(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］で示される化合物又はその塩。
0005598468.tif 000031
〔式中、Ｒ１〜Ｒ６は夫々独立して、一般式［１０１］
0005598468.tif 000032
（式中、Ｒ１０１〜Ｒ１０４は夫々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍは２〜６の整数を表す。また、Ｒ１０２〜Ｒ１０４のうちの２つ又は３つとそれらが結合する窒素原子とでヘテロ環状アンモニウムカチオンを形成していてもよい。）で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基；
アミド結合を１〜１０個有していてもよく、且つ
一般式［２］
0005598468.tif 000033
（式中、Ｒ１２は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオン、アンモニウムイオン又はアニオンを表す。）で示される基
を置換基として有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基；
或いはアミド結合を１〜１０個有していてもよく、且つ
一般式［３］
0005598468.tif 000034
（式中、Ｒ１３は水素原子、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオン、アンモニウムイオン又はアニオンを表す。）で示される基を置換基として有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基を表す。
Ｒ７〜Ｒ１０は夫々独立して炭素数１〜６のアルキル基；炭素数２〜６のアルキニル基；炭素数６〜１０のアリール基；炭素数１〜６のアルコキシ基；炭素数６〜１０のアリールオキシ基；炭素数１〜６のアルキルスルホニル基；炭素数６〜１０のアリールスルホニル基；一般式［２］で示される基；一般式［３］で示される基；ハロゲン原子；水素原子；水酸基；シアノ基；ニトロ基；又は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数１〜１０のアルコキシカルボニル基、炭素数２〜２０のアシル基及びスルホ基から選ばれる置換基によりアミノ基の水素原子１〜２個が置換された置換アミノ基を表し、
Ｒ１１は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜６のアルキニル基又は炭素数６〜１０のアリール基を表し、ｎは０〜３の整数を表す。
但し、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも１つは一般式［１０１］で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基である。〕
【請求項２】
一般式［１］で示される化合物が、下記一般式［１’］で示されるものである、請求項１に記載の化合物。
0005598468.tif 000035
（式中、Ｒ１ａ〜Ｒ６ａは夫々独立して一般式［１０１］で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基、或いは一般式［２］で示される基又は一般式［３］で示される基を置換基として有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基を表し、Ｒ８ａは、一般式［３］で示される基を表し、Ｒ１１ａは炭素数１〜１０のアルキル基を表し、ｎは前記に同じ。
但し、Ｒ１ａ〜Ｒ６ａの少なくとも１つは一般式［１０１］で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基を表す。）
【請求項３】
Ｒ１又はＲ２が、一般式［１０１］で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
一般式［１］で示される化合物が、一般式［３］で示される基、又は一般式［３］で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基を、１〜４個含有するものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
一般式［１］で示される化合物が、一般式［３］で示される基、又は一般式［３］で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基を４個含有するものである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ８が一般式［３］で示される基であり、Ｒ１又はＲ２の何れか一方、Ｒ３又はＲ４の何れか一方、及びＲ５又はＲ６の何れか一方が、当該一般式［３］で示される基を置換基として有する炭素数１〜１０のアルキル基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１又はＲ２の何れか一方が、一般式［１０１］で示される基を置換基として有する炭素数１〜６のアルキル基であり、他方が一般式［３］で示される基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
一般式［１０１］に於けるＲ１０１が水素原子であり、Ｒ１０２〜Ｒ１０４の何れか一つが水素原子であり、他方二つが炭素数１〜３のアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
一般式［１０１］で示される基がN,N-ジメチルアンモニオエチルカルバモイル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３及びＲ４の何れか一方が一般式［３］で示される基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ５及びＲ６の何れか一方が一般式［３］で示される基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が炭素数１〜６のアルキル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
一般式［１］で示される化合物が、下記一般式［１−２］
0005598468.tif 000036
（式中、Ｒ１〜Ｒ１１及びその他の定義は前記に同じ。）で示される化合物である、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な第４級アンモニウムカチオン含有ピラゾール系シアニン色素に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生化学検査や遺伝子検査の分野では、測定対象物の検出に対して高い検出感度が求められており、標識剤（標識物質）である蛍光色素の位置づけが非常に重要なファクターとなってきている。【０００３】
蛍光色素のうち、500nm以上の近赤外領域に蛍光特性を有する色素として、シアニン色素誘導体が汎用されており、例えばＣｙ３、Ｃｙ５〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社（旧社名アマシャムバイオサイエンス社）製〕等が先導的な蛍光試薬として知られている。【０００４】
Ｃｙ３及びＣｙ５は、２つのインドレニン骨格をポリメチン鎖で結合した構造（インドレニン系シアニン色素）を有しており、この構造を基本骨格として、例えば水溶性の改善、会合状態の回避等による高感度化を目的とした各種シアニン色素誘導体が開発されている（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３等参照）。また、他のシアニン色素誘導体として、アザインドレニン骨格とピラゾール骨格がポリメチン鎖で結合された構造を有するものが開発されている（例えば特許文献４、特許文献５等参照）。更には、例えばポリメチン鎖等で結合された２つのインドレニン骨格が更にスペーサー等で架橋された構造を有するものが開発されている（例えば特許文献６、特許文献７、特許文献８等）。【０００５】
また、従来の光学系よりも短波長領域で、高感度且つ高い水溶性を示す蛍光色素として、ピラゾール骨格とインドール骨格を有するシアニン系色素誘導体が開発されている（特許文献９）。【０００６】
一方、蛍光色素は電気泳動に於ける内部標準物質としても用いることができる。しかし、高い蛍光強度を有するもので、且つ泳動速度をコントロールできる蛍光色素については未だ充分なものが得られておらず、更なる開発が望まれている。【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，２６８，４８６号公報
【特許文献２】米国特許第５，４８６，６１６号公報
【特許文献３】米国特許第５，５６９，７６６号公報
【特許文献４】特開２００３−０３４６９６号公報
【特許文献５】特開２００３−０３４６９７号公報
【特許文献６】米国特許第５，５７１，３８８号公報
【特許文献７】米国特許第５，８００，９９５号公報
【特許文献８】国際公開ＷＯ０１／０２３７４号公報
【特許文献９】国際公開ＷＯ２００７／１１４３９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、短波長領域で、高い蛍光強度を有する、ピラゾール骨格とインドール骨格がポリメチン鎖で結合された構造を有し、その構造を有する分子内に第４級アンモニウムカチオンを更に導入することで、泳動速度のコントロール可能な新規なシアニン色素誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、下記一般式［１］で示される化合物又はその塩。
0005598468.tif 000002
【００１０】
〔式中、Ｒ１〜Ｒ６は夫々独立して、一般式［１０１］
0005598468.tif 000003
【００１１】
（式中、Ｒ１０１〜Ｒ１０４は夫々独立して水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表し、ｍは２〜６の整数を表す。また、Ｒ１０２〜Ｒ１０４のうちの２つ又は３つとそれらが結合する窒素原子とでヘテロ環状アンモニウムカチオンを形成していてもよい。）で示される基を置換基として有するアルキル基；或いはアミド結合を有していてもよい、一般式［２］
0005598468.tif 000004
【００１２】
（式中、Ｒ１２は水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオン、アンモニウムイオン又はアニオンを表す。）で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］
0005598468.tif 000005
【００１３】
（式中、Ｒ１３は水素原子、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオン、アンモニウムイオン又はアニオンを表す。）で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ７〜Ｒ１０は夫々独立してアルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換アミノ基、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基、一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基、ハロゲン原子、水素原子、水酸基、シアノ基若しくはニトロ基を表し、Ｒ１１は水素原子、アルキル基、アルキニル基若しくはアリール基を表し、ｎは０〜３の整数を表す。但し、Ｒ１〜Ｒ６のうち少なくとも１つは一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基である。〕
【発明の効果】
【００１４】
