(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均分子量が２０万〜１６０万であるヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有し、
前記ヒアルロン酸および／またはその塩は、平均分子量が５０万〜３００万のヒアルロン酸および／またはその塩４５〜８５％と、平均分子量が１，０００〜１０万のヒアルロン酸および／またはその塩１５〜５５％とを混合して得られる、経口用ドライアイ改善剤。
【請求項２】
請求項１に記載の経口用ドライアイ改善剤を含有する食品組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の経口用ドライアイ改善剤を有効成分として含有する医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドライアイ症状の改善に有効な経口用ドライアイ改善剤、ならびに前記経口用ドライアイ改善剤を含む食品組成物および医薬品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代は視覚優位社会であり、現代人は目を酷使する機会が多く、ドライアイに悩む患者の数は一昔前よりも増加している。
【０００３】
ドライアイの原因は多岐にわたっている。例えば、パソコンのモニター、テレビ画面、携帯電話画面を見続けることにより、まばたきが減少して眼の表面が乾きやすくなる。さらに、冷暖房などの空調により眼の表面が乾きやすくなる。また、涙の分泌は副交感神経に支配されており、交感神経優位の状態（緊張時）では涙量が減少するため、ストレスによって交感神経優位の状態になることが原因でドライアイが発症することもある。
【０００４】
また、加齢により涙量が減少することが知られている。さらには、コンタクトレンズの長時間使用によって目の表面が荒れることが原因でドライアイを発症する例や、レーシックなどの目の手術後にドライアイを発症する例も報告されている。あるいは、シェーグレン症候群などの自己免疫疾患やスティーブンスジョンソン症候群などの病気が原因で重篤なドライアイが発症する例が報告されている。
【０００５】
ドライアイの改善に関しては、特許文献１にヒアルロン酸蓄積促進用組成物が開示されている。しかしながら、同公報では、ヒアルロン酸自体を経口摂取してドライアイを改善することについて実証されていない。
【０００６】
また、特許文献２には、眼精疲労用飲食品組成物が開示されている。しかしながら、同公報は、眼精疲労および眼精疲労が原因による肩・腰の凝り又は頭が重い等の症状の改善に関するものであり、ドライアイについては言及されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−８９４５４号公報
【特許文献２】特開２００５−２８７３７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ドライアイ症状の改善に有効な経口用ドライアイ改善剤、ならびに前記経口用ドライアイ改善剤を含む食品組成物および医薬品組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様に係る経口用ドライアイ改善剤は、上記ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する。
【００１０】
上記経口用ドライアイ改善剤において、前記ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量は２０万〜３００万であることができる。
【００１１】
上記経口用ドライアイ改善剤において、前記ヒアルロン酸および／またはその塩は、平均分子量が５０万〜３００万のヒアルロン酸および／またはその塩３５〜９５％と、平均分子量が１,０００〜１０万のヒアルロン酸および／またはその塩５〜６５％とを混合して得ることができる。
【００１２】
本発明の他の一態様に係る食品組成物は、上記経口用ドライアイ改善剤を含有する。
【００１３】
本発明のさらに他の一態様に係る医薬品組成物は、上記経口用ドライアイ改善剤を有効成分として含有する。
【発明の効果】
【００１４】
上記経口用ドライアイ改善剤によれば、ヒアルロン酸および／またはその塩を含有することにより、ドライアイ症状を効果的に改善することができる。
【００１５】
