(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の分析方法であって、
前記試料を、前記標的核酸にハイブリダイズすることが可能なプライマー又はプローブと、標識とに接触させて、前記試料中の前記標的核酸の分析を行い、
前記プライマー又はプローブは、固相に固定されており、かつ、
前記プライマー又はプローブは、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）または（１８ｂ）で表される構造を少なくとも一つ含む核酸分子であり、
前記標識は、前記プライマー又はプローブの一部として前記プライマー又はプローブに共有結合しており、かつ、
前記標識は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、前記プライマー又はプローブが前記標的核酸とハイブリダイズしない場合は前記標識が消光し、前記プライマー又はプローブが前記標的核酸とハイブリダイズした場合は前記標識が発光し、
前記プライマー又はプローブと標的核酸とのハイブリダイズによる前記標識の発光の検出により分析を行い、
前記プライマー又はプローブにハイブリダイズした前記標的核酸を洗浄により除去し、前記プライマー又はプローブに、再度、標的核酸をハイブリダイズさせ、再度、前記標識の発光の検出により分析を行う
ことを特徴とする分析方法。
【化１６】
0005598784.tif 000092
【化１６ｂ】
0005598784.tif 000093
【化１７】
0005598784.tif 000094
【化１７ｂ】
0005598784.tif 000095
【化１８】
0005598784.tif 000096
【化１８ｂ】
0005598784.tif 000097
前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ii）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、前記エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１６）および（１６ｂ）中、Ｌ１およびＬ２は前記リンカーであり、Ｌ３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ１およびＬ２がＢに直接結合していてもよく、
ただし、
前記式（１６）、（１７）および（１８）中、Ｅは、前記（ｉ）の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのＯ原子がＳ原子で置換されていても良く、
前記式（１６ｂ）、（１７ｂ）および（１８ｂ）中、Ｅは、前記（ii）の原子団であり、
前記式（１７）および（１７ｂ）中、各Ｂは、同一でも異なっていても良く、各Ｅは、同一でも異なっていても良い。
【請求項２】
前記標的核酸が複数種類であり、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ検出する請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記プライマー又はプローブが、複数種類である請求項１または２記載の分析方法。
【請求項４】
前記プライマー又はプローブが固定された前記固相の表面が、平面、チップ平面、球体表面または立体表面である請求項１から３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
前記固相の表面が、バックグラウンドを軽減するコーティングがされた表面である請求項１から４のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項６】
前記バックグラウンドを軽減するコーティングが、グラフト重合処理によるコーティングである請求項５記載の分析方法。
【請求項７】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）が、それぞれ２以上の整数である、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項８】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素、ビオチンまたはそれらの誘導体から誘導される基である、請求項１から７のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項９】
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、下記式（７）から（９）のいずれかで表される原子団である、請求項１から８のいずれか一項に記載の分析方法。
【化７】
0005598784.tif 000098
【化８】
0005598784.tif 000099
【化９】
0005598784.tif 000100
式（７）〜（９）中、
Ｘ１およびＸ２は、Ｓ、ＯまたはＳｅであり、
ｎ’’は、０または正の整数であり、
Ｒ１〜Ｒ１０、Ｒ１３〜Ｒ２１は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）および（１７ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
Ｒ１５は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｒ１６は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｚ１１中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１と、Ｚ１２中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
【請求項１０】
前記式（７）〜（９）中、
Ｒ１〜Ｒ２１において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基である、請求項９記載の分析方法。
【請求項１１】
前記式（７）〜（９）中、
Ｒ１１およびＲ１２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）および（１７ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する、請求項９または１０記載の分析方法。
【請求項１２】
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（７）または（８）で表される原子団であり、
前記式（７）または（８）で表されるＺ１１およびＺ１２が、下記式（１９）または（２０）で示される基である請求項９から１１のいずれか一項に記載の分析方法。
【化１９】
0005598784.tif 000101
【化２０】
0005598784.tif 000102
式（１９）および（２０）中、
Ｘ１、Ｒ１からＲ１０、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１１ならびにＲ１２は、式（７）〜（９）と同じである。
【請求項１３】
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（１９）で表される原子団であり、
前記式（１９）中、
Ｘ１は、Ｓであり、
Ｒ１からＲ１０は、水素原子であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）および（１７ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、他方は、メチル基である、請求項１２記載の分析方法。
【請求項１４】
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（１９）で表される原子団であり、
前記式（１９）中、
Ｘ１は、Ｓであり、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９およびＲ１０は、水素原子であり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ１２は、メチル基であり、
Ｒ８は、ハロゲン原子であり、
Ｒ１１は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基である、請求項１２記載の分析方法。
【請求項１５】
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（７）で表される原子団であり、
前記式（７）中、
Ｘ１は、Ｓであり、
ｎは、１であり、
Ｒ１からＲ１０、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１７は、水素原子であり、
Ｒ１１は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、
Ｒ１２は、メチル基である、請求項９記載の分析方法。
【請求項１６】
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、下記の各化学式のいずれかで表される原子団である、請求項９記載の分析方法。
【化１Ｚ】
0005598784.tif 000103
【化２Ｚ】
0005598784.tif 000104
【化３Ｚ】
0005598784.tif 000105
【化４Ｚ】
0005598784.tif 000106
【化５Ｚ】
0005598784.tif 000107
【化６Ｚ】
0005598784.tif 000108
上記各化学式中、
ｎは、正の整数である。
【請求項１７】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂが、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格を有する原子団である請求項１から１６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１８】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂが、人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、前記人工核酸塩基が、2-アミノ-6-(N,N-ジメチルアミノ)プリン  ピリジン-2-オン、5-メチルピリジン-2-オン、2-アミノ-6-(2-チエニル)プリン、ピロール-2-カルボアルデヒド、9-メチルイミダゾ[(4,5)-b]ピリジン、5-ヨード-2-オキソ(1H)ピリジン  2-オキソ-(1H)ピリジン、2-アミノ-6-(2-チアゾリル)プリン、7-(2-チエニル)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン、ブロモチミン、アザアデニンまたはアザグアニンである請求項１から１６のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項１９】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂが、人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、前記人工核酸塩基が、Py、Py  der.、Pu、またはPu  der.である請求項１から１６のいずれか一項に記載の分析方法。
前記Pyとは、下記式（１１）で表記される6員環のうち、1位にＥと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py  der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式（１２）で表記される縮合環のうち、9位にＥと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu  der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
【化１１−１２】
0005598784.tif 000109
【請求項２０】
前記式（１６）で表される構造が、下記式（１６−１）または（１６−２）で表される構造であり、
前記式（１６ｂ）で表される構造が、下記式（１６ｂ−１）または（１６ｂ−２）で表される構造であり、
前記式（１７）で表される構造が、下記式（１７−１）で表される構造であり、
前記式（１７ｂ）で表される構造が、下記式（１７ｂ−１）で表される構造であり、
前記式（１８）で表される構造が、下記式（１８−１）で表される構造であり、
前記式（１８ｂ）で表される構造が、下記式（１８ｂ−１）で表される構造である、
請求項１から１９のいずれか一項に記載の分析方法。
【化１６−１】
0005598784.tif 000110
【化１６−２】
0005598784.tif 000111
【化１６ｂ−１】
0005598784.tif 000112
【化１６ｂ−２】
0005598784.tif 000113
【化１７−１】
0005598784.tif 000114
【化１７ｂ−１】
0005598784.tif 000115
【化１８−１】
0005598784.tif 000116
【化１８ｂ−１】
0005598784.tif 000117
前記式（１６−１）、（１６−２）、（１６ｂ−１）、（１６ｂ−２）、（１７−１）、（１７ｂ−１）、（１８−１）および（１８ｂ−１）中、
ｌ、ｍおよびｎ’は任意であり、同一でも異なっていても良く、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、
Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２およびｂは、前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）と同じであり、
前記式（１６−１）、（１６−２）、（１７−１）および（１８−１）において、リン酸架橋中のＯ原子は、１つ以上がＳ原子で置換されていてもよい。
【請求項２１】
前記式（１６−１）、（１６−２）、（１６ｂ−１）、（１６ｂ−２）、（１７−１）、（１７ｂ−１）、（１８−１）および（１８ｂ−１）中、
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ、２以上の整数である、請求項２０記載の分析方法。
【請求項２２】
前記核酸分子が、下記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４または１１４−２で表されるヌクレオチド構造、またはそれらの幾何異性体、立体異性体もしくは塩である構造を少なくとも一つ含む核酸分子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の分析方法。
【化１０６】
0005598784.tif 000118
【化１１０】
0005598784.tif 000119
【化１１３】
0005598784.tif 000120
【化１１７】
0005598784.tif 000121
【化１２０】
0005598784.tif 000122
【化１２２】
0005598784.tif 000123
【化１２３】
0005598784.tif 000124
【化１２４】
0005598784.tif 000125
【化１１４−２】
0005598784.tif 000126
上記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４および１１４−２中、ｎは正の整数である。
【請求項２３】
前記リンカー長ｎが２〜６の範囲である、請求項１６または２２記載の分析方法。
【請求項２４】
前記プライマー又はプローブが、プライマーであり、
前記プライマーを前記試料に接触させることにより、前記プライマーを前記標的核酸にハイブリダイズさせて前記標的核酸の増幅反応を行い、
さらに、前記増幅反応における前記標的核酸の増幅度を継時的に計測することにより、前記標的核酸の分析を行う請求項１から２３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項２５】
前記標的核酸の増幅反応を、ブリッジPCR法で行う請求項２４記載の分析方法。
【請求項２６】
前記プライマーが、一対のプライマーであり、
前記一対のプライマーは、それぞれ、前記標識が共有結合していることにより、前記標識を前記プライマーの一部として含み、
前記一対のプライマーに共有結合した前記各標識は、それぞれ、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記各標識は、互いに異なり、
前記ブリッジPCR法において、蛍光を生じさせないか、又は、１色ないし３色の蛍光を生じさせて蛍光色を解析することにより、又は、前記各標識の蛍光強度に差を生じさせて前記蛍光強度差を測定することにより、前記標的核酸における複数座位の変異有無検出又は前記複数座位の発現量分析を同時に行う請求項２５記載の分析方法。
【請求項２７】
前記プライマーが、一対のプライマーであり、
前記一対のプライマーは、それぞれ、前記標識が共有結合していることにより、前記標識を前記プライマーの一部として含み、
前記一対のプライマーに共有結合した前記各標識は、それぞれ、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記各標識は、互いに異なり、
前記ブリッジPCR法において、蛍光を生じさせないか、又は、１色ないし３色の蛍光を生じさせて蛍光色を解析することにより、又は、前記各標識の蛍光強度に差を生じさせて前記蛍光強度差を測定することにより、前記標的核酸を含む試料全体における変異の割合を測定する請求項２５記載の分析方法。
【請求項２８】
前記プライマーが、一対のプライマーであり、
前記一対のプライマーは、それぞれ、前記標識が共有結合していることにより、前記標識を前記プライマーの一部として含み、
前記一対のプライマーに共有結合した前記各標識は、それぞれ、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記各標識は、互いに異なり、
前記ブリッジPCR法において、蛍光を生じさせないか、又は、１色ないし３色の蛍光を生じさせて蛍光色を解析することにより、又は、前記各標識の蛍光強度に差を生じさせて前記蛍光強度差を測定することにより、前記標的核酸を含む試料の品質を確認する請求項２５記載の分析方法。
【請求項２９】
前記標的核酸の増幅反応を、等温増幅法で行う請求項２４記載の分析方法。
【請求項３０】
前記プライマーの２点以上のスポットが、前記固相に任意の位置関係で固定されている請求項２４から２９のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項３１】
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、
さらに、前記ＲＮＡの逆転写反応を行い、
前記逆転写反応を、前記プライマーが固定された前記固相で、前記増幅反応の前または前記増幅反応と同時に行う、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項３２】
前記増幅反応を、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（逆転写ポリメラーゼ）又はＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて行う、請求項２４から３１のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項３３】
前記増幅反応後、融解曲線解析を行うことによって前記標的核酸の変異の有無を検出する請求項２４から３２のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項３４】
前記融解曲線解析を、プローブを用いて行い、
前記プローブが、エキシトン効果を示す蛍光性原子団を含む請求項２４から３３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項３５】
エキシトン効果を示す蛍光性原子団を含む前記プローブを、複数種類用いる請求項３４記載の分析方法。
【請求項３６】
前記プライマー又はプローブが、プローブである請求項１から２３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項３７】
前記試料は、あらかじめ増幅された前記標的核酸を含む請求項３６記載の分析方法。
【請求項３８】
さらに、融解曲線解析を行うことによって前記標的核酸中の変異の有無を検出する請求項３６または３７記載の分析方法。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の分析方法を行うためのキットであり、
前記キットが、前記プライマー又はプローブと、前記プライマー又はプローブに共有結合した前記標識と、前記プライマー又はプローブを固定するための支持体とを含み、
前記支持体が、前記固相を含むキット。
【請求項４０】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の分析方法を行うためのマイクロアレイであり、
前記マイクロアレイが、前記プライマー又はプローブと、前記プライマー又はプローブに共有結合した前記標識と、前記プライマー又はプローブを固定するための支持体とを含み、
前記支持体が、前記固相を含み、かつ、前記プライマー又はプローブが、前記固相に固定されているマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器に関する。
【背景技術】
【０００２】
一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）や遺伝子変異を含む遺伝子型解析は、「テーラーメイド医療」の根拠を提供する拠点ともいえ、その必要性が急速に高まっている。医薬品の副作用を低減させるために、米国食品医薬品局は新薬の申請の際に薬剤の効果に関するＳＮＰや遺伝子変異の情報の添付を義務付ける方向にあり、我が国においてもＳＮＰや遺伝子変異の解析の必要性が高まっている。【０００３】
核酸のコピー数や変異を測定する機器は、学術上、臨床上、汎用される。一つの遺伝子のコピー数や変異を見ることによって、薬の反応性や予後などが予測できるバイオマーカーが多く発見されている。たとえば、イレッサ、ハーセプチンなどが例に挙げられる。しかし、たった一つのバイオマーカーで、切れ味よく予測できる例はそれほど多くはなく、生体内は、さまざまなネットワークによって、制御されてホメオスターシスが保たれている。【０００４】
特に最近、転写因子や非タンパクコードRNA（ncRNA）がお互いに形成するBasin  Networkの概念が提唱されている（非特許文献１〜３）。細胞が形質を維持するためには、必ず限られた数の転写因子とncRNAが、セントラルドグマのあらゆるレベルで作用しあい、特に、転写レベルの調節の寄与度は大きいと考えられている。これらの特定の転写因子やncRNAの核内濃度は一定であるかもしくは振動しており、決して、核内濃度は発散しない。一度発散すると、核内の転写因子・ncRNA間で形成しているネットワークのバランスが変化して、次のネットワーク形態に変化し、細胞は分化、癌化、老化、などの次の表現形質を示すようになる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Nature  Genetics  41,  553−562  (2009)
【非特許文献２】Nature  Genetics  41,  563−571  (2009)
【非特許文献３】Nature  Genetics  41,  572−578  (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記Basin  Networkは、核内転写レベルの調節ネットワークであるが、実際は、核内ゲノムDNAのエピゲノムの状態（ヘテロクロマチン形成やDNAのメチレーションなどの修飾）、RNA干渉のようにRNAそのものの分解代謝や、RNAの翻訳レベル、さらに、直接タンパク質への結合などによるタンパク質が機能するレベルのステップにも調節が行われている。その結果として、RNAやDNAの状態をたった一つの遺伝子をみることで、これらのネットワークが、どのように機能しているのかということは推し量れないのが現状である。ガンの予後診断、下記に記す薬への反応性（ResponderとNon−responder）などの診断を行うためには、細胞の機能状態を計測、定義できる技術でなくてはならない。しかも、これらの調節状態に寄与する転写因子やncRNAなどの遺伝子は、もともと発現量が低く、生理活性を持つ発現量が低い状態での発現量の変化を検出する必要がある。さらに、実際の臨床では、外来・手術室などで簡便にはかることができ、すぐにその場で結果を出すことが要求される。【０００７】
そこで、本発明は、迅速かつ簡便に標的核酸の分析を行うことが可能な、標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明の分析方法は、
試料中の標的核酸の分析方法であって、
前記試料を、前記標的核酸にハイブリダイズすることが可能なプライマー又はプローブと、標識とに接触させて、前記試料中の前記標的核酸の分析を行い、
前記プライマー又はプローブは、固相に固定されており、
前記標識は、前記プライマー又はプローブが前記標的核酸とハイブリダイズしない場合は消光し、前記プライマー又はプローブが前記標的核酸とハイブリダイズした場合は発光する標識であり、
前記標識の発光の検出により分析を行うことを特徴とする。【０００９】
本発明のキットは、前記本発明の分析方法を行うためのキットであり、前記キットが、前記プライマー又はプローブと、前記標識と、前記プライマー又はプローブを固定するための支持体とを含み、前記支持体が、前記固相を含むキットである。【００１０】
本発明の分析機器は、前記本発明の分析方法を行うための分析機器であり、前記標識の発光を検出するための発光検出手段を含む分析機器である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器によれば、迅速かつ簡便に標的核酸の分析を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例１において、プライマー対を用いた場合、目的核酸の増幅産物が生成されていることを示す写真である。
【図２】図２は、実施例１において、フォワードプライマーのみを用いた場合、目的核酸の増幅産物の生成が観察できなかったことを示す写真である。
【図３】図３は、実施例２−Ａにおいて、オリゴ合成の品質チェック結果を示す写真である。
【図４】図４は、実施例２−Ｂにおいて、ＰＣＲ後産物の電気泳動結果を示す図である。
【図５】図５は、実施例２−Ｃにおいて、アクチンベータメッセンジャーRNA合成用鋳型DNAの合成結果を示す写真である。
【図６】図６は、実施例２−Ｃにおいて、CUGA  7  in  vitro  Transcription  KitによるアクチンベータメッセンジャーRNA合成結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例２−Ｄにおいて、GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社Gene−Proサーマルサイクラーの動作チェック結果とスライドガラスで作製した反応チャンバー内でのPCR反応の確認を示すものである。
【図８】図８は、実施例２−Ｅにおいて、蛍光顕微鏡での観察結果を示す写真である。
【図９】図９は、実施例２−Ｅにおいて、蛍光顕微鏡での観察結果を示す写真である。
【図１０】図１０は、実施例２−Ｅにおいて、蛍光顕微鏡での観察結果を示す写真である。
【図１１】図１１は、実施例２−Ｆにおいて、固相化PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。
【図１２】図１２は、実施例２−Ｇにおいて、ツーステップRT−PCR後サンプルの電気泳動結果を示すものである。
【図１３】図１３は、実施例２−Ｈにおいて、ワンステップRT−PCR後サンプルの電気泳動結果を示すものである。
【図１４】図１４は、実施例２−Ｉにおいて、ガラス基板で作製したチャンバー内で反応させたワンステップRT−PCR後サンプルの電気泳動結果を示す。
【図１５】図１５は、実施例２−Ｊにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。
【図１６】図１６は、実施例２−Ｊにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。
【図１７】図１７は、実施例２−Ｋにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（メッセンジャーRNA濃度）を示す写真である。
【図１８】図１８は、実施例２−Ｋにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（メッセンジャーRNA濃度）を示す写真である。
