(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機相（Ｉ）及びミネラル相（ＩＩ）を含む合成材料であり：
−有機相（Ｉ）はコラーゲンＩトリプルへリックスから構成される線条のあるコラーゲンフィブリルを含み、前記線条の間隔は６７ｎｍであり、フィブリルは整列されたドメイン及びコレステリックドメインと関連した三次元ジオメトリーでは長い距離にわたり整列されているが、等方性ドメインではそれらは整列されておらず；
−ミネラル相（ＩＩ）は空間群６／ｍの六角形結晶構造を有するアパタイト結晶を有し、この結晶は少なくともカルシウムイオン及び少なくともリン酸イオンを含むものであり；
−ミネラル相のアパタイト結晶の軸ｃは、有機相の線条のあるコラーゲンフィブリルの長手方向軸に共整列されており；
−材料中のコラーゲン含有量は７５ｍｇ／ｃｍ3以上である、材料。
【請求項２】
ミネラル相は精製ヒドロキシアパタイト結晶からなる請求項１の材料。
【請求項３】
ミネラル相は下式（Ｉ）の化学量論的ヒドロキシアパタイト結晶からなる請求項１又は２の材料。
Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2                （Ｉ）
【請求項４】
式（Ｉ）のヒドロキシアパタイト結晶のＣａ／Ｐ原子比は１．６７である請求項３の材料。
【請求項５】
ミネラル相は少なくとも水酸化物イオンを同様に含むアパタイト結晶を含み、その中ではリン酸イオン及び／又は水酸化物イオンは部分的に炭酸イオンにより置換されている請求項１の材料。
【請求項６】
ミネラル相は、Ｃａ2+イオン、ＰＯ43-イオン及びＯＨ-イオンを含み、その中の少なくとも１のＣａ2+、ＰＯ43-又はＯＨ-イオンは部分的にその他のイオンで置換されているむアパタイト結晶を含む請求項１の材料であり：
−部分的にＣａ2+イオンと置換可能なイオンはＭｇ2+、Ｃｕ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+、Ｃｄ2+、Ｐｂ2+、Ｎａ+、Ｋ+及びＥｕ3+イオンから選ばれ；
−部分的にＰＯ43-イオンと置換可能なイオンはＣＯ32-、ＳｉＯ43-、ＡｓＯ43-、ＭｎＯ43-、ＶＯ43-、ＣｒＯ43-及びＨＰＯ42-イオンから選ばれ；
−部分的にＯＨ-イオンと置換可能なイオンはＣＯ32-、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、Ｓ2-及びＯ2-イオンから選ばれる、材料。
【請求項７】
プロテオグリカン、グリコサミノグリカン及び／又はミネラル化を促進する有機分子を２％未満の量で含む請求項１〜６いずれか１項記載の材料。
【請求項８】
有機相（Ｉ）の前駆体であるコラーゲンの初期酸性水溶液、及びミネラル相（ＩＩ）の前駆体である少なくとも１の水溶液を調製するステップと、ｐＨ値を少なくとも７まで上昇させてコラーゲンを沈殿させるステップとを含む請求項１の材料の製造方法であり；
−酸性水溶液中のコラーゲン濃度は少なくとも７５ｍｇ／ｍｌで、かつ前記ｐＨの上昇中は一定であり、
−ミネラル相前駆体は少なくとも１のカルシウム塩及び少なくとも１のリン酸塩を含み、
−ミネラル相（ＩＩ）の沈殿は、ミネラル相前駆体溶液を有機相（Ｉ）へ接触させることにより行われ、前記接触は有機相（Ｉ）の沈殿の前又は後に行われる、方法。
【請求項９】
有機相（Ｉ）のコラーゲンはミネラル相（ＩＩ）の前駆体の中性溶液と接触する前に沈殿させる請求項８の方法であって、前記中性溶液は少なくともカルシウム塩及び少なくともリン酸塩を含む方法。
【請求項１０】
有機相（Ｉ）の前駆体の酸性溶液をミネラル相（ＩＩ）の前駆体の酸性溶液と接触させ、得られた混合物のｐＨを上昇させてコラーゲン及びアパタイトの共沈殿を生じる請求項８の方法。
【請求項１１】
濃縮された有機相（Ｉ）の前駆体の酸性溶液を透析膜中に封入されたモールド中に収容し、次に全体をミネラル相（ＩＩ）の前駆体の溶液中に浸漬する請求項１０の方法。
【請求項１２】
コラーゲンの濃縮溶液を透析膜からなる可撓性エンベロープ中へ導入し、次に前記エンベロープをミネラル相（ＩＩ）の前駆体の溶液中に浸漬する請求項１０の方法。
【請求項１３】
前記ミネラル相ＩＩは精製ヒドロキシアパタイト結晶からなる請求項２記載の材料を製造する請求項８の方法であり、それが置かれた密閉チャンバー内で行われ：
−少なくとも１の第一コンテナが、ミネラル相ＩＩの前駆体である、少なくとも１のリン酸塩及び少なくとも１のカルシウム塩の水溶液を含み、その溶液中に、有機相（Ｉ）の前駆体であるコラーゲンの初期酸性水溶液が収容されている少なくとも１の透析バッグが浸漬され；
−少なくとも１の第二コンテナはアンモニア水溶液又は（ＮＨ4）2ＣＯ3パウダーを収容しており；
−（ミネラル相Ｉ前駆体溶液の体積）／（密閉チャンバー内容積）割合は２×１０-3であり；
