(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記アミノ酸配列SEQ  ID NO:3  に示されるアミノ酸配列を有する成熟ヒト腫瘍壊死因子の、バリンVal(91)からグリシンGly(121)までの領域のアミノ酸配列、又はその一部分から選択されるタンパク質であって、但し、前記タンパク質がリシンLys(98)からグルタミン酸Glu(116)までの領域のアミノ酸配列を少なくとも備えており、システインCys(101)をグリシンで置換し、リシンLys(98)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(116)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド結合が形成され、
ることを特徴とするタンパク質：
アミノ酸配列SEQ  ID  NO:3
(NH2)Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu(COOH)
【請求項２】
アミノ酸配列SEQ IDNO:1
(NH2)Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly(COOH)
を備えるタンパク質であって、リシンLys(8)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(26)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド結合が形成されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
アミノ酸配列SEQ ID NO: 2
(NH2)Lys Ser Pro Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly AlaGlu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu(COOH)
を備えるタンパク質であって、リシンLys(1)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(19)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド結合が形成されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
薬剤として使用するための請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項５】
肺水腫の治療に使用するための請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質を備えることを特徴とする薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、上皮イオンチャネルを活性化するため、肺機能を改善するため、及び肺水腫等の水腫を治療するための薬剤として使用できるシステイン非含有環状タンパク質に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
第一に、細胞層及び組織を介する液体輸送は、活性ベクトルイオン輸送、例えばナトリウム輸送による浸透圧勾配に基づくものである。主として、例えば上皮ナトリウムチャネル複合体（ENaC）のような厳密に制御され且つ極めて重要なイオンチャネルによって達成される。水は、この勾配に受動的に従っており、とりわけ、水チャネルのアクアポリン５のような特定の水チャネルを通る。肺組織に関しては、ポンピング細胞の側底で、Na+/K+ ATPaseが、その間隙に向けてナトリウムのベクトル輸送を促進し、最終的にはイオンのベクトル輸送をリンパ管及び血管に向けて促進することが知られている。このように、前記輸送は能動的であって、肺圧差及び肺胞タンパク質濃度とは無関係に生じる。
【０００３】
水腫は、例えば、肺だけでなく、脳や皮膚等の組織内における体液の病的な蓄積である。肺での水腫を肺水腫と呼ぶ。肺水腫は、主に、体液の溢出と再吸収間の不均衡が原因となる。非常に多くの場合、肺組織の透過性が損なわれると、体液供給の増加が起こり、体液が肺胞内に蓄積する。
【０００４】
肺胞から間隙への体液の戻り輸送の欠如により生じるこのような透過性の異常は、急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、又は重症急性呼吸器症候群（SARS）、肺炎及び多臓器不全に対して特に重大である。しかしながら、上記透過性異常はまた、呼吸により誘発される肺損傷、肺移植、輸液に関連する肺損傷、治療目的のIL-2投与又は喘息等の他の肺疾患にも関与する。
【０００５】
組織又は臓器、例えば肺における体液の蓄積が増大する結果、必要なガス交換が遅れるか又は完全に抑制される。呼吸空気からの酸素が血液に供給されないと、酸素の欠乏により臓器が致死的な損傷を受ける可能性がある。
【０００６】
透過性水腫の治療に対する一般的な標準治療法は存在しない。一般に、肺水腫の患者に人工呼吸を施行することによって、血液への酸素の供給を確保し、ひいては臓器への酸素供給を確保しようと試みる。
【０００７】
