(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における後天性免疫不全症候群 (AIDS)を予防または治療するのに使用するための、配列番号1のアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項２】
タンパク質が、２、３、４またはそれ以上の HIV-1 サブタイプに対する免疫応答を刺激することができる、請求項 1の医薬組成物。
【請求項３】
タンパク質が、５つのHIV-1 サブタイプに対する免疫応答を刺激することができる、請求項 2の医薬組成物。
【請求項４】
タンパク質が、配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項 1の医薬組成物。
【請求項５】
タンパク質が、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項 1の医薬組成物。
【請求項６】
タンパク質が、配列番号2において1〜10 アミノ酸が切断されたアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項1〜 5のいずれかの医薬組成物。
【請求項７】
タンパク質が、配列番号2において1〜14 アミノ酸が切断されたアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項1〜5のいずれかの医薬組成物。
【請求項８】
タンパク質が、A、B、C、D、E、F、G、H、J、およびKから選択される ２、３、４、５またはそれ以上の HIV-1 サブタイプからのTat タンパク質に対する免疫応答を刺激することができる、請求項1〜7のいずれかの医薬組成物。
【請求項９】
タンパク質が化学合成されたタンパク質である、請求項1〜8のいずれかの医薬組成物。
【請求項１０】
タンパク質が組換えタンパク質である、請求項1〜8のいずれかの医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質を、医薬上許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１２】
タンパク質が、2、3、4またはそれ以上の HIV-1 サブタイプに対する免疫応答を刺激することができる、請求項 11の医薬組成物。
【請求項１３】
タンパク質が、５つのHIV-1 サブタイプに対する免疫応答を刺激することができる、請求項 12の医薬組成物。
【請求項１４】
HIV-1 感染に対する予防用または治療用ワクチンとして使用するための、請求項 11の医薬組成物。
【請求項１５】
患者における後天性免疫不全症候群 (AIDS)を予防または治療するのに使用するための、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、医薬上許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１７】
HIV-1 感染に対する予防用または治療用ワクチンとして使用するための、請求項 15の医薬組成物。
【請求項１８】
位置 22にシステインを含むトランス活性化能力のある Tat Oyi タンパク質を活性成分として含む、ワクチン。
【請求項１９】
タンパク質が配列番号1または配列番号2から選択される、請求項 18のワクチン。
【請求項２０】
さらにアジュバントを含む、請求項18または19のワクチン。
【請求項２１】
注射により温血動物を免疫することにおける使用のための、配列番号1または配列番号2の少なくとも一方を含むタンパク質およびアジュバントを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト患者における後天性免疫不全症候群 (AIDS)を予防または治療するための組成物および方法、ならびにHIV-感染に対するワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
技術的背景:
AIDSに対するワクチンの探究は、HIV-1の発見(Barre-Sinoussi et al.、1983)以来いまだに重要な問題である。HIV-1 エンベロープ(envelop)タンパク質を標的とする古典的なワクチンアプローチの不成功により、Tatと称される転写タンパク質のHIV-1 トランス活性化因子などの別の標的の使用が、そのHIV 感染細胞に対する免疫細胞応答の崩壊を含む細胞外の機能により(Jeang et al.、1999)注目されている。
【０００３】
Tatは主に２つの異なる長さ、86-87 残基または99-101 残基にて存在し、多面的活性を示す(Jeang et al.、1999)。長い形態はその第二エキソンコード配列において終止コドンをもたらす非同義単一ヌクレオチド多型の存在に起因してサブタイプ Dを除くすべてのHIV-1 サブタイプからの臨床分離株において支配的である(Jeang et al.、1999)。Tatは６つの領域に分けられ(Kuppuswamy et al.、1989)、その１つは塩基性領域と称され、Tat活性のほとんどに関与している。生物学的に活性のTat 変異体のNMR 研究により、塩基性領域および残りの機能的領域が溶媒に良好に曝露され、よく保存された Trp 11を有するN-末端の一部から構成されるコアを取り囲むことが明らかになった(Peoloponese et al.、2000; Gregoire et al.、2001、Watkins et al.、2008)。様々なTat 変異体において、このフォールディングは水溶液中においては類似しているが、疎水性溶媒に曝されると劇的に変化しうる (Peoloponese et al.、1999)。 Tatは柔軟なタンパク質であり、構造変化は、その薬理学的標的にそれが結合するために必要である (Loret et al.、1992)。
【０００４】
Tatは主に感染細胞の核においてみられ、そこでそれはトランス活性化転写(trans-acting-transcriptional)活性化因子として機能し(Wong-Staal et al、1985; Fujisawa et al.、1985)、それは、細胞内タンパク質およびウイルスmRNA上のステム-バルジ(stem-bulge)ループリーダーRNAである、TAR (トランス活性化応答領域)との相互作用ならびにTatのアセチル化(Bres et al.、2002)を含む複雑な過程により、転写の開始およびRNA 鎖伸長に関与していることが知られている (Cullen、1990)。研究により、それはまたHIV-1 RNAの逆転写にも関与していることが示された(Harrich et al.、1997)。
【０００５】
シグナル配列が存在しないにも拘わらず、TatはHIV-1-感染細胞によって分泌される唯一のHIV-1 タンパク質であり、HIV-1-感染細胞の培養上清中(0.1 - 1 ng/ml) (Ensoli et al.、1990; Westendorp et al.、1995b; Chang et al、1997) およびHIV-1-感染患者の血清中(1-40 ng/ml)に検出可能なレベルにてみられる(Xiao et al.、2000; Westendorp et al.、1995b)。細胞外Tatは多面的活性を示すが(Jeang et al.、1999)、最も重要なことは、細胞膜を横断し、ミトコンドリア経路を介してアポトーシスを導くことにより、非感染T細胞のアポトーシスを引き起こすことである(Chen et al.、2002、Campbell et al.、2004、de Mareuil et al.、2005)。SHIV-1 により攻撃されたマカク(macaque)における細胞外 Tatのインビボでの中和はCD8+ T 細胞の上昇を引き起こし、HIV-1感染CD4+ T 細胞は検出不可能となる (Watkins et al.、2006)。
【０００６】
したがって、HIV-1発病におけるTatの役割は、感染細胞におけるHIV-1 複製のための必須のタンパク質としてのみならず、細胞外毒素としての役割もある (Gallo、1999)。それゆえ、Tatを標的とするワクチンの開発は有意義である(Goldstein、1996)。しかし、Tatに対する抗体を有する血清反応陽性(seropositive)患者は、すべてのHIV-1 サブタイプからのTat 変異体は認識することができない(Campbell et al.、2007b)。さらに、これら抗体はAIDSへの疾患の進行を遅らせることができない(Senkaali et al.、2008)。
【０００７】
以前に提案されているように(Godstein、1996、Zagury et al.、1998、Cafaro et al.、1999)、欧州および北米において主にみられるB サブタイプ Tatを用いるTat ワクチンが、世界の他の地域、特にアフリカにおけるHIV-1 感染に対する治療および予防効果を提供する可能性は低いことは明白である。さらに、B サブタイプ Tatを用いるTat ワクチンは、免疫系が細胞外 Tatを中和することができないことにより、欧州および北米においてさえ治療および予防効果を提供する可能性が低い。
【０００８】
Tatに対する現在までの２つの主なワクチン戦略は不活化されたか(Zagury et al.、1998)または完全な活性を有する(Cafaro et al.、1999)B-サブタイプ欧州Tat 変異体の短い86 残基バージョンを使用する。これら２つのアプローチがマカクに対して試験され、次いで、同種(homologous)SHIV-1 攻撃 (Cafaro et al.、1999; Pauza et al.、2000)がなされた。カニクイザル (Cafaro et al.、1999)およびアカゲザル (Pauza et al.、2000)に対してそれぞれなされたこれら２つの研究においてウイルス血症の顕著な低下が観察されたが、一次(primo-)感染の間の完全な保護は示されなかった。別の研究は、Tat ワクチン接種を受けた(vaccinated)カニクイザル(Maggiorella et al.、2004)に対するSHIV-1 攻撃の後の感染の長期制御を示した。これらの研究は、生物学的に活性の Tatを用いるワクチンがサルに対して行われた安全性研究により示されるように安全なアプローチであるようであることを指摘しており、かかる研究においては局所または全身毒性あるいは有害作用は観察されなかった (Cafaro et al.、1999、2001; Caselli et al.、1999、Goldstein et al.、2000)。
【０００９】
SIV 攻撃 (Allen et al.、2002) またはTat-Rev タンパク質をコードする組換えウイルスによるワクチン接種(Verrier et al.、2002)によって保護が観察されなかったため、マカクに対するTat ワクチン研究において相反する結果がみられることを注目することは興味深い。これらの相反する結果は、異なる免疫療法、ウイルスストック、ウイルス攻撃の経路および動物種によって説明することが可能である。第一の研究におけるSIV TatおよびHIV-1 Tatの間の相違および第二の研究のためにTat-Rev 組換えタンパク質がネイティブな Tat フォールディングまたはネイティブな Rev フォールディングを有さない可能性により、保護の非存在を説明できる可能性がある。しかしより複雑なのは、Tat、Env およびGagを発現する同様のウイルスベクターを用いる、逆の結論を与える２つの別の研究の結果である。１つの研究はベクターに入れられた(vectored)Tatは有効であるが、GagおよびEnvは有効でないことを示す一方(Stittelaar et al.、2002)、もう１つの研究は、ベクターに入れられた(vectored)GagおよびEnvが有効であるが、Tatは有効でないことを示した (Liang et al.、2005)。これら２つの研究の主な相違は、一方は、ワクチンとSHIVとの両方においてTat Bru 配列を用いる同種攻撃を使用しており(Stittelaar et al.、2002)、他方は、ワクチンにおいてTat Bru 配列およびSHIV においてTat Jrを用いる異種攻撃を使用していることである(Liang et al.、2005)。HIV-1 JrおよびHIV-1 BruはB サブタイプであるが(図1)、それらのTat 配列は、コンフォメーション変化を誘導する非保存的突然変異を有する (Gregoire & Loret.、1996)。攻撃のために用いたワクチンとウイルスの間のこれらの突然変異が、第二の研究におけるTatベクター化(vectored)ワクチンの有効性の欠如を説明できる可能性がある(Liang et al.、2005)。第二の研究は現実をより忠実に模倣していることは明白である。というのは、ワクチン接種を受けたヒトは同種ウイルス感染には曝されることはないと考えられるからであるが、かかる場合、なぜ同種 Gag およびEnvが用いられたのか疑問である (Liang et al.、2005)。
【００１０】
最近の20年にわたり、HIV-1 エンベロープタンパク質を標的とするHIV-1 ワクチン研究が同種 SHIV/マカクモデルを用いて調べられており、成功を収めている(Feinberg et al.、2002)。しかし、臨床試験は成功しなかった(Vanichseni et al.、2004)。これはHIV-1の高い遺伝的多様性に起因し、この理由により、遺伝的に異なるウイルスを用いるマカクにおける異種 SHIV 攻撃を、あるワクチンがヒトにおけるHIV-1 感染に対して有効であるかどうかを判定するために使用しなければならなかった(Feinberg et al.、2002)。同種 SHIV 攻撃の成功がインビボでのTat ワクチン接種の利益(interest)を示すために有用であるならば、世界中のヒトにおけるTat ワクチンの開発はTatの遺伝的多様性を考慮しなければならない。B サブタイプ Tat Bruによる免疫化は、世界の汚染物質(contamination)の75％に対応するAおよびC HIV-1 サブタイプからのTat 変異体に対して有効な応答を刺激しないということを注目することは重要である(Opi et al.、2002)。
【００１１】
