(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自然界に存在するクリングルドメインの遺伝子をテンプレートとしてプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、クリングルドメインが自然界に存在しないアミノ酸配列を有するように、クリングルドメイン構造骨格の維持に重要な保存アミノ酸残基を除いたアミノ酸残基に人為的な突然変異を誘導する段階を含み、
タンパク質骨格ライブラリーに由来した前記突然変異体が、下記のアミノ酸配列を有するクリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質変異体であることを特徴とする、クリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの製造方法：
CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELCXxPRC（配列番号；１９）
ここで、Ｘはセリン、チロシン、プロリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アラニンまたはアスパラギン酸塩であり、ｘはグルタミン、アルギニン、リシン、グルタミン酸またはグリシンである。
【請求項２】
前記プライマーが、配列番号１〜配列番号８よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質骨格ライブラリーの製造方法。
【請求項３】
前記クリングルドメインがヒトプラスミノゲンのクリングルドメインであることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質骨格ライブラリーの製造方法。
【請求項４】
前記ヒトプラスミノゲンのクリングルドメインが、配列番号４９に記載されたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質骨格ライブラリーの製造方法。
【請求項５】
前記ヒトプラスミノゲンのクリングルドメインの遺伝子が、配列番号５０に記載された塩基配列を有することを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質骨格ライブラリーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クリングルドメイン(Kringle domain)の構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリー構築方法、このライブラリーに由来した様々な標的分子に特異的に結合して標的分子の生物学的活性を調節するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格ライブラリー及び突然変異体、クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格モノマーの組み合わせによるオリゴマー構築方法、並びに多重特異性を与えるためのオリゴマー生成方法に関する。また、本発明は、クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格モノマーのループグラフト(loop grafting)による多結合モノマー(multivalent monomer)及び多重特異性モノマー(multispecific monomer)の生成方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のアミノ酸配列と２次、３次構造を分析すると、多くのタンパク質が独立的なドメイン（またはモジュール）から構成されている。ドメインは構造的・機能的・独立的な単位である。同一のドメインはいろいろのタンパク質に一つ以上分布でき、一つのタンパク質はいろいろのドメインから構成できる。ドメインの具体的な情報はＰｒｏｓｉｔｅ(Hulo N., et al., Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/)、ＳＭＡＲＴ(Letunic I., et al., Nucleic Acids Res., 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/)などの生物情報学Ｗｅｂサイトで探索することができ、代表的なドメインの例は免疫グロブリン様、フィブロネクチンＩＩ、ＩＩＩ、クリングルなどである。
【０００３】
生体分子間の相互作用（例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸など）は、細胞の生長、分化、発達、細胞間／内におけるシグナル伝達、物質移動などの様々な生命現象を起こす重要な機能を果たす。既存の標的分子に特異的に結合して生物学的活性を調節する分子として、抗体（全体または切片）が主導的に開発されてきた。ところが、抗体の問題点は、発現量が少なく、溶解度が低く、動物細胞発現細胞株を使用しなければならず、精製費用が高く、還元的細胞内環境で安定性が低下するという様々な問題点などがある。よって、抗体の問題点を克服しながら抗体のように標的分子に特異的に結合する特性を有する、抗体以外のタンパク質を開発しようとする努力が行われている（総説論文： Hey, et al., Trends in Biotech. 23:514-522, 2005; Skerra, Current Opin. Biotech., 18:295-304, 2007）。このようなタンパク質をタンパク質骨格(protein scaffold)、代替タンパク質骨格(alternative protein scaffold)、代替骨格(alternative scaffold)、非抗体タンパク質骨格(non-antibody protein scaffold)、または代替タンパク質結合体(alternative binding protein)と呼ぶ（以下、「タンパク質骨格」という）(総説論文：Skerra A, FEBS J, 275:2677-2683, 2008; Skerra, Current Opin. Biotech., 18:295-304, 2007; Nygren P., et al., J. Immunol Method, 290:3-28, 2004)。モデルタンパク質骨格は、構造的な安定性を与える部位のアミノ酸配列を保存させて構造骨格は維持させ、表面に露出されている残基またはループ構造に無作為の、或いはデザインされた突然変異を誘導してライブラリーを構築した後、標的分子に特異的に結合する突然変異体を分離する。
【０００４】
クリングルドメインは、ヒトを含む様々な種のタンパク質に独立モジュールとして存在し、数十個〜数百個が一つのタンパク質に存在する（表１参照）(Castellino, et al., J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo, et al., J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Cao, et al., Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002)。自然界に存在する様々な生命体の８９３個のタンパク質にアミノ酸配列の異なる１６６３個のグリングルドメインが存在し、ヒトには３１個のタンパク質にアミノ酸配列の異なる３９個のクリングルドメインが分布している（参照：Prosite(Hulo N., et al., Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/); SMART(Letunic I., et al., Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/)）(Castellino, et al., J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo, et al., J Mol Evol, 40:331-336, 1995)。各クリングルドメインの間は約２０個のアミノ酸連結環(inter-kringle domain)から構成されている。クリングルドメインの正確な機能は未だ解明されていないが、様々な生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、細胞膜、リン脂質など）の所属タンパク質に結合能を付与し、その所属タンパク質の様々な生物学的活性を調節する(Cao, et al., Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002)。クリングルドメインは、代表的に成長因子(growth factors)、プロテアーゼ(protease)、血液凝固因子(coagulation factors)、膜貫通受容体(transmembrane receptors)などに散在している(Castellino, et al., J Mol Evol, 26:358-369, 1987)。特に、クリングルドメインは単独で或いは他のタンパク質に属しておりながら抗血管新生(antiangiogenesis)機能を行うことができる。アンギオスタチン(angiostatin)の場合、４つのクリングルドメインを持っており、この構造がアンギオスタチンの抗血管形成機能に必須的である(Cao, et al., Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002)。線維素溶解(fibrinolysis)に関与するプラスミノゲンとプラスミンに存在するクリングルドメインのリシン結合部位(lysine binding site)は、２つのタンパク質の細胞外基質分子と細胞受容体との結合部位として知られており、２つのタンパク質の機能である線維素溶解作用においてクリングルのリシン結合部位が重要であると考えられている(Cao, et al., Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002)。
【０００５】
【表１】
0005616890.tif 000002
【０００６】
表１にはクリングルドメインを含むタンパク質、及び各タンパク質のクリングルドメイン数が記載されている。
【０００７】
クリングルは、ヒトを含む多様な生命体のいろんなタンパク質に独立に３次構造をもって存在するドメインまたはモジュールである。典型的なクリングルドメインは、約８０個のアミノ酸から構成されており、３つのジスルフィド結合(S-S bond)で連結された３次構造を持っており、この３つのジスルフィド結合が構造的に堅い様々なループ構造を提供している(Castellino, et al., J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo, et al., J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino, et al., Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti, et al., Biochemistry, 38:15741-15755, 1999)。典型的なクリングルドメインのジスルフィド結合パターンは１−６、２−４及び３−５である。すなわち、前記ジスルフィド結合パターンはシステイン１番とシステイン８０番との間に、システイン２２番とシステイン６３番との間に、システイン５１とシステイン７５番との間に形成される(Ikeo, et al., J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino, et al., Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti, et al., Biochemistry, 38:15741-15755, 1999)。
【０００８】
クリングルドメインは、自然界の生命体に存在する８９３個以上のタンパク質（ヒトには少なくとも３１個のヒトタンパク質）に存在する。クリングルドメインは、構造的安定性を与えるための一部のアミノ酸が保存されており、残りの部分はアミノ酸またはヌクレオチドレベルでは保存されていない。したがって、このようなクリングルドメインの典型的な構造的特性を与えるアミノ酸配列は保存して構造骨格（例えば、３つの分子内ジスルフィド結合（１−６、２−４及び３−５のジスルフィド結合パターンを有する）及びこれにより生成されるループ構造）を成すようにし、構造的に柔軟なループ構造部分に意図的または無作為に突然変異を導入し、多様な自然界に存在しないアミノ酸配列組み合わせを有するように突然変異体ライブラリーを構築する方法と、デザインされたライブラリーから、様々な標的分子に特異的に結合するクリングルドメイン構造骨格基盤の突然変異体を分離して、同定し、特性を究明する必要が明白である。また、クリングルドメイン構造基盤の突然変異体は、標的分子の生物学的活性を調節することにより、多様な疾患の予防、探知、診断、治療または軽減するための方法及び組成物の開発が使用できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、クリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーを構築する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、クリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーに由来した様々な標的分子に特異的に結合して標的分子の生物学的活性を調節する、クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、標的分子に特異的に結合する前記クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体をコードするＤＮＡ、これを含む発現ベクターを提供することにある。
【００１２】
本発明の別の目的は、標的分子に特異的に結合する前記クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体を発現、精製する方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的は、クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体のモノマーにヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃドメインを融合することにより、アビディティ(avidity)及び免疫反応誘導を与えるためのＦｃ融合クリングルドメイン変異体生成方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、クリングルドメインの構造を基盤とするタンパク質骨格変異体のモノマーの組み合わせによるオリゴマー構築方法、及び多重特異性を与えるためのオリゴマー生成方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、クリングルドメインの構造を基盤とするタンパク質骨格変異体のモノマーのループグラフト(loop grafting)による多結合モノマー(multivalent monomer)及び多重特異性モノマー(multispecific monomer)を生成する方法を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体の有効量を動物、好ましくはヒトに投与することを含み、疾患または障害、特に癌及びその他の免疫関連疾患を予防、探知、診断、治療または軽減するための方法及び組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明のある観点によれば、クリングルドメイン構造骨格の維持に重要な保存アミノ酸残基を除いたアミノ酸残基に人為的な突然変異を誘導する段階を含む、クリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの製造方法を提供する。
【００１８】
本発明の一具体例において、クリングルドメイン構造骨格の維持に重要な保温アミノ酸残基は、Ｃ１、Ｇ６、Ｙ９、Ｄ１０、Ｇ１１、Ｔ１６、Ｇ１９、Ｃ２２、Ｑ２３、Ｗ２５、Ｐ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｇ３４、Ｋ４８、Ｎ４９、Ｙ５０、Ｃ５１、Ｒ５２、Ｎ５３、Ｐ５４、Ｄ５５、Ｐ６１、Ｗ６２、Ｃ６３、Ｆ６４、Ｔ６５、Ｅ７３、Ｌ７４、Ｃ７５、Ｐ７８、Ｒ７９、及びＣ８０よりなる群から選ばれた少なくとも一つの残基を含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明の一具体例において、人為的な突然変異は、アミノ酸残基２、３、４、５、７、８、１２、１３、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２４、２６、２７、２８、２９、３２、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５６、５７、５８、５９、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７６、及び７７よりなる群から選ばれた少なくとも一つの残基で起こり、これらの残基は、欠失されるか、或いはセリン、チロシン、プロリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アラニン、アスパラギン酸塩、グルタミン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、及びグリシンよりなる群から選ばれた少なくとも一つの残基で置換されることが好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
上述したように、クリングルドメイン残基の番号は、クリングルドメイン標準番号システム(standard KD numbering convention)による(Cao Y et al. (2002) Curr. Med. Chem. Anticancer Agents, 2(6): 667-681; Marti DN et al. (1999) Biochemistry 38(48):15741-15755)。
【００２１】
本発明の別の具体例において、本発明の製造方法は、自然界に存在するグリングルドメインの遺伝子をテンプレートとしてプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、クリングルドメインが自然界に存在しないアミノ酸配列を有するように、クリングルドメイン構造骨格の維持に重要な保存アミノ酸残基を除いたアミノ酸残基に人為的な突然変異を誘導する段階をさらに含み、
【００２２】
前記ライブラリーに由来した突然変異体が、下記のアミノ酸配列を有するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質変異体であることを特徴とする、請求項４に記載のクリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの製造方法：
【００２３】
CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELCXxPRC（配列番号：１９）
【００２４】
ここで、Ｘはセリン、チロシン、プロリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アラニンまたはアスパラギン酸塩であり、ｘはグルタミン、アルギニン、リシン、グルタミン酸またはグリシンである。  
【００２５】
本発明の一具体例において、クリングルドメインは、プラスミノゲンのクリングルドメインであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２６】
本発明の一具体例において、前記プライマーは、配列番号１〜配列番号８よりなる群から選ばれることが好ましいが、これに限定されない。
【００２７】
本発明の一具体例において、クリングルドメインの例はプラスミノゲンのクリングルドメインであることが好ましいが、これに限定されず、前記プラスミノゲンのクリングルドメインは、配列番号４９に記載されたアミノ酸配列、及び前記アミノ酸配列に少なくとも一つの置換、欠損、逆位または転座などの突然変異が誘導された、突然変異体プラスミノゲンのクリングルドメインも本発明の権利範囲に含まれる。
【００２８】
本発明の一具体例において、前記プラスミノゲンのクリングルドメインをコードする遺伝子は、配列番号５０に記載された塩基配列を有する遺伝子、または遺伝子コードの縮退(degeneracy)などを考慮し、この配列と８０％以上の相同性を有する遺伝子であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２９】
また、本発明は、本発明のタンパク質骨格ライブラリーの製造方法で製造された、クリングルドメインの構造を基盤として構築されたタンパク質骨格ライフラリーを提供する。
【００３０】
本発明の一具体例において、前記ライブラリーは配列番号１３に記載されたライブラリーであることが好ましいが、これに限定されず、本発明の好適な実施例において、前記ライブラリーは、配列番号１４〜配列番号１８よりなる群から選択されたタンパク質骨格ライブラリーであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３１】
また、本発明は、前記タンパク質骨格ライブラリーを標的分子と反応させ、標的分子に特異的高親和度を有するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体を選別する方法を提供する。
