(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原およびタンパク質毒素をコードするヌクレオチド配列の担体としての微生物であって、以下の成分、すなわち
（Ｉ）少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質の少なくとも一つの完全抗原または部分抗原をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列と、
（ＩＩ）少なくとも一つのタンパク質毒素および／または少なくとも一つのタンパク質毒素サブユニットをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列と、
（ＩＩＩ）ａ）前記微生物の外表面上で成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の発現を可能にし、ならびに／または成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の前記発現産物の分泌を可能にする、少なくとも一つの輸送系をコードする；および／または成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の分泌を可能にする少なくとも一つのシグナル配列をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列と、
（ＩＶ）成分（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のうちの一つまたは複数の発現を活性化する少なくとも一つの配列のための少なくとも一つのヌクレオチド配列で、前記活性化配列が前記微生物内で活性化されることができ、および／または組織細胞特異的、腫瘍細胞特異的、マクロファージ特異的、樹状突起特異的、リンパ球特異的、機能特異的、もしくは非細胞特異的であるヌクレオチド配列と、
を含み、成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれも、１回または複数回存在することが可能であり、成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）からの一つの成分が複数回存在する場合、それは互いに非依存的に同一であるかまたは異なりこともあり、かつ
成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）が同一でなく、かつ成分（Ｉ）は毒素ではない、微生物。
【請求項２】
（ＩＩＩ）ａ）に加えて、または（ＩＩＩ）ａ）に代えて、ｂ）哺乳類細胞のサイトゾル内で前記微生物を溶菌するため、および溶菌した前記微生物に含有されるプラスミドまたは発現ベクターを細胞内に遊離させるために少なくとも一つのタンパク質をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記微生物が細菌、グラム陽性菌、グラム陰性菌、または真核細胞から選択され、前記微生物は減弱されている、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
前記微生物が、大腸菌種、大腸菌、サルモネラ菌種、チフス菌、ネズミチフス菌、エルシニア菌種、エンテロコリチカ菌、ビブリオ菌種、コレラ菌、赤痢菌種、シゲラ・フレックスネリ、またはシュードモナス菌種から選択される、請求項１から３までのいずれか１項記載の微生物。
【請求項５】
コレラ菌が微生物として除外される、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
成分（Ｉ）による少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質の少なくとも一つの完全抗原または部分抗原が、野生型タンパク質ならびにそれらの公知の変異体である受容体；受容体の細胞外部分、膜貫通部分、もしくは細胞内部分；接着分子；接着分子の細胞外部分、膜貫通部分、もしくは細胞内部分；シグナル伝達タンパク質；細胞周期タンパク質；転写因子；分化タンパク質；胚タンパク質；ウイルスタンパク質；アレルゲン；病原性微生物のタンパク質；病原性真核生物のタンパク質；癌精巣抗原タンパク質；腫瘍抗原タンパク質；および／または組織細胞特異的タンパク質からなる群から選択され、組織細胞が甲状腺、乳腺、唾液腺、リンパ節、乳腺、胃粘膜、腎臓、卵巣、前立腺、頚部、膀胱漿膜、および母斑からなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項７】
成分（Ｉ）による少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質の少なくとも一つの完全抗原または部分抗原が、野生型タンパク質ならびにそれらの公知の変異体であるＨｅｒ−２／ｎｅｕ、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、ミッドカイン受容体、ＥＧＦ受容体、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＴＲＡＩＬ受容体、ＦＡＳ、ＴＮＦα受容体、ＴＧＦβ受容体、ラクトフェリン受容体、塩基性ミエリン、α−ラクトアルブミン、ＧＦＡＰ、線維性酸性タンパク質、チロシナーゼ、ＥＧＲ−１、ＭＵＣ１、ｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ５９９Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ、Ｂ−Ｒａｆキナーゼドメイン、Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｂｆｌ−１、Ｂｒａｇ−１、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂａｘ、ＢＡＤ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｃｒ／ａｂｌ、Ｍｙｂ、Ｃ−Ｍｅｔ、ＩＡＰ１、ＩＡＯ２、ＸＩＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ  ＬＩＶＩＮ、サバイビン、ＡＰＡＦ−１、サイクリンＤ（１〜３）、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＨ、Ｃｄｋ−１、Ｃｄｋ−２、Ｃｄｋ−４、Ｃｄｋ−６、Ｃｄｋ−７、Ｃｄｃ２５Ｃ、ｐ１６、ｐ１５、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１８、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｐ１３０、Ｅ２Ｆ（１〜５）、ＧＡＡＤ４５、ＭＤＭ２、ＰＣＮＡ、ＡＲＦ、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ、Ａｋｔ、Ｐｌ３Ｋ、ｍＴＯＲ、ｐ５３および相同体、Ｃ−Ｍｙｃ、ＮＦｋＢ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｓｐ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原、α−胎児タンパク質、ＰＡＰ；ＰＳＭＡ；ＳＴＥＡＰ；ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、ＭＡＲＴ、Ｇｐ１００、ＧＲＰ、ＴＣＦ−４；ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、インフルエンザウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ５Ｎ１）および（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルスのウイルス抗原；赤血球凝集素、赤血球凝集素Ｈ１、赤血球凝集素Ｈ５、赤血球凝集素Ｈ７、赤血球凝集素ＨＡ１、赤血球凝集素ＨＡ１２、赤血球凝集素ＨＡ１２Ｃ、ノイラミニダーゼ、ｐ６０、ＬＬＯ、ウレアーゼ、ＣＳＰ、ｃａｌｆｌａｇｉｎ、および／またはＣＰＢからなる群から選択され、または成分（Ｉ）による少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質のうち少なくとも一つの完全抗原または部分抗原が、以下の野生型タンパク質ならびにそれらの公知の変異体：
AAK1、AATK、ABL1、ABL2、ACK1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、ADCK1、ADCK2、ADCK4、ADCK5、ADRBK1、ADRBK2、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、ALK7、ALS2CR2、ALS2CR7、AMHR2、ANKK1、ANKRD3、APEG1、ARAF、ARK5、ATM、ATR、AURKA、AURKB、AURKC、AXL、BCKDK、BCR、BIKE、BLK、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BMX、BRAF、BRD2、BRD3、BRD4、BRDT、BRSK1、BRSK2、BTK、BUB1、BUB1B、CABC1、CAMK1、CaMK1b、CAMK1D、CAMK1G、CAMK2A、CAMK2B、CAMK2D、CAMK2G、CAMK4、CAMKK1、CAMKK2、CASK、CCRK、CDC2、CDC2L1、CDC2L5、CDC42BPA、CDC42BPB、CDC7L1、CDK10、CDK11、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK8、CDK9、CDKL1、CDKL2、CDKL3、CDKL4、CDKL5、CHEK1、CHUK、CIT、CLK1、CLK2、CLK3、CLK4、CRK7、CSF1R、CSK、CSNK1A1、CSNK1D、CSNK1E、CSNK1G1、CSNK1G2、CSNK1G3、CSNK2A1、CSNK2A2、DAPK1、DAPK2、DAPK3、DCAMKL1、DCAMKL2、DCAMKL3、DDR1、DDR2、DMPK、DMPK2、DYRK1A、DYRK1B、DYRK2、DYRK3、DYRK4、EEF2K、EGFR、EIF2AK3、EIF2AK4、EPHA1、EPHA10、EPHA2、EPHA3、EPHA4、EPHA5、EPHA6、EPHA7、EPHA8、EPHB1、EPHB2、EPHB3、EPHB4、EPHB6、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ERK8、ERN1、ERN2、FASTK、FER、FES、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FGR、FLJ23074、FLJ23119、FLJ23356、FLT1、FLT3、FLT4、FRAP1、FRK、FYN、GAK、GPRK5、GPRK6、GPRK7、GRK4、GSG2、GSK3A、GSK3B、GUCY2C、GUCY2D、GUCY2F、H11、HAK、HCK、HIPK1、HIPK2、HIPK3、HIPK4、HRI、HUNK、ICK、IGF1R、IKBKB、IKBKE、ILK、INSR、INSRR、IRAK1、IRAK2、IRAK3、IRAK4、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KIS、KIT、KSR、KSR2、LAK、LATS1、LATS2、LCK、LIMK1、LIMK2、LMR3、LMTK2、LOC149420、LOC51086、LRRK2、LTK、LYN、MAK、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K3、MAP2K4、MAP2K5、MAP2K6、MAP2K7、MAP3K1、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K12、MAP3K13、MAP3K14、MAP3K2、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K6、MAP3K7、MAP3K8、MAP3K9、MAP4K1、MAP4K2、MAP4K3、MAP4K4、MAP4K5、MAPK1、MAPK10、MAPK11、MAPK12、MAPK13、MAPK14、MAPK3、MAPK4、MAPK6、MAPK7、MAPK8、MAPK9、MAPKAPK2、MAPKAPK3、MAPKAPK5、MARK、MARK2、MARK3、MARK4、MAST1、MAST205、MAST3、MAST4、MASTL、MATK、MELK、MERTK、MET、MGC33182、MGC42105、MGC43306、MGC8407、MIDORI、MINK、MKNK1、MKNK2、MLCK、MLK4、MLKL、MOS、MST1R、MST4、MUSK、MYLK、MYLK2、MYO3A、MYO3B、NEK1、NEK10、NEK11、NEK2、NEK3、NEK4、NEK5、NEK6、NEK7、NEK8、NEK9、NLK、NPR1、NPR2、NRBP、NRBP2、NRK、NTRK1、NTRK2、NTRK3、OBSCN、OSR1、PACE-1、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PAK6、PAK7、PASK、PCTK1、PCTK2、PCTK3、PDGFRA、PDGFRB、PDK1、PDK2、PDK3、PDK4、PDPK1、PFTK1、PHKG1、PHKG2、PIK3R4、PIM1、PIM2、PIM3、PINK1、PKE、PKMYT1、pknbeta、PLK、PLK3、PRKAA1、PRKAA2、PRKACA、PRKACB、PRKACG、PRKCA、PRKCB1、PRKCD、PRKCE、PRKCG、PRKCH、PRKCI、PRKCL1、PRKCL2、PRKCM、PRKCN、PRKCQ、PRKCZ、PRKD2、PRKDC、PRKG1、PRKG2、PRKR、PRKWNK1、PRKWNK2、PRKWNK3、PRKWNK4、PRKX、PRKY、PRPF4B、PSKH1、PSKH2、PTK2、PTK2B、PTK6、PTK7、PTK9、PTK9L、PXK、QSK、RAD53、RAF1、RAGE、RET、RHOK、RIOK1、RIOK2、RIPK1、RIPK2、RIPK3、RIPK5、RNASEL、ROCK1、ROCK2、ROR1、ROR2、ROS1、RPS6KA1、RPS6KA2、RPS6KA3、RPS6KA4、RPS6KA5、RPS6KA6、RPS6KB1、RPS6KB2、RPS6KC1、RPS6KL1、RYK、SBK、SCYL1、SCYL2、SGK、SgK069、SgK085、SgK110、SGK2、SgK223、SgK269、SgK424、SgK493、SgK494、SgK495、SGKL、SK681、SLK、SMG1、SNARK、SNF1 LK、SNF1 LK2、SNK、SNRK、SRC、SRMS、SRPK1、SRPK2、SSTK、STK10、STK11、STK16、STK17A、STK17B、STK18、STK19、STK22B、STK22C、STK22D、STK23、STK24、STK25、STK3、STK31、STK32B、STK33、STK35、STK36、STK38、STK38L、STK39、STK4、STLK5、STYK1、SUDD、SYK、TAF1、TAF1L、TAO1、TAOK1、TAOK3、TBCK、TBK1、TEC、TEK、TESK1、TESK2、TEX14、TGFBR1、TGFBR2、TIE、TIF1、TLK1、TLK2、TNIK、TNK1、TOPK、TP53RK、TRAD、TRIB1、TRIB2、TRIB3、TRIM28、TRIM33、TRIO、TRPM6、TRPM7、TRRAP、TSSK4、TTBK1、TTBK2、TTK、TTN、TXK、TYK2、TYRO3、ULK1、ULK2、ULK3、ULK4、VRK1、VRK2、VRK3、WEE1、Wee1B、YANK1、YES1、ZAK��および／またはZAP70からなるキナーゼの群から選択される、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
成分（ＩＩ）が細菌毒素、エンテロトキシン、外毒素、Ｉ型毒素、ＩＩ型毒素、ＩＩＩ型毒素、ＩＶ型毒素、Ｖ型毒素、ＲＴＸ毒素、ＡＢ毒素、Ａ−Ｂ毒素、Ａ／Ｂ毒素、Ａ＋Ｂ毒素、Ａ−５Ｂ毒素、および／またはＡＢ５毒素からなる群から選択される、請求項１から７までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
成分（ＩＩ）がアデニル酸シクラーゼ毒素、炭疽毒素、炭疽毒素（ＥＦ）、炭疽毒素（ＬＦ）、ボツリヌス毒素、コレラ毒素（ＣＴ、Ｃｔｘ）、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ、ＣｔｘＢ）、ジフテリア毒素（ＤＴ、Ｄｔｘ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＴ毒素、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴＢ）、大腸菌ＳＴ毒素、大腸菌熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）、発赤毒素、表皮剥脱性毒素、外毒素Ａ、パーフリンジェンス  エンテロトキシン、百日咳毒素（ＰＴ、Ｐｔｘ）、志賀毒素（ＳＴ、Ｓｔｘ）、志賀毒素サブユニットＢ（ＳＴＢ、ＳｔｘＢ）、志賀様毒素、ブドウ球菌エンテロトキシン、破傷風毒素（ＴＴ）、毒素性ショック症候群毒素、（ＴＳＳＴ−１）、ベロ毒素（ＶＴ）、ディフィシル菌の毒素Ａ（ＴＡ）もしくは毒素Ｂ（ＴＢ）、ソルデリ菌の致死毒素（ＬＴ）もしくは出血性毒素（ＨＴ）、またはノーヴィ菌のα毒素（ＡＴ）から選択される、請求項８に記載の微生物。
【請求項１０】
成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）が結合されて、両成分によってコードされる融合タンパク質の発現および／または分泌を可能にする、請求項１から９までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
前記融合タンパク質がＣｔｘＢ−ＰＳＡ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ、ＣｔｘＢ−Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ、ＣｔｘＢ−ＨＡ１、またはＣｔｘＢ−ＨＡ１２Ｃから選択される、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
成分（ＩＩＩ）ａ）がＩ型分泌系、ＩＩ型分泌系、ＩＩＩ型分泌系、ＩＶ型分泌系、Ｖ型分泌系、大腸菌（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）、大腸菌（非ｈｌｙ特異的細菌プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）、カウロバクター・クレセンタスのＳ層（ＲｓａＡ）タンパク質のための輸送シグナル、大腸菌のＴｏｌＣタンパク質のための輸送シグナル、分泌シグナルＶｔｇｓｓおよび／またはリステリオリシン（ｐ６０および／またはＡｃｔＡ）に由来する分泌シグナルからなる群から選択され、ならびに成分（ＩＩＩ）ｂ）がエンドリシン、グラム陽性菌の溶菌タンパク質、リステリア菌の溶菌タンパク質、リステリア菌のＰＬＹ５５１、および／またはリステリア菌のホリンからなる群から選択される、請求項１から１１までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
成分（ＩＩＩ）ａ）が前記微生物の外表面上で成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の同時発現を可能にし、ならびに／または成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の同時分泌を可能にするただ一つの輸送系をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列である、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
成分（ＩＩＩ）ａ）が、大腸菌（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）または大腸菌（非ｈｌｙ特異的細菌プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列である、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
成分（ＩＩＩ）ａ）により成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物が分泌される、請求項１から１４までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１６】
成分（Ｉ）がＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆキナーゼドメイン、Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、赤血球凝集素ＨＡ１、赤血球凝集素ＨＡ１２、赤血球凝集素ＨＡ１２Ｃからなる群から選択され、成分（ＩＩ）がコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ、ＣｔｘＢ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴＢ）、破傷風毒素（ＴＴ）からなる群から選択され、成分（ＩＩＩ）ａ）がＨｌｙ分泌系（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の成分と共に大腸菌のＨｌｙＡ溶血素輸送シグナルからなる群から選択され、成分（ＩＶ）が大腸菌ｈｌｙ遺伝子座の内在性プロモーターからなる群から選択され、成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）が結合されて、両成分によってコードされる融合タンパク質の発現が可能になり、融合タンパク質が分泌される、請求項１から１５までのいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１７】
医薬組成物であって、請求項１から１６までのいずれか一項による少なくとも１種類の微生物、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
微生物が、少なくとも１種類の凍結乾燥させた微生物である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
薬物であって、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の少なくとも１種類の微生物、または請求項１７または１８に記載の少なくとも１種類の医薬組成物を含む、薬物。
【請求項２０】