特に、上記経口用ドライアイ改善剤において、前記ヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量が２０万〜３００万である場合、医師にドライアイであると診断された患者のドライアイ症状を効果的に改善することができ、かつ、ドライアイ症状の改善効果を長期的に持続させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例４において撮影された、蛍光標識ヒアルロン酸を経口投与したウサギの角膜表面の蛍光顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の一実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤を詳細に説明する。なお、本発明において「％」は「質量％」を意味する。
【００１８】
１．経口用ドライアイ改善剤
本発明の一実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤はヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１９】
１．１．ヒアルロン酸および／またはその塩
ここで、「ヒアルロン酸」とは、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの二糖からなる繰り返し構成単位を１以上有する多糖類をいう。また、「ヒアルロン酸の塩」としては、特に限定されないが、食品または薬学上許容しうる塩であることが好ましく、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００２０】
ヒアルロン酸は、基本的にはβ−Ｄ−グルクロン酸の１位とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンの３位とが結合した２糖単位を少なくとも１個含む２糖以上のものでかつβ−Ｄ−グルクロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチル−グルコサミンとから基本的に構成され、２糖単位が複数個結合したもの、またはそれらの要素が結合した糖であってもよい。該糖は不飽和糖であってもよく、不飽和糖としては、非還元末端糖、通常、グルクロン酸の４，５位炭素間が不飽和のもの等が挙げられる。
【００２１】
ヒアルロン酸および／またはその塩は、動物等の天然物（例えば鶏冠、さい帯、皮膚、関節液などの生体組織など）から抽出されたものでもよく、または、微生物もしくは動物細胞を培養して得られたもの（例えばストレプトコッカス属の細菌等を用いた発酵法）、化学的もしくは酵素的に合成されたものなどいずれも使用することができる。
【００２２】
１．１．１．分子量
本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤で使用されるヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量は、ドライアイ症状の改善を持続的に行なうことができる点で、２０万〜３００万であることが好ましい。この場合、前記ヒアルロン酸および／またはその塩は例えば、平均分子量が５０万〜３００万のヒアルロン酸（以下「高分子ヒアルロン酸」ともいう。）および／またはその塩３５〜９５％と、平均分子量が１，０００〜１０万のヒアルロン酸（以下「低分子ヒアルロン酸」ともいう。）および／またはその塩５〜６５％とを混合して得ることができる。また、本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤で使用されるヒアルロン酸および／またはその塩の平均分子量は、２０万〜１６０万であることがより好ましい。この場合、前記ヒアルロン酸および／またはその塩は例えば、高分子ヒアルロン酸および／またはその塩４５〜８５％と、低分子ヒアルロン酸および／またはその塩１５〜５５％とを混合して得ることができる。
【００２３】
１．１．２．分子量の測定方法
本発明で規定される平均分子量の測定方法について説明する。
【００２４】
