(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の標的核酸配列の有無を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）標的核酸を含むサンプルと、（ｉ）３’末端と、５’末端と、該標的核酸の第一の領域に相補的な配列とを含むオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに（ｉｉ）デテクター・オリゴヌクレオチドであって、３’末端と、５’末端と、５’末端に１つ以上の非切断性ヌクレオチドが組み込まれた該標的核酸配列の第二の領域に相補的なヌクレオチドの配列と、該標的核酸に相補的ではなくかつ該デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されたヌクレオチドの配列とを含むデテクター・オリゴヌクレオチドとを接触させ、これによってハイブリダイゼーション条件下で二重鎖の混合物であって、該オリゴヌクレオチドプライマーにおよび該デテクター・オリゴヌクレオチドにアニーリングされた該標的核酸を含む二重鎖の混合物を形成し、その結果該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端が該デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端の上流である、工程と；
（ｂ）工程（ａ）のサンプルを、該アニーリングされたデテクター・オリゴヌクレオチドを切断するのに十分な条件下で切断剤に対して暴露させ、それによって該標的核酸に相補的ではないヌクレオチドの配列を含む単一の大きさの種の質量識別可能な生成物を遊離させる工程と；
（ｃ）質量分析によって該単一の大きさの種の質量識別可能な生成物の有無を検出し、それによって該サンプル中の該標的核酸配列の有無を検出する工程と、
を包含する、方法。
【請求項２】
サンプル中の標的核酸配列の有無を検出する増幅方法であって、以下の工程：
（ａ）該サンプルを含む増幅反応物に対して１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、第一のプライマーが該標的核酸配列の一方の鎖における第一の領域に相補的な配列を含み、第二のプライマーが該標的核酸配列の第二の鎖における第一の領域に相補的な配列を含む、工程と
（ｂ）少なくとも１つのデテクター・オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここで該デテクター・オリゴヌクレオチドは、５’末端に１つ以上の非切断性ヌクレオチドが組み込まれた該標的核酸の一方の鎖における第二の領域に相補的なヌクレオチドの配列と、該標的核酸に相補的ではなくかつ該デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されたヌクレオチドの配列とを含み、そして該デテクター・オリゴヌクレオチドは、工程（ａ）の該オリゴヌクレオチドプライマーによって結合される該標的核酸配列内でアニーリングし、それによって、アニーリングされた二重鎖を作製し、さらに、各々のオリゴヌクレオチドプライマーが、同じ核酸鎖にアニーリングされた任意のデテクター・オリゴヌクレオチドの上流の相補的なテンプレートに対してアニーリングするように選択される工程と；
（ｃ）（ｉ）該標的配列内に含まれるテンプレート核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドのアニーリング、ならびに（ｉｉ）該プライマーオリゴヌクレオチドの伸長、の増幅サイクル工程を可能にする条件下で、テンプレート依存性重合化剤として、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して該標的核酸配列を増幅する工程であって、該核酸増幅酵素がプライマー伸長生成物を合成し、一方で該核酸増幅酵素の該５’→３’ヌクレアーゼ活性が同時に、該デテクター・オリゴヌクレオチドから該標的核酸に相補的ではないヌクレオチドの配列を含む単一の大きさの種の質量識別可能な生成物を遊離させる工程と；
（ｄ）質量分析法によって該単一の大きさの種の質量識別可能な生成物の有無を検出し、それによって該サンプル中の該標的配列の有無を検出する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３】
標的核酸の有無を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該標的核酸に対して、第一のオリゴヌクレオチドプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程であって、該デテクター・オリゴヌクレオチドは、５’末端に１つ以上の非切断性ヌクレオチドが組み込まれた該標的核酸配列に相補的なヌクレオチドの配列と、該標的核酸に相補的ではなくかつ該デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されたヌクレオチドの配列とを含む、工程と；
（ｂ）該デテクター・オリゴヌクレオチドの方向に該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するように酵素を導入する工程であって、該酵素が該デテクター・オリゴヌクレオチドを切断しそれによって該標的核酸に相補的ではないヌクレオチドの配列を含む単一の大きさの種の質量識別可能な生成物を遊離させる工程と；
（ｃ）質量分析計によって該単一の大きさの種の質量識別可能な生成物の有無を検出する工程と；
を包含する、方法。
【請求項４】
工程ａ）およびｂ）が単一の閉じた反応容器中で同時に行われる、請求項１または３に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）、ｂ）およびｃ）が単一の閉じた反応容器中で同時に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記デテクター・オリゴヌクレオチドが酵素によって伸長できない、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
２つ以上の標的核酸が、単一の多重化反応で検出される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項８】
２つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチドが、多重化反応で２つ以上の標的核酸を検出するために用いられる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項９】
前記標的核酸が、核酸の混合物を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸の混合物が、母の核酸および胎児の核酸を含み、さらに核酸の該混合物が、妊娠雌性由来のサンプルから得られている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーの合成生成物に結合する第二のオリゴヌクレオチドプライマーが導入され、これによって引き続いて指数関数的増幅が生じ得る、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的核酸が最初は一本鎖核酸分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記切断剤が５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が標的核酸を増幅し得るポリメラーゼ活性を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記非切断性ヌクレオチドがロックド核酸（ＬＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記デテクター・オリゴヌクレオチドが検出部分を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出部分が、糖、タンパク質、抗体、化合物、質量タグ、蛍光タグ、チャージタグおよび疎水性タグからなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記単一の大きさの種の質量識別可能な生成物が、遊離の際に固体支持体に結合し得る、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２０】
前記単一の大きさの種の質量識別可能な生成物が遊離後に増幅される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２１】
前記デテクター・オリゴヌクレオチドが、前記標的核酸のメチル化状態に基づいてメチル化特異的配列に選択的に結合する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、Ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−イオントラップ、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳおよびＬＯＩ−ＭＳからなる群より選択される質量分析法によって行われる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出が、リアルタイムで行われる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２４】
競合因子テンプレート核酸が導入され、さらに該競合因子テンプレート核酸が内部コントロールとして機能する、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプル中の前記標的核酸配列の量が決定される、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項２６】
前記デテクター・オリゴヌクレオチドが、副溝結合部位を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
多重化アッセイにおいて核酸を検出および定量するための現行の方法は、検出のために蛍光色素を利用するアッセイに特に限られている。例えば、Ｗｈｉｔｅは、ＴａｑＭＡＮ（登録商標）アッセイを用いる多重化の問題を考察している（非特許文献１）。他の問題のなかでも、蛍光色素は、限られた多重化の選択肢しかもたらさず、プライマー伸長およびライゲーションベースのＳＮＰ分析、続いてユニバーサルＰＣＲおよびチップ・アレイに対するハイブリダイゼーションを例えば用いることによって、これらの限界を克服しようとする現在利用可能な方法はしばしば、極めて時間を浪費するものである（例えば、１〜２日）。
【０００２】
質量分析法の使用では、検出チャネル数の増大のおかげで改良された多重化のための溶液が得られるが、以前に開示された質量分析に基づく方法の実用性は、さらに改善され得る。例えば、ＰＣＲ増幅したＤＮＡに対するペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブの高い特異性のハイブリダイゼーションの使用、および引き続く質量分析法による検出は、Ｒｏｓｓによって記載されている（非特許文献２）。また、プライマー伸長法および質量分析法によるプライマー伸長生成物の検出は、Ｈａｆｆによって記載されている（非特許文献３）。さらなる質量分析法に基づく方法は、Ｊｕｒｉｎｋｅらによって記載されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｗｈｉｔｅ、「Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９６年、第１４巻、第１２号、ｐ.４７８−４８３
【非特許文献２】Ｒｏｓｓ、「Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ」、１９９７年、第６９巻、ｐ.４１９７
【非特許文献３】Ｈａｆｆ、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」、１９９７年、第２５巻、ｐ.３７４９
【非特許文献４】Ｊｕｒｉｎｋｅら、「Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」、２００２年、第７７巻、ｐ.５７−７４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（要旨）
本発明は一部は、核酸のような標的生体分子を特定および定量するため、ならびに標的生体分子配列、例えば、核酸配列またはヌクレオチド配列を検出するための方法を提供する。本発明の方法は、複数の標的核酸を、ＰＣＲ後の酵素的処理を省いたままで、単一のサンプルまたは複数のサンプル中で同時に検出するために有益である。大セットの特有の、質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）を生成してもよく、これによって複数の標的核酸の同時の検出が可能になる。さらに本明細書で記載されるとおり、１つ以上の標的核酸を、標準的な増幅方法によって増幅して、ここでこの増幅プロセスがデテクター（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）プローブを切断かつ分解し、これが質量分析法によって検出可能な特異的な質量識別可能な生成物を生じる。複数のＭＤＰの検出によって、複数の標的核酸の特定および／または定量が可能になる。
【０００５】
各々の質量識別可能な生成物（ＭＤＰ）は、特有の物理的特徴を有し、その特徴によって、同じアッセイで用いられる他の質量識別可能な生成物に比較した場合、特異的に特定することが可能になる。この質量識別可能な生成物は、この相違に基づいて分離および特定され得る。例えば、ＭＤＰは、その固有の、所定の質量に基づいてお互いから異なり得、かつ質量分析法によって検出され得る。従って、質量分析による分析で、標的核酸の存在が、この質量識別可能な生成物を通じて間接的に明らかになる。
【０００６】
従って、本発明は部分的には、増幅反応において標的核酸配列を検出、必要に応じて定量する方法を提供し、この方法は：１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、ここで第一のプライマーがこの標的核酸配列の一方の鎖における領域に相補的な配列を含み、かつ第二のプライマーがこの標的核酸配列の第二の鎖における領域に相補的な配列を含む、工程と；この標的核酸の領域に相補的な配列を含む少なくとも１つのデテクター（ｄｅｔｅｃｔｏｒ）オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここでこのデテクター・オリゴヌクレオチドが、第一の工程のオリゴヌクレオチドプライマーによって結合される標的核酸配列内でアニーリングし、それによって、アニーリングされた二重鎖を作製し、さらに、各々のオリゴヌクレオチドプライマーが、同じ核酸鎖にアニーリングされた任意のデテクター・オリゴヌクレオチドの上流の相補的なテンプレートに対してアニーリングするように選択される工程と；この標的核酸配列を増幅する工程であって、（ｉ）この標的配列内に含まれるテンプレート核酸配列に対してオリゴヌクレオチドプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程、ならびに（ｉｉ）プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させる工程であって、上記核酸増幅酵素がプライマー伸長生成物を合成し、一方でこの核酸増幅酵素の５’→３’ヌクレアーゼ活性が同時に、デテクター・オリゴヌクレオチドおよびその相補的なテンプレート核酸配列を含むアニーリングされた二重鎖からＭＤＰ’ｓを遊離し、これによって１つ以上のＭＤＰ’ｓを作製する工程という、増幅サイクル工程を可能にする条件下で、テンプレート依存性重合化剤として、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用する、標的核酸配列を増幅する工程と；質量分析法によって１つ以上のＭＤＰを検出し、それによってサンプル中の標的配列の有無を検出する工程と、を包含する。代表的には、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応である。この増幅反応はまた、複数の標的が特定される多重反応であってもよい。関連の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００より多く、かつ標的核酸の間の全ての数、またはより多い標的核酸が、単一の反応で、または多重化反応で検出される。別の実施形態では、２つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチドを用いて、多重化反応における２つ以上の標的核酸を検出する。
【０００７】
ある実施形態では、複数の多形性、例えば、単一ヌクレオチド多形態（一塩基遺伝子多型）（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）（ＳＮＰ’ｓ）、または遺伝子を、標的増幅の条件下で１つの試薬と標的核酸とを組み合わせることによって同時に決定され得る。各々の対の試薬は、標的核酸に結合するオリゴヌクレオチドプライマー、およびデテクター・オリゴヌクレオチド（改変されていてもいなくてもよい）を含む。ＳＮＰ遺伝子型決定の場合、デテクター・オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰの部位に結合し、かつオリゴヌクレオチドは、以後の遊離の際に検出可能な検出特徴を有する。好ましい実施形態では、この検出特徴は、質量分析法によって検出可能である。遺伝子発現分析の場合には、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、遺伝子特異的配列に結合して、オリゴヌクレオチドは、その引き続く遊離の際に検出可能な検出特徴を有する。配列増幅の条件は、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、および効率的な配列増幅を可能にする補助的な試薬を使用し得る。補助的な試薬の例としては、限定はしないが、ベタイン、ＣＧリッチ領域についてはＤＭＳＯ、界面活性剤およびピロホスファターゼが挙げられる。配列増幅が使用され、これによって標的核酸に結合されたデテクター・オリゴヌクレオチドが切断、および／または分解され、遊離され、および引き続いて、質量分析法によって検出される。各々のＳＮＰまたは特定のＭＤＰに関連する遺伝子を有することによって、当業者は、ＳＮＰ、またはサンプルに存在する遺伝子を決定し得る。
【０００８】
別の関連の実施形態では、サンプル中の標的核酸配列を検出するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅方法が提供され、この方法は以下の工程：サンプルを含むＰＣＲ反応物に１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、第一のＰＣＲプライマーが標的核酸配列の一方の鎖における領域に相補的な配列を含み、第二のＰＣＲプライマーがこの標的核酸配列の第二の鎖における領域に相補的な配列を含む、工程と；標的核酸の領域に相補的な配列を含む少なくとも１つのデテクター・オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここでこのデテクター・オリゴヌクレオチドが、第一の工程ＰＣＲプライマーによって結合される標的核酸配列内でアニーリングし、それによって、アニーリングされた二重鎖を作製し、さらに、各々のＰＣＲプライマーが、同じ核酸鎖にアニーリングされた任意のデテクター・オリゴヌクレオチドの上流の相補的なテンプレートに対してアニーリングするように選択される工程と；増幅工程であって、（ｉ）標的配列内に含まれるテンプレート核酸配列に対してプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングさせる工程、ならびに（ｉｉ）前記核酸ポリメラーゼ酵素がプライマー伸長生成物を合成し、一方でこの核酸ポリメラーゼ酵素の５’→３’ヌクレアーゼ活性が同時に、デテクター・オリゴヌクレオチドおよびその相補的なテンプレート核酸配列を含むアニーリングされた二重鎖からＭＤＰ’ｓを遊離し、これによって１つ以上のＭＤＰ’ｓを作製するプライマーを伸長する工程という、ＰＣＲサイクリング工程を可能にする条件下で、テンプレート依存性重合化剤として、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼ酵素を使用して標的核酸配列を増幅する工程と；質量分析法によって１つ以上のＭＤＰを検出し、それによってサンプル中の標的配列の有無を検出する工程と、を包含する。別の実施形態では、ＰＣＲサイクリングを可能にする条件は必要に応じて鎖の変性を包含し得る。
【０００９】
本発明はまた部分的には、標的核酸を検出する方法を提供し、この方法は、以下の工程：この標的核酸に対してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、この同じ標的核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と；このデテクター・オリゴヌクレオチドの方向にこのオリゴヌクレオチドプライマーを伸長するように酵素を導入する工程であって、この酵素がこのデテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断しそれによってその少なくとも一部を遊離し、それによって１つ以上のＭＤＰを生成する工程と；質量分析計によって１つ以上のＭＤＰを検出する工程を包含する。関連の実施形態では、上記デテクター・オリゴヌクレオチドの一部は、部分的に切断され得、従って標的核酸から解離し得る。従って、この実施形態では、ＭＤＰは、標的核酸から解離する部分的に切断されたデテクター・オリゴヌクレオチドを含んでもよく、引き続き質量分析計によって検出される。別の実施形態では、第一のオリゴヌクレオチドの合成生成物に結合する第二のオリゴヌクレオチドが導入され、これによって指数関数的増幅が引き続き生じ得る。関連の実施形態では、標的核酸は最初は一本鎖核酸分子、例えば、ｃＤＮＡである。
【００１０】
本発明はまた、部分的には、サンプル中の標的核酸配列を検出する非増幅ベースの方法を提供し、この方法は以下の工程：標的核酸を含むサンプルと、（ｉ）３’末端および５’末端を備え、かつ標的核酸の領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、および（ｉｉ）３’末端および５’末端を備え、かつこの標的核酸配列の第二の領域に相補的な配列を含むデテクター・オリゴヌクレオチドとを接触させ、これによって（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で、二重鎖の混合物であって、このオリゴヌクレオチドプライマーにおよびこのデテクター・オリゴヌクレオチドにアニーリングされた標的核酸を含む二重鎖混合物を作成し、その結果このオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端がデテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端の上流である、工程と；この第一の工程由来のサンプルを、このアニーリングされたデテクター・オリゴヌクレオチドまたはその少なくとも１つのフラグメントを切断および遊離するのに十分な条件下で切断剤に対して暴露させ、それによって１つ以上のＭＤＰを生成する工程と；質量分析によって１つ以上のＭＤＰを検出し、それによってサンプル中の標的核酸配列の有無を検出する工程とを包含する。
【００１１】
本発明はさらに、部分的には、標的核酸を検出する方法を提供し、この方法は、標的核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と；切断剤を導入して、デテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断する工程と；この部分的に切断されたデテクター・オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを、質量分析法によって検出する工程とを包含する。
【００１２】
ある実施形態では、この検出条件によってデテクター・オリゴヌクレオチドを置換および分解する、オリゴヌクレオチドプライマーの伸長が可能になり、それによってオリゴヌクレオチドフラグメントおよび／またはそれに結合される任意の検出特徴が得られる。ある実施形態では、標的核酸が、増幅反応によって検出方法の前に増幅される。別の実施形態では、検出前の全工程は単独の閉じた反応容器中で同時に行う。別の実施形態では、この方法の増幅または伸長の工程は、シグナルが検出されるまで繰り返す。関連の実施形態では、増幅の工程の回数を決定する。
【００１３】
