(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シゲラに対する免疫反応を起こすのに効果的な量の配列番号２のシゲラタンパク質ＩｃｓＰ２又は配列番号４のＳｉｇＡ２タンパク質、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、シゲラに対し哺乳動物を免疫させるためのワクチン組成物。
【請求項２】
シゲラに対する免疫反応を起こすのに効果的な量の配列番号２のシゲラタンパク質ＩｃｓＰ２、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、シゲラに対し哺乳動物を免疫させるためのワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＩｃｓＰ２タンパク質は、破傷風毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌毒素Ｂサブユニットおよびフラジェリンでなる群から選択される担体タンパク質に化学的に接合されている請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
シゲラに対する免疫反応を起こすのに効果的な量の配列番号４のシゲラＳｉｇＡ２、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、シゲラに対し哺乳動物を免疫させるためのワクチン組成物。
【請求項５】
前記ＩｃｓＰ２タンパク質は、配列番号２のＩｃｓＰ２の配列をコーディングするポリヌクレオチドと、破傷風毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌毒素Ｂサブユニット及びフラジェリンからなる群から選択される担体タンパク質の配列をコーディングするポリヌクレオチドとの遺伝子融合の翻訳産物である請求項２に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記ＳｉｇＡ２タンパク質は、破傷風毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌毒素Ｂサブユニット及びフラジェリンからなる群から選択される担体タンパク質に化学的に接合されている請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＳｉｇＡ２タンパク質は、破傷風毒素、ジフテリア毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌毒素Ｂサブユニット及びフラジェリンからなる群から選択される担体タンパク質と、前記配列番号４のＳｉｇＡ２タンパク質とが遺伝子工学的に融合された生成物である請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
さらにアジュバントを含む請求項１〜請求項７の何れか一項に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
さらにアジュバントを含み、前記アジュバントは、油中水型エマルジョン及びダブルオイルでなる群から選択されるエマルジョンのオイル相である請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号４のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０に記載のポリペプチドをコーディングする単離された核酸。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリペプチドをコーディングする単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のポリペプチドをコーディングする単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１２〜１４の何れか一項に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１６】
バクテリアベクター、ウイルスベクター、バクテリオファージ、酵母ベクター、ウイルス−類似粒子及びプラスミドＤＮＡでなる群から選択される請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１８】
タンパク質発現に適した条件下で請求項１７の宿主細胞を培養する段階、及び前記ポリペプチドを収集する段階を含む、配列番号２のシゲラＩｃｓＰ２ポリペプチド及び配列番号４のＳｉｇＡ２ポリペプチドの製造方法。
【請求項１９】
（ａ）配列番号２のシゲラＩｃｓＰ２及び配列番号４のＳｉｇＡ２、及び（ｂ）アジュバントを含む免疫性組成物であって、前記（ａ）及び（ｂ）の量は組み合わせてシゲラに対する免疫反応を起こすのに効果的な免疫性組成物。
【請求項２０】
請求項３に記載のシゲラＩｃｓＰ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２１】
請求項７に記載のＳｉｇＡ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項２２】
前記抗体は、さらに酵素、フルオロクロム、レクチン、炭水化物、ビオチン、アビジン、放射性同位元素、毒素及び重金属でなる群から選択される標識を含む請求項２０又は２１に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号２のシゲラＩｃｓＰ２タンパク質又は配列番号４のＳｉｇＡ２タンパク質に共有結合されたシゲラバクテリアのＯ抗原からなるポリサッカライドでなる接合体分子。
【請求項２４】
請求項１０又は１１に記載のポリペプチドに共有結合されたシゲラバクテリアのＯ抗原からなるサッカライドを含む接合体分子。
【請求項２５】
疫痢に対し免疫が必要な哺乳動物を免疫させるための請求項２３又は２４に記載の接合体分子を含むワクチン。
【請求項２６】
サルモネラチフィＶｉポリサッカライド又はサルモネラパラチフィポリサッカライドを含む接合体分子であって、前記ポリサッカライドは配列番号２のシゲラＩｃｓＰ２又は配列番号４のＳｉｇＡ２タンパク質に共有結合されている接合体分子。
【請求項２７】
サルモネラチフィＶｉポリサッカライド又はサルモネラパラチフィポリサッカライドを含む接合体分子であって、前記ポリサッカライドは請求項１０又は１１に記載のポリペプチドに共有結合されている接合体分子。
【請求項２８】
疫痢及び請求項２６又は２７に記載のポリサッカライドを発現する病原体によりもたらされる腸チフスに対し、免疫が必要な哺乳動物を免疫させるための請求項２３又は２４に記載の接合体分子を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【先の出願への相互参照】
【０００１】
本発明は、その全体が引用により本発明に含まれている２００８年１０月２１日付で出願された米国仮特許出願第６１／１０７，３０６号に対し３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９による優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、シゲラ種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．）及び大腸菌腸管浸透性菌株にも存在する新規のタンパク質抗原、及び前記抗原をシゲラ種及び血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）によりもたらされる疫痢（ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ）及び腸管浸透性大腸菌（ＥＩＥＣ，  ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｅ．  ｃｏｌｉ）バクテリアによりもたらされる疾患に対するワクチンを開発するのに用いる方法に関する。本発明はさらに、疫痢の診断及びシゲラバクテリアの同定のための前記新規の抗原及び当該抗体の用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
シゲラ種は、結腸（ｃｏｌｏｎ）の上皮細胞を感染させることにより、人間において細菌性赤痢（ｂａｃｉｌｌａｒｙ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ）をもたらすグラム陰性のバクテリア病原体である。シゲラは、１次的に腸の上皮細胞（ＩＥＣ、Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ）を感染させる。シゲラは、食菌作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）を介し宿主細胞内にバクテリアの吸収を誘導するエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）を運ぶためのメカニズムを提供する幾種類のタンパク質を発現する。前記エフェクターの感染を達成するため、シゲラは類型ＩＩＩ分泌（ＴＴＳ、ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）システムを用いて上皮細胞内への進入を誘導し、感染した大食細胞の死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を触発させる。
【０００４】
シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓ．  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シゲラ・フレックスネリ（Ｓ．  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ボイディ（Ｓ．  ｂｏｙｄｉｉ）及びシゲラ・ソンネイ（Ｓ．  ｓｏｎｎｅｉ）を含むシゲラ種のバクテリアは、人間において発展途上国で年間百万人の死亡原因（殆どが子供である）になる結腸上皮の破壊により特定される疾患である疫痢の原因になる。
【０００５】
シゲラ・ディセンテリアエには１５種の血清型があり、シゲラ・フレックスネリでは１４種の血清型及び亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が認識されており、シゲラ・ボイディは２０種の血清型を有し、シゲラ・ソンネイには一つの血清型が存在するが、これらの出現率（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ）は均一に分布されていない。先進国で最も一般的であり、一部のラテンアメリカ国家で出現率が増加するシゲラ種は、シゲラ・ソンネイである。志賀毒素（Ｓｈｉｇａ−ｔｏｘｉｎ）を生成することのできるシゲラ・ディセンテリアエタイプ１は、高い疾病率及び死亡率をもたらし得る。シゲラ・フレックスネリは発展途上国の風土病領域（ｅｎｄｅｍｉｃ  ｒｅｇｉｏｎ）で最も一般的である。世界保健機関（ＷＨＯ）は発展途上国のため疫痢に対するワクチンの開発を最優先と看做した。
【０００６】
抗生剤を利用して疫痢の発生を調節及び治療するのが可能であるが、抗体の高い価格、及び甚だしくは最も最近の抗体に対しても抗体抵抗性シゲラ種が絶えず出現することは、世界の発展途上区域でシゲラ及び関連腸管浸透性大腸菌疾患の調節を助ける効果的なワクチンに対する必要性を強調している（１２）。
【０００７】
成功的な感染を確立するため、シゲラは宿主の免疫反応、特に炎症を引き起こす反応を細密に調節する。サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）と対照的に、シゲラは極性化された（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）腸の上皮細胞の頂極（ａｐｉｃａｌ  ｐｏｌｅ）を浸透するには効果的でない。その代わりに、シゲラは上皮障壁を破壊するため多形核白血球（ＰＭＮ、ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）の移動を要し、上皮細胞の側底極（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｐｏｌｅ）を通じた細胞の浸透を促進させる（２６）。先天性免疫システムの細胞により促進される宿主の炎症反応はＰＭＮを炎症部位に引き込む。したがって、シゲルラによる細胞浸透のためには、感染の初期段階に炎症を触発させることが求められる。細胞の細胞内区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に到達するバクテリアは細胞から細胞へ成長及び拡散され、宿主の免疫防御から保護される。しかし、感染した上皮細胞は、炎症過程でバクテリアの浸透を検出する監視者（ｓｅｎｔｉｎｅｌ）、及び特に粘膜性炎症を開始及び組織するサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）及びケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）のような媒介者（ｍｅｄｉａｔｏｒ）の主な供給源として大きな役割を果たす。上皮細胞によるバクテリアの認識は、本質的に微生物モチーフ（ｍｏｔｉｆ）であるペプチドグリカンを感知する細胞内分子であるＮｏｄ１／ＣＡＲＤ４を介し細胞内で生じる（８）。Ｎｏｄ１の活性はインターロイキン８（ＩＬ−８）のようなケモカインの発現を誘導するＮＦ−κＢ及びｃ−Ｊｕｎ  Ｎ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）を誘導する他の炎症促進性の信号経路を誘導する。したがって、過度な炎症を触発させることは宿主でのシゲラの生存に害となる。
【０００８】
自然的なシゲラ感染は免疫を与え、以後の同質的な毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｔ）シゲラの感染に対する保護を提供する（５）。このような排他的な人間疾病は、感染した患者からの糞口経路を介し直接的に、又は汚染した食べ物及び水を介し間接的に伝染される。これは１００匹ほどの少ない微生物でも伝染され得る非常に伝染性のある感染である（６）。力学的研究及び志願者研究から、シゲラに対する保護免疫はＬＰＳ又はＯ−特異的抗原に対するものであり、したがって、血清型と関連があることを明らかにした。生きている弱毒化されたシゲラ（１６、２２）、死んだシゲラ全体バクテリア（１８）、及びプロテオソーム（２４）、破傷風毒素（２５）及びリボソーム（３１）のような担体に接合されたシゲラ・リポポリサッカライド（ＬＰＳ、ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）又はＯ−ポリサッカライドを用いることを含むシゲラワクチンのための多くの接近法が用いられてきた。数年間の広範な研究にも拘わらず、前記シゲラ種等に対する効果的且つ廉価なワクチンは未だ利用可能ではない。
【０００９】
経口用生菌ワクチンとして弱毒化されたシゲラ菌株を用いれば保護効能が誘導されるものと表れた。遺伝的によく特性化された浸透性シゲラワクチンの臨床試験結果は有望である。経口投与されたＣＶＤ１２０８、ＳＣ６０２、ＷＲＳＳ１及びＷＲＳｄ１ワクチン候補者は志願者試験で安全で免疫性があり、ＳＣ６０２の場合は疫痢に対し保護するものと表れた（１１、１６、１７、３３）。ＣＶＤ１２０８を利用した臨床試験は、一部シゲラ生菌ワクチンを利用するとき見られる微熱及び下痢症候（ｓｙｍｐｔｏｍ）がワクチン菌株からｓｅｎ及びｓｅｔ遺伝子を除去することにより減少され得ることを見せている。一つの血清型から他の血清型への重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）との成功的な戦略は進行中の研究分野であるが、結局は殆どのシゲラに対し保護することのできる相違する血清型のシゲラ菌株の多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）混合物を用いることを求めるはずである（２１）。６個のアジア国家におけりシゲラ下痢の最近のマルチセンター研究は、患者から単離されたシゲラ種の相対的な分布が相違する国家及び位置で多様であるとのことを見せている。さらに、シゲラ・フレックスネリ血清型は位置ごとに、甚だしくは毎年その分布が非常に異質的であった。シゲラ種及び血清型の異質的な分布は、世界的に疫痢を防止するためには多価の又は交差−保護性シゲラワクチンが必要であることを提示する（３５）。広いスペクトルのカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を与えるための目的のワクチンは、全ての重要なシゲラ血清型を含ませることを必要とするはずである（２１）。このようなジレンマを解消するため、シゲラ・フレックスネリ２ａ、３ａ及び６菌株とともに弱毒化されたシゲラ・ソンネイ及びシゲラ・ディセンテリアエ１菌株を含む「５価の剤形」の利用に基づくワクチン戦略が支持されてきた（Ｎｏｒｉｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）。他の一方で、例えば死んだ又は生きている弱毒化された全体バクテリアのようなシゲラ由来の血清型−特異的及び交差−反応性抗原を含む複雑な構造を利用することは、シゲラの最も共通的な種及び血清型によりもたらされる感染に対しワクチン化するための接近法として看做され得た。Ｉｐａタンパク質及びＬＰＳからなり、シゲラ水抽出物由来の精製された複合体である、鼻腔内に投与されたＩｎｖａｐｌｅｘが提示されてきており、現在ウォルターリード陸軍研究所（ＷＲＡＩＲ、Ｗａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄ  Ａｒｍｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で第１相試験中である（２３）。
【００１０】
したがって、世界の発展途上区域におけるシゲラ及び関連腸管浸透性大腸菌疾患の調節を助けるための効果的なワクチンに対する必要性がある。
【発明の概要】
【００１１】
ある具現例で、本発明は、シゲラに対する免疫反応を起こすのに効果的な量のＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２でなる群から選択されるシゲラタンパク質、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含むシゲラに対し、哺乳動物を免疫させるためのワクチン組成物に関する。ある具現例で、前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２タンパク質は、他のタンパク質と化学的に接合されるか遺伝工学的に融合されている。
【００１２】
追加具現例で、本発明は、シゲラに対し免疫反応を起こすのに効果的な量のシゲラＩｃｓＰ２、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含むシゲラに対し、哺乳動物を免疫させるためのワクチン組成物に関する。
【００１３】
他の追加具現例で、本発明は、シゲラに対し免疫反応を起こすのに効果的な量のシゲラＳｉｇＡ２、及び薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含むシゲラに対し、哺乳動物を免疫させるためのワクチン組成物に関する。
【００１４】
他の追加具現例で、本発明は、化学的に接合されるか遺伝工学的に融合されたＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２を一定量含むシゲラに対し、哺乳動物を免疫させるためのワクチン組成物に関する。
【００１５】
ある具現例で、前記ワクチン組成物はアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含む。
【００１６】
ある具現例で、前記アジュバントは油中水型エマルジョン（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）及びダブルオイル（ｄｏｕｂｌｅ  ｏｉｌ）エマルジョンでなる群から選択されるエマルジョンのオイル相（ｏｉｌ  ｐｈａｓｅ）である。
【００１７】
追加具現例で、本発明は、配列番号２で記載されるアミノ酸配列（シゲラＩｃｓＰ２の場合）を含む単離されたポリペプチドに関する。
【００１８】
追加具現例で、本発明は、配列番号４で記載されるアミノ酸配列（ＳｉｇＡ２の場合）を含む単離されたポリペプチドに関する。
【００１９】
追加具現例で、本発明は、前記シゲラＩｃｓＰ２ポリペプチドをコーディングする単離された核酸配列に関する。
【００２０】
追加具現例で、本発明は前記ＳｉｇＡ２ポリペプチドをコーディングする単離された核酸配列に関する。
【００２１】
追加具現例で、本発明は、シゲラＩｃｓＰ２ポリペプチド及びＳｉｇＡ２ポリペプチドをコーディングする単離された核酸配列に関する。
【００２２】
追加具現例で、本発明は、請求項８、９又は１０の核酸配列を含むベクターに関する。追加具現例で、本発明は、本発明に開示された任意のベクターで伝達感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した宿主細胞に関する。
【００２３】
追加具現例で、本発明は、タンパク質発現のため適した条件下で本発明で開示された任意の宿主細胞を培養する段階、及び前記培養された細胞から前記ポリペプチドを収集する段階を含むシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２ポリペプチドの製造方法に関する。
【００２４】
追加具現例で、本発明は、（ａ）シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２、及び（ｂ）アジュバントを含む免疫性組成物に関するものであって、前記（ａ）及び（ｂ）の量は組み合わせてシゲラに対する免疫反応を起こすのに効果的である。
【００２５】
追加具現例で、本発明は、本発明に開示されたワクチン組成物を効果量で投与する段階を含む、病原性感染を病むか病原性感染に敏感な哺乳動物を治療する方法に関する。ある具現例で、前記ワクチン組成物の効果量は大凡１０μｇ〜大凡２ｍｇの間の範囲である。
【００２６】
追加具現例で、本発明は、本発明に開示されたワクチン組成物のうち何れか一つを効果量で投与する段階を含む、哺乳動物の免疫反応を調節する方法に関する。ある具現例で、前記ワクチン組成物の効果量は大凡１０μｇ〜大凡２ｍｇである。
【００２７】
追加具現例で、本発明は、シゲラＩｃｓＰ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。
【００２８】
追加具現例で、本発明はＳｉｇＡ２ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。ある具現例で、前記抗体は標識（ｌａｂｅｌ）をさらに含む。追加具現例で、前記標識は酵素、タンパク質、ペプチド、抗原、抗体、レクチン、炭水化物、ビオチン、アビジン、放射性同位元素、毒素及び重金属でなる群から選択される。追加具現例で、前記抗体は人間化抗体である。追加具現例で、前記抗体はＣＤＲ−グラフト抗体である。追加具現例で、前記抗体はキメラ抗体である。追加具現例で、前記抗体は抗体切片である。追加具現例で、前記抗体はモノクローナル抗体である。追加具現例で、前記抗体はポリクローナル抗体である。
【００２９】
追加具現例で、本発明はシゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２タンパク質に共有結合されたシゲラバクテリアのＯ抗原を含むサッカライドを含む接合体分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に関する。
【００３０】
追加具現例で、本発明は、本発明で開示されたもののようなポリペプチドに共有結合されたシゲラバクテリアのＯ抗原を含むサッカライドを含む接合体分子に関する。
【００３１】
追加具現例で、本発明は、疫痢に対し哺乳動物を免疫させるため、本発明に開示されたもののような接合体分子を含むワクチンに関する。
【００３２】
追加具現例で、本発明は、シゲラ属と係わりのないバクテリア由来のサッカライドを含む接合体分子に関するものであって、前記サッカライドはシゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２タンパク質に共有結合される。
【００３３】
追加具現例で、本発明は、シゲラ属と係わりのないバクテリア由来のサッカライドを含む接合体分子に関するものであって、前記サッカライドは本発明に開示されたもののようなポリペプチドに共有結合される。
【００３４】
追加具現例で、本発明は、疫痢及び腸チフス疾患に対し哺乳動物を免疫させるため、本発明に開示されたもののような接合体分子を含むワクチンに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＩｃｓＰ２を利用した免疫が、シゲラ・フレックスネリ２ａを利用した肺チャレンジに対し動物を保護するとのことを示す図である。前記結果はさらに、弱毒化されたシゲラ・フレックスネリ生菌ワクチン菌株（ＳＣ６０２）を鼻腔内に投与すれば、チャレンジに対しマウスを保護するとのことを示す。