【００３２】
本発明の前記変異体選別方法において、前記標的分子の例は、細胞死受容体（ＤＲ）４、細胞死受容体（ＤＲ）５、腫瘍壊死因子α、糖タンパク質ＩＩβ／ＩＩＩα受容体または糖タンパク質ＩＩβ／ＩＩＩα、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ； vascular endothelial growth factor）、血管内皮細胞成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ； vascular endothelial growth factor receptor）、チロシンキナーゼ抑制剤(tyrosin kinase inhibitor)、表皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor)、血小板由来成長因子(platelet-derived growth factor)、血小板由来成長因子受容体(platelet-derived growth factor receptor)、幹細胞因子受容体（ｃ−ｋｉｔ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３（Ｆｌｔ−３）、インターロイキン１、インターロイキン６、インターロイキン３２、インターロイキン２受容体、ＣＤ３、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ３２、ＣＤ６４、及びＲａｆよりなる群から選ばれる少なくとも一つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００３３】
また、本発明は、前記標的分子に特異的高親和度を有するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体を選別する方法によって製造された、標的分子に特異的高親和度を有するクリングルドメイン突然変異体を提供する。
【００３４】
本発明の一実施例において、前記突然変異体は、下記アミノ酸配列の少なくとも一つを有するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体であることが好ましいが、これに限定されない。
【００３５】
【表２】
0005616890.tif 000003
【００３６】
本発明の他の実施例において、前記突然変異体は、下記アミノ酸配列の少なくとも一つを有するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体であることが好ましいが、これに限定されない。
【００３７】
【表３】
0005616890.tif 000004
【００３８】
本発明の別の実施例において、前記突然変異体は下記アミノ酸配列の少なくとも一つを有するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体であることが好ましいが、これに限定されない。
【００３９】
【表４】
0005616890.tif 000005
【００４０】
また、本発明は、同じ標的分子に結合する、本発明のクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体を選別する方法によって生成されたタンパク質骨格突然変異体のモノマーを用いてＦｃ融合体、ホモオリゴマー(homo-oligomers)またはヘテロオリコマー(hetero-oligomers)を生成する方法を提供する。
【００４１】
また、本発明は、２つ以上の互いに異なる標的分子にそれぞれ特異的に結合する、本発明のクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体を選別する方法によって生成されたタンパク質骨格モノマーを分離した後、リンカーを用いてそれぞれのモノマーの組み合わせによってオリゴマーを生成して多重標的分子に同時に結合することが可能なオリゴマーの製造方法を提供する。
【００４２】
また、本発明は、２つ以上の互いに異なる標的分子に結合する、本発明のクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体を選別する方法によって生成されたタンパク質骨格モノマーを分離した後、結合ループ分析に基づいたモノマーのループグラフト(loop grafting)によって多結合モノマー(multivalent monomer)または多重特異性モノマー(multispecific monomer)を生成する方法を提供する。
【００４３】
また、本発明は、本発明の標的分子に特異的高親和度を有するクリングルドメイン突然変異体を有効成分として含む、癌治療または予防用組成物を提供する。
【００４４】
また、本発明は、本発明の標的分子に特異的高親和度を有するクリングルドメイン突然変異体を有効成分として含む、ＴＮＦα過発現または過存在により引き起こされる自己免疫疾患の治療または予防用組成物を提供する。
【００４５】
以下、本発明の好適な実施例をより詳細に説明する。
【００４６】
本発明において、タンパク質骨格（またはタンパク質テンプレート）ライブラリーに活用されるクリングルドメインは、自然界に存在する様々な生命体の８９３個のタンパク質に分布しているアミノ酸配列の異なる１６６３個のクリングルドメイン、または好ましくはヒトに由来した３１個のタンパク質に分布している３９個のクリングルドメインを含む（参照：Prosite： http://kr.expasy.org/prosite/;SMART:http://smart.embl-heidelberg.de/）。
【００４７】
Ｉ
本発明において、クリングルドメインの由来は、ヒト由来のタンパク質、例えばプロトロンビン、プラスミノゲン、プラスミン、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（ｕＰａ） 、組織型プラスミノゲン活性化因子（ｔＰａ）、血液凝固因子ＸＩＩ(Hagenman factor）、アポリポタンパク質Ａ(apolipoprotein A)、肝細胞成長因子(ＨＧＦ(Hepatocyte growth factor)／ＳＦ(Scatter Factor))、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ(Macrophage-stimulating protein)／ＨＧＦ様タンパク質）、クレメン(Kremen)、ニューロトリプシン(Neurotrypsin/Motopsin)、血漿ヒアルロナン結合タンパク質（ＰＨＢＰ(plasma hyaluroan binding protein)）であってもよい。
【００４８】
本発明において、用語「標的分子」は、自然界に存在する分子、例えばタンパク質、リン脂質、細胞膜、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、炭水化物、イオンなどを意味し、これらの単独分子形態、またはこれらの複合体分子を含む。また、標的分子は細胞、組織、または自然界に存在しない新規形態の分子を含んでもよい。
【００４９】
本発明において、ヒト由来ＤＲ５は、ＴＮＦ受容体ファミリー（細胞死受容体−５；ＴＲＡＩＬ−受容体２；ＤＲ５） の一員であり、ＴＲＡＩＬに結合し、Ｃ末端に細胞内死ドメインを有する受容体である(Pan, et al., Science 277:815-818, 1997)。ＤＲ５は、ＴＲＡＩＬに結合する場合、様々な癌細胞株に対して生体外(in vitro)または生体内(in vivo)でアポトーシスを誘導する。
【００５０】
本発明において、ヒト由来ＤＲ４は、ＴＮＦ受容体ファミリー（細胞死受容体−４；ＴＲＡＩＬ−受容体１；ＤＲ４）の一員であり、ＴＲＡＩＬに結合し、Ｃ末端に細胞内死ドメインを有する受容体である(Pan, et al., Science 276:111-113, 1997)。ＤＲ４は、ＴＲＡＩＬに結合する場合、様々な癌細胞株に対してインビトロ(in vitro)またはインビボ(in vivo)でアポトーシスを誘導する(Pan, et al., Science 276:111-113, 1997)。
【００５１】
本発明において、ヒト由来ＴＮＦα（腫瘍壊死因子、tumor necrosis factor alpha)は、単球(monocytes)またはマクロファージ(macrophage)などの様々な細胞から分泌されるサイトカインであって、多様な機能を有する炎症促進タンパク質である(Pennica D. et al., Nature, 312:724-729, 1984; Feldmann M, Nature Rev. Immunol, 2:364-371, 2002; Zhang G, Curr Opin Struct Biol, 14:154-160, 2004)。ＴＮＦαは、関節炎(arthiritis)、インスリン抵抗性(insulin resistance)、脂質代謝(lipid metabolism)などの様々な疾患に連関している。ＴＮＦαは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）が発現される様々な細胞に細胞死を誘導して疾患を誘導する(Feldmann M, Nature Rev. Immunol, 2:364-371, 2002; Zhang G, Curr Opin Struct Biol, 14:154-160, 2004)。
【００５２】
本発明に係るクリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの構築方法では、クリングルドメインの典型的な構造的安定性を与えるアミノ酸配列は維持し（例えば、３つの分子内のジスルフィド結合（ジスルフィド結合パターンは１−６、２−４及び３−５）及び周囲の保存アミノ酸残基）、ジスルフィド結合により生成されるループ構造部分には自然界に存在しない様々なアミノ酸配列の組み合わせを持たせる。
【００５３】
本発明に係るクリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーを介して様々な標的分子に特異的に結合して標的分子の生物学的活性を調節するクリングルドメイン突然変異体を選別して分離することができる。
【００５４】
本発明に係る標的分子に特異的に結合するクリングルドメイン突然変異体は、標的分子の特定部位の一箇所にのみ付着するのではなく、いろいろの部位に特異的に付着できるため、標的分子に多クローン性(polyclonal)のクリングルドメイン突然変異体を分離することができる。
【００５５】
本発明に係る標的分子に特異的に結合する前記クリングルドメイン突然変異体は、酵母、ピキアまたは動物宿主細胞で溶液状態でモノマーとして発現及び精製することができる。
【００５６】
本発明に係る標的分子に特異的に結合するクリングルドメイン突然変異体は、モノマーまたはこれらの組み合わせによるオリゴマーに構築でき、様々な標的分子に対してそれぞれ選別されたモノマーの組み合わせによって、少なくとも一つの標的分子に特異的に結合する多重特異的オリゴマーを生成することができる。
【００５７】
本発明に係る同じ標的分子の異なる部位または２つ以上の互いに異なる標的分子に結合するモノマーの結合ループ分析(binding loop analysis)に基づいて同一または異なるモノマーの他のループ部位にグラフトして多結合モノマー(multivalent monomer)または多重特異性モノマー(multispecific monomer)を生成することができる。
【００５８】
本発明に係る標的分子ＤＲ４及びＤＲ５に特異的に結合するクリングルドメイン突然変異体は、モノマーであって、多様な癌細胞株に対する細胞死を誘導することができる。また、これらの同じ標的分子に対してオリゴマーに構築でき、ＤＲ４及びＤＲ５に同時に付着できる二重特異的オリゴマーを生成することにより、癌細胞の細胞死効果を極大化させることができる。様々な標的分子に対してそれぞれ選別されたモノマーの組み合わせによって、少なくとも一つの標的分子に特異的に結合する多重特異的オリゴマーを生成することができる。また、結合ループ分析(binding loop analysis)に基づいて、同じ標的分子に対してそれぞれ選別されたモノマーの融合或いは結合ループグラフトによって多結合モノマー(multivalent monomer)を生成することができ、異なる標的分子に対してそれぞれ選別されたモノマーのループグラフト(loop grafting)によって多重特異性モノマー(multispecific monomer)を生成することができる。
【００５９】
本発明に係る標的分子ＴＮＦαに特異的に結合するクリングルドメイン突然変異体は、モノマーであって、様々なＴＮＦαを中和させることにより、ＴＮＦαの過量存在により引き起こされる疾患（例えば関節炎、クローン病）などに使用できる。また、ＴＮＦαに対してオリゴマーに構築でき、標識分子（例えば、Ｔａｇｓ）または抗体の不変領域（Ｆｃ）部分などと融合して生物学的活性を極大化させることができる。また、異なる標的分子に対して選別されたモノマーの組み合わせによって、少なくとも一つの標的分子に特異的に結合する多重特異的オリゴマーを生成することができる。また、結合ループ分析(binding loop analysis)に基づいて、同じ標的分子に対してそれぞれ選別されたモノマーのループグラフトによって多結合モノマー(multivalent monomer)を生成することができる。
【００６０】
本発明の別の実施例は、クリングルドメイン突然変異体のモノマー、オリゴマー、融合タンパク質、多結合モノマー及び多重特異性モノマーなどの有効量を動物、好ましくはヒトに投与することを含んで、疾患または障害、特に癌及びその他の免疫関連疾患を予防、探知、診断、治療または軽減するための方法及び組成物を提供する。
【００６１】
本発明の一実施例は、標的分子に特異的に結合する人工的なモノマーを含むタンパク質を提供する。一部の実施例において、そのモノマードメインは少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれ以上のジスルフィド結合を含む。
【００６２】
本発明において、「モノマードメイン」または「モノマー」は、タンパク質またはポリペプチドにおいて発見される独立部位を意味する。モノマードメインは、フランキング自然アミノ酸配列の不在下に溶液で元来３次構造を形成する。本発明のモノマードメインはターゲット分子に特異的に結合するために選択できる。
【００６３】
本発明において、「ループ」は、モノマードメインタンパク質の骨格構造(scaffold)の結合により環境に典型的に露出されるモノマードメイン部位を意味し、標的分子結合に関与する。
【００６４】
本発明において、「オリゴマー」は、少なくとも２つのモノマードメインを含むペプチドを意味する。オリゴマー内の分離されたモノマードメインはリンカーによって連結できる。
【００６５】
本発明の「標的分子」は、単一分子から複合標的分子まで広範囲な物質及び分子を含む。標的分子は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物またはペプチドドメインによって認知できる別の分子であってもよい。標的分子は、ここに記載されたスクリーニング分析で含まれるか、或いは特定タンパク質の相互作用を促進または阻害して定義できる。
【００６６】
本発明において、「リンカー」は、２つ以上の独立的な分離されたモノマードメインを連結もしくは結合する部位または部位群を意味する。リンカーは、独立的な分離されたモノマードメインをオリゴマーと共に連結されるときに分離された状態を維持させる。適切なリンカーはポリペプチド、ポリ核酸及びその類似体を含む。適切なリンカーは、炭素骨格に挿入された少なくとも一つの酸素原子を有する、選択的に置換されたアルキレンを含む。リンカーは元来配列の一部、その変異体または合成配列である。
【００６７】
本発明において、「ベクター」は、宿主で宿主染色体とは独立して複製できるポリヌクレオチドを意味する。ベクターの例はプラスミドを含む。ベクターは典型的に複製オリジンを有し、転写及び翻訳終結子、転写及び翻訳開始配列、並びに特定核酸の発現調節に有用なプロモーターを含むことができる。
【００６８】
本発明において、「組み換え」とは、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の投与、或いは天然核酸またはタンパク質の変更によって変形することを意味する。よって、例えば、組み換え細胞は細胞の元来（非組み換え）形態では発見されない遺伝子を発現し、或いは全く発現されないか、非正常的またはよく発現されない天然遺伝子を発現する。
【００６９】
本発明において、「クリングルドメイン構造基盤のタンパク質変異体」または「クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体」とは、自然界に存在するクリングルドメインの典型的な構造的安定性を与えるアミノ酸配列が保存されてクリングルドメイン特有の構造骨格（例えば、３つの分子内ジスルフィド結合（ジスルフィド結合パターンは１−６、２−４及び３−５）及びこれにより生成されるループ）は有するが、それ以外のループ構造には自然界に存在しない様々なアミノ酸配列の組み合わせを有するため、クリングルドメインの構造は維持するが、自然界に存在しないアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。このようなクリングルドメイン構造基盤のタンパク質変異体は、自然界に存在するクリングルドメインが結合するタンパク質の他にも、様々な標的分子に特異的に結合して標的分子の生物学的活性を調節することができる。
【００７０】
本発明において、「タンパク質骨格ライブラリー」とは、クリングルドメインの典型的な構造的安定性を与えるアミノ酸配列地域は保存させ、それ以外のループ構造部分には存在しない様々なアミノ酸配列の組み合わせを有するタンパク質骨格総集合体を意味する。このようなタンパク質骨格ライブラリーは、多様なプライマーを合成することにより、オーバーラッピングＰＣＲ(overlapping PCR)、ＤＮＡ入れ替え(DNA shuffling)、エラープローンＰＣＲ(error prone PCR)、人工ＤＮＡ合成(artificial DNA synthesis)などの多様な技術を用いて製造でき、この増幅されたライブラリーは酵母表面発現ベクターまたは動物細胞表面発現ベクターに挿入し、形質転換して発現することができる。タンパク質骨格ライブラリーの大きさは制限できないが、形質転換される過程で大きさが制限されるため、ライブラリーの多様性は通常１０７〜１０１３程度である。このように発現されたタンパク質骨格ライブラリーから、様々な標的分子に対して特異的に結合する特定のタンパク質骨格変異体を選別して分離することができる。
【００７１】
本発明において、「自然界に存在しないアミノ酸」とは、自然的に起こるポリペプチドを配列して当該位置で発生するアミノ酸以外のアミノ酸を意味する。
【００７２】
本発明のオリゴマーは少なくとも２つ以上のモノマーを含む。例えば、本発明のオリゴマーは、２〜約４個、２〜約８個、２〜約１０個、３〜約１０個のモノマードメイン、約４個、５個、６個または約７個のモノマードメインを含むことができる。一部の実施例において、各モノマードメインは一つの標的分子に特異的に結合する。これら実施例の一部において、各モノマードメインは、標的分子上の異なる位置に結合する。同じ標的分子に結合する多重モノマーまたはドメインは、各個別モノマーと比較して標的分子に対するオリゴマーの改良された結合力を示す結合効果を引き起こす。
【００７３】
他の実施例において、オリゴマーは、異なる標的分子に対する特異性を有するモノマードメインを含む。例えば、そのような様々なモノマードメインのオリゴマーは、ウイルス複製システムの異なる構成要素に特異的に結合し或いは標的細胞または組織内の異なる標的分子に結合することができる。同様に、治療分子は、細胞または組織特異性を有する他のモノマードメインを含むオリゴマーのモノマーに治療物質を結合させることにより、細胞または組織を標的化することもできる。
【００７４】
オリゴマーはモノマーの多様な組み合わせを含むことができる。例えば、単一オリゴマーでは、選択されたモノマードメインは同一であってもよく、一致してもよい。
【００７５】
例えば、本発明において、オリゴマーは下記の一つであってもよい：（１）ホモオリゴマー（同じドメインのオリゴマー、すなわちＡ１−Ａ１−Ａ１−Ａ１）、（２）ヘテロオリゴマー（すなわち、Ａｌ−Ａ２−Ａ３−Ａ４）。
【００７６】
本発明において、選択されたモノマードメインはリンカーによって連結されてオリゴマーを形成することができる。
【００７７】
リンカーによって選択されたモノマードメインの連結は、当業界における公知の様々な技術を用いて達成できる。例えば、選択されたモノマーをコードするポリヌクレオチドの組み合わせ連結(combinatorial assembly)は、制限酵素処理とライゲーション、ＰＣＲ基盤セルフプライミングオーバーラップ反応(PCR-based self-priming overlap reaction)、または他の組み換え方法によって達成できる。
【００７８】
リンカーは、自然的に存在するか、或いは合成またはこれらの組み合わせであってもよい。例えば、合成リンカーは配列とサイズがランダム化されたリンカーであってもよい。
【００７９】
本発明において、選択されたモノマードメインは結合ループ分析(binding loop analysis)に基づいたモノマーのループグラフトを介して多結合モノマー及び多重特異性モノマーを形成することができる。
【００８０】
結合ループ分析は、実施例及び図３に記述されたループ１−７を基盤として酵母細胞発現技術によって達成できる。
【００８１】
モノマーのループグラフトは、当業界における公知の様々な技術を用いて達成できる。例えば、選択されたモノマーをコードするポリヌクレオチドの組み合わせ連結は、制限酵素処理とリライゲーション、ＰＣＲ基盤セルフプライミングオーバーラップ反応、または他の組み換え方法によって達成できる。
