(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型単純ヘルペスウイルス２型のゲノムの全長を保持し、そのゲノムのＵＬ５０−ＵＬ５１遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換え単純ヘルペスウイルス２型。
【請求項２】
野生型単純ヘルペスウイルス２型のゲノムの全長を保持し、そのゲノムのＵＬ５０−ＵＬ５１遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換え単純ヘルペスウイルス２型ゲノムを保持した大腸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン開発や遺伝子治療ベクター開発等に有用な組換えウイルスの製造法、単純ヘルペスウイルス２型のゲノムの全長を保持した組換えウイルス、およびこれを保持した大腸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療ベクターや多価ワクチンといった組換えウイルスを作製するには、ウイルスゲノムのいずれかの領域に外来遺伝子を挿入する必要がある。そして、得られる組換えウイルスは、本来の遺伝子治療ベクターやワクチンのウイルスゲノムの遺伝子を欠損したり、性状を変化させては問題がある。
【０００３】
組換えウイルスの作製技術の従来の手法としては、マーカー（ＴＫ、ＬａｃＺ）遺伝子を利用した培養細胞内での相同組換え法（非特許文献１）や、コスミドを利用した培養細胞内での相同組換え法（非特許文献２）等が知られているが、これら従来の手法はいずれも挿入しようとする外来遺伝子側に関する技術であり、挿入される側であるウイルスゲノムについては何ら着目されていない。
【０００４】
ところで、単純ヘルペスウイルス（HSV：herpes simplex virus）感染症は、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２感染によって引き起こされる。ＨＳＶ−１は主に口腔、上気道粘膜を中心とした上半身に感染し、口内炎や口唇ヘルペスを発症させる。一方、ＨＳＶ−２は主に性器を中心とし下半身に感染し、性器ヘルペスを発症させる。ＨＳＶのワクチンは開発されていない。また、ＨＳＶは遺伝子治療ベクターとしても有用であり、いくつかは臨床試験段階である。
【０００５】
ウイルスのワクチンや遺伝子治療ベクターの開発には、組換えウイルス作製の技術が必須である。ワクチン開発には病原性因子の不活化が、遺伝子治療ベクターの開発には、病原性因子の不活性に加え、外来遺伝子の搭載が必要となる。
【０００６】
近年、大型のＤＮＡ cloning systemであるbac system（bacterial artificial chromosome system）を利用し、大腸菌内で相同組換えを行う手法が報告され、従来よりも組換えウイルスの作製が迅速かつ簡便に行えるようになりつつある。
【０００７】
bac systemにおいて中核をなす材料は、ウイルスゲノムを保持する大腸菌である。この大腸菌を得ることができれば、大腸菌の遺伝学を用いて、様々なウイルスゲノムの改変が可能となる。また、bac systemにおいては、バクミドをウイルスゲノムに挿入することが、ゲノムの大腸菌保持には必須であり、バクミド挿入によってウイルスゲノムの遺伝子を欠損したり、野生体のウイルス性状を変化させては問題がある。しかしながら、ＨＳＶに関するbac systemを利用したウイルスゲノムを保持する大腸菌の作製に関する従来の報告例においては、バクミド（bacmid）の挿入によってPackagin signalが欠損していたり（非特許文献３〜５）、あるいはＴＫ（非必須なＨＳＶ遺伝子）にbacmidが挿入されている（非特許文献６）場合が多い。このような欠損や挿入が存在していると、多目的なベクターの作製に適さない場合があり、また、ウイルス自体の基礎研究に用いる上で障害となっていた。また、bacmidは7kbpと比較的大きいので、組換えウイルスの病原性やその組換えウイルスが保持しうる外来遺伝子の長さを限定してしまうので、除去するシステムが必要である。
【０００８】
ＨＳＶ−１については、ＵＬ３およびＵＬ４遺伝子の遺伝子間領域にバクミドを挿入することにより、野生体の性状を保持した完全長の感染性ＨＳＶ−１ウイルスゲノムを保持した大腸菌の作製に成功し、先に報告した（特許文献１）。
【０００９】
しかしながら、ＨＳＶ−２に関しては、ゲノムの全長を実質的に保持した組換えウイルスを維持しうる大腸菌は得られていなかった。
