(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシネトバクター属の解析に適した核酸塩基配列を含有しているＰＮＡプローブであって、前記核酸塩基配列が配列番号８または９であるＰＮＡプローブ。
【請求項２】
アシネトバクター属を検出、同定または定量するためのＰＮＡプローブであって、前記ＰＮＡプローブの核酸塩基配列が配列番号８または９であるＰＮＡプローブ。
【請求項３】
前記プローブが、１以上の検出可能な部分によって標識されている、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項４】
試料中に存在していてもよい微生物を解析するためのインサイチューハイブリダイゼーションに使用される、請求項１に記載のＰＮＡプローブ。
【請求項５】
試料中のアシネトバクター属の微生物を検出、同定または定量するための方法であって；
前記試料に、請求項１に記載のＰＮＡプローブの少なくとも１つを接触させる工程；
試料中のアシネトバクター属の微生物の標的配列に、前記ＰＮＡプローブをハイブリダイズさせる工程；ならびに
試料中のアシネトバクター属の微生物の存在、同定および／または量を示すハイブリダイゼーションを検出する工程、を含んでいる方法。
【請求項６】
解析がインサイチューにて行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、前記ＰＮＡプローブと非標的配列との任意のハイブリダイゼーションを、減少または除去させるためのブロッキングプローブを、少なくとも１つ添加する工程を含んでいる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、請求項２に記載のＰＮＡプローブのセットの使用を含んでいる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の１以上のＰＮＡプローブおよび使用上の注意を含んでいる、１以上のアシネトバクター属の微生物を検出、同定、または定量するためのキット。
【請求項１０】
請求項１に記載のＰＮＡプローブの少なくとも１つを含んでいるＰＮＡプローブセットであって、２以上のプローブが、同時蛍光により第３の色を生成するために使用される、ＰＮＡプローブセット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、２００５年６月２日に仮出願がなされた米国仮特許出願番号第６０／６８７，１７８、および２００５年８月１日に仮出願がなされた米国仮特許出願番号第６０／７０４，５５２に基づく優先権を主張するものである。なお、これら仮出願のそれぞれの内容全体は、参照によって、本明細書に援用される。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、試料中に存在していてもよい微生物の解析に用いるためのペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブ、ＰＮＡプローブセット、および方法に関する。本発明のプローブの対象となる微生物には、エシェリキア・コリ（Escherichia coil）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、アシネトバクター（Acinetobacter）属、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Streptococcus agalactiae）およびそれらの門、ならびにフンギ（菌類（Fungi））が含まれる。さらに、本発明は、そのようなＰＮＡプローブを含む診断キットに関する。
【０００３】
〔発明の背景〕
感染症の診断は、例えば、表現型マーカーの培養試験および生化学試験のような、いまだ、古典的な細菌学的手法に基づいて行われることが多い。そして、一般的に、最終的な診断が下されるまでに、１日、２日〜数週間、さらには数ヶ月を要する。その間、患者には、しばしば、予備的な試験結果および臨床的な症状に基づいて、経験的な治療が施され、これによりしばしば、抗生物質の不必要な使用および後遺症が招かれる。
【０００４】
微生物を解析するための従来の生化学的手法は、手間がかかるものであり、誤認があることもよく知られている。したがって、最適な抗生物質治療および患者管理を確実に行うためには、微生物を迅速かつ正確に、検出、同定および／または定量するための方法が重要である。
【０００５】
その名にもかかわらず、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ペプチドでもなく、核酸でもない。また、酸でさえもない。ＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対ルールに従って、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）と、配列特異的にハイブリダイズすることが可能で非自然発生的なポリアミドである（米国特許第５，５３９，０８２、およびEgholmら, Nature 365:566-568 (1993)を参照）。しかし、核酸は、遺伝的伝達および遺伝的表現の因子として生物の生命において中心的な役割を果たす生物学的材料であるのに対して、ＰＮＡは、化学者の心のうちで考えられ、そして、合成有機化学を用いて作られた完全な人工分子として近年開発された。また、ＰＮＡは、核酸とは構造的にも異なる。両者は、共通の核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を利用するが、これらの分子のバックボーンは、構造的に異なる。ＲＮＡおよびＤＮＡのバックボーンは、リボースおよび２‐デオキシリボースのリン酸ジエステル単位の繰り返しからなる。これに対して、最も一般的なＰＮＡのバックボーンは、（アミノエチル）‐グリシンサブユニットからなる。さらに、ＰＮＡでは、核酸塩基は、付加的なメチレンカルボニル部分によって、上記バックボーンに連結されている。したがって、ＰＮＡは、酸ではない。また、ＤＮＡおよびＲＮＡに存在するような電荷をもつ酸基を含まない。バックボーンが電荷をもたないため、ＰＮＡプローブは、不安定な条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡにハイブリダイズすることができる。また、バックボーンが電荷をもたないため、ＤＮＡプローブに接近できないことが知られている高度に構造化されたｒＲＮＡおよび２本鎖ＤＮＡのような標的に、ＰＮＡプローブは接近することができる。また、（Stephano & Hyldig-Nielsen, IBC Library Series Publication #948. International Business Communication, Southborough, MA, pp. 19-37 (1997)を参照）。ＰＮＡは、配列特異的に核酸とハイブリダイズするので、プローブベースのハイブリダイゼーションアッセイ系を開発する際、有用な研究対象となりうる。しかしながら、ＰＮＡプローブは、構造または機能において核酸プローブと同等の物ではない。
【０００６】
リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）配列または該ｒＲＮＡに対応するゲノムＤＮＡ配列（ｒＤＮＡ）の比較解析は、細菌種間の系統発生の関係を立証するための方法として、広く受け入れられるようになった（Woese, Microbiol. Rev. 51:221-271 (1987)を参照）。Bergeyの体系的な細菌学のマニュアルは、ｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの配列比較に基づいて改定された。近縁の種間でのリボソームＲＮＡまたはｒＤＮＡの配列の相違によれば、微生物を同定するための特異的なプローブを設計することができる。したがって、診断微生物学を、古典的な微生物学を特徴付けるような一連の表現型マーカー（Delong ら., Science 342:1360-1363 (1989)）よりもむしろ１遺伝子マーカーに基づくものにすることができる。
【０００７】
特定の微生物を検出するためのＰＮＡ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＰＮＡ ＦＩＳＨ）技術は、いくつかの文献に記載されている（例えば、Stender ら, J Clin Microbiol. 1999 Sep;37(9):2760-5; Rigby ら J Clin Microbiol. 2002 Jun;40(6):2182-6;および Oliveira ら J Clin Microbiol. 2002 Jan;40(1 ):247-51.を参照）。また、いくつかのキットが商業的に入手することができる（AdvanDx, Inc, Wobum MA）。その名の通り、ＰＮＡ ＦＩＳＨは、蛍光標識されたＰＮＡプローブを使用して、ＰＮＡプローブが試料中の標的核酸と特異的にハイブリダイズすることに基づいて、該試料を輝かせる。通常、ＰＮＡプローブは、リボソームＲＮＡのような高コピー数の標的を検出するために設計される。ＰＮＡ ＦＩＳＨ法は、種レベルで微生物を迅速かつ正確に同定する潜在能力を有するという点において、古典的な微生物学的検出技術を超える改良技術として受け入れられている。ＰＮＡ ＦＩＳＨ技術の１つの制限は、実績のあるプローブ配列の入手可能性にある。新規なプローブを製造し、試験するためには、ある程度の費用を要し、また、プローブの設計にはある程度の技術が必要であるため、有用性が証明された新規なプローブ配列は、あまり記載されていない。
