(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における心筋梗塞後の左室リモデリングを検出するためのインビトロでの方法であって、
（ｉ）対象から得た血液試料中のトロポニンＴプールにおける、セリン２０７でリン酸化したトロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｉｉ）前記レベルを対照と比較する工程、
を含み
（ｉｉｉ）ここで、該血液試料中のセリン２０７でリン酸化したトロポニンＴのレベルの低下が、左室リモデリングの指標である、検出方法。
【請求項２】
下記工程：
（ｉｖ）前記試料のトロポニンＴプールにおけるグリコシル化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｖ）前記レベルを対照と比較する工程、
をさらに含み、
（ｖｉ）ここで、前記試料中のグリコシル化トロポニンＴレベルの上昇が、左室リモデリングの指標である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、左室リモデリングを検出するための、並びに心不全のリスクを管理及び認識するための新しいバイオマーカーを提供する。従って、本発明は、左室リモデリングを検出する及び心不全のリスクを予測する方法及びキットを提供する。
【０００２】
発明の背景
今日心不全は、米国で５百万人以上の人が罹患し、かつ、毎年約５００，０００人が新しく患者になっている主要な健康問題であり、そしてその有病率は着々と上昇している。心不全は体が必要としているのに十分な血流を心臓が供給するその能力の、構造又は機能の損傷に関連する問題を伴う症状である。
【０００３】
この病理は異なる因子から引き起こされ、そしていくつかの複雑な機序を生じる。この重篤な障害の臨床管理のため、新しいバイオマーカー及び治療標的の発見が重要となってきていると考えられる。特に、より容易にモニタリングするために、現在の研究は血清バイオマーカーに焦点を絞っている。
【０００４】
心不全のような心臓障害のバイオマーカーとして用いられる酵素、ホルモン、生理活性物質及び心臓系のその他マーカーは増え続けている。現在、心筋梗塞後の心不全の管理に用いられるバイオマーカーの中には、血清トロポニンＴ（Newby LK et al, 1998; Latini R et al, 2007）及びトロポニンＩ、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）がある。これらのバイオマーカーは、心不全の病理発生の原因となった、異なる経路を評価する：ＢＮＰは左室過負荷に反応して上昇し；ＣＲＰは炎症のマーカーであり；そしてトロポニンの増加は筋細胞が損傷したことを示す。
【０００５】
しかしながら、心不全を管理するため、より早期に検出するため、又はそのような障害のリスクを認識するため、及びより容易な試験のため、新しいバイオマーカーがさらに必要とされている。
【０００６】
現代的な治療方法によっても、心筋梗塞後の左室リモデリングがおよそ３０％の患者に認められる。左室リモデリングは最初は、心臓の拍出機能を維持する保護的な機序と考えることができるが、最終的にはそれは左室機能全体の悪化から心不全を引き起こす。心筋梗塞はしばしば見られるイベントであるため（フランスでは毎年１２０，０００例）、現在の心不全の蔓延においては左室リモデリングが重要な原因である。リモデリングに特異的な血中マーカーを発見することにより、心不全の発生を予測する生物学的試験の開発が可能になるだろう。
【０００７】
発明の概要
本発明は、対象における心筋梗塞後の左室リモデリングを検出するインビトロでの方法に関し、前記方法は、
（ｉ）対象から得た血液試料中のトロポニンＴプールにおける、リン酸化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｉｉ）前記レベルを対照と比較する工程、
を含み、
（ｉｉｉ）ここで該血液試料中のリン酸化トロポニンＴのレベルの低下は、左室リモデリングの指標となる。
【０００８】
本発明はまた、心筋梗塞を経験した対象における心不全のリスクを予測するインビトロでの方法に関し、前記方法は、
（ｉ）対象から得た血液試料中のトロポニンＴプールにおける、リン酸化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｉｉ）前記レベルを対照と比較する工程、
を含み、
（ｉｉｉ）ここで該血液試料中のリン酸化トロポニンＴのレベルの低下は、心不全のリスクが高いことの指標となる。
【０００９】
本発明はさらに、心筋梗塞を経験していない対象における心不全のリスクを予測するインビトロでの方法に関し、前記方法は、
（ｉ）対象から得た血液試料中のトロポニンＴプールにおける、リン酸化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｉｉ）前記レベルを対照と比較する工程、
を含み、
（ｉｉｉ）ここで該血液試料中のリン酸化トロポニンＴのレベルの上昇は、心不全のリスクが高いことの指標となる。
【００１０】
従って本発明は、対象における心不全のリスクのバイオマーカーとしてのリン酸化トロポニンＴの使用に関し、そして本発明の方法を使用するためのキットを提供する。
【００１１】
本発明の詳細な説明
発明者らは、翻訳後修飾を受けたトロポニンＴ、より具体的にはリン酸化トロポニンＴが、心不全を引き起こす心筋梗塞後の左室リモデリングのバイオマーカーであることを示した。実際に、リン酸化のレベルは左室リモデリング症例において低下する。さらに、トロポニンＴのグリコシル化のレベルについても研究を行い、これは左室リモデリング症例では上昇することを示した。従って、心筋梗塞を経験した対象における心不全のリスクのバイオマーカーとして、翻訳後修飾を受けたトロポニンＴを用いることができる。
【００１２】
発明者らはまた、翻訳後修飾を受けたトロポニンＴ、より具体的にはリン酸化トロポニンＴが、心筋梗塞を経験していない対象における心不全のリスクのバイオマーカーとしても用いることが可能であることを示した。しかし驚くことに、発明者らは、心筋梗塞を経験していない対象においては、リン酸化レベルの上昇及び／又はグリコシル化レベルの低下が心不全のリスクと関係することを示した。
【００１３】
従って、心筋梗塞を経験した又は経験していない対象における心不全のバイオマーカーとして、及び心筋梗塞後の左室リモデリングのバイオマーカーとして、翻訳後修飾を受けたトロポニンＴを用いることが可能である。
【００１４】
定義
用語「トロポニンＴ（ＴｎＴ）」は、当該分野におけるその一般的な意味を有し、かつ、心臓障害のバイオマーカーとして既に用いられている筋原繊維タンパク質である、心臓での形態のトロポニンＴを指す。この用語は、天然に生じる心筋トロポニンＴ及び変異体、並びにその修飾形態を含んでもよい。心筋トロポニンＴはいずれの供給源からのものであってもよいが、典型的には哺乳類の（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類）の心筋トロポニンＴ、特にヒト心筋トロポニンＴである。ヒトにおける天然の心筋トロポニンＴのアミノ酸配列の例はＰ４５３５９（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｄａｔａｂａｓｅ）に、そしてラットにおける天然のアミノ酸配列の例はＰ５０７５３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｄａｔａｂａｓｅ）に示されている。
【００１５】
本発明では、用語「リン酸化トロポニンＴ」は、セリンがリン酸化された、特定の形態のトロポニンＴを指す。すなわち、開始メチオニンの除去を考慮すると（２００９年４月１４日のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５７．１：エントリー４１２５２５）、ヒトタンパク質ではセリン２０７がリン酸化され（Ｐ４５３７９の２０７番目の位置を参照のこと（１〜２９７  ａａ））、ラットタンパク質ではセリン２０８がリン酸化される（Ｐ５０７５３の２０８番目の位置を参照のこと（１〜２９８  ａａ））。
【００１６】
本発明では、用語「グリコシル化トロポニンＴ」は、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃにＯ−グリコシド結合した単糖であるβ−Ｎ−アセチルグルコサミンによってグリコシル化された、特定の形態のトロポニンＴを指す。
【００１７】
本発明では、用語「トロポニンＴプール」は、対象から得た生物試料中に含まれる、全ての形態のトロポニンＴを指し、これは翻訳後修飾を受けたものであっても修飾されていないものであってもよい。従ってプールは、修飾を受けていないトロポニンＴ、リン酸化トロポニンＴ及びグリコシル化トロポニンＴを含む。
【００１８】
本明細書において、用語「バイオマーカー」及び「マーカー」は同じ意味で用いられる。それらは、生物学的プロセス、生物学的イベント、及び／又は病理状態を明示する物質を指す。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、心不全に罹患することができるヒト又は別の哺乳類（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、など）を指すが、それらは疾患を有していても有していなくてもよい。本発明の特定の実施形態においては、対象はヒトである。具体的には、この対象は患者であってもよい。
【００２０】