請求項１から１６までのいずれか一項に記載の微生物の使用であって、無制御細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、細胞腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓癌、腎細胞腫、前立腺癌、前立腺細胞腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺癌、骨肉腫、網膜芽腫、胸腺腫、精巣癌、肺癌、気管支癌、乳癌、乳腺細胞腫、腸癌、大腸腫瘍、結腸癌、直腸癌、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣の腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、頚部細胞腫、子宮体癌、子宮体細胞腫、子宮内膜癌、膀胱癌、膀胱癌、皮膚癌、基底細胞腫、棘細胞癌、メラノーマ、眼内メラノーマ、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルス性または細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応および自己免疫疾患からなる群から選択される生理的および／または病態生理的な状態の処置および／または予防のための薬物の生成のための微生物の使用。
【請求項２１】
プラスミドまたは発現ベクターであって、請求項１から１６までのいずれか一項による成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）を含む、プラスミドまたは発現ベクター。
【請求項２２】
請求項１から１６までのいずれか一項による微生物の生成のための方法であって、請求項２１に記載のプラスミドまたは発現ベクターが生成され、および微生物が前記プラスミドまたは発現ベクターによって形質転換される方法。
【請求項２３】
医薬品キットであって、請求項１から１６までのいずれか一項に記載の少なくとも１種類の微生物、または請求項１７に記載の医薬組成物、または請求項１９に記載の薬物、および薬学的に許容される緩衝剤を含む、医薬品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原およびタンパク質毒素をコードする異種ヌクレオチド配列からなる担体としての微生物、その生成方法、ならびに対応するプラスミドまたは発現ベクターに関する。これらの微生物は、薬物として、特に種々の腫瘍の処置のための腫瘍ワクチンとして用いられることができる。
【０００２】
癌の免疫療法は、腫瘍処置の有望な選択肢を意味する。様々なアプローチを用いる多数の臨床試験は、患者におけるその有効性に集中している。原理的には、受動的免疫療法と積極的免疫療法との区別がつけられる。
【０００３】
積極的免疫療法は、ワクチンが関連する腫瘍特異的免疫応答の誘導を目的とする。後者は、現在、いくつかの様々なアプローチを用いて臨床的に探索されている。例えば、いわゆる全菌体ワクチンがあり、その供給原料は、直接的に患者から得た（自己の）腫瘍細胞あるいは適切な細胞系に由来する（異種の）腫瘍細胞である。これらの細胞は、次いで、通常は、不活性化され、特異的に操作さて、患者に（再）適用される。
【０００４】
対照的に、抗原特異的ワクチンは、一つ（または複数）の腫瘍特異的抗原、抗原または特異的抗原コードＤＮＡの部分、ならびにいわゆる抗イディオタイプのワクチンを含有する。通常、これらのワクチンは分離されずに、適切な担体との組み合わせで注射される。従って、従来からの様々なアジュバントが利用される一方、サイトカイン等の生体免疫賦活薬との組み合わせも同様に利用されている。
【０００５】
免疫活性化の目的で、破傷風毒素等の免疫賦活薬に関連する抗原を含有するアプローチが適用されている。さらに、樹状細胞との組み合わせで抗原を適用する試みもある。そして最後に、ウイルス担体または細菌担体と組換え生ワクチンとを用いる試みもいくつかある。
【０００６】
抗原を用いるアジュバントとしての、細菌毒素（例えば破傷風毒素、志賀毒素、致死毒素、またはコレラ毒素）の融合タンパク質は、ワクチンとして（特に感染症に対する）長い間利用されている（Ｆｒｅｙｔａｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  １９９９）。さらに、標的細胞特異的分子（例えば腫瘍細胞の細胞表面分子）と混合されることが多い天然毒素も、標的細胞を破壊するために用いられる。
【０００７】
この点で、通常、酵素ユニットおよびタンパク質結合ドメインを含む天然毒素を有する融合タンパク質は、アジュバントとしての用途でそれらの最適な効果を発揮する（Ｆｒｅｙｔａｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，１９９９）。これらのワクチンを用いて、粘膜免疫後（特に経口免疫後でも）、満足できる免疫応答が得られる。これらの融合タンパク質の問題は、天然毒素の毒性が高く、従ってヒトにおいて確立できないことである（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００８】
従って、一連の研究の全体は、同時にアジュバント効果を保存する毒素の解毒作用に費やされている。しかし、ほとんどの場合、アジュバント効果は、毒作用に関与する酵素活性と同時に発生する（Ｌｙｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）ので、解毒作用は、一部の毒素がそれらの酵素活性、アジュバント活性を失わないことが可能であるように見えても、簡単に行われることはできない（Ｈｏｒｍｏｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｌｙｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０００９】
コレラ毒素（ＣＴ）の場合、いくつかの解毒作用の試みが行われている（Ａｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｙｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｅｒｉｋｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｋｗｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）が、しかし粘膜アジュバントとしての用途が普及している（Ｆｒｅｙｔａｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）。従って、とりわけ、Ｔ細胞支持を制限する毒素関連ＭＨＣクラスＩＩの増大をもたらす抗体応答（主として粘膜ＩｇＡ）の効果的な誘導は、タンパク質抗原および融合または同時投与される毒素を含むワクチンのための粘膜アジュバントにとって主要な必須条件である（Ｆｒｅｙｔａｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ）。
【００１０】
コレラ毒素（特にそのＢサブユニット（ＣｔｘＢ））に関しては、この毒素はＧＭ−１受容体への結合に関与し、分離されたとき、毒作用を示さないので、アジュバントとしてテストされている（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。ＣｔｘＢによるタンパク質融合は、いわゆるＴｈ２免疫応答の一次誘導によって特徴づけられる。これらは、サイトカイン（例えばＩＬ−４またはＩＬ−６）によって主に特徴づけられ、主として抗体の誘導を引き起こすが、細胞免疫応答（特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ））を全く開始しない、もしくはせいぜい限局的に開始するＴ細胞応答である（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００１１】
さらに、粘膜アジュバントとしてのＣｔｘＢは、タンパク質抗原の全身性寛容を誘導する。全身性寛容は、抗原特異的リンパ球（特にＴ細胞またはＢ細胞）の欠乏または不活性化を説明する。従って、この種類のアプローチは、全身性免疫応答の誘導に適用できない（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）。
【００１２】
粘膜適用とは対照的に、毒素抗原の融合タンパク質の腹腔内適用または皮下適用は、全身性応答ならびに低細胞傷害性応答を誘導することができる。これは、モデル系（例えば（Ｂｅｃｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）参照）において腫瘍ワクチン投与で利用されている。しかし、そのような応答も、精製抗原それ自体によって得られ、主として、用いられるアジュバントに依存する。そのモデル系で測定されるＣＴＬ応答が多少低いという事実は別として、その防御がこれらの効果に依存さえしていた証拠がなかった。さらに、抗原は、経口的ではなくて、抗原の直接的な注射（皮下、皮内、筋肉内、腹腔内の注射）によってのみ適用された。
【００１３】
解毒された毒素に融合される抗原タンパク質は、経口腫瘍ワクチンとして適用される場合、概して効果がない。その主な理由は、全身性免疫応答が全く存在しなくわずかに低い全身性免疫応答が誘導される場合、またはＣｔｘＢの場合でも、全身性寛容の誘導ならびに粘膜制限抗体の誘導、およびＴｈ２型免疫応答にある。
【００１４】
例えばＭｃＳｏｒｌｅｙらは、ＣｔｘＢ抗原融合タンパク質による鼻腔内免疫（腫瘍ワクチンのための全身性応答を誘導する好ましい方法を表す）が望ましく寛容し、従ってＴｈ１細胞を不活性化し、一方Ｔｈ２細胞は影響されないことを示した（ＭｃＳｏｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。Ｔｈ２応答は、主にＩＬ−４またはＩＬ−６を産生するヘルパーＴ細胞によって特徴づけられる。これらのサイトカインは、従来のワクチンのほとんどの場合に防御を提供しているＢ細胞による抗体産生の開始に特に関与する。対照的に、Ｔｈ１Ｔ細胞は、主に、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ、従って細胞免疫応答に関与するサイトカインを分泌する。免疫化戦略の目的によって、Ｔｈ２免疫応答（いわゆるＴｈ２バイアス）を支配する抗体またはＴｈ１応答（いわゆるＴｈ１バイアス）を支配する細胞が開始されるかどうかが極めて重要である。
【００１５】
対照的に、ヘルパーＴ細胞を産生するＩＦＮ−γによる細胞免疫応答を支配するＴｈ１の全身的誘導および細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の誘導は、腫瘍免疫療法に不可欠である。
【００１６】
先行技術は、毒素がアジュバントとして機能できることを示す。特にコレラ毒素（ＣＴ）は、強いアジュバント効果を示す。しかし、この効果は、毒素が解毒されると直ちに著しく減弱される。そのサブセットＣｔｘＢに関して、経口適用は全身性寛容をさらに誘導する。この問題は、鼻腔適用によって部分的に回避されることができる。しかし、経鼻投与が適用される場合、他の問題が生じる。特に、脳でのＧＭ−１受容体の発現（ｖａｎ  Ｇｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）に関してＣｔｘＢサブユニットに付随するもので、特に重篤な副作用のリスクの増大を示す（Ｍｕｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００１７】
これらの問題を克服するためには、毒素および（異種の）抗原を同時発現する組換え生ワクチンを生成することが可能である。この選択肢は、感染症ワクチン（すなわち、特定の病原体（例えば結核病原体）に対して向けられ、その病原体に対する免疫を誘導することを意味するワクチン）に関してすでに探究されている。
【００１８】
そのような感染症ワクチンを開発する過程で、適切な（異種の）抗原に融合された組換え毒素は、生ワクチンまたは不活化ワクチンとしてのいずれかで、経口で投与されるいくつかの組換え菌種を用いて、すでに生成されている。ほとんどの場合、生成された菌種は、組換え毒素を発現しただけであった。従って、これらのアプローチは、毒素それ自体および結果的に菌株（病原体）を発現するその毒素に対して単に免疫性を与えること（抗体応答の誘導）を主に目的とした。これらの種類のワクチンは、腫瘍治療での潜在的な腫瘍ワクチンとしての用途に適してない。驚くことではないが、対応する試験がそのような適用の可能性を何も述べていない（Ｒｅｖｅｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）（Ｖｅｒｔｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）（Ｆｒｅｙｔａｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  １９９９；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００１９】
感染症ワクチンに関して、抗体応答の誘導の過程で毒素は、アジュバントとして機能せず、有力であるのは粘膜抗体の免疫応答の誘導である。これらの感染症ワクチン試験は、全身性免疫応答を含まず、含んでも極めて弱いものだけてある。腫瘍ワクチンとは対照的に、そのようなワクチンは、細胞免疫応答の（特に細胞傷害性Ｔ細胞の）誘導を探究しない。病原性微生物を発現させる毒素は、通常、細胞外のライブパターンを示し、従ってＣＴＬの活性化に寄与しない（すなわち、そのような感染症ワクチンによって与えられる防御作用はＣＴＬ非依存性である）。
【００２０】
以下の菌種：組換え乳酸桿菌（Ｒｅｖｅｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、リステリア（Ｖｅｒｔｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、炭疽菌（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍｅｓｎａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、赤痢菌（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ）、大腸菌（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、ビブリオ（Ｂｕｔｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｔｈｕｎｇａｐａｔｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、およびサルモネラ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）は、記述した感染症ワクチンの試験で使用されている。
【００２１】
さらに、異種抗原（サルモネラ、赤痢菌（Ｇａｒｍｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ；Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ）、エルシニア（Ｓｏｒｙ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｅｌｉｓ，  １９９０）、ビブリオ（Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ａ）、大腸菌（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））として毒素の表面提示（Ｋｏｎｉｅｃｚｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）または分泌によって粘膜免疫応答を増強されることが試みられた。しかし、これらの追加の場合、毒素それ自体は、免疫応答が向けられる抗原を表す。
【００２２】
従って、注目すべきことは、毒素がアジュバントとして機能しないこと、または記述する研究が付加的な別の（異種の）抗原による融合タンパク質として毒素を発現させることを目的としないことである。さらに、ＣＴまたはＣｔｘＢによる融合タンパク質はこれらの系によって生成されず、または融合タンパク質は示唆されなかった。
【００２３】
従って、上記に引用した文献に記述される融合タンパク質は、ペプチド分泌シグナル（例えばＨｌｙＡ）の融合タンパク質、および毒素タンパク質であるが、毒素および（異種の）抗原からなる融合タンパク質ではない。
【００２４】
これらの研究の主な目的は、単に、最適な粘膜免疫応答を獲得することであった（Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ）。全身性免疫応答の誘導は、遂行されなかった。しかし、とにかく測定される場合、これらの種類のモデルでの防御が主として抗体によってもたらされる（例えば［３１］を比較されたい）ので、全身性免疫応答の分析は、抗体（特に、全身性ＩｇＡ）に制限される。全身性細胞免疫応答（特に細胞傷害性Ｔ細胞応答）の誘導は、記述されてない。強力な単なる細胞質発現が不容性凝集体の生成をもたらすことが多いので、分泌シグナルによる融合は、毒素の溶解性を高め、それらの安定性をそれぞれ増強させるために主として用いられた（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ）。
【００２５】
この点において、著者のなかには、分泌シグナルによる融合タンパク質が早急に細胞質分解を引き起こすことを観察し（Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ）、一方他の著者は安定化を観察している。従って、先行技術は、この点で相反する。今までのところ、分泌された毒素（毒素＋分泌シグナル）による以前の実験は、何よりも安定性を高めることを目的とし、これはすべての実験で明らかに達成されなかった。
【００２６】
一つの理由は、種々の発現強度およびプラスミド安定性に確かに見出される。Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌらは、用いられるプラスミド系が極めて不安定であり、および何よりも（選択なしに）単に少数の細菌に見出されると記述している。可能な解決策として、著者は、ミニトランスポゾンを介して染色体組込みを用いている（Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ａ；Ｔｚｓｃｈａｓｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６ｂ）。
【００２７】
しかし、そのような系にはいくつかの不都合がある。一方では、組込みの点が限定されてないので、宿主菌株の非所望の表現型変化（たとえば隣接する遺伝子の発現の増大／減少）をもたらし得る。他方では、単一のゲノムコピーを用いる予想される発現レベルは低いだけであり、免疫原性に負の効果を及ぼす。結局、染色体トランスポゾンの組込みは、反復成分の両側で自然発生的切断を極めて頻繁にもたらすために、比較的不安定である。
【００２８】
上記のように、先行技術は、分泌された異種毒素の安定性に関して相反する。
【００２９】
Ｇａｒｍｏｒｙらは、異種抗原の分泌が免疫原性に関して何ら特別な利点を有さないとさえ想定する（Ｇａｒｍｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。他の場合では、静脈内投与後、分泌される毒素への全身性抗体応答の増大が観察されたが、経口適用では観察されなかった。反対のすべては、経口適用が間接的に問題にさえされている（Ｒｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００３０】
最終的に、破傷風毒素を生成するグラム陽性菌（ラクトバチルス・プランタルム）での研究は、菌株（毒素を分泌し、それらの膜に結合したその毒素を提示し、またはその毒素を細胞質に含有する）と比較すると、全身性抗体応答の誘導において何ら有意差を示さなかった（Ｒｅｖｅｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【００３１】
全身性細胞免疫応答（特に細胞傷害性Ｔ細胞応答）およびそれによって生ずる防御は、研究されず、記述されてなかった。
【００３２】
上記に引用した、毒素に基づく感染症ワクチンの先行技術は、アジュバントとして用いる毒素の分泌が、全身性（細胞）免疫応答の誘導に関して、有利性を表すかどうかを明言できない。反対のすべては、上記に引用した研究がむしろ安定性の問題を指摘し、かつ分泌される異種毒素の有利性が見当たらないことを述べている。分泌シグナル、毒素、および異種抗原からなる融合タンパク質は、全く記述されず、または示唆されてない。
【００３３】
先行技術が提示された上記の節では、毒素を異種発現し、および感染症ワクチンとして使用され得る細菌担体を記述する。引用された例では、主として、毒素の発現または安定性および毒素の溶解性に関する改変（例えば強力な発現プロモーターの挿入、または分泌シグナルへの毒素の融合）が行われた。
【００３４】
他の著者らは、生ワクチンでの異種抗原への毒素の遺伝子融合も研究した。これらの場合、毒素は、主にアジュバントとして用いられた。一部の場合（例えば（Ｂｒａｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００））では、異種抗原はアジュバントとして機能し、毒素は適切な抗原として機能した。
【００３５】
しかし、前述の場合、注目すべきは、毒素抗原の遺伝子融合コンストラクトの発現は、もっぱら、細胞質またはペリプラズマで起こった。毒素抗原のコンストラクトは、追加の分泌シグナル（その完全な分泌をもたらす）に融合されず、または直接的に分泌されなかった。
【００３６】
これらの毒素抗原遺伝子融合コンストラクトの過程で、組換え大腸菌（Ｃｌｅｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、炭疽菌（Ｂｒｏｓｓｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、赤痢菌（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｒａｎａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、およびビブリオ菌株（Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）が用いられた。サルモネラ（（Ｇａｒｍｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）に要約される）の場合も、抗原によるＣＴ変異体の融合（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）または抗原による他の毒素が記述されている（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃａｒｄｅｎａｓ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  １９９３；Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｃｈａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ；Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｐｏｇｏｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓｃｈｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｍｅｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【００３７】
これらの場合の大多数では、主な焦点は粘膜（抗体）免疫応答の誘導に関し、および先進性免疫応答の誘導のために経口適用ではなく皮下適用が選択された［３６］。
【００３８】
