(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象において後期子宮頸癌を治療するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第１のペプチドは、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントであり、これによって、前記組み換えリステリア株は、前記Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、前記組み換えリステリア株は、前記ヒト対象に投与され、前記後期子宮頸癌は、ステージＩＩＩ又はステージＩＶである、使用。
【請求項２】
後期子宮頸癌からヒト対象を保護するための組成物の調製における、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第１のペプチドは、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントであり、これによって、前記組み換えリステリア株は、前記Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、前記組み換えリステリア株は、前記ヒト対象に投与され、前記後期子宮頸癌は、ステージＩＩＩ又はステージＩＶである、使用。
【請求項３】
ヒト対象において後期子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第１のペプチドは、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントであり、前記組み換えリステリア株は、前記ヒト対象に投与され、前記後期子宮頸癌は、ステージＩＩＩ又はステージＩＶである、使用。
【請求項４】
後期子宮頸癌のヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、前記第１のペプチドは、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントであり、前記組み換えリステリア株は、前記ヒト対象に投与され、前記後期子宮頸癌は、ステージＩＩＩ又はステージＩＶである、使用。
【請求項５】
前記ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントは配列番号１を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０９の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記組み換えリステリア株は、１×１０９の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、請求項１〜４及び６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記組み換えリステリア株は、３．３１×１０９の生命体の用量で前記ヒト対象に投与される、請求項１〜４及び６のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記組み換えリステリア株は、組み換えリステリア・モノサイトゲネス株である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
前記組み換えリステリア株は、動物宿主で継代されている、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記組み換えポリペプチドは、前記組み換えリステリア株によって発現される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記組み換えリステリア株は、前記組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記プラスミドは、細菌転写因子をコード化する遺伝子を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記プラスミドは、代謝酵素をコード化する遺伝子を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
前記Ｅ７抗原を含む、または前記Ｅ７抗原の発現を誘導する第２の組成物が、前記組み換えリステリア株と併用される、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記組み換えリステリア株は、凍結または凍結乾燥された細胞バンクに保管されていたものである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記組み換えリステリア株は、解凍または再構成時に９０％を上回る生存能力を呈する、請求項１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記ステージＩＩＩは、ステージＩＩＩＢである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記ステージＩＶは、ステージＩＶＢである、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸癌の治療、および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えリステリア株であって、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択される、組み換えリステリア株を提供する。本発明はまた、ヒト対象において抗Ｅ７  ＣＴＬ応答を誘導するための方法、ならびにＨＰＶ介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、組み換えリステリア株の使用を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００４／０６２５９７号号公報
【特許文献２】ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００７／０６１８４８号公報
【特許文献３】米国特許第５，７２３，３３５号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６６３，１５３号明細書
【特許文献５】ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９５／２６２０４号公報
【特許文献６】米国特許出願公開第２００５／０１１８１８４号明細書
【背景技術】
【０００３】
世界中で、毎年約５００，０００の子宮頸癌の症例が診断されている。頸部の癌（子宮頸癌）は、頸部の粘膜で発症する。正常な頸部細胞は、徐々に癌になる前癌病変を来たす。頸部上皮内腫瘍形成（ＣＩＮ）、扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、および生体内新形成、異形成を含む、いくつかの用語が、これらの前癌病変を説明するために使用される。
【０００４】
２つの主要なタイプの子宮頸癌である、扁平上皮癌および腺癌がある。子宮頸癌および子宮頸前癌は、顕微鏡像によって分類される。約８０％〜９０％の子宮頸癌は扁平上皮癌であり、これは、子宮頸内部の表面を覆う、扁平上皮細胞と呼ばれる平坦な薄い細胞に似た細胞で構成される。扁平上皮癌はほとんどの場合、子宮頸外部と子宮頸内部がつながる場所で発症する。
【０００５】
残りの１０％〜２０％の子宮頸癌は腺癌である。腺癌は、２０歳から３０歳の女性において、より一般的になってきている。子宮頸部腺癌は、子宮頸内部の粘液産生腺細胞から発達する。あまり一般的ではないが、子宮頸癌は、扁平上皮癌と腺癌の両方の特徴を有することがある。これらは、「腺扁平上皮癌」または「混合癌」と呼ばれる。
【０００６】
当該技術分野において子宮頸癌のための改善された治療法が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、子宮頸癌の治療および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む、組み換えリステリア株であって、該第１のペプチドが、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択される、組み換えリステリア株を提供する。本発明はまた、ヒト対象において抗Ｅ７  ＣＴＬ応答を誘導するための方法、ならびにＨＰＶ介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、該組み換えリステリア株の使用も提供する。
【０００８】
一実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書に提供し、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０９の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
【０００９】
一実施形態において、子宮頸癌からヒト対象を保護するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０１０の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
【００１０】
別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、およびＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０１０の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
【００１１】
別の実施形態において子宮頸癌のヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用であって、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０１０の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
各実施形態において、子宮頸癌は、後期子宮頸癌（ステージＩＩＩＢ及びステージＩＶＢを含む）であっても良く、第１のペプチドは、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントであっても良い。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、異なる発現系を使用して、Ｅ７を発現および分泌する。Ｌｍ−Ｅ７は、遺伝子カセットを、Ｌ．モノサイトゲネスゲノムのｏｒｆＺドメインに導入することによって生成した。（Ａ）ｈｌｙプロモータは、ｈｌｙシグナル配列、およびＬＬＯの最初の５つのアミノ酸（ＡＡ）、その後ＨＰＶ−１６  Ｅ７の発現を促進する。（Ｂ）Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、ｐｒｆＡ株ＸＦＬ−７を、プラスミドｐＧＧ−５５で形質転換することによって生成した。ｐＧＧ−５５は、ＬＬＯ−Ｅ７の非溶血性融合の発現を促進するｈｌｙプロモータを有する。ｐＧＧ−５５はまた、生体内ＸＦＬ−７によるプラスミドの保持を選択する、ｐｒｆＡ遺伝子を含有する。
【図２】Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＥ７を分泌する。Ｌｍ−Ｇａｇ（レーン１）、Ｌｍ−Ｅ７（レーン２）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（レーン３）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（レーン４）、ＸＦＬ−７（レーン５）、および１０４０３Ｓ（レーン６）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉブロスで３７℃で終夜増殖させた。吸光度６００ｎｍでＯＤによって測定された同等の数の細菌をペレットし、１８ｍｌのそれぞれの上清をＴＣＡ沈殿させた。Ｅ７発現をＷｅｓｔｅｒｎブロットによって分析した。ブロットを抗Ｅ７  ｍＡｂ、その後ＨＲＰ共役抗マウス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でプローブし、次いでＥＣＬ検出試薬を使用して現像した。
【図３】ＬＬＯ−Ｅ７融合の腫瘍免疫療法の有効性。腫瘍接種後７、１４、２１、２８および５６日目のマウスにおけるミリメートル単位の腫瘍の大きさを示す。未処理のマウス：白丸、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７：黒丸、Ｌｍ−Ｅ７：四角、Ｌｍ−Ｇａｇ：白ひし形、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ：黒三角。
【図４】ＴＣ−１細胞に曝露した際に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化されたマウスからの脾細胞は増殖する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、または対照ｒＬｍ株で免疫化および追加免疫した。追加免疫後６日目に脾細胞を採取し、示される割合で放射されたＴＣ−１細胞とともにプレートした。細胞を３Ｈチミジンでパルスし、採取した。Ｃｐｍは（実験的ｃｐｍ）−（無ＴＣ−１対照）として定義する。
【図５Ａ】Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＥ７を分泌することを示すＷｅｓｔｅｒｎブロット。レーン１：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、レーン２：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７．００１、レーン３：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．３、レーン４：Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７−２．５．４。
【図５Ｂ】Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（四角）、Ｌｍ−Ｅ７（楕円）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（Ｘ）を投与したマウス、および未処理のマウス（ワクチン接種を受けていない、無地三角）の腫瘍の大きさ。
【図６Ａ】４ＬＭワクチンを作出するために使用されたプラスミド挿入物の略図。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７挿入物は、使用されたリステリア遺伝子のすべてを含有する。これは、ｈｌｙプロモータ、ｈｌｙ遺伝子の最初の１．３ｋｂ（タンパク質ＬＬＯをコード化する）、およびＨＰＶ−１６  Ｅ７遺伝子を含有する。ｈｌｙの最初の１．３ｋｂは、シグナル配列（ｓｓ）およびＰＥＳＴ領域を含む。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、ｈｌｙプロモータ、シグナル配列、ならびにＰＥＳＴおよびＥ７配列を含むが、切断ＬＬＯ遺伝子の残りは含まない。Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、ＰＥＳＴ領域を含まないが、ｈｌｙプロモータ、シグナル配列、Ｅ７、および切断ＬＬＯの残りを含有する。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ｈｌｙプロモータ、シグナル配列、およびＥ７のみを有する。
【図６Ｂ】上部パネル：ＰＥＳＴ領域を含有するリステリアコンストラクトは、腫瘍退縮を誘導する。下部パネル：２つの別個の実験における、腫瘍チャレンジ後２８日目の腫瘍の大きさの平均。
【図６Ｃ】ＰＥＳＴ領域を含有するリステリアコンストラクトは、脾臓内においてより高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導する。３つの実験からのデータの平均および標準誤差を示す。
【図７Ａ】ＴＣ−１腫瘍細胞を投与し、その後Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を投与された、またはワクチン接種無し（未処置）のマウスにおける、脾臓内におけるＥ７特異的ＩＦＮガンマ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導、ならびに腫瘍に浸入した数。
【図７Ｂ】（Ａ）に記載のマウスの脾臓および腫瘍における、Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞の誘導および浸入。
【図８】ＰＥＳＴ領域を含有するリステリアコンストラクトは、腫瘍内において、より高い割合のＥ７特異的リンパ球を誘導する。Ａ．１つの実験からの代表的なデータ。Ｂ．３つすべての実験からのデータの平均および標準誤差。
【図９】Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスは、甲状腺において腫瘍を発達させ、ここでは、Ｅ７遺伝子が発現される。マウスを３ヶ月目に屠殺し、甲状腺を取り出し、薄片とし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Ａ．左パネル：倍率２０×での正常な甲状腺。卵胞は正常な大きさであり、豊富なピンク色の細胞質（矢印）を有する立方細胞で覆われている。右パネル：Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウス甲状腺。コロイドの産生の増加により、大きく拡大した卵胞に留意されたい。卵胞を覆う立方細胞は、微小の細胞質により小さい。
【図１０】Ｅ７メッセージは、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの甲状腺および髄質胸腺上皮細胞で発現する。（Ａ）Ｅ７導入遺伝子の組織特異的発現は、甲状腺のみで検出されるが、肝臓、脾臓、または全胸腺では検出されない。レーン１：肝臓、レーン２：脾臓、レーン３：甲状腺、レーン４：全胸腺。（Ｂ）髄質胸腺上皮細胞（ｍＴＥＣｓ）はＥ７を発現する。４０サイクルで負荷した同等量のｃＤＮＡに関するＲＴ−ＰＣＲ結果を示す。レーン５：カテプシンＳ、レーン６：Ｅ７、レーン７：アクチン、レーン８：陰性対照。
【図１１】ＲＡＨＹＮＩＶＴＦペプチドおよびＣｐＧアジュバントは、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおけるＴＣ−１チャレンジに対して保護しない。２つの群のトランスジェニックマウスが、Ｅ７ペプチドおよびアジュバント、またはＰＢＳのいずれかを受けた。第３の群の野生型Ｃ５７Ｂｌ／６対照マウスは、Ｅ７ペプチドおよびアジュバントを受けた。マウスに７日あけて２回、腹腔内（ｉ．ｐ．）にワクチン接種し、ＴＣ−１細胞数５×１０４で７日後にチャレンジした。免疫化されていないマウスを屠殺する必要性があるまで、腫瘍を５日毎に測定した。エラーバー：平均値からの標準偏差。
【図１２Ａ】本発明のワクチンは、野生型マウス、ならびにＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫化したトランスジェニックマウス、未処理のままのマウス、またはＬＭ−ＮＰで処置したマウス（対照）のうち、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおいて固形腫瘍の退縮を誘導する。
【図１２Ｂ】本発明のワクチンは、野生型マウス、ならびにＬＭ−ＡｃｔＡ−Ｅ７で免疫化したトランスジェニックマウス、未処理のままのマウス、またはＬＭ−ＮＰで処置したマウス（対照）のうち、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおいて固形腫瘍の退縮を誘導する。
【図１３Ａ】ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７のＩＶ免疫化は、マウス１匹あたり１×１０６のＣＦＵと低い用量で、確立された腫瘍の退縮を誘導する上で有効である。
【図１３Ｂ】ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７臨床試験における２つのコホートに対する腫瘍負荷。
【図１４Ａ】組み換えリステリアワクチンベクターの細菌負荷（病原性）における継代の効果。上部パネル：Ｌｍ−Ｇａｇ、下部パネル：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７。
【図１４Ｂ】脾臓内の組み換えＬｍ−Ｅ７の細菌負荷における継代の効果。４匹のマウスからの脾臓ホモジネートのミリリットルあたりの生細菌の平均ＣＦＵを示す。
【図１５】継代されたＬｍ−Ｇａｇ対継代されていないＬｍ−Ｇａｇの投与後の、ＨＩＶ−ＧａｇおよびＬＬＯに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導。マウスを、１０３（Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ）または１０５（Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｈ）ＣＦＵの継代されたリステリアワクチンベクターで免疫化し、抗原特異的Ｔ細胞を分析した。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ：継代されていないリステリアワクチンベクター。Ａ〜Ｄ：ＭＨＣクラスＩ  ＨＩＶ−Ｇａｇペプチドへの免疫応答。Ｅ〜Ｈ：ＬＬＯペプチドへの免疫応答。Ｉ：ＨＰＶ  Ｅ７からの対照ペプチドで刺激した１０５のＣＦＵの継代されたＬｍ−Ｇａｇで免疫化されたマウスからの脾細胞。
【図１６Ａ】ＬＢ安定性試験によるプラスミド単離。
【図１６Ｂ】ＴＢ安定性試験によるプラスミド単離。
【図１６Ｃ】ＴＢ安定性試験による定量化。
【図１７】ＬＢ内で増殖された細菌からの、存続能力のある細菌のクロラムフェニコール（ＣＡＰ）耐性、およびＣＡＰ感受性コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数。暗色バー：ＣＡＰ＋、白色バー：ＣＡＰ−。各時点に対する２つの暗色バーおよび２つの白色バーは、２通りの試料を表す。
【図１８】ＴＢ内で増殖された細菌からの、存続能力のある細菌のＣＡＰ耐性、およびＣＡＰ感受性ＣＦＵの数。暗色バー：ＣＡＰ＋、白色バー：ＣＡＰ−。各時点に対する２つの暗色バーおよび２つの白色バーは、２通りの試料を表す。
【図１９】短期凍結保存後のＬ．モノサイトゲネスの増殖。
【図２０】−７０℃での保管後のＬＢ  ＲＷＣＢの生存能力。
【図２１】−７０℃での保管後のＴＢ  ＲＷＣＢの生存能力。
【図２２】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の２００ｍＬのＬＢおよびＴＢ培養物の成長曲線。
【図２３】５０ｍＬ段階で、ＡＡ、ビタミンおよび微量元素を含む、および含まない４つの規定培地におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の増殖。「ＡＡ＋Ｖｉｔｓ＋ＴＥ＋」は、バルク培地、必須成分、ＡＡ、ビタミンおよび微量元素を意味する。「ＡＡ＋Ｖｉｔｓ＋ＴＥ−」は、バルク培地、必須成分、ＡＡ、およびビタミンを意味する。「ＡＡ＋Ｖｉｔｓ−ＴＥ−」は、バルク培地、必須成分、およびＡＡを意味する。「ＡＡ−Ｖｉｔｓ−ＴＥ−」は、バルク培地および必須成分を意味する。
【図２４】２００ｍＬ段階で、アミノ酸、ビタミンおよび微量元素を含む、および含まない４つの規定培地におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の増殖。群は、図２３のように標識する。
【図２５】無機窒素を含む、および含まない、異なる濃度の栄養補助剤を含む２００ｍＬの培養物の規定培地におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の増殖。
【図２６】グルタミンおよび鉄を含む、ならびに含まない、異なる濃度の栄養補助剤で補助された２００ｍＬの培養物の規定培地におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の増殖。
【図２７Ａ】ＴＢおよび規定培地の５Ｌ発酵槽におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の成長曲線。
【図２７Ｂ】異なる密度のＴＢの５Ｌ発酵槽で増殖されたＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の生存能力。
【図２７Ｃ】異なる密度の規定培地の５Ｌ発酵槽で増殖されたＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の生存能力。
【図２８】−２０℃で３日間保管した後に残存する存続能力のある細胞の割合（％）。
【図２９】−７０℃で３日間保管した後に残存する存続能力のある細胞の割合（％）。
【図３０Ａ】液体窒素での急速冷凍、および−７０℃での３日間の保管後に残存する存続能力のある細胞の割合（％）。
【図３０Ｂ】いくつかの条件に対する生存能力研究の要約。
【図３０Ｃ】解凍後の凍結保存された試料の成長動力学。
【図３１】規定培地で増殖されたリステリアワクチンベクターは、確立された腫瘍の増殖に対してマウスを効果的に保護する。「ＢＨＩ培養」−ブレインハートインフュージョン培地で培養されたベクター。「テリフィックブロス培養」および「規定培地培養」−示される培地で培養されたベクター。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、子宮頸癌を治療、子宮頸癌から保護、子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、対象に、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）フラグメントおよびＥ７抗原を含む融合ペプチドを含む組み換えリステリア株を投与するステップを含む。本発明はまた、ヒト対象において抗Ｅ７ＣＴＬ応答を誘導し、組み換えリステリア株の投与を含む、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法も提供する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、ヒト対象において、子宮頸癌を治療、阻害、抑制、または予防する方法を提供し、該対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、該組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、ヒト対象における子宮頸癌を治療する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がＥ７抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００１５】
Ｎ末端ＬＬＯタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質フラグメントは、ＨＰＶ  Ｅ７抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態において、Ｎ末端ＬＬＯタンパク質フラグメントは、融合タンパク質のＮ末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、該組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がＥ７抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００１７】
別の実施形態において、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための方法を本明細書において提供し、該対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がＥ７抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００１８】
ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントは、ＨＰＶ  Ｅ７抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントは、融合タンパク質のＮ末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００１９】
本明細書に提供する、ＬＬＯ−抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫を誘導し（実施例１）、抗原特異的Ｔ細胞増殖を惹起し（実施例２）、抗原特異的な腫瘍浸潤Ｔ細胞を生成し（実施例４）、Ｅ６およびＥ７等の抗原に対する中枢寛容および末梢寛容を解除する（実施例５〜９）。したがって、本発明のワクチンは、Ｅ７およびＥ６に対する免疫応答の誘導に有効である。さらに、組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する（実施例１０）。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌を治療、阻害、抑制、または予防する方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、ヒト対象において子宮頸癌を治療する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において、子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２２】
別の実施形態において、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための方法を本明細書に提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がＥ７抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２３】
Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質フラグメントは、ＨＰＶ  Ｅ７抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態において、Ｎ末端ＡｃｔＡタンパク質フラグメントは、融合タンパク質のＮ末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２４】
本明細書で提供する、ＡｃｔＡ抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫を誘導し（実施例３）、抗原特異的な腫瘍浸潤Ｔ細胞を生成し（実施例４）、Ｅ６およびＥ７等の抗原に対する中枢寛容および末梢寛容を解除する（実施例５〜９）。さらに、本発明の組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する（実施例１０）。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌を治療、阻害、抑制、または予防する方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、ヒト対象において子宮頸癌を治療する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がＥ７抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物で、ヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２７】
別の実施形態において、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための方法を本明細書において提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がＥ７抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物で、ヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２８】
ＰＥＳＴ配列およびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、別の実施形態において、互いに直接融合される。別の実施形態において、ＰＥＳＴ配列およびＨＰＶ  Ｅ７抗原をコード化する遺伝子は、互いに直接融合される。別の実施形態において、ＰＥＳＴ配列およびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、リンカーペプチドを介して結合される。別の実施形態において、ＰＥＳＴ配列およびＨＰＶ  Ｅ７抗原は、異種ペプチドを介して結合される。別の実施形態において、ＰＥＳＴ配列は、ＨＰＶ  Ｅ７抗原に対してＮ末端側にある。別の実施形態において、ＰＥＳＴ配列は、融合タンパク質のＮ末端の大部分である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００２９】
本明細書で提供する、ＰＥＳＴ様配列抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫（実施例３）を誘導し、抗原特異的な腫瘍浸潤Ｔ細胞を生成する（実施例４）。さらに、本発明の組み換えリステリア株は、安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する（実施例１０）。
【００３０】
別の実施形態において、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための方法を本明細書に提供し、該対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含む。別の実施形態において、該組み換えリステリア株は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む。別の実施形態において、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００３１】
本発明は、子宮頸癌の治療、および子宮頸癌からの保護に関して使用するための、組み換えリステリア株を提供し、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含み、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択される。本発明はまた、ヒト対象において抗Ｅ７  ＣＴＬ応答を誘導するための方法、およびＨＰＶ介在性疾患、疾病、および症状を治療するための方法における、組み換えリステリア株の使用を提供する。
【００３２】
一実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療するための組成物の調製のための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０９の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
【００３３】
一実施形態において、子宮頸癌からヒト対象を保護するための組成物を調製するための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、該組み換えリステリア株は、該Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０９の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
【００３４】
別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための組成物を調製するための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、およびＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０１０の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
【００３５】
別の実施形態において、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための組成物を調製するための、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７抗原に融合された第１のペプチドを含む組み換えポリペプチドを含む、組み換えリステリア株の使用を本明細書で提供し、該第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、該組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０１０の生命体の用量で該ヒト対象に投与される。
【００３６】
別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療する方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア株を投与するステップをふくむ。別の実施形態において、子宮頸癌からヒト対象を保護する方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア株を投与するステップを含む。別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導するための方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア株を投与するステップを含む。別の実施形態において、ヒト対象において子宮頸癌を治療、阻害、予防、もしくは抑制する、またはヒト対象において子宮頸癌に対する免疫応答を誘導する方法を本明細書で提供し、対象に、弱毒化した栄養要求性リステリア・モノサイトゲネス株を投与するステップを含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、ｄａｌ遺伝子に変異を含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、ｄａｔ遺伝子に変異を含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、ｄａｌおよびｄａｔ遺伝子に変異を含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリアは、プレフェン酸デヒドラターゼに変異を含む。別の実施形態において、酵素プレフェン酸デヒドラターゼは、フェニルアラニンの生合成経路において、後期に作用する酵素である。別の実施形態において、組み換えリステリアは、増殖のために、外因性フェニルアラニンを必要とする。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、増殖のために、外因性アラニンを必要とする。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、増殖のために、外因性Ｄアラニンを必要とする。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、増殖のために、外因性トレオニンを必要とする。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株リステリア株は、組み換えポリペプチドを含む。別の実施形態において、弱毒化した栄養要求性リステリア株は、抗原を含む。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導する。別の実施形態において、Ｅ７抗原に対して誘導された免疫応答は、ヒト対象において子宮頸癌を治療する。
【００３７】
別の実施形態において、本発明は、ＨＰＶに対してヒト対象にワクチン接種するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ＨＰＶに対してヒト対象にワクチン接種する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、ＨＰＶに対してヒト対象にワクチン接種するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ＨＰＶに対してヒト対象にワクチン接種する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、ＨＰＶに対してヒト対象にワクチン接種するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ＨＰＶに対してヒト対象にワクチン接種する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４０】
本明細書に提供する、抗原の、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列含有ペプチドへの融合を発現する組み換えリステリア株は、抗Ｅ６およびＥ７免疫を誘導し（実施例３）、Ｅ６およびＥ７等の抗原に対する中枢寛容および末梢寛容を抑止する（実施例５〜９）。さらに、本発明の組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する（実施例１０）。したがって、本発明のリステリア株は、ＨＰＶに対して対象にワクチン接種するために使用することができ、これによって、ＨＰＶ介在性発癌を予防または阻害する。
【００４１】
別の実施形態において、対象は、ＨＰＶ介在性癌を発症するリスクがあり、一実施形態において、これは子宮頸癌である。一実施形態において、ヒトパピローマウイルスＤＮＡは、９０％以上の子宮頸癌の病変で検出され得る。別の実施形態において、対象は、ＨＰＶ介在性癌を発症するリスクがあり、一実施形態において、これは非子宮頸部の肛門性器管癌であり、一実施形態において、これは肛門、外陰部、または膣内腫瘍である。一実施形態において、ＨＰＶ介在性癌は、陰茎上皮内腫瘍であり、一実施形態において、子宮頸部上皮内腫瘍を有する女性の性交渉の相手に高い罹患率で見られる。一実施形態において、ＨＰＶ介在性癌は、非子宮頸部の肛門性器上皮の癌である。別の実施形態において、対象は、ＨＰＶ陽性である。別の実施形態において、対象の性交渉の相手は、ＨＰＶ陽性である。別の実施形態において、対象は、子宮頸部上皮内腫瘍を呈する。別の実施形態において、対象は、扁平上皮内病変を呈する。別の実施形態において、対象は、子宮頸部に異形成を呈する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４２】
本発明の方法の標的であるＨＰＶは、別の実施形態において、ＨＰＶ  １６である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態において、ＨＰＶは、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選択される。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態において、ＨＰＶは高リスクＨＰＶ型である。別の実施形態において、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶ型である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌の退縮を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌の退縮を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌の再発を低減するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌の再発の発生を低減する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４５】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の形成を抑制するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の形成を抑制する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４６】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸癌の寛解を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸癌の寛解を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４７】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の増殖を妨害するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の増殖を妨害する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４８】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の大きさを低減するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において子宮頸部腫瘍の大きさを低減する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００４９】
本発明の方法によって標的とされる子宮頸部腫瘍は、別の実施形態において、扁平上皮癌である。
【００５０】
別の実施形態において、本発明の方法は、子宮頸部の進行性の扁平上皮細胞癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の方法は、再発性の子宮頸部の扁平上皮細胞癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の方法は、進行した子宮頸部の扁平上皮細胞癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。別の実施形態において、本発明の方法は、当該技術分野で既知の、任意の他の形態または種類の子宮頸癌を予防、治療、阻害、または抑制するために使用することができる。
【００５１】
別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、腺癌である。別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、腺扁平上皮癌である。別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、小細胞癌である。別の実施形態において、子宮頸部腫瘍は、当該技術分野で既知の任意の他の種類の子宮頸部腫瘍である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５２】
別の実施形態において、子宮頸癌に対する免疫応答を治療、保護、または誘導するための本発明の方法では、Ｅ７抗原の代わりに、またはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ  Ｅ６抗原を用いる。
【００５３】
別の実施形態において、子宮頸癌に対する免疫応答を治療、保護、または誘導するための本発明の方法では、ＬＬＯフラグメントの代わりに、またはＬＬＯフラグメントに加えて、ＡｃｔＡタンパク質フラグメントを用いる。
【００５４】
別の実施形態において、子宮頸癌に対する免疫応答を治療、保護、または誘導するための本発明の方法では、ＬＬＯフラグメントの代わりに、またはＬＬＯフラグメントに加えて、ＰＥＳＴ様配列含有タンパク質フラグメントを用いる。
【００５５】
別の実施形態において、本発明は、ヒト対象において抗Ｅ７細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を誘導するための方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、ヒト対象において抗Ｅ７  ＣＴＬ応答を誘導する。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドを含む。別の実施形態において、該方法は、本発明の組み換えリステリア株で対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物で対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、該方法は、対象の細胞がＥ７抗原を発現するように誘導する免疫原性組成物で、対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、ＣＴＬ応答は、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状に対する、治療上の有効性がある。別の実施形態において、ＣＴＬ応答は、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状に対する、予防上の有効性がある。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５６】
別の実施形態において、本発明は、対象において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療、または寛解する方法を提供し、対象に、組み換えリステリア株を投与するステップを含み、組み換えリステリア株は、ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントおよびＨＰＶ  Ｅ７抗原を含む組み換えポリペプチドを含み、これによって、組み換えリステリア株は、Ｅ７抗原に対する免疫応答を誘導し、これによって、対象においてＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解する。別の実施形態において、対象はヒト対象である。別の実施形態において、対象は、当該技術分野で既知の、任意の他の種類の対象である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５７】
疾患、疾病、もしくは症状を生じるＨＰＶは、別の実施形態において、ＨＰＶ  １６である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態において、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態において、ＨＰＶは高リスクＨＰＶ型である。別の実施形態において、ＨＰＶは粘膜ＨＰＶ型である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５８】
別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状は、性器疣贅である。別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状は、性器疣贅ではないものである。別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状は、呼吸器乳頭腫である。別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状は、当該技術分野で既知の、任意の他のＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００５９】
別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、Ｅ７抗原の代わりに、またはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ  Ｅ６抗原を用いる。
【００６０】
別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、ＬＬＯフラグメントの代わりに、またはＬＬＯフラグメントに加えて、ＡｃｔＡタンパク質フラグメントを用いる。
【００６１】
別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、ＬＬＯフラグメントの代わりに、またはＬＬＯフラグメントに加えて、ＰＥＳＴ様配列含有タンパク質フラグメントを用いる。
【００６２】
別の実施形態において、ＨＰＶ介在性疾患、疾病、もしくは症状を治療または寛解するための本発明の方法では、Ｅ７抗原の代わりに、またはＥ７抗原に加えて、ＨＰＶ  Ｅ６抗原を用いる。
【００６３】
本発明の方法および組成物の抗原は、別の実施形態において、ＨＰＶ  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、抗原はＨＰＶ  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、抗原は当該技術分野で既知の任意の他のＨＰＶタンパク質である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００６４】
「Ｅ７抗原」とは、別の実施形態において、Ｅ７タンパク質を指す。別の実施形態において、該用語は、Ｅ７フラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、Ｅ７ペプチドを指す。別の実施形態において、該用語は、当該技術分野で既知の、任意の他の種類のＥ７抗原を指す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００６５】
本発明の方法および組成物のＥ７タンパク質は、別の実施形態において、ＨＰＶ  １６  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−１８  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−３１  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−３５  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−３９  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−４５  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−５１  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−５２  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質はＨＰＶ−５８  Ｅ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、高リスクＨＰＶ型のＥ７タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は粘膜ＨＰＶ型のＥ７タンパク質である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００６６】
「Ｅ６抗原」とは、別の実施形態において、Ｅ６タンパク質を指す。別の実施形態において、該用語は、Ｅ６フラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、Ｅ６ペプチドを指す。別の実施形態において、該用語は、当該技術分野で既知の、任意の他の種類のＥ６抗原を指す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００６７】
本発明の方法および組成物のＥ６タンパク質は、別の実施形態において、ＨＰＶ  １６  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−１８  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３１  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３５  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−３９  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−４５  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５１  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５２  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質はＨＰＶ−５８  Ｅ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、高リスクＨＰＶ型のＥ６タンパク質である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、粘膜ＨＰＶ型のＥ６タンパク質である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００６８】
別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、関心対象となる抗原を含む、または発現する組み換えリステリア株を静脈内投与するステップを含み、第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する。
【００６９】
別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、第１のペプチドの関心対象となる抗原への融合を含む、免疫原性組成物を静脈内投与するステップを含み、第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、および（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する。
【００７０】
別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、組み換えポリペプチドを含む組み換えリステリア株を静脈内投与するステップを含み、組み換えポリペプチドは、関心対象となる抗原に融合された第１のペプチドを含み、第１のペプチドは、（ａ）ＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメント、（ｂ）ＡｃｔＡタンパク質、もしくはそのＮ末端フラグメント、（ｃ）ＰＥＳＴ様配列含有ペプチドから選択され、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象にワクチン接種する。
