(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リソソーム蓄積障害の治療に使用するための、配列番号1のアミノ酸配列を持つHsp70タンパク質またはその生物学的に活性な変異体を含む、医薬組成物：
ここで、当該変異体のアミノ酸配列は、配列番号1に対して少なくとも90％同一であり、
当該変異体は、BMP(ビス(モノアシルグリセロ)リン酸)との相互作用が可能であり、かつ、
当該変異体は、シャペロン活性を有する。
【請求項２】
前記変異体のアミノ酸配列が、配列番号1に対して、99.9〜95％同一である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記変異体のアミノ酸配列が、配列番号1に対して、95〜90％同一である、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記変異体が、配列番号1のアミノ酸番号30〜382で表されるHsp70タンパク質のATPアーゼドメインのすべてまたは一部を含む、請求項1〜3の何れか1項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記変異体が、配列番号1のアミノ酸番号30〜382で表されるHsp70タンパク質のATPアーゼドメインのアミノ酸位置90にトリプトファンを含む、請求項4に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記リソソーム蓄積障害が、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、シアリドーシス、異染性白質ジストロフィー、およびサポシン欠損症からなる群から選択される、請求項1〜5の何れか1項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ニーマンピック病が、ニーマンピック病A型、B型、またはC型である、請求項6に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記リソソーム蓄積障害が、ムコ多糖症、糖タンパク質蓄積障害、ムコリピドーシス、および脂質蓄積障害からなる群から選択される、請求項1〜5の何れか1項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記脂質蓄積障害がスフィンゴリピドーシス、ガングリオシドーシス、および白質ジストロフィーからなる群から選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記リソソーム蓄積障害が、疾患の病理に関与する欠陥酵素の残存酵素活性を有するとして特徴付けられる、請求項1〜9の何れか1項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記残存酵素活性が、0.1％〜50％の範囲の残存酵素活性である、請求項10に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる、２００８年６月２６日出願のデンマーク特許出願ＰＡ  ２００８００８８５の非仮特許出願である。仮特許出願または本出願で言及した全ての特許文献および非特許文献は、参照によりその全容が本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
本発明は、分子シャペロンＨｓｐ７０とリソソームリン脂質ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ、また別名ＬＢＰＡとしても知られる）との間の相互作用を利用することによる酵素活性の調節の分野に関する。Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用がリソソーム区画のＢＭＰ相互作用酵素の活性を調節するため、本発明は、リソソーム蓄積症の病理を逆転するための手段を提供する。
【背景技術】
【０００３】
分子シャペロンは、タンパク質の立体配座の再構成が起こる細胞の全ての区画内に見られ、タンパク質合成が細胞内の折り畳まれていないペプチドの主な供給源であるが、タンパク質を構造的に不安定にさせ得る高温または他の刺激への細胞の曝露、従って折り畳み構造がほどけて凝集する傾向は、防御タンパク質の産生に関与する特定の細胞応答に一致する。この応答は、原核細胞から真核細胞に至るどの細胞型でも観察され、熱ショック応答またはストレス応答と呼ばれる。この応答によって誘導されるタンパク質は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）として知られ、いくつかのファミリーが存在する。
【０００４】
シャペロンのファミリーの主な例はＨｓｐ７０タンパク質である。このファミリーは、最近、その抗アポトーシス特性によって最も際立っているシャペロンとしての機能、免疫におけるその機能、および癌細胞のＨｓｐ７０のアップレギュレーションへの明らかな依存に加えて、細胞恒常性の他の側面に関係するとされている。さらに、Ｈｓｐ７０は、リソソーム完全性の保護の役割を果たすことができる。しかし、このために分子機構は不明のままである。
【０００５】
リソソーム蓄積症は、リソソーム区画内での物質の蓄積、および罹病した個体に対する致命的な影響をもたらす、結果として起こるリソソーム区画の不安定化によって特徴付けられる希少な疾患群である。物質は、その異化作用に関与する酵素の欠乏によってリソソーム区画内に蓄積する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在まで、殆どのリソソーム蓄積症に利用可能な治療が存在しない。この疾患群の根本的な原因は、特定のリソソーム酵素が、脂質などの特定のリソソーム物質を効率的に異化作用できないことである。したがって、患者に組換え酵素を与えることによる酵素補充療法（ＥＲＴ）の使用が、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）およびファブリー病（Ｆａｂｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含むこれらの疾患の一部に対して行われている。しかし、ＥＲＴは、その使用を一部の分野に限定し得る非常に高価な形態の療法であり、しかも、組換え酵素が産生される特定のタイプの疾患のみに有効である。本発明は、リソソーム蓄積障害を治療するための新たな手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明では、Ｈｓｐ７０と細胞膜、特に原形質膜およびリソソーム膜との間の結合についての分子機序の理解を提供することによって、Ｈｓｐ７０のリソソーム膜安定化に対する寄与の分子機序を開示する。
【０００８】
Ｈｓｐ７０が、リソソームの完全性を保護する役割を果たすことができることが文献から分かっている。しかし、その分子機構は、未解明のままである。加えて、この特性が主要なストレス誘導性Ｈｓｐ７０（ＨｓｐＡ１Ａ／Ａ１Ｂ、この研究ではＨｓｐ７０と呼ぶ）に特有のものであるか否か、または他のＨｓｐ７０のファミリーメンバーが同じ特徴を有し得るか否かについての疑問のいずれにも取り組んでいない。
【０００９】
これらの未回答の疑問は、Ｈｓｐ７０のリソソーム保護効果の分子機序を調べるという本発明の主な目的の１つを促した。この目的を達成するために、イオジキサノール勾配超遠心分離に基づいた細胞下画分プロトコルと同様に、組換えＨｓｐ７０とその変異体の作製方法を構築した。リソソーム膜完全性の直接的な評価についてのアッセイは、リソソームの光酸化誘導透過化に基づいて構築され、これにより、リソソーム膜を感作または保護する能力に関してＨｓｐ７０および他の成分の効果を評価するリアルタイム顕微鏡法が可能となる。組換えＨｓｐ７０および変異体の様々な脂質との相互作用を、リポソーム９０度光散乱、トリプトファン蛍光シフト、および表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）の測定を含む様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムで調べた。Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用についての概念モデルの構築は、コンピューター内でのＨｓｐ７０の静電表面モデリングを利用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムで観察された脂質相互作用のｉｎ  ｖｉｖｏでの妥当性を評価するために、ＢＭＰとＨｓｐ７０の相互作用を、両方の構成要素に関して標的とした。この機構が利用可能であることをさらに示すために、シスプラチンの投与によって誘導される細胞死のモードを特徴付け、そしてリソソームＨｓｐ７０を、癌および非形質転換細胞系の両方においてこの細胞死系で標的とした。