即ち、約０．０５ｇの精製ヒアルロン酸を精密に量り、０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液に溶かし、正確に１００ｍＬとした溶液及びこの溶液８ｍＬ、１２ｍＬ並びに１６ｍＬを正確に量り、それぞれに０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液を加えて正確に２０ｍＬとした溶液を試料溶液とする。この試料溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ濃度の塩化ナトリウム溶液につき、日本薬局方（第十四改正）一般試験法の粘度測定法（第１法 毛細管粘度測定法）により３０．０±０．１℃で比粘度を測定し（式（１））、各濃度における還元粘度を算出する（式（２））。還元粘度を縦軸に、本品の換算した乾燥物に対する濃度（ｇ／１００ｍＬ）を横軸にとってグラフを描き、各点を結ぶ直線と縦軸との交点から極限粘度を求める。ここで求められた極限粘度をＬａｕｒｅｎｔの式（式（３））に代入し、平均分子量を算出する（T.C. Laurent, M. Ryan, A. Pietruszkiewicz,:B.B.A., 42, 476-485(1960)）。
【００２５】
（式１）
比粘度 ＝ {(試料溶液の所要流下秒数)/(０．２ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム溶液の所要流下秒数)}−1
【００２６】
（式２）
還元粘度（ｄＬ／ｇ）＝ 比粘度/(本品の換算した乾燥物に対する濃度(ｇ／１００ｍＬ))
【００２７】
（式３）
極限粘度（ｄＬ／ｇ）＝３．６×１０−４Ｍ０．７８
Ｍ：平均分子量
【００２８】
１．１．３．ヒアルロン酸の製造
本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤で使用されるヒアルロン酸は、市販品を使用することができるが、例えば、以下の製造法１および２に従って製造することもできる。
【００２９】
（ｉ）製造法１（鶏冠からの抽出）
まず、鶏冠に加熱処理を施す。これは、鶏冠に含まれる蛋白質を熱変性させたり、酵素失活させたりするためである。加熱処理は如何なる方法をとってもよいが、熱水中に鶏冠を浸漬する方法をとると効率よく行なうことができる。加熱温度や時間は、鶏冠中の蛋白質が変性したり、酵素が失活したりする範囲内であれば、特に制限がなく、熱水による加熱法を採用する場合は、６０〜１００℃の熱水中に原料を２０〜９０分間浸漬するとよい。
【００３０】
なお、凍結した鶏冠を用いる場合には、鶏冠をそのまま加熱してもよいが、凍結鶏冠を流水中等に入れ緩慢解凍した後、加熱処理を施したほうが一定品位のものが得られやすく、好ましい。
【００３１】
次に、加熱処理した鶏冠をペースト化する。このペースト化によりヒアルロン酸の収率が向上する。ペースト化に先立ち、加熱処理後の鶏冠を細断機により薄く切断したり、または肉挽き用チョッパー等で細断したりしておくと、ペースト化がしやすくなる。ペースト化の一例を示すと、鶏冠に対して約１〜５倍量の清水を加え、ホモゲナイザーにて１０〜６０分間ホモゲナイズを行なうことで、鶏冠は破砕・微粒子化され、ペーストに仕上げることができる。なお、ペースト化には、ホモゲナイザーの他に、高速撹拌機や擂潰機を用いてもよい。
【００３２】
次に、ペースト化した鶏冠に、塩酸、硫酸等の酸剤、または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ剤を添加し酸処理またはアルカリ処理してヒアルロン酸を低分子化し、処理後のヒアルロン酸の平均分子量を調整する。調整方法としては、酸剤あるいはアルカリ剤の濃度、添加量および処理時間等を適宜組み合わせて、処理後のヒアルロン酸が所望の分子量となるようにすればよいが、アルカリ処理による方法がヒアルロン酸の分子量をコントロールし易く好ましい。アルカリ処理による一例を示すと、ペースト化した鶏冠に、鶏冠に対し１０〜３０％濃度のアルカリ水溶液を約１〜５％添加し、２５〜７０℃で約１５〜９０分間処理を行った後、塩酸等で中和し、分子量を調整する。
【００３３】
次に、分子量を調整した原料に蛋白分解酵素を添加して、プロテアーゼ処理する。使用する蛋白分解酵素は、市販しているものであれば種類を問わず使用することができ、例えば、ペプシン、トリプシン、パパイン、プロメリン等が挙げられる。蛋白分解酵素の添加量は、鶏冠に対して０．０１〜１％が適当である。また、プロテアーゼ処理の温度と時間は、３５〜６５℃で１〜１０時間の範囲が適当である。
【００３４】