支持菌株としてサルモネラをもちいる一部の研究は、その菌株の単なる特徴づけに限定され（Ｇｏｍｅｚ−Ｄｕａｒｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｊａｇｕｓｚｔｙｎ−Ｋｒｙｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、他の研究は粘膜および／または全身性抗体応答および／または防御を分析するだけである（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃａｒｄｅｎａｓ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  １９９３；Ｄｕｎｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｈａｒｏｋｏｐａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ａ；Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４ｂ；Ｐｏｇｏｎｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｓｍｅｒｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓｏｍｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。抗原と破傷風毒素との融合を偶発的に用い、感染症ワクチンとしてもっぱら用いられるこれらのすべての場合では、全身性細胞免疫応答（特に細胞傷害性Ｔ細胞応答）は研究されなかった。
【００３９】
従って、それらの研究の焦点が感染症ワクチンとしての抗体媒介作用に置かれているので、免疫学的観点から、腫瘍ワクチンとしての用途の可能性についての結論は、これらの研究からは引き出せない。
【００４０】
研究された免疫応答のイソタイプ分析を含む調査は、より適切であると思われる。実際に、細胞免疫応答は、これらの場合では直接的に測定されないが、抗体応答のイソタイププロファイルによって免疫応答のＴｈ１／Ｔｈ２バイアスに関する結論が可能になる。ＩｇＧ１のような抗体イソタイプは、Ｔｈ２応答と関連し、ＩｇＧ２ａのようなイソタイプは、Ｔｈ１応答に関連する。すでに述べたように、Ｔｈ１応答は細胞に支配される免疫応答であり、一方Ｔｈ２応答は主として液性抗体による応答を表す。依然として、それらの研究は腫瘍ワクチンを記述してなく、または抗腫瘍剤としてのどのような用途を示唆しない。
【００４１】
破傷風毒素抗原融合タンパク質を発現させる担体としてサルモネラに基づく一つの感染症ワクチンの研究は、イヌで実現化された。イヌにおいて誘発された低抗体応答は、抗体プロファイルに関してＴｈ１バイアス（従って、むしろ細胞型免疫応答と関連する応答）を示す（Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。確かに、イヌの免疫学は、辛うじて研究されるだけである。従って、どの程度までイヌの抗体プロファイルがＴｈ１バイアスに関する情報を与えることができるかは不明瞭である。
【００４２】
しかし、同程度のコンストラクトを用いて、同じグループによって行われたマウスでの研究では、ＩｇＧ１に対して、ＩｇＧ２ａに対するのと同じレベルを有する抗体プロファイルが示された。これは、混合されたＴｈ１／Ｔｈ２応答を示唆する。
【００４３】
興味深いことに、以前の免疫化のためにほとんどのヒトで見出されるように、破傷風毒素に対する現存する免疫は、ＩｇＧ１の別の比較的強力な誘導を引き起こし、一方ＩｇＧ２ａはほとんど誘導されない。これは、異なるＴｈ２のバイアスを明白に示す（Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。このため、腫瘍ワクチンとして生ワクチンに基づく破傷風毒素は、ヒト使用にとってむしろ有害である。強力なＴｈ２抗体に支配される応答は、破傷風毒素特異的応答を示すこれらの患者の大多数において誘導されることが予想され得るからである。
【００４４】
わずかな研究も、細胞免疫応答を分析して、毒素融合の有り無しで遺伝子コンストラクトを比較する。例えば、一つの場合では、破傷風毒素の有り無しで抗原の融合は、サルモネラにおいて比較されてきた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）。そこで、破傷風毒素抗原融合コンストラクトは、主として全抗体レベルを増大させ、一方Ｔｈ１／Ｔｈ２プロファイルは、ほとんど変化しなかった。典型的なＴｈ１サイトカインの抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞分泌でさえ、例えばＩＦＮ−γおよびＩＬ−２それぞれは、弱い相違を示すだけであった。同じグループによる初期の研究では、細胞ＩＦＮ−γレベルも、測定された。しかし、破傷風毒素無しのコンストラクトによって何ら比較が引き出されなかった（Ｃｈａｂａｌｇｏｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．）。赤痢菌（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｒａｎａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）またはビブリオ(Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，；Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．)のような異なるグラム陰性菌担体による他の研究は、それぞれ、イソタイプおよび細胞免疫応答を分析しなかった。
【００４５】
要約すれば、記述した様々な研究は、抗体による液性免疫応答の誘導に明らかに重点的に取り組んでいると言える。実際に、遺伝毒素の抗原コンストラクトは用いられるが、これらのコンストラクトは、分泌シグナルが備わってなく、または直接的に分泌されない。しかし、どんな条件下でも、全身性細胞免疫応答（特に細胞傷害性Ｔ細胞応答）は、分析されなかった。さらには、そのような細胞の細胞傷害性Ｔ細胞応答は、液性抗体応答から決定されることができなく、およびその抗体応答は、構成されたＴｈ１／Ｔｈ２であるかどうかを検出することができない。
【００４６】
しかし、腫瘍ワクチン投与療法での使用に不可欠であるのは、まさにこれらの細胞の細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答である。
【００４７】
従って、粘膜感染症ワクチンだけに制限される毒素抗原融合に関して、最先端の技術からは、腫瘍ワクチンとしてそのようなコンストラクトのいずれかの潜在的用途についての記述ができない。
【００４８】
すでに述べたように、遺伝子融合コンストラクトの発現は、分泌系の補助無しで実現化される。毒素および毒素抗原コンストラクトは、それぞれ、通常、細胞質ならびにペリプラズマに（すなわち、二つの膜の間）位置している。効果的な細胞免疫応答を誘導するために、毒素は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に自由に到達できなければならない。通常、天然毒素は、グラム陰性菌のペリプラズムで産生される。これは、単なる粘膜免疫応答には十分である。ペリプラズム毒性は、結腸でペリプラズムから抜け出すことができ、従って、到達することもできるからである（Ｈｕｎｔ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｙ，  １９９１）。しかし、これは、その担体が結腸外部の抗原提示細胞（例えばパイエル板またはリンパ節もしくは脾臓等のリンパ器官）を標的するかどうかを考慮しない。
【００４９】
原理的には、二つの因子は、腫瘍ワクチンの効率のために不可欠である。すなわち、Ｔｈ１型の細胞免疫応答の誘導、および自然免疫系（腫瘍治療の効率にとって重要な役割を果たす、例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、およびγ−δＴ細胞）の成分の関与である（Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００５０】
自然免疫系のこれらの成分の重要性は、複数のレベルにある。適切に活性化されたＮＫＴ細胞およびγ−δＴ細胞は、大量のＩＦＮ−γを局所的に産生することができる。また、Ｔ細胞が極性化した特定のＴｈ１によって産生されるこのインターフェロンは、腫瘍治療に関連する複数の機能を有する。その中心機能のうちの一つは血管新生の抑制である。それは、腫瘍の酸素および栄養素供給を切り離して、事実上腫瘍を飢餓状態にする。さらに、ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を認識ずる受容体を有する。これらの分子が細胞上に存在する場合、ＮＫ細胞は抑制される。
【００５１】
特定の細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するワクチンに関して、腫瘍細胞は、これらのＣＴＬによって死滅させられ得る。腫瘍では極めて頻繁に起こることだが、腫瘍細胞がＭＨＣクラスＩ分子を発現させるその能力を喪失する場合、特定の細胞傷害性Ｔ細胞は無効となる。従って、この場合では、ＮＫ細胞の抑制が止まり、ＮＫ細胞は腫瘍細胞を直接的に排除することができる。
【００５２】
従って、腫瘍ワクチンが両成分を効果的に誘導する場合、それは理想的である。融合毒素アジュバントのＴｈ１−Ｔｈ２バイアスに関して、矛盾するデータが存在する。前述したように、分離された様式で適用される毒素抗原融合コンストラクトは、強力なＴｈ２極性化免疫応答を明らかに誘導する。一部の著者らは、生担体に対する低Ｔｈ２バイアスを、依然として記述し、他の著者らは、わずかなＴｈ１バイアスを理解する。
【００５３】
しかしこの場合もやはり、これらのデータは、非分泌型コンストラクトだけに基づく。そのような種類の感染症ワクチンによる自然免疫の誘導は、いまだかつて比較されたこともまたは熟考されたこともなかった。
【００５４】
すでに述べたように、その主な理由は、現存するワクチンが粘膜感染症ワクチンであって、腫瘍ワクチンでないからである。従って、Ｔｈ１免疫応答、ＣＴＬ免疫応答、および自然免疫系の様々な応答は、目標内でなかった。対照的に、腫瘍ワクチンに関して、これらの免疫応答の誘導は、不可欠である。
【００５５】
興味深いことに、細胞生物学では天然毒素は、シグナル経路の抑制剤として一般に用いられている。そのため特に、天然の百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素（コレラ毒素ではなく）は、ＮＫ細胞の特定のアポトーシスパターンを抑制することができることが示されている（Ｒａｍｉｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。異なる調査研究は、コレラ毒素（そのＢサブユニットではなく）が特定のＮＫ細胞の機能を遮断することを示すことができた（Ｐｏｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。リンパ球の走化性を抑制するために、天然の百日咳毒素が用いられる（Ｓｐａｎｇｒｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。たとえこれらの研究が腫瘍ワクチン投与に取り組まないとしても、腫瘍治療に不可欠である自然免疫系の応答が誘導されるよりはむしろ抑制されるので、当業者は、腫瘍ワクチンとしての毒素の用途が有害であると判断を下すだろう。
【００５６】
他の調査研究は、天然の百日咳毒素（不活性の百日咳毒素ではない）のような毒素が自然免疫系の成分を効果的に誘導することを示すことができた。腫瘍に対する免疫療法に関して、これは（仮にあったとしても）、天然毒素を用いる必要があることを意味する。しかし、毒性の理由から、そのような種類の投与は、実行不可能である。さらに、そのような誘導は、二次免疫応答に向けられるＴｈ２を必ずもたらす。これは、今度は腫瘍治療にとって有害となる（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。従って、自然免疫応答の誘導に関して、先行技術は、腫瘍ワクチン投与を記述することも熟慮することもない。反対のすべては、文献の批判的な分析が腫瘍治療での毒素の使用に不利に働くことさえある。
【００５７】
しかし興味深いのは、毒素またはそれらのサブユニットと他の刺激物質との相乗効果（例えば、免疫刺激ＤＮＡオリゴヌクレオチドと、低メチル化ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ  ＯＤＮ）（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）またはリポサッカリド（ＬＰＳ）との相乗効果）である。ＬＰＳの場合では、主として単球の誘導は毒素のＢサブユニットを介して主に増加するように思われ、一方それは、全体としての毒素（ホロ毒素）によって抑制される（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。しかし、これらの研究は、ＬＰＳまたはＣｐＧのような物質がアジュバントとしてそれに加えられる、精製毒素抗原融合コンストラクトの使用にだけに依存する。さらに、適応免疫応答を誘導するが、腫瘍に直接的に攻撃しないマクロファージ上でのみ行う分析もある。従って、これらの研究は、自然免疫系の成分（特に、腫瘍を直接的に攻撃できるＮＫ細胞）の誘導に関して、有意性がない。
【００５８】
しかし、他の研究は、ＮＫ細胞が緑膿菌外毒素Ａ等の毒素によって活性化され、および走化性的に誘引され得ることを示している（Ｍｕｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。実験系に応じて、ＮＫ細胞応答およびＴｈ１応答の抑制はそれによってほとんど起こるのだが、Ｔｈ１応答も誘導されることができる（Ｍｉｃｈａｌｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。しかし、これらのアッセイは、エンテロトキシンＡの肝毒性の分析を主として目的とし、腫瘍ワクチン投与を言及してない。興味深いことに、効果は極めて用量依存的であるが、ほんのわずかな用量の変化もその効果を反転させることができる。しかし、著者らは、どの応答がｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に起こるかを明らかにすることができなかった。結果として、毒素または解毒された毒素でもアジュバントとして用いられる場合、データはどの効果が起こり得るかの予測を提供しない。
【００５９】
全般的に見て、免疫応答は、適用される特定の系に強く依存する。ほとんどの場合では、粘膜抗感染症ワクチンは、効果的な粘膜免疫応答を誘導するために、粘膜で免疫系の局所操作を目的とする（Ｌｙｃｋｅ，  ２００５）。しかし、これらの研究には、腫瘍ワクチンの開発が含まれてない。さらに、それらの研究は、全身性細胞免疫応答（特に、腫瘍ワクチン投与に必須である細胞傷害性Ｔ細胞の応答）の誘導についての情報が欠けている。
【００６０】
異種抗原の分泌が全身性免疫応答に対して利点を与えることはすでに示されている（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。しかし、記述された分泌型抗原は、分泌型毒素抗原コンストラクトではなく、毒素またはそのサブユニットは使用されなかった。それによって達成可能な、トランスジェニック腫瘍モデルにおける免疫応答も、極めて限定された（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。実際に、弱い抗体および細胞傷害性Ｔ細胞応答は、腫瘍の進行から部分的に保護されたこの場合において誘導されることが可能であった。しかし、免疫応答それ自体のみならず、保護それ自体も限定された。同様に、腫瘍ワクチン投与のこれらの研究は、非分泌型コンストラクトとの比較が欠けている。さらに、比較研究は、腫瘍ワクチン投与と関連して行われず（Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、および分泌に関してなんら有利性が分らない、さらなる研究と対照的である（Ｇａｒｍｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｒｏｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００６１】
要約すれば、前述したように、先行技術は分泌に関して極めて矛盾しており、全般的に見て、腫瘍治療における分泌型毒素抗原コンストラクトの潜在的利点に関して何らヒントを与えない。反対のすべては、現存する文献の批判的な分析がそのような種類の用途にむしろ異議を唱える。
【００６２】
細菌毒素（Ｔｏｄａｒ，  ２００２）：化学的レベルで、２種類の細菌毒素がある。すなわち、グラム陰性菌の細胞壁と結合するリポ多糖類、および細菌細胞から遊離されて、細菌増殖の部位から離れた組織部位で作用し得るタンパク質である。細胞結合リポ多糖（ＬＰＳ）毒素は内毒素とよばれ、および細胞外拡散毒素は外毒素とよばれる。
【００６３】
外毒素は、指数関数的増殖の間、生細菌によって分泌される、通常、可溶性タンパク質であるが、一部の場合では外毒素は、細菌細胞の溶菌によって遊離される。この毒素の産生は、通常、毒素と関連する疾患を引き起こす特定の細菌種に特異的である（例えば破傷風菌は破傷風毒素だけを産生し、ジフテリア菌はジフテリア毒素だけを産生する）。グラム陽性およびグラム陰性の両細菌は、可溶性タンパク質毒素を産生する。
【００６４】
一般に、タンパク質（外）毒素には三つのクラスがある。すなわち、（ｉ）宿主細胞表面に結合して、免疫応答を調節するが、細胞内に転位置されないＩ型毒素（スーパー抗原）、（ｉｉ）宿主細胞膜上で作用して、宿主細胞を漏出させて死滅させるＩＩ型毒素（ポア形成毒素）、（ｉｉｉ）一つの特異的受容体を介して宿主細胞に結合し、細胞内に転位置され、そこで活性化して、宿主細胞のタンパク質または他の成分を修飾するＩＩＩ型毒素（Ａ−Ｂ毒素）。
【００６５】
上記に示すように、宿主細胞に関して細胞内に作用するＩＩＩ型毒素は、二つの成分からなる。すなわち、一つの成分（サブユニットＡ）は、毒素の酵素活性に関与し、他の成分（サブユニットＢ）は、宿主細胞膜上で特定の受容体に結合して、その膜を横切って酵素を移動させることに関わる。酵素成分は、それが天然毒素（Ａ＋Ｂ）から遊離されるまで、活性でない。分離されたＡサブユニットは、酵素的に活性であるが、結合能力および細胞への侵入能力が欠けている。分離したＢサブユニットは、標的細胞に結合する（および天然毒素の結合を遮断する）ことも可能だが、それらは無毒である。
【００６６】
毒素サブユニットは合成されて配置され得るには、種々の方法がある。すなわち、Ａ＋Ｂは、その毒素が、標的細胞表面で相互作用する二つの別々のタンパク質サブユニットとして合成され、分泌されることを表す。Ａ−ＢまたはＡ−５ＢまたはＡＢ５は、ＡサブユニットおよびＢサブユニットが別々に合成されるが、分泌およびそれらの標的への結合の間は、非共有結合によって結合されることを表す。５ＢまたはＢ５は、タンパク質の結合ドメインが５つの同一のサブユニットで構成されることを表す。ＡＢまたはＡ／Ｂは、単一のポリペプチドとして合成され、ＡドメインおよびＢドメインに分けられた毒素を表示する。その分割は、タンパク質切断によって分離されることもある。ＡＢまたはＡ／Ｂ毒素の例は、ジフテリア毒素、外毒素Ａ、ボツリヌス毒素、および破傷風毒素である。Ａ−５ＢまたはＡＢ５毒素の例は、コレラ毒素および志賀毒素であり、一方Ａ−Ｂ毒素の例は、炭疽毒素ＬＦおよび炭疽毒素ＥＦである。
【００６７】
さらに、該先行技術に関する関連文献は以下を含む。すなわち、
Ｍｉｃｈｌらは、固形腫瘍のための治療薬として細菌および細菌毒素の使用を記述する。毒素抗原融合コンストラクトならびにそのようなコンストラクトの細菌ターゲティングが開示される。ジフテリア毒素（ＤＴ）、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）、およびウエルシュ菌（クロストリジウム・パーフリンジェンス・エンテロトキシン）（ＣＰＥ）の用途が研究されている。しかし、著者らは、コレラ毒素の用途を述べておらず、または細菌送達による毒素抗原融合コンストラクトの明らかな分泌を示すことも表すこともない（Ｍｉｃｈｌ  ａｎｄ  Ｇｒｅｓｓ，  ２００４）。
【００６８】
Ｌａｈｉｒｉは、様々な細菌毒素についての概要を提示し、それらの多様な用途を考察する。著者は、毒素抗原融合タンパク質を述べているが、コレラ毒素、および分泌された毒素抗原融合コンストラクトの細菌ターゲティングについては言及しない（Ｌａｈｉｒｉ，  ２０００）。
【００６９】
Ｌａｖｅｌｌｅらは、免疫調節薬として感染病原体の分子を開示する。著者らは、コレラ毒素抗原融合タンパク質を述べているが、そのようなコンストラクトは、タンパク質として直接的に適用されるだけであり、遺伝子改変生ワクチンを用いて適用されるのではない（Ｌａｖｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００７０】
国際特許出願第０１／７４３８３号は、キメラ抗原エンテロトキシン粘膜免疫原に関し、コレラ毒素サブユニットＡ２およびＢの用途についても述べている。しかし、そのようなキメラ免疫原は、常にＡ２サブユニットおよびサブユニットＢを同時に含み、かつ腫瘍治療においてではなく粘膜免疫化において使用するためのものである。
【００７１】
国際公開第０２／０７７２４９号は、異種タンパク質を特定の突然変異標的細胞に送達するための非病原性エンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）の突然変異系統を記述する。コレラ毒素サブユニットＡ１の用途も、述べられているが、その特許文献は分泌について言及せず、感染症の処置および感染症の状態だけを参照する。
【００７２】
国際特許出願第２００４／０１８６３０号は、二本鎖真核生物発現カセットをコードする組換え二本鎖ＲＮＡファージを開示する。コレラ毒素サブユニットＡは述べられているが、この文献はさらに適切ではない。
【００７３】
Ｈｏｌｍｇｒｅｎらは、粘膜免疫化およびアジュバントの分野について簡単な概要を提示する。著者らは、とりわけ、粘膜アジュバントとしてのコレラ毒素の効果を考察しているが、遺伝子発現系または生ワクチンについての情報を開示せず、腫瘍治療についても言及しない（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００７４】
ＨｏｌｍｇｒｅｎおよびＣｚｅｒｋｉｎｓｋｙも、粘膜免疫およびワクチンについての概要を提示する。しかし、この論文は、抗感染性だけに制限され、腫瘍治療の分野における明らかに可能な用途を論ずることも表すこともない（Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ，  ２００５）。
【００７５】
ＦｒｅｙｔａｇおよびＣｌｅｍｅｎｔｓによる別の総説は、抗感染性免疫療法での適用のための粘膜アジュバントを考察する。コレラ毒素が粘膜アジュバントとして述べられているが、著者は、分泌された毒素抗原コンストラクトおよび投与の可能な分野としての腫瘍治療について言及しない（Ｆｒｅｙｔａｇ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  ２００５）。
【００７６】
ＳｈａｗおよびＳｔａｒｎｂａｃｈは、ワクチン抗原を送達するための改変細菌毒素の用途を記述する。しかし、その論文は、コレラ毒素を述べず、さらにワクチン投与理由で毒素抗原融合タンパク質の直接適用に限定される（Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｓｔａｒｎｂａｃｈ，  ２００３）。
【００７７】
