(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属キレート形成ポリマー核、該金属キレート形成ポリマーを被覆する磁性金属酸化物、及び該ポリマーに共有結合で結合したＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を含む、ナノ粒子であって、該金属キレート形成ポリマーはアミノ基を含み、該結合が該ポリマー内のアミノ基とＴＲＡＩＬのアミノ基間のものである、上記ナノ粒子。
【請求項２】
前記ポリマーが、金属イオンを結合することができる官能基を含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記ポリマーが、ゼラチン、ポリメチレンイミン、キトサン又はポリリシンを含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記磁性金属酸化物が、酸化鉄、又は酸化鉄由来のフェライトである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記酸化鉄が、マグネタイト、マグヘマイト、又はこれらの混合物であり、且つ前記フェライトが、式（Ｆｅ，Ｍ）３Ｏ４の酸化物であり、ここで、Ｍが、遷移金属イオンを表す、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
少なくとも１種の付加的な薬剤を更に含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記ポリマーがゼラチンであり、及び、前記磁性金属酸化物が酸化鉄である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記少なくとも１種の付加的な薬剤が、ｃＲＧＤペプチド又はペプチド模倣体である、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項９】
腫瘍細胞におけるアポトーシス、自己貪食又は両者を誘導するための、請求項１に記載のナノ粒子を含む薬剤。
【請求項１０】
該細胞にγ線を照射するための、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞は神経膠腫細胞、腫瘍幹細胞、癌腫細胞、乳癌細胞、又は肺癌細胞である、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞におけるアポトーシス、自己貪食又は両者の誘導が、癌に冒されている患者を治療するものである、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１３】
前記癌が神経膠腫、癌腫、乳癌、肺癌である、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項１４】
プロテアソーム阻害薬を更に同時に又は別々に含む、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が非癌細胞に対して非毒性である、請求項９に記載の薬剤。
【請求項１６】
神経膠腫に冒された対象を治療するための、請求項１に記載のナノ粒子を含む薬剤。
【請求項１７】
プロテアソーム阻害薬を更に同時に又は別々に含む、請求項１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記ナノ粒子は、非癌細胞に非毒性である、請求項１６に記載の薬剤。
【請求項１９】
前記神経膠腫にγ線を照射するための、請求項１６に記載の薬剤。
【請求項２０】
非癌細胞に非毒性である、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
薬剤、染料標識、造影剤、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
前記染料標識が蛍光染料である、請求項２１に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
前記ＴＲＡＩＬが金属キレート形成ポリマーに直接的又は間接的に結合している、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１のナノ粒子と医薬として許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項２５】
請求項１に記載のナノ粒子の調製方法であって、以下の連続した段階：
ａ）可溶性金属キレート形成ポリマーを含む水溶液と少なくとも１つの可溶性金属塩を混合する段階；
ｂ）該溶液内に形成した金属イオンを酸化させる段階；
ｃ）該溶液の酸性度を塩基性ｐＨに調整することによって、該溶液内の前記ナノ粒子を形成させる段階；
ｄ）該溶液に付加的な部分の金属塩を加える段階；
ｅ）該溶液内に形成した金属イオンを酸化させる段階；
ｆ）該溶液の酸性度を塩基性ｐＨに調整する段階；
ｇ）段階ｄからｆまでを少なくとも１回繰り返す段階；
ｈ）該ナノ粒子の金属キレート形成ポリマー中の第１級アミンに官能性を付与する段階；
ｉ）該金属キレート形成ポリマー中の第１級アミンを有する官能性を付与したナノ粒子に少なくともＴＲＡＩＬを接触させて、該ポリマー中のアミノ基と該ＴＲＡＩＬ中のアミノ基との間に共有結合を形成する段階；及び
ｊ）該ナノ粒子の表面上に残った活性部位をブロックする段階、
を含む方法。
【請求項２６】
前記重合体金属キレート剤が官能基を含み、該官能基がアミノ、ヒドロキシル、カルボキシレート、−ＳＨ、エーテル、イミン、ホスフェート及びスルフィド基を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記重合体金属キレート剤がゼラチン、ポリメチレンイミン、デキストラン、キトサン、ポリリシン、ポリビニルピロリドン又はそれらの組み合わせを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノ粒子の前記官能性付与は、該ナノ粒子を塩化アクリロイル、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ジカルボニルイミダゾール、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル又はそれらの任意の組み合わせに接触させることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記官能性付与は前記ナノ粒子に被覆形成ポリマーを被覆させることを更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記官能性付与は前記被覆形成ポリマーに塩化アクリロイル、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ジカルボニルイミダゾール、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）、ｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル又はそれらの任意の組み合わせに架橋させることを更に含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記水溶液は薬剤、染料標識、造影剤、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記可溶性金属キレート形成ポリマーが薬剤、染料標識、造影剤、又はそれらの任意の組み合わせに結合した、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記薬剤がＴＲＡＩＬである、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記染料標識が蛍光染料である、請求項３１又は３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁性金属酸化物で被覆された金属キレート剤であるポリマー（該ポリマーには少なくとも１種の活性薬剤が共有結合で結合している）からなるナノ粒子、並びにその医薬組成物及び使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、大きさが数ナノメートルから０．１μｍまでの範囲の球状粒子である。粒度分布の狭いナノスケールのポリマー性粒子は、一般に、制御された沈殿法又は不均一重合技術によって、例えば、最適な乳化又は逆乳化重合法によって形成される。固体材料の特性は、それらの大きさをナノメートルサイズの領域にまで縮小すると、劇的な変化を受ける。粒子が小さいほど、それらを構成する原子の部分がより大きく表面に配置されることに留意することが重要である。特に約２０ｎｍ未満の大きさのナノ粒子は、大きな材料では観察されない表面及び界面現象、例えば、より低い融点及び沸点、より低い焼結温度及び低減された流動抵抗を顕著に示す。
【０００３】
それらの球状形状及び大きな表面積を考慮すると、ナノスケールの粒子は、複合材料、触媒、三次元構造体及び光工学的用途などの材料科学における多様な諸問題に対して巧妙な解決策を提供する可能性があり、さらには、特異的な細胞標識及び分離、細胞増殖、アフィニティークロマトグラフィー、診断、血液灌流による特異的血液浄化、薬物送達及び制御放出などの生物医学的応用で使用できる（Ｂｏｃｋｓｔａｌｌｅｒら、２００３年；Ｈｅｒｇｔら、２００４年；Ｍａｒｇｅｌら、１９９９年）。それぞれの応用は、種々の最適な物理的及び化学的特性を有するポリマー性ナノ粒子を必要とする。種々の表面化学、例えば、ヒドロキシル、カルボキシル、ピリジン、アミド、アルデヒド及びフェニルクロロメチルなどの多様な表面官能基を有する多種類のナノスケール粒子の合成及び使用が、既に、発表されている（Ｍａｒｇｅｌら、１９９９年）。このようなナノ粒子は、多様な工業的及び医学的応用、例えば、酵素固定化、オリゴヌクレオチド及びペプチド合成、薬物送達、特異的な細胞標識及び分離、医療用造影、生物学的接着剤、及び難燃性ポリマーに向けて設計されている。（Ｂｕｎｋｅｒら、１９９４年；Ｓｚｙｍｏｎｉｆｋａ及びＣｈａｐｍａｎ、１９９５年；Ｍａｒｇｅｌら、１９９９年；国際公開第２００４／０４５４９４号；Ｇａｌｐｅｒｉｎら、２００７年）。
【０００４】
特に興味があるのは、望ましくない化合物から磁界によって粒子及び／又はその複合体を分離するのに通常使用される磁気特性をもつ粒子である。それらの磁気特性のため、これらの粒子は、磁気記録、磁気シーリング、電磁遮蔽及び生物医学的応用などのいくつかのさらなる重要な応用を有する。磁性酸化鉄、すなわちマグネタイト及びマグヘマイトのナノ粒子は、生物医学的応用、例えば、磁気温熱療法、磁気ドラッグターゲッティング、磁気細胞分離のために、及びＭＲＩ造影剤として研究されてきた主要な粒子である（Ｌａｃｏｓｔｅら、１９９３年；Ｇｒｅｅｎ−Ｓａｄａｎら、２００５年；Ｌｅｅｍｐｕｔｔｅｎ及びＨｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ、１９７４年；Ｈｅｒｇｔら、２００４年）。磁性酸化鉄ナノ粒子は、非毒性で生分解性があり、ＭＲＩ造影剤としての臨床的使用が既に承認されている。これらのナノ粒子は、通常、化学量論的濃度の第一鉄及び第二鉄イオン、並びにデキストランなどのポリマー性安定剤を含む水性溶液に、塩基、例えば、ＮａＯＨ又はアンモニアを、ｐＨが塩基性（通常は８．０より高く）となるまで添加することによって調製される。得られた被覆磁性酸化鉄ナノ粒子を、次いで、種々の方法によって、例えば、磁気カラム又は透析によって洗浄する。有効な酸化鉄磁性ナノ粒子を合成するための広範な努力が、この数年実施されてきたが、これらのナノ粒子の殆どは、インビボでの医学的応用で有毒であると考えられる広い粒度分布、鉄イオンの溶脱、及び凝集進行に向かう不安定性などの重大な欠点をもつ。
【０００５】
本明細書中に完全に開示されているように参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０６２０７９号及び同一出願人の対応する欧州特許第１０８８３１５号Ｂ１は、鉄イオンとのキレートを形成するポリマー、例えば、水性溶液中に溶解されたゼラチン上への酸化鉄の制御された核形成、それに続く、該ゼラチン／酸化鉄核上への酸化鉄膜の薄層の段階的成長によって形成される、新規な均一磁性ゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を開示している。これらの磁性ナノ粒子は、極めて狭い粒度分布で、且つ約１０ｎｍから１００ｎｍまで範囲の大きさで調製することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一態様において、本発明は、磁性金属酸化物で被覆された金属キレート剤であるポリマーからなり、少なくとも１種の活性薬剤が、該ポリマーに共有結合で結合している、ナノ粒子を提供する。
【０００７】
別の態様において、本発明は、上で規定したようなナノ粒子及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物、並びに各種使用方法を提供する。
【０００８】
本発明の医薬組成物は、とりわけ、腫瘍を検出するのに；腫瘍の増殖を低減又は阻害するのに、又は患者において腫瘍を外科的に除去した部位に残された腫瘍細胞の増殖を低減又は阻害するのに；腫瘍の増殖を低減又は阻害し、さらにその大きさを監視するのに；且つ候補化合物での治療に対する腫瘍細胞の応答を評価するのに使用される可能性がある。加えて、これらの組成物は、炎症部位の検出及び前記炎症の治療に、並びに２型糖尿病、肥満、及び食欲不振の治療に使用される可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、磁性金属酸化物で被覆された金属キレート剤であるポリマーからなり、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド又は小分子から選択される抗腫瘍活性を有する少なくとも１種の薬剤が、該磁性金属酸化物の外表面に結合している、ナノ粒子を提供する。本発明は、さらに、腫瘍の増殖を低減又は阻害するのに使用するための、これらのナノ粒子及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物、並びに各種使用方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】例１に記載のように、成長ステップ中に薄い磁性被覆加工を４回繰り返すことによって調製された、増大した平均直径を有するゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）顕微鏡写真を示す図である。
【図１Ｂ】例１に記載のように、成長ステップ中に薄い磁性被覆加工を５回繰り返すことによって調製された、増大した平均直径を有するゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）顕微鏡写真を示す図である。
【図１Ｃ】例１に記載のように、成長ステップ中に薄い磁性被覆加工を６回繰り返すことによって調製された、増大した平均直径を有するゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）顕微鏡写真を示す図である
【図１Ｄ】例１に記載のように、成長ステップ中に薄い磁性被覆加工を７回繰り返すことによって調製された、増大した平均直径を有するゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）顕微鏡写真を示す図である。
【図２】例１に記載のように調製され、且つ水に分散されたゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子の直径のヒストグラムを示す図である。
【図３Ａ】例１に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の高分解能ＴＥＭ（ＨＴＥＭ）を示す図である。
【図３Ｂ】例１に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の電子線回折（ＥＤ）画像を示す図である。
【図４】例１に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示す図である。
【図５】例１に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子のメスバウアースペクトルを示す図である。
【図６】例１に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子について得られた室温での磁化（ＶＳＭ）ループを示す図である。
【図７】例２に記載のような、蛍光染料で標識されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の調製の核形成ステップを図解した図である。
【図８】１０℃での３５日間の、遊離の腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の安定性を、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子に複合されたＴＲＡＩＬ（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）と比較して示した図である。
【図９Ａ】ヒトＡ１７２神経膠腫細胞における、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）、遊離ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）によって誘導されるアポトーシスを示す図である。
【図９Ｂ】原発性ＨＦ２０２０腫瘍から確立された神経膠腫球における、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）、遊離ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）によって誘導されるアポトーシスを示す図である。
【図１０】ヒト神経膠腫標本ＨＦ１２５４、ＨＦ１３０８及びＨＦ２０２０から確立された神経膠腫球状体のアポトーシスに対する遊離ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）の効果を示す図である。球状体を、２４穴プレート中に播種し、培地（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、１０ｎｇ／ｍＬ）で処理した。細胞死は、処理の２４時間後にＬＤＨアッセイを使用して判定した。結果は、２つの異なる実験における三つ組の平均±ＳＥである。
【図１１】神経膠腫細胞Ｕ８７、Ａ１７２及びＵ２５１に対する、並びに神経膠腫細胞ＨＦ１３０８、ＨＦ１２５４及びＨＦ１３１６の一次培養に対する遊離ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、１０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）の細胞毒性効果を示す図である。ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）単独又はＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、対照として役立った。細胞死は、処理の２４時間後にＦＡＣＳ分析によって判定した。