本発明のピラゾール系シアニン色素は、ピラゾール骨格とインドール骨格がポリメチン鎖で結合された構造を有し、その構造を有する分子内に第４級アンモニウムカチオンが導入された新規なシアニン色素誘導体であるため、高い蛍光強度を有し、且つその分子内に含有されるカチオンとアニオンの数を変動させることにより、電気泳動させた場合の泳動時間をコントロールすることが可能となる。そのため、これを電気泳動に於ける内部標準物質として使用した場合、目的の位置に蛍光物質のピークを出現させることができ、測定対象物質のピークを明確に特定することができる。【００１５】
また、本発明のピラゾール系シアニン色素は、一般式［１０１］で示される第４級アンモニウムカチオン基を有する、即ち、当該カチオン基はローンペアを有する酸素原子及び窒素原子を有するため、これを蛍光色素に導入した場合はその蛍光特性が変動する可能性もあった。しかし、本発明の化合物は当該カチオン基を含有していながら、良好で安定な蛍光特性を示すことが見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１におけるDNA標識抗体の調製方法を示した図である。
【図２】実施例１におけるキャピラリーチップのレイアウトを示した図である。
【図３】実施例１におけるキャピラリーチップの泳動用試料と試液の配置関係を模式的に示した図である。
【図４】本発明の方法において、AFPを測定した時のエレクトロフェログラムである。
【図５】本発明の方法において、PIVKA IIを測定した時のエレクトロフェログラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．本発明の化合物［１］
一般式［１］に於いて、Ｒ１〜Ｒ６で示される、一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、好ましくは直鎖状のものであり、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜５のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられ、中でも、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ペンチル基等の直鎖状の炭素数１〜５のアルキル基が好ましい。
【００１８】
一般式［１０１］に於いて、Ｒ１０１〜Ｒ１０４で示される炭素数１〜３のアルキル基としては、直鎖状又は分枝状であり、好ましくは直鎖状であり、通常炭素数１〜３、好ましくは１〜２、より好ましくは１のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基等が挙げられ、中でもメチル基が好ましい。
【００１９】
一般式［１０１］に於けるＲ１０１の中でも水素原子が好ましい。
【００２０】
Ｒ１０１〜Ｒ１０３としては、中でも、一つが水素原子であり、他の二つがアルキル基（特にメチル基がより好ましい）である場合が好ましい。
【００２１】
ｍは、通常２〜６の整数、好ましくは２〜４、より好ましくは２である。
【００２２】
Ｒ１０２〜Ｒ１０４のうちの２つ又は３つとそれらが結合する窒素原子とで形成されるヘテロ環状アンモニウムカチオンとしては、例えばピリジニウム基、炭素数１〜３のN-アルキルピリジニウム基（例えばN-メチルピリジニウム基、N-エチルピリジニウム基、N-n-プロピルピリジニウム基、N-イソプロピルピリジニウム基等）が挙げられる。
【００２３】
一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基に於ける置換基は当該アルキル基の末端の炭素原子に置換されているのが好ましい。
【００２４】
一般式［１０１］で示される基の好ましい具体例としては、例えばジメチルアンモニオエチルカルバモイル基、トリメチルアンモニオエチルカルバモイル基、ジエチルアンモニオエチルカルバモイル基、トリエチルアンモニオエチルカルバモイル基、ジメチルアンモニオプロピルカルバモイル基、トリメチルアンモニオプロピルカルバモイル基、ジイソプロピルアンモニオプロピルカルバモイル基、トリイソプロピルアンモニオプロピルカルバモイル基、ピリジニオエチルカルバモイル基、ピリジニオプロピルカルバモイル基、メチルピペリジノエチルカルバモイル基、メチルピペリジノプロピルカルバモイル基、エチルピペリジノエチルカルバモイル基、エチルピペリジニオプロピルカルバモイル基等が挙げられ、中でもジメチルアンモニオエチルカルバモイル基、ジエチルアンモニオエチルカルバモイル基が好ましく、更にジメチルアンモニオエチルカルバモイル基がより好ましい。
【００２５】
一般式［１］に於けるＲ１〜Ｒ６のうち、通常１〜４、好ましくは１〜２、より好ましくは１つが一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基である。中でも、Ｒ１又はＲ２の何れか一方が、好ましくはＲ１が、一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基であるものが好ましい。
【００２６】
一般式［１］に於いて、Ｒ１〜Ｒ６で示される、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基のアミド結合を有するアルキル基としては、置換（即ち、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基で置換された）又は無置換アルキル基のアルキル鎖中にアミド結合を通常１〜１０個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個含有しているものが挙げられる。
【００２７】
Ｒ１〜Ｒ６で示される、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜５のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられ、中でも、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ペンチル基等の直鎖状の炭素数１〜５のアルキル基が好ましい。
【００２８】
Ｒ１〜Ｒ６で示される、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有するアルキル基としては、当該アミド結合を有していてもよいアルキル基中の水素原子の一部が当該置換基（一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基）で置換されているものが挙げられ、中でも、当該アルキル基の末端の炭素原子に該置換基が置換されているものが好ましい。
【００２９】
一般式［１］に於けるＲ１〜Ｒ６の中でも、Ｒ１とＲ２の何れか一方（好ましくはＲ２）、Ｒ３とＲ４の何れか一方、及びＲ５とＲ６の何れか一方が、一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であるものが好ましい。
【００３０】
一般式［２］及び［３］に於いて、Ｒ１２及びＲ１３で示されるアルカリ金属原子としては、例えばリチウム原子、ナトリウム原子、カリウム原子、ルビジウム原子等が挙げられ、中でもナトリウム原子又はカリウム原子が好ましく、特にナトリウム原子がより好ましい。
【００３１】
一般式［１］に於けるＲ１〜Ｒ６の中でも、少なくとも１つ（好ましくはＲ１）が一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基であるものが好ましい。本発明の一般式［１］で示される化合物中に含有される一般式［１０１］で示される基の数は、通常１〜６の整数、順に好ましくは１〜４、１〜２の整数、１である。
【００３２】
Ｒ１２及びＲ１３で示される有機アンモニウムイオンとしては、例えばトリアルキルアンモニウムイオン等が挙げられる。当該トリアルキルアンモニウムイオンとしては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０のもの、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばトリメチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、トリn-プロピルアンモニウムイオン、トリイソプロピルアンモニウムイオン、トリブチルアンモニウムイオン、トリペンチルアンモニウムイオン、トリヘキシルアンモニウムイオン、トリヘプチルアンモニウムイオン、トリオクチルアンモニウムイオン、トリノニルアンモニウムイオン、トリデシルアンモニウムイオン、トリシクロプロピルアンモニウムイオン、トリシクロブチルアンモニウムイオン、トリシクロペンチルアンモニウムイオン、トリシクロヘキシルアンモニウムイオン、トリシクロヘプチルアンモニウムイオン、トリシクロオクチルアンモニウムイオン、トリシクロノニルアンモニウムイオン、トリシクロデシルアンモニウムイオン等が挙げられ、中でもトリメチルアンモニウムイオン又はトリエチルアンモニウムイオンが好ましく、特に、トリエチルアンモニウムイオンがより好ましい。
【００３３】
一般式［２］に於いて、Ｒ１２で示される炭素数１〜１０のアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-へキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、イソノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。
【００３４】
一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基の好ましい具体例としては、例えばカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、そのアニオン〔カルボキシレート（−ＣＯＯ−）〕、そのアルカリ金属塩（例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩等）、そのアンモニウム塩、その有機アンモニウム塩（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、トリプロピルアンモニウム塩等）等が挙げられる。
【００３５】
一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基の好ましい具体例としては、例えばスルホ基（−ＳＯ３Ｈ）、そのアニオン〔スルホネート（−ＳＯ３−）〕、そのアルカリ金属塩（例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、ルビジウム塩等）、そのアンモニウム塩、その有機アンモニウム塩（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、トリプロピルアンモニウム塩等）等が挙げられる。
【００３６】
一般式［１］に於いて、Ｒ１及びＲ２の何れか一方が、例えばカルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシブチル基、カルボキシペンチル基、これらのアニオン（カルボキシレート）、これらのアルカリ金属塩の基（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、これらの有機アンモニウム塩の基（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、アンモニウム塩等）等の一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基、或いは例えばスルホエチル基、スルホプロピル基、スルホブチル基、スルホペンチル基、これらのアニオン（スルホネート）、これらのアルカリ金属塩の基（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、これらの有機アンモニウム塩の基（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、アンモニウム塩等）等の一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基であるものが好ましく、特にＲ１が一般式［１０１］で示される基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であり、Ｒ２が一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であるものがより好ましい。
