(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリオフィレンオキサイドおよび下記構造式を有する化合物より成る群から選択される１以上を有効成分とするヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤。
【化１】
0005487227.tif 000006
（ＸはＣＨ３、ＮＨ２またはＮＨＣＨ３である。）
【請求項２】
前記ヒアルロン酸合成酵素遺伝子がHas2である請求項１記載のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、皮膚（表皮及び真皮）、軟骨、関節液などに存在する高分子多糖類であり、細胞間隙への水分の保持、組織内にジェリー状のマトリックスを形成することに基づく細胞の保持、組織の潤滑性と柔軟性の保持、機械的障害等の外力に対する抵抗、および細菌感染の防止など、多くの機能を有している。ヒアルロン酸は、皮膚に多量に存在し、水分を保持する能力が非常に高く、肌のみずみずしさ、ハリ、弾力性に深く関わっており、加齢と共にヒアルロン酸量が減少することに伴い、皮膚のハリが衰え、シワやたるみなどの皮膚老化現象が現れるといわれている。従って、うるおいや張りのある肌を保つためにヒアルロン酸を化粧品等に配合して外からヒアルロン酸を補給することが行われているが、近年、肌の表面からヒアルロン酸を与えるだけでなく、肌の中でヒアルロン酸合成を促進させる薬剤の開発が注目されている。
【０００３】
また、熱傷受傷後の治癒過程で、壊死組織の下方から増生してくる肉芽組織の初期から組織全体が肉芽組織に置き換えられるまでの期間では、肉芽中にヒアルロン酸が著しく増加することが知られており（非特許文献１）、熱傷の初期の治療薬としても、ヒアルロン酸産生促進剤が期待されている。
【０００４】
例えば、ウチワサボテン属（Opuntia）に属する植物の果実から得られるカクタスフルーツ果汁、アムラ（Phyllanthus emblica）の植物体またはその抽出物、ショウガ科マンゴージンジャー（Curcuma amada ROXB.）の植物体またはその抽出物等が、ヒト真皮線維芽細胞においてヒアルロン酸の産生を促進させることが報告されている（特許文献１および２）。
【０００５】
ヒアルロン酸は、皮膚では角層、表皮及び真皮中に含まれ、ヒトのヒアルロン酸合成に関与する酵素としては、３種類のヒアルロン酸合成酵素（HAS1、HAS2、HAS3）が存在することが報告されている。また、それらヒアルロン酸合成酵素により産生されるヒアルロン酸は、103Da程度〜107Daにおよぶ多様な分子量をとり、その分子量の違いにより多様な生物学的又は物理学的な性質を示すことが知られている。ヒアルロン酸の分子量の違いは、保水力、粘弾性等の物理的な性質に影響し、特に、保湿力の高い高分子ヒアルロン酸は、皮膚のハリの衰え、シワやたるみなどの皮膚老化現象に深く関与すると考えられている。また、真皮や表皮中の高分子ヒアルロン酸は、主にヒアルロン酸合成酵素２（HAS2）により産生されることも分っており、例えば、（−）−ムスコンがHas2遺伝子の発現を促進させることが知られている（例えば、非特許文献２、非特許文献３を参照）。
【０００６】
また、トクサ科トクサ属に属する植物の抽出物が、正常ヒト表皮ケラチノサイトにおいてHAS2mRNA発現量を高め、表皮細胞における高分子ヒアルロン酸の産生を促進させることが報告されている（特許文献３）。
【０００７】
さらに、正常ヒト皮膚線維芽細胞においてヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現の概日リズムを誘導し、さらにその評価系において、ジュニパーオイル、ユーカリオイル、サイプレスオイル等の精油がHas2遺伝子の発現を促進したことが報告されている（特許文献４）。
【０００８】
上述したように、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子、特に高分子ヒアルロン酸の産生に寄与するヒアルロン酸合成酵素２遺伝子（Has2）の発現を促進させることにより、皮膚の老化防止（皮膚のハリや弾力性保持）、保湿、関節炎の予防、改善等、熱傷の初期の治療等、ヒアルロン酸産生の促進により恩恵を受ける様々な症状、疾病等を効果的に防止または改善等することが可能である。従って、幅広い用途に活用できかつ効果的にヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進できる新規薬剤の開発が尚強く望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１−１９５４７３号公報
【特許文献２】特開２０１０−２２９１１１号公報
【特許文献３】特開２０１１−１９５４９３号公報
【特許文献４】国際公開第２０１１／１２２０４０号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】「結合組織と疾患」、講談社、１５３頁、１９８０年
【非特許文献２】Sakai S. et al., Skin Pharmacol. Appl. Skin Physiol., 12, 276-283 (1999)
【非特許文献３】Sayo T. et al.，Skin Pharmacol Physiol, 17, 77-83 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記のような事情に鑑み、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進できる新規薬剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、培養ヒト皮膚線維芽細胞において、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現の概日リズムを誘導することに成功し、さらにその系において、遺伝子発現量が高い時点で評価することにより、試験物質のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進効果を高感度で評価することを可能にした。本発明者は、その評価系において、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキサイド、ならびに安息香酸メチル（メチルベンゾエート）誘導体が、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキサイド、および下記構造式を有する化合物より成る群から選択される１以上を有効成分とする。
