(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離されたモノクローナル抗体であって、
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８８３０のハイブリドーマにより産生される１３Ｃ３と称されるモノクローナル抗体である、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離されたモノクローナル抗体であって、
ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８８３０のハイブリドーマにより産生される１３Ｃ３と称されるモノクローナル抗体のヒト化型である、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項３】
Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離されたモノクローナル抗体であって、
配列番号：１３で表されるＣＤＲ１領域、配列番号：１４で表されるＣＤＲ２領域、および配列番号：１５で表されるＣＤＲ３領域を含む可変軽鎖、並びに、配列番号：２０で表されるＣＤＲ１領域、配列番号：２１で表されるＣＤＲ２領域、および配列番号：２２で表されるＣＤＲ３領域を含む可変重鎖を含む、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項４】
ヒト化モノクローナル抗体である、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
組織または体液の試料中のβ−アミロイドペプチドのプロトフィブリルの形態の量を定量する方法であって、
（ａ）前記組織または体液の試料を、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体に接触させる段階；および、
（ｂ）前記試料中のβ−アミロイドペプチドのプロトフィブリルの形態の量を定量する段階；
を含む、方法。
【請求項６】
β−アミロイドペプチドの低分子量の形態に対して最小の親和性を示す、β−アミロイドペプチドのプロトフィブリルの形態を検出するキットであって、
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント；および、
（ｂ）前記抗体またはそのフラグメントに、直接的または間接的に結合する、試薬；
を含む、キット。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体と、製薬上許容される担体と、を含む、薬剤組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の有効量を含み、β−アミロイド線維プラークの形成および沈着を阻害し、アルツハイマー病に罹患したヒトにおけるβ−アミロイド線維プラークの沈着を治療または予防するための薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年１１月１６日に提出された、仮出願第６０／９８８，４８１号、および２００８年１月８日に提出された、第６１／０１９，７４７号の優先権を主張し、その内容は参照として組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、ヒトベータ−アミロイドペプチドから形成されるプロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用する、単離された抗体に関する。これらの抗体は、ベータ−アミロイドペプチドの低分子量の形態に対して、最小の親和性を示す、または検出可能な親和性を示さない。本明細書中に開示される抗体は、アルツハイマー病の発症および進行に関連する、ベータ−アミロイドプラークの沈着の診断、治療および／または予防に有用であろう。
【背景技術】
【０００３】
ベータ−アミロイド（Ａβ）ペプチドは、不溶性Ａβペプチド原線維（フィブリル：ｆｉｂｒｉｌ）の形成およびこれらの原線維が沈着してアミロイドプラークを形成することを通して、アルツハイマー病（「ＡＤ」）の原因となる物質であると考えられている。脳の記憶および他の認知機能に重要な領域内でのこのようなプラークの形成は、この疾患に関連する認知証を引き起こすと考えられている（Ｓｅｌｋｏｅ，１９９４，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５３：４３８−４４７を参照）。ベータ−アミロイドペプチドは、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの両方によって、それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端において、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からタンパク質分解処理された３９−４３アミノ酸長のペプチドの群を含む。これらは、少なくとも５つの、それぞれ５６３、６９５、７１４、７５１、および７７０アミノ酸長の、異なるＡＰＰのアイソフォームである（Ｗｉｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３２３を参照）。これらのＡＰＰのアイソフォームは、ＡＰＰ遺伝子の一次転写の選択的スプライシングによって生じる。多くのミスセンス変異が、常染色体優性早発性アルツハイマー病を有するファミリーにおけるＡＰＰにおいて同定されている。いくつかの変異は、セクレターゼ開裂部位の近傍でクラスターになり、他の形態に比べて、より原線維発生的であり、より速く凝集する傾向があるＡβ形態（例えば、Ａβ４２）の産生または比率の増加によってＡＰＰ代謝に影響する。神経毒性は、可溶性Ａβペプチドの不溶性の原線維（フィブリル：ｆｉｂｒｉｌ）への凝集を介して生成される高分子量の原線維に存在し、その後、原線維がアミロイドプラーク中に取り込まれる。中間体の原線維の形態は、プロトフィブリル（ＰＦ）の形態、すなわち、インビトロで可溶性であり、約〜６７０ｋＤａの実体として単離されうる、Ａβペプチドの高分子量オリゴマーの形態である。したがって、不溶性Ａβペプチド原線維のインビトロの形成は、構造的に異なる、可溶性の高分子量のプロトフィブリルの形態を形成する、Ａβペプチドの初期のオリゴマー形成の最終結果である。これらの過渡的なプロトフィブリルの構造は、アルツハイマー病（ＡＤ）および他のタンパク質凝集疾患における細胞機能障害および神経細胞欠損の原因であるアミロイド線維の前駆体である。
【０００４】
Ａβペプチドの生成を防ぐ試みにおいて、例えばＡＰＰのタンパク質分解処理を防ぐ阻害剤などの、様々な治療が進められてきた。また、抗Ａβ抗体の投与（アミロイド沈着の除去を引き起こすために）、またはＡβペプチド抗原を用いた免疫化（液性応答を促進するために）などの免疫療法戦略がプラークのサイズおよび密度を減少させる試みにおいて行なわれてきた。
【０００５】
Ｌａｎｎｆｅｌｔらによる、米国特許第７，１７９，４６３号には、Ａβペプチドのコード領域内の北極（Ａｒｃｔｉｃ）変異からなるプロトフィブリルに対する抗体の投与によるアルツハイマー病の治療方法が開示されている。明細書中に前記抗体の例示はなく、Ａβペプチドの低分子量の形態に対する親和性についての比較も示されていない。
【０００６】
Ｓｃｈｅｎｋらによる米国特許第６，７６１，８８８号および第６，７５０，３２４号には、Ａβ４２のアミノ酸配列に沿った様々なエピトープを認識する一連の抗体が開示されている。Ａβ４２のＮ−末端および中央領域に対して特異的な抗体は、生体外（エキソビボ）および生体内（インビボ）の両方でプラークを減少させる効果を示した。
【０００７】
アルツハイマー病の治療および予防の分野における現在の知識にもかかわらず、この疾患を治療および／または予防する、改善された組成物および方法の必要性が残っている。本発明の組成物および方法は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態に特異的であるが、Ａβペプチドの低分子量の形態に対して最小の検出可能な親和性を示す抗体の開示によって、これらの要求に対処し、適合する。このような抗体を含む製薬上有効な組成物は、アルツハイマー病の発症および進行に関連することが知られている、ベータ−アミロイドプラークの沈着の治療および／または予防に有用であろう。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、β−アミロイドペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープに特異的な結合を示す、単離された抗体に関する。野生型ベータ−アミロイド（Ａβ）ペプチドの単量体は当該分野で公知であり、本明細書中で配列番号：１として表す。本発明の単離された抗体は、このようなＡβペプチドのより高分子量のプロトフィブリルの形態の反復コンフォメーショナルエピトープに対して親和性を有するが、Ａβペプチドの単量体または二量体の形態のようなＡβペプチドの他の形態に対しては、最小の親和性を示す、または親和性を示さない。
【０００９】
本発明はまた、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離された抗体であって、これによって、プロトフィブリルエピトープは、Ａβペプチドの露出部分のアミノ末端部分を含む、Ａβ−プロトフィブリルの形態の露出領域によって提示される、単離された抗体に関する。
【００１０】
さらに、本発明は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離された抗体であって、これによって、プロトフィブリルエピトープは、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸１−２０（配列番号：２）を含む、Ａβ−プロトフィブリルの形態の露出領域によって提示される、単離された抗体に関する。
【００１１】
本発明はまた、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離された抗体であって、これによって、プロトフィブリルエピトープは、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸４−１２および９−２０（それぞれ、配列番号：３および４）を含む、Ａβ−プロトフィブリルの形態の露出領域によって提示される、単離された抗体に関する。
【００１２】
本発明は、一部分において、モノクローナル抗体１３Ｃ３、１Ｄ１および１９Ａ６ならびに１３Ｃ３、１Ｄ１および１９Ａ６の任意の親和性成熟型に関する。本発明はさらに、１３Ｃ３、１Ｄ１および１９Ａ６について本明細書中に記載されるような機能的特異性を模倣する抗体に関する。そのため、本発明はまた、必ずしも制限されないが、アミノ酸の置換（例えば、ＶＨまたはＶＬ領域の親和性成熟の指令された形態として）、欠失、付加、アミノ末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）およびカルボキシ末端切断などを含み、これらの変異が、１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６または１３Ｃ３様抗体結合タンパク質の同様のまたは改善された型となる、抗体または抗体結合部分の基礎を提供するような、１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６または１３Ｃ３、１Ｄ１、もしくは１９Ａ６様抗体の生物学的活性フラグメントおよび／または変異体に関する。本発明のこの部分の一実施形態において、１３Ｃ３のＶＨおよびＶＬ領域は、それぞれ、配列番号：７（ＶＨ）および／または配列番号：５（ＶＬ）で表されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
さらに、本発明は、１３Ｃ３、１Ｄ１、または１９Ａ６抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子に関し、特に、１３Ｃ３の生物学的に関連した部分、あるいは、１３Ｃ３、１Ｄ１、もしくは１９Ａ６抗体の親和性成熟型または他の変異型をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。そのため、本発明の一実施形態は、１３Ｃ３のＶＨおよびＶＬ領域（それぞれ、配列番号：８（１３Ｃ３：ＶＨ領域）および配列番号：６（１３Ｃ３：ＶＬ領域）で表される）をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子に関する。
【００１４】
本発明はまた、本明細書中に開示される単離された抗体１３Ｃ３、１Ｄ１または１９Ａ６、すなわち、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、抗体に関する。
【００１５】
本発明はまた、本発明のモノクローナル抗体を産生することができる、ハイブリドーマに関する。本発明の特定のハイブリドーマは、例示されたモノクローナル抗体１３Ｃ３、１９Ａ６および１Ｄ１をそれぞれ産生するハイブリドーマを含む。
【００１６】
本発明は、本明細書中に開示され、さらに定義される単離された抗体：Ａβのプロトフィブリルの形態の反復コンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性および特異的に結合する能力を示すが、Ａβの低分子量の形態に対して、最小の親和性を示す、または測定可能な親和性を示さない、単離された抗体：を含む、製薬上有効な組成物に関する。これらの組成物は、任意で、１以上の担体、１以上の賦形剤および／または１以上の化学的誘導体を含んでもよい。
【００１７】
本発明はまた、本明細書中に開示される単離された抗体、すなわち、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態の反復コンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定される親和性を示すが、Ａβペプチドの低分子量の形態に対して、最小の親和性を示す、または測定可能な親和性を示さない、抗体を含む製薬上有効な組成物を個人に投与する段階を含む、アルツハイマー病に罹患している個人を治療する方法に関する。これらの方法は、アルツハイマー病に罹患している個人の脳におけるアミロイド沈着の量を減少させるための治療上の介入を提供するであろう。本発明のこの部分の特定の実施形態は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープに対して、特にプロトフィブリルエピトープが、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸１−２０（配列番号：２）を含むＡβ−プロトフィブリルの形態の露出領域によって提示されることによって、特異的な親和性（少なくとも、Ａβペプチドの低分子量の形態と比較して）を示す抗体を用いて製剤化された、製薬上有効な組成物を投与する段階を含む、アルツハイマー病に罹患している個人を治療する方法に関する。本明細書中に開示された、これらの治療上および予防上の方法に関する具体的な実施形態は、例示されたマウスモノクローナル抗体１３Ｃ３、１９Ａ６、１Ｄ１に加えて、任意のこのような抗体の親和性成熟型、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒトモノクローナル抗体、および／または本明細書中で説明される抗体または特異的結合要素を含むが、これに制限されない、当該分野で公知の任意の他のこのような抗体の形態を利用することができる。本明細書中、任意のこのような抗体または特異的結合要素は、「１３Ｃ３様抗体」と称されうる。したがって、「１３Ｃ３様抗体」は、本明細書中に開示される１３Ｃ３モノクローナル抗体もまた含むことを意味している。
【００１８】
本発明はまた、アルツハイマー病に関連するフィブリル（原線維）および／または老人斑の形成の阻害剤として作用しうる化合物をスクリーニングおよび選択する方法に関する。このような方法論は、フィブリルおよび／またはプラークの形成の過程を調節する化合物を選択するための様々な抗体／ペプチド／試験化合物相互作用アッセイにおいて、１３Ｃ３様特性（例えば、ＡβペプチドのＬＭＷの形態に対するＰＦの形態の特異的な親和性）を有する抗体を用いる段階を含む。
