(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼの混合物を含む酵素組成物であって、前記フィターゼが配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記アルファ‐アミラーゼが、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）であり、
前記酵素組成物がデンプン加水分解組成物であることを特徴とする、
前記酵素組成物。
【請求項２】
前記フィターゼが配列番号３に対して少なくとも９９％の配列同一性を有することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記フィターゼが、配列番号３であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
デンプンを液化する方法であって、
フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼにｐＨ４．０とｐＨ６．２の間のｐＨで、製粉穀物のスラリーを接触させること、及び
液化デンプンを得るために、５分から８時間４０℃から１１０℃までの温度でスラリーを反応すること、
を含み、
前記フィターゼが配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記アルファ‐アミラーゼが、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）であることを特徴とする、前記方法。
【請求項５】
前記製粉穀物が、トウモロコシ、大麦、小麦、米、ソルガム、ライ、キビ、及びライ小麦の群より選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
デンプンを液化する方法であって、
ａ．４．０から６．２の範囲のｐＨで２分から４時間の間、粒状デンプン基質の初期デンプンゼラチン化温度より０から３０℃まで低い温度にて、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼと粒状デンプン基質含有スラリーをインキュベーションすること、及び
ｂ．ｐＨ４．０から６．２の範囲のｐＨで、５分から６時間の間、初期デンプンゼラチン化温度より０から４５℃高い温度まで温度を上昇すること及び液化デンプンを得ることを含み、
前記フィターゼが配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記アルファ‐アミラーゼが、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）であることを特徴とする、
前記方法。
【請求項７】
さらに、デキストリンを得るために液状化デンプンを糖化すること、及び前記デキストリンを回収することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、最終産物を得るために、適切な発酵条件下、前記デキストリンを発酵することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記最終産物がアルコール、有機酸、糖アルコール、アスコルビン酸中間体、アミノ酸、及び蛋白質の群から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルコールがエタノールであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
デンプン液化プロセスに必要なアルファ‐アミラーゼの用量を低減する方法であって、製粉穀物含有スラリーをアルファ‐アミラーゼに接触させること、及び前記スラリーをフィターゼに接触させること、を含み、
前記フィターゼが配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記アルファ‐アミラーゼが、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）であることを特徴とする、
前記方法。
【請求項１２】
全粒粉砕穀物においてフィチン酸含有量を低減する方法であって、
粉砕穀物のスラリーをフィターゼに接触させること、及び
さらに前記スラリーをアルファ‐アミラーゼと接触すること、を含み、
前記フィターゼが配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記アルファ‐アミラーゼが、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）であることを特徴とする、
前記方法。
【請求項１３】
前記アルファ‐アミラーゼ及びフィターゼが同時に添加されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
エタノールを生産する方法であって、
基質含有製粉穀物のスラリーをフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼとｐＨ４．０からｐＨ６．２の間のｐＨで接触すること、
液化デンプンを得るために４０から１１０℃の温度で５分から８時間の間、前記スラリーを反応すること、
前記液状化デンプンを糖化するグルコアミラーゼに前記液状化デンプンを接触させてデキストリンを生産すること、及び
エタノールを生産するためにデキストリンを発酵すること、を含み、
前記フィターゼが配列番号３に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、
前記アルファ‐アミラーゼが、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）であることを特徴とする、
前記方法。
【請求項１５】
植物原料が粉砕又は製粉穀物であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が酸又はアルカリの添加を含まないことを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記スラリーが、アルファ‐アミラーゼの熱安定性を増加するために十分な時間前記フィターゼと共に処理されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記スラリーが、より低いｐＨでデンプンを加水分解させるために十分な時間フィターゼと共に処理されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記スラリーが、アルファ‐アミラーゼのフィチン酸阻害を低減するために十分な時間フィターゼと共に処理されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００７年２月７日に出願した米国仮出願６０／９００，２３７と２００７年３月６日に出願した米国仮出願６０／９０５，２２２及び２００７年３月６日に出願した米国特許出願１１／７１４，４８７に基づいて優先権を主張するものであり、これらの出願の各内容は、それらの全体について引用により取り込まれる。
【０００２】
本発明は少なくとも一つ以上のフィターゼ及び少なくとも一つのアルファ‐アミラーゼを含む酵素組成物、デンプンの液化方法、及びグルコース及びアルコール類（例、エタノール）等の最終産物の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
産業用発酵は、酵素類、蛋白質類、アミノ酸類、有機酸類、糖アルコール類、医薬品類、及び他の生物化学薬品類のような、多くの最終産物の生産のための原料として、グルコースを主に用いる。多くの利用においてグルコースはデンプン及びセルロース（例、全体を粉砕される穀物）含有基質の酵素的転換から生産される。デンプンは、アミロース及びアミロペクチンという二つのポリサッカライド分画を有し、顆粒状粒子として、植物細胞中に存在する。これらの顆粒の部分的結晶構造は冷水中不溶性であり、その結果、水に対するデンプン顆粒の可溶化は一般的に顆粒の結晶構造を崩壊するための熱エネルギーが必要となる。多大なプロセスをデンプン可溶化に使用し、これらは粒状デンプン（例えば、STARCH  CHEMISTRY  AND  TECHNOLOGY,  Eds  R.L.  Whistler他、2nd  Ed.,  1984  Academic  Press  Inc.,  Orlando  FL及びSTARCH  CONVERSION  TECHNOLOGY,  Eds  G.M.A.  Van  Beynum他、Food  Science  and  Technology  Series  1985  Marcel  Dekker  Inc.  NYを参照）含有基質の直接的及び間接的加熱を含む。
【０００４】
一般的に、デンプンからグルコースへの処理は、二段階からなり、これらの段階はデンプンの液状化及び液化デンプンの糖化を含む。さらに、段階は、（ａ）所望の最終産物が精製デキストロース又はフルクトースの場合に、精製及び異性化又は（ｂ）所望の最終産物が例えば、アルコール（例、エタノール）の場合に、発酵及び蒸留を含んでよい。
【０００５】
デンプン液状化プロセスの目的はデンプンポリマー顆粒のスラリーを低粘度のさらに短い鎖の長さであるデキストリンの液体へ転換することである。これは、デンプン転換プロセスにて用いる産業用装置の便利な操作のための重要な段階である。通常、デンプンは高温及び酵素的生物的変換の使用により液化される。例えば、通常の酵素的液状化プロセスは熱安定性微生物のアルファ‐アミラーゼ（例、スペザイム（商標）プライム（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＰＲＩＭＥ）及びスペザイム（商標）フレッド  （ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）  (ジェネンコ  インターナショナル社)、又はターマミルＳＣ（ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＳＣ）、ターマミル  スープラ  （ＴＥＲＭＡＭＹＬ  ＳＵＰＲＡ）又はターマミル  １２０Ｌ（ＴＥＲＭＡＮＹＬ  １２０Ｌ）  (ノボザイムズ)）を粒状デンプン含有基質を含むスラリーに添加し、pHを５．５から６．５の間及び９０℃以上の温度に調整することを伴う。デンプンはゼラチン化し、そして、糖化酵素に接触される。典型的に、糖化は、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（例、オプチデックスＬ−４００（ＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００）(ジェネンコ  インターナショナル社)）由来のグルコアミラーゼのようなグルコアミラーゼの存在下液状化段階のｐＨより酸性のｐＨで起こる。
【０００６】
数多くのバリエーションがデンプン基質の液状化及び糖化には存在し、従来技術による進歩にもかかわらず、より有用なデンプンの液状化手段の必要性がなお存在する。
【発明の概要】
【０００７】
ある実施態様においては、本発明は少なくとも一つフィターゼ及び少なくとも一つのアルファ‐アミラーゼを含む酵素組成物に関する。いくつかの実施態様においては、フィターゼは細菌ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）及び変異体及びそれらの修飾体由来のものである。いくつかの実施態様においては、フィターゼは、配列番号１に記載の配列又は配列番号１の変異体（例えば、配列番号２又は配列番号３）に少なくとも７５％同一性を有する野生型配列を含むフィターゼである。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又はバシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来である。さらなる実施態様においては、アルファ‐アミラーゼはバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）から得られる親アルファ‐アミラーゼの変異体である。いくつかの実施態様においては、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼ酵素を混合製剤又は混合物で提供する。いくつかの実施態様においては、本発明による酵素組成物はフィターゼに加えて少なくとも二つのアルファ‐アミラーゼ（例えば、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアルファ‐アミラーゼ及びバシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ‐アミラーゼ）を含んでよい。
【０００８】
他の実施態様においては、本発明は上述のようなフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼ含有酵素組成物を含むデンプン加水分解組成物に関する。
【０００９】
さらなる実施態様においては、本発明は乾燥又は湿式製粉プロセスのいずれかの、デンプン基質を含むスラリー中のデンプンを液化する方法に関し、その方法は約ｐＨ４．０からｐＨ６．２未満までに基質含有スラリーのｐＨを調整すること、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼの組み合わせを任意の順序でスラリーに添加すること、該フィターゼが野生型及びそれらの変異体を含むブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）由来であることを特徴とし、及び液化デンプンを得るために約４０から１１０℃の温度で５分から８時間の間スラリーを反応することを含む。
【００１０】
さらなる実施態様においては、本発明は粒状デンプン含有基質からデンプンを液化する方法に関し、ａ）約４．０から約６．２のｐＨ範囲で、約２分から約４時間の間、基質の初期デンプンゼラチン化温度より０から約３０℃まで低い温度で、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼと粒状デンプン基質含有基質を含むスラリーをインキュベーションすること、ｂ）ｐＨ約４．０から約６．２の間のｐＨで、約５分から約６時間の間、初期デンプンゼラチン化温度より０から約４５℃高い温度まで上昇させ、液化デンプンを得ることを含む方法である。さらに、方法はデキストリンを得るために液化デンプンを糖化すること及びデキストリンを回収することを含んでよい。いくつかの実施態様においては、さらに、方法は、アルコール（例えば、エタノール）、有機酸類（例えば、コハク酸、乳酸）、糖アルコール類（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、ＤＫＧ，ＫＬＧ）、アミノ酸（例えば、リジン）、及び蛋白質類の（例えば、抗体及びそれらのフラグメント）ような最終産物を得るために、適切な発酵条件下、デキストリンを発酵することを含む。ある実施態様においては、方法は第一及び／又は第二液状化段階において任意の順序でＢＰ−１７及び少なくとも一つのアルファ‐アミラーゼの組み合わせを同時に又は分離してスラリーに添加することを含む。
【００１１】
さらに別の実施態様においては、本発明は粉砕穀物のようなデンプン基質及びアルファ‐アミラーゼを含むスラリーを本発明にかかるフィターゼと接触することを含むデンプン液状化プロセスに必要とされるアルファ‐アミラーゼの量を低減する方法に関する。
【００１２】
さらなる実施態様においては、本発明は、粉砕穀物のスラリーを本発明にかかるフィターゼに接触させ、及び任意的に粉砕穀物とアルファ‐アミラーゼとのスラリーにフィターゼを同時又は連続的に接触させることによる、粒状デンプンを含む全粒粉砕穀物におけるフィチン酸含有量を低下する方法に関係する。
【００１３】
さらに別の実施態様においては、本発明はフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼ存在下植物原料を発酵し、発酵した原料を蒸留して、エタノールを生産することを含む、エタノール生産方法に関する。いくつかの実施態様においては、植物原料は粉砕又は製粉穀物である。いくつかの実施態様においては、方法は酸又はアルカリの添加を伴わない。いくつかの実施態様においては、スラリーをアルファ‐アミラーゼの熱安定性を増加するために十分な時間フィターゼ処理する。いくつかの実施態様においては、スラリーを低いｐＨでデンプン加水分解するのに十分な時間フィターゼ処理する。さらなる実施態様においては、スラリーをアルファ‐アミラーゼのフィチン酸阻害を低減するために十分な時間フィターゼ処理する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１に任意的な前処理段階（第一液状化）を含む本発明の実施態様を図式的に示す。
【図２】図２に８５℃、ｐＨ５．８及び実施例８に記載の条件でのフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼに接触させた全粒粉砕トウモロコシの３６％ｄｓスラリーの粘度減少を示す。
【図３】図３にさらに実施例９に記載のようにスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びＢＰ−１７の組合せでｐＨ５．８にて３０％ｄｓトウモロコシ粉スラリーの粘度の減少を示す。
【図４】図４にブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの野生型及びＢＰ−１７変異体両者の異種発現のために用いたｐＴＲＥＸ４／ｐｈｙｔａｓｅ融合構築体を示す。
【図５】図５にブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの野生型及びＢＰ−１７変異体両者の異種発現のために用いたｐＴＲＥＸ４／ｐｈｙｔａｓｅ直接構築体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本明細書にて他に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術的及び特別な用語はこの発明に属する当業者によって普通に理解されるものと同様の意味を持つ。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、他、  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ２Ｄ  ＥＤ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  (１９９４)及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，  ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，  ＮＹ  (１９９１)が、当業者には本発明で用いられる用語の多くの一般的辞書となる。さらに、特定の用語は明瞭性のため及び参照の場合のために下記に定義する。
【００１６】
本明細書にて用いる用語「フィターゼ（ｐｈｙｔａｓｅ）」はフィチン酸を含むリン酸エステルの加水分解を触媒し、無機のリン酸塩及びイノシトールを放出することのできる酵素をいう。いくつかの実施態様においては、フィチン酸に加えて、フィターゼがリン酸化の度合いを仲介するイノシトールリン酸塩の少なくとも一つを加水分解することができてよい。
【００１７】
本明細書にて用いる用語「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」は、宿主細胞中に自然発生的に生じる酵素をいう。いくつかの実施態様においては、用語「親（ｐａｒｅｎｔ）」又は「親配列（ｐａｒｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」が用語「野生型」と互換可能に用いる。
【００１８】
用語「野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ（ＷＴ−ＢＰ）」は、配列番号１のアミノ酸配列を有する酵素をいう。
【００１９】
用語「ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ−１１（ＢＰ−１１）」は、配列番号２のアミノ酸配列を有する変異フィターゼ酵素をいう。
【００２０】
用語「ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ−１７（ＢＰ−１７）」は、配列番号３のアミノ酸配列を有する変異フィターゼ酵素をいう。
【００２１】
「アルファ‐アミラーゼ（Ａｌｐｈａ  ａｍｙｌａｓｅｓ）」はアルファ‐１、４、‐グルカン‐グルカノヒドロラーゼ（Ｅ.  Ｃ.  ３．２.１．１）であり、デンプン（例、アミロペクチン又はアミロースポリマー）中アルファ‐１、４、グルコシド内部結合を切断又は加水分解する酵素である。
【００２２】
用語「機能的に同等（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）フィターゼ（ＷＴ−ＢＰ）と同様の酵素的特徴を有する酵素及び野生型フィターゼ由来の酵素を意味する。
【００２３】