【化１】
0005487227.tif 000002
（ＸはＣＨ３、ＮＨ２またはＮＨＣＨ３である。）
これら特定の化合物がヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進できることは今まで全く知られていなかった。
【００１４】
ヒトのヒアルロン酸合成酵素としてHAS1、HAS2、HAS3が存在するが、保湿力の高い高分子ヒアルロン酸は主にHAS2により産生されるため、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、HAS2の遺伝子（has2）の発現を促進するものであることが好ましい。
【００１５】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、医薬、医薬部外品、化粧料、食品、雑貨、衣料等様々な態様で使用でき、安全かつ効果的にヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を高めて、皮膚の老化防止（皮膚のハリや弾力性保持）、保湿、潤い付与、関節炎等の予防、改善等、さらには熱傷の初期の治療等、ヒアルロン酸の産生促進により恩恵を受ける様々な症状または疾患を治療または改善等することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、コルチゾールによるヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現の概日リズムの誘導を示すグラフ
【図２】培養ヒト皮膚線維芽細胞における、試験物質によるヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現促進を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、β−カリオフィレン、カリオフィレンオキサイド、または上記の安息香酸メチル（メチルベンゾエート）誘導体を有効成分とする。それら化合物はいずれも既知化合物であるが、以下に簡単に説明する。
【００１８】
β−カリオフィレン（4, 11, 11-トリメチル−8−メチレンバイサイクロ[7.2.0]ウンデセン）は、下記構造式で示される分子量２０４．３６のセスキテルペン類で、市販品の多くはクローブ油から分離されたものである。天然には、クローブ油、コパイバ油、ラベンダー油などに存在することが知られている。
【化２】
0005487227.tif 000003
【００１９】
カリオフィレンオキサイド（(1R,4R,6R,10S)-4,12,12-トリメチル-9-メチレン-5-オキサトリシクロ[8.2.0.04,6]ドデカン）は、下記構造式で示される分子量２２０．３５のセスキテルペン類で、β-カリオフィレンを過酸でモノエポキシ化することにより合成することができる。天然にはクローブ油、ラベンダー油等に存在することが知られている。
【化３】
0005487227.tif 000004
【００２０】
また、本発明で用いられる安息香酸メチル誘導体である2-メチル安息香酸メチルは分子量150.18の無色液体である。2-アミノ安息香酸メチルは分子量１５１．１７の液体で、メタノール120部にアントラニル酸８０部を加え、４０度以下で濃硫酸１００部を徐々に加え、７５〜８３度で反応を完結し、メタノール回収後、炭酸ナトリウム１１０部、水２４０部の溶液中に加えて中和し水洗後蒸留により精製することにより得られる。O-ニトロトルエンからの合成法もある。天然には、ネロリ、イランイラン花精油等に存在することが知られている。2-メチルアミノ安息香酸メチルは分子量１６５．２の無色液体で、天然にはオレンジの果皮、マンダリン油等に存在することが知られている。
【００２１】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、上記化合物の１種または２種以上を含む。本発明において、上記化合物は天然由来のものであっても、あるいは合成されたものであってもよい。
【００２２】
本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、単独で用いてもよいが、他のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進作用を有する薬剤と組み合せて使用してもよい。
【００２３】
さらに、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤は、それらを単独で用いてもよいが、様々な対象物に含めることができる。その対象物の種類に応じて、上記の必須成分の他に、任意の構成要素をさらに含めることができる。
【００２４】
例えば、対象物が皮膚外用剤である場合には、その剤形（例えば、液剤、粉末剤、顆粒剤、エアゾール剤、固形剤、ジェル剤、パッチ剤、坐剤等）や、製品形態（例えば化粧料、医薬品、医薬部外品等）に応じて、通常そのような皮膚外用剤に含まれる任意の成分を、上記のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤と共に含んでいてよい。皮膚外用剤は、皮膚（頭皮、頭髪、爪も含む）に対して適用する組成物全般を包括する概念であり、例えば、基礎化粧料、メーキャップ化粧料、毛髪化粧料、皮膚もしくは毛髪洗浄料等の化粧料や、軟膏剤、パッチ剤、坐剤、歯磨等の種々の医薬品ないし医薬部外品等を含む。その剤形も特に限定されず、例えば、水溶液系、可溶化系、乳化系、油液系、ゲル系、ペースト系、軟膏系、エアゾール系、水−油２層系、水−油−粉末３層など、任意の剤型を含む。皮膚外用剤が化粧料である場合、例えば、香水、オードトワレ、オーデコロン、クリーム、乳液類、化粧水、ファンデーション類、粉白粉、口紅、石鹸、シャンプー・リンス類、ボディーシャンプー、ボディーリンス、ボディーパウダー類、浴剤類等が挙げられる。
【００２５】