【００１９】
さらに、本発明は、被験者または患者のプロトフィブリルの水準を特異的に決定するための診断アッセイの方法に関する。このようなアッセイは、特に制限されないが、例えば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学的アッセイ、免疫沈降法、または他の公知の免疫化学的アッセイなどの当業者に公知で適用可能な任意の技術によって実施されうる。したがって、本発明のこの部分の一実施形態は、被験者または患者からの組織試料を採取すること、および診断キットをおよび関連するアッセイを用いて試料中のＰＦＡβの水準を決定することに関する；この際、前記キットは１３Ｃ３様抗体を含み、これによって組織試料中のＰＦＡβの水準の特異的な決定が可能になる。分析のための組織試料は、典型的には、被験者または患者からの血液、血漿、血清、粘液または脳脊髄液である。
【００２０】
そのため、本発明の抗体は、少なくとも以下の用途に用いられうる：（１）単独で、または任意の可能な併用治療と併用して、アルツハイマー病に関連するプラーク沈着を防止または低減するための、予防上または治療上の薬剤として；（２）アルツハイマー病の治療に関連する予防上または治療上のワクチン戦略において、有効な抗体応答を引き出すために用いられうる、ペプチド免疫原の設計において；（３）本発明の抗体に結合する潜在エピトープを模倣する、予防上または治療上の抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）を生成するために；および、（４）プロトフィブリル形成の阻害剤のスクリーニングに用いるための、あるいは予防上および／または治療上の計画に用いるための、本発明の中和抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）から誘導されるペプチドの設計において；および、（４）ＡＤ発症のリスクを有する患者の血清またはＣＳＦ中のプロトフィブリル型Ａβの濃度を決定する診断試薬として。
【００２１】
本発明の目的は、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸１−２０（配列番号：２）を含む、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態の露出したコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、親和性を示す抗体を提供することである。
【００２２】
さらに、本発明の目的は、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸４−１２および９−２０（配列番号：３、４）を含む、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態の露出したコンフォメーショナルエピトープと相互作用し、親和性を示す抗体を提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、アルツハイマー病に関連するプラークの沈着につながる、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形成を防止または低減する、１３Ｃ３様抗体を提供することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、アルツハイマー病に関連するプラーク沈着の治療に有用であろう化合物を選択するための、抗体／ペプチド／試験化合物の相互作用アッセイにおける１３Ｃ３様抗体を用いたアッセイを提供することである。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の会合定数を意味し、「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を意味する。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、「エピトープ」または「抗原決定基」の用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位、または、分子上の部位であってこれに対して抗体が産生される、および／またはこれに抗体が結合する、部位を意味する。例えば、エピトープは、エピトープを定義する抗体によって認識されうる。エピトープは、「直線状エピトープ」（一次アミノ酸一次配列はこのエピトープ；典型的には固有の配列中に少なくとも３つの隣接するアミノ酸残基、より通常には少なくとも５、そして約８〜約１０までのアミノ酸；を含む）、または「コンフォメーショナルエピトープ」（一次の隣接するアミノ酸配列がエピトープの唯一の決定成分ではない、エピトープ）でありうる。このコンフォメーショナルエピトープはペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識するため、コンフォメーショナルエピトープは、直線状エピトープに比べて多数のアミノ酸を含みうる。例えば、タンパク質分子が折り重なって三次元構造を形成する場合、コンフォメーショナルエピトープを形成する特定のアミノ酸および／またはポリペプチド骨格は、抗体がエピトープを認識できるように並列になる。エピトープのコンフォメーションを決定する方法としては、特に制限されないが、例えば、Ｘ線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴分光法、および部位特異的スピン標識法、および電子常磁性共鳴分光法が挙げられる。例えば、その全体の開示が参照として本明細書中に組み込まれる、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、２つの実体の間の「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、少なくとも１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１または１０１０Ｍ−１の親和力（親和性、ａｆｆｉｎｉｔｙ）を意味する。
【００２８】
本明細書中で用いる場合、「プロトフィブリル（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌ）」は、曲線構造を形成する球状構造の列を表すように見える、Ａβペプチドを含む球状構造を含むプロトフィブリル型の凝集体である。
【００２９】
本明細書中で用いる場合、「単離された」の用語は、当該分野で用いられるものと同様に用いられる。すなわち、抗体／特異的結合要素、核酸分子などが見いだされる状態である。抗体／特異的結合要素および核酸分子は、それらの自然環境において、またはそれらが調製された環境（例えば、細胞培養）（このような調製が組み換えＤＮＡ技術（インビトロまたはインビボで行なわれる）による場合）において見出される、他のポリペプチドまたは核酸のような、これらと自然に会合する物質を含まない、または実質的に含まないであろう。「単離された」は、初期の環境から除去された後の、同定され、特性評価された本発明の成分を含む任意の形態を包含する。例としては、特に制限されないが、希釈剤、インビトロまたはインビボで修飾され（例えば、抗体グリコシル化）、その環境から除去された、抗体／特異的結合要素、核酸分子およびその部分を含む製剤である、薬剤製剤が挙げられる。
【００３０】
本明細書中で用いる場合、「組み換えヒト抗体」の用語は、当該分野において公知の組み換えＤＮＡ技術および非ヒトトランスジェニックの多様な手法によって生成された「抗体」の生存可能なサブセットを表す。このような方法論は、以下の由来のうち１つから抗体を生成するために用いられる：（ｉ）コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された、ｓｃＦｖまたは代替（オルタナティブ）抗体；（ｉｉ）宿主細胞、好ましくは哺乳類の宿主細胞に、安定にまたは過渡的に導入（トランスフェクト）された、それぞれの発現ベクターから生成された部分的または完全な抗体（例えば、ＡβのＰＦの形態に対して特異性を示す抗体の所定の形態の発現を促進するように、ＶＨおよびＶＬ鎖をコードするヌクレオチド配列をそれぞれＣＨおよびＣＬヌクレオチド配列とともに発現ベクターにサブクローニングする）；および／または（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリン遺伝子を含む非ヒトトランスジェニック動物から単離された、または、所望のヒト組み換え抗体を生成するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子の配列を他のＤＮＡ配列に組み換え「ミキシングおよびマッチング」することによる、他の任意の方法論による、抗体。
【００３１】
「被験者」または「患者」の用語は、脊索動物門の任意の一員を含むことを意味し、特に制限されないが、ヒトならびにチンパンジーおよび他のサル種などのヒト以外の霊長類を含む、他の霊長類；牛、羊、豚、ヤギ、および馬などの家畜；犬および猫などの飼育哺乳動物；マウス、ラットなどのげっ歯類、およびモルモットなどの実験動物；ニワトリ、シチメンチョウなどの家禽、野鳥および狩猟鳥、および他のキジ類の鳥であるアヒル、ガチョウなどの、鳥類が挙げられる。
【００３２】
疾患を「治療する」または「治療」の用語は、疾患の徴候および症状を緩和するために１以上の薬剤を被験者（ヒトまたはその他）に投与することを含みうる、プロトコルを実行することを意味する。緩和は、疾患の徴候または症状が現れる前、およびこれらが現れた後に起こりうる。したがって、「治療する」または「治療」は、疾患を「予防する」または「予防」を含む。アルツハイマー病の場合、「予防する」または「予防」は、アルツハイマー病に関連する症状の発症を防ぐ、または遅らせるために、治療のコースが先になる状況においてもまた、起こりうる。加えて、「治療する」または「治療」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、そして具体的には被験者に限界的なプラスの効果しかないプロトコルを含む。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「活性成分」の用語は、ベータ−アミロイドのプロトフィブリル構造のアミノ末端部分に親和性および特異性（例えば、特異的結合）を示す、１３Ｃ３様抗体を意味する。
【００３４】
本明細書中で用いる場合、抗体の「有効量」または「製薬上有効な量」の用語は、本明細書中で用いる場合、所望の生物学的結果を提供するための、無毒であるが十分な活性成分の量を意味する。任意の個々の場合における適当な「有効」量は、当業者によって慣用の実験方法を用いて決定されうる。
【００３５】
本明細書中で用いる場合、「製薬上許容される」または「薬理的に許容される」の用語は、物質が、何らの望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、それが含まれる組成物（例えば、「製薬上許容される組成物」）のいかなる成分とも有害な相互作用をすることなく、製剤化された生理学的薬剤とともに、薬剤運搬デバイスにおいて、個人に投与されうることを意味する。
【００３６】
本明細書中で用いる場合、互換的に使用されうる「薬理的に許容される担体」および「製薬上許容される担体」の表現は、生物体に有意な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性および特性を損なわない、担体、希釈剤および賦形剤を意味する。アジュバントはこれらの表現の下に含まれる。
【００３７】
本明細書中で用いる場合、「賦形剤」の用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために薬剤組成物に添加される不活性な物質を意味する。
【００３８】
「最小の親和性」の用語は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態に対する抗体の親和性（親和力）の、原線維（フィブリル）、シート構造、および低分子量オリゴマーおよび単量体などのＡβペプチドの他の形態に対する抗体の親和性（親和力）との比較において用いられ、プロトフィブリル型のＡβの形態に対する親和力の、他のＡβの形態に対する親和力に対する比が、約２よりも大きいことを示す。好ましくは、前記比は、約３、または約４、または約５よりも大きい。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、プロトフィブリルオリゴマーの形成を含む、Ａβ原線維発生の過程を示す。
【図２】図２Ａ−Ｂは、溶離体積についてｍＡＵ２１５での吸光度（２１５ｎｍでの吸光度）で示されるように、時間０（Ａ）および４時間（Ｂ）でのＡβ原線維発生およびＡβ形態の精製の過程を示す。４時間（Ｂ）で、低分子量（ＬＭＷ）の形態は、〜１５ｋＤａの二量体として溶離するが、プロトフィブリルの形態のサイズは、〜６７０ｋＤａで溶離する。
【図３】図３Ａ−Ｂは、ＡβのＰＦおよびＬＭＷの形態の両方の濃度の増加に対する、４５０／６５０ｎｍで読み取った光学濃度（ＯＤ）によって示されるように、Ａβのプロトフィブリル（ＰＦ：−◆−）および低分子量（ＬＭＷ：−■−）の形態に対するモノクローナル抗体１３Ｃ３（Ａ）および４Ｇ８（Ｂ）の特異性を示す。
【図４】図４Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体４Ｇ８（Ａ）、１３Ｃ３（Ｂ）およびコントロールＩｇＧ１（Ｃ）の、０．２５μｇ／ｍｌ  ＬＭＷＡβ〜４．０μｇ／ｍｌ  ＬＭＷＡβの異なる濃度のＡβの低分子量（ＬＭＷ）の形態に対する親和性を示す、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）結合アッセイのデータを示す。
【図５】図５Ａ−Ｂは、上述の抗Ａβ抗体によって認識されたエピトープを同定するデータを示す。図５Ａは、実施例５に記載されるように、モノクローナル抗体１３Ｃ３（上のパネル）、１Ｄ１（中央のパネル）および４Ｇ８（下のパネル）の、一連のオーバーラップする１３のアミノ酸ペプチドに対するウエスタンドットブロットを表す。図５Ｂは、アミノ酸配列Ａβ１−４２（配列番号：１）を、モノクローナル抗体１３Ｃ３および１Ｄ１の予測されるエピトープとともに表す。
【図６】図６は、モノクローナル抗体１３Ｃ３（−■−）および４Ｇ８（−◆−）の、Ａβオリゴマーを分泌する７ＰＡ２の上清からのＳＥＣフラクションとの反応性を示す。プロトフィブリル（ＰＦ）および低分子量（ＬＭＷ）のフラクションは、４５０／６５０で読み取った光学濃度（ＯＤ）によって測定された値としてｘ軸に示される。
【図７】図７Ａ−Ｃは、Ａβフィブリル上の反復構造に対するモノクローナル抗体１３Ｃ３の親和性を示す、薄片免疫電子顕微鏡の顕微鏡写真（Ｂ、Ｃ）を示す。コントロール免疫−ＥＭはＩｇＧ１（Ａ）である。
【図８】図８Ａ−Ｂは、代表的なＴｇＣＲＮＤ８トランスジェニックマウスにおけるコントロールＩｇＧ１（Ａ）抗体の投与後のプラークの数の減少を、１３Ｃ３モノクローナル抗体（Ｂ）の投与と比較して示す、電子顕微鏡写真のデータを示す。
【図９】図９Ａ−Ｂは、ＴｇＣＲＮＤトランスジェニックマウスの、１３Ｃ３モノクローナル抗体を用いた週１回（Ａ）または週２回（Ｂ）の計画の治療は、老人斑の形成の減少をもたらすことを示す。
【図１０】図１０は、ｍＡｂ１３Ｃ３のクローニングされた軽および重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、ＡＰＰトランスジェニックマウスにおける１３Ｃ３の急性末梢投与は、参照抗体３Ｄ６の投与と異なって、血漿Ａβの増加をもたらさないことを示す。