【００３７】
また、一般式［１］に於いて、Ｒ３とＲ４の好ましい組み合わせ及びＲ５とＲ６の好ましい組み合わせとしては、何れか一方（即ち、Ｒ３とＲ４の何れか一方及びＲ５とＲ６の何れか一方）が炭素数１〜５のアルキル基（例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基等）であり、他方が、例えばカルボキシエチル基、カルボキシプロピル基、カルボキシブチル基、カルボキシペンチル基、これらのアニオン（カルボキシレート）、これらのアルカリ金属塩の基（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、これらのアンモニウム塩の基若しくは有機アンモニウム塩の基（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩等）等の一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基、例えばスルホエチル基、スルホプロピル基、スルホブチル基、スルホペンチル基、これらのアニオン（スルホネート）、これらのアルカリ金属塩の基（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）、有機アンモニウム塩の基（例えばトリメチルアンモニウム塩、トリエチルアンモニウム塩、アンモニウム塩等）等の一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であるものが好ましく、特に、何れか一方（即ち、Ｒ３とＲ４の何れか一方及びＲ５とＲ６の何れか一方）が炭素数１〜５のアルキル基であり、他方が一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基であるものがより好ましい。
【００３８】
一般式［１］に於いて、Ｒ７〜Ｒ１０で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。
【００３９】
Ｒ７〜Ｒ１０で示されるアルキニル基としては、通常炭素数２〜６、好ましくは２〜４のものが挙げられ、具体的には、例えばエチニル基、2-プロピニル基、3-ブチニル基、1-メチル-2-プロピニル基、4-ペンチニル基、2-メチル-4-ペンチニル基、5-ヘキシニル基等が挙げられる。
【００４０】
Ｒ７〜Ｒ１０で示されるアリール基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００４１】
Ｒ７〜Ｒ１０で示されるアルコキシ基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシ基、エトキシ基、n-プロポキシ基、イソプロポキシ基、n-ブトキシ基、イソブトキシ基、sec-ブトキシ基、tert-ブトキシ基、n-ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、sec-ペンチルオキシ基、tert-ペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、n-ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、sec-ヘキシルオキシ基、tert-ヘキシルオキシ基、ネオヘキシルオキシ基、シクロプロポキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基等が挙げられる。
【００４２】
Ｒ７〜Ｒ１０で示されるアリールオキシ基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニルオキシ基、ナフトキシ基等が挙げられる。
【００４３】
Ｒ７〜Ｒ１０で示されるアルキルスルホニル基としては、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）の−ＯＨ基がアルキル基で置換されたものが挙げられ、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、n-プロピルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基、n-ブチルスルホニル基、イソブチルスルホニル基、sec-ブチルスルホニル基、tert-ブチルスルホニル基、n-ペンチルスルホニル基、イソペンチルスルホニル基、sec-ペンチルスルホニル基、tert-ペンチルスルホニル基、ネオペンチルスルホニル基、n-ヘキシルスルホニル基、イソヘキシルスルホニル基、sec-ヘキシルスルホニル基、tert-ヘキシルスルホニル基、ネオヘキシルスルホニル基、シクロプロピルスルホニル基、シクロブチルスルホニル基、シクロペンチルスルホニル基、シクロヘキシルスルホニル基等が挙げられる。
【００４４】
Ｒ７〜Ｒ１０で示されるアリールスルホニル基としては、スルホ基（−ＳＯ３Ｈ）の−ＯＨ基がアリール基で置換されたものが挙げられ、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニルスルホニル基、ナフチルスルホニル基等が挙げられる。
【００４５】
Ｒ７〜Ｒ１０で示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００４６】
Ｒ７〜Ｒ１０で示される置換アミノ基としては、アミノ基の水素原子１〜２個が置換基で置換されたものが挙げられ、これら置換基としては、例えばアルキル基、アルコキシカルボニル基、アシル基、スルホ基等が挙げられる。
【００４７】
Ｒ７〜Ｒ１０で示される置換アミノ基の置換基として挙げられるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-へキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、イソノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。
【００４８】
Ｒ７〜Ｒ１０で示される置換アミノ基の置換基として挙げられるアルコキシカルボニル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、n-プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、n-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、sec-ブトキシカルボニル基、tert-ブトキシカルボニル基、n-ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、sec-ペンチルオキシカルボニル基、tert-ペンチルオキシカルボニル基、ネオペンチルオキシカルボニル基、n-ヘキシルオキシカルボニル基、イソヘキシルカルボニル基、sec-ヘキシルオキシカルボニル基、tert-ヘキシルオキシカルボニル基、ネオヘキシルオキシカルボニル基、n-ヘプチルオキシカルボニル基、イソヘプチルオキシカルボニル基、sec-ヘプチルオキシカルボニル基、tert-ヘプチルオキシカルボニル基、ネオヘプチルオキシカルボニル基、n-オクチルオキシカルボニル基、イソオクチルオキシカルボニル基、sec-オクチルオキシカルボニル基、tert-オクチルオキシカルボニル基、ネオオクチルオキシカルボニル基、n-ノニルオキシカルボニル基、イソノニルオキシカルボニル基、sec-ノニルオキシカルボニル基、tert-ノニルオキシカルボニル基、ネオノニルオキシカルボニル基、n-デシルオキシカルボニル基、イソデシルオキシカルボニル基、sec-デシルオキシカルボニル基、tert-デシルオキシカルボニル基、ネオデシルオキシカルボニル基、シクロプロポキシカルボニル基、シクロブトキシカルボニル基、シクロペンチルオキシカルボニル基、シクロヘキシルオキシカルボニル基、シクロヘプチルオキシカルボニル基、シクロオクチルオキシカルボニル基、シクロノニルオキシカルボニル基、シクロデシルオキシカルボニル基等が挙げられる。
【００４９】
Ｒ７〜Ｒ１０で示される置換アミノ基の置換基として挙げられるアシル基としては、例えば脂肪族カルボン酸由来のもの、芳香族カルボン酸由来のもの等が挙げられる。
【００５０】
当該脂肪族カルボン酸由来のアシル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状でもよく、また更に鎖中に二重結合を有していてもよく、通常炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１５、より好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、イコサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、オレオイル基等が挙げられる。
【００５１】
当該芳香族カルボン酸由来のアシル基としては、通常炭素数７〜１５、好ましくは７〜１１のものが挙げられ、具体的には、例えばベンゾイル基、ナフトイル基、アントイル基等が挙げられる。
【００５２】
Ｒ７〜Ｒ１０の好ましい例としては、Ｒ７〜Ｒ１０の中の３つが水素原子であり、残りの一つが一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基であるものが挙げられ、当該スルホン酸由来の基の中でも、例えばスルホ基、そのアニオン（即ち、スルホネート）、そのアルカリ金属塩、有機アンモニウム塩等が好ましく、特に、例えばスルホ基、スルホネート、そのアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩等）等がより好ましく、特に、Ｒ８が一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基であるものが好ましい。
【００５３】
一般式［１］に於いて、Ｒ１１で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜６、より好ましくは１〜４のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-へキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、イソノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。
【００５４】
Ｒ１１で示されるアルキニル基としては、通常炭素数２〜６、好ましくは２〜４のものが挙げられ、具体的には、例えばエチニル基、2-プロピニル基、3-ブチニル基、1-メチル-2-プロピニル基、4-ペンチニル基、2-メチル-4-ペンチニル基、5-ヘキシニル基等が挙げられる。
【００５５】
Ｒ１１で示されるアリール基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００５６】
一般式［１］に於けるＲ１１の中でもアルキル基が好ましく、特に、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基等がより好ましい。
【００５７】
一般式［１］に於いて、ｎは、通常０〜３の整数、好ましくは１又は２、より好ましくは２である。
【００５８】