特定の実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドのプライマー（単数または複数）に対して高濃度で導入する。また、ある実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、酵素によって伸長できない場合もあり得る。別の実施形態では、２つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチドを用いて、単一の標的核酸を検出するか、または２つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドプライマーによって結合される標的核酸配列内でアニーリングする。
【００１４】
ある実施形態では、この切断剤は酵素である。ある実施形態では、この酵素は５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する。他の実施形態では、この酵素は標的核酸を増幅し得るポリメラーゼ活性を有する。ある実施形態では、この酵素はＤＮＡポリメラーゼであり、他の実施形態では、この酵素はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。例示的なＤＮＡポリメラーゼとしては、ＴａｑポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩが挙げられる。別の実施形態では、この酵素は熱安定性である。
【００１５】
本発明は部分的には、デテクター・オリゴヌクレオチドの置換および／または分解から生じるＭＤＰの作成を提供する。一実施形態では、同じデテクター・オリゴヌクレオチドからの２つ以上の質量識別可能な生成物（ＭＤＰ）が、標的核酸に対応する質量特異的な検出シグナルを作成する、質量分析法によって検出される。別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的核酸に対して非相補的であるヌクレオチドの配列を含む。この非相補的な領域は、デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端であっても、デテクター・オリゴヌクレオチドの真ん中であっても（このデテクター・オリゴヌクレオチドが標的核酸に対して依然としてアニーリングし得る場合）、またはデテクター・オリゴヌクレオチドの３’末端であってもよい。他の実施形態では、このＭＤＰは、遊離の際に固体支持体に結合し得る。例えば、ＭＤＰは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法分析のマトリックスに直接結合し得る。別の実施形態では、１つ以上のＭＤＰが、例えば、ユニバーサルプライマーシステムを用いることによって、その遊離後に増幅される。
【００１６】
ある実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライマーを利用して、酵素的修飾から生じる配列特異的プライマーまたはオリゴヌクレオチドを増幅する核酸検出方法に組み込まれ、ここでこの増幅プロセスが質量分析によって検出可能な質量識別可能な生成物を生じる。さらに詳細には、本発明の実施形態は、複数の標的核酸配列であって、各々が３’→５’に第一、第二および第三の標的ドメインを含み、この第一の標的ドメインが検出位置を含み、第二の標的ドメインが少なくとも１つのヌクレオチドである配列を提供する工程と、標的核酸配列と各々の標的配列についてのプローブのセットとを接触させる工程であって、各々のセットが：第一のプローブ（５’→３’方向に、第一のユニバーサルプライミング配列を含む第一のドメインと、第二のドメイン（デテクター・オリゴヌクレオチド結合ドメインを含む）および第三のドメイン（標的配列の第一の標的ドメインに実質的に相補的な配列を含む）、ならびに３’の４つの末端塩基内のインテロゲーション位置を含む）、第二のプローブ（第一のドメイン（標的配列の第三の標的ドメインに実質的に相補的な配列を含み、１セットの第一のハイブリダイゼーション複合体を形成する）、および第二のドメイン（第二のユニバーサルプライミング配列）を含む）工程と、この第一のハイブリダイゼーション複合体と、少なくとも第一のユニバーサルプライマー（第一のユニバーサルプライミング配列にハイブリダイズする）と、伸長酵素とｄＮＴＰｓとを、このインテロゲーション位置が検出位置で塩基と相補的である場合、第一のプローブの伸長が第二の標的ドメインを通じて生じて、第二のハイブリダイゼーション複合体を形成するような条件下で接触させる工程と、この第二のハイブリダイゼーション複合体とリガーゼとを接触させて伸長された第一のプローブを第二のプローブに対して連結して増幅テンプレートを形成する工程とを包含する。この実施形態はさらに、デテクター・オリゴヌクレオチドを導入し、ここで特異的なデテクター・オリゴヌクレオチドが、配列特異的な増幅テンプレートにアニーリングする工程と、酵素を導入して増幅テンプレートを増幅する工程と、増幅反応から生じる１つ以上のＭＤＰを検出する工程と、ここで標的核酸配列の有無を決定する工程とを包含する。別の実施形態では、本発明の方法は、米国特許第６，７９７，４７０号；米国特許第６，８９０，７４１号、米国特許第６，８１２，００５号、米国特許第６，８９０，７４１号、米国特許出願公開２００２０００６６１７号、米国特許出願公開第２００３００３６０６４号、米国特許出願公開第２００３０１０４４３４号、米国特許出願公開第２００３０２１１４８９号、米国特許出願公開第２００３０１０８９００号、米国特許出願公開第２００３０１７０６８４号、米国特許出願公開第２００４０１２１３６４号、米国特許出願公開第２００４０２２４３５２号、米国特許出願公開第２００４０２２４３５２号（その全てが参照によって本明細書に援用される）に開示される方法と組み合わせて利用される。
【００１７】
ある実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドは修飾されず、この場合、オリゴヌクレオチドフラグメントを含む未修飾のＭＤＰは質量分析法によって検出される。他の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、１つ以上のヌクレオシド修飾を含む。ヌクレオシド修飾は、ヌクレオチド、リン酸骨格または糖部分に対する修飾を包含する。ヌクレオシド修飾は、デテクター・オリゴヌクレオチドの非相補的領域に存在しても、デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端に存在しても、デテクター・オリゴヌクレオチドの３’末端に存在しても、またはデテクター・オリゴヌクレオチドの真ん中に存在してもよく、これによって、標的核酸に対するデテクター・オリゴヌクレオチドの標的特異的ハイブリダイゼーションが保証される。別の実施形態では、ヌクレオシド修飾は、同位体濃縮、同位体枯渇およびハロゲン修飾からなる群より選択される。別の実施形態では、同位体コードは、重水素、または他の適切な同位体の導入によって達成される。
【００１８】
特定の実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドは、１つ以上の切断認識部位を含む。別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非分解性ヌクレオチドを含む。なお別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、１つ以上の切断認識部位および１つ以上の非分解性ヌクレオチドを含む。
【００１９】
好ましい実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、１つ以上のロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡｓ）を含み、これが非分解性ヌクレオチドとして機能して、これによって切断のポイントを制御する。ＬＮＡｓは、その相補体と極めて安定に結合して、新生のデオキシヌクレオチドに対する極めて低率の切断を有する。この効果は、２つを置くことまたはお互いに対して隣接するＬＮＡによってさらに増強され得る。さらに、ＬＮＡは、それらが組み込まれるオリゴヌクレオチドの融解温度を高める。質量分解産物の切断部位は、このようにして生成物のサイズの予測性および適切な特定のために制御される。
【００２０】
別の実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドは、１つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡｓ）を含む。
【００２１】
ある実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、１つ以上の検出部位を含む。一実施形態では、この検出部分は、任意の１つ以上のコンポマー、糖、ペプチド、タンパク質、抗体、化合物（例えば、ビオチン）、質量タグ（例えば、金属イオンまたは化学基）、蛍光タグ、チャージタグ（例えば、ポリアミンまたはチャージ色素など）、および疎水性タグであってもよい。関連の実施形態では、検出部分は、質量識別可能な生成物（ＭＤＰ）または質量分析法によって検出されるＭＤＰの一部である。特定の実施形態では、検出部分は、蛍光タグまたは質量分析法によって検出される標識である。ある実施形態では、検出部分は、デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端であり、検出部分は、デテクター・オリゴヌクレオチドの非相補的領域に結合されるか、または検出部分は、非相補的配列の５’末端である。別の実施形態では、その検出部分は、内部ヌクレオチド内に組み込まれるか、もしくは連結されるか、またはデテクター・オリゴヌクレオチドの３’末端でヌクレオチドに連結される。さらに別の実施形態では、１つ以上の検出部分を、単独でまたは組み合わせていずれかで用いる。
【００２２】
特定の実施形態では、この検出部分は合成ポリマーまたはバイオポリマー（生体高分子）またはそのいくつかの組み合わせであるが、他の実施形態では、この検出部分は、質量分析計によって検出され得る任意の化合物である。特定の実施形態では、この検出部分は、モノマーユニットを含むバイオポリマーであり、ここで各々のモノマー単位は、アミノ酸、核酸およびサッカライドのうちの任意の１つ以上から別々にかつ独立して選択される。アミノ酸および核酸は、好ましいモノマー単位である。各々のモノマー単位は、別々にかつ独立して選択され得るので、バイオポリマー検出部分は、ポリ核酸、ペプチド、ペプチド核酸、オリゴヌクレオチドなどであってもよい。
【００２３】
ある実施形態では、この検出部分は、合成ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルフェノール、ポリプロピレングリコール、ポリメチルメタクリレート、およびその誘導体である。合成ポリマーは代表的には、本質的にエチレングリコール、ビニルフェノール、プロピレングリコール、メチルメタクリレートおよびその誘導体からなる群より選択されるモノマー単位を含んでもよい。さらに代表的には、検出部分は、ポリエチレングリコール単位を含むポリマーであってもよい。
【００２４】
本発明は部分的には、特定の標的核酸配列に結合するプローブとして機能するデテクター・オリゴヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは選択的に遺伝子特異的配列に結合し、これによって遺伝子発現分析が可能になる。別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは選択的に、対立遺伝子特異的配列に結合する。関連の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的ヌクレオチド塩基（単数または複数）は、検出部分またはヌクレオシド修飾を含む。好ましい実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドの対立遺伝子特異的ヌクレオチド塩基（単数または複数）は、このデテクター・オリゴヌクレオチドの真ん中にまたは５’末端に向かって入る。
【００２５】
本発明はまた部分的には、エピジェネティックな相違、例えば、メチル化、アセチル化および他の非配列変化修飾に基づいて標的核酸を検出する方法を提供する。一実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的核酸のメチル化状況に基づいてメチル化特異的配列に選択的に結合する。関連の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、選択的に、亜硫酸水素塩処理の前、あるいは亜硫酸水素塩処理後の標的核酸のメチル化状況に基づいて、メチル化特異的配列に結合する。別の実施形態では、標的核酸は、メチル化ＤＮＡに結合し得るポリペプチドで容器をコーティングすること；このポリペプチドと、メチル化および／または非メチル化ＤＮＡを含むサンプルとを接触させること；ならびにメチル化ＤＮＡに対するこのようなポリペプチドの結合を検出することによってメチル化ＤＮＡについて選択的に富化される（増幅の前または増幅の後のいずれか）。メチル化ＤＮＡを検出するための方法は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ０６０５６４７８Ａ１（参照によって本明細書に援用される）に記載される。
【００２６】
本発明は、部分的には、標的核酸を検出する方法を提供する。一般には、この方法は、複数のデテクター・オリゴヌクレオチド（各々のデテクター・オリゴヌクレオチドが、上記のように、所定のアッセイ（例えば、対立遺伝子特異的、遺伝子特異的、配列特異的、メチル化特異的など）について特異的に設計される）を得る工程を包含する。各々のデテクター・オリゴヌクレオチドが大多数で、標的核酸の有無に関連する１つ以上の特有の質量識別可能な生成物を生じ得ることが好ましい。「特有の質量分析可能な生成物」とは、各々のデテクター・オリゴヌクレオチドが大多数で、他の全てのデテクター・オリゴヌクレオチドから異なる質量識別可能な生成物（単数または複数）を複数で生じるということを意味する。複数は一般に、２つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチドを含むことが理解される。次に、標的分子を複数のデテクター・オリゴヌクレオチドと、ＭＤＰ（質量分析法によって分析される）の生成を可能にするのに適切な条件下で接触させる。代表的には、質量は、特定の標的核酸の指標である。この方法では、標的分子は、ＭＤＰの特有の組み合わせに従って特定され得る。実施例１は、Ｒｈｅｓｕｓ  Ｄ遺伝子のエキソン１０の検出のための配列特異的なアッセイの例を提供する。別の実施例では、アッセイは、標的核酸の各々の特定のＳＮＰについて設計され、ここでアッセイのデテクター・オリゴヌクレオチドは、どのＳＮＰが存在するかに依存して特有のＭＤＰを生じる。２つのＳＮＰが、特定の位置で検出されるべき場合、２つの対立遺伝子特異的デテクター・オリゴヌクレオチドを特有のＭＤＰとともに用いる。遺伝子発現分析のためには、遺伝子特異的デテクター・オリゴヌクレオチドおよび競合因子を用いてもよい。例えば、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４００８１９９３号（Ｃａｎｔｏｒら）を参照のこと。
【００２７】
ある実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、対立遺伝子特異的配列に選択的に結合する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端の少なくとも１塩基上流である。
【００２８】
本発明は部分的には、質量分析法によってＭＤＰを検出する方法を提供する。ある実施形態では、この検出は、質量分析法によって行われ、この質量分析は以下のうちの１つであってもよい：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、Ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−イオントラップ、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳ、イオン移動度ＭＳ、レーザー脱離イオン化質量分析法（ＬＤＩ−ＭＳ）および四重極ＭＳ。他の質量分析法デバイスおよび方法（既存であるか、または開発され得る）は、本発明の範囲内である。
【００２９】
本発明はまた部分的には、生体分子、例えば、標的核酸を検出および定量する方法を提供し、ＰＣＲ産物の生成は、質量識別可能な生成物（ＭＤＰ）の検出によってモニターされる。一実施形態では、この検出はリアルタイムで行われる。ある実施形態では、このリアルタイムの検出は、エレクトロスプレー質量分析計またはＬＣ−ＭＳで行われる。別の実施形態では、１つ以上のＭＤＰが、増幅プロセスの間特定の時間に対応する質量分析関連の媒体の特定の位置にスポットされる。質量分析関連の媒体の例は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳに適切なマトリックスである。別の実施形態では、競合因子テンプレート核酸が導入され、ここでこのテンプレート核酸は内部コントロールとして機能する。さらに別の実施形態では、この増幅サイクルの回数は、定量的結果を得るように決定する。反応混合物中に存在する出発標的核酸の量は、サイクルの閾値（Ｃｔ）、または当該分野で公知の任意の他の方法によって定量されてもよい。
【００３０】
また本明細書で提供されるのは、標的核酸配列を検出するための方法であって、質量識別可能な生成物を含む核酸サンプルを質量分析法によって分析する工程を包含し、ここでこの質量識別可能な生成物は、（ａ）標的核酸に対してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程と；（ｂ）この同じ標的核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と；（ｃ）この標的核酸と、このオリゴヌクレオチドプライマーをこのデテクター・オリゴヌクレオチドの方向に伸長する酵素とを接触させる工程とを包含し、ここで：このデテクター・オリゴヌクレオチドまたはその一部は、標的核酸配列に対して相補的であり、この酵素は、このデテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断しそれによってその少なくとも一部を遊離し、それによって１つ以上の質量識別可能な生成物を生成し；それによってこの標的核酸配列が、質量分析可能な生成物を質量分析法によって特定することによって検出される、方法である。特定の実施形態では、上記第一のオリゴヌクレオチドの合成生成物に対して結合する第二のオリゴヌクレオチドが導入され、これによって指数関数的増幅が引き続き生じ得る。
【００３１】
また標的核酸配列を検出するための方法も提供され、この方法は、質量識別可能な生成物を含む核酸サンプルを質量分析法によって分析する工程を包含し、ここでこの質量識別可能な生成物は、（ａ）標的生体分子と、検出可能なプローブがこの標的生体分子に特異的に結合する条件下で、テンプレート核酸として機能するオリゴヌクレオチドを含むこの検出可能なプローブとを接触させる工程と；（ｂ）このテンプレート核酸に対してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングする工程と；（ｃ）この同じテンプレート核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と；（ｄ）このテンプレート核酸と、このオリゴヌクレオチドプライマーをこのデテクター・オリゴヌクレオチドの方向に伸長する酵素とを接触させる工程とから生じ、ここで：このデテクター・オリゴヌクレオチドまたはその一部は、標的核酸配列に対して相補的であり、この酵素は、このデテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断しそれによってその少なくとも一部を遊離し、それによって１つ以上の質量識別可能な生成物を生成し；それによってこの標的核酸配列が、質量分析可能な生成物を質量分析法によって特定することによって検出される。特定の実施形態では、上記第一のオリゴヌクレオチドの合成生成物に対して結合する第二のオリゴヌクレオチドが導入され、これによって指数関数的増幅が引き続き生じ得る。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
サンプル中の標的核酸配列を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）標的核酸を含むサンプルと、（ｉ）３’末端および５’末端を備え、かつ該標的核酸の領域に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、ならびに（ｉｉ）３’末端および５’末端を備え、かつ該標的核酸配列の第二の領域に相補的な配列を含むデテクター・オリゴヌクレオチドとを接触させ、これによって（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション条件下で二重鎖の混合物であって、該オリゴヌクレオチドプライマーにおよび該デテクター・オリゴヌクレオチドにアニーリングされた該標的核酸を含む二重鎖混合物を形成し、その結果該オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端が該デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端の上流である、工程と；
（ｂ）工程（ａ）のサンプルを、該アニーリングされたデテクター・オリゴヌクレオチドまたはその少なくとも１つのフラグメントを切断および遊離するのに十分な条件下で切断剤に対して暴露させ、それによって１つ以上の質量識別可能な生成物を生成する工程と；（ｃ）質量分析によって１つ以上の質量識別可能な生成物を検出し、それによって該サンプル中の該標的核酸配列の有無を検出する工程と、
を包含する、方法。
（項目２）
サンプル中の標的核酸配列を検出する増幅方法であって、以下の工程：
（ａ）該サンプルを含む増幅反応物に対して１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、第一のプライマーが該標的核酸配列の一方の鎖における領域に相補的な配列を含み、第二のプライマーが該標的核酸配列の第二の鎖における領域に相補的な配列を含む、工程と
（ｂ）該標的核酸配列の領域に相補的な配列を含む少なくとも１つのデテクター・オリゴヌクレオチドを提供する工程であって、ここで該デテクター・オリゴヌクレオチドが、工程（ａ）の該オリゴヌクレオチドプライマーによって結合される該標的核酸配列内でアニーリングし、それによって、アニーリングされた二重鎖を作製し、さらに、各々のオリゴヌクレオチドプライマーが、同じ核酸鎖にアニーリングされた任意のデテクター・オリゴヌクレオチドの上流の相補的なテンプレートに対してアニーリングするように選択される工程と；
（ｃ）（ｉ）該標的配列内に含まれるテンプレート核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドのアニーリング、ならびに（ｉｉ）該プライマーオリゴヌクレオチドの伸長、の増幅サイクル工程を可能にする条件下で、テンプレート依存性重合化剤として、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を使用して標的核酸配列を増幅する工程であって、該核酸増幅酵素がプライマー伸長生成物を合成し、一方で該核酸増幅酵素の該５’→３’ヌクレアーゼ活性が同時に、該デテクター・オリゴヌクレオチドおよびその相補的なテンプレート核酸配列を含むアニーリングされた二重鎖から質量識別可能な生成物を遊離させ、これによって１つ以上の質量識別可能な生成物を作製する工程と；
（ｄ）質量分析法によって該１つ以上の質量識別可能な生成物を検出し、それによって該サンプル中の該標的配列の有無を検出する工程と、
を包含する、方法。
（項目３）
標的核酸を検出する方法であって、以下の工程：
（ａ）該標的核酸に対してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングして、同じ標的核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と；
（ｂ）該デテクター・オリゴヌクレオチドの方向に該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するように酵素を導入する工程であって、該酵素が該デテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断しそれによってその少なくとも一部を遊離し、それによって１つ以上の質量識別可能な生成物を生成する工程と；
（ｃ）質量分析計によって１つ以上の質量識別可能な生成物を検出する工程と；
を包含する、方法。
（項目４）
工程ａ）およびｂ）が単一の閉じた反応容器中で同時に行われる、項目１または３に記載の方法。
（項目５）
工程ａ）、ｂ）およびｃ）が単一の閉じた反応容器中で同時に行われる、項目２に記載の方法。
（項目６）
上記デテクター・オリゴヌクレオチドが酵素によって伸長できない、項目２または３に記載の方法。
（項目７）
２つ以上の標的核酸が、単一の多重化反応で検出される、項目１、２または３に記載の方法。
（項目８）
２つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチドが、多重化反応で２つ以上の標的核酸を検出するために用いられる、項目１、２または３に記載の方法。
