(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群：
【化１】
0005411929.tif 000030
0005411929.tif 000031
から選択される化合物又はその塩。
【請求項２】
Ｏ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質の生産方法であって、
（ａ）前記蛋白質を産生する培養液中で細胞を増殖させる段階と；
（ｂ）Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化を阻害する請求項１に記載の１種以上の化合物と培養液を接触させる段階と；
（ｃ）宿主細胞により産生された蛋白質を単離する段階を含む前記方法。
【請求項３】
（ａ）蛋白質をコードする核酸を準備する段階と；
（ｂ）核酸を細胞に導入する段階
により細胞の培養液を準備する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化を阻害する１種以上の化合物のいずれかと培養液を接触させる前に、核酸を導入した多数の細胞を得るために十分な時間にわたって培養液を増殖させる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化を阻害する１種以上の化合物のいずれかの存在下で培養液を増殖させる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
核酸を誘導性プロモーターと機能的に連結する請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化を阻害する前記１種以上の化合物とプロモーターのインデューサーとに培養液を接触させて蛋白質の発現を誘導し、前記１種以上の阻害剤とインデューサーの存在下で細胞により産生される蛋白質を単離してＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質を生産する前に、核酸を導入した多数の細胞を得るために十分な時間にわたって培養液を増殖させる請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化を阻害する前記１種以上の化合物と培養液を接触させ、Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化を阻害する前記１種以上の化合物とインデューサーの存在下で細胞により産生される蛋白質を単離してＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質を生産する前に、培養液をプロモーターのインデューサーと所定時間接触させて蛋白質の発現を誘導する請求項６に記載の方法。
【請求項９】
細胞が真菌細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
細胞が酵母細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
細胞がＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ及びＨａｎｓｅｎｕｌａから構成される群から選択される請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
細胞がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓである請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
細胞がＮ−グリカングリコフォームを主体とする糖蛋白質を産生するように遺伝子改変された酵母又は糸状菌細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
Ｎ−グリコシル化パターンがヒト様又はヒト化型である糖蛋白質を産生するように細胞が遺伝子改変されている請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
培地１リットル当たり少なくとも１００ｍｇの収率で蛋白質を生産する請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
糖蛋白質は触媒作用、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション、並びに分子認識及び会合等のヒト及び他の哺乳動物における多くの必須機能に介在する。糖蛋白質は真核生物において非サイトゾル蛋白質の大部分を構成する（Ｌｉｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｏｎ，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７）。多数の糖蛋白質が治療目的に利用されており、この二十年間に天然に存在する糖蛋白質の組換え体はバイオテクノロジー産業の主要な部分になっている。治療薬として使用されている組換えグリコシル化蛋白質の例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及びヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＨ）が挙げられる（Ｃｕｍｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １：１１５−１３０）。潜在的予防薬及び治療薬として生産された組換え蛋白質が臨床に近付くにつれ、組換え生産された糖蛋白質のグリコシル化パターンの変動は科学界で最近関心の高い話題となっている。
【０００２】
一般に、糖蛋白質オリゴ糖のグリコシル化構造はこれらを生産するために使用される細胞の宿主種により異なる。非ヒト宿主細胞で生産される治療用蛋白質はヒトに免疫原性応答を誘発し得る非ヒトグリコシル化を含む可能性が高く、例えば酵母における高マンノシル化（Ｂａｌｌｏｕ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０−４７０）；植物におけるα（１，３）−フコース及びβ（１，２）−キシロース（Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：３６５−３７２）；チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５−６２）；並びにマウスにおけるＧａｌα−１，３Ｇａｌグリコシル化（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ，１４：４７７−４７９）が報告されている。動物細胞中で蛋白質と結合した糖鎖としては、蛋白質中のアスパラギン（Ａｓｎ）残基と結合したＮ−グリコシド結合型糖鎖（別称Ｎ−グリカン；又はＮ−結合型グリコシル化）と、蛋白質中のセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基と結合したＯ−グリコシド結合型糖鎖（別称Ｏ−グリカン；又はＯ−結合型グリコシル化）が挙げられる。
【０００３】
非ヒト哺乳動物細胞により産生される糖蛋白質のオリゴ糖構造はヒト糖蛋白質のオリゴ糖構造と密接に関連する傾向があるため、大半の商業用糖蛋白質は哺乳動物細胞で生産されている。しかし、哺乳動物細胞には蛋白質産生用宿主細胞としていくつかの重大な欠点がある。コストがかかるという点以外に、哺乳動物細胞における蛋白質の生産方法では不均質なグリコフォーム集団を生じ、体積当たりの力価が低く、安定な細胞株を作製するためには持続的なウイルス閉じ込めと相当の時間が同時に必要となる。
【０００４】
蛋白質上の特定グリコフォームがその薬物動態、薬力学、受容体相互作用及び組織特異的標的特性を含む蛋白質の性質に大きな影響を与える可能性があることはよく知られている（Ｇｒａｄｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２８５−２９７）。例えば、Ｉｇの各種グリコシル化パターンは各種生物学的性質に相関することが示されている（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，１９９７，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，６５：１１１−１２８；Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２６−３２）。更に、糖蛋白質のガラクトシル化は細胞培養条件により変動し得るため、糖蛋白質組成によっては糖蛋白質上の特定ガラクトースパターンに応じて免疫原性になる場合があることも示されている（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：８３９−８４５）。しかし、どの特定グリコフォームが望ましい生物学的機能に寄与するのか分からないため、糖蛋白質上の特定グリコフォームを増加できるようにすることが非常に望ましい。グリコフォーム毎に異なる生物学性質に相関しているため、特定グリコフォームをもつ糖蛋白質の増加能を使用すれば、糖蛋白質の特定グリコフォームと特定の生物学的機能の関係を解明することができる。また、特定グリコフォームをもつ糖蛋白質を増加できるならば、特定の特異性をもつ治療用糖蛋白質を製造することも可能になる。従って、特定グリコフォームを増加した糖蛋白質組成物の製造が非常に望ましい。
【０００５】
Ｎ−結合型グリコシル化の経路は多くの分析の対象となっているが、Ｏ−結合型グリコシル化のプロセスと機能はよく分かっていない。しかし、Ｎ−結合型グリコシル化とは対照的に、Ｏ−グリコシル化はシスゴルジで生じる翻訳後イベントであることが知られている（Ｖａｒｋｉ，１９９３，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，３：９７−１３０）。Ｎ−結合型グリコシル化と同様のＯ−結合型グリコシル化のコンセンサスアクセプター配列は存在しないと思われるが、数種の糖蛋白質の多数のＯ−結合型グリコシル化部位の周囲のアミノ酸配列を比較すると、グリコシル化残基に対して−１及び＋３位のプロリン残基の頻度が高く、セリン、スレオニン及びアラニン残基が著しく増加していることが分かる（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７５：５２９−５３４）。糖蛋白質におけるセリン残基とスレオニン残基の部分もＯ−グリコシル化の潜在部位であると思われる。
【０００６】