【特許文献１】特開２００３−１８９８８２号公報
【非特許文献１】Post L. E. et al. Cell24:555-565, 1981
【非特許文献２】CunninghamC. et al. Virol. 197:116-124, 1993
【非特許文献３】Saeki Y. et al. Hum. Gen. Ther. 9:2787-2794, 1998
【非特許文献４】Tom A. S. et al. J. Virol. 72:7137-7143, 1998
【非特許文献５】Suter M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12697-12702, 1999
【非特許文献６】Horsburgh B. C. et al. GeneTher. 6:922-930, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ウイルスゲノムの遺伝子を欠損したり、性状を変化させることなく、ウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入する方法を提供することにある。
また、本発明は、ＨＳＶ−２のゲノムの全長を保持した組換えＨＳＶ−２を提供し、そのウイルスゲノムを保持した大腸菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで本発明者は、標的ウイルスゲノムの有する遺伝子を欠損させず、かつ性状に影響を与えることなく、外来遺伝子を挿入して組換えウイルスを作製すべく種々検討したところ、外来遺伝子の挿入領域として、標的ウイルスゲノム中の相互に逆方向からコードされる遺伝子のｐｏｌｙＡシグナル間の領域を選択すれば、容易に目的とする組換えウイルスが作製できることを見出した。そして、ＨＳＶ−２においては、ＵＬ５０とＵＬ５１の遺伝子のｐｏｌｙＡシグナル間領域にバクミドを挿入すれば、ＨＳＶ−２のゲノムの全長を実質的に保持した組換えＨＳＶ−２が得られることを見出し、そのウイルスゲノムを大腸菌に保持させることにより、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、標的ウイルスゲノム中の相互に逆方向からコードされる２種の遺伝子のｐｏｌｙＡシグナル間の領域（ＨＳＶ−１のＵＬ３−ＵＬ４間を除く）に、外来遺伝子を挿入することを特徴とする、組換えウイルスの製造法を提供するものである。
また、本発明は、標的ウイルスゲノム中の相互に逆方向からコードされる２種の遺伝子のｐｏｌｙＡシグナル間の領域（ＨＳＶ−１のＵＬ３−ＵＬ４間を除く）にバクミドを挿入し、得られた組換えウイルスゲノムを大腸菌に導入させることを特徴とする、野生型ウイルスゲノムの全長を実質的に保持した組換えウイルスゲノム導入大腸菌の製造法を提供するものである。
また、本発明は、野生型ＨＳＶ−２のゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのＵＬ５０−ＵＬ５１遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換えＨＳＶ−２を提供するものである。
さらに、本発明は、野生型ＨＳＶ−２のゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのＵＬ５０−ＵＬ５１遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換えＨＳＶ−２ゲノムを保持した大腸菌を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明方法によれば、ワクチン開発や遺伝子治療ベクター開発のツールとして有用な組換えウイルスが容易に作製できる。また、外来遺伝子として、バクミドを用いれば、当該組換えウイルスゲノムを保持した大腸菌が得られる。得られた大腸菌は、ウイルス改変を著しく簡便にするため、これを利用してワクチン開発や遺伝子治療ベクターの開発が可能となる。
また、本発明の組換えＨＳＶ−２は、野生型ＨＳＶ−２のゲノムの全長を実質的に保持するため、遺伝子発現やワクチン開発のためのベクターおよび基礎的研究に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
まず、標的ウイルスゲノムの特定部位に外来遺伝子を挿入する方法について説明する。