【０００８】
〔発明の概要〕
本発明は、関心のある試料中に存在していてもよい微生物の解析に有用なＰＮＡプローブ、およびその使用、ならびにキットを対象としている。本発明によれば、ＰＮＡプローブは、ｒＲＮＡ、または、該ｒＲＮＡもしくはその相補体に対応しているゲノム配列（ｒＤＮＡ）を対象としている。好ましい実施の形態において、本発明のプローブは、試料中に存在していてもよい任意の微生物のインサイチュー（in situ）ハイブリダイゼーション解析に使用される。また、最も好ましいインサイチューハイブリダイゼーション解析は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション解析である。
【０００９】
１実施の形態において、本発明は微生物（例えば、エシェリキア・コリ、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、ストレプトコッカス・アガラクチエ、フンギ、および、アシネトバクター属）を検出、同定および／または定量するためのＰＮＡプローブを対象としている。
【００１０】
これらのＰＮＡプローブは、核酸プローブと比較して、物理化学的なＰＮＡプローブの特有の特徴を有しており、たった１つのＰＮＡプローブを使用することで迅速かつ正確な解析を実施することができる。また、多くの微生物は比較的堅い細胞膜を備えており、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション解析に適用された場合に、核酸プローブと比較したときに、前記細胞膜へのＰＮＡプローブの改良された浸入は有利となる。核酸プローブには、架橋剤および／または酵素による、固定化と透過化とが必要とされることに対して（例えば、Kempfら,J.Clin.Microbiol 38:830-838(2000)を参照）、これらのＰＮＡプローブを、実施例１に説明されたような下記の塗沫標本に、直接塗布することができる。
【００１１】
好ましい実施の形態において、これらのＰＮＡプローブは、比較的短い核酸塩基配列、例えば８‐１７塩基を有しており、より好ましくは、実施例１に説明されたような１５核酸塩基である。自然に生じている核酸プローブは、それらの低い融解温度（Tm）値のために、典型的に少なくとも１８核酸塩基である（例えば、Kempfら,J.Clin.Microbiol 38:830-838を参照）。この違いにより、これらのＰＮＡプローブに、微生物から得られたｒＲＮＡまたはｒＤＮＡの解析に必要な、１つのみもしくはごくわずかな核酸塩基の違いを有している非常に密接な非標的配列（標的ではない配列）に対する、より良好な識別力が与えられる。
【００１２】
本発明のＰＮＡプローブの核酸塩基は、ACA-CAC-ACT-GAT-TCA（配列番号１）、CAC-CTA-CAC-ACC-AGC（配列番号２）、CAC-TTA-CCA-TCA-GCG（配列番号３）、ACA-CCA-AAC-CTC-AGC（配列番号４）、ACA-CCA-AAC-ATC-AGC（配列番号５）、CCC-TAG-TCG-GCA-TAG（配列番号６）、CCA-AGA-GAT-CCG-TTG（配列番号７）、CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C（配列番号８）、および、GCT-CAC-CAG-TAT-CG（配列番号９）からなる群より選ばれる。１以上のこれらのプローブまたはそれらのプローブの相補体は、本発明の最も好ましいプローブセットに含まれている。
【００１３】
本発明の好ましいプローブは、少なくとも１つの検出可能な部分によって標識されている（ここで、検出可能な１以上の部分は、抱合体、分枝検出システム、発色団、蛍光団、スピンラベル、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジウムエステル、および発光化合物からなる群から選ばれる）。本発明の蛍光標識プローブは自己報告性（self-reporting）であってもよく、最も好ましくは本発明の自己報告性の蛍光プローブは、ＰＮＡ直鎖ビーコンである。本発明のプローブは、独立した検出が可能な、または同時蛍光（同時発生的な蛍光）による検出が可能な、２以上の蛍光標識を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明の他の概念には、プローブに機能を付与する部分を含有しているＰＮＡプローブが含まれる。そのような部分には、スペーサーおよびリンカー基が含まれるが、これらに限定されない。同じように、本発明のＰＮＡプローブは、膜、スライド、アレイ、ビーズ、または粒子などの固体の支持体に結合しているプローブを包含している。
【００１５】
本発明のプローブセットは、試料中に存在していてもよい微生物を解析するための２以上のＰＮＡプローブを含んでいる。プローブセットは、好ましくは、検出可能な部分によって標識されている。プローブセットは同じ検出可能な部分によって標識されてもよいし、または、独立したプローブシグナルの解析のために異なって標識されてもよい。また、同時蛍光により第３のシグナルを引き起こすために、プローブセットのうちの２以上異って標識された蛍光プローブを使用してもよいということが、本発明の概念に含まれる。
【００１６】
本発明の方法は、試料と１以上の前記ＰＮＡプローブとを接触させる工程を含有している。前記方法によれば、適切なハイブリダイゼーション条件下での、前記プローブのプローブする核酸塩基配列の標的配列に対するハイブリダイゼーションに関連付けることにより、（ｉ）試料中の微生物の存在の有無、および／または数を、検出、同定、および／または定量することができ、ならびに／あるいは（ｉｉ）抗生物質に対する感受性を決定することができる。したがって、上記解析は、最も確実な成果を有する１つのアッセイ（シングルアッセイ）に基づいている。一方、微生物を解析するための現状の決まりきった方法は、多重検定を必要とする多数の表現型特性に基づいている。
【００１７】
好ましい実施の形態において、本発明の方法は、試料中に存在していてもよい微生物を、インサイチューハイブリダイゼーション解析するために用いられる。そして、最も好ましいインサイチューハイブリダイゼーション解析は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション解析である。本発明の好ましい方法において、試料は、生物試料であり、血液、尿、分泌物、汗、痰、糞便、粘膜、または、それらの培養物などが含まれている。
【００１８】
本発明の好ましい方法は、ＰＮＡプローブと非標的配列とのハイブリダイゼーションを、減少または除去させるための未標識ブロッキングプローブを、必要に応じて含んでいる。本発明の方法は、ハイブリダイゼーションの前に、架橋試薬または酵素を使用する工程を含んでいない。
【００１９】
また、本発明の方法は、反応において、生成、合成、または増幅された標的核酸を検出するために使用してもよい。前記標的核酸を生成、合成、または増幅するための好ましい方法は、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、ＲＣＡ、および、Ｑ‐βレプリカーゼを含んでいる。
【００２０】
本発明の方法は、前記標的核酸が膜、スライド、ビーズ、または、粒子などの表面に固定されているものを含んでいる。さらに、そのようなものは、アレイの構成要素であってもよい。必要に応じて、本発明の方法は、膜、スライド、ビーズ、または、粒子などの表面に固定されているＰＮＡプローブを含んでいてもよい。さらに、該ＰＮＡプローブは、アレイの構成要素であってもよい。
【００２１】
本発明の極めて好ましい実施の形態では、患者への医療は、ｉ）該患者から試料を取得する工程；ｉｉ）該試料中の微生物の存在を決定、微生物の量を決定、および／または微生物を同定する工程；ならびにｉｉｉ）必要に応じて、感染の治療をするために、抗生物質を少なくとも１種投与する工程、を含んでいる。
【００２２】
