、ＣｈＡｄ３０）、（配列番号１０７、ＣｈＡｄ３１）、（配列番号１０９、ＣｈＡｄ３７）、（配列番号１１１、ＣｈＡｄ３８）、（配列番号１１３、ＣｈＡｄ４４）、（配列番号１１５、ＣｈＡｄ６３）及び（配列番号１１７、ＣｈＡｄ８２）と呼び、配列リストに記載する。
【００２０】
第三の局面において、本発明は、本明細書中で開示する方法に従い単離された、２１種類のさらなるチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２）の繊維及びヘキソンタンパク質に対するアミノ酸配列を提供する。
【００２１】
本明細書中で開示され主張される繊維タンパク質は、（配列番号８３、ＣｈＡｄ３）、（配列番号８４、ＣｈＡｄ６）、（配列番号４８、ＣｈＡｄ２０）、（配列番号４９、ＣｈＡｄ４）、（配列番号５０、ＣｈＡｄ５）、（配列番号５１、ＣｈＡｄ７）、（配列番号５２、ＣｈＡｄ９）、（配列番号５３、ＣｈＡｄ１０）、（配列番号５４、ＣｈＡｄ１１）、（配列番号５５、ＣｈＡｄ１６）、（配列番号５６、ＣｈＡｄ１７）、（配列番号５７、ＣｈＡｄ１９）、（配列番号５９、ＣｈＡｄ８）、（配列番号６１、ＣｈＡｄ２２）、（配列番号６３、ＣｈＡｄ２４）、（配列番号６５、ＣｈＡｄ２６）、（配列番号６７、ＣｈＡｄ３０）、（配列番号６９、ＣｈＡｄ３１）、（配列番号７１、ＣｈＡｄ３７）、（配列番号７３、ＣｈＡｄ３８）、（配列番号７５、ＣｈＡｄ４４）、（配列番号７７、ＣｈＡｄ６３）及び（配列番号７９、ＣｈＡｄ８２）と呼ばれる。図２０Ａから２０Ｇは、本明細書中で開示され主張される繊維タンパク質のアミノ酸配列を、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、Ｐａｎ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、Ｐａｎ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）の繊維タンパク質のアミノ酸配列と比較するアラインメントを提供する。
【００２２】
本明細書中で開示され主張されるヘキソンタンパク質は、（配列番号１２２、ＣｈＡｄ３）、（配列番号１２３、ＣｈＡｄ６）、（配列番号８７、ＣｈＡｄ２０）、（配列番号８８、ＣｈＡｄ４）、（配列番号８９、ＣｈＡｄ５）、（配列番号９０、ＣｈＡｄ７）、（配列番号９１、ＣｈＡｄ９）、（配列番号９２、ＣｈＡｄ１０）、（配列番号９３、ＣｈＡｄ１１）、（配列番号９４、ＣｈＡｄ１６）、（配列番号９５、ＣｈＡｄ１７）、（配列番号９６、ＣｈＡｄ１９）、（配列番号９８、ＣｈＡｄ８）、（配列番号１００、ＣｈＡｄ２２）、（配列番号１０２、ＣｈＡｄ２４）、（配列番号１０４、ＣｈＡｄ２６）、（配列番号１０６、ＣｈＡｄ３０）、（配列番号１０８、ＣｈＡｄ３１）、（配列番号１１０、ＣｈＡｄ３７）、（配列番号１１２、ＣｈＡｄ３８）、（配列番号１１４、ＣｈＡｄ４４）、（配列番号１１６、ＣｈＡｄ６３）及び（配列番号１１８、ＣｈＡｄ８２）と呼ばれる。図３１Ａから３１Ｊは、本明細書中で開示され主張されるヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、Ｐａｎ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、Ｐａｎ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）、（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列との比較を与える。ヘキソンタンパク質の多配列アラインメントにより、熟練者は、ヒトアデノウイルス血清型の提案される分類に従う系統発生解析を行うことが可能となる（Ｒｕｘ，Ｊ．Ｊ．ら、（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：９５５３−９５６６）。
【００２３】
代替的局面において、本発明はさらに、２１種類のさらなるチンパンジーアデノウイルス分離株を提供する。ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７及びＣｈＡｄ１９を含有する試料を、Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙのもと、オリジナル委託物として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ、Ｐｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＳＰ４  ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により、２００３年１２月１２日に委託した。この委託物に対して、次の受託番号が割り当てられた：０３１２１２０１（ＣｈＡｄ４）、０３１２１２０２（ＣｈＡｄ５）、０３１２１２０３（ＣｈＡｄ７）、０３１２１２０４（ＣｈＡｄ９）、０３１２１２０５（ＣｈＡｄ１０）、０３１２１２０６（ＣｈＡｄ１１）、０３１２１２０７（ＣｈＡｄ１６）、０３１２１２０８（ＣｈＡｄ１７）、０３１２１２０９（ＣｈＡｄ１９）及び０３１２１２１０（ＣｈＡｄ２０）。
【００２４】
ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２を含有する試料を、Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙのもと、オリジナル委託物として、ＥＣＡＣＣ（Ｐｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＳＰ４  ０ＪＧ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）により、２００５年１月１２日に委託した。これらの委託物に対して、次の受託番号が割り当てられた：０５０１１２０１（ＣｈＡｄ８）、０５０１１２０２（ＣｈＡｄ２２）、０５０１１２０３（ＣｈＡｄ２４）、０５０１１２０４（ＣｈＡｄ２６）、０５０１１２０５（ＣｈＡｄ３０）、０５０１１２０６（ＣｈＡｄ３１）、０５０１１２０７（ＣｈＡｄ３７）、０５０１１２０８（ＣｈＡｄ３８）、０５０１１２０９（ＣｈＡｄ４４）、０５０１１２１０（ＣｈＡｄ６３）及び０５０１１２１１（ＣｈＡｄ８２）。
【００２５】
これらの委託物は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  ＰｒｏｃｅｄｕｒｅにおけるＢｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙの条項に従い維持される。これらの委託物は、当業者に対する便宜としてのみ、なされたものであり、委託物が２５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２のもとで要求されることの承認ではない。特許の付与において、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８（ｂ）において規定される要件を除き、委託した物質の公共に対する利用可能性における制限は全て、変更不能に取り除かれる。
【００２６】
さらなる局面において、本発明はまた、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞に感染することができ、コードされる導入遺伝子産物の発現を支配することができる、複製欠損組み換えアデノウイルスベクターを提供する。本明細書中で示されるように、開示するベクターは、免疫反応が望まれる免疫原を含有する導入遺伝子の送達に対する使用のためのワクチン担体としての使用に適する。特定の実施形態において、本発明は、ヒトＥ１発現（つまりパッケージング）細胞株において高レベルで複製することができる、組み換え複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを提供する。ある実施形態において、本発明は、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞において複製できる組み換えアデノウイルスを提供する。
【００２７】
一般に、本発明に包含される組み換えベクターは、ヒト集団において一般に直面させられるアデノウイルス血清型に対して既存の免疫を回避するワクチン担体を提供する。とりわけ、本発明の組み換えベクターは、本明細書中で、ヒトアデノウイルス由来ベクターの共通血清型と交差反応する中和Ｂエピトープを欠いていることが示される、ベクター骨格配列を含有する。
【００２８】
本発明はさらに、アデノウイルス部分及びプラスミド部分を含み、該アデノウイルス部分が通常、ａ）ウイルス左端（ＩＴＲ及びパッケージングシグナル）、ｐＩＸ遺伝子の一部及びウイルスゲノム右端と；ｂ）遺伝子発現カセットと、を含む、群特異的シャトルベクターを提供する。この群特異的シャトルベクターは、同じ血清型サブグループ（つまり、サブグループＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ）に割り当てられ、本明細書中で開示されるヌクレオチド配列を操作するために、及び／又は、Ｅ１領域を欠くチンパンジーアデノウイルスゲノムを含有するアデノウイルスプレプラスミドを生じる、同じサブグループに属する他のチンパンジーアデノウイルスをクローニングするために、使用することができるアデノウイルスの間で観察される、ヌクレオチド配列相同性を活用するように設計されている。
【００２９】
本発明の他の局面には、アデノウイルスワクチンベクター及び／又はアデノウイルスプレプラスミドベクターを含有する宿主細胞が含まれ、該ベクターの生成方法には、アデノウイルスワクチンベクターを、アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する宿主細胞に導入することと、得られたアデノウイルスワクチンベクターを回収することと、が含まれる。特定の実施形態において、本発明は、アデノウイルスＥ１発現ヒト細胞に、開示するアデノウイルスベクターの１つを導入することと、得られた組み換えアデノウイルスを回収することと、を含む、複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターを生成する方法を提供する。
【００３０】
本発明の別の局面はまた、本発明のアデノウイルスベクターを含有するワクチン組成物を提供する。組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターを含有する組成物は、単独で、又はその他のウイルス性もしくは非ウイルス性ベースのＤＮＡ／タンパク質ワクチンと組み合わせて、投与し得る。これらはまた、幅広い治療計画の一部として投与し得る。これらの組成物は、予防的又は治療的設定のいずれかで、哺乳動物宿主、好ましくはヒト宿主に投与することができる。本明細書中で示されるように、初回刺激追加免疫計画又は血清学的に区別されるＡｄベクターの複数回注射など、単独又は組合せ方式での開示するワクチン組成物の投与の結果、その導入遺伝子によりコードされる免疫原を特異的に認識することができる、哺乳動物における免疫反応が誘導される。
【００３１】
本明細書中で開示され主張される方法の１つは、少なくとも、その野生型Ｅ１遺伝子の機能的欠失を含有し、少なくとも１個の標的抗原をコードするヌクレオチド配列の発現を支配することができるプロモーターを含む配列を担う、組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターの十分量を、哺乳動物（未処置又は標的抗原に対して免疫活性となるように初回刺激されているもののいずれか）に投与することを含み、本組み換えベクターの投与が抗原特異的免疫反応を誘発（又は刺激）する。
【００３２】
ある実施形態において、本発明は、感染物質に対して免疫反応（予防的又は治療的）を誘導するように設計された方法を提供する（例えば、ウイルス性もしくは細菌病原体又は哺乳動物寄生生物）。第二の実施形態において、本発明は、ＴＡＡなどの、自己抗原に対する寛容性を打破する、哺乳動物において免疫反応を誘導するように設計された方法を提供する。本発明のこの局面は、癌ワクチンの調製及び投与のための、ワクチン担体としての、開示するベクターの使用をもくろむ。
【００３３】
本発明のさらに他の実施形態及び長所は、次の本発明の詳細な説明から容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、ＣｈＡｄ６シャトルベクター（ｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３）を構築するために使用されるクローニングストラテジーを要約する概略図である。
【図２】図２は、Ｅ．コリ株ＢＪ５１８３での相同組み換えによりＣｈＡｄ６ウイルスゲノムをクローニングするために使用されるクローニングストラテジーを説明する概略図である。
【図３】図３は、ｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３  ＧＡＧ：ｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３  ＳＥＡＰ；ｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３  ＥＧＦＰ及びｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３  ＮＳ  ＭＵＴを含む、様々なＣｈＡｄ６シャトルプラスミドのエレメントを説明する概略図である。
【図４】図４は、ＣｈＡｄ６ΔＥ１発現ベクターをクローニングするために使用される相同組み換えスキームを説明する概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｆ】図５Ｆは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｇ】図５Ｇは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｈ】図５Ｈは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｉ】図５Ｉは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｊ】図５Ｊは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図５Ｋ】図５Ｋは、ＣｈＡｄ３（配列番号１）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ａ】図６Ａは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｇ】図６Ｇは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｈ】図６Ｈは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｉ】図６Ｉは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｊ】図６Ｊは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図６Ｋ】図６Ｋは、ＣｈＡｄ６（配列番号２）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ａ】図７Ａは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｇ】図７Ｇは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｈ】図７Ｈは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｉ】図７Ｉは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｊ】図７Ｊは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図７Ｋ】図７Ｋは、ＣＶ３２（配列番号３）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ａ】図８Ａは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｆ】図８Ｆは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｇ】図８Ｇは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｈ】図８Ｈは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｉ】図８Ｉは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｊ】図８Ｊは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図８Ｋ】図８Ｋは、ＣＶ３３（配列番号４）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ａ】図９Ａは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｆ】図９Ｆは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｇ】図９Ｇは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｈ】図９Ｈは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｉ】図９Ｉは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図９Ｊ】図９Ｊは、ＣＶ２３（配列番号５）のゲノムヌクレオチド配列を与える。
【図１０】図１０は、ＣｈＡｄ２０（配列番号６）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１１】図１１は、ＣｈＡｄ４（配列番号７）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１２】図１２は、ＣｈＡｄ５（配列番号８）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１３】図１３は、ＣｈＡｄ７（配列番号９）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１４】図１４は、ＣｈＡｄ９（配列番号１０）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１５】図１５は、ＣｈＡｄ１０（配列番号１１）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１６】図１６は、ＣｈＡｄ１１（配列番号１２）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１７】図１７は、ＣｈＡｄ１６（配列番号１３）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１８】図１８は、ＣｈＡｄ１７（配列番号１４）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図１９】図１９は、ＣｈＡｄ１９（配列番号１５）の繊維遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２の繊維タンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２の繊維タンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２の繊維タンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２の繊維タンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図２０Ｅ】図２０Ｅは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２の繊維タンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図２０Ｆ】図２０Ｆは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２の繊維タンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図２０Ｇ】図２０Ｇは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２の繊維タンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号８５）、ＣＶ６８（配列番号８６）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号８０）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号８１）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号８２）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図２１】図２１は、ＣｈＡｄ２０（配列番号１６）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２２】図２２は、ＣｈＡｄ４（配列番号１７）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２３】図２３は、ＣｈＡｄ５（配列番号１８）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２４】図２４は、ＣｈＡｄ７（配列番号１９）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２５】図２５は、ＣｈＡｄ９（配列番号２０）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２６】図２６は、ＣｈＡｄ１０（配列番号２１）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２７】図２７は、ＣｈＡｄ１１（配列番号２２）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２８】図２８は、ＣｈＡｄ１６（配列番号２３）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図２９】図２９は、ＣｈＡｄ１７（配列番号２４）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図３０】図３０は、ＣｈＡｄ１９（配列番号２５）のヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｅ】図３１Ｅは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｆ】図３１Ｆは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｇ】図３１Ｇは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｈ】図３１Ｈは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｉ】図３１Ｉは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３１Ｊ】図３１Ｊは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の、Ｃ１（配列番号１２４）、ＣＶ６８（配列番号１２５）、ＰＡＮ５（ＣＶ２３とも呼ばれる。）（配列番号１１９）、ＰＡＮ６（ＣＶ３２とも呼ばれる。）（配列番号１２０）及びＰａｎ７（ＣＶ３３とも呼ばれる。）（配列番号１２１）からの参照繊維タンパク質配列との比較を与える。