Ｏ−結合型グリコシル化で役割を果たす１つの遺伝子ファミリーはＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：蛋白質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）をコードする遺伝子である。これらの高度に保存された遺伝子はヒト、齧歯類、昆虫等の高等真核生物と、真菌類等の下等真核生物の両者で同定されている。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ等の酵母はＰｍｔホモログをコードする７個までのＰＭＴ遺伝子をコードする（Ｗｉｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３  Ｏｃｔ；１３（５）：６２１−３０に概説）。酵母において、Ｏ−結合型グリコシル化は７個のＯ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の１個によりドリコールリン酸マンノースに由来する初期のマンノースが小胞体の新生糖蛋白質のセリン又はスレオニン残基に付加されることにより開始する。酵母にはＰｍｔホモログをコードする７個のＰＭＴ遺伝子が存在すると思われるが、酵母における分泌型真菌及び異種蛋白質のＯ−マンノシル化はヘテロダイマーとして機能すると思われるＰｍｔ１とＰｍｔ２をコードする遺伝子に主に依存する。ＰＭＴ１及びＰＭＴ２とその蛋白質産物である夫々Ｐｍｔ１及びＰｍｔ２は種間で高度に保存されていると思われる。
【０００７】
ＴａｎｎｅｒらはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＰＭＴ１及びＰＭＴ２遺伝子と、Ｏ−結合型グリコシル化の低下した組換え蛋白質が産生されるようにＰＭＴ遺伝子の１個以上を遺伝子改変した真菌細胞を使用してＯ−結合型グリコシル化の低下した組換え蛋白質を作製する方法を米国特許第５，７１４，３７７号に記載している。
【０００８】
Ｎｇらはアンチセンスもしくは同時抑圧の使用、又はＯ−結合型グリコシル化に関連する遺伝子、特にＰＭＴ遺伝子の１個以上を機能低下突然変異させた酵母宿主株の構築によるＯグリコシル化の阻害を米国特許出願公開第２００２００６８３２５号に開示している。
【０００９】
ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）は高等真核生物に認められるムチン型Ｏ−結合型グリコシル化に関与している。これらの酵素は蛋白質中の特定のセリン及びスレオニンアミノ酸のヒドロキシ基にＮ−アミノ酸ガラクトサミンを付加することによりこれらのアミノ酸のＯ−グリコシル化を開始し、その後、マンノース残基を段階的に付加することができる。ＣｌａｕｓｅｎらはＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼ）をコードする核酸ファミリーを米国特許第５，８７１，９９０号及び米国特許出願公開第２００５００２６２６６号に開示している。ＣｌａｕｓｅｎはポリペプチドＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのレクチンを選択的に阻害し、Ｏ−グリカン生合成に関与する他のグリコシルトランスフェラーゼの基質として機能させず、Ｏ−グリコシル化を阻害するために、ＧａｌＮＡｃ−β−ベンジルの使用を米国特許出願公開第２００３０１８６８５０号に開示している。
【００１０】
Ｏ−結合型グリコシル化の阻害剤が記載されている。例えば、Ｏｒｃｈａｒｄらは米国特許第７，１０５，５５４号にベンジリデンチアゾリジンジオンと、抗真菌剤（例えば抗カビ剤）としてのその使用について記載している。これらのベンジリデンチアゾリジンジオンはＰｍｔ１酵素を阻害し、Ｏ−結合型マンノ蛋白質の形成を防止し、真菌細胞壁の完全性を損なうことが報告されている。結末として、細胞膨潤を招き、最終的に破裂により死に至る。
【００１１】
Ｋｏｎｒａｄらは組織又は細胞におけるＯ−結合型蛋白質グリコシル化を薬理的に阻害することにより糖尿病を治療又は予防する方法を米国特許出願公開第２００２０１２８２３５号に開示している。この方法はＯ−結合型Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼと結合することによりＯ−結合型グリコシル化を阻害する（Ｚ）−１−［Ｎ−（３−アンモニオプロピル）−Ｎ−（ｎ−プロピル）アミノ］ジアゼニウム−１，２−ジオール酸又はその誘導体による糖尿病個体の治療に依存している。
【００１２】
Ｋｏｊｉｍａらは白血球又は腫瘍細胞によるＳＬｅｘ又はＳＬｅａの発現を阻止し、それにより内皮細胞や血小板へのこれらの細胞の接着を阻害するために、Ｏ−α−ＧａｌＮＡｃの蓄積に繋がるＯ−グリコシル化の伸長を阻害するベンジル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミン等の化合物を使用してＯ−グリコシル化を阻害するための治療用組成物を米国特許第５，２６８，３６４号に開示している。
【００１３】
Ｂｏｉｍｅらはグリコシル化部位のアミノ酸配列を改変することによりＯ−結合型グリコシル化を改変したホルモン変異体を米国特許第６，１０３，５０１号に開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，７１４，３７７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００２００６８３２５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８７１，９９０号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００５００２６２６６号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３０１８６８５０号明細書
【特許文献６】米国特許第７，１０５，５５４号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００２０１２８２３５号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２６８，３６４号明細書
【特許文献９】米国特許第６，１０３，５０１号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｌｉｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｏｎ，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：１−２７
【非特許文献２】Ｃｕｍｍｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １：１１５−１３０
【非特許文献３】Ｂａｌｌｏｕ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４４０−４７０
【非特許文献４】Ｃａｂａｎｅｓ−Ｍａｃｈｅｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，９：３６５−３７２
【非特許文献５】Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：５−６２
【非特許文献６】Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｍｍｕｎ．Ｔｏｄａｙ，１４：４７７−４７９
【非特許文献７】Ｇｒａｄｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２８５−２９７
【非特許文献８】Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ，１９９７，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，６５：１１１−１２８
【非特許文献９】Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：２６−３２
【非特許文献１０】Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２８５：８３９−８４５
【非特許文献１１】Ｖａｒｋｉ，１９９３，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．，３：９７−１３０
【非特許文献１２】Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７５：５２９−５３４
【非特許文献１３】Ｗｉｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３  Ｏｃｔ；１３（５）：６２１−３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明はＯ−結合型グリコシル化の低下した組換え蛋白質の生産に有用なＰｍｔ蛋白質の新規阻害剤に関する。この結果、真菌及び酵母細胞から産生される蛋白質のＯ−結合型グリコシル化を制御することが可能になる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
Ｏ−結合型グリコシル化量の低下した蛋白質組成物を製造するための化合物と方法について記載する。前記方法はＰｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化の所定のベンジリデンチアゾリジンジオン阻害剤の存在下で培養した細胞中で蛋白質を生産する段階を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】実施例４として示す新規阻害剤を含むＰｍｔ阻害剤がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌型組換えモノクローナル抗体のＯ−グリコシル化に及ぼす効果を示す。Ｐｍｔの化学的阻害剤はＯ−グリコシル化を用量依存的に低下させた。抗ヒトＨ＋Ｌ抗体を使用するウェスタンブロッティングを使用し、増量しながら（左側のレーン方向に高用量）Ｐｍｔ阻害剤で処理した株の増殖培地中で重鎖（Ｈｃ）と軽鎖（Ｌｃ）を検出した。移動度の最も遅いバンド（星印で示す）がＰｍｔ阻害剤処理により除去されるＯ−グリコシル化Ｈｃに相当する。
【図１Ｂ】実施例４として示す新規阻害剤を含むＰｍｔ阻害剤がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌型組換えモノクローナル抗体のＯ−グリコシル化に及ぼす効果を示す。Ｐｍｔの化学的阻害剤はＯ−グリコシル化を用量依存的に低下させた。抗ヒトＨ＋Ｌ抗体を使用するウェスタンブロッティングを使用し、増量しながら（左側のレーン方向に高用量）Ｐｍｔ阻害剤で処理した株の増殖培地中で重鎖（Ｈｃ）と軽鎖（Ｌｃ）を検出した。移動度の最も遅いバンド（星印で示す）がＰｍｔ阻害剤処理により除去されるＯ−グリコシル化Ｈｃに相当する。