−第一コンテナ中に収容されたミネラル相Ｉ前駆体溶液の高さは３〜５ｃｍの範囲であり、前記コンテナの直径は２〜５ｃｍであり；
−（アンモニア水溶液の体積）／（密閉チャンバー内容積）割合は８×１０-3であるか、（（ＮＨ4）2ＣＯ3パウダーの体積）／（密閉チャンバー内容積）割合は６×１０-3である方法。
【請求項１４】
コラーゲンの初期酸性水溶液のコラーゲン濃度は７５ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬであり、酸の存在下でｐＨは４未満である、請求項８の方法。
【請求項１５】
ミネラル相（ＩＩ）の前駆体の溶液の、カルシウム前駆体濃度は溶解限度未満であり、フォスフェート前駆体濃度は溶解限度未満であり、前駆体の量はＣａ／Ｐモル比が１．５〜１．８となる範囲である、請求項８の方法。
【請求項１６】
請求項６の材料を製造するための請求項８の方法であって、ミネラル相前駆体の溶液は又、そのカチオンは少なくとも部分的にＣａ2+と置換されることを意図する１以上の塩、及び／又は、そのアニオンは少なくとも部分的にＰＯ43-又はＯＨ-と置換されることを意図する１以上の塩を含む、方法。
【請求項１７】
請求項７の材料を製造するための請求項８の方法であって、ミネラル相（ＩＩ）の前駆体の溶液は又、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン及び／又はミネラル化を促進する有機分子を含む、方法。
【請求項１８】
ｐＨの上昇は塩基性気体雰囲気により行われる請求項８の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨代用物及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は、主に、細胞、有機タンパク質ネットワークを構成するコラーゲンＩ型、及びナノメーターサイズのヒドロキシアパタイト結晶からなるミネラル相を構成要素とするハイブリッド材料である。この大スケールの有機／ミネラル三次元連合体は、骨組織へ弾力性及び硬さの両方を付与し、骨組織へ負荷される力に耐えることを可能とする。従って、骨は硬く、高密度で非常に強い。
【０００３】
Weiner及びWagner(Ann.Rev.Mater.Sci.28,271-298,1998)らは、下記記載及び添付図１に示される７レベルへ分類可能な種々のスケールに基づく階層的組織を提案記載した：
レベル１（図１ａ）：骨の２個の主要な基本的コンポーネント構成要素、即ち、ヒドロキシアパタイト小板(platelet)及び線条のあるコラーゲンフィブリルは、組織の第一階層レベルを構成する。これは、ナノメータースケールでの組織の最も低いレベルである。アパタイト相は特に、特徴的な（００２）及び（３００）等の細網間面(inter-reticular plane)の存在により特徴付けられる。アパタイト結晶は、この組織レベルでは、特別の配向性を示さない。コラーゲンフィブリルは、電子顕微鏡により視認可能な周期的線条により特徴付けられ、その線条は複数のコラーゲンＩ分子のアセンブリの結果であり、６７ｎｍの周期的シフトを引き起こす。
【０００４】
レベル２（図１ｂ）：ヒドロキシアパタイト小板が、それらの軸ｃに従い、線条のあるコラーゲンフィブリルの主軸に沿って共整列して、第二レベルを構成する。即ち、アパタイトの細網間面（００２）はフィブリルの主軸に対して垂直に、従って、コラーゲンフィブリル（線条＝６７ｎｍ）の軸的周期性に従い（即ち、線条に従い）配向される。文言「ミネラル化されたコラーゲンフィブリル」が使用される（幅１００〜３００ナノメーター）。レベル２もまた、ナノメータースケールである。
【０００５】
レベル３（図１ｃ）：幾つかのミネラル化されたコラーゲンフィブリルは、平行な束で並んで組み立てられ、ミネラル化されたコラーゲン線維を形成する（幅１〜３マイクロメーター）。マイクロメーター的スケールはこの組織レベル３で到達する。
レベル４（図１ｄ）：ミネラル化されたコラーゲンフィブリル又は線維は、三次元組織化されるために複雑に込み入っている。特に、このレベルで、フィブリル／線維が、優先的な方向に長い距離にわたり(over a large distance)、整列される場合及び／又は「コレステリック」ジオメトリーに従ったそれらのスタックに特徴的なアーチ状構造を形成する場合、ドメインの共存を区別することが可能である。フィブリル／線維が組織化されていない場合のドメイン（「等方性」ドメイン）も又、区別できる。スケールはマイクロメーターからミリメーターまで変化する。
【０００６】
レベル５（図１ｅ）：高密度(compact)骨は、「オステオン」と称されるミリメーターサイズの平行な円筒状構造構成を有す。断面では、これらオステオンは同心円状コラーゲンラメラからなることが認められる。