さらにもう１つ別の実施の形態では、本発明は、試料中に存在していてもよい微生物を検出、同定、および／または定量する、ならびに／または抗生物質に対する耐性を決定するアッセイを実施するのに適しているキットを対象としている。本発明のキットは、１以上のＰＮＡプローブ、および、アッセイを実施するために、そうでなければ、アッセイの実施を容易にするように選択される他の試薬または組成物を含有している。好ましいキットの形態は、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイを実施するために設計されたキット、およびリアルタイムＰＣＲアッセイを実施するために設計されたキットを含んでいる。好ましいキットは、臨床標本などの試料、またはその培養物を検査するために設計されている。
【００２３】
適切なＰＮＡプローブは、効果のあるこれらのプローブする核酸塩基配列を必ずしも厳密に有しているわけではなく、特定のアッセイ条件にしたがって、改変されることがある、ということを技術分野の通常の知識を有する者は正しく理解するであろう。例えば、融解温度を低くする、および／またはストリンフェンシーを調整するために、ハイブリッドの安定性を変更することが必要である場合に、核酸塩基配列を切断することにより、短いＰＮＡプローブを調製することができる。同様に、ＰＮＡプローブの配列内に識別する核酸塩基が残る限りは、核酸塩基配列が一端において切断され、かつ、もう一方の端において延長されていてもよい。本明細書に記載のパラメーターの範囲内にある、プローブする核酸塩基配列のそのような変形は、本発明の実施の形態であると考えられる。
【００２４】
本発明のＰＮＡプローブ、方法、およびキットは、対象とされている微生物に対する感受性と特異性との両方を立証している。さらに、本明細書に記載のアッセイは迅速（３時間よりも少ない）であり、そして、１つのアッセイにおいて微生物を解析することができる。また、プローブする配列の相補体は、標的ｒＤＮＡを用いるアッセイ（リアルタイムＰＣＲなど）に同等に適している、ということも、技術分野の通常の知識を有する者は正しく理解するであろう。
【００２５】
〔発明の詳細な記述〕
＜１．定義＞
（ａ）本明細書で用いられる場合、用語「核酸塩基」とは、自然発生的または非自然発生的な複素環の部分（moiety）であって、核酸技術またはペプチド核酸技術を利用する者に一般的に知られ、核酸に配列特異的に結合することができるポリマーを生じる複素環の部分を意味する。
【００２６】
適切な核酸塩基の非限定的な例には、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５‐プロピニル‐ウラシル、２‐チオ‐５‐プロピニル‐ウラシル、５‐メチルシトシン、偽イソシトシン、２‐チオウラシルおよび２‐チオチミン、２‐アミノプリン、Ｎ９‐（２‐アミノ‐６‐クロロプリン）、Ｎ９‐（２，６‐ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９‐（７‐デアザ‐グアニン）、Ｎ９‐（７‐デアザ‐８‐アザ‐グアニン）、ならびにＮ８‐（７‐デアザ‐８‐アザ‐アデニン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。適切な核酸塩基の非限定的なその他の例には、Buchardtら(米国特許第６，３５７，１６３号、国際公開公報ＷＯ９２／２０７０２またはＷＯ９２／２０７０３；参照によって本明細書に援用される)の図２（Ａ）および２（Ｂ）に記載された核酸塩基が含まれる。
【００２７】
（ｂ）本明細書で用いられる場合、用語「核酸塩基配列」は、核酸塩基を含むサブユニットを備えるポリマーのあらゆる断片を意味する。適切なポリマーまたはポリマー断片の非限定的な例には、オリゴデオキシヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、ペプチド核酸、核酸類似体（nucleic acid analogs）、核酸模倣体（nucleic acid mimics）、および／またはキメラが含まれる。
【００２８】
（ｃ）本明細書で用いられる場合、用語「標的配列」は、アッセイで検出される核酸塩基配列を意味する。
【００２９】
（ｄ）本明細書で用いられる場合、用語「プローブ」は、関心のある生物の標的分子の標的配列に、配列特異的にハイブリダイズするように設計されたプローブする核酸塩基配列を有しているポリマー（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、キメラ、または連結されたポリマー）を意味する。
【００３０】
（ｅ）本明細書で用いられる場合、「解析する」は、検出、同定、および／または定量するため、ならびに／あるいは抗生物質に対する耐性（抗生物質に対する感受性）を決定するために、個々の細菌を特徴づけることを意味する。
【００３１】
（ｆ）本明細書で用いられる場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、２以上のＰＮＡサブユニット（残基）を含有している、任意のオリゴマーまたはポリマー断片を意味する。「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」には、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，５２７，６７５号、第５，６２３，０４９号、第５，７１４，３３１号、第５，７１８，２６２号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号、第５，８３７，４５９号、第５，８９１，６２５号、第５，９７２，６１０号、第５，９８６，０５３号、第６，１０７，４７０号、第６，２０１，１０３号、第６，３５０，８５３号、第６，３５７，１６３号、第６，３９５，４７４号、第６，４１４，１１２号、第６，４４１，１３０号、第６，４５１,９６８号、第６９６９７６６号、および第７０２２８５１号のうち、任意の１以上において、ペプチド核酸として参照、または請求項に記載された、オリゴマーまたはポリマー断片のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。なお、上記特許文献は、全て、参照によって、本明細書に援用される。また、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、以下の刊行物に記載された核酸模倣体のうち、２以上のサブユニットを含む、任意のオリゴマーまたはポリマー断片に対しても用いられる。
Lagriffoulら, Bioorg & Medical Chemistry Letters 4: 1081-1082 (1994)；
Petersenら, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 6: 793-796 (1996)；
Diderichsenら, Tett. Lett. 37: 475-478 (1996)；
Fujiiら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 637-627 (1997)；
Jordanら Bioorg. Med. Chem. Lett. 7: 687-690 (1997)；
Krotzら, Tett. Lett. 36: 6941-6944 (1995)；
Lagriffoulら, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1081-1082 (1994)；
Diederichsen, U., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7: 1743-1746 (1997)；
Loweら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 , (1997) 1 : 539-546；
Loweら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 11 : 547-554 (1997)；
Loweら, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1 :5 55- 560 (1997); 
Howarth ら., J. Org. Chem. 62: 5441-5450 (1997)；
Altmann, K- Hら, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 7: 1119-1122 (1997)；
Diederichsen, U., Bioorganic & Med. Chem. Lett., 8: 165-168 (1998)；
Diederichsenら, Angew. Chem. Int. Ed., 37: 302-305 (1998)；
Cantinら, Tett. Lett, 38: 4211-4214 (1997)；
Ciapettiら, Tetrahedron, 53: 1167-1176 (1997)；
Lagriffouleら, Chem. Eur. J., 3: 912-919 (1997)；
Kumarら, Organic Letters 3(9): 1269-1272 (2001)；ならびに、