最後に、得られたプロテアーゼ処理物からヒアルロン酸を分取して、粗製のヒアルロン酸を得た後、このヒアルロン酸を精製することにより純度９０％以上のヒアルロン酸が得られる。
【００３５】
ここで、ヒアルロン酸の分取・精製は、常法に従って行なうことができる。例えば、まず、プロテアーゼ処理した原料を濾過して固形物を除去して、粗製のヒアルロン酸を含有した濾液を得る。なお、濾過に先立ち、脱臭・脱色や一部の蛋白分解物を除去する目的で、プロテアーゼ処理物に活性炭を添加し処理してもよい。そして得られた濾液に食塩を溶解させた後、エタノールを添加してヒアルロン酸を沈殿させ、沈殿物を分取する。その後、この沈殿物にエタノール濃度約８０〜９５容量％の含水エタノールを添加し、ホモゲナイザーで洗浄し、沈殿物を分取する。この含水エタノールによる洗浄を２〜１０回程度繰り返し、分取した沈殿物を乾燥することで、製造法１のヒアルロン酸を得ることができる。
【００３６】
（ｉｉ）製造法２（微生物発酵法）
ヒアルロン酸産出ストレプトコッカス属の微生物（Streptococcus Zoopidemicus）の培養液に活性炭を添加して脱臭・脱色処理を行った後、濾過処理する。得られた濾液に食塩を溶解させた後、エタノールを添加してヒアルロン酸を沈殿させ、沈殿物を分取する。その後、この沈殿物にエタノール濃度約８０〜９５容量％の含水エタノールを添加し、ホモゲナイザーで洗浄し、沈殿物を分取する。この含水エタノールによる洗浄を２〜１０回程度繰り返し、分取した沈殿物を乾燥することで、製造法２のヒアルロン酸を得ることができる。
【００３７】
なお、本発明において使用するヒアルロン酸の純度は、飲食品に使用できるレベルであればよく、好ましくは９０％以上であればよく、より好ましくは９５％以上であればよい。この純度は乾燥物換算で１００％よりヒアルロン酸以外の不純物を除いた値として定義される。ここで、不純物としては、蛋白分解物、脂肪分（粗脂肪）、コンドロイチン硫酸等が挙げられる。具体的に鶏冠を原料とするヒアルロン酸の純度は、以下式（４）で求めることができる。
【００３８】
（式４）
ヒアルロン酸の純度（％）＝１００−蛋白分解物（％）−粗脂肪（％）−コンドロイチン硫酸（％）
式４中、蛋白分解物（％）はＬｏｗｒｙ法により求めた値であり、粗脂肪（％）は新・食品分析法（光琳（株）発行）「第１章一般成分および関連成分、１−４脂質、１−４−２エーテル抽出法」により求めた値であり、また、コンドロイチン硫酸（％）は、以下に説明する方法により得た値である。
【００３９】
まず、ヒアルロン酸を乾燥し、その５０ｍｇを精密に量り、精製水を加えて溶かし、正確に１００ｍＬとして試験溶液とし、その試験溶液４ｍＬを試験管にとり、０．５ｍｏｌ／Ｌ濃度の硫酸１ｍＬを加えて混和し、水浴中で１０分間加熱し、その後冷却して得られた溶液に０．０４ｍｏｌ／Ｌ濃度の臭化セチルトリメチルアンモニウムを０．２ｍＬ加えて混和し、室温で１時間放置し、層長１０ｍｍ、波長６６０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００４０】
次に、得られた吸光度データをコンドロイチン硫酸の検量線に適用して精製ヒアルロン酸中のコンドロイチン硫酸量（％）を求める。ここで、その検量線は、クジラ軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（ＳＧ（Special Grade）、生化学工業株式会社製）を乾燥（減圧、五酸化リン、６０℃、５時間）させたものを精密に量り、精製水を加えて溶かし、１ｍＬ中に１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇのコンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩を含む溶液をそれぞれ調製し、それぞれの溶液４ｍＬについて、０．５ｍｏｌ／Ｌ濃度の硫酸１ｍＬを加えて混和した後、０．０４ｍｏｌ／Ｌ濃度の臭化セチルトリメチルアンモニウムを０．２ｍＬ加えて混和し、室温で１時間放置した後、同様に吸光度を測定し、その吸光度を縦軸に、対応するコンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩溶液（μｇ／ｍＬ）を横軸にプロットすることによって作成したものである。
【００４１】
１．１．４．剤型、用量およびその他の成分