【００７１】
一実施形態において、本発明の方法で使用するための組成物は、静脈内投与される。別の実施形態において、ワクチンは経口投与されるが、別の実施形態において、ワクチンは非経口投与される（例えば、皮下投与、筋肉内投与等）。
【００７２】
さらに、別の実施形態において、組成物またはワクチンは、例えば、直腸坐薬または尿道坐薬といった坐薬として投与される。さらに、別の実施形態において、医薬組成物は、ペレットの皮下移植によって投与される。さらなる実施形態において、ペレットは、一定期間にわたる薬剤の制御放出を提供する。さらに別の実施形態において、医薬組成物は、カプセル形態で投与される。
【００７３】
一実施形態において、投与経路は、非経口であり得る。別の実施形態において、経路は、眼内、結膜、局所、経皮、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、膣内、直腸、腫瘍内、傍癌（parcanceral）、経粘膜、筋肉内、血管内、心室内、頭蓋内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、鼻腔内（滴下）、舌下、経口、エアロゾル、もしくは坐薬、またはこれらの組み合わせであり得る。吸入による鼻腔内投与または適用に関しては、該化合物の溶液または懸濁液を、適切な担体の存在下で、混合、およびエアロゾル化または噴霧する。かかるエアロゾルは、本明細書に記載のいかなる薬剤をも含み得る。一実施形態において、本明細書に記載される組成物は、頭蓋内投与に好適な形態であり得、これは、一実施形態において、髄腔内および脳室内投与である。一実施形態において、投与レジメンは、治療する状態の正確な特性、状態の重篤性、患者の年齢および健康状態全般、体重、ならびに個々の患者の反応等の要因に基づき、熟練した臨床医によって決定されるであろう。
【００７４】
非経口適用に関しては、注射用滅菌溶液、好ましくは、油性溶液または水溶液、ならびに懸濁液、エマルション、またはインプラント（坐薬およびかん腸を含む）が特に好適である。アンプルは、好都合な単位用量である。かかる坐薬は、本明細書に記載のいかなる薬剤をも含み得る。
【００７５】
例えば、リポソーム、または活性化合物が、例えば、マイクロカプセル化、多層コーティング等によって、分解性が異なるコーティングによって保護されるものといった、持続放出または指向性放出組成物を製剤化することができる。かかる組成物は、即時放出または緩徐放出のために製剤化され得る。例えば、注射のための生成物を調製するために、新規化合物をフリーズドライし、得られた凍結乾燥物を使用することもまた可能である。
【００７６】
液体製剤に関しては、薬学的に許容可能な担体は、水溶液もしくは非水溶液、懸濁液、エマルションまたは油であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール溶液／水溶液、エマルション、または生理食塩水および緩衝媒質を含む懸濁液が挙げられる。油の例は、石油、動物油、植物油、または合成起源の油であり、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油である。
【００７７】
一実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容可能なものである。一実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、安全であり、かつ本発明において使用するための、有効量の少なくとも１つの化合物の所望の投与経路に適切な送達を提供するいかなる製剤をも指す。該用語は、緩衝製剤の使用も指し、ここで、ｐＨは、化合物の安定性および投与経路に従い、ｐＨ４．０からｐＨ９．０の範囲の特定の所望の値に維持される。
【００７８】
一実施形態において、本発明の組成物または本発明の方法で使用される組成物は、単独で、またはある組成物とともに投与することができる。別の実施形態において、従来の賦形剤、すなわち、活性化合物と有害に反応しない、非経口、腸内（例えば、経口）、または局所適用に好適な薬学的に許容可能な有機または無機担体物質と混合した本発明の組成物を使用することができる。一実施形態において、好適な薬学的に許容可能な担体としては、水、食塩水、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロースまたはデンプン等）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、白色パラフィン、グリセロール、アルギン酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、医薬調製物は滅菌することができ、所望に応じて、活性化合物と有害に反応しない、助剤（例えば、滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、着色物質、香味物質および／または芳香物質等）と混合することができる。別の実施形態において、これらは、所望の場合、例えば、ビタミンといった他の活性薬剤と組み合わせることもできる。
【００７９】
一実施形態において、本発明の方法で使用するための組成物は、担体／希釈剤とともに投与することができる。固体担体／希釈剤としては、ゴム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
一実施形態において、本発明の組成物は、本発明の組成物、および子宮頸癌の予防または治療に効果的な１つまたは複数の追加の化合物を含み得る。一部の実施形態において、追加の化合物は、化学療法に有用な化合物を含み得、これは、一実施形態において、シスプラチンである。別の実施形態において、イホスファミド、フルオロウラシルもしくは５−ＦＵ、イリノテカン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル、ゲムシタビン、トポテカン、またはこれらの組み合わせを、本発明の方法で使用するために、本発明の組成物とともに投与することができる。別の実施形態において、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスペース、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、Ｇｌｉａｄｅｌインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組み合わせを、本発明の方法で使用するために、本発明の組成物とともに投与することができる。
【００８１】
別の実施形態において、本発明は、関心対象となる抗原に対してヒト対象におけるＣＴＬ応答を誘導する方法を提供し、該方法は、ヒト対象に、関心対象となる抗原を含む、または発現する組み換えリステリア株を投与するステップを含み、これによって、関心対象となる抗原に対してヒト対象におけるＣＴＬ応答を誘導する。別の実施形態において、投与するステップは、静脈内投与である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００８２】
本明細書に提供される、ＬＬＯ−抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫を誘導し（実施例１）、抗原特異的Ｔ細胞増殖を惹起し（実施例２）、抗原特異的な腫瘍浸潤Ｔ細胞を生成し（実施例４）、Ｅ６およびＥ７等の抗原に対する末梢寛容を抑止する（実施例５〜９）。したがって、本発明のワクチンは、Ｅ７およびＥ６に対する免疫応答の誘導に有効である。さらに、組み換えリステリア株は安全であり、ヒト対象における疾患指標を改善する（実施例１０）。
【００８３】
別の実施形態において、関心対象となる抗原は、ＨＰＶ−Ｅ７である。別の実施形態において、抗原はＨＰＶ−Ｅ６である。別の実施形態において、抗原はＨｅｒ−２である。別の実施形態において、抗原はＮＹ−ＥＳＯ−１である。別の実施形態において、抗原はテロメラーゼである。別の実施形態において、抗原はＳＣＣＥである。別の実施形態において、抗原はＨＭＷ−ＭＡＡである。別の実施形態において、抗原はＷＴ−１である。別の実施形態において、抗原はＨＩＶ−１  Ｇａｇである。別の実施形態において、抗原はプロテイナーゼ３である。別の実施形態において、抗原はチロシナーゼ関連タンパク質２である。別の実施形態において、抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）である。別の実施形態において、抗原は、Ｅ７、Ｅ６、Ｈｅｒ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、テロメラーゼ、ＳＣＣＥ、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＷＴ−１、ＨＩＶ−１  Ｇａｇ、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２、Ｍｕｃ１、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、またはこれらの組み合わせから選択される。
【００８４】
別の実施形態において、抗原は、腫瘍関連抗原であり、これは一実施形態において、以下の腫瘍抗原のうちの１つである：ＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）タンパク質（例えば、ＭＡＧＥ  １、ＭＡＧＥ  ２、ＭＡＧＥ  ３、ＭＡＧＥ  ４、チロシナーゼ）、変異ｒａｓタンパク質、変異ｐ５３タンパク質、ｐ９７メラノーマ抗原、進行した癌に関連するｒａｓペプチドもしくはｐ５３ペプチド、子宮頸癌に関連するＨＰＶ１６／１８抗原、乳癌に関連するＫＬＨ抗原、結腸直腸癌に関連するＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ｇｐ１００、メラノーマに関連するＭＡＲＴ１抗原、または前立腺癌に関連するＰＳＡ抗原。別の実施形態において、本発明の組成物および方法のための抗原は、メラノーマ関連抗原であり、これは、一実施形態において、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＨＳＰ−７０、ベータＨＣＧ、またはこれらの組み合わせである。
【００８５】
別の実施形態において、抗原は、感染性疾患抗原である。
【００８６】
他の実施形態において、抗原は、病原真菌、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスから派生する。他の実施形態において、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インスリンペプチドＢ、ジャガイモ粉状そうか病菌抗原、ビブリオ抗原、サルモネラ抗原、肺炎球菌抗原、呼吸器合胞体ウイルス抗原、ヘモフィルスインフルエンザ外膜  タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ菌のウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌ピリン、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５もしくは−４５型ヒトパピローマウイルスからのヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、またはこれらの組み合わせから選択される。
【００８７】
他の実施形態において、抗原は、以下の疾患のうちの１つに関連する。コレラ、ジフテリア、ヘモフィルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、百日咳（pertussis）、天然痘、肺炎球菌性肺炎、ポリオ、狂犬病、風疹、破傷風、結核、腸チフス、水痘帯状疱疹、百日咳（whooping cough）３黄色熱、アジソン病からの免疫原および抗原、アレルギー、アナフィラキシー、ブルトン症候群、固形および血液感染性腫瘍を含む癌、湿疹、橋本甲状腺、多発性筋炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、後天性免疫不全症候群、腎臓、心臓、膵臓、肺、骨、および肝臓移植等の移植片拒絶、グレーブス疾患、多内分泌腺自己免疫疾患、肝炎、顕微鏡的多発性動脈炎、結節性多発動脈炎、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、セリアック病、抗体介在性腎炎、糸球体腎炎、リウマチ性疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、血清反応陰性脊椎関節炎、鼻炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症、硬化性胆管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、疱疹状皮膚炎、乾癬、白斑、多発性硬化症、脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、ランバート・イートン症候群、強膜、上強膜、ブドウ膜炎、慢性粘膜皮膚カンジダ症、じん麻疹、乳児一過性低ガンマグロブリン血、骨髄腫、Ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、アミロイドーシス、慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、マラリアサーカムスポロザイト（malarial circumsporozite）タンパク質、微生物抗原、ウイルス抗原、自己抗原、ならびにリステリア症。
【００８８】
それぞれの抗原が、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８９】
本発明の方法および組成物によって誘導される免疫応答は、別の実施形態において、Ｔ細胞応答である。別の実施形態において、免疫応答は、Ｔ細胞応答を含む。別の実施形態において、応答はＣＤ８＋Ｔ細胞応答である。別の実施形態において、応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００９０】
本発明の方法および組成物のＮ末端ＬＬＯタンパク質フラグメントは、別の実施形態において、配列番号１を含む。別の実施形態において、フラグメントは、ＬＬＯシグナルペプチドを含む。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号２５を含む。別の実施形態において、フラグメントは、およそ配列番号２５からなる。別の実施形態において、フラグメントは、本質的に、配列番号２５からなる。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号２５に対応する。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号２５に相同する。別の実施形態において、フラグメントは、配列番号２５のフラグメントに相同する。実施例のうちのいくつかで使用されるΔＬＬＯは、４１６アミノ酸長（シグナル配列を除く）であったが、システイン４８４を含有する活性化ドメインを含む、アミノ末端からの８８残基は切断残基であった。活性化ドメインを含まない、特にシステイン４８４を含まないいかなるΔＬＬＯも、本発明の方法および組成物に好適であることは、当業者には明らかとなるであろう。別の実施形態において、Ｅ７またはＥ６抗原のＰＥＳＴ様ＡＡ配列、配列番号１を含む、いかなるΔＬＬＯへの融合も、抗原の細胞性および抗腫瘍免疫を高める。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００９１】
本発明のワクチンを構築するために用いられるＬＬＯタンパク質は、別の実施形態において、以下の配列を有する。
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ジェンバンクアクセッション番号Ｐ１３１２８、配列番号２７、核酸配列はジェンバンクアクセッション番号Ｘ１５１２７に記載）。この配列に対応する、前駆タンパク質の最初の２５アミノ酸は、シグナル配列であり、細菌によって分泌される際、ＬＬＯから開裂する。したがって、本実施形態において、全長の活性ＬＬＯタンパク質は、５０４残基長である。別の実施形態において、上記のＬＬＯフラグメントは、本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯフラグメントの源として使用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００９２】
別の実施形態において、本発明の組成物および方法で用いられるＬＬＯタンパク質のＮ末端フラグメントは、以下の配列を有する。
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤ（配列番号２５）。
【００９３】
別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、本明細書で用いるＬＬＯタンパク質の約アミノ酸２０〜４４２に対応する。
【００９４】
別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、以下の配列を有する。
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤ（配列番号２６）。
【００９５】
別の実施形態において、「切断ＬＬＯ」または「ΔＬＬＯ」とは、ＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯのフラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯフラグメントを指す。
【００９６】
別の実施形態において、該用語は、アミノ末端に活性化ドメインを含まない、およびシステイン４８４を含まない、ＬＬＯフラグメントを指す。別の実施形態において、該用語は、溶血性ではないＬＬＯフラグメントを指す。別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、活性化ドメインの欠失または変異によって、非溶血性となる。別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、システイン４８４の欠失または変異によって、非溶血性となる。別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、別の場所での欠失または変異によって、非溶血性となる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【００９７】
別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、およそＬＬＯタンパク質の最初の４４１アミノ酸からなる。別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、およそＬＬＯの最初の４２０アミノ酸からなる。別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、ＬＬＯタンパク質の非溶血性形態である。
【００９８】
別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、上記のアミノ酸範囲のうちの１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含む。残基番号は、別の実施形態において、上に列挙した残基番号に正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＬＬＯタンパク質が本明細書で用いるＬＬＯタンパク質に対して、挿入または欠失を有する場合、残基番号は、適宜調節され得る。
【００９９】
別の実施形態において、ＬＬＯフラグメントは、当該技術分野で既知の任意の他のＬＬＯフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１００】
別の実施形態において、本発明は、対象においてＨＳＶ感染の発生を治療、抑制、阻害、または低減する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。一実施形態において、ＨＳＶ感染はＨＳＶ−１感染である。一実施形態において、ＨＳＶ感染はＨＳＶ−２感染である。一実施形態において、ＨＳＶ感染は一次ＨＳＶ感染である。一実施形態において、ＨＳＶ感染は、一次ＨＳＶ感染後の炎症、再発、または口唇ＨＳＶである。一実施形態において、ＨＳＶ感染はＨＳＶ脳炎である。一実施形態において、ＨＳＶ感染はＨＳＶ新生児感染である。一実施形態において、対象はＨＩＶに感染している。
【０１０１】
別の実施形態において、本発明は、対象において一次ＨＳＶ感染後の口唇ＨＳＶを阻害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明は、ＨＳＶ感染の再発を予防する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、ＨＳＶ感染の再発の重篤性を減退させる方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、ＨＳＶ感染の再発の頻度を低減する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。一実施形態において、本発明は、ＨＩＶに感染した対象において、記載される方法のいずれかを提供する。
【０１０３】
「ＨＳＶ−２」とは、別の実施形態において、単純ヘルペスウイルス２を指す。別の実施形態において、該用語はＨＳＶ−２  ３３３株を指す。別の実施形態において、該用語は２．１２株を指す。別の実施形態において、該用語はＨＧ５２株を指す。別の実施形態において、該用語はＭＳ株を指す。別の実施形態において、該用語はＧ株を指す。別の実施形態において、該用語は１８６株を指す。別の実施形態において、該用語は当該技術分野で既知の任意の他のＨＳＶ−２株を指す。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明は、ＨＳＶ感染に対して、対象にワクチン接種する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象においてＨＳＶ感染を抑制する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象においてＨＳＶ感染を妨害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象において一次ＨＳＶ感染を妨害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。別の実施形態において、本発明は、対象においてニューロンＨＳＶの拡大を妨害する方法を提供し、該方法は、該対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。
【０１０５】
一実施形態において、感染を妨害する（例えば、一実施形態においては、「ＨＳＶ感染を妨害する」または「一次ＨＳＶ感染を妨害する」）という用語は、感染性ウイルスの力価を９０％減少させることを指す。別の実施形態において、力価は５０％減少する。別の実施形態において、力価は５５％減少する。別の実施形態において、力価は６０％減少する。別の実施形態において、力価は６５％減少する。別の実施形態において、力価は７０％減少する。別の実施形態において、力価は７５％減少する。別の実施形態において、力価は８０％減少する。別の実施形態において、力価は８５％減少する。別の実施形態において、力価は９２％減少する。別の実施形態において、力価は９５％減少する。別の実施形態において、力価は９６％減少する。別の実施形態において、力価は９７％減少する。別の実施形態において、力価は９８％減少する。別の実施形態において、力価は９９％減少する。別の実施形態において、力価は９９％以上減少する。
【０１０６】
別の実施形態において、該用語は、ウイルス複製の程度を９０％減少させることを指す。別の実施形態において、複製は５０％低減される。別の実施形態において、複製は５５％低減される。別の実施形態において、複製は６０％低減される。別の実施形態において、複製は６５％低減される。別の実施形態において、複製は７０％低減される。別の実施形態において、複製は７５％低減される。別の実施形態において、複製は８０％低減される。別の実施形態において、複製は８５％低減される。別の実施形態において、複製は９２％低減される。別の実施形態において、複製は９５％低減される。別の実施形態において、複製は９６％低減される。別の実施形態において、複製は９７％低減される。別の実施形態において、複製は９８％低減される。別の実施形態において、複製は９９％低減される。別の実施形態において、複製は９９％以上低減される。
【０１０７】
ＨＳＶ複製およびＨＳＶ感染の程度を判定する方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Lambiase Aら（Topical treatment with nerve growth factor in an animal model of herpetic keratitis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2007 May 4）、Ramaswamy Mら（Interactions and management issues in HSV and HIV coinfection. Expert Rev Anti Infect Ther. 2007 Apr;5(2):231-43）、およびJiang Cら（Mutations that decrease DNA binding of the processivity factor of the herpes simplex virus DNA polymerase reduce viral yield, alter the kinetics of viral DNA replication, and decrease the fidelity of DNA replication. J Virol. 2007 Apr;81(7):3495-502）に説明される。それぞれの方法が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明は、対象において単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染を治療する、その病原を低減する、その症状を寛解する、その二次症状を寛解する、その発生を低減する、その再発までの潜伏期を延長する方法を提供し、対象に、本発明のワクチンを投与するステップを含む。本発明の方法および組成物によって治療または寛解するＨＳＶ感染は、別の実施形態において、性器のＨＳＶ感染である。
【０１０９】
本発明の方法を使用して、ＨＳＶ感染、または対象がＨＳＶに曝露した後のかかる感染に関連する一次もしくは二次症状の治療、阻害、抑制等を行えることを理解されたい。別の実施形態において、対象は、ワクチン接種前に、ＨＳＶに感染している。別の実施形態において、対象は、ＨＳＶ感染のリスクがある。別の実施形態において、対象が、ワクチン接種時に、ＨＳＶに感染しているかどうかに関わらず、本発明の方法によるワクチン接種は、ＨＳＶ感染、またはかかる感染に関連する一次もしくは二次症状の治療、阻害、抑制等に有効である。
【０１１０】
一実施形態において、症状は一次症状であるが、別の実施形態において、症状は二次症状である。一実施形態において、「一次」とは、対象のウイルス感染の直接的な結果である症状を指す一方、一実施形態において、「二次」とは、一次原因に由来するか、または一次原因の結果として生じる症状を指す。一実施形態において、本発明において使用するための組成物および株は、一次もしくは二次症状、またはＨＳＶ感染に関連する二次的合併症を治療する。
【０１１１】
別の実施形態において、組み換えリステリア株は、１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵの用量でヒト対象に投与される。別の実施形態において、用量は５〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は７〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は１０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は２０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は３０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は７０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は１００〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は１５０〜５００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜３００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜２００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜１５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜１００×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜７０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜５０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜３０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は５〜２０×１０８ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は１〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は１〜２０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は２〜３０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は１〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は２〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は３〜１０×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は２〜７×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は２〜５×１０９ＣＦＵである。別の実施形態において、用量は３〜５×１０９ＣＦＵである。
【０１１２】
別の実施形態において、用量は１×１０９〜３．３１×１０９の生命体であり、これは、前臨床データを考慮すると予想外に低用量の組み換えリステリアである。
【０１１３】
別の実施形態において、用量は１．５×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は２×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は３×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は４×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は５×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は６×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は７×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は８×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は１０×１０９の生命体である。別の実施形態において、用量は１．５×１０１０の生命体である。別の実施形態において、用量は２×１０１０の生命体である。別の実施形態において、用量は２．５×１０１０の生命体である。別の実施形態において、用量は３×１０１０の生命体である。別の実施形態において、用量は３．３×１０１０の生命体である。別の実施形態において、用量は４×１０１０の生命体である。別の実施形態において、用量は５×１０１０の生命体である。
【０１１４】
それぞれの用量および用量範囲が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明の方法の組み換えポリペプチドは、組み換えリステリア株によって発現する。別の実施形態において、発現は組み換えリステリア株によって担持されるヌクレオチド分子により介在される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１１６】
別の実施形態において、組み換えリステリア株は、組み換えポリペプチドをコード化するプラスミドによって、組み換えポリペプチドを発現する。別の実施形態において、プラスミドは、細菌転写因子をコード化する遺伝子を含む。別の実施形態において、プラスミドは、リステリア転写因子をコード化する。別の実施形態において、転写因子はｐｒｆＡである。別の実施形態において、転写因子は当該技術分野で既知の任意の他の転写因子である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１１７】
別の実施形態において、プラスミドは、代謝酵素をコード化する遺伝子を含む。別の実施形態において、代謝酵素は細菌代謝酵素である。別の実施形態において、代謝酵素はリステリア代謝酵素である。別の実施形態において、代謝酵素はアミノ酸代謝酵素である。別の実施形態において、アミノ酸代謝遺伝子は、細胞壁合成経路に関与する。別の実施形態において、代謝酵素は、Ｄアミノ酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｄａｔ）産物である。別の実施形態において、代謝酵素は、アラニンラセマーゼ遺伝子（ｄａｌ）産物である。別の実施形態において、代謝酵素は当該技術分野で既知の任意の他の代謝酵素である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１１８】
別の実施形態において、本発明の方法は、本発明の組み換えリステリア株でヒト対象を追加免疫するステップをさらに含む。別の実施形態において、追加免疫接種に使用する組み換えリステリア株は、初回「プライミング」接種に使用する株と同一である。別の実施形態において、追加免疫株は、プライミング株とは異なる。別の実施形態において、同一の用量がプライミングおよび追加免疫接種に使用される。別の実施形態において、より高い用量が追加免疫に使用される。別の実施形態において、より低い用量が追加免疫に使用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明の方法は、ヒト対象に、Ｅ７抗原を含む免疫原性組成物を接種するステップをさらに含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、組み換えＥ７タンパク質またはそのフラグメントを含む。別の実施形態において、免疫原性組成物は、組み換えＥ７タンパク質またはそのフラグメントを発現するヌクレオチド分子を含む。別の実施形態において、非リステリア接種はリステリア接種後に行われる。別の実施形態において、非リステリア接種はリステリア接種の前に行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１２０】
「追加免疫」とは、別の実施形態において、追加のワクチン用量の対象への投与を指す。本発明の方法の別の実施形態において、２回の追加免疫（または合計３回の接種）が行われる。別の実施形態において、３回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、４回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、５回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、６回の追加免疫が行われる。別の実施形態において、７回以上の追加免疫が行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１２１】
一実施形態において、ワクチンの追加免疫は、初回ワクチン接種の２１日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の７日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の１４日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の２８日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の１０日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の２５日後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の１ヵ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の６週間後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の２ヵ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の３ヵ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の４ヶ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の５ヶ月後に提供される。別の実施形態において、追加免疫は、初回ワクチン接種の６ヶ月後に提供される。一実施形態において、追加免疫は、以上に説明した期間のいかなる組み合わせでも提供される。
【０１２２】
本発明の方法および組成物の組み換えリステリア株は、別の実施形態において、組み換えリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・シーリゲリ（Listeria seeligeri）株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・グレイ（Listeria grayi）株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・イバノヴィ（Listeria ivanovii）株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・ムレイ（Listeria murrayi）株である。別の実施形態において、リステリア株は、組み換えリステリア・ウエルシュメリ（Listeria welshimeri）株である。別の実施形態において、リステリア株は、当該技術分野で既知の、任意の他のリステリア種の組み換え株である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１２３】
別の実施形態において、本発明の組み換えリステリア株は、動物宿主を介して継代されている。一実施形態において、該継代は、組み換えリステリア株を投与するステップの前に行われる。別の実施形態において、継代は、ワクチンベクターとしての、該株の有効性を最大限にする。別の実施形態において、継代は、リステリア株の免疫原性を安定化させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の病原性を安定化させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の免疫原性を増加させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の病原性を増加させる。別の実施形態において、継代は、リステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態において、継代は、リステリア株の不安定な亜株の罹患率を低減する。別の実施形態において、リステリア株は、抗原含有組み換えペプチドをコード化する遺伝子のゲノム挿入を含有する。別の実施形態において、リステリア株は、抗原含有組み換えペプチドをコード化する遺伝子を含むプラスミドを担持する。別の実施形態において、継代は、本明細書に説明するとおり（例えば、実施例１２）、または特許文献１（参照することにより、本明細書に組み込む）に説明されるとおりに行われる。別の実施形態において、継代は、当該技術分野で既知の、任意の他の方法によって行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１２４】
別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、冷凍された細胞バンクに保管されている。別の実施形態において、組み換えリステリア株は、凍結乾燥された細胞バンクに保管されている。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。一実施形態において、細胞バンクは、特許文献２（参照することにより、本明細書に組み込む）に説明されるとおりである。
【０１２５】
一実施形態において、リステリア株の凍結保存および凍結乾燥のための方法、リステリア株の細胞バンクまたは１組のワクチン用量を産生するための方法、それを特性評価する方法、および本発明の方法に有用な規定の微生物培地は、特許文献２（参照することにより、その全体を本明細書に組み込む）に説明されるとおりである。
【０１２６】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の細胞バンクは、マスター細胞バンクである。別の実施形態において、細胞バンクは、作業細胞バンクである。別の実施形態において、細胞バンクは、医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）の細胞バンクである。別の実施形態において、細胞バンクは、臨床用材料の生産のためのものである。別の実施形態において、細胞バンクは、ヒトでの使用のための規制実施に適合する。別の実施形態において、細胞バンクは、当該技術分野で既知の任意の他の種類の細胞バンクである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１２７】
「医薬品適正製造基準」は、別の実施形態において、米国連邦規則集の（２１  ＣＦＲ  ２１０?２１１）によって、定義される。別の実施形態において、「医薬品適正製造基準」は、臨床用材料の生産、または食用のための他の基準（例えば、米国以外の国の基準）によって定義される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１２８】
別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、１組のワクチン用量からのものである。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、本明細書に説明される方法によって産生される冷凍貯蔵物からのものである。
【０１３０】
別の実施形態において、本発明の方法で用いる組み換えリステリア株は、本明細書に説明される方法によって産生される凍結乾燥された貯蔵物からのものである。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、解凍時に、９０％を上回る生存能力を呈する。別の実施形態において、解凍は、凍結保存のための保管、または２４時間の冷凍保管後に行う。別の実施形態において、保管は２日間である。別の実施形態において、保管は３日間である。別の実施形態において、保管は４日間である。別の実施形態において、保管は１週間である。別の実施形態において、保管は２週間である。別の実施形態において、保管は３週間である。別の実施形態において、保管は１ヶ月間である。別の実施形態において、保管は２ヶ月間である。別の実施形態において、保管は３ヶ月間である。別の実施形態において、保管は５ヶ月間である。別の実施形態において、保管は６ヶ月間である。別の実施形態において、保管は９ヶ月間である。別の実施形態において、保管は１年間である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１３２】
別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、一回分のワクチン用量は、栄養培地でリステリア株の培養物を増殖させるステップと、グリセロールを含む溶液で培養物を凍結するステップと、摂氏−２０度未満でリステリア株を保存するステップと、を含む方法によって凍結保存される。別の実施形態において、温度は摂氏約−７０度である。別の実施形態において、温度は摂氏約−７０〜−８０度である。
【０１３３】
別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、一回分のワクチン用量は、本発明の規定培地（以下に説明）でリステリア株の培養物を増殖させるステップと、グリセロールを含む溶液で培養物を凍結するステップと、摂氏−２０度未満でリステリア株を保存するステップと、を含む方法によって凍結保存される。別の実施形態において、温度は摂氏約−７０である。別の実施形態において、温度は摂氏約−７０〜−８０である。別の実施形態において、本発明のいかなる規定微生物培地も、本方法において使用することができる。それぞれの規定微生物培地が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１３４】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、培養物（例えば、１回分のリステリアワクチン用量を産生するために使用されるリステリアワクチン株の培養物）は、細胞バンクからインキュベートされる。別の実施形態において、培養物は冷凍貯蔵物から播種される。別の実施形態において、培養物は開始培養物から播種される。別の実施形態において、培養物はコロニーから播種される。別の実施形態において、培養物は、中間対数増殖期で播種される。別の実施形態において、培養物は、およそ中間対数増殖期で播種される。別の実施形態において、培養物は、別の増殖期で播種される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１３５】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、凍結のために使用される溶液は、グリセロールを２〜２０％の量で含有する。別の実施形態において、量は２％である。別の実施形態において、量は２０％である。別の実施形態において、量は１％である。別の実施形態において、量は１．５％である。別の実施形態において、量は３％である。別の実施形態において、量は４％である。別の実施形態において、量は５％である。別の実施形態において、量は２％である。別の実施形態において、量は２％である。別の実施形態において、量は７％である。別の実施形態において、量は９％である。別の実施形態において、量は１０％である。別の実施形態において、量は１２％である。別の実施形態において、量は１４％である。別の実施形態において、量は１６％である。別の実施形態において、量は１８％である。別の実施形態において、量は２２２％である。別の実施形態において、量は２５％である。別の実施形態において、量は３０％である。別の実施形態において、量は３５％である。別の実施形態において、量は４０％である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１３６】
別の実施形態において、凍結のために使用される溶液は、グリセロールの代わりに、別の束一性添加剤または不凍特性を有する添加剤を含有する。別の実施形態において、凍結のために使用される溶液は、グリセロールに加えて、別の束一性添加剤または不凍特性を有する添加剤を含有する。別の実施形態において、添加剤はマンニトールである。別の実施形態において、添加剤はＤＭＳＯである。別の実施形態において、添加剤はスクロースである。別の実施形態において、添加剤は当該技術分野で既知である、任意の他の束一性添加剤または不凍特性を有する添加剤である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１３７】
別の実施形態において、リステリア株の培養物を増殖させるために用いる栄養培地は、ＬＢである。別の実施形態において、栄養培地はＴＢである。別の実施形態において、栄養培地は規定培地である。別の実施形態において、栄養培地は本発明の規定培地である。別の実施形態において、栄養培地は、当該技術分野で既知の任意の他の種類の栄養培地である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１３８】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、増殖させるステップは、振盪フラスコで行われる。別の実施形態において、フラスコはバッフル付き振盪フラスコである。別の実施形態において、増殖は、バッチ発酵槽で行われる。別の実施形態において、増殖は、撹拌槽またはフラスコで行われる。別の実施形態において、増殖は、エアリフト発酵槽で行われる。別の実施形態において、増殖は、フェッドバッチで行われる。別の実施形態において、増殖は、連続細胞反応器で行われる。別の実施形態において、増殖は、固定化細胞反応器で行われる。別の実施形態において、増殖は、当該技術分野で既知である、任意の他の細菌増殖手段で行われる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１３９】
別の実施形態において、一定ｐＨが、培養物の増殖中維持される（例えば、バッチ発酵槽において）。別の実施形態において、ｐＨは約７．０に維持される。別の実施形態において、ｐＨは約６である。別の実施形態において、ｐＨは約６．５である。別の実施形態において、ｐＨは約７．５である。別の実施形態において、ｐＨは約８である。別の実施形態において、ｐＨは６．５〜７．５である。別の実施形態において、ｐＨは６〜８である。別の実施形態において、ｐＨは６〜７である。別の実施形態において、ｐＨは７〜８である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１４０】
別の実施形態において、一定温度が、培養物の増殖中維持される。別の実施形態において、温度は約３７℃に維持される。別の実施形態において、温度は３７℃である。別の実施形態において、温度は２５℃である。別の実施形態において、温度は２７℃である。別の実施形態において、温度は２８℃である。別の実施形態において、温度は３０℃である。別の実施形態において、温度は３２℃である。別の実施形態において、温度は３４℃である。別の実施形態において、温度は３５℃である。別の実施形態において、温度は３６℃である。別の実施形態において、温度は３８℃である。別の実施形態において、温度は３９℃である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１４１】
別の実施形態において、一定の溶存酸素濃度が培養物の増殖中維持される。別の実施形態において、溶存酸素濃度は、飽和の２０％に維持される。別の実施形態において、濃度は飽和の１５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の１６％である。別の実施形態において、濃度は飽和の１８％である。別の実施形態において、濃度は飽和の２２％である。別の実施形態において、濃度は飽和の２５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の３０％である。別の実施形態において、濃度は飽和の３５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の４０％である。別の実施形態において、濃度は飽和の４５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の５０％である。別の実施形態において、濃度は飽和の５５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の６０％である。別の実施形態において、濃度は飽和の６５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の７０％である。別の実施形態において、濃度は飽和の７５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の８０％である。別の実施形態において、濃度は飽和の８５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の９０％である。別の実施形態において、濃度は飽和の９５％である。別の実施形態において、濃度は飽和の１００％である。別の実施形態において、濃度は飽和のほぼ１００％である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１４２】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、培養物は、１つの容器あたり最大容積２リットル（Ｌ）を有する培地で増殖される。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積２００ｍｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積３００ｍｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積５００ｍｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積７５０ｍｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積１Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積１．５Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積２．５Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最大容積３Ｌを有する。
【０１４３】
別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積２Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積５００ｍｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積７５０ｍｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積１Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積１．５Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積２．５Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積３Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積４Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積５Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積６Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積８Ｌを有する。別の実施形態において、培地は、１つの容器あたり最小容積１０Ｌを有する。
【０１４４】
それぞれの容積が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１４５】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、凍結または凍結乾燥するステップは、培養物が０．７単位のＯＤ６００を有するときに行われる。別の実施形態において、培養物は、０．８単位のＯＤ６００を有する。別の実施形態において、ＯＤ６００は約０．７単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は約０．８単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．６５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．７５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．８５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．６〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．６５〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．７〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．７５〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．８〜０．９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．７５〜１単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は０．９〜１単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１単位を上回る。
【０１４６】