本明細書において、用語「生物試料」は、その最も広い意味で使用される。生物試料は通常、対象から得られる。試料は、本発明のバイオマーカーが評価することのできる、いずれの生物組織又は液体であってもよい。しばしば、試料は「臨床試料」、すなわち患者由来の試料となるだろう。そのような試料は、細胞を含む場合のある又は含まない場合のある体液、例えば血液（例えば、全血、血清又は血漿）を含むがこれらには限定されない。用語「生物試料」はまた、生物試料を処理することによって得られる、いずれの材料をも包含する。得られた材料は、試料から単離した細胞（又はそれらの後代）又は試料から抽出したタンパク質を含むがこれらには限定されない。生物試料の処理は、１回以上のろ過、蒸留、抽出、濃縮、干渉化合物の不活性化、試薬の添加などを含んでもよい。
【００２１】
本発明では、生物試料は血液試料（全血、血清又は血漿）である。
【００２２】
本明細書において、用語「正常な」及び「健康な」は同じ意味で用いられる。それらは、いずれの心血管症状をも示していない対象、及び心不全又はその他の心血管疾患と診断されていない対象を指す。好ましくは、正常な対象は心血管系に影響を及ぼす薬物での治療を受けておらず、いずれのその他疾患を有すると診断されていない対象である。特定の実施形態において正常な対象は、試験する生物試料を得た対象と比較した場合に、同様の性別、年齢、及び／又はボディマス・インデックスを有する。本明細書において用語「正常な」はまた、健康な対象から得られた試料を意図するために用いられる。
【００２３】
本発明に関連する、対象を特徴付けるために用いられる用語「対照」は、健康な対象又は心血管疾患以外の特定の疾患だと診断された患者を指す。用語「対照試料」は、健康な対象又は循環器疾患以外の疾患だと診断された患者から得た１つ又は１つ以上の試料を指す。
【００２４】
その最も広い意味において、用語「予防する」又は「予防」は、まだそれを有するとは診断されていない疾患又は状態が対象における発症を防ぐことを指す。
【００２５】
その最も広い意味において、用語「治療する」又は「治療」は、そのような用語が適用される障害若しくは状態、又はそのような障害若しくは状態の１つ以上の症状の進行を、反転させる、軽減する、阻害することを指す。
【００２６】
用語「薬学上の」又は「薬学上許容可能な」は、哺乳類、特にヒトに適切に投与したときに、有害な、アレルギー性の、又はその他の副作用を生じない、分子単位及び組成物を指す。薬学上許容可能な担体又は賦形剤は、有毒でない固体、半固体、又は液体充填剤、希釈剤、カプセル化剤、又は任意の型の製剤助剤を指す。
【００２７】
本発明の予測的方法
本発明の第一の目的は、対象における心筋梗塞後の左室リモデリングを検出するインビトロでの方法に関し、前記方法は、
（ｉ）対象から得た血液試料中のトロポニンＴプールにおける、リン酸化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｉｉ）前記レベルを対照と比較する工程、
を含み、
（ｉｉｉ）ここで該血液試料中のリン酸化トロポニンＴのレベルの低下は、左室リモデリングの指標となる。
【００２８】
特定の実施形態において前記方法は、
（ｉｖ）前記試料のトロポニンＴプールにおけるグリコシル化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｖ）前記レベルを対照と比較する工程、
さらに含んでもよく、
（ｖｉ）ここで前記試料中のグリコシル化トロポニンＴレベルの上昇は、左室リモデリングの指標となる。
【００２９】
左室リモデリングは、約３０％の症例において生じ、長期的には心不全を引き起こす、複雑な心筋梗塞後の過程である。
【００３０】
従って、本発明のさらなる目的は、心筋梗塞を経験した対象における心不全のリスクを予測するためのインビトロでの方法に関し、前記方法は、
（ｉ）対象から得た血液試料中のトロポニンＴプールにおける、リン酸化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｉｉ）前記レベルを対照と比較する工程、
を含み、
（ｉｉｉ）ここで該血液試料中のリン酸化トロポニンＴのレベルの低下は、心不全のリスクが高いことの指標となる。
【００３１】
特定の実施形態においてこの方法は、
（ｉｖ）前記血液試料中のトロポニンＴプールにおけるグリコシル化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｖ）前記レベルを対照と比較する工程、
をさらに含み、
（ｖｉ）ここで前記試料中のグリコシル化トロポニンＴレベルの上昇は、心不全のリスクが高いことの指標となる。
【００３２】
本発明では、リン酸化トロポニンＴのレベルは全トロポニンＴに対するリン酸化トロポニンＴの比に相当し、並びにグリコシル化トロポニンＴのレベルは全トロポニンＴに対するグリコシル化トロポニンＴの比に相当する。
【００３３】
一般的には、リン酸化トロポニンＴレベル低下とは、対照試料において測定したレベルの５０％以下に相当する。
【００３４】
本発明の別の目的は、心筋梗塞を経験していない対象における心不全のリスクを予測するためのインビトロでの方法に関し、前記方法は、
（ｉ）対象から得た血液試料中のトロポニンＴプールにおける、リン酸化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｉｉ）前記レベルを対照と比較する工程、
を含み、
（ｉｉｉ）ここで該血液試料中のリン酸化トロポニンＴのレベルの上昇は、心不全のリスクが高いことの指標となる。
【００３５】
特定の実施形態においてこの方法は、
（ｉｖ）前記血液試料中のトロポニンＴプールにおけるグリコシル化トロポニンＴのレベルを測定する工程、
（ｖ）前記レベルを対照と比較する工程、
をさらに含み、
（ｖｉ）ここで前記試料中のグリコシル化トロポニンＴレベルの低下は、心不全のリスクが高いことの指標となる。
【００３６】
本発明では、リン酸化トロポニンＴのレベルは全トロポニンＴに対するリン酸化トロポニンＴの比に相当し、並びにグリコシル化トロポニンＴのレベルは全トロポニンＴに対するグリコシル化トロポニンＴの比に相当する。
【００３７】
一般的には、リン酸化トロポニンＴレベルの上昇は、対照試料を用いて測定したレベルの１５０％以上に相当する。
【００３８】
本発明では、リン酸化トロポニンＴは、対象における心筋梗塞後の左室リモデリングのバイオマーカーとして用いられる。
【００３９】
さらに、グリコシル化トロポニンＴもまた、対象における心筋梗塞後の左室リモデリングのバイオマーカーとして用いることができる。
【００４０】
本発明の別の実施形態では、リン酸化トロポニンＴは、対象における心不全のリスクのバイオマーカーとして用いられる。特に、前記対象は、心筋梗塞を経験した又は経験していない対象である。
【００４１】
さらに、グリコシル化トロポニンＴもまた、対象における心不全のリスクのバイオマーカーとして用いることができる。特に、前記対象は、心筋梗塞を経験した又は経験していない対象である。
【００４２】
本発明のバイオマーカーは、当該分野において周知の様々な方法によって検出することができる。
【００４３】
特定の実施形態において本発明の方法は、生物試料と、生物試料中に存在するバイオマーカーと選択的に相互作用することが可能な結合パートナーとを接触させる工程を含む。
【００４４】
従って、リン酸化トロポニンＴの結合パートナーは、リン酸化されていないトロポニンＴではなく、リン酸化トロポニンＴを選択的に認識し、並びにグリコシル化トロポニンＴの結合パートナーは、グリコシル化されていないトロポニンＴではなく、グリコシル化トロポニンＴを選択的に認識する。
【００４５】
結合パートナーは、抗体であってもよく、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体である。別の実施形態では、結合パートナーは、アプタマーであってもよい。
【００４６】
本発明のポリクローナル抗体又はその断片は、適切な抗原又はエピトープを、例えばブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、及びマウスなどから選択した宿主動物に投与することにより、既知の方法に従って得ることができる。抗体生産を高めるために、当該分野において既知の様々なアジュバントを使用することができる。ポリクローナル抗体もまた本発明の実施において有用ではあるが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、不死化細胞株を培養することによって抗体分子の生産を提供する、任意の技術を用いることにより準備及び単離することができる。生産及び単離のための技術には、Kohler and Milstein(1975)により始めて記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Cote et al.、1983）；及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al.1985）が含まれるがこれらには限定されない。
【００４８】