国際特許出願第０３／０７２７８９号は、腫瘍の処置用に用いられる細胞抗原をコードするヌクレオチド配列の担体として微生物に関する。この特許文献は、腫瘍治療の分野で分泌および用途を述べているが、細菌毒素および融合タンパク質について全く言及しない。
【００７８】
Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ、Ｄｉｅｔｒｉｃｈ、およびＧｏｅｂｅｌ、ならびにＧｅｎｔｓｃｈｅｖらは、腫瘍ワクチン開発において細胞ターゲティングおよびその用途を記述する。しかし、これらの二つの文献は、腫瘍治療における細菌毒素および融合タンパク質の用途を言及しない（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）。
【００７９】
国際特許出願第９８／２３７６３号は、ｈｙｌＡに融合する異種抗原を含む融合ポリペプチドと共に、大腸菌溶血素ＢサブユニットおよびＤサブユニットを発現させるコレラ菌細胞を開示する。さらに、コレラ毒素サブユニットＢおよび分泌シグナル配列の融合ポリペプチド、異種抗原およびコレラ毒素Ａ２サブユニットを発現させるコレラ菌ワクチン菌株が記述される。最後に、Ｃ．ディフィシル毒素Ａまたは毒素Ｂサブユニットの抗原部分に融合するコレラ毒素Ｂサブユニットを含む融合ポリペプチドが開示される。しかし、この特許出願は、腫瘍治療におけるタンパク質毒素の融合タンパク質、さらにその上に異種の非タンパク質毒素抗原の用途を述べてない。
【００８０】
Ｄｉｅｔｒｉｃｈおよび同僚は、二種類のワクチン送達ツール（細胞性免疫で用いられることが可能な溶血素Ａおよびリステリオリシン）を考察する。しかし、タンパク質毒素−異種抗原の融合タンパク質または同時発現は述べられてない（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００８１】
Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖらは、チフス菌Ｔｙ２１ａワクチン菌株で抗原送達のための大腸菌のα溶血素分泌系の用途を記述する。しかし、著者らは、腫瘍治療で細菌毒素および融合タンパク質の用途を述べない（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００８２】
国際特許出願第０２／４７７２７号は、タンパク質毒素のＢ−サブユニットを含む治療薬に関する。文献は、ウイルス抗原を有するＣｔｘＢおよびＥｔｘＢの融合タンパク質を開示する。細菌ワクチンまたは細菌ワクチン送達は述べられてない。
【００８３】
Ｃｈｅｎｇ−ｈｕａ  Ｓおよび同僚は、コレラ毒素Ｂサブユニットと、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２エピトープとの遺伝子融合、および直接的免疫化研究における融合タンパク質の抗原性を記述する。しかし、細菌ワクチンまたは細菌ワクチン送達は述べられてない（Ｃｈｅｎｇ−ｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【００８４】
Ｓａｎｃｈｅｚらは、ＤＮＡワクチンと同時に皮内に投与される場合（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、コレラ毒素Ｂサブユニット遺伝子が粘膜の免疫グロブリンＡ、Ｔｈ１型、およびＣＤ８+細胞傷害性応答を増強させる（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）ことを開示する。しかし、このアプローチでは、著者らは、自らアジュバントを促進するＴｈ１として作用する担体としてＤＮＡを用いる。さらに、そのタンパク質は、宿主細胞によって産生され、直接的にまたは細菌担体を介して送達されず、従って、真核細胞に直接的に使用可能である。
【００８５】
国際特許出願第０１／２９２３３号は、キメラ免疫原組成物およびそれらの組成物をコードする核酸に関する。しかし、細菌ワクチンまたは細菌ワクチン送達は述べられてない。
【００８６】
国際特許出願第２００７／０４４４０６号は、ＩＩＩ型分泌シグナルを有するＳｏｐＥに基づいている細菌抗原送達系を用いて、免疫応答を刺激する方法に関する。しかし、この特許出願は、腫瘍治療での細菌毒素および融合タンパク質の用途を述べてない。
【００８７】
要約すれば、天然毒素は、それらの強い毒性のためヒトでの使用を確立され得ないことを先行技術から結論づけることができる。さらに、腫瘍治療でのそれら天然毒素の適用は、自然免疫系の応答（特にＮＫ細胞の応答）が抑制されるために、有害である。しかし、腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現させるそれら細胞の能力を極めて頻繁に失うことがあり、従ってＣＴＬの認識および攻撃に抵抗性であるので、腫瘍治療の成功にとって重大な成分は、この免疫応答である。
【００８８】
一方、解毒した毒素のサブユニットを単体または（異種の）抗原タンパク質に融合させて使用することは、強度に弱毒化したアジュバント効果および／または免疫系の誘導された全身性寛容、ならびに粘膜に制限された抗体およびＴｈ２型免疫応答をもたらす。
【００８９】
さらに、抗感染症ワクチン（すなわち、抗原または毒素それ自体でさえ標的にする）の過程で記述されるだけである、（異種の）抗原毒素融合タンパク質の分泌は、細胞質発現に対して何ら利点を示さないばかりか、一般的にむしろ不適切であるといわれている。
【００９０】
全般的に見て、腫瘍の治療的アプローチは、提示されることもなく、ヘルパーＴ細胞を産生するＩＦＮγによるＴｈ１支配型細胞免疫応答の全身的誘導も、ＣＴＬの誘導も、自然免疫系の活性化も、記述されることなくまたは達成されなかった。それらすべては、腫瘍治療に不可欠である。
【００９１】
本発明は、強力な、全身的細胞性免疫系の応答を誘導し、かつ効果的な腫瘍治療を達成することができる方法によって、新規の腫瘍ワクチンを提供する目的を有する。
【００９２】
本発明の目標は、抗原および以下の成分を含むタンパク質毒素をコードするヌクレオチド配列の担体としての微生物を提供することで、一つの態様において驚くほど解決されている。すなわち、
（Ｉ）少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質の少なくとも一つの完全抗原または部分抗原をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列；
（ＩＩ）少なくとも一つのタンパク質毒素および／または少なくとも一つのタンパク質毒素サブユニットをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列；
（ＩＩＩ）ａ）微生物の外表面上で成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の発現を可能にし、ならびに／または成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の分泌を可能にする少なくとも一つの輸送系をコードする；ならびに／また成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の分泌を可能にする少なくとも一つのシグナル配列をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列；
ｂ）場合により、哺乳類細胞のサイトゾル内で微生物を溶菌するため、および溶菌した微生物に含有されるプラスミドまたは発現ベクターを細胞内に遊離させるために少なくとも一つのタンパク質をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列；
（ＩＶ）成分（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のうちの一つまたは複数の発現のための少なくとも一つの活性化配列のための少なくとも一つのヌクレオチド配列、ここで前述の活性化配列は、微生物内で活性化されることができ、および／または組織細胞特異的、腫瘍細胞特異的、マクロファージ特異的、樹状突起特異的、リンパ球特異的、機能特異的、または非細胞特異的である；
成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）のいずれも、１回または複数回のいずれかで存在することが可能であり、成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）からの一つの成分が複数回存在する場合、それは互いに非依存的に同一であるかまたは異なり得る。
【００９３】
好ましい実施形態では、上述の成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）を含む微生物が提供され、成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）は同一でない。すなわち、成分（Ｉ）は少なくとも一つのタンパク質毒素および／または少なくとも一つのタンパク質毒素サブユニットをコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列をコードしない。
【００９４】
本発明の過程で成分（ＩＶ）と関連して、用語「組織細胞特異的」は、標的組織細胞（例えば前立腺組織内のホルモン依存性プロモーター）内で特異的に活性化される活性化配列をいう。
【００９５】
本発明の過程で成分（ＩＶ）と関連して、用語「腫瘍細胞特異的」は、腫瘍細胞（例えば腫瘍特異的腫瘍遺伝子の作用によって活性化されるプロモーターエレメント）内で特異的に活性化される活性化配列をいう。
【００９６】
本発明の過程で成分（ＩＶ）と関連して、用語「マクロファージ特異的」は、マクロファージ特異的遺伝子をコードする（例えばＦ４／８０をコードする遺伝子）プロモーターエレメント等のマクロファージ内で特異的に活性化される活性化配列をいう。
【００９７】
本発明の過程で成分（ＩＶ）と関連して、用語「樹状突起特異的」は、樹状細胞内で特異的に活性化される（例えばＢ７．１の発現を制御するプロモーターエレメント）活性化配列をいう。用語「樹状突起特異的」および「樹状細胞特異的」は、同等である。すなわち、それらは同じ意味を有し、かつ両方とも樹状細胞をいう。
【００９８】
本発明の過程で成分（ＩＶ）と関連して、用語「リンパ球特異的」は、リンパ球系統の細胞内で特異的に活性化されるエレメント（例えばＴ細胞内でＣＤ３分子の発現を調節するプロモーターエレメント、または成熟Ｂ細胞内でＣＤ２０の発現を調節するプロモーターエレメント）をいう。
【００９９】
本発明の過程で成分（ＩＶ）と関連して、用語「機能特異的」は、細胞状況で（例えばｐ５３発現を喪失した腫瘍細胞内で）特異的に活性化される活性化配列、または状況に応じて（例えば細胞局在もしくは酸素圧）細菌内で活性化される活性化配列をいう。
【０１００】
本発明の過程で成分（ＩＶ）と関連して、用語「非細胞特異的」は、遍在的に活性である（例えば構成的に活性な細菌プロモーター）活性化配列をいう。
【０１０１】
本発明の過程で、用語「ヌクレオチド配列」は、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、またはｄｓＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをいう。好ましいのはｄｓＤＮＡである。
【０１０２】
本発明の過程で、用語「抗原」は、抗体と反応する分子（すなわち、抗体を生成することができる）をいう。一部の抗原は、それ自体によって、抗体産生を誘発せず、抗体産生を誘導することができるものだけを免疫原とよばれる。本発明の目的で、公知の抗原のすべての種類は、含まれることを意図する。不当な負担なしに、データベースおよび／または実験的なスクリーニングによって潜在的抗原についての必要な情報を回収することは当業者の知識の範囲内である。抗原の例は、特に細胞抗原、組織細胞特異的抗原（例えば腫瘍が由来する組織細胞）、細胞タンパク質抗原、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質抗原  等である。好ましいのは、タンパク質抗原である。さらに好ましいのは、異種抗原または外来抗原（すなわち、本発明のそれぞれの微生物にとって内在性でない抗原、または本発明のそれぞれの微生物によって本来発現されないが、標準の分子生物技術の方法によって該微生物に導入される抗原）である。
【０１０３】
本発明の過程で、用語「完全抗原」は、上記の定義によって抗体と反応する完全な分子をいう。完全抗原の例は、例えば完全長タンパク質があり、これらも好ましい。
【０１０４】
本発明の過程で、用語「部分抗原」は、上記の定義によって抗体と反応する分子の特定の部分をいう。部分抗原は、例えばタンパク質モチーフ（例えばタンパク質内のアミノ酸ループ、タンパク質キナーゼドメイン、エピトープ）であり得る。好ましいのは、タンパク質キナーゼドメインおよびエピトープである。後者は、抗体によって認識される抗原の特異的部位（抗原決定基ともよばれる）である。
【０１０５】
本発明の過程で「タンパク質」に関連して、用語「野生型」および「変異型」は、「天然の」支配するアミノ酸配列（それぞれのヌクレオチド配列によってコードされる）からなるタンパク質、およびそれぞれ野生型配列と比較すると、タンパク質のアミノ酸配列（それぞれヌクレオチド配列によってコードされた）に一つまたは複数の変異を有するタンパク質をいう。好ましくは、野生型タンパク質および／または変異型タンパク質は、腫瘍細胞に由来する。部分抗原に関しては、アミノ酸配列は変異を包含する（すなわち、好ましくは一つまたは複数の変異（例えばＢ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅエピトープ）を含有するエピトープが選択される）ことがさらに好ましい。
【０１０６】
本発明の意味での微生物は、細菌、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および真核細胞であり、後者は、単細胞寄生虫、酵母、腫瘍細胞、および細胞株細胞（例えば出芽酵母、リーシュマニア菌種、患者由来の自己腫瘍細胞、および腫瘍細胞系）を含む。そのような微生物は、通常、その微生物にとって外来である（異種または異質の）ヌクレオチド配列の転移のための担体として用いられる。好ましくは、それらの病原性を減弱させた細菌、例えばａｒｏＡ、ａｒｏ、ａｓｄ、ｇａｌ、ｐｕｒ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／Ｑ、ｏｍｐの欠失遺伝子または不活性化遺伝子を有する細菌、温度感受性変異または抗生物質依存性変異である細菌が用いられる（Ｃａｒｄｅｎａｓ  ａｎｄ  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，  １９９２）。さらに、上記成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）を含む微生物として好ましいのは、担体としてのグラム陰性、減弱した通性細胞内細菌であり、それは腸粘膜を抑えることができる（例えばサルモネラ菌種または 赤痢菌種）。
【０１０７】
好ましい実施形態では、上記成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）を含む微生物が提供される。ここで、微生物は、細菌、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真核細胞からなる群から選択され、および好ましくは、大腸菌種、大腸菌、サルモネラ菌種、チフス菌、ネズミチフス菌、エルシニア菌種、エンテロコリチカ菌、ビブリオ菌種、コレラ菌、リステリア菌種、リステリア菌、赤痢菌種、シゲラ・フレックスネリからなる群から選択され、ここで好ましくは微生物の病原性は減弱される。さらに好ましいのは、コレラ菌は、上記に定義する微生物から除外される。
【０１０８】
任意の微生物に関連して用語「菌種」は、本発明の目的で与えられた属のすべてのメンバー（種、亜種等）を含むことを意図する。例えば、用語「サルモネラ菌種」は、サルモネラ属（例えばチフス菌、およびネズミチフス菌）のすべてのメンバーを含むことを意図する。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、上記の定義による微生物が提供され、そこで成分（Ｉ）による少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質の少なくとも一つの完全抗原または部分抗原は、以下の野生型タンパク質およびそれらの公知の変異体からなる群から選択される。すなわち、受容体；受容体の細胞外部分、膜貫通部分、もしくは細胞内部分；接着分子；接着分子の細胞外部分、膜貫通部分、または細胞内部分；シグナル伝達タンパク質；細胞周期タンパク質；転写因子；分化タンパク質；胚タンパク質；ウイルスタンパク質；アレルゲン；病原性微生物のタンパク質；病原性真核生物のタンパク質；癌精巣抗原タンパク質；腫瘍抗原タンパク質；および／または組織細胞特異的タンパク質、組織細胞は、甲状腺、乳腺、唾液腺、リンパ節、乳腺、胃粘膜、腎臓、卵巣、前立腺、頚部、膀胱漿膜、および母斑からなる群から選択される。
【０１１０】
変異型タンパク質に関して、突然変異は発癌性であり得、およびその本来の細胞機能の喪失または獲得を引き起こし得る。
【０１１１】
そのような抗原は、細胞において細胞増殖および細胞分裂の制御を行い、正常な細胞の細胞膜上で、例えばＭＨＣクラスＩ分子によって提示される。腫瘍細胞では、これらの抗原は過剰に発現されるか、または特異的に変異していることが多い。そのような突然変異は、結果として、癌遺伝子抑制因子の機能制限または癌遺伝子に対する癌原遺伝子の活性化を有することが可能であり、および腫瘍増殖に単独で関与する、または過剰発現と共に関与し得る。しかし、そのような細胞抗原は、患者の腫瘍疾患に影響する免疫反応を引き起こすことなく、腫瘍細胞の膜上で提示され、従って腫瘍細胞上で抗原を表す。Ｒａｐｐ（米国特許第５，１５６，８４１号）は、すでに、腫瘍性タンパク質の用途（すなわち、腫瘍ワクチン用の免疫原としての癌遺伝子の発現産物）を記述している。
【０１１２】
本発明による種々の抗原およびそれらの（発癌性）突然変異の例は、以下のとおりである。ｉ）受容体（例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、ラクトフェリン受容体、ミッドカイン受容体、ＥＧＦ受容体、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＴＲＡＩＬ受容体、ＦＡＳ、ＴＮＦα受容体、ＴＧＦβ受容体）；ｉｉ）シグナル伝達タンパク質（例えばｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ５９９Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ、Ｂ−Ｒａｆキナーゼドメイン、Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ、Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｂｆｌ−１、Ｂｒａｇ−１、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂａｘ、ＢＡＤ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｃｒ／ａｂｌ、Ｍｙｂ、Ｃ−Ｍｅｔ、ＩＡＰ１、ＩＡＯ２、ＸＩＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ  ＬＩＶＩＮ、サバイビン、ＡＰＡＦ−１）；ｉｉｉ）細胞周期の制御のタンパク質（例えばサイクリンＤ（１〜３）、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＨ、Ｃｄｋ−１、Ｃｄｋ−２、Ｃｄｋ−４、Ｃｄｋ−６、Ｃｄｋ−７、Ｃｄｃ２５Ｃ、ｐ１６、ｐ１５、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１８、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｐ１３０、Ｅ２Ｆ（１〜５）、ＧＡＡＤ４５、ＭＤＭ２、ＰＣＮＡ、ＡＲＦ、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ、ｐ５３、および相同体）；ｉｖ）転写因子（例えばＣ−Ｍｙｃ、ＮＦｋＢ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｓｐ１）；ｖ）胚タンパク質（例えば癌胎児性抗原、α−胎児タンパク質、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ）；ｖｉ）分化抗原（例えばＭＡＲＴ、Ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＲＰ、ＴＣＦ−４、塩基性ミエリン、α−ラクトアルブミン、ＧＦＡＰ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、線維性酸性タンパク質、ＥＧＲ−１、ＭＵＣ１）；ｖｉｉ）ウイルス抗原（例えば以下のウイルス：ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、インフルエンザウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ５Ｎ１）および（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルス）；赤血球凝集素、赤血球凝集素Ｈ１、赤血球凝集素Ｈ５、赤血球凝集素Ｈ７、赤血球凝集素ＨＡ１（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、赤血球凝集素ＨＡ１２（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、赤血球凝集素ＨＡ１２Ｃ（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、ノイラミニダーゼ、微生物抗原（ｐ６０）、ＬＬO、ウレアーゼ。真核生物病原体の抗原、すなわち、ＣＳＰ（マラリア）、ｃａｌｆｌａｇｉｎ（トリパノソーマ）、ＣＰＢ（大形リーシュマニア）等。
【０１１３】