【発明の効果】
【００８２】
本発明に係るクリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリー構築方法は、クリングルドメインの典型的な構造的安定性を与えるアミノ酸配列は維持し、ジスルフィド結合により生成されるループ構造部分に、自然界に存在しない様々なアミノ酸配列の組み合わせを持たせて、クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格ライブラリーを介して様々な標的分子に特異的に結合して標的分子の生物学的活性を調節するクリングルドメイン突然変異体を選別分離することができるという効果がある。
【００８３】
また、本発明に係る標的分子に特異的に結合するクリングルドメイン突然変異体は、標的分子の特定部位の一箇所にのみ付着するのではなく、いろいろの部位に特異的に付着できるため、標的分子から多クローン性のクリングルドメイン突然変異体を分離することができる。
【００８４】
また、本発明に係る標的分子に特異的に結合する前記クリングルドメイン突然変異体は、ピキア宿主細胞で溶液状態でモノマーとして発現及び精製することができ、このようなモノマーまたはこれらの組み合わせによってオリゴマーに構築でき、様々な標的分子に対してそれぞれ選別されたモノマーの組み合わせによって少なくとも一つの標的分子に特異的に結合する多重特異的オリゴマーを生成することができる。
【００８５】
例えば、本発明に係る標的分子ＤＲ４及びＤＲ５に特異的に結合するクリングルドメイン突然変異体は、モノマーであって、様々な癌細胞株に対する細胞死を誘導することができる。また、これらの同じ標的分子に対してオリゴマーに構築でき、ＤＲ４及びＤＲ５に同時に付着できる二重特異的オリゴマーを生成することにより、癌細胞の細胞死効果を極大化させることができる。また、これらの同じ標的分子に対してモノマーのループグラフト(loop grafting)によってＤＲ４及びＤＲ５に同時に付着できる多結合モノマーを生成することにより、癌細胞の細胞死効果を極大化させることができる。様々な標的分子に対してそれぞれ選別されたモノマーの組み合わせによって、少なくとも一つの標的分子に特異的に結合する多重特異性モノマー(multispecific monomer)を生成することができ、また、本発明に係る標的分子ＴＮＦαに特異的に結合するクリングルドメイン突然変異体は、モノマーであって、多様なＴＮＦαを中和させることにより、ＴＮＦαの過量存在により生成される疾患（例えば関節炎、クローン病）などに使用できる。また、ＴＮＦαに対してオリゴマーに構築でき、標識分子（例えば、Ｔａｇｓ）または抗体の不変領域（Ｆｃ）部分などと融合して生物学的活性を極大化させることができる。また、標的分子に対して選別されたモノマーの組み合わせによってホモオリゴマーを生成することができる。また、モノマーのループグラフトによってＴＮＦαに同時に付着できる多結合モノマー(multivalent monomer)を生成して治療効果を極大化させることができる。
【００８６】
上述したように、本発明は、クリングルドメイン突然変異体のモノマー、オリゴマー、融合タンパク質などの有効量を動物、好ましくはヒトに投与することを含んで、疾患または障害、特に癌及びその他の免疫関連疾患を予防、探知、診断、治療または軽減するための方法及び組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１はヒトに存在するアミノ酸配列が異なる３９個のクリングルドメインの保存アミノ酸配列を示す。
【図２】図２はヒト由来クリングルドメインの各残基に最も保存されたアミノ酸及びその保存率を模式的に示す。
【図３】図３はプラスミノゲンのクリングルドメイン２の（ＰＤＢ ＩＤ＝１Ｂ２Ｉ）三次構造に基づいて、アミノ酸配列が少なく保存されている７個のループを示す。ここで、図３ａ及びｂはプラスミノゲンクリングルドメイン２の二次構造及び３つのジスルフィド結合を示し、図３ｃ及びｄはプラスミノゲンクリングルドメイン２の表面を示す。
【図４】図４はクリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーを構築し、標的分子に特異的に結合するタンパク質骨格モノマーを分離してその活用を図式化して示す。図４ａは各標的分子に対して選別されたクリングルドメイン変異体の親和度の改良を示す。図４ｂは各標的分子の作用メカニズムによるクリングルドメイン変異体のオリゴマーの構築を示す。図４ｃは各標的分子に対して選別されたクリングルドメイン変異体のＦｃ融合体の構築を示し、図４ｄは各標的分子に対して選別されたクリングルドメイン変異体の結合ループ分析、及び多結合モノマーと多重特異性モノマーの構築方法を図式的に示す。
【図５】図５はヒトプラスミノゲンのクリングルドメイン２に基づいて様々な標的分子に特異的に結合することが可能なタンパク質構造骨格として活用するために具体的なクリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーを構築した戦略を模式的に示す。
【図６】図６はクリングルドメインタンパク質骨格ライブラリーの構築過程を示す模式図である。図６ａは８つのプライマーがオーバーラップしてクリングルドメインタンパク質骨格ライブラリーの遺伝子が形成される過程を示し、図６ｂは酵母表面発現の過程を模式的に示す。
【図７】図７は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングル突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングル突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図７、図９及び図１１）または非還元性（図８、図１０及び図１２）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。
【図８】図８は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングル突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングル突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図７、図９及び図１１）または非還元性（図８、図１０及び図１２）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。
【図９】図９は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングル突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングル突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図７、図９及び図１１）または非還元性（図８、図１０及び図１２）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。
【図１０】図１０は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングル突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングル突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図７、図９及び図１１）または非還元性（図８、図１０及び図１２）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。
【図１１】図１１は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングル突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングル突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図７、図９及び図１１）または非還元性（図８、図１０及び図１２）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。
【図１２】図１２は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングル突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングル突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図７、図９及び図１１）または非還元性（図８、図１０及び図１２）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。
【図１３】図１３は、ＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)（Ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）によって抗−ＤＲ４、−ＤＲ５及び−ＴＮＦαクリングルドメインがモノマーとして存在することを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Size exclusion chromatography column)（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ＧＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実験した結果である。
【図１４】図１４は、ＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)（Ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）によって抗−ＤＲ４、−ＤＲ５及び−ＴＮＦαクリングルドメインがモノマーとして存在することを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Size exclusion chromatography column)（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ＧＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実験した結果である。
【図１５】図１５は、ＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)（Ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｏｄｕｌｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）によって抗−ＤＲ４、−ＤＲ５及び−ＴＮＦαクリングルドメインがモノマーとして存在することを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Size exclusion chromatography column)（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ＧＣ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実験した結果である。
【図１６】図１６は、標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【図１７】図１７は、標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【図１８】図１８は、標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【図１９】図１９は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の交差反応性をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【図２０】図２０は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の交差反応性をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【図２１】図２１は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の交差反応性をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【図２２】図２２は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の結合部位(binding site)を比較するためにＴＲＡＩＬなどの標的分子に対して選別されたそれぞれのクリングルドメイン突然変異体に対して競争的ＥＬＩＳＡによってそれぞれの結合部位を分析したものである。
【図２３】図２３は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の結合部位(binding site)を比較するためにＴＲＡＩＬなどの標的分子に対して選別されたそれぞれのクリングルドメイン突然変異体に対して競争的ＥＬＩＳＡによってそれぞれの結合部位を分析したものである。
【図２４】図２４は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の結合部位(binding site)を比較するためにＴＲＡＩＬなどの標的分子に対して選別されたそれぞれのクリングルドメイン突然変異体に対して競争的ＥＬＩＳＡによってそれぞれの結合部位を分析したものである。
【図２５】図２５は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の結合部位(binding site)を比較するためにＴＲＡＩＬなどの標的分子に対して選別されたそれぞれのクリングルドメイン突然変異体に対して競争的ＥＬＩＳＡによってそれぞれの結合部位を分析したものである。
【図２６】図２６は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の結合部位(binding site)を比較するためにＴＲＡＩＬなどの標的分子に対して選別されたそれぞれのクリングルドメイン突然変異体に対して競争的ＥＬＩＳＡによってそれぞれの結合部位を分析したものである。
【図２７】図２７は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の結合部位(binding site)を比較するためにＴＲＡＩＬなどの標的分子に対して選別されたそれぞれのクリングルドメイン突然変異体に対して競争的ＥＬＩＳＡによってそれぞれの結合部位を分析したものである。
【図２８】図２８はＣＤを用いて野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２と抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６の二次構造を分析した結果を示す。
【図２９】図２９は熱力学的ストレスの下で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の結合能力をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す。
【図３０】図３０は野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２と抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の示差走査熱容量分析結果と最大熱容量温度を示す。
【図３１】図３１はクリングルドメイン突然変異体とヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃドメイン融合体の模式図、及びダイマーとして存在することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ結果を示す。
【図３２】図３２はクリングルドメイン突然変異体とヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃドメイン融合体の模式図、及びダイマーとして存在することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ結果を示す。
【図３３】図３３はクリングルドメイン突然変異体とヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃドメイン融合体の模式図、及びダイマーとして存在することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ結果を示す。
【図３４】図３４はクリングルドメイン突然変異体とヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃドメイン融合体の模式図、及びダイマーとして存在することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ結果を示す。
【図３５】図３５は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体とＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す。
【図３６】図３６は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体とＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す。
【図３７】図３７は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体とＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す。
【図３８】図３８は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体とＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す。
【図３９】図３９は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体とＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す。
【図４０】図４０は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した（図４６）。
【図４１】図４１は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した（図４６）。
【図４２】図４２は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した（図４６）。
【図４３】図４３は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した（図４６）。
【図４４】図４４は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した（図４６）。
【図４５】図４５は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した（図４６）。
【図４６】図４６は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した（図４６）。
【図４７】図４７は抗−ＤＲ４、抗−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体による細胞死が精製されたＤＲ４、ＤＲ５により抑制されることをＭＴＴアッセイで評価した結果を示す。
【図４８】図４８は抗−ＤＲ４、抗−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体による細胞死が精製されたＤＲ４、ＤＲ５により抑制されることをＭＴＴアッセイで評価した結果を示す。
【図４９】図４９はエンリッチメント細胞株のＢＪＡＢ細胞株（ヒトＢリンパ球、Ｂ細胞リンパ腫）、ＤＲ５をノックアウトしたＢＪＡＢ ＤＲ５−／−細胞株、Ｈ４６０細胞株、及びＤＲ４を過発現させたＨ４６０細胞株で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体としてのＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５と結合する程度を、実施例６で説明した方法でＦＡＣＳによって測定した結果を示す。
【図５０】図５０はエンリッチメント細胞株のＢＪＡＢ細胞株（ヒトＢリンパ球、Ｂ細胞リンパ腫）、ＤＲ５をノックアウトしたＢＪＡＢ ＤＲ５−／−細胞株、Ｈ４６０細胞株、及びＤＲ４を過発現させたＨ４６０細胞株で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体としてのＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５と結合する程度を、実施例６で説明した方法でＦＡＣＳによって測定した結果を示す。
【図５１】図５１はエンリッチメント細胞株のＢＪＡＢ細胞株（ヒトＢリンパ球、Ｂ細胞リンパ腫）、ＤＲ５をノックアウトしたＢＪＡＢ ＤＲ５−／−細胞株、Ｈ４６０細胞株、及びＤＲ４を過発現させたＨ４６０細胞株で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体としてのＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５と結合する程度を、実施例６で説明した方法でＦＡＣＳによって測定した結果を示す。