【００１０】
Ｈｓｐ７０のリソソーム膜安定化に対する寄与についての分子機序に取り組むために、本発明者らは、細胞質Ｈｓｐ７０の影響を排除し得る系を構築しようとした、すなわちＨｓｐ７０をリソソームに直接送達する必要があった。Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄらによる電子顕微鏡写真が、Ｈｓｐ７０がリソソーム内に存在できることを示したため、組換えヒトＨｓｐ７０（ｒＨｓｐ７０）の作製方法を構築することに決め、エンドサイトーシス機構を、ｒＨｓｐ７０をリソソームに直接送達するための送達経路として利用することを期待した。このため、本発明者らは、リソソームソーティングシグナルのＨｓｐ７０への付加、潜在的に破壊する機能、および過剰発現によって起こり得る合併症の回避の必要性がなくなるであろう。エンドサイトーシス法は、さらに、一定量のｒＨｓｐ７０の滴定を可能にし、長い目で見ると、細胞外Ｈｓｐ７０の取り込みの機構を研究する可能性を開くであろう。
【００１１】
Ｈｓｐ７０の作製の方法を確立したため、次に、そのエンドサイトーシスを確認するために、Ｈｓｐ７０をフルオロフォアＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８（Ｈｓｐ７０−ＡＦ４８８）で標識した。共焦点イメージングにより、この方法でｒＨｓｐ７０を実際にリソソームに送達できることが明らかにされた。リソソーム膜安定性に対する影響を評価するために、本発明者らは、次に、１つのリソソームのレベルでのリソソーム膜透過化を定量するための方法を構築し、この方法を利用してエンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０の効果を評価した。これらの方法は、実施例１および２の基礎をなし、これらの実施例で、本発明者らは、エンドリソソーム陰イオン性リン脂質ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）に対するｐＨ依存性の高親和性結合によってリソソームを安定させることによってＨｓｐ７０が細胞の生存を向上させることを示す。Ｈｓｐ７０の正に帯電したＡＴＰアーゼドメインは、結合に関与するが、基質結合ドメインも、リソソームの効果的な安定化に必要である。興味深いことに、この相互作用およびそれが提供する保護は、トリプトファン９０に依存し、このトリプトファン９０は、ＡＴＰアーゼドメインの正に帯電したウェッジに位置する。重要なことに、細胞保護効果は、ｒＨｓｐ７０のエンドサイトーシス送達によって得ることができ、ＢＭＰ抗体またはＨｓｐ７０阻害剤の細胞外投与によって特異的に逆戻りさせることができる。
【００１２】
これに加えて、本発明者らはまた、Ｈｓｐ７０のリソソーム膜保護機構を腫瘍形成およびプログラム細胞死の事象に結び付けようともした。したがって、本発明者らは、一般的な化学療法剤、シスプラチンの投与によって開始される細胞死プラグラムを特徴付け、シスプラチンはカスパーゼに依存しないが、プロテアーゼのリソソーム放出によって特徴付けられることを見出した。トランスジェニックＨｓｐ７０およびエンドサイトーシスされたＨｓｐ７０は、シスプラチン曝露に際して、リソソーム膜を安定させることによって細胞の生存を向上させることができる。興味深いことに、本発明者らは、リソソームＨｓｐ７０自体またはそのリソソーム相互作用のパートナー、ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）の標的化が、シスプラチンに対して形質転換前立腺細胞系は感作するが、非形質転換前立腺細胞系は感作しないことを示し、これは、ＢＭＰとＨｓｐ７０の相互作用を癌治療の薬理学的標的として利用することの実験的証拠である。
【００１３】
興味深いことに、Ｈｓｐ７０−２は、Ｈｓｐ７０と８６％のアミノ酸相同性を有するが、リソソーム膜を直接保護することはできなかった。しかし、Ｈｓｐ７０−２の欠乏も、リソソーム膜透過化をもたらし、プログラム細胞死を確かにする。この効果は、Ｈｓｐ７０−２とリソソーム区画との間の直接的な相互作用に依存するのではなく、むしろ、Ｈｓｐ７０−２の欠乏に応答した水晶体上皮由来成長因子（ＬＥＤＧＦ）のダウンレギュレーションによって構成される。
【００１４】
この研究の方法および結果は、実施例の節で詳細に述べる。
【００１５】
リソソーム安定化を促進するリソソームＢＭＰとの相互作用によるＨｓｐ７０の細胞保護効果の分子機序を本明細書で解明したため、これらの知見は、リソソーム蓄積症の治療標的の基礎となる。
【００１６】
驚くべきことに、組換えＨｓｐ７０を細胞に供給すると、本明細書でニーマンピック病（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）およびファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）として示されているリソソーム蓄積症の病状が効率的に逆戻りすることを実証した。さらに、Ｈｓｐ７０誘導物質ベンジルアルコールを細胞に供給すると、本明細書でニーマンピック病として示されているリソソーム蓄積症の病状が効率的に逆戻りした。
【００１７】
したがって、本発明は、それを必要とする個体におけるＨｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を直接または間接的に上昇させることによって、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を供給することによって、またはＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質を供給することによってリソソーム蓄積症を治療するための方法を提供する。
【００１８】
本発明は、一態様では、リソソーム蓄積障害の薬剤として使用するため、またはその治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤に関する。
【００１９】
一実施形態では、前記生理活性剤は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体である。
【００２０】
別の実施形態では、前記生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質である。
【００２１】
また、本発明の一態様は、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含むリソソーム蓄積症を治療するための方法を提供することである。
【００２２】
一実施形態では、前記治療は、予防、治癒、または改善である。
【００２３】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、ニーマンピック病（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ファーバー病（Ｆａｒｂｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、クラッベ病（Ｋｒａｂｂｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ファブリー病（Ｆａｂｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ゴーシェ病（Ｇａｕｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、シアリドーシス（Ｓｉａｌｉｄｏｓｉｓ）、異染性白質ジストロフィー（Ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、およびサポシン欠損症（ｓａｐｏｓｉｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）からなる群から選択される。
【００２４】
別の実施形態では、前記リソソーム蓄積症は、疾患の病理に関与する欠陥酵素の残存酵素活性を有するとして特徴付けられる。
【００２５】
本発明はまた、本発明による生理活性剤を、少なくとも１つの他の治療方式と併用して投与することを含むリソソーム蓄積症の治療方法にも関する。
【００２６】
本発明のさらなる態様は、酵素の酵素活性を調節するための方法であって、前記酵素がＢＭＰ（ビス（モノアシルグリセロ）リン酸）と相互作用し、前記方法が、
（ｉ）本発明による生理活性剤を投与するステップと、
（ｉｉ）ＢＭＰとＨｓｐ７０との間の相互作用を可能にするステップと、
（ｉｉｉ）ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性を調節するステップと、を含む、方法を提供することである。
【００２７】