【図１２】図１２は、１３Ｃ３はＡＤの脳においてヒトアミロイド神経炎プラーク（凝集した）を認識するが、参照３Ｄ６抗Ａβ抗体と異なってＡβ沈着を拡散させないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、アルツハイマー病（ＡＤ）の発病に重要な役割を担う。β−およびγ−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解処理は、通常３９〜４３アミノ酸長のＡβペプチド（Ａβ）を生成する。アルツハイマー病の発症は、脳におけるＡβのオリゴマーの、または凝集した形態の蓄積によって特徴づけられる。本発明の免疫学的組成物は、アルツハイマー病の治療または予防に、診断アッセイにおける試薬としての使用に、加えて、アミロイド沈着の低分子阻害剤の設計に、有用である。本発明の１３Ｃ３様抗体は、哺乳類、特にヒトの一般集団に、前記疾患の発症を除去、低減、または遅延させるのに十分な量および／または投与量計画で、意図された製薬上許容される製剤で、予防的に投与されうる。予防上の治療の方法は、アルツハイマー病の遺伝子的または家族性リスクを有することがわかっている個人に、特に必要である。アルツハイマー病のリスクの多数の遺伝子マーカーが同定されており、特に制限されないが、一例として、ＡＰＰ変異（例えば、Ｉｎｄｉａｎ変異（Ｖａｌ７１７Ｐｈｅ）、Ｓｗｅｄｉｓｈ変異（Ｌｙｓ６７０Ａｓｎ、Ｍｅｔ６７１Ｌｅｕ）、Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ変異（Ａｌａ６９２Ｇｌｙ）、Ｄｕｔｃｈ変異（Ｇｌｕ６９３Ｇｌｎ）、Ｉｒａｎｉａｎ変異（Ｔｈｒ７１４Ａｌａ）、Ｇｅｒｍａｎ変異（Ｖａｌ７１５Ａｌａ）およびＦｌｏｒｉｄａ変異（Ｉｌｅ７１６Ｖａｌ）が挙げられる。アルツハイマー病のリスクの増大を示しうるさらなる変異としては、プレセニリン遺伝子（ＰＳｌおよびＰＳ２）およびＡｐｏＥ４における変異が挙げられる。本発明はまた、現在痴呆の特徴からアルツハイマー病に罹患していると認識できる、特に上記のリスク因子の存在下でまたはすでにこのような疾患に罹患している個人のための、アルツハイマー病の症状および合併症を治癒する、または少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で１３Ｃ３様抗体を含む、製薬上許容される組成物を介した、治療上の介入に関する。本明細書中で意図する予防上のまたは治療を含む治療方法は、早発性または遅発性アルツハイマー病の対処に用いられうる。アルツハイマー病の発症におけるＡβのオリゴマーの形態の重要性の観点から、本発明は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態の反復コンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定された親和性を示す、単離された抗体に関する。野生型Ａβペプチド（Ａβ４２；４２アミノ酸形態）の単量体は、当該分野で公知であり、本明細書中で配列番号：１と表す。
【００４１】
【化１】
0005616230.tif 000002
【００４２】
本発明の単離された抗体は、Ａβペプチドの、より高分子量のオリゴマーのプロトフィブリルの形態の反復コンフォメーショナルエピトープに対して親和性を示すが、Ａβペプチドの低分子量の単量体および二量体などの他の形態に対して最小の親和性を示すであろう。
【００４３】
本発明はまた、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離された抗体であって、これによって、プロトフィブリルエピトープは、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸末端部分を含むＡβ−プロトフィブリルの形態の露出領域によって提示される、単離された抗体に関する。
【００４４】
さらに、本発明は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示す、単離された抗体であって、これによって、プロトフィブリルエピトープは、以下のように、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸１−２０（配列番号：２）を含む、Ａβ−プロトフィブリルの形態の露出領域によって提示される、単離された抗体に関する。
【００４５】
【化２】
0005616230.tif 000003
【００４６】
本明細書中に例示されるように、Ａβペプチドのプロトフィブリル（ＰＦ）の形態に対して特異的親和性を特異的に示すが、Ａβペプチドの低分子量種に対して最小の親和性を示すマウスモノクローナル抗体が同定された。Ａβの二量体の形態（〜１５ｋＤａ）は、時間とともに重合して、約６７０ｋＤａの分子量を有するＡβの可溶性のＰＦの形態を形成する。マウスは、このより高分子量のＰＦＡβで免疫化された。モノクローナル抗体は、Ａβペプチドの高分子量ＰＦの形態に対して特異性を有し、Ａβの低分子量の形態に最小の結合能を示す、または結合能を示さないようにスクリーニングされた。本発明のこの部分は、Ａβペプチドの〜６７０ｋＤａの高分子量プロトフィブリルの形態（すなわち、１３Ｃ３、１Ｄ１および１９Ａ６）に対する、１３Ｃ３系列のモノクローナル抗体のスクリーニング、単離、および特性評価によって実証される。この系列のモノクローナル抗体は、インビトロで目的の特異性を示す一方、トランスジェニックマウスアルツハイマー病モデルにおける、アルツハイマー病に関連するプラークの形成をも減少させる。したがって、本発明の具体的な実施形態において、単離された抗体は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用し、これに対して測定可能な親和性を示し、これによって、プロトフィブリルエピトープは、Ａβペプチドの露出部分のアミノ酸４−１２（配列番号：３）および９−２０（配列番号：４）を含む、Ａβ−プロトフィブリルの形態の露出領域によって提示される。
【００４７】
【化３】
0005616230.tif 000004
【００４８】
本発明の一実施形態は、１３Ｃ３について開示されたように、ＡβペプチドのＬＭＷの形態に対してＰＦへの１３Ｃ３様特異性を付与するために、ＶＨ（配列番号：７）および／またはＶＬ（配列番号：５）領域を含む抗体に関する。さらなる実施形態は、ＡβペプチドのＬＭＷの形態よりもＰＦの形態に対して特異性を示す、１３Ｃ３様抗体またはその生物学的に関連したフラグメントである。したがって、本発明はまた、１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６または１３Ｃ３様抗体の生物学的活性フラグメントおよび／または変異体；特に制限されないが、アミノ酸の置換（例えば、ＶＨまたはＶＬ領域の親和性成熟の指向された形態として）、欠失、付加、アミノ末端切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）およびカルボキシ末端切断など、これらの変異が、１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６または１３Ｃ３様抗体結合タンパク質と同様の、または改善された型となる、抗体または抗体結合部分の基礎を提供するようなものが挙げられる；に関する。本明細書中に言及したように、本発明のこの部分の一実施形態は、それぞれ配列番号：７および／または配列番号：５で表されるアミノ酸配列を含む、このような抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域に関する。本発明は、同一の抗体またはその部分を発現する異なるＤＮＡ分子を与えうる、コドン重複の存在に言及する（例えば、ＩｇＧの同一のｓｃＦｖあるいはＶＨおよび／またはＶＬ部分をコードする代替核酸分子）。本明細書の目的のためには、１以上の置換されたコドンを有する配列は、縮重変異（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）として定義されるであろう。配列変異の他の原因は、ＲＮＡエディティングを通して起こりうる。このようなＲＮＡエディティングは、オープンリーディングフレームにおける変化が、発現されたタンパク質のアミノ酸残基の変化をもたらさない、他の形態のコドン重複をもたらしうる。発現された抗体の最終的な物理的特性を改善する、ＤＮＡ配列または翻訳された抗体における変異もまた、本発明の技術的範囲に含まれる。そのため、本発明は、（ｉ）１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６または任意の他のこのような１３Ｃ３様抗体の親和性成熟型、および／または（ｉｉ）１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６または任意の他のこのような１３Ｃ３様抗体の変異型；特に制限されないが、公知の親和性成熟法および部位特異的変異を導入するための公知の組み換えＤＮＡ技術を通して生成された、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域における１以上の変異を含む；に関する。したがって、本発明の単離された抗体は、Ａβペプチドのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に相互作用する抗体である。本発明の単離された抗体は、このようなＡβペプチドのより高分子量のプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープに対して親和性を示すが、原線維（フィブリル）、シート構造、ならびに低分子量オリゴマーおよび単量体などのＡβペプチドの他の形態に対しては最小の親和性を示すであろう。
【００４９】
本発明はまた、単離されたモノクローナル抗体１３Ｃ３に関する。本発明のこの部分はまた、モノクローナル抗体１３Ｃ３を産生するハイブリドーマに関する。モノクローナル抗体１３Ｃ３を産生するハイブリドーマは、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−８８３０から入手可能である。
【００５０】
本発明はまた、単離されたモノクローナル抗体１Ｄ１に関する。本発明のこの部分はまた、モノクローナル抗体１Ｄ１を産生するハイブリドーマに関する。
【００５１】
本発明はまた、単離されたモノクローナル抗体１９Ａ６に関する。本発明のこの部分はまた、モノクローナル抗体１９Ａ６を産生するハイブリドーマに関する。
【００５２】
本発明はまた、アルツハイマー病に関連するフィブリルおよび／または老人斑の形成の阻害剤として作用しうる化合物を選択するためのスクリーニングの方法に関する。このような方法論は、フィブリルおよび／またはプラークの形成の過程を調節する化合物を選択するために、多様な抗体／ペプチド／試験化合物相互作用アッセイにおいて、ＡβペプチドのＰＦの形態に対して１３Ｃ３様の親和性を有する抗体を用いることを含む。前記化合物は、非タンパク質様有機または無機分子、ペプチド（例えば、潜在的な予防上または治療上のペプチドワクチンとして）、タンパク質、ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）またはＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）でありうる。ＡβペプチドのＰＦの形態への結合に関して、１３Ｃ３様抗体と効果的に競合する任意のこのようなペプチドまたは小さな分子は、アルツハイマー病の予防上または治療上の治療に関する可能なリード化合物を与えることが、本明細書の開示および教示の検討によって明らかになるであろう。そのため、相互作用アッセイが、ＡβペプチドのＰＦの形態の１３Ｃ３エピトープを占有またはこれと相互作用し、抗体を置き換える化合物を同定するための高スループットスクリーニングの目的で用いられうる。
【００５３】
アルツハイマー病の予防上または治療上の治療に有用な化合物（例えば、小さな無機分子またはペプチドワクチン候補）のスクリーニングにおいて不可欠な試薬として本発明の１３Ｃ３様抗体を組み込み、これに依存する、当該分野で公知の、多様な抗体／抗原を用いたアッセイ；特に制限されないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット分析、検出可能な生物学的相互作用に依存し、分離または洗浄の段階を必要としない、任意の均質アッセイ（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを参照）および／またはＳＰＲを用いた技術（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅを参照）；が用いられうる。１３Ｃ３様抗体の使用を通して同定された、化合物および／またはペプチドワクチン候補は、多様なアッセイによって検出されうる。前記アッセイは、既知の抗体／抗原複合体を形成する能力の変化の有無を決定するための簡単な「イエス／ノー」アッセイであってもよく、ＥＬＩＳＡを用いたアッセイ、均質アッセイ、またはＳＰＲを用いたアッセイなどのアッセイを用いることによって、定量的な性質で行なわれてもよい。そのため、本発明は、使用される既知の方法論にかかわらず、ＡβペプチドのＰＦの形態の１３Ｃ３エピトープのアミノ末端部分の適当なペプチドまたはタンパク質模倣に対して、試験化合物の１３Ｃ３様抗体と競合する能力を測定する、任意のこのようなアッセイに関する。
【００５４】
本明細書中に記載される抗体は、組織試料中のＡβプロトフィブリルの形態の存在を決定するための多数の異なるイムノアッセイにおける基本的な試薬として用いられうる。一般に、前記抗体は、定性的または定量的にかかわらず任意の型のイムノアッセイに採用されうる。これは、二部位サンドイッチアッセイおよび非競合型単一部位イムノアッセイの両方に加えて、通常の競合結合アッセイを含む。興味深い一実施形態は、検出の容易性およびその定量的な性質から、多数の変形が存在し、そのすべてが本発明のこの部分に包含されることを意図する、サンドイッチアッセイまたは二抗体アッセイである。例えば、典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいては、未標識抗体を、例えばマイクロタイタープレートウェルなどの固体基板に固定化し、試験される試料を結合された分子に接触させる。適当なインキュベーション時間、抗体−抗原二元複合体の形成に十分な時間の後、次に、検出可能な信号を誘導しうるレポーター分子で標識された二次抗体が添加され、異なる部位で抗原と結合し、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体を形成するのに十分な時間、インキュベーションが継続される。任意の未反応原料が洗浄によって除去され、抗原の存在が、既知の量の抗原を含むコントロール試料との比較によって定量されうる、信号の観察によって決定される。フォワードサンドイッチアッセイの変形としては、試料および抗体の両方が同時に結合された抗体に添加される同時アッセイ、または、標識された抗体および試験される試料がはじめに合わされ、インキュベートされて、未標識表面結合抗体に添加される、逆サンドイッチアッセイが挙げられる。これらの技術は当業者に公知であり、部分的な変形の可能性は明らかであろう。本明細書中で用いる場合、「サンドイッチアッセイ」は、基本的な二部位法のすべての変形を包含することを意図している。
【００５５】
本発明のサンドイッチアッセイのための唯一の制限因子は、両方の抗体が、Ａβプロトフィブリルの形態に対して異なる結合特異性を有することである。したがって、多数の可能な組み合わせが可能である。より具体的な例として、典型的なフォワードサンドイッチアッセイにおいては、一次抗体は、共有結合で、または受動的に、固体支持体に結合される。固体表面は、通常ガラスまたはポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンである。前記固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、もしくはマイクロプレートの形態、またはイムノアッセイを行なうのに適した任意の他の表面でありうる。結合工程は、当技術分野で周知である。結合の後、固相−抗体複合体を、試験試料に備えて洗浄する。次いで、Ａβプロトフィブリルの形態を含む試験される体液のアリコートを固相複合体に添加し、存在する任意のＡβプロトフィブリルの形態のタンパク質がＡβプロトフィブリルの形態に特異的な抗体に結合するのに十分な時間、２５℃でインキュベートする。次いで、二次抗体を固相複合体に添加し、二次抗体が一次抗体−抗原固相複合体に結合するのに十分なさらなる時間、２５℃でインキュベートする。二次抗体は、レポーター分子に結合し、その可視信号は、試料中の任意の抗原への二次抗体の結合を示すために用いられる。本明細書中で用いる場合、「レポーター分子」は、その化学的な性質から、抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に検出可能な信号を提供する分子を意味する。検出は、試料中の抗原の量を決定できるように、少なくとも相対的に定量可能でなければならない；これは、絶対値で計算されうる、または、既知の通常の水準の抗原を含む標準（または一連の標準）との比較によって行なわれうる。