【図５２】図５２はエンリッチメント細胞株のＢＪＡＢ細胞株（ヒトＢリンパ球、Ｂ細胞リンパ腫）、ＤＲ５をノックアウトしたＢＪＡＢ ＤＲ５−／−細胞株、Ｈ４６０細胞株、及びＤＲ４を過発現させたＨ４６０細胞株で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体としてのＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５と結合する程度を、実施例６で説明した方法でＦＡＣＳによって測定した結果を示す。
【図５３】図５３はエンリッチメント細胞株のＢＪＡＢ細胞株（ヒトＢリンパ球、Ｂ細胞リンパ腫）、ＤＲ５をノックアウトしたＢＪＡＢ ＤＲ５−／−細胞株、Ｈ４６０細胞株、及びＤＲ４を過発現させたＨ４６０細胞株で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体としてのＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５と結合する程度を、実施例６で説明した方法でＦＡＣＳによって測定した結果を示す。
【図５４】図５４はエンリッチメント細胞株のＢＪＡＢ細胞株（ヒトＢリンパ球、Ｂ細胞リンパ腫）、ＤＲ５をノックアウトしたＢＪＡＢ ＤＲ５−／−細胞株、Ｈ４６０細胞株、及びＤＲ４を過発現させたＨ４６０細胞株で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体としてのＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５と結合する程度を、実施例６で説明した方法でＦＡＣＳによって測定した結果を示す。
【図５５】図５５はＪｕｒｋａｔとＨＬ６０細胞株でａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩ染色をＦＡＣＳで分析した結果を示す。
【図５６】図５６腫瘍接種の後、野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２、抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ５４８、及びＴＲＡＩＬを腫瘍内に直接注入し、しかる後に、２日間隔で腫瘍の体積を測定したデータ、並びに腫瘍を摘出したデータを示す。
【図５７】図５７は腫瘍接種の後、野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２、抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ５４８、及びＴＲＡＩＬを腫瘍内に直接注入し、しかる後に、２日間隔で腫瘍の体積を測定したデータ、並びに腫瘍を摘出したデータを示す。
【図５８】図５８は抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の生物学的活性をインビトロ及びインビボにて同定した結果を示す。図５８は野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６とＫＤＴ２６−Ｆｃ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂのＴＮＦαによるＷＥＨＩ１６４細胞株の細胞死阻害を評価した結果を示す。
【図５９】図５９は抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の生物学的活性をインビトロ及びインビボにて同定した結果を示す。図５９は対照群としてのヒトＩｎＧ１、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ＫＤＴ２６−ＦｃのインビボでＴＮＦαの媒介毒性阻害を生存分析グラフで示す。
【図６０】図６０は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３、ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８クリングルドメイン変異体、抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いて連結することによりホモダイマー(homodimer)を構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６０は構築されたホモダイマーの模式図を示す。
【図６１】図６１は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３、ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８クリングルドメイン変異体、抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いて連結することによりホモダイマー(homodimer)を構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６１は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及びＫＤ４１５ホモダイマーのＤＲ４に対する親和度をＥＬＩＳＡで決定したものである。図６２は抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６及びＫＤ５４８ホモダイマーのＤＲ５に対する親和度をＥＬＩＳＡで決定したものである。図６３は抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６ホモダイマーのＴＮＦαに対する親和度をＥＬＩＳＡで決定したものである。
【図６２】図６２は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３、ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８クリングルドメイン変異体、抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いて連結することによりホモダイマー(homodimer)を構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【図６３】図６３は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３、ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８クリングルドメイン変異体、抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いて連結することによりホモダイマー(homodimer)を構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６３は抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６ホモダイマーのＴＮＦαに対する親和度をＥＬＩＳＡで決定したものである。
【図６４】図６４は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ４ ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、または抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ-）４リンカーを用いて連結することによりヘテロダイマーを構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６４は構築されたヘテロダイマーの模式図を示す。
【図６５】図６５は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ４ ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、または抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ-）４リンカーを用いて連結することによりヘテロダイマーを構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６５はＫＤ４１３−ＫＤ４１５ヘテロダイマーの標的分子ＤＲ４に対する親和度をＥＬＩＳＡでそれぞれ決定したものである。
【図６６】図６６は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ４ ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、または抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ-）４リンカーを用いて連結することによりヘテロダイマーを構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６６はＫＤ４１３−ＫＤ５０６ヘテロダイマーの標的分子ＤＲ４に対する親和度をＥＬＩＳＡでそれぞれ決定したものである。
【図６７】図６７は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ４ ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、または抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ-）４リンカーを用いて連結することによりヘテロダイマーを構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６７はＫＤ４１３−ＫＤ５０６ヘテロダイマーの標的分子ＤＲ５に対する親和度をＥＬＩＳＡでそれぞれ決定したものである。
【図６８】図６８は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ４ ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、または抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ-）４リンカーを用いて連結することによりヘテロダイマーを構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図６８はＫＤ４１３−ＫＤ５０６のＤＲ４及びＤＲ５に対する結合をサンドイッチＥＬＩＳＡで決定したものである。
【図６９】図６９は各標的分子に対して選別されたクリングルドメイン変異体の結合分析(binding loop analysis)を行ったものである。クリングルドメイン変異体のそれぞれのループを野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２のアミノ酸配列で突然変異(backmutation)させ、酵母細胞の表面に発現させた後、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＴＮＦαに対する結合能力をフローサイトメトリーで分析し、しかる後に、その結合程度をＭＦＩ(mean fluorescence intensity)で定量化したものである。
【図７０】図７０はクリングルドメイン変異体のループをグラフトする方法の例を模式図として示す。例えば、クリングルドメインのループ５及び６を、三次構造上において反対側に向かいながら、ループ構造が互いに最も似ているループ３及び４へグラフトさせる方法を図式化したものである。
【図７１】図７１は二重結合モノマー(bivalent monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−４と、二重特異性モノマー(bispecific monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−５及びＫＤ５０６−４が標的分子と結合することをサンドイッチＥＬＩＳＡで定量したものである。図７１は抗−ＤＲ４二重結合モノマーＫＤ４１３−４が、底にコートされたＤＲ４と溶液状態のＤＲ４に同時に結合することを示す結果である。
【図７２】図７２は二重結合モノマー(bivalent monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−４と、二重特異性モノマー(bispecific monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−５及びＫＤ５０６−４が標的分子と結合することをサンドイッチＥＬＩＳＡで定量したものである。図７２は抗−ＤＲ４／ＤＲ５二重特異性モノマーＫＤ４１３−５が、底にコートされたＤＲ４と溶液状態のＤＲ５に同時に結合することを示す結果である。
【図７３】図７３は二重結合モノマー(bivalent monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−４と、二重特異性モノマー(bispecific monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−５及びＫＤ５０６−４が標的分子と結合することをサンドイッチＥＬＩＳＡで定量したものである。図７３は抗−ＤＲ５／ＤＲ４二重特異性モノマーＫＤ５０６−４が、底にコートされたＤＲ５と溶液状態のＤＲ４に同時に結合することを示す結果である。対照群としてはＫＤ４１３Ｌ５６、ＫＤ５０６Ｌ５６７、ＫＤ５４８Ｌ５６が使用されたが、いずれもサンドイッチＥＬＩＳＡ結果によって二重結合または二重特異性が無いことを確認した。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【００８９】
実施例１：ヒトクリングルドメインのアミノ酸配列と構造の特性
【００９０】
ヒトには３１個のタンパク質にアミノ酸配列の異なる３９個のクリングルドメインが分布している（参照： Prosite (Hulo N., et al., Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/; SMART (Letunic I., et al., Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/) (Castellino, et al., J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo, et al., J Mol Evol, 40:331-336, 1995)。クリングルドメインを持っている代表的なタンパク質の例には、アポリポタンパク質Ａ（３８種のクリングルドメイン）、血液凝固因子ＸＩＩ（１種のクリングルドメイン）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ、４種のクリングルドメイン）、肝細胞成長因子様タンパク質（４種のクリングルドメイン）、肝細胞成長因子活性化因子、プラスミノゲン（５種のクリングルドメイン）、トロンビン（２種のクリングルドメイン）、組織型プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ、２種のクリングルドメイン）、及びウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子（１種のクリングルドメイン）などがある。
【００９１】
図１はヒトに存在するアミノ酸配列の異なる３９個のクリングルドメインの保存アミノ酸配列を示す。図１に示すように、各クリングルドメインは約８０個のアミノ酸からなり、特定の位置に６個のシステインが保存されており、残りのアミノ酸は様々なアミノ酸が混在している(Cao, et al., Curr.Med.Chem. 12:667-681, 2002)。保存比率によって５つの色に区分し、各アミノ酸部位に存在するアミノ酸を全て表現した。アミノ酸配列が少なく保存された部分には非常に多様なアミノ酸が既に存在しうることを示している。これは、クリングルドメインの典型的な構造的安定性を与えるアミノ酸配列は維持させ（例えば、３つの分子内ジスルフィド結合（ジスルフィド結合パターンは１−６、２−４及び３−５）及び周囲の保存アミノ酸残基）、アミノ酸が相対的に少なく保存された部分にアミノ酸組み合わせライブラリーを構築することができることを示す。
【００９２】
図２はヒト由来クリングルドメインの各残基に最も保存されたアミノ酸及びその保存率を模式的に示した。１００％保存された残基はクリングルドメインの構造的安定性を与えるシステイン残基（Ｃｙｓ１、Ｃｙｓ２２、Ｃｙｓ５１、Ｃｙｓ６３、Ｃｙｓ７５、及びＣｙｓ８０）とシステイン周辺残基である。残りの位置におけるアミノ酸は大部分７０％以上または４０％以上の保存率を示し、３５番残基の最も保存されたアミノ酸がＧｌｙであり、その保存率は３５％程度である。典型的なクリングルドメインの二次元的構造の特性は保存された６個のシステイン残基間のジスルフィド結合によって与えられ、その結合パターンは１−６、２−４及び３−５であるが、すなわちシステイン１番とシステイン８０番との間に、システイン２２番とシステイン６３番との間に、及びシステイン５１番とシステイン７５番との間に形成される(Ikeo, et al., J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino, et al., Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti, et al., Biochemistry, 38:15741-15755, 1999)。保存された６個のシステインは3つのジスルフィド結合を構成してクリングルドメインの構造的安定性を高める(Magnusson, et al., Leiden Universitaire Pers. pp. 25, 1975)。
【００９３】
図３はプラスミノゲンのクリングルドメイン２（ＰＤＢ ＩＤ＝１Ｉ５Ｋ）の三次構造に基づいて、アミノ酸配列が少なく保存されている７個のループを示す。ここで、図３ａ及びｂはプラスミノゲンクリングルドメイン２の二次構造及び３つのジスルフィド結合を示し、図３ｃ及びｄはプラスミノゲンのクリングルドメイン２の表面を示す。抗体のＣＤＲ(complementarity determining region)のように様々な標的分子との高親和度、高特異性を有するタンパク質構造骨格を開発するためには、まず構造的安定性を与える不変のアミノ酸領域があり、その周囲の領域に突然変異が挿入できる柔軟性のあるループ構造を有するタンパク質が最適である。このような側面において、クリングルドメインの折り畳みに基づいて、多様なアミノ酸の組み合わせが挿入できるループ１からループ７までの部分を定めた。ループ１は残基２−１３、ループ２は残基１４−２１、ループ３は２３−３６、ループ４は残基３７−５０、ループ５は残基５２−６２、ループ６は残基６４−７４、ループ７は残基７６−７９である。プラスミノゲンのクリングルドメイン２は、約２６％のβ−プリーツ(β-pleated)構造、約１３％のβ−ターン(β-turn)構造、約１５％の３１螺旋構造、約６％の３１０螺旋構造を有し、プラスミノゲンのクリングルドメイン２の残りは無作為ループの構造的特徴を有する (Marti DN. Et al., Biochemistry, 38:15741-15755, 1999)。
【００９４】
実施例２：クリングルドメイン構造基盤の変異体モノマーの融合によるオリゴマー構築方法、多重特異性のオリゴマー生成方法及び標識分子融合の構築方法
【００９５】
図４はクリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーを構築し、標的分子に特異的に結合するタンパク質骨格モノマーを分離した後のタンパク質骨格モノマーの活用を図式化して示す。図４ａは標的分子に結合して標的分子の生物学的活性を制御することが可能なモノマーとしての活用方法、図４ｂは選別されたモノマーのリンカーによる連結を用いたモノマーの組み合わせによってダイマー、トリマーなどのホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーを生成し、標的分子に高親和度と特異性をもって結合するように活用することが可能な方法を図式的に示す。ヘテロオリゴマーのうち標的分子が異なる場合は、標的分子Ａ、Ｂを同時に認識して標的分子の生物学的活性を新しく調節することができるという利点がある。勿論、標的分子が２種類ではなく、２種類以上になり得る。したがって、多数の標的分子が多重特異的なオリゴマーを製造するために用いられ得る。オリゴマーを構築及び生成した場合は、標的分子に対する親和度がアビディティ(avidity)効果のおかげで増加し、多様な標的分子部位に結合するモノマーの組み合わせによって標的分子の生物学的活性を効率よく調節することができ、モノマーより大きさが大きいため薬物動力学的な側面においても利点がある。図４ｃは、選別されたクリングルドメインを基盤として、標識分子（例えば、６ｘＨｉｓ ｔａｇｓ、Ｃ−ｍｙｃ ｔａｇ、Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒｓ、ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌタンパク質、ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇタンパク質、酵素など）または抗体の不変領域（Ｆｃ）が融合した融合タンパク質を構築してタンパク質骨格モノマーに追加的機能を与える方法を図式的に示す。標識分子がクリングルドメインに融合すると、標識分子の特性がクリングルドメインに付加的に導入されて精製、診断、イメージング、治療などの目的で活用でき、抗体の不変領域を融合させると、精製、イメージングだけでなく、生体内で免疫細胞を誘導して多様な生物学的活性を保有させることができる。また、これらの融合タンパク質は、モノマーより大きさが大きいため、薬物動力学的な側面においても利点がある。図４ｄは前述したように一つの標的分子または２つの標的分子に対して選別されたクリングルドメイン変異体において標的分子と結合する結合ループを分析した後、これらの結合ループを、結合に参与しない他のループに結合して新しい機能を得ることができる。第一に、同じ標的分子に対して選別されたループを用いて多結合モノマーを構築する場合、モノマーのみでアビディティ効果を誘導することができ、１３ｋＤａというタンパク質の分子量を維持することにより、抗体の使用が不可能な様々な薬物伝達体系を試みることができる。第二に、同一または異なる標的分子に対して選別されたループを用いて多重特異性モノマーを構築する場合、各標的分子のみを目的としたときの欠点を克服し、相乗効果を誘導することができる。また、１３ｋＤａというタンパク質の分子量を維持することにより、抗体の使用が不可能な様々な薬物伝達体系を試みることができる。