血清反応陽性の長期非進行 (long-term non-Progressor)(LTNP)患者が、血清反応陽性の急速進行(Rapid Progressor)(RP)患者よりもTat 抗体の高いレベルを有していたという発見により (Re et al.、1995; van Baalen et al.、1997; Zagurry et al.、1998、Re et al.、2001; Addo et al.、2001、Belliard et al.、2003)、Tat ワクチンの開発に対する興味が起こっている。1:1000の血清希釈度では、Tat Bruは、欧州においてRP 患者の30％のみにより認識され (Zagury et al.、1998)、アフリカにおいては10から14％においてのみ認識されるということを注目するのは興味深い(Butto et al.、2003)。このパーセンテージは、サブタイプA、CおよびDからの別のTat 変異体が試験される場合はアフリカにおいて50％にまで達しうる (Campbell et al.、2007)。この結果は、Tat 変異体における突然変異がどのように免疫原性に影響しうるかを説明するのみならず、それは多数の血清反応陽性患者がTatを認識することができないことを示す。さらにアフリカ人のRP 患者におけるTat 抗体はAIDSの進行に影響を有さない(Sankali et al.、2008)。それは、大多数のHIV-1 感染患者にとって、Tatはこのタンパク質が彼らの血中に存在するにもかかわらず認識されず、Tatを認識する患者はこのタンパク質を中和することができないということを示す。Tatがそのようにヒト免疫系によって良好には認識されない理由は、Tatの塩基性領域とプロタミンなどのヒトタンパク質にみられるエピトープとの配列類似性に起因しうる。Tat 塩基性領域 (領域 IV)に対する免疫応答を引き起こすことにより、ヒトでの自己免疫応答が導かれることは明らかである。領域 IVはTat 変異体の間で良好に保存されているが(図 1)、それはHIV-1 感染患者からの血清によっては認識されない(Campbell et al.、2007)。HIV-1 感染母からの新生児の３分の２がHIV-1 感染をエスケープすることに成功していることに注目することは興味深い(Beattie et al.、2001)。彼らは18 ヶ月齢までは血清反応陽性であり、次いで逆血清転換する(retro seroconvert)。HIV 感染に耐性である新生児のこのような大きな割合は、HIVに対する先天性免疫に起因しうる遺伝学的要因を排除する。Tatを認識する免疫系の抑制が成人においては存在しうるが、新生児には存在しないという可能性がある。というのはプロタミンは性成熟に伴って現れるからである。
【００１２】
HIV-1に対して成人において起こる自然免疫に対してより注意を払うべきである。HIV-1に対する自然免疫は、 ヒトの人口の低い割合において観察され、ケモカイン突然変異からHIV-1 エンベロープに対する中和抗体を生産する能力に渡るまで種々の機構を包含する (概説としてMarmor et al.、2006を参照されたい)。自然免疫は先天性または後天性でありうるが、後者がもちろんワクチン開発のためにもっとも興味深い。HIV-1に対する自然免疫を有する患者は露出血清反応陰性(exposed and persistently seronegative)(EPS)または血清反応陽性および長期非進行者 (LTNP)であり得る。ほとんどの場合において、この自然免疫は先天性免疫であると判明している。しかし、おそらくは獲得免疫に起因してHIV-1に耐性であり、ウイルスに高度に露出された患者の非常に稀な集団が存在する。EPSであるケニアの売春婦(sex worker)が非常によく研究されており、彼女たちの HIV-1に対する耐性はHIV-1に対する有効なCD8 T 細胞応答を発達させる彼女達の能力に関連しているようである (McMichael & Rowland-Jones、2001)。しかし、逆説であるのは、EPSのケニアの売春婦におけるCD8 T 細胞応答は、最終的にはAIDSを発症する血清反応陽性のケニアの売春婦のCD8 T 細胞応答よりも５桁低いということである(Alimonti et al.、2006)。事態をより複雑にすることには、コートジボワール(Ivory Cost)、ベトナムおよびカンボジアにおける類似のコホートのEPS 患者の研究は、彼らはHIV-1特異的CD8 T 細胞応答を有さないが、ナチュラルキラー (NK) 細胞応答(Scott-Algara et al.、2003; Jennes et al.、2006)、HIV-1 エンベロープタンパク質に対する抗体(Nguyen et al.、2006)またはウイルス侵入工程に影響する細胞性因子 (Saez-Cirion et al.、2006) を有することを示す。これらのケニアのEPS患者は先天性免疫を有していたと信じられていたが、売春をやめた後に血清反応陽性になった彼女たちのうち少なくとも一部については獲得免疫であったことが判明した(Kaul et al.、2001)。
【００１３】
より興味深いものはガボンにおいて同定されたEPS コホートの研究であった(Huet et al.、1989)。アフリカにおいて８０年代において、「Haut Ogooueo」と呼ばれるガボンのへき地において、HIV-1 感染患者がAIDSの発症へと至らないことが観察された(Delaporte et al.、1988)。疫学的調査が決定され、２年間750名の妊婦に対して実施されたところ、25名が血清反応陽性であると同定された(Huet et al.、1989)。これら25名の血清反応陽性の女性から、23名が逆血清転換し(retro seroconverted)、２年間の調査の間にEPSとなった。EPS 患者は通常検出可能なウイルスを有さないが、Oyiと呼ばれる一人の患者から、彼女が依然として血清反応陽性であった時に、HIV-1 株を単離およびクローン化することが可能であった(Huet et al.、1989)。HIVへの最初の曝露の後何年もかけて構成された売春婦または麻薬使用者のその他のEPS コホートと異なり、このガボンコホートは一次感染の間に構成され、ウイルスをクローン化することができた理由を説明している。HIV-1 Oyiに感染したすべての女性が逆血清転換し(retro seroconvert)たが、HIV-1に対するCTL 応答を維持しており、P24に対する抗体を有していた(Huet et al.、1989)。このコホートにおけるEPS 表現型の高い割合(92％)は、この逆血清転換がおそらくは獲得免疫に起因し、先天性免疫に起因するものではなかったであろうことを示す。この疫学的調査の公表の１０年後、この23名の女性は良好な健康状態にあり、彼女達の血液においてHIV-1または感染の兆候はもはや検出不可能であった。さらに、HIV-1 感染は、他の中央アフリカ諸国と比較してガボンにおいて非常に低いようである(Delaporte et al.、1996)。HIV-1 Oyiは通常のHIV-1 株とtat 遺伝子を除いては類似した遺伝子を有しており、tat 遺伝子はその他のTat 変異体においてみられない突然変異を有していた(Gregoire & Loret、1996)。Tat Oyiによる免疫化は、38％にのぼる突然変異を有するにもかかわらず異なるTat 変異体を認識することができる抗体をウサギにおいて生じさせ、これはその他のTat 変異体によっては不可能である(Opi et al.、2002)。Tat OyiはTat 変異体において保存されている三次元エピトープに対して体液性免疫応答を誘導するようであり、この体液性応答が細胞外 Tatの中和を可能にしていた可能性がある。細胞外Tatのこの役割は８０年代においては知られておらず、Tatに対する抗体の存在はこのガボンコホートにおいて試験されていなかった(Huet et al.、1989)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
７頭のアカゲザルがアジュバントを補足された合成 Tat Oyiにより免疫され、次いで、欧州のSHIV BX08による異種攻撃がTat Oyi ワクチン接種を受けたマカクおよび対照マカクに対して実施された。Tat Oyi ワクチン接種を受けたマカクでは、対照マカクと比較してCD8 T 細胞の発生を伴うウイルス血症が少なかった。さらに、SHIV 感染細胞は、Tat Oyi ワクチン接種を受けたマカクにおいて攻撃後8週目においてもはや検出不可能であった。ウイルス血症が最も低かったマカクは、SHIV エンベロープタンパク質に対する抗体を有していなかったことを注目することは興味深い。このマカクに再び攻撃を与えたところ、短期間血清反応陽性となり、血清転換した(Watkins et al.、2006)。それゆえEPS 患者のいる地域において観察されたことをマカクに対して実験的に再現することが可能であった。この「EPS マカク」が検出可能なウイルス血症を有していたことを注目することは重要である(watkins et al.、2006)。これは非常に有望な結果である。というのは、それは異種 SHIV 攻撃であったためと、それはHIV 感染細胞のレベルを劇的に低下させることが可能であることを示すためである。この目的はHAART治療の下の血清反応陽性患者において今まで達成されたことがない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要:
本発明は、患者における後天性免疫不全症候群 (AIDS)を予防または治療する方法を提供し、ここで、患者に、アミノ酸配列
WKHPGSQPKTACNNCYCKRCCLHCQVCFTKKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSKTHQVSLSKQPASQPRGDPTGPKES 
(配列番号1)を含むタンパク質、またはTat タンパク質に対する免疫応答を刺激することができるその変異体、または該タンパク質または変異体をコードするポリヌクレオチドを投与する。
【００１６】
好ましくは、該タンパク質または変異体は、2、3、4またはそれ以上の HIV-1 サブタイプに対する免疫応答を刺激することができるものである。
【００１７】
好ましい態様において、該タンパク質または変異体は、A、B、C、D、E、F、G、H、J、およびKから選択される２、３、４、５またはそれ以上の HIV-1 サブタイプからのTat タンパク質に対する免疫応答を刺激することができるものである。
【００１８】
最も好ましくは、該タンパク質または変異体は、５つのHIV-1 サブタイプ、好ましくは A、B、C、D、およびEに対する免疫応答を刺激することができるものである。
【００１９】
好ましくは、該タンパク質は、アミノ酸配列
MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACNNCYCKRCCLHCQVCFTKKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSKTHQVSLSKQPASQPRGDPTGPKESKKKVERETETDPED 
(配列番号2)を含むか、またはそれからなる。
【００２０】
配列番号2は、WO00/61067に記載されるHIV Oyi Tat タンパク質とは、位置 22におけるシステインによって異なっており、これがトランス活性化能力を回復させる。本発明において用いられるタンパク質は、Tatの機能的活性、即ち、HeLa P4 細胞アッセイにおいてHIV-1 遺伝子トランス活性化ができる活性(図4)を示す。
【００２１】
位置 22におけるセリンのシステインによる置換は、Tat Oyi S22 よりもTat Oyi C22 をよりよく認識する100名の血清反応陽性患者のコホートからの血清により示されるように、元のTat Oyi 配列の免疫原性を増強した(図 2)。Tat Oyi Cys 22のこのトランス活性化活性は、3D 構造が正しいものであることを確認し、臨床試験のためにタンパク質を特徴決定することを可能にする。
【００２２】
本発明のさらなる対象は、活性成分として、好ましくは配列番号1または配列番号2から選択される、位置 22にシステインを含むトランス活性化能力のある(transactivation competent) Tat Oyi タンパク質を含むワクチンである。
【００２３】
好ましい態様において、ワクチンはアジュバントを含む。
【００２４】
本発明のさらに別の対象は、配列番号1または配列番号2の少なくとも１つを含む有効量のタンパク質およびアジュバントを注射することを含む、温血動物を免疫する方法である。
【００２５】
この方法はさらに、タンパク質が５つまたはそれ以上のHIV-1 サブタイプに対する免疫応答を引き起こすか否かを判定する工程を含み得、ここで、タンパク質は、少なくとも５つの HIV-1 サブタイプからのTat タンパク質に対する免疫応答を刺激する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図 1は、３つのコホート、１つはベトナム人EPS 患者(n=25)であり、第二はフランス人血清反応陽性患者(n=100)であり、第三は、フランス人血清反応陰性未感作(naive)患者(n=20)であった、における抗-Tat IgGの検出を示すグラフである。３つのタイプの血清学的パターンが、５つの主要なHIV-1 サブタイプを代表するTat 変異体によるELISA 滴定曲線において患者の血液サンプルについて観察された。図 1Aは、あるベトナム人EPS 患者からの血清により得られた６つのTat 変異体の認識を示す。Tat 抗体のレベルは、６つのTat 変異体に関して同じではなく、Tat CM240がこのベトナム人の患者については最もよく認識された。図 1Bは１または２のみのTat 変異体を認識する別の患者を示し、これはフランス人血清反応陽性コホート(n=100)において主に観察される。図 1Cは、Tat 変異体の認識の非存在であり(ODが0.1に及ばない)、フランス人血清反応陰性コホート (n=20)に典型的であるが、フランス人血清反応陽性コホートの半分およびベトナム人EPS コホートの３分の１においてもそうである。