【図１９】図１９は、実施例２−Ｋにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（メッセンジャーRNA濃度）を示す写真である。
【図２０】図２０は、実施例２−Ｋにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（メッセンジャーRNA濃度）を示す写真である。
【図２１】図２１は、実施例２−Ｌにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（PCRサイクル数）を示す写真である。
【図２２】図２２は、実施例２−Ｌにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（PCRサイクル数）を示す写真である。
【図２３】図２３は、実施例２−Ｌにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（PCRサイクル数）を示す写真である。
【図２４】図２４は、実施例２−Ｌにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（PCRサイクル数）を示す写真である。
【図２５】図２５は、実施例２−Ｌにおいて、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（PCRサイクル数）を示す写真である。
【図２６】図２６は、実施例２−Ｍにおいて、蛍光標識した固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRの結果を示す写真である。
【図２７】図２７は、実施例２−Ｍにおいて、蛍光標識した固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRの結果を示す写真である。
【図２８】図２８は、Ｅプローブの使用形態の一例を模式的に示す図である。Ｅプローブを固相化したマイクロアレイ上で、検体サンプルとハイブリダイゼーションを行い、蛍光シグナルを検出することで目的の産物の有無や変異の有無を測定する。さらに、そのマイクロアレイを洗浄することで、同一のマイクロアレイを用いて、同様な検出が可能になり、検体サンプルに特殊な修飾をすることなく、さらにはハイブリダイゼーション後に特別な発色酵素反応を必要としない繰り返し使用可能なマイクロアレイとなる。
【図２９】図２９は、ＥプライマーのブリッジＰＣＲへの適用例を模式的に示す図である。Ｅプライマーを固相化したマイクロアレイ上で、検体サンプルとアニーリングさせブリッジＰＣＲを行い、蛍光シグナルを検出することで目的の産物の有無や変異の有無を測定する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について、例を挙げてさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の説明により限定されない。
【００１４】
本発明は、例えば、下記［１］〜［４６］のようにも記載し得るが、これには限定されない。
［１］
試料中の標的核酸の分析方法であって、
前記試料を、前記標的核酸にハイブリダイズすることが可能なプライマー又はプローブと、標識とに接触させて、前記試料中の前記標的核酸の分析を行い、
前記プライマー又はプローブは、固相に固定されており、
前記標識は、前記プライマー又はプローブが前記標的核酸とハイブリダイズしない場合は消光し、前記プライマー又はプローブが前記標的核酸とハイブリダイズした場合は発光する標識であり、
前記標識の発光の検出により分析を行うことを特徴とする分析方法。
［２］
前記標的核酸の分析後、前記標的核酸を除去し、前記プライマー又はプローブを再利用する［１］に記載の分析方法。
［３］
前記標的核酸が複数種類であり、前記複数種類の標的核酸をそれぞれ検出する［１］または［２］に記載の分析方法。
［４］
前記プライマー又はプローブが、複数種類である［１］から［３］のいずれかに記載の分析方法。
［５］
前記プライマー又はプローブが固定された前記固相の表面が、平面、チップ平面、球体表面または立体表面である［１］から［４］のいずれかに記載の分析方法。
［６］
前記固相の表面が、バックグラウンドを軽減するコーティングがされた表面である［１］から［５］のいずれかに記載の分析方法。
［７］
前記バックグラウンドを軽減するコーティングが、グラフト重合処理によるコーティングである［６］記載の分析方法。
［８］
前記プライマー又はプローブの前記標識が、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である［１］から［７］のいずれかに記載の分析方法。
［９］
前記プライマー又はプローブが、前記標識を、前記プライマー又はプローブの一部として含み、
前記標識が、前記プライマー又はプローブに共有結合している［１］から［８］のいずれかに記載の分析方法。
［１０］
前記プライマー又はプローブが、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）または（１８ｂ）で表される構造を少なくとも一つ含む核酸分子である［９］記載の分析方法。
【化１６】
0005598784.tif 000002
【化１６ｂ】
0005598784.tif 000003
【化１７】
0005598784.tif 000004
【化１７ｂ】
0005598784.tif 000005
【化１８】
0005598784.tif 000006
【化１８ｂ】
0005598784.tif 000007
前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ii）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１６）および（１６ｂ）中、Ｌ１およびＬ２は前記リンカーであり、Ｌ３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ１およびＬ２がＢに直接結合していてもよく、
ただし、
前記式（１６）、（１７）および（１８）中、Ｅは、前記（ｉ）の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのＯ原子がＳ原子で置換されていても良く、
前記式（１６ｂ）、（１７ｂ）および（１８ｂ）中、Ｅは、前記（ii）の原子団であり、
前記式（１７）および（１７ｂ）中、各Ｂは、同一でも異なっていても良く、各Ｅは、同一でも異なっていても良い。
［１１］
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）が、それぞれ２以上の整数である、［１０］記載の分析方法。
［１２］
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素、ビオチンまたはそれらの誘導体から誘導される基である、［１０］または［１１］記載の分析方法。
［１３］
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、下記式（７）から（９）のいずれかで表される原子団である、［１０］から［１２］のいずれかに記載の分析方法。
【化７】
0005598784.tif 000008
【化８】
0005598784.tif 000009
【化９】
0005598784.tif 000010
式（７）〜（９）中、
Ｘ１およびＸ２は、Ｓ、ＯまたはＳｅであり、
ｎ’’は、０または正の整数であり、
Ｒ１〜Ｒ１０、Ｒ１３〜Ｒ２１は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）および（１７ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
Ｒ１５は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｒ１６は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｚ１１中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１と、Ｚ１２中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
［１４］
前記式（７）〜（９）中、
Ｒ１〜Ｒ２１において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基である、［１３］記載の分析方法。
［１５］
前記式（７）〜（９）中、
Ｒ１１およびＲ１２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）および（１７ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する、［１３］または［１４］記載の分析方法。
［１６］
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（７）または（８）で表される原子団であり、
前記式（７）または（８）で表されるＺ１１およびＺ１２が、下記式（１９）または（２０）で示される基である［１３］から［１５］のいずれかに記載の分析方法。
【化１９】
0005598784.tif 000011
【化２０】
0005598784.tif 000012
前記式（１９）および（２０）中、
Ｘ１、Ｒ１からＲ１０、Ｒ１３およびＲ１４、Ｒ１１ならびにＲ１２は、前記式（７）〜（９）と同じである。
［１７］
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（１９）で表される原子団であり、
前記式（１９）中、
Ｘ１は、Ｓであり、
Ｒ１からＲ１０は、水素原子であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）および（１７ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、他方は、メチル基である、［１６］記載の分析方法。
［１８］
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（１９）で表される原子団であり、
前記式（１９）中、
Ｘ１は、Ｓであり、
Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９およびＲ１０は、水素原子であり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ１２は、メチル基であり、
Ｒ８は、ハロゲン原子であり、
Ｒ１１は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基である、［１６］記載の分析方法。
［１９］
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、前記式（７）で表される原子団であり、
前記式（７）中、
Ｘ１は、Ｓであり、
ｎは、１であり、
Ｒ１からＲ１０、Ｒ１５、Ｒ１６およびＲ１７は、水素原子であり、
Ｒ１１は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、
Ｒ１２は、メチル基である、［１３］記載の分析方法。
［２０］
Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、下記の各化学式のいずれかで表される原子団である、［１３］記載の分析方法。
【化１Ｚ】
0005598784.tif 000013
【化２Ｚ】
0005598784.tif 000014
【化３Ｚ】
0005598784.tif 000015
【化４Ｚ】
0005598784.tif 000016
【化５Ｚ】
0005598784.tif 000017
【化６Ｚ】
0005598784.tif 000018
上記各化学式中、
ｎは、正の整数である。
［２１］
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂが、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格を有する原子団である［１０］から［２０］のいずれかに記載の分析方法。
［２２］
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂが、人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、前記人工核酸塩基が、2-アミノ-6-(N,N-ジメチルアミノ)プリン  ピリジン-2-オン、5-メチルピリジン-2-オン、2-アミノ-6-(2-チエニル)プリン、ピロール-2-カルボアルデヒド、9-メチルイミダゾ[(4,5)-b]ピリジン、5-ヨード-2-オキソ(1H)ピリジン  2-オキソ-(1H)ピリジン、2-アミノ-6-(2-チアゾリル)プリン、7-(2-チエニル)-イミダゾ[4,5-b]ピリジン、ブロモチミン、アザアデニンまたはアザグアニンである［１０］から［２０］のいずれかに記載の分析方法。
［２３］
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂが、人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、前記人工核酸塩基が、Py、Py  der.、Pu、またはPu  der.である［１０］から［２０］のいずれかに記載の分析方法。
前記Pyとは、下記式（１１）で表記される6員環のうち、1位にＥと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py  der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式（１２）で表記される縮合環のうち、9位にＥと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu  der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
【化１１−１２】
0005598784.tif 000019
［２４］
前記式（１６）で表される構造が、下記式（１６−１）または（１６−２）で表される構造であり、
前記式（１６ｂ）で表される構造が、下記式（１６ｂ−１）または（１６ｂ−２）で表される構造であり、
前記式（１７）で表される構造が、下記式（１７−１）で表される構造であり、
前記式（１７ｂ）で表される構造が、下記式（１７ｂ−１）で表される構造であり、
前記式（１８）で表される構造が、下記式（１８−１）で表される構造であり、
前記式（１８ｂ）で表される構造が、下記式（１８ｂ−１）で表される構造である、
［１０］から［２３］のいずれかに記載の分析方法。
【化１６−１】
0005598784.tif 000020
【化１６−２】
0005598784.tif 000021
【化１６ｂ−１】
0005598784.tif 000022
【化１６ｂ−２】
0005598784.tif 000023
【化１７−１】
0005598784.tif 000024
【化１７ｂ−１】
0005598784.tif 000025
【化１８−１】
0005598784.tif 000026
【化１８ｂ−１】
0005598784.tif 000027
前記式（１６−１）、（１６−２）、（１６ｂ−１）、（１６ｂ−２）、（１７−１）、（１７ｂ−１）、（１８−１）および（１８ｂ−１）中、
ｌ、ｍおよびｎ’は任意であり、同一でも異なっていても良く、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、
Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２およびｂは、前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）と同じであり、
前記式（１６−１）、（１６−２）、（１７−１）および（１８−１）において、リン酸架橋中のＯ原子は、１つ以上がＳ原子で置換されていてもよい。
［２５］
前記式（１６−１）、（１６−２）、（１６ｂ−１）、（１６ｂ−２）、（１７−１）、（１７ｂ−１）、（１８−１）および（１８ｂ−１）中、
ｌ、ｍおよびｎは、それぞれ、２以上の整数である、［２４］記載の分析方法。
［２６］
前記核酸分子が、下記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４または１１４−２で表されるヌクレオチド構造、またはそれらの幾何異性体、立体異性体もしくは塩である構造を少なくとも一つ含む核酸分子である、［１０］記載の分析方法。
【化１０６】
0005598784.tif 000028
【化１１０】
0005598784.tif 000029
【化１１３】
0005598784.tif 000030
【化１１７】
0005598784.tif 000031
【化１２０】
0005598784.tif 000032
【化１２２】
0005598784.tif 000033
【化１２３】
0005598784.tif 000034
【化１２４】
0005598784.tif 000035
【化１１４−２】
0005598784.tif 000036
上記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４および１１４−２中、ｎは正の整数である。
［２７］
前記リンカー長ｎが２〜６の範囲である、［２０］または［２６］記載の分析方法。
［２８］
前記プライマー又はプローブが、プライマーであり、
前記プライマーを前記試料に接触させることにより、前記プライマーを前記標的核酸にハイブリダイズさせて前記標的核酸の増幅反応を行い、
さらに、前記増幅反応における前記標的核酸の増幅度を継時的に計測することにより、前記標的核酸の分析を行う［１］から［２７］のいずれか１項に記載の分析方法。
［２９］
前記標的核酸の増幅反応を、ブリッジPCR法で行う［２８］記載の分析方法。
［３０］
前記プライマーが、一対のプライマーであり、
前記一対のプライマーは、それぞれ、前記標識が共有結合していることにより、前記標識を前記プライマーの一部として含み、
前記一対のプライマーに共有結合した前記各標識は、それぞれ、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記各標識は、互いに異なり、
前記ブリッジPCR法において、蛍光を生じさせないか、又は、１色ないし３色の蛍光を生じさせて蛍光色を解析することにより、又は、前記各標識の蛍光強度に差を生じさせて前記蛍光強度差を測定することにより、前記標的核酸における複数座位の変異有無検出又は前記複数座位の発現量分析を同時に行う請求項［２９］記載の分析方法。
［３１］
前記プライマーが、一対のプライマーであり、
前記一対のプライマーは、それぞれ、前記標識が共有結合していることにより、前記標識を前記プライマーの一部として含み、
前記一対のプライマーに共有結合した前記各標識は、それぞれ、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記各標識は、互いに異なり、
前記ブリッジPCR法において、蛍光を生じさせないか、又は、１色ないし３色の蛍光を生じさせて蛍光色を解析することにより、又は、前記各標識の蛍光強度に差を生じさせて前記蛍光強度差を測定することにより、前記標的核酸を含む試料全体における変異の割合を測定する請求項［２９］記載の分析方法。
［３２］
前記プライマーが、一対のプライマーであり、
前記一対のプライマーは、それぞれ、前記標識が共有結合していることにより、前記標識を前記プライマーの一部として含み、
前記一対のプライマーに共有結合した前記各標識は、それぞれ、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、
前記各標識は、互いに異なり、
前記ブリッジPCR法において、蛍光を生じさせないか、又は、１色ないし３色の蛍光を生じさせて蛍光色を解析することにより、又は、前記各標識の蛍光強度に差を生じさせて前記蛍光強度差を測定することにより、前記標的核酸を含む試料の品質を確認する請求項［２９］記載の分析方法。
［３３］
前記標的核酸の増幅反応を、等温増幅法で行う［２８］記載の分析方法。
［３４］
前記プライマーの２点以上のスポットが、前記固相に任意の位置関係で固定されている［２８］から［３３］のいずれかに記載の分析方法。
［３５］
前記標的核酸が、ＲＮＡであり、
さらに、前記ＲＮＡの逆転写反応を行い、
前記逆転写反応を、前記プライマーが固定された前記固相で、前記増幅反応の前または前記増幅反応と同時に行う、［２８］から［３４］のいずれかに記載の分析方法。
［３６］
前記増幅反応を、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（逆転写ポリメラーゼ）又はＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて行う、［２８］から［３５］のいずれかに記載の分析方法。
［３７］
前記増幅反応後、融解曲線解析を行うことによって前記標的核酸の変異の有無を検出する［２８］から［３６］のいずれかに記載の分析方法。
［３８］
前記融解曲線解析を、プローブを用いて行い、
前記プローブが、エキシトン効果を示す蛍光性原子団を含む［３７］に記載の分析方法。
［３９］
エキシトン効果を示す蛍光性原子団を含む前記プローブを、複数種類用いる［３８］記載の分析方法。
［４０］
前記プライマー又はプローブが、プローブである［１］から［２７］のいずれかに記載の製造方法。
［４１］
前記試料は、あらかじめ増幅された前記標的核酸を含む［４０］記載の分析方法。
［４２］
さらに、融解曲線解析を行うことによって前記標的核酸中の変異の有無を検出する［４０］または［４１］記載の分析方法。
［４３］
［１］から［４２］のいずれかに記載の分析方法を行うためのキットであり、
前記キットが、前記プライマー又はプローブと、前記標識と、前記プライマー又はプローブを固定するための支持体とを含み、
前記支持体が、前記固相を含むキット。
［４４］
［１］から［４２］のいずれかに記載の分析方法を行うための分析機器であり、
前記標識の発光を検出するための発光検出手段を含む分析機器。
［４５］
少なくとも１点以上のスナップショットのデータを取得するための手段を有する、［４４］記載の分析機器。
［４６］
継時的にデータを取得するための手段を有する、［４４］または［４５］記載の分析機器。
【００１５】
［用語］
本発明の（本明細書中で使用する）いくつかの用語について、以下のとおり説明する。なお、特に定義しない用語については、その用語の一般的な意味どおりに解釈すべきものとする。また、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、などの略号による表示は、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従って使用する。
【００１６】
本発明において「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、核酸を意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡのいずれも包含する。上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また、上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。さらに、本明細書では、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」の用語は、「核酸」の用語と互換的に使用されるものとする。
【００１７】
本発明において「遺伝子」とは、２本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを含むことを意図して使用されている。また、その塩基配列や配列鎖長によって特に制限されるものではない。
【００１８】
本発明において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及び、これらの断片、さらにヒトゲノムのいずれも含む。その「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「核酸」が含まれる。そのような同族体、変異体又は誘導体をコードする「核酸」としては、ある特定のストリンジェントな条件下で、塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「核酸」を挙げることができる。また、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことも意味する。
【００１９】
本発明において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことを意味する。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３'末端にリボヌクレオチドを結合させていくうえでＲＮＡが合成される。これらのＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、コード領域、発現制御領域、エキソンやイントロンをはじめとした様々な転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれることを意味する。
【００２０】
本発明において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与するものを意味する。本明細書で使用する「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含み、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。
【００２１】
本発明において「プローブ」とは、特に限定されないが、例えば、Ｅプローブならびに、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドなどを意味する。
【００２２】
「プライマー」とは、特に限定されないが、例えば、Ｅプライマーならびに、遺伝子の発現によって生じたＲＮＡ又はそれに由来するポリヌクレオチドを特異的に認識し、増幅する、連続するポリヌクレオチド及び／又はそれに相補的なポリヌクレオチドなどを意味する。
【００２３】
本発明において「相補的なポリヌクレオチド（相補鎖、逆鎖）」とは、配列番号によって定義される塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、からなるポリヌクレオチドの全長配列、又はその部分配列、（ここでは便宜上、これを正鎖と呼ぶ）に対してＡ：Ｔ（Ｕ）、Ｇ：Ｃといった塩基対関係に基づいて、塩基的に相補的な関係にあるポリヌクレオチドを示す。かかる相補鎖は、対象とする正鎖の塩基配列と完全に相補配列を形成する場合に限らず、対象とする正鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズできる程度の相補関係を有するものであってもかまわない。
【００２４】
本発明において「ストリンジェントな条件」とは、プローブが他の配列に対するよりも、検出可能により大きな程度（例えばバックグラウンドよりも少なくとも１．２倍）で、その標的配列に対してハイブリダイズする条件のことを意味する。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ハイブリダイゼーションが行われる環境によって大きく異なる。ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のストリンジェンシーを制御することにより、プローブに対して１００％相補的である標的配列が同定され得る。
【００２５】
本発明において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異などに起因した天然の変異体、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその部分配列において１、２もしくは３又はそれ以上、好ましくは１もしくは２個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、あるいはｍｉＲＮＡの前駆体ＲＮＡの塩基配列、もしくは該塩基配列においてuがtである塩基配列、又はその部分配列において１又は２以上、好ましくは１又は数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含む変異体、または該塩基配列の各々又はその部分配列と約５０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、あるいは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと上記定義のストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を示す。
【００２６】
本発明において「％同一性」は、一般的にＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質又は遺伝子の検索システムを用いて、ギャップを導入して、又はギャップを導入しないで、決定することができる。