別の態様では、本発明は、薬剤として使用するためのＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体に関する。
【００２８】
一態様では、本発明は、酵素の酵素活性を調節するための方法であって、前記酵素がＢＭＰと相互作用し、前記方法が、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を、ＢＭＰとＨｓｐ７０またはその前記機能的断片もしくは機能的変異体との間の相互作用を可能にするのに適した形態で投与し、これによりＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性を調節するステップを含む、方法に関する。
【００２９】
好ましくは、Ｈｓｐ７０またはその前記機能的断片もしくは機能的変異体は、ＢＭＰと共有結合または非共有結合複合体を形成する。
【００３０】
好ましくは、ＢＭＰは、サポシンと相互作用する。
【００３１】
好ましくは、前記サポシンは、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、およびサポシンＤからなる群から選択される。
【００３２】
好ましくは、前記酵素は、スフィンゴミエリナーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、シアリダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシルセラミダーゼ、グルコシルセラミダーゼ、および酸性セラミダーゼからなる群から選択される。
【００３３】
好ましくは、酵素活性の前記調節は、前記酵素の酵素活性のアップレギュレーションである。
【００３４】
別の態様では、本発明は、薬剤として使用するためのＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体に関する。好ましくは、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、ニーマンピック病、ゴーシェ病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、およびシアリドーシスなどのリソソーム蓄積障害の治療、軽減、または予防に使用することができる。
【００３５】
別の態様では、本発明は、化合物の取り込みを増加させるための方法であって、前記化合物をＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体と共に投与するステップを含む、方法に関する。一実施形態では、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、前記化合物に共有結合している。別の実施形態では、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体が、前記化合物に非共有結合している。
【００３６】
本発明の一実施形態は、ニーマンピック病、ゴーシェ病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、およびシアリドーシスなどのリソソーム蓄積障害に関連した酵素の酵素活性のアップレギュレーションのための方法に関する。好ましくは、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病である。
【００３７】
リソソーム蓄積障害は、不十分な酵素活性によって引き起こされるため、この障害を軽減または治癒するために酵素活性を上昇させることが本発明の目的である。
【００３８】
Ｈｓｐ７０は、ＢＭＰと相互作用することが示された。ＢＭＰは、様々な他のタンパク質の補助因子として機能するため、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用は、これらの様々な他のタンパク質の機能を調節することができる。例えば、ＢＭＰは、ａＳＭａｓｅの補助因子として機能する。したがって、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用は、ａＳＭａｓｅの活性を上昇させることができる。ニーマンピック病は、ａＳＭａｓｅ活性の低下に関係しているため、Ｈｓｐ７０は、ａＳＭａｓｅの活性を上昇させることによってニーマンピック病を軽減または治癒することができる。同様に、ＢＭＰは、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、およびサポシンＤの補助因子として機能する。これらのサポシンタンパク質は、他のリソソーム蓄積障害に関係しているため、Ｈｓｐ７０は、サポシンまたは前記サポシンに関係する酵素の活性を上昇させることによって他のリソソーム蓄積障害を軽減または治癒することができる。
【００３９】
本発明の一実施形態では、Ｈｓｐ７０は、リソソーム蓄積障害の治療において酵素補充療法と併用して投与される。この方式では、Ｈｓｐ７０の酵素活性効果によって、必要な酵素量を、有意に削減することができる。
【００４０】
別の実施形態では、Ｈｓｐ７０が、酵素補充療法において酵素の取り込みを促進するために使用されるため、関連する細胞によって取り込まれる酵素量を増加させた。
【００４１】
定義および省略形
ａＳＭａｓｅ／ＡＳＭ  酸性スフィンゴミエリナーゼ
ＡＤＤ７０：Ｈｓｐ７０に対するＡＩＦ誘導デコイ
ＡＩＦ：アポトーシス誘導因子
ＡＯ：アクリジンオレンジ
Ａｐａｆ−１：アポトーシスプロテアーゼ活性化因子１
Ｂａｇ−１：Ｂｃｌ−２関連アタノジーン−１（ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ−１）
Ｂｃｌ−２：Ｂ細胞リンパ腫／白血病２
Ｂｉｄ：ＢＨ３相互作用ドメイン死作動薬
ＢＭＰ：ビス（モノアシルグリセロ）リン酸
ＣＡＲＤ：カスパーゼリクルートドメイン
カスパーゼ：システインアスパラギン酸特異的プロテアーゼ
ＣＨＩＰ：Ｈｓｐ７０結合ドメインタンパク質のカルボキシ末端
ＣｙｔＣ：シトクロムＣ
ＤＤ：死ドメイン
ＤＥＤ：死エフェクタードメイン
ｄｓＲＮＡ：二本鎖ＲＮＡ
ｅＨｓｐ７０：細胞外Ｈｓｐ７０
ＥＲ：小胞体
ＥＲＴ  酵素補充療法
ＦＡＤＤ：Ｆａｓ関連死ドメイン含有タンパク質
ＨＩＰ：Ｈｓｐ７０相互作用タンパク質
ＨＲＰ：西洋わさびペルオキシダーゼ
ＨＳ：熱ショック／ストレス
ＨＳＥ：熱ショック要素
ＨＳＦ：熱ショック因子
Ｈｓｐ：熱ショックタンパク質
ＨｓｐＢＰ１：熱ショックタンパク質結合タンパク質１
ＩＡＰ：アポトーシスタンパク質の阻害剤
ｉＭＥＦ：不死化マウス胎児線維芽細胞
ＪＮＫ：ｃ−ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ
ＬＡＭＰ−１／−２：リソソーム結合膜タンパク質−１／−２
ＬＢＰＡ：リゾビスホスファチジン酸
ＬＥＤＧＦ：水晶体上皮由来成長因子
ＬＭＰ：リソソーム膜透過化
ＭＩＣ−１：マクロファージ阻害サイトカイン１
ＭＯＭＰ：ミトコンドリア外膜透過化
ＭＰＲ  マンノース６−リン酸受容体
ＭＴＴ：３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブロミド
ＮＰＤ  ニーマンピック病
ＮＰＤＡ  ニーマンピック病Ａ型
ＮＰＤＢ  ニーマンピック病Ｂ型
ＮＰＤＣ  ニーマンピック病Ｃ型
ＮＰＤＤ  ニーマンピック病Ｄ型
ＰＣＤ：プログラム細胞死
ＰＫＣ：プロテインキナーゼＣ
ＰＯＰＣ：パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン
ＰＯＰＳ：パルミトイル−オレオイル−ホスファチジルセリン
ＲＮＡｉ：ＲＮＡ干渉
ＲＯＳ：活性酸素種
ＳＤ：標準偏差
ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ
Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ：カスパーゼの二次ミトコンドリア由来活性化因子
ｔＢｉｄ：切断型Ｂｉｄ
ＴＮＦ：腫瘍壊死因子
ＴＮＦＲ：ＴＮＦ受容体
ＴＲＡＤＤ：ＴＮＦＲ関連死ドメインタンパク質
ＴＲＡＦ：ＴＮＦＲ関連因子
【００４２】
リソソーム蓄積障害（ＬＳＤ）：用語「リソソーム蓄積障害」と「リソソーム蓄積症」は同義語として使用される。
【００４３】
Ｈｓｐ７０の機能的断片：用語「Ｈｓｐ７０の機能的断片」は、所望の機能を有するＨｓｐ７０の任意の断片を意味すると解釈されたい。酵素活性の調節に関しては、機能的断片は、酵素活性を調節できる断片である。物質の取り込みの増加に関しては、Ｈｓｐ７０の機能的断片は、前記物質の取り込みを増加させることができる断片である。機能的断片の正確な定量的効果は、完全長分子の効果とは異なるであろうことを理解されたい。場合によっては、機能的断片は、実際に、完全長分子よりも効果的であり得る。さらに、完全長分子の代わりとしての断片の使用は、断片の大きさが小さいため有利であろう。