【図１２】Ａ１７２細胞に対する非蛍光の又は蛍光染料で標識されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子に複合されたＴＲＡＩＬの細胞毒性効果を示す図である。Ａ１７２細胞を、対照ナノ粒子（ＮＰ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＴＲＡＩＬ複合型非蛍光ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）、対照ローダミン標識化ナノ粒子（ＮＰＲ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）又はＴＲＡＩＬ複合型ローダミン標識化ナノ粒子（ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ）と共に５時間インキュベートした。細胞アポトーシスは、プロピジウムヨージド染色及びＦＡＣＳ分析を使用して判定し、結果は、３つの異なる実験の平均±ＳＥである。
【図１３】ＴＲＡＩＬ複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ）の神経膠腫細胞中への特異的内部移行を、正常な星状細胞と比較して示す図である。ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬを、Ａ１７２細胞と及び正常な星状細胞と共に３０分間インキュベートし、細胞の免疫蛍光を、共焦点顕微鏡法を使用して判定した。結果は、類似の結果を与えた３つの実験の１つを表す。
【図１４】Ｕ８７、Ａ１７２、Ｕ２５１及びＬＮ−１８神経膠腫細胞系に対するγ−照射及とＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＲ−ＴＲＡＩＬ）との相乗効果を示す図である。細胞を、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）と、又はゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）単独と共に２４時間インキュベートするか、或いはγ−照射（１０Ｇｙを２時間）し、次いでＮＰ−ＴＲＡＩＬ（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ＋Ｒａｄ、５ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）と、又はＮＰ単独（ＮＰ−Ｒａｄ）と２４時間処理した。細胞アポトーシスは、ＦＡＣＳ分析によって判定した。
【図１５】ｃＲＧＤペプチド（ｃＲＧＤ）及びｃＲＧＤペプチド複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ｃＲＧＤ）は、両方とも、対照又はゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）単独で処理した細胞と比較して、神経膠腫Ｕ２５１細胞における自己貪食、すなわち断続染色の増加を誘導することを示す図である。
【図１６】子宮頸癌細胞系ＨｅＬａ、乳癌細胞系ＭＣＦ−７及び肺癌細胞Ａ５４９のアポトーシスに対するＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）の効果を示す図である。各種細胞系を、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）、ナノ粒子（ＮＰ）単独又はＰＢＳ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と共に２４時間インキュベートし、データを、平均±ＳＥとして示す。
【図１７Ａ】腫瘍標本２３５５から確立された神経膠腫幹細胞球状体に対するγ−照射とＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）との相乗効果を示す図である。細胞を、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ナノ粒子（ＮＰ）単独（Ｃｏｎｔｒｏｌ）又はＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ／ｍＬ）のどれかと２４時間処理し、次いで、上清液を捕集し、ＬＤＨ分析を実施した。照射（ＩＲ）とＴＲＡＩＬとの併用効果を評価するために、細胞を、まず５Ｇｙの放射線で照射し、４時間後にＴＲＡＩＬ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬのどちらかでさらに２４時間処理した。細胞死は、培養上清液中のＬＤＨ濃度を使用して判定した。結果は、３つの同じ実験の中の、三つ組で実施された１つの実験を表す。
【図１７Ｂ】腫瘍標本２３０３から確立された神経膠腫幹細胞球状体に対するγ−照射とＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）との相乗効果を示す図である。細胞を、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ナノ粒子（ＮＰ）単独（Ｃｏｎｔｒｏｌ）又はＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ／ｍＬ）のどれかと２４時間処理し、次いで、上清液を捕集し、ＬＤＨ分析を実施した。照射（ＩＲ）とＴＲＡＩＬとの併用効果を評価するために、細胞を、まず５Ｇｙの放射線で照射し、４時間後にＴＲＡＩＬ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬのどちらかでさらに２４時間処理した。細胞死は、培養上清液中のＬＤＨ濃度を使用して判定した。結果は、３つの同じ実験の中の、三つ組で実施された１つの実験を表す。
【図１８】卵巣癌細胞のアポトーシスに対するＩＬ−１２及びＩＬ−１２複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＩＬ−１２）の効果を示す図である。卵巣癌細胞を、培地単独、ＩＬ−１２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ナノ粒子（ＮＰ、５０μｇ／ｍＬ）単独又はＮＰ−ＩＬ−１２（５０ｎｇの結合ＩＬ−１２／ｍＬ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、ＬＤＨアッセイを使用して細胞死について分析した。
【図１９】ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）又はナノ粒子（ＮＰ）単独のどちらかで処理されたラットからの腫瘍切片を示す図である。ラット脳中の異種移植片としてヒトＵ２５１神経膠腫細胞を採用し、腫瘍を７日間発育させ、その時点で、ＮＰ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬのどちらかを腫瘍部位に頭蓋内で注入した。処理の７日後に、ＰＢＳ（示さない）、ＮＰ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬで処理された対照ラットの腫瘍における細胞アポトーシスの程度を調べ、細胞アポトーシスを、アポトーシス細胞を特異的に検出するＴＵＮＥＬ染色（褐色染色）を使用して判定した。
【図２０】ヒトＵ２５１を移植されたラットの生存に対するＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）の効果を示す図である。腫瘍細胞移植の７日後に、ナノ粒子（ＮＰ）単独、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ又はＰＢＳを腫瘍中に直接的に注入し、動物を、窮迫及び／又は罹患の徴候について観察し、その時点で安楽死させた。
【図２１】罹患時点での腫瘍容積に対するＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）（２１Ｃ）の効果をナノ粒子（ＮＰ）単独（２１Ｂ）又はＰＢＳ（２１Ａ）投与と比較して示す図である。ラットを安楽死の時点でホルマリン灌流し、脳を摘出し、Ｈ＆Ｅ染色を実施した。代表的な腫瘍容積切片を示す。一連の写真上の数字は、安楽死の日を表す。
【図２２】ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）の投与が、ナノ粒子（ＮＰ）単独又はＰＢＳの投与と比較して、総合的な腫瘍量の減少をもたらすことを示す図である。ラットに頭蓋内でヒトＵ２５１細胞を移植し、７日後に、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、ＮＰ又はＰＢＳを投与した。２１日目に動物を安楽死させ、脳組織を摘出し、容積測定のため切片に切断した。スライドを、この判定で使用されるすべてのスライドに対して同一の設定で写真記録した。容積を、１５枚目毎の５μｍ切片について腫瘍の最大幅及び長さを測定することによって判定した。各切片の容積を判定し、腫瘍端に達するまで次に測定される切片までの切片数を乗算する。
【図２３】腫瘍増殖部位を追跡するゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）の能力を示す図である。Ｕ２５１腫瘍細胞移植の７日後に、ローダミン標識化ＮＰ（ＮＰＲ）を、ラット脳の対側半球中に移植した。４日後に、動物を安楽死させ、脳を摘出し、切片化及び造影のために急速凍結した。パネルＡ、Ｄ及びＧは、ＮＰＲ注入部位に近い脳梁部分におけるＮＰＲの画像を示し；パネルＢ、Ｅ及びＨは、ＮＰＲ移植の部位を示し；パネルＣ、Ｆ及びＩは、腫瘍細胞部位に近い脳梁部分におけるＮＰＲの画像を示す。倍率は、４×（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）；１０×（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）；及び２０×（パネルＧ、Ｈ、Ｉ）である。
【図２４】ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）の投与が、具体的にはパネルｂ、ｄ及びｆで示される大きな領域の組織破壊をもたらし、これは、ナノ粒子（ＮＰ）単独又はＰＢＳ投与のどちらでも観察されないことを示す図である。０日目に、ヌードラットにＵ２５１ｎ腫瘍を移植し；７日目に、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、ＮＰ単独又はＰＢＳを腫瘍内で投与し；１４日目に、動物を安楽死させ、組織を摘出した。ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（パネルａ〜ｆ）；ＮＰ（パネルｇ〜ｌ）；ＰＢＳ（パネルｍ〜ｒ）。倍率は、１×（パネルａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ、ｋ、ｍ、ｏ、ｑ）；１０×（パネルｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ、ｌ、ｎ、ｒ）である。矢印は、腫瘍塊の下部を示す。
【図２５】ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）を受け入れたラットにおける腫瘍細胞破壊の増加を、ナノ粒子（ＮＰ）又はＰＢＳの単独と比較して示す図である。０日目に、動物にヒトＵ２５１ｎ細胞を移植し、７日目に、ＰＢＳ、ＮＰ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬを投与した。１４日目に、動物を安楽死させ、脳組織を処理し、ヘマトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）及びエオシン染色した。ＰＢＳ（パネルａ〜ｂ）；ＮＰ（パネルｃ〜ｅ）；ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（パネルｆ〜ｈ）。倍率は４０×。
【図２６】ＭＲＩによって示されるように、ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）（２６Ｂ）は、ナノ粒子（ＮＰ）単独（２６Ａ）と比較して、腫瘍の縁端及び内部の両方でより低いシグナル強度を誘導することを示す図であり、ＮＰ−ＴＲＡＩＬが、ヌードラット内に移植されたヒト神経膠腫異種移植片の境界及び内部に到達することを示している。Ｕ２５１ｎヒト神経膠腫細胞をヌードラット中に移植し、１１日後に、ＮＰ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬを腫瘍の対側側に頭蓋内で注入した。８日後に、ＭＲ画像を得た。各図は、ＭＲＩの４連続切片を示し、各切片は、エコー時間（ＴＥ）を異にする４枚の画像を有する。より長いＴＥ（小ボックス中の右下画像）。鉄によるより大きなシグナル強度損失（黒色）。Ｒ−右；Ｌ−左；ＩＳ−注入部位（左）；Ｔｍ−腫瘍（右）；ＬＶ−脳側室；及び３Ｖ−第三脳室。
【図２７】インビボで腫瘍細胞によって取り込まれるＴＲＡＩＬ複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ）の能力を示す図である。ＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞移植の７日後に、ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ）単独又はＮＰＲ−ＴＲＡＩＬを、腫瘍塊内に直接的に移植した。４日後に、動物を安楽死させ、脳を摘出し、切片化及び造影（赤色及び緑色は、それぞれＮＰＲ及びＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞の存在を示す）のために急速凍結した。パネルＧ、Ｈ及びＩに示すように、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬは、腫瘍塊の領域に見出されるばかりでなく、腫瘍細胞と共存している（パネルＩ）。しかし、ＮＰＲ単独は、腫瘍塊の領域中に見出されるが、腫瘍細胞と共存していない（パネルＤ、Ｅ、及び特にＦ）。対照動物は、ＰＢＳで処理した。
【図２８】ｃＲＧＤペプチド複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ｃＲＧＤ）は、インビボで腫瘍細胞に向かって移動することを示す図である。ＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞移植の７日後に、ＮＰＲ−ｃＲＧＤ（約２μｇのｃＲＧＤペプチドに結合している０．０５ｍｇのナノ粒子を含む１０μＬ）を、ヌードラット脳の対側側に注入した。４日後に、動物を安楽死させ、脳を摘出し、切片化及び造影（赤色及び緑色は、それぞれ、ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ）及びＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞の存在を示す）のために急速凍結した。
【図２９】ｃＲＧＤペプチド複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ｃＲＧＤ）及びＴＲＡＩＬ複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ）が両方ともインビボで損傷部位に向かって移動することを示す図である。損傷は、脳の左側でのＰＢＳのニードル注入によって誘導し、４日後に、５μＬ（２５μｇ）のローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ）単独、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇの結合ＴＲＡＩＬ）及びＮＰＲ−ｃＲＧＤを、脳の対側側に注入した。４日後に、動物を屠殺し、ＮＰＲの蛍光を、蛍光顕微鏡下で視覚化した。示したように、ＮＰＲは、脳の他の部位に殆ど存在しなかったが、それらの分布は豊富であった。ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬは、主として損傷部位に沿って局在した。対照的に、ＮＰＲ−ｃＲＧＤは、損傷脳側の全体にわたって及び脳梁に沿って分布した。
【図３０Ａ】膀胱癌腫瘍細胞ＴＳＵ−ＰＲ１に対する、ＴＲＡＩＬ（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬに結合している１０〜４０ｎｇ／ｍＬ）のプロテアソーム阻害薬（ＰＳ、５ｍＭ）の不在又は存在下の両方での効果を示す図である。２４時間後に、細胞死を、ＬＤＨアッセイを使用して判定した。１００％の細胞死は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した細胞で判定し、データを正規化した。
【図３０Ｂ】乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ及び正常乳腺細胞ＭＣＦ１０Ａの両方に対する、ＴＲＡＩＬ（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬに結合している１０〜４０ｎｇ／ｍＬ）のプロテアソーム阻害薬（ＰＳ、５ｍＭ）の不在又は存在下の両方での効果を示す図である。２４時間後に、細胞死を、ＬＤＨアッセイを使用して判定した。１００％の細胞死は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理した細胞で判定し、データを正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様において、本発明は、磁性金属酸化物で被覆された金属キレート剤であるポリマーからなり、少なくとも１種の活性薬剤が該ポリマーに共有結合で結合しているナノ粒子を提供する。
【００１２】
本発明の磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子は、あたかも本明細書中に完全に開示されているように参照によりその全体で本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０６２０７９号に開示されている磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子をベースにするが、さらに、該ナノ粒子内部のポリマーに共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤を含む。このようなナノ粒子は、当技術分野で周知の任意の適した方法、例えば、後記の例１〜３に詳細に記載される方法によって、すなわち、少なくとも１種の活性薬剤が共有結合で結合している金属キレート形成ポリマー、例えば、ゼラチン（ここで、前記ポリマーは、水性溶液に溶解される）上への磁性金属酸化物、例えば、酸化鉄の制御された核形成、それに続く、ポリマー／金属酸化物核上への磁性金属酸化物薄膜層の段階的成長によって調製することができる。これらの例中で示されるように、この収率はほぼ１００％である。
【００１３】