（項目９）
上記標的核酸が、核酸の混合物を含む、項目１、２または３に記載の方法。
（項目１０）
上記核酸の混合物が、母の核酸および胎児の核酸を含み、さらに核酸の該混合物が、妊娠雌性由来のサンプルから得られている、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記第一のオリゴヌクレオチドの合成生成物に結合する第二のオリゴヌクレオチドが導入され、これによって引き続いて指数関数的増幅が生じ得る、項目３に記載の方法。
（項目１２）
上記標的核酸が最初は一本鎖核酸分子である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記切断剤が５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する、項目１に記載の方法。
（項目１４）
上記酵素が５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目１５）
上記酵素が標的核酸を増幅し得るポリメラーゼ活性を有する、項目３に記載の方法。
（項目１６）
上記同じデテクター・オリゴヌクレオチド由来の２つ以上の質量識別可能な生成物が、質量分析法によって検出され、さらに該２つ以上の質量識別可能な生成物が、標的核酸に対応する質量特異的な検出サインを生じる、項目１、２または３に記載の方法。
（項目１７）
上記デテクター・オリゴヌクレオチドが、上記標的核酸に非相補的であるヌクレオチドの配列を含む、項目１、２または３に記載の方法。
（項目１８）
上記デテクター・オリゴヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオシド修飾を含む、項目１、２または３に記載の方法。
（項目１９）
上記ヌクレオシド修飾が１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）の組み込みである、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記デテクター・オリゴヌクレオチドが検出部分を含む、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２１）
上記検出部分が、糖、タンパク質、抗体、化合物、質量タグ、蛍光タグ、チャージタグおよび疎水性タグからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
上記１つ以上の質量識別可能な生成物が、遊離の際に固体支持体に結合し得る、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２３）
上記１つ以上の質量識別可能な生成物がその遊離後に増幅される、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２４）
上記デテクター・オリゴヌクレオチドが、上記標的核酸のメチル化状態に基づいてメチル化特異的配列に選択的に結合する、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２５）
上記検出が、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、Ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ、ＥＳＩ−ＴＯＦ、ＥＳＩ−イオントラップ、ＬＣ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳおよびＬＯＩ−ＭＳからなる群より選択される質量分析法によって行われる、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２６）
上記検出が、リアルタイムで行われる、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２７）
競合因子テンプレート核酸が導入され、さらに該競合因子テンプレート核酸が内部コントロールとして機能する、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２８）
上記サンプル中の上記標的核酸配列の量が決定される、項目１、２または３に記載の方法。
（項目２９）
上記デテクター・オリゴヌクレオチドが、副溝結合部位を含む、項目１、２または３に記載の方法。
（項目３０）
標的生体分子を検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）検出可能なプローブを、標的生体分子を含むサンプルに導入する工程であって、該検出可能なプローブが、標的生体分子に結合するか、そうでなければ接触し、さらに該検出可能なプローブが、テンプレート核酸として機能するオリゴヌクレオチドを含む工程と；
（ｂ）該テンプレート核酸に対してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、同じテンプレート核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程と；
（ｃ）該デテクター・オリゴヌクレオチドの方向に該オリゴヌクレオチドプライマーを伸長するように酵素を導入する工程であって、該酵素が該デテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断しそれによってその少なくとも一部を遊離し、それによって１つ以上の質量識別可能な生成物を生成する工程と；
（ｄ）質量分析計によって該１つ以上の質量識別可能な生成物を検出する工程と；
を包含する、方法。
（項目３１）
２つ以上の検出可能プローブが、工程（ａ）に導入される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
上記検出可能なプローブが標的生体分子に特異的に結合される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
上記２つ以上の検出可能プローブが上記標的生体分子と接触するとき、該検出可能なプローブは、連結してテンプレート核酸を形成するオリゴヌクレオチドを含む、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
標的核酸配列を検出する方法であって、質量識別可能な生成物を含む核酸サンプルを質量分析計によって分析する工程を包含し、ここで該質量識別可能な生成物は、（ａ）標的核酸に対してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし；（ｂ）同じ標的核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングし；そして（ｃ）該標的核酸と、該オリゴヌクレオチドプライマーを該デテクター・オリゴヌクレオチドの方向に伸長する酵素とを接触させることによって生じ、ここで：
該デテクター・オリゴヌクレオチドまたはその一部は、該標的核酸配列に対して相補的であり、
該酵素は、該デテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断しそれによってその少なくとも一部を遊離し、それによって１つ以上の質量識別可能な生成物を生成し；
それによって該標的核酸配列が、質量識別可能な生成物を質量分析法によって特定することによって検出される、方法。
（項目３５）
質量識別可能な生成物を含む核酸サンプルを質量分析法によって分析する工程を包含する、標的核酸配列を検出する方法であって、ここで該質量識別可能な生成物が、（ａ）標的生体分子と、検出可能なプローブが該標的生体分子に特異的に結合する条件下で、テンプレート核酸として機能するオリゴヌクレオチドを含む該検出可能なプローブとを接触させ；（ｂ）該テンプレート核酸に対してオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし；（ｃ）該同じテンプレート核酸に対してデテクター・オリゴヌクレオチドをアニーリングし；そして（ｄ）該テンプレート核酸と、該オリゴヌクレオチドプライマーを該デテクター・オリゴヌクレオチドの方向に伸長する酵素とを接触させることによって生じ、ここで：
該デテクター・オリゴヌクレオチドまたはその一部は、標的核酸配列に対して相補的であり、
該酵素は、該デテクター・オリゴヌクレオチドの少なくとも一部を切断しそれによってその少なくとも一部を遊離し、それによって１つ以上の質量識別可能な生成物を生成し；
それによって該標的核酸配列が、質量識別可能な生成物を質量分析法によって特定することによって検出される、方法。
（項目３６）
上記第一のオリゴヌクレオチドの合成生成物に対して結合する第二のオリゴヌクレオチドが導入され、これによって引き続いて指数関数的増幅が生じ得る、項目３４または３５に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１−１】図１は、質量分析法を用いる標的核酸の検出の略図である。反応成分としては、標的核酸、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマー、デテクター・オリゴヌクレオチド、増幅酵素、および増幅試薬、例えば、緩衝液（単数または複数）およびヌクレオチドが挙げられる。工程Ａでは、プライマーの伸長が生じる。伸長の間、デテクター・オリゴヌクレオチドが置換されて分解される（工程Ｂ）。各々の増幅サイクルの間、質量識別可能な生成物（ＭＤＰ）（これはこの図では変性生成物とも呼ばれる）が酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって生成される（工程Ｃ）。増幅後、ＭＤＰは必要に応じて調整されて、質量分析法によって後に検出され得る。反応の副産物としては、とりわけ、ＰＣＲ生成物、レフトオーバープライマー（ｌｅｆｔｏｖｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）、非分解性のオリゴヌクレオチドプライマー、およびＭＤＰが挙げられる（工程Ｄ）。工程Ｅは、例示的なスペクトログラムであり、ｙ軸は任意の強度（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ａ．ｉ．）であり、かつｘ軸は質量電荷比（ｍａｓｓ  ｏｖｅｒ  ｃｈａｒｇｅ）（ｍ／ｚ）である。ＭＤＰの存在によって標的核酸の存在が確認される。
【図１−２】図１は、質量分析法を用いる標的核酸の検出の略図である。反応成分としては、標的核酸、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマー、デテクター・オリゴヌクレオチド、増幅酵素、および増幅試薬、例えば、緩衝液（単数または複数）およびヌクレオチドが挙げられる。工程Ａでは、プライマーの伸長が生じる。伸長の間、デテクター・オリゴヌクレオチドが置換されて分解される（工程Ｂ）。各々の増幅サイクルの間、質量識別可能な生成物（ＭＤＰ）（これはこの図では変性生成物とも呼ばれる）が酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって生成される（工程Ｃ）。増幅後、ＭＤＰは必要に応じて調整されて、質量分析法によって後に検出され得る。反応の副産物としては、とりわけ、ＰＣＲ生成物、レフトオーバープライマー（ｌｅｆｔｏｖｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）、非分解性のオリゴヌクレオチドプライマー、およびＭＤＰが挙げられる（工程Ｄ）。工程Ｅは、例示的なスペクトログラムであり、ｙ軸は任意の強度（ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ａ．ｉ．）であり、かつｘ軸は質量電荷比（ｍａｓｓ  ｏｖｅｒ  ｃｈａｒｇｅ）（ｍ／ｚ）である。ＭＤＰの存在によって標的核酸の存在が確認される。
【図２】図２は、デテクター・オリゴヌクレオチドが５’非相補性領域を含む、質量分析法を用いる標的核酸の検出の略図である。工程Ｂでは、酵素は、デテクター・オリゴヌクレオチドの５’非相補性領域を遊離し、これは工程Ｃで検出される。図９は、実験的なスペクトログラムを示し、ここで５’非相補性ＭＤＰが生成され検出される。この図の底部で「標的ＮＳを特定する」という用語は、「標的ヌクレオチド配列を特定する」ことを指す。
【図３】図３は、質量分析法を用いる標的核酸の略図であって、ここでデテクター・オリゴヌクレオチドは３’非相補性領域を含む。工程Ｂでは、この酵素は、デテクター・オリゴヌクレオチドの３’非相補性領域を遊離し、これが工程Ｃで検出される。この図の底部で「標的ＮＳを特定する」という用語は、「標的ヌクレオチド配列を特定する」ことを指す。一実施形態では、本発明は部分的には、切断および検出される３’非相補性領域を包含し得る。さらに関連の実施形態では、３’非相補性領域の上流のこのハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、非切断性または非分解性であり、これによって特有の既定の切断生成物が生じる。
【図４−１】複数の標的核酸を検出するための多重化アッセイの略図である。アッセイは４つの標的（１〜４）の各々の標的について設計され、ここで各々の標的は、特定の長さ（Ｌ１−Ｌ４）の５’非相補性領域を有する特有のデテクター・オリゴヌクレオチドを有する。増幅の際（工程Ａ）、ＭＤＰの５’非相補性領域は、標的が存在する場合に生成される。この特定の実施例では、標的１および４が存在し、そのためＬ１およびＬ４のＭＤＰが生成されて、質量分析法によって検出される（工程Ｂのスペクトログラムで図示される）。
【図４−２】複数の標的核酸を検出するための多重化アッセイの略図である。アッセイは４つの標的（１〜４）の各々の標的について設計され、ここで各々の標的は、特定の長さ（Ｌ１−Ｌ４）の５’非相補性領域を有する特有のデテクター・オリゴヌクレオチドを有する。増幅の際（工程Ａ）、ＭＤＰの５’非相補性領域は、標的が存在する場合に生成される。この特定の実施例では、標的１および４が存在し、そのためＬ１およびＬ４のＭＤＰが生成されて、質量分析法によって検出される（工程Ｂのスペクトログラムで図示される）。
【図５】図５は、本発明のリアルタイム実施形態の略図である。このスキームは図１に示されるものと同様であるが、質量分析法による分析を、あらゆるサイクルの後に、または所定の時点で行う（例えば、５サイクルごとの後に）。標的核酸が存在する場合、変性生成物（すなわち、ＭＤＰ）シグナル強度は、あらゆるサイクルごとに増大するが、プライマーおよび未変性のデテクター・オリゴヌクレオチドシグナル強度は消費および分解に起因して減少する。
【図６−１】図６は、標的生体分子を検出するためにユニバーサルプライマーが利用されるアッセイのバリエーションの略図である。この詳細な図では、遺伝子型決定アッセイが示され、ここでは、各々の単一ヌクレオチド多形態（一塩基遺伝子多型）（ＳＮＰ）が特有のセットのプライマーを有する。例えば、ＳＮＰ３は、それぞれＣ対立遺伝子およびＧ対立遺伝子に対応する、配列領域５および６（Ｓ５およびＳ６）を有する対立遺伝子特異的プライマーを用いてアッセイされる。下流のプライマーも導入され、ＣＳ３、またはコモン・プライマー３（ｃｏｍｍｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ３）と命名される。工程Ａでは、このプライマーは、標的にハイブリダイズして、対立遺伝子が存在するとき、対立遺伝子特異的プライマー伸長が生じる。伸長の際に、連結生成物が形成される。この連結生成物のアッセイ特異的な配列領域に相補的であるデテクター・オリゴヌクレオチドが導入され、ｃＳ５およびｃＳ６、またはＳＮＰ３アッセイについては相補的プライマー５および６と命名される。ユニバーサルプライマーを用いる連結生成物の増幅の際、デテクター・オリゴヌクレオチド（ｃＳ５およびｃＳ６）を置換および分解して、ＭＤＰを生成し、これを質量分析法によって検出する。例示的な質量スペクトログラムによって、ＳＮＰ１については対立遺伝子Ａ、ＳＮＰ２については対立遺伝子Ｔ、およびＳＮＰ３については対立遺伝子ＣおよびＧの両方（ヘテロ接合性）の存在が明らかになる。
【図６−２】図６は、標的生体分子を検出するためにユニバーサルプライマーが利用されるアッセイのバリエーションの略図である。この詳細な図では、遺伝子型決定アッセイが示され、ここでは、各々の単一ヌクレオチド多形態（一塩基遺伝子多型）（ＳＮＰ）が特有のセットのプライマーを有する。例えば、ＳＮＰ３は、それぞれＣ対立遺伝子およびＧ対立遺伝子に対応する、配列領域５および６（Ｓ５およびＳ６）を有する対立遺伝子特異的プライマーを用いてアッセイされる。下流のプライマーも導入され、ＣＳ３、またはコモン・プライマー３（ｃｏｍｍｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ３）と命名される。工程Ａでは、このプライマーは、標的にハイブリダイズして、対立遺伝子が存在するとき、対立遺伝子特異的プライマー伸長が生じる。伸長の際に、連結生成物が形成される。この連結生成物のアッセイ特異的な配列領域に相補的であるデテクター・オリゴヌクレオチドが導入され、ｃＳ５およびｃＳ６、またはＳＮＰ３アッセイについては相補的プライマー５および６と命名される。ユニバーサルプライマーを用いる連結生成物の増幅の際、デテクター・オリゴヌクレオチド（ｃＳ５およびｃＳ６）を置換および分解して、ＭＤＰを生成し、これを質量分析法によって検出する。例示的な質量スペクトログラムによって、ＳＮＰ１については対立遺伝子Ａ、ＳＮＰ２については対立遺伝子Ｔ、およびＳＮＰ３については対立遺伝子ＣおよびＧの両方（ヘテロ接合性）の存在が明らかになる。
【図７−１】図７は、非核酸検出（例えば、タンパク質検出）に有用な本発明の実施形態の略図である。各々のアプタマーは、標的結合ドメイン（Ａ１〜Ａ３）、特有の配列（Ｓ）（ここに特有の相補的なデテクター・オリゴヌクレオチド（ＣＳ）が引き続く増幅の間に結合し得る）、およびユニバーサルプライマー結合部位を含む。工程Ａでは、標的タンパク質が免疫化抗体に結合する。工程Ｂでは、非結合試薬が洗浄によって除去され、アプタマーのライブラリーが付加される。相補的なアプタマーが標的タンパク質に結合し、非相補的なアプタマーが洗い流される。ユニバーサルプライマーおよび配列特異的デテクター・オリゴヌクレオチドが付加される（工程Ｃ）。増幅の際、デテクター・オリゴヌクレオチドが置き換えられ、分解されて、ＭＤＰが生じ、これが質量分析法によって検出される（工程Ｄ）。ＭＤＰ１およびＭＤＰ３の存在は、それぞれタンパク質１およびタンパク質３の存在を示す。
【図７−２】図７は、非核酸検出（例えば、タンパク質検出）に有用な本発明の実施形態の略図である。各々のアプタマーは、標的結合ドメイン（Ａ１〜Ａ３）、特有の配列（Ｓ）（ここに特有の相補的なデテクター・オリゴヌクレオチド（ＣＳ）が引き続く増幅の間に結合し得る）、およびユニバーサルプライマー結合部位を含む。工程Ａでは、標的タンパク質が免疫化抗体に結合する。工程Ｂでは、非結合試薬が洗浄によって除去され、アプタマーのライブラリーが付加される。相補的なアプタマーが標的タンパク質に結合し、非相補的なアプタマーが洗い流される。ユニバーサルプライマーおよび配列特異的デテクター・オリゴヌクレオチドが付加される（工程Ｃ）。増幅の際、デテクター・オリゴヌクレオチドが置き換えられ、分解されて、ＭＤＰが生じ、これが質量分析法によって検出される（工程Ｄ）。ＭＤＰ１およびＭＤＰ３の存在は、それぞれタンパク質１およびタンパク質３の存在を示す。
【図７−３】図７は、非核酸検出（例えば、タンパク質検出）に有用な本発明の実施形態の略図である。各々のアプタマーは、標的結合ドメイン（Ａ１〜Ａ３）、特有の配列（Ｓ）（ここに特有の相補的なデテクター・オリゴヌクレオチド（ＣＳ）が引き続く増幅の間に結合し得る）、およびユニバーサルプライマー結合部位を含む。工程Ａでは、標的タンパク質が免疫化抗体に結合する。工程Ｂでは、非結合試薬が洗浄によって除去され、アプタマーのライブラリーが付加される。相補的なアプタマーが標的タンパク質に結合し、非相補的なアプタマーが洗い流される。ユニバーサルプライマーおよび配列特異的デテクター・オリゴヌクレオチドが付加される（工程Ｃ）。増幅の際、デテクター・オリゴヌクレオチドが置き換えられ、分解されて、ＭＤＰが生じ、これが質量分析法によって検出される（工程Ｄ）。ＭＤＰ１およびＭＤＰ３の存在は、それぞれタンパク質１およびタンパク質３の存在を示す。
【図８】図８は、ＰＣＲ増幅の間のエキソン１０特異的なデテクター・オリゴヌクレオチドから生成されたＭＤＰを示す質量スペクトログラムである（質量は１９００〜３０００Ｄａにおよぶ）。２１２３．６Ｄａ、２４３７．０Ｄａおよび２７２６．２Ｄａの質量シグナルは、第一のハイブリダイズされたＴヌクレオチドで切断されたポリＡタグ（６アデニン）（ＡＡＡＡＡＡＴ）、第一の２つのハイブリダイズされたヌクレオチドの後ろで切断されるポリＡタグ（ＡＡＡＡＡＡＴＡ）、および最初の３つのハイブリダイズされたヌクレオチドの後ろで切断されるポリＡタグ（ＡＡＡＡＡＡＴＡＣ）を含む５’ＭＤＰに相当する。Ｙ軸は、シグナル強度であって、Ｘ軸は質量対電荷比である。
【図９】図９は、ＰＣＲ増幅の間に生成されたエキソン５特異的なデテクター・オリゴヌクレオチドから生成されたＭＤＰを示す質量スペクトログラムである（質量は２５００〜７０００Ｄａにおよぶ）。５７６５および６３３５．９Ｄａの質量シグナルは、残りの、未使用のＰＣＲプライマーに相当する。２７４１．６Ｄａおよび３０３２．６Ｄａの質量シグナルは、最初のハイブリダイズされたＴヌクレオチドで切断されるポリＡタグ（８アデニン）（ＡＡＡＡＡＡＡＡＴ）、および最初の２つのハイブリダイズされたヌクレオチドの後ろで切断されるポリＡタグ（ＡＡＡＡＡＡＴＣ）を含む５’ＭＤＰに相当する。Ｙ軸は、シグナル強度であって、Ｘ軸は質量対電荷比である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（詳細な説明）
本発明は、現行の核酸検出および定量方法を上回るいくつかの利点、例えば、多重化の増大、アッセイ簡便性、はやいサイクリング時間、およびＰＣＲ後処理なしなどをもたらす。現行の方法はしばしば、固相精製、移動および洗浄工程、ならびにＰＣＲ後の酵素反応を含む多段階の反応を要し、この全てが全体のアッセイ時間および費用を増大させ、それによって方法の適用性が制限される。例えば、ＴａｑＭａｎ−ベースのＱＰＣＲ方法は、それらが色素を用いることによって制限されるが、本発明の方法は各々のアッセイについて示される固有の検出特徴の数で制限されるだけである。これによって、有限な質量範囲にまたがるＭＤＰの一義的な検出が可能になる。
【００３４】
このアッセイはまた単純である。一実施形態では、１つの増幅または伸長工程（閉じた試験管内で起きる）しかなく、そのため生成物は増幅後酵素反応に移動されることも、それに供されることもない。また、増幅工程によって、はやいサイクリングが可能になり（すなわち、アッセイはプラトー期で終わる）、そのため速度および回転時間は、サイクリング速度によって制限されるだけであり−はやいサイクルが用いられ得る。結局、増幅後の処理はない。例えば、どの生成物も固体支持体に捕獲されることも、捕獲プローブに結合されてさらに酵素によって操作されることも必要もない。
【００３５】
本発明は、限定はしないが、診断、科学捜査および保安用途、例えば、個人（例えば、航空機の搭乗客）の特定を含むある範囲の適用のために１つ以上のサンプルから多数の配列を同時に特定および定量するという利点を提供する。特定の適用では、本発明は、特定の疾患（単数または複数）に関連する複数の多形性の有無について１つ以上のサンプルを分析する、特定の疾患（単数または複数）に関連する１つ以上の遺伝子の発現を分析する、または、数日ではなく数時間で行うことができる、単純な高速多重アッセイにおいて１つ以上のサンプルの起源を特定するという利点を提供する。
【００３６】
本発明の方法は、限定はしないが、核酸検出、例えば、配列認識、ＳＮＰ検出、転写分析またはｍＲＮＡ決定、対立遺伝子決定、変異決定およびメチル化分析を含む生体分子標的の検出／分析のための多重化アッセイを行うのに有用性を見出す。別の実施形態では、本発明の方法は、非核酸生体分子、例えば、タンパク質またはペプチドの検出および定量のための近接性ライゲーション、またはイムノアッセイベースの方法と組み合わせて用いられてもよい。例えば、一実施形態では、本発明のデテクター・オリゴヌクレオチドは、核酸増幅反応のためのテンプレートとして引き続き機能する、早期近接性ライゲーション反応またはイムノアッセイの間に生成される連結された複合体に対してアニーリングされる。ライゲーション複合体の増幅の際、質量識別可能な生成物を本明細書に記載のように作成して検出し、これによって多重化の増大を可能にする。近接性ライゲーションおよびイムノアッセイは、さらに、米国特許第５，６６５，５３９号；米国特許第６，５１１，８０９号；米国特許第６，８７８，５１５号；米国特許出願公開第２００５０２３３３５１号；米国特許出願公開第２００２００６４７７９号に；ならびにＲｏｇｅｒ  Ｂｒｅｎｔおよび彼の共同研究者によって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）ｉｎ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００５  Ｊａｎ；２（１）：３１〜７（その全てが参照によって本明細書に援用される）に記載される。