一般式［１］に於ける、本発明の化合物中に含有される一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基（例えばスルホ基等）は、水溶性を高め、該色素分子間での会合による蛍光消光を抑制し、蛍光強度を高めるため多く導入されている方が好ましく、本発明の化合物中に通常１〜４個、好ましくは３〜４個、より好ましくは４個含有される。また、本願化合物中に一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基が４個含有される場合の好ましい導入部位としては、一般式［１］に於けるＲ３とＲ４の何れか一方、Ｒ５とＲ６の何れか一方、及びＲ１とＲ２の何れか一方（好ましくはＲ２）に、一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有する炭素数１〜５のアルキル基として導入され、更にＲ８に一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基として導入されるのが好ましい。
【００５９】
一般式［１］で示される化合物としては、例えば一般式［１−１］
0005598468.tif 000006
【００６０】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１１は前記に同じ。）で示される化合物（一般式［１］に於けるｎ＝１のものに相当）、一般式［１−２］
0005598468.tif 000007
【００６１】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１１は前記に同じ。）で示される化合物（一般式［１］に於けるｎ＝２のものに相当）、一般式［１−３］
0005598468.tif 000008
【００６２】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１１は前記に同じ。）で示される化合物（一般式［１］に於けるｎ＝０のものに相当）、一般式［１−４］
0005598468.tif 000009
【００６３】
（式中、Ｒ１〜Ｒ１１は前記に同じ。）で示される化合物（一般式［１］に於けるｎ＝３のものに相当）等が挙げられ、中でも一般式［１−１］又は［１−２］で示されるものが好ましい。
【００６４】
また、本発明の化合物［１］の中でも、例えば下記一般式［１’］
0005598468.tif 000010
【００６５】
（式中、Ｒ１ａ〜Ｒ６ａは夫々独立して一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基、或いは一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ８ａは、一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を表し、Ｒ１１ａはアルキル基を表し、ｎは前記に同じ。但し、Ｒ１ａ〜Ｒ６ａの少なくとも１つは一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基を表す。）で示されるものが好ましい。
【００６６】
一般式［１’］に於いて、Ｒ１ａ〜Ｒ６ａで示される、一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基としては、前記一般式［１］に於けるＲ１〜Ｒ６で示される、一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基の例示と同様のものが挙げられる。
【００６７】
Ｒ１ａ〜Ｒ６ａで示される、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基としては、前記一般式［１］に於けるＲ１〜Ｒ６で示される、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基の一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基の例示と同様のものが挙げられる。
【００６８】
Ｒ３ａ及びＲ４ａとしては、夫々独立して一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基が挙げられるが、中でもその一方が一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有するアルキル基であり、他方がアルキル基であるものが好ましい。
【００６９】
Ｒ５ａ及びＲ６ａとしては、夫々独立して一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基が挙げられるが、中でもその一方が一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有するアルキル基であり、他方がアルキル基であるものが好ましい。
【００７０】
Ｒ１１ａで示されるアルキル基としては、前記一般式［１］に於けるＲ１１で示されるアルキル基の例示と同様のものが挙げられる。
【００７１】
一般式［１’］に於いて、Ｒ１ａ〜Ｒ６ａの少なくとも１つは一般式［１０１］で示される基を置換基として有するアルキル基である。
【００７２】
一般式［１−２］で示される化合物の好ましい具体例としては、例えば下記表２で示されるもの等が挙げられる。
【００７３】
【表１】
0005598468.tif 000011
【００７４】
２．本発明の化合物［１］の合成法
２−１．インドレニン化合物−ピラゾール化合物複合体（本発明の一般式［１］で示される化合物に相当）の合成
一般式［１］で示される化合物は、例えば下記方法によって合成し得る。
0005598468.tif 000012
【００７５】
※Ph＝フェニル基
（式中、Ｒ１７はアルキル基又はアリール基を表し、Ｒ１〜Ｒ１１及びｎは前記に同じ。）
【００７６】
一般式［１０］及び［１１］に於いて、Ｒ１７で示されるアルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０、好ましくは１〜３のものが挙げられ、具体的には、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基、イソヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、n-ヘプチル基、イソヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、n-オクチル基、イソオクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、n-ノニル基、イソノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、n-デシル基、イソデシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基等が挙げられる。
【００７７】
Ｒ１７で示されるアリール基としては、通常炭素数６〜１０のものが挙げられ、具体的には、例えばフェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００７８】
即ち、先ず、一般式［８］で示されるインドレニン化合物（インドレニン骨格部分）、一般式［９］で示される化合物〔一般式［８］で示される化合物に対して１〜２倍モル〕及び一般式［１０］で示される酸無水物〔一般式［８］で示される化合物に対して１〜２０倍モル〕（例えば無水酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸、安息香酸無水物等）を、必要ならば溶媒（例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸等のカルボン酸類、例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ-ブチロニトリル等のニトリル類等）に溶解し、０〜１５０℃（好ましくは４０〜１２０℃）で０．１〜２４時間（好ましくは０．５〜１２時間、より好ましくは１〜８時間）で反応させることにより一般式［１１］で示される化合物が得られる。
【００７９】
次いで、一般式［１１］で示される化合物及び一般式［１２］で示される化合物（ピラゾール骨格部分）〔一般式［１１］で示される化合物に対して０．５〜１０倍モル、好ましくは１〜５倍モル〕を、塩基性触媒（basic catalyst）（例えばピリジン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、ピリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類、例えば水素化ナトリウム等の金属水素化物類、例えばn-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類等）の存在下、脱水縮合剤（condensing agent）〔例えば濃硫酸、五酸化二リン、無水塩化亜鉛等の無機脱水剤類、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピルカルボジイミド)塩酸塩等のカルボジイミド類、無水酢酸、ポリリン酸、カルボニルジイミダゾール、p-トルエンスルホニルクロライド等〕を用いて、必要ならば溶媒（例えばN,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、N,N-ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、アセトアミド、Ｎ-メチルピロリドン等のアミド類、例えばアセトニトリル、プロピオニトリル、ｎ-ブチロニトリル等のニトリル類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール、1,4-ブタンジオール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、アニソール、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、例えばジメチルスルホキシド等のスルホキシド類）中で０〜１５０℃（好ましくは４０〜１２０℃）で０．１〜２４時間（好ましくは０．５〜１２、より好ましくは１〜８時間）で反応させることにより、目的物である一般式［１］で示される化合物が得られる。
【００８０】
２−２．カチオン導入工程の合成
本発明に係る一般式［１０１］で示される基を導入する方法を、一般式［１］で示される化合物のうち、一般式［２４］で示される化合物〔即ち、一般式［１］に於けるＲ１が一般式［１０１］で示される基（但し、Ｒ１０４が水素原子である場合に相当）を置換基として有するアルキル基である化合物に相当〕を合成する場合を例にとって以下に説明する。
0005598468.tif 000013
【００８１】
（式中、Ｔ１２はアルキレン基を表し、Ａはテトラフルオロボレート又はヘキサフルオロホスフェートを表し、Ｒ３〜Ｒ１２、Ｒ１０１〜Ｒ１０３、ｍ及びｎは前記に同じ。）
【００８２】
尚、一般式［２２］で示される化合物は、一般式［１］で示される化合物のうち、Ｒ１が一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基を置換基として有するアルキル基（即ち、−Ｔ１２−ＣＯＯＲ１２基に相当）である場合の化合物に相当する。
【００８３】
一般式［２２］〜［２４］に於いて、Ｔ１２で示されるアルキレン基としては、直鎖状又は分枝状でもよく、好ましくは直鎖状のものであり、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜４のものであり、具体的には、例えばメチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基等の直鎖状アルキレン基、例えばエチリデン基、プロピレン基、イソプロピリデン基、エチルエチレン基、1,2-ジメチルエチレン基、1,2-ジエチルエチレン基、1,2-ジ-n-プロピルエチレン基、1,2-ジ-n-ブチルエチレン基等の分枝状アルキレン基等が挙げられ、中でも直鎖状アルキレン基が好ましく、就中、エチレン基、ペンタメチレン基等がより好ましい。
【００８４】