腫瘍壊死因子（TNF）に由来する個々のペプチドが、特許文献１（独国特許第３８４１７５９号明細書）で知られている。
【０００８】
Carswell et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975（非特許文献１）では、マイコバクテリア株カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）に予め感染させた動物であって、内毒素で処理した動物の血清が、マウスの異なる腫瘍で出血性壊死を引き起こしたことが報告されている。この活性は、腫瘍壊死因子に起因した。また、TNFは、複数の形質転換細胞株に対して、インビトロで細胞増殖抑制活性又は細胞毒性活性を示すが、正常なヒト及び動物の細胞株は、これによる影響を受けない（非特許文献２：M. R. Ruff et al, Lymphokines, Vol. II, Academic Press Inc., New York, 1981, pp 235-275）。ヒトTNFの生物学的特徴付け及び遺伝子は、既に報告されている（非特許文献３：D Pennica et al, Nature 312, 724, 1984; 非特許文献４：Aggarwal, B. B. et al, J. Biol. Chem. 260, 2334-2345, 1985; 非特許文献５：Nedwin, G.E. et al, Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985）。
【０００９】
これらのデータから、ヒト成熟腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）について、以下に示すタンパク質の構造を導き出すことが可能である：
SEQ ID NO: 3
(NH2)Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu(COOH)
【００１０】
更に、ウシ、ウサギ及びマウスのTNF遺伝子が記載されている（非特許文献６：Goeddel D. V. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986）。
【００１１】
その細胞毒性作用に加えて、TNFは、とりわけ、炎症反応に深く関与している（非特許文献７：J. W. Larrick et al, Pharmac. Res. Vol. 5, No. 3, 129-139, 1988）。動物モデルでは、敗血性ショック（非特許文献８：Torti F. M. et al, Science 229, 867-869, 1985）及び移植片対宿主疾患（非特許文献９：Piguet, P F et al, J. Exp. Med. 166, 1280, 1987）においてTNFの関与を実証することができた。
【００１２】
Lucas R et al, Science (1994) Vol. 263. no. 5148, pp. 814-817（非特許文献１０）には、TNFのSer(99)からGlu(116)の領域に由来しており、水腫の治療のために提案したペプチドが記載されている。前記ペプチドは、特許文献２（国際公開第00/09149号）の主題でもある。しかしながら、特許文献２に記載のこのペプチドを使用可能にするため、Pro(100)の位置をアミノ酸のシステインに人為的に置換する必要があり、また、Cys(101)の位置をアミノ酸のグリシンに人為的に置換する必要がある。Ser(99)からGlu(116)の直鎖ペプチドは、本発明に従う効果を有していないので（非特許文献１１：Hribar M. et al., Eur. J. Immunol. (1999), Vol. 29, 3105-3111; 非特許文献１２：Braun C., J. Immunol. (2005), 175: 3402-3408; 非特許文献１３：Fukuda N. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2001) 280: L1258-L1265）、Glu(116)の位置をアミノ酸のシステインで更に置換する必要があった。
【００１３】
このような特許文献２に記載のペプチドは、溶液中で還元することが知られている位置(100)及び(116)の２つのシステインを含んでおり、ここで、該システイン間での硫黄架橋が切断され、ペプチドの環状構造が分解し、それによりペプチドが効果の無い状態になってしまうため、薬剤の調製には適していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】独国特許第3841759号明細書
【特許文献２】国際公開第00/09149号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Carswell et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3666, 1975
【非特許文献２】M. R. Ruff et al, Lymphokines, Vol. II, Academic Press Inc., New York, 1981, pp 235-275
【非特許文献３】D Pennica et al, Nature 312, 724, 1984