【００４４】
Ｈｓｐ７０の機能的変異体：用語「Ｈｓｐ７０の機能的変異体」は、所望の機能を有するＨｓｐ７０の任意の変異体を意味すると解釈されたい。酵素活性の調節に関しては、機能的変異体は、酵素活性を調節できる変異体である。物質の取り込みの増加に関しては、Ｈｓｐ７０の機能的変異体は、前記物質の取り込みを増加させることができる断片である。機能的変異体の正確な定量的効果は、完全長分子の効果とは異なるであろうことを理解されたい。場合によっては、機能的変異体は、実際に、完全長分子よりも効果的であり得る。
【００４５】
「生理活性剤」（すなわち、生物学的に活性な物質／作用物質）は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証できる、有利な場合が多いある種の薬理学的効果を提供する物質または混合物の任意の作用物質、薬物、化合物、組成物である。本明細書で使用されるこの用語には、個体に局所効果または全身効果を生じさせる任意の生理学的または薬理学的に活性な物質がさらに含まれる。生理活性剤のさらなる例には、限定されるものではないが、オリゴ糖を含むまたはこれからなる作用物質、多糖を含むまたはこれからなる作用物質、任意選択でグリコシル化されたペプチドを含むまたはこれからなる作用物質、任意選択でグリコシル化されたポリペプチドを含むまたはこれからなる作用物質、核酸を含むまたはこれからなる作用物質、オリゴヌクレオチドを含むまたはこれからなる作用物質、ポリヌクレオチドを含むまたはこれからなる作用物質、脂質を含むまたはこれからなる作用物質、脂肪酸を含むまたはこれからなる作用物質、脂肪酸エステルを含むまたはこれからなる作用物質、および二次代謝産物を含むまたはこれからなる作用物質が含まれる。生理活性剤は、ヒトまたは任意の他の動物などの個体の治療において予防的または治療的に用いることができる。本明細書で使用される生理活性剤は、Ｈｓｐ７０の細胞内濃度および／または活性を上昇させることができる物質である。
【００４６】
本明細書で使用される用語「薬物」または「薬剤」には、ヒトまたは動物の体で局所的または全身に作用する生物学的、生理学的、または薬理学的に活性な物質が含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される用語「治療すること」、「治療」、および「療法」は等しく、治癒療法、予防または防止療法、および改善または姑息療法を指す。この用語には、有利または所望の生理学的な結果を得る方法が含まれ、この方法は臨床的に確立することができる。本発明の趣旨において、有利または所望の臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能または検出不能にかかわらず、症状の軽減、疾患の範囲の減少、安定した（すなわち、悪化しない）状態、状態／症状の進行または悪化の遅延または遅れ、状態または症状の改善または緩和、および寛解（部分的でも完全でもよい）が含まれる。本明細書で使用される用語「緩和」およびその変形語は、本発明の組成物を投与しない場合と比較して、生理学的状態または症状の範囲および／または不所望の発現が減少すること、および／または進行の時間経過が遅くなるまたは長くなることを意味する。
【００４８】
「治療効果」または「療法効果」は、用語「治療すること」および「治療」の定義を構成する基準によって測定されたときに治療されている状態に変化がある場合に現われる。少なくとも５％の改善、好ましくは１０％の改善、より好ましくは少なくとも２５％の改善、さらに好ましくは少なくとも５０％、例えば、少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも１００％の改善がある場合に治療されている状態に「変化」がある。この変化は、個体の治療された状態の重症度の改善に基づく、または生理活性剤もしくは本発明の医薬組成物と組み合わせた生理活性剤で治療されたもしくは治療されていない個体の集団における改善された状態の頻度の差に基づくことができる。
【００４９】
「生理活性剤」の「薬理学的有効量」、「薬学的有効量」、または「生理学的有効量」は、治療される個体の血中または作用部位（例えば、肺、胃系、結腸直腸系、前立腺など）に所望のレベルの活性剤を供給して、本明細書に記載されている医薬組成物が投与されたときに予想された生理学的応答を付与するために必要である、このような組成物中に存在する活性剤の量である。正確な量は、多数の因子、例えば、活性剤、組成物の活性、利用する送達装置、組成物の物理特性、意図する患者の使用（すなわち、１日当たりの投与回数）、および患者の考慮すべき事項などに依存し、本明細書で提供される情報に基づいて当業者が容易に決定することができる。生理活性剤の「有効量」は、１回の投与で投与する、または好ましくは２４時間以内に、合計すると有効量になる量を複数回に分けて投与することができる。有効量は、適切な量および投与のタイミングを決定するための標準的な臨床診断法で決定することができる。「有効量」は、治療を行う医療関係者および／または個人の側の経験的および／または個体に合わせた（ケースバイケース）決定の結果とすることができることを理解されたい。
【００５０】
本明細書で使用される用語、有利な効果を「促進する」および「向上させる」ならびにそれらの変形は、プラセボに対する生理活性剤の治療効果、または本発明の生理活性剤を用いずに医薬組成物を投与した時に通常得られるよりも高い最新医療の治療効果の上昇を指す。「治療効果の上昇」は、生理活性剤（複数可）の投与の結果として得られる治療効果の強さおよび／または範囲における促進および／または増加がある場合に現われる。「治療効果の上昇」には、治療効果の期間の延長も含まれる。「治療効果の上昇」は、生理活性剤の非存在下での多量の医薬組成物の投与と比較して、本発明によって提供される生理活性剤（複数可）と同時投与される場合、同じ恩恵および／または効果を得るためにより少ない量の医薬組成物で済む場合にも現われ得る。効果の促進は、必ずしもではないが好ましくは、医薬組成物単独では治療効果がないまたは低い急性の症状の治療となる。促進は、医薬組成物単独の投与と比較して、本発明の生理活性剤が、医薬組成物と同時投与された場合に、治療効果が少なくとも５％、例えば、治療効果が少なくとも１０％上昇すると達成される。好ましくは、この上昇は、少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも１００％である。本明細書で使用される、生理活性剤（複数可）または生理活性剤と最新の薬剤を「同時に投与する」またはそれらの「同時投与」は、一定の期間以内での、本発明の１つ以上の生理活性剤の投与、または本発明の１つ以上の生理活性剤と最新の医薬組成物の投与を指す。この期間は、好ましくは７２時間未満、例えば、４８時間未満、例えば、２４時間未満、例えば、１２時間未満、例えば、６時間未満、例えば、３時間未満である。しかし、これらの用語は、生理活性剤と治療組成物を一緒に投与できることも意味する。
【００５１】
用語「個体」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバー、好ましくはヒトを含む霊長類を指す。好適な実施形態では、本明細書で使用される個体は、どの年齢でもよい男性または女性のヒトである。
【００５２】
「それを必要とする個体」は、本発明の恩恵を受け得る個体を指す。一実施形態では、前記それを必要とする個体は、病気の個体であり、前記病気はリソソーム蓄積症である。
【００５３】
用語「天然ヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、天然に見られる４つのデオキシリボヌクレオチド、ｄＡ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＣ（ＤＮＡの構成成分）ならびに４つのリボヌクレオチド、Ａ、Ｇ、Ｕ、およびＣ（ＲＮＡの構成成分）のいずれかを指す。各天然ヌクレオチドは、糖部分（リボースまたはデオキシリボース）、リン酸部分、および天然／基準塩基部分を含むまたは実質的にこれらからなる。天然ヌクレオチドは、アデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）と対を形成し；そしてグアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と対を形成し、対応する塩基対が２本の相補的な逆平行鎖の一部である公知の塩基対の規則（ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ）に従ってヌクレオチドに相補的に結合する。塩基対形成は、所定のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドとの間の特異的なハイブリダイゼーションをもたらす。