【図２】図 2は、フランス人血清反応陽性コホート (n=100)の血清による７つのTat 変異体の認識を示すグラフである。HIV-1 サブタイプA (Ug11RP)、B (HXB2)、C (96BW)、D (Eli)およびE (CM240)からのTat 変異体代表(representatives)は、文字A、B、C、DおよびEに対応する。文字Oは、Tat Oyi Ser22に対応し、Oc22はTat Oyi Ser22に対応する。この実験は、Cys 22 突然変異はTat Oyi の認識を変化させなかったが、元のTat Oyi 配列の免疫原性をむしろ増強させたことを示す。これは確実にTat 野生型により類似しているシステイン領域に起因する。
【図３】図 3は、分析用(analytical)HPLCにおいて25分にて単一ピーク(single peak)を有する精製されたサブフラクションからのアリコートの質量分析を示す。観察された分子量(MW)は、Tat Oyi Cys 22について予測されたMWである11578とほとんど正確に対応している。精製は11578より小さいまたは大きい分子量を有するペプチドの痕跡量もない程度に成功した。5784.5のピークは11575のピークのシャドウ(shadow)ピーク (質量の２分の１)に対応する。
【図４】図 4は、HIV LTRによりトランスフェクトされたHeLa細胞を用いたトランス活性化アッセイを示すグラフである。合成 Tat Oyi Cys 22の生物学的活性を、HIV LTRの制御下の細菌 lac-Z 遺伝子を有するHeLa P4 細胞を用いる細胞培養アッセイによって試験した。活性のTat タンパク質は、細胞質(cytoplasmic)および細胞膜を横断し、β-ガラクトシダーゼの細胞質蓄積によって明らかなようにlac Z 遺伝子を「トランス活性化する」ことができる。2 x 105 細胞/ウェルを24-ウェルプレートにおいて37℃、5％ CO2にて10％ 胎児ウシ血清を追加したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM)中でインキュベートした。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、0.01％ プロタミン (Sigma) および0.1％ ウシ血清アルブミン (Sigma)を追加したDMEM中に希釈したTat タンパク質を添加した。２つのTat タンパク質について１つの濃度を試験し (500 nM)、これによりβ-ガラクトシダーゼのレベルが細胞外 Tatに関して用量依存的であることを確認した。37℃、5％ CO2で16時間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解した。タンパク質を抽出し、β-ガラクトシダーゼ含量を市販の抗原検出捕捉ELISA (β-ガラクトシダーゼ ELISA、Roche Molecular Biochemicals)により測定した。 吸光度値は405 nmにて測定した。
【図５】図 5は、Tat Oyi Ser 22およびTat Oyi Cys 22の円偏光二色性 (CD) スペクトルを示す。CD スペクトルは20℃で20 mM リン酸バッファー、pH 4.5の存在下で、260-178 nmの範囲に渡ってJASCO Corp. J-810 分光偏光計 (Japan)にて100 μm 路長(path length)を用いて記録した。データは0.5 nm間隔にて工程自動応答手順(step auto response procedure)(JASCO)を用いて収集した。CD スペクトルはアミドあたりΔεとして表す。タンパク質濃度はTat Oyi Ser22 について1 mg/mlであり、Tat Oyi Cys22について0.3 mg/mlであった。２つのCD スペクトルは同一であり、cys22ser 突然変異がCDにより検出可能な変化を誘導しないことを示す。
【図６】図 6は、Tat Oyi Cys22の分子モデリングを示す。分子モデリングをBiopolymer、Discover およびHomologyを含む Insight II 2002 パッケージ(Accelrys、San Diego、CA)によって行った。２つのモデルを構築し、それはTat Oyi Ser 22 (データ示さず)およびTat Oyi Cys 22に対応するものであった。モデルはCV Force Fieldおよびエネルギー最小化のための共役勾配アルゴリズム(gradient conjugate algorithm)を用いてTat Eli NMR 構造 (Watkins et al.、2008)から得た。２つのモデルは同一であったため、cys22ser 突然変異は分子モデリングから推定され得た変化を誘導しない。Glu 100 突然変異を含むC-末端が、Tat 変異体における最も保存された配列を有する領域3および4と非常に近い(very close of)ことを観察することは興味深い。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明:
本発明者は、HIV-感染に耐性の患者(ベトナム人EPS 患者)が５つの主要な HIV-1 サブタイプ(図 1A)の代表であるTat 変異体を認識することができることを観察した。これらの結果は、異なるTat変異体に関する相互(cross)認識能力を有するTat 抗体が、HIVに対する有効な細胞性免疫応答を回復させることができたことを示す。
【００２８】
これに基づき、本発明は患者における後天性免疫不全症候群 (AIDS)を予防または治療する方法を提供し、ここで、患者には、配列番号1または2のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはTat タンパク質に対する免疫応答を刺激することができるその変異体が投与される。
【００２９】
好ましくは、タンパク質は、２、３、４またはそれ以上のHIV-1 サブタイプに対する免疫応答を刺激することができるものである。もっとも好ましくは、タンパク質は、少なくとも５つのHIV-1 サブタイプからのTat 変異体に対する免疫応答を刺激することができるものである。
【００３０】
好ましい態様において、患者には、配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、もっとも好ましくは、配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質が投与される。
【００３１】
別の態様において、患者には、配列番号1または2の配列の切断形態(truncated form)を含むタンパク質が投与される。例えば、タンパク質は1〜10 アミノ酸、好ましくは 1〜8、好ましくは 1〜6、好ましくは 1〜4、好ましくは 1または2 アミノ酸がN-末端にて切断された(truncated of)ものであってよい。患者には、1〜14 アミノ酸、好ましくは 1〜12、好ましくは 1〜10、好ましくは 1〜8、好ましくは 1〜6、好ましくは 1〜4、好ましくは 1または2 アミノ酸がC-末端にて切断された配列番号1または2のアミノ酸配列を含むタンパク質が投与されてもよい。
【００３２】
投与すべきタンパク質は、配列番号1または配列番号2に由来する変異体であってもよい。
【００３３】
好ましくは、タンパク質変異体は、保存的アミノ酸置換によって配列番号1または配列番号2とは異なるものである。保存的アミノ酸置換は同じクラスのアミノ酸の間での置換である。これらのクラスとしては、例えば、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシン;塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン ;酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸; および、非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびシステインが挙げられる。
【００３４】
好ましくは少なくとも５つの HIV-1 サブタイプからのTatタンパク質に対する免疫応答を刺激することができるタンパク質変異体は、好ましくは、配列番号1または配列番号2と少なくとも 80％、好ましくは 少なくとも 85％、好ましくは 少なくとも 90％、好ましくは 少なくとも 95％の同一性を示すものである。
【００３５】
相同性または同一性は、配列分析ソフトウェア、例えば、the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、WI 53705の配列分析ソフトウェアパッケージを用いて決定される。アミノ酸配列は同一性を最大化するようにアラインされる。適切なアラインメントを達成するために配列にギャップを人工的に導入してもよい。いったん至適アラインメントが設定されると、相同性または同一性の程度は、位置の総数に対する両方の配列のアミノ酸が同一である位置のすべてを記録することによって確立される。
【００３６】
投与すべきタンパク質変異体は、化学修飾、例えば、ペプチド結合の偽(pseudo)ペプチド結合への修飾を含んでいてもよい。
【００３７】
「偽ペプチド」という用語は、参照ペプチドと類似であるが、１以上のペプチド結合、--CO--NH--が、ペプチド結合と同等な結合により置換されている偽ぺプチドと称される化合物をいい、かかる結合としては、例えば --CH 2--NH--、--CH 2--S--、--CH 2--O--、--CO--CH 2--CO--、--CH 2--CH2--が挙げられる。
【００３８】
「変異体」という用語は、さらに１または数個のアミノ酸の、天然アミノ酸ではない化学的残基による置換を包含する。L-アミノ酸による置換もまた含まれる。
【００３９】
本発明の別の側面において、尿クリアランスおよび使用する治療用量の低下、および、血漿中の半減期の上昇のために、タンパク質はそのC-末端またはリジン残基によってポリエチレングリコール (PEG) 分子に共有結合しており、特に1500または4000 MWのPEGが挙げられる。さらに別の態様において、タンパク質の半減期はタンパク質を薬物送達システムのための生分解性および生体適合性ポリマー材料に含めてミクロスフェアを形成させることによって上昇される。ポリマーおよびコポリマーとしては、例えば、ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド) (PLGA) (US2007/0184015、SoonKap Hahn et alに記載)が挙げられる。
【００４０】
さらなる態様において、タンパク質は、担体と結合または会合される。担体は当該技術分野において公知である(Plotkin、1999)。細菌性担体(即ち、細菌由来の担体)としては、限定されないが、コレラ毒素 B サブユニット (CTB); ジフテリア毒素突然変異体 (CRM197); ジフテリア トキソイド; B群レンサ球菌アルファC タンパク質; 髄膜炎菌性外膜タンパク質 (OMPC); 破傷風トキソイド;分類不可能なインフルエンザ菌の外膜タンパク質(例えば、P6); B群髄膜炎菌の組換えクラス3 ポーリン (rPorB); 加熱死バング菌; 加熱死 リステリア菌; および緑膿菌 組換えエキソタンパク質 Aが挙げられる。別の担体としては、キーホールリンペットヘモシアニン (KLH)がある。ウイルス由来担体の例は当該技術分野において公知であり、 B型肝炎ウイルス表面抗原 (HBsAg) 粒子およびB型肝炎ウイルスコア抗原(HBcAg)が挙げられる。
【００４１】
好ましい態様において、好ましくは少なくとも５つの HIV-1 サブタイプからのTat タンパク質に対する免疫応答を刺激することができるタンパク質変異体は、トランス活性化の能力があるものである。
【００４２】
有利なことには、タンパク質変異体は、HIV-1 サブタイプA、B、C、DおよびEからのTat タンパク質に対する免疫応答を刺激することができる(E サブタイプ HIV 株は主に東南アジアに観察されるが、A サブタイプ株の組換え形態であるとしばしばみなされる)。
【００４３】
タンパク質または変異体は、組換えタンパク質であり得、あるいは好ましくは化学合成されたタンパク質であってよく、それは固相合成および好ましくは迅速なFMOC戦略において合成されうる。
【００４４】
タンパク質が化学合成によって生産される場合、本発明によるポリペプチドは、単一の配列の形態で合成されてもよいし、後で互いに連結される数個の配列の形態にて合成されてもよい。化学合成は固相または溶液中で実施することができ、これら２つの合成技術は当業者に周知である。これらの技術は特に、Atherton and Shepard によって 「Solid phase peptide synthesis (IRL press Oxford、1989)」および Houbenweyl によって「Methoden der organischen Chemie」、 E.Wunsch発行の[Methods in Organic Chemistr]  Vol. 15-I and II、Stuttgart、1974、および以下の文献に記載されており、これらは引用によりその全体が本明細書に含まれる: P E Dawson et al. (Science 1994; 266(5186):776-9); G G Kochendoerfer et al. (1999; 3(6):665-71); et P E Dawson et al.、Annu. Rev. Biochem. 2000; 69:923-60。
【００４５】
タンパク質は、当業者に周知の遺伝子操作技術を用いて生産してもよい。タンパク質を遺伝子操作によって生産する場合、それは、NH 2-末端に、最初の開始コドンの翻訳に対応する追加のメチオニン残基を含む。これらの技術は、Molecular Cloning: a molecular manual、by Maniatis et al.、Cold Spring Harbor、1989に詳細に記載されている。
【００４６】
タンパク質はしたがって、精製形態、即ち、少なくとも 80％、85％、90％、95％、またはそれを超える純度を示す形態において得られうる。純度は、混合物に存在する混入物(contaminant)であると考えられるその他のタンパク質に対して規定される。この純度は、クマシー・ブルーを用いてSDS-PAGEの比色分析によって評価される。バンドの濃度測定により、純度を定量することが可能となる。純度はまた、様々なピークの面積を測定することにより逆相 HPLCによって測ることも可能である。
【００４７】