【非特許文献４】Aggarwal, B. B. et al, J. Biol. Chem. 260, 2334-2345, 1985
【非特許文献５】Nedwin, G.E. et al, Nucl. Acids Res. 13, 6361, 1985
【非特許文献６】Goeddel D. V. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 597, 1986
【非特許文献７】J. W. Larrick et al, Pharmac. Res. Vol. 5, No. 3, 129-139, 1988
【非特許文献８】Torti F. M. et al, Science 229, 867-869, 1985
【非特許文献９】Piguet, P F et al, J. Exp. Med., 166, 1280, 1987
【非特許文献１０】Lucas R et al, Science (1994) Vol. 263. no. 5148, pp. 814-817
【非特許文献１１】Hribar M. et al., Eur. J. Immunol. (1999), Vol. 29, 3105-3111
【非特許文献１２】Braun C., J. Immunol. (2005), 175: 3402-3408
【非特許文献１３】Fukuda N. et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol (2001) 280: L1258-L1265
【発明の概要】
【００１６】
驚くべきことに、システインがない環状ペプチドが現在見出され、該ペプチドは、成熟腫瘍壊死因子（TNF）に由来し、興味深い生物学的性質を示す。
【００１７】
本発明で使用される成熟腫瘍壊死因子（TNF）は、ヒト成熟腫瘍壊死因子であることが好ましい。
【００１８】
一の態様において、本発明は、成熟ヒト腫瘍壊死因子のバリンVal(91)からグリシンGly(121)までの領域のアミノ酸配列又はその一部分から選択されるタンパク質を提供するものであり、但し、該タンパク質は、リシンLys(98)からグルタミン酸Glu(116)までの領域のアミノ酸配列を少なくとも備えており、システインCys(101)がグリシンによって置換され、リシンLys(98)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(116)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド基が形成されている。
【００１９】
本発明に従って提供されるタンパク質は、本明細書において「本発明に従うタンパク質」とも称される。
【００２０】
本発明によれば、アミノ酸配列
SEQ ID: NO: 1
(NH2)Val-Asn-Leu-Leu-Ser-Ala-Ile-Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu-Pro-Ile-Tyr-Leu-Gly(COOH)（ここで、リシンLys(8)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(26)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド結合が形成されている）、
SEQ ID: NO: 2
(NH2)Lys-Ser-Pro-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Glu(COOH)（ここで、リシンLys(1)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(19)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド結合が形成されている）
を備えるタンパク質が特に適している。
【００２１】
本発明に従うタンパク質は、例えば既知の方法に類似する適切な方法で作製するか、又は本明細書に記載されるように、例えばペプチド化学による化学合成や微生物プロセスの使用によって作製することができる。遊離アミノ基と遊離カルボキシル基の間でのアミド結合の導入は、同様に、例えば既知の方法に類似する適切な方法か又は本明細書に記載されるようにして行うことができる。
【００２２】
本発明に従うタンパク質は、遊離形態で存在してもよいし、塩の形態、例えば酢酸塩又はトリフルオロ酢酸塩等の酸付加塩の形態で存在することができ、更なる態様において、本発明は、本発明に従うタンパク質を塩の形態で提供する。
【００２３】
本発明に従うタンパク質は、興味深い生物学的活性を示し、それ故、薬剤として使用できることが分かった。
【００２４】
更なる態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明に従うタンパク質を提供し、例えば、薬剤としての本発明に従うタンパク質の使用である。
【００２５】