即ち、一般式［２２］で示される化合物を、例えば一般式［６２］で示される化合物等のスクシンイミド化試薬（一般式［２２］で示される化合物に対して１〜１０倍モル）と塩基性触媒（例えばN-エチルジイソプロピルアミン、ピリジン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類等）の存在下、適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）中、０〜４０℃で０．１〜１２時間反応させることにより、一般式［２３］で示される化合物が得られる。
【００８５】
次いで、一般式［２３］で示される化合物と、例えば一般式［１０２］で示されるカチオン化試薬（一般式［２３］で示される化合物に対して１〜５倍モル）を適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）中、０〜４０℃で０．１〜１２時間反応させることにより、一般式［２４］で示される化合物が得られる。
【００８６】
本発明に係るスクシンイミド化試薬としては、上記一般式［６２］で示される化合物に限らず、通常この分野で用いられるものが全て挙げられ、具体的には、例えばジ（N-スクシンイミジル）カルボネート（ＤＳＣ）、2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、2-（5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシミド）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＮＴＵ）等が挙げられる。また、スクシンイミド化反応を行う場合には、適宜塩基性触媒（例えばトリエチルアミン、N-エチルジイソプロピルアミン、ピリジン、N,N-ジメチルアニリン、ピペリジン、4-ジメチルアミノピリジン、1,5-ジアザビシクロ[4.3.0]ノナ-5-エン、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン、トリ-n-ブチルアミン等の有機アミン類等）の存在下で反応させてもよい。
【００８７】
２−３．インドレニン化合物の合成
一般式［８］で示される化合物（インドレニン骨格部分）の合成法を以下に説明する。
0005598468.tif 000014
【００８８】
※Ts＝トシル（p-トルエンスルホニル）基
（式中、Ｘはハロゲン原子を表し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ７〜Ｒ１０は前記に同じ。）
【００８９】
一般式［１６］に於いて、Ｘで示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
【００９０】
即ち、一般式［１３］で示されるケトン化合物及び一般式［１４］で示される化合物を適当な溶媒中（例えば酢酸、プロピオン酸等のカルボン酸類、例えばエチレングリコール、1,4-ブタンジオール等のアルコール類等）、４０〜２５０℃で０．１〜２４時間反応させることにより、一般式［２１］で示される化合物が得られる（例えばJournal of Organic Chemistry, 42(14), 2474~80, 1977等）。
【００９１】
次いで、一般式［１５］で示される化合物を一般式［１６］で示されるハロゲン化化合物）又は一般式［１７］で示されるトシレート化合物とを、適当な溶媒中（例えばクロロベンゼン、1,2-ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素類、例えば1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、例えばトルエン、キシレン、ベンゼン等の芳香族炭化水素類、例えばＤＭＡ、ＤＭＦ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）に溶解し、４０〜２００℃で１〜２４時間反応させることにより、一般式［８］で示されるインドレニン化合物が得られる（例えばJ. Chem. Soc., Perkin Trans.1. 947~952. 1984等）。
【００９２】
一般式［１３］で示されるケトン化合物は、市販品（例えば3-メチル-2-ブタノン、3-メチル-2-ペンタノン、3-メチル-2-ヘキサノン、１-シクロプロピルエタノン、1-シクロブチルエタノン等）を用いてもよいし、常法により適宜合成されたものを用いてもよい。該ケトン化合物の合成例としては、例えば2-メチルアセト酢酸エチルと脱離基（例えばハロゲン原子、トシレート基等）を有する化合物を塩基性触媒（例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム等の金属水素化物類、例えば炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、例えばナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類等、例えばn-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類、例えばリチウムジイソプロピルアミド等のアルカリ金属アミド類等）の存在下、適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、Ｎ-メチルピロリドン等のアミド類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、例えばジメチルスルホキシド等のスルホキシド類等）中、−８０〜１００℃で０．１〜２４時間反応させ、次いで、得られた溶液を酸触媒を用い脱炭酸を行う方法（例えばModern Synthetic Reactions, California, 2 nd ed.,p.492, 510, 756 (1972)等参照）等が挙げられる。
【００９３】
一般式［１４］で示される化合物は、市販品を用いてもよいし、常法により適宜合成されたものを用いてもよい。
【００９４】
２−４．ピラゾール化合物の合成
一般式［１２］で示される化合物（ピラゾール骨格部分）の合成法を以下に説明する。
0005598468.tif 000015
【００９５】
（式中、Ｒ２、Ｒ５〜Ｒ６、Ｒ１１及びＸは前記に同じ。）
【００９６】
即ち、一般式［１８］で示されるジケトン化合物とヒドラジンを、適当な溶媒（例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール等のアルコール類等）中、６０〜１００℃で１〜４時間脱水反応させ、一般式［２６］で示される４Ｈ−ピラゾール化合物が得られる（例えばAdv. Heterocycle. Chem. Vol.34. 53~78. 1983等）。
【００９７】
次いで、一般式［１９］で示される４Ｈ−ピラゾール化合物を一般式［２０］で示されるハロゲン化化合物又は一般式［２１］で示されるトシレート化合物とを、適当な溶媒（例えばクロロベンゼン、1,2-ジクロロベンゼン等のハロゲン化芳香族炭化水素類、例えば1,2-ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、例えばトルエン、キシレン、ベンゼン等の芳香族炭化水素類、例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、N-メチルピロリドン等のアミド類等）中、８０〜１４０℃で１〜１２時間でN-アルキル化反応させ、一般式［１２］で示される化合物が得られる（例えばJ. Chem. Soc., Perkin Trans.1. 947~952. 1984等）。
【００９８】
一般式［１８］で示されるジケトン化合物は、市販品（例えば3,3-ジメチル-2,4-ペンタンジオン等）を用いてもよいし、常法により適宜合成されたものを用いてもよい。該ケトン化合物の合成例としては、例えば3-メチル-2,4-ペンタンジオンや4-アセチル-5-オキソヘキサン酸エチルエステルを脱離基（例えばハロゲン原子、トシレート基等）を有する化合物を塩基性触媒（例えば水素化ナトリウム、水素化カリウム等の金属水素化物類、例えば炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属炭酸塩、例えばナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキシド、カリウムtert-ブトキシド等のアルカリ金属アルコキシド類、例えばn-ブチルリチウム等の塩基性アルカリ金属化合物類、例えばリチウムジイソプロピルアミド等のアルカリ金属アミド類等）の存在下、適当な溶媒（例えばＤＭＦ、ＤＭＡ、アセトアミド、Ｎ-メチルピロリドン等のアミド類、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、エチレングリコール等のアルコール類、例えばテトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコールモノエチルエーテル等のエーテル類、例えばジメチルスルホキシド等のスルホキシド類等）中、−８０〜１００℃で０．１〜２４時間反応させる方法（例えばModern Synthic Reactions, California, 2 nd ed.,p.492, 510, 756 (1972)等）等が挙げられる。
【００９９】
３．本発明の一般式［１］で示される化合物の性質
このようにして得られた本発明の一般式［１］で示される化合物（以下、「本発明の化合物［１］」と略記する場合がある。）は、635nm付近に励起波長を有する蛍光物質であり、例えば蛍光標識物質、電気泳動に於ける内部標準物質等の用途が期待されている。
【０１００】
本発明の化合物［１］は、その分子内に、一般式［１０１］で示される基（即ち、アンモニウムカチオン基）を有しているため、これをプラスからマイナスへ電気泳動させた場合、本発明に係るアンモニウムカチオン基の存在により泳動時間を遅らせることが可能となる。更に、本発明の化合物中には、アニオン基として一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を導入することも可能であるため、分子内のカチオン基とアニオン基の数を適宜コントロールすることが可能であるため、電気泳動の際の移動度がコントロールされた本発明の化合物を合成することが可能となる。
【０１０１】
特に、本発明の化合物［１］は、これと基本骨格は同じで、本発明に係る一般式［１０１］で示される基が一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基（即ちアニオン基）に置換された化合物（以下、本発明に係るアニオン基含有化合物）と共に内部標準物質として用いた場合、本発明に係るアニオン基含有化合物は、これをプラスからマイナスへ電気泳動させた場合、本発明に係る化合物［１］よりも泳動時間を早めることが可能となるので、測定対象物質のピークを２つの内部標準物質のピークの間となるように調整することができ、これにより測定対象物質のピークを容易に同定することが可能となる。
【０１０２】
本発明に係るアニオン基含有化合物の具体例としては、例えば一般式［５０］で示される化合物又はその塩
0005598468.tif 000016
【０１０３】
〔式中、Ｒ１ｂ〜Ｒ６ｂは夫々独立して、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］
0005598468.tif 000017
【０１０４】
（式中、Ｒ１２は前記に同じ。）で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］
0005598468.tif 000018
【０１０５】