【図２】ＩｃｓＰ２を利用した粘膜性免疫が、独特な（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）血清型のシゲラ・フレックスネリにより誘導された肺炎に対しマウスを保護するとのことを示す図である。
【図３】ＩｃｓＰ２を利用した粘膜性免疫が、独特な血清型のシゲラ・ディセンテリアエタイプ１により誘導された肺炎に対しマウスを保護するとのことを示す図である。
【図４】ＳｉｇＡ２を利用した粘膜性免疫は、シゲラ・フレックスネリ２ａ（２４５７Ｔ）チャレンジに対しては保護するが、シゲラ・フレックスネリ５ａ（Ｍ９０Ｔ）に対しは保護しないとのことを示す図である。
【図５】ＳｉｇＡ２又はＩｃｓＰ２と共にＣＴアジュバントを粘膜に投与すれば、血清抗体反応を誘導するとのことを示す図である。
【図６Ａ】ＳｉｇＡ２を利用して免疫された動物が、脾臓（図６Ａ）及び肺（図６Ｂ）全てで、ＩｇＡ−及びＩｇＧ−ＡＳＣ反応が優勢に増加するとのことを示すグラフである。
【図６Ｂ】ＳｉｇＡ２を利用して免疫された動物が、脾臓（図６Ａ）及び肺（図６Ｂ）全てで、ＩｇＡ−及びＩｇＧ−ＡＳＣ反応が優勢に増加するとのことを示すグラフである。
【図７】ＳｉｇＡ２を利用した全身性（ｉ．ｐ．）及び粘膜性（ｉ．ｎ．）免疫が、肺及び脾臓で抗体反応を誘導するとのことを示すグラフである。
【図８】マウス抗血清によりシゲラ菌株内のＳｉｇＡ２タンパク質が認識されると、ＳｉｇＡ２タンパク質に対し誘発するとのことを示す図である。
【図９Ａ】ＳｉｇＡ２に対するテスト抗血清が、シゲラ・フレックスネリにより誘導されたプラック（ｐｌａｑｕｅ）の形成を抑制するとのことを示す図である。
【図９Ｂ】ＳｉｇＡ２に対するテスト抗血清が、シゲラ・フレックスネリにより誘導されたプラック（ｐｌａｑｕｅ）の形成を抑制するとのことを示す図である。
【図１０】シゲラ種のそれぞれの血清型でのｓｉｇＡ遺伝子及びｉｃｓＰ遺伝子の存在を示すゲル写真である。
【図１１】ＳｉｇＡ２に対する抗体が、シゲラ・フレックスネリ２ａによる角結膜炎を抑制することを示す図である。
【図１２】ＩｃｓＰ２切片のＤＮＡ配列及び全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）ＩｃｓＰ配列内のその位置を示す図である。前記ＩｃｓＰ２切片は、シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ菌株の全体ゲノム配列の全長ｉｃｓＰ遺伝子から抽出された。
【図１３Ａ】ＳｉｇＡ２切片のＤＮＡ配列及び全長ＳｉｇＡ配列内のその位置を示す図である。前記ＳｉｇＡ２切片は、シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ菌株の全体ゲノム配列の全長ｓｉｇＡ遺伝子から抽出された。
【図１３Ｂ】ＳｉｇＡ２切片のＤＮＡ配列及び全長ＳｉｇＡ配列内のその位置を示す図である。前記ＳｉｇＡ２切片は、シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ菌株の全体ゲノム配列の全長ｓｉｇＡ遺伝子から抽出された。
【図１３Ｃ】ＳｉｇＡ２切片のＤＮＡ配列及び全長ＳｉｇＡ配列内のその位置を示す図である。前記ＳｉｇＡ２切片は、シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ菌株の全体ゲノム配列の全長ｓｉｇＡ遺伝子から抽出された。
【図１３Ｄ】ＳｉｇＡ２切片のＤＮＡ配列及び全長ＳｉｇＡ配列内のその位置を示す図である。前記ＳｉｇＡ２切片は、シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ菌株の全体ゲノム配列の全長ｓｉｇＡ遺伝子から抽出された。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、シゲラ感染に対するワクチン組成物内の候補者タンパク質抗原としてＩｃｓＰ及びＳｉｇＡを同定したことに関する。より具体的に、本発明は、毒性シゲラバクテリアによりもたらされる感染に対し保護免疫反応を誘導することのできるシゲラＩｃｓＰ及びＳｉｇＡの特定ポリペプチド部分（ｍｏｉｅｔｙ）又は切片に関する。前記特定ポリペプチドは、以下にそれぞれＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２で表す。ＩｃｓＰ２は全てのシゲラ種で共通であり、さらにＥＩＥＣにも存在する。ＳｉｇＡ２はシゲラ・フレックスネリ２ａ、シゲラ・ボイディ及びシゲラ・ソンネイ菌株に存在する。
【００３７】
本発明は、シゲラの表面に係わったものに同定されるか及び／又はシゲラから分泌され、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・ボイディ及びシゲラ・ディセンテリアエを含むシゲラ類型及び種に共通であり、ワクチンで投与されるとき疫痢及び他の腸内感染に対し保護することのできるタンパク質抗原ＩｃｓＰ及びＳｉｇＡに関する。併せて、本発明はさらに、シゲラ種及びＥＩＥＣ間に共通のこのような抗原等のうち一部に関する。本発明はさらに、前記抗原に対し誘発された抗体及びＤＮＡ探針（ｐｒｏｂｅ）をシゲラ及びＥＩＥＣ感染の診断に用いる用途に関する。
【００３８】
抗原の同定及び前記抗原の特性分析
シゲラ種であるシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７Ｔ（３７）及びＳｆ３０１（１５）、シゲラ・フレックスネリ５ｂ菌株Ｓｆ８４０１（２０）、シゲラ・ディセンテリアエ１菌株Ｓｄ１９７、シゲラ・ボイディ血清型４菌株Ｓｂ２２７及びシゲラ・ソンネイ菌株Ｓｓ０４６の全体ゲノム配列は利用可能である（３８、３９）。前記シゲラ菌株の全体ゲノム配列以外にも、多数のシゲラ種由来の毒性プラスミドの完全なヌクレオチド配列もまた利用可能である（３、１４）。
【００３９】
ＩｃｓＰ
宿主細胞の細胞質内でのシゲラの移動は、前記バクテリアが宿主細胞のアクチンをその表面に募集して前記バクテリアを一細胞から他の細胞へ進ませるアクチンの尾（ａｃｔｉｎ  ｔａｉｌ）を形成する能力に依存する（２）。アクチンの尾の組み立ては、前記バクテリアの一極の外表面上で発見される単一のバクテリアタンパク質ＩｃｓＡにより媒介され、前記極でアクチンの組み立てが生じる（２７）。前記ＩｃｓＡタンパク質は前記バクテリアの古い極（ｏｌｄ  ｐｏｌｅ）に位置し、アクチンの組み立てのために必要充分なものである（９）。前記ｉｃｓＡ遺伝子は前記シゲラ毒性プラスミド上に位置し、前記バクテリアの移動に必須であるため、全ての血清型及び種等に存在する（３８）。前記ＩｃｓＡタンパク質は二つのドメイン（ｄｏｍａｉｎ）を含む：ａ−ドメイン（５３〜７５８残基）はアクチン組立ての決定因子（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を含み、バクテリア表面から細胞外環境に延長される傍ら、β−ドメイン（７５９〜１、１０２残基）は外膜内に埋め込まれている（３２）。
【００４０】
ＩｃｓＡは、外膜プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）であるＩｃｓＰによりバクテリア表面から徐々に切断される（７）。ＩｃｓＰは、シゲラの大きい（２３０ｋｂ）毒性プラスミド上でモノシストロン性オペロン（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｏｐｅｒｏｎ）によりコーディングされる（３）。ＩｃｓＰがなければ表面ＩｃｓＡの分布が変更されるようにして、極性キャップ（ｃａｐ）が維持され、一部ＩｃｓＡがバクテリアの側壁に沿って分布されるようにする。３２７個のアミノ酸配列のポリペプチドは、大腸菌プロテアーゼＯｍｐＰ及びＯｍｐＴとそれぞれ５８％の配列相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、サルモネラ・チフィムリウム・プロテアーゼＥ前駆体であるＰｒｔＡと４２％の配列相同性、エルシニア・ペスティス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）フィブリノリジン前駆体であるＰｌａと４０％の配列相同性を有する（２９）。
【００４１】
ＳｉｇＡ
ｓｉｇＡ遺伝子は、シゲラ・フレックスネリ２ａ染色体ＤＮＡの病原性島（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄ）上に位置している。ｓｉｇＡはシゲラ・フレックスネリの血清型２ａで排他的に発見されるものと信じられたが、ｓｉｇＡの存在はさらにシゲラ・ボイディ及びシゲラ・ソンネイでも報告された（３８）。配列分析は、ｓｉｇＡがオートトランスポータタンパク質のＳＰＡＴＥ（ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）サブファミリーに属する１３９  ｋＤａタンパク質をコーディングしていることを表す（１）。腸毒性（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｃ）及び細胞変性（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ）プロテアーゼである腸凝集性（ｅｎｔｅｒｏａｇｇｒｅｇａｔｉｖｅ）大腸菌オートトランスポータＰｅｔと比べるとき、ＳｉｇＡタンパク質のアミノ酸相同性は５８％である（１）。ＳｉｇＡ突然変異体バクテリアは野生型シゲラと比べるとき減少した流体蓄積（ｆｌｕｉｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）を見せるが、前記突然変異体バクテリアは依然相当な流体蓄積を誘導することができ、これはＳｉｇＡがシゲラ・フレックスネリ２ａにより製造された多くの腸毒素中の一つであることを表す。
【００４２】
全部ではなくとも殆どのシゲラ種及び血清型に共通である新規の抗原を同定することは、このような抗原に実際に保護性があれば理想的なはずである。ゲノミックス（ｇｅｎｏｍｉｃｓ）及びプロテオミクス  （ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）は、新しいワクチン標的を見付けて効果的なワクチンを開発する能力に至大な影響を及ぼしてきており、一部のシゲラ表面タンパク質は、疫痢に対する潜在的なワクチン候補者として認識されている（１３、１９、３６）。
【００４３】
本発明はさらに、関心のあるシゲラタンパク質のクローニング、発現及び精製に関する。精製されたタンパク質は（１）マウス肺炎モデル、（２）ギニーピッグ角結膜炎（ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）モデル及び（３）ギニーピッグ大腸炎モデル（前記モデル等は１０、２８及び３０に開示されている）の３種の動物モデルで保護性免疫を免疫化及び評価するために用いられた。
【００４４】
ある具現例で、本発明は、シゲラ種の共通的なタンパク質抗原をスクリーニングする方法を提供し、本発明で用いられる前記方法は、粘膜性病原体のタンパク質抗原をスクリーニングするのに適用され得る。
【００４５】
ある具現例で、本発明は、前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２ポリペプチドに対し特異的な抗体の製造方法、及び前記共通的な抗原に特異的な当該ＤＮＡ探針を製造する方法を提供する。このような抗体及びＤＮＡ探針は、前記共通の抗原又は当該遺伝子の検出、及びシゲラ及びＥＩＥＣによりもたらされる細菌性赤痢の診断に用いられ得る。治療用抗体はさらに、前記当該タンパク質抗原を発現するバクテリアによりもたらされる急性細菌性赤痢を病んでいる患者を治療するために用いられ得る。
【００４６】
細菌性赤痢の診断
シゲラ種以外にも、ある大腸菌菌株は疫痢をもたらし得る。現在、人間で胃腸炎をもたらす腸毒性大腸菌（集合的にＥＥＣ群と表す）には４種のクラスが認識されている。大腸菌は、人間及び他の霊長類の正常な腸内細菌叢（ｆｌｏｒａ）の一部である。少数の大腸菌菌株は、幾種類の相違するメカニズムにより人間の疾病をもたらし得る。これらの中には腸管浸透性（ＥＩＥＣ）菌株もある。ある食べ物が細菌性赤痢の原因になるこのような病原性腸管浸透性（ＥＩＥＣ）菌株を匿わせ得るかは知られていない。腸管浸透性大腸菌（ＥＩＥＣ）は、細菌性赤痢と知られている疾病を起こし得る。このような症状の原因となるＥＩＥＣ菌株は、シゲラ種と密接に係わる。ＥＩＥＣを摂取した後、前記微生物は腸の上皮細胞を侵犯して軽い形態の疫痢を起こし、たびたびシゲラ種によりもたらされる疫痢に誤認される。前記疾病は、感染した個体の大便で血液及び粘液が現われるものと特定される。シゲラ及びＥＩＥＣ感染の診断は相対的に難しいが、その理由は前記バクテリアが大便から単離されなければならないためであり、感染性用量のシゲラ及びＥＩＥＣは１０〜１００匹の微生物ほど少ないものと思われる。
【００４７】
感染した個体の大便から微生物を培養することと、組職培養又は適宜な動物モデルで単離物の浸透性を立証することとが、このような微生物によりもたらされる疫痢の診断に必要である。しかし、このような接近法は煩わしく時間消耗的である。
【００４８】
エケベリアＰ．などは次のように開示している：『（…）４種のシゲラ種（シゲラ・ディセンテリアエ、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ボイディ及びシゲラ・ソンネイ）は古典的に選択培地で大便検体を培養し、種−特異的抗血清により単離物の凝集をテストすることにより同定される。抗血清で凝集しないラクトース−発酵性及び非−ラクトース−発酵性ＥＩＥＣ及びシゲラ単離物を同定するためＤＮＡ探針を用いてきた。シゲラ抗血清を利用した受容性（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細菌学実験室を利用することができれば、これらＤＮＡ探針はシゲラの同定のため必要でない。ＥＩＥＣ感染と係る前記臨床的疾病は疫痢と類似する。しかし、疫痢を有する子供達より少ないＥＩＥＣ感染を有する子供達が、大便内にオカルト（ｏｃｃｕｌｔ）血液（３６％対８２％）と高出力フィールド当り１０個以上の大便白血球（３６％対６７％）を有する。標準細菌学的方法及びシゲラ／ＥＩＥＣ探針を利用した交雑のための大腸菌単離物のテストが、現在これら腸内病原体によりもたらされる感染を診断する最も敏感な手段である。細菌学実験室が利用可能でない状況でシゲラ及びＥＩＥＣ感染を同定するより速やかな方法は、免疫学的分析を含む。』（４０）（Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９１  Ｍａｒ−Ａｐｒ；１３  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２２０−５）。
【００４９】
本発明は、部分的にＩｃｓＰ２がＥＩＥＣによっても発現され、その配列はシゲラＩｃｓＰ２の配列とは非常に相同的であるが、他の３種のクラスの腸内毒性（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｌｅｎｔ）大腸菌（ＥＥＣ）の遺伝子とは相同的でないことを見付けたことに関する。結果的に、本発明の一側面は、ＥＩＥＣに対する保護用製剤としてのＩｃｓＰ２だけでなく、シゲラ及びＥＩＥＣ全てによりもたらされる疫痢の診断に用いられ得るシゲラＩｃｓＰ２に特異的な抗体及びＤＮＡ探針に関する。
【００５０】
一つの具現例で、本発明で開示されたシゲラポリペプチド抗原は、薬学的に許容可能な希釈剤とともに投与される。このような剤形は注射（皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ））により投与されるか、接着性パッチを利用して肌上に局所塗布され得る。他の一方で、前記ワクチンは薬学的に許容可能なビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を利用して粘膜性経路（経口、口腔、舌下（ｓｕｂｌｉｎｇｕａｌ）、エーロゾル、点鼻液、直腸）により投与される。前記抗原はさらに、後続する免疫反応を向上させるためアジュバントとともに混合され得る。このようなアジュバントの例にはアルミニウム塩、ＩＳＣＯＭ、サポニン系アジュバント、水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）及び油中水型エマルジョン、ムラミルジペプチドのようなトール様（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体リガンド、大腸菌ＬＰＳ、メチル化されないＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、リポテイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）及びペプチドグリカンがあり、これに限定されるものではない。腸毒素及びそのアジュバントはコレラ毒素、熱−敏感性（ｌａｂｉｌｅ）大腸菌腸毒素、百日咳毒素、志賀毒素及び類似体（ａｎａｌｏｇ）のような活性誘導体である。
【００５１】
本発明の追加具現例で、開示された抗原は非毒性又は弱毒化されたバクテリア内でクローニング及び発現され、後者はシゲラＩｃｓＰ及びＳｉｇＡの一つ又は全てをコーディングする遺伝子を含む開放解読枠（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）と機能的に繋がれるｍＲＮＡの合成を開始することのできるＤＮＡプロモーター因子を含むベクターとして用いられる。結果物のタンパク質（等）は、バクテリア表面及び／又はペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）で放出及び組み立てられる。以後、このような非毒性又は弱毒化されたバクテリアは経口用又は粘膜用ワクチンとして用いられ得る。大腸菌、サルモネラ種、シゲラ種、ビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、バチルス種、クロストリディウム種、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ミコバクテリア種、ラクトバチルス種、ラクトコッカス種、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）のようなバクテリアベクターの例は本技術分野に知られている。他の具現例で、前記ＩｃｓＰ及びＳｉｇＡ抗原は、適宜なプロモーターが装着されているシゲラの非毒性菌株又は弱毒化された菌株内で過剰発現される。ＩｃｓＰ又はＳｉｇＡ抗原の一つ又は全てを発現するこのようなバクテリアは、疫痢に対する生菌ワクチンとして用いられ得る。他の一方で、このような過剰発現菌株はホルマリン又は加熱により不活性化可能であり、結果物のバクテリアは死菌ワクチンとして用いられ得る。本発明の追加具現例は、シゲラ種を形質変換させるため用いられるベクターであり、異形（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）抗原をペリプラズムに発現させる。前記発現は、経口投与後シゲラの本質的な組職トロピズム（ｔｒｏｐｉｓｍ）（大腸の上皮）を変更するか、菌株の浸透性を著しく減少させるようではない。適宜なシゲラ種はシゲラ・ソンネイ、シゲラ・ディセンテリアエ、シゲラ・フレックスネリ及びシゲラ・ボイディの生きている、弱毒化されたワクチン菌株を含む。例示的な形質転換されたシゲラ菌株はシゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（３０９８））、シゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（ｃｆａＡＥ））、シゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（ｐＣＦＡＩ））及びシゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（ｐＣＦＡＩ／ＬＴＢ））のようなシゲラワクチン菌株を含む。前記菌株は、宿主上皮細胞内でシゲラを細胞内及び細胞間で拡散させることのできるｉｃｓＡ遺伝子及びバクテリアによる鉄習得で役割を果たすｉｕｃＡ遺伝子で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有するものと特定される。これら形質転換されたシゲラ菌株は免疫性組成物、特に経口用又は粘膜投与用ワクチンとして用いるのに適する。他のバクテリアが開示されてきており、ベクターシステムとしての用途が本技術分野によく知られている：
サルモネラ及び大腸菌バクテリア表面タンパク質が、生菌ワクチンの開発を含む多様な目的で外来エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）の担体又はビヒクルとして用いられてきた（米国特許第５，３４８，８６７号、発明者：Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，  Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ，  Ｅａｒｈａｒｔ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｆ．）。
信号配列をコーディングする発現カセットを持っているラクトバチルスであって、生物学的活性ポリペプチドは異形カルボキシ−末端標的領域に繋がれている（ＷＯ２００５／０１２４９１，  ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２４６０）（発明者：ＣＨＡＮＧ，  Ｃｈｉａ−Ｈｗａ，  ＬＩＵ，  Ｘｉａｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
バクテリア表面タンパク質の発現：Ｓｍｉｔ，  Ｊｏｈｎ；及びＮｉｎａ  Ａｇａｂｉａｎ；『Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｌａｙｅｒ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ』（１９８４）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６０，  １１３７−１１４５。米国特許第５，５００，３５３号。
宿主細胞での再組合ポリペプチドの区画化（ＰＣＴ／ＥＰ００／００６８６、米国特許第６，６１０，５１７号、発明者：Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｂｉｔｚ）。
タンパク質の酵母細胞表面ディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）及びその用途（米国特許第６，４２３，５３８号、Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｋ．  Ｄａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）。
関心のある生成物（タンパク質又はポリペプチド）をコーディングする異形ＤＮＡを発現する再組合マイコバクテリア、特に再組合Ｍ．  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（米国特許第５，５９１，６３２号、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）。
再組合タンパク質を発現するためのグラム−陽性バクテリアの用途（米国特許第５，８２１，０８８号、Ｄａｒｚｉｎｓ，  Ａｌｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。Ｇｉａｎｎｉ  Ｐｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．、『Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｐｔｏｃｏｃｃｉ』、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（Ｍａｙ  １９９２）６０：１９０２−１９０７。
バチルスでの発現及び分泌方法（米国特許第５，０３２，５１０号）−Ｓ．  Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ。
【００５２】
さらに、哺乳動物細胞、組職、器官及び個体内にＩｃｓＰ及び／又はＳｉｇＡポリペプチドを取り入れるため用いられるベクターは、ＩｃｓＰ及び／又はＳｉｇＡをコーディングするトランス遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の発現を調節する適宜なプロモーター因子が装着された弱毒化したウイルスを含み、ＩｃｓＰ及び／又はＳｉｇＡを製造するため準備及び使用可能である。ＩｃｓＰ及び／又はＳｉｇＡを発現するため使用可能なウイルスベクターの例は、アデノウイルス、ポリオウイルス、シンドビス（ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス、パピローマウイルス、レトロウイルス又はレンチウイルスを含むが、これに限定されるものではない。ＩｃｓＰ及び／又はＳｉｇＡを発現するため用いられる追加ベクターは、ウイルス−類似粒子（ＶＬＰ、ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）及びバクテリオファージを含む。