【００２７】
本発明において「誘導体」とは、Ｅプローブ、Ｅプライマー、修飾核酸、非限定的に例えば、蛍光団などによるラベル化誘導体、修飾ヌクレオチド(例えばハロゲン、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、チオ、カルボキシメチルなどの基を含むヌクレオチド及び塩基の再構成、二重結合の飽和、脱アミノ化、酸素分子の硫黄分子への置換などを受けたヌクレオチドなど)を含む誘導体、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）などを含むことを示す。
【００２８】
本発明における「分析」には、例えば、定性分析、定量分析、半定量分析、変異検出が含まれる。
【００２９】
本発明において「予測、判定、検出又は診断」とは、特に限定されないが、例えば、がんやその他の疾患の罹患の有無、罹患の程度もしくは改善の有無や改善の程度を診断するために、がんやその他の疾患の予防、改善又は治療に有用な候補物質をスクリーニングするために、直接又は間接的に利用されるものを意味する。これにはがんやその他の疾患の罹患に関連して生体内、特に組織や血液中において発現が変動する遺伝子を特異的に認識し、また結合することのできるヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、上記性質に基づいて生体内、組織や細胞内などで発現した上記遺伝子を検出するためのプローブとして、また生体内で発現した上記遺伝子を増幅するためのプライマーとして有効に利用することが可能である。
【００３０】
本発明において予測、判定、検出又は診断の対象となる「試料」とは、特に限定されないが、例えば、がんやその他の疾患ならびに健康状態の変化の発生にともない遺伝子、または発現する遺伝子が変化する生体サンプル試料のことをいう。具体的には組織及びその周辺の脈管、リンパ節及び臓器、また転移が疑われる臓器、および血液、尿、唾液、便、毛髪、皮膚、汗などを含み、その他生体から採取可能なものを意味する。
【００３１】
［本発明の標的核酸の分析方法］
本発明の標的核酸の分析方法は、例えば、以下のような特徴を有する。ただし、これらの説明は例示であり、本発明を何ら限定しない。
【００３２】
前述のBasin  Networkの問題点などから、標的核酸の分析方法には、例えば、下記条件（１）〜（３）を満たすことが求められる。
（１）複数の座位を同時に定量的に計測する技術であること。
（２）転写因子など微量の発現量のRNAを計測することができる感度が高い技術であること。
（３）これらを実際に臨床で用いられるためには、非常に迅速かつ簡便な技術であること。
【００３３】
近年は、薬も、ResponderとNon−responderを区別するマーカーがないことには、認可が困難であり、実用に届かないことが多い。下記に詳述するように、ネットワークが薬の反応性や予後などを支配しているわけであるから、当然、たった一つの遺伝子を見ることにより、臨床上有用な情報を予測することは非常に難しいし、論理的に無理がある。システムバイオロジーを見ることにより、これらの臨床上の予測情報を収集する動きがある。
【００３４】
そこで、一つの個体から採取されたサンプルの多座位を計測する技術が待たれる。さらに、システムバイオロジー的に計測、判定をするためには、多座位を一度に、計測することが必要になってくる。しかも、臨床の場では、POCTが期待され、外来、病棟、手術室などで、すぐに患者のサンプルから情報を得ることが重要になってきているため、簡便に、迅速に計測できる技術が待たれる。
【００３５】
これらの目的には、一般に、マイクロアレイが用いられている。マイクロアレイは、検体のRNA（DNA）に逆転写ポリメラーゼ（DNAポリメラーゼ）で蛍光色素などの標識を入れ、この標識核酸を固相化されているチップの上にハイブリダイゼーションさせて検出するものであるが、バックグラウンドを除くために余分な標識核酸を除く操作が必要であり、非常に手間と時間がかかる。さらに、スキャンを行う必要があるので、全体として所要時間がかかるなどの問題点がある。一度にたくさんの遺伝子を解析するためには、このようなマイクロアレイなどの技術が必要であるが、余分な標識核酸を洗浄除去しなければならないなど作業上の手間暇がかかり、操作が煩雑で、結果の再現性があまり高くないなど問題点が多い。
【００３６】
一方で、感度がよい方法としてqRT−PCR、qPCRが用いられているが、この手法は、一つ一つの遺伝子（座位）の標的配列に関して、各々別々のプライマーを設計しなくてはならない。これらのプライマーが別々の異なる反応液（チューブ内）で反応するために、鋳型となるRNAやDNAは、その反応液の数に分割して各々の反応液の中に入れなくてはならない。したがって、非常に少量の核酸サンプルしかない場合は、この方法では、複数の遺伝子（多座位）を測定するときにも、その数は自ずと制限される。
【００３７】
つまり、qRT−PCRやqPCRの時には、測定するべき標的領域数（座位数）の反応液に分けなければならないが、分配するときには、必ず物理的にその量にぶれが生じることになり、測定に誤差が生じる。さらに、各反応液間でプライマーの配列および標的配列が異なるので、これらの増幅効率は一定にはならない。このように、反応液分配による誤差があるために、現在のqRT−PCRやqPCRでは増幅率による誤差を正確に測定できない。
【００３８】
マイクロアレイには数百から数万種の遺伝子に対応した塩基配列を利用したプローブまたはプライマーが固定されている。被検試料をマイクロアレイに添加することによって試料中の遺伝子がプローブまたはプライマーと結合し、この結合量を何らかの手段によって測定することにより、被検試料中の遺伝子量を知ることができる。マイクロアレイ上に固定化するプローブまたはプローブに対応した遺伝子の選択は自由である。
【００３９】
手術時又は内視鏡検査時に採取した試料であるがん患者のがん病変部とがん患者の正常組織部を用いて、試料中の遺伝子発現量を比較することによってがんマーカーとなりうる遺伝子群を推定することも可能である。また、健康状態を知るために、健康状態時の遺伝子発現パターンと健康状態に問題がある遺伝子発現パターンを比較することで、疾患に対する自覚症状がないような予備患者においても検査、診断が可能になる。
【００４０】
マイクロアレイは多座位を見ることができ、一つの標識核酸溶液で多座位を計測できる利点があるが、増幅し標識を入れる手間がかかり、目的核酸とプライマーまたはプローブのハイブリダイゼーションに時間がかかり、その検出感度はあまり良くない。さらに、スペクトルレンジが狭く、既知配列しか検出できず、変異検出にはS/N比が低く判定の精度があまり良くないなどの問題点が多くある。
【００４１】
それに比べマルチプレックスな定量PCR（qRT−PCR)は、感度が良く、スペクトルレンジも広く、増幅している間に立ち上がり時間（Ct）で鋳型の遺伝子量の測定が可能であり、融解曲線を書かせることで変異情報が得られる利点がある。逆に、標的核酸の一つ一つに対して別のプライマーをデザインする必要があり、煩雑で時間と手間がかかり、別々の反応系とするために、一座位ずつ別々のチューブで反応させる必要がある。検出したい座位の数だけ、取り分ける手間がかかり、さらに、鋳型とする核酸（RNA,DNA）などを反応数分に分けなければならず、大量の鋳型核酸が必要となる問題点もある。
【００４２】
これらの欠点を補うように、Bridge  Multiple  qRT−PCRとするとかなりの利点がある。チップ上のブリッジPCRであれば、チップの上にプライマーが固定してあるので、別々の反応系が不要となる（ブリッジPCRについては、例えば、特表平１０−５０５４９２号公報参照）。一つの液相で反応でき、一座位ずつ別々のチューブで反応させる必要がない。座位数分を取り分ける手間がかからず、さらに、鋳型とする核酸（RNA,DNA）などを反応数分に分ける必要がないので、少量の鋳型核酸で実行可能となる。特に、一細胞からのRNAで大量の座位の計測が可能になり、全量1マイクロリットル以下で反応可能（おそらく、1ミリ角のチップなら、50ナノリットルでも可能）となる。目的によっては予めRNaseHを添加しておくことも効果的である。
【００４３】
さらに、エキシトンプライマー（Ｅプライマー、例えば、特許第４７６１０８６号公報および特許第４３７０３８５号公報参照）を上記Bridge  Multiple  qRT−PCRに適用すると、標的核酸を標識する必要がなく、RNA、DNAなどの計測するべきサンプルをそのままチップ上にかけるだけで検出可能になる。感度は、Multiple  qRT−PCRに比べて向上し、その他の利点もMultiple  qRT−PCRと同等以上と考えられる。液相と違い、色素の波長を変えることで、複数のサンプルを一チップで、または、一つの遺伝子の異なる領域、または、異なる遺伝子を同時に計測できる。これは、すべての反応に内部コントロールを置くことができるので、臨床検査キットに必須な条件を満たしている。特に、エキシトンプローブ（Ｅプローブ）を使用したマイクロアレイは、検出目的である例えばPCR増幅産物を蛍光標識などすることは必要なく、ハイブリダイゼーションの検出後、そのマイクロアレイを洗浄し、次の検体を添加することで、特別な標識や発色反応をさせることなく何度でもマイクロアレイを再利用できるメリットがある。今日のエコロジーのことを考慮しても再利用可能なマイクロアレイは非常に需要である。
【００４４】
さらに具体的に説明すると、本発明を利用することで、qRT−PCRのような1サンプル／チューブではなく一枚のアレイで多検体を定量可能となり、マイクロアレイにおけるcRNA調製といった増幅・標識工程を別途行う必要がなく、全てをアレイ上で行うことが可能となる。また、ブリッジPCRにより形成されるクラスターはアレイのスポットに比べて相当に小さく、クラスター密度が低い範囲ではデジタルカウントが可能となるので、クラスターのカウントだけでなく、蛍光強度による定量も可能である。さらに、低蛍光レンジでも蛍光強度はクラスターにより維持されるため(スポット全体に広がって希釈されるようなことがないので)、マイクロアレイよりも微量域のダイナミックレンジが広くなることが期待される。特に、Ｅプライマーの利用により、増幅したクラスターだけが蛍光を発し、特別な作業を伴わず簡便に測定することができる。
【００４５】
本発明において、蛍光を検出、計測する場合、ブリッジPCRを用いた増幅過程（つまりクラスター）を蛍光観察するので励起用にレーザー光源が必要なく、簡単なランプ光源で検出可能になる。また、蛍光検出用カメラも超高感度EMCCDカメラを必要とせず、通常のCCDカメラで十分に測定が可能である。つまり、計測機器が簡素化できる利点がある。本発明において、増幅したクラスターだけが蛍光を発するので背景光が減り、よりクリアな像が取得できる。さらに、より広領域をハイスピードでスキャンする場合にラインスキャン法を用いることも可能である。この方法を用いることで、ステージを一定速度で動かし続けながら動画を取得し、あとから一枚の広領域静止画を作成することも可能となる。この方法を用いるとステージの移動限界にもよるが、原理的には多検体の種類がどれだけ増えても（どれだけ広領域でも）対応することができる。
【００４６】
本発明の核酸の分析方法は、例えば、ＤＮＡチップを用いて行うことができる。以下に、ＤＮＡチップについて例を挙げて説明する。
【００４７】
ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）は、例えば、上述したオリゴヌクレオチド誘導体の少なくとも１つ以上を固定化させてなる。固定化とは、吸着も含む概念であり、また共有結合等による結合も含まれることを意味する。
【００４８】
ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）を作成する際の基板表面へのＤＮＡのスポット径に特に制限はないが、通常は０．５〜２００００μｍ、より好ましくは５〜２０００μｍ、より好ましくは５０〜２００μｍ程度である。また、スポットピッチに特に制限はなく、通常は１〜５００００μｍ、より好ましくは１０〜５０００μｍ、より好ましくは１００〜５００μｍ程度である。
【００４９】
ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）に用いられる担体としては、例えば、微小多孔質ガラス、ポーラスガラス等のガラス、ポリスチレン、金属、フェライトを芯にグリシンメタクリレートで表面を覆った磁性ビーズ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、担体の形状は、板状（基板状）、ビーズ状等、どのような形状のものであってもよい。
【００５０】
ＤＮＡチップは、ブローブオンキャリア法を用いたものであってもかまわない。プローブオンキャリア法とは、ＤＮＡ合成に最も適した素材とされる微小多孔質ガラス（ＣＰＧ）上でＤＮＡプローブを合成した後、プローブ分子をＣＰＧ担体から切り離すことなく、ＣＰＧに結合したＤＮＡプローブを用いてＳＮＰｓ検出に用いる手法のことを意味する。用いられるＣＰＧのサイズは、好ましくは粒径が５０Åから５００００Å、より好ましくは５００Åから５，０００Åである。このプローブオンキャリア法を用いることにより、ＤＮＡプローブの基板への固定化操作を省略することができるため、ＤＮＡチップ合成のハイスループット化ができる。ＤＮＡ合成反応効率が９９．８％以上と非常に高いため、ＤＮＡプローブの純度を高くすることができ、ＤＮＡチップの正確性が大幅に向上するという利点がある。さらに、必要なＤＮＡプローブを有するＣＰＧは、大量生産が可能であり、コストの低減や、より質の高い品質管理ができる。また、従来のＤＮＡチップは、ほとんどがスライドガラス平面上で二次元的に検出を行っていたのに対し、プローブオンキャリア法では、ＣＰＧを用いているため、三次元的な検出が可能となり、ＤＮＡプローブの高密度な配置が可能となり、高い感度の検出が可能となる。
【００５１】
上述した、プローブオンキャリア法に、既存のＤＮＡ合成システムを適用した場合、核酸塩基部の保護基を除去する過程（アンモニア処理）で、リンカー部分のＳｉ−Ｏ結合が切断されてしまい、約９０％のＤＮＡプローブが担体表面から脱離してしまうという現象が見られることがある。
【００５２】
担体表面に、オリゴヌクレオチド誘導体を固定化する場合には、オリゴヌクレオチド誘導体を適当なリンカーを介して、例えば金属−硫黄結合等の方法によって結合させる方法が挙げられる。また、担体表面に固定化させるオリゴヌクレオチド誘導体は１種類のみならず、２種類以上であってもよい。また、担体と結合していない方の置換基は、ＤＮＡチップ等として用いた際の検出に用いるために、蛍光分子、消光分子等を結合させてもよい。
【００５３】
ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）は、試料中の核酸の同定方法等に用いることができる。方法としては、まず、試料と、ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）とをハイブリダイズさせる。ハイブリダイズに際しては、ＤＮＡチップ（又はマイクロアレイ）に固定されたオリゴヌクレオチド誘導体に対し、試料を例えば０．０１μＭ〜１０００μＭ程度添加することができる。また、ハイブリダイズの条件は、ポリヌクレオチド誘導体の種類によって異なるが、例えば０〜１００℃、より好ましくは２０〜９０℃、より好ましくは３０〜８０℃の温度で、例えば数秒〜数十時間程度であるが、この条件範囲に限定されるわけではない。
【００５４】
ハイブリダイズ終了後は、チップの種類に適した洗浄液で２〜５回洗浄を行う。このように、オリゴヌクレオチド誘導体は、核酸の同定方法や遺伝子検出に用いることができる。遺伝子検出の手法としては、上述した、ＤＮＡチップ、マイクロアレイに加え、リアルタイムＰＣＲが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００５５】
本発明において「検出」とは、特に限定されないが、例えば、チップ基板上にスポット状に増幅されたプローブまたはプライマーの蛍光シグナルを蛍光画像により網羅的に検出することを示す。検出装置としては一般的な蛍光顕微鏡が必要であるが、特に、Ｅプローブ又はＥプライマーを励起するための光源、ダイクロイックミラー、励起フィルタ、蛍光フィルタ及び検出のためのカメラを有するのが望ましい。及び、Ｅプローブ又はＥプライマーの蛍光強度を時系列的に計測するためには、同じ画像スキャンを何度も精度良くかつ広範囲で行う必要があるため、位置精度の高い制御可能なステージが必要となる。検出カメラは蛍光シグナルを非増幅あるいは増幅可能なもの、ならびに広範囲に連続的に画像の取得できるラインスキャンカメラも含む。
【００５６】
標的核酸中のヌクレオチドの同定方法は、オリゴヌクレオチド誘導体などを、試料中の標的核酸とハイブリダイズ、またはアニーリング、伸長反応させる工程：及びハイブリダイズ産物または、増幅産物を検出する工程を有する。本発明の標的核酸中のヌクレオチドの同定方法においては、最初にオリゴヌクレオチド誘導体を、試料中の標的核酸とハイブリダイズさせる。用いられる試料としては、特に制限はなく、核酸を含むものであればよく、例えば、細胞抽出液、血液等の体液、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド等が挙げられる。プライマーやプローブのハイブリダイズの条件は上述した通りである。
【００５７】
生体サンプルの増幅させる方法にブリッジＰＣＲ法がある。当該ブリッジＰＣＲ法において、そのプライマーの５’末端は支持体に固相化されており、目的産物にプライマーがアニーリングした時に伸長反応がおきる。さらに、熱変性、アニーリング、伸長反応を支持体上で繰り返すことで、目的の生体サンプルの目的増幅領域が存在した時に、その増幅産物が得られる。特に、本発明において、目的増幅領域に特異的な配列を含むＥプライマーをマイクロアレイに固相しておくことで、その目的増幅が起きた時のみに、そのＥプライマーが固相されている部分のみで増幅反応が起き、そのままＥプライマーの蛍光シグナルを測定することが可能となる。
【００５８】
エキシトン効果（exciton  coupling）とは、例えば、複数の色素が並行に集合し、H会合体（H−aggregate）を形成することにより、ほとんど蛍光発光を示さなくなる効果である。この効果は、色素の励起状態が、Davydov  splittingにより２つのエネルギーレベルに分裂し、上位エネルギーレベルへの励起→下位エネルギーレベルへの内部変換（internal  conversion）→発光が熱的に禁制、という理由で生じると考えられる。ただし、これらの説明は、本発明を何ら制限しない。エキシトン効果が起こりうることは、H会合体を形成した色素の吸収バンドが単一の色素の吸収バンドより短い波長に現れることで確認できる。このような効果を示す色素としては、例えば、チアゾールオレンジとその誘導体、オキサゾールイエローとその誘導体、シアニンとその誘導体、ヘミシアニンとその誘導体、メチルレッドとその誘導体、ほか一般的にシアニン色素、アゾ色素と呼ばれる色素群が挙げられる。エキシトン効果によれば、例えば、本発明の蛍光色素を核酸に結合させた場合、一本鎖状態での蛍光強度を抑え、二重らせん構造を一層効果的に検出可能である。
【００５９】
ＥプライマーまたはＥプローブとは、例えば、特許第4370385号公報に記載の構造の核酸分子でも良く、また、例えば、以下に説明する構造の核酸分子でも良い。
【００６０】
本発明の核酸プローブにおいて、核酸分子の構造は、例えば、下記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）または（１８ｂ）で表される構造を少なくとも一つ含む標識核酸であっても良い。また、これらの互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩も、本発明における標識核酸に含まれる。以下、蛍光性を示す原子団Ｚ１１およびＺ１２を有する、下記各式で表される構造を、「標識構造」といることがある。また、前記標識構造を含む前記標識核酸を「標識プローブ」ということがある。
【００６１】
本発明において、「標的核酸配列」とは、増幅目的の核酸配列だけでなく、これに相補的な配列も含む。
【００６２】
【化１６】
0005598784.tif 000037
【化１６ｂ】
0005598784.tif 000038
【化１７】
0005598784.tif 000039
【化１７ｂ】
0005598784.tif 000040
【化１８】
0005598784.tif 000041
【化１８ｂ】
0005598784.tif 000042
【００６３】
式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ii）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１６）および（１６ｂ）中、Ｌ１およびＬ２は前記リンカーであり、Ｌ３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ１およびＬ２がＢに直接結合していてもよく、
ただし、
式（１６）、（１７）および（１８）中、Ｅは、前記（ｉ）の原子団であり、リン酸架橋中の少なくとも一つのＯ原子がＳ原子で置換されていても良く、
式（１６ｂ）、（１７ｂ）および（１８ｂ）中、Ｅは、前記（ii）の原子団であり、
式（１７）および（１７ｂ）中、各Ｂは、同一でも異なっていても良く、各Ｅは、同一でも異なっていても良い。
【００６４】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）は、それぞれ２以上の整数であることが好ましい。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）は、上限は特に制限されないが、例えば１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、特に好ましくは１０以下である。
【００６５】
Ｚ１１およびＺ１２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団である。これにより、ターゲット配列と結合したときの蛍光色素周りの環境変化、例えば、二重らせん構造となったときの蛍光の増大が大きく、ターゲット配列をいっそう効果的に検出することができる。
【００６６】
Ｚ１１およびＺ１２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であればよく、特に制限されない。Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素またはそれらの誘導体から誘導される基であることがより好ましい。また、その他の公知の色素から誘導される基も、適宜用いることができる。DNA等の核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素は、数多く報告されている。典型的な例では、エチジウムブロミドがDNAの二重らせん構造にインターカレーションして強い蛍光を示すことが知られており、DNA検出に多用されている。また、ピレンカルボキシアミドやプロダンのような微視的極性に応じて蛍光強度を制御できる蛍光色素も知られている。また、前記チアゾールオレンジは、ベンゾチアゾール環とキノリン環をメチン基で連結した蛍光色素であり、通常微弱な蛍光を示すが、二重らせん構造をもつDNAにインターカレーションすることによって強い蛍光発光を与えるようになる。その他、例えば、フルオレセインやCy5、Cy3等の色素も挙げられる。
【００６７】
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ独立に、下記式（７）から（９）のいずれかで表される原子団であることがより好ましい。
【化７】
0005598784.tif 000043
【化８】
0005598784.tif 000044
【化９】
0005598784.tif 000045
【００６８】
前記式（７）〜（９）中、
Ｘ１およびＸ２は、Ｓ、ＳｅまたはＯであり、
ｎ’’は、０または正の整数であり、
Ｒ１〜Ｒ１０、Ｒ１３〜Ｒ２１は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
Ｒ１５は、前記式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｒ１６は、前記式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｚ１１中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１と、Ｚ１２中のＸ１、Ｘ２およびＲ１〜Ｒ２１とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００６９】
前記式（７）〜（９）中、Ｒ１〜Ｒ２１において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基であることがさらに好ましい。
【００７０】
前記式（７）〜（９）中、Ｒ１１およびＲ１２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１６）、（１６ｂ）、（１７）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１もしくはＬ２に結合することがさらに好ましい。前記ポリメチレンカルボニル基の炭素数は、その上限は特に制限されないが、例えば１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下、特に好ましくは１０以下である。
【００７１】
Ｚ１１およびＺ１２は、前記式（７）〜（９）で表される場合は、例えば、それぞれ独立に、下記式（１９）または（２０）で示される基であることがより好ましい。
【化１９】
0005598784.tif 000046
【化２０】
0005598784.tif 000047
【００７２】
前記式（１９）および（２０）中、Ｘ１は−Ｓ−又は−Ｏ−を示す。Ｒ１からＲ１０、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、又はアミノ基を示す。Ｒ１１及びＲ１２の一方は、前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中のＬ１およびＬ２に結合する連結基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の他方は水素原子、または低級アルキル基を示す。
【００７３】
また、Ｚ１１およびＺ１２が、それぞれ独立に、下記の各化学式のいずれかで表される原子団であることが特に好ましい。
【化１Ｚ】
0005598784.tif 000048
【化２Ｚ】
0005598784.tif 000049
【化３Ｚ】
0005598784.tif 000050
【化４Ｚ】
0005598784.tif 000051
【化５Ｚ】
0005598784.tif 000052
【化６Ｚ】
0005598784.tif 000053
上記各化学式中、
ｎは、正の整数であり、２〜６の範囲であることが特に好ましい。
【００７４】
前記式（１６）、（１７）、（１６ｂ）、（１７ｂ）、（１８）および（１８ｂ）中、Ｂは、天然核酸塩基骨格を有していても良いが、前述の通り、人工核酸塩基骨格を有していてもよい。例えば、Ｂが、Py（ピリミジン環）、Py  der.、Pu（プリン環）、またはPu  der.で表される構造であることが好ましい。ただし、
前記Pyとは、下記式（１１）で表記される6員環のうち、1位にＥと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py  der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式（１２）で表記される縮合環のうち、9位にＥと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu  der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
【００７５】
【化１１−１２】
0005598784.tif 000054
【００７６】
また、本発明の核酸プローブにおける前記核酸分子は、例えば、下記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４または１１４−２で表されるヌクレオチド構造、またはそれらの幾何異性体、立体異性体もしくは塩である構造を少なくとも一つ含んでいても良い。
【化１０６】
0005598784.tif 000055
【化１１０】
0005598784.tif 000056
【化１１３】
0005598784.tif 000057
【化１１７】
0005598784.tif 000058
【化１２０】
0005598784.tif 000059
【化１２２】
0005598784.tif 000060
【化１２３】
0005598784.tif 000061
【化１２４】
0005598784.tif 000062
【化１１４−２】
0005598784.tif 000063
上記化学式１０６、１１０、１１３、１１７、１２０、１２２、１２３、１２４および１１４−２中、リンカー長ｎは、正の整数であり、２〜６の範囲であることが好ましい。