国際公開公報ＷＯ９６／０４０００に開示されているような、Shahらによるペプチド核酸をもとにする核酸模倣体（ペナム（ＰＥＮＡＭ））。最も好ましい実施の形態では、ＰＮＡサブユニットは、メチレンカルボニル結合によって、Ｎ‐［２‐（アミノエチル）］グリシンのバックボーンのアザ窒素原子に結合した、自然発生的または非自然発生的な核酸塩基からなる。
【００３２】
（ｇ）本明細書で用いられる場合、用語「標識」および「検出可能な部分」は、同義であり、プローブに結合することができ、ある手段または方法によってプローブを検出可能にする部分を意味する。
【００３３】
（ｈ）本明細書で用いられる場合、用語「同時蛍光」は、分離できないほど空間的に十分近くに位置する２以上の標識の発光を同時に検出することにより生じる色の認識を説明するために用いられる。同時蛍光は、目または光を感知する装置のいずれかで検出することができる。
【００３４】
＜２．説明＞
（１）総論
〔ＰＮＡ合成〕
ＰＮＡを化学的に組み立てる方法は、よく知られている（米国特許第５，５３９，０８２号、第５，５２７，６７５号、第５，６２３，０４９号、第５，７１４，３３１号、第５，７１８，２６２号、第５，７３６，３３６号、第５，７７３，５７１号、第５，７６６，８５５号、第５，７８６，４６１号、第５，８３７，４５９号、第５，８９１，６２５号、第５，９７２，６１０号、第５，９８６，０５３号、第６，１０７，４７０号、第６，２０１，１０３号、第６，３５０，８５３号、第６，３５７，１６３号、第６，３９５，４７４号、第６，４１４，１１２号、第６，４４１，１３０号、第６，４５１，９６８号、第６，９６９，７６６号、および第７，０２２，８５１号を参照）。これら特許文献は、全て、参照によって本明細書に援用される組み込まれる。また、ＰＮＡを化学的に組み立てる方法については、PerSeptive Biosystems社および／またはApplied Biosystems社の製品文献も参照されたい。また、ＰＮＡ合成の方法論の一般的な参考文献として、Nielsen ら., Peptide Nucleic Acids; Protocols and Applications, Horizon Scientific Press, Norfolk England (1999)も参照されたい。
【００３５】
ペプチド核酸の化学的な組み立てを自動的に行うことをサポートする薬品および器具は、現在、商業的に入手することができる。同様に、標識または未標識のＰＮＡオリゴマーをカスタムＰＮＡオリゴマーの供給メーカーから商業的に入手することができる。ＰＮＡの化学的な組み立ては、固相ペプチド合成に似ている。ＰＮＡの化学的な組み立てでは、組み立ての各サイクルで、オリゴマーは、伸長中のポリマーに付加されるための次のシントンと縮合される反応性アルキルアミノ末端を有する。
【００３６】
ＰＮＡは、サブマイクロモル〜ミリモル、もしくはそれ以上のいかなるスケールで合成されてもよい。ＰＮＡは、一般的には、ＸＡＬ、ＰＡＬ、またはその他の多くの適切な商業的に入手可能なペプチド合成支援物（support）を用いるExpedite Synthesizer (Applied Biosystems)上でＦｍｏｃ（Ｂｈｏｃ）保護基モノマーを用いて、２マイクロモルスケールで合成されうる。別の方法として、適切な固体の支持体(例えば、ＭＢＨＡ支持体）を備えるModel 433A Synthesizer (Applied Biosystems)を用いてもよい。さらに、その他の多くの自動化合成装置および合成支援物を用いてもよい。合成は、連続的なフロー法および／またはバッチ法を用いて実施することができる。また、ＰＮＡは手動で合成してもよい。
【００３７】
〔ＰＮＡ標識〕
ＰＮＡを標識するための好ましい非限定的な方法は、米国特許第６，１１０，６７６号、第６，３６１，９４２号、第６，３５５，４２１号、第６，９６９，７６６号、および第７，０２２，８５１号、本明細書の後述の実施例に記載されている。または、そうでなければ、ＰＮＡ合成およびペプチド合成の技術分野でよく知られている。
【００３８】
〔標識〕
本発明の実施に使用されるＰＮＡプローブを標識するのに適した検出可能な部分（標識）の非限定的な例には、デキストラン抱合体、分枝核酸検出システム、発色団、蛍光団、スピンラベル、放射性同位体、酵素、ハプテン、アクリジウムエステル、および化学発光化合物が含まれる。その他の適した標識試薬および好ましい連結方法は、ＰＮＡ合成、ペプチド合成、または核酸合成の技術分野の通常の知識を有する者によって認識されうる。
【００３９】
好ましいハプテンには、５‐（６）‐カルボキシフルオレセイン、２，４‐ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、およびビオチンが含まれる。
【００４０】
好ましい蛍光色素（蛍光団）には、５‐（６）‐カルボキシフルオロセイン（Ｆｌｕ）、６‐（（７‐アミノ‐４‐メチルクマリン‐３‐アセチル）アミノ）ヘキサン酸（Ｃｏｕ）、５（および６）‐カルボキシ‐Ｘ‐ローダミン（Ｒｏｘ）、シアニン２（Ｃｙ２）ダイ、シアニン３（Ｃｙ３）ダイ、シアニン３．５（Ｃｙ３．５）ダイ、シアニン５（Ｃｙ５）ダイ、シアニン５．５（Ｃｙ５．５）ダイ、シアニン７（Ｃｙ７）ダイ、シアニン９（Ｃｙ９）ダイ（シアニンダイ２、３、３．５、５、および５．５はAmersham, Arlington Heights, ILからＮＨＳエステルとして入手可能である）、ＪＯＥ、Ｔａｍａｒａ、またはＡｌｅｘａダイシリーズ（Molecular Probes, Eugene, OR）が含まれる。
【００４１】
好ましい酵素には、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ ＰＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、シークエナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ１、およびｐｈｉ２９ポリメラーゼ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および最も好ましくは、大豆ペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）が含まれる。
【００４２】
〔非標識プローブ〕
本発明の実施に用いられるプローブは、本発明の方法（例えば、固体の支持体に結合させるとき）において、作用可能なように、検出可能な部分によって標識されている必要はない。
【００４３】
〔自己表示プローブ（self-indicating probe）〕
ビーコンプローブは、ドナー部分およびアクセプター部分を含む自己表示プローブの例である。該ドナー部分およびアクセプター部分は、該アクセプター部分が該ドナー部分から伝達されるエネルギーを受け取ったり、さもなければ、該ドナー部分からのシグナルを消失させたりするように作用する。また、上説した（適切なスペクトル特性を有する）蛍光団は、エネルギー伝達アクセプターとしても作用する。好ましくは、該アクセプター部分は、クエンチャー部分である。好ましくは、該クエンチャー部分は、非蛍光性の芳香部分または複素環部分である。好ましいクエンチャー部分は、４‐（（‐４‐（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸（ダブシル）である。好ましい実施の形態では、上記自己表示ビーコンプローブは、米国特許第６，４８５，９０１号により詳しく記載されているようなＰＮＡ直鎖ビーコンである。
【００４４】
別の実施の形態では、本発明の自己表示プローブは、国際公開公報ＷＯ９７／４５５３９に記載されているタイプにある。これらの自己表示プローブは、ビーコンプローブと比較したとき、シグナルを生成するために、レポーターが核酸と相互作用しなければならない点において主に異なる。
【００４５】
〔スペーサー部分／リンカー部分〕
一般的に、スペーサーは、かさ高い標識試薬がプローブのハイブリダイズ特性に与える不利な効果を最小限にするために使用される。本発明の核酸塩基ポリマーにとって好ましいスペーサー部分／リンカー部分は、１以上のアミノアルキルカルボン酸（例えば、アミノカプロン酸）、アミノ酸側鎖（例えば、リジンまたはオミチン（omithine）の側鎖）、天然アミノ酸（例えば、グリシン）、アミノオキシアルキル酸（例えば、８‐アミノ‐３，６‐ジオキサオクタン酸）、アルキルジ酸（例えば、コハク酸）、アルキルオキシジ酸（例えば、ジグリコール酸）、またはアルキルジアミン（例えば、１，８‐ジアミノ‐３，６‐ジオキサオクタン）からなる。
【００４６】
〔ハイブリダイゼーション条件／ストリンジェンシー〕