本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤はヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として通常５％以上含有するものであり、好ましくは１０％以上含有する。
【００４２】
本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤を経口摂取することによって、ドライアイの症状の改善を図ることができる。
【００４３】
ヒアルロン酸および／またはその塩は生体物質であるため、多量に摂取しても副作用がない、またはきわめて低いと考えられるが、本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤として摂取するヒアルロン酸および／またはその塩の量は、一日当たり１〜１０００ｍｇ、好ましくは１５〜３００ｍｇを目安とすることができる。また、本発明のヒアルロン酸および／またはその塩を含有する飲料の場合は、本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤が飲料である場合、該飲料中にヒアルロン酸および／またはその塩を０．００１〜１％、好ましくは０．０１〜０．５％含有させることができる。
【００４４】
本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤は、ヒアルロン酸および／またはその塩以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の成分を含むことができる。そのような成分の例としては水、賦形剤、抗酸化剤、防腐剤、湿潤剤、粘稠剤、緩衝剤、吸着剤、溶剤、乳化剤、安定化剤、界面活性剤、滑沢剤、水溶性高分子、甘味料、矯味剤、酸味料、アルコール類等が挙げられる。
【００４５】
本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤の態様は特に限定されないが、例えば、上記経口用ドライアイ改善剤を含有する食品組成物であることができる。この場合、ガム、キャンディー、グミキャンディー、トローチ様食品、ゼリー飲料、米飯加工食品、製パン類、レトルト缶詰、冷凍食品、惣菜、乾燥食品、マヨネーズ等調味料、飲料、菓子、デザート類、サプリメント類等の一般食品全般、生理機能を表現することを許可された特定保健用食品全般が挙げられ、このうち、利便性に優れている点で、サプリメント類が好ましい。
【００４６】
サプリメント類の形態としては、例えば、錠剤状、散剤状、細粒状、顆粒状、カプセル状（ハードカプセル、ソフトカプセル）等の固形状、液状、懸濁液状、ゼリー状、シロップ状等の流動状が挙げられる。
【００４７】
また、本実施形態に係る経口用ドライアイ改善剤の他の態様として、例えば、上記経口用ドライアイ改善剤を有効成分として含有する医薬組成物が挙げられる。この場合、該医薬組成物は例えば、上述のサプリメント類として例示した形態と同様の形態をとることができる。
【００４８】
２．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００４９】
２．１．実施例１（試験食の製造）
まず、経口用ドライアイ改善剤として、以下の配合にて処方例１〜３の試験食（ソフトカプセル）を製造した。
【００５０】
なお、処方例１〜３において使用した高分子ヒアルロン酸は、上記製造法２に準じて平均分子量が１５０万となるよう調製したものであり、低分子ヒアルロン酸は、上記製造法１に準じて平均分子量が６，０００となるよう調製したものである。
【００５１】
すなわち、処方例１の試験食に含まれるヒアルロン酸の平均分子量は７５．３万であり、平均分子量が１５０万の高分子ヒアルロン酸と、平均分子量が６，０００の低分子ヒアルロン酸とを混合したものである。すなわち、後述するように、処方例１の試験食に含まれるヒアルロン酸は、平均分子量が１５０万（５０万〜３００万）のヒアルロン酸５０％と、平均分子量が６，０００（１，０００〜１０万）のヒアルロン酸５０％とを混合して得られたものである。
【００５２】
また、処方例２の試験食は、平均分子量が１５０万の高分子ヒアルロン酸を配合したものである。
【００５３】
また、処方例３の試験食は、平均分子量が６，０００の低分子ヒアルロン酸を配合したものである。
【００５４】
２．１．１．処方例１
（ソフトカプセル内容物の配合）
高分子ヒアルロン酸    ４４ｍｇ