例えば、ヒト細胞での生化学検査は、本発明に従うタンパク質が、ヒトTNFとは対照的に、炎症性又は毒性を実質的に示さないことを示す。該検査のため、血液からのヒト免疫細胞を本発明に従うタンパク質と低濃度で混合し、実験室にて一般的な方法でインキュベートされる。続いて、炎症用マーカータンパク質を従来の方法によって無細胞の培地内で決定する。本発明に従うタンパク質、例えばアミノ酸配列SEQ ID No: 1又はSEQ ID No: 2のタンパク質の添加にもかかわらず、例えば、炎症マーカーインターロイキン−6（IL-6）等の炎症性タンパク質を検出することができない。
【００２６】
更なる態様において、本発明は、炎症を防ぐための方法、例えば、腫瘍壊死因子、例えばヒト腫瘍壊死因子に由来のタンパク質の医療用途においてIL-6等の炎症マーカーの形成を防ぐための方法を提供し、該方法は、本発明に従うタンパク質を使用することを特徴とする。
【００２７】
更に、実験室にて一般的な方法は、パッチ・クランプ検査によってイオンチャネルの活性化を検出することであり、このことは、例えば、Clunes M.T. et al, J Physiol Volume 577, No. 3, 809-819（2004年6月15日）において説明される。イオンチャネルのパッチ・クランプ検査のため、ガラスカニューレを薄く伸展させ、中性緩衝液を充填する。該ガラスカニューレ（パッチ・クランプピペット）を、無傷の上皮細胞上に慎重に押し付ける。膜の一部がピペットの下に位置する。それにより、ピペット内部と外液の間に電気抵抗が生じる。感度の良い増幅器に取り付けた電極をピペット液に浸漬する。
【００２８】
驚くことに、本発明に従うタンパク質、例えば、ここで説明されるようにアミド結合によって環化したアミノ酸配列SEQ ID No: 1又はSEQ ID No: 2のタンパク質は、上皮イオンチャネルを活性化し、このことは、電気信号の振幅の変化によって検出することができることが分かる。本発明に従うタンパク質がシステイン又は硫黄架橋を含有しないという事実の結果として、かかるタンパク質を還元することができない。
【００２９】
急性肺損傷のシミュレーション及び肺水腫の形成のため、例えばマウス又はラット等の実験動物の肺を、実験室にて一般的な方法で、酸性の食塩水により数回すすぎ洗いすることができる（例えば、Isik F. et al., Eur J Cardiothorac Surg (2005); 28: 301-305に従う）。この結果、肺機能が低下する。本発明に従うタンパク質、例えば、ここで説明されるようにアミド結合によって環化したアミノ酸配列SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2のタンパク質を霧として又は水溶液で実験動物の肺に注入する場合、動脈血中の酸素含有量の増加によって示唆されるように、肺機能の明らかな改善が3〜5時間以内に起こる。従って、本発明に従うタンパク質は、肺水腫等の水腫の治療に使用できる。
【００３０】
他の態様において、本発明は、本発明に従うタンパク質を肺機能に関連する疾患を治療するために提供するものであり、例えば、肺機能に関連する疾患の治療用の薬剤を製造するために本発明に従うタンパク質を使用することである。
【００３１】
肺機能に関連する疾患の治療には、例えば、上皮イオンチャネルの活性化、肺機能の改善及び／又は肺水腫等の水腫の治療、
急性肺損傷ALIの治療、
急性呼吸窮迫症候群ARDSの治療、
重症急性呼吸器症候群（SARS）の治療、
肺炎の治療、
多臓器不全の場合の治療、
呼吸により誘発される肺損傷、肺移植、輸液により誘発される肺損傷、治療目的のIL-2投与又は喘息の場合の治療、
が含まれ、例えば、上皮イオンチャネルの活性化、肺機能の改善及び／又は肺水腫等の水腫の治療である。
【００３２】
他の態様において、本発明は、肺機能に関連する疾患の治療方法を提供するものであり、かかる治療を必要とする患者に対して、本発明に従うタンパク質を十分な量投与することを特徴とする。
【００３３】
本明細書で使用される患者には、哺乳類、例えばヒトが含まれる。
【００３４】
本発明に従うタンパク質は、薬剤の形態で投与されることができる。
【００３５】
他の態様において、本発明は、本発明に従うタンパク質を、例えば、キャリア又は希釈剤、例えば充填剤、結合剤、フロー調整剤、潤滑油、香味剤、糖質若しくは甘味剤、匂い物質、防腐剤、安定効果を有する物質、保湿剤、乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用の塩及び／又は緩衝液（混合物）等の少なくとも１つの薬学的に許容されるアジュバントと組み合わせて備えることを特徴とする薬剤を提供するものである。
【００３６】
疾患治療用の本発明に従うタンパク質の適当量は、当然ながら、異なるパラメータ、例えば、使用されるタンパク質の化学的性質及び薬物動態、個々の患者、治療される疾患、適用の種類に強く依存するものの、大型哺乳類の成功した一日量は、例えば0.0001g〜1.5gの範囲に及ぶ量であり、例えば、0.001mg／kg体重〜約20mg／kg体重である。適用は、経腸的に又は非経口的に行ってもよいし、非経口的に行うのが好ましい。本発明に従う薬剤は、例えば既知の方法と類似した方法で、例えば混合、顆粒化、コーティング、溶解、凍結乾燥によって作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を備えるタンパク質のHPLCクロマトグラムを示す。単位：ｙ軸：吸収，mAU；ｘ軸：時間，分。