【図３２】図３２は、本明細書中で開示される、オリゴマー及びプライマーを含む、人工的配列、配列番号２６から４０及び配列番号４５及び４６のリストを与える。
【図３３】図３３は、様々な血清型サブグループ（つまり、サブグループＣ、Ｅ及びＤ）に属するＣｈＡｄベクターの免疫付与ブレイクポイントを図示したものである。ｇａｇ−発現する、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ２０、ＣＶ３３、ＣＶ６８、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣＶ３２、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ７及びＣｈＡｄ１６ベクターで免疫付与したマウスにおいてタイター決定実験を行うことにより、測定可能な免疫反応を誘発する最低用量を調べた。
【図３４】図３４は、ヒトアデノウイルスベクター（ＭＲＫＡｄ５  ＴｈＣＥＡ）と、次いで、１２週間の間隔後、チンパンジーアデノウイルスベクター（ＣＶ３３  ＲｈＣＥＡ）で連続的に免疫付与したアカゲザルにおいて誘発されるＣＥＡ特異的Ｔ細胞反応のグラフである。ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより免疫反応を評価した。データは、アカゲザルＣＥＡ  Ｃ及びＤペプチドプールの非存在下（ＤＭＳＯ）及び存在下でのインキュベーション後の、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）百万個あたりのスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数を示す。
【図３５】図３５は、ＰＡＵＰＳＥＡＲＣＨ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３，Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、ＴＲＥＥＶＩＥＷにより視覚化し操作した、全長ヘキソンペプチド配列の多配列アラインメントから推定される、ヒト及びチンパンジーアデノウイルスの系統樹を与える。
【図３６】図３６は、ｈＡｄ５に前もって曝露したマウスへのＣｈＡｄ３及びｈＡｄ５  ｇａｇベクターの投与に対する反応において得られた免疫付与結果を表すグラフである。精製脾臓細胞を用いて、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴにより、免疫付与から３週間後に、細胞性免疫を評価した。
【図３７】図３７は、ＣｈＡｄ３ｈＣＥＡ及びＡｄ５ｈＣＥＡで免疫付与したヒトＣＥＡトランスジェニックマウスにおいて誘発された、抗ＣＥＡ  ＣＭＩのキネティクスを表すグラフである。ＣＥＡペプチドプールで刺激したＰＢＭＣのＩＣＳにより、ＣＭＩを評価した。結果は、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋／総ＰＢＭＣの％として表す。
【図３８Ａ】図３８Ａは、ＥＧＦＰを発現し、様々なサブグループ（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）に属する様々なＣｈＡｄベクターの、ｍｏｉ  ５０、２５０及び１２５０に曝露した様々なヒト初代細胞の感染効率を表すグラフである。結果は、蛍光細胞／総細胞の％として表す。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、ＥＧＦＰを発現し、様々なサブグループ（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）に属する様々なＣｈＡｄベクターの、ｍｏｉ  ５０、２５０及び１２５０に曝露した様々なヒト初代細胞の感染効率を表すグラフである。結果は、蛍光細胞／総細胞の％として表す。
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、ＥＧＦＰを発現し、様々なサブグループ（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）に属する様々なＣｈＡｄベクターの、ｍｏｉ  ５０、２５０及び１２５０に曝露した様々なヒト初代細胞の感染効率を表すグラフである。結果は、蛍光細胞／総細胞の％として表す。
【図３８Ｄ】図３８Ｄは、ＥＧＦＰを発現し、様々なサブグループ（Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）に属する様々なＣｈＡｄベクターの、ｍｏｉ  ５０、２５０及び１２５０に曝露した様々なヒト初代細胞の感染効率を表すグラフである。結果は、蛍光細胞／総細胞の％として表す。
【００３５】
本発明の詳細な説明
本明細書及び添付の請求項の範囲を通して使用される場合、次の定義及び略語が適用される。
【００３６】
「カセット」という用語は、その転写及び翻訳調節配列に従って発現されるべき、少なくとも１個の核酸配列を含有する核酸分子を指す。カセットを変化させることにより、様々な配列及び配列の組合せの発現を支配するために組み込まれるベクターが生じる。本発明との関連において、本カセットに存在する核酸配列は通常、免疫原をコードする。５’及び３’末端に存在するように操作された制限部位のために、本カセットを容易に挿入、除去又は別のカセットで置換することができる。
【００３７】
「ｃｉｓ作用エレメント」という用語は、遺伝子を制御するヌクレオチド配列に連結されるヌクレオチド配列を指す。ＤＮＡに存在するｃｉｓ作用エレメントは、転写を制御し、ｍＲＮＡに転写されたものは、ＲＮＡプロセシング、ターンオーバー及びタンパク質合成を制御することができる。
【００３８】
「ベクター」という用語は、宿主生物又は宿主組織にＤＮＡ断片を導入することができる、ある手段を指す。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む。）、バクテリオファージ及びコスミドを含む、様々なタイプのベクターがある。
【００３９】
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、転写活性を開始し、駆動させるために、ＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成する。本複合体は、エンハンサーなどの活性化配列又はサイレンサーなどの抑制配列により修飾され得る。
【００４０】
「医薬的有効量」という用語は、宿主細胞に形質導入し、免疫反応を誘発するための導入遺伝子発現の十分なレベルを与える、特定の投与経路において効果的な、組み換えアデノウイルスの量を指す。
【００４１】
「複製能のある」組み換えアデノウイルス（ＡｄＶ）という用語は、原型を保つ、又は機能的な必須初期遺伝子（つまり、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ及びＥ４）を有するアデノウイルスを指す。野生型アデノウイルスは、複製能がある。
【００４２】
「複製欠損」組み換えＡｄＶという用語は、ウイルス複製に必須の遺伝子産物を、少なくとも機能的に欠損する、又は完全除去されるように加工されているため、複製ができないようにされているアデノウイルスを指す。本発明の組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターは、複製欠損である。
【００４３】
「哺乳動物」という用語は、ヒトを含む、あらゆる哺乳動物を指す。
【００４４】
核酸配列との関連における、「％配列同一性」又は「同一」という用語は、最大一致に対して並べた場合に同じである、２つの配列における残基を指す。配列同一性比較の長さは、そのゲノムの全長（例えば約３６ｋｂｐ）、遺伝子のオープンリーディングフレームの全長、タンパク質、サブユニット又は酵素［例えば、アデノウイルスコード領域を与える表を参照のこと。］又は少なくとも約５００から５０００ヌクレオチドの断片にわたり得、それが望ましい。しかし、より小さい断片（例えば、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０から２４ヌクレオチド、少なくとも２８から３２ヌクレオチド、少なくとも３６以上のヌクレオチド）の間での同一性もまた望ましい。同様に、「％配列同一性」は、タンパク質の全長にわたる、又はその断片にわたるアミノ酸配列に対して容易に決定し得る。適切であるものとして、断片は、少なくとも約８アミノ酸の長さであり、約７００アミノ酸以下であり得る。適切な断片の例を本明細書中で述べる。
【００４５】
初期設定で本明細書中で定義されるようなアルゴリズム及びコンピュータープログラムを用いて、同一性が容易に決定される。好ましくは、このような同一性は、タンパク質、酵素、サブユニットの全長にわたるか、又は少なくとも約８アミノ酸の長さの断片にわたる。しかし、同一性は、同一遺伝子産物が置かれている使用に適した、より短い領域に基づくものであり得る。
【００４６】
一般に、アデノウイルスコンストラクト、遺伝子コンストラクトは、本明細書中に含有される遺伝子を参照して名付ける。例えば、「ｐＣｈＡｄ３  ΔＥ１ｇａｇ」は、Ｅ１領域が欠失している、ＣｈＡｄ３  チンパンジーアデノウイルスゲノムを含有するプラスミドコンストラクトを指す。このプラスミドにおいて、Ｅ１領域は、ヒトＣＭＶプロモーターと、次いでウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの調節下でＨＩＶｇａｇ遺伝子を含有する免疫原発現カセットにより置換される。同様に、ｐＣＶ３３ＤＥ１−Ｅ３  ＮＳｍｕｔは、Ｅ１及びＥ３領域が欠失しており、ヒトＣＭＶプロモーターと、次いでウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルの調節下において、ＨＣＶ非構造遺伝子を含む免疫原発現カセットで置換されている、ＣＶ３３  チンパンジーアデノウイルスゲノムを含有する、本明細書中で開示される第二のプラスミドコンストラクトを指す。
【００４７】
略語「Ａｇ」は抗原を指す。
【００４８】
本明細書及び添付の請求項の範囲を通して使用される場合、単数体「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明確に示されない限り、複数形の意味を含む。
【００４９】
アデノウイルス（Ａｄ）は、いくつかの鳥類及び哺乳動物宿主において同定されている、エンベロープがない２０面体のウイルスである。ヒトＡｄ（ｈＡｄ）は、全ての既知のヒト及び動物の多くのＡｄ系を含む（例えば、ウシ、ブタ、イヌ、マウス、ウマ、サル及びヒツジ）、マストアデノウイルス属に属する。ヒトアデノウイルスは、ラット及びアカゲザル赤血球の赤血球凝集特性、ＤＮＡ相同性、制限酵素切断パターン、Ｇ＋Ｃ含量の割合及び発癌性を含む、多くの、生物学的、化学的、免疫学的及び構造的基準に基づいて、６個のサブグループ（ＡからＦ）に分けられる（Ｓｔｒａｕｓ，１９８４，Ａｄｅｎｏｂｉｒｕｓｅｓ、Ｈ．Ｇｉｎｓｂｅｒｇ編、ｐｐｓ．４５１−４９８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｓ  Ｐｒｅｓｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ，１９９０  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ及びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、ｐｐｓ．１６７９−１７２１）。今日までに、５１種類の異なる血清型が認識され、これらの赤血球凝集特性及び生物物理的及び生化学的基準に基づき、サブグループにグループ分けされている。
【００５０】
アデノウイルスビリオンは、２０面体で対称であり、血清型によって、６０から９０ｎｍの直径である。この２０面体キャプシドは、３つの主要なタンパク質、ヘキソン（ＩＩ）、ペントンベース（ＩＩＩ）及びノブ付き繊維（ＩＶ）ならびに、多くの少量のタンパク質（つまり、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａ及びＩＶａ２）からなる（Ｗ．Ｃ．Ｒｕｓｓｅｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：２５７３−２６０４（２０００））。ヒトにおいて観察される、既存の免疫のある局面は、液性免疫であり、この結果、ウイルスタンパク質に対して特異的な抗体が産生され持続され得る。アデノウイルスにより誘発される液性反応は主に、主要な構造タンパク質：ヘキソン、ペントン及び繊維に対するものである。
【００５１】
公表されている報告から、複数の血清型に対する抗体を含有するタイターが共通であること（Ｄａｍｂｒｏｓｉｏ，Ｅ．（１９８２）Ｊ．Ｈｙｇ．（Ｌｏｎｄｏｎ）８９：２０９-２１９）及び既存のタイターの大部分が、中和活性を有することが、分かっている。アデノウイルスに対する中和免疫は、タイプ特異的であり、アデノウイルスの特定の血清型による感染により、その血清型のみに対する免疫が与えられる。いくつかの報告から、ヘキソンに対して向けられる抗体が、最強であり、最も中和能力が高いことが示唆されている（Ｔｏｏｇｏｏｄ，Ｃ．Ｉ．Ａ．，Ｃｒｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．及びＨａｙ  Ｒ．Ｔ．（１９９２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３，１４２９−１４３５）。したがって、タイプ特異的中和に関与するエピトープが、様々な血清型由来のヘキソン配列のアラインメントにより同定される７個の超可変領域に位置すると仮定することは、理にかなっている（Ｃｒａｗｆｏｒｄ−Ｍｉｋｓｚａ，Ｌ及びＤ．Ｐ．Ｓｃｈｎｕｒｒ（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１８３６−１８４４）。
【００５２】
タイプ特異的中和抗体の存在と、同じ血清型に基づくベクターにより免疫反応を誘発できないこととの間の正相関は、未処置動物への処置動物からの免疫血清の受動転移を含む、様々な方法により分かっている。一般に、特異的なウイルス血清型に対して既存の液性免疫により、ベクター投与の治療効率が低下する。さらに、特異的ウイルス血清型に基づくベクターの投与により、同じ血清型の再投与を防御する、ベクターに対する免疫反応が誘発される。
【００５３】
特定の実施形態において、本発明は、ｈＡｄの共通血清型に対する既存の免疫の結果に付随する不都合な影響を回避する方法を提供する。とりわけ、本発明は、ヒトにおいて回避しない血清型を特徴とするチンパンジーアデノウイルスベクターの使用をもくろむ。したがって、本発明は、ワクチン担体として、共通ヒト血清型と交差反応する中和Ｂ細胞エピトープを欠く、アデノウイルス（ＣｈＡｄ）ベクターを提供する。
【００５４】
アデノウイルス特異的細胞性免疫（ＣＭＩ）が、交差反応性であり得ることが報告されているが、複数血清型の繰り返し注射に基づくワクチン接種実験が、１個のベクターを用いた免疫付与スケジュールよりも高い効率であることが示されている。これらの実験はさらに、ワクチン目的のベクター投与の主な制限が、そのベクターに対する液性の既存の免疫であることを示す。ワクチン担体としてのヒトアデノウイルスの使用に付随する問題を解決することができる可能性のある方法には、既存の免疫反応に直面することが予想される、アデノウイルスのさらに高用量の投与（例えば、サブグループＣ血清型）及び稀少なヒト血清型に基づくベクターの使用が含まれる。しかし、ワクチンの用量を高くして使用することにより、ワクチンのコストが上昇し、望ましくない副作用のリスクが増加し、前臨床試験の結果から、ヒトの代替的血清型は、ｈＡｄ５及びｈＡｄ６よりも免疫原性が低いことが示唆されている。
【００５５】
本ベクターのアデノウイルス骨格エレメントに対する宿主の液性及び細胞性免疫反応の問題を回避する、及び複製能のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）が混入し得るヒトアデノウイルス由来ベクターストックの使用のリスクを最小化する試みにおいて、いくつかの非ヒトアデノウイルスの特徴が調べられ、ワクチン担体として開発されている（Ｓｏｕｄｏｉｓ，Ｃら（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７４：１０６３９-１０６４９；Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆら（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５：１１６０３-１１６１３；Ｃｏｈｅｎ，Ｃ．Ｊ．ら（２００２）Ｊ．Ｇｎｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８３：１５１-１５５）。既存の免疫に関連する問題を回避するための非ヒトアデノウイルス配列の使用に内在する前提は、共通ヒトアデノウイルス血清型に対する中和抗体が非ヒトウイルスを交差中和しないと思われる観察に基づくものである。しかし、ウイルス及び細胞性の要因の不適合により、非ヒト細胞株で増殖させなければならないという欠点を特徴とする、代替的ベクター系（ウシ、ヒツジ、イヌ）の大部分に対して、実用上の限界がある。
【００５６】
Ｗｉｌｓｏｎらは、チンパンジーの腸間膜リンパ節からもともと単離された、チンパンジーアデノウイルス  タイプ６８（ＣＶ６８）Ｃ６８に基づく複製欠損ベクターの特性を述べる報告を公表し（Ｂａｓｎｉｇｈｔ，Ｍら（１９７１）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｍｉｏｌ．９４：１６６−１７１）、ＣＶ６８は、完全に配列決定され、ヒトアデノウイルスと全体的な構造が類似していることが分かった（Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２３）：１１６０３−１１６１３（２００１））。このウイルスのゲノムは、３６,５２１塩基対の長さであり、ヒトアデノウイルスのサブグループＥと、最も類似しているものとして述べられており、配列決定されたヒトＡｄ４オープンリーディングフレームの殆どと９０％の同一性がある。ＣＶ６８  ＩＴＲは、１３０塩基対の長さであり、主要なアデノウイルスの初期及び後期遺伝子の全てが存在する。ＣＶ６８は、ヒトにおいて循環せず、共通ヒト血清型のものと交差反応する中和Ｂ細胞エピトープを欠く血清型を特徴とする。チンパンジーアデノウイルスがヒトアデノウイルスと類似しているにもかかわらず、チンパンジー血清型に対する交差反応性中和免疫は、ヒトにおいて立証されていない（Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００１）７５（２３）：１１６０３−１３）。
【００５７】
ＣＶ６８由来の組み換えベクターは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体を発現する細胞の形質導入を支持するのに十分にヒト血清型と類似であるものとして述べられている（Ｃｏｈｅｎ，Ｃら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８３：１５１−１５５（２００２））。注目に値すべきは、ＣＶ６８が、ヒトアデノウイルス５型からのＥ１を含有するその複製２９３細胞を支持するのに十分なレベルでヒトアデノウイルスと類似していることを特徴とすることである（Ｆａｒｉｎａ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２３）：１１６０３−１１６１３（２００１））。さらに、ヒト血清型５Ｅ１の隣接配列が、ＣＶ６８由来ベクター配列のそれと非相同的であるという観察から、相同組み換えは起こらないと予想される。したがって、ＣＶ６８由来ワクチンストックにＲＣＡが混入する可能性は低いと推測される。
【００５８】
同じ研究者グループは、続いて、マウスにおける、狂犬病ウイルス糖タンパク質に対する抗体の誘導のためのワクチン担体としての、ＣＶ６８由来アデノウイルス配列の使用を報告した。ＣＶ６８の複製欠損体は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子をミニジーンカセットで置換することにより作製された。狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする導入遺伝子産物を含有するＥ１欠失含有アデノウイルス組み換え体（ＡｄＣ６８ｒａｂ．ｇｐ）で免疫付与したマウスは、狂犬病ウイルスに対する防御免疫を生じ、別の狂犬病ウイルスの致死用量を用いた病原体付与に対して耐性を保持した（Ｘｉａｎｇ，Ｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（５）：２６６７−２６７５（２００２））。ＨＩＶ−１のｇａｇのコドン最適化した短縮型を発現する、第二のＣＶ６８コンストラクトは、最近、マウスにおいて活発なｇａｇ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することが報告された。ワクチン誘導反応は、ワクシニアｇａｇ組み換えウイルスを用いた病原体投与に対して防御を与えることが示された（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１４１６−１４２２（２００３））。ＣＶ６８ｇａｇ又はＡｄ５ｇａｇベクターを用いて、ヒトアデノウイルス血清型５に対して前もって免疫付与したマウスの実験的ワクチン接種から、ＣＶ６８ワクチンによるものよりも、Ａｄ５によって誘発されるウイルス病原体付与に対して、ｇａｇ特異的Ｔ細胞及び防御が顕著に低下することが示された。Ｃ６８ｇａｇワクチンの効率の低下は、Ａｄ５特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｉｄ）の交差反応性により生じた。
【００５９】
このデータと合わせて考えると、サル由来複製欠損アデノウイルスベクターが、共通ヒト血清型に基づくベクターよりも、ヒトワクチン担体としての使用により適している可能性があることが示唆される。本明細書中で示されるように、ヒトＡｄ５（図３６）に対して強く免疫付与されたマウスを、ＣｈＡｄ３−ｇａｇアデノウイルスベクターで免疫付与できるという実験結果から、既存の抗ヒトＡｄ５免疫が、ＣｈＡｄベクターにより誘発されるｇａｇ特異的ＣＭＩ反応を低下させなかったことが示される。これらの結果は、ヒトＡｄ５交差反応性Ｂ及びＴ細胞エピトープが、ＣｈＡｄ３又はＣｈＡｄ６ベクターにおいて存在しないという結論と合致する。
【００６０】
一般に、アデノウイルスゲノムは、よく調べられており、いくつかの異なる血清型が存在するにもかかわらず、特異的機能が同じように位置しつつアデノウイルスゲノムの全体的構成において、いくつかの共通の保存がある。Ｗｉｌｓｏｎらにより開示されたチンパンジーアデノウイルス  Ｃ１及びＣＶ６８のヌクレオチド配列及び各ウイルスのＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４及びＬ５遺伝子の位置は、米国特許第６，０８３，７１６号（Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）及びＰＣＴ公開出願ＷＯ０３／０００８５１（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｉｍｉｏｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）により与えられる（これらの教示は、参照により本明細書中に組み込む。）。