酵素（例、アルファ‐アミラーゼ、フィターゼ、又はその同類）に関して用いる場合、用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、自然的に生じる酵素由来の酵素であるが、自然発生的酵素に比較して一以上のアミノ酸の置換、挿入、欠損を有する酵素を意味する。その用語は、酵素のハイブリッドの形態を含み、例えば、酵素がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（例、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））由来のＣ末端と異なるバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（例、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））由来のＮ末端を有してもよい。変異体は、野生型と比較して、熱安定性の増加、蛋白質分解安定性の増加、特異的活性の増加、基質特異性の拡張、ｐＨ範囲に対する活性の拡張、又はそれらの組み合わせのような、しかしこれらに限定されないが、一以上の改変される特徴を有してよい。
【００２４】
用語「接触すること」は、少なくとも一つの酵素が少なくとも一つの最終産物へ基質を転換できるように各基質に十分接近させることをいう。少なくとも一つの酵素を含む少なくとも一つの溶液を対応する酵素基質と混合することによって「接触すること（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」に至ることは、当業者の知るところである。
【００２５】
「液状化（Ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ）」又は「液化する（ｌｉｑｕｅｆｙ）」は、デンプンがより短い鎖及びより低い粘性のデキストリンに転換するプロセスを意味する。
【００２６】
「デキストリン（Ｄｅｘｔｒｉｎｓ）」はグルコースの短鎖ポリマー（例、２から１０単位）である。
【００２７】
本明細書にて用いる用語「デンプン（ｓｔａｒｃｈ）」は、植物性ポリサッカライドの炭水化物の複合体を含み、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘで表すアミロース及びアミロペクチンを含む任意の原料をいい、ここでｘは任意の数字である。
【００２８】
用語「粒状デンプン（ｇｒａｎｕｌａｒ  ｓｔａｒｃｈ）」は、生デンプン、つまり、ゼラチン化温度にさらされていないデンプンを意味する。
【００２９】
用語「糖化酵素（ｓａｃｃｈａｒｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）」及び「グルコアミラーゼ（ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ）（Ｅ.  Ｃ.  ３．２.１．３）」は本明細書にて互換可能に用い、デンプン及び関連オリゴサッカライドとポリサッカライドの非還元末端からＤ‐グルコースの放出を触媒することができる任意の酵素をいう。
【００３０】
用語「オリゴサッカライド（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」は、グリコシド結合で結合する２から１０のモノサッカライド単位を有する任意の化合物をいう。単糖のこれらの短鎖ポリマーはデキストリンを含む。
【００３１】
用語「ＤＥ」又は「デキストロース当量（ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、乾燥重量を基本にＤ‐グルコースとして計算される、還元糖全体の濃度を測定するための業界基準である。非加水分解粒状デンプンはＤＥが実質的に０であり、Ｄ‐グルコースはＤＥが１００となる。
【００３２】
用語「グルコースシロップ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｓｙｒｕｐ）」は、グルコースの固体を含む水溶性の組成物をいう。グルコースシロップは少なくとも２０のＤＥを有する。いくつかの実施態様においては、グルコースシロップは２１％より多い水分を含まず、デキストロースとして換算して２５％未満の還元糖を含まない。ある実施態様においては、グルコースシロップは少なくとも９０％のＤ‐グルコースを含み、他の実施態様においては、少なくとも９５％のグルコースを含む。いくつかの実施態様においては、用語グルコース及びグルコースシロップは互換可能に用いる。
【００３３】
用語「全体の糖度（ｔｏｔａｌ  ｓｕｇａｒ  ｃｏｎｔｅｎｔ）」は、デンプン組成物中に存在する全体の糖の含有量をいう。
【００３４】
用語「乾燥固体（ｄｒｙ  ｓｏｌｉｄｓ）（ｄｓ）」は、乾燥重量を基本として％表示のスラリーの全体の固体をいう。
【００３５】
本明細書にて同定されたアミノ酸配列又は核酸配列に関して本明細書で用いる「配列同一性割合（％）（ｐｅｒｃｅｎｔ(％)ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、必要であれば、最大の割合の配列同一性を達成するように、いずれの同類置換をも配列同一性の一部として考慮することなく、配列を整列し及びギャップを挿入した後、配列中のアミノ酸残基又はヌクレオチドと同定された候補配列におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドとの割合で定義される。周知である配列整列をする方法と配列同一性の決定は過度の実験をせずに行うことができ、同一性値の計算は確定的に得られる。例えばＡｕｓｕｂｅｌ他編、(１９９５)Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,  １９章(Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｅｌｙ‐Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ,  ＮｅｗＹｏｒｋ)及びＡＬＩＧＮ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｄａｙｈｏｆｆ  （１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５:Ｓｕｐｐｌｅ  ３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ,  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ,  Ｄ.Ｃ.）を参照願いたい。多くのアルゴリズムは配列を整列させ、配列同一性を決定するのに利用可能である。例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ他のｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９７０）Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.４８:４４３、スミス他のｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（１９８１）Ａｄｖ.Ａｐｐｌ.Ｍａｔｈ.２:４８２,  Ｐｅａｒｓｏｎ他のｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ  (１９８８)  Ｐｒｏｃ.  Ｎａｔｌ.  Ａｃａｄ.  Ｓｃｉ.  ８５:２４４４,  ｔｈｅ  Ｓｍｉｔｈ‐Ｗｓｔｅｒｍａｎ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  (Ｍｅｔｈ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.７０:１７３‐１８７(１９９７)及びＢＬＡＳＴＰ,  ＢＬＡＳＴＩＮ,  ａｎｄ  ＢＬＡＳＴＸ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ(参照Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）J.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２１５:４０３−４１０)を参照されたい。これらのアルゴニズムに使用するコンピュータープログラムは入手可能であり、以下のものを含むがこれらに限定はされない。即ち、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｎｇ(ＤＡＮＳＴＡＲ)ソフトウエア又はＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｍｅｔｈ.  Ｅｎｚｙｍ.,  ２６６:４６０-４８０(１９９６))、又はＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ(Ａｌｔｓｃｈｕｌ他)上記、ＦＡＳＴＡ及びＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  (ＧＣＧ)パッケージ、バージョン８、マジソン、ウィスコン州米国にて入手可能なＴＦＡＳＴＡ及びＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅｓ,  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州による  ＣＬＵＳＴＡＬ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＰＣ/Ｇｅｎｅ  ｐｒｏｇｒａｍである。当業者であれば比較される配列の長さに渡って最大の配列比較を達成するために必要であるアルゴリズムを含め、整列を測定する適切なパラメーターを決定できる。好ましくは、配列同一性はプログラムによって決定されたデフォルトパラメーターを使用することにより決定される。特に、配列同一性はＳｍｉｔｈ-Ｗａｔｅｒｍａｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏ���ｉｔｈｍ  (Ｍｅｔｈ.  Ｍｏｌ.  Ｂｉｏｌ.  ７０:  １７３-１  ８７  (１９９７))  によって決定される。このアルゴリズムは次のサーチパラメーターで、すなわち１２のギャップ開始ペナルティ及び１のギャップ伸長ペナルティで、アファインギャップサーチを使用しているＭＳＰＲＣＨ  ｐｒｏｇｒａｍ  (Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ)  で実行される。好ましくは対のアミノ酸の比較はＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ,  Ｉｎｃ.,  Ｍａｄｉｓｏｎ,  Ｗｉｓ.の１２のギャップウエイトと２のレングスウエイトをもつＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列を使用しているＧＣＧ配列分析ソフトウエアパッケージの使用により実行される。二つのアミノ酸配列の最適整列に関して、種々のアミノ酸配列の連続セグメントは参照アミノ酸配列に対して追加アミノ酸残基又は欠損アミノ酸残基をもってもよい。参照アミノ酸配列と比較するために使用した連続セグメントは少なくとも２０アミノ酸残基を含んでもよく、３０、４０、５０又はそれ以上のアミノ酸残基を含んでもよい。誘導体のアミノ酸配列中ギャップを含む関係で増加した配列同一性の補正はギャップペナルティを割り当てることにより実行できる。
【００３６】
用語「％ホモロジー（％  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は用語「％同一性（％  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」と本明細書にて互換可能に用いる。二つの配列間の同一性を決定するために用いることのできる典型的なコンピュータプログラムは、一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、及びＴＢＬＡＳＴＸ、ＢＬＡＳＴＰとＴＢＬＡＳＴＮ、及びインターネットで公的に入手可能なもの(例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイト上ＢＬＡＳＴページを参照)を含むが、これらに限定されない。また、Ａｌｔｓｃｈｕｌ,  他、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７を参照願いたい。
【００３７】
得られる核酸配列をＧｅｎＢａｎｋＤＮＡ配列における核酸配列及び他の公的データベースと比較して評価する場合、配列検索は一般的にＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＧｅｎＢａｎｋ蛋白質配列における核酸配列及び他の公的データベースにおけるアミノ酸配列に対してすべてのリーディングフレーム中に翻訳される核酸配列を検索するために有用である。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸ両者はオープンギャップペナルティ１１．０、及び拡張ギャップペナルティ１．０のデフォルトパラメータを用いて計算され、ＢＬＯＳＵＭ‐６２マトリックスを利用する。（例、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、他、１９９７参照）
【００３８】
二以上の配列間で「％同一性」を決定するために、選択される配列の好ましいアラインメントを、例えば、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒバージョン６．５のＣＬＵＳＴＡＬ‐Ｗプログラムを用いて行い、オープンギャップペナルティ１０．０、拡張ギャップペナルティ０．１、及びＢＬＯＳＵＭ‐３０相似行列を含むデフォルトパラメータで操作する。
【００３９】
用語「製粉する（ｍｉｌｌｅｄ）」は、すりつぶす、押しつぶす、断片化する、又は粒子サイズを小さくする他の任意の手段によって、サイズを小さくする植物原料をいうために本明細書にて用いる。製粉には乾式又は湿式製粉を含む。「乾式製粉（Ｄｒｙ  ｍｉｌｌｉｎｇ）」は乾燥穀物全体の製粉をいう。「湿式製粉（Ｗｅｔ  ｍｉｌｌｉｎｇ）」は穀物を柔らかくするために穀物を最初に水に浸すプロセスをいう。
【００４０】
用語「ゼラチン化（ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ）」は一般的に、粘性のある懸濁液を形成するために加熱によるデンプン分子の可溶化をいう。
【００４１】
用語「ゼラチン化温度（ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は基質を含むデンプンのゼラチン化が始まる最も低い温度をいう。ゼラチン化の適切な温度は特定のデンプンで決定され、植物の種、及び環境と成長条件のような因子次第で変化してよい。
【００４２】
用語「ゼラチン化温度未満（ｂｅｌｏｗ  ｔｈｅ  ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）」は、ゼラチン化温度より低い温度をいう。
【００４３】
用語「スラリー（ｓｌｕｒｒｙ）」は不溶性固体（例えば、粒状デンプン）を含む水溶性混合液をいう。
【００４４】
用語「発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」は、より簡単な有機化合物を生産するために微生物によって有機基質の酵素的及び嫌気的分解をすることをいう。発酵は嫌気的条件下で行われる一方、この用語は単に嫌気条件下で行われるものに限定されず、酸素存在下での発酵も意図する。
【００４５】
語句「同時糖化発酵（ＳＳＦ）」は、エタノール生産微生物のような発酵生物と糖化酵素のような少なくとも一つの酵素が同じ反応器中同じ工程で併用する最終産物の生産工程をいう。
【００４６】
用語「蒸留残液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）」は、懸濁微粒子及び溶解原料を含む固体（例えば、スクリーニング又は遠心分離によって生じる）から分離される蒸留物（ｓｔｉｌｌａｇｅ）の液体部分を意味する。用語「バックセット（ｂａｃｋｓｅｔ）」及び／又は「補充水（ｍａｋｅ−ｕｐ  ｗａｔｅｒ）」は一般的に再循環される蒸留残液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）を意味するために用いる。
【００４７】
用語「最終産物（ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）」は、発酵基質から酵素的に転換される任意の炭素源由来産物をいう。いくつかの好ましい実施態様においては、最終産物はアルコール（例えば、エタノール）である。
【００４８】
用語「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ）」は用語「から由来する（ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」、「得られる（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」又は「から得られる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ）」、及び「から単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」を含み、いくつかの実施態様においては、ヌクレオチド配列によりコードするポリペプチドが、そのヌクレオチドが自然的に存在する又はヌクレオチドが挿入されていた細胞から生産される意味で本明細書にて用いる。
【００４９】
本明細書にて用いる用語「発酵生物（ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」は、発酵における使用に適し、直接又は間接的に最終産物を生産するのに適する任意の微生物又は細胞をいう。
【００５０】
本明細書にて用いる用語「エタノール生産者（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ）」又は「エタノール生産微生物（ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」は単糖又はオリゴ糖からエタノールを生産することのできる発酵微生物をいう。
【００５１】
本明細書にて用いる用語「回収される（ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ）」、「単離される（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」、及び「分離される（ｓｅｐａｒａｔｅｄ）」は、自然に結合する少なくとも一つの成分から除去される蛋白質、細胞、核酸、又はアミノ酸をいう。
【００５２】
用語「蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」及び「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、本明細書にて互換可能に用いる。本明細書及び特許請求の範囲において、従来の１文字及び３文字のアミノ酸残基コードを使用する。アミノ酸の３文字コードは、生化学命名に関するＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡＣ‐ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  （ＪＣＢＮ））に基づいて定められる。また、ポリペプチドが、遺伝子コードの縮重により二以上のヌクレオチド配列によりコードされてよいことは理解される。
【００５３】
用語「作動的に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、要素が機能的に関連するように調整される位置に並んで位置することをいう。例えば、プロモーターは、配列の転写を調節する場合、コード配列に作動的に連結する。
【００５４】
用語「選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ）」は、導入される核酸又はベクターを含む宿主細胞の選択を容易にするために宿主細胞中に発現できる遺伝子をいう。選択マーカーの例は、抗生物質（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又は、クロラムフェニコール）及び／又は宿主細胞の栄養的利益のような、代謝利益を与える遺伝子を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
ポリヌクレオチド又は蛋白質に関して、用語「異種の（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」は宿主細胞に自然的に発生しないポリヌクレオチド又は蛋白質をいう。いくつかの実施態様においては、蛋白質は商業的に重要な産業用蛋白質である。その用語は自然的に発生する遺伝子、変異遺伝子、及び／又は合成遺伝子によりコードする蛋白質を含むと考えられる。  
【００５６】
ポリヌクレオチド又は蛋白質に関して、用語「内因性の（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）」は宿主細胞中に自然的に発生するポリヌクレオチド又は蛋白質をいう。
【００５７】