【００３７】
質量分析方法によって検出可能な質量識別可能な生成物を生成する増幅ベースの方法を用いる利点は、多くの標的核酸を同じ時点で同時に検出する能力である。本発明の方法は、既存の蛍光発色段ベースの方法によって生成される広範な重複するスペクトルに起因して限定される。従って、蛍光多重化のための上限は約１０の異なる標識である可能性が最も高い。現在の質量分析ベースの方法は、約５０−ｐｌｅｘｅｓまでの多重化反応に有用である。本明細書に開示される質量分析ベースの方法では、種々の標的の約５０または数百、おそらくは数千さえ超える多重化が可能である。この高レベルの多重化能力に起因して、多くのアッセイを同時に用いるだけでなく、任意の個々のデテクター・オリゴヌクレオチドを多くの異なる検出特徴で標識することができる。
【００３８】
結局、このアッセイは、初回の回転および多重化能力を必要とする任意の分野（例えば、公安）で多大な有用性を有する。このアッセイは高速かつ強固であり、検出プラットフォームは小さく、極めて正確、かつ使用が簡単であり、これによって本発明の方法は、広範な適用に理想的であり、この適用としては、臨床サンプル内の感染性因子の検出、科学捜査、診断、研究（例えば、クローン内の遺伝子（ｃＤＮＡ）インサートの検出）、セキュリティおよび屋外での使用が挙げられる。
【００３９】
（Ａ．定義）
「サンプル」という用語は、本明細書において用いる場合、核酸を含む試料または培養物（例えば、微生物培養物）を包含する。「サンプル」という用語はまた、生物学的サンプルおよび環境サンプルの両方を包含するものとする。サンプルは、合成由来の試料を含んでもよい。生物学的サンプルとしては、全血、血清、血漿、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞洗浄液、胃液、腹膜液、管洗浄液、耳洗浄液、関節鏡検査洗浄液）、生検サンプル、尿、便、喀痰、唾液、鼻粘膜、前立腺液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、乳汁、胚細胞、および胎児細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、この生物学的サンプルは血液であり、さらに好ましくは血漿である。本明細書において用いる場合、「血液」という用語は、慣習的に規定されるとおり、全血または血液の任意の画分、例えば、血清および血漿を包含する。血漿とは、抗凝血剤で処置した血液の遠心分離から生じる全血の画分をいう。血清とは、血液サンプル凝固後に残る液体の水様の部分をいう。環境的サンプルとしては、環境物質、例えば、表面物質、土壌、水および工業的サンプル、ならびに食物および乳加工の機器、装置、装備、用具、破棄可能および破棄不能な物品から得られるサンプルが挙げられる。これらの例は本発明に適用可能なサンプルのタイプを制限すると解釈されるべきではない。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「標的」または「標的核酸」という用語は、任意の分子であってその存在が検出もしくは測定されるべきであり、その機能、相互作用または特性が研究されるべきである任意の分子を意味するものとする。従って、標的は本質的に、検出可能なプローブ（例えば、デテクター・オリゴヌクレオチド）もしくはアッセイが存在するか、または当業者によって生成され得る任意の分子を包含する。例えば、標的は生体分子、例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、または炭水化物であってもよく、これは検出可能なプローブ（例えば、抗体）と結合し得るか、そうでなければ接触し得、ここでこの検出可能なプローブはまた、本発明の方法によって検出され得る核酸を含む。本明細書において用いる場合、「検出可能なプローブ」とは、目的の標的生体分子に対してハイブリダイズまたはアニーリングし得、かつ本明細書に記載のような標的生体分子の特異的な検出を可能にする任意の分子または因子をいう。本発明の一局面では、標的は核酸であり、検出可能なプローブは、デテクター・オリゴヌクレオチドである。「核酸」および「核酸分子」という用語は、本開示全体にわたって交換可能に用いられ得る。この用語はオリゴヌクレオチド、オリゴ、ポリヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、細菌ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、触媒性ＲＮＡ、クローン、プラスミド、Ｍ１３、Ｐ１、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、増幅核酸、アンプリコン、ＰＣＲ産物、および他のタイプの増幅核酸、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドおよびポリアミド核酸（ＰＮＡ）をいい、その全てが一本鎖型であっても二本鎖型であってもよく、他に限定しなければ、天然に存在するヌクレオチド、ならびにそれらの組み合わせおよび／または混合物と同様の方式で機能し得る天然のヌクレオチドの公知のアナログを包含する。従って、「ヌクレオチド」という用語は、天然に存在するヌクレオチド、および修飾された／天然には存在しないヌクレオチド（ヌクレオシドの三リン酸塩、二リン酸塩、および一リン酸塩、ならびにポリ核酸またはオリゴヌクレオチド内に存在する一リン酸塩モノマー）の両方を指す。ヌクレオチドはまた、リボ；２’−デオキシ；２’，３’−デオキシ、ならびに当該分野で周知のありとあらゆる他のヌクレオチド模倣物であってもよい。模倣物としては、鎖終止ヌクレオチド、例えば、３’−Ｏ−メチル、ハロゲン化塩基または糖置換基；別の糖構造（非糖、アルキル環構造を含む）；イノシンを含む別の塩基；デアザ−修飾；χ（ｃｈｉ）およびψ（ｐｓｉ）、リンカー修飾；質量標識修飾；ホスホジエステル修飾または置換（ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ボラノホスフェート、アミド、エステル、エーテルを含む）；ならびに塩基または完全なインターヌクレオチド間置換（光切断性ニトロフェニル部分などの切断性結合を含む）が挙げられる。
【００４１】
標的の有無は、定性的または定量的に測定され得る。標的は、例えば、単純もしくは複雑な混合物を含む種々の異なる形態であっても、または実質的に精製された形態であってもよい。例えば、標的は、他の成分を含むサンプルの一部であってもよいし、またはサンプルの唯一もしくは主要な成分であってもよい。従って、標的は、細胞丸ごともしく組織の成分であっても、細胞もしくは組織の抽出物であっても、その分画された溶解液であっても、または実質的に精製された分子であってもよい。また、標的は、公知または未知の配列または構造のいずれを有してもよい。
【００４２】
「アミノ酸」という用語は、本明細書において用いる場合、天然に存在するアミノ酸、および任意の修飾されたアミノ酸（当該分野で周知である方法によって合成されるか、または得ることができる）を指す。
【００４３】
「増幅反応」という用語は、核酸の標的配列のコピーを増幅するための任意のインビトロ方法をいう。
【００４４】
「増幅する」とは、増幅を可能にするために十分な条件に対して溶液を供する工程をいう。増幅反応の成分としては、限定はしないが、例えば、プライマー、ポリヌクレオチドテンプレート、ポリメラーゼテンプレート、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、ｄＮＴＰなどが挙げられ得る。「増幅する」という用語は代表的には、標的核酸における「指数関数的」増大をいう。しかし、「増幅する」とは本明細書において用いる場合また、核酸の選択標的配列の数の直線的な増大をいい、ただし一度だけの単回プライマー伸長工程とは異なる。
【００４５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、標的の二本鎖ＤＮＡの特異的なセグメントまたは配列がゲノム進行で増幅される方法をいう。ＰＣＲは、当該分野で周知である；例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、および同第４，６８３，２０２号；ならびにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓら、編、１９９０を参照のこと。
【００４６】
「オリゴヌクレオチド」は本明細書において用いる場合、ホスホジエステル結合によって連結される天然または修飾されたヌクレオシドの単量体の直線状のオリゴマー、またはそのアナログを指す。オリゴヌクレオチドとしては、標的核酸に特異的に結合し得る、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー型、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）、などが挙げられる。通常の単量体は、ホスホジエステル結合またはそのアナログによって連結されて、２〜３個の単量体単位（例えば、３〜４）、から数十個の単量体単位（例えば、４０〜６０）のサイズにおよぶオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字の配列によって提示されるときはいつでも、別段の注記がない限り、そのヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であること、および「Ａ」がデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」がデオキシシチジンを示し、「Ｇ」がデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はデオキシチミジンを示し、「Ｕ」はリボヌクレオシド、ウリジンを示すことが理解される。通常は、オリゴヌクレオチドは、４つの天然のデオキシヌクレオチドを含む；しかし、それらはまた、リボヌクレオシド、または天然のヌクレオチドアナログを含んでもよい。酵素が特異的なオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質、例えば、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などの要件を活性について有するならば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質の適切な組成物生物の選択は、当業者の知識の十分に範囲内である。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「オリゴヌクレオチドプライマー」、または単に「プライマー」とは、標的核酸テンプレート上で配列にハイブリダイズして、デテクター・オリゴヌクレオチドの検出を容易にするポリヌクレオチド配列をいう。本発明の増幅実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、核酸合成の開始点として機能する。非増幅の実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーは、切断剤によって切断され得る構造を作成するために用いられ得る。プライマーは、種々の長さであってもよく、しばしば５０ヌクレオチド長未満、例えば、１２〜２５ヌクレオチド長である。ＰＣＲにおける使用のためのプライマーの長さおよび配列は、当業者に公知の原理に基づいて設計され得る。
【００４８】
「デテクター・オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書において用いる場合、目的の標的核酸に対してハイブリダイズまたはアニーリングし得、かつこの標的核酸の特異的な検出を可能にするポリヌクレオチド配列を指す。
【００４９】
「ミスマッチヌクレオチド」または「ミスマッチ」とは、標的配列に対してその位置（単数または複数）で相補的でないヌクレオチドをいう。デテクター・オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのミスマッチを有してもよいが、２、３、４、５、６または７以上のミスマッチヌクレオチドを有してもよい。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「多形性」という用語は、対立遺伝子改変体をいう。多形性とは、単一ヌクレオチド多形態（一塩基遺伝子多型）（ＳＮＰ’ｓ）および単純な配列長さ多形性を包含し得る。多形性は、別の対立遺伝子に比べた一対立遺伝子での１つ以上のヌクレオチド置換基に起因し得、または挿入もしくは欠失、複製、反転および当該分野で公知の他の変更に起因し得る。
【００５１】
本明細書において用いる場合、「質量識別可能な生成物」という用語は、「切断生成物」、「分解生成物」、または「プローブフラグメント」と交換可能に用いられ得る。この略語に加えて、「ＭＤＰ」を用いてもよい。「質量識別可能な生成物」という用語は、本明細書の方法によって記載されるようなデテクター・オリゴヌクレオチドの切断および遊離から生じる１つ以上の分解生成物をいう。質量識別可能な生成物（ＭＤＰ）とは、限定はしないが、未修飾のデテクター・オリゴヌクレオチド・フラグメント、修飾されたデテクター・オリゴヌクレオチド・フラグメント（例えば、同位体が富化されるか、または枯渇されたオリゴヌクレオチドフラグメント）、検出部分を含むオリゴヌクレオチドフラグメント、デテクター・オリゴヌクレオチドから遊離された検出部分、および標的核酸に相補的でないデテクター・オリゴヌクレオチド・フラグメントを含んでもよい。質量識別可能な生成物はまた、デテクター・オリゴヌクレオチドの部分的分解の際、標的核酸から解離する部分的に切断されたデテクター・オリゴヌクレオチド・フラグメントを含んでもよい。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「質量特異的な検出サイン（ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」という用語は、２つ以上の質量識別可能な生成物が検出され、従って、標的核酸について２つ以上の質量ピークを有するスペクトログラムを生じる場合をいう。デテクター・オリゴヌクレオチドの切断の際、質量分析方法によって検出可能である複数のＭＤＰが生成され得る。各々の検出アッセイは、それ自体の質量特異的検出サインを有し得、このサインは、同じ標的核酸に対応する種々の質量を有する複数の切断産物を含む。
【００５３】
本明細書において用いられる「修飾された」という用語は、検出特徴を含むように変更されているデテクター・オリゴヌクレオチドをいう。
【００５４】
「検出特徴（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｅａｔｕｒｅ）」という用語は、本明細書において用いる場合、例えば、質量の相違またはサイズの相違によって、質量分析法または任意の他の大きさに基づく分離方法、例えば、ゲル電気泳動（アクリルアミドまたはアガロースゲル、紙などを含む種々の支持体上）、クロマトグラフィーまたは濾過によって検出可能である分離特徴を作成するために導入されている修飾をいう。分離の特徴によって、特異的なＭＤＰまたはサブセットのＭＤＰをより大きいセットのＭＤＰから検出することが可能になる。検出特徴としては、限定はしないが、検出部分、およびヌクレオシド修飾が挙げられる。
【００５５】
「検出部分」という用語は本明細書において用いる場合、検出可能な（好ましくは定量化可能な）効果をもたらすために用いられ得、かつ核酸（例えば、デテクター・オリゴヌクレオチド）に結合されるか、または組み込まれ得る任意の原子または分子をいう。１つの好ましい実施形態では、この検出部分は、特有の質量によって特徴付けられる部分であり、これによって、質量に基づく分離において、例えば、質量分析法、ゲル電気泳動、クロマトグラフィーまたは濾過による、特異的な特定が可能になる。検出部分としては限定はしないが、ヌクレオチド、コンポマー（ｃｏｍｐｏｍｅｒ）、糖、ペプチド、タンパク質、および抗体、化合物、金属化合物、電子吸着物質、結合部分、例えば、ビオチン、質量タグ、蛍光タグ、チャージタグ（ｃｈａｒｇｅ  ｔａｇ）、揮発性タグおよび疎水性タグが挙げられる。本発明と組み合わせて用いられ得る検出部分のさらなる例は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００３０１９４７１７号（出願番号１０／２２１，６６６）に示される。
【００５６】
「コンポマー（ｃｏｍｐｏｍｅｒ）」という用語は、本明細書において用いる場合、アッセイされているサンプル中の特定の標的分子の存在を間接的に示すためのコンポマーテンプレートから、標的検出アッセイで合成された分子である。コンポマーは１つ以上のサブユニットからなる。コンポマー重合化のための特に好ましいサブユニットは、核酸塩基のサブユニットである。コンポマーは、参照によって全体が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００５０２８７５３３号（シリアルナンバー１０／８７４８９８）に詳細に記載される。
【００５７】
「ヌクレオシド修飾」という用語は、本明細書において用いる場合、デテクター・オリゴヌクレオチドの変更を分子レベルで指す（例えば、塩基部分、糖部分、またはリン酸塩骨格）。ヌクレオシド修飾としては限定はしないが、切断ブロッカーまたは切断誘導因子の導入、副溝・バインダーの導入、同位体富化、同位体枯渇、重水素の導入、およびハロゲン修飾が挙げられる。ヌクレオシド修飾はまた、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増大するか、またはデテクター・オリゴヌクレオチドの融点を増大する部分を含み得る。例えば、ヌクレオチド分子は、ヌクレアーゼによる切断に耐性である、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）ヌクレオチドを生じる２’および４’炭素を接続する外部架橋で修飾されてもよい。
【００５８】
標的ポリヌクレオチドについてのプローブのような、別の分子に対する１分子の結合について言及する「特異的」または「特異性」という用語は、２つの分子の間の安定な複合体の認識、接触および形成であって、同時に他の分子とのその分子の認識、接触または複合体形成が実質的に少ないことをいう。本明細書において用いる場合、「アニーリングする（ａｎｎｅａｌ）という用語は、２つの分子の間の安定な複合体の形成をいう。
【００５９】
プローブは、そのプローブの少なくとも１つの領域が核酸配列の相補体の少なくとも１つの領域と実質的な配列同一性を共有する場合に核酸配列に「ハイブリダイズ可能である」。「実質的な配列同一性」とは、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９５％、または９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性である。ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の配列同一性を決定する目的のため、ＵおよびＴはしばしば、同じヌクレオチドとみなす。例えば、配列ＡＴＣＡＧＣを含むプローブは、配列ＧＣＵＧＡＵを含む標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズし得る。
【００６０】
本明細書において用いる場合、「切断剤（ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｇｅｎｔ）」という用語は、限定はしないが酵素を含む、質量分析可能な生成物を生じるデテクター・オリゴヌクレオチドを切断し得る任意の手段をいう。増幅が生じない方法については、切断剤は単に、デテクター・オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを切断、分解、そうでなければ遊離するように機能し得る。切断剤は酵素であってもよい。切断剤は、天然であっても、未修飾であってもまたは修飾であってもよい。
【００６１】
増幅が生じる方法については、切断剤は好ましくは、合成（または重合化）活性およびヌクレアーゼ活性を有する酵素である。このような酵素はしばしば、核酸増幅酵素である。核酸増幅酵素の例は、核酸ポリメラーゼ酵素、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａｑＭＡＮ（登録商標））またはＥ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩである。この酵素は天然に存在しても、合成であっても、未修飾であってもまたは修飾であってもよい。
【００６２】
「ポリメラーゼ」という用語は、テンプレートとしてＤＮＡまたはＲＮＡを用いてヌクレオチド鎖に対するヌクレオチド単位の付加によって、ポリヌクレオチド合成を触媒する酵素をいう。この用語は、完全な酵素または触媒性ドメインのいずれかを指す。
【００６３】
（Ｂ．誘導）
本発明は部分的には、質量分析法によって検出されるべきハイブリダイゼーションプローブを使用する定量的増幅プロセス、ならびに合成かつヌクレアーゼ活動し得る単一の酵素を含む反応に関連する。対照的に、いずれかに記載される特定の定量的増幅適用は、（ａ）質量分析以外の方法によって検出される検出標識、例えば、蛍光タグを含むハイブリダイゼーションプローブ（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号を参照のこと）、または（ｂ）非増幅ベースの方法において切断構造を切断するために使用される複数の切断剤（例えば、米国特許第５，７１９，０２８号を参照のこと）を要する。本明細書に記載される実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドは、テンプレートを増幅するプライマーとともに増幅反応物中に含まれる。さらに、デテクター・オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントは、多重化の増強レベルを可能にする質量分析法によって検出される。ある実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、修飾されており、他の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは未修飾である。この増幅条件、酵素特性、デテクター・オリゴヌクレオチド特性、デテクター・オリゴヌクレオチド結合特性および質量識別可能な生成物検出方法は、本明細書において以降にさらに詳細に記載される。
【００６４】
（Ｃ．増幅条件）
一実施形態では、本明細書に記載の方法は、多重化方式で正確かつ鋭敏な核酸分析を可能にする、改変された定量的増幅方法を使用する。米国特許第４，６８３，１９５号、および同第４，６８３，２０２号（ＭｕｌｌｉｓおよびＭｕｌｌｉｓら）に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニングも精製もなしに、ゲノムＤＮＡの混合物中で標的配列のセグメントの濃度を増大するための方法を記載する。ＰＣＲを用いれば、標的の濃度を容易に検出可能なレベルまで直接増大し得る。この標的配列を増幅するためのプロセスは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的であるモル過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に対して導入する工程を包含する。この混合物は変性され、次いでハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、このプライマーは、ポリメラーゼで伸長されて、相補的な鎖が形成される。変性、ハイブリダイゼーション、およびポリメラーゼ伸長の工程を必要なたびに繰り返して、所望の標的配列の比較的高濃度のセグメントを得る。
【００６５】
本発明の方法によって、増幅反応を、単独の閉じた反応容器中で同時に行うことが可能になり、ここでは増幅工程をシグナルが検出されるまで反復してもよい。この合成の副産物は、一ヌクレオチド、二ヌクレオチドおよびより大きいヌクレオチドフラグメントの混合物からなるデテクター・オリゴヌクレオチド由来のオリゴヌクレオチドフラグメントである。このデテクター・オリゴヌクレオチドは、質量分析方法によって検出可能な検出特徴を含むように修飾してもよいし、またはオリゴヌクレオチドフラグメントは、所定の分子量または大きさの質量識別可能な生成物を得るために修飾してもよい。変性、デテクター・オリゴヌクレオチドおよびプライマーアニーリングの反復サイクル、ならびにプライマー伸長およびデテクター・オリゴヌクレオチドの切断によって、プライマーによって規定される標的領域の指数関数的蓄積、および質量識別可能な生成物の指数関数的生成が得られる。十分なサイクルを行って、ＭＤＰの検出可能な種を達成する。
【００６６】