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを課したり、制御したりするために共通に用いられる因子には、ホルムアミド濃度（またはその他の化学変性剤）、塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨ、およびカオトロピック試薬の有無が含まれるということを、核酸ハイブリダイゼーションの技術分野の通常の知識を有する者は、認識するだろう。プローブと標的配列との組み合わせに応じた最適なストリンジェンシーは、しばしば、上記のストリンジェンシー因子のいくつかを固定し、ストリンジェンシー因子の１つだけを変化させたときの影響を調べるというよく知られた技術によって見出される。ＰＮＡのハイブリダイゼーションはイオン強度には全く依存しないことを除いては、同じストリンジェンシー因子を調整することにより、ＰＮＡの核酸に対するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御することができる。あるアッセイに対して最適なストリンジェンシーは、所望の程度の識別が達成されるまで、各ストリンジェンシー因子を試験することにより、実験的に決定することができる。
【００４７】
〔適したハイブリダイゼーション条件〕
一般的に、バックグラウンドを引き起こす核酸配列が、標的配列に密接に関連していればしているほど、より注意深くストリンジェンシーを制御しなければならない。また、ストリンジェンシー因子の最適化による識別力の改良可能な限度を越えて、識別力を改良するための手段として、ブロッキングプローブが用いられてもよい。したがって、適したハイブリダイゼーション条件には、あるアッセイによって、（該アッセイにとって望まれる許容範囲内で）正確かつ再現可能な結果が得られるような、所望の程度の識別力を達成する条件が含まれる。本発明は、ＰＮＡプローブを使用するため、ＤＮＡプローブを用いた従来の方法よりも、著しく優れている。ＰＮＡの利点の１つは、ＰＮＡは、ＤＮＡプローブには好ましくない、または不安定な条件でハイブリダイズすることである。そのような条件としては、例えば、低イオン強度（低塩）条件、および高濃度の低級アルコール（すなわち、５０％エタノール）条件が挙げられる。
【００４８】
単なる日常的な実験と本明細書の開示内容の助けがあれば、当技術分野の知識を有する者は、本明細書に記載した方法および組成物を用いたアッセイを実施するのに適したハイブリダイゼーション条件を、容易に決定することができるであろう。適切なインサイチューハイブリダイゼーション条件またはＰＣＲ条件は、インサイチューハイブリダイゼーションまたはＰＣＲの手順を実施するために適した条件を含む。したがって、適切なインサイチューハイブリダイゼーション条件またはＰＣＲ条件は、本明細書の開示内容を用いれば、付加的に日常的な実験を行うにしろ、行わないにしろ、当技術分野の知識を有する者には明らかであるだろう。
【００４９】
〔ブロッキングプローブ（blocking probe）〕
ブロッキングプローブは、プローブするポリマーのプローブする核酸塩基配列が非標的配列に結合することを抑制するために用いることが可能な核酸プローブまたは非核酸プローブである。好ましいブロッキングプローブは、ＰＮＡプローブである（米国特許第６，１１０，６７６号を参照）。ブロッキングプローブは、プローブする核酸塩基配列と非標的配列との間のハイブリダイゼーションによって形成されるというより、非標的配列とハイブリダイズし、より熱力学的に安定な複合体を形成することにより、作用すると考えられている。より安定で好ましい複合体を形成することは、プローブする核酸塩基配列と非標的配列との間でより不安定で好ましくない複合体が形成されることを阻害する。したがって、存在して、該アッセイの能力を妨げる非標的配列に、該プローブが結合することを抑制するために、ブロッキングプローブを、本発明の方法、キット、および組成物に用いることができる。ブロッキングプローブは、特に、系統学的に近縁の種の識別に有利である。
【００５０】
〔プローブする核酸塩基配列（probing nucleobase sequence）〕
本発明のプローブのプローブする核酸塩基配列は、該構成物の特異的な配列認識部分である。したがって、プローブする核酸塩基配列は、特定の標的配列にハイブリダイズするように設計された核酸塩基配列である。該プローブする核酸塩基配列によれば、標的配列の存在の有無または量を用いて、試料中の関心のある生物の存在の有無または数を直接または間接的に検出することができる。結果的に、該プローブのプローブする核酸塩基配列の長さおよび配列組成は、一般的に、選択するアッセイの形態において、プローブに要求されることを十分に考えて、例えば、適切なハイブリダイゼーション条件で、標的配列と安定な複合体を形成するように、選択される。
【００５１】
エシェリキア・コリの検出、同定、および／または計数に適した、本発明のプローブの好ましいプローブする核酸塩基配列は、ACA-CAC-ACT-GAT-TCA（配列番号１）という核酸塩基配列およびその相補体を含む。
【００５２】
ストレプトコッカス・アガラクチエの検出、同定、および／または計数に適した、本発明のプローブの好ましいプローブする核酸塩基配列は、ACA-CCA-AAC-CTC-AGC（配列番号４）およびACA-CCA-AAC-ATC-AGC（配列番号５）という核酸塩基配列、ならびにそれらの相補体を含む。配列番号４および配列番号５に基づいて設計されたプローブは、たった１塩基対の違いで、ストレプトコッカス・アガラクチエの自然発生的な変異体を検出するために用いられる(Kempf ら 2003)。
【００５３】
クレブシエラ・ニューモニエの検出、同定、および／または計数に適した、本発明のプローブの好ましいプローブする核酸塩基配列は、CAC-CTA-CAC-ACC-AGC（配列番号２）という核酸塩基配列およびその相補体を含む。クレブシエラ・オキシトカの検出、同定、および／または計数に適した、本発明のプローブの好ましいプローブする核酸塩基配列は、CAC-TTA-CCA-TCA-GCG（配列番号３）という核酸塩基配列およびその相補体を含む。
【００５４】
フンギの検出、同定、および／または計数に適した、本発明のプローブの好ましいプローブする核酸塩基配列は、CCC-TAG-TCG-GCA-TAG（配列番号６）およびCCA-AGA-GAT-CCG-TTG（配列番号７）という核酸塩基配列、ならびにそれらの相補体を含む。配列番号６および配列番号７は、それぞれ、１８Ｓ ｒＲＮＡ配列および５．８Ｓ ｒＲＮＡ配列に対応する真菌（pan-fungal）プローブにあたる。これらの真菌（pan-fungal）プローブは、配列アライメントによって広範囲の真菌ファミリーを検出できるものと予測される。該真菌（pan-fungal）プローブは、子嚢菌および担子菌の門のフンギを特に広くカバーすることができると予測される。
【００５５】
アシネトバクター属の検出、同定、および／または計数に適した、本発明のプローブの好ましいプローブする核酸塩基配列は、CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C（配列番号８）およびGCT-CAC-CAG-TAT-CG（配列番号９）という核酸塩基配列、ならびにそれらの相補体を含む。
【００５６】
本発明は、これら同定されたプローブする核酸塩基配列の変形は、微生物の解析に適したプローブを提供することが期待される。本明細書に記載のパラメーターの範囲内にある、プローブする核酸塩基配列の変形は、本発明の実施の形態であると考えられる。
【００５７】
一般的な変形には、欠失、挿入、およびフレームシフトが含まれる。
【００５８】
さらに、より短いプローブする核酸塩基配列は、上記同定された配列を切断することによって生じさせることができる。
【００５９】
本発明のプローブは、一般的に、標的配列にまさしく相補的であるプローブする核酸塩基配列を有する。プローブと標的配列との間に１以上の部位変異（塩基ミスマッチ）が存在するプローブを用いた場合、より大きな配列識別力が得られることを実証したので、別の形態として、実質的に相補的なプローブする核酸塩基配列を用いてもよい（Guo ら., Nature Biotechnology 15: 331-335 (1997)を参照）。結果的に、プローブする核酸塩基配列は、上記同定されたプローブする核酸塩基配列とわずか９０％のホモロジーしかなくてもよい。上記のパラメーターの範囲に入る実質的に相補的なプローブする核酸塩基配列は、本発明の実施の形態と認められる。
【００６０】
検出される標的配列が増幅または複製されると、同定された標的配列の相補体を生じるため、上記プローブする核酸塩基配列の相補体は、本発明の実施の形態と認められる。
【００６１】
〔検出、同定、および／または計数〕
検出とは、試料中に存在していてもよい生物の存在の有無を解析することを意味する。また、同定とは、属名および種名による該生物の認識を成し遂げることを意味する。定量とは、試料中の生物を計数することを意味する。あるアッセイの形態では、検出、同定および計数を同時に行う（例えば、Stender, H. ら., J. Microbiol. Methods. 45:31-39 (2001)を参照）。別のアッセイの形態では、検出と同定とを行う（例えば、Stender, H. ら., Int. J. Tuberc. Lung Dis. 3:830-837 (1999)を参照）。さらに別のアッセイの形態では、同定のみを行う（例えば、Oliveira, K ら. J. Clin. Microbiol. 40:247-251 (2002)を参照）。