【００５６】
このタイプのアッセイにおいて最もよく用いられるレポーター分子は、酵素または蛍光発色団である。酵素イムノアッセイの場合、酵素は、しばしばグルタールアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩によって、二次抗体に結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）される。しかしながら、容易に理解されるように、当業者に公知の広範囲の異なる結合技術が存在する。一般的に用いられる酵素としては、中でも、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。特異的酵素とともに用いる基質は、一般に、対応する酵素によって加水分解すると検出可能な色の変化を生じるように選択される。例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、アルカリ性ホスファターゼ結合体との使用に適しており、ペルオキシダーゼ結合体には、１，２−フェニレンジアミンまたはトルイジンが一般的に用いられる。また、上記の発色性基質に代えて、蛍光生成物を与える蛍光発生基質を用いることもできる。すべての場合において、酵素標識抗体を、一次抗体−Ａβプロトフィブリルタンパク質複合体に添加し、複合体に結合させ、次いで過剰の試薬を洗浄して除く。その後、適当な基質を含む溶液を抗体−抗原−標識抗体の三次複合体に添加する。基質は二次抗体に結合した酵素と反応して定性的な視覚的信号を与え、これは、通常分光光度法によりさらに定量され、血清試料中に存在する抗体の量の評価を与える。
【００５７】
さらに、フルオレセインまたはローダミンのような蛍光性化合物を、抗体の結合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させることができる。特定の波長の光の照射によって活性化されると、蛍光発色団標識抗体は、光エネルギーを吸収して分子の励起状態を誘起し、その後、より長波長の特性の光を放出する。発光は、光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色として現れる。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）の場合と同様、蛍光標識抗体を一次抗体−Ａβプロトフィブリルの形態のタンパク質複合体に結合させる。結合していない試薬を洗浄した後、次いで残存する三元複合体が適当な波長の光に露光され、観察された蛍光が抗原の存在を示す。免疫蛍光法およびＥＩＡ法は、いずれも十分に確立されており、本発明の方法に特に好ましい。しかしながら、放射性同位体、化学発光または生物発光分子などの他のレポーター分子もまた用いられうる。当業者であれば所望の用途に適するように手順を変更する方法は明らかであろう。
【００５８】
他の実施形態においては、試験される試料（例えば、Ａβプロトフィブリルの形態を含む、ヒトの血液または髄液）は、共有結合または非共有結合によって固体基板に接着されて、単一部位イムノアッセイに用いられうる。未標識抗Ａβプロトフィブリルタンパク質抗体を、固体基板に結合した試料に接触させる。適当な時間、抗体−抗原二元複合体を形成させるのに十分な時間のインキュベーションの後、次いで、検出可能な信号を誘導可能なレポーター分子で標識された二次抗体を添加し、抗原−抗体−標識抗体の三元複合体を形成するのに十分な時間、インキュベーションを継続する。単一部位イムノアッセイの場合、二次抗体は、対象のＡβプロトフィブリルタンパク質の形態に特異的な抗体に結合することができる、一般的な抗体（すなわち、免疫グロブリンに対するｚｅｎｏｇｅｎｅｉｃ抗体、特に、レポーター分子に結合した抗（ＩｇＭおよびＩｇＧ））でありうる。
【００５９】
１３Ｃ３様抗体は、公知の多数の形態のうちの一つが用いられうる。抗体は、関連する抗体フラグメント、抗体結合部分、特異的結合要素、非タンパク質合成模倣、または、結合特異性／中和活性を少なくとも実質的に有する実体を意味する当該分野で公知の任意の他の関連する用語の、任意のタイプの形態をとりうる。したがって、「抗体」の用語は、本明細書のすべての文脈で用いられる場合、特に制限されないが、任意の特異的結合要素、免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭ）；ならびにその生物学的に関連したフラグメントまたは特異的結合要素（特に制限されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ（一本鎖または関連する実体）など）を意味する。したがって、「抗体」が、ジスルフィド結合によって互いに結合した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質またはその抗原結合部分を意味することは、当業者に公知であり、概説としてのみ含まれる。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。重鎖および軽鎖の双方の可変領域は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。４つのＦＷＲ領域は、相対的に逆であるが、ＣＤＲ領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、超可変領域を提示し、以下のように、ＮＨ２末端からＣＯＯＨ末端へ配置される：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含むが、アイソタイプに依存して、定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介しうる。すなわち、「抗体」の実用的定義には、トランスジェニック非ヒト動物から生成されたヒト抗体としてのキメラ抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体に加えて、当業者に適用可能な多くの技術を用いてライブラリから選択された抗体もまた含まれる。抗体フラグメントは、以下に概説するように、当業者にとって公知であり適用可能な技術を用いて得られる。したがって、「抗体」は、本明細書中に記載されるように、Ａβのプロトフィブリルの形態のコンフォメーショナルエピトープと特異的に結合する、任意のこのような実体または特異的結合要素である。したがって、「抗体」の用語は、天然のまたは部分的にもしくは全体的に合成によって製造された免疫グロブリン；抗体結合ドメインである、または抗体結合ドメインと実質的にホモログである結合ドメインを有する、任意のポリペプチドまたはタンパク質を記述する。これらは、天然源から誘導されてもよく、部分的にまたは全体的に合成によって製造されてもよい。抗体の例としては、特に制限されないが、免疫グロブリンのアイソタイプおよびそのアイソタイプのサブクラス；Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄおよび二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）などの抗原結合ドメインを含むフラグメント；などが挙げられる。モノクローナル抗体および他の抗体を操作し組み換えＤＮＡ技術を用いて、本来の抗体���特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を製造することが可能であることは当該分野で公知である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡの、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域への導入を展開させる。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、産生された抗体の結合特異性を変えうる、もしくは変えない遺伝子変異または他の変化を受けてもよい。抗体は多様に修飾されてもよく、「抗体」の用語は、要求される特異性を有する結合ドメインを有する、任意の特異的結合要素または物質を包含するものとして解釈されなければならない。したがって、この用語は、天然のものであっても全体的もしくは部分的に合成されたものであっても、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む「抗体」の、抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物、およびホモログを包含する。このような実体は、抗体の「抗原結合部分」または「特異的結合要素」の用語に包含される結合フラグメントであってよく、特に制限されないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる一価のフラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインを含むｄＡｂフラグメント；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；（ｖｉｉ）ＶＨおよびＶＬに加えてＣＬまたはＣＨを含む抗体フラグメントである、「ｓｃＡｂ」；および、（ｖｉｉｉ）特に制限されないが、フィブロネクチンＩＩＩ型ポリペプチド抗体（例えば、Ｋｏｉｄｅによる２００４年３月９日に発行された米国特許第６，７０３，１９９号およびＰＣＴ国際出願公開ＷＯ  ０２／３２９２５を参照）などの、足場タンパク質に基づく人工抗体が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組み換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する単一のタンパク質鎖とすることができる合成リンカーによって結合されうる。
【００６０】
一実施形態において、本発明の単離された１３Ｃ３または１３Ｃ３様抗体の可変軽（ＶＬ）領域は、３３９塩基対のヌクレオチド配列（配列番号：６）によってコードされた、１１３アミノ酸のペプチド配列（配列番号：５）を含みうる。
【００６１】
【化４】
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【００６２】
さらなる実施形態において、本発明の単離された１３Ｃ３または１３Ｃ３様抗体の可変重（ＶＨ）領域は、３４５塩基対のヌクレオチド配列（配列番号：８）によってコードされた、１１５アミノ酸のペプチド配列（配列番号：７）を含みうる。
【００６３】
【化５】
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【００６４】
さらなる実施形態において、ＶＬ鎖のフレームワーク領域であるＦＷＲｌ、ＦＷＲ２、ＦＷＲ３およびＦＷＲ４は、下記のように、それぞれ配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２で表されるアミノ酸から構成されうる。
【００６５】
【化６】
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【００６６】
さらなる実施形態において、ＶＬ鎖の相補性決定領域であるＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、下記のように、それぞれ配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５で表されるアミノ酸から構成されうる。
【００６７】
【化７】
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【００６８】
さらなる実施形態において、ＶＨ鎖のフレームワーク領域であるＦＷＲｌ、ＦＷＲ２、ＦＷＲ３およびＦＷＲ４は、下記のように、それぞれ配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８および配列番号：１９で表されるアミノ酸から構成されうる。
【００６９】
【化８】
0005616230.tif 000009
【００７０】
さらなる実施形態において、ＶＨ鎖の相補性決定領域であるＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、下記のように、それぞれ配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２で表されるアミノ酸から構成されうる。
【００７１】
【化９】
0005616230.tif 000010
【００７２】
開示された治療方法に用いられるポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、公知の技術によって得られうる。選択された標的のコンフォメーショナルエピトープに対して特異性を示す単一特異性マウス抗体は、この領域に対して反応性を有する抗体を含む哺乳類の抗血清から精製されるか、またはＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの技術（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）を用いてモノクローナル抗体として調製されうる。本明細書中で用いる場合、単一特異性抗体は、１３Ｃ３系列のモノクローナル抗体を用いて本明細書中で例示したマウスモノクローナル抗体などの、均一な結合特性を有する単一の抗体種または複数の抗体種として定義される。ハイブリドーマ細胞は、安定なハイブリドーマを生成することができる条件下で、脾臓リンパ体を適当な結合パートナー、好ましくは骨髄腫細胞と混合することによって製造される。細胞および骨髄腫細胞を産生する脾臓の抗体は、抗体の産生のために結合され、選択され、スクリーニングされる。抗体のポジティブウェルからのハイブリドーマ細胞は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎのｓｏｆｔ  ａｇａｒ技術（１９７３，Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）などの技術によってクローニングされる。モノクローナル抗体は、インビボで、それぞれのハイブリドーマ細胞を初期プライミングされたマウスに注入し、時間間隔をおいて腹水を回収することによって産生され、当該分野で公知の技術によって調製される。
【００７３】
上記の種特異性モノクローナル抗体の他に、本発明の抗体はまた、例えばマウス源から誘導された可変領域および目的の宿主源（例えば、ヒト；総説として、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，１９８９，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４４：６５−９２を参照）から誘導された定常領域から構築されたモノクローナル抗体である、「キメラ抗体」の形態でありうる。例えば、げっ歯類（例えば、マウス）抗体からの可変軽および重ＤＮＡ配列（例えば、それぞれ配列番号：６および８）は、哺乳類の発現ベクターにクローニングされうる。これらの軽および重「キメラ」発現ベクターは、レシピエント細胞株に共トランスフェクトされ、公知の技術によって選択され拡大される。次いで、この細胞株は、公知の細胞培養技術によって、キメラ抗体の軽鎖および重鎖の両方を産生する。このようなキメラ抗体は、本来のげっ歯類のモノクローナルの抗原結合能を有する一方、宿主の投与による免疫原生問題を有意に減少させることが歴史的に示されている。
【００７４】