【００６１】
アデノウイルスゲノムの端部には、逆方向末端反復（ＩＴＲ）として知られている配列が含まれ、これは、ウイルス複製に必要である。ウイルスはまた、ウイルスコードプロテアーゼを含有し、これは、感染性ビリオンを生成するのに必要とされる構造タンパク質の一部のプロセシングに必要である。アデノウイルスゲノムの構造は、宿主細胞の形質導入後、ウイルス遺伝子が発現される順番で述べられる。より具体的には、ウイルス遺伝子は、転写がＤＮＡ複製開始の前に起こるか、後に起こるかに従い、初期（Ｅ）又は後期（Ｌ）遺伝子と呼ばれる。形質導入の初期において、アデノウイルスのＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４遺伝子が、ウイルス複製に対して宿主細胞を準備するために発現される。このウイルスは、ウイルスゲノムの必須の初期領域１（Ｅ１）を欠失させることにより、複製欠損にされ得る。Ｂｒｏｄｙら、１９９４  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．，７１６：９０−１０１。後期の間、ウイルス粒子の構造要素をコードする、後期遺伝子Ｌ１−Ｌ５の発現のスイッチが入る。後期遺伝子は全て、１個のプロモーターの調節下となり、ペントン（Ｌ２）、ヘキソン（Ｌ３）、１００ｋＤａ  足場タンパク質（Ｌ４）及び繊維タンパク質（Ｌ５）を含むタンパク質をコードし、これらは、アデノウイルスＤＮＡがキャプシド化されるようになる、新しいウイルスを形成する。ウイルスの血清型に依存して、１個の宿主細胞において、１０，０００から１００，０００の子孫アデノウイルス粒子が生じ得る。最終的に、アデノウイルス複製プロセスにより、細胞溶解が起こる。
【００６２】
本明細書中で開示される複製欠損アデノウイルスベクターは、開示されているチンパンジー核酸配列からの特定のヌクレオチド配列の欠失により、及び導入遺伝子の挿入、発現又はその他の遺伝子操作に有用な他のＤＮＡ配列由来の配列の挿入により構築される。したがって、本明細書中で述べる組み換えチンパンジーアデノウイルスは、１又は複数のチンパンジーアデノウイルス由来のアデノウイルス配列又はチンパンジーアデノウイルスもしくはヒトアデノウイルス由来の配列を含有し得る。適切なポリヌクレオチド配列は、組み換えにより、合成により、又は天然ソースから単離して、作成され得る。本発明の特定の局面における使用に適切なアデノウイルス配列には、共通ヒト血清型と交差反応する中和Ｂ細胞エピトープを欠失している配列が含まれる。
【００６３】
最低限、本発明の組み換えチンパンジーアデノウイルス（例えばベクター）は、少なくとも１個の免疫原発現カセットと組み合わせて、複製及びビリオンのキャプシド化に必要なチンパンジーアデノウイルス  ｃｉｓ作用エレメントを含有する。通常、このｃｉｓ作用エレメントは、少なくとも１個の抗原をコードする導入遺伝子を含む発現カセットに隣接する。より具体的に、本発明のベクターは、アデノウイルスの、不可欠なｃｉｓ作用５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（これは、複製の開始点として機能する。）、３’ＩＴＲ配列、パッケージング／エンハンサードメイン及び異種分子をコードするヌクレオチド配列を含有する。本発明のベクターは、組み換えベクターが、最少のアデノウイルス配列のみを含有するか、特定遺伝子における機能的欠失（例えばＥ１及び／又はＥ３又はＥ４領域）のみがある全体のアデノウイルスゲノムを含有するかに関わらず、チンパンジーアデノウイルスキャプシドを含有する。
【００６４】
一般に、本明細書中で開示するアデノウイルスベクターは、複製欠損アデノウイルスゲノム（このアデノウイルスゲノムは、機能的Ｅ１遺伝子を持たない。）と；ａ）免疫反応が望まれる少なくとも１個の免疫原をコードする核酸と、ｂ）該免疫原をコードする核酸配列と機能可能に連結された異種（つまり、アデノウイルス配列に関して）プロモーターとを含有する免疫原発現カセットと；転写終結因子と、を含有する。
【００６５】
より具体的には、本発明は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４からなる群から選択される、少なくとも１個の初期遺伝子を欠く、組み換えアデノウイルスゲノムからなる複製欠損ベクターを提供する。ある実施形態において、この複製欠損ベクターは、本明細書中で開示するアデノウイルス分離株の１つ（例えば、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３又はＣｈＡｄ８２）のＥ１遺伝子を、免疫原発現カセットで置換又は破壊することにより調製される。例えば、ＣｈＡｄ３（配列番号１）又はＣｈＡ６（配列番号２）のＥ１遺伝子を欠失させる／破壊することにより、ベクターを調製することができる。あるいは、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２又はＣｈＡｄ２０を含む、本明細書中で開示する他のアデノウイルス分離株のいずれか１つから、複製欠損ベクターを調製することができる。他の実施形態において、本発明の複製欠損ベクターは、機能的Ｅ３遺伝子を欠失するように、場合によっては加工されている、本明細書中で開示するＣｈＡｄのうち１個に由来するアデノウイルスゲノムを含む。初期遺伝子を完全に除去するか、又はその遺伝子を非操作可能又は非機能的にすることによって、本明細書中で開示するチンパンジーアデノウイルス配列は、複製欠損になされうると理解されたい。
【００６６】
本発明は、１又は複数の選択された遺伝子産物を発現するアデノウイルスの能力を破壊する「機能的欠失」などの改変があることを特徴とするベクターを包含すると理解されたい。本明細書中で使用される場合、「機能的欠失」という用語は、広く、特定の遺伝子産物を非機能的にする効果を有する改変を包含する。一般に、機能的欠失は、アデノウイルス遺伝子の部分的又は全体的欠失の形をとる。しかし、これらに限定されないがフレームシフト突然変異を導入する改変を行うことを含む、その他の操作でもまた機能的欠失を達成することを当業者は容易に認めるであろう。例えば、本発明の組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターは、本ウイルスのアデノウイルスＥ１Ａ及び／又はＥ１Ｂ発現能力を妨害する、又は機能的に欠失させるよう設計されている改変を導入することにより、複製欠損になされ得る。
【００６７】
Ｅ２遺伝子の群からの１又は複数の遺伝子の発現を妨害する、又は機能的に欠失させるよう設計されている改変を導入することにより、複製欠損アデノウイルスベクターを得ることができることは周知である。より詳しく述べると、ポリメラーゼ遺伝子又は、末端直前のタンパク質遺伝子もしくはＤＮＡ結合タンパク質遺伝子を不活性化することにより、複製欠損ベクターを構築することができる。さらに、Ｅ４領域により発現される遺伝子の欠失又は不活性化は、複製欠損  ｃｈｉｍｐ  Ａｄベクターを構築するための代替的方法である。初期遺伝子欠失又は不活性化を、さらに短縮されたベクターを作製するために、組み合わせることができる。あるいは、複製欠損ＣｈＡｄベクターはまた、後期遺伝子Ｌ１からＬ５などの他のウイルス遺伝子において、さらなる改変を含み得る。さらに、異なる血清型から得られたヘキソン及び繊維遺伝子を組み合わせることにより、新規アデノウイルスワクチン担体を生成させることができる。ヘキソン及び繊維遺伝子シャッフリング法の利用によってもまた、研究者らは、ＣｈＡｄの生物学的特性を変化させ、様々な指向性を有する、又は新しい血清学的特性を有する、ベクターの作製を促進することができる。
【００６８】
本発明は、単独で、又は何らかの組合せで、その改変遺伝子の生物学的活性を効果的に破壊する、遺伝子全体又はその一部の欠失を含む組み換えアデノウイルスベクターを包含すると理解されたい。本明細書中で示されるように、Ｅ１遺伝子の機能的欠失と組み合わせて、異種のＡｄ５  Ｅ４配列をベクターに導入することは、望ましいものであり得るが、例えば、Ｅ４領域により発現される遺伝子の機能的欠失を有する組み換えサルアデノウイルスを構築することができる。あるいは、アデノウイルス  遅初期（ｄｅｌａｙｅｄ  ｅａｒｌｙ）Ｅ３遺伝子の機能を削除し得るが、Ｅ３の機能は、組み換えアデノウイルス粒子の産生に必要ではないため、本発明で有用なウイルスをパッケージングすることが可能な組み換え体を作製するために、この遺伝子産物を置換する必要はない。
【００６９】
本発明のある実施形態において、使用される複製欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１及び場合によってはＥ３における欠失を含有する、チンパンジーサブグループＣアデノウイルスである。例えば、ＣｈＡｄ３の場合、適切なＥ１欠失／破壊は、ｂｐ４６０からｂｐ３５４２の領域に導入することができる（配列番号１を参照。）。ＣｈＡｄ６の場合、適切なＥ１欠失／破壊は、ｂｐ４５７からｂｐ３４２５の領域に導入することができる（配列番号２を参照。）。ＣＶ３２の場合、Ｅ１欠失は、好ましくは、ｂｐ４５６からｂｐ３４１６である（配列番号３を参照。）；ＣＶ３３の場合、Ｅ１欠失は、好ましくは、ｂｐ４５６からｂｐ３４２５（配列番号４を参照。）であり、ＣＶ２３の場合、Ｅ１欠失は、好ましくは、ｂｐ４５６からｂｐ３４１５（配列番号５を参照。）である。ＣＶ３２及びＣＶ３３に対するＥ３欠失は、好ましくは、それぞれ、ｂｐ２７４４６からｂｐ３１９１１（配列番号３を参照。）であり、ｂｐ２７１４６からｂｐ３１６０９（配列番号４を参照。）である。当業者は、配列相同性及び多配列アラインメントに基づき、他のチンパンジー分離株に対する同等な配列を容易に決定することができる。
【００７０】
Ｅ１欠失アデノウイルスベクターを構築するために、そのベクター骨格の構造及び導入遺伝子を含有する核酸配列の組成に関して多くのことを決定しなければならないことを、当業者は、容易に認めるであろう。例えば、研究者らは、Ｅ１欠失の大きさが導入遺伝子の大きさに適合するか否かを調べなければならない。適合しない場合、そのベクターの骨格にさらなる欠失を導入しなければならない。
【００７１】
導入遺伝子を有する核酸配列は、遺伝子又は遺伝子の機能的部分であり得、通常は、発現カセットの形態で存在する。通常、遺伝子発現カセットには、（ａ）タンパク質又は関心のある抗原をコードする核酸と；（ｂ）そのタンパク質をコードする該核酸に機能可能に連結された異種のプロモーターと；（ｃ）転写終結シグナルと、が含まれる。本核酸は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡであり得、２本鎖又は１本鎖であり得る。この酸は、所望する宿主における発現のために、コドン最適化され得る（例えば、哺乳動物宿主）。
【００７２】
導入遺伝子が導入される骨格内の部位及びその導入遺伝子の方向に関しても決定を行わなければならない。より具体的に、Ｅ１パラレル（５’から３’に転写）又は反パラレル（そのベクター骨格に対して、３’から５’方向に転写）方向で、導入遺伝子を挿入することができる。さらに、そのベクターが、同定されその導入遺伝子に機能可能に連結される必要があるワクチン担体としての使用のために調製されている、哺乳動物宿主細胞においてその導入遺伝子の発現を支配することが可能な適切な転写調節エレメントである。「操作可能に連結された」配列には、それらが調節する核酸配列に隣接する発現調節配列及び、トランスで作用する、又は調節される核酸配列を調節するのに離れて作用する調節配列の両方が含まれる。
【００７３】
調節配列には、転写開始、終結、エンハンサー及びプロモーター配列などの適切な発現調節配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；翻訳効率を促進する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を促進する配列及び場合によっては、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。これら及び他の共通のベクターエレメントの選択は、従来のものであり、多くの適切な配列が当業者にとり周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及びそこで引用する文献、例えば、３．１８−３．２６ページ及び１６．１７-１６．２７、及びＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｈｏｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）。
【００７４】
具体的な実施形態において、本プロモーターは、真核ＲＮＡポリメラーゼにより認識される異種のプロモーター（つまり、アデノウイルス配列に対して。）である。好ましい実施形態において、このプロモーターは、「強力」又は「効率的」プロモーターである。強力なプロモーターの例は、前初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：３９７９−３９８６（参照により組み込む。））。（ＣＭＶ）なしで、又はイントロンＡ配列（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）とともに、ヒトＣＭＶプロモーターを使用することができるが、ＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーター及びβアクチンプロモーターを含む、強力な免疫グロブリン又はその他の真核遺伝子プロモーターなどのその他の既知のプロモーターの多くのいずれかを使用し得ることを当業者は、認識するであろう。
【００７５】
本発明において使用できるプロモーターのさらなる例は、強力な免疫グロブリンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーター及びβアクチンプロモーターであるが、本発明の方法に従い、意図する宿主において発現を実行することができるあらゆるプロモーターを使用することができることを、当業者は認め得る。このプロモーターは、Ｔｅｔオペレーター配列などの調節可能配列を含み得る。転写及び発現の調節の可能性を与えるこれらのような配列は、遺伝子転写の抑制が求められる場合に有用である。
【００７６】
適切な遺伝子発現カセットはまた、転写終結配列も含む。好ましい転写終結因子は、ウシ成長ホルモン終結因子である。ＣＭＶ  ｉｎｔＡ−ＢＧＨ終結因子の、プロモーター／転写終結の組合せは、特に好ましいが、その他のプロモーター／終結因子の組合せもまた使用し得る。本明細書中で示されるように、ウシ成長ホルモン終結／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）又は次のように定義される５０ヌクレオチド長の短い合成ｐｏｌｙＡシグナル（ＳＰＡ）：即ちＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号２６）である。一般に、適切な終結配列を例示する。導入遺伝子を含有する核酸配列の後であって、Ｅ３’アデノウイルスＩＴＲ配列の前に、ｐｏｌｙＡシグナルを挿入する。
【００７７】
本明細書中で述べられる組み換えアデノウイルスベクターには、アデノウイルスの１又は複数の株由来のアデノウイルス配列が含まれる。適切な配列は、天然のソースから得ることができ、組み換えにより、合成により、又は他の遺伝子操作もしくは化学的方法により作製することができる。特定の実施形態において、この組み換えチンパンジーアデノウイルスは、非チンパンジーアデノウイルスポリヌクレオチド配列を含有するキメラ組み換え体である。適切な非チンパンジーアデノウイルス配列は、ヒトアデノウイルス株から得ることができる。例えば、ｈＡｄ５  Ｅ４（Ａｄ５  ｎｔ３２８１６からｎｔ３５６１９）又はＡｄ５Ｅ４  ｏｒｆ６（Ａｄ５  ｎｔ３３１９３からｎｔ３４０７７）（Ａｄ５  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ：Ｍ７３２６０）により、ネイティブのＥ４領域を置換することができる。
【００７８】
一般に、本発明の組み換えアデノウイルスベクターにより送達される免疫原（抗原性分子）は、コードされる産物の転写及び／又は翻訳を宿主細胞において指示するのに必要な調節配列を与えるヌクレオチド配列と組み合わせて、導入遺伝子によりコードされるポリペプチド、タンパク質又は酵素産物を含有する。この導入遺伝子の組成は、ベクターの意図する使用に依存する。例えば、哺乳動物宿主において、感染物質に対して特異的な、抗体反応又は細胞性免疫反応を誘発するために免疫原性組成物が設計されている場合、病原体特異的免疫を受容者に与えると予想される少なくとも１個の免疫原性産物をコードする核酸配列を利用することが適切である。あるいは、癌ワクチンとしての使用のためにその組成物が調製される場合、適切な導入遺伝子は、ＴＡＡなどの自己抗原の免疫原性部分を含有し得、それは、特定のＴＡＡに対する宿主寛容性を打破するため、及び癌の発症を防ぐか、又は腫瘍成長を防ぐのに十分な長期（例えば記憶）反応を誘発するために十分な効力の防御的免疫反応を誘発する目的に関して選択される。したがって、哺乳動物宿主に感染する幅広い病原性物質（これらに限定されないが、ウイルス、寄生生物、細菌及び真菌など。）又は癌もしくは腫瘍細胞から、適切な免疫原性遺伝子産物を得ることができる。試験免疫原の特定の設定で本明細書中において本発明を説明しているが、本発明は、本明細書中で例示される抗原の使用に限定されないことを理解されたい。より具体的には、本発明は、これらに限定されないがＴＡＡなどの、免疫原としての、異種及び自己抗原の両方の使用をもくろむ。
【００７９】
ある実施形態において、本発明は、感染物質により発現される抗原（つまり免疫原）に対する免疫反応を誘導する、免疫原性組成物（例えばワクチン）を提供する。例えば、ヒト及び／又は非ヒト動物種に感染するウイルスに対する免疫反応を誘発することが望ましい。予防的及び／又は治療的免疫反応が望まれるウイルスファミリーの例には、アフソウイルス、カルディオウイルス、エンテロウイルス、へパトウイルス、パレコウイルス、リノウイルスなどの６種類の異なる属を含むピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーが含まれる。免疫反応が望まれるピコルナウイルスの例は、口蹄疫ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトＡ型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス、リノウイルスである。カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）には、ウイルスのノーウォーク群により生じるヒトにおける流行性胃腸炎及び、ウサギ出血性疾患ウイルスに関するウサギにおける出血性疾患及びネコカリシウイルスにより生じる呼吸器疾患のような、動物におけるその他の疾患を伴う、様々な属が含まれる。
【００８０】
免疫反応を誘発することが望まれ得るウイルスの別のファミリーは、ヒトならびに多くの様々な動物種から単離された、ウイルスを含むアストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）である。ヒトアストロウイルスは、胃腸炎及び低年齢児の下痢に関連する。あるいは、２つの属：アルファウイルス及びルビウイルスを含む、ウイルスのトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーに対する免疫を哺乳動物宿主に付与することが望まれ得る。アルファウイルスは、関節炎（つまり、チックングニアウイルス、シンドビスウイルス）又は脳炎（つまり、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）などの、ヒト及び獣医学の疾患に関与する。
【００８１】
風疹ウイルスは、代替的なウイルス標的を与え、ルビウイルス属のメンバーのみが、発熱及びリンパ節炎を伴う軽度発疹疾患の流行に関与する。風疹ウイルス感染はまた、妊娠初期に母親が感染した際の、胎児の異常にも関与する。フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）は、重要なヒトならびに動物病原体を含む、３種類の属：フラビウイルス属、ペスチウイルス属及びヘパチウイルス属からなる別のウイルスファミリーである。フラビウイルス属メンバーの多くは、発熱、脳炎及び出血熱を含む、様々な疾患を引き起こす、節足動物媒介性ヒト病原体である。デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスは、世界中が関心を持っている、又はある地域（風土病的）で関心が持たれている主要な病原体である。ペスチウイルス属には、ウシウイルス性下痢ウイルス、ブタコレラウイルス、ボーダー病ウイルスなどの、経済的に非常に重要な動物病原体が含まれる。Ｃ型肝炎ウイルスは、急性及び慢性肝炎に関与する、ヘパチウイルス（Ｈｅｐａｃｉ  ｖｉｒｕｓ）属の唯一のメンバーである。組み換えアデノウイルスにより発現されるＨＣＶタンパク質は、世界中で１億７千万人を侵すウイルス感染の結果を制限する、防御的ならびに治療的免疫反応を誘発することができる。
【００８２】
あるいは、感染に対する防御を獲得するために、組み換えアデノウイルスベクターにより、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバー由来の抗原を発現させることができる。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ−Ｃｏウイルス）に対する防御は、これらに限定されないが、ヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、膜（Ｍ）糖タンパク質、スパイク（Ｓ）糖タンパク質、小型エンベロープ（Ｅ）タンパク質又はそのウイルスにより発現されるその他の何らかのポリペプチドを含む、１又は複数のＳＡＲＳ  Ｃｏｖタンパク質を発現する、ＣｈＡｄ３、４、５、６、７、９、１０、１１、１６、１７、１９、２０、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２を含む群から選択される１又は複数のチンパンジーアデノウイルスで免疫付与することにより獲得することができる。狂犬病ウイルスを含むラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）メンバーは、ウイルスタンパク質を発現する組み換えワクチンの標的であり得る。
【００８３】