別の実施形態において、ＯＤ６００は１単位を大幅に上回る（例えば、培養物がバッチ発酵槽で産生されるとき）。別の実施形態において、ＯＤ６００は７．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．２単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は６．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は７単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は８単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は９単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は９．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１０単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１０単位よりも大きい。
【０１４７】
別の実施形態において、ＯＤ６００は１〜２単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．５〜２．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２〜３単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２．５〜３．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３〜４単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３．５〜４．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４〜５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４．５〜５．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５〜６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５．５〜６．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１〜３単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．５〜３．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２〜４単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２．５〜４．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３〜５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４〜６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５〜７単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２〜５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３〜６単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４〜７単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５〜８単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．２〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は６〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は６．５〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は７〜７．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１０単位よりも大きい。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．２〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は２．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は３．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は４．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は５．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は６〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は６．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は７〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は７．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は８〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は９．５〜８．５単位である。別の実施形態において、ＯＤ６００は１０単位である。
【０１４８】
別の実施形態において、冷凍もしくは凍結乾燥するステップは、培養物が、１×１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌのバイオマスを有している際に行われる。別の実施形態において、バイオマスは１．５×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは１．５×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは２×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは３×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは４×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは５×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは７×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは９×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは１０×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは１２×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは１５×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは２０×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは２５×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは３０×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは３３×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは４０×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは５０×１０９ＣＦＲ／ｍｌである。別の実施形態において、バイオマスは５０×１０９ＣＦＲ／ｍｌを上回る。
【０１４９】
ＯＤ６００測定値および培養物のバイオマス測定値の各数および範囲が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５０】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、リステリア培養物を液体窒素でフラッシュ凍結し、その後、最終冷凍温度で保管する。別の実施形態において、培養物をより段階的に冷凍する（例えば、最終保管温度の培養物のバイアルに配置することによって）。別の実施形態において、培養物を細菌培養物を冷凍するための、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって冷凍する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５１】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、培養物の保管温度は、摂氏−２０〜−８０度（℃）である。別の実施形態において、温度は−２０℃を大幅に下回る。別の実施形態において、温度は−７０℃よりも高くない。別の実施形態において、温度は−７０℃である。別の実施形態において、温度は約−７０℃である。別の実施形態において、温度は−２０℃である。別の実施形態において、温度は約−２０℃である。別の実施形態において、温度は−３０℃である。別の実施形態において、温度は−４０℃である。別の実施形態において、温度は−５０℃である。別の実施形態において、温度は−６０℃である。別の実施形態において、温度は−８０℃である。別の実施形態において、温度は−３０〜−７０℃である。別の実施形態において、温度は−４０〜−７０℃である。別の実施形態において、温度は−５０〜−７０℃である。別の実施形態において、温度は−６０〜−７０℃である。別の実施形態において、温度は−３０〜−８０℃である。別の実施形態において、温度は−４０〜−８０℃である。別の実施形態において、温度は−５０〜−８０℃である。別の実施形態において、温度は−６０〜−８０℃である。別の実施形態において、温度は−７０〜−８０℃である。別の実施形態において、温度は−７０℃よりも低温である。別の実施形態において、温度は−８０℃よりも低温である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５２】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、もしくは凍結乾燥は、最大２４時間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大２日間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大３日間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大４日間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大１週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大２週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大３週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大１ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大２ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大３ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大５ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大６ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大９ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最大１年間である。
【０１５３】
別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低１週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低２週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低３週間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低１ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低２ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低３ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低５ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低６ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低９ヶ月間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低１年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低１．５年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低２年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低３年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低５年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低７年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、最低１０年間である。別の実施形態において、凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、１０年間よりも長い。
【０１５４】
それぞれの凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥期間が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５５】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、リステリア細菌は、長期間の凍結保存もしくは冷凍保管後の解凍後、本質的に直ちに対数増殖を呈する（実施例１４）。別の実施形態において、リステリア細菌は、長期間の凍結乾燥後の再構成後、本質的に直ちに対数増殖を呈する。別の実施形態において、「本質的に直ちに」とは、細胞バンクまたは開始培養物からの細胞で、新しい培地を播種してから約１時間以内を指す。別の実施形態において、細菌は、凍結保存もしくは保管期間後の解凍後、間もなく（例えば、種々の実施形態において、１０分後、２０分後、３０分後、４０分後、５０分後、１時間後、７５分後、９０分後、１０５分後、または２時間後）、対数増殖を呈する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５６】
「長期間」の凍結保存、冷凍保管、または凍結乾燥は、別の実施形態において、１ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、２ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、３ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、５ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、６ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、９ヶ月である。別の実施形態において、該期間は、１年である。別の実施形態において、該期間は、１．５年である。別の実施形態において、該期間は、２年である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５７】
別の実施形態において、「対数増殖」とは、培養物が増殖する条件（例えば、培地の種類、温度等）に対して観察される最大値に近い倍加時間を指す。別の実施形態において、「対数増殖」とは、培養物の希釈の適度に一定の数時間（例えば、１時間、１．５時間、２時間、または２．５時間）後（任意に、短い回復期間後）の倍加時間を指す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５８】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のリステリアワクチン株は、凍結保存の１４日後の解凍後、９０％以上の生存能力を保持する（実施例１４）。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、凍結保存期間後、１００％に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、約９０％である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、９０％に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、少なくとも９０％である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、８０％以上である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１５９】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物のリステリアワクチン株は、凍結乾燥後の再構成後、９０％以上の生存能力を保持する。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、凍結乾燥期間後、１００％に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、約９０％である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、９０％に近い。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、少なくとも９０％である。別の実施形態において、解凍後の生存能力は、８０％以上である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１６０】
別の実施形態において、本発明の細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのメチオニン、ならびに（２）有効量の（ａ）システイン、（ｂ）ｐＨ緩衝剤、（ｃ）炭水化物、（ｄ）二価カチオン、（ｅ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｆ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｇ）リボフラビン、（ｈ）チオクト酸（リポ酸としても知られる）、（ｉ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される別の成分、またはさらなる成分、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６１】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのシステイン、ならびに（２）有効量の（ａ）メチオニン、（ｂ）ｐＨ緩衝剤、（ｃ）炭水化物、（ｄ）二価カチオン、（ｅ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｆ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｇ）リボフラビン、（ｈ）チオクト酸、（ｉ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６２】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）１リットルあたり約０．００１２３〜０．００２４６モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｇ）リボフラビン、（ｈ）チオクト酸、（ｉ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６３】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）約１．８〜３．６ｇ／Ｌのグルタミンもしくは別の窒素源、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）リボフラビン、（ｈ）チオクト酸、（ｉ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６４】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）約１５〜約３０ｍｇ／Ｌのリボフラビン、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）チオクト酸、（ｉ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６５】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのチオクト酸、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）リボフラビン、（ｉ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６６】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのメチオニンおよびシステイン、（２）１リットルあたり約０．００１２３〜０．００２４６モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、（３）約１．８〜約３．６ｇ／Ｌのグルタミンもしくは別の窒素源、（４）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのチオクト酸、（５）約１５〜約３０ｍｇ／Ｌのリボフラビン、ならびに（６）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｅ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｆ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６７】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのメチオニンおよびシステイン、（２）１リットルあたり約０．００１２３〜０．００２４６モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、（３）約１．８〜約３．６ｇ／Ｌのグルタミンもしくは別の窒素源、（４）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのチオクト酸、（５）約１５〜約３０ｍｇ／Ｌのリボフラビン、ならびに（６）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）ロイシン、（ｅ）イソロイシン、（ｆ）バリン、（ｇ）アルギニン、（ｈ）ヒスチジン、（ｉ）トリプトファン、（ｊ）フェニルアラニン、（ｋ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｌ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１６８】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される、それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌの１つまたは複数の成分、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）  リボフラビン、（ｉ）  チオクト酸、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩から選択される１つまたは複数の成分。
【０１６９】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニン、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）リボフラビン、（ｉ）チオクト酸、（ｊ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１７０】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）約０．２〜約０．７５の、ビオチンおよびアデニンより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）リボフラビン、（ｉ）チオクト酸、（ｊ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｋ）チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｌ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１７１】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約３〜約６ｍｇ／Ｌの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）リボフラビン、（ｉ）チオクト酸、（ｊ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｋ）ビオチン、（ｌ）アデニン、ならびに（ｌ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１７２】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．２〜約０．７５ｍｇ／Ｌの、ビオチンおよびアデニンより選択される１つまたは複数の成分、（２）それぞれ約３〜約６ｍｇ／Ｌの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（３）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）リボフラビン、（ｉ）チオクト酸、（ｊ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、カルシウム、およびクエン酸塩より選択される１つまたは複数の成分。
【０１７３】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．００５〜約０．０２ｇ／Ｌの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）リボフラビン、（ｉ）チオクト酸、（ｊ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｋ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分。
【０１７４】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）約０．４〜約１ｇ／Ｌのクエン酸塩、ならびに（２）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、（ｃ）二価カチオン、（ｄ）メチオニン、（ｅ）システイン、（ｆ）第二鉄もしくは第一鉄イオン、（ｇ）グルタミンもしくは別の窒素源、（ｈ）リボフラビン、（ｉ）チオクト酸、（ｊ）ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（ｋ）コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される１つまたは複数の成分、ならびに（ｌ）アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分。
【０１７５】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのメチオニンおよびシステイン、（２）１リットルあたり約０．００１２３〜０．００２４６モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、（３）約１．８〜約３．６ｇ／Ｌのグルタミンもしくは別の窒素源、（４）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのチオクト酸、（５）約１５〜約３０ｍｇ／Ｌのリボフラビン、（６）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌの、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンより選択される１つまたは複数の成分、（７）それぞれ約０．２〜約０．７５ｍｇ／Ｌの、ビオチンおよびアデニンより選択される１つまたは複数の成分、（８）それぞれ約３〜約６ｍｇ／Ｌの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、（９）それぞれ約０．００５〜約０．０２ｇ／Ｌの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される１つまたは複数の成分、（１０）約０．４〜約１ｇ／Ｌのクエン酸塩、ならびに（１１）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、および（ｃ）二価カチオン。
【０１７６】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのメチオニンおよびシステイン、（２）１リットルあたり約０．００１２３〜０．００２４６モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、（３）約１．８〜約３．６ｇ／Ｌのグルタミンもしくは別の窒素源、（４）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのチオクト酸、（５）約１５〜約３０ｍｇ／Ｌのリボフラビン、（６）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニン、（７）それぞれ約０．２〜約０．７５ｍｇ／Ｌの、ビオチンおよびアデニンより選択される１つまたは複数の成分、（８）それぞれ約３〜約６ｍｇ／Ｌの、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドより選択される１つまたは複数の成分、（９）それぞれ約０．００５〜約０．０２ｇ／Ｌの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される１つまたは複数の成分、（１０）約０．４〜約１ｇ／Ｌのクエン酸塩、ならびに（１１）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、および（ｃ）二価カチオン。
【０１７７】
別の実施形態において、細胞バンク、冷凍貯蔵物、または１組のワクチン用量は、以下のものを含む規定微生物培地で増殖される。（１）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのメチオニンおよびシステイン、（２）１リットルあたり約０．００１２３〜０．００２４６モルの第二鉄もしくは第一鉄イオン、（３）約１．８〜約３．６ｇ／Ｌのグルタミンもしくは別の窒素源、（４）約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのチオクト酸、（５）約１５〜約３０ｍｇ／Ｌのリボフラビン、（６）それぞれ約０．３〜約０．６ｇ／Ｌのロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニン、（７）それぞれ約０．２〜約０．７５ｍｇ／Ｌのビオチンおよびアデニン、（８）それぞれ約３〜約６ｍｇ／Ｌのチアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミド、（９）それぞれ約０．００５〜約０．０２ｇ／Ｌの、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、およびカルシウムより選択される１つまたは複数の成分、（１０）約０．４〜約１ｇ／Ｌのクエン酸塩、ならびに（１１）有効量の（ａ）ｐＨ緩衝剤、（ｂ）炭水化物、および（ｃ）二価カチオン。
【０１７８】
別の実施形態において、本発明の規定微生物培地は、水性溶媒をさらに含む。別の実施形態において、水性溶媒は水である。別の実施形態において、水性溶媒は、当該技術分野で既知の任意の他の水性溶媒である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１７９】
本発明の方法および組成物で用いられる炭水化物は、別の実施形態において、グルコースである。別の実施形態において、炭水化物はラクトースある。別の実施形態において、炭水化物はフルクトースある。別の実施形態において、炭水化物はマンノースある。別の実施形態において、炭水化物はセロビオースある。別の実施形態において、炭水化物はトレハロースある。別の実施形態において、炭水化物はマルトースある。別の実施形態において、炭水化物はグリセロールある。別の実施形態において、炭水化物はグルコサミンある。別の実施形態において、炭水化物はＮ−アセチルグルコサミンある。別の実施形態において、炭水化物はＮ−アセチルムラミン酸ある。別の実施形態において、炭水化物は、リステリアによって用いることができる任意の他の炭水化物である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１８０】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する炭水化物の量は、約１２〜１８グラム／リットル（ｇ／Ｌ）である。別の実施形態において、該量は、１５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１０ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、９ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１１ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１２ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１３ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１４ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１６ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１７ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１８ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１９ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、２０ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、２０ｇ／Ｌを上回る。
【０１８１】
別の実施形態において、該量は、９〜１５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１０〜１５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１１〜１５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１２〜１６ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１３〜１７ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１４〜１８ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１６〜１９ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１７〜２０ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１０〜２０ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１２〜２０ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１５〜２０ｇ／Ｌである。
【０１８２】
別の実施形態において、培地内の炭水化物の総量は、上記の量のうちの１つである。別の実施形態において、培地内の炭水化物うちのの１つの量は、上記の量のうちの１つである。別の実施形態において、培地内の炭水化物のそれぞれの量は、上記の量のうちの１つである。
【０１８３】
炭水化物の上記の量のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１８４】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するコバルトは、別の実施形態において、コバルトイオンとして存在する。別の実施形態において、コバルトは、コバルト塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化コバルトである。別の実施形態において、塩は当該技術分野で既知の任意の他のコバルト塩である。別の実施形態において、コバルトは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のコバルトとして存在する。
【０１８５】
別の実施形態において、コバルト塩は水和物（例えば、塩化コバルト六水和物）である。別の実施形態において、コバルト塩は無水である。別の実施形態において、コバルト塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のコバルト塩である。上記の形態のコバルトのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１８６】
本発明の方法および組成物の規定培地の成分の水和物は、別の実施形態において、一水和物である。別の実施形態において、水和物は二水和物である。別の実施形態において、水和物は三水和物である。別の実施形態において、水和物は四水和物である。別の実施形態において、水和物は五水和物である。別の実施形態において、水和物は六水和物である。別の実施形態において、水和物は七水和物である。別の実施形態において、水和物は、当該技術分野で既知の任意の他の水和物である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１８７】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する銅は、別の実施形態において、銅イオンとして存在する。別の実施形態において、銅イオンは銅（Ｉ）イオンである。別の実施形態において、銅イオンは銅（ＩＩ）イオンである。別の実施形態において、銅イオンは銅（ＩＩＩ）イオンである。
【０１８８】
別の実施形態において、銅は、銅塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化銅である。別の実施形態において、塩は当該技術分野で既知の任意の他の銅塩である。別の実施形態において、銅は当該技術分野で既知の任意の他の形態の銅として存在する。
【０１８９】
別の実施形態において、銅塩は水和物（例えば、塩化銅二水和物）である。別の実施形態において、銅塩は無水である。別の実施形態において、銅塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の銅塩である。上記の形態の銅のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１９０】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するホウ素は、別の実施形態において、ホウ酸イオンとして存在する。別の実施形態において、ホウ素は、ホウ酸（borate acid）（例えば、ホウ素性酸、Ｈ３ＢＯ３）として存在する。別の実施形態において、ホウ素は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のホウ素として存在する。
【０１９１】
別の実施形態において、ホウ酸塩またはホウ酸は、水和物である。別の実施形態において、ホウ酸塩またはホウ酸は、無水である。別の実施形態において、ホウ酸塩またはホウ酸は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のホウ酸塩またはホウ酸である。上記の形態のホウ素のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１９２】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するマンガンは、別の実施形態において、マンガンイオンとして存在する。別の実施形態において、マンガンは、マンガン塩として存在する。別の実施形態において、塩は硫酸マンガンである。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他のマンガン塩である。別の実施形態において、マンガンは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のマンガンとして存在する。
【０１９３】
別の実施形態において、マンガン塩は水和物（例えば、硫酸マンガン一水和物）である。別の実施形態において、マンガン塩は無水である。別の実施形態において、マンガン塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のマンガン塩である。上記の形態のマンガンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１９４】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するモリブデンは、別の実施形態において、モリブデン酸イオンとして存在する。別の実施形態において、モリブデンはモリブデン塩として存在する。別の実施形態において、塩はモリブデン酸ナトリウムである。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他のモリブデン塩である。別の実施形態において、モリブデンは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のモリブデンとして存在する。
【０１９５】
別の実施形態において、モリブデン塩は水和物（例えば、モリブデン酸ナトリウム二水和物）である。別の実施形態において、モリブデン塩は無水である。別の実施形態において、モリブデン塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のモリブデン塩である。上記の形態のモリブデンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１９６】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する亜鉛は、別の実施形態において、亜鉛イオンとして存在する。別の実施形態において、亜鉛は、亜鉛塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化亜鉛である。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他の亜鉛塩である。別の実施形態において、亜鉛は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の亜鉛として存在する。
【０１９７】
別の実施形態において、亜鉛塩は水和物（例えば、塩化亜鉛七水和物）である。別の実施形態において、亜鉛塩は無水である。別の実施形態において、亜鉛塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の亜鉛塩である。上記の形態の亜鉛のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０１９８】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する鉄は、別の実施形態において、第二鉄イオンとして存在する。別の実施形態において、鉄は第一鉄イオンとして存在する。別の実施形態において、鉄は第二鉄塩として存在する。別の実施形態において、鉄は第一鉄塩として存在する。別の実施形態において、塩は硫酸第二鉄である。別の実施形態において、塩はクエン酸第二鉄である。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他の第二鉄塩である。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他の第一鉄塩である。別の実施形態において、鉄は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の鉄として存在する。
【０１９９】
別の実施形態において、第二鉄または第一鉄塩は水和物（例えば、硫酸第二鉄一水和物）である。別の実施形態において、第二鉄または第一鉄塩は無水である。別の実施形態において、第二鉄または第一鉄塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態の第二鉄または第一鉄塩である。上記の形態の鉄のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２００】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するカルシウムは、別の実施形態において、カルシウムイオンとして存在する。別の実施形態において、カルシウムは、カルシウム塩として存在する。別の実施形態において、塩は塩化カルシウムである。別の実施形態において、塩は、当該技術分野で既知の任意の他のカルシウム塩である。別の実施形態において、カルシウムは、当該技術分野で既知の任意の他の形態のカルシウムとして存在する。
【０２０１】
別の実施形態において、カルシウム塩は水和物（例えば、塩化カルシウム二水和物）である。別の実施形態において、カルシウム塩は無水である。別の実施形態において、カルシウム塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のカルシウム塩である。上記の形態のカルシウムのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２０２】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するクエン酸塩は、別の実施形態において、クエン酸イオンとして存在する。別の実施形態において、クエン酸塩は、クエン酸塩として存在する。別の実施形態において、クエン酸塩は、クエン性酸（例えば、クエン酸）として存在する。別の実施形態において、クエン酸塩は、クエン酸第二鉄およびクエン酸の両方として存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、クエン酸塩は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のクエン酸塩として存在する。
【０２０３】
別の実施形態において、クエン酸塩またはクエン酸は、水和物である。別の実施形態において、クエン酸塩またはクエン酸は無水である。別の実施形態において、クエン酸塩またはクエン酸は、当該技術分野で既知の任意の他の形態のクエン酸塩またはクエン酸である。上記の形態のクエン酸塩のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２０４】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するコバルトは、別の実施形態において、０．０２ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０２ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．００３ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．００５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．００７ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０１ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０１５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０２５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０３ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．００３〜０．００６ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．００５〜０．０１ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０１〜０．０２ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０２〜０．０４ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０３〜０．０６ｇ／Ｌである。
【０２０５】
別の実施形態において、コバルトは、０．０２ｇ／Ｌの塩化コバルト六水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するコバルトの量は、約０．０２ｇ／Ｌの塩化コバルト六水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するコバルトの量は、上記の量または範囲の塩化コバルト六水和物の別のモル当量である。上記の量または範囲のコバルトのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２０６】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する銅は、別の実施形態において、０．０１９ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０１９ｇ／Ｌである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。
【０２０７】
別の実施形態において、銅は、０．０１９ｇ／Ｌの塩化銅二水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在する銅の量は、約０．０１９ｇ／Ｌの塩化銅二水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在する銅の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、塩化銅二水和物のモル当量である。上記の量または範囲の銅のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２０８】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するホウ酸塩系は、別の実施形態において、０．０１６ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０１６ｇ／Ｌである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。
【０２０９】
別の実施形態において、ホウ酸塩系は、０．０１６ｇ／Ｌのホウ酸のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するホウ酸塩系の量は、約０．０１６ｇ／Ｌのホウ酸のモル当量である。別の実施形態において、存在するホウ酸塩系の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、ホウ酸のモル当量である。上記の量または範囲のホウ酸塩系のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２１０】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するマンガンは、別の実施形態において、０．０１６ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０１６ｇ／Ｌである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。
【０２１１】
別の実施形態において、マンガンは、０．０１６ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するマンガンの量は、約０．０１６ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するマンガンの量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、硫酸マンガン一水和物のモル当量である。上記の量または範囲のマンガンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２１２】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するモリブデンは、別の実施形態において、０．０２ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０２ｇ／Ｌである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。
【０２１３】
別の実施形態において、モリブデンは、０．２ｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム二水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するモリブデンの量は、約０．０２ｇ／Ｌのモリブデン酸ナトリウム二水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するモリブデンの量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、モリブデン酸ナトリウム二水和物のモル当量である。上記の量または範囲のモリブデンのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２１４】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する亜鉛は、別の実施形態において、０．０２ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０２ｇ／Ｌである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。
【０２１５】
別の実施形態において、亜鉛は、０．０２ｇ／Ｌの塩化亜鉛七水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在する亜鉛の量は、約０．０２ｇ／Ｌの塩化亜鉛七水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在する亜鉛の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、塩化亜鉛七水和物のモル当量である。上記の量または範囲の亜鉛のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２１６】
別の実施形態において、硫酸第二鉄または関連化合物は、本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する。別の実施形態において、硫酸第二鉄または関連化合物は、０．０１ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０１ｇ／Ｌである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。
【０２１７】
別の実施形態において、鉄は、０．０１ｇ／Ｌの硫酸第二鉄のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在する鉄の量は、約０．０１ｇ／Ｌの硫酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在する鉄の量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、硫酸第二鉄のモル当量である。上記の量または範囲の鉄のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２１８】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するカルシウムは、別の実施形態において、０．０１ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０１ｇ／Ｌである。他の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。
【０２１９】