レベル６（図１ｆ）：長骨のセルリッチ中心部分は「海綿骨」と呼ばれる。この骨中で、骨ラメラは薄く不規則な列(row)のマクロ多孔質ネットワークを形成する。高密度骨／海綿骨コンビネーションは、組織レベル６を構成する。スケールは１ミリメーターを超える。
レベル７（図１ｇ）：最終レベルは非常に単純な全体骨である。
【０００７】
合成材料（「インプラント材料」と称する）又は天然材料（「グラフト」と称する）の幾つかのクラスが先行技術で提示されている。インプラント材料は一般に生体不活性がある、即ち単に（生体）組織により許容される、又は生体適合性がある、即ち宿主組織中に完全に統合される。グラフトは、移植対象の患者から採取される（自家移植）か、他人から採取される（同種移植）骨組織であり、一般に骨誘導性、即ち骨再生の誘導が可能である。
【０００８】
しかしながら、骨誘導性骨代用物、即ち骨再建を誘導可能なものは、空想的な代用物に過ぎない。このような材料の開発は困難で複雑である。これら材料を目的の場所に配置するには、ヒト又は動物身体中でのその完全な統合を最適化し、かつ拒絶反応を避けるために、特定の結晶相及び化学的性質を有する構成要素を使用する必要がある。その三次元的組織体は再建されて、宿主組織によるその代用物のコロニゼーションに適している、第一に機械的性質、第二に多孔性を提供する必要がある。有機的骨ネットワーク（２０質量％）の組織体へのアクセス、及び組織内でのそのミネラル相（７０質量％）とのその連合は、in vitroで再生するのが非常に困難である。
【０００９】
骨代用物の合成の観点から多くの研究、特にコラーゲンミネラル化に関する研究、がなされてきた。シチメンチョウ骨腱コラーゲンのミネラル化はW.Traubら[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989,86,9822-9826]により研究されたが、得られた材料は骨組織体と類似の(analogous)性質を示さなかった。他の試験がin vitroで、精製コラーゲンにより行われたが、試験が行われた強度の希釈条件下では、生体骨組織中に認められる骨密度及び三次元的コラーゲン組織体を有する材料を得ることは不可能であった[参照D.Lickorishら(J.Biomed.Mat.Res.2004,68A,19-27);S.Yunokiら(Mat.Lett.,2006,60,999-1002);D.A.Wahlら(Eur.Cell.Mat.2006,11,43-56)]。
【００１０】
周囲温度での（ＮＨ4）ＣＯ3パウダーの熱分解により発生する、アンモニア雰囲気下でのＣａＣｌ2溶液からの方解石ＣａＣＯ3の結晶化が、L.Addadiら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987,84,2732-2736)により記載された。
【００１１】
酸溶液からｐＨ上昇によりコラーゲンを沈殿させることは公知の手法である。R.L.Ehrmanら(J.Nat.Cancer Inst.1956,16,1375-1403)は、コラーゲンの酢酸溶液をＮＨ3蒸気と接触させる方法を記載している。それは微粒子を含むゲルへ変換する。得られた材料構造は記載されていない。
【００１２】
M.M.Giraud-Guilleら(J.Mol.Biol.1995,251,197-202)及び(J.Mol.Biol.1992,224,861-873)は、コラーゲンの濃縮溶液を使用して得られる「液晶」構造、及びｐＨを酸性から塩基性へ上昇させることにより得られるゾル−ゲル転移を記載している。
【００１３】
G. Mosser, M.M.Giraud-Guille ら (Matrix Biol. 2006, 25, 3-13)は、コラーゲンの酸性溶液（５ｍｇ／ｍＬ）をガラスのマイクロチャンバー中で徐々に濃縮して、コラーゲン分子の広範囲に及ぶらせん状組織体及び濃度勾配を得る方法を記載している。次に、この溶液をアンモニア蒸気と接触させ、コラーゲンフィブリルを形成し、液体相中に保持された組織体を安定化させる。
【００１４】
B.A.Harleyら(Biomaterials 2006, 27, 866-874)も同様に、グルコサミノグリカンを含むコラーゲンの構造化マトリックスの製造を記載している。コラーゲンマイクロフィブリルは、コンドロイチン硫酸塩と４℃で均一混合される。次に溶液は、モールド中で遠心分離され、超急速凍結され、凍結乾燥され、次に１０５℃で５０ｍＴｏｒｒ真空下で２４時間架橋される。コラーゲンのフィブリル特性は記載されていない。
【００１５】