低分子ヒアルロン酸    ４４ｍｇ
オリーブ油          ２０２ｍｇ
ミツロウ              １０ｍｇ
―――――――――――――――――
合計                ３００ｍｇ／粒
【００５５】
２．１．２．処方例２
（ソフトカプセル内容物の配合）
高分子ヒアルロン酸    ８８ｍｇ
オリーブ油          ２２７ｍｇ
ミツロウ              １５ｍｇ
―――――――――――――――――
合計                ３００ｍｇ／粒
【００５６】
２．１．３．処方例３
（ソフトカプセル内容物の配合）
低分子ヒアルロン酸    ８８ｍｇ
オリーブ油          １９０ｍｇ
ミツロウ              ２２ｍｇ
―――――――――――――――――
合計                ３００ｍｇ／粒
【００５７】
２．２．実施例２（ドライアイ改善効果の評価）
実施例１の処方例１〜３で得られた試験食（ヒアルロン酸の摂取量：２６４ｍｇ／日）を、ドライアイの自覚症状がある被験者（２４名／群）に１日３粒、４週間連用摂取させた。
【００５８】
２．２．１．評価方法
試験開始前（試験食の摂取前）、試験開始２週間後、４週間後および６週間後（摂取終了から２週間後）にドライアイの症状である下記の１２項目についてアンケート調査を行い、下記度合いによって点数化し、合計点をスコアとして評価を行った。その結果を表１に示す。
【００５９】
（アンケート項目）
（１）眼の疲れ
（２）めやにが出る
（３）眼がごろごろする
（４）眼が重たい
（５）眼が乾く
（６）眼の不快感がある
（７）眼の痛み
（８）涙が多く出る
（９）ものがかすんで見える
（１０）眼のかゆみ
（１１）光を見るとまぶしく感じる
（１２）眼が赤い（充血）
（各症状の度合いの点数）
かなりある：３点
多少ある  ：２点
あまりない：１点
全くない  ：０点
【００６０】
２．２．２．評価結果
【００６１】
【表１】
0005601805.tif 000002
【００６２】
表１によれば、試験開始前のスコアおよび試験開始後のスコアについて、有意差検定を行った結果、全ての群で、試験開始前のスコアに比べて試験開始後のスコアは有意に（ｐ＜０．００１／３）減少した。
【００６３】
以上の結果から、ヒアルロン酸を含有する経口用ドライアイ改善剤は、ドライアイ症状を改善できることが確認された。
【００６４】
２．３．実施例３（ドライアイ改善効果の評価）
実施例１で調製された処方例１〜３の試験食（ヒアルロン酸の摂取量：２６４ｍｇ／日）を、ドライアイと医師に診断された被験者（９名／群）に１日３粒、４週間連用摂取させた。評価方法および評価項目は実施例２と同様であった。その結果を表２に示す。
【００６５】
【表２】
0005601805.tif 000003
【００６６】
表２によれば、試験開始前のスコアおよび試験開始後のスコアについて、有意差検定を行った結果、処方例１（高分子ヒアルロン酸＋低分子ヒアルロン酸）摂取群および処方例２（高分子ヒアルロン酸）摂取群において、試験開始前のスコアに比べて試験開始後のスコアは有意に（ｐ＜０．０５／３）減少した。
【００６７】
一方、処方例３（低分子ヒアルロン酸）摂取群では、試験開始前のスコアと比べ、試験開始後のスコアが減少する傾向が見られたものの、有意な減少は認められなかった。
【００６８】
また、処方例１（高分子ヒアルロン酸＋低分子ヒアルロン酸）摂取群は、試験開始から６週間後のスコアが、試験開始から４週間後のスコアと比較して増加しなかった。このことから、処方例１（高分子ヒアルロン酸＋低分子ヒアルロン酸）摂取群では、試験食の摂取を終了した後でもドライアイ改善効果が継続する傾向があることが確認された。
【００６９】
以上の結果から、平均分子量２０万〜３００万（処方例１：７５．３万および処方例２：１５０万）のヒアルロン酸を含有する経口用ドライアイ改善剤は、医師にドライアイであると診断された患者のドライアイ症状を改善でき、特に、平均分子量が５０万〜３００万のヒアルロン酸および／またはその塩３５〜９５％と、平均分子量が１，０００〜１０万のヒアルロン酸および／またはその塩５〜６５％とを混合して得られる処方例１のヒアルロン酸が特に、ドライアイ改善効果が高いことが理解できる。
【００７０】
２．４．実施例４（蛍光標識ヒアルロン酸の角膜への移行の評価）
本実施例では、被験物質（蛍光標識ヒアルロン酸）をウサギに経口投与した後、角膜を採取して蛍光標識ヒアルロン酸の検出を蛍光顕微鏡にて行った。