キメラ抗体の論理的な改善は、キメラのまたは完全なマウスモノクローナル抗体の使用と比較して、治療上の抗体に対する免疫応答を備える患者の確率を間違いなく低減させる、「ヒト化抗体」である。マウスＭａｂの「ヒト化」の戦略は、ヒトの配列におけるものと異なるアミノ酸残基を、個々の残基の部位指向性突然変異によって、または全体の相補性決定領域をグラフトすることによって置き換えることに基づいている（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２６）。この技術はまた、現在では当該分野で公知であり、この技術の進歩のための多数の戦略；特に制限されないが、「再構成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照）、「ハイパーキメラ化（ｈｙｐｅｒｃｈｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２８６９−２８７３を参照）、または「張り合わせ（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）」（Ｍａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｄ  Ｖｅｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ１８  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｍｅｔｃａｌｆ  ｅｎｄ  Ｄａｌｔｏｎ，ｅｄｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，２９１−３１２）を含むいわゆる実行戦略によって提示されている。これらの戦略はすべて、げっ歯類およびヒトの配列を比較して、げっ歯類からヒトコンセンサスへの特定のアミノ酸置換が適当であるか決定することをある程度含む。変異が何であれ、ＣＤＲグラフトによるヒト化抗体の生成に関する中心的な主題は、軽鎖および重鎖の両方からのこれらの３つの抗原結合部位がどこでげっ歯類発現抗体クローンから事実上除かれ、ヒト抗体のフレームワーク領域をコードする発現ベクターにサブクローニング（または「グラフト」）されるのかである。例えば、上記の技術を用いると、ヒト化抗体が発現され、ここで、可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、それぞれ配列番号：１３、１４および１５で表され、可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、それぞれ、配列番号：２０、２１および２２で表される。したがって、「ヒト化抗体」は、事実上、マウスのＣＤＲ（上述の戦略の１以上を組み込むことによって生じる任意のさらなる改善を差し引く）のみから構築された抗体であり、可変領域の残部および定常領域の全部はヒト由来のものである。
【００７５】
本発明はまた、１３Ｃ３抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域に関する、単離された核酸分子および関連するアミノ酸配列に関し、より具体的には、１３Ｃ３の生物学的に関連した部分、あるいは１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６もしくは他の１３Ｃ３様抗体の親和性成熟型または他の変異型をコードする、単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）に関する。これらの核酸は、実質的に他の核酸を含まない。ほとんどのクローニングの目的において、ＤＮＡは好ましい核酸である。これらのＤＮＡ分子は、発現ベクターにサブクローニングされ、続いて選択された宿主細胞にトランスフェクトされ、この際、組み換え宿主細胞は、１３Ｃ３、１Ｄ１、１９Ａ６または１３Ｃ３、１Ｄ１、もしくは１９Ａ６様抗体あるいはその親和性成熟型の、関連する部分の実質的な水準の源を提供する。このような手法は、ｓｃＦｖの生成などの様々な用途に、または、ＩｇＧ抗体などの、ヒトＣＨおよびＣＬ領域をコードする哺乳類の発現ベクターシステムにおけるこれらのＶＨおよびＶＬ鎖の共発現のために、用いられうる。遺伝子コードの縮重は、２つのアミノ酸を除くすべてについて、１を超えるコドンが特定のアミノ酸をコードするものである。これは、本発明の抗体をコードする合成ＤＮＡ（この際、合成ＤＮＡのヌクレオチド配列が本明細書中に開示されたヌクレオチド配列と大きく異なるが、なおこのような抗体をコードする）の構築を可能にする。このような合成ＤＮＡは、本発明の技術的範囲に含まれることを意図している。このような合成ＤＮＡを特定の宿主細胞または生物体に発現させようとする場合、このような合成ＤＮＡのコドン使用は、その特定の宿主のコドン使用を反映し、したがって本発明の抗体の発現のより高い水準をもたらすように調節されうる。換言すると、特定のアミノ酸をコードするさまざまなコドンにおけるこの重複は、本発明の技術的範囲に含まれる。したがって、本発明はまた、以下に示すように、同一のアミノ酸の最終的な翻訳をコードする代替コドンを含むＲＮＡをコードする、これらのＤＮＡ配列に向けられている。
【００７６】
【化１０】
0005616230.tif 000011
【００７７】
次いで、このような組み換え発現ベクターは、代替抗体の形態を生成するために適当な細胞株に安定にまたは過渡的にトランスフェクトされうる。
【００７８】
本発明は、同一の抗体またはその部分を発現する異なるＤＮＡ分子（例えば、ＩｇＧの同一のｓｃＦｖあるいはＶＨおよび／またはＶＬ部分をコードする代替核酸分子）を与えうる、コドン重複の存在に言及する。本明細書の目的のためには、１以上の置換されたコドンを有する配列は、縮重変異（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）として定義されるであろう。配列変異の他の原因は、ＲＮＡエディティングを通して生じうる。このようなＲＮＡエディティングは、オープンリーディングフレームの変化が、発現されたタンパク質のアミノ酸残基の変化をもたらさない、他の形態のコドン重複をもたらしうる。発現された抗体の最終的な物理的特性を改善する、ＤＮＡ配列または翻訳された抗体における変異もまた、本発明の技術的範囲に含まれる。そのため、本発明は、（ｉ）特に制限されないが、１３Ｃ３、１９Ａ６および１Ｄ１などの、１３Ｃ３様抗体の親和性成熟型；および／または（ｉｉ）特に制限されないが、１３Ｃ３、１９Ａ６および／または１Ｄ１などの１３Ｃ３様抗体の変異型；特に制限されないが、公知の親和性成熟法および部位特異的変異を導入するための公知の組み換えＤＮＡ技術を通して生成された、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域における１以上の変異を含む；に関する。このような単離された、または精製された核酸分子は、１３Ｃ３様抗体のＶＨおよび／またはＶＬ領域を提示するであろう。これらの核酸は、実質的に他の核酸を含まない。ほとんどのクローニングの目的において、ＤＮＡは好ましい核酸である。これらのＤＮＡ分子は、発現ベクターにサブクローニングされ、次いで選択された宿主細胞にトランスフェクトされ、この際、組み換え宿主細胞は、１３Ｃ３様抗体またはその親和性成熟型の関連する部分の実質的な水準の源を提供する。このような手法は、ｓｃＦｖの生成などの様々な用途に、または、ＩｇＧ抗体などのヒトＣＨおよびＣＬ領域をコードする哺乳類の発現ベクターシステムにおけるこれらのＶＨおよびＶＬ鎖の共発現のために用いられうる。
【００７９】
本発明はまた、１３Ｃ３様抗体のそれぞれの重および／または軽領域をコードする核酸分子を含む、原核生物および真核生物の両方の組み換えベクターならびに組み換え宿主に関する。これらの核酸分子は、全体的にまたは部分的に、自然には結合しない他のＤＮＡ分子（すなわち、組み換えヒト抗体の生成に用いられる免疫グロブリン遺伝子を含むＤＮＡ分子）と結合し、それぞれのヒト組み換え抗体をコードする「組み換えＤＮＡ分子」を形成しうる。これらのベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されうる。ほとんどのクローニングの目的において、ＤＮＡベクターが好ましい。典型的なベクターとしては、プラスミド、修飾ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、酵母人工染色体、およびエピソームまたは集積化ＤＮＡの他の形態が挙げられる。特定の遺伝子トランスファー、組み換えヒト抗体の生成、または他の用途のための適当なベクターを決定することは、当業者の範囲内である。所望の核酸分子を発現ベクターにサブクローニングし、前記ベクターを含む宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする方法、およびそれぞれの発現ベクターを宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を適当な環境下で培養する段階を含む、実質的に純粋なタンパク質を作製する方法は公知である。このように製造された抗体（ＩｇＧ組み換えヒト抗体など）は、通常の方法で宿主細胞から採取されうる。任意の公知の発現ベクターは、適当なプロモーターおよび他の適当な転写調節要素を含む任意のベクターを含めて、本発明のこの部分を実施するために用いられうる。得られた発現構築物は、原核生物および真核生物の宿主細胞中に移動され、組み換えタンパク質を産生する。本明細書中、発現ベクターは、適当な宿主におけるクローン化ＤＮＡの転写およびそのｒｎＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。このようなベクターは、バクテリア、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞などの様々な宿主において、真核細胞のＤＮＡの発現に用いられうる。特異的に設計されたベクターは、バクテリア−酵母またはバクテリア−動物細胞のような宿主間でＤＮＡの相互自律増殖を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞での自律的複製のための複製起点、選択可能マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性および活性プロモーターを含まなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼにＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、ｒｎＲＮＡに高頻度で開始させるものである。このような操作の技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されており、当業者に公知であり利用可能である。発現ベクターとしては、特に制限されないが、クローニングベクター、修飾（改変）クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミドまたはウイルスが挙げられる。適当な市販されている哺乳類の発現ベクターとしては、特に制限されないが、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（インビトロジェン）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（プロメガ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｎｐ（インビトロジェン）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐＭＣｌｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐＸＴｌ（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ＥＢＯ  ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）  ｐＢＰＶ−ｌ（８−２）  （ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）、ならびに１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）が挙げられる。また、多様なバクテリアの発現ベクターが用いられ、特に制限されないが、ｐＣＲ２．１（インビトロジェン）、ｐＥＴ１  ｌａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ  ｇｔｌ  １（インビトロジェン）、およびｐＫＫ２２３−３（ファルマシア）が挙げられる。加えて、様々な真菌細胞の発現ベクターが用いられ、特に制限されないが、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン）およびＰｉｃｈｉｅ発現ベクター（インビトロジェン）が挙げられる。また、多様な昆虫の細胞の発現ベクターが用いられ、特に制限されないが、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩおよびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（インビトロジェン）、ならびにｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられる。
【００８０】
組み換え宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよく、特に制限されないが、大腸菌などのバクテリア、酵母などの真菌細胞、特に制限されないが、ウシ、ブタ、サル、およびげっ歯類由来の細胞株などの哺乳類の細胞、ならびに昆虫の細胞が挙げられる。適当な哺乳類種としては、特に制限されないが、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １．２）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣＨＴＢ−８５）、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−ｌ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）、およびＣＰＡＥ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２０９）が挙げられる。
【００８１】
また、上記で概説した再エンジニアリング（ｒｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）抗体に対する他の改善は、完全なヒトモノクローナル抗体の生成である。第１は、免疫系を有し、これによってマウス抗体遺伝子が不活性化され、順に機能的ヒト抗体遺伝子のレパートリーで置き換えられるが、一方でマウス免疫系の他の成分を変化させない、遺伝子改変（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）マウス種の使用を含む。このような遺伝子改変マウスは、天然のインビボの免疫応答および高い親和性の完全なヒトモノクローナル抗体をもたらす親和性成熟過程を可能にする。この技術はまた、現在では当該分野で公知であり、特に制限されないが、米国特許第５，９３９，５９８号；第６，０７５，１８１号；第６，１１４，５９８号；第６，１５０，５８４号および関連するファミリー（Ａｂｇｅｎｉｘに帰属され、そのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ技術を開示する）；に加えて、米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号；第５，６６１，０１６号；第５，８１４，３１８号；第５，８７４，２９９号；および第５，７７０，４２９号（ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに帰属され、「ＵｌｔｒａＭａｂ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ」の傘下でＭｅｄａｒｅｘを通して入手可能）などの様々な文献に全体的に詳細に記載されている。また、Ｋｅｌｌｅｒｍａｎおよび  Ｇｒｅｅｎの総説（２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５９３−５９７）を参照のこと。