【図１Ｃ】実施例４として示す新規阻害剤を含むＰｍｔ阻害剤がＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける分泌型組換えモノクローナル抗体のＯ−グリコシル化に及ぼす効果を示す。Ｐｍｔの化学的阻害剤はＯ−グリコシル化を用量依存的に低下させた。抗ヒトＨ＋Ｌ抗体を使用するウェスタンブロッティングを使用し、増量しながら（左側のレーン方向に高用量）Ｐｍｔ阻害剤で処理した株の増殖培地中で重鎖（Ｈｃ）と軽鎖（Ｌｃ）を検出した。移動度の最も遅いバンド（星印で示す）がＰｍｔ阻害剤処理により除去されるＯ−グリコシル化Ｈｃに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は特定宿主細胞中でＯ−結合型グリコシル化を受け易い蛋白質についてこの細胞型におけるＯ−結合型グリコシル化量を低下させた（Ｏ−結合型グリコシル化ゼロを含む）組換え蛋白質（ポリペプチドと糖蛋白質を含む）を発現させるための新規化合物と方法を提供する。前記方法は該当蛋白質が宿主細胞中でＯ−結合型グリコシル化を受け易い場合に、前記細胞中における蛋白質のマンノースからセリン又はスレオニン残基への転移に関与するＤｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：蛋白質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）蛋白質の１種以上の活性の阻害剤である本発明の１種以上の新規化合物の存在下に前記宿主細胞中で前記蛋白質の発現を誘導する段階を含み、場合により前記蛋白質の発現誘導時にＢｏｂｒｏｗｉｃｚらの米国出願公開第２００７０６１６３１号に記載されているような１種以上のα１，２−マンノシダーゼを併用してもよい。前記阻害剤の存在下で発現される蛋白質は前記阻害剤の不在下で産生させた場合に蛋白質上に存在するようなＯ−結合型グリコシル化量に比較してＯ−結合型グリコシル化量が低下している。前記方法は、通常ではＯ−結合型グリカンをもつ蛋白質を産生する下等真核生物（例えば酵母）や細菌等についてＯ−結合型グリカン数を低下させた宿主細胞中で蛋白質のＯ−グリコシル化量を低下させることが望ましい治療関連蛋白質を産生させる手段となるため、特に有用である。なお、本方法は下等真核生物中でＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質を発現させるのに特に適しているが、高等真核生物や細菌でも本方法を実施することができる。
【００２０】
本発明のＰｍｔ阻害剤は以下の群：
【００２１】
【化１】
0005411929.tif 000002
0005411929.tif 000003
又はその塩から選択される。
【００２２】
本明細書に記載する方法は蛋白質がＯ−結合型グリコシル化を受け易い宿主細胞中でＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質を産生させるための所定の従来技術の方法の改良である。例えば、ＴａｎｎｅｒらはＯ−結合型グリコシル化の低下した組換え蛋白質を産生するようにＰｍｔ蛋白質をコードするＰＭＴ遺伝子の１個以上を遺伝子改変した酵母細胞等の真菌細胞を使用してＯ−結合型グリコシル化の低下した組換え蛋白質を作製する方法を米国特許第５，７１４，３７７号に記載している。真菌宿主細胞でＰＭＴ１、ＰＭＴ２又はＰＭＴ４遺伝子を欠失させると、真菌宿主細胞でＯ−結合型グリコシル化の低下した組換え蛋白質の産生が可能になるが、宿主細胞増殖にはＰＭＴ遺伝子の発現が重要であり、単独でどれを欠失させても真菌宿主細胞の増殖能は悪化し、Ｏ−結合型グリコシル化量の低下した宿主細胞又は組換え蛋白質を十分な量で生産することが困難になる。ＰＭＴ２と同時にＰＭＴ１又はＰＭＴ４を欠失させると、真菌宿主細胞に致命的であると思われる。従って、宿主細胞中のＰＭＴ遺伝子の遺伝子除去はＯ−結合型グリコシル化を低下させた組換え蛋白質を生産するためには望ましくない手段であると思われる。
【００２３】
これに対して、本発明の方法で使用される宿主細胞中のＰＭＴ遺伝子は改変又は欠失されていないため、宿主細胞は細胞増殖に重要なこれらの蛋白質をＯ−グリコシル化することができ、この時点までＰｍｔ蛋白質の活性は阻害される。一般に、この結果として、ＰＭＴ遺伝子を欠失させた場合に得られるレベルよりも高レベルまで宿主細胞を増殖させることが可能になる。更に、特定態様では、宿主細胞中の組換え蛋白質の発現は誘導性プロモーターにより制御され、組換え蛋白質の発現が誘導されるまで宿主細胞中のＰｍｔ活性は阻害されない。このため、組換え蛋白質の発現誘導とＰｍｔ阻害剤の添加前に組換え蛋白質をコードする核酸を含む大量の宿主細胞を培養生産することができる。従って、１個以上のＰＭＴ遺伝子を欠失させた培養増殖不良な宿主細胞よりも短期間にＯ−結合型グリコシル化を低下させた組換え蛋白質をより大量に培養生産することが可能になる。
【００２４】
本明細書に記載するＰｍｔ阻害剤は実施例５に示すように効力が増加するため、Ｏｒｃｈａｒｄら（米国特許第７，１０５，５５４号）及びＢｏｂｒｏｗｉｃｚら（米国出願公開第２００７０６１６３１号）に従来記載されている阻害剤よりも改善されている。効力の増加により、真菌Ｏ−グリコシル化を許容可能なレベルまで低下させるために使用する阻害剤の量を減らすことができ、及び／又はＯ−グリカンを完全に除去する可能性が高まる。
【００２５】
本明細書に記載する方法は主に特定のＮ−結合型グリカン構造をもつ糖蛋白質を産生するように遺伝子改変されているだけでなく、糖蛋白質をＯ−グリコシル化する宿主細胞中におけるＯ−結合型グリコシル化の低下した糖蛋白質の産生を容易にする。主に特定のＮ−結合型グリコフォームをもつ多様な糖蛋白質の製造方法が米国特許第７，０２９，８７２号と、米国出願公開第２００５０１７０４５２号、２００５０２６０７２９号、２００４０２３００４２号、２００５０２０８６１７号、２００５０２０８６１７号、２００４０１７１８２６号、２００６０１６０１７９号、２００６００４０３５３号及び２００６０２１１０８５号に開示されている。本明細書に開示する方法を使用し、主に特定のＮ−結合型グリカン構造をもち、Ｏ−結合型グリコシル化の低下した糖蛋白質を産生させるためには、上記特許及び特許出願に記載されている宿主細胞のいずれか１種を使用することができる。主に特定のＮ−結合型グリカン構造をもつ糖蛋白質を産生するように遺伝子改変した所定の宿主細胞は改変していない宿主細胞ほど良好に特定条件下で培養増殖できないことが判明した。例えば、高マンノシル化に関与する遺伝子を欠失させ、特定の哺乳動物又はヒト様Ｎ−結合型グリカン構造を産生させるために必要な他の遺伝子を付加した特定真菌及び酵母細胞は遺伝子改変していない真菌又は酵母細胞ほど良好に増殖することができない。これらの遺伝子改変真菌又は酵母細胞では、ＰＭＴ遺伝子の欠失を更に導入すると、細胞致死性になるか、又は十分な量まで培養増殖する能力に悪影響を与える場合がある。本明細書に記載する方法は組換え糖蛋白質の発現を誘導する段階と、場合により１種以上のα１，２−マンノシダーゼと共にＰｍｔ蛋白質の活性の阻害剤を添加する段階よりも前に細胞を十分な量まで培養増殖させ、主に特定のＮ−結合型グリカン構造をもち、Ｏ−結合型グリコシル化の低下した組換え糖蛋白質を生産することにより、ＰＭＴ遺伝子を欠失させる潜在的な悪影響を回避する。
【００２６】
本明細書に記載する方法の１側面は、Ｏ−結合型グリコシル化が低下し、主に特定のＮ−結合型グリコフォームを含む糖蛋白質組成物を提供することであり、このような組換え糖蛋白質はＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞培養から生産される同一糖蛋白質の組成物に比較して生物活性の増加及び／又は望ましくない免疫原性の低下を示すことができる。Ｏ−結合型グリコシル化が低下し、主にＮ−結合型グリコフォームを含む糖蛋白質組成物を生産すると、望ましくない結果を誘導及び／又はより有効なグリコフォームを減弱する恐れのある有害又は不活性なグリコフォームと不均質混合物の生産が避けられるという利点もある。従って、例えば主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２及びＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含み、Ｏ−結合型グリコシル化の低下した糖蛋白質分子の治療用医薬組成物はより低用量で十分に有効になり、より高い効果／効力が得られると思われる。
【００２７】
一般に、Ｏ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質の生産方法は、Ｏ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質を生産することが望ましい組換え又は異種蛋白質をコードする核酸で宿主細胞を形質転換する段階を含む。組換え蛋白質をコードする核酸は組換え蛋白質の発現を可能にする調節配列と機能的に連結される。このような調節配列としては誘導性プロモーターと、場合により融合蛋白質をコードする核酸の上流ないし５’側のエンハンサーと、組換え蛋白質をコードする核酸の３’
側ないし下流の転写終結部位が挙げられる。核酸は更に一般にリボソーム結合部位をもつ５’ＵＴＲ領域と３’非翻訳領域をコードする。核酸は組換え蛋白質を発現させる細胞で複製可能なベクターの成分であることが多い。ベクターは更に形質転換細胞の認識を可能にするためのマーカーを含むことができる。他方、所定の細胞種、特に酵母は外来ベクター配列をもたない核酸で首尾よく形質転換することができる。
【００２８】
目的の組換え蛋白質をコードする核酸は数種類の起源から得ることができる。保存領域のプライマーを使用して蛋白質を発現させることが分かっている細胞株からｃＤＮＡ配列を増幅することができる（例えばＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５８１−５９６（１９９１）参照）。科学文献中の配列に基づいて核酸を新規に合成することもできる。目的の配列に対応するオーバーラップするオリゴヌクレオチドの伸長により核酸を合成することもできる（例えばＣａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３，３５３−３６０（２０００）参照）。
【００２９】