【００７７】
本発明の核酸プローブに含まれる前記標識構造の数は、特に限定されないが、例えば、１〜１００個程度、好ましくは、１から２０個程度である。また、前記標識プローブにおいて、前記標識構造が含まれる部位も特に制限されない。
【００７８】
本発明の核酸プローブ（標識プローブ）において、それぞれの核酸の基本骨格は、特に制限されず、例えば、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、修飾オリゴヌクレオシド、ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、修飾ポリヌクレオシド、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、または、これらキメラ分子のいずれであっても良いし、その他の構造であっても良い。また、前記核酸の基本骨格は、天然のものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。前記核酸は、本発明の核酸プローブの場合、例えば、塩基対結合を形成し得るものであればよく、核酸試料や標的核酸配列の場合、例えば、相補鎖合成のための鋳型として機能すればよい。このため、前記核酸は、例えば、部分的に、または、全体が完全に人工的な構造からなるヌクレオチド誘導体であってもよい。前記核酸を構成する人工塩基としては、例えば、2-amino-6-(N,N-dimethylamino)purinepyridin-2-one、5-methylpyridin-2-one、2-amino-6-(2-thienyl)purine、pyrrole-2-carbaldehyde、9-Methylimidazo[(4,5)-b]pyridine、5-iodo-2-oxo(1H)pyridine  2-oxo-(1H)pyridine、2-amino-6-(2-thiazolyl)purine、7-(2-thienyl)-imidazo[4,5-b]pyridine等があげられるが、これには限定されない。本発明の核酸プローブとしては、基本骨格は、例えば、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、それらの修飾体であることが好ましい。本発明において、「ヌクレオチド」とは、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれであってもよく、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、例えば、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのいずれか一方から構成されてもよいし、両者を含んでもよい。本発明において、核酸の構成塩基数は、特に制限されない。核酸という用語は、一般に、ポリヌクレオチドという用語と同義である。オリゴヌクレオチドという用語は、一般に、ポリヌクレオチドの中でも、特に構成塩基数が少ないものを示す用語として用いる。一般には、例えば、2〜100塩基長、より一般的には2〜50塩基長程度のポリヌクレオチドを「オリゴヌクレオチド」と呼ぶが、これらの数値に限定されるものではない。ポリヌクレオチドという用語は、本発明において、例えば、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびに、ペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ-オリゴ核酸などの人工合成核酸をも含むものとする。
【００７９】
前記ペプチド核酸（PNA）は、一般に、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース主鎖が、ペプチド主鎖で置換された構造を有する。前記ペプチド主鎖としては、例えば、アミド結合によって結合したN−(2−アミノエチル)グリシンの反復単位があげられる。PNAのペプチド主鎖に結合させる塩基としては、例えば、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、イノシン、ウラシル、５−メチルシトシン、チオウラシルおよび2,6−ジアミノプリン等の天然に存在する塩基、ブロモチミン、アザアデニンおよびアザグアニン等の人工塩基があげられるが、これに限定されない。
【００８０】
LNAは、一般に、糖−リン酸骨格において、リボースの2'位の酸素原子と4'位の炭素原子との間がメチレン架橋で結合された、2つの環状構造を持つ核酸である。LNAを含むオリゴヌクレオチドがDNAとアニールすると、二本鎖のコンフォメーションが変化し、熱安定性が上昇する。LNAは、通常のオリゴヌクレオチドに比較して核酸に対する結合力が強いため、例えば、オリゴヌクレオチドの設計条件によって、より確実、強固なハイブリダイゼーションが可能となる。
【００８１】
ＥプライマーまたはＥプローブを構成する塩基数は、特に限定されないが、例えば、３〜１００程度、好ましくは６〜５０、より好ましくは６〜２５である。
【００８２】
ＥプライマーまたはＥプローブの原料は特に限定されないが、例えば、以下に示す化合物、核酸または標識物質であっても良い。
【００８３】
前記化合物は、モノヌクレオシドまたはモノヌクレオチドから誘導される構造を有する化合物であって、前記構造が下記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）で表される化合物、その互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩である。
【化１−１ｃ】
0005598784.tif 000064
【００８４】
前記式（１）、（１ｂ）および（１ｃ）中、
Ｂは、天然核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシル）骨格または人工核酸塩基骨格を有する原子団であり、
Ｅは、
（ｉ）デオキシリボース骨格、リボース骨格、もしくはそれらのいずれかから誘導される構造を有する原子団、または
（ii）ペプチド構造もしくはペプトイド構造を有する原子団であり、
Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、水素原子、保護基、または蛍光性を示す原子団であり、同一でも異なっていてもよく、
Ｑは、
Ｅが前記（ｉ）の原子団である場合はＯであり、
Ｅが前記（ii）の原子団である場合はＮＨであり、
Ｘは、
Ｅが前記（ｉ）の原子団である場合は、水素原子、酸で脱保護することが可能な水酸基の保護基、リン酸基（モノホスフェート基）、二リン酸基（ジホスフェート基）、または三リン酸基（トリホスフェート基）であり、
Ｅが前記（ii）の原子団である場合は、水素原子またはアミノ基の保護基であり、
Ｙは、
Ｅが前記（ｉ）の原子団である場合は、水素原子、水酸基の保護基、またはホスホロアミダイト基であり、
Ｅが前記（ii）の原子団である場合は、水素原子または保護基であり、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、それぞれ、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長（主鎖原子数）は任意であり、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに同一でも異なっていても良く、
Ｄは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、Ｐ＝Ｏ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基であり、
ｂは、単結合、二重結合もしくは三重結合であるか、
または、前記式（１）中、Ｌ１およびＬ２は前記リンカーであり、Ｌ３、Ｄおよびｂは存在せず、Ｌ１およびＬ２がＢに直接結合していてもよく、
前記式（１ｂ）中、Ｔは、
Ｅが前記（ｉ）の原子団である場合は、リン酸架橋（ＰＯ４−）であり、１以上の酸素原子（Ｏ）が硫黄原子（Ｓ）で置換されていても良く、
Ｅが前記（ii）の原子団である場合は、ＮＨである。
【００８５】
前記式（１）、（１ｂ）および（１ｃ）中、Ｅは、例えば、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＬＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）の主鎖構造を有する原子団であることが好ましい。
【００８６】
また、前記式（１）および（１ｃ）中、
【化６Ｃ】
0005598784.tif 000065
で表される原子団が、下記式（２）〜（４）のいずれかで表される原子団であり、
【化２−４】
0005598784.tif 000066
前記式（１ｂ）中、
【化６Ｂ】
0005598784.tif 000067
で表される原子団が、下記式（２ｂ）〜（４ｂ）のいずれかで表される原子団であることが好ましい。
【化２ｂ−４ｂ】
0005598784.tif 000068
【００８７】
前記式（２）〜（４）および（２ｂ）〜（４ｂ）中、
Ａは、水素原子、水酸基、アルキル基、アルコキシ基、または電子吸引基であり、
ＭおよびＪは、それぞれ、ＣＨ２、ＮＨ、ＯまたはＳであり、同一でも異なっていても良く、
Ｂ、ＸおよびＹは、それぞれ、前記式（１）、（１ｂ）または（1ｃ）と同じであり、
前記式（２）、（３）、（２ｂ）および（３ｂ）において、リン酸架橋中のＯ原子は、１つ以上がＳ原子で置換されていてもよい。
【００８８】
Ｅは、例えば、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾ＤＮＡの主鎖構造を有する原子団であることが、合成の容易さ等の観点から好ましいが、ＬＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）の主鎖構造を有する原子団であっても良い。
【００８９】
前記式（２）および（２ｂ）中、Ａにおいて、例えば、前記アルキル基がメチル基であり、前記アルコキシ基がメトキシ基であり、前記電子吸引基がハロゲンであることが好ましい。
【００９０】
前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）中、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）が、それぞれ２以上の整数であることが好ましい。Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖長（主鎖原子数）は、前述と同様に、上限は特に制限されず、例えば１００以下である。
【００９１】
前記化合物は、例えば、下記式（５）、（６）、（６ｂ）または（６ｃ）で表される化合物、その互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩であることが好ましい。
【化５−６ｃ】
0005598784.tif 000069
【００９２】
前記式（５）、（６）、（６ｂ）および（６ｃ）中、ｌ、ｍおよびｎ’は任意であり、同一でも異なっていても良く、主鎖中に、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＰおよびＳｉを、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、主鎖中に、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合およびチオエステル結合を、それぞれ含んでいても含んでいなくても良く、Ｂ、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、ｂ、Ｘ、ＹおよびＴは、前記式（１）および（１ｂ）と同じである。前記式（５）、（６）、（６ｂ）および（６ｃ）中、ｌ、ｍおよびｎが、それぞれ、２以上の整数であることが好ましい。ｌ、ｍおよびｎの上限は特に制限されないが、例えば１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、特に好ましくは１０以下である。
【００９３】
前記化合物において、Ｚ１１およびＺ１２が、エキシトン効果を示す原子団であることが好ましい。これにより、例えば、二重らせん構造となったときの蛍光の増大が大きく、二重らせん構造をいっそう効果的に検出することができる。ただし、前記化合物においては、Ｚ１１およびＺ１２が、エキシトン効果を示す原子団でなくても、また、蛍光性を示す原子団（色素）が１分子中に１個のみ導入されていても、二重らせん構造を効果的に検出することは可能である。
【００９４】
Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、前述の通り、蛍光性を有する原子団であることが好ましい。前記蛍光性を有する原子団は、特に制限されない。Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素またはそれらの誘導体から誘導される基であることがより好ましい。また、その他の公知の色素から誘導される基も、適宜用いることができる。DNA等の核酸に結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素は、数多く報告されている。典型的な例では、エチジウムブロミドがDNAの二重らせん構造にインターカレーションして強い蛍光を示すことが知られており、DNA検出に多用されている。また、ピレンカルボキシアミドやプロダンのような微視的極性に応じて蛍光強度を制御できる蛍光色素も知られている。また、前記チアゾールオレンジは、ベンゾチアゾール環とキノリン環をメチン基で連結した蛍光色素であり、通常微弱な蛍光を示すが、二重らせん構造をもつDNAにインターカレーションすることによって強い蛍光発光を与えるようになる。その他、例えば、フルオレセインやCy3等の色素も挙げられる。
【００９５】
また、Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、それぞれ独立に、下記式（７）から（９）のいずれかで表される原子団であることがより好ましい。
【化７】
0005598784.tif 000070
【化８】
0005598784.tif 000071
【化９】
0005598784.tif 000072
【００９６】
前記式（７）〜（９）中、
Ｘ１は、Ｓ、ＯまたはＳｅであり、
ｎ’’は、０または正の整数であり、
Ｒ１〜Ｒ１０、Ｒ１３〜Ｒ２１は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、またはアミノ基であり、
Ｒ１１およびＲ１２のうち、一方は、前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）中のＬ１もしくはＬ２、前記式（５）、（６）、（６ｂ）または（６ｃ）中のＮＨに結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基であり、
Ｒ１５は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｒ１６は、式（７）、（８）または（９）中に複数存在する場合は、同一でも異なっていても良く、
Ｚ１１中のＸ１およびＲ１〜Ｒ２１と、Ｚ１２中のＸ１およびＲ１〜Ｒ２１とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００９７】
式（７）〜（９）中、Ｒ１〜Ｒ２１において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基であることがさらに好ましい。
【００９８】
式（７）〜（９）中、Ｒ１１およびＲ１２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）中のＬ１もしくはＬ２、前記式（５）、（６）、（６ｂ）または（６ｃ）中のＮＨに結合することがさらに好ましい。前記ポリメチレンカルボニル基の炭素数は、その上限は特に制限されないが、例えば１００以下である。
【００９９】
Ｚ１１およびＺ１２は、前記式（７）〜（９）で表される場合は、例えば、それぞれ独立に、下記式（１９）または（２０）で示される基であることがより好ましい。
【化１９】
0005598784.tif 000073
【化２０】
0005598784.tif 000074
【０１００】
前記式（１９）および（２０）中、Ｘ１は−Ｓ−又は−Ｏ−を示す。Ｒ１からＲ１０、Ｒ１３およびＲ１４はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ニトロ基、又はアミノ基を示す。Ｒ１１及びＲ１２の一方は、前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）中のＬ１もしくはＬ２、前記式（５）、（６）、（６ｂ）または（６ｃ）中のＮＨに結合する連結基を示し、Ｒ１１及びＲ１２の他方は水素原子、または低級アルキル基を示す。
【０１０１】
前記化合物は、例えば、下記式（１０）で表される構造を有する化合物、その互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩であっても良い。
【化１０】
0005598784.tif 000075
式（１０）中、
Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｑ、ＸおよびＹは、前記式（１）と同じである。
【０１０２】
前記式（１）、（１ｂ）および（１ｃ）中、Ｂは、天然核酸塩基骨格を有していても良いが、前述の通り、人工核酸塩基骨格を有していてもよい。
例えば、Ｂが、Py、Py  der.、Pu、またはPu  der.で表される構造であることが好ましい。ただし、
前記Pyとは、下記式（１１）で表記される6員環のうち、1位にＥと結合する共有結合手を有し、5位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Py  der.とは、前記Pyの6員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良く、
前記Puとは、下記式（１２）で表記される縮合環のうち、9位にＥと結合する共有結合手を有し、8位にリンカー部と結合する共有結合手を有する原子団であり、
前記Pu  der.とは、前記Puの5員環の全原子の少なくとも一つがＮ、Ｃ、ＳまたはＯ原子で置換された原子団であり、前記Ｎ、Ｃ、ＳまたはＯ原子は、適宜、電荷、水素原子または置換基を有していても良い。
【化１１−１２】
0005598784.tif 000076
【０１０３】
前記化合物は、例えば、下記式（１３）または（１４）で表される化合物、その互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩であっても良い。
【化１３】
0005598784.tif 000077
【化１４】
0005598784.tif 000078
前記式（１３）および（１４）中、Ｅ、Ｚ１１、Ｚ１２、Ｑ、ＸおよびＹは、前記式（１）と同じであり、Py、Py  der.、Pu、およびPu  der.は、前述の定義のとおりである。
【０１０４】
前記化合物がホスホロアミダイト基を有する場合、前記ホスホロアミダイト基は、例えば、下記式（１５）で表されることが好ましい。
−Ｐ（ＯＲ２２）Ｎ（Ｒ２３）（Ｒ２４）  （１５）
式（１５）中、Ｒ２２はリン酸基の保護基であり、Ｒ２３およびＲ２４はアルキル基、またはアリール基である。
前記式（１５）において、Ｒ１５がシアノエチル基であり、Ｒ１６およびＲ１７において、前記アルキル基がイソプロピル基であり、前記アリール基がフェニル基であることがより好ましい。
【０１０５】
前記化合物において、例えば、前記式（１）で表される化合物が、下記式（２１）で表される化合物であっても良い。
【化２１】
0005598784.tif 000079
【０１０６】
式（２１）中、Ａは水素原子または水酸基を示す。好ましくは、Ａは水素原子である。Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルの残基を示す。例えば、アデニン及びグアニンは、８位で二重結合と結合し、シトシン、チミン又はウラシルは５位で二重結合と結合している。Ｚ１１及びＺ１２は各々独立に、蛍光性を示す原子団、水素原子、またはアミノ基の保護基を示し、チアゾールオレンジ誘導体、又はオキサゾールイエロー誘導体の残基が特に好ましい。Ｘは、水素原子、酸で脱保護できる水酸基の保護基、あるいはモノホスフェート基、ジホスフェート基又はトリホスフェート基を示す。Ｙは水素原子、水酸基の保護基、又はホスホロアミダイト基である。
【０１０７】
前記式（２１）で表される化合物は、例えば、下記式（２２）で表されることがより好ましい。
【化２２】
0005598784.tif 000080
【０１０８】
前記式（２２）中、Ａは水素原子または水酸基を示す。Ｚ１１及びＺ１２は各々独立に、蛍光性を示す原子団、水素原子、又はアミノ基の保護基を示し、チアゾールオレンジ誘導体、又はオキサゾールイエロー誘導体の残基が特に好ましい。Ｘは、水素原子、酸で脱保護できる水酸基の保護基、あるいはモノホスフェート基、ジホスフェート基又はトリホスフェート基を示す。Ｙは水素原子、水酸基の保護基、又はホスホロアミダイト基である。
【０１０９】
前記式（２１）または（２２）の化合物において、Ｚ１１およびＺ１２が水素原子、又はアミノ基の保護基である場合は、一分子中に２つのアミノ基（又は保護されたアミノ基）を有することから、これらのアミノ基を利用して一分子中に２分子の標識分子を導入することができる。例えば、蛍光物質、化学発光物質などを結合して、標識核酸を製造することにより、核酸検出の感度を向上させることが可能である。さらにＺ１１およびＺ１２が蛍光性を示す原子団である場合のように、特定の蛍光物質で標識することにより、核酸の検出を簡便に行うことも可能である。
【０１１０】
また、前記式（２１）または（２２）の化合物において、Ｚ１１およびＺ１２が蛍光性を示す原子団である化合物は、２分子の蛍光性分子、例えば、チアゾールオレンジ誘導体又はオキサゾールイエロー誘導体で修飾したヌクレオシドまたはヌクレオチドである。このような化合物を含む一本鎖核酸からなるプローブは、エキシトンカップリングによる消光が引き起こされることにより、プローブのみの状態では蛍光は極めて弱いが、ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズすることにより強い蛍光発光を示す。すなわち、例えば、チアゾールオレンジ誘導体又はオキサゾールイエロー誘導体の蛍光は、そのひずんだ構造により強く抑制されているが、チアゾールオレンジ誘導体又はオキサゾールイエロー誘導体は、ＤＮＡに結合することにより、構造のひずみが解消・固定化され、強い蛍光を示すようになる。蛍光は、例えば、４８８ｎｍ、５１４ｎｍのＡｒレーザーを使用して励起することにより検出できるが、これに限定されない。
【０１１１】
前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）で表される化合物は、例えば、ＥプライマーまたはＥプローブ（標識核酸）の合成に供することができる。すなわち、前記化合物は、核酸の標識物質（核酸ラベル化試薬）として用いることができる。例えば、前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）で表される化合物をヌクレオチド基質として用いて、一本核酸を鋳型とした核酸合成反応を行うことによって、あるいは、前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）で表される化合物を用いて一本鎖核酸を化学合成（例えば、核酸自動合成機を用いたホスホロアミダイト法などの化学合成法）することによって、一分子中に前記化合物を少なくとも１分子以上含む核酸を製造することができる。このとき、前記原子団Ｚ１１およびＺ１２は、それぞれ、蛍光性を示す原子団であっても良いが、水素原子または保護基であっても良い。前記原子団Ｚ１１およびＺ１２が、例えば、蛍光性を示す原子団であれば、本発明の標識プローブを製造でき、水素原子または保護基であれば、さらに、これらの原子や基を、蛍光性を示す原子団で置換することにより、本発明の標識プローブを製造できる。
【０１１２】
ＥプライマーまたはＥプローブに含まれる前記式（１）、（１ｂ）または（１ｃ）の化合物の数は特に限定されないが、例えば、１〜１００個程度、好ましくは１から２０個程度である。
【０１１３】
前記化合物または核酸（標識プローブ）は、例えば、下記式（２３）〜（２５）のいずれかで表される構造を有していても良い。これにより、例えば、色素を導入した蛍光プローブとして好ましく用いることができる。ただし、蛍光プローブとして好適な化合物は、これらに限定されない。
【化２３】
0005598784.tif 000081
【０１１４】
前記式（２３）において、塩基Ｂには、2個の色素（Fluo）が連結している。塩基Ｂがリンカーと結合する部位は特に制限されないが、例えば、ピリミジン4位、5位もしくは6位、プリン2位、3位、6位、7位もしくは8位のうち1ヶ所でリンカーに連結している。リンカーは、1ヶ所の塩基接続部位を有し、途中で2つ以上に分岐し、末端で色素と連結する。塩基もしくは色素との連結方法は、二重結合や三重結合に対する金属触媒反応や環形成縮合反応やマイケル付加反応などにより形成される結合のほかにも、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミン形成反応などにより形成される結合を用いることができる。リンカーについては、長さ（l,  m,  n）は自由であり、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、アミン、イミン、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合などを含んでもよい。また、2量化によって引き起こされるエキシトン効果を妨げないことが好ましい。分岐部（X）は、炭素、ケイ素、窒素、リン、ホウ素の各原子であり、プロトネーション（例えばNH+）や酸化（例えばP=O）が起こっていてもよい。色素は2量化によってエキシトン効果を示すものを用いることが好ましく、リンカーと接続する箇所は色素のどの部分でもよい。式（２３）中では、DNAの部分構造であるデオキシリボヌクレオチドが示されているが、それに代わって核酸骨格がリボヌクレオチド（RNA）のほか、2’-O-メチルRNAや2’-フルオロDNAなどの糖修飾核酸、ホスホロチオエート核酸などのリン酸修飾核酸、PNAやLNA（BNA）などの機能性核酸でもよい。
【０１１５】
【化２４】
0005598784.tif 000082
【０１１６】
前記式（２４）中、塩基Ｂには、2個の色素（Fluo）が連結している。塩基Ｂとリンカーとの結合箇所は、特に制限されないが、例えば、ピリミジン4位、5位もしくは6位、プリン2位、3位、6位、7位もしくは8位のうち2ヶ所でリンカーに連結している。２つのリンカーは、それぞれ1ヶ所の塩基接続部位を有し、もうひとつの末端で色素と連結する。塩基もしくは色素との連結方法は、二重結合や三重結合に対する金属触媒反応や環形成縮合反応やマイケル付加反応などにより形成される結合のほかにも、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミン形成反応などにより形成される結合を用いることができる。リンカーについては、長さ（l,  m）は自由であり、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、アミン、イミン、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合などを含んでもよい。また、2量化によって引き起こされるエキシトン効果を妨げないことが好ましい。色素は2量化によってエキシトン効果を示すものを用いることが好ましく、リンカーと接続する箇所は色素のどの部分でもよい。前記式（２４）中では、DNAの部分構造であるデオキシリボヌクレオチドが示されているが、それに代わって核酸骨格がリボヌクレオチド（RNA）のほか、2’-O-メチルRNAや2’-フルオロDNAなどの糖修飾核酸、ホスホロチオエート核酸などのリン酸修飾核酸、PNAやLNA（BNA）などの機能性核酸でもよい。
【０１１７】
【化２５】
0005598784.tif 000083
【０１１８】
前記式（２５）においては、連続するヌクレオチドの各塩基（B1,B2）にそれぞれ1個の色素（Fluo）を連結している。各塩基がリンカーと結合する箇所は特に制限されないが、例えば、ピリミジン4位、5位もしくは6位、プリン2位、3位、6位、7位もしくは8位のうち1ヶ所でリンカーに連結している。２つのリンカーは、それぞれ1ヶ所の塩基接続部位を有し、もうひとつの末端で色素と連結する。塩基もしくは色素との連結方法は、二重結合や三重結合に対する金属触媒反応や環形成縮合反応やマイケル付加反応などにより形成される結合のほかにも、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミン形成反応などにより形成される結合を用いることができる。リンカーについては、長さ（l,  m）は自由であり、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、アミン、イミン、エーテル結合、チオエーテル結合、チオエステル結合などを含んでもよい。また、2量化によって引き起こされるエキシトン効果を妨げないことが好ましい。色素は2量化によってエキシトン効果を示すものを用いることが好ましく、リンカーと接続する箇所は色素のどの部分でもよい。前記式（２５）中では、DNAの部分構造であるデオキシリボヌクレオチドが示されているが、それに代わって核酸骨格がリボヌクレオチド（RNA）のほか、2’-O-メチルRNAや2’-フルオロDNAなどの糖修飾核酸、ホスホロチオエート核酸などのリン酸修飾核酸、PNAやLNA（BNA）などの機能性核酸でもよい。