いくつかのタイプの治療用組成物が、少なくとも５つの HIV-1 サブタイプからのTat タンパク質に対する免疫応答を誘発するために使用することが可能である。
【００４８】
本発明の対象は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、または好ましくは少なくとも５つの HIV-1 サブタイプからのTat タンパク質に対する免疫応答を刺激することができるその変異体を、医薬上許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物である。
【００４９】
ワクチンとしての使用のために好適であると提案される免疫原性組成物は、本明細書に開示されるようにして調製される免疫原性 Tat Oyi Cys 22 タンパク質および/またはペプチド (例えば、配列番号1、2、または配列番号1または2の断片)から直接容易に調製することができる。好ましくは、抗原性物質は、徹底的に透析して望ましくない低分子量の分子を除く、および/または、所望の媒体(vehicle)へとより容易に製剤するために凍結乾燥する。
【００５０】
ペプチド配列を活性成分として含むワクチンの調製は、米国特許 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; および4.578,770号により例証されているように当該技術分野において一般的によく理解されている。典型的には、かかるワクチンは、注入物質(injectable)として液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製される:注射前に液体とされる溶液または懸濁液に好適な固体形態も調製することができる。調製物は乳化されてもよい。活性免疫原性成分は、しばしば、医薬上許容され、活性成分と適合性の賦形剤と混合される。好適な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびそれらの組合せが挙げられる。さらに、所望の場合、ワクチンは、少量の補助物質、例えば 湿潤剤または乳化剤、pH 緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強するアジュバントを含んでいてもよい。
【００５１】
ワクチンは、例えば、皮下または筋肉注射でのいずれかの注射により、非経口で常套的に投与することができる。その他の投与様式のために好適なさらなる製剤としては、坐薬および、場合によっては経口製剤が挙げられる。坐薬のための、常套的な結合剤および担体としては、例えば、ポリアルカレングリコール(polyalkalene glycol)またはトリグリセリドが挙げられ得る:かかる坐薬は、活性成分を0.5％〜10％、好ましくは 1-2％の範囲で含む混合物から形成することができる。経口製剤にはそのように通常使用される賦形剤、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形態をとり、10-95％、好ましくは 25-70％の活性成分を含む。
【００５２】
タンパク質は、中性または塩形態としてワクチンへと製剤することができる。医薬上許容される塩としては、例えば、酸付加塩(ペプチドの遊離アミノ基と形成される)および無機酸、例えば、塩酸またはリン酸と形成されるもの、または例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄、および、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から由来しうる。
【００５３】
ワクチンは、投与製剤(dosage formulation)と適合するように投与され、そして量は治療上有効かつ免疫原性となるようにされる。投与量は処置すべき対象に依存し、例えば、個体の免疫系が抗体を合成する能力、望まれる保護の程度に依存する。投与に必要な活性成分の正確な量は施術者の判断に依存する。しかし、好適な用量範囲はワクチン接種あたり数百マイクログラムの活性成分のオーダーである。初回投与および追加接種の好適な用法も変動しうるが、典型的には、初回投与の後に、続く接種またはその他の投与が行われる。
【００５４】
適用の方法も広範に変動しうる。ワクチンの投与のためのあらゆる常套方法が適用可能である。それらには固体の生理的に許容される基材(base)上での、または生理的に許容される分散液中での経口適用、注射等による非経口適用が含まれると考えられる。ワクチンの用量は投与経路に依存し、宿主の大きさに応じて変動する。
【００５５】
好ましい態様において、本発明の組成物はさらにアジュバントを含む。アジュバントは配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質、またはその変異体の免疫原性を促進または上昇させるいずれかの物質、混合物、溶質または組成物から選択することができ、ここで、アジュバントは免疫応答を増強することができるものである。アジュバントの例としては好ましくはリン酸カルシウムが挙げられるが、ALUMホスフェート、ALUMヒドロキシド、Montanide CpG、QS21、ISCOMまたはMPL(monophosphoryl lipid A)も挙げられる。
【００５６】
ワクチンのためのアジュバント効果を達成するその他の方法としては、薬剤、例えば、リン酸緩衝食塩水中0.05 〜0.1 ％ 溶液として一般に使用されるミョウバン(aluminum hydroxide or phosphate (alum))、0.25 ％ 溶液として用いられる糖の合成ポリマー(Carbopol)との混合物の使用、70℃〜101℃で30秒から2分間のそれぞれ熱処理によるワクチン中のタンパク質の凝集が挙げられる。アルブミンに対するペプシン処理(Fab) 抗体の再活性化による凝集、細菌細胞、例えば、C. parvumまたはグラム陰性細菌の内毒素またはリポ多糖成分との混合物、生理的に許容される油性媒体、例えば、代用閉塞(block substitute)として使用されるマンニドモノオレアート(mannide mono-oleate (Aracel A))中の乳濁液またはペルフルオロカーボン (Fluosol-DA)の20 ％ 溶液との乳濁液を用いることもできる。
【００５７】
多くの例において、ワクチンの複数回投与を行うのが望ましく、通常は６回を超えないワクチン接種、より通常は４回を超えないワクチン接種および好ましくは１回以上の、通常は少なくとも約３回のワクチン接種が好ましい。ワクチン接種は通常、２−１２週間隔、より通常には３−５週間隔で行われる。1-5年、通常３年の間隔での定期的追加免疫は抗体の保護レベルを維持するために望ましい。免疫化の経過は抗原に対する抗体についてのアッセイにより追跡することができる。
【００５８】
本発明によるタンパク質組成物は当業者に公知のいかなる常套方法を用いて調製してもよい。常套的には、タンパク質は医薬上許容される希釈剤または賦形剤、例えば、水またはリン酸緩衝食塩水溶液と混合される。賦形剤または希釈剤は、選択された医薬形態、投与方法および経路、および薬学の慣行の関数として選択される。好適な賦形剤または希釈剤、および医薬製剤に関する要求は、Remington's Pharmaceutical Sciencesに詳細に記載されており、これは本分野の参考技術を表す。
【００５９】
別の医薬組成物は、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列、または上記に規定したその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む。かかる医薬組成物は宿主に投与、例えば注射(DNA ワクチン接種として知られる)され、該核酸はインビボで Tat ポリペプチドを発現する。かかるDNA ワクチンは通常プラスミドベクターから構成される。裸の(naked)DNAの送達は有効性が低いことが示されており、いくつかの担体が通常、DNAの細胞への送達および取り込みを向上させるのに必要とされる。２つのタイプの担体が今までに開発されている: (1) ウイルス性担体(アデノウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス)、または(2)非-ウイルス性担体、例えば、ポリマー(および特にカチオン性ポリマー)、カプセル封入-DNA (リポソームは、ポリアニオン、例えば DNAおよびRNAと自発的かつ迅速に相互作用するカチオン性脂質を含むことにより、リポソーム/核酸複合体が形成される)または金微粒子に結合したDNA。さらに、核酸の細胞取り込みを助ける薬剤、例えば、カルシウムイオン、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質およびその他のトランスフェクション促進剤が有利に使用されうる。
【００６０】
上記の組成物はワクチンの分野において通常用いられているいずれの常套的な経路を介して投与してもよく、例えば、非経口 (静脈内、筋肉内、皮下等)経路が挙げられる。本発明の関係において、筋肉内投与が好ましくは注射可能組成物について用いられる。かかる投与は大腿または腕の筋肉において有利には行われる。本発明による組成物はまた、有利には経口投与もされうる。経鼻、経膣または経腸粘膜投与もまた、本発明の関係において推奨されうる。投与はまた、単回用量、または例えば0日目、および1 ヶ月目、3 ヶ月目、6 ヶ月目および12 ヶ月目での反復用量を与えることによって行われうる。１日目(J0)および1 ヶ月目および3 ヶ月目での追加免疫による注射が好ましくは用いられ、その周期は処置する医者によって容易に決定されうる。 
【００６１】
一般的には、各用量は約 5μg〜約 500 μg、好ましくは10〜200μgのタンパク質を含むであろう。より好ましい用量は、約 50 μgの免疫原としてのタンパク質でありうる。その他の用量範囲もまた当業者によって想定されうる。初回用量の後、所望により、望ましい場合には反復追加免疫をおこなってもよい。
【００６２】
本発明はまた、医薬品として使用するため、特に、HIV 感染に対する予防用または治療用ワクチンとして使用するための医薬組成物を包含するよう意図される。
【００６３】
好ましい側面によると、本発明の対象は、本明細書に記載するタンパク質、あるいは、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、ヒトを免疫するための使用である。本発明はそれゆえ、好ましくは、特異的体液性応答を誘発するために該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与する方法に関する。
【００６４】
本発明はしたがって、該体液性応答を誘発するために十分な量の上記の医薬組成物の投与を含む、HIV 中和抗体を誘発する方法を提供する。
【００６５】
「特異的体液性応答」という表現は、Tat 変異体の間でよく保存されている表面に対して特異的に向けられた抗体の産生を含む応答を意味する意図である。特異的抗体の産生は、当業者に周知の常套技術、例えば、ELISA、RIAまたはウェスタンブロットを用いて容易に判定することができる。
【００６６】
本明細書において用いられるTat タンパク質および変異体は、多数の、あるいはすべての、HIVのリスクにあるか、またはHIVに感染した個体の保護および/または処置に有用であり得るワクチンの開発のための価値ある候補である。
【００６７】
治療効果は、抗ウイルス処置をされていない血清反応陽性患者が、より低いウイルス血症、リンパ球 CD4 細胞の上昇および/またはより低含量のリンパ球 CD8 細胞を有する場合に認識される。
【００６８】
より具体的には、治療効果は、少なくとも 55名のHIV 血清反応陽性患者のコホートの30 ％が、６ヶ月間のHAART処置の中断後、そのウイルス血症を50 コピー/ml未満に維持する場合に認識される。
【００６９】
AIDSの症状がみられる(declared) 患者において、かかる抗-Tat ワクチンはHIV-感染細胞によるその分泌の後のTat タンパク質の直接作用に連関しているようである特定の病理症状、例えば、カポジ肉腫または神経学的症候群の発症率を制限しうるであろう。
【００７０】
無症候性の患者においては、本発明の医薬組成物は、より低いウイルス血症、リンパ球 CD4 細胞の上昇および/またはより低含量のリンパ球 CD8 細胞によって、AIDSへの進行を遅延させることが期待される。かかるワクチンは患者に、感染の発症においてはあてはまらないようである、HIV 感染細胞に対する有効な免疫細胞応答の回復を可能とするであろう。特に、その活性がTatにより阻害される、細胞障害性 T リンパ球 (CTL)、NK 細胞およびマクロファージの活性の回復である。ワクチン接種は患者が少なくとも非進行者(non progressor)となるのを可能とする結果を有するであろう。本発明によりHIV 感染細胞を排除するためのワクチン接種が提供され、AIDSに対する治療処置が提供される。
【００７１】
図面および実施例はその範囲を限定することなく本発明を説明するものである。
【実施例】
【００７２】
材料および方法
タンパク質合成
Tat タンパク質を自動合成機(ABI 433A、Perkin Elmer、Applied Biosystem Inc.)でHMPがあらかじめ充填されている(preloaded)樹脂(0.5-0.65mmol) (Perkin Elmer、Applied Biosystem Inc.、Forster City、CA)上でBarany and Merrifield (1980)の方法にしたがってアセンブリーさせた(assembled)。
【００７３】
HIV LTRによりトランスフェクトされたHeLa細胞を用いるトランス活性化アッセイ
