(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を生成するための血液、好ましくは末梢血を採取するキットであって、抗凝固剤とＭＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を含有する採取された血液を保持できる第一容器（１２）を少なくとも有し、前記第一容器（１２）にあるＭＣＳＦの濃度は、２ｎＭから２０ｎＭの間であるキット。
【請求項２】
請求項１に記載のキットであって、前記第一容器（１２）にあるＭＣＳＦの濃度は、８ｎＭから１０ｎＭの間であるキット。
【請求項３】
請求項１または２に記載のキットであって、前記抗凝固剤は、ヘパリンもしくはＥＤＴＡであるキット。
【請求項４】
請求項１〜３の何れかに記載のキットであって、前記第一容器（１２）のための閉塞要素（２２）を有するキット。
【請求項５】
請求項１〜４の何れかに記載のキットであって、前記幹細胞の接着を防ぐ材料の内壁が少なくともある第二容器（１８、２０）を少なくとも有するキット。
【請求項６】
請求項５に記載のキットであって、前記材料は、赤外線および／またはガンマ線で処理されたポリプロピレン（ＰＰ）などのプラスチック材料であるキット。
【請求項７】
請求項５もしくは６に記載のキットであって、各容器（１８、２０）に閉塞要素（２４）を有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、成体幹細胞の生成のための血液、好ましくは末梢血の採取のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在まで治療できないと思われていた症状を改善することに成功していることから、近年、治療分野における幹細胞の使用は、幅広く認められている。
【０００３】
しかしながら、幹細胞を得るための公知の方法は、長く、煩雑で、しかも高価であった。
【０００４】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、研究だけでなく薬剤の製造、および臓器移植などにも利用できる（Ｗａｇｅｒｓ  Ａ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；Ｇｒｉｆｆｔｈ  Ｌ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【０００５】
多能性幹細胞には、胚性幹細胞と成体幹細胞とがある。前者は、８日目の胚盤胞に由来し、成体幹細胞は主に骨髄、脂肪もしくは筋肉組織、末梢血もしくは臍帯血から得ることができる。
【０００６】
幹細胞の定義は、常に変化しており、現段階では、幹細胞を分離もしくは特定する一般的な見解もしくは標準的方法などはない。これらの全ての細胞について、胚性細胞（ＥＳ）および成体幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）および間葉系細胞（ＭＳＣ）双方ともについて、様々な遺伝子マーカーが特定されており、これらのうちいくつかは多くの細胞系に共通している（Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；Ｋａｎｇ  Ｗ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｚｈａｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，  １９７６）。
【０００７】
現状では、胚性細胞組織、胎児、および臍帯から分離された幹細胞の使用に関する研究の方が多く行われているが、これは法律的および倫理的問題を引き起こしている。
【０００８】
それ以上に、今日、これらの細胞の使用は、様々な副作用を有している。例えば、感染症のリスク、移植の場合であれば拒絶反応のリスク、馬などのいくつかの哺乳類においては奇形種などが挙げられる。
【０００９】
これらの問題を克服するために、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」治療において、好ましくは、骨髄、脂肪組織、もしくは末梢血から分離された自己幹細胞を使用することが知られている。成体幹細胞から始まり、分化を誘導する特定因子の手段により期待されるセルラインにおける幹細胞の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」（もしくは、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」）の分化工程があり、続いて、得られた分化したセルラインの「ｉｎ  ｖｉｖｏ」の移植工程と、がある。この方法の問題点は、対象となる生物に再導入された分化した細胞が自己細胞と認識されないために拒絶反応を起こすことであり、これは、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」で誘導された分化工程においてこれらの細胞が自己認識因子を失ってしまうことに起因する。
【００１０】