あるいは、本発明のバイオマーカーに対する一本鎖抗体を生産するために、一本鎖抗体の生産について記載された技術を適用することができる（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。本発明の実施において有用な抗体にはまた、完全な抗体分子をペプシンによって消化することによって生成することができるＦ（ａｂ’）２断片、及びＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるＦａｂ断片を含む抗バイオマーカー断片もまた含まれるがこれらには限定されない。あるいは、本発明のバイオマーカーに対する所望の特異性を有する断片を迅速に同定できるようにするために、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築することができる。例えば、抗体のファージディスプレイを用いることができる。そのような方法においては、好適なバクテリオファージ、例えばＭ１３の表面上に、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はＦａｂ断片が発現される。簡単に説明すると、タンパク質を用いて免疫した好適な宿主、例えばマウス、の脾臓細胞を摘出する。このタンパク質に対する所望の抗体を生産するそれらの細胞から、ＶＬ及びＶＨ鎖のコード領域を得る。これらのコード領域を次に、ファージ配列の末端に融合させる。好適な担体、例えば細菌、にこのファージを導入すると、このファージは抗体断片を提示する。抗体のファージディスプレイは、当業者に既知のコンビナトリアル手法によってもまた提供される。ファージが提示した抗体断片をその後、免疫アッセイの一環として用いてもよい。
【００４９】
トロポニンＴに対する市販されているモノクローナル抗体の例としては、Ａｂｃａｍ（クローン１Ａ１１、２Ｆ３、及び１Ｆ１１）及びＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（クローン２Ｇ３）から購入した抗体が挙げられる。トロポニンＴに対する、市販されているポリクローナル抗体の例としては、ＨｙＴｅｓｔ  Ｌｔｄ（ｒｅｆ：４Ｔ１９＿２）から購入した抗体が挙げられる。それらを、バイオマーカーの量と全トロポニンＴの量との間の比を測定するために使用する。
【００５０】
別の実施形態では、結合パートナーはアプタマーであってもよい。アプタマーは、分子認識の点において抗体の代わりとなる、あるクラスの分子である。アプタマーは、高い親和性及び特異性をもって、実質的にどのクラスの標的分子をも認識することができる、オリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドを、Tuerk C. 1997に記載されているように、ランダム配列ライブラリーのＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）を介して単離することができる。ランダム配列ライブラリーはＤＮＡのコンビナトリアル化学手法によって得ることができる。このライブラリー中では、各メンバーはユニーク配列の、最終的に化学修飾された、リニアなオリゴマーである。このクラスの分子についての生じ得る修飾、使用及び利点はJayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、２種類のハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリーから選抜された、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のチオレドキシンＡのようなプラットフォームタンパク質上に提示された、構造的に制限された抗体の可変領域を含む（Colas et al., 1996）。
【００５１】
抗体又はアプタマーのような本発明の結合パートナーを、蛍光分子、放射性分子又は当該分野において既知の任意の標識体のような検出可能な分子又は基質を用いて標識することができる。通常（直接又は間接的のいずれかで）シグナルを提供する標識体は、当該分野において既知である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、抗体に関する用語「標識した」は、放射性物質又は蛍光色素分子（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリトリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））のような検出可能な基質を抗体又はアプタマーに結合（すなわち物理的に結合）させることによる、抗体又はアプタマーの直接的な標識、並びに検出可能な基質を用いて反応させることによる、プローブ又は抗体の間接的な標識を包含することを目的とする。本発明の抗体又はアプタマーを、当該分野において既知の任意の方法により放射性分子を用いて標識することもできる。例えば放射性分子には、Ｉ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８のようなシンチグラフィを用いた研究用の放射性原子が含まれるが、これらには限定されない。
【００５３】
前述したアッセイに、結合パートナー（すなわち抗体又はアプタマー）の固相支持体への結合を含めてもよい。本発明の実施において使用することができる固相支持体には、ニトロセルロース（例えば、膜状の又はマイクロタイターウェル形態の）；ポリ塩化ビニル（例えばシート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレン・ラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性ビーズ、磁気反応性ビーズなどのような基体が含まれる。
【００５４】
本発明のバイオマーカーを、競合、直接反応、又はサンドイッチ型アッセイのような免疫アッセイを含む、標準的な免疫診断法を用いて検出してもよい。そのようなアッセイには、凝集試験；ＥＬＩＳＡのような酵素で標識した及び酵素介在性免疫アッセイ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降が含まれるがこれらには限定されない。
【００５５】
より具体的には、本発明のバイオマーカーに対する一連の抗体を用いてマイクロタイタープレートのウェルをコーティングする、ＥＬＩＳＡ法を用いることができる。次に、前記バイオマーカーを含む又は含むと考えられる生物試料をコーティングしたウェルに添加する。抗体−抗原複合体を形成させるのに十分な時間インキュベートした後、結合しなかった成分を除去するためにプレートを洗浄してもよく、そして検出可能に標識した二次結合分子を添加する。この二次結合分子を、試料中の任意の捕捉したマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、そして当該分野において周知の方法を用いて二次結合分子の存在を検出する。
【００５６】
バイオマーカーの検出（免疫アッセイベースの方法を用いた又は用いない）にはまた、化合物の分離（化合物の分子量に基づく遠心分離；質量及び電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；及び用いられる特定の固相への化合物の親和性に基づく固相アフィニティー）を含めてもよい。一旦分離すれば、その化合物に既知の「分離プロファイル」、例えば保持時間、に基づいて本発明のバイオマーカーを同定することができ、そして標準的な技術によって測定することができる。
【００５７】
あるいは、分離した化合物を、例えば質量分析計を用いて、検出及び測定することができる。
【００５８】
リン酸化及びグリコシル化トロポニンＴを含む全ての形態のトロポニンＴを認識する結合パートナーを用いた前記方法により、全トロポニンＴのレベルを測定することができる。
【００５９】
本発明のキット
本発明のさらなる態様は、本発明の予測的方法の実施のための、有用な材料を含むキットを提供する。本明細書において提供される診断／予測方法は、診断検査技師、研究者又は開業医によって実施され得る。本発明は、これらの異なる状況において使用することができるキットを提供する。
【００６０】
対象における左室リモデリングを検出するため又は心不全のリスクを予測するために、生物試料中の本発明の特異的バイオマーカーを検出するための材料及び試薬を、キット中に共に組み入れてもよい。
【００６１】
一実施形態において本発明のキットは、リン酸化トロポニンＴに対する少なくとも１つの抗体又はその他の結合パートナー、及び全ての形態のトロポニンＴに結合することができる、トロポニンＴに対する抗体又はその他の結合パートナーを含む。
【００６２】
別の実施形態では、本発明のキットは、リン酸化トロポニンＴに対する少なくとも１つの抗体又はその他の結合パートナー、及びグリコシル化トロポニンＴに対する抗体又はその他の結合パートナーを含む。本発明のキットはまた、全ての形態のトロポニンＴの結合パートナーを含む場合がある。
【００６３】
検出を容易にするために、結合パートナーにタグを付けることもできる。結合パートナーを基体（例えば、ビーズ、アレイ、など）表面に固定化しても又はしなくてもよい。例えば、本発明に関するキットは、本明細書において提供される方法で心不全のリスクを予測するための、アレイを含んでもよい。あるいは、本発明に関するキットに、結合パートナーを固定化するための（例えば、ゲル電気泳動とメンブレンへのトランスファーを介して）基体表面（例えばメンブレン）を含めてもよい。
【００６４】
加えて、本発明のキットはまた、キットに含まれる結合パートナーと本発明のバイオマーカーとの間で形成される複合体を検出するための、少なくとも１つの試薬を通常含む。
【００６５】
方法によっては、１つ以上の抽出緩衝液及び／又は試薬、ウェスタンブロット緩衝液及び／又は試薬、及び検出手段をキットにさらに含めてもよい。方法中の様々な工程を実施するための、これら緩衝液及び試薬の使用についてのプロトコールを、キットに含めてもよい。
【００６６】
本発明のキットに含まれる異なる試薬を、固形（例えば凍結乾燥した）又は液体の形態で提供することもできる。本発明のキットに任意で、それぞれ個々の緩衝液及び／又は試薬用の、異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ又は瓶）を加えてもよい。各構成要素は通常、それぞれの容器中に好適な容量で、又は濃縮された形態で提供されるだろう。開示された方法中の特定の工程を実施するために好適なその他の容器をもまた提供してもよい。市販するために、キット中の個々の容器は好ましくは厳重に密閉される。