C.Guoら(Biomaterials 2007, 28, 1105-1114)は、コラーゲンフィブリル溶液の整列のために磁気ビーズを使用することを記載している。濃度２．５ｍｇ／ｍｌのリン酸緩衝溶液中で調製され、４℃に保持されたコラーゲン溶液を、磁気ビーズと接触させる。同様に同一サンプルを、最終コラーゲン濃度１．２ｍｇ／ｍｌで細胞存在下で調製する。両方のケースで、サンプルを１Ｇ未満の磁界中に置き、温度を３７℃まで上昇させてフィブリル生成を誘導する。ＣＯ2雰囲気が、細胞がマトリックス中へ統合される時に使用される。マトリックスは非常にゆるやかであり、コラーゲンのフィブリル特性は記載されていない。M.J.Olsza ら(Calcif. Tissue Int. 2003, 72, 583-591)は、ポリ（アスパラギン酸）型ポリマーの存在下又は非存在下でのコラーゲンスポンジの石灰化を記載した。コラーゲンスポンジは、ウシ腱から得られたコラーゲンＩ型から構成されている。ミネラルは炭酸カルシウムであり、リン酸カルシウムではなく、従ってアパタイト相は得られていない。線条のある線維の存在は記載されておらずコラーゲン線維は配向されていない。J.H.Bradtら(Chem. Mater. 1999, 11, 2694-2701)は、ＨＣｌで酸性化され、ＣａＣｌ2を含む、１ｍｇ／ｍＬのコラーゲン溶液（カーフ皮膚コラーゲンＩ型）である第一溶液、及びリン酸イオンを含む緩衝溶液である第二溶液の２種の溶液を４℃で調製する方法を記載した。次にリン酸溶液は、コラーゲン溶液と混合され、ｐＨ６．８となることを可能とし、全混合物を３０℃へ加熱する。共沈殿は、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト及びオクタリン酸カルシウムを含有する混合物相を生じる。更に、コラーゲン線維は単離された非配向線維であり、高密度マトリックスを構成しない。N.Gehrke, N.Nassifら(Chem. Mater. 2005, 17, 6514-6516)は、ポリ（アスパラギン酸）型ポリマーの存在下又は非存在下での、予め脱ミネラル化された真珠層有機的ネットワークの、炭酸カルシウムによる再ミネラル化を記載している
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】G. Mosser, M.M.Giraud-Guille ら(Matrix Biol. 2006, 25, 3-13)
【非特許文献２】B.A.Harleyら(Biomaterials 2006, 27, 866-874)
【非特許文献３】C.Guoら(Biomaterials 2007, 28, 1105-1114)
【非特許文献４】M.J.Olsza ら(Calcif. Tissue Int. 2003, 72, 583-591)
【非特許文献５】J.H.Bradtら(Chem. Mater. 1999, 11, 2694-2701)
【非特許文献６】N.Gehrke, N.Nassifら(Chem. Mater. 2005, 17, 6514-6516)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
今日まで、天然骨で観察される、アパタイト結晶のミネラル相で連合されたレベル４のコラーゲンの三次元的組織体を再生する骨代用物を得ることを可能とする公知の合成方法は存在しない。
本発明の目的は、生体骨の構造と非常に近似する構造（レベル４）を有する生体適合性のある骨代用物として使用できる合成的材料、及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の合成的材料は、有機相（Ｉ）及びミネラル相（ＩＩ）を含む。
有機相（Ｉ）はコラーゲンＩトリプルへリックスから構成される線条のある(striee)コラーゲンフィブリルを含み、前記線条(striation)の周期的間隔は約６７ｎｍであり、フィブリルは整列されたドメイン及びコレステリックドメインと関連した三次元ジオメトリーでは長い距離にわたり整列(ordonnees a grande distance)されているが、等方性ドメインではそれらは整列されていない。
【００１９】
ミネラル相（ＩＩ）は空間群６／ｍの六角形結晶構造を有するアパタイト結晶を有し、この結晶は少なくともカルシウムイオン及び少なくともリン酸イオンを含む。
本発明の材料中で、ミネラル相のアパタイト結晶の軸ｃは、有機相の線条のあるコラーゲンフィブリルの長手方向軸に共整列(co-aligned)されている。
材料中のコラーゲン含有量は７５ｍｇ／ｃｍ3以上である。
前記材料中、種々のドメイン（コレステリック、整列された、等方性）の大きさのオーダーは、約５０ミクロンである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】７個のレベルのスケールに基づく骨の階層的組織を示す。
【図２】Ｘ線散乱による材料分析を示す。
【図３】ミネラル化され配向されたフィブリルの存在を示す顕微鏡写真である。
【図４】トルイジンブルー染色された半薄切片の偏光光学的顕微鏡での観察写真である。