後記の例１〜２では、金属キレート形成ポリマーとしてのゼラチン及び磁性金属酸化物としての酸化鉄からなる、本発明の磁性ナノ粒子の調製について説明する。これらの例中で示されるように、本発明の磁性ナノ粒子は、極めて狭い粒度分布で、且つ約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲の大きさで調製できる。さらに、これらの例は、ナノ粒子の均一性、原子秩序、磁気特性及び結晶特性を詳細に示す。本発明のナノ粒子は超常磁性である、すなわち、それらは、磁界の存在下で磁化されるが、磁界の不在下で残留磁気は観察されない。
【００１４】
例１〜２中に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の表面分析は、ナノ粒子の内部及び表面の両方にゼラチンが存在することを立証した。見出されたように、表面のゼラチンは、ナノ粒子、並びにそれを介して適切なリガンドを共有結合で結合できるカルボキシレート及び第一級アミンなどの官能基に対して、凝集に対抗するさらなる安定化を提供する。
【００１５】
好ましくは、本発明のナノ粒子の大きさは、３００ｎｍ未満、より好ましくは１００ｎｍ未満である。
【００１６】
本発明によれば、本発明のナノ粒子の調製に使用される金属キレート形成ポリマーは、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシレート、−ＳＨ、エーテル、イミン、ホスフェート又はスルフィド基などから選択される、金属イオン、特に鉄イオンを結合することができる官能基を有するポリマーでよい。好ましい実施形態において、金属キレート形成ポリマーは、ゼラチン、ポリメチレンイミン、キトサン又はポリリシン、より好ましくはゼラチンから選択される。
【００１７】
一実施形態において、前記の金属キレート形成ポリマーを被覆する磁性金属酸化物は、酸化鉄又は酸化鉄から誘導されるフェライトである。酸化鉄は、マグネタイト、マグヘマイト、又はこれらの混合物でよく、フェライトは、式（Ｆｅ，Ｍ）３Ｏ４の酸化物であり、ここで、Ｍは、好ましくはＺｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋又はＮｉ２＋から選択される遷移金属イオンである。好ましい実施形態において、本発明のナノ粒子の調製に使用される磁性金属酸化物は、酸化鉄である。
【００１８】
本発明によれば、金属キレート形成ポリマーに共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤は、限定はされないが、蛍光染料、造影剤、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド又は小分子から選択できる。
【００１９】
一実施形態において、金属キレート形成ポリマーに共有結合で結合している活性薬剤は、蛍光染料である。蛍光染料の例には、限定はされないが、ローダミン又はフルオレセインが含まれる。
【００２０】
別の実施形態において、金属キレート形成ポリマーに共有結合で結合している活性薬剤は、造影剤、すなわち、Ｘ線造影又は磁気共鳴造影（ＭＲＩ）において体内構造の視認性を向上させるのに使用される化合物である。Ｘ線造影のための造影剤の例には、限定はされないが、非水溶性であり、嚥下される又は浣腸剤として投与される消化管中でのみ使用される、硫酸バリウムをベースにした造影剤、並びに身体の殆どどこでも、特に静脈内及び動脈内、鞘内（脊椎）及び腹腔内で使用できる、ヨウ素をベースにした水溶性造影剤が含まれる。一般に使用されるヨウ素化造影剤は、ジアトリゾエート（Ｈｙｐａｑｕｅ５０）、メトリゾエート（Ｉｓｏｐａｑｕｅ  Ｃｏｒｏｎａｒ３７０）、イオキサグレート（Ｈｅｘａｂｒｉｘ）、イオパミドール（Ｉｓｏｖｕｅ３７０）、イオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ３５０）、イオキシラン（Ｏｘｉｌａｎ）、イオプロミド及びイオジキサノール（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ３２０）である。
【００２１】
さらなる実施形態において、金属キレート形成ポリマーに共有結合で結合している活性薬剤は、ペプチド又はペプチド模倣体である。
【００２２】
フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの細胞外マトリックス要素のアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ；ＲＧＤ）モチーフは、インテグリンに結合し、インテグリンで媒介される接着は、細胞の生存、増殖及び移動を調節する細胞内シグナル伝達事象をもたらす。ＲＧＤを含むペプチドを選別するファージディスプレイ法によって得られるデータは、それらのペプチドが腫瘍血管の内皮内膜へ選択的に結合することを明らかにした。ＲＧＤペプチドは、また、シグナル伝達を遅延させ、細胞の移動に影響を及ぼし、腫瘍細胞の退縮又はアポトーシスを誘導する。内皮又は腫瘍細胞のどちらかのインテグリンへ結合することによって、ＲＧＤペプチドは、腫瘍転移過程にとって必須である、腫瘍細胞−細胞外マトリックス及び腫瘍細胞−内皮細胞の接着を阻害して細胞輸送をインビボで調節する能力がある。いくつかの研究は、ＲＧＤを含む化合物が、腫瘍細胞の転移過程をインビトロ及びインビボで妨害できることを指摘している。個々のインテグリンに対して特異的であるペプチドは、かなり興味深く、医学的意義があり得る。αｖβ３インテグリンは、腫瘍血管新生に関連することが明らかにされた最初のインテグリンであり、αｖβ３インテグリンを特異的に封鎖するＲＧＤペプチドは、薬物を腫瘍血管系に向ける上での、腫瘍及び網膜の血管新生の阻害薬、骨粗鬆阻症の阻害薬としての有望性を示す。結果として、インテグリンに結合するペプチド及びペプチド模倣体を設計及び産生するのに多くの研究が注ぎ込まれた。
【００２３】
好ましい一実施形態において、ペプチド又はペプチド模倣体は、かくして、環状のＲＧＤ（ｃＲＧＤ）ペプチド又はペプチド模倣体、或いは非環式のＲＧＤを含むペプチド又はペプチド模倣体である。より好ましい実施形態において、ｃＲＧＤペプチドは、配列がシクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号１）のｃＲＧＤペプチドである。
【００２４】
よりさらなる実施形態において、金属キレート形成ポリマーに共有結合で結合している活性薬剤は、ポリペプチドである。
【００２５】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ、Ａｐｏ−２リガンド、Ａｐｏ−２Ｌ又はＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌとも呼ばれる）は、サイトカインに属する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーであり、その細胞死受容体の関与を介してアポトーシスを開始する能力がある。このファミリーのさらなるメンバーは、例えば、ＴＮＦα（ＴＮＦとも呼ばれる）、ＴＮＦβ、ＴＬ１Ａ（ＴＮＦ様リガンド）、リンホトキシン−β（ＬＴβ）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも呼ばれる）、Ａｐｏ−３リガンド（ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも呼ばれる）及びＴＡＬＬ−１（ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも呼ばれる）である（国際公開第２００４／００１００９号；Ｗａｎｇ及びＥｌ−Ｄｅｉｒｙ、２００３年）。
【００２６】
ＴＲＡＩＬは、その細胞外ドメインのＣＤ９５Ｌ（２８％同一）及びＴＮＦ（２３％同一）との配列相同性をベースにして最初に同定されクローン化されたＩＩ型膜貫通タンパク質である。ヒトＴＲＡＩＬポリペプチドの天然配列は、２８１アミノ酸長であるが、若干の細胞は、細胞外領域のポリペプチドの酵素的開裂によって天然の溶性形態のポリペプチドを産生できる。他の殆どのＴＮＦファミリーメンバーと同様、ＴＲＡＩＬは、２つのそのサブユニット間の界面でそれぞれ受容体分子を結合するホモ三量体を生成する。実際、ＴＲＡＩＬは、ＴＮＦリガンドファミリーの殆どと同様、異なる生物活性をもつことのできる膜結合形態及び可溶性形態の両方中に見出される。ＴＮＦファミリーの４つのメンバー、すなわち、Ｆａｓリガンド、ＴＮＦα、ＴＬ１Ａ及びＴＲＡＩＬは、アポトーシスを誘導するそれらの能力ゆえに、卓越している。他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、可溶性ＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）は、システイン残基が一緒にＺｎ原子に配位し、三量体の安定性及び最適な生物学的活性にとって必須である特有の構造的特徴を有する。機能研究は、ＴＲＡＩＬが、結腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳の腫瘍、並びに黒色腫、白血病及び多発性骨髄腫を含む各種腫瘍細胞系においてインビトロでアポトーシスを誘導する強力な能力を有するが、殆どの正常細胞ではそうではないことを示し、癌治療におけるその潜在的な治療的応用を強調した（国際公開第２００４／００１００９号；Ｗａｎｇ及びＥｌ−Ｄｅｉｒｙ、２００３年；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９９年；Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａら、２００７年；Ｓｍｙｔｈら、２００３年）。効力又は細胞死誘導に関してＴＲＡＩＬのように真に癌細胞特異的である薬剤は、極めて少数のみである。その発現がしっかりと調節され、且つ活性化細胞上で単に一過性で発現されることの多い他のＴＮＦファミリーメンバーと対照的に、ＴＲＡＩＬのｍＲＮＡは、広範な範囲の組織中で恒常的に発現される。ＴＲＡＩＬの主な生物学的機能は、アポトーシスの誘導であると思われるが、このリガンドの完全な生理学的役割は、今なお完全には解明されていない。肝臓のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上でのＴＲＡＩＬの発現は、ＮＫ細胞の大部分が、野生型及びＴ−細胞欠乏マウス中でＴＲＡＩＬ及びＩＦＮγの両方を恒常的に産生するので、ＮＫ細胞からオートクリン様式で分泌されるＩＦＮγによって調節されるように思われる。マウスでの遺伝子ノックアウト研究は、ＴＲＡＩＬが、免疫細胞による抗腫瘍監視において重要な役割を有すること、及びそれが、胸腺細胞のアポトーシスを媒介し、自己免疫疾患の誘導において重要であることを示した。
【００２７】
ＴＲＡＩＬは、その受容体との相互作用を介してアポトーシスを誘導する。これまで、ＴＲＡＩＬに対するＤＲ４、ＫＩＬＬＥＲ／ＤＲ５、ＤｃＲ１（Ｔｒａｉｌ−Ｒ３  ＴＲＩＤ）及びＤｃＲ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）を含む４種の相同ヒト受容体、並びに最初はＲＡＮＫＬ／ＯＰＧＬ受容体として同定されるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）と呼ばれる第５番目の可溶性受容体が同定されている。ＤＲ４及びＤＲ５は、両方とも、保存デスドメイン（ＤＤ）モチーフを含み、アポトーシスシグナルを送ることができる。残りの３種の受容体は、過剰発現された場合にＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを阻害するそれらの能力に対して「デコイ」として作用すると思われる。デコイ受容体１（ＤｃＲ１）及びＤｃＲ２は、ＤＲ４及びＤＲ５の細胞外ドメインに近い相同性を有する。ＤｃＲ２は、切断型非機能性細胞質ＤＤを有し、一方、ＤｃＲ１は、サイトゾル領域を欠き、糖リン脂質部分を介して原形質膜につなぎ留められる。ＴＲＡＩＬに対する受容体としてのＯＰＧの生理学的関連性は、生理学的温度でのこのリガンドに対する親和性が極めて低いので、不明である。ＴＲＡＩＬの選択的抗腫瘍活性に対して考え得る説明は、デコイ受容体が、腫瘍細胞と比較して正常細胞中で優先的に発現され、ＴＲＡＩＬの作用を妨害することである（国際公開第２００４／００１００９号；Ｗａｎｇ及びＥｌ−Ｄｅｉｒｙ、２００３年；Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａ、２００７年；Ｓｈａｈら、２００３年）。もう１つの考え得る説明は、殆どの腫瘍細胞系が、アゴニストＴＲＡＩＬ受容体を発現するが、アンタゴニスト受容体をまったく又は検出できないレベルで発現することであり、一方、正常細胞は、アンタゴニストＴＲＡＩＬ受容体を発現することが見出されており、それゆえ、ＴＲＡＩＬは、腫瘍細胞だけの選択的致死を可能にすることができる（Ｗｅｉら、２００６年）。
【００２８】
初期の有望な結果にもかかわらず、最近の研究は、種々の腫瘍においていくつかのＴＲＡＩＬ抵抗性癌細胞を同定している。癌細胞のＴＲＡＩＬに対する抵抗性は、細胞死受容体の差別的発現を含むことのできる各種分子標的の調節を介して発現すると思われる。細胞死受容体のシグナル伝達経路の分子的解析をベースにして、ＴＲＡＩＬの効力を高めるために、ＴＲＡＩＬと組み合わせた通常的抗癌薬の投与又は照射を含むいくつかの新たな取り組みが開発されている（Ｓｈａｎｋａｒ及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ、２００４年；Ｓｍｙｔｈら、２００３年）。
【００２９】
したがって、好ましい一実施形態において、ポリペプチドは、サイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＴＮＦ−β；ＴＮＦ関連サイトカイン又はインターロイキン（ＩＬ）である。ＴＮＦ関連サイトカインの非制限的例には、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド及びＡｐｏ−３リガンドが含まれ、ＴＲＡＩＬが好ましい。最も好ましい実施形態において、サイトカインはＴＲＡＩＬである。インターロイキンの非制限的例には、抗腫瘍活性を有する任意のインターロイキンが含まれ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３及びＩＬ−２７が好ましい。
【００３０】
別の実施形態において、ポリペプチドは酵素である。
【００３１】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、アバスチン又はレミケードなどの抗体である。アバスチンは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対抗するモノクローナル抗体であり、新たな血管の形成を封鎖することによって腫瘍の増殖を阻害するための癌治療で使用される。レミケードは、ＴＮＦα、炎症応答をトリガーし且つ維持する鍵となるサイトカインの１つに結合すること、及びそれがＴＮＦα受容体に結合するのを防止することによって自己免疫障害を治療するのに使用されるモノクローナル抗体である。
【００３２】
よりさらなる実施形態において、ポリペプチドは、ホルモン、すなわち、インスリン、オベスタチン又はグレリンなどのポリペプチドホルモンである。
【００３３】
別の実施形態において、金属キレート形成ポリマーに共有結合で結合している活性薬剤は、小分子である。
【００３４】
好ましい一実施形態において、小分子は、アントラサイクリン化学療法薬である。アントラサイクリン化学療法薬は、ダウノルビシン（アドリアマイシンとしても知られる）、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンを含むアントラサイクリンファミリーの任意の化学療法薬でよい。より好ましい実施形態において、アントラサイクリン化学療法薬は、キニン含有アントラサイクリンであり、腫瘍学において最も広範に処方され、利用される効果的な化学療法薬であるドキソルビシンである。ドキソルビシンは、膀胱、胃、卵巣、肺及び甲状腺の腫瘍を含む広範な範囲のヒト悪性腫瘍で指示され、乳癌、並びに急性リンパ芽球性及び骨髄性白血病、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ユーイング及び骨原生骨腫瘍、軟部組織肉腫、及び小児癌（神経芽細胞腫及びウィルムス腫瘍など）を含むその他の徴候の治療に利用できる最も活性のある薬剤の１つである。
【００３５】
別の好ましい実施形態において、小分子は、葉酸代謝拮抗薬、すなわち、葉酸の機能を損なう薬物である。葉酸代謝拮抗薬のよく知られ且つ好ましい例が、酵素であるジヒドロ葉酸レダクターゼを阻害し、かくしてプリン及びピリミジン合成にとって必須であるテトラヒドロ葉酸の形成を防止し、結果としてＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の産生阻害をもたらす葉酸類似体である、メトトレキセートである。葉酸代謝拮抗薬のその他の例には、トリメトプリム、ピリメタミン及びペメトレキセドが含まれる。葉酸代謝拮抗薬はヌクレオチドの代謝を妨げるので、それらの作用は、急速に分裂する細胞を特異的に標的とする。
【００３６】
さらなる好ましい実施形態において、小分子は、抗生物質である。
【００３７】
さらに別の好ましい実施形態において、小分子は、アミン由来ホルモン、すなわち、アミノ酸であるチロシン及びトリプトファンの誘導体である。アミン由来ホルモンの非制限的例には、カテコールアミン、例えば、エピネフリン、ノルエピネフリン及びドーパミン、並びにチロキシンが含まれる。
【００３８】
さらに別の好ましい実施形態において、小分子は、脂質又はリン脂質由来ホルモン、すなわち、リノール酸及びアラキドン酸などの脂質並びにリン脂質から誘導されるホルモンである。脂質及びリン脂質由来ホルモンの主な部類が、コレステロールから誘導されるステロイドホルモン、例えば、テストステロン及びコルチゾール、並びにエイコサノイド、すなわち、プロスタグランジンである。
【００３９】
よりさらなる好ましい実施形態において、小分子は、抗炎症薬である。
【００４０】
抗炎症薬は、痛風のための標準的治療であるコルチコステロイド、アルカロイドコルヒチン、或いは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、限定はされないが、アスピリン、コリン及びサリチル酸マグネシウム、サリチル酸コリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサール、エトドラク、フェノプロフェンカルシウム、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、サリチル酸マグネシウム、メクロフェナム酸ナトリウム、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、ロフェコキシブ、サルサレート、サリチル酸ナトリウム、スリンダック、トルメチンナトリウム及びバルデコキシブから選択できる。
【００４１】
前記のすべてを考慮して、１つの好ましい実施形態において、金属キレート形成ポリマーはゼラチンであり、金属酸化物は酸化鉄であり、ゼラチンに共有結合で結合している薬剤は、（ｉ）蛍光染料、好ましくはローダミン又はフルオレセイン、（ｉｉ）ＴＮＦ又はＴＮＦ関連サイトカイン、好ましくはＴＲＡＩＬ、（ｉｉｉ）アントラサイクリン化学療法薬、好ましくはドキソルビシン、（ｉｖ）葉酸代謝拮抗薬、好ましくはメトトレキセート、又は（ｖ）これらの組合せから選択される。より好ましい実施形態において、ゼラチンに共有結合で結合している前記少なくとも１種の薬剤は、蛍光染料又はＴＲＡＩＬである。