【００６７】
特定の実施形態においては、本発明の方法に従って対象における心不全のリスクを予測するための、キット中の構成要素の使用説明書がキットに含まれる。本発明の方法のキットの使用説明書には、対象から得た生物試料の処理及び／又は試験の実施の方法についての説明、又は結果の解釈方法についての説明を含めてもよい。キットにはまた、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を管理する行政機関により規定された形式での警告を含めることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】ＭＩ後のＬＶリモデリングを有する患者の血漿におけるヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴの低下。患者由来の血漿（１μL）を用いて、全ヒトＴｎＴに対する抗体（図１Ａ）及びヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴに対する抗体（図１Ｂ）によるウェスタンブロット解析を行った。図１Ｃは、全ヒトＴｎＴ及びヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴ間の比の解析結果を示す。Ｍｗの位置を右側に示した。２つの独立した集団（集団１及び集団２とした）中の全ヒトＴｎＴ及びＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴを定量した。各集団をＬＶリモデリングのパーセンテージにより３分割し、材料及び方法に記載したように測定した。第１三分位に含まれる患者のリモデリングの割合は低度であり（白色）、第２三分位に含まれる患者は中度のリモデリングを示し（灰色）、そして第３三分位に含まれる患者は高度のリモデリングを示した（黒色）。データは、任意の単位（Ａ．Ｕ．）における平均±ＳＥＭとして表す。†  ｐ＜０．００１、‡  ｐ＜０．０００１。
【図１Ｂ】ＭＩ後のＬＶリモデリングを有する患者の血漿におけるヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴの低下。患者由来の血漿（１μL）を用いて、全ヒトＴｎＴに対する抗体（図１Ａ）及びヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴに対する抗体（図１Ｂ）によるウェスタンブロット解析を行った。図１Ｃは、全ヒトＴｎＴ及びヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴ間の比の解析結果を示す。Ｍｗの位置を右側に示した。２つの独立した集団（集団１及び集団２とした）中の全ヒトＴｎＴ及びＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴを定量した。各集団をＬＶリモデリングのパーセンテージにより３分割し、材料及び方法に記載したように測定した。第１三分位に含まれる患者のリモデリングの割合は低度であり（白色）、第２三分位に含まれる患者は中度のリモデリングを示し（灰色）、そして第３三分位に含まれる患者は高度のリモデリングを示した（黒色）。データは、任意の単位（Ａ．Ｕ．）における平均±ＳＥＭとして表す。†  ｐ＜０．００１、‡  ｐ＜０．０００１。
【図１Ｃ】ＭＩ後のＬＶリモデリングを有する患者の血漿におけるヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴの低下。患者由来の血漿（１μL）を用いて、全ヒトＴｎＴに対する抗体（図１Ａ）及びヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴに対する抗体（図１Ｂ）によるウェスタンブロット解析を行った。図１Ｃは、全ヒトＴｎＴ及びヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴ間の比の解析結果を示す。Ｍｗの位置を右側に示した。２つの独立した集団（集団１及び集団２とした）中の全ヒトＴｎＴ及びＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴを定量した。各集団をＬＶリモデリングのパーセンテージにより３分割し、材料及び方法に記載したように測定した。第１三分位に含まれる患者のリモデリングの割合は低度であり（白色）、第２三分位に含まれる患者は中度のリモデリングを示し（灰色）、そして第３三分位に含まれる患者は高度のリモデリングを示した（黒色）。データは、任意の単位（Ａ．Ｕ．）における平均±ＳＥＭとして表す。†  ｐ＜０．００１、‡  ｐ＜０．０００１。
【００６９】
実施例
Ｉ．心筋梗塞を経験した患者の心不全についての研究
材料及び方法
動物。本研究において実施した全ての実験は、米国国立衛生研究所（ＵＳ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が公開した、実験動物の世話及び使用への指針（ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ８５〜２３，１９９６年に改正）、及びフランス法に従った。Pfeffer et alによって記載され、その後Mulder et alによって改変された方法に従い、左冠状動脈を結紮することにより、１０週齢のオスのＷｉｓｔａｒラット（ｎ＝３２）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）に心筋梗塞（ＭＩ）を誘導した。これにはＨＦ（心不全）群も含めた。同じプロトコールを用いて処理したが、スネアを結紮しなかった別の２９匹のラットを、偽手術又は対照群とした。全てのラットは、標準的なラット用飼料及び水を随意摂取することができ、１２時間／１２時間の明／暗周期下で維持した。
【００７０】
外科手術の７日あるいは２ヶ月後、各動物の血行動態測定及び心エコー検査（対照及びＨＦ）を行い、その後、近年Cieniewski-Bernard, C. et al, 2008によって記載されたように動物を屠殺し心臓を摘出した。簡単に説明すると、心臓を摘出し、次に、氷冷したクレブス・ヘンゼライト緩衝液中で血液を除去するためにインキュベートした。その後、心臓の各部分を注意深く切開して壊死した部分全てを除去した。ＬＶを直ちに液体窒素中で凍結し、解析まで−８０℃で保存した。ＬＶタンパク質を、抗プロテアーゼ（２０mLの緩衝液につき１錠、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＴＭ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ，  Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）及び抗フォスファターゼ（１／１００、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ  １及び２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＰＵＧＮＡｃ（５０μmol／Ｌ、ＣａｒｂｏＧｅｎ）を含む４０mmol／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５中、氷上でＤｏｕｎｃｅ−Ｐｏｔｔｅｒホモジナイザーにより抽出した。可溶性画分を１．５mLのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、ブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を決定した。
【００７１】
患者。２００２〜２００４（集団１）及び２００６〜２００７（集団２）の間に登録された、独立した２つの集団について、ＬＶリモデリングを解析した（表２）。両群の患者への対象患者選定基準は、前壁Ｑ波ＭＩで入院し、退院前の心エコーでは梗塞部分の少なくとも３つのＬＶセグメントが無動性であることとした。除外基準は、超音波検査画像の質が不十分、致死的な非心臓疾患、有意な弁膜症、又は後壁Ｑ波ＭＩとした。一連の超音波検査は、退院の直前及びＭＩの１年後に行った。市販の第二高調波画像システムを用いて超音波データを取得し、画像を光学ディスク上に記録した。ＬＶ短軸の２Ｄ心エコー図を、左胸骨傍領域の３つのレベル（僧帽弁、乳頭筋の中央レベル、及び心尖）から記録した、心尖部４腔及び２腔断片画像に基づいた標準的な画像処理プロトコールを用いた。全ての心エコー図をＬｉｌｌｅ  Ｃｏｒｅ  Ｅｃｈｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）において、Savoye C et al, 20065により既に記載されているように解析した。ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｓｉｍｐｓｏｎ法により、ＬＶ容積及び駆出率を計算した。局所的な収縮機能を評価するために、ＬＶを１６のセグメントモデルに分割した。ＬＶリモデリングは、基準時（退院前）から１年後までの左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）の変化のパーセンテージで表した：（ＬＶＥＤＶ１年後−ＬＶＥＤＶ基準時）／ＬＶＥＤＶ基準時ｘ１００。全ての患者から、最初の入院中の試験登録時に血液試料を採取し、ＥＤＴＡチューブに入れた。血漿を処理し、２時間以内に−８０℃で保存した。
【００７２】