【図５】Ｘ線散乱による材料分析である。
【図６】らせん状組織体（コレステリックドメイン）を示すミネラル化された線維の存在を示す、ＳＥＭ顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の特別の例では、ミネラル相は精製ヒドロキシアパタイト結晶から構成される。本発明の目的において、用語「精製ヒドロキシアパタイト」は、ブラシュ石等の他のリン酸結晶相を含まないヒドロキシアパタイトを意味する。
【００２２】
本発明の他の例では、ミネラル相は下式（Ｉ）の化学量論的ヒドロキシアパタイト結晶からなる。
Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2                  （Ｉ）
【００２３】
本発明の他の例では、式（Ｉ）のヒドロキシアパタイト結晶のＣａ／Ｐ原子比は１．６７である。
本発明の他の例では、ミネラル相は少なくとも水酸化物イオンも含むアパタイト結晶を含み、その中ではリン酸イオン（Ｂ型）及び／又は水酸化物イオン（Ａ型）は部分的に炭酸イオンにより置換されている。
これらヒドロキシアパタイト中で、結晶構造の１以上のサイトはイオンフリーでもよい。この場合、それらは１以上のイオンギャップとして記載されるものを含む非化学量論的ヒドロキシアパタイトである。
【００２４】
他の例では、ミネラル相はＣａ2+イオン、ＰＯ43-イオン及びＯＨ-イオンを含み、その中の少なくとも１のＣａ2+、ＰＯ43-又はＯＨ-イオンは部分的にその他のイオンで置換されているアパタイト結晶を含む。
部分的にＣａ2+イオンと置換可能なイオン中、Ｍｇ2+、Ｃｕ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+、Ｃｄ2+、Ｐｂ2+、Ｎａ+、Ｋ+及びＥｕ3+イオンが挙げられる。
部分的にＰＯ43-イオンと置換可能なイオン中、ＣＯ32-、ＳｉＯ43-、ＡｓＯ43-、ＭｎＯ43-、ＶＯ43-、ＣｒＯ43-及びＨＰＯ42-イオンが挙げられる。
部分的にＯＨ-イオンと置換可能なイオン中、ＣＯ32-、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、Ｓ2-及びＯ2-イオンが挙げられる。
【００２５】
本発明の材料は、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン及び／又はミネラル化を促進する有機分子を最小量で含む。ここで、用語「最小量」は、２％未満の割合を意味することを意図する。
【００２６】
本発明の材料の特性は、光学的顕微鏡分析、走査型電子顕微鏡ＳＥＭ分析、透過型電子顕微鏡ＴＥＭ分析及びＸ線回折分析により決定できる。
本発明の材料の半薄切片は、偏光光学的顕微鏡で観察されて複屈折性を示した。理論的には、顕微鏡プラットフォームの回転の間それらのフリンジの動きに関連する、照明されたバンド及び消光されたバンドの変化が観察された場合、それはらせん構造を示す。
本発明の材料のサンプルは、ＳＥＭ分析され、ミネラル化された層中に埋められた（immerged）配向フィブリルを示したが、約１マイクロメーターの別個に区別できる結晶集合体の存在は無かった。
【００２７】
本発明の材料のＸ線小角散乱イメージは、コラーゲンフィブリルの異方性シグナル及び周期Ｄ＝６７ｎｍの調波（harmonics of the period）を示す。Ｘ線広角散乱イメージは、アパタイト相の複数の主ピークを示す。フィブリルのシグナル及びミネラルのシグナル間の共整列の存在は、本発明の材料を特徴付ける。この共整列は、更に特にフィブリルが整列された領域中に局部的に示される。
【００２８】
本発明の材料は、有機相（Ｉ）の前駆体であるコラーゲンの初期酸性水溶液、及びミネラル相（ＩＩ）の前駆体である少なくとも１の水溶液を調製するステップと、ｐＨ値を少なくとも７まで上昇させてコラーゲンを沈殿させるステップとを含む方法により製造できる。その方法は下記特徴を有する；
【００２９】
−酸性水溶液中のコラーゲン濃度は少なくとも７５ｍｇ／ｍｌで、かつ前記ｐＨの上昇中は一定であり、
−ミネラル相前駆体は少なくとも１のカルシウム塩及び少なくとも１のリン酸塩を含み、
−ミネラル相（ＩＩ）の沈殿は、ミネラル相前駆体溶液を有機相（Ｉ）へ接触させることにより行われ、前記接触は有機相（Ｉ）の沈殿の前又は後に行われる。接触時間は、沈殿速度及び最終材料中に予測されるミネラルフィラーのレベルに応じて設定される。
【００３０】
前記方法の第一例では、有機相（Ｉ）のコラーゲンはミネラル相（ＩＩ）の前駆体の中性溶液と接触する前に沈殿させる。この場合、ミネラル相（ＩＩ）の前駆体の溶液は少なくともカルシウム塩及び少なくともリン酸塩を含む。最終材料中のミネラル相の割合は、溶液内に導入されるイオン量により調整される。この例では、コラーゲンは、それがミネラル相と接触する前に、フィブリル性構造をとっている必要がある。