【０１１９】
なお、前記化合物または核酸（例えば、本発明の標識核酸）に互変異性体または立体異性体（例：幾何異性体、配座異性体および光学異性体）等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体も本発明に用いることができる。また、前記化合物または核酸の塩は、酸付加塩でも良いが、塩基付加塩でも良い。さらに、前記酸付加塩を形成する酸は無機酸でも有機酸でも良く、前記塩基付加塩を形成する塩基は無機塩基でも有機塩基でも良い。前記無機酸としては、特に限定されないが、例えば、硫酸、リン酸、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜フッ素酸、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜フッ素酸、亜塩素酸、亜臭素酸、亜ヨウ素酸、フッ素酸、塩素酸、臭素酸、ヨウ素酸、過フッ素酸、過塩素酸、過臭素酸、および過ヨウ素酸等があげられる。前記有機酸も特に限定されないが、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸等があげられる。前記無機塩基としては、特に限定されないが、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩等があげられ、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウム等があげられる。前記有機塩基も特に限定されないが、例えば、エタノールアミン、トリエチルアミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等があげられる。これらの塩の製造方法も特に限定されず、例えば、前記電子供与体・受容体連結分子に、前記のような酸や塩基を公知の方法により適宜付加させる等の方法で製造することができる。また、置換基等に異性体が存在する場合はどの異性体でも良く、例えば、「ナフチル基」という場合は、1-ナフチル基でも2-ナフチル基でも良い。
【０１２０】
また、本発明において、アルキル基としては、特に限定されないが、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基およびtert-ブチル基等が挙げられ、アルキル基を構造中に含む基（アルキルアミノ基、アルコキシ基等）においても同様である。また、ペルフルオロアルキル基としては、特に限定されないが、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基およびtert-ブチル基等から誘導されるペルフルオロアルキル基が挙げられ、ペルフルオロアルキル基を構造中に含む基（ペルフルオロアルキルスルホニル基、ペルフルオロアシル基等）においても同様である。本発明において、アシル基としては、特に限定されないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、シクロヘキサノイル基、ベンゾイル基、エトキシカルボニル基、等が挙げられ、アシル基を構造中に含む基（アシルオキシ基、アルカノイルオキシ基等）においても同様である。また、本発明において、アシル基の炭素数にはカルボニル炭素を含み、例えば、炭素数１のアルカノイル基（アシル基）とはホルミル基を指すものとする。さらに、本発明において、「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指すが、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。また、本発明において、アミノ基の保護基としては、特に制限されないが、例えば、トリフルオロアセチル基、ホルミル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基（例えばアセチル、エチルカルボニル等）、Ｃ１−６アルキル−スルホニル基、tert−ブチルオキシカルボニル基（以下、Ｂｏｃとも称する）、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、アリールカルボニル基（例えばフェニルカルボニル、ナフチルカルボニル等）、アリールスルホニル基（例えばフェニルスルホニル、ナフチルスルホニル等）、Ｃ１−６アルキルオキシ−カルボニル基（例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル等）、Ｃ７−１０アラルキル−カルボニル基（例えばベンジルカルボニル等）、メチル基、アラルキル基（例えばベンジル、ジフェニルメチル、トリチル基等）、等が用いられる。これらの基は１ないし３個のハロゲン原子（例えばフッ素、塩素、臭素等）、ニトロ基等で置換されていてもよく、その具体例としては、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基、ｍ−クロロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。また、本発明において、水酸基の保護基（酸で脱保護することが可能なものを含む）としては、特に制限されないが、例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ピクシル基などが挙げられる。
【０１２１】
ＥプライマーまたはＥプローブの製造方法は、特に限定されず、例えば、公知の合成方法（製造方法）を適宜参考にしても良い。具体的には、例えば、以下のように、特許第4370385号公報に開示されている方法を参考にしても良い。
【０１２２】
一例として、前記式（２１）で表される化合物の場合は、下記式（２６）で示される化合物のカルボキシル基を活性化した後、トリス（２−アミノエチル）アミンを反応させる工程；アミノ基を保護する工程：及び上記で得られた化合物中に存在する水酸基を保護基で保護する反応と、得られた化合物中に存在する水酸基にリン酸又はホスホロアミダイト基を付加する反応とを行う工程を含む製造方法により製造してもよい。
【化２６】
0005598784.tif 000084
前記式（２６）中、Ａは水素原子または水酸基を示す。Ｂはアデニン、グアニン、シトシン、チミン又はウラシルの残基を示す。
【０１２３】
ＥプライマーまたはＥプローブの製造に応用できる製造方法（合成方法）としては、例えば、以下の方法がある。すなわち、まず、DNAの簡便なラベル化法として、DNA中の活性なアミノ基とラベル化剤中の活性化されたカルボキシル基とを緩衝溶液中で反応させる方法が広く用いられている。この方法は、本発明の化合物または核酸のいずれの製造にも応用可能であり、特に、リンカーまたは色素の導入に応用できる。アミノ基の導入法としては、GLEN  RESEARCH社が販売しているAmino  modifierホスホロアミダイトを利用する方法などがある。
【０１２４】
前記原子団Ｚ１１およびＺ１２は、例えば、保護基から水素原子に変換し（保護基を外し）、さらに、水素原子から、蛍光性を有する原子団（色素）で置換することができる。保護基を外す方法は特に制限されず、公知の方法を適宜用いることができる。蛍光性を有する原子団（色素）で置換する方法も特に制限されず、例えば、Ｚ１１およびＺ１２が水素原子である本発明の化合物または核酸と、蛍光性分子（色素）とを適宜反応させればよい。例えば、Ｚ１１およびＺ１２の少なくとも一方が活性アミノ基であると、蛍光性分子（色素）と反応しやすいため好ましく、Ｚ１１およびＺ１２の両方が活性アミノ基であることがより好ましい。蛍光性分子（色素）も特に制限されないが、例えば、前記式（７）〜（９）のいずれかで表される化合物（ただし、Ｒ１１およびＲ１２のいずれもが、水素原子もしくは低級アルキル基、またはカルボキシポリメチレン基である）であっても良い。また、核酸（ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシド）の場合、保護基を外す工程および蛍光性を有する原子団（色素）で置換する工程は、重合（核酸合成）の前でもよいし、後でもよい。例えば、合成工程で色素部分がダメージを受けることを防止する観点から、重合（核酸合成）の後に蛍光性を有する原子団（色素）を導入することが好ましい。
【０１２５】
色素としては、前述の通り、特に制限されず、あらゆる色素が使用可能であるが、例えば、シアニン色素が好ましく、チアゾールオレンジが特に好ましい。シアニン色素は、例えば、ヘテロ原子を有する２つの複素環がメチンリンカーで結ばれた化学構造をしている。複素環の種類やメチンリンカーの長さを変えること、または複素環への置換基導入などにより、さまざまな励起・発光波長の蛍光色素を合成することが可能である。また、DNA導入のためのリンカー導入も比較的容易である。なお、チアゾールオレンジは水中でほとんど蛍光を出さないが、DNAまたはRNAと相互作用することにより強い蛍光を発する。核酸との相互作用により、色素分子間の相互作用が抑制されること、そして色素分子の２つの複素環の間のメチンリンカー周りの回転が抑制されることが蛍光強度の増加につながると考えられている。なお、チアゾールオレンジ色素の使用方法については、良く知られているが、例えば、H.  S.  Rye,  M.  A.  Quesada,  K.  Peck,  R.  A.  Mathies  and  A.  N.  Glazer,  High-sensitivity  two-color  detection  of  double-stranded  DNA  with  a  confocal  fluorescence  gel  scanner  using  ethidium  homodimer  and  thiazole  orange,  Nucleic  Acids  Res.,  1991,  19,  327-33；及びL.  G.  Lee,  C.  H.  Chen  and  L.  A.  Chiu,  Thiazole  orange:  a  new  dye  for  reticulocyte  analysis,  Cytometry,  1986,  7,  508-17を参照して用いることができる。
【０１２６】
本発明において、ＥプライマーまたはＥプローブの基本骨格は、前述の通り、特に制限されず、例えば、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、修飾オリゴヌクレオシド、ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、修飾ポリヌクレオシド、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＬＮＡ、またはＰＮＡ（ペプチド核酸）のいずれであっても良いし、その他の構造であっても良い。ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾ＤＮＡを基本骨格とする方が合成が容易であり、色素での置換（色素分子の導入）等もしやすいため好ましい。ＬＮＡまたはＰＮＡに色素分子を導入する方法は特に制限されず、公知の方法を適宜用いることができる。具体的には、例えば、Analytical  Biochemistry  2000,  281,  26-35.  Svanvik,  N.,  Westman,  G.,  Wang,  D.,  Kubista,  M.  (2000)  Anal  Biochem.  281,  26-35.  Hrdlicka,  P.  J.,  Babu,  B.  R.,  Sorensen,  M.  D.,  Harrit,  N.,  Wengel,  J.  (2005)  J.  Am.  Chem.  Soc.  127,  13293-13299.等を参照することができる。
【０１２７】
オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、修飾オリゴヌクレオシド、ポリヌクレオチド、修飾ポリヌクレオチド、ポリヌクレオシド、修飾ポリヌクレオシド、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾ＤＮＡを基本骨格とする核酸の合成方法は良く知られており、例えば、いわゆるホスホロアミダイト法等により合成することができる。その原料となるホスホロアミダイト試薬も、公知の方法で簡便に合成することができる。本発明の核酸がＤＮＡ、特に短いオリゴＤＮＡの場合、例えば、ＤＮＡ自動合成機等で簡便に合成することができる。また、例えば、ＰＣＲ等により、長鎖状の核酸（ＤＮＡ）等を合成することもできる。ＤＮＡと色素分子との結合箇所は、前述の通り特に制限されないが、例えば、チミジンの5位が特に好ましい。チミジンの5位からさまざまな置換基を伸ばしたヌクレオチド誘導体の三リン酸はＤＮＡポリメラーゼによる導入効率が比較的良いことが知られている。これにより、例えば、本発明の核酸が、短いオリゴＤＮＡである場合のみならず、長鎖ＤＮＡである場合にも簡便な合成が可能である。
【０１２８】
特に、例えば、チアゾールオレンジを利用した、一本鎖DNAである本発明の蛍光プローブ（標識核酸）は、例えば、（１）DNA自動合成機で合成したDNAに緩衝溶液中で色素をつけるだけで調製でき、合成的に容易である、（２）酵素的に調製した長鎖DNAと色素を反応させることで、長鎖の蛍光プローブの作製も可能である、などの利点を有している。また、例えば、500nm付近の比較的長波長の光で励起できる。
【０１２９】
次に、ＥプライマーまたはＥプローブが有する蛍光性原子団について説明する。前記蛍光性原子団は、例えば、
（i）  一つの分子内の二つの平面化学構造が同一平面内ではなく、ある一定の角度をもって存在するが、その分子が核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには二つの平面化学構造が同一平面内に並ぶように配置することによって蛍光発光が生じるものであるか、
（ii）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子がターゲット分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子群からなるものであるか、または、
（iii）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子がターゲット分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴とするものである。
前記（ii）または（iii）の場合において、前記色素分子が、前記（i）記載の分子であることが好ましい。
【０１３０】
前記式中、Ｚ１１およびＺ１２が、エキシトン効果を示す原子団であることにより、ターゲット分子と結合したときの蛍光色素周りの環境変化、例えばＤＮＡが２本鎖形成となったときの蛍光の増大が大きくなり、いっそう効果的に検出することができる。
【０１３１】
色素としては、前述の通り、特に制限されず、あらゆる色素が使用可能であるが、例えば、シアニン色素が好ましく、チアゾールオレンジが特に好ましい。シアニン色素は、例えば、ヘテロ原子を有する２つの複素環がメチンリンカーで結ばれた化学構造をしている。複素環の種類やメチンリンカーの長さを変えること、または複素環への置換基導入などにより、さまざまな励起・発光波長の蛍光色素を合成することが可能である。また、ＤＮＡ導入のためのリンカー導入も比較的容易である。なお、チアゾールオレンジは水中でほとんど蛍光を出さないが、ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用することにより強い蛍光を発する。核酸との相互作用により、色素分子間の相互作用が抑制されること、そして色素分子の２つの複素環の間のメチンリンカー周りの回転が抑制されることが蛍光強度の増加につながると考えられている。なお、チアゾールオレンジ色素の使用方法については、良く知られているが、例えば、H.  S.  Rye,  M.  A.  Quesada,  K.  Peck,  R.  A.  Mathies  and  A.  N.  Glazer,  High−sensitivity  two−color  detection  of  double−stranded  DNA  with  a  confocal  fluorescence  gel  scanner  using  ethidium  homodimer  and  thiazole  orange,  Nucleic  Acids  Res.,  1991,  19,  327−33；及びL.  G.  Lee,  C.  H.  Chen  and  L.  A.  Chiu,  Thiazole  orange:  a  new  dye  for  reticulocyte  analysis,  Cytometry,  1986,  7,  508−17を参照して用いることができる。
【０１３２】
以下に実施例を記載する。ただし本発明は、以下の実施例によりなんら制限および限定されない。
【実施例】
【０１３３】
核酸分子の合成は、以下の合成例に基づき、またはこれに準じて行った。これらの合成方法（製造方法）は、特許第4370385号の実施例に記載の合成方法と同様である。【０１３４】
［中間体合成例１〜３］
下記スキーム１にしたがって、２つの活性アミノ基がそれぞれトリフルオロアセチル基で保護された化合物１０２および１０３を合成（製造）し、さらに、ホスホロアミダイト１０４を合成した。
【化Ｓ１】
0005598784.tif 000085
スキーム１  反応試薬と反応条件  (a)  (i)  N-hydroxysuccinimide,  EDC/DMF,  (ii)  tris(2-aminoethyl)-  amine/CH3CN,  (iii)  CF3COOEt,  Et3N;  (b)  DMTrCl/pyridine;  (c)  2-cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropyl  phosphoramidite,  1H-tetrazole/CH3CN.【０１３５】
前記スキーム１について、より詳しくは以下の通りである。【０１３６】
［中間体合成例１：2-[2-[N,N-ビス(2-トリフルオロアセトアミドエチル)]-アミノエチル]カルバモイル-(E)-ビニル)-２'-デオキシウリジン(2-[2-[N,N-bis(2-  trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-  deoxyuridine、化合物１０２)の合成］
出発原料の(E)-5-(2-カルボキシビニル)-2'-デオキシウリジン（(E)-5-(2-carboxyvinyl)-2'-  deoxyuridine、化合物１０１）は、Tetrahedron  1987,  43,  20,  4601-4607に従って合成した。すなわち、まず、430mgの酢酸パラジウム(II)(FW224.51)と1.05gのトリフェニルホスフィン  (FW262.29)に71mLの1,4-ジオキサンを加え、さらに7.1mLのトリエチルアミン(FW101.19,  d=0.726)を加え、70℃で加熱撹拌した。反応溶液が赤褐色から黒褐色に変化したら14.2gの2'-デオキシ-5-ヨードウリジン  (FW354.10)と7.0mLのアクリル酸メチル(FW86.09,d=0.956)を1,4-ジオキサンに懸濁させたものを加え、125℃で1時間加熱還流させた。その後、熱いうちにろ過し、メタノールで残さを洗浄し、ろ液を回収した。そのろ液から溶媒を減圧留去した後、シリカゲルカラムで生成物を精製した(5-10%  メタノール/ジクロロメタン)。集めたフラクションの溶媒を減圧留去し、残った白色固体を減圧下で乾燥した。その乾燥固体に約100mLの超純水を加え、3.21gの水酸化ナトリウム(FW40.00)を加え、25℃で終夜撹拌した。その後、濃塩酸を加えて溶液を酸性にし、生じた沈殿をろ過、超純水で洗浄し、減圧下で乾燥した。これにより、目的化合物（化合物１０１）8.10g(収率68%)を白色粉末として得た。なお、前記白色粉末が目的化合物１０１であることは、1HNMR測定値が文献値と一致することから確認した。また、13CNMR測定値を以下に記す。【０１３７】
(E)-5-(2-カルボキシビニル)-2'-デオキシウリジン（化合物１０１）：13CNMR(DMSO-d6):δ168.1,  161.8,  149.3,  143.5,  137.5,  117.8,  108.4,  87.6,  84.8,  69.7,  60.8,  40.1.【０１３８】
次に、1.20gの(E)-5-(2-カルボキシビニル)-2'-デオキシウリジン１０１(分子量298.25)と925mgのN-ヒドロキシスクシンイミド(分子量115.09)と1.54gの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(分子量191.70)を撹拌子の入ったナスフラスコに入れ、20mLのDMFを加えて、25℃で16時間撹拌した。約1mLの酢酸を加え、300mLの塩化メチレンと100mLの超純水を加え、激しく撹拌した。水層を除き、さらに100mLの超純水を加え、同様に2回洗浄した。生じた沈殿をろ過し、塩化メチレンで洗浄し、減圧下で乾燥した。ろ液から溶媒を留去し、生じた沈殿に塩化メチレンを加えて、沈殿を前記と同様に回収した。回収した沈殿を全て合わせ、それを80mLのアセトニトリルに懸濁させ、激しく撹拌した。そこに3.0mLのトリス(2-アミノエチル)アミン(分子量146.23,  d=0.976)を一気に加え、25℃でさらに10分間撹拌した。その後、4.8mLのトリフルオロ酢酸エチル(分子量142.08,  d=1.194)を加え、さらに5.6mLのトリエチルアミン(分子量101.19,  d=0.726)を加え、25℃で3時間撹拌した。溶媒を留去し、シリカゲルカラムで精製した(5-10%  MeOH/CH2Cl2)。溶媒を留去し、少量のアセトンに溶解させ、エーテルを加えると白色沈殿を生じた。ろ過、エーテルで洗浄後、減圧下で乾燥し、884mg(33.5%)の目的物質（化合物１０２）を得た。【０１３９】
なお、原料、溶媒等の使用量、反応時間および工程を若干変化させる以外は上記と同様に合成したところ、収率を37％まで向上させることができた。すなわち、597mg(2.0mmol)の(E)-5-(2-カルボキシビニル)-2'-デオキシウリジン１０１(分子量298.25)と460mg(4.0mmol)のN-ヒドロキシスクシンイミド(分子量115.09)と(767mg,  4.0mmol)の1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド  ヒドロクロリド(分子量191.70)を撹拌子の入ったナスフラスコに入れ、5.0mLのDMFを加えて、25℃で3時間撹拌した。約0.5mLの酢酸を加え、100mLの塩化メチレンと100mLの超純水を加え、激しく撹拌した。生じた沈殿をろ過し、水で洗浄し、減圧下で終夜乾燥させた。得られた白色の残渣を50mLのアセトニトリルに懸濁させ、激しく撹拌した。そこに3.0mL(20mmol)のトリス(2-アミノエチル)アミン(分子量146.23,  d=0.976)を一気に加え、25℃でさらに10分間撹拌した。その後、4.8mLのトリフルオロ酢酸エチル(分子量142.08,  d=1.194)を加え、さらに5.6mL(40mmol)のトリエチルアミン(分子量101.19,  d=0.726)を加え、25℃で16時間撹拌した。溶媒を留去し、シリカゲルカラムで精製した(5-10%  MeOH/CH2Cl2)。溶媒を留去し、少量のアセトンに溶解させ、エーテルを加えると白色沈殿を生じた。ろ過、エーテルで洗浄後、減圧下で乾燥し、453mg(37%)の目的物質（化合物１０２）を白色粉末として得た。以下に、化合物１０２の機器分析値を示す。【０１４０】
2-[2-[N,N-ビス  (2-トリフルオロアセトアミドエチル)]-アミノエチル]カルバモイル-(E)-ビニル)-２'-デオキシウリジン(化合物１０２)：
1HNMR(CD3OD):δ8.35(s,1H),  7.22(d,  J=15.6Hz,  1H),  7.04(d,  J=15.6Hz,  1H),  6.26(t,  J=6.6Hz,  1H),  4.44-4.41(m,  1H),  3.96-3.94(m,  1H),  3.84(dd,  J=12.2,  2.9Hz,  1H),  3.76(dd,  J=12.2,  3.4Hz,  1H),  3.37-3.30(m,  6H),  2.72-2.66(m,  6H),  2.38-2.23(m,  2H).13CNMR(CD3OD):δ169.3,  163.7,  159.1(q,J=36.4Hz),  151.2,  143.8,  134.3,  122.0,  117.5(q,J=286Hz),  110.9,  89.1,  87.0,  71.9,  62.5,  54.4,  53.9,  41.7,  38.9,  38.7.  HRMS(ESI)  calcd  for  C22H29F6N6O8  ([M+H]+)  619.1951,  found  619.1943.【０１４１】
［中間体合成例２：5'-O-ジメトキシトリチル-(２-[２-[N,N-ビス(２-トリフルオロアセタミドエチル)]-アミノエチル]カルバモイル  -(E)-ビニル)-2'-デオキシウリジン(5'-O-DMTr-(2-[2-[N,N-bis(2-  trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-  deoxyuridine、化合物１０３)の合成］
化合物１０２の5'-水酸基をDMTr基で保護し、化合物１０３を得た。すなわち、まず、618mgの化合物１０２(分子量618.48)と373mgの4,4'-ジメトキシトリチルクロリド(分子量338.83)を撹拌子の入ったナスフラスコに入れ、10mLのピリジンを加えて、25°で16時間撹拌した。少量の水を加え、溶媒を留去し、シリカゲルカラムで精製した(2-4%  MeOH,  1%  Et3N/CH2Cl2)。目的化合物１０３を含むフラクションの溶媒を留去し、735.2mg(79.8%)の目的物質（化合物１０３）を得た。以下に、化合物１０３の機器分析値を示す。【０１４２】
5'-O-(ジメトキシトリチル)-(２-[２-[N,N-ビス(２-トリフルオロアセタミドエチル)]-アミノエチル]カルバモイル-(E)-ビニル)-2'-デオキシウリジン(化合物１０３)：
1HNMR(CD3OD):δ7.91(s,  1H),  7.39-7.11(m,  9H),  7.02(d,  J=15.6Hz,  1H),  6.93(d,  J=15.6Hz,  1H),  6.80-6.78(m,  4H),  6.17(t,  J=6.6Hz,  1H),  4.38-4.35(m,  1H),  4.06-4.04(m,  1H),  3.68(s,  6H),  3.32-3.22(m,  8H),  2.66-2.55(m,  6H),  2.40(ddd,  J=13.7,  5.9,  2.9Hz,  1H),  2.33-2.26(m,  1H).13CNMR(CD3OD):δ168.9,  163.7,  160.1,  159.1(q,  J=36.9Hz),  151.0,  146.1,  143.0,  137.0,  136.9,  134.1,  131.24,  131.16,  129.2,  128.9,  128.0,  122.5,  117.5(q,  J=286.7Hz),  114.2,  110.9,  88.1,  87.9,  87.6,  72.6,  65.0,  55.7,  54.2,  53.9,  41.7,  38.9,  38.6.  HRMS(ESI)  calcd  for  C43H47F6N6O10([M+H]+)  921.3258,  found  921.3265.【０１４３】
［中間体合成例３：5'-O-(ジメトキシトリチル)-(2-[2-[N,N-ビス(2-トリフルオロアセタミドエチル)]-アミノエチル]カルバモイル  -(E)-ビニル)-2'-デオキシウリジン  3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホロアミダイト(5'-O-DMTr-(2-[2-[N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)]-aminoethyl]carbamoyl-(E)-vinyl)-2'-deoxyuridine,  3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite、化合物１０４)の合成］