さらに別の好ましい実施形態では、上記の定義により微生物が提供され、ここで成分（Ｉ）による少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質のうち少なくとも一つの完全抗原または部分抗原が以下の野生型タンパク質およびそれらの公知の変異体からなる群から選択される。すなわち、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体、ミッドカイン受容体、ＥＧＦ受容体、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ４、ＴＲＡＩＬ受容体、ＦＡＳ、ＴＮＦα受容体、ＴＧＦβ受容体、ラクトフェリン受容体、塩基性ミエリン、α−ラクトアルブミン、ＧＦＡＰ、線維性酸性タンパク質、チロシナーゼ、ＥＧＲ−１、ＭＵＣ１）、ｃ−Ｒａｆ（Ｒａｆ−１）、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ５９９Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ、Ｂ−Ｒａｆキナーゼドメイン、Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｂｆｌ−１、Ｂｒａｇ−１、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂａｘ、ＢＡＤ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂｉｄ、Ｂｉｋ、Ｈｒｋ、Ｂｃｒ／ａｂｌ、Ｍｙｂ、Ｃ−Ｍｅｔ、ＩＡＰ１、ＩＡＯ２、ＸＩＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ  ＬＩＶＩＮ、サバイビン、ＡＰＡＦ−１、サイクリンＤ（１〜３）、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＨ、Ｃｄｋ−１、Ｃｄｋ−２、Ｃｄｋ−４、Ｃｄｋ−６、Ｃｄｋ−７、Ｃｄｃ２５Ｃ、ｐ１６、ｐ１５、ｐ２１、ｐ２７、ｐ１８、ｐＲｂ、ｐ１０７、ｐ１３０、Ｅ２Ｆ（１〜５）、ＧＡＡＤ４５、ＭＤＭ２、ＰＣＮＡ、ＡＲＦ、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＢＲＣＡ、Ａｋｔ、Ｐ１３Ｋ、ｍＴＯＲ、ｐ５３および相同体、Ｃ−Ｍｙｃ、ＮＦｋＢ、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ−２、Ｓｐ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児性抗原、α−胎児タンパク質、ＰＡＰ；ＰＳＭＡ；ＳＴＥＡＰ；ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣＡ、ＭＡＲＴ、Ｇｐ１００、ＧＲＰ、ＴＣＦ−４、ウイルス抗原（例えばＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＣＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＨＳＶ、インフルエンザウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス（Ｈ５Ｎ１）および（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ型ウイルス、インフルエンザＣ型ウイルスのウイルス）；赤血球凝集素、赤血球凝集素Ｈ１、赤血球凝集素Ｈ５、赤血球凝集素Ｈ７、赤血球凝集素ＨＡ１（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、赤血球凝集素ＨＡ１２（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、赤血球凝集素ＨＡ１２Ｃ（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、ノイラミニダーゼ、ｐ６０、ＬＬO、ウレアーゼ、ＣＳＰ、ｃａｌｆｌａｇｉｎ、ならびに／またはＣＰＢ。
【０１１４】
さらに別の好ましい実施形態では、上記の定義により微生物が提供され、ここで成分（Ｉ）による少なくとも一つの野生型タンパク質または変異型タンパク質のうち少なくとも一つの完全抗原または部分抗原が以下の野生型タンパク質およびそれらの公知の変異体（括弧内はアクセッション番号）からなる群から選択される。
【０１１５】
0005479102.tif 000002
【０１１６】
0005479102.tif 000003
【０１１７】
0005479102.tif 000004
【０１１８】
0005479102.tif 000005
【０１１９】
0005479102.tif 000006
【０１２０】
本発明の過程で用語「アレルゲン」は、本明細書に定義するように、過敏症および／またはアレルギー反応を誘発する完全抗原または部分抗原をいう。例としては、Ｄｅｒ  ｐ５（ダニ）、Ｂｅｔ  ｖ１（カバノキの花粉）、Ｐｈｌ  ｐ１（牧草花粉）、Ａｓｐ  ｆｌ／ａ（コウジカビ）、ＰＬＡ  ２（ミツバチ）、Ｈｅｖ  ｂ（ラテックス）（Ｓｃｈｍｉｄ−Ｇｒｅｎｄｅｌｍｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｃｒａｍｅｒｉ，  ２００１）がある。
【０１２１】
微生物病原体および真核生物病原体の抗原ならびに癌精巣抗原の抗原は、上記の一覧表に含まれている。
【０１２２】
本発明の過程で、成分（ＩＩ）によるタンパク質毒素および／またはそれらのサブユニットは、好ましくは、細菌タンパク質毒素であり、より好ましくは、外毒素である。細菌外毒素の例としては、Ｉ型毒素（スーパー抗原）、ＩＩ型毒素（ポア形成毒素）、およびＩＩＩ型毒素（Ａ−Ｂ毒素）である。
【０１２３】
好ましい実施形態では、上記の定義による微生物が提供され、成分（ＩＩ）は、細菌毒素、エンテロトキシン、外毒素、Ｉ型毒素、ＩＩ型毒素、ＩＩＩ型毒素、ＩＶ型毒素、Ｖ型毒素、ＲＴＸ毒素、ＡＢ毒素、Ａ−Ｂ毒素、Ａ／Ｂ毒素、Ａ＋Ｂ毒素、Ａ−５Ｂ毒素、および／またはＡＢ５毒素からなる群から選択される。
【０１２４】
さらに好ましい実施形態では、上記の定義による微生物が提供され、成分（ＩＩ）は、アデニル酸シクラーゼ毒素、炭疽毒素、炭疽毒素（ＥＦ）、炭疽毒素（ＬＦ）、ボツリヌス毒素、コレラ毒素（ＣＴ、Ｃｔｘ）、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ、ＣｔｘＢ）、ジフテリア毒素（ＤＴ、Ｄｔｘ）、大腸菌ＬＴ毒素、大腸菌熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴＢ）、大腸菌ＳＴ毒素、大腸菌熱安定性エンテロトキシン（ＳＴ）、発赤毒素、表皮剥脱性毒素、外毒素Ａ、パーフリンジェンス  エンテロトキシン、百日咳毒素（ＰＴ、Ｐｔｘ）、志賀毒素（ＳＴ、Ｓｔｘ）、志賀毒素サブユニットＢ（ＳＴＢ、ＳｔｘＢ）、志賀様毒素、ブドウ球菌エンテロトキシン、破傷風毒素（ＴＴ）、毒素性ショック症候群毒素、（ＴＳＳＴ−１）、ベロ毒素（ＶＴ）、ディフィシル菌の毒素Ａ（ＴＡ）および毒素Ｂ（ＴＢ）、ソルデリ菌の致死毒素（ＬＴ）および出血性毒素（ＨＴ）、ノーヴィ菌のα毒素（ＡＴ）からなる群から選択される。
【０１２５】
しかし、本発明の成分（ＩＩ）による毒素としてコレラ毒素またはそのサブユニットＣｔｘＢを用いる場合、細菌担体（微生物）として.コレラ菌を利用しないことが好ましい。
【０１２６】
好ましい実施形態では、上記の定義による微生物が提供される。ここで、成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）は結合されて、両成分によってコードされる融合タンパク質の発現および／または分泌を可能にする。より好ましくは、この融合タンパク質は、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−ＨＡ１（インフルエンザウイルスの赤血球凝集素のサブユニット１）、ＣｔｘＢ−ＨＡ１２Ｃからなる群から選択される。
【０１２７】
分泌は、化学物質を細胞から分離、同化、および遊離する方法であり、すなわち分泌化学物質または物質の量である。分泌は、真核生物だけに特有ではなく、細菌および古細菌にも存在する。ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）型輸送体は、生命のこれら３つのドメインすべてに共通である。分泌系はまた別の保存分泌系である。これは、酵母のＳｅｃ６１トランスロコン複合体および細菌のＳｅｃ  Ｙ−Ｅ−Ｇ複合体からなる真核生物小胞体におけるトランスロコンと相同である。グラム陰性菌は二つの膜を有し、従って、分泌形態をさらに複雑にする。従って、グラム陰性菌には、少なくとも５種類の特殊化分泌系がある。すなわち、
（１）Ｉ型分泌系：これは、上述のＡＴＰ結合カセット輸送体と同じである。
【０１２８】
（２）ＩＩ型分泌系：これは、内膜を横切るタンパク質のための分泌系および外膜を横切る別の特別な系に依存する。細胞線毛は、分泌系の改変を用いるがＩ型系とは異なる。
【０１２９】
（３）ＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）：細菌鞭毛基底小体と相同である。それは、細菌（例えば赤痢菌またはエルシニア）が真核細胞内にタンパク質を注入することができる分子シリンジのようなものである。サイトゾルで低濃度Ｃａ2+は、Ｔ３ＳＳを調節するゲートを開く。植物病原体でのＨｒｐ系は、同様の機構を介して植物内にヘアピンを注入する。
【０１３０】
（４）ＩＶ型分泌系：これは、細菌（および古細菌鞭毛）の接合機構と相同であり、ＤＮＡおよびタンパク質の両方を輸送することができる。これは、アグロバクテリウム・ツメファシエンスで発見され、クラウンゴール（腫瘍）を発生する宿主内にＴ１プラスミドおよびタンパク質を導入するために、この系を用いる。ピロリ菌は、ＩＶ型分泌系を用いて胃上皮細胞内にＣａｇ  Ａを注入する。百日咳菌（百日咳の原因物質）は、ＩＶ型分泌系を介して百日咳毒素を部分的に分泌する。
【０１３１】
（５）Ｖ型分泌系（自己輸送体ともよばれる）：これは内膜を横切るための分泌系を使用する。残りのペプチドを外に輸送するために、この経路を使用するタンパク質はそれらのＣ末端にβバレルを形成し、外膜内に挿入する能力を有する。最終的に、βバレルは切断されて外膜に置き去りにされることもある。一部の人は、自己輸送体のこれらの残遺物がβバレルと類似するポリンを生じさせたと考えている。
【０１３２】
ミトコンドリアおよび葉緑体と同様に細菌も、多数の他の特別な輸送系（例えば双アルギニン転位（Ｔａｔ）経路）を使用する。これは、分泌依存排出と対照的に、完全に折り畳まれたタンパク質を、膜を横切って輸送する。この系の名前は、この系を標的にするために必要とされるシグナル配列における二つの連続したアルギニンに対する必要性に由来する。グラム陰性菌における分泌は、適切な分泌系（例えばＨｌｙＩ型またはＩＩＩ型分泌系またはＡＩＤＡ自己輸送体）によって内膜および外膜を克服することを含む。グラム陽性菌において、分泌系は内膜および細胞壁を克服しなければならない。これは、ほとんどの菌株では適切な分泌シグナルによる融合によって達成されることができる。
【０１３３】
成分（ＩＩＩ）ａ）は、微生物の外表面上で成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物を発現させることを可能にし、および／または成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物を分泌させることを可能にする少なくとも一つの輸送系をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列である。それぞれの成分は、選択肢として、微生物の膜上で分泌されるまたは発現されることができる（すなわち膜結合型である）。そのような輸送系は、例えばｉ）Ｉ型分泌系、ＩＩ型分泌系、ＩＩＩ型分泌系、ＩＶ型分泌系、Ｖ型分泌系、ｉｉ）大腸菌（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）；以下の輸送シグナル：分泌のため−ＨｌｙＢおよびＨｌｙＤのタンパク質の存在下で、Ｃ末端ＨｌｙＡ輸送シグナル；膜結合発現のため−ＨｌｙＢタンパク質の存在下で、Ｃ末端ＨｌｙＡ輸送シグナル、ｉｉｉ）大腸菌（非ｈｌｙ特異的細菌プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）、ｉｖ）カウロバクター・クレセンタスのＳ層タンパク質（ＲｓａＡ）のための輸送シグナル；分泌および膜結合発現のため−Ｃ末端ＲｓａＡ輸送シグナル、ｖ）ＴｏｌＣタンパク質大腸菌のための輸送シグナル；膜結合発現のため−ＴｏｌＣのＮ末端輸送シグナル（大腸菌の膜内在性タンパク質ＴｏｌＣは、大腸菌の外膜の多機能ポア形成タンパク質であり、例えばコリシンＥ１の受容（Ｍｏｒｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）およびコリシンＶの分泌（Ｆａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）の機能に加えて、Ｕ３ファージの受容体として役立つ（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０））が用いられる；このタンパク質は、大腸菌だけでなく、数多くのグラム陰性菌にも見出される（Ｗｉｅｎｅｒ，  ２０００）；その外膜の局在性および広域の発生のために、ＴｏｌＣは、例えば免疫反応を引き起こすための異種抗原を示す理想的な候補となる。
【０１３４】
グラム陽性菌は外膜を包含しない。これらの場合での分泌は、単純であり、細胞膜および細胞壁を通る輸送のための専用の分泌機構を通常は必要としない。グラム陽性菌の場合では、異種タンパク質のＮ末端に融合した分泌シグナルは、通常、分泌には必要十分である。それについてこれらのシグナル配列が記述されるタンパク質は、主に分泌される細菌タンパク質をすべて含む。リステリアの例は、リステリオリシン（ｐ６０またはＡｃｔＡ）由来の分泌シグナルである。保留シグナルの非存在下で小胞体へのタンパク質を標的にするシグナル配列（例えば遍在性分泌シグナルＶｔｇｓｓ）は、分泌には必要十分である場合、一般に、同様のアプローチが真核細胞に適用される。
【０１３５】
任意の成分（ＩＩＩ）ｂ）は、哺乳類細胞のサイトゾル内で微生物を溶菌するため、および溶菌した微生物に含有されるプラスミドまたは発現ベクターを細胞内で遊離するための少なくとも一つのタンパク質をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列である。そのような溶解タンパク質（エンドリシン）は、例えば、リステリン特異的溶解タンパク質（例えばＰＬＹ５５１  （Ｌｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５））および／またはリステリアプロモーターの制御下のリステリア特異的ホリンである。本発明の好ましい実施形態は、異なる成分（ＩＩＩ）ｂ）の組み合わせ（例えば溶解タンパク質とホリンとの組み合わせ）である。
【０１３６】
（ＩＩＩ）ａ）および／または（ＩＩＩ）ｂ）の両成分は、互いに構成的活性型から非依存的であり得る。
【０１３７】
好ましい実施形態では、上記の定義による微生物が提供される。ここで、成分（ＩＩＩ）ａ）は、Ｉ型分泌系、ＩＩ型分泌系、ＩＩＩ型分泌系、ＩＶ型分泌系、Ｖ型分泌系、大腸菌（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）、大腸菌（非ｈｌｙ特異的細菌プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）、カウロバクター・クレセンタスのＳ層タンパク質（ＲｓａＡ）のための輸送シグナル、大腸菌のＴｏｌｃタンパク質のための輸送シグナル、分泌シグナルＶｔｇｓｓおよび／またはリステリオリシン（ｐ６０またはＡｃｔＡ）由来の分泌シグナルからなる群から選択され、ここで成分（ＩＩＩ）ｂ）は、エンドリシン、グラム陽性菌の溶菌タンパク質、リステリア菌の溶菌タンパク質、リステリア菌のＰＬＹ５５１、および／またはリステリア菌のホリンからなる群から選択される。
【０１３８】
さらに好ましい実施形態では、同じ成分（ＩＩＩ）ａ）は、微生物の外表面上で成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の発現を可能にし、ならびに／または成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の分泌を可能にする。すなわち、この好ましい実施形態では、成分（ＩＩＩ）ａ）は、微生物の外表面上で成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の同時発現を可能にし、ならびに／または成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物の同時分泌を可能にするただ一つの輸送系をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列である。そのような好ましい成分（ＩＩＩ）ａ）は、大腸菌（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）または大腸菌（非ｈｌｙ特異的細菌プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の溶血素輸送系（シグナル）をコードする少なくとも一つのヌクレオチド配列である。
【０１３９】
さらに別の好ましい実施形態では、上記の定義による微生物が提供される。ここで、成分（ＩＩＩ）ａ）により成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）の発現産物が分泌される。より好ましくは、成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）は、結合され、両成分によってコードされる融合タンパク質として共に発現されて分泌される。最も好ましくは、この融合タンパク質は、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ、ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ（キナーゼデッド）、ＣｔｘＢ−ＨＡ１（インフルエンザウイルスの赤血球凝集素のサブユニット１）、ＣｔｘＢ−ＨＡ１２Ｃからなる群から選択される。
【０１４０】
本発明の過程で「分泌」は、適切な分泌系（例えば上記に説明した分泌系）を用いてグラム陰性菌の両膜を通して、またはグラム陽性菌の内膜および細胞壁を通して、タンパク質抗原、タンパク質毒素、および／または毒素抗原融合タンパク質を隣接した環境に分泌することをいう。
【０１４１】
分泌系（例えば大腸菌由来の溶血素Ｉ型分泌系）を用いての分泌産物は、通常すべての細胞画分に見出される（細胞質で膜に結合した画分、自己膜小胞に位置する画分、および隣接する環境に完全に分泌された画分（Ｂａｌｓａｌｏｂｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））ことが知られているように、本発明の過程での分泌は、完全でなくてもよい。しかし、完全な分泌またはほぼ完全な分泌（すなわち完全に分泌された分泌産物の大部分の量）が望ましく好ましい。
【０１４２】
成分（ＩＶ）は、成分（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のうちの一つまたは複数の発現のための少なくとも一つの活性化配列のための少なくとも一つのヌクレオチド配列を表す。ここで、前述の活性化配列は、微生物中で活性化されることができ、および／または組織細胞特異的、腫瘍細胞特異的、マクロファージ特異的、樹状突起特異的、リンパ球特異的、機能特異的、または非細胞特異的である。
【０１４３】
発現が微生物の外表面上の膜結合型である場合、その活性化配列は、好ましくは、微生物中で活性化されることができるように選択される必要がある。そのような活性化配列は、例えば、ｉ）構成的に活性のプロモーター領域（例えば、大腸菌のβラクタマーゼ遺伝子、またはｔｅｔＡ遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）（Ｂｕｓｂｙ  ａｎｄ  Ｅｂｒｉｇｈｔ，  １９９４）を有するプロモーター領域、大腸菌ｈｌｙ遺伝子座の内在性プロモーター）；ｉｉ）誘導されることが可能であるプロモーター、好ましくは、細胞での受容後に活性化するプロモーターである。これらのプロモーターには、リステリア菌のａｃｔＡプロモーター（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）またはネズミチフス菌のｐａｇＣプロモーター（Ｂｕｍａｎｎ，  ２００１）が属する。
【０１４４】
微生物が哺乳類細胞のサイトゾルに溶菌した後に、プラスミドを遊離する場合、その活性化配列は細胞特異的ではないが、組織細胞特異的、細胞周期特異的、または機能特異的である。好ましくは、そのような活性化配列が選択され、それらはマクロファージ、樹状細胞、およびリンパ球で特に活性化される。
【０１４５】
さらに好ましい実施形態では、上記の定義による微生物が提供される。ここで，成分（Ｉ）は、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメイン、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ  ＫＤ（キナーゼデッド）、Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ（キナーゼデッド）、Ｂ−ＲａｆＫＤ（キナーゼデッド）、Ｂ−Ｒａｆキナーゼドメイン、Ｂ−ＲａｆキナーゼドメインＫＤ（キナーゼデッド）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、赤血球凝集素ＨＡ１（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、赤血球凝集素ＨＡ１２（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１））、赤血球凝集素ＨＡ１２Ｃ（好ましくは、インフルエンザＡ型ウイルス由来（Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／１  （ＫＡＮ−１）２００４（Ｈ５Ｎ１）からなる群から選択される；
成分（ＩＩ）は、コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ、ＣｔｘＢ）、大腸菌熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴＢ）、破傷風毒素（ＴＴ）からなる群から選択される；
成分（ＩＩＩ）ａ）は、Ｈｌｙ分泌系（ｈｌｙ特異的プロモーターの制御下でＨｌｙＡ、ＨｌｙＢ、およびＨｌｙＤを含有するヌクレオチド配列）の成分と共に大腸菌のＨｌｙＡ溶血素輸送シグナルからなる群から選択される；
成分（ＩＶ）は、大腸菌ｈｌｙ遺伝子座の内在性プロモーターからなる群から選択される；
ここで、成分（Ｉ）および成分（ＩＩ）は、結合されて、両成分によってコードされる融合タンパク質の発現を可能にし、融合タンパク質が分泌される。
【０１４６】
成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）により上記に説明した微生物ならびに好ましい実施形態は、以下本発明の微生物とよぶ。
【０１４７】
本発明の微生物は、腫瘍治療における腫瘍ターゲティングの過程で生ワクチンとしての使用に有利に適している。すなわち、遺伝情報の担体として機能する本発明の微生物を用いて、タンパク質毒素と共に異種抗原は、腫瘍部位に輸送され、融合タンパク質として発現され、ｉｎ  ｓｉｔｕで分泌される。
【０１４８】
本発明の微生物は、輸送され，コードされて、発現させた毒素抗原融合タンパク質の効率的で優れた発現および分泌を介して、驚くほど有利に特徴づけられる（すなわち、細胞質凝集体および／またはペリプラズマ凝集体が生じない）。
【０１４９】
さらに、経口投与されるタンパク質ワクチンと比較して、本発明の微生物の投与による強力な全身性細胞免疫系応答は驚くほど誘発される。対照的にタンパク質ワクチンは、免疫系の全身性寛容を誘発する。
【０１５０】
最も顕著には、Ｔｈ１の全身性細胞免疫系応答の誘導以外に、本発明の微生物は、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を誘導し、このＣＴＬ免疫応答を強く増強する。
【０１５１】
さらに、強力な細胞全身性のＴｈ１およびＣＴＬの免疫系応答の誘導および／または増強に加えて、自然免疫系（例えばＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、および／またはγ−δＴ細胞）も、相乗的方法で本発明の微生物によって驚くほど活性化される。
【０１５２】
コレラ毒素を毒素成分として用いる場合、本発明の微生物は、ヒトにおいて通常存在する毒素に対する免疫が既存しない（例えば、小児期の抗破傷風ワクチン投与による破傷風毒素と対照的に）利点を有する。従って、コレラ毒素および／またはそのサブユニット（特にＣｔｘＢ）の使用が好ましい。