１側面では、所望時に蛋白質の発現を誘導できるように、蛋白質をコードする核酸を誘導性プロモーターと機能的に連結する。別の側面では、蛋白質をコードする核酸を構成性プロモーターと機能的に連結する。発現された蛋白質を単離し易くするために、細胞培養培地中に蛋白質を分泌させた後に単離できるようにするシグナル配列を蛋白質に付加することが一般に好ましい。第１の側面では、Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化の１種以上の阻害剤を培地に添加する前に所望量の蛋白質を産生させるために十分な所望の多重度の宿主細胞を生産するために十分な時間にわたって形質転換宿主細胞を培養する。インデューサーと阻害剤を同時に培地に添加してもよいし、１種以上のＰｍｔ阻害剤を添加する前にインデューサーを培地に添加してもよいし、インデューサーを添加する前に１種以上のＰｍｔ阻害剤を培地に添加してもよい。Ｏ−結合型グリコシル化の低下した誘導蛋白質が産生され、培地から回収することができ、あるいはシグナル配列をもたない蛋白質の場合には溶解により宿主細胞から回収することができる。蛋白質をコードする核酸を構成性プロモーターと機能的に連結する第２の側面では、１種以上のＰｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤を培地に添加すると同時に培養株を樹立し、産生されるＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質を培地から回収することができ、あるいはシグナル配列をもたない蛋白質の場合には溶解により宿主細胞から回収することができる。
【００３０】
本明細書では、Ｏ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質を生産するのために有用なＰｍｔ蛋白質の１種以上の活性を阻害する化合物又は組成物について記載する。宿主細胞が真菌や酵母等の下等真核生物である場合には、阻害剤は少なくともＰｍｔ１もしくはＰｍｔ２、又はその両方の活性を阻害することが望ましい。高等真核生物では、阻害剤はＰｍｔ１又はＰｍｔ２に対応する高等真核生物でのホモログの活性を阻害することが望ましい。
【００３１】
本発明の化合物は無傷の機能的ＰＭＴ遺伝子をもつＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株でＯ−結合型グリコシル化の低下した組換え蛋白質を生産するのに有効であることが判明した。表１と実施例５の図１から明らかなように、無傷の機能的ＰＭＴ遺伝子をもつ組換えＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの培養物に添加し、組換え蛋白質の発現時に誘導性プロモーターと機能的に連結した組換えヒト抗Ｈｅｒ２抗体蛋白質をコードする核酸で形質転換した上記４種類のＰｍｔ化学阻害剤のいずれか１種は、Ｏｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｏｒｇａｎ  ＆  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００４）１４：３９７５−３９７８）及びＥＰ１３１３４７１Ｂ１を含む同一著者による特許公開とＢｏｂｒｏｗｉｃｚらの米国出願公開第２００７０６１６３１号に記載されているＰｍｔ阻害剤であるＰｍｔｉ−３で処理したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞に認められるＯ−結合型グリコシル化レベルに対して改善された低いＯ−結合型グリコシル化レベルをもつ組換え蛋白質を生じた。
【００３２】
宿主細胞
本明細書で使用する「細胞」なる用語は以下に記載する宿主細胞を意味する。本明細書に記載する方法の宿主細胞としては高等真核細胞と下等真核細胞の両方が挙げられるが、下等真核細胞（例えば糸状菌や酵母細胞）は経済的に培養でき、蛋白質収率が高く、適宜改変すると、適切なグリコシル化パターンをもつ蛋白質を産生することができるので、一般に蛋白質の発現に好ましい。下等真核生物としては、酵母、真菌類、襟鞭毛虫類、微胞子虫類、アルベオラータ（例えば渦鞭毛虫類）、ストラメノパイル（例えば褐藻類、原生動物）、紅藻植物門（例えば紅藻類）、植物（例えば緑藻類、植物細胞、コケ）及び他の原生生物か挙げられる。酵母及び真菌類としては限定されないが、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉｅａ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種（例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種（例えばＦｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ及びＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａが挙げられる。特に酵母は遺伝学が確立しており、迅速な形質転換、試験蛋白質局在ストラテジー及び簡単な遺伝子ノックアウト技術が可能になるため、一般に好ましい。適切なベクターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他のグリコール酸酵素を含むプロモーター等の発現制御配列と、複製起点、終結配列等を必要に応じてもつ。
【００３３】
高い細胞密度まで増殖できると共に大量の組換え蛋白質を分泌できるという理由から、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ及びＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ等の各種酵母が細胞培養に一般に好ましい。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、フサリウム種、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓ等の糸状菌を使用して工業規模で組換え蛋白質を生産することもできる。
【００３４】
グリコシル化パターンがヒト様又はヒト化型である蛋白質又は糖蛋白質を発現するように、下等真核生物、特に糸状菌と酵母を遺伝子改変することができる。これはＧｅｒｎｇｒｏｓｓらにより米国特許第ＵＳ７０２９８７２号と米国特許出願公開第２００４００１８５９０号、２００５０１７０４５２号、２００５０２６０７２９号、２００４０２３００４２号、２００５０２０８６１７号、２００４０１７１８２６号、２００５０２０８６１７号、２００６０１６０１７９号、２００６００４０３５３号及び２００６０２１１０８５号に記載されているように、選択された内在グリコシル化酵素を除去すること及び／又は外来酵素を供給することにより実現することができる。従って、特定のＮ−グリカン構造の高収率生産を可能にするように１種以上の酵素又は酵素活性を発現するように宿主細胞を付加的又は代替的に操作することができる。例えば通常では酵素に関連しないシグナルペプチドにより酵素が最適活性をもつような宿主細胞内オルガネラをこのような酵素の標的とすることができる。糖ヌクレオチドトランスポーター及び／又はヌクレオチドジホスファターゼ酵素を発現するように宿主細胞を改変することもできる。トランスポーターとジホスファターゼは適切な区画にグリコシル化酵素の適切な基質を提供し、競合的生成物阻害を低減し、ヌクレオチド二リン酸の除去を促進することにより、人工グリコシル化工程の効率を改善する。例えばＧｅｒｎｇｒｏｓｓらの米国特許出願公開第２００４００１８５９０号及びＨａｍｉｌｔｏｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４−４６並びに上記米国特許及び特許出願参照。
【００３５】
例えば、低下させないと糖蛋白質のＮ−グリカンにマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を低下させると共に、３０モル％を上回るＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをもつ組換え糖蛋白質の産生を可能にするα−１，２マンノシダーゼ活性の異所性発現用核酸を更に含むように宿主細胞（例えば酵母又は真菌）を選択又は操作することができる。本明細書に記載する方法に従って宿主細胞中で糖蛋白質を産生させると、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造をもち、別の方法により細胞中で産生される糖蛋白質に比較してＯ−グリコシル化の低下した糖蛋白質が宿主細胞により産生される。別の側面では、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをもつ糖蛋白質の産生を可能にするように、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性の異所性発現用核酸を更に含むように宿主細胞を操作する。本明細書に記載する方法に従って宿主細胞中で糖蛋白質を産生させると、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造をもち、別の方法により細胞中で産生される糖蛋白質に比較してＯ−グリコシル化の低下した糖蛋白質が宿主細胞により産生される。更に別の側面では、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをもつ糖蛋白質の産生を可能にするように、マンノシダーゼＩＩ活性の異所性発現用核酸を更に含むように宿主細胞を操作する。本明細書に記載する方法に従って宿主細胞中で糖蛋白質を産生させると、主にＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造をもち、別の方法により細胞中で産生される糖蛋白質に比較してＯ−グリコシル化の低下した糖蛋白質が宿主細胞により産生される。更に別の側面では、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをもつ糖蛋白質の産生を可能にするように、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性の異所性発現用核酸を更に含むように宿主細胞を操作する。本明細書に記載する方法に従って宿主細胞中で糖蛋白質を産生させると、主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカン構造をもち、別の方法により細胞中で産生される糖蛋白質に比較してＯ−グリコシル化の低下した糖蛋白質が宿主細胞により産生される。更に他の側面では、任意組合せでＮ−結合型グリコシル化に関与し、例えばシアリルトランスフェラーゼ活性、クラスＩＩ及びＩＩＩマンノシダーゼ活性、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＩＸ活性、並びにガラクトーストランスフェラーゼ活性をコードする１種以上の高等真核生物遺伝子を更に含むことにより特定のハイブリッド又は複合Ｎ−グリカン又はヒト様Ｎ−グリカン構造を産生するように上記宿主細胞を更に操作することができる。細胞はＵＤＰ特異的ジホスファターゼ活性、ＧＤＰ特異的ジホスファターゼ活性及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃトランスポーター活性をコードする核酸の１種以上を更に含むことが一般に好ましい。