【００５３】
さらに、ＩｃｓＰ及びＳｉｇＡは選別遺伝子、酵母配列及びＩｃｓＰ及び／又はＳｉｇＡをコーディングするポリヌクレオチドを含む再組合発現ベクター内に含まれ得、前記ポリヌクレオチドは酵母プロモーターに機能的に繋がれており、前記ベクターは本発明のＩｃｓＰ及び／又はＳｉｇＡポリペプチドを生産する酵母細胞を伝達感染させるために用いられる。本発明の再組合発現ベクターは、酵母細胞で本発明のタンパク質を発現するようにデザインされ得る。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）及びクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）のような酵母でタンパク質を発現する方法は、本技術分野によく知られている。
【００５４】
さらに、本発明は、前記ＩｃｓＰ及びＳｉｇＡ遺伝子、並びにＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２ポリペプチドに特異的な試薬を診断テストのデザインに用いる用途に関する。
【００５５】
本発明の追加具現例で、開示された抗原は非毒性又は弱毒化されたバクテリア内でクローニング及び発現され、後者はシゲラＩｃｓＰ及びＳｉｇＡをコーディングする遺伝子の一つ又は全てを含む開放解読枠と機能的に繋がるｍＲＮＡの合成を開始することのできるＤＮＡプロモーター因子を含むベクターとして用いられる。結果物のタンパク質（等）は、バクテリア表面及び／又はペリプラズムで放出及び組み立てられる。以後、このような非毒性又は弱毒化されたバクテリアは、経口用又は粘膜用ワクチンとして用いられ得る。他の具現例で、前記ＩｃｓＰ及びＳｉｇＡ抗原は、適宜なプロモーターが装着されている非毒性シゲラ菌株又は突然変異シゲラ菌株内で過剰発現される。以後、ＩｃｓＰ又はＳｉｇＡ抗原の一つ又は全てを発現するこのようなバクテリアは、疫痢に対する生菌ワクチンとして用いられ得る。他の一方で、このような過剰発現菌株はホルマリン又は加熱により不活性化可能であり、結果物のバクテリアは死菌ワクチンとして用いられ得る。本発明の追加具現例は、シゲラ種を形質転換させるため用いられるベクターであり、異形抗原をペリプラズムに発現させる。前記発現は、経口投与後シゲラの本質的な組職トロピズム（大腸の上皮）を変更するか、菌株の浸透性を著しく減少させるようではない。適宜なシゲラ種はシゲラ・ソンネイ、シゲラ・ディセンテリアエ、シゲラ・フレックスネリ及びシゲラ・ボイディの生きている、弱毒化されたワクチン菌株を含む。例示的な形質転換されたシゲラ菌株はシゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（３０９８））、シゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（ｃｆａＡＥ））、シゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（ｐＣＦＡＩ））及びシゲラ・フレックスネリ２ａ（ＳＣ６０８（ｐＣＦＡＩ／ＬＴＢ））のようなシゲラワクチン菌株を含む。前記菌株は、宿主上皮細胞内でシゲラを細胞内及び細胞間で拡散させることのできるｉｃｓＡ遺伝子及びバクテリアによる鉄習得で役割を果たすｉｕｃＡ遺伝子で欠失を有するものと特定される。これら形質転換されたシゲラ菌株は免疫性組成物、特に経口用又は粘膜投与用ワクチンとして用いるのに適する。他のバクテリアが開示されてきており、ベクターシステムとしての用途が本技術分野によく知られている：
サルモネラ及び大腸菌バクテリア表面タンパク質が、生菌ワクチンの開発を含む多様な目的で外来エピトープの担体又はビヒクルとして用いられてきた（米国特許第５，３４８，８６７号、発明者：Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，  Ｇｅｏｒｇｅ，  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ，  Ｅａｒｈａｒｔ，  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｆ．）。
信号配列をコーディングする発現カセットを持っているラクトバチルスであって、生物学的活性ポリペプチドは異形カルボキシ−末端標的領域に繋がれている（ＷＯ２００５／０１２４９１，  ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００２４６０）（発明者：ＣＨＡＮＧ，  Ｃｈｉａ−Ｈｗａ，  ＬＩＵ，  Ｘｉａｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
バクテリア表面タンパク質の発現：Ｓｍｉｔ，  Ｊｏｈｎ；及びＮｉｎａ  Ａｇａｂｉａｎ；『Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｌａｙｅｒ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ』（１９８４）Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６０，  １１３７−１１４５。米国特許第５，５００，３５３号。
宿主細胞での再組合ポリペプチドの区画化（ＰＣＴ／ＥＰ００／００６８６、米国特許第６，６１０，５１７号、発明者：Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｂｉｔｚ）。
タンパク質の酵母細胞表面ディスプレイ及びその用途（米国特許第６，４２３，５３８号、Ｗｉｔｔｒｕｐ，  Ｋ．  Ｄａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）。
関心のある生成物（タンパク質又はポリペプチド）をコーディングする異形ＤＮＡを発現する再組合マイコバクテリア、特に再組合Ｍ．  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（米国特許第５，５９１，６３２号、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．）。
再組合タンパク質を発現するためのグラム−陽性バクテリアの用途（米国特許第５，８２１，０８８号、Ｄａｒｚｉｎｓ，  Ａｌｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）。Ｇｉａｎｎｉ  Ｐｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．、『Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｓｔｅｒｐｔｏｃｏｃｃｉ』、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（Ｍａｙ  １９９２）６０：１９０２−１９０７。
バチルスでの発現及び分泌方法（米国特許第５，０３２，５１０号）−Ｓ．  Ｋｏｖａｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ。
【００５６】
さらに、本発明は、前記ＩｃｓＰ及びＳｉｇＡ遺伝子、並びにＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２ポリペプチドに特異的な試薬を診断テストのデザインに用いる用途に関する。
【００５７】
重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）と呼ばれる遺伝子増幅技術は、本技術分野によく知られており、シゲラ感染の診断のため用いられてきた（４１）。本発明は、前記ＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２遺伝子配列に結合することのできる特異的なプライマーを開示する。このようなプライマーは、臨床サンプル（例えば、大便）内に存在するバクテリア由来のｉｃｓＰ又はｓｉｇＡ遺伝子を増幅するため用いられ得、増幅された切片は視覚的方法、測光法（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）、同位元素法又は蛍光検出法により検出可能である。したがって、本発明は、前記ＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２遺伝子配列を、シゲラ種及びＥＩＥＣによりもたらされる疫痢の診断に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーとして用いる用途を請求する。
【００５８】
さらに、本発明は、ＳｉｇＡ２及びＩｃｓＰ２に対する抗血清の製造に関する。このような抗血清は、相違するシゲラ種により発現される当該ポリペプチドと反応することができた。併せて、このような抗血清は、シゲラバクテリアによるＨｅｌａ細胞の試験管内感染を抑制し、角結膜炎モデルでシゲラによりもたらされる炎症に対し動物を保護することができた。
【００５９】
さらに、本発明は、ＩｃｓＰ２とシゲラのＯポリサッカライド抗原の接合体、及びＳｉｇＡ２とシゲラのＯポリサッカライド抗原の接合体に関する。病原性バクテリア表面の前記Ｏ−特異的ポリサッカライドは、保護性抗原及び必須の毒性因子全てであるものと思われる。大部分のポリサッカライドが弱化した免疫システムを持つ乳児及び成人で保護性レベルの抗−ポリサッカライド抗体を起こすことができないとのことは、Ｔ−細胞依存的な特性を与えるタンパク質に共有的に付着されることにより克服可能である。このような原理は、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ（Ｈｉｂ）、肺炎球菌性肺炎及びナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するワクチンを構築するようにした。接合体技術をグラム−陰性バクテリアの前記Ｏ−特異的ポリサッカライドに拡張すれば、新しい糖接合体（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）ワクチンが生成されるようにした。本来、アベリー及びゲーベル（Ａｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｅｂｅｌ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ５０：５３１（１９２９））及びゲーベル（Ｇｏｅｂｅｌ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ５０：４６９−５２０（１９２９））は、肺炎球菌タイプ３ポリサッカライドの免疫原性は、これを担体タンパク質に化学的に結合させることにより増加され得ることを見せた。前記原理は、他の病原体のポリサッカライドの免疫原性を増加させるため成功的に適用されてきた。タンパク質担体にポリサッカライドを共有的にカップリングさせる方法は本技術分野に知られており、次を含む：
【００６０】
Ｇｕ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６４（１０），  （１９９６），  ｐｐ．  ４０４７−４０５３．
【００６１】
Ｇｕｐｔａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｏｒ  Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ，  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  ｂｙ  Ｔｗｏ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｃｈｅｍｅｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６３（８），  （１９９５），  ｐｐ．  ２８０５−２８１０．
【００６２】
Ｇｕｐｔａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｓｏｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｏ１  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｉｎａｂａ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６０（８），  （１９９２），  ｐｐ．  ３２０１−３２０８．
【００６３】
Ｋｏｎａｄｕ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：  Ｐｈａｓｅ  １  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｏ１５７  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １７７，  （１９９８），  ｐｐ．  ３８３−３８７．
【００６４】
Ｋｏｎａｄｕ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｈａｓｅ  １  ａｎｄ  Ｐｈａｓｅ  ２  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ，  Ｔｅｅｎａｇｅｒｓ，  ａｎｄ  ２−  ｔｏ  ４−  Ｙｅａｒ  Ｏｌｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  Ｖｉｅｔｎａｍ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６８（３），  （２０００），  ｐｐ．  １５２９−１５３４．
【００６５】
Ｋｏｎａｄｕ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６２（１１），  （１９９４），  ｐｐ．  ５０４８−５０５４．
【００６６】
Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １６１，  （１９９０），  ｐｐ．  ８２１−８３２．
【００６７】
Ｔａｙｌｏｒ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｔｙｐｅ  １，  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  Ｔｙｐｅ  ２ａ，  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  （Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｏｉｄｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６１，  （１９９３），  ｐｐ．  ３６７８−３６８７．
【００６８】
ＷＯ／１９９９／００３８７１；米国特許第４，７７１，１２７号；米国特許第５，８６６，１３２号。
【００６９】
他の具現例で、本発明は、ポリサッカライドの抗原性及び免疫原性を向上させるため、前記シゲラＯポリサッカライドがスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）を介しＩｃｓＰ又はＳｉｇＡ中一つにカップリングされた接合体に関し、前記接合体は、前記タンパク質及びポリサッカライド全てに対する免疫反応を誘導するために用いられる。
【００７０】
さらに他の具現例で、前記シゲラＩｃｓＰ及びＳｉｇＡタンパク質は化学的に接合されるか、例えばワクチンで免疫原に用いるための他のタンパク質との遺伝子融合生成物であり得る。このようなタンパク質は破傷風毒素、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌腸毒素Ｂサブユニット及びフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を含む。前記タンパク質等は本技術分野によく知られており、下記文献等に開示されているように、このような目的で産業及び／又は研究で広範に用いられてきた：
ＳＪ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ａｎｄ  ＪＦ  Ｈａｌｓｅｙ．  Ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｓ  ａ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ａ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ  １３３，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  １８１８−１８２４．
Ｓ．  Ｓｈａｈ，  Ｒ．  Ｒａｇｈｕｐａｔｈｙ，  Ｏｍ．  Ｓｉｎｇｈ，  Ｇ．Ｐ．  Ｔａｌｗａｒａｎｄ  Ａ．  Ｓｏｄｈｉ．  Ｐｒｉｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ａ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｈＣＧ  ｉｎ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ａｎ  ｈＣＧ−ｃａｒｒｉｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １７，  Ｉｓｓｕｅｓ  ２３−２４，  １９９９，  Ｐａｇｅｓ  ３１１６−３１２３．
ＬＥ  ＭＯＩＧＮＥ  Ｖｉｎｃｅｎｔ；  ＲＯＢＲＥＡＵ  Ｇｅｏｒｇｅｓ；  ＭＡＨＡＮＡ  Ｗａｈｉｂ；  Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  ａｓ  ａ  ｇｏｏｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｔｈ１  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐ２７  （Ｒｖ２１０８）  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００８，  ｖｏｌ．  ４５，  ｎｏ  ９，  ｐｐ．  ２４９９−２５０７．
Ｃａｍｉｌｏ  Ｃｕａｄｒｏｓ，  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  Ｊ．  Ｌｏｐｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，  Ａｎａ  Ｌｕｃｉａ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，  Ｍｉｃｈａｅｌ  ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ．  Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｍａｙ  ２００４，  ｐ．  ２８１０−２８１６，  Ｖｏｌ．  ７２，  Ｎｏ．  ５．
【００７１】
さらに他の具現例で、本発明は、サルモネラチフィ（Ｔｙｐｈｉ）Ｖｉポリサッカライド又はサルモネラパラチフィ（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ）のような他の腸病原性（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ）バクテリアのポリサッカライドが、スペーサを介しＩｃｓＰ又はＳｉｇＡ中一つに共有的にカップリングされている接合体に関し、前記接合体は、前記タンパク質とポリサッカライド全てに対する免疫反応を誘導し、したがって、疫痢及び腸チフス（又はパラチフス）疾患全てに対しワクチン化するために用いられる。
【００７２】
さらに、本発明は、疫痢を病むと知られているか疑われる患者でシゲラを検出するための診断方法に用いるため、動物で抗−シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２抗体及び再組合ポリペプチドを製造する方法を提供する。免疫されたマウス及びギニーピッグの血清内に存在するこのような抗体はさらに、例えば馬、山羊、兎、猿、牛、ろ馬、ハムスターのような他の動物種で製造され得る。分子生物学及びハイブリドーマの使用を含むことのような抗体技術は、研究者及び臨床医が一般的な診断及び臨床手続で有用な非常に特異的で強力なモノクローナル抗体のソース（ｓｏｕｒｃｅ）を利用できるようにした。このようなモノクローナル抗体は、適宜な骨髓細胞を有するＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２中一つで免疫された動物から免疫細胞の標準融合により得られ得る。より具体的に、本発明の核酸、タンパク質又はペプチド分子は、シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２に結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体を開発するために用いられ得る。本発明のシゲラＩｃｓＰ２−又はＳｉｇＡ２−結合抗体を製造するため、培養物で連続的な細胞株により抗体分子の製造を提供する任意の技術が用いられ得る。例えば、本来Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，４９５−４９７（１９７５））が用いられ得る。さらに、米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  （Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  １９８８）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  （Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎ．Ｙ．，  １９９２−１９９６）参照。
【００７３】
高親和性及び高結合活性（ｈｉｇｈ  ａｖｉｄｉｔｙ）の人間抗体を生成するための他の有益な経路は、米国特許第６，５３７，８０９号に開示されているように、自然型の（ｎａｔｉｖｅ）人間リンパ球を試験管内で抗原プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）する段階、結果物である試験管内抗原プライミングされたリンパ球を、免疫損傷されたドナー（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｄｏｎｏｒ）、例えばＳＣＩＤマウスに伝達する段階、前記免疫損傷されたドナーを抗原でブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）する段階、前記ドナーから人間抗体を分泌するＢ−細胞（ＩｇＧ分泌）を単離する段階、及び前記単離された人間抗体分泌細胞をＥＢＶ形質転換させる段階を含む。
【００７４】
本発明の抗体は、人間抗体の保存領域がマウスの軽鎖及び重鎖可変領域にクローニングされた一部の人間及び一部のマウス抗体を含むキメラ抗体を含む。ある場合において、人間配列の７０％が維持される。人間化抗体は大凡９０％の人間抗体骨組（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）が維持され、前記げっ歯類（ｍｕｒｉｎｅ）とは相補性決定領域のみ組み合わされるキメラ抗体である。さらに、完全な人間化抗体が本発明で考慮される。
【００７５】
シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２のアミノ酸配列内に含まれるエピトープに結合する再組合げっ歯類又はキメラげっ歯類−人間又は人間−人間抗体は、公知の技術を利用して提供され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８７，  １９９２，  １９９３）；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）；  ＥＰ０２３９４００参照。
【００７６】