【００９６】
実施例３：クリングルドメイン構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの構築戦略及び構築
【００９７】
実施例１においてヒトクリングルドメインのアミノ酸配列及び構造的特性を分析した結果に基づいて、クリングルドメインの安定的な構造骨格は維持しながら、ループ１−７部位にアミノ酸突然変異が入り込むようにして、クリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーを構築し、このクリングルドメインライブラリーから、多様な標的分子に特異的に結合して標的分子の生物学的活性を調節するクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体を分離しようとした。このために、クリングルドメインの典型的な構造的安定性を与える不変なアミノ酸配列は維持し（例えば、３つの分子内ジスルフィド結合（ジスルフィド結合パターンは１−６、２−４及び３−５）及び周囲の保存アミノ酸残基）、ジスルフィド結合により生成され、構造的に柔軟性のあるループ構造部分に、自然界に存在しない様々なアミノ酸配列の組み合わせを持つように突然変異体ライブラリーを構築する戦略を立てた。
【００９８】
図５は、ヒトプラスミノゲンのクリングルドメイン２を基盤として、多様な標的分子に特異的に結合することが可能なタンパク質構造骨格として活用するために具体的なクリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーを構築した戦略を図式的に示す。すなわち、ヒトクリングルドメインアミノ酸配列のうち、保存度が最も高く、構造的に最も重要なジスルフィド結合をする６つのシステインを保存した（Ｃ１、Ｃ２２、Ｃ５１、Ｃ６３、Ｃ７５及びＣ８０）。また、クリングルドメインの構造において疎水性核を構成するアミノ酸を保存した（Ｋ４８、Ｎ４９、Ｙ５０、Ｃ５１、Ｒ５２、Ｎ５３、Ｐ５４、Ｄ５５、Ｐ６１、Ｗ６２、Ｃ６３、Ｆ６４、及びＴ６５）(Marti, et al., Biochemistry 38:15741-15755, 1999)。これと共に、保存度が高いと判断されるＧ６、Ｙ９、Ｄ１０、Ｇ１１、Ｔ１６、Ｇ１９、Ｑ２３、Ｗ２５、Ｐ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｇ３４、Ｅ７３、Ｌ７４、Ｐ７８及びＲ７９のアミノ酸を保存した。最後に、目的物質に対する特異的親和度のみを有するタンパク質構造骨格を構築するために、クリングルドメインが元々持っている結合能力を除去しなければならない。Ｙ３６、Ｉ３７、Ｄ５５、Ｒ５６、Ｅ５７、Ｗ６２、Ｃ６３、Ｆ６４、Ｒ７１、Ｗ７２、Ｅ７３及びＬ７４のようなアミノ酸残基が形成した結合部位にリシン（Ｌｙｓ）またはその類似体(analog)物質が結合する(Marti, et al, Biochemistry 38:15741-15755, 1999)。前記アミノ酸残基において、Ｄ５５、Ｗ６２、Ｃ６３、Ｆ６４、Ｅ７３、Ｌ７４を除いた残り部分を全て変えた。結論的に、突然変異が誘導されるようにしたアミノ酸残基番号は２、３、４、５、７、８、１２、１３、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２４、２６、２７、２８、２９、３２、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５６、５７、５８、５９、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７６及び７７であった。総４５個のアミノ酸残基に突然変異が誘導されるようにした。
【００９９】
クリングルドメインの構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリー構築の目的は、多様な標的分子に高親和度をもって特異的に結合する突然変異体が分離されるようにすることにある。すなわち、標的分子となる生体高分子（タンパク質／核酸／脂質／炭水化物など）及び小分子(small molecules)などに特異的に結合しなければならない。このために、元々抗体が体細胞超変異(somatic hypermutation)の際に多く追加されるアミノ酸Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇを含み、分子間非共有結合（水素結合、イオン結合、疎水性結合など）をすることが可能なアミノ酸が各突然変異部位に取り込まれるようにライブラリーを構築しようとした。このために、クリングルドメインの各残基に変異されるアミノ酸はトリプレットＮＭＣとＶＲＧが交互に取り込まれるようにする。トリプレットＶＲＧは一番目にＶ（Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧ）、二番目にＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）、三番目にＧ）をコードし、これによりＧｌｎ（１／５挿入確率）、Ａｒｇ（２／５挿入確率）、Ｌｙｓ（１／５挿入確率）、Ｇｌｕ（１／５挿入確率）、Ｇｌｙ（１／５挿入確率）の５つのアミノ酸で置換できる。トリプレットＮＭＣは一番目にＮ（Ｎ＝Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ）、二番目にＭ（Ｍ＝ＡまたはＣ）、三番目にＣ）をコードし、Ｓｅｒ（１／８挿入確率）、Ｔｙｒ（１／８挿入確率）、Ｐｒｏ（１／８挿入確率）、Ｈｉｓ（１／８挿入確率）、Ｔｈｒ（１／８挿入確率）、Ａｓｎ（１／８挿入確率）、Ａｌａ（１／８挿入確率）、Ａｓｐ（１／８挿入確率）の８つのアミノ酸を同一の確率で置換されるようにすることができる。このようなアミノ酸代替ライブラリー構築戦略は、多様な物理化学的特性を有するアミノ酸が置換できるため、多様な標的分子に特異的に結合することが可能なクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格ライブラリーを提供することができる。
【０１００】
クリングルドメインライブラリーを構築するために８つのプライマーを製作して使用した（表5）。８つのプライマーはいずれも、融解温度（Ｔｍ）５５℃以上の重なり部分を持っている。８つのプライマー（配列番号１〜８）を用いてオーバーラッピングＰＣＲを行ってクリングルドメインライブラリー発現ベクターを構築した（図６）(Lee HW. et al., Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006)。クリングルドメインライブラリーの遺伝子を増幅させるために正方向プライマー（配列番号９）と逆方向プライマー（配列番号１０）を用いて増幅した。
【０１０１】
ヒトクリングルドメインライブラリーが酵母表面発現ベクターと相同性組み換え(homologous recombination)メカニズムによって酵母に形質転換されるようにするために、増幅されたヒトクリングルドメイン発現ベクター（１０μｇ／μｌ）とヒトクリングルドメイン酵母表面発現ベクター(pCTCON, Colby, et al., Methods enzymol, 388:248-258)（１μｇ／μｌ）を同時に混ぜて、酵母に対して電気形質転換（エレクトロポレーション）を１０回繰返し行ってライブラリーを構築した(Lee HW. et al., Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006; Kim YS. et al., Proteins: structure, function, and bioinformatics, 62:1026-1035, 2006)。クリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーのサイズは、階段式希釈を行った後、選択培地で成長したコロニーの数を測定することにより、２×１０６セルであることを確認した。
【０１０２】
【表５】
0005616890.tif 000006
【０１０３】
表５はクリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーを構築するために使用されたオリゴヌクレオチド塩基配列を示す。
【０１０４】
実施例４：クリングルドメイン構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの分析
【０１０５】
プラスミノゲンのクリングルドメイン２遺伝子を骨格として構築されたタンパク質骨格ライブラリーが計画のとおり構築されたかを確認するために、構築された酵母ライブラリーで形質転換された酵母表面発現ベクターを無作為に回収し、挿入されたクリングルドメインのヌクレオチド配列を分析した(Lee HW. et al, Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006; Kim YS. et al., Proteins: structure, function, and bioinformatics, 62:1026-1035, 2006)。ヌクレオチド配列は正方向プライマー（配列番号１１＝５’−ＧＴＴ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＴ ＣＴＧ ＣＡＧ Ｇ−３’）と逆方向プライマー（配列番号１２＝５’−ＧＡＴ ＴＴＴ ＧＴＴ ＡＣＡ ＴＣＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＴＴＧ−３’）を用いて分析し、アミノ酸配列は正規コードによって決定した。意図されたライブラリー構築方法によってクリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーが持つことが可能なヌクレオチド塩基配列は配列場号１３に示した。クリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーから無作為に選定してヌクレオチド配列を決定したクローンの塩基配列は配列番号１４〜１８である。配列番号１４〜１８はクリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーが持つことが可能なヌクレオチド配列に含まれ、クリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの一部のヌクレオチド配列分析によってクリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーが計画のとおり構築されたことを確認した。
【０１０６】
【表６】
0005616890.tif 000007
【０１０７】
表６はクリングルドメインの構造を基盤として構築されたタンパク質骨格ライブラリーの塩基配列の分析を示す。
【０１０８】
実施例５：様々な標的分子の準備
【０１０９】
実施例４において構築されたクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格ライブラリーから多様な標的分子に特異的に結合するモノマーが分離及び選別できるか否かを研究した。モデル標的分子はヒト由来細胞死受容体５(death receptor 5)（ＴＲＡＩＬ−受容体２（以下「ＤＲ５」という）、細胞死受容体４(death receptor 4)（ＴＲＡＩＬ−受容体１、以下「ＤＲ４」という）、及びＴＮＦαを使用した。
標的分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦα）に対する発現及び精製は、本出願人によって既に発表された論文に詳細に記述されている(Lee HW. et al, Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212; Kim MS. et al., J Mol Biol, 374:1374-1388, 2007)。標的分子ＤＲ４はＤＲ４の細胞外ドメイン（アミノ酸残基１−２１６）をバクテリア発現ベクターにインフレームにて制限酵素ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いてクローニングした(Lee HW. et al., Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212)。この際、バクテリア発現ベクターはＴ７プロモーター−ＤＲ４−６ｘＨｉｓ ｔａｇを持つようにデザインした（ｐＣＲＴ７ＮＴ−ＴＯＰＯ）。標的分子ＤＲ５はＤＲ５の細胞外ドメイン（アミノ酸残基１−１３０）をバクテリア発現ベクターにインフレームにて制限酵素ＮｈｅＩ／ＸｈｏＩを用いてクローニングした(Lee HW. et al., Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212)。この際、バクテリア発現ベクターはＴ７プロモーター−ＤＲ５−６ｘＨｉｓ ｔａｇを持つようにデザインした（ｐＥＴ２１ｂ、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ））。標的分子ＴＮＦαは、ＴＮＦαの細胞外ドメイン（アミノ酸残基１−１５７）をバクテリア発現ベクターにインフレームにて制限酵素ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いてクローニングした(Kim MS. et al., J Mol Biol, 374:1374-1388, 2007)。この際、バクテリア発現ベクターはＴ７プロモーター−ＴＮＦα−６ｘＨｉｓ ｔａｇを持つようにデザインした（ｐＥＴ２３ｄ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）。
【０１１０】
発現は、全ての目的の物質に対して同一の方法を使用した。大腸菌を３７℃でＯ．Ｄ．６００＝０．６程度培養した後、タンパク質発現のために１ｍＭ ＩＰＴＧ(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）を添加した後、３０℃で１０時間さらに培養した。遠心分離機（Ｍｅｇａ ２１Ｒ、Ｈａｎｉｌ、韓国）を用いて大腸菌を集めた後、超音波を用いて（ＳＯＮＩＣＳ、Ｖｉｂｒａ ＣｅｌｌＴＭ、ＵＳＡ）大腸菌を粉砕した。遠心分離機（Ｍｅｇａ ２１Ｒ、Ｈａｎｉｌ、韓国）を用いて大腸菌粉砕物を除去した上澄み液のみを得てｈｉｓ−ｔａｇタンパク質を特異的によく精製するＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用した。精製された目的物質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で、ＤＲ４が約１６ｋＤａ、ＤＲ５が約１６ｋＤａ、ＴＮＦαが約１７ｋＤａの分子量をそれぞれ示し、９０％以上の純度で精製された。
【０１１１】
精製された目的物質、例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαの活性を確認するために、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ２０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｃｏ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて、ＤＲ４、ＤＲ５はＴＲＡＩＬとの親和度の検証により活性を確認し、ＴＮＦαはＲＥＭＩＣＡＤＥ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ、Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）との親和度の検証によって活性を確認した。
【０１１２】
実施例６：クリングルドメイン構造を基盤としたタンパク質骨格ライブラリーからの様々な標的分子に特異的に結合するモノマーの分離（抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメインの選別）
【０１１３】
クリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーから目的物質としてのＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαに特異的高親和度(high specific affinity)を示すクリングルドメインを選別するために、実施例５で精製した目的物質のＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαをビオチン化させた後（ＥＺ−ＬＩＮＫＴＭＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））、酵母細胞の表面に発現されたクリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーと３７℃で１時間反応させた。ビオチン化された目的物質と反応した酵母細胞の表面に発現されたクリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーをＡｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ ＭＡＣＩＢｅａｄＴＭ（１３０−０９１−１４７、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）と４℃で２０分間反応させた後、ＭＡＣＳ(magnetic activated cell sorting)を用いて目的物質のＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαに高親和度を有するクリングルドメインを酵母細胞の表面に発現した酵母を濃縮した。次いでＭＡＣＳを順次３回行った後、ＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)を順次３回行った。ＦＡＣＳは次の過程によって行われた。バクテリアから精製された目的物質のＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαをビオチン化させた後（ＥＺ−ＬＩＮＫＴＭ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ））、二次にＰＥが結合されたストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳＡ−ＰＥ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＵＳＡ））を付けてＦＡＣＳ(fluorescence activated cell sorting)によって分析した。
【０１１４】
クリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーがｃ−ｍｙｃ ｔａｇを持って酵母細胞の表面に発現するようにして１次にマウス由来抗ｃ−ｍｙｃ ９ｅ１０ｍＡｂ（Ｉｇ Ｔｈｅｒａｐｙ、韓国）に結合させ、二次にＦＩＴＣが結合された抗マウス抗体（ＦＩＴＣ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ、Ｓｉｇｍａ）を用いて染色してクリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーの発現程度を測定した。
【０１１５】
クリングルドメイン突然変異体ライブラリーを用いてＭＡＣＳとＦＡＣＳを順次行うことにより、目的物質、すなわちＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαに特異的高親和度を有するクリングルドメイン突然変異体クローンを選別するために、各ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳを行った後、１００ｎＭのビオチン化させた標的分子を用いて親和度をＦＡＣＳによって分析した。対照群としてプラスミノゲンクリングルドメイン２と選別前のタンパク質骨格ライブラリーに対しても分析した。
【０１１６】
前述したような高速選別方法によって各標的分子に高親和度特異性の高いクローンを濃縮した後、最終的に個別クローンを得た(Lee HW. et al., Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212; Kim MS. et al., J Mol Biol, 374:1374-1388, 2007)。
【０１１７】
標的分子ＤＲ４に特異的高親和度を示すクリングルドメイン突然変異体クローンＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６、ＫＤ４５９が分離された。
