(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋なフルオレセインを調製する方法であって、
（ａ）商用グレードのフルオレセインを、還流温度で、無水酢酸を溶媒および試薬の両方として用いて、Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインに転化するステップと、
（ｂ）該商用グレードのフルオレセインから生成したジアセチルフルオレセインを水中で水酸化ナトリウムを用いて加水分解して、フルオレセインを形成するステップと、
（ｃ）溶液中の該フルオレセインに色度を減少させるのに有効な炭を添加して、フルオレセイン／炭混合物を形成するステップと、
（ｄ）該フルオレセイン／炭混合物を濾過して濾液を形成させるステップと、
（ｅ）該濾液にエタノールを添加してエタノール対水の比率を２：１にしたものを得るステップと、
（ｆ）２〜４時間の間冷却しつつ、塩酸溶液を用いてｐＨを１．０〜２．５のレベルに調整して、沈殿物を形成するステップと、
（ｇ）該溶液を濾過して該沈殿物を保持するステップと、
（ｈ）該沈殿物を水およびエタノールで洗浄するステップと
を含み、
ここで、得られた該フルオレセインは、検出可能なフルオレセイン関連物質不純物が存在しない場合、または単一のフルオレセイン関連物質不純物が検出される場合に０．１重量％を上回らない量で存在するとき、または複数のフルオレセイン関連物質不純物が検出される場合に該複数のフルオレセイン関連物質不純物が全体で０．６重量％を上回らない量で存在するときに、実質的に純粋であると定義される、
方法。
【請求項２】
前記フルオレセイン関連物質不純物は、レゾルシノールとコハク酸との反応から生じる合成不純物、異性体、酸化生成物、二量体生成物、および以下の式    
【化２】
0005384363.tif 000026
のいずれかによって定義されるフルオレセイン分解生成物からなる、
請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、実質的に純粋なフルオレセインを含む組成物、実質的に純粋なフルオレセインを調製するためのプロセス、かかるプロセスによって調製された実質的に純粋なフルオレセイン、フルオレセインの純度を判断するための分析的方法、および血管造影法において使用するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
フルオレセインは、橙赤色の化合物、Ｃ２０Ｈ１２Ｏ５であり、アルカリ溶液中で強い蛍光発光を示し、例えば、診断目的の薬剤として、海洋学におけるトレーサーとして、またテキスタイル染料としてなどの応用分野で使用される。
【０００３】
フルオレセインは、ドイツ人化学者Ａｄｏｌｆ  Ｖｏｎ  Ｂａｅｙｅｒによって、１８７１年に初めて、石油誘導体のレゾルシノール（１，３−ジヒドロキシベンゼン）と無水フタル酸とから合成された。ドイツ人細菌学者Ｐａｕｌ  Ｅｒｌｉｃｈは、当時「ウラニン」として知られたこの蛍光色素を使用して（フルオレセインのナトリウム塩として）、眼房水の分泌経路を追跡した。これは、生理学の研究のためにｉｎ  ｖｉｖｏで蛍光色素を使用した始めての例であると考えられている。
【０００４】
フルオレセイン血管造影法は、眼底血管の状態の研究を可能にする重要な診断手段である。このような血管は、網膜に影響を与える多くの疾患の要因である。血管造影法は、患者の腕の静脈内にフルオレセインを注射することによって実施する。短時間（典型的には、２、３秒から数秒）で、色素は眼底血管まで進行するので、特殊フィルターを備えたカメラを用いて、色素が眼血管内を循環している間に画像化する。そのように生成された画像を検査することにより、あらゆる循環問題、例えば血管の漏出、膨張、異常なもしくは新しい血管などについて評価を行なうことができる。
【０００５】
フルオレセインは、青色光を吸収し、４６５〜４９０ｎｍの波長でピーク吸収および励起が生じる。蛍光発光は、５２０〜５３０ｎｍの黄緑色の波長で生じる。一般的にフルオレセインといわれているが、血管造影法に使用される色素はフルオレセインナトリウム、つまりフルオレセインの可溶性ジナトリウム塩である。
【０００６】
フルオレセインの健康成人への投与量は、静脈注射５００ｍｇである。これは、典型的には、１０％溶液５ｍＬ、または２５％溶液２ｍＬの用量で包装されている。循環系に入ると、色素分子のおよそ８０％が血清タンパク質と結合する。残りの非結合または遊離フルオレセイン分子は、適切な波長の光によって励起された場合に蛍光を発する。色素は、肝臓で代謝されてフルオレセインモノグルクロニドを形成し、最終的に、投与後２４〜３６時間以内に尿によって排泄される。
【０００７】
フルオレセイン配合物中のフルオレセインの純度は、副作用および注射に対する耐性と相関する可能性があるという報告がされている非特許文献１。したがって、血管造影法に使用するフルオレセイン組成物から、全てまたは実質的に全ての不純物を排除することが、本発明の主目的である。
【０００８】
以下の出版物を参照すると、フルオレセイン組成物、ならびにフルオレセインを調製および精製するためのプロセスに関するさらなる情報が得られるであろう。
【０００９】
特許文献１（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）の「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｐｕｒｐｏｓｅｓ」は、ピリジンを用いてフルオレセインを調製するためのプロセスを記載している。
【００１０】
特許文献２（Ｔｒａｎ−Ｇｕｙｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）の「Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｉｔｙ  Ｐｈｔｈａｌｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  Ｓａｍｅ」は、無水溶媒を用いてフルオレセインを調製するためのプロセスを記載している。
【００１１】
また、さらなる背景については、以下の特許または広報を参照することができる：特許文献３（Ｓｕｊｅｅｔｈ）の「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｃｅｓｓ  Ｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ  ａｓ  ａ  Ｓｏｌｖｅｎｔ」、および特許文献４（Ｋｒａｎｚ）の「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ−Ｐｈｔｈａｌｅｉｎｓ」。
【００１２】
高度に精製されたフルオレセインは、注射を目的とする溶液の調製に必要とされる。使用される精製されたフルオレセインは、理想的には、（ｉ）毒性であるおよび／または蛍光発光が欠如する可能性がある不純物を含まず、（ｉｉ）注射可能なフルオレセイン製品の許容できないほど高い重量オスモル濃度または高浸透圧をもたらしうる塩の含有量が低く、また（ｉｉｉ）低色である。ある不純物は強い色を呈する。したがって、特定の周波数での色の不在は、かかる不純物が存在しないことを示す。したがって、フルオレセイン組成物の色プロファイルは、重要な品質特性であり、純度の視覚的指標であると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】独国特許発明第１３６４９８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０１０６２３４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６３７，７３３号明細書