二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動、リン酸化されたタンパク質の定量、及び質量分析法。二次元ゲル電気泳動をCieniewski-Bernard, C. et al al, 2008に記載されているように行った。手術の２ヶ月後に対照（ｎ＝４）及びＨＦ（ｎ＝４）ラットから得たＬＶタンパク質（５００mg）について解析し、ｐＨ３〜１０の線形勾配を有する２４cmのドライストリップ（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で混合した。受動的な再水和（ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）工程は、電流を流さずに、９時間、２０℃で行った。フォーカシングは、２０℃、５０Ｖで９時間（能動的な再水和（ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）工程）、２００Ｖで１時間（ｌｉｎｅａｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）、１０００Ｖで１時間（ｌｉｎｅａｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）、１０，０００Ｖで６時間（ｌｉｎｅａｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）及び１０，０００Ｖで４．５時間（ｆａｓｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）行った。次に、平衡化したＩＰＧストリップゲルを１２％のＤｕｒａｃｒｙｌ（商標）（Ｄｉｇｉｌａｂ（登録商標）ｇｅｎｏｍｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）ゲルの先端にアプライした。ゲルの左側に、４μLのＰｅｐｐｅｒｍｉｎｔ  Ｓｔｉｃｋ（商標）Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ（商標））を含ませた２mm四方のろ紙をアプライした。電気泳動は、大きな縦型のＥｔｔａｎ  Ｄａｌｔｓｉｘ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、泳動緩衝液（２５mmol／Ｌ  Ｔｒｉｓ、１９２mmol／Ｌ  グリシン、０．１％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、０．３７％  ＡＰＳ（ｗ／ｖ）及び０．０４％  ＴＥＭＥＤ（ｖ／ｖ））中、１０℃、７０Ｖで一晩行った。
【００７３】
Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎを用いた二次元電気泳動の蛍光染色は、ゲルを３０％（ｖ／ｖ）メタノール、５％酢酸（ｖ／ｖ）中で２時間固定し、１８MΩのＨ２Ｏで洗浄し、Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ（商標））と共に９０分インキュベートし、そして２０％アセトニトリル（ＡＣＮ）、（ｖ／ｖ）、５％ナトリウムアセテート１mol／Ｌ、ｐＨ４（ｗ／ｖ）で３０分、３回洗浄し、その後１８MΩのＨ２Ｏで１時間最終的に洗浄することによって脱染色することにより、行った。Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄで染色したゲルの画像を、Ｅｔｔａｎ  Ｄｉｇｅ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて励起波長５４０nm及び放射波長５９５nmで取得した。その後ゲル中の全タンパク質をＳｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ（商標））を用いて一晩染色し、その後１８MΩ−Ｈ２Ｏを用いて１０分間１回、１０％メタノール（ｖ／ｖ）、７％酢酸（ｖ／ｖ）を用いて１０分間２回、１８MΩ−Ｈ２Ｏを用いて１０分間２回以上洗浄することによって脱染色した。Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙで染色したゲルの画像を、Ｅｔｔａｎ  Ｄｉｇｅ  Ｉｍａｇｅｒを用いて励起波長４８０nm及び放射波長５３０nmで取得した。
【００７４】
Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄ  及び  Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙで染色したゲルの画像をＴＩＦ形式に変換し、そしてＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  ２Ｄ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）６．０ゲル画像解析ソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にインポートした。３つの指標（ｓｍｏｏｔｈ、１０；ａｒｅａ、５；ｓａｌｉｅｎｃｙ、２）に従って、スポットを自動で検出した。各ゲルからバックグラウンドを除去し、手動で、例えば、スポットの付加、分割又は除去を行い、画像を編集した。Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄで染色したゲルを基準又はマスターゲルとして選択し、Ｓｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙで染色したゲル中の対応するスポットとの自動でのマッチングに用いた。対照ラット（ｎ＝４）及びＨＦ−ラット（ｎ＝４）からの試料を用いたゲルを比較し、データを解析した。手動での編集し、マッチングにより画像を確認した後、ソフトウェアにより、タンパク質のスポットの容積の差を解析した。各画像における全スポット容積を計算し、そして各スポットに、全スポットの全容量中の割合として、正規化したスポット容積を割り当てた。Ｐｒｏ−Ｑ（登録商標）Ｄｉａｍｏｎｄで検出した１つのスポット、及びＳｙｐｒｏ（登録商標）Ｒｕｂｙによって検出した同じスポットの、正規化した容積におけるパーセンテージの比を評価し、その後対照とＨＦ−ラットとの間でこの比が有意に（ｐ＜０．０５）異なるポリペプチドのスポットを選抜した。
【００７５】
近年Cieniewski-Bernard, C. et al, 2008及びPottiez G et al, 2009により詳細に記載された方法により、ＬＶリン酸タンパク質（８００μｇ）を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０を用いて染色した後のゲル内消化法により同定し、そしてタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ  ＰＲＯ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、またＭＡＬＤＩでは同定できなかったスポットについてはＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ（Ｂｒｅｍｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）のＰｒｏｔｅｉｎｅｅｒ（商標）ワークフローを用いて同定した。
【００７６】
ペプチドのモノアイソトピック質量について、３つの別個のソフトウェアプログラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／）、ＰｒｏＦｏｕｎｄ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／）及びＭａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／））を用い、ＮＣＢＩ及び  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質データベースの検索を行った。データベース検索には、異なる特徴、すなわち、ラットの種、切れ残ったペプチド（ｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）、部分的な化学修飾（メチオニンの酸化及びシステインのカルバミドメチル化）及び５０ｐｐｍのマストレランスセッティング、を用いた。同定したとする基準としては、確率スコア、一致したペプチドの数（最低４ペプチド）、配列をカバーしている程度（＞２０％）及び質量、並びにタンパク質の等電点、を用いた。
【００７７】
免疫沈降及びウェスタンブロット解析。ＲＩＰＡ緩衝液（１０mmol／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、１５０mol／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％  ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｖ／ｖ）、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、１０％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、及び１０％  オルトバナジウム酸ナトリウム（ｗ／ｖ））に希釈した１μgの抗体と混合した２５又は５０μgのＬＶタンパク質又は１μLの血漿を用いて、免疫沈降を行った。ローテーター上、４℃で一晩インキュベートした後、免疫複合体を４℃、ローテーター上で１時間、ｎＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に沈降させた。免疫沈降物を最初にＲＩＰＡ緩衝液で洗浄し、その後９０％  ＲＩＰＡ緩衝液（ｖ／ｖ）、ＮａＣｌ  ０．５mol／Ｌで、次に５０％  ＲＩＰＡ緩衝液（ｖ／ｖ）、５０％  ＴＮＥ緩衝液（ｖ／ｖ）（１０mmol／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０mmol／Ｌ  ＮａＣｌ、１mmol／Ｌ  ＥＤＴＡ）で、そして最後にＴＮＥ緩衝液で洗浄し、その後ウェスタンブロット解析用にＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で抽出した。