本明細書にて、細胞に関して用いる場合の用語「形質転換される（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」「安定に形質転換される（ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」及び「トランスジェニックの（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）」は、遺伝子に組み込まれ又は複数世代を通して維持されるエピソームプラスミドとして組み込まれる外来種（例えば、異種の）の核酸配列を細胞が有することを意味する。
【００５８】
本明細書にて用いる用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが生産されるプロセスをいう。プロセスは転写及び翻訳を含む。
【００５９】
核酸配列を細胞に挿入する文脈で用いる用語「導入される（ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ）」は、「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」、又は「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」又は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」を意味し、核酸配列が細胞（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）の遺伝子へ取り込まれ、自律的レプリコンに転換し、又は一時的に発現（例えば、トランスフェクションされるｍＲＮＡ）しうるように核酸配列を真核細胞又は原核細胞に取り込む表現を含む。
【００６０】
本明細書と添付請求の範囲に使用している、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は内容が明らかに他の事を指示していない限り、複数の指示対象であることを含む。すなわち、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」の意味は一以上の細胞及び当業者等に理解されるそれらの同等のものを含む。
【００６１】
数値範囲が与えられる場合、内容が明らかに他の事を指示していない限り、その範囲の最大限定値と最小限定値の間に最小限定単位の１０分の１に至るまで各介在値も具体的に開示されると理解される。任意に記載される値又は記載される範囲中の介在値と任意に他に記載される値又は記載される範囲中の介在値の間のより狭い範囲をそれぞれ本発明内に含む。これらのより狭い範囲の最大限定値及び最小限定値を独立してその範囲を含み又は除いてもよく、最大限定値と最小限低値どちらか一方、又は両方をより狭い範囲に含む場合又は含まない場合の各範囲もまた本発明の範囲に含まれ、記載される範囲における任意の具体的な除かれる限定値を条件とする。記載される具体的範囲が限定値のひとつ又は両方を含む場合、それらの含まれる限定値のどちらか一つ又は両方を除く範囲もまた、本発明に含まれる。
【００６２】
本明細書を通して、用語の他の定義が本明細書の他の場所に含まれることがある。一般的な実施態様がより詳しく説明される前にここにおいて、本発明が記載される特定の実施態様及びもちろん改変されるであろう実施態様に限定されないことを指摘する。
【００６３】
本明細書にて示す刊行物は本出願の出願前にそれらの開示があったことを単に示すだけである。本明細書が、本発明が先行発明の理由によりそのような刊行物に先行する権利を与えないということを承認するものではない。
【００６４】
典型的な実施態様
本発明者等はフィターゼ、特に、野生型ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）フィターゼ（例えば、Ｐ１−２９，配列番号１）及びそれらの変異体（例えば、ＢＰ−１１、配列番号２及びＢＰ−１７配列番号３）をアルファ‐アミラーゼ含有デンプン加水分解プロセスへ添加することによってフィターゼのないアルファ‐アミラーゼの使用に対して特定の有意な効果があることを発見した。さらに、本発明者等は野生型ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）フィターゼ（例えば、Ｐ１−２９）及びそれらの変異体の使用がデンプン加水分解の効率性を増加する手段であることを見出した。
【００６５】
現在のエタノールプロセスは液状化酵素及び酵母発酵に適切な条件を供給するためにデンプン液状化の前後にｐＨ調整が必要である。そのｐＨ調整は多くの不利益をもたらす。例えば、ｐＨの調整は、発酵生物を阻害できる高塩の原因となる。また、硫酸を使用する場合、硫黄除去の問題が生じてくる。さらに、ｐＨ調整はプロセスにおける追加段階を要求し、その結果効率性が低減する。フィターゼを有する液状化酵素（例えば、アルファ‐アミラーゼ）を安定化することにより、液状化が通常必要とされるｐＨより低いｐＨで行うことができることが見出された。実際に、フィターゼを有する処理によって、ｐＨ調整していない全粒粉砕穀物スラリー、高いレベルの蒸留残液を含有する全粒粉砕穀物スラリーでさえ、そのｐＨで液状化が生じる結果となった。このことにより、全粒粉砕穀物のエタノールへの転換の間の酸又はアルカリを用いるｐＨ調整の除去を可能とした。さらに、これはｐＨを調整しない単一液状化段階又は低量の酵素を用いる二つの液状化段階におけるデンプンからグルコースへの転換を可能とした。さらなる効果として、これにより更なるｐＨの調整なしに同時糖化発酵を行うためのプロセスを有効とした。さらに、ｐＨ調整を行うプロセスでさえアルファ‐アミラーゼの熱安定性を増加する結果となった。
【００６６】
フィターゼ‐
いくつかの実施態様においては、本発明に有用な少なくとも一つフィターゼはブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．）である微生物由来のものである。ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．）は、ブティアウクセラ  アグレスティス（Ｂ．  ａｇｒｅｓｔｉｓ）、  ブティアウクセラ  ブレネラエ（Ｂ．  ｂｒｅｎｎｅｒａｅ）、ブティアウクセラ  フェラギターゼ（Ｂ．  ｆｅｒｒａｇｕｔｉａｓｅ）、ブティアウクセラ  ガビニアエ（Ｂ.  ｇａｖｉｎｉａｅ）、ブティアウクセラ  イザルディイ（Ｂ.  ｉｚａｒｄｉｉ）、ブティアウクセラ  ノアキアエ（Ｂ.  ｎｏａｃｋｉａｅ）、及びブティアウクセラ  ワ−ムボールディアエ（Ｂ.  ｗａｒｍｂｏｌｄｉａｅ）を含む。ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種はＤＳＭＺ、ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  (Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｂｅ  ７Ｂ,  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ,  Ｇｅｒｍａｎｙ)  から入手できる。登録番号ＮＣＩＭＢ  ４１２４８にて寄託されるブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）の菌株であるＰ１−２９は、フィターゼが本発明によって得られ及び使用されてよい特に有用な菌株の例である。フィターゼはＷＯ  ０６／０４３１７８に記載の方法により、例えば、ハイブリダイゼーション法によりブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．）から同定されてよい。
【００６７】
好ましい実施態様においては、本発明に有用なフィターゼは、配列番号１（表１を参照）記載の及びそれらの変異体のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％配列同一性を有する。好ましい実施態様においては、フィターゼはブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐ．）由来である。より好ましくは、本発明に有用なフィターゼは配列番号１に記載の又はそれらの変異体のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％から９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施態様においては、フィターゼは配列番号１のアミノ酸配列を含む。
0005463146.tif 000002
【００６８】
いくつかの実施態様においては、フィターゼは配列番号１に少なくとも９５％配列同一性を含むアミノ酸配列のフラグメントであり、そのフラグメントは、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸を含む。いくつかの実施態様においては、フラグメントはフィターゼ活性を有する。いくつかの実施態様においては、フラグメントは、配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の活性を有する。
【００６９】
他の実施態様においては、フィターゼは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するフィターゼの変異体である。好ましい変異体はＰＣＴ特許出願ＷＯ  ２００６／０４３１７８に記載の変異体である。
【００７０】
配列番号１の他の好ましい変異体は、本明細書にて開示する配列番号１の次の位置の少なくとも一つに変異を加えるポリペプチドを含む。それらの位置は、２６、３７、８９、９２、１３４、１６０、１６４、１７１、１７６、１７８、１８８、１９０、１９２、２０７、２０９、２１１、２３５、２４８、２５６、２６１、２７０、３０６、又は３１８である。いくつかの実施態様においては、変異体は、配列番号１に相当する次の位置において変異を加えるフィターゼポリペプチドを含む。それらの位置は、８９、１３４、１６４、１７６、１７８、２０７、２０９、２４８、２５６、２６１、及び２７０である。他の実施態様においては、変異体は、配列番号１に相当する位置にて少なくとも一つさらに変異を含んでもよい。いくつかの実施態様においては、配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の活性を有する。
【００７１】
他の実施態様においては、フィターゼは、K26E、T134V/I、F164S、T176K、K207T/E、D211C、又はQ256Yに相当する位置において少なくとも一つの変異を有してよい。他の実施態様においては、変異体は、変異の組み合わせを含むポリペプチドを含む。例えば、ＷＯ  ２００６/０４３１７８の表１を見ると、ＰＣＴ出願の公報の配列番号３に関連して番号付けをしている。いくつかの実施態様においては、変異体は、配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の活性を有する。
【００７２】
本発明のいくつかの実施態様においては、フィターゼは、配列番号２のアミノ酸配列又はそれに少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するフィターゼを含む、又はからなる。また、本明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含む、又はから成るフィターゼは、野生型ブティアウクセラ種（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ  ｓｐｐ．）の変異体としてＷＯ  ２００６/０４３１７８に開示される。この変異体は本明細書にてＢＰ−１１という。配列番号１（ＢＰ−ＷＴ）とＢＰ−１１変異体（配列番号２）のアミノ酸配列の間には１１のアミノ酸残基が異なり、表２の配列番号２においてこれらの残基を太字及び下線にて示す。いくつかの実施態様においては、フィターゼＢＰ−１１を含んでよく、１、２、３、又はそれ以上のアミノ酸変異をしてよい。
0005463146.tif 000003
【００７３】
本発明のいくつかの実施態様においては、変異体は、配列番号１のA89、D92、T134、F174、T186、A188、K207、A209、S248、Q256、A261、及びN269に位置する残基に相当するアミノ酸残基おける置換を含む又はからなる。いくつかの実施態様においては、フィターゼは配列番号３又はそれに少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％及び少なくとも９９％アミノ酸配列同一性を有するフィターゼを含む、又はからなる。配列番号３の変異体は本明細書にてＢＰ−１７という。配列番号１とＢＰ−１７変異体（配列番号３）のアミノ酸配列の間では１２のアミノ酸残基が異なり、これらは次の置換のとおりである。即ち、A89T、D92A、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E、及びN269Kである。さらに、ＢＰ−１７は、９２番目の残基に相当する位置で一つのアミノ酸置換がＢＰ−１１と異なる。つまり、いくつかの実施態様においては、変異体は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有し、少なくとも９２番目のアミノ酸がアラニンである。他の実施態様においては、変異体は、配列番号３に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有し、少なくとも９２番目のアミノ酸がアラニンである。他の実施態様においては、変異体は、配列番号１に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％配列同一性を有し、少なくとも９２番目のアミノ酸がアラニン、及びA89T、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E、及びN269Kの群から選択される少なくとも一つの他のアミノ酸置換を有する。ＢＰ−ＷＴとＢＰ−１７残基間の違いは下記表３の太字及び下線で示す。
0005463146.tif 000004
【００７４】
いくつかの実施態様においては、配列番号２又は配列番号３に対して少なくとも９５％配列同一性を有するフィターゼは、同類アミノ酸置換（ａ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を含んでよい。例えば、同類アミノ酸置換はＡｌａをＧｌｙ又はＣｙｓと置換し、ＡｒｇをＬｙｓ、Ｍｅｔ、又はＩｌｅと置換し、ＡｓｎをＡｓｐ又はＧｌｕと置換し、ＡｓｐをＡｓｎ又はＧｌｎと置換し、ＣｙｓをＭｅｔ又はＴｈｒと置換し、ＧｌｎをＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐと置換し、ＧｌｙをＡｌａ又はＰｒｏと置換し、ＩｌｅをＶａｌ、Ｌｅｕ、又はＭｅｔと置換し、ＬｅｕをＶａｌ又はＭｅｔと置換し、ＬｙｓをＡｒｇ、Ｍｅｔ又はＩｌｅと置換し、ＭｅｔをＣｙｓ、Ｉｌｅ，Ｌｅｕ、又はＶａｌと置換し、ＰｈｅをＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐと置換し、ＳｅｒをＴｈｒ、Ｍｅｔ又はＣｙｓと置換し、ＴｈｒをＳｅｒ、Ｍｅｔ又はＶａｌと置換し、ＴｙｒをＰｈｅ又はＨｉｓと置換し、及びＶａｌをＬｅｕ、Ｉｌｅ又はＭｅｔと置換する場合を含む。いくつかの実施態様においては、同類アミノ酸置換は少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性を有する。いくつかの実施態様においては、同類アミノ酸置換はフィターゼ活性を有する。
【００７５】
いくつかの実施態様においては、フィターゼは、配列番号２又は配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列のフラグメントであり、そのフラグメントは、少なくとも３５０アミノ酸、少なくとも３７５アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸を含む。いくつかの実施態様においては、フラグメントはフィターゼ活性を有する。いくつかの実施態様においては、フラグメントは、配列番号１の親又は野生型フィターゼのフィターゼ活性に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の活性を有する。
【００７６】
アルファ‐アミラーゼ‐
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは、有効量が添加される時、ｐＨ３．０から７．０の範囲及び好ましくはｐＨ３．５から６．５の範囲で活性を有する場合、酸安定アルファ‐アミラーゼである。本発明による有用なアルファ‐アミラーゼは菌類のアルファ‐アミラーゼ又は細菌類のアルファ‐アミラーゼでよい。さらに、アルファ‐アミラーゼは、野生型アルファ‐アミラーゼ、変異体、又はそれらのフラグメント、又は例えば、ある微生物源の触媒領域及び別の微生物源からのデンプン結合部位由来のハイブリッドアルファ‐アミラーゼでよい。
【００７７】
菌類アルファ‐アミラーゼの例は、糸状菌の菌種から得られるものを含み、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  カワチ（Ａ.  ｋａｗａｃｈｉ）、及びアスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ））、トリコデルマ  種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）、リゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、及びペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
より好ましくは、酸安定性アルファ‐アミラーゼは細菌の菌種由来である。細菌の菌種はバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、及びラクトバシルス種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）を含むがこれらに限定されない。いくつかの細菌の菌種は、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、及びバシルス  コアグランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）のようなバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）を含む。特にバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。
【００７９】
本発明の組成物及びプロセスに用いる好ましい細菌アルファ‐アミラーゼの一つは、USP  5,093,257、USP  5,763,385、USP  5,824,532、USP  5,958,739、USP  6,008,026、USP  6,093,563、USP  6,187,576、USP  6,297,038、USP  6,361,809、  USP  6,867,031、US  2006/0014265、WO  96/23874、WO  96/39528、WO  97/141213、WO  99/19467、及びWO  05/001064に記載のアルファ‐アミラーゼの一つを含む。
【００８０】
本発明により取り込まれる方法及び組成物に用いると考えられる商業的に入手可能なアルファ‐アミラーゼは、スペザイム（商標）ＡＡ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＡＡ）、スペザイム（商標）フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）、  スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）、ＧＺＹＭＥ  ９９７及びＣＬＡＲＡＳＥ  Ｌ(ジェネンコ  インターナショナル社)、ターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）１２０−Ｌ、ＬＣ及びＳＣ及びスープラ（ＳＵＰＲＡ）  (ノボザイムズ  バイオテック（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）)、リコザイム  Ｘ（ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ  Ｘ）及びサン  スーパー（ＳＡＮ  ＳＵＰＥＲ  ）(ノボザイムズ  エイエス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ/Ｓ）)、及びＵＬＴＲＡ  ＴＨＩＮ（Ｄｉｖｅｒｓａ/Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を含む。いくつかの実施態様おいては、ＷＯ  ０５／１１１２０３記載のスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及び／又はスペザイム  フレッド（ＳＰＥZＹＭＥ  ＦＲＥＤ）が  ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ又は変異体との組み合わせで用いる。