【特許文献４】米国特許第１，９６５，８４２号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｙａｎｎｕｚｉら、「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ」、Ａｍ．Ｊ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、１９７４年、７８、（２）、ｐ.２１７−２２１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
フルオレセイン組成物中に存在しうる非常に低レベルの不純物を同定し、定量化するための方法が必要とされている。このような方法は、存在しうる不純物を分離、同定、および定量化することができるべきである。
【００１６】
したがって、高純度で、低色で、塩化ナトリウム含有量が少ないフルオレセイン組成物、およびかかるフルオレセインを生成するための、ピリジンあるいはその他の非水（また有害である可能性がある）溶媒の使用を必要としないプロセス、ならびにかかるフルオレセインの純度を判断するための方法が必要とされている。本発明は、これらの必要性を満たすことを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の背景）
本発明は、実質的に純粋なフルオレセインを含む組成物、精製されたフルオレセインを調製するための新規の改良されたプロセス、およびこれらのプロセスによって生成されたフルオレセインの組成物に関する。また本発明は、実質的に純粋なフルオレセインを含む血管造影法で使用するための医薬組成物、およびフルオレセイン組成物の純度を判断する方法に関する。本発明の方法によって生成された高度に精製されたフルオレセインは、従来のフルオレセイン組成物よりも低いレベルの関連不純物質を有する。また、このような新規のプロセスによって生成されたフルオレセインは、他の既知の組成物よりも低色で（５９０ｎｍにおいて）、明らかに目に見える純度の指標を提示している。また、本発明のフルオレセインは、塩化ナトリウム含有量が少ないため、他の既知の組成物よりもより容易に薬学的使用のために調剤される。本発明のプロセスは、精製プロセスにおけるピリジンの使用を排除し、無水溶媒の使用を不要にし、未精製のフルオレセインをアセチル化するために必要とされる無水酢酸の量を減らし、高度に精製されたフルオレセインの収率を向上させることによって、他の既知のプロセスを改良する。また、本発明は、フルオレセイン組成物中の関連不純物質を分離し、定量化するための、またそれによってフルオレセイン組成物の純度を判断するための信頼できる方法を提供することによって、最新技術を進歩させる。
【００１８】
本発明は様々な応用分野において実施でき、これには以下に要約するものが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明の一実施形態は、実質的に純粋なフルオレセインを含む組成物、より具体的には、ピリジンを実質的に含まないフルオレセインに関する。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、約０．１重量％、より好ましくは０．０１重量％を上回る濃度のいかなる関連不純物質も含有しない、実質的に純粋なフルオレセインに関する。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、約０．０１５〜約０．０５０ＡＵＣの色度を有する実質的に純粋なフルオレセインに関する。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、約０．２５重量％未満の残留塩化物含有量を有する実質的に純粋なフルオレセインに関する。
【００２３】
本発明の別の実施形態は、物質関連不純物の総量が約０．６重量％未満、好ましくは０．０６重量％未満である、実質的に純粋なフルオレセインに関する。
【００２４】
本発明の別の実施形態は、実質的に純粋なフルオレセインの調製のためのプロセスに関する。このプロセスは、ジアセチルフルオレセインを加水分解してフルオレセインを形成するステップと、フルオレセインを炭で処理するステップと、濾過するステップと、濾液にエタノールを添加するステップと、酸性溶液を用いてｐＨを調整して沈殿物を形成するステップと、濾過するステップと、洗浄するステップとを含む。本実施形態の一態様において、ｐＨレベルは、約１．０〜約２．５に調整される。別の態様では、約２０℃〜約２５℃冷却温度を維持しながらｐＨレベルを調整し、ｐＨレベルは約２〜４時間の間に調整する。また、本発明は、かかるプロセスによって生成された実質的に純粋なフルオレセイン組成物にも関する。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、フルオレセイン関連不純物質のレベルを定量化するためのＨＰＬＣ法を提供する。この方法は、組成物の高圧液体クロマトグラムを得るステップと、関連不純物質に対応する、クロマトグラムにおけるピークを同定するステップと、ピークの面積測定値を得て、その相対濃度を判断するステップとを含む。本実施形態の一態様において、ピークは、約０．７５、１．１９、１．２３、１．６８、および１．７１の相対ＨＰＬＣ保持時間を有する。別の実施形態は、フルオレセイン中の関連不純物質を同定するためのＨＰＬＣ／ＭＳ法を提供する。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態は、実質的に純粋なフルオレセインを含む、血管造影法で使用するための医薬組成物、より具体的には、フルオレセインがピリジンを実質的に含まない組成物に関する。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態は、実質的に純粋なフルオレセインを含む、血管造影法で使用するための医薬組成物に関し、この組成物は約０．１重量％、より好ましくは０．０１重量を上回る濃度のいかなる物質関連不純物も含有しない。
【００２８】
本発明の別の好ましい実施形態は、実質的に純粋なフルオレセインを含む、血管造影法で使用するための医薬組成物に関し、この組成物中に存在する関連不純物質の総量は、約０．６重量％未満、より好ましくは約０．０６重量％未満である。
【００２９】
本発明の別の好ましい実施形態は、実質的に純粋なフルオレセインを含む、血管造影法で使用するための医薬組成物に関し、このフルオレセインは、約０．０１５〜約０．０５０ＡＵＣの色度を有する。
【００３０】
本発明の別の好ましい実施形態は、血管造影法で使用するためのフルオレセインの医薬組成物に関し、この組成物は、残留塩化物量約０．２５重量％未満を有する。本発明はまた、以下をも提供する。
（１）  実質的に純粋なフルオレセインを含む、組成物。
（２）  ピリジンを実質的に含まない、項目１に記載の組成物。
（３）  約０．１重量％を上回る濃度のいかなる関連不純物質も含有しない、項目１に記載の組成物。
（４）  約０．０１重量％を上回る濃度のいかなる関連不純物質も含有しない、項目３に記載の組成物。
（５）  前記組成物中に存在する関連不純物質の総量は約０．６重量％未満である、項目１に記載の組成物。
