(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機フッ素化合物を含む反応溶液中においてポリペプチドを化学修飾することを特徴とする、化学修飾されたポリペプチドの製造方法であって、有機フッ素化合物が、2,2,2−トリフルオロエタノール又は1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールであり、ポリペプチドがコラーゲン又はゼラチンであり、化学修飾が、アミド結合又はエステル結合を介してなる化学修飾である、上記の製造方法。
【請求項２】
ポリペプチドがゼラチンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化学修飾が、分子間の架橋反応、又は分子内の架橋反応である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
化学修飾が、ポリペプチドへの官能基の導入である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
縮合剤を用いて化学修飾を行う、請求項１から４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
有機フッ素化合物が2,2,2−トリフルオロエタノールである、請求項１から５の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子およびポリペプチドの効率的な化学修飾方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体由来の高分子である生体高分子はそれぞれ特異な物理的および生物的な性質を有することから、医学および生物学用途で頻繁に利用されている。しかし、生体高分子は一般に合成高分子に比べて加工性や性能の制御に劣っており、生体高分子と合成高分子のハイブリッド化や低分子化合物による化学修飾による生体高分子の高機能化が計られている。【０００３】
一方、遺伝子工学の発展により、様々な生体のタンパク質と同等、類似なタンパク質、あるいは新規なタンパク質を人工的に合成することができている。特に、人工的に合成したタンパク質は化学修飾可能な官能基の導入も可能であり、該新規タンパク質の化学修飾により、より高機能のタンパク質類似体を作成することが可能となっている。しかしながら、該手法では、側鎖への官能基の導入は限られており、導入不可能な官能基が多いのが現状である。【０００４】
生体高分子やポリペプチドの側鎖を化学修飾する際には、一般に水中でアミノ基あるいはカルボキシル基を用い、縮合反応による方法を用いる。すなわち、水溶性の生体高分子やポリペプチドを水に溶解し、縮合剤により所望の官能基を有する化合物との反応により、官能基を生体高分子やポリペプチドに導入している（特許文献１）。該手法では、難水溶性の化合物の導入には適用が困難である。難水溶性の化合物の導入には、水酸化ナトリウム水溶液にてあらかじめ修飾する化合物を溶解した後、ｐＨを中性付近に戻し、水中にて反応する方法が用いられる（非特許文献１）。しかし、該手法では、疎水性の高い化合物では溶解度が稼げないこと、アルカリにて分解や反応を起こす官能基を有する化合物には適用できないことが示唆された。【０００５】
一方、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP）はコラーゲンやゼラチンといったタンパク質を溶解することから、組織構築用マトリックス（特許文献２）やエレクトロスピニング法による繊維状マトリックスの作成（特許文献３、及び特許文献４）が行われている。しかし、これらは単にマトリックスを作成するにとどまっており、タンパク質自身の化学修飾についての教示も示唆もない。【０００６】
【非特許文献１】Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition  16（７）809-827,  2005
【特許文献１】特開２００１−２２４６７７号公報
【特許文献２】特表２００２−５３１１８２号公報
【特許文献３】特表２００４−５３２８０２号公報
【特許文献４】特開２００４−３２１４８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、生体高分子あるいはポリペプチドを、疎水性の化合物又は塩基性条件下で分解や反応を起こす化合物で化学修飾する方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、有機フッ素化合物を含む反応溶液中において生体高分子又はポリペプチドを化学修飾することによって、疎水性の高い化合物あるいはアルカリにて分解や反応を起こす化合物でも効率よく導入できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明によれば、有機フッ素化合物を含む反応溶液中において生体高分子又はポリペプチドを化学修飾することを特徴とする、化学修飾された生体高分子又はポリペプチドの製造方法が提供される。