塩基対形成は、基礎であり、この基礎により、鋳型オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドの合成を酵素が触媒することができる。この合成では、形成ブロック（通常は、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧのリボまたはデオキシリボ誘導体の三リン酸）が、鋳型オリゴヌクレオチドによって誘導されて、正しい相補的な配列を持つ相補的なオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド配列のその相補的な配列による認識は、塩基対を形成している、対応および相互作用する塩基によって媒介される。本来は、塩基対形成に導く特異的な相互作用は、塩基のサイズならびに塩基の水素結合供与体および受容体のパターンによって制御されている。大きいプリン塩基（ＡまたはＧ）は、小さいピリミジン塩基（Ｔ、Ｕ、またはＣ）と対を形成する。加えて、塩基間の塩基対の認識は、塩基間で形成される水素結合による影響を受ける。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対のジオメトリでは、６員環（天然オリゴヌクレオチドのピリミジン）は、中間の水素結合が２つの環の原子を結合し、両側の水素結合が各環に付加された官能基を結合し、供与基が受容基と対を形成した、融合した６員環と５員環（天然オリゴヌクレオチドのプリン）からなる環系に並置されている。
【００５４】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって作製された断片、ならびにライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用、およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって作製された断片を指す。核酸分子は、自然発生のヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡなど）、自然発生のヌクレオチドの類似体（例えば、自然発生のヌクレオチドのα−鏡像異性型）、または両方の組合せである単量体から構成することができる。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジンまたはプリン塩基部分における変更を有することができる。糖修飾には、例えば、１つまたは複数のヒドロキシル基のハロゲン、アルキル基、アミン、およびアジド基での置換が含まれ、または、糖は、エーテルもしくはエステルとして官能性を持たせることができる。さらに、糖部分全体を、アザ−糖および炭素環糖類似体などの立体的および電子的に類似の構造で置換することができる。塩基部分の修飾の例には、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または他の公知の複素環置換が含まれる。核酸単量体は、ホスホジエステル結合またはこのような結合の類似体によって連結することができる。ホスホジエステル結合の類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌｉｄａｔｅ）、ホスホロアミダートなどが含まれる。用語「核酸分子」には、例えば、いわゆる「ペプチド核酸」も含まれ、ペプチド核酸には、ポリアミドバックボーンに取り付けられた自然発生または修飾された核酸塩基が含まれる。核酸は、１本鎖または２本鎖であり得る。
【００５５】
用語「核酸分子の相補体」は、基準ヌクレオチド配列と比較して逆方向である相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチド分子を指す。例えば、配列５’ＡＴＧＣＡＣＧＧＧ３’は、５’ＣＣＣＧＴＧＣＡＴ３’に相補的である。
【００５６】
「単離核酸分子」は、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない核酸分子である。例えば、細胞のゲノムＤＮＡから分離された成長因子をコードするＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。単離核酸分子の別の例は、生物のゲノムに組み込まれていない化学的に合成された核酸分子である。特定の種から単離された核酸分子は、その種由来の染色体の完全ＤＮＡ分子よりも小さい。
【００５７】
「核酸分子構築物」は、天然に存在しない構成に組み合わされて並置された核酸のセグメントを含むように人間の介入によって改変された１本鎖または２本鎖の核酸分子である。
【００５８】
「線状ＤＮＡ」は、遊離５’末端および遊離３’末端を有する非環状ＤＮＡ分子を指す。線状ＤＮＡは、酵素消化または物理的破壊によってプラスミドなどの閉じた環状のＤＮＡ分子から調製することができる。
【００５９】
「相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）」は、逆転写酵素によって鋳型ｍＲＮＡから形成された１本鎖ＤＮＡ分子である。典型的には、ｍＲＮＡの一部に相補的なプライマーを、逆転写の開始に利用する。当業者はまた、このような１本鎖ＤＮＡ分子とその相補的なＤＮＡ鎖からなる２本鎖ＤＮＡ分子を指す際にも用語「ｃＤＮＡ」を使用する。用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ分子のクローンも指す。
【００６０】
「異種ＤＮＡ」は、所与の宿主細胞内で自然には存在しないＤＮＡ分子またはＤＮＡ分子の集団を指す。特定の宿主細胞に対して異種のＤＮＡ分子は、その宿主ＤＮＡが非宿主ＤＮＡ（すなわち、外来性ＤＮＡ）と組み合わせられれば、宿主細胞種（すなわち、内在性ＤＮＡ）由来のＤＮＡを含み得る。例えば、転写プロモーターを含む宿主ＤＮＡセグメントに機能的に連結されたポリペプチドをコードする非宿主ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ分子は、異種ＤＮＡ分子と見なされる。逆に、異種ＤＮＡ分子は、外来性プロモーターに機能的に連結された内在性遺伝子を含み得る。別の例示として、野生型細胞由来の遺伝子を含むＤＮＡ分子は、そのＤＮＡ分子が、野生型遺伝子が欠失した突然変異細胞内に導入された場合、異種ＤＮＡであると見なされる。
【００６１】
「ポリペプチド」は、天然または合成的に作製されたにかかわらず、好ましくはペプチド結合のみによって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。非宿主ＤＮＡ分子の発現によって産生されるポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドを含み、前記タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、翻訳後修飾されてもされなくてもよい。翻訳後修飾は、例えば、リン酸化、メチル化、およびグリコシル化であり得る。
【００６２】
用語「発現」は、遺伝子または遺伝子産物の生合成を指す。
【００６３】
「ハイブリダイズする」は、異なる源に由来する核酸鎖をアニーリングすること；すなわち元は対でなかったＤＮＡの２本の鎖の相補的な領域間で塩基対を形成することを意味する。用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）、１．１０１−１．１０４に従って定義されている。好ましくは、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃で、１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１時間洗浄した後、特に、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６２℃、最も好ましくは６８℃で、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで１時間洗浄した後に、正のハイブリダイゼーションシグナルが観察されることを意味する。
【００６４】
「完全な相同性」の伸長は、相互作用するヌクレオチドの配列に沿って対を形成しているヌクレオチドの一致として定義され；自然発生のＲＮＡでは、ＡとＵおよびＧとＣが対を形成する。
【００６５】
「プロモーター」は、構造遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位に近接した、遺伝子の５’非コード領域に位置する。転写の開始で機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴付けられる。プロモーターが誘導プロモーターの場合は、転写速度が、誘導剤に応答して上昇する。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターの場合は、転写速度は、誘導剤によって調節されない。抑制プロモーターも知られている。