（６）  前記組成物中に存在する関連不純物質の総量は約０．０６重量％未満である、項目５に記載の組成物。
（７）  前記実質的に純粋なフルオレセインは、約０．０１５〜約０．０５０ＡＵＣの色度を有する、項目１に記載の組成物。
（８）  前記組成物中に存在する残留塩化物の量は、約０．２５重量％未満である、項目１に記載の組成物。
（９）  実質的に純粋なフルオレセインを調製するためのプロセスであって、
（ａ）ジアセチルフルオレセインを加水分解して、フルオレセインを形成するステップと、
（ｂ）溶液中の該フルオレセインに炭を添加して、フルオレセイン／炭混合物を形成するステップと、
（ｃ）該フルオレセイン／炭混合物を濾過するステップと、
（ｄ）濾液にエタノールを添加するステップと、
（ｅ）酸性溶液を用いてｐＨを調整して、沈殿物を形成するステップと、
（ｆ）濾過するステップと、
（ｇ）洗浄するステップと
を含む、プロセス。
（１０）  ステップ（ｅ）におけるｐＨは、約１．０〜約２．５のレベルに調整される、項目９に記載のプロセス。
（１１）  ステップ（ｅ）は、冷却を伴って実施される、項目９に記載のプロセス。
（１２）  ステップ（ｅ）は、約２〜約４時間の間に実施される、項目９に記載のプロセス。
（１３）  項目９に記載のプロセスによって調製された、実質的に純粋なフルオレセイン。
（１４）  フルオレセイン組成物の純度を判断するための方法であって、
（ａ）前記組成物の高圧液体クロマトグラムを得るステップと、
（ｂ）関連不純物質に対応する、該クロマトグラムにおけるピークを同定するステップと、
（ｃ）該ピークの面積測定値を得て、その相対濃度を判断するステップと
を含む、方法。
（１５）  前記ピークは、約０．７５、１．１９、１．２３、１．６８、および１．７１の相対ＨＰＬＣ保持時間を有する、項目１４に記載の方法。
（１６）  実質的に純粋なフルオレセインと注射用賦形剤とを含む、血管造影で使用するための医薬組成物。
（１７）  前記組成物は、ピリジンを実質的に含まない、項目１６に記載の組成物。
（１８）  前記組成物は、約０．１重量％を上回る濃度のいかなる関連不純物質も含有しない、項目１６に記載の組成物。
（１９）  前記組成物中に存在する関連不純物質の総量は、約０．６重量％未満である、項目１６に記載の組成物。
（２０）  前記実質的に純粋なフルオレセインは、約０．０１５〜約０．０５０ＡＵＣの色度を有する、項目１６に記載の組成物。
（２１）  前記組成物中に存在する残留塩化物の量は、約０．２５重量％未満である、項目１６に記載の組成物。
（２２）  項目９に記載のプロセスによって調製された実質的に純粋なフルオレセインを含む、組成物。
（２３）  ジアセチルフルオレセインの脱アセチル化によって調製された実質的に純粋なフルオレセインを含む、組成物。
【００３１】
以下の図面および発明を実施するための形態を用いて、本発明をさらに十分に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】フルオレセイン洗浄実験の実験計画の概要である。
【図２】フルオレセインｐＨ／沈殿実験の実験計画の概要である。
【図３】実施例３に記載される、フルオレセイン原体の色強度を示すＵＶ／ＶＩＳスペクトルである。
【図４】実施例５に記載される、希釈液ブランクのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】実施例５に記載される、１％ＵＳＰフルオレセイン参照標準物質のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】実施例５に記載される、供給元Ａのフルオレセイン原料のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】実施例５に記載される、０．８％レゾルシノールを添加したフルオレセイン原料の新規のプロセスのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】実施例５および６に記載される、フルオレセインの構造および不純物の提示構造の図である。
【図９】フルオレセイン注入液の代表的ＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】（ａ）は、ＵＶ検出によるフルオレセイン注入液のクロマトグラムであり、（ｂ）は、１３．６５〜１４．４５分に抽出されたフルオレセインのＨＰＬＣピークのサーモスプレー質量スペクトルである。
【図１１】（ａ）は、質量分析計を用いたｍ／ｚ２５９での質量選択検出による、フルオレセイン注入液中の不純物Ａのクロマトグラムであり、（ｂ）は、１１．９５〜１２．０５分に抽出された不純物ＡのＨＰＬＣピークのサーモスプレー質量スペクトルである。
【図１２】（ａ）は、質量分析計を用いたｍ／ｚ２８５での質量選択検出による、フルオレセイン注入液中の不純物Ｂのクロマトグラムであり、（ｂ）は、１５．４５〜１５．５５分に抽出された不純物ＢのＨＰＬＣピークのサーモスプレー質量スペクトルである。
【図１３】（ａ）は、質量分析計を用いたｍ／ｚ３４７での質量選択検出による、フルオレセイン注入液中の不純物Ｃのクロマトグラムであり、（ｂ）は、１６．１０〜１６．５０分に抽出された不純物ＣのＨＰＬＣピークのサーモスプレー質量スペクトルである。
【図１４】（ａ）は、質量分析計を用いたｍ／ｚ３４７での質量選択検出による、フルオレセイン注入液中の不純物Ｄのクロマトグラムであり、（ｂ）は、１８．２０〜１８．６５分に抽出された不純物ＤのＨＰＬＣピークのサーモスプレー質量スペクトルである。
【図１５−１】（ａ）は、質量分析計を用いたｍ／ｚ３３３での質量選択検出による、フルオレセイン中の不純物Ｅのクロマトグラムであり、（ｂ）は、１３．２３〜１３．５２分に抽出された不純物ＥのＨＰＬＣピークのＡＰＣＩ質量スペクトルである。
【図１５−２】（ｃ）は、２２０〜５００ｎｍの総吸光度スキャンでの検出による、フルオレセイン中の不純物Ｅのクロマトグラムであり、（ｄ）は、不純物ＥのピークのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルである。
【図１６−１】（ａ）は、質量分析計を用いたｍ／ｚ４２５での質量選択検出による、フルオレセイン中の不純物Ｆのクロマトグラムであり、（ｂ）は、１９．１０〜１９．３２分に抽出された不純物ＦのＨＰＬＣピークのＡＰＣＩ質量スペクトルである。
【図１６−２】（ｃ）は、２２０〜５００ｎｍの総吸光度スキャンでの検出による、フルオレセイン中の不純物Ｆのクロマトグラムであり、（ｄ）は、不純物ＦのピークのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルである。
【図１７−１】（ａ）は、質量分析計を用いたｍ／ｚ３７５での質量選択検出による、フルオレセイン中の不純物Ｇのクロマトグラムであり、（ｂ）は、２１．２７〜２１．５４分に抽出された不純物ＧのＨＰＬＣピークのＡＰＣＩ質量スペクトルである。
【図１７−２】（ｃ）は、２２０〜５００ｎｍの総吸光度スキャンでの検出による、フルオレセイン中の不純物Ｇのクロマトグラムであり、（ｄ）は、不純物ＧのピークのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルである。
【図１８】（ａ）は、５１．７５〜５１．８５分に抽出された不純物Ｈ−１のＨＰＬＣピークのＡＰＣＩ質量スペクトルであり、（ｂ）は、２２０〜５００ｎｍの総吸光度スキャンでの検出による、フルオレセイン中の不純物Ｈ−１のクロマトグラムである。