好ましくは、生体高分子は、タンパク質、多糖、及びそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
好ましくは、生体高分子はタンパク質である。【００１０】
好ましくは、タンパク質はコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、及びアンチトロンビンIIIからなる群から選ばれる少なくとも一種を含む。
好ましくは、タンパク質は、ヒト、牛、豚、魚、又は植物に由来するタンパク質、あるいは遺伝子組み換えタンパク質である。【００１１】
好ましくは、化学修飾は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、又はウレタン結合を介してなる化学修飾である。
好ましくは、化学修飾は、分子間の架橋反応、又は分子内の架橋反応である。
好ましくは、化学修飾は、生体高分子又はポリペプチドへの官能基の導入である。
好ましくは、生体高分子の化学修飾のために使用される化合物は、炭酸エステル基、エポキシド基、エステル基、アミド基、又はジチオカルバミル基を有している化合物である。
好ましくは、縮合剤を用いて化学修飾を行う。
好ましくは、酸無水物、酸塩化物、又はエポキシドとの反応により化学修飾を行う。【００１２】
好ましくは、有機フッ素化合物の炭素数は１から８である。
好ましくは、有機フッ素化合物は、アルコール、ケトンである。
好ましくは、有機フッ素化合物は、2,2,2−トリフルオロエタノール、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール、又はヘキサフルオロアセトンである。
好ましくは、有機フッ素化合物は2,2,2−トリフルオロエタノールである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明を実施することにより、（１）水系に比べて効率の高い反応を行うことができ、（２）水溶液中では低温でゲル形成するゼラチンのような基質でかつ反応性の高い試薬を用いる場合にハンドリングが容易になり、（３）疎水性の高い化合物による修飾が可能となる。それらの結果、本発明の方法によれば、生体高分子やポリペプチドへ、種々の官能基を導入することが可能となり、生体高分子やポリペプチドの高機能化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明で用いる生体高分子（生体由来の高分子）は、本発明を実現可能である限りは特に規定はないが、好ましくはタンパク質、多糖、又はそれらの誘導体又は塩類である。タンパク質の場合は、球状、繊維状等のタンパク質のいずれでもよい。本発明でいう生体高分子には合成ポリペプチドも含まれる。生体高分子は、より好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ラミニン、カゼイン、フィブロイン、フィブリン、キトサン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンIIIおよびヒアルロン酸エステルである。さらに好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、フィブロインである。最も好ましくはコラーゲンまたはゼラチンである。タンパク質の由来は特に限定せず、ヒト、牛、豚、魚、および遺伝子組み換え体のいずれを用いても良い。遺伝子組み換え体としては、例えばEP0926543B,WO2004-085473号明細書、EP1398324A、EP1014176A、US6645712に記載のものを用いることができるがこれらに限定されるものではない。また、該生体高分子は部分的に加水分解されていてもよい。【００１５】
本発明で用いるポリペプチドの製法に特に規定はないが、例えば、大腸菌又は酵母で合成した任意のポリペプチド、又は化学合成した任意のポリペプチドを用いることができる。【００１６】
本発明で用いる有機フッ素化合物については生体高分子又はポリペプチドを溶解する限りは特に限定はないが、好ましくは炭素数１から８の有機フッ素化合物である。より好ましくは炭素数１から６の有機フッ素化合物である。より好ましくは炭素数１から３の有機フッ素化合物である。さらに好ましくは、有機フッ素化合物はアルコール、ケトン、またはカルボン酸である。特に好ましくは、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP）、2,2,2-トリフルオロエタノール（TFE）、ヘキサフルオロアセトン。最も好ましくは2,2,2−トリフルオロエタノールである。該有機フッ素化合物は単独または該有機フッ素化合物と相溶性の溶媒との混合で用いても構わない。【００１７】