本発明の抗−シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２抗体及び／又はペプチドは、サンプル内のシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２又は抗−シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２抗体を検出又は定量する免疫分析用として有用である。シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２に対する免疫分析は、典型的にＩｃｓＰ２特異的抗体又はＳｉｇＡ２特異的抗体に選択的に結合することのできる、本発明の検出可能に標識された高親和性（又は高結合活性）抗−シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２抗体又はポリペプチドの存在下で臨床的又は生物学的サンプルをインキュベーションする段階、及びサンプル内に結合された前記標識されたペプチド又は抗体を検出する段階を含む。多様な臨床分析手続が本技術分野によく知られている。例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ８０’ｓ（Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐａｒｋ，１９８１）参照。このようなサンプルは、組職の血液、血清及び大便サンプル、又は貧血又は経口用緩下溶液（ｌａｘａｔｉｖｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）の後で結腸直腸トラック（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｒａｃｋ）から収集された液体を含み、後述したようにＥＬＩＳＡ分析を行うことになる。
【００７７】
したがって、抗−シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２抗体又はシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２ポリペプチドは、ニトロセルローズ又は可溶性タンパク質を固定することのできる他の固形支持体に固定可能である。以後、前記支持体は適宜なバッファで洗浄された後、検出可能に標識されたシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的ペプチド又は抗体で処理され得る。以後、前記固相支持体を前記バッファで再度洗浄し、結合されていないペプチド及び抗体を除去することができる。以後、前記固形支持体上に結合された標識の量は公知の方法の段階により検出され得る。
【００７８】
『固相支持体』又は『担体』はペプチド、抗原又は抗体に結合することのできる任意の支持体を表す。周知の支持体又は担体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルフルオリド（ＰＶＤＦ）、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、自然型又は変形されたセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及び磁鉄石（ｍａｇｎｅｔｉｔｅ）を含む。前記担体の本性は、本発明の目的のためある程度可溶性であるか不溶性であり得る。前記支持体物質は、カップリングされた分子がシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２又は抗−シゲラＩｃｓＰ２又は抗−シゲラＳｉｇＡ２抗体に結合することができる限り、実質的に任意の可能な構造的な外形（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有することができる。したがって、前記支持体の外形は、ビード（ｂｅａｄ）でのように球形であるか、テストチューブの内表面又は棒の外表面でのように円筒状であり得る。他の一方、前記表面はシート、培養皿、テストストリップなどのように扁平でもよい。例えば、支持体はポリスチレンビードを含むことができる。本技術分野の当業者は抗体、ペプチド又は抗原に結合するための多い他の適宜な担体を知っているか、日常の実験によりこれらを確認することができるはずである。
【００７９】
周知の方法の段階等は、与えられたロット（ｌｏｔ）の抗−シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２ペプチド及び／又は抗体の結合活性を決めることができる。本技術分野の熟練した当業者は、日常の実験により可動性（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）及び最適分析条件を決めることができる。
【００８０】
シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２特異的ペプチド及び／又は抗体を検出可能に標識することは、酵素免疫分析（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）に用いるため酵素を結合させることにより達成することができる。前記結合された酵素は露出した基質と反応し、例えば分光光度法、蛍光検出法又は視覚的手段により検出可能な化学的成分を生成する。本発明のシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体を検出可能に標識するために用いられ得る酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これに限定されるものではない。
【００８１】
前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体を放射性標識することにより、放射免疫分析（ＲＩＡ）を用いてシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２を検出することが可能である。Ｗｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ  ＆  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｎ．Ｙ．（１９７８）参照。前記放射性同位元素は、ガンマカウンター又は閃光（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ）カウンターを利用することのような手段により、又はオートラジオグラフィー法（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）により検出され得る。本発明の目的のため特に有用な同位元素は３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ及び１２５Ｉである。
【００８２】
さらに、前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体を蛍光化合物で標識することも可能である。前記蛍光標識された抗体が適当な波長の光に露出されると、その存在が蛍光により検出され得る。最もよく用いられる蛍光標識化合物はフルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、フィコシアニン（ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ｏ−フタルデヒド（ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）及びフルオレスカミン（ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）である。
【００８３】
さらに、前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体は、１２５Ｅｕ又はランタン系列の他の金属のような蛍光放出金属を利用して検出可能に標識され得る。これら金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなこのような金属のキレートグループを利用して、前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体に付着され得る。
【００８４】
さらに、前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体は、化学発光化合物にカップリングされることにより検出可能に標識され得る。前記化学発光標識された抗体の存在は、化学反応過程の間に誘発される発光の存在を検出することにより測定される。有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウム・エステル（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ）、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルである。
【００８５】
同様に、生物発光化合物が本発明のシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体、一部、切片、ポリペプチド又は誘導体を標識するために用いられ得る。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効能を増加させる生物学的システムで発見される化学発光の一形態である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより測定される。標識の目的のための重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）である。
【００８６】
前記シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２特異的抗体、一部、切片、ポリペプチド又は誘導体の検出は、例えば検出可能な標識が放射性ガンマエミッタ（ｅｍｉｔｔｅｒ）であれば閃光カウンターにより、例えば前記標識が蛍光物質であれば蛍光検出器により達成され得る。酵素標識の場合、前記検出は、前記酵素に対する基質を取り入れる比色法により達成され得る。検出はさらに、類似に準備された標準品と比べて基質の酵素反応の度合いを視覚的に比べることにより達成され得る。
【００８７】
本発明の目的のため、前記分析により検出されるシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２は、生物学的サンプル内に存在することができる。シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２を含む任意のサンプルが用いられ得る。例えば、前記サンプルは、例えば、血液、血清、小便、大便、組職抽出物又は均質物などのような生物学的流体である。しかし、本発明はこのようなサンプルのみを利用する分析に限定されるものではなく、本技術分野の通常の当業者は、他のサンプルを用いることがようにする適宜な条件を決めることができる。
【００８８】
本発明の抗体、切片又は誘導体は『ツーサイト（ｔｏｗ−ｓｉｔｅ）』又は『サンドイッチ』分析にも知られている免疫検出分析（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）で利用するように適応され得る。典型的な免疫検出分析で、一定量の標識されていない抗体（又は抗体の切片）がテストされる流体に不溶性の固形支持体に結合され、一定量の検出可能に標識された可溶性抗体が添加され、固相抗体、抗原及び標識された抗体の間に形成された三元（ｔｅｒｎａｒｙ）複合体を検出及び／又は定量するようにする。
【００８９】
典型的な免疫検出分析は、前記固相に結合された抗体が先ずテストされるサンプルと接触し、バイナリー（ｂｉｎａｒｙ）固相抗体−シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２複合体を形成することにより、前記サンプルからシゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２含有タンパク質を抽出する『フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）』分析を含む。適宜なインキュベーション期間後、前記固形支持体を洗浄することにより未反応シゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２があれば、これを含む前記流体サンプルの残留物を除去した後、知られた量の標識された抗体（『レポーター分子』として作用する）を含む溶液と接触する。前記標識された抗体が標識されない抗体を介し前記固形支持体に結合されたシゲラＩｃｓＰ２又はＳｉｇＡ２と複合体を形成するようにする二番目のインキュベーション期間後、前記固形支持体を再度洗浄して反応しない標識された抗体を除去する。このような類型のフォワードサンドイッチ分析は、シゲラＩｃｓＰ２及び／又はＳｉｇＡ２が存在するか否かを決めるのに用いられるか、前記標識された抗体の測定値を知られた量のシゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２を含む標準サンプルに対し得られた測定値と比べることにより定量することができる。このような『ツーサイト』又は『サンドイッチ』分析はＷｉｄｅ，  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９−２０６  （Ｋｉｒｋｈａｍ，  ｅｄ．，  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，  １９７０）により開示されている．
【００９０】
さらに、シゲラＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２に対し有用な他の類型の『サンドイッチ』分析は、所謂『同時』及び『リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）』分析である。同時分析は、固形支持体に結合された抗体及び標識された抗体が全て、テストされるサンプルに同時に添加される単一インキュベーション段階を含む。インキュベーションが完了すれば、前記固形支持体を洗浄して流体サンプルと複合体を形成しない標識された抗体の残留物を除去する。以後、前記固形支持体に係る標識された抗体の存在は、従来のサンドイッチ分析でのように測定される。
【００９１】
前記『リバース』分析で、順次、先ず前記流体サンプルに標識された抗体溶液を添加した後、適当なインキュベーション期間後固形支持体に結合された標識されない抗体を添加することが利用される。二番目のインキュベーション後、従来の方式で前記固相を洗浄することにより、テストされるサンプル及び反応しない標識された抗体溶液の残留物から自由にする。以後、固形支持体に係る標識された抗体の測定は、前記『同時』及び『フォワード』分析でのように測定される。一具現例で、別途のエピトープに特異的な本発明の抗体の組合せが敏感な三つの部位（ｔｈｒｅｅ−ｓｉｔｅ）免疫放射測定分析（ｉｍｍｕｎｏｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）を構築するために用いられ得る。
【００９２】
本発明によれば、本技術分野の技術内には分子免疫学、細胞免疫学、薬理学及び微生物学で普通用いられるものなどのような多様な手段と技術があり得る。このような手段と技術は、例えば次の文献等に詳しく開示されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．：  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ；  Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．：  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ；  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．：  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ；  Ｃｏｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．：  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ；  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．：  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ；  ａｎｄ  Ｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００５）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．：  Ｈｏｂｏｋｅｎ，  ＮＪ．
【００９３】
本明細書に開示された略字は、測定単位、技術、特性又は化合物に該当し、次の通りである：『ｍｉｎ』は分を意味し、『ｈ』は時間（等）を意味し、『μｌ』はマイクロリットル（等）を意味し、『ｍｌ』はミリリットル（等）を意味し、『ｍＭ』はミリモルを意味し、『Ｍ』はモルを意味し、『ｍｍｏｌｅ』はミリモル（等）を意味し、『ｋｂ』はキロベースを意味し、『ｂｐ』は塩基対（等）を意味し、『ＩＵ』は国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｔ）を意味する。
【００９４】
『重合酵素連鎖反応』はＰＣＲと略称する；『逆転写酵素重合酵素連鎖反応』はＲＴ−ＰＣＲと略称する；『非翻訳区域』はＵＴＲと略称する；『ドデシル硫酸ナトリウム』はＳＤＳと略称する；及び『高圧液体クロマトグラフィー』はＨＰＬＣと略称する。
【００９５】
本発明で用いられたもののようなＤＮＡの『増幅』は、ＤＮＡ配列の混合物内で特定ＤＮＡ配列の濃度を増加させるため重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることを表す。ＰＣＲの説明に対してはＳａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８，２３９：４８７を参照。
【００９６】
『ポリヌクレオチド』又は『ヌクレオチド配列』は、ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸内の一連のヌクレオチド塩基（『ヌクレオチド』とも呼ばれる）であって、二つ以上のヌクレオチドの任意の鎖を意味する。ヌクレオチド配列は、典型的にタンパク質及び酵素を作るため細胞機械（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）により用いられる情報を含む遺伝情報を運ぶ。前記用語等は、二重又は単一本のゲノム及びｃＤＮＡ、ＲＮＡ、任意の合成及び遺伝的に操作されたポリヌクレオチド、及びセンス及びアンチセンスポリヌクレオチド全て（たとえ、センス本だけが本発明で表れているものの）を含む。これは単一及び二重本分子等、即ちＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドだけでなく、塩基をアミノ酸バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に接合させることにより形成される『タンパク質核酸』（ＰＮＡ）を含む。これはさらに、例えばチオウラシル、チオグアニン及びフルオロウラシルのような変形された塩基を含む核酸を含む。
【００９７】
本発明において、前記核酸は自然的調節（発現調節）配列の側にあり得、又はプロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及び他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、反応因子、サプレッサー（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）、信号配列、ポリアデニン化配列、イントロン、５’及び３’非コーディング領域などを含む異形配列と係り得る。前記核酸はさらに、本技術分野に知られた多くの手段により変形可能である。このような変形の非制限的な例は、メチル化、『キャップ』、一つ以上の自然的に発生するヌクレオチドを類似体に組み換えること、及び例えば、非電荷性（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ）結合を有する変形（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、及び電荷性結合を有する変形（例えば、  ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）のようなヌクレオチド間の変形を含む。ポリヌクレオチドは、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、信号ペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）、インターカレータ（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）（例えば、アクリジン、ソラーレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）など）、キレーター（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属など）及びアルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｏｒ）のような一つ以上の追加的な共有結合された部分（ｍｏｉｅｔｙ）を含むことができる。前記ポリヌクレオチドは、メチル又はエチルホスホトリエステル又はアルキルホスホラミデート結合の形成により誘導され得る。併せて、本発明において、前記ポリヌクレオチドはさらに、検出可能な信号を直接的に又は間接的に提供することのできる標識で変形され得る。例示的な標識は、放射性同位元素、蛍光分子、ビオチンなどを含む。
【００９８】
『核酸の交雑（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）』との用語は、ＡはＴ（又は、ＲＮＡ核酸の場合はＵ）と対をなし、ＣはＧと対をなす二つの単一本核酸間の逆平行（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ）水素結合を表す。核酸分子は、所定の厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下で一核酸分子の少なくとも一本が他の核酸分子の相補性塩基と水素結合を形成することができるとき互いに『交雑することができる』。交雑の厳密性は、例えば（ｉ）交雑及び／又は洗浄が行われる温度、（ｉｉ）イオンの強さ及び（ｉｉｉ）前記交雑及び洗浄溶液のホルムアミドのような変性剤の濃度だけでなく、他のパラメータ（ｐａｒａｍｅｔｅｒ）により決定される。交雑は、前記二つの本が実質的に相補的な配列を含むことを要する。しかし、交雑の厳密性に従い、ある程度の不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が容認されてもよい。『低い厳密性』条件下では、さらに大きい百分率の不一致が容認され得る（即ち、逆平行ハイブリッドの形成を防止しないはずである）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌ．，  １９９４，  Ｃｈ．  ７  参照。
【００９９】
典型的に、高い厳密性で二つの本が交雑することは、その配列がその長さの延長された部分にかけて高い程度の相補性を表すことを要する。高い厳密性条件の例は、次を含む：６５℃で０．５  Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡでフィルタ−結合ＤＮＡに対し交雑した後、６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ（１×ＳＳＣは０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５  Ｍ  クエン酸ナトリウム）、又はオリゴヌクレオチド分子の場合は大凡３７℃（大凡１４ヌクレオチド長さのオリゴの場合）、大凡４８℃（大凡１７ヌクレオチド長さのオリゴの場合）、大凡５５℃（２０ヌクレオチド長さのオリゴの場合）及び大凡６０℃（２３ヌクレオチド長さのオリゴの場合）で６×ＳＳＣ／０．５％ピロリン酸ナトリウムで洗浄する。したがって、『高い厳密性の交雑』との用語は、二つの本がそのヌクレオチド配列が殆ど完全に相補的な時にのみ『交雑』螺旋を形成するように対をなす溶媒と温度の組合せを表す（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌ．，  １９９４，  Ｃｈ．  ７  参照）。
【０１００】
中間又は普通の厳密性条件（例えば、６５℃で２×ＳＳＣの水溶液；他の一方で、例えば、６５℃で０．５  Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡでフィルタ−結合ＤＮＡに対し交雑した後、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳで洗浄すること）及び低い厳密性条件（例えば、５５℃で２×ＳＳＣの水溶液）は、二つの配列の間に交雑が起きるための当該全体相補性が低いことを要する。任意の与えられた厳密性交雑反応のための特定温度及び塩条件は、標的ＤＮＡの濃度及び探針の長さ及び塩基組成に依存し、普通日常の予備実験で経験的に決定される（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９７５；  ９８：  ５０３；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  ｖｏｌ．  ２，  ｃｈ．  ９．５０，  ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ａｔ  ｐ．  ２．１０．３  参照）。