本発明方法においては、標的ウイルスゲノム中の相互に逆方向からコードされる２種の遺伝子のｐｏｌｙＡシグナル間の領域に、外来遺伝子を挿入する。標的ウイルスとしては、ＤＮＡ型であれば特に制限されないが、例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、パポーバウイルスが挙げられる。
【００１５】
標的ウイルスゲノム中の相互に逆方向からコードされる２種の遺伝子のｐｏｌｙＡシグナル間の領域とは、２種の遺伝子が隣接して存在し、かつそれらの２種の遺伝子が逆方向からコードされる領域の中のｐｏｌｙＡシグナルとｐｏｌｙＡシグナルの間の領域である（図１参照）。これらの領域は、標的ウイルスのゲノムについてのデータベースに基づいて選択することができる。例えばＨＳＶ−２においては、ＵＬ３−ＵＬ４領域、ＵＬ７−ＵＬ８領域、ＵＬ１０−ＵＬ１１領域、ＵＬ１５−ＵＬ１８領域、ＵＬ２１−ＵＬ２２領域、ＵＬ２６−ＵＬ２７領域、ＵＬ３５−ＵＬ３６領域、ＵＬ４０−ＵＬ４１領域、ＵＬ４５−ＵＬ４６領域、ＵＬ５０−ＵＬ５１領域、ＵＬ５５−ＵＬ５６領域、Ｕｓ１−Ｕｓ２領域およびＵｓ９−Ｕｓ１０領域の１３ヶ所存在する。
標的ウイルスゲノム中の同一方向にコードされる２種の遺伝子の間の領域に外来遺伝子を挿入すると、プロモーターを破壊するおそれがある。この点、本発明方法で用いるｐｏｌｙＡシグナル間領域であれば、標的ウイルスゲノムの遺伝子の欠損や性状の変化がない。
【００１６】
外来遺伝子としては、バクミド、レポーター遺伝子、免疫原生のあるタンパク質をコードする遺伝子、遺伝子治療に用いられる遺伝子等が挙げられ、組換えウイルスゲノムを大腸菌に保持させることを目的とする場合には、バクミドが好ましい。バクミドとしては、例えば２つのｌｏｘＰの間にバクミドが挟まれたベクターを用いてもよく、２つのｌｏｘＰの間にバクミドおよび検出可能なレポーター遺伝子が挟まれたベクターを用いてもよい。ここで検出可能なレポーター遺伝子としては、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク）、ＣＡＴ（クロラムフェンコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＤｓＲｅｄ、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）、ｌａｃＺ、カエデ、ルシフェラーゼ等が用いられる。このうちＧＦＰが特に好ましい。
【００１７】
外来遺伝子のｐｏｌｙＡシグナル間領域への挿入は、制限酵素部位を利用した通常のクローニング手段によって行うことができる。例えば、標的ウイルスゲノム中の目的挿入部位である前記ｐｏｌｙＡシグナル間領域を含む断片をプラスミドにクローニングする。得られたプラスミドの２つのｐｏｌｙＡシグナル間に、２つのｌｏｘＰの間に外来遺伝子（必要に応じてレポーター遺伝子も導入する）が挟まれたものを挿入することにより、目的のｐｏｌｙＡシグナル間領域に外来遺伝子が挿入されたプラスミドが得られる。
【００１８】
次に標的ウイルスＤＮＡと、上記外来遺伝子挿入プラスミドとを、標的ウイルスが感染する細胞にトランスフェクトし、相同組換えを行えば目的の組換えウイルスを得ることができる。当該感染細胞から、例えばレポーター遺伝子が発現している細胞を選択することにより、目的の組換えウイルスを選択することができる。
【００１９】
得られた組換えウイルスが、バクミドを有している場合には、当該組換えウイルスゲノムを大腸菌等の細菌に導入させることにより、組換えウイルスを保持した細菌を得ることができる。
【００２０】
得られた組換えウイルスをＶｅｒｏ細胞、rabbit skin cells等のウイルスが感染する細胞に感染させて、その細胞から環状ウイルスＤＮＡを採取し、その環状ウイルスＤＮＡを大腸菌に導入すればよい。
【００２１】
次に、本発明の組換えＨＳＶ−２の製法について説明する。本発明の組換えＨＳＶ−２は、前記ｐｏｌｙＡシグナル間領域としてＵＬ５０−ＵＬ５１間領域を採用し、外来遺伝子としてバクミドを採用したものである。ＨＳＶ−２においては、ＵＬ３−ＵＬ４間領域バクミドを挿入しようとしたが、挿入できなかった。従って、ＨＳＶ−２にバクミドを挿入する場合には、ＵＬ５０−ＵＬ５１間領域が好適である。まず、ＵＬ５０−ＵＬ５１間領域を含む断片を含有するプラスミドを構築する。このプラスミドのＵＬ５０−ＵＬ５１間領域にバクミドを挿入する。具体的には、２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたバクミドを含むプラスミド、または２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたバクミドおよびレポーター遺伝子（例えばＧＦＰ）を含むプラスミドを用いて、２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたバクミド、または２つのｌｏｘＰ配列に挟まれたバクミドおよびレポーター遺伝子を、前記プラスミドのＵＬ５０−ＵＬ５１間領域に挿入する。