本発明によって、特に現在利用可能なアッセイに比べて、多重アッセイをより容易に設計して行う能力を含む、多くの利点が得られる。多重化アッセイでは、いくつかの標的核酸を同時に検出し得る。多重形式では、特に設計されたデテクター・オリゴヌクレオチドのセットを用い、その結果得られた質量識別可能な生成物は、お互いから識別され得る特有の質量を有する。多重化実験を用いれば、２つ以上の標的核酸、１０以上の標的核酸、１００以上の標的核酸、または１，０００以上の標的核酸を同じアッセイで検出し得る。多重アッセイで用いられるデテクター・オリゴヌクレオチドの数は、検出されるべき標的核酸の数以上である。例えば、多重化実験を用いて１０個の標的核酸を検出する場合、１０個以上のデテクター・オリゴヌクレオチド（固有の質量の１０個以上の質量識別可能な生成物を生じる）を用いる。単独のアッセイで検出され得る分析物の数は、単独のアッセイで検出され得る質量識別可能な生成物の数によってのみ制限される。本明細書に記載される場合、質量分析法は、質量のわずかな差を解析し得、これによって単一のアッセイにおける多数のデテクター・オリゴヌクレオチドの使用が可能になる。
【００６７】
（Ｄ．プライマーの特性）
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、任意の適切な方法、例えば、当業者に周知であるリン酸トリエステルおよびリン酸ジエステルを用いる方法などを用いて調製され得る。ある実施形態では、１つ以上の検出部分がデテクター・オリゴヌクレオチドに含まれる。このオリゴヌクレオチドはまた、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で、例えば、副溝・バインダーまたはインターカレート剤を用いて修飾されてもよい。
【００６８】
増幅反応のためのプライマーを公知のアルゴリズムに従って設計する。このプライマーを、標的核酸に隣接する配列にハイブリダイズするように設計する。代表的には、市販のまたは特注のソフトウェアは、アニーリング温度が融点に近いようなプライマーを設計するアルゴリズムを用いる。増幅プライマーは通常少なくとも１２塩基、たいていの場合は約１５、１８または２０塩基長である。プライマーは代表的には、特定の反応に関与する全てのプライマーがお互いの５℃以内、最も好ましくは２℃以内の融点を有するように設計される。プライマーはさらに、それ自体またはお互いに対するプライミングを回避するように設計される。プライマー濃度はしばしば増幅される標的配列の量に結合するのに十分であり、それによって増幅された配列の量の正確な評価が得られる。当業者は、プライマーの濃度がプライマーの結合親和性、および結合されるべき配列の量に従って変化するということを認識する。代表的なプライマー濃度は、０．０１μＭ〜１．０μＭにおよぶ。また、プライマー濃度は、デテクター・オリゴヌクレオチド濃度に対して変化し得、ここでデテクター・オリゴヌクレオチド濃度は、プライマー濃度よりも大きい。
【００６９】
別の実施形態では、フォワードおよびリバースプライマーの濃度は、お互いに対して変化してもよく（ときに非対称ＰＣＲとも呼ばれる条件）、これによってテンプレートＤＮＡの１方の鎖を他よりも優先的に増幅し得る。好ましい実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドが結合する鎖が優先的に増幅される。
【００７０】
増幅反応は、プライマーが標的配列テンプレートにハイブリダイズしてポリメラーゼによって伸長される条件下でインキュベートされる。このような反応条件は、目的の標的核酸およびプライマーの組成に依存して変化してもよい。増幅反応サイクル条件は、プライマーが標的テンプレート配列に特異的にハイブリダイズして伸長されるように選択される。標的テンプレートに特異的にハイブリダイズするプライマーは、分析されるサンプル中に存在し得る他の核酸に比較して優先的に標的核酸を増幅する。
【００７１】
（Ｅ．酵素の特性）
本発明は、検出可能な質量識別可能な生成物を分解および遊離する切断剤の使用を組み込む。異なるタイプの核酸を切断するために用いられ得る、いくつかのヌクレアーゼが当該分野で公知である。例えば、二本鎖ＤＮＡを切断し得るヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅＩおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩ）、または一本鎖ＤＮＡを切断し得るヌクレアーゼ（例えば、ヌクレアーゼＳ１）が利用される。ヌクレアーゼとしては、単にヌクレアーゼとして機能する酵素、およびヌクレアーゼ活性を含む多機能酵素、例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。種々の細菌種由来の、または設計された変異体に由来するＴａｑポリメラーゼのいくつかの誘導体（核酸ハイブリッドの特定の構造を切断する）が公知である（Ｋａｉｓｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１３８７〜２１３９４（１９９９）；Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：６１４３〜６１４８（１９９９）；Ｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２４６９３〜２４７００（２０００））。例えば、特異的な核酸構造でのみ切断するＣｌｅａｖａｓｅ（商標）酵素（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が開発されている。好ましい実施形態では、切断剤は、ポリメラーゼ活性およびヌクレアーゼ活性を有する酵素であり、ここでは質量識別可能な生成物が生成されながら標的核酸が指数関数的に増幅される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、この酵素は、デテクター・オリゴヌクレオチドの１ヌクレオチドを、標的に対してハイブリダイズされるデテクター・オリゴヌクレオチド領域の５’末端へ切断する。別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドごとに切断されることはない。代わりに、切断は、２つ以上のヌクレオチドの質量識別可能な生成物を生じる検出部分の導入またはヌクレオシド修飾を通じて調節される。好ましい実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドは、再生可能かつ識別可能なＭＤＰを生じるような方法で切断される。
【００７３】
（Ｆ．デテクター・オリゴヌクレオチド特性）
本発明のデテクター・オリゴヌクレオチドは、任意の安定なサイズであってもよく、代表的には、約６〜約１００ヌクレオチド、さらに好ましくは約６〜約８０ヌクレオチド、それより頻繁には約１０〜約４０ヌクレオチドの範囲である。デテクター・オリゴヌクレオチドの正確な配列および長さは、部分的には、それが結合する標的ポリヌクレオチドの性質に依存する。この結合の位置および長さは、特定の実施形態について、適切なアニーリングおよび融解の物性を得るように変化されてもよい。このようなデザインの選択を行うための手引きは、多くの当該分野で認識される引用文献に見ることができる。デテクター・オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、標的核酸を増幅するためのプライマーを用いる標的配列の増幅と組み合わせれば、サンプル中の標的核酸配列の量の定量的な決定が得られる。好ましい実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、非延長性であり（例えば、３’ジデオキシヌクレオチドの導入を通じて）、それによって、増幅のアーチファクトの可能性が減る。
【００７４】
このデテクター・オリゴヌクレオチドはまた、標的核酸配列に対するミスマッチを、例えば、標的核酸配列の不変の（非多形的な）位置で、含み得る。ある実施形態では、さらなるヌクレオチド、例えば、２、３、４、５、６または７つ以上のヌクレオチドが標的核酸に対してミスマッチであり得る。ある実施形態では、このさらなるミスマッチが、標的核酸配列とのハイブリダイゼーションの前に、上流のデテクター・オリゴヌクレオチド配列とのステム−ループ構造を形成する。このミスマッチヌクレオチドは、デテクター・オリゴヌクレオチドに対して５’側に存在しても、３’側に存在しても、または内部に存在してもよい。３’ミスマッチの例は、参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００６００２４６９５号に記載される。別の実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドの相補的領域の５’末端は、ＧＣクランプを含んでもよい。
【００７５】
デテクター・オリゴヌクレオチドは、修飾されても、未修飾でもよい。修飾されるオリゴヌクレオチドは、検出部分またはヌクレオシド修飾を含んでもよい。検出部分およびヌクレオシド修飾、ならびにそれらを作成および使用する方法の例は、米国特許第５，１７４，９６２号；米国特許第５，３６０，８１９号；米国特許第５，５１６，９３１号；米国特許第６，２６８，１２９号；米国特許第６，６３５，４５２号；米国特許第６，３２２，９８０号；米国特許第６，５１４，７００号；米国特許第６，６４９，３５１号；米国特許第６，６１３，５０９号；および米国特許出願公開第２００６０１７２３１９（全てが参照によって本明細書に援用される）に記載される。
【００７６】
「検出部分」という用語は、質量標識、タグまたはシグナルをいう。本発明の検出部分のタイプの例としては、化合物のレパートリー、好ましくは、類似の質量分光脱離特性を共有し、かつ類似または同一のカップリング化学を有しており複数の検出部分改変体の合成を合理化するものが挙げられる。本発明の検出部分は、質量分析計によって検出可能である。質量分析技術の代表的なタイプとしては、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法、直接レーザー脱離質量分析法、エレクトロスプレーイオン化質量分析法、二次中性粒子質量分析法、および二次イオン質量分析法が挙げられ、レーザー脱離イオン化が好ましい。ダイナミックレンジの質量スペクトル測定は、一般に、シグナルの処理および分析における対数増幅器および／または可変減衰器の使用によって拡張できる。
【００７７】
他の関連の実施形態では、ヌクレオチドは、限定はしないが放射性分子、蛍光分子、抗体、抗体フラグメント、ハプテン、炭水化物、ビオチン、ビオチンの誘導体、リン光部分、発光部分、電気化学発光部分、着色部分、および検出可能な電子スピン共鳴、電気容量、比誘電率、または導電率を有する部分を含むデテクター・オリゴヌクレオチドの検出、切断、または切断耐性を可能にする任意のタイプの化学基または部分で標識され得る。ヌクレオチドは、１つまたは２つ以上のタイプの化学基または化学部分で標識され得る。各々のヌクレオチドは、同じ化学基または部分で標識されてもよい。あるいは、各々の異なるヌクレオチドが、異なる化学基または部分で標識されてもよい。この標識されたヌクレオチドは、ｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ、またはｄＮＴＰｓおよびｄｄＮＴＰｓの両方の混合物であってもよい。未標識のヌクレオチドはｄＮＴＰｓ、ｄｄＮＴＰｓ、またはｄＮＴＰｓおよびｄｄＮＴＰｓの両方の混合物であってもよい。
【００７８】
ヌクレオチドの任意の組み合わせを用いて、限定はしないが未標識のデオキシヌクレオチド、標識されたデオキシヌクレオチド、未標識のジデオキシヌクレオチド、標識されたジデオキシヌクレオチド、標識および未標識のデオキシヌクレオチドの混合物、標識および未標識のジデオキシヌクレオチドの混合物、標識デオキシヌクレオチドおよび標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、標識デオキシヌクレオチドおよび未標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、未標識デオキシヌクレオチドおよび未標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、未標識デオキシヌクレオチドおよび標識ジデオキシヌクレオチドの混合物、ジデオキシヌクレオチドアナログ、デオキシヌクレオチドアナログ、ジデオキシヌクレオチドアナログおよびデオキシヌクレオチドアナログの混合物、リン酸化ヌクレオシドアナログ、２’−デオキシヌクレオチド−５’−三リン酸塩、および修飾された２’−デオキシヌクレオチド−５’−三リン酸塩を含むヌクレオチドを組み込んでもよい。
【００７９】
４つ全てのヌクレオチドを、異なる蛍光基で標識してもよく、これによって１つの反応を４つ全ての標識されたヌクレオチドの存在下で行うことが可能になる。あるいは、４つの別個の「フィルイン（ｆｉｌｌ  ｉｎ）」反応を目的の各々の遺伝子座について行ってもよい；各々の４つの反応は、異なる標識ヌクレオチド（例えば、ｄｄＡＴＰ＊、ｄｄＴＴＰ＊、ｄｄＧＴＰ＊、またはｄｄＣＴＰ＊、ここで＊は、標識されたヌクレオチドを示す）を含む。各々のヌクレオチドは、異なる化学基で標識されても、または同じ化学基で標識されてもよい。この標識されたヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチドであっても、またはデオキシヌクレオチドであってもよい。
【００８０】
別の実施形態では、ヌクレオチドは、限定はしないが、フルオレセイン、ピレン、７−メトキシクマリン、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ．ＴＭ．、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ６８０、ＡＭＣＡ−Ｘ、ジアルキルアミノクマリン、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  Ｆｌ−Ｘ、ＤＴＡＦ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｄａｎｓｙｌ−Ｘ、６−ＦＡＭ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ−Ｘ、Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｅｏｓｉｎ、臭化エチジウム、ＮＢＤ、ＴＥＴ、２’、４’、５’、７’テトラブロモスルホンフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｆｌ  ＢＲ２、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＨＥＸ、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−Ｘ．、ＰｙＭＰＯ、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＴＡＭＲＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、Ｃｙ３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ−ｘ、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ｃａｒｂｏｘｙＸｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲ−Ｘ．、Ｃｙ５、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ  ＃１、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ  ＃２、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＲｅｄ、またはナフトフルオレセインを含む蛍光色素で標識され得る。
【００８１】
検出部分は、バイオポリマー、および合成のポリマーを含むありとあらゆる種々のタイプの化合物を含んでもよい。検出部分として、単独でまたはポリマー型で用いられ得る代表的な生物学的モノマー単位としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）アミノ酸、非天然のアミノ酸、核酸、糖類、炭水化物、ペプチド模倣物および核酸模倣物が挙げられる。好ましいペプチドは天然に存在し、安定で、かつ比較的小型である（例えば、ニューロペプチド・サブスタンスＰ）。好ましいアミノ酸としてはまた、単純な脂肪族側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンおよびヒスチジン）、酸素およびイオウを含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、メチオニン、およびシステイン）、カルボン酸基またはアミド基を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン）、および強い塩基性の基を含む側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジンおよびアルギニン）、およびプロリンが挙げられる。上記のアミノ酸の誘導体も、モノマー単位として考慮される。本明細書において用いられるアミノ酸誘導体は、その構造内にアミノ置換カルボン酸の塩基性アミノ酸コアを含む任意の化合物であって、代表的な例としては限定はしないが、アザセリン、フルオロアラニン、ＧＡＢＡ、オルニチン、ノルロイシンおよびサイクロセリンが挙げられる。上記のアミノ酸由来のペプチドも、モノマー単位として用いられ得る。代表的な例としては、天然に存在するペプチドおよび合成のペプチドの両方が挙げられ、ここで約５００ダルトンを超える分子量、約５００〜５０００ダルトンのペプチドが好ましい。糖類の代表的な例としては、リボース、アラビノース、キシロース、グルコース、ガラクトースおよび２〜７個の炭素の鎖から構成される他の糖誘導体が挙げられる。代表的な多糖類（ポリサッカライド）としては、グリコシド結合を介して連結された上記の糖類単位の組み合わせが挙げられる。一般には任意の１検出部分内のポリマー単位の配列は、重要ではない；総量は、標識の重要な特徴である。本発明のある実施形態では、ペプチド検出部分をヌクレオチドと組み合わせて、ＭＤＰのライブラリーを得る。例えば、同じペプチド（例えば、サブスタンスＰ：以下の配列：Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔを有する１１アミノ酸のポリペプチド）を、種々の量のヌクレオチドのライブラリー（例えば、全ての可能な４マー）に結合体化する。
【００８２】
本発明に従うモノマー単位は、核酸塩基の化合物、またはヌクレオシド修飾から構成され得る。本明細書において用いる場合、核酸塩基という用語は、その構造内にプリン、ピリミジン、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはこれらの任意の誘導体、例えば、保護された核塩基、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、フォリン酸アナログ、ホスホン酸メチル誘導体、ホスホトリエステル誘導体、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）誘導体、またはホスホロチオエート誘導体を含む任意の部分を指す。
【００８３】
本発明による検出部分はまた、規定の質量値を有しており、バイオアッセイの間に水溶性を保持しており、質量分析法によって検出可能である任意の有機または無機ポリマーを含んでもよい。代表的な合成のモノマー単位（ポリマー型で質量単位として用いられ得る）としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルフェノール、ポリメチルメタクリレート、ポリプロピレングリコール、ポリピロールおよびそれらの誘導体が挙げられる。広範な種々のポリマーが当業者に容易に利用可能である。ポリマーは、単一のタイプのモノマー単位、またはモノマー単位の組み合わせから構成し、混合されたポリマーを作製してもよい。任意の検出部分内のポリマー単位の配列は、重要ではない；総質量が標識の重要な特徴である。
【００８４】
約５００Ｄａ未満の質量を有する不揮発性検出部分については、通常有意なイオン形質が必要である；代表的な例としては、四級アンモニウム塩のポリエチレングリコールオリゴマー（例えば、Ｒ−−（Ｏ−−ＣＨ２−−ＣＨ２）ｎ  −−Ｎ（ＣＨ３）３＋Ｃｌ−）およびカルボン酸および塩のポリエチレングリコールオリゴマー（例えば、Ｒ−−（Ｏ−−ＣＨ２  −−ＣＨ２）ｎ  −−ＣＯ２  −−Ｎａ＋）が挙げられる。
【００８５】
不揮発性検出部分の例としては代表的には約５００Ｄａ未満の分子量のポリエチレングリコールおよび低分子ペプチド（天然または修飾）の低分子オリゴマーが挙げられる。これらの場合、本明細書において考慮される全ての場合について、質量分析は電子付着によってではない。
【００８６】
本発明の検出部分はまた、非ポリマーである、種々の不揮発性および揮発性の有機化合物を包含し得る。不揮発性の有機化合物の代表的な例としては、ヘム基、色素、有機金属化合物、ステロイド、フラーレン、レチノイド、カロテノイドおよび芳香族多環式炭化水素が挙げられる。
【００８７】
シグナル重複を回避するためにデテクター・オリゴヌクレオチドで複数の検出部分を用いる場合が好ましい。単一の荷電を有する検出部分について大きい一次シグナルを示すことに加えて、シグナルを示すための検出部分の複数の荷電されたバージョンの電位、および検出部分の二量体化バージョンもある。シグナル検出部分の複数のシグナルの存在は、潜在的に、第二の検出部分の一次ピークのシグナルと重複しかつ不明瞭であり得る。従って代表的には、所定の分析のために用いられる検出部分の範囲は、多重に荷電されない質量範囲を有してもよいし、または二量体種は、全ての検出部分の検出を妨害し得、例えば、この検出部分は、最少の質量標識が最大の検出部分の質量の半分を超える質量範囲を有してもよい。
【００８８】
他の検出部分としては、塩基に連結された蛍光およびクエンチャー（当該分野で周知である）が挙げられる。それらは、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．），Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘ．），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａ．），またはＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．）から入手できる。ある場合には、塩基に連結された蛍光を、オリゴヌクレオチド（塩基と連結された反応性基で合成した）の合成後修飾によってオリゴヌクレオチド中に組み込む。この蛍光は、糖または塩基の３’ＯＨに結合されてもよい。塩基に連結された蛍光および／またはクエンチャーを用いて、特定の質量の特有のＭＤＰを作製してもよく、次にこれを質量分析法によって検出してもよい。
【００８９】
別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、切断できない（すなわち、非分解性またはヌクレアーゼ耐性の）ヌクレオチドを含む。本明細書において記載されるとおり、本発明の酵素は、ヌクレアーゼ感受性であるデテクター・オリゴヌクレオチド中の任意の結合を切断し得る。しかし、標的結合部分（すなわち、標的核酸とハイブリダイズするかまたは相補的であるデテクター・オリゴヌクレオチドの部分）において少なくとも１つのヌクレアーゼ耐性結合を有する利点とは、デテクター・オリゴヌクレオチドが、切断の際に単一の大きさの種の質量識別可能な生成物を生じるということである。特に好ましい切断不能な（または切断耐性の）ヌクレオチドは、ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）である。ロックド核酸はまた、アクセス不能なＲＮＡとも呼ばれ、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、しばしば、２’および４’炭素をつなぐ外部架橋で修飾される。ＬＮＡヌクレオチドは、所望の場合はいつでもオリゴヌクレオチド・デテクター中でＤＮＡまたはＲＮＡ塩基とともに組み込まれ得る。一実施形態では、１つ以上のＬＮＡをデテクター・オリゴヌクレオチドの相補性（またた標的結合部分）領域の５’末端中に組み込む。
【００９０】
ロックドリボース（ｌｏｃｋｅｄ  ｒｉｂｏｓｅ）高次構造は、塩基のスタッキングおよび骨格のプレ組織化を増強し、それによって、ＬＮＡが組み込まれているデテクター・オリゴヌクレオチドの熱安定性（融点）を有意に増大する。この効果はさらにお互いに対して隣接する２つ以上のＬＮＡを置くことによって増強され得る。下の実施例３を参照のこと。
【００９１】
ヌクレアーゼ切断可能な結合としては、例えば、ホスホジエステル結合を挙げることが可能で、ヌクレアーゼ耐性結合としては、例えば、チオリン酸エステル、ホスフィン酸塩、メチルホスホネート、ホスホラミダイト、または亜リン酸誘導体以外のリンカー、例えば、アミドおよびボロン酸結合、またはアルキルシリルジエステルおよびペプチド核酸を挙げることができる。
【００９２】
別の実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドは、酵素によって切断可能な基または結合を含む。酵素切断可能な遊離基としては、ホスホジエステルまたはアミド結合、ならびに、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が挙げられる。
【００９３】