別の実施形態において、カルシウムは、０．０１ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するカルシウムの量は、約０．０１ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物のモル当量である。別の実施形態において、存在するカルシウムの量は、バルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、塩化カルシウム二水和物のモル当量である。上記の量または範囲のカルシウムのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２０】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するクエン酸塩は、別の実施形態において、０．９ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、クエン酸の形態で、０．６ｇ／Ｌである（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、クエン酸第二鉄の形態で、０．４ｇ／Ｌである（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、クエン酸の形態で０．６ｇ／Ｌ、およびクエン酸第二鉄の形態で０．４ｇ／Ｌである（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は約０．６ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．１ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．２ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．３ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．４ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．７ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．８ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１ｇ／Ｌを上回る。
【０２２１】
別の実施形態において、クエン酸塩は、０．６ｇ／Ｌのクエン性酸のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、約０．６ｇ／Ｌのクエン性酸のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、約０．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、０．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、０．６ｇ／Ｌのクエン性酸、および０．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄のモル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、０．６ｇ／Ｌのクエン性酸、および０．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄の約モル当量である。別の実施形態において、存在するクエン酸塩の量は、クエン酸塩に関して上に記載される量または範囲のいずれかのクエン性酸のモル当量である。上記の量または範囲のクエン酸塩のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２２】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する、アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドのうちの１つまたは複数は、別の実施形態において、遊離化合物として存在する。別の実施形態において、上記化合物のうちの１つは、その塩として存在する。別の実施形態において、上記化合物のうちの１つは、その誘導体として存在する。別の実施形態において、上記化合物のうちの１つは、その水和物として存在する。他の実施形態において、塩、誘導体、もしくは水和物は、当該技術分野で既知のいかなる塩、誘導体、もしくは水和物であることも可能である。上記の形態のアデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２３】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するチアミン（ビタミンＢ１）は、別の実施形態において、チアミンＨＣｌの形態で存在する。別の実施形態において、チアミンは、当該技術分野で既知のチアミンの任意の他の塩、誘導体、もしくは水和物として存在する。別の実施形態において、別の形態のビタミンＢ１がチアミンに代用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２４】
別の実施形態において、チアミンは、４ｍｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．５ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．７ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、１．５ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、２ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、３ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、５ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、６ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、８ｍｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、８ｍｇ／Ｌを上回る。別の実施形態において、チアミンは、４ｍｇ／ＬのチアミンＨＣｌのモル当量である量で存在する。別の実施形態において、チアミンは、上記の量のうちの１つのチアミンＨＣｌのモル当量である量で存在する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２５】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するピリドキサール（ビタミンＢ６）は、別の実施形態において、ピリドキサールＨＣｌの形態で存在する。別の実施形態において、ピリドキサールは、当該技術分野で既知のピリドキサールの任意の他の塩、誘導体、もしくは水和物として存在する。別の実施形態において、別の形態のビタミンＢ６がピリドキサールに代用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２６】
別の実施形態において、ピリドキサールは、４ｍｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。別の実施形態において、存在するピリドキサールの量は、約４ｍｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌのモル当量である。別の実施形態において、存在するピリドキサールの量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、ピリドキサールＨＣｌのモル当量である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２７】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するアデニン（ビタミンＢ４）は、別の実施形態において、遊離アデニンの形態で存在する。別の実施形態において、アデニンは、当該技術分野で既知のアデニンの任意の他の塩、誘導体、もしくは水和物として存在する。別の実施形態において、別の形態のビタミンＢ４がアデニンに代用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２８】
別の実施形態において、アデニンは、０．２５ｍｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。別の実施形態において、存在するアデニンの量は、約０．２５ｍｇ／Ｌの遊離アデニンのモル当量である。別の実施形態において、存在するアデニンの量は、コバルトに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、遊離アデニンのモル当量である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２２９】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するビオチン（ビタミンＢ７）は、別の実施形態において、遊離ビオチンの形態で存在する。別の実施形態において、ビオチンは、当該技術分野で既知のビオチンの任意の他の塩、誘導体、もしくは水和物として存在する。別の実施形態において、別の形態のビタミンＢ７がビオチンに代用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３０】
別の実施形態において、ビオチンは、２ｍｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。別の実施形態において、存在するビオチンの量は、約２ｍｇ／Ｌの遊離ビオチンのモル当量である。別の実施形態において、存在するビオチンの量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、遊離ビオチンのモル当量である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３１】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するパラアミノ安息香酸（ビタミンＢ−ｘ）は、別の実施形態において、遊離パラアミノ安息香酸の形態で存在する。別の実施形態において、パラアミノ安息香酸は、当該技術分野で既知のパラアミノ安息香酸の任意の他の塩、誘導体、もしくは水和物として存在する。別の実施形態において、別の形態のビタミンＢ−ｘがパラアミノ安息香酸に代用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３２】
別の実施形態において、パラアミノ安息香酸は、４ｍｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。別の実施形態において、存在するパラアミノ安息香酸の量は、約４ｍｇ／Ｌの遊離パラアミノ安息香酸のモル当量である。別の実施形態において、存在するパラアミノ安息香酸の量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、遊離パラアミノ安息香酸のモル当量である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３３】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するパントテン酸（ビタミンＢ５）は、別の実施形態において、カルシウムパントテン酸の形態で存在する。別の実施形態において、パントテン酸は、当該技術分野で既知のパントテン酸の任意の他の塩、誘導体、もしくは水和物として存在する。別の実施形態において、別の形態のビタミンＢ５がパントテン酸に代用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３４】
別の実施形態において、パントテン酸は、４ｍｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。別の実施形態において、存在するパントテン酸の量は、約４ｍｇ／Ｌのパントテン酸カルシウムのモル当量である。別の実施形態において、存在するパントテン酸の量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、パントテン酸カルシウムのモル当量である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３５】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するニコチンアミド（ビタミンＢ３）は、別の実施形態において、遊離ニコチンアミドの形態で存在する。別の実施形態において、ニコチンアミドは、当該技術分野で既知のニコチンアミドの任意の他の塩、誘導体、もしくは水和物として存在する。別の実施形態において、別の形態のビタミンＢ３がニコチンアミドに代用される。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３６】
別の実施形態において、ニコチンアミドは、４ｍｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかである。別の実施形態において、存在するニコチンアミドの量は、約４ｍｇ／Ｌの遊離ニコチンアミドのモル当量である。別の実施形態において、存在するニコチンアミドの量は、チアミンに関して上に記載される量または範囲のいずれかの、遊離ニコチンアミドのモル当量である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３７】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在するロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンのうちの１つまたは複数は、別の実施形態において、遊離アミノ酸として存在する。別の実施形態において、上記の化合物のうちの１つは、その塩として存在する。別の実施形態において、上記の化合物のうちの１つは、その誘導体として存在する。別の実施形態において、上記の化合物のうちの１つは、その水和物として存在する。他の実施形態において、塩、誘導体、もしくは水和物は、当該技術分野で既知のいかなる塩、誘導体、もしくは水和物であることも可能である。上記の形態のアデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミドのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３８】
別の実施形態において、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニンのうちの１つまたは複数は、０．４ｇ／Ｌの量で存在する（実施例１５〜１６）。別の実施形態において、該量は、約０．０５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．０７ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．１ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．１５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．２ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．３ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．５ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．６ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．８ｇ／Ｌである。別の実施形態において、該量は、０．８ｇ／Ｌを上回る。別の実施形態において、これらのアミノ酸のうちの１つまたは複数は、０．４ｇ／Ｌの遊離アミノ酸のモル当量である量で存在する。別の実施形態において、該量は、上記の量のうちの１つの遊離アミノ酸のチアミンのモル当量である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２３９】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、表３Ｂの第２部に記載されるアミノ酸（ＡＡ）（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、およびフェニルアラニン）のうちの２つを含有する。別の実施形態において、規定培地は、これらのＡＡのうちの３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの４つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの５つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの６つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちのすべてを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの少なくとも２つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの少なくとも３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの少なくとも４つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの少なくとも５つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのＡＡのうちの少なくとも６つを含有する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２４０】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、表３Ｂの第３部に記載されるビタミン（例えば、アデニン、ビオチン、チアミン、ピリドキサール、パラアミノ安息香酸、パントテン酸、およびニコチンアミド）のうちの２つを含有する。別の実施形態において、規定培地は、これらのビタミンのうちの３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの４つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの５つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの６つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちのすべてを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの少なくとも２つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの少なくとも３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの少なくとも４つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの少なくとも５つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらのビタミンのうちの少なくとも６つを含有する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２４１】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、表３Ｂの第４部に記載される微量元素（例えば、コバルト、銅、ホウ素、マンガン、モリブデン、亜鉛、鉄、カルシウム、およびクエン酸塩）のうちの２つを含有する。別の実施形態において、規定培地は、これらの微量元素のうちの３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの４つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの５つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの６つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの７つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの７つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちのすべてを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの少なくとも２つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの少なくとも３つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの少なくとも４つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの少なくとも５つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの少なくとも６つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの少なくとも７つを含有する。別の実施形態において、培地は、これらの微量元素のうちの少なくとも８つを含有する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２４２】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、上記の成分の部類のうちの２つから２つ以上の成分（例えば、表３Ｂの第２部に記載されるＡＡのうちの２つ以上、および第３部に記載されるビタミンのうちの２つ以上）を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の２つの成分の部類のうちの２つから３つ以上の成分（例えば、表３Ｂの第２部に記載されるＡＡのうちの３つ以上、および第４部に記載される微量元素のうちの３つ以上）を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のうちの２つから４つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のうちの２つから５つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のうちの２つから６つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のうちの２つから７つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のうちの２つからの成分のすべてを含有する。
【０２４３】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、上記の部類の成分のすべてから２つ以上の成分（例えば、ＡＡ、ビタミンおよび微量元素からそれぞれ２つ以上の成分）を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類の成分のすべてから３つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のすべてから４つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のすべてから５つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のうちの２つからすべてを上回る成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のすべてから７つ以上の成分を含有する。別の実施形態において、培地は、上記の部類のすべてからの成分のすべてを含有する。
【０２４４】
別の実施形態において、培地は、上記の部類のそれぞれからの成分の数の任意の他の組み合わせ（例えば、２つのＡＡ、２つのビタミン、および３つの微量元素、３つのＡＡ、３つのビタミン、および２つの微量元素、２つのＡＡ、３つのビタミン、および微量元素のすべて等）を含有する。
【０２４５】
上記の部類のそれぞれからの成分の数の上記の組み合わせのそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２４６】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、上記のレシピ、成分の混合物、具体的な量の成分の記載、または上記の部類のそれぞれからの成分の数の組み合わせのうちの１つからなる。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２４７】
本発明の方法および組成物の規定微生物培地に存在する二価カチオンは、別の実施形態において、Ｍｇである。別の実施形態において、二価カチオンはＣａである。別の実施形態において、二価カチオンは、当該技術分野で既知の任意の他の二価カチオンである。Ｍｇは、他の実施形態において、当該技術分野で既知のいかなる形態のＭｇでも存在し得る（例えば、ＭｇＳＯ４（実施例１５〜１６））。別の実施形態において、二価カチオンは、約０．４１ｇ／ｍＬのモル当量である量で存在する。他の実施形態において、二価カチオンは、当業者に既知の別の有効量で存在する。
【０２４８】
別の実施形態において、グルタミン以外の窒素源が、本発明の規定培地において用いられる。別の実施形態において、窒素源は別のＡＡである。別の実施形態において、窒素源は、別のペプチドもしくはタンパク質源である（例えば、カシトンまたはカザミノ酸）である。別の実施形態において、窒素源は、塩化アンモニウムである。別の実施形態において、窒素源は、硝酸アンモニウムである。別の実施形態において、窒素源は、硫酸アンモニウムである。別の実施形態において、窒素源は、別のアンモニウム塩．  別の実施形態において、窒素源は、当該技術分野で既知の任意の他の窒素源である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２４９】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定微生物培地は、動物源に由来する派生した成分を含有しない。別の実施形態において、規定微生物培地は、不完全な規定組成物の動物由来成分（例えば、酵母エキス、バクト・トリプトン等）を含まない。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２５０】
別の実施形態において、「規定微生物培地」とは、成分が既知である、培地を指す。別の実施形態において、該用語は、動物現に由来する成分を含有しない培地を指す。別の実施形態において、該用語は、成分が化学的に特性化された培地を指す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２５１】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、約１．１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬまでリステリア株の増殖を支持する（例えば、フラスコでの増殖の際、実施例１３〜１６）。別の実施形態において、規定培地は、約１．１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬまで増殖を支持する（例えば、発酵槽での増殖の際、実施例１３〜１６）。別の実施形態において、規定培地は、約５×１０９ＣＦＵ／ｍＬまで増殖を支持する（例えば、発酵槽での増殖の際、実施例１３〜１６）。別の実施形態において、規定培地は、存続能力のある細菌の増殖（例えば、生存能力を著しく損失することなく、凍結保存することができる細菌）を、約３×１０１０ＣＦＵ／ｍＬまで支持する（例えば、発酵槽での増殖の際、実施例１３〜１６）。別の実施形態において、規定培地は、約４．５のＯＤ６００まで増殖を支持する（実施例１３〜１６）。他の実施形態において、規定培地は、本明細書に挙げられる別のＯＤ６００値まで増殖を支持する。他の実施形態において、規定培地は、本明細書に挙げられる別のＣＦＵ／ｍＬ値まで増殖を支持する。別の実施形態において、規定培地は、ＴＢで得られるものとおよそ同等の密度まで増殖を支持する。別の実施形態において、規定培地は、ＬＢで得られるものとおよそ同等の密度まで増殖を支持する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２５２】
別の実施形態において、本発明の方法および組成物の規定培地は、約０．２５ｈ−１のリステリア株の増殖率を支持する（実施例）。別の実施形態において、増殖率は、約０．１５ｈ−１である。別の実施形態において、増殖率は、約０．２ｈ−１である。別の実施形態において、増殖率は、約０．３ｈ−１である。別の実施形態において、増殖率は、約０．４ｈ−１である。別の実施形態において、増殖率は、約０．５ｈ−１である。別の実施形態において、増殖率は、約０．６ｈ−１である。別の実施形態において、規定培地は、ＴＢで得られるものとおよそ同等の増殖率を支持する。別の実施形態において、規定培地は、ＬＢで得られるものとおよそ同等の増殖率を支持する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２５３】
別の実施形態において、本発明のペプチドは、融合ペプチドである。別の実施形態において、「融合ペプチド」とは、ペプチド結合もしくは他の化学結合によってともに結合した２またはそれ以上のタンパク質を含む、ペプチドもしくはポリペプチドを指す。別の実施形態において、タンパク質は、ペプチドもしくは他の化学結合によってともに直接結合する。別の実施形態において、タンパク質は、２つまたはそれ以上のタンパク質間の１つまたは複数のＡＡ（例えば、「スペーサ」）とともに結合する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２５４】
別の実施形態において、本発明のワクチンは、アジュバントをさらに含む。本発明の方法および組成物に用いられるアジュバントは、別の実施形態において、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態において、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態において、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦをコード化するヌクレオチド分子である。別の実施形態において、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦをコード化するヌクレオチド分子を含む。別の実施形態において、アジュバントは、サポニンＱＳ２１である。別の実施形態において、アジュバントは、サポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態において、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡである。別の実施形態において、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡを含む。別の実施形態において、アジュバントは、ＳＢＡＳ２である。別の実施形態において、アジュバントは、ＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態において、アジュバントは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、アジュバントは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインである。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインを含む。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインをコード化するヌクレオチド分子である。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインをコード化するヌクレオチド分子を含む。別の実施形態において、アジュバントは、キルグリコシドであるか、またはこれを含む。別の実施形態において、アジュバントは、細菌マイトジェンであるか、またはこれを含む。別の実施形態において、アジュバントは、細菌毒素であるか、またはこれを含む。別の実施形態において、アジュバントは、当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントであるか、これを含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２５５】
別の実施形態において、本発明のヌクレオチドは、リステリア株においてコード化されたペプチドの発現を駆動する、プロモータ、調節配列、またはこれらの組み合わせに操作可能に連結される。遺伝子の構成的発現を駆動するために有用な、プロモータ、調節配列、およびその組み合わせは、当該技術分野で公知であり、例えば、リステリアのＰｈｌｙＡ、ＰＡｃｔＡ、ｈｌｙ、ＡｃｔＡ、およびｐ６０プロモータ、連鎖球菌（Streptococcus）ｂａｃプロモータ、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）ｓｇｉＡプロモータ、およびバシルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）ｐｈａＺプロモータが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態において、本発明のペプチドをコード化する核酸の誘導性および組織特異的発現は、ペプチドをコード化する核酸を、誘導性および組織特異的プロモータ／調節配列の制御下におくことで達成される。この目的に有用な組織特異的または誘導性調節配列、プロモータ、およびその組み合わせの例としては、ＭＭＴＶ  ＬＴＲ誘導性プロモータ、およびＳＶ４０後期エンハンサ／プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態において、金属、グルココルチコイド等の誘導剤に応答して誘導されるプロモータが用いられる。したがって、本発明が、既知または未知のいずれかであり、かつプロモータまたは調節配列に操作可能に連結される所望のタンパク質の発現を駆動することができる、いかなるプロモータまたは調節配列の使用をも含むことを理解されよう。一実施形態において、調節配列はプロモータであり、別の実施形態において、調節配列はエンハンサであり、別の実施形態において、調節配列はサプレッサであり、別の実施形態において、調節配列はリプレッサであり、別の実施形態において、調節配列はサイレンサである。
【０２５６】
一実施形態において、本発明の組成物および方法で使用するためのＡｃｔＡ配列は、リステリア・モノサイトゲネスからのものであり、これは、一実施形態において、ＥＧＤ株、１０４０３Ｓ株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ  ５３４８株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６４）、または当該技術分野で既知である、リステリア・モノサイトゲネスの任意の他の株である。
【０２５７】
一実施形態において、本発明の方法および組成物に用いられるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントは、ＡｃｔＡの最初の３９０ＡＡ、別の実施形態において、ＡｃｔＡの最初の４１８ＡＡ、別の実施形態において、ＡｃｔＡの最初の５０ＡＡ、別の実施形態において、ＡｃｔＡの最初の１００ＡＡを含むか、またはこれから構成され、これは、一実施形態において、配列番号２に提供されるもの等のＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、本発明の方法および組成物に用いられるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントは、ＡｃｔＡの最初の１５０ＡＡ、別の実施形態において、ＡｃｔＡの最初の約２００ＡＡを含むか、またはこれから構成され、これは、一実施形態において、本明細書に説明する２つのＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、本発明の方法および組成物に用いられるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントは、ＡｃｔＡの最初の２５０ＡＡ、別の実施形態において、ＡｃｔＡの最初の３００ＡＡを含むか、またはこれから構成される。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、上記のＡＡ範囲のうちの１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有する。残基番号は、別の実施形態において、上に記載する残基番号に正確に対応する必要はなく、例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書で用いられるＡｃｔＡタンパク質に対して、挿入または欠失を有する場合、残基番号は、当該技術分野で公知である、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ等の配列アラインメントツールを使用して、当業者にとって通常のものとなるように、適宜調節することができる。
【０２５８】
別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質のＮ末端部分は、本明細書に説明する１、２、３、または４つのＰＥＳＴ様配列（一実施形態において、配列番号２〜５、３８〜４０、もしくはそれらのホモログである）、または、本明細書に説明する方法およびアルゴリズムを使用して、または当該技術分野で既知の代替の方法を使用することによって決定することができる、他のＰＥＳＴ様配列を含む。
【０２５９】
本発明の方法および組成物に用いられるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントは、別の実施形態において、配列番号２３に記載される配列を有する。
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号２３）。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号２３に記載される配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２３のホモログである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２３の変異体である。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２３のアイソフォームである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２３のフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２３のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２３の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２３のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２６０】
別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質のフラグメントをコード化する組み換えヌクレオチドは、配列番号２４に記載される配列を含む。
ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号２４）。別の実施形態において、組み換えヌクレオチドは、配列番号２４に記載される配列を有する。別の実施形態において、組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質のフラグメントをコード化する任意の他の配列を含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２６１】
本発明の方法および組成物に用いられるＡｃｔＡタンパク質のＮ末端フラグメントは、別の実施形態において、配列番号３６に記載される配列を有し、ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＥＥＬＥＫＳＮＫＶＫＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＡＫＡＥＫＧＰＮＮＮＮＮＮＧＥＱＴＧＮＶＡＩＮＥＥＡＳＧＶＤＲＰＴＬＱＶＥＲＲＨＰＧＬＳＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＡＮＫＲＫＶＡＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫＡＮＱＫＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＴＰＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＭＲＥＴＡＰＳＬＤＳＳＦＴＳＧＤＬＡＳＬＲＳＡＩＮＲＨＳＥＮＦＳＤＦＰＬＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号３６）、これは、一実施形態において、リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３ＳからのＡｃｔＡに対する最初の３９０ＡＡである。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号３６に記載される配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、当該技術分野で既知の任意の他のＡｃｔＡフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３６のホモログである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３６の変異体である。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３６のアイソフォームである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３６のフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３６のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３６の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３６のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２６２】
別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質のフラグメントをコード化する組み換えヌクレオチドは、配列番号３７に記載される配列を含み、ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔａｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｃｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｃａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａｇｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔｇａｇｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａａａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇｃａａａａｇｃａｇａｇａａａｇｇｔｃｃｇａａｔａａｃａａｔａａｔａａｃａａｃｇｇｔｇａｇｃａａａｃａｇｇａａａｔｇｔｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｔｃｇａｃｃｇａｃｃａａｃｔｃｔｇｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇｔｃｔｇｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇａａａａｇｃｃａｔａｇｃｇｔｃｇｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃａｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｃａａａｔａａｇａｇａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｔｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｃｇａｇｔｃｔａｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｔｃａａａａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃｇａｔｇｃｔｔｃｔｃｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔａｃｔｃｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｔａｔｇｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇｃｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａｇｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｃｇａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｔａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号３７）、これは、一実施形態において、リステリア・モノサイトゲネス１０４０３Ｓ株のＡｃｔＡをコード化する最初の１１７０ヌクレオチドである。別の実施形態において、組み換えヌクレオチドは、配列番号３７に記載される配列を有する。別の実施形態において、組み換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質のフラグメントをコード化する、任意の他の配列を含む。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２６３】
本発明の方法および組成物の別の実施形態において、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、抗原に融合され、これは、一実施形態において、Ｅ７またはＥ６抗原である。別の実施形態において、ＰＥＳＴ配列は、該抗原に融合される。別の実施形態において、ＰＥＳＴ含有配列は該抗原に融合される。本明細書で提供する、ＰＥＳＴ様配列−抗原融合を発現する組み換えリステリア株は、抗腫瘍免疫を誘導し（実施例３）、抗原特異的、腫瘍浸潤Ｔ細胞を生成する（実施例４）。さらに、増強された細胞性免疫が、抗原を含む融合タンパク質、およびＰＥＳＴ様ＡＡ配列（ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１））を含有するＬＬＯに示された。
【０２６４】
別の実施形態において、他の原核生物に由来する、他のＬＭ  ＰＥＳＴ様配列およびＰＥＳＴ様配列への、抗原の融合も、抗原の免疫原性を増強するであろう。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は、別の実施形態において、配列番号２〜７より選択される配列を有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、ＬＭ  ＡｃｔＡタンパク質からのＰＥＳＴ様配列である。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２、３、および４に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２、３、４、および５に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質が含むＰＥＳＴ様配列は、配列番号２、３、４に記載されるものであるか、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質が含むＰＥＳＴ様配列は、配列番号２、３、４、５に記載されるものであるか、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号２に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号３に記載される配列に８２％相同するＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号４に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号４に記載される配列に９５％相同するＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号５に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号２に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号３に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号４に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号５に記載されるＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号２、３、４に記載されるＰＥＳＴ様配列、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態において、ＡｃｔＡフラグメントは、配列番号２、３、４、５に記載されるＰＥＳＴ様配列、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号２）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号３）、ＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫ（配列番号３８）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号４）、ＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号３９）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号５）、ＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号４０）である。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、連鎖球菌（Streptococcus）種のストレプトリジンＯタンパク質からのものである。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）ストレプトリジンＯからのもの（例えば、ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号６））であり、これは、一実施形態において、ストレプトリジンＯのＡＡ３５〜５１である。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・エキシミリス（Streptococcus equisimilis）ストレプトリジンＯからのもの（例えば、ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号７））であり、これは、一実施形態において、ストレプトリジンＯのＡＡ３８〜５４である。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物に由来する別のＰＥＳＴ様ＡＡ配列である。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野で既知の任意の他のＰＥＳＴ様配列である。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２６５】
他の原核生物のＰＥＳＴ様配列は、例えば、ＬＭに関してRechsteiner and Rogers（1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271）によって説明されるもの等の方法に従って、同定することができる。代わりに、他の原核生物からのＰＥＳＴ様ＡＡ配列もまた、この方法に基づき、同定することができる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列が予想される他の原核生物には、他のリステリア種が含まれるが、これに限定されない。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、抗原タンパク質内に埋め込まれる。したがって、別の実施形態において、「融合」とは、抗原の一端で連結されるか、抗原内に埋め込まれる、抗原およびＰＥＳＴ様アミノ酸配列の両方を含む、抗原タンパク質を指す。
【０２６６】
別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、例えば、CaSPredictor（Garay-Malpartida HM, Occhiucci JM, Alves J, Belizario JE. Bioinformatics. 2005 Jun;21 Suppl 1:i169-76）等の、当該技術分野で既知の任意の他の方法またはアルゴリズムを使用して同定される。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、PESTfind Programを使用して同定され、これは、一実施形態において、http://bio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/EMBOSS/emboss.pl?_action=manual&_app=pestfindで公的に利用可能であり、一実施形態において、Austrian National EMBnet nodeからの、Michael K. Schuster and Martin Grabnerによって書かれたアプリケーションである。一実施形態において、Scott Rogers and Martin Rechsteiner（Ｃ）１９８６によって書かれた元のPESTfind Programを使用することができる。
【０２６７】
ＰＥＳＴインデックスは、１の値を、アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、それぞれの３０〜３５のＡＡストレッチに対して算出される。ＰＥＳＴ残基のそれぞれに対する係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）のそれぞれに対しては０である。
【０２６８】
別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、３のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、４のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、５のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、６のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、７のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、８のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、９のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１０のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１１のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１２のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１３のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１４のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１５のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１６のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１７のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１８のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、１９のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２０のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２０のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２１のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２２のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２３のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２４のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２５のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２６のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２７のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２８のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、２９のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、３０のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、３１のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、３２のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、３３のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、３４のＣＶを有する。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、３５のＣＶを有する。