【０１０１】
本発明で用いられたように、『標準交雑条件』との用語は、少なくとも７５％の配列同質性を有する配列が交雑されるようにする交雑条件を表す。特定の具現例によれば、高い厳密性の交雑条件は、少なくとも８０％の配列相同性、少なくとも９０％の配列相同性、少なくとも９５％の配列相同性、又は少なくとも９９％の配列相同性を有する配列のみを交雑するようにするため用いられ得る。
【０１０２】
本発明の任意の所望の核酸に『交雑する』核酸分子は、任意の長さであり得る。一具現例で、このような核酸分子は、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個及び少なくとも７０個のヌクレオチド長さである。他の具現例で、交雑する核酸分子は、特定の所望の核酸と殆ど同一な長さである。
【０１０３】
『単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）』との用語は、対象物質が普通発見される環境から前記対象物質が除去されることを意味する。したがって、単離された生物学的物質は細胞成分、即ち前記物質が発見されるか製造される細胞の成分がないこともある。単離された核酸分子は、例えばＰＣＲ生成物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又は制限酵素切片を含む。さらに、単離された核酸分子は、例えばプラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列を含む。単離された核酸分子は、前記核酸分子が発見され得るゲノムから切断されるのが好ましく、非調節性配列、非コーディング配列、又は前記ゲノム内で発見されるとき、前記核酸分子の上流又は下流に位置する他の遺伝子にこれ以上結合されていないことがより好ましい。単離されたタンパク質は、細胞内で前記タンパク質が関連している他のタンパク質又は核酸又はこれら全て、又はもし膜−関連タンパク質であれば細胞膜と関連され得る。
【０１０４】
『宿主細胞』は、ベクター又はポリヌクレオチド分子を挿入するための受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）であり得るか、受容体を有する個別細胞又は細胞培養物を含む。本発明において、宿主細胞はバクテリア、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞であり得る。
【０１０５】
状態、疾病又は症状の『処理』又は『治療』は次を含む：
（１）前記状態、疾病又は症状の臨床又は準臨床症侯が、前記状態、疾病又は症状を病むか、これに脆弱であり得るが、前記状態、疾病又は症状の臨床又は準臨床徴候を未だ経験するか表しない哺乳動物で表れることを防止するか遅延させること；又は
（２）前記状態、疾病又は症状を抑制すること、即ち前記疾患又はその再発（維持治療の場合）、又は少なくともその臨床又は準臨床徴候のうち一つの発生を阻止、減少又は遅延させること；又は
（３）前記疾患を軽減させること、即ち前記状態、疾病又は症状、又は少なくともその臨床又は準臨床徴候のうち一つの退行（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）をもたらすこと。
【０１０６】
治療される対象に対する利点は、統計学的に有意であるか、少なくとも患者又は医者に認知可能なことである。
【０１０７】
『免疫反応』は、宿主で関心のある組成物又はワクチンに対し、細胞性及び／又は抗体−媒介性免疫反応が発生することを表す。このような反応は、普通前記関心のある組成物又はワクチン内に含まれる抗原、又は抗原等を特異的に狙う抗体、Ｂ細胞、ヘルパー（ｈｅｐｌｅｒ）Ｔ細胞、及び／又は細胞毒性Ｔ細胞を生成する対象からなる。さらに、前記免疫反応は、その活性が関心のある生物体を超すものであって、他の免疫又はアレルギー反応を抑制することのできる調節性Ｔ−細胞を含むことができる。
【０１０８】
『治療学的有効量』は状態、疾病又は症状を治療するため哺乳動物に投与されるとき、化合物、アジュバント又はワクチン組成物がこのような治療に効果を奏するのに十分な量を意味する。前記『治療学的有効量』は、投与される化合物、バクテリア又は類似体だけでなく、前記疾患及びその重症度（ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、治療される哺乳動物の年齢、重量、物理的症状及び反応性に従い変わるはずである。
【０１０９】
『予防学的有効量』は、用量及び必要な期間の間所望の予防結果を達成するための有効量を表す。典型的に、予防学的用量は疾患の以前又は初期段階で用いられるので、予防学的有効量は前記治療学的有効量より少ないはずである。
【０１１０】
本発明により提供された組成物を治療用に用いることが可能であるが、これを薬学的剤形、例えば所望の投与経路及び標準薬学的実務と関連して選択された適宜な薬学的賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、希釈剤、担体との混合物として投与することが好ましいこともある。したがって、一側面で、本発明は少なくとも一つの活性型組成物又は薬学的に許容可能なその誘導体を含み、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤及び／又は担体に係る薬学的組成物又は剤形を提供する。前記賦形剤、希釈剤及び／又は担体は、前記剤形の他の成分と両立可能であり、その受容者に有害でないとの側面で『許容可能』でなければならない。
【０１１１】
本発明の組成物は、人間又は脊椎動物の薬物で用いるため、任意の便利な方式で投与するために剤形化され得る。したがって、本発明は、その範囲内に人間又は脊椎動物の薬物で用いるように適応された本発明の生成物を含む薬学的組成物を含む。
【０１１２】
好ましい具現例で、前記薬学的組成物は液体経口用剤形として便利に投与される。前記剤形の運搬には物理的な制約がないが、経口運搬が簡便かつ便利であり、経口用剤形は牛乳、ヤクルト及び乳児用流動食のような追加的な混合物を直ちに収容するので好ましい。他の経口用剤形は本技術分野によく知られており、錠剤、糖衣錠、ジェルキャップ（ｇｅｌｃａｐ）、カプセル及び医療用食品を含む。例えば、錠剤は濡れた、乾燥した又は流動化されたベッド（ｂｅｄ）顆粒化方法を利用する、よく知られた圧搾技術により製作され得る。
【０１１３】
このような経口用剤形は、一つ以上の適宜な賦形剤、希釈剤及び担体の補助で従来の方式通り用いるために提供され得る。薬学的に許容可能な賦形剤は、生物活性物質のための剤形の形成を助けるか形成するようにし、希釈剤、結合剤、滑沢剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｎｔ）、発色剤及び他の成分等を含む。保存剤、安定化剤、染料及び甚だしくは香味剤も薬学的組成物内に提供され得る。保存剤の例は、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。抗酸化剤及び懸濁化剤（ｓｕｓｐｅｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）も用いられ得る。賦形剤は、その所望の機能を行うことに加え、非毒性で、攝取時によく耐えられ、生物活性物質の攝取を妨げなければ薬学的に許容可能なものである。
【０１１４】
治療学的用途のため許容可能な賦形剤、希釈剤及び担体は薬学分野によく知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．  ２００５）に開示されている。薬学的賦形剤、希釈剤及び担体の選択は、所望の投与経路及び標準薬学的実務に係わり選択され得る。
【０１１５】
本発明で用いられたように、『薬学的に許容可能な』との表現は、一般に生理学的に容認されるものと看做される分子エンティティ（ｅｎｔｉｔｙ）及び組成物を表す。
【０１１６】
『患者』又は『対象』は哺乳動物を表し、人間及び脊椎動物対象を含む。
【０１１７】
アジュバント剤形又は前記アジュバントを含むワクチン組成物の用量は、疾患の本性、患者の病歴、投与頻度、投与方式、宿主からの前記製剤の除去などに伴い非常に変わるはずである。初期用量は多く、以後の維持用量は少ないこともある。前記用量は、効果的な免疫学的記憶を維持するため、毎月又は毎年のように希に投与され得る。
【０１１８】
『担体』との用語は、前記化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを表す。このような薬学的担体は、水及びピーナッツ油、大豆油、ミネラルオイル、胡麻油などのような石油、動物、植物又は合成起原のオイルを含むオイルのような滅菌された液体であり得る。水又は水溶液、生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液が、特に注射用溶液のための担体として好ましく導入される。他の一方で、前記担体は一つ以上の結合剤（圧搾された丸剤の場合）、滑沢剤、カプセル化剤、香味剤及び発色剤を含む固形剤形の担体であり得るが、これに限定されるものではない。適宜な薬学的担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる『Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ』に開示されている。
【０１１９】
さらに、本発明は、薬学的組成物及びワクチンを包括する。本発明の薬学的組成物及びワクチン組成物は、少なくとも一つの前記新規のシゲラ抗原及び一つ以上のアジュバントとともに薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。薬学的組成物及びワクチンの剤形化方法は、前述のＲｅｍｉｎｇｔｏｎの文献に開示されているように、本技術分野の熟練した当業者によく知られている。
【０１２０】
剤形。本発明の組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、エマルジョン化剤、アジュバント及び／又は担体を含むことができる。このような組成物は、多様なバッファ内容物（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテート、フォスフェート）、ｐＨ及びイオンの強度；界面活性剤及び可溶化剤のような添加剤（例えば、ツイン８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、二亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメルソル、ベンジルアルコール）及びバルキング（ｂｕｌｋｉｎｇ）物質（例えば、ラクトース、マンニトール）；前記物質をポリ乳酸、ポリグリコール酸などのようなポリマー性化合物の特定準備物又はリポソーム内に含ませることを含む。さらに、ヒアルロン酸も用いられ得る。例えば、引用により本発明に含まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．（１９９０，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  １８０４２）ｐａｇｅｓ  １４３５−１７１２  参照。
【０１２１】
本発明で用いるために考慮されるのは経口用固形剤形であり、引用により本発明に含まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．  １９９０（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ  １８０４２）の  Ｃｈａｐｔｅｒ  ８９に一般に開示されている。固形剤形は錠剤、カプセル、丸剤、トローチ（ｔｒｏｃｈ）、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、カシェ剤（ｃａｃｈｅｔ）、ペレット、粉末又は顆粒を含む。さらに、リポソーム性又はタンパク質性カプセル化が本発明の組成物を剤形化するため用いられ得る（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されたタンパク質性ミクロスフェア）。リポソーム性カプセル化が用いられ得、前記リポソームは多様なポリマーで誘導され得る（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療剤用に可能な固形剤形は、引用により本発明に含まれているＭａｒｓｈａｌｌ，  Ｋ．  Ｉｎ：  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，  Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｓ．  Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｔ．  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０，  １９７９に開示されている。一般に、前記剤形は、前記治療剤及び胃腸の環境に対し保護し、腸内で生物学的活性物質を放出させる不活性成分を含むはずである。
【０１２２】
さらに、本発明で用いるために考慮されるのは、薬学的に許容可能なエマルジョン、溶液、サスペンション及びシロップを含む経口投与用液体剤形であり、不活性希釈剤；アジュバント、湿潤剤、エマルジョン化剤及び懸濁化剤；及び甘味剤、香味剤、発色剤及び芳香剤を含む他の成分を含むことができる。
【０１２３】
経口用剤形の場合、放出位置は胃腸、小腸（十二指腸、空腸（ｊｅｊｕｎｕｍ）、回腸（ｉｌｅｕｍ））又は大腸であり得る。本技術分野の熟練した当業者は、例えば腸溶コーティング（ｅｎｔｅｒｉｃ  ｃｏａｔｉｎｇ）を用いることにより、胃腸では溶解されないものの、その物質を腸内の十二指腸又は他所に放出する剤形を利用することができる。腸溶コーティングとして用いられるより一般的な不活性成分の例は、セルロースアセテートトリメリテート（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ  ５０、ＨＰＭＣＰ  ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、ユードラジット（Ｅｕｄｒａｇｉｔ）Ｌ３０Ｄ、アクアテリック（Ａｑｕａｔｅｒｉｃ）、セルロースアセテートフタレート（ＣＡＰ）、ユードラジットＬ、ユードラジットＳ及びシェラック（Ｓｈｅｌｌａｃ）である。これらコーティングは、混合されたフィルムとして用いられ得る。
【０１２４】
さらに、コーティング又はコーティングの混合物は、胃腸に対する保護を目的にしない錠剤上に用いられ得る。これは、糖コーティング又は前記錠剤を呑みやすくするコーティングを含むことができる。カプセルは、乾燥した治療剤（即ち、粉末）の運搬用に硬質のシェル（ｈａｒｄ  ｓｈｅｌｌ）（例えば、ゼラチン）でなるか、液体形態の場合、軟質のゼラチンシェルが用いられ得る。カシェ剤のシェル物質は、厚い澱粉又は別の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、成形された錠剤又は錠剤研磨物の場合、湿気マッシング技術（ｍｏｉｓｔ  ｍａｓｓｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が用いられ得る。カプセル投与用物質の剤形はさらに、粉末、軽く圧搾されたプラグ、又は甚だしくは錠剤の形態であり得る。前記治療剤は、圧搾により製造可能である。
【０１２５】
当業者は、不活性物質を利用して治療剤の体積を希釈又は増加させることができる。前記希釈剤は炭水化物、特にマンニトール、β−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、変形したデキストラン及び澱粉を含むことができる。さらに、カルシウムトリホスフェート、炭酸マグネシウム及び塩化ナトリウムを含む特定無機塩も充填剤として用いられ得る。ある商業的に利用可能な希釈剤はＦａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ  １５００、エンコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）及びアビセル（Ａｖｉｃｅｌｌ）である。
【０１２６】
崩壊剤は、治療剤の剤形で固形剤形内に含まれ得る。崩壊剤として用いられる物質は、澱粉、澱粉基盤の市販される崩壊剤、Ｅｘｐｌｏｔａｂ、ナトリウム澱粉グリコレート、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ウルトラミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、橙皮、酸カルボキシメチルセルロース、天然スポンジ及びベントナイトを含むが、これに限定されるものではなく、これら全てが用いられ得る。前記崩壊剤はさらに、不溶性カチオン性交換樹脂であり得る。粉末化されたガムが崩壊剤及び結合剤として用いられ得、アガー、カラヤ（Ｋａｒａｙａ）又はトラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）のような粉末化されたガムを含むことができる。アルギン酸及びそのナトリウム塩もまた崩壊剤として有用である。結合剤は、治療剤とともに取って硬質錠剤を形成するのに使用可能であり、アカシア、トラガカント、澱粉及びゼラチンのような天然生成物由来の物質を含む。他のもの等にはメチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）全て、アルコール性溶液内で前記ペプチド（又は誘導体）を顆粒化するのに用いられ得る。
【０１２７】
剤形工程の間にくっ付くことを防止するため、ガンマ剤（ａｎｔｉｆｒｉｃｔｉｏｎａｌ  ａｇｅｎｔ）が前記剤形内に含まれ得る。潤滑剤が前記ペプチド（又は誘導体）と金型壁（ｄｉｅ  ｗａｌｌ）との間に層として用いられ得、潤滑剤はそのマグネシウム及びカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油及びワックスを含むが、これに限定されるものではない。さらに、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、多様な分子量のポリエチレングリコール、カルボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ）４０００及び６０００などの可溶性潤滑剤が用いられ得る。
【０１２８】
剤形化する間に薬物の流動特性を改善し、圧搾する間に再配列を助けることのできる滑沢剤が添加され得る。前記滑沢剤は澱粉、タルク、発熱性シリカ及び水和されたケイアルミン酸を含むことができる。
【０１２９】
水性環境中へ治療剤が溶解されることを補助するため、界面活性剤が湿潤剤として添加されてもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム及びスルホン酸ジオクチルナトリウムなどのアニオン性洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）を含むことができる。カチオン性界面活性剤が使用可能であり、塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）又はベンゾエトミウムクロリド（ｂｅｎｚｅｔｈｏｍｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含むことができる。界面活性剤として剤形中に含めることができる潜在的な非イオン性洗剤のリストは、ラウロマクロゴール（ｌａｕｒｏｍａｃｒｏｇｏｌ）４００、ポリオキシル４０ステアリン酸、ポリオキシエチレン水和された（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ）ヒマシ油１０、５０及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５及び８０、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、単独に又は相違する比の混合物として前記タンパク質または誘導体の剤形中に存在し得る。
【０１３０】
放出が調節される経口用剤形が本発明の実施において用いられ得る。前記治療剤は、拡散、又は例えばガムのような浸出（ｌｅａｃｈｉｎｇ）メカニズムにより放出を可能にする不活性マトリックス中に組み込むことができる。遅変性マトリックスもまた、前記剤形中に組み込んでもよい。ある腸溶コーティングはさらに、遅延性放出効果を有する。別の形の調節された放出は、オロス（Ｏｒｏｓ）治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく、即ち、前記治療剤が、浸透作用によって単一の小さな開口部を通って、水が入り、製剤は外へ押し出すようにする半透過性膜内に入っている方法によるものである。
【０１３１】
他のコーティングが、前記剤形に用いられ得る。これらは、コーティングパンに適用できる多様な糖を含む。前記治療剤はさらに、フィルムコーティングされた錠剤内で提供可能であり、この場合に用いられる物質は、２群に分けられる。第１は、非腸溶（ｎｏｎｅｎｔｅｒｉｃ）物質であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、プロビドン及びポリエチレングリコールを含む。第２の群は、一般にフタル酸のエステルである腸溶物質からなる。物質の混合物が、最適のフィルムコーティングを提供するため用いられ得る。フィルムコーティングは、パンコーティング機又は流動床中で、又は圧縮コーティングによって行われ得る。
【０１３２】
一具現例で、本発明に開示されたシゲラポリペプチド抗原は、薬学的に許容可能な希釈剤とともに投与される。このような剤形は、注射（皮下、皮内、筋肉内）により投与されるか、接着性パッチを利用して肌上に局所塗布され得る。他の一方で、前記ワクチンは薬学的に許容可能なビヒクルを利用して粘膜性経路（経口、口腔、舌下、点鼻液、エーロゾル、直腸）により投与される。前記抗原はさらに、後続する免疫反応を向上させるためアジュバントとともに混合され得る。このようなアジュバントの例には、アルミニウム塩、ＩＳＣＯＭ、サポニン系アジュバント、水中油型及び油中水型エマルジョン、ムラミルジペプチドのようなトール様受容体リガンド、大腸菌ＬＰＳ、メチル化されないＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、リポテイコ酸、ペプチドグリカンがあり、これに限定されるものではない。腸毒素及びそのアジュバントはコレラ毒素、熱−敏感性大腸菌腸毒素、百日咳毒素、志賀毒素及び類似体のような活性誘導体である。
【０１３３】
非経口投与のための本発明に係る製造物は、滅菌された水性又は非水性溶液、サスペンション又はエマルジョンを含む。非水性溶媒又はビヒクルの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル及びコーンオイルのような植物性オイル、ゼラチン及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。このような剤形はさらに、アジュバント、保存剤、湿潤剤、エマルジョン化剤及び分散剤を含むことができる。前記薬学的組成物は、例えば、バクテリア保持フィルタを通して濾過するか、滅菌剤を組成物中に組み込むか、組成物に放射能処理をするか、又は組成物を加熱することによって滅菌してもよい。それらはまた、使用の直前に、滅菌水又は幾つかのその他の滅菌された注射可能な媒体を用いて製造してもよい。
【０１３４】
ワクチン。ワクチンの場合において、アジュバントなく抗原を単独に利用する１次チャレンジ（ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）は、体液性又は細胞性免疫反応を起こすのに失敗するとのことが度々観察される。したがって、本発明のワクチンはコレラ毒素、アジュバント特性を有する切片及び突然変異体又は誘導体、大腸菌熱−敏感性腸毒素、アジュバント特性を有する切片及び突然変異体又は誘導体、水中油型及び油中水型エマルジョン、ムラミルジペプチドのようなトール様受容体リガンド、大腸菌ＬＰＳ、メチル化されないＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、リポテイコ酸及びペプチドグリカンを含むが、これに限定されるものではないアジュバントを含むことができる。腸毒素及びそのアジュバントはコレラ毒素、熱−敏感性大腸菌腸毒素、百日咳毒素、志賀毒素及び類似体のような活性誘導体である。完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、アルミニウムヒドロキシドのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル又は炭化水素エマルジョン、キーホールリンペットヘモシニアン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、及びＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）及びコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用な人間アジュバントのような他のアジュバントが用いられ得る。アジュバントは、抗原を徐々に放出する組職の貯蔵所（ｄｅｐｏｔ）、又は免疫反応を非特異的に向上させるリンパ系活性剤として機能することができる（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，  １９８４，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ｃｕｍｍｉｎｇｓ：  Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ｐ．３８４）。ワクチンが人間対象で用いるための意図であれば、前記アジュバントは薬学的に許容可能でなければならない。