【００４２】
本発明によれば、前に規定したナノ粒子は、磁性金属酸化物の外表面に物理的に又は共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤をさらに含むことができ、ここで、前記少なくとも１種の活性薬剤は、ポリマーに共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤と同一又は異なるものである。
【００４３】
一実施形態において、前記活性薬剤は、磁性金属酸化物の外表面に共有結合で結合している。
【００４４】
後記の例４中で示されるように、磁性ナノ粒子を各種のポリマー、例えば、多糖類、タンパク質及びポリエチレングリコールで被覆することによって、これらの磁性ナノ粒子を安定化し、且つ外面の官能基をこれらの磁性ナノ粒子に共有結合で結合するための各種技術が確立された。これら被覆の官能基を、次いで、種々の試薬、例えば、タンパク質、酵素及び生物医学的応用のための薬物を共有結合させるのに使用した。
【００４５】
したがって、一実施形態において、磁性金属酸化物の外表面に共有結合で結合している活性薬剤は、実際には、磁性金属酸化物表面に結合した官能基を含む分子を介して結合している。いくつかの実施形態において、この分子は、多糖類、より好ましくはキトサン；タンパク質、より好ましくはゼラチン又はアルブミン；ペプチド；或いはポリアミンから選択されるポリマーを含む。
【００４６】
別の実施形態において、磁性金属酸化物の外表面に共有結合で結合している活性薬剤は、実際には、磁性金属酸化物外表面に結合した活性化リガンドを介して結合している。好ましい実施形態において、活性化リガンドは、塩化アクリロイル、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）、ジカルボニルイミダゾール、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）又はｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルである。より好ましい実施形態において、活性化リガンドはＤＶＳである。
【００４７】
上述のように、いくつかの場合では、活性化リガンドを、さらに、金属酸化物被覆の外側に伸びたポリマーに結合できる。
【００４８】
例５中で示されるように、活性薬剤を、磁性金属酸化物の外表面に物理的に結合することもできる。この物理的結合は、活性薬剤（単数又は複数）と磁性金属酸化物の外表面との間の非共有結合性相互作用、例えば、疎水性結合、イオン性相互作用及び水素結合に基づく。
【００４９】
したがって、別の実施形態において、（ｂ）の活性薬剤（単数又は複数）は、磁性金属酸化物の外表面に物理的に結合している。
【００５０】
本発明によれば、磁性金属酸化物の外表面に結合している少なくとも１種の活性薬剤は、限定はされないが、ポリマーに共有結合で結合している活性薬剤について前に規定したような、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド又は小分子から選択できる。一実施形態において、前記ペプチド又はペプチド模倣体は、環状のＲＧＤ（ｃＲＧＤ）ペプチド又はペプチド模倣体、好ましくは配列番号１のｃＲＧＤペプチド、或いは非環式のＲＧＤを含むペプチド又はペプチド模倣体であり；前記ポリペプチドは、サイトカイン、酵素、抗体、好ましくはアバスチン又はレミケード、或いはホルモン、好ましくはインスリン、オベスタチン又はグレリンであり；前記サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド又はＡｐｏ−３リガンド、好ましくはＴＲＡＩＬから選択されるＴＮＦ関連サイトカイン、或いはインターロイキン（ＩＬ）、好ましくは抗腫瘍活性を有するＩＬ、より好ましくはＩＬ−１２、ＩＬ−２３又はＩＬ−２７から選択され；前記小分子は、メトトレキセートなどの葉酸代謝拮抗薬、抗生物質、アミン由来ホルモン、脂質又はリン脂質由来ホルモン、抗炎症薬、或いはダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン又はミトキサントロン、好ましくはドキソルビシンから選択されるアントラサイクリン化学療法薬から選択される。
【００５１】
磁性金属酸化物の表面に共有結合又は物理的のどちらかで結合している活性薬剤（単数又は複数）の濃度は、結合形成パラメーター、例えば、工程中での活性薬剤（単数又は複数）濃度を変更することによって制御できる。
【００５２】
好ましい一実施形態において、本発明は、前に規定したようなナノ粒子を提供し、ここで、前記ポリマーはゼラチンであり、前記磁性金属酸化物は酸化鉄であり、ポリマーに共有結合で結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、（ｉ）蛍光染料、好ましくはローダミン又はフルオレセイン、（ｉｉ）ＴＮＦ又はＴＮＦ関連サイトカイン、好ましくはＴＲＡＩＬ、（ｉｉｉ）アントラサイクリン化学療法薬、好ましくはドキソルビシン、（ｉｖ）葉酸代謝拮抗薬、好ましくはメトトレキセート、又は（ｖ）これらの組合せから選択され、且つ磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、（ｖｉ）ＴＮＦ又はＴＮＦ関連サイトカイン、好ましくはＴＲＡＩＬ、（ｖｉｉ）ｃＲＧＤペプチド、好ましくは配列番号１のｃＲＧＤペプチド、（ｖｉｉｉ）抗腫瘍活性を有するインターロイキン、好ましくはＩＬ−１２、又は（ｉｘ）これらの組合せから選択される。より好ましい実施形態において、ポリマーに共有結合で結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、蛍光染料又はＴＲＡＩＬであり、磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤はＴＲＡＩＬである。
【００５３】
別の態様において、本発明は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００５４】
本発明の医薬組成物は、各種の生物学的、医学的及び治療的応用のために使用できる。
【００５５】
一実施形態において、本出願の医薬組成物は、診断、薬物安定化、薬物送達及び薬物の制御放出に使用される。
【００５６】
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくはゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を含有し、ここで、ポリマーに共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤は、蛍光染料である。この医薬組成物は、腫瘍検出のために使用できる。
【００５７】
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくはゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を含有し、ここで、ポリマーに共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤は、造影剤である。この医薬組成物は、Ｘ線造影又は磁気共鳴造影（ＭＲＩ）に使用できる。本発明は、かくして、必要とする個体に前記医薬組成物を投与することを含む、Ｘ線造影又は磁気共鳴造影（ＭＲＩ）のための方法に関する。
【００５８】
好ましい実施形態において、この組成物は、磁性金属酸化物の外表面に結合している腫瘍特異的細胞マーカーを結合することができる分子をさらに含むことができる。この組成物は、腫瘍の検出に使用できる。本発明は、かくして、必要とする個体に前に規定したような医薬組成物を投与することを含む、腫瘍の検出方法に関する。
【００５９】
用語「腫瘍特異的細胞マーカーを結合することができる分子」は、本明細書中で使用する場合、腫瘍に付随する抗原に向けられた抗体又はそのフラグメント；腫瘍に付随するリガンドに特異的な受容体又はそのフラグメント；或いは腫瘍に付随する受容体のリガンドを指す。
【００６０】
さらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくは、ゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を含み、ここで、ポリマーに共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤及び磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、同一又は異なって、ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド、又はＡｐｏ−３リガンドから選択されるＴＮＦ関連サイトカイン；ＩＬ−１２、ＩＬ−２３又はＩＬ−２７から選択される抗腫瘍活性を有するインターロイキン；ｃＲＧＤペプチド、好ましくは配列番号１のｃＲＧＤペプチド、ｃＲＧＤペプチド模倣体、ＲＧＤを含むペプチド又はペプチド模倣体；抗体、好ましくはアバスチン；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン又はミトキサントロンから選択されるアントラサイクリン化学療法薬；葉酸代謝拮抗薬；或いはこれらの組合せから選択される。好ましい実施形態において、ポリマーに共有結合で結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、ＴＲＡＩＬ、ドキソルビシン、メトトレキセート又はこれらの組合せから選択され、且つ磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、ＴＲＡＩＬ、配列番号１のｃＲＧＤペプチド、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せから選択される。この医薬組成物は、腫瘍の増殖を低減又は阻害するのに、或いは患者において腫瘍を外科的に除去した部位に残存している腫瘍細胞の増殖を低減又は阻害するのに使用できる。本発明は、かくして、さらに、前記患者に前記医薬組成物を投与することを含む、腫瘍の増殖を低減又は阻害する、或いは患者において腫瘍を外科的に除去した部位に残された腫瘍細胞の増殖を低減又は阻害する方法に関する。
【００６１】
よりさらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくはゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を含有し、ここで、ポリマーに共有結合で結合している少なくとも１種の活性薬剤は、蛍光染料又は造影剤であり、且つ磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド、又はＡｐｏ−３リガンドから選択されるＴＮＦ関連サイトカイン；ＩＬ−１２、ＩＬ−２３又はＩＬ−２７から選択される抗腫瘍活性を有するインターロイキン；ｃＲＧＤペプチド、好ましくは配列番号１のｃＲＧＤペプチド、ｃＲＧＤペプチド模倣体、ＲＧＤを含むペプチド又はペプチド模倣体；抗体、好ましくはアバスチン；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン又はミトキサントロンから選択されるアントラサイクリン化学療法薬；葉酸代謝拮抗薬；或いはこれらの組合せから選択される。好ましい実施形態において、磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、ＴＲＡＩＬ、配列番号１のｃＲＧＤペプチド、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せから選択される。この医薬組成物は、腫瘍の増殖を低減又は阻害するのに、及びその大きさを監視するのに使用できる。本発明は、かくして、さらに、前記患者に前記医薬組成物を投与することを含む、患者における腫瘍の増殖を低減又は阻害する、及びその大きさを監視する方法に関する。
【００６２】
用語「腫瘍」は、本明細書中で使用する場合、限定はされないが、脳腫瘍、好ましくは神経膠腫、結腸癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌、黒色腫、白血病又は多発性骨髄腫、好ましくは神経膠腫などの任意の腫瘍、並びにそれらの転移を指す。好ましい実施形態において、腫瘍は神経膠腫である。
【００６３】
脳腫瘍、特に悪性神経膠腫は、最も侵襲性のヒト癌に属する。悪性神経膠腫を有する患者は、これらの脳腫瘍が、従来の癌治療である放射線又は化学療法に殆ど応答しないので、不幸な予後を有する（Ｗｅｉら、２００６年）。神経膠腫の侵襲性の性質の原因となる特徴には、広範な脳水腫及び高度の血管新生に加えて、急速な増殖、遠い脳領域へのびまん性増殖及び浸潤が含まれる。悪性神経膠腫を有する患者は、１年未満の生存期間中央値をもち、長期生存者は偶然に存在するだけである。腫瘍と正常脳組織とを区別する上での困難性、及び脳を浸潤する神経膠腫の並外れた能力は、神経膠腫の療法及び診断において深刻な難題を提起し（Ｇｉｅｓｅら、２００３年）、現在、神経外科、放射線療法又は化学療法におけるさらなる進歩が、これらの患者の予後を相当に改善するとは予想されない（Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓら、２００５年）。
【００６４】
さらに、現代臨床神経腫瘍学において、組織病理学的診断は、任意の他のパラメーターを超えて、治療決定及び予後推定に影響を及ぼす。残念ながら、星状細胞腫瘍のはなはだしい不均一性は、それらの病理学的分類をやや困難にしている（Ｓａｎｓｏｎら、２００４年）。現在、神経膠芽細胞腫に対する特異的マーカーは存在せず、これらの患者の診断は、腫瘍検体の組織学的評価によって判定される。さらに、マーカーは、低悪性度星状細胞腫の神経膠芽細胞腫への進行を予測するのに利用できない。したがって、神経膠腫に特異的なマーカーの同定は、脳腫瘍の診断、並びに予後及び低悪性度星状細胞腫の腫瘍への進行の予測を助けることができる。
【００６５】
未分化型星状細胞腫及び多形性神経芽細胞腫を含む悪性神経膠腫は、最も一般的な原発性脳腫瘍である。現在の治療選択肢には、手術、放射線療法及び化学療法が含まれるが、予後は、極めて不良であり、かくして、代替治療手段の開発が、強く望まれる。遺伝子療法は、悪性神経膠腫に対する革新的な治療手段と考えられ、この１０年間に、中枢神経系中での外来遺伝子の発現を可能にする送達システムの開発に大きな関心が寄せられてきた。この目的に関して、カチオン性アルブミンナノ粒子、リポソーム及び不完全複製単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）中に組み込まれた、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）をコードするプラスミド又はベクターが開発された。（Ｓｈａｈら、２００３年；Ｖａｎ  Ｍｅｉｒ及びＢｅｌｌａｉｌ、２００４年；Ｃａｒｌｏ−Ｓｔｅｌｌａら、２００７年；Ｗｅｉ  Ｌｕら、２００６年；Ｚｈａｎｇら、２００２年）。しかし、通常の治療に比べた遺伝子療法戦略の優越性に関する客観的な証拠を提供する、説得力のある臨床試験は出現していない。遺伝子療法に対する代わりの取り組みには、腫瘍中へのＴＲＡＩＬの直接送達が含まれる。この取り組みは、しかし、ＴＲＡＩＬの制約された安定性及びその低いバイオアベイラビリティー、細胞膜を横切る上での非効率性、及び貧弱なインビボでの代謝安定性のため、難題を提示する（Ｄｅｎｉｃｏｕｒｔ及びＤｏｗｄｙ、２００４年；Ｓｈｉｒ及びＬｅｖｉｔｚｋｉ、２００１年；Ｓｈａｈら、２００３年；国際公開第２００４／０４５４９４号）。
【００６６】
したがって、好ましい実施形態において、腫瘍は神経膠腫である。
【００６７】
本発明の医薬組成物は、腫瘍の増殖を、その大きさを監視して又はしないで、低減又は阻害すること、或いは患者において腫瘍を外科的に除去した部位に残された腫瘍細胞の増殖を低減又は阻害することを目指す場合に、放射線療法と組み合わせて使用することができる。それを考慮して、（ｉ）腫瘍の増殖を低減又は阻害するための、（ｉｉ）患者において腫瘍を外科的に除去した部位に残された腫瘍細胞の増殖を低減又は阻害するための、或いは（ｉｉｉ）腫瘍の増殖を低減又は阻害し、且つその大きさを監視するための、前に規定したような各種方法を、放射線療法と組み合わせて実施することができる。
【００６８】
酸化鉄が炎症部位に誘引されることは周知であるので、よりさらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子を含有し、ここで、前記磁性金属酸化物は酸化鉄であり、ポリマーに共有結合で結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は蛍光染料又は造影剤であり、且つ磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は抗炎症薬である。この医薬組成物は、個体における炎症部位の検出及び前記炎症の治療に使用することができる。本発明は、かくして、炎症部位を検出するための、及び前記炎症を治療するための方法に関するものであり、必要とする個体に前記医薬組成物を投与することを含む。
【００６９】
さらに別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくはゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を含有し、ここで、ポリマーに共有結合で結合している前記少なくとも１種の活性薬剤、及び磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、それぞれ独立にインスリンである。この医薬組成物は、２型糖尿病を治療するのに使用できる。本発明は、かくして、必要とする個体に前記医薬組成物を投与することを含む、２型糖尿病を治療する方法に関する。
【００７０】
さらに別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくはゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を含有し、ここで、ポリマーに共有結合で結合している前記少なくとも１種の活性薬剤、及び磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、それぞれ独立にオベスタチンである。この医薬組成物は、肥満を治療するのに使用できる。本発明は、かくして、必要とする個体に前記医薬組成物を投与することを含む、肥満を治療する方法に関する。
【００７１】
さらなる実施形態において、本発明の医薬組成物は、前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくはゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子を含有し、ここで、ポリマーに共有結合で結合している前記少なくとも１種の活性薬剤、及び磁性金属酸化物の外表面に結合している前記少なくとも１種の活性薬剤は、それぞれ独立にグレリンである。この医薬組成物は、食欲不振を治療するのに使用できる。本発明は、かくして、必要とする個体に前記医薬組成物を投与することを含む、食欲不振を治療する方法に関する。