【００８２】
最後に、多くの技術を用いてライブラリから抗体フラグメントを選択する技術は、当業者に適用可能であり、特に制限されないが、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：４９３７−４９４２）、バクテリアディスプレイ（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：２９−３４）および／または酵母ディスプレイ（Ｋｉｅｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１３０３−１３１０）などが、標的サイトカインに特異的に結合する一本鎖抗体を選択するための先に議論した技術の代替として用いられうる。一本鎖抗体は、フィラメント状ファージ技術を用いて直接製造された一本鎖抗体のライブラリから選択される。ファージディスプレイ技術は当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，７３３，７４３号；第５，８７１，９０７号；第５，８７２，２１５号；第５，８８５，７９３号；第５，９６２，２５５号；第６，１４０，４７１号；第６，２２５，４４７号；第６，２９１６５０号；第６，４９２，１６０号；第６，５２１，４０４号；第６，５４４，７３１号；第６，５５５，３１３号；第６，５８２，９１５号；第６，５９３，０８１号に加えて、他の米国ファミリーまたは１９９２年５月２４日に提出された独国特許第９２０６３１８号の優先権に基づく出願に開示される、ケンブリッジアンタイボディテクノロジー（ＣＡＴ）社の技術を参照；また、Ｖａｕｇｈｎ，ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４を参照）。一本鎖抗体はまた、ＤＮＡ増幅法（例えば、ＰＣＲ）などの使用可能な組み換えＤＮＡ技術を用いることによって、または、場合によっては、それぞれのハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型として用いることによって、設計および構築されうる。一本鎖抗体は、単一特異性または二特異性、二価または四価でありうる。一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、以下に説明するように、手動または自動ヌクレオチド合成を用いて構築され、標準的な組み換えＤＮＡ法を用いて発現構築物にクローニングされ、そして細胞に導入されてコード配列を発現する。
【００８３】
本発明はさらに、アルツハイマー病に関連するフィブリルおよび／または老人斑の形成を阻害するための予防上または治療上の選択を供給する、有効量の１３Ｃ３様抗体または親和性成熟型を含む、抗体を用いた薬剤組成物に関する。本発明の抗体を用いた薬剤組成物は、当該分野で公知の多数の戦略によって製剤化されうる（例えば、ＭｃＧｏｆｆ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒ，２０００，Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ／Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＭｃＮａｌｌｙ，Ｅ．Ｊ．，ｅｄ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；ｐｐ．１３９−１５８；Ａｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉｓ，２０００，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｔａｌｙｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ；ｐｐ．１４５−１７７；Ａｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：４１−１２１を参照）。患者に投与するのに適した製薬上許容される組成物は、生物学的活性を維持し、一方でまた許容される温度範囲内での保存の間の最大安定性を促進する製剤中に、抗体の有効量を含むであろう。薬剤組成物はまた、所望の製剤に依存して、製薬上許容される希釈剤、製薬上許容される担体および／または製薬上許容される賦形剤、あるいは動物またはヒトに投与するための薬剤組成物の製剤に通常用いられる任意のこのようなビヒクルを含みうる。希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンク溶液が挙げられる。本発明の薬剤組成物または製剤に有用な賦形剤の量は、必要とする被験者に運搬されたときに抗体が均一に分散されるように、抗体を組成物の全体に均一に分布させる量である。これは、所望の有益な苦痛緩和または治癒の結果を与えつつ、同時に、高すぎる濃度によって生じうるいかなる副作用も最小にする濃度に、抗体を希釈することに役立ちうる。これは、保存効果もまた有しうる。したがって、高い生理学的活性を有する抗体に対しては、より多くの賦形剤が用いられるであろう。一方、より低い生理学的活性を示す任意の活性成分に対しては、より少ない量の賦形剤が用いられるであろう。一般に、組成物中の賦形剤の量は、組成物の総量の約５０重量％〜９９．９重量％でありうる。抗体が特に低い生理学的活性を示す場合、賦形剤の量は１重量％の少量でありうる。一方、特に高い生理学的活性を有する抗体に対しては、賦形剤の量は、約９８．０重量％〜約９９．９重量％でありうる。加えて、前記抗体は、「化学的誘導体」（通常は基礎分子の一部ではない、さらなる化学的部分を含む分子）の形態で投与されうる。これらの部分は、生物学的薬剤の溶解度、半減期、吸収などを改善しうる。または、これらの部分は、抗体の望ましくない副作用を軽減しうる。薬剤組成物はまた、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの大きな、ゆっくりと代謝される高分子、および共重合体（例えばラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロースなど）、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸共重合体、および脂質凝集体（油滴またはリポソームなど）を含みうる。加えて、これらの担体は、免疫刺激剤（すなわち、アジュバント）として機能しうる。非経口投与のためには、本発明の薬剤は、水油、生理食塩水、グリセロールまたはエタノールなどの滅菌液でありうる、製薬上の担体を含む生理学的に許容される希釈剤中の、物質の溶液または懸濁液の注射可能な投与量として投与されうる。さらに、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤が組成物中に存在しうる。薬剤組成物の他の成分は、石油、動物、野菜、または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、および鉱物油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコール類は、特に注射可能溶液において、好ましい液体の担体である。
【００８４】
抗体製剤は、液体の形態または固体の形態でありうる。固体製剤は、一般に、凍結乾燥され、一回または複数回の投与の前に、溶液中に投入される。前記製剤は、熱変性を避けるために、極端な温度またはｐＨにさらされてはならない。したがって、本発明の抗体組成物を生物学的に関連したｐＨ範囲内で製剤化することが不可欠である。保存の間に適当なｐＨを維持するために緩衝化された溶液が、特に製剤から投与までより長い期間保存される液体製剤のために示される。現在まで、液体および固体製剤の両方が、より長期間の安定性を保つために、より低い温度（通常２〜８℃）での保存を要する。製剤化された抗体組成物、特に液体製剤は、保管中のタンパク質分解の防止または最小化のために、特に制限されないが、有効な濃度（通常＜１％  ｗ／ｖ）のベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、メチルパラベン、および／またはプロピルパラベンなどの静菌剤を含みうる。静菌剤は、患者によっては禁忌でありうる。したがって、凍結乾燥された製剤は、このような成分を含む、または含まない溶液中に再構成されうる。特に制限されないが、抗凍結剤としての糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、グリセロールおよびズルシトールなどのポリヒドロキシ炭化水素および／またはスクロース、ラクトース、マルトースまたはトレハロースなどの二糖が挙げられるが必ずしもこれらに制限されない）および、場合によっては、関連する塩（特に制限されないが、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌ）などのさらなる成分が、緩衝化された液体または固体の抗体製剤に添加されうる。これらの抗体製剤、特に長期間の保存が予定されている液体製剤は、２〜８℃またはそれ以上の温度での長期間の安定性を促進しつつ、また、非経口注射に有用な製剤を作製するために有用な、合計オスモル濃度の範囲に依存するであろう。合計オスモル濃度（溶液中の総分子数）の有効な範囲は、約２００ｍＯｓ／Ｌから約８００ｍＯｓ／Ｌである。スクロースまたはソルビトールなどの抗凍結剤の量は、溶液の合計オスモル濃度が適当な範囲内に維持されるように、製剤中の塩の量に依存することは明らかであろう。したがって、無塩製剤は、約５％〜約２５％のスクロースを含んでもよく、スクロースの好ましい範囲は約７％〜約１５％であり、無塩製剤における特に好ましいスクロース濃度は１０％〜１２％である。または、無塩のソルビトールベースの製剤は、約３％〜約１２％の範囲でソルビトールを含んでもよく、好ましい範囲は約４％〜７％であり、無塩製剤におけるソルビトールの特に好ましい範囲は約５％〜約６％である。無塩製剤は、もちろん、有効なオスモル濃度の水準を維持するために、それぞれの抗凍結剤をより高い濃度範囲で含んでもよい。これらの製剤はまた、二価陽イオン（ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２およびＭｎＣｌ２などが挙げられるが必ずしもこれらに制限されない）；および非イオン性界面活性剤（ポリソルベート−８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０（登録商標））、ポリソルベート−６０（Ｔｗｅｅｎ  ６０（登録商標））、ポリソルベート−４０（Ｔｗｅｅｎ  ４０（登録商標））およびポリソルベート−２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））、ポリオキシエ��レンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ  ５８（登録商標）、Ｂｒｉｊ  ３５（登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されない）に加えて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １１４（登録商標）、ＮＰ４０（登録商標）、Ｓｐａｎ  ８５およびＰｌｕｒｏｎｉｃシリーズの非イオン性界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  １２１）などの他のものが挙げられる）；を含んでもよい。このような成分の任意の組み合わせは、可能な静菌剤の含有を含めて、本発明の抗体含有製剤を満たすために有用でありうる。本発明の抗体組成物はまた、通常は免疫グロブリン分子の一部ではない、さらなる化学的部分を含む抗体を記載する、「化学的誘導体」（例えば、ペグ化）でありうる。このような部分は、基礎分子の溶解度、半減期、吸収などを改善しうる。または、前記部分は、基礎分子の望ましくない副作用を軽減しうる、もしくは基礎分子の毒性を低下させうる。
【００８５】
多様な担体、希釈剤、賦形剤などの数々の例が知られており、その内容が参照として本明細書中に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  ｅｄ．；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）に加えて、本明細書中で引用された文献に開示されている。簡単に説明すれば、改善された移動、運搬、耐性などを提供するために、適当な担体、賦形剤および他の物質が薬剤組成物の製剤に組み込まれうることが理解されるであろう。生物学的薬剤および／またはさらなる活性成分を担体に組み込む方法は、当業者に公知であり、生物学的薬剤の性質および本発明を実施する者によって選択された担体の性質に依存する。イオン結合、ゲル封入、または担体内部への物理的なトラッピング、イオン導入、および生物学的薬剤の溶液への担体の浸漬が、開示された治療方法の実施に用いられる薬剤組成物の製剤において検討される、適当な例である。または、前記担体は、生物学的薬剤の希釈剤にすぎなくてもよい。これらの製剤としては、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、オイル、脂質、無水吸収ベース、水中油または油中水型エマルション、カルボワックス（ｃａｒｂｏｗａｘ）エマルション（多様な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカルボワックスを含む半固体混合物が挙げられる。本発明の化合物を用いた投与量計画は、患者の型、種、年齢、体重、性別、および医学的状態；治療される状態の重症度；投与経路；患者の腎臓、肝臓、および心臓血管の機能；ならびに採用されるその特定の生物学的薬剤を含む、さまざまな因子に従って選択される。通常の技術を有する医師または獣医は、状態の進行の防止、対抗、または停止のために必要な薬剤の有効量を容易に決定および処方できるであろう。薬剤の濃度を、毒性がなく、効果が得られる範囲に達成する際の最適精度は、標的部位への薬剤のアベイラビリティの速度論に基づく計画を必要とする。これは、薬剤の分布、平衡、および除去の考慮を含む。製剤中の活性成分が製剤によって不活性化されず、製剤が生理学的に適合すれば、上述の製剤のいずれもが、本発明に従って治療およびセラピーに適しうる。
【００８６】
本発明の薬剤組成物は、当該分野で適用可能な任意の方法、戦略および／または組み合わせで、アルツハイマー病に対する治療上の治療を提供するのに十分な量で、宿主に投与されうる。これらの組成物は、公知の様々な経路、特に非経口経路（特に制限されないが、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、または皮下（ＳＣ）投与などの非経口経路；ここで、ＩＶ投与は治療上の抗体の投与の技術分野において標準である；）で、個人に提供されうる。これらの組成物は、別個または複数の投与量（すなわち、治療計画を通して製剤の滅菌状態を維持することによる、時間差の抗体の投与）で投与されうる。本発明の化合物を用いた投与量計画は、患者（ヒトの患者など）の型、種、年齢、体重、性別、および医学的状態；治療される状態の重症度；投与経路；患者の腎臓、肝臓、および心臓血管の機能；ならびに採用されるその特定の抗体を含む、さまざまな因子に従って選択される。通常の技術を有する医師または獣医は、抗体の有効な治療上の量を容易に決定および処方できるであろう。抗体の濃度を、毒性がなく、効果が得られる範囲に達成する際の最適精度は、標的部位への薬剤のアベイラビリティの速度論に基づく計画を必要とする。これは、薬剤の分布、平衡、および除去の考慮を含む。本明細書中に記載された抗体は、適当な投与量で単独で用いてもよい。または、他の物質との共投与または逐次的投与も望ましい。本発明の抗体の治療上の投与量計画を、代替の予防上または治療上の計画と併用して与えることも可能であろう。有効な投与量計画は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与された他の医薬、および治療が予防的であるか治療的であるか、を含む多くの異なる因子に依存して変化するであろう。１３Ｃ３様抗体の投与では、投与量は、宿主の体重に対して約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、より通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇである。アルツハイマー病の場合、アミロイド沈着は脳で起こり、本発明の薬剤はまた、本発明の薬剤の血液−脳境界を越える通過を増加させる他の物質と併用して投与されうる。