【０１３５】
投与。このような薬学的組成物及びワクチンは、経口（固形又は液体）、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）又は皮下注射）、経皮内（受動的に又はイオン移動（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）又は電気穿孔を利用して）、粘膜内（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）（鼻、腟、直腸又は舌下）、又は吸入投与経路、又は生分解性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）挿入体を利用して投与可能であり、それぞれの投与経路に適した剤形に剤形化され得る。
【０１３６】
一つの好ましい具現例で、前記組成物又はワクチンは、肺運搬（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）により投与される。前記組成物又はワクチンは、吸い込む間に哺乳動物の肺に運ばれ、肺の上皮ライニング（ｌｉｎｉｎｇ）を横切って血流に入り込む  ［例えば、Ａｄｊｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９０；  ７：５６５−５６９；  Ａｄｊｅｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １９９０；６３：１３５−１４４  （ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ  ａｃｅｔａｔｅ）；  Ｂｒａｑｕｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １９８９；１３（ｓｕｐ５）：１４３−１４６  （ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１）；  Ｈｕｂｂａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｖｏｌ．ＩＩＩ，  ｐｐ．  ２０６−２１２  （ａ１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ）；  Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９８９；８４：１１４５−１１４６  （ａ−１−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）；  Ｏｓｗｅｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  『Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ』，  １９９０；  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ＩＩ  Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，  Ｃｏｌｏｒａｄｏ  （ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ）；  Ｄｅｂｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９８８；１４０：３４８２−３４８８  （ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａ）；及びＰｌａｔｚなどの米国特許第５，２８４，６５６号（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）参照］。全身性効果のための薬物の肺運搬用方法及び組成物は、Ｗｏｎｇなどの米国特許第５，４５１，５６９号に開示されている。さらに、Ｌｉｃａｌｓｉなどの米国特許第６，６５１，６５５号を参照。
【０１３７】
本発明の実施に用いるため、治療用生成物の肺運搬のためにデザインされたネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）、計量された用量吸入器及び粉末吸入器を含むが、これに限定されるものではない多様な範囲の機械装置が考慮され、これら全ては本技術分野の熟練した当業者において慣れている。本発明の実施のため適した商業的に利用可能な装置のある特定の例は、ウルトラベント（Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ）ネブライザー（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）；エーコン（Ａｃｏｒｎ）ＩＩネブライザー（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，  ＣＯ）；ベントリン（Ｖｅｎｔｏｌｉｎ）  計量された用量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣ）；及びスピンヘイラ（Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ）粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）である。このような全ての装置は、前記治療剤の調剤に適した剤形を用いることを要する。典型的に、それぞれの剤形は、導入される装置の類型に特異的であり、治療に有用な通常の希釈剤、アジュバント、界面活性剤及び／又は担体以外に適切な噴射剤（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ）物質を用いることを含むことができる。さらに、リポソーム、マイクロカプセル又はミクロスフェア、包接錯体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）又は他の類型の担体を用いることが考慮される。
【０１３８】
計量された用量吸入装置とともに用いるための剤形は、一般に界面活性剤の補助で噴射剤中にサスペンドされた治療剤を含む微細に分けられた粉末を含むはずである。前記噴射剤はクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン又はトリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含む炭化水素、又はそれらの組合せのように、このような目的のため導入される任意の従来の物質であり得る。適宜な界面活性剤は、トリオレイン酸ソルビタン及びダイズレシチンを含む。さらに、オレイン酸も界面活性剤として有用であり得る。
【０１３９】
粉末吸入装置から調剤するための剤形は、前記治療剤を含む微細に分けられた乾燥した粉末を含むはずであり、さらにラクトース、ソルビトル、スクロース又はマンニトールのようなバルキング製剤を、例えば前記剤形の５０〜９０重量％のように、前記装置から粉末が分散されることを促進する量で含むはずである。前記治療剤は最も有益には、最も効果的に遠位肺まで運ぶため、１０ｍｍ（又はμｍ）以下、最も好ましくは０．５〜５ｍｍの平均粒子大きさの粒子形態で準備されなければならない。
【０１４０】
さらに、前記治療剤の鼻腔又は他の粘膜性運搬が考慮される。鼻腔運搬は、前記組成物を鼻に投与した後、前記生成物が肺内に沈着する必要がなく、直接血流へ通過するようにする。鼻腔運搬用剤形は、アジュバントとしてデキストラン又はシクロデキストラン及びサポニンを有するものらを含む。
【０１４１】
本発明の組成物又はワクチンは、一つ以上の追加的な活性成分、薬学的組成物又はワクチンとともに結合され投与され得る。本発明の治療剤は動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは人間に投与され得る。
【０１４２】
用量。
本技術分野に良好に確立された方法論に従い、試験管内テストで良好に行われる本発明の化合物及び組成物の効果的な用量及び毒性は、前記シゲラ抗原、ポリペプチド、薬学的又はワクチン組成物が治療学的に有効なものと表れており、これら薬物が人間の臨床試験に対し提案された同一の経路により投与可能な小さな動物モデル（例えば、マウス又はラット）を利用する前臨床研究で決定される。
【０１４３】
本発明で用いられるための剤形又は用量は、本発明で開示された成分等を治療学的有効量に含む必要はないが、その理由は、このような治療学的有効量はこのような剤形又は服用形態を複数で投与することにより達成可能であるためである。
【０１４４】
本発明の方法で用いられる任意の薬学的組成物において、前記治療学的に効果的な用量は、先ず動物モデルから推定され得る。以後、動物システムから得た用量−反応カーブは、人間で初期臨床研究のためのテスティング用量を決定するのに用いられる。それぞれの組成物に対し安全性を決定するにおいて、投与量及び頻度は臨床試験で用いるように予測されるものらを満たすか、これを上回らなければならない。
【０１４５】
本発明で開示されているように、本発明の組成物中の成分等の用量は、持続的に又は間歇的に投与される用量が、動物テスト及び患者の個別的な症状の結果を考慮した後に決定される量を超過しないことを保証するように決定される。
勿論、特定用量は服用手続、年齢、体重、性別、敏感性、食べ物、服用期間、組合せで用いられる薬物及び疾患の重症度のような、患者又は対象動物の症状に従い変化する。ある条件下の適宜な用量及び服用時間は、前述の指標基盤のテストにより決定され得るが、標準臨床技術に従い、実務者の判断及びそれぞれの患者の状況（年齢、一般的な症状、症候の重症度、性別など）により調整され最終的に決定可能である。
【０１４６】
本発明の組成物の毒性及び治療学的効能は、実験動物での標準薬学的手続により、例えばＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な（ｌｅｔｈａｌ）用量）及びＥＤ５０（母集団の５０％に治療学的に効果的な用量）を測定することにより決定され得る。治療及び毒性効果の間の用量比は治療学的指数であり、これはＥＤ５０／ＬＤ５０の比で表され得る。大きい治療指数を表す組成物が好ましい。
【０１４７】
動物研究から得られたデータは、人間で用いるための用量範囲を剤形化するのに用いられ得る。人間での治療学的に効果的な用量は、好ましくは毒性が殆どないかないＥＤ５０を含む循環する濃度範囲内に置かれている。前記用量は、導入される剤形及び利用される投与経路に従い、このような範囲内で変わり得る。理想的には、それぞれの薬物の単一な用量が毎日用いられなければならない。
【実施例】
【０１４８】
以下、実施例１〜実施例１４で導入される物質及び方法を開示する。
【０１４９】
物質及び方法
シゲラＳｉｇＡ２及びＩｃｓＰ２ポリペプチドのクローニング、発現及び錠剤
【０１５０】
タンパク質抗原のＤＮＡ配列は、前述のように利用可能である（３７）。シゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７ＴのＳｉｇＡ  ＤＮＡ配列は、遺伝子銀行の寄託番号［Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＥ０１４０７３］から入手した。さらに、シゲラ・フレックスネリ５ａ菌株Ｍ９０ＴのｉｃｓＰ  ＤＮＡ配列は、遺伝子銀行の寄託番号［Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＬ３９１７５３］から入手した。相違するシゲラ種間のヌクレオチドの相同性及びアミノ酸配列の同一性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は９９％以上である。ＤＮＡ切片を商業的に利用可能な大腸菌過剰発現プラスミドｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）内に挿入させ、ＴＡＬＯＮ金属−親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）を利用して製造社の指針に従い精製した。
【０１５１】
プライマー：
ＩｃｓＰ２切片がシゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ菌株由来であれば、ＩｃｓＰ２プライマーセットＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＧＧＧＧＧＧＡＧＣ及びＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＴＡＣＴＴＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴを増幅のために用いた。増幅された切片（配列番号１、３９０  ｂｐ、下線を引いた配列）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化させた（図１２にボックスで表した配列）。
【０１５２】
ＳｉｇＡ２プライマーセットＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡ及びＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＴＣＧＣＣＴＧをシゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ菌株由来のＳｉｇＡ２切片の増幅のために用いた。増幅された切片（配列番号３、７９５  ｂｐ、下線を引いた配列）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化させた（図１３ｂにボックスで表した配列）。
【０１５３】
増幅されたＩｃｓＰ２切片及びＳｉｇＡ２切片をｐＥＴ２１ｄのＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位内に挿入させ、再組合ＤＮＡはシーケンシングを利用して確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）バクテリアをそれぞれの再組合プラスミドで形質転換させ、３７℃で培地内の０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）によりタンパク質の過剰発現を誘導した。それぞれの切片を過剰発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を収穫しており、冷凍／解凍した後、６Ｍウレア（ｕｒｅａ）の存在下で音波処理して破砕した。大腸菌抽出物を１２，０００×ｇで遠心分離し、上澄液を予め平衡化された（１×結合バッファ：２０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ  ７．９、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール及び６Ｍウレアを利用する）ＴＡＬＯＮ樹脂コラム（３ｍｌ）上にローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）した。前記コラムを２０ｍｌの１×結合バッファ及び３０ｍｌの１×洗浄バッファ（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ  ７．９、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール及び６Ｍウレア）を利用して洗浄し、前記タンパク質を１×湧出バッファ（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ  ７．９、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール）により湧出した。
【０１５４】
さらに他のＩｃｓＰの切片も、前述のようにサブクローニングした（プライマーセットＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＴＡＡＣＴＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴ及びＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＴＧＴＡＡＣＧＡＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＡ）。
【０１５５】
ｉｃｓＰ及びｓｉｇＡ遺伝子が破砕された突然変異体菌株（シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ背景）の構築：ｉｃｓＰ及びｓｉｇＡ遺伝子が破砕された突然変異体菌株を、対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）交換法（１７）を利用して個別的に構築した。簡単に、ｉｃｓＡ切片の場合はプライマーＩｃｓ５Ｔｒ／Ｉｃｓ３Ｔｒ（５’−ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＡＣＣＡＣＴＡＡＣＴＡＴＣＣＡＣＴＴ−３’／５’−ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＧＧＴ  ＣＣＡ−３’）を利用し、ｓｉｇＡ切片の場合はＳｉｇ５Ｔｒ／Ｓｉｇ３Ｔｒ（５’−ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＡＧＴ−３’／５’−ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＴＡ  ＣＧＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＴＧＡ−３’）を利用してｉｃｓＰ及びｓｉｇＡの内部３００ｎｔ  ＤＮＡ切片（ヌクレオチド６１から３６０まで）を増幅した。前記切片等を自殺プラスミドｐＳＷ２３．ｏｒｉＴ内に挿入させた。前記再組合プラスミドｐＳＷｉｃｓＰＴｒ及びｐＳＥｓｉｇＡＴｒを利用して大腸菌菌株ＢＷ１９６１０（ｐｉｒ＋  ＡｍｐＳ  Ｃｍｒ）を形質転換させた。それぞれのプラスミドをＢＷ１９６１０から精製しており、大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒ（ｐｉｒ＋  Ｔｒａ＋  ＡｍｐＳ  Ｃｍｒ）を形質転換させるために用いた。大腸菌ＳＭ１０λｐｉｒをシゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔと共に接合させ、クロラムフェニコール抵抗性シゲラ・フレックスネリをコンゴレッド／ストレプトマイシン／クロラムフェニコールプレート上で単離した。それぞれのノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）菌株において、毒性プラスミド及びゲノム上の遺伝子は二つの切片に分けられる：３６０ヌクレオチドの５’末端切片と３’末端切片。このような突然変異菌株上のそれぞれの遺伝子の破砕は、ＰＣＲ及びシーケンシングにより確証した。それぞれの菌株を免疫されたマウスをチャレンジするために用いた。
【０１５６】
さらに、３種の別のＳｉｇＡタンパク質の切片を、次のようなプライマーセットを利用して前述のように精製した：ＳｉｇＡ１切片のプライマーセット：ＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＴＧＧＣＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＴＧＣ及びＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡ（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを利用した８２４ｂｐ切片）、ＳｉｇＡ３切片のプライマーセット：ＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡ及びＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＧＣＣＡＴＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＡ（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩを利用した８２２ｂｐ切片）、及びＳｉｇＡ４切片のプライマーセット：ＣＣＣＧＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＡＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧ及びＣＧＧＣＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＡＡＣＧＧＡＡＧＴＴＧＧ（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩを利用した７０２ｂｐ切片）。前述のように、これら切片を過剰発現及び精製した。前記ＳｉｇＡ１切片は免疫原性を見せていたが保護してはいず、ＳｉｇＡ３及びＳｉｇＡ４切片はマウスで抗体反応を誘発しなかった。全てのプライマーは、ゼノテク社（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ、Ｔａｅｊｏｎ、Ｋｏｒｅａ）から購入した。
【０１５７】
バクテリア菌株
シゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７Ｔ及びシゲラ・フレックスネリ５ａ菌株Ｍ９０Ｔは、フィリップ・サンソネッティ博士（Ｄｒ．  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，  Ｐａｒｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）により提供された。
【０１５８】
シゲラ・ボイディ（ＩＢ８２９５）血清型１は、２００２年に収集されたパキスタンの疫痢患者から入手した（国際ワクチン研究所の所蔵品）。
【０１５９】
シゲラ・ソンネイ（ＩＢ４２００）は、２００４年にインドから収集された疫痢患者から入手され、Ｇ．Ｂ．ネア博士（Ｄｒ．Ｇ．Ｂ．Ｎａｉｒ，ＮＩＣＥＤ，Ｉｎｄｉａ）により提供された。
【０１６０】
シゲラ・ディセンテリアエ血清型１は、Ｄ．コペコ博士（Ｄｒ．Ｄ．Ｋｏｐｅｃｋｏ，ＦＤＡ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）により提供された。
【０１６１】
動物の免疫
全ての動物は、国際指針に従い国際ワクチン研究所（ソウル）の動物保護施設で特定病原体不在の条件下で維持され、本発明で開示された全ての実験は動物実験に対する国際ワクチン研究所の倫理委員会により承認された。
【０１６２】
本発明の目的のため、免疫性アジュバントは『特定のワクチン抗原と組合せで用いられるとき、抗原特異的免疫反応を加速、持続又は向上させる作用をする任意の物質』（Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，  ｂｙ  Ｓｈｉｎ  Ｓａｓａｋｉ  ａｎｄ  Ｋｅｎｊｉ  Ｏｋｕｄａ．  Ｉｎ  Ｄ．Ｂ．  Ｌｏｗｒｉｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｇ．  Ｗｈａｌｅｎ  （ｅｄｉｔｏｒｓ），  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００．  ＩＳＢＮ  ９７８−０−８９６０３−５８０−５）であるだけでなく、『ワクチンに対する免疫反応をブースティングして少ないワクチンが必要であるように助けるために用いられる物質』（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｔｅｍｐｌａｔｅｓ／ｄｂ＿ａｌｐｈａ．ａｓｐｘ  ＣｄｒＩＤ＝４３９８７）に定義される。コレラ毒素、メチル化されていないＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）及びアルミニウム塩は、抗原と共に投与されるときの公知のアジュバントである。