別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、副溝・バインダー（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）（ＭＧＢ）を含み、このＭＧＢは、特定のアッセイに依存して、デテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端、真ん中、または３’末端にある。副溝結合タンパク質および／または修飾された塩基ＤＮＡプローブ（結合体化された副溝・バインダー（ＭＧＢ）と結合された）は、一本鎖ＤＮＡ標的との極めて安定な二重鎖を形成し、これによって、ハイブリダイゼーションベースのアッセイに、さらに短いプローブを用いることが可能になる（例えば、米国特許第５，８０１，１５５号）。従って、ある実施形態では、副溝・バインダー基はまた、デテクター・オリゴヌクレオチド中に、例えば、プローブの３’末端で含まれる。種々の適切な副溝・バインダーは、文献に記載されている。例えば、米国特許第５，８０１，１５５号；Ｗｅｍｍｅｒ  ＆  Ｄｅｒｖａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７：３５５−３６１−（１９９７）；Ｗａｌｋｅｒ，ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ４４：３２３−３３４（１９９７）；Ｚｉｍｍｅｒ  ＆  Ｗａｈｎｅｒｔ，  Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ．４７：３１〜１１２（１９８６）；およびＲｅｄｄｙ，ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．８４：１〜１１１（１９９９）を参照のこと。オリゴヌクレオチドに対してリンカーを通じてＭＧＢｓ（および他の部分）を結合するための適切な方法は、例えば、米国特許第５，５１２，６７７号；同第５，４１９，９６６号；同第５，６９６，２５１号；同第５，５８５，４８１号；同第５，９４２，６１０号および同第５，７３６，６２６号（その全てが参照によって本明細書に援用される）に記載される。
【００９４】
別の実施形態では、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、同位体でコードされたヌクレオチドを含む。一例では、対立遺伝子特異的デテクター・オリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ対立遺伝子に対してハイブリダイズする同位体コードされたヌクレオチドを含む。この同位体コードされたデテクター・オリゴヌクレオチドが次に、同位体コードされた質量識別可能な生成物を生じる。一実施形態では、１つだけの同位体コードされたヌクレオチドまたは同位体コードされたヌクレオチドを含む短いフラグメント（例えば、２、３または４塩基）を生成して、質量分析法によって検出する。１つだけのヌクレオチドが検出される場合、精製は単純化される。なぜならリン酸骨格が存在せず、塩付加形成が最小化されるからである。例えば、米国特許第６，６１３，５０９号（参照によって本明細書に援用される）を参照のこと、これは、核酸への同位体の組み込みを記載している。
【００９５】
別の実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドは、その融点（Ｔｍ）を増大するように修飾され得る。一実施形態では、このプライマー融点はしばしば、約５８〜６０℃であり、デテクター・オリゴヌクレオチドのＴｍはしばしば、プライマーのＴｍよりも１０℃高い。両方のプライマーのＴｍはしばしば、ほぼ等しい。
【００９６】
（Ｇ．デテクター・オリゴヌクレオチドの結合特性）
ある実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドの分解を、構造中の核酸の１つ以上が標的から解離され得る条件下で行う。一実施形態では、デテクター・オリゴヌクレオチドの全体または部分的な解離によって、複数の質量識別可能な生成物の形成が可能になる。ある実施形態では、このような解離は、温度の上昇によって誘導され、その結果１つ以上のオリゴヌクレオチドは標的鎖に対してもはやハイブリダイズできない。他の実施形態では、このような解離が生じる。なぜなら、オリゴヌクレオチド生成物の切断は、反応条件下で標的鎖に結合できない切断生成物のみを生じるからである。好ましい実施形態では、切断にかかわらずオリゴヌクレオチドが標的鎖と会合し（すなわち、ハイブリダイズし）その標的鎖から解離し得る条件を選択する。特に好ましい実施形態では、二重鎖構造の一部のとき切断され得るデテクター・オリゴヌクレオチドのコピー数が標的核酸鎖のコピー数を、部分的に切断されるデテクター・オリゴヌクレオチドが解離するとき十分な量で超え、標的鎖がデテクター・オリゴヌクレオチドのインタクトなコピーと会合する可能性が、デテクター・オリゴヌクレオチドの切断されたコピーと会合する可能性より大きいように条件を選択する。
【００９７】
（Ｈ．質量識別可能な生成物の検出方法）
質量識別可能な生成物は、限定はしないが、長さ、質量、電荷または質量対電荷比を含む特定の物理的特質または検出特徴によって識別可能である。好ましい実施形態では、この検出特徴は質量である。別の関連の実施形態では、ＭＤＰは、限定はしないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法での飛行時間質量を含む、物理的特質に関連する挙動によって識別可能であり得る。関連の実施形態では、１つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチド由来のＭＤＰを遊離して、質量スペクトルマトリックスから選択的に脱着させ、その結果非選択性のプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチド（すなわち、標的核酸が存在しない）は脱着しない。これらの実施形態については、ＭＤＰは、デテクター・オリゴヌクレオチドまたは反応混合物に存在する他の非ＭＤＰよりも質量スペクトルマトリックスからより効率的に脱着しなければならない。好ましい質量スペクトルマトリックスとしては、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）、クエン酸二アンモニウム（ａｍｍｏｎｉｕｍｃｉｔｒａｔｅ）（ＤＡＣ）およびそれらの組み合わせが挙げられる。別の実施形態では、質量スペクトルマトリックスが、タンパク質の分析のために設計され得る。タンパク質分析のための例示的なマトリックスとしては、限定はしないが、ＤＨＢおよびＣＨＣＡが挙げられる。
【００９８】
この方法はさらに、未切断または部分的に切断されたデテクター・オリゴヌクレオチド由来の１つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチドのフラグメント（すなわち、ＭＤＰ）を分離するさらなる工程を包含し得る。分離は、捕獲リガンド、例えば、ビオチンまたは他のアフィニティーリガンド、および捕捉剤、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、レセプター、ＭＤＰに相補的な捕獲プローブ、またはその機能的なフラグメント（捕獲リガンドに対して特異的な結合活性を有する）を用いて達成され得る。ＭＤＰは、捕捉剤に特異的な結合活性を有する捕獲リガンドを含んでもよい。ＭＤＰは当該分野で周知の方法を用いてビオチニル化されるかまたはアフィニティーリガンドに結合され得る。下の実施例４を参照のこと。捕獲リガンドおよび捕捉剤はまた、ＭＤＰの残りの部分に対して重量を付加するために用いられてもよく、この結果、これは、質量分析方法において検出されたＭＤＰの質量範囲から排除され得る。一実施形態では、捕獲プローブは切断生成物のユニバーサル増幅のためのユニバーサルプライマーを有し得る。
【００９９】
分離工程はまた、塩、酵素、または他の緩衝液成分をＭＤＰから除去するために用いられ得る。当該分野で周知のいくつかの方法、例えば、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、または沈澱を用いて、サンプルを浄化してもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを用いて、サンプルから塩を除去してもよい。分離方法の選択は、サンプルの量に依存し得る。例えば、少量のサンプルが利用可能であるか、または小型化された装置を用いる場合、マイクロ−アフィニティークロマトグラフィー分離工程を用いてもよい。さらに、分離工程が所望されるかどうか、および分離方法の選択は、用いられる検出方法に依存し得る。例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化およびエレクトロスプレーイオン化の効率は、サンプルから塩を除去することによって改善され得る。例えば、塩は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化でレーザーからエネルギーを吸収して、低いイオン化効率を生じ得る。
【０１００】
質量分析方法は本発明の質量識別可能な生成物を検出するための好ましい方法であり、従って、標的核酸を特定および／または定量する。質量識別可能な生成物は、質量分析計でイオン化されて、イオンはその質量対電荷比に基づいて空間または時間で分離されてもよい。次いで、質量分析計は、各々のイオンに関連する質量を計算する。従って、質量分析法について言及される場合、質量という用語は、質量対電荷比を簡単に記載するために用いられ得る。
【０１０１】
質量分析法は、分子を分離および特定するための鋭敏かつ正確な技術である。一般には、質量分析計は、２つの主要な構成要素、イオンの発生のためのイオン源、およびイオンの質量対電荷比を測定するための質量選択性分析器（これらのイオンについて質量の測定値に変換される）を有する。いくつかのイオン化方法が当該分野で公知であって、本明細書に記載される。質量識別可能な生成物は、デテクター・オリゴヌクレオチドから、切断の前、間または後に荷電され得る。結果として、質量分析法によって測定される質量識別可能な生成物は常に電荷が必要ではない。なぜなら、電荷は、質量分析法手順を通じて獲得され得るからである。質量分析法では、ＭＤＰの任意の成分、例えば、電荷および検出部分を、ＭＤＰの質量に寄与するために用いてもよい。
【０１０２】
種々の質量分析法、例えば、四極子質量分析法、イオントラップ質量分析法、飛行時間質量分析法、ガスクロマトグラフィー質量分析法およびタンデム型質量分析法は、本明細書に記載されるとおり、種々のイオン源および質量分析器（カスタマイズされた検出プロトコールを設計するのに可塑性を可能にする）を利用し得る。さらに、質量分析計をプログラムして、全てのイオンをイオン源から質量分析計に、連続して、または同時に伝達してもよい。さらに、質量分析計をプログラムして、他のイオンをブロックしながら、特定の質量のイオンを質量分析計中に選択してもよい。
【０１０３】
質量分析計中のイオンの動きを正確に制御する能力によって、検出プロトコール中のより大きい選択肢が可能になり、これは、例えば、多重化実験から多数の質量識別可能な生成物が分析されている場合、有利であり得る。例えば、多数のＭＤＰでの多重化実験では、一群の類似のレポーターから個々のレポーターを選択し、次いでそのレポーターを別々に分析することが有利であり得る。質量分析計によって検出される質量範囲を制御するのに基づく別の利点としては、非切断または部分的に切断されたタグ化プローブが分析されることを排除して、アッセイからバックグラウンドのノイズを減らす能力が挙げられる。
【０１０４】
質量分析計は、わずかな質量の相違を有するイオンを解像して、高い程度の正確性でイオンの質量を測定することができる。従って、類似の質量のＭＤＰを同じ実験で一緒に用いることができる。なぜなら、質量分析計は、密接に関連するタグでさえ質量を区別し得る。質量分析方法を用いて達成される高い程度の解像および質量の正確性によって、多数のセットのタグ化プローブの使用が可能になる。なぜなら、得られたレポータータグは、お互いから識別され得るからである。多数のセットのタグ化プローブを使用する能力は、多重化実験を設計する場合有利である。
【０１０５】
質量識別可能な生成物の質量を検出するための質量分析法を用いる別の利点は、このタイプの質量分析の高い感度に基づく。質量分析法は、イオン源によって形成されるイオンの大部分を利用すること、およびこれらのイオンを質量分析器を通じて検出器に効率的に移動することによって高い感度を得る。この高レベルの感度のおかげで、限られた量のサンプルでさえ、質量分析法を用いて測定され得る。これは、各々のＭＤＰ種の量が少なくてもよい多重化実験で有利であり得る。
【０１０６】
質量分析法は、当該分野で周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ〜７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）を参照のこと）。質量分析法に関連する基本的なプロセスは、サンプル由来の気相イオンの生成、およびそれらの質量の測定である。
【０１０７】
気相イオンの動きは、質量分析計で生成された電磁場を用いて正確に制御され得る。これらの電磁場におけるイオンの動きは、イオンのｍ／ｚに比例し、これがｍ／ｚ、従ってサンプルの質量を測定する基礎となる。これらの電磁場におけるイオンの動きによって、イオンが含まれて集束されることが可能になり、これが高感度の質量分析を説明する。ｍ／ｚ測定の経過の間、イオンを高い効率で、粒子検出器に移動して、これがこれらのイオンの到着を記録する。各々のｍ／ｚでのイオンの量は、グラフ上のピークによって実証され、ここでｘ軸はｍ／ｚであり、ｙ軸は相対存在量である。種々の質量分析計は、種々のレベルの解像度を有する、すなわち、質量が密接に関連したイオンの間のピークを解像する能力である。この解像度は、Ｒ＝ｍ／δｍとして規定され、ここでｍはイオンの質量であり、δｍは質量スペクトル中の２つのピークの間の質量の相違である。例えば、１０００という解像度を有する質量分析計は、１００．１というｍ／ｚを有するイオンから１００．０というｍ／ｚを有するイオンを解像できる。
【０１０８】
いくつかのタイプの質量分析計が利用可能であり、また種々の構成で作製され得る。一般には、質量分析計は、以下の主要な構成要素を有する：サンプルインレット、イオン源、質量分析器、検出器、減圧（真空）システム、および装置制御システム、ならびにデータシステム。サンプルインレット、イオン源、および質量分析器の相違は一般に、装置のタイプおよびその能力を規定する。例えば、インレットは、キャピラリーカラム液体クロマトグラフィー源であってもよく、または直接のプローブもしくはステージ（例えば、マトリックス支援レーザー脱離で用いられる）であってもよい。共通のイオン供給源は、例えば、エレクトロスプレーであり、これは、ナノスプレーおよびマイクロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離を含む。例示的な質量分析器としては、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析器、および飛行時間質量分析器が挙げられる。
【０１０９】
イオン形成プロセスは、質量スペクトル分析の出発点である。いくつかのイオン化方法が利用可能であり、イオン化方法の選択は、分析されるべきサンプルに依存する。例えば、ポリペプチドの分析のためには、比較的穏やかなイオン化手順、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）が所望され得る。ＥＳＩについては、サンプルを含む溶液を、高圧で微細なニードルを通過させて、強力な電場を作り、これによって質量分析計に向けられる高い荷電の液滴の微細なスプレーを生じる。他のイオン化手順としては、例えば、高速原子衝撃（ｆａｓｔ−ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（ＦＡＢ）が挙げられ、これは、固体サンプルをたたいて脱離およびイオン化を生じる中性原子の高エネルギービームを用いる。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＭＡＬＤＩ）は、ＵＶ吸収化合物マトリックス中で結晶化されているサンプルをたたくためにレーザーパルスが用いられる方法である。当該分野で公知の他のイオン化手順としては、例えば、プラズマおよびグロー放電、プラズマ脱離イオン化、共鳴イオン化、および二次イオン化が挙げられる。質量識別可能な生成物は、タグ化プローブからの切断の前、間または後にイオン化され得る。
【０１１０】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、本明細書に記載される方法に有用であるいくつかの特性を有する。例えば、ＥＳＩは、イオン化または気化するのが困難であるポリペプチドなどの生物学的分子に用いられ得る。さらに、ＥＳＩの有効性は極めて高く、高度に鋭敏な測定法の基礎が得られる。さらに、ＥＳＩ手順は、溶液から荷電された分子を生成し、これは溶液中にある質量識別可能な生成物を分析するのに便利である。対照的に、ＭＡＬＤＩなどのイオン化手順は、イオン化の前にサンプルの結晶化を必要とする。
【０１１１】
ＥＳＩは、荷電された分子を溶液から直接生成し得るので、液体クロマトグラフィーシステム由来のサンプルと適合性である。例えば、質量分析計は、画分がクロマトグラフィーカラムから質量分析計に流れるように、ＨＰＬＣのような液体クロマトグラフィーシステムのインレットを備えてもよい。この液体クロマトグラフィーシステムおよび質量分析計の直列的な配置は、時にＬＣ−ＭＳと呼ばれる。ＬＣ−ＭＳシステムは、例えば、質量分析法による分析の前に切断されたＭＤＰから未切断または部分的に切断されたＭＤＰを分離するために用いられ得る。さらに、クロマトグラフィーを用いて、質量分析法による分析の前に、ＭＤＰサンプルから塩または他の緩衝成分を除去してもよい。例えば、逆相ＨＰＬＣカラムを用いるサンプルの脱塩を、直列または非直結式で用いて、イオン化プロセスの有効性を増大し、これによって質量分析法による検出の感度を改善してもよい。
【０１１２】
種々のイオン源と対になり得る、種々の質量分析器が利用可能である。種々の質量分析器は、当業者に公知であり、かつ本明細書に記載のような種々の利点を有する。検出のために選択される質量分析計および方法は、特定のアッセイに依存する。例えば、検出のために少量のイオンが生成される場合、より感受性の質量分析器を用いてもよい。いくつかのタイプの質量分析器および質量分析方法が下に記載される。
【０１１３】
イオン移動度質量（ｉｏｎ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｍａｓｓ）（ＩＭ）分光測定は、質量分析計（ＭＳ）に対して新しい次元を加える気相分離方法である。ＩＭは、その衝突断面積に基づいて気相を分離し、かつ飛行時間（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＴＯＦ）質量分析計とカップリングされて、タンパク質およびペプチドの特定および特徴づけに用いられる強力なツールを作製し得る。従って、ＩＭ−ＭＳは、質量識別可能な生成物がタンパク質またはペプチドである場合、本発明に特に有用である。ＩＭ−ＭＳは、Ｖｅｒｂｅｃｋらによって、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｖｏｌ  １３，  Ｉｓｓｕｅ  ２，５６〜６１）にさらに詳細に考察される。
【０１１４】
四重極質量分析法は、四重極質量フィルターまたは分析器を利用する。このタイプの質量分析器は、２セットの２つの電気的に接続されたロッドとして配置される４つのロッドから構成される。ｒｆおよびｄｃ電圧の組み合わせを、各々の対のロッドに供して、これが、質量フィルターの始まりから末端に移動するにつれて、イオンの周期的振動を生じる電場を生じる。これらの電場の結果は、１対のロッドにおける高域質量フィルター、および他の対のロッドにおける低域フィルターの生成である。高域フィルターと低域フィルターとの間の重複によって、両方のフィルターを通過し、かつ四重極の長さを横断し得る規定のｍ／ｚが残る。このｍ／ｚは四重極質量フィルター中で選択され安定なままであるが、全ての他のｍ／ｚは不安定な軌道を有し、かつ質量フィルター中で残らないままである。質量スペクトルは、加えられた電場を傾斜させることによって生じ、その結果増大するｍ／ｚは、質量フィルターを通じて通過し、検出器に達するように選択される。さらに、四重極はまた、ｒｆ−のみの電場を加えることによって全てのｍ／ｚのイオンを含みかつ伝えるように設定され得る。これによって四重極が質量分析計の領域におけるレンズまたは集束システムとして機能することが可能になり、ここでイオン伝達は質量フィルタリングなしで必要とされる。これは、下にさらに記載されるようなタンデム質量分析計で使用されるものである。
【０１１５】
四重極質量分析器、および本明細書に記載される他の質量分析器は、規定のｍ／ｚまたは質量範囲を分析するようにプログラムされ得る。質量分析計のこの特性は、本明細書に記載される本発明に有用である。切断された質量識別可能な生成物の質量の範囲は、アッセイの前に公知であるので、質量分析計は、計画された正確な質量範囲のイオンを伝達し、一方ではより高いまたは低い質量範囲のイオンは排除するようにプログラムされ得る。質量範囲を選択する能力は、アッセイ中のバックグラウンドノイズを低下させ得、従ってシグナル対ノイズ比を増大し得る。さらに、規定の質量範囲を用いて、任意の未切断のデテクター・オリゴヌクレオチド（質量識別可能な生成物の質量よりも高い質量である）の分析を省いてもよい。従って、質量分析計によって、固有の分離工程、ならびに質量識別可能な生成物の検出および特定を達成し得る。
【０１１６】
イオントラップ質量分析法は、イオントラップ質量分析器を利用する。これらの質量分析器では、全てのｍ／ｚのイオンが最初にトラップされて、質量分析器中で周期的に振動するように電場を加える。イオンは、八極子レンズシステムなどの集束デバイスを通じてイオン源からイオントラップに入る。イオントラッピングは、励起および電極を通る検出器へのエジェクションの前にトラッピング領域で生じる。質量分析は、トラップの外でかつ検出器の中に漸増するｍ／ｚのイオンを押し出す方式で、振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）の振幅を増大する電圧を連続的に加えることによって達成される。四重極質量分析法とは対照的に、選択されたｍ／ｚを有するイオンを除く全てのイオンが質量分析器の電場に保持される。イオントラップに対する利点の１つは、それらが、一度に捕捉されるイオンの数を限るように注意さえすれば、極めて高い感度を有するということである。イオンの数の制御は、イオンがトラップ中に注入される時間を変化させることによって達成され得る。イオントラップの質量分離は、四重極質量フィルターのものと同様であるが、イオントラップは低いｍ／ｚ限界を有する。
【０１１７】
飛行時間質量分析法は、飛行時間質量分析器を利用する。ｍ／ｚ分析のこの方法については、イオンは最初に定量の運動エネルギーを、電場（高電圧によって発生する）中での加速によって与えられる。加速後、イオンは、フィールドフリー（ｆｉｅｌｄ−ｆｒｅｅ）領域または「ドリフト」領域に入り、ここである速度（そのｍ／ｚに反比例する）で移動する。従って低いｍ／ｚを有するイオンは、高いｍ／ｚを有するイオンよりも急速に移動する。フィールドフリー領域の長さをイオンが移動するのに必要な時間を測定して、イオンのｍ／ｚを算出するために用いる。
【０１１８】
このタイプの質量分析における考慮の１つは、研究されるイオンのセットが同時に分析器に導入されるということである。例えば、このタイプの質量分析は、イオンを短い明確なパルスで生じるＭＡＬＤＩのようなイオン化技術に十分適している。別の考慮は、運動エネルギーの量を変動する、イオンによって生成される速度の広がりを制御することである。より長い飛行チューブ、イオン反射体、またはより高い加速電圧の使用によって、速度の広がりの影響を最小限にすることが補助され得る。飛行時間質量分析器は、四重極またはイオントラップ型の質量分析器よりも高レベルの感度および広いｍ／ｚ範囲を有する。また、このタイプの質量分析器では、質量分析器のスキャンが必要でないので、データが迅速に獲得できる。
【０１１９】
ガスクロマトグラフィー質量分析法ではしばしば、標的をリアルタイムで検出するための素晴らしいソリューリョンが得られる。このシステムのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）部分は、化学的混合物を分析物（例えば、ＭＤＰ）のパルスに分離し、質量分析法（ＭＳ）は、この分析物を特定しかつ定量する。
【０１２０】
タンデム質量分析法は、上記のような質量分析器の組み合わせを利用し得る。タンデム質量分析計は、イオンのｍ／ｚに従ってそのイオンを分離するための第一の質量分析器を用いて、さらなる解析のために本発明のイオンを単離し得る。次いで、目的の単離されたイオンをフラグメントイオンに壊して（衝突活性化解離または衝突誘発性解離と呼ばれる）、そのフラグメントイオンを第二の質量分析器によって分析する。これらのタイプのタンデム質量分析計システムは、タンデム・イン・スペース・システム（ｔａｎｄｅｍ  ｉｎ  ｓｐａｃｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と呼ばれる。なぜなら、２つの質量分析器が、通常は衝突セルによって空間中で分けられているからである。タンデム質量分析器システムはまた、タンデム・イン・タイム（ｔａｎｄｅｍ  ｉｎ  ｔｉｍｅ）システムを含み、ここでは、１つの質量分析器を用いるが、この質量分析器は、イオンを単離し、断片化を誘発し、次いで質量分析を行うために連続して用いられる。