合成 Tat Oyi Cer22の生物学的活性を、HIV LTRの制御下の細菌 lac-Z 遺伝子を有するHeLa P4 細胞を用いる細胞培養アッセイにより試験した。活性のTatタンパク質は、細胞質膜および細胞膜を横切り、β-ガラクトシダーゼの細胞質蓄積により明らかなようにlac Z 遺伝子を「トランス活性化する」ことができる。2 x 10 5 細胞/ウェルを37℃、5％ CO2で10％ 胎児ウシ血清を追加したダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM)中で24-ウェルプレートにてインキュベートした。24時間後、細胞をPBSで洗浄し、0.01％ プロタミン (Sigma) および0.1％ ウシ血清アルブミン (Sigma)を追加したDMEM中に希釈したTat タンパク質を添加した。β-ガラクトシダーゼのレベルが細胞外 Tatに関して用量依存的であることを確かめるために２つのTat タンパク質の１つの濃度(500 nM)を試験した。37℃、5％ CO2 にて16時間後、細胞をPBSで洗浄し、溶解した。タンパク質を抽出し、β-ガラクトシダーゼ含量を市販の抗原検出捕捉ELISA (β-ガラクトシダーゼ ELISA、Roche Molecular Biochemicals)を用いて測定した。吸光度値を405 nmにて測定した。
【００７４】
円偏光二色性 (CD) 
CD スペクトルを20℃で20 mM リン酸バッファー、pH 4.5の存在下で、JASCO Corp. J-810 分光偏光計 (Japan)を用いて100 μm 路長にて260-178 nmの範囲にわたって記録した。データを工程自動応答手順(JASCO)を用いて0.5 nm間隔にて収集した。CD スペクトルをΔε/アミドとして表す。
【００７５】
分子モデリング: 
分子モデリングを、Biopolymer、Discover および Homologyを含むInsight II 2002 パッケージ (Accelrys、San Diego、CA)を用いて実施した。モデルはCV Force Field およびエネルギー最小化のための共役勾配アルゴリズムを用いてTat Eli NMR 構造 (Watkins et al.、2008)から得た。
【００７６】
ヒト血清
持続的に曝露される(exposed persistently)血清反応陰性 (EPS)患者 (n=25)は、注射針の共用を介してHIV-1 感染のリスクに高度に曝されていたことがあり、1996年以来追跡されており (Truong et al、2003)、科学的研究についての同意を示している(Tran et al、2006)、ベトナム人の静脈内麻薬使用者(IDU)であった。フランス人のヒト血液サンプルを、20名のHIV-1 血清反応陰性および100名のHIV-1 血清反応陽性の白人患者の一群から得た。それらはマルセイユにある病院センターにて収集した。HIV-1 血清反応陽性患者のほとんどは抗レトロウイルス療法 (HAART)を受けている。フランス人の血清反応陰性コホートにおける試験への参加者は研究の目的について知らされた(1983年に改訂された1975年のHelsinki Declarationにしたがって)。すべての血液サンプルは各人の出身国において収集され凍結された。
【００７７】
ELISA アッセイ
ヒトまたはマウス血清におけるtatに対する抗体は、Maxisorp U96 イムノプレート (Nunc)を用いる標準的酵素免疫測定 アッセイ (ELISA)によって検出した。プレートをリン酸バッファー 100 mM pH 4.5中に希釈した各Tat 変異体について0.5μg/ウェル用いて16時間 4℃で被覆した。現在、世界中に５つの主要なHIV-1 サブタイプが存在する: サブタイプ AおよびCが優勢であり(72 ％)、主にアフリカ、インドおよび南米においてみられ; サブタイプ B (10 ％)は主に欧州および北米にみられ; サブタイプ D は主にアフリカにおいてみられ、サブタイプ E (現在では組換え形態CRF_01AEとして記載される)は主に東南アジアにおいてみられる(Hemelaar et al.、2006)。 Tatの変動はこの地理的多様性にしたがい、A、B、C、D および E HIV-1 サブタイプからのTat 変異体の間で40 ％もの突然変異が観察されるが、これらはTat 活性を修飾するものではなく、Tat 免疫特性に影響を与えるものである(Opi et al.、2002、2004)。これにより、本発明者らはHIV-1 サブタイプA、B、C、DおよびEを代表するためにTat Ug 11 RP、Tat HXB2、Tat 92Br、Tat EliおよびTat CM240を用いた。これら５つの合成タンパク質はTat 生物学的活性を有し、サイズは99から 101 残基であり、現在の現場でのTatの優性型である(Jeang et al.、1999)。Tat Oyi Cys 22およびTat Oyi Ser 22の認識をこれら５つのTat 変異体とともに同じプレート上で比較した。プレートを次いで室温で１時間200 μlの2％ ミルクを追加したPBSとともにインキュベートした。血清 (１つのプレートについて１つの血清)を0.2％ ミルクを追加した様々な希釈度のPBSに添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。0.2％ミルクを追加したPBS中に1:1000 に希釈した二次抗体 (抗-ヒトまたは抗 マウス IgG ペルオキシダーゼ(Sigma))を各ウェルに添加し、室温で１時間穏やかに振盪した。プレートを200 μlの1 X PBS/0.05％ Tween 20 (Genaxis)でそれぞれの続く工程の間に３回洗浄した。検出(Revelation)は各ウェルに添加した100 μlの ABTS (2,2’-アジノ-ビス-3-エチルベンズ-チアゾリン-6-スルホン酸(Sigma))を用いて行い、吸光度はEL800ユニバーサルマイクロプレートリーダー(BIO-TEK INSTRUMENT、INC)で405 nmにて読み取った。
【００７８】
実施例 1 :ベトナム人EPS 患者からの血清はTat Oyiを含む５つの主要な HIV-1 サブタイプからのTat 変異体を認識することができる
EPS 患者において検出される抗-Tat IgG:
本発明者らは、ベトナムにおけるEPS 患者のコホートにおいてTat 抗体を検出することができた。本発明者らは、そのうち１つはベトナム人EPS 患者 (n=25)であり、第二はフランス人血清反応陽性患者(n=100)であり、第三は、フランス人血清反応陰性未感作(naive)患者 (n=20) である３つのコホートに対して、Tat Oyiを含む５つの主要な HIV-1 サブタイプを代表するTat 変異体についてELISA試験を実施した。３つのタイプの血清学的パターンが Elisa 試験において観察された(図 1)。第１のタイプはすべての Tat変異体の特異的認識 (ODが0.1を超える)によって特徴づけられ、EPS コホート (n=25)においてのみ観察される。図 1Aは、ベトナム人EPS 患者からの血漿によって得られた６つのTat 変異体の認識を示す。Tat 抗体のレベルは６つのTat 変異体に関して同じではなく、HIV-1 CM240 からのTat(Carr et al.、1996)がこの患者についてもっともよく認識される。第２の血清学的パターンは、少なくとも１つの Tat 変異体に対する特異的認識の非存在によって特徴づけられ、主に血清反応陽性コホート (n=100)において観察される。図 1Bは、フランス人の血清反応陽性患者からの血清によって得られた１つのみのTat 変異体の認識を示す。血清反応陽性患者は２以上のTat 変異体を認識することができるが、すべてのTat 変異体を認識することはできない(Campbell et al.、2007)。第３の血清学的パターンはいずれのTat 変異体も認識しないものであり、それは0.1より小さいODによって特徴づけられる。図1Cは、フランス人血清反応陰性患者からの血清によって得られたTat 変異体の認識の非存在を示す。この血清学的パターンは未感作患者のフランス人血清反応陰性コホートのすべてのボランティアにおいて観察されるだけでなく、フランス人血清反応陽性患者の半分、およびベトナム人EPS コホートの３分の１においても観察される (データ示さず)。図 1Aに示すようにTat CM240がベトナム人コホートにおいてもっともよく認識され、次いで、Tat Oyiであることに注目することは興味深い。Tat CM240はベトナムに特有のHIV-1 E サブタイプを代表する (Lan et al.、2003)。これらベトナム人の患者におけるTat Oyiの良好な認識は、Tat Oyiの特別の免疫特性を示す。
【００７９】
血清反応陽性患者において観察された６つのTat 変異体の相互認識の非存在: 
EPS 患者の主要な相違を図 1Bに示す。患者の半分のみがTat 抗体を有しており、彼らの血清は一般に１または２のTat 変異体を認識することが可能であった (図 1B)。この結果は血清反応陽性患者のウガンダのコホートについて観察された結果と非常に類似している (Campbell et al.、2007)。しかしながら、この研究の設計は、フランス人の血清反応陽性コホートにおいて１年間にわたり５回の血液サンプリングが行われたため異なるものであった。患者のいくらかにおいてTatに対する抗体が消失し、彼らがTatに対する抗体を再び有した場合に、認識されるのは同一のTat 変異体であることに注目することは非常に興味深かった(データ公表せず)。フランス人の血清反応陽性患者のほとんど(75 ％)はB サブタイプ HIV-1 株に感染しており、75 ％が有効に Tat HXB2、Tat Oyi Ser 22またはTat Oyi Cys 22を認識する。しかしながらTat HXB2 配列が欧州人のB-サブタイプ Tat 変異体と最も近い相同性を有するにもかかわらず、Tat Oyi が Tat HXB2よりもより良好に認識されるという観察は興味深い。EPS ベトナム人コホートについては、これらの結果はTat Oyiの特異的免疫特性を確認する。
【００８０】
本発明者らはSer/cys 22 突然変異が Tat Oyiの免疫認識を変化させないであろうと予測した。これは、フランス人血清反応陰性コホートによって確認された。というのは、Cys 22 突然変異はTat Oyiの認識を変化させなかったからである。システインリッチ領域と野生型 Tat 変異体との相同性におそらくは起因して、Tat Oyi Cys 22の認識はTat Oyi S22と比較してより良好であるという観察は興味深い。
【００８１】
滴定曲線はしばしばフランス人血清反応陽性コホートにおいて Tat Ug 11RPとTat CM240とについて同一である (データ示さず)。これは、類似のエピトープがこれら２つの変異体において認識され、これら２つの変異体を認識する患者の数を人工的に増加させることを示唆する。滴定曲線は図 1Aに示すようにベトナム人EPS 患者においてTat Ug 11RP とTat CM240とで異なる。図 1Aにおいてもっとも上の曲線はTat CM240に起因する。これは、ベトナムにおいてはTat CM240と E サブタイプ Tat 変異体とに共通するもう１つのエピトープが存在することを示す。滴定曲線はまた、Tat OyiとTat HXB2との間でベトナム人およびフランス人の患者の両方についてしばしば同一である(データ示さず)。
【００８２】
図 1および図 2はTat 変異体の間で共通のエピトープがないことを示す。というのは我々のElisa 試験は、患者に感染したHIV-1 サブタイプをほとんど同定することを可能にするからである。したがって、それによりEPS 患者におけるTat IgG 抗体 の検出がHIV-1ではないであろう病原体からの感染に起因しうるという可能性は非常に低くなる。
【００８３】
議論
Tat Oyi (101 残基)は急速進行者である患者からの Tat 変異体にはみられない突然変異を有し(Greogoire & Loret、1996)、本発明者らはこれら突然変異がTat Oyiに、Tat 変異体におけるよく保存された領域に対応する3D エピトープを有する能力を与えると考える(Opi et al.、2002、Watkins et al.、2006)。それゆえ、Tat Oyiがベトナム人EPS コホートにおいて非常に良好に認識され、この認識がTat HXB2との共通のエピトープによって説明できないことは驚くべきである。
【００８４】
この研究は、タイ人患者において同定されたHIV-1 CM240 からのTat (Carr et al.、1996)が、ベトナム人EPS 患者においてもっとも認識されることを明らかにする。HIV-1 CM240は東南アジアにおいて典型的であり、この結果は、Tatに対する獲得体液性応答がおそらくEPSにおいて起こり、多数回の曝露にもかかわらずHIV-1に対して彼らが耐性であることの原因であり得ることを示す。特異的体液性応答は、CD4-GP120複合体に関してこのEPS ベトナム人コホートにおいても観察された (Lopalco et al.、2005)。このEPS ベトナム人コホートは、欧州の患者のEPS コホートに関するHIV-1 免疫の類似の兆候を有し(Lopalco et al.、2005)、Tat CM240の認識は、EPS ベトナム人患者がHIVに感染しているがHIV-1 感染に抵抗性となっていることを確認する。一方、EPS 患者の３分の１は検出可能な Tat 抗体を有さず、彼らの HIVに対する耐性はTat 抗体に起因するようではないようである(データ示さず)。先天性免疫が最近、この非常に同じのベトナム人EPS コホートにおいて同定され、ここで５名の患者が彼らのCD4 リンパ球のHIV 侵入工程に影響をおよぼす細胞性因子に突然変異を有していた(Saez-Cirion et al.、2006)。これら患者の１人が、この研究においてTatを認識しないEPS 患者のなかにいることを知ることは興味深い。
【００８５】
Tat 抗体は血清反応陽性患者の血清において検出されてきており、長期非進行者 (LTNP) のステータスとの相関が観察された(Zagury et al.、1998; Re et al.、2001; Belliard et al.、2003)。変性 Tat 変異体またはペプチドがこれらの研究において用いられ、Tat 抗体は血清反応陽性患者の３分の１においてのみ検出された (Zagury et al.、1998)。本発明者らは、Tatの三次元構造を維持するためにpH 4.5にて全長 Tat 変異体を用いること、および検出を低希釈度 (1/4)の血液サンプルから開始することにおいて新規なTat 抗体を検出するプロトコールを開発した。この新しいプロトコールにより特異的Tat 抗体の検出を血清反応陽性患者の50％にまで上昇させることが可能となる。しかしその血中に細胞外 Tat を有する血清反応陽性患者の50 ％がまったくTat 変異体を認識しないことは驚くべきである。一方、Tat 抗体の濃度はEPS 患者に関して血清反応陽性患者において２倍高いが、Tat 抗体の量は、Tatを産生するHIV 感染細胞の潜在的な量に関してEPS 患者において膨大なままである。奇妙なことはベトナム人におけるTat Oyiの認識である。1/1000 血液サンプル希釈度を用いたベトナム人コホートについての第１スクリーニング実験において、本発明者らは、EPS 患者の56 ％においてTat Oyiに対する抗体の存在を検出することができた。１／４血液サンプル希釈度から開始する新しいプロトコールにより、別のTat 変異体が、EPS コホートにおいて有意に認識されたことに注目することが可能となった (図 1A)。