次に野生型ＨＳＶ−２ＤＮＡと得られた組換えプラスミドとを、ＨＳＶ−２が感染する細胞にトランスフェクトし、相同組換えを行えば、野生型ＨＳＶ−２のゲノムの全長を実質的に保持し、そのゲノムのＵＬ５０−ＵＬ５１遺伝子間領域にバクミドが挿入された組換えＨＳＶ−２が得られる。ここで、実質的にとは、機能を損ねない範囲でゲノムの全長を保持していることをいう。
【００２２】
得られた組換えＨＳＶ−２ゲノムを大腸菌に導入させれば、この組換えＨＳＶ−２ゲノムを保持した大腸菌が得られる。
【００２３】
また、得られた組換えＨＳＶ−２は、ｌｏｘＰ部位を有するため、Ｃｒｅリコンビナーゼによりバクミドまたはバクミドとレポーター遺伝子を除去することができる。
【００２４】
得られた組換えＨＳＶ−２、または、得られた組み換えＨＳＶ−２ゲノムを大腸菌に保持させ、そのウイルスゲノムから再構築させた組み換えＨＳＶ−２は、野生型ＨＳＶ−２と同程度の増殖能と病原性を有し、ウイルスベクター、ワクチンのプラットフォームとして用いることが可能である。
【実施例】
【００２５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００２６】
本実施例においては、遺伝子クローニングおよびその解析は、マニアティス（Maniates）らのモレキュラー・クローニング・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning-A Laboratory Manual）、およびコールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）(1982)に基づいて行った。実験方法は、Ausubel. FらのCurrent Protocols in Molecular Biology(1987)中に詳細に記載されているような標準の実験室的方法に従った。
【００２７】
実施例１
（遺伝子間領域に蛍光タンパク質カセットを挿入した組み換えウイルスの製造法）
【００２８】
（１）トランスファープラスミドの構築
p26.5-Venusは、HSV-1(F)のUL26.5プロモーター領域(nt 51388 to nt 51673)、Venus蛍光タンパク質遺伝子、HSV-1 UL21およびUL22の双方向poly Aシグナルを含む270bp断片をpBluescript II KS+ (Stratagene)にクローニングした。p26.5-VenusのSacI-KpnI断片をpRB442 (J. Virol. 65: 938-944, 1991)のBamHIサイトにクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in UL3-4を作製した。UL50, UL51を含むHSV-1(F)のBglII-EcoRＩ断片(nt 106750 to nt 110095)をpBluescript II KS+にクローニングしたプラスミドのUL50および  UL51のpoly Aシグナル間領域にPacIサイトを導入したプラスミド、pUL50-51pacを作製した。pUL50-51pacのPacIサイトにp26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in UL50-51を作製した。Us1, Us2を含むHSV-1(F)のEcoRI-BamHI断片(nt 131535 to nt 136289)をpBluescript II KS+にクローニングしたプラスミドのUs1およびUs2のpoly Aシグナル間領域にPacIサイトを導入したプラスミド、pUs1-2pacを作製した。pUs1-2pacのPacIサイトにp26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in Us1-2を作製した。