その他の可能な標的には、重症出血熱の流行に関与する、エボラ様ウイルス及びマルブルグ様ウイルス属が含まれるフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）；麻疹、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルスのような、ヒトにおいて知られる最も流行しているいくつかのウイルス及びニューカッスル病及び牛疫ウイルスなどの獣医学的に関心のあるウイルスを含むパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；インフルエンザＡ、Ｂ、Ｃウイルスを含むオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；リフトバレー熱、Ｓｉｎ  Ｎｏｍｂｒｅ（シンノンブレ）、ハンタ、プーマラウイルスなどの重要なヒト病原体を含む、節足動物から脊椎動物宿主に主に伝染するブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）；リンパ球性脈絡髄膜炎、ラッサ熱、アルゼンチン出血熱、ボリビア出血熱ウイルスを含む、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）；主にウマ及びヒツジにおいて中枢神経疾患を引き起こすウイルスを含む、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；世界中での幼児及び低年齢児における重症下痢疾患の最も重要な原因である、ロタウイルスファミリー及び、ヒト及び他の動物両方に伝染し得るオルビウイルス（ブルータング病、伝染性出血性疾患ウイルス）を含む、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）；ヒト免疫不全ウイルス１及び２（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）及びヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプＥ１及び２（ＨＴＬＶ１及び２）のような、重要なヒト病原体ならびにヒツジ及びヤギに伝染するマエディ／ビスナウイルス、ウマに伝染するウマ感染性貧血ウイルス、ウシに伝染するウシ免疫不全ウイルス、ネコに伝染するネコ免疫不全ウイルスなどの非ヒトレンチウイルスを含むウイルスの大きなグループである、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）グループ小型ＤＮＡ癌原性ウイルス、典型ウイルスは、それぞれマウス及びアカゲザルに感染するポリオーマ及びＳＶ４０、（ＳＶ４０に非常に関連しているＢＫ及びＪＣウイルスは、ヒト患者から単離された。）；パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）は、いぼ及びコンジローマを発生させる、ヒトを含む高等脊椎動物に感染するＤＮＡウイルスの群からなる。パピローマウイルス感染は、ヒト及び動物両方での癌の発生に関連する。ヒトパピローマウイルスは、子宮頸癌、膣癌及び皮膚癌に関与する。ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）は、ヒト及びその他の哺乳動物に対するいくつかの重要な病原体が分類される亜科を含む。抗原の適切なソースは、これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルス１及び２、水疱瘡ウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６Ａ、６Ｂ及び７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルスである。抗原のさらに適切なソースは、サル痘ウイルス、伝染性軟属腫（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ  ｃｏｎｔａｇｉｓｕｍ）ウイルス、天然痘ウイルスのようなポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）のメンバー；へパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）の典型メンバーである、Ｂ型肝炎ウイ��スならびに、Ｄ型肝炎（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｄｅｌｔａ）ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスのような、急性及び／又は慢性肝炎を引き起こすその他のウイルスである。
【００８４】
本発明のアデノウイルスベクターはまた、細菌、真菌、寄生生物病原体を含む非ウイルス性病原体により発現されるタンパク質に対して、ヒト又は動物において免疫反応を刺激するように設計される免疫原性組成物の調製に適切である。例えば、本明細書中で開示するベクターは、これらに限定されないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎レンサ球菌）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ（破傷風菌）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ（髄膜炎菌）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ（ジフテリア菌）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（マイコバクテリウム・テュバキュローシス））、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｌｅｐｒａｅ（ライ菌）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（リステリアモノサイトジェン）及びＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｆｉｌａ（レジオネラニューモフィラ）に対するワクチンを調製するために使用することができる。予防的又は治療的ワクチンを調製することが望まれ得る、真菌及び哺乳動物寄生生物の例には、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダアルビカンス）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ（アスペルギウス・フミガタス）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ（ヒストプラズム・カプスラーツス）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ（四日熱マラリア原虫）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ（リーシュマニア・メジャー）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍｅ  ｃｒｕｚｉ（トリパノソーマ・クルジ）及びｂｒｕｃｅｉ（ブルシェイ）、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ（ビルハルツ住血吸虫）、ｍａｎｓｏｎｉ（マンソン住血吸虫）及びｊａｐｏｎｉｃｕｍ（日本住血吸虫）；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ（エンタモエバ・ヒストリチカ）及びヒトフィラリアに関与することが知られているフィラリアの多数の種が含まれる。
【００８５】
癌は、一般に、細胞周期の維持又は細胞増殖の調節に関与するポリペプチドをコードする遺伝子の脱制御を含む（例えば、増殖因子、癌遺伝子、受容体及び腫瘍抑制因子）。癌に関わる遺伝子の多くの産物は、様々な腫瘍細胞の表面で発現される。Ｔ及びＢリンパ球により認識され得る様々な腫瘍抗原が、ヒト及び動物の癌で同定されている。腫瘍細胞において発現されるのに加えて、正常組織及び／又は胎児発生中にも発現されるため、抗癌ワクチン試験での使用に適切なヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の大部分は、「自己抗原」として説明される。ＴＡＡに対する標的集団の免疫寛容性により、多くの癌ワクチンが効果がないとされる理由が説明される。
【００８６】
腫瘍抗原は、Ｔ／Ｂ細胞反応を刺激することができる、変化した細胞性タンパク質の例である、Ｒａｓ、ｐ５３又はＢｃｒ−Ａｂ１タンパク質などの、癌原遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子で変化が起こる正常細胞遺伝子の発癌突然変異体により産生され得る。腫瘍抗原は、腫瘍細胞で過剰発現されるか（チロシナーゼ、ＧＰ１００、ＭＡＲＴは、メラニン産生細胞において低レベルで正常に発現され、メラノーマにおいて過剰発現される。）、又は腫瘍細胞において異常に発現される（メラノーマ及び多くの癌腫において発現されるが、精巣及び胎盤において正常に発現される、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ。）。腫瘍抗原は、発癌ウイルスの産物であり得る：子宮頸部癌により発現される、パピローマウイルスＥ６及びＥ７タンパク質；ＥＢＶ＋リンパ腫及び上咽頭癌により産生される、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ−１タンパク質；ＳＶ４０誘導実験的腫瘍におけるＳＶ４０  Ｔ抗原。癌胎児性抗原は、癌細胞及び正常な発生過程（胎児）の組織において高レベルで発現されるが、成人組織では発現されない。癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）は、よく特性が調べられている癌胎児性抗原の例である。
【００８７】
最近の証拠により、免疫反応を誘発する、したがってワクチン治療に対する免疫原に適切な抗原のクラスを生じさせることができるＴＡＡの存在が裏付けられている。しかし、抗原のクラスとして、ＴＡＡは、周知のとおり弱い免疫原であり、ＴＡＡに非常に特異的なＴ細胞は、Ｔ細胞発生の過程で欠失するか、アネルギー化されている。したがって、特定のＴＡＡに対する、腫瘍を有する宿主の免疫反応は非常に弱いと予想される。標的ＴＡＡに対する宿主の寛容性を打破するという固有の必要性があるため、実験的臨床ワクチン研究は、特に、ＴＡＡ特異的Ｔ細胞反応を促進するＴＡＡ免疫付与ストラテジーの開発に焦点を当てている。一般に、効果的な癌ワクチンは、免疫寛容性を乗り越え、かつ、宿主の免疫反応を、予防的及び／又は防御的なレベルに上げなければならない。多くの実験的ワクチン研究における抗腫瘍効果は、ＴＡＡに対するＴ細胞反応に相関がある。
【００８８】
代替的実施形態において、本発明は、腫瘍抗原に対する免疫反応を誘導するために使用することができる、免疫原性組成物（例えば、癌ワクチン）をもくろむ。適切な組成物は、腫瘍抗原をコードする核酸配列を含有する組み換えチンパンジーアデノウイルス及び生理学的に許容可能な担体を含有する。特定の実施形態において、カセットのコード配列エレメントは、癌関連抗原などの自己抗原由来の免疫原性ペプチド配列などの、１個の免疫原をコードし得る。ある実施形態において、免疫原をコードする核酸配列（つまり導入遺伝子）は、特定の哺乳動物種での発現のためにコドン最適化され得る。他の実施形態において、コード配列は、１又は複数のコドン最適化された腫瘍抗原などの、複数の免疫原をコードし得る。例えば、開示するアデノウイルスベクターを利用する癌ワクチンは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、Ｈｅｐｃａｍ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、テロメラーゼ、ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｕｃ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ストロメリシン  ３、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ３、ＣＭＬ６８、ＣＭＬ６６、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＳＸ−２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＮＹ−ＢＲ−６２、ｈＫＬＰ２、ＶＥＧＦなどの、自己抗原の組合せをコードし得る。
【００８９】
効果的な癌ワクチンの開発には、ワクチン接種された患者において抗原特異的免疫を誘発するストラテジー及び活性のある免疫付与終了後に免疫反応の生成が持続することの検証が必要である。このストラテジーの成功は、標的抗原に対して向けられる測定可能な免疫反応が、癌発生又は再発に対する防御に相関するか否かに依存する。細胞性免疫及び液性免疫両方のエフェクターメカニズムにより、腫瘍細胞が殺滅されることが示されている。しかし、実験系からのデータにより、腫瘍細胞の除去に対して、抗原特異的Ｔ細胞が、最も強力な免疫メカニズムを与えることが示唆される。腫瘍特異的抗原（例えばＴＡＡ）のエフェクターＴ細胞による認識により、ＴＡＡが腫瘍拒絶抗原として機能することができるようになると予想される。公表されている実験から、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞反応の刺激が、最善の腫瘍クリアランスの達成に重要であることが示唆されている（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．（１９９１）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４９：２８１−３５５；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．ら（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５８８−９４）。臨床反応（つまり効能）は、インターフェロンγ分泌細胞毒性Ｔ細胞の増加と関与する。本ワクチン担体の効率を明らかにするための、本明細書中で使用される、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイなどのアッセイの出現により、研究者らは、ワクチン接種計画に対するＴ細胞反応を測定できるようになり、それにより癌ワクチンの開発が促進される。
【００９０】
癌ワクチンは、予防的又は治療的の何れかであり得る。癌ワクチンの予防的使用の基礎をなす一般的な仮定は、腫瘍を有する対象において、ＴＡＡが非常に弱い免疫原であるか機能的に非免疫原性であるということである。より具体的には、癌免疫学の分野において、癌に罹患した患者における免疫療法として、ワクチンを使用することができる。したがって、既存の腫瘍又は悪性腫瘍により発現されるＴＡＡに向けられる免疫反応を誘発するように、癌ワクチンを設計することができる。したがって、特定の実施形態において、治療的癌ワクチンは、従来の治療法に対する耐性が進展しているか、従来の治療後に再発が起こる可能性が高い、腫瘍を有する患者における使用を意図する。
【００９１】
アデノウイルスの高い免疫原性により、アデノウイルスベクターは、自己抗原に対する宿主寛容性を打破するために設計されたワクチン担体の関連における使用のための、特に優れた候補となる。自己免疫疾患において最初に記載された、エピトープ又は決定基拡大の現象は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ限定反応の両方と関与し、ＨＥＲ２  ｎｅｕタンパク質特異的Ｔ細胞免疫の発生と相関がある。エピトープ拡大は、免疫原性タンパク質の特定部分に対する免疫反応の生成を表し、次いで、同じタンパク質に存在する、他の抗原性決定基に対する免疫の自然な拡大が起こる。例えば、Ｄｉｓｉｓらは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子と混合した、ＨＥＲ−２タンパク質の強力なＴヘルパーエピトープ由来のペプチドを含有するワクチンを投与した、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現悪性腫瘍がある患者の８４％でエピトープ拡大を観察した（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００２）２０（１１）：２６２４-２６３２）。重要なことは、エピトープ拡大が、ＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質ドメイン反応の生成と相関したことであり、このことから、免疫付与が効果的に免疫寛容性を回避したことが示唆される。
【００９２】
癌ワクチンに対する標的としての、開示するアデノウイルスベクター及び方法の使用に適切なＴＡＡは、いくつかの特徴を保持すべきである。例えば、標的ＴＡＡは、好ましい発現プロファイルを有さなければならず、これは、正常組織と比較して、腫瘍又は悪性腫瘍組織において、選択的に発現されるか、過剰発現されることを意味する。さらに、腫瘍発生に関与するＴＡＡは、癌進行の様々な段階で保持される可能性がより高いので、適切な標的ＴＡＡはまた、腫瘍進行及び転移を通じて保持されるべきである。適切な標的ＴＡＡはまた、腫瘍内で均一に発現される。第三に、適切な標的ＴＡＡは、絶対的な免疫寛容性に対する対象であってはならない。より具体的には、関心のあるＴＡＡに対して認識し、かつ反応することができるＴ細胞は、宿主のＴ細胞レパートリーから完全に欠失されていないことのいくつかの証拠があるべきである（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９（８）：２１９７（２００２））。
【００９３】
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、抗癌ワクチンのための標的抗原としての使用のために魅力的なＴＡＡとなる多くの特徴を有する。これは、有利な発現パターンを特徴とする、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである。これは、全ヒト癌の５０％を超えるものにおいて、発現され、腫瘍発生プロセスに関わっており、このことから、その発現が、癌進行を通して、選択され、保持され得ることが示唆される。さらに、ＣＥＡに対する免疫寛容性が絶対的ではないことが分かっている。公表された研究から、ヒトＴ細胞が、ＣＥＡを発現する癌細胞を、認識し、活性化し、溶解させることが分かっている（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ，Ｎ．Ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９（８）：２１９７（２００２））。例えば、その後のペプチドべースのインビトロ刺激と組み合わせた、ＣＥＡを発現する組み換えワクシニアウイルスを用いた患者への免疫付与により、自己腫瘍を細胞溶解できる、ＣＤ８＋ＭＨＣ−限定ＣＴＬが生成した（Ｔｓａｎｇ，Ｋ．Ｙ，ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，（１９９５）８７：９８２−９９０）。あるいは、手術後の結腸直腸癌患者に対する組み換えＣＥＡを用いた免疫付与が、組み換えＣＥＡに対する、弱い抗体及び細胞性応答を誘導したことが報告された（Ｓａｍａｎｃｉ，Ａら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４７：１３１−１４２）。さらに、結腸直腸癌と診断された患者への抗ＣＥＡ  抗イディオタイプ抗体の投与により、抗ＣＥＡ抗体が生じ、イディオタイプ特異的Ｔ細胞増殖が起こった（Ｆｏｏｎ，Ｌ，Ａ．ら（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６：３３４−３４２）。文献により、また、いくつかの異なるワクチン接種法を用いて、癌患者におけるＣＥＡに対する寛容性を乗り越えることができることが示される（つまり、組み換えＣＥＡ又は組み換えオルトポックスもしくはアビポックスＣＥＡウイルスを用いたワクチン接種、抗イディオタイプ抗体の投与、ＣＥＡアゴニストエピトープによる樹状細胞のパルシング）。
【００９４】
ＣＥＡは、正常胎児結腸で発現される、正常結腸粘膜では非常に低い、癌胎児性糖タンパク質である。これは、多くの腺癌、特に結腸、膵臓、乳房、肺、直腸及び胃の腺癌においても過剰発現される。多くの結腸直腸癌及びある癌腫は、血清中で測定可能な高レベルのＣＥＡを産生し、それにより、特に結腸直腸癌の患者において、最も広く使用される悪性の血清マーカーの１つとなっている。
【００９５】
本発明の組成物及び方法における使用のための適切な免疫原を提供する第二のＴＡＡは、ＨＥＲ２／ｅｒｂ−２（ｎｅｕとも呼ばれる。）癌原遺伝子の産物である。ＣＥＡのように、ＨＥＲ２／ｎｅｕは、有利な発現パターンを有し、絶対的寛容性の対象ではない。より具体的には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ転写産物及び１８５ｋＤポリペプチド産物の発現を検出したところ、皮膚及び乳房を含む様々な組織の正常成人上皮細胞及び胃腸組織、生殖管及び尿路では低レベルであり；胚発生中の対応する胎児組織では高レベルであった（Ｐｒｅｓｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９５３−９６２（１９９０））。いくつかの証拠から、ヒト乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌及び結腸直腸癌でのＨＥＲ−２の増幅と悪性形質転換との間の関連が示唆される（Ｄｉｓｉｓ及びＣｈｅｅｖｅｒ，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７１：３４３−３７１（１９９７））。一般に、ＨＥＲ２／ｎｅｕの過剰発現は、癌患者に対して、予後が悪いこと及び再発率が高いことと相関がある（Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７−７１２（１９８９））。したがって、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質に特異的なワクチンは、多くの様々なヒト悪性腫瘍における疾患再発の予防において、広く適用でき、利用できると思われる。
【００９６】
ＨＥＲ２／ｎｅｕは、生来のチロシンキナーゼ活性を保持し、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体に対する高い相同性を示す膜貫通糖タンパク質をコードする（Ａｋｉｙａｍａ，Ｔら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：１６４４−１６４６）。癌免疫療法に対してＨＥＲ２を標的として利用した最初の臨床研究の１つでは、ＨＥＲ−２特異的モノクローナル抗体Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎが乳癌の治療に対して用いられた（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＭＭ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒ．２１：３０９−３１８）。これにより、自己抗原提示細胞を活性化するためのＨＥＲ−２ドメインを含有する組み換え融合タンパク質の使用を含む、効果的な抗腫瘍反応を誘発するための、免疫系のＴ細胞アームに対する標的としてのＨＥＲ−２の使用に焦点を当てたその後の試みが導かれた。公表されている報告により、ｎｅｕ発現性の、乳癌及び卵巣癌に罹患している多くの癌患者において、ＨＥＲ２／ｎｅｕ癌遺伝子のタンパク質産物に対する免疫反応が得られることが分かっている（例えば、抗原特異的抗体及びＴ細胞を産生する。）
【００９７】