【００８１】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼはターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）のようなアルファ‐アミラーゼである。ターマミル様アルファ‐アミラーゼはアミノ酸レベルがバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼと実質的に相同性を有するアルファ‐アミラーゼを示すことを意味し、例えば、ＷＯ  ０６／０６６５９４の配列番号4に設計されるバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼと少なくとも約７５％配列同一性を有し、８０％、８５％、  ９０％、  ９５％、９９％、及び１００％の配列同一性を含む。
【００８２】
本発明よって含まれる酵素組成物は混合される又は製剤設計される酵素組成物を含んでもよい。酵素成分は一緒に（混合物）混合される少なくとも二つの酵素成分又は一以上のプロセス段階の間に個々に添加される酵素成分を含む混合製剤として用いてよい。これは経時的に別々の酵素成分を加えることによりアミラーゼに対するフィターゼの酵素比を維持するようにしてもよく、その結果、例えば、その成分等を同時に添加してもよい。製剤設計される酵素組成物とは、酵素が一定の製剤様式で、例えば一定の割合で、提供されることを意味する。いくつかの実施態様においては、組成物は配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するフィターゼ及び／又は配列番号２と少なくとも９５％の配列同一性を有するフィターゼ及び／又は配列番号３と少なくとも９５％の配列同一性を有するフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼを含んでよい。
【００８３】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは、スペザイム  ＡＡ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＡＡ）、リコザイム（ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ）又はスペザイム  エクストラ（ＳＰＥZＹＭＥ  ＸＴＲＡ）のようなバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアルファ‐アミラーゼを含んでよい。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ‐アミラーゼを含んでよい。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは、ハイブリッド酵素でもよく、例えば、ハイブリッド酵素は、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の菌株及びバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の菌株由来のフラグメントを含むでもよい。
【００８４】
いくつかの実施態様においては、酵素組成物又は混合物はａ）ＢＰ‐ＷＴ、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）、及び任意にスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）、b)ＢＰ‐ＷＴ変異体、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）、及び任意にスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）、c)ＢＰ−１７、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及び任意にスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）を含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、アルファ‐アミラーゼ及びブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼを含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びＢＰ‐ＷＴを含む。いくつかの実施態様においては、組成物はスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及び配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３に少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％及び９９％の配列同一性を有するフィターゼを含む。いくつかの実施態様においては、組成物はスペザイム（商標）フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）及びＢＰ−WTを含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、スペザイム（商標）フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）及びＢＰ−１７を含む。いくつかの実施態様においては、組成物は、スペザイム（商標）フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＦＲＥＤ）及び少なくとも配列番号１、配列番号２及び／又は配列番号３に約７５％の配列同一性を有するフィターゼを含み、さらに８０％、８５％、９０％、９５％、及び９９％の配列同一性を有するフィターゼを含む。
【００８５】
混合製剤又は各々含む製剤のうちいずれかのフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼを含む酵素組成物はデンプン加水分解組成物を含む。例えば、（ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ））  のひとつである、ＭＡＸＡＬＩＱ（商標）である。ある実施態様においては、フィターゼは、リコザイム（ＬＩＱＵＯＺＹＭＥ）、ターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）ＬＣ又はＳＵＰＲＡのようなアルファ‐アミラーゼとの組み合わせでよい。デンプン液状化に用いるアルファ‐アミラーゼの混合物は、知られており、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来アルファ‐アミラーゼ及び  バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来アルファ‐アミラーゼの混合物を含む混合酵素産物を開示するＵＳＰ  ４，９３３，２７９に引用されている。
【００８６】
いくつかの実施態様においては、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼの添加は、酵素が混合物として又は個別に添加されるいずれの場合にも、前記フィターゼを有していないアルファ‐アミラーゼの場合に使用するものより、低いｐＨでデンプン液状化のプロセスを行うことができる。例えば、デンプン液状化プロセスは本発明により含まれるフィターゼを伴わないアルファ‐アミラーゼ使用より約０．５から１．５単位低い（例えば、約０．２、０．３、０．４、０．５、０．７、０．８、１．０、１．２  または１．５単位低い）ｐＨで導入できる。
【００８７】
いくつかの実施態様においては、フィターゼ組成物及びアルファ‐アミラーゼ組成物を用いる場合、例えば、デンプン加水分解のプロセスのときに、フィターゼ(ＦＴＵ／ｇ  ｄｓ)とアルファ‐アミラーゼ(ＡＡＵ／ｇ  ｄｓ)の比は約１５：１から約１：１５、あるいは、約１０：１から約１  ：１０、あるいは、約５：１から約１：５、あるいは、約３：１から約１：２であり、約１：１、約１．１：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１及び約２：１を含む。
【００８８】
フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼを含有するある有用な酵素組成物は、混合物として又は個別的に添加されるいずれかの場合にも「方法」の見出しの箇所にてさらに詳しく述べるように、デンプン加水分解組成物を含む。
【００８９】
第二酵素‐
本発明のいくつかの実施態様は、組成物又はアルファ‐アミラーゼ及びフィターゼの混合物を含むけれども、任意的に、組成物は他の酵素を含んでもよい。あるいは、他の酵素を、組成物と同時に、又はプロセスの異なる時間に本発明の方法の間の多様な時点で組成物とは別に添加してもよい。例えば、液状化の間に添加される有用な他の成分は、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、フィターゼ、プルラナーゼ、ベータ‐アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ベータ‐グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、エステラーゼ、シクロデキストリントランスグルコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅｓ），ベータ‐アミラーゼ、及びそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００９０】
グルコアミラーゼ（Ｅ.Ｃ.３．２.１．３.）は細菌類、植物及び／又は菌類を源に発現する異種の又は内因性の蛋白質由来でよい。本発明に有用なグルコアミラーゼは糸状菌類及び酵母のいくつかの菌株によって生産される。特に、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌種から分泌されるグルコアミラーゼは、商業的に重要である。適切なグルコアミラーゼは自然発生的な野生型グルコアミラーゼも変異体及び遺伝子組み換えが行われている変異グルコアミラーゼ（例えば、ハイブリッドグルコアミラーゼ）も含む。次のグルコアミラーゼは本発明により含まれるプロセス中に用いるグルコアミラーゼの例であるが、これらに限定されるものではない。アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｇ１及びＧ２グルコアミラーゼ（例えば、Ｂｏｅｌ他、（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ.  ３：  １０９７  −  １  １０２：  ＷＯ  ９２／００３８１、ＷＯ  ００／０４１３６及びＵＳＰ  ６，３５２，８５１を参照）、アスペルギルス  アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（例えば、ＷＯ  ８４／０２９２１参照）、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（例えば、Ｈａｔａ他、（１９９１）  Ａｇｒｉｃ.  Ｂｉｏｌ.  Ｃｈｅｍ.  ５５：９４１−９４９参照）及びアスペルギルス  シロウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ）(例えば、Ｃｈｅｎ他、（１９９６）  Ｐｒｏｔ.  Ｅｎｇ.  ９：４９９  −  ５０５：  Ｃｈｅｎ他、(１９９５)  Ｐｒｏｔ.  Ｅｎｇ.  ８：５７５−５８２；及びＣｈｅｎ他、（１９９４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ.  ３０２：２７５−２８１を参照)である。
【００９１】
また、グルコアミラーゼは、タラロミセス  エマーソニー（Ｔ.  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、タラロミセス  レイセタヌス（Ｔ.  ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）、タラロミセス  デュポンティ（Ｔ.  ｄｕｐｏｎｔｉ）、及びタラロミセス  テルモフィラス（Ｔ.  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）  (例えば、ＷＯ  ９９／２８４８８；  ＵＳＰ  Ｎｏ.  ＲＥ：  ３２，１５３；  ＵＳＰ  Ｎｏ.  ４，５８７，２１５を参照)のようなタラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）の菌株、トリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）及び特に、ＵＳ  Ｐａｔ.  Ｐｕｂ.  Ｎｏ.  ２００６‐００９４０８０に記載の配列番号４と少なくとも約８０％、８５％、９０％及び９５％の配列同一性を有するグルコアミラーゼのようなトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の菌株、リゾプス  ニベウス（Ｒ.  ｎｉｖｅｕｓ）及びリゾプス  オリザエ（Ｒ.  ＯＲＹＺＡＥ）のようなリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の菌株、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）の菌株、フミコーラ  グリセア（Ｈ．  ｇｒｉｓｅａ）（例えば、Ｂｏｅｌ他、（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ.  ３：１０９７−１１０２；  ＷＯ  ９２／００３８１  ；  ＷＯ  ００／０４１３６；  Ｃｈｅｎ他、（１９９６）  Ｐｒｏｔ.  Ｅｎｇ.  ９：４９９−５０５；  Ｔａｙｌｏｒ他、（１９７８）  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ.  ６１  ：３０１−３０８；  ＵＳＰ.  ４，５１４，４９６；  ＵＳＰ  ４，０９２，４３４；  ＵＳＰ  ４，６１８，５７９；  Ｊｅｎｓｅｎ他、（１９８８）  Ｃａｎ.  Ｊ.  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.  ３４：２１８−２２３及びＷＯ  ２００５／０５２１４８の配列番号３を参照）のようなフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の菌株から得られる。いくつかの実施態様においては、グルコアミラーゼは、ＷＯ  ０５／０５２１４８記載の配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％の配列同一性を有する。本発明に有用な他のグルコアミラーゼは、アセリア  ロルフシイ（Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ）及びそれらの変異体(例えば、ＷＯ  ０４／１１１２１８を参照)から得られるものを含む。また、本明細書の単糖化について述べている他のグルコアミラーゼの例を参照願いたい。
【００９２】
商業的に用いるグルコアミラーゼ活性を有する酵素は、例えば、アスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（例えば、ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）製の商品名ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ、ＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００及びＧ  ＺＹＭＥ  Ｇ９９０  ４Ｘを参照）又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）種（例えば、日本の新日本化学製の商品名ＣＵ．ＣＯＮＣを参照）から生産される。また、商業的な消化酵素は、日本の天野製薬製の商品名グルクザイム（ＧＬＵＣＺＹＭＥ）（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、（１９８５）  Ｊ.  Ｂｉｏｃｈｅｍ.  ９８：６６３−６７１を参照）である。さらなる酵素はリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）のグルコアミラーゼ（Ｅ．  Ｃ．３．２．１．３）の３つの形態を含む、すなわち、「Ｇｌｕｃ１」（ＭＷ  ７４，０００）、「Ｇｌｕｃ２」（ＭＷ  ５８，６００）及び「Ｇｌｕｃ３」（ＭＷ  ６１，４００）である。また、酵素調製ＧＣ４８０（ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ））を本発明に用いる。上記のグルコアミラーゼ及び商業的酵素の例は本発明をこれらに限定することを意図せず、単に実施例として提供される。
【００９３】
いくつかの実施態様においては、添加酵素は、細菌類又は菌類のアルファ‐アミラーゼのような第二のアルファ‐アミラーゼであり、他の実施態様においては、アルファ‐アミラーゼは、菌類又は細菌類のアルファ‐アミラーゼのミュータント又は変異体のような誘導体である。任意のアルファ‐アミラーゼを用いることができ、周知のものも、本明細書に記載のものも含まれる。本発明による少なくとも一つのアルファ‐アミラーゼ及びフィターゼとの有用な組み合わせとなるアルファ‐アミラーゼの例は、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）由来のものに限定されない。
【００９４】
いくつかの追加的アルファ‐アミラーゼはバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス  コアグランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、及びそれらのハイブリッド、ミュータント、及び変異体（例えば、ＵＳＰ  ５，７６３，３８５、ＵＳＰ  ５，８２４，５３２、ＵＳＰ  ５，９５８，７３９、ＵＳＰ  ６，００８，０２６及びＵＳＰ  ６，３６１，８０９を参照）を含むバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来である。これらのアミラーゼのいくつかは商業的に入手可能である。例えば、ノボ  ノルディスク  エーエス（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ・Ｓ）から入手可能なターマミル（ＴＥＲＭＡＭＹＬ）及びＳＵＰＲＡ、Ｄｉｖｅｒｓａから入手可能なＵＬＴＲＡＴＨＩＮ、ノボ  ノルディスク  エーエス（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ/Ｓ）から入手可能なリコザイム（ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ）ＳＣ、及びダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.，  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）から入手可能なスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及びＧＺＹＭＥ  Ｇ９９７である。
【００９５】
他の実施態様においては、本発明は第二のフィターゼの添加を含む。本明細書のフィターゼのセクションで記載の任意のフィターゼを用いることができる。
【００９６】
また、セルラーゼをアルファ‐アミラーゼ及びグルコアミラーゼに加えることができる。セルラーゼはセルロース（β‐１，４‐Ｄ‐グルカン結合）及び／又はリン酸膨張セルロースのようなそれらの誘導体を加水分解する酵素組成物である。セルラーゼはエキソセロビオヒドロラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）（ＣＢＨ）エンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びベータ‐グルコシダーゼ（ＢＧ）（ＥＣ３．２．１９１、ＥＣ３．２．１．４及びＥＣ３．２.１．２１）に分類できる。セルラーゼはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、テルモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）からのセルラーゼを含む。食品業界で販売される商業的に入手可能なセルラーゼは、ＲＯＶＡＢＩＯ（Ａｄｉｓｓｅｏ）、ＮＡＴＵＧＲＡＩＮ（ＢＡＳＦ）、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ  ＢＧＬ(ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）)及びＥＣＯＮＡＳＥ（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）のようなベータ‐グルカナーゼである。
【００９７】