また、例えば、芳香剤、消臭剤、アロマキャンドル、インセンス、文房具、財布、バッグ、靴等の任意の雑貨類や、例えば下着、洋服、帽子、ストッキング、靴下等の任意の衣類、あるいは例えば散剤、顆粒、錠剤、カプセル剤等様々な形態のサプリメント（栄養補助食品）、菓子、飲料等の任意の食品等に、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤を含めることができ、また吸入医薬品や空間散布剤のような吸入製品において用いてもよい。
【００２６】
尚、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤の使用態様を例示したが、これらに限定されるものではなく、本発明の効果を達成できる限り、任意の態様で用いることができる。また、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤の他に、具体的な態様に応じて、他のヒアルロン酸産生促進作用を有する薬剤を、本発明の効果を損なわない限り配合することができる。
【００２７】
対象物中における本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤の配合量は、用いる化合物の種類や形態、対象物等によって適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば、対象物の全質量に対して、０．００００１〜１００質量％であり、より好適には、０．０００１〜５０質量％であり、さらに好適には、０．０００１〜２０質量％である。
【００２８】
尚、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤やそれを配合した対象物の具体的な適用は、特に限定されないが、例えば、皮膚の老化防止（皮膚のハリや弾力性保持）、保湿、関節炎の予防、改善等、熱傷の初期の治療等、ヒアルロン酸産生の促進により恩恵を受ける様々な症状、疾病等の予防、改善等に使用できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。尚、ヒトにおけるヒアルロン酸合成酵素遺伝子としてHas1, Has2, Has3が知られているが、本実施例では代表として、ヒトヒアルロン酸合成酵素２遺伝子（hHas2）の発現を測定した。下記で用いる試験物質は市販されている化合物を購入したものを使用した。
【００３０】
培養ヒト皮膚線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現の概日リズムの誘導
培養ヒト皮膚線維芽細胞を用いた系でヒアルロン酸合成酵素遺伝子（hHas2）の発現の概日リズムを誘導できることを確認した。
【００３１】
培養ヒト皮膚線維芽細胞は、正常成人皮膚由来線維芽細胞を購入し（Cell Application, Inc）、実験に用いた。10%FBS、20mM HEPES、Glutamax、抗菌剤を添加したDMEM培地に播種し、37℃、5%CO2にて培養した。培養６日目に、コルチゾール50ng/mlを添加して２時間処理した後、経時的に細胞をサンプリングした。市販のRNA抽出キットを使用して細胞からRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法によりhHas2遺伝子の発現量を測定した。また同様に、ハウスキーピング遺伝子であるRPLP0の発現量を定量して内部標準として用い、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。
【００３２】
生体内で、コルチゾール等のグルココルチコイドは末梢組織等の生体時計の調節に関与し、朝起床時にコルチゾールの血中濃度が上昇して生体時計をリセットすると考えられている。培養細胞では通常、個々の細胞がばらばらのタイミングでリズムを刻んでいるが、コルチゾールのようなシグナル刺激因子で刺激することにより、培養細胞においても概日リズムを誘導することができる。
【００３３】
hHas2の発現を測定した結果を図１に示す。コルチゾールで刺激することにより、約２４時間周期の概日リズムを刻んでhHas2が発現されることを確認できた。
【００３４】
ヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進効果の評価
上記の結果から、培養ヒト皮膚線維芽細胞評価系において、hHas2はコルチゾールによる刺激により概日リズムを刻むことが認められた。発現量が高い時間帯での評価が望ましいため、刺激の１６時間後における遺伝子発現量を指標として、試験物質のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進効果を評価した。
【００３５】
上記と同様の方法により、正常成人皮膚由来線維芽細胞（Cell Application, Inc）を播種し、培養６日目に、各薬剤を50ppmとなるように添加して、１６時間後に細胞をサンプリングした。尚、コントロールとして、試験物質の代わりに同量のエタノールを添加した。市販のRNA抽出キットを使用して細胞からRNAを抽出し、市販のPCRプライマー（Perfect Real Time Primer、タカラバイオ社）を用い、RT-PCR法によりhHas2遺伝子の発現量を測定した。また同様に、ハウスキーピング遺伝子であるRPLP0の発現量を定量して内部標準として用い、RPLP0の発現量に対する目的遺伝子の相対的発現量を算出した。得られた値について、Dunnettの多重比較検定を行い、コントロールと比較して片側５％の危険率で有意差があるものを効果有りと判定した。
【００３６】
図２に、試験物質の添加１６時間後のhHas2遺伝子の相対発現量を示す。
【００３７】
また、下記の表１に、１６時間後のhHas2遺伝子の相対発現量を示す。
【表１】
0005487227.tif 000005
【００３８】
β−カリオフィレン、カリオフィレンオキサイド、２−メチル安息香酸メチル、２−メチルアミノ安息香酸メチル、およびアミノ安息香酸メチル（メチルアンスラニレート）は、コントロールと比較してhHas2遺伝子の発現量を共に有意に高め、それら化合物がヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進し得ることが示された。
【００３９】
(配合例)