標的分子ＤＲ５に特異的高親和度を示すクリングルドメイン突然変異体クローンＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５、ＫＤ５５８、ＫＤ５５９が分離された。
【０１１８】
標的分子ＴＮＦαに特異的高親和度を示すクリングルドメイン突然変異体クローンＫＲＴ０１、ＫＲＴ０２、ＫＲＴ０８、ＫＲＴ２６が分離された。
各標的分子に特異的高親和度を示す酵母クローンからプラスミドを回収してクリングルドメイン突然変異体の核酸塩基配列とアミノ酸配列を決定した。塩基配列は正方向プライマー（配列番号１１）と逆方向プライマー（配列番号１２）を用いて分析し、アミノ酸配列は正規コードによって決定した。
【０１１９】
表６は各標的分子ＤＲ４、ＤＲ５及びＴＮＦαに対して選別された個別クローンのアミノ酸配列と保存されたアミノ酸配列を整頓したものである。クリングルドメインを基盤としたタンパク質骨格ライブラリーの構築戦略によれば、アミノ酸変異が無作為に行われる場合、各アミノ酸がＸ部位で１２．５％、Ｚ部位で１６．７％の確率で現れなければならない（図４）。ところが、表６に示すように、無作為にアミノ酸変異が行われる場合よりは高い確率で傾向性を示すアミノ酸部位が存在する。
抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体のアミノ酸配列分析に基づいてＮ末端糖化(N-glycosylation)分析の結果、ＫＤ４０４が一つのＮ末端糖化部位を持っていた。抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体のアミノ酸配列分析に基づいて分析した等電点（ｐＩ）はいずれもクローンで約ＰＨ８．０の範囲を持っている（Ｅｘｐａｓｙ分析、Ｗｅｂページ：www.expasy.org）。
【０１２０】
実施例７：抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の発現及び精製
【０１２１】
クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体のうち、抗−ＤＲ４突然変異体（ＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６、ＫＤ４５９）、抗−ＤＲ５突然変異体（ＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５、ＫＤ５５９）、及び抗−ＴＮＦα変異体（ＫＤＴ２６、ＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８）を酵母ピキアパストリス(pichia pastoris)発現ベクター（ｐＰＩＣＺａＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にインフレーム(in-frame)にて制限酵素ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩを用いてクローニングした。この際、ピキアパストリス酵母発現ベクターはＡＯＸ３プロモーター−Ｍｆａ分泌標的化配列−クリングルドメイン−ｍｙｃ ｔａｇ−６ｘ Ｈｉｓ ｔａｇを持つようにデザインされた（ｐＰＩＣＺａＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）。
【０１２２】
発現は、酵母（ピキアパストリス−ＧＳ１１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を３０℃でＢＭＧＹ(buffered complex glycerol)（１％酵母抽出液（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）＋２％ペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）＋１．３４％酵母ナイトロジェンベース（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）＋１００ｍＭ ｐＨ６．０リン酸カリウム（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）＋１％グリセロール（ＢＩＯ ＢＡＳＩＣ Ｉｎｃ．，Ｃａｎａｄａ））培地でＯＤ６００＝１５〜２０程度に培養した後、タンパク質発現のためにＢＭＭＹ(buffered complex methanol)（１％酵母抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）＋２％ペプトン（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｎｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）＋１．３４％酵母窒素塩基（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）＋１００ｍＭ ｐＨ６．０リン酸カリウム（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）＋０．５％メタノール（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ＵＳＡ））培地で２４時間毎に０．５％メタノールを追加しながら３日間培養した。精製は上澄み液から行い、６ｘＨｉｓ−ｔａｇタンパク質を特異的によく精製するＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を使用した。
【０１２３】
図７〜１２は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングル突然変異体クローン、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングル突然変異体クローン、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図７、図９及び図１１）または非還元性（図８、図１０及び図１２）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。クリングルドメインは９８％以上の純度で精製された。精製されたクリングルドメインは、還元性、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で全て約１３ｋＤａの分子量を示した。これは発現精製されたクリングルドメインが溶液状態でモノマーとして存在し、非自然的なジスルフィド結合によってダイマーまたはオリゴマーを形成しないことを示す。クリングルドメインの濃度及び量はＢｒａｄｆｏｒｄ及びＢＣＡを用いて定量した。
【０１２４】
図１３〜図１５は、ＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)（Ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｄｕｌｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）によって抗−ＤＲ４、−ＤＲ５及び−ＴＮＦαクリングルドメインがモノマーとして存在することを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Size exclusion chromatography column)（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ＧＣ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実験した結果である。溶出バッファはＰＢＳ（ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）であり、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎである。タンパク質サイズマーカーとして使用されたタンパク質はアルブミン（６６ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、キモトリプシノゲン（２５ｋＤａ）、リボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）である。全てのクリングル突然変異体のクローンで１つの極点が測定され、これは抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメインがモノマーとして存在することを示す。
【０１２５】
実施例８：抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαのクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の親和度及び交差反応性の測定と結合部位の分析
【０１２６】
抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の標的分子に対する親和度と交差反応性を測定するために、ＥＬＩＳＡ(enzyme linked immunosorbent assay)を行った。標的分子ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦα及びＤｃＲ１、ＤｃＲ２を９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎ．，ＵＳＡ）に１時間３７℃で結合させた後、０．１％ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間３回洗浄する。１％ＰＢＳＢ（１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）で１時間結合した後、０．１％ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸塩、２．７ｍＭ ＫＣｌ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ ｃｏ．，ＵＳＡ）で１０分間３回洗浄する。抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体を結合させた後、０．１％ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄する。一次的にマウス由来抗ｃ−ｍｙｃ ９ｅ１０ｍＡｂ（Ｉｇ Ｔｈｅｒａｐｙ、韓国）に結合させ、二次的にはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が結合された抗マウス抗体（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ、Ｓｉｇｍａ）と結合させる。ｐＮＰＰ(p-nitrophenyl palmitate)（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ ｃｏ．，ＵＳＡ）と反応させて４０５ｎｍの吸光度を定量した。
【０１２７】
図１６〜図１８は、標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。図１６は標的分子ＤＲ４に対して選別されたクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。親和度は２９０ｎＭ〜３７９４ｎＭの水準で測定された。図１７は標的分子ＤＲ５に対して選別されたクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＳＩＡで定量したものである。親和度は２９４ｎＭ〜５３９６ｎＭの水準で測定された。図１８は標的分子ＴＮＦαに対して選別されたクローンの親和度をＥＬＩＳＡで定量したものであり、親和度は２９ｎＭ〜３８２９ｎＭの水準で測定された。
【０１２８】
図１９〜図２１は標的分子ＤＲ４に対して選別されたＫＤ４０４、ＫＤ４０８、ＫＤ４０９、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４２１、ＫＤ４３７、ＫＤ４４５、ＫＤ４５６及びＫＤ４５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＤＲ５に対して選別されたＫＤ５０２、ＫＤ５０３、ＫＤ５０５、ＫＤ５０６、ＫＤ５０９、ＫＤ５３７、ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５５及びＫＤ５５９クリングルドメイン突然変異体、標的分子ＴＮＦαに対して選別されたＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８及びＫＤＴ２６クリングルドメイン突然変異体の交差反応性をＥＬＩＳＡで定量したものである。図１９は標的分子ＤＲ４に対して選別されたクローンのＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤＲ４及びＤＲ５に対する反応性をＥＬＩＳＡで定量したものである。大部分のクローンが標的分子ＤＲ４に特異的に結合した。ＫＤ４０４はＤｃＲ１、ＤＲ５に対して強い交差反応性を有し、ＫＤ４４９は異なる標的分子に対して弱い交差反応性を有する。これはＤＲ４に対して選別されたクリングルドメイン突然変異体の大部分が標的分子にのみ結合し、他の分子には結合力がないか或いは非常に弱いため、交差反応性は無いことを示唆する。図２０は標的分子ＤＲ５に対して選別されたクローンのＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤＲ４及びＤＲ５に対する反応性をＥＬＩＳＡで定量したものである。大部分のクローンが標的分子ＤＲ５に特異的に結合した。ＫＤ５４２、ＫＤ５４８、ＫＤ５５９は異なる標的分子に対して交差反応性を有した。これはＤＲ５に対して選別されたクリングルドメイン突然変異体が標的分子にのみ結合し、他の分子には結合力がないか或いは非常に弱いため、交差反応性はないことを示唆する。          
【０１２９】
図２１は標的分子ＴＮＦαに対して選別されたクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ０１、ＫＤＴ０２、ＫＤＴ０８、ＫＤＴ２６のＴＮＦα、ＤＲ４及びＤＲ５に対する反応性をＥＬＩＳＡで定量したものである。全ての抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体は標的分子ＴＮＦαに特異的に結合した。これはＴＮＦαに対して選別されたクリングルドメイン突然変異体が標的分子にのみ結合し、他の分子には結合力がないか非常に弱いため、交差反応性はないことを示唆する。
【０１３０】
図２２〜図２７は、抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の結合部位(binding site)を比較するために、ＴＲＡＩＬなどの標的分子に対して選別されたそれぞれのクリングルドメイン突然変異体に対して競争的ＥＬＩＳＡによってそれぞれの結合部位を分析したものである。図２２、図２３、図２４及び図２５は競争的ＥＬＩＳＡによってＴＲＡＩＬと抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体との結合部位を比較した結果である。図２２は抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３がＴＲＡＩＬとは異なる結合部位を持っていることを示唆する。図２３は抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１５がＴＲＡＩＬとは異なる結合部位を持っていることを示唆する。図２４は抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６がＴＲＡＩＬとは異なる結合部位を持っていることを示唆する。図２５は抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５４８がＴＲＡＩＬとは結合部位を一部共有することを示唆する。図２６は抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３とＫＤ４１５が互いに結合部位を共有しないことを示唆する。図２７は抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６とＫＤ５４８が互いに結合部位を共有しないことを示唆する。
【０１３１】
実施例９：抗−ＤＲ４、抗−ＤＲ５、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の二次構造の分析及び熱力学的安定性の評価
【０１３２】
抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の標的分子に対する二次構造を分析するために、Ｆａｒ−ＵＶ ＣＤスペクトル（１９０〜２６０ｎｍ）を用いて分析した。抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体はｐＨ７．４ＰＢＳで１００μｇ／ｍＬの濃度で０．１ｃｍの長い石英製のキュベット(quartz cuvette)に入れてＪ−７１５分光偏光計(J-715 spectropolarimeter)（Ｊａｓｃｏ Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）を用いて０．５ｎｍの間隔で１９０ｎｍ〜２６０ｎｍの波長の範囲で測定した。対照群としてはｐＨ７．４ＰＢＳを用いてグラフを補正し、４回重複測定によって平均グラフを得た。
図２８は円偏光二色性分析（ＣＤ）を用いて野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２と抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６の二次構造を分析した結果である。選別されたクリングルドメイン突然変異体は、野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２と類似のスペクトルを示し、２０２〜２０５ｎｍ領域で負の最大頂点を有し、２２０ｎｍで弱い陰の変曲点を有する。      
【０１３３】
このようなＣＤのスペクトルは、典型的な無作為的構造と弱いプリーツ構造を示す。また、広範囲なループ地域に多くの突然変異が起こったにも拘らず、野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２と類似の２次構造を維持することが分かる。
【０１３４】
抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の標的分子に対する熱力学的安定性を評価するために、ＥＬＩＳＡと示差走査熱容量分析器（Differential Scanning Calorimetry、ＤＳＣ）を使用した。熱力学的ストレスが抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の標的分子結合能力に与える影響を評価するために、抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体を３７℃と５０℃で１日間隔で１４日間熱力学的ストレスを与えた。熱力学的ストレスを受けた抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の結合能力は、実施例８で言及された方法と同一の方法でＥＬＳＩＡによって測定された。図２９は熱力学的ストレスの下で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の結合能力をＥＬＩＳＡによって測定した結果である。その結果は、最初結合能力の８４％以上を維持することを示す。
【０１３５】
抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体が熱力学的ストレスの下に結合能力を維持するという事実を裏付けるために、示差走査熱容量分析によって最大熱容量温度（Ｔｍ）を分析した。熱力学的変性は４℃〜９０℃の範囲で１℃／ｍｉｎの速度で測定した。クリングルドメイン突然変異体を除いた同一のバッファ組成を用いて測定値を補正した。抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の最大熱容量温度は、比熱（maximal heat capacity at constant pressure、Ｃｐ）の温度で測定され、これを転換したものである(Chang Y. et al., Biochemistry 36(25):7652-7663)。
【０１３６】
図３０は野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２と抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の示差走査熱容量分析結果と最大熱容量温度を示す。各最大熱容量温度は、野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２の場合には４９．８℃、抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３は５０．５℃、ＫＤ４１５は４６．７℃、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６は４９．８℃、ＫＤ５４８は５７．２℃、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６は５１．９℃とそれぞれ測定された。図３０は、広範囲なループ領域に多くの突然変異が起こったにも拘らず、野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２と類似の熱力学的安定性を有することを示唆する。
【０１３７】