様々な中間体プラスミド及びシャトルベクターへの組み換えアデノウイルス配列、導入遺伝子及び他のベクターエレメントのアセンブリー及び、組み換えウイルス粒子を産生させるためのプラスミド及びベクターの使用は全て、当業者にとって周知の標準的教科書に記載されているような従来技術を使用することにより達成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））。そのような技術には、これらに限定されないが、従来のｃＤＮＡクローニング技術、アデノウイルスゲノム由来の重複オリゴヌクレオチド配列の使用、相同組み換え、ポリメラーゼ連鎖反応、標準的トランスフェクション技術、寒天重層におけるウイルスのプラーク生成及びその他の関連方法が含まれる。
【００９８】
原核細胞におけるポリヌクレオチドの調製を促進するために、プラスミド型のアデノウイルスベクターを調製することが多い（アデノウイルスプレプラスミド）。このアデノウイルスプレプラスミドは、アデノウイルス部分及びプラスミド部分を含有する。このアデノウイルス部分は、基本的に、本発明のアデノウイルスベクター（Ｅ１、場合によってはＥ３領域が、非機能性であるか欠失している、アデノウイルス配列を含有する。）及び都合のよい制限部位に隣接した免疫原発現カセットを含有するアデノウイルス部分と同じである。
【００９９】
アデノウイルスプレプラスミドのプラスミド部分は、抗生物質の発現が真核細胞において起こらないように、原核プロモーターの転写調節下に、抗生物質耐性マーカーを含有することが多い。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子及びその他の医薬適合性の抗生物質を使用し得る。原核生物における発酵によるポリヌクレオチドの高レベル産生を促進するために、アデノウイルスプレプラスミドが原核性の複製起点を含有し、高コピー数であることが好都合である。多くの市販の原核クローニングベクターによりこれらの利益を得られる。必須でないＤＮＡ配列を除去することが望ましい。ベクターが真核細胞において複製できることもまた望ましい。これにより、ポリヌクレオチドワクチン配列の、受容者のゲノムへの組み込みのリスクが最小に抑えられる。特定の組織タイプにポリヌクレオチドの発現を限定することが望ましいかどうかを問わず、組織特異的プロモーター又はエンハンサーを使用し得る。
【０１００】
アデノウイルス骨格ＤＮＡ及び適切なシャトルベクター（特異的欠失を標的とするように、及び結果として得られるプラスミドに所望する制限部位を組み込むように設計される。）を用いた相同組み換えにより、アデノウイルスプレプラスミド（望ましい欠失及び挿入を有する複製欠損アデノウイルスのゲノムを含有するプラスミド）を生成させることができる。例えば、所望する欠失を考慮したアデノウイルス末端のＰＣＲ及び適切なクローニングプラスミドへの個別のセグメントの、続いて行われるクローニングなど、本技術分野で広く理解され認識される一般的方法を用いて、この目的における用途のシャトルベクターを生成させることができる。次に、アデノウイルスプレプラスミドを消化し、リン酸カルシウム共沈殿又はその他の適切な手段を介して補完的な細胞株にトランスフェクションすることができる。次に、ウイルス複製及び増幅が起こり、これは、顕著な細胞変性効果により明らかになる現象である。次に、ウイルス複製の完了後、感染細胞及び培地を回収する（一般に、トランスフェクションから、７日から１０日後。）。
【０１０１】
一般に、所望するアデノウイルスプレプラスミドの構築及びアセンブリー後、アデノウイルスＥ１を発現しているヒト細胞株に導入することにより、アデノウイルスプレプラスミドをウイルスとする。パッケージング細胞株とベクターのウイルス遺伝子との間の相補により、ベクターのアデノウイルス−導入遺伝子配列を複製させ、ビリオンキャプシド中にパッケージングされ、その結果、組み換えアデノウイルスの産生が起こる。本発明の方法での使用のために、当業者とって公知のあらゆる様々な方法により、得られたウイルスを単離し、精製し得る。
【０１０２】
チンパンジーアデノウイルス遺伝子の、１又は複数の選択した欠失をウイルスベクターに導入したとき、産生細胞株中に存在する配列による産生プロセスの間に、欠失遺伝子産物の機能を補われ得ることは、当業者にとって容易に明らかである。したがって、パッケージングに必要であるがそのベクターにおいて機能しないアデノウイルス機能の一部又は全てを特徴とする、永久的に形質転換された細胞株により、操作した遺伝子の機能を与えることができる（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４のいずれか。）。あるいは、その機能を与えるのに必要な遺伝子を含有するコンストラクトを用いて、適切な細胞に感染又は一時的トランスフェクションを行うことにより、適切なパッケージング細胞株に対して必要なアデノウイルス機能を与えることができる。
【０１０３】
したがって、本発明はまた、Ｅ１発現ヒト細胞株においてチンパンジーアデノウイルスベクターを生成させる方法を提供する。より具体的には、公知の細胞株  ２９３及びＰＥＲ．Ｃ６ＴＭを含むＥ１補完細胞株中に、開示されたベクターを増殖させることができる。これらの両細胞株は、アデノウイルスＥ１遺伝子産物を発現する。ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭは、１９９７年１月３日公開のＷＯ９７／００３２６に記載されている（これは、参照により本明細書中に組み込む。）。これは、複製欠損第一世代アデノウイルスの産生を補完するが、相同組み換えによる複製能のあるアデノウイルスの生成を防ぐように設計されているＥ１遺伝子セグメントにより形質導入されている初代ヒト網膜芽細胞株である。２９３細胞は、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ３６：５９−７２（これも、参照により本明細書中に組み込む。）において記載されている。「第一世代アデノウイルス」という用語が、Ｅ１領域が非機能的であるか欠失しているかのいずれかであり、場合によってはＥ３領域が非機能的であるか欠失している、複製欠損アデノウイルスを指すことを、当業者は、認識するであろう。
【０１０４】
臨床試験においてワクチン組成物としての使用を意図する複製欠損アデノウイルスベクターのバッチは、ＲＣＡ不含であることが証明されているべきである（Ｆａｌｌａｕｘ，Ｆ．Ｊ．ら（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，９：１９０９−１９１７）。実施に際し、これは、費用のかかるスクリーニングプログラムを確立し利用する必要がある、手間のかかるプロセスである。ＲＣＡ生成が高頻度に起こることにより、生成したバッチに対する失敗率が高まるだけでなく、スケールアップが非常に制限されることを、当業者は認めるであろう。ベクターのヌクレオチド配列とヘルパー産生／パッケージング細胞株のゲノムに存在するアデノウイルス配列との間の配列相同性を削除することにより、相同組み換えにより生成するＲＣＡが混入するベクターのバッチ産生の可能性が取り除かれると思われる。
【０１０５】
通常、組み換え複製欠損アデノウイルスベクターは、トランスにおいてＥ１遺伝子産物を与える細胞株中に増殖する。ベクターが、同じ又は非常に似た血清型由来である場合、トランスでの必須のＥ１遺伝子産物の供給は、非常に効果的である。例えば、Ｅ１欠失（つまりΔＥ１）グループＣ血清型（Ａｄ２及びＡｄ５）ベクターが、Ａｄ５  Ｅ１領域を含有し、発現する、２９３又はＰＥＲ．Ｃ６細胞において増殖できることは、周知である。しかし、２９３及びＰＥＲ．Ｃ６産生細胞に存在するＡｄ５  Ｅ１配列が、必ずしも非グループＣ血清型の複製を完全に補完し得るとは限らないことが観察されている。したがって、サブグループＣ以外のＥ１欠失血清型、例えば、サブグループＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ及びＦ由来のものの複製は、対応する野生ウイルスと比較して、より低効率であるか、又は２９３又はＰＥＲ．Ｃ６細胞において全く複製し得ない。これは、Ａｄ５（グループＣ）Ｅ１  Ｂ  ５５Ｋ遺伝子産物が、非グループＣ血清型のＥ４  ｏｒｆ６遺伝子産物と機能的に相互作用できないからである。
【０１０６】
Ａｄ５  Ｅ１発現細胞における複製効率の低下は、様々なサブグループのベクターによって変化し得る。サブグループＤ及びＥ  アデノウイルス由来のΔＥ１ベクターが、２９３及びＰｅｒ．Ｃ６ＴＭ細胞において様々な効率でレスキュー可能であり、増殖可能である一方、サブグループＢのΔＥ１ベクターは、増殖能が完全に損なわれている（Ｖｏｇｅｌｓ  Ｒら、（２００３）Ａｕｇ．Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ３５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓ  ｏｆ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７７（１５）：８２６３-７１）。
【０１０７】
Ａｄ５  Ｅ１ｂ  ５５ｋとベクター発現Ｅ４  ｏｒｆ６  タンパク質との間の相互作用が、同じサブグループのメンバー内で保存されているにもかかわらず、このことは、非Ｃ血清型のＥ４  ｏｒｆ６  タンパク質が発現される場合、十分安定ではないであろうことを示す。Ｅ１ｂ  ５５ｋ／Ｅ４  ｏｒｆ６複合体の形成が不十分であるか不安定であることから、ΔＥ１ベクターの増殖が低下しなくなる。したがって、成功裡に、かつ効率よく、グループＢ血清型の組み換えアデノウイルスをレスキューするために、関心のある血清型のＥ１領域を発現する細胞株を生成させることが必要とされ得ることが、実験的に分かっている。２９３又はＰＥＲ．Ｃ６ＴＭなどの、Ａｄ５  Ｅ１を発現する細胞において、発現をＥ１ｂ  ５５Ｋタンパク質に限定することができる。あるいは、適切なＡｄ５  Ｅ１発現細胞株を、Ａｄ５  Ｅ１に加えて全体のＡｄ５  Ｅ４領域（又はＥ４ｏｒｆ６のみ）を発現するように、改変することができる。Ａｄ５  Ｅ１及びｏｒｆ６の両方を発現する細胞株の生成は、代替的なアデノウイルス血清型を補完するのに有用である；例えば、Ａｂｒａｈａｍｓｅｎら、１９９７  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９４６−８９５１を参照のこと。
【０１０８】
Ａｄ５補完細胞株へのＥ４（ｏｒｆ６）の組み込みは、トランスで血清型特異的Ｅ１遺伝子産物を与える血清型特異的細胞株の生成であるとして知られている。あるいは、非グループＣベクター増殖効率は、ネイティブＥ４領域の、Ａｄ５  ｏｒｆ６での置換によるウイルス骨格の改変により向上させ得る。ネイティブ  ｏｒｆ６のみをＡｄ５又は他のサブグループＣウイルス（Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ６）由来のｏｒｆ６と置換することによって、同様の結果を得ることができる。米国特許第５，８４９，５６１号は、Ａｄ５−Ｅ４遺伝子の一部も発現するＡｄ５−Ｅ１補完細胞株における、Ｅ１欠失非グループＣアデノウイルスベクターの補完を開示する。
【０１０９】
Ｖｉｇｎｅらに発行された米国特許第６，１２７，１７５号は、アデノウイルスのＥ４領域の一部、好ましくは、ｏｒｆ６／ｏｒｆ６／７を発現する、安定的にトランスフェクションされた哺乳動物細胞株を開示する。このような細胞株は、Ｅ４領域を欠く組み換えＡｄゲノムの補完に有用である。
【０１１０】
ワクチン組成物を含む、開示するアデノウイルスベクターを含有する組成物は、本発明の重要な局面である。哺乳動物宿主、好ましくはヒト宿主に、予防的又は治療的設定のいずれかで、これらの組成物を投与することができる。宿主／ワクチンとして可能なものには、これらに限定されないが、霊長類、特にヒト及び非ヒト霊長類が含まれ、商業用動物又は家畜として重要なあらゆる非ヒト哺乳動物が含まれる。組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターを含有する組成物は、単独で又はその他のウイルス性もしくは非ウイルス性ベースのＤＮＡ／タンパク質ワクチンと組み合わせて投与し得る。これらはまた、広範囲の治療計画の一部として投与し得る。
【０１１１】
本発明の特定の実施形態において、自己抗原又は腫瘍関連抗原に対する宿主の寛容性を打破するために設計された免疫付与プロトコールにおいて、開示するベクターを使用し得る。多くのＴＡＡの同定により、癌治療に対する、活性のあるワクチン接種アプローチの開発が可能となった。プロセシングされ、提示される細胞表面抗原及び細胞内抗原の両方が、有用な標的を与える。一般に、自己抗原に対する宿主寛容性を打破する、開示する方法には、（ａ）抗原特異的免疫反応が望まれる自己抗原をコードするヌクレオチド配列を担う、第一のＣｈＡｄベクター又はプラスミドベクターを含有する第一のワクチン組成物を投与することにより、自己抗原に対する抗原特異的反応を刺激することと、（ｂ）少なくともゲノムのＥ１遺伝子の機能的欠失を含有し、そのＥ１遺伝子部位において配列が、初回刺激段階で送達された同じ自己抗原をコードするＤＮＡの発現を支配することができるプロモーターを含有する、異なる血清型の組み換えＣｈＡｄベクターを含有する第二のワクチン組成物を投与することにより、（ａ）の免疫反応を保持し、拡大することとが含まれ、それにより、自己抗原に対する寛容性を打破する効果を有する免疫反応を宿主が備える。
【０１１２】
したがって、熟練者は、宿主寛容性を打破するための使用に適切であり得るいくつかの異なる免疫付与プロトコールを設計するために、この開示を利用することができる。例えば、最初又は初回免疫付与が、ＴＡＡなどの特定の自己抗原をコードするプラスミドＤＮＡを含み、何らかのその後の免疫付与が、ＣｈＡｄベクターを含む、プロトコールを利用することができる。自己抗原をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡ配列は、１又は複数の注射において、電気刺激あり、又はなしで、筋肉内に送達され得る。例えば、エレクトロポレーションを介した、ＴＡＡをコードするプラスミドＤＮＡの複数回（例えば、３もしくは４もしくは５）筋肉内注射と、それに続く、同じＴＡＡをコードする導入遺伝子を含有するＣｈＡｄベクターの１又は複数の筋肉内注射に基づく免疫付与プロトコールは、本明細書中で開示され主張される一般的方法に包含される。
【０１１３】
あるいは、寛容性を打破するための適切なプロトコールは、自己抗原をコードする導入遺伝子を含有するＣｈＡｄ又はｈＡｄベクターを用いた、１又は複数の初回刺激免疫付与と、それに続く、同じもの又は、初回免疫付与に使用されるベクターと交差反応しないことが知られている、異なるＣｈＡｄベクターを用いた、１又は複数の追加免疫付与を含み得る。例えば、初回刺激のためにＣｈＡｄ３を用い、追加免疫のためにＣｈＡｄ６を用いる免疫付与プロトコール、又は初回刺激のためにＣｈＡｄ３を用い、続いて追加免疫のためにＣｈＡｄ６及びＣｈＡｄ９を用いる免疫付与プロトコールを、宿主寛容性を打破するために使用し得る。特定の実施形態において、本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＥｐＣａＭ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、テロメラーゼ、ｇａｐ１００、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、Ｍｕｃ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン、ストロメリシン  ３、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ３、ＣＭＬ６８、ＣＭＬ６６、ＯＹ−ＴＥＳ−１、ＳＳＸ−２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３、ＮＹ−ＣＯ−５８、ＮＹ−ＢＲ−６２、ｈＫＬＰ２、ＶＥＧＦからなる群から選択される、少なくとも１個の腫瘍関連抗原を含有する自己抗原の使用をもくろむ。特定の実施形態において、本発明は、癌に罹患している哺乳動物に、ＴＡＡをコードする組み換えチンパンジーアデノウイルスを送達することによる、選択された悪性腫瘍に特異的な腫瘍関連抗原に対する免疫反応（例えば液性又は細胞性）を誘導するための方法を提供する。本発明のこの局面の好ましい実施形態において、誘発される免疫反応は、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の産生を特徴とする免疫反応で構成される。
【０１１４】
本発明の免疫原性組成物は、予防的又は治療的設定のいずれかで、哺乳動物宿主、好ましくはヒト宿主に投与することができる。可能性のある宿主／ワクチンには、これらに限定されないが、霊長類、特にヒト及び非ヒト霊長類が含まれ、商業用動物又は家畜として重要なあらゆる非ヒト哺乳動物が含まれる。組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターを含有する組成物は、単独で又はその他のウイルス性もしくは非ウイルス性ベースのＤＮＡ／タンパク質ワクチン組み合わせて、投与し得る。これらはまた、広範囲の治療計画の一部として投与し得る。本発明の方法での使用に適切な組成物は、緩衝液、生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水、スクロース、その他の塩及びポリソルベートなどの、生理学的に許容可能な成分と組み合わせて、本発明の組み換えウイルスベクターを含有し得る。この組成物は、筋肉内注射時に組織に刺激を与えない。この組成物は、好ましくは、使用時まで凍結される。場合によっては、本発明のワクチン組成物は、これらに限定されないが、アジュバント、安定化剤、ｐＨ調整剤又は保存料などの、他の成分を含有するように処方し得る。このような成分は、当業者にとって周知である。
【０１１５】
本発明の組み換えチンパンジーアデノウイルスが、宿主細胞に形質導入され、受容者／ワクチンに対して治療的利益又は防御的免疫を与える免疫反応を誘発するのに十分な導入遺伝子の発現量を与えるために、選択した投与経路において効果的な組み換えウイルス量である「効果的な量」で、ヒト又は獣医学的宿主に投与されることが想定される。
【０１１６】
ワクチン受容者に導入されるべき本ワクチン組成物におけるウイルス粒子量は、使用される転写及び翻訳プロモーターの強さ及び発現される遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般に、１ｘ１０７から１ｘ１０１２粒子（つまり、１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、５ｘ１０７、１ｘ１０８、２ｘ１０８、３ｘ１０８、５ｘ１０８又は１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、５ｘ１０９、）、好ましくは、約１ｘ１０１０から１ｘ１０１１粒子の免疫学的又は予防的有効量を、直接筋肉組織に投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した押印（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏ）及び腹腔内又は吸入送達などのその他の投与様式ももくろまれる。
【０１１７】
本発明の組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターは、混合様式の初回刺激／追加免疫ワクチン接種計画の一部として、又は様々な血清型ベクターの複数注射に基づくワクチン接種計画において、単独で投与し得る。通常、少なくとも１個の免疫原を含有する初回刺激投与は、特定の病原体又は自己抗原に対する効果的な免疫反応を必要とする哺乳動物宿主に投与される。この投与は、効果的に、その後の抗原の同定において、宿主が免疫原に対してすぐに免疫反応を促進又は増強することができるように、免疫反応を刺激する。初回刺激及び追加免疫に対して代替的処方を利用する、混合様式ワクチン接種スキームの結果、免疫反応が促進される。初回刺激−追加免疫投与は通常、対象を少なくとも１回刺激することと（ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などによる。）、規定の時間の経過後、次に、追加免疫を行うこと（ウイルスベクター、プラスミド、タンパク質などによる。）を含む。複数免疫付与は、通常１回から４回であるが、さらに多く行い得る。初回刺激と追加免疫との間の時間の長さは、通常、約４ヶ月から１年の間で変化し得うるが、当業者が認める場合、他の時間枠を使用し得る。中和免疫が明らかとなる前に、各ベクターの複数回注射を約２週間の時間枠内で投与することができる。
【０１１８】
本発明のある実施形態において、アデノウイルスワクチンベクターの複数回の投与でワクチンを与え、このウイルスワクチンは、プラスミドワクチンの投与を伴う計画で与え得る。本明細書中で開示するベクターと組み合わせた使用に適切なプラスミドワクチンは、免疫原コード配列及び転写終結因子配列に機能可能に連結された、免疫原をコードする核酸配列の発現を支配することができる異種のプロモーターと組み合わせた、免疫反応の初回刺激又は増強が望ましい、少なくとも１個の免疫原をコードするプラスミドを含む。
【０１１９】
例えば、組み換え複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターの様々な血清型の複数注射を利用する投与計画を使用することができる。あるいは、プラスミドワクチンの最初の投与（つまり初回刺激投与）及び、該プラスミドワクチンにおいて送達された同じ免疫原のコード配列を含有する複製欠損組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターを含有する第二の投与（つまり追加免疫投与）を個体に与え得る。あるいは、その個体に少なくとも１個の免疫原をコードするヒトアデノウイルスワクチンベクターの最初の投与を行い、次いで、本明細書中で開示する複製欠損組み換えチンパンジーアデノウイルスベクター（これは、初回刺激投与において送達された同じ免疫原のコード配列を含有する。）を含有する第二の投与を行い得る。第二の代替的実施形態において、本発明のベクターを含有するワクチン組成物を最初に投与し、次いで、プラスミドワクチン投与を行い得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、ウイルスベクター又はプラスミド形態のいずれかで、同じ免疫原の複数回投与を個体に行い得る。これは、規定の最小時間をあけて投与を行い得る。
【０１２０】
目的の１個のタンパク質又は抗原が、本発明の組み換え複製欠損チンパンジーアデノウイルスベクターにより送達されるのに加えて、別個のビヒクルを介して、又は同じビヒクルを介してのいずれかで、２以上のタンパク質又は抗原を送達することができる。複数のオープンリーディングフレームを含むアデノウイルスプレプラスミドの生成のための、適切なシャトルプラスミドに、複数の遺伝子／機能的同等物を連結することができる。この複数の遺伝子／機能的同等物に対するオープンリーディングフレームを、別個のプロモーター及び転写終結配列に、機能可能に連結することができる。
【０１２１】
本明細書中で示されるように、適切な免疫付与計画において、様々なアデノウイルス血清型を用いることができる。このようなプロトコールの一例は、第一の血清型（例えばＣｈＡｄ３又はＣｈＡｄ６）の組み換えアデノウイルスベクターを含有する初回刺激投与と、その後の、第二の血清型の組み換えチンパンジーアデノウイルスベクターを含有する追加免疫投与である。代替的な実施形態において、この初回刺激投与は、異なるタンパク質／抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含有する、別個のアデノウイルスビヒクルの混合物を含み得る。このような場合、この追加免疫投与は、初回免疫投与で送達された同じ又は類似の抗原セットをコードする遺伝物質を含有する組み換えウイルスベクターを投与する、という条件で、別個のタンパク質／抗原をコードする遺伝子をそれぞれ含有するベクターの混合物を含み得る。これらの複数の遺伝子／ベクター投与様式をさらに組み合わせることができる。特異的抗原からの複数であるが別個の成分を含む、併用様式計画に着手することは、さらに、本発明の範囲内にある。