また、キシラナーゼも含むことができる。キシラナーゼ（例えば、エンド‐β‐キシラナーゼ（Ｅ．  Ｃ．  ３．２．１．８）は、キシラン骨格鎖を加水分解するが、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、アシドサーマス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、ミクロテトラスポラ（Ｍｉｃｒｏｔｅｔｒａｐｓｏｒａ）又はテルモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ）のような細菌由来でよい。さらに、キシラナーゼは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）でもよい。（例えば、ＥＰ４７３  ５４５、ＵＳＰ  ５，６１２，０５５、ＷＯ  ９２／０６２０９およびＷＯ  ９７／２０９２０参照願いたい。）商業的調製品は、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ及びＦＥＥＤＴＲＥＡＴ  Ｙ５（ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＲＯＮＯＺＹＭＥ  ＷＸ(ノボザイムズ  エイエス（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ)）、及びＮＡＴＵＧＲＡＩＮ  ＷＨＥＡＴ（ＢＡＳＦ）を含む。
【００９８】
また、プロテアーゼも含むことができる。プロテアーゼは、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  レンツス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、及びバシルス  ズブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来でよい。これらの供給源は、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びそれらの変異体（ＵＳＰ  ４，７６０，０２５）から得られるスブチリシンのようなスブチリシンを含む。適切な業務用プロテアーゼは、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ  Ｐ  ３０００（ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.，  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ））及びスミザイム  ＦＰ（ＳＵＭＩＺＹＭＥ  ＦＰ）（新日本(Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ)）を含む。また、プロテアーゼは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、ＮＳＰ‐２４）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、及び、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）のような菌類由来でもよい。
【００９９】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、及びキシラナーゼから選択される二以上の組み合わせを含んでよい。
【０１００】
また、酸性菌体プロテアーゼ（Ａｃｉｄ  ｆｕｎｇａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ）（ＡＦＰ）を、本発明の酵素組成物及び混合物中に含んでよい。例えば、菌体プロテアーゼは、アスペルギルス  ニガー（Ａ．  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス  アワモリ（Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス  オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、及びムコール  ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）（例えば、本発明における有用なＡＦＰのためにＵＳ出願番号１１／３１２，２９０、２００５年１２月２０日出願を参照）のような、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）から得られるものである。
【０１０１】
使用方法‐
本発明の方法はデンプン転換プロセスにおけるデンプン液状化の間におけるアルファ‐アミラーゼを伴う本発明のフィターゼの使用に関し、その結果、より低いｐＨでプロセスを行うことができる。いくつかの実施態様においては、方法はｐＨ調整のための酸又はアルカリの添加がもはや必要ない。いくつかの実施態様においては、方法は、第一の液状化段階及び第二の液状化段階を含む。また、いくつかの実施態様においては、方法はアルファ‐アミラーゼを伴わない前処理段階を含むことができる。すなわち、前処理段階はアルファ‐アミラーゼを伴い又は伴わずにできるが、アルファ‐アミラーゼを含む場合、それを第一液状化段階とも呼ぶことができる。いくつかの実施態様においては、方法は発酵性糖の生産をもたらす。いくつかの実施態様においては、プロセスはエタノールを生成する。
【０１０２】
本発明による有用な基質は、液状デンプンを含む穀物及び／又は植物の原料を含む。植物原料は小麦、トウモロコシ、ライ、ソルガム（ミロ）、米、キビ、オオムギ、ライ小麦、キャッサバ（タピオカ）、ジャガイモ、サツマイモ、サトウダイコン、サトウキビ、及び大豆及びエンドウ豆のような豆類を含む植物から得られるが、これらに限定されない。本発明に有用な植物の原料は、トウモロコシ、オオムギ、小麦、米、ミロ、及びそれらの組み合わせを含む。植物原料はハイブリッド変異体及び遺伝的に修飾される変異体（例えば、異種性遺伝子を含むトランスジェニックトウモロコシ、オオムギ、又大豆）を含んでよい。植物の任意の部分は、葉、茎、さや、殻、塊茎、トウモロコシの穂軸、穀物の粒、及び同様物のような植物の部位を含む基質を提供するために用いてよいが、これらに限定されない。実質的に、いくつかの実施態様においては、植物全体を用いてよく、例えばトウモロコシ茎葉全体を用いてよい。いくつかの実施態様においては、未精白の穀物を粒状デンプンの供給源として用いてよい。未精白の穀物は、トウモロコシ、小麦、ライ、オオムギ、ソルガム、及びそれらの組み合わせを含む。他の実施態様においては、粒状デンプンは、繊維、内胚乳、及び／又は胚成分を含む分画穀物から得てよい。トウモロコシ及び小麦のような植物原料を分画する方法は周知である。いくつかの実施態様においては、異なる供給源から得られる植物原料を、本発明（例えば、トウモロコシとミロ又はトウモロコシとオオムギ）のプロセスに用いる基質を得るために一緒に混合してよい。
【０１０３】
いくつかの実施態様においては、植物原料は製粉のような手段により調製されてよい。二つの一般的な製粉方法が本発明の方法に好ましく、これらは湿式製粉または乾燥製粉である。例えば、乾燥製粉において、未精白の穀物を製粉し、プロセスに用いる。湿式製粉においては、穀物は分離される（例えば、あらびき粉から胚）。特に未精白の穀物を製粉する手段は周知であり、ハンマーミル及びローラーミルの使用を含む。製粉の方法は周知技術であり、ＴＨＥ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ：  Ａ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＢＥＶＥＲＡＧＥ,  ＦＵＥＬ  ＡＮＤ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ  ３ｒｄ  ＥＤ.  Ｋ.  Ａ.  Ｊａｃｑｕｅｓ他、Ｅｄｓ,（１９９９）  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ.に引用されている。２章及び４章を参照願いたい。
【０１０４】
いくつかの実施態様においては、製粉であれ、他の方法であれ粉末にされる植物原料は液体と混合することによりデンプン基質を含むスラリーが得られる。いくつかの実施態様においては、スラリーは、バックセットのようなデンプンプロセスの副流を含んでよい。いくつかの実施態様においては、スラリーは、１５−５５％ｄｓ（例えば、２０−５０％、２５−４５％、２５−４０％、及び２０−３５％ｄｓ）を含む。
【０１０５】
いくつかの実施態様においては、本発明のフィターゼ及びアルファ‐アミラーゼの組み合わせを製粉デンプン基質（例えば、製）のスラリーに添加できる。いくつかの実施態様においては、スラリーは約４．０から約６．５未満の範囲のｐＨで、また、約４．０から約６．２未満の範囲のｐＨで、また、約４．５から約６．０未満のｐＨで及び好ましくは約５．０から約６．０（例えば、約５．４から約５．８まで）に維持され、液化デンプンを得るために、スラリー中の製粉粒状デンプンは２分から８時間（例えば、５分から６時間、５分から４時間及び３０分から４時間）の間酵素組成物と接触できる。いくつかの実施態様においては、温度は４０から１１５℃の範囲である。いくつかの実施態様においては、温度は４０から１１０℃、また５０から１１０℃、また６０から１１０℃、また６０から１００℃及びまた７０から９５℃の範囲である。
【０１０６】
いくつかの実施態様においては、フィターゼをより低いｐＨで、酸又はアルカリの不添加のスラリーのｐＨよりも低いｐＨでプロセスを行うことができる十分な量でスラリーに添加する。いくつかの実施態様においては、フィターゼはアルファ‐アミラーゼの熱安定性を増加するのに十分な量においてフィチン酸レベルを低減する。いくつかの実施態様においては、ＩＰ６フィチン酸が減少する。ＩＰ６とは６個のリン酸基を含むイノシトールである。通常ＩＰ６は、１から５個のリン酸基（ＩＰ５‐ＩＰ１）をそれぞれ有する誘導体の多様な量を有する。
【０１０７】
いくつかの実施態様においては、フィターゼをアルファ‐アミラーゼの熱安定性の増加をもたらすのに十分な時間及び十分な量添加する。いくつかの実施態様においては、フィターゼを低いｐＨでアルファ‐アミラーゼ存在下、デンプンの加水分解をするために十分な量加える。いくつかの実施態様においては、フィターゼは、低いｐＨでアルファ‐アミラーゼの熱安定性を増加するのに十分な量を加える。ｐＨ調整がプロセスに含まれる場合でさえ、フィターゼが特に、フィターゼを含まない状態で安定している場合より低いｐＨでアルファ‐アミラーゼの増強される熱安定性を与える。
【０１０８】
当業者は、本発明に従ってプロセスに用いるブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼの有効量を容易に決定できる。デンプン液化の最適用量を植物原料のタイプ、粘度、プロセス時間、ｐＨ、温度及びｄｓのような処理パラメータにて決定する。一般的ガイドラインとして、いくつかの実施態様においては、液状化プロセスに用いるフィターゼの量は０．００１から約５０ＦＴＵ／ｇｄｓ、いくつかの実施態様においては、約０．０１から約５．０ＦＴＵ／ｇｄｓ、あるいは、約０．０５から約１０ＦＴＵ／ｇｄｓ、及びまた約０．１０から約５．０ＦＴＵ／ｇｄｓの範囲である。
【０１０９】
いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼの量は、当業者が周知のアルファ‐アミラーゼの有効量である。いくつかの実施態様においては、範囲は約０．０５から約５０ＡＡＵ／ｇｄｓ、また約０．１から約２０ＡＡＵ／ｇｄｓ及びまた約１．０から約１０ＡＡＵ／ｇｄｓである。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼの範囲は約０．５から約１００ＬＵ／ｇｄｓ、また約１．０から約５０ＬＵ／ｇｄｓ、及びまた約５．０から約２５ＬＵ／ｇｄｓである。さらなる実施態様においては、アルファ‐アミラーゼの量は約０．０１から約１０．０ｋｇ／メトリックトン（ＭＴ）ｄｓ、また約０．０５から約５．０ｋｇ／ＭＴｄｓ、及びまた約０．１から約４．０ｋｇ／ＭＴｄｓの範囲である。
【０１１０】
また、粒状デンプン基質（例えば、粉砕穀物）のような基質を含むスラリーを前処理（インキュベーション）段階で処理することは本発明の範囲内であると考えられる。
【０１１１】
インキュベーション段階はデンプン基質（例えば、粉砕穀物）を含むスラリーを粒状デンプンのデンプンゼラチン化温度より０から３０℃低い温度で本発明によるフィターゼ及び任意にアルファ‐アミラーゼに接触させることを含む。この温度はデンプンゼラチン化温度より０から２５℃、０から２０℃、０から１５℃、及び０から１０℃低くてよい。この具体的値は変化し、スラリーを含む粒状デンプンのタイプで決定される。例えば、トウモロコシのデンプンゼラチン化温度は一般的にライ又は小麦のデンプンゼラチン化温度より高い。いくつかの実施態様においては、温度は４５から８０℃の間、また５０から７５℃の間、また５０から７２℃の間及びある実施態様においては、温度は６８℃未満、６５℃未満、６２℃未満、６０℃未満、及びまた５５℃未満である。他の実施態様においては、温度は４０℃より高い、４５℃より高い、５０℃より高く及び５５℃より高い。いくつかの実施態様においては、インキュベーション温度は、約５８と７２℃の間、また約６０と約６８℃の間である。インキュベーションを約４．０から約６．５、また約４．０から約６．０及び約ｐＨ５．０から約６．０の範囲のｐＨで、約２分から約５時間（例えば、約５分から約３時間、約１５分から約２．５時間及び約３０分から約２時間）の間行う。いくつかの実施態様においては、インキュベーション段階はアルファ‐アミラーゼを有さないフィターゼの添加を含む。他の実施態様においては、フィターゼ及びアルファ‐アミラーゼをインキュベーション段階の間、混合物として添加または続けて添加する。
【０１１２】
さらなる段階において、インキュベーションされる基質は約４．０から約６．５のｐＨで２分から８時間（例えば、２分から６時間、５分から４時間及び好ましくは１時間から２時間）の間、インキュベーションされる基質をデンプンゼラチン化温度より０から５５℃のような高い温度（例えば、６５℃から１２０℃まで、７０℃から１１０℃まで、７０℃から９０℃まで）に上昇させることにより液化する。
【０１１３】
いくつかの実施態様においては、熱安定性アルファ‐アミラーゼはこの段階に添加されるが、他の実施態様においては、追加的アルファ‐アミラーゼは添加されない。いくつかの実施態様においては、インキュベーション及び温度上昇段階のｐＨは実質的に同じｐＨ範囲（例えば、ｐＨ約４．５から約６．０又はｐＨ約５．０から約６．０）で行う。
【０１１４】
いくつかの実施態様においては、粒状デンプン含有基質をゼラチン化温度未満の温度で本発明によるフィターゼと接触することを含むインキュベーション段階は温度上昇段階の間アルファ‐アミラーゼの安定性を増強する。いくつかの実施態様においては、アルファ‐アミラーゼ安定性の増強は約５．８から約５．２の範囲のｐＨである。
【０１１５】
さらに方法は、デキストリンを得、回収するために、糖化酵素（例えば、ＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００、ＯＰＴＩＭＡＸ  ４０６０  ＶＨＰ、ＦＥＲＭＥＮＺＹＭＥ  Ｌ−４００、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ、ＧＺＹＭＥ  ４８０（ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ.,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ））を有する液化基質を糖化することを含んでよい。これらの方法は周知でありグルコアミラーゼのような糖化酵素及び任意の他の第二酵素の添加を含む。
【０１１６】
糖化プロセスは１２から１２０時間続けてよい。しかしながら、３０分から２時間の間、前糖化を行い、それから発酵の間に糖化を完了することが通常である。時々、これを同時糖化発酵（ＳＳＦ）という。通常、糖化を３０から６５℃の温度で一般的にｐＨ４．０から５．０で行う。
【０１１７】
糖化酵素として用いるグルコアミラーゼ（ＧＡ）（Ｅ.  Ｃ.  ３．２．１．３．）は当業者に知られるものや、見出し本明細書中の「第二酵素」の見出しの箇所に記載のものである。
【０１１８】
いくつかの実施態様においては、本発明は、約５．０から約６．０の範囲のｐＨで１５分から約４時間及び５５から６８℃の温度で本発明に含まれるフィターゼを伴って粒状デンプン（粉砕穀物）含有基質を含むスラリーをインキュベーションすることを含むデンプン含有スラリーの粘度を低減する方法を含む。いくつかの実施態様においては、インキュベーション段階後、スラリーの温度を７０から９０℃の間に上げる。温度上昇後に得られる液体の粘度は本発明に含まれるフィターゼでインキュベーションしていない対応する液体と比較して粘度が低減される。いくつかの実施態様においては、この粘度の低下により、デンプン加水分解プロセスに用いるアルファ‐アミラーゼの量は減少される。例えば、同じ条件下、同じレベルの粘度を得るために、同じｐＨ（例えば、約５．５から約６．０）で必要とされるアルファ‐アミラーゼの量は、アルファ‐アミラーゼが本発明のフィターゼと組み合わされる場合約２０％、３０％、４０％、５０％、又は６０％低下する。
【０１１９】
いくつかの実施態様においては、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ又はそれらの変異体及びアルファ‐アミラーゼ組成物又は混合物の使用を含む方法は、高いデキストロース生産をもたらす。いくつかの実施態様においては、液状化及び糖化によって生産されるグルコースの収率（加水分解され、溶解される乾燥固体の全量のうちのグルコースの割合）は少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％である。
【０１２０】
いくつかの実施態様においては、さらに生産されるグルコースはフルクトース又は高い精製度のデキストロースを生産するために用いてよい。本発明のいくつかの実施態様においては、グルコースを遠心分離、膜分離、及び従来のろ過方法のような周知方法により処理によりすりつぶされたものから分離する。グルコースを周知方法によりフルクトースシロップへ酵素的に転換してよい。
【０１２１】
いくつかの実施態様においては、さらに、アルコール（例えば、エタノール）、有機酸類（例えば、コハク酸、乳酸）、糖アルコール類（例えば、グリセロール）、アスコルビン酸中間体（例えば、グルコネート、ＤＫＧ，ＫＬＧ）、アミノ酸（例えば、リジン）、及び蛋白質類の（例えば、抗体及びそれらのフラグメント）ような最終産物を得るために、適切な発酵条件下、微生物の発酵における発酵用原料としてデキストリン（例えば、グルコース）の使用を含む。
【０１２２】
発酵に用いる生物は所望の最終産物により決定する。典型的に、エタノールが、必要とする最終産物の場合、酵母を発酵用生物として用いる。いくつかの実施態様においては、エタノール生産微生物は酵母及び具体的にはサッカロミセス  セレビジアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＵＳＰ  ４，３１６，９５６）の菌株のようなサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）である。多くのサッカロミセス  セレビジアエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は商業的に入手可能であり、これらはＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ‘ｓ  Ｙｅａｓｔ）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（Ａｌｌｔｅｃｈ）、ＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）、ＲＥＤ  ＳＴＡＲ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ）及びＡｎｇｅｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｙｅａｓｔ（Ａｎｇｅｌ  Ｙｅａｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ,  Ｃｈｉｎａ）を含むが、これらに限定されない。方法に使用する最初の酵母の量は、適切な期間に商業用十分なエタノールの量を生産する（例えば、７２時間未満で２５から４０％ＤＳを有する基質から少なくとも１０％のエタノールを生産する）のに効果的な量である。酵母細胞は一般的に１０４から１０１２の量で供給され、好ましくは、発酵培地の１ｍｌあたり１０７から１０１０生存酵母数で供給される。発酵は、さらに発酵微生物（例えば、酵母）、栄養素、酸及び／又は追加的酵素を含むことができ、フィターゼを含むことができるが、これに限定されない。
【０１２３】
発酵における酵母の使用は周知であり、ＴＨＥ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ,  Ｋ.  ＪＡＣＱＵＥＳ他、ＥＤＳ.  １９９９,  ＮＯＴＴＩＮＧＨＡＭ  ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ  ＰＲＥＳＳ,  ＵＫを参照できる。いくつかの実施態様においては、本発明にかかる方法により生産されるエタノールの量は、少なくとも８％、少なくとも１０％、少なくとも１２％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも２０％及び少なくとも２２％（ｖ／ｖ）である。
【０１２４】
任意的に、発酵に続いて、例えば、アルコール（例えば、エタノール）を蒸留により抽出できる。エタノールは燃料、携帯用又は産業用エタノールとして使用できる。
【０１２５】