【０１６３】
５〜６週齢のめすＢａｌｂ／ｃマウスを多様な経路で投与してタンパク質抗原を免疫させた。用量：それぞれの免疫において、２５μｇ用量のタンパク質抗原を等張の発熱体−不在ホスフェート−バッファ生理食塩水、ｐＨ  ７．４（ＰＢＳ）内でアジュバントと混合した。前記アジュバントは、コレラ毒素（ＣＴ）（３〜５μｇ／用量）、ＣｐＧ  ＯＤＮ（４μｇ／用量）又はアルミニウムヒドロキシド（ａｌｕｍ）からなっている。
【０１６４】
腹腔内投与
合計０．２ｍｌ体積のＰＢＳ内で２５μｇのタンパク質抗原を、アジュバントと共に又はアジュバントなく腹腔内注射で投与した。マウスを２週間隔で３回免疫させた。
【０１６５】
鼻腔内投与
２５μｇのタンパク質抗原を３μｇのコレラ毒素（ＣＴ）と共に混合し、それぞれの鼻孔を介し５０μｌの総体積（鼻孔当り大凡２５μｌ）で投与した。２週及び４週後、同一の条件下でマウスを再び免疫させた。
【０１６６】
直腸投与
１００μｇのタンパク質抗原をＣＴ（５μｇ）と混合し、直腸肛門の穴内に挿入されたピペットを利用して０．２ｍｌの最終体積で投与した。ギニーピッグをそれぞれの免疫の間に２週間隔で３回免疫させた。
【０１６７】
疫痢の動物モデル
マウス肺炎モデル：５０μｌ  ＰＢＳ内の２×１０７  ＣＦＵのシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７Ｔを免疫されたマウスの鼻孔に接種した。動物を１０日間毎日観察した。シゲラ・フレックスネリ５ａ菌株Ｍ９０Ｔ及びシゲラ・ディセンテリアエ１菌株もチャレンジ実験に用いた。
【０１６８】
ギニーピッグ角結膜炎モデル：シゲラタンパク質抗原をアジュバントであるＣＴと共に３回連続的に免疫させた最後の１週後、ギニーピッグを麻酔させ、１×１０５  ｃｆｕ／２０μｌのシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７Ｔをギニーピッグの眼の結膜嚢内に注入した。眼周囲の症候を４〜５日間毎日観察した。全身性免疫と比べるため、５０μｇのタンパク質を３μｇのＣＴと共に２週間隔で３回腹腔内経路を介し投与し、免疫されたギニーピッグを前述のように最終免疫１週後にチャレンジした。
【０１６９】
ギニーピッグ大腸炎モデル：最近開発された腸の疫痢モデル（３０）を使って本発明に開示された新規のシゲラ共通タンパク質抗原の保護効能を評価した。簡単に、シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔ（１×１０９  ＣＦＵ）又はシゲラ・フレックスネリ５ａ菌株Ｍ９０ＴをＳｈｉｍ、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｃｈａｎｇなどにより開示されているように、５週齢のギニーピッグの直腸肛門の穴を介し注入して投与した（３０）。疫痢症候（下痢、裏急後重（ｔｅｎｅｓｍｕｓ））に対し毎日動物を調査した後、結腸組職検体を解剖学的に分析する前にペントバルビタールを過量投与して動物を犠牲させた。
【０１７０】
シゲラ共通タンパク質抗原に対する全身性及び粘膜性免疫反応の測定
生物学的流体の収集
血清及び分泌物（唾液、腟及び直腸洗浄物）を一番目に免疫させる１週間前に収集し、１週後それぞれ免疫させた。
【０１７１】
器官抽出物及び細胞サスペンション単離物の製造
最後の免疫１週後、マウスをペントバルビタールで麻酔させ、０．２ｍｌ生理食塩水内の１２５  ｉ．ｕ．のヘパリン（ＳＩＧＭＡ、ＭＯ、ＵＳＡ）を腹腔内注射した。心臓から直接採血した後、頚椎脱臼でマウスを犠牲させた。肺が脹れ上がって綺麗になるまで心臓の右心室内にヘパリン（１０  ｉ．ｕ．／ｍｌ）を含むＰＢＳ  １５ｍｌを注射して灌流させた。微細に切断された肺切片をＤＮａｓｅ  １（０．１ｍｇ／ｍｌ）が補充されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｕ．Ｋ．）内のコラゲナーゼＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ）で３７℃で３０分間消化させ、単一細胞サスペンションを細胞ストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒ）を介し濾過して収集した。ナイロン篩を介し脾臓を押圧することにより、脾臓から単一細胞サスペンションを得た。全てのサスペンションは、アンモニウムクロライドを処理することにより赤血球を除去し、洗浄しており、５％  ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地に再浮遊させた後、後述するＥＬＩＳＰＯＴ分析により分析されるまで（３０分以内）氷上に保管した。
【０１７２】
細胞のない器官抽出物を製造するため、ＰＥＲＦＥＸＴ技術（３４）を用いた。灌流された動物の肺を切断し、小さい（２〜３ｍｍ厚さ）切片にスライスした後、一定に撹拌しながらヘパリンを含むＰＢＳ内で３７℃で３０分間インキュベーションすることにより再灌流させた。遠心分離（５００ｒｐｍ、３分）により切片をペレット化し、トリトンＸ１００、ＰＭＳＦ及びプロテアーゼ抑制剤でなる抽出バッファ内に再浮遊させた（３４）。サンプルを液体窒素内で急遽凍結させ、−７０℃に保管した。使用前にサンプルを室温で解凍し、遠心分離した（２，０００ｒｐｍ、５分）。上澄液を収集し、後述したようにＥＬＩＳＡにより特定抗体の活性を分析した。
【０１７３】
抗体ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）
血清、分泌物及び組職ＰＥＲＦＥＸＴ抽出物内のシゲラ共通タンパク質抗原に対する抗体のレベルを標準固相酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）により推定した。ポリスチレン  ９６−ウェルプレート（ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の個別ウェルをそれぞれのタンパク質でコーティングし（１μｇ／ｍｌのＰＢＳ；０．１ｍｌ／ウェル；周囲温度で一晩中インキュベーション）、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳ内の５％（体積／体積）脱脂乳でブロッキングし（０．２ｍｌ／ウェル；周囲温度で３０分）、ＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄した。ＰＢＳ−ツイーン内のサンプルを５％脱脂乳溶液で２倍ずつ連続希釈し、周囲温度で２時間の間抗原コーティングされたウェルでインキュベーションし、プレートをＰＢＳ−ツイーンで３回洗浄して結合されない抗体を除去した。次に、適切に希釈された（１／５，０００）西洋ワサビペルオキシダーゼと接合された山羊抗−マウスＩｇＡ又はＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）を含むＰＢＳ−ツイーン０．１ｍｌを個別ウェルに添加した。以後、前記プレートをＰＢＳで３回洗浄し、発色性酵素基質を添加した後、酵素結合活性をモニタリングした。５０μｌの０．５  Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加することにより色の発生を中断させ、ＥＬＩＳＡ判読器を利用して分光光度法（Ｏ．Ｄ４５０）で測定した。データは幾何平均抗体力価で表現しており、力価は対照群（サンプルなし）に添加されたものと同一であるか、それ以上の吸光度値を生成する最も多く希釈されたサンプルの逆数として定義した。
【０１７４】
ＥＬＩＳＰＯＴ分析：シゲラタンパク質抗原に対し特異的な抗体を生成する細胞の頻度を、酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）分析により測定した（４）。比較のため、コレラ毒素（ＣＴ）に対する抗体を生成する細胞の頻度を適用可能時に測定した。簡単に、１０μｇのコレラ毒素、５０μｇのＳｉｇＡ２、及びＰＢＳで希釈された１００μｇのＳｉｇＡ２タンパク質を、底にニトロセルローズのある９６−ウェルＨＡプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）の個別ウェルに添加した。４℃で一晩中インキュベーションした後、それぞれのウェルをＰＢＳで洗浄し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ培養培地（ＧＩＢＣＯ，ＵＫ）でブロッキングした。免疫されたマウスの肺及び脾臓細胞サスペンションを、ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で２倍ずつ連続希釈（ウェル当り８００，０００個の単核細胞から始める）してインキュベーションした。３７℃で４時間インキュベーションした後、個別ウェルをＰＢＳで５回、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼが接合された、マウスＩｇＧ又はマウスＩｇＡに対する山羊抗体を含むＰＢＳ−ツイーン（１：１，０００希釈）０．１ｍｌに室温で１時間の間露出させた。ＰＢＳ−ツイーンで３回、ＰＢＳで４回洗浄した後、スポットが消失するまで色原体（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）基質に１０〜２０分間ウェルを露出させた。以後、プレートを流れる水道水で洗浄した後乾燥した。以後、立体顕微鏡を利用してスポットを計数した。データは、百万個の細胞に調整されたスポット−形成細胞（ＳＦＣ）の数として表現した。
【０１７５】
実施例１
ＩｃｓＰ２を利用した粘膜性免疫は、シゲラ・フレックスネリ２ａにより誘導された肺炎に対しマウスを保護する。
マウスを前述のように、鼻腔内経路によりＣＴと共にＩｃｓＰ２で免疫させた。動物を致死用量のシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７Ｔでチャレンジした。図１の結果は、ＩｃｓＰタンパク質を利用した免疫は、シゲラ・フレックスネリ２ａを利用した肺チャレンジに対し動物を保護するとのことを示す。図１に示した結果から、弱毒化されたシゲラ・フレックスネリ生菌ワクチン菌株（ＳＣ６０２）を鼻腔内投与しても、チャレンジに対しマウスを保護するとのことを示す。
【０１７６】
実施例２
ＩｃｓＰ２を利用した粘膜性免疫は、独特の血清型のシゲラ・フレックスネリにより誘導された肺炎に対しマウスを保護する。
マウスを前述のように、鼻腔内経路によりＣＴと共にＩｃｓＰ２で免疫させた。動物を致死用量のシゲラ・フレックスネリ５ａ菌株Ｍ９０Ｔ（５０μｌ内の２×１０７  ＣＦＵ）でチャレンジした。図２の結果は、ＩｃｓＰタンパク質を利用した免疫は、シゲラ・フレックスネリ５ａを利用した肺チャレンジに対し動物を保護するとのことを示す。逆に、生きている弱毒化されたシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株（ＳＣ６０２）を鼻腔内投与すれば、相違する（５ａ）血清型に属するシゲラ菌株に対しマウスを保護することに失敗した（図２の黒四角で要約されている結果により見せられた通りである）。
【０１７７】
実施例３
ＩｃｓＰ２を利用した粘膜性免疫は、シゲラ・ディセンテリアエにより誘導された肺炎に対しマウスを保護する。
マウスを前述のように、鼻腔内経路によりＣＴと共にＩｃｓＰ２で免疫させた。動物を致死用量のシゲラ・ディセンテリアエタイプ１（Ｄ．Ｋｏｐｅｃｄｋｏ博士（ＦＤＡ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）により提供された菌株）でチャレンジした。
【０１７８】
図３で提供された結果は、動物がＩｃｓＰ２で免疫されるとき、動物は他のシゲラ種、即ちシゲラ・ディセンテリアエタイプ１によるチャレンジに対し保護されるとのことを示す。逆に、生きている弱毒化されたシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株であるＳＣ６０２は、シゲラ・ディセンテリアエタイプ１を利用した致死的な肺チャレンジに対しマウスを保護することに失敗した。
【０１７９】
前記実験から、ＩｃｓＰ２は独特の血清型に属するシゲラ・フレックスネリを利用した粘膜性感染に対してだけでなく、シゲラ・ディセンテリアエのような相違するシゲラ種によりもたらされる感染に対しても保護するとの結論を下ろすことができる。
【０１８０】
実施例４
ＳｉｇＡ２を利用した粘膜性免疫は、シゲラ・フレックスネリ２ａ（２４５７Ｔ）チャレンジに対しては保護するものの、シゲラ・フレックスネリ５ａ（Ｍ９０Ｔ）に対しては保護しない。
ＳｉｇＡタンパク質は、シゲラ・フレックスネリ２ａでのみ排他的に存在し、他の血清型のシゲラ・フレックスネリでは存在しないものと知られている（１）。ＳｉｇＡ２タンパク質で免疫されたマウスを、致死用量のシゲラ・フレックスネリ２ａ（２４５７Ｔ、黒丸）及びシゲラ・フレックスネリ５ａ（Ｍ９０Ｔ、黒四角）でチャレンジした。２４５７Ｔでチャレンジされたマウスは８０％の生存を見せたが、シゲラ・フレックスネリ５ａでチャレンジされたマウスは、バクテリアにより誘導された肺炎により死んだ。ＰＢＳで免疫されたマウスは、２４５７Ｔ（図４の白丸）及びＭ９０Ｔ（図４の白四角）の二つの菌株により１００％死ぬとのことを見せた。
【０１８１】
実施例５
ＩｃｓＰ２を利用した免疫は、実験的な角結膜炎に対し保護する。
【０１８２】
ギニーピッグを前述のように、ＩｃｓＰ２及び対照群（ＰＢＳで免疫されたシャム（ｓｈａｍ））で免疫させた。ＩｃｓＰ２及びＣＴを利用した３回の連続的な免疫の最後の免疫１週後に、動物を１×１０５コロニー形成単位の毒性シゲラ・フレックスネリ２ａ  ２４５７Ｔを利用して鼻腔内又は腹腔内経路により投与してチャレンジした。以後、チャレンジ２４時間及び４８時間後に眼の炎症（角結膜炎）の症状及び強度に対しギニーピッグを調査した。検出可能な炎症のない動物は保護されたものと看做した。下記表１で見られるところのように、鼻腔内又は腹腔内経路により投与されたＩｃｓＰ２で免疫された動物の４０〜５０％がシゲラにより誘導された角結膜炎に対し保護されたが、対照群動物（ＰＢＳで処理される）は全て角結膜炎を表した。
【表１】
0005382380.tif 000002
【０１８３】
実施例６
ＩｃｓＰ２、ＳｉｇＡ２を利用した免疫は、シゲラにより誘導された実験的な直腸結腸炎に対し保護する。
ＩｃｓＰ２、ＳｉｇＡ２、ＳＣ６０２及びＰＢＳで免疫されたギニーピッグを、１×１０９  ＣＦＵの接種物（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）で毒性シゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７でチャレンジしており、接種２４時間後下痢、結腸の出血及び裏急後重の頻度に対し調査した。表２に見られるところのように、対照群（ＰＢＳ処理される）動物は全て直腸結腸粘膜の出血を見せており、これら大部分は下痢（固形大便なし）をし、直腸の裏急後重とも呼ばれる大便の捻挫症状を表した。逆に、ＳｉｇＡ２で免疫された動物は直腸結腸炎の症状がなかったが、裏急後重は表した。生きている弱毒化されたシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株ＳＣ６０２で免疫された動物は、毒性シゲラ・フレックスネリ２ａ（２４５７Ｔ菌株）を利用したチャレンジに対し保護された。最も重要なことは、精製されたＩｃｓＰ２で免疫されたギニーピッグは、さらにシゲラ・フレックスネリ２ａ（２４５７Ｔ菌株）を利用したチャレンジに対しても完全に保護された。
【表２】
0005382380.tif 000003
【０１８４】
実施例７
ＩｃｓＰ２は、シゲラにより誘導されたギニーピッグ大腸炎モデルで、相違する血清型のシゲラ・フレックスネリ及びシゲラ・ディセンテリアエタイプ１に対し保護性免疫を誘導する。
【表３】
0005382380.tif 000004
【０１８５】
実施例８
ＣＴアジュバントと共にＳｉｇＡ２又はＩｃｓＰ２を粘膜に投与すれば、血清抗体反応を誘導する。
以後、３回目の鼻腔内免疫１週後に血清抗体のレベルを測定した。図５で見られるところのように、それぞれの免疫に対し１０μｇの量のそれぞれのシゲラタンパク質で免疫されたマウスは、当該抗原に対し激しい（ｖｉｇｏｒｏｕｓ）血清ＩｇＧ抗体反応を表したが、これは２回目の免疫後に既に表れており、３回目のワクチン化によりさらに増加した。図５は、それぞれの３回の連続的な免疫後の抗体の力価が、ＳｉｇＡ２及びＩｃｓＰ２タンパク質に対し表れていることを見せる。
【０１８６】
実施例９
シゲラ共通タンパク質抗原を粘膜に投与すれば、全身性及び粘膜性免疫反応を誘導する。
ＣＴでアジュバントされたＳｉｇＡ２又はＩｃｓＰ２で３回鼻腔内免疫させた１週後に収集された細胞サスペンションに対し行われたＥＬＩＳｐｏｔ分析により、ＳｉｇＡ２又はＩｃｓＰ２で免疫されたマウスの脾臓及び肺内の抗体−分泌細胞を計数した。図６ａ及び図６ｂに示した結果は、３〜４匹のマウス群に対し測定された百万単核細胞当りＡＳＣの平均数（ヒストグラム）と前記平均の標準偏差（垂直の線）で表現される。図で見られるところのように、ＳｉｇＡ２で免疫された動物は、脾臓（図６ａ）及び肺（図６ｂ）全てでＩｇＡ−ＡＳＣ反応を優勢に表し、さらにＩｇＧ−ＡＳＣ反応も表した。ＩｃｓＰ２で免疫されたマウスでは、ＩｃｓＰ２特異的ＩｇＡ−及びＩｇＧ−ＡＳＣ反応に対し非常に類似する結果が得られた。
【０１８７】
鼻腔内（ｉ．ｎ．）経路又は腹腔内（ｉ．ｐ．）経路によりＳｉｇＡ２で免疫されたマウスの肺抽出物を、３回の連続的な免疫の最後の免疫１週後にＳｉｇＡ２特異的ＩｇＧ抗体活性に対し分析した。図７で見られるところのように、ＳｉｇＡ２を利用した全身性（ｉ．ｐ．）及び粘膜性（ｉ．ｎ．）免疫は、肺及び血清で抗体反応を誘導した。ＩｃｓＰ２を鼻腔内投与した後、ＩｃｓＰ２で免疫されたマウスでも類似する肺反応が記録された。
【０１８８】
併せて考慮するとき、前記結果等は粘膜に投与されたＳｉｇＡ２及びＩｃｓＰ２が免疫性であり、全身性及び粘膜性抗体反応を誘導することができることを示す。
【０１８９】
実施例１０
ＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２に対する血清抗体は、全長ＩｃｓＰ及びＳｉｇＡシゲラタンパク質と反応する。
シゲラタンパク質のウエスタンブロット分析：シゲラ・フレックスネリ血清型２ａ  ２４５７Ｔ、シゲラ・ボイディ及びシゲラ・ソンネイの全体細胞の洗剤抽出物に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っており、前記タンパク質をニトロセルローズ膜へ伝達した。膜を（ＰＢＳ−ツイーン２０内で）１／５０又は１／１００に希釈されたマウス抗血清で、周囲温度で２時間の間インキュベーションした。前記抗血清は、前述のようにミョウバン（ａｌｕｍ）賦形剤と共に投与されたＳｉｇＡ２及びＩｃｓＰ２の腹腔内注射により得た。ＰＢＳ−ツイーンで洗浄した後、前記膜をマウスＩｇに対するアルカリホスファターゼ接合された山羊抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ，ＵＳＡ）でさらにインキュベーションした。洗浄後、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ色原体基質を添加することにより膜を現像した。比較目的のため、別途の膜をクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）で染色した。図９ａ及び図９ｂで見られるところのように、ＳｉｇＡ２及びＩｃｓＰ２に対し誘発された抗血清は、相違するシゲラ種（シゲラ・フレックスネリ２ａ、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ソンネイ及びシゲラ・ディセンテリアエ）の全長ＳｉｇＡ及びＩｃｓＰ２（矢印はタンパク質の位置に当る）を認識することができる。
【０１９０】
実施例１１
ＳｉｇＡ２に対する抗血清の試験管内抑制効果
全面生長した（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＨｅＬａ細胞を、浸透性１００、１０及び１の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、ｍ．ｏ．ｉ．）で、３７℃で２時間の間シゲラ・フレックスネリ２ａ２４  ５７Ｔ菌株で感染させた。前記バクテリアを洗浄し、培養物をアガロースで覆った。注射後４８時間に行われたＧｉｅｍｓａ染色によりプラクを視覚化した。ＳｉｇＡ２に対する抗血清がプラクの形成を抑制する能力をテストするため、浸透性バクテリア及びテスト抗血清を細胞に添加する前に２０分間混合した（図９ａ及び図９ｂ）。Ｇｉｅｍｓａ染色後プラクの減少をモニタリングした。図９ｂに示されているように、ＳｉｇＡ２に対する抗体は、シゲラ・フレックスネリによるプラクの形成を抑制した。Ｍ．Ｏ．Ｉ．１０で、感染した細胞で浸透性シゲラ・フレックスネリ２ａにより誘導されたプラクの数は、抗血清のない対照群（図９ａ）と比べてＳｉｇＡ２に対するマウス抗血清の存在時（図９ｂ）に大凡６０％減少した。
【０１９１】
実施例１２
シゲラ菌株におけるＩｃｓＰ及びＳｉｇＡの存在を確証する。
【０１９２】
前記『シゲラＳｉｇＡ２及びＩｃｓｐ２ポリペプチドのクローニング、発現及び精製』部分で開示された過剰発現ベクターの構築に用いられたプライマーを利用したＰＣＲにより、シゲラ菌株におけるＩｃｓＰ及びＳｉｇＡの存在を確証した。
【０１９３】
図１０に示されているように、ＳｉｇＡ２及びＩｃｓＰ２切片に対するプライマーセットを利用したＰＣＲにより、それぞれのシゲラ種の血清型でのｓｉｇＡ遺伝子及びｉｃｓＰ遺伝子の存在を確証した。シゲラ・ディセンテリアエのｓｉｇＡを除き、全ての菌株からｓｉｇＡ２及びｉｃｓＰ２の核酸切片をＰＣＲにより増幅した。前記ｓｉｇＡ遺伝子は、全体ゲノムシーケンシング結果によりシゲラ・ディセンテリアエ菌株ではないものと知られている（３９）。
【０１９４】
実施例１３
ＳｉｇＡ２に対する抗体は、シゲラ・フレックスネリ２ａによる角結膜炎を抑制する。
毒性シゲラ・フレックスネリ２ａ菌株２４５７Ｔ（２０μｌでの２×１０４コロニー形成単位）をＰＢＳ、同一体積のＳｉｇＡ２に対する抗血清又は前免疫（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）血清と混合した後、ギニーピッグの結膜嚢内に接種した。図１１のＡで見られるところのように、左上のパネルは、対照群動物でシゲラ・フレックスネリ２ａ（２４５７Ｔ菌株）の接種後、普通の（２４時間）眼周囲炎症を見せ、４８時間には深刻になったことを見せる（右上パネル、図１１のＢ）。逆に、図１１の下側二つのパネルで見られるところのように、ＳｉｇＡ２に対する抗血清は、シゲラ・フレックスネリ（２４５７Ｔ菌株）バクテリアの同時投与により誘導される眼の炎症を２４時間（図１１のＣ）及び４８時間（図１１のＤ）後に抑制した。前免疫血清と混合したバクテリアで接種されたギニーピッグは角結膜炎が発生した。
【０１９５】
実施例１４
ｉｃｓＰ及びｓｉｇＡが破砕された突然変異体菌株は、それぞれＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２により誘導された免疫から免れることができる。
ＩｃｓＰ２、ＳｉｇＡ２又はＳＣ６０２（生きている弱毒化されたシゲラ・フレックスネリ２ａ菌株）でマウスをそれぞれ免疫させた。シゲラ・フレックスネリ２ａ又はＩｃｓＰ又はＳｉｇＡのうち一つが欠失されたシゲラ・フレックスネリ２ａ（本発明ではＫＯ菌株と表す）で動物等をチャレンジした。表４に示したように、マウスはシゲラ・フレックスネリ２ａを利用したチャレンジでは生存したものの、ＫＯ菌株を利用したチャレンジでは死んだが、これはそれぞれＩｃｓＰ２及びＳｉｇＡ２により誘導された保護の特異性を見せるものである。
【表４】
0005382380.tif 000005
【０１９６】
参考文献
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１３．  Ｊｅｎｎｉｓｏｎ，  Ａ．Ｖ．，  Ｒ．  Ｒａｑｉｂ，  ａｎｄ  Ｎ．Ｋ．  Ｖｅｒｍａ．  ２００６．  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２４５７Ｔ．  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １２：６６８３−８．
１４．  Ｊｉａｎｇ，  Ｙ．，  Ｆ．  Ｙａｎｇ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．  Ｙａｎ，  Ｈ．  Ｎｉｅ，  Ｚ．  Ｘｉｏｎｇ，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｄｏｎｇ，  Ｙ．  Ｘｕｅ，  Ｘ．  Ｘｕ，  Ｙ．  Ｚｈｕ，  Ｓ．  Ｃｈｅｎ，  ａｎｄ  Ｑ．  Ｊｉｎ．  ２００５．  Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＳＳ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ．  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５４：１４９−５９．