【００８６】
結論: 
血清反応陽性患者の半分のみがTatに対する抗体を有しており、６つのTat 変異体を認識することができなかった。さらに、これらTatに対する抗体は消失しうる。これらの特徴は、それらが細胞外 Tatを中和することができないことを説明しうる。Tat は細胞障害性 T リンパ球においてアポトーシスを誘導し得 (Westendorp et al.、1995)かつ、Fas リガンドの過剰発現によりマクロファージを阻害しうる(Cohen et al.、1999)ことが示されている。EPS コホートにおけるHIV-1 に対する唯一の細胞性応答はナチュラルキラー (NK) 細胞に起因し、TatはNK 細胞における細胞アポトーシスを誘導することができる(Poggi et al.、2002)。本発明者らの結果は、異なる Tat 変異体に関して相互認識能力を有するTat 抗体は、HIVに対する有効な細胞性免疫応答を回復させることができることを示唆する。EPS コホートにおける大多数の患者のなかでのTatを特異的に認識するIgGの存在は、Tatに対する獲得免疫が実際に起こっており、その細胞性免疫の回復を可能としたことを示唆する。この獲得免疫は、 Tat Oyiを有するガボン人において観察された突然変異と類似のベトナム人のTat 変異体における突然変異に起因しうる。Tat Oyiに特異的な突然変異のなかで、Glu 100は、負の電荷の出現がTat 変異体の間で高度に保存された表面に対応するTat Oyiの表面に対する免疫原性を誘発しうることから、非常に興味深いと考えられる。
【００８７】
実施例2 : Tat Oyi Cys 22の合成、精製および特徴決定
Tat OyiCys22 (配列番号2)を固相ペプチド合成においてアセンブリーさせた。樹脂の切断の前に、330 mgの粗物質を理論量である707 mgから得た。合成収率は46.7 ％であり、合成 Tat Oyi Ser 22において観察されたものと類似である。 
【００８８】
樹脂および保護基をタンパク質内容物からトリフルオロ酢酸により切断した。タンパク質内容物をまずターシャル(tertio)ブチルエーテル(TBE)による沈降により精製してTBEに可溶性の遊離の保護基を除いた。ペレットを乾燥させ、 0.1％ TFA 緩衝水溶液に再懸濁し、次いで樹脂をろ過 (0.22 μm)により除いた。樹脂非含有のタンパク質内容物 (およそ 240 mg)を凍結乾燥し、0.1％ TFA 緩衝水溶液に濃度20 mg/mlの４つのおよそ 60 mgのフラクションとして再懸濁し、これらフラクションをF1、F2、F3およびF4と称した。各フラクションはほぼ 15 ODユニットを含む。
【００８９】
精製をBeckman C8 逆相カラム(10x150 mm)を備えたBeckman 高圧液体クロマトグラフィー (HPLC)装置を用いて各フラクションに対して行った。バッファー Aは0,1％ TFAを含む水であり、バッファー Bは0,1％ TFAを含むアセトニトリル (Merck)であった。グラジエントは40分にて15-35％のバッファー Bであり、2 ml/分の流速であった。
【００９０】
C8 逆相分離の後に得られた異なるサブフラクションから、サブフラクションにおいてTrpの典型的な吸収スペクトルを検出することが可能であった。HPLC 分析をMerck RP-8 カラム (4,6x100 mm)を用いて同様のバッファーにより、ただし、40分で10-50％のグラジエント、0.8 ml/分の流速を用いて行った。Trpの典型的な吸収スペクトルを有するサブフラクションは25分での単一ピークにより特徴づけられ、Tat Oyi Ser 22と同じ保持時間を有する(データ示さず)。突然変異は Tat Oyiの疎水性を変化させなかった。
【００９１】
Tat Oyi Cys 22の予測された11578 MWに対応する質量が、HPLCにおいて25分にて単一ピークを有するサブフラクションに観察された(図 3)。質量分析によると混入物は観察されなかった。同じ質量スペクトルが-22℃で保存したTat Oyi Cys22によって６ヶ月後に得られたことに注目するのは興味深い。活性物質の分解の非存在はワクチン接種運動を勇気づけるものである。
【００９２】
精製 Tat Oyi Cys 22の合計量は280 nmでのODユニットの３分の１に対応し、タンパク質含量の合計量の５分の１に対応する。
【００９３】
さらなる特徴決定、例えば、トランス活性化アッセイ (図 4)および円偏光二色性 (図 5)をTat Oyi Cys 22を用いて行った。トランス活性化アッセイはTat HXB2を対照として用いて行った。トランス活性化は Tat Oyi Cys 22によりTat HXB2と類似のレベルにて観察され、一方、変異体 Tat Oyi Ser 22はトランス活性化することができない。Cys 22 突然変異は、Tat Oyi Cys 22がその他の活性なTat 変異体に類似の構造を有することを示す生物学的試験を有することを可能とする。
【００９４】
円偏光二色性 (CD)を同じ日にTat Oyi Cys 22およびTat Oyi Ser 22について行った。CD スペクトル (図 5)により、 突然変異 Cys22SerはCDにより検出可能な構造変化を誘導しないことが明らかである。
【００９５】
突然変異によって誘導された可能性があるが、CDによっては検出されない可能性のある変化を評価するために、Tat Oyi Cys22およびTat Oyi Ser22の分子モデリングを行った (図 6)。分子モデリングは突然変異 Ser22Cysが構造変化を誘導しないことを確認する。Serと Cysとの間の唯一の相違は、側鎖における異なる原子（酸素と硫黄との違い）である。硫黄と酸素は周期表(Mendelief table)の同じ列上にあり、求核試薬としての化学的類似性を共有する。硫黄は酸素より大きく、硫黄に結合する水素は酸素に結合する水素よりも不安定である。これは唯一の、Tat OyiCys22 がトランス活性化することができ、Tat OyiSer22ができないことの理由の説明であると考えられる。
【００９６】
Glu 100 突然変異を含むC-末端がTat 変異体におけるもっとも保存された配列を有する領域3および4と非常に近接しているという観察は興味深い。
【００９７】
実施例 3 : Tat Oyi Cys 22による免疫化
マウスの免疫化を Tat Oyi Cys 22 (配列番号2)を用いて行った。臨床試験のために計画されたものと比較して１０００倍高い濃度のTat Oyi Cys 22によってもマウスにおいて毒性は観察されなかった (データ示さず)。
【００９８】
参考文献
Addo MM, Altfeld M, Rosenberg ES, Eldridge RL, Philips MN, Habeeb K, Khatri A, Brander C, Robbins GK, Mazzara GP, Goulder PJ, Walker BD; and HIV Controller Study group: The HIV-1 regulatory proteins Tat and Rev are frequently targeted by cytotoxic T lymphocytes derived from HIV-1-infected individuals. Proc Natl Acad Sci U S A 2001, 98, 1781-1786.
Alimonti, J.B., Kimani, J., Matu, L., Wachihi, C., Kaul, R., Plummer, F.A., & Fowke, K.R. Characterization of CD8 T-cell responses in HIV-1-exposed seronegative commercial sex workers from Nairobi, Kenya. Immunol Cell Biol. 2006,84:482-485.
Allen, T. M., L. Mortara, B. R. Mothe, M. Liebl, P. Jing, B. Calore, M. Piekarczyk, R. Ruddersdorf, D. H. O'Connor, X. Wang, C. Wang, D. B. Allison, J. D. Altman, A. Sette, R. C. Desrosiers, G. Sutter, and D. I. Watkins. Tat-vaccinated macaques do not control simian immunodeficiency virus SIVmac239 replication. J. Virol. 2002, 76: 4108-4112.
Arya SK, Guo C, Josephs SF, Wong-Staal F: Trans-activator gene of human T-lymphotropic virus type III (HTLV-III) Science 1985, 229:69-73.
Barany, G. & Merrifield, R.B. The peptide : Analysis, Synthesis, Biology. Volume 2. Edited by : Gross E, Meinhofer J. Academic Press, New York, 1980:1-284.
Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, Nugeyre MT, Chamaret S, Gruest J, Dauguet C, Axler-Blin C, Vezinet-Brun F, Rouzioux C, Rozenbaum W, Montagnier L. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). 1983. Science. 1983,220:868-871.
Bell CM, Connell BJ, Capovilla A, Venter WD, Stevens WS, Papathanasopoulos MA: Molecular characterization of the HIV type 1 subtype C accessory genes vif, vpr, and vpu. AIDS Res Hum Retroviruses 2007, 23:322-330.
Belliard G, Romieu A, Zagury JF, Dali H, Chaloin O, Le Grand R, Loret E, Briand JP, Roques B, Desgranges C, Muller S. Specificity and effect on apoptosis of Tat antibodies from vaccinated and SHIV-infected rhesus macaques and HIV-infected individuals. Vaccine. 2003,21:3186-3199.
Berkhout B, Silverman RH, Jeang KT. Tat trans-activates the human immunodeficiency virus through a nascent RNA target. Cell. 1989,59:273-282.
1.Bhoopat L, Rithaporn TS, Khunamornpong S, Bhoopat T, Taylor CR, Thorner PS: Cell reservoirs in lymph nodes infected with HIV-1 subtype E differ from subtype B: identification by combined in situ polymerase chain reaction and immunohistochemistry. Mod Pathol 2006, 19:255-263.
Bres V, Tagami H, Peloponese JM, Loret E, Jeang KT, Nakatani Y, Emiliani S, Benkirane M, Kiernan RE. Differential acetylation of Tat coordinates its interaction with the co-activators cyclin T1 and PCAF. EMBO J. 2002,21:6811-6819.
Butto, S., Fiorelli, V., Tripiciano, A., Ruiz-Alvarez, M. J., Scoglio, A., Ensoli, F., Ciccozzi, M., Collacchi, B., Sabbatucci, M., Cafaro, A., Guzman, C. A., Borsetti, A., Caputo, A., Vardas, E., Colvin, M., Lukwiya, M., Rezza, G., Ensoli, B. and the Tat Multicentric Study Group. Sequence conservation and antibody cross-recognition of clade B human immunodeficiency virus (HIV) type 1 Tat protein in HIV-1-infected Italians, Ugandans, and South Africans. J. Infect. Dis. 2003, 188 : 1171-1180.