本発明で用いる有機フッ素化合物は特に限定するものではないが、常温で液体のものが好ましい。このうち、好ましくは炭素数２〜８である非芳香族有機フッ素化合物又は炭素数６〜１２の芳香族含フッ素エステル類、カルボン酸類、ニトリル類である。炭素数２〜８である非芳香族有機フッ素化合物としては、炭素数２〜８のフッ素含有アルコール類、フッ素含有アミド類、フッ素含有エステル類、フッ素含有カルボン酸、フッ素含有エーテル類が好ましい。該有機フッ素化合物はフッ素以外の元素が含まれていても構わない。例えば、ハロゲン原子で一部が置換されていても構わない。このうちより好ましくは炭素数が２から３であるフッ素含有アルコールである。最も好ましくは1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、トリフルオロ酢酸、およびペンタフルオロプロピオン酸である。また、該溶媒は種々の溶媒と相溶性があるため、相溶性のある溶媒との混合溶媒として利用しても構わない。【００１８】
1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール（HFIP）や2,2,2−トリフルオロエタノール（TFE）に代表される有機フッ素化合物はコラーゲンやゼラチンといったタンパク質を溶解する。さらに、例えば、ゼラチンを含むHFIP溶液を4℃としてもゲル形成しない。従って、反応性の高い反応にもハンドリングが容易である。【００１９】
本発明でいう化学修飾の例としては、生体高分子又はポリペプチドの架橋、及び生体高分子又はポリペプチドへの官能基の導入を挙げることができる。【００２０】
生体高分子又はポリペプチドの架橋は、架橋剤を用いて行うことができる。本発明で用いる架橋剤は本発明を実施可能である限りは特に限定はなく、化学架橋剤でも酵素でもよいが、特に化学縮合剤が好ましい。架橋剤としては、例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、シアナミド、ビニルスルホン、ジエポキシドなどが挙げられる。好ましくは、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドである。タンパク質の縮合に水よりも求核性の低い溶媒を用いることが望ましい。HFIPやTFEはアルコールであるが、水酸基の酸性度が高く、求核性が低い。従って、該溶媒による求核攻撃を伴う反応の阻害が少ないことが考えられる。【００２１】
本発明を生体高分子への官能基の導入に適用する場合、縮合剤とともに、所望の官能基を有する化合物を反応させる、または所望の官能基を有する酸無水物、酸塩化物、あるいはエポキシドと反応させる。縮合剤としては上述の架橋剤と同様のものが好ましい。用いる化合物としては、特に限定はないが、疎水性の高い官能基、アルカリにて分解、反応を起こす官能基を含む化合物が本発明の目的を達成するために好ましい。好ましくは、エステル基、アミド基、ジチオカルバミル基、炭酸エステル基、エポキシド基、α−オルソエステル基を有する化合物、α、β不飽和結合を有する化合物である。例えば、２−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸、３−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸、４−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸、２−ビニル安息香酸、３−ビニル安息香酸、４−ビニル安息香酸、カルボキシル化カンファキノンが挙げられる。
また、化学修飾に用いる化合物として、酸無水物（例えば：２−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸無水物、３−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸無水物、４−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸無水物、２−ビニル安息香酸無水物、３−ビニル安息香酸無水物、４−ビニル安息香酸無水物）、酸塩化物（例えば：２−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸塩化物、３−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸塩化物、４−N,N-ジエチルジチオカルバミルメチルー安息香酸塩化物、２−ビニル塩化ベンゾイル、3−ビニル塩化ベンゾイル、４−ビニル塩化ベンゾイル）、エポキシドを用いることができる。【００２２】
本発明では、生体高分子あるいはポリペプチドを化学修飾する際、反応混合物中の縮合剤の濃度は一般的には1.0〜10重量％であり、好ましくは1.0〜5.0重量％である。【００２３】
生体高分子の化学修飾には、生体高分子の溶液と反応基質を混合する過程とそれらの均一溶液の反応する過程の２つの過程を有する。
本発明において生体高分子と反応基質との混合温度は、溶液を均一に攪拌できる限り特に限定されないが、好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは０℃〜３０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃〜１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。【００２４】