ヒトでは、末梢血から幹細胞を得ることは、血漿交換法もしくはルーコアフェレーシス（ｌｅｕｃｏａｐｈｅｒａｅｓｉｓ）と呼ばれる処理を通して、精製することが伴う。該幹細胞は、血液から抽出され、回収され、そして、化学療法もしくは放射線治療の直後に患者に接種される。
【００１１】
血漿交換法では、これは６から８時間かかるが、腕の血管または首もしくは胸の血管から血液がとられ、そして幹細胞を取り除く機械へと通す。このようにして、精製された血液は患者へと戻り、回収された細胞は液体窒素の中で冷凍保存される（Ｃｏｎｄｏｍｉｎｅｓ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｋａｎｇ  Ｗ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。この技術は、苦痛を伴うという他に、患者にとって非常にストレスがかかる。  なによりも、この技術は、循環している幹細胞の本当の分別および／または精製を提供しているわけではない。主な精製の技術としては：
−成長因子もしくは血小板誘導体（ＴＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ）などの使用があるが、これらを抽出するのは非常にコストがかかる（Ｈｏｕ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）；
−骨髄から得られた幹細胞の分離、これは精製することができ、したがって、抽出された原料に含まれる細胞の１５％を治療に使用できる；
−脂肪組織から得られた幹細胞の分離、これは、予めドナーからかなりの量の組織を手術により取り除く必要があり、経静脈注射による投与ができない；
−テンドトロフィン（Ｔｅｎｄｏｔｒｏｐｈｉｎ）としてしられるＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１）（Ｆｉｅｄｌｅｒ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）；
−ＵＢＭ（尿道膀胱マトリクス（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｍａｔｒｉｘ）：これは、サイトカインを含んでいる（しかし、有核細胞はない）ブタ由来のものであり、傷の瘢痕化を促すが、病巣の再生はしない（Ｚｈａｎｇ  ＹＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。
【００１２】
“Ａ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｂｓｅｔ  ａｃｔｓ  ａｓ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ”およびＷＯ−Ａ−２００４／０４３９９０において、別の公知の方法がＺｈａｏ  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．，  により記載されている。この方法は、単核白血球由来の幹細胞を生成する方法であり、これは末梢血から単核白血球を分離する工程と、分裂促進成分と接触させる工程と、それに続いて、末梢血から得られた単核白血球の培養液を細胞の増殖に適した条件にする工程と、を有する。
【００１３】
この方法は、始めに単核白血球を分離する工程が必要で、次に培養による増殖工程が必要であるため、時間がかかり、十分な数の幹細胞を得るためには１５から２０日とかかり、さらには、多能性幹細胞を得ることはできない。すなわち、非特異的であり、患者に直接かつ直後に接種するのに適している。
【００１４】
また、単核白血球から幹細胞を調製する構成は、ＷＯ−Ａ−２００５／０４６５７０、ＷＯ−Ａ−２００７／１３１２００、ＷＯ−Ａ−０３／０８３０９２でも知られている。しかしながら、これらは、細胞部分、すなわち単核白血球、だけを分離するために予め精製する必要があり、さらに続いて、所望の幹細胞を得るために増殖も必要である。これらの文献に記載されている方法は、十分な量の幹細胞を得るには非常に長い時間がかかり、１５から４０日間かかる。
【００１５】
上述のように、薬理学的治療に適した幹細胞を得るのを可能にする容易に入手可能な材料、特に血液、特に末梢血から得られる成体幹細胞の増殖方法、もしくは分離および精製を完成する明かな必要性がある。
【００１６】
また、血液、好ましくは末梢血から幹細胞を、可能な限り短時間で生成する明かな必要性があり、このようにすることで患者に素早く介入することができる。
【００１７】
本願発明の目的は、したがって、多能性幹細胞の生成のための血液、好ましくは末梢血の採取のためのキットを達成することであり、これにより多能性幹細胞の素早い生成を可能にすることである。
【００１８】
現在の技術の問題点を解決するため、およびこれらの他の目的および有利な点を得るために、本出願人は、本願発明を作成し、試験し、実施した。
【発明の概要】
【００１９】
本願発明は、独立請求項により特徴づけられ、そして従属請求項は、本願発明の他の特徴もしくは主な発明概念に対する変形例を記載している。
【００２０】