【００７８】
ＬＶ由来のタンパク質（２５〜５０μg、ＬＶ又は１μL、血漿由来）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％  アクリルアミドゲル）で分離し、そして０．４５μm  Ｈｙｂｏｎｄ（商標）ニトロセルロースメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にトランスファーした。ロードした全タンパク質の確認は、メンブレンをＰｏｎｃｅａｕ  ｒｅｄで染色して目視で行った。次にブロットをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎに溶解した５％  脱脂粉乳又はＢＳＡ（ｗ／ｖ）中で飽和させ、そして特定のタンパク質に対する抗体を含むブロッキング溶液中で、一晩ブロッキングした。一次抗体としては、ホスホセリン残基（モノクローナル  ｐ−セリン抗体、クローンＰＳＲ−４５、Ｐ５７４７、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、免疫沈降の前又は後）、ホスホトレオニン残基（モノクローナル  ｐ−トレオニン抗体、クローンＨ−２、ｓｃ−５２６７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、免疫沈降の前又は後）、プロテインキナーゼＣアルファ（ポリクローナル  ＰＫＣα抗体、ＡＨＯ０７０２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）５０μgタンパク質／レーン、１／２５０）、プロテインキナーゼＣデルタ（モノクローナル  ＰＫＣδ抗体、クローンＺＰ０１２、４１−０３００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）５０μg、１／２５０）、プロテインキナーゼＣイプシロン（ポリクローナル  ＰＫＣε抗体、ＡＨＯ０７４３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）５０μg、１／１０００）、トロポニンＩ（ポリクローナル  トロポニンＩ抗体、＃４００２、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、２５μg、１／１０００）、トロポニンＩ  Ｓ２３／２４リン酸化（ポリクローナル  ホスホトロポニンＩ抗体、＃４００４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、２５μg、１／５００）、トロポニンＴ（モノクローナル  トロポニンＴ−Ｃ抗体、クローン２Ｇ３、ｓｃ−３３７２１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、５０μg、免疫沈降の前又は後、１／１００）及びＯ−ＧｌｃＮＡｃ部分（Ｃｏｖａｎｃｅ、５０μg又はＩＰ後、１／１０００）、に対するものを用いた。次にブロットをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で５回、各回につき１０分間洗浄し、そしてブロッキング溶液に溶解した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体と共に１時間インキュベートした。二次抗体としては、ＥＣＬ（商標）抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体、ロバ由来（ＮＡ９３４Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＥＣＬ（商標）抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体、ヒツジ由来（ＮＡ９３１Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、を用いた。メンブレンをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で５回、各回につき１０分間洗浄した。その後ブロットを、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ（商標））ウェスタンブロット検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートした。検出はＥｔｔａｎ  ＤＩＧＥ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、励起波長４８０nm及び放射波長５３０nmで行った。Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒ��ｄ）を用いて、バンドの蛍光強度を定量した。
【００７９】
トロポニンＴ及びホスホ−トロポニンＴ特異的抗体。標準的なプロトコールに従って、ラットトロポニンＴに保存された２０２〜２１５番目の配列（ＴｎＴ又はリン酸化Ｓｅｒ２０８−ＴｎＴのいずれかに特異的な領域である）に対する抗ペプチドポリクローナル抗体を開発した（３ヶ月間免疫化による、Ｐ．Ａ．Ｒ．Ｉ．Ｓ  ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｆｒａｎｃｅ）。各形態のトロポニンＴを認識するための試験用に、ポリクローナル抗体を、リン酸化Ｓｅｒ２０８−及びリン酸化を受けていないＴｎＴペプチドを用いて精製した。ポリクローナル抗体を全ての実験用に精製した。抗体の特異性を試験するために、５０μgのＬＶタンパク質を５０及び１００単位のアルカリフォスファターゼ（Ｍ０２９０Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、３７℃で１８時間処理した。次にタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％  アクリルアミドゲル）で分離し、ＰＶＤＦメンブレン上にトランスファーし、そして、リン酸化した又はリン酸化を受けていないＳｅｒ２０８ペプチド（２０２〜２１５  ａａ）と共に予めインキュベートしておいたＳｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴ又はＴｎＴ（１／１０００）のいずれかに対する抗体（最終濃度１０μg／mL）を含むブロッキング溶液中で、一晩ブロッキングした。精製したポリクローナル抗体によるウェスタンブロット解析を、５０μgのＬＶタンパク質又は１μLのラット若しくはヒト血漿を用い、上述したように行った。
【００８０】
統計分析。別段の指定のない限り、連続変数を、平均±ＳＤとして表した。ＬＶＥＤ（１年後対基準時）間の差は、対応のあるスチューデントのｔ検定により評価した。群間での差は、対応のない２標本のスチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡにより、事後比較（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）についてのＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ法に従って比較した。ｐ＜０．０５の値を示す場合に統計的に有意な差があると見なした。
【００８１】
結果
手術２ヶ月後の、対照及び心不全モデルラットにおける左室のディファレンシャルリン酸化プロテオーム解析。この試験では、左冠状動脈を結紮することによりＭＩを誘導した実験モデル（ＨＦ−ラット及び偽手術（対照）ラット）のＬＶリモデリング及び機能不全における、心臓のリン酸化プロテオームの変化を解析した。手術後７日目及び２ヶ月目にラットを麻酔し、詳細な心エコー、血行動態及び組織形態学的指標、を測定した。
【００８２】
２ヶ月後のプロテオーム解析では、ＬＶのプロテオームパターンが同様であるが（対照及びＨＦラットで検出されたリン酸化スポットはそれぞれ３０９±４９及び２８４±２９）、群間のＬＶリン酸化プロテオームパターンが、対照及びＨＦラットで検出された（ｐ＝０．０１３）リン酸化スポットがそれぞれ３２±５及び５２±８と、異なることを明らかにした。大部分のスポットを含む２Ｄ−ゲルを用いて、群間で差次的にリン酸化された６９のスポットを選択し、それらのうちの５３は質量分析により同定することができた。これらのタンパク質をその機能的意義により、８つのカテゴリー（分子シャペロン、酸化ストレス関連タンパク質、代謝酵素、呼吸鎖関連タンパク質、ＡＴＰ合成に関与するタンパク質、キニン経路に関与するタンパク質、又は膠質浸血圧に関与するタンパク質、そして最後はいくつかの筋フィラメントの要素）に分類した。
【００８３】
トロポニンＴ（ＴｎＴ）のリン酸化が変化するという発見は、後半のカテゴリーにおいて特に興味深いものである。ＴｎＴ自体は心血管障害におけるよく確立されたバイオマーカーであり、血清ＴｎＴレベルの上昇は、ＭＩ（Newby, LK et al, 1998）及びＨＦ（Latini R et al, 2007）を含む症状における臨床転帰の変化と関連する。そこで我々は、ＨＦにおけるＴｎＴリン酸化の低下過程をより詳細に解析した。