【００７２】
さらなる態様において、本発明は、候補化合物での治療に対する腫瘍細胞の応答性を評価する方法に関するものであり、前記腫瘍から採取された生検材料からの細胞を前に規定したような磁性ポリマー／金属酸化物複合ナノ粒子、好ましくはゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子と接触させること、及び腫瘍細胞の生存率を監視することを含み、ここで、ナノ粒子中の磁性金属酸化物の外表面に結合している活性薬剤は、評価される候補化合物であり、ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド又はＡｐｏ−３リガンドから選択されるＴＮＦ関連サイトカイン；ＩＬ−１２、ＩＬ−２３又はＩＬ−２７から選択される抗腫瘍活性を有するインターロイキン；ｃＲＧＤペプチド、好ましくは配列番号１のｃＲＧＤペプチド、ｃＲＧＤペプチド模倣体、ＲＧＤを含むペプチド又はペプチド模倣体；抗体、好ましくはアバスチン；ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン又はミトキサントロンから選択されるアントラサイクリン化学療法薬；葉酸代謝拮抗薬；或いはこれらの組合せから選択され、且つ該ナノ粒子は、ポリマーに共有結合で結合している蛍光染料又は造影剤を含む。
【００７３】
別の態様において、本発明は、磁性金属酸化物で被覆された金属キレート剤であるポリマーからなるナノ粒子を提供し、ここで、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド又は小分子から選択される抗腫瘍活性を有する少なくとも１種の薬剤が、磁性金属酸化物の外表面に結合している。
【００７４】
もっぱらナノ粒子の外表面に、並びに金属キレート形成ポリマー及び磁性金属酸化物に結合している抗腫瘍薬を有するナノ粒子の大きさに関する各種の規定は、少なくとも１種の活性薬剤をポリマーに共有結合で結合するに際して前に規定した磁性ナノ粒子に関して規定したものと同じである。さらに、磁性ナノ粒子に関して規定したように、抗腫瘍活性を有する薬剤を、磁性金属酸化物の外表面に共有結合で又は物理的に結合することができる。
【００７５】
前に規定したように、抗腫瘍活性を有する薬剤は、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド又は小分子でよい。
【００７６】
一実施形態において、抗腫瘍活性を有する薬剤は、ｃＲＧＤペプチド又はペプチド模倣体などのペプチド又はペプチド模倣体、或いは非環式のＲＧＤを含むペプチド又はペプチド模倣体である。好ましい実施形態において、ｃＲＧＤペプチドは、配列番号１のｃＲＧＤペプチドである。
【００７７】
さらなる実施形態において、抗腫瘍活性を有する薬剤は、サイトカイン、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βなどのポリペプチド；ＴＮＦ関連サイトカイン又はインターロイキンである。ＴＮＦ関連サイトカインの非制限的例には、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド、及びＡｐｏ−３リガンドが含まれる。好ましい実施形態において、サイトカインは、ＴＲＡＩＬ、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３又はＩＬ−２７、より好ましくはＴＲＡＩＬである。
【００７８】
さらに別の実施形態において、抗腫瘍活性を有する薬剤は、小分子である。小分子の非制限的例には、前に規定したようなアントラサイクリン化学療法薬及び葉酸代謝拮抗薬、好ましくはそれぞれドキソルビシン及びメトトレキセートが含まれる。
【００７９】
一実施形態において、本発明は、もっぱらナノ粒子の外表面に結合している抗腫瘍薬を有するナノ粒子を提供し、ここで、前記ペプチド又はペプチド模倣体は、ｃＲＧＤペプチド又はペプチド模倣体、好ましくは配列番号１のｃＲＧＤペプチド、或いは非環式のＲＧＤを含むペプチド又はペプチド模倣体であり；前記ポリペプチドは、ＴＮＦ−α；ＴＮＦ−β；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＡＬＬ−１、ＴＮＦ様リガンドＴＬ１Ａ、リンホトキシン−β（ＬＴ−β）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド、又はＡｐｏ−３リガンド、好ましくはＴＲＡＩＬから選択されるＴＮＦ関連サイトカイン；インターロイキン（ＩＬ）、好ましくはＩＬ−１２、ＩＬ−２３又はＩＬ−２７；或いは抗体、好ましくはアバスチンから選択されるサイトカインであり；前記小分子は、メトトレキセートから選択される葉酸代謝拮抗薬、或いはダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロン、好ましくはドキソルビシンから選択されるアントラサイクリン化学療法薬、又はこれらの組合せから選択される。好ましい実施形態において、前記ポリマーはゼラチンであり、前記磁性金属酸化物は酸化鉄であり、且つ抗腫瘍活性を有する前記少なくとも１種の薬剤は、ＴＮＦ又はＴＮＦ関連サイトカイン、アントラサイクリン化学療法薬、葉酸代謝拮抗薬、又はこれらの組合せである。最も好ましい実施形態において、抗腫瘍活性を有する前記少なくとも１種の薬剤は、ＴＲＡＩＬである。
【００８０】
さらに他の態様において、本発明は、腫瘍の増殖を低減又は阻害するのに使用するための、前に規定したようにもっぱらナノ粒子の外表面に結合している抗腫瘍薬を有するナノ粒子及び医薬として許容し得る担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００８１】
好ましい実施形態において、この医薬組成物は、もっぱらナノ粒子の外表面に結合している抗腫瘍薬を有するナノ粒子を含有し、ここで、抗腫瘍活性を有する少なくとも１種の薬剤は、ＴＲＡＩＬ、配列番号１のｃＲＧＤペプチド、ＩＬ−１２、ドキソルビシン、メトトレキセート又はこれらの組合せである。
【００８２】
前に規定したように、もっぱらナノ粒子の外表面に結合している抗腫瘍薬を有するナノ粒子は、腫瘍の増殖を低減又は阻害するのに、或いは患者において腫瘍を外科的に除去した部位に残された腫瘍細胞の増殖を低減又は阻害するのに使用することができる。本発明は、かくして、さらに、腫瘍の増殖を低減又は阻害するための、或いは患者において腫瘍を外科的に除去した部位に残された腫瘍細胞の増殖を低減又は阻害するための方法に関するものであり、前記患者に前記医薬組成物を投与することを含む。前に説明したように、これらのナノ粒子を、放射線療法と組み合わせて使用できる。したがって、この方法は、放射線療法と組み合わせて実施できる。
【００８３】
さらに別の態様において、本発明は、候補化合物での治療に対する腫瘍細胞の応答性を評価する方法に関するものであり、前記腫瘍から採取された生検材料からの細胞を、前に規定したようにもっぱらナノ粒子の外表面に結合している抗腫瘍薬を有するナノ粒子、好ましくはもっぱらナノ粒子の外表面に結合している抗腫瘍薬を有するゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子と接触させること、及び腫瘍細胞の生存率を監視することを含み、ここで、ナノ粒子の磁性金属酸化物の外表面に結合している抗腫瘍薬は、評価される候補化合物である。
【００８４】
本発明によって提供される医薬組成物は、通常の技術、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５年に記載のように調製できる。組成物は、固体、半固体又は液体形態でよく、さらに、医薬として許容し得る増量剤、担体又は希釈剤、及びその他の不活性成分及び賦形剤を含むことができる。さらに、医薬組成物は、ナノ粒子の徐放出用に設計することができる。組成物は、任意の適切な経路、例えば、静脈内、経口、非経口、直腸、経皮又は局所で投与できる。投与量は、患者の状態で左右され、実施者によって適切と考えられるように決定される。
【００８５】
投与経路は、活性化合物を適切な又は望ましい作用部位に効果的に輸送する任意の経路でよく、静脈内経路が好ましい。固体担体を経口投与用に使用するなら、調合物を、錠剤化し、硬質ゼラチンカプセル中に粉末又はペレットの形態で充填することができ、或いはロゼンジの形態でもよい。液体担体を使用するなら、調合物は、シロップ、乳液又は軟質ゼラチンカプセルの形態でよい。タルク及び／又は炭水化物の担体又は結合剤などを有する錠剤、糖衣錠又はカプセルは、経口適用に特に適している。錠剤、糖衣錠又はカプセル用の好ましい担体には、乳糖、コーンスターチ及び／又は馬鈴薯デンプンが含まれる。
【００８６】
上述のように、悪性神経膠腫は、患者における最も一般的な原発性の頭蓋内腫瘍である。これらの腫瘍の予後は、それらが、放射線又は化学療法に殆ど応答しないので、不良である。腫瘍と正常脳組織とを区別する上での困難性、及び脳に浸潤する神経膠腫の並外れた能力は、神経膠腫の療法及び診断において深刻な難題を提起する。
【００８７】
ＴＲＡＩＬは、初期には細胞膜で発現され、続いてタンパク質分解プロセシングで誘導される膜貫通タンパク質である。溶性ＴＲＡＩＬ（ｓＴＲＡＩＬ）は、殆どの正常細胞を避けながら、多様な起源の腫瘍細胞でアポトーシスを誘導することができる。しかし、以前の殆どの研究は、細胞培養で実施されたが、インビボでのｓＴＲＡＩＬの送達及び効率は、あまり確立されておらず、成功していない。インビボでのｓＴＲＡＩＬ治療に関する主な障害は、タンパク質分解の切断によるその短い半減期のせいであり、それゆえ、過剰量のｓＴＲＡＩＬを必要とする。インビボでのｓＴＲＡＩＬ治療は、ＴＲＡＩＬを脳に投与する上での困難、及びインビボにおけるＴＲＡＩＬに対する神経膠腫の相対的鈍感性のため、神経膠腫腫瘍に対して特別な効果はない。
【００８８】
後記の例６〜８は、少なくとも１種の活性薬剤が、ナノ粒子内部のポリマーに共有結合で結合し、且つ任意選択で、同一又は異なる活性薬剤が、磁性金属酸化物の外表面に結合している場合、並びに活性薬剤がポリマーに共有結合で結合しなかった場合の両方での、本発明のゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を用いて実施したインビトロ及びインビボでの各種実験を詳細に説明する。
【００８９】
これらの例中に示すように、蛍光及び非蛍光性ゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子の両方に対するＴＲＡＩＬの複合化は、ｓＴＲＡＩＬを有意に安定化し、ｓＴＲＡＩＬの酵素分解を最小化し、それによって、腫瘍細胞のアポトーシスに必須なｓＴＲＡＩＬの量を低減した。この取り組みは、効率的なアポトーシスのための腫瘍細胞へのｓＴＲＡＩＬの選択的送達を可能にする。さらに、ｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子は、浸潤性腫瘍細胞を選択的に追跡し、インビボで細胞毒性効果を発揮し、腫瘍を有する動物の生存を有意に増加させた。ｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子の細胞毒性効果に抵抗性であった腫瘍細胞は、低レベルのγ−照射と、それに続くｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子での治療との併用治療を使用することによって敏感になった。別法として、これらの細胞を、１種を超える活性薬剤が複合されたナノ粒子で効率的に治療した。この目的に使用される活性薬剤は、ｓＴＲＡＩＬ、及びｃＲＧＤペプチド、ＩＬ−１２、ｃＲＧＤペプチド及びアドリアマイシンなどのその他の抗癌薬（単数又は複数）であった。これらの薬剤を、種々の組合せで、磁性金属酸化物表面、ナノ粒子内部のポリマーのどちらかに、或いはその両方に結合した。
【００９０】
治療的応用に加えて、これらのｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子は、ＭＲＩ及び／又は蛍光による腫瘍造影のためのマーカーとして役立った。ヒト神経膠腫腫瘍を移植された動物モデルにおいてこれらの造影モダリティを使用することによって、ｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子は、腫瘍部位に移行し、腫瘍の周辺及び内部に蓄積し、一方、ｓＴＲＡＩＬを結合していないナノ粒子は、より徐々に移行し、腫瘍細胞の周辺のみに蓄積することが立証された。ｓＴＲＡＩＬを複合したナノ粒子を、ｓＴＲＡＩＬを安定化するための、腫瘍を診断するための、及びアポトーシスを誘導するために腫瘍を標的化することを助けるためのビヒクルとして使用する。蛍光染料をポリマーに結合したナノ粒子を使用することによって、ｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子が、浸潤性腫瘍細胞を識別し、標的にすることがさらに示された。神経膠腫細胞を特異的に標的にするｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子の能力を、脳内腫瘍の境界を判定するのに、及び再発性神経膠腫と放射線誘導性壊死とを区別するのに採用することもできる。加えて、神経膠腫以外の腫瘍細胞、例えば、癌腫、乳癌及び肺癌を標的とすること、及びそれらのアポトーシスを誘導することに関するｓＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子の効率を立証した。
【００９１】
本発明を、これより以下の非制限的実施例により説明する。
【実施例】
【００９２】
（例１）ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の合成及び特徴づけ
大きさが約５ｎｍから１００ｎｍの範囲であり狭い粒度分布のゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を、国際公開第９９／０６２０７９号に詳細に記載のように、核形成、それに続くゼラチン／酸化鉄核上への磁性酸化鉄薄膜の制御された成長によって調製した。核形成ステップは、ゼラチンのキレート形成部位へのＦｅ＋２イオンの錯体形成、それに続くキレート化されたＦｅ＋２のＦｅ＋３への部分酸化（ほぼ５０％まで）を基礎とし、その結果、水溶性ゼラチンはキレート化されたＦｅ＋２及びＦｅ＋３イオンの両方を含んでいた。次いで、ＮａＯＨ又は代わりにアンモニア水溶液を約ｐＨ９．５となるまで添加することによってゼラチン／酸化鉄の核を形成した。ゼラチン核上への磁性膜の成長は、核形成ステップを数回繰り返すことによって完遂された。
【００９３】
簡潔には、平均乾燥直径が１５ｎｍのナノ粒子を、２００ｍｇのゼラチン（Ｓｉｇｍａ社）を含む８０ｍＬの水溶液に、ＦｅＣｌ２溶液（１０ミリモル／５ｍＬのＨ２Ｏ）続いてＮａＮＯ２溶液（７ミリモル／５ｍＬのＨ２Ｏ）を添加することによって調製した。１０分間反応させた後、ＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）をｐＨ９．５になるまで添加した。この手順を、４回、又はより大きな粒子が所望されるならそれ以上繰り返した。次いで、形成された磁性ナノ粒子を、磁気勾配カラムを使用して洗浄して過剰な試薬を洗い流した。表面分析により、ナノ粒子の内部及び表面上の両方でのゼラチンの存在が立証された。表面のゼラチンは、ナノ粒子、並びにそれを介して適切なリガンドを共有結合で結合できるカルボキシレート及び第一級アミンなどの官能基に対して、凝集に対抗するさらなる安定化を提供する。図１Ａ〜１Ｄは、成長ステップ中で磁性薄膜形成工程をそれぞれ４〜７回繰り返すことによって形成される、大きくなった平均直径を有する磁性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。図２は、前記のように調製され、水に分散された乾燥平均直径が１５ｎｍの磁性ナノ粒子が、約１００ｎｍの水力学的平均直径を有する１本の狭い個体群をもつことを示している。図３Ａ〜３Ｂは、０．４７９ｎｍのｄ−間隔を有する結晶構造を示している高分解能ＴＥＭ（ＨＴＥＭ）画像（３Ａ）、磁性ナノ粒子の結晶的特性を示す鮮明な環を描写している電子線回折（ＥＤ）画像（３Ｂ）を示す。図４は、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンを示し、これらのナノ粒子の結晶核が、殆ど完全にマグヘマイト（γ−Ｆｅ２Ｏ３）からなることを示している。Ｘ線ラインの拡がりから、１５ｎｍの磁性核の平均直径が導き出される。図５は、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子のメスバウアースペクトルを示し、さらに、これらのナノ粒子がマグヘマイトからなることを示している。まず、この核形成及び成長工程によってマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）ナノ粒子が作り出され、次いで、それが、熱力学的により安定な酸化鉄、マグヘマイトへ酸化されたと想定される。図６は、乾燥直径が１５ｎｍのマグヘマイト型ナノ粒子の室温でのヒステリシスループを表し、これらのナノ粒子のＭ（Ｈ）曲線は、いかなる保持力をも示さず、且つ１０，０００エルステッド（Ｏｅ）で飽和せず、一方、１０，０００エルステッドで得られる磁気モーメントが、約４１ｅｍｕ／ｇであることを示している。この特性は、両方とも、超常磁性挙動を代表する。
【００９４】
様々な大きさ及び特性を有する均一なゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を、以前に国際公開第９９／０６２０７９号に開示されているように、調製条件、例えば、酸化試薬、鉄塩の種類、ｐＨ及び温度を変えて調製した。乾燥直径が１５ｎｍより小さく５ｎｍまでの大きさの均一なナノ粒子を、酸、例えば、ｐＨが約１．０のＨＣｌ、又はＥＤＴＡ及びシュウ酸などの鉄キレートを形成するリガンドを用いる、１５ｎｍのナノ粒子の漸進的表面溶解によって調製した。所望の直径を達成した後に、磁性ナノ粒子を、蒸留水中で洗浄した。
【００９５】
（例２）蛍光染料で標識されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の合成
蛍光染料を主として磁性複合ナノ粒子内に封じ込めた、蛍光染料で標識されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を、図７に図示するように、ゼラチンを、蛍光染料に共有結合で結合しているゼラチンに代えて例１に記載のように調製した。例えば、２００ｍｇのゼラチンを含む２０ｍＬ水溶液に、５ｍｇのローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）を含む０．５ｍＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を徐々に添加することによって、ローダミンで標識されたナノ粒子を調製した。水溶液のｐＨをＮａＯＨ水溶液（１Ｎ）を添加して９．５まで上昇させ、溶液を６０℃で１時間振盪した。この方法は、ゼラチンのヒドロキシル及びアミン基の一部とＲＩＴＣのイソチオシアネートとの間のチオ尿素及び／又はチオウレタン結合を介する共有結合の形成を含む。次いで、過剰のＲＩＴＣを、前者の水溶液の６０℃でのＨ２Ｏに対する徹底的な透析（カットオフ：１２〜１４０００）、又は磁気カラムを通す洗浄によって、ゼラチンと複合したローダミン鎖から除去した。溶液の容積を８０ｍＬに調整し、次いで例１に記載のように合成を継続した。