実施例１０：Ｆｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメインの発現及び精製
【０１３８】
実施例７で説明したクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格変異体のうち抗−ＤＲ４突然変異体（ＫＤ４１３、ＫＤ４１５）、抗−ＤＲ５突然変異体（ＫＤ５０６、ＫＤ５４８）、及び抗−ＴＮＦα変異体（ＫＤＴ２６）が含まれた酵母ピキアパストリス発現ベクター（ｐＰＩＣＺａＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）にインフレーム(in-frame)にて制限酵素ＡｆｌＩＩ／ＸｂａＩを用いてヒト免疫グロブリンＧ１のヒンジからＦｃドメイン部分をクローニングした（ｐＰＩＣＺａＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）。
発現は、実施例７で説明したものと同様に行われた。精製は、上澄み液から精製を行い、Ｆｃタンパク質を特異的によく精製するタンパク質Ａ−セファロースＦＦカラム（ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）を使用した。
【０１３９】
図３１〜図３４はクリングルドメイン突然変異体とヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃドメイン融合体の模式図及びダイマーとして存在することを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ結果である。図３１はＦｃ融合クリングルドメイン突然変異体の模式図を示し、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）として作用することを示す。図３２及び図３３は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦα Ｆｃ融合クリングル突然変異体を精製した後、還元性（図３２）または非還元性（図３３）の条件で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析したものである。Ｆｃ融合クリングルドメインは９８％以上の純度で精製された。精製されたクリングルドメインは還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でいずれも約３８ｋＤａ、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でいずれも約７６ｋＤａのサイズを示した。これは発現精製されたＦｃ融合クリングルドメインが溶液状態でダイマーとして存在し、ヒンジ領域のジスルフィド結合によってダイマーを良く形成することを示す。Ｆｃ融合クリングルドメインの濃度及び量はＢｒａｄｆｏｒｄ及びＢＣＡによって定量した。
【０１４０】
図３４はＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)（Ｔｈｅ Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）によって抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦα Ｆｃ融合クリングルドメインがダイマーとして存在することを確認するために、サイズ排除クロマトグラフィーカラム(Size exclusion chromatography clumn)（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００ １０／３００ＧＣ、ＧＥ  Ｈａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実験した結果である。実験条件は実施例７と同様である。タンパク質サイズマーカーとして、アルコールデヒドロゲナーゼ（１５０ｋＤａ）、オボアルブミン（４５ｋＤａ）、キモトリプシノゲン（２５ｋＤａ）、リボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）を使用した。全てのＦｃ融合クリングル突然変異体のクローンで一つの極点が測定され、これはＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメインがダイマーとして存在することを示す。
【０１４１】
実施例１１：Ｆｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメインの親和度の分析
【０１４２】
Ｆｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメインと標的分子間の親和度を分析するために、実施例８で言及された方法と同様にＥＬＩＳＡによって分析した。
図３５〜図３９は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体とＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体の親和度をＥＬＩＳＡによって測定した結果である。図３５〜図３９のＥＬＩＳＡ結果によって測定されたＦｃ融合抗−ＤＲ４、−ＤＲ５、−ＴＮＦαクリングルドメインの親和度は、ＫＤ４１３−Ｆｃが６０±８ｎＭ、ＫＤ４１５−Ｆｃが５３±６ｎＭ、ＫＤ５０６−Ｆｃが４３±６ｎＭ、ＫＤ５４８−Ｆｃが５８±５ｎＭ、ＫＤＴ２６−Ｆｃが３．８±０．４ｎＭである。
【０１４３】
実施例１２：抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のインビトロ生物学的活性の同定
【０１４４】
精製された抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体の細胞死評価のために、癌細胞株のうちＴＲＡＩＬ−感受性細胞株ＨＣＴ１１６（Human Colorectal Carcinoma cell line、大腸癌細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４７））、Ｈ４６０（Human NSCLS Cell lines、肺癌細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１７７））、Ｊｕｒｋａｔ（Human acute T cell leukemia cell line、血液癌細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２））、ＨＬ６０（Human acute promyelocytic leukemia cell line、血液癌細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０））、ＴＲＡＩＬ抵抗性細胞株Ｕ８７ＭＧ（Human glioblalioma cell line、脳癌細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１４））、ＨｅｐＧ２（Human carcinoma hepatocell line、肝癌細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＨＢ−８０６５））をモデルとして、抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体（０．００１〜５μＭ）を処理した後、ＭＴＴアッセイによって細胞死を評価した(Park KJ. et al., Cancer Research, 67:7327-7334, 2007, Orogen N. et al., Cancer Research, 60(22):6259-6265, 2000)。
【０１４５】
付着性細胞株のＨＣＴ１１６、Ｈ４６０、Ｕ８７ＭＧ、ＨｅｐＧ２細胞株を培養容器(T-flask)から分離するために、ＴＥ(trypsin-EDTA)バッファを１ｍＬ処理した後、１０％のウシ胎仔血清アルブミン（ＦＢＳ(fatal vobine serum albumin)、ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．，ＵＳＡ）が含有されたＤＭＥＭ(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．，ＵＳＡ）培地５ｍＬでＴＥの反応を止め、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１０％ウシ胎仔血清アルブミン（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．，ＵＳＡ）が含有されたＤＭＥＭ(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．，ＵＳＡ）培地で再び懸濁した後、９６ウェルプレートにウェル当たり細胞を１×１０４個ずつ分注して２４時間３７℃で５％ＣＯ２の培養器で培養した後、ＭＴＴ分析に使用した。エンリッチメント細胞株のＪｕｒｋａｔ、ＨＬ６０細胞株は１０％ウシ胎仔血清アルブミン（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏ．，ＵＳＡ）が含有されたＲＰＭＩ１６４０(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)（Ｗｅｌｇｅｎｅ、ＵＳＡ）培地で再び懸濁した後、９６ウェルプレートにウェル当たり細胞を１×１０４ずつ分注して２４時間３７℃で５％ＣＯ２の培養器で培養した後、ＭＴＴ分析に使用した。
【０１４６】
図４０〜図４６は抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のうち生物学的活性を有する抗−ＤＲ４、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ４１３−Ｆｃ、ＫＤ４１５−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤ５０６−Ｆｃ、ＫＤ５４８−Ｆｃ（０．００１〜５μＭ）によって６０時間培養した後、ＨＣＴ１１６（図４０）、Ｈ４６０（図４１）、Ｕ８７ＭＧ（図４２）、ＨｅｐＧ２（図４３）、Ｊｕｒｋａｔ（図４４）、ＨＬ６０（図４５）に濃度依存的に細胞死が引き起こされることをＭＴＴアッセイで分析した結果を示す。同一の時間培養した野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２（ＰｇｎＫＤ２）処理対照群は細胞死が観察されていない（図４６）。また、同一の時間培養したＴＲＡＩＬ処理対照群はＴＲＡＩＬ感受性細胞株のＨＣＴ１１６、Ｈ４６０、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０でのみ細胞死が観察された（図４６）。各細胞株に対するＥＣ５０（細胞死５０％を達成するタンパク質濃度）は次のとおりであり、ＨＣＴ１１６、Ｈ４６０、Ｕ８７ＭＧ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ６０の順である。ＫＤ４１３は５．３±０．２μＭ、５．９±０.５μＭ、０．９±０．２μＭ、０．０９±０．０３μＭ、１．４±０．２μＭであり、ＫＤ４１５は１１．０±０．９μＭ、５．３±０．４μＭ、４．９±０．６μＭ、０．２±０．１μＭ、０．１３±０．０２μＭであり、ＫＤ４１３−Ｆｃは０．３８±０．０８μＭ、０．２２±０．０６μＭ、０．１４±０．０４μＭ、０．０６±０．０１μＭ、０．０２±０．０１μＭであり、ＫＤ４１５−Ｆｃは０．１８±０．０４μＭ、０．２０±０．０８μＭ、０．２０±０．０５μＭ、０．０８±０．０１μＭ、０．０６±０．０１μＭであり、ＫＤ５０６は６．３±０．５μＭ、１０．４±１．４μＭ、５．８±０．６μＭ、０．２±０．１μＭ、０．２１±０．０１μＭであり、ＫＤ５４８は９．３±０．８μＭ、９．９±０．７μＭ、４．６±０．４μＭ、０．３±０．１μＭ、０．２６±０．０２μＭであり、ＫＤ５０６−Ｆｃは０．０８±０．０３μＭ、０．２３±０．０５μＭ、０．２０±０．０６μＭ、０．０８±０．０１μＭ、０．２３±０．０４μＭであり、ＫＤ５４８−Ｆｃは０．５２±０．０６μＭ、０．４５±０．０４μＭ、０．４０±０．０６μＭ、０．０７±０．０１μＭ、０．２２±０．０４μＭである。この結果は標的分子に特異的に選別されたクリングルドメイン突然変異体が標的分子に結合して生物学的活性を示すことができることを示す。また、実施例８で記述したように同じ抗原に対して互いに異なる結合部位を持っているため、互いに異なる結合部位を有するクリングルドメイン突然変異体を共に処理する場合に相乗効果を得ることができる。図４０〜図４６に示すように、抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３とＫＤ４１５を共に処理する場合、相乗効果により１０〜１００倍増進されたＥＣ５０を示す。ＨＣＴ１１６、Ｈ４６０、Ｕ８７ＭＧの三つの細胞株におけるＥＣ５０は０．０５３±０．００５μＭ、０．０６６±０．００４μＭ、０．１２１±０．００８μＭである。抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６とＫＤ５４８を共に処理する場合、相乗効果により１０〜１００倍増進されたＥＣ５��を示す。ＨＣＴ１１６、Ｈ４６０、Ｕ８７ＭＧの三つの細胞株におけるＥＣ５０は、０．０２１±０．００２μＭ、０．０６４±０．００５μＭ、０．１４２±０．０１２μＭである。
【０１４７】
図４７及び図４８は抗−ＤＲ４、抗−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体による細胞死が精製されたＤＲ４及びＤＲ５により抑制されることをＭＴＴアッセイで評価した結果を示す。これは抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体による細胞死が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５によることを示す。抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６、ＫＤ５４８ １μＭを大腸菌で精製したＤＲ４、ＤＲ５ １０μＭと１時間反応させた後、前述したＨＣＴ１１６、Ｈ４６０細胞株に処理し、４０時間後にＭＴＴアッセイで分析した。野性型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを対照群として使用した。野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２は、ＤＲ４、ＤＲ５を問わず細胞死を誘導することができず、ＴＲＡＩＬはＤＲ４、ＤＲ５がある場合に部分的に細胞死が阻害された。抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５はＤＲ４によってのみ細胞死が阻害された。抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６はＤＲ５によってのみ細胞死が阻害された。ところが、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５４８はＤＲ４、ＤＲ５の両方とも結合能力があって（図２０）、ＴＲＡＩＬのようにＤＲ４、ＤＲ５がある場合、いずれも部分的に細胞死が阻害された。
【０１４８】
図４９〜図５４はエンリッチメント細胞株のＢＪＡＢ細胞株（ヒトＢリンパ球、Ｂ細胞リンパ腫）、ＤＲ５を完全不活性化したＢＪＡＢ ＤＲ５−／−細胞株、Ｈ４６０細胞株、ＤＲ４を過発現させたＨ４６０細胞株で抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体のＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ４、ＤＲ５と結合する程度を、実施例６で説明した方法でＦＡＣＳによって測定した結果を示す。図４９及び図５０はＤＲ５が完全に不活性化された場合、抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３及びＫＤ４１５は細胞表面の結合程度がそのまま維持されることが分かるが、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６及びＫＤ５４８は細胞表面の結合程度が減少する。これにより、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６及びＫＤ５４８が細胞表面のＤＲ５に特異的に結合することを示す。図５１ 及び図５２は、ＤＲ４が過発現される場合、抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５は細胞表面の結合程度が増加するが、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５０６、ＫＤ５４８は細胞表面の結合程度が維持されるので、細胞表面のＤＲ４に特異的に抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５が結合することを示す。図５３は図４９及び図５０を図式化したグラフであり、図５４は図５１及び図５２を図式化したグラフである。
【０１４９】
実施例１３：抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造を基盤としたタンパク質骨格突然変異体の細胞死メカニズムの分析
【０１５０】
抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造を基盤としたタンパク質骨格突然変異体の細胞死がアポトーシスメカニズムであることを分析するために、実施例１１で記述したようにエンリッチメント細胞株ＪｕｒｋａｔとＨＬ６０細胞株に抗−ＤＲ４、ＤＲ５クリングルドメインを３５時間処理した後、ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、実施例６で説明したようにＦＡＣＳで測定した。対照群として０．５μｇ／ｍＬ（〜 ３０ｎＭ）のＴＲＡＩＬを４時間処理し、ＦＡＣＳで分析した。
【０１５１】
図５５はＪｕｒｋａｔとＨＬ６０細胞株においてａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣとＰＩ染色をＦＡＣＳで分析した結果を示す。対照群としてのＴＲＡＩＬは、初期アポトーシスの特徴であるａｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＦＩＴＣ＋／ＰＩ−の細胞がＪｕｒｋａｔ細胞株で３９．６％、ＨＬ６０細胞株で３９．７％分布し、抗−ＤＲ４クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３はＪｕｒｋａｔ細胞株で１７．５％、ＨＬ６０細胞株で３５．９％分布し、抗−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ５４８はＪｕｒｋａｔ細胞株で４０．６％、ＨＬ６０細胞株で２１．３５％分布しており、アポトーシスが細胞死メカニズムであることを示す。
【０１５２】
実施例１４：抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体のインビボ(in vivo)生物学的同定
【０１５３】
抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体のインビボ生物学的同定のために、４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ無胸腺ヌードマウス(athymic nude mouse)（ＣＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎｌｎｕ／Ｃｒｌ、１５〜２０ｇ、Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ Ｉｎｃ．（Ｋｏｒｅａ））の右の脚にＨＣＴ１１６とＵ８７ＭＧ細胞株を一匹当たり５×１０6細胞だけを接種した。約７日後に腫瘍サイズが約５０ｍｍ３となったとき、７匹のマウスに抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ５４８を処理し、対照群として野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とＴＲＡＩＬを使用した。治療は２日間隔で計７回実行し、抗−ＤＲ４、ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ５４８、野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２は２０ｍｇ／ｋｇ、ＴＲＡＩＬは１５ｍｇ／ｋｇの濃度で腫瘍に直接注入した(Ashkenazi A & Herbst RS J Clin Invest, 118(6): 1979-1990, 2008, Ashkenazi A. et al., J Clin Invest 104(2):155-162, 1999)。腫瘍の大きさは腫瘍の長さと幅を測定し、０．５×（長さ)２×(幅)２の公式で計算した(van der Sloot AM. et al., Proc Natl Acd Sci USA, 103(23):8634-8639, 2006, Pukac L. et al., Br J Cancer 92(*)1430-1441, 2005)。野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２、抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ５４８及びＴＲＡＩＬが注入されたマウスは、特別な行動、様子及び体重の変化をみせておらず、腫瘍接種２３日後に犠牲された。その後、腫瘍を摘出し、腫瘍の重さを測定した。