Cafaro, A., Caputo, A., Fracasso, C., Maggiorella, M.T., Goletti, D., Baroncelli, S., Pace, M., Sernicola, L., Koanga-Mogtomo, M.L., Betti, M., Borsetti, A., Belli, R., Akerblom, L., Corrias, F., Butto, S., Heeney, J., Verani, P., Titti, F. and Ensoli, B. Control of SHIV-89.6P-infection of cynomolgus monkeys by HIV-1 Tat protein vaccine. Nat. Med. 1999, 6 : 643-650.
Cafaro, A., Titti, F., Fracasso, C., Maggiorella, M. T., Baroncelli, S., Caputo, A., Goletti, D., Borsetti, A., Pace, M., Fanales-Belasio, E., Ridolfi, B., Negri, D. R., Sernicola, L., Belli, R., Corrias, F., Macchia, I., Leone, P., Michelini, Z., Ten Haaft, P., Butto, S., Verani, P., and Ensoli, B. Vaccination with DNA containing tat coding sequences and unmethylated CpG motifs protects cynomolgus monkeys upon infection with simian/human immunodeficiency virus (SHIV89.6P) Vaccine 2001, 19: 2862-2877.
Campbell GR, Pasquier E, Watkins J, Bourgarel-Rey V, Peyrot V, Esquieu D, Barbier P, de Mareuil J, Braguer D, Kaleebu P, Yirrell DL, Loret EP. The glutamine-rich region of the HIV-1 Tat protein is involved in T-cell apoptosis. J Biol Chem. 2004,279:48197-48204.
Campbell GR, Senkaali D, Watkins J, Esquieu D, Opi S, Yirrell DL, Kaleebu P, Loret EP: Tat mutations in an African cohort that do not prevent transactivation but change its immunogenic properties Vaccine 2007, 25:8441-8417.
Campbell GR, Watkins JD, Esquieu D, Pasquier E, Loret EP, Spector SA: The C-terminus of HIV-1 Tat modulates the extent of CD178 mediated apoptosis of T cells. J Biol Chem 2005, 280:38376-38382.
Campbell GR, Watkins JD, Singh KK, Loret EP, Spector SA: Human immunodeficiency virus type 1 subtype C Tat fails to induce intracellular calcium flux and induces reduced tumor necrosis factor production from monocytes. J Virol 2007, 81:5919-5928.
Carr JK, Salminen MO, Koch C, Gotte D, Artenstein AW, Hegerich PA, St Louis D, Burke DS, McCutchan FE. Full-length sequence and mosaic structure of a human immunodeficiency virus type 1 isolate from Thailand.  J Virol. 1996,9, 5935-5943. 
Caselli, E., Betti, M., Grossi, M. P., Balboni, P. G., Rossi, C., Boarini, C., Cafaro, A., Barbanti-Brodano, G., Ensoli, B. and Caputo, A. DNA immunization with HIV-1 tat mutated in the trans activation domain induces humoral and cellular immune responses against wild-type Tat. J. Immunol. 1999, 162: 5631-5638.
Chang HC, Samaniego F, Nair BC, Buonaguro L, Ensoli B: HIV-1 Tat protein exits from cells via a leaderless secretory pathway and binds to extracellular matrix-associated heparan sulfate proteoglycans through its basic region. AIDS 1997, 11:1421-1431.
Chen D, Wang M, Zhou S, Zhou Q. HIV-1 Tat targets microtubules to induce apoptosis, a process promoted by the pro-apoptotic Bcl-2 relative Bim. EMBO J. 2002,21:6801-6810. 
Coetzer M, Cilliers T, Ping LH, Swanstrom R, Morris L: Genetic characteristics of the V3 region associated with CXCR4 usage in HIV-1 subtype C isolates. Virology 2006, 356:95-105.
Cohen SS, Li C, Ding L, Cao Y, Pardee AB, Shevach EM, Cohen DI. Pronounced acute immunosuppression in vivo mediated by HIV Tat challenge. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999,96:10842-10847. 
Cullen BR: The HIV-1 Tat protein: an RNA sequence-specific processivity factor? Cell 1990, 63:655-657.
de Mareuil J, Carre M, Barbier P, Campbell GR, Lancelot S, Opi S, Esquieu D, Watkins JD, Prevot C, Braguer D, Peyrot V, Loret EP. HIV-1 Tat protein enhances microtubule polymerization. Retrovirology. 2005, 2:5.
Delaporte, E., Dupont, A., Merlin, M., Josse, R., Hamono, B., Larouze, B. & Brun-Vezinet, F. Seroepidemiological survey of HIV-1 and HIV-2 antibodies in Gabon. AIDS 1988, 2: 136-137.
Delaporte, E., Janssens, W., Peeters, M., Buve, A., Dibanga, G., Perret, J. L., Ditsambou, V., Mba, J. R., Courbot, M. C., Georges, A., Bourgeois, A., Samb, B., Henzel, D., Heyndrickx, L., Fransen, K., Van der Groen, G. ＆ Larouze，B. Epidemiological and moleculer characteristics of HIV infection in Gabon, 1986-1994, AIDS 1996, 8: 903-910.
Ensoli B, Barillari G, Salahuddin SZ, Gallo RC, Wong-Staal F. Tat protein of HIV-1 stimulates growth of cells derived from Kaposi’s sarcoma lesions of AIDS patients.
Nature. 1990,345:84-86.
Feinberg MB & Moore JP. AIDS vaccine models: challenging challenge viruses. Nat Med 2002, 8: 207-210.
Fisher AG, Ratner L, Mitsuya H, Marselle LM, Harper ME, Broder S, Gallo RC, Wong-Staal F. Infectious mutants of HTLV-III with changes in the 3' region and markedly reduced cytopathic effects. Science. 1986,233:655-659. 
Fittipaldi A, Ferrari A, Zoppe M, Arcangeli C, Pellegrini V, Beltram F, Giacca M: Cell membrane lipid rafts mediate caveolar endocytosis of HIV-1 Tat fusion proteins. J Biol Chem 2003, 278:34141-34149.
Fujisawa J, Seiki M, Kiyokawa T, Yoshida M: Functional activation of the Long Terminal Repeat of Human T cell leukemia virus type I by a trans-acting factor. Proc Natl Acad Sci U S A 1985, 82: 2277-2281.
Gallo RC: Tat as one key to HIV-induced immune pathogenesis and Tat toxoid as an important component of a vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96:8324-8326.
Goldstein G: HIV-1 Tat protein as a potential AIDS vaccine. Nat Med 1996, 9:960-964.
Goldstein, G., Manson, K., Tribbick, G. & Smith, R. Minimization of chronic plasma viremia in rhesus macaques immunized with synthetic HIV-1 Tat peptides and infected with a chimeric simian/human immunodeficiency virus (SHIV33). Vaccine 2000, 25: 2789-2795.
Gregoire C, Peloponese JM Jr, Esquieu D, Opi S, Campbell G, Solomiac M, Lebrun E, Lebreton J, Loret EP. Homonuclear (1)H-NMR assignment and structural characterization of human immunodeficiency virus type 1 Tat Mal protein. Biopolymers. 2001,62:324-335.
Gregoire CJ, Loret EP. Conformational heterogeneity in two regions of TAT results in structural variations of this protein as a function of HIV-1 isolates. J Biol Chem. 1996,271:22641-22646.
Hemelaar J, Gouws E, Ghys PD, Osmanov S Global and regional distribution of HIV-1 genetic subtypes and recombinants in 2004. AIDS. 2006,20:13-23.
Huet, T., Dazza, M. C., Brun-Vezinet, F., Roelants, G. E. & Wain-Hobson, S. A highly defective HIV-1 strain isolated from a healthy Gabonese individual presenting an atypical western blot. AIDS. 1989, 3: 707-715.
Jeang KT, Xiao H, Rich EA. Multifaceted activities of the HIV-1 transactivator of transcription, Tat. J Biol Chem. 1999;274:28837-28840. Review.
Jennes, W., Verheyden, S., Demanet, C., Adje-Toure, C. A., Vuylsteke, B., Nkengasong, J. N., Kestens, L. Cutting Edge: Resistance to HIV-1 Infection among African Female Sex Workers Is Associated with Inhibitory KIR in the Absence of Their HLA Ligands. J Immunol. 2006, 177: 6588-6592.
Kaleebu P, Nankya IL, Yirrell DL, Shafer LA, Kyosiimire-Lugemwa J, Lule DB, Morgan D, Beddows S, Weber J, Whitworth JA: Relation between chemokine receptor use, disease stage, and HIV-1 subtypes A and D: results from a rural Ugandan cohort. J Acquir Immune Defic Syndr 2007, 45:28-33.
Kaul, R., Rowland-Jones, S.L., Kimani, J., Dong, T., Yang, H. B., Kiama, P., Rostron, T., Njagi, E., Bwayo, J. J., MacDonald, K. S., McMichael, A. J., Plummer, F. A. Late seroconversion in HIV-resistant Nairobi prostitutes despite pre-existing HIV-specific CD8+ responses. J Clin Invest. 2001, 107: 341-349.
Kuiken C, Leitner T, Foley B, Hahn B, Marx P, McCutchan F, Wolinsky S, Korber B, (Eds). HIV Sequence Compendium. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, NM, LA-UR 06-0680; 2008.
Kuppuswamy M, Subramania T, Srinivasan A, Chinnadurai G: Multiple functional domains of Tat the trans-activator of HIV-1 defined by mutational analysis. Nucl Acid Res 1989, 17:3551-3561.
Lan NT, Recordon-Pinson P, Hung PV, Uyen NT, Lien TT, Tien HT, Garrigue I, Schrive MH, Pellegrin I, Lafon ME, Aboulker JP, Barre-Sinousi F, Fleury HJ. HIV type 1 isolates from 200 untreated individuals in Ho Chi Minh City (Vietnam): ANRS 1257 Study. Large predominance of CRF01_AE and presence of major resistance mutations to antiretroviral drugs. AIDS Res Hum Retroviruses. 2003,19:925-928. 
Levy JA. HIV pathogenesis: knowledge gained after two decades of research. Adv Dent Res. 2006,19:10-16. Review
Liang X, Casimiro DR, Schleif WA, Wang F, Davies ME, Zhang ZQ, Fu TM, Finnefrock AC, Handt L, Citron MP, Heidecker G, Tang A, Chen M, Wilson KA, Gabryelski L, McElhaugh M, Carella A, Moyer C, Huang L, Vitelli S, Patel D, Lin J, Emini EA, Shiver JW. Gag and Env but not Tat show efficacy against simian-human immunodeficiency virus 89.6P challenge in Mamu-A*01-negative rhesus monkeys. J Virol. 2005, 19: 12321-12331.
Lopalco L, Barassi C, Paolucci C, Breda D, Brunelli D, Nguyen M, Nouhin J, Luong TT, Truong LX, Clerici M, Calori G, Lazzarin A, Pancino G, Burastero SE. Predictive value of anti-cell and anti-human immunodeficiency virus (HIV) humoral responses in HIV-1-exposed seronegative cohorts of European and Asian origin. J Gen Virol. 2005,86:339-348.
Loret EP, Georgel P, Johnson WC Jr, Ho PS. Circular dichroism and molecular modeling yield a structure for the complex of human immunodeficiency virus type 1 trans-activation response RNA and the binding region of Tat, the trans-acting transcriptional activator. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992,89:9734-9738.
Maggiorella, M. T., Baroncelli, S., Michelini, Z., Fanales-Belasio, E., Moretti, S., Sernicola, L., Cara, A., Negri, D. R., Butto, S., Fiorelli, V., Tripiciano, A., Scoglio, A., Caputo, A., Borsetti, A., Ridolfi, B., Bona, R., ten Haaft, P., Macchia, I., Leone, P., Pavone-Cossut, M. R., Nappi, F., Ciccozzi, M., Heeney, J., Titti, F., Cafaro, A. and Ensoli, B. Long-term protection against SHIV89.6P replication in HIV-1 Tat vaccinated cynomolgus monkeys. Vaccine 2004, 22: 3258-3269.
Marmor M, Hertzmark K, Thomas SM, Halkitis PN, Vogler M. Resistance to HIV infection.
J Urban Health. 2006,83:5-17. Review.
McMichael AJ, Rowland-Jones SL. Cellular immune responses to HIV. Nature. 2001, 410:980-987. Review.