【図１９】（ａ）は、５２．６７〜５２．７９分に抽出された不純物Ｈ−２のＨＰＬＣピークのＡＰＣＩ質量スペクトルであり、（ｂ）は、２２０〜５００ｎｍの総吸光度スキャンでの検出による、フルオレセイン中の不純物Ｈ−２のクロマトグラムである。
【図２０】不純物Ｈ−２のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度スキャンである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
本明細書において使用される際、以下の略語および用語は、特別の定めのない限り以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００３４】
略語「ＡＰＣＩ」は、大気圧化学イオン化を意味する。
【００３５】
略語「Ｍ／Ｓ」または「ＭＳ」は、質量分析計を意味する。
【００３６】
略語「ＨＰＬＣ」は、高速液体クロマトグラフィーを意味する。
【００３７】
略語「ＵＶ−Ｖｉｓ」は、紫外可視を意味する。
【００３８】
略語「ＬＣ／ＭＳ」は、液体クロマトグラフィー／質量分析計を意味する。
【００３９】
「炭」という用語は、色度を減少させるのに有効な活性炭素剤を包含する。例示的な薬剤には、供給元Ｕｎｉｖａｒ  ＵＳＡ（米国テキサス州ダラス）から市販されている、Ｎｏｒｉｔ（登録商標）  ＳＡ  ＰｌｕｓおよびＮｏｒｉｔ（登録商標）  ＳＸ  Ｕｌｔｒａが含まれるが、これらに限定されない。色度を減少させることができる炭の形態は、通常の実験によって判断することができる（例えば、別の市販の炭の形態であるＤａｒｃｏ（登録商標）  ＫＢは、色度を減少させるのに有効でないことが判断されている）。
【００４０】
「色度（ｃｏｌｏｒ  ｎｕｍｂｅｒ）」という用語は、ｐＨ９．４の水酸化ナトリウムと重炭酸ナトリウムの水溶液中で調製したフルオレセイン原料１．０％溶液の、５９０ｎｍで測定した場合の吸光度である。
【００４１】
「フルオレセイン原体」および「フルオレセイン原料」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００４２】
「関連不純物質」という用語は、フルオレセインおよび／またはフルオレセイン反応物の合成不純物、異性体、酸化生成物、二量化生成物、および分解生成物を包含する。かかる関連不純物質の例示的構造は、図８に示す。
【００４３】
「ピリジンを実質的に含まない」という用語は、フルオレセイン組成物が少なくとも９９％ピリジンを含まないことを意味する。より好ましくは、分析純度が少なくとも９９．９％であり、さらに好ましくは、フルオレセイン組成物はピリジン全く含まない。
【００４４】
「実質的に純粋なフルオレセイン」という用語は、不純物、例えば関連不純物質などの完全な不在、あるいはほぼ完全な不在を指す。例えば、フルオレセイン組成物が実質的に純粋であるとされる場合、検出可能な関連不純物質が存在しないか、あるいは単一の関連不純物質が検出される場合、それが０．１重量％を上回らない量で存在し、または複数の関連不純物質が検出される場合、それらは全体で０．６重量％を上回らない量で存在する。
【００４５】
本発明のプロセスは、低い関連不純物質プロファイルを有するフルオレセイン生成物を生成する。精製されたフルオレセイン材料でさえ、低レベルのある不純物、例えばレゾルシノールおよび２−（２’，４’−ジヒドロキシベンゾイル）安息香酸などを含有しうることは一般的に知られている。しかしながら、フルオレセインの市販試料が、レゾルシノールおよび２−（２’，４’−ジヒドロキシベンゾイル）安息香酸に加え、いくつかの不純物を含有しうることはこれまでは知られていなかった。これらの潜在的不純物の量は、本発明のプロセスによって実質的に減少される。かかる不純物は、本明細書において、集合的に「関連不純物質」と称する。
【００４６】
このような関連不純物質の分子量をＬＣ／ＭＳによって判断するために実験を行なった。また、理論に縛られることは望まないが、これらの不純物の構造を本明細書において提示する（図８を参照）。精製されたフルオレセイン組成物中にさえ存在しうる低レベルの関連不純物質を分解し、定量化するためのプロセスを発見した。詳細は下記に記載する。本発明のプロセスが実質的に低下したレベルの関連不純物質を有する高度に精製されたフルオレセインを提供することを発見した。これは、下記の表１に示す本発明の精製されたフルオレセイン原体の不純物プロファイルにおいて、下記の表２に示す様々な製造業者からの工業グレードのフルオレセインの不純物プロファイル、および下記の表３〜５に示す様々な製造業者からのフルオレセイン原体の不純物プロファイルと比較して見ることができる。
【００４７】
【表１】
0005384363.tif 000002
【００４８】
【表２−１】
0005384363.tif 000003
【００４９】
【表２−２】
0005384363.tif 000004
【００５０】
【表３】
0005384363.tif 000005
【００５１】
【表４】
0005384363.tif 000006
【００５２】
【表５−１】
0005384363.tif 000007
【００５３】
【表５−２】
0005384363.tif 000008
本発明に関与する一般的プロセスの概要を下記に説明する。商用グレードのフルオレセインを還流温度で無水酢酸と反応させることによってジアセチル化する。そのように生成したジアセチル化フルオレセインを単離し、その後塩基と反応させて、脱アセチル化フルオレセインを生成し、これを次に炭で処理して、高純度かつ低塩化物含有量の低色フルオレセインを生成する。下記に反応スキームを示す。
【００５４】
【化１】
0005384363.tif 000009
本発明の純フルオレセインを調製するために使用する特定の溶媒、反応時間および温度、ならびにｐＨ値は、一連の実験に基づいて決定された。これらの実験の目標は、低色および低塩含有量を有する高純度の医薬品グレードのフルオレセインを得ること、また従来の既知の方法で使用される有害な溶媒、すなわちピリジンの使用を避けることであった。さらなる目標は、例えば、最低限の量の溶媒を用いることによって、あるいは必要なステップの反応サイクル時間を短縮することによって、プロセスに関わる費用と時間を最小限に抑えることであった。
【００５５】
フルオレセインを精製するプロセスは、フルオレセインをＯ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインに転化させることから始める。このために、無水酢酸を溶媒および試薬として使用し、従来技術のプロセスで使用される有害な溶媒、ピリジンの使用を完全に回避する。したがって、フルオレセインと無水酢酸との混合物を還流下で数時間攪拌し、得られた懸濁液を冷ます。凝固点またはそのすぐ下の温度までさらに冷却することにより、完全な結晶化が生じる。結晶化した物質を収集して、まず冷無水酢酸で、次に冷アセトンで洗浄する。次に、この物質を攪拌と穏やか加熱によってアセトン中に再懸濁する。冷却後、白色結晶性物質を収集し、冷アセトンで洗浄し、風乾して、高純度Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインを得る。
【００５６】