【００６６】
「調節要素」は、プロモーターの活性を調節するヌクレオチド配列である。例えば、調節要素は、特定の細胞、組織、または細胞小器官で排他的または優先的に転写を可能にする細胞因子と結合するヌクレオチド配列を含み得る。これらのタイプの調節要素は、通常は、「細胞特異的」、「組織特異的」、または「細胞小器官特異的」に発現される遺伝子に結合する。
【００６７】
「エンハンサー」は、転写開始部位に対するエンハンサーの距離または方向にかかわらず、転写の効率を上げることができる一種の調節要素である。
【００６８】
「クローニングベクター」は、宿主細胞で自律的に複製する能力を有するプラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどの核酸分子である。クローニングベクターは、典型的には、ベクターの必須の生物学的機能を失わずに確実に核酸分子の挿入を可能にする１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、およびクローニングベクターで形質転換される細胞の識別および選択に使用するのに適したマーカー遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む。マーカー遺伝子は、典型的には、テトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。
【００６９】
「発現ベクター」は、宿主細胞で発現される遺伝子をコードする核酸分子である。典型的には、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写終結因子を含む。遺伝子発現は、通常はプロモーターの制御下に置かれ、このような遺伝子は、プロモーターに「機能的に連結」されていると言われる。同様に、調節要素およびコアプロモーターは、調節要素がコアプロモーターの活性を調節する場合は機能的に連結されている。「転写ベクター」と呼ばれるより単純なベクターは、転写され得るだけで翻訳され得ない：発現ベクターとは異なり、標的細胞で複製され得るが発現され得ない。転写ベクターは、それらの挿入断片を増幅するために使用される。
【００７０】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターなどの異種核酸分子を含む細胞である。
【００７１】
トランスフェクションは、真核細胞内への外来物質の導入を表す。非ウイルス法に用いる用語「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞に関する場合に最も頻繁に使用されるが、用語「形質転換」は、細菌ならびに菌類、藻類、および植物などの非動物真核細胞における非ウイルスＤＮＡ移入を表す際に好まれる。両方の化学的および物理的方法は、細胞を形質移入するために利用することができる。
【００７２】
「ポリペプチド」は、天然または合成的に作製されるかにかかわらず、好ましくはペプチド結合のみによって結合されたアミノ酸残基のポリマーである。非宿主ＤＮＡ分子の発現によって産生されるポリペプチドは、「異種」ペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、タンパク質、ペプチド、およびポリペプチドを含み、前記タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、翻訳後修飾されてもされなくてもよい。翻訳後修飾は、例えば、リン酸化、メチル化、およびグルコシル化であり得る。
【００７３】
「アミノ酸残基」は、ペプチド結合またはペプチド結合とは異なる結合によって連結された天然または非天然アミノ酸残基とすることができる。アミノ酸残基は、Ｄ立体配置またはＬ立体配置とすることができる。アミノ酸残基は、炭素原子または炭素原子鎖を含む中心部分によって分離されたアミノ末端部分（ＮＨ２）およびカルボキシ末端部分（ＣＯＯＨ）を含み、これらの少なくとも一方は、少なくとも１つの側鎖または官能基を含む。ＮＨ２は、アミノ酸またはペプチドのアミノ末端に存在するアミノ基を指し、ＣＯＯＨは、アミノ酸またはペプチドのカルボキシ末端に存在するカルボキシ基を指す。一般用語、アミノ酸は、天然および非天然のアミノ酸の両方を含む。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３：３５５２−５９（１９６９）に列記され、そして３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．、節１．８２２（ｂ）（２）に採用されている標準的な命名法の天然アミノ酸は、以下に示す表１に列記されているアミノ酸の群に属する。非天然アミノ酸は、表１に列記されていないアミノ酸である。非天然アミノ酸の例は、例えば、参照によりその全容が本明細書に組み入れられる３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．、節１．８２２（ｂ）（４）に列記されているアミノ酸である。また、非天然アミノ酸残基には、限定されるものではないが、修飾されたアミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基、およびＤ−アミノ酸残基の立体異性体が含まれる。
【００７４】
【表１】
0005616336.tif 000002
【００７５】
「等価なアミノ酸残基」は、ポリペプチドの構造および／または機能性を実質的に変更することなく、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基に取って代わることができる別のアミノ酸残基を指す。したがって、等価なアミノ酸は、側鎖の嵩、側鎖の極性（極性または非極性）、疎水性（疎水性または親水性）、ｐＨ（酸性、中性、塩基性）、および炭素分子の側鎖機構（芳香族／脂肪族）などの類似の特性を有する。したがって、「等価なアミノ酸残基」は、「保存的なアミノ酸置換」と見なすことができる。
【００７６】
等価なアミノ酸の分類は、一実施形態では、次のクラス：（１）ＨＲＫ、（２）ＤＥＮＱ、（３）Ｃ、（４）ＳＴＰＡＧ、（５）ＭＩＬＶ、および（６）ＦＹＷとなる。
【００７７】
本明細書で使用される用語「等価なアミノ酸置換」の意味の範囲内で、１つのアミノ酸を、一実施形態では、以下に示すアミノ酸群の中の別のアミノ酸で置換することができる。
（ｉ）極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、およびＣｙｓ）
（ｉｉ）非極性側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、およびＭｅｔ）
（ｉｉｉ）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ）
（ｉｖ）環側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ）
（ｖ）芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）
（ｖｉ）酸性側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
（ｖｉｉ）塩基性側鎖を有するアミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）
（ｖｉｉｉ）アミド側鎖を有するアミノ酸（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）
（ｉｘ）ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
（ｘ）硫黄（ｓｕｌｐｈｏｒ）含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ）
（ｘｉ）中性の弱い疎水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
（ｘｉｉ）親水性酸性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）
（ｘｉｉｉ）疎水性アミノ酸（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）
【００７８】
本発明はまた、Ｈｓｐ７０の変異体またはその断片にも関し、置換が、配列相同性を使用して置換がタンパク質機能に影響を与えるか否かを予測するコンピューター分析によって設計された（例えば、Ｐａｕｌｉｎｅ  Ｃ．ＮｇおよびＳｔｅｖｅｎ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１１巻、第５版、８６３−８７４、Ｍａｙ  ２００１）。
【００７９】