188mg（0.20mmol）の化合物１０３(分子量920.85)をCH3CNと共沸させ、28.6mg（0.40mmol）の1H-テトラゾール(分子量70.05)を加え、真空ポンプで一晩吸引乾燥した。5.1mLのCH3CNを加えて試薬を溶解後、撹拌し、194μL（0.60mmol）の2-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロアミダイト(分子量  301.41,  d=0.949)を一気に加え25℃で2時間撹拌した。50mLの酢酸エチルと50mLの飽和重曹水を混合したものを加え、分液し、有機層を飽和食塩水で  洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムをろ過により除去した後、溶媒を留去した。この分液による粗生成物をCH3CN共沸後、収率100%で生成物(化合物１０４)を得たと仮定して0.1MのCH3CN溶液とし、DNA合成に使用した。なお、化合物１０４が得られていることは、前記粗生成物の31PNMR(CDCl3)とHRMS(ESI)から確認した。これらの値を以下に示す。【０１４４】
化合物１０４：
31PNMR(CDCl3)  δ  149.686,  149.430;  HRMS  (ESI)  calcd  for  C52H64F6N8O11P([M+H]+)  1121.4336,  found  1121.4342.【０１４５】
［中間体合成例４：DNAオリゴマー合成］
【化Ｓ２】
0005598784.tif 000086
【０１４６】
化合物１０４を用いたDNA自動合成機によるオリゴDNA合成は、1μmolスケールで通常のホスホロアミダイト法(DMTr  OFF)によって行い、後述の実施例に示す配列のDNAオリゴマーを合成した。脱保護は、濃アンモニア水（28質量％）により、55℃で16時間行った。スピードバックでアンモニアを揮発させ、0.45μmフィルターに通した後、切り出したDNAオリゴマーを逆相HPLCにより分析し、約10.5分に現れたピークを精製した(CHEMCOBOND  5-ODS-H（商品名）10×150mm、3mL/min、5-30%  CH3CN/50mM  TEAAバッファー  pH7(20分)、260nmで検出)。精製した生成物はMALDI  TOFマスのネガティブモードにより分子量を測定し、目的の配列を有することが確認された。【０１４７】
なお、合成した各DNAの濃度を決定するために、精製した各DNAを、ウシ腸アルカリホスファターゼ(50U/mL)、ヘビ毒液ホスホジエステラーゼ(0.15U/mL)およびP1ヌクレアーゼ(50U/mL)により、25℃で16時間かけて完全消化した。得られた消化液を、CHEMCOBOND  5-ODS-H（商品名）カラム(4.6×150mm)のHPLCで解析した。その際、展開液としては0.1M  TEAA（pH  7.0）を用い、流速は1.0mL/minとした。前記合成したDNAの濃度は、dA、dC、dGおよびdTをそれぞれ0.1mM濃度で含む標準溶液の  ピーク面積と比較して決定した。さらに、前記合成したDNAは、MALDI  TOFマススペクトルによっても同定した。【０１４８】
［核酸分子合成例：チアゾールオレンジから誘導される構造を１分子中に２箇所有する核酸分子の合成］
【化Ｓ４】
0005598784.tif 000087
【０１４９】
上記スキーム４の通り、チアゾールオレンジから誘導される構造を１分子中に２箇所有するDNAオリゴマー（オリゴヌクレオチド）１１０を合成した。より詳しくは、以下の通りである。【０１５０】
チアゾールオレンジ誘導体１０７の合成は、Organic  Letters  2000,  6,  517-519を参考に下記スキーム５の通り行った。
【化Ｓ５】
0005598784.tif 000088
【０１５１】
（１）N-メチルキノリニウムヨージド（化合物１１１）の合成
まず、N-メチルキノリニウムヨージド（化合物１１１）を、前記文献の記載に従って合成した。具体的には、無水ジオキサン42mL中に、キノリン2.4mLとヨウ化メチル4mLを加え、150℃で1時間撹拌した後、ろ過によって沈殿物を集め、エーテル及び石油エーテルで洗浄、乾燥し、N-メチルキノリニウムヨージド（化合物１１１）を得た。【０１５２】
（２）3-(4-カルボキシブチル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミド（化合物１１２）の合成
8mLの2-メチルベンゾチアゾール(FW149.21,  d=1.173)と9.4gの5-ブロモ吉草酸（5-ブロモペンタン酸）(FW181.03)を110℃で16時間撹拌した。粗生成物を室温に冷却し、生じた固体をメタノール20mLに懸濁させ、さらにエーテル40mLを加えた。生じた沈殿をろ過し、ジオキサンで2-メチルベンゾチアゾールの匂いがなくなるまで洗浄し、エーテルでさらに洗浄し、減圧下で乾燥して9.8gの白色粉末を得た。この白色粉末の1HNMRを測定したところ、２位がアルキル化された目的物3-(4-カルボキシブチル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミド（化合物１１２）と、２位がアルキル化されていない3-(4-カルボキシブチル)-ベンゾチアゾリウム  ブロミドとの混合物であった。プロトンのピーク比は、アルキル化されていないもの：アルキル化されたもの＝10：3であった。この粗生成物を、そのまま次の反応に用いた。【０１５３】
（３）1-メチル-4-[{3-(4-カルボキシブチル)-2(3H)-ベンゾチアゾリリデン}メチル]キノリニウム  ブロミド（化合物１０７）の合成
上記（２）で得られた、3-(4-カルボキシブチル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミド（化合物１１２）を含む粗生成物2.18gと、700mgのN-メチルキノリニウムヨージド（化合物１１１）(FW271.10)を、3.6mLのトリエチルアミン(FW101.19,  d=0.726)存在下、10mLの塩化メチレン中、25℃で2時間撹拌した。その後、エーテル50mLを加え、生じた沈殿を濾取し、エーテルで洗浄し、減圧下で乾燥した。その沈殿を超純水50mLに懸濁させ、濾取し、超純水で洗浄し、減圧下で乾燥した。さらに前記沈殿をアセトニトリル50mLに懸濁させ、濾取し、アセトニトリルで洗浄し、減圧下で乾燥させて307.5mgの赤色粉末を得た(収率25.3%)。この赤色粉末が目的物（化合物１０７）であることは、1HNMRスペクトルを文献値と対比して確認した。【０１５４】
また、3-(4-カルボキシブチル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミド（化合物１１２）および1-メチル-4-[{3-(4-カルボキシブチル)-2(3H)-ベンゾチアゾリリデン}メチル]キノリニウム  ブロミド（化合物１０７）は、以下のようにしても合成することができた。すなわち、まず、11.7mL(92mmol)の2-メチルベンゾチアゾール(FW149.21,  d=1.173)と13.7g(76mmol)の5-ブロモ吉草酸（5-ブロモペンタン酸）(FW181.03)を150℃で1時間撹拌した。粗生成物を室温に冷却し、生じた固体をメタノール50mLに懸濁させ、さらにエーテル200mLを加えた。生じた沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧下で乾燥して19.2gの淡紫色粉末を得た。この粉末は、目的化合物１１２（3-(4-カルボキシブチル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミド）と2-メチルベンゾチアゾリウムブロミドとの混合物であった。この混合物を1HNMR（in  DMSO-d6）測定し、8.5ppmのピーク（目的化合物１１２由来）と、8.0ppmのピーク（2-メチルベンゾチアゾリウムブロミド由来）とのピーク面積比から、目的化合物１１２の収量を9.82g(14mmol,  32%)と算出した。この混合物（粗生成物）は、精製せずに次の反応に使用した。なお、5-ブロモ吉草酸（5-ブロモペンタン酸）を4-ブロモ酪酸（4-ブロモブタン酸）に変える以外は同様の方法でリンカー（カルボキシル基に連結したポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝３の3-(4-カルボキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドを合成したところ、収率４％で得られた。また、5-ブロモ吉草酸（5-ブロモペンタン酸）を6-ブロモヘキサン酸に変える以外は同様の方法でリンカー（カルボキシル基に連結したポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝５の3-(4-カルボキシペンチル)-2-メチルベンゾチアゾリウムブロミドを合成したところ、収率３５％で得られた。さらに、5-ブロモ吉草酸（5-ブロモペンタン酸）を7-ブロモヘプタン酸に変える以外は同様の方法でリンカー（カルボキシル基に連結したポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝６の3-(4-カルボキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドを合成したところ、収率２２％で得られた。【０１５５】
次に、化合物１１２（3-(4-カルボキシブチル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミド）と2-メチルベンゾチアゾリウムブロミドとを含む前記混合物（粗生成物）3.24gに、1.36g(5.0mmol)のN-メチルキノリニウム  ヨージド（化合物１１１）(FW271.10)、7.0mL(50mmol)のトリエチルアミン(FW101.19,  d=0.726)、および100mLの塩化メチレンを加え、透明な溶液を得た。この溶液を、25℃で16時間攪拌した。その後、溶媒を減圧留去した。残渣にアセトン（200mL）を加え、得られた沈殿を濾取し、アセトンで洗浄した。そうして得られた残渣を減圧乾燥し、乾燥後の赤色残渣を蒸留水（50mL）で洗浄した。これをさらに濾取し、蒸留水で洗浄し、減圧下で乾燥させて、目的物（化合物１０７）を赤色粉末として得た(654mg,  1.39mmol,  28%)この赤色粉末が目的物（化合物１０７）であることは、1HNMRスペクトルを文献値と対比して確認した。以下に、1HNMRおよび13CNMR(DMSO-d6)のピーク値と、HRMS(ESI)の測定値を示す。【０１５６】
化合物１０７：1HNMR(DMSO-d6):δ  8.74(d,  J=8.3Hz,  1H),  8.51(d,  J=7.3Hz,  1H),  7.94-7.89(m,  3H),  7.74-7.70(m,  1H),  7.65(d,  J=8.3Hz,  1H),  7.55-7.51(m,  1H),  7.36-7.32(m,  1H),  7.21(d,  J=7.3Hz,  1H),  6.83(s,  1H),  4.47(t,  J=7.1Hz,  2H),  4.07(s,  3H),  2.22(t,  J=6.6Hz,  1H),  1.77-1.63(m,  4H);  13CNMR(DMSO-d6,  60℃)  δ  174.6,  158.8,  148.4,  144.5,  139.5,  137.6,  132.7,  127.9,  126.8,  125.5,  124.1,  123.7,  123.6,  122.4,  117.5,  112.6,  107.6,  87.4,  45.6,  42.0,  35.5,  26.2,  22.3;  HRMS  (ESI)  calcd  for  C23H23N2O2S  ([M.Br]+)  391.1480,  found  391.1475.【０１５７】
なお、リンカー（カルボキシル基に連結したポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝３の4-((3-(3-カルボキシプロピル)ベンゾ[d]チアゾール-2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウム  ブロミドを、前記3-(4-カルボキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドと2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドの混合物から上記化合物１０７と同様の方法で合成したところ、収率４３％で得られた。以下に、機器分析値を示す。【０１５８】
4-((3-(3-カルボキシプロピル)ベンゾ[d]チアゾール-2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウムブロミド：
1HNMR  (DMSO-d6)  δ  8.85  (d,  J=8.3Hz,  1H),  8.59  (d,  J=7.3Hz,  1H),  8.02.7.93  (m,  3H),  7.78.7.70  (m,  2H),  7.61.7.57  (m,  1H),  7.42.7.38  (m,  1H),  7.31  (d,  J=6.8Hz,  1H),  7.04  (s,  1H),  4.47  (t,  J=8.1Hz,  2H),  4.13  (s,  3H),  2.52.2.48  (m,  2H),  1.99.1.92  (m,  2H);  13CNMR  (DMSO-d6,  60℃)  δ  174.3,  158.9,  148.6,  144.5,  139.5,  137.7,  132.7,  127.9,  126.7,  125.6,  124.1,  124.0,  123.7,  122.5,  117.5,  112.5,  107.6,  87.7,  45.6,  42.0,  31.6,  22.4;  HRMS  (ESI)  calcd  for  C22H21N2O2S  ([M.Br]+)  377.1324,  found  377.1316.【０１５９】
また、リンカー（カルボキシル基に連結したポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝５の4-((3-(3-カルボキシペンチル)ベンゾ[d]チアゾール-2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウムブロミドを、前記3-(4-カルボキシペンチル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドと2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドの混合物から上記化合物１０７と同様の方法で合成したところ、収率２６％で得られた。以下に、機器分析値を示す。【０１６０】
4-((3-(3-カルボキシペンチル)ベンゾ[d]チアゾール-2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウムブロミド：
1HNMR(DMSO-d6)  δ  8.70  (d,  J=8.3Hz,  1H),  8.61(d,  J=6.8Hz,  1H),  8.05.8.00(m,  3H),  7.80.7.73(m,  2H),  7.60.7.56(m,  1H),  7.41.7.35(m,  2H),  6.89(s,  1H),  4.59(t,  J=7.3Hz,  2H),  4.16(s,  3H),  2.19(t,  J=7.3Hz,  1H),  1.82.1.75(m,  2H),  1.62.1.43(m,  4H);  13CNMR  (DMSO-d6,  60℃)  δ  174.5,  159.0,  148.6,  144.7,  139.7,  137.8,  132.9,  127.9,  126.9,  125.2,  124.2,  123.8,  123.6,  122.6,  117.8,  112.6,  107.7,  87.4,  45.6,  42.1,  36.0,  26.3,  25.9,  24.9;  HRMS(ESI)  calcd  for  C24H25N2O2S  ([M.Br]+)  405.1637,  found  405.1632.【０１６１】
さらに、リンカー（カルボキシル基に連結したポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝６の4-((3-(3-カルボキシヘキシル)ベンゾ[d]チアゾール  -2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウムブロミドを、前記3-(4-カルボキシヘキシル)-2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドと2-メチルベンゾチアゾリウム  ブロミドの混合物から上記化合物１０７と同様の方法で合成したところ、収率２２％で得られた。以下に、機器分析値を示す。【０１６２】
4-((3-(3-カルボキシヘキシル)ベンゾ[d]チアゾール-2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウムブロミド：
1HNMR(DMSO-d6)  δ  8.72(d,  J=8.3Hz,  1H),  8.62(d,  J=6.8Hz,  1H),  8.07.8.01(m,  3H),  7.81.7.75(m,  2H),  7.62.7.58(m,  1H),  7.42.7.38(m,  2H),  6.92(s,  1H),  4.61(t,  J=7.3Hz,  2H),  4.17(s,  3H),  2.18(t,  J=7.3Hz,  1H),  1.82.1.75(m,  2H),  1.51.1.32(m,  6H);  13CNMR(DMSO-d6,  60℃)  δ  174.0,  159.1,  148.6,  144.7,  139.8,  137.8,  132.9,  127.9,  126.8,  125.0,  124.2,  123.8,  123.6,  122.6,  118.0,  112.7,  107.8,  87.4,  45.5,  42.1,  33.4,  27.9,  26.4,  25.5,  24.1;  HRMS(ESI)  calcd  for  C25H27N2O2S  ([M.Br]+)  419.1793,  found  419.1788.【０１６３】
（４）N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル１０９の合成
9.4mg（20μmol）の1-メチル-4-[{3-(4-カルボキシブチル)-2(3H)-ベンゾチアゾリリデン}メチル]キノリニウム  ブロミド（化合物１０７）(FW471.41)、4.6mg（40μmol）のN-ヒドロキシコハク酸イミド（化合物１０８）(FW115.09)、およ  び7.6mg（40μmol）のEDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）(FW191.70)を、1mLのDMF中において25℃で16時間撹拌し、色素（化合物１０７）のカルボキシ基が活性化されたN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（化合物１０９）を得た。この反応生成物は、精製せず、反応溶液(色素20mM)をそのままオリゴマーDNA（オリゴヌクレオチド）１０５との反応に使用した。【０１６４】
さらに、原料として、化合物１０７に代えてリンカー（ポリメチレン鎖）の炭素数を変化させた化合物を用いる以外は上記化合物１０９と同様の方法で、リンカー（ポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝３の4-((3-(4-(スクシンイミジルオキシ)-4-オキソブチル)ベンゾ[d]チアゾール-2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウム  ブロミドを合成した。さらに、同様に、リンカー（ポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝５の4-((3-(4-(スクシンイミジルオキシ)-4-オキソヘキシル)ベンゾ[d]チアゾール-2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウム  ブロミドと、リンカー（ポリメチレン鎖）の炭素数ｎ＝６の4-((3-(4-(スクシンイミジルオキシ)-4-オキソヘプチル)ベンゾ[d]チアゾール  -2(3H)-イリデン)メチル)-1-メチルキノリニウム  ブロミドとを合成した。【０１６５】
（５）２分子のチアゾールオレンジで修飾されたDNAオリゴマー（オリゴヌクレオチド）１１０の合成
二つの活性アミノ基を有するDNAオリゴマー（オリゴヌクレオチド）１０５は、前記中間体合成例４と同様に、DNA自動合成機により通常の方法で合成した。次に、このDNAオリゴマー（オリゴヌクレオチド）１０５を、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（化合物１０９）と反応させ、チアゾールオレンジから誘導される構造を１分子中に２箇所有する核酸分子であるDNAオリゴマー（オリゴヌクレオチド）１１０を合成した。すなわち、まず、30μLのDNAオリゴマー１０５（ストランド濃度320μM)と10μLのNa2CO3/NaHCO3  buffer(1M,  pH9.0)と60μLのH2Oを混合し、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（化合物１０９）のDMF溶液(20mM)100μLを加え、よく混合した。25℃で16時間静置した後、800μLのH2Oを加え、0.45μmのフィルターに通し、逆相HPLCで精製した(CHEMCOBOND  5-ODS-H  10×150mm、3mL/min、5-30%  CH3CN/50mM  TEAAバッファー(20分)、260nmで検出)。【０１６６】
実施例１
［固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRによるアクチンベータメッセンジャーRNAの分子カウント実験］
１．  下記配列番号１および２で表される特異的プライマーの5’端をビオチン化したプライマーを合成した。
フォワード：5’−AAA  AAA  AAA  AGG  CAT  GGG  TCA  GAA  GGA  TT−3’（配列番号１）
リバース：5’−AAA  AAA  AAA  AAG  GTG  TGG  TGC  CAG  ATT  TTC−3’（配列番号２）
２．  ビオチンコートスライドガラス(アライアンステクノロジー社)のビオチンコートされている面に粘着フレーム(タカラバイオ社)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。そのチャンバー内にグリセロールを添加した生理食塩水で調製した20μg/mlアビジンタンパク質溶液を全面添加して、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置してアビジンタンパク質をスライドガラス表面に固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して、余分なアビジンタンパク質を除去した。
３．  生理食塩水に10%グリセロールとなるようにグリセロールを添加し、3.3マイクロモルの濃度に調製したビオチン化プライマーを添加した。このとき、プライマー対溶液及びフォワードプライマーのみの溶液をそれぞれ用意した。アビジン固相化スライドガラスのアビジン固相化チャンバー内にプライマー対溶液もしくはフォワードプライマー溶液を全面添加し、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置して、ビオチン化プライマーを固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して余分なプライマーを除去した。
４．  Platinum  Taq用緩衝液中に1.6mM硫酸マグネシウム、0.2mM  dNTP、SYBR  Green溶液、200ユニットSuperScriptIII、2ユニットPlatinum  Taqを混合した逆転写とPCRを同一反応液中で行うことが出来る反応液を調製し、100pMになるようにアクチンベータメッセンジャーRNAを添加した。プライマー対及びフォワードプライマーのみをそれぞれ固相化したスライドガラス上のチャンバーに25マイクロリットル反応液を添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社)でチャンバーを閉じた。
５．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したGene−Proサーマルサイクラー（Bioer  Technology社）の反応チャンバーにスライドガラスを設置し、55℃30分、94℃4分の加熱後、94℃1分、60℃1分、68℃1分の温度サイクルを40回繰り返した。その後、68℃で5分間インキュベートして反応を終了した。
６．  反応終了したスライドガラスを蛍光顕微鏡で励起波長470nmにて励起して、525nmの蛍光を観察した。
７．  この結果、プライマー対を用いた場合、目的核酸の増幅産物が生成されていることを示す、無数のクラスターの蛍光が観察され（図１）、フォワードプライマーのみを用いたときは観察できなかった（図２）。【０１６７】
実施例２
［実施例２−Ａ．プライマーの設計とプライマーの品質確認］
ヒト  アクチンベータメッセンジャー遺伝子配列（NCBIリファレンス配列：NM_001101.3）に対して下記に示すプライマーオリゴを設計した。なお、前記「プライマーオリゴ（以下において、単に「オリゴ」という場合もある。）」は、プライマーであるオリゴヌクレオチドをいう。以下において同様である。【０１６８】
【表１】
0005598784.tif 000089
【０１６９】
U（エキシトンダイ  短波長(510/530)標識化T）およびZ（エキシトンダイ  長波長(570/590)標識化T）の構造は、それぞれ、下記化学式のとおりである。
【化Ｕ】
0005598784.tif 000090
【化Ｚ】
0005598784.tif 000091
U（エキシトンダイ  短波長(510/530)標識化T）の構造は、前記DNAオリゴマー（オリゴヌクレオチド）１１０が有するエキシトンダイ標識化T構造と同一である。U（エキシトンダイ  短波長(510/530)標識化T）を含む核酸は、前記合成例に従って合成した。また、Z（エキシトンダイ  長波長(570/590)標識化T）を含む核酸の合成も、前記合成例の方法に準じて行った。【０１７０】
なお、前記表１に示したプライマーオリゴの配列に、下記の配列番号を付す。
ACTB−T7RNAF  プライマー（5’−CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGATGATGATATCGCCGCGCT−3’：配列番号３）
ACTB−RNAR  プライマー（5’−CATTTTTAAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC−3’：配列番号４）
ACTB−5’F  プライマー（5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’：配列番号５）
ACTB−5’R  プライマー（5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’：配列番号６）
ACTB−5’F_5’Bio  プライマー（5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’,  5’末ビオチン化：配列番号７）
ACTB−5’R_5’Bio  プライマー（5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’,  5’末ビオチン化：配列番号８）
ACTB−5’F_5’BioM  プライマー（5’−AAAAAAAAAAGGCATGGGTCAGAAGGATT−3’,  5’末ビオチン化：配列番号９）
ACTB−5’R_5’BioM  プライマー（5’−AAAAAAAAAAAGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１０）
ACTB−5'F_ExS(5’−GGCATGGGT*CAGAAGGATT−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１１、T*の位置が標識化T［前記U］)
ACTB−5'R_ExS(5’−AGGTGTGGT*GCCAGATTTTC−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１２、T*の位置が標識化T［前記U］)