【０１５３】
本発明の微生物は、標的腫瘍（免疫）治療に基づく生ワクチンの経口投与に特に適している。それによって改善された患者コンプライアンスが達成できる。
【０１５４】
しかし、本発明の微生物は、腫瘍治療における使用だけに限定されない。主に、本発明の微生物は、全身性細胞のＴｈ１免疫系応答の誘導が必須である治療を必要とするすべてのこうした疾患の処置および／または予防にも適している。そのような感染性疾患の例としては、ＨＩＶ、インフルエンザ、ＨＣＶおよび他のウイルス性疾患、結核菌、リステリア菌、ならびに他の細菌性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
本発明の微生物は、粘膜免疫系応答と全身性細胞免疫応答との組み合わせによる最適な防御を必要とするインフルエンザのような疾患の処置に完全に適している。さらに、本発明の微生物は、アレルギー疾患（例えばアレルギー性鼻炎）の免疫のようなＴｈ１の特異的誘導にとって有用であり得る。そのような場合では、抗原は、タンパク質毒素成分に融合されるアレルゲンであり、それぞれのワクチンの作用原理は、アレルギー反応（疾患）でアレルゲンに対するＴｈ２優位の免疫応答からＴｈ１免疫応答への免疫応答シフトである。
【０１５６】
好ましい適用方法は、経口適用である。好ましい実施形態では、本発明によるサルモネラ菌株を、適切な培地で発酵させ、収集し、遠心によって洗浄し、その後に処方し、適切な物質を用いて安定化させ、次いで凍結乾燥させる。凍結乾燥させた物質を、多数の生細胞数（好ましくは１０9乃至１０10の範囲の細胞）を含有する胃耐性カプセルに充填する。それらのカプセルを液体と共に経口で摂取する。
【０１５７】
あるいは、上述のように凍結乾燥させた細菌を、胃酸を中和させることができる緩衝剤を含有する小袋と共に分布させる（医薬品キット）。好ましい実施形態では、この緩衝剤は炭酸緩衝剤である。使用直前にこの緩衝剤を水で調製して、溶解させる。その後直ちに、凍結乾燥させた細菌を、水で混合させて摂取する。
【０１５８】
さらに別の方法は、凍結細菌の使用である。この場合では、洗浄後細菌を、安定剤（好ましくは、ショ糖またはグリセリン）を介して安定化させ、その後凍結させて−８０℃で、好ましくは投与量あたり１０9乃至１０10の細胞濃度で保存する。この製剤は、好ましくは、上述のように炭酸緩衝剤と共に医薬品キットで用いる。
【０１５９】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、本発明の微生物を少なくとも１種類（好ましくは本発明の少なくとも１種類の凍結乾燥させた微生物）および薬学的に許容される担体（好ましくはカプセル）を含み、提供される。
【０１６０】
本発明による成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）は、当業者に周知の方法によって本発明の微生物内に導入される。微生物が細菌を表す場合、その成分は、プラスミドまたは発現ベクター内に挿入され、次いでそのプラスミドまたは発現ベクターは、その細菌内に移される。本発明のプラスミド、発現ベクター、および微生物の生成に適した分子生物学的クローニングおよび形質転換の技術は、当業者に周知であり、日常的な実験研究を意味する。
【０１６１】
本発明の別の主題は、本発明の微生物を含有する薬物製剤の投与である。投与は局所的または全身的に（例えば経口で、経口的に、経直腸的に、表皮内に、皮下組織内に、筋肉組織内に、体腔内に、器官内に、腫瘍内に、または血液循環内に）なされる。
【０１６２】
そのような薬物製剤は、注射に適した（例えば薬剤師によく知られている）溶液中の本発明の微生物の懸濁液である。
【０１６３】
本発明の特定の主題は、疾患の処置および／または予防のために、本発明による薬物の経口的または経直腸的な投与である。投与は、単回または複数回なされることが可能である。各投与では、本発明のおおよそ１０乃至１０11の微生物が投与される。本発明の微生物のこの回数による投与が十分な免疫反応を起こさない場合、注射される回数を増やす必要がある。
【０１６４】
本発明の微生物の投与後、細胞提示成分（Ｉ）の寛容（例えば、腫瘍が生ずる腫瘍細胞または組織細胞）は破壊され、腫瘍および／またはその組織細胞に対して作られる強い全身性免疫応答が引き起こされる。成分（Ｉ）の選択に応じて、この細胞免疫反応は、全く腫瘍だけに対して、または腫瘍細胞が生ずる組織細胞を含む腫瘍細胞に対しても作られる。
【０１６５】
別の態様では、本発明の目標は、上記に説明した遺伝子成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）または本明細書で明らかにした少なくとも１種類の医薬組成物を含む、本発明の少なくとも１種類の微生物を含む薬物を提供することによって解決されている。
【０１６６】
好ましい実施形態では、本発明の微生物を用いて、無制御細胞分裂、悪性腫瘍、良性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、細胞腫、過剰増殖障害、カルチノイド、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、脳および／または神経系および／または髄膜から生ずる腫瘍、神経膠腫、神経芽細胞腫、胃癌、腎臓癌、腎細胞腫、前立腺癌、前立腺細胞腫、結合組織腫瘍、軟部組織肉腫、膵臓腫瘍、肝腫瘍、頭部腫瘍、頚部腫瘍、食道癌、甲状腺癌、骨肉腫、網膜芽腫、胸腺腫、精巣癌、肺癌、気管支癌、乳癌、乳腺細胞腫、腸癌、大腸腫瘍、結腸癌、直腸癌、婦人科腫瘍、卵巣腫瘍／卵巣の腫瘍、子宮癌、子宮頚癌、頚部細胞腫、子宮体癌、子宮体細胞腫、子宮内膜癌、膀胱癌（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱癌（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、皮膚癌、基底細胞腫、棘細胞癌、メラノーマ、眼内メラノーマ、白血病、慢性白血病、急性白血病、リンパ腫、感染症、ウイルス性または細菌性感染症、インフルエンザ、慢性炎症、臓器拒絶反応、および／または自己免疫疾患からなる群から選択される生理的および／または病態生理的な状態の処置および／または予防のための薬物を生成することができる。
【０１６７】
細菌感染症は、炭疽、細菌性髄膜炎、ボツリヌス中毒、ブルセラ症、カンピロバクター症、ネコ引っ掻き病、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、膿痂疹、ネジオネラ症、らい病（ハンセン病）、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染症、ノカルジア症、百日咳、ペスト、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱（ＲＭＳＦ）、ナルモネラ症、しょう紅熱、細菌性赤痢、梅毒、破傷風、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス熱、チフス、尿路感染症、細菌性心臓疾患を含むがこれらに限定されない。
【０１６８】
ウイルス感染症は、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、水痘、感冒、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、手足口病、肝炎、単純ヘルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ、ラッサ熱、麻疹、マールブルク出血熱、伝染性単核球症、流行性耳下腺炎、灰白脊髄炎、進行性多巣性白質脳症、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘（痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル疾患、黄熱.を含むがこれらに限定されない。
【０１６９】
慢性炎症または慢性炎症性疾患は、慢性胆嚢炎、気管支拡張症、関節リウマチ、橋本甲状腺炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病）、珪肺症および他のじん肺症を含むがこれらに限定されない。
【０１７０】
自己免疫疾患は、全身性症候群（例えばＳＬＥ、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチおよび多発性筋炎）、ならびに局所性症候群（例えばＩＤＤＭ、橋本甲状腺炎、アジソン病、尋常性天疱瘡、乾癬、アトピー性皮膚炎、アトピー性症候群、喘息、自己免疫性溶血性貧血、多発性硬化症）を含むがこれらに限定されない。
【０１７１】
本明細書に記述し明らかにしたように、生理的および／または病態生理的な状態の処置および／または予防で使用するために、本明細書に記述したすべての実施形態により本明細書に明らかにしたように少なくとも１種類の微生物、または本明細書に明らかにしたように少なくとも１種類の医薬組成物を含む対応する薬物も、本発明によって含まれる。
【０１７２】
別の態様では、本発明の目標は、本明細書に説明するように成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）を含むプラスミドまたは発現ベクターを提供することによって解決されている。本明細書に説明するように成分（Ｉ）乃至（ＩＶ）を含む少なくとも１種類のプラスミドまたは発現ベクターを有する、本発明の微生物が好ましい。
【０１７３】
別の態様では、本発明の目標は、本発明の微生物の生成のための方法を提供することによって解決されている。ここで、本明細書に説明するプラスミドまたは発現クベターが生成され、次いで微生物はこのプラスミドまたは発現クベターで形質転換される。
【０１７４】
別の態様では、本発明の目標は、本発明の少なくとも１種類の微生物、または上述した医薬組成物、または上述した薬物、および薬学的に許容される緩衝剤（好ましくは炭酸緩衝剤）を含む医薬品キットを提供することによって解決されている。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】大腸菌溶血素Ａ（ｈｌｙＡ）分泌シグナルのヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。Ｎｓｉｌ部位に下線を引く。
【図２】大腸菌溶血素Ｉ型輸送系の大腸菌溶血素Ｂ（ｈｌｙＢ）のヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。
【図３】大腸菌溶血素Ｉ型輸送系の大腸菌溶血素Ｄ（ｈｌｙＤ）のヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。
【図４】シグナルペプチドなしのヒト前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。アクセッション番号Ｍ２６６６３（ヒト前立腺−特異的抗原  ｍＲＮＡ、完全コード配列）、領域１００〜８０７（対応するペプチド：ＡＡ２６〜２６１）。
【図５】領域２０４〜４９４を包含する、シグナルペプチドなしのコレラ毒素サブユニットＢ（ＣｔｘＢ）のヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。アクセッション番号Ｋ０１１７０（コレラ  エンテロトキシンサブユニットＡ２（γ）のためのコレラ菌ｔｏｘＡおよびｔｏｘＢ遺伝子コレラ菌）。
【図６】ヒトＢ−ｒａｆタンパク質（ＢＲＡＦ）のＢ−Ｒａｆキナーゼドメイン（Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ）のヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。アクセッション番号Ｍ９５７１２（ヒトＢ−ｒａｆタンパク質（ＢＲＡＦ）ｍＲＮＡ、完全コード配列）、Ｖ６００Ｅ突然変異を含有する、領域１４４８〜１４７７なしの領域１４０３〜２３５９（対応するペプチド：ＡＡ４６３〜４７２なしのＡＡ４４８〜７６６）。
【図７】ヒトＨＬＡ  Ｂ２７制限Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅエピトープのヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。
【図８】ＣｔｘＢ−ＰＳＡ−ＨｌｙＡの遺伝子融合コンストラクトのヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。
【図９】Ｃｔｘ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅ−ＨｌｙＡの遺伝子融合コンストラクトのヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。
【図１０】ＣｔｘＢ−Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００ＥキナーゼドメインＫＤ−ＨｌｙＡの遺伝子融合コンストラクトのヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。
【図１１】ｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡ−ＣｔｘＢのための種々の細菌種組換えでのＰＳＡ−ＣｔｘＢ融合タンパク質の機能的発現および分泌を示す。
【図１２】種々の生ワクチン担体で免疫したマウスにおいて、ＣＤ８+Ｔ細胞および自然免疫系（ＮＫ細胞）の応答のための方法としてＩＦＮ−γを分泌する脾細胞を示す図である。
【図１３】種々の生ワクチン担体での免疫化に応答して、腫瘍容積の減少を示す図である。
【図１４】ＣｔｘＢ−ＯＶＡ融合コンストラクトによる様々な免疫アジュバントを有する種々の生ワクチンで免疫したマウスにおいて、ＣＤ８+Ｔ細胞および自然免疫系（ＮＫ細胞）の応答のための方法としてＩＦＮ−γを分泌する脾細胞を示す図である。
【図１５】膜貫通領域（ＨＡ１２ｃ）なしでＨ５Ｎ１赤血球凝集素（ＨＡ１＋ＨＡ２、ＨＡ１２で示す）の完全配列を包含する動物用ワクチン菌株において、ニワトリインフルエンザ赤血球凝集素Ｈ１−ＣｔｘＢ融合タンパク質の効率的な発現および機能的分泌を示す図である。減弱させた生ネズミチフス菌ｖａｃＴ（ｇｙｒＡ  Ｄ８７Ｇ）および減弱させた生腸炎菌ｖａｃＥ（菌株Ｓｍ２４／Ｒｉｆ１２／Ｓｓｑ）（両菌ともＬＯＨＭＡＮＮ  ＡＮＩＭＡＬ  ＨＥＡＬＴＨ  ＧＭＢＨ  ＆  ＣＯ  ＫＧ）。
【図１６】ＣｔｘＢ−ＨＡ１２ｃ−ＨｌｙＡ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を示す図である。
【図１７】チフス菌Ｔｙ２１ａおよび他の菌種内に電気穿孔処理されたベクターｐＭＢＫＤＣを用いての、融合タンパク質の発現および分泌を示す。Ａ）レーンＡ１〜Ａ３：検出のために抗Ｂ−Ｒａｆ抗体を用いての、ＴＰ  ＳｔＭｏＢＫＤＣによる上清の分析。レーンＡ１：チフス菌Ｔｙ２１ａ  ｐＭｏＢＫＤＣ、Ａ２：チフス菌Ｔｙ２１ａ、Ａ３：ネズミチフス菌ａｒｏＡ。Ｂｒａｆ−Ｖ６００Ｅ  ＫＤ−ＣｔｘＢ融合タンパク質を上の矢印で示す。この融合タンパク質は、おおよそ４８ｋＤａの予想される大きさを有する。タンパク質マーカー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ着色タンパク質ラダー（＃１０７４８−０１０）。Ｂ）検出抗体として新規に生成された抗ＨｌｙＡ抗体を用いる、Ａと同等の分析。レーン１、２：ＳｔＭｏＰＣコンストラクト、レーン３：チフス菌Ｔｙ２１ａ  ＭｏＢＫＤＣ、レーン４：大腸菌ＭｏＢＫＤＣ、レーン５：チフス菌Ｔｙ２１ａ、レーン６：ネズミチフス菌ａｒｏＡ。タンパク質マーカー：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ着色タンパク質ラダー（＃１０７４８−０１０、ロット１３１５５９２）。
【図１８】空ベクターｐＭＫｈｌｙ１の完全ヌクレオチド配列（５′→３′）を示す図である。
【０１７６】
引用した参考文献および特許は、それら全体が参考として本明細書で援用される。本発明を、以下の実施例を用いて（しかし、それに制限されることなく）より詳細に説明する。
【０１７７】
実施例
実施例１：様々な細菌担体の菌株でＰＳＡ−ＣｔｘＢ融合タンパク質の構築、発現、および分泌
腫瘍抗原の融合タンパク質を分泌する大腸菌Ｉ型溶血素分泌系の可能性を証明し、その有効性を示すために、ここに前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびタンパク質毒素成分、アジュバントとしてのＣｔｘＢ、ＰＳＡ−ＣｔｘＢ融合タンパク質を、本明細書に説明したように構築した。発現および分泌を、腫瘍治療において生ワクチン株として潜在的に有用である様々なグラム陰性菌株で試験した。分子生物学的クローニングは、以前に記述されている（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，国際特許出願第０３／０７２７８９号）プラスミド／発現ベクターｐＭＯｈｌｙ１に基づいている。
【０１７８】
１Ａ  カナマイシン耐性ｐＭＯｈｌｙ１−発現ベクター誘導体の構築
ｐＭＯｈｌｙ１のアンピシリン耐性カセットの置換を、（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ，  ２０００）に記述されるように行った。
【０１７９】
要約すると、センスプライマーＰ１（５′−ＧＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３′）およびアンチセンスプライマーＰ２（５′−ＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡ−３′）および鋳型としてプラスミドｐＫＤ４をＰＣＲで用いて、アンピシリン耐性遺伝子（下線部）と相同の領域によって隣接されるカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎR）を有する断片を生成した。
【０１８０】
ＰＣＲ断片の形質転換に先立ち、ｐＫＤ４６プラスミドおよび標的プラスミドｐＭＯｈｌｙ１を内部に持つ大腸菌株ＢＷ２５１４を３７℃で、０．２％Ｌ−（＋）−アラビノースを追加したＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ）で３乃至４時間増殖させた。
【０１８１】
形質転換の後、その細菌細胞を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ寒天板上に広げて、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１８２】
翌日、ＫａｎRクローンを採取して、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＬＢ培地でさらに４８時間インキュベートして、プラスミドに与えるすべてのアンピシリン耐性を取り除いた。
【０１８３】
最終的に、クローンをＫａｎRおよびアンピシリン感受性表現型で選択した。ＫａｎRカセットによるＡｐＲ遺伝子の置換を、ＰＣＲおよび塩基配列決定法によって確認した。結果として生じたプラスミドをｐＭＫｈｌｙ１と呼んだ。
【０１８４】
１Ｂ  ｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡプラスミドのクローニング
センスプライマーＰＳＡ−Ｎｓｉｌ（５′−ＧＡＴＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＣＴＣＡＴ−３′；Ｎｓｉｌ制限部位を下線で示す）およびアンチセンスプライマーＰＳＡ−Ｎｓｉ２（５’−ＧＧＴＧＣＴＣＡＴＧＣＡＴＴＧＧＣＣＡＣＧ−３′）を用いて、ＰＳＡをコードするＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲをＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ６０（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ドイツ国ゲッティンゲン）で、９４℃で１分間、５４℃で１分間、および７２℃で２分間を３０サイクル行った。
【０１８５】
Ｎｓｉｌ制限酵素による消化後、ｐｓａ遺伝子を有するＤＮＡ断片を搬出ベクターｐＭＫｈｌｙ１の単一のＮｓｉｌ部位に挿入した。結果として生じたプラスミドｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡを大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、ドイツ）から分離させて、制限分析によって分析し、配列決定した。
【０１８６】
１Ｃ  ｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡ／ＣｔｘＢプラスミドのクローニング
センスプライマーＰｔａｃ−Ｓａｌｌ（５′−ＡＡＡＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧＴＣＧＴＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣ−３′）およびアンチセンスプライマーＰｔａｃ−Ｎｏｔｌ（５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴＣＣ−３′）を用いて、ｐＧＥＸ−６ｐ−１−プラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）から、Ｐｔａｃプロモーターをコードする２０１ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲを、Ｔ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ドイツ）で、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間を３０サイクル行った。センスプライマーＲｂｓ−Ｎｏｔｌ−順方向（５′−ＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＧＧ−３′）およびアンチセンスプライマーｃｔｂ−Ｓａｌｌ−逆方向（５′−ＴＴＴＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＴＧＣＣＡＴＡＣＴＡＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３′）を用いて、コレラ菌Ｅｌ  ｔｏｒ由来のＣｔｘＢのリボソーム結合部位をコードする４１３ｂｐのＤＮＡ断片および全コード配列をＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲをＴ３  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ドイツ）で、ステップ１（９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で２分を３０サイクル）で行った。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）による精製およびＮｏｔｌ制限酵素による両断片の消化後、両ＤＮＡ断片を連結させ、５９４ｂｐのＰｔａｃ−ｃｔｘＢ断片をもたらした。結果として生じた断片も精製し、Ｓａｉｌ制限酵素による消化後、Ｐｔａｃ−ｃｔｘＢ断片を、搬出ベクターｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡの単一のＳａｉｌ部位に挿入した。結果として生じたプラスミドｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡ／ＣｔｘＢを大腸菌ＤＨ５α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、ドイツ）から分離させて、分析し、配列決定した。