標準分析法の不正確さにより、ポリマーの分子量および長さは、概略値であることを理解されたい。このような値が、「約」Ｘまたは「概ね」Ｘとして表される場合、Ｘの表示値は、±２０％、例えば、±１０％、例えば、±５％の精度であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ａＳＭａｓｅのＢＭＰに対する結合およびセラミドのレベルに対するＨｓｐ７０の影響を示す図である。（Ａ）予め結合されたＨｓｐ７０の機能に応じたｐＨ４．５での０．２μＭ  ａＳＭａｓｅのＢＭＰ含有リポソームに対する結合（実施例１に類似の実験、さらなる詳細については「材料および方法」の項目を参照）。Ｈｓｐ７０を１０分間解離させ、これによりａＳＭａｓｅの添加の前に解離の低い漸近線に達している。（Ｂ）野生型（ＷＴ）ｉＭＥＦおよびＨｓｐ７０−トランスジェニック（Ｈｓｐ７０−ＴＧ）ｉＭＥＦの共焦点顕微鏡検査およびセラミドレベルの定量。セラミドに対するマウスモノクローナル抗体（クローン１５ｂ４）を用いて免疫検出を行った。６つの所定の領域のレーザー走査顕微鏡写真に基づいて定量を行い、次いでＬＳＭ  Ｄｕｏソフトウエアで定量を行った。
【図２】ｉＭＥＦ−ＷＴ（不死化マウス胎児線維芽細胞、野生型）における酸性スフィンゴミエリナーゼ活性に対するｒＨｓｐ７０の効果を示す図である。ｒＨｓｐ７０を、３ｎＭ、３０ｎＭ、および３００ｎＭで細胞に投与し、ａＳＭａｓｅの活性を測定した（Ａ５００が、濁度を増加させる産生されたセラミドの指標である）。コントロール細胞をＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で処理した。
【図３】様々な線維芽細胞における酸性ＳＭａｓｅ活性を示す図である。ＮＰＤＡ：ニーマンピック病Ａ型。
【図４】主なスフィンゴ脂質加水分解の模式図である。短い親水性頭基を有するスフィンゴ脂質のエキソ加水分解（ｅｘｏｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）には、非酵素補助因子、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（ＳＡＰまたはサポシン）が必要である。それぞれの酵素の先天性欠損および対応する活性化タンパク質の先天性欠損の両方が、リソソーム脂質の蓄積をもたらし、結果として様々なスフィンゴリピドーシスが発現する。Ｆｅｒｌｉｎｔｚら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、（１０２）３５−４３、１９９９を参照。
【図５】リソソームＨｓｐ７０がリソソーム膜を安定させることを示す図である。（ａ）３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８（緑色）と共に２４時間インキュベートし、固定し、そしてリソソーム内在性膜タンパク質１（ＬＭＰ−１；赤色）で染色したＵ−２−ＯＳ細胞の代表的な共焦点画像。他の細胞小器官マーカーとの共局在化については図９を参照。（ｂ）Ｕ−２−ＯＳ細胞を３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８と共に２４時間インキュベートし、その後冷凍／解凍サイクルを繰り返し、軽い膜画分（ＬＭＦ）を遠心分離して得た上清（ｓｕｐ．）および膜（ｍｅｍｂ．）におけるｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８の定量を行った。リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ−２）およびカテプシンＢ（Ｃａｔ  Ｂ）の免疫ブロット分析が、分画法の有効性を実証する。（ｃ）光酸化（アクリジンオレンジおよび青色光）に曝露されたＵ−２−ＯＳ細胞の代表的な静止画。リソソーム完全性の喪失は、赤色染色の消失および緑色染色の増加によって可視化された。（ｄおよびｅ）Ｕ−２−ＯＳ細胞を示された組換えタンパク質（３００ｎＭ）と共に２４時間インキュベートし、光酸化時のリソソーム完全性について分析した。示されている場合は、組換えタンパク質の添加の前に、細胞を示されたｓｉＲＮＡで４８時間処理した（ｅ）。値は、３つ（ｄ）または５つ（ｅ）の独立した実験についての平均±ＳＤを表す。未処理のまま、またはコントロールもしくはＨｓｐ７０  ｓｉＲＮＡで処理したＵ−２−ＯＳ細胞由来の示されたタンパク質の代表的な免疫ブロットが、右側に示されている。スケールバー：２０μｍ（ａおよびｃ）。
【図６】Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間のｐＨ依存性相互作用がリソソーム膜を安定させることを示す図である。（ａ）ｐＨ７．４（左）およびｐＨ６．０（右）での、リポソームを含む示された脂質（ｘ＝０．２）へのｒＨｓｐ７０（０．１２ナノモルのアリコート中）の添加時のリポソーム９０度光散乱における相対変化。（ｂ）２４時間のビヒクル（−）または３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０の添加の前に、Ｕ−２−ＯＳ細胞を、未処理（−）のまま放置するか、または５０μｇ／ｍｌ抗ＢＭＰもしくはコントロールＩｇＧと共に７時間インキュベートして、光酸化時のリソソーム完全性について分析した。（ｃ）２４時間のビヒクル（−）または２５μＭシスプラチンの添加の前に、Ｕ−２−ＯＳ細胞を、未処理のまま放置するか、または５０μｇ／ｍｌ抗ＢＭＰもしくはコントロールＩｇＧと共に７時間インキュベートして、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色後のアポトーシス細胞の形態について分析した。（ｄ）相対ピーク蛍光強度の変化によって測定した、ｐＨ６．０でのｒＨｓｐ７０およびその変異体とＰＯＰＣ／ＢＭＰ（ｘＢＭＰ＝０．２）リポソームの相互作用。タンパク質濃度は、０．３６μＭ（ｒＨｓｐ７０）、０．５μＭ（ΔＡＴＰ）、および０．３５μＭ（ΔＰＢＤ）（左）または０．４３μＭ（右）であり、リポソームを１０μＭアリコートで添加した。（ｅ）ｐＨ４．５で、野生型ｒＨｓｐ７０（ＷＴ）、欠失（ΔＡＴＰおよびΔＰＢＤ）ｒＨｓｐ７０、および点（Ｗ９０ＦおよびＷ５８０Ｆ）突然変異ｒＨｓｐ７０と、固定されたＬＵＶ（平均直径：１００ｎｍ；全脂質濃度：０．１ｍＭ；組成：スフィンゴミエリン（ｘ＝０．１）、ホスファチジルコリン（ｘ＝０．５）、コレステロール（ｘ＝０．２）、およびＢＭＰ（ｘ＝０．２））と、の間の相互作用のＢＩＡｃｏｒｅ分析。平衡に達するまでリポソームを注入し（１００秒）、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５）に溶解した示された濃度（左）または３００ｎＭ（右）の組換えタンパク質を２０μｌ／分の流速で２００秒間注入し、次いで１０分間の解離相を行った。リポソーム平衡の後に測定した応答シグナルとタンパク質−リポソーム平衡の後に測定した応答シグナルとの間の差としてΔＲＵを定義した。（ｆおよびｇ）Ｕ−２−ＯＳ細胞を、未処理のまま（コントロール）放置するか、もしくは示された組換えＨｓｐ７０タンパク質（３００ｎＭ）と共に２４時間インキュベートして、光酸化時のリソソーム完全性について分析した（ｆ）、またはビヒクル（白いバー）もしくは２５μＭシスプラチン（黒いバー）で２４時間処理し、アポトーシス様形態について分析した（ｇ）。（ｈ）Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインのリボンおよび分子表面モデル。ＡＴＰ（ファンデルワールス−表面表現）を、ＡＴＰ−結合ポケット内に結合して可視化することができる。緑色および紫色スフェアはそれぞれ、配位カルシウムイオンおよびナトリウムイオンのファンデルワールス−表面を示す。底部のドメインの正に帯電した部分およびＷ９０の位置に留意されたい。これらの値は、最少で５つの独立した実験（ｂ、ｃ、ｆ、およびｇ）の平均±ＳＤを表す。