【００６２】
〔抗生物質に対する耐性〕
抗生物質に対する耐性を決定するとは、耐性に関与する特定の遺伝子または変異に基づいて、抗生物質に対する生物の感受性を解析すること、または抗菌物質に対する感受性を解析することを意味する。
【００６３】
＜ＩＩ．本発明の好ましい実施の形態＞
（ａ）ＰＮＡプローブ
一実施の形態において、本発明のＰＮＡプローブは、微生物を検出、同定および／または定量するために適している。上記解析に適したＰＮＡプローブの一般的な特徴（例えば、長さ、標識、核酸塩基配列、およびリンカー等）は、本明細書に記載されている。本発明のＰＮＡの好ましいプローブする核酸塩基配列は、表１に一覧されている。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
本発明のＰＮＡプローブは、（本明細書で既に説明したように、）プローブする核酸塩基配列をたった１つだけ含んでいてもよいし、多くの付加的な部分を含んでいてもよい。付加的な部分の非限定的な例には、検出可能な部分（標識）、リンカー、スペーサー、天然もしくは非天然のアミノ酸、またはＰＮＡ、ＤＮＡもしくはＲＮＡのその他のサブユニットが含まれる。付加的な部分は、あるアッセイにおいて機能するものであってもよいし、機能しないものであってもよい。しかし、一般的に、付加的な部分は、ＰＮＡプローブを用いるアッセイ系の設計の段階で、機能するように選択される。本発明の好ましいＰＮＡプローブは、蛍光団、酵素、およびハプテンからなる群より選択される１以上の検出可能な部分により標識される。
【００６６】
好ましい実施の形態では、本発明のプローブは、インサイチューハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイおよび蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイに用いられる。バックグラウンドシグナルを越えて、特異的に結合するプローブの検出可能な部分を検出できるように、ＩＳＨアッセイまたはＦＩＳＨアッセイにおいて用いられる過剰なプローブは除去される。なお、上記バックグラウンドシグナルは、存在はするがハイブリダイズはしていないプローブによって生じる。一般的に、過剰なプローブは、試料を一定時間インキュベートした後、洗い流される。しかし、過剰な自己表示プローブは、完全には、試料から除去（洗浄）する必要がなく、また、検出可能なバックグランドが全くもしくはほとんど生じないので、本発明の実施の形態では、自己表示プローブを用いることが好ましい。
【００６７】
ＩＳＨアッセイまたはＦＩＳＨアッセイに加えて、本明細書に記載の選択されたプローブする核酸塩基配列を含む自己表示プローブは、特に、リアルタイムＰＣＲと同等のあらゆる種類のアッセイに有効である。また、自己表示装置（例えば、側面フローアッセイ（lateral flow assay）や自己表示アレイにも有効である。
【００６８】
（ｂ）ＰＮＡプローブセット
本発明のプローブセットは、２以上のＰＮＡプローブを含む。一実施の形態では、プローブセット中のいくつかのＰＮＡプローブは、ブロッキングプローブであってもよい。プローブセットにおいて、本発明の１以上のプローブは、いかなるグループのプローブであってもよい。また、標識プローブまたは未標識プローブのいずれを含んでいてもよい。また、本明細書に具体的には記載されていないプローブを含んでいてもよい。しかし、上記プローブセットは、本発明のプローブを少なくとも１つは含む。好ましいプローブセットには、クレブシエラ属を検出するためのCAC-CTA-CAC-ACC-AGC（配列番号２）およびCAC-TTA-CCA-TCA-GCG（配列番号３）；ストレプトコッカス・アガラクチエバリアントを検出するためのACA-CCA-AAC-CTC-AGC（配列番号４）およびACA-CCA- AAC-ATC-AGC（配列番号５）；フンギを検出するためのCCC-TAG-TCG-GCA-TAG（配列番号６）およびCCA-AGA-GAT-CCG-TTG（配列番号７）；アシネトバクター属を検出するためのCCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C（配列番号８）およびGCT-CAC-CAG-TAT-CG（配列番号９）が含まれる。
【００６９】
（ｃ）方法
別の実施の形態において、本発明は、試料中に含まれていてもよい微生物を解析するのに適した方法を対象としている。微生物の解析に適したＰＮＡプローブの一般的で特有の特徴は、本明細書で既に説明した。好ましいプローブする核酸塩基配列を表１に一覧している。
【００７０】
本発明の試料中の微生物を解析するための方法は、特定の標的配列にハイブリダイズするのに適した１以上のＰＮＡプローブを、試料と接触させることを含む。
【００７１】
上記方法によれば、その後、試料中の微生物を検出、同定、および／または定量したり、微生物の抗生物質に対する抵抗性を決定したりすることができる。これは、適切なハイブリダイゼーション条件下で、ＰＮＡプローブのプローブする核酸塩基配列が検出対象である微生物の標的配列にハイブリダイズすることを、試料中の該微生物の存在の有無または数と相関付けることにより実現できる。一般的に、この相関付けは、プローブ／標的配列のハイブリッドを直接的または間接的に検出することによって実現できる。
【００７２】
〔蛍光インサイチューハイブリダイゼーションおよびリアルタイムＰＣＲ〕
本発明のＰＮＡプローブ、方法、キット、および組成物は、特に、微生物をプローブを用いて迅速に解析することに有効である。好ましい実施の形態では、インサイチューハイブリダイゼーションまたはＰＣＲは、微生物を解析するためのアッセイ形態として用いられる。最も好ましいアッセイ形態は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＰＮＡ ＦＩＳＨ）またはリアルタイムＰＣＲである（Stender ら. J. Microbiol. Methods 48:1-17 (2002)によって総説）。ＰＮＡ ＦＩＳＨ解析のための顕微鏡用塗布標本は、ハイブリダイゼーションに先立ち、架橋剤または酵素で処理されていないことが好ましい。
【００７３】
〔代表的なアッセイ形態〕
ＰＮＡ ＦＩＳＨを実施するための代表的な方法は、Oliveira et., J. Clin. Microbiol 40:247-251 (2002)；Rigby ら., J. Clin. Microbiol. 40:2182-2186 (2002)；Stender ら., J. Clin. Microbiol. 37:2760-2765 (1999)；Perry- O'Keefe ら., J. Microbiol. Methods 47:281-292 (2001)に見出すことができる。ある方法によれば、試料の顕微鏡用塗布標本（例えば、陽性の血液培養液、ただしこれに限定されない）は、顕微鏡のスライドガラス上で調製され、ハイブリダイゼーション緩衝液に溶解したフルオレセイン標識のＰＮＡプローブの１滴で覆われる。該顕微鏡用塗布標本上に、カバーガラスをのせ、確実に、均等に覆う。続いて、該スライドガラスを、スライドウォーマーまたはインキュベーター上で、５５℃で９０分間置いておく。ハイブリダイゼーション後、該スライドガラスを、予め温めておいたストリンジェントな洗浄溶液にスライドガラスを沈めることにより、上記カバーガラスを除去する。そして、該スライドガラスを３０分間洗浄する。最後に、該顕微鏡用塗布標本を、１滴のマウント液を用いてマウントし、カバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡で検査する。
【００７４】
本発明のキットに含まれるＰＮＡプローブを用いて解析される試料中に存在していてもよい微生物は、いくつかの器具によって決定される。上記器具としては、例えば、顕微鏡（例えば、Oliveira ら., J. Clin. Microbiol 40:247-251 (2002)を参照）、フィルム（例えば、Perry-O'Keefe ら., J. Appl. Microbiol. 90:180-189 (2001)を参照）、カメラおよびインスタントフィルム（例えば、Stender ら., J. Microbiol. Methods 42:245-253 (2000)を参照）、ルミノメーター（例えば、Stender ら., J. Microbiol. Methods. 46:69-75 (2001)を参照）、レーザースキャン装置（例えば、Stender ら., J. Microbiol. Methods. 45: 31-39 (2001)を参照）、またはフローサイトメーター(例えば、Wordon ら., Appl. Environ. Microbiol. 66:284-289 (2000)を参照)を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。自動スライドスキャナーおよびフローサイトメーターは、関心のある試料に存在する微生物の数を迅速に定量する上で、特に有効である。