【０２６９】
一実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、本明細書に説明する、または当該技術分野で既知のアルゴリズムのうちの１つを使用して同定されるＰＥＳＴ配列である。別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、構造上、既知のＰＥＳＴ配列に類似した配列であり、別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、既知のＰＥＳＴ配列と類似の機能を有するか、または、別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、既知のＰＥＳＴ配列に構造上および機能上の両方で類似している。一実施形態において、既知のＰＥＳＴ配列と類似の構造は、閾値スコアよりも高いスコアとなり、これは、一実施形態において、本明細書の上に説明されるアルゴリズムのうちの１つ（一実施形態において、PESTfind）を使用すると５である。一実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴモチーフを含む配列である。ＰＥＳＴ様配列を同定するためのそれぞれの方法が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２７０】
別の実施形態において、本発明のＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはそのフラグメントは、本明細書に記載される配列に正確に記載されるものである必要はなく、本明細書の他の箇所に記載される抗原に融合されるＬＬＯまたはＡｃｔＡタンパク質の機能的特性を保持する、他の改変、修飾、変更を行うことができる。別の実施形態において、本発明は、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはそのフラグメントの類似体を用いる。類似体は、別の実施形態において、保存ＡＡ配列の相違、または配列に影響を及ぼさない修飾、またはこの両方の点が、自然発生タンパク質またはペプチドとは異なる。例えば、保存アノ酸の変更を行うことができ、これは、タンパク質またはペプチドの一次配列を変更するが、通常はその機能を変えることはない。一実施形態において、保存アミノ酸の置換には、以下の基内の置換が含まれる。（ａ）グリシン、アラニン、（ｂ）バリン、イソロイシン、ロイシン、（ｃ）アスパラギン酸、グルタミン酸、（ｄ）アスパラギン、グルタミン、（ｅ）セリン、トレオニン、（ｆ）リシン、アルギニン、（ｇ）フェニルアラニン、チロシン。一実施形態において、保存ＡＡ置換は、極性ＡＡを他の極性ＡＡで、非極性ＡＡを他の非極性ＡＡで、荷電ＡＡを他の荷電ＡＡで、非荷電ＡＡを他の非荷電ＡＡで、疎水性ＡＡを他の疎水性ＡＡで、塩基性ＡＡを他の塩基性ＡＡで、酸性ＡＡを他の酸性ＡＡで、または当該技術分野で公知のこれらの組み合わせで置換することを含む。
【０２７１】
一実施形態において、修飾（通常、一次配列を改変しない）には、ポリペプチドの生体内、または生体外化学誘導体化、例えば、アセチル化またはカルボキシル化が含まれる。また、グリコシル化の修正、例えば、その合成およびプロセス、またはさらなるプロセスステップ中、例えば、グリコシル化に影響を及ぼす、ポリペプチドの酵素（例えば、哺乳類のグリコシル化もしくは脱グリコシル化酵素）への曝露によって、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修正することによって成されるものも含む。また、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホトレオニンといったリン酸化アミノ酸残基を有する配列も含まれる。
【０２７２】
また、タンパク質分解へのそれらの耐性を改善するため、または溶解特性を最適化するため、または治療薬としてよりそれらをより好適にするために、通常の分子生物学的技術を使用して修正されたポリペプチドも含む。かかるポリペプチドの類似体としては、自然発生Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えば、Ｄ−アミノ酸、または非自然発生合成アミノ酸を含むものが挙げられる。本発明のペプチドは、本明細書に記載される具体的な例示的なプロセスのうちのいずれの生成物にも限定されない。
【０２７３】
一実施形態において、本発明のワクチンは、アジュバントを含み、別の実施形態において、該ワクチンは、アジュバントを含まない。「アジュバント」とは、別の実施形態において、個体に投与する際、または生体外で試験する際、抗原が投与される個体または試験系において、抗原への免疫応答を増加させる、化合物を指す。別の実施形態において、免疫アジュバントは、単独で投与した際、弱い免疫原性である（すなわち、抗体力価または細胞媒介性免疫応答を誘導しない、または弱い抗体力価または細胞媒介性免疫応答を誘導する）、抗原への免疫応答を増強する。別の実施形態において、アジュバントは、抗原への抗体力価を増加させる。別の実施形態において、アジュバントは、個体における免疫応答を達成するのに効果的な抗原の用量を低下させる。
【０２７４】
本発明の方法および組成物で用いるアジュバントは、別の実施形態において、ＣｐＧ含有ヌクレオチド配列である。別の実施形態において、アジュバントは、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、アジュバントは、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。別の実施形態において、アジュバントはＯＤＮ  １８２６であり、これは、一実施形態において、Coley Pharmaceutical Groupより入手される。別の実施形態において、アジュバントは、アルミニウム塩アジュバントである。別の実施形態において、アジュバントは、モンタニドＩＳＡアジュバントである。別の実施形態において、アジュバントは、補体成分Ｃ３ｄの三量体である。別の実施形態において、三量体は、タンパク質免疫原に共有結合する。別の実施形態において、アジュバントはＭＦ５９である。別の実施形態において、アジュバントは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質である。別の実施形態において、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦをコード化するヌクレオチド分子である。別の実施形態において、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦをコード化するヌクレオチド分子を含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、サポニンＱＳ２１である。別の実施形態において、アジュバントは、サポニンＱＳ２１を含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）である。別の実施形態において、アジュバントは、ＭＰＬを含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、ＳＢＡＳ２である。別の実施形態において、アジュバントは、ＳＢＡＳ２を含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、アジュバントは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインである。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインを含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインをコード化するヌクレオチド分子である。別の実施形態において、アジュバントは、免疫刺激サイトカインをコード化するヌクレオチド分子を含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、キルグリコシドを含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、細菌マイトジェンを含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、細菌毒素を含む混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、当該技術分野で既知の任意の他のアジュバントの混合物である。別の実施形態において、アジュバントは、上記のアジュバントのうちの１つまたは複数の混合物である。
【０２７５】
「ＣｐＧ含有ヌクレオチド」、「ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」、「ＣｐＧオリゴヌクレオチド」、および類似の用語は、別の実施形態において、非メチル化ＣｐＧ部分を含有する、８〜５０のヌクレオチド長のヌクレオチド分子を指す。
【０２７６】
別の実施形態において、「核酸」または「ヌクレオチド」とは、一連の少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせを指す。該用語には、別の実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。「ヌクレオチド」とは、一実施形態において、核酸ポリマーのモノマー単位を指す。ＲＮＡは、一実施形態において、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、阻害性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）およびリボザイムの形態である。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用は、説明されている（Caudy AA et al., Genes & Devel 16: 2491-96、およびその中の参考文献）。ＤＮＡは、他の実施形態において、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、線状ＤＮＡ、または染色体ＤＮＡもしくはこれらの群の誘導体の形態であることが可能である。さらに、これらの形態のＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であることが可能である。該用語はまた、別の実施形態において、他の種類の骨格を含有するが、同一の塩基を含有する人工核酸も含む。一実施形態において、人工核酸は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド骨格およびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施形態において、ヌクレオチドは、修飾されたオキセタンである。別の実施形態において、ヌクレオチドは、１つまたは複数のリン酸ジエステル結合の、ホスホロチオエート結合による置き換えによって修飾される。別の実施形態において、人工核酸は、当該技術分野で既知の、天然核酸のリン酸骨格の任意の他の変異体を含有する。ホスホロチオエート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、例えば、Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57、およびRaz NK et al. Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84に説明される。核酸の生成および使用は、当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds.、およびMethods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cell (2003) Purchio and G. C. Fareedに説明される。それぞれの核酸誘導体が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２７７】
それぞれの種類の修飾オリゴヌクレオチドが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２７８】
修飾した骨格を有する核酸の生成のための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、特許文献３及び特許文献４（Hutchersonら）ならびに関連する特許文献５に説明される。それぞれの方法が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２７９】
別の実施形態において、総Ｅ７タンパク質またはそのフラグメントのいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ様配列含有ペプチドに融合され、本発明の方法の組み換えペプチドを生成する。用いられるＥ７タンパク質（全体またはフラグメント源としてのいずれか）は、別の実施形態において、以下の配列を有する。
【０２８０】
ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号３０）。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３０のホモログである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３０の変異体である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３０のアイソフォームである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３０のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３０のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３０の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３０のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２８１】
別の実施形態において、Ｅ７タンパク質の配列は、以下のとおりである。
【０２８２】
ＭＨＧＰＫＡＴＬＱＤＩＶＬＨＬＥＰＱＮＥＩＰＶＤＬＬＣＨＥＱＬＳＤＳＥＥＥＮＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＨＴＭＬＣＭＣＣＫＣＥＡＲＩＥＬＶＶＥＳＳＡＤＤＬＲＡＦＱＱＬＦＬＮＴＬＳＦＶＣＰＷＣＡＳＱＱ（配列番号３１）。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３１のホモログである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３１の変異体である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３１のアイソフォームである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３１のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３１のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３１の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、配列番号３１のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２８３】
別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載される核酸配列によってコード化される。Ｍ２４２１５、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、Ｍ１４１１９、または当該技術分野で既知の他の配列。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７７５３０６．１、ＣＡＡ２４３１６．１、ＣＡＡ４４６４８．１、ＡＡＡ４６９２８．１、ＣＡＡ７５４７１、ＣＡＡ６３８７４、ＣＡＡ６３８８３．１、ＮＰ＿９３２３２０．１、ＮＰ＿０４３４１７．１、ＡＡＲ１３０１５．１、または当該技術分野で既知の他の配列に記載される、配列を有する。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のホモログである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のアイソフォームである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２８４】
別の実施形態において、総Ｅ６タンパク質またはそのフラグメントのいずれかは、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴ様配列含有ペプチドに融合され、本発明の方法の組み換えペプチドを生成する。用いられるＥ６タンパク質（全体またはフラグメント源としてのいずれか）は、別の実施形態において、以下の配列を有する。
【０２８５】
ＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＣＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬ（配列番号３２）。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３２のホモログである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３２の変異体である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３２のアイソフォームである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３２のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３２のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３２の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３２のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２８６】
別の実施形態において、Ｅ６タンパク質の配列は以下のとおりである。
【０２８７】
ＭＡＲＦＥＤＰＴＲＲＰＹＫＬＰＤＬＣＴＥＬＮＴＳＬＱＤＩＥＩＴＣＶＹＣＫＴＶＬＥＬＴＥＶＦＥＦＡＦＫＤＬＦＶＶＹＲＤＳＩＰＨＡＡＣＨＫＣＩＤＦＹＳＲＩＲＥＬＲＨＹＳＤＳＶＹＧＤＴＬＥＫＬＴＮＴＧＬＹＮＬＬＩＲＣＬＲＣＱＫＰＬＮＰＡＥＫＬＲＨＬＮＥＫＲＲＦＨＮＩＡＧＨＹＲＧＱＣＨＳＣＣＮＲＡＲＱＥＲＬＱＲＲＲＥＴＱＶ（配列番号３３）。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３３のホモログである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３３の変異体である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３３のアイソフォームである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３３のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３３のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３３の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、配列番号３３のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２８８】
別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つに記載される核酸配列によってコード化される。ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、Ｍ１４１１９、または当該技術分野で既知の他の配列。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７７５３０５．１、ＣＡＡ２４３１４．１、ＣＡＡ４４６４７．１、ＡＡＡ４６９２７．１、ＡＢＩ３２３６４．１、ＡＡＹ６９３７８．１、ＡＡＹ６９３７３．１、ＡＡＹ６９３６６．１、ＣＡＡ６３８８１．１、ＣＡＡ７５４７０．１、ＮＰ＿９３２３１９．１、ＡＡＰ１９６３２．１、または当該技術分野で既知の他の配列に記載される配列を有する。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のホモログである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のアイソフォームである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のホモログのフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列の変異体のフラグメントである。別の実施形態において、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリのうちの１つからの配列のアイソフォームのフラグメントである。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２８９】
一実施形態において、「変異体」とは、集団の大部分とは異なるが、依然としてそれらのうちの１つとみなされる共通機作に十分類似している、アミノ酸もしくは核酸配列（または他の実施形態において、生命体もしくは組織）を指す（例えば、スプライス変異体）。
【０２９０】
一実施形態において、「アイソフォーム」とは、分子の型、例えば、別のアイソフォーム、または同一タンパク質の型と比較して、わずかな相違のみを有する、タンパク質を指す。一実施形態において、アイソフォームは、異なるが、関連する遺伝子から生成され得、別の実施形態において、代替のスプライシングによって同一の遺伝子から生じ得る。別の実施形態において、アイソフォームは、単一のヌクレオチド多型によって生じる。
【０２９１】
一実施形態において、「フラグメント」とは、全長のタンパク質もしくはポリペプチドよりも短いか、または少ないアミノ酸を含む、タンパク質もしくはポリペプチドを指す。別の実施形態において、フラグメントとは、全長の核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを含む核酸を指す。別の実施形態において、フラグメントは、Ｎ末端フラグメントである。別の実施形態において、フラグメントは、Ｃ末端フラグメントである。一実施形態において、フラグメントは、タンパク質、ペプチド、または核酸の配列内の一部である。一実施形態において、フラグメントは、機能的フラグメントである。別の実施形態において、フラグメントは、免疫原性フラグメントである。一実施形態において、フラグメントは、１０〜２０の核酸もしくはアミノ酸を有し、別の実施形態において、フラグメントは、５を上回る核酸もしくはアミノ酸を有し、別の実施形態において、フラグメントは、１００〜２００の核酸もしくはアミノ酸を有し、別の実施形態において、フラグメントは、１００〜５００の核酸もしくはアミノ酸を有し、別の実施形態において、フラグメントは、５０〜２００の核酸もしくはアミノ酸を有し、別の実施形態において、フラグメントは、１０〜２５０の核酸もしくはアミノ酸を有する。
【０２９２】
一実施形態において、「免疫原性」または「免疫原性の」は、本明細書において、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体が動物に投与される際、動物における免疫応答を惹起する、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の先天的能力を指すように使用される。したがって、「免疫原性を増強する」とは、一実施形態において、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体が動物に投与される際、動物における免疫応答を惹起する、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の能力を増加することを指す。免疫応答を惹起するタンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体の能力の増加は、一実施形態において、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対するより多くの抗体、抗原または生命体に対するより多様な抗体、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に特異的なより多くのＴ細胞、タンパク質、ペプチド、核酸、抗原または生命体に対するより大きな細胞毒性もしくはヘルパーＴ細胞応答等によって、測定することができる。一実施形態において、「治療する」とは、治療療法または予防もしくは防止対策のいずれかを指し、その目的は、本明細書の上に説明する標的病状もしくは疾病を予防または軽減することである。したがって、一実施形態において、治療には、疾患、疾病もしくは状態、またはこれらの組み合わせに関連する症状の重篤性に作用する、治癒する、抑制する、阻害する、予防する、低減する、疾患、疾病もしくは状態、またはこれらの組み合わせに関連する症状の発症を遅延させる、疾患、疾病もしくは状態、またはこれらの組み合わせに関連する症状を低減することが含まれ得る。したがって、一実施形態において、「治療する」とは、とりわけ、進行を遅延させること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増大すること、回復を早めること、代替療法の有効性を増加させること、代替療法に対する耐性を減少させること、またはこれらの組み合わせを指す。一実施形態において、「予防する」とは、とりわけ、症状の発症を遅延させること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの数もしくは頻度を減少させること、症状エピソード間の潜伏期を増加させること、またはこれらの組み合わせを指す。一実施形態において、「抑制する」または「阻害する」とは、とりわけ、症状の重篤性を低減すること、急性エピソードの重篤性を低減すること、症状の数を低減すること、疾患関連の症状の発生を低減すること、症状の潜伏期を低減すること、症状を寛解すること、二次症状を低減すること、二次感染を低減すること、患者の生存を延長すること、またはこれらの組み合わせを指す。
【０２９３】
一実施形態において、「ホモログ」とは、特定の核酸もしくはアミノ酸配列と、ある割合の配列同一性を共有する、核酸もしくはアミノ酸配列を指す。一実施形態において、本発明の組成物および方法に有用な配列は、本明細書に説明する、または当該技術分野で既知の、特定のＬＬＯ配列もしくはそのＮ末端フラグメント、ＡｃｔＡ配列もしくはそのＮ末端フラグメント、Ｅ７配列、Ｅ６配列、またはＰＥＳＴ様配列のホモログであり得る。別の実施形態において、本発明の組成物および方法に有用な配列は、本明細書に説明する、いかなる配列のホモログであり得る。一実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも７０％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも７２％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも７５％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも７８％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも８０％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも８２％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも８３％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも８５％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも８７％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも８８％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９０％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９２％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９３％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９６％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９７％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９８％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、少なくとも９９％の同一性を共有する。別の実施形態において、ホモログは、特定の配列と、１００％の同一性を共有する。それぞれの可能性が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２９４】
一実施形態において、本発明の配列および／または本明細書に説明する配列のうちのいかなるホモログも、本発明の一部であるとみなされることを理解されたい。
【０２９５】
一実施形態において、本発明の意味における「機能的」は、本明細書において、生物学的活性または機能を呈する、タンパク質、ペプチド、核酸、そのフラグメントもしくは変異体の先天的能力を指すように使用される。一実施形態において、かかる生物学的機能は、例えば、膜結合受容体といった相互作用パートナーへのその結合特性、および別の実施形態において、その三量体化特性である。本発明の機能的フラグメントおよび機能的変異体の場合、これらの生物学的機能は、実際、例えば、それらの特異性もしくは選択性に関して、変更され得るが、基本的な生物学的機能を保持している。
【０２９６】
本明細書に記載されるいかなるＡＡ配列に対するタンパク質および／またはペプチド相同性も、一実施形態において、イムノブロット解析を含む、当該技術分野で十分に説明される方法、または利用可能な多くのソフトウェアパッケージのいずれかを使用し、確立された方法を介した、ＡＡ配列のコンピュータアルゴリズム解析によって決定される。これらのパッケージの一部としては、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈまたはＳｃａｎｐｓパッケージが挙げられ、例えば、他の実施形態において、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムの使用、ならびに／または解析のためのグローバル／ローカルもしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントを用いる。それぞれの相同性を決定する方法が、本発明の個別の実施形態を表す。
【０２９７】
別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、またはそのフラグメントは、化学共役によって、Ｅ７もしくはＥ６抗原に結合する。別の実施形態において、グルタルアルデヒドが共役のために使用される。別の実施形態において、共役は、当該技術分野で既知のいかなる好適な方法をも使用して行われる。それぞれの可能性が、本発明の別の実施形態を表す。
【０２９８】
別の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、例えば、適切な配列のクローン化および制限、または以下に説明する方法による直接的な化学合成を含む、いかなる好適な方法によっても調製される。別の実施形態において、部分配列はクローン化され、適切な部分配列が、適切な制限酵素を使用して開烈される。次いで、別の実施形態において、フラグメントを結紮し、所望のＤＮＡ配列を生成する。別の実施形態において、融合タンパク質をコード化するＤＮＡは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）といったＤＮＡ増幅方法を使用して生成される。まず、新しい末端のどちら側の天然ＤＮＡのセグメントも別々に増幅する。１つの増幅された配列の５´末端は、ペプチドリンカーをコード化し、他方の増幅された配列の３´末端もまた、ペプチドリンカーをコード化する。第１のフラグメントの５´末端が、第２のフラグメントの３´末端に相補的であるため、２つのフラグメント（例えば、ＬＭＰアガロースでの部分的精製後）は、第３のＰＣＲ反応において、重なりのあるテンプレートとして使用することができる。増幅された配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側のセグメント（ここでアミノ配列を形成）、リンカー、および開放部位のアミノ側の配列（ここでカルボキシル配列を形成）を含有する。次いで、挿入物をプラスミドに結紮する。
【０２９９】
一部の実施形態において、「含む（comprising）」という用語は、他の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列の包含、ならびに当該技術分野で既知であり得る他のポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列の包含を指し、これは、一実施形態において、抗原またはリステリアポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列を含み得る。一部の実施形態において、「本質的に〜から構成される」という用語は、本発明の方法で使用するための組成物を指し、これは、具体的な組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列、またはそのフラグメントを有する。しかしながら、組み換えポリペプチドの利用に直接関与しない、他のポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列が含まれ得る。一部の実施形態において、「〜から構成される」という用語は、本明細書に説明するいかなる形態または実施形態での、特定の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列、またはフラグメント、あるいは本発明の組み換えポリペプチド、アミノ酸配列、もしくは核酸配列、またはフラグメントの組み合わせを有する、本発明の方法で使用するための組成物を指す。
【０３００】
別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、Ｅ７、Ｅ６、もしくは他の抗原、またはそのフラグメントは、当業者に既知の手段によって共役される。別の実施形態において、Ｅ７、Ｅ６、またはそのフラグメントは、直接、またはリンカー（スペーサ）を介して、ＡｃｔＡタンパク質またはＬＬＯタンパク質に共役される。別の実施形態において、キメラ分子は、一本鎖の融合タンパク質として組換えで発現する。
【０３０１】
別の実施形態において、本発明の融合ペプチドは、標準的な化学ペプチド合成技術を使用して合成される。別の実施形態において、キメラ分子は、単一の連続ポリペプチドとして合成される。別の実施形態において、ＬＬＯタンパク質、ＡｃｔＡタンパク質、Ｅ７、Ｅ６、もしくは他の抗原、またはそのフラグメントは、別々に合成され、次いで、ある分子のアミノ末端を、他の分子のカルボキシル末端と縮合することによって融合し、これによって、ペプチド結合を形成する。別の実施形態において、ＡｃｔＡタンパク質またはＬＬＯタンパク質および抗原はそれぞれ、ペプチドスペーサ分子の一端と縮合され、これによって、連続した融合タンパク質を形成する。
【０３０２】
別の実施形態において、本発明のペプチドおよびタンパク質は、StewartらがSolid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, III.で説明する、またはBodanszkyおよびBodanszky（The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York）が説明する、固体相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって調製される。別の実施形態において、好適に保護されたＡＡ残基は、そのカルボキシル基を介して、架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂等の誘導体化された、不溶性ポリマー支持剤に結合する。「好適に保護された」とは、アミノ酸の両方のアルファアミノ基、およびいかなる側鎖官能基上の保護基の存在をも指す。側鎖保護基は、合成中に使用される溶媒、試薬および反応条件に対して概して安定しており、最終ペプチド生成物に影響を及ぼさない条件の下で除去可能である。オリゴペプチドの段階的な合成は、初期ＡＡからＮ保護基を除去し、所望のペプチドの配列における次のＡＡのカルボキシル末端をそこへ連結することによって行われる。このＡＡもまた、好適に保護される。次にくるＡＡのカルボキシルは、活性化され、カルボジイミド、対照的な酸無水物、またはヒドロキシベンゾトリアゾールまたはペンタフルオロフェニルエステル等の「活性エステル」基への形成等の、反応基への形成によって、支持結合されたＡＡのＮ末端と反応する。
【０３０３】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法を簡便に実践するためのキットを提供し、本発明の１つまたは複数のワクチン、アプリケータ、および本発明の方法を実践する上で、どのようにキット構成物を使用するかを説明した説明書を含む。
【０３０４】
本発明のいかなる方法でも使用されるいかなる組成物も、本発明で説明する疾患および状態を治療する、予防する、阻害する、抑制する、または本発明で説明する疾患および状態に関連する症状を寛解するための組成物の調製に使用され得ることを理解されたい。
【０３０５】
模範方法を以下に説明するが、本開示を踏まえて、当業者には他の有用な方法が明らかとなろう。これらの方法のそれぞれが、本発明の個別の実施形態を表す。
【０３０６】
実験の詳細
【０３０７】
実施例１：ＬＬＯ−抗原の融合は抗腫瘍免疫を誘導する
【０３０８】
材料および実験方法（実施例１〜２）
【０３０９】
細胞株
【０３１０】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス同系ＴＣ１腫瘍細胞をＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した。Ｔ．Ｃ．Ｗｕ氏（Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD）より提供されたＴＣ１は、ＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７で低レベルを発現し、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ癌遺伝子で形質転換した、腫瘍原性の高い肺上皮細胞である。ＴＣ１を、ＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）の２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍｌのＧ４１８、および１０％のNational Collection Type Culture−109培地で、３７℃、１０％ＣＯ２下で増殖させた。Ｃ３は、ＨＰＶ１６の完全ゲノムで不死化し、ｐＥＪ−ｒａｓで形質転換した、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス胚細胞である。ＥＬ−４／Ｅ７は、レトロウイルスにＥ７を用いて形質導入した胸腺腫ＥＬ−４である。
【０３１１】
リステリア・モノサイトゲネス株および増殖
【０３１２】
使用したリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系中のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子、図１Ａ）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムに組み込まれた単一コピーのＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」、エピソーム発現系中のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８」、染色体に組み込まれた単一コピーのＨＩＶ−１  Ｇａｇ遺伝子カセット）であった。プライマー５´−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３´（配列番号８、下線部はＸｈｏＩ部位）および５´−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（配列番号９、下線部はＳｐｅＩ部位）を用いてＰＣＲでＥ７を増幅し、ｐＣＲ２．１（Invitrogen, San Diego, CA）にライゲートした。ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩの消化によりＥ７をｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＧＧ−５５にライゲートした。ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性転写因子ｐｒｆＡを、マルチコピーシャトルプラスミドｐＡＭ４０１（Wirth R et al, J Bacteriol, 165: 831, 1986）にクローン化し、ｐＧＧ−５５を産生した。ｈｌｙプロモータは、ＸｈｏＩ部位を介してＥ７遺伝子に連結された、ｈｌｙ遺伝子産物の第１の４４１ＡＡ（溶血性Ｃ末端が欠失しており、以下、「ΔＬＬＯ」と称され、配列番号２５に記載される配列を有する）の発現を駆動し、ＬＬＯ−Ｅ７として転写および分泌されるｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生じる。ｐＧＧ−５５を用いたリステリア菌のｐｒｆＡ陰性株ＸＦＬ−７（University of Pennsylvania、Hao Shen博士より提供）の形質転換が、生体内でプラスミドを保持するために選択された（図１Ａ〜Ｂ）。プライマー５´−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（配列番号１０、下線部はＮｈｅＩ部位）および５´−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３´（配列番号１１、下線部はＸｈｏＩ）を用いて、ｈｌｙプロモータおよび遺伝子断片を産生した。プライマー５´−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（配列番号１２、下線部はＸｂａＩ部位）および５´−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（配列番号１３、下線部はＳａｌＩ部位）を用いて、ｐｒｆＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモータと、ＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインでのＥ７の発現および分泌を駆動するシグナル配列とを含む発現カセットを導入することにより、Ｌｍ−Ｅ７を産生した。プライマー５´−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３´（配列番号２８、下線部はＢａｍＨＩ部位）および５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３´（配列番号２９、下線部はＸｂａＩ部位）を用いて、ＰＣＲでＥ７を増幅した。次いで、Ｅ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターにライゲートした。得られたプラスミドｐＺＹ−２１−Ｅ７（ＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに対応する１．６−ｋｂ配列の中央に挿入された発現カセットを含む）で、ＬＭ菌株１０４０３Ｓを形質転換した。相同性ドメインでは、相同的組換えによるＥ７遺伝子カセットのｏｒｆＺドメインへの挿入が可能である。Ｅ７遺伝子カセット���ｏｒｆＺドメインに組み込みについて、クローンをスクリーニングした。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍｌ）を含む（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）または含まない（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）ブレインハートインフュージョン培地で細菌を増殖させた。細菌は等量に分割して−８０℃で冷凍した。ウエスタンブロットにより発現を確認した（図２）。
【０３１３】
ウエスタンブロット
【０３１４】
リステリア株をLuria−Bertani培地で３７℃で増殖させて採取し、６００ｎｍの光学濃度で測定した。上清をＴＣＡ沈殿させて、０．１Ｎ  ＮａＯＨを添加した１×試料緩衝液に再懸濁した。同量の各細胞ペレットまたはＴＣＡ沈殿させた各上清を４％〜２０％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（NOVEX, San Diego, CA）に負荷した。ゲルをフッ化ポリビニリデンに移し、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Zymed Laboratories, South San Francisco, CA）でプローブし、次いで、ＨＲＰ結合抗マウス二次抗体（Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, U.K.）でインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製のＥＣＬ検出試薬を用いて展開して、Hyperfilm（Amersham Pharmacia Biotech）に露光した。
【０３１５】
腫瘍の増殖の測定
【０３１６】
表面の長径および短径を測るノギスを用いて１日おきに腫瘍を測定した。これら２つの測定値の平均を、様々な時点における腫瘍の平均直径としてミリメートルで示した。腫瘍の直径が２０ｍｍに到達した時点でマウスを屠殺した。各時点における腫瘍の測定値は、生存するマウスについてのみ示したものである。
【０３１７】
リステリア菌の組換えが確立した腫瘍の増殖に与える影響
【０３１８】
２×１０５のＴＣ１細胞を、６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Charles River）の左側腹部皮下に接種した。腫瘍接種から１週間後、腫瘍は触知可能な直径４〜５ｍｍの大きさに達した。７日目および１４日目に、８匹から成るマウスの群を、腹腔内ＬＤ５０＝０．１のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）を用いて処置した。
【０３１９】
５１Ｃｒ放出アッセイ
【０３２０】
ＬＤ５０＝０．１のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）の腹腔内に免疫した。免疫化から１０日後に脾臓を採取した。照射したＴＣ１細胞をフィーダー細胞として用いて培養液中に脾細胞を確立し（脾細胞：ＴＣ１、１００：１）、体外で５日間刺激してから、以下の標的を用いて標準的な５１Ｃｒ放出アッセイに使用した：ＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥ７Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）でパルスしたＥＬ−４。３通り行われたＥ：Ｔ細胞比は、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間インキュベートした後、細胞をペレット化して、各ウェルから５０μｌの上清を除去した。Ｗａｌｌａｃ社（Gaithersburg, MD）のシンチレーションカウンター１４５０を用いて試料のアッセイを行った。特異的溶解率（％）は［（実験で得られた１分当たりの計測値（ｃｐｍ）−自然発生的ｃｐｍ）／（合計ｃｐｍ−自然発生的ｃｐｍ）］×１００として決定した。
【０３２１】
ＴＣ１特異的増殖
【０３２２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＬＤ５０＝０．１で免疫し、２０日後にＬＤ５０＝１のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇを腹腔内注射することにより追加免疫した。追加免疫から６日後、免疫したマウスおよび未処理のマウスから脾臓を採取した。２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、または３×１０３の照射ＴＣ１細胞／ウェルをＥ７  Ａｇ源として、またはＴＣ１細胞を用いずに、または１０μｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａを用いて、平底９６ウェルプレートの培養液中に脾細胞を５×１０５／ウェルで確立した。４５時間後、０．５μＣｉ［３Ｈ］チミジン／ウェルで細胞をパルスした。１８時間後、Ｔｏｍｔｅｃ社（Orange, CT）のHarvester96を用いてプレートを回収し、Ｗａｌｌａｃ社のシンチレーションカウンター１４５０を用いて増殖を評価した。１分当たりの計測値（ｃｐｍ）における変化は、実験で得られた計測値（ｃｐｍ）−抗原を含まない値（ｃｐｍ）として算出した。
【０３２３】
フローサイトメトリー法による分析
【０３２４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＬＤ５０＝０．１のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７を用いて静脈内（ＩＶ）に免疫し、３０日後に追加免疫した。セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標））ソフトウェア（Becton Dickinson, Mountain View, CA）とともにファックスキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標））フローサイトメーターを用いて、ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ；ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７Ｈ−２Ｄｂ四量体の３色フローサイトメトリーを行った。追加免疫から５日後に、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）または対照（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドを負荷したＨ−２Ｄｂ四量体を用いて、採取した脾細胞を室温（ＲＴ）で染色した。四量体はLarry R.Pease博士（Mayo Clinic, Rochester, MN）ならびにNIAID Tetramer Core FacilityおよびNIH AIDS Research and Reference Reagent Programより提供されたものであり、希釈率１／２００で使用した。四量体＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を分析した。
【０３２５】
Ｂ１６Ｆ０−Ｏｖａを用いた実験
【０３２６】
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに５×１０５のＢ１６Ｆ０−Ｏｖａ細胞を接種した。３、１０および１７日目に、８匹のマウスから成る群をＬＤ５０＝０．１のＬｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）およびＬｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）で免疫し、８匹は未処理のままにした。
【０３２７】
統計
【０３２８】
腫瘍の直径を比較するために、各群の腫瘍の大きさの平均値および標準偏差（Ｓ．Ｄ．）を決定して、スチューデントｔ検定を用いて統計学的有意性を決定した。ｐ≦０．０５を有意であると見なした。
【０３２９】
結果
【０３３０】
Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７をＴＣ１の増殖に影響を与える能力について比較した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部に皮下腫瘍を確立した。７日後、腫瘍は触知可能な大きさ（４〜５ｍｍ）に達した。７日目および１４日目に、ＬＤ５０＝０．１のＬｍ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、または対照としてＬｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰを用いて、マウスにワクチン接種した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、確立したＴＣ１腫瘍のうちの７５％の完全退縮を誘導し、同群の残りの２匹のマウスにおいて腫瘍の増殖が抑制された（図３）。それに対して、Ｌｍ−Ｅ７およびＬｍ−Ｇａｇを用いた免疫化は、腫瘍の退縮を誘導しなかった。この実験を複数回繰り返したところ、常に同様の結果であった。また、異なる免疫化プロトコル下においても、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で同様の結果を達成した。別の実験においても、単回免疫により、マウスに確立した５ｍｍのＴＣ１腫瘍を治癒することが可能であった。
【０３３１】
他の実験において、Ｅ７を発現する別の２つの腫瘍細胞株であるＣ３およびＥＬ−４／Ｅ７で、同様の結果が得られた。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたワクチン接種の有効性を確認するために、腫瘍を除去した動物を、それぞれ６０日目または４０日目に、ＴＣ１またはＥＬ−４／Ｅ７腫瘍細胞で再チャレンジした。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫した動物は、実験終了時まで腫瘍を発生しなかった（ＴＣ１の場合は１２４日目、ＥＬ−４／Ｅ７の場合は５４日目）。
【０３３２】
したがって、ΔＬＬＯとの融合タンパク質としての抗原の発現は、抗原の免疫原性を増強する。
【０３３３】
実施例２：ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７処理はＴＣ１特異的脾細胞の増殖を惹起する
【０３３４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いたＬｍ−Ｅ７によるＴ細胞の誘導を測定するために、免疫したマウスにおいて、抗原特異的免疫能の尺度であるＴＣ１特異的増殖応答を測定した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で免疫したマウス由来の脾細胞を、Ｅ７源としての照射ＴＣ１細胞に曝露すると、増殖が見られた（ＴＣ１の比率は２０：１、４０：１、８０：１、および１６０：１（図４））。反対に、Ｌｍ−Ｅ７およびｒＬｍ対照で免疫したマウス由来の脾細胞は、バックグラウンドレベルの増殖を示したのみであった。
【０３３５】
実施例３：ＡｃｔＡ−Ｅ７融合およびＰＥＳＴ−Ｅ７融合は抗腫瘍免疫を付与する
【０３３６】
材料および実験方法
【０３３７】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７の構築
【０３３８】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７はＬＭの組み換え株であり、切断されたａｃｔＡタンパク質に融合されたＥ７タンパク質を発現するプラスミドを含む。Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７は、ｐＤＰ−２０２８を修飾することで構築されるプラスミドベクターｐＤＤ−１を、リステリア菌内に導入することにより産生される。ｐＤＤ−１は、ＡｃｔＡ−Ｅ７の発現と分泌を駆動する３１０ｂｐのｈｌｙプロモータおよびｈｌｙシグナル配列（ｓｓ）のコピーを発現する発現カセット、４つのＰＥＳＴ配列（配列番号３７）を含むａｃｔＡ遺伝子の１１７０ｂｐ（分子の第１の３９０ＡＡから構成される切断されたＡｃｔＡポリペプチド、配列番号３６）、３００ｂｐのＨＰＶ  Ｅ７遺伝子、１０１９ｂｐのｐｒｆＡ遺伝子（病原性遺伝子の発現を抑制する）、および形質転換された細菌クローンを選択するためのＣＡＴ遺伝子（クロラムフェニコール抵抗性遺伝子）（Sewell et al. (2004), Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 130: 92−97）を含む。