本発明者により開発された血液、好ましくは末梢血から得られた幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏの成長および精製のための方法は、本出願人の国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５９５３１にも記載されており、本願にはその全てが参照として記載されている。前記方法は、成体幹細胞を得ることを可能にし、二つのサブ工程を有する第一工程を有する：
ａ）血液が採取された後、８から１５ｎＭの濃度、好ましくは１０ｎＭの濃度のＭＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を使ってｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理により、末梢血の幹細胞を成長させる第一サブ工程；
ｂ）好ましくは、フィコールグラディエント（Ｆｉｃｏｌｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）での分離による第二サブ工程。
【００２１】
第一サブ工程は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理が行われた時の状態により様々な所要時間を有し、発明者らはＭＣＳＦによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理の所要時間が２４から９６時間、有利には４８から７２時間の間であることを試験的に確認しており、これは、幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ９０／３４およびＣＤ１１７での標識のある成長を安定させる。この状態は、最適なものと考えられる。
【００２２】
第二サブ工程の精製は、基本的には、赤血球を破壊することを意図している。
【００２３】
第二工程は、前記ｂ）工程で得られたセミ生成物を使用し、
ｃ）３５から５５ｎＭ、好ましくは５０ｎＭ、さらに好ましくは４５ｎＭの濃度でのＭＣＳＦを使ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理の手段により、前記ｂ）工程で精製された末梢血の幹細胞の成長を提供する。
【００２４】
この濃度でのＭＣＳＦでは、前記細胞は、成体幹細胞の表現型を維持することができる。
【００２５】
この第二工程は、２４から９６時間、好ましくは４８時間から７２時間の間の所要時間を有する。
【００２６】
５５ｎＭ以上の濃度のＭＣＳＦ（例えば、７０ｎＭ）を使用すると、２４時間後には、すでに前記細胞が多能性幹細胞の表現型を有していないことが観察されている。
【００２７】
特に、血液採取後にＭＣＳＦの懸濁液での分化および成長をさせる前記工程ａ）は、幹細胞の割合を増加させることができる。それに引き続く前記ｂ）工程は、患者に接種されたあとｉｎ  ｖｉｖｏで拒絶反応を引き起こさずに直接分化し、成体多能性幹細胞を得ることを可能にする。
【００２８】
この生成の効果的な点は、幹細胞マーカーＣＤ９０、ＣＤ９０／３４、ＣＤ３４、およびＣＤ１１７の存在下で生成されることであり、さらに分化もしくは増殖以降も自己認識の因子を失わないことである。このような細胞は、一度患者に接種された後でも、拒絶反応、感染症、奇形種の発生などの副作用を起こさず、ｉｎ  ｖｉｖｏで分化することができ、さらに多能性幹細胞として作用することができる。
【００２９】
このようにして分化もしくは増殖した前記細胞は、局所的もしくは経静脈経由で一度接種すると、処置されている生物の病状および必要性に応じて、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」において（適切な成長因子および／または化学的刺激による現在の技術において知られている「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」方法ではない（Ｇｕｌａｔｉ  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｋａｔｓ  Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２；  Ｏｋａｚａｋｉ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５））、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞、神経細胞、および肝細胞の形態的および化学的特徴を全て獲得する。この方法は、幹細胞を採取するためにこれまで使用されてきた方法よりも浸潤性が少なく、痛みも少なく（血漿交換法とは異なる）、そしてより経済的である。
【００３０】
最後に、これらの細胞を簡単に得ることができ、さらに例えば、液体窒素内などで長期間保存できるということは、本願発明に係る方法により得られた該細胞を、自家移植およびその他多くの病気（種々の病巣、代謝異常、急性および慢性的な神経性および炎症性の病巣など）の治療に適したものにする。
【００３１】
本願発明の特徴によると、上述の方法に係る多能性幹細胞を生成するための血液、好ましくは末梢血の採取のためのキットは、抗凝固剤およびＭＣＳＦ物質を含有する得られた血液を保持する第一容器、例えば試験管を有する。
【００３２】