【０１８７】
１Ｄ  ＰＳＡ−ＣｔｘＢ−ＨｌｙＡ融合コンストラクトのクローニング
センスプライマー５′ｃｔｘＢ  Ｎｓｉｌ  （５′−ＧＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴ−３′）およびアンチセンスプライマー３′ｃｔｘＢ  Ｓｒｆｌ  Ｎｓｉｌ（５′−ＧＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３′）（Ｓｒｆｌ部位を下線付き太文字で示す）を用いて、コレラ菌Ｅｌ  ｔｏｒ由来のｃｔｘＢ遺伝子を表すおおよそ３００ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）による精製およびＮｓｉｌ制限酵素による消化後、Ｎ末端シグナル配列のない全ｃｔｘＢ遺伝子を有するＤＮＡ断片を、搬出ベクターｐＭＫｈｌｙ１の単一のＮｓｉｌ部位に挿入した。結果として生じたプラスミドｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢを大腸菌ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から分離させて分析し、配列決定した。ヒトｐｓａ遺伝子を、プライマー５−ＰＳＡ−Ｂｌｕｎｔ（５′−ＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＣ−３′）および３−ＰＳＡ−Ｂｌｕｎｔ（５′−ＧＧＧＧＴＴＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴ−３′）を用いてＰＣＲによってプラスミドｐＣＤＮＡ３ＰＳＡから増幅させた。ＰＣＲを、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ６０（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ドイツ国ゲッティンゲン）で、９４℃で１分間、５６℃で１分間、および７２℃で２分間を３０サイクル行った。引き続いて０．７ｋｂＤＮＡ産物を、ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢのＳｒｆｌ部位にクローン化した。結果として生じたプラスミドｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＰＳＡを制限分析および塩基配列決定法によって確認した。
【０１８８】
１Ｅ  種々の細菌種における融合タンパク質の発現および分泌
標準電気穿孔方法を用いて、プラスミドｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＰＳＡを種々のエレクトロコンピテント菌種に形質転換させた。カナマイシン耐性単コロニーを採取して、ＢＨＩ培地（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国：子ウシの脳、２００ｇから注入、６．０ｇ／Ｌ；ウシの心臓、２５０ｇから注入、９．８ｇ／Ｌ；プロテオースペプトン１０．０ｇ／Ｌ；塩化ナトリウム５．０ｇ／Ｌ；ブドウ糖２．０ｇ／Ｌ；リン酸ナトリウム２．５ｇ／Ｌ）で、ｍＬあたり１×１０9細胞の密度まで増殖させた。増殖に続き、２０ｍＬの培養物を４℃で、Ｈｅｒａｅｕｓ遠心分離機で、４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で３０分間遠心した。１８ｍＬの上清を新しいチューブに移した。その後、１．８ｍＬのＴＣＡ（トリクロロ酢酸、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、ドイツ）を加えて溶液を混合させ、氷上で少なくとも１時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を４℃で、Ｈｅｒａｅｕｓ遠心分離機で４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で３０分間遠心させた。上清をデカントし、次いでペレットを１ｍＬアセトンｐ．ａ．（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、ドイツ）で洗浄した。沈殿物を４℃で、Ｈｅｒａｅｕｓ遠心分離機で４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で１０分間遠心させた。ペレットを空気乾燥させて、βメルカプトエタノール有りまたは無しで１５０μＬ  ５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（７０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４０％（ｖ／ｖ）グリセリン、３％（ｖ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム、５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、および０．０５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）に溶解させた（Ｌａｅｍｍｌｉ，  １９７０）。２０μL溶液を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥの各レーンで使用した。分離させたタンパク質を、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、イギリス）に電気泳動的に移し（ウエスタンブロット）、次いで１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（塩化カリウム０．２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム０．２０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８．００ｇ／Ｌ、無水リン酸二ナトリウム１．１５ｇ／Ｌ）を用いて一晩ブロックした。該膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄して、ポリクローナルウサギ抗ＰＳＡ抗体（１：７５０、ＤＡＫＯ、デンマーク）、ＣｔｘＢ抗体（１：１０００、Ｚｙｔｏｍｅｄ、ドイツ国ベルリン）、またはＨｌｙＡｓ抗体（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６））と共にインキュベートし、続いてＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（１／２，０００、Ｄｉａｎｏｖａドイツ国ハンブルグ）と共に１時間インキュベートした。ウエスタンブロットを、化学発光を増強したキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）を用いて展開させた。
【０１８９】
図１１は、大腸菌種、サルモネラ症、シトロバクター菌種、チフス菌Ｔｙ２１ａ、ネズミチフス菌種、エルウィニア菌種、およびシゲラ・フレックスネリ菌種を含む種々の菌種においてＰＳＡ−ＣｔｘＢ融合タンパク質の機能的発現および分泌を示す。
【０１９０】
ＰＳＡ−ＣｔｘＢ融合タンパク質を発現し分泌するチフス菌Ｔｙ２１ａ菌株を、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）にＤＳＭ１９２４４の下で寄託した。
【０１９１】
実施例２：腫瘍抗原およびＣｔｘＢまたはＣｔｘＢ単独の融合タンパク質を分泌するサルモネラ菌株で免疫したマウスでの腫瘍細胞接種に対する免疫応答および防御
以下の実験によって、腫瘍原およびタンパク質毒素の分泌型融合タンパク質の優れた予防効果を動物腫瘍モデルで示した。このモデルについて、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ融合タンパク質を発現し分泌する菌株ネズミチフス菌ａｒｏＡ（ＳＬ７２０７）ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＰＳＡを、他の対照菌株と比較した。
【０１９２】
２Ａ  免疫化方法
ＤＢＡ／２マウスを３週間の間隔で、３回、免疫させた。細菌での免疫化のため、動物に５０μＬの７％ＮａＨＣＯ3を胃内に適用させることによって前処置して、胃内ｐＨを上げた。前処置から５乃至１０分後、５×１０8カナマイシン耐用生細菌を１００μＬ量のＰＢＳで胃内に適用した。対照として、（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）に記述するように、マウスを、ＰＳＡ（ｐｃＤＮＡ−ＰＳＡ）をコードするネイキッドプラスミドＤＮＡで筋肉内に免疫した。
【０１９３】
２Ｂ  Ｔ細胞応答
最後の免疫化から７日後、免疫したマウスの脾細胞を、以前に発表された（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）ように脾臓をメッシに通過させ、その後に赤血球を溶解させることによって調製した。ＰＳＡ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の検出のためのＥＬＩＳＰＯＴ分析を、（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に発表されたプロトコルに従って行った。
【０１９４】
要約すると、ＰＳＡ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ分析のために、９６ウェルのニトロセルロースプレート（Ｍｉｌｌｉｔｉｔｅｒ  ＨＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）を、１００μＬの炭酸緩衝剤（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）（ｐＨ９．６）中の抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｒ４（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）５μｇ／ｍＬでコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックし、ワクチン接種したマウス由来の１×１０5脾細胞を、ウェルあたり１００μＬ  ＲＰ１０（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）中で加えた。
【０１９５】
ＣＤ８+Ｔ細胞応答の分析のために、Ｐ８１５細胞クローンＰＰＳＡ２４を発現するＰＳＡを用いた。要約すると、このクローンは、プラスミドｐＣＤＮＡ３によってコードされるＣＭＶプロモーターを介して完全長ＰＳＡを発現する（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。３７℃で、３０Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２の存在下の５％ＣＯ２で、２０乃至２２時間のインキュベーション後、該プレートを洗浄し、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−γモノクローナル抗体ＸＭＢ１．２（０．２５μｇ／ｍＬ、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）１００μＬと共にさらに２時間インキュベートした。該プレートを洗浄して、３７℃で、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の１／２０，０００希釈液１００μＬの存在下で１時間インキュベートした。水に溶解させた既製の基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．ミズーリ州セントルイス）５０μＬを加えて、斑点を可視化した。手術用顕微鏡下、３倍拡大率で斑点を数えた。
【０１９６】
ペプチド特異的Ｔ細胞（ＣＴＬ）の頻度を、１０5脾細胞あたりのＩＦＮ−γ分泌細胞の数で表す。再刺激後のＴ細胞応答の分析のために、２．５×１０7脾細胞を、６０Ｕ／ｍＬの組換えＩＬ−２の存在下のＲＰ１０培地（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）で、Ｐ８１５細胞（Ｆｅｎｓｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）を発現する２×１０6照射したＰＳＡで５日間再刺激した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を、上述のように、４×１０5支持細胞（すなわち、ナイーブのＤＢＡ／２マウス由来の新しく調製した脾細胞）と、１０5ＰＰＳＡ２４細胞とで混合した再刺激細胞を種々の量（ウェルあたり１０5、３×１０4、１０4、または３×１０3）で用いることによって行った。
【０１９７】
細胞免疫応答（特に、ＣＤ８+細胞傷害性Ｔ細胞）の誘導は、腫瘍治療の効率のために有用な役割を果たしている（Ｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  ２００１）。従って、ＰＳＡ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を誘導するために、ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＰＳＡ発現ベクターを有する組換え菌種ネズミチフス菌（ＳＬ７２００７）の有効性を最初に試験した。
【０１９８】
この目的で週齢１０乃至１４のＤＢＡ−２の雌マウス６４匹を、本明細書に記述するように陽性対照として、組換えＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ（ｎ＝１０）、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＰＳＡ（ｎ＝１０）、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡ（ｎ＝１０）、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡ／ＣｘｔＢ（ｎ＝１０）、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ１（ｎ＝７）、およびネイキッドｐｃＤＮＡ３−ＰＳＡ（ｎ＝１０）で経口免疫した。
【０１９９】
図１２は、ＤＮＡ免疫化マウスが著明なＣＤ８+Ｔ細胞応答を示したことを明らかにするＥＬＩＳＰＯＴデータを示す。再刺激の後、顕著な免疫応答を、ＣｔｘＢに融合させたサルモネラ菌を分泌するＰＳＡタンパク質でワクチン接種した動物で検出したが、ＰＳＡ単独またはＰＳＡおよびＣｔｘＢを別々に分泌する菌株では検出しなかった。興味深いことに、ただＣｔｘＢ毒素だけを分泌するサルモネラ菌で予防接種した動物も、再刺激後に著しい免疫応答を示した。これらの応答は、標的細胞系を非特異的に認識する、ＮＫ細胞または自然免疫系の他の細胞に起因する可能性が最も高い。従って、ＣｔｘＢ単独分泌型に関するデータから、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ分泌型融合タンパク質（ＩＦＮ−γ分泌脾細胞）で観察した免疫応答は、ＣＤ８+Ｔ細胞応答ならびに自然免疫系（可能性が最も高いのはＮＫ細胞）の著明な応答で構成されると結論づけることができる。
【０２００】
２Ｃ  腫瘍細胞接種に対する防御
免疫化の防御能力を分析するために、群あたり６乃至７匹のマウスを上記のスケジュールに従って免疫した。３回目の免疫化から２週間後、マウスに、剪毛した腹部の皮膚の各側腹部に１×１０６細胞を２ヶ所の皮下注射によってＰＰＳＡ２４（上記参照）で接種した。腫瘍出現に関して、マウスを１４日間モニターし、腫瘍容積を（ａ）最大および（ｂ）最小の腫瘍径を測定することによって評価した。腫瘍容積を、以下の式を用いて、回転楕円体として算出した。
【０２０１】
【数１】
0005479102.tif 000007
【０２０２】
結果を、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、一元ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎｅｔｔの多重比較ポストテストによって有意性を分析した。ＡＮＯＶＡが有意性を明らかにした場合のみ、ポストテストを行った。
【０２０３】
図１３は、平均値±標準偏差としての結果を示す。６日目、９日目、１２日目、および１４日目に有意な防護効果を観察した。予想どおり、対照として含んだネイキッドＤＮＡワクチン投与は、腫瘍の増殖からマウスを完全に防御した。しかし、ネイキッドＤＮＡワクチン投与は、ヒトにおいて最も中程度の効率を示している。細菌コンストラクトに関して、ワクチン菌株ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＰＳＡ（ＣｔｘＢ−ＰＳＡ融合タンパク質を発現し分泌する）が最も効率的であることが判明した。腫瘍接種から９日、１２日、および１４日後に腫瘍量が有意に減少した。注目すべきは、１４日目に、菌株ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢも、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＰＳＡと同程度の値で腫瘍増殖を減少させた。有意ではないが、この遅発効果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定した細胞応答と十分に適合する。さらに、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡ菌株も、１４日目に有意な防御を達成した。これは、この菌株が、検出閾値以下であるＴ細胞応答を誘導したことも示している。対照的に、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ−ＰＳＡ／ＣｘｔＢ菌株は、関連性の効果を誘導しなく、ＳＬ７２０７／ｐＭＫｈｌｙ１単独と同じ範囲内にとどまった。
【０２０４】
実施例３：チフス菌Ｔｙ２１ａでの腫瘍遺伝子−毒素融合タンパク質の発現および分泌
実施例１と類似する別の腫瘍抗原である、キナーゼドメインに１０ａａ欠失を有する腫瘍遺伝子Ｂ−Ｒａｆ  Ｖ６００Ｅのキナーゼドメインを用いた（ＢＲａｆ  Ｖ６００Ｅキナーゼドメインキナーゼデッド（ＫＤ）、すなわち短縮してＢＲａｆ＊ＫＤ、さらに短縮してＢＫＤ）。この腫瘍遺伝子およびタンパク質毒素成分（ここではＣｔｘＢ）、アジュバントとしてＢＫＤ−ＣｔｘＢ融合タンパク質を本明細書に記述するように構築した。発現および分泌を、ヒトワクチン菌株のチフス菌Ｔｙ２１ａで示した。分子クローニングは、以前に記述されている（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）プラスミド／発現ベクターｐＭＯｈｌｙ１に基づき、クローニング方法は本出願の実施例１と類似する。結果として生じるベクターをｐＭＢＫＤＣと命名する。融合タンパク質の配列を図１０に示す。
【０２０５】
図１７は、チフス菌株Ｔｙ２１ａおよび他の菌種に電気穿孔処理されたベクターｐＭＢＫＤＣを用いての、融合タンパク質の発現および分泌を示す。
【０２０６】
ＢＫＤ−ＣｔｘＢ融合タンパク質を発現し分泌するチフス菌Ｔｙ２１ａを、ＤＳＭ１９２４５の下で、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＤＳＭＺ）に寄託した。
【０２０７】
実施例４：ＯＶＡ−ＣｔｘＢ融合コンストラクトと、遺伝的にコードされた種々の免疫アジュバントとの比較
生ワクチンによって分泌される毒素−抗原融合タンパク質の免疫学的有効性を比較するために、免疫学的研究で広く使用されている抗原（ニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）およびＣｔｘＢ）を包含する融合タンパク質を構築した。
【０２０８】
センスプライマーＮｓｉｌ−ＯＶＡ−順方向５′−ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＴＧＣ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＣＣＴ  ＧＧ−３′およびアンチセンスプライマーＮｓｉｌ−ＯＶＡ−逆方向５′−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣ−３′を用いて、卵子遺伝子（ＮＭ２０５１５２）を表す１０３３ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）による精製およびＮｓｉｌ制限酵素による消化後、Ｎ末端シグナル配列のない全卵子遺伝子を有するＤＮＡ断片を、搬出ベクターｐＭＫｈｌｙ１の単一のＮｓｉｌ部位に挿入した。結果として生じたプラスミドｐＭＫｈｌｙ−Ｏｖａを大腸菌ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から分離させて、分析し配列決定した。
【０２０９】
センスプライマー５′ｃｔｘＢ  Ｎｓｉｌ（５′−ＧＣＡＴＡＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴ−３′）およびアンチセンスプライマー３′ｃｔｘＢ  Ｓｒｆｌ  Ｎｓｉｌ（５′−ＧＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣＴＴＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＧＣ−３′）（Ｓｒｆｌ部位は下線付き太文字で示す）を用いて、コレラ菌Ｅｌ  ｔｏｒ由来のｃｔｘＢ遺伝子を表すおおよそ３００ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）による精製およびＮｓｉｌ制限酵素による消化後、Ｎ末端シグナル配列のない全ｃｔｘＢ遺伝子を有するＤＮＡ断片を、搬出ベクターｐＭＫｈｌｙ１の単一のＮｓｉｌ部位に挿入した。結果として生じたプラスミドｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢを大腸菌ＤＨ５α（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から分離させて、分析し配列決定した。卵子遺伝子を、５−ＯＶＡ−Ｓｆｒｌ  ＧＣＣ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＧＣＴ  ＣＴＡおよび３−ＯＶＡ−Ｓｆｒｌ  ＡＧＧ  ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＣＣのプライマーを用いてＰＣＲによって、ｐＣＩ−ＯＶＡプラスミドから増幅させた。ＰＣＲを、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ６０（Ｂｉｏｍｅｔｒａ、ドイツ国ゲッティンゲン）で、９４℃で１分間、４９℃で１分間、および７２℃で２分３０秒間を３０サイクル行った。引き続いて１．１ｋｂＤＮＡ産物を、ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢのＳｒｆｌ部位にクローン化した。結果として生じたｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−ＯＶＡプラスミドを制限分析および塩基配列決定法によって調べた。