【０１２１】
タンデム・イン・スペース（ｔａｎｄｅｍ  ｉｎ  ｓｐａｃｅ）のカテゴリーの質量分析計は、２つ以上の質量分析器を有する。例えば、タンデム四重極質量分析計システムは、第一の四重極質量フィルター、続いて、衝突セル、続いて、第二の四重極質量フィルター、次いで検出器を有してもよい。別の配置は、第一の質量分析器のために四重極質量フィルターを、および第二の質量分析器のために飛行時間質量分析器を、２つの質量分析器を隔てる衝突セルとともに用いることである。他のタンデム・システムは当該分野で公知であり、これにはリフレクトロン飛行時間質量分析法、タンデムセクター質量分析法、およびセクター−四重極質量分析法が挙げられる。
【０１２２】
タンデム・イン・タイム（ｔａｎｄｅｍ  ｉｎ  ｔｉｍｅ）のカテゴリーの質量分析計は、種々の時点で種々の機能を果たす１つの質量分析器を有する。例えば、イオントラップ質量分析計を用いて、全てのｍ／ｚのイオンをトラップしてもよい。トラップから目的のイオンのｍ／ｚを除く全てのｍ／ｚのイオンをエジェクトする一連のｒｆスキャン機能を適用する。目的のｍ／ｚが単離された後、ｒｆパルスを加えて、イオントラップ中のガス分子との衝突を生じて、イオンの断片化を誘導する。次いで、断片化されたイオンのｍ／ｚ値を質量分析器によって測定する。イオンサイクロトロン共鳴装置（フーリエ変換質量分析器としても公知）は、タンデム・イン・タイム（ｔａｎｄｅｍ−ｉｎ−ｔｉｍｅ）のシステムの例である。
【０１２３】
いくつかのタイプのタンデム型質量分析実験を、その実験の各々の段階で選択されるイオンを制御することによって行ってもよい。異なるタイプの実験は、質量分析器の異なるモードの操作（時に「スキャン、走査」と呼ばれる）を利用する。最初の例では、質量スペクトルスキャンと呼ばれ、第一の質量分析器および衝突セルが全てのイオンを質量分析のために第二の質量分析器に伝える。第二の実施例では、プロダクトイオンスキャン（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｏｎ  ｓｃａｎ）と呼ばれ、目的のイオンを第一の質量分析器中で質量選択し、次いで衝突セル中に断片化する。次いで、形成されたイオンを、第二の質量分析器をスキャンすることによって質量分析する。第三の実施例では、前駆体イオンスキャンと呼ばれ、第一の質量分析器をスキャンして、質量分析されるイオンを断片化のために衝突セルに連続的に伝える。第二の質量分析器は、検出器への伝達のために目的のプロダクトイオンを質量選択する。従って、この検出器シグナルは、共通のプロダクトイオンへ断片化され得る全ての前駆体イオンの結果である。他の実験フォーマットは、ニュートラル・ロス・スキャンを包含し、ここでは一定量の相違が質量スキャンについて説明される。これらの種々のタンデム質量分析計のスキャン手順の使用は、多重化実験のように単独の実験で多数のセットのレポータータグを測定する時に有利であり得る。
【０１２４】
代表的な適用では、反応の間に生成される質量識別可能な生成物の量を、サイクル閾値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｃｔ）の値（核酸の検出可能な量を生成するのに必要なサイクルの数に相当する）に基づいて決定する。Ｃｔ値の決定は、当該分野で周知である。要するに、ＰＣＲの間、形成されたアンプリコンの量が増大するにつれて、シグナル強度は測定可能なレベルまで増大して、反応が非対数期に入る後期のサイクルではプラトーに達する。反応の対数期の間のサイクル数に対してシグナル強度をプロットすることによって、測定可能なシグナルが得られる特定のサイクルを推論して、これを用いて、ＰＣＲの開始の前に標的の量を算出する。Ｃｔを決定する例示的な方法は、加水分解プローブに関して、Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：９８６〜９４，１９９６に記載される。
【０１２５】
定量化のために、当業者は、コントロールを使用することを選択してもよく、コントロールによって、存在するかまたは導入される標的の量に関してシグナルが得られる。相対的な量のシグナルを絶対量へ変換することを可能にするコントロールは、質量識別可能な生成物の検出の前に各々のサンプルに、既知量の質量タグまたは質量標識を添加することによって達成される。例えば、ＤｉｎｇおよびＣａｎｔｏｒ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ｍａｒ  １８；１００（６）：３０５９〜６４（定量的な遺伝子発現分析の方法を記載しており、ここでコントロールのヌクレオチドは、それを目的の遺伝子から識別するために人工的な一塩基変異多型（一塩基遺伝子多型）を含む）を参照のこと。ＭＤＰの検出を妨害しない任意の質量タグを、質量シグナルを正規化するために用いてもよい。このような標準は好ましくは、サンプル中の任意の分子タグの特性とは異なる分離特性を有し、同じまたは異なる質量サインを有し得る。
【０１２６】
（Ｉ．組成物およびキット）
別の局面では、本発明は、本発明の方法を行うためのキットを包含し、このようなキットは、１つ以上の標的核酸を検出または測定するための、プライマー（例えば、ユニバーサルプライマー）、およびデテクター・オリゴヌクレオチドを備える。このようなキットはさらに、検出のためにデテクター・オリゴヌクレオチドまたはそのフラグメントを切断して遊離する増幅反応を行うための酵素および適切な緩衝液を備える。特定の実施形態では、キットは、１つ以上の質量識別可能な生成物を生じ得る１つ以上のデテクター・オリゴヌクレオチド、および質量分析法と関連する１つ以上の試薬を備えてもよく、この後者は、例えば、１つ以上の質量標準（例えば、内部標準としての使用のため）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法のためのマトリックス（例えば、３−ヒドロキシピコリン酸）、核酸結合樹脂（例えば、Ｃ１８樹脂）、および／または核酸を調節するための溶液（例えば、塩溶液）であってもよい。
【実施例】
【０１２７】
本明細書において以降に提供される例は、本発明を例示するものであり、限定はしない。
【０１２８】
（実施例１）
ＲｈＤ遺伝子のエキソン１０の検出  
検出アッセイを行って、Ｒｈｅｓｕｓ  Ｄ遺伝子のエキソン１０領域を検出した。ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドの設計は、詳細な説明の節に従って行った。この特定のアッセイでは、デテクター・オリゴヌクレオチドは、６つのアデニンからなる非相補的な５’オーバーハングを担持する。標的配列（ＲｈＤのエキソン１０）がサンプル中に存在するので、ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズした。増幅の間、デテクター・オリゴヌクレオチドは、上流ＰＣＲプライマーから伸長するＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって分解された。分解の間、５’ポリＡタグを含んでいる質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）を遊離して、質量分光分析によって明瞭に特定した（図８を参照のこと）。これらの質量シグナルの検出によって、標的核酸の存在を確認した。
【０１２９】
プライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドの配列：
以下のプライマーを、ＲｈｅｓｕｓＤ（ＲｈＤ）遺伝子のエキソン１０内の部分的な配列の増幅のために用いた：
フォワードＰＣＲプライマー：５’ＣＣＴＣＴＣＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＧＣＡＴＴ３’
リバースＰＣＲプライマー：５’ＡＧＴＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＡＣＡＴＴ３’
以下のデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズして、分解され、ＭＤＰ’ｓを生じ、これが質量分析法によって検出された：
デテクター・オリゴヌクレオチド：５’ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＣＣＧＴＴＣＣＣＴ３’
ＰＣＲミックス：
ＰＣＲプライマーをＰＣＲプライマーについては９００ｎＭという、デテクター・オリゴヌクレオチドについては２００ｎＭという最終濃度で用いた。
【０１３０】
このＰＣＲミックスはまた、２０ｎｇというゲノムＤＮＡ（ＲｈＤ＋個体の）、２５μｌの２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（緩衝液およびＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ酵素を含む））、および水を最終容積５０μｌまで含んだ。
【０１３１】
反応は、９６−ウェルのＡＢＧｅｎｅマイクロタイタープレートで行った。
【０１３２】
（サイクリング条件：）
このＰＣＲミックスを１０分間、９５℃で活性化し、次いで、９５℃１５秒間、および６０℃１分間の４０サイクルに供した。
【０１３３】
質量スペクトル分析のためのサンプル調製：
１０μｌのＰＣＲ生成物を新規な９６−ウェルマイクロタイタープレートに移し、１５ｍｇのアンモニウムをロードしたイオン交換樹脂（Ｃｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ（登録商標））を含む２０μｌの水をこのＰＣＲ産物に加えた。この反応混合物を１５分間インキュベートして、穏やかに回転させた。
【０１３４】
ピンツール（ｐｉｎｔｏｏｌ）デバイス（Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ（登録商標））を用いて、１５ｎｌの分析物を小型化チップアレイ（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（登録商標）、ＳＥＱＵＥＮＯＭ（登録商標））に移した。
【０１３５】
質量スペクトル解析：
データの獲得および分析は、卓上型、リニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，  ＳＥＱＵＥＮＯＭ（登録商標））を用いて行った。各々のスペクトルについて、少なくとも２０のレーザーショットが蓄積された。標的核酸の存在（ここではＲｈＤ遺伝子のエキソン１０）を、エキソン１０特異的なデテクター・オリゴヌクレオチドの質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）によって特定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルは、ＲｈＤ遺伝子のエキソン１０の検出を例示する（図８を参照のこと）。３つのＭＤＰは、標的配列（ＲｈＤ遺伝子のエキソン１０）が、増幅の間に存在するとき、およびこのデテクター・オリゴヌクレオチドが増幅の間に標的核酸にハイブリダイズし得るときのみ生成され得る。
【０１３６】
（実施例２）
ＲｈＤ遺伝子のエキソン５の検出
検出アッセイを行って、ＲｈｅｓｕｓＤ遺伝子のエキソン５領域を検出した。ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドの設計は詳細な説明の節に従って行った。この特定のアッセイでは、このデテクター・オリゴヌクレオチドは、８つのアデニンからなる非相補的な５’オーバーハングを担持する。標的配列（ＲｈＤのエキソン５）がサンプルに存在したので、ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズした。増幅の間、デテクター・オリゴヌクレオチドは、上流ＰＣＲプライマーから伸長するＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって分解された。分解の間、５’ポリＡタグを含んでいる質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）を遊離して、質量分光分析によって明瞭に特定した（図９を参照のこと）。これらの質量シグナルの検出によって、標的核酸の存在を確認した。
【０１３７】
プライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドの配列：
以下のプライマーを、ＲｈｅｓｕｓＤ（ＲｈＤ）遺伝子のエキソン５内の部分的な配列の増幅のために用いた：
フォワードＰＣＲプライマー：５’ＣＧＣＣＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＧ３’
リバースＰＣＲプライマー：５’ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＴＴＣ３’
以下のデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズして、分解され、ＭＤＰ’ｓを生じ、これが質量分析法によって検出された：
デテクター・オリゴヌクレオチド：５’ＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＧＣＴ３’
ＰＣＲミックス：
ＰＣＲプライマーをＰＣＲプライマーについては９００ｎＭという、デテクター・オリゴヌクレオチドについては２００ｎＭという最終濃度で用いた。
【０１３８】
このＰＣＲミックスはまた、２０ｎｇというゲノムＤＮＡ（ＲｈＤ＋個体の）、２５μｌの２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（緩衝液およびＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ酵素を含む））、および水を最終容積５０μｌまで含んだ。
【０１３９】
反応は、９６−ウェルのＡＢＧｅｎｅマイクロタイタープレートで行った。
【０１４０】
（サイクリング条件：）
このＰＣＲミックスを１０分間、９５℃で活性化し、次いで、９５℃で１５秒間、および６０℃で１分間の４０サイクルに供した。
【０１４１】
質量スペクトル分析のためのサンプル調製：
１０μｌのＰＣＲ生成物を新規な９６−ウェルマイクロタイタープレートに移し、１５ｍｇのアンモニウムをロードしたイオン交換樹脂（Ｃｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を含む２０μｌの水をこのＰＣＲ産物に加えた。この反応混合物を１５分間インキュベートして、穏やかに回転させた。
【０１４２】
ピンツール（ｐｉｎｔｏｏｌ）デバイス（Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を用いて、１５ｎｌの分析物を小型化チップアレイ（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（商標）、ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））に移した。
【０１４３】
質量スペクトル解析：
データの獲得および分析は、卓上型、リニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を用いて行った。各々のスペクトルについて、少なくとも２０のレーザーショットが蓄積された。標的核酸の存在（ここではＲｈＤ遺伝子のエキソン５）を、エキソン５特異的なデテクター・オリゴヌクレオチドの質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）によって特定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルは、ＲｈＤ遺伝子のエキソン５の検出を例示する（図９を参照のこと）。３つのＭＤＰは、標的核酸配列（ＲｈＤ遺伝子のエキソン５）が、増幅の間に存在するとき、およびこのデテクター・オリゴヌクレオチドが増幅の間に標的核酸にハイブリダイズし得るときのみ生成され得る。
【０１４４】
（実施例３）
ＬＮＡおよび３’伸長ブロッカーを含む修飾されたデテクター・オリゴヌクレオチドを用いる性の決定のためのＹ染色体マーカーの１０−ｐｌｅｘセット
検出アッセイを行って、Ｙ染色体に特異的な１０の領域を検出した。ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いて本発明で記載される基準に合致するように設計した。例えば、デテクター・オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーよりも約１０℃高い融点を有するように設計した。さらにポリＡ／Ｇテールをこのデテクター・オリゴヌクレオチドの５’末端に付加して、ここで長さおよび配列は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで２０００〜６０００Ｄａ内の切断産物を、間隔を空けてかつ分離するために可変であった。
【０１４５】
この特定の多重化アッセイでは、デテクター・オリゴヌクレオチドは、複数のアデニンおよび／またはグアニンからなる非相補的な５’−オーバーハングを担持する。Ｙ染色体が存在するサンプル（例えば雄性のサンプル）では、ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズする。増幅の間、デテクター・オリゴヌクレオチドは、上流ＰＣＲプライマーから伸長するＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって分解された。分解の間、１０のアッセイのうち９が首尾よく、質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）（５’ポリＡまたはポリＡ／Ｇタグを含んでいる）が遊離されて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量測定分析によって明瞭に特定された。これらの質量シグナルの検出によって、標的核酸の存在を確認した。
【０１４６】
Ｙ染色体テンプレートが存在しないサンプル（例えば、雌性サンプルまたは陰性コントロール（ＮＴＣ）サンプル）では、ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズせず、５’−ポリＡまたはポリＡ／Ｇタグは検出されなかった。
【０１４７】
プライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチド配列：
下に示されるデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズして、分解され、質量分析法によって検出されるＭＤＰを生じる。この配列は、「＋」を含んでもよく、これは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または「／３Ｐｈｏｓ／」および「／ＩｎｖｄＴ／」（これはそれぞれ、リン酸基および逆位デオキシチミンの導入を示す）を示している。
【０１４８】
ロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡｓ）は、その補体を極めて安定に結合し、新生のデオキシヌクレオチドに対して切断の速度が極めて低下している。これは、切断のポイントを制御するように機能し、それによって、均一な切断生成物が生じる。この効果は、お互いに対して隣接する２つのＬＮＡｓを配置することによってさらに増強され得る。
【０１４９】
１つ以上のリン酸基または逆位のデオキシチミンの導入は、デテクター・オリゴヌクレオチドの相補的な部分の３’末端（これは、サイクリングの間ＤＮＡポリメラーゼによるデテクター・オリゴヌクレオチドの伸長を妨げる）をブロックするように機能する。このような望まれない伸長は、５’テールの切断が生じた後の標的への競合的結合、およびｄＮＴＰｓのようなＰＣＲ反応成分の枯渇を含むいくつかの可能性のあるネガティブな効果を有し得る。
【０１５０】
以下のプライマーを、ＢＰＹ２遺伝子内の部分的配列の増幅のために用いた（ＢＰＹ２−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＡＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド（複数のデテクター・オリゴヌクレオチドを異なるアッセイで個々に試験した）：  
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｔ＋ＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡ−３’
（ここで＋はロックド核酸（ＬＮＡ）である）
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｔ＋ＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｔ＋ＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’。
【０１５１】
以下のプライマーを、ＣＤＹ１遺伝子内の二次的な部分的配列の増幅のために用いた（ＣＤＹ１−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＧ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ＋Ｃ＋ＴＧＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＧＡ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ＋Ｃ＋ＴＧＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ＋Ｃ＋ＴＧＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
以下のプライマーを、ＣＤＹ１遺伝子内の部分的配列の増幅のために用いた（ＣＤＹ１−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＣＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
以下のプライマーを、Ｙ染色体のＣＹＯＲＦ１４領域内の部分的配列の増幅のために用いた（ＣＹＯＲＦ１４−３アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＡＡＴ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｇ＋ＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＣＴ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｇ＋ＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＣＴ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｇ＋ＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／／−３’
ＰＲＹ遺伝子内の部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＰＲＹ−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ａ＋ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ａ＋ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ａ＋ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
ＲＢＭＹ１Ａ１遺伝子内の部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＲＢＭＹ１Ａ１−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＣＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
ＲＢＭＹ１Ａ１遺伝子内の二次的な部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＲＢＭＹ１Ａ１−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＡＴＴＡＣＴＣＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