【００７１】
２．４．１．蛍光標識ヒアルロン酸の調製
本実施例では、２種類のヒアルロン酸を用いて、蛍光標識ヒアルロン酸（試作品Ａおよび試作品Ｂ）を調製した。試作品Ａの調製に用いたヒアルロン酸は、上記製造法２に準じて平均分子量が７０万となるよう調製したものであり、試作品Ｂに用いたヒアルロン酸は、上記製造法２に準じて平均分子量が２．６万となるよう調製したものである。
【００７２】
標識法は、Belder等の方法に準拠し（de Belder A.N., and Wik K.O., Carbohydr. Res. 44, 251-257, 1975）、Fluorescein-Amine isomer I (Sigma-Aldrich製) を用いて標識した。
【００７３】
具体的には、試作品Ａの場合、平均分子量７０万のヒアルロン酸を０．２％になるように精製水に溶解し、その半分の体積のdimethyl sulfoxide(DMSO; 和光純薬、特級を加えた。次いで、ヒアルロン酸の１／２の重量のFluorescein-Amine isomer I（MP Biomedicals; Mw 347.3）をヒアルロン酸溶液の１／１００量のDMSO/ acetaldehyde (Fluka)/cyclohexyl isocyanide(Fluka)（４５０：２５：２５）に溶かし、ヒアルロン酸溶液に加えた。
【００７４】
次に、２５℃で５時間インキュベートした後、４倍体積の塩化ナトリウム飽和エタノールを加えてヒアルロン酸を沈殿させた。この沈殿を水に再溶解し、塩化ナトリウム飽和エタノールによるエタノール沈殿を２回繰り返した後、沈殿物を精製水に溶解させて水溶液を調製し、排除分子量１万の透析膜を用いてこの水溶液に対して透析を行い、凍結乾燥することで蛍光標識ヒアルロン酸（試作品Ａ）を得た。
【００７５】
また、試作品Ｂの場合、平均分子量２．６万のヒアルロン酸を用い、２５℃で５時間インキュベートした後、エタノール沈殿を行わずにそのまま透析を行った以外は試作品Ａと同様の方法で蛍光標識ヒアルロン酸（試作品Ｂ）を得た。
【００７６】
２．４．２．評価方法
ウサギの体重１ｋｇに対し２００ｍｇの被験物質（試作品ＡおよびＢ、投与用量：２０ｍＬ／ｋｇ、投与液濃度：被験物質の１％水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ））をウサギ（Japanese White種、北山ラベス社製）に単回経口投与（注射筒および胃ゾンデを用いて胃内に強制経口投与）した後、２４時間目に採取した角膜を０．５％ＣＰＣホルマリンにて固定した後、スクロース６０％溶液で置換後ＯＣＴコンパウンドに包埋し、ドライアイスで凍結させた。次に、凍結した角膜をクリオスタットにて約１０μｍに薄切した後、蛍光標識ヒアルロン酸の検出を蛍光顕微鏡にて行なった。
【００７７】
２．４．３．評価結果
上記評価方法にしたがって処理された角膜の蛍光顕微鏡写真を図１に示す。図１において、特に蛍光の強いところを＊（白色）で示している。
【００７８】
図１によれば、蛍光標識ヒアルロン酸の投与後０．５時間経過時では、試作品Ｂの方が試作品Ａより蛍光が強く、角膜上皮に強い蛍光が認められた。一方、蛍光標識ヒアルロン酸の投与後２４時間経過時では、試作品Ａの方が試作品Ｂよりも若干強い蛍光が確認された。
【００７９】
以上の結果から、試作品Ｂ投与群では、経口投与後０．５時間以内に蛍光標識ヒアルロン酸が涙液に移行したと推察される。また、試作品Ａ投与群および試作品Ｂ投与群ともに、経口投与後２４時間経過時に角膜表面に蛍光が確認されたことから、蛍光標識ヒアルロン酸が角膜に存在していることが明らかになった。これにより、試作品Ａで用いた平均分子量２０万〜３００万（試作品Ａ：７０万）のヒアルロン酸および試作品Ｂで用いた平均分子量１，０００〜１０万（試作品Ｂ：２．６万）のヒアルロン酸は長時間の持続性に優れているといえる。
【００８０】
また、試作品Ａ投与群は試作品Ｂ投与群と比較して、経口投与後２４時間経過時における蛍光が強かったことから、試作品Ａ投与群は試作品Ｂ投与群と比較して、角膜に存在する蛍光標識ヒアルロン酸の量が多いことが明らかになった。これにより、試作品Ａで用いた平均分子量２０万〜３００万（試作品Ａ：７０万）のヒアルロン酸は、長時間の持続性により優れているといえる。
【図１】
0005601805.tif 000004