【０１２２】
ヒトベクターのウイルスエレメントに対して向けられた既存の免疫により中和されないチンパンジーアデノウイルス由来の組み換えベクターを使用することにより、ワクチン担体としてのヒトＡｄベクターの使用に対する代替法が得られる。アデノウイルスが高免疫原性であるため、アデノウイルスベクターは、自己抗原に対する宿主寛容性を打破するために設計されたワクチン担体の関連での使用のための特に優れた候補である。さらに、ヒトウイルスと同等の効率での、ヒト細胞、特にＰｅｒ．Ｃ６ＴＭ細胞株でのｃｈｉｍｐ  ウイルスの増殖能により、調節の観点及び治療法又はワクチンの大規模産生に対する両方から、顕著な有利性が与えられる。したがって、本発明は、遺伝子ワクチン接種のためのワクチン担体として、単独で、又は組み合わせて、使用し得る、組み換えウイルス調製を可能にする、チンパンジーアデノウイルス配列、ベクター及びプラスミドのコレクションを提供する。
【０１２３】
本明細書中で言及した公表物は全て、本発明との関連で使用され得る方法及び物質を説明し開示する目的のために、参照により組み込む。明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１２４】
添付の図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態を説明してきたが、本発明がまさにその実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、様々な変更及び改変が当業者によりなされ得ることを理解されたい。
【０１２５】
次の実施例は、本発明を説明するが、限定するものではない。
【実施例１】
【０１２６】
ＣｈＡｄの単離、クローニング、配列決定及び特性決定
チンパンジーアデノウイルスの単離
ウイルス輸送培地（ＶＴＭ；  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ  Ｍ４−Ｒ  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ，  Ｒｅｍｅｌ  Ｉｎｃ．）において便検体を回収し、次にＮＩＲＣ（Ｎｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ４４０１  Ｗ．  Ａｄｍｉｒａｌ  Ｄｏｙｌｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｎｅｗ  Ｉｂｅｒｉａ，  ＬＡ  ７０５６０）で−７０℃にて凍結又は直接凍結した。この検体を細胞培養物への接種のために処理するまで＜−７０℃で凍結保存した。この検体を細胞培養物へ接種する際、この検体を解凍し、次に過剰の氷冷ウイルス輸送培地中でボルテックスした。前記検体を懸濁液へ入れて解離させた後、それらを１５００から１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を０．８μｍシリンジフィルター及び０．２μｍシリンジフィルターを通じて連続して濾過し、次にこの濾過した材料を細胞培養物へ接種した（シェルバイアルへ２００から２５０μｌ、及び試験管培養物へ２５０から３００μｌ）。処理した各検体を２９３細胞もしくはＡ５４９細胞を播種した試験管培養物及びシェルバイアル培養物へと接種した。
【０１２７】
対照（ポジティブ及びネガティブ）培養物を、１セットの試料を接種する各場合に調製した。設定におけるシェルバイアルに全て接種したら、それらを室温にて６０±１０分間、２０００ｒｐｍ（９００ｘｇ）で遠心分離した。培養物中の熱損傷を防止するため、ローターの回転が停止した直後に前記バイアルを遠心分離機から取り出した。遠心分離後、交差汚染を防止するため、各バイアルにおいて新鮮な滅菌済みパスツールピペットを使用して、接種材料を前記シェルバイアルから吸引した。各洗浄につき１．０ｍｌの新鮮な培地を使用して、前記培養物を３回洗浄した。３回目の洗浄の後、新鮮な培地（１．０ｍｌ）を各バイアルへピペットを介して添加し、前記シェルバイアルを３５から３７℃のインキュベーターの中で３日から４日間（約９６時間）静置した。
【０１２８】
培養期間の終了時に、上清を前記培養物から吸引し、各洗浄に対して約１．０ｍｌの緩衝液を使用して、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）緩衝液で各バイアルにおける細胞層を２回洗浄した。１．０ｍＬの冷アセトンを各バイアルへ添加する（２から８℃で１０分間）ことにより、細胞を固定した。アセトン洗浄したスライドを、シェルバイアルカバースリップと関連付けた検体認識番号で標識した。このシェルバイアルカバースリップを、一次マウス抗アデノウイルス抗体［ＭＡＢ８０５２、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ］を使用してアデノウイルス感染細胞の蛍光標識用に処理した。蛍光顕微鏡を使用して、スライドを評価する。ウェル（１＋から４＋）にわたる免疫蛍光がカバーする範囲に留意して、１０倍の対物レンズを使用して各調製物をスキャンした。４０倍の対物レンズを使用して特異的免疫蛍光の有無を確認した。前記シェルバイアルについて記載したものと同じ手順で、試験管培養物に接種した（例えば、ネガティブ対照を最初に処理し、次いで、臨床検体及びポジティブ対照）。この接種材料を３６から３８℃にて６０分から１２０分間吸着させた。吸着時間後、この検体／対照を試験管から吸引し、新鮮な培地と交換した。
【０１２９】
接種から３日から４日後、及び、その後週に１回、この培養試験管から培地を吸引し、１．５ｍｌの新鮮な培地と交換した。培養試験管をＣＰＥについて、接種後少なくとも２１日間、少なくとも１日おきに目で見て観察した。チンパンジー検体で接種した培養物を対照と比較し、ＣＰＥの程度を観察することによって評価した。１４日後に、ＣＰＥを示さない培養物を新鮮な試験管培養物へ通し、２１日後にＣＰＥに対して陰性である培養試験管を陰性とみなした。３＋から４＋のＣＰＥの培養試験管を１０秒間ボルテックスした。細胞を試験管壁から、滅菌済みの１．０ｍＬ血清学用ピペットを使用して回収し、培養上清中で懸濁した。５ｍＬのスナップキャップ試験管に検体認識番号及び日付を付した後、−７０℃で保存した。この細胞懸濁液  ５００μｌを、培養試験管からスナップキャップ試験管へ移し、アデノウイルスを検出するための間接免疫蛍光抗体技術（シェルバイアルを染色するための手段と同等）を使用して処理するまで、２℃から８℃で最長１日間保存した。
【０１３０】
チンパンジーアデノウイルス増幅
ＡＴＣＣ又はＥｓｏｔｅｒｉｘ  Ｉｎｃ．，．  Ａｕｓｔｉｎ，  Ｔｅｘａｓから購入した野生型チンパンジーアデノウイルスＣＶ３２、ＣＶ３３、ＣＶ２３及びＣＶ６８（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＶ３２、ＶＲ−５９２；ＣＶ３３、ＶＲ−５９３；）及びオリジナルの分離株を、ヒトＥ１発現細胞株ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ又は２９３を使用することによって以下のように増殖させた。簡潔には、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ  ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％  ペニシリン−ストレプトマイシン、２ｍＭ  グルタミン及び１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２  （Ｐｅｒ．Ｃ６ＴＭ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を培養した。５％  ウマ血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ中でアデノウイルス感染を行った。細胞の１００％がウイルスにより誘導される細胞病理学的効果（ＣＰＥ）を呈したら、感染した細胞及び培地を回収し、凍結融解を３回繰り返して細胞溶解させた。
【０１３１】
野生型チンパンジーアデノウイルス（ＣＶ）ストックを全て、増幅の第一継代後に９６穴プレートに播種した２９３細胞を感染させることによってクローニングした。ウイルスクローニングは、ウイルス増幅の第一継代で得られる細胞溶解液の希釈を制限することによって行った。５個の単離されたクローンを拾い、連続して増殖させた。増幅の３回から４回の連続した継代の後、５つの２層細胞ファクトリー（ＮＵＮＣ）上に播種した細胞において、アデノウイルスの大規模調製を行った（１つの細胞ファクトリーにつき２億個の細胞）。塩化セシウム密度勾配における超遠心段階を２回行い、細胞溶解液から、精製したウイルス粒子を得た。
【０１３２】
ウイルスゲノムＤＮＡの配列決定
１％ＳＤＳ−ＴＥＮ中のプロテイナーゼＫ（０．５ｍｇ／ｍｌ）で（５５℃で２時間）消化することにより、精製ウイルス調製物  ３ｘ１０１２ｐｐから、ゲノムＤＮＡを単離した。フェノール−クロロホルム抽出ならびにエタノール沈殿の後、このゲノムＤＮＡを水中で再懸濁し、ゲノム配列決定に供した。
【０１３３】
全長のＡｄゲノム配列決定のため、精製ウイルスＤＮＡを霧状にし、無作為にせん断された断片を得た。Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼ及びポリヌクレオチドキナーゼのＫｌｅｎｏｗ断片を用いて、このＤＮＡ断片を平滑末端化にした。平滑末端断片を低融点アガロースゲル電気泳動に供し、１から３ｋｂの範囲の大きさの断片を精製し、ｐＵＣ１９ベクターのＳｍａＩ部位へとクローニングし、ショットガンライブラリを作製した。ライゲーションを使用してコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’を形質転換した。Ｘ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有するＬＢ寒天上での白色／青色スクリーニングにより陽性コロニーを同定した。プラスミドＤＮＡの３個から４個の９６穴ブロックをライブラリから単離し、ｐＵＣ順方向プライマー及び逆方向プライマーを用いて配列決定した。配列決定の読み取りは全て、Ｐｈｒｅｄ−Ｐｈｒａｐソフトウェアパッケージを使用して性質及びベクター配列についてスクリーニングした。このスクリーニングを通過した読み取りをコンティグに集めた。プライマーは、ギャップを閉鎖し、両端のＤＮＡ配列を決定するために、アデノウイルスＤＮＡを直接配列決定するよう設計した。
【０１３４】
ＣｈＡｄ３（配列番号１）、ＣｈＡｄ６（配列番号２）、ＣＶ３２（配列番号３）、ＣＶ３３（配列番号４）、及びＣＶ２３（配列番号５）を含む選択されたウイルスについて完全なウイルスゲノム配列決定が行われた。表１は、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ６、Ｐａｎ５（ＣＶ２３）、Ｐａｎ６（ＣＶ３２）、Ｐａｎ７（ＣＶ３３）、Ｃ１及びＣ６８アデノウイルスゲノムのヌクレオチド配列間の同一性の割合を要約するデータを提供する。アラインメントは、ＦＡＳＴＡパッケージ第２版の一部としてのＡＬＩＧＮプログラムを使用して計算した（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｒ．  Ｐｅｎｓｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ；  Ｍｙｅｒｓ  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ，  ＣＡＢＩＯＳ  １９８９，  ４：１１−１７）。
【０１３５】
【表１】
0005427874.tif 000002
【０１３６】
新規のアデノウイルス分離株（例えば、ＣｈＡｄ２０、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ８、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１６、ＣｈＡｄ１７、ＣｈＡｄ１９、ＣｈＡｄ２２、ＣｈＡｄ２４、ＣｈＡｄ２６、ＣｈＡｄ３０、ＣｈＡｄ３１、ＣｈＡｄ３７、ＣｈＡｄ３８、ＣｈＡｄ４４、ＣｈＡｄ６３及びＣｈＡｄ８２）の特徴を調べるために、ヘキソン及び繊維遺伝子のヌクレオチド配列もプライマーウォーキングにより決定した。繊維遺伝子は、配列番号６から１５（配列番号６、ＣｈＡｄ２０；（配列番号７、ＣｈＡｄ４）；配列番号８、ＣｈＡｄ５）；配列番号９、ＣｈＡｄ７）；配列番号１０、ＣｈＡｄ９）；配列番号１１、ＣｈＡｄ１０）；配列番号１２、ＣｈＡｄ１１）；配列番号１３、ＣｈＡｄ１６）；配列番号１４、ＣｈＡｄ１７）；配列番号１５、ＣｈＡｄ１９）及び（配列番号５８、ＣｈＡｄ８）、（配列番号６０、ＣｈＡｄ２２）、（配列番号６２、ＣｈＡｄ２４）、（配列番号６４、ＣｈＡｄ２６）、（配列番号６６、ＣｈＡｄ３０）、（配列番号６８、ＣｈＡｄ３１）、（配列番号７０、ＣｈＡｄ３７）、（配列番号７２、ＣｈＡｄ３８）、（配列番号７４、ＣｈＡｄ４４）、（配列番号７６、ＣｈＡｄ６３）及び（配列番号７８、ＣｈＡｄ８２）である。図２０Ａから２０Ｇは本明細書中で開示され主張される前記ＣｈＡｄ分離株の繊維タンパク質のアミノ酸配列の比較を与える。
【０１３７】
ヘキソン遺伝子配列は、配列番号１６から２５（配列番号１６、ＣｈＡｄ２０）；配列番号１７、ＣｈＡｄ４）；配列番号１８、ＣｈＡｄ５）；配列番号１９、ＣｈＡｄ７）；配列番号２０、ＣｈＡｄ９）；配列番号２１、ＣｈＡｄ１０）；配列番号２２、ＣｈＡｄ１１）；配列番号２３、ＣｈＡｄ１６）；配列番号２４、ＣｈＡｄ１７）；配列番号２５、ＣｈＡｄ１９）、（配列番号９７、ＣｈＡｄ８）、（配列番号９９、ＣｈＡｄ２２）、（配列番号１０１、ＣｈＡｄ２４）、（配列番号１０３、ＣｈＡｄ２６）、（配列番号１０５、ＣｈＡｄ３０）、（配列番号１０７、ＣｈＡｄ３１）、（配列番号１０９、ＣｈＡｄ３７）、（配列番号１１１、ＣｈＡｄ３８）、（配列番号１１３、ＣｈＡｄ４４）、（配列番号１１５、ＣｈＡｄ６３）及び（配列番号１１７、ＣｈＡｄ８２）である。図３１Ａから３１Ｊは、本明細書に開示され主張されるＣｈＡｄ分離株のヘキソンタンパク質のアミノ酸配列の比較を与える。
【０１３８】
チンパンジーアデノウイルスの分類
異なるチンパンジーアデノウイルス株の分類は、６個のサブグループへのヒトアデノウイルス血清型のすでに提唱されている分類（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，  ＭＳ  （１９９０）  Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ及びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．１６７９−１７４０）に従い、Ａｌｉｇｎ  Ｘプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，  Ｉｎｃ）を使用することによるアミノ酸及びヌクレオチド配列アラインメントにより得た。
【０１３９】
新たな分離株の最初の分類は、異なる制限エンドヌクレアーゼによるウイルスゲノムの制限パターンを観察すること及びヘキソン遺伝子の超可変領域７（ＨＶＲ７）の配列分析により得られた。このために、ＨＶＲ７に隣接する高度に保存された領域に関して２つのプライマー：ＴＧＴＣＣＴＡＣＣＡＲＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧＡ（配列番号４５）及びＧＴＧＧＡＡＲＧＧＣＡＣＧＴＡＧＣＧ（配列番号４６）を設計した。精製ウイルスＤＮＡ又は未精製２９３細胞溶解液をテンプレートとして使用するＰＣＲによりこのＨＶＲ７を増幅した後配列決定した。ＨＶＲ７配列分析に基づいて、我々は、新たに単離されたウイルスを、ヒトＡｄウイルスについて提唱されるサブグループ（Ａ〜Ｆ）へ分類した（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，ＭＳ（１９９０）Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編（ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ｐｐ．１６７９−１７４０）。
【０１４０】
図３５に示される系統発生樹はヒト及びチンパンジーのアデノウイルスへキソンアミノ酸配列のアラインメントにより得られた。この結果は、Ａｌｉｇｎ  Ｘプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ）を使用することによるヘキソンＨＶＲ７に限定したヌクレオチド配列アラインメントに基づく最初の分類と一致する。この系統樹は、ＰＡＵＰＳＥＡＲＣＨ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３，Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）を使用する全長のヘキソンペプチド配列の多配列アラインメントから推定し、ＴＲＥＥＶＩＥＷにより可視化を行い、操作した。Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅにおいて実装されるＰＡＵＰＳＥＡＲＣＨプログラムを使用してブートストラップ信頼分析を実行した。各アラインメントについて、検索基準として「Ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ  Ｓｅａｒｃｈ」を用い、最適性基準としてＭａｘｉｍｕｍ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙを用いて、前記プログラムを１０００個の複製物に関して実行し、報告する信頼値は、５０％多数決コンセンサス（５０％  ｍａｊｏｒｉｔｙ−ｒｕｌｅ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）から得た。
【実施例２】
【０１４１】
ＣｈＡｄシャトルベクター及び発現ベクターの構築及びレスキュー
ベクター構築及びレスキュー
ウイルスゲノムの左右両端由来のウイルスＤＮＡ配列を含有する適切なシャトルベクターを用いて、相同組み換えにより、ゲノムウイルスＤＮＡを標準プラスミドベクターにクローニングした（図２）。下記でさらに詳しく述べるように、グループ特異的シャトルベクターを開発するために、同一血清型サブグループに分類されるウイルス間で観察される配列相同性を利用した。サブグループＤ及びＥへ分類されるチンパンジーアデノウイルスのゲノムウイルスＤＮＡは、両サブグループに属するウイルスをクローニングするための共通のシャトルベクターの構築が可能となるのに十分な相同性を生じた。
【０１４２】
サブグループＤ／Ｅシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ６ウイルスゲノムを完全に配列決定し（配列番号２）、得られた情報を使用して、サブグループＤ及びＥのチンパンジーアデノウイルスの相同組み換えによるクローニングを促進するためにシャトルベクターを構築した。
【０１４３】
本明細書でｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３と呼ばれるＣｈＡｄ６シャトルベクターの構築を図１に記載する。図３２は、本明細書に記載されるクローニング実験で使用されるオリゴヌクレオチド配列（配列番号２６から４０及び配列番号４５から４６）のリストを提供する。簡潔に述べると、オリゴヌクレオチド、５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＣ−３（配列番号２７）及び５’−ＣＧＣＴＧＧＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＣＴＣ−３’（配列番号２８）を使用して、ＰＣＲによりＣｈＡｄ６ＤＮＡの左端由来の４５７ｂｐを増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＳｎａＢＩで消化し、ＥｃｏＲＩ−ＳｎａＢＩで切断しておいたｐＮＥＢＡｄ３５−２へクローニングし、ｐＮＥＢＣｈＡｄ６−ＬＩを得た。右のＣｈＡｄ６  ＩＴＲ（ｂｐ３６２２２からｂｐ３６６４８）を、ＰＣＲにより、オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＧＡＡＧＣＴＴＧＴＴＴＡＡＡＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴ−３’（配列番号２９）及び５’−ＡＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＧＴＣＣＡＴＡＧＣＴＴＡＣＣＧ−３’（配列番号３０）を用いて増幅し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩで切断しておいたｐＮＥＢＣｈＡｄ６-ＬＩへクローニングし、その結果、ｐＮＥＢＣｈＡｄ６−ＲＬＩを得た。最後に、ＣｈＡｄ６ゲノムＤＮＡ配列のヌクレオチド３４２６から３８１３に対応するＤＮＡ断片を、オリゴヌクレオチド５’ＡＴＧＣＴＡＣＧＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ−３’（配列番号３１）及び５’−ＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＴＴＣＡＧＧＣＴＧＧＣＧ−３’（配列番号３２）を用いて増幅し、ＳｎａＢＩ及びＡｓｃＩで消化した後にＳｎａＢＩ−ＡｓｃＩで消化しておいたｐＮＥＢＣｈＡｄ６−ＲＬＩにライゲーションし、その結果、ｐＮＥＢＣｈＡｄ６−ＲＬＩｄＥ１を得た。
【０１４４】
ＤＨ５ａ  Ｅ．コリ株における組み換え及びプラスミド増幅効率を向上させるため、ＣｈＡｄ６の左右両方のＩＴＲを含有する１３０６ｂｐ断片及びｐＩＸ遺伝子断片を、ｐＮＥＢＣｈＡｄ６−ＲＬＩｄＥ１から、ＰｍｅＩ消化により切り出し、ｐＭＲＫＡｄ５ＳＥＡＰからの、オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＴＣＴＡＧＴＴＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＣＧＡＣＧＣＧ−３’（配列番号３３）及び５’ＴＴＣＧＡＴＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＧＡＡＡＴＴＡＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号３４）を使用するＰＣＲ増幅により得られた異なるプラスミドベクターへ移した。この最後のライゲーション段階により、ＣｈＡｄ６シャトルベクター  ｐＡＲＳＣｈＡｄ６−３が生じた。
【０１４５】
サブグループＣシャトルベクターの構築
ＣｈＡｄ３ウイルスゲノムを完全に配列決定し（配列番号１）、得られた情報を使用して、サブグループＣチンパンジーアデノウイルスの相同組み換えによるクローニングを促進するためにシャトルベクターを構築した。
【０１４６】