【００８７】
本発明の１３Ｃ３様抗体組成物の運搬および投与量計画に関する他の形態は、非注射可能または注射可能なデバイスを含みうる、非経口経路を介した薬剤運搬に関する。典型的には、注射可能な組成物は、液体の溶液または懸濁液して調製されてもよく；また、注射前に、液体ビヒクルの溶液もしくは懸濁液に適した固体形態が調製されてもよい。調製はまた、上述したように、乳化されうる、またはリポソームもしくはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはアジュバント効果を高めるための共重合体などのマイクロ粒子中に封入されうる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５２３；Ｈａｎｅｓ，１９９７，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１１９を参照）。本発明の薬剤は、活性成分の持続またはパルス放出を可能にするように製剤されうる、デポ注射またはインプラント調製の形態で投与されうる。
【００８８】
具体的な実施形態としては、本明細書中で議論したように、さらに当該分野で知られているように、ＰＬＧＡマイクロ粒子に加えて、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）（ＰＥＶＡｃ）を含むポリマー系非分解性ビヒクルが挙げられる。加えて、抗体を用いた治療上の製品の制御放出および局所的運搬が、Ｇｒａｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４（７）：１０２９−１０４４）に解説されており、これはその全体が本明細書中に参照として組み込まれる。抗体を封入することができる適当なマイクロカプセルとしては、さらに、コアセルベーション法または界面重合によって調製された、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル、およびポリメチルメタクリレートのマイクロカプセルが挙げられる。「ＩＧＦ−１持続放出製剤の製造方法」と題されたＰＣＴ国際出願公開ＷＯ  ９９／２４０６１；ここで、タンパク質がＰＬＧＡマイクロ粒子に封入されており、この文献は、その全体が参照として本明細書中に組み込まれる；を参照のこと。加えて、リポソームまたはアルブミンマイクロ粒子などの、マイクロエマルションまたはコロイド状薬剤運搬システムもまた用いられうる。他の好ましい持続放出組成物は、投与の部位に抗体を保持するために、生体接着性材料を採用する。上述したように、持続放出製剤は、その中に抗体が処理され、非即時的放出を提供する、生分解性ポリマーを含みうる。非注射可能デバイスは、本明細書中、「インプラント」、「製薬デポインプラント」、「デポインプラント」、「非注射可能デポ」、またはいくつかのこのような同様の用語で記述されうる。通常のデポインプラントとしては、特に制限されないが、固体生分解性および非生体分解性ポリマーデバイス（伸長高分子（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ）または同軸ロッド形状デバイスなど）に加えて、同様に当該分野で公知の多数のポンプシステムが挙げられる。注射可能デバイスは、ボーラス注射（注射の後の薬剤の放出および消失）と、保存リザーバーを注射部位に提供し、長期間にわたる生物学的薬剤の持続放出を可能にする、リポジトリまたはデポ注射とに分けられる。デポインプラントは、抗体の長期間にわたる長時間放出のための適当なリザーバーを提供するために、運搬の位置に外科的に繋留されうる。このようなデバイスは、あらかじめ選択された期間にわたる治療に、治療上または予防上必要な量で薬剤製剤を運ぶことができるであろう。デポインプラントはまた、治療期間中の身体プロセス（タンパク質分解など）による分解（劣化）からの製剤の保護を提供しうる。当該分野で知られているように、「持続放出」の用語は、このような物質のブロック重合体マトリックスからの長期間にわたる漸進的な（連続的または不連続の）放出を意味する。具体的なデバイスにかかわらず、１３Ｃ３様抗体組成物の持続放出は、局所的な、生物学的に有効な抗体の濃度をもたらすであろう。生物学的薬剤の持続放出は、製剤に依存して、１日、数日、１週間以上であるが、最も可能性が高いのは、１か月以上、または約６か月までの期間であろう。当該分野で公知の天然または合成高分子は、その多用途の分解速度、安全性、および���体適合性などの特性のため、デポインプラントとして有用であろう。これらの共重合体は、活性成分の薬剤動力学を修正する、物質を酵素の攻撃の他、接着または注射部位での時間による分解から遮蔽するために、操作されうる。当業者であれば、当該分野において、それぞれの製造工程、使用される触媒、および持続放出デポインプラントまたはデポ注射の最終的な分子量を含む、これらの共重合体の特性を操作するための十分な教示があることを理解するであろう。天然高分子としては、特に制限されないが、タンパク質（例えば、コラーゲン、アルブミンまたはゼラチン）；多糖（セルロース、でんぷん、アルギン酸塩、キチン、キトサン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸）および脂質が挙げられる。生分解性合成高分子としては、特に制限されないが、各種ポリエステル、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、ポリラクチド（［ＰＬＡ］；米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、ポリラクチド−コ−グリコリドなどのポリラクテートポリグリコレート（ＰＬＧＡ）（例えば、米国特許第４，７６７，６２８号および第５，６５４，００８号参照）、ポリグリコリド（ＰＧ）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コンジュゲート、ポリオルソエステル類、ポリアスピリン類、ポリホスファゲン類、ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ＰＶＡ−ｇ−ＰＬＧＡ、ＰＥＧＴ−ＰＢＴ共重合体（ポリアクティブ）、メタクリレート類、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（プルロニクス）、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＡＡ共重合体、ＰＬＧＡ−ＰＥＯ−ＰＬＧＡ、ポリオルソエステル（ＰＯＥ）類、またはこれらの任意の組み合わせが、上述したように（例えば、米国特許第６，９９１，６５４号および米国特許出願第２００５０１８７６３１号を参照、いずれもその全体が参照として本明細書中に組み込まれる）挙げられ、ハイドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７；Ｌａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５を参照）、非分解性エチレン−ビニルアセテート（例えば、エチレンビニルアセテートディスクおよびポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート））、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）などの分解性乳酸グリコール酸共重合体、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）、ヒアルロン酸ゲル（例えば、米国特許第４，６３６，５２４号を参照）、アルギン酸懸濁液、ポリオルソエステル（ＰＯＥ）などが挙げられる。ポリラクチド（ＰＬＡ）およびそのグリコリドとの共重合体（ＰＬＧＡ）は、ＰＬＡ重合体を用いた最初の非経口持続放出製剤として１９８９年に承認されたＬｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）の製品化によって当該分野で公知である。活性成分の持続放出を達成するために賦形剤としてＰＬＡおよびＰＬＧＡを用いる製品のさらなる例としては、Ａｔｒｉｄｏｘ（ＰＬＡ；歯周病）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  Ｄｅ���ｏｔ（ＰＬＧＡ；ｈＧＨを含む）およびＴｒｅｌｓｔａｒ  Ｄｅｐｏｔ（ＰＬＧＡ；前立腺癌）が挙げられる。他の合成高分子としては、特に制限されないが、ポリ（ｃ−カプロラクトン）、ポリ３−ヒドロキシブチレート、ポリ（β−リンゴ酸）およびポリ（ジオキサノン）；ポリ無水物、ポリウレタン（ＷＯ  ２００５／０１３９３６を参照）、ポリアミド類、シクロデキストラン類、ポリオルソエステル類、ｎ−ビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド／ポリエチレンテレフタレート、ポリホスファゼン、ポリホスフェート、ポリホスホネート、ポリオルソエステル、ポリシアノアクリレート、ポリエチレングリコール、ポリジヒドロピランおよびポリアセタールが挙げられる。非生分解性デバイスとしては、特に制限されないが、各種のセルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースアセテートプロピオネート、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、シリコン系インプラント（ポリジメチルシロキサン）、アクリル重合体（ポリメタクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシ（エチルメチルアクリレート）の他、ポリエチレン−コ−（ビニルアセテート）、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン、ポロキサミン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル、ポリエチレン−クロロトリフルオロエチレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたは「テフロン（商標）」）、スチレンブタジエンゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフェニレンオキサイド−ポリスチレン、ポリ−ａ−クロロ−ｐ−キシレン、ポリメチルペンテン、ポリスルホンおよび関連する他の生体安定高分子が挙げられる。持続放出デポ製剤に適した担体としては、特に制限されないが、マイクロ粒子、フィルム、カプセル、粒子、ゲル、コーティング、マトリックス、ウエハー、錠剤または他の薬剤運搬組成物が挙げられる。このような持続放出製剤の例は、上述した通りである。さらに、米国特許第６，９５３，５９３号；第６，９４６，１４６号；第６，６５６，５０８号；第６，５４１，０３３号；および第６，４５１，３４６号（これらのそれぞれの内容は参照として本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。投与量形態は、薬剤製剤を、予め選択された期間にわたる治療に、治療上要求される量および濃度で運ぶことができなければならず、治療期間中、身体プロセスによる分解から製剤を十分に保護しなければならない。例えば、投与量形態は、代謝プロセスによる分解、および、例えば、リーク、クラック、破壊または変形などのリスクに対して保護する特性を有する材料で作製されたエクステリアによって囲まれていてもよい。これは、例えば、患者による通常の関節および他の動きの結果として薬剤放出デバイスにかかる物理的な力によって、または、例えば、対流ドラッグデリバリーデバイスにおいては、リザーバー内で生じた圧力に伴う物理的な力などの、使用中に受ける力の下で、投与量形態が制御されずに放出されることを防ぎうる。薬剤リザーバー、または薬剤を保持もしくは含有するための他の手段はまた、活性剤製剤との意図しない反応を避けるような材料で構成されなければならず、好ましくは生体���合性である（例えば、投与量形態がインプラントされる場合、それは患者の身体または体液に対して実質的に非反応性である）。一般に、それぞれの生物学的薬剤は、必要に応じて、少なくとも１２時間から少なくとも１週間、そして最も多くは、薬剤を運搬するためのインプラントを介して、少なくとも１０、２０、３０、１００日もしくは少なくとも４か月、または少なくとも６か月以上、個人に投与される。１３Ｃ３様抗体は、製剤が放出される部位の近くの組織の乱れまたは外傷を最小にするために、例えば、約０．００１ｍｌ／日〜１ｍｌ／日のような相対的に低い体積速度で運搬されうる。前記製剤は、具体的な生物学的薬剤に依存して、低い投与量で、例えば、約０．０１μｇ／時または０．１μｇ／時、０．２５μｇ／時、１μｇ／時から、一般的には約２００μｇ／時までの速度で放出されうる、または、前記製剤は、低い体積速度で、例えば、約０．００１ｍｌ／日〜約１ｍｌ／日の体積速度で、例えば、０．０１μｇ／日から約２０ｍｇ／日までで運搬される。投与量は、用いられる活性成分（例えば、ＩｇＧ抗体）の効能、バイオアベラビリティおよび毒性のような様々な因子、ならびに被験者の要求に依存する。
【００８９】
本発明の、これらの、および他の目的、利点、ならびに特徴は、以下にさらに十分に説明する方法論および組成物の詳細を読むことによって明らかになるであろう。
【実施例】
【００９０】
実施例１：アミロイドベータ（Ａβ４２）のプロトフィブリルの形態の調製
Ａβ４２合成ペプチド（カリフォルニア州、アメリカンペプタイド社）を、Ｆｅｚｏｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｅｚｏｕｉ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍｙｌｏｉｄ  ７（３）：１６６−１７８．（２０００））に記載の方法に従って調製した。簡単に説明すると、凍結乾燥されたＡβ４２を、２ｍＭのＮａＯＨに、１ｍｇ／ｍｌの濃度（ｐＨ〜１０．５）で溶解させ、その後超音波処理および凍結乾燥を行った。ＮａＯＨ処理したＡβを、１ｍｇ／ｍｌの濃度で水に溶解させ、０．２２μｍのＵＬＴＲＡＦＲＥＥ−ＭＣフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）を用いて濾過した。０．５ｍｇ／ｍｌのペプチド溶液を、最終濃度が、リン酸塩：５０ｍＭ、塩化ナトリウム：１００ｍＭに緩衝化し、室温で４時間インキュベートした。プロトフィブリルの形態を低分子量のタンパク質から分離するために、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて上清を分別した。次いで、精製されたＳＥＣフラクションを４℃で保存した。
【００９１】
様々な形態のＡβ４２タンパク質は、単量体または二量体として互いに会合して高分子量オリゴマー（プロトフィブリル）を形成する能力を示すことがわかった（図１）。可溶性プロトフィブリルのさらなる凝集は、タンパク質の不溶性の形態を生成し、一方、プロトフィブリルは解離して低分子量の形態に戻りうる。
【００９２】
Ａβのプロトフィブリルの形態を低分子量のタンパク質から精製するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５サイズ排除カラムを用いてＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムで試料を分別した。図２Ａは、ＡＤ４２合成ペプチドを室温でインキュベートしないと、オリゴマーが凝集せず、プロトフィブリルが形成されないことを示す。図２Ｂは、Ａβ４２合成ペプチドの４時間のインキュベーションの後、それに続くＳＥＣ精製が、決定的なプロトフィブリルのフラクションを示すことを表す。