【００３６】
本明細書に教示するようなＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質及び糖蛋白質を発現させるためには植物及び植物細胞培養物を使用することができる（例えばＬａｒｒｉｃｋ  ＆  Ｆｒｙ，１９９１，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：１７２−８９；Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：８６５−７４；Ｄｕｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２８１−９３；Ｈｉａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６−８参照）。好ましい植物宿主としては、例えばアブラナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、マルバタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａ）及びジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）が挙げられる。
【００３７】
本明細書に教示するようなＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質及び糖蛋白質を産生させるためには、例えばバキュロウイルス系発現システム等の昆虫細胞培養物を使用することもできる（例えばＰｕｔｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６５１−６５４参照）。
【００３８】
本明細書に教示するようなＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質及び糖蛋白質を発現及び産生させるためには、一般に下等真核生物や原核生物ほど経済的に培養できないが、哺乳動物組織細胞培養物を使用することもできる（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）参照）。適切な宿主としては、ＣＨＯ細胞株、各種ＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくはミエローマ細胞株等、又は形質転換Ｂ細胞もしくはハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞の発現ベクターは複製起点、プロモーター、エンハンサー等の発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９−６８）と、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写ターミネーター配列等の必要なプロセシング情報部位を含むことができる。発現制御配列は免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルス等に由来するプロモーターである。一般に、発現ベクターにはｎｅｏＲ発現カセット等の選択マーカーが含まれる。
【００３９】
発現させようとする蛋白質をコードする核酸は細胞宿主の種類により異なる従来方法により宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム処理、プロトプラスト融合、自然交配、リポフェクション、バイオリスティクス法、ウイルス形質導入又はエレクトロポレーションを細胞宿主に使用することができる。植物細胞及び組織にはタングステン粒子バリスイック遺伝子導入が好ましい（一般に、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）参照）。
【００４０】
発現後、硫安沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当分野の標準手順によりＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質又は糖蛋白質を精製することができる（一般にＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）参照）。医薬用には、均質度が少なくとも約９０〜９５％の実質的に純粋な糖蛋白質が好ましく、９８〜９９％又はそれ以上の均質度が最も好ましい。必要に応じて部分的又は均質まで精製後、（体外を含む）治療又はアッセイ法、免疫蛍光染色等の開発及び実施に蛋白質を使用することができる。（一般に、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｓ．Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９７９  ａｎｄ  １９８１参照））。
【００４１】
従って、主要種としてＮ−グリカン構造を含み、Ｐｍｔ介在性Ｏ−結合型グリコシル化阻害剤又は２個以上のマンノース残基をグリカン構造から除去することが可能なα−１，２−マンノシダーゼ又はその両者の存在下でインキュベートしてしない宿主細胞で産生された糖蛋白質の組成物に比較してＯ−結合型グリコシル化の低下した糖蛋白質組成物も提供する。特定側面において、糖蛋白質組成物はＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、Ｇａｌ（ＧｌｃＮＡｃ）２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、（ＧａｌＧｌｃＮＡｃ）２Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、及びＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームから構成される群から選択される主要なＮ−グリカン構造をもつ糖蛋白質を含む。
【００４２】
医薬組成物
活性治療剤としての糖蛋白質と医薬的に許容可能な他の各種成分を含有する医薬組成物にＯ−結合型グリコシル化の低下した蛋白質及び糖蛋白質を配合することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９８０）参照）。好ましい剤形は所期投与方法と治療用途により異なる。組成物には目的の製剤に応じて動物又はヒト投与用医薬組成物を製剤化するために一般に使用される賦形剤として定義される医薬的に許容可能な非毒性キャリヤー又は希釈剤を更に添加することができる。希釈剤は組成物の生物活性に影響を与えないように選択される。このような希釈剤の例は蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液及びハンクス液である。更に、医薬組成物又は製剤には他のキャリヤー、アジュバント、又は非毒性非治療用非免疫原性安定剤等も加えることができる。
【００４３】
非経口投与用医薬組成物は無菌で実質的に等張且つパイロジェンフリーであり、ＦＤＡ又は同様の機関のＧＭＰに従って製造される。水、油類、食塩水、グリセロール又はエタノール等の滅菌液とすることができる医薬キャリヤーと共に生理的に許容可能な希釈剤に薬剤を溶解又は懸濁した注射剤として糖蛋白質を投与することができる。更に、湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質等の助剤を組成物に加えることができる。医薬組成物の他の成分は石油、動物、植物又は合成由来成分であり、例えば落花生油、大豆油及び鉱物油が挙げられる。一般に、プロピレングリコールやポリエチレングリコール等のグリコール類が特に注射溶液用の好ましい液体キャリヤーである。活性成分の持続放出を可能にするように製剤化することができるデポー注射剤やインプラント製剤として糖蛋白質を投与することもできる。一般に、組成物は液体溶液又は懸濁液としての注射剤として製造され、注射前に液体賦形剤に溶解又は懸濁するのに適した固体製剤を製造することもできる。上記のようなアジュバント効果を高めるために、製剤をポリラクチド、ポリグリコリド又はコポリマー等のリポソーム又は微粒子で乳化又はカプセル化することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，１５２７（１９９０）及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８，９７−１１９（１９９７）参照）。
【００４４】
「又はその塩」なる用語は無機又は有機塩基を含む許容可能な塩基から製造される塩を意味する。無機塩基から誘導される塩としてはアルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、三価鉄、二価鉄、リチウム、マグネシウム、三価マンガン、二価マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等の塩が挙げられる。固体形態の塩は２種類以上の結晶構造で存在してもよいし、水和物形態でもよい。塩基から誘導される塩としては第一級、第二級及び第三級アミン、置換アミン（天然置換アミンを含む）、環状アミン、並びに塩基性イオン交換樹脂（例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等）の塩が挙げられる。
【００４５】
本発明の組成物は１個以上の不斉中心を含む場合があり、従って、ラセミ体及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、ジアステレオマー混合物及び個々のジアステレオマーとして存在することができる。本発明はこれらの化合物のこのような全異性体を含むものとする。
【００４６】