簡潔には、本明細書でｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰと呼ばれるサブグループＣチンパンジーアデノウイルスをクローニングするのに使用されるシャトルベクターを以下のように構築した。ｐＩＸコード化領域を含有するＣｈＡｄ３ＤＮＡ断片（ヌクレオチド３５４２から４１０５）を、オリゴヌクレオチド５’−ＴＡＴＴＣＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＡＧＴＧＧＧＣＧ−３’（配列番号３５）及び５’−ＴＡＧＧＣＧＣＧＣＣＣＴＴＡＡＡＣＧＧＣＡＴＴＴＧＴＧＧＧＡＧ−３’（配列番号３６）を使用するＰＣＲにより増幅し、ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩにより消化し、その後ＳｇｆＩ−ＡｓｃＩで消化したｐＡＲＳＣＶ３２−３へとクローニングし、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３Ｄを得た。ＣｈＡｄ３右端（ｎｔ３７３２０から３７４４１）を、オリゴヌクレオチド５’−ＣＧＴＣＴＡＧＡＡＧＡＣＣＣＧＡＧＴＣＴＴＡＣＣＡＧＴ−３’（配列番号３７）及び５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＴ−３’（配列番号３８）を用いたＰＣＲにより増幅し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化した後、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３Ｄへライゲーションし、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＤを得た。ＣｈＡｄ３ウイルスＤＮＡ左端（ｎｔ１から４６０）を、オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴ−３’（配列番号３９）及び５’−ＡＴＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＧＣＡＧＡＣＴＴＴＧ−３’（配列番号４０）を用いたＰＣＲにより増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＳｇｆＩで消化した後、ＥｃｏＲＩ及びＳｇｆＩで切断したｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＤへクローニングし、その結果、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＬＤを得た。このウイルスＤＮＡカセットはまた、酵素切断によってプラスミドＤＮＡからウイルスＤＮＡが放出されるよう、両ＩＴＲの端にある制限酵素部位（ＰｍｅＩ）を含有するように設計された。
【０１４７】
サブグループＢシャトルベクターの構築
サブグループＢシャトルの構築は、サブグループＣ及びＤ／Ｅシャトルの構築についてすでに記載したストラテジーに従った。簡潔には、ｐＡＲＳ−ＣｈＡｄ３ＲＬＤが左端、ｐＩＸ領域、右端を、ＣｈＡｄ３０の対応する断片と置換することによって改変した。さらに、ＣｈＡｄ３０のＥ４領域を、ＣｈＡｄ３０Ｅ４プロモーター調節の下でクローニングされるＡｄ５Ｅ４  ｏｒｆ６と置換した。このシャトルプラスミドを、ｐＣｈＡｄ３０  ＥＧＦＰシャトルベクターと命名した。
【０１４８】
ΔＥ１チンパンジーアデノウイルスベクターの構築
サブグループＢ：サブグループＢのチンパンジーアデノウイルスベクターをＥ．コリ株ＢＪ５１８３における相同組み換えにより構築した。ＢＪ５１８３細胞に対して、ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉで消化したｐＣｈＡｄ３０ＥＧＦＰシャトルベクターと、ＣｈＡｄ８及びＣｈＡｄ３０の精製ウイルスＤＮＡとを用いて、同時形質変換した。ｐＩＸ遺伝子、直線化したｐＣｈＡｄ３０ＥＧＦＰシャトルの両端に存在する右ＩＴＲ  ＤＮＡ配列及びウイルスゲノムＤＮＡの間の相同組み換えにより、プラスミドベクターにおける挿入が可能になり、ＥＧＦＰ発現カセットにより置換されるＥ１領域が同時に欠失した。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢｇｈポリＡ）に基づいた発現カセットを構築して、分泌されるアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＥＧＦＰ、ＨＩＶｇａｇ、ＨＣＶ  ＮＳ領域（ＣｈＡｄ６シャトルベクターについて図３に記載されるようなもの。）、並びにヒト及びアカゲザル由来のＣＥＡ及びＨＥＲ２  ｎｅｕのような腫瘍関連抗原を発現させた。全ての発現カセットを相同組み換えによりＣｈＡｄ３０ベクターへと挿入した。
【０１４９】
サブグループＣ：サブグループＣのチンバンジーアデノウイルスベクターをＥ．コリ株ＢＪ５１８３における相同組み換えにより構築した。ＢｓｔＥＩＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉで切断したｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰシャトルベクターと、ＣｈＡｄ３、ＣｈＡｄ１１、ＣｈＡｄ１９及びＣｈＡｄ２０の精製ウイルスＤＮＡと、を用いて、ＢＪ５１８３細胞に対して同時形質変換を行った。ｐＩＸ遺伝子、直線化したｐＣｈＡｄ３ＥＧＦＰシャトルの端に存在する右ＩＴＲ  ＤＮＡ配列と、ウイルスゲノムＤＮＡとの間の相同組み換えにより、プラスミドベクターにおける挿入が可能になり、ＥＧＦＰ発現カセットにより置換されるＥ１領域が同時に欠失した。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢｇｈポリＡ）に基づいた発現カセットを構築して、分泌されるアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＥＧＦＰ、ＨＩＶｇａｇ、ＨＣＶ  ＮＳ領域（ＣｈＡｄ６シャトルベクターに対して図３に記載されるようなもの。）、並びにヒト及びアカゲザル由来のＣＥＡ及びＨＥＲ２  ｎｅｕのような腫瘍関連抗原を発現させた。
【０１５０】
サブグループＤ及びＥ：サブグループＤ及びＥのチンパンジーアデノウイルスに基づいたΔＥ１ベクターを構築するため、シャトルベクターｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３をＡｓｃＩで消化し、Ｅ．コリ株  ＢＪ５１８３に、ＣＶ３２、ＣＶ３３、ＣＶ６８、ＣｈＡｄ４、ＣｈＡｄ５、ＣｈＡｄ６、ＣｈＡｄ７、ＣｈＡｄ９、ＣｈＡｄ１０及びＣｈＡｄ１６の精製ウイルスＤＮＡを用いて同時形質転換した。ｐＩＸ遺伝子及び直線化したｐＣｈＡｄ６−３の端に存在する右ＩＴＲ  ＤＮＡ配列と、ウイルスゲノムＤＮＡとの間の相同組み換えにより、プラスミドベクターにおける挿入が可能となり、Ｅ１領域が同時に欠失した。（図２及び図４）。ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ＢｇｈポリＡ）に基づいた発現カセットを構築して、分泌されるアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ＥＧＦＰ、ＨＩＶｇａｇ、ＨＣＶ  ＮＳ領域（図３）、並びにヒト及びアカゲザル由来のＣＥＡ及びＨＥＲ２  ｎｅｕのような腫瘍関連抗原を発現させた。図４に記載されるようなΔＥ１アデノウイルスプレプラスミドへの相同組み換えによって転移されるｐＡＲＳ  ＣｈＡｄ６−３ベクターの１個のＳｎａＢＩ部位へ全発現カセットを挿入した。
【０１５１】
ΔＥ１ベクターのレスキュー及び増幅
６ｃｍの細胞培養皿に播種された５ｘ１０６個のＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞を、エンドヌクレアーゼ消化によりプラスミド配列から放出されるクローン化されたウイルスベクター１０μｇでトランスフェクトションした。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＤＮＡトランスフェクションを行った。トランスフェクションした細胞及び培地を、トランスフェクションから５から１０日後に回収し、凍結解凍により溶解した。次に、レスキューしたベクターを２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞での連続継代により増幅した。総計１から２ｘ１０９個の細胞において、５から１０個の細胞ファクトリー（ＮＵＮＣ，Ｉｎｃ．）上に播種した細胞を感染させることによって大規模増幅を行った。塩化セシウム勾配上での２回の超遠心により、精製ベクター調製物を得て、１０％グリセロールを含有するＰＢＳに対して透析し、分注して−７０℃にて保存した。
【実施例３】
【０１５２】
中和実験
本明細書で開示されるチンパンジーアデノウイルスに対する中和抗体のヒト血清における普及率を評価するため、中和アッセイを実行した。このアッセイにより、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）に対する遺伝子を担うチンパンジーアデノウイルスがヒト２９３細胞に対して形質導入する能力に及ぼす血清プレインキュベーションの効果を評価した。中和タイターは、ウイルスのみのポジティブ対照において観察されるＳＥＡＰ活性の５０％の低下を与える血清の希釈度として定義される。
【０１５３】
ＣＶ３３−ＳＥＡＰ、ＣＶ３２−ＳＥＡＰ及びＣｈＡｄ３−ＳＥＡＰの２ｘ１０６個から１．５ｘ１０７個の自然粒子を完全培地１００μｌに希釈し、完全培地に希釈したヒト又はチンパンジー血清等量に添加した。各血清試料を様々な希釈率で試験した（１／１８希釈から開始して、１／４希釈を５回行い、１:４６０８まで。）。試料を３７℃で１時間プレインキュベーションし、その後９６穴プレートへ播種した２９３細胞（１個のウェルあたり３ｘ１０４個の細胞）へ添加した。インキュベーションの１時間後に接種材料を除去し、細胞に新鮮培地を再供給し、２４時間後、培地５０μｌを取り出し、ＳＥＡＰ活性を化学発光アッセイにより測定した。ウイルスのみのポジティブ対照において観察されるＳＥＡＰ活性の５０％低下を与える血清の希釈度として、中和タイターを定義する。１００検体のヒト血清のパネルをＣｈＡｄ中和活性について検査した。並行して同じパネルをＡｄ５  ＳＥＡＰベクターに関して検査した。
【０１５４】
【表２】
0005427874.tif 000003
【０１５５】
表２で与える結果は、チンパンジーアデノウイルス由来のベクターに対して向けられた、中和抗体のヒト血清における普及率が非常に低いことを示す。ＣＶ３２ベクターにおいて２００の閾値を超えるタイターを示すものは、４検体の血清のみであるのに対し、ＣｈＡｄ３  ＳＥＡＰベクターについては、８検体が２００を超えるタイターを示した。一方、検査したチンパンジー血清のパネルは、抗チンパンジーＡｄ免疫性の普及率が非常に高いことを示した。これらの知見から、予想したように、チンパンジーＡｄに基づくベクターがヒトにおいて中和される機会が非常に少ないことが確認された。それゆえこれらの知見は、Ａｄ５などの共通のヒトＡｄ血清型に基づいたウイルスベクターの投与を制限する、既存の抗ヒトＡｄ免疫性の問題に対する理想的な解決を呈示する。
【実施例４】
【０１５６】
ＣｈＡｄベクター親和性
Ａｄ５ベクター及びＣｈＡｄベクターを介した遺伝子導入の効率を、異なる組織由来のヒト初代細胞のパネルにおけるＥＧＦＰ発現により評価した。ヒト軟骨細胞、骨芽細胞、ケラチン生成細胞、メラニン細胞、骨格筋細胞及びメラニン細胞を製造者の説明書に従って培養した。ヒト単球細胞、未成熟及び成熟樹状細胞（ＤＣ）を記載されているように得た（Ｒｏｍａｎｉ，Ｎ．ら、１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９６，１３７．）。形質導入された蛍光細胞をＦＡＣＳ分析により検出した。試験するヒト初代細胞のパネルには、心臓循環器疾患、関節リウマチ、組織工学（骨、皮膚及び軟骨）及びワクチン接種の分野におけるインビボ及びエクスビボでの遺伝子導入を利用した異なる治療ストラテジーに対する重要な標的細胞である細胞が含まれる。図３８Ａから図３８Ｄで示す結果は、異なる細胞タイプの感染の差異に基づく効率により示されるように、ＣＡＲに代わる受容体を、異なるチンパンジーアデノウイルスが認識できることが示唆される。
【０１５７】
マウス免疫付与実験
方法及び材料
免疫付与プロトコール及び脾臓細胞／ＰＢＭＣ調製
免疫付与：緩衝液  ０．１ｍＬで希釈した、選択したアデノウイルスを用いてマウスに免疫付与した。各ベクター用量を５０μｌずつ２つに分割し、マウスの両側の大腿四頭筋に注射した。
【０１５８】
脾臓細胞調製：マウスを注射３週間後に屠殺し、それらの脾臓を摘出し、Ｒ１０（１０％ＦＣＳ、５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ＲＰＭＩ培地１６４０中の１ｘペニシリン−ストレプトマイシン溶液）  １０ｍＬに移した。スチール製の網を介して脾臓を細分化し、Ｒ１０  ２ｍＬでこの網を洗浄した後、脾臓細胞を５０ｍＬのファルコンチューブに移し、１２００ｒｐｍで１０分間室温（ｒｔ）にて遠心分離した。上清を除去し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ＃７９−０４２２ＤＧ）３ｍＬを添加した。細胞を５分間ｒｔでインキュベーションした。１ｘＰＢＳ  ４５ｍｌを添加し、試験管を上述のように遠心分離した。Ｒ１０  ３０ｍＬで洗浄した後、細胞をＲ１０  ５ｍＬ中で再懸濁し、７０ｍナイロン細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ２３５０）を介して濾過した。細胞  １０μＬをＴｕｒｋ溶液（Ｍｅｒｃｋ  ０４０４１７３４５）９９０μＬで希釈し、計数した。最終的に、細胞をＲ１０中で、１０７個細胞／ｍＬに希釈した。
【０１５９】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）調製：マウス血液試料（１５０μＬ）を２ｍＬのエッペンドルフチューブへ５０μＬ  ＰＢＳ／２％ＥＤＴＡとともに移した。１ｍＬ  ＡＣＫ緩衝液を各チューブへ添加した。ＲＴで５分間穏やかに混合し、インキュベーションした。試料を微量遠心器において１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を除去し、同じ免疫付与コホート由来の白血球ペレットを合わせた。ＡＣＫ緩衝液インキュベーションを繰り返した後、ＰＢＭＣのペレットを、Ｒ１０培地  １ｍＬに再懸濁した。
【０１６０】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＩＰ４５プレートを、ＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈した、１００μｌ／ウェルの精製ラット抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５１２１６）でコーティングし、４℃で一晩（ｏ／ｎ）インキュベーションした。プレートを滅菌済みＰＢＳで２回洗浄し、ＣＯ２インキュベーターの中でＲ１０  ２００μｌ／ウェルとともに２時間インキュベーションすることにより、非特異的結合部位をブロックした。ＨＩＶｇａｇを発現するＡｄベクターによる免疫付与実験において、９マーのペプチド（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ、Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてマッピングされるＣＤ８ＨＩＶＧＡＧエピトープ）（配列番号４７）をＲ１０中で２μｇ／ｍＬに希釈し、５０μｌ／ウェルの量でウェルに添加した。ＨＣＶ−ＮＳ発現ベクターを用いて行った免疫付与実験において、ＮＳ３ヘリカーゼドメインをカバーするペプチドのプールならびにヘリカーゼドメインに含まれるマッピングされたＣＤ８エピトープを呈示する９マーのペプチドを使用した。ヒトＣＥＡ抗原を発現するＣｈＡｄによる免疫化実験を、全アミノ酸配列をカバーする、重複する１５マーペプチドのプールにより評価した。対照としてＤＭＳＯ及びコンカナバリンＡを使用した。細胞を各ウェルへ５ｘ１０５及び２．５ｘ１０５の量で添加した。ＣＯ２インキュベーターにおいて一晩インキュベーションした後、プレートを０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで洗浄し、アッセイ緩衝液（５％ＦＢＳ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ）で１／２５０に希釈したビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ．５５４４１０）  ５０μｌ／ウェルを添加した。プレートを４℃で一晩インキュベーションし、上述のように洗浄した。ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ複合体（ＢＤ５５４０６５）をアッセイ緩衝液で１／２５００に希釈し、５０μＬ／ウェルの量で室温にて２時間添加した。洗浄後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  １ステップ溶液（ＰｉｅｒｃＥ３４０４２）５０μＬ／ウェルを添加してプレートを発色させた。ウェルを脱イオン水で洗浄することにより反応を停止させた。スポットをＥＬＩＳＰＯＴリーダーにより自動計数した。
【０１６１】
マウス  ＩＦＮ−γ細胞内染色（ＩＣＳ）
脾臓細胞をＲ１０  １ｍＬ中２ｘ１０６個細胞に希釈し、２μｇ／ｍＬの濃度の上述と同じ抗原で刺激した。対照として、ＤＭＳＯ及びブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を使用した。ＣＯ２インキュベーター中で一晩インキュベーションした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳ、０．０１％ＮａＮ３、ＰＢＳ）で洗浄し、精製した抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃブロック（クローン２．４Ｇ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５３１４２）を１／２５に希釈し、１００μＬ／試料の量で添加し、４℃で１５分間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で１：５０に希釈したＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３ｅ（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃５５３０６６）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４（クローンＬ３Ｔ４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５３１４２）及びＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ８ａ（クローン５３−６．７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５３０３６）を１００μＬ／試料の量で添加した。細胞をｒｔで３０分間インキュベーションし、洗浄し、固定し、浸透させ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍ２）、ＰｅｒｍＷａｓｈ（１００μＬ／試料）中で１：５０に希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５４４１１）とともにＲＴにて３０分間インキュベーションした。洗浄後、細胞を１％  ホルムアルデヒド／ＰＢＳ  ５００μＬに再懸濁し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）をＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。
【実施例５】
【０１６２】
ＣｈＡｄベクターはマウスにおいて強いＣＭＩ反応を誘発する
本明細書に開示されるＣｈＡｄベクターが細胞性免疫反応（ＣＭＩ）を誘発する能力を、ＨＩＶｇａｇ導入遺伝子を発現するベクターを使用してマウスにおいて評価した。簡潔に述べると、５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの群に、様々なベクターを、マウス１匹あたり１０５から１０１０ｖｐの、１０倍ずつ増加する用量で注射した。
【０１６３】
注射から３週間後に、脾臓細胞中のｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を定量することにより、免疫反応の強さを調べた。Ｂａｌｂ／ＣマウスにおいてマッピングされるｇａｇＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを再現するペプチドによるインビトロ刺激後に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって又はＩＦＮ−γ細胞内染色及びＦＡＣＳ分析によって、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を調べた。
【０１６４】
表３で報告する５匹の免疫付与動物から得られた結果は、９マーのＣＤ８＋ｇａｇエピトープ又はｇａｇペプチドプールとのインキュベーション後の、脾臓細胞１００万個あたりのスポット形成細胞数として示す。ｇａｇペプチドプールは、全ｇａｇ配列を包含する１０−ａａまで重複する２０−ａａペプチドからなる。ポジティブの値を太字で示す。
【０１６５】
表３で与えるデータから、本明細書に開示され主張されるＣｈＡｄベクターの投与により、ｈＡｄ５によって誘発される反応に匹敵する強い細胞性免疫反応が誘発されることが示される。ポジティブの免疫付与結果（免疫付与ブレイクポイント）を生じる最低のベクター用量で観察することによって、発明者らは、１０６ｐｐベクター用量でのブレイクポイントを有するもっとも有力なサブグループＣのＣｈＡｄ３ｇａｇである、様々なベクターの効力を評価した。免疫付与ブレイクポイントによる評価を図３３に示す。
【０１６６】
【表３】
0005427874.tif 000004
【実施例６】
【０１６７】
ＣｈＡｄ３ベクター及びＣＶ３３ＧＡＧベクターはＧＡＧ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を特徴とするＣＭＩ反応を誘発する。
【０１６８】
ＨＩＶｇａｇ導入遺伝子を含むＣｈＡｄベクターに反応して誘発されるＣＭＩ反応の特徴を調べるために、様々な用量のベクターで免疫付与した５匹のマウスのコホートからプールされた脾臓細胞を細胞内ＩＦＮ−γ染色により分析した。表３及び表４に示されるデータは個別の実験において回収された。
【０１６９】