（式中、Ｒ１３は前記に同じ。）で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ７ｂ〜Ｒ１０ｂは夫々独立してアルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、置換アミノ基、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基、一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基、ハロゲン原子、水素原子、水酸基、シアノ基若しくはニトロ基を表し、Ｒ１１ｂは水素原子、アルキル基、アルキニル基若しくはアリール基を表し、ｎ’は０〜３の整数を表す。但し、Ｒ１ｂ〜Ｒ６ｂのうち少なくとも１つは一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基であるか、或いはこれらを置換基として有する。〕が挙げられる。上記一般式［５０］で示される化合物又はその塩は、635nm付近に励起波長を有する蛍光物質であり、蛍光検出による測定に於いて、特に有用な内部標準物質となる。
【０１０６】
一般式［５０］中のＲ１ｂ〜Ｒ６ｂで示される、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基としては、一般式［１］に於けるＲ１〜Ｒ６で示される、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有していてもよいアルキル基の例示と同様のものが挙げられる。
【０１０７】
Ｒ１ｂ〜Ｒ６ｂで示される、アミド結合を有していてもよい、一般式［２］で示される基カルボン酸由来の又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基を置換基として有するアルキル基としては、当該アミド結合を有していてもよいアルキル基中の水素原子の一部が当該置換基（一般式［２］で示されるカルボン酸由来の基又は一般式［３］で示されるスルホン酸由来の基）で置換されているものが挙げられ、中でも、当該アルキル基の末端の炭素原子に該置換基が置換されているものが好ましい。
【０１０８】
Ｒ７ｂ〜Ｒ10ｂで示されるアルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、ハロゲン原子及び置換アミノ基は、一般式［１］に於けるＲ７〜Ｒ10で示されるアルキル基、アルキニル基、アリール基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、ハロゲン原子及び置換アミノ基の例示と夫々同じものが挙げられる。
【０１０９】
一般式［５０］に於けるＲ11ｂで示されるアルキル基、アルキニル基及びアリール基としては、一般式［１］に於けるＲ11で示されるアルキル基、アルキニル基及びアリール基の例示と夫々同様のものが挙げられる。
【０１１０】
Ｒ１１ｂの中でもアルキル基が好ましく、就中、例えばメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基等がより好ましい。
【０１１１】
一般式［５０］に於いて、ｎ’は、通常０〜３の整数、好ましくは１又は２、より好ましくは２である。
【０１１２】
一般式［５０］の好ましい具体例としては、例えば
【０１１３】
0005598468.tif 000019
【０１１４】
0005598468.tif 000020
【０１１５】
0005598468.tif 000021
【０１１６】
が挙げられ、中でも
0005598468.tif 000022
【０１１７】
が好ましい。
本発明に係るアニオン基含有化合物である一般式［５０］で示される化合物は、例えば常法（国際公開WO2007/114398号公報）に従って合成することができる。
【０１１８】
本発明の化合物を内部標準物質や蛍光標識物質として用いることのできる測定対象物質としては、通常この分野で測定されているもの全てが含まれ、特に限定はされないが、具体的には、例えばペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）、タンパク質［例えば免疫グロブリンＡ（IgA）、免疫グロブリンＥ（IgE）、免疫グロブリンＧ（IgG）、免疫グロブリンＭ（IgM）、免疫グロブリンＤ（IgD）、β2−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質、例えばアミラーゼ、アルカリホスファターゼ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ等の酵素タンパク質、例えば結核菌、肺炎球菌、ジフテリア菌、髄膜炎菌、淋菌、ブドウ球菌、レンサ球菌、腸内細菌、大腸菌、ヘリコバクター・ピロリ等の細菌、ルベラウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ＡＴＬウイルス、ＡＩＤＳウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ポリオウイルス、ＥＢウイルス、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ等のウイルス、例えばカンジダ、クリプトコッカス等の真菌、レプトスピラ、梅毒トレポネーマ等のスピロヘータ、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物等に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖、例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ、ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ，ブタクサ、オオアワガエリ、ハルガヤ、ライムギ等の花粉、例えばネコ、イヌ、カニ等の動物、例えば米、卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等の気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン、例えばリポタンパク質等の脂質、例えばトリプシン、プラスミン、セリンプロテアーゼ等のプロテアーゼ、例えばＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＰＧＩ、ＰＧII等の腫瘍マーカータンパク等］、糖鎖（例えばＣＡ１９−９、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＡ１２５、癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質が有する糖鎖等の腫瘍マーカー糖鎖抗原糖鎖、例えばＡＢＯ糖鎖等）、レクチン（例えばコンカナバリンＡ、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、小麦胚芽レクチン等）、リン脂質（例えばカルジオピリン等）、リポ多糖（例えばエンドトキシン等）、化学物質（例えばＰＴＨ、Ｔ３、Ｔ４、ＴＳＨ、インシュリン、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン等のホルモン、例えばトリブチルスズ、ノニルフェノール、４−オクチルフェノール、フタル酸ジ−ｎ−ブチル、フタル酸ジシクロヘキシル、ベンゾフェノン、オクタクロロスチレン、フタル酸ジ−２−エチルヘキシル等の環境ホルモン）、レセプター（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等に対するレセプター）、リガンド（例えばエストロゲン、ＴＳＨ等）等が挙げられ、中でも、例えばＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＰＧＩ、ＰＧＩＩ等の腫瘍マーカータンパクやＣＡ１９−９、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＡ１２５、癌細胞の産生する特殊な糖鎖を有する物質が有する糖鎖等の腫瘍マーカー糖鎖抗原糖鎖が好ましく、ＡＦＰ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩが特に好ましい。
【０１１９】
本発明の化合物を内部標準物質や蛍光標識物質として用いた測定方法に於ける電気泳動法としては、通常この分野で用いられる方法全てが含まれるが、中でもキャピラリー内で行われる電気泳動法（キャピラリー電気泳動法）がより好ましい。該キャピラリー電気泳動法の中でも、キャピラリーチップで行われる電気泳動法が好ましい。キャピラリー（マイクロ）チップ電気泳動法とは、チップ基板上に断面の直径100μm以下のキャピラリーを形成させ、このキャピラリー中で電気泳動を行なう技術であり、キャピラリー内に電圧をかけることによってサンプル内に存在する物質の電荷の差をその移動度の差として分離する方法である。
【０１２０】
キャピラリー電気泳動法は、用いられる泳動溶液により、キャピラリーゾーン電気泳動法やキャピラリーゲル電気泳動法に分類されるが、本発明の方法は何れにも適用し得る。分離の精度を考慮すると、上記の中でもキャピラリーゲル電気泳動法が好ましい。
【０１２１】
上記キャピラリー電気泳動法で用いられるキャピラリーの材質としては、通常この分野で用いられるものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばガラス、石英、シリコン等のシリカ系化合物、例えばサイクリックオレフィンコポリマー(COC)、サイクリックオレフィンポリマー（COP）、ポリメチルメタクリレート、ポリメチルシロキサン、ポリビニルクロライド、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン等の合成ポリマー等が挙げられ、中でも合成ポリマーが好ましい。また、キャピラリーの内径及び長さは、測定対象物質を分離し得るものであればよく特に限定されないが、内径は、通常１〜1000μm、好ましくは１〜200μm、より好ましくは１〜100μmであり、長さは、通常0.1mm〜100cm、好ましくは0.1mm〜20cm、より好ましくは0.1mm〜10cmである。
【０１２２】
本発明に係る電気泳動法で用いられる泳動溶液としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、キャピラリーゾーン電気泳動法の場合、具体的には、例えばpH5〜10、好ましくは6〜8の緩衝液が挙げられ、緩衝液としては具体的には例えば乳酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液、フタル酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビツール緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、キャピラリーゲル電気泳動法の場合、例えばポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール），ポリプロピレンオキサイド等のポリエーテル類、例えばポリエチレンイミン等のポリアルキレンイミン、例えばポリアクリル酸，ポリアクリル酸エステル，ポリアクリル酸メチル等のポリアクリル酸系ポリマー、例えばポリアクリルアミド，ポリメタクリルアミド等のポリアミド系ポリマー、例えばポリメタクリル酸，ポリメタクリル酸エステル，ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリル酸系ポリマー、例えばポリビニルアセテート，ポリビニルピロリドン，ポリビニルオキサゾリドン等のポリビニル系ポリマー、例えばプルラン，エルシナン，キサンタン，デキストラン，グアガム等の水溶性ヒドロキシルポリマー、例えばメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性セルロース化合物、これらの誘導体、及びこれらポリマーを構成するモノマーユニットを複数種含有するコポリマー等のポリマーを、上記キャピラリーゾーン電気泳動の泳動溶液として用いられる緩衝液に添加したもの等が挙げられる。尚、上記ポリマーは、２種以上を組み合わせて添加してもよい。また、上記した如きポリマーの分子量としては、通常500Da〜6000kDa、好ましくは１〜1000kDa、より好ましくは100〜1000kDaである。また、上記ポリマーの濃度は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常0.01〜40％（W/V）、好ましくは0.01〜20％（W/V）、より好ましくは0.1〜10％（W/V）である。尚、上記充填剤を泳動用緩衝液に添加した際の、泳動用緩衝液の粘度は、通常２〜1000センチポアズ、好ましくは５〜200センチポアズ、より好ましくは10〜100センチポアズである。