【０３３９】
プライマー５´−ＧＧＧＧＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（下線部はＸｂａＩ部位、配列番号１４）およびプライマー５´−ＡＴＣＴＴＣＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＴＧＣＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＣＧＣ−´３（下線部はＮｏｔＩ部位、最初の１８ヌクレオチドはＡｃｔＡ遺伝子と重複、配列番号１５）を用いて、ｐＧＧ５５からｈｌｙプロモータ（ｐＨｌｙ）および遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。（実施例１）。プライマー５´−ＧＣＧＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＴ−３´（下線部はＮｏｔＩ部位、配列番号１６）およびプライマー５´−ＴＧＴＡＧＧＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＴＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＧＣＧＡＴＣＡＡＴＴＴＣ−３´（下線部はＸｈｏＩ部位、配列番号１７）を用いて、ＬＭ１０４０３の野生型ゲノムからａｃｔＡ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマー５´−ＧＧＡＡＴＴＧＡＴＣＧＣＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡ−３´（下線部はＸｈｏＩ部、配列番号１８）およびプライマー５´−ＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（下線部はＸｍａＩ部位、配列番号１９）を用いて、ｐＧＧ５５（ｐＬＬＯ−Ｅ７）からＥ７遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマー５´−ＴＧＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（下線部はＸｍａＩ部位、配列番号２０）およびプライマー５´−ＧＧＧＧＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（下線部はＳａｌＩ部位、配列番号２１）を用いて、ＬＭ１０４０３の野生型ゲノムからｐｒｆＡをＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモータ−ａｃｔＡ遺伝子の融合（ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ）をＰＣＲで産生し、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号１４）および下流ａｃｔＡプライマー（配列番号１７）を用いて、精製したｐＨｌｙ  ＤＮＡおよび精製したａｃｔＡ  ＤＮＡから増幅した。
【０３４０】
ｐｒｆＡ遺伝子に融合したＥ７遺伝子（Ｅ７−ｐｒｆＡ）をＰＣＲで産生し、上流Ｅ７プライマー（配列番号１８）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号２１）を用いて、精製したＥ７  ＤＮＡおよび精製したｐｒｆＡ  ＤＮＡから増幅した。
【０３４１】
Ｅ７−ｐｒｆＡの融合産物に融合されたｐＨｌｙ−ａｃｔＡの融合産物をＰＣＲで産生し、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号１４）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号２１）を用いて、精製した融合ｐＨｌｙ−ａｃｔＡ  ＤＮＡ産物および精製した融合Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡ産物から増幅し、ｐＣＲＩＩ（Invitrogen, La Jolla, Calif.）にライゲートした。コンピテントな大腸菌（TOP10´F、Invitrogen, La Jolla, Calif.）をｐＣＲＩＩ−ＡｃｔＡＥ７で形質転換した。溶解および単離後、ＢａｍＨＩ（予想される断片の大きさ７７０ｂｐおよび６４００ｂｐ（または、挿入がベクター内で反転される場合は２５００ｂｐおよび４１００ｂｐ））およびＢｓｔＸＩ（予想される断片の大きさ２８００ｂｐおよび３９００ｂｐ）を用いた制限分析によりプラスミドをスクリーニングし、また上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号１４）および下流ｐｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号２１）を用いたＰＣＲ分析によってもスクリーニングした。
【０３４２】
ＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いた二重消化によりｐＣＲＩＩからｐＨｌｙ−ａｃｔＡ−Ｅ７−ｐｒｆＡ  ＤＮＡインサートを切り出して、同じくＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化したｐＤＰ−２０２８にライゲートした。コンピテントな大腸菌ＴＯＰ１０´Ｆ（Invitrogen, La Jolla, Calif.）を、ｐＡｃｔＡＥ７発現系で形質転換した後、上流ｐＨｌｙプライマー（配列番号１４）および下流ＰｒｆＡ遺伝子プライマー（配列番号２１）を用いて、ＰＣＲ分析によりクロラムフェニコール抵抗性のクローンをスクリーニングした。ｐＡｃｔＡＥ７を含むクローンをブレインハートインフュージョン培地（クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ（マイクログラム）／ｍｌ（ミリリットル）を含む、Difco, Detroit, Mich.）に増殖させ、ＤＮＡ精製システムキットＭｉｄｐｒｅｐ（Promega, Madison, Wis.）を用いて、細菌細胞からｐＡｃｔＡＥ７を単離した。ペニシリン処理したリステリア菌のｐｒｆＡ陰性菌株（ＸＦＬ−７菌株）をIkonomidis et al.（1994, J. Exp. Med. 180: 2209−2218）が記載するようにｐＡｃｔＡＥ７発現系を用いて形質転換し、プラスミドを生体内で保持するためにクローンを選択した。クロラムフェニコール（２０ｍｃｇ／ｍｌ）を含むブレインハートインフュージョン培地で、クローンを３７oＣで増殖させた。細菌を等量に分割し、−８０℃で冷凍した。
【０３４３】
免疫ブロットによる抗原発現の検証
【０３４４】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７がＡｃｔＡ−Ｅ７（約６４ｋＤ），を分泌することを検証するために、リステリア株をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地において３７℃で増殖させた。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて培養液の上清からタンパク質を沈殿させ、０．１Ｎ水酸化ナトリウムを含む１×試料緩衝液に再懸濁させた。ＴＣＡ沈殿させたそれぞれの上清を同量で４％〜２０％トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル（NOVEX, San Diego, Calif.）に負荷した。ゲルをフッ化ポリビニリデン膜に移し、１：２５００抗Ｅ７モノクローナル抗体（Zymed Laboratories, South San Francisco, Calif.）でプローブし、次いで、１：５０００の西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, England）でプローブした。Ａｍｅｒｓｈａｍ社製の強化化学発光検出試薬を用いてブロットを展開し、オートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露光した（図５Ａ）。
【０３４５】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉの構築（図６Ａ）
【０３４６】
Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、プロモータおよびｈｌｙ遺伝子のＰＥＳＴ配列（具体的にはＬＬＯの第１の５０ＡＡ）のみを含むことを除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一である。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を構築するために、ＳＯＥ（重複伸長による遺伝子スプライシング）ＰＣＲ技術を用いて、ｈｌｙプロモータおよびＰＥＳＴ領域を全長Ｅ７遺伝子に融合した。ＬＬＯの第１の４４１ＡＡを含むプラスミドｐＧＧ−５５から、Ｅ７遺伝子およびｈｌｙ−ＰＥＳＴ遺伝子断片を増幅し、従来のＰＣＲ技術を用いてともにスプライスした。最終的なプラスミドを作製するために、ｈｌｙ−ＰＥＳＴ−Ｅ７断片ｐＶＳ１６．５とｐｒｆＡ遺伝子を、体外で選択するためのクロラムフェニコール抵抗性遺伝子を含むプラスミドｐＡＭ４０１にサブクローン化し、得られたプラスミドをＸＦＬ−７を形質転換するために用いた。
【０３４７】
Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７は、ＰＥＳＴ配列が欠失していることを除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と同一の組換えリステリア株である。ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子からＰＥＳＴを含有する領域（３３３〜３８７ｂｐ）を除去するために設計されたプライマーを用いてエピソーム発現系を構築したことを除いて、本質的にＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７について記載したように作製した。融合遺伝子Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、ＰＥＳＴ領域またはＬＬＯを持たないＥ７を分泌する組換え菌株である。この菌株を形質転換するために使用したプラスミドは、プロモータの遺伝子断片およびＥ７遺伝子に融合されたシグナル配列を含有する。このコンストラクトは、染色体に組み込まれたＥ７遺伝子の単一コピーを発現した元のＬｍ−Ｅ７とは異なる。Ｌｍ−Ｅ７ｅｐｉは、発現されたＥ７抗原の形態を除いて、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７に完全に同系である。
【０３４８】
結果
【０３４９】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７によって誘導された抗腫瘍免疫をＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と比較するために、２×１０５ＴＣ１腫瘍細胞をマウスの皮下に移植し、触知可能な大きさ（約５ミリメーター［ｍｍ］）になるまで増殖させた。７日目および１４日目に、ＬＤ５０＝１のＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（５×１０８ＣＦＵ）、（×）Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０８ＣＦＵ）（□）またはＬｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）（○）のいずれか１つを用いて、マウスの腹腔内に免疫した。２６日目までに、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７のすべての動物には腫瘍がなく、その状態を維持したのに対し、未処理の動物（△）およびＬｍ−Ｅ７で免疫したすべての動物は、大きな腫瘍を発生した（図５Ｂ）。したがって、ＡｃｔＡ−Ｅ７融合を用いたワクチン接種は、腫瘍退縮を引き起こす。
【０３５０】
また、Ｅ７発現腫瘍の退縮を引き起こす能力についてＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを比較した。４０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの左側腹部に腹腔内ＴＣ１腫瘍を確立した。腫瘍が４〜５ｍｍに達した後に、マウスを８匹から成る５つの群に割り振った。各群を４つの組換えＬＭワクチンのうちの１つで処理し、１群を未処理のままにした。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ５／８例および３／８例において、確立した腫瘍の退縮を誘導した。Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処理したマウスの腫瘍の大きさの平均値には、いずれの時点においても統計学的な差異は見られなかった。しかしながら、ＰＥＳＴ配列を含まないＥ７を発現したワクチンＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７およびＬｍ−Ｅ７ｅｐｉは、１匹のマウスを除いて腫瘍退縮を引き起こすことはできなかった（図６Ｂ、上パネル）。これは２つの実験を代表するものであり、２８日目に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７で処理した腫瘍とＬｍ−Ｅ７ｅｐｉまたはＬｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７で処理した腫瘍との間で、腫瘍の大きさの平均値における統計学的に有意な差異が観察された（スチューデントｔ検定Ｐ＜０．００１、図６Ｂ下パネル）。また、ＰＥＳＴ含有ワクチンを接種したマウスの脾臓における３回の実験に渡って、四量体陽性脾細胞の割合に再現性よく増加が見られた（図６Ｃ）。したがって、ＰＥＳＴ−Ｅ７融合を用いたワクチン接種は腫瘍退縮を引き起こす。
【０３５１】
実施例４：Ｅ７のＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列との融合は、Ｅ７特異的免疫を強化し、腫瘍浸潤Ｅ７特異的ＣＤ８＋細胞を産生する
【０３５２】
材料および実験方法
【０３５３】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｃｌの２×１０５ＴＣ１腫瘍細胞を含む５００ｍｃｌ（マイクロリットル）のマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））と、さらに４００ｍｃｌのマトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標））（BD Biosciences, Franklin Lakes, N.J.）を、１２匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３）の左側腹部に皮下移植した。７日目、１４日目、および２１日目にマウスの腹腔内に免疫し、２８日目に脾臓および腫瘍を採取した。マウスから腫瘍マトリゲルを除去し、２ミリリットル（ｍｌ）のＲＰ１０培地を含む氷上のチューブ内で４℃で一晩インキュベートした。鉗子で腫瘍を細かくして２ｍｍ大のブロックに切断し、３ｍｌの酵素混合物（０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ−Ｐ、ＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＡｓｅ−１）とともに、３７℃で１時間インキュベートした。組織懸濁液をナイロンメッシュで濾過し、四量体染色およびＩＦＮ−γ染色のために５％ウシ胎仔血清とＰＢＳ中の０．０５％ＮａＮ３を用いて洗浄した。
【０３５４】
１０７細胞／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下において、脾細胞および腫瘍細胞を１マイクロモル（ｍｃｍ）のＥ７ペプチドとともに５時間インキュベートした。細胞を２回洗浄して、５０ｍｃｌの抗マウスＦｃ受容体の上清（２．４  Ｇ２）中で１時間または一晩４℃でインキュベートした。表面分子ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌに対して細胞を染色し、透過処理して、透過処理キットＧｏｌｇｉ−ｓｔｏｐ（登録商標）またはＧｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（登録商標）（Pharmingen, San Diego, Calif.）を用いて固定し、ＩＦＮ−γを染色した。レーザー式のフローサイトメーターＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて５００，０００イベントを取得し、Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）を用いて分析した。活性化した（ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）ＣＤ８＋Ｔ細胞内のＩＦＮ−γ分泌細胞の割合を算出した。
【０３５５】
四量体染色は、Ｈ−２Ｄｂ四量体にフィコエリトリン（ＰＥ）結合Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号２２）を負荷して室温で１時間染色し、抗アロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＭＥＬ−１４（ＣＤ６２Ｌ）およびＦＩＴＣ結合ＣＤ８を用いて４℃で３０分間染色した。脾臓および腫瘍における四量体＋ＣＤ８＋ＣＤ６２Ｌｌｏｗ細胞を比較して、細胞を分析した。
【０３５６】
結果
【０３５７】
Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７が抗原特異的な免疫を増強する能力を分析するために、ＴＣ１腫瘍細胞をマウスに移植し、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１×１０６ＣＦＵ）、またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（２×１０８ＣＦＵ）のいずれかを用いて免疫するか、または未処置のままにした（未投与）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７群のマウスの腫瘍は、Ｌｍ−Ｅ７または未投与マウスと比較して、高い割合のＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ａ）および四量体特異的ＣＤ８＋細胞（図７Ｂ）を含んでいた。
【０３５８】
別の実験において、腫瘍を持つマウスにＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７、Ｌｍ−ΔＰＥＳＴ−Ｅ７、またはＬｍ−Ｅ７ｅｐｉを投与し、腫瘍内のＥ７特異的リンパ球のレベルを測定した。７日目および１４日目に、ＬＤ５０＝０．１の４つのワクチンでマウスを処置した。２１日目に腫瘍を採取し、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ８に対する抗体およびＥ７／Ｄｂ四量体で染色した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７を用いてワクチン接種したマウスにおいて、腫瘍内の四量体陽性リンパ球の割合に増加が見られた（図８Ａ）。この結果は、３回の実験に渡って再現可能であった（図８Ｂ）。
【０３５９】
したがって、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７、およびＬｍ−ＰＥＳＴ−Ｅ７は、それぞれ、腫瘍浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および腫瘍退縮に有効である。
【０３６０】
実施例５：Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウス表現型：自然発生腫瘍の増殖モデルおよび腫瘍抗原に対する耐性
【０３６１】
物質および実験方法
【０３６２】
サイログロブリンプロモータ（ブリュッセルのＭ.Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒ氏より提供）の制御下でＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７遺伝子を含有するプラスミドを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス接合体を注射した。数リットルのマウス尾試料から、ＰＣＲを用いてＥ６／Ｅ７遺伝子をスクリーニングした。Ｅ７遺伝子およびサイログロブリンプロモータを大半の子孫に組み込んだ。Ｆ０×野生型の交配のために、Ｅ７陽性のモザイク化トランスジェニックマウスを選択した。その結果得られたＦ１世代を、ＰＣＲを用いてＥ７遺伝子の存在についてスクリーニングした。Ｆ０×野生型の繁殖ペアから生まれたＥ７陽性の仔を、Ｆ１×Ｆ１の交配のために選択した。ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲおよび△△Ｃｔ法（Charles River、2001）を用いて、Ｆ１繁殖ペアに由来する世代の接合状態を決定した。ホモ接合型のＥ７トランスジェニックマウスをＦ２×Ｆ２の交配のために選択した。その結果得られたＦ３世代を、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲおよび戻し交配を行うことでスクリーニングし、ホモ接合性のフィデリティを確認した。すべてのホモ接合型系統について、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを用いてＥ７遺伝子の遺伝子コピー数および導入遺伝子発現のレベルを評価した。戻し交配を６回行った後、これらの系統をコロニーの親として使用した。「結果」の項目に記載するように、甲状腺過形成の外観により、導入遺伝子発現をさらに確認した。
【０３６３】
結果
【０３６４】
Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスを作製し、表現型を評価した。８週目に、マウスは甲状腺過形成を発症し始め、６ヶ月目には触知可能な甲状腺腫を発症した。６〜８ヶ月目までに、ほとんどのマウスが甲状腺癌を呈した。月齢３ヶ月で屠殺したトランスジェニックマウスは、癌の初期の兆候である正常な甲状腺構造の脱分化を示した。肥大した脱分化細胞は、甲状腺ホルモンが蓄積するコロイドで満たされていた（図９）。
【０３６５】
実施例６：Ｅ７はＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの胸腺髄質上皮細胞に発現される
【０３６６】
胸腺においてＥ７が発現されたかどうかを決定するために、６〜８週齢のマウスにおいて、肝臓、脾臓、胸腺および甲状腺を、導入遺伝子の発現について調べた。甲状腺には大量のＥ７メッセージが見られたが、その他の組織においては見られなかった（図１０Ａ）。末梢で発現された臓器特異的抗原（サイログロブリンを含む）のメッセージのレベルが、胸腺標本全体において検出を行うには低すぎることが明らかになったため、胸腺標本全体にＥ７メッセージが存在しなかったことは、胸腺における発現の欠如を示唆することにはならない（Derbinski, J., A. Schulte, B. Kyewski, and L. Klein. 2001. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat Immunol 2:1032）。
【０３６７】
胸腺における抹消抗原（サイログロブリンを含む）に対する耐性は、胸腺髄質上皮細胞（ｍＴＥＣｓ）の自己免疫調節遺伝子（ＡＩＲＥ）による、これらの遺伝子の一過性発現によって媒介され、発現のピークは出産の前に発生する。ＡＩＲＥは、自己耐性を維持する転写因子である。トランスジェニックマウスにおけるＥ７の発現が同一のパターンで生じていたかどうかを決定するために、Ｅ７の発現について幼若マウス（３〜５週齢）のＥ６／Ｅ７胸腺からのｍＴＥＣを調べた。
【０３６８】
ｍＴＥＣはＥ７メッセージを発現しており、また、ｍＴＥＣにおいて発現されることが知られるカテプシンＳも発現していた（図１０Ｂ）。したがって、Ｅ７はトランスジェニックマウスの胸腺で発現され、このことは、これらのマウスが、Ｅ７抗原に対する耐性を示したことを表すものである。
【０３６９】
実施例７：ペプチドベースのワクチンは、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおける腫瘍チャレンジから防御しない
【０３７０】
Ｅ７の自己発現がワクチンの有効性に与える影響の尺度として、免疫賦活性ＣｐＧ配列１８２６  （Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, Koretzky GA, Klinman DM. Nature 374:546）とともにＥ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）ベースのワクチンを用いて、腫瘍防御実験においてＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスを検査した。ペプチドベースのワクチンにより、すべての野生型マウスが腫瘍チャレンジから防御された一方で、トランスジェニックマウスにおいては腫瘍チャレンジに対する影響は見られなかった（図１１）。したがって、Ｅ６／Ｅ７マウスは腫瘍チャレンジを拒む能力の低下を示し、Ｅ７に対して耐性を持つというさらなる証拠を提供した。
【０３７１】
実施例８：ＬＬＯとＡｃｔＡとの融合は、Ｅ７発現腫瘍に対するＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの免疫耐性を克服する
【０３７２】
本発明のワクチンが、Ｅ７発現腫瘍に対するＥ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの免疫耐性を克服する能力を検査するために、６〜８週齢の野生型マウスおよびトランスジェニックマウスの皮下（ＳＣ）に１０５ＴＣ１細胞を移植して固形腫瘍を形成し、７日後および１４日後に、マウスを免疫してない状態のままにするか、またはＬＭ−ＮＰ（対照）、１×１０８ｃｆｕのＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７（図１２Ａ）もしくは２．５×１０８ｃｆｕのＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７（図１２Ｂ）を用いて腹腔内に免疫した。予想した通り、未投与マウスは腫瘍量が多く、２ｃｍを超える腫瘍のために２８日目または３５日目までに屠殺した。それとは対照的に、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７のいずれかの投与は、３５日目までに、それぞれ、野生型マウスの７／８匹または６／８匹、およびトランスジェニックマウスの３／８匹に完全な腫瘍退縮をもたらした。完全な腫瘍退縮を示さなかったトランスジェニックマウスにおいて、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７をワクチン接種したマウスおよびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７をワクチン接種したマウスに、顕著な腫瘍増殖の遅延が観察された。
【０３７３】
トランスジェニックマウスにおいて完全な腫瘍退縮および／または腫瘍増殖の遅延を誘導する本発明のワクチンの効果は、ペプチドベースのワクチンの無効力と好対照であった。したがって、本発明のワクチンは、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスのＥ７発現腫瘍に対する免疫耐性を克服することができた。
【０３７４】
実施例９：ＬＬＯとＡｃｔＡとの融合は、Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスにおける自発性（自然発生）腫瘍を減少させる
【０３７５】
Ｅ６／Ｅ７トランスジェニックマウスの自発性腫瘍に対するＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７おおびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７ワクチンの影響を決定するために、１×１０８Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７または２．５×１０８Ｌｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７を用いて、８ヶ月間１ヶ月に１回、６〜８週齢のマウスを免疫した。最後の免疫化から２０日後にマウスを屠殺し、甲状腺を除去して重量を計測した。この実験を２回行った（表１）。
【０３７６】
【表１】
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【０３７７】
両方の実験において、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７で処理したマウスと未処理マウスとの間の甲状腺の重量における差異、およびＬｍ−ＬＬＯ−ＡｃｔＡで処理したマウスと未処理マウスとの間の甲状腺の重量における差異は有意（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０５）であったのに対し、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰで処理したマウス（無関係の抗原対照）と未処理マウスとの間の差異は有意ではないことから（スチューデントｔ検定）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＡｃｔＡ−Ｅ７が、自然発生腫瘍の増殖を抑制したことが明らかになった。したがって、本発明のワクチンは、新しいＥ７発現腫瘍の形成を防ぐ。
【０３７８】
上記実施例における所見をまとめると、ＬＬＯ−抗原とＡｃｔＡ−抗原の融合は、（ａ）腫瘍浸潤性の抗原特異的Ｔ細胞を含む腫瘍特異的な免疫応答を誘導し、腫瘍退縮を誘導すること、ならびに、正常な腫瘍および特に侵襲性の腫瘍の両方の腫瘍の増殖を制御することが可能であり、（ｂ）自己抗原に対する耐性を克服し、かつ、（ｃ）自然発生腫瘍の増殖を防ぐ。これらの所見は、種々の異なる抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍型を用いた実行に成功したことからも明かなように、多数の抗原、ＰＥＳＴ様配列、および腫瘍型に一般化することが可能である。
【０３７９】
実施例１０：ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンは安全であり、子宮頸癌患者における臨床的指標を向上する
【０３８０】
材料および実験方法
【０３８１】
試験デザイン：本試験は、非盲検、非ランダム化試験であった。進行性、再発性または重度の子宮頸部扁平上皮癌に罹患する合計２０人の成人女子が試験に組み入れることとなったが、１５人の患者のみが治療および分析を受けた。２１日に１回、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を静脈内投与し、合計２回の治療を行った。各投与の後で患者を５日間入院させ、各注入後にＩＶおよび経口によるアンピシリン投与を行った。安全性および有効性を評価する目的で、また研究デザインに従って免疫性の分析のために試料を取得する目的で、通院による経過観察を行った。本試験にエントリした患者全員について、死亡するまで経過を観察することとした。
【０３８２】
組み入れ基準：本治験における患者全員が「重度の、進行性または再発性の子宮頸癌」であると診断され、エントリ時の評価は、全員がステージＩＶＢの疾患を有すると病期分類されたことを示すものであった。患者全員が、カンジジン、流行性耳下腺炎、破傷風、またはツベルクリン精製タンパク誘導体（ＰＰＤ）から選択された３つのメモリー抗原（memory antigens）を含有するアネルギーパネルに対して陽性の免疫応答を示し、妊娠しておらずまたＨＩＶ陽性でもなく、４週間の間に治験薬を接種しておらず、またステロイドを投与されてもいなかった。１８歳以上の患者が試験に参加する資格を有するものとした。患者は、進行性、再発性または重度であって、現存の治療に対して不応性であると組織学的に確認された子宮頸癌に罹患しており、遅延型過敏症（ＤＴＨ）スクリーニングパネルに陽性の反応を示した。患者は１つの原発性癌のみを有していた。患者は、米国東部癌治療共同研究グループ（ＥＣＯＧ）のパフォーマンス・ステータス（ＰＳ）≦２（カルノフスキー＞６０％）であった。患者の平均余命は６ヶ月を上回るものであった。
【０３８３】
プロトコル：生理食塩水２５０ｍｌの静脈内（ＩＶ）注入３０分として、２つのワクチンを３週間の間隔で患者に投与した。５日後、患者にＩＶアンピシリンの単回投与を行い、退院後はさらに１０日間アンピシリンを経口投与させた。全体的な健康を決定するために、食欲、日常生活の課題を遂行する能力、安眠等の全体的な活力とクオリティ・オブ・ライフの尺度であるカルノフスキー・パフォーマンス指標を用いた。また、安全性および一般的な健康について以下の指標を決定した。アルカリホスファターゼ、ビリルビン（直接ビリルビンおよび総ビリルビンの両方）、γグルタミルトランスペプチダーゼ（ｇｇｔ）、コレステロール、収縮期、拡張期、および心拍数、米国東部癌治療共同研究グループ（ＥＣＯＧ）の疾患進行の評価基準である、カルノフスキーと類似するクオリティ・オブ・ライフの指標、ヘマトクリット、ヘモグロビン、血小板レベル；リンパ球レベル、ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノ基転移酵素）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、およびＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）。２回目の投与から３週間目および３ヶ月目に患者の経過観察を行い、患者の固形癌治療効果判定基準（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors（ＲＥＣＩＳＴ））スコアを決定し、腫瘍の大きさを判定するためにスキャンを行い、治験の最後に行われる、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞集団の評価を含む免疫学的分析のために血液試料を採取した。
【０３８４】
治療期間：全体として、１日目および２２日目に行ったＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いた２回の治療を含めて、患者の参加は１１１日間続いた（スクリーニングを除く）。
【０３８５】
評価の基準：
【０３８６】
安全性：
【０３８７】
ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７投与の安全性は、以下に関する投与前ベースラインからの変化に基づいて評価した。注射から１０分後の注射部位の腫脹、刺激感、免疫応答またはその他の異常の観察、身体検査所見、バイタルサイン、臨床パラメータにおける変化（血液学および血清化学）、尿中、血液および糞便試料におけるリステリア・モノサイトゲネスの存在、ＥＣＯＧパフォーマンス・ステータス、報告された有害事象。
【０３８８】
免疫原性：
【０３８９】
フローサイトメトリーによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のためのサイトカイン分析、ならびにＤ４＋およびＣＤ８＋活性化細胞の決定による評価に基づく、抗腫瘍応答のパラメータにおける投与前ベースラインからの変化に基づいて、２回用量でのＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７投与の免疫原性を評価した。これらの分析のために、初回の投与前ならびに３、６、１２および１６週目に、血液試料を採取した。しかしながら、試験の最中に採取した血液試料は、生存能力について検査した。採取した試料のいずれも生存能力が低かったため、評価可能なデータが得られなかった。また、何人かの患者は試料が不足していた。
【０３９０】
有効性：
【０３９１】
ＲＥＣＩＳＴ基準によって決定される腫瘍応答。
【０３９２】
試験期間中、患者全員を生存について監視した。
【０３９３】
統計学的方法：本試験では、推計分析は予定されていなかった。分析は記述統計学を用いて行われた。すべての分析は、バージョン８．２またはそれより上のバージョンのＳＡＳ（登録商標）を用いて、特定の分析に適切な手順により行った。
【０３９４】
リステリア株：ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７の作製については実施例１に記載した。実施例１２に記載するように、作業用細胞バンク調製前に、細菌を２回マウスに継代した。細胞バンクは、解凍時に９０％を上回る生存能力を示した。
【０３９５】
結果
【０３９６】
前臨床試験
【０３９７】
臨床試験の前に、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与（ＩＶ）と腹腔内投与の抗腫瘍効果を決定するために前臨床試験を行った。１×１０４ＴＣ１細胞を含有する腫瘍を皮下に確立した。７日目および１４日目に、１０８、１０７、１０６、または１０５の用量を用いた１０８ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７の腹腔内投与またはＬＭ−ＬＬＯ−Ｅの静脈内投与のいずれかによりマウスを免疫した。３５日目に、いずれもの経路で１０８ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７を投与された、または１０７ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７を静脈内投与された５／８匹のマウス、および１０６ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７を静脈内投与された４／８匹のマウスは治癒した。それとは対照的に、１０７未満、またはある場合には１０８未満の用量を用いたＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７の腹腔内投与には、腫瘍の増殖を抑制する効果は見られなかった。したがって、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７の静脈内投与が、腹腔内投与よりも効果的である。
【０３９８】
臨床試験
【０３９９】
重度の、進行性、または再発性の子宮頸癌に罹患する患者におけるＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの安全性および有効性を評価するために、第Ｉ／ＩＩ相臨床治験を実施した。患者を５人ずつコホート１〜２に割り当て、それぞれ１×１０９または３．３×１０９ＣＦＵを投与した。さらに患者５人ずつをコホート３〜４に割り当て、それぞれ１×１０１０または３．３１×１０１０ＣＦＵを投与した。予定していた第４コホートでは、用量制限毒性基準を満たしたため投薬は行われず、結果的に第３コホートの後で試験を中止した。
【０４００】
安全性データ
【０４０１】
第１コホート
【０４０２】
注入開始から１〜２時間以内に、第１コホートの患者全員が、軽度から中等度の発熱および悪寒の発症を報告した。患者の中には、悪心を伴うまたは伴わない嘔吐を呈する者もあった。１つの例外を除いて（後に説明する）、これらの症状を回復させるためには、パラセタモール等の非ステロイド性薬剤の単回投与が十分であった。中程度の、一過性の循環器系への影響が、発熱とともに、そして発熱の時間を同じくして、観察された。他の有害事象は報告されなかった。
【０４０３】
子宮頸癌もこれほど後期になると、患者の１年生存率は典型的には１０〜１５％であり、いずれの腫瘍治療も効果を示さなかったことになる。実際、患者２は若い患者であり、疾患の侵襲性が非常に高かったため、治験終了後まもなく亡くなった。
【０４０４】
投与後２、３、および５日目に定量的血液培養を評価した。本コホートの評価可能な患者５人のうち、４人はいずれの時点においても血清リステリア菌を示さず、１人は２日目に微量（３５ＣＦＵ）の循環性のリステリア菌を示したものの、３日目および５日目には検出可能なリステリア菌を示さなかった。
【０４０５】
患者５は、初回のワクチン接種に対して、投与後４８時間に渡る軽度の発熱という反応を示したため、抗炎症剤を用いて治療した。一時期、中程度の重症度まで熱が上昇し（３８．４℃を超えることはなかった）、一連のアンピシリン投与後に解熱した。患者は、抗生物質の投与中に軽度の蕁麻疹を経験したが、抗生物質の投与終了後には症状が治まった。血液培養はすべて無菌であり、循環器データは他の患者に観察された値の範囲内であり、血清化学値は正常であったため、この患者はリステリア症を有さないことが分かった。さらに、アネルギーパネルがメモリー抗原の１／３に対する強い反応を示し、機能免液の存在を示唆した（他の患者と同様）。その後、患者５に追加免疫を接種すると、他の患者全員と同様の反応を明らかに示した。
【０４０６】
第２コホートおよび全体的な安全性の観察
【０４０７】
どちらのコホートにおいても、注入後に肝機能試験における軽度かつ一過性の変化が観察された。これらの変化は、治験を監視する担当医師により臨床的な有意性はないと判定され、体循環から肝臓および脾臓に急激に移動した細菌による短期間の感染であると予測された。全般的に、上記の「方法」の項目に記載したすべての安全性の指標については、ごくわずかの正味変化が見られるかまたは全く変化が見られず、優れた安全性プロファイルを示唆するものであった。本コホートにおける副作用プロファイルは、はじめのコホートに見られたものと事実上同じであり、医原性感染症の誘導に続いて起こるサイトカインおよび類似する薬剤の及ぼす影響と関連する、用量非依存性の一連の症状であると思われた。いずれの時点においても血清リステリア菌は観察されず、いずれのコホートにおいても用量制限毒性は観察されなかった。
【０４０８】
有効性：第１コホート
【０４０９】
以下の有効性の指標が、治験を終了した第１コホートの患者３人に観察された（表２）。
【０４１０】
【表２Ａ】
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【０４１１】
【表２Ｂ】
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【０４１２】
患者１は、各々２０ｍｍの腫瘍を２個伴って治験にエントリしたが、治験の最中にそれぞれ１８ｍｍおよび１４ｍｍまで縮小し、ワクチンの治療効果が示唆された。また、患者１は、カルノフスキー・パフォーマンス指標７０で治験にエントリし、投与後には９０まで上昇した。セルビア共和国ベオグラードの腫瘍学および放射線学研究所（Institute for Oncology and Radiology）の安全性検討委員会の会議で、腫瘍学部の責任者であるSini?a Radulovicは、治験を実施する以下の団体の代表者達に本結果を提示した：フリーランスの腫瘍学者として団体のために働くMichael Kurman；メルク社のためにガーダシルの第ＩＩＩ相治験を、そしてグラクソスミスクライン社のためにセルバリックスの治験を実施した、エモリー大学所属の婦人科腫瘍学者Kevin Ault；および米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の婦人科悪性腫瘍化学療法研究機構（Gynecologic Oncology Group）の創設者であり、ミシシッピ大学婦人科腫瘍学教授であるTate Thigpen。Radulovic博士の意見では、患者１は、本ワクチンの治療により臨床的有用性を示した。
【０４１３】
患者２は、死亡する前に、腫瘍が１／２縮小するという複雑な反応を示した。
【０４１４】
患者３は、血小板数が９３６×１０９／ｍｌまで増加する等の傍腫瘍性疾患（癌の付帯徴候であり、癌に続発する別の続発症を伴う患者の総体的な衰弱状態）を伴って組み入れられた。初回投与後、血小板数は、ほぼ正常レベルの４６５×１０９／ｍｌまで減少した。
【０４１５】
患者４は、各々２０ｍｍの腫瘍を２個伴って治験にエントリしたが、治験の最中にそれぞれ１８ｍｍおよび１４ｍｍまで縮小し、ワクチンの治療効果が示唆された。患者４は、１回目と２回目の投与の間に、１．６Ｋの体重増加および約１０％のヘモグロビン数増加を示した。
【０４１６】
有効性：第２コホートおよび総合観察
【０４１７】
最低用量のコホートにおいて、２人の患者が腫瘍の縮小を示した。この効果が見られた時期は、経時的に免疫応答が発生した後で起こったという点で、免疫学的応答における効果が観察された時期と一致していた。これまで腫瘍量を評価した第２コホートの患者２人のうちの１人が、ワクチン接種後の時点で飛躍的な腫瘍量の減少を示した。治験開始時には、この患者は１３ｍｍ、１３ｍｍ、および１４ｍｍの３つの腫瘍を有していた。ワクチンを２回投与した後、腫瘍のうちの２つが９．４ｍｍおよび１２ｍｍまで縮小し、３つめの腫瘍はもはや検出不可能であった。
【０４１８】
２つのコホートの腫瘍量を図１３Ｂに示す。まとめると、注射によるプライミングと追加免疫１回を含む治療計画において、比較的低用量のＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７を投与するだけで、データを収集した患者６人のうちの３人が奏効を達成したことになる。
【０４１９】
第３コホート：安全性
【０４２０】
用量制限毒性：1×１０１０投与量群の３人の患者（患者０１−００７、０２−００６、０４−００６）が低血圧を発症したために、用量制限毒性プロトコルに詳述されるＤＬＴ基準に従って、本試験を中止した。
【０４２１】
１日目または２２日目のいずれかに発生した低血圧の発症は、中程度の重症度であると見なされ、治験担当医師によって、おそらく試験ワクチンと関連していると見なされた。患者全員に併用薬を投与し、（患者０１−００７および０４−００６）の事象は回復したが、患者０２−００６はさらに２日間低血圧を呈した。
【０４２２】
考察
【０４２３】
子宮頸癌もこれほど後期になると、患者の１年生存率は典型的には１０〜１５％であり、いずれの腫瘍治療も効果を示さなかったことになる。ステージＩＶＢの子宮頸癌を回復に向かわせるために有効な治療はまだ明らかになっていない。このステージにおいて子宮頸癌を治療することの難しさにも関わらず、コホートＩおよびＩＩの２／６人の患者において抗腫瘍効果が観察された。また、上述したように、他の有効性を示唆する状態が、治験を終了した患者において観察された。
【０４２４】
結論として、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７は、患者の大半に発熱、悪寒、悪心および嘔吐を含む一連のインフルエンザ様副作用をもたらし、これらの副作用は軽度から中程度であり、１×１０９および３．３×１０９群において良好な忍容性を示した。薬剤投与と関連する副作用は、主に、短期間の介入可能なインフルエンザ様症状を含む。本治験では肝機能とＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７との関係を決定することはできなかったが、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅが単独でＬＦＴ上昇の近因である可能性は少ないと思われた。用量制限性の低血圧が用量１×１０１０で観察された。ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７は、用量１×１０９および３．３×１０９で、末期の子宮頸癌において安全に使用することができる。
【０４２５】
したがって、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７は、ヒト対象において安全であり、比較的低用量で投与された場合でも子宮頸癌患者の臨床的指標を向上する。追加免疫のワクチン接種の数を増やした場合、および／または少量の抗生物質を投与した場合もしくは注入からしばらく経ってから抗生物質を投与した場合に、さらに良い結果が観察される可能性がある。さらに追加免疫を投与することにより、得られる免疫応答がいっそう増強される可能性が非常に高い。さらに、免疫系が癌を攻撃し続けるため、観察された治療的免疫応答の良い効果が、時間の経過とともに持続する可能性が高い。
【０４２６】
実施例１１：ステージＩＩおよびＩＩＩ子宮頚部上皮内腫瘍の治療におけるＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７の安全性および有効性
【０４２７】
材料および実験方法
【０４２８】
組み入れ基準
【０４２９】
１８歳以上であり、連邦政府、州および施設のガイドラインに従ってインフォームドコンセントを提供することができること。
【０４３０】
患者は、外科的処置が適応されるステージＩＩまたはステージＩＩＩのいずれかの子宮頚部上皮内腫瘍を有していなければならず、手術の前に６ヶ月間の治療および観察期間を持つために十分な低悪性度の疾患であること。
【０４３１】
ＨＰＶ−１６Ｅ７陽性である。
【０４３２】
細胞学的な兆候がＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩの診断と一致すること。
【０４３３】
本試験への参加資格のあるすべての患者は、治験責任医師と面談を行い、治験エントリの前に治験責任医師から承認されなければならない。
【０４３４】
患者は、上記実施例に記載したアネルギーパネルに使用される検査薬のうちの少なくとも１つに陽性反応を示さなければならない。遅延性の過敏性刺激の投与に反応して、縦横の測定値の合計が少なくとも５ｍｍとなる局所組織反応を形成することによって定義される陽性反応が必要である。
【０４３５】
除外基準
【０４３６】
初回試験の投与前４週間以内に化学療法、放射線療法、またはステロイドを投与された患者、または４週間前に投与された薬剤による有害事象から回復していない患者。
【０４３７】
投与２８日前に他のいずれかの治験薬を投与された患者。
【０４３８】
リステリア症の既往。
【０４３９】
前癌または合併癌の既往。
【０４４０】
アネルギーパネルによるスクリーニングの陰性結果から、免疫不全であることが証明された患者。
【０４４１】
これに限定されないが、進行中または活動性の感染症、症候性うっ血性心不全、不安定性狭心症、不整脈、または、試験要件を順守することが難しい精神病／社会的状況を含む、コントロール不良の介入性の疾病。
【０４４２】
肝炎、肝硬変、または血清酵素によって判定される他のいずれかの肝機能障害。
【０４４３】
妊娠中の女性および積極的に妊娠する努力を行っている女性。
【０４４４】
既知のＨＩＶ陽性患者。
【０４４５】
ペニシリンアレルギー。
【０４４６】
安全性の主要エンドポイント：
【０４４７】
観察される腫脹、刺激感、免疫応答またはその他の異常を含む投与部位の発生率および重症度。
【０４４８】
試験期間を通して評価された有害事象の発生率および重症度。
【０４４９】
１６週間に渡る投与の各時点における臨床血液学および血清化学検査の結果における変化。
【０４５０】
初回投与に続く入院期間中に定量的血液培養によって決定される、血液からのＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７クリアランス速度。
【０４５１】
有効性の主要エンドポイント：
【０４５２】
腟頚管検査においてＣＩＮが正常な状態まで退縮している。
【０４５３】
手術をキャンセルまたは遅延するほど十分にＣＩＮが正常な状態まで退縮している。
【０４５４】
手術後細胞診の向上。
【０４５５】
免疫原性の主要エンドポイント：
【０４５６】
患者のＨＬＡタイピング（クラスＩおよびＩＩ）。
【０４５７】
観察された副作用に対応する投与後の血清サイトカインプロファイルの定量化。
【０４５８】
投与後のマクロファージの活性化を評価するマクロファージ活性化パラメータの定量化。
【０４５９】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な活性化Ｔ細胞の同定および投与後のＴ細胞応答の定量化。
【０４６０】
ＴＡＡ  ＤＴＨへと遊走するＴ細胞サブセットの定量化。
【０４６１】
免疫原性基準：
【０４６２】
血清サイトカイン
【０４６３】
患者の血清中でＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＬ−１２を評価し、以下の時点で回収した。
【０４６４】
スクリーニング、１日目。
【０４６５】
１日目投与前、１日目投与後３時間、１日目投与後１２時間、２日目投与後２４時間、および５日目。
【０４６６】
２２日目投与前、２２日目投与後３時間、２２日目投与後１２時間、２３日目投与後２４時間、および２６日目。
【０４６７】
４３日目投与前、４３日目投与後３時間、４３日目投与後１２時間、４４日目投与後２４時間、および４７日目。
【０４６８】
Ｔ細胞応答
【０４６９】
ＨＰＶ−１６Ｅ７で刺激した患者のＴ細胞について、以下のサイトカイン放出プロファイルを評価した：ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＬ−４。
【０４７０】
患者から標本抽出した細胞について、以下の時点でアッセイを行った：スクリーニング、１日目投与前、２２日目投与前、４３日目投与前、１２６日目および１８０日目。
【０４７１】
遅延型過敏症テスト
【０４７２】
以下の試験日にＤＴＨテストを実施した：スクリーニング、５日目、２６日目、４７日目、１２６日目および１８０日目。
【０４７３】
マクロファージ活性化
【０４７４】
マクロファージ活性化の評価のための試料を、以下の試験日時に採取した。
【０４７５】
１日目投与前、１日目投与後３時間、１日目投与後１２時間、２日目投与後２４時間、および５日目。
【０４７６】
２２日目投与前、２２日目投与後３時間、２２日目投与後１２時間、２３日目投与後２４時間、および２６日目。
【０４７７】
４３日目投与前、４３日目投与後３時間、４３日目投与後１２時間、４４日目投与後２４時間、および４７日目。
【０４７８】
ワクチン投与
【０４７９】
ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７を３０分間の静脈内注入として投与し、各投与ごとに新たに解凍して生理食塩水中２５０ｍｌで希釈した。
【０４８０】
安全性の検討
【０４８１】
有害事象は、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の共通毒性基準に基づいて等級分けした。用量制限毒性は以下のうちのいずれかとして定義される。
【０４８２】
非血液毒性：
【０４８３】
１．症状から推定的な細菌性髄膜炎が判定される。
【０４８４】
２．１０日間の抗生物質投与後５日および１５日に持続性のリステリア症が見られる。
【０４８５】
３．ＩＣＵへの入室を必要とする臨床的敗血症。
【０４８６】
４．治療的介入を正当化するのに十分な血圧低下。
【０４８７】
５．等級３〜４のトランスアミナーゼ上昇が最低でも７日間続くことにより証明される肝炎。
【０４８８】
６．十分な医療介入にもかかわらず、等級３〜４の胃腸毒性が見られる。
【０４８９】
７．任意の等級３注射部位反応。
【０４９０】
８．子宮頸癌またはその他の併発症に起因するとは思われない、等級３以上の任意の有害事象。
【０４９１】
血液毒性：
【０４９２】
１．好中球絶対数（ＡＮＣ）等級４が最低でも７日間続く、または３８．５℃以上の熱を伴う等級４の好中球減少として定義される好中球減少性発熱。
【０４９３】
２．血小板数等級４または等級３の血小板数を伴う出血。
【０４９４】
治療ワクチンと関連する等級３以上の有害事象が存在しない条件で、各症例において次のコホートで用量増加を行う。
【０４９５】
結果
【０４９６】
手術の前に６ヶ月間の治療および観察期間を持つのに十分な低悪性度の疾患を有する、ステージＩＩまたはステージＩＩＩの子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ  ＩＩ／ＩＩＩ）に罹患する女性が組み入れられた。患者は、入院患者として３週間の間をおいて３回のＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７投与を受け、外来通院して、ワクチンに対する反応評価、分析のための試料採取、および疾患評価を行った。免疫性分析のために治験期間を通して試料を採取し、試験終了時にアッセイを行った。
【０４９７】
標準的な理学的、血液学的、および血清化学的な測定値によって安全性を評価し、血液培養を用いて血清リステリアを評価した。免疫学的活性は、血清サイトカインの放出、腫瘍抗原に対する活性化Ｔ細胞応答、マクロファージ活性化、および腫瘍抗原に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）の分野において評価した。
【０４９８】
臨床的に、主要エンドポイントによって患者をグループ化した。すなわち、患者が手術をする必要がないほど十分な寛解を示したかどうかである。手術を必要とする患者は、対照群よりも軽度の疾患を呈しているかどうかによりグループ化した。ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７は、手術を必要とする女性の割合を減少させるか、かつ／または、手術を必要とする患者において疾患の程度を減少させる。
【０４９９】
実施例１２：マウスにリステリア菌ワクチンのベクターを継代することは、異種性および内在性抗原に対する免疫応答の増強を惹起する
【０５００】
材料および方法
【０５０１】
細菌株
【０５０２】
リステリア・モノサイトゲネス株１０４０３Ｓ血清型１（ATCC, Manassas, Va.）は、これらの試験に使用された野生型の生命体であり、後に記載するコンストラクトの親株である。１０４０３Ｓ株は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入されると、約５×１０４ＣＦＵのＬＤ５０を有する。「Ｌｍ−Ｇａｇ」は、修飾したシャトルベクターｐＫＳＶ７を用いてリステリアの染色体に安定に組み込まれた、ＨＩＶ−１株のＨＸＢ（シンシチウム形成表現型を有するサブタイプＢの臨床株）ｇａｇ遺伝子のコピーを含有する組み換えＬＭ株である。ウエスタンブロットによって決定された通り、該株によってＧａｇタンパク質が発現かつ分泌された。株はすべてブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロスまたは寒天プレート（Difco Labs, Detroit, Mich）で増殖させた。