以下、本発明のヒアルロン酸合成酵素遺伝子発現促進剤の配合例を示すが、本発明の実施は以下に限定されるものではない。尚、下記において配合量は全て製品全量に対する質量％で表す。
【００４０】
フレグランス
（１）アルコール                                                    ７５．０
（２）精製水                                                       残余
（３）ジプロピレングリコール                                          ５．０
（４）本発明のHas遺伝子発現促進剤：β−カリオフィレン               １０．０
（５）酸化防止剤                                                      ８．０
（６）色素                                                          適量
（７）紫外線吸収剤                                                  適量
【００４１】
ルームフレグランス
（１）アルコール                                                    ８０．０
（２）精製水                                                        残余
（３）酸化防止剤                                                      ５．０
（４）本発明のHas遺伝子発現促進剤：カリオフィレンオキサイド           ３．０
（５）３−メチル−３メトキシブタノール                                ５．０
（６）ジベンジリデンソルビトール                                      ５．０
【００４２】
インセンス
（１）タブ粉                                                        ７５．５
（２）安息香酸ナトリウム                                            １５．５
（３）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチル安息香酸メチル           ５．０
（４）ユーカリオイル                                                  １．０
（５）精製水                                                        残余
【００４３】
入浴剤
（１）硫酸ナトリウム                                                ４５．０
（２）炭酸水素ナトリウム                                            ４５．０
（３）ラベンダーオイル                                                ９．０
（４）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル     １．０
【００４４】
マッサージ用ジェル
（１）エリスリトール                                                  ２．０
（２）カフェイン                                                      ５．０
（３）オウバク抽出物                                                  ３．０
（４）グリセリン                                                    ５０．０
（５）カルボキシビニルポリマー                                        ０．４
（６）ポリエチレングリコール４００                                  ３０．０
（７）エデト３ナトリウム                                              ０．１
（８）ポリオキシレン（１０）メチルポリシロキサン共重合体              ２．０
（９）スクワラン                                                      １．０
（１０）水酸化カリウム                                                ０．１５
（１１）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−アミノ安息香酸メチル         １．０
【００４５】
マッサージクリーム
（１）固形パラフィン                                                  ５．０
（２）ミツロウ                                                      １０．０
（３）ワセリン                                                      １５．０
（４）流動パラフィン                                                ４１．０
（５）１．３−ブチレングリコール                                      ４．０
（６）モノステアリン酸グリセリン                                      ２．０
（７）ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル                  ２．０
（８）ホウ砂                                                          ０．２
（９）カフェイン                                                      ２．０