脾臓細胞を  Ｒ１０  １ｍＬで２ｘ１０６個細胞に希釈し、２μｇ／ｍＬの濃度で上述と同じ抗原で刺激した。対照として、ＤＭＳＯ及びＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）を使用した。ＣＯ２インキュベーターで一晩インキュベーションした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳ、０．０１％ＮａＮ３、ＰＢＳ）で洗浄し、精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃブロック（クローン２．４Ｇ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５３１４２）を１／２５に希釈し、１００μＬ／試料の量で添加し、４℃で１５分間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で１：５０希釈した、ＡＰＣ標識抗マウスＣＤ３ｅ（クローン１４５−２Ｃ１１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５３０６６）、ＰＥ標識抗マウスＣＤ４（クローンＬ３Ｔ４、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５３１４２）及びＰｅｒＣＰ標識抗マウスＣＤ８ａ（クローン５３−６．７、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５３０３６）を１００μＬ／試料の量で添加した。細胞を室温で３０分間インキュベーションし、洗浄し、固定し、浸透させ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ、ＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍ２）、ＰｅｒｍＷａｓｈ（１００μｌ／試料）で１：５０に希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩＦＮ−γ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ｃａｔ．５５４４１１）とともにＲＴで３０分間インキュベーションした。洗浄後、細胞を１％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ  ５００μＬに再懸濁し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析した。
【０１７０】
表４は、ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかであるｇａｇ特異的ＣＤ３＋Ｔ細胞の割合を要約するデータを与える。ポジティブの結果を太字で示す。本明細書で与えるデータから、様々な血清型サブグループ（つまりサブグループＣ、Ｄ及びＥ）へと分類されるウイルス由来のＣｈＡｄベクターにより誘発される免疫反応の細胞特性が同様であり、ｇａｇ特異的反応は全て、ＣＤ８＋Ｔ細胞を主に特徴とすることが示される。さらに、多量のベクターでｇａｇ特異的ＣＤ４＋反応が全ての免疫付与実験で明らかになることを留意すること。ＩＣＳアッセイにより、ＣｈＡｄ３ベクターが１０６個のベクター用量で抗ｇａｇＣＤ８＋反応を刺激できることが確認された。
【０１７１】
【表４】
0005427874.tif 000005
【実施例７】
【０１７２】
ＣｈＡｄベクターは、ＨＣＶ  ＮＳ特異的Ｔ細胞反応を誘発する。
【０１７３】
ＣＶ３２−ＮＳｍｕｔベクター及びＣＶ３３−ＮＳｍｕｔベクターの効力をＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔの効力に対して、Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６において評価した。１０７から１０９ｖｐ／マウスの、１０倍ずつ増加する量のベクターを動物に注射した。単回注射の３週間後に、ＮＳ３タンパク質のヘリカーゼドメインにおいてマッピングされるＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを再現する９マーペプチドでＴ細胞を刺激して、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びＩＦＮ−γ細胞内染色により、ＣＭＩを分析した。表５で与えるデータは、ＮＳ３  ９マーペプチド非存在下（偽）又は存在下におけるインキュベーション後の、１００万個の脾臓細胞あたりのスポット形成細胞数を要約する。
【０１７４】
ＨＣＶ−ＮＳを発現するＣＶ３２ベクター及びＣＶ３３ベクターの両者は強いＴ細胞反応を刺激することが本データから示される。ＣＶ３２ベクターに対する最初の陽性結果が１０９ｖｐ／用量を注射することにより得られたという観察に基づき、ＣＶ３２ＤＥ１Ｅ３  ＮＳｍｕｔベクターの免疫付与効力は、ヒトサブグループＣのＡｄ６ＤＥ１Ｅ３  ＮＳｍｕｔベクターよりも、約１／１００と、低いと思われる。ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔを使用する並行した実験から、１０７ｖｐ／動物の用量が細胞性免疫性を刺激するのに十分であることが示された。それゆえ本結果から、ｇａｇ発現ベクターによる実験（表３参照）においても観察されたヒトサブグループＣベクター（ｈＡｄ５及びｈＡｄ６など）に対して、ＣＶ３２由来のベクターの免疫付与効力が低いことが確認される。
【０１７５】
【表５】
0005427874.tif 000006
【実施例８】
【０１７６】
抗Ａｄ５既存免疫はＣｈＡｄ３ｇａｇにより誘発される抗ＧＡＧ  ＣＭＩを抑制しない。
【０１７７】
高い血清普及率の（ｓｅｒｏｐｒｅｖａｌｅｎｔ）Ａｄ５に対する既存免疫性のＣｈＡｄ３免疫付与への影響を調べるために、１コホートにつきＢａｌｂＣマウス５匹の４コホートに対して、大腿四頭筋にＡｄ５野生型１回１０１０ｖｐを第０週及び第２週の２回注射してプレ免疫付与した。対照として１コホート５匹の２コホートのマウスに緩衝液のみを同じ時点で注射した。次に、Ａｄ５でプレ免疫付与したマウスのコホートに対して、Ａｄ５ｇａｇベクター又はＣｈＡｄ３ｇａｇベクターのいずれか  １０６ｖｐ又は１０７ｖｐ／マウスで免疫付与した。対照（未処理の）マウスのコホートを、Ａｄ５ｇａｇベクター又はＣｈＡｄ３ｇａｇベクター  １０６ｖｐ／マウスで免疫付与した。
【０１７８】
抗Ａｄ５及びＣｈＡｄ３の中和免疫性を、Ａｄ５ベクター及びＣｈＡｄ３  ＳＥＡＰベクターを使用して上述の中和アッセイにより第４週に評価した。ＢａｌｂＣマウスにおいてマッピングされるｇａｇエピトープを含有するｇａｇ９マーペプチドで刺激した、精製脾臓細胞においてＥＬＩＳＰＯＴ分析により抗ｇａｇ免疫性を評価した。図３６で報告する結果から、抗Ａｄ５免疫性がＣｈＡｄ３ｇａｇにより誘発される抗ｇａｇＣＭＩを抑制しないのに対し、予測されるように、抗Ａｄ５免疫性がＡｄ５ｇａｇ免疫付与を完全に遮断することが示された。
【実施例９】
【０１７９】
ＣｈＡｄ３ｈＣＥＡ免疫化はヒトＣＥＡを発現するトランスジェニックマウスにおいて強いＣＥＡ特異的免疫反応を誘発する。
【０１８０】
本明細書で開示し主張するＣｈＡｄベクターが自己抗原に対して免疫反応を誘発し、それゆえにその寛容性を打破する能力も、ヒトＣＥＡを発現するトランスジェニックマウスにおいて評価した（Ｃｌａｒｋｅ，Ｐら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９８８）５８（７）：１４６９−７７．）。
【０１８１】
８匹のマウスのコホートの大腿四頭筋にＣｈＡｄ３ｈＣＥＡ又はＡｄ５ｈＣＥＡ  １０１０ｖｐを既に述べたように注射した。ａａ４９７から端（ａａ７０３）までのヒトＣＥＡアミノ酸配列を包含する１５マーペプチドのプールで刺激したＰＢＭＣに対して、ＣＥＡに対する免疫反応を７５日目まで毎週モニタリングした。ＣＥＡペプチドプールインキュベーションに反応した、ＣＤ４−ＣＤ８＋Ｔ細胞分泌性インターフェロン−γを調べるＩＣＳによって、抗ＣＥＡ免疫性を評価した。
【０１８２】
図３７で報告する結果から、ＣｈＡｄ３ｈＣＥＡベクター免疫付与が、同じ導入遺伝子を発現するＡｄ５よりも、ヒトＣＥＡに対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応をより持続するよう刺激することが示される。
【０１８３】
霊長類免疫付与実験
方法及び材料
免疫付与プロトコール
本明細書に開示し主張するＣｈＡｄベクターがアカゲザル（本明細書でサルと呼ばれる。）においてＣＭＩを誘発する能力も評価した。サルを麻酔し（ケタミン／キシラジン）、本ワクチンをツベルクリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して両側の三角筋へ０．５ｍｌずつ筋肉内に送達した。全ての場合において、このサルの体重は、３から１０ｋｇであり、各ワクチンの用量は緩衝液１ｍｌ中で投与した。
【０１８４】
免疫付与手法の間、何回か回収した血液試料から、血清及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。動物の取り扱い及び処置は全て、ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌに記載の原則に従い、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認される基準に従った。
【０１８５】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
アカゲザルについてのＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、いくつかの改変を行い、上述のプロトコール（Ａｌｌｅｎら、２００１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２）：７３８−７４９）に従って実行した。ｇａｇ特異的刺激について、１０−ａａの重複がある全ＨＩＶ−１ｇａｇ配列を包含する２０−ａａのペプチドからペプチドプールを調製した（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐ．，  Ｄｕｂｌｉｎ，  ＣＡ）。ＨＣＶ  ＮＳ特異的刺激について、１０−ａａの重複があるＮＳ３からＮＳ５ｂの全ＨＣＶ−ＮＳ配列を包含する１５−ａａペプチドから、６個のペプチドプールを調製した。
【０１８６】
ＨＥＲ２  ｎｅｕ及びＣＥＡ特異的刺激を、１０−ａａの重複がある全タンパク質の配列を包含する１５−ａａのペプチドで実行した。
【０１８７】
２から４ｘ１０５個の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）５０μｌを各ウェルへ添加した。小さなサイズを８０ｆＬでカットオフして、細胞をＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２粒子アナライザーを使用して計数した。培地  ５０μｌ又はペプチドあたり８μｇ／ｍｌのｇａｇペプチドプールのいずれかをこのＰＢＭＣへ添加した。この試料を３７℃、５％ＣＯ２で２０時間から２４時間インキュベーションした。このように、スポットを発色させ、プレートを特注の画像化装置及びＩｍａｇｅＰｒｏプラットフォーム（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，  ＭＤ）に基づいた自動計数サブルーチンを使用して処理した。計数を１０６個の細胞インプットに対して正規化した。
【０１８８】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
２ｘ１０６  ＰＢＭＣ／ｍＬ完全ＲＰＭＩ培地  １ｍＬ（１７ｘ１００ｍｍの丸底ポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ）に入れた。）に、抗ｈＣＤ２８（クローンＬ２９３、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及び抗ｈＣＤ４９ｄ（クローンＬ２５、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）モノクローナル抗体を、終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加した。ｇａｇ特異的刺激については、ペプチドプール  １０μＬ（ペプチド１個につき０．４ｍｇ／ｍｌ）を添加した。同様の条件をＨＣＶ  ＮＳ特異的刺激について使用した。このチューブを３７℃で１時間インキュベーションした後、５ｍｇ／ｍＬのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）２０μｌＬを添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、９０％湿度で１６時間インキュベーションした。冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳ  ４ｍＬを各チューブへ添加し、細胞を１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離してペレットを得た。細胞をＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に再懸濁し、いくつかの蛍光標識ｍＡｂを使用して表面マーカーに対して染色した（３０分間、４℃）（そのモノクローナル抗体は、チューブ１本あたり２０μｌの、抗ｈＣＤ３−ＡＰＣ、クローンＦＮ−１８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）；２０μｌ  抗ｈＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、クローンＳＫ１（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，  ＮＪ）；及び２０μＬ  抗ｈＣＤ４−ＰＥ、クローンＳＫ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）であった。）。この段階から、試料を暗所で取り扱った。細胞を洗浄し、７５０μＬ  １ｘＦＡＣＳ  Ｐｅｒｍ緩衝液（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で室温にて１０分間インキュベーションした。この細胞をペレットにし、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に再懸濁し、ＦＩＴＣ−抗ｈＩＦＮ−γ、クローンＭＤ−１（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）０．１μｇを添加した。３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器の４色チャネル全部を使用して試料を分析した。本データを分析するため、下部側及び前方に散乱するリンパ球集団を最初にゲーティングした。サイトカイン陽性反応についての共通の蛍光のカットオフをＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両集団について使用し、試料の偽反応及びｇａｇペプチド反応チューブの両者に対して使用した。
【実施例１０】
【０１８９】
ＣｈＡｄΔＥ１−ｇａｇベクターを使用する同種初回刺激−追加免疫法はサルにおけるｇａｇ特異的Ｔ細胞を誘発する。
【０１９０】
１コホート３匹の動物のコホートに以下のコンストラクトのいずれかを第０週及び第４週で筋肉内注射により与えた。すなわちＣＶ３２ΔＥ１−ｇａｇ  １０１０ｖｐ又はＣＶ３３ΔＥ１−ｇａｇ  １０１０ｖｐ又はＭＲＫＡｄ５ΔＥ１ｇａｇ  １０１０ｖｐ及び１０８ｖｐであった。４週間隔で回収したＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより分析した。Ｇａｇペプチドプール非存在下（偽）又は存在下でのインキュベーション後の、１００万個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞数を示す表６で与える結果から、非ヒト霊長類においてｇａｇ特異的Ｔ細胞の有意なレベルをＣＶ３２ΔＥ１−ｇａｇ及びＣＶ３３ΔＥ１ｇａｇの両者が誘導できることが確認される。興味深いことに、単回投与（第４週）後、ＣＶ３２ΔＥ１−ｇａｇ反応は、１０８ｖｐ／投与のＭＲＫＡｄ５ΔＥ１−ｇａｇに匹敵し、１０１０ｖｐ／投与のＭＲＫＡｄ５−ｇａｇのそれより低かったことに留意すること。１０１０ｖｐ／投与のＣＶ３３ΔＥ１−ｇａｇは、１０１０ｖｐ／投与のＭＲＫＡｄ５−ｇａｇのそれに匹敵する反応を誘導する。この結果は２回目の投与後の第８週で確認された。
【０１９１】
【表６】
0005427874.tif 000007
【実施例１１】
【０１９２】
ＣｈＡｄベクターは、異種初回刺激−追加免疫法においてＨＣＶ  ＮＳ特異的Ｔ細胞反応を誘発する。
【０１９３】
個別の実験において、２匹及び３匹のサルのグループに第０週、第４週で動物１匹につき１０８ｖｐ又は１０１０ｖｐでＭＲＫ  Ａｄ６ＮＳｏｐｔｍｕｔベクターを用いて免疫付与を行った。この動物を第２４週で、同じ用量の同じウイルスで追加免疫し、１０１０個ｖｐ／動物でＣＶ３３−ＮＳｍｕｔにより第１０４週に再度追加免疫を行った。この結果は、ＨＣＶ  ＮＳペプチドプールの非存在下（偽）又は存在下でのインキュベーション後の１００万個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞数を要約する表７及び表８に示す。
【０１９４】
ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴにより評価されるように、Ｔ細胞免疫性は１０１０ｖｐを注射した動物において最初の投与後第４週で（表８）、及び１０８ｖｐで注射した動物において第８週（２回目の投与後）で（表７）ピークの反応を示した。この反応は第２４週での注射により促進されなかった（同種追加免疫）のに対し、強い促進効果がＣＶ３３−ＮＳｍｕｔによる注射の後に観察された（異種追加免疫）。
【０１９５】
【表７】
0005427874.tif 000008
【０１９６】
【表８】
0005427874.tif 000009
【０１９７】
チンパンジーＡｄベクターによる異種追加免疫の効率を第二の実験において評価した。３匹のサルのコホートに対して、第０週及び第４週に、ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ（１０１０ｖｐ／動物）、ＭＲＫＡｄ６ＮＳｍｕｔ（１０１０ｖｐ／動物）又は両ベクター（各ベクターにつき１０１０ｖｐ／動物）の組み合わせで免疫付与し、その後第２４週で同じ抗原で追加免疫した（同種追加免疫）。同種追加免疫を同じ抗原で実行し、異種追加免疫をＣＶ３３ｇａｇ、ＣＶ３２ＮＳｍｕｔ又は前記２つのベクターの組み合わせで実行した。表９で与える結果は、ＨＣＶ  ＮＳペプチドプール非存在下（偽）又は存在下でのインキュベーション後、１００万個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞数を要約する。
【０１９８】
同じコホートを、第５１週に、ＣＶ３３ｇａｇ（１０１０ｖｐ／動物）、ＣＶ３２ＮＳｍｕｔ（１０１０ｖｐ／動物）及び前記２つのベクターの組み合わせ（各ベクターにつき１０１０ｖｐ／動物）で再度追加免疫した。表９で与える結果はさらに、この反応がワクチンの初回用量の注射後第４週で観察されるピークを下回るため、同種追加免疫が効果的ではなかったことを示す。異種チンパンジーベクターによる免疫付与後第５４週で、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴにより強い免疫促進効果が測定された。
【０１９９】
【表９】
0005427874.tif 000010
【実施例１２】
【０２００】
ＴＡＡを含むＣｈＡｄベクターによるワクチン接種は寛容性を打破し、サルにおけるＴＡＡ特異的Ｔ細胞反応を誘発する。
【０２０１】
チンパンジーアデノウイルスベクターが自己抗原に対する寛容性を打破し、ヒトアデノウイルスベクターにより初回刺激された免疫反応を促進するためのチンパンジーベクターの有用性を証明するのに十分に免疫原性があるか否かを調べるために設定した実験を、１コホート４匹のサルのコホートにおいて実施した。腫瘍関連抗原ＣＥＡを含むＡｄ５ＤＥ１  ＲｈＣＥＡ（１０１１ｖｐ）の３回の注射を第０週、第２週及び第４週に行って動物に免疫付与した後、第１６週、第１８週及び第２０週に、ＣＶ３３ＤＥ１  ＲｈＣＥＡ（１０１１ｖｐ）によるワクチン接種を行った。アカゲザルＣＥＡペプチドを用いて、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより、Ｔ細胞反応を測定した。
【０２０２】
アカゲザルＣＥＡ  Ｃ及びＤペプチドプール非存在下（ＤＭＳＯ）又は存在下のインキュベーション後の１００万個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞数を与える図３４に報告される結果により、２つの異なるＡｄ血清型によるワクチン接種に基づく免疫付与プロトコールが、非ヒト霊長類において、ＣＥＡに対してＴ細胞反応を持続させるに到ることが確認される。
【０２０３】
本発明はその特定の好ましい実施形態に関して詳細に記載されているが、改変及びバリエーションが、記載され、主張される本発明の精神及び範囲内であることは理解されよう。
【図１】
0005427874.tif 000011
【図２】
0005427874.tif 000012
【図３】
0005427874.tif 000013
【図４】
0005427874.tif 000014
【図５Ａ】
0005427874.tif 000015
【図５Ｂ】
0005427874.tif 000016
【図５Ｃ】
0005427874.tif 000017
【図５Ｄ】
0005427874.tif 000018
【図５Ｅ】
0005427874.tif 000019
【図５Ｆ】
0005427874.tif 000020
【図５Ｇ】
0005427874.tif 000021
【図５Ｈ】
0005427874.tif 000022
【図５Ｉ】
0005427874.tif 000023
【図５Ｊ】
0005427874.tif 000024
【図５Ｋ】
0005427874.tif 000025
【図６Ａ】
0005427874.tif 000026
【図６Ｂ】
0005427874.tif 000027
【図６Ｃ】
0005427874.tif 000028
【図６Ｄ】
0005427874.tif 000029
【図６Ｅ】
0005427874.tif 000030
【図６Ｆ】
0005427874.tif 000031
【図６Ｇ】
0005427874.tif 000032
【図６Ｈ】
0005427874.tif 000033
【図６Ｉ】
0005427874.tif 000034
【図６Ｊ】
0005427874.tif 000035
【図６Ｋ】
0005427874.tif 000036
【図７Ａ】
0005427874.tif 000037
【図７Ｂ】
0005427874.tif 000038
【図７Ｃ】
0005427874.tif 000039
【図７Ｄ】
0005427874.tif 000040
【図７Ｅ】
0005427874.tif 000041
【図７Ｆ】
0005427874.tif 000042
【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【図３１Ｆ】
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【図３１Ｇ】
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【図３１Ｈ】
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【図３１Ｉ】
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【図３１Ｊ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【配列表】
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