UL3, UL4遺伝子を含むHSV-2 186ウイルスゲノムのBamHI断片(nt 6772 to nt 14950)をpBluescript II KS+にクローニングしたプラスミドのUL3およびUL4のpoly Aシグナル間領域にPacIサイトを導入したプラスミド、p2UL3-4pacを作製した。p2UL3-4pacのPacIサイトにp26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in 2UL3-4を作製した。UL50, UL51遺伝子を含むHSV-2 186株のゲノムDNA NotI-ClaI断片(n.n. 106473 to n.n. 110443)をpBluescript II KS+ (Stratagene)のNotI-ClaIサイトにクローニングした(pBS-2NC)。pBS-2NCにおけるUL50およびUL51遺伝子のpoly Aシグナル間領域にあるNdeIサイトに、p26.5-VenusのSacI-KpnI断片をクローニングし、トランスファープラスミドp26.5-Venus in 2UL50-51を作製した。
【００２９】
（２）組み換えウイルスの作製
p26.5-Venus in UL3-4、p26.5-Venus in UL50-51またはp26.5-Venus in Us1-2とHSV-1(F)株のウイルスDNAをウサギ皮膚細胞(RSC)にトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、Venus発現カセットが各遺伝子間領域に挿入された組み換えウイルスYK336 (UL3-UL4遺伝子間)、YK338 (UL50-UL51遺伝子間) 、YK339 (Us1-Us2遺伝子間)(図２)を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、100%のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。YK336, YK338, YK339が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。
【００３０】
p26.5-Venus in 2UL3-4またはp26.5-Venus in 2UL50-51とHSV-2 186株のウイルスDNAをウサギ皮膚細胞(RSC)にトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、Venus発現カセットが各遺伝子間領域に挿入された組み換えウイルスYK381(UL3-UL4遺伝子間)、YK382 (UL50-UL51遺伝子間) (図３)を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、100%のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。YK381, YK382が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。
【００３１】
（３）組み換えウイルスの性状解析
YK336, YK338, YK339および野生型HSV-1(F)をVero細胞にMOI 0.01またはMOI 5で感染させウイルスの細胞内外のウイルス量を計測することにより、増殖能を比較した（図４）。YK336, YK338, YK339は培養細胞において、野生体と同程度の増殖能を有していることが明らかになった。
YK381, YK382および野生型HSV-2 186をVero細胞にMOI 0.01またはMOI 3で感染させウイルスの細胞内外のウイルス量を計測することにより、増殖能を比較した（図５）。YK381, YK382は培養細胞において、野生体と同程度の増殖能を有していることが明らかになった。
YK336, YK338, YK339と野生型HSV-1(F)について、様々な量のウイルスをマウスの脳内に接種し、LD50を算出した。その結果、各ウイルスのLD50の値に有意な差は見られなかった（表１）。
YK381,YK382と野生型HSV-2 (186)について、様々な量のウイルスをマウスの脳内に接種し、LD50を算出した。その結果、両ウイルスのLD50の値に有意な差は見られなかった（表２）。
【００３２】
【表１】
0005517116.tif 000002
【００３３】
【表２】
0005517116.tif 000003
【００３４】
以上の結果より、HSVゲノム中の相互に逆方向からコードされる２種の遺伝子のpoly Aシグナル間領域に外来遺伝子を挿入しても、培養細胞での増殖およびマウスモデルでの病原性に影響を及ぼさないことが明らかになった。
【００３５】
実施例２
（１）pBS246GFPBACの構築