【００３１】
前記方法の第二例では、有機相（Ｉ）の前駆体の酸性溶液を（ＩＩ）の前駆体の酸性溶液と接触させる。この混合物は次にｐＨを上昇させてコラーゲン及びアパタイトの共沈殿を生じさせる。この例では、コラーゲン初期濃度を一定に保つことが特に重要である。希釈防止の第一手段は、濃縮された有機相（Ｉ）の前駆体の酸性溶液をモールド中に収容することであり、そのモールドの形状は目的用途に適したものであり、それは透析膜中に封入される。第二手段は、濃縮されたコラーゲン溶液を透析膜からなる可撓性エンベロープ中に導入することである。モールド又はエンベロープは、次にミネラル相（ＩＩ）の前駆体の溶液中に浸漬される。
【００３２】
本発明の材料のミネラル相ＩＩが精製ヒドロキシアパタイト結晶からなる場合、本発明の方法は、好ましくはそれが置かれた密閉チャンバー内で行われ；
−少なくとも１の第一コンテナが、ミネラル相ＩＩの前駆体である、少なくとも１のリン酸塩及び少なくとも１のカルシウム塩の水溶液を含み、その溶液中に、有機相（Ｉ）の前駆体であるコラーゲンの初期酸性水溶液が収容されている少なくとも１の透析バッグが浸漬され；
−少なくとも１の第二コンテナはアンモニア水溶液又は（ＮＨ4）2ＣＯ3パウダーを収容しており；
−（ミネラル相Ｉ前駆体溶液の体積）／（密閉チャンバー内容積）割合は約２×１０-3であり；
−第一コンテナ中に収容されたミネラル相Ｉ前駆体溶液の高さは約３〜５ｃｍの範囲であり、前記コンテナの直径は約２〜５ｃｍであり；
−（アンモニア水溶液の体積）／（密閉チャンバー内容積）割合は８×１０-3であるか、（（ＮＨ4）2ＣＯ3パウダーの体積）／（密閉チャンバー内容積）割合は約６×１０-3である。
【００３３】
これら条件に準拠した場合、ミネラル相ＩＩは精製アパタイトからなり他種のリン酸カルシウム相を含まない材料が得られる。
【００３４】
コラーゲンの初期酸性水溶液は、好ましくは下記特性を有する。
−コラーゲン濃度は７５ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１００ｍｇ／ｍＬ〜４００ｍｇ／ｍＬである。
−ｐＨは４未満、好ましくは３未満であり、酸、好ましくは０．５Ｍ酢酸の存在下である。
【００３５】
ミネラル相（ＩＩ）の前駆体の溶液は、好ましくは下記特性を有する。
−カルシウム前駆体、例えばＣａＣｌ2、の濃度は溶解限度未満、好ましくは２．５ｍＭ〜１．５Ｍ、より好ましくは１１〜５５０ｍＭである。
−リン酸前駆体、例えばＮａＨ2ＰＯ4、の濃度は溶解限度未満、好ましくは１．５〜９００ｍＭ、より好ましくは６６〜３３０ｍＭである。
−前駆体の量はＣａ／Ｐモル比が１．５〜１．８となる範囲、好ましくは約１．６７である。
【００３６】
一例として、２０℃での溶解限度は、ＮａＨ2ＰＯ4は７．０８Ｍであり、ＣａＣｌ2は３．８３Ｍである。
【００３７】
目的材料のミネラル相が、Ｃａ2+イオン、ＰＯ43-イオン及びＯＨ-イオンを含み、その中の少なくとも１のＣａ2+、ＰＯ43-又はＯＨ-イオンは部分的にその他のイオンで置換されているアパタイト結晶を含む場合、ミネラル相前駆体の溶液は又１以上の塩を含み、そのカチオンは少なくとも部分的にＣａ2+と置換されることを意図され、及び／又は、そのアニオンは少なくとも部分的にＰＯ43-又はＯＨ-と置換されることを意図される。
【００３８】
Ｃａ2+と置換されることを意図するカチオンの塩は、好ましくは一価又は二価カチオンを含む塩、例えばＭｇＣｌ2、ＢａＣｌ2、ＳｒＣｌ2、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＮＨ4Ｃｌを含む。ＣＯ32-前駆体はＮａＨＣＯ3でもよい。ＣＯ32-前駆体の量は、好ましくはＮａＨ2ＰＯ4／ＮａＨＣＯ3割合が１となる量である。炭酸塩の存在下で、Ｃａ／（Ｐ＋Ｃ）モル比は１．５〜１．８、好ましくは約１．６７である。
【００３９】
ミネラル相（ＩＩ）前駆体溶液は又、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン及び／又はミネラル化を促進する有機分子、酸性アミノ酸ポリマー鎖等、好ましくはポリ（アスパラギン酸）であり、鎖長５〜１５０、好ましくは約１５アミノ酸ユニットを有する、を含み、濃度は０．０１μｇ／ｍＬ〜１．５ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬである。
【００４０】
ｐＨの上昇は、好ましくは塩基性気体雰囲気、特にＮＨ3雰囲気、又は（ＮＨ4）2ＣＯ3雰囲気により行われ、特別の態様ではＰＯ43-又はＯＨ-は部分的にＣＯ32-で置換される。
【００４１】
特別の例として、本発明の方法は、共沈殿により得られた材料が生体液（体液）に類似する「ＳＢＦ」（Simulated Body Fluid）溶液で含浸される追加的ステップを含み、、次に溶媒のｐＨは７．４へ調整される。