ACTB−5'F_ExL(5’−GGCATGGGT*CAGAAGGATT−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１３、T*の位置が標識化T［前記Z］)
ACTB−5'R_ExL(5’−AGGTGTGGT*GCCAGATTTTC−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１４、T*の位置が標識化T［前記Z］)
ACTB−5’F_5’BioM_Cy5(5’−AAAAAAAAAAGGCATGGGTCAGAAGGATT−3’)の5’端をビオチン化、3’端をCy5で標識：配列番号１５）【０１７１】
オリゴの合成はオペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼した。なお、合成方法は、前述のとおり、DNAオリゴマー（オリゴヌクレオチド）１１０の合成方法と同じか、またはそれに準じた。合成されたプライマーオリゴは以下の方法で品質を確認した。
１．  理化学研究所  オミックス基盤研究領域で保持しているcDNAクローンコレクションからヒト  アクチンベータcDNAを含む大腸菌クローンAK025375をアンピシリンを含むLB寒天培地に画線し、37℃  一晩培養後に単一コロニーを得た。
２．  単一コロニーを掻き取り、10マイクロリットルの滅菌蒸留水に懸濁した。
３．  0.2ミリリットルのPCR用チューブを用意し、HotStar  Taq用緩衝液中に1mM塩化マグネシウム、0.16mM  dNTP、1.25ユニットHotStar  Taq  DNAポリメラーゼ(QIAGEN)を混合した反応液を調製し、前述のアクチンベータcDNAを含む大腸菌クローン懸濁液を1  マイクロリットル添加。そこへ、0.5μM  ACTB−5’F  プライマー（5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’：配列番号５）/0.5μM  ACTB−5’R  プライマー（5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’：配列番号６）対(A)もしくは0.5μM  ACTB−T7RNAF  プライマー（5’−CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGATGATGATATCGCCGCGCT−3’：配列番号３）/0.5μM  ACTB−RNAR  プライマー（5’−CATTTTTAAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC−3’：配列番号４）対(B)もしくは0.5μM  ACTB−5’F_5’Bio  プライマー（5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’,  5’末ビオチン化：配列番号７）/0.5μM  ACTB−5’R_5’Bio  プライマー（5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’,  5’末ビオチン化：配列番号８）対(C)もしくは0.5μM  ACTB−5’F_5’BioM  プライマー（5’−AAAAAAAAAAGGCATGGGTCAGAAGGATT−3’,  5’末ビオチン化：配列番号９）/0.5μM  
ACTB−5’R_5’BioM  プライマー（5’−AAAAAAAAAAAGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１０）対(D)を各々1種類添加して全体で50マイクロリットルのPCR反応溶液を作製した。
４．  PCR反応溶液を入れた0.2ミリリットルPCRチューブをGeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、95℃15分の加熱後、94℃15秒、60℃30秒、72℃2分の温度サイクルを30回繰り返した。その後、72℃で10分間インキュベートして反応を終了した。
５．  反応終了後の反応液50マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を90マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置。エタノールを捨てた後にほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、41マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を40マイクロリットル回収した。
６．  MPG  Streptavidin  beads(タカラバイオ株式会社)  を100マイクロリットル分取し、マグネットプレートにセットして3分間静置後上清を取り除いた。100マイクロリットルの洗浄バッファー(4.5モル/リットル  塩化ナトリウム、50ミリモル/リットル  エチレンジアミン四酢酸を含む)を加えて懸濁し、マグネットプレートにセットして3分間静置後上清を取り除いた。洗浄バッファーによる洗浄を全部で3回繰り返し、最後に200マイクロリットルの洗浄バッファーを加えて再懸濁した。
７．  (A)、(C)、(D)のプライマー対を添加したサンプルを20マイクロリットル分取し、10  x  RNaseOneバッファーを2.2マイクロリットル添加し、さらに洗浄バッファーで再懸濁したMPG  Streptavidin  beadsを51.8マイクロリットル添加したのちに37℃で30分間インキュベートした。インキュベートの間、5分ごとにピペッターを用いて10回懸濁した。インキュベート終了後にマグネットプレートにセットして5分間静置し、上清を回収してMPG  Streptavidin  beads補足処理後サンプルとした。
８．  1.0%  アガロースゲルを作製し、TAEバッファー下で100V  70分電気泳動した。泳動終了後  SYBR  Goldで振盪しながら室温で10分間染色し、染色終了後にゲルを取り出し、紫外線照射下でバンドを確認した。【０１７２】
図３は、オリゴ合成の品質チェック結果を示す写真である。
（図３の説明）
−：プライマーのビオチン化無し
＋：プライマーのビオチン化有り
レーン1：マーカー
レーン2：マーカー
レーン3：空きレーン
レーン4：プライマーセットBによるPCR後のサンプル
レーン5：プライマーセットAによるPCR後のサンプル
レーン6：プライマーセットCによるPCR後のサンプル
レーン7：プライマーセットDによるPCR後のサンプル
レーン8：プライマーセットAによるPCR後のサンプルをストレプトアビジンビーズに接触させた後の上清サンプル
レーン9：プライマーセットCによるPCR後のサンプルをストレプトアビジンビーズに接触させた後の上清サンプル
レーン10：プライマーセットDによるPCR後のサンプルをストレプトアビジンビーズに接触させた後の上清サンプル【０１７３】
レーン4の結果より、アクチンベータメッセンジャーRNAを合成するための鋳型を作製するプライマーオリゴセットがワークすることが確認できた。
レーン5とレーン8の結果より、PCR実験のためのプライマーオリゴセットAがワークすることが確認できた。また、これらのプライマーオリゴはきちんと設計通りビオチン化されていないことが確認できた。
レーン6とレーン9の結果より、プライマーオリゴセットCがワークすることが確認できた。また、これらのプライマーオリゴはきちんと設計通りビオチン化されていることが確認できた。
レーン7とレーン10の結果より、プライマーオリゴセットDがワークすることが確認できた。また、これらのプライマーオリゴはきちんと設計通りビオチン化されていることが確認できた。【０１７４】
［実施例２−B．アクチンベータDNAの調製］
１．  ヒト  アクチンベータcDNAを含む大腸菌クローンAK025375の単一コロニーを掻き取り、10マイクロリットルの滅菌蒸留水に懸濁した。
２．  0.2ミリリットルのPCR用チューブを用意し、HotStar  Taq用緩衝液中に1  mM塩化マグネシウム、0.16  mM  dNTP、0.5μM  ACTB−5’F  プライマー（5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’：配列番号５）、0.5μM  ACTB−5’R  プライマー（5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’：配列番号６）、1.25ユニットHotStar  Taq  DNAポリメラーゼ(QIAGEN)を混合した反応液を調製し、前述のアクチンベータcDNAを含む大腸菌クローン懸濁液を1  マイクロリットル添加して全体で50マイクロリットルのPCR反応溶液を作製した。
３．  PCR反応溶液を入れた0.2ミリリットルPCRチューブをGeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、95℃15分の加熱後、94℃15秒、60℃30秒、72℃30秒の温度サイクルを30回繰り返した。その後、72℃で10分間インキュベートして反応を終了した。
４．  反応終了後の反応液50マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を90マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置した。エタノールを捨てた後にほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、41マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を40マイクロリットル回収した。
５．  上記サンプル溶液をバイオアナライザ  DNA1000  kit(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて測定した。【０１７５】
図４は、PCR後産物の電気泳動結果を示す図である。図示のように、目的どおり133bpの大きさのPCR産物を合成できたことが確認された。これを今後行う固相化PCRの鋳型として使用することにした。【０１７６】
［実施例２−C．アクチンベータメッセンジャーRNAの調製］
１．  ヒト  アクチンベータcDNAを含む大腸菌クローンAK025375の単一コロニーを掻き取り、100マイクロリットルの滅菌蒸留水に懸濁した。
２．  0.2ミリリットルのPCR用チューブを用意し、KOD−Plus−Neo用緩衝液中に1.5  mM塩化マグネシウム、0.2  mM  dNTP、0.3μM  ACTB−T7RNAF  プライマー（5’−CTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGATGATGATATCGCCGCGCT−3’：配列番号３）、0.3μM  ACTB−RNAR  プライマー（5’−CATTTTTAAGGTGTGCACTTTTATTCAACTGGTC−3’：配列番号４）、1ユニットKOD−Plus−Neo  DNAポリメラーゼ(TOYOBO)を混合した反応液を調製し、前述のアクチンベータcDNAを含む大腸菌クローン懸濁液を1  マイクロリットル、2マイクロリットル、5マイクロリットル、10マイクロリットル添加して全体で50マイクロリットルのPCR反応溶液を4種類作製した。
３．  PCR反応溶液を入れた0.2ミリリットルPCRチューブをGeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、94℃2分の加熱後、98℃10秒、60℃30秒、68℃1分の温度サイクルを30回繰り返した。その後、68℃で10分間インキュベートして反応を終了した。
４．  反応終了後の反応液50マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を90マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置した。エタノールを捨てた後にほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、41マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を40マイクロリットル回収し、アクチンベータメッセンジャーRNA合成用鋳型DNAとした。
５．  回収したアクチンベータメッセンジャーRNA合成用鋳型DNAを1.0%  アガロースゲル、TAEバッファー下で100V  70分電気泳動した。泳動終了後  SYBR  Goldを含むTAEバッファーで振盪しながら室温で10分間染色し、染色終了後にゲルを取り出し、紫外線照射下でバンドを確認した。PCR後産物の濃度はNanoDrop  8000(Thermo  SCIENTIFIC社)で測定した。
６．  0.2ミリリットルのPCR用チューブを用意し、  CUGA7  transcription用緩衝液中に1Mジチオスレイトール、0.16mM  CTP、0.16mM  UTP、0.16mM  GTP、0.16mM  ATP、1マイクロリットルのCUGA  7  Enzyme  Solution(株式会社ニッポンジーン)を混合した反応液を調製し、0.1ピコモル/リットル濃度になるようアクチンベータメッセンジャーRNA合成用鋳型DNAを添加して全体で20マイクロリットルの反応溶液を作製した。37℃  2時間インキュベートし、インキュベート後に2マイクロリットルのDNase  Enzyme  Solutionを加えて37℃で30分間インキュベートした。
７．  反応終了後の反応液22マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を39.6マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置。エタノールを捨てた後にほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、21マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を20マイクロリットル回収した。再度21マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を20マイクロリットル回収し、前述の回収サンプルと合わせて40マイクロリットルのアクチンベータメッセンジャーRNA溶液を得た。
８．  アクチンベータメッセンジャーRNA溶液をバイオアナライザ  RNA6000  pico  kit(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて測定した。濃度はNanoDrop  8000(Thermo  SCIENTIFIC社)で測定した。【０１７７】
図５は、アクチンベータメッセンジャーRNA合成用鋳型DNAの合成結果を示す写真である。同図における前記鋳型DNAの合成は、PCR時に添加するヒト  アクチンベータcDNAを含む大腸菌クローンAK025375の懸濁液を1マイクロリットル、2マイクロリットル、5マイクロリットル、10マイクロリットルと添加量を変えてPCRを行った。図示のとおり、懸濁液1−5マイクロリットル添加で1751bpの目的サイズのアクチンベータメッセンジャーRNA合成用鋳型DNAを合成することができた。【０１７８】
図６は、CUGA  7  in  vitro  Transcription  KitによるアクチンベータメッセンジャーRNA合成結果を示す図である。図示のとおり、目的とする1730bpの大きさのRNA産物を合成することができた。
（図６の説明）
L：マーカー
レーン1：RNA合成後サンプル（希釈なし）
レーン2：RNA合成後サンプル（RNase  free蒸留水で10倍希釈）
レーン3：RNA合成後サンプル（RNase  free蒸留水で100倍希釈）
レーン4：RNA合成後サンプル（RNase  free蒸留水で100倍希釈）
レーン5：RNA合成後サンプル（RNase  free蒸留水で1000倍希釈）
レーン6：RNA合成後サンプル（RNase  free蒸留水で10,000倍希釈）【０１７９】
［実施例２−D．サーマルサイクラーの動作確認及びスライドガラス基板上でのPCRの確認］
１．  スライドガラスに粘着フレーム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。
２．  ヒト  アクチンベータcDNAを含む大腸菌クローンAK025375の単一コロニーを掻き取り、100マイクロリットルの滅菌蒸留水に懸濁した。
３．  Platinum  Taq用緩衝液中に1.5mM塩化マグネシウム、0.2mM  dNTP、アクチンベータメッセンジャーRNAに対して特異的なプライマーミックス(フォワード：5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’、リバース：5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’、各々0.2  μM)、1ユニットPlatinum  Taq  DNA  ポリメラーゼ(インビトロジェン)を混合した反応液を調製し、前述のアクチンベータcDNAを含む大腸菌クローン懸濁液を1マイクロリットル添加して全体で50マイクロリットルのPCR反応溶液を作製した。上記PCR反応溶液を反応チャンバー内に25マイクロリットル添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じた。
フォワード：5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’（配列番号１６）
リバース：5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’（配列番号１７）
４．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社Gene−Proサーマルサイクラーの反応チャンバーに前述の反応液を封入したスライドガラスを設置し、94℃4分の加熱後、94℃1分、60℃1分、72℃1分の温度サイクルを30回繰り返した。その後、72℃で5分間インキュベートして反応を終了した。
５．  反応終了したスライドガラスを取り出し、カバーフィルムを剥がしながらピペッターを用いて反応液を20マイクロリットル回収した。回収した反応液20マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を36マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置した。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置。エタノールを捨てた後にほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、21マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を20マイクロリットル回収した。
６．  上記サンプル溶液をバイオアナライザDNA  1000  kit(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて測定した。【０１８０】
図７は、GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社Gene−Proサーマルサイクラーの動作チェック結果とスライドガラスで作製した反応チャンバー内でのPCR反応の確認を示すものである。図示のとおり、PCRチューブで行ったPCR実験（実施例2−A.  レーン5）と同様に133bpの大きさのPCR産物を合成することができた（薄いラインながら明確に確認できた）。これにより、サーマルサイクラーの動作確認とスライドガラスで作製した反応チャンバー内でPCR反応が進行することを確認できた。
（図７の説明）
L：マーカー
レーン1:  PCR後のサンプル【０１８１】
［実施例２−E．ビオチン化プライマーのビオチンコートカバーガラスへの結合確認］
１．  特異的プライマー(5’−AAAAAAAAAAGGCATGGGTCAGAAGGATT−3’)の5’端をビオチン化、3’端をCy5で標識したプライマー（ACTB−5’F_5’BioM_Cy5：配列番号１５）を合成した。
２．  ビオチンコートカバーガラス(株式会社アライアンステクノロジーBiotin/cover  slip/Bio_02−C)のビオチンコートされている面に粘着フレーム(タカラバイオ社製TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。そのチャンバー内にグリセロールを添加した生理食塩水で調製した20μg/mlストレプトアビジンタンパク質溶液を全面添加して、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置してストレプトアビジンタンパク質をスライドガラス表面に固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して、余分なストレプトアビジンタンパク質を除去した。
３．  生理食塩水に10%グリセロールとなるようにグリセロールを添加し、最終濃度50ピコモル/リットル濃度、200ピコモル/リットル濃度になるようCy5標識ビオチン化プライマー溶液を各々別々の0.5ミリリットルチューブに50マイクロリットル調製した。ストレプトアビジン固相化カバーガラスのストレプトアビジン固相化チャンバー内にCy5標識ビオチン化プライマー溶液を全面添加し、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置して、Cy5標識ビオチン化プライマーを固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して余分なプライマーを除去した。
４．  生理食塩水25マイクロリットルを添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じたカバーガラスをニコン社製Eclipse  Ti蛍光顕微鏡で励起波長640nmにて励起して、692±20nmの蛍光を観察した。【０１８２】
図８、図９および図１０は、蛍光顕微鏡での観察結果を示す写真であり、それぞれ、ネガティブコントロール（ストレプトアビジンなし、200pM  Cy5標識ビオチン化プライマー添加、インキュベート後に洗浄）、50pM  Cy5  oligo（ストレプトアビジン添加後wash、50pM  Cy5  標識ビオチン化プライマー添加、インキュベート後に洗浄）および200pM  Cy5  oligo（ストレプトアビジン添加後wash、200pM  Cy5  標識ビオチン化プライマー添加、インキュベート後に洗浄）を示す。図示のとおり、ビオチン化プライマーに標識してあるCy5に由来する蛍光スポットが濃度依存的に変化しており、ストレプトアビジンを加えていないネガティブコントトールの画像では全く蛍光スポットが見えないので、ビオチン化プライマーの結合がうまく行っていることを確認できた。また、本法で用いた洗浄方法が非特異的なビオチン化プライマーを取り除くのに有効なことを確認できた。【０１８３】
［実施例２−F．調製したアクチンベータDNAを用いてガラス基板で作製したチャンバー内でPCR反応系の有効性と固相化PCRの有効性確認］
１．  特異的プライマー(フォワード：5’−AAA  AAA  AAA  AGG  CAT  GGG  TCA  GAA  GGA  TT−3’：配列番号１、リバース：5’−AAA  AAA  AAA  AAG  GTG  TGG  TGC  CAG  ATT  TTC−3’：配列番号２)の5’端をビオチン化したプライマーを合成した。
２．  ビオチンコートカバーガラス(株式会社アライアンステクノロジーBiotin/cover  slip/Bio_02−C)のビオチンコートされている面に粘着フレーム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。そのチャンバー内にグリセロールを添加した生理食塩水で調製した20μg/mlストレプトアビジンタンパク質溶液を全面添加して、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置してストレプトアビジンタンパク質をスライドガラス表面に固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して、余分なストレプトアビジンタンパク質を除去した。
３．  生理食塩水に10%グリセロールとなるようにグリセロールを添加し、最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるよう各々ビオチン化フォワードプライマーとリバースプライマーの2種類を添加した。ストレプトアビジン固相化カバーガラスのストレプトアビジン固相化チャンバー内にビオチン化プライマー対溶液を全面添加し、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置して、ビオチン化プライマー対を固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して余分なプライマーを除去した。
４．  Platinum  Taq用緩衝液中に1.5mM塩化マグネシウム、0.2mM  dNTP、SYBR  Green溶液、1ユニットPlatinum  Taq  DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)を混合した反応液を調製し、20pMになるようにアクチンベータDNAを添加した。プライマー対を固相化したカバーガラス上のチャンバーに25マイクロリットルの反応液を添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じた。
５．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社製Gene−Proサーマルサイクラーの反応チャンバーにカバーガラスを設置し、94℃4分の加熱後、94℃1分、60℃1分、72℃1分の温度サイクルを40回繰り返した。その後、72℃で10分間インキュベートして反応を終了した。
６．  反応終了したカバーガラスをニコン社Eclipse  Ti蛍光顕微鏡で励起波長470nmにて励起して、525nmの蛍光を観察した。【０１８４】
図１１は、固相化PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。図示のとおり、SYBR  Greenによる蛍光スポットを確認することができたので、固相化PCRによる二本鎖DNAのクラスターができていることを確認できた。【０１８５】
［実施例２−G．調製したアクチンベータメッセンジャーRNAを用いてのツーステップRT−PCR反応系の有効性確認］
１．  1μM  ACTB−5’Rプライマー  2マイクロリットル、10mM  dNTP  1マイクロリットル、アクチンベータメッセンジャーRNAを1マイクログラム/マイクロリットル  になるよう添加した10マイクロリットルの溶液を0.2マイクロリットルPCRチューブに作製し、GeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、65℃  5分間インキュベートした。インキュベート後氷上で2分間冷却した。反応液が入ったチューブにSuperScriptIII用緩衝液、0.1M  ジチオスレイトール  2マイクロリットル、25mM  塩化マグネシウム  4マイクロリットルを添加し、GeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、15℃  20分間インキュベートした。インキュベート後、反応液が入ったチューブにRNaseOUT  1マイクロリットル、200ユニット/マイクロリットル  SuperScriptIII  1マイクロリットルを添加してGeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、55℃  50分、70℃  10分間反応させた。反応後反応液が入ったチューブを氷上で2分間冷却した。冷却後、50ユニットｖRNaseIf(NEW  ENGLAND  BioLabs)  、2ユニットRNaseH(タカラバイオ)  を加えてGeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、37℃  30分間インキュベートした。
２．  反応液22マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を39.6マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置。エタノールを捨てた後にほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、21マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を20マイクロリットル回収し、これを逆転写反応産物溶液とした。