【０１２３】
上記泳動溶液には、電気浸透流の影響を減らすための物質、例えばポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、含フッ素芳香族炭化水素、糖類等を含んでいてもよく、その濃度は通常この分野で用いられる範囲で設定されればよい。
【０１２４】
本発明に係る電気泳動法における泳動時の電圧は、泳動溶液や用いられる装置等により異なるため通常この分野で用いられている範囲から適宜設定されればよい。
【０１２５】
本発明に係る電気泳動法における試料や内部標準物質である本発明の化合物［１］と本発明に係るアニオン基含有化合物の導入方法は通常この分野でなされている方法であればよく、特に限定されないが、例えば吸引法、加圧法、電気的導入法等が挙げられ、中でも加圧法が好ましい。なお、本発明に係る内部標準物質は、試料中に予め溶解した状態で導入しても、試料と内部標準物質を含む溶液を別々に導入しても何れでもよい。内部標準物質の導入量は、キャピラリーの内径や長さ、検出器の種類や感度等の条件により異なるが、通常、試料の注入量と同じ量が用いられる。なお、上記試料や本発明に係る内部標準物質の導入は、自体公知の等速電気泳動（ITP）により濃縮した後、その濃縮物をそのままキャピラリー電気泳動に導入してもよい。この場合、例えばマイクロチップ電気泳動で行う場合には、ITP電気泳動とキャピラリー電気泳動とが連結しているチップを用い、連続してITP電気泳動、キャピラリー電気泳動を行うのが望ましい。
【０１２６】
上記試料としては、上記測定対象物質が含まれる溶液であればよく、特に限定はされないが、具体的には例えば血清，血漿，髄液，滑液，リンパ液等の体液、尿，糞便のような排泄物、喀たん，膿，皮膚由来物等の生体由来試料、例えば食品，飲料，水道水，海水，湖沼水，河川水，工場廃液，半導体用洗浄水，医療器具等を洗浄した後の洗浄液等の環境試料及びこれらを水や通常この分野で用いられている例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液等に適宜溶解させて再構成して得られた処理物等が挙げられる。
【０１２７】
本発明に係る電気泳動法は、具体的には例えば、内径50〜100μm、長さ１〜10cmのキャピラリーに、例えば0.1〜1.0％ポリジメチルアミノエチルメタクリレート、1〜5％グリセロール、0.01〜0.1％BSAを含有するTris-HClバッファーを充填し、キャピラリーの開始末端から、1〜10psiで30〜60秒の加圧法により内部標準物質１種を含む試料をキャピラリーに導入し、次いで1〜10psiで30〜60秒の加圧法によりその他の内部標準物質をキャピラリーに導入した後、例えば1000〜3000Vの電圧を10〜60分印加することにより電気泳動を行い、蛍光検出器やUV検出器等の検出器により測定される。
【０１２８】
本発明に係る測定方法においては、上記の如き条件で電気泳動を行い、測定対象物質及び内部標準物質の泳動状態を蛍光検出器やUV検出器等の検出器により測定してエレクトロフェログラムを得、該エレクトロフェログラム中の内部標準物質のピークを同定した後、その泳動時間等から測定対象物質のピークを同定する。
【０１２９】
具体的に説明すると、例えば内部標準物質２つを用い、試料中の測定対象物質を測定する場合、予め内部標準物質と測定対象物質の標準品を電気泳動させ、内部標準物質２つ及び測定対象物質の泳動時間、並びに、内部標準物質それぞれの泳動時間の比率及び内部標準物質と測定対象物質の泳動時間の比率を測定する。次いで、試料と測定対象物質とを同条件で電気泳動し、泳動時間及び先に求めた内部標準物質それぞれの泳動時間の比率から２つの内部標準物質のピークを特定する。最後に、該２つの内部標準物質の泳動時間及び先に求めた内部標準物質と測定対象物質の泳動時間の比率から測定対象物質のピークが特定される。
【０１３０】
また、本発明の化合物は標識物質としても使用可能であり、この場合は、本発明の化合物に被標識物質と結合し得る反応活性基を導入すればよく、該反応活性基、その導入方法等は、通常この分野で用いられる方法が挙げられる。
【０１３１】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【実施例】
【０１３２】
実施例１．本発明の化合物(15)の合成
0005598468.tif 000023
※Me＝メチル基【０１３３】
（１）インドレニン化合物(8)の合成
0005598468.tif 000024
※Et＝エチル基、Ph＝フェニル基【０１３４】
〔化合物(2)の合成〕
N,N-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（80ml）中に、エチル-２-メチルアセトアセテート(1)（25.0g、0.173mol）、１，３−プロパンスルトン（23.3g、0.190mol）及び水素化ナトリウム（8.5g、0.208mol）を添加し、90℃で終夜攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、水（200ml）、ジエチルエーテル（200ml）を加え２回洗浄を行った。その後水層部分を減圧留去し、化合物(2)を得た（42.1g、収率９１％）。【０１３５】
〔化合物(3)の合成〕
化合物(2)（40.5g、0.152mol）を濃塩酸（60ml）中、100℃で３時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール）を用いて精製し、化合物(3)を得た（16.6g、収率５６％）。【０１３６】
〔化合物(5)の合成〕
化合物(3)（10.0g、0.051mol）及び化合物(4)（12.9g、0.066mol）を酢酸（50ml）中、120℃で４時間加熱還流を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：水）を用いて精製し、化合物(5)を得た（11.5g、収率６５％）。
物性データ：IR(KBr) (cm-1)：3450, 1196【０１３７】
〔化合物(6)の合成〕
化合物(5)（11.5g、0.033mol）を水（50ml）及びエタノール（50ml）中に溶解し、室温下で４時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：水）を用いて精製し、化合物(6)を得た（10.3g、収率８０％）。
物性データ：Mass（nega=346）
IR(KBr) (cm-1)：3444, 1193【０１３８】
〔化合物(7)の合成〕
化合物(6)（10.0g、0.026mol）及び６−ブロモヘキサン酸（9.97g、0.052mol）を１，２−ジクロロベンゼン（100ml）中に溶解し、１２０℃で終夜攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、酢酸エチルを用いて３回洗浄し、化合物(7)を得た（11.5g、収率８９％）。
物性データ：Mass（nega=460）
IR(KBr) (cm-1)：3446, 1723, 1194【０１３９】
〔化合物(8)の合成〕
化合物(7)（1.5g、2.967mmol）及びマロン酸アルデヒドアニリド塩酸塩（0.77g、2.967mmol）を無水酢酸（20ml）中に溶解し、１２０℃で１時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：１０％アセトニトリル水溶液）を用いて精製し、インドレニン化合物(8)を得た（0.18g、収率１０％）。
物性データ：Mass（nega:posi=631:633）
IR(KBr) (cm-1)：3443, 1716, 1574, 1465, 1189【０１４０】
（２）ピラゾール化合物(12)の合成
0005598468.tif 000025
※ＤＭＡ＝ジメチルアセトアミド【０１４１】
〔化合物(10)の合成〕
ＤＭＦ（100ml）中、３−メチル−２,４−ペンタンジオン（化合物(9)）（15.0g、0.13mol）、１，３−プロパンスルトン（16.1g、0.13mol）及び水素化ナトリウム（5.0g、0.208mol）を用いて、５０℃で１６時間攪拌反応を行った。反応終了後、１Ｎ水酸化ナトリウムで中和し、溶媒を減圧留去し、水（200ml）及びジエチルエーテル（200ml）を加え２回洗浄を行った。その後水層部分を減圧留去し、ピラゾール化合物(10)を得た（32.2g、収率９６％）。
物性データ：IR(KBr) (cm-1)：3474, 1695, 1665, 1191【０１４２】
〔化合物(11)の合成〕
化合物(10)（10.0g、0.042mol）及びヒドラジン一水和物（2.1g、0.042mol）をエタノール（EtOH）（150ml）中に溶解し、８０℃で３時間攪拌反応を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出液：メタノール/クロロホルム=１/１）を用いて精製し、化合物(11)を得た（9.0g、収率９２％）。
物性データ：IR(KBr) (cm-1)：3421, 1195【０１４３】
〔化合物(12)の合成〕
化合物(11)（4.8g、0.019mol）及び１，３−プロパンスルトン（2.5g、0.02mol）をジメチルアセトアミド（30ml）中に溶解し、１４０℃で４時間攪拌を行った。反応終了後、酢酸エチル（200ml）を加え、析出した結晶を濾過し、ピラゾール化合物(12)を得た（5.3g、収率７６％）。
物性データ：Mass（nega=352）
IR(KBr) (cm-1)：3446, 1194【０１４４】
（３）インドレニン化合物−ピラゾール化合物複合体(13)〜(15)（本発明の化合物）の合成
0005598468.tif 000026
【０１４５】
〔化合物(13)の合成〕（公知化合物）
実施例１の（１）で得られたインドレニン化合物(8)（0.1g、0.158mmol）及び実施例１の（２）で得られたピラゾール化合物(12)（0.17g、0.474mmol）をＤＭＦ（2ml）中に溶解し、ピリジン（1ml）及び無水酢酸（0.5ml）を加え、８０℃で１時間攪拌を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、逆相カラムクロマトグラフィー（溶出液：１０％メタノール水溶液）及びSephadex  LH−２０〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（株）（旧アマシャムバイオサイエンス（株））社製〕（溶出液：メタノール）を用いて精製し、化合物(13)を得た（15mg、収率１２％）。
物性データ：Mass（nega=850）【０１４６】
化合物(13)の蛍光特性を以下に示す。
0005598468.tif 000027
【０１４７】
〔化合物(14)の合成〕
化合物(13)（13mg、0.015mmol）をＤＭＦ（0.6ml）中に溶解し、２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）（46mg）及びN−エチルジイソプロピルアミン（(i-Pr)2NEt）（600μl）を加え、室温で１時間攪拌を行った。反応終了後、酢酸エチル（15ml）を加えて晶析させた後、遠心分離により、化合物(14)を得た（13mg、収率９０％）。
物性データ：Mass（nega=947）【０１４８】
〔化合物(15)の合成〕（本発明の化合物）
化合物(14)（7mg）をＤＭＦ（0.5mL）に溶解し、Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノエチルアミン（10mg）、トリエチルアミン（Et3N）（2μl）を添加した後、３時間攪拌を行った。反応終了後、溶媒を減圧留去し、分取逆相カラムを用いて精製することで化合物(15)を得た（3.2mg）。