Mishra M, Vetrivel S, Siddappa NB, Ranga U, Seth P: Clade-specific differences in neurotoxicity of human immunodeficiency virus-1 B and C Tat of human neurons: significance of dicysteine C30C31 motif. Ann Neurol 2008, 63:366-376.
Nguyen, M., Pean, P., Lopalco, L., Nouhin, J., Phoung, V., Ly, N., Vermisse, P., Henin, Y., Barre-Sinoussi, F., Burastero, S. E., Reynes, J. M., Carcelain, G., Pancino, G. HIV-specific antibodies but not T cell responses are associated with protection in seronegative partners of HIV-1-infected individuals in Cambodia. J Acquir Immune Defic Syndr. 2006, 42: 412-419.
Opi S, Peloponese JM Jr, Esquieu D, Campbell G, de Mareuil J, Walburger A, Solomiac M, Gregoire C, Bouveret E, Yirrell DL, Loret EP. Tat HIV-1 primary and tertiary structures critical to immune response against non-homologous variants. J Biol Chem. 2002,277:35915-35919. 
Opi S, Peloponese JM Jr, Esquieu D, Watkins J, Campbell G, De Mareuil J, Jeang KT, Yirrell DL, Kaleebu P, Loret EP. Full-length HIV-1 Tat protein necessary for a vaccine. Vaccine. 2004,22:3105-3111.
Opi S, Peloponese JM, Jr, Esquieu D, Campbell G, de Mareuil J, Walburger A, Solomiac M, Gregoire C, Bouveret E, Yirrell DL, Loret EP: Tat HIV-1 primary and tertiary structures critical to immune response against non-homologous variants. J Biol Chem 2002, 277:35915-35919.
Osmanov S, Pattou C, Walker N, Schwardlander B, Esparza J; WHO-UNAIDS Network for HIV Isolation and Characterization. Estimated global distribution and regional spread of HIV-1 genetic subtypes in the year 2000. J Acquir Immune Defic Syndr. 2002,29:184-190.
Pacyniak E, Gomez ML, Gomez LM, Mulcahy ER, Jackson M, Hout DR, Wisdom BJ, Stephens EB: Identification of a region within the cytoplasmic domain of the subtype B Vpu protein of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) that is responsible for retention in the golgi complex and its absence in the Vpu protein from a subtype C HIV-1. AIDS Res Hum Retroviruses 2005, 21:379-394. 
Pauza, C. D., Trivedi, P., Wallace, M., Ruckwardt, T. J., Le Buanec, H., Lu., W, Bizzini, B., Burny, A., Zagury, D. & Gallo, R. C. Vaccination with tat toxoid attenuates disease in simian/HIV-challenged macaques. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97: 3515-3519.
Peloponese JM Jr, Collette Y, Gregoire C, Bailly C, Campese D, Meurs EF, Olive D, Loret EP. Full peptide synthesis, purification, and characterization of six Tat variants. Differences observed between HIV-1 isolates from Africa and other continents. J Biol Chem. 1999,274:11473-11478.
Peloponese JM Jr, Gregoire C, Opi S, Esquieu D, Sturgis J, Lebrun E, Meurs E, Collette Y, Olive D, Aubertin AM, Witvrow M, Pannecouque C, De Clercq E, Bailly C, Lebreton J, Loret EP. 1H-13C nuclear magnetic resonance assignment and structural characterization of HIV-1 Tat protein. C R Acad Sci III. 2000,323:883-894.
Peloponese JM, Gregoire C, Opi S, Esquieu D, Sturgis J, Lebrun E, Meurs E, Collette Y, Olive D, Aubertin AM, Witvrow M, Pannecouque C, De Clercq E, Bailly C, Lebreton J, Loret EP: 1H-13C nuclear magnetic resonance assignment and structural characterization of HIV-1 Tat protein C R Acad Sci III 2000, 323:883-894.
Plotkin, Vaccines 3rd Ed. Philadelphia, WB Saunders Co. 1999
Poggi A, Carosio R, Spaggiari GM, Fortis C, Tambussi G, Dell'Antonio G, Dal Cin E, Rubartelli A, Zocchi MR. NK cell activation by dendritic cells is dependent on LFA-1-mediated induction of calcium-calmodulin kinase II: inhibition by HIV-1 Tat C-terminal domain. J Immunol. 2002, 1:95-101.
Ranga U, Shankarappa R, Siddappa NB, Ramakrishna L, Nagendran R, Mahalingam M, Mahadevan A, Jayasuryan N, Satishchandra P, Shankar SK, Prasad VR: Tat protein of human immunodeficiency virus type 1 subtype C strains is a defective chemokine. J Virol 2004, 78:2586-2590.
Ranjbar S, Rajsbaum R, Goldfeld AE: Transactivator of transcription from HIV type 1 subtype E selectively inhibits TNF gene expression via interference with chromatin remodeling of the TNF locus. J Immunol 2006, 176:4182-4190.
Re MC, Vignoli M, Furlini G, Gibellini D, Colangeli V, Vitone F, La Placa M. Antibodies against full-length Tat protein and some low-molecular-weight Tat-peptides correlate with low or undetectable viral load in HIV-1 seropositive patients. J Clin Virol. 2001,21:81-89.
Renjifo B, Gilbert P, Chaplin B, Msamanga G, Mwakagile D, Fawzi W, Essex M, and the Tanzanian Vitamin and HIV Study Group: Preferential in-utero transmission of HIV-1 subtype C as compared to HIV-1 subtypes A or D. AIDS 2004, 18:1629-1636.
Roof P, Ricci M, Genin P, Montano MA, Essex M, Wainberg MA, Gatignol A, Hiscott J: Differential regulation of HIV-1 clade-specific B, C, and E long terminal repeats by NF-kappaB and the Tat transactivator. Virology 2002, 296:77-83.
Saez-Cirion A, Versmisse P, Truong LX, Chakrabarti LA, Carpentier W, Barre-Sinoussi F, Scott-Algara D, Pancino G. Persistent resistance to HIV-1 infection in CD4 T cells from exposed uninfected Vietnamese individuals is mediated by entry and post-entry blocks. Retrovirology 2006, 3: 81-86.
Scott-Algara, D., Truong, L. X., Versmisse, P., David, A., Luong, T. T., Nguyen, N. V., Theodorou, I., Barre-Sinoussi, F., Pancino, G. Cutting edge: increased NK cell activity in HIV-1-exposed but uninfected Vietnamese intravascular drug users. J Immunol. 2003, 171: 5663-5667.
Senkaali, D., Kebba, A., Shafer, L. A., Campbell, G., Loret, E., Van der Paal, L., Grosskurth, H., Yirrell, D. & Kaleebu, P. Tat specific binding IgG and disease progression in HIV-1 infected Ugandans AIDS 4, 587-94 (2008).
Singh KK, Spector SA. Host Genetic Determinants of HIV Infection and Disease Progression in Children. Pediatr. Res. 2009, in press.
Stittelaar, KJ, Gruters, RA, Schutten, M, van Baalen, CA, van Amerongen, G, Cranage, M, Liljestrom, P, Sutter, G, Osterhaus, AD. Comparison of the efficacy of early versus late viral proteins in vaccination against SIV. Vaccine 2002, 20: 2921-2927.
Tran HK, Chartier L, Troung LX, Nguyen NN, Fontanet A, Barre-Sinoussi FE, Pancino G, Scott-Algara D. Systemic immune activation in HIV-1-exposed uninfected Vietnamese intravascular drug users. AIDS Res Hum Retroviruses. 2006,22:255-261.
Truong LX, Luong TT, Scott-Algara D, Versmisse P, David A, Perez-Bercoff D, Nguyen NV, Tran HK, Cao CT, Fontanet A, Follezou JY, Theodorou I, Barre-Sinoussi F, Pancino G. CD4 cell and CD8 cell-mediated resistance to HIV-1 infection in exposed uninfected intravascular drug users in Vietnam. AIDS. 2003 ,17:1425-1434.
Van Baalen CA, Pontesilli O, Huisman RC, Geretti AM, Klein MR, de Wolf F, Miedema F, Gruters RA, Osterhaus AD: Human immunodeficiency virus type 1 Rev- and Tat-specific cytotoxic T lymphocyte frequencies inversely correlate with rapid progression to AIDS. J. Gen Virol. 1997, 78: 1913-1918.
Vanichseni S, Tappero JW, Pitisuttithum P, Kitayaporn D, Mastro TD, Vimutisunthorn E, van Griensvan F, Heyward WL, Francis DP, Choopanya K; Bangkok Vaccine Evaluation Group. Recruitment, screening and characteristics of injection drug users participating in the AIDSVAX B/E HIV vaccine trial, Bangkok, Thailand. AIDS 2004, 18: 311-316.
Vasan A, Renjifo B, Hertzmark E, Chaplin B, Msamanga G, Essex M, Fawzi W, Hunter D: Different rates of disease progression of HIV type 1 infection in Tanzania based on infecting subtype. Clin Infect Dis 2006, 42:843-852.
Vendeville A, Rayne F, Bonhoure A, Bettache N, Montcourrier P, Beaumelle B: HIV-1 Tat enters T cells using coated pits before translocating from acidified endosomes and eliciting biological responses. Mol Biol Cell 2004, 15:2347-2360.
Verrier B, Le Grand R, Ataman-Onal Y, Terrat C, Guillon C, Durand PY, Hurtrel B, Aubertin AM, Sutter G, Erfle V, Girard M. Evaluation in rhesus macaques of Tat and Rev-targeted immunization as a preventive vaccine against mucosal challenge with SHIV-BX08. DNA Cell Biol 2002, 21: 653-658.
Wadia JS, Stan RV, Dowdy SF: Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat Med 2004, 10:310-315.
Walker PR, Ketunuti M, Choge IA, Meyers T, Gray G, Holmes EC, Morris L: Polymorphisms in Nef associated with different clinical outcomes in HIV type 1 subtype C-infected children. AIDS Res Hum Retroviruses 2007, 23:204-215. 
Watkins J, Campbell GR, Halimi H, Loret EP: Homonuclear 1H NMR and Circular Dichroism Study of the HIV-1 Tat Eli variant. Retrovirology 2008, 5:83.
Watkins JD, Lancelot S, Campbell GR, Esquieu D, de Mareuil J, Opi S, Annappa S, Salles JP, Loret EP. Reservoir cells no longer detectable after a heterologous SHIV challenge with the synthetic HIV-1 Tat Oyi vaccine. Retrovirology. 2006,3:8.
Westendorp MO, Frank R, Ochsenbauer C, Stricker K, Dhein J, Walczak H, Debatin KM, Krammer PH. Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120. Nature. 1995,375:497-500.
Wolf D, Witte V, Laffert B, Blume K, Stromer E, Trapp S, d'Aloja P, Schurmann A, Baur AS. HIV-1 Nef associated PAK and PI3-kinases stimulate Akt-independent Bad-phosphorylation to induce anti-apoptotic signals. Nat Med. 2001,7:1217-1224.
Wong-Staal F, Gallo RC, Chang NT, Ghrayeb J, Papas TS, Lautenberger JA, Pearson ML, Petteway SR, Jr, Ivanoff L, Baumeister K, Whitehorn EA, Rafalski JA, Doran JR, Josephs SJ, Starcich B, Livak KJ, Patarca R, Haseltine WA, Ratner L: Complete nucleotide sequence of the AIDS virus HTLV-III. Nature 1985, 313:277-284.
Xiao H, Neuveut C, Tiffany HL, Benkirane M, Rich EA, Murphy PM, Jeang KT: Selective CXCR4 antagonism by Tat: implications for in vivo expansion of coreceptor use by HIV-1 2000 Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97:11466-11471.
Zagury JF, Sill A, Blattner W, Lachgar A, Le Buanec H, Richardson M, Rappaport J, Hendel H, Bizzini B, Gringeri A, Carcagno M, Criscuolo M, Burny A, Gallo RC, Zagury D: Antibodies to the HIV-1 Tat protein correlated with nonprogression to AIDS: a rationale for the use of Tat toxoid as an HIV-1 vaccine. J. Hum. Virol. 1998,1:282-292.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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