１５．  Ｊｉｎ，  Ｑ．，  Ｚ．  Ｙｕａｎ，  Ｊ．  Ｘｕ，  Ｙ．  Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｓｈｅｎ，  Ｗ．  Ｌｕ，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｈ．  Ｌｉｕ，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｆ．  Ｙａｎｇ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｇ．  Ｙａｎｇ，  Ｈ．  Ｗｕ，  Ｄ．  Ｑｕ，  Ｊ．  Ｄｏｎｇ，  Ｌ．  Ｓｕｎ，  Ｙ．  Ｘｕｅ，  Ａ．  Ｚｈａｏ，  Ｙ．  Ｇａｏ，  Ｊ．  Ｚｈｕ，  Ｂ．  Ｋａｎ，  Ｋ．  Ｄｉｎｇ，  Ｓ．  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．  Ｃｈｅｎｇ，  Ｚ．  Ｙａｏ，  Ｂ．  Ｈｅ，  Ｒ．  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．  Ｍａ，  Ｂ．  Ｑｉａｎｇ，  Ｙ．  Ｗｅｎ，  Ｙ．  Ｈｏｕ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｙｕ．  ２００２．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ：  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ａｎｄ  Ｏ１５７．  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：４４３２−４４４１．
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２１．  Ｎｏｒｉｅｇａ，  Ｆ．Ｒ．，  Ｆ．Ｍ．  Ｌｉａｏ，  Ｄ．Ｒ．  Ｍａｎｅｖａｌ，  Ｓ．  Ｒｅｎ，  Ｓ．Ｂ．  Ｆｏｒｍａｌ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．  Ｌｅｖｉｎｅ．  １９９９．  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｃｒｏｓｓ−Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６７：７８２−７８８．
２２．  Ｎｏｒｉｅｇａ，  Ｆ．Ｒ．，  Ｊ．Ｙ．  Ｗａｎｇ，  Ｇ．  Ｌｏｓｏｎｓｋｙ，  Ｄ．Ｒ．  Ｍａｎｅｖａｌ，  Ｄ．Ｍ．  Ｈｏｎｅ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．  Ｌｅｖｉｎｅ．  １９９４．  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｔａ  ａｒｏＡ  ｄｅｌｔａ  ｖｉｒＧ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ｓｔｒａｉｎ  ＣＶＤ  １２０３，  ａ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ  ｌｉｖｅ  ｏｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６２：５１６８−５１７２．
２３．  Ｏａｋｓ，  Ｅ．Ｖ．，  ａｎｄ  Ｋ．Ｒ．  Ｔｕｒｂｙｆｉｌｌ．  ２００６．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ａｎｄ  Ｓ．  ｓｏｎｎｅｉ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｉｎｖａｓｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  （Ｉｎｖａｐｌｅｘ）  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２２９０−３０１．
２４．  Ｏｒｒ，  Ｎ．，  Ｇ．  Ｒｏｂｉｎ，  Ｄ．  Ｃｏｈｅｎ，  Ｒ．  Ａｒｎｏｎ，  ａｎｄ  Ｇ．Ｈ．  Ｌｏｗｅｌｌ．  １９９３．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ−ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６１  ：２３９０−５．
２５．  Ｐａｓｓｗｅｌｌ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｅ．  Ｈａｒｌｅｖ，  Ｓ．  Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，  Ｃ．  Ｃｈｕ，  Ｄ．  Ｍｉｒｏｎ，  Ｒ．  Ｒａｍｏｎ，  Ｎ．  Ｆａｒｚａｎ，  Ｊ．  Ｓｈｉｌｏａｃｈ，  Ｄ．Ａ．  Ｂｒｙｌａ，  Ｆ．  Ｍａｊａｄｌｙ，  Ｒ．  Ｒｏｂｅｒｓｏｎ，  Ｊ．Ｂ．  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎ．  ２００１．  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｉｓｒａｅｌ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６９：１３５１−７．
２６．  Ｐｅｒｄｏｍｏ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｐ．  Ｇｏｕｎｏｎ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．  Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ．  １９９４．  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｂｙ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：６３３−４３．
２７．  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｄ．  Ｍｏｎａｃｋ，  Ｓ．Ｊ．  ＭｃＣａｌｌｕｍ，  Ａ．  Ｖｅｇａｓ，  Ｅ．  Ｐｈａｍ，  Ｍ．Ｂ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．  Ｔｈｅｒｉｏｔ．  ２００１．  Ｔｈｅ  ｍａｋｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｒａｄｉｅｎｔ：  ＩｃｓＡ  （ＶｉｒＧ）  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｉｎ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４１  ：８６１−７２．
２８．  Ｓｅｒｅｎｙ，  Ｂ．  １９５７．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｓａ．  Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｈｕｎｇ  ４：３６７−３７６．
２９．  Ｓｈｅｒｅ，  Ｋ．Ｄ．，  Ｓ．  Ｓａｌｌｕｓｔｉｏ，  Ａ．  Ｍａｎｅｓｓｉｓ，  Ｔ．Ｇ．  Ｄ’Ａｖｅｒｓａ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｂ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ．  １９９７．  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｃｓＰ，  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅｓ  ＩｃｓＡ，  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ａｃｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２５：４５１−６２．
３０．  Ｓｈｉｍ，  Ｄ．−Ｈ．，  Ｔ．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｓ．−Ｙ．  Ｃｈａｎｇ，  Ｓ．−Ｍ．  Ｐａｒｋ，  Ｐ．Ｊ．  Ｓａｎｓｏｎｅｔｔｉ，  Ｃ．  Ｓａｓａｋａｗａ，  ａｎｄ  Ｍ．−Ｎ．  Ｋｗｅｏｎ．  ２００７．  Ｎｅｗ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ：  Ｉｔｓ  Ｕｓｅｆｕｌｎｅｓｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：２４７６−２４８２．
３１．  Ｓｈｉｍ，  Ｄ．Ｈ．，  Ｓ．Ｙ．  Ｃｈａｎｇ，  Ｓ．Ｍ．  Ｐａｒｋ，  Ｈ．  Ｊａｎｇ，  Ｒ．  Ｃａｒｂｉｓ，  Ｃ．  Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ，  Ｓ．  Ｕｅｍａｔｓｕ，  Ｓ．  Ａｋｉｒａ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｎ．  Ｋｗｅｏｎ．  ２００７．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆｆｅｒｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５：４８２８−３６．
３２．  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｔ．，  Ｍ．Ｃ．  Ｌｅｔｔ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｓａｓａｋａｗａ．  １９９５．  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ＶｉｒＧ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：３０８７４−８０．
３３．  Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，  Ｍ．Ｍ．，  Ａ．Ｂ．  Ｈａｒｔｍａｎ，  Ｊ．Ｗ．  Ｎｅｗｌａｎｄ，  Ｖ．Ｓ．  Ｉｖａｎｏｖａ，  Ｔ．Ｌ．  Ｈａｌｅ，  Ｍ．  ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｂｕｔｔｅｒｔｏｎ．  ２００２．  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ＷＲＳｄ１，  ａ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  １  ｖａｃｃｉｎｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０：２９５０−８．
３４．  Ｖｉｌｌａｖｅｄｒａ，  Ｍ．，  Ｈ．  Ｃａｒｏｌ，  Ｍ．  Ｈｊｕｌｓｔｒｏｍ，  Ｊ．  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ．  １９９７．  ”ＰＥＲＦＥＸＴ”：  ａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｔ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｌｅｖｅｌ．  Ｒｅｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：２５７−６６．
３５．  ｖｏｎ  Ｓｅｉｄｌｅｉｎ，  Ｌ．，  Ｄ．Ｒ．  Ｋｉｍ，  Ｍ．  ＡＩｉ，  Ｈ．  Ｌｅｅ，  Ｘ．  Ｗａｎｇ，  Ｖ．Ｄ．  Ｔｈｉｅｍ，  Ｇ．  Ｃａｎｈ  ｄｏ，  Ｗ  Ｃｈａｉｃｕｍｐａ，  Ｍ．Ｄ．  Ａｇｔｉｎｉ，  Ａ．  Ｈｏｓｓａｉｎ，  Ｚ．Ａ．  Ｂｈｕｔｔａ，  Ｃ．  Ｍａｓｏｎ，  Ｏ．  Ｓｅｔｈａｂｕｔｒ，  Ｋ．  Ｔａｌｕｋｄｅｒ，  Ｇ．Ｂ．  Ｎａｉｒ，  Ｊ．Ｌ．  Ｄｅｅｎ，  Ｋ．  Ｋｏｔｌｏｆｆ，  ａｎｄ  Ｊ．  Ｃｌｅｍｅｎｓ．  ２００６．  Ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｉｎ  ｓｉｘ  Ａｓｉａｎ  ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ：  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｕｒｄｅｎ，  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ，  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ３：ｅ３５３．
３６．  Ｗｅｉ，  Ｃ．，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  Ｚｈｕ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．  Ｌｅｎｇ，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｙ．  Ｘｕｅ，  Ｌ．  Ｓｕｎ，  Ｗ．  Ｌｉ，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  ａｎｄ  Ｑ．  Ｊｉｎ．  ２００６．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ５：１８６０−５．
３７．  Ｗｅｉ，  Ｊ．，  Ｍ．Ｂ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  Ｖ．  Ｂｕｒｌａｎｄ，  Ｍ．Ｍ．  Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ，  Ｗ．  Ｄｅｎｇ，  Ｇ．  Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，  Ｇ．Ｆ．  Ｍａｙｈｅｗ，  Ｇ．  Ｐｌｕｎｋｅｔｔ，  ＩＩＩ，  Ｄ．Ｊ．  Ｒｏｓｅ，  Ａ．  Ｄａｒｌｉｎｇ，  Ｂ．  Ｍａｕ，  Ｎ．Ｔ．  Ｐｅｒｎａ，  Ｓ．Ｍ．  Ｐａｙｎｅ，  Ｌ．Ｊ．  Ｒｕｎｙｅｎ−Ｊａｎｅｃｋｙ，  Ｓ．  Ｚｈｏｕ，  Ｄ．Ｃ．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  ａｎｄ  Ｆ．Ｒ．  Ｂｌａｔｔｎｅｒ．  ２００３．  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２ａ  Ｓｔｒａｉｎ  ２４５７Ｔ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ７１：２７７５−２７８６．
３８．  Ｙａｎｇ，  Ｆ．，  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｘ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．  Ｊｉａｎｇ，  Ｙ．  Ｙａｎ，  Ｘ．  Ｔａｎｇ，  Ｊ．  Ｗａｎｇ，  Ｚ．  Ｘｉｏｎｇ，  Ｊ．  Ｄｏｎｇ，  Ｙ．  Ｘｕｅ，  Ｙ．  Ｚｈｕ，  Ｘ．  Ｘｕ，  Ｌ．  Ｓｕｎ，  Ｓ．  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．  Ｎｉｅ，  Ｊ．  Ｐｅｎｇ，  Ｊ．  Ｘｕ，  Ｙ．  Ｗａｎｇ，  Ｚ．  Ｙｕａｎ，  Ｙ．  Ｗｅｎ，  Ｚ．  Ｙａｏ，  Ｙ  Ｓｈｅｎ，  Ｂ．  Ｑｉａｎｇ，  Ｙ．  Ｈｏｕ，  Ｊ．  Ｙｕ，  ａｎｄ  Ｑ．  Ｊｉｎ．  ２００５．  Ｇｅｎｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ，  ｔｈｅ  ｅｔｉｏｌｏｇｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｉｌｌａｒｙ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：６４４５−５８．
３９．  Ｙａｎｇ，  Ｊ．，  Ｌ．  Ｃｈｅｎ，  Ｊ．  Ｙｕ，  Ｌ．  Ｓｕｎ，  ａｎｄ  Ｑ．  Ｊｉｎ．  ２００６．  ＳｈｉＢＡＳＥ：  ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：Ｄ３９８−４０１．
４０．  Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  Ｐ，  Ｓｅｔｈａｂｕｔｒ  Ｏ，  Ｐｉｔａｒａｎｇｓｉ  Ｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ａｎｄ  ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｒｅｖ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  １９９１  １３  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２２０−５．  Ｒｅｖｉｅｗ．
４１．  Ｓｅｔｈａｂｕｔｒ  Ｏ，  Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ  Ｐ，  Ｈｏｇｅ  ＣＷ，  Ｂｏｄｈｉｄａｔｔａ  Ｌ，  Ｐｉｔａｒａｎｇｓｉ  Ｃ．  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ａｎｄ  ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｙ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｏｏｌｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ  ｉｎ  Ｔｈａｉｌａｎｄ．  Ｊ  Ｄｉａｒｒｈｏｅａｌ  Ｄｉｓ  Ｒｅｓ．  １９９４  １２：２６５−９．
４２．  Ｇｕ，  Ｘ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  Ｌｉｐｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｎｔｙｐｅａｂｌｅ  Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６４（１０），  （１９９６），  ｐｐ．  ４０４７−４０５３．
４３．  Ｇｕｐｔａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１１１  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，  Ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ  ｏｒ  Ｈｙｄｒａｚｉｎｅ，  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  ｂｙ  Ｔｗｏ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓｃｈｅｍｅｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６３（８），  （１９９５），  ｐｐ．  ２８０５−２８１０．
４４．  Ｇｕｐｔａ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．．  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｓｏｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｏ１  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ｉｎａｂａ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｃｈｏｌｅｒａ  Ｔｏｘｉｎ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６０（８），  （１９９２），  ｐｐ．  ３２０１−３２０８．
４５．  Ｋｏｎａｄｕ，  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：  Ｐｈａｓｅ  １  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｏ１５７  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｘｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １７７，  （１９９８），  ｐｐ．  ３８３−３８７．
４６．  Ｋｏｎａｄｕ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｈａｓｅ  １  ａｎｄ  Ｐｈａｓｅ  ２  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ，  Ｔｅｅｎａｇｅｒｓ，  ａｎｄ  ２−  ｔｏ  ４−  Ｙｅａｒ  Ｏｌｄ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  Ｖｉｅｔｎａｍ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６８（３），  （２０００），  ｐｐ．  １５２９−１５３４．
４７．  Ｋｏｎａｄｕ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６２（１１），  （１９９４），  ｐｐ．  ５０４８−５０５４．
４８．  Ｒｏｂｂｉｎｓ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．．  ”Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ”，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  １６１，  （１９９０），  ｐｐ．  ８２１−８３２．
４９．  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ  Ｔｙｐｅ  １，  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  Ｔｙｐｅ  ２ａ，  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  （Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｔｏｘｏｉｄｓ”，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ６１，  （１９９３），  ｐｐ．  ３６７８−３６８７．
５０．  ＷＯ／１９９９／００３８７１．
５１．  米国特許第４，７７１，１２７号
５２．  米国特許第５，８６６，１３２号．
【０１９７】
本発明は、本明細書に開示された特定の具現例よりその範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書に開示されたものなどに加え、本発明の多様な具現例が前述の内容及び添付の図から、本技術分野の当業者において自明になるはずである。このような変形は、添付された請求項の範囲内に属するための意図である。併せて、全ての値等は近似値であり、説明のため提供されるとの点が理解されなければならない。
【０１９８】
特許、特許出願、公開文献、製品の説明及びプロトコル（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）が本出願の全般に亘って引用されており、その開示された内容は、全ての目的のためにその全体が引用により本発明に含まれる。
【図１】
0005382380.tif 000006
【図２】
0005382380.tif 000007
【図３】
0005382380.tif 000008
【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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