次に、このＯ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインを転化させてフルオレセインに戻し、ナトリウム塩を形成し、最終不純物を除去する。この転化をもたらすために、Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインのアセチル基を苛性溶液を用いて加水分解する。したがって、Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインおよびメタノールを好適な容器に入れ、調製した脱イオン水に水酸化ナトリウムを加えた溶液を添加し、混合物を攪拌しながら加熱還流する。次に混合物を冷却し、濾過助剤を用いて濾過し、その後メタノールで洗浄する。次に減圧蒸留によって濾液の容積を減らし、水を添加し、反応混合物を冷却する。次に反応混合物のｐＨを８．５〜８．７に調整する。好適な炭、例えばＮｏｒｉｔ（登録商標）  ＳＸ  Ｕｌｔｒａを添加し、１時間攪拌する。必要であれば、炭処理ステップを繰り返す。次に、重要な沈殿ステップが続く。まず、濾液にエタノールを添加して、エタノールと水を２：１の比率にする。この比率は、沈殿手段において、水に対するより高い比率の有機溶媒は、フルオレセイン生成物中により低い塩化物含有量をもたらすという予期せぬ発見に基づく。この作用を認識するために行なった実験は、下記にさらに記載する。次に、フルオレセインを酸性化するために、較正済みのｐＨ範囲を確立するように、希塩酸溶液を添加する。この範囲は、より低いｐＨがより望ましい色を有する生成物を提供するという予期せぬ発見に基づく。より具体的には、実験を通して、濾液の最適ｐＨ範囲は１．０〜２．５にすべきであり、酸性化は、生成物の凝集を避けるためにゆっくりと、例えば２〜４時間かけて、冷却しながら行なうべきであると判断した。さらなる攪拌および冷却後、フルオレセインを濾過によって単離する。生成物を水とエタノールとの溶液で洗浄し、生成物を乾燥させて、収率８０〜９０％の非常に高品質のフルオレセインを得る。この高純度フルオレセインは、注射用フルオレセインの調製に使用することができる。このために、フルオレセインを水酸化ナトリウムを用いて可溶性ジナトリウム塩の形態に転化し、アンプルに充填してから滅菌する。
【００５７】
本発明のプロセスを実現するために行なった実験法の一例は、フルオレセイン生成物が沈殿するｐＨ範囲の較正である。このｐＨ範囲は、形成された生成物の色のスペクトルに関する経験的観察に一部基づいて、高い範囲から低い範囲に調整した。したがって、低色生成物の目標を達成するためにフルオレセイン生成物を沈殿させるべき最適ｐＨ範囲は、約ｐＨ１．０〜約ｐＨ２．５であると判断した。
【００５８】
また、沈殿手段において、水性溶媒に対する有機溶媒のより高い比率は、フルオレセイン生成物中により低い塩化物含有量をもたらすことも、予期せずして発見された。この結果は、低い有機／水性比率は、塩化ナトリウムレベルを下げるために必要であろうと予想していたため、予期していなかった。より高比率の有機溶媒の使用は、濾過速度を向上させる付加的利点を有し、それによって材料を処理するのに要する時間が短縮される。
【００５９】
本発明のプロセスを開発するために、さらなる沈殿実験を行なったが、これは下記に記載し、また図１および２に示す。具体的には、下記の表６に示すように、沈殿プロセスを変更することによって塩化物レベルを下げるために実験を行なった。
【００６０】
【表６】
0005384363.tif 000010
表６は、沈殿媒体の溶媒比率の変更は、存在する塩化物の量に影響を及ぼすことを示している。具体的には、沈殿媒体中のエタノールの水に対する比率を上げると、より低い塩化物含有量が生じる。実験Ａは、水：エタノール（１：１）の沈殿媒体の容積を１０容積（基準）から１５容積に増加させた場合、塩化物含有量がわずかに減少することを示している（表６を参照）。実験Ｂは、水：エタノール（１：１、１０容積、基準）からの沈殿を水：エタノール（２：１、１５容積）からの沈殿と比較している。本実験の結果は直観に反したものであり、より低い水含有量およびより少ない容積を有する基準反応物が、より低い塩化物含有量をもたらしている。
【００６１】
実験Ｃは、水：エタノール（１：１、１０容積、基準）からの沈殿を水：エタノール（１：２、１５容積）からの沈殿と比較している。実験Ｃの結果は、より高い有機含有量の沈殿媒体は、より低い塩化物含有量を生じさせることを示している。
【００６２】
沈殿媒体中のより高い有機含有量がより低い塩化物含有量を生じさせる傾向は、実験Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ、ならびに実験Ｈ、Ｉ、Ｊ、およびＫにおいて、洗浄を行なっていない生成物と洗浄を行なった生成物の双方について再現している。結果は直観に反するように思われるが、理論に縛られることなく、より高い有機含有量は、生成物ケーキのより速くより効率的な洗浄を可能にすると考えられる。
【００６３】
検討した別の態様は、フルオレセインの色が、沈殿媒体のｐＨに依存しているかどうかである。下記の図７を参照（エタノール：水の比率が２：１の沈殿媒体を使用）。
【００６４】
【表７】
0005384363.tif 000011
結果は、フルオレセインの色がｐＨ変化に対して敏感であることを示している。例えば、ｐＨ約３．０では、生成物の外観は栗色の色調を呈し始めるが、これは望ましくないとみなされる。
【００６５】
下記の実施例１〜８は、本発明のある実施形態をさらに説明するために提供される。実施例５、６、７、および／または８から得られた代表的データは、図９〜１９に示す。
【００６６】
図９〜１４のデータは、ＨＰＬＣと連結したサーモスプレー質量分析計を用いたＬＣ／ＭＳによって得た。ピークは、ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）およびサーモスプレー質量分析計を使用して観察した。実験条件：器具＝Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｏｄｅｌ  ６００  ＭＳ  ＨＰＬＣシステムおよびＷａｔｅｒｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４８６ＭＳ  ＵＶ検出器（２８０ｎｍ）と連結した、Ｖｅｓｔｅｃ  Ｍｏｄｅｌ  ２０１Ｂサーモスプレー質量分析計；カラム＝Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ−８、５μ、３．９×１５０ｍｍ；移動相＝Ｂ０％からＢ１００％までを２５分間でプログラムした直線勾配；移動相Ａ＝０．１Ｍ酢酸アンモニウムを含む１０：９０（Ｖ：Ｖ）メタノール：水；移動相Ｂ＝０．１Ｍ酢酸アンモニウムを含むメタノール；流速＝１．０ｍＬ／分；試料濃度＝未希釈；注射量＝２０μＬ。
【００６７】
図１５〜２０のデータは、ＨＰＬＣと連結した質量分析計を用いたＬＣ／ＭＳによって得た。質量分析計は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）インターフェースとともに使用し、この質量分析計を正イオン検出モードで作動した。ピークは、２２０〜５００ｎｍの総吸光度をモニターするＵＶ−Ｖｉｓ検出器と質量分析計とを使用して観察した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ−８カラム（３．９×１５０ｍｍ）を流速０．６ｍＬ／分で使用し、移動相Ｂ０％から移動相Ｂ１００％までを３０分間でプログラムした。移動相Ｂは、０．０１Ｍ酢酸アンモニウムを含むメタノールとし、移動相Ａは、０．０１Ｍ酢酸アンモニウムを含む１０：９０／メタノール：水とした。