生体高分子と反応基質とを攪拌した後は温度を上昇させることができる。反応温度としては反応が進行する限りは特に限定はないが、生体高分子の変性や分解を考慮すると実質的には０℃〜６０℃であり、より好ましくは０℃〜４０℃であり、より好ましくは３℃〜２５℃であり、より好ましくは３℃から１５℃であり、さらに好ましくは３℃〜１０℃であり、特に好ましくは３℃〜７℃である。【００２５】
本発明により得られる化学修飾（架橋又は官能基導入）された生体高分子又はポリペプチドからなる構造物の形態は特に規定はないが、例えばスポンジ、フィルム、不織布、ファイバー（チューブ）、粒子などが挙げられる。形状はいずれの形状でも適用可能であるが、例えば角錐、円錐、角柱、円柱、球、紡錘状の構造物および任意の型により作成した構造物が挙げられる。好ましくは、角柱、円柱、紡錘状の構造物および任意の型により作成した構造物である。より好ましくは、角錐、円錐、角柱、円柱である。最も好ましくは角柱、円柱である。【００２６】
該構造物の大きさは特に限定されないが、スポンジ、不織布であれば好ましくは500 cm四方以下である。好ましくは100 cm以下である。特に好ましくは50 cm以下である。最も好ましくは10 cm以下である。ファイバー（チューブ）であれば、ファイバーまたはチューブの直径（または一辺）は1 nm以上10 cm以下である。好ましくは1 nm以上1 cm以下である。より好ましくは1 nm以上100 μmである。特に好ましくは1 nm以上1μm以下である。最も好ましくは1 nm以上10 nm以下である。また、長さは特に限定されるものではないが、好ましくは10 μm以上100 m以下である。より好ましくは100 μm以上10 m以下である。さらに好ましくは1 mm以上1 m以下である。最も好ましくは1 cm以上30 cm以下である。粒子であれば、好ましくは1 nmから1 mm、より好ましくは10 nmから200 μm、さらに好ましくは50 nmから100 μm、特に好ましくは100 nmから10μmである。【００２７】
構造物の厚さについては特に限定されないが、好ましくは1 nm以上である。より好ましくは、10 nm以上である。より好ましくは100 nm以上である。より好ましくは1 μm以上である。さらに好ましくは10 μm以上である。最も好ましくは100 μm以上である。【００２８】
本発明の方法により製造される化学修飾された生体高分子又はポリペプチドには、必要に応じて添加剤を加えても良い。添加剤の例としては、薬剤、色素剤、柔軟剤、経皮吸収促進剤、保湿剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、香料、pH調整剤が挙げられる。【００２９】
本発明により製造した化学修飾された生体高分子又はポリペプチドは、その中に薬剤を封入して用いることができる。該薬剤の具体例としては、例えば抗癌剤（例えば、パクリタキセル、トポテシン、タキソテール、5-フルオロウラシル、シスプラチン）、免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン、タクロリムス、シクロスポリン）、抗炎症剤、抗血栓剤、抗精神剤（例えば、塩酸アミトリプチリン）、抗うつ剤、抗酸化剤、抗アレルギー剤、増殖因子（例えば、繊維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、神経増殖因子）、ホルモン、サプリメント成分、化粧品成分が挙げられる。【００３０】
本発明の方法により製造される化学修飾された生体高分子又はポリペプチドの用途は特に限定することはないが、経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、注射治療剤、化粧品、サプリメント、食品、および色素材である。好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤、化粧品である。さらに好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤、経口治療剤である。最も好ましくは経皮吸収剤、局所治療剤である。【００３１】
本発明により製造される化学修飾された生体高分子又はポリペプチドの用途として、例えば、抗癌剤を含有する皮膚外用剤が挙げられる。皮膚外用剤の適用疾患としては、例えば、皮膚癌、角化症、悪性黒色腫、菌状息肉症、乳癌、前立腺癌、子宮癌、膣癌、陰茎癌、大腸癌である。好ましくは、皮膚癌、角化症である。【００３２】
本発明により製造される化学修飾された生体高分子又はポリペプチドは、生体組織中への埋め込み材として利用できる。例えば、細胞を包埋した架橋した生体高分子を損傷部位に埋め込み、組織を修復することができる。また、別の形態によると、増殖因子や各種薬剤を封入した架橋した生体高分子を生体組織中に埋め込み、組織を修復することができる。【００３３】
化学修飾された生体高分子又はポリペプチドに封入する細胞の種類は特に限定されないが、例えば、骨髄細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、上皮細胞が挙げられる。