pEGFP-C1 (Clontech)をBglII, BamHIで消化した。その後、末端を平滑化し、ライゲーションを行った。そのAseI-AflIII断片を平滑末端化し、pBS246 (Invitrogen)のSmaIサイトにクローニングした。さらに、pBelloBAC11 (Research Genetics)のSalI断片を平滑末端化し、EcoRVにクローニングした。（図６）
【００３６】
（２）pBS-2NC-EGFP/BACの構築
HSV-2 186株のゲノムDNA NotI-ClaI断片(n.n. 106473 to n.n. 110443)をpBliuescript II KS+ (Stratagene)のNotI-ClaIサイトにクローニングした(pBS-2NC)。得られたプラスミドのNdeIサイトを平滑化し、pBS246GFPBACのNotI断片を平滑末端化したものをクローニングして、pBS-2NC-EGFP/BACを構築した。（図６）
【００３７】
（３）YK351の構築
pBS-2NC-EGFP/BACとHSV-2 186株のウイルスDNAをウサギ皮膚細胞(RSC)にトランスフェクトした。その後、相同組み換えによって産生された、EGFP発現カセットとbacmidがUL50とUL51の遺伝子間領域に挿入された組み換えウイルスYK351を、蛍光顕微鏡下において、蛍光を発するプラークを採取することによって選択した。また、100%のプラークが蛍光を発するまで、蛍光顕微鏡下においてプラーク純化を行った。YK351が目的の組み換えウイルスであることはサザン法にて確認した。YK351はUL50とUL51の遺伝子間領域にloxP配列で挟まれたbacmidおよびEGFP発現カセットが挿入され、如何なる既知のHSV-2 ORFも欠損しない全長のHSV-2遺伝子を有している（図７）。
【００３８】
実施例３（YEbac356の構築）
YK351をVero細胞に感染させ、その感染細胞からHirt法により環状ウイルスDNAを抽出した。抽出した環状ウイルスDNAを大腸菌DH10B (Invitrogen)にエレクトロポレーション法によって導入し、クロラムフェニコール添加培地にて選択し、YK351ゲノムを保持する大腸菌YEbac356を得た。（図７）
【００３９】
実施例４（pYEbac356から再構築された組み換えウイルス(YK356)の性状解析）
大腸菌YEbac356からアルカリSDS法によって感染性のHSV DNA (pYEbac356)を抽出し、これをリン酸カルシウム法でRSCにトランスフェクションした。その結果、感染性の組み換えHSV-2 (YK356)の産生が確認された。
pYEbac356から再構築された組み換えウイルス(YK356)と野生型HSV-2 186 DNAについて、アガロース電気泳動上の制限酵素(NotI)切断パターンを図８に示す。図８においてaはbacmid挿入によって見られるバンドであり、bはbacmid挿入によって消失するバンドである。図８に示すように、YK356の制限酵素切断パターンは、bacmid挿入領域を除いて、野生型HSV-2(186)のパターンとほぼ一致した。
得られたYK356および野生型HSV-2 186をVero細胞にMOI 0.01またはMOI 3で感染させウイルスの細胞内および細胞外のウイルス量を計測することにより、増殖能を比較した（図９）。YK356は培養細胞において、野生体と同程度の増殖能を有していることが明らかになった。
【００４０】
YK356と野生型HSV-2 186について、ICRマウスの脳内に10PFUの各ウイルス接種し、2週間の生存を観察した。その結果、YK356と野生型HSV-2 186のマウス生存曲線は一致していた（図１０）。また、様々な量のウイルスをマウスの脳内に接種し、LD50を算出した。その結果、両ウイルスのLD50の値に有意な差は見られなかった（表３）。
【００４１】
【表３】
0005517116.tif 000004
【００４２】
Creリコンビナーゼを発現する組み換えアデノウイルスAxCANCreとYK356をVero細胞に重感染させ、bacmidの除去を試みた(J. Virol. 77: 1382-1391, 2003)。得られた組み換えウイルスYK361は、ウイルスゲノムからbacmidが除去されていることをサザン法で確認された（図１１）。サザン法では、HSV-2 186, YK356, YK361のウイルスDNAをNotIで処理後、実験に供した。プローブは、UL50, UL51遺伝子にまたがる500bpの領域をPCRで増幅したものを用いた。PCRには以下のprimerを用いた。acgcctgtgcgtttgttgta（配列番号１）およびatggtcaacctcgagaggct（配列番号２）。