【実施例】
【００６８】
実施例１
フルオレセインジアセテートの形成
【００６９】
【化２】
0005384363.tif 000012
５リットルの三口丸底フラスコに、フルオレセイン（１０００ｇ、３．０１モル）および無水酢酸（１６２２ｇ、１５．９モル）を加えた。得られた混合物を還流下で３〜５時間攪拌し、得られた懸濁液を室温まで冷ました。継続して攪拌しながら、反応混合物を−５〜３℃までさらに冷却して、完全な結晶化を生じた。結晶化した物質をＢｕｃｈｎｅｒフィルター上に収集し、冷無水酢酸（２×５００ｍＬ）で洗浄し、次に冷アセトン（１×６００ｍＬ）で洗浄した。この物質を部分的に乾燥させ、攪拌と穏やかな加熱によってアセトン（１０００ｍＬ）中に再懸濁した。冷めたあと、白色結晶性物質をフィルター上に収集し、冷アセトン（２×７００ｍＬ）で洗浄し、風乾した。収率：約７５％〜８５％；ＴＬＣによる単一スポット；ＭＰ＝２０３〜２０５．５℃；純度９９．７％。
【００７０】
実施例２
ジアセチルフルオレセインからのフルオレセインの形成、ナトリウム塩の形成、および最終不純物の除去
【００７１】
【化３】
0005384363.tif 000013
Ｏ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセイン（１０００ｇ）およびメタノール（４０００ｍＬ）を好適な反応器に入れた。これとは別に、脱イオン水（６２０ｍＬ）に水酸化ナトリウム溶液（４８０ｇ、５０％苛性）を含む溶液を調製した。この水酸化ナトリウム溶液をＯ，Ｏ’−ジアセチルフルオレセインおよびメタノール含有の反応器に入れた。混合物を加熱還流し、還流下で９０分間攪拌した。反応混合物を２０℃〜２５℃まで冷却した。濾過助剤（１００ｇ）を用いてこの混合物を濾過し、その後メタノール（５００ｍＬ）で洗浄した。濾液（５０００ｍＬ）を減圧下で蒸留して残留量１４００ｍＬ〜１７００ｍＬにし、次に反応混合物を２０℃〜２５℃まで冷却した。脱イオン水（５０００ｍＬ）を蒸留濃縮物に添加した。これとは別に、脱イオン水（７２ｇ）に水酸化ナトリウム溶液（５６ｇ、５０％苛性）を含む溶液を調製した。調製したばかりの水酸化ナトリウム溶液（１００ｍＬ）を用いて、反応物のｐＨを８．５〜８．７に調整した。Ｎｏｒｉｔ  ＳＸ  Ｕｌｔｒａ（１００ｇ）、濾過助剤（１００ｇ）、および脱イオン水（５００ｍＬ）を反応物に室温で添加し、続いてその混合物を１時間攪拌した。このバッチを濾過し、さらにＮｏｒｉｔ  ＳＸ  Ｕｌｔｒａ（１００ｇ）および脱イオン水（５００ｍＬ）を室温で濾液に添加し、続いてその混合物を１時間攪拌した。このバッチを濾過し、脱イオン水（２０００ｍＬ）で洗浄した。エタノール（１００００ｍＬ）を濾液に添加した。これとは別に、脱イオン水（３２０ｍＬ）に塩酸（３２％、８２０ｇ）を溶解して塩酸溶液を調製した。この希酸性溶液を用いて、濾液のｐＨを１．０〜２．５に調整し、その間バッチの温度は２０℃〜２５℃に維持した。バッチを２０℃〜２５℃で１時間攪拌し、その後濾過によって単離した。溶液（注射用水：エタノール）：（３：１）、（２×１０００ｍＬ）でケーキを洗浄した。生成物を乾燥させ、典型的な収率８０〜９０％の非常に高品質のフルオレセインを得た。
【００７２】
実施例３
フルオレセイン原体の色強度
機器
１ｃｍセルに対応し、６６０ｎｍから５７０ｎｍまでをスキャンできる分光光度計。
【００７３】
６６０ｎｍから５７０ｎｍまでの波長に適した材料、例えば石英の分光光度計用セル（光路長１ｃｍ）。
【００７４】
フルオレセイン原体の色強度を下記のように測定した。ｐＨ９．４の水酸化ナトリウムと重炭酸ナトリウムの水溶液中で調製したフルオレセイン原料の１．０％溶液の色を判断するために、その５９０ｎｍでの吸収を測定することによる手段を用いた。この値は、「色度」とも称することができる。５９０ｎｍでの吸光度測定値の増加は、完成した製剤の目に見える色強度の増加に対応する。
【００７５】
フルオレセイン（２５０ｍｇ±５ｍｇ、正確に計量）および重炭酸ナトリウム（５０ｍｇ）を計量して、２５ｍＬビーカーに入れた。水酸化ナトリウム（１％、５ｍＬ）を加えた。溶液を攪拌しながら穏やかに加温した。全ての材料が溶解し、溶液が透明になるまで、水酸化ナトリウム（１％、さらに１ｍＬまで、合計６．０ｍＬ）を加えた。反応物を室温まで冷却した。必要であれば、１％水酸化ナトリウムを滴下して用い、ｐＨを９．４に調整した。ｐＨが９．４を上回る場合、溶液を廃棄し、より少ない水酸化ナトリウムを用いて再調製した。溶液をメスフラスコ（２５ｍＬ）に定量的に移動し、精製水を適量加えて２５．０ｍＬにした。最終濃度は、１０ｍｇ／ｍＬ、または１％とした。
【００７６】
方法
試料および参照セルキュベットに精製水でブランクのユーザーベースラインを確立し、６６０ｎｍから５７０ｎｍまでを１００ｎｍ／分でスキャンして、分光光度計をゼロに調節した。フルオレセイン溶液（１％）を試料キュベットに加えた。試料溶液を１００ｎｍ／分で６６０ｎｍから５７０ｎｍまでスキャンした。５９０ｎｍで吸光度の読み取り値を記録した。試料の個々のアリコートに二重測定を行なった。表１は、この方法を用いたいくつかのフルオレセイン原料試料試験の典型的な色度結果を記載している。結果は、下の項に示す方程式を用いて補正した。図３は、フルオレセイン原料試料から得られた典型的なスペクトルを示している。
【００７７】
計算
以下のように、吸光度読み取り値を試料濃度に対して補正した：
【００７８】
【数１】
0005384363.tif 000014
フルオレセイン試料ロットの色強度測定値は、実施例２に記載のように得た。これを下記の表８に記載する。
【００７９】
【表８】
0005384363.tif 000015
実施例４
電位差滴定法によるフルオレセイン残留塩化物の判定
機器
Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ７１６  ＤＭＳ  Ｔｉｔｒｉｎｏ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｔｉｔｒａｔｏｒまたは同等のもの
Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ７３０  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｈａｎｇｅｒおよび７５９  Ｓｗｉｎｇ  Ｈｅａｄ  ＡｕｔｏＳａｍｐｌｅｒまたは同等のもの
Ａｇ  Ｔｉｔｒｏｄｅ電極
５桁分析天秤または同等のもの
ソニケーター
ホットプレート
３，０００ｒｐｍが可能な遠心機
培養管、１６×１２５ｍｍ、ＶＷＲ  カタログ番号４７７２９−５７８または同等のもの
１６ｍｍ培養管用白色キャップ、ＶＷＲ  カタログ番号６０８２８−７６０または同等のもの
血清フィルター、６．×１６ｍｍ、ＶＷＲ  カタログ番号２８２９５−５５６または同等のもの。
【００８０】
以下の方法を用いて、硝酸銀電位差滴定法、自動滴定装置、および銀電極を使用して、フルオレセイン中の残留塩化物量を定量化した。
【００８１】
（１）試薬溶液調製、水酸化アンモニウム（５Ｎ）
濃水酸化アンモニウム（約３３８ｍＬ）を精製水（約６００ｍＬ）に添加して、精製水で１０００ｍＬに希釈した。銀電極をすすぎ、保存するために、この溶液を自動滴定装置に使用した。
【００８２】
（２）標準溶液調製、硝酸銀、０．１０Ｎ、水性