【００９６】
類似の方法を、他の適切な染料、例えば、フルオレセインを用いて実施した。
【００９７】
（例３）薬物（単数又は複数）を含むゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の合成
薬物を含むゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を、ゼラチンを、薬物に共有結合で結合しているゼラチンに代えて、例１に記載のように調製した。例えば、アドリアマイシン（Ａｌｄｒｉｃｈ社）を、Ｍｅｌａｍｅｄ及びＭａｒｇｅｌ（２００１年）が発表しているようなカルボジイミド活性化法によって共有結合でゼラチンに結合した。簡潔には、２００ｍｇのゼラチン及び５ｍｇのアドリアマイシンを含む２０ｍＬのＭＥＳ緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ５．０、Ｓｉｇｍａ社）に、１２３ｍｇのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓｉｇｍａ社）及び８２ｍｇのＣＤＣ（１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩、Ｓｉｇｍａ社）を添加し、次いで、溶液を、６０℃で２時間振盪した。溶液を、水に対する透析（カットオフ：１２〜１４０００）によって洗浄して過剰な試薬を洗い流した。溶液の容積を８０ｍＬに調整し、次いで、例１に記載のように合成を継続した。
【００９８】
類似の方法で、メトトレキセート又は／及びｓＴＲＡＩＬを別々に又は組み合わせて共有結合でゼラチンに結合した、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を調製した。
【００９９】
（例４）ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の官能化
例１〜３に記載のように調製したゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の表面に官能基を作り出すための各種方法は、（ｉ）被覆形成ポリマー、例えば、デキストランのナノ粒子表面に対する高い親和性、（ｉｉ）マイケル付加反応による、ナノ粒子表面上の官能基と、所望の官能性リガンド（例えば、ナノ粒子表面上で活性化される二重結合を有するタンパク質などのアミノリガンド）との間での共有結合の形成、又はＭｅｌａｍｅｄ及びＭａｒｇｅｌ（２００１年）が発表しているようなカルボジイミド活性化法による、カルボキシレート基（ゼラチン被覆に属する）に対する共有結合の形成、及び（ｉｉｉ）ナノ粒子表面上での被覆形成ポリマー、例えば、ゼラチン又はアルブミンの沈殿などの様々な原理に基づいて開発されている。ナノ粒子表面の官能基を、次いで、様々な活性化法によって、各種薬物、例えば、ＴＲＡＩＬ及びｃＲＧＤペプチドを共有又は物理的に結合するのに使用した。
【０１００】
４（ｉ）活性化される二重結合を用いる官能化
例１〜３に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子にジビニルスルホン（ＤＶＳ）を、当初の［ＤＶＳ］／［ナノ粒子］の重量比を４／１として添加し、次いで、トリエチルアミンを１０．５のｐＨに到達するように添加し、続いて６０℃で一夜インキュベートした。形成された官能化ゼラチン／酸化鉄−ＤＶＳナノ粒子、又は蛍光染料標識化ゼラチン／酸化鉄−ＤＶＳナノ粒子を、次いで、磁気勾配カラムを用い０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ＝８．３）で洗浄し、４℃で貯蔵した。
【０１０１】
４（ｉｉ）活性化される二重結合を含む架橋型デキストラン被覆を用いる官能化
例１〜３に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の水性分散液に２％（ｗ／ｖ）デキストラン（ＭＷ４８，０００、Ｓｉｇｍａ社）を添加し、デキストランを溶解した後、水性分散液を８５℃で３時間振盪した。デキストランで被覆されたナノ粒子を、磁気カラムを使用し、水で洗浄して過剰なデキストランを洗い流した。物理的に吸着されたデキストランの水性連続相中への漏れを防止するために、及び表面で活性化される二重結合を生じさせるために、デキストラン被覆の架橋を、ＤＶＳを用いて前記の４（ｉ）に記載のように実施した。
【０１０２】
４（ｉｉｉ）活性化される二重結合の不在又は存在下でゼラチン又はアルブミン被覆を用いる官能化
例１〜３に記載のように調製されたゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の水性分散液に０．２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを添加し、次いで、水性分散液を８５℃で３時間振盪した。水性分散液を室温まで冷却し、次いで、ゼラチンで被覆されたナノ粒子を、磁気カラムを用いて洗浄した。必要なら、前記の４（ｉ）に記載のようにＤＶＳ誘導体化を実施した。
【０１０３】
ゼラチンをウシ又はヒト血清アルブミンに代えて、ナノ粒子上のアルブミン被覆を同様に実施した。
【０１０４】
（例５）官能性ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子上への薬物の固定化
５（ｉ）ゼラチン／酸化鉄−ＤＶＳ磁性複合ナノ粒子上へのヒトＴＲＡＩＬ又はＩＬ１２の固定化
例４に記載のように調製された１ｍｇのゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を含む１ｍＬの重炭酸塩緩衝分散液（０．１Ｍ、ｐＨ＝８．３）に、２０μｇのヒトＴＲＡＩＬ（ｈＴＲＡＩＬ、ＣｙｔｏＬａｂ社、イスラエル）を添加し、次いで、分散液を室温で６０分間混合した。この方法は、ナノ粒子の残留二重結合とＴＲＡＩＬの第一級アミノ基とのマイケル付加による結合形成を含む。次いで、活性化される残留二重結合の封鎖を、グリシンを用い、グリシン（１％ｗ／ｖ）を添加すること及び分散液の混合を室温でさらに６０分間継続することによって実施した。過剰な未結合のｈＴＲＡＩＬ及びグリシンを、磁気勾配カラムを使用してＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で除去した。結合したｈＴＲＡＩＬの濃度は、ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（９００−Ｋ１４１、ロット番号１１０４１４１０、ＣｙｔｏＬａｂ社、イスラエル）で測定して、約２０００ｎｇ／ｍｇナノ粒子であることが見出された。
【０１０５】
ｈＴＲＡＩＬをＩＬ１２に代えて、ゼラチン／酸化鉄−ＤＶＳ磁性複合ナノ粒子上にＩＬ１２を同様に結合した。
【０１０６】
５（ｉｉ）ゼラチン／酸化鉄−ＤＶＳ磁性複合ナノ粒子上へのｃＲＧＤペプチドの固定化
上記５（ｉ）に記載の実験を、２０μｇのｈＴＲＡＩＬを配列シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（配列番号１）を有する３ｍｇのｃＲＧＤペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ケンタッキー州４０２２４、米国）に代えて繰り返した。ネガティブ対照として、ｃＲＧＤペプチドを配列シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）を有するｃＲＡＤペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）に代えて類似の方法を実施した。
【０１０７】
５（ｉｉｉ）ゼラチン／酸化鉄−ＤＶＳ磁性複合ナノ粒子上へのｈＴＲＡＩＬ及びｃＲＧＤペプチドの固定化
前記５（ｉ）に記載の実験を、グリシンを３ｍｇのｃＲＧＤペプチドに代えて繰り返し、結果として、残っているＤＶＳの活性化される残留二重結合をｃＲＧＤペプチドに複合した。
【０１０８】
５（ｉｖ）ゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子上への生物活性試薬、例えば、ｈＴＲＡＩＬ及び／又はｃＲＧＤペプチドの固定化
ヒトＴＲＡＩＬ及び／又はｃＲＧＤペプチドを、例１〜３及び例４（ｉｉｉ）により調製されたゼラチン／酸化鉄複合ナノ粒子に、Ｍｅｌａｍｅｄ及びＭａｒｇｅｌ（２００１年）に記載のようなカルボジイミド活性化法により共有結合で結合した。簡潔には、２００ｍｇのナノ粒子を含む２０ｍＬのＭＥＳ緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ５．０、Ｓｉｇｍａ社）に、１２３ｍｇのＮＨＳ及び８２ｍｇのＣＤＣを添加し、次いで、ナノ粒子分散液を室温で３時間振盪した。活性化されたナノ粒子を、磁気勾配カラムを使用してＰＢＳで徹底的に洗浄し、次いで、２０ｍＬの洗浄された活性化ナノ粒子分散液に、８ｍｇのｈＴＲＡＩＬ又は５０ｍｇのｃＲＧＤペプチドを含む５ｍＬのＰＢＳ溶液を添加した。懸濁液を、室温で約８時間振盪し、次いで、残留活性化基の封鎖を、グリシン（２００ｍｇ）又はｃＲＧＤペプチド（５０ｍｇ）のどちらかを用いて、それぞれ５（ｉ）又は５（ｉｉｉ）に記載のように実施した。
【０１０９】
５（ｖ）ゼラチン／酸化鉄−ＤＶＳ磁性複合ナノ粒子上へのアバスチン又はレミケードの固定化
例４に記載のように調製された１ｍｇのゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を含む１ｍＬの重炭酸塩緩衝分散液（０．１Ｍ、ｐＨ＝８．３）に、２０μｇのモノクローナル抗体、アバスチン（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）又はレミケード（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）を添加し、次いで、分散液を室温で６０分間混合する。この方法は、ナノ粒子の残留二重結合とアバスチン又はレミケードの第一級アミノ基とのマイケル付加による結合形成を含む。次いで、残留活性化二重結合の封鎖を、グリシンを用い、グリシン（１％ｗ／ｖ）を添加すること及び分散液の混合を室温でさらに６０分間継続することによって実施する。過剰の未結合アバスチン又はレミケード及びグリシンを、磁気勾配カラムを使用してＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で除去する。
【０１１０】
５（ｖｉ）ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子上への生物活性試薬、例えば、ｈＴＲＡＩＬの物理的固定化
例３に記載のように調製された１ｍｇの非官能化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子、又は例４（ｉｉｉ）に記載のように調製されたアルブミン被覆化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子を含む１ｍＬの重炭酸塩又はＰＢＳ緩衝分散液（０．１Ｍ、ｐＨ＝８．３）に、２０μｇのヒトＴＲＡＩＬ（ｈＴＲＡＩＬ、ＣｙｔｏＬａｂ社、イスラエル）を添加した。次いで、分散液を室温で１２０分間混合し、結果として、ｈＴＲＡＩＬを、非被覆又はアルブミン被覆化ナノ粒子に非共有結合で結合した。この物理的な結合形成は、ＴＲＡＩＬとナノ粒子との間の非共有結合性相互作用、例えば、疎水性結合、イオン性相互作用及び水素結合に基づく。過剰の未結合ｈＴＲＡＩＬを、磁気勾配カラムを使用してＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で除去した。
【０１１１】
５（ｖｉｉ）ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子上へのヒトＴＲＡＩＬの固定化
ヒトｓＴＲＡＩＬを、Ｍｅｌａｍｅｄ及びＭａｒｇｅｌ（２００１年）が発表しているようなカルボジイミド活性化法により、ゼラチン／酸化鉄ナノ粒子に直接結合した。典型的な実験において、１０ｍｇのナノ粒子を含む１５ｍＬのＭＥＳ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ５．０）に、１２３ｍｇのＮＨＳ及び８２ｍｇのＣＤＣを添加した。次いで、ナノ粒子混合物を、室温で約３時間振盪した。活性化されたナノ粒子を、磁気勾配カラムを使用して洗浄した。次いで、８ｍＬの洗浄された活性化ナノ粒子のＰＢＳ分散液に、０．５ｍｇのｓＴＲＡＩＬを含むＰＢＳ溶液（２ｍＬ）を添加した。次いで、分散液を室温で約２時間振盪した。次いで、残留活性化二重結合の封鎖を、グリシン又は第一級アミノポリエチレングリコールを用いて、グリシン（１％ｗ／ｖ）（又は第一級アミノポリエチレングリコール、５ｍｇ）を添加すること、及び分散液の混合を室温でさらに６０分間継続することによって実施した。過剰の未結合ｈＴＲＡＩＬ及びグリシン（又はアミノポリエチレングリコール）を、磁気勾配カラムを使用して、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で除去した。
【０１１２】
５（ｉ）〜５（ｖｉ）に記載の結合生物活性剤の濃度は、結合パラメーター、例えば、ｈＴＲＡＩＬ濃度を変更することによって制御した。
【０１１３】
（例６）インビトロ研究：神経膠腫細胞の標的化、造影及びアポトーシス
材料及び方法
細胞系：次の実験で使用されるすべての細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）又はＨｅｒｍｅｌｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州）から入手した。すべての細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン−ペニシリンで補足されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中、５％ＣＯ２下に３７℃で培養した。
【０１１４】
細胞アポトーシスの測定：細胞のアポトーシスは、プロピジウムヨージド（ＰＩ）染色を使用して測定し、Ｒｉｃｃａｒｄｉ及びＮｉｃｏｌｅｔｔｉ（２００６年）によって発表されているようなフローサイトメトリーによって、及びＢｌａｓｓら（２００２年）によって発表されているような抗ヒストン抗体を使用するＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ）によって分析した。細胞（１０６／ｍＬ）を、３７℃の６穴プレートに播種し、指示された処理（１０μＬ以下のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）又はペプチド、例えば、ＴＲＡＩＬ、又は未結合若しくはペプチド結合型ナノ粒子を含むＰＢＳを添加）で２４時間処理した。剥離細胞及びトリプシン処理接着細胞を、捕集し、氷上において７０％エタノール中で１時間固定し、ＰＢＳで洗浄し、ＲＮアーゼ（５０μＭ）と室温で１５分間処理した。次いで、細胞を、ＰＩ（５μｇ／ｍＬ）で染色し、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎセルソーターで分析した。
【０１１５】
細胞の生存能を、死亡細胞から培地に放出される細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａ社から購入したキット）を測定することによって、さらに定量的に評価した。この目的の場合、対照及び処理細胞から上清液を捕集し、続いて遠心（１，４００×ｇ、１０分間）し、上清液を９６穴プレートに移し、製造業者の説明書に従ってＬＤＨを測定した。
【０１１６】
６（ｉ）ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子への複合化によるＴＲＡＩＬの安定化
分解に対する遊離及び複合型ＴＲＡＩＬの安定性を調べるために、遊離ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ）又はＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、１００ｎｇ  ＴＲＡＩＬ）のどちらかを含む１ｍＬのＰＢＳを１０℃でインキュベートし、ＴＲＡＩＬの濃度を３５日間測定した。図８は、ナノ粒子へのＴＲＡＩＬの複合化が、ＴＲＡＩＬを安定化し、その結果、複合型ＴＲＡＩＬの初期濃度を１０℃で３５日目まで維持したことを示している。対照的に、遊離ＴＲＡＩＬは、これらの条件下で有意に分解した。
【０１１７】
６（ｉｉ）ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、ヒト神経膠腫細胞及び原発性腫瘍から確立された神経膠腫球におけるアポトーシスを誘導する
ヒト神経膠腫細胞Ａ１７２を、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）又はＮＰ−ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）のどちらかと５時間インキュベートした。細胞アポトーシスを、プロピジウムヨージド染色で判定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）及び細胞の形態学的外観の両方によって分析した。図９Ａは、遊離ＴＲＡＩＬが、細胞の約４８％のアポトーシスを誘導し、一方、ＮＰ−ＴＲＡＩＬは、細胞の約５７％のアポトーシスを誘導し、ナノ粒子単独は、有意な細胞アポトーシスを誘導しなかったことを示している。換言すれば、複合型ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシス活性は、遊離のそれによって誘導されるものに比べて少なくとも１０倍高かった。
【０１１８】
遊離ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）及びＮＰ−ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）のアポトーシス効果を、３種の異なる腫瘍、すなわち、ＨＦ２０２０、ＨＦ１２５４及びＨＦ１３０８に由来する神経膠腫球状体を使用してさらに試験した。これらの培養物は、それらが、その三次元構造及び細胞−細胞相互作用を維持するので、元々の腫瘍により類似している。見出されたように、図９Ｂに示すＨＦ２０２０、及びＨＦ１３０８に由来する神経膠腫球状体は、ＴＲＡＩＬ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬに応答して細胞アポトーシスを受けたが、一方ＨＦ１２５４は、わずかに軽度の細胞アポトーシスを受けた。詳細には、図９Ｂ及び図１０に示すように、ＴＲＡＩＬ及びＮＰ−ＴＲＡＩＬは、両方とも、ＨＦ２０２０及びＨＦ１３０８神経膠腫球状体においてＬＤＨ濃度を有意に高めた。
【０１１９】
６（ｉｉｉ）各種神経膠腫細胞系及び神経膠腫一次培養物における、遊離ＴＲＡＩＬ及びＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の細胞毒性効果