生体組織中への埋め込み部位として特に強度が求められる部位としては、例えば、骨、軟骨、心臓、血管などが挙げられる。【００３４】
生体組織中への埋め込み材としての利用の別の形態として、生体内での治療器具へのコーティングが挙げられる。例えば、人工血管、人工心臓等の人工臓器、血管内治療用のステントが挙げられる。ステントに用いる場合、抗癌剤や免疫抑制剤を架橋した生体高分子に封入し、ステント表面にコーティングすることが挙げられる。【００３５】
本発明で用いる手法は、未修飾では該有機フッ素化合物に溶解しない化合物であっても使用可能である。すなわち、水系での化学修飾では効率が悪く、化合物の高導入率化は達成できないが、疎水性化合物の導入により該有機フッ素化合物に溶解する場合は、１段階目に水系での化合物の導入反応を、２段階目に有機フッ素化合物での化学反応を行うことで生体高分子あるいはポリペプチドへの疎水性の化合物の高導入率化が可能となる。【００３６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：疎水性化合物によるゼラチンの化学修飾（ジチオカルバミル化）
縮合剤として水溶性カルボジイミド（Water Soluble Carbodiimide：WSC）（223 mg）および4−ジチオカルバミルメチル安息香酸（165 mg）を含む2,2,2-トリフルオロエタノール溶液（6 mL）を0℃で1時間攪拌した後、ゼラチン（PSKゼラチン、ニッピ社製、300 mg）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）57 mgおよびジメチルアミノピリジン（DMAP）60  mgを含むTFE溶液（6 mL）に室温で加えた。該溶液を１日攪拌した。該溶液をろ過し、水にて希釈した。該ろ液を３日間透析し（ダイアリシスメンブラン36、和光純薬製）、凍結乾燥した。ジチオカルバミル基の導入量を得られた凍結乾燥体をUV-可視スペクトルにより280 nmの吸光度を測定することにより算出したところ、85％のアミノ基がジチオカルバミル化されたゼラチンを得た。【００３８】
一方、Journal of Biomaterial Science, Polymer Edition  16（７）809-827,  2005（非特許文献１）に記載の手法により、4-ジチオカルバミルメチル安息香酸（165 mg）を1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解した後、1N塩酸にて中和してｐH8とし、WSCを含むPBS溶液6 ｍLに加え、０℃で１時間攪拌した。該溶液をゼラチン（3ｇ）を含むPBS溶液（6 mL）に加え、室温にて１日攪拌した。反応液のｐHを8と10の２種類検討した。得られた懸濁液をろ過、透析した後、凍結乾燥した。ジチオカルバミル基を上記と同様に計測したところ、ｐH8の反応液では12％、ｐH10の反応液では75％であった。ｐH10で反応して得られたジチオカルバミル化ゼラチンは一部導入されたジチオカルバミル基が加水分解されたことを示唆する、チオール基を検出した。【００３９】
ゼラチン側鎖への官能基の導入にTFEを用いることで、水系では困難であった疎水性の高い化合物の導入が容易となり、またアルカリによる分解を受ける官能基の導入が可能となったと言える。
ここで、４−ジチオカルバミルメチル安息香酸のcLogPは3.6であり、疎水性である。また、ジチオカルバミル基はアルカリにより分解を受け、チオールを産生する官能基である。【００４０】
実施例２：疎水性のテレフタル酸を用いたゼラチンの架橋
ＷＳＣ（同人化学社製）38.4ｍｇ（テレフタル酸の２倍モル量）とテレフタル酸16.6 mgを含むHFIP溶液（1 mL）を４℃で1時間攪拌し、カルボキシル基を活性かした後、酸処理ゼラチン（PSKゼラチン、ニッピ社製）を600 mg、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）115 mgおよびジメチルアミノピリジン（DMAP）122 mg含むTFE溶液（2 mL）に加えた。該溶液を室温にて3時間静置すると、溶液全体がゲル状に硬化した。【００４１】
実施例３：疎水性化合物によるゼラチンの化学修飾
ＷＳＣ（223 mg）および4−ジチオカルバミルメチル安息香酸（165 mg）を含む2,2,2-トリフルオロエタノール溶液（6 mL）を0℃で1時間攪拌した後、ゼラチン（PSKゼラチン、ニッピ社製、300 mg）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）57 mgおよびジメチルアミノピリジン（DMAP）60  mgを含むTFE-HFIP混合溶液（6 mL、TFE/HFIP=5）に室温で加えた。該溶液を１日攪拌した。該溶液をろ過し、水にて希釈した。該ろ液を３日間透析し（ダイアリシスメンブラン36、和光純薬製）、凍結乾燥した。ジチオカルバミル基の導入量を得られた凍結乾燥体をUV-可視スペクトルにより280 nmの吸光度を測定することにより算出したところ、75％のアミノ基がジチオカルバミル化されたゼラチンを得た。