分析証明書を備える市販用に溶液として調製された０．１０Ｎ硝酸銀を使用することが好ましい。ただし、市販の認可された硝酸銀溶液が入手できない場合は、硝酸銀（１７．０ｇ）を計量して、精製水（１０００ｍＬ）に溶解し、標準としてもよい。塩化カリウム参照標準物質（乾燥、５０ｍｇ）を計量して、滴定用容器内で精製水（約３０ｍＬ）に溶解した。この溶液に硝酸（１ｍＬ）を加えた。この溶液を銀ビレット電極を用いて、電位差滴定によって滴定した。０．１０Ｎの硝酸銀１ｍＬが塩化カリウム７．４５５ｍｇに対応した。以下の方程式を用いて、硝酸銀の規定度を計算した：Ｎ  ＡｇＮＯ３＝（ＫＣｌｍｇ×ＫＣｌ純度）／（ＡｇＮＯ３ｍＬ×７４．５５）。
【００８３】
（３）試料調製および滴定
フルオレセイン原料（２ｇ）を計量して培養管（１６×１２５ｍｍ）に入れた。精製水（熱水、１０ｍＬ）を加えた。硝酸（１ｍＬ）を加えて、全管に栓をし、２分間振盪し、１５分間超音波処理した。全管を３０分間遠心分離した（約３，０００ｒｐｍ）。血清フィルターを用いて、沈殿剤を上澄みから分離した。溶液をデカントして滴定容器に入れた。精製水（１回分５ｍＬ）を用いて、血清をすすぎ、濾過した。すすぎ液を滴定容器に注入した。血清フィルターを除去して、廃棄した。２回目も上記の手段を繰り返すが、ただし全管に栓をして１分間振盪し、全管を２０分間遠心分離した（約３，０００ｒｐｍ）。１回目および２回目の抽出物からの溶液を混ぜ合わせ、血清フィルターを精製水ですすいだ。混ぜ合わせた溶液を０．１０Ｎ  ＡｇＮＯ３でその電位差滴定終点まで滴定した。滴定パラメータには、各試料のあとに洗浄サイクル（５Ｎ水酸化アンモニウム）およびすすぎサイクル（５Ｎ水酸化アンモニウム）を用いることが含まれる。パラメータの一覧は下記に示す。
【００８４】
（４）計算
【００８５】
【数２】
0005384363.tif 000016
Ｖ＝滴定した０．１０Ｎ  ＡｇＮＯ３の容積
Ｎ＝ＡｇＮＯ３滴定剤の規定度
３５．４５３＝塩化物の分子量
Ｗ＝例で使用したフルオレセインの重量
【００８６】
【表９】
0005384363.tif 000017
実施例５
この手段では、フルオレセイン原料の溶液をメタノール中で調製し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム、勾配移動相プログラミング、およびＣ−１８カラムを用いて、その関連物質から分離した。関連物質をフルオレセイン参照標準物質の１％溶液に対して定量化した。紫外線ＨＰＬＣ検出器を用いて、波長２８０ｎｍにおけるピーク反応を測定した。移動相Ａは、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム、１０％メタノール／９０％水、および０．５％酢酸である。移動相Ｂは、０．０１Ｍ酢酸アンモニウム、１００％メタノール、０．５％酢酸である。参照標準物質をメタノール中のフルオレセイン０．５ｍｇ／ｍＬ溶液とし、メタノール中に最終濃度０．００５ｍｇ／ｍＬまで希釈するか、あるいはフルオレセイン０．５ｍｇ／ｍＬの試料最終理論濃度１％を同様に調製した。ＨＰＬＣ  ＵＶ／ＶＩＳ検出器および２８０ｎｍをモニターする能力を備える、プログラムした勾配操作が可能な高速液体クロマトグラフィーシステムを用いた。カラム：３．９×１５０ｍｍ  Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ−１８カラム、５μｍ、（または同等のもの）フルオレセインに対し少なくとも２０，０００プレート／カラムが可能。流速：０．６ｍＬ／分。勾配プログラムは以下のとおりとした：
【表Ａ】
0005384363.tif 000018
【００８７】
ピーク面積を用いて、０．０２５％以上の既知および未知の不純物のパーセント濃度を下記の計算の項に示すように計算した。本方法の定量化の限界は０．０２５％であるが、不純物は通常は≧０．０５％の濃度で報告される。フルオレセインの分析で９つの不純物が見られ、それらの分子量をＬＣ／ＭＳによって判定した。それらの提示構造は、図８に示す。不純物Ｈは、２つのジアステレオマー、Ｈ−１およびＨ−２として見られた。このクロマトグラフ法を用いた本手段で例として挙げるフルオレセインのロット中で同定された不純物の典型的な相対保持時間（ＲＲＴ）、容量係数（ｋ’）、溶出時の勾配組成物（Ｂ％）は、以下のとおりである：
【表Ｂ】
0005384363.tif 000019
【００８８】
フルオレセインのクロマトグラムにおけるピークは、ピークの相対保持時間、容量係数、およびおおよその移動相組成物が、上記の挙げた関連物質に相当する場合、関連物質Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ−１、またはＨ−２として同定することができる。ただし、相対保持時間のそれぞれの値は、クロマトグラフシステムによっておよそ０．０２異なりうる。またクロマトグラフシステムの修正は、上記に挙げた値に影響を与えうる。不純物Ｂ、Ｃ、Ｅ、およびＧは、ここで検定した４つのフルオレセインロットにおいては同定されなかったが、先の供給元ＡのフルオレセインのＬＣ／ＭＳ分析は、不純物Ｂ、Ｃ、Ｅ、およびＧが、ＲＲＴ１．０９、１．１１、１．２０、および１．４４に近似したかもしれないことを示唆している。それぞれＲＲＴ１．１０および１．７４を有する２つの未知の不純物が、本文書において報告されるフルオレセイン原料の４つのロット中に存在した。これらの濃度は、０．０２５％〜０．０５％であった。ＲＲＴ＝１．１０における未知のピークが不純物ＢまたはＣのいずれかであった可能性がある。フルオレセイン原料試料のクロマトグラムは、図６に示す。ジアセチルフルオレセインは、フルオレセイン原体中で観察され、フルオレセインに対する保持時間１．３５において出現する。
【００８９】
レゾルシノールは、フルオレセインの既知の一般的な不純物である。レゾルシノールは、フルオレセインの合成において出発物質として使用され、潜在的な分解生成物である。レゾルシノールは、上記のようにＲＲＴ＝０．１４、ｋ’＝２．９、およびＢ％＝２４．６で溶出することがわかっている。レゾルシノールは、場合により、未分解の二重線として溶出するのが観察されうる。レゾルシノールを含有するフルオレセイン原体のクロマトグラムは、図７に示す。
【００９０】
あらゆる関連のないピーク（すなわち、溶媒先端、システムピーク）をレゾルシノールに加えて同定したが、以下の計算から省いた。レゾルシノールは、ＲＲＴ約０．１４で溶出した（図７を参照）。それぞれの関連物質のパーセント濃度は、下記に示すとおり計算した。
【００９１】
【数３】
0005384363.tif 000020
濃度０．０２５％以上の不純物を合計することによって不純物の合計を計算する。
以下の式に従って保持比を計算する：
【００９２】
【数４】
0005384363.tif 000021
本方法の定量化の限界は、フルオレセイン０．１２７μｇ／ｍＬとして定めた（試料調製濃度０．０２５％）。検出の限界は、フルオレセイン０．０５μｇ／ｍＬと決定した（試料調製濃度０．０１％）。
【００９３】
供給元Ａのフルオレセイン原料の４ロットを本方法を用いて分析した。７つの不純物を検出し、５つの不純物（Ａ、Ｄ、Ｆ、Ｈ−１、およびＨ−２）を同定した。報告できる不純物（≧０．０２５％）の合計パーセントは、０．２％〜０．７％の範囲であった。結果は下記の表１０に記載する。
【００９４】