【００９３】
実施例２：プロトフィブリル型Ａβに特異性を有するモノクローナル抗体の生成
１３Ｃ３、１９Ａ６および１Ｄ１抗体を、公知のプロトコル（Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．（１９８８））を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスをフィブリル型Ａβタンパク質で免疫化することによって作製した。脾臓を除去し、いくつかの９６ウェルプレート中でＳＰ２骨髄腫細胞と融合させた。融合培地で成長をモニターし、抗体捕獲イムノアッセイによって、上清について、そのプロトフィブリル型フラクションに結合する能力をスクリーニングした。
【００９４】
実施例３：プロトフィブリル型Ａβに特異性を有するモノクローナル抗体の特性評価
ハイブリドーマ（１３Ｃ３、１９Ａ６および１Ｄ１）から産生されたモノクローナル抗体をさらに特性評価するために、抗体捕獲アッセイを用いた。マイクロタイタープレートを用い、２μｇ／ｍｌのプロトフィブリル型Ａβ４２タンパク質の溶液５０μｌを各ウェルに添加し、プレートを４０℃で１晩インキュベートした。インキュベーションの後、残った抗原の溶液を除去し、ＰＢＳ溶液で洗浄した。結合した抗原を含むプレートにハイブリドーマの上清の段階希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートした。この一次抗体の溶液を除去し、ウェルを再びＰＢＳ溶液で洗浄した。次に、酵素標識二次抗体を添加し、室温で１時間インキュベートした。二次抗体の溶液の除去の後、結合した酵素に特異的な発色性基質を反応に添加し、捕獲された抗体の検出は、定量的な結果を与えた。
【００９５】
さらに、二次試薬をアイソタイプ特異的抗免疫グロブリン抗体に変化させて、各モノクローナルの特定の免疫グロブリンのアイソタイプを同定した。これらの実験において、１３Ｃ３、１９Ａ６および１Ｄ１モノクローナル抗体の結合特異性を比較するために、市販の抗Ａβ４２抗体を用いた。
【００９６】
図３ＡおよびＢは、抗体捕獲イムノアッセイにおいて１３Ｃ３抗体の特異性を試験するために用いた、Ａβ４２ペプチドのプロトフィブリル（ＰＦ）および低分子量（ＬＭＷ）の形態を表す。具体的には、図３Ａは、１３Ｃ３抗体がＡβ４２のプロトフィブリルの形態（ＰＦ）に特異的であり、タンパク質の低分子量（ＬＭＷ）の形態を認識しないことを示す、ＥＬＩＳＡから得られたプロットを表す。図３Ｂは、市販の４Ｇ８抗体を用いたＥＬＩＳＡのデータを表し、これがＡβ４２タンパク質の低分子量およびプロトフィブリルの形態の両方を認識することを示す。
【００９７】
実施例４：表面プラズモン共鳴法（ｂＩＡＣＯＲＥ）を用いた、Ａβ４２のプロトフィブリルの形態に対するモノクローナル抗体の特異性
表１（下記）に記載の精製されたモノクローナル抗体を、文献のプロトコル（Ｎｉｃｅ，ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  ２１：３３９−３５２（１９９９））に従って、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップに固定化した。ＢＩＡｃｏｒｅの光応答の高い感度は、反射率の変化を定量化し、リガンドのみのベースライン応答が発生する。相互作用分析が行なわれ、被分析物として、Ａβ４２のＬＭＷの形態またはＰＦの形態が溶液中でセンサーチップ上に注入され、表面プラズモン共鳴における変化が、各抗体のＬＭＷおよびＰＦ  Ａβ４２に結合する能力の特異性を同定する応答を発生させる。１３Ｃ３および１９Ａ６抗体の両方が全て、Ａβ４２のＬＭＷの形態に比べて、より高い特異性でＰＦの形態に結合した。この実験で用いた全ての抗体のうち、市販の抗体は、ＰＦ結合／ＬＭＷ結合の比で示されるように、Ａβ４２のＰＦの形態よりもＡβ４２のＬＭＷ形態に対してより高い特異性を示した。
【００９８】
【表１】
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【００９９】
表面プラズモン共鳴分析は、センサーグラムによって、１３Ｃ３（図４Ｂ）がＡβ４２タンパク質のＬＭＷの形態を結合しないことを示した。しかしながら、４Ｇ８（図４Ａ）は、ＬＭＷ  Ａβ４２タンパク質の標準的な会合／解離曲線を示す。抗体アイソタイプコントロールＩｇＧ１（図Ｃ）は、同様に、ＬＭＷ  Ａβを結合しない。表面プラズモン共鳴法の検出原理を用いた自動ＢＩＡｃｏｒｅシステムがこの実験に使用された。１９Ａ６抗体の結合特異性データは、１９Ａ６が結合比５．８を有し、これは結合比５．３の１３Ｃ３と同等であることを示した。
【０１００】
実施例５：１３Ｃ３抗体のエピトープマッピング
１３Ｃ３、１Ｄ１および１９Ａ６のエピトープのマッピングを、文献のプロトコル（Ｋｏｒｔｈ，ｅｔ  ａｌ．３９０：７４（１９９７））に従って、ＲｅｐｌｉＴｏｐｅマイクロアレイシステム（ＪＰＴペプチドテクノロジー社）を用いて行なった。マイクロアレイ上の各スポットは、Ａβ４２の１３アミノ酸のペプチドを含み、ここで、マイクロアレイ上の位置のそれぞれのシフトは、アミノ酸シフト（Ｎ−末端からＣ−末端へ）、すなわち、配列番号：２３、配列番号：２４、・・・配列番号：５１、および配列番号：５２を表す。以下に、スライドアレイ上の位置に対応するペプチドと、その正確なアミノ酸配列を示す。一度ペプチドがＲｅｐｌｉＴｏｐｅマイクロアレイに固定されると、試料は１３Ｃ３抗体とともにインキュベートされ、その後、続いて、選択された化学発光標識に結合した二次で標識した。信号を与えるスポットは、抗体によるタンパク質上のエピトープ結合部位を表す。
【０１０１】
【化１１】
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【０１０２】
図５Ａは、Ａβ１−４２ペプチド上の抗体１３Ｃ３、１Ｄ１および４Ｇ８のエピトープを同定する、ＲｅｐｌｉＴｏｐｅマイクロアレイ実験からのドットブロットを表す。結合した抗体は、化学発光信号によって表される。図５Ｂは、配列中に生じたときの１３Ｃ３エピトープのポリペプチドセグメントを示す、Ａβ１−４２アミノ酸配列を表す。１Ｄ１抗体は、１３Ｃ３と同じエピトープを示し、一方、市販の４Ｇ８抗体は、異なるエピトープを同定した。
【０１０３】
実施例６：１３Ｃ３特異性の特性評価
図６は、Ａβオリゴマーを分泌する細胞株である７ＰＡ２細胞株からの上清のサイズ排除クロマトグラフィーからのフラクションを表す。ＳＥＣ精製７ＰＡ２からのプロトフィブリル型および低分子量フラクションとの１３Ｃ３抗体の結合をさらに特性評価するために、抗体捕獲アッセイを用いた。マイクロタイタープレートを用いて、各フラクションの１：２００希釈液１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを４℃で１晩インキュベートした。インキュベーションの後、残った抗原の溶液を除去し、ＰＢＳ溶液で洗浄した。結合した抗原を含むプレートに１３Ｃ３の上清の段階希釈液を添加し、室温で１時間インキュベートした。この一次抗体の溶液を除去し、ウェルを再びＰＢＳ溶液で洗浄した。次に、酵素標識二次抗体を添加して、室温で１時間インキュベートした。二次抗体の溶液の除去の後、結合した酵素に特異的な発色性基質を反応に添加し、捕獲された抗体の検出は、定量的な結果を与えた。このアッセイは、１３Ｃ３抗体はプロトフィブリル型のフラクションのみを特異的に認識するが、４Ｇ８抗体はすべてのフラクションを認識することを確認した。７ＰＡ２細胞株は、ハーバード大学医学部のＤｅｎｎｉｓ  Ｊ．Ｓｅｌｋｏｅによって提供された。
【０１０４】
実施例７：ＥＭによる１３Ｃ３の反応性の特性評価
染色方法は、標準的なプロトコル（Ｂｒｅｎｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｄａ  ３４，１０３−１１０（１９５９））を用いて行なった。少量（１０μｌ）の０．２ｍｇ／ｍｌのプロトフィブリルの溶液を、カーボン被膜Ｆｏｒｍｖａｒグリッド（４００メッシュ）に２分間塗布した。次いで、グリッドを１％ＢＳＡ中でブロックし、１３Ｃ３抗体と共にインキュベートし、その後、続いて金コロイドに結合した二次抗体と共にインキュベートした。試料を、３０秒ずつ、連続して２回、２％のリンタングステン酸の液滴上に設置することによって陰性染色した。過剰の染料を濾紙で取り除き、グリッドを空気乾燥させ、ＪＥＯＬ  １００ＣＸの透過電子顕微鏡で８０ｋＶで観察した。画像を大フォーマットＫｏｄａｋ  ４４８９ネガに記録し、フラットベッドスキャナでデジタル化した。
【０１０５】
ＩＥＭ（免疫電子顕微鏡）像は、抗Ａβ抗体クローン１３Ｃ３のＡβ４２線維への結合特異性を示し（図７Ｂおよび７Ｃ）、一方、アイソタイプコントロール抗体であるＩｇＧ１は結合を示さない（図７Ａ）ことを示す。二次抗体は、金コロイド粒子に結合している。
【０１０６】
実施例８：ヒトＡＤのマウスモデルの１３Ｃ３治療
１３Ｃ３モノクローナル抗体を、アルツハイマー病マウスモデルであるＴｇＣＲＮＤ８におけるＡβプラークの治療に用いた。マウスは、１月齢以内に現れる、マウスの脳におけるＡβアミロイドプラークの沈着を加速する、ヒトＡＰＰ６９５  ｃＤＮＡ導入遺伝子（トランスジーン）を有する。５週齢の５匹のＴｇＣＲＮＤ８マウスの試料群は、７週間の間、週１回、マウスの体重に対して１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、１３Ｃ３モノクローナル抗体の免疫化を与えられた。５匹のＴｇＣＲＮＤ８マウスの第２群に、治療コースを与えられたが、アイソタイプコントロールＩｇＧ１抗体が投与された。週１回に代えて、週２回の治療にして実験を繰り返した。
【０１０７】
コントロールおよび実験動物の両方を１２週齢で致死させた。脳の組織標本から、１３Ｃ３で治療したマウスにおいてＡβプラークの減少が明らかになった。
【０１０８】
ＴｇＣＲＮＤ８マウスからの凍結保存された脳の連続切片を、１３Ｃ３またはＩｇＧ１モノクローナル抗体で処理した。図８Ａおよび８Ｂは、それぞれの抗体間のＡβアミロイドプラークの数の差を表す。
【０１０９】
統計的ｔ検定によって、週１回の１３Ｃ３抗体での治療は、アルツハイマー病モデルにおいてＡβアミロイドプラークを減少させる（図９Ａ）ことが示される。しかしながら、週２回の治療（図９Ｂ）は、同様の水準のプラークの減少を示す。
【０１１０】
上記のＴｇＣＲＮＤ８マウスはすべて、トロント大学のＤａｖｉｄ  Ｗｅｓｔａｗａｙ博士によって提供されたものである。
【０１１１】
実施例９：ＭＡＢ  １３Ｃ３の可変領域の分子特性評価
ＩｇＧ重鎖可変領域およびＩｇＧカッパ軽鎖領域を、１３Ｃ３ハイブリドーマからクローニングした。重鎖および軽鎖の両方の配列（図１０）が、ＥＭＢＬ−バンクおよびＥｎｓｅｍｂｌデータライブラリ（Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ６７１−４（２００５））から抽出された、ヒトおよびマウスの免疫グロブリン遺伝子座からの生殖系列バリアブル遺伝子のデータベースである、ＶＢＡＳＥ２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ）を用いて解析された。解析の結果から、重鎖および軽鎖可変領域の両方が、新たに同定された免疫グロブリンからであるが、データベースの他の免疫グロブリンの可変領域と、それぞれ７３％および８１％の同一性を有することが確認された。また、フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が、これらのデータベースに対して、これらの配列において同定された。結果は、ＶＢＡＳＥ、ＲＡＢＡＴおよびＩＭＧＴ／ＬＩＧＭデータベースに対して配列を分析した場合とわずかに異なっただけであった。
【０１１２】
実施例１０：ＡＰＰトランスジェニックマウスにおける１３Ｃ３の急性末梢投与は、参照抗体３Ｄ６の投与と異なり血漿Ａβの増加を招かない
ＡＰＰトランスジェニックマウス（Ｔｈｙ  ＡＰＰＳＬ、１０−１４週齢）に、抗体１３Ｃ３、コントロールＩｇＧ１（ＤＭ４、Ａβを認識しない）、およびＡβのすべてのコンフォマーを認識する参照抗Ａβ抗体３Ｄ６を、１０ｍｇ／ｋｇ（すなわち３００μｇ／マウス）の投与量で腹腔内注射した。血漿Ａβは、同じマウスで、注射前の時間０、注射後６時間、２４時間および７日で定量した。血漿Ａβの定量は、１３Ｃ３または３Ｄ６のＡβへの結合を妨げない抗Ａβ抗体対を用いたイムノアッセイによって行なった。
【０１１３】
Ａβのすべてのコンフォマーに対する抗体である３Ｄ６の投与は、おそらくＡβ分子を分解から保護することによって、血漿Ａβの大幅な増加を招く。この効果は、抗Ａβ免疫療法の作用のメカニズムとして、潜在的な「末梢沈降」仮説を示唆するために用いられた（Ｄｅｍａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＰＮＡＳ  １７：８８５０）。３Ｄ６と異なって、１３Ｃ３の投与は、全く血漿Ａβの濃度の上昇を導かない。これは、Ａβのプロトフィブリルの形態に対して特異的であり、Ａβペプチドの可溶性単量体またはオリゴマーの形態を認識しない抗体である１３Ｃ３の特性と一致する。これらの形態は、おそらく、血漿中に存在するものである。
【０１１４】
実施例１１：１３Ｃ３はＡＤ脳におけるヒトアミロイド神経炎プラーク（凝集）を認識するが、参照３Ｄ６抗Ａβ抗体と異なってＡβ沈着を拡散しない
ヒトのアルツハイマーと診断された脳の切片についての免疫組織化学研究を、１３Ｃ３および３Ｄ６抗体を用いて、標準的な技術を用いて行なった。抗体の免疫染色を、ＤＡＢ色原体を用いて検出した（図１２）。１３Ｃ３は、成熟アミロイド神経炎プラーク（濃密プラークともいう）の典型的なモルフォロジーを有するアミロイド沈着を、より軽いハロに囲まれた非常に高密度のコアで、またはより大きなプラークの場合、非常に強い染色で、標識する。隣接する脳の切片において、より低倍率で見た場合（図１２、左側のパネル）、３Ｄ６は、１３Ｃ３に比べてより多くの対象を染色する。より高倍率でのさらなる特性評価（図１２、右側のパネル）は、３Ｄ６が、１３Ｃ３と同じ成熟アミロイド神経炎プラークを標識し、加えて、抗Ａβ免疫標識を用いて古くから記載されていた、多数の拡散アミロイド沈着を標識することを示した。拡散プラークは、チオフラビンＳおよびフィブリルの他の組織学的マーカーによって検出されないため、文献（Ｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２１：１３３）に記載されるように、フィブリルの性質を有さない。２つの抗体の感度の差を除外するために、同様の実験を高濃度（２０μｇ／ｍｌ）の１３Ｃ３を用いて行なったが、再び、拡散沈着は検出されなかった。このデータは、３Ｄ６と異なって、Ａβのプロトフィブリルの形態に対して特異的であり、Ａβペプチドの可溶性単量体またはオリゴマーの形態を認識しない抗体である１３Ｃ３の特性と一致する。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、アルツハイマー病の治療および診断に適用される。
【０１１６】
本明細書中に引用されるすべての文献、特許文献および非特許文献の両方は、本発明は属する技術分野における当業者の技術水準を示す。これらの文献はすべて、各文献が具体的におよび個々に参照として組み込まれることを示された場合と同等の範囲まで、全体が参照として本明細書中に組み込まれる。
【０１１７】
本明細書中に記載された発明は、特定の実施形態を参照して説明されてきたが、これらの実施形態は、本発明の原理および応用を単に説明するためのものであると理解されるべきである。したがって、以下の特許請求の範囲にとって定義される本発明の精神および技術的範囲を逸脱することなく、例示的な実施形態に多様な修正が行われ、他の変更が行なわれうることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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