いくつかの実施態様においては、デンプン加水分解の間における本発明に含まれるフィターゼ組成物の使用は、発酵培地のフィチン酸量、蒸留残液のフィチン酸塩の量及び／又は乾燥した蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎｓ）（ＤＤＧ）、可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）(ＤＤＧＳ)、湿った蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｗｅｔ  ｇｒａｉｎｓ）（ＤＷＧ）、及び可溶性物質添加湿潤蒸留穀物残渣（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｗｅｔ  ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｏｌｕｂｌｅｓ）（ＤＷＧＳ）のような発酵の副産物のフィチン酸含有量を低減する。いくつかの実施態様においては、本発明の方法（例えば、３０から６０分のインキュベーションを含むがこれらに限定されない）は、フィターゼのない状態での実質的に同様のプロセスと比較した場合少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％及び９０％及びそれ以上に得られる発酵培地ろ過物のフィチン酸含有量を低減することができる。いくつかの実施態様においては、ＤＤＧＳ中に見られるフィチン酸塩含有量が、請求項記載のプロセスと実質的に同様であるが本発明によるフィターゼがない状態であって相当するプロセスからＤＤＧＳ中のフィチン酸塩含有量と比較した場合、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％及び少なくとも９０％低減される。例えば、ＤＤＧＳの商業的試料中のフィチン酸塩の％は多様であるけれども、フィチン酸塩％の一般的な範囲は約１％から約３％またはそれ以上でもよい。いくつかの実施態様においては、本発明のプロセスから得られるＤＤＧＳ中のフィチン酸塩％は１．０％未満、０．８％未満、０．５％未満及びまた０．３％未満である。いくつかの実施態様においては、蒸留残液中に見られるフィチン酸塩含有量は請求項記載のプロセスと実質的に同様であるが本発明によるフィターゼがない状態であって相当するプロセスから得られる蒸留残液中フィチン酸塩含有量と比較した場合、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、及び少なくとも９０％低減されてよい。
【０１２６】
工業用エタノールプロセスにおいて、エタノールは、発酵ストリーム（バックセット）へリサイクルされうる及びしばしばリサイクルされる蒸留残液部分であるろ過物から蒸留されてよい。本発明は、請求項記載のプロセスと実質的に同様であるが本発明によるフィターゼがない状態であって相当するプロセスから得られる蒸留残液中フィチン酸塩含有量と比較した場合、低いフィチン酸塩を有する蒸留残液を得る。例えば、約８％ｄｓを有する蒸留残液中のフィチン酸塩（ｐｐｍ）の量は、２５００から３０００ｐｐｍの範囲でよい。本発明のいくつかの実施態様においては、蒸留残液中のフィチン酸塩含有量は、基質が本明細書に記載の方法に従って処理される場合、２０００ｐｐ未満、１０００ｐｐ未満、５００ｐｐ未満、１００ｐｐ未満、５０ｐｐ未満である。
【実施例】
【０１２７】
本発明を次の実施例にてさらに詳しく述べるが、これは特許請求の範囲を限定することを全く意図していない。添付図面は本発明の明細書及び本発明の記載の不可分な一部として考えられる。すべての引用文献は、記載されるすべてのものを本明細書に引用することにより具体的に本明細書に取り込まれる。次の実施例は本発明を説明するために提供されるが、特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１２８】
開示及び次の実施例のセクションにおいて、つぎの略語が適用される。ｗｔ％（質量パーセント（ｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒｃｅｎｔ）、℃（摂氏(ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃｅｎｔｉｇｒａｄｅ)、Ｈ２Ｏ（水（ｗａｔｅｒ））、ｄＨ２Ｏ（蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ））、ｄＩＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ  ｗａｔｅｒ,Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ)、ｇまたはｇｍ（グラム（ｇｒａｍｓ））、μg（マイクログラム(ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ)）、ｍｇ（ミリグラム（ｍｉｌｌｉｇｒａｍｓ））、ｋｇ（キログラム（ｋｉｌｏｇｒａｍｓ））、μL（マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｓ））、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル(ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒｓ)、ｍｍ（ミリメートル（ｍｉｌｌｉｍｅｔｅｒｓ））、μm（マイクロメートル(ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ)）、M（モル（ｍｏｌａｒ））、ｍＭ（ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ））、μM（マイクロモル(ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ)）、Ｕ（ユニット(ｕｎｉｔｓ)）、ＭＷ（分子量(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ)）、ｓｅｃ（秒(ｓｅｃｏｎｄｓ)）、ｍｉｎ（ｓ）（分(ｍｉｎｕｔｅ／ｍｉｎｕｔｅｓ)）、ｈｒ（ｓ）（時間(ｈｏｕｒ／ｈｏｕｒｓ)）、ｄｓ（乾燥固体(ｄｒｙ  ｓｏｌｉｄｓ)）、ＤＯ（溶解酸素(ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ  ｏｘｙｇｅｎ)）、Ｗ／Ｖ（重量／体積(ｗｅｉｇｈｔ  ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ)）、Ｗ／Ｗ（重量／重量(ｗｅｉｇｈｔ  ｔｏ  ｗｅｉｇｈｔ)）、Ｖ／Ｖ（体積／体積(ｖｏｌｕｍｅ  ｔｏ  ｖｏｌｕｍｅ)）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ジェネンコー  インターナショナル社(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ)）、ＩＫＡ  (アイケーエー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．  ２６３５  Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈａｓｅ  Ｐａｒｋｗａｙ  ＳＥ，  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＮＣ)）、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン  (Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ  Ｉｎｃ，  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ)、ＭＴ（メトリックトン（Ｍｅｔｒｉｃ  ｔｏｎ））、Ｎｃｍ（ニュートンセンチメートル(Ｎｅｗｔｏｎ  ｃｅｎｔｉｍｅｔｅｒ)）、ＥＴＯＨ（エタノール(ｅｔｈａｎｏｌ)）、ｅｑ（当量(ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ)、Ｎ（規定
(Ｎｏｒｍａｌ)）ｄｓ又はＤＳ（乾燥固体含有量(ｄｒｙ  ｓｏｌｉｄｓ  ｃｏｎｔｅｎｔ)）、／ｇ  ｄｓ（１グラム乾燥固体当たり(ｐｅｒ  ｇｒａｍ  ｄｒｙ  ｓｏｌｉｄｓ)）、ＳＡＰＵ（分光光度計プロテアーゼユニット(ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｕｎｉｔ)。
【０１２９】
方法
粘土測定：グラスクッカー‐粘度計、ＬＲ‐２．ＳＴシステムＩＫＡを粘度測定するために用いる。手短に説明すると、粘度計は、ユーロスター  ラボテクニック  パワー  コントロール‐粘度計（Ｅｕｒｏｓｔａｒ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ｐｏｗｅｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ−ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ）(ビスコクリック（Ｖｉｓｃｏｋｌｉｃｋ）粘度計の粘度範囲は０から６００Ｎｃｍ)によって攪拌されるアンカーミキサーを有する２０００ｍｌの二重壁のガラス容器からなる。一般的に、本明細書に記載する実施例のために、デンプン基質及び適切な酵素量を含有するスラリーを粘度計容器に注いだ。温度及び粘度を８５℃まで加熱する間記録し、インキュベーションをさらに６０分から１２０分間続けた。Ｎｃｍとして測定される粘度は間隔を置いて記録した。
【０１３０】
高圧クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による炭水化物及びアルコール分析：
オリゴサッカライド反応産物の組成物を屈折率（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）（ＲＩ）検出器(ＥＲＣ−７５１５Ａ  ＲＩ検出器,  Ａｎｓｐｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．)に接続し５０℃に維持したＨＰＬＣカラム(レゼックス（Ｒｅｚｅｘ）  ８ｕ  ８％  Ｈ，  モノサッカライド)が備わったＨＰＬＣ（ベックマンシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）  Ｇｏｌｄ  ３２  Ｋａｒａｔ  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，  ＣＡ）により測定した。サッカライド類は分子量に基づいて分離された。ＤＰ１の記号は、グルコースのようなものサッカライド、ＤＰ２の記号は、マルトースのようなジサッカライド、ＤＰ３の記号は、マルトトリオースのようなトリサッカライド及びＤＰ４＋の記号は、４以上の重合（ＤＰ）度を有するオリゴサッカライドである。
【０１３１】
フィターゼ活性（ＦＴＵ）を無機リン酸塩の放出により測定した。無機リン酸塩は酸性モリブデン酸塩／バナジウム酸塩試薬を用いて黄色性の複合体を形成し、黄色性複合体は分光光度計にて波長４１５ｎｍで測定した。そして放出される無機リン酸塩をリン酸塩検量線で定量した。フィターゼの１単位（ＦＴＵ）は欧州標準（ＣＥＮ／ＴＣ  ３２７，２００５−ＴＣ３２７ＷＩ  ００３２７０ＸＸ）で与えられる反応条件下、１分当たりフィチン酸塩から１マイクロモルの無機リン酸塩が放出される酵素量である。
【０１３２】
フィチン酸含有量：フィチン酸は、５％スラリー（乾燥サンプルとして）のｐＨをｐＨ１０．０に調整することによってサンプルから抽出され、それからイオン交換カラムを用いてＨＰＬＣにより検出される。フィチン酸はＮａＯＨグラジエントシステムを用いてカラムから溶出された。液体中のフィチン酸含有量はフィチン酸を標準に対して比較して計算された。
【０１３３】
アルファ‐アミラーゼ活性（ＡＡＵ）は写真分光学的に測定されるヨード染色能の減少割合を反映して、デンプン加水分解の割合によって決定できる。微生物アルファ‐アミラーゼ活性の１ＡＡＵは標準条件下、１分当たり１０ｍｇのデンプンを加水分解することのできる酵素量である。
【０１３４】
また、アルファ‐アミラーゼ活性は、可溶性デンプン単位（ＳＳＵ）として算定でき、ｐＨ４．５で５０℃の酵素サンプルの一部によって可溶性ジャガイモデンプン基質（４％ＤＳ）の加水分解の度合いに基づく。還元糖含有量はＭｉｌｌｅｒ，  Ｇ．  Ｌ．  （１９５９）  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ.  ３１  ：４２６−４２８に記載のＤＮＳ方法を用いて測定される。
【０１３５】
スペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）に対するＬＩＱＵＩＦＯＮ  Ｕｎｉｔｓ  (ＬＵ)におけるアルファ‐アミラーゼ活性はＵＳＰ  ５，９５８，７３９記載の方法に従って測定された。手短に説明すると、試験方法は、化学的にブロックされる非還元末端糖を有する基質としてｐ−ニトロフェニルマルトヘプトシド（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｍａｌｔｏｈｅｐｔｏｓｉｄｅ）を用いる。ｐ−ニトロフェニルの放出の割合はアルファ‐アミラーゼ活性と比例し、放出は４１０ｎｍで測定される。活性は標準コントロールに対して計算される。
【０１３６】
グルコアミラーゼ活性単位（ＧＡＵ）はグルコアミラーゼの活性を測定するためのＰＮＰＧ試験を用いて測定される。
【０１３７】
実施例
実施例１：スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及びＢＰ‐ＷＴ
全粒粉砕トウモロコシ（３６％ｄｓ、８００ｇ粉砕トウモロコシ）の液体スラリー（１．０ｋｇｓ）を調製した。スラリーのｐＨは希釈Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．８に調整した。スラリーをフラスコに移しススペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（ジェネンコー（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ））を２．８ＡＡＵ／ｇｄｓ（＋又は−で７．２ＦＴＵｇｄｓのＢＰ‐ＷＴ（配列番号１））にて添加し、又はスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）をフィターゼなしで５．６ＡＡＵ／ｇｄｓ添加し、すべての場合においてスラリーを６５℃で３０分間インキュベーションした。
【０１３８】
予熱される全粒粉砕トウモロコシスラリーを粘度計（ＩＫＡ）に取り付けられた容器に移した。スラリーは８５℃に到達するまで連続的に温められた。それからスラリーをこの温度に維持した。スラリーの粘度を温度が上昇した時に測定した（表４）。
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【０１３９】
表４の粘度データは、８５℃で標準量のスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（５．６ＡＡＵ／ｇｄｓ）を有する全粒粉砕トウモロコシのインキュベーションが、２３．８Ｎｃｍで安定した粘度を有する液状化をなした。それに対して、半分の量のスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２．８ＡＡＵ／ｇｄｓ）及び７．２ＦＴＵのＢＰ−ＷＴで全粒粉砕トウモロコシの前処理を行った場合８５℃の液状化における低い粘度を示した。
【０１４０】
実施例２：スペザイム  エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＥＴＨＹＬ）及びＢＰ‐ＷＴ
スペザイム  エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＥＴＨＹＬ）の効果をブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ（ＢＰ‐ＷＴ）を有する全粒粉砕トウモロコシのインキュベーションの間に検討した。条件は実施例１に記載と同様であり、ｐＨ５．８であった。さらに、全粒粉砕トウモロコシのインキュベーションの温度を８５℃に上げる前に低いｐＨ（ｐＨ４．５、６５℃）で行った。開始０分にて、サンプルは最初の１０分間においては３０秒ごとにサンプリングを行い、その後６２分までに４分ごとにサンプリングを行った。いくつかの結果を表５Ａ（ｐＨ５．８、６５℃、３０分インキュベーション）及び表５Ｂ（ｐＨ４．５、６５℃、３０分インキュベーション）にまとめる。
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【０１４１】
実施例３：スペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）及びＢＰ‐ＷＴ
スペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）の効果をブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ（ＢＰ‐ＷＴ）を有する全粒粉砕トウモロコシのインキュベーションの間に検討した。条件は、温度を８５℃に上げる前に実施例１（ｐＨ５．８、６５℃、３０分インキュベーション）に記載と同様であった。開始０分にて、サンプルは最初の１０分間においては３０秒ごとにサンプリングを行い、その後６２分までに４分ごとにサンプリングを行った。結果を表６にまとめる。
0005463146.tif 000008
【０１４２】
フィターゼ及びスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）を伴ってｐＨ５．８、６５℃、３０分のインキュベーションという実験条件での表６に示す結果から、液状化が低減される粘度を有することがわかった。
【０１４３】
実施例４：ＢＰ‐ＷＴ存在下での粘度効果
３６％全粒粉砕トウモロコシ含有スラリーのｐＨを希釈ＨＣＬを用いてｐＨ５．８、ｐＨ５．４、ｐＨ５．２又はｐＨ５．０に調整した。スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２．０ＡＡＵ／ｇｄｓ）及びＢＰ−ＷＴ（３．６ＦＴＵ／ｇｄｓ）をスラリーに添加し、６５℃、３０分に維持した。フィターゼを有していないスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（４．０ＡＡＵ／ｇｄｓ、ｐＨ５．８）をコントロールとして用いた。スラリーの粘度を８５℃に加熱する間に測定した（表７）。
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【０１４４】
表７は、ｐＨ５．８、ｐＨ５．４、及びｐＨ５．２でのＢＰ−ＷＴ及びスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２．０ＡＡＵ／ｇｄｓ）を用いるスラリーの粘度における低下をｐＨ５．８でのコントロールであるスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（４．０ＡＡＵ／ｇｄｓ）を有するスラリーの粘度における低下と比較した。しかしながら、組み合わせにおけるアルファ‐アミラーゼの量がコントロールにおける量の半分であった。ｐＨ５．０のデータは示していない。スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及びＢＰ−ＷＴの組み合わせはコントロールと比較した試験の条件下でスラリーの粘度を低下していなかった。
【０１４５】
実施例５：蒸留残液及びＤＤＧＳの効果
全粒粉砕トウモロコシスラリー（３６％ｄｓ）を２．０ＡＡＵのスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及び３．６ＦＴＵのブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ‐ＷＴ存在下６５℃にて３０分、６０分、又は１２０分インキュベーションした。条件は実施例１に上述した通りであった。特定の時間後、温度を８５度に上げ、６０分間この温度を維持した。液化デンプン基質のｐＨをｐＨ４．２に低下し、さらに、酵母発酵条件下にて評価した。液化デンプンの％ｄｓを３１％ｄｓに調整した。ＦＥＲＭＥＮＺＹＭＥ（商標）Ｌ−４００を０．４ＧＡＵ／ｇｄｓで添加し、酵母発酵を３２℃で行った。最終アルコール濃度、蒸留残液とＤＤＧＳの残りのデンプン含有量とフィチン酸含有量は測定された（表８）。
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【０１４６】
表８の結果から、たった３０分のインキュベーション時間で得られる発酵ろ過液のフィチン酸含有量を著しく低減できる。標準コントロール（フィターゼを含まない状態）のろ過液は、３０分インキュベーションサンプルのろ過液中のたった５６ｐｐｍ及び１２０分インキュベーションサンプルのろ過液中の４０ｐｐｍに比較して４８０ｐｐｍであった。
【０１４７】
実施例６：液化デンプン‐ＢＰ−ＷＴからグルコースの生産