ＮａＣｌ：１３７〜２１３ｍＭ（例えば２１３．０ｍＭ）、
ＮａＨＣＯ3：１．２〜６．３ｍＭ（例えば、６．３ｍＭ）、
ＫＣｌ：３〜４．５ｍＭ（例えば４．５ｍＭ）、
Ｋ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ：１〜１．５ｍＭ（例えば１．５ｍＭ）、
ＣａＣｌ2：２．６〜３．８ｍＭ（例えば３．８ｍＭ）、
Ｎａ2ＳＯ3Ｎａ2ＳＯ4：０．５〜０．７５ｍＭ（例えば０．７５ｍＭ）、
ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：１．５〜２．３ｍＭ（例えば２．３ｍＭ）。
【００４２】
このＳＢＦ溶液濃度は、生体液用に実際に測定されたものの約１．５倍を示す（参照Zhang L.J.ら, Mater. Lett. 2004, 58, 719-722）。
【００４３】
ｐＨは、０．０１ｍｏｌ／Ｌのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び０．０１ｍｏｌ／ＬのＨＣｌ混合物を用いて、３７℃で７．４へ調整することができる。
【実施例】
【００４４】
本発明は下記実施例により更に詳細に示されるが、これらは本発明を限定するものではない。
実施例中、下記手順に従い若齢Ｗｉｓｔａｒラットの尾から調製されたコラーゲンＩ型を使用した。ラット尾の腱を無菌層流フード内で切除し、次に１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、８．０７ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4及び１．４７ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄して、細胞及び血液の痕跡を除去した。次に腱を４Ｍ ＮａＣｌ溶液中に含浸して、残存するインタクト細胞を除去すると共に、高分子量タンパク質の一部を沈殿させる。緩衝生理食塩水で更に洗浄後、腱を５００ｍＭ酢酸水溶液へ溶解させる。得られた溶液を４１，０００ｇで２時間の遠心分離により清澄化する。コラーゲンＩ型以外のタンパク質を、３００ｍＭのＮａＣｌ水溶液から選択的に沈殿させ、次に４１，０００ｇで３時間の遠心分離により除去する。コラーゲンは、６００ｍＭ ＮａＣｌ水溶液からの沈殿による上澄みから回収され、３，０００ｇで４５分の遠心分離にかける。得られたペレットは、５００ｍＭ酢酸水溶液中に溶解し、次に同一の溶媒中で注意深く透析して完全にＮａＣｌを除去する。
【００４５】
溶液は４℃に維持して、使用前に４１，０００ｇで４時間遠心分離する。種々の濃度のコラーゲン溶液を、５００ｍＭ酢酸水溶液中に５０％（ｍ／ｖ）まで溶解されたポリエチレングリコール（３５ｋＤａ、Ｆｌｕｋａ製）に対する逆透析又は層流フード内でのゆっくりとした蒸発により調製する。酸性溶液のコラーゲン濃度は、フィブリル生成前にヒドロキシプロリン量を測定することにより決定された。勿論、他のコラーゲン源も使用可能である。
【００４６】
実施例１
ミネラル相前駆体溶液を、４０ｍＬの水、１１０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、６６ｍＭのＣａＣＬ2、５００ｍＭの酢酸及び０．４０μｇのポリ（アスパラギン酸）中に溶解させて調製した。溶液はＰＨ２．２で平衡である。
この実施例で使用されたコラーゲン溶液は、コラーゲンを約３００ｍｇ／ｍＬ量含有した。それは部分的にフィブリル性弾力性ゲルの形態である。
【００４７】
コラーゲン溶液を、透析バッグ（ＭＷ＝３５００Ｄａ）中に導入し、バッグをオープンコンテナ中の無機相前駆体溶液内に置いた。このコンテナを次に、温度２０℃で塩の完全な沈殿が起こるまでアンモニア雰囲気に置いた。
アンモニア雰囲気は、コラーゲン及びヒドロキシアパタイトの共沈殿を生じ、それは３時間以降視認できた。反応溶媒は、反応が完了するまで８日間放置できる。
サンプルを溶液、好ましくはＰＢＳリン酸緩衝溶液中に含浸させることにより洗浄した。
【００４８】
図２にＸ線散乱による材料分析を示す。図２ａはＳＡＸＳイメージを示し、図２ｂはＷＡＸＳイメージを示す。ＳＡＸＳイメージは、コラーゲンフィブリルの異方性シグナル及び間隔Ｄ＝６７ｎｍの調波を示す。これは、フィブリルの主軸に沿った６７ｎｍごとの線条周期性を示す。ＷＡＸＳイメージは、アパタイト存在の特徴である（００２）反射が、（ａ）で観察されたフィブリルシグナルと同じ方向に補強されていることを示す。従ってこれは、アパタイト結晶のｃ軸が、コラーゲンフィブリルの主軸に沿って配向していることを示す。フィブリル内のコラーゲン分子の距離間隔（interdistance）ｄlateralに対応するシグナルは、（００２）反射に垂直であり、アパタイトの（３００）反射に平行である。従って、細網間面は、コラーゲン分子の方向に優先的に配向されている。このＸ線散乱軌跡は、骨で観察されるものと同等である。