本明細書に特に定義しない限り、本発明に関して使用する全科学技術用語及び術語は当業者に通常理解されている通りの意味である。更に、内容からそうでないことが必要とされる場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。一般に、本明細書に記載する生化学、酵素学、分子及び細胞生物学、微生物学、遺伝学並びに蛋白質及び核酸化学とハイブリダイゼーションに関して使用する術語とその技術は当分野で周知であり、広く使用されているものである。特に指定しない限り、本発明の方法及び技術は本明細書の随所に引用及び記載する各種一般文献及び特殊文献に記載されているような当分野で周知の慣用方法に従って一般に実施される。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２及び２００２補遺）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  Ｉ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ  ＩＩ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９７６）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）参照。
【００４７】
以下、実施例により本発明の各種Ｐｍｔ阻害剤の製造方法について記載する。
【実施例１】
【００４８】
【化２】
0005411929.tif 000004
0005411929.tif 000005
【００４９】
ステップＡ
【００５０】
【化３】
0005411929.tif 000006
【００５１】
１−１（５．９０ｇ，２５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）溶液にＮａＨ（２．０ｇ，５０ｍｍｏｌ）を少量ずつ加えた。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌した。次にＮＢＳ（４．８６ｇ，２７．５ｍｍｏｌ）を加え、１５分間撹拌した。白色固体を濾過し、濾液を濃縮して残渣を得、ＣＨＣｌ３に溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させて１−２（５ｇ，収率６３％）を得、それ以上精製せずに次段階で使用した。
【００５２】
ステップＢ
【００５３】
【化４】
0005411929.tif 000007
【００５４】
１−２（１．８ｇ，６ｍｍｏｌ）と１−３（１．３ｇ，５ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（５ｍＬ）溶液にＮａＨ（２．４ｇｇ，１０ｍｍｏｌ）を加えた後、室温で一晩撹拌した。得られた混合物を水とＥｔＯＡに分配した。有機層を合わせてブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣにより精製し、１−４（８００ｍｇ，収率４０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．６６（ｓ，１Ｈ），７．７４〜７．７１（ｍ，２Ｈ），７．４９〜７．４６（ｍ，１Ｈ），７．３７〜７．３３（ｍ，５Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝２．０２Ｈｚ，１Ｈ），６．９７〜６．９２（ｍ，３Ｈ），４．２８〜４．１９（ｍ，６Ｈ），３．１６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），１．１１（ｍ，６Ｈ）。
【００５５】
ステップＣ
【００５６】
【化５】
0005411929.tif 000008
【００５７】
ＬＡＨ（３８０ｍｇ，１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に０℃で１−４（１．３ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を希ＨＣｌ水溶液で注意深く処理した後、水とＥｔＯＡに分配した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣにより精製し、１−５（２６０ｍｇ，収率２０％）を得た。
【００５８】
ステップＤ
【００５９】
【化６】
0005411929.tif 000009
【００６０】
１−５（３００ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）の２，２−ジメトキシプロパン（１ｍＬ）溶液に触媒量のＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（〜１０ｍｇ）を加えた後、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を分取ＴＬＣにより直接精製し、１−６（１００ｍｇ，収率２８％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δｐｐｍ  ７．５２（ｄ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ，２Ｈ），７．４０〜７．１５（ｍ，５Ｈ），６．９０〜６．８５（ｍ，２Ｈ），６．８０〜６．７５（ｍ，２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），４．２３（ｍ，６Ｈ），３．０（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｔ，６Ｈ）。
【００６１】
ステップＥ
【００６２】
【化７】
0005411929.tif 000010
【００６３】
１−６（１００ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（２５ｍＬ）溶液にＭｎＯ２（１７４ｍｇ，２ｍｍｏｌ）を一度に加え、得られた混合物を約２時間加熱還流した。室温まで冷却後、混合物を濾過し、濾液を濃縮し、残渣を分取ＴＬＣにより精製し、１−７（６０ｍｇ，収率６０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δｐｐｍ  ９．５（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｍ，３Ｈ），７．２５（ｍ，６Ｈ），７．０（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｍ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．７６（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｍ，６Ｈ），３．０（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｔ，６Ｈ）。
【００６４】
ステップＦ
【００６５】
【化８】
0005411929.tif 000011
【００６６】
１−７（８０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液に６Ｎ  ＨＣｌを加え、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、粗生成物１−８（６０ｍｇ，収率８２％）を得、それ以上精製せずに次段階に供した。
【００６７】
ステップＧ
【００６８】
【化９】
0005411929.tif 000012
【００６９】
１−８（６０ｍｇ，０．１４６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液に℃でＮａＨ（２４ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を同一温度で約３０分間撹拌後、ＣＨ３Ｉ（０．２ｍＬ）を加えた。混合物を同一温度で更に１時間撹拌した。次に混合物をＨ２ＯとＥｔＯＡｃに分配した。有機層を合わせてブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。残渣を分取ＴＬＣにより精製し、１−９（４０ｍｇ，収率６３．０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δｐｐｍ  ９．６（ｓ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．０８Ｈｚ，２Ｈ），７．４３（ｍ，１Ｈ），７．３６〜７．３０（ｍ，５Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝２．０２Ｈｚ，１Ｈ），７．０（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８９（ｍ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝６．５６Ｈｚ，２Ｈ），３．９５〜３．８５（ｍ，４Ｈ），３．３０（ｓ，６Ｈ），３．１３（ｄｄ，Ｊ１＝６．２６Ｈｚ，Ｊ２＝６．２６Ｈｚ，２Ｈ）。
【００７０】
ステップＨ
【００７１】
【化１０】
0005411929.tif 000013
【００７２】
１−９（４０ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）、１−１０（１９ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）及びＮＨ４ＯＡｃ（７０ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ）をトルエン（１０ｍＬ）に加えた混合物を窒素下で約３時間加熱還流した。室温まで冷却後、得られた混合物をｐＨ＝４〜５まで希ＨＣｌ水溶液により処理した後、Ｈ２ＯとＥｔＯＡｃに分配した。有機層を合わせてブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残渣を分取ＨＰＬＣにより精製し、実施例１（３０ｍｇ，収率５０％）を黄色い固体として得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δｐｐｍ  ７．４６〜７．５３（ｍ，３Ｈ），７．３１〜７．４０（ｍ，５Ｈ），７．１５〜７．１８（ｍ，１Ｈ），６．９２〜７．０６（ｍ，４Ｈ），４．７１（ｓ，２Ｈ），４．２５〜４．３０（ｍ，２Ｈ），３．８５〜３．９４（ｍ，４Ｈ），３．２６〜３．２９（ｍ，６Ｈ），３．１０〜３．１３（ｄｄ，Ｊ＝６．２６Ｈｚ，Ｊ＝６．２６Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ  ｍ／ｚ  ６１２（Ｍ＋１）＋。
【実施例２】
【００７３】
【化１１】
0005411929.tif 000014
0005411929.tif 000015
【００７４】
ステップＡ
【００７５】
【化１２】
0005411929.tif 000016
【００７６】