物性データ：Mass（nega=933）【０１４９】
化合物(15)の蛍光特性を以下に示す。
0005598468.tif 000028
【０１５０】
実施例２．本発明の化合物の蛍光強度の測定
公知化合物(13)及び本発明の化合物(15)の相対蛍光強度を概算した。
先ず、公知化合物(13)の蛍光強度から、１μＭ当りの蛍光強度を測定し、この蛍光強度値を１００とした場合の、本発明の化合物の相対蛍光強度を概算した。【０１５１】
公知化合物(13)を精製水１ｍLに溶解した。本溶液を５０ｍMりん酸緩衝液（ｐH７．５）で２００倍希釈し、ＯＤ値を測定した。次いで、実施例１の（１）で得られた本発明の化合物(15)を精製水１ｍLに溶解し、公知化合物(13)と同等のＯＤ値になるよう、５０ｍMりん酸緩衝液（ｐH７．５）で希釈した。この時、公知化合物(13)のＯＤ値１単位当りの蛍光強度を１００として、下記本発明の化合物(15)の相対蛍光強度を概算した。その結果を表２に示す。
0005598468.tif 000029
【０１５２】
【表２】
0005598468.tif 000030
【０１５３】
表２の結果から明らかなように、本発明の化合物(15)は、公知化合物(13)と同様の蛍光強度を示すことが分かった。【０１５４】
実験例１  AFPの分離測定
本発明の化合物を電気泳動に於ける内部標準物質として用いて、AFPの分離測定を行った。
〔分析物（抗原）〕
α−フェトプロテイン（AFP）（和光純薬工業（株）製）【０１５５】
〔移動度変化結合物質（DNA標識抗体）〕
図１に示した手順に従って、DNAが結合した抗AFP抗体Fab'フラグメントを調製した。
即ち、先ず、常法により５’末端にNH2基が導入された250bpのDNA断片を精製し（精製末端アミノ化DNA）、次いで、このDNA断片に導入されたNH2基とスルホスクシニミジル 4-（p-マレイミドフェニル）ブチレイト（Sulfo-SMPB）リンカー（スクシンイミド基とマレイミド基を有するリンカー、ピアス社製）のスクシンイミド基とを常法により反応させた後、ゲル濾過処理を行い、未反応リンカーを除去して、リンカーが結合した250bpDNA断片を得た。得られたリンカー結合250bpDNA断片と、予め抗AFP抗体ＷＡ１（和光純薬工業（株）製）を用いて常法に従い調製した抗AFP抗体ＷＡ１Fab’フラグメントとを反応させた。得られた反応物を、夫々DEAEカラムを用いて精製し、250bpDNA断片が結合した抗AFP抗体ＷＡ１Fab’フラグメント（250bpDNA標識抗体）を調製した。【０１５６】
〔標識結合物質（蛍光標識抗体）〕
ＷＡ１抗体とは異なるＡＦＰのエピトープを認識する抗AFP抗体ＷＡ２（和光純薬工業（株）製）を常法により処理して抗AFP抗体ＷＡ２Fab’フラグメントとし、当該フラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647（AnaSpec社製）を導入して、HiLyte647標識抗AFP抗体ＷＡ２Fab’フラグメント（蛍光標識抗体）を調製した。【０１５７】
〔内部標準物質〕
内部標準物質１として、実施例１で得られた公知化合物(13)（本願化合物の中間体）を用いた。
内部標準物質２として、実施例１で得られた本発明の化合物(15)を用いた。【０１５８】
〔キャピラリーチップ〕
図２に示すレイアウトを有するキャピラリーチップを、『マイクロ化学チップの技術と応用  北森武彦ほか  2004年出版（丸善株式会社）』に記載の方法に従い、以下のように作成した。
即ち、石英基板上に成膜したSi上にフォトレジスト膜を成膜した。このフォトレジストに図２に示すキャピラリデザイン（レイアウト）を有するマスクを用いて露光し、現像を行った。現像によりフォトレジストが除かれた部分のSiをスパッタによって除去した後、フッ化水素溶液を用いてウエットエッチングを行って石英基板にキャピラリチャンネル溝（細管）を作製した。石英基板上に残るフォトレジスト及びSi膜を除去した後、当該石英基板と液だめのための穴（ウェル）を有するカバープレートとをHF接合法によって張り合わせてキャピラリーチップを作製した。【０１５９】
尚、図２中、ＴＢはトレーリングバッファー導入用ウェル、ＬＢ１及びＬＢ２はリーディングバッファー導入用ウェルを、Ｓは泳動用試料導入用ウェルを、Ｒ１は試液（250bpDNA標識抗体含有溶液）導入用ウェルを、Ｗ１、Ｗ２及びＷ３は、ドレイン用ウェルをそれぞれ示す。【０１６０】
〔電気泳動〕
(1)リーディングバッファー
ポリジメチルアクリルアミド(pDMA)を0.6 ％ (w/v)、グリセロールを3 ％ (w/v)、NaClを75mM, 牛血清アルブミン(BSA)を0.01 ％及びLCAを4 mg/ml 含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、リーディングバッファーとした。【０１６１】
(2)トレーリングバッファー
pDMAを6 ％(w/v)、グリセロールを3％ (w/v)、BSA を0.01％及びHEPESを125mM 含有する75mM Trisバッファーをトレーリングバッファーとした。【０１６２】
(3)泳動用試料
ポリジメチルアクリルアミド(pDMA)を0.6 ％ (w/v)、グリセロールを3 ％ (w/v)、NaClを75mM、BSAを0.01 ％及びMESを3.6mM含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、サンプルバッファーとし、100pMのAFPを含む血清 １μL、1μM 蛍光標識抗体及び1nM WAKO-635蛍光色素 １μL、サンプルバッファー ８μLを0.5mLチューブで混合し、10μLの反応液を調製した。
反応液は氷上に静置させ、約30分抗原抗体反応させ、蛍光標識抗体−AFP免疫複合体を形成させた。尚、蛍光標識抗体の最終濃度は、100nMである。
得られた、免疫複合体含有反応液を泳動用試料とした。【０１６３】
(4)試液（250bpDNA標識抗体含有溶液）
100nM 250bpDNA標識抗体及び1nM WAKO-635−NH2蛍光色素を含有するリーディングバッファー（50mM Cl−イオン含有）を試液とした。【０１６４】
(5)電気泳動手順
a)泳動用試料及び試液の導入
図２のＳウェル（泳動用試料導入用ウェル）に泳動用試料（蛍光標識抗体−AFP免疫複合体含有溶液）  10μL、Ｒ１ウェル（試液導入用ウェル）に試液（DNA標識抗体含有溶液）  10μL、ＬＢ１ウェル及びＬＢ２ウェルにリーディングバッファー  10μL、ＴＢウェルにトレーリングバッファー  10μLをそれぞれ滴下し、Ｗ１（ドレイン用ウェル）−Ｗ２（ドレイン用ウェル）−Ｗ３（ドレイン用ウェル）間に  30秒間、-５psiの圧力を印加して、泳動用試料、試液及びリーディングバッファー、トレーリングバッファーをチャネルに導入した。キャピラリー内の泳動用試料と試液の配置関係を、図３に模式的に示す。尚、図３中、斜線部分は泳動用試料の配置部分を、また、点部分は試液の配置部分をそれぞれ示す。【０１６５】
b)ITP（反応、濃縮、分離）・検出
図３のＴＢウェル−ＬＢ１ウェル間に、3000Vの電圧を印加して、30℃で、試液中の250bpDNA標識抗体を泳動用試料中の蛍光標識抗体−AFP免疫複合体と接触させて、蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体の免疫複合体を形成させ、これを等速電気泳動（ITP）で濃縮した。
尚、反応時間は約100秒（250bpDNA標識抗体が電気泳動試料のゾーン（斜線ゾーン）を通り抜ける時間として）であった。ＬＢ２まで等速電気泳動されて、免疫複合体がＬＢ２を通り抜けたことを電圧の変化で判断して、陰電極をＴＢからＬＢ２に切り替えて、さらに検出部分（ＬＢ２チャネルクロス部分から２cmのキャピラリー部分）で、蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体の免疫複合体のピークが検出されるまでキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を行った。
尚、検出は、635nmレーザー励起によりＬＢ２チャネルクロス部分から２cmのキャピラリー部分の蛍光強度を蛍光顕微鏡（BX-50；KSオリンパス（株）製）により経時的に測定することによって行った。【０１６６】
〔結果〕
図４に、泳動用試料を用いた場合の電気泳動像（電気泳動クロマトグラム）を示す。尚、図４において、縦軸は蛍光強度を、横軸はリテンションタイムをそれぞれ示す。
図４の結果より、本発明に係る内部標準物質１及び２を用いて上記の如く電気泳動を行うと、内部標準物質両者のピークの間に測定対象とするAFP-L1とAFP-L3のピークが現れるようになり、両者のピークを容易に同定できることが判った。【０１６７】
実施例２  PIVK IIの分離測定
〔分析物（抗原）〕
Poser JW, Price PA.  J Biol Chem. 1979 Jan 25;254(2):431-6に記載の方法により、PIVK IIを調整した。【０１６８】
〔移動度変化結合物質（DNA標識抗体）〕
抗AFP抗体ＷＡ１Fab’フラグメントの代わりにPIVKA II Fab’フラグメントを用いた以外は実験例１と同様に調製し、抗PIVKA II抗体Fab’フラグメント（250bpDNA標識抗体）を得た。【０１６９】
〔標識結合物質（蛍光標識抗体）〕
抗プロトロンビン抗体を常法により調製、処理して抗プロトロンビン抗体Fab’フラグメントとし、当該フラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647（AnaSpec社製）を導入して、HiLyte647標識抗プロトロンビン抗体Fab’フラグメント（蛍光標識抗体）を調製した。【０１７０】
〔内部標準物質〕
実験例１と同じ内部標準物質１及び２を用いた。
〔キャピラリーチップ〕
実験例１と同じものを用いた。
〔電気泳動〕
(1)リーディングバッファー
実験例１と同じものを用いた。
(2)トレーリングバッファー
実験例１と同じものを用いた。【０１７１】
(3)泳動用試料
ポリジメチルアクリルアミド(pDMA)を0.6 ％ (w/v)、グリセロールを3 ％ (w/v)、NaClを75mM、BSAを0.01 ％及びMESを3.6mM含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、サンプルバッファーとし、100pMのPIVKA IIを含む血清 １μL、1μM 蛍光標識抗体及び1.4nM 内部標準物質１ 5μL、サンプルバッファー ８μLを0.5mLチューブで混合し、反応液を調製した。
反応液は氷上に静置させ、約30分抗原抗体反応させ、蛍光標識抗体−PIVKA II免疫複合体を形成させた。尚、蛍光標識抗体の最終濃度は、100nMである。
得られた、免疫複合体含有反応液を泳動用試料とした。【０１７２】
(4)試液（250bpDNA標識抗体含有溶液）
200nM 250bpDNA標識抗体及び140pM内部標準物質２を含有するリーディングバッファー（50mM Cl−イオン含有）を試液とした。【０１７３】
(5)電気泳動手順
実験例１と同じ方法で、泳動用試料及び試液を導入し、ITPで濃縮後、ＣＧＥを行い、635nmレーザー励起によりＬＢ２チャネルクロス部分から２cmのキャピラリー部分の蛍光強度を蛍光顕微鏡（BX-50；KSオリンパス（株）製）により経時的に測定した。【０１７４】
〔結果〕
図５に、泳動用試料を用いた場合の電気泳動像（電気泳動エレクトロフェログラム）を示す。尚、図５において、縦軸は蛍光強度を、横軸はリテンションタイムをそれぞれ示す。
図５の結果より、本発明に係る内部標準物質１及び２を用いて電気泳動を行うことにより、PIVKA IIのピークを両内部標準物質の間に位置させることができ、それによりPIVKA IIのピークを容易に同定できることが判った。
【図１】
0005598468.tif 000037
【図２】
0005598468.tif 000038
【図３】
0005598468.tif 000039
【図４】
0005598468.tif 000040
【図５】
0005598468.tif 000041