３６％ｄｓ全粒粉砕トウモロコシスラリーを実施例１と記載と同様の条件下スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２．０ＡＡＵ）及び３．６ＦＴＵのブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼ‐ＷＴ存在下６５℃にて３０分間インキュベーションした。３０分後、温度を８５度に上げ、さらに６０分間８５℃に維持した。液状化の温度を６０度に下げ、ｐＨをｐＨ４．２に調整した。液化デンプンをＨ２Ｏを用いて３２及び３６％ｄｓに調整し、ｄｓトウモロコシの０．４Ｋｇｓ／ＭＴの量のＯＰＴＩＭＡＸ（商標）４０６０  ＶＨＰを用いて６０℃にて糖化を行った。サンプルを６０℃のインキュベーションの間異なる間隔でサンプリングを行い、ＨＰＬＣを用いてグルコース生産量を分析した（表９）。
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【０１４８】
得られる高いデキストロース産物はアルコール、有機酸類、アミノ酸類、アスコルビン酸中間体、糖アルコール類及びその類似物を含むがこれらに限定されない最終産物の生産のための発酵プロセスにおける原料として用いてよい。
【０１４９】
実施例７：フィターゼインキュベーションの粘度に対する効果
８５℃に上昇した温度でのフィターゼ含有インキュベーションの粘度低下に対する効果は、ｐＨ５．８で６５℃にて全粒粉砕トウモロコシ（３６％ｄｓ）をＢＰ−ＷＴ（３．６ＦＴＵ／ｇ  ｄｓ）とインキュベーションした場合の種々の条件下、試験された。
【０１５０】
条件１はフィターゼを添加せず、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（４ＡＡＵ／ｇｄｓ）をたった３０分間のインキュベーションに加えた場合のコントロールである。条件２はＢＰ−ＷＴをインキュベーションの最初に加え、スラリーを６０分間インキュベーションした。約６０分でスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２ＡＡＵ／ｇｄｓ）をスラリーに加えた。条件３はＢＰ−ＷＴ及びスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２ＡＡＵ／ｇｄｓ）を６０分インキュベーションの最初に加えた。及び条件４は、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２ＡＡＵ／ｇｄｓ）をインキュベーションの最初に加え３０分間インキュベーションした。すべてのケースにおいてインキュベーション時間後温度を８５℃に上げた。粘度を時間に対して測定した。
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【０１５１】
表１０及び１１に示すように、約７２から７４℃のゼラチン化温度にて、粘度のピークはスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２ＡＡＵ／ｇｄｓとは対照的に４ＡＡＵ／ｇｄｓ）の高い用量によって低下した。しかしながら、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）存在または非存在下ＢＰ−ＷＴ伴うインキュベーションは８５℃での温度上昇加熱段階の間５０％低減したスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）の用量の場合でさえ８５℃にて粘度の著しい低下を認めた。
【０１５２】
実施例８：アルファ‐アミラーゼの混合物
３６％ｄｓスラリーの全粒粉砕トウモロコシをｐＨ５．８で３０分間６５℃にてインキュベーションした。スラリーを下記に示す処理の一つと接触させ、過熱し、８５℃に維持した。粘度測定は前処理、温度上昇、および温度維持段階の間１０から３０秒ごとに行った。
処理１‐スペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）（１０ＬＵ）＋スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２ＡＡＵ）、
処理２‐スペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）（５ＬＵ）＋スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（１ＡＡＵ）＋ＢＰ−ＷＴ（７．６ＦＴＵ／ｇｄｓ）、
処理３‐スペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）（２．５ＬＵ）＋スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２ＡＡＵ）＋ＢＰ−ＷＴ（７．６ＦＴＵ／ｇｄｓ）、
処理４‐スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２ＡＡＵ）＋ＢＰ−ＷＴ（３．６ＦＴＵ／ｇｄｓ）、
処理５‐スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（４ＡＡＵ）。
【０１５３】
図２に結果を示す。フィターゼの添加はアルファ‐アミラーゼの安定性を拡張し、これは図２において時間（Ｘ軸）に対する粘度（Ｎｃｍ）（Ｙ軸）の降下により理解される。粘度のピーク（約７２℃から７５℃）で、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）はとても効果的な粘度の低下であったが、より高い温度ではスペザイム  フレッド（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及びＢＰ−ＷＴの組み合わせがよりよい粘度の低下であった。
【０１５４】
実施例９：スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及びＢＰ−１７の粘度に対する効果
３０％ｄｓトウモロコシ粉スラリー（ｐＨ５．８）を酵素なしで６５℃で１０分間プレインキュベーションをし、それからフィターゼを含まずスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２．０ＡＡＵ／ｇ及び４．０ＡＡＵ／ｇ）存在下又はスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）（２．０ＡＡＵ／ｇ）＋ＢＰ−１７（７．３ＦＴＵ／ｇ）存在下６５℃で３０分間インキュベーションした。酵素との前処理の３０分後８５℃に温度を上昇させ、スラリーをさらに３０分間８５℃に維持した。図３に示すように、時間（分）に対して粘度（Ｍ（μＮｍ）を測定した場合ＢＰ−１７の添加はスラリーの粘度低下に必要なアルファ‐アミラーゼの量を低減した。
【０１５５】
実施例１０：フィターゼのエタノール収率及びＤＤＧＳに対する効果
エタノールの収率とＤＤＧＳに対するフィターゼの効果を従来の液状化プロセス間に分析した。フィターゼ処理を伴う及び伴わない液状化をＤＤＧＳ組成物のフィチン酸に対して比較するために及びまたエタノール収率と比較するために従来の酵母発酵中に用いた。全粒粉砕トウモロコシスラリー、具体的には、３０％蒸留残液Ｖ／Ｖ含有３２％ｄｓトウモロコシを用い、ｐＨを希水酸化ナトリウムを用いてｐＨ５．８に調整し、スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）を４ＡＡＵ／ｇｄｓ  ｃｏｒｎで添加し７０℃で３０分インキュベーションした。それから処理済みスラリーを３分のホールドタイムで２２５°Ｆに維持したパイロットプラントジェットクッカー（ｐｉｌｏｔ  ｐｌａｎｔ  ｊｅｔ  ｃｏｏｋｅｒ）に通した。それからゼラチン化デンプンを大気圧で処理され８５℃に維持した。液状化を完全にするために追加量のスペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）を１．５ＡＡＵ／ｇｄｓ  ｃｏｒｎで添加しさらに９０分維持した。フィターゼ処理液状化を調製したが、ＢＰ−１７フィターゼをスラリー処理の間４ＦＴＵ／ｇｄｓ  ｃｏｒｎで添加した。
【０１５６】
それから液状化のｐＨを希硫酸を用いてｐＨ４．２に調整し、酵母発酵を行った。各実験において、培地の調製前に容器の風袋を得た。８００グラムの３２％ＤＳトウモロコシ液状化物を１Ｌフラスコに入れた。レッドスターエタノールレッド酵母（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ  ｙｅａｓｔ）の播種材料を一時間穏やかな攪拌下、４０グラムの水に１０グラムの酵母及び１グラムのグルコースを加えることによって調製した。５ｍｌの酵母播種材料を平衡化した発酵装置に添加した。同時糖化発酵の開始のためにＧ  Ｚｙｍｅ（商標）４８０エタノール（ジェネンコー‐ダニスコ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ−Ｄａｎｉｓｃｏ））を０．４ＧＡＵ／ｇｄｓ．ｃｏｒｎにて添加した。発酵フラスコの初期の総重量を測定し、発酵装置を３２℃に維持される水浴に設置した。発酵を行い、発酵の間、重量の減少を異なる時間間隔で測定した。二酸化炭素の減少による減少重量をアルコール収率を計算するために用いた。発酵の終わりに、最終総重量を測定した。培地は定量的に５Ｌの丸底容器に移された。約８００ｍｌの蒸留液になるまで真空下、蒸留を行い、２００ｍｌの水を含む容器に集めた。エタノールを２Ｌまで希釈し、ＨＰＬＣにて分析した。乾燥する前に沈殿物の重量及びＤＳを測定した。残留デンプン及びフィチン酸分析をＤＤＧＳ及び蒸留残液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）にて行った。化学量論計算を重量減少、蒸留、及び残留デンプン分析に基づいて次のように行った。
【０１５７】
ＣＯ２重量減少を用いるエタノール計算：
エタノール生産（ｍｍｏｌ）＝ＣＯ２の減少（ｇ）／８８
エタノール生産（ｇ）＝（ＣＯ２の減少（ｇ）／８８）＊９２＝＞ＣＯ２の減少（ｇ）＊１．０４５
エタノール生産（ｍｌ）＝（（ＣＯ２の減少（ｇ）／８８）＊９２）／０．７８９＝＞ＣＯ２の減少（ｇ）ｘ１．３２５
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【０１５８】
表１２のデータはＤＤＧＳ及び蒸留残液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）におけるフィチン酸含有量に顕著な差を示した。ＢＰ−１７の使用によりＤＤＧＳ及び蒸留残液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）中のフィチン酸が９０％より多く減少する結果となった。
【０１５９】
実施例１１から１５は野生型及び変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼを直接的に又はトリコデルマ  レーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中の融合蛋白質として発現させた。すべてのケースにおいて、１０ｇ／Ｌより多いとても高いレベルで発現が見られた。
【０１６０】
実施例１１：Ｋｅｘ２部位を有していない融合蛋白質としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）における野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡをＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ  (ＢｉｏＰａｒｋ  Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．  １１，  Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ)によって合成した。制限酵素認識部位であるＳｐｅＩ及びＡｓｃＩをクローニング目的（表１３、配列番号４を参照）でインキュベーションした。フィターゼのオープンリーディングフレーム（配列番号４）をベクターであるｐＴｒｅｘ４のＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位（図４を参照）へ挿入した。得られる構築体をバイオ‐ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）(Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ)社のＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）由来の菌株へバイオリスティックス的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）に形質転換した。形質転換の操作方法はＦｏｒｅｍａｎ（ＷＯ２００５／００１０３６）によって記載される。安定した形質転換体を得た後、これらの形質転換体をＦｏｒｅｍａｎにより記載されるようにブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの発現分析のために振盪フラスコ培養にて増殖した。ＷＯ２００５／００１０３６に記載の形質転換及び発現分析の手順は参照によりそれらの全体が本明細書に取り込まれる。ＭＭアセトアミドプレートにて数日間培養後、安定した形態を示す形質転換体を３０ｍｌのプロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地含有２５０ｍｌ振盪フラスコに植菌した。プロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地は３０g／Ｌのアルファ‐ラクトース、６．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣａＣＬ２、ｌｍｌ／Ｌの１０００Ｘ微量元素塩液、２ｍｌ／Ｌの１０％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、２２．５ｇ／Ｌのプロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）綿実粉(Ｔｒａｄｅｒｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｍｅｍｐｈｉｓ，  ＴＮ)、及び０．７２ｇ／ＬのＣａＣＯ３を含んだ。２８℃及び２２５ｒｐｍで２日間培養後１０％プロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地を３０ｍＬのラクトース限定培地を含む２５０ｍＬの振盪フラスコに移した。ラクトース限定培地の組成物は次に示すものであった。それは、５g／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／ＬのＰＩＰＰＳ緩衝液、９ｇ／Ｌのカザミノ酸、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍｌ／ＬのＭａｚｕ  ＤＦ６０−Ｐ消泡剤(ｍａｚｕｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｇｕｒｎｅｅ，  ＩＬ)、ｌｍｌ／Ｌの１０００Ｘ微量元素塩液、ｐＨ５．５である。４０ｍｌ／Ｌの４０％（ｗ／ｖ）ラクトース液を滅菌後培地に加えた。ラクトース限定培地入り振盪フラスコを２から３日間２２５ｒｐｍで２８℃にてインキュベーションした。培地の上澄みのサンプルを適切な体積の還元剤含有４ＸＮｕＰＡＧＥサンプル緩衝液(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ)と混合し、４−１２％ＮｕＰＡＧＥプレキャストゲルとＭＯＰＳ泳動用緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕ���  Ｓｔａｉｎ  (インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ)を用いて蛋白質検出のために染色した。約９６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約９６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
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【０１６１】
実施例１２：Ｋｅｘ２部位を有する融合蛋白質としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）における野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを鋳型（表１３の配列番号４を参照）としてＧＥＮＥＡＲＴによる合成されるＤＮＡを用いてポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）によって増幅した。用いるＰＣＲ装置はＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＣＲにて用いるＤＮＡポリメラーゼはヘラクレス（ＨＥＲｃｕｌａｓｅ）(ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）)であった。フィターゼオープンリーディングフレームを増幅するために用いたプライマーはプライマーＳＫ６６７（前方）５´CACTACTAGTGTCGCTGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAG‐３´（配列番号６）、及びプライマーＳＫ６６４  ５´GAGTTCGGCGCGCCTTACTGGA‐３´（配列番号７）であった。前者のプライマーは、Ｋｅｘ２プロテアーゼによって効率的に切断するためにクローニング目的のためのＳｐｅＩ部位に沿ってVAVEKR（配列番号８）のアミノ酸配列を含んだ。野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は次の通りである。段階１：９４℃１分間。段階２：９４℃３０秒間。段階３：５８℃３０秒間。段階４：７２℃１分間。段階２、３及び４をさらに２４回繰り返した。段階５：７２℃５分間。段階６：保存用４℃。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  (キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）)を用いて精製し、制限酵素ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化した。消化ＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製し、ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位（図４を参照）でｐＴｒｅｘ４ベクターへライゲーションした。ライゲーション反応物をＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）セル(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)に形質転換した。得られる構築体をバイオラッド社のＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を用いてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）由来の菌株へバイオリスティックス的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃａｌｌｙ）に形質転換した。形質転換の操作方法はＦｏｒｅｍａｎ（ＷＯ２００５／００１０３６）によって記載される。安定した形質転換体を得た後、これらの形質転換体を実施例１１に記載のように培養し蛋白質発現を同定した。約９６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約９６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
【０１６２】