【００４３】
実施例５（YEbac356内におけるHSV-2ゲノムへの変異導入）
既知の方法(J. Virol. 81: 10575-10587, 2007)を利用して、HSV-2のUL11領域にカナマイシン耐性遺伝子を挿入することによって、当該ウイルス遺伝子を不活化させることを試みた。また、Us3のLys-220をmethionineに置換する変異導入も試みた。既知の方法(J. Virol. 81: 10575-10587, 2007)によって、大腸菌内において、HSV-2ゲノムに変異を導入後、大腸菌よりウイルスゲノムを抽出し、RSCにトランスフェクションすることによって変異ウイルスを得た(YK801: UL11変異、YK811: Us3変異)。変異導入には以下のprimerを用いた。
UL11変異：caccgacggcggggaggtcgtctcgctgaccgcccactaatttgacgtcgtggacatcga aggatgacgacgataagtaggg（配列番号３）およびtaccctcttcttcggactcgatgtccacgacgtcaaattagtgggcggtcagcgagacgacaaccaattaaccaattctgattag（配列番号４）。
Us3変異：tgatagcagccacccgaactaccctcatcgggtaatcgtcatggcggggtggtacgccagaggatgacgacgataagtaggg（配列番号５）およびgccgcgcctcgtggctcgtgctggcgtaccaccccgccttgacgattacccgatgagggtcaaccaattaaccaattctgattag（配列番号６）。
UL11の変異導入は、YK801, YK356のウイルスゲノムをBamHIで処理後、サザン法に供して確認した。プローブは、UL11およびUL12遺伝子にまたがる約500bpの領域をPCRで増幅したものを用いた。Primerは、gtggtgtttattttcccccc（配列番号７）およびtcgagccggggatctaccgg（配列番号８）。Us3の変異導入はYK811のウイルスゲノムの当該領域の塩基配列を決定することによって確認した。図１２および１３に示すように、目的の変異導入（配列番号９、１０）が確認された。
【００４４】
HSV-2の完全長のウイルスゲノムを保持する大腸菌YEbac356の構築に成功した。YEbac356が保持するウイルスゲノム(pYEbac356)から再構築された組み換えウイルスは培養細胞における増殖能およびマウス動物モデルにおける病原性が野生体ウイルスと同様であった。また、Cre-loxP系を用いて容易にbacmidをウイルスゲノムより除去することが可能であった。さらに、YEbac356内で目的の変異を容易に導入することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】挿入部位であるｐｏｌｙＡシグナル間領域を示す図である。
【図２】ＹＫ３３６、ＹＫ３３８、ＹＫ３３９の構築工程を示す図である。
【図３】ＹＫ３８１およびＹＫ３８２の構築工程を示す図である。
【図４】ＨＳＶ−１、ＹＫ３３６、ＹＫ３３８およびＹＫ３３９の増殖能を示す図である。
【図５】ＨＳＶ−２、ＹＫ３８１およびＹＫ３８２の増殖能を示す図である。
【図６】ｐＢＳ−２ＮＣ−ＧＦＰ／ＢＡＣの構築工程を示す図である。
【図７】ＹＫ３５１およびＹＥｂａｃ３５６の構築工程を示す図である。
【図８】ＹＫ３５６（図中でＢＡＣと表示）の制限酵素切断パターンを示す図である。図中、ＨＳＶ−２（１８６）は野生型である。
【図９】ＹＫ３５６（図中でＢＡＣと表示）および野生型ＨＳＶ−２  １８６（図中で１８６と表示）の増殖能を示す図である。図中［  ］内はＭＯＩ（感染の多重性）を示す。上限は細胞内ウイルス量、下段は細胞外ウイルス量を示す。
【図１０】マウスに対する感染実験結果（生存曲線）を示す。ＢＡＣはＹＫ３５６、１８６に野生型である。
【図１１】ＹＫ３６１の構築工程を示す図である。
【図１２】ＹＫ８０１とＹＫ３５６のサザンブロッティング結果を示す図である。
【図１３】野生型（ｗｔ）とＵｓ３変異導入（ＵＳ３−ＫＭ）の点変異結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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