【０２１０】
Ｔｈ１免疫応答を誘発するこの融合タンパク質の能力を、インターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（ＩＬ−１２）、およびケモカイン（ＩＰ−１０）をコードするＤＮＡ送達プラスミド（真核生物プロモーターの制御下でタンパク質をコードする）と組み合わせて、分泌されるＯＶＡ単独をコードするｐＭＫｈｌｙベクターの能力と比較した。
【０２１１】
免疫化方法およびＥＬＩＳＰＯＴ分析を、上述のように行った。要約すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、異なる菌株で３回、経口で免疫させた。最終免疫化から７日後、脾細胞を取り出し、５日間再刺激させて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで分析した。脾細胞の再刺激のために、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（文字はアミノ酸を表す）ペプチドでパルスした細胞（卵白アルブミンのＨ−２b制限型ＭＨＣ−１エピトープ）を用いた。
【０２１２】
図１４は、ＩＦＮ−γまたはＩＰ−１０を同時送達するコンストラクトと比較して、ＯＶＡ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答および自然免疫系の潜在的応答を誘導する際のニワトリ卵白アルブミン（ＯＶＡ）およびＣｔｘＢを含む融合タンパク質の優れた有効性を示す。その有効性は、ＩＬ−１２コンストラクトを同時送達する菌株と同様の有効性を示す。
【０２１３】
実施例５：ウイルス抗原の発現および分泌
いずれかの（非腫瘍）抗原の発現および分泌に対する本発明の微生物の適合性を、動物用ワクチン菌株（ネズミチフス菌ＶａｃＴ）でＣｔｘＢに融合させたニワトリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１の赤血球凝集素Ｈ１タンパク質の発現を介して示した。
【０２１４】
センスプライマー５′−ＨＡ−Ｇ：  ５′−ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＣＡＡ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  −３′およびアンチセンスプライマー３−ＨＡ１２Ｃ：  ５′−ＴＡＣ  ＴＣＣ  ＡＣＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＴＣＴ−３′をＰＣＲで用いて、Ｃ末端膜ドメイン（Ｈ１２Ｃ）がないＨ５をコードするＤＮＡ断片を増幅させた。続いてＰＣＲ産物を、ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢのＳｒｆｌ部位にクローン化させた。結果として生じたｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−Ｈ１２Ｃプラスミドを、制限分析および塩基配列決定法によって調べた。ＣｔｘＢおよびＨｌｙＡに対して産生されるポリクローナル抗体を用いる免疫ブロットによって示したように（図２）、ネズミチフス菌ＶａｃＴ／ｐＭＫｈｌｙ−ＣｔｘＢ−Ｈ１２Ｃ菌株は、ハイブリッドＨ５タンパク質を効率的に発現し、分泌した。分泌されたＨ５の量は、実験条件下で２乃至３μｇタンパク質／ｍＬ上清であった。
【０２１５】
細菌をＢＨＩ培地で１×１０9細胞／ｍＬの密度まで増殖させた。２０ｍＬの培養物を４℃で、Ｈｅｒｅａｕｓ遠心分離機で、４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で３０分間遠心させた。１８ｍＬの上清を新しいチューブに移した。続いて、１８ｍＬのＴＣＡ（トリクロロ酢酸、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、ドイツ）を加えて、溶液を混合させて、氷上で少なくとも１時間インキュベートした。インキュベーション後、懸濁液を４℃で、Ｈｅｒｅａｕｓ遠心分離機で、４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で３０分間遠心させた。上清をデカントして、ペレットを１ｍＬのアセトンｐ．ａ．（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ、ドイツ）で洗浄した。沈澱物を４℃で、Ｈｅｒｅａｕｓ遠心分離機で、４０００ｒｐｍ（３０００ｇ）で１０分間遠心させた。ペレットを空気乾燥させて、１５０μＬ  ５×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液に溶解させた。その溶液２０μＬを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥの各レーンで使用した。分離させたタンパク質をＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、英国リトルチャルフォント）に電気泳動的に移し、次いで１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて一晩ブロックした。該膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄して、ポリクローナルウサギ抗ＣｔｘＢ抗体（１：１０００、Ｚｙｔｏｍｅｄ、ドイツ国ベルリン）またはＨｌｙＡｓ抗体（Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）と共にインキュベートし、続いてＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（１／２，０００、Ｄｉａｎｏｖａ、ドイツ国ハンブルグ）と共に１時間インキュベートした。ウエスタンブロットを、化学発光を増強したキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）を用いて行った。
【０２１６】
図１５は、動物用ワクチン菌株（ネズミチフス菌ＶａｃＴ）でのＨＡ１２Ｃ−ＣｔｘＢ融合タンパク質の効率的な発現および機能的分泌を示す。
【０２１７】
実施例６：ＩＩＩ型分泌系を介する毒素アジュバントおよび腫瘍抗原の融合タンパク質の発現ならびに分泌
いくつかの種類のグラム陰性菌は、抗原分泌のために活用されることができるＩＩＩ型分泌系を有する。通常、これらの系を、異種抗原を細胞に直接注入するために利用することができる。この実施例では、分泌シグナル（ＹｏｐＥ）としての役目を果たすエルシニアの毒素成分は、熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢ（ＬＴ−Ｂ）断片と遺伝的に融合され、アジュバントおよび腫瘍抗原ＰＳＡとしての役目を果たす。このコンストラクトを、適切な（好ましくは減弱させた）エルシニア菌株で発現させる。それによってＹｏｐＥシグナル配列を介する内在性ＩＩＩ型分泌機構によって融合タンパク質の分泌をもたらす。
【０２１８】
この実施例では、遺伝子融合ＹｏｐＥ１８−ＬＴ−Ｂ−ＰＳＡを、プラスミドｐａＣＹＣ１８４のＥｃｏＲｌ部位にクローン化する。ネコ遺伝子と同じ方向性を有するコンストラクトの用途のために、ネコプロモーターをコードするプラスミドによって発現される産物をもたらす（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｅｒｍｅｎｔａｓ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｉｎｆｏ／ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ／ｍａｐｐａｃｙｃ１８４．ｈｔｍ）。発現の向上のためには、任意の適切なプロモーターを使用することができる。
【０２１９】
以下に、クローニング方法を例証する。熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢを包含する大腸菌またはこの配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２４２４１８）を包含するベクター由来の染色体ＤＮＡを、ＰＣＲ反応で以下のプライマー：Ｅｃｏ−ｙｏｐｅ１８−ｆ（ＥｃｏＲ１部位＋ＹｏｐＥ１８シグナル配列を包含する）：５′−ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＣＡＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＴＧＴＣＡＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡＴ３′（５′領域ブラック：ＥｃｏＲ１部位＋３塩基５′、レッド： ＹｏｐＥタンパク質（ａａ１乃至１８）のＩＩＩ型分泌のための分泌シグナルをコードする配列、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ９２０６６、イタリック体の領域：ＬＴ−Ｂ遺伝子の相同領域（ＧＢアクセッション番号２４２４１８）、塩基４乃至２８）。リン酸化逆方向プライマーＬＴ−Ｂ−ｒ：５′ＧＴＴＴＴＣＣＡＴＡＣＴＧＡＴＴＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＴＴＧＧ−３′（ＧＢアクセッション番号ＡＦ２４２４１８の逆方向鎖３７２乃至３４１）を用いて増幅させる。
【０２２０】
同時に、本出願に説明するようにベクターｐＭＫ  ＣｔｘＢ−ＰＳＡ由来のＰＳＡ配列を、以下のプライマー：リン酸化順方向プライマーｐｓａ−ｆ：５′−ＧＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＣＧＡＧ−３′逆方向プライマーｐｓａ−ｅｃｏ−ｒ；５′ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＧＡＴＡＣＣＴＴＧＡＡＧＣＡＣ（５′ブラック：ＥｃｏＲ１部位＋３塩基５′、ブルー：終止コドン、ブラック：ＰＳＡ配列の３′領域、本出願）を用いて増幅させる。
【０２２１】
続いて、二つの断片を、適切な条件下でＤＮＡリガーゼによって連結する。連結の後、新しい断片を、上述のＥｃｏ−ｙｏｐｅ１８−ｆおよびＰＳＡ−Ｅｃｏ−Ｒプライマーを用いて、第２のＰＣＲ反応で増幅させる。
【０２２２】
結果として生じる断片を、適切なＰＣＲ精製キットを用いて精製して、緩衝剤およびオリゴヌクレオチドを取り除き、続いて適切な反応条件下でＥｃｏＲ１酵素で消化させる。結果として生じる１０４０ｂｐの断片を、ＥｃｏＲ１で消化したベクターｐａＣＹＣ１８４に連結したアガロースゲル電気泳動を用いて精製する。テトラサイクリン抵抗性の塩基配列の後、ｃｍ感受性クローン、ｃｍ遺伝子よりも同じ方向性で組み込まれる正しい配列を有するクローンを選択して、電気穿孔を使用して、適切なエルシニア菌株に形質転換させる。このワクチン菌株は、その内在性ＩＩＩ型分泌系を介してＬＴ−Ｂ−ＰＳＡ融合を分泌する。
【０２２３】
実施例７：グラム陽性細菌における毒素−抗原融合の発現および分泌
グラム陽性および陰性の細菌は、分泌のために種々の必要条件を有する。グラム陰性菌は二つの膜を有し、従って、分泌シグナルに加えて分泌機構は完全な分泌のために必須である。グラム陽性菌の場合、分泌シグナル配列は十分である。
【０２２４】
この実施例では、ｐ６０分泌シグナルを用いる、リステリアでの破傷風トキソイドＰＳＡ融合物の分泌のための系を説明する。
【０２２５】
第１のステップでは、ベクターｐＵＣ１８（ＰＳ）ａｃｔＡＯＶＡＴｉｎｌＡ（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を、Ｎｓｉｌを用いて消化させ、続いて適切な条件下で３′−５′エキソヌクレアーゼを用いて処置する。最終的に、断片をアガロースゲル電気泳動によって精製する。
【０２２６】
同時に、破傷風トキソイド断片Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１２７３９）を、以下のリン酸化プライマー：ｔｅｔｃ順方向：５′−ＴＡＡＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴＴＧＴＴＧＧＧＴＴＧ−３′を用いて、適切な供給源（例えば破傷風菌株由来のゲノムＤＮＡ）から増幅させる。しかるに下線を引いた追加の塩基は、融合物（ｔｅｃｔ逆方向５′−ＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＴＣＴＧ−３′）の正しいフレ−ムを確実にするためである。
【０２２７】
ＢＲＡＦ  ＫＤ断片を、以下のリン酸化プライマー：ｂｒ順方向：５′−ＧＡＴＴＧＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧ−３′、ｂｒ逆方向：５′−ＣＣＣＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＣＣ−３′を用いて、本出願に説明するプラスミドｐＭＯ  ＢＫＤＣから増幅させる。
【０２２８】
両断片を、適切なＰＣＲ精製キットを用いて精製し、続いて適切な条件下でＤＮＡリガーゼと連結させる。連結後、断片を、適切なＰＣＲ精製キットを用いて再度精製し、ｔｅｔｃ順方向プライマーおよびｂｒ逆方向プライマーを用いて増幅させる。増幅後、結果として生じた２２８０ｂｐの断片を、アガロースゲル電気泳動によって精製し、次いでｐＵＣ１８（ＰＳ）ａｃｔＡＯＶＡＴｉｎｌＡの精製したＮｓｉｌ−３′−５′エキソヌクレアーゼ断片に連結させる。連結および大腸菌への形質転換後、断片をフレームに運ぶクローンを選択する。続いて、プラスミドを、ＰｓｔＩおよびＳａｃＩを用いて切断し、２８３７ｂｐの断片を、ゲル電気泳動を用いて精製し、次いで適切に消化させたＰｓｔＩおよびＳａｃＩならびに精製したベクターｐＳＰ１１８（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に連結させる。結果として生じるベクター（ｐＳＰ１１８−ａｃｔ−ＴｅｔＣ−ＢＲａｆ＊ＫＤ）を、ｔｒｐＳ欠失を有するリステリア菌株（例えばリステリア菌δ−ｔｒｐｓ  δ−ａｒｏＡ／Ｂ（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６））に形質転換させる。この設定では、プラスミドは、ｔｒｐＳ（「平衡致死系」）に基づくプラスミドを介して安定化し、およびプラスミドは、菌株の細胞内溶解を引き起こすファージ溶菌素をコードする。ａｃｔ−ＴｅｔＣ−ＢＲａｆ＊ＫＤカセットは、ａｃｔＡプロモーターの制御下で主として真核生物宿主細胞内で発現する。これは、多少細胞外に漏れやすい（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。このカッセトのａｃｔＡシグナル配列は、ＴｅｔＣ−ＢＲａｆ＊ＫＤ融合タンパク質の分泌を引き起こす。
【０２２９】
実施例８：毒素抗原融合物を分泌する真核細胞
この実施例では、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ融合タンパク質を分泌する真核細胞系（例えば腫瘍細胞系）を構築する。この目的のため、一般的な分泌シグナルを利用する（米国特許第６，７３３，９９７号）。それは、原理的には、異なる起源の細胞（哺乳類細胞、酵母、および原核細胞）において対応する発現カセットの分泌を可能にする。
【０２３０】
第１のステップでは、ＣｔｘＢ−ＢＲａｆ＊ＫＤの融合物を、以下のプライマー：  ＣＢ−順方向：５′−ａｔｃＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＡＴＴＴＧＴＧＴＧＣ−３′（小文字：スペーサー、下線部：ＢａｍＨ１部位、大文字：ＣｔｘＢ  ５′）。
【０２３１】
ＣＢ−逆方向：５−ｔａｇＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＧＧＡＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＣＣＡＴＡＴＣＣ−３′（小文字：スペーサー、下線部：ＢａｍＨ１部位、イタリック体：終止コドン、大文字：ＢＲａｆ＊ＫＤ  ３′）を用いてプラスミドｐＭＯ  ＢＫＤＣ（本出願）から増幅させる。
【０２３２】
続いて、ＰＣＲ産物を、適切なＰＣＲ精製キットを用いて精製し、続いて、断片（内部ＢａｍＨ１部位）をＢａｍＨ１で部分的に消化させる。部分消化の１２３１ｂｐ断片を、アガロースゲル電気泳動を介して分離し、その後に消化したＢａｍＨ１およびゲル精製プラスミドｐＶｔｇＥＧＦＰ（米国特許出願第６７３３９９７号）に連結する。続いて、Ｖｔｇｓｓとインフレームの方向性を有するクローンを選択して、ｐＶｔｇＣｔｘＢＲＡｆと命名する。このプラスミドは、電気穿孔を介して真核細胞系に形質転換させることができる。それは、ｋａｎ／ｎｅｏ選択カセットを介して選択され得る。細胞系は、異種癌ワクチンとしての用途のための癌細胞系のような細胞系、自己癌ワクチンとしての用途のための患者由来の腫瘍細胞を確立することができる。
【０２３３】
どんな場合でも、ＣｔｘＢ−ＢＲａｆ＊ＫＤに遺伝的に融合したベクターｐＶｔｇＥＧＦＰによってコードされる分泌シグナルＶｔｇｓｓは、融合タンパク質の分泌をもたらす。
【０２３４】
同様のアプローチを用いて、融合タンパク質を酵母で発現することもできる。例として、米国特許第６，７３３，９９７号の図１１に示されているように、改変クローニング戦略を示す。第１のステップでは、上述のプラスミドｐＶｔｇＣｔｘＢＲＡｆからのＶｔｇｓｓ−ＣｔｘＢ−ＢＲａｆ＊ＫＤの融合物を含有する該カセットを、ＥａｇｌおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを介して切取り、ベクターｐＢＳＰＧＫ（米国特許第６，７３３，９９７号、図１１）に挿入する。続いて、結果として生じるベクターをＳａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させて、ＰＧＫエレメントを包含する断片およびＶｔｇｓｓ−ＣｔｘＢ−ＢＲａｆ＊ＫＤの融合物をベクターｐＹＥＸ−Ｓ１の対応する領域に組み込む（米国特許第６，７３３，９９７号（図１１）の記述と類似する）。結果として生じるプラスミドを、出芽酵母のように酵母菌株に電気穿孔によって形質転換させることができる。酵母は、融合タンパク質を発現させ、分泌し、ワクチン投与目的で使用することができる。
【０２３５】
略語
ＡＢＣ      ＡＴＰ結合カセット
ＡＩＤＡ      拡散粘着に関与する付着因子
ＡＰＣ      抗原提示細胞
ａｒｏＡ      ａｒｏＡ遺伝子
ＡＴ      α毒素
ＡＴＰ      アデノシン三リン酸
Ｂ−Ｒａｆ  ＫＤ      Ｂ−Ｒａｆキナーゼドメイン
ＢＳＡ      ウシ血清アルブミン
Ｃａｇ  Ａ      ピロリ菌の病原性タンパク質に関連する主要疾患
ＣＰＥ      クロストリジウム・パーフリンジェンス・エンテロトキシン
ＣｐＧ    ＣｐＧモチーフを包含する低メチル化免疫賦活性ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ配列ＣＴ／Ｃｔｘ      コレラ毒素
ＣＴＢ／ＣｔｘＢ      コレラ毒素サブユニットＢ
ＣＴＬ      細胞傷害性ＣＤ８+Ｔ細胞（Ｔキラー細胞）
ＣＭＶ      サイトメガロウイルス
ＤＮＡ      デオキシリボ核酸
ｄｓ      二本鎖
ＤＴ／Ｄｔｘ      ジフテリア毒素
Ｅ．ｃｏｌｉ      大腸菌
ＥＢＶ      エブスタイン・バーウイルス
ＧＭ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ      モノシアロガングリオシド受容体１
ＨＡ      赤血球凝集素
ＨＣＶ      Ｃ型肝炎ウイルス
ＨＩＶ      ヒト免疫不全ウイルス
ＨＩｙ      溶血素
ＨＰＶ      ヒトパピローマウイルス
ＨＴ      出血性毒素
ｉ．ｄ．      皮内の
ｉ．ｍ．      筋肉内の
ｉ．ｐ．      腹腔内に
ＩＦＮ      インターフェロン
ＩｇＡ      免疫グロブリンイソタイプＡ
ＩｇＧ  免疫グロブリンイソタイプＧ
ＩＬ      インターロイキン
ＫＤ      キナーゼデッド
ＬＰＳ      リポ多糖
ＬＴ      大腸菌熱不安定性エンテロトキシン
ＬＴ      致死毒素
ＬＴＢ      大腸菌熱不安定性エンテロトキシンサブユニットＢ
ｍＡｂ      モノクローナル抗体
ＭＨＣ      主要組織適合複合体
ＮＫ  ｃｅｌｌ      ナチュラルキラー細胞
ＮＫＴ  ｃｅｌｌ      ナチュラルキラーＴ細胞
ＰＡＧＥ      ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ      リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ      ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥ      シュードモナス外毒素Ａ
ＰＳＡ      前立腺特異的抗原
ＰＴ／Ｐｔｘ      百日咳毒素
ＲＮＡ      リボ核酸
ｓ．ｃ．      皮下の
ＳＤＳ      ドデシル硫酸ナトリウム
Ｓｅｃ      一般的な分泌（Ｓｅｃ）経路
ｓｓ      一本鎖
ＳＴ      大腸菌熱安定性エンテロトキシン
ＳＴ／Ｓｔｘ      志賀毒素
ＳＴＢ／ＳｔｘＢ      志賀毒素サブユニットＢ
Ｔ３ＳＳ      ＩＩＩ型分泌系
Ｔａｔ      双アルギニン転位
ＴＣＡ      トリクロロ酢酸
Ｔｈ１（ｃｅｌｌ）      炎症性ＣＤ４+Ｔ細胞
Ｔｈ２（ｃｅｌｌ）      ヘルパーＣＤ４+Ｔ細胞
ＴＳＳＴ−１      毒素性ショック症候群毒素
ＴＴ      破傷風毒素
ＶＴ      ベロ毒素
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【０２３６】
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【０２３７】
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【０２３８】
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【０２３９】
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【０２４０】
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【０２４１】
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【０２４２】
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【０２４３】
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【０２４４】
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【０２４５】
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【０２４６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ）】
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【図１７Ｂ）】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【配列表】
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