【図１Ｂ】アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるタンパク質のHPLCクロマトグラムを示す。単位：ｙ軸：吸収，mAU；ｘ軸：時間，分。
【図２Ａ】アミノ酸配列SEQ ID NO: 1のタンパク質によるナトリウムイオンチャネルの活性化を示す。単位：ｙ軸：数；ｘ軸：振幅，pA。
【図２Ｂ】アミノ酸配列SEQ ID NO: 2のタンパク質によるナトリウムイオンチャネルの活性化を示す。単位：ｙ軸：数；ｘ軸：振幅，pA。
【図３Ａ】アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を備えるタンパク質の投与に応じる動脈血中の酸素含有量の増加を示す。単位：ｙ軸：酸素含有量，％；ｘ軸：測定時間，分。
【図３Ｂ】アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるタンパク質の投与に応じる動脈血中の酸素含有量の増加を示す。単位：ｙ軸：酸素含有量，％；ｘ軸：測定時間，分。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
例１：アミノ酸SEQ ID NO: 1を備えるタンパク質の合成（ここで、リシンLys(8)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(26)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド結合が形成されている）
アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を備えるタンパク質は、以下に示す工程のFmoc固相合成を経て完全に自動で合成された。
0005427186.tif 000002
【００３９】
リシン（位置８）のイプシロン−アミノ基をグルタミン酸（位置２６）のガンマ−カルボキシル基に結合させることによって、環化を達成し、これにより、アミド結合が形成された。これは、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）によってグルタミン基のガンマ−カルボキシル基を活性エステルに変換し、その後、該活性エステルがリシンのイプシロン−アミノ基と自発的に反応することで達成され、これにより、タンパク質に閉環を形成する。続いて、該タンパク質を逆相HPLCに通して試験することで、図１Ａに示す結果を得た。
【００４０】
例２：アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるタンパク質の合成（ここで、リシンLys(1)の側鎖のアミノ基とグルタミン酸Glu(19)の側鎖のカルボキシル基の間にアミド結合が形成されている）
アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるタンパク質は、以下に示す工程のFmoc固相合成を経て完全に自動で合成された。
0005427186.tif 000003
【００４１】
リシン（位置１）のイプシロン−アミノ基をグルタミン酸（位置１９）のガンマ−カルボキシル基に結合させることによって、環化を達成し、これにより、アミド結合が形成された。これは、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）によってグルタミン基のガンマ−カルボキシル基を活性エステルに変換し、その後、該活性エステルがリシンのイプシロン−アミノ基と自発的に反応することで達成され、これにより、タンパク質に閉環を形成する。続いて、該タンパク質を逆相HPLCに通して試験することで、図１Ｂに示す結果を得た。
【００４２】
例３：細胞培養
電気生理学的検査をヒトH441細胞に行った。H441細胞は、ヒト肺上皮細胞であって、肺中の水及び電解質の拡散に関与する。H441細胞は、American Tissue Culture Collectionから入手され、通常の細胞培養容器においてRPMI 1640培地（Invitrogen）で培養した。該細胞培養培地は、4.5 g/litreのグルコース、1%のペニシリン／ストレプトマイシン及び5%のウシ胎仔血清を更に含んだ。パッチ・クランプ検査のため、細胞を小さいガラス板上に移した。
【００４３】
例４：アミノ酸配列SEQ ID NO: 1及びSEQ ID NO: 2を備えるタンパク質によるヒト上皮細胞のイオンチャネルの活性化
「パッチ・クランプ」技術の「全細胞」及び「細胞接着」構造において、H441細胞から巨視的電流及び単一チャネル電流が放出された（Hamill et al, Pflugers Arch. 1981, 391 (2): 85-100, 1981）。
【００４４】
個々のイオンチャネルの測定のため、135mMのＮａ−グルコン酸塩、15mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl2、2mMのCaCl2、5mMのグルコース、10mMのHepesの溶液（pH 7.4）にタンパク質を溶解させ、パッチピペットに充填した。細胞膜電極を、140mMのKCl、15mMのNaCl、5mMのMgCl2、10mMのHepesで作った脱分極溶液（pH 7.4）を用いて0mVに脱分極させた。測定中、−100Vの電圧（パッチ）を調整した。