（１０）防腐剤                                                        適量
（１１）酸化防止剤                                                    適量
（１２）本発明のHas遺伝子発現促進剤：カリオフィレンオキサイド         ０．５
（１３）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル   ０．５
（１４）精製水                                                        残余              
【００４６】
芳香性繊維
キュプロアンモニウムセルロース溶液（セルロース濃度１０重量％、アンモニウム濃度７重量％、銅濃度３．６重量％）に、本発明のHas遺伝子発現促進剤を内包したマイクロカプセル（粒子径５０μｍ以下、マイクロカプセルに占める化合物の割合は５０重量％）をセルロース重量に対して０．１〜２０重量％の範囲内で添加、混和した後、通常の湿式紡糸方法に従って紡糸し、精錬工程、乾燥工程を経て、芳香性繊維を得た。
【００４７】
顆粒
（１）スクラロース                                                    ０．１
（２）本発明のHas遺伝子発現促進剤：β−カリオフィレン                 ０．１
（３）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチル安息香酸メチル           ０．１
（３）香味料                                                          ５．０
（４）賦形剤（セオラス）                                            １０．０
（５）マルチトール                                                    残余
【００４８】
錠剤（チュアブルタイプ）
（１）イノシトール                                                  １１．０
（２）マルチトール                                                  ２１．０
（３）スクロース                                                      ０．５
（４）鮭白子抽出物（ＤＮＡ  Ｎａ）                                    ０．１
（５）酵母抽出物                                                      ０．１
（６）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−アミノ安息香酸メチル           ０．１
（７）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル     ０．１
（７）香味料                                                          ５．０
（８）賦形剤                                                          残余
【００４９】
タブレット
（１）潤沢剤（ショ糖脂肪酸エステル等）                                １．０
（２）アラビアガム水溶液（５％）                                      ２．０
（３）酸味料                                                          １．０
（４）着色料                                                          適量
（５）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチル安息香酸メチル           ０．１
（５）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチルアミノ安息香酸メチル     ０．１
（６）糖質（粉糖またはソルビトール等）                                残余
【００５０】
キャンディー
（１）砂糖                                                          ５０．０
（２）水飴                                                          ４７．９５
（３）有機酸                                                          ２．０
（４）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−アミノ安息香酸メチル           ０．０５
【００５１】
ガム
（１）砂糖                                                          ４３．０
（２）ガムベース                                                    ３０．９５
（３）グルコース                                                    １０．０
（４）水飴                                                          １６．０
（５）本発明のHas遺伝子発現促進剤：２−メチル安息香酸メチル           ０．０５
【００５２】
これら配合例の製品は、それぞれの製品形態の典型的な使用態様における使用テストにより、ヒアルロン酸合成酵素遺伝子の発現を促進して、ヒアルロン酸の産生を高めることができる。
【図１】
0005487227.tif 000007
【図２】
0005487227.tif 000008