【図７】Ｈｓｐ７０がＡＳＭ活性を刺激し、これによりリソソームが安定することを示す図である。（ａ）予め結合されたｒＨｓｐ７０に応じたｐＨ４．５での２００ｎＭ  ｒＡＳＭのＢＭＰ含有リポソームに対する結合のＢｉａｃｏｒｅ測定。この実験は、図６ｅの説明文に記載されているように行い、１０分間のｒＨｓｐ７０解離相の後にｒＡＳＭを１８０秒間添加し、次いでさらに１０分間の解離相を行った。（ｂ）野生型（ＷＴ）およびＨｓｐ７０トランスジェニック（Ｈｓｐ７０）ＭＥＦ（左のグラフ）の溶解物におけるＡＳＭ活性、ならびに示されているように３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０と共に２４時間または４８時間インキュベートしたＷＴ  ＭＥＦにおけるＡＳＭ活性。（ｃおよびｄ）示された濃度のデシプラミンで３時間処理したＷＴおよびＨｓｐ７０  ｉＭＥＦにおける生存率（ＭＴＴの減少；ｃ）および細胞質カテプシン活性（ｚＦＲａｓｅ；ｄ）。（ｅ）リソソーム完全性の喪失の１つの生細胞のイメージング（ＷＴおよびＨｓｐ７０  ＭＥＦならびに１２．５μＭおよび２５μＭデシプラミン（それぞれ左および右のグラフ）と共に３時間インキュベートしたＨｓｐ７０  ＭＥＦにおける光酸化）。赤色蛍光の消失（左のグラフ）および緑色蛍光の増加（右のグラフ）を連続的に測定し、リソソーム完全性の喪失に関する全速度曲線（ｆｕｌｌ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）を得た。２５〜６０の細胞を、所定の領域からの実験によって調べた）、Ｈｓｐ７０対ＷＴおよびＨｓｏ７０＋デシプラミン（ｄｅｓｐｒａｍｉｎｅ）対Ｈｓｐ７０に対してｐ＜０．００１。すべての値は、最少で３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図８】ＮＰＤＡ線維芽細胞において、ｒＨｓｐ７０がＡＳＭ活性を刺激し、リソソームを安定させ、そしてリソソームの体積を減少させることを示す図である。（ａ）図３ｅと同様に分析したＮＰＤＡ患者由来の一次線維芽細胞のリソソーム安定性の１つの生細胞のイメージング、ｐ＜０．００１。（ｂ）未処理のまま放置、または３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０で４８時間処理（左のグラフ）、または１５０ｎＭ  ｒＡＳＭ単独もしくは３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０と組み合わせて２４時間処理した（右のグラフ）ＮＰＤＡ線維芽細胞のＡＳＭ活性。ｐ値は、得られた酵素速度（ＤＡ５００／ｍｇタンパク質／分）から計算した。右側の写真は、リソトラッカー  レッド（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）を用いた共染色によって可視化されたリソソーム区画内へのｒＡＳＭ（緑色）のエンドサイトーシスによる取り込みおよびリソソーム区画へのその局在化を実証している。（ｃ）未処理のまま放置、または３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０、１５０ｎＭ  ａＳＭａｓｅ、もしくはｒＨｓｐ７０とａＳＭａｓｅの組み合わせで２４時間処理したＮＰＤＡ線維芽細胞のリソソーム安定性を図３ｅと同様に分析した。未処理細胞と比較したすべての処理に対してｐ＜０．００１。（ｄ）未処理のまま放置、または３００ｎＭ  ＢＳＡ、３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０、１５０ｎＭ  ｒＡＳＭ（１５０ｎＭ）、もしくはｒＨｓｐ７０とｒＡＳＭの組み合わせで２４時間処理したＮＰＤＡ線維芽細胞における細胞の共焦点切断面のリソソーム領域の定量。右側の写真は、ＮＰＤＡ線維芽細胞のリソソーム区画（赤色）の体積に対するｒＨｓｐ７０（緑色）の効果を実証している。白い矢印は、ｒＨｓｐ７０がエンドサイトーシスされリソソーム区画が消失した細胞を示している。これらの値は、３つの独立した実験についての平均±ＳＤを表す。スケールバー＝２０μＭ。ＵＴ＝未処理。
【図９】エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８とリソソームの共局在化を示す図である。３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０−ＡＦ４８８（緑色）と共に２４時間インキュベートし、固定し、そして次の細胞小器官マーカー（赤色）：リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１；リソソーム）、ＬＡＭＰ−２（リソソーム）、ＬＢＰＡ／ＢＭＰ（６Ｃ４；エンドリソソーム区画）、ｃｕｔ  ｃ（ミトコンドリア）、ＳＥＲＣＡ（ＥＲ）、およびｇｏｌｇｉｎ−９７（Ｇｏｌｇｉ）で染色したＵ−２−ＯＳ細胞の代表的な共焦点画像。スケールバー：２０μｍ（ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、およびＢＭＰ）または１０μｍ（Ｃｙｔ  ｃ、ＳＥＲＣＡ、およびＧｏｌｇｉｎ−９７）。
【図１０】ｒＨｓｐ７０の存在下でのｒＡＳＭ（組換えａＳＭａｓｅ）とＢＭＰの相互作用を示す図である。（ａ）ｐＨ４．５での固定された陰イオン性リポソーム（平均直径が１００ｎｍ、全脂質濃度が０．１ｍＭ、および組成；１０モル％スフィンゴミエリン、５０モル％ホスファチジルコリン、２０モル％コレステロール、および２０モル％ＢＭＰ）とｒＡＳＭの相互作用。リポソームの結合の後に測定した応答シグナルを０と定義する。（ｂ）後のｒＡＳＭの結合に対する予め結合されたｒＨｓｐ７０の効果。示された量のｒＨｓｐ７０量を、（ａ）と同様に、固定された陰イオン性リポソームと共にインキュベートした。ｒＨｓｐ７０の１０分間の解離相の後、２００ｎＭ  ｒＡＳＭを１８０秒間添加し、次いで１０分間の解離を行った。
【図１１】ニーマンピックＡ型（ＮＰＤＡ）患者の線維芽細胞に対する低分子Ｈｓｐ７０誘導物質；ベンジルアルコールの効果を示す図である。（Ａ）用量依存性のベンジルアルコールによるＮＰＤＡ  ＧｏｔｚにおけるＨｓｐ７０の誘導（タンパク質の発現）。（Ｂ）ＮＰＤＡ  Ｇｏｔｚ細胞を４０ｍＭベンジルアルコールで処理した後のＮＰＤＡ  Ｇｏｔｚリソソームの安定性の上昇。（Ｃ）リソソームの断面積によって測定した、４０ｍＭベンジルアルコールで処理した後のＮＰＤＡ  Ｇｏｔｚ細胞の病変の減少（方法は実施例２に詳述）。
【図１２】リソソーム安定性に対するａＳＭａｓｅ欠乏の影響を示す図である。酸性スフィンゴミエリナーゼ（ｓｉ９３８、ｓｉ１２５７、ｓｉ１３４０）およびコントロールｓｉＲＮＡ（ｍｍ）を標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、製造業者のガイドラインに従ってオリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡの濃度：５０ｎＭ。７２時間後、アクリジンオレンジ媒介光酸化の１つの生細胞のイメージングによるリソソーム安定性について分析された細胞およびＲＴ−ＰＣＲ（不図示）によってノックダウンが確認された。緑色蛍光の増加を連続的に測定し、リソソーム完全性の喪失に関する全速度曲線を得た。グラフから分かるように、ａＳＭａｓｅを標的とするｓｉＲＮＡで処理した細胞は、リソソーム安定性の著しい低下を示している。この方法は、実施例２で詳細に説明される。
【図１３】全ＮＰＤＡ／Ｂ細胞系のｒＨｓｐ７０での処理が、リソソームの病変を劇的に逆転する、すなわちリソソームの断面積を減少させることを示す図である。未処理のまま放置、またはコントロールとして３００ｎＭ  ＢＳＡもしくはデキストランで２４時間処理した、または３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０、１５０ｎＭ  ｒｈａＳＭａｓｅ、もしくはこれらの組合せで２４時間処理したニーマンピック病Ａ型およびＢ型の線維芽細胞（ＮＰＤＡ／ＮＰＤＢ）および正常な線維芽細胞（ＢＪ）の細胞の共焦点断面におけるリソソームの面積の定量。３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ（Ｗ９０Ｆ）、すなわちＢＭＰと相互作用しないＨｓｐ７０変異体で２４時間処理したＮＰＤＡ細胞は、コントロール細胞に相当する効果を有する。この方法については実施例２を参照されたい。
【図１４】Ｈｓｐ７０トランスジェニック線維芽細胞およびｒＨｓｐ７０処理ＮＰＤＡ線維芽細胞におけるａＳＭａｓｅの活性の上昇を示す図である。野生型（ＷＴ）またはＨｓｐ７０トランスジェニック（ＴＧ）（ＡおよびＢ）の不死化マウス胎児線維芽細胞（ｉＭＥＦ）および未処理のまま放置またはｒＨｓｐ７０で処理したニーマンピック病Ａ型患者の線維芽細胞（ＮＰＤＡ８３／２４）（Ｃ）における脂質種（示されているスフィンゴミエリンおよびセラミド）の質量分光分析。低レベルのスフィンゴミエリンおよび高レベルのセラミドは、酸性スフィンゴミエリナーゼの活性の増加を示唆する。
【図１５】ファーバー病患者の線維芽細胞における病変の逆転を示す図である。ファーバー病患者由来の細胞の共焦点断面におけるリソソームの面積の定量。ファーバー病患者の線維芽細胞（Ｆａｒｂｅｒ８９／７３およびＦａｒｂｅｒ８９／７８）を、未処理のまま放置するか、または示されているように３００ｎＭ  ＢＳＡまたは３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０で２４時間処理した。図から分かるように、ファーバー病患者の線維芽細胞のｒＨｓｐ７０での処理により、リソソームの病変が劇的に逆転する、すなわちリソソームの断面積が減少する。方法の説明については実施例２を参照されたい。
【図１６】Ｈｓｐ７０が他の分子のエンドサイトーシスによる取り込みