(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＣＤ１９発現腫瘍細胞の成長を阻害するための医薬の製造のための抗体−パートナー分子複合体の使用であって、ここに、該抗体−パートナー分子複合体が、
ＣＤ１９に特異的に結合し、かつ、
（ａ）配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３０に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３７に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５１に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３０に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３７に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５２に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、または
（ｃ）配列番号１７に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５３に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分
を含む、使用。
【請求項２】
モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、
（ａ）配列番号１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号９に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、または
（ｃ）配列番号２に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号１０に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
ＣＤ１９発現腫瘍細胞がＢ細胞悪性腫瘍細胞である、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
Ｂ細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、またはワンデンストロームマクログロブリン血症である、請求項３記載の使用。
【請求項５】
Ｂ細胞悪性腫瘍がバーキットリンパ腫または多発性骨髄腫である、請求項３記載の使用。
【請求項６】
対象においてＢ細胞を枯渇させるための医薬の製造のための抗体−パートナー分子複合体の使用であって、ここに、該抗体−パートナー分子複合体が、
ＣＤ１９に特異的に結合し、かつ、
（ａ）配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３０に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３７に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５１に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３０に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３７に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５２に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、または
（ｃ）配列番号１７に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５３に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分
を含む、使用。
【請求項７】
抗体−パートナー分子複合体が、
（ａ）配列番号１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号９に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、または
（ｃ）配列番号２に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号１０に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項６記載の使用。
【請求項８】
対象における癌を治療するための医薬の製造のための抗体−パートナー分子複合体の使用であって、ここに、該抗体−パートナー分子複合体が、
ＣＤ１９に特異的に結合し、かつ、
（ａ）配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３０に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３７に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５１に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号１６に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２３に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３０に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３７に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４４に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５２に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３、または
（ｃ）配列番号１７に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号４５に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号５３に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分
を含む、使用。
【請求項９】
抗体−パートナー分子複合体が、
（ａ）配列番号１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号８に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号９に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域、または
（ｃ）配列番号２に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域および配列番号１０に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
Ｂ細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、またはワンデンストロームマクログロブリン血症である、請求項８記載の使用。
【請求項１１】
Ｂ細胞悪性腫瘍がバーキットリンパ腫または多発性骨髄腫である、請求項８記載の使用。
【請求項１２】
パートナー分子が化学リンカーにより抗体またはその抗原結合部分に複合される、請求項１〜１１のいずれか１項記載の使用。
【請求項１３】
化学リンカーがペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、またはジスルフィドリンカーである、請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
抗体またはその抗原結合部分が非フコシル化される、請求項１〜１３のいずれか１項記載の使用。
【請求項１５】
抗体またはその抗原結合部分がヒト抗体またはその部分である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の使用。
【請求項１６】
対象がヒト患者である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００６年１２月１３日に出願された米国仮特許出願第６０／８６９，９０４号明細書および２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，７００号明細書の優先権を主張するものであり、それらの教示内容は参照により本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
ＣＤ１９は、Ｂ細胞分化において早期に発現されかつＢ細胞の最終分化が惹起されるまで発現され続ける９５ｋＤａの膜受容体である（Ｐｅｚｚｕｔｔｏら、（１９８７年）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１３８：２７９３頁（非特許文献１）；Ｔｅｄｄｅｒら（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５：４３７頁（非特許文献２））。ＣＤ１９細胞外ドメインは、より小さく潜在的なジスルフィド様ドメインにより分離される２つのＣ２型免疫グロブリン（ＩＧ）様ドメインを有する。ＣＤ１９細胞質ドメインは構造的に独特であるが、ヒト、マウス、およびモルモットの間で高度に保存される（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、（１９９８年）Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２６７頁（非特許文献３））。ＣＤ１９は、Ｂリンパ球の細胞表面上に見出されるタンパク質複合体の一部である。タンパク質複合体は、ＣＤ１９、ＣＤ２１（補体受容体、２型）、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１）、およびＣＤ２２５（Ｌｅｕ−１３）を含む（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ、上記（非特許文献３））。
【０００３】
ＣＤ１９はＢ細胞内での膜貫通シグナルの重要な調節物質である。ＣＤ１９の細胞表面密度の増加または減少はＢ細胞の発生および機能に作用し、自己免疫疾患または低γグロブリン血症などの疾患をもたらす（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ、上記（非特許文献３））。ＣＤ１９複合体は、Ｂ細胞膜上で見出される２つの別々のシグナル伝達複合体の架橋を介し、インビボで抗原に対するＢ細胞の応答を増強する。膜のＩｇＭおよびＣＤ１９に関連した２つのシグナル形質導入複合体は、異なる機序によりホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を活性化する。ＣＤ１９およびＢ細胞受容体の架橋により、ＰＬＣの活性化に必要なＩｇＭ分子の数が減少する（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ、上記（非特許文献３）；Ｇｈｅｔｉｅ、上記）。さらに、ＣＤ１９はＡｒｃファミリーキナーゼの増幅のための特定のアダプタータンパク質として機能する（Ｈａｓｅｇａｗａら（２００１年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：３１９０頁（非特許文献４））。
【０００４】
ＣＤ１９への結合により、Ｂ細胞の活性化および増殖に対し、生じる架橋の量に応じて促進および阻害の双方がなされることが示されている（Ｔｅｄｄｅｒ、上記）。ＣＤ１９は、９０％超のＢ細胞リンパ腫上に発現され、かつインビトロおよびインビボでリンパ腫の成長に作用することが予測されている（Ｇｈｅｔｉｅ、上記）。ＣＤ１９に対して産生される抗体はマウス抗体であった。ヒト対象の治療でマウス抗体を使用する場合の欠点は、患者への投与に対するヒト抗マウス（ＨＡＭＡ）の応答である。したがって、ＣＤ１９により媒介される疾患の治療および／または予防にとってより有効なＣＤ１９に対し、改善された治療抗体への需要が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｐｅｚｚｕｔｔｏら、（１９８７年）ＪＩｍｍｕｎｏｌ．１３８：２７９３頁
【非特許文献２】Ｔｅｄｄｅｒら（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １５：４３７頁
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、（１９９８年）Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２６７頁
【非特許文献４】Ｈａｓｅｇａｗａら（２００１年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：３１９０頁
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、ＣＤ１９に特異的に結合しかつ極めて多数の望ましい特性を示す単離モノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体を提供する。これらの特性は、ヒトＣＤ１９に対する高親和性結合、ＣＤ１９を発現する細胞による内在化、および／または抗原依存性細胞毒性に対する媒介能を含む。例えば、本発明の抗体を用い、ＣＤ１９タンパク質の検出またはＣＤ１９を発現する細胞、例えばＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の成長の阻害が可能である。また、本開示の抗体および組成物を用い、種々のＣＤ１９媒介性疾患を治療するための方法が提供される。
【０００７】
一局面では、本開示は、単離モノクローナルヒト抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体はヒトＣＤ１９に結合し、かつ、
（ａ）ヒトＣＤ１９に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する特性、
（ｂ）ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞に結合する特性、
（ｃ）ＣＤ１９発現細胞により内在化されている特性、
（ｄ）ＣＤ１９発現細胞に対して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示す特性、および
（ｅ）細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ１９発現細胞の成長を阻害する特性
のうちの少なくとも１つを示す。
【０００８】
好ましくは抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のうちの少なくとも２つを示す。より好ましくは抗体は少なくとも特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のうちの少なくとも３つを示す。より好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のうちの４つを示す。さらにより好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）の５つすべてを示す。別の好ましい態様では、抗体は、細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ１９発現腫瘍細胞の成長を阻害する。
【０００９】
一態様では、抗体はヒトＣＤ１９に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に２×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に４×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に３×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、またはヒトＣＤ１９に２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。
【００１０】
好ましくは、抗体はヒト抗体であるが、他の態様では抗体はマウス抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体でありうる。
【００１１】
別の局面では、本発明は単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関し、ここで抗体は参照抗体により認識されるヒトＣＤ１９上のエピトープへの結合に対して交差競合し、ここで参照抗体は
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または参照抗体は（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または参照抗体は（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または参照抗体は（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または参照抗体は（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または参照抗体は（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または参照抗体は（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、
または参照抗体は（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
別の局面では、本開示は、ヒトＶＨ５−５１遺伝子の産物であるかまたはそれからに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。本開示はまた、ヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。本開示はまた、ヒトＶＫＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。本開示はまた、ヒトＶＫＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。本開示はまた、ヒトＶＫＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。
【００１３】
好ましい態様では、本開示は、（ａ）ヒトＶＨ５−５１または１−６９遺伝子の重鎖可変領域、および（ｂ）ヒトＶＫＬ１８、Ａ２７またはＶＫＬ１５の軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１４】
別の局面では、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここでは、（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列は配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８のアミノ酸配列およびその保存的修飾体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）抗体はヒトＣＤ１９に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合しかつ（ｄ）ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞に結合する。
【００１５】
好ましくは、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。好ましくは、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
【００１６】
好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【００１７】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００１８】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００１９】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３２を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【００２０】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２１】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２２】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２３】
別の好ましい組み合わせは、
（ａ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【００２４】
他の好ましい抗体またはその抗原結合部分は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ここで抗体はＣＤ１９に対して特異的に結合する。
【００２５】
好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２６】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２７】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００２９】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３０】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３１】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３２】
別の好ましい組み合わせは、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００３３】
本開示の別の局面では、ＣＤ１９への結合に対して上記抗体のいずれかと競合する抗体またはその抗原結合部分あるいは断片が提供される。
【００３４】
本開示の抗体は、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプの例えば完全長抗体でありうる。あるいは、抗体は、抗体断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦａｂ’２断片、または一本鎖抗体でありうる。
【００３５】
本開示はまた、治療物質、例えば細胞毒素または放射性同位体に結合された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体を提供する。
【００３６】
特に好ましい態様では、本発明は、（例えばチオール結合を介して）細胞毒素（例えば、本明細書または２００６年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８８２，４６１号明細書または２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，３００号明細書（それら全体が参照により本明細書中に援用される）に記載の細胞毒素）に結合された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体を提供する。例えば、様々な態様では、本発明は、
（ｉ）
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｈ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、細胞毒素に結合された抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体、
（ｉｉ）
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、
（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、
（ａ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分、
（ａ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含む抗体またはその抗原結合部分、または
（ａ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む抗体またはその抗原結合部分を含み、ここで抗体またはその抗原結合部分は細胞毒素に結合された、免疫複合体、ならびに
（ｉｉｉ）
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｇ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ｈ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む（例えばヒトＣＤ１９への結合に対する交差競合相手の）抗体により認識される場合と同じエピトープに結合する、細胞毒素に結合された抗体またはその抗原結合部分を含む免疫複合体
という好ましい免疫複合体を提供する。
【００３７】
本開示は、抗体またはその抗原結合部分あるいは断片とは異なる結合特異性を有する第２の機能部分に連結された本開示の抗体またはその抗原結合部分を含む二重特異性分子も提供する。
【００３８】
本開示の抗体またはその抗原結合部分あるいは免疫複合体または二重特異性分子と薬学的に許容できる担体とを含む組成物も提供される。
【００３９】
本開示の抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにかかる核酸を含む発現ベクターおよびかかる発現ベクターを含む宿主細胞も本開示によって包含される。かかる発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗ＣＤ１９抗体を調製するための方法も提供され、それは（ｉ）宿主細胞内で該抗体を発現する工程と、（ｉｉ）宿主細胞から該抗体を単離する工程とを含みうる。
【００４０】
さらに別の局面では、本発明は抗ＣＤ１９抗体を調製するための方法に関する。本方法は、
（ａ）（ｉ）配列番号１６〜２２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２３〜２９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／もしくは配列番号３０〜３６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域の抗体配列；ならびに／または（ｉｉ）配列番号３７〜４３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号４４〜５０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／もしくは配列番号５１〜５８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の抗体配列を提供する工程と、
（ｂ）重鎖可変領域の抗体配列および／または軽鎖可変領域の抗体配列の範囲内で少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製する工程と、
（ｃ）タンパク質として改変抗体配列を発現させる工程と、
を含む。
【００４１】
本開示は、ＣＤ１９に高親和性で特異的に結合する単離抗ＣＤ１９抗体−パートナー分子複合体、特にヒトモノクローナル抗体を含むものも提供する。特定のかかる抗体−パートナー分子複合体は、ＣＤ１９発現細胞内に内在化される能力があり、かつ抗原依存性細胞毒性を媒介する能力がある。本開示は、本明細書中に開示される抗ＣＤ１９抗体−パートナー分子複合体を用い、癌、例えば非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫を含むＢ細胞悪性腫瘍を治療するための方法も提供する。
【００４２】
本開示のパートナー分子に複合される抗体またはその抗原結合部分を含有する組成物も提供される。本明細書中に開示される抗体パートナー分子複合体中での抗体に有利に複合されうるパートナー分子として、限定はされないが、薬剤としての分子、細胞毒素、マーカー分子（例えば放射性同位体）、タンパク質および治療物質が挙げられる。抗体−パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含有する組成物も本明細書中に開示される。
【００４３】
一局面では、かかる抗体−パートナー分子複合体は化学リンカーを介して複合される。一部の態様では、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍとして示される。他のリンカーはヒドラジンおよびジスルフィドリンカーを含み、それぞれ本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｈ−（Ｌ１）ｍまたは（Ｌ４）ｐ−Ｊ−（Ｌ１）ｍとして示される。パートナーに結合されているリンカーに加え、本発明は、本質的に任意の分子種への結合に適する切断可能なリンカーアームも提供する。
【００４４】
別の局面では、本発明はＣＤ１９発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関する。本方法は、ＣＤ１９発現腫瘍細胞を本開示の抗体−パートナー分子複合体にＣＤ１９発現腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む。好ましい態様では、パートナー分子は治療物質、例えば細胞毒素である。特に好ましいＣＤ１９発現腫瘍細胞はＢ細胞腫瘍細胞である。
【００４５】
別の局面では、本発明は、対象における癌を治療する方法に関する。本方法は、癌が対象において治療されるように、対象に本開示の抗体−パートナー分子複合体を投与する工程を含む。好ましい態様では、パートナー分子は治療物質、例えば細胞毒素である。治療対象の特に好ましい癌はＢ細胞悪性腫瘍、例えば非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫である。
【００４６】
本開示の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および実施例から明白となり、それらは限定するものとして解釈されるべきではない。本願の全体を通じて言及されるあらゆる参考文献の内容、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、特許および公開された特許出願は、参照により本明細書中に明示的に援用される。
[請求項101]
ヒトCD19に結合し、かつ
(a)ヒトCD19に1×10-7M以下のKDで結合する特性、
(b)Rajiおよび/またはDaudi B細胞腫瘍細胞に結合する特性、
(c)CD19発現細胞により内在化されている特性、
(d)CD19発現細胞に対して抗体依存性細胞毒性(ADCC)を示す特性、および
(e)細胞毒素に複合される場合、インビボでCD19発現細胞の成長を阻害する特性、
のうちの少なくとも1つを示す単離ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、治療物質であるパートナー分子とを含む、抗体-パートナー分子複合体。
[請求項102]
抗体が特性(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)のうちの少なくとも2つを示す、請求項101記載の抗体-パートナー分子。
[請求項103]
抗体が特性(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)のうちの少なくとも3つを示す、請求項101記載の抗体-パートナー分子。
[請求項104]
抗体が特性(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)のうちの少なくとも4つを示す、請求項101記載の抗体-パートナー分子。
[請求項105]
抗体が特性(a)、(b)、(c)、(d)、および(e)の5つすべてを示す、請求項101記載の抗体-パートナー分子。
[請求項106]
抗体がヒトCD19に5×10-8M以下のKDで結合する、請求項101記載の抗体-パートナー分子。
[請求項107]
抗体がヒトCD19に5×10-9M以下のKDで結合する、請求項101記載の抗体-パートナー分子。
[請求項108]
(a)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(c)配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号11のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(e)配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(f)配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(g)配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(h)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む参照抗体により認識されるヒトCD19上のエピトープに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、治療物質であるパートナー分子とを含む、抗体-パートナー分子複合体。
[請求項109]
参照抗体が、
配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項110]
参照抗体が、
配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項111]
参照抗体が、
配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項112]
参照抗体が、
配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号11のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項113]
参照抗体が、
配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項114]
参照抗体が、
配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項115]
参照抗体が、
配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項116]
参照抗体が、
配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項108記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項117]
ヒトVH5-51遺伝子、ヒトVH5-51遺伝子、またはヒトVH1-69遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含む抗体-パートナー分子複合体であって、該抗体がCD19に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分と治療物質であるパートナー分子とを含む抗体-パートナー分子複合体。
[請求項118]
ヒトVKL18遺伝子、ヒトVKA27遺伝子、またはヒトVKL15遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含む抗体-パートナー分子複合体であって、該抗体がCD19に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分と治療物質であるパートナー分子とを含む抗体-パートナー分子複合体。
[請求項119]
抗体が、
(a)配列番号16を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号23を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号30を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号37を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号44を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号51を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項120]
抗体が、
(a)配列番号16を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号23を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号30を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号37を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号44を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号52を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項121]
抗体が、
(a)配列番号17を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号24を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号31を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号38を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号45を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号53を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項122]
抗体が、
(a)配列番号18を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号25を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号32を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号39を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号46を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号54を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項123]
抗体が、
(a)配列番号19を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号26を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号33を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号40を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号47を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号55を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項124]
抗体が、
(a)配列番号20を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号27を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号34を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号41を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号48を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号56を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項125]
抗体が、
(a)配列番号21を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号28を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号35を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号42を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号49を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号57を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項126]
抗体が、
(a)配列番号22を含む重鎖可変領域CDR1、
(b)配列番号29を含む重鎖可変領域CDR2、
(c)配列番号36を含む重鎖可変領域CDR3、
(d)配列番号43を含む軽鎖可変領域CDR1、
(e)配列番号50を含む軽鎖可変領域CDR2、および
(f)配列番号58を含む軽鎖可変領域CDR3
を含む、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項127]
(a)配列番号1〜7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
(b)配列番号8〜15からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む抗体-パートナー分子複合体であって、該抗体がヒトCD19タンパク質に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分と治療物質であるパートナー分子とを含む抗体-パートナー分子複合体。
[請求項128]
抗体が、
配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項129]
抗体が、
配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項130]
抗体が、
配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項131]
抗体が、
配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号11のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項132]
抗体が、
配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項133]
抗体が、
配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項134]
抗体が、
配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項135]
抗体が、
配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項127記載の抗体-パートナー分子。
[請求項136]
(a)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(b)配列番号1のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号9のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(c)配列番号2のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号10のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(d)配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号11のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(e)配列番号4のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号12のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(f)配列番号5のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
(g)配列番号6のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号14のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
(h)配列番号7のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号15のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む抗体により認識されるヒトCD70タンパク質上のエピトープに結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分と、治療物質であるパートナー分子とを含む、抗体-パートナー分子複合体。
[請求項137]
請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
[請求項138]
治療物質が細胞毒素である、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項139]
請求項138記載の抗体-パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
[請求項140]
治療物質が放射性同位体である、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項141]
請求項140記載の抗体-パートナー分子複合体および薬学的に許容できる担体を含む、組成物。
[請求項142]
CD19発現腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、該CD19発現腫瘍細胞と請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体とを、該CD19発現腫瘍細胞の成長が阻害されるように接触させる工程を含む、方法。
[請求項143]
対象においてB細胞を枯渇させる方法であって、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体を、該対象からB細胞を枯渇させるのに有効な量で、該対象に投与する工程を含む、方法。
[請求項144]
CD19発現腫瘍細胞がB細胞悪性腫瘍細胞である、請求項143記載の方法。
[請求項145]
B細胞悪性腫瘍が非ホジキンリンパ腫である、請求項144記載の方法。
[請求項146]
B細胞悪性腫瘍がマントル細胞リンパ腫である、請求項144記載の方法。
[請求項147]
対象における癌を治療する方法であって、癌が該対象において治療されるように、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体を該対象に投与する工程を含む、方法。
[請求項148]
癌が非ホジキンリンパ腫である、請求項147記載の方法。
[請求項149]
癌がマントル細胞リンパ腫である、請求項147記載の方法。
[請求項150]
パートナー分子が化学リンカーにより抗体に複合される、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項151]
化学リンカーが、ペプチジルリンカー、ヒドラジンリンカー、およびジスルフィドリンカーからなる群から選択される、請求項150記載の抗体-パートナー分子複合体。
[請求項152]
抗体またはその抗原結合部分が非フコシル化される、請求項101記載の抗体-パートナー分子複合体。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】２１Ｄ４および２１Ｄ４ａヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号５９）およびアミノ酸配列（配列番号１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号２３）およびＣＤＲ３（配列番号３０）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図１Ｂ】２１Ｄ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６６）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３７）、ＣＤＲ２（配列番号４４）およびＣＤＲ３（配列番号５１）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図１Ｃ】２１Ｄ４ａヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６７）およびアミノ酸配列（配列番号９）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３７）、ＣＤＲ２（配列番号４４）およびＣＤＲ３（配列番号５２）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２Ａ】４７Ｇ４ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６０）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１７）、ＣＤＲ２（配列番号２４）およびＣＤＲ３（配列番号３１）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図２Ｂ】４７Ｇ４ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６８）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３８）、ＣＤＲ２（配列番号４５）およびＣＤＲ３（配列番号５３）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図３Ａ】２７Ｆ３ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６１）およびアミノ酸配列（配列番号３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１８）、ＣＤＲ２（配列番号２５）およびＣＤＲ３（配列番号３２）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図３Ｂ】２７Ｆ３ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６９）およびアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。ＣＤＲ１（配列番号３９）、ＣＤＲ２（配列番号４６）およびＣＤＲ３（配列番号５４）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図４Ａ】３Ｃ１０ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６２）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２６）およびＣＤＲ３（配列番号３３）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図４Ｂ】３Ｃ１０ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号７０）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４０）、ＣＤＲ２（配列番号４７）およびＣＤＲ３（配列番号５５）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図５Ａ】５Ｇ７ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６３）およびアミノ酸配列（配列番号５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２０）、ＣＤＲ２（配列番号２７）およびＣＤＲ３（配列番号３４）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図５Ｂ】５Ｇ７ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号７１）およびアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４１）、ＣＤＲ２（配列番号４８）およびＣＤＲ３（配列番号５６）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図６Ａ】１３Ｆ１ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６４）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２１）、ＣＤＲ２（配列番号２８）およびＣＤＲ３（配列番号３５）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図６Ｂ】１３Ｆ１ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号７２）およびアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４２）、ＣＤＲ２（配列番号４９）およびＣＤＲ３（配列番号５７）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図７Ａ】４６Ｅ８ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号６５）およびアミノ酸配列（配列番号７）を示す。ＣＤＲ１（配列番号２２）、ＣＤＲ２（配列番号２９）およびＣＤＲ３（配列番号３６）領域が図示され、Ｖ、ＤおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図７Ｂ】４６Ｅ８ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号７３）およびアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。ＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号５０）およびＣＤＲ３（配列番号５８）領域が図示され、ＶおよびＪ生殖細胞系誘導体が示される。
【図８】２１Ｄ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）および２１Ｄ４ａの重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１）とヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号７４）とのアラインメントを示す。ＪＨ４ｂ生殖細胞系は配列番号８０として開示される。
【図９】４７Ｇ４の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号２）とヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９アミノ酸配列（配列番号７５）とのアラインメントを示す。ＪＨ５ｂ生殖細胞系は配列番号８１として開示される。
【図１０】２７Ｆ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号３）とヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号７４）とのアラインメントを示す。ＪＨ６ｂ生殖細胞系は配列番号８２として開示される。
【図１１】３Ｃ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４）とヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９アミノ酸配列（配列番号７５）とのアラインメントを示す。ＪＨ６ｂ生殖細胞系は配列番号８２として開示される。
【図１２】５Ｇ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５）とヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号７４）とのアラインメントを示す。ＪＨ６ｂ生殖細胞系は配列番号８３として開示される。
【図１３】１３Ｆ１の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号６）とヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号７４）とのアラインメントを示す。ＪＨ６ｂ生殖細胞系は配列番号８２として開示される。
【図１４】４６Ｅ８の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号７）とヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１アミノ酸配列（配列番号７４）とのアラインメントを示す。ＪＨ６ｂ生殖細胞系は配列番号８２として開示される。
【図１５】２１Ｄ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号８）とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号７６）とのアラインメントを示す。ＪＫ２生殖細胞系は配列番号８４として開示される。
【図１６】２１Ｄ４ａの軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号９）とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号７６）とのアラインメントを示す。ＪＫ３生殖細胞系は配列番号８５として開示される。
【図１７】４７Ｇ４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１０）とヒト生殖細胞系ＶｋＡ２７アミノ酸配列（配列番号７７）とのアラインメントを示す。ＪＫ３生殖細胞系は配列番号８５として開示される。
【図１８】２７Ｆ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１１）とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号７６）とのアラインメントを示す。ＪＫ２生殖細胞系は配列番号８４として開示される。
【図１９】３Ｃ１０の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１２）とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１５アミノ酸配列（配列番号７８）とのアラインメントを示す。ＪＫ２生殖細胞系は配列番号８４として開示される。
【図２０】５Ｇ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号７６）とのアラインメントを示す。ＪＫ１生殖細胞系は配列番号８６として開示される。
【図２１】１３Ｆ１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４）とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号７６）とのアラインメントを示す。ＪＫ２生殖細胞系は配列番号８７として開示される。
【図２２】４６Ｅ８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１５）とヒト生殖細胞系ＶｋＬ１８アミノ酸配列（配列番号７６）とのアラインメントを示す。ＪＫ２生殖細胞系は配列番号８７として開示される。
【図２３】ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体４７Ｇ４がヒトＣＤ１９に特異的に結合することを示す実験の結果を示すグラフである。
【図２４Ａ】ＣＤ１９に対するヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉ細胞に対する結合に対して競合することを示す実験の結果を示すグラフである。
【図２４Ｂ】ＣＤ１９に対するヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉ細胞に対する結合に対して競合することを示す実験の結果を示すグラフである。
【図２５Ａ】ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、３Ｃ１０、５Ｇ７および１３Ｆ１がＢ細胞腫瘍細胞系の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。ヒトＣＤ１９が形質移入されたＣＨＯ細胞に対するＨｕＭＡｂ  ２１Ｄ４および４７Ｇ４のフローサイトメトリー。
【図２５Ｂ】ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、３Ｃ１０、５Ｇ７および１３Ｆ１がＢ細胞腫瘍細胞系の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。Ｄａｕｄｉ  Ｂ腫瘍細胞に対するＨｕＭＡｂ  ４７Ｇ４のフローサイトメトリー。
【図２５Ｃ】ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、３Ｃ１０、５Ｇ７および１３Ｆ１がＢ細胞腫瘍細胞系の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞に対するＨｕＭＡｂ  ２１Ｄ４および４７Ｇ４のフローサイトメトリー。
【図２５Ｄ】ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、３Ｃ１０、５Ｇ７および１３Ｆ１がＢ細胞腫瘍細胞系の細胞表面に結合することを示すフローサイトメトリー実験の結果を示す。Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞に対するＨｕＭＡｂ  ２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、３Ｃ１０、５Ｇ７および１３Ｆ１のフローサイトメトリー。
【図２６Ａ】３Ｈ−チミジン放出アッセイによる、ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４および４７Ｇ４がＣＨＯ−ＣＤ１９およびＣＤ１９発現Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞に侵入することを示す内在化実験の結果を示す。ＨｕＭＡｂ  ４７Ｇ４のＣＨＯ−ＣＤ１９細胞への内在化。
【図２６Ｂ】３Ｈ−チミジン放出アッセイによる、ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４および４７Ｇ４がＣＨＯ−ＣＤ１９およびＣＤ１９発現Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞に侵入することを示す内在化実験の結果を示す。ＨｕＭＡｂ  ２１Ｄ４および４７Ｇ４のＲａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞への内在化。
【図２７Ａ】ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞を殺傷することを示すチミジン取り込みアッセイの結果を示す。
【図２７Ｂ】ヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞を殺傷することを示すチミジン取り込みアッセイの結果を示す。
【図２８】Ｒａｍｏｓ全身モデルでのマウスの生存についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを示す。
【図２９Ａ】Ｒａｍｏｓ全身モデルでのマウスの体重変化を示す。
【図２９Ｂ】Ｒａｍｏｓ全身モデルでのマウスの体重変化を示す。
【図３０Ａ】裸抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４での治療がインビボでリンパ腫腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。ＡＲＨ−７７腫瘍。
【図３０Ｂ】裸抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４での治療がインビボでリンパ腫腫瘍に対して直接の阻害効果を有することを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。Ｒａｊｉ腫瘍。
【図３１】非フコシル化ヒトモノクローナル抗ＣＤ１９抗体がＡＤＣＣ依存性にヒト白血病細胞上で細胞毒性を増大させていることを示す抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイの結果を示す。
【図３２】細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体が腫瘍体積を減少させることを示すインビボでのマウス腫瘍モデル試験の結果を示す。毒素１はサイトトキシンＮ１でありかつ毒素２はサイトトキシンＮ２である。
【図３３】Ｒａｊｉ腫瘍モデル試験におけるマウスの体重変化を示す。毒素１はサイトトキシンＮ１でありかつ毒素２はサイトトキシンＮ２である。
【図３４】フコシル化または非フコシル化抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂでの治療後におけるＣＤ２０＋細胞の集団の減少を示すカニクイザル試験の結果を示す。
【図３５】フコシル化または非フコシル化抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂでの治療後における各カニクイザルの結果を示す。
【図３６Ａ】単独のまたは細胞毒素と複合されたヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉおよびＳＵ−ＤＨＬ−６  Ｂ細胞腫瘍細胞を殺傷することを示すチミジン取り込みアッセイの結果を示す。
【図３６Ｂ】単独のまたは細胞毒素と複合されたヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉおよびＳＵ−ＤＨＬ−６  Ｂ細胞腫瘍細胞を殺傷することを示すチミジン取り込みアッセイの結果を示す。
【図３６Ｃ】単独のまたは細胞毒素と複合されたヒトＣＤ１９に特異的なヒトモノクローナル抗体がＲａｊｉおよびＳＵ−ＤＨＬ−６  Ｂ細胞腫瘍細胞を殺傷することを示すチミジン取り込みアッセイの結果を示す。
【図３７】皮下異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する免疫複合体抗ＣＤ１９−Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図３８】皮下バーキットリンパ腫ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する免疫複合体抗ＣＤ１９−Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図３９】全身ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する免疫複合体抗ＣＤ１９−Ｎ２のインビボでの有効性を示す。
【図４０Ａ】Ｂ細胞（ＣＤ２０＋）が２１Ｄ４の最低または０．０１ｍｇ／ｋｇ以上での投与後、用量依存的に減少したことを示す。０．１ｍｇ／ｋｇの投与後、Ｂ細胞はベースラインの１６％から３２％に減少した。
【図４０Ｂ】２１Ｄ４の投与後でのＢ細胞の枯渇の規模および長さがリツキシマブの０．１ｍｇ／ｋｇの注射の場合に類似したことを図示する。
【図４１】Ｒａｊｉ異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの単回投与のインビボでの有効性を示す。
【図４２】アイソタイプ対照を含む、Ｒａｊｉ異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの単回投与のインビボでの有効性を示す。
【図４３】Ｒａｍｏｓ異種移植片Ｅｓ１ｅヌードマウスモデルにおける腫瘍形成に対する抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの単回投与および反復投与のインビボでの有効性を示す。
【図４４】Ｄａｕｄｉ異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの単回投与のインビボでの有効性を示す。
【図４５】ＳＵ−ＤＨＬ６異種移植片ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍形成に対する抗ＣＤ１９−Ｎ２の単回投与のインビボでの有効性を示す。Ｎ２＝サイトトキシンＢ。
【図４６】サイトトキシンＡの構造である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
詳細な説明
本開示は、単離モノクローナル抗体、特にヒトＣＤ１９に高親和性で特異的に結合しかつ望ましい機能特性を有するヒトモノクローナル抗体に関する。特定の態様において、本開示の抗体は、特定の重鎖および軽鎖の生殖細胞系配列に由来し、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。本開示は、単離抗体や、かかる抗体、抗体−パートナー分子複合体、およびかかる抗体を含む二重特異性分子を作製する方法、ならびに本開示の抗体、抗体−パートナー分子複合体または二重特異性分子を含有する薬学的組成物を提供する。本開示はまた、該抗体を用い、例えばＣＤ１９を検出するとともに、ＣＤ１９の発現を伴う疾患、例えばＣＤ１９を発現するＢ細胞悪性腫瘍を治療する方法に関する。したがって、本開示はまた、本開示の抗ＣＤ１９抗体および抗体−パートナー分子複合体を用い、例えば非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、および多発性骨髄腫の治療における、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療する方法を提供する。
【００４９】
本開示がより容易に理解されうるように、まず特定の用語が定義される。詳細な説明を通してさらなる定義が示される。
【００５０】
本明細書で用いられる「ＣＤ１９」という用語は、例えば、ヒトＣＤ１９の変異体、アイソフォーム、相同体、オーソログおよびパラログを示す。したがって、本開示のヒト抗体は、特定の場合、ヒト以外の種由来のＣＤ１９と交差反応しうる。特定の態様では、抗体は１種類以上のヒトＣＤ１９タンパク質に対して完全に特異的であり、非ヒト交差反応の種または他のタイプを示すことはないか、あるいは特定の他の種由来であっても他のあらゆる種由来ではないＣＤ１９と交差反応しうる（例えば霊長類ＣＤ１９と交差反応してもマウスＣＤ１９と交差反応しない場合がある）。「ヒトＣＤ１９」という用語は、ヒト配列ＣＤ１９、例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７０（配列番号７９）を有するヒトＣＤ１９の完全アミノ酸配列を示す。「マウスＣＤ１９」という用語は、マウス配列ＣＤ１９、例えばＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ３７３９０を有するマウスＣＤ１９の完全アミノ酸配列を示す。ヒトＣＤ１９配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７０のヒトＣＤ１９とは例えば非保存領域内に保存された変異体を有することにより異なる場合があり、ＣＤ１９はＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７０のヒトＣＤ１９と実質的に同じ生物学的機能を有する。
【００５１】
特定のヒトＣＤ１９配列は、一般にアミノ酸配列がＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７０のヒトＣＤ１９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸配列が他の種（例えばマウス）のＣＤ１９アミノ酸配列と比較される場合にヒトであることが同定されたアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒトＣＤ１９は、アミノ酸配列がＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７０のＣＤ１９と少なくとも９５％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一でありうる。特定の態様では、ヒトＣＤ１９配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７０のＣＤ１９配列に対して１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の態様では、ヒトＣＤ１９は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７７０のＣＤ１９配列に対して５個以下、またはさらに４個以下、３、２、もしくは１個のアミノ酸の差を示しうる。パーセント同一性は、本明細書中に記載のように判定されうる。
【００５２】
「免疫応答」という用語は、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合での正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的損傷、それらの破壊または人体からの除去をもたらす、例えば、（抗体、サイトカイン、および補体を含む）上記の細胞または肝臓によって生成されるリンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、および可溶性高分子の作用を示す。
【００５３】
「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達を担う種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を示す。本明細書で用いられる「細胞表面受容体」という語句は、例えばシグナルの受け取りおよび細胞の原形質膜を通過するかかるシグナルの伝達が可能な分子および分子の複合体を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例として、ＣＤ１９受容体が挙げられる。
【００５４】
本明細書で記載の「抗体」という用語は、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を示す。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３という３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに再分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存される領域が組み入れられうる。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介しうる。
【００５５】
本明細書で用いられる抗体の「抗原断片」および「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えばＣＤ１９）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を示す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（「ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単一の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６頁）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）１つの可変ドメインおよび２つの定常ドメインを有する重鎖可変領域であるナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインのＶＬおよびＶＨが別々の遺伝子でコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が、それらの一価分子を形成するように対をなす場合の単一のタンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーによる組換え方法を用いて連結されうる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３頁を参照）。かかる一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるようにも意図されている。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、断片における有用性が無傷抗体の場合と同様の方法でスクリーニングされる。
【００５６】
本明細書で用いられる「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を示すように意図されている（例えば、ＣＤ１９に対して特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ１９以外の抗原に対して特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし、ＣＤ１９に対して特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＣＤ１９分子に対する交差反応性を有しうる。さらに、単離抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００５７】
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一の分子組成物の抗体分子の調製物を示す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。
【００５８】
本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する抗体を含むように意図されている。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされることのないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的な突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含みうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を含むように意図されていない。
【００５９】
「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の双方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する、単一の結合特異性を提示する抗体を示す。一態様では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００６０】
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、組換え手段により調製、発現、作製または単離されるすべてのヒト抗体、例えば（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子におけるトランスジェニックまたはトランスクロモゾーム（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）あるいはそれから調製されるハイブリドーマから単離される抗体（さらに下記に記載）、（ｂ）形質転換されることでヒト抗体を発現する宿主細胞、例えばトランスフェクトーマ（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される抗体、（ｃ）組換えられたコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作製または単離される抗体を含む。かかる組換えヒト抗体は、フレームワークおよびＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する場合の可変領域を有する。しかし、特定の態様では、かかる組換えヒト抗体に対し、インビトロでの突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックな動物が用いられる場合、インビボでの体細胞突然変異誘発）を実施可能であり、それ故、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ配列に由来しかつそれらに関連する一方、インビボでヒト抗体生殖細胞系レパートリーの範囲内に天然に存在することがない配列である。
【００６１】
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭまたはＩｇＧｌ）を示す。
【００６２】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という語句は、本明細書中で「抗原に対して特異的に結合する抗体」という用語と同義的に用いられる。
【００６３】
「ヒト抗体誘導体」という用語は、ヒト抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の作用物質または抗体との複合体を示す。
【００６４】
「ヒト化抗体」という用語は、別の哺乳類種、例えばマウスの生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている場合の抗体を示すように意図されている。さらなるフレームワーク領域の修飾がヒトフレームワーク配列内でなされうる。
【００６５】
「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列が１種類に由来しかつ定常領域配列が別の種類に由来する場合の抗体、例えば可変領域配列がマウス抗体に由来しかつ定常領域配列がヒト抗体に由来する場合の抗体を示すように意図されている。
【００６６】
「抗体模倣体」は、抗体の抗原に対する結合能を模倣する能力があるが、天然の抗体構造に限定されない分子を示すように意図されている。かかる抗体模倣体の例として、限定はされないが、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、ダルピン（ＤＡＲＰｉｎｓ）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）、およびバーサボディ（Ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ）が挙げられ、これらのすべては従来式の抗体結合を模倣する間に異なる機序から生成されかつそれを介して機能する結合構造を用いる。
【００６７】
本明細書で用いられる「パートナー分子」という用語は、抗体−パートナー分子複合体内で抗体に複合された実体を示す。パートナー分子の例として、薬剤、細胞毒素、（限定はされないが、ペプチドおよび蛍光色素マーカーなどの小分子マーカーと放射性同位体などの単一原子マーカーとを含む）マーカー分子、タンパク質ならびに治療物質が挙げられる。
【００６８】
本明細書で用いられる「ヒトＣＤ１９に特異的に結合する」抗体は、ヒトＣＤ１９に１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下、より好ましくは３×１０−８Ｍ以下、より好ましくは１×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を示すように意図されている。
【００６９】
本明細書で用いられる、タンパク質または細胞に「実質的に結合することのない」という用語は、タンパク質または細胞に高親和性で結合することのない、すなわちタンパク質または細胞に１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで結合することを示す。
【００７０】
本明細書で用いられる「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の結合速度を示すように意図されている一方、本明細書で用いられる「Ｋｄｉｓ」または「Ｋｄ」という用語は特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を示すように意図されている。本明細書で用いられる「ＫＤ」という用語は解離定数を示すように意図されており、それはＫｄ対Ｋａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、かつモル濃度（Ｍ）として表現されるものである。抗体におけるＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定可能である。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの利用によるものである。
【００７１】
本明細書で用いられるＩｇＧ抗体における「高親和性」という用語は、標的抗原に対して１×１０−７Ｍ以下、より好ましくは５×１０−８Ｍ以下およびさらにより好ましくは１×１０−９Ｍ以下およびさらにより好ましくは５×１０−９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに応じて変化しうる。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高親和性」結合は、１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を示す。
【００７２】
本明細書で用いられる「対象」という用語は任意のヒトまたは非ヒト動物を示す。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【００７３】
結合として用いられるかまたは結合に垂直に示される記号「−」は、示される部分が固体支持体などの分子の残りに結合される点を示す。
【００７４】
「アルキル」という用語は、それ単独でまたは別の置換基の一部として、他に明記しない限り、直鎖または分岐鎖または環状の炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、それは完全に飽和、単不飽和もしくはポリ不飽和の場合があり、かつ規定数の炭素原子を有する（すなわちＣ１〜Ｃ１０は１〜１０個の炭素を意味する）二価および多価基を含みうる。飽和炭化水素基の例として、限定はされないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチルなどの基や、例えばｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの相同体および異性体が挙げられる。不飽和アルキル基は１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例として、限定はされないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびにより高級な相同体および異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、他に明記しない限り、下記により詳細に定義されるアルキルの誘導体、例えば「ヘテロアルキル」を含むように意図されている。炭化水素基に限定されたアルキル基は「ホモアルキル」と称される。
【００７５】
単独でのまたは別の置換基の一部としての「アルキレン」という用語は、限定はされないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−として例示される、アルカンから誘導される二価基を意味し、下記に「ヘテロアルキレン」として記述される基をさらに含む。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１〜２４個の炭素原子を有することになり、本発明では１０個以下の炭素原子を有する基が好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、鎖がより短いアルキルまたはアルキレン基である。
【００７６】
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた「ヘテロアルキル」という用語は、他に明記しない限り、安定な直鎖または分岐鎖または環状の炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味し、規定数の炭素原子とＯ、Ｎ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、ここで窒素、炭素および硫黄原子は場合により酸化され、窒素ヘテロ原子は場合により四級化されうる。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置または分子の残りに結合されたアルキル基の位置に配置されうる。例として、限定はされないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。最大で２つのヘテロ原子、例えば−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などが連続しうる。同様に、単独でのまたは別の置換基の一部としての「ヘテロアルキレン」という用語は、限定はされないが−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−として例示される、ヘテロアルキルから誘導される二価基を意味する。ヘテロアルキレン基においては、ヘテロ原子はまた鎖末端の一方または両方を占有しうる（例えばアルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。「ヘテロアルキル」および「ヘテロアルキレン」という用語は、ポリ（エチレングリコール）およびその誘導体を包含する（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｃａｔａｌｏｇ、２００１年を参照）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基においては、連結基の式が記された方向は、連結基の方向を全く意味していない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’は−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２の双方を表す。
【００７７】
「アルキル」または「ヘテロアルキル」という用語と併用される「低級」という用語は、１〜６個の炭素原子を有する部分を示す。
【００７８】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」、「アルキルスルホニル」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、それらの従来の意味で用いられ、それぞれ酸素原子、アミノ基、ＳＯ２基または硫黄原子を介して分子の残りに結合されたアルキル基を示す。「アリールスルホニル」という用語はＳＯ２基を介して分子の残りに結合されたアリール基を示し、「スルフヒドリル」という用語はＳＨ基を示す。
【００７９】
一般に「アシル置換基」もまた上記の基から選択される。本明細書で用いられる「アシル置換基」という用語は、本発明の化合物の多環核に結合された基を示し、それに直接的または間接的に結合されたカルボニル炭素の原子価を満たしている。
【００８０】
単独でのまたは別の用語と組み合わせられた「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、他に明記しない限り、それぞれ置換もしくは未置換「アルキル」および置換もしくは未置換「ヘテロアルキル」の環状バージョンを示す。さらに、ヘテロシクロアルキルにおいては、ヘテロ原子が分子の残りに結合された複素環の位置を占有しうる。シクロアルキルの例として、限定はされないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例として、限定はされないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。環状構造のヘテロ原子および炭素原子は場合により酸化される。
【００８１】
単独でのまたは別の置換基の一部としての「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、他に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むように意図されている。例えば、「ハロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル」という用語は、限定はされないが、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピルなどを含むように意図されている。
【００８２】
「アリール」という用語は、他に明記しない限り、置換もしくは未置換のポリ不飽和の芳香族炭化水素置換基を意味し、これは共に縮合されるかまたは共有結合される単一環または複数環（好ましくは１〜３つの環）でありうる。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を有するアリール基（または環）を示し、ここで窒素、炭素および硫黄原子は場合により酸化され、かつ窒素原子は場合により四級化される。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りに結合されうる。アリールおよびヘテロアリール基の非限定例として、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンジミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系の各々における置換基は、下記の許容できる置換基の群から選択される。「アリール」および「ヘテロアリール」は、縮合されるかまたはそれ以外ではアリールまたはヘテロアリール系に結合された１つ以上の非芳香環系といった環系も包含する。
【００８３】
簡略化のため、「アリール」という用語は、他の用語（例えばアリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と併用される場合、上で定義されたアリールおよびヘテロアリール環の双方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（例えばメチレン基）が例えば酸素原子（例えばフェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチロキシ）プロピルなど）で置換されているアルキル基を含むアルキル基（例えばベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど）に結合されたアリール基といった基を含むように意図されている。
【００８４】
上記の各用語（例えば「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」）は、指定される基の置換および未置換形態の双方を含む。基の各タイプにおける好ましい置換基は下記に提供される。
【００８５】
アルキルにおける置換基およびヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルとも称されることが多い基を含む）はそれぞれ一般に「アルキル置換基」および「ヘテロアルキル置換基」と称され、限定はされないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２から、０〜（２ｍ’＋１）（式中、ｍ’はかかる基内での炭素原子の総数である）の範囲の数で選択される種々の基のうちの１つ以上でありうる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’の各々は、好ましくは独立して、水素、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、例えば１〜３個のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは未置換アルキル、アルコキシまたはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を示す。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、Ｒ基の各々はＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基の各々としてこれらの基の２つ以上が存在する場合に独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に結合される場合、それらは窒素原子と結合し、５、６、もしくは７員環が形成されうる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、限定はされないが、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むように意図されている。置換基についての上の考察から、当業者は、「アルキル」という用語が水素基以外の基に結合された炭素原子を含む基、例えばハロアルキル（例えば−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など）を含むように意図されることを理解するであろう。
【００８６】
アルキル基について記述される置換基と同様、アリール置換基およびヘテロアリール置換基はそれぞれ、一般に「アリール置換基」および「ヘテロアリール置換基」と称され、例えば、ハロゲン、ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、ならびにフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから、０から芳香環系上の開放原子価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）の総数の範囲の数で選択され、式中Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、好ましくは水素、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキルおよびヘテロアルキル、未置換アリールおよびヘテロアリール、（未置換アリール）−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、ならびに（未置換アリール）オキシ−（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから独立して選択される。本発明の化合物が例えば２つ以上のＲ基を含む場合、各Ｒ基はＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’基の各々としてこれらの基の２つ以上が存在する場合に独立して選択される。
【００８７】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上のアリール置換基のうちの２つが、場合により、式−Ｔ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＲＲ’）ｑ−Ｕ−（式中、ＴおよびＵは独立してＮＲ−、−Ｏ−、−ＣＲＲ’−または単結合であり、かつｑは０〜３の整数である）の置換基と置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つが、場合により式−Ａ（ＣＨ２）ｒＢ−（式中、ＡおよびＢは独立して−ＣＲＲ’−、−Ｏ−、−ＮＲ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−または単結合であり、かつｒは１〜４の整数である）の置換基と置換されうる。そのように形成された新環の単結合のうちの１つが、場合により二重結合と置換されうる。あるいは、アリールまたはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基のうちの２つが、場合により式（ＣＲＲ’）ｓ−Ｘ−（ＣＲ’’Ｒ’’’）ｄ−（式中、ｓおよびｄは独立して０〜３の整数であり、かつＸはＯ−、−ＮＲ’−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、または−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’−である）の置換基と置換されうる。置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’およびＲ’’’は、好ましくは水素または置換もしくは未置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルから独立して選択される。
【００８８】
本明細書で用いられる「ジホスフェート」という用語は、限定はされないが、２つのリン酸基を有するリン酸のエステルを含む。「トリホスフェート」という用語は、限定はされないが、３つのリン酸基を有するリン酸のエステルを含む。例えば、ジホスフェートまたはトリホスフェートを有する特定の薬剤は、
0005517626.tif 000002
を含む。
【００８９】
本明細書で用いられる「ヘテロ原子」という用語は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）およびケイ素（Ｓｉ）を含む。
【００９０】
記号「Ｒ」は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクリル基から選択される置換基を表す一般的略語である。
【００９１】
本発明の様々な局面は、以下のサブセクションでさらに詳述される。
【００９２】
特定の機能特性を有する抗ＣＤ１９抗体
本開示の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または特性により特徴づけられる。例えば、抗体はヒトＣＤ１９に特異的に結合する。好ましくは、本開示の抗体はＣＤ１９に高親和性、例えば１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合する。本開示の抗ＣＤ１９抗体は、好ましくは
（ａ）ヒトＣＤ１９に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、
（ｂ）ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞に結合し、
（ｃ）ＣＤ１９発現細胞により内在化され、
（ｄ）ＣＤ１９発現細胞に対して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示し、かつ
（ｅ）細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ１９発現細胞の成長を阻害する
という特性のうちの１つ以上を示す。
【００９３】
好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）にうちの少なくとも２つを示す。より好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のうちの少なくとも３つを示す。より好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のうちの４つを示す。さらにより好ましくは、抗体は特性（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）の５つすべてを示す。別の好ましい態様では、抗体が細胞毒素に複合される場合、抗体はインビボでＣＤ１９発現腫瘍細胞の成長を阻害する。
【００９４】
好ましくは、抗体はヒトＣＤ１９に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に４×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に３×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ヒトＣＤ１９に２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、またはヒトＣＤ１９に１×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。
【００９５】
ＣＤ１９に対する本発明の抗体の結合は、当該技術分野で十分に確立された１つ以上の技術を用いて評価されうる。例えば、好ましい態様では、フローサイトメトリーアッセイにより抗体の試験が可能であり、そこでは、抗体がヒトＣＤ１９を発現する細胞系、例えば細胞表面上でＣＤ１９を発現するように形質移入されているＣＨＯ細胞またはＯＶＣＡＲ３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＣＦＰＡＣ−１および／もしくはＫＢなどのＣＤ１９発現細胞系と反応される（適切なアッセイおよび細胞系のさらなる説明については例えば実施例３Ａを参照）。さらにまたは代わりに、結合動態（例えばＫＤ値）を含む抗体の結合についてはＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで試験可能である（適切なアッセイについては例えば実施例３Ｂを参照）。さらに他の適切な結合アッセイとして、例えば組換えＣＤ１９タンパク質を用いるＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる（適切なアッセイについては例えば実施例１を参照）。
【００９６】
好ましくは、本開示の抗体は、ＣＤ１９タンパク質に５×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ１９タンパク質に３×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ１９タンパク質に１×１０−８Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ１９タンパク質に７×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、ＣＤ１９タンパク質に６×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合するか、またはＣＤ１９タンパク質に５×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。ＣＤ１９に対する抗体の結合親和性は、例えば標準のＢＩＡＣＯＲＥ分析により評価可能である（例えば実施例３Ｂを参照）。
【００９７】
ＣＤ１９発現細胞による抗ＣＤ１９抗体の内在化を評価するための標準アッセイは当該技術分野で既知である（例えば実施例５に記載のＨｕｍ−ＺＡＰおよび免疫蛍光アッセイを参照）。ＣＤ１９のＣＡ１２５への結合および抗ＣＤ１９抗体によるその阻害を評価するための標準アッセイもまた当該技術分野で既知である（例えば実施例６に記載のＯＶＣＡＲ３細胞接着アッセイを参照）。ＣＤ１９発現細胞に対するＡＤＣＣを評価するための標準アッセイもまた当該技術分野で既知である（例えば実施例７に記載のＡＤＣＣアッセイを参照）。抗ＣＤ１９抗体およびその細胞毒素複合体によるインビボでの腫瘍細胞の成長の阻害を評価するための標準アッセイもまた当該技術分野で既知である（例えば実施例８に記載の腫瘍異種移植片マウスモデルを参照）。
【００９８】
本発明の好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体である。さらにまたは代わりに、抗体は例えばキメラまたはヒト化モノクローナル抗体であってもよい。
【００９９】
モノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８
本開示の好ましい抗体は、実施例１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２に記載のように単離されかつ構造的に特徴づけられたヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８である。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶＨアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、１、２、３、４、５、６および７で示される。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５で示される。
【０１００】
これらの各抗体がＣＤ１９に結合しうると仮定すると、ＶＨおよびＶＬ配列が「混合され、一致する」ことで、本開示の他の抗ＣＤ１９結合分子の作製が可能である。かかる「混合され、一致する」抗体のＣＤ１９結合については上記でかつ実施例に記載の結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて試験されうる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合され、一致する場合、特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＨ配列は構造的に類似のＶＨ配列と交換される。同様に、好ましくは特定のＶＨ／ＶＬ対由来のＶＬ配列は構造的に類似のＶＬ配列と交換される。
【０１０１】
したがって、一局面では、本開示は、
（ａ）配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含み、ＣＤ１９、好ましくはヒトＣＤ１９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１０２】
好ましい重鎖および軽鎖の組み合わせは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および（ｂ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む。
【０１０３】
別の局面では、本開示は、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８の重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３またはそれらの組み合わせを含む抗体を提供する。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２で示される。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９で示される。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６で示される。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶｋＣＤＲ１のアミノ酸配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３で示される。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶｋＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０で示される。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶｋＣＤＲ３のアミノ酸配列は、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８で示される。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）を用いて図示される。
【０１０４】
これらの各抗体がＣＤ１９に結合可能でありかつ抗原結合特異性が主にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域により提供されると仮定すると、ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が「混合されて一致する」（すなわち、各抗体がＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３とＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を有する必要があるが、異なる抗体由来のＣＤＲが混合されて一致する）ことで、本開示の他の抗ＣＤ１９結合分子の作製が可能である。かかる「混合されて一致する」抗体のＣＤ１９への結合は、上記や実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析）を用いて試験可能である。好ましくは、ＶＨＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。同様に、ＶＫＣＤＲ配列が混合されて一致する場合、特定のＶＫ配列由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、好ましくは構造的に類似のＣＤＲ配列と置換される。新規のＶＨおよびＶＬ配列の作製が、１つ以上のＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ領域配列を２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のモノクローナル抗体ＣＤＲ１における本明細書中に開示されるＣＤＲ配列由来の構造的に類似の配列と置換することにより可能であることは当業者に容易に理解されるであろう。
【０１０５】
したがって、別の局面では、本開示は、
（ａ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；ならびに
（ｆ）配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３；
を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで抗体はＣＤ１９、好ましくはヒトＣＤ１９に対して特異的に結合する。
【０１０６】
好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号５１を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０７】
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号１６を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２３を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３０を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３７を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号４４を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号５２を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０８】
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号１７を含む重鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２４を含む重鎖可変領域のＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３１を含む重鎖可変領域のＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号４５を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号５３を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ３
を含む。
【０１０９】
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号１８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１０】
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１１】
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１２】
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号４９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１３】
別の好ましい態様では、抗体は、
（ａ）配列番号２２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号４３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
（ｆ）配列番号５８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含む。
【０１１４】
ＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２ドメインから独立したＣＤＲ３ドメインが単独で抗体の同族抗原に対する結合特異性を決定しうることと、共通のＣＤＲ３配列に基づく同じ結合特異性を有する複数の抗体が予測どおりに産生されうることは、当該技術分野で周知である。例えば、（マウス抗ＣＤ３０抗体Ｋｉ−４の重鎖可変ドメインＣＤＲ３のみを用いるヒト化抗ＣＤ３０抗体の産生について記載する）Ｋｌｉｍｋａら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０頁（２０００年）；（親マウスＭＯＣ−３１抗ＥＧＰ−２抗体の重鎖ＣＤＲ３配列のみを用いる組換え上皮糖タンパク質−２（ＥＧＰ−２）抗体について記載する）Ｂｅｉｂｏｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９頁（２０００年）；（マウス抗インテグリンαｖβ３抗体ＬＭ６０９の重鎖および軽鎖可変ＣＤＲ３ドメインを用いる一群のヒト化抗インテグリンαｖβ３抗体においては、各メンバー抗体は、ＣＤＲ３ドメイン外部の異なる配列を含み、親マウス抗体と同じエピトープに親マウス抗体と同程度に高いまたはそれより高い親和性で結合可能である点について記載する）Ｒａｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５頁（１９９８年）；（ＣＤＲ３ドメインが抗原結合に対して最も有意な寄与をもたらす点を開示する）Ｂａｒｂａｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２頁（１９９４年）；（ヒト胎盤ＤＮＡに対する３つのＦａｂ（ＳＩ−１、ＳＩ−４０、およびＳＩ−３２）の重鎖ＣＤＲ３配列の抗破傷風トキソイドＦａｂの重鎖上への移植により既存の重鎖ＣＤＲ３が置換される点を記載し、ＣＤＲ３ドメインが単独で結合特異性を与えた点について示している）Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３頁（１９９５年）；および（単一特異性ＩｇＧ破傷風トキソイドに結合するＦａｂ  ｐ３１３抗体の重鎖に対する親多重特異性Ｆａｂ  ＬＮＡ３の重鎖ＣＤＲ３のみの転移が親Ｆａｂの結合特異性を保持するのに十分であったという移植試験について記載する）Ｄｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９頁（１９９６年）を参照のこと。（抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体のＣＤＲ３に基づくペプチドミメティクスについて記載する）Ｂｅｒｅｚｏｖら、ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ  ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８（２００１年）；（抗ホスファチジルセリン抗体のＣＤＲ３ドメインに対応する１２個のアミノ酸合成ポリペプチドについて記載する）Ｉｇａｒａｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７頁（１９９５年）；（抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに由来する単一のペプチドがインビトロでウイルスを中和可能であることを示す）Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：８０７−１０頁（１９９８年）；（マウス抗ＨＩＶ抗体の重鎖ＣＤＲ３ドメインに基づくペプチドについて記載する）Ｌｅｖｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８頁（１９９３年）；（ｓｃＦｖの結合をＺ−ＤＮＡ結合抗体の重鎖ＣＤＲ３領域の移植に���り可能にすることについて記載する）ＰｏｌｙｍｅｎｉｓおよびＳｔｏｌｌｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９頁（１９９４年）；ならびに（重鎖ＣＤＲ３での多様性が通常では同一のＩｇＭ分子における種々のハプテンとタンパク質抗原との識別を可能にするのに十分であることについて記載する）ＸｕおよびＤａｖｉｓ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５頁（２０００年）。さらに、単一のＣＤＲドメインによって定義される特許化された抗体について記載する米国特許第６，９５１，６４６号明細書；米国特許第６，９１４，１２８号明細書；米国特許第６，０９０，３８２号明細書；米国特許第６，８１８，２１６号明細書；米国特許第６，１５６，３１３号明細書；米国特許第６，８２７，９２５号明細書；米国特許第５，８３３，９４３号明細書；米国特許第５，７６２，９０５号明細書および米国特許第５，７６０，１８５号明細書を参照のこと。これらの各参考文献はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１１５】
したがって、本開示は、ヒトまたは非ヒト動物に由来する抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＤ１９に特異的に結合可能である。特定の局面の範囲内で、本開示は、非ヒト抗体、例えばマウスまたはラット抗体に由来する１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでモノクローナル抗体はＣＤ１９に特異的に結合可能である。一部の態様の範囲内で、非ヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、かつ／または（ｄ）対応する親非ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１１６】
他の局面の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などのヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここでヒト抗体はＣＤ１９に特異的に結合可能である。他の局面の範囲内で、本開示は、例えば非ヒト動物から得られるヒト抗体などの第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ３ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、ここで第１のヒト抗体はＣＤ１９に特異的に結合可能であり、かつ第１のヒト抗体由来のＣＤＲ３ドメインはＣＤ１９への結合特異性が欠如したヒト抗体内のＣＤＲ３ドメインを置き換えることでＣＤ１９に特異的に結合可能な第２のヒト抗体が産生される。一部の態様の範囲内で、第１のヒト抗体由来の１つ以上の重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ３ドメインを含む本発明の抗体は、（ａ）結合に対して競合可能であり、（ｂ）機能特性を保持し、（ｃ）同じエピトープに結合し、および／または（ｄ）対応する第１の親ヒト抗体と類似の結合親和性を有する。
【０１１７】
特定の生殖細胞系配列を有する抗体
特定の態様では、本開示の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
【０１１８】
例えば、好ましい態様では、本開示はヒトＶＨ５−５１遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。別の好ましい態様では、本開示はヒトＶＨ１−６９遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに別の好ましい態様では、本開示はヒトＶｋＬ１８遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに別の好ましい態様では、本開示はヒトＶｋＡ２７遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに別の好ましい態様では、本開示はヒトＶｋＬ１５遺伝子の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、ＣＤ１９に特異的に結合する、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらに別の好ましい態様では、本開示は、
（ａ）ヒトＶＨ５−５１または１−６９遺伝子（遺伝子はそれぞれ配列番号７４および７５で示されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する重鎖可変領域を含み、
（ｂ）ヒトＶｋＬ１８、ＶｋＡ２７またはＶｋＬ１５遺伝子（遺伝子はそれぞれ配列番号７６、７７および７８で示されるアミノ酸配列をコードする）の産物であるかまたはそれに由来する軽鎖可変領域を含み、かつ
（ｃ）ＣＤ１９、好ましくはヒトＣＤ１９に特異的に結合する、
単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１１９】
かかる抗体はまた、上で詳述される機能特性、例えばヒトＣＤ１９への高親和性結合、ＣＤ１９発現細胞による内在化、ＣＤ１９発現細胞に対するＡＤＣＣに対する媒介能および／または細胞毒素に複合される場合におけるインビボでのＣＤ１９発現腫瘍細胞の腫瘍成長に対する阻害能のうちの１つ以上を有しうる。
【０１２０】
ＶＨおよびＶＫ（それぞれＶＨ５−５１およびＶＫＬ１８）を有する抗体の例として、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、２７Ｆ３、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８が挙げられる。ＶＨおよびＶＫ（それぞれＶＨ１−６９およびＶＫＡ２７）を有する抗体の例として、４７Ｇ４が挙げられる。ＶＨおよびＶＫ（それぞれＶＨ１−６９およびＶＫＬ１５）を有する抗体の例として、３Ｃ１０が挙げられる。
【０１２１】
本明細書で用いられるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られる場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。かかる系は、目的の抗原とともにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを免疫する工程または目的の抗原とともにファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングする工程を含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体が、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列においてヒト抗体の配列に対して最も近い（すなわち最大の％同一性がある）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより、かかるものとして同定されうる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産物」であるかまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば自然発生的体細胞突然変異または部位特異的突然変異の意図的導入に起因し、生殖細胞系配列と比べてアミノ酸の差を有しうる。しかし、選択されたヒト抗体は、典型的にはアミノ酸配列においてヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であり、かつ、ヒト抗体が他種の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列（例えばマウス生殖細胞系配列）と比較される場合にヒトであるものと同定されるアミノ酸残基を有する。特定の場合、ヒト抗体は、アミノ酸配列において生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一でありうる。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは１０個以下のアミノ酸の差を示すことになる。特定の場合、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子にコードされるアミノ酸配列とは５個以下またはさらには４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸の差を示しうる。
【０１２２】
相同抗体
さらに別の態様では、本開示の抗体は、本明細書中に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで抗体は本開示の抗ＣＤ１９抗体の所望の機能特性を保持する。
【０１２３】
例えば、本開示は、
（ａ）重鎖可変領域が配列番号１、２、３、４、５、６および７からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域が配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４および１５からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも８０％相同なアミノ酸配列を含み、
（ｃ）抗体がヒトＣＤ１９に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、
（ｄ）ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞に結合する
重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１２４】
さらにまたは代わりに、抗体は、例えばヒトＣＤ１９への高親和性結合、ＣＤ１９発現細胞による内在化、ＣＤ１９発現細胞に対するＡＤＣＣに対する媒介能および／または細胞毒素に複合される場合におけるインビボでのＣＤ１９発現腫瘍細胞の腫瘍成長に対する阻害能といった上で考察された機能特性のうちの１つ以上を有しうる。
【０１２５】
様々な態様では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
【０１２６】
他の態様では、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は、上で示される配列に８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％相同でありうる。上で示される配列のＶＨおよびＶＬ領域に対して高い（すなわち８０％以上の）相同性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体が、配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２または７３をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発）と、その後の本明細書中に記載の機能アッセイを用いてのコードされた改変抗体の保持された機能（すなわち上記の（ｃ）〜（ｄ）に示される機能）についての試験により得られうる。
【０１２７】
本明細書で用いられる２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、２つの配列間のパーセント同一性に相当する。２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列で共有される同一位置の数の関数（すなわち％相同性＝同一位置の数／位置の全体数×１００）であり、２つの配列の最適なアラインメントにおいて導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、下記の非限定例にて記載のように数学的アルゴリズムを用いて行われうる。
【０１２８】
２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７頁（１９８８年））を用いて決定可能であり、同アルゴリズムはＰＡＭ１２０重み残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（Ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティを用いてＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入されている。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３頁（１９７０年））アルゴリズムを用いて決定可能であり、同アルゴリズムはブロッサム（Ｂｌｏｓｓｕｍ）６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４のギャップ重量および１、２、３、４、５もしくは６の長さ重量を用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラム中に包含されている。
【０１２９】
さらにまたは代わりに、本開示のタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用い、公的データベースで探索を行い、例えば関連配列を同定することが可能である。かかる探索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０頁のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実行可能である。ＢＬＡＳＴタンパク質の探索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行うことで、本開示の抗体分子に相同なアミノ酸配列が得られうる。比較目的でギャップドアラインメント（ｇａｐｐｅｄ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を得るため、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２頁に記載のようにギャップドＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）が用いられうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、各プログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が有用である。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【０１３０】
保存的修飾を有する抗体
特定の態様では、本開示の抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここでこれらのＣＤＲ配列のうちの１つ以上は既知の抗ＣＤ１９抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはその保存的修飾を含み、かつここで抗体は本開示の抗ＣＤ１９抗体の所望の機能特性を保持する。抗原結合を除去することのない特定の保存的配列修飾の作製が可能であることは当該技術分野で理解されている。例えば、（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）に特異的な抗体のＣＤＲ３重鎖ドメインにおける突然変異分析について記載する）Ｂｒｕｍｍｅｌｌら（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１１８０−８頁；（抗ＵＡ１抗体における突然変異試験について記載する）ｄｅ  Ｗｉｌｄｔら（１９９７年）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１頁；（ＨＣＤＲ３の中央における変異が親和性の欠如または低下をもたらしたことを示す）Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖら（１９９７年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０頁；（ＣＤＲ３領域内での単一のアミノ酸変化により結合活性が失われたことを記載する）Ｈａｌｌら（１９９２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２頁；（抗原結合におけるＴｙｒ残基の寄与について記載する）ＫｅｌｌｅｙおよびＯ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５頁；（結合における疎水性の効果について記載する）Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙら（１９９８年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６頁；ならびに（ＨＣＤＲ３アミノ酸変異体について記載する）Ｂｅｅｒｓら（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３頁を参照のこと。したがって、本開示は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで
（ａ）重鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｂ）軽鎖可変領域のＣＤＲ３配列は、配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、
（ｃ）抗体はヒトＣＤ１９に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、
（ｄ）ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞に結合する。
【０１３１】
さらにまたは代わりに、抗体は、例えばヒトＣＤ１９への高親和性での結合、ＣＤ１９発現細胞による内在化、ＣＤ１９発現細胞に対するＡＤＣＣを媒介する能力および／または細胞毒素に複合される場合でのインビボでのＣＤ１９発現腫瘍細胞の腫瘍成長に対する阻害能といった上記の機能特性の１つ以上を保有しうる。
【０１３２】
好ましい態様では、重鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ２配列は、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。別の好ましい態様では、重鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含み、かつ軽鎖可変領域のＣＤＲ１配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列とその保存的修飾を含む。
【０１３３】
様々な態様では、抗体は、例えばヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体でありうる。
【０１３４】
本明細書で用いられる「保存的配列修飾（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）」という用語は、アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に対して有意に作用または改変することのないアミノ酸修飾を示すように意図されている。かかる保存的修飾は、アミノ酸置換、付加および欠失を含む。修飾は、当該技術分野で既知の標準技術、例えば部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発により本開示の抗体に導入されうる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される場合の置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基で置換可能であり、改変抗体は保持された機能（すなわち上記の（ｃ）〜（ｄ）に示される機能）について本明細書中に記載の機能アッセイを用いて試験可能である。
【０１３５】
本開示の抗ＣＤ１９抗体と同じエピトープに結合する抗体
別の態様では、本開示は、本開示の抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（すなわち、ＣＤ１９への結合に対して本開示のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）のいずれかにより認識されるヒトＣＤ１９上のエピトープに結合する抗体を提供する。好ましい態様では、交差競合試験における参照抗体は、（配列番号１および８でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体２１Ｄ４、または（配列番号１および９でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体２１Ｄ４ａ、または（配列番号２および１０でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体４７Ｇ４、または（配列番号３および１１でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体２７Ｆ３、または（配列番号４および１２でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体３Ｃ１０、または（配列番号５および１３でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体５Ｇ７、または（配列番号６および１４でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体１３Ｆ１、または（配列番号７および１５でそれぞれ示されるＶＨおよびＶＬ配列を有する）モノクローナル抗体４６Ｅ８でありうる。標準のＣＤ１９結合アッセイでは、かかる交差競合抗体は、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８と交差競合するその能力に基づいて同定されうる。標準ＥＬＩＳＡアッセイの使用が可能であり、そこでは組換えヒトＣＤ１９タンパク質がプレート上に固定化され、抗体のうちの１つが蛍光標識され、非標識抗体の標識抗体の結合に対して競合する能力が評価される。さらにまたは代わりに、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を用い、抗体の交差競合する能力の評価が可能である。例えば、実施例３にさらに記載のように、ＢＩＡｃｏｒｅを用いるエピトープビニング実験によると、３Ｃ１０、６Ａ４および７Ｂ１抗体がＣＤ１９上の異なるエピトープを認識し、それに結合することが示された。試験抗体、例えば２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８のヒトＣＤ１９への結合に対する阻害能によると、試験抗体がヒトＣＤ１９への結合に対して２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８と競合可能であることから、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８の場合と同じヒトＣＤ１９上のエピトープに結合することが示される。好ましい態様では、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８の場合と同じヒトＣＤ１９上のエピトープに結合する抗体はヒトモノクローナル抗体である。実施例に記載のように、かかるヒトモノクローナル抗体は調製され、単離されうる。
【０１３６】
改変され修飾された抗体
さらに、本発明の抗体を、出発原料として使用可能である１つ以上の既知のＣＤ１９抗体のＶＨおよび／またはＶＬ配列を有する抗体を用いて調製し、修飾抗体を改変することが可能であり、ここで修飾抗体は最初の抗体と比較して改変された特性を有しうる。抗体は、一方もしくは両方の可変領域（すなわちＶＨおよび／またはＶＬ）内、例えば１つ以上のＣＤＲ領域内および／または１つ以上のフレームワーク領域内での１つ以上のアミノ酸の修飾によって改変可能である。さらにまたは代わりに、抗体は、例えば定常領域内で残基を修飾し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変可能である。
【０１３７】
特定の態様では、ＣＤＲ移植を用いて抗体の様々な領域を改変することが可能である。抗体は、６つの重鎖および軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基全体に支配的な標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、各抗体間でＣＤＲ外部の配列よりも多様である。ＣＤＲ配列が大部分の抗体−抗原相互作用に関与することから、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体由来のＣＤＲ配列を含む発現ベクターの作成により発現することは可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７頁；Ｊｏｎｅｓ  Ｐ．ら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５頁；Ｑｕｅｅｎ  Ｃ．ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３頁；Ｗｉｎｔｅｒに交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１３８】
したがって、本開示の別の態様は、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９、ならびに配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０、ならびに配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含む単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分に関する。したがって、かかる抗体は、モノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８のＶＨおよびＶＬＣＤＲ配列を有し、さらにこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を有しうる。
【０１３９】
かかるフレームワーク配列は、生殖細胞系の抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースまたは出版された参考文献から得られうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、（インターネット上のｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能な）「Ｖベース（ＶＢａｓｅ）」ヒト生殖細胞系配列データベースや、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）」、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ．Ｍ．ら（１９９２年）「Ｔｈｅ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａｂｏｕｔ  Ｆｉｆｔｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｌｏｏｐｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；ならびにＣｏｘ  Ｊ．Ｐ．Ｌ．ら（１９９４年）「Ａ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｒｍ−ｌｉｎｅ  ＶＨ  Ｓｅｇｍｅｎｔｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  Ｓｔｒｏｎｇ  Ｂｉａｓ  ｉｎ  ｔｈｅｉｒ  Ｕｓａｇｅ」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６頁（これら各々の内容は参照により本明細書中に明示的に援用される）において見出されうる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子における生殖細胞系ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース内に見出されうる。例えば、ＨＣｏ７  ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、３−３３（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）ならびに３−７（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）にて入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２  ＨｕＭＡｂマウス内で見出される以下の重鎖生殖細胞系配列は、付属のＧｅｎｂａｎｋ登録番号：１−６９（ＮＧ＿００１０１０９、ＮＴ＿０２４６３７およびＢＣ０７０３３３）、５−５１（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、４−３４（ＮＧ＿００１０１０９およびＮＴ＿０２４６３７）、３−３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）ならびに３−２３（ＡＪ４０６６７８）にて入手可能である。ヒト重鎖および軽鎖生殖細胞系配列のさらに別の入手源は、ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から入手可能なヒト免疫グロブリン遺伝子のデータベースである。
【０１４０】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のギャップドＢＬＡＳＴと称される配列類似性を探索する方法（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２頁）の１つを用いて集められたタンパク質配列データベースに対して比較される。ＢＬＡＳＴは、抗体配列とデータベース配列の間での統計的に有意なアラインメントが、整列されたワードの高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）を有する傾向が高いという点でヒューリスティックアルゴリズムである。スコアが延長またはトリミングにより改善されえないセグメント対はヒットと称される。つまり、Ｖベース（ＶＢＡＳＥ）由来のヌクレオチド配列（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ１／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐ）が翻訳され、かつＦＲ１〜ＦＲ３フレームワーク領域の間の領域および同領域を含む領域が保持される。データベース配列は平均９８残基長を有する。タンパク質の全長にわたり正確に一致する二重配列が除去される。オフの低複雑性フィルタを除くデフォルトの標準パラメータおよびＢＬＯＳＵＭ６２の置換マトリックスを備えたｂｌａｓｔｐプログラムを用いるタンパク質におけるＢＬＡＳＴ探索では、配列一致をもたらす上位５つのヒットがフィルタにかけられる。ヌクレオチド配列は全部で６つのフレームで翻訳され、データベース配列の一致するセグメント内に停止コドンを全く有しないフレームはヒットの可能性があると考えられる。次いで、これはＢＬＡＳＴプログラムｔｂｌａｓｔｘを用いて確認され、これにより全部で６つのフレーム内で抗体配列が翻訳され、全部で６つのフレーム内で動的に翻訳されたＶベース（ＶＢＡＳＥ）ヌクレオチド配列に対する翻訳が比較される。例えばＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）から入手可能な他のヒト生殖細胞系配列データベースが、上記のＶＢＡＳＥと同様に検索されうる。
【０１４１】
同一性は、抗体配列と配列の全長にわたるタンパク質データベースとの間の正確なアミノ酸の一致である。正（同一性＋置換の一致）は同一ではなく、ＢＬＯＳＵＭ６２置換行列によって導かれるアミノ酸置換である。抗体配列がデータベース配列のうちの２つと同じ同一性で一致する場合、大部分の正を伴うヒットであれば一致する配列ヒットであることが決定されることになる。
【０１４２】
本開示の抗体において用いられる好ましいフレームワーク配列は、本開示の選択される抗体により用いられるフレームワーク配列、例えば本開示の好ましいモノクローナル抗体により用いられるＶＨ５−５１フレームワーク配列（配列番号７４）および／またはＶＨ１−６９フレームワーク配列（配列番号７５）および／またはＶＫＬ１８フレームワーク配列（配列番号７６）および／またはＶＫＡ２７フレームワーク配列（配列番号７７）および／またはＶＫＬ１５フレームワーク配列（配列番号７８）と構造的に類似のものである。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列、ならびにＶＫＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列はフレームワーク配列の元となる生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子内に見出される配列と同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植されうるか、あるいはＣＤＲ配列は生殖細胞系配列と比べて１つ以上の突然変異を有するフレームワーク領域上に移植されうる。例えば、特定の例ではフレームワーク領域内の残基を突然変異させ、抗原の抗体への結合能を維持または促進することが有益であることが見出されている（例えば、Ｑｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０１４３】
可変領域修飾の別のタイプは、アミノ酸残基をＶＨおよび／またはＶＫのＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内で変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善するものである。部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発を行い、突然変異を導入可能であり、かつ、目的の抗体の結合または他の機能特性に対する効果が、本明細書中に記載されかつ実施例に提供されるインビトロまたはインビボアッセイにおいて評価されうる。好ましくは、（上で考察の）保存的修飾が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、付加または欠失でありうるが、好ましくは置換である。さらに典型的には、ＣＤＲ領域内の１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つ以下の残基が改変される。
【０１４４】
したがって、別の態様では、本開示は、（ａ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；（ｃ）配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；（ｄ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ１領域；（ｅ）配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ２領域；ならびに（ｆ）配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８からなる群から選択されるアミノ酸配列あるいは配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８と比べて１つ、２つ、３つ、４つもしくは５つのアミノ酸置換、欠失または付加を有するアミノ酸配列を含むＶＫＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗ＣＤ１９モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【０１４５】
本開示の改変抗体は、例えば抗体の特性を改善するためにＶＨおよび／またはＶＫ内のフレームワーク残基に修飾が施されている場合の抗体を含む。典型的には、かかるフレームワーク修飾を施すことで抗体の免疫原性が低下する。例えば、１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列に「復帰突然変異する（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅ）」ことである。より詳細には、体細胞突然変異を経ている抗体は、該抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を有しうる。かかる残基は、抗体フレームワーク配列を抗体が由来する生殖細胞系配列と比較することにより同定されうる。
【０１４６】
例えば、下記の表１は、重鎖親生殖細胞系配列と異なる抗ＰＤ−１抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３および５Ｆ４のフレームワーク領域内でのアミノ酸変化の数を示す。フレームワーク領域配列内でのアミノ酸残基の１つ以上をそれらの生殖細胞系配置に戻すため、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介性突然変異誘発により生殖細胞系配列に「復帰突然変異される（ｂａｃｋｍｕｔａｔｅｄ）」可能性がある。
【０１４７】
（表１）重鎖生殖細胞系配置からの抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、４Ａ１１、７Ｄ３、および５Ｆ４に対する修飾
0005517626.tif 000003
【０１４８】
フレームワーク修飾の別のタイプは、フレームワーク領域内またはさらに１つ以上のＣＤＲ領域内で１つ以上の残基を変異させ、Ｔ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは、「脱免疫（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」とも称され、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号明細書にさらに詳述されている。
【０１４９】
フレームワークまたはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えまたはその他として、本開示の抗体は、Ｆｃ領域内で修飾を含み、典型的には抗体の１つ以上の機能特性、例えば血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合性および／または抗原依存性の細胞毒性を変化させるように改変されうる。さらに、本開示の抗体は、化学的に修飾されうる（例えば１つ以上の化学的部分が抗体に結合されうる）か、または修飾によりそのグリコシル化が改変されさらに抗体の１つ以上の機能特性が改変されうる。これらの各態様は下記にさらに詳述されている。Ｆｃ領域内の残基の番号付与はＫａｂａｔのＥＵ指数のものである。
【０１５０】
一態様では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば増加または減少するように修飾される。このアプローチは、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化することで、例えば軽鎖および重鎖の構築が促進されるかあるいは抗体の安定性が増大または低下する。
【０１５１】
別の態様では、抗体のＦｃヒンジ領域の突然変異により抗体の生物学的半減期が減少する。より詳細には、抗体により天然Ｆｃ−ヒンジドメインＳｐＡ結合と比べてブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合が低下するように、１つ以上のアミノ酸変異がＦｃ−ヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入される。このアプローチは、Ｗａｒｄらによる米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳述されている。
【０１５２】
別の態様では、抗体の修飾によりその生物学的半減期が増加する。様々なアプローチが可能である。例えば、Ｗａｒｄに交付された米国特許第６，２７７，３７５号明細書に記載のように、１つ以上の以下の変異、すなわちＴ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆが導入可能である。あるいは、Ｐｒｅｓｔａらによる米国特許第５，８６９，０４６号明細書および米国特許第６，１２１，０２２号明細書に記載のように、生物学的半減期を増加させるため、抗体はＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから得られるサルベージ（ｓａｌｖａｇｅ）受容体結合エピトープを有するようにＣＨ１またはＣＬ領域内で改変されうる。
【０１５３】
さらに他の態様では、Ｆｃ領域は少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と置換し、抗体のエフェクター機能を改変することによって改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がエフェクターリガンドに対して改変された親和性を有しても親抗体の抗原への結合能を保持する程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。親和性が改変される対象のエフェクターリガンドは、例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号明細書および米国特許第５，６４８，２６０号明細書（いずれもＷｉｎｔｅｒらによる）にさらに詳述されている。
【０１５４】
別の例では、アミノ酸残基３２９、３３１および３２２から選択される１つ以上のアミノ酸が、抗体がＣ１ｑ結合を改変しおよび／または補体依存性の細胞毒性（ＣＤＣ）を低減または根絶している程度に異なるアミノ酸残基と置換されうる。このアプローチは、米国特許第６，１９４，５５１号明細書（Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる）にさらに詳述されている。
【０１５５】
別の例では、アミノ酸位置２３１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２３９内の１つ以上のアミノ酸残基が改変されることにより、抗体の補体を固定する能力が改変される。このアプローチは、ＢｏｄｍｅｒらによるＰＣＴ公開、国際公開第９４／２９３５１号パンフレットにさらに記載されている。
【０１５６】
さらに別の例では、以下の位置、すなわち２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８もしくは４３９での１つ以上のアミノ酸の修飾によるＦｃ領域の修飾により、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力が増大しかつ／または抗体のＦｃγ受容体に対する親和性が増大する。このアプローチは、ＰＣＴ公開、国際公開第００／４２０７２号パンフレット（Ｐｒｅｓｔａによる）にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、かつ結合が改善された変異体についての記載がなされている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．ら（２００１年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４頁を参照）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特異的変異がＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。さらに、以下の変異体の組み合わせ、すなわちＴ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡがＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改善することが示された。
【０１５７】
さらに別の態様では、本発明の抗体のＣ末端は、米国仮特許出願第６０／９５７，２７１号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）で記載のようにシステイン残基の導入により修飾される。かかる修飾は、限定はされないが、完全長重鎖配列のＣ末端もしくはその近傍での既存のアミノ酸残基の置換、ならびに完全長重鎖配列のＣ末端へのシステインを有する延長部の導入を含む。好ましい態様では、システインを有する伸長は（Ｎ末端からＣ末端で）アラニン−アラニン−システイン配列を含む。
【０１５８】
好ましい態様では、かかるＣ末端のシステイン修飾の存在により、パートナー分子、例えば治療物質またはマーカー分子の複合における位置が提供される。特に、Ｃ末端のシステイン修飾に起因する反応性チオール基の存在を利用し、下記に詳述されるジスルフィド結合を用いてパートナー分子を複合することが可能である。この方法での抗体とパートナー分子との複合は、結合の特異的部位全体にわたる制御の促進を可能にする。さらに、Ｃ末端もしくはその近傍での結合部位の導入により、複合は抗体の機能特性との干渉を低下させるかまたは除去するように最適化可能であり、それにより複合製剤の簡素化された分析および品質の制御が可能になる。
【０１５９】
さらに別の態様では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体が作製されうる（すなわち抗体におけるグリコシル化が失われる）。グリコシル化の改変により、例えば抗体の抗原に対する親和性が増大しうる。かかる炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を改変することによりなされうる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換がなされうる結果、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位でのグリコシル化が失われる。かかるアグリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性が増大しうる。かかるアプローチは、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および米国特許第６，３５０，８６１号明細書（Ｃｏらに付与）にさらに詳述されている。グリコシル化を改変するためのさらなるアプローチが、Ｈａｎａｉらに交付された米国特許第７，２１４，７７５号明細書、Ｐｒｅｓｔａに交付された米国特許第６，７３７，０５６号明細書、Ｐｒｅｓｔａに交付された米国特許出願公開第２００７００２０２６０号明細書、Ｄｉｃｋｅｙらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８４９２６号パンフレット、Ｚｈｕらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０８９２９４号パンフレット、およびＲａｖｅｔｃｈらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５５９１６号パンフレットにおいてさらに詳述されており、これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１６０】
さらにまたは代わりに、グリコシル化の改変タイプを有する抗体、例えば減量されたフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体または増強されたＧｌｃＮａｃ二分構造を有する抗体が作製されうる。かかる改変されたグリコシル化パターンにより、抗体のＡＤＣＣ能力が増大することが示されている。かかる炭水化物修飾は、例えばグリコシル化機構が改変された宿主細胞内で抗体を発現することにより行われうる。グリコシル化機構が改変された細胞については当該技術分野で記載がなされており、本開示の組換え抗体を発現することによりグリコシル化が、改変抗体が産生される宿主細胞として用いられうる。例えば、細胞系Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９は、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９細胞系内で発現される抗体がその炭水化物上にフコースを含まないように、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１、６）フコシルトランスフェラーゼ）を含まない。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５およびＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞系は、２つの置換ベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞内での標的化されたＦＵＴ８遺伝子の破壊により作製された（Ｙａｍａｎｅらによる米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号明細書およびＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら（２００４年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２頁を参照）。別の例として、Ｈａｎａｉらによる欧州特許第１，１７６，１９５号明細書は、機能的に破壊されたフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系について記載している。かかる細胞系内で発現される抗体は、α１，６結合に関連した酵素の低減または除去により低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を示す。Ｈａｎａｉらは、フコースを抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンに添加するのに低い酵素活性を有するかまたは酵素活性を有することのない細胞系、例えばラット骨髄腫細胞系ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）についても記載している。ＰｒｅｓｔａによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットには、フコースをＡｓｎ（２９７）に連結された炭水化物に結合させる能力が低下した（その宿主細胞内で発現される抗体の低フコシル化ももたらす）変異ＣＨＯ細胞系、Ｌｅｃ１３細胞について記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０頁も参照）。ＵｍａｎａらによるＰＣＴ公開、国際公開第９９／５４３４２号パンフレットには、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えばβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を、改変された細胞系内で発現される抗体が抗体のＡＤＣＣ活性の増大をもたらすＧｌｃＮａｃ二分構造の増大を示すように発現するように改変された細胞系について記載されている（Ｕｍａｎａら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０頁も参照）。あるいは、抗体のフコース残基はフコシダーゼ酵素を用いて切断されうる。例えば、フコシダーゼのα−Ｌ−フコシダーゼはフコシル残基を抗体から除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎ���  Ａ．Ｌ．ら（１９７５年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３頁）。
【０１６１】
さらにまたは代わりに、グリコシル化の改変タイプを有する抗体の作製が可能であり、ここでその改変は抗体のシアル化のレベルに関係する。かかる改変は、Ｄｉｃｋｅｙらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０８４９２６号パンフレットおよびＲａｖｅｔｃｈらに交付されたＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５５９１６号パンフレットに記載されており、それら双方はそれら全体が参照により援用される。例えば、アルスロバクター・ウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）シアリダーゼなどのシアリダーゼとの酵素反応を用いることができる。かかる反応の条件は、一般に米国特許第５，８３１，０７７号明細書に記載されており、その全体が参照により本明細書中に援用される。適切な酵素の他の非限定例として、ノイラミニダーゼおよびＮ−グリコシダーゼＦ（それぞれＳｃｈｌｏｅｍｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５（４）、８８２−８９３頁（１９７５年）およびＬｅｉｂｉｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３３８、５２９−５３８頁（１９９９年）に記載）が挙げられる。脱シアル化抗体が親和性クロマトグラフィーを用いてさらに精製可能である。あるいは、本方法を用い、例えばシアリルトランスフェラーゼ酵素の使用によりシアル化のレベルを上昇させることができる。かかる反応の条件は、一般にＢａｓｓｅｔら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５１（３）、３０７−３１１頁（２０００年）に記載されている。
【０１６２】
本開示で検討される本明細書中の抗体の別の修飾がペグ化である。抗体をペグ化することで、例えば抗体の生物学的（例えば血清）半減期が増加されうる。抗体をペグ化するため、抗体またはその断片は典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つ以上のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に結合した状態になるという条件下で反応する。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似反応性の水−可溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で用いられる「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するのに用いられているＰＥＧの形態のいずれかを包含するように意図されている。特定の態様では、ペグ化されるべき抗体はアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当該技術分野で既知であり、本開示の抗体に適用可能である。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照のこと。
【０１６３】
抗体断片および抗体模倣体
本発明は、従来の抗体に限定されることなく、抗体断片および抗体模倣体の使用を通じて実施可能である。下記に詳述のように、多種多様な抗体断片および抗体模倣技術が現在では開発されており、当該技術分野で広く知られている。多数のこれら技術、例えばドメイン抗体、ナノボディ、およびユニボディでは従来の抗体構造の断片またはそれに対する他の修飾が用いられる一方、他の技術、例えば従来の抗体結合を模倣する一方、異なる機序から産生され、それを介して機能する結合構造を用いるアフィボディ、ダルピン、アンチカリン、アビマー、およびバーサボディも存在する。
【０１６４】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の最小の機能結合単位であり、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応するものである。ドメイン抗体は約１３ｋＤａの分子量を有する。Ｄｏｍａｎｔｉｓは、完全ヒトＶＨおよびＶＬ  ｄＡｂにおける一連の大規模かつ高度に機能的なライブラリ（各ライブラリ内に１００億超の異なる配列）を開発しており、これらのライブラリを用いて治療標的に特異的なｄＡｂを選択する。多数の従来の抗体に対し、ドメイン抗体は細菌、酵母、および哺乳類細胞系内で十分に発現される。ドメイン抗体およびその産生方法のさらなる詳細については、米国特許第６，２９１，１５８号明細書；米国特許第６，５８２，９１５号明細書；米国特許第６，５９３，０８１号明細書；米国特許第６，１７２，１９７号明細書；米国特許第６，６９６，２４５号明細書；米国特許出願公開第２００４／０１１０９４１号明細書；欧州特許出願第１４３３８４６号明細書および欧州特許第０３６８６８４号明細書および欧州特許第０６１６６４０号明細書；国際公開第０５／０３５５７２号パンフレット、国際公開第０４／１０１７９０号パンフレット、国際公開第０４／０８１０２６号パンフレット、国際公開第０４／０５８８２１号パンフレット、国際公開第０４／００３０１９号パンフレットおよび国際公開第０３／００２６０９号パンフレットの参照により得られうる（これら各々はその全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１６５】
ナノボディは、天然の重鎖抗体の固有の構造および機能特性を有する抗体由来の治療タンパク質である。これらの重鎖抗体は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）および２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を有する。重要なことには、クローニングされ、単離されたＶＨＨドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を内在する完全に安定的なポリペプチドである。ナノボディは、ヒト抗体のＶＨドメインとの高い相同性を有し、かつ活性の任意の低下を伴うことなくさらにヒト化されうる。重要なことには、ナノボディは免疫原性の低い可能性を有し、霊長動物試験でナノボディのリード化合物を用いて確認されている。
【０１６６】
ナノボディでは、従来の抗体の利点を小分子薬物の重要な特徴と組み合わされる。ナノボディは、従来の抗体と同様、その標的および低い固有の毒性に対し、高い標的特異性、高親和性を示す。しかし、ナノボディは、小分子薬物と同様、酵素を阻害し、受容体のクレフトに容易に接近可能である。さらに、ナノボディは極めて安定的であり、注射以外の手段で投与可能であり（例えば国際公開第０４／０４１８６７号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される）、製造が容易である。ナノボディの他の利点は、小さいサイズに起因するまれであるかまたは隠されたエピトープの認識、タンパク質標的の空洞または活性部位へのその固有の三次元構造に起因する高い親和性および選択性による結合性、薬物形式の柔軟性、半減期の調整ならびに薬物発見の容易性および速度を含む。
【０１６７】
ナノボディは、単一の遺伝子によりコードされ、ほぼすべての原核生物および真核生物宿主、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（例えば米国特許第６，７６５，０８７号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））、カビ（例えばコウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））ならびに酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）またはピヒア（Ｐｉｃｈｉａ））（例えば米国特許第６，８３８，２５４号明細書を参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））において効率的に産生される。産生プロセスは拡張可能であり、数キログラム量のナノボディが産生されている。ナノボディは、従来の抗体と比べて優れた安定性を示すことから、貯蔵寿命が長く即使用可能な溶液として調合可能である。
【０１６８】
ナノクローン（Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ）法（例えば国際公開第０６／０７９３７２号パンフレットを参照（その全体が参照により本明細書中に援用される））は、Ｂ細胞の自動化された高スループットな選択に基づき所望の標的に対するナノボディを産生するための独自の方法であり、場合により本発明との関連で用いられうる。
【０１６９】
ユニボディは別の抗体断片技術であるが、この技術はＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づくものである。ヒンジ領域の欠失により、従来のＩｇＧ４抗体に対して本質的に半分のサイズでありかつＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子が生成される。ＩｇＧ４抗体が不活性であることから免疫系と相互作用することがないことも周知であり、これは免疫応答が望ましくない場合の疾患の治療において有利な場合があり、この利点はユニボディに受け継がれる。例えば、ユニボディは、その結合対象の細胞を殺傷することなく阻害または沈黙するように機能しうる。さらに、癌細胞に結合するユニボディは、それらを刺激して増殖させることはない。さらに、ユニボディが従来のＩｇＧ４抗体の約半分のサイズであることから、それは大きい固形腫瘍全体により適切な分布を示すとともに有利な有効性を発揮する可能性がある。ユニボディは、全ＩｇＧ４抗体と同様の速度で身体から除去され、その抗原に対して全抗体と同様の親和性で結合可能である。ユニボディのさらなる詳細は、特許出願国際公開第２００７／０５９７８２号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の参照により得られうる。
【０１７０】
アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子は、スタフィロコッカル（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つに由来する、５８−アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の新しいクラスを表す。この３つのヘリックスバンドル（ｈｅｌｉｘ  ｂｕｎｄｌｅ）ドメインはコンビナトリアルファージミドライブラリの作成物における足場として用いられており、それから所望の分子を標的にするアフィボディ変異体がファージディスプレイ技術を用いて選択されうる（Ｎｏｒｄ  Ｋ．、Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  Ｅ．、Ｒｉｎｇｄａｈｌ  Ｊ．、Ｓｔａｈｌ  Ｓ．、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ．Ａ．、「Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｏｆ  ａｎ  α−ｈｅｌｉｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎ」、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９７年；１５：７７２−７頁、Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ．、Ｇｒｏｎｌｕｎｄ  Ｈ．、Ｕｈｌｅｎ  Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ．Ａ．、「Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ａ（ＩｇＡ）−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２年；２６９：２６４７−５５頁）。アフィボディ分子におけるその低い分子量（６ｋＤａ）とともに単純で強固な構造により、それが例えば検出試薬のような多種多様な用途に適するようになり（Ｒｏｎｍａｒｋ  Ｊ．、Ｈａｎｓｓｏｎ  Ｍ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｔ．ら、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｆｆｉｂｏｄｙ−Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒａｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２年；２６１：１９９−２１１頁）、かつ受容体相互作用が阻害される（Ｓａｎｄｓｔｏｒｍ  Ｋ．、Ｘｕ  Ｚ．、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｇ．、Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ．Ａ．、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ２８−ＣＤ８０  ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｂｙ  ａ  ＣＤ２８−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｂｏｄｙ  ｌｉｇａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ２００３年；１６：６９１−７頁）。アフィボディおよびそれを産生する方法のさらなる詳細が、米国特許第５，８３１，０１２号明細書により得られうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１７１】
標識されたアフィボディは、多数のアイソフォームを判定するためのイメージング用途においても有用でありうる。
【０１７２】
ダルピン（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能を用いるように開発された抗体模倣ＤＲＰ（設計されたリピートタンパク質）技術の一例である。アンキリンまたはロイシンリッチのリピートタンパク質などのリピートタンパク質は、偏在する結合分子であり、抗体と異なり細胞内および細胞外に生じる。それら固有のモジュール構造は、構造単位の反復（リピート）を特徴とし、共に蓄積され、可変でかつモジュール式の標的に結合する表面を示す伸長されたリピートドメインが形成される。このモジュール性に基づき、非常に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリが生成されうる。この方法は、可変の表面残基およびリピートドメインへのランダムアセンブリを示す自家和合性リピートに共通の設計を含む。
【０１７３】
ダルピンは、細菌発現系内で極めて高収量に産生可能であり、既知の最も安定なタンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルスおよび膜タンパク質を含む広範囲の標的タンパク質に対して極めて特異的な高親和性のダルピンが選択されている。１桁のナノモル〜ピコモルの範囲内の親和性を有するダルピンが得られうる。
【０１７４】
ダルピンは、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、チップ用途、親和性精製またはウエスタンブロッティングを含む広範囲の用途で用いられている。ダルピンは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合された細胞内マーカータンパク質としての細胞内区画内で活性が高いことも判明した。ダルピンは、ｐＭ範囲内のＩＣ５０でウイルスの侵入を阻害するのにさらに用いられた。ダルピンは、タンパク質−タンパク質相互作用の遮断に望ましいだけでなく酵素の阻害に望ましい。プロテアーゼ、キナーゼおよびトランスポーターの阻害に奏功しており、ほとんどの場合、アロステリック阻害様式である。腫瘍に対する極めて迅速で特異的な濃縮および極めて好ましい腫瘍対血液比により、インビボでの診断的または治療的アプローチに十分に適合するダルピンが作製される。
【０１７５】
ダルピンおよび他のＤＲＰ技術に関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００４／０１３２０２８号明細書および国際特許出願公開、国際公開第０２／２０５６５号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１７６】
アンチカリンはさらなる抗体模倣技術であるが、この場合、結合特異性は、ヒト組織内および体液中で自然にかつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、進化することで、化学的感受性があるかまたは不可溶性の化合物の生理的輸送および保存に関連したインビボでの機能の範囲を果たしている。リポカリンは、タンパク質の一末端で４つのループを支持する高度に保存されたβ−バレルを含む強固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットに対する入口（ｅｎｔｒａｎｃｅ）を形成し、分子のこの部分における高次構造上の差は各リポカリン間の結合特異性におけるばらつきを示している。
【０１７７】
保存されたβシートフレームワークにより支持される超可変ループの全体構造から免疫グロブリンが連想されるが、リポカリンはサイズの観点で抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりもわずかに大きい１６０〜１８０個のアミノ酸の単一のポリペプチド鎖からなる。
【０１７８】
リポカリンはクローニングされ、アンチカリンの作製のため、そのループには改変がなされる。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが生成されており、アンチカリンの提示は、結合機能の選択およびスクリーニング、それに続く、原核系または真核系におけるさらなる分析のための可溶性タンパク質の発現および産生を可能にする。試験によると、仮想的に任意のヒト標的タンパク質に特異的なアンチカリンの開発が可能で、その単離が可能であり、ナノモルのまたはより高い範囲での結合親和性が得られうることを示すことに奏功している。
【０１７９】
アンチカリンは、二重標的化された（ｄｕａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）タンパク質、いわゆるデュオカリンとしても形式化されうる。デュオカリンは、標準の作製プロセスを用いて１つの容易に生成される単量体タンパク質内の２つの別々の治療標的に結合する一方、その２つの結合ドメインの構造的方向性にかかわらず標的の特異性および親和性を保持する。
【０１８０】
単一の分子を通じての複数の標的の調節は、２つ以上の病原因子を含むことで知られる疾患において特に有利である。さらに、デュオカリンなどの二価または多価の結合形式は、疾患における細胞表面分子の標的化において有意な可能性を有し、シグナル伝達経路に対して作動効果を媒介するか、または細胞表面受容体の結合およびクラスタリングを介して内在化効果の増大を誘発する。さらに、デュオカリンの固有の高い安定性は単量体アンチカリンに匹敵し、デュオカリンに対して柔軟な製剤および送達の可能性をもたらす。
【０１８１】
アンチカリンに関するさらなる情報が、米国特許第７，２５０，２９７号明細書および国際特許出願公開番号、国際公開第９９／１６８７３号パンフレットに見出されうる（それら双方はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１８２】
本発明との関連で有用な別の抗体模倣技術がアビマーである。アビマーは、インビトロでのエクソンシャッフリングおよびファージディスプレイによりヒト細胞外受容体ドメインの大きいファミリーから進化したものであり、結合および阻害特性を備えた多重ドメインタンパク質を生成する。複数の独立した結合ドメインの連結により結合活性がもたらされることが示されており、結果として従来の単一のエピトープ結合タンパク質に対して親和性および特異性が改善される。他の有望な利点として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内での多重標的に特異的な分子の単純かつ効率的な産生、プロテアーゼに対する改善された熱安定性および耐性が挙げられる。ナノメートル以下の親和性を有するアビマーが種々の標的に対して得られている。
【０１８３】
アビマーに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００６／０２８６６０３号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２３４２９９号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２２３１１４号明細書、米国特許出願公開第２００６／０１７７８３１号明細書、米国特許出願公開第２００６／０００８８４４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０２２１３８４号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１６４３０１号明細書、米国特許出願公開第２００５／００８９９３２号明細書、米国特許出願公開第２００５／００５３９７３号明細書、米国特許出願公開第２００５／００４８５１２号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号明細書に見出されうる（それらすべてはそれら全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１８４】
バーサボディは、本発明との関連で利用可能な別の抗体模倣技術である。バーサボディは、１５％を超えるシステインを有する３〜５ｋＤａの小さいタンパク質であり、高いジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアの代わりとなる。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸の少数のジスルフィドとの置換により、より小さくより親水性が高く（低下した凝集および非特異的結合）、プロテアーゼおよび熱に対してより耐性があり、かつＭＨＣ提示の大部分に寄与する残基が疎水性であることからより低いＴ細胞エピトープの密度を有するタンパク質が生成される。これらの特性の４つすべてが免疫原性に作用することで周知であり、それらは共に免疫原性の大幅な低下の原因になると予想される。
【０１８５】
バーサボディについての着想は、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ、およびアネモネにより生成される天然の注射可能な生物医薬から得られるものであり、予想外に低い免疫原性を示すことが知られている。選択された天然タンパク質ファミリーから、サイズの設計およびスクリーニングにより、疎水性、タンパク質分解の抗原プロセシング、およびエピトープ密度が注射可能な天然タンパク質における平均を大幅に下回るレベルまで最小化される。
【０１８６】
バーサボディの構造を仮定すると、これらの抗体模倣体は多価、多重特異性、半減期機構の多様性、組織標的化モジュールおよび抗体Ｆｃ領域の非存在を含む多目的形式を提供する。さらに、バーサボディは、高収量で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で作製され、かつ、バーサボディはその親水性および小サイズ故に可溶性が高く、高濃度に調合されうる。バーサボディは、特に熱安定的であり（それは沸騰可能であり）、長い貯蔵寿命をもたらす。
【０１８７】
バーサボディに関するさらなる情報が、米国特許出願公開第２００７／０１９１２７２号明細書に見出されうる（その全体が参照により本明細書中に援用される）。
【０１８８】
上で提供された抗体断片および抗体模倣技術の詳細な説明は、本明細書との関連で用いられうるあらゆる技術の包括的リストであるように意図されていない。例えば、また限定を目的としない場合、他のポリペプチドに基づく技術、例えばＱｕｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５（８）９２１−９２９頁（２００７年）（その全体が参照により本明細書中に援用される）で概説された相補性決定領域の融合、ならびに核酸に基づく技術、例えば米国特許第５，７８９，１５７号明細書、米国特許第５，８６４，０２６号明細書、米国特許第５，７１２，３７５号明細書、米国特許第５，７６３，５６６号明細書、米国特許第６，０１３，４４３号明細書、米国特許第６，３７６，４７４号明細書、米国特許第６，６１３，５２６号明細書、米国特許第６，１１４，１２０号明細書、米国特許第６，２６１，７７４号明細書、および米国特許第６，３８７，６２０号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）に記載のＲＮＡアプタマー技術を含む種々のさらなる技術が本発明との関連で利用可能である。
【０１８９】
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、抗ＣＤ１９抗体の様々な物理的特性によりさらに特徴づけられうる。様々なアッセイを用い、これらの物理的特性に基づいて抗体の異なるクラスの検出および／または識別が可能である。
【０１９０】
いくつかの態様では、本開示の抗体は、軽鎖または重鎖可変領域のいずれかにおいて１つ以上のグリコシル化部位を有しうる。可変領域内に１つ以上のグリコシル化部位が存在する結果、抗原結合の改変により抗体の免疫原性または抗体のｐＫの変化が増大しうる（Ｍａｒｓｈａｌｌら（１９７２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２頁；Ｇａｌａ  Ｆ．Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．（２００４年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４頁；Ｗａｌｌｉｃｋら（１９８８年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９頁；Ｓｐｉｒｏ  Ｒ．Ｇ．（２００２年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７頁；Ｍｉｍｕｒａら（２０００年）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６頁）。グリコシル化はＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を有するモチーフで生じることが知られている。可変領域のグリコシル化はグライコブロット（Ｇｌｙｃｏｂｌｏｔ）アッセイを用いて試験可能であり、同アッセイでは、抗体の切断によりＦａｂが産生され、次いで過ヨウ素酸酸化およびシッフ（Ｓｃｈｉｆｆ）塩基形成を測定するアッセイを用いてグリコシル化が試験される。あるいは、可変領域のグリコシル化はディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）光クロマトグラフィー（ディオネックス−ＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ−ＬＣ））を用いて試験可能であり、そこでは糖類がＦａｂから切断されて単糖類にされ、各糖類の含量が分析される。いくつかの例では、可変領域のグリコシル化を有することのない抗ＣＤ１９抗体を有することが好ましい。これは、可変領域内にグリコシル化モチーフを有することのない抗体を選択するかまたはグリコシル化モチーフ内の残基を当該技術分野で周知の標準技術を用いて突然変異させることにより実現されうる。
【０１９１】
好ましい態様では、本開示の抗体はアスパラギン異性部位を有することがない。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果が各々、Ｎ−ＧまたはＤ−Ｇ配列上で生じうる。脱アミドまたはイソアスパラギン酸効果の結果、主鎖ではなく側鎖のカルボキシ末端から離れてキンク構造を生成することにより抗体の安定性を低下させるイソアスパラギン酸が生成される。イソアスパラギン酸の生成は等量（ｉｓｏ−ｑｕａｎｔ）アッセイを用いて測定可能であり、そこでは逆相ＨＰＬＣを用いてイソアスパラギン酸についての試験が行われる。
【０１９２】
各抗体は特有の等電点（ｐＩ）を有することになるが、一般に抗体は６〜９．５のｐＨ範囲に収まることになる。ＩｇＧ１抗体におけるｐＩは典型的には７〜９．５のｐＨ範囲内に収まり、かつＩｇＧ４抗体におけるｐＩは典型的には６〜８のｐＨ範囲内に収まる。抗体はこの範囲外のｐＩを有する場合がある。効果は一般に未知であるが、正常な範囲外のｐＩを有する抗体がインビボ条件下である程度のアンフォールディングおよび不安定性を有しうることが推定される。等電点はキャピラリー等電点電気泳動アッセイを用いて試験可能であり、それはｐＨ勾配を生成し、そこでは精度向上のためにレーザー集光が用いられうる（Ｊａｎｉｎｉら（２００２年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２３：１６０５−１１頁；Ｍａら（２００１年）Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ  ５３：Ｓ７５−８９頁；Ｈｕｎｔら（１９９８年）Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ａ  ８００：３５５−６７頁）。いくつかの例では、正常な範囲内に収まるｐＩ値を有する抗ＣＤ１９抗体を有することが好ましい。これは正常な範囲内のｐＩを有する抗体を分泌するかまたは帯電した表面残基を当該技術分野で周知の標準の技術を用いて突然変異することによりなされうる。
【０１９３】
各抗体は、熱安定性を示す融解温度を有することになる（Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ  Ｒ．およびＭａｎｎｉｎｇ  Ｍ．Ｃ．（２００２年）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３６１−７１頁）。より高い熱安定性は、インビボで全体的により高い抗体安定性を示す。抗体の融解点は、示差走査熱量測定などの技術を用いて測定されうる（Ｃｈｅｎら（２００３年）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２０：１９５２−６０頁；Ｇｈｉｒｌａｎｄｏら（１９９９年）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ６８：４７−５２頁）。ＴＭ１は抗体の初期のアンフォールディングの温度を示す。ＴＭ２は抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。一般に、本開示の抗体のＴＭ１が６０℃超、好ましくは６５℃超、さらにより好ましくは７０℃超であることが好ましい。あるいは、抗体の熱安定性は円二色性を用いて測定されうる。（Ｍｕｒｒａｙら（２００２年）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｓｃｉ  ４０：３４３−９頁）。
【０１９４】
好ましい態様では、急速に分解することのない抗体が選択される。抗ＣＤ１９抗体の断片化は、当該技術分野で十分に理解されているようにキャピラリー電気泳動（ＣＥ）およびＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて測定されうる（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ａ．Ｊ．およびＨｕｇｈｅｓ  Ｄ．Ｅ．（１９９５年）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６７：３６２６−３２頁）。
【０１９５】
別の好ましい態様では、最小の凝集効果を有する抗体が選択される。凝集が、望ましくない免疫応答および／または改変されるかもしくは好ましくない薬物動態学的特性の誘因となりうる。一般に、抗体では、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下およびさらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、単量体、二量体、三量体または多量体を同定するためのサイズ排除カラム（ＳＥＣ）高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および光散乱を含む、当該技術分野で周知のいくつかの技術により測定されうる。
【０１９６】
抗体を改変する方法
上で考察のように、本明細書中に開示されるＶＨおよびＶＫ配列を有する抗ＣＤ１９抗体を用い、ＶＨおよび／またはＶＫ配列またはそれらに結合される定常領域を修飾することにより、新しい抗ＣＤ１９抗体の産生が可能である。したがって、本開示の別の局面では、本開示の抗ＣＤ１９抗体、例えば２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８の構造的特徴を用い、ヒトＣＤ１９への結合など、本開示の抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する構造的に関連した抗ＣＤ１９抗体が産生される。例えば、上で考察のように、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８またはそれらの変異体のうちの１つ以上のＣＤＲ領域を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換え的に結合させることで、組換え操作されたさらなる本開示の抗ＣＤ１９抗体の作製が可能である。修飾の他のタイプとして、前セクションに記載のタイプが挙げられる。改変方法における出発原料は、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域である。改変抗体を作製するのに、本明細書中に提供される１つ以上のＶＨおよび／もしくはＶＫ配列またはそれらの１つ以上のＣＤＲ領域を有する抗体を実際に調製する（すなわちタンパク質として発現させる）必要はない。それに対し、配列内に含まれる情報を出発原料として用い、元の配列に由来する「第二世代」配列が作製され、次いで「第二世代」配列が調製され、タンパク質として発現される。
【０１９７】
したがって、別の態様では、本開示は、抗ＣＤ１９抗体を調製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１６、１７、１８、１９、２０、２１および２２からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８および２９からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号３０、３１、３２、３３、３４、３５および３６からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域抗体配列；ならびに／あるいは（ｉｉ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２および４３からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、および／または配列番号５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７および５８からなる群から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域抗体配列を提供する工程と、
（ｂ）重鎖可変領域抗体配列および／または軽鎖可変領域抗体配列の内部の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変し、少なくとも１つの改変抗体配列を作製する工程と、
（ｃ）改変抗体配列をタンパク質として発現する工程と、
を含む方法を提供する。
【０１９８】
標準の分子生物学技術を用い、改変抗体配列の調製および発現が可能である。
【０１９９】
好ましくは、改変された抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書中に記載の抗ＣＤ１９抗体の機能特性のうちの１つ、一部または全部を保持する抗体であり、ここでの機能特性は、限定はされないが、
（ａ）ヒトＣＤ１９に１×１０−７Ｍ以下のＫＤで結合し、
（ｂ）ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞に結合し、
（ｃ）ＣＤ１９発現細胞により内在化され、
（ｄ）ＣＤ１９発現細胞に対して抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を示し、かつ
（ｅ）細胞毒素に複合される場合、インビボでＣＤ１９発現細胞の成長を阻害する
という機能特性を含む。
【０２００】
改変抗体の機能特性は、当該技術分野で使用可能でありおよび／または本明細書中に記載の標準アッセイ、例えば実施例で示されるアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を用いて評価可能である。
【０２０１】
本開示の抗体を改変する方法の特定の態様では、変異が、抗ＣＤ１９抗体のコード配列の全部もしくは一部に沿ってランダムまたは選択的に導入可能であり、かつ、得られる修飾された抗ＣＤ１９抗体における結合活性および／または本明細書中に記載の他の機能特性についてスクリーニング可能である。突然変異方法については当該技術分野で記載がなされている。例えば、ＳｈｏｒｔによるＰＣＴ公開、国際公開第０２／０９２７８０号パンフレットでは、抗体変異を飽和突然変異誘発、合成的ライゲーションアセンブリー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）またはそれらの組み合わせを用いて作製しスクリーニングするための方法が記載されている。あるいは、ＬａｚａｒらによるＰＣＴ公開、国際公開第０３／０７４６７９号パンフレットでは、コンピュータによるスクリーニング方法を用いて抗体の生理化学的特性を最適化する方法が記載されている。
【０２０２】
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の局面は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞内に、細胞溶解液中にまたは部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態で存在しうる。核酸は、当該技術分野で周知のアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他を含む標準技術により、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば他の細胞核酸もしくはタンパク質から除去精製される場合、「単離される」かまたは「実質的に純粋な状態にされる」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。本開示の核酸が例えばＤＮＡまたはＲＮＡでありうるとともに、イントロン配列を有するかまたは有しない場合がある。好ましい態様では核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０２０３】
本開示の核酸は、標準の分子生物学技術を用いて得られうる。ハイブリドーマ（例えばさらに下記のヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体においては、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡが標準のＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得られうる。（例えばファージディスプレイ技術を用いる）免疫グロブリン遺伝子ライブラリから得られる抗体については、抗体をコードする１つ以上の核酸がライブラリから回収されうる。
【０２０４】
本開示の好ましい核酸分子は、２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１または４６Ｅ８モノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ配列をコードするものである。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶＨ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４および６５で示される。２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８のＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２および７３で示される。
【０２０５】
一旦ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片を標準の組換えＤＮＡ技術によりさらに操作することで、例えば可変領域遺伝子が完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換されうる。これらの操作では、ＶＬもしくはＶＨをコードするＤＮＡ断片が別のタンパク質、例えば抗体の定常領域またはフレキシブルリンカー（ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒ）をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。これに関連して用いられる「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片が２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームに保持するように連結されることを意味するように意図されている。
【０２０６】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばＫａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片が標準のＰＣＲ増幅により得られうる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡは重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。
【０２０７】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で既知であり（例えばＫａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により得られうる。好ましい態様では、軽鎖定常領域はカッパまたはラムダ定常領域でありうる。
【０２０８】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するのに、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片がフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されることで、ＶＨおよびＶＬ配列はフレキシブルリンカーで連結されたＶＬおよびＶＨ領域を有する隣接した一本鎖タンパク質として発現されうる（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６頁；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３頁；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４頁を参照）。
【０２０９】
本開示のモノクローナル抗体の産生
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体の方法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５頁の標準の体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む種々の技術により産生可能である。原理上、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を産生するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換が用いられうる。
【０２１０】
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生成は極めて十分に確立された方法である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコルおよび技術は当該技術分野で既知である。融合相手（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合方法についても既知である。
【０２１１】
本開示のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように調製される非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製されうる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、目的の非ヒトハイブリドーマから得られ、標準の分子生物学技術を用いて非マウス（例えばヒト）免疫グロブリン配列を有するように改変されうる。例えば、キメラ抗体を作製するため、マウス可変領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒト定常領域に連結されうる（例えばＣａｂｉｌｌｙらに交付された米国特許第４，８１６，５６７号明細書）。ヒト化抗体を作製するため、マウスＣＤＲ領域は当該技術分野で既知の方法を用いてヒトフレームワークに挿入されうる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒに交付された米国特許第５，２２５，５３９号明細書ならびにＱｕｅｅｎらに交付された米国特許第５，５３０，１０１号明細書；米国特許第５，５８５，０８９号明細書；米国特許第５，６９３，７６２号明細書および米国特許第６，１８０，３７０号明細書を参照）。
【０２１２】
好ましい態様では、本開示の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ＣＤ１９に特異的なかかるヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなくヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾームマウスを用いて産生されうる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾームマウスは、本明細書中で各々ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）およびＫＭマウス（登録商標）と称されるマウスを含み、本明細書中で総称して「ヒトＩｇマウス」と称される。
【０２１３】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ（登録商標），Ｉｎｃ．）は、内在性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的化された変異とともに未転位のヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を有する（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら  １９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫に応答し、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子がクラススイッチおよび体細胞突然変異を受け、高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体が産生される（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．ら（１９９４年）上記；Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．（１９９４年）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」１１３：４９−１０１頁にレビュー；Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．およびＨｕｓｚａｒ  Ｄ．（１９９５年）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁；ならびにＨａｒｄｉｎｇ  Ｆ．およびＬｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．（１９９５年）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁）。ＨｕＭａｂマウス（登録商標）の調製および使用ならびにかかるマウスにより保有されるゲノム修飾については、Ｔａｙｌｏｒ  Ｌ．ら（１９９２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５頁；Ｃｈｅｎ  Ｊ．ら（１９９３年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４頁；Ｃｈｏｉら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３頁；Ｃｈｅｎ  Ｊ．ら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら（１９９４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０頁；Ｔａｙｌｏｒ  Ｌ．ら（１９９４年）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１頁；ならびにＦｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁にさらに記載されている（これらすべての内容はそれら全体が参照により本明細書中に具体的に援用される）。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；米国特許第５，５６９，８２５号明細書；米国特許第５，６２５，１２６号明細書；米国特許第５，６３３，４２５号明細書；米国特許第５，７８９，６５０号明細書；米国特許第５，８７７，３９７号明細書；米国特許第５，６６１，０１６号明細書；米国特許第５，８１４，３１８号明細書；米国特許第５，８７４，２９９号明細書；および米国特許第５，７７０，４２９号明細書（すべてはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、Ｓｕｒａｎｉらに交付された米国特許第５，５４５，８０７号明細書；ＰＣＴ公開、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット、国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第９９／４５９６２号パンフレット（すべてはＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに交付）、ならびにＫｏｒｍａｎらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０１／１４４２４号パンフレットを参照のこと。ヒトλ軽鎖遺伝子を保有するトランスジェニックマウス、例えばＢｒｕｇｇｅｍａｎｎによるＰＣＴ公開の国際公開第００／２６３７３号パンフレットで記載のものを用いてもよい。例えば、ヒトλ軽鎖導入遺伝子を保有するマウスをヒト重鎖導入遺伝子（例えばＨＣｏ７）を保有しかつ場合によりヒトκ軽鎖導入遺伝子（例えばＫＣｏ５）も保有するマウスと異種交配し、ヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子の双方を保有するマウスの作製が可能である（例えば実施例１を参照）。
【０２１４】
別の態様では、本開示のヒト抗体は、導入遺伝子およびトランスクロモゾーム上でヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖トランスクロモゾームを保有するマウスを用いて産生されうる。このマウスは、本明細書中で「ＫＭマウス（登録商標）」と称され、Ｉｓｈｉｄａらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに詳述されている。
【０２１５】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスジェニック動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＤ１９抗体が産生されうる。例えば、キセノマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）として称される他のトランスジェニック系の使用が可能であり、かかるマウスは、例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらに交付された米国特許第５，９３９，５９８号明細書；米国特許第６，０７５，１８１号明細書；米国特許第６，１１４，５９８号明細書；米国特許第６，１５０，５８４号明細書および米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。
【０２１６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する他のトランスクロモゾーム動物系は当該技術分野で使用可能であり、その使用により、本開示の抗ＣＤ１９抗体の産生が可能である。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランスクロモゾームとヒト軽鎖トランスクロモゾームとの双方を保有するマウスの使用が可能であり、かかるマウスについてはＴｏｍｉｚｕｋａら（２０００年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７頁に記載されている。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランスクロモゾームを保有するウシについての記載が当該技術分野でなされており（例えば、Ｋｕｒｏｉｗａら（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４頁およびＰＣＴ出願の国際公開第２００２／０９２８１２号パンフレット）、その使用により、本開示の抗ＣＤ１９抗体の産生が可能である。
【０２１７】
本開示のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリをスクリーニングするためのファージディスプレイ法を用いても調製可能である。ヒト抗体を単離するためのかかるファージディスプレイ法は、当該技術分野で確立されたものである。例えば、Ｌａｄｎｅｒらに交付された米国特許第５，２２３，４０９号明細書；米国特許第５，４０３，４８４号明細書；および米国特許第５，５７１，６９８号明細書；Ｄｏｗｅｒらに交付された米国特許第５，４２７，９０８号明細書および米国特許第５，５８０，７１７号明細書；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらに交付された米国特許第５，９６９，１０８号明細書および米国特許第６，１７２，１９７号明細書；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらに交付された米国特許第５，８８５，７９３号明細書；米国特許第６，５２１，４０４号明細書；米国特許第６，５４４，７３１号明細書；米国特許第６，５５５，３１３号明細書；米国特許第６，５８２，９１３０号明細書、米国特許第６，５８２，９１５号明細書および米国特許第６，５９３，０８１号明細書を参照のこと。
【０２１８】
本開示のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト抗体反応が免疫時に生成されうるようにヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて調製されうる。かかるマウスは、例えばＷｉｌｓｏｎらに交付された米国特許第５，４７６，９９６号明細書および米国特許第５，６９８，７６７号明細書に記載されている。
【０２１９】
別の態様では、ヒト抗ＣＤ１９抗体が、Ｂｕｅｃｈｌｅｒらによる米国特許第６，７９４，１３２号明細書に記載のようにヒトＩｇマウスとファージディスプレイ技術を併用して調製される。より詳細には、本方法は最初に、（上記のＨｕＭａｂマウスまたはＫＭマウスなどの）ヒトＩｇマウスにおけるマウスの１つ以上のＣＤ１９抗原での免疫による抗ＣＤ１９抗体応答の生成と、その後のマウスのリンパ細胞由来のヒト抗体鎖をコードする核酸の単離およびこれらの核酸のディスプレイベクター（例えばファージ）への導入によるディスプレイパッケージのライブラリの提供を含む。したがって、各ライブラリメンバーはヒト抗体鎖をコードする核酸を含み、各抗体鎖がディスプレイパッケージから提示される。次いで、ライブラリを、ＣＤ１９タンパク質を用いてスクリーニングし、ＣＤ１９に特異的に結合するライブラリメンバーが単離される。次いで、選択されたライブラリメンバーの核酸挿入物が単離され、標準の方法により配列決定され、選択されたＣＤ１９結合剤の軽鎖および重鎖可変配列が決定される。可変領域は、標準の組換えＤＮＡ技術、例えば可変領域のヒト重鎖および軽鎖定常領域をＶＨ領域がＣＨ領域に動作可能に連結されかつＶＬ領域がＣＬ領域に動作可能に連結されるように保有する発現ベクターへのクローニングにより、完全長抗体鎖に変換されうる。
【０２２０】
ヒトＩｇマウスの免疫化
ヒトＩｇマウスの使用により本開示のヒト抗体が産生される場合、かかるマウスは、Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁；ならびにＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットおよび国際公開第０１／１４４２４号パンフレットに記載のように、ＣＤ１９抗原および／または組換えＣＤ１９、またはＣＤ１９タンパク質を発現する細胞、またはＣＤ１９融合タンパク質の精製または濃縮された調製物で免疫されうる。好ましくは、マウスは１回目の注入時には６〜１６週齢となる。例えば、ＣＤ１９抗原の精製または組換え調製物（５〜５０μｇ）を用い、ヒトＩｇマウスの腹腔内および／または皮下での免疫が可能である。最も好ましくは、本開示の抗体の産生に用いられる免疫原は、そのＮ末端で非１９ＣＤポリペプチド（例えば、Ｈｉｓタグ）に融合する、ＣＤ１９タンパク質の細胞外ドメインを含む、ＣＤ１９融合タンパク質である（実施例１でさらに記載）。
【０２２１】
ヒトＣＤ１９に結合する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するための詳細な方法が下記の実施例１に記載されている。様々な抗原を用いる試験を重ねることで、トランスジェニックマウスが、最初に完全フロインドアジュバント中の抗原で腹腔内（ＩＰ）に免疫され、それに続き、不完全フロインドアジュバント中の抗原で隔週、最大で全６回ＩＰ免疫される時、応答することが示されている。しかし、フロインド以外のアジュバントについても有効であることが見出されている（例えば、ＲＩＢＩアジュバント）。さらに、アジュバントの非存在下では全細胞における免疫原性が高いことが見出されている。免疫応答は、後眼窩（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ）の出血により得られる血漿試料を用いる免疫プロトコルを通して監視可能である。血漿はＥＬＩＳＡでスクリーニング可能であり（後述するように）、十分な力価の抗ＣＤ１９ヒト免疫グロブリンを有するマウスが融合において用いられうる。マウスは、例えば殺傷および脾臓摘出の３日前、抗原で静脈内に追加免疫されうる。免疫ごとに２〜３の融合がなされる必要がありうることが想定される。典型的にはマウス６〜２４匹が各抗原に対して免疫される。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２株の双方が用いられる。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子は共に２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する単一のマウスに育種されうる。その他としてまたはさらに、ＫＭマウス（登録商標）株が用いられうる。
【０２２２】
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
本開示のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫されたマウス由来の脾細胞および／またはリンパ節細胞が単離され、適切な不死化細胞系、例えばマウス骨髄腫細胞系に融合されうる。生成されたハイブリドーマでは、抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニング可能である。例えば、免疫されたマウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液が、５０％ＰＥＧとともにＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６に融合されうる。あるいは、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液は、ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ大型チャンバ細胞融合エレクトロポレーター（ＣｙｔｏＰｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ  Ｍａｒｙｌａｎｄ）を用いる、電場に基づく電気融合法を用いて融合されうる。細胞は、平底マイクロタイタープレート内に約２×１０５でプレーティング後、２０％胎仔クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ｏｒｉｇｅｎ）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのヘペス、０．０５５ｍＭの２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；ＨＡＴは融合の２４時間後に添加される）を含有する選択培地内で２週間インキュベートされる。約２週間後、細胞はＨＡＴがＨＴと交換された培地内で培養されうる。次いで、各ウェルにおけるヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体についてはＥＬＩＳＡによりスクリーニング可能である。一旦多数のハイブリドーマの成長が生じると、培地は通常１０〜１４日後に観察されうる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再プレーティングされ、再びスクリーニングされ、依然としてヒトＩｇＧ陽性である場合、モノクローナル抗体は限界希釈により少なくとも２回サブクローニングされうる。次いで、特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養することで、組織培地内に少量の抗体が産生されうる。
【０２２３】
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマはモノクローナル抗体の精製用の２リットルのスピナーフラスコ内で成長されうる。親和性クロマトグラフィー前、上清がプロテインＡ−セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を用いて濾過され、濃縮される。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーで検査することで純度が保証されうる。緩衝溶液はＰＢＳに交換可能であり、濃度は１．４３の減衰係数を用い、ＯＤ２８０により判定可能である。モノクローナル抗体は、一定量に分割され、−８０℃で保存されうる。
【０２２４】
本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体は、例えば当該技術分野で周知のように組換えＤＮＡ技術と遺伝子形質移入方法を併用し、宿主細胞のトランスフェクトーマ内でも産生されうる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２頁）。
【０２２５】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現するため、部分長または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡが標準の分子生物学技術（例えば目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング）により得られ、ＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように発現ベクターに挿入されうる。これに関連し、「作動可能に連結される」という用語は、抗体遺伝子が、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというその意図された機能を果たすようにベクターにライゲートされることを意味するように意図されている。発現ベクターおよび発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞と適合可能であるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクターに挿入されうるかまたは、より典型的には両遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準の方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーションまたは制限部位が全く存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により発現ベクターに挿入される。本明細書中に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結されかつＶｋセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作製可能である。さらにまたは代わりに、組換え発現ベクターは、抗体鎖の宿主細胞からの分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームに連結されるようにベクターにクローニングされうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンンパク質由来のシグナルペプチド）でありうる。
【０２２６】
抗体鎖遺伝子に加え、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御因子（例えばポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。かかる調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０年））に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が形質転換対象の宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの要素に依存しうることが当業者により理解されるであろう。哺乳類宿主細胞の発現における好ましい調節配列は、哺乳類細胞内で高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス因子、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えばアデノウィルスメジャー後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターが用いられうる。さらに、異なる供給源由来の配列からなる調節因子、例えばＳＲαプロモーター系は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１のＳＶ４０初期プロモーターおよび長い末端リピートに由来する配列を有するものである（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ら（１９８８年）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２頁）。
【０２２７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本開示の組換え発現ベクターは、追加配列、例えば宿主細胞内でのベクターの複製（例えば複製の起点）を調節する配列および選択可能マーカー遺伝子を保有しうる。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、米国特許第４，６３４，６６５号明細書および米国特許第５，１７９，０１７号明細書（いずれもＡｘｅｌらによる）を参照）。例えば典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上で薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、（メトトレキセートの選択／増幅の場合にｄｈｆｒ−宿主細胞内で用いられる）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８の選択用の）ネオ遺伝子を含む。
【０２２８】
軽鎖および重鎖の発現においては、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準技術により宿主細胞に形質移入される。「形質移入」という用語の様々な形態は、外因性ＤＮＡの原核または真核宿主細胞への導入のための一般に用いられる多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、カルシウム−リン酸塩の沈降、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質移入などを包含するように意図されている。原核または真核宿主細胞のいずれかにおいて本開示の抗体を発現することは理論的に可能であるが、真核細胞内および最も好ましくは哺乳類宿主細胞内での抗体の発現が、かかる真核細胞および特に哺乳類細胞が適切に折り畳まれ免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が原核細胞よりも高いことから最も好ましい。原核生物での抗体遺伝子の発現は、高収量の活性抗体の産生にとって無効であることが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．およびＷｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５年）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３頁）。
【０２２９】
本開示の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１頁に記載のように、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：４２１６−４２２０頁に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞の場合の使用においては、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号パンフレット（Ｗｉｌｓｏｎに付与）、国際公開第８９／０１０３６号パンフレット（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎに付与）および欧州特許第３３８，８４１号明細書（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎに付与）に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞内での抗体の発現またはより好ましくは抗体の宿主細胞が成長される培地への分泌を実現するのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて培地から回収されうる。
【０２３０】
抗原に結合する抗体の特徴づけ
本開示の抗体のヒトＣＤ１９への結合については、例えば標準ＥＬＩＳＡにより試験可能である。つまり、マイクロタイタープレートをＰＢＳ中、０．２５μｇ／ｍｌで精製物でコートし、次いでＰＢＳ中、５％ウシ血清アルブミンでブロッキングする。抗体の希釈物（例えばＣＤ１９免疫マウス由来の血漿の希釈物）を各ウェルに添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼに複合された二次試薬（例えばヒト抗体においてはヤギ−抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃに特異的なポリクローナル試薬）とともに３７℃で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色させ、４０５〜６５０のＯＤで分析する。好ましくは、最高の力価を生み出すマウスが融合に用いられることになる。
【０２３１】
上記のＥＬＩＳＡアッセイを用い、ＣＤ１９免疫原と陽性の反応性を示すハイブリドーマについてのスクリーニングも可能である。ＣＤ１９タンパク質に高い結合活性および／または親和性で結合するハイブリドーマがサブクローニングされ、さらに特徴づけられる。各ハイブリドーマ由来の１つのクローンは、（ＥＬＩＳＡにより）親細胞の反応性を保持し、−１４０℃で保存された５〜１０のバイアルの細胞バンクの作製および抗体精製のために選択されうる。
【０２３２】
抗ＣＤ１９抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコ内で成長させ、モノクローナル抗体の精製を行ってもよい。上清を、プロテインＡ−セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いる親和性クロマトグラフィー前に濾過し、濃縮してもよい。溶出されたＩｇＧをゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィーにより検査し、純度を保証してもよい。緩衝溶液をＰＢＳに交換し、濃度を、１．４３消衰係数を用いるＯＤ２８０によって決定してもよい。モノクローナル抗体を一定量に分割し、−８０℃で保存してもよい。
【０２３３】
選択された抗ＣＤ１９モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを判定するため、各抗体が市販の試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてビオチン化されうる。未標識のモノクローナル抗体およびビオチン化モノクローナル抗体を用いる競合試験が、上記のようなＣＤ１９でコートされるＥＬＩＳＡプレートを用いて実施可能である。ビオチン化ｍＡｂの結合がストレプトアビジン−アルカリホスファターゼプローブで検出可能である。
【０２３４】
精製抗体アイソタイプを判定するため、アイソタイプＥＬＩＳＡを特定のアイソタイプの抗体に対して特異的な試薬を用いて行ってもよい。例えば、ヒトモノクローナル抗体アイソタイプを判定するため、マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍｌの抗ヒト免疫グロブリンで４℃で一晩コートしてもよい。１％  ＢＳＡでブロック後、プレートを１μｇ／ｍｌ以下の試験モノクローナル抗体または精製されたアイソタイプ対照と周囲温度で１〜２時間反応させる。次いで、ウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭのいずれかに特異的なアルカリホスファターゼと複合されたプローブと反応させてもよい。プレートを発色させ、上記のように分析する。
【０２３５】
抗ＣＤ１９ヒトＩｇＧでは、ウエスタンブロッティングにより、ＣＤ１９抗原との反応性についてさらに試験してもよい。つまり、ＣＤ１９に対し、調製し、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ってもよい。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に移し、１０％ウシ胎仔血清でブロックし、試験対象のモノクローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧの結合性を、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質タブレット（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）を用いて発色させてもよい。
【０２３６】
本開示の抗体の結合特異性は、例えばフローサイトメトリーにより、抗体のＣＤ１９タンパク質を発現する細胞への結合を監視することによっても判定可能である。ＯＶＣＡＲ３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＣＦＰＡＣ−１またはＫＢ細胞（実施例３にさらに記載する）のようなＣＤ１９タンパク質を自然に発現する細胞または細胞系の使用が可能であるか、または、細胞系、例えばＣＨＯ細胞系には、細胞表面上でＣＤ１９を発現するような、ＣＤ１９をコードする発現ベクターの形質移入が可能である。タグに対する抗体を用いる検出においては、形質移入されたタンパク質は、好ましくはＮ末端にタグ、例えばｍｙｃタグを含みうる。本開示の抗体のＣＤ１９タンパク質への結合性は、形質移入細胞を抗体とともにインキュベートし、結合抗体を検出することにより判定可能である。形質移入されたタンパク質上での抗体のタグへの結合は、陽性対照として用いられうる。
【０２３７】
二重特異性分子
別の局面では、本開示は、本開示の抗ＣＤ１９抗体またはその断片を含む二重特異性分子を特徴とする。本開示の抗体またはその抗原結合部分が別の機能分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体または受容体にのリガンド）に誘導体化または連結され、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子が生成されうる。本開示の抗体が実際に２つ以上の他の機能分子に誘導体化または連結され、３つ以上の異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子が生成される可能性があり、かかる多重特異性分子は本明細書で用いられる「二重特異性分子」という用語に包含されるようにも意図されている。本開示の二重特異性分子を作製するため、本開示の抗体は、二重特異性分子が生成されるように、１つ以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣体（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｉｍｅｔｉｃ）に（例えば化学共役、遺伝子融合、非共有結合またはその他により）機能的に連結されうる。
【０２３８】
したがって、本開示は、ＣＤ１９に対する少なくとも１つの第１の結合特異性および第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。本開示の特定の態様では、第２の標的エピトープはＦｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。したがって、本開示は、ＦｃγＲまたはＦｃαＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核球細胞（ＰＭＮ））とＣＤ１９を発現する標的細胞の双方に結合可能な二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、エフェクター細胞に対するＣＤ１９発現細胞を標的にし、かつ、Ｆｃ受容体媒介性のエフェクター細胞活性、例えばＣＤ１９発現細胞の食作用、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出あるいはスーパーオキシドアニオンの生成を引き起こす。
【０２３９】
二重特異性分子が多重特異性である場合の本開示の態様では、同分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＣＤ１９結合特異性に加え、第３の結合特異性をさらに含みうる。一態様では、第３の結合特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ−ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）部分、例えば細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体に結合し、それによりＦｃ受容体または標的細胞抗原における結合決定因子の効果の促進をもたらす抗体、機能抗体断片またはリガンドでありうる。「抗促進因子部分」はＦｃ受容体または標的細胞抗原に結合しうる。あるいは、抗促進因子部分は、第１および第２の結合特異性の結合対象である実体とは異なる実体に結合しうる。例えば、抗促進因子部分は、（例えば標的細胞に対する免疫応答の増大をもたらすＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１または他の免疫細胞を介して）細胞毒性Ｔ細胞に結合しうる。
【０２４０】
一態様では、本開示の二重特異性分子は、結合特異性として、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、または一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体またはその抗体断片を含む。Ｌａｄｎｅｒらに交付された米国特許第４，９４６，７７８号明細書（その全体は参照により明示的に援用される）に記載のように、抗体は、Ｆｖまたは一本鎖コンストラクトなどの軽鎖または重鎖二量体またはその任意の最小断片でもありうる。
【０２４１】
一態様では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により遮断されることはない。本明細書で用いられる「ＩｇＧ受容体」という用語は、染色体１上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを示す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）にグループ化された全部で１２の膜貫通または可溶性受容体アイソフォームをコードする。好ましい一態様では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａの分子であり、単量体ＩｇＧに対して高い親和性を示す（１０８〜１０９Ｍ−１）。
【０２４２】
特定の好ましい抗Ｆｃγモノクローナル抗体の産生および特徴づけについては、Ｆａｎｇｅｒらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第８８／０００５２号パンフレットおよび米国特許第４，９５４，６１７号明細書において記載されており、それらの教示内容は参照により本明細書中に十分に援用される。これらの抗体は受容体のＦｃγ結合部位から離れた部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合することから、それらの結合がＩｇＧの生理的レベルにより実質的に遮断されることはない。本開示で有用な特異的な抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ９４６９から入手可能である。他の態様では、抗Ｆｃγ受容体抗体はモノクローナル抗体２２のヒト化形態である（Ｈ２２）。Ｈ２２抗体の産生および特徴づけについては、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１５５（１０）：４９９６−５００２頁およびＴｅｍｐｅｓｔらに交付されたＰＣＴ公開、国際公開第９４／１０３３２号パンフレットに記載されている。Ｈ２２抗体産生細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１の指定の下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託されたものであり、登録番号ＣＲＬ１１１７７を有する。
【０２４３】
さらに他の好ましい態様では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性はヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃ−α受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体により提供され、その結合は好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）により遮断されることはない。「ＩｇＡ受容体」という用語は、染色体１９上に位置する１つのα遺伝子の遺伝子産物（ＦｃαＲＩ）を含むように意図されている。この遺伝子は、５〜１１０ｋＤａの数種の交互にスプライスされた膜貫通アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球上に構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団上に発現されることはない。ＦｃαＲＩは、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２の双方に対して中程度の親和性（約５×１０７Ｍ−１）を有し、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインへの暴露時に増加する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ら（１９９６年）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０頁）。Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７として同定された４つのＦｃαＲＩに特異的なモノクローナル抗体は、ＩｇＡリガンド結合ドメイン外部のＦｃαＲＩに結合するものであり、記載がなされている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ら（１９９２年）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４頁）。
【０２４４】
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、（１）主に免疫エフェクター細胞、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞の上で発現され、（２）高レベルで発現され（例えば１細胞当たり５，０００〜１００，０００）、（３）細胞毒性活性のメディエーター（例えばＡＤＣＣ、食作用）であり、かつ（４）それらに対して標的とされる、自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介することから、本開示の二重特異性分子において用いられる要因となる好ましい誘発受容体である。
【０２４５】
ヒトモノクローナル抗体が好ましい一方、本開示の二重特異性分子において用いられうる他の抗体がマウス、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２４６】
本開示の二重特異性分子は、構成要素の結合特異性、例えば抗ＦｃＲおよび抗ＣＤ１９結合特異性を当該技術分野で既知の方法を用いて複合することにより調製されうる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々にもたらされ、次いで互いに複合されうる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、種々の共役剤または架橋剤が共有結合に用いられうる。架橋剤の例として、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら（１９８４年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６頁；Ｌｉｕ  Ｍ．Ａ．ら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８頁を参照）。他の方法として、Ｐａｕｌｕｓ（１９８５年）Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．Ｎｏ．７８：１１８−１３２頁；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１−８３頁およびＧｌｅｎｎｉｅら（１９８７年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：２３６７−２３７５頁に記載の方法が挙げられる。好ましい複合剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、いずれもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から入手可能である。
【０２４７】
結合特異性が抗体である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して複合されうる。特に好ましい態様では、ヒンジ領域は、複合に先立ち、奇数、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を有するように修飾される。
【０２４８】
あるいは、両方の結合特異性は同じベクター内にコードされ、かつ同じ宿主細胞内で発現され、構築されうる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本開示の二重特異性分子は、１つの一本鎖抗体および結合決定因子を含む一本鎖分子、または２つの結合決定因子を含む一本鎖二重特異性分子でありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの一本鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号明細書；米国特許第５，４５５，０３０号明細書；米国特許第４，８８１，１７５号明細書；米国特許第５，１３２，４０５号明細書；米国特許第５，０９１，５１３号明細書；米国特許第５，４７６，７８６号明細書；米国特許第５，０１３，６５３号明細書；米国特許第５，２５８，４９８号明細書；および米国特許第５，４８２，８５８号明細書に記載されている（これらのすべては参照により本明細書中に明示的に援用される）。
【０２４９】
二重特異性分子のその特異的な標的に対する結合は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば成長阻害）またはウエスタンブロットアッセイによって確認されうる。これらの各アッセイでは、一般に、特別な目的のタンパク質−抗体複合体の存在が目的の複合体に対して特異的な標識試薬（例えば抗体）の使用により検出される。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識しかつそれに対して特異的に結合する酵素結合抗体または抗体断片を用いて検出されうる。あるいは、複合体は種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて検出されうる。例えば、抗体は放射活性物質で標識され、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で用いられうる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  Ｂ．、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月（参照により本明細書中に援用される）を参照）。放射性同位体は、ガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用などの手段あるいはオートラジオグラフィーにより検出されうる。
【０２５０】
リンカー
本発明は、抗体が化学リンカーを介してパートナーに連結された抗体−パートナー複合体を提供する。一部の態様では、リンカーはペプチジルリンカーであり、本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍとして表される。他のリンカーは、ヒドラジンおよびジスルフィドリンカーを含み、それぞれ本明細書中で（Ｌ４）ｐ−Ｈ−（Ｌ１）ｍまたは（Ｌ４）ｐ−Ｊ−（Ｌ１）ｍとして表される。本発明は、パートナーに結合されているリンカーに加え、本質的に任意の分子種への結合に適する切断可能なリンカーアームも提供する。本発明のリンカーアームの局面は、本明細書中でその治療部分への結合を参照することにより例示される。しかし、リンカーが限定はされないが診断剤、分析剤、生体分子、標的化剤、検出可能な標識などを含む多様な種に結合可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。
【０２５１】
抗体−パートナー複合体におけるペプチジルおよび他のリンカーの使用については、米国仮特許出願第６０／２９５，１９６号明細書；米国仮特許出願第６０／２９５，２５９号明細書；米国仮特許出願第６０／２９５３４２号明細書；米国仮特許出願第６０／３０４，９０８号明細書；米国仮特許出願第６０／５７２，６６７号明細書；米国仮特許出願第６０／６６１，１７４号明細書；米国仮特許出願第６０／６６９，８７１号明細書；米国仮特許出願第６０／７２０，４９９号明細書；米国仮特許出願第６０／７３０，８０４号明細書；および米国仮特許出願第６０／７３５，６５７号明細書および米国特許出願第１０／１６０，９７２号明細書；米国特許出願第１０／１６１，２３４号明細書；米国特許出願第１１／１３４，６８５号明細書；米国特許出願第１１／１３４，８２６号明細書、米国特許出願第１１／３９８，８５４号明細書および米国特許第６，９８９，４５２号明細書、ならびにＰＣＴ特許出願のＰＣＴ／ＵＳ２００６／３７７９３号明細書において記載され、これら全部は参照により本明細書中に援用される。
【０２５２】
さらなるリンカーが、米国特許第６，２１４，３４５号明細書（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、米国特許出願公開第２００３／００９６７４３号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１３０１８９号明細書（いずれもＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓに付与）、ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２、５２７７頁（１９９９年）；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３、３０９３頁（２０００年）；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６６、８８１５頁、（２００１年）；国際公開第０２／０８３１８０号パンフレット（Ｓｙｎｔａｒｇａ）；Ｃａｒｌら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２４、４７９頁、（１９８１年）；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら、Ｂｉｏｏｒｇ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８、３３４７頁（１９９８年）；および米国仮特許出願第６０／８９１，０２８号明細書（２００７年２月２１日出願）において記載されている。
【０２５３】
一局面では、本発明は、治療物質およびマーカーに対する標的化基への結合に有用なリンカーに関する。別の局面では、本発明は、化合物に安定性をもたらすか、そのインビボでの毒性を低減するか、またはそれ以外ではその薬動力学、バイオアベイラビリティおよび／または薬力学に好ましい作用をもたらすといったリンカーを提供する。かかる態様では、一旦薬剤がその作用部位に送達されると、リンカーが切断され活性薬剤が放出されることが一般に好ましい。したがって、本発明の一態様では、本発明のリンカーは、一旦治療物質またはマーカーから除去されると（活性化される間など）リンカーの存在の痕跡が全く残らないようにトレースレスである。
【０２５４】
本発明の別の態様では、リンカーは、治療作用またはマーカー活性の部位など、標的細胞内またはその近傍の部位でのその切断される能力により特徴づけられる。かかる切断は本質的に酵素的でありうる。この特徴は、治療物質またはマーカーの全身活性化の低減や、毒性および全身性副作用の低減に役立つ。酵素的切断にとって好ましい切断可能な基は、ペプチド結合、エステル結合、およびジスルフィド結合を含む。他の態様では、リンカーはｐＨに感受性があり、ｐＨの変化を通じて切断される。
【０２５５】
本発明の重要な局面は、リンカーの切断速度を制御する能力である。速やかに切断されるリンカーが望ましい場合が多い。しかし、一部の態様では、より緩やかに切断されるリンカーが好ましい場合がある。例えば、徐放製剤または速やかな放出成分と緩やかな放出成分の双方を有する製剤では、より緩やかに切断されるリンカーを提供することが有用でありうる。国際公開第０２／０９６９１０号パンフレットは、ヒドラジンリンカーを有する数種の特異的リガンド−薬剤複合体を提供する。しかし、リンカー組成物を要求される環化速度に応じて「調節する（ｔｕｎｅ）」見込みはなく、リガンドを記載の特定の化合物よりも緩やかな速度で薬剤から切断することが多数の薬剤−リンカー複合体にとって好ましい。それに対し、本発明のヒドラジンリンカーが環化速度の非常に高速から非常に低速までの範囲を備えることにより、所望の環化速度に基づく特定のヒドラジンリンカーの選択が可能になる。
【０２５６】
例えば、切断時に単一の５員環を生成するヒドラジンリンカーの場合、非常に高速な環化が得られうる。細胞毒性物質の細胞への標的化送達にとって好ましい環化速度は、切断時にジェミナル（ｇｅｍｉｎａｌ）位置に２つのメチル基を有するリンカーから得られる２つの５員環または単一の６員環のいずれかを生成するヒドラジンリンカーを用いて得られる。ｇｅｍ−ジメチル効果により、ジェミナル位置に２つのメチル基を有しない単一の６員環の場合と比べて環化反応の速度が加速されることが示されている。これは同環内に解放されている株から得られる。しかし時として、置換基は反応速度を高めるのではなく低下させうる。遅延の理由が立体障害に帰着されうることが多い。例えば、ｇｅｍジメチル置換により、ジェミナル炭素がＣＨ２である場合よりも極めて迅速な環化反応が生じうる。
【０２５７】
しかし、一部の態様ではより緩やかに切断されるリンカーが好ましい場合があることに着目することが重要である。例えば、徐放製剤または速やかな放出および緩やかな放出成分の双方を有する製剤では、より緩やかに切断されるリンカーを提供することが有用でありうる。特定の態様では、低速の環化が、切断時にｇｅｍ−ジメチル置換基を有しない単一の６員環、または単一の７員環を生成するヒドラジンリンカーを用いてなされる。
【０２５８】
リンカーはまた、治療物質またはマーカーを循環中での分解に対して安定化させるのに役立つ。この特徴は、かかる安定化の結果、結合された治療物質またはマーカーの循環半減期が延長されることから有意な効果をもたらす。リンカーはまた、結合された治療物質またはマーカーの活性を複合体が循環中に比較的良性であるように弱めるのに役立ち、かつ、所望の作用部位での活性化後に望ましい効果を有し、例えば毒性を示す。治療物質複合体においては、リンカーのこの特徴は同剤の治療指数を改善するのに役立つ。
【０２５９】
安定化基は、好ましくは、治療物質またはマーカーのクリアランスおよび代謝を血液中または非標的組織内に存在しうる酵素により制限するように選択され、さらに同剤またはマーカーの細胞への輸送を制限するように選択される。安定化基は、同剤またはマーカーの分解を遮断するのに役立ち、また同剤またはマーカーの他の物理的特性をもたらすように作用しうる。安定化基はまた、同剤またはマーカーの安定性を製剤または非製剤形態のいずれかで保存される間に改善しうる。
【０２６０】
望ましくは、安定化基は、治療物質またはマーカーのヒト血液中、３７℃で２時間の保存により試験される場合に同剤またはマーカーを分解から保護するのに役立ち、かつ所与のアッセイ条件下でヒト血液中に存在する酵素により、２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満およびさらにより好ましくは２％未満の同剤またはマーカーの切断をもたらす場合、治療物質またはマーカーの安定化に有用である。
【０２６１】
本発明は、これらのリンカーを有する複合体にも関する。より詳細には、本発明は疾患の治療、特に癌化学療法に用いられうるプロドラッグに関する。詳細には、本明細書中に記載のリンカーの使用により、類似構造のプロドラッグと比べて、活性の高い特異性、低下した毒性、および血中での改善された安定性を示すプロドラッグが提供される。
【０２６２】
本明細書中に記載の本発明のリンカーは、パートナー分子内部の種々の位置に存在しうる。
【０２６３】
したがって、インビボ、例えば血流中で、かかる基が欠如した構築物の速度よりも高い速度で切断されることになる、種々の基のいずれかをその鎖の一部として有しうるリンカーが提供される。リンカーアームと治療物質および診断物質との複合体も提供される。リンカーは、治療物質のプロドラッグ類似体を形成しかつ治療物質または診断物質を標的化剤、検出可能な標識、または固体支持体に可逆的に連結するのに有用である。リンカーは、細胞毒素を含む複合体に組み込まれうる。
【０２６４】
プロドラッグの抗体への結合により、従来の細胞毒性薬の抗体複合体の全体においてさらなる安全性の利点が得られうる。プロドラッグの活性化が、腫瘍細胞内および血漿を含むいくつかの正常組織内の双方でエステラーゼにより得られうる。ヒトにおける関連エステラーゼ活性のレベルは、マウスで観察されるレベルより低いが、ラットおよび非ヒト霊長類で観察されるレベルに酷似することが示されている。プロドラッグの活性化は、グルクロニダーゼによる切断によっても得られうる。
【０２６５】
切断可能なペプチド、ヒドラジン、またはジスルフィド基に加え、１つ以上の自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ）基Ｌ１が場合により細胞毒素と標的化剤の間に導入される。これらのリンカー基はまた、スペーサー基として記述され、少なくとも２つの反応官能基を有しうる。典型的には、スペーサー基の一方の化学官能基が治療物質の化学官能基、例えば細胞毒素に結合する間、スペーサー基の他方の化学官能基は標的化剤または切断可能なリンカーの化学官能基に結合するように用いられる。スペーサー基の化学官能基の例として、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボニル基、カルボキシ基、アミノ基、ケトン基、およびメルカプト基が挙げられる。
【０２６６】
Ｌ１で表される自己犠牲リンカーは、一般に置換もしくは未置換アルキル基、置換もしくは未置換アリール基、置換もしくは未置換ヘテロアリール基または置換もしくは未置換ヘテロアルキル基である。一態様では、アルキルまたはアリール基は１〜２０個の炭素原子を含みうる。それらはまた、ポリエチレングリコール部分を含みうる。
【０２６７】
典型的なスペーサー基として、例えば、６−アミノヘキサノール、６−メルカプトヘキサノール、１０−ヒドロキシデカン酸、グリシンおよび他のアミノ酸、１，６−ヘキサンジオール、β−アラニン、２−アミノエタノール、システアミン（２−アミノエタンチオール）、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸、３−マレイミド安息香酸、フタリド、α−置換フタリド、カルボニル基、アミナールエステル、核酸、ペプチドなどが挙げられる。
【０２６８】
スペーサーは、さらなる分子量および化学官能基を細胞毒素−標的化剤複合体に導入するのに役立ちうる。一般に、さらなる分子量および官能基は複合体の血清半減期および他の特性に作用することになる。したがって、スペーサー基の注意深い選択を通じ、ある範囲の血清半減期を有する細胞毒素複合体が生成されうる。
【０２６９】
薬剤成分の直近に位置するスペーサーは、（Ｌ１）ｍ（式中、ｍは０、１、２、３、４、５、および６から選択される整数である）としても示される。複数のＬ１スペーサーが存在する場合、同一のまたは異なるスペーサーのいずれかが用いられうる。Ｌ１は任意の自己犠牲的な基でありうる。
【０２７０】
Ｌ４は好ましくは複合体に同部分を有するリンカーを用いて溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかまたは複合体の加水分解速度を変化させるリンカー部分である。Ｌ４リンカーは自己犠牲的である必要がない。一態様では、Ｌ４部分は、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアルキル、または未置換ヘテロアルキルであり、これらのいずれかが直鎖状、分岐鎖状、または環状でありうる。置換基は、例えば、低級（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、アルコキシ、アルキルチオ、アルキルアミノ、またはジアルキルアミノでありうる。特定の態様では、Ｌ４は非環状部分を含む。別の態様では、Ｌ４は任意の正または負に帯電したアミノ酸重合体、例えばポリリシンまたはポリアルギニンを含む。Ｌ４はポリエチレングリコール部分などの重合体を含みうる。さらに、Ｌ４リンカーは、例えば重合体成分と小さい化学的成分の双方を含みうる。
【０２７１】
好ましい態様では、Ｌ４はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。Ｌ４のＰＥＧ部分は１〜５０単位の長さでありうる。好ましくは、ＰＥＧは１〜１２の繰り返し単位、より好ましくは３〜１２の繰り返し単位、より好ましくは２〜６の繰り返し単位、またはさらにより好ましくは３〜５の繰り返し単位および最も好ましくは４の繰り返し単位を有することになる。Ｌ４は、単にＰＥＧ部分からなりうるか、あるいはさらなる置換もしくは未置換のアルキルまたはヘテロアルキルも有しうる。ＰＥＧとＬ４部分の一部として結合し、複合体の水溶性を高めることは有用である。さらに、ＰＥＧ部分は薬剤と抗体との複合の間に生じうる凝集の程度を低下させる。
【０２７２】
一部の態様では、Ｌ４は、（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合される、
0005517626.tif 000004
を含む。Ｒ２０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、およびＲ２６’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され、かつｓおよびｔは独立して１〜６の整数である。好ましくは、Ｒ２０、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’は疎水性である。一部の態様では、Ｒ２０はＨまたはアルキル（好ましくは未置換低級アルキル）である。一部の態様では、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’は、独立してＨまたはアルキル（好ましくは未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。一部の態様では、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６およびＲ２６’はすべてがＨである。一部の態様では、ｔは１でありかつｓは１または２である。
【０２７３】
ペプチドリンカー（Ｆ）
上で考察のように、本発明のペプチジルリンカーは、一般式：（Ｌ４）ｐ−Ｆ−（Ｌ１）ｍ（式中、Ｆはペプチジル部分を含むリンカー部分を表す）により表されうる。一態様では、Ｆ部分は任意の追加の自己犠牲リンカーＬ２およびカルボニル基を含む。別の態様では、Ｆ部分はアミノ基および任意のスペーサー基Ｌ３を含む。
【０２７４】
したがって、一態様では、ペプチジルリンカーを含む複合体は、式（ａ）：
0005517626.tif 000005
の構造を含む。
【０２７５】
この態様では、Ｌ１は上記のような自己犠牲リンカーであり、かつ、Ｌ４は上記のように好ましくは溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかあるいは加水分解速度を変化させる部分である。Ｌ２は自己犠牲リンカーを表す。さらに、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６であり、かつｏおよびｐは独立して０もしくは１である。ＡＡ１は１種類以上の天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸を表し、ｃは１〜２０の整数である。一部の態様では、ｃは２〜５の範囲内であるかまたは２もしくは３である。
【０２７６】
上記式（ａ）の本発明のペプチドリンカーにおいては、ＡＡ１は、そのアミノ末端で、Ｌ４に直接連結されるか、またはＬ４が不在の場合にはＸ４基（すなわち、標的化剤、検出可能な標識、保護反応官能基または非保護反応官能基）に直接連結される。一部の態様では、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合されたカルボン酸アシル基を含まない。したがって、これらの態様では、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載のペプチドリンカーにおいて必要であるように、Ｌ４またはＸ４のいずれかとＡＡ１の間に直接カルボン酸アシル単位が必ずしも存在する必要がない。
【０２７７】
別の態様では、ペプチジルリンカーを含む複合体は、式（ｂ）：
0005517626.tif 000006
の構造を含む。
【０２７８】
この態様では、Ｌ４は上記のように、好ましくは溶解度の増大または凝集特性の低下をもたらすかあるいは加水分解速度を変化させる部分であり、Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むスペーサー基であり、かつＬ３のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシル基がＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成し、かつｏおよびｐは独立して０または１である。ＡＡ１は１種類以上の天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸を表し、ｃは１〜２０の整数である。この態様では、Ｌ１は存在しない（すなわち一般式中でｍは０である）。
【０２７９】
上記式（ｂ）の本発明のペプチドリンカーにおいては、ＡＡ１は、そのアミノ末端で、Ｌ４に直接連結されるか、またはＬ４が不在の場合にはＸ４基（すなわち、標的化剤、検出可能な標識、保護反応官能基または非保護反応官能基）に直接連結される。一部の態様では、Ｌ４が存在する場合、Ｌ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合されたカルボン酸アシル基を含まない。したがって、これらの態様では、米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載のペプチドリンカーにおいて必要であるように、Ｌ４またはＸ４のいずれかとＡＡ１の間に直接カルボン酸アシル単位が必ずしも存在する必要がない。
【０２８０】
自己犠牲リンカーＬ２
自己犠牲リンカーＬ２は、２つの距離が離れた化学的部分を共に通常は安定なトリパーテート（ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ）分子に共有結合可能な二機能の化学的部分であり、それにより酵素切断を用いてトリパーテート分子から前記距離が離れた化学的部分のうちの一方が放たれ、前記酵素切断後、分子の残りから自発的切断が生じ、前記距離が離れた化学的部分の他方が放たれる。本発明によると、自己犠牲スペーサーは、その一方の末端でペプチド部分に共有結合されかつその他方の末端で薬剤部分（その誘導化が薬理学的活性を阻害する）の化学反応性がある部位に共有結合されることで、距離が離れ、ペプチド部分および薬剤部分を共に標的酵素の不在下で安定でかつ薬理学的に不活性であるトリパーテート分子に共有結合させるが、それはスペーサー部分およびペプチド部分に共有結合することによりトリパーテート分子からのペプチド部分の放出に作用する結合でかかる標的酵素により酵素的に切断可能である。次いで、かかる酵素切断は、スペーサー部分の自己犠牲的特徴を活性化し、スペーサー部分を薬剤部分に共有結合させることにより薬理活性形態での薬剤の放出に作用する結合の自発切断を開始させることになる。
【０２８１】
自己犠牲リンカーＬ２は任意の自己犠牲的な基でありうる。好ましくは、Ｌ２は、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換および未置換アリール、ならびに置換および未置換ヘテロアリールである。  
【０２８２】
１つの特に好ましい自己犠牲スペーサーＬ２は、式（ｃ）：
0005517626.tif 000007
で表されうる。
【０２８３】
アミノベンジル基の芳香環は１つ以上の「Ｋ」基で置換されうる。「Ｋ」基は、通常では環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つに結合される水素を置換する芳香環上の置換基である。「Ｋ」基は単一の原子、例えばハロゲンでありうるか、または多重原子群、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノでありうる。各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は独立してＨ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）からなる群から独立して選択される。典型的なＫ置換基は、限定はされないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３およびメチルを含む。「Ｋｉ」においては、ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。好ましい一態様では、ｉは０である。
【０２８４】
上記の構造のエーテル酸素原子はカルボニル基に結合される。ＮＲ２４官能基から芳香環への系統は、アミンの官能基が５個の炭素（いずれも環を形成し、−ＣＨ２−Ｏ−基で置換されない）のいずれかに結合されうることを示す。好ましくは、ＸのＮＲ２４官能基は−ＣＨ２−Ｏ−基に対するパラ配位で芳香環に共有結合される。Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から選択されるメンバーである。特定の態様では、Ｒ２４は水素である。
【０２８５】
一態様では、本発明は、上記の式（ａ）のペプチドリンカーを提供し、ここでＦは構造：
0005517626.tif 000008
を含み、式中Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から選択される）を提供する。各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は独立してＨ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択される）からなる群から独立して選択されるメンバーであり、かつｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。
【０２８６】
別の態様では、上記式（ａ）のペプチドリンカーは、構造：
0005517626.tif 000009
を含む−Ｆ−（Ｌ１）ｍ−を含み、式中各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。
【０２８７】
一部の態様では、自己犠牲スペーサーＬ１またはＬ２は、
0005517626.tif 000010
を含み、式中Ｒ１７、Ｒ１８、およびＲ１９の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換のヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択され、かつｗは０〜４の整数である。一部の態様では、Ｒ１７およびＲ１８は独立してＨまたはアルキル（好ましくは未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル）である。好ましくは、Ｒ１７およびＲ１８はＣ１〜Ｃ４アルキル、例えばメチルまたはエチルである。一部の態様では、ｗは０である。任意の特定の理論に拘束されたくないが、この特定の自己犠牲スペーサーが比較的速やかに環化することが実験的に見出されている。
【０２８８】
一部の態様では、Ｌ１またはＬ２は、
0005517626.tif 000011
を含む。
【０２８９】
スペーサー基Ｌ３
スペーサー基Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンまたはカルボキシル官能基を含むように特徴づけられ、かつ、Ｌ３基のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシルがＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成する。Ｌ３は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、または置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から選択されうる。好ましい態様では、Ｌ３は芳香族性基を含む。より好ましくは、Ｌ３は安息香酸基、アニリン基またはインドール基を含む。−Ｌ３−ＮＨ−スペーサーとして機能しうる構造の非限定例として、
0005517626.tif 000012
といった構造が挙げられ、式中ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、かつＲ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０２９０】
Ｌ３を有する本発明のリンカーの切断時、Ｌ３部分は薬剤Ｄに結合されたままである。したがって、Ｌ３部分はＤに結合されたその存在がＤの活性を有意に変化させないように選択される。別の態様では、薬剤Ｄ自体の一部がＬ３スペーサーとして機能する。例えば、一態様では、薬剤Ｄは薬剤の一部がＬ３スペーサーとして機能するデュオカルマイシン誘導体である。かかる態様の非限定例として、ＮＨ２−（Ｌ３）−Ｄが
0005517626.tif 000013
からなる群から選択される構造を有する場合が挙げられ、式中ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり、かつ各構造上のＮＨ２基は（ＡＡ１）ｃと反応して−（ＡＡ１）ｃ−ＮＨ−を形成する。
【０２９１】
ペプチド配列ＡＡ１
ＡＡ１基は、単一のアミノ酸またはアミド結合により結合された複数のアミノ酸を表す。アミノ酸は天然アミノ酸および／または非天然α−アミノ酸でありうる。
【０２９２】
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、機能的に、単一のアミノ酸（ｃ＝１の場合）またはアミド結合により互いに結合された複数のアミノ酸のアミド化残基である。本発明のペプチドは、生体系における目的の位置で酵素によるペプチドの酵素触媒化切断を誘導するように選択される。例えば、標的化剤を用いて細胞に標的化されるがその細胞により内在化されない複合体においては、例えばペプチドが細胞外で切断されるように近隣での死滅に向かう細胞の細胞内容物の放出により、細胞外マトリックス内に存在しうる１種類以上のプロテアーゼにより切断されるペプチドが選択される。ペプチド内部のアミノ酸の数は１〜２０個の範囲でありうるが、より好ましくは（ＡＡ１）ｃを含む、１〜８個のアミノ酸、１〜６個のアミノ酸または１、２、３もしくは４個のアミノ酸が存在することになる。特異的酵素により切断されやすいペプチド配列または酵素のクラスは当該技術分野で周知である。
【０２９３】
血清、肝臓、腸管などにおける酵素により切断される多数のペプチド配列は、当該技術分野で既知である。本発明の典型的なペプチド配列は、プロテアーゼにより切断されるペプチド配列を含む。プロテアーゼ感受性配列の使用についてなされる考察の中心は、図示の簡素化を意図したものであり、本発明の範囲を限定することに役立つものではない。
【０２９４】
ペプチドを切断する酵素がプロテアーゼである場合、リンカーは一般にプロテアーゼに対する切断認識配列を有するペプチドを含む。プロテアーゼに対する切断認識配列は、タンパク質分解切断の間にプロテアーゼにより認識される特定のアミノ酸配列である。多数のプロテアーゼ切断部位が当該技術分野で既知であり、これらおよび他の切断部位は、リンカー部分内に含まれうる。例えば、Ｍａｔａｙｏｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：９５４頁（１９９０年）；Ｄｕｎｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４１：２５４頁（１９９４年）；Ｓｅｉｄａｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：１７５頁（１９９４年）；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：６１５頁（１９９４年）；Ｗｅｂｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：５９５頁（１９９４年）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４：４１２頁（１９９４年）；Ｂｏｕｖｉｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４８：６１４頁（１９９５年）、Ｈａｒｄｙら、ｉｎ  Ａｍｉｌｏｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ａｇｉｎｇ，ａｎｄ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｍａｓｔｅｒｓら編、１９０−１９８頁（１９９４年）を参照のこと。
【０２９５】
ペプチド配列（ＡＡ１）ｃのアミノ酸は、腫瘍関連プロテアーゼなどの特定の分子による選択的酵素切断に対するその適合性に基づいて選択される。用いられるアミノ酸は天然または非天然アミノ酸でありうる。それらはＬまたはＤ配置でありうる。一態様では、少なくとも３種の異なるアミノ酸が用いられる。別の態様では、２種のアミノ酸のみが用いられる。
【０２９６】
好ましい態様では、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃはリソソームプロテアーゼにより切断されるその能力に基づいて選択され、その非限定例としてカテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＬおよびＳが挙げられる。好ましくは、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃはインビトロでカテプシンＢにより切断可能であり、それは当該技術分野で既知のインビトロでのプロテアーゼ切断アッセイを用いて試験されうる。
【０２９７】
別の態様では、ペプチド配列（ＡＡ１）ｃは、腫瘍関連プロテアーゼ、例えば腫瘍細胞近傍で細胞外に見出されるプロテアーゼにより切断されるその能力に基づいて選択され、その非限定例として、チメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ（ＴＯＰ）およびＣＤ１０が挙げられる。ペプチドのＴＯＰまたはＣＤ１０により切断される能力は、当該技術分野で既知のインビトロでのプロテアーゼ切断アッセイを用いて試験されうる。
【０２９８】
本発明の複合体での使用に適するペプチド配列の適例として、限定はされないが、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ、Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｎ９−トシル−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｎ９−ニトロ−Ａｒｇ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号８８）、β−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（配列番号８９）Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号９０）、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（配列番号１０１）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ、ならびにＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｖａｌが挙げられる。好ましいペプチド配列はＶａｌ−ＣｉｔおよびＶａｌ−Ｌｙｓである。
【０２９９】
別の態様では、薬剤部分の直近に位置するアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｉｔ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される。さらに別の態様では、薬剤部分の直近に位置するアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌからなる群から選択される。
【０３００】
プロテアーゼは癌転移に関与している。プロテアーゼウロキナーゼの合成の増大が、多数の癌内での転移能の増強と相関していた。ウロキナーゼは細胞外空間内に偏在するプラスミノゲンからプラスミンを活性化し、その活性化により転移性腫瘍細胞の浸潤を媒介する細胞外マトリックス内でタンパク質の分解が引き起こされうる。プラスミンはまたコラゲナーゼを活性化する故、毛細管およびリンパ系の周囲の基底膜内でのコラーゲンの分解を促進可能であり、それにより腫瘍細胞の標的組織への浸潤が可能になる（Ｄａｎｏら、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．、４４：１３９頁（１９８５年））。したがって、ウロキナーゼにより切断されるペプチド配列のリンカーとしての使用は本発明の範囲内に含まれる。
【０３０１】
本発明は、トリプターゼによる切断に感受性があるペプチド配列の使用についても提供する。ヒトマスト細胞は、α、βＩ、βＩＩ、およびβＩＩＩと称される少なくとも４種の異なるトリプターゼを発現する。これらの酵素は血漿プロテアーゼ阻害剤により制御されることがなく、インビトロで数種の生理的基質を切断するだけである。セリンプロテアーゼのトリプターゼファミリーは、マスト細胞を含む種々のアレルギー性および炎症性疾患に関与しており、その理由はこれらの障害を有する患者由来の体液中で見出されるトリプターゼレベルの上昇にある。しかし、疾患の病態生理におけるトリプターゼの正確な役割はいまだに明らかにされていない。トリプターゼの生物学的機能および対応する生理学的結果の範囲は、それらの基質特異性により実質的に画定される。
【０３０２】
トリプターゼは、腫瘍転移および浸潤に関連したプロテアーゼのチモーゲン形態であるプロウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）の強力な活性化因子である。細胞溢出および移動において細胞外マトリックスの破壊をまねくプラスミノゲンカスケードの活性化は、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＬｙｓのＰ４〜Ｐ１配列（配列番号９１）のプロウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子のトリプターゼ活性化の機能でありうる（Ｓｔａｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６９（１３）：９４１６−９４１９頁（１９９４年））。血管透過性の調節に関与する神経ペプチドＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）もまた主にＴｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（配列番号９２）配列でトリプターゼにより切断される（Ｔａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３：２７−３２頁（１９９０年））。Ｇタンパク質共役受容体ＰＡＲ−２をＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（配列番号９３）配列でトリプターゼにより切断し活性化することで、線維芽細胞の増殖が促進されうる一方、トロンビン活性化受容体ＰＡＲ−１がＰｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号９４）配列でトリプターゼにより不活性化される（Ｍｏｌｉｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７２（７）：４０４３−４０４９頁（１９９７年））。総合すれば、このエビデンスは、トリプターゼにおける疾患の結果としての組織リモデリングでの中心的役割を示唆する。これはいくつかのマスト細胞媒介性の障害において観察される重大な変化に合致する。慢性喘息および他の長期の呼吸器疾患の１つの特質は、その生理的標的のトリプターゼ活性化の結果でありうる下層組織の線維化および肥厚である。同様に、血管新生が種々の癌におけるマスト細胞密度、トリプターゼ活性および予後不良に関連することを一連の報告が示している（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３（１１）：１３８２−９７頁（１９９９年））；Ｔａｋａｎａｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  ８８（１２）：２６８６−９２頁（２０００年）；Ｔｏｔｈ−Ｊａｋａｔｉｃｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３１（８）：９５５−９６０頁（２０００年）；Ｒｉｂａｔｔｉら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８５（２）：１７１−５頁（２０００年））。
【０３０３】
特定のプロテアーゼが選択されたペプチド配列を切断するか否かを評価するための方法は当該技術分野で既知である。例えば、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）蛍光発生ペプチド基質の使用は、プロテアーゼ特異性を測定するための十分に確立された方法である（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  Ｍ．ら（１９７７年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７８：４７−５１頁）。アニリド結合の特異的切断により蛍光発生ＡＭＣ脱離基が遊離し、各基質における切断速度の簡易な測定が可能になる。より最近では、ＡＭＣペプチド基質ライブラリのアレイ（Ｌｅｅ  Ｄ．ら（１９９９年）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ９：１６６７−７２頁）および位置走査ライブラリ（Ｒａｎｏ  Ｔ．Ａ．ら（１９９７年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：１４９−５５頁）を用い、単一の実験での広範囲の基質のサンプリングによるプロテアーゼのＮ末端特異性の迅速なプロファイリングが行われている。したがって、当業者は、過度の実験に依存することなく、ペプチド配列のアレイを評価し、本発明におけるその有用性を判定することが容易にできる。
【０３０４】
本発明の抗体−パートナー複合体は、場合により２種以上のリンカーを有しうる。これらのリンカーは同じかまたは異なる場合がある。例えば、ペプチジルリンカーを用いて薬剤のリガンドへの連結が可能であり、第２のペプチジルリンカーにより診断剤の複合体への結合が可能である。追加のリンカーにおける他の使用として、分析剤、生体分子、標的化剤、および検出可能な標識の抗体−パートナー複合体への連結が含まれる。
【０３０５】
また、例えば本発明の化合物の二量体、三量体、四量体およびより高級な相同体またはそれらの反応類似体などの種を含む多価種である本発明の化合物は、本発明の範囲内に含まれる。多価種は、本発明の単一種または２種以上の種から構築可能である。例えば、二量体構築物は「ホモ二量体」または「ヘテロ二量体」でありうる。さらに、本発明の化合物またはその反応類似体がオリゴマーまたはポリマーフレームワーク（例えばポリリシン、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプンなど）に結合された多価構築物は本発明の範囲内に含まれる。フレームワークは、好ましくは多官能性である（すなわち本発明の化合物に結合するための一連の反応部位を有する）。さらに、フレームワークは、本発明の単一種または本発明の２種以上の種で誘導体化されうる。
【０３０６】
さらに、本発明は、類似官能基でない類似化合物よりも高い水溶性を有する化合物が得られる官能化された化合物を含む。したがって、本明細書中に示される置換基のいずれかが水溶性を高めている類似基と置換されうる。例えば、水酸基をジオールまたは第４級アミン、ヒドロキシアミンもしくは類似の水溶性がより高い部分を有するアミンと置換することは本発明の範囲内に含まれる。好ましい態様では、さらなる水溶性が、本明細書中に示される化合物のイオンチャネルに対する活性にとって本質的でない部位での、親化合物の水溶性を高める部分との置換により与えられる。有機化合物の水溶性を高める方法は当該技術分野で既知である。かかる方法は、限定はされないが、常に帯電した部分、例えば第４級アンモニウムまたは生理学的関連ｐＨで帯電した基、例えばカルボン酸、アミンで有機核を官能化する工程を含む。他の方法は、有機核にヒドロキシルまたはアミンを有する基、例えばアルコール、ポリオール、ポリエーテルなどを付加する工程を含む。代表例は、限定はされないが、ポリリシン、ポリエチレンイミン、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）を含む。これらの化合物に適する官能化の化学反応および戦略は当該技術分野で既知である。例えば、Ｄｕｎｎ  Ｒ．Ｌ．ら編、「ＰＯＬＹＭＥＲＩＣ  ＤＲＵＧＳ  ＡＮＤ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＳＹＳＴＥＭＳ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  第４６９巻」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９９１年を参照のこと。
【０３０７】
ヒドラジンリンカー（Ｈ）
第２の態様では、本発明の複合体はヒドラジン自己犠牲リンカーを含み、ここで複合体は構造：
0005517626.tif 000014
を有し、式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、およびＸ４は上で定義された通りであり、かつ本明細書中にさらに記載され、かつＨは構造：
0005517626.tif 000015
を含むリンカーであり、式中、ｎ１は１〜１０の整数であり、ｎ２は０、１、もしくは２であり、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーであり、かつＩは結合（すなわち骨格の炭素と隣接窒素の間の結合）かまたは
0005517626.tif 000016
のいずれかであり、式中、ｎ３が０である場合、ｎ２が０でないという条件でｎ３は０もしくは１であり、かつｎ４は１、２、もしくは３であり、式中Ｉが結合である場合、ｎ１は３でありかつｎ２は１であり、Ｄは
0005517626.tif 000017
である可能性がなく、式中、ＲはＭｅまたはＣＨ２−ＣＨ２−ＮＭｅ２である。
【０３０８】
一態様では、フェニル環上での置換はパラ置換である。好ましい態様では、ｎ１は２、３、もしくは４であるかまたはｎ１は３である。好ましい態様では、ｎ２は１である。好ましい態様では、Ｉは結合（すなわち骨格の炭素と隣接窒素の間の結合）である。一局面では、ヒドラジンリンカーＨは、例えばｎ３が０でかつｎ４が２である場合、切断時に６員の自己犠牲リンカーを形成しうる。別の局面では、ヒドラジンリンカーＨは切断時に２つの５員の自己犠牲リンカーを形成しうる。さらに他の局面では、切断時、Ｈは５員の自己犠牲リンカーを形成するか、Ｈは７員の自己犠牲リンカーを形成するか、またはＨは５員の自己犠牲リンカーおよび６員の自己犠牲リンカーを形成する。切断の速度は、切断時に形成される環の大きさに影響される。したがって、望まれる切断の速度に依存して切断時に形成されるべき適切な大きさの環が選択されうる。
【０３０９】
５員のヒドラジンリンカー
一態様では、ヒドラジンリンカーは５員のヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは構造
0005517626.tif 000018
を含む。
【０３１０】
好ましい態様では、ｎ１は２、３、もしくは４である。別の好ましい態様では、ｎ１は３である。
【０３１１】
上記の構造では、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。一態様では、各Ｒ２４はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル、より好ましくはＨまたはＣＨ３である。別の態様では、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の態様では、各Ｒ２４はＨである。各Ｒ２４は、化合物の立体効果を調整しかつ溶解度を変化させるように選択される。
【０３１２】
５員のヒドラジンリンカーは、薬剤をリンカーから分離する１つ以上の環化反応を受ける可能性があり、例えば
0005517626.tif 000019
で記述されうる。
【０３１３】
本発明の５員のリンカーを調製するための典型的な合成経路は、
0005517626.tif 000020
である。
【０３１４】
Ｃｂｚで保護されたＤＭＤＡ  ｂは塩化チオニルを含有する溶液中の２，２−ジメチル−マロン酸ａと反応し、Ｃｂｚ−ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロン酸ｃが形成される。化合物ｃはＥＤＣの存在下でＢｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｄと反応し、ＤＭＤＡ−２，２−ジメチルマロニック（ｄｉｍｅｔｈｙｌｍａｌｏｎｉｃ）−Ｂｏｃ−Ｎ−メチルヒドラジンｅが形成される。
【０３１５】
６員のヒドラジンリンカー
別の態様では、ヒドラジンリンカーは６員のヒドラジンリンカーを含み、ここでＨは構造：
0005517626.tif 000021
を含む。
【０３１６】
好ましい態様では、ｎ１は３である。上記構造では、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。一態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。別の態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたはＣ１〜Ｃ３アルキル、より好ましくはＨまたはＣＨ３である。別の態様では、少なくとも１つのＲ２４はメチル基である。別の態様では、各Ｒ２４はＨである。各Ｒ２４は、化合物の立体効果を調整しかつ溶解度を変化させるように選択される。好ましい態様では、Ｈは構造：
0005517626.tif 000022
を含む。
【０３１７】
一態様では、Ｈはジェミナルジメチル置換を含む。上記構造の一態様では、各Ｒ２４は独立してＨまたは置換もしくは未置換アルキルである。
【０３１８】
６員のヒドラジンリンカーは薬剤をリンカーから分離する環化反応を受けることになり、
0005517626.tif 000023
のように記述されうる。
【０３１９】
本発明の６員のリンカーを調製するための典型的な合成経路は、
0005517626.tif 000024
である。
【０３２０】
ジクロロメタンを含有する溶液中のＣｂｚで保護されたジメチルアラニンａはＨＯＡｔおよびＣＰＩと反応し、Ｃｂｚで保護されたジメチルアラニンヒドラジンｂが形成された。ヒドラジンｂはメタノールの作用により脱保護され、化合物ｃが形成される。
【０３２１】
他のヒドラジンリンカー
本発明が７員を有するリンカーを含む点が検討される。このリンカーであれば５員または６員のリンカーと同程度に速やかに環化しない可能性が高いことになるが、これは一部の抗体−パートナー複合体にとって好ましい場合がある。同様に、ヒドラジンリンカーは２つの６員環を含むか、またはヒドラジンリンカーは１つの６員および１つの５員の環化生成物を有しうる。５員および７員のリンカーならびに６員および７員のリンカーについても検討される。
【０３２２】
別のヒドラジン構造Ｈは、式
0005517626.tif 000025
を有し、式中、ｑは０、１、２、３、４、５、もしくは６であり、かつ各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーである。このヒドラジン構造は５員環、６員環、または７員環も形成し、追加成分の添加によって複数の環が形成される可能性がある。
【０３２３】
ジスルフィドリンカー（Ｊ）
さらに別の態様では、リンカーは酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。一態様では、本発明は、式（ｄ）：
0005517626.tif 000026
による構造を有する細胞毒性抗体−パートナー化合物を提供し、式中、Ｄ、Ｌ１、Ｌ４、およびＸ４は上で定義された通りであり、かつ本明細書中にさらに記載され、かつＪは構造：
を有する基を含むジスルフィドリンカーであり、式中、各Ｒ２４は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、および未置換ヘテロアルキルからなる群から独立して選択されるメンバーであり；各Ｋは、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ２１Ｒ２２、ＮＲ２１ＣＯＲ２２、ＯＣＯＮＲ２１Ｒ２２、ＯＣＯＲ２１、およびＯＲ２１（式中、Ｒ２１およびＲ２２は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキルおよび未置換ヘテロシクロアルキルからなる群から独立して選択される）からなる群から独立して選択されるメンバーであり；ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数であり；ならびにｄは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数である。
【０３２４】
ジスルフィドリンカーの芳香環は１つ以上の「Ｋ」基と置換されうる。「Ｋ」基は、通常では環構造の一部である４つの非置換炭素のうちの１つに結合される水素を置換する芳香環上の置換基である。「Ｋ」基は、単一原子、例えばハロゲンでありうるか、または多原子基、例えばアルキル、ヘテロアルキル、アミノ、ニトロ、ヒドロキシ、アルコキシ、ハロアルキル、およびシアノでありうる。典型的なＫ置換基は、限定はされないが、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＮＨＣＯＣＨ３、Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨＣＯＣＦ３およびメチルを独立して含む。「Ｋｉ」においては、ｉは０、１、２、３、もしくは４の整数である。特定の態様では、ｉは０である。
【０３２５】
好ましい態様では、リンカーは、式：
0005517626.tif 000027
の酵素的に切断可能なジスルフィド基を含む。
【０３２６】
この態様では、Ｌ４、Ｘ４、ｐ、およびＲ２４の属性は上で定義された通りであり、かつｄは０、１、２、３、４、５、もしくは６である。特定の態様では、ｄは１または２である。
【０３２７】
より特異的なジスルフィドリンカーは下記の式で示される。
0005517626.tif 000028
【０３２８】
この態様の具体例は以下の通りである。
0005517626.tif 000029
【０３２９】
好ましくは、ｄは１もしくは２である。
【０３３０】
別のジスルフィドリンカーは下記の式で示される。
0005517626.tif 000030
【０３３１】
この態様の具体例は以下の通りである。
0005517626.tif 000031
【０３３２】
好ましくは、ｄは１または２である。
【０３３３】
様々な態様では、ジスルフィドはアミンに対してオルトである。別の特定の態様では、ａは０である。好ましい態様では、Ｒ２４はＨおよびＣＨ３から独立して選択される。
【０３３４】
本発明のジスルフィドリンカーを調製するための典型的な合成経路は以下の通りである。
0005517626.tif 000032
【０３３５】
３−メルカプトプロピオン酸ａの溶液はアルドリチオール−２と反応し、３−メチルベンゾチアゾリウムヨージドｂが形成される。３−メチルベンゾチアゾリウムヨージドｃは水酸化ナトリウムと反応し、化合物ｄが形成される。メタノールを含有する化合物ｄの溶液はさらに化合物ｂと反応し、化合物ｅが形成される。化合物ｅは塩化アセチルおよびメタノールの作用により脱保護され、化合物ｆが形成される。
【０３３６】
数種の細胞毒素、リンカーおよび治療物質を抗体に複合させるための他の方法についてのさらなる考察として、Ｇａｎｇｗａｒらに交付され、「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」という表題のＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０５９４０４号パンフレット、Ｓａｉｔｏ  Ｇ．ら（２００３年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５頁；Ｔｒａｉｌ  Ｐ．Ａ．ら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７頁；Ｐａｙｎｅ  Ｇ．（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２頁；Ａｌｌｅｎ  Ｔ．Ｍ．（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３頁；Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．およびＫｒｅｉｔｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（２００２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１頁；Ｓｅｎｔｅｒ  Ｐ．Ｄ．およびＳｐｒｉｎｇｅｒ  Ｃ．Ｊ．（２００１年）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４頁（これら各々はそれら全体が参照により本明細書中に援用される）も参照のこと。
【０３３７】
パートナー分子
一局面では、本発明は、パートナー分子、例えば細胞毒素、薬剤（例えば免疫抑制剤）または放射性毒素に複合された抗体を特徴とする。かかる複合体は、本明細書中で「免疫複合体」とも称される。１種類以上の細胞毒素を含有する免疫複合体は「免疫細胞毒素」と称される。細胞毒素または細胞毒性物質は、細胞に対して有害な（例えば殺傷する）任意の作用物質を含む。
【０３３８】
本発明のパートナー分子の例として、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体または相同体が挙げられる。パートナー分子の例として、例えば、アンチメタボライト（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（元はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（元はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）も挙げられる。
【０３３９】
本発明の抗体に複合可能なパートナー分子の他の好ましい例として、デュオカルマイシン、カリケアマイシン、メイタンシンおよびアウリスタチン、ならびにこれらの誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例は市販されている（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
【０３４０】
パートナー分子の好ましい例として、ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンが挙げられる。ＣＣ−１０６５は、Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙにより１９８１年にストレプトマイセス・ゼレンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｚｅｌｅｎｓｉｓ）から最初に単離され（Ｈａｎｋａら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３１：１２１１頁（１９７８年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３３：９０２頁（１９８０年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．３４：１１１９頁（１９８１年））、インビトロおよび実験動物の双方で強力な抗腫瘍および抗菌活性を有することが見出された（Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：９９９頁（１９８２年））。ＣＣ−１０６５は、好ましくは５’−ｄ（Ａ／ＧＮＴＴＡ）−３’および５’−ｄ（ＡＡＡＡＡ）−３’の配列を有するマイナーグルーブ内の二本鎖Ｂ−ＤＮＡに結合し（Ｓｗｅｎｓｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：２８２１頁（１９８２年））、３’−アデニンのＮ３位を分子内に存在するそのＣＰＩの左側ユニットによりアルキル化する（Ｈｕｒｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：８４３頁（１９８４年））。ＣＣ−１０６５は、その強力かつ広範な抗腫瘍活性に反し、実験動物において遅発性死亡を引き起こすことからヒトでは使用できない。
【０３４１】
ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシンの多数の類似体および誘導体は当該技術分野で既知である。多数の化合物の構造、合成および特性の研究についてのレビューがなされている。例えば、Ｂｏｇｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５：１４３８頁（１９９６年）およびＢｏｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：７８７頁（１９９７年）を参照のこと。
【０３４２】
協和発酵工業（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙａ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）のあるグループが多数のＣＣ−１０６５誘導体を調製している。例えば、米国特許第５，１０１，０３８号明細書；米国特許第５，６４１，７８０号明細書；米国特許第５，１８７，１８６号明細書；米国特許第５，０７０，０９２号明細書；米国特許第５，７０３，０８０号明細書；米国特許第５，０７０，０９２号明細書；米国特許第５，６４１，７８０号明細書；米国特許第５，１０１，０３８号明細書および米国特許第５，０８４，４６８号明細書、ならびにＰＣＴ出願の国際公開第９６／１０４０５号パンフレットおよび欧州特許出願公開第０５３７５７５Ａ１号明細書を参照のこと。
【０３４３】
Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｕｐｊｏｈｎ）はまた、ＣＣ−１０６５の誘導体の調製に積極的に取り組んでいる。例えば、米国特許第５，７３９，３５０号明細書；米国特許第４，９７８，７５７号明細書、米国特許第５，３３２，８３７号明細書および米国特許第４，９１２，２２７号明細書を参照のこと。
【０３４４】
本発明の特に好ましい局面は、式（ｅ）：
0005517626.tif 000033
による構造を有する細胞毒性化合物を提供し、式中、環系Ａは、置換もしくは未置換アリール置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーである。典型的な環系はフェニルおよびピロールを含む。
【０３４５】
記号ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるか、またはＥおよびＧは、場合により結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成される。
【０３４６】
記号Ｘは、Ｏ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーを表す。Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０３４７】
記号Ｒ３は、（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１から選択されるメンバーを表し、式中Ｒ１１は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２またはＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４である。記号Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールを独立して表し、式中Ｒ１２およびＲ１３は、それらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ１２、Ｒ１３、またはＲ１４のうちの１つ以上は、その構造内部に切断可能な基を含みうる。
【０３４８】
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２（式中、ｎは１〜２０の整数である）から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対は、それらの結合対象の炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、式中Ｒ１５およびＲ１６は、それらの結合対象の窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。１つの典型的な構造がアニリンである。
【０３４９】
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６は、場合によりそれらの構造内部に１つ以上の切断可能な基、例えば切断可能なリンカーまたは切断可能な基質を有する。典型的な切断可能な基は、限定はされないが、ペプチド、アミノ酸、ヒドラジン、ジスルフィド、およびセファロスポリン誘導体を含む。
【０３５０】
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６の少なくとも１つを用い、本明細書中に記載のように、薬剤が本発明のリンカーまたは酵素切断可能な基質、例えばＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２、またはＪに結合される。
【０３５１】
さらなる典型的な態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６の少なくとも１つは化合物への複合に適する反応基を担持する。さらなる典型的な態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換アルキルおよび置換ヘテロアルキルから独立して選択され、かつアルキルまたはヘテロアルキル部分の遊離末端に反応官能基を有する。Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５およびＲ１６のうちの１つ以上は、別種、例えば標的化剤、検出可能な標識、固体支持体などに複合されうる。
【０３５２】
Ｒ６は、存在するかまたは存在しない単結合である。Ｒ６が存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成される。Ｒ７はＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−である。Ｒ７が−ＣＨ２−である場合、それはシクロプロパン環の成分である。記号Ｘ１は、ハロゲン、例えばＣｌ、ＢｒもしくはＦなどの離脱基を表す。Ｒ６およびＲ７の結合は、化学価の原理に反しないように解釈される。
【０３５３】
Ｘ１は任意の離脱基でありうる。有用な離脱基は、限定はされないが、ハロゲン、アジド、スルホン酸エステル（例えばアルキルスルホニル、アリールスルホニル）、オキソニウムイオン、アルキル過塩素酸塩、アンモニオアルカンスルホン酸エステル、アルキルフルオロスルホネートおよびフッ素化物（例えばトリフレート、ノナフレート、トレシレート）などを含む。離脱基として有用な特定のハロゲンは、Ｆ、ＣｌおよびＢｒである。特定の一連の反応条件に適するこれらおよび他の離脱基の選択は当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｍａｒｃｈ  Ｊ．、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９２年；Ｓａｎｄｌｅｒ  ＳＲ、Ｋａｒｏ  Ｗ、「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８３年；およびＷａｄｅ  ＬＧ、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９８０年を参照）。
【０３５４】
６員環内部の曲線は、環が１以上の不飽和度を有し、それは芳香族性でありうることを示す。したがって、下記などの環構造およびそれに関連する構造が、式（ｆ）：
0005517626.tif 000034
の範囲内に含まれる。
【０３５５】
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させ、かつ
0005517626.tif 000035
を含み、式中、ｖは１〜６の整数であり；かつＲ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択される。一部の態様では、Ｒ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’はすべてＨである。一部の態様では、ｖは１〜３の整数（好ましくは１）である。この単位を用い、アリール置換基を薬剤から分離することで、多剤耐性のための基質である化合物の生成に対する抵抗または回避がなされうる。
【０３５６】
一態様では、Ｒ１１は、自己環化することなく、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる部分Ｘ５を含む。部分Ｘ５は、好ましくは酵素を用いて切断可能であり、切断される場合、活性薬剤を提供する。例として、Ｒ１１は構造（右側が薬剤の残りに共役した状態）：
0005517626.tif 000036
を有しうる。
【０３５７】
典型的な態様では、式（ｅ）の環系Ａは、置換もしくは未置換フェニル環である。環系Ａは、本明細書中の定義セクションで示される１つ以上のアリール置換基で置換されうる。一部の態様では、フェニル環は、ＣＮまたはメトキシ部分で置換される。
【０３５８】
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させ、かつＲ３はＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１から選択される。Ｒ１１は、ＳＯ（ＯＨ）２、−ＰＯ（ＯＨ）２、−ＡＡｎ、−Ｓｉ（ＣＨ３）２Ｃ（ＣＨ３）３、−Ｃ（Ｏ）ＯＰｈＮＨ（ＡＡ）ｍ、
0005517626.tif 000037
または任意の他の糖もしくは糖の組み合わせ、
0005517626.tif 000038
およびその薬学的に許容できる塩から選択され、式中ｎは１〜１０の範囲内の任意の整数であり、ｍは１〜４の範囲内の任意の整数であり、ｐは１〜６の範囲内の任意の整数であり、かつＡＡは任意の天然または非天然アミノ酸である。一部の態様では、ＡＡｎまたはＡＡｍはペプチドリンカー（Ｆ）における上記と同じアミノ酸配列から選択され、場合によりＲ４、Ｒ４’、Ｒ５、もしくはＲ５’のリンカー部分で用いられるアミノ酸配列と同じである。少なくとも一部の態様では、Ｒ３はインビボで切断可能であることで活性薬剤化合物がもたらされる。少なくとも一部の態様では、Ｒ３はインビボでの化合物の溶解度を増大させる。一部の態様では、血中での活性薬剤の濃度の低下速度はＲ３の切断速度よりも実質的に速いことで活性薬剤がもたらされる。これは、活性薬剤の毒性がプロドラッグ形態の毒性よりも実質的に高い場合、特に有用でありうる。他の態様では、活性薬剤をもたらすためのＲ３の切断の速度は血中での活性薬剤の濃度の低下の速度よりも速い。
【０３５９】
別の典型的な態様では、本発明は、式（ｇ）：
0005517626.tif 000039
による構造を有する化合物を提供する。
【０３６０】
この態様では、置換基Ｒ３、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７およびＸの属性は式（ａ）における上記と実質的に同じであるとともに、特定の態様において好ましい。記号Ｚは、Ｏ、ＳおよびＮＲ２３から独立して選択されるメンバーである。記号Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーを表す。各Ｒ２３は独立して選択される。記号Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８もしくはＣＯ２Ｒ８を表す。Ｒ８は、置換アルキル、未置換アルキル、ＮＲ９Ｒ１０、ＮＲ９ＮＨＲ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーである。Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択される。Ｒ２はＨまたは置換もしくは未置換低級アルキルである。Ｒ２が置換アルキルである場合、それはペルフルオロアルキル、例えばＣＦ３以外であることが一般に好ましい。一態様では、Ｒ２は置換アルキルであり、ここでは置換基はハロゲンではない。別の態様では、Ｒ２は未置換アルキルである。
【０３６１】
一部の態様では、Ｒ１はエステル部分、例えばＣＯ２ＣＨ３である。一部の態様では、Ｒ２は低級アルキル基であり、それは置換もしくは未置換でありうる。ここで好ましい低級アルキル基はＣＨ３である。一部の好ましい態様では、Ｒ１はＣＯ２ＣＨ３でありかつＲ２はＣＨ３である。
【０３６２】
一部の態様では、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’は、Ｈ、ハロゲン、ＮＨ２、ＯＭｅ、Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（Ｒ２９）２およびＮＯ２から独立して選択されるメンバーである。各Ｒ２９は、独立してＨまたは低級アルキル（例えばメチル）である。
【０３６３】
一部の態様では、薬剤は、離脱基Ｘ１がハロゲン、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびアジドから選択されるメンバーであるように選択される。一部の態様では、Ｘ１はＦ、Ｃｌ、またはＢｒである。
【０３６４】
一部の態様では、ＺはＯまたはＮＨである。一部の態様では、ＸはＯである。
【０３６５】
さらに別の典型的な態様では、本発明は、式（ｈ）または（ｉ）：
0005517626.tif 000040
による構造を有する化合物を提供する。
【０３６６】
式（ｅ）のデュオカルマイシン類似体の別の好ましい構造は、環系Ａが未置換もしくは置換フェニル環である場合の構造である。環系Ａがピロールである場合での式７の構造における上記の薬剤分子上の好ましい置換基はまた、環系Ａが未置換もしくは置換フェニル環である場合での好ましい置換基である。
【０３６７】
例えば、好ましい態様では、薬剤（Ｄ）は、構造（ｊ）：
0005517626.tif 000041
を含む。
【０３６８】
この構造では、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｘは式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、式中Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０３６９】
Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、またはＣＯ２Ｒ８であり、式中Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、式中Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【０３７０】
Ｒ１’は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８であり、式中Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、式中Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【０３７１】
Ｒ２は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルまたはシアノまたはアルコキシであり、かつＲ２’は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルである。
【０３７２】
Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５またはＲ１６の少なくとも１つは、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
【０３７３】
薬剤（Ｄ）の別の態様は構造（ｋ）を含み、式中Ｒ４およびＲ４’は結合し、ヘテロシクロアルキル：
0005517626.tif 000042
が形成される。
【０３７４】
この構造では、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ６、Ｒ７、Ｘは式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、式中Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０３７５】
Ｒ３２は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２から選択され、式中ｎは１〜２０の整数である。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、式中Ｒ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ３２は、場合により、その構造内部に１つ以上の切断可能な基、例えば切断可能なリンカーまたは切断可能な基質を有する。典型的な切断可能な基は、限定はされないが、ペプチド、アミノ酸、ヒドラジン、ジスルフィド、およびセファロスポリン誘導体を含む。さらに、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１５、およびＲ１６に対する本明細書中に記載の置換基の選択はＲ３２にも適用可能である。
【０３７６】
Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１５、Ｒ１６、またはＲ３２の少なくとも１つは、薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。少なくとも一部の態様では、Ｒ３２は薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
【０３７７】
この化合物の好ましい一態様は、
0005517626.tif 000043
である。
【０３７８】
Ｒ１は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ８、またはＣＯ２Ｒ８であり、式中Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、式中Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【０３７９】
Ｒ１’は、Ｈ、置換もしくは未置換低級アルキル、またはＣ（Ｏ）Ｒ８であり、式中Ｒ８はＮＲ９Ｒ１０およびＯＲ９から選択されるメンバーであり、式中Ｒ９およびＲ１０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアルキルから独立して選択されるメンバーである。
【０３８０】
Ｒ２は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルまたはシアノまたはアルコキシであり、かつＲ２’は、Ｈ、または置換もしくは未置換低級アルキルまたは未置換ヘテロアルキルである。
【０３８１】
さらなる態様は、式：
0005517626.tif 000044
を有する。
【０３８２】
この構造では、Ａ、Ｒ６、Ｒ７、Ｘ、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、およびＲ５’は式（ｅ）において上記の通りである。さらに、ＺはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり、式中Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーである。
【０３８３】
Ｒ３３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、ならびにＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２から選択され、式中ｎは１〜２０の整数である。Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルおよび置換もしくは未置換ペプチジルを独立して表し、式中Ｒ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成される。Ｒ３３は薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦ、Ｈ、Ｊ、もしくはＸ２に結合させる。
【０３８４】
好ましくは、Ａは置換もしくは未置換フェニルまたは置換もしくは未置換ピロールである。さらに、Ｒ１１に対する本明細書中に記載の置換基の選択はＲ３３にも適用可能である。
【０３８５】
リガンド
Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるリガンドを表す。好ましいリガンドは標的化剤、例えば抗体およびその断片である。
【０３８６】
一部の態様では、Ｘ４基はＲ２９、ＣＯＯＲ２９、Ｃ（Ｏ）ＮＲ２９、およびＣ（Ｏ）ＮＮＲ２９から選択されるメンバーとして記述可能であり、式中Ｒ２９は、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換ヘテロアリールから選択されるメンバーである。さらに別の典型的な態様では、Ｒ２９はチオール反応性メンバーである。さらに典型的な態様では、Ｒ２９は、ハロアセチルおよびアルキルハロゲン化誘導体、マレイミド、アジリジン、およびアクリロイル誘導体から選択されるチオール反応性メンバーである。上記チオール反応性メンバーは、例えば標的化剤のアミノ酸の側鎖、例えば抗体と反応しうる反応性保護基として作用することで、標的化剤をリンカー−薬剤部分に結合させうる。
【０３８７】
検出可能な標識
本発明の化合物および方法と併用される特定の標識または検出可能な基は、本発明の化合物の活性または有用性と有意に干渉することがない限り、一般に本発明の重要な局面ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料でありうる。かかる検出可能な標識はイムノアッセイの分野で十分に開発されており、一般にかかる方法で有用な大部分の任意の標識が本発明に適用可能である。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明で有用な標識は、磁気ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光色素（例えばフルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般に用いられるその他のもの）、ならびにコロイド状金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）などの比色標識を含む。
【０３８８】
標識は、当該技術分野で周知の方法に従い、本発明の化合物に直接的または間接的に共役されうる。上記のように、多種多様な標識の使用が可能であり、そこでの標識の選択は、要求される感受性、化合物との複合の容易性、安定性の要求、使用可能な器具類、および使い捨ての設備（ｄｉｓｐｏｓａｌ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）に依存する。
【０３８９】
本発明の化合物が検出可能な標識に複合される場合、標識は好ましくは放射性同位体、蛍光物質、蛍光物質前駆体、発色団、酵素およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるメンバーである。様々な基を抗体に複合するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、抗体に複合されることが多い検出可能な標識は、酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼである。
【０３９０】
非放射性標識は間接的手段により結合されることが多い。一般に、リガンド分子（例えばビオチン）は複合体の成分に共有結合される。次いで、リガンドは別の分子（例えばストレプトアビジン分子）に結合し、それは本質的に検出可能であるかあるいはシグナル系、例えば検出可能な酵素、蛍光化合物、または化学発光化合物に共有結合される。
【０３９１】
本発明の複合体の成分はまた、例えば酵素またはフルオロフォアとの複合により、シグナル生成化合物に直接複合されうる。標識としての目的の酵素は、主に加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ（ｏｘｉｄｏｔａｓｅｓ）、特にペルオキシダーゼとなる。蛍光化合物は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含む。化学発光化合物は、ルシフェリン、および２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含む。使用可能な様々な標識またはシグナル生成系についてのレビューとしては、米国特許第４，３９１，９０４号明細書を参照のこと。
【０３９２】
標識を検出する手段は当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合、検出用手段はオートラジオグラフィーなどではシンチレーションカウンターまたは写真フィルムを含む。標識が蛍光標識である場合、それは蛍光色素を適切な光の波長で励起し、得られる蛍光を検出することで検出可能である。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などの電子検出器の使用により、写真フィルムを用いて視覚的に検出可能である。同様に、酵素標識は、酵素に適する基質を提供し、得られた反応生成物を検出することにより検出可能である。最後に、簡素な比色標識は、単に標識に関連する色を観察することにより検出可能である。したがって、様々なディップスティックアッセイでは、複合された金がピンク色を呈することが多い一方、様々な複合ビーズがビーズの色を呈する。
【０３９３】
蛍光標識は取扱い上の注意がほとんど要求されないという利点を有し、高スループット画像化技術（コンピュータを含む集積システムにおける分析用の画像のデジタル化を含む光学分析）への適合性が高いことから、ここでは好ましい。好ましい標識は、典型的には、標識における高い感受性、高い安定性、低いバックグラウンド、低い環境感受性および高い特異性のうちの１つ以上で特徴づけられる。多数の蛍光標識が、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に既知の多数の他の市販元から市販されている。さらに、当業者は、特定の用途に適するフルオロフォアの選択方法を理解し、市販品として容易に入手できない場合、必要なフルオロフォアを新規に合成するかまたは市販の蛍光化合物を合成的に修飾し、所望の蛍光標識の入手に至ることができるであろう。
【０３９４】
小分子のフルオロフォアに加え、天然蛍光タンパク質およびかかるタンパク質の改変類似体は本発明で有用である。かかるタンパク質として、例えば、刺胞動物の緑色蛍光タンパク質（Ｗａｒｄら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．３５：８０３−８０８頁（１９８２年）；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、７２Ｂ：７７−８５頁（１９８２年））、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｉｓｃｈｅｒｉ）株由来の黄色蛍光タンパク質（Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：５５０９−１５頁（１９９０年））、渦鞭毛藻のシンビオジニウム種（ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ  Ｓｙｍｂｉｏｄｉｎｉｕｍ  ｓｐ．）由来のペリジニン−クロロフィル（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：６７３：７７頁（１９９４年））、海洋シアノバクテリア、例えばシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）由来のフィコビリンタンパク質、例えばフィコエリトリンおよびフィコシアニン（Ｗｉｌｂａｎｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２２６−３５（１９９３年））などが挙げられる。
【０３９５】
一般に、細胞毒素と標的化剤（または他の作用物質）、場合によりスペーサー基の間での結合の形成に先立ち、化学官能基の少なくとも１つが活性化されることになる。当業者は、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシ基を含む種々の化学官能基が種々の標準の方法および条件を用いて活性化されうることを理解するであろう。例えば、細胞毒素または標的化剤の水酸基がホスゲンでの処理を通じて活性化され、対応するクロロぎ酸塩（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）またはクロロぎ酸ｐ−ニトロフェニル（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍａｔｅ）が形成され、対応する炭酸塩が形成されうる。
【０３９６】
典型的な態様では、本発明ではカルボキシル官能基を含む標的化剤が使用される。カルボキシル基は、例えば対応するアシルハロゲン化物または活性エステルへの変換により活性化されうる。この反応は、Ｍａｒｃｈ、上記、３８８−８９頁で例示のように種々の条件下で行われうる。典型的な態様では、ハロゲン化アシルは、カルボキシル含有基と塩化オキサリルとの反応を通じて調製される。活性化剤は細胞毒素または細胞毒素−リンカーアーム複合体と反応し、本発明の複合体が形成される。当業者は、カルボキシル含有標的化剤の使用はあくまで例示であり、多数の他の官能基を有する作用物質が本発明のリンカーに複合されうることを理解するであろう。
【０３９７】
反応官能基
例示の簡素化のため、以下の考察では細胞毒素と標的化剤との複合について着目される。その着目により本発明の一態様が例示され、その他は当業者により容易に推定される。本発明が単一の態様に関する考察に着目することによって限定されることは全く意図されていない。
【０３９８】
本発明の典型的な化合物は一般に置換もしくは未置換アルキルまたはヘテロアルキル鎖上に位置する反応官能基を担持することから、それらの別種への容易な結合が可能になる。反応基にとって好都合な位置は鎖の末端位置である。
【０３９９】
本発明の実施において有用な反応の反応基およびクラスは、一般にバイオコンジュゲート化学の技術分野で周知のものである。反応官能基は保護または非保護の場合があり、基の保護性は有機合成の技術分野で既知の方法により変化しうる。反応性の細胞毒素類似体の場合に使用可能な好ましい反応のクラスは比較的穏やかな条件下で進行するものである。これらは、限定はされないが、求核置換基（例えばアミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子置換基（例えばエナミン反応）、ならびに炭素−炭素および炭素−ヘテロ原子の複数の結合の付加（例えばマイケル反応、ディールス−アルダー付加）を含む。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ、「Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５年；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９６年、およびＦｅｅｎｅｙら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ」、第１９８巻、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９８２年において考察されている。
【０４００】
典型的な反応タイプは、カルボキシル基と、限定はされないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルを含むその様々な誘導体との反応を含む。水酸基は、エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換されうる。ハロアルキル基は、例えば、アミン、カルボン酸アニオン、チオールアニオン、カルボアニオン、またはアルコキシドイオンとの反応により新種に変換される。求ジエン体（例えばマレイミド）基はディールス−アルダー付加に関与する。アルデヒドまたはケトン基は、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムにまたはグリニャール付加またはアルキルリチウム付加のような機序を介して変換されうる。ハロゲン化スルホニルは例えばアミンと容易に反応し、スルホンアミドが形成される。アミンまたはスルフヒドリル基は、例えばアシル化、アルキル化または酸化される。アルケンは、付加環化、アシル化、マイケル付加などを用いて一連の新種に変換されうる。エポキシドは、アミンおよびヒドロキシル化合物と容易に反応する。
【０４０１】
当業者は、これら結合の多数が種々の方法でかつ種々の条件を用いて生成可能であることを容易に理解するであろう。エステルの調製においては例えばＭａｒｃｈ、上記、１１５７頁を参照し；チオエステルにおいてはＭａｒｃｈ、上記、３６２−３６３頁、４９１頁、７２０−７２２頁、８２９頁、９４１頁、および１１７２頁を参照し；炭酸塩においてはＭａｒｃｈ、上記、３４６−３４７頁を参照し；カルバメートにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１５６−５７頁を参照し；アミドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１５２頁を参照し；尿素およびチオ尿素においてはＭａｒｃｈ、上記、１１７４頁を参照し；アセタールおよびケタールにおいてはＧｒｅｅｎｅら、上記、１７８−２１０頁およびＭａｒｃｈ、上記、１１４６頁を参照し；アシルオキシアルキル誘導体においては「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ｔｏｐｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｋ．Ｂ．Ｓｌｏａｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年を参照し；エノールエステルにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１６０頁を参照し；Ｎ−スルホニルイミデートにおいてはＢｕｎｄｇａａｒｄら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１：２０６６頁（１９８８年）を参照し；無水物においてはＭａｒｃｈ、上記、３５５−５６頁、６３６−３７頁、９９０−９１頁、および１１５４頁を参照し；Ｎ−アシルアミドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、３７９頁を参照し；Ｎ−マンニッヒ塩基においてはＭａｒｃｈ、上記、８００−０２頁および８２８頁を参照し；ヒドロキシメチルケトンエステルにおいてはＰｅｔｒａｃｅｋら、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、５０７：３５３−５４頁（１９８７年）を参照し；ジスルフィドにおいてはＭａｒｃｈ、上記、１１６０頁を参照し；かつホスホン酸エステルおよびホスホンアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄａｔｅ）においては。
【０４０２】
反応官能基は非保護であり、反応に関与または干渉しないように選択されうる。あるいは、反応官能基は保護基の存在により反応への関与から保護されうる。当業者は、特定の官能基を選択された一連の反応条件への干渉から保護する方法を理解するであろう。有用な保護基の例として、Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年を参照のこと。
【０４０３】
典型的には、標的化剤は、その各化学官能基による標準の化学技術を用いて細胞毒素に共有結合される。場合により、リンカーまたは作用物質は１つ以上のスペーサー基を介して作用物質に共役される。スペーサー基は、併用される場合、等しいかまたは異なりうる。
【０４０４】
一般に細胞毒素と反応官能基、場合によりスペーサー基の間での結合の形成に先立ち、化学官能基の少なくとも１つが活性化されることになる。当業者は、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシ基を含む種々の化学官能基が種々の標準の方法および条件を用いて活性化されうることを理解するであろう。典型的な態様では、本発明は反応官能基としてカルボキシル官能基を含む。カルボキシル基は上記のように活性化されうる。
【０４０５】
切断可能な基質
本発明の切断可能な基質は「Ｘ２」として表される。好ましくは、切断可能な基質は酵素により切断されうる切断可能な酵素基質である。好ましくは、酵素は、治療されるべき腫瘍または他の標的細胞と直接的または間接的に優先的に結合される。酵素は、治療されるべき腫瘍または他の標的細胞により生成されうる。例えば、切断可能な基質は、腫瘍または他の標的細胞の近傍もしくは内部に見出される酵素により優先的に切断可能なペプチドでありうる。さらにまたは代わりに、酵素は、腫瘍細胞に特異的に結合する標的化剤、例えば腫瘍抗原に特異的な抗体に結合されうる。
【０４０６】
上記の薬剤への共役に適する酵素切断可能な基質の例として、ＰＣＴ特許出願公開の国際公開第００／３３８８８号パンフレット、国際公開第０１／９５９４３号パンフレット、国際公開第０１／９５９４５号パンフレット、国際公開第０２／００２６３号パンフレット、および国際公開第０２／１００３５３号パンフレット（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）は、切断可能なペプチドの薬剤への結合について開示している。ペプチドは、腫瘍に関連した酵素、例えばトロウアーゼ（ｔｒｏｕａｓｅ）（チメットオリゴペプチダーゼなど）、ＣＤ１０（ネプリリシン）、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ２またはＭＭＰ９など）、ＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼ（ヘプシン、テスチシン、ＴＭＰＲＳＳ４、またはマトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１など）、またはカテプシンにより切断可能である。この態様では、プロドラッグは、上記の薬剤、ペプチド、安定化基、また場合により薬剤とペプチドの間の連結基を含む。安定化基がペプチドの末端に結合されることで、プロドラッグが腫瘍または他の標的細胞に到達するまで分解から保護される。適切な安定化基の例として、非アミノ酸、例えばコハク酸、ジグリコール酸、マレイン酸、ポリエチレングリコール、ピログルタミン酸、酢酸、ナフチルカルボン酸、テレフタル酸、およびグルタル酸誘導体；ならびにアスパラギン酸のβ−カルボキシ基またはグルタミン酸のγ−カルボキシル基でのペプチドのＮ末端に結合された遺伝的にコードされないアミノ酸またはアスパラギン酸またはグルタミン酸が挙げられる。
【０４０７】
ペプチドは、典型的には３〜１２個（またはそれより多数）のアミノ酸を含む。特定のアミノ酸の選択は、少なくとも部分的にペプチドの切断に用いられる酵素、ならびにインビボでのペプチドの安定性に依存することになる。適切な切断可能なペプチドの一例がβ−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号１０２）である。これが安定化基と結合することで、スクシニル−β−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号１０２）が形成されうる。適切な切断可能なペプチドの他の例が上記の参考文献にて提供される。
【０４０８】
一具体例として、ネプリリシン、中性エンドペプチターゼ（ＮＥＰ）、および急性リンパ芽球性白血病共通抗原（ＣＡＬＬＡ）としても知られるＣＤ１０はＩＩ型細胞表面亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。ＣＤ１０との使用に適する切断可能な基質として、ＬｅｕＡｌａＬｅｕおよびＩｌｅＡｌａＬｅｕが挙げられる。ＣＤ１０に対する他の既知の基質が最大で５０アミノ酸長のペプチドを含むが、基質が大きくなると触媒効率は低下することが多い。
【０４０９】
別の具体例はマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）に基づく。おそらくは最良に特徴づけられたタンパク質分解酵素は腫瘍に関連し、腫瘍微小環境内でのＭＭＰの活性化には明らかな相関がある。特に、可溶性のマトリックス酵素ＭＭＰ２（ゼラチナーゼＡ）およびＭＭＰ９（ゼラチナーゼＢ）については徹底した試験が行われ、腫瘍成長を含む組織リモデリングの間に選択的に活性化されることが示されている。デキストランとメトトレキサートの複合体については、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９により切断されるように設計されたペプチド配列の設計および試験が行われている（Ｃｈａｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１５：９３１−９４１頁（２００４年））；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）およびドキソルビシン（Ｂａｅら、Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．２９：１５−２３頁（２００４年））、ならびにアルブミンおよびドキソルビシン（Ｋｒａｔｚら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１：２００１−２００６頁（２００１年））。ＭＭＰとの使用に適する配列の例として、限定はされないが、ＰｒｏＶａｌＧｌｙＬｅｕＩｌｅＧｌｙ（配列番号９５）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＶａｌ（配列番号９６）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｙＧｌｎ（配列番号９７）、ＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅｕ（配列番号９８）、ＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＭｅｔＬｅｕＳｅｒＧｌｎ（配列番号９９）、およびＧｌｙＰｒｏＬｅｕＧｌｙＬｅｕＴｒｐＡｌａＧｌｎ（配列番号１００）が挙げられる（例えば上記の参考文献ならびにＫｌｉｎｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．１：９−２２頁（２００４年）およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：６０６１−６０６７頁（２０００年）を参照）。他の切断可能な基質の使用も可能である。
【０４１０】
さらに別の例がＩＩ型膜貫通セリンプロテアーゼである。この酵素の基として、例えばヘプシン、テスチシン、およびＴＭＰＲＳＳ４が挙げられる。ＧｌｎＡｌａＡｒｇは（乳癌および卵巣癌において過剰発現される）マトリプターゼ／ＭＴ−ＳＰ１の場合に有用な１つの基質配列であり、ＬｅｕＳｅｒＡｒｇは（前立腺癌および一部の他の腫瘍タイプにおいて過剰発現される）ヘプシンの場合に有用である（例えば、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３６７２０−３６７２５頁およびＫｕｒａｃｈｉおよびＹａｍａｍｏｔｏ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  Ｖｏｌ．２」、第２版（Ｂａｒｒｅｔｔ  ＡＪ、Ｒａｗｌｉｎｇｓ  ＮＤおよびＷｏｅｓｓｎｅｒ  ＪＦ編）、１６９９−１７０２頁（２００４年）を参照）。他の切断可能な基質の使用も可能である。
【０４１１】
切断可能な基質配列の別のタイプとして、腫瘍または細胞と結合状態になる切断可能な基質を切断する能力がある別の酵素の調製が含まれる。例えば、酵素が腫瘍特異抗体（または腫瘍もしくは受容体リガンドなどの他の標的細胞に優先的に引き付けられる他の実体）に共役され、次いで酵素−抗体複合体が患者に提供されうる。酵素−抗体複合体は、腫瘍に関連した抗原に由来し、結合される。次いで、薬剤−切断可能な基質複合体がプロドラッグとして患者に提供される。薬剤は、薬剤−切断可能な基質複合体が腫瘍と結合状態になっている酵素と、切断可能な基質が切断されかつ薬剤が遊離されるように相互作用する場合に、腫瘍の近傍でのみ放出される。例えば、米国特許第４，９７５，２７８号明細書；米国特許第５，５８７，１６１号明細書；米国特許第５，６６０，８２９号明細書；米国特許第５，７７３，４３５号明細書、および米国特許第６，１３２，７２２号明細書（これらのすべては参照により本明細書中に援用される）はかかる配列を開示している。適切な酵素および基質の例として、限定はされないが、β−ラクタマーゼおよびセファロスポリン誘導体、カルボキシペプチターゼＧ２およびグルタミン酸およびアスパラギン酸および葉酸誘導体が挙げられる。一態様では、酵素−抗体複合体は、目的の標的細胞上または標的部位で発現される抗原に対するその特異性に基づいて選択される抗体または抗体断片を含む。抗体についての考察が上記に与えられる。適切なセファロスポリン−切断可能な基質の一例が、
0005517626.tif 000045
である。
【０４１２】
複合体の例
本発明のリンカーおよび切断可能な基質は、種々のパートナー分子を有する複合体内で用いられうる。本発明の複合体の例が、下記にさらに詳述される。他に指定がない限り、置換基は、細胞毒素、リンカー、および切断可能な基質に関するセクションで上記のように定義される。
【０４１３】
Ａ．リンカー複合体
適切な複合体の一例が、式：
0005517626.tif 000046
の化合物であり、式中Ｌ１は自己犠牲リンカーであり；ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｆは構造：
0005517626.tif 000047
を含むリンカーであり、式中ＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群から独立して選択される１種類以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ２は自己犠牲リンカーでありかつ
0005517626.tif 000048
を含み、式中Ｒ１７、Ｒ１８、およびＲ１９の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択され、かつｗは０〜４の整数であり；ｏは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり；ｐは０もしくは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるメンバーであり；かつＤは構造：
0005517626.tif 000049
を含み、式中、環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３はＯＲ１１であり、式中Ｒ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され；式中ｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、式中Ｒ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、式中Ｘ１は離脱基であり、式中Ｒ１１は前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させる。
【０４１４】
一部の態様では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の一例として、
0005517626.tif 000050
が挙げられる。
【０４１５】
複合体のタイプの別の例が、式：
0005517626.tif 000051
の化合物であり、式中Ｌ１は自己犠牲リンカーであり；ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｆは構造：
0005517626.tif 000052
を含むリンカーであり、式中ＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群から独立して選択される１種類以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ２は自己犠牲リンカーであり；ｏは０もしくは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり；ｐは０もしくは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるメンバーであり；かつＤは構造：
0005517626.tif 000053
を含み、式中、環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群から選択されるメンバーであり、式中Ｒ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、式中Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、式中Ｒ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、式中ｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、式中Ｒ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；式中Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させ、かつ
0005517626.tif 000054
を含み、式中ｖは１〜６の整数であり；かつＲ２７、Ｒ２７’、Ｒ２８、およびＲ２８’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、式中Ｘ１は離脱基である。
【０４１６】
一部の態様では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の１つの具体例が、
0005517626.tif 000055
であり、式中ｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４１７】
適切な複合体の別の例が、式：
0005517626.tif 000056
の化合物であり、式中Ｌ１は自己犠牲リンカーであり、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり、Ｆは構造：
0005517626.tif 000057
を含むリンカーであり、式中ＡＡ１は天然アミノ酸および非天然α−アミノ酸からなる群から独立して選択される１つ以上のメンバーであり；ｃは１〜２０の整数であり；Ｌ３は第一級もしくは第二級アミンを含むスペーサー基またはカルボキシル官能基であり；ここでＬ３が存在する場合、ｍは０でありかつＬ３のアミンがＤの懸垂カルボキシル官能基とアミド結合を形成するか、またはＬ３のカルボキシルがＤの懸垂アミン官能基とアミド結合を形成し；ｏは０もしくは１であり；Ｌ４はリンカーメンバーであり、ここでＬ４は（ＡＡ１）ｃのＮ末端に直接結合された
0005517626.tif 000058
を含み、式中Ｒ２０は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり、Ｒ２５、Ｒ２５’、Ｒ２６、およびＲ２６’の各々は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され、かつｓおよびｔは独立して１〜６の整数であり；ｐは１であり；Ｘ４は保護反応官能基、非保護反応官能基、検出可能な標識、および標的化剤からなる群から選択されるメンバーであり、かつＤは構造：
0005517626.tif 000059
を含み、式中、環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群から選択されるメンバーであり、式中Ｒ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、スルホネート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、式中Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、式中Ｒ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、式中ｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、式中Ｒ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、式中Ｘ１は離脱基であり、式中Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５、Ｒ５’、Ｒ１５またはＲ１６のうちの少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＦに結合させる。
【０４１８】
一部の態様では、薬剤は上記の構造（ｃ）または（ｆ）を有する。複合体としての使用に適する化合物の１つの具体例が、
0005517626.tif 000060
であり、式中ｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４１９】
複合体としての使用に適する化合物の他の例として、
0005517626.tif 000061
0005517626.tif 000062
0005517626.tif 000063
0005517626.tif 000064
0005517626.tif 000065
が挙げられ、式中Ｒは
0005517626.tif 000066
であり、かつｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４２０】
複合体はまた、構造（ｇ）、例えば化合物：
0005517626.tif 000067
0005517626.tif 000068
を有する薬剤を用いて形成可能であり、式中ｒは０〜２４の範囲内の整数である。
【０４２１】
複合体はまた、構造：
0005517626.tif 000069
0005517626.tif 000070
0005517626.tif 000071
0005517626.tif 000072
を有する薬剤を用いて形成されうる。
【０４２２】
かかる細胞毒素の合成に加え、抗体へのその結合に関する詳細が、２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，３００号明細書に開示されている。
【０４２３】
特定の態様では、抗ＣＤ１９が、リンカーおよび構造Ｎ１：
0005517626.tif 000073
の治療物質に複合される。
【０４２４】
特定の態様では、抗ＣＤ１９が、リンカーおよび構造Ｎ２：
0005517626.tif 000074
の治療物質に複合される。
【０４２５】
Ｂ．切断可能なリンカー複合体
適切な複合体の一例が、構造：
0005517626.tif 000075
を有する化合物であり、式中Ｌ１は自己犠牲スペーサーであり、ｍは０、１、２、３、４、５、もしくは６の整数であり；Ｘ２は切断可能な基質であり；かつＤは構造：
0005517626.tif 000076
を含み、式中、環系Ａは、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル基から選択されるメンバーであり；ＥおよびＧは、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、ヘテロ原子、単結合から独立して選択されるメンバーであるか、またはＥおよびＧは結合し、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリールおよび置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから選択される環系が形成され；ＸはＯ、ＳおよびＮＲ２３から選択されるメンバーであり；Ｒ２３は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、およびアシルから選択されるメンバーであり；Ｒ３は（＝Ｏ）、ＳＲ１１、ＮＨＲ１１およびＯＲ１１からなる群から選択されるメンバーであり、式中Ｒ１１は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換ヘテロアルキル、未置換ヘテロアルキル、ジホスフェート、トリホスフェート、アシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２Ｒ１３、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１２、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２Ｒ１３、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ１２）２、Ｃ（Ｏ）ＣＨＲ１２Ｒ１３、ＳＲ１２およびＳｉＲ１２Ｒ１３Ｒ１４からなる群から選択されるメンバーであり、式中Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキルおよび置換もしくは未置換アリールから独立して選択されるメンバーであり、式中Ｒ１２およびＲ１３はそれらの結合対象である窒素または炭素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され；Ｒ６は存在するかまたは存在しない単結合であり、存在する場合、Ｒ６およびＲ７は結合し、シクロプロピル環が形成され；かつＲ７はＲ６と前記シクロプロピル環内でＣＨ２−Ｘ１もしくは−ＣＨ２−で結合され、式中Ｘ１は離脱基であり、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’は、Ｈ、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換ヘテロアリール、未置換ヘテロアリール、置換ヘテロシクロアルキル、未置換ヘテロシクロアルキル、ハロゲン、ＮＯ２、ＮＲ１５Ｒ１６、ＮＣ（Ｏ）Ｒ１５、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１５Ｒ１６、ＯＣ（Ｏ）ＯＲ１５、Ｃ（Ｏ）Ｒ１５、ＳＲ１５、ＯＲ１５、ＣＲ１５＝ＮＲ１６、およびＯ（ＣＨ２）ｎＮ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択されるメンバーであるか、またはＲ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’の任意の隣接対はそれらの結合対象である炭素原子とともに結合し、４〜６員を有する置換もしくは未置換シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル環系が形成され、式中ｎは１〜２０の整数であり；Ｒ１５およびＲ１６は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、および置換もしくは未置換ペプチジルから独立して選択され、式中Ｒ１５およびＲ１６はそれらの結合対象である窒素原子とともに場合により結合し、４〜６員を有し、場合により２つ以上のヘテロ原子を有する置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル環系が形成され、式中Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５およびＲ５’のメンバーうちの少なくとも１つは前記薬剤をＬ１（存在する場合）またはＸ２に結合させ、かつ
0005517626.tif 000077
からなる群から選択され、式中Ｒ３０、Ｒ３０’、Ｒ３１、およびＲ３１’は、Ｈ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、および置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキルから独立して選択され；かつｖは１〜６の整数である。
【０４２６】
適切な切断可能なリンカーの例として、β−ＡｌａＬｅｕＡｌａＬｅｕ（配列番号１０２）および
0005517626.tif 000078
が挙げられる。
【０４２７】
薬学的組成物
別の局面では、本開示は、組成物、例えば薬学的に許容できる担体とともに調合された本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分のうちの１つまたは組み合わせを含有する薬学的組成物を提供する。かかる組成物は、本開示の（例えば２種もしくは３種以上の異なる）抗体または免疫複合体または二重特異性分子のうちの１つまたはそれらの組み合わせを含有しうる。例えば、本開示の薬学的組成物は、標的抗原上で異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組み合わせを含有しうる。
【０４２８】
本開示の薬学的組成物は、併用療法、すなわち他の作用物質との併用であっても投与可能である。例えば、併用療法は、本開示の抗ＣＤ１９抗体と、少なくとも１つの他の抗癌剤との併用を含みうる。併用療法で用いられうる治療物質の例が、本開示の抗体の使用に関する下記セクションにおいてより詳細に記載される。
【０４２９】
本明細書で用いられる「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合可能な、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に依存し、活性化合物、すなわち抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を酸の活性および化合物を不活性化しうる他の天然条件から保護するための材料でコートされうる。
【０４３０】
本開示の薬学的品化合物は、１つ以上の薬学的に許容できる塩を含む。「薬学的に許容できる塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持する塩を示し、任意の望ましくない毒物学的効果を与えることがない（例えば、ベルゲ（Ｂｅｒｇｅ），Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９頁を参照）。かかる塩の例として、酸添加塩および塩基添加塩が挙げられる。酸添加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸や、脂肪族モノカルボキシル酸およびジカルボキシル酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸から誘導される塩を含む。塩基添加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどや、非毒性有機アミン、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどから誘導される塩を含む。
【０４３１】
本開示の薬学的組成物は、薬学的に許容できる酸化防止剤も含有しうる。薬学的に許容できる酸化防止剤の例として、（１）水溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油可溶性酸化防止剤、例えばアスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど；および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０４３２】
本開示の薬学的組成物中に用いられうる適切な水性および非水性担体の例として、水、エタノール、ポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物、植物オイル、例えばオリーブオイルならびに注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。適切な液性が、例えば、コーティング材、例えばレシチンの使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。
【０４３３】
これらの組成物は、防腐剤、浸潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有しうる。微生物の出現の防止は、上記の滅菌法と、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの封入との双方により保証されうる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含めることも望ましい場合がある。さらに、注射可能な薬学的形態の吸収遅延がモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の封入によりもたらされうる。
【０４３４】
薬学的に許容できる担体は、注射可能な無菌溶液または分散系の即時調製のための無菌水溶液または分散系および無菌粉末を含む。薬学的活性物質におけるかかる媒体および作用物質の使用については当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体または作用物質が活性化合物と混合できない場合を除き、本開示の薬学的組成物におけるそれらの使用が検討される。補助活性化合物も組成物中に組み込み可能である。
【０４３５】
治療組成物は、典型的には製造および保存の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の規則的構造として調合されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散系でありうる。適切な液性が、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用、分散の場合に必要とされる粒径の維持ならびに界面活性剤の使用により維持されうる。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコールまたは塩化ナトリウムを含めることが好ましいことになる。注射可能な組成物の遅延された吸収は、組成物中に吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアレート塩（ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ  ｓａｌｔ）およびゼラチンを含めることによりもたらされうる。
【０４３６】
注射可能な無菌溶液は、必要に応じ、上掲の原料の１つもしくは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込み、その後に滅菌および精密ろ過を施すことにより調製されうる。一般に、分散系は、塩基性分散系および上掲の原料由来の必要な他の原料を含有する無菌溶媒に活性化合物を組み込むことにより調製される。注射可能な無菌溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え任意の所望の追加原料をその予め無菌濾過された溶液から生成する真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０４３７】
担体材料と組み合わせることで単一の剤形を生成可能な活性成分の量は、治療される対象および特定の投与方法に依存して変化することになる。単一の剤形を生成するための担体材料と併用可能な活性成分の量は、一般に治療効果をもたらす組成物の量となる。一般に、この量は、薬学的に許容できる担体との併用で、１００％のうち、活性成分の約０．０１％〜約９９％、好ましくは活性成分の約０．１％〜約７０％、最も好ましくは活性成分の約１％〜約３０％の範囲となる。
【０４３８】
投与計画を調節することで最適な所望の応答（例えば治療応答）がもたらされる。例えば、単回ボーラスが投与されうるか、数回の分割用量が長期にわたり投与されうるかまたは同用量が治療状況の要件で示されるように比例的に漸減または増加されうる。投与の容易さおよび用量の均一性を意図し、非経口組成物を投与単位形態で調製することが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、試験されるべき対象に対する単一の用量として適合する物理的に別々の単位であり、各単位は必要とされる薬学的担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された既定量の活性化合物を有する。本開示の投与単位形態における仕様は、（ａ）活性化合物固有の特性および達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）個体における感受性を治療するためにかかる活性化合物を化合する当該技術分野に内在する制限により決定づけられ、かつそれらに直接依存している。
【０４３９】
抗体の投与においては、用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、およびより一般的には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。典型的な治療計画では、毎週１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１か月に１回、３か月ごとに１回または３〜６か月ごとに１回の投与が必要とされる。本開示の抗ＣＤ１９抗体に対する好ましい投与計画は、抗体の静脈内投与を介した１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、ここで抗体は（ｉ）６回投与を４週ごと、次いで３か月ごと；（ｉｉ）３週ごと；（ｉｉｉ）１回の３ｍｇ／ｋｇ体重、次いで３週ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重といった投与計画のうちの１つを用いて投与される。
【０４４０】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する、２つ以上のモノクローナル抗体が同時投与され、いずれの場合でも投与される各抗体の用量は指定範囲内に含まれる。多くの場合、抗体が通常投与される。単回投与間の間隔は、例えば、週単位、月単位、３か月単位または年単位であってもよい。患者における抗体の標的抗原に対する血中濃度の測定により示されるように、間隔は不規則であってもよい。用量は、ある方法では約１〜１０００μｇ／ｍｌ、またある方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を得るように調節される。
【０４４１】
あるいは、抗体は徐放製剤として投与可能であり、いずれの場合でも低頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。一般に、ヒト抗体は最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体がそれに続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるかまたは治療的であるかに依存して変化しうる。予防的適用においては、比較的低用量が長期にわたり比較的低頻度の間隔で投与される。一部の患者が、余生にわたって治療を受け続けている。治療的適用においては、疾患の進行が低下または終結されるまで、好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量が必要とされる場合がある。その後、患者は予防計画通りに投与されうる。
【０４４２】
異常な細胞増殖に関連する疾患の予防および／または治療での使用においては、約０．００１μＭ〜２０μＭの投与化合物の血中濃度が好ましく、ここで約０．０１μＭ〜５μＭが好ましい。
【０４４３】
本明細書中に記載の化合物の経口投与における患者への用量は、典型的には約１ｍｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／日、より典型的には約１０ｍｇ／日〜約１，０００ｍｇ／日、および最も典型的には約５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の範囲である。患者の体重について述べると、典型的用量は、約０．０１〜約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、より典型的には約０．１〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、および最も典型的には約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば５ｍｇ／ｋｇ／日または３ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
【０４４４】
少なくとも一部の態様では、腫瘍成長を遅らせるかまたは阻害する患者への用量は１μｍｏｌ／ｋｇ／日以下であってもよい。例えば、患者への用量は、（薬剤のモルについては）０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４５、０．３、０．２、０．１５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、もしくは０．００５μｍｏｌ／ｋｇ以下であってもよい。好ましくは、抗体−薬剤複合体は、少なくとも５日間にわたり日用量で投与される場合、腫瘍の成長を遅らせる。少なくとも一部の態様では、腫瘍はＳＣＩＤマウスにおけるヒト型腫瘍である。例として、ＳＣＩＤマウスは（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹから入手可能な）ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウスであってもよい。
【０４４５】
本開示の薬学的組成物中での活性成分の実際の用量レベルは、患者に毒性をもたらすことなく、特定の患者、組成物および投与様式について所望の治療応答を得るのに有効な活性成分の量を得るように変化しうる。選択される用量レベルは、用いられる本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、用いられる特定の化合物の投与経路、投与時間、排出速度、用いられる特定の組成物と併用される治療薬、他の薬物、化合物および／または材料の持続時間、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般健康および過去の病歴、ならびに医術において周知の要素のようなものを含む種々の薬物動態学的因子に依存することになる。
【０４４６】
本開示の抗ＣＤ１９抗体の「治療有効用量」は、好ましくは疾患徴候の重症度の低下、疾患徴候のない期間の頻度および持続時間の増大あるいは疾患の苦しみに起因する機能障害または身体障害の予防をもたらす。例えば、ＣＤ１９＋腫瘍の治療における「治療有効用量」は、好ましくは細胞成長または腫瘍成長を、未治療の対象に対し、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、およびさらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。化合物の腫瘍成長に対する阻害能は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価可能である。あるいは、組成物のこの特性は、化合物の細胞成長に対する阻害能の試験により評価可能であり、かかる阻害は当業者に既知のアッセイによりインビトロで測定可能である。治療有効量の治療化合物により、腫瘍サイズが低減しうるかまたはそうでなくても対象における徴候が改善しうる。当業者であれば、対象の大きさ、対象の徴候の重症度および選択された投与における特定の組成物または経路などの要素に基づき、かかる量を決定できるであろう。
【０４４７】
本開示の組成物は、種々の当該技術分野で既知の方法のうちの１つ以上を用い、１つ以上の投与経路を介して投与されうる。当業者に理解されるように、投与の経路および／または方法は所望の結果に応じて変化することになる。本開示の抗体における好ましい投与経路は、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば注射もしくは注入によるものを含む。本明細書で用いられる「非経口投与」という語句は、経腸および局所投与以外の投与方法、通常は注射によるものを意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入を含む。
【０４４８】
あるいは、本開示の抗体は、非経口でない（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路、例えば局所経路、表皮または粘膜の投与経路を介し、例えば、経鼻的、経口的、経膣的、経直腸的、舌下的または局所的に投与されうる。
【０４４９】
活性化合物は、迅速な放出に対する化合物、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤を保護することになる担体とともに調製されうる。生体分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられうる。かかる製剤を調製するための多数の方法が特許化されているかまたは一般に当業者に既知である。例えば、「Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照のこと。
【０４５０】
治療組成物は、当該技術分野で既知の医療器具を用いて投与可能である。例えば、好ましい態様では、本開示の治療組成物は、ニードルレス皮下注射器具、例えば米国特許第５，３９９，１６３号明細書；米国特許第５，３８３，８５１号明細書；米国特許第５，３１２，３３５号明細書；米国特許第５，０６４，４１３号明細書；米国特許第４，９４１，８８０号明細書；米国特許第４，７９０，８２４号明細書；または米国特許第４，５９６，５５６号明細書に開示された器具を用いて投与可能である。本開示において有用な周知のインプラントおよびモジュールの例として、薬物を制御された速度で小出しするための埋め込み式マイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書、皮膚を通してメディカント（ｍｅｄｉｃａｎｔｓ）を投与するための治療器具を開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書、薬物を正確な注入速度で送達するための薬物注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書、連続的薬物送達のための流量可変の埋め込み式注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書、マルチチャンバ式の区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書、ならびに浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が挙げられる。これらの特許は参照により本明細書中に援用される。多数の他のかかるインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に既知である。
【０４５１】
特定の態様では、本開示のヒトモノクローナル抗体を調合し、インビボで適切な分布を保証することが可能である。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多数の親水性の高い化合物を排除する。（必要に応じて）本開示の治療化合物がＢＢＢを通過することを保証するため、それらを例えばリポソームの形で調合してもよい。リポソームを作製する方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；米国特許第５，３７４，５４８号明細書；および米国特許第５，３９９，３３１号明細書を参照のこと。リポソームは特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つ以上の部分を含みうることから、標的化された薬剤送達が促進される（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５頁を参照）。典型的な標的化部分は、葉酸塩またはビオチン（例えばＬｏｗらに交付された米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら（１９８８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８頁）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら（１９９５年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０頁；Ｍ．Ｏｗａｉｓら（１９９５年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０頁）；界面活性剤のプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５年）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４頁）；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０頁）を含み、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３頁；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４年）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３頁も参照のこと。
【０４５２】
本発明の使用および方法
本開示の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物、抗体−パートナー分子複合体組成物および方法は、ＣＤ１９媒介性障害の診断および治療を含む、極めて多数のインビトロおよびインビボでの診断的および治療的有用性を有する。例えば、これらの分子を、インビトロまたは生体外で培地内の細胞にまたは例えばインビボでヒト対象に投与し、種々の障害を治療し、予防し、かつ診断してもよい。本明細書で用いられる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むように意図されている。非ヒト動物は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類および爬虫類を含む。好ましい対象は、ＣＤ１９活性に媒介されるかまたは調節される障害を有するヒト患者を含む。本方法は、異常なＣＤ１９の発現を伴う疾患を有するヒト患者の治療に特に適する。ＣＤ１９に対する抗体−パートナー分子複合体が別の作用物質と並行投与される場合、２者は順次または同時投与されうる。
【０４５３】
ＣＤ１９に対する本開示の抗体の特異的結合を仮定すると、本開示の抗体を用いて細胞の表面上でのＣＤ１９の発現の特異的な検出が可能であり、さらにそれを用いて免疫親和性精製を介したＣＤ１９の精製が可能である。
【０４５４】
さらに、様々な腫瘍細胞上でのＣＤ１９の発現を仮定すると、本開示のヒト抗体−パートナー分子複合組成物および方法を用い、発癌性疾患、例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小くびれ細胞型リンパ腫（ｎｏｄｕｌａｒ  ｓｍａｌｌ  ｃｌｅａｖｅｄ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、胚中心芽球性／胚中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞リンパ腫を含む、ＣＤ１９を発現する腫瘍細胞の存在により特徴づけられる疾患を有する対象の治療が可能である。
【０４５５】
さらに、ＣＤ１９の過剰発現は、Ｂ細胞の耐性の欠損および自己免疫疾患の発症をもたらす場合がある（Ｔｅｄｄｅｒら（２００５年）Ｃｕｒｒ  Ｄｉｒ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ８：５５頁）。この自己免疫効果は、関節リウマチ患者の炎症をきたした関節におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞の蓄積により認められている（Ｈｅら（２００１年）Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ２８：２１６８頁）。したがって、本開示のヒト抗体、抗体組成物および方法を用い、自己免疫疾患、例えば関節リウマチを含む、ＣＤ１９を発現するＢ細胞の存在によって特徴づけられる疾患を有する対象の治療が可能である。
【０４５６】
一態様では、本開示の抗体（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）を用い、ＣＤ１９のレベルまたは膜表面上にＣＤ１９を有する細胞のレベルの検出が可能であり、ここでレベルは特定の疾患徴候に関連づけられうる。あるいは、抗体を用い、ＣＤ１９の機能（ここでは特定の疾患徴候の予防または改善に関連づけられうることから疾患のメディエーターとしてＣＤ１９に関与する）の阻害または遮断が可能である。これは、試料および対照試料を抗ＣＤ１９抗体と、抗体とＣＤ１９との間での複合体の形成を可能にする条件下で接触させることにより行われうる。試料中および対照中では、抗体とＣＤ１９との間で形成される任意の複合体が検出され、比較される。
【０４５７】
別の態様では、本開示の抗体（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）におけるインビトロでの治療的または診断的使用に関連した結合活性が最初に試験されうる。例えば、本開示の組成物は、下記実施例に記載のフローサイトメトリーアッセイを用いて試験されうる。
【０４５８】
本開示の抗体（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子、免疫複合体ならびに組成物）は、ＣＤ１９関連疾患の治療および診断においてさらなる有用性を有する。例えば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子および免疫複合体を用い、ＣＤ１９を発現する細胞の成長の阻害および／またはその殺傷、ヒトエフェクター細胞の存在下でのＣＤ１９を発現する細胞の食作用またはＡＤＣＣの媒介、またはＣＤ１９リガンドのＣＤ１９への結合の遮断といった生物学的活性のうちの１つ以上をインビボまたはインビトロで誘発することが可能である。
【０４５９】
特定の態様では、抗体（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子ならびに組成物）をインビボで用い、種々のＣＤ１９関連疾患の治療、予防または診断がなされる。ＣＤ１９関連疾患の例として、特に、自己免疫疾患、関節リウマチ、癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小くびれ細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、胚中心芽球性／胚中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞リンパ腫が挙げられる。
【０４６０】
本開示の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）をインビボおよびインビトロで投与する適切な経路は当該技術分野で周知であり、当業者により選択されうる。例えば、抗体組成物を注射（例えば静脈内または皮下）により投与してもよい。用いられる分子の適切な用量は、対象の年齢および体重ならびに抗体組成物の濃度および／または調合に依存することになる。
【０４６１】
上記のように、本開示のヒト抗ＣＤ１９抗体を、１つもしくは他の複数の治療物質、例えば細胞毒性物質、放射性毒性物質（ｒａｄｉｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）または免疫抑制剤と同時投与してもよい。抗体を（免疫複合体としての）作用物質に連結するかまたは作用物質とは別々に投与してもよい。後者（別々の投与）の場合、作用物質の前、後またはそれと同時に抗体を投与するかまたは他の既知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と併せて同時投与してもよい。かかる治療物質は、特にドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチンブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシルおよびシクロホスファミドヒドロキシウレア（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）などの抗悪性腫瘍薬を含み、それら単独では患者に対して毒性または亜毒性のレベルでのみ有効である。シスプラチンは、４週ごとに１回、１００ｍｇ／用量で静脈内投与され、アドリアマイシンは、２１日ごとに１回、６０−７５ｍｇ／ｍｌ用量で静脈内投与される。本開示のヒト抗ＣＤ１９抗体またはそれらの抗原結合断片と化学療法剤の同時投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果をもたらす異なる機序を介して作用する２つの抗癌剤を提供する。かかる同時投与は、抗体に反応しなくなる薬剤に対する耐性または腫瘍細胞の抗原性における変化が生じることによる問題を解決しうる。  
【０４６２】
標的特異的なエフェクター細胞、例えば本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）に連結したエフェクター細胞は、治療物質としても用いられうる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球または単球などのヒト白血球でありうる。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞および他のＩｇＧ−もしくはＩｇＡ−受容体担持細胞を含む。必要に応じ、エフェクター細胞を試験されるべき対象から得てもよい。標的特異的なエフェクター細胞を生理学的に許容できる溶液中の細胞の懸濁液として投与してもよい。投与される細胞の数は１０８−１０９程度でありうるが、治療目的に応じて変化することになる。一般に、数は、標的細胞、例えばＣＤ１９を発現する腫瘍細胞で局在化を得、かつ例えば食作用による細胞死を有効にするのに十分な数となる。投与経路もまた変化しうる。
【０４６３】
標的特異的なエフェクター細胞による治療を、標的化細胞を除去するための他の技術と併せて行ってもよい。例えば、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）および／またはこれらの組成物が備えられたエフェクター細胞を用いる抗腫瘍療法を化学療法と併用してもよい。さらに、併用免疫療法を用い、２つの異なる細胞毒性のあるエフェクター集団を指令し、腫瘍細胞を拒絶することが可能である。例えば、抗Ｆｃ−γ  ＲＩまたは抗ＣＤ３に連結された抗ＣＤ１９抗体は、ＩｇＧ−またはＩｇＡ−受容体に特異的な結合剤と併用可能である。
【０４６４】
本開示の二重特異性および多重特異性分子を用い、エフェクター細胞上のＦｃγＲまたはＦｃγＲレベルの例えば細胞表面上の受容体のキャッピングおよび除去による調節も可能である。抗Ｆｃ受容体の混合物もこの目的で用いられうる。
【０４６５】
補体結合部位、例えば補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＭ由来の部分を有する本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）も補体の存在下で用いられうる。一態様では、本開示の結合剤および適切なエフェクター細胞による標的細胞を含む細胞の集団の生体外治療は、補体または補体を含有する血清の添加により補完されうる。本開示の結合剤でコートされた標的細胞の食作用は補体タンパク質の結合により改善されうる。別の態様では、本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）でコートされた標的細胞も補体により溶解されうる。さらに別の態様では、本開示の組成物は補体を活性化することがない。
【０４６６】
本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）はまた、補体とともに投与可能である。特定の態様では、本開示はヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子および血清または補体を含有する組成物を提供する。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子の近接位置に存在するときに有利でありうる。あるいは、本開示のヒト抗体、多重特異性または二重特異性分子と補体または血清を別々に投与してもよい。
【０４６７】
本開示の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性または多重特異性分子または免疫複合体）とその使用説明書を含むキットも本開示の範囲内に含まれる。キットは、１つ以上の追加試薬、例えば免疫抑制試薬、細胞毒性物質または放射性毒性物質あるいは１つ以上の追加の本開示のヒト抗体（例えば、第１のヒト抗体とは異なる、異なるＣＤ１９抗原内のエピトープに対して結合する相補活性を有するヒト抗体）をさらに含みうる。
【０４６８】
したがって、本開示の抗体組成物で治療される患者に、別の治療物質、例えばヒト抗体の治療効果を促進または増強する細胞毒性物質または放射性毒性物質を（本開示のヒト抗体の投与の前、投与と同時または投与後に）さらに投与してもよい。
【０４６９】
他の態様では、対象をさらに、ＦｃγまたはＦｃγ受容体の発現または活性を調節する、例えば促進または阻害する作用物質で治療する、例えば対象をサイトカインで治療することが可能である。多重特異性分子による治療の間での投与における好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。
【０４７０】
本開示の組成物（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子）を用い、ＦｃγＲまたはＣＤ１９を発現する細胞を、例えばかかる細胞を標識する目的で標的にすることも可能である。かかる使用においては、結合剤を検出可能な分子に連結してもよい。したがって、本開示は、ＦｃγＲなどのＦｃ受容体、またはＣＤ１９を発現する細胞を生体外またはインビトロで局在化するための方法を提供する。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素または酵素共同因子でありうる。
【０４７１】
特定の態様では、本開示は、試料中のＣＤ１９抗原の存在を検出するか、またはＣＤ１９抗原の量を測定するための方法であって、試料および対照試料を、ＣＤ１９に、抗体またはその一部とＣＤ１９との複合体の形成を可能にする条件下で特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む方法を提供する。次いで、複合体の形成が検出され、ここで対照試料と比べた場合の試料間での複合体形成の差は試料中でのＣＤ１９抗原の存在を示す。
【０４７２】
他の態様では、本開示は、対象におけるＣＤ１９媒介性疾患、例えば自己免疫疾患、関節リウマチ、癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小くびれ細胞型リンパ腫、リンパ球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、レンネルトリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、胚中心芽球性／胚中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、Ｂ細胞系のびまん性大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連体腔に基づくリンパ腫、胎生期癌、鼻咽頭の未分化癌（例えばシュミンケ腫瘍）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、および他のＢ細胞リンパ腫を、上記のヒト抗体を対象へ投与することにより治療するための方法を提供する。かかる抗体およびその誘導体を用い、特定の障害に関連したＣＤ１９誘発性活性、例えば増殖および分化が阻害される。抗体をＣＤ１９と接触させることにより（例えば抗体を対象に投与することにより）、ＣＤ１９のかかる活性に対する誘発能が阻害され、それ故に関連疾患が治療される。抗体組成物を単独投与するか、あるいは抗体組成物と相加的または相乗的に作用する別の治療剤、例えば細胞毒性剤または放射性毒性剤（ｒａｄｉｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）と並行投与することで、ＣＤ１９媒介性疾患の治療または予防が可能である。
【０４７３】
さらに別の態様では、本開示の免疫複合体を用い、化合物（例えば、治療物質、標識、細胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剤など）がＣＤ１９細胞表面受容体を有する細胞に、かかる化合物を抗体に結合することにより標的化されうる。例えば、抗ＣＤ１９抗体は、米国特許第６，２８１，３５４号明細書および米国特許第６，５４８，５３０号明細書、米国特許出願公開第２００３００５０３３１号明細書、米国特許出願公開第２００３００６４９８４号明細書、米国特許出願公開第２００３００７３８５２号明細書、および米国特許出願公開第２００４００８７４９７号明細書で記載されるかまたは国際公開第０３／０２２８０６号パンフレットで公開された毒素化合物のいずれかに複合されうる。したがって、本開示は、（例えば、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素共同因子を用いて）生体外またはインビボでＣＤ１９を発現する細胞を局在化するための方法も提供する。あるいは、免疫複合体を用い、ＣＤ１９細胞表面受容体を有する細胞が細胞毒素または放射性毒素のＣＤ１９への標的化により死滅されうる。
【０４７４】
本開示は以下の実施例によりさらに例示され、実施例はさらに限定するものとして解釈されるべきでない。本願を通して言及されるあらゆる図面およびあらゆる参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開された特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書中に明示的に援用される。
【実施例】
【０４７５】
実施例１：ＣＤ１９に対するヒトモノクローナル抗体の産生
抗原
Ｂ細胞腫瘍細胞系のＲａｊｉ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）およびＤａｕｄｉ（ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−２１３）を免疫における抗原として用いた。
【０４７６】
トランスジェニックトランスクロモゾームＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）
ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックトランスクロモゾームマウスのＫＭ株を用い、ＣＤ１９に対する完全ヒトモノクローナル抗体を調製した。このマウス株では、Ｃｈｅｎら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０頁に記載のように内在性マウスκ軽鎖遺伝子のホモ接合が破壊されており、ＨｕＭａｂマウスについてＰＣＴ公開の国際公開第０１／０９１８７号パンフレットの実施例１に記載のように内在性マウス重鎖遺伝子のホモ接合が破壊されている。マウスは、Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁に記載のヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を保有する。マウスは、ＰＣＴ公開の国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載のヒト重鎖トランスクロモゾームＳＣ２０も保有する。
【０４７７】
ＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）の免疫化
ＣＤ１９に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するため、ＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）のコホートをＲａｊｉまたはＤａｕｄｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞系のいずれかで免疫した。一般的な免疫化スキームは、Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ．ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１頁およびＰＣＴ公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレットに記載されている。マウスは抗原の１回目の注入時に６〜１６週齢であった。細胞調製物を用い、マウス（ＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標））の腹腔内（ＩＰ）に免疫した。
【０４７８】
トランスジェニックマウスを完全フロインドアジュバント中の抗原またはリビアジュバントで腹腔内に２回免疫した後、不完全フロインド中の抗原またはリビアジュバントで３〜２１日間腹腔内に免疫した（最大、全部で１１回の免疫化）。免疫応答を眼窩後方からの採血（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａｌ  ｂｌｅｅｄｓ）により監視した。血漿を（下記の）ＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、抗ＣＤ１９ヒト免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合に用いた。殺傷および脾臓の摘出の３日前、マウスを抗原で静脈内に追加免疫した。
【０４７９】
抗ＣＤ１９抗体を産生するＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）の選択
ＣＤ１９に結合する抗体を産生するＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）を選択するため、免疫マウス由来の血清を、最初にＦｉｓｈｗｉｌｄ  Ｄ．ら（１９９６年）、上記で記載の改良されたＥＬＩＳＡで試験した。つまり、マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍｌの精製組換えＣＤ１９融合タンパク質でコートし、５０μｌ／ウェルを４℃で一晩インキュベートし、次いでＰＢＳ中２００μｌ／ウェルの５％ＢＳＡでブロッキングした。ＣＤ１９免疫マウス由来の血漿の希釈物を各ウェルに添加し、周囲温度で１〜２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼと複合したヤギ−抗ヒトκ軽鎖ポリクローナル抗体とともに室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをｐＮＰＰ基質で発色させ、ＯＤ４１５〜６５０での分光光度計で分析した。抗ＣＤ１９抗体の最高の力価を発現するマウスを融合に用いた。下記のように融合を行い、ハイブリドーマ上清での抗ＣＤ１９活性についてＥＬＩＳＡにより試験した。
【０４８０】
ＣＤ１９に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成
ＫＭ−ＭＯＵＳＥ（登録商標）から単離したマウス脾細胞を、標準プロトコルに基づくＰＥＧまたはＣｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅの大型チャンバ式の細胞融合エレクトロポレーターパルス（Ｃｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ、ＭＤ）を用いる電場に基づく電気融合のいずれかを用い、マウス骨髄腫細胞系とＰＥＧで融合した。次いで、生成されたハイブリドーマにおける抗原特異的な抗体の産生についてスクリーニングした。免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一の細胞懸濁液を、ＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）の数の１／４と５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）を用いて融合した。細胞を、平底マイクロタイタープレート内に約１×１０５細胞／ウェルでプレーティングした後、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ＣＲＬ１００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム下）＋５ｍＭヘペス、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマシシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）内に１０％ウシ胎仔血清、１０％Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３）条件培地、３〜５％ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ）を含有する選択培地内で約２週間インキュベートした。１〜２週間後、細胞をＨＡＴがＨＴと交換された培地内で培養した。次いで、各ウェルにおけるヒト抗ＣＤ１９モノクローナルＩｇＧ抗体について、ＥＬＩＳＡ（上記）によりスクリーニングした。一旦大規模なハイブリドーマの成長が生じると、通常で１０〜１４日後、培地を監視した。抗体を分泌するハイブリドーマを再プレーティングし、再びスクリーニングし、ヒトＩｇＧが依然として陽性である場合、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体を限界希釈により少なくとも２回サブクローニングした。次いで、さらなる特徴づけのため、安定なサブクローンをインビトロで培養し、組織培地内で少量の抗体を産生した。
【０４８１】
さらなる分析のため、ハイブリドーマクローン２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８を選択した。
【０４８２】
実施例２：ヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８の構造的特徴づけ
２１Ｄ４および２１Ｄ４ａモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、標準ＰＣＲ技術を用いて２１Ｄ４ハイブリドーマから得て、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定した。２１Ｄ４ハイブリドーマが２つの軽鎖（配列番号８および９）のうちの一方と対をなす重鎖を有する抗体を産生することは注目される。両方の抗体（すなわち、配列番号１および８にそれぞれ該当するＶＨおよびＶＬ配列を有する２１Ｄ４と配列番号１および９にそれぞれ該当するＶＨおよびＶＬ配列を有する２１Ｄ４ａ）はＣＤ１９に結合する。標準ＰＣＲ技術を用い、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ配列を、それぞれ２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、２７Ｆ３、３Ｃ１０、５Ｇ７、１３Ｆ１および４６Ｅ８ハイブリドーマから得て、標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定した。
【０４８３】
２１Ｄ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ａとそれぞれ配列番号５９および１に示す。
【０４８４】
２１Ｄ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ｂとそれぞれ配列番号６６および８に示す。
【０４８５】
２１Ｄ４重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、２１Ｄ４重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。２１Ｄ４  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ５−５１配列のアラインメントを図８に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２１Ｄ４  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図１Ａおよび８とそれぞれ配列番号１６、２３および３０に図示されるに至った。
【０４８６】
２１Ｄ４軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、２１Ｄ４軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。２１Ｄ４  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１８配列のアラインメントを図１５に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２１Ｄ４  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図１Ｂおよび１５とそれぞれ配列番号３７、４４および５１に図示されるに至った。
【０４８７】
２１Ｄ４ａの重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ａとそれぞれ配列番号５９および１に示す。
【０４８８】
２１Ｄ４ａの軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１Ｃとそれぞれ配列番号６７および９に示す。
【０４８９】
２１Ｄ４ａ重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、２１Ｄ４ａ重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ４ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。２１Ｄ４ａ  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ５−５１配列のアラインメントを図８に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２１Ｄ４ａ  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図１Ａおよび８とそれぞれ配列番号１６、２３および３０に図示されるに至った。
【０４９０】
２１Ｄ４ａ軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、２１Ｄ４ａ軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ３由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。２１Ｄ４ａ  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１８配列のアラインメントを図１６に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２１Ｄ４ａ  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図１Ｃおよび１６とそれぞれ配列番号３７、４４および５２に図示されるに至った。
【０４９１】
４７Ｇ４の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２Ａとそれぞれ配列番号６０および２に示す。
【０４９２】
４７Ｇ４の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図２Ｂとそれぞれ配列番号６８および１０に示す。
【０４９３】
４７Ｇ４重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、４７Ｇ４重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系６−１９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ５ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。４７Ｇ４  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ１−６９配列のアラインメントを図９に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる４７Ｇ４  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図２Ａおよび９とそれぞれ配列番号１７、２４および３１に図示されるに至った。
【０４９４】
４７Ｇ４軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、４７Ｇ４軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＡ２７由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ３由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。４７Ｇ４  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＡ２７配列のアラインメントを図１７に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる４７Ｇ４  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図２Ｂおよび１７とそれぞれ配列番号３８、４５および５３に図示されるに至った。
【０４９５】
２７Ｆ３の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３Ａとそれぞれ配列番号６１および３に示す。
【０４９６】
２７Ｆ３の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図３Ｂとそれぞれ配列番号６９および１１に示す。
【０４９７】
２７Ｆ３重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、２７Ｆ３重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系６−１９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。２７Ｆ３  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ５−５１配列のアラインメントを図１０に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２７Ｆ３  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図３Ａおよび１０とそれぞれ配列番号１８、２５および３２に図示されるに至った。
【０４９８】
２７Ｆ３軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、２７Ｆ３軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。２７Ｆ３  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１８配列のアラインメントを図１８に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる２７Ｆ３  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図３Ｂおよび１８とそれぞれ配列番号３９、４６および５４に図示されるに至った。
【０４９９】
３Ｃ１０の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ａとそれぞれ配列番号６２および４に示す。
【０５００】
３Ｃ１０の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図４Ｂとそれぞれ配列番号７０および１２に示す。
【０５０１】
３Ｃ１０重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、３Ｃ１０重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ１−６９由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系１−２６由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。３Ｃ１０  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ１−６９配列のアラインメントを図１１に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる３Ｃ１０  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図４Ａおよび１１とそれぞれ配列番号１９、２６および３３に図示されるに至った。
【０５０２】
３Ｃ１０軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、３Ｃ１０軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１５由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。３Ｃ１０  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１５配列のアラインメントを図１９に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる３Ｃ１０  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図４Ｂおよび１９とそれぞれ配列番号４０、４７および５５に図示されるに至った。
【０５０３】
５Ｇ７の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ａとそれぞれ配列番号６３および５に示す。
【０５０４】
５Ｇ７の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５Ｂとそれぞれ配列番号７１および１３に示す。
【０５０５】
５Ｇ７重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、５Ｇ７重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系３−１０由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。５Ｇ７  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ５−５１配列のアラインメントを図１２に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる５Ｇ７  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図５Ａおよび１２とそれぞれ配列番号２０、２７および３４に図示されるに至った。
【０５０６】
５Ｇ７軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、５Ｇ７軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ１由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。５Ｇ７  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１８配列のアラインメントを図２０に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる５Ｇ７  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図５Ｂおよび２０とそれぞれ配列番号４１、４８および５６に図示されるに至った。
【０５０７】
１３Ｆ１の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図６Ａとそれぞれ配列番号６４および６に示す。
【０５０８】
１３Ｆ１の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図６Ｂとそれぞれ配列番号７２および１４に示す。
【０５０９】
１３Ｆ１重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、１３Ｆ１重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系６−１９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。１３Ｆ１  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ５−５１配列のアラインメントを図１３に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１３Ｆ１  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図６Ａおよび１３とそれぞれ配列番号２１、２８および３５に図示されるに至った。
【０５１０】
１３Ｆ１軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、１３Ｆ１軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。１３Ｆ１  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１８配列のアラインメントを図２１に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる１３Ｆ１  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図６Ｂおよび２１とそれぞれ配列番号４２、４９および５７に図示されるに至った。
【０５１１】
４６Ｅ８の重鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図７Ａとそれぞれ配列番号６５および７に示す。
【０５１２】
４６Ｅ８の軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図７Ｂとそれぞれ配列番号７３および１５に示す。
【０５１３】
４６Ｅ８重鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン重鎖配列との比較によると、４６Ｅ８重鎖ではヒト生殖細胞系ＶＨ５−５１由来のＶＨセグメント、ヒト生殖細胞系６−１９由来のＤセグメント、およびヒト生殖細胞系ＪＨ６ｂ由来のＪＨセグメントが用いられることが示された。４６Ｅ８  ＶＨ配列と生殖細胞系ＶＨ５−５１配列のアラインメントを図１４に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる４６Ｅ８  ＶＨ配列のさらなる分析により、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図７Ａおよび１４とそれぞれ配列番号２２、２９および３６に図示されるに至った。
【０５１４】
４６Ｅ８軽鎖免疫グロブリン配列と既知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン軽鎖配列との比較によると、４６Ｅ８軽鎖ではヒト生殖細胞系ＶＫＬ１８由来のＶＬセグメントおよびヒト生殖細胞系ＪＫ２由来のＪＫセグメントが用いられることが示された。４６Ｅ８  ＶＬ配列と生殖細胞系ＶＫＬ１８配列のアラインメントを図２２に示す。ＣＤＲ領域決定のＫａｂａｔシステムを用いる４６Ｅ８  ＶＬ配列のさらなる分析により、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域が図７Ｂおよび２２とそれぞれ配列番号４３、５０および５８に図示されるに至った。
【０５１５】
実施例３：抗ＣＤ１９ヒトモノクローナル抗体の結合特異性および結合動態の特徴づけ
この実施例では、抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４および４７Ｇ４の結合親和性をＥＬＩＳＡ分析により試験した。
【０５１６】
ＥＬＩＳＡによる結合特異性
マイクロタイタープレートをＰＢＳ中１．０μｇ／ｍｌでの精製完全長ＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質５０μｌでコートし、次いでＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン１５０μｌでブロッキングした。プレートを３０分〜１時間インキュベートしておき、３回洗浄した。ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ１９抗体４７Ｇ４の希釈物を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。既知のマウス抗ＣＤ１９抗体を陽性対照として用いた。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼに複合したヤギ抗ヒトＩｇＧ  κに特異的な二次試薬とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（１．４６ｍＭｏｌ／Ｌ）で発色させ、４９０ｎｍのＯＤで分析した。結果を図２３に示す。ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂ  ４７Ｇ４はヒトＣＤ１９ペプチドに特異的に結合した。
【０５１７】
抗ＣＤ１９抗体のエピトープマッピング
フローサイトメトリーを用い、抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂのエピトープ分類を判定した。抗ＣＤ１９ヒトモノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、３Ｃ１０、５Ｇ７、５Ｇ７−Ｎ１９Ｋ、５Ｇ７−Ｎ１９Ｑおよび１３Ｆ１のエピトープへの結合を、Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞を０．３μｇ／ｍｌのビオチン化された２１Ｄ４または２１Ｄ４ａ抗ＣＤ１９ヒトモノクローナル抗体のいずれかとともにインキュベートし、洗浄し、その後に冷却した抗ＣＤ１９ヒトモノクローナル抗体を添加することにより評価した。アイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。結合を、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて実施した。結果を図２４ＡおよびＢに示す。データの分析時、抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、３Ｃ１０、５Ｇ７および１３Ｆ１は同じエピトープ領域において競合する。
【０５１８】
実施例４：ＣＤ１９抗体のＢ細胞由来腫瘍細胞系への結合
フローサイトメトリーによりＣＤ１９  ＨｕＭＡｂのＢ細胞腫瘍系のＲａｊｉおよびＤａｕｄｉまたはＣＨＯ−ＣＤ１９形質移入細胞系への結合を評価した。ＣＨＯ細胞に膜貫通形態のＣＤ１９をコードする完全長ｃＤＮＡを有する発現プラスミドを形質移入した。Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、およびＣＤ１９−ＣＨＯ細胞系を２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、５Ｇ７、５Ｇ７−Ｎ１９Ｋ、５Ｇ７−Ｎ１９Ｑ、３Ｃ１０または１３Ｆ１といったＣＤ１９  ＨｕＭＡｂのうちの１つとともにインキュベートした。既知のマウス抗ＣＤ１９抗体を陽性対照として用いた。細胞を洗浄し、フィコエリトリン標識抗ヒトまたは抗マウス二次抗体のいずれかにより検出し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＨＯ−ＣＤ１９細胞系、Ｄａｕｄｉ  Ｂ細胞系、Ｒａｊｉ  Ｂ細胞系への結合およびＲａｊｉ  Ｂ細胞系に対する拡張された結合セットにおける結果をそれぞれ図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃおよび２５Ｄに示す。ヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体２１Ｄ４および４７Ｇ４はＣＨＯ−ＣＤ１９細胞系に結合した。ヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、５Ｇ７、５Ｇ７−Ｎ１９Ｋ、５Ｇ７−Ｎ１９Ｑ、３Ｃ１０および１３Ｆ１はＲａｊｉ  Ｂ細胞系に結合した。抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂ抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、３Ｃ１０、５Ｇ７、５Ｇ７−Ｎ１９Ｋ、５Ｇ７−Ｎ１９Ｑ、および１３Ｆ１におけるＥＣ５０値はそれぞれ０．１４１３、０．１２９３、０．２３９９、０．１８７８、０．２２４０、０．２１６７および０．２６５９と計算された。４７Ｇ４はＤａｕｄｉ  Ｂ腫瘍細胞系に結合することも示された。すべての結果が染色の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）による測定値として示される。これらのデータは、ＣＤ１９タンパク質がＢ細胞の起源である腫瘍細胞系の表面上に発現され、かつ抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂ抗体２１Ｄ４、２１Ｄ４ａ、４７Ｇ４、５Ｇ７、５Ｇ７−Ｎ１９Ｋ、５Ｇ７−Ｎ１９Ｑ、３Ｃ１０および１３Ｆ１が細胞表面上に発現されるＣＤ１９に結合することを示す。
【０５１９】
実施例５：Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞に対する抗ＣＤ１９ヒト抗体２１Ｄ４および４７Ｇ４のＳｃａｔｃｈａｒｄ結合分析
Ｒａｊｉ細胞をＡＴＣＣ（登録番号ＣＣＬ−８６）から得て、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ内で成長させた。細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩで、４℃で２回洗浄し、細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ培地内（２４ｍＭトリスｐＨ７．２、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＮ  ＫＣｌ、２ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡを含有する結合緩衝液中）で４×１０７細胞／ｍｌに調節した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅプレート（ＭＡＦＢ  ＮＯＢ）を水中、１％脱脂粉乳でコートし、４℃で一晩保存した。プレートを結合緩衝液で洗浄し、結合緩衝液中の未標識抗体（１０００倍過剰）２５μｌをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ９６ウェルガラスファイバーフィルタプレート内の対照ウェルに添加した（非特異的結合ＮＳＢ）。緩衝液２５μｌのみを最大結合の対照ウェルに添加した（全結合）。結合緩衝液中、可変濃度の１２５Ｉ−抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４または４７Ｇ４  ２５μｌおよびＲａｊｉ細胞（４×１０７細胞／ｍｌ）２５μｌを添加した。プレートを振とう器上、４℃、２００ＲＰＭで２時間インキュベートした。インキュベーションの完了時、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅプレートを冷却した洗浄用緩衝液（２４ｍＭトリスｐＨ７．２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＮ  ＫＣｌ、２ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＢＳＡ）０．２ｍｌで３回洗浄した。フィルタを除去し、ガンマカウンターで計数した。平衡結合の評価を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で単一部位の結合パラメータを用いて行った。上記のｓｃａｔｃｈａｒｄ結合アッセイを用いると、抗体のＲａｊｉ細胞に対するＫＤは２１Ｄ４において約２．１４ｎＭであり、４７Ｇ４において１２．０２ｎＭであった。
【０５２０】
実施例６：抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の内在化
抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂのＣＤ１９発現Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞またはＣＤ１９を形質移入したヒトＣＨＯ細胞への内在化能力について、Ｈｕｍ−Ｚａｐ内在化アッセイを用いて試験した。Ｈｕｍ−Ｚａｐでは、二次抗体の毒素サポリンに複合されたヒトＩｇＧに対する親和性結合を介した一次ヒト抗体の内在化について試験する。
【０５２１】
ＣＨＯ−ＣＤ１９またはＲａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞系を、ウェル１００μｌ内に１．０×１０４細胞／ウェルで、一晩または翌日に２時間播種した。抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４または４７Ｇ４のいずれかをウェルに３０ｎＭの開始濃度で添加し、１：３の段階希釈で力価測定した。ＣＤ１９に非特異的なヒトアイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。Ｈｕｍ−Ｚａｐ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＴ−２２−２５）を１１ｎＭの濃度で添加し、プレートを４８時間インキュベートしておいた。次いで、プレートに１．０μＣｉの３Ｈ−チミジンを１８〜２４時間パルスし、採取し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で読み取った。ＣＨＯ−ＣＤ１９およびＢ腫瘍細胞上での内在化における結果をそれぞれ図２６Ａおよび２６Ｂに示す。ＣＨＯ−ＣＤ１９細胞についてはＨｕＭＡｂ４７Ｇ４のみを試験した。抗ＣＤ１９抗体４７Ｇ４は、ＣＨＯ−ＣＤ１９細胞上で３Ｈ−チミジン取り込みにおける抗体濃度依存性の低下を示した。２１Ｄ４および４７Ｇ４  ＨｕＭＡｂの双方は、Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞上で３Ｈ−チミジン取り込みにおける抗体濃度依存性の低下を示した。このデータは、抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４および４７Ｇ４がＣＤ１９発現ＣＨＯ−ＣＤ１９トランスフェクタント細胞およびＢ腫瘍細胞に内在化することを示す。
【０５２２】
実施例７：細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体の細胞死の評価
この実施例では、チミジン取り込みアッセイにおいて、細胞毒素に複合された抗ＣＤ１９モノクローナル抗体のＣＤ１９＋細胞系を殺傷する能力について試験した。この実験ではサイトトキシンＮ１を用いた。
【０５２３】
抗ＣＤ１９モノクローナル抗体をリンカー、例えばペプチジル、ヒドラゾンまたはジスルフィドリンカーを介して細胞毒素に複合させた。ＣＤ１９＋発現Ｒａｊｉ細胞系を２．５×１０４細胞／ウェルで３時間播種した。抗ＣＤ１９抗体−細胞毒素複合体をウェルに３０ｎＭの開始濃度で添加し、１：３の段階希釈で力価測定した。ＣＤ１９に非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。１０倍過剰な冷却抗体である２１Ｄ４ａまたはアイソタイプ対照抗体のいずれかを用い、結合を競合させる。プレートを６９時間インキュベートしておいた。次いで、プレートに１．０μＣｉの３Ｈ−チミジンを２４時間パルスし、採取し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で読み取った。結果を、ＥＣ５０値を伴う図２７ＡおよびＢに示す。このデータは、抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４がＲａｊｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞を殺傷することを示す。
【０５２４】
実施例８：抗ＣＤ１９抗体を用いるインビボでのＢ細胞腫瘍の治療
この実施例では、癌性Ｂ細胞腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスを、インビボで裸抗ＣＤ１９  ２１Ｄ４抗体または細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４のいずれかで治療し、抗体の腫瘍成長に対するインビボ効果を試験した。この実験ではサイトトキシンＮ１を用いた。
【０５２５】
細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体を上記のように調製した。機能ＢおよびＴリンパ球が欠損した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを用い、Ｂ細胞の悪性度を試験した。Ｒａｍｏｓ  Ｂ腫瘍細胞系由来の細胞を静脈内注射した。マウスを１９．６ｍｇ／ｋｇの細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体または３０ｍｇ／ｋｇの裸抗ＣＤ１９抗体のいずれかで治療した。アイソタイプ対照抗体または調製用緩衝液を陰性対照として用いた。アイソタイプ対照をＮ１でのリンカーの切断により放出された遊離毒素に複合した。動物に腹膜腔内注射により抗体またはビヒクルを含有するＰＢＳ約２００μｌを投与した。抗体−細胞毒素複合体を７日目に単回投与として注射する一方、裸抗体を、１日目に単回投与の予防モデルとしてまたは７、１４および２１日目に治療モデルとして注射した。マウスの後肢麻痺については、約６週間、毎日監視した。電子キャリパーを用い、腫瘍を三次元的に（高さ×幅×長さ）測定し、腫瘍体積を計算した。後肢麻痺がある場合、マウスを安楽死させた。
【０５２６】
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析（図２８）で記載のように、細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体、予防的に投与される裸抗ＣＤ１９抗体または治療計画として投与される抗ＣＤ１９抗体での治療時に平均生存時間が増加した。図示される平均生存時間の最大の増加は、裸抗ＣＤ１９抗体を用いる予防的治療によるものであった。
【０５２７】
体重の変化を体重の変化率として測定し、計算した。データを図２９ＡおよびＢに示す。３０日間にわたり、１つの細胞毒素と複合された抗体の場合に体重変化において正味の増加が生じ、抗体および細胞毒素（複合体ではない）の場合に体重変化において正味の減少が生じた。予防的な裸抗ＣＤ１９抗体または抗ＣＤ１９抗体のいずれかによる治療計画の場合、体重変化において正味の増加が生じた。
【０５２８】
実施例９：裸抗ＣＤ１９抗体を用いるインビボでの腫瘍異種移植片モデルの治療
リンパ腫腫瘍を移植したマウスを、インビボで裸抗ＣＤ１９抗体で治療し、抗体の腫瘍成長に対するインビボ効果について試験した。
【０５２９】
ＡＲＨ−７７（ヒトＢリンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６２１）およびＲａｊｉ（ヒトＢリンパ球性バーキットリンパ腫；ＡＴＣＣ登録番号ＣＣＬ−８６）細胞を標準の実験方法を用いてインビトロで増殖させた。６〜８週齢の雄ＣＢ１７．ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の右脇腹に、マウス１匹当たりＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１）０．２ｍｌ中、５×１０６個のＡＲＨ−７７またはＲａｊｉ細胞を皮下移植した。移植後、週２回、マウスを秤量し、その腫瘍について電子キャリパーを用いて三次元的に測定した。腫瘍体積を高さ×幅×長さ／２として計算した。平均８０ｍｍ３のＡＲＨ−７７腫瘍または平均１７０ｍｍ３のＲａｊｉ腫瘍を有するマウスを治療群に無作為化した。０日目、マウスに対し、ＰＢＳビヒクル、アイソタイプ対照抗体または裸抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂ  ２Ｈ５を腹腔内投与した。腫瘍が腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ３）に達した時、マウスを安楽死させた。結果を図３０Ａ（ＡＲＨ−７７腫瘍）および３０Ｂ（Ｒａｊｉ腫瘍）に示す。裸抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４は、腫瘍エンドポイント体積（２０００ｍｍ３）に達するまでの平均時間を延長し、腫瘍成長の進行を遅延させた。したがって、抗ＣＤ１９抗体単独による治療は、腫瘍成長に対して直接のインビボ阻害効果を有する。
【０５３０】
実施例１０：非フコシル化（Ｎｏｎｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＨｕＭＡｂの産生
量が減少したフコシル残基を有する抗体が、抗体のＡＤＣＣ能力を高めることが示されている。この実施例では、フコシル残基が欠損している抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂ  ２１Ｄ４が産生されている。
【０５３１】
フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８が欠損したＣＨＯ細胞系Ｍｓ７０４−ＰＦ（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）に対し、抗体２１Ｄ４の重鎖および軽鎖を発現するベクターをエレクトロポレートした。薬剤耐性クローンを、６ｍＭのＬ−グルタミンおよび５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を有するＥｘ−Ｃｅｌｌ  ３２５−ＰＦ  ＣＨＯ培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）内での成長により選択した。標準ＥＬＩＳＡアッセイにより、クローンにおけるＩｇＧの発現についてスクリーニングした。
【０５３２】
ＣＥ−ＬＩＦによるＭａｂにおけるオリゴ糖の特徴づけ
ＣＨＯフコシル化細胞系由来の抗ＣＤ１９抗体およびＭｓ７０４−ＰＦ由来の抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の試料に由来するＮ−結合オリゴ糖に関する比較分析を、キャピラリー電気泳動・レーザー励起蛍光（ｃＬＩＦ）（ＣｈｅｎおよびＥｖａｎｇｅｌｉｓｔａ（１９９８年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １５：１８９２頁）により行った。精製抗体のＮ−結合オリゴ糖が、試料を１２．５ｍＵ  ＰＮＧａｓｅＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）とともに４０℃で一晩インキュベートすることによりＩｇＧ試料（１００μｇ）から放出された。Ｎ−結合グリカンは、使用条件下で、ＣＨＯフコシル化および非フコシル化細胞内で発現されたＨｕＭＡｂ  ２１Ｄ４のＦｃ部分から放出された。エタノール沈殿によりＭＡＢタンバク質を除去してから、グリカンを含有する上清を、真空遠心分離により乾燥させ、脱シアル化およびフコース残基の欠損が最小化された穏やかな還元アミノ化条件下（ＴＨＦ（Ｓｉｇｍａ）中、１５％酢酸および１Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム）での１９ｍＭ  ８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホネート（ＡＰＴＳ）（Ｂｅｃｋｍａｎ）中に再懸濁した。４０℃で一晩、グリカン標識反応を持続可能にした後、試料を水中で２５倍に希釈した。ＡＰＴＳ標識グリカンを、５０ｃｍの有効長を有する内径５０μｍのＮ−ＣＨＯでコートされたキャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用い、逆極性を有するＰ／ＡＣＥ  ＭＤＱ  ＣＥシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ）上でのレーザー励起蛍光を備えたキャピラリー電気泳動に適用した。試料を（８秒間）圧力注射し、２５ｋＶでのＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｅｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用い、２０℃で分離を２０分間行った。分離を、３ｍＷアルゴンイオンレーザーと４８８ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの放射を備えたレーザー励起蛍光検出システム（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて監視した（ＭａおよびＮａｓｈａｂｅｈ（１９９９年）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：５１８５頁）。オリゴ糖特性における差を、Ｍｓ７０４−ＰＦ細胞系との比較としてフコシル化細胞系から得られた抗体の間で観察し、それはＭｓ７０４−ＰＦ由来の抗ＣＤ１９抗体においてフコース残基が存在しない場合に一致した。
【０５３３】
ＨＰＡＥ−ＰＡＤでのＨＰＬＣによる単糖分析
ＩｇＧ試料（２００μｇ）に対し、２Ｎ  ＴＦＡ（中性糖の評価用）または６Ｎ  ＨＣｌ（アミノ糖の評価用）のいずれかを用いて酸加水分解を１００℃で４時間行った。ＨＰＡＥ−ＰＡＤ（Ｄｉｏｎｅｘ）による分析に先立ち、試料を周囲温度で真空遠心分離により乾燥させ、水２００μｌ中に戻した。単糖を、予備カラムのＡｍｉｎｏ  ＴｒａｐおよびＢｏｒａｔｅ  Ｔｒａｐ（Ｄｉｏｎｅｘ）を備えたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１０  ４×２５０ｍｍのカラムを用いて分離した。手順はＤｉｏｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｎｏｔｅ  ５３に従った。単糖ピークの同一性および相対存在量を単糖の基準（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて判定した。
【０５３４】
非フコシル化抗ＣＤ１９  ２１Ｄ４抗体についても標準のキャピラリー等電点電気泳動キットアッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて試験した。アッセイでは、フコシル化２１Ｄ４においてはｐＨ８．４５、フコシル化２１Ｄ４ａにおいてはｐＨ８．４４および８．２１、ならびに非フコシル化２１Ｄ４抗体においてはｐＨ８．５２および８．３０のｐＩ観察値が得られた。
【０５３５】
実施例１１：抗ＣＤ１９抗体のＡＤＣＣ活性の評価
この実施例では、蛍光細胞毒性アッセイにおける、フコシル化および非フコシル化抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介し、エフェクター細胞の存在下でＣＤ１９＋細胞を殺傷する能力について試験した。
【０５３６】
非フコシル化ヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体２１Ｄ４を上記のように調製した。ヒトエフェクター細胞を以下のように全血から調製した。ヒト末梢血単核球を標準のＦｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ分離によりヘパリン化全血から精製した。細胞を１０％ＦＢＳ（培地）および２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−２を含有するＲＰＭＩ１６４０培地内で再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を採取し、培地内で１回洗浄し、２×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。標的ＣＤ１９＋細胞を、２．５ｍＭプロベネシド（アッセイ培地）を補充した培地内で、１×１０６個の標的細胞／ｍＬ当たりＢＡＴＤＡ２．５μｌでのＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）とともに３７℃で２０分間インキュベートした。標的細胞を、２０ｍＭヘペスおよび２．５ｍＭプロベネシドを含有するＰＢＳ中で４回洗浄し、スピンダウンし、アッセイ培地内で最終体積を１×１０５細胞／ｍｌにした。
【０５３７】
ＣＤ１９＋細胞系ＡＲＨ−７７（ヒトＢリンパ芽球性白血病；ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−１６２１）の、フコシル化および非フコシル化ヒト抗ＣＤ１９モノクローナル抗体２１Ｄ４に対する抗体特異的なＡＤＣＣについて、以下のＤｅｌｆｉａ蛍光放射分析を用いて試験した。標的細胞系ＡＲＨ７７（標識標的細胞１００μｌ）を、エフェクター細胞５０μｌおよび２１Ｄ４もしくは非フコシル化２１Ｄ４のいずれかの抗体５０μｌとともにインキュベートした。実験を通して標的対エフェクター比として１：５０を用いた。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照を陰性対照として用いた。２１００ｒｐｍのパルス回転および３７oＣで１時間のインキュベーション後、上清を採取し、再び迅速に回転させ、上清２０μｌを平底プレートに移し、それに対してＥｕ溶液（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）１８０μｌを添加し、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｌｐｈａ  ＴＲＦプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で読み取った。溶解率を、（試料放出−自然放出＊１００）／（最大放出−自然放出）（式中、自然放出は標的細胞のみを有するウェルからの蛍光であり、かつ最大放出は標的細胞を含有し、３％ライゾールで処理されているウェルからの蛍光である）に従って計算した。ＡＲＨ−７７細胞系における細胞毒性の特異的溶解率を図３１に示す。ＣＤ１９＋発現細胞系ＡＲＨ−７７は、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４での抗体媒介性細胞毒性と、抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４の非フコシル化形態に関連した特異的溶解率の増加を示した。このデータは、非フコシル化ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ１９抗体がＣＤ１９＋発現細胞に特異的な細胞毒性の増大を示すことを示す。
【０５３８】
実施例１２：示差走査熱量測定による抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の熱安定性
抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の熱安定性をその融解温度の熱量分析を用いて比較した。
【０５３９】
融解温度Ｔｍの熱量測定をオートサンプラー（ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＬＬＣ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）と組み合わせたＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ示差走査マイクロ熱量計プラットフォーム上で行った。試料の細胞体積は０．１４４ｍＬである。抗体のグリコシル化および脱グリコシル化形態に関する変性データを、２．３μＭの濃度、３０〜９５℃、１℃／分の速度で試料を加熱することにより得た。タンパク質試料はｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に存在した。同じ緩衝液を参照細胞において用い、比較によりモル熱容量を得た。観察されたサーモグラムでのベースラインを修正し、正規化データを、ソフトウェアＯｒｉｇｅｎ  ｖ７．０を用い、２段階モデルに基づいて分析した。データを表２に示す。
【０５４０】
（表２）抗ＣＤ１９抗体の熱安定性の測定
0005517626.tif 000079
【０５４１】
実施例１３：グリコシル化部位の評価
配列分析によると、ＨｕＭＡｂ抗ＣＤ１９抗体５Ｇ７は可変領域内にＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化モチーフを有することが見出された。Ｎ−結合配列部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）の存在は必要であるが炭水化物のＭａｂへの付加にとって十分ではない。すなわち、タンパク質フォールディングおよび溶媒接近性に起因して実際には炭水化物を付加しないＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を有することは考えられる。５Ｇ７の可変領域内でのグリコシル化部位の確認については、ＬＣ−ＭＳおよびウエスタン分析の双方により試験した。
【０５４２】
液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）はタンパク質、例えば抗体の質量を測定するための標準ツールである。分析に先立ち、抗ＣＤ１９  ＨｕＭＡｂの５Ｇ７および１３Ｆ１のＮ−結合オリゴ糖が、１２．５ｍＵ  ＰＮＧａｓｅＦ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）を含有する試料を４０℃で一晩インキュベートすることにより、ＩｇＧ試料（１００μｇ）から放出された。使用条件下で、ＨｕＭＡｂのＦｃ部分からＮ−結合グリカンが放出された。クローン５Ｇ７においては、２つの質量を大量に観察し、一方（４９，８５５Ｄａ）は保存されたＮ−結合部位（Ｎ２９７）での定常領域内の糖を除去するためのＰＮＧａｓｅＦ消化後での予測された質量に対応し、かつ第２の質量（５２，０９３Ｄａ）は第２の部位での炭水化物の付加に一致した。Ｆａｂ領域グリカンはＰＮＧａｓｅＦ消化により除去されず、それ故にこのデータはクローン５Ｇ７の可変領域内での炭水化物の存在を支持することを見出している。クローン１３Ｆ１においては、観察された質量は炭水化物の結合を伴わないタンパク質配列の予測された質量に一致した。
【０５４３】
上記結果を確認するため、クローン５Ｇ７および１３Ｆ１のＦａｂ断片についてのウエスタンブロットアッセイを、炭水化物に特異的な染色方法を用いて完了した。１．２５μｇの活性化パパインの１ｍＭシステインを含有する２５μｇのＩｇＧ試料への添加により、ＦａｂおよびＦｃ断片が生成された。試料を４０℃で４時間インキュベートし、反応を３０ｍＭヨードアセトアミドで停止させた。試料を４〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した後、ＰＶＤＦ膜上への電子ブロッティング（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を行った。ブロットの炭水化物に特異的な染色を、製造業者により提案されたプロトコルに従い、Ｇｅｌ  Ｃｏｄｅ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行った。結果によると、Ｆａｂのグリコシル化が５Ｇ７抗体においては検出されたが１３Ｆ１抗体においては検出されなかった。これらの結果は、５Ｇ７抗体がＦａｂ領域内でグリコシル化されることを示した。
【０５４４】
上で考察のように、抗ＣＤ１９モノクローナル抗体５Ｇ７はグリコシル化部位を有する可変領域を有する。可変領域内のグリコシル化部位が抗体の免疫原性の増強または改変された抗原結合によるｐＫ値の変化をもたらしうることから、可変領域Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化モチーフ配列を突然変異させてグリコシル化を低下させることが有利でありうる。標準の分子生物学技術を用いて５Ｇ７抗体配列を修飾することで、Ｎ−Ｉ−Ｓ配列がＫ−Ｉ−Ｓ（５Ｇ７−Ｎ１９Ｋ）またはＱ−Ｉ−Ｓ（５Ｇ７−Ｎ１９Ｑ）のいずれかに対する位置１９から変化した。
【０５４５】
実施例１４：蛍光分光による抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の安定性
抗ＣＤ１９モノクローナル抗体の安定性を、蛍光分光により化学変性の中点を測定することにより比較した。
【０５４６】
化学変性の蛍光測定を、Ｍｉｃｒｏｍａｘプレートリーダー（ＳＰＥＸ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＮＪ）を備えたＳＰＥＸ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ  ３．２２上で行った。ＰＢＳ緩衝液中の１６の異なる濃度のグアニジン塩酸塩中で平衡化するために２４時間放置された抗体試料に対して測定を行った。黒色で小体積の非結合表面３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）内で測定を行い、測定にはウェル体積１２μＬ内で２μＭの抗体が必要であった。蛍光を２８０ｎｍで励起し、放射スペクトルを３００〜４００ｎｍで測定した。走査速度は１秒／ｎｍであり、スリットを５ｎｍの帯域に設定した。ブランク緩衝液を、ＰＢＳを用いて機能させ、自動的にデータから差し引いた。データを表３に示す。
【０５４７】
（表３）抗ＣＤ１９抗体の蛍光安定性
0005517626.tif 000080
【０５４８】
実施例１５：抗ＣＤ１９抗体を用いるインビボでのＢ細胞Ｒａｊｉ腫瘍の治療
この実施例では、癌性Ｂ細胞腫瘍を移植したＳＣＩＤマウスをインビボで裸抗ＣＤ１９抗体または細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体のいずれかで治療し、抗体の腫瘍成長に対するインビボ効果について試験した。
【０５４９】
細胞毒素に複合された抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４を上記のように調製した。この実施例では、抗ＣＤ１９−Ｎ１複合体および抗ＣＤ１９−Ｎ２複合体の双方について試験した。機能ＢおよびＴリンパ球が欠損した重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスを用い、Ｂ細胞の悪性度を試験した。Ｒａｊｉ  Ｂ腫瘍細胞系由来の細胞を皮下注射した。マウスを３０ｍｇ／ｋｇの抗体または０．３μｍｏｌｅ／ｋｇ（細胞毒素）の抗体−細胞毒素複合体で治療した。アイソタイプ対照抗体または調製用緩衝液を陰性対照として用いた。動物に抗体またはビヒクルを含有するＰＢＳ約２００μｌを腹膜腔内注射で投与した。抗体を０日目の単回投与（ＳＤ）または０、７および１４日目の反復投与（ＲＤ）のいずれかとして注射した。マウスにおける腫瘍成長を、電子キャリパーを用いて毎日監視し、腫瘍を三次元的に（高さ×幅×長さ／２）測定し、腫瘍体積を計算した。腫瘍が腫瘍エンドポイント（２０００ｍｍ３）に達するかまたは２０％を超える体重減少を示す場合、マウスを安楽死させた。結果を図３２に示す。各場合においては、抗ＣＤ１９抗体は陰性対照と比較してより小さい腫瘍体積を示すとともに、細胞毒素と複合された抗体は裸抗体による治療の場合よりも小さい腫瘍体積を示す。
【０５５０】
体重の変化についても測定し、体重の変化率として計算した。結果を図３３に示す。結果は、細胞毒素と複合された抗体の場合には体重変化において正味の減少を示し、かつビヒクルまたは裸抗体のいずれかの場合には体重の正味の増加を示した。
【０５５１】
実施例１６：カニクイザルにおけるＢ細胞試験
この実施例では、カニクイザルに親抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４または非フコシル化（ｎｆ）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４のいずれかを静脈内注射した。投与後に絶対白血球数および白血球サブセットを測定し、投与前値と比較した。
【０５５２】
カニクイザルから採取した血液試料を親ＣＤ１９抗体またはｎｆ抗ＣＤ１９抗体のいずれかで染色し、標準方法を用いてＦＡＣＳにより分析した。すべてのサル由来のＢ細胞を親およびｎｆ抗ＣＤ１９抗体の双方で陽性染色される試験に含めた。雄ザル２匹および雌ザル２匹を各群中に含めた。血液試料を７日前および投与前に採取した。伏在静脈内で緩徐ボーラス静脈内注射を行い、動物に１ｍｇ／ｋｇの親またはｎｆ抗ＣＤ１９抗体を投与した。血液試料を、投与後の２４時間、４８時間、７２時間、および７日目、１４日目、２１日目および２８日目に採取した。ＰＫ測定、血液学およびフローサイトメトリーのため、血液試料を採取した。各時点で、以下の細胞表面抗原、すなわちＣＤ２＋／ＣＤ２０＋（全リンパ球）、ＣＤ２０＋（Ｂリンパ球）、ＣＤ３＋（Ｔリンパ球）、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋（Ｔヘルパーリンパ球）、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋（Ｔ細胞毒性リンパ球）、ＣＤ３−／ＣＤ１６＋（ＮＫ細胞）、ＣＤ３−／ＣＤ１４＋（単球）を血液から監視した。
【０５５３】
図３４は、ＣＤ２０陽性細胞の数の、７日前および投与前の平均値と比較される場合での変化を示す。親抗ＣＤ１９抗体が２４時間後にＣＤ２０陽性Ｂ細胞の数での５５％の減少を誘発する一方、非フコシル化抗体はより強力な阻害をもたらし、Ｂ細胞数が約９０％低下した。ｎｆ抗ＣＤ１９群においては、治療後の２日目、３日目および７日目、Ｂ細胞数はこのレベルを維持した一方、親抗体はベースラインに回帰し始めるように見られる。図３５は、各サル個体におけるＣＤ２０陽性細胞でのベースラインからの変化率を示す。ｎｆ抗ＣＤ１９抗体で治療されたすべてのサル４匹が示すＣＤ２０陽性細胞のパーセントにおける低下は親抗ＣＤ１９抗体と比較する場合により有意であった。併せて、これらのデータは、ｎｆ抗ＣＤ１９抗体が循環Ｂ細胞の枯渇時に親抗体と比較する場合により有効であることを意味する。
【０５５４】
実施例１７：抗ＣＤ１９抗体の免疫組織化学的試験
ＨｕＭａｂ抗ＣＤ１９の組織結合特性を評価するため、ＦＩＴＣと複合した２１Ｄ４（２１Ｄ４−ＦＩＴＣ、Ｆ：Ｐ＝４）および非フコシル化２１Ｄ４（ｎｆ２１Ｄ４）（ｎｆ２１Ｄ４−ＦＩＴＣ、Ｆ：Ｐ＝３）を、脾臓、扁桃腺、小腸、小脳、大脳、心臓、肝臓、肺、および腎臓を含む正常な（非腫瘍性）ヒト組織群（１〜２試料／各組織）、ならびに慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、およびびまん性大Ｂ細胞リンパ腫を含むＢ細胞腫瘍（１〜２試料／各組織）において試験した。非フコシル化２１Ｄ４抗体を上記のように調製した。ＦＩＴＣと複合したＨｕ−ＩｇＧ１（Ｈｕ−ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ）をアイソタイプ対照抗体として用いた。
【０５５５】
急速凍結し、ＯＣＴ包埋した正常組織およびリンパ腫組織をＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から購入した。５μｍのクライオスタット切片を室温で１０分間アセトンで固定し、使用まで−８０℃で保存した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋システム（Ｄａｋｏ．Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を用いるペルオキシダーゼ間接免疫染色を我々の通常のプロトコルに従って行った。つまり、スライドをＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で２回洗浄し、次いでＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋システムにおいて供給されるペルオキシダーゼブロックとともに１０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄後、スライドを、１％ヒトγグロブリンおよび１ｍｇ／ｍｌの熱凝集ヒトＩｇＧを補充したＤａｋｏタンパク質ブロックとともに２０分間インキュベートし、非特異的結合部位をブロッキングした。次いで、一次抗体（０．４もしくは２μｇ／ｍｌでの２１Ｄ４−ＦＩＴＣおよびｎｆ２１Ｄ４−ＦＩＴＣ）またはアイソタイプ対照（０．４もしくは２μｇ／ｍｌでのＨｕ−ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ）を切片上に適用し、１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、スライドをマウス抗−ＦＩＴＣ抗体（２０μｇ／ｍｌ）とともに３０分間インキュベートした。ＰＢＳでさらに３回洗浄後、スライドをＤａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋システムにおいて供給されるペルオキシダーゼと複合した抗マウスＩｇＧ重合体とともに３０分間インキュベートした。最後に、スライドを上記のように洗浄し、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋システムにおいて供給されるＤＡＢ基質−色素原溶液と６分間反応させた。次いで、通常の組織学的手順に従い、スライドを脱イオン水で洗浄し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）で対比染色し、脱水し、清浄化し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ、ＮＪ）でカバースリップした。
【０５５６】
２１Ｄ４−ＦＩＴＣおよびｎｆ２１Ｄ４−ＦＩＴＣの双方での特異的染色を、リンパ系またはリンパ球に富む組織内（脾臓、扁桃腺および小腸）およびリンパ腫組織内で観察した。脾臓および扁桃腺においては、強力な特異的染色が、主にＢ細胞領域、すなわち脾臓のリンパ小節、扁桃腺のマントルゾーンおよび胚中心に分布した。小腸においては、強力な特異的免疫反応性がＰｅｙｅｒのパッチまたはリンパ球凝集体内に、また軽度から強力な染色が粘膜のラミナプロプリア内のびまん性リンパ球内に主に局在化された。濾胞性リンパ腫および辺縁帯リンパ腫の腫瘍細胞内では強力な染色を呈し、かつ慢性リンパ性白血病、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、およびマントル細胞リンパ腫においては中等度から強力な染色を呈した。
【０５５７】
正常な小脳、大脳、心臓、肝臓、肺、および腎組織においては、２１Ｄ４−ＦＩＴＣまたはｎｆ２１Ｄ４−ＦＩＴＣのいずれかで染色する場合、肺および腎組織内での巣状リンパ球様細胞または凝集体における一部の染色を除いて有意な染色は全く観察されなかった。さらに、これらの組織を最大で１０μｇ／ｍｌのより高い濃度で染色した。同様に、アイソタイプ対照抗体との比較によると、特異的染色は全く観察されなかった。
【０５５８】
２１Ｄ４−ＦＩＴＣおよびｎｆ２１Ｄ４−ＦＩＴＣの比較によると、すべての組織内で類似の染色パターンが示された。特異的染色は、０．４μｇ／ｍｌで飽和したかまたはほぼ飽和した。しかし、２１Ｄ４−ＦＩＴＣによる染色強度は、ｎｆ２１Ｄ４−ＦＩＴＣによる染色強度よりも約０．５〜１グレード強力である。これは部分的には２１Ｄ４−ＦＩＴＣのより高いＦ：Ｐ比（４：３）に起因しうる。
【０５５９】
実施例１８：抗ＣＤ１９抗体の細胞死の評価
この実施例では、チミジン取り込みアッセイにおいて、単独のまたは細胞毒素に複合された抗ＣＤ１９モノクローナル抗体のＣＤ１９＋細胞系を殺傷する能力について試験した。
【０５６０】
抗ＣＤ１９モノクローナル抗体を、リンカー、例えばペプチジル、ヒドラゾンまたはジスルフィドリンカーを介して細胞毒素（Ｎ１）に複合させた。ＣＤ１９＋を発現するＲａｊｉまたはＳＵ−ＤＨＬ−６細胞系を１×１０４細胞／ウェルで播種した。抗ＣＤ１９抗体単独または抗ＣＤ１９抗体−細胞毒素複合体のいずれかを３０ｎＭの開始濃度でウェルに添加し、８回の希釈において１：３の段階希釈で力価測定した。ＣＤ１９に非特異的なアイソタイプ対照抗体を陰性対照として用いた。プレートを６９時間インキュベートしておいた。次いで、プレートに０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンで２４時間パルスし、採取し、Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）で読み取った。結果をＥＣ５０値とともに図３６に示す。図３６ＡはＲａｊｉ細胞上の裸抗体を示す。図３６ＢはＳＵ−ＤＨＬ−６細胞上の裸抗体を示す。図３６ＣはＳＵ−ＤＨＬ−６細胞上の細胞毒素と複合された抗ＣＤ１９抗体を示す。このデータは、抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４がＲａｊｉ  Ｂ細胞腫瘍細胞に結合、それを殺傷し、かつＳＵ−ＤＨＬ−６細胞に対する予想外に高いレベルの細胞死を有することを示す。
【０５６１】
実施例１９：Ｂ細胞枯渇試験
抗ＣＤ１９抗体がＢ細胞を枯渇させる能力があったか否かを判定するため、全血Ｂ細胞枯渇アッセイを設定した。
【０５６２】
ヒト全血はＡｌｌＣｅｌｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）から購入し、室温で同日に送られた。全血２ｍｌを、１〜３０ｍｇ／ｍｌの指示抗体の不在下もしくは存在下でまたは未処理群としてＰＢＳ中でインキュベートした。血液−抗体混合物を５％ＣＯ２とともに３７℃で一晩インキュベートした。実験日に、血液を、１０分間インキュベートした後、遠心分離することにより、１：１０の比でのＲＢＣ溶解緩衝液で２回溶解した。２回目の回転後、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳおよび２０％ヴェルセンを含有するＰＢＳ＋カルシウムおよびマグネシウム）で１回洗浄した後、ＦＡＣＳ染色を、標準のフローサイトメトリープロトコルを用い、Ｔ細胞マーカーとして抗ＣＤ３抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＢ細胞マーカーとして抗ＣＤ１９抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行った。細胞を、最終の洗浄に先立ち氷上で２０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液中の５ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム溶液（Ｓｉｇｍａ）中に再懸濁した。データを、Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎによるＦＡＳＣａｌｉｂｕｒシステムおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いるフローサイトメトリーにより収集し、リンパ球サイズのゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）を用いるＦｌｏｗＪｏソフトウェアを介して分析した。変化率を、（非治療群における陽性Ｂ細胞のパーセント−抗体治療群における陽性Ｂ細胞のパーセント）÷非治療群における陽性Ｂ細胞のパーセント×１００の測定により計算した。結果を表４に示す。健常血液ドナーから、一晩のインキュベーション（抗体なし）後、８．７％のＢ細胞が血中に残存した。全血を３０ｍｇ／ｍｌの陽性対照Ｒｉｔｕｘａｎとともにインキュベートすることにより、未処理の抗体のない群と比較した場合にＢ細胞の数が４６％枯渇した。非フコシル化（ｎｆ）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４で治療した群はＢ細胞の枯渇に対して顕著な効果を有し、Ｂ細胞が約４０％阻害された。親抗体２１Ｄ４は、Ｂ細胞数に対して穏やかな効果を有した。
【０５６３】
（表４）全血からのＢ細胞の枯渇
0005517626.tif 000081
【０５６４】
実施例２０：皮下異種移植片モデルでの抗ＣＤ１９免疫複合体のインビボでの有効性
抗ＣＤ１９免疫複合体がインビボで腫瘍成長を阻害するかまたは低下させる能力があったか否かを判定するため、ＳＣＩＤマウスにおける皮下異種移植片モデルについて試験した。ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹当たりでＰＢＳ０．１ｍｌおよびｍａｔｒｉｇｅｌ０．１ｍｌ中の１×１０７個のＲａｊｉ細胞を皮下移植した。腫瘍形成を、平均腫瘍体積が（高精度キャリパーを用いて）約５０ｍｍ３であることが測定されるまで監視した。腫瘍担持マウス８匹からなる群を、（ａ）ビヒクル対照、（ｂ）アイソタイプ対照、（ｃ）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４、または（ｄ）抗体２１Ｄ４を用いる免疫複合体抗ＣＤ１９−Ｎ２のうちの１つの単回投与で治療した。免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２およびアイソタイプ対照−Ｎ２（ＩｇＧ−Ｎ２）を、マウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）に、Ｎ２相当の０．３μｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した。抗ＣＤ１９抗体を２５．７ｍｇ／ｋｇ（すなわち、免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２において用いられるＮ２相当に対して等しいタンパク質用量）で投与した。腫瘍成長を、実験を通して高精度キャリパーを用いた測定により監視した。図３７で明らかなように、免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２による単回投与治療の結果、対照または抗ＣＤ１９抗体単独で治療される場合にサイズが成長した腫瘍を有するマウスと比較し、１０日以内に腫瘍を有しないマウスが得られた（最大６０日間、腫瘍を有しない状態が維持された）。
【０５６５】
実施例２１：バーキットリンパ腫モデルでの抗ＣＤ１９免疫複合体のインビボでの有効性
抗ＣＤ１９免疫複合体がインビボで腫瘍成長を用量依存的に阻害するかまたは低下させる能力があったか否かを判定するため、皮下バーキットリンパ腫ＳＣＩＤマウスモデルについて試験した。ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹当たりでＰＢＳ０．１ｍｌおよびｍａｔｒｉｇｅｌ０．１ｍｌ中の１×１０７個のＲａｊｉ細胞を皮下移植した。腫瘍形成を、平均腫瘍体積が（高精度キャリパーを用いて）約７０ｍｍ３であることが測定されるまで監視した。腫瘍担持マウス８匹からなる群を、（ａ）ビヒクル対照、（ｂ）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４、または（ｃ）抗体２１Ｄ４を用いる免疫複合体抗ＣＤ１９−Ｎ２のうちの１つで治療した。１週間後、２用量の免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２を、各マウス群に、Ｎ２相当の０．３μｍｏｌ／ｋｇ、０．１μｍｏｌ／ｋｇ、０．０３μｍｏｌ／ｋｇおよび０．０１μｍｏｌ／ｋｇといった用量のうちの１つで腹腔内投与した。抗ＣＤ１９抗体を２５ｍｇ／ｋｇ（すなわち、免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２において用いられるＮ２相当に対して等しいタンパク質用量）で投与した。腫瘍成長を、実験を通して高精度キャリパーを用いた測定により監視した。図３８で明らかなように、腫瘍体積が用量依存的に減少するとともに、０．３μｍｏｌ／ｋｇでの免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２により腫瘍体積が増加したより低い用量の場合と比較し、２０〜３０日目までに腫瘍を有しないマウスが得られた。
【０５６６】
実施例２２：全身モデルでの抗ＣＤ１９免疫複合体のインビボでの有効性
抗ＣＤ１９免疫複合体がインビボで腫瘍成長を用量依存的に阻害するかまたは低下させる能力があったか否かを判定するため、皮下バーキットリンパ腫ＳＣＩＤマウスモデルについて試験した。
【０５６７】
ＳＣＩＤマウスに、マウス１匹当たりでＰＢＳ０．１ｍｌ中の１×１０６個のＲａｊｉ細胞を、尾静脈を介して静脈内移植した。移植の１週間後、マウス６匹からなる群を、（ａ）ビヒクル対照、（ｂ）抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４、または（ｃ）抗体２１Ｄ４を用いる免疫複合体抗ＣＤ１９−Ｎ２のうちの１つの単回投与で治療した。免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２を、各マウス群に、Ｎ２相当の０．３μｍｏｌ／ｋｇまたは０．１μｍｏｌ／ｋｇといった用量のうちの１つで腹腔内投与した。抗ＣＤ１９抗体を３０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２において用いられるＮ２相当に対して等しいタンパク質用量）で投与した。腫瘍成長を、実験を通し、Ｒａｊｉ細胞の中枢神経系への浸潤の結果としての後肢麻痺の発症を測定することにより監視した。図３９で明らかなように、０．３μｍｏｌ／ｋｇでの免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２による治療の場合、後肢麻痺が発症したマウスは全くなかった一方、０．１μｍｏｌ／ｋｇでの免疫複合体ＣＤ１９−Ｎ２による治療の場合、マウスの１５％が後肢麻痺を発症しなかった。それに対し、抗ＣＤ１９単独で治療されたすべてのマウスが移植後５０日以内に後肢麻痺を発症した。
【０５６８】
実施例２３：カニクイザルにおける単回投与の薬理
抗ＣＤ１９抗体２１Ｄ４の薬理を評価するため、０．０１、０．１、１、もしくは１０ｍｇ／ｋｇの非フコシル化（ＮＦ）抗体の単回静脈内注射をカニクイザルに投与した。ＣＤ２０＋Ｂ細胞をＦＡＣＳにより評価した。各血液試料の一定分量１００μＬを清浄な標識チューブに入れ、適量の市販の蛍光色素標識抗ＣＤ２０抗体を添加した。一定分量を室温で約３０分間インキュベートし、光から保護した。標識後、市販の溶解溶液を添加して赤血球を除去し、残存する無傷細胞（約１〜２×１０６細胞／ｍＬ）を直ちに分析するかまたは分析するまで（採血後１２０時間以内）約４℃で保存した。分析の直前、懸濁液を室温まで穏やかに加温した。
【０５６９】
Ｂ細胞（ＣＤ２０＋）は、２１Ｄ４の最低または０．０１ｍｇ／ｋｇ以上での投与後、用量依存的に減少した（図４０Ａ）。Ｂ細胞は、０．１ｍｇ／ｋｇの投与後、ベースラインの１６％から３２％に減少した。投与後の５６日目、Ｂ細胞の回復が見られた。この試験においては、Ｂ細胞枯渇の規模および長さはリツキシマブの０．１ｍｇ／ｋｇの注射の場合と類似していた（図４０Ｂ）。
【０５７０】
Ｂ細胞は、１ｍｇ／ｋｇの２１Ｄ４の投与後、最低でベースラインの３％から９％であった。動物４匹中２匹においては、Ｂ細胞は投与後３６日目に回復し始め、投与の７か月以内に完全に回復した。他の動物２匹においては、Ｂ細胞の回復は投与後６〜１１週目に始まり、投与後７か月目でベースラインの５６％および５８％であった。
【０５７１】
１０ｍｇ／ｋｇの２１Ｄ４の投与後におけるＢ細胞の減少は、１ｍｇ／ｋｇの投与後のそれに類似していた（３％〜１１％対３％〜９％）。この試験では、投与後１５日目に動物４匹に対して検視を行った。試験項目に関連する実験結果は、動物の４匹中２匹における軽度の脾リンパ腫の濾胞性萎縮に限られた。これは認識可能な胚中心がほとんど存在しないことや、脾臓内部のＢ細胞における主要な位置であるリンパ濾胞のサイズの低下により特徴づけられた。他の組織（下顎および腸間膜リンパ節や腸関連リンパ系組織（ｇｕｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ））内でのリンパ濾胞は同様の作用を受けなかった。さらなる動物２匹を回復期に保持し、Ｂ細胞が投与後２０週以内にベースラインの７５％超に回復した。１８４日目、これらの動物に対して検視を行い、顕微鏡による病理学的評価時に見られる脾臓またはリンパ節における薬理学的効果が全くなかった。したがって、ＮＦ２１Ｄ４のカニクイザルへの投与は耐容性が良好であり、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の枯渇の予想される薬理学的効果をもたらした。
【０５７２】
実施例２４：カニクイザルにおける複数回投与の薬理
１０ｍｇ／ｋｇ（×３）の非フコシル化（ＮＦ）２１Ｄ４を毎月投与した結果、動物の６匹中４匹においては８５日目に至るまでＢ細胞数がベースラインの５％未満になった。他の動物２匹においては、１回目の投与後、Ｂ細胞はベースラインの１０％未満であった。これらの動物のうちの１匹においては、Ｂ細胞は２９日目にベースラインの１７％に増加し、次いで８５日目に至るまで一定を保持した。他の動物においては、Ｂ細胞数は７１日目までにベースラインの６９％に増加した。ＩｇＧおよびＩｇＭレベルについては試験を通じて測定し、ＮＦ２１Ｄ４の投与による作用を受けなかった。９２日目、動物の６匹中４匹に対して検視を行った。組織学的実験結果には、脾臓（動物の４匹中２匹）および腸間膜リンパ節（動物の４匹中１匹）における軽度から中等度のリンパ濾胞萎縮が含まれた。これは認識可能な胚中心がほとんど存在しないことや、脾臓内部のＢ細胞における主要な位置であるリンパ濾胞のサイズにおける低下により特徴づけられた。残りの動物２匹を回復期に保持した。Ｂ細胞数は１６９日目に増加し始め、２２５日目にはベースラインの３１％および３８％であった。これらの動物は、Ｂ細胞数がベースライン値の７５％超になるまで監視されることになる。
【０５７３】
１、１０もしくは５０ｍｇ／ｋｇを毎週投与しても、結果的にＢ細胞数が有意に減少し、最低でベースラインの１６％未満であった。３０日目、１群当たり６匹に対して検視を行い、組織学的実験結果には動物の１８匹中１０匹の脾臓における最小から中等度のリンパ濾胞のびまん性萎縮が含まれた。大部分の動物において、脾臓、リンパ節、および骨髄におけるＣＤ２０＋リンパ球の減少も見られた。
【０５７４】
実施例２５：抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡによるインビボでの腫瘍成長の阻害
この実施例は、３つのヒトリンパ腫モデル（ＳＣＩＤマウスにおけるＲａｊｉおよびＤａｕｄｉおよびＥｓ１ｅヌードマウスにおけるＲａｍｏｓ）を用いての、抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡ複合体のリンパ腫に対する標的化治療薬としての有用性を示す。サイトトキシンＡの構造を図４６に示す。
【０５７５】
これらの動物モデルを用い、インビボでの抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡ複合体の有効性を試験した。ＣＤ１９抗体２１Ｄ４の細胞毒素複合体は、本明細書中でＣＤ１９−サイトトキシンＡと称され、サイトトキシンＡに結合されたＣＤ１９抗体２１Ｄ４から構成される。サイトトキシンＡおよびその調製物については、２００６年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／８８２，４６１号明細書および２００７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６０／９９１，３００号明細書でさらに記載されており、これらの内容全体は具体的に参照により本明細書中に援用される。サイトトキシンＡ細胞毒素はプロドラッグ形態であり、活性のための抗体からの放出にとどまらず活性部分を放出するための４’カルバメート基の切断も必要である。
【０５７６】
Ｒａｊｉリンパ腫モデルでの抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの活性を実証するため、皮下Ｒａｊｉ異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて治験を実施した。Ｒａｊｉ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中で１０００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１９０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を単回用量として０．０３、０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかの抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に、ビヒクル単独または０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のアイソタイプ対照抗体サイトトキシンＡ複合体を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの体重を試験の全期間にわたって記録し、それを投与後の６３日間にわたって継続することができた。結果を図４１および４２に示す。図４１は単一のグラフでの結果を示し、かつ図４２はアイソタイプ対照を含む結果を示す。結果は、抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡ複合体がリンパ腫の治療において有効であり、かつ治療が用量依存性であることを示す。
【０５７７】
第２のリンパ腫モデルについてはＲａｍｏｓ異種移植片を用いて行った。Ｒａｍｏｓ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中で１０００万個）をＥｓ１ｅヌードマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に皮下移植し、腫瘍が１１０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス１０匹からなる群を、単回用量（０日目）または反復用量（０、１１および２５日目）のいずれかとして０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に、ビヒクル単独、０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重の抗ＣＤ１９抗体単独またはアイソタイプ対照抗体サイトトキシンＡ複合体を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの体重を試験の全期間にわたって記録し、それを投与後の６０日間にわたって継続することができた。結果を図４３に示す。結果は、抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡ複合体がこの動物モデルにおけるリンパ腫の治療においても有効であることを示す。
【０５７８】
第３のリンパ腫モデルについてはＤａｕｄｉ異種移植片を用いて行った。Ｄａｕｄｉ細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中で１０００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が７０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス８匹からなる群を、単回用量として０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかの抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に、ビヒクル単独、０．３μｍｏｌ／ｋｇの抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡの用量に一致する抗ＣＤ１９抗体単独または０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のアイソタイプ対照抗体サイトトキシンＡ複合体を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの体重を試験の全期間にわたって記録し、それを投与後の５８日間にわたって継続することができた。結果を図４４に示す。結果は、抗ＣＤ１９−サイトトキシンＡ複合体がこの動物モデルでのリンパ腫の治療においても有効であることを示す。
【０５７９】
実施例２６：抗ＣＤ１９−Ｎ２によるインビボでの腫瘍成長の阻害
この実施例は、ＳＵ−ＤＨＬ−６リンパ腫モデルにおける抗ＣＤ１９−Ｎ２の有効性を示す。ＣＤ１９抗体２１Ｄ４の細胞毒素複合体は本明細書中でＣＤ１９−Ｎ２と称され、それはＮ２に結合されたＣＤ１９抗体２１Ｄ４から構成される。
【０５８０】
皮下ＳＵ−ＤＨＬ−６異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおいて治験を実施した。ＳＵ−ＤＨＬ−６細胞（マウス１匹当たりＰＢＳ０．１ｍｌおよびＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）０．１ｍｌ中で１０００万個）をＳＣＩＤマウスに皮下移植し、腫瘍が１４０ｍｍ３の平均サイズに達した時、マウス１０匹からなる群を単回用量として０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のいずれかの抗ＣＤ１９−Ｎ２の腹腔内注射により治療した。さらに、対照群に、ビヒクル単独または０．１もしくは０．３μｍｏｌ／ｋｇ体重のアイソタイプ対照抗体Ｎ２複合体を注射した。腫瘍体積（ＬＷＨ／２）およびマウスの体重を試験の全期間にわたって記録し、それを投与後の６４日間にわたって継続することができた。結果を図４５に示す。結果は、抗ＣＤ１９−Ｎ２複合体がリンパ腫の治療において有効かつ選択的であり、かつ治療が用量依存性であることを示す。
【０５８１】
配列表の概要
0005517626.tif 000082
0005517626.tif 000083
【図１Ａ】
0005517626.tif 000084
【図１Ｂ】
0005517626.tif 000085
【図１Ｃ】
0005517626.tif 000086
【図２Ａ】
0005517626.tif 000087
【図２Ｂ】
0005517626.tif 000088
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005517626.tif 000090
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
0005517626.tif 000093
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0005517626.tif 000101
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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