【００８４】
ＨＦラットのＬＶでのトロポニンＴのリン酸化の低下。２Ｄ−ゲル電気泳動実験で観察されたＴｎＴリン酸化の低下を確認するために、次に、タンパク質のリン酸化を受ける特定のアミノ酸の位置、及びＭＩ後二ヶ月のＨＦの経過中に変化するＴｎＴリン酸化の度合いを決定した。
【００８５】
ＴｎＴに対する特異的抗体を用いた免疫沈降と、その後のホスホ−セリン（Ｓｅｒ）、−トレオニン（Ｔｈｒ）又は−チロシン（Ｔｙｒ）抗体を用いたウェスタンブロット解析により、ＴｎＴのセリン及びトレオニン残基がリン酸化されることを決定した。２ヶ月後のＨＦラットのＬＶにおけるＴｎＴ  Ｓｅｒ−残基のリン酸化の度合いは有意に低下したが、ＴｎＴ  Ｔｈｒ−残基のリン酸化は有意に変化しないことが認められた。加えて、対照及びＨＦラット間での全ＴｎＴの発現は変化しなかった。ＴｎＴ  Ｓｅｒ−残基のリン酸化が有意に低下するという同様の結果は、ＭＩ後７日目のＨＦラットにおいても認められた。
【００８６】
リン酸化における変化がＴｎＴに特異的であることを確認するために、トロポニンＩ（ＴｎＩ）又はＳｅｒ２３／２４リン酸化ＴｎＩのいずれかに対する特異的抗体を用い、ＴｎＩのＳｅｒ２３／２４リン酸化の低下は心臓のトロポニンの不全と非不全との間の機能的な差の原因である（Messer AE et al, 2007）という提唱を考慮して、同じ試料についてのウェスタンブロット解析を行った。我々のモデルでは、手術後７日又は２ヶ月目のＨＦラット又は対照ラットでのＴｎＩ又はＳｅｒ２３／２４リン酸化ＴｎＩいずれの発現の変化も認められなかった。
【００８７】
次に、ＴｎＴ  Ｓｅｒ−リン酸化の調節と関連するシグナル伝達タンパク質についての解析を行った。バイオインフォマティクス解析（ＮｅｔＰｈｏｓ  ２．０  Ｓｅｒｖｅｒ、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓ（商標）及び  Ｓｃａｎｓｉｔｅ）により、（ラットＴｎＴ配列の）２０８番目の位置のセリンのみがリン酸化され得ること、並びにＳｅｒ２０８の周辺のアミノ酸がプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）及びプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）と保存された領域であることが示唆された。
【００８８】
特異的抗体を用いて評価した、ＨＦラットのＬＶ及び血漿中でのＳｅｒ２０８リン酸化トロポニンＴの低下。リン酸化されたＳｅｒ２０８を有する、ラットＴｎＴ配列（１〜２９８  ａａ）の２０２〜２１５番目のアミノ酸残基を含むホスホペプチドを合成した。このアミノ酸配列は、ヒト（Ｓｅｒ２０７）、マウス（Ｓｅｒ２１０）、ウサギ（Ｓｅｒ２１０）及びウシ（Ｓｅｒ１９４）の種において高度に保存されている。このペプチド配列を用いてポリクローナル抗体を生産し、そしてリン酸化した及びリン酸化していないＴｎＴの両方を用いて精製し、それらの特異性について試験した。両方の抗体は、ラットＬＶ由来の３４ｋＤａのＴｎＴを検出した。Ｓｅｒ２０８−リン酸化及びリン酸化を受けていないペプチドの両方を用いて、Ｓｅｒ２０８−リン酸化形態のＴｎＴに対する抗体の特性を解析した。Ｓｅｒ２０８−リン酸化ペプチドを用いた場合にのみ抗体の結合が見られなくなった。対照的に、リン酸化を受けていないペプチドを用いて精製した抗体の結合は、両方のペプチドと共にインキュベートすることにより見られなくなり、このことは、この抗体がリン酸化を受けていない形態のトロポニンだけでなく、全ＴｎＴを認識することを意味する。Ｓｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴについて抗体の特異性をさらに確認するために、全てのリン酸塩成分を除去するためにＬＶタンパク質をアルカリフォスファターゼで処理した。これによってもまた、抗体の結合は見られなくなった。
【００８９】
次に、Ｓｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴに対する抗体の、その他のトロポニンに対する交差反応性について試験した。対応するＴｎＩ配列は、ラットＴｎＴとは５／１４、ヒトＴｎＴとは０／１４の共通のアミノ酸を有し、両方の種におけるこの配列にはセリン残基がない。免疫沈降には、ＬＶタンパク質からの全又はＳｅｒ２３／２４−リン酸化ＴｎＩの特異的抗体もまた用いた。Ｓｅｒ２０８−リン酸化及び全ＴｎＴ抗体を用いたウェスタンブロット解析ではシグナルが検出されず、従ってＴｎＩとの交差反応性がないことが示された。
【００９０】
次に、これらのＳｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴ及び全ＴｎＴに特異的な抗体を用いて、ＨＦラットにおけるＴｎＴのＳｅｒ２０８−リン酸化の度合いを正確に定量し、そして間接的な方法から得られたデータの確認を行った。全ＴｎＴに対する抗体を用いることにより、２ヶ月目のＨＦラットのＬＶにおけるＴｎＴ発現には何ら変化ないことを見いだし、そしてそれらのＬＶにおけるＴｎＴのＳｅｒ２０８−リン酸化レベルが低下したことを確認した。従ってこれらのラットにおいては、Ｓｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴの全ＴｎＴに対する比は有意に低下した。結果は７日目のＨＦラットにおいても同様であった。
【００９１】
次に、ＴｎＴのＳｅｒ２０８−リン酸化における変化が、ＨＦラットの血漿においても検出及び定量できるかどうかについて試験した。２ヶ月目のＨＦラットの血漿においては、全ＴｎＴは中程度ながらも有意に増加しており（１．７倍に）、ＬＶにおいてと同様に、血漿においてもＳｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴの有意な低下が認められた。結果は７日目のＨＦラットにおいても同様であった。血漿について定量したＳｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴの全ＴｎＴに対する比は、両時点で、対照ラットよりもＨＦラットにおいて有意に低かった。
【００９２】
ＬＶリモデリングを有する患者の血漿におけるヒトＳｅｒ２０７−リン酸化トロポニンＴの減少。ＭＩのＨＦを有するラットの血漿においてＳｅｒ２０８−リン酸化ＴｎＴが特異的に低下するという我々の発見は、血中のリン酸化ＴｎＴがＭＩ患者のＬＶリモデリングのバイオマーカーになりうることを示唆するものであった。我々のポリクローナル抗体がヒトＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴ配列をもまた特異的に認識したため、前壁ＭＩを有する２つの異なる患者集団における血中リン酸化ＴｎＴを定量した。ＭＩ後１年間の完全な心エコーフォローアップを大部分の患者から得た。両集団において、基準時から１年間での進行性のＬＶ容積の増加をＬＶリモデリングとした。アンジオテンシン変換酵素阻害薬及びβ遮断薬を含む抗リモデリング剤のほぼ全身への投与にもかかわらず、リモデリング過程が生じた。
【００９３】
ＴｎＴ解析用に、集団１からはＭＩ後７±３日の、集団２からはＭＩ後５±１日の血液試料を得た。患者を、ＭＩの１年後に測定した患者らの左心室拡張末期容積に基づいてＬＶリモデリングの３分位に分割した。第一三分位は最も低度のリモデリングを有する患者、第二三分位は中度のリモデリングを有する患者、そして第三三分位は最も高度のリモデリングのある患者とした。抗リモデリング剤の投与は、３群において同様であった。図１に示すように、集団１における全ＴｎＴ発現は、ＬＶリモデリング三分位によっても変化はなかったが、集団２においては、中度及び高度のリモデリングを有する患者においては、中程度ではあるが有意ではない全ＴｎＴの発現が認められた。両集団において、Ｓｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴは有意に低下し、Ｓｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴ／全ＴｎＴ率は、中度又は高度のリモデリングを有する患者において非常に有意に低下した。この発見は、２つの独立した患者集団において同様であった。
【００９４】
リン酸化トロポニンＴ／全ＴｎＴ比と拡張末期容積（ＥＤＶ）における変化のパーセンテージとの間の関係
連続変数は別段の指定のない限り、平均±ＳＤ又は２５番目から７５番目のパーセンタイルの中間値として表した。正規分布を取らない変数については、統計的検定の前にログ変換した。ＥＤＶにおける差を（１年後対基準時）、対応のあるスチューデントのｔ検定によって評価した。群間の差は、対応のない２標本のスチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡにより、事後比較についてのＳｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ法に従って比較した。カテゴリーデータは、カイ二乗検定又はフィッシャーの直接確率検定を用いて、適切に解析した。ＥＤＶにおける変化のパーセンテージとＳｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴ対全ＴｎＴとの間の関係は、線形回帰によって解析した。ＥＤＶの変化における独立要因を、多重線形回帰により同定した。単変量解析においてｐ値が＜０．０５だった変数をモデルに加えた。共直線性は、候補となる予測因子間の相関マトリックスを用いて除外した。ｐが＜０．０５である値を統計的に有意であると見なした。解析は、ＳＡＳソフトウェア（ｒｅｌｅａｓｅ  ９．１、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｒｙ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【００９５】