【０５０３】
細菌培養
【０５０４】
パッセンジャー抗原および／または融合タンパク質を発現する単一クローンからの細菌を選択して、ＢＨＩブロス中で一晩培養した。培養液のアリコートを、添加剤を加えずに−７０℃で冷凍した。この原液から、培養液を６００ｎｍで０．１〜０．２Ｏ．Ｄまで増殖させ、再び添加剤を加えずにアリコートを−７０℃で冷凍した。クローン化した細菌プールを調製するために上記手順を用いたが、それぞれの継代の後、本明細書に記載されるように、多くの細菌クローンを選択して標的抗原の発現について調べた。外来性抗原の発現が確認されたクローンを次の継代に使用した。
【０５０５】
マウスにおける細菌の継代
【０５０６】
６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスのメスをJackson Laboratories（Bar Harbor, Me）より購入し、無菌マイクロアイソレーター環境に維持した。−７０℃で冷凍保存した保存培養のアリコートにおける生存細菌の力価は、解凍中および使用前のＢＨＩ寒天プレートに播種することにより決定した。全部で５×１０５の細菌をＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に静脈内注入した。３日後、脾臓を採取し、ホモジナイズして、連続希釈した脾臓ホモジネートをＢＨＩブロス中で一晩インキュベートし、ＢＨＩ寒天プレートに播種した。さらなる継代には、アリコートを再度０．１〜０．２Ｏ．Ｄまで増殖させ、−７０℃で冷凍し、再び細菌力価を連続希釈によって決定した。初代継代（継代０）の後で、この順序を合計４回繰り返した。
【０５０７】
細胞内サイトカイン染色：ＩＦＮ−γ
【０５０８】
５０Ｕ／ｍｌのヒト組み換えＩＬ−２および１マイクロリットル／ｍｌのＢｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（登録商標）；PharMingen, San Diego, CA）を添加した完全ＲＰＭＩ−１培地で、ＨＩＶ−ＧＡＧ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ、配列番号３４）、リステリアＬＬＯ（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ、配列番号３５）またはＨＰＶウイルス遺伝子Ｅ７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（配列番号２２）に対する細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）のエピトープの存在下または不在下において、１マイクロモル濃度でリンパ球を５時間培養した。はじめに細胞の表面染色を行い、洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを用いて、製造業者の推奨（PharMingen, San Diego, CA）に従って細胞内サイトカイン染色に供した。細胞内ＩＦＮ−γ染色には、ＦＩＴＣ結合ラット抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（クローンＸＭＧ  １．２）およびそのアイソタイプ対照Ａｂ（ラットＩｇＧ１、どちらもPharMingen社製）を使用した。１％ウシ血清アルブミンおよび０．０２％アジ化ナトリウム（ＦＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ）を含有するＰＢＳ中で、全部で１０６細胞を４℃で３０分間染色してから、ＦＡＣＳ緩衝液中で３回洗浄した。ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）フローサイトメーターまたはファックスキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標））計器（Becton Dickinson, San Jose, CA）のいずれかで試料データを取得した。ファックスキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標））フローサイトメーターを使用してＣＤ８（ＰＥＲＣＰ結合、ラット抗マウスクローン５３−６．７、Pharmingen, San Diego, Calif）、ＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ結合、ラット抗マウスクローンＭＥＬ−１４）、および細胞内ＩＦＮ−γの３色フローサイトメトリーを行い、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェア（Becton Dickinson, Mountain View, CA）を用いてデータをさらに分析した。ＣＤ８＋および細胞内ＩＦＮ−γ染色について分析する前に、細胞をＣＤ８（高密度）およびＣＤ６２Ｌ（低密度）でゲートをかけた。
【０５０９】
結果
【０５１０】
マウスにおける継代が組み換えリステリア・モノサイトゲネスの病原性を増加する
【０５１１】
異なる３つのコンストラクトを用いて、組み換えリステリ菌アワクチンの継代がベクターに与える影響を決定した。これらのコンストラクトのうち２つがパッセンジャー抗原のゲノム挿入を保有しており、すなわち、第１のコンストラクトはＨＩＶｇａｇ遺伝子（Ｌｍ−Ｇａｇ）を含み、第２のコンストラクトはＨＰＶ  Ｅ７遺伝子（Ｌｍ−Ｅ７）を含む。第３のコンストラクト（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）は、切断されたＬＬＯと融合されたパッセンジャー抗原（ＨＰＶ  Ｅ７）の融合遺伝子を含むプラスミド、およびリステリア菌の病原性因子を制御する陽性調節因子である遺伝子コード化ｐｒｆＡを含んでいた。それなしでは細菌が非病原性となるため、生体宿主において選択圧力がプラスミドの保存に有利に働くように、このプラスミドを用いてｐｒｆＡ陰性変異体を補完した。３つのコンストラクトはすべて、多くの細菌の世代を得るために広範に体外で増殖させた。
【０５１２】
脾臓において生存する細菌の数によって測定されるように、最初の２継代のそれぞれを用いて細菌を継代させることにより、細菌の病原性増加をもたらした。Ｌｍ−ＧａｇおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７については、各継代の第２継代まで病原性が増加した（図１４Ａ）。プラスミド含有コンストラクトＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、病原性における最も飛躍的な増加を示した。継代を行う前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の初回免疫用量を１０７細菌まで増加しなければならず、細菌を回収するために、脾臓を２日目に採取する必要があった（Ｌｍ−Ｇａｇに対する１０５細菌の初回用量は３日目に採取されたのに対して）。初代継代を行った後、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の標準用量は３日目に採取できるほど十分であった。Ｌｍ−Ｅ７については、病原性は継代していない細菌の１．５桁分だけ増加した（図１４Ｂ）。
【０５１３】
したがって、マウスに継代させることは、リステリア菌ワクチン株の病原性を増加させる。
【０５１４】
継代はリステリア・モノサイトゲネスがＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する能力を増加する
【０５１５】
次に、継代が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発に与える効果を、ＨＩＶ−ＧａｇペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩ（配列番号３４）およびＬＬＯ  ９１−９９（ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ、配列番号３５）を用いて、ＭＨＣ−クラスＩに特異的な免疫優性ペプチドによる細胞内サイトカイン染色によって決定した。１０３ＣＦＵの継代させた細菌（Ｌｍ−Ｇａｇ）をマウスに注射することにより、有意な数のＨＩＶ−Ｇａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が惹起されたのに対し、同じ用量の継代していないＬｍ−Ｇａｇは、検出可能なＧａｇ特異的ＣＤ８＋細胞を誘発しなかった。継代されていない細菌の用量を１００倍増加させても、それらの相対的な非病原性を補完することはなく、実際、より高い用量でも、検出可能なＧａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が惹起されることはなかった。継代した細菌を同じ用量だけ増加すると、Ｇａｇ特異的Ｔ細胞誘発を５０％増加した（図１５）。ＬＬＯ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞でも、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘発において同じパターンが観察され、内在性リステリア抗原であるＬＬＯとともに観察されたことから、これらの結果はパッセンジャー抗原の特性によって引き起こされるものではないことが明らかになった。
【０５１６】
したがって、マウスに継代させることは、リステリア菌ワクチン株の免疫原性を増強する。
【０５１７】
実施例１３：抗生物質の不在下においてＰｒｆＡ欠失ＬＭ株のＰｒｆＡ含有プラスミドが安定する
【０５１８】
材料および実験方法
【０５１９】
細菌
【０５２０】
リステリア・モノサイトゲネス株ＸＦＬ７は、部分的に病原性を回復しＣＡＰ抵抗をもたらすｐＧＧ５５を保有するｐｒｆＡ遺伝子ＸＦＬ７に３００塩基の欠失を含有し、特許文献６に記載されている。
【０５２１】
リステリア菌からプラスミドを抽出するためのプロトコル展開
【０５２２】
リステリア・モノサイトゲネスＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の研究作業用細胞バンク１ｍＬバイアルを、３４μｇ／ｍＬのＣＡＰを含有するＢＨ１倍地２７ｍＬに播種し、２００ｒｐｍで２４時間３７℃で増殖させた。
【０５２３】
培養液の２．５ｍＬずつの試料７つをペレット状にし（１５０００ｒｐｍで５分間）、５０μｌのリゾチーム溶液を用いて、そのペレットを３７℃で０〜６０分の様々な時間インキュベートした。
【０５２４】
リゾチーム溶液：
−１Ｍ二塩基性リン酸カリウム２９μｌ
−１Ｍ一塩基性リン酸カリウム２１μｌ
−ｌ４０％ショ糖５００（０．４５／μｍフィルタを通して濾過滅菌）
−水４５０μｌ
−リゾチーム６０μｌ（５０ｍｇ／ｍＬ）
【０５２５】
リゾチームを用いてインキュベートした後、懸濁液を前回と同様に遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、QIAprep Spin Miniprep Kit（登録商標）（Qiagen, Germantown, Maryland）のプロトコルの変更版に従って、各ペレットをプラスミド抽出に供した。プロトコルに対する変更は次の通りである。
１．緩衝液ＰＩ、Ｐ２およびＮ３の体積をすべて３倍増量して、増加したバイオマスが完全に溶解されるようにした。
２．Ｐ２を添加する前に、再懸濁した細胞に２ｍｇ／ｍＬのリゾチームを加えた。次いで、中和する前に、溶解液を３７℃で１５分間インキュベートした。
３．濃度を増加するために、５０μＬではなく３０μＬの溶液にプラスミドＤＮＡを再懸濁した。
【０５２６】
別の実験では、細胞をＰ１緩衝液＋リゾチームで１５分間インキュベートし、次いで、Ｐ２（溶解緩衝液）およびＰ３（中和緩衝液）を用いて室温でインキュベートした。
【０５２７】
それぞれの継代培養から単離した同じ体積のプラスミドＤＮＡを、臭化エチジウムで染色した０．８％アガロースゲルに流し、構造または分離の不安定性の兆候がないか調べるために可視化した。
【０５２８】
リステリア・モノサイトゲネスＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７からプラスミドを抽出することにより、リゾチームを用いたインキュベーション時間を増加すると、約５０分のインキュベーションでの最適レベルまで効率が向上することが明らかになった。
【０５２９】
これらの結果は、リステリア菌ワクチン株からプラスミドを抽出するための効率的な方法を提供する。
【０５３０】
レプリカ平板法
【０５３１】
元の培養液を希釈したものを、ＣＡＰ（３４μｇ／ｍＬ）の不在下または存在下において、ＬＢを含有するプレートまたはＴＢ寒天を含有するプレート上に播種した。選択的寒天と非選択的寒天との間の数の差異を、プラスミドの肉眼的な分離不安定性が存在していたかどうかを決定するために用いた。
【０５３２】
結果
【０５３３】
抗生物質の不在下におけるリステリア・モノサイトゲネス株ＸＦＬ７中のｐＧＧ５５プラスミドの遺伝的安定性（すなわち、選択圧力（例えば、抗生物質の選択圧力）の不在下において、プラスミドが細菌に保持される程度または細菌と安定して会合し続ける程度）を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ：５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｇ／ｍｌ大豆ペプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス）およびＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＢ：１０ｇ／Ｌグルコース、１１．８ｇ／Ｌ大豆ペプトン、２３．６ｇ／Ｌ酵母エキス、２．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、９．４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４）の両方において、二つの同一培地で、連続継代培養することにより評価した。２５０ｍＬのバッフル付き振盪フラスコ中の新規培地５０ｍＬに、一定数の（１ＯＤｍＬ）細胞で播種し、次いで、２４時間間隔で継代培養した。オービタルシェーカーで、培養液を３７℃および２００ｒｐｍでインキュベートした。各継代培養でＯＤ６００を測定し、ＬＢで３０世代およびＴＢで４２世代に到達するまでに経過した細胞の倍加時間（または世代）を算出するために用いた。各継代培養の段階（およそ４世代ごと）で分かっている数の細胞（１５ＯＤｍＬ）を遠心分離によってペレット状にし、上記Qiagen QIAprep Spin Miniprep（登録商標）プロトコルを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。精製後、プラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供し、続いて臭化エチジウム染色を行った。調製に用いたプラスミドの量は試料間で若干異なったものの、全体的な傾向としては、細菌の世代数と対応して一定の量であった（図１６Ａ〜Ｂ）。したがって、ｐＧＧ５５は、たとえ抗生物質の不在下であってもＸＦＬ７株において安定性を示した。継代培養の各段階で、寒天プレートを用いたレプリカ平板法により、安定性試験の最中にプラスミドの安定性も監視した。アガロースゲル電気泳動の結果と一致して、ＬＢまたはＴＢ液体培養のいずれにおいても、試験を通してプラスミド含有細胞の数に全体的な変化は見られなかった。（それぞれ、図１７および１８）。これらの所見は、ｐｒｆＡに変異体を含有するリステリア株において、ｐｒｆＡをコードするプラスミドが抗生物質の不在下で安定性を示したことを実証するものである。
【０５３４】
実施例１４：リステリア菌ワクチン株の冷凍保存条件の最適化
【０５３５】
材料および実験方法
【０５３６】
以下のプロトコルに従ってＬＢを用いた研究作業用細胞バンク（ＲＷＣＢ）を作製した：２Ｌの振盪フラスコ中のＣＡＰ３４μｇ／ｍＬを含むＬＢまたはＴＢに増殖させた２００ｍＬの培養液から、いくつかの異なるＯＤ６００で５ＯＤｍＬの試料を取り出した。５ＯＤｍＬの試料を２０％ｖ／ｖグリセロールを用いて冷凍保存し、−７０℃未満で１日冷凍してから解凍し、次いでそれを用いてスターター培養に用いたのと同じ５０ｍＬの培地に播種した。ＯＤ６００を監視することによりこれらの培養液の初期の増殖速度を測定し、遅滞期の兆候について成長曲線を比較した。
【０５３７】
増殖期中期で冷凍保存した５０バイアルのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を含有するＲＷＣＢを作製した。元のグリセロール原液からの細胞ＣＴＬ  ２００３＃０８１０Ｎを、３４μｇ／ｍＬのＣＡＰを含むＬＢ−寒天プレート上に画線培養した。２４時間のインキュベーション後、単一コロニーを選択して、５ｍＬのＬＢ−ＣＡＰで２４時間３７℃で増殖させ、次いでそれを用いて５０ｍＬのＬＢ−ＣＡＰを播種した。グリセロールを２０％ｖ／ｖまで加えてから、ＯＤ６０００．７で細胞を冷凍保存した。培養液を１ｍＬのアリコートとして、滅菌冷凍バイアル（cryovial）に入れて−７０℃未満で保存した。
【０５３８】
結果
【０５３９】
ｐＧＧ５５プラスミドを保有するリステリア・モノサイトゲネス株ＸＦＬ７（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と称される）を冷凍保存するための最適な培養密度を決定するために、２００ｍＬ（ミリリットル）のバッフル付き振盪フラスコ中で、ＬＢまたはＴＢのいずれかを用いて細菌を増殖させた。様々な６００A光学濃度（ＯＤ６００）で、５ＯＤｍＬ（すなわち、ＯＤ６００の値とｍｌで表した培養液の体積との積）のアリコートを除去し、グリセロールを２０％ｖ／ｖまで加え、細胞を−７０℃で冷凍した。−７０℃で２４ｈ（時間）保存した後、５ＯＤｍＬの試料を解凍し、同種の新規培地（ＬＢまたはＴＢ）５０ｍＬを播種するために用いて、初期の成長速度を監視した。すべての培養物は、直ちに指数関数的な増殖を始め、遅滞期の兆候は見られなかった（図１９）。したがって、利用したＯＤ６００の中で、最も高いＯＤ６００（ＬＢは０．８、ＴＢは１．１）が、短期間の冷凍保存に最適であると決定した。
【０５４０】
次に、２０％ｖ／ｖグリセロールを０．８ＯＤ６００培養液に加えて−７０℃で保存することにより、ＬＢを用いた研究作業用細胞バンク（ＲＷＣＢ）を作製した（上記の材料および実験方法の項目を参照）。冷凍する前に、実施例１３に記載するようにレプリカ平板法を用いて、ＲＷＣＢの生存能力を決定した。規定間隔後にＲＷＣＢのバイアルを解凍し、生存能力を決定した。図２０に示すように、第１のＬＢ細胞バンクにおける生存能力は、−７０℃で保存した後に１×１０９から３×１０８ＣＦＵ／ｍＬへと減少したと思われた。
【０５４１】
今度は、それぞれ０．７２および０．７４のＯＤ６００で、第２および第３のＬＢ  ＲＷＣＢを作製した。これらの２つのＲＷＣＢは、一連の試験を通して、８から１２×１０８ＣＦＵ／ｍＬの範囲の生存能力を示し、生存能力における減少は見られなかった。これらのＲＷＣＢと第１のＲＷＣＢとの間の差異は、冷凍保存した時点でのＯＤ６００における差異に起因する可能性が高い。したがって、光学濃度０．８は、指数関数的な増殖の終わりおよびＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の定常期の初めに対応する可能性が高い。したがって、ＯＤ６０００．７がその後用いられた。第２のＲＷＣＢには２００３＃０９３３Ａの番号を割り当て、その後の実験で使用する培養液を播種するために利用した。
【０５４２】
また、培養液からＯＤ６００１．１でＴＢ  ＲＷＣＢを作製した。生存細胞の数は１×１０９ＣＦＵ／ｍＬで安定していた（図２１）。
【０５４３】
これらの所見は、本発明の方法（例えば、２０％グリセロールおよびＯＤ６０００．７の条件）が、安定した長期の生存能力を持つ冷凍保存されたリステリア菌ワクチン株および原液の産生において有用性を有することを証明するものである。
【０５４４】
実施例１５：振盪フラスコ発酵においてリステリア菌ワクチン株を増殖するための培地の最適化
【０５４５】
材料および実験方法
【０５４６】
培養液
【０５４７】
４つの異なる規定培地（容積５０ｍＬ）のそれぞれに２５０μＬアリコートのＬＢ  ＲＷＣＢを播種し、２５０ｍＬ振盪フラスコ内で３７℃で一晩インキュベートした。次いで、２０ＯＤｍＬの培養液５０ｍＬを用いて２Ｌの振盪フラスコ内の同じ培地２００ｍＬに播種した。この種類の細胞増殖手順は、細菌の生存能力および指数関数的な増殖を促す。
【０５４８】
結果
【０５４９】
その増殖能を評価するために、ＬＢおよびＴＢ中のリステリア菌ワクチン株の成長曲線をさらに詳細に調べた。ＬＢおよびＴＢにおいて到達した最大ＯＤ６００は４および０．８ユニットであり、それぞれ約１×１０１０および９×１０８ＣＦＵ／ｍＬに対応していた（図２２）。
【０５５０】
次いで、ＴＢの増殖と同様の増殖を支持することが可能な規定の合成培地を開発するために実験を行った。優れた緩衝能力が振盪フラスコ内で増殖するための要求にふさわしいため、リン酸緩衝液の代わりにＭＯＰＳ  ｐＨ緩衝液を用いた。下の表３Ａでは、出発点として使用した式をまとめて示した。ｐＨ緩衝液および標準成分（「基本成分」）に加えて、栄養補助剤を含有する培地がワクチン株の増殖を向上すると予想された。これらの栄養補助剤を、必須化合物、アミノ酸、ビタミンおよび微量元素の４つの群に分けた。
【０５５１】
【表３Ａ】
0005479918.tif 000005
【０５５２】
後者３群（アミノ酸、ビタミン、微量元素）による栄養補助剤の補給がＬｍ−ＬＬ０−Ｅ７の増殖を向上するかどうかを決定するために、５０ｍＬのスターター培養液中で増殖させ、次いで、振盪フラスコ内の以下の培地の培養液２５０ｍＬで増殖させた。
１．バルク培地（すなわち、水＋表３Ａの基本成分）、必須成分、アミノ酸、ビタミンおよび微量元素．
２．バルク培地、必須成分、アミノ酸およびビタミン
３．バルク培地、必須成分およびアミノ酸
４．バルク培地および必須成分
【０５５３】
ＡＡおよびビタミン両方の存在が培養液５０ｍＬにおける有意な増殖を支持するために必要であり、微量元素の存在が増殖率を高めた（図２３）。しかしながら、２００ｍＬの段階では、微量元素の存在は増殖率に影響を及ぼさなかった（図２４）。５０ｍＬの段階において、微量元素は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がＬＢ細胞バンクから規定培地へ適応するのを支持した可能性がある。これらの結果に基づいて、表３Ａの４つすべての群を次の実験における規定培地に含んだ。
【０５５４】
次の実験では、表３の４群の栄養補助剤の濃度を増加することの影響を調べた。これらの４群すべての成分濃度を２〜４倍増加して、それぞれ「２×」および「４×」の規定培地を作製した。また、ＮＨ４ＳＯ４の形態の無機窒素を１、２または３ｇ／Ｌ含有する４×規定培地を検査した。これらの５つの培養液の増殖を上記５０ｍＬ〜２００ｍＬプロトコルの表３Ａ（「対照」）の培地と比較した。
【０５５５】
最初の４時間は、検査したすべての培地が同様の増殖を示した。この時点で、対照培地における増殖は減速し始め、１３時間で完全に停止したのに対し、２×および４×培地は指数関数的な増殖を支持し続けた（図２５）。２×および４×培地を含有するフラスコの最終ＯＤ６００は、それぞれ２．５ユニットおよび３．５に達した。ＮＨ４ＳＯ４を含むことで、最終的なバイオマス濃度がわずかに増加したが、増殖率は大幅に低下した。
【０５５６】
したがって、栄養レベルを増加させてＮＨ４ＳＯ４を含まないことが、規定培地におけるワクチン株の増殖を有意に向上した。これらの結果に基づいて、次の実験にはＮＨ４ＳＯ４を含まなかった。
【０５５７】
次に、５０ｍＬおよび２００ｍＬの培養液において以下の追加修飾が培地に与える影響を調べた：１）表３の４群の栄養補助剤の濃度をさらに増加する（元の濃度の６倍および８倍まで）、２）グルタミン（有機窒素源）の濃度を元の濃度の８倍まで増加する、３）培地から鉄を除去する。図２６（２００ｍＬの培養液からの結果）に示すように、グルタミンまたは４群の栄養補助剤のいずれかの濃度をさらに増加することにより、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の最終バイオマス濃度は向上されなかった。それとは対照的に、鉄を除去することで、最大バイオマス濃度が減少された。
【０５５８】
４×培地のグルコース濃度を増加することの効果を調べた。グルコース濃度を１０１５ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌに増加することにより、増殖率およびバイオマスが有意に向上された。
【０５５９】
それぞれの４×栄養補助剤の最終ＯＤ６００は４．５であり、これは１．１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬに対応し、ＴＢで取得された最終バイオマスとほぼ同じであった。したがって、ＴＢと同じ程度リステリア菌ワクチン株の増殖を支持する規定培地を開発した。
【０５６０】
結論として、表３の４群の栄養補助剤の元の濃度の４×濃度を含む培地（これ以降、「４×培地」と称される）は、５０ｍＬおよび２００ｍＬの振盪フラスコ培養液におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の最適な増殖を支持した。最適な増殖には鉄が必要であった。グルコースを１０ｇ／Ｌから１５ｇ／Ｌへと増加することにより、得られた合計バイオマスが増加した。得られた最適化規定培地のレシピを表３Ｂに示す。
【０５６１】
【表３Ｂ】
0005479918.tif 000006
【０５６２】
実施例１６：バッチ発酵においてリステリア菌ワクチン株を増殖するための培地の最適化
【０５６３】
材料および実験方法
【０５６４】
３４μｇ／ｍＬのＣＡＰを含む４５００ｍＬのＴＢまたは規定培地のいずれかを含有するＦＴ  Ａｐｐｌｉｋｏｎ社製５／７Ｌ発酵槽容器を本実施例に利用した。２０ＯＤｍＬのＬｍ−ＬＬ０−Ｅ７を用いて、ＣＡＰを含有する２００ｍＬのスターター培養液を播種し、オービタルシェーカーで、培養液を３７℃および２００ｒｐｍで１０時間、増殖期中期に達するまで増殖させた。４５０ＯＤｍＬの本培養液を用いて発酵槽に播種した。３７℃、７．０、および２０％飽和レベルで発酵する間、温度、ｐＨおよび溶存酸素濃度を連続的に監視および調節した。
【０５６５】
結果
【０５６６】
溶存酸素濃度またはｐＨ等の因子は、振盪フラスコ内で制御されないため、前回の実施例においてそれらの因子がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の増殖を制限した可能性があった。この可能性と一致して、振盪フラスコ内の培養液のｐＨは約５．５ユニットまで低下した。それとは対照的に、バッチ発酵槽において、ｐＨおよび溶存酸素レベルが連続的に監視および調節された。このようにして、バッチ発酵に用いる培地を最適化するために、本実施例において別の実験を行った。
【０５６７】
Ｌｍ−ＬＬ０−Ｅ７の培養液２００ｍＬをＴＢまたは表３Ｂの規定培地のいずれかにおいて、増殖期中期に達するまで一晩増殖させた（ＯＤ６００１〜２）。次いで、４５０ＯＤｍＬのスターター培養液を用いて、同じ培地を含有する５Ｌのバッチ発酵槽に播種した。ＴＢ培養液において増殖させた細菌は、播種すると直ちに特異的な増殖率０．５ｈ−１で指数関数的に増殖し始め、次いで、播種から約７時間後に減速期に突入し、生存細胞密度２．１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬで定常期に達した（図２７Ａ）。規定培地で増殖させた細菌も指数関数的な増殖を示したが、増殖率は０．２５ｈ−１であり、最終生存細胞密度は１．４×１０１０ＣＦＵ／ｍＬであった。バッチ発酵からは合計収率８．９×１０１３ＣＦＲが得られた。両方のバッチ発酵は、炭素制限の結果として定常期に突入し、定常期にはグルコース濃度がゼロに達したという所見によって証拠付けられた。ＬＭはＡＡを炭素源として利用することができないため、細胞は炭水化物の不在下では増殖することができなかった。
【０５６８】
検査したすべての密度で、ＴＢで増殖させた細菌は、プロセスの次の段階中も、その生存能力を保持した（図２７Ｂ）。規定培地で増殖させた細菌は、生存能力を３〜４の光学濃度まで維持した（図２７Ｃ）。
【０５６９】
鉄の沈殿を防ぐためには、鉄とマグネシウム鉄を別々に水に溶解させて６０℃まで加熱し、次いで、濾過滅菌すると同時に発酵槽の培養培地に加えることができることが、さらに明らかになった。
【０５７０】
実施例１７：リステリア菌ワクチン株の冷凍保存条件のさらなる最適化
【０５７１】
次の実験では、４つの異なる添加剤、すなわち、グリセロール、マンニトール、ＤＭＳＯおよびショ糖のそれぞれの存在下において、冷凍保存したＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の生存能力を調べた。対照としてＰＢＳを用いた。また、−２０℃、−７０℃、および液体窒素中での急速冷凍後に−７０℃で保存、の３つの異なる保存方法を比較した。
【０５７２】
表３Ｂの４×培地２００ｍＬを含有する振盪フラスコをＯＤ６００１．６まで増殖させた。１０ｍＬずつの試料１５本を遠心分離によってペレット化し、上清を除去して、２％ｗ／ｖの適切な凍結保護物質を含有する１０ｍＬのＰＢＳ中に細胞を再懸濁させた。再懸濁した各試料を１ｍＬのアリコートとしてバイアルに移し、適切な方法を用いて保存した。保存前および保存後３〜２８日に、レプリカ平板法を用いて生存能力を測定し（ＣＡＰ有りおよび無しで）、残りの生存細胞の割合を算出した。細菌が約１００％の生存能力を示したことから、２％ｗ／ｖグリセロールを用いた−７０℃の保存が最良の短期冷凍保存方法であることが分かった。用いられたいくつかの条件下において、細胞は３〜２８日に渡って高い生存能力を維持した（図２８〜３０）。規定培地で増殖させたリステリア菌のワクチンベクターは、確立した腫瘍の増殖から効果的にマウスを防御した（図３１）。
【０５７３】
結論：実施例１３〜１７
【０５７４】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７中のｐＧＧ５５プラスミドの遺伝的安定性には、３５または４２細胞世代以降、構造的または分離的な不安定性の兆候は見られなかった。ＲＷＣＢを作製し、そのＲＷＣＢに保存した細胞の生存能力は、冷凍および解凍後、約ｌ×１０９ＣＦＵ／ｍＬで一定の状態を保った。２つの複合培地がＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の増殖を支持する能力を評価した。ＬＢおよびＴＢは、約９×１０８ＣＦＵ／ｍＬおよび１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬの最大細胞密度まで増殖を支持し、それぞれＯＤ６０００．８および４．０ユニットに対応するものであった。ＴＢと同様の程度まで増殖を支持した規定培地を開発し、振盪フラスコ培養に最適化した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、振盪フラスコ培養と比較すると、５Ｌのバッチ発酵槽においてより高いバイオマス濃度に達したが、それは発酵槽におけるｐＨを制御する能力に起因する可能性が高い。細胞の冷凍保存のための最適な方法についても調べた。２％ｗ／ｖグリセロールを含有するＰＢＳ中に冷凍保存したＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、３日間−７０℃未満で保存した後に約１００％の生存能力を示した。
【０５７５】
実施例１８：１×１０９および３．３×１０９のＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７ワクチンは安全であり、子宮頸癌患者の臨床的指標を向上する
【０５７６】
使用した投与計画は、プライミングと追加免疫の単回投与という、最小限のワクチン投与計画になるように意図的に設計した。治療意図（Inten−to−treat）群では、５３．８５％の患者に病勢安定が報告され、３８．５％の患者に勢進行が報告され、１人の患者（７．７％）は他覚的部分寛解（ＰＲ）を示した。全体として、評価可能な１３人の患者のうち４人（３０．０８）に腫瘍量の減少が見られ、３人の患者は腫瘍量の約２０％の減少、そして１人の患者は３２％の減少を経験した。本治験は、1×1010生命体/ワクチン接種未満という用量上限を確立した。
【０５７７】
目的
【０５７８】
主要目的：進行性、再発性または重度の子宮頸部扁平上皮癌において、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７型を発現する生きたリステリア・モノサイトゲネスのワクチンベクターを用いたワクチン接種の安全性および実行可能性を確立すること。
【０５７９】
副次目的：ベクターによって送達される誘導された免疫の種類、およびワクチン中に送達される生命体の数との関係を決定すること、ならびに試験期間中の生存を監視し、発生する何れの反応をも記述すること。
【０５８０】
試験デザイン：Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７−０１のプロトコルは、非盲検、非ランダム化試験であった。進行性、再発性または重度の子宮頸部扁平上皮癌に罹患する合計２０人の成人女子が試験に組み入れられた。２１日に１回、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を静脈内投与し、合計２回の治療を行った。各投与の後で患者を５日間入院させ、各注入後にＩＶおよび経口によるアンピシリン投与を行った。安全性および有効性を評価する目的で、また研究デザインに従って免疫性の分析のために試料を取得する目的で、通院による経過観察を行った。
【０５８１】
本試験にエントリした患者全員について、死亡するまで経過を観察することとした。
【０５８２】
（予定していたおよび実際に分析を行った）患者の人数および種類：２０人の予定のところ、１５人が治療および分析を受けた。患者は転移性子宮頸癌を有し、以前に行った化学療法、放射線療法、および／または手術は失敗に終わっていた。
【０５８３】
診断および主な組み入れ基準：１８歳以上の患者が試験に参加する資格を有するものとした。患者は、進行性、再発性または重度であって、現存の治療に対して不応性であると組織学的に確認された子宮頸癌に罹患していなければならず、遅延型過敏症（ＤＴＨ）スクリーニングパネルに陽性の反応を示す必要があった。患者は１つの原発性癌のみを有していなければならなかった。患者は、米国東部癌治療共同研究グループ（ＥＣＯＧ）のパフォーマンス・ステータス（ＰＳ）≦２（カルノフスキー＞６０％）でなければならなかった。患者の平均余命は６ヶ月を上回っていなければなかなかった。
【０５８４】
治験薬、用量および投与方法、ならびにロット番号：全コホートに用量漸増デザインを用いて、コホート内の各患者に同じ用量を２回投与するように、３つの用量レベルで静脈内（ＩＶ）注入によりＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を投与した。２１日に１回、それぞれの試験参加者に３０分に渡る注入を行い、合計２回の治療を行った。
【０５８５】
予定していた第４コホートでは、用量制限毒性基準を満たしたため投薬は行われず、その結果、第３コホートの後で試験を中止した。
【０５８６】
対照治療、用量および投与方法、ならびにロット番号：本試験において対照治療は用いられなかった。
【０５８７】
治療期間：１日目および２２日目に行ったＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７を用いた２回の治療を含め、全体で患者の参加は１１１日間続いた（スクリーニングを除く）。
【０５８８】
評価基準
【０５８９】
安全性：
【０５９０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７投与の安全性は、以下に関する投与前ベースラインからの変化に基づいて評価した。
・注射から１０分後の注射部位の腫脹、刺激感、免疫応答またはその他の異常の観察
・身体検査所見
・バイタルサイン
・臨床パラメータにおける変化（血液学および血清化学）
・尿中、血液および糞便試料におけるリステリア・モノサイトゲネスの存在
・ＥＣＯＧパフォーマンス・ステータス
・報告された有害事象
【０５９１】
免疫原性
【０５９２】
フローサイトメトリーによるＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のためのサイトカイン分析、ならびにＤ４＋およびＣＤ８＋活性化細胞の決定による評価により、抗腫瘍応答のパラメータにおける投与前ベースラインからの変化に基づいて、２回用量でのＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７投与の免疫原性を評価した。これらの分析のために、初回の投与前ならびに３、６、１２および１６週目に、血液試料を採取した。
【０５９３】
試験の最中に採取した血液試料を、生存能力について検査した。採取した試料のいずれも生存能力が低かったため、評価可能なデータが得られなかった。また、何人かの患者は試料が不足していた。
【０５９４】
有効性：
【０５９５】
ＲＥＣＩＳＴ基準を用いて腫瘍応答を決定した。
【０５９６】
試験期間中、患者全員を生存のために監視した。
【０５９７】
統計手法
【０５９８】
本試験では、推計分析は予定されていなかった。分析は記述統計学を用いて行われた。すべての分析は、バージョン８．２またはそれより上のバージョンのＳＡＳ（登録商標）を用いて、特定の分析に適切な手順により行った。
【０５９９】
安全性の結果
【０６００】
全体として、１５人（１００％）の患者が有害事象（ＡＥ）を経験した。最も多く報告されたＡＥは、発熱、悪寒、貧血、頭痛、嘔吐、悪心、頻拍症および筋骨格痛であった。薬剤に関連するＡＥには、発熱、嘔吐、悪寒、頭痛、頻拍症、および悪心を含む「インフルエンザ様」症状が含まれていた。
【０６０１】
合計で２人の患者が６つの重篤な有害事象（ＳＡＥ）を報告した（３．３×１０９および１×１０１０群にそれぞれ１人ずつ）。ＳＡＥには、３．３×１０９群における血中アミラーゼの増加、貧血、心臓／呼吸停止、代謝性アシドーシスおよび腎不全、１×１０１０群における血中クレアチニンの増加が含まれた。治験担当医師により、それらの事象は試験ワクチンとは関連がないと見なされた。３．３×１０９群の患者は重篤なＡＥのために死亡した。
【０６０２】
１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群において、それぞれ合計で２人（４０．０％）、４人（８０．０％）、および３人（６０．０％）の患者が重度のＡＥを報告した。５人（３３．３％）の患者において重度であると見なされた、対象となるＡＥで治療に関連するのは、熱性疾患（発熱）および肝機能分析（ＧＧＴ増加および乳酸脱水素酵素増加）であった。
【０６０３】
試験中、大半の患者が臨床化学的および血液学的な異常値を示した。これらの患者のうちの少数には臨床的に有意な値が報告され、これらの患者のうちの何人かについては、観察された異常が基礎疾患に起因する可能性があった。臨床的に有意な化学パラメータは、６人の患者において主にＧＧＴ、尿素およびクレアチニンであった。臨床的に有意な血液学的パラメータは、８人の患者において主にヘマトクリット、ＨｂおよびＲＢＣであり、これらの患者のほとんどにはＡＥとして貧血が報告されており、治験担当医師によって、重度の重症度ではあるが、試験ワクチンとはおそらく関連していないと見なされた。
【０６０４】
全体として、理学的検査における変化は臨床的に有意であるとは見なされなかった。異常な理学的所見の大半は、疾患である子宮頸部の癌と関連していた。大半の患者に報告された血圧（低下）、心拍数（増加）および体温（上昇）における経時的な変化中央値は、一見したところ、発熱反応と一致しているようであった。しかしながら、投与後１２時間で中央値は正常な範囲内となり、治療群間での差異は見られなかった。体温の上昇が血圧低下および心拍数増加をもたらす等の発熱と循環生理学的事象との間の周知の関係を考慮すると、発熱時のみに循環器系のＡＥが観察されたことは、これらの事象が関連している可能性を示唆し、また、低血圧および頻拍症は、ほとんどの患者に報告された発熱の付帯徴候である可能性が高いことを示唆するものであった。
【０６０５】
リステリア菌は血液から急速に除去され（１人の患者のみが、投与後２日目にリステリア菌数の低下を示したが、翌日には除去されていた）、尿、糞便中への排出も観察されなかった。
【０６０６】
ＤＬＴ基準に従い、１×１０１０群の３人の患者（患者０１−００７、０２−００６、０４−００６）が経験した低血圧イベントにより、本試験は中止された。
【０６０７】
有効性の結果
【０６０８】
合計３８．５％の患者が病勢進行を報告した一方で、５３．８５％の患者において病勢安定が報告され、ＲＥＣＩＳＴ基準による部分寛解が１人の患者（７．６９％）に観察された。標的病変の部分寛解は、患者０４−００３（病変の大きさにおける合計３２．５％の縮小）に報告され、非標的病変の完全寛解が患者０１−００４に報告された。
【０６０９】
全体として、腫瘍の大きさの平均値に低下は見られなかった。興味深いことに、患者を一人一人個別に検討した場合は、４人の患者において全体的な腫瘍の大きさの減少が観察された。７９日目には、患者０３−００１の病変をすべて数えたわけではないことに留意されたい。サンプルサイズが小さかったために、統計的検出力を適用することができなかった。標的病変に対するＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の効果を決定し、治療に対する全体的な応答を評価するためには、より大きいサイズのサンプルを用いてさらに評価を行う必要がある。
【０６１０】
患者のうちの１人は死亡する前に試験から離脱していたものの、試験のプロトコル期間中に２件の死亡があった。これらの死亡はどちらも治験薬の投与とは無関係であると見なされた。さらに３人の患者が、試験の生存経過観察中に死亡した。
【０６１１】
全体として、ＥＣＯＧパフォーマンス・ステータスおよびカルノフスキー指標における経時的な向上は見られなかった。
【０６１２】
結論
【０６１３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、大半の患者に発熱、悪寒、悪心および嘔吐を含む一連のインフルエンザ様副作用をもたらした。これらの副作用は、主として軽度から中程度の重症度であった。
【０６１４】
この集団における用量制限性の低血圧は、１×１０１０の用量で観察された。
【０６１５】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、１×１０９および３．３×１０９の用量で、末期の子宮頸癌患者において安全に使用することができる。
【０６１６】
患者の内訳
【０６１７】
患者の内訳の概要を表４に示す。合計１５人の患者が試験に組み入れられた。５人の患者はそれぞれ、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０９）、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（３．３×１０９）、またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０１０）（ＣＦＵ）の２回投与を受けた。７人の患者がすべての治療および経過観察のための通院を終了したが、３．３×１０９コホートの患者で経過観察のための通院をすべて終了した者はいなかった。合計８人の患者が、病勢進行（６人の患者）、治験担当医師の決定、および死亡（各１名）のために試験を中止した。
【０６１８】
２人の患者が、試験への組み入れ資格の例外を認められた。１人の患者は、クレアチニンの値が許容される組み入れ／除外基準よりも高い状態で試験に組み入れられ（０１−００１）、患者０２−００６は、試験エントリの時点では測定可能な病変を有さなかった。組み入れ資格の例外に対する正当化が試験担当医師から提供され、試験依頼者から承認された。
【０６１９】
【表４】
0005479918.tif 000007
【０６２０】
プロトコル期間（１１１日間）中に発生したことが報告された２件の死亡（患者０４−００５および０４−００４）があった。しかしながら、後者の患者は途中で試験から離脱させられ、患者の死亡についての情報は、生存経過観察中に得られたものである。患者０１−００１、０１−００２および０１−００３は、生存経過観察中に死亡した。
【０６２１】
全体として、本試験に参加した患者の年齢は３５歳から７２歳までの範囲であり、平均年齢は５６歳であった。白人女性が試験集団の５３．３％を占め、本試験に含まれた他の人種群はラテン／ヒスパニックであった。全体として、患者の６０％は閉経後であり、患者の４０％は不妊症であった。一連の治療において、年齢、身長および体重に関連する違いはなかった。
【０６２２】
治療／手術歴
【０６２３】
全体として、最も多く報告された癌以外の有意な治療／手術歴および合併症は４人（２６．７％）の患者に見られた消化器系であり、内分泌代謝、筋骨格および尿生殖器がそれぞれ２人（１３．３％）の患者に見られた。
【０６２４】
全体として、最も多く報告された癌に関連する有意な治療／手術歴および合併症は９人（６０％）の患者に見られた尿生殖器であり、消化器系、腎臓、および筋骨格がそれぞれ６人（４０．０％）の患者に見られた。
【０６２５】
全体的な罹病期間の中央値は２．０年であった。合計１３人（８６．７％）の患者が以前に化学療法を受けており、これらの患者全員がプラチナ含有化合物（リスト１６．４．５．６）の投与を受けたことがあった。１人の患者（０１−００３）は以前に化学療法を受けておらず、１人の患者はエストロゲン投与のみを受けていた（０２−００６）。患者０４−００１および０１−００５以外は、すべての患者が以前に放射線照射（８６．７％）を受けたことがあった（リスト１６．４．５．６）。各投与量群から２名ずつ６人（４０％）の患者（０１−００２、０１−００４、０４−００２、０４−００４、０１−００５および０２−００６）が、以前に疾患のための手術を受けたことがあった。
【０６２６】
スクリーニング時の前治療薬および併用薬
【０６２７】
全体として、スクリーニング時に患者に頻繁に使用されていた併用薬として、鎮痛剤、抗炎症剤および抗リウマチ剤が５人（３３％）の患者、利尿剤が４人（２６％）の患者、酸関連疾患のための薬剤、および精神安定剤が、それぞれ３人（２０．０％）の患者に使用されていた。
【０６２８】
最も多く使用された併用薬は、基本語でトラマドール（２０．０％）、ジクロフェナクおよびオメプラゾール（１３．３％）であった。
【０６２９】
２人の対象（対象０１−００３（１×１０９群）および０２−００６（１×１０１０群））以外は、患者全員が以前にプラチナ療法を受けていたが、最初の試験用量が投与される少なくとも４週間前に中止された。
【０６３０】
スクリーニング時のＨＰＶ−１６Ｅ７組織生検
【０６３１】
ＨＰＶ−３１生検陽性を示した３．３×１０９群の患者０４−００４および０４−００５以外は、他の患者全員がスクリーニング時のＨＰＶ−１６Ｅ７生検に陽性を示した。１×１０１０群の患者０２−００６は、試験開始時に測定可能な病変を持たずに試験に組み入れられたので記録保存された試料が存在しなかったため、この患者からの生検試料を入手することができなかった。
【０６３２】
アネルギーパネルおよびペニシリンアレルギー
【０６３３】
患者全員が、カンジジン、ツベルクリンおよび／または破傷風／ジフテリアのうちの１〜３つの抗原に陽性反応を示した。ペニシリンに対する反応を示した患者はいなかった。
【０６３４】
疾患の重症度
【０６３５】
下の表において、各群の患者の出身国、診断の時期、年齢、診断時および投与時の病期、ならびに前治療の様式が明瞭に分かる。「診断時の病期」は、最初はプロトコルに含むことが要求されていなかったが、医薬品開発受託機関（ＣＲＯ）により収集されて検証され、その後のプロトコル補正時にデータベースに入力された。
【０６３６】
【表５】
0005479918.tif 000008
【０６３７】
【表６】
0005479918.tif 000009
【０６３８】
疾患の重症度の程度は、全群間で同程度であった。1人を除く患者全員が化学療法に失敗しており、ほとんどが外科的および放射線学的治療にも失敗していた。
【０６３９】
安全性評価
【０６４０】
曝露の程度
【０６４１】
試験に組み入れられた１５人の患者全員に、１日目および２２日目に、生理食塩水（体積２５０ｍｌ）中の試験ワクチンを、３０分間の静脈内注入として投与した。
【０６４２】
投与された実用量
【０６４３】
本試験において、１×１０９、３．３×１０９、１×１０１０および３．３×１０１０の通常用量を投与することが、治験依頼者の意向であった。試験バイアルには通常用量に基づいてラベルを貼り、実用量については、各用量ごとに分析証明書（Certificate of Analysis（ＣｏＡ））を付けた。それぞれ１ｍｌで完全な用量となる濃度とし、正確に１ｍｌが吸い上げられるように、材料にいくらか余裕を持たせるため、１本に１．１ｍｌを加えた。
【０６４４】
通常用量は、製剤の製造時の光学濃度に基づいて割り当てられ、６００ｎｍの波長域で製剤を透過する光の量を定量化することにより決定される。バッチを等量に分割して容器に入れる必要があり、また、放出試験を行うために冷凍する必要があるため、この迅速な手順が用いられる。冷凍／解凍サイクルの数は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の有効性を損なうことが明らかになっているため、最小限に抑えなければならない。実際の濃度は、希釈、播種および数量測定、次いで、その数量に基づいて用量を外挿することにより決定される。これは、初回のバイアル注入後に行い、各用量ごとにＣｏＡが提供される。本試験における最低用量の実用量は１，０００，０００，０００微生物と規定されているため、実際に数量を測定することは不可能であり、したがって、作業目的で迅速な推量が行われ、この数量は変動性であって、１×１０９の通常用量である薬剤ロットの実際の用量は異なるものであり、ログ単位の１／２を上回ることも多いことを認識した上で、より定量的な数量が提供される。
【０６４５】
本治験において実際に投与された用量を下の表7に示す。
【０６４６】
【表７】
0005479918.tif 000010
【０６４７】
所与の実用量は、指定された通常用量を超過していないことに留意されたい。
【０６４８】
曝露
【０６４９】
１日目および２２日目の２回、３０分の２５０ｍｌ注入で患者全員をＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に曝露した。下に示すように、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に関連する有害事象は、短期間のインフルエンザ様症状のようであった。
【０６５０】
【表８】
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【０６５１】
６人の患者が病勢進行のために治験を早期に中止した。１人の患者は、試験中に死亡し、１人の患者は、治験担当医師が化学療法および手術を再開する決定を下したために早期中止となった。その患者については後に考察する。
【０６５２】
有害事象
【０６５３】
有害事象のまとめ
【０６５４】
有害事象（ＡＥ）の概要を表９に示す。すべての命名法および定義は、有害事象共通用語規準（Common Terminology Criteria for Adverse Events v.3.0（ＣＴＣＡＥ  ３．０））、およびＡＥを１＝軽度、２＝中程度、３＝重度、および４＝活動不能または生命を脅かすにランク付けする４段階の等級分けシステムの使用に由来する。
【０６５５】
【表９】
0005479918.tif 000012
【０６５６】
１５人の患者全員が少なくとも１つのＡＥを経験した。最も多く報告されたＡＥは、「インフルエンザ様」症候群（発熱、悪寒、頭痛、嘔吐、悪心、筋骨格痛）、貧血および頻拍症であった。全体として、６０．０％の患者が重度のＡＥを経験し、１×１０９群（４０．０％）の患者と比較すると、３．３×１０９（８０．０％）および１×１０１０（６０．０％）群の患者からの報告がやや多かった。
【０６５７】
１５人の患者全員が治療に関連するＡＥ（おそらく関連しているまたは関連しているかもしれない）を経験した。治験担当医師により試験ワクチンと関連があると見なされたＡＥは、発熱、嘔吐、悪寒、頭痛、頻拍症、悪心、低血圧、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）および血中アルカリホスファターゼであった。該当するＡＥの中で、最も頻繁に報告されたのは熱性疾患、悪心および嘔吐の症状、ならびに悪寒であった。
【０６５８】
３．３×１０９群の患者０４−００５および１×１０１０群の患者０１−００６はＳＡＥを経験した。０１−００６はクレアチニンの増加を経験した。患者０４−００５は、本治験参加中に死亡した。該患者は等級４およびＳＡＥに関連する様々な腎不全、代謝の混乱、および心臓死を経験した。これらの事象と治療との関係は、すべての事象において「関連なし」と見なされた。また、１×１０９および３．３×１０９群の患者０１−００２は、等級４の呼吸困難を経験したため、迅速に治療して効果を得た。
【０６５９】
試験ワクチンの早期中止に至るＡＥは見られなかった。しかしながら、合計で８人の患者が試験を中止した（１×１０９群：２人の患者、３．３×１０９群：５人の患者、１×１０１０群：１人の患者）。中止の理由は、病勢進行（６人の患者）、治験担当医師の決定（１人の患者）、および死亡（１人の患者）であった。
【０６６０】
有害事象の解析
【０６６１】
器官別大分類（System Organ Class（ＳＯＣ））によるＡＥを表１０に示す。
【０６６２】
【表１０】
0005479918.tif 000013
【０６６３】
全体として、最も多く報告された器官別大分類（ＳＯＣ）は、それぞれ、全身障害および投与局所様態（１００％）、胃腸障害（８６．７％）、血液／リンパ系障害（６０．０％）、神経系障害（５３．３％）、心臓障害（４６．７％）、臨床検査（４６．７％）、代謝および栄養障害（４０％）、筋骨格および結合組織障害および血管障害（２６．７％）であった。報告された他のすべての事象は、２人以上の患者には経験されなかった。
【０６６４】
血液／リンパ系障害は、１×１０９群（１人［２０％］の患者）と比較すると、３．３×１０９（５人［１００％］の患者）および１×１０１０（３人［６０．０％］の患者）群の患者から報告された割合が高かった。臨床検査は、３．３×１０９（４人［８０．０％］の患者）および１×１０１０（３［６０．０％］患者）群の患者から報告されただけであった。１×１０１０群の患者のみが血管障害（４人［８０．０％］の患者）を報告した。
【０６６５】
基本語によるＡＥを表１１に示す。
【０６６６】
【表１１】
0005479918.tif 000014
【０６６７】
全体として、最も多く報告されたＡＥは、発熱（１００％）、悪寒、貧血および頭痛（５３．３％）、嘔吐（６０．０％）、悪心および頻拍症（４６．７％）、筋骨格痛（２６．６％）、低血圧、血中アルカリホスファターゼ増加、γ−グルタミルトランスフェラーゼ増加、食欲不振ならびに疲労（２０．０％）であった。
【０６６８】
低用量群（２人の患者［４０．０％］）と比較すると、嘔吐を経験した患者は３．３×１０９（３人［６０．０％］の患者）および１×１０１０（４人［８０．０％］の患者）群でやや多かった。低用量群（１人［２０．０％］の患者）と比較すると、３．３×１０９（４人［８０．０％］の患者）および１×１０１０（３人［６０．０％］の患者）群のほうが貧血を経験した患者が多かった。他の治療群の１人の患者（２０．０％）と比較すると、３．３×１０９群では５人の患者（１００％）が頻拍症を経験した。低血圧を経験したのは１×１０１０群の患者のみ（３人［６０．０％］の患者）であり、この事象は用量制限毒性基準を満たしていた（項目７．２．３．３を参照）。血中アルカリホスファターゼ増加およびγ−グルタミルトランスフェラーゼ増加は、３．３×１０９（２人［４０．０％］の患者）および１×１０１０（１人［２０．０％］の患者）群の患者から報告された。食欲不振は、１×１０９群の６０．０％の患者のみが経験した。腹痛およびアラニンアミノトランスフェラーゼ増加は３．３×１０９および１×１０１０群の１人の患者のみが経験した。１×１０９群の２人の患者（４０．０％）のみが疲労を報告し、１×１０１０群の２人の患者のみが傾眠を報告した。
【０６６９】
有害事象の重症度
【０６７０】
全体として、大半の患者（９人の患者［６０．０％］）が重度のＡＥを報告した。合計で、４人（２６．６％）および２人（１３．３％）の患者が、それぞれ中程度のＡＥおよび生命を脅かすまたは活動不能のＡＥを経験した。１×１０９群（２人［４０．０％］の患者）と比較すると、３．３×１０９群（４人［８０．０％］の患者）および１×１０１０群（３人［６０．０％］の患者）の患者から重度のＡＥがより多く報告された。
【０６７１】
全体として、最も頻繁に報告されたＳＯＣは、全身障害および投与局所様態：５人（３３．３％）の患者、血液およびリンパ系障害：３人（２０．０％）の患者、臨床検査：４人（２６．７％）の患者、胃腸障害ならびに筋骨格および結合組織障害：２人（１３．３％）の患者であった。いずれの治療群においても、２人以上の患者が他のすべての重度の／生命を脅かす事象を経験することはなかった。生命を脅かすまたは活動不能な事象は、血液およびリンパ系障害、呼吸器、胸部および横隔障害疾患、心臓障害、代謝および栄養障害、ならびに腎臓および泌尿器疾患と関連していた。
【０６７２】
最も多く報告された重度の程度のＡＥ（基本語）は、３人（２０．０％）の患者における発熱（全体としては３．３×１０９群の２人（４０．０％）の患者および１×１０１０群の１人（２０．０％）患者）、３人（２０．０％）の患者における貧血（１×１０９群の１人（２０．０％）の患者および１×１０１０群の２人（４０．０％）の患者）、２人（１３．３％）の患者におけるγ−グルタミルトランスフェラーゼ増加（両方の患者とも３．３×１０９群）、２人（１３．３％）の患者における筋骨格痛（両方の患者とも１×１０９群）であった。他のすべての重度の事象は、いずれの治療群においても２人以上の患者から報告されてはおらず、それらには疲労、全身性不腫、腹痛、下痢、痙攣、血中アミラーゼ増加、血中クレアチニン増加、血中乳酸脱水素酵素増加、リンパ不腫、および胸壁痛が含まれた。３．３×１０９群の患者０４−００５はアミラーゼ増加、貧血、アシドーシス、腎不全および心停止を経験した。この患者は、試験中に死亡した。また、１×１０１０群の患者０１−００６は、重度のクレアチニン増加を経験した。
【０６７３】
有害事象と治験薬との関係
【０６７４】