【０１５４】
図５６及び図５７は、腫瘍接種の後、野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２、抗−ＤＲ４、−ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ５４８及びＴＲＡＩＬを腫瘍内に直接注入した後、２日間隔で腫瘍の体積を測定したデータ、及び腫瘍を摘出したデータである。図５６はＨＣＴ１１６細胞株、図５７はＴＲＡＩＬ抵抗性細胞株Ｕ８７ＭＧ細胞株の結果である。この動物実験結果は、抗−ＤＲ４、ＤＲ５クリングルドメイン突然変異体ＫＤ４１３、ＫＤ５４８がインビボでＴＲＡＩＬ感受性細胞株のＨＣＴ１１６、抵抗性細胞株のＵ８７ＭＧ細胞株で腫瘍成長を効果的に阻害することを示唆する。
【０１５５】
実施例１５：抗−ＴＮＦαクリングルドメイン構造基盤のタンパク質骨格突然変異体の生物学的活性評価
【０１５６】
野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２とｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）を対照群として、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６と、ＫＤＴ２６のＦｃ融合体であるＫＤＴ２６−ＦｃのヒトＴＮＦαの細胞毒性をＷＥＨＩ１６４細胞株（マウス線維肉腫、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７５１）で同定した(MinSoo, Kim, et al., J Mol Biol 374(5):1374-1388, 2007, MooYoung, Song, et al., Exp Mol Med 40(1):35-42, 2008)。ＷＨＥＩ１６４細胞株を１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに３倍数で接種して、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ入りのＲＰＭＩ１６４０で２０時間培養した後、培地に２μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤを追加し、共に１ｎｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαを処理した後、０．１ｎＭ から２μＭの濃度で野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６とＫＤＴ２６−Ｆｃ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂを処理し、２０時間後にＭＴＴアッセイで細胞死を評価した。ＩＣ５０（50% inhibiting concentration)はシグマプロットソフトウェア（Ｓｉｇｍａ ｐｌｏｔ、ＳＰＳＳ Ｉｎｃ）を用いて決定した。
【０１５７】
図５８は野生型プラスミノゲンクリングルドメイン２、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６とＫＤＴ２６−Ｆｃ、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂのＴＮＦαによるＷＥＨＩ１６４細胞株の細胞死阻害を評価した結果を示す。ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂのＩＣ５０は約２ｎＭであり、ＫＤＴ２６のＩＣ５０は０．７８±０．０３μＭ、ＫＤＴ２６−ＦｃのＩＣ５-０は５．２±０．７ｎＭとそれぞれ測定された。
【０１５８】
インビボでのＴＮＦαの細胞毒性中和実験のために、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ）を病原体のない条件で腹腔注射によってＫＲＴ ２６−Ｆｃ（５ ａｎｄ ２５μｇ／マウス）、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ（５ ａｎｄ ２５μｇ／マウス）、ヒト抗体対照群ＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ）（５μｇ／マウス）を１３匹に注入した。１時間の後、投与１２時間後の致死率が９０％であることを確認した投薬量、すなわちマウス１匹当たり０．４μｇのヒトＴＮＦαとマウス１匹当たり７ｍｇ Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮ、Ｓｉｇｍａ）を腹腔注射で注入した(MooYoung, Song, et al., Exp Mol Med 40(1):35-42, 2008)。生存率は６時間ごとに記録し、ログ−ランクテストを用いて生存率を分析した。
【０１５９】
図５９は対照群としてのヒトＩｇＧ１  ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、ＫＤＴ２６−ＦｃのインビボでＴＮＦαの媒介毒性阻害を生存分析グラフで示す。ｐ値は、５μｇ／マウスで注入したｉｎｎｆｌｉｘｉｍａｂの場合には０．０００１、２５μｇ／マウスで注入したｉｎｆｌｉｘｉｍａｂの場合には０．０００１、５μｇ／マウスで注入したＫＤＴ２６−Ｆｃの場合には０．００２、２５μｇ／マウスで注入したＫＤＴ２６−Ｆｃの場合には０．００３８とそれぞれ測定された。これは抗−ＴＮＦαクリングルドメイン突然変異体ＫＤＴ２６−Ｆｃが効果的に動物実験モデルで作用することを示唆する。
【０１６０】
実施例１６：同じ標的分子に結合するクリングルドメイン突然変異体モノマーを用いてホモオリゴマーを生成する方法
【０１６１】
実施例２で説明したようにホモオリゴマーを生成する場合には、標的分子に対する親和度がアビディティ効果のおかげで増加し、多様な標的分子部位に結合するモノマーの組み合わせで標的分子の生物学的活性を効率よく調節することができ、モノマーより大きさが大きいため、薬物動力学的の側面においても利点がある。
このために、抗−ＤＲ４クリングルドメイン変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、抗−ＤＲ５クリングルドメイン変異体ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン変異体ＫＤＴ２６モノマーをリンカーを用いて連結することにより、ホモダイマーを構築した。
【０１６２】
クリングルドメインホモダイマーは、クリングルドメインの間に（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）４［（Ｇ４Ｓ）４］のリンカーを用いて構築した。すなわち、ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、ＫＤＴ２６がクローニングされている酵母ピキアパストリス発現ベクター（ｐＰＩＣＺａＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）に、インフレームにて制限酵素ＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩを用いて、（Ｇ４Ｓ）４のリンカーを有するクリングルドメインホモダイマーをクローニングした（図６０）。この際、ピキア酵母発現ベクターはＡＯＸ３プロモーター−ＭＦａ分泌シグナル配列−クリングルドメイン−ｍｙｃ ｔａｇ−６ｘ Ｈｉｓ ｔａｇを持つようにデザインされた（ｐＰＩＣＺａＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）。
【０１６３】
構築されたクリングルドメインホモダイマーの発現及び精製は、実施例８で説明された方法と同一の方法によって行われた。
【０１６４】
ホモダイマーの標的分子に対する親和度は、実施例８で説明されたようにＥＬＩＳＡによって決定されたもので、各クリングルドメイン変異体モノマーと比較した（図６１、図６２及び図６３）。
【０１６５】
図６０〜図６３は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３、ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６、ＫＤ５４８クリングルドメイン変異体、抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いてホモダイマー(homodimer)を構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【０１６６】
図６０は構築されたホモダイマーの模式図を示す。図６１は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及びＫＤ４１５ホモダイマーのＤＲ４に対する親和度をＥＬＩＳＡで決定したものである。抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３ホモダイマーの親和度は４３±５ｎＭ、抗−ＤＲ４ ＫＤ４１５ホモダイマーの親和度は８７±６ｎＭとそれぞれ決定された。図６２は抗−ＤＲ５ ＫＤＲ５０６及びＫＤ５４８ホモダイマーのＤＲ５に対する親和度をＥＬＩＳＡで決定したものである。抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６ホモダイマーの親和度は３１±３ｎＭ、抗−ＤＲ５ ＫＤ５４８ホモダイマーの親和度は５３±７ｎＭとそれぞれ決定された。図６３は抗−ＴＮＦα ＫＤＴ２６ホモダイマーのＴＮＦαに対する親和度をＥＬＩＳＡで決定したものである。親和度は８±１ｎＭ水準と測定された。
【０１６７】
前記実験結果はクリングルドメイン変異体モノマーをホモダイマーに変換した場合、アビディティ効果によりターゲット分子に対する親和度が約１０倍程度向上することを示す。
【０１６８】
実施例１７：２つ以上の異なる標的分子にそれぞれ特異的に結合するクリングルドメイン変異体をリンカーを用いて連結することにより、多重標的分子に同時に結合することが可能なオリゴマーの製造方法
【０１６９】
抗−ＤＲ４クリングルドメイン変異体ＫＤ４１３とＫＤ４１５を、抗−ＤＲ４クリングルドメイン変異体ＫＤ４１３と抗−ＤＲ５クリングルドメイン変異体ＫＤ５０６をリンカーを用いて連結することにより、ヘテロダイマーを構築した。クリングルドメインヘテロダイマーは、選別されたクリングルドメイン変異体の間に（Ｇ４Ｓ）４リンカーを用いて、実施例１６と同様の方法で構築した。
【０１７０】
発現及び精製は、実施例８で説明されたクリングルドメイン変異体を精製する方法と同様の方法によって行われた。
【０１７１】
図６４〜図６８は抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ４ ＫＤ４１５クリングルドメイン変異体、または抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３及び抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６クリングルドメイン変異体を（Ｇ４Ｓ-）４リンカーを用いて連結することによりヘテロダイマーを構築した模式図、及び各標的分子に対する親和度をＥＬＩＳＡで定量したものである。
【０１７２】
図６４は構築されたヘテロダイマーＫＤ４１３−ＫＤ４１５及びＫＤ４１３−ＫＤ５０６の模式図を示す。
【０１７３】
図６５はＫＤ４１３−ＫＤ４１５ヘテロダイマーの標的分子ＤＲ４に対する親和度、図６６はＫＤ４１３−ＫＤ５０６ヘテロダイマーの標的分子ＤＲ４（左パネル）およびＤＲ５（右パネル）に対する親和度をサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定したものである。
【０１７４】
図６７はＫＤ４１３−ＫＤ５０６のプレートコートされたＤＲ４および可溶性ＤＲ５に対する親和度をサンドイッチＥＬＩＳＡによって決定したものである。データが示すように、ＫＤ４１３−ＫＤ４１５ヘテロダイマーはＤＲ４の異なる部位を認識するため、それぞれのモノマーより高い親和度を示した（図６５）。ＫＤ４１３−ＫＤ５０６ヘテロダイマーはＤＲ４とＤＲ５の両方に結合していることが（図６６）、サンドイッチＥＬＩＳＡによって確認された（図６７）。しかし、ＫＤ４１３はＤＲ４にのみ結合し、ＫＤ５０６はＤＲ５にのみ結合した。
【０１７５】
前記実験結果は、異なる標的分子に特異的に結合するクリングルドメイン変異体をヘテロダイマーに連結した場合に二重特異性(bispecificity)が与えられることを示す結果である。
【０１７６】
実施例１８：ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαに特異的に結合するクリングルドメイン変異体の標的分子と結合する結合ループマッピング
実施例１で記述したようにクリングルドメインは７つのループがあり、クリングルドメイン基盤のタンパク質骨格ライブラリーは７つのループを全て変異させてライブラリーを構築した。したがって、抗−ＤＲ４クリングルドメイン変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、抗−ＤＲ５クリングルドメイン変異体ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン変異体ＫＤＴ２６は、標的分子と結合可能な７つのループを有する。７つのループのうち標的分子に結合するループを探すために、抗−ＤＲ４クリングルドメイン変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、抗−ＤＲ５クリングルドメイン変異体ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン変異体ＫＤＴ２６のうちのいくつかのループを野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２のアミノ酸配列を持つように復帰突然変異(back mutation)した。ループ１、２、３及び４を抗−ＤＲ４クリングルドメイン変異体ＫＤ４１３、ＫＤ４１５、抗−ＤＲ５クリングルドメイン変異体ＫＤ５０６、ＫＤ５４８、抗−ＴＮＦαクリングルドメイン変異体ＫＤＴ２６のアミノ酸配列を有し、残りのループのアミノ酸配列は、野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２のアミノ酸配列を有するクローンをＫＤ４１３Ｌ１２３４、ＫＤ４１５Ｌ１２３４、ＫＤ５０６Ｌ１２３４、ＫＤ５４８Ｌ１２３４、ＫＤＴ２６Ｌ１２３４と命名した。このような方式でループ５、６及び７を除いた残りのアミノ酸配列が野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２のアミノ酸配列を有するクローンをＫＤ４１３Ｌ５６７、ＫＤ４１５Ｌ５６７、ＫＤ５０６Ｌ５６７、ＫＤ５４８Ｌ５６７、ＫＤＴ２６Ｌ５６７と命名した。ループ５及び６を除いた残りのアミノ酸配列が野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２のアミノ酸配列を有するクローンをＫＤ４１３Ｌ５６、ＫＤ４１５Ｌ５６、ＫＤ５０６Ｌ５６、ＫＤ５４８Ｌ５６、ＫＤＴ２６Ｌ５６と命名した。ループ５を除いた残りのアミノ酸配列が野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２のアミノ酸配列を有するクローンをＫＤ４１３Ｌ５、ＫＤ４１５Ｌ５、ＫＤ５０６Ｌ５、ＫＤ５４８Ｌ５、ＫＤＴ２６Ｌ５と命名した。新しく構築されたクローンは、実施例３で詳細に記載されたように、酵母表面提示ベクターｐＣＴＣＯＮにクローニングされた。
【０１７７】
図６９は各標的分子に対して選別されたクリングルドメイン変異体の結合ループ分析(binding loop analysis)を行ったものである。すなわち、野生型のプラスミノゲンクリングルドメイン２のアミノ酸配列にそれぞれのループが突然変異された抗−ＤＲ４、ＤＲ５クリングルドメイン変異体を酵母表面発現システムを用いて、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２に対する結合能力、及び抗−ＴＮＦαクリングルドメイン変異体のＴＮＦαに対する結合能力をフローサイトメトリーで分析した後、その結合程度をＭＦＩ(mean fluorescence intensity)で定量化したものである。ＫＤ４１３は交差反応性なしに標的分子ＤＲ４に対してのみ結合し、ＫＤ４１３Ｌ５６が最も強い標的分子ＤＲ４の親和度を示すため、ループ５及び６が標的分子ＤＲ４との結合において最も重要であることが分かる。ＫＤ４１５は交差反応性なしに標的分子ＤＲ４に対してのみ結合し、ＫＤ４１５Ｌ５６７が最も強い標的分子ＤＲ４の親和度を示すため、ループ５、６及び７が標的分子ＤＲ４との結合において最も重要であることが分かる。ＫＤ５０６は交差反応性なしに標的分子ＤＲ５に対してのみ結合し、ＫＤ５０６Ｌ５６７が最も強い標的分子ＤＲ５の親和度を示すため、ループ５、６及び７が標的分子ＤＲ５との結合において最も重要であることが分かる。ＫＤ５４８は実施例８の結果のようにＤＲ４、ＤＲ５の両方ともに結合し、ＫＤ５４８Ｌ５６が最も強い標的分子ＤＲ５の親和度を示すため、ループ５及び６が標的分子ＤＲ５との結合において最も重要であることが分かる。ＫＤＴ２６は交差反応性なしに標的分子ＴＮＦαに対してのみ結合し、ＫＤＴ２６Ｌ５６が最も強い標的分子ＴＮＦαの親和度を示すため、ループ５及び６が標的分子ＴＮＦαとの結合において最も重要であることが分かる。
【０１７８】
実施例１９：同じ標的分子の異なる部位または２つ以上の互いに異なる標的分子に結合するクリングルドメイン変異体の結合ループを同一または異なるモノマーの他のループ部位にグラフトして多結合モノマー(multivalent monomer)または多重特異性モノマー(multispecific monomer)を生成製造する方法
【０１７９】
実施例１８において、結合ループ分析を介して抗−ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦαクリングルドメイン変異体が標的分子の結合に関与する重要ループを決定した。このループを同一または別のクリングルドメインモノマーにおいて、標的分子との結合に参与しない又は弱く参与する他のループにグラフトして、多結合モノマー及び多重特異性モノマーを構築した。
【０１８０】
抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３の場合、ループ５及び６が標的分子ＤＲ４との結合において重要な役割を果たすので、ＫＤ４１３のループ５及び６を図７０のように３次構造上反対方向に向いているＫＤ４１３のループ３及び４にそれぞれグラフトさせた。新しく構築されたクローンはＫＤ４１３−４と名付けられた。
【０１８１】
抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３の場合にはループ５及び６が標的分子ＤＲ４との結合において重要な役割を果たし、抗−ＤＲ５ ＫＤ５０６の場合にはループ５、６及び７が標的分子ＤＲ５との結合において重要な役割を果たすので、ＫＤ４１３のループ５及び６を３次構造上において反対方向に向いているＫＤ５０６ループ３及び４にグラフトした。新しく構築されたクローンはＫＤ５０６−４と名付けられた。
【０１８２】
抗−ＤＲ５ ＫＤ５４８の場合にはループ５及び６が標的分子ＤＲ５に対する結合において重要な役割を果たし、抗−ＤＲ４ ＫＤ４１３の場合にはループ５及び６が標的分子ＤＲ４に対する結合において重要な役割を果たすので、ＫＤ５４８のループ５及び６を３次構造上において反対方向に向いているＫＤ４１３のループ３及び４にグラフトして、このクローンをＫＤ４１３−５と名付けた。
【０１８３】
図７０はクリングルドメイン変異体のループをグラフトする方法の例を模式図として示す。例えば、クリングルドメインのループ５及び６を、三次構造上において反対方向に向いていて、ループ構造が互いに最も似ているループ３及び４にグラフトさせる方法を図式化したものである。
【０１８４】
図７１〜図７３は二重結合モノマー(bivalent monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−４と、二重特異性モノマー(bispecific monomer)として構築されたクリングルドメイン変異体ＫＤ４１３−５及びＫＤ５０６−４が標的分子と結合することをサンドイッチＥＬＩＳＡで定量したものである。図７１は抗−ＤＲ４二重結合モノマーＫＤ４１３−４が、底にコートされたＤＲ４と溶液状態のＤＲ４に同時に結合することを示す結果である。対照群としてＫＤ４１５Ｌ５６を使用し、二重結合性がないことを確認した。図７２は抗−ＤＲ４／ＤＲ５二重特異性モノマーＫＤ４１３−５が、底にコートされたＤＲ４と溶液状態のＤＲ５に同時に結合することを示す結果である。対照群としてＫＤ４１３Ｌ５６を使用し、二重結合性がないことを確認した。図７３は抗−ＤＲ５／ＤＲ４二重特異性モノマーＫＤ５０６−４が、底にコートされたＤＲ５と溶液状態のＤＲ４に同時に結合することを示す結果である。対照群としてＫＤ５０６Ｌ５６７を使用し、二重結合性(bivalency)が無いことを確認した。
【０１８５】
これらの実験結果は、同じ標的分子の異なる部位または２つ以上の互いに異なる標的分子に結合するクリングルドメイン変異体の結合ループを同一または異なるモノマーの他のループ部位にグラフトして多結合モノマーまたは多重特異性モノマーを生成することができることを示す。
【図１】
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【図３１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【配列表】
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