神経膠腫細胞Ｕ８７、Ａ１７２及びＵ２５１、並びに神経膠腫細胞ＨＦ１３０８、ＨＦ１２５４及びＨＦ１３１６の一次培養物を、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）又はゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）単独と共に２４時間インキュベートした。次いで、細胞を、捕集し、プロピジウムヨージドで染色し、ＦＡＣＳ分析でｓｕｂ−Ｇ０集団（アポトーシス細胞）について分析した。図１１は、すべての場合に、ＮＰ単独の細胞毒性効果は、ＰＢＳによって引き起こされる効果と相違なかったこと、及びＮＰ−ＴＲＡＩＬは、遊離ＴＲＡＩＬのそれに比べて有意により高い細胞毒性活性を呈示したことを示している。
【０１２０】
６（ｉｖ）各種神経膠腫細胞におけるＴＲＡＩＬ複合型非蛍光及び蛍光染料標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の細胞毒性効果
ヒト神経膠腫細胞Ａ１７２細胞を、非蛍光ナノ粒子（ＮＰ−Ｃｏｎｔｒｏｌ）、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）、ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ）及びＴＲＡＩＬ複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ、１０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）と共に５時間インキュベートした。アポトーシスを、プロピジウムヨージド染色を使用して判定し、ＦＡＣＳで分析した。図１２に示すように、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシス（５１％）は、ＮＰ−ＴＲＡＩＬによって誘導されるもの（４５％）に類似していた。同様の結果が、他の神経膠腫細胞、例えば、Ｕ２５１及びＵ８７についても観察された。これらの結果は、蛍光性ＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子が、それらの非蛍光性対応物に類似し、遊離ＴＲＡＩＬのそれに比べて約１０倍多い神経膠腫細胞のアポトーシスを誘導することを示している。
【０１２１】
６（ｖ）蛍光性ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の神経膠腫細胞中への特異的内部移入
正常星状細胞に比較した神経膠腫細胞に対するＮＰ−ＴＲＡＩＬの特異性を、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬを用いて調べた。詳細には、ヒト神経膠腫細胞Ａ１７２及び正常ヒト星状細胞を、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ（１０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）と共に３０分間インキュベートし、細胞を、共焦点顕微鏡を使用して観察し、写真撮影した。図１３に示すように、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬは、処理の３０分以内にＡ１７２細胞に入り込み、ＥＲ／ゴルジ領域に蓄積し、一方、正常星状細胞では極めて弱い蛍光が観察された。同様に、ＴＲＡＩＬと複合されていないＮＰＲは、両方の細胞型において細胞に入り込まなかった（データは示さない）。これらの結果は、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬが、おそらく、ＴＲＡＩＬ受容体への結合形成に続く内部移入によって神経膠腫細胞に入り込み、且つそれらは、細胞中に薬物を送達するＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子の能力に対して重要な関連を有する可能性があることを示している。
【０１２２】
６（ｖｉ）γ−照射とＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子との相乗効果
ＮＰ−ＴＲＡＩＬは、多くの神経膠腫細胞系においてアポトーシスを誘導したが、この処理に抵抗性のあるいくつかの神経膠腫細胞が存在した。かくして、γ線は、ＴＲＡＩＬ受容体の発現を高めることによって腫瘍細胞のＴＲＡＩＬに対する感度を高めることが報告されているので、神経膠腫細胞のアポトーシスに対するＮＰ−ＴＲＡＩＬとγ線との併用処理の効果を調べた。詳細には、ＴＲＡＩＬに対して敏感であったＡ１７２及びＵ２５１細胞、並びにＴＲＡＩＬに対して低い応答を示したＵ８７細胞、及びＴＲＡＩＬ処理に抵抗性であったＬＮ−１８細胞を採用し、最適状態に及ばない濃度のＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）及びγ線（１０Ｇｙ）を使用した。細胞をＮＰ単独、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍｌ）、γ線（１０Ｇｙ）、又はＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍｌ）とγ線（１０Ｇｙ）の組合せで処理した。併用処理では、細胞を、最初に照射し、２時間後に、ＮＰ単独で又はＮＰ−ＴＲＡＩＬで処理した。２４時間後に、細胞アポトーシスを判定した。図１４は、併用処理によって誘導されるアポトーシスが、有意に高められたこと、及び低線量のγ−照射を付加することが、ＮＰ−ＴＲＡＩＬに対するいくつかの神経膠腫細胞の抵抗性を克服したことを示している。
【０１２３】
６（ｖｉｉ）ｃＲＧＤペプチド複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、神経膠腫細胞において自己貪食を誘導する
神経膠腫細胞中で誘導される別のタイプの細胞死は、Ｇｏｚｕａｃｉｋ及びＫｉｍｃｈｉ（２００４年）の文献に記載のようなＩＩ型細胞死又は自己貪食である。自己貪食を特徴付けるために、細胞を、ＬＣ３−ＧＦＰプラスミドでトランスフェクトし、自己貪食性空胞形成の蓄積を調べた。見出されたように、対照細胞では、ＩＣ３−ＧＦＰが細胞中のいたるところに出現したが、自己貪食細胞では、断続染色が観察された。それを考慮して、ＮＰ単独で処理された対照細胞中及びｃＲＧＤペプチド複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ｃＲＧＤ）で処理された細胞中のＬＣ３−ＧＦＰのパターンを調べた。この目的のために、Ｕ２５１細胞を、ＬＣ３−ＧＦＰで２４時間トランスフェクトし、細胞を、ｃＲＧＤペプチド（１０μｇ／ｍＬ）、ＮＰ単独又はＮＰ−ｃＲＧＤ（約４μｇ  ｃＲＧＤ／ｍＬ）でさらに２４時間処理し、次いで、断続ＧＦＰ染色を有する細胞の割合を計算した。図１５に示すように、約２４時間で、ｃＲＧＤで処理された細胞の約３０％及びＮＰ−ｃＲＧＤで処理された細胞の約１８％が、ＬＣ３−ＧＦＰの高められた断続パターンを示した。それとは対照的に、対照又はＮＰで処理された細胞のほんの２〜３％が、断続染色を示した。
【０１２４】
６（ｖｉｉｉ）ＴＲＡＩＬ及びｃＲＧＤペプチド複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の相乗効果
この実験では、ＴＲＡＩＬ処理に抵抗性であったＬＮ−１８細胞を、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬ及びｃＲＧＤペプチド複合型ナノ粒子（例５（ｉｉｉ）に記載のように調製された）又はアドリアマイシンを含むＴＲＡＩＬ及びｃＲＧＤペプチド複合型ナノ粒子（例３及び５（ｉｉｉ）に記載のように調製された）と共に２４時間インキュベートした。付加的薬物（ｃＲＧＤペプチド及びアドリアマイシン）の相乗効果が、ＮＰ−ＴＲＡＩＬでは約８％、ＴＲＡＩＬ及びｃＲＧＤペプチド複合型ナノ粒子では約２５％、及びアドリアマイシンを含むＴＲＡＩＬ及びｃＲＧＤペプチド複合型ナノ粒子では４５％であった、アポトーシスパーセントの有意な増加によって立証された。
【０１２５】
６（ｉｘ）各種腫瘍細胞のアポトーシスに対するＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の効果
この実験では、神経膠腫以外の腫瘍細胞に対するＮＰ−ＴＲＡＩＬの効果を、子宮頸癌細胞系ＨｅＬａ、乳癌細胞系ＭＣＦ−７及び肺癌細胞Ａ５４９を使用して調べた。図１６は、５時間のインキュベーション後のＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）、ＮＰ単独又はＰＢＳ（対照）のアポトーシス効果を示している。示したように、ＰＢＳ及びＮＰは、両方とも、微々たるアポトーシス効果を有したのに、ＮＰ−ＴＲＡＩＬは、ＴＲＡＩＬによって誘導されるものの少なくとも２倍である有意なアポトーシスを誘導し、ナノ粒子へのＴＲＡＩＬの複合化は、そのアポトーシス効果を維持し、さらには各種癌細胞に対するその効果を増大させたことを示した。細胞アポトーシスは、プロピジウムヨージド（ＰＩ）染色を使用して判断し、フローサイトメトリーで分析した。
【０１２６】
６（ｘ）ヒト神経膠腫幹細胞球に対するγ−照射とＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子との相乗効果
神経膠腫幹細胞を、腫瘍標本２３５５及び２３０３から確立し、球状体として増殖させ、培養組織中に２ヶ月間維持した。神経膠腫幹細胞は、自己複製を示し、ポリ−Ｌ−リシン上で星状細胞、ニューロン及びオリゴデンドロサイトに分化した。細胞に対するＮＰ及びＮＰ−ＴＲＡＩＬの効果を調べるために、球状体を、６穴プレートに播種し、ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＮＰ単独又はＮＰ−ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）で２４時間処理した。次いで、上清液を捕集し、ＬＤＨ分析を実施した。
【０１２７】
γ線とＴＲＡＩＬとの併用効果を評価するために、細胞を、まず５Ｇｙの放射線で照射し、４時間後に、ＴＲＡＩＬ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬのどちらかでさらに２４時間処理した。細胞死を、培養上清液中のＬＤＨ濃度を使用して判定した。様々な処理で誘導されるアポトーシス効果は、両方の神経膠腫幹細胞系で類似しており、図１７Ａ〜１７Ｂに示した。ＮＰ単独、γ−照射単独又は遊離ＴＲＡＩＬでは微々たるアポトーシス効果が観察された。ＮＰ−ＴＲＡＩＬは、中位のアポトーシス効果を誘導したが、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ及び遊離ＴＲＡＩＬは、両方とも、γ−照射と一緒になって、有意なアポトーシスを誘導した。
【０１２８】
６（ｘｉ）ＩＬ−１２複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、ヒト卵巣癌細胞においてアポトーシスを誘導する
卵巣癌細胞を、培地単独、ＩＬ−１２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＮＰ（５０μｇ／ｍＬ）又はＩＬ−１２複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＩＬ−１２、５０ｎｇ  ＩＬ−１２／ｍＬ）で処理し、２４時間インキュベートし、次いで、ＬＤＨアッセイを使用して細胞死について分析した。図１８に示すように、ＩＬ−１２及びＮＰ−ＩＬ−１２は、両方とも、さらに細胞形態に反映されたように、培養細胞中で細胞死を誘導した。
【０１２９】
（例７）インビボ研究：神経膠腫細胞の標的化、造影及びアポトーシス
材料及び方法
細胞系及び動物：Ｕ２５１細胞を、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）又はＨｅｒｍｅｌｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈｅｎｒｙ  Ｆｏｒｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州）から得た。すべての細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ、ユタ州）、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン−ペニシリンで補足されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中、５％ＣＯ２下に３７℃で培養した。雌性Ｎｕ／Ｎｕラットを、ＮＣＩ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ社（Ｆｏｒｔ  Ｄｅｔｒｉｃｋｓ、メリーランド州）から得た。すべてのラットが、腫瘍移植の時点で６〜８週齢であった。
【０１３０】
腫瘍移植及びナノ粒子投与：ラットを、入荷後、使用に先立って１週間順化させた。腫瘍細胞の移植に先立って、動物を麻酔し、無菌手術に備えた。頭皮を貫いて長さ１ｃｍの切り目を作り、２６ゲージのニードルを使用して、捩じることによって、正中線の右側に２ｍｍ且つ背側に２ｍｍの位置に頭骨を通して穴を静かに開けた。次いで、動物を、マイクロ−マニピュレーター及びシリンジホルダーを具備した脳定位固定装置（Ｋｏｐｆ社、Ｔｕｊｕｎｇａ、カリフォルニア州）中に配置した。ニードルを事前に形成した穴中に３ｍｍ下げ、０．５ｍｍ上昇させ、腫瘍塊（５μＬ）を、全部で２．５分にわたって徐々に注入した。ニードルを、定位置に１分間残し、次いで、１分間にわたって徐々に上昇させた。脳定位固定装置から動物を取り出し、穴をボーンワックスで密閉し、頭皮を縫い合わせ、動物を回復について監視した。腫瘍移植後の４、７又は１０日目に、対照ナノ粒子（０．０５ｍｇ）の存在しない若しくは存在するＰＢＳ（１０μＬ）、ＴＲＡＩＬ複合型ナノ粒子（０．０５ｍｇのナノ粒子に複合された１００ｎｇのＴＲＡＩＬ）又は遊離ＴＲＡＩＬ（１００、２００又は８００ｎｇ）を、同一手法で同側又は対側半球中に移植した。選んだ時点又は罹患徴候の時点のどちらかで、生理食塩水、それに続く１０％ホルマリンでの標準灌流を実施した。脳を取り出し、さらなる処置のため１０％中性緩衝ホルマリン中に一夜浸漬した。蛍光で標識された腫瘍及びナノ粒子を可視化するために、選んだ時点で、生理食塩水での標準灌流を実施した。脳を取り出し、さらなる可視化に向けて、クライオスタットを使用して切片化のために急速凍結した。
【０１３１】
組織化学、免疫組織化学、ナノ粒子の可視化及びアポトーシスの検出：ホルマリンで固定した組織をパラフィン中に包埋し、切片化（５μｍ）し、組織形態学的評価のためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。ヘマトキシリンは、核、細胞質の酸性領域及び軟骨マトリックスを青色に染色する。エオシンは、細胞質の塩基性領域及びコラーゲン繊維をピンク色に染色する（Ｇａｒｔｎｅｒ及びＨｉａｔｔ、２００１年）。５μｍの切片を、６０℃のオーブン中で１時間乾燥し、定型的にｄｄＨ２Ｏに至るまで脱パラフィンした。ヒト細胞を検出するには、切片を１：２５０で希釈のヒトミトコンドリア抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、カタログ＃Ｈ１００６０）と共にインキュベートした。免疫組織化学は、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｎｅｍｅｓｉｓ  ７２００（Ｃｏｎｃｏｒｄ社、カリフォルニア州）染色剤及び試薬を使用して実施した。切片を、Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｓｎｉｐｅｒブロックで７分間封鎖し、Ｂｉｏｃａｒｅ希釈液中、一次抗体と共に６０分間インキュベートした。緩衝液で洗い流した後、切片を、アビジン−ビオチンで１５分間封鎖した。洗い流した後、汎用リンク、続いて、ＨＰ（Ｂｉｏｃａｒｅ社）及びＢｅｔａｚｏｉｄ  ＤＡＢを使用して抗原を検出した。緩衝液に続いてｄＨ２Ｏで洗い流し、ＣＡＴヘマトキシリンで１０秒間対比染色した。対照切片を、一次抗体なしで処理した。
【０１３２】
ナノ粒子の可視化（青色）のためのゴモリ鉄反応染色（Ｓｈｅｅｈａｎ及びＨｒａｐｃｈａｋ、１９８０年）を、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からの５μｍ切片を利用して行った。５μｍ切片を６０℃のオーブン中で１時間乾燥し、定型的にｄｄＨ２Ｏに至るまで脱パラフィンした。残りのすべてのステップには、酸で洗浄したガラス器具を使用した。スライドを、等部の２０％ＨＣｌ及び１０％ヘロシアン化カリウム水中に１０〜２０分間浸漬した。次いで、スライドを、ｄｄＨ２Ｏ中で十分洗い流し、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄで２分間対比染色し、続いて脱水、洗浄し、次いでカバーガラスをかぶせた。各染色に対する陽性対照として脾臓の切片を使用した。
【０１３３】
アポトーシス細胞の染色は、アポトーシス細胞を特異的に検出するＴＵＮＥＬ染色（褐色染色）を使用して実施した（Ｓｈａｈら、２００３年）。簡潔には、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の染色を、Ａｐｏｐｔａｇ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、カリフォルニア州）を製造業者の説明書に従って利用して実施した。簡潔には、ホルマリン固定パラフィン包埋組織からの５μｍ切片を、６０℃のオーブン中で１時間乾燥し、定型的に脱パラフィンした。次いで、組織を、プロテイナーゼＫ（２０μｇ／ｍＬ）で１５分間、室温で前処理した。スライドをｄｄＨ２Ｏ中で２回洗浄し、内在性ペルオキシダーゼを３．０％過酸化水素／ＰＢＳ中、室温で５分間失活させた。スライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、各スライドに７５μＬ／５ｃｍ２の平衡緩衝液を少なくとも１０秒間添加した。過剰の液体を軽く叩き落し、５５μＬ／５ｃｍ２のＴｄＴ酵素を添加した。スライドを１時間インキュベートし、次いで、停止／洗浄緩衝液中で撹拌しながら１５秒間、次いで室温で１０分間洗浄した。次に、スライドを、３種のＰＢＳでそれぞれ１分間洗浄し、続いて６５μＬ／５ｃｍ２の抗ジゴキシゲニン複合体と共に３０分間インキュベートした。４種のＰＢＳでの各２分間に続いて、スライドを、７５μＬ／５ｃｍ２のペルオキシダーゼ基質と共に室温で３〜６分間インキュベートした。スライドを、最後の３種のｄｄＨ２Ｏでそれぞれ１分間洗浄し、ｄｄＨ２Ｏ中で５分間インキュベートし、次いで、メチルグリーンを用い室温で１０分間対比染色し、ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、１００％ｎ−ブタノールで洗浄し、キシレンで脱水し、パーマウント（ｐｅｒｍｏｕｎｔ）を用いてカバーガラスをかぶせた。
【０１３４】
造影：免疫組織学的及び組織化学的画像は、×１０、×２０及び×４０の対物レンズをニコンＤＸＭ１２００Ｃデジタルカメラに連結し、Ｄｅｌｌ  Ｏｐｔｉｐｌｅｘ  ＧＸ６２０コンピューター上のＡＣＴ−１Ｃソフトウェアを使用してデジタル化された、ニコンＥｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００Ｍ顕微鏡を使用して室温で撮影した。複合像作製のためにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ中にＴｉｆｆ画像を取り込んだ。挿入写真は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して行われた拡大写真である。