本キットを使用すると、上述の方法の手段による幹細胞の成長および生成をすばやく開始するための血液、好ましくは末梢血を採取することが可能になる。
【００３３】
したがって、本願発明の主な有利な点としては、全血を直接処理することで、現在の技術と比較して非常に限られた時間で、例えばたったの４８時間で、多能性幹細胞を十分な量得られることである。したがって、本願発明に係る血液を採取するためのキットは、全血、好ましくは末梢血から、直接多能性幹細胞を得るための短時間で且つ効果的な解決方法として提唱されている。
【００３４】
典型的には、本願発明に係る該キットの試験管内のＭＣＳＦの濃度は、２から２０ｎＭの間で変化し、好ましくは、８から１０ｎＭの間である。
【００３５】
通常、抗凝固剤として、ヘパリンもしくはＥＤＴＡが使われている。
【００３６】
抗凝固剤は、血液の凝固を防ぐために必須であり、ＭＣＳＦは、幹細胞の成長および増殖に関与している。
【００３７】
本願発明の変形例では、該キットは、試験管などの第一容器とは別に、一以上の容器を有することができる。後者は、好ましくは、例えばポリプロピレン（ＰＰ）などのプラスチック材の内壁で少なくとも作られており、これらは赤外線もしくは紫外線により処置されることにより該内壁に幹細胞がくっつくのを防ぎ、それにより、これらの凝固を防いでおり、この凝固は避けるべき状態なのである。
【００３８】
典型的には、上記後者の場合、経静脈用に得られた幹細胞は、第二容器にいれられ、局所用は、異なる大きさの第三容器にいれられる。
【００３９】
前記容器内で生成された幹細胞は、すぐに使用することができ、もしくは液体窒素内で保存することができるため、必要な時に使える。
【００４０】
他の変形例では、前記容器は、抗凝固剤およびＭＣＳＦを有する血液を採取するためのものと、保存用のものとは、所定の分類により一般的、順番もしくは作成した整理番号により識別することができ、それにより幹細胞が用意されたラボにおける識別と、郵送するときの識別を簡便にする。
【００４１】
一義的識別のために、対応する光学もしくは電子的読み取り機を使って、バーコードおよび／またはＲＦＩＤタグ、読み取りもしくは読み取り／書き込み用を容器に使用することもできる。
【００４２】
上述の方法の第一成長サブ工程は、血液が凝固しないように、好ましくは血液がサンプルされた直後に開始する。
【００４３】
血液の凝固を防ぎ、そして血液が採られてから可能な限り短い時間で幹細胞増殖させるために、「直後に」とは、血液が採られた後から血液が凝固するまでの間の可能な限り短い時間を意味する。
【００４４】
言い換えると、本願発明では血液が凝固する前に前記増殖が始まることが重要であることを考慮すると、「直後に」とは、患者から血液が採取された直後に幹細胞の成長を開始することを言う。
【００４５】
事実、患者から採取された血液は抗凝固剤およびＭＣＳＦと共に試験管の中に入れられる。抗凝固剤が、凝固反応を阻止し、一方で同時に存在しているＭＣＳＦは増殖を素早く開始させ、そして患者を治療するまでの時間を最小限にすることを保証する。
【００４６】
この定義は、血液、好ましくは末梢血のサンプルを患者から採取し、幹細胞を生成する能力に変化をきたさない保存処理される血液の凝固を防止するために抗凝固剤が添加されている血液の場合も含む。
【００４７】
必要であれば、血液は、保存されている場所から取り出され、上記のように幹細胞の増殖工程の対象となり、すなわち、ＭＣＳＦを加えて、必要な量の幹細胞を非常に素早く得る。
【００４８】
したがって、血液、好ましくは末梢血をサンプルし、保存する工程は、本願発明の範囲に含まれ、前記工程は、適切な血液バンクで幹細胞を生成することができ、さらにその後、ＭＣＳＦを加えることにより、多能性幹細胞の生成が必要になったときの使用も可能にする。
【００４９】
典型的には、保存されている場所から血液を取り出した後、２から２０ｎＭの濃度、好ましくは８から１０ｎＭのＭＣＳＦがすでに入っている容器に該血液が入れられる。
【００５０】
これにより、幹細胞を保存する複雑且つ高価な工程を回避することが可能になり、これは例えば、上述したように液体窒素の使用を提供し、また代わりに、血液を保存する従来の技術のみの使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、本願発明のキットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
添付の図１を参照すると、多能性幹細胞の生成のための本願発明に係る末梢血を採取するためのキット１０は、ＭＣＳＦ１４と、この場合はヘパリン１６を保持しているガラス製の試験管１２を有する。
【００５３】
試験管１２の中のＭＣＳＦ濃度は、８から１０ｎＭである。
【００５４】
該キットは、他に２つの試験管１８および２０を有し、これは、赤外線もしくはガンマ線で処理されたポリプロピレン（ＰＰ）などのプラスチック材料から形成されている。
【００５５】
第二試験管１２、１８は、経静脈の使用のための細胞を保存することを意図しており、そして、第三試験管２０は、局所使用のためである。
【００５６】
前記試験管１８および２０の中身を確実に滅菌することが重要である。
【００５７】