治験担当医師によって治療と関連した（おそらく関連しているまたは関連しているかもしれない）ＡＥであるとみなされたＡＥ（基本語）を有する患者数を表１２にまとめた。全体として、最も頻繁に報告されたワクチンに関連する事象は、発熱：１５人（１００％）の患者、嘔吐：９人（６０％）の患者、悪寒：８人（５３．３％）の患者、頻拍症および頭痛：７人（４６．７％）の患者、悪心：５人（３３．３％）の患者、γ−グルタミルトランスフェラーゼ増加および低血圧：３人（２０．０％）の患者、ならびに血中アルカリホスファターゼ増加：２人（１３．３％）の患者であった。治療と関連すると考えられる他のすべてのＡＥは、いずれの治療群においても２人以上の患者は経験しておらず、それには無力症、疲労、アラニンアミノトランスフェラーゼ増加、アスパラギン酸アミノ基転移酵素増加、結合したビリルビンの増加、血中乳酸脱水素酵素の増加、リパーゼ増加、体重増加、貧血、傾眠、胸壁痛および発疹が含まれた。
【０６７５】
【表１２】
0005479918.tif 000015
【０６７６】
試験ワクチンとおそらく関連しているまたは関連しているかもしれないと見なされた重度のＡＥが、以下の通り６人の患者によって報告された。
【０６７７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０９）
【０６７８】
患者０１−００１は、２００６年４月１日（１日目）に疲労を経験したが、何の処置も行わずに該事象は同日中に回復した。
【０６７９】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（３．３×１０９）
【０６８０】
患者０３−００１は、２００６年１２月１日（８日目）にＧＧＴ増加と診断されたが何の処置も行われず、試験時には該事象が持続していた。
【０６８１】
患者０４−００２および０４−００３は、それぞれ２００６年１１月１６日および２７日（両方とも２２日目）に発熱を経験したため併用薬が投与され、該事象は同日中に回復した。
【０６８２】
患者０４−００４は、２００７年１月１１日（２９日目）にＧＧＴ増加および血中乳酸脱水素酵素増加を示した。ＧＧＴの上昇は、２９日目および３６日目に臨床的に有意であると判断されたが、本患者の試験参加最終日である４３日目にはそうは見なされなかった。ＬＤＨ値が治験担当医師によって有意であると判断されることは一度も無く、試験日４３日目には正常に戻った。何の処置も行われず、両方の事象とも試験時には持続していた。
【０６８３】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１×１０１０）
【０６８４】
患者０１−００７は２００７年３月６日（２３日目）に発熱を経験したため併用薬が投与され、該事象は同日中に回復した。
【０６８５】
生命を脅かすＡＥは、治験担当医師によって試験ワクチンとは無関係であると見なされた。
【０６８６】
合計で１×１０１０群の３人の患者が低血圧を経験し、用量制限毒性基準により試験中止という結果になった。
【０６８７】
対象となる有害事象および用量制限毒性
【０６８８】
対象となるＡＥは、リステリア感染症の既知の病態生理から予測される可能性があると定義され、徹底的に評価することができる。
【０６８９】
対象となる５つの事象は、体温感覚［悪寒］、熱性疾患、肝機能分析、悪心および嘔吐症状、ならびに血管性低血圧症（vascular hypotensive disorders）である。３．３×１０９群（悪寒および血管性低血圧症）および１×１０９群（肝機能分析および）で２つの事象が報告されなかったという例外はあったが、全治療群ですべての患者が少なくとも１つの対象となる事象を経験した。すべての事象は治療に関連していると見なされた。最も頻繁に報告された対象となる事象は、発熱：１５人［１００％］の患者、悪心および嘔吐症状：１１人（７３．３％）の患者（１×１０９群で３人（６０．６％）、ならびに３．３×１０９および１×１０１０群でそれぞれ４人（８０．０％）の患者）、悪寒：８人（５３．３％）の患者（１×１０９および１×１０１０群でそれぞれ４人（８０．０％）の患者）であった。
【０６９０】
用量制限毒性：１×１０１０用量群の３人の患者（患者０１−００７、０２−００６、０４−００６）が低血圧を発症したために、用量制限毒性プロトコルに詳述されるＤＬＴ基準に従って、本試験を中止した。
【０６９１】
患者０１−００７は、２回目の投与後８時間に、４５ｍｍＨｇの拡張期ＢＰを経験した。この事象は投与後３時間の縮小期ＢＰ７５ｍｍＨｇおよび最高体温が４１℃まで上昇したことが関連している。
【０６９２】
患者０２−００６は、２回目の投与後２〜８時間に拡張期ＢＰ３９〜４９ｍｍＨｇを経験した。これらの事象は、収縮期ＢＰ７６〜９２ｍｍＨｇおよび３７．３〜３８．７℃の体温と関係していた。２３日目および２４日目には、同患者において５０ｍｍＨｇを下回る拡張期ＢＰが観察された。
【０６９３】
患者０４−００６は、初回投与後１２時間に拡張期ＢＰ４５ｍｍＨｇを経験し、それは投与後３時間の収縮期ＢＰ８７ｍｍＨｇおよび体温４０℃と関連していた。またこの患者は、２回目の投与後３〜１０時間に拡張期ＢＰ４２〜４４ｍｍＨｇを経験しており、それは収縮期ＢＰ７２〜８６ｍｍＨｇおよび３９．２〜３７．１℃の体温と関連していた。またこの患者は、２日目、８日目、および２３日目に、５０ｍｍＨｇを下回る拡張期ＢＰも示した。
【０６９４】
１日目または２２日目のいずれかに発生した低血圧イベントは、中程度の重症度であると見なされ、治験担当医師により、試験ワクチンとおそらく関連していると見なされた。（患者０１−００７および０４−００６）については、患者全員が併用薬を投与され、該事象は同日中に回復した。しかしながら患者０２−００６は、さらに２日間低血圧を示した。
【０６９５】
５人患者の患者において等級３の発熱が報告された。すべての投与量群において発生した重度の発熱は、発生時に迅速に治療を行ったため、１時間を超えて持続することはなかった。１×１０９群の患者０４−００１は、初回投与後２時間に４０．１℃の発熱を経験した。３．３×１０９群の患者０４−００２は、初回投与後３時間に４０．５℃の発熱、そして２回目の投与後３時間に４０．２℃の発熱を経験した。３．３×１０９群の患者０４−００３は、２回目の投与後２時間に４０．１℃の発熱を経験した。１×１０１０群の患者０１−００７は、２回目の投与後３時間に４１℃の発熱を経験した。
【０６９６】
３．３×１０９群の他の２人の患者は、対象となる重度のＡＥを示し、それらは肝機能分析に見られる変化として現れた。患者０３−００１は重度のＧＧＴ上昇を経験した：８日目の初回投与後に最初に観察され、２回目の投与までには回復したが、２２日目の２回目の投与に続き、２９日目に再発した。患者０４-００４は、２２日目にＡＬＴおよびＧＧＴの有意な上昇を示したが、１５日目の２回目の投与前にはそれらの事象は見られなかった。２９日目および３６日目にＧＧＴにおける重度の上昇は見られたがＡＬＴの上昇は見られず、患者の治験参加最終日である４３日目には既に重度ではなくなっていた。対象となる他のすべての事象は、軽度または中程度の重症度であった。
【０６９７】
初回投与からいずれかのＡＥまでの時間は、対象となるＡＥの大半において、治療のための初回投与から中央値で１日後であると報告された。
【０６９８】
２回目の投与からいずれかのＡＥまでの時間は、初回投与の後に見られたのと同様のパターンであった。
【０６９９】
初回投与から最大重症度の対象となるいずれかのＡＥまでの時間に関しては、１×１０９および３．３×１０９群では中央値で２２日、１×１０１０群では１日が報告された。
【０７００】
患者ごとの有害事象の一覧表
【０７０１】
死亡
【０７０２】
１人の患者（患者０４−００５）は、試験に能動的に参加している最中に死亡した。該死亡は、腎不全、代謝性アシドーシス、および心停止によるものだった。結果を項目７．３．１．２に、叙述を項目７．３．２に概説する。１人の患者（０４−００４）は１１１日間のプロトコル期間中に死亡したが、病勢進行のために試験から離脱した後であった。データベースロックの日にち（２００７年８月３１日）までに、３人の患者（０１−００１、０１−００２、および０１−００３）が、３ヶ月ごとに継続的に行われた生存経過観察中に死亡した。
【０７０３】
試験時の０４−００５の死は、担当医師によって腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）によるものであると見なされた。患者の最後の臨床検査は、２２日目の２回目の投与に続いて２９日目に行われた。初回投与後８日目および１５日目に、クレアチニン上昇を示した。２回目の投与日に、ＣＯ２／重炭酸塩、尿素／血中尿素窒素、クレアチニンの臨床的に有意な異常を認め、２９日目まで持続した（その時点でアミラーゼおよびリパーゼも上昇していた）。この期間中、該患者は大半の腎機能を失い、高度のアシドーシスとなり、致死的冠動脈疾患を起こした。ＴＬＳはカリウムおよび／またはリン酸塩の上昇と関連することが多いが、この症例には観察されなかった。
【０７０４】
他の重篤な有害事象
【０７０５】
３．３×１０９群の患者０４−００５が経験したすべてのＳＡＥは、生命を脅かすが試験ワクチンとはおそらく関連していないと見なされた。これらは、腎不全、アシドーシス、そしてそれに続く致死的心不全から構成されていた。１×１０１０群の患者０１−００６が経験した貧血および血清クレアチニンの上昇を含むＳＡＥは、重度ではあるが治験薬とはおそらく関連していないと見なされた。
【０７０６】
他の有意な有害事象
【０７０７】
試験ワクチンと関連する重度のＡＥおよび試験の中止に至るＤＬＴを示した患者を、それぞれ表１３および表１４に示す。
【０７０８】
【表１３】
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【０７０９】
【表１４】
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【０７１０】
死亡、その他の重篤な有害事象および他のいくつかの重要な有害事象の叙述
【０７１１】
本項では、治験担当医師によって重篤であると見なされたＡＥが報告された患者についての叙述を示す。
【０７１２】
患者０４−００５：腎不全／代謝性アシドーシス  ３．３×１０９群
【０７１３】
胃炎（２００６年１１月以降）、両側水腎症（２００６年４月以降）、両側尿管拡張（２００６年４月以降）、、貧血（２００６年４月以降）、リンパ浮腫（右骨盤部）（２００６年４月以降）の既往を有する６２歳のヒスパニック系女性患者は、２００４年１２月に、進行性、再発性および重度の子宮頸部扁平上皮癌（切除不能、ステージＩＩｂ）であると診断された。患者は２００５年６月１日に最後の放射線療法を、そして２００６年１０月１２日に化学療法（カルボプラチン）を受けていた。２００６年１１月２４日に本試験に組み入れられた。２００６年１２月に、試験ワクチン（３．３×１０９ｃｆｕのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）の初回投与を受けた。
【０７１４】
２００７年１月１９日（３８日目）、患者は、腎不全およびその結果生じた代謝性アシドーシスの兆候および症状を伴い入院した。血中アミラーゼ増加、貧血、および腹痛が報告された。患者は謝性アシドーシスおよび疼痛のために、それぞれ重炭酸ナトリウム５０ｍＥｑの静脈内投与およびナルフフィン（nalfufin）（Nalbuphine：ナルブフィン）１０ｍｇの静脈内投与代を受けた。同日、患者は心臓／呼吸停止を経験して死亡した。治験担当医師の意見では、予想した通り、腹痛は腫瘍崩壊症候群に起因するものであり、腎不全は水腎症の結果である可能性が高く、死因は腎不全、代謝性アシドーシスおよび心停止であった。患者はスクリーニング時にはＷＮＬ（正常範囲内）であったが、初回投与日に尿素／ＢＵＮおよびクレアチニンの上昇を示した。８日目および１５日目も依然としてクレアチニンは上昇したままであり、２２日目にクレアチニン、ＢＵＮおよび重炭酸塩における臨床的に有意な変化が見られ、２９日目までそれが持続した。患者の最後の試験のための来院日である２９日目には、アミラーゼおよびリパーゼも有意に上昇していた。２２日目に、ＲＢＣ、Ｈｂおよびヘマトクリットにおける臨床的に有意な減少を呈し、２９日目までには見られなくなったが、当日、ＷＢＣおよび好中球絶対数における臨床的に有意な減少をみとめた。間もなくして患者は死亡した。
【０７１５】
治験担当医師は、この事象について、死亡という理由から重篤であり、重度（血中アミラーゼ増加）〜生命を脅かす（代謝性アシドーシス、貧血、腹痛、腎不全および心臓／呼吸停止）重症度であり、試験ワクチンとは関連していないと見なした。
【０７１６】
上記事象を治療するために使用した併用薬：重炭酸ナトリウムおよびナルブフィンを含む静脈内投与用液剤
【０７１７】
【表１５】
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【０７１８】
患者０１−００６：血中クレアチニン増加  １×１０１０群
【０７１９】
良性卵巣嚢胞（１９７７年１月、外科的に除去済み）、右足の帯状疱疹（２００６年４月）、糞便中の血液および粘液（２００６年１２月以降）の既往を有する６２歳の白人女性患者は、２００５年１２月２７日に、進行性、再発性および重度の子宮頸部扁平上皮癌（転移性および切除不能、ステージＩＩＩＢ）であると診断された。患者は２００６年月７日に最後の放射線療法を、そして２００６年８月２日に化学療法（シスプラチン）を受けていた。２００７年１月９日に本試験に組み入れられた。２００７年１月３１日に、試験ワクチン（１×１０１０ｃｆｕのＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）の初回投与を受けた。
【０７２０】
２００７年３月７日（３６日目）、患者は血中クレアチニンの増加を呈し、翌日入院となった。３月１５日、患者に経皮的腎瘻造設術（ＰＣＮ）を施行して、血中クレアチニンを減少させた。治験担当医師の意見では、重度の重症度であるこの事象は、入院に起因するものであるが、試験ワクチンと関連する可能性は低いとのことだった。２００７年３月１０日（３９日目）、患者は、２００７年３月９日から認められた貧血を治療するために、赤血球の輸血を１回受けた。該事象は３日間続き、重度ではあるが、試験ワクチンと関連しているとは見なされなかった。２００７年３月１２日（４１日目）、痙攣（発作）のためにフェノバルビタールの単回投与を用いて患者を治療したところ、同日中に治まった。２００７年３月２０日に実施した脳内ＣＴスキャンでは、ＣＮＳ転移の兆候は見られなかった。２００７年３月２１日（５０日目）に実施した腹部および骨盤スキャンならびに鎖骨上超音波で、病勢進行が認められた。治験担当医師の意見では、重度の該事象は、試験ワクチンとは関連していないが、貧血（根底にある病勢進行）と関連しているとのことだった。患者は２０７年３月２８日にＰＣＮを留置したままで退院し、すべての事象は回復した。
【０７２１】
事象の治療のために用いた併用薬および介入：フェノバルビタール、輸血、および経皮的腎瘻造設術
【０７２２】
【表１６】
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【０７２３】
死亡、その他の重篤な有害事象および他の有意な有害事象の分析および考察
【０７２４】
本試験中には１件の死亡が報告されており、他の４件の死亡は、ＣＲＦ（症例報告書）の試験終了後のページに報告されている。３．３×１０９および１×１０１０群からそれぞれ１人の患者の合計２人の患者が、６つの重篤なＡＥを報告した（項目７．３．１．２）。ＳＡＥには、３．３×１０９群の血中アミラーゼ増加、貧血、心臓／呼吸停止、代謝性アシドーシスおよび腎不全、ならびに１×１０１０群の血中クレアチニン増加が含まれた。
【０７２５】
すべてのＳＡＥは、治験薬とは関連していないと見なされた。
【０７２６】
本治験に組み込まれた患者に発生した唯一の死亡は患者０４−００５であり、重度または生命を脅かす血中アミラーゼの増加、貧血、代謝性アシドーシスを経験し、心停止のために死亡した。項目７．３．２に叙述を提示する。
【０７２７】
同様に、３６日目および４３日目にＢＵＮおよびクレアチニンの上昇というＳＡＥを経験し、クレアチニンの上昇は治験の終わりまで続いた１×１０１０群の患者０１−００６についての叙述も、項目７．３．２に示す。
【０７２８】
これらの２つのＳＡＥのいずれも、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と関連するとは考えられなかった。
【０７２９】
３．３×１０９群の４人（８０．０％）の患者および１×１０１０群の１人（２０．０％）の患者の合計で５人（３３．３％）の患者が、経験的に対象となると定義される重度のＡＥ（熱性疾患、および肝機能分析）を報告した。これらの事象は試験ワクチンと関連があると見なされた。
【０７３０】
ＤＬＴ事象である低血圧が、１×１０１０群の３人の患者から報告された。プロトコルに従って、試験は中止される結果となった。
【０７３１】
治験薬の永久的な中止に至るＡＥを経験した患者はいなかった。
【０７３２】
臨床検査評価
【０７３３】
経時的な臨床検査値
【０７３４】
患者の大半が、本試験中に異常な臨床化学および／または血液学的な値を示した。これらの臨床的異常のほとんどが、治験担当医師によって臨床的に有意であるとは見なされなかった。
【０７３５】
個々の患者の変化
【０７３６】
臨床化学
【０７３７】
臨床化学において、ＣＯ２／重炭酸塩、尿素（ＢＵＮ）、クレアチニン、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴおよびＧＧＴについて、ベースライン（スクリーニング）からの臨床的に有意な変化が報告された。ベースラインでは、尿素（ＢＵＮ）、ＣＯ２／重炭酸塩、アルカリホスファターゼ、ＡＬＴおよびＧＧＴに関する臨床的に有意な異常値は報告されなかった。臨床的に有意な値が報告されたのは３人以下の患者であった。
【０７３８】
血液学
【０７３９】
血液学において、ＲＢＣ、Ｈｂ、ヘマトクリット、ＷＢＣおよび好中球絶対数（ＡＮＣ）について、ベースラインからの臨床的に有意な変化が報告された。臨床的に有意なベースライン値は見られなかった。
【０７４０】
個別の臨床的に有意な異常
【０７４１】
臨床的に有意な臨床値の大半は、ＧＧＴ、クレアチニンおよび尿素（ＢＵＮ）、ヘモグロビン、ヘマトクリットであり、その多くは基礎疾患によるものであるか、または以前の化学療法の影響である可能性があった。
【０７４２】
臨床化学
【０７４３】
合計で６人の患者に臨床的に有意に異常な化学値が報告された（表１７）：１×１０９群の患者０１−００１、３．３×１０９群の患者０４−００４、０４−００５、０３−００１、および１×１０１０群の患者０１−００５、０１−００６。
【０７４４】
【表１７】
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【０７４５】
血液学
【０７４６】
合計で８人の患者に臨床的に有意に異常な血液学的値が報告された（表１８）：１×１０９群の患者０１−００３、３．３×１０９群の患者０３−００１、０４−００２、０４−００３、０４−００４、０４−００５、ならびに１×１０１０群の患者０１−００５および０１−００６。
【０７４７】
【表１８】
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【０７４８】
報告されたヘモグロビンの値における減少は、基礎疾患および治験薬の投与とは関係のない他の原因（例えば以前のプラチナ療法）に起因する可能性があったため、治験薬とのいずれの関係も、将来的な試験においてさらに調査されるべきである。
【０７４９】
バイタルサイン、理学的所見および安全性に関連する他の観察項目
【０７５０】
バイタルサインおよび体重
【０７５１】
バイタルサインおよび体重を測定した。
【０７５２】
１日目投与前および投与後
【０７５３】
治療したすべての患者において一貫した所見は、体温上昇、血圧低下、心拍数増加、および投与後まもなく始まって投与後の数時間持続した呼吸数増加であった。これらの事象は、低い方の２つの投与量群において良好な忍容性を示し、非処方薬に反応した。最高用量を投与した１×１０１０群において、液剤を必要とする用量制限性の低血圧が観察されたが、これらの問題は迅速に回復した。
【０７５４】
全体として、投与前の収縮期ＢＰの中央値は１３０．３ｍｍＨｇであり、群の中央値は、１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群において、それぞれ１１０．０、１４０．０、１２９．０ｍｍＨｇであった。全体として、経時的に中央値は徐々に減少した。すなわち投与後１時間の１２９ｍｍＨｇから投与後８時間には９３．０ｍｍＨｇになり、投与後１０時間および１２時間にわずかに増加した（それぞれ９５および１００．０ｍｍＨｇ）。投与後１２時間で、１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群においてそれぞれ１００．０、９１．０、および９９．０ｍｍＨｇと、中央値は治療群間で同様であった。収縮期ＢＰにおける重度の変化は観察されなかった。
【０７５５】
全体として、投与前の拡張期ＢＰの中央値は７７．０ｍｍＨｇであり、１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群において、それぞれ７５．０、９０．０および７２ｍｍＨｇであった。全体として、経時的に拡張期ＢＰの中央値は徐々に減少した、すなわち投与後１時間の７５ｍｍＨｇから投与後６時間には６０．０ｍｍＨｇとなった。投与後８〜１２時間で、全体としての値は６０．０ｍｍＨｇで一貫していた。投与後１２時間の拡張期ＢＰの中央値は１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群において６０．０ｍｍＨｇであった。本治験において、拡張期ＢＰにおける臨床的に有意な重度のＡＥが認められ、項目７．２．３．３．に示した。
【０７５６】
全体として、投与前の心拍数の中央値は１分間に８２．０拍（拍／分）であり、１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群において、それぞれ７２．０、９０．０、７８．０拍／分であった。全体として、心拍数の中央値は、投与後１時間（８６．０拍／分）から徐々に減少した。心拍数の中央値における増加は、投与３時間後にピークを向かえ（１１０．０拍／分）、投与後１２時間には９６．０拍／分まで徐々に減少した。治療群間で同様の傾向が見られた。投与後１２時間には、１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群においてそれぞれ９６．０、９７．０、９３．０と、治療群間での中央値は同様であった。本治験中は、心拍数についての有意なＡＥは観察されなかった。
【０７５７】
投与前の呼吸数の中央値は、１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群においてそれぞれ１８．０、２０．０および１８．０と、治療群間で同様であった。投与後の様々な時点における変化はごくわずかであり、治療群間で同様の値が観察された。本治験では有意な呼吸数のＡＥは観察されなかった。
【０７５８】
全体として、投与前の体温中央値（℃）は３６．２℃であり、治療群間で同様の結果であった。体温の中央値は３７．８（投与後２時間）から３８．９（投与後４時間）に上昇し、その後３７．７（投与後６時間）から３７．０（投与後１２時間）へと徐々に低下した。１×１０１０群における投与後２〜１０時間の体温は＞３７．５℃であり、３．３×１０９群では投与後２〜６時間、１×１０９群では投与後３〜６時間で＞３７．５℃であった。投与後１２時間の１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群における体温の中央値は、それぞれ３７．０、３６．８および３７．５℃だった。本治験中、体温において臨床的に有意な重度のＡＥは認められなかった。
【０７５９】
投与前の体重は治療群間で同様であり、全体の中央値は６４．０Ｋｇであった。
【０７６０】
２２日目投与前および投与後
【０７６１】
２２日目には、１日目の投与前および投与後に測定されたバイタルサインおよび体重と同様の傾向が観察されたが、以下のような例外があった。
【０７６２】
全体として、投与後１時間に、１２２．０ｍｍＨｇ（投与前）から１３０ｍｍＨｇ（投与後）へと収縮期ＢＰの中央値に上昇が見られた。この中央値の上昇は、１×１０９用量群で観察された大きな変化によるものであった。全体としての中央値は、１日目の投与後の状態について記載したのと同様の様式で１時間後から低下した。この治療段階において、１×１０１０群の３人の患者が低血圧を経験した。
【０７６３】
理学的所見
【０７６４】
本試験中、少数の患者に正常〜異常な理学的所見が報告された。報告された身体所見の異常は、全体的な様子（頭、目、耳、鼻および喉）、リンパ腺（胸、腹）、神経および筋骨格であった。正常〜異常な理学的所見のほとんどは、基礎疾患である子宮頸部の癌の進行によるものである可能性が高い。
【０７６５】
注射部位の評価
【０７６６】
注射部位の腫脹、刺激感、または免疫応答を経験した患者はいなかった。
【０７６７】
血液、尿および便の培養
【０７６８】
試験２日目に、１人の患者（１×１０９群の患者０１−００１）の血液試料のみがリステリア菌陽性（３５ｃｆｕ／ｍＬ）であったが、試験３日目には除去された。
【０７６９】
補正番号５の一環として尿および便の検査がプロトコルに加えられたが、この補正の前には多くの患者が組み入れられていた。１×１０９ｃｆｕ群の患者でこの補正のために検査を受けた者はいなかった。３．３×１０９ｃｆｕ群の２人の患者（０４−００４および０４−００５）と、１×１０９ｃｆｕ群の３人の患者（０１−００５、０２−００６、および０４−００６）が、リスト１６．４．４．６に記載されるように糞便試料の検査を受けたが、どの試料も陽性ではなかった。同一の患者が、尿検査の試料も提供したが、いずれの試料においてもリステリア菌は存在しなかった（リスト１６．４．４．５）。したがって、最も高い２つの用量群の５人の患者の尿および便培養にてリステリア菌は認められなかった。
【０７７０】
併用薬
【０７７１】
癌と無関連の併用薬
【０７７２】
癌と無関連の併用薬は、３．３×１０９コホートの３人（６０％）の患者にのみ使用された：ＷＨＯのＡＴＣ分類レベル２の薬物である抗炎症剤および抗リウマチ剤、全身用抗ウイルス剤および機能性胃腸障害用薬剤。
【０７７３】
用量に関連する併用薬の使用は行われなかった。
【０７７４】
癌と関連する併用薬
【０７７５】
ＷＨＯの薬剤に関するＡＴＣ分類による癌関連併用薬で頻繁に報告されたのは以下の通りである：鎮痛剤：１５人（１００％）の患者、血液代替物および灌流液、機能性胃腸障害のための薬剤：それぞれ７人の（４６．７％）の患者、全身用抗ヒスタミン剤、緩下剤：それぞれ６人の（４０．０％）の患者、抗貧血性剤：５人の（３３．３％）患者、および全身用抗菌剤：４人（２６．７％）の患者。低用量群の１〜２人の患者と比較すると、１×１０１０群では患者の１００％が血液代替物および灌流液、ならびに機能性胃腸障害のための薬剤の投与を受けた。１×１０１０（２０．０％）および１×１０９（０％）群の患者と比較すると、３．３×１０９群（８０．０％）においてより高い割合の患者が抗貧血剤の投与を受けた。その結果を表１９にまとめる。
【０７７６】
機能性胃腸障害のための薬剤は、主として、そのほとんどが治療に関連する事象である嘔吐および悪心のために服用された。重度の貧血を呈した患者（試験ワクチンとは無関係）にも、機能性胃腸障害のための薬剤が投与された。
【０７７７】
【表１９】
0005479918.tif 000022
【０７７８】
アンピシリンの投与
【０７７９】
プロトコルに指定されるように、すべての患者に６日目および２７日目にアンピシリンを静脈内投与し、それぞれの薬剤注入後に５日間経過させてから抗生物質を投与した。抗生物質を静脈内投与を行うごとに、アンピシリン経口薬をさらに１０日間投与した。患者０１−００４を除く組み入れられた患者全員に、プロトコルに従ってアンピシリンを投与した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の注入から４８時間以内に、中程度の重症度（最高体温３９℃）の継続する発熱状態のために、患者０１−００４にアンピシリンを静脈内投与した。該事象は４８時間持続し、その時点でプロトコルにより抗生物質療法を行うことが義務付けられた。その後、該事象は迅速に回復した。患者は、局所的な蕁麻疹のために、アンピシリンの経口投与の代わりにシプロシノール（ciprocinol）の投与を続けた。
【０７８０】
試験の早期終了
【０７８１】
完全な組み入れと１×１０１０群の治療が終了した後、１×１０１０群の治療を行う前に本治験を中止した。これは、７．２．３．３項に記載するように、３人の患者が用量制限性の低血圧を経験したため、プロトコル設計に従ってのことである。
【０７８２】
安全性の結論
【０７８３】
本試験におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の安全性に関する結論は、重度の転移性子宮頸癌と、本治験の患者１５人中１３人が以前に受けた化学療法を用いた治療との、両方の背景に照らして評価する必要がある。以前の化学療法については、すべてにプラチナベースの薬剤が使用されており、プラチナは、貧血や腎機能不全を含む多くの長期的な毒性と関連している。
【０７８４】
治療を受けた１５人（１００％）の患者全員がＡＥを経験した。最も多く報告されたＡＥは、発熱、悪寒、貧血、頭痛、嘔吐、悪心、頻拍症および筋骨格痛であった。薬剤に関連するＡＥには、発熱、嘔吐、悪寒、頭痛、頻拍症、および悪心を含む「インフルエンザ様」症候群が含まれた。報告された「インフルエンザ様」症候群は、軽度から中程度の重症度であり、１×１０９および３．３×１０９の用量で標準的な非処方薬に反応を示したため、その忍容性は許容できると見なされた。１×１０１０の用量は、以下に記載する用量制限毒性を引き起こした。
【０７８５】
３×１０９および１×１０１０群におけるそれぞれ１人の患者の合計２人の患者が、６つのＳＡＥを報告した。ＳＡＥには、３．３×１０９群の血中アミラーゼ増加、貧血、心臓／呼吸停止、代謝性アシドーシスおよび腎不全、ならびに１×１０１０群の血中クレアチニン増加が含まれた。これらの事象は、治験担当医師によって治験ワクチンとは関連していないと見なされた。３．３×１０９群の患者は、アシドーシスおよび腎不全に続発した心不全のために死亡した。
【０７８６】
１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群において、それぞれ合計で２人（４０．０％）、４人（８０．０％）、および３人（６０．０％）の患者が重度のＡＥを報告した。５人（３３．３％）の患者において重度であると見なされた対象となるＡＥで治療に関連していたのは、熱性疾患（発熱）および肝機能分析（ＧＧＴ増加および乳酸脱水素酵素増加）であった。リステリア菌が、肝臓および脾臓に対して栄養性の影響を及ぼすことが知られているため（治験薬概要書に強調されている）、肝機能検査に特別の注意が払われた。しかしながら、末期の患者集団におけるＬＦＴ上昇は珍しくないため、基礎疾患、前治療、および抗生物質療法に起因する可能性もあった。さらに、患者が殺菌線量のアンピシリンの静脈内投与、または静脈内および経口投与の両方のいずれかを受けた後に、すべてのＬＦＴ上昇が認められたことに留意する必要があり、肝機能異常の上昇がリステリア菌の注入に直接起因していると考えることは困難であった。将来的に、ＬＴＦにおける変化と治験薬との間に何らかの関係を確立することが可能であるかどうかを決定するために、試験が設計されるべきである。
【０７８７】
試験中、大半の患者が臨床化学的および血液学的な異常値を示した。これらの患者の中には臨床的に有意な値が報告された者もあり、そのほとんどは基礎疾患または前治療に起因する可能性があった。臨床的に有意な化学パラメータは、６人の患者において主にＧＧＴ、尿素およびクレアチニンであった。臨床的に有意な血液学的パラメータは、８人の患者において主にヘマトクリット、ＨｂおよびＲＢＣであった：これらの患者のほとんどにはＡＥとして貧血が報告されたが、治験担当医師によって、重度の重症度ではあるが、試験ワクチンとはおそらく関連していないと見なされた。
【０７８８】
全体として、理学的検査における変化は臨床的に有意であるとは見なされなかった。異常な理学的所見の大半は、疾患である子宮頸部の癌と関連していた。血圧（低下）、心拍数（増加）および体温（上昇）における中央値の経時的な変化が、大半の患者に報告された。しかしながら、投与後１２時間で中央値は正常な範囲内となり、治療群間での差異は見られなかった。体温の上昇が血圧低下および心拍数増加をもたらす等の発熱と循環生理学的事象との間の既知の関係を考慮すると、発熱時のみに循環器系のＡＥが観察されたことは、これらの事象が関連している可能性を示唆し、また、低血圧および頻拍症は、ほとんどの患者に報告された発熱の付帯徴候であり、インフルエンザ様症候群の一環である可能性を示唆するものであった。
【０７８９】
リステリア菌は血液から急速に除去され、１人の患者のみが、薬剤投与の翌日に非常に低濃度（３５ＣＦＵ）の血清リステリア菌を示したが、その翌日には回復した。これらの結果は、臨床的に有意なリステリア症がこの治験薬によって引き起こされる確立は低いという安心感を与えるものである。同時に、検査した患者のいずれにも尿、糞便中へのリステリア菌排出は観察されなかったため、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の排出は非常に起こりにくいと結論付けることができる。しかしながら、本試験には比較的少人数の患者が参加したことを踏まえると、これらの観察は将来的な調査によって確認されるべきであろう。
【０７９０】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に起因するとされ得る副作用プロファイルは、悪心、嘔吐、発熱、および悪寒の一連のインフルエンザ様症状を含むと考えられ、また、これらの症状はリステリア病と関連していることが多いため、リステリアの既知の病態生理と一致すると考えられた。リステリア菌は、強力な自然免疫応答の既知の刺激因子であり、これらの症状は、自然免疫応答の最中に起こる血液中へのサイトカイン放出と関連する症状と一致している。この点において、何人かの患者は経過観察のための通院をすべて終了しなかったものの、本患者集団におけるリステリア菌の効果についての妥当な評価が達成されたと考えられる。患者０４−００５（２回目の薬剤投与の後２２〜２６日目に入院していたが、４３日目の経過観察のために来院する前に亡くなった）を除いて、４３日目には１５人中１４人全員、７９日目には１５人中１０人の患者、そして試験最終日である１１１日目には１５人中７人の患者が、経過観察のための通院を達成した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７と関連するＡＥは、４３日目の来院前にすべて回復したと考えられるため、この情報の欠落が、本治験におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の副作用についての我々の理解を損ねるとは思われない。
【０７９１】
プロトコル（補正５、２００６年１０月１２日）に詳述されるＤＬＴ基準に従って、１×１０１０群の３人の患者（患者０１−００７、０２−００６、０４−００６）が経験した低血圧イベントにより本試験は中止された。
【０７９２】
したがって、本治験において実証されたＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の安全性に関して、我々は次のような結論を下す。
【０７９３】
本試験において、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の投与に関連する副作用は、インフルエンザ様症状に限定されていると考えられる。これは、感染疾患と関連する既知のインフルエンザ様症候群と一致しており、免疫細胞から全身循環へとサイトカインが放出されることに起因するものである。リステリア菌は感染病原体であり、高レベルのサイトカイン放出によって特徴付けられる特に強力な自然免疫応答を刺激することが知られており、この副作用パターンはリステリア菌の既知の作用と一致するものである。
【０７９４】
低血圧の形で用量制限毒性を引き起こす用量でも、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は急速に血液から除去されるため、リステリア症と関連する症状を引き起こす可能性は低い。
【０７９５】
検査した患者において、尿、糞便中へのリステリア菌排出は観察されなかった。数は少ないが、これらの患者は検査した最も高い２つの用量群に属しており、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７がリステリア菌排出をもたらす可能性は低いことを示唆するものである。
【０７９６】
すべての投与量群において高熱が発生し、また検査した最低投与量群において、１人の患者が抗生物質の投与によってのみ回復した持続性の軽度から中程度の発熱を経験していることから、発熱はＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対する特異体質反応である可能性があり、この重要なパラメータを特徴付けるためにさらに研究が必要である。
【０７９７】
リステリア菌が肝臓および脾臓に栄養性であることは知られているが、肝機能検査の上昇は、殺菌線量の抗生物質を投与した後にのみ、数人の患者に見られたのみであった。多くの異なるシチュエーションにおいて、また多くの状況（本治験において行われたように、アンピシリンの投与を含む）においてＬＦＴの上昇が起こることから、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７投与と肝機能検査の上昇との間の関係について、本治験から明確な関係を見出すことはできない。
【０７９８】
検査した低い方の２つの用量１×１０９および３．３×１０９では、重度の転移性子宮頸癌に罹患する女性にＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を安全に投与することができ、また、観察されたＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の副作用プロファイルは、この疾患の治療に使用される他の治療剤に引けを取らなかった。
【０７９９】
有効性評価
【０８００】
有効性の解析
【０８０１】
有効性の主要エンドポイント
【０８０２】
有効性の主要評価項目は、患者の固形癌治療効果判定基準（ＲＥＣＩＳＴ）によって決定された腫瘍反応であった。
【０８０３】
最良の全般的反応
【０８０４】
治療意図群の１３人の患者のうち、７人（５３．８５％）が安定した病勢を有し、５人（３８．５％）が進行性の病勢を有していた。１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群において、それぞれ２人（４０％）、２人（５０％）、および１人（２５％）の患者は病勢が安定していた。
【０８０５】
部分寛解が１人の患者（７．６９％）に報告され（患者０４−００３）、７９日目の標的病変の大きさにベースラインからの変化（−３２．４８４％）が認められた。
【０８０６】
患者０４−００３の部分寛解（ＰＲ）
【０８０７】
ＲＥＣＩＳＴ基準は、初回の基準反応決定から４週間後に反復スキャンを実施してその反応を確認することを規定している。患者０４−００３の場合、これは不可能であった。それにもかかわらず、筆者は、これが真の部分寛解（ＰＲ）であり、いずれの事象においても臨床的に有意な結果であると考える。
【０８０８】
患者０４−００３は、２００４年に切除不能なステージＩＩＩＢの子宮頸癌であると診断され、その時点で２サイクルのシスプラチンおよび骨盤照射を同時に受けた。患者は、スパイラルＣＴ上の３つの指標病変である１３０ｍｍの子宮病変、１４ｍｍの後下腿病変、および１３ｍｍの右腸骨結節を伴って本治験に組み込まれた。７９日目の評価で、同患者は９０ｍｍの子宮腫瘤、１２ｍｍの後下腿病変を呈し、結節性の異常は見られなかった。医師は、そのまま患者の観察を続ける代わりに治験から離脱させて、パクリタキセルおよびカルボプラチンを６回コースで投与して、広汎性子宮全摘を施行した。化学療法の後、患者０４−００３の残存する子宮腫瘤は４０ｍｍとなり、後下腿の疾患は消失した。腫瘤を除去し、良性であると考えられたが、検体の周縁部にいくらかの悪性度が病理組織学的に観察された。術後間もなくして、患者の担当医師であるＤｒ．Ｇａｏｎａは治験依頼者に連絡を取り、患者に腫瘍は見られず、正常なパフォーマンススコアを示し、すべての臨床値は正常範囲内であることを確認した。この状態は、本稿の執筆中である２００７年１２月３１日現在まで持続している。
【０８０９】
ＣＲＯおよび治験担当医師との通信を付録Ａに示す。
【０８１０】
［免疫療法が細胞障害性療法に対する反応率を増加させるという所見は、今や他者によって報告されている。ｐ５３を標的とする免疫療法とプラチナを含む投与計画とを組み合わせた、最近行われた広範囲の非小細胞肺癌の治験で、免疫化に続いて細胞障害性療法を行った場に６２％の奏効率を得ている（４）。我々の実験は、これらの筆者のものと合致するようである。］
【０８１１】
したがって、患者０４−００３に事象が発生した時に、ＲＥＣＩＳＴ基準が要求する経過観察のためのスキャンは含まれなかったが、担当医師が患者の反応の性質を確認することにより、この場合Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７が臨床上有用であることが示唆された。さらに、データベースを閉じてから６ヶ月、患者が治験を開始してから１年以上が経った現在、このステージＩＶｂ患者に腫瘍は無く、正常なパフォーマンススコアを示しており、臨床値もすべて正常範囲であるということは、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の使用から予期しなかった治療的有効性が引き出されたことを示唆するものであり、同患者の結果が薬剤に対する反応によるものであることと一致する。
【０８１２】
有効性の副次エンドポイント
【０８１３】
長径の合計および標的病変のベースラインからの変化
【０８１４】
長径の合計と標的病変を決定した。
【０８１５】
初回投与後、試験日４３日目、７９日目および１１１日目に腫瘍の評価を行った。１１１日目は試験の最終日であった。
【０８１６】
総体的に、ベースライン（６９．２ｍｍ）から７９日目（７９．６ｍｍ）までに標的病変において増加が見られ、続いて１１１日目に減少（５６．６ｍｍ）が見られた。ベースラインでの標的病変の大きさの中央値は、１×１０９群（５２．２ｍｍ）と比較すると、３．３×１０９（８７．０ｍｍ）および１×１０１０（７２．８ｍｍ）群においてより高かった。４３日目には、１×１０９（１２．０ｍｍ）および１×１０１０群（１０．８ｍｍ）と比較すると、３．３×１０９群において腫瘍の大きさの変化は見られなかった。
【０８１７】
７９日目には、他の治療群において観察された腫瘍の大きさの中央値のわずかな増加と比較すると、３．３×１０９群において３７．０ｍｍの減少が見られた。中央値がベースラインから確かに増加したこと（７９日目に１０３ｍｍ）に対して、３．３×１０９群において観察された減少は、何人かの患者が早期中止したために、７９日目はベースライン（４人患者）よりも少ない試料の大きさ（２人の患者）で計算した結果である。ベースラインでの患者０３-００１および０４−００３の病変の大きさの合計はそれぞれ１２４ｍｍおよび１５７ｍｍであり、７９日目には、病変の大きさの合計はそれぞれ１００ｍｍおよび１０６ｍｍであった。７９日目には、患者０３−００１のすべての病変を数えたわけではないことに留意されたい。
【０８１８】
本試験の治療意図に基づく解析群における１３人の患者にという非常に小さな試料の大きさに対して記述統計を行ったため、患者の何人かについては個人ベースで分析することが重要であった。腫瘍の大きさのデータをリスト１６．２．６．１に示す。全体として、治療意図に基づく解析群の４人の患者（３０．７７％）が、本治験において腫瘍量の減少を経験した。安定した病勢の３人の患者が腫瘍量における減少を経験した。１×１０９ｃｆｕを投与した患者０１−００４は、腫瘍量における２０％（８ｍｍ）の減少を経験した。３０３ｘ１０９を投与した群の患者０３−００１は、全体で１９．３６％（２４ｍｍ）の腫瘍量が減少した。１×１０１０群の患者０１−００７では、全部で２０．８３％（５ｍｍ）の腫瘍量が減少した。３．３×１０９群の患者の１人である０４−００３には、ＲＥＣＩＳＴ基準による他覚的ＰＲが認められ、腫瘍量３２．４８％（５１ｍｍ）の減少を経験した。
【０８１９】
患者０４−００３のベースラインでの標的病変（１３ｍｍ）は、７９日目には検出されなかった（０ｍｍ）。ベースラインで患者０１−００４に認められた１つの非標的病変は、４３日目には検出されなかった。
【０８２０】
興味深いのは、用量反応相関が観察されなかったこと、また全群の患者が進行を経験し、全群の患者が腫瘍量における減少を経験したことである。評価可能な１３人の患者のうち、３０％と１４２．５の間の腫瘍量増加を伴って、低い方の２つの投与量群の５人の患者の病勢が進行した。
【０８２１】
個々の患者の腫瘍測定
【０８２２】
病勢が進行するまでの時間および病勢安定の期間
【０８２３】
１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群（それぞれ３人、２人および１人の患者）において、進行が見られた患者の病勢が進行するまでの時間は４３日以内だった。患者０１−００１（１×１０９）は例外で、試験ワクチンの初回投与から８０日後に病勢が進行した。
【０８２４】
これらの患者に対する試験ワクチンの初回投与後、病勢が進行する前に、平均で少なくとも４３日未満は、病勢安定が報告されることはなかった。
【０８２５】
全体的な反応の期間
【０８２６】
結果の概要によると、相対的には標的病変への反応は見られない。しかしながら、個々の患者分析では、１人の患者（患者０４−００３）が、標的病変が検出されないこと（０ｍｍ）を含むＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７治療に対する他覚的部分寛解を示した。
【０８２７】
生存
【０８２８】
下の表は、２００７年１０月９日のワールドワクチンコングレス（World Vaccine Congress）で、本データのプレゼンテーションに使用した。表中のデータは閉じたデータベースと一致するものであり、本情報を提示する前に確認した。その日の時点では、１×１０９群の２人の患者および３．３×１０１０群の３人の患者が死亡したが、高用量群では死亡した患者がいないことを示している。
【０８２９】
【表２０】
0005479918.tif 000023
【０８３０】
死亡までの時間
【０８３１】
治療意図に基づく解析群の評価可能な１３人の患者のうち、５人は１×１０９、４人は３．３×１０９、および４人は１×１０１０の投与を受けた。１×１０９群において合計３／５人の死亡が報告された：初回投与から１１９日後（患者０１−００２）、３４８日後（患者０１−００３）および３６８日後（患者０１−００１）。３．３×１０９群においては、初回投与から８８日後に合計１／４人（患者０４−００４）の死亡が報告された。１×１０１０群（４／４患者）において死亡は見られなかった。
【０８３２】
ＥＣＯＧパフォーマンス・ステータスにおけるベースラインからの変化
【０８３３】
総体的に、ＥＣＯＧパフォーマンス・ステータスの平均値において、ベースラインからの有意な変化は見られなかった。１×１０９群では、２人の患者に向上が見られ、３人には変化が見られなかった。３．３×１０９群では、３人の患者のパフォーマンス・ステータスが悪化し、２人には変化が見られなかった。１×１０１０群では、２人の患者が悪化し、３人には変化が見られなかった。
【０８３４】
カルノフスキー指標におけるベースラインからの変化
【０８３５】
ベースラインでは、１×１０９、３．３×１０９および１×１０１０群におけるカルノフスキー指標の平均値は７８．０、７５．０および９０．０％であった。総体的に、カルノフスキー指標の平均値において、経時的にベースラインからの有意な変化は見られなかった。しかしながら、１×１０９群（６．０％）および３．３×１０９群（−２．５％）と比較すると、１×１０１０群において、ベースラインから４３日目までの顕著ではあるがわずかな減少（−１７．５％）が観察された。リスト１６．２．５．２から分かるように、１×１０９群の２人の患者にカルノフスキー・ステータス・スコアの低下が見られた。パフォーマンス・ステータスの悪化は、１×１０９、３．３×１０９、１×１０１０投与量群においてそれぞれ１人、３人、および２人の患者に見られたが、１×１０９、３．３×１０９、１×１０１０投与量群において、それぞれ２人、２人、および３人の患者にはパフォーマンス・ステータスの変化は見られなかった。
【０８３６】
ＨＰＶ種の役割
【０８３７】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７はＨＰＶ−１６Ｅ７を標的とし、本治験の最初はＨＰＶ−１６の患者のみが組み入れられた。しかしながら、ＨＰＶ−１６を標的とする抗原の付着が、他のＨＰＶ種によって誘発される疾病に対して有効性を有する可能性を示唆していたため、すべてのＨＰＶ種の組み入れを許可するようにプロトコルが補正された。腫瘍の減退を経験した患者のうち、０１−００４（１×１０９）、０３−００１（３．３×１０９）、０４−００３（３．３×１０９）および０１−００７（１×１０１０）は、すべてＨＰＶ−１６陽性であった（リスト１６．４．５．４）。
【０８３８】
免疫原性
【０８３９】
本試験中に採取した血液試料の生存能力について検査した。採取した試料のいずれも生存能力が低かったため、評価可能なデータが得られなかった。また、何人かの患者は試料が不足していた。
【０８４０】
有効性の結論
【０８４１】
１３人の患者の治療意図群の試料において、合計で患者の３８．５％が進行性疾患として報告され、これらの患者のうちの４人（１人は治験と治験の間ではあるが進行性疾患のために治験を中止した後、あとの３人は治験後ではあるが試験後のＣＲＦに報告するために間に合う時点で）が死亡した（１×１０９群の３人の患者および３．３×１０９群の１人の患者）。全体的な腫瘍量の減少を経験した３人の患者のうち、５３．８５％の患者に病勢安定が報告された。標的病変の部分寛解が１人（７．６９％）の患者（０４−００３）に報告され（全体的な病変の大きさの３２．５％が減少）、１つの標的（０４−００３）および１つの非標的（０１−００４）病変の完全消失が報告された。
【０８４２】
すべての患者を総体的に検討した際には、腫瘍の大きさの平均値に減少は見られなかった。興味深いことに患者を一人一人個別に検討した場合は、４人の患者において全体的な腫瘍の大きさの減少が観察された。７９日目には、患者０３−００１の病変をすべて数えたわけではないことに留意されたい。試料の大きさが小さかったために、統計的検出力を適用することができなかった。標的病変に対するＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の効果を決定し、治療に対する全体的な応答を評価するためには、より大きい大きさの試料を用いてさらに評価を行う必要がある。
【０８４３】
全体として、経時的なＥＣＯＧパフォーマンス・ステータスおよびカルノフスキー指標における向上は見られなかった。
【０８４４】
本データに基づいて、重度の、進行性または再発性の子宮頸癌の治療におけるＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の有効性に関する結論は出すことができなかった。
【０８４５】
考察および全体的な結論
【０８４６】
この第Ｉ相、非盲検、用量漸増試験は、主としてヒトパピローマウイルス１６Ｅ７型（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７）を発現する生きたリステリア・モノサイトゲネスの安全性および実行可能性を確立するために設計された。試験は、免疫化後の免疫原性を評価するためのものであった。免疫原性分析のために試料のアッセイを行ったが、試験１日目の試料が不足しており、採取した試料の全体的な質が低かったため、データの有用な解釈をすることはできなかった。免疫原性試料は治験依頼者によって分析された。
【０８４７】
いずれの反応も報告され、試験期間中は生存のために監視を行った。進行性、再発性または重度の子宮頸部扁平上皮癌に罹患する合計１５人の患者が試験に組み入れられた。これらは、他に治療オプションが残されていない末期の患者であった。この患者集団の全員が前治療に失敗し、ほとんどは複数の前治療に失敗していた。１５人中１３人の患者が、腎臓および血液学的機能に長期的な影響を与えることが知られるプラチナベースの薬剤の投与を受けていた。これらの患者のＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７に対する反応を評価する場合には、疾患および前治療の影響を考慮しなくてはならない。
【０８４８】
組み入れられた患者全員がアネルギーパネルに陽性を示し、それはリステリア症の発症に対する免疫応答を開始する患者の能力を示唆するものであり、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は低い方の２つの投与量群において良好な忍容性を示すと思われ、薬剤関連有害事象は、ほとんどの場合は非処方薬に対する反応であるインフルエンザ様症候群または肝機能検査の上昇に限られていた。
【０８４９】
リステリア・モノサイトゲネスはグラム陽性細菌であり、病理学的レベルで、健常な個人において軽度の消化器不調、悪心および下痢の原因となる可能性があり、また免疫不全の個人および新生児において重篤な感染症の原因となる可能性がある。薬剤に関連するＡＥは、主として、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７等の免疫刺激療法と関連することが多い「インフルエンザ様」症候群（発熱［発熱］、嘔吐、悪寒、悪心、頻拍症、および頭痛を含む）を含む。このように、急性かつ一過性の傾向があるこれらの副作用は全員の患者に明らかに観察され、典型的には数時間以内に回復した。
【０８５０】
観察されたインフルエンザ様症候群の有意性は今のところ不明である。それは、自然免疫応答によってもたらされる血清サイトカインと関連しており、また強力な獲得免疫応答と関連していることが多い。リステリア菌は強力な獲得免疫応答と関連しており、またリステリア菌に関連する疾病はインフルエンザ様症候群と関連していることに留意されたい。
【０８５１】
３．３×１０９群の２人の患者（４０％）および１×１０１０群の１人の患者（２０％）がＬＦＴの上昇を報告したが、１×１０９群からの報告はなかった。しかしながら、すべてのＬＦＴ上昇は、リステリア菌を無菌化することが知られる用量で、アンピシリンの静脈内および経口投与した後に起こっており、アンピシリンの使用はＬＦＴの上昇に中程度かつ一過性の影響を及ぼすことが立証されており、患者は各注入から５日後に抗生物質の投与を開始し、その後１１日間投与を受けた。これらの事象が発生した８日目と２９日目の通院の間に、患者はアンピシリンを服用していた。また、ＬＦＴの上昇は重度の疾病においてよく見られ、それは本試験の患者集団を特徴付けるものであった。
【０８５２】
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の投与から１２時間後まで、体温、心拍数の上昇および低血圧が患者の大半に報告された。１×１０１０群の３人の患者が、プロトコルに従ってＤＬＴのために試験の中止に至る低血圧イベントを経験した。患者０１−００７のみが、低血圧と関連する重度の発熱（発熱）を経験した。他の２人の患者は、低血圧と関連する中程度の発熱を報告した。これらの事象は、入院患者の評価期間中に発生し、即時に適切な治療が施され、重篤または重度の事象は迅速に回復した。
【０８５３】
治療ワクチンのベクターとしてのリステリア菌の使用を理解するために欠かせない論点は、病原性と免疫有効性との間の関係である。自然免疫は、効果的な獲得免疫応答のための「お膳立て」をすると考えられる。したがって、強力な自然免疫応答の一部としての血清サイトカインの放出は、有効な治療効果の前兆となると推測される。
【０８５４】
ほとんどの患者（１１／１５人）は放射線療法と化学療法との組み合わせを受けており、残りの４人の患者は２つの治療オプションのうちの１つのみを受けていた。以前の治療の毒性作用はすべて試験組み入れ前に消失していなくてはならないものの、以前の侵襲的治療が臓器系に取り返しのつかないダメージを与えたという可能性を否定することはできない。したがって、本試験のすべての安全性パラメータを、この事実に照らして考慮するべきである。例えば、プラチナベースの治療が、貧血および腎機能障害を引き起こす可能性があることは十分立証されている。副作用の多くは、疾病の前治療または病勢進行と関連していると思われる。
【０８５５】
我々は、治療意図に基づく解析群において、５３．８５％の患者に病勢安定が報告され、３８．５％の患者に病勢進行が報告され、１人の患者（７．７％）に他覚的ＰＲが示されたのを観察した。３人の患者が約２０％の腫瘍量減少、１人の患者は３２％の腫瘍量減少を経験し、全体としては１３人中４人（３０．０８）の評価可能な患者に腫瘍量の減少が見られた。総体的には腫瘍の大きさの平均値に減少は見られなかった。試料の大きさが小さかったために、統計的検出力を適用することができなかった。標的病変に対するＬｍ−ＬＬＯ−Ｅ７の有効性を決定し、治療に対する全体的な応答を評価するためには、より大きい大きさの試料を用いてさらに評価を行う必要がある。
【０８５６】
古典的な化学療法および放射線療法とは異なり、現在の免疫療法は遅延型反応によって特徴付けられることが知られている。これは、直接的に毒性治療を行うよりも遅い時間で治療効果をもたらす免疫システムを再構成する必要があることによるものである。
【０８５７】
患者が早期に試験を終了したことは、作用の毒性機序が極めて迅速な反応をもたらし、医師にとっては免疫応答に見られるよりもずっと早い反応（もし起こる場合は）が一般的である、化学療法と放射線療法に基づいた癌治療の現行モデルに起因する。癌ワクチンコンソーシアム（Cancer Vaccine Consortium）によって最近提案された免疫療法の治験を実施するための新しい方法に関する議案書において、免疫療法が有効性を現すまでに４〜６ヶ月またはそれより長い期間が必要であることが認識されており、この団体は、たとえ短期の病勢進行が認められたとしても、実験的に有効性を決定するために十分な期間、患者に治療を加えない状態を保つことを提案している。
【０８５８】
結論として、
・Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、大半の患者に発熱、悪寒、悪心および嘔吐を含む一連のインフルエンザ様副作用をもたらす。
・これらの副作用は、軽度から中程度であり、１×１０９および３．３×１０９群において良好な忍容性を示した。
・薬剤投与と関連する副作用は、主に、短期間の介入可能なインフルエンザ様症候群を含む。
・本治験では肝機能とＬＭ−ＬＬＯ−Ｅ７との関係を決定することはできなかったが、ＬＭ−ＬＬＯ−Ｅが単独でＬＦＴ上昇の近因である可能性は少ないと思われた。
・用量制限性の低血圧が用量１×１０１０で観察された。
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７は、１×１０９および３．３×１０９の用量で、末期の子宮頸癌において安全に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【配列表】
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