３．  0.2ミリリットルのPCR用チューブを用意し、HotStar  Taq用緩衝液中に1mM塩化マグネシウム、0.16mM  dNTP、1.25ユニットHotStar  Taq  DNAポリメラーゼ(QIAGEN)を混合した反応液を調製し、前述の逆転写反応産物溶液を1  マイクロリットル添加した。そこへ、0.5μM  ACTB−5’F  プライマー（5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’：配列番号５）/0.5μM  ACTB−5’R  （5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’：配列番号６）プライマー対を添加して全体で50マイクロリットルのPCR反応溶液を作製した。
４．  PCR反応溶液を入れた0.2マイクロリットルPCRチューブをGeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、95℃15分の加熱後、94℃15秒、60℃30秒、72℃30秒の温度サイクルを30回繰り返した。その後、72℃で10分間インキュベートして反応を終了した。
５．  反応液50マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を90マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置。エタノールを捨てた後にほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、41マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を40マイクロリットル回収し、これをPCR反応溶液とした。
６．  上記サンプル溶液をバイオアナライザDNA  1000  kit(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて測定した。【０１８６】
図１２は、ツーステップRT−PCR後サンプルの電気泳動結果を示すものである。
（図１２の説明）
レーン1−3：逆転写後のサンプル（1：希釈なし2：5倍希釈3：ネガティブコントロール（RNA鋳型なし））
レーン4−6：PCR後のサンプル（4：希釈なし5：5倍希釈6：ネガティブコントロール（RNA鋳型なし））【０１８７】
図１２のレーン4とレーン5より、133bpの大きさのRT−PCR産物が合成できたので、実施例2−C.で合成したアクチンベータメッセンジャーRNAがRT−PCRの鋳型として使用できることが分かった。また、今回用いたツーステップRT−PCRの反応系がうまく機能することを確認できた。【０１８８】
［実施例２−H．ワンステップRT−PCR反応系の有効性確認］
１．  0.2ミリリットルPCR用チューブにPlatinum  Taq用緩衝液中に1.6mM硫酸マグネシウム、0.2mM  dNTP、アクチンベータメッセンジャーRNAに対して特異的なプライマーミックス(フォワード：5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’：配列番号１６、リバース：5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’：配列番号１７、各々0.2μM)、最終濃度0.5μg/μl  アクチンベータメッセンジャーRNA  、2ユニットPlatinum  Taq  DNA  ポリメラーゼ(インビトロジェン)  を混合した反応液に各々100ユニット、200ユニット、500ユニット  SuperScriptIII(インビトロジェン)を添加した逆転写とPCRを同一反応液中で行うことが出来る反応液を調製した。
２．  反応溶液を入れた0.2マイクロリットルPCRチューブをGeneAmp  PCR  System  9700  サーマルサイクラー(アプライドバイオシステムズ社)にセットし、55℃  30分、94℃  2分の加熱後、94℃  15秒、60℃  30秒、68℃  30秒の温度サイクルを40回繰り返した。その後、68℃で5分間インキュベートして反応を終了した。
３．  反応終了した反応液50マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を90マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置。エタノールを捨てた後に、ほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、41マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を40マイクロリットル回収した。
４．  上記サンプル溶液をバイオアナライザDNA  1000  kit(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて測定した。【０１８９】
図１３は、ワンステップRT−PCR後サンプルの電気泳動結果を示すものである。図示のとおり、目的産物である133bpのバンドを確認できたので、ワンステップRT−PCRの反応系がうまく機能することを確認できた。逆転写酵素SuperScriptIII  100,200,および500ユニットいずれにおいてもうまく機能することを確認できた。
（図１３の説明）
L：マーカー
レーン1：RT−PCR後のサンプル希釈なし(SuperScriptIII  100ユニット添加)
レーン2：RT−PCR後のサンプル5倍希釈(SuperScriptIII  100ユニット添加)
レーン3：RT−PCR後のサンプル希釈なし(SuperScriptIII  200ユニット添加)
レーン4：RT−PCR後のサンプル5倍希釈(SuperScriptIII  200ユニット添加)
レーン5：RT−PCR後のサンプル希釈なし(SuperScriptIII  500ユニット添加)
レーン6：RT−PCR後のサンプル5倍希釈(SuperScriptIII  500ユニット添加)
レーン7：RT−PCR後のサンプル希釈なし(鋳型となるアクチンベータメッセンジャーRNAなし、SuperScriptIII  100ユニット添加)【０１９０】
［実施例２−I．ガラス基板で作製したチャンバー内でのワンステップRT−PCR反応系の有効性確認］
１．スライドガラスに粘着フレーム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。
２．Platinum  Taq用緩衝液中に1.6mM硫酸マグネシウム、0.2mM  dNTP、アクチンベータメッセンジャーRNAに対して特異的なプライマーミックス(フォワード：5’−GGCATGGGTCAGAAGGATT−3’：配列番号１６、リバース：5’−AGGTGTGGTGCCAGATTTTC−3’：配列番号１７、各々0.2μM)、200ユニットSuperScriptIII(インビトロジェン)、2ユニットPlatinum  Taq  DNA  ポリメラーゼ(インビトロジェン)を混合した逆転写とPCRを同一反応液中で行うことが出来る反応液を調製し、0.5μg/μlになるようにアクチンベータメッセンジャーRNAを添加した。
３．  上記反応液を反応チャンバー内に25マイクロリットル反応液を添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じた。
４．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社Gene−Proサーマルサイクラーの反応チャンバーに前述の反応液を封入したスライドガラスを設置し、55℃  30分、94℃  4分の加熱後、94℃  1分、60℃  1分、68℃  1分の温度サイクルを40回繰り返した。その後、68℃で5分間インキュベートして反応を終了した。
５．  反応終了したスライドガラスを取り出し、カバーフィルムを剥がしながらピペッターを用いて反応液を20マイクロリットル回収した。回収した反応液20マイクロリットルにAgencourt  AMPure  XP(Beckman  Coulter社)を36マイクロリットル添加して混和後、室温30分で放置した。30分後、マグネットプレート上へ設置し5分静置。ビーズを吸い込まないように上清を捨てて70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置後にエタノールを捨てて再び70%濃度エタノール  200マイクロリットルを加えて15秒放置。エタノールを捨てた後に、ほこりが入らないように注意しながら3分間乾燥させた。乾燥後、マグネットプレートからはずし、21マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えてよく混和させた。再びマグネットプレートに設置して5分静置後、上清を20マイクロリットル回収した。
６．  上記サンプル溶液をバイオアナライザDNA  1000  kit(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて測定した。【０１９１】
図１４は、ガラス基板で作製したチャンバー内で反応させたワンステップRT−PCR後サンプルの電気泳動結果を示す。図示のとおり、目的産物である133bpのバンドを確認できたので、ガラス基板で作製したチャンバー内で反応させたワンステップRT−PCRの反応系がうまく機能することを確認できた。
（図１４の説明）
L：マーカー
レーン1−3:ワンステップRT−PCR後のサンプル【０１９２】
実施例２−J．固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRによるアクチンベータメッセンジャーRNAの分子カウント実験
１．  特異的プライマー(フォワード：5’−AAA  AAA  AAA  AGG  CAT  GGG  TCA  GAA  GGA  TT−3’：配列番号１、リバース：5’−AAA  AAA  AAA  AAG  GTG  TGG  TGC  CAG  ATT  TTC−3’：配列番号２)の5’端をビオチン化したプライマーを合成した。
２．  ビオチンコートカバーガラス(株式会社アライアンステクノロジーBiotin/cover  slip/Bio_02−C)のビオチンコートされている面に粘着フレーム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。そのチャンバー内にグリセロールを添加した生理食塩水で調製した20μg/mlストレプトアビジンタンパク質溶液を全面添加して、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置してストレプトアビジンタンパク質をスライドガラス表面に固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して、余分なストレプトアビジンタンパク質を除去した。
３．  生理食塩水に10%グリセロールとなるようにグリセロールを添加し、最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化フォワードプライマーと最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化リバースプライマーの2種類を添加、もしくはネガティブコントロール用に最終濃度6.6マイクロモル/リットルになるようフォワードプライマーのみを添加した。ストレプトアビジン固相化カバーガラスのストレプトアビジン固相化チャンバー内にビオチン化プライマー対溶液もしくはネガティブコントロール用のフォワードプライマー溶液を全面添加し、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置して、ビオチン化プライマー対もしくはネガティブコントロール用のビオチン化フォワードプライマーを固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して余分なプライマーを除去した。
４．  Platinum  Taq用緩衝液中に1.6  mM硫酸マグネシウム、0.2  mM  dNTP、SYBR  Green溶液、200ユニットSuperScriptIII(インビトロジェン)、2ユニットPlatinum  Taq  DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)を混合した逆転写とPCRを同一反応液中で行うことが出来る反応液を調製し、100pMになるようにアクチンベータメッセンジャーRNAを添加した。プライマー対及びネガティブコントロール用にフォワードプライマーのみをそれぞれ固相化したカバーガラス上のチャンバーに25マイクロリットル反応液を添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じた。
５．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社製Gene−Proサーマルサイクラーの反応チャンバーにカバーガラスを設置し、55℃30分、94℃4分の加熱後、94℃1分、60℃1分、68℃1分の温度サイクルを40回繰り返した。その後、68℃で5分間インキュベートして反応を終了した。
６．  反応終了したカバーガラスをニコン社Eclipse  Ti蛍光顕微鏡で励起波長470nmにて励起して、525nmの蛍光を観察した。【０１９３】
図１５および図１６は、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果を示す写真であり、それぞれ、ネガティブコントロール（フォワードプライマーのみを固相化、100nM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加）および100pM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加、の結果を示すものである。図示のとおり、フォワードプライマーとリバースプライマーを両方固相化した反応チャンバー内でのみSYBR  Green由来の蛍光スポットを確認できた。このことにより、蛍光スポットが二本鎖DNAクラスターに由来し、固相化したプライマー対でブリッジRT−PCR反応系がうまく進行することを確認することができた。【０１９４】
［実施例２−K．固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRによるアクチンベータメッセンジャーRNAの分子カウント実験（鋳型メッセンジャーRNA濃度と増幅の確認の再現性）］
１．  特異的プライマー(フォワード：5’−AAA  AAA  AAA  AGG  CAT  GGG  TCA  GAA  GGA  TT−3’：配列番号１、リバース：5’−AAA  AAA  AAA  AAG  GTG  TGG  TGC  CAG  ATT  TTC−3’：配列番号２)の5’端をビオチン化したプライマーを合成した。
２．  ビオチンコートカバーガラス(株式会社アライアンステクノロジーBiotin/cover  slip/Bio_02−C)のビオチンコートされている面に粘着フレーム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。そのチャンバー内にグリセロールを添加した生理食塩水で調製した20μg/mlストレプトアビジンタンパク質溶液を全面添加して、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置してストレプトアビジンタンパク質をスライドガラス表面に固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して、余分なストレプトアビジンタンパク質を除去した。また、この時ネガティブコントロールとしてストレプトアビジンの代わりにRNaseフリー水を加えて作製したグリセロールを添加した生理食塩水を添加したビオチンコートカバーガラスも用意した。
３．  生理食塩水に10%グリセロールとなるようにグリセロールを添加し、最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化フォワードプライマーと最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化リバースプライマーの2種類を添加した。ストレプトアビジン固相化カバーガラスのストレプトアビジン固相化チャンバー内とネガティブコントロール用のチャンバー内にビオチン化プライマー対溶液を全面添加し、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置して、ビオチン化プライマー対を固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して余分なプライマーを除去した。
４．  Platinum  Taq用緩衝液中に1.6mM硫酸マグネシウム、0.2mM  dNTP、SYBR  Green溶液、200ユニットSuperScriptIII(インビトロジェン)、2ユニットPlatinum  Taq  DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)を混合した逆転写とPCRを同一反応液中で行うことが出来る反応液を調製し、100nM、100pM、100fMになるようにそれぞれアクチンベータメッセンジャーRNAを添加した。プライマー対を固相化したカバーガラス、またはネガティブコントロール用のカバーガラス上のチャンバーに25マイクロリットル反応液を添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じた。
５．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社Gene−Proサーマルサイクラーの反応チャンバーにカバーガラスを設置し、55℃30分、94℃4分の加熱後、94℃1分、60℃1分、68℃1分の温度サイクルを40回繰り返した。その後、68℃で5分間インキュベートして反応を終了した。
６．  反応終了したカバーガラスをニコン社Eclipse  Ti蛍光顕微鏡で励起波長470nmにて励起して、525nmの蛍光を観察した。【０１９５】
図１７、図１８、図１９および図２０は、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（メッセンジャーRNA濃度）を示す写真であり、それぞれ、ネガティブコントロール（ストレプトアビジンなし、100nM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加）、100fM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加、100pM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加、および100nM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加の結果である。図示のとおり、100fM、100pM、100nMと加えるアクチンベータメッセンジャーRNA量が増えるに従ってSYBR  Green由来の蛍光スポット数が増えた。【０１９６】
［実施例２−L．固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRによるアクチンベータメッセンジャーRNAの分子カウント実験（PCRサイクル数）］
１．  特異的プライマー(フォワード：5’−AAA  AAA  AAA  AGG  CAT  GGG  TCA  GAA  GGA  TT−3’：配列番号１、リバース：5’−AAA  AAA  AAA  AAG  GTG  TGG  TGC  CAG  ATT  TTC−3’：配列番号２)の5’端をビオチン化したプライマーを合成した。
２．  ビオチンコートカバーガラス(株式会社アライアンステクノロジーBiotin/cover  slip/Bio_02−C)のビオチンコートされている面に粘着フレーム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。そのチャンバー内にグリセロールを添加した生理食塩水で調製した20μg/mlストレプトアビジンタンパク質溶液を全面添加して、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置してストレプトアビジンタンパク質をスライドガラス表面に固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して、余分なストレプトアビジンタンパク質を除去した。
３．  生理食塩水に10%グリセロールとなるようにグリセロールを添加し、最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化フォワードプライマーと最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化リバースプライマーの2種類を添加、もしくはネガティブコントロール用に最終濃度6.6マイクロモル/リットルになるようフォワードプライマーのみを添加した。ストレプトアビジン固相化カバーガラスのストレプトアビジン固相化チャンバー内にビオチン化プライマー対溶液もしくはネガティブコントロール用のビオチン化フォワードプライマー溶液を全面添加し、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置して、ビオチン化プライマー対もしくはネガティブコントロール用のビオチン化フォワードプライマーを固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して余分なプライマーを除去した。
４．  Platinum  Taq用緩衝液中に1.6mM硫酸マグネシウム、0.2mM  dNTP、SYBR  Green溶液、200ユニットSuperScriptIII(インビトロジェン)、2ユニットPlatinum  Taq  DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)を混合した逆転写とPCRを同一反応液中で行うことが出来る反応液を調製し、100pMになるようにアクチンベータメッセンジャーRNAを添加した。プライマー対を固相化したカバーガラス、またはネガティブコントロール用のカバーガラス上のチャンバーに25マイクロリットル反応液を添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じた。
５．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社Gene−Proサーマルサイクラーの反応チャンバーにカバーガラスを設置し、55℃30分、94℃4分の加熱後、94℃1分、60℃1分、68℃1分の温度サイクルを10、20、30、40回繰り返して反応させた。
６．  各々のサイクル終了後にカバーガラスを取り出し、遮光して4℃で冷蔵保管した。ニコン社Eclipse  Ti蛍光顕微鏡で励起波長470nmにて励起して、525nmの蛍光を観察した。【０１９７】
図２１、図２２、図２３、図２４および図２５は、ブリッジRT−PCR後カバーガラスの蛍光顕微鏡観察結果（PCRサイクル数）を示す写真であり、それぞれ、ネガティブコントロール（フォワードプライマーのみ固相化）、PCR  10サイクル、PCR  20サイクル、PCR  30サイクル、およびPCR  40サイクルの結果である。20サイクルまではブリッジPCRによるDNAクラスターの形成が本観察方法では確認できず、30サイクルを超えてDNAクラスターが見えた。【０１９８】
［実施例２−M．自己蛍光/消光する蛍光色素を標識した固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRによるアクチンベータメッセンジャーRNAの分子カウント実験］
１．  自己蛍光/消光する蛍光性プライマー（エキシトンプライマー、S.  Ikeda,  A.  Okamoto,  Chem.  Asian  J.  2008,  3,  958-968.）であるACTB−5'F_ExS(5’−GGCATGGGT*CAGAAGGATT−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１１)、  ACTB−5'R_ExS(5’−AGGTGTGGT*GCCAGATTTTC−3’,  5’末ビオチン化：配列番号１２)を作製した（T*の位置を蛍光標識）。
２．  ビオチンコートカバーガラス(株式会社アライアンステクノロジーBiotin/cover  slip/Bio_02−C)のビオチンコートされている面に粘着フレーム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)を貼り付けて反応チャンバーを作成した。そのチャンバー内にグリセロールを添加した生理食塩水で調製した20μg/mlストレプトアビジンタンパク質溶液を全面添加して、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置してストレプトアビジンタンパク質をスライドガラス表面に固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して、余分なストレプトアビジンタンパク質を除去した。
３．  生理食塩水に10%グリセロールとなるようにグリセロールを添加し、最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化エキシトンフォワードプライマーと最終濃度3.3マイクロモル/リットルになるようビオチン化エキシトンリバースプライマーの2種類を添加、もしくはネガティブコントロール用に最終濃度6.6マイクロモル/リットルになるようフォワードプライマーのみを添加した。ストレプトアビジン固相化カバーガラスのストレプトアビジン固相化チャンバー内にビオチン化プライマー対溶液もしくはネガティブコントロール用にビオチン化フォワードプライマー溶液を全面添加し、乾燥を防ぐためにシャーレの蓋でカバーした後、37℃で30分放置して、ビオチン化エキシトンプライマー対もしくはネガティブコントロール用のビオチン化エキシトンフォワードプライマーを固相化した。固相化後、生理食塩水で3回洗浄して余分なプライマーを除去した。
４．  Platinum  Taq用緩衝液中に1.6mM硫酸マグネシウム、0.2mM  dNTP、200ユニットSuperScriptIII(インビトロジェン)、2ユニットPlatinum  Taq  DNAポリメラーゼ(インビトロジェン)を混合した逆転写とPCRを同一反応液中で行うことが出来る反応液を調製し、100pMになるようにアクチンベータメッセンジャーRNAを添加した。プライマー対を固相化したカバーガラス、またはネガティブコントロール用のカバーガラス上のチャンバーに25マイクロリットルの反応液を添加し、カバーフィルム(タカラバイオ社TakaraSlide  seal  for  in  situ  PCR)でチャンバーを閉じた。
５．  GenePro  Insitu  “Japanese  Version”  B−4  ブロックを装着したBioer  Technology社Gene−Proサーマルサイクラーの反応チャンバーにカバーガラスを設置し、55℃30分、94℃4分の加熱後、94℃1分、60℃1分、68℃1分の温度サイクルを40回繰り返して反応させた。その後、68℃で5分間インキュベートして反応を終了した。
６．  反応終了したカバーガラスをニコン社Eclipse  Ti蛍光顕微鏡で励起波長470nmにて励起して、520nmの蛍光を観察した。【０１９９】
図２６および図２７は、蛍光標識した固相化特異的プライマーセットを用いたブリッジRT−PCRの結果を示す写真であり、それぞれ、ネガティブコントロール（フォワードプライマーのみ固相化、100pM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加）、および、エキシトンフォワードプライマー／エキシトンリバースプライマーを固相化、100pM  アクチンベータメッセンジャーRNA添加したものである。DNA二本鎖形成によって自己蛍光する蛍光性プライマー（エキシトンプライマー）をフォワード側とリバース側を両方固相化してRT−PCRするとSYBR  Greenを入れた時と同様RT−PCR後にDNAクラスター由来の蛍光スポットを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
以上説明したとおり、本発明の標的核酸の分析方法、キットおよび分析機器によれば、迅速かつ簡便に標的核酸の分析を行うことが可能である。本発明によれば、例えば、健康状態および様々な疾患の予後の予測、判定、検出又は診断に有用な予測、判定、検出又は診断用組成物、前記組成物を利用した健康状態および様々な疾患の予後の予測、判定、検出又は診断方法、ならびに前記組成物を利用した健康状態および様々な疾患の予後の予測、判定、検出又は診断キットならびに装置を提供することで、例えば医療分野の疾患の検査、診断などに対して良好な結果を提供することができるため、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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