ＲＢＭＹ２遺伝子内の部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＲＢＭＹ２−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＧＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＡＧＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
ＸＫＲＹ遺伝子内の部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＸＫＲＹ−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＴＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＴＧＴＴＧＴ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＴＡＡＴＡＴＧＴＡＧＧ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡ−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
ＸＫＲＹ遺伝子内の二次的な部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＸＫＲＹ−３アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＴＡＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧ−３’
または
５’−ＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−ＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧ／３ＩｎｖｄＴ／−３’。
【０１５２】
ＰＣＲミックス：
ＰＣＲプライマーをＰＣＲプライマーについては９００ｎＭという、デテクター・オリゴヌクレオチドについては２５０ｎＭという最終濃度で用いた。
【０１５３】
このＰＣＲミックスはまた、２５ｎｇというゲノムＤＮＡ（雄性または雌性）、２５μｌの２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（緩衝液およびＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ酵素を含む））、および水を最終容積５０μｌまで含んだ。
【０１５４】
反応は、９６−ウェルのＡＢＧｅｎｅマイクロタイタープレートで行った。
【０１５５】
（サイクリング条件：）
このＰＣＲミックスを１０分間、９５℃で活性化し、次いで、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間の５５サイクルに供した。
【０１５６】
質量スペクトル分析のためのサンプル調製：
１０μｌのＰＣＲ生成物を新規な９６−ウェルマイクロタイタープレートに移し、１５ｍｇのアンモニウムをロードしたイオン交換樹脂（Ｃｌｅａｎ  Ｒｅｓｉｎ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を含む２０μｌの水をこのＰＣＲ産物に加えた。この反応混合物を１５分間インキュベートして、穏やかに回転させた。
【０１５７】
ピンツール（ｐｉｎｔｏｏｌ）デバイス（Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を用いて、１５ｎｌの分析物を小型化チップアレイ（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（商標）、ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））に移した。
【０１５８】
質量スペクトル解析：
データの獲得および分析は、卓上型、リニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を用いて行った。各々のスペクトルについて、少なくとも２０のレーザーショットが蓄積された。標的核酸の存在（ここではＹ染色体上に見出される１０個の特定の領域のうち９つ）を、プライマーセットについて特異的なデテクター・オリゴヌクレオチドの質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）によって首尾よく特定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルは、１０−ｐｌｅｘ反応の９０％検出速度を例示する。１０個のＭＤＰは、標的配列（Ｙ染色体特異的領域）が、増幅の間に存在するとき、およびこのデテクター・オリゴヌクレオチドが増幅の間に標的核酸にハイブリダイズし得るとき、首尾よく生成される。
【０１５９】
（実施例４）
５’ビオチン化デテクター・オリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを精製のために用いる、性の決定のためのＹ染色体マーカーの１０−ｐｌｅｘセット
検出アッセイを行って、Ｙ染色体に特異的な１０の領域を検出した。このアッセイは、ビオチン化デテクター・オリゴヌクレオチドおよびストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズをＭＤＰ’ｓの捕捉のために用いた追加の浄化工程を包含した。ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いて本発明で記載される基準に合致するように設計した。例えば、デテクター・オリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーよりも約１０℃高い融点を有するように設計した。
【０１６０】
特定の多重化アッセイでは、デテクター・オリゴヌクレオチドは、複数のアデニンおよび／またはグアニンからなる非相補的な５’−オーバーハングを担持する。Ｙ染色体が存在するサンプル（例えば雄性のサンプル）では、ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズした。増幅の間、デテクター・オリゴヌクレオチドは、上流ＰＣＲプライマーから伸長するＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって分解された。分解の間、１０個の質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）（５’ポリＡまたはポリＡ／Ｇタグを含んでいる）のうち９つが遊離されて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量測定分析によって明瞭に特定された。これらの質量シグナルの検出によって、１０個のアッセイのうち９つで標的核酸の存在が確認された。
【０１６１】
Ｙ染色体テンプレートが存在しないサンプル（例えば、雌性サンプルまたは陰性コントロール（ＮＴＣ）サンプル）では、ＰＣＲプライマーおよびデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズせず、５’−ポリＡまたはポリＡ／Ｇタグが検出されなかった。ユニプレックス（ｕｎｉｐｌｅｘ）反応を、全体的プロセスを通じて行い、次いでプールして単一のチップエレメント（これも成功することが証明された）で全てのアッセイを検出した。
【０１６２】
下に示されるデテクター・オリゴヌクレオチドは、標的にハイブリダイズして、分解され、質量分析法によって検出されるＭＤＰを生じる。この配列は、「＋」を含んでもよく、これは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または「／３Ｐｈｏｓ／」および「／ＩｎｖｄＴ／」（これはそれぞれ、リン酸基および逆位デオキシチミンの導入を示す）を示している。またデテクター・オリゴヌクレオチドは、ビオチンに相当する「Ｂｉｏｓｇ／」も含んでもよい。
【０１６３】
以下のプライマーをＢＰＹ２遺伝子内の部分的配列の増幅のために用いた（ＢＰＹ２−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＡＣＴＣＴＡＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド（複数のデテクター・オリゴヌクレオチドを種々のアッセイで個々に試験した）：
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｔ＋ＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡ−３’  
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｔ＋ＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｔ＋ＴＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＡ／３ＩｎｖｄＴ−３’。
【０１６４】
以下のプライマーをＣＤＹ１遺伝子内の二次的な部分的配列の増幅のために用いた（ＣＤＹ１−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＴＧＴＣＴＣＧ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ＋Ｃ＋ＴＧＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＧＡ−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ＋Ｃ＋ＴＧＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧ＋Ｃ＋ＴＧＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＡＴＣＡＣＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
以下のプライマーを、ＣＤＹ１遺伝子内の部分的配列の増幅のために用いた（ＣＤＹ１−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＴ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＧＴＡＴＴＣＣＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ−３’  
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
Ｙ染色体のＣＹＯＲＦ１４領域内の部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＣＹＯＲＦ１４−３アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＴＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧ  −３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＧＴＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＡＡＴ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｇ＋ＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＣＴ−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｇ＋ＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＣＴ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｇ＋ＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＴＧＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／−３’。
【０１６５】
以下のプライマーをＰＲＹ遺伝子内の部分的配列の増幅のために用いた（ＰＲＹ−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＧＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＡＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＣＴＴＣＣＣＡＡＡＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ａ＋ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴ−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ａ＋ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ａ＋ＧＣＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＡＧＣＣＴ／３ＩｎｖｄＴ／−３’。
【０１６６】
ＲＢＭＹ１Ａ１遺伝子内の部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＲＢＭＹ１Ａ１−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＣＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＡＧＴＣＴＣＴＴＡＡＴＡＧＣＡＣＴＧＡＧ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡ−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’。
【０１６７】
ＲＢＭＹ１Ａ１遺伝子内の二次的な部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＲＢＭＹ１Ａ１−２アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＣＴＡＡＴＴＡＣＴＣＡＴＴＴＣＣＣＣＡＧ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＡＣＴＣＡＡＣＡＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡ−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＧＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＣＡＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’。
【０１６８】
ＲＢＭＹ２遺伝子内の部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＲＢＭＹ２−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＴＡＧＡＴＧＣＣＡＣＡＴＡＡＣＴＴＧＡＧＣ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣ−３’
または
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ＋Ｃ＋ＧＡＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
以下のプライマーをＸＫＲＹ遺伝子内の部分的配列の増幅のために用いた（ＸＫＲＹ−１アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＡＣＧＴＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＴＧＴＴＧＴ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＣＴＡＡＴＡＴＧＴＡＧＧ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡ−３’
または
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴ＋Ｇ＋ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＡＣＧＧＣＡＡＴＴＡＴＴＧＡ／３ＩｎｖｄＴ／−３’
ＸＫＲＹ遺伝子内の二次的な部分的配列の増幅のために以下のプライマーを用いた（ＸＫＲＹ−３アッセイ）：
フォワードＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＴＡＣＴＡＴＧＣＣＴＡＣ−３’
リバースＰＣＲプライマー：５’−ＡＣＧＴＴＧＧＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＧＴＣＴＣＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧ−３’
デテクター・オリゴヌクレオチド：
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧ−３’
または
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧ／３Ｐｈｏｓ／−３’
または
５’−／５Ｂｉｏｓｇ／ＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡ＋Ｔ＋ＧＣＴＣＡＣＴＴＧＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧ／３ＩｎｖｄＴ／−３’。
【０１６９】
ＰＣＲミックス：
ＰＣＲプライマーをＰＣＲプライマーについては９００ｎＭという、デテクター・オリゴヌクレオチドについては２５０ｎＭという最終濃度で用いた。
【０１７０】
このＰＣＲミックスはまた、２５ｎｇというゲノムＤＮＡ（雄性または雌性）、２５μｌの２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（緩衝液およびＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）Ｇｏｌｄ酵素を含む））、および水を最終容積５０μｌまで含んだ。
【０１７１】
反応は、９６−ウェルのＡＢＧｅｎｅマイクロタイタープレートで行った。
【０１７２】
（サイクリング条件：）
このＰＣＲミックスを１０分間、９５℃で活性化し、次いで、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で１分間の５５サイクルに供した。
【０１７３】
ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを用いる質量スペクトル分析のためのサンプル調製（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ（登録商標））：
ビーズ調製：
１．ミックスして５０μｌのビーズ−スピンをアリコートして、スピンして上清を除く  
２．７５μｌの洗浄緩衝液（提供される）−スピンを添加して上清を除く
ビーズ結合：
３．ビーズに２５μｌの結合緩衝液（提供される）を添加する。
【０１７４】
４．３５μｌのナノピュア水をビーズを含む試験管に添加する。
【０１７５】
５．１５μｌのＰＣＲ／ヌクレアーゼ反応物をビーズを含む試験管に添加する。
【０１７６】
６．外界温度で１５分間回転させる。
ビーズ洗浄：
７．乾燥するまでスピンして上清を除去する
８．１×洗浄緩衝液（提供される）を用いて洗浄する
９．スピンして上清を除去する
ビーズからの生成物溶出
１０．２５μｌの２５％ＮＨ４ＯＨ（新鮮に調製）をビーズに添加する
１１．６０℃で１０分間インキュベートする
１２．スピンして上清を新しい試験管に取り出す（生成物を含む）
１３．フタを空けて外界温度で６０分間振盪する。
【０１７７】
ピンツール（ｐｉｎｔｏｏｌ）デバイス（Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を用いて、１５ｎｌの分析物を小型化チップアレイ（ＳｐｅｃｔｒｏＣＨＩＰ（商標）、ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））に移した。
【０１７８】
質量スペクトル解析：
データの獲得および分析は、卓上型、リニアＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＳＥＱＵＥＮＯＭ，Ｉｎｃ（登録商標））を用いて行った。各々のスペクトルについて、少なくとも２０のレーザーショットが蓄積された。標的核酸の存在（ここではＹ染色体上に見出される１０個の特定の領域のうち９つ）を、プライマーセットについて特異的なデテクター・オリゴヌクレオチドの質量識別可能な生成物（ＭＤＰ’ｓ）によって特定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルは、１０−ｐｌｅｘ反応の９０％検出速度を例示する。標的配列（Ｙ染色体特異的領域）が、増幅の間に存在するとき、およびこのデテクター・オリゴヌクレオチドが増幅の間に標的核酸にハイブリダイズし得るときのみ、９個のＭＤＰが生成された。ユニプレックス増幅、その後の各々の反応物の５μｌをプールすることによって、同様の結果が生じた。
【０１７９】
＊＊＊
本明細書に援用される各々の特許、特許出願、刊行物および書類の全体が参照によって援用される。上記の特許、特許出願、刊行物および書類の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であるという承認ではなく、これらの刊行物または書類の内容または日付に関して、いかなる承認を構成することもない。
【０１８０】
本発明の基本的な局面から逸脱することなく前述のものに対して改変を行い得る。本発明は、１つ以上の特異的な実施形態に関してかなり詳細に記載されてきたが、当業者は、本出願で詳細に開示される実施形態に対して変化がなされ得、さらにこれらの改変および改良は本発明の範囲および趣旨の範囲内であるということを認識する。
【０１８１】
本明細書に例示的に記載される本発明は適切には、本明細書に詳細に開示されない任意の要素の非存在下で行われてもよい。従って、例えば、本明細書において各々の場合には、「〜を含む」、「本質的に〜からなる」、および「〜からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかで置換されてもよい。使用されている用語および表現は、説明の用語として用いられ、限定ではなく、このような用語および表現の使用は、示されかつ記載される特徴の任意の等価物またはその一部を排除せず、種々の改変が、特許請求される本発明の範囲内で可能である。「１つの、ある（ａ）（不定冠詞）」、または「１つの、ある（ａｎ）（不定冠詞）」、という用語は、それが要素のうちの１つ、または要素のうちの２つ以上のいずれが記載されるかを文脈上明らかにするのでない限り、それが修飾する要素のうちの１つを指しても、または複数を指してもよい（例えば、「１つの（不定冠詞、ａ）プライマー」とは、１つ以上のプライマーを意味し得る）。本明細書において用いる場合、「約」という用語は、ときには背景にあるパラメーターの１０％内の値（すなわち、プラスマイナス１０％）、ときには背景にあるパラメーターの５％内の値（すなわち、プラスマイナス５％）、ときには背景にあるパラメーターの２．５％内の値（すなわち、プラスマイナス２．５％）、またはときには背景にあるパラメーターの１％内の値（すなわち、プラスマイナス１％）、および時には、バリエーションなしのパラメーターをいう。例えば、「約１００ヌクレオチド」の長さとは、９０ヌクレオチド〜１１０ヌクレオチドの長さを含んでもよい。従って、本発明は、代表的な実施形態および任意の特徴によって詳細に開示されてきたが、本明細書に開示される概念の改変およびバリエーションが、当業者によって用いられ得、このような改変およびバリエーションが本発明の範囲内とみなされるということが理解されるべきである。
【０１８２】
本発明の実施形態は、添付の特許請求の範囲に示される。
【図１−１】
0005382802.tif 000002
【図１−２】
0005382802.tif 000003
【図２】
0005382802.tif 000004
【図３】
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【図４−１】
0005382802.tif 000006
【図４−２】
0005382802.tif 000007
【図５】
0005382802.tif 000008
【図６−１】
0005382802.tif 000009
【図６−２】
0005382802.tif 000010
【図７−１】
0005382802.tif 000011
【図７−２】
0005382802.tif 000012
【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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