化合物２−１（１５０ｍｇ，０．５８ｍｍｏｌ，１．０当量）、化合物２−２（２１４ｍｇ，０．８７ｍｍｏｌ，１．５当量）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液にＣｓ２ＣＯ３（１６１ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ，０．８５当量）を加えた。次に混合物を室温で一晩撹拌後、８０℃まで１．５時間加熱した。得られた混合物を次にＨ２ＯとＥｔＯＡｃに分配した。有機層を合わせてブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、分取ＴＬＣにより精製し、２−３（１２２ｍｇ，収率４９．４％）を得た。
【００７７】
ステップＢ
【００７８】
【化１３】
0005411929.tif 000017
【００７９】
化合物２−３（１２２ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ，１．０当量）、２−４（５７ｍｇ，０．３０ｍｍｏｌ，１．０５当量）及びＮＨ４ＯＡｃ（２２３ｍｇ．２．９０ｍｍｏｌ，１０．０当量）をトルエン（１５ｍＬ）に加えた混合物を窒素下に約３時間加熱還流した。得られた混合物を１０％塩酸で処理してｐＨ＝４〜５とした後、Ｈ２ＯとＥｔＯＡｃに分配した。有機層を合わせてブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、分取ＴＬＣにより精製し、実施例２（５２ｍｇ，収率２９．９％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．４１−７．４７（ｍ，３Ｈ），７．１９−７．３５（ｍ，１０Ｈ），６．９９−７．０７（ｍ，３Ｈ），６．８７−６．９２（ｍ，２Ｈ），６．２２（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），４．２４−４．２９（ｍ，２Ｈ），３．７２−３．１３（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ  ｍ／ｚ  ６００（Ｍ＋ｌ）＋。
【実施例３】
【００８０】
【化１４】
0005411929.tif 000018
0005411929.tif 000019
【００８１】
ステップＡ
【００８２】
【化１５】
0005411929.tif 000020
【００８３】
３−１（１ｇ，６．３７ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に−７０℃でＢｕＬｉ（３ｍＬ，７．６８ｍｍｏｌ）を滴下した後、混合物を室温で３０分間撹拌した。再び−７０℃まで冷却後、シクロヘキサンカルボアルデヒド（０．７２ｇ，６．４３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を滴下した。３０分間撹拌後、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を混合物に加え、得られた混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、３−２（１．５２ｇ，１４．３％）を粗製油状物として得た。
【００８４】
ステップＢ
【００８５】
【化１６】
0005411929.tif 000021
【００８６】
３−２（６００ｍｇ，３．１ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１５ｍＬ）に加えた混合物に０℃でＳＯＣｌ２（２ｍＬ）を滴下した。次に得られた混合物を２時間室温で撹拌した。混合物を減圧濃縮後、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥後、濃縮し、３−３（５００ｍｇ，粗生成物）を得た。
【００８７】
ステップＣ
【００８８】
【化１７】
0005411929.tif 000022
【００８９】
３−３（４５０ｍｇ，粗生成物）と３−４（３７５ｍｇ，１．４４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液にＣｓ２ＣＯ３（３９９ｍｇ，１．２２ｍｍｏｌ）を一度に加えた後、混合物を１１０℃まで１８時間加熱した。混合物をＨ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残渣をＴＬＣにより精製し、３−５（１３０ｍｇ）を油状物として得、次段階でそのまま使用した。
【００９０】
ステップＤ
【００９１】
【化１８】
0005411929.tif 000023
【００９２】
３−５（１３０ｍｇ，０．３ｍｍｏｌ）と３−６（６０ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）をトルエン（１５ｍＬ）に加えた混合物にＮＨ４ＯＡｃ（１８０ｍｇ，２．３４ｍｍｏｌ）を一度に加えた後、混合物を３．５時間加熱還流した。次に混合物を室温まで冷却し、１０％  ＨＣｌ水溶液を加えてｐＨ＝５とした。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を合わせてＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、黄色い油状物を得た。残渣を分取ＴＬＣにより精製し、実施例３（１５０ｍｇ，収率８２．４％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．６０（ｓ，１Ｈ），７．１９〜７．４９（ｍ，１１Ｈ），６．８８（ｓ，１Ｈ），６．８１（ｓ，１Ｈ），５．０５（ｓ，１Ｈ），４．６５（ｓ，２Ｈ），４．２５〜４．３９（ｍ，２Ｈ），３．１５（ｍ，２Ｈ），１．６０〜１．９８（ｍ，５Ｈ），１．００〜１．４６（ｍ，６Ｈ）。ＭＳ  ｍ／ｚ：６０７（Ｍ＋１）＋。
【実施例４】
【００９３】
【化１９】
0005411929.tif 000024
【００９４】
ステップＡ
【００９５】
【化２０】
0005411929.tif 000025
【００９６】
ナトリウム（８．５ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）を４０℃で２−メチルプロパン−１−オール（１．３ｇ，１７．５ｍｍｏｌ）に溶解した後、化合物４−１（２ｇ，１６．７ｍｍｏｌ）を５０℃で３０分間かけて滴下した。次に反応混合物を７０℃まで加熱し、一晩撹拌した。得られた混合物をＨ２ＯとＥｔＯＡｃに分配した。有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮し、４−２（１．０ｇ，粗生成物）を得、次段階でそのまま使用した。
【００９７】
ステップＢ
【００９８】
【化２１】
0005411929.tif 000026
【００９９】
４−２（１．０ｇ，粗生成物）と４−３（４００ｍｇ，１．６４ｍｍｏｌ，１．０当量）とＰＰｈ３（５１６ｍｇ，１．９６ｍｍｏｌ，１．２当量）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に０℃でＤＩＡＤ（４０６ｍｇ，１．９６ｍｍｏｌ，１．２当量）を滴下した。得られた混合物を室温で一晩撹拌後、Ｈ２ＯとＥｔＯＡｃに分配した。有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮し、分取ＴＬＣにより精製し、４（９０ｍｇ，収率１２．０％）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ９．７２（ｓ，１Ｈ），７．２８−７．４０（ｍ，９Ｈ），６．９８−７．０５（ｔ，Ｊ＝８．７８Ｈｚ，２Ｈ），６．８９−６．９２（ｄ，Ｊ＝８．２８Ｈｚ，１Ｈ），５．４２−５．４６（ｍ，１Ｈ），４．２２−４．３２（ｍ，２Ｈ），３．８６−３．９２（ｍ，１Ｈ），３．６８−３．７４（ｍ，１Ｈ），３．２４−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．１２−３．１８（ｍ，２Ｈ），１．８２−１．９０（ｍ，１Ｈ），０．８４−０．８８（ｍ，６Ｈ）。
【０１００】
ステップＣ
【０１０１】
【化２２】
0005411929.tif 000027
【０１０２】
実施例４の製造は実施例３の製造と同様である。１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．４９（ｓ，１Ｈ），７．２４−７．４０（ｍ，７Ｈ），６．９８−７．０５（ｍ，４Ｈ），６．９０−６．９１（ｍ，１Ｈ），５．３７−５．４０（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｓ，２Ｈ），４．２１−４．３２（ｍ，２Ｈ），３．８３−３．８８（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．３３−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．０９−３．１３（ｔ，Ｊ＝６．５７Ｈｚ，２Ｈ），１．７９−１．８７（ｍ，１Ｈ），０．８６−０．８８（ｍ，６Ｈ）。
【実施例５】
【０１０３】
本実施例はヒト抗Ｈｅｒ２抗体の重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードする発現ベクターで形質転換し、本明細書に記載する新規Ｐｍｔ阻害剤で処理したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓがＯ−グリコシル化の低下した糖蛋白質を産生したことを示す。
【０１０４】
発現／組込みプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８は抗Ｈｅｒ２の重鎖（Ｈｃ）及び軽鎖（Ｌｃ）をコードするメタノール誘導型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＡＯＸ１プロモーターの制御下におかれた発現カセットを含む。α−ＭＡＴプレシグナルペプチド（配列番号１及び２）のＮ末端に融合した抗Ｈｅｒ２  Ｈｃ及びＬｃをＧｅｎｅ  Ａｒｔ  ＡＧにより合成した。ユニークな５’ＥｃｏＲ１及び３’Ｆｓｅ１部位をもつように各々を合成した。抗Ｈｅｒ２  Ｈｃのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号３及び４に示す。抗Ｈｅｒ２  Ｌｃのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を夫々配列番号５及び６に示す。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＴＲＰ２標的核酸とゼオシン耐性マーカーを含み、ＡＯＸ１プロモーターとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＹＣターミネーターの制御下におかれた発現カセットを作製できる発現プラスミドベクターｐＧＬＹ２１９８に、ユニークな５’ＥｃｏＲ１及び３’Ｆｓｅ１部位を使用して、α−ＭＡＴプレシグナルペプチドに融合したＨｃ及びＬｃ蛋白質をコードする両方の核酸フラグメントを夫々別々にサブクローニングし、夫々プラスミドベクターｐＧＬＹ２９８７及びｐＧＬＹ２３３８を形成した。次にＢａｍＨＩとＮｏｔＩで消化することによりＬｃ発現カセットをプラスミドベクターｐＧＬＹ２３３８から切出し、ＢａｍＨ１とＮｏｔ１で消化しておいたプラスミドベクターｐＧＬＹ２９８７にサブクローニングし、最終発現プラスミドベクターｐＧＬＹ２９８８を作製した。