ＭＩ後７±３日目に、生物学的解析用の血液試料を得た。集団中の全ＴｎＴの発現には、ＬＶＲ三分位による差はなかった。Ｓｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴ、及びその全ＴｎＴに対する比は、中度又は高度リモデリングを呈する患者においては非常に有意に低下した。
【００９６】
基準時から１年後の、この比及びＥＤＶの変化のパーセンテージとの間の関係（連続変数として表す）を、線形回帰を用いて解析し、そして、これが統計的に有意であることを見いだした（ｐ＝０．０００３）。多変量解析によって、ＥＤＶの変化に独立して関連する、ＬＶＲの３つの独立要因、Ｓｅｒ２０７−リン酸化ＴｎＴの全ＴｎＴに対する比（ｐ＝０．００２）、壁運動収縮指標（ｐ＝０．００２）、及び高血圧（ｐ＝０．０４５）、を決定した。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
ＨＦラットのＬＶ及び血漿においてはＯ−ＧｌｃＮＡｃ化トロポニンＴが増加する。ＴｎＴに対する特異的抗体を用いた免疫沈降と、その後のＯ−ＧｌｃＮＡｃ部分抗体を用いたウェスタンブロット解析により、我々は、７日後（ｐ＝０．００２３）及び２ヶ月後（ｐ＝０．００００００４）のＨＦラットの左室におけるＯ−ＧＬｃＮＡｃ−ＴｎＴが有意に上昇することを見いだした。
【００９９】
次に、Ｏ−ＧＬｃＮＡｃ−ＴｎＴの変化がＨＦラットの血漿中においても検出及び定量できるかどうかについて解析した。７日後（ｐ＝０．０１２）及び２ヶ月後（ｐ＝０．０００４）のＨＦラットの血漿においてもまた、Ｏ−ＧＬｃＮＡｃ−ＴｎＴは有意に増加した。
【０１００】
ＨＦラットのトロポニンＴにおいては、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ化とリン酸化との間に相互関係があると仮定することができる。
【０１０１】
ＩＩ．梗塞を呈さない患者の心不全についての研究
ＰＴＨＦプロトコール。ＰｒｏＴｅｏｍｉｃ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ（ＰＴＨＦ）は、収縮機能障害（左室駆出分画率＜３５％）を原因とし、非虚血性拡張型心筋症の予後評価のために循環器科に送られた重症心不全患者３０人を対象とした臨床試験である。対照群は、ＣＨＲＵ  ｄｅ  Ｌｉｌｌｅ（ＣＨＲＵ  ｏｆ  Ｌｉｌｌｅ）のＣＩＣ−ＣＲＢによって健康なボランティア母集団から選抜された３０人の対照から構成した。これらの、心不全を罹患した患者群と年齢及び性別が一致した対照について心臓検査及び超音波スキャンによる心臓の解析を行った。
【０１０２】
我々の特異的ポリクローナル抗体及びウェスタンブロット解析を用いることにより、全トロポニンＴのレベル、リン酸化Ｓｅｒ２０７−トロポニンＴを定量し、そしてリン酸化Ｓｅｒ２０７−トロポニンＴの全トロポニンＴに対する比を計算した。対照及び患者から得たデータを以下に示す。
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
これらの結果は、リン酸化トロポニンＴを左室リモデリングのバイオマーカーとしてだけではなく、心不全（梗塞を呈する又は呈さない症例の）のバイオマーカーとしても使用することができることを示すものである。グリコシル化トロポニンＴもまた、そのような機序の指標となり、トロポニンＴのリン酸化について得られた結果を正確に確認するために用いることができると考えられる。
【０１０５】
ＰＴＨＦ研究の患者におけるトロポニンＴ−ＯＧｌｃＮＡｃの血漿レベルの上昇
１μLの血漿を、ＲＩＰＡ緩衝液（１０mmol／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ、１５０mol／Ｌ  ＮａＣｌ、１０％  ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ｖ／ｖ）、０．５％  デオキシコール酸ナトリウム（ｗ／ｖ）、１０％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、及び１０％  オルトバナジウム酸ナトリウム（ｗ／ｖ））に希釈した１μｇの抗体と混合し、免疫沈降を行った。ローテーター上、４℃で一晩インキュベートした後、免疫複合体をｎＰｒｏｔｅｉｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にローテーター上、４℃で１時間沈降させた。免疫沈降物を最初にＲＩＰＡ緩衝液で、次に９０％  ＲＩＰＡ緩衝液（ｖ／ｖ）、ＮａＣｌ  ０．５mol／Ｌ、その後５０％  ＲＩＰＡ緩衝液（ｖ／ｖ）、５０％  ＴＮＥ緩衝液（ｖ／ｖ）（１０mmol／Ｌ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１５０mmol／Ｌ  ＮａＣｌ、１mmol／Ｌ  ＥＤＴＡ）、そして最後にＴＮＥ緩衝液で洗浄し、その後Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中でウェスタンブロット解析用に抽出した。
【０１０６】
タンパク質（１μLの血漿由来）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％  アクリルアミドゲル）で分離し、０．４５μm  Ｈｙｂｏｎｄ（商標）ニトロセルロースメンブレン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にトランスファーした。ロードした全タンパク質を、メンブレンをＰｏｎｃｅａｕ  ｒｅｄで染色することにより、目視で確認した。次にブロットをＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で洗浄し、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳又はＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎに溶解したＢＳＡ中で飽和させ、そして特定のタンパク質に対する抗体を含むブロッキング溶液中で一晩ブロッキングした。一次抗体としては、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ部分（マウスモノクローナルＯ−ＧｌｃＮＡｃ抗体、クローンＣＴＤ１１０．６、ＭＭＳ−２４８Ｒ−０５００、Ｃｏｖａｎｃｅ、ＩＰ用）を用いた。ウェスタンブロット解析用の二次抗体としては、ＥＣｌ（商標）抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ結合全抗体、ヒツジ由来（ＮＡ９３１Ｖ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び抗マウスＩｇＭペルオキシダーゼ結合、ヤギ由来（Ａ８７８６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。
【０１０７】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃタンパク質のウェスタンブロットでの特異性は、酵素消化により制御された。全てのリン酸化を受けた残基又はＯ−ＧｌｃＮＡｃ残基を除去するために、１μＬの血漿を酵素緩衝液で希釈した１００単位のアルカリフォスファターゼ（Ｍ０２９０Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））又は１００ｍＭのクエン酸塩緩衝液で希釈した１５単位のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼｆ（Ｐ０７２１Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））で、１８時間、３７℃で処理した。
【０１０８】
バンドの強度はＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）画像解析ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、以下に詳述するように定量した：１）検出した各バンド、及びメンブレンのバックグラウンドの定量には決められたサイズ四方の区画を用いた；２）ＬＶ試料に対応する各バンドについては、バックグラウンドの値を強度の値から差し引いた；３）ブロット間の差をなくすために、各試料の強度の値を標準値に対して正規化した。
【０１０９】
Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ部分に対する特異的抗体を用いて、血漿（１μＬ）タンパク質の免疫沈降を行い、そしてＰＴＨＦ研究の対照（ｎ＝３０）及び症例（ｎ＝３０）のｃＴｎＴを用いたウェスタンブロットを行った。
【０１１０】
【表３】
0005598537.tif 000004
【０１１１】
参考文献
本出願を通じて、本発明が属する分野の最先端の技術を記載するために様々な参考文献を用いた。これら参考文献の開示は、ここで参照することにより、本開示に組み入れられるものとする。
【表４】
0005598537.tif 000005
0005598537.tif 000006
【図１Ａ】
0005598537.tif 000007
【図１Ｂ】
0005598537.tif 000008
【図１Ｃ】
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