【００４９】
図３は、ＳＥＭ顕微鏡写真を示す。これは、ミネラル化され配向されたフィブリル（整列されたドメイン）の存在を示す。
【００５０】
図４は、材料の造影剤として働くトルイジンブルーで染められ、交差した偏光子（Ａ、Ｂ）間で偏光光学的顕微鏡により観察された半薄切片を示す。４Ｂは、交差している偏光子間であるが４Ａに比べ４５°回転して観察された４Ａと同じ領域を示す。複屈折は、一方では、有機相組織に依存するが、他方では、そのミネラル相による含浸に依存する。２種の偏光子位置間での複屈折バンドの変化は、別個のドメインの共存を示す：（ｉ）ミネラル化されたコラーゲンフィブリルが互いに整列されているため、４Ａ及び４Ｂ間で消滅する複屈折領域により特徴付けられる整列されたドメイン；及び（ｉｉ）ミネラル化されたコラーゲンフィブリルの配向は一の面から他の面へ規則的に回転するため、その明るいバンドと暗いバンドとの交代（alternating）は、４Ａ及び４Ｂ間で逆転する(invert)複屈折領域に特徴付けられるコレステリックドメイン。第３のドメインは、前記２種と共存するものであり、これはミネラル化されたコラーゲンフィブリルが材料内にランダムに分散されている「等方性」ドメインであり、従って、このドメインは４Ａ及び４Ｂ中で複屈折領域を示さない。
【００５１】
前記のとおり調製された材料の機械的性質、特に、ナノ押し込み硬さ評価(nanoindentation)技術に従った弾性率、の測定評価も行われた。測定評価は、商品名Ｕｂｉ１ナノメカニカル押し込み硬さ評価システム（Hysitron Inc.社製、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）及びBerkovichインデンターチップ、〜１０μｍ2により行われた。コラーゲンフィブリルの長手方向軸に対して０°及び９０°の弾性率は、１．４３±１．１８であった。この率の大きさのオーダーは、天然の高密度骨で得られる値、即ち１．５０±０．３１５と同等であり、本発明の材料の異方性の程度を示し、従ってそのフィブリル性組織体は骨のそれと類似している。
【００５２】
実施例２
希コラーゲン溶液（１ｍｇ／Ｌ）を、水蒸発を阻止する（counter）手法で１５μＬガラスマイクロチャンバー中に注入した。注入は高密度液晶コラーゲン相が得られるまで続けた。コラーゲンをアンモニア雰囲気下で沈殿させ、次にマイクロチャンバーをミネラル前駆体溶液中に含浸し（溶液は下記成分を含む：２１３．０ｍＭのＮａＣｌ、６．３ｍＭのＮａＨＣＯ3、４．５ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＫ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ、３．８ｍＭのＣａＣｌ2、０．７５ｍＭのＮａ2ＳＯ3Ｎａ2ＳＯ4及び２．３ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）、ｐＨ７．４に調整し、この溶液内で６月間温度３７℃で維持した。
【００５３】
沈殿した材料を、次にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中に含浸して洗浄した。
図５は、Ｘ線散乱による材料分析を示す。５ａはＳＡＸＳイメージを示し、５ｂはＷＡＸＳイメージを示す。２個のイメージは、実施例１に類似する。
【００５４】
実施例３
コラーゲン溶液を、予めＮａＨ2ＰＯ4（６６ｍＭ）及びＣａＣｌ2（１１０ｍＭ）溶液に対して透析して５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、水蒸発を阻止する手法で１５μＬガラスマイクロチャンバー内へ注入した。注入は高密度液晶コラーゲン相が得られるまで続けた。マイクロチャンバーを、オープンコンテナ中の実施例１に類似する無機相前駆体溶液中に含浸した。このコンテナを次に、温度２０℃で塩の完全な沈殿が起こるまで炭酸アンモニウム雰囲気に置いた。
【００５５】
アンモニア及び二酸化炭素雰囲気は、コラーゲン及びヒドロキシアパタイトの共沈殿を生じ、それは３時間以降視認できた。反応溶媒は、反応が完了するまで８日間放置できる。
サンプルをＰＢＳリン酸緩衝溶液中に含浸させることにより洗浄した。
図６はＳＥＭ顕微鏡写真を示す。これは、らせん状組織体（コレステリックドメイン）を示すミネラル化された線維の存在を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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