【０１３５】
蛍光画像は、×４、×１０及び×２０の対物レンズをデジタルカメラに連結したニコンＣ１共焦点顕微鏡を使用して室温で撮影した。複合像作製のために、ビットマップ画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ中に取り込んだ。
【０１３６】
インビボでのＭＲ造影研究：適切な麻酔状態は、ハロタン（Ｎ２：Ｏ２が２：１の混合物中で、導入には３％、維持には０．７〜１．５％）を使用して得られた。麻酔されたラットを、ＢＲＵＫＥＲコンソール（Ｂｅｌｌｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）にインターフェースで連結された７テスラの穴径２０ｃｍの超伝導マグネット（Ｍａｇｎｅｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａｂｉｎｇｄｏｎ、英国）中に配置した。最大勾配が４５ガウス／ｃｍの１２ｃｍ自己シールド型勾配セットを使用した。ラジオ周波数（ＲＦ）のパルスを、動物頭骨の中心線上に配置された直径３．２ｃｍの表面受信コイルからのＴＴＬ制御によって能動的にデカップルされた直径７．５ｃｍのサドル型コイルによって印加した。脳定位固定イヤーバーを使用して、造影処理中の動きを最小化した。フィードバック制御されたウォーターバスを使用して、直腸温度を３７±０．５℃に維持した。各ＭＲＩセッションでのマグネット中での動物の再現性ある配置のために、改変された迅速低角度撮影（ＦＬＡＳＨ）造影シーケンスを採用した。ＭＲ研究は、Ｔ１−及びＴ２−及びＴ２＊加重ＭＲＩスキャンを使用して実施した。酸化鉄で標識された細胞を検出する場合、一般に採用されるスキャンは、Ｔ２＊Ｗ勾配エコーである。Ｔ１−、Ｔ２−及びＴ２＊加重ＭＲＩスキャンのための平均検査時間は、脳腫瘍のインビボ研究の場合、それぞれ、ほぼ９、１３及び１３分であった。ＭＲＩを取得するために、次のパラメーターを使用した：Ｔ１−加重多重スライスシーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝５００／１０ミリ秒、１２８×１２８マトリックス、１３〜１５スライス、１ｍｍ厚、３２ｍｍ撮像視野（ＦＯＶ）、励起回数（ＮＥＸ）＝４）。Ｔ２加重画像は、標準二次元フーリエ変換（２ＤＴＦ）多重スライス（１３〜１５）多重エコー（６エコー）ＭＲＩを使用して得た。６セットの一連の画像（各セットに対して１３〜１５スライス）を、１０、２０、３０、４０、５０及び６０ミリ秒のＴＥ並びに３０００ミリ秒のＴＲを使用して得た。画像は、３２ｍｍのＦＯＶ、１ｍｍのスライス厚、１２８×１２８のマトリックス、及びＮＥＸ＝２を使用して作製した。Ｔ２＊加重画像は、標準多重スライス（１３〜１５スライス）、多重勾配エコー（６エコー）ＭＲＩを使用して得た。６セットの一連の画像（各セットに対して１３〜１５スライス）は、５、１０、１５、２０、２５及び３０ミリ秒のＴＥ並びに３０００ミリ秒のＴＲを使用して得た。画像は、３２ｍｍのＦＯＶ、１ｍｍのスライス厚、１２８×１２８のマトリックス及びＮＥＸ＝２を使用して作製した。Ｔ２及びＴ２＊画像の両方を使用して、Ｔ２及びＴ２＊マップを測定した。三次元（３Ｄ）勾配エコーＭＲ画像は、ＴＲ＝１００ミリ秒、ＴＥ＝６ミリ秒、１０°のフリップ角（ＦＡ）、３２×３２×１６ｍｍ３のＦＯＶ、２５６×１９２×６４のマトリックス、及びＮＥＸ＝１を使用して得た。全シーケンスの総時間はほぼ２０分間であった。体温を維持するために、加熱パッドを使用した。直腸プローブを使用して、体温をモニターした。画像品質を３テスラと７テスラのＭＲ装置間で比較するために、ランダムに選択された動物は、３テスラを使用するＭＲＩを受けた。３テスラのＭＲＩで造���する場合、適切な麻酔は、塩化ケタミン及びキシラジンを注入することによって達成された。加熱された覆布でラットを適切に覆って体温を維持した。
【０１３７】
７（ｉ）神経膠腫動物モデルの確立
ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）のインビボでの効果を調べるために、２種の神経膠腫動物モデルを確立した。第１モデルでは、ヒトＵ８７又はＵ２５１細胞を、ヌードマウス中に頭蓋内で移植した。第２モデルでは、新鮮な手術腫瘍検体からのヒト神経膠腫細胞を採用し、ヌードラット中に移植し、元々の腫瘍の初期特性を維持する腫瘍を作り出し、かくして様々な抗癌治療に対するこれらの腫瘍の応答を予測できる系を提供した。
【０１３８】
７（ｉｉ）ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、神経膠腫において細胞アポトーシスを誘導する
ＮＰ−ＴＲＡＩＬのインビボでの効果を調べるために、異種移植片としてヒトＵ２５１神経膠腫細胞を採用した。腫瘍を７日間発育させ、その時点で、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ）単独又はＰＢＳを腫瘍部位に頭蓋内で注入した。治療の７日後に、細胞アポトーシスの程度を調べた。細胞アポトーシスは、アポトーシス細胞を特異的に検出するＴＵＮＥＬ染色（褐色染色）を使用して判定した。図１９は、ＮＰ単独又はＮＰ−ＴＲＡＩＬのどちらかで処理されたラットからの腫瘍切片を示す。示したように、ＮＰ単独は、有意な程度の細胞アポトーシスを誘導しなかったが、ＮＰ−ＴＲＡＩＬは、ＴＵＮＥＬ（褐色染色）陽性細胞によって判定されるような大規模な細胞アポトーシスを誘導した。なお、ＰＢＳで処理されたラットでも、有意な細胞アポトーシスは、示されなかった（データは示さない）。
【０１３９】
７（ｉｉｉ）ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、神経膠腫において生存を延長する
ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ  ＴＲＡＩＬ）が生存上の利益を提供できるか否かを判定するために、ＰＢＳ、ＮＰ単独又はＮＰ−ＴＲＡＩＬを、ヌードラット脳中の異種移植片ヒトＵ２５１腫瘍中に腫瘍内で直接的に送達した。次いで、動物を、罹患の徴候についてモニターし、任意の徴候の出現又は腫瘍移植後８５日目の時点で安楽死させた。図２０に示すように、ＮＰ−ＴＲＡＩＬでの処理は、ＮＰ単独（ｐ＝０．０２４８）又はＰＢＳ（ｐ＝０．０２８８）のそれを超えて生存を有意に延長した。罹患時点での代表的腫瘍の顕微鏡写真を図２１Ａ〜２１Ｃに示す。腫瘍罹患のために安楽死させた動物では大きな腫瘍が明らかであるが、打ち切った動物では腫瘍は明らかでない。しかし、これらの動物では若干の瘢痕形成が、明らかである（矢印）。各シリーズは、同一動物及び２ｍｍ離れた切片から撮影される。また、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（１００ｎｇ  ＴＲＡＩＬ）を含む１０μＬの注入されるＰＢＳを１００、２００及び８００ｎｇのｓＴＲＡＩＬに代えたｓＴＲＡＩＬを用いて、類似の実験を完遂した。これらの実験は、ＰＢＳで観察されたものに類似の生存結果を示した。しかし、より高濃度のｓＴＲＡＩＬでの実験は、オリゴデンドロサイトに対して若干の傷害を示した。
【０１４０】
７（ｉｖ）ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、神経膠腫において腫瘍容積を低減する
腫瘍量に対するＮＰ−ＴＲＡＩＬの効果を判定するために、ＰＢＳ、ＮＰ単独又はＮＰ−ＴＲＡＩＬを、ヌードラットの脳中の異種移植片ヒトＵ２５１腫瘍中に腫瘍内で直接的に送達した。腫瘍移植の２１日後に動物を安楽死させ、切片化及びＨ＆Ｅ染色のために脳を摘出した。脳を、２ｍｍのブロックに切断し、処理し、明確な腫瘍をもつブロックを、５μｍの切片に切断し、１５番目毎に切片を確保しＨ＆Ｅで染色し、このスライドに関する腫瘍容積を判定した。１５番目毎のスライドに関する腫瘍の最大の幅及び高さを測定し、明白な腫瘍を有する各スライドに関して最大のＷ×ＨＸ（５×１５）を乗算することによって総腫瘍量を決定し、これらの数を加算した。統計的有意性を、ＦｉｓｃｈｅｒのＰＬＳＤを使用するＳｔａｔｖｉｅｗを用いて決定した（有意水準５％）。図２２に示すように、ＮＰ−ＴＲＡＩＬの投与は、ＮＰ単独又はＰＢＳと比較して腫瘍量を有意に低減した。ＮＰ単独とＰＢＳ投与の間で有意差は認められなかった。
【０１４１】
７（ｖ）腫瘍追跡能力
ＮＰが移植部位から腫瘍増殖部位に移動する能力は、特に脳腫瘍の療法に対する、ＮＰの有用な治療潜在能力である。したがって、その能力を判定するために、０日目に、Ｕ２５１腫瘍細胞をヌードラットの脳の左半球中に移植し、７日後に、ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ）を腫瘍移植と同方向ではあるが対側半球中に投与した。１１日目（ＮＰＲ投与の４日後）に、動物を安楽死させ、生理食塩水で灌流し、脳を取り出し、凍結切片化及び共焦点顕微鏡法での分析のために急速凍結した。図２３に示すように、ＮＰＲは、脳梁に沿って追跡することが容易に認められる。若干のＮＰＲは、むしろ腫瘍塊から遠い方に移動するが、大部分のＮＰＲは、左半球中の腫瘍塊に向かって移動していることが認められた。類似の挙動が、ローダミン標識化ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ）について観察された。
【０１４２】
７（ｖｉ）腫瘍破壊
この実験では、腫瘍を破壊するＮＰ−ＴＲＡＩＬの能力を判定した。詳細には、０日目に、ヌードラットにＵ２５１ｎ腫瘍を移植した。７日目に、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ、ＮＰ単独又はＰＢＳを新生物内で投与し、１４日目に、動物を安楽死させ、組織を摘出した。図２４に示すように、ＮＰ−ＴＲＡＩＬの投与は、ＮＰ単独又はＰＢＳを投与された動物では認められなかった、腫瘍塊の底部における大きな腫瘍破壊領域の発生につながった。ＮＰ−ＴＲＡＩＬ投与に続いて、多くの壊死及びアポトーシス細胞が、この領域内に認められたが（右パネル）、ＮＰ又はＰＢＳ投与の後では認められなかった。図２５は、療法に続く腫瘍破壊領域の大きな拡大を示している。
【０１４３】
７（ｖｉｉ）ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子は、ＭＲＩで示されるように、ヌードラット内に移植されたヒト神経膠腫異種移植片の境界及び内部に到達する
Ｕ２５１ｎヒト神経膠腫細胞をヌードラットに移植し、１１日後に、ＮＰ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬを、腫瘍の対側側に頭蓋内で注入した。８日後に、ＭＲ画像を得た。図２６Ａ〜２６Ｂに示すように、ＮＰ−ＴＲＡＩＬ（２６Ｂ）は、腫瘍の縁端及び内部の両方で、ＮＰ単独（２６Ａ）に比較してより低いシグナル強度を誘導した。低い強度は、ナノ粒子の存在を暗示する。
【０１４４】
７（ｖｉｉｉ）腫瘍細胞によるＴＲＡＩＬ複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子のインビボ取り込み
ＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞を移植して７日後に、腫瘍塊内にＮＰＲ単独又はＮＰＲ−ＴＲＡＩＬを直接的に移植した。４日後に、動物を安楽死させ、脳を摘出し、切片化及び造影（赤色及び緑色は、それぞれＮＰＲ及びＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞の存在を示している）のために急速凍結した。図２７に示すように、ＮＰＲ単独は、腫瘍細胞の周辺領域中に見出されたが、腫瘍細胞と共存せず（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬは、腫瘍細胞と共存して腫瘍破壊領域中に見出された（パネルＧ、Ｈ、Ｉ）。さらに、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬで処理された動物中で認められる腫瘍は、ＰＢＳ又はＮＰＲで処理された動物の両方中で認められる腫瘍に比較して退化していることを示しており、この切片中で明瞭に認められる腫瘍細胞は、ほんの少数であった。この実験は、例６（ｖ）においてインビトロで示されたように、ＴＲＡＩＬが、腫瘍細胞のＮＰ取り込みにつながったことを示している。
【０１４５】
７（ｉｘ）ｃＲＧＤペプチド複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の神経膠腫への移動
ＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞を移植して７日後に、ｃＲＧＤペプチド複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰＲ−ｃＲＧＤ、約２μｇのｃＲＧＤペプチドに複合された０．０５ｍｇのナノ粒子を含む１０μＬ）を、脳の対側側に注入した。４日後に、動物を安楽死させ、脳を摘出し、切片化及び造影（赤色及び緑色は、それぞれＮＰＲ及びＧＦＰ−Ｕ２５１腫瘍細胞の存在を示している）のために急速凍結した。図２８は、ＮＰＲ−ｃＲＧＤが、腫瘍部位に移動したことを示している。
【０１４６】
７（ｘ）ｃＲＧＤペプチド及びＴＲＡＩＬ複合型ローダミン標識化ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の損傷部位に向けた移動
損傷は、脳の左側でのＰＢＳのニードル注入によって誘導した。４日後に、５μＬ（２５μｇ）のＮＰＲ単独、ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬ（５０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ）及びＮＰＲ−ｃＲＧＤを、脳の対側側に注入した。４日後に、動物を屠殺し、蛍光顕微鏡下でＮＰＲの蛍光を可視化した。図２９に示すように、脳の反対側にＮＰＲは殆ど存在しなかったが、それらの分布は豊富であった。ＮＰＲ−ＴＲＡＩＬは主として損傷部位に沿って局在した。対照的に、ＮＰＲ−ｃＲＧＤは、損傷脳の側の全体にわたって、さらに脳梁に沿って分布した。これらの結果は、ナノ粒子が、損傷部位を追跡する若干の能力を有すること、及びＮＰＲ−ＴＲＡＩＬが、損傷部位での選択的蓄積を示すことを示唆している。ＮＰＲ−ｃＲＧＤは、追跡能力を有するが、それらの分布は、損傷部位に限定されず、それらは、やはりそこに蓄積する炎症細胞に結合する可能性がある。これらの結果は、薬物を脳損傷、脳卒中及び脳の炎症性疾患に送達するためにＮＰ系を使用することに対して重要な関連を有する。
【０１４７】
（例８）ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子の膀胱癌細胞、乳癌細胞及び正常乳腺細胞に対する細胞毒性効果
これらの実験では、ＴＲＡＩＬ複合型ゼラチン／酸化鉄磁性複合ナノ粒子（ＮＰ−ＴＲＡＩＬ）の神経膠腫細胞以外の各種癌細胞に対する細胞毒性効果を判定した。詳細には、使用する癌細胞系は、膀胱癌細胞ＴＳＵ−ＰＲ１及び乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢとし、対照として正常乳腺細胞ＭＣＦ１０Ａを使用した。加えて、プロテアソーム阻害薬（ＰＳ）、大部分の細胞内タンパク質分解の原因である多触媒性プロテイナーゼ複合体と組み合わせたＮＰ−ＴＲＡＩＬのこれらの細胞に対する効果を研究した。プロテアソームの薬理学的阻害薬は、インビトロ及びインビボで抗腫瘍活性を有する。前臨床研究は、プロテアソームの阻害が、ＴＲＡＩＬなどのその他癌治療薬の活性を、部分的には化学療法抵抗性の経路を下向き調節することによって増強することを立証している。
【０１４８】
細胞（１×１０５／ウェル）を、ＰＳ（５ｍＭ）の不在又は存在下で、様々な濃度のＴＲＡＩＬ（１０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、ＮＰ又はＮＰ−ＴＲＡＩＬ（１０〜４０ｎｇ  ＴＲＡＩＬ／ｍＬ）で処理した。細胞死は、２４時間後にＬＤＨアッセイを使用して判定した。１００％の細胞死は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で処理された細胞中で判定し、データを正規化した。
【０１４９】
図３０Ａ〜３０Ｂに示すように、正常乳腺細胞ＭＣＦ１０Ａは、上記処理のすべてに対して応答せず、これらの処理が正常細胞に対して非毒性であることを示した。さらに示すように、ＮＰ−ＴＲＡＩＬの活性は、ＰＳでの処理の後で増強された。この発見は、特に効果的な治療戦略を計画する場合に、大きな重要性を有する可能性がある。
【０１５０】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４ａ】
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【図２４ｂ】
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【図２４ｃ】
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【図２４ｄ】
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【図２４ｅ】
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【図２４ｆ】
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【図２４ｇ】
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【図２４ｈ】
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【図２４ｉ】
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【図２４ｊ】
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【図２４ｋ】
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【図２４ｌ】
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【図２４ｍ】
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【図２４ｎ】
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【図２４ｏ】
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【図２４ｐ】
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【図２４ｑ】
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【図２４ｒ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【配列表】
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