実施例１３：直接的な構築としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）における野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを鋳型（表１３の配列番号４を参照）としてＧＥＮＥＡＲＴによる合成されるＤＮＡを用いてポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）によって増幅した。用いるＰＣＲ装置はＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＣＲにて用いるＤＮＡポリメラーゼはヘラクレス（ＨＥＲｃｕｌａｓｅ）(ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）)であった。フィターゼオープンリーディングフレームを増幅するために用いたプライマーは、プライマーＳＫ６８０（前方）５´-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-３´(配列番号９)、及びプライマーＳＫ６  ５´-CCTTACTGGAGCTGGCAG-３´(配列番号１０)であった。前者のプライマーは、ｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)へクローニングするために必要な５´末端にさらに４つのヌクレオチド（配列‐ＣＡＣＣ）を含んだ。野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は次の通りである。段階１：９４℃１分間。段階２：９４℃３０秒間。段階３：５８℃３０秒間。段階４：７２℃１分間。段階２、３及び４をさらに２４回繰り返した。段階５：７２℃５分間。段階６：保存用４℃。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  (キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）)を用いて精製した。精製されるＰＣＲ産物は最初にｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)へクローニングされ、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）セル(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)に形質転換した。フィターゼオープンリーディングフレームの正しい配列番号を有するｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターをメーカーの使用説明書（図５を参照）にそってＬＲクロナーゼＩＩ(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）)を用いてｐＴｒｅｘ３ｇに組み換えた。得られる構築体を形質転換し、蛋白質を実施例１１に記載のように同定した。約４６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約４６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
【０１６３】
実施例１４：Ｋｅｘ２部位を有する融合蛋白質としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）におけるＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
ＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームをＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（ＢｉｏＰａｒｋ  Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒ．  １  １，  Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ)  (表１４配列番号５を参照)によって合成した。アミノ酸配列VAVEKR（配列番号８）をクローニング目的のための制限酵素認識部位ＳｐｅＩ及びＡｓｃＩに沿って、融合蛋白質のＫｅｘ２プロテアーゼ切断のために含んだ。フィターゼオープンリーディングフレームをベクターｐＴｒｅｘ４のＳｐｅＩ及びＡｓｃＩ部位へ挿入した。得られる構築体を形質転換し、蛋白質を実施例１１に記載のように同定した。約９６ｋＤａの明らかな分子量を有する蛋白質バンドが染色ゲルに観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約９６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
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【０１６４】
実施例１５：直接的な構築としてトリコデルマ  レーシ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）におけるＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの構築及び発現
ＢＰ−１７変異体ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを鋳型としてＧＥＮＥＡＲＴ(表１４配列番号５を参照)によって合成されるＤＮＡを用いてポリメレースチェーン反応（ＰＣＲ）によって増幅した。用いるＰＣＲ装置はＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００  （ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＣＲにて用いるＤＮＡポリメラーゼはヘラクレス（ＨＥＲｃｕｌａｓｅ）(ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））であった。フィターゼオープンリーディングフレームを増幅するために用いるプライマーは、プライマーＳＫ６８０（前方）５´-CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC-３´(配列番号９)、及びプライマーＳＫ６  ５´-CCTTACTGGAGCTGGCAG-３´(配列番号１０)であった。前者のプライマーは、ｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)）へクローニングするために必要な５´末端にさらに４つのヌクレオチド（配列‐ＣＡＣＣ）を含んだ。野生型ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼのオープンリーディングフレームを増幅するためのＰＣＲ条件は次の通りである。段階１：９４℃１分間。段階２：９４℃３０秒間。段階３：５８℃３０秒間。段階４：７２℃１分間。段階２、３及び４をさらに２４回繰り返した。段階５：７２℃５分間。段階６：保存用４℃。ＰＣＲ産物はＱｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  (キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ)）を用いて精製した。精製されるＰＣＲ産物は最初にｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））へクローニングされ、ＴＯＰ１０ケミカルコンピテント大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）セル(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換した。フィターゼオープンリーディングフレームの正しい配列番号を有するｐＥＮＴＲＹ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターをメーカーの使用説明書（図５を参照）に沿ってＬＲクロナーゼＩＩ(インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)）を用いてｐＴｒｅｘ３ｇに組み換えた。得られる構築体を形質転換し、蛋白質発現を実施例１１に記載のように同定した。Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ染色分析により約４６ｋＤａの蛋白質バンドが観察された。融合蛋白質の期待される分子量は約４６ｋＤａである。蛋白質は１０ｇ／Ｌより多い発現が認められた。
【０１６５】
実施例１６から２０によってアルファ‐アミラーゼ及びブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）フィターゼの組み合わせがアルファ‐アミラーゼの阻害を減少させ、アルカリ又は酸添加がなくても低いｐＨでエタノール発酵を促進させることを示す多くのデータを提供する。
【０１６６】
実施例１６：アルファアミラーゼ熱安定性でのフィチン酸阻害の除去効果
全粒粉砕トウモロコシ（５０％蒸留残液含有３２‐４０％ｄｓトウモロコシ）の水溶性スラリーをｐＨ５．８、７０℃にてインキュベーションした。熱安定性フィターゼ（ＢＰ−１７）及び二つの液化熱安定性アルファ‐アミラーゼであるダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，  Ｉｎｃ．,  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）製のスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）を比較実験のために用いた。
【０１６７】
全粒粉砕トウモロコシ（Ｂａｄｇｅｒ  Ｓｔａｔｅ  Ｅｔｈａｎｏｌ，  Ｍｏｎｒｏｅ，  ＷＩ）を最終濃度が３２％ｄｓになるように５０％（Ｖ／Ｖ）蒸留残液含有の水と混合した。トウモロコシ固体を二重釜で調製した。スラリーをよく混ぜスラリーのｐＨを炭酸ナトリウム又は水酸化ナトリウムを用いて商業的エタノールプロセスの液状化のための典型的なｐＨであるｐＨ５．８に調整した。このスラリーを二重釜にて混合し、６５‐７０℃の前処理温度に上げる。７０℃に達する直前に、液化酵素スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）（ｄｓトウモロコシ１グラム当たり１０ＡＡＵ）又は遺伝子組み換えが行われているバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のアルファ‐アミラーゼ（ダニスコ  ユーエス社  ジェネンコ  ディビジョン（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ,  Ｉｎｃ．，  Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）製のスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）を添加し、第一液状化段階（１°液状化、図１を参照）を始めるための時間がスタートした。スラリーをＢＰ−１７フィターゼ（ｄｓトウモロコシ１グラム当たり１２ＦＴＵ）を加えた又は加えていない酵素の存在下４０分間インキュベーションした。前処理スラリーをそれから蒸気及び水を用いて所望の温度に予熱したジェットクッカー（ｊｅｔ  ｃｏｏｋｅｒ）(１８０−２２５°F)に通した。スラリーを最高速度（１．５セッティング）４リットル／分にてジェットクッカーを通して送った。保持コイルの最初３ループを用いて３分ちょっとの保持時間を得た。すべての水を置換し及び所望の温度を安定に維持した後、第二の液状化段階（２°液状化）を始めるために、溶解されどろどろとなったトウモロコシの一部を集め、８５℃の第二の槽（頭上で攪拌している）へ移した。サンプルを０、３０、６０、９０分での粘度（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄにより）、ブリックス（ｂｒｉｘ）及びＤＥ（Ｓｃｈｏｏｒｌｓより）を試験するために採取した。結果を表１５にまとめる。
【０１６８】
表１５は全粒粉砕トウモロコシのジェットクッカー（ｊｅｔ  ｃｏｏｋｅｒ）(２２５°F)を通した後異なるアルファ‐アミラーゼの熱安定性における第一液状化条件の効果の比較を示す。第一液状化条件は、水中３２％全粒粉砕トウモロコシのスラリーであり、ｐＨをｐＨ５．８に調整し、異なる酵素存在下７０℃で４０分間インキュベーションした。ジェットクッカー処理の条件は２２５°Ｆで３分間であった。
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【０１６９】
第一液状化の間ＢＰ−１７フィターゼの添加によって０．６０％ｄｓトウモロコシから０．０９％ｄｓトウモロコシまで全粒粉砕トウモロコシのフィチン酸含有量が低減した（＞８５％減少）。表１５に記載のデータは、ＤＥ進行又は粘度低下に基づいて、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）が２２５°Ｆのジェットクッカー処理温度で完全に不活化したことを示した。しかしながら、ジェットクッカー処理前のフィターゼによるフィチン酸阻害の除去によって、第二液状化段階の間８５℃でのＤＥの促進及び粘度減少によって示すようにアルファ‐アミラーゼの熱安定性における著しい増加が認められた。その結果よりフィチン酸はアルファ‐アミラーゼを阻害したこと及び阻害の除去によって液化熱安定性アルファ‐アミラーゼの熱安定性及び／又はｐＨ安定性を増加したことを示した。
【０１７０】
実施例１７：アルファ‐アミラーゼｐＨ安定性におけるフィチン酸阻害の除去の効果
全粒粉砕トウモロコシを水と蒸留残液の比を５０：５０にして３２％（ｄｓトウモロコシ）スラリーにした。スラリーｐＨを測定しｐＨ５．１５にした。スラリーを二重釜にて水および蒸気を用いて７０℃（１５８°Ｆ）に加熱した。液状化酵素（スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及びＢＰ−１７）を添加し、スラリーを４０分間７０℃の温度に維持することにより前処理した。前処理４０分後スラリーを大きなパイロットプラントジェット（Ｍ  １０３  ｈｙｄｒｏ−ｈｅａｔｅｒを備えた）を用いて３分間ホールドタイムにて２２５°Ｆに維持したジェットクッカーに通した。液状化物をジェットクッカーから集め８５℃の水浴に置いた。液状化物を連続的に攪拌し、９０分間８５℃に保った。サンプルを０、３０、６０、９０分で集めた。すべてのサンプルをブリックス（Ｂｒｉｘ）、ＤＥ（Ｓｃｈｏｏｒｌｓの方法を用いて）、及び粘度（２０ｒｐｍでＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ２）で試験した。また液状化の試験をスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）及びＢＰ−１７フィターゼを用いて実施した。
【０１７１】
任意のｐＨ調整せずに全粒粉砕トウモロコシの液状化を行なう間のＤＥ進行及び粘度減少を表１６に示す。スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）又はスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）は、フィチン酸によるアミノ酸の阻害が除かれる場合ｐＨ５．２での全粒粉砕トウモロコシの液状化プロセスにおいてうまく用いることができることをデータは示した。
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【０１７２】
表１５及び表１６は、液状化の粘度における減少を伴って８５℃でのＤＥ進行の安定した増加という結果が得られたことに示されるように、２２５°Ｆでの高温ジェットクッカー処理前にスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）及びスペザイム（商標）エチル（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＥＴＨＹＬ）のフィチン酸の減少によって、低いｐＨ安定性で活性の安定性が著しく増加することを示した。
【０１７３】
実施例１８：アルファ‐アミラーゼの１回投与量対分割投与量
この実施例は全粒粉砕トウモロコシの液状化プロセスにおけるアルファ‐アミラーゼの一回投与量及び分割投与量の比較を示す。全粒粉砕トウモロコシを水及び蒸留残液（総量２．８％）を用いて４０％（ｄｓトウモロコシ）へスラリー化した。それから、このスラリーを６Ｎ硫酸を用いてｐＨ５．２に調整した。スラリーを二重釜にて水及び蒸気を用いて１５５°Ｆに加熱した。スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）及びＢＰ−１７フィターゼをそれぞれ１０ＡＡＵ／ｇ  ｄｓ  ｃｏｒｎ及び１２．８ＦＴＵ／ｇ  ｄｓ  ｃｏｒｎ加えた。スラリーを４０分間１５５°Ｆの温度に維持して前処理を行った。処理４０分後スラリーをパイロットプラントジェット（Ｍ  １０３  ｈｙｄｒｏ−ｈｅａｔｅｒを備えた）を用いて１分間ホールドタイムにて２２５°Ｆに維持したジェットクッカーに通した。第二液状化のために液状化物をジェットクッカーから集め８５℃の水浴においた。三つの各別の第二液状化、即ち１）スペザイム  エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ）を添加しないケース、２）１ＡＡＵ／ｇ  ｄｓ  ｃｏｒｎ量のアルファ‐アミラーゼの追加のケース、及び３）２ＡＡＵ／ｇ  ｄｓ  ｃｏｒｎ量アルファ‐アミラーゼの追加のケースを行った。液状化を連続的攪拌及び９０分間８５℃で行った。試料を０、３５、及び６０分にて採取した。すべてのサンプルをブリックス（Ｂｒｉｘ）、ＤＥ（Ｓｃｈｏｏｒｌｓの方法を用いて）、及び粘度（２０ｒｐｍでＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ２）を試験した表１７。
【０１７４】
表１７は１回用量（第一液状化）及び分割用量（第二液状化）のスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）の比較である。
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【０１７５】
表１７に示すデータは、スペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）活性の多くの量が第一段階の液状化におけるスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）の安定化によって２２５°Ｆのジェットクッカー処理温度を通して残っていたことを示した。ＤＥの増加及び粘度減少の両者が第二液状化段階でのスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）の２回目の用量を追加せずに見られた。しかしながら、さらに第二液状化段階でのスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）の２回目の用量追加によってＤＥ進行も粘度減少も増強された。
【０１７６】
実施例１９：ＤＤＧＳ及びエタノール生産における効果
液状化物はアルコール生産用エタノール発酵における発酵原料として用いられた。第一液状化段階でフィターゼが無い状態でｐＨ５．８にてスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）を用いる従来の液状化プロセスから得られる液状化物＃１（５０％蒸留残液含有３２％ｄｓトウモロコシ）を用いた。また、実施例１７から得られる液状化物を用いた液状化物＃２は、第一液状化段階でフィターゼ処理ともない及び発酵前になされるｐＨの調整をしていない状態のスペザイム（商標）エクストラ（ＳＰＥＺＹＭＥ（商標）ＸＴＲＡ）を用いた。コントロール液状化物‐１のｐＨを従来のエタノールプロセスのように希硫酸を用いて４．２に調整する一方、実施例１７からの液状化物はなんらｐＨの調整をせずに用いた（液状化物＃２）。実施例１７からの液状化物を本発明のプロセスのためのｐＨ未調整試験に用いた。各実験において、容器の風袋量を培地調製の前に測定した。３２％ＤＳトウモロコシ液状化（２リットル）を２Ｌフラスコへ入れた。レッド酵母（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ  ｙｅａｓｔ）(Ｌｅｓａｆｆｒｅ)播種材料を一時間穏やかな攪拌下、４０グラムの水に１０グラムの酵母及び１グラムのグルコースを加えることによって調製した。５ｍｌの酵母播種材料を平衡化した発酵装置に添加し、続いて同時糖化発酵の開始のためにＧ  Ｚｙｍｅ（商標）４８０エタノール（ジェネンコー‐ダニスコ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ−Ｄａｎｉｓｃｏ））を０．４ＧＡＵ／ｇｄ  ｃｏｒｎにて添加した。発酵フラスコの初期の総重量を測定し、発酵装置を３２℃に維持される水浴に設置した。試料を異なる時間で採取し、ＨＰＬＣを用いて炭水化物含有量及びエタノール含有量を分析した。また、発酵を各液状化の１キログラムを用いて行い、発酵中の重量減少を異なる時間で測定した。二酸化炭素の消失による重量減少に基づいて、アルコールを測定した（表１８）。発酵の終わりに、最終総重量を測定した。培地は定量的に５Ｌの丸底容器に移された。約８００ｍｌのエタノールになるまで真空下、蒸留を行い、２００ｍｌの水を含む容器に集めた。エタノールを２Ｌまで希釈し、ＨＰＬＣにて分析した。乾燥する前に沈殿物の重量及びＤＳを測定した。残留デンプン分析をＤＤＧＳにて行った。化学量論計算を重量減少、蒸留、及び残留デンプン分析に基づいて行った。
【０１７７】
ＣＯ２重量減少を用いるエタノール計算：
エタノール生産（ｍｍｏｌ）＝ＣＯ２の減少（ｇ）／８８
エタノール生産（ｇ）＝（ＣＯ２の減少（ｇ）／８８）＊９２＝＞ＣＯ２の減少（ｇ）＊１．０４５
エタノール生産（ｍｌ）＝（（ＣＯ２の減少（ｇ）／８８）＊９２）／０．７８９＝＞ＣＯ２の減少（ｇ）ｘ１．３２５
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【０１７８】
表１８のデータはプロセス間で遊離した硫酸塩及びフィチン酸含有量が大きく異なることを示した。第一液状化における熱安定性アルファ‐アミラーゼのフィチン酸阻害の除去によってフィチン酸含有量の減少、高く遊離し有効なリン酸塩及び硫酸塩の減少を伴うＤＤＧＳが得られた。すなわち、ｐＨ調整をしないプロセスによってデンプン液状化プロセスにおける熱安定性液化アルファ‐アミラーゼに対して低いｐＨでのｐＨ安定性の効果をもたらした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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