本手段の代替として、試料および標準物質の調製物用の希釈液を変更して、レゾルシノールとその他の関連不純物質との同時分析を可能にする。希釈液を調製するために、まず酢酸アンモニウム０．７７ｇを水１０００ｍＬに溶解して、酢酸を用いてｐＨを３．９に調整し、その後同量の酢酸アンモニウム緩衝液とメタノールとを加える。最初に１５ｍＬに対して５０ｍｇの比率でフルオレセインをメタノールに溶解したあと、この希釈液をメタノールの代わりに使用して、実施例５に記載の手段と同様に標準物質および試料を希釈し、ブランクもメタノールから希釈液に変更する。フルオレセインの標準物質と試料の調整物は、希釈液での希釈後、光から保護する。レゾルシノールとフタル酸との典型的な相対保持時間（ＲＲＴ）は、以下のとおりである：
【表Ｃ】
0005384363.tif 000022
【００９５】
ＲＲＦ（相対感度係数）を不純物の計算に追加してもよい（ＲＲＦは、フルオレセインに対する反応を表わす）。
【表Ｄ】
0005384363.tif 000023
【００９６】
１不純物Ｄ、Ｆ、Ｈ−１、およびＨ２の相対感度係数は決定されていない。それらの相対感度係数は、１．０と仮定される。
【００９７】
各関連物質のパーセント濃度は、下記のように計算することができる：
【００９８】
【数５】
0005384363.tif 000024
【００９９】
【表１０】
0005384363.tif 000025
実施例６
フルオレセイン関連不純物質の独自性を判断するために、研究を実施した。フルオレセインの試料を不純物の存在および濃度について分析した。高速液体クロマトグラフィー／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）によって、同定分析を実施した。
【０１００】
ＬＣ／ＭＳシステムによる代表的ＨＰＬＣクロマトグラムを図９に再現する。フルオレセインは、クロマトグラム中に主要ピークを表わした。図１０（ｂ）に示すフルオレセインのサーモスプレー質量スペクトルは、分子量３３２と一致する、ｍ／ｚ３３３におけるＭ＋Ｈ分子イオンを表わした。
【０１０１】
図１１（ｂ）に示すように、不純物Ａのサーモスプレー質量スペクトルは、ｍ／ｚ２５９にＭ＋Ｈ分子イオンを表わし、分子量２５８を示した。図８に提示する不純物Ａ［２−（２’，４’−ジヒドロキシベンゾイル）安息香酸］の構造は、フルオレセイン調製物中の不純物として以前に報告されている。
【０１０２】
図１２（ｂ）に示すように、不純物Ｂのサーモスプレー質量スペクトルは、ｍ／ｚ２８５にＭ＋Ｈ分子イオンを表わし、分子量２８４を示唆している。分子量２８４は、成分式Ｃ１５Ｈ８Ｏ６、Ｃ１６Ｈ１２Ｏ５、またはＣ１７Ｈ１８Ｏ４に相当しうる。図８に示す不純物Ｂの提示構造は、レゾルシノールのコハク酸との反応から生じうる（フルオレセインのフタル酸前駆体中の不純物として）。
【０１０３】
図１３（ｂ）に示すように、不純物Ｃのサーモスプレー質量スペクトルは、ｍ／ｚ３４７にＭ＋Ｈ分子イオンを表わす。これは、分子量３４６を表わし、フルオレセインから１４質量単位の増加に相当する。
【０１０４】
図１４（ｂ）に示すように、不純物Ｄのサーモスプレー質量スペクトルもｍ／ｚ３４７にＭ＋Ｈ分子イオンを表わすが、これは不純物Ｃの異性体と思われる。不純物ＣおよびＤについて提示される構造は、互いに互変異性体であり、双方ともフルオレセインのキニーネ型酸化生成物である。
【０１０５】
図１５（ｂ）に示すように、不純物ＥのＡＰＣＩは、ｍ／ｚ３３３にＭ＋Ｈ分子イオンを表わして分子量３３２を示し、また４９２ｎｍにＵＶｍａｘを有するＵＶスペクトル表わした。したがって、不純物Ｅは、フルオレセインの位置異性体でありえると思われる。
【０１０６】
図１６（ｂ）に示すように、不純物ＦのＡＰＣＩは、ｍ／ｚ４２５にＭ＋Ｈ分子イオンを表わして分子量４２４を示し、４００ｎｍを上回るＵＶｍａｘを生じた。スペクトルは、親化合物に加えられた追加レゾルシノール分子と一致すると思われる。したがって、化合物Ｆは、３つのレゾルシノールから形成しうる一方、親化合物は、２つのレゾルシノールから形成しうる。
【０１０７】
図１７（ｂ）に示すように、不純物ＧのＡＰＣＩは、ｍ／ｚ３７５にＭ＋Ｈ分子イオンを表わして分子量３７４を示し、４８４ｎｍにＵＶｍａｘを表わした。スペクトルと親油性の双方は、フルオレセインの酢酸エステルと一致すると思われた。
【０１０８】
図１８（ａ）および１９（ａ）に示すように、不純物Ｈ−１およびＨ−２のＡＰＣＩは、両化合物についてｍ／ｚ７３９にＭ＋Ｈ分子イオンを表わして、それぞれについて分子量７３８を示唆した。両化合物のＵＶ−Ｖｉｓ吸光度スペクトルは同様であり、２３３ｎｍにＵＶｍａｘを有し、４６２および４８８ｎｍに比較的弱い吸収極大を有した。不純物Ｈ−２の吸光度スペクトルは、図２０に示す。
【０１０９】
実施例７
注射用フルオレセイン、またはＦｌｕｏｒｅｓｃｉｔｅ  ２５％の調製
配合槽内の必要とされる注射用水の６０％に、必要量の水酸化ナトリウムを溶解して、計量した。フルオレセインを加えて、溶解した。溶解するために必要な場合、追加の注射用水を加えたが、容積は総容積の９０％を上回らないようにした。フルオレセインが３０分攪拌後に完全に溶解しない場合、次のステップに進んでｐＨを調整した。ｐＨは９．４に調整したが、これは水酸化ナトリウム３Ｎおよび／または塩酸ＩＮで行なった。混合物を１８０Ｒ．Ｐ．Ｍで３０分間攪拌した。ｐＨを再確認した。９．３を下回る、または９．５を上回る場合、水酸化ナトリウム３Ｎおよび／または塩酸ＩＮでｐＨを９．４に再調整した。フルオレセインナトリウム溶液に注射用水を追加して所定の容積にし、１５分間攪拌した。ｐＨを上記のように再確認した。窒素槽を用いて、膜孔サイズ５ミクロン、０．８ミクロン、および０．４５ミクロンの３枚の連続するメンブレンフィルターを通して溶液を加圧濾過して、滅菌充填槽に入れた。生成物のｐＨを上記の手段を用いて再確認した。試料を実験室試験用に無菌的に取り出した。生成物をあらかじめ滅菌したアンプルに充填した。各アンプルには、２．１５〜２．２５ｍＬを加えた。充填直後に、標準方法で試料をチップシールまたはプルシールした。各アンプルのシールは、滅菌の際に試験した。アンプルを高圧蒸気殺菌法によって１２１℃でバッチサイズに応じて２０分間以上滅菌した。漏れを慎重に検査した。最適な光条件下で、各アンプルに粒状物質が存在しないか個々に検査した。
【０１１０】
実施例８
注射用フルオレセイン、またはＦｌｕｏｒｅｓｃｉｔｅ  １０％の調製
注射用フルオレセインを調製するための代替手段として、好適なステンレススチール槽に、冷注射用水（およそ３０℃）のバッチ量のおよそ７０％〜７５％を加えた。フルオレセインを加え、懸濁液が完成するまで混合した。初期ｐＨを記録した。十分な量（総容積のおよそ７．５％）の７Ｎ水酸化ナトリウムを加え、その後追加量の７Ｎ水酸化ナトリウムを、追加ごとにおよそ１５分間待ったあとにｐＨ値を確認しながら、ｐＨ９．４を目標に、ｐＨが９．３〜９．５になるまで加えた。ｐＨが９．５を上回る場合、ｐＨ範囲９．３〜９．５を達成するために、ＩＮ塩酸を加えてｐＨを調整した。このｐＨ範囲に達したあと、混合を１５分以上継続した。バッチを注射用水で最終重量にし、３０分以上混合した。ｐＨを試験して、必要に応じて水酸化ナトリウムまたは塩酸で調整した。生成物を無菌的に滅菌バイアルに充填し、標準実施手段に従ってさらなる検査および試験を行なった。
【０１１１】
本明細書において強調される特定の実施形態は、本発明の全ての実施形態の列挙するものではない。また、当業者は、通常の実験法を用いるだけで、本発明の実施形態の多数の同等物を認識する、あるいは解明することができるであろう。かかる同等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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