全ての試験管１２、１８および２０は、対応するストッパー２２、２４により閉塞される。
【００５８】
該ストッパー２２、２４は、圧力式、ねじ込み式などであってもよい。前記試験管１２の前記ストッパー２２は、例えば圧力式のものでもよい。各前記試験管１８および２０のストッパー２４は、例えばねじ込み式のものでもよい。
【００５９】
第二試験管１８の大きさは：高さ１１５ｍｍ、直径１７ｍｍ、厚さ０．３ｍｍ、容量１２ｍｌである。一方で、第三試験管２０の大きさは：高さ１１０ｍｍ、直径３０ｍｍ、厚さ０．３ｍｍ、容量４０ｍｌである。
【００６０】
本願発明に係るＭＣＳＦによる増殖の後、末梢血から分離された細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）として「ｉｎ  ｖｉｖｏ」で機能し、治療出来ない外傷や、病巣や、もしくは典型的な方法および／または薬ではゆっくりしか治らないものを数ヶ月で解消するのに適する。
【実施例】
【００６１】
サンプリング：
末梢血の各サンプル０．５から７ｍｌを馬および犬の下肢から採取し、すぐに適量のヘパリンおよびＭＣＳＦ（１０ｎＭ）が入った試験管に入れた。
【００６２】
他の抗凝固剤として、ＥＤＴＡなどが使用されてもよい。
【００６３】
この時点で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの第一サブ工程が行われており、ＭＣＳＦのおかげで、幹細胞の分化と、事前の成長が起きている。
【００６４】
精製：
血液サンプルは、ＮＨ４ＣＬ（２００ｍＭ）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に１：５で薄められ、これにより赤血球の溶解を起し、そして１０，０００ｇで遠心し、ＰＢＳで２回洗浄してからまた２００ｇで遠心する。得られた有核細胞は、３７℃において７から１２時間、好ましくは１０から１２時間培養され、フィコールグラディエントで分離することにより精製し、その後分離し、そしてＲＰＭＩ１６４０培地（ライフテクノロジー社製、ニューヨーク州グランドアイランド工場）で３回洗浄する。
【００６５】
一度、洗浄されると、前記細胞は、ＭＣＳＦ４５ｎＭの５０ｎｇ／ｍｌの存在下において、さらに２４から７２時間培養され、ＣＤ９０の表現型（ベクトンディキソン社製フローフォトメーターＦＡＣＳｃａｎを使用してサイトフローメトリー分析により断定）がおおよそ９５％である細胞を得ることができ、そして、局所もしくは１０，０００ｇにおける遠心処理に必要な細胞数を得るために増殖させ、経静脈治療のために約９０ｘ１０３細胞／ｍｌの濃度でＰＢＳで懸濁した。
【００６６】
免疫染色：
細胞の表現型解析のために、前記細胞は、ＰＢＳで洗浄され、その後ＰＢＳ中にホルムアルデヒド４％を含むスライド上において２０℃で２０分間固定された。
【００６７】
細胞内タンパク質を特定するために、前記細胞は、２０℃においてトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で５分間透過処理され、その後、１％のＢＳＡ（非特異的抗体をブロックするため）を含有するＰＢＳで薄められた一次抗体と共に１時間培養された。３回の洗浄を続けて行った後、前記スライドは、適切な蛍光色素：ＦＩＴＣもしくはテトラメチルローダミンＢイソチオシアネート（ＴＲＩＣ）、もしくはＣｙ５と結合した二次抗体と共に４５分間培養した。
【００６８】
二次抗体はすべて、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社でロバを宿主として作成された。
【００６９】
免疫細胞化学は、温度は４℃、湿度は飽和大気で行われた。３回の洗浄後、前記スライドは、「ｇｅｌｖａｔｏｌ＿ＰＢＳ」を使って取り付けられた。
【００７０】
その後、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（カルフォルニア州サンレアンドロ、コルテックス・バイオケム社製  ポリクローナル羊抗体）に対する直接的な免疫蛍光の内部スタンダードを使い、蛍光顕微鏡により蛍光画像が得られた。
【００７１】
ネガティブコントロールおよび蛍光発光の背景レベルを較正するために、対象のサンプルと同じアイソタイプの非特異的抗体で培養されたスライドが使用された。
【００７２】
前述の方法は、全てのマーカー（ＣＤ９０、ＣＤ９０／３４、ＣＤ３４およびＣＤ１１７）と、以下の表１に記載のマーカーを特定するために使用された。
表：ＭＣＳＦ（ＰＳＣ）で処理された細胞および末梢血から採取されたミクロファージの特徴。
【表１】
0005517362.tif 000002
【００７３】
本願発明の分野および範囲を逸脱しない限りにおいて、上述の幹細胞の生成のための血液好ましくは末梢血の採取ためのキットには、種々の変形および追加ができることは明白である。
【００７４】
本願発明は、実施例を参照して説明されたが、当業者であれば、特許請求の範囲に記載の特徴を備えた幹細胞の生成のための血液好ましくは末梢血の採取ためのキットをその他の様々な同等な物から達成でき、したがってこれらは本願の特許請求の範囲に記載された保護範囲に全て入るものである。
【図１】
0005517362.tif 000003