【００４５】
このプロトコルは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2を備えるタンパク質と、ナトリウムチャネル阻害剤アミロリドとを加えることによって行われた。このようにして得られる電流散逸は、蓄積されて、プログラムPCLAMP 6.0を用いて解析された。アミノ酸配列SEQ ID NO: 1及びSEQ ID NO: 2を備えるタンパク質によるナトリウムイオンチャネルの活性化を示すという結果は、図２Ａ及び図２Ｂから明らかである。
【００４６】
例５：肺水腫の実験動物研究
オスのウィスター系ラット（体重250g〜350g）をRompun（登録商標）（0.02ml／100g）及びKetavet（登録商標）（0.1ml／100g）で麻酔する。呼吸は、72blows／分のサイクルで行われ、吸入時間が0.2秒で、呼気時間が0.5秒である。体温は、平均で37℃〜39℃の範囲である。正常状態で、PaO2（動脈の酸素分圧）は、500〜550mmHgの範囲である。急性肺損傷のシミュレーション及び肺水腫の形成のため、肺を酸性食塩水（pH 5）で7〜9回すすぎ洗いする。1時間後、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2を備えるタンパク質を滅菌食塩水に溶解させ、霧状で気管内に投与する（最大投与量：0.5ml）。それぞれ60分間隔で、動物から動脈血（0.1ml）を抜き、酸素含有量を通常値に対する％で決定する。アミノ酸配列SEQ ID NO: 1又はSEQ ID NO: 2を備えるタンパク質を投与した後、図３Ａ又は図３Ｂから明らかなように、血液中の酸素含有量は増加する。また、例６も参照されたい。
【００４７】
例６：アミノ酸配列SEQ ID NO: 1及びSEQ ID NO: 2を備えるタンパク質による肺機能の改善
本発明に従うタンパク質、例えばアミノ酸配列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2又はSEQ ID NO: 3を備えるタンパク質の肺機能に対する刺激的効果の検証を、肺水腫を誘発させた実験動物研究によって行う。実験手順は、例５で説明される。
気管内吸入については、それぞれの場合で125μgのタンパク質をpH 7.3の150mMの食塩水に溶解させる。動脈血の酸素含有量は、肺のすすぎ洗いを行う直前、肺のすすぎ洗いの60分後、肺のすすぎ洗いの180分後に測定される。肺のすすぎ洗いを行う直前の酸素含有量が100％であると決定する。それぞれの最終的な肺のすすぎ洗いの60分後、血中の酸素含有量は、平均でほんの20%になる。酸素含有量のパーセンテージは、3時間以内に、アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を備えるタンパク質で治療を行う場合で62％の値まで上昇し、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるタンパク質で治療を行う場合で75％の値まで上昇する。
タンパク質を加えないと、肺機能の改善（酸素含有量20％）は、肺のすすぎ洗いから180分以内で起きないであろう。
上記結果は、
アミノ酸配列SEQ ID NO: 1を備えるタンパク質に関しては図３Ａで説明され、
アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるタンパク質に関しては図３Ｂで説明される。
【００４８】
例７：炎症パラメータの測定
ヒトの新鮮血は、炎症促進性分子に対して極めて鋭敏な反応を示し、とりわけ、炎症マーカーのインターロイキン−6（IL-6）を放出する場合である。炎症促進反応を測定するため、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるタンパク質の濃度でのヒト新鮮血のサンプルを、1ng/ml〜10μg/mlの濃度でインキュベートした。37℃で24時間インキュベートした後、ELISZAによって溶液中の炎症マーカーインターロイキン-6を定量的に測定した。LPSは、ポジティブコントロールとして機能を果たした（3ng/ml及び100ng/mlの濃度）。
このようにして、表１に示す測定データが得られ、該測定データは、血液細胞からの炎症マーカーインターロイキン-6の放出に関し、LPSと比較してアミノ酸配列SEQ ID NO: 2を備えるペプチドタンパク質が及ぼす影響を示す。
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【００４９】
表１の測定データは、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2のタンパク質を用いて新鮮血中のヒト免疫細胞をインキュベートすることによって、炎症マーカーIL-6が実質的に放出されず、従って、炎症反応を引き起こさないことを示す。対照的に、ポジティブコントロールとしてのLPSでのインキュベーションは、炎症マーカーインターロイキン-6の激しい放出を引き起こす。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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