【００７５】
自己報告ＰＮＡプローブを用いたリアルタイムＰＣＲを実施するための代表的な方法は、Fiandaca ら., 要約, Nucleic Acid-Based technologies. DNA/RNA/PNA Diagnostics, Washington, DC, May 14-16, 2001、およびPerry-O'Keefe ら ., 要約, International Conference on Emerging Infectious Diseases, Atlanta, 2002に見出すことができる。
【００７６】
（ｄ）キット
さらに別の実施の形態において、本発明は、試料中に存在していてもよい微生物を解析するアッセイを実施するのに適したキットを対象としている。微生物の解析に適したＰＮＡプローブの一般的で好ましい特徴は、本明細書に既に記載されている。好ましいプローブする核酸塩基配列は、表１に一覧されている。さらに、試料中の微生物を解析するためのＰＮＡプローブを用いるのに適した方法は、既に明細書に記載されている。
【００７７】
本発明のキットは、１以上のＰＮＡプローブ、およびその他の試薬もしくは組成物を含む。それらは、試料中の微生物を解析するために用いられるアッセイを実施するため、さもなければ、アッセイの実施を容易にするように、選択される。
【００７８】
上記キットは、例えば、インサイチューアッセイや、核酸増幅技術を用いた用途に用いられる。核酸増幅技術の非限定的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、標準置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）、Ｑ‐βレプリカーゼ、および、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が含まれるが、これらに限定されない。したがって、いくつかの実施の形態では、その他の試薬は、インサイチューアッセイまたは核酸増幅に基づくアッセイを実施するための緩衝液、酵素、および／またはマスターミックスが含まれうる。
【００７９】
（ｅ）本発明を用いる代表的な用途
本発明のＰＮＡプローブ、方法、およびキットは、食品、飲料、水、医薬品、パーソナルケア用品、乳製品、または環境試料、ならびにそれらの培養液の中の微生物の解析だけではなく、臨床試料（例えば、尿、血液、傷、唾液、咽喉診察用の綿棒、胃洗浄液、気管支洗浄液、生体組織、呼気、および痰）中の微生物の解析に、特に有効である。
【００８０】
〔付加的な検出方法〕
フルオレセインおよびＴａｍｒａによって標識したプローブについて説明したが、感知可能な第３の色を生成する蛍光標識のあらゆる組み合わせを用いることは、本発明の範疇に含まれる。同様に、複数の感知可能な色を生成する２以上の標識を用いることもまた、想像される。潜在的に蛍光性を有する標識は、本明細書に記載されている。２以上の蛍光部分の同時発生的な蛍光は、色のスペクトルを生成させる上で、有効であることが実証されている（Kool ら JACS 2003）。色の組み合わせは、２以上の蛍光団を混合し、それらの割合を調整することにより実現される。例えば、２つの赤色部分と、１つの緑色部分とを組み合わせると、１つの赤色部分と、２つの緑色部分との組み合わせによる色とは異なる色を生成することができる。これらの様々な色合いの目による正確な感知は、現実的には限界があるが、そのような微妙な色の変化を正確に感知する装置を考えることは困難ではない。
【００８１】
〔検出可能な部分および独立して検出可能な部分／多重解析〕
多重ハイブリダイゼーションアッセイは、本発明によれば実施することができる。多重アッセイでは、関心のある多くの条件が、同時に試験される。多重解析は、アッセイ中またはアッセイ完了後に、試料成分を分類する能力、またはそれに関連するデータに依存する。本発明の好ましい実施の形態では、１以上の全く独立して検出可能な部分を用いて、あるアッセイに用いられる２以上の異なるプローブが標識されうる。独立して検出可能な各部分を区別および／または定量する能力は、ハイブリダイゼーションアッセイを多重化するための手段を提供する。全く別々に（独立して）標識された各プローブのハイブリダイゼーションを、特定の核酸配列と関連付けることは、該試料中で検出しようとする各生物の存在の有無、または量の指標となる。
【００８２】
結果的に、本発明の多重解析は、同一のアッセイの中で、同一試料中の２以上の異なる生物（例えば、クレブシエラの各種）の存在の有無、または量を同時に検出するために用いることができる。例えば、多重アッセイは、独立して検出可能な蛍光団または独立して検出可能な蛍光団セットを用いて標識された、２以上の各ＰＮＡプローブを用いてもよい。
【００８３】
したがって、本発明は、一実施の形態として、患者を治療する方法を提供する。該方法は、以下の（ａ）〜（ｃ）の工程のうち、少なくとも１工程、好ましくは全工程を含む。
（ａ）患者から生物試料を取得する工程
（ｂ）微生物の存在を決定、微生物の量を決定、および／または微生物を同定する工程、ならびに、
（ｃ）感染症を排除するために、活性を有する抗生物質を、少なくとも１種投与する工程。
【００８４】
さらに、本発明は、本明細書に記載した、少なくとも１つ、好ましくは２以上のＰＮＡプローブを含むＰＮＡプローブセットを提供する。上記プローブセットには、同時蛍光によって第３の色を生成するプローブが含まれることが好ましい。
【００８５】
本発明の好ましい実施の形態について説明したが、本明細書で説明した概念を取り込んだその他の実施の形態を用いうることは、当技術分野の技能を有するものには、明らかであるだろう。したがって、これらの実施の形態は、開示した実施の形態に限定されるものではなく、むしろ、特許請求の範囲の精神および範囲によってのみ限定されるべきものである。
【００８６】
〔実施例〕
本発明について、以下の実施例に基づいて説明するが、本発明を決して限定するものではない。
【００８７】
〔実施例１〕
＜ＰＮＡプローブ配列＞
Ｋｐｎ２３Ｓ０１‐Ｆｌｕ  FIu-OO-CACCTACACACCAGC-NH2（配列番号２）
Ｋｏｘ２３Ｓ０１‐Ｔａｍ  Tam-OO-CACTTACCATCAGCG-NH2（配列番号３）
（注釈：上記ＰＮＡプローブの末端の説明に用いられる汎用の専門用語に関し、Ｏは８‐アミノ‐３，６‐ジオキサオクタン酸、ｆｌｕは５（６）‐カルボキシ‐フルオレセイン、ｔａｍは５（６）‐カルボキシテトラメチローダミンである。）
【００８８】
＜細菌株＞
クレブシエラ・ニューモニエおよび クレブシエラ・オキシトカ種を含む様々な典型的なグラム陰性桿菌の寄託株（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を一晩培養して準備した。
【００８９】
＜顕微鏡用塗布標本の作製＞
各菌株について、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ１００を含むリン酸緩衝生理的食塩水１滴と、培養液１滴とを混合することによって、テフロン（登録商標）でコーティングされた顕微鏡スライドガラス（AdvanDx, Woburn, MA）の直径８ｍｍのウェル上に、顕微鏡用塗布標本を作製した。その後、該スライドガラスを５５℃のスライドウォーマー上に、２０分間置いて、上記顕微鏡用塗布標本を乾燥させた。続いて、該顕微鏡用塗布標本を、９６％（ｖ／ｖ）エタノールに５分間〜１０分間浸すことにより殺菌し、風乾させた。
【００９０】
＜蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）＞