【０１０５】
抗Ｈｅｒ２発現株ｙＧＬＹ４２８０を以下のように構築した。ＴＲＰ２標的領域を切断する制限酵素Ｓｐｅ１で消化した５μｇのｐＧＬＹ２９８８を使用して株ｙＧＬＹ２２−１を形質転換した。従来記載されている方法（Ｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ  ２０：１２７９（２００３）；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １００：５０２２（２００３）；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４（２００３））を使用して株ｙＧＬＹ２２−１（ｏｃｈ１Δ：：ｌａｃＺｂｍｔ２Δ：：ｌａｃＺ／ＫｌＭＮＮ２−２／ｍｎｎ４Ｌ１Δ：：ｌａｃＺ／ＭｍＳＬＣ３５Ａ３ｐｎｏ１Δｍｎｎ４Δ：：ｌａｃＺｍｅｔ１６Δ：：ｌａｃＺ）を構築した。
【０１０６】
ｙＧＬＹ２２−１の形質転換は原則的に以下のように実施した。ＯＤが約０．２〜６になるまでＹＧＬＹ２２−１をＹＰＤ培地（酵母エキス（１％）、ペプトン（２％）、デキストロース（２％））５０ｍＬ中で一晩培養した。氷上で３０分間インキュベーション後、細胞を２５００〜３０００ｒｐｍで５分間遠心することによりペレット化した。培地を除去し、細胞を氷冷滅菌１Ｍソルビトールで３回洗浄後、氷冷滅菌１Ｍソルビトール０．５ｍｌに再懸濁した。直鎖化ＤＮＡ１０μＬ（１０ｕｇ）と細胞懸濁液１００μＬをエレクトロポレーションキュベットに加え、氷上で５分間インキュベートした。プリセットされたＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓプロトコル（２ｋＶ，２５μＦ，２００Ω）に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌでエレクトロポレーションを行った直後にＹＰＤＳ回復培地（ＹＰＤ培地＋１Ｍソルビトール）１ｍＬを加えた。形質転換細胞を室温（２６℃）で４時間〜一晩回復させた後、細胞を選択培地に撒いた。ゼオシンを加えた培地で選択後、形質転換細胞を小規模発現分析によりスクリーニングし、抗Ｈｅｒ２発現を検出した。高レベル抗Ｈｅｒ２発現に基づいて株ｙＧＬＹ４２８０を選択した。
【０１０７】
１％酵母エキス、２％ペプトン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０），１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン、及び１％グリセロールから構成される緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）を使用して振盪フラスコで２４℃にて株ｙＧＬＹ４２８０の抗Ｈｅｒ２蛋白質発現を実施した。蛋白質発現誘導培地はＢＭＧＹのグリセロールを１％メタノールに代えた緩衝メタノール複合培地（ＢＭＭＹ）とした。誘導培地添加時に１００％メタノール中のＰｍｔ阻害剤を増殖培地に終濃度０．１５ｕｇ／ｍＬまで加えた。これはＰｍｔ阻害剤で処理しない場合に観測される値の約５０％までＯ−グリコシル化を低下させるために十分な中間用量であり、従って各種阻害剤の効力の比較を可能にする。誘導培地で２４時間更に増殖後、培養液を回収し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清から細胞を除去した。
【０１０８】
Ｄｉｏｎｅｘ−ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用してＯ−グリカン測定を以下のように実施した。Ｏ−グリコシル化低下を測定するために、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２）：２１０−５（２００６））を使用して蛋白質を増殖培地から精製し、アルカリ除去（β除去）によりＯ−グリカンを蛋白質から遊離及び分離させた（Ｈａｒｖｅｙ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １８：３４９−４５１（１９９９））。この方法は更に、遊離したＯ−グリカン（オリゴマンノース又はマンノース）の新たに形成された還元末端をマンニトールに還元する。従って、各Ｏ−グリカンのユニークな指標としてマンニトール基を利用することができる。β除去にはＰＢＳ緩衝液１００μＬ容量に含まれる０．５ｎｍｏｌ以上の蛋白質が必要であった。サンプルを水素化ホウ素アルカリ試薬２５μＬで処理し、５０℃で１６時間インキュベートした。アラビトール内部標準約２０ｕＬを加えた後、氷酢酸１０μＬを加えた。次にＳＥＰＡＢＥＡＤＳとＡＧ  ５０Ｗ−Ｘ８樹脂の両方を充填したＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターでサンプルを遠心し、水洗した。洗浄液を含むサンプルをプラスチックオートサンプラーに移し、遠心蒸発器で蒸発乾涸した。１％  ＡｃＯＨ／ＭｅＯＨ  １５０μＬをサンプルに加え、サンプルを遠心蒸発器で蒸発乾涸した。この最後の段階を更に５回繰返した。水２００μＬを加え、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーとパルス式電気化学検出法を組合せたＤｉｏｎｅｘ  ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）によりサンプル１００μＬを分析した。マンニトール回収量に基づいて平均Ｏ−グリカン率を求めた。
【０１０９】
結果を表１に要約する通り、４種類の新規Ｐｍｔ阻害剤である実施例１〜４はＯｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｏｒｇａｎ  ＆  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００４）１４：３９７５−３９７８）及びＥＰ１３１３４７１Ｂ１を含む同一著者による特許公開とＢｏｂｒｏｗｉｃｚらの米国出願公開第２００７０６１６３１号に記載されているようなＰｍｔ阻害剤であるＰｍｔｉ−３で観測されるレベルよりも低レベルまでＯ−グリコシル化を低下させることが明らかである。Ｐｍｔｉ−３は以下の化学構造をもつ。
【０１１０】
【化２３】
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【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
図１は新規Ｐｍｔ阻害剤がＰｉｃｈｉａにより産生される組換え蛋白質のＯ−グリコシル化を有効に低下させることを実証する画像であり、抗Ｈｅｒ２重鎖（Ｈｃ）のＯ−グリコシル化に及ぼすＰｍｔ阻害剤の増量の効果を示す。ウェル当たりＢＭＧＹ培地０．５ｍｌを加えた９６穴ディープウェルプレート（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に株ｙＧＬＹ４２８０を接種した。激しく振盪しながら２４時間増殖後に９６ウェルプレートを２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞をペレット化した。培地を除去し、ＢＭＭＹ培地０．５ｍＬによる洗浄段階後、Ｐｍｔ阻害剤を第１行から最終行まで（１１穴）２倍ずつ希釈したＢＭＭＹ培地０．２ｍＬに細胞を再懸濁した。ウェル＃１には阻害剤５ｕｇ／ｍＬを加え、ウェル＃２には２．５ｕｇ／ｍＬを加え、以下同様にしてウェル＃１０に０．００９ｎｇ／ｍＬを加え、＃１１には阻害剤を加えなかった。激しく振盪しながら更に２４時間増殖後にプレートを２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞をペレット化し、清澄化した上清をウェスタンブロット分析し、抗Ｈｅｒ２発現を検出した。ウェスタンブロットは以下のように実施した。Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０−６８５に従って還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により上清７μＬを分離後、ニトロセルロースメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ，現Ｗｈａｔｍａｎ，Ｉｎｃ．，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）にエレクトロブロットした。ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＨｃ及びＬｃ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してウェスタンブロットで抗Ｈｅｒ２抗体鎖を検出し、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ金属増感型ＤＡＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して展開した。図１は実施例４からの新規Ｐｍｔ阻害剤（ＥＸ．４，図１Ａ）をＯｒｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．からのＰｍｔｉ−３（図１Ｂ）と対照としての不活性化合物（図１Ｃ）に対比試験したこのような分析の１例の結果を示す。図１Ａ及びＢに示すように、実施例４とＰｍｔｉ−３は０．０１８ｕｇ／ｍＬまでの低濃度で抗Ｈｅｒ２  ＨｃのＯ−グリコシル化を有効に低下させた。これに対して不活性対照化合物（図１Ｃ）はＨｃ  Ｏ−グリコシル化の低下を示さなかった。実施例１、２及び３に示す阻害剤でも同様の結果が得られた。これらの結果をまとめると、実施例１〜４に示す新規Ｐｍｔ阻害剤は真菌Ｏ−グリコシル化の有効な阻害剤であることが分かる。
【０１１３】
本明細書では例示態様について本発明を説明するが、当然のことながら本発明はこれらの態様に限定されない。本明細書の教示を受けた当業者は本発明の範囲に含まれる他の変形及び態様も認識しよう。従って、本発明は以下の特許請求の範囲のみにより限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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