顕微鏡用塗布標本を、１０％（ｗ／ｖ）硫酸デキストラン、１０ｍＭ ＮａＣｌ、３０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム、０．２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．２％（ｗ／ｖ）フィコール、５ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ‐１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ならびに５００ｎＭ Ｋｐｎ２３Ｓ０１‐Ｆｌｕプローブおよび５００ｎＭ Ｋｏｘ２３Ｓ０１‐Ｔａｍプローブ（Ｆｌｕは、特徴的な緑色の蛍光を発する蛍光色素であり、Ｔａｍは、特徴的な赤色の蛍光を発する蛍光色素である）を含むハイブリダイゼーション液１滴で覆った。上記顕微鏡用塗布標本をハイブリダイゼーション液で確実に、かつ均一に覆うために、上記顕微鏡用塗布標本の上にカバーガラスを置いた。続いて、該スライドガラスをスライドウォーマー（Slidemoat, Boekel, Germany）の上に置いて、５５℃で９０分間インキュベートした。ハイブリダイゼーション後、該スライドガラスを、ウォーターバス内で、５５℃に予め温めておいた２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ１０）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ（スライドガラス１枚あたり約２０ｍｌ）に沈めることにより、上記カバーガラスを取り除き、３０分間洗浄した。最後に、マウティリング溶液（AdvanDx, Woburn, MA）を一滴用いて、各顕微鏡用塗布標本をマウントし、カバーガラスで覆った。顕微鏡試験は、ＦＩＴＣ／テキサスレッドの２波長帯フィルターセットを備える蛍光顕微鏡を用いて行った。クレブシエラ・ニューモエは、緑色の蛍光を発する桿菌として同定された。また、クレブシエラ・オキシトカは、赤色の蛍光を発する桿菌として同定された。結果を表２に示す。
【００９１】
【表２】
0005479731.tif 000003
【００９２】
表２によれば、試験した１０種のグラム陰性桿菌種のうち、たった２つの種、すなわち、緑色の蛍光を発する桿菌を含むクレブシエラ・ニューモエの試料および赤色の蛍光を発する桿菌を含むクレブシエラ・オキシトカの試料でしか、ポジティブな結果は得られなかった。このポジティブな結果は、試験したプローブ混合物は、クレブシエラ・ニューモニエの緑色およびクレブシエラ・オキシトカの赤色というそれぞれの種に特異的なシグナルを生成することを示している。
【００９３】
〔実施例２〕
＜ＰＮＡプローブ配列＞
Ｓａｇａ１６Ｓ０３‐Ｆｌｕ  Flu-OO-ACACCAAACCTCAGC（配列番号４）
Ｓａｇａ１６Ｓ０４‐Ｆｌｕ  Flu-OO-ACACCAAACATCAGC（配列番号５）
（注釈：上記ＰＮＡプローブの末端の説明に用いられる汎用の専門用語に関し、Ｏは８‐アミノ‐３，６‐ジオキサオクタン酸、ｆｌｕは、５（６）‐カルボキシ‐フルオレセインである。）
【００９４】
＜細菌株＞
ストレプトコッカス・アガラクチエを含む様々な典型的なグラム陽性球菌の寄託株（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を一晩培養して準備した。
【００９５】
＜顕微鏡用塗布標本の作製＞
顕微鏡用塗布標本は、実施例１で説明した通りに作製した。
【００９６】
＜蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）＞
ハイブリダイゼーションは、プローブに、５００ｎＭ Ｓａｇａ１６Ｓ０３‐Ｆｌｕ、５００ｎＭ Ｓａｇａ１６Ｓ０４‐Ｆｌｕ、もしくは５００ｎＭ Ｓａｇａ１６Ｓ０３‐Ｆｌｕおよび５００ｎＭ Ｓａｇａ１６Ｓ０４‐Ｆｌｕの組み合わせ（”デュアルプローブ”）のいずれかを用いたことを除いて、実施例１で説明した通りに行った。顕微鏡試験は、ＦＩＴＣ／テキサスレッドの２波長帯フィルターセットを備える蛍光顕微鏡を用いて行った。ストレプトコッカス・アガラクチエは、緑色の蛍光を発する球菌として同定された。結果を表３に示す。
【００９７】
【表３】
0005479731.tif 000004
【００９８】
表３によれば、ポジティブな結果は、ストレプトコッカス・アガラクチエを検出するために、Ｓａｇａ１６Ｓ０３プローブ、またはデュアルプローブセットのいずれかを用いた時に見られた。その他の結果は全て、ネガティブであった。このことは、上記プローブおよびプローブセットは、特異的であることを示している。
【００９９】
〔実施例３〕
＜ＰＮＡプローブ配列＞
ＰＦ‐Ａｄｘ１  Flu-OO-CCCTAGTCGGCATAG（配列番号６）
ＰＦ‐Ａｄｘ２  Flu-OO-CCAAGAGATCCGTTG（配列番号７）
（注釈：上記ＰＮＡプローブの末端の説明に用いられる汎用の専門用語に関し、Ｏは８‐アミノ‐３，６‐ジオキサオクタン酸、ｆｌｕは、５（６）‐カルボキシ‐フルオレセインである。）
【０１００】
＜細菌株および菌類株＞
ストレプトコッカス・アガラクチエを含む様々な典型的なグラム陽性球菌の寄託株（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を一晩培養して準備した。
【０１０１】
＜顕微鏡用塗布標本の作製＞
顕微鏡用塗布標本は、実施例１で説明した通りに作製した。
【０１０２】
＜蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）＞
ハイブリダイゼーションは、プローブに、５００ｎＭ ＰＦ‐Ａｄｘ１、または５００ｎＭ ＰＦ‐Ａｄｘ２のいずれかを用いたことを除いて、実施例１で説明した通りに行った。顕微鏡試験は、ＦＩＴＣ／テキサスレッドの２波長帯フィルターセットを備える蛍光顕微鏡を用いて行った。フンギは、緑色の蛍光を発する球菌または菌糸として同定された。結果を表４に示す。
【０１０３】
【表４】
0005479731.tif 000005
【０１０４】
表４によれば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・カテヌラタ（Candida catenulata）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含め、ＰＦ‐Ａｄｘ１プローブを用いて試験した菌類生物の全てがポジティブであった。試験した細菌種（S. アウレウス（S.aureus）およびエシェリキア・コリ）は、ともにネガティブであった。ＰＦ‐Ａｄｘ２プローブは、カンジダグラブラタがネガティブであったことを除いて、ＰＦ‐Ａｄｘ１の結果と類似するパターンを示した。公開されているカンジダ・グラブラタの５．８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列アライメントにより、上記ネガティブな結果の有力な原因となりうる、上記遺伝子における１塩基のミスマッチが存在することが分かった。
【０１０５】
〔実施例４〕
＜ＰＮＡプローブ配列＞
Ｅｃｏ２３Ｓ２７７‐Ｆｌｕ      Flu-OO-ACA-CAC-ACT-GAT-TCA（配列番号１）
Ａｂａｕ２３Ｓ‐０３ｂ‐Ｆｌｕ  Flu-OO-CCT-CTC-ATC-GCA-TTA-C（配列番号８）
Ａｂａｕ１６Ｓ‐０４ｃ‐Ｆｌｕ  Flu-OO-GCT-CAC-CAG-TAT-CG（配列番号９）
（注釈：上記ＰＮＡプローブの末端の説明に用いられる汎用の専門用語に関し、Ｏは８‐アミノ‐３，６‐ジオキサオクタン酸、ｆｌｕは、５（６）‐カルボキシ‐フルオレセインである。）
【０１０６】
＜細菌株＞
様々なグラム陰性桿菌（細菌）全ての様々な典型的な細菌種の寄託株（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を一晩培養して準備した。
【０１０７】
＜顕微鏡用塗布標本の作製＞
顕微鏡用塗布標本は、実施例１で説明した通りに作製した。
【０１０８】
＜蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）＞
ハイブリダイゼーションは、プローブに、５００ｎＭ Ｅｃｏ２３Ｓ２７７‐Ｆｌｕ、２００ｎＭ Ａｂａｕ２３Ｓ‐０３ｂ‐Ｆｌｕまたは２００ｎＭ Ａｂａｕ１６Ｓ‐０４ｃ‐Ｆｌｕのいずれかを用いたことを除いて、実施例１で説明した通りに行った。顕微鏡試験は、ＦＩＴＣ／テキサスレッドの２波長帯フィルターセットを備える蛍光顕微鏡を用いて行った。緑色の蛍光を発する桿菌（rods）（桿菌（bacilli））をポジティブとして同定した。結果を表４に示す。
【０１０９】
【表５】
0005479731.tif 000006
【０１１０】
表４によれば、ポジティブな結果は、エシェリキア・コリの分離菌に対してＥｃｏ２３Ｓ２７７‐Ｆｌｕプローブを試験したとき、およびアシネトバクター属に対してＡｂａｕ２３Ｓ‐０３ｂ‐ＦｌｕおよびＡｂｕ２３Ｓ‐０３ｂを試験したときに得られた。それ以外の結果は全て、ネガティブであった。このことは、プローブおよびプローブセットは特異的であることを示している。
【０１１１】
＜同等物（Equivalents）＞
本発明を具体的に示し、好ましい実施の形態を参照しながら説明したが、特許請求の範囲に定義したように、当技術分野の通常の技能を有する者であれば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、様々な変形例を理解し、改変することができるであろう。当技術分野において通常の技能を有する者は、僅かな日常的な実験を用いて、本明細書に記載した本発明の特定の実施の形態と同等の多くの実施の形態を確認することができる。各請求項の範囲は、このような同等物を含有することを意図するものである。
【０１１２】
本明細書で述べた全ての参考文献の開示内容は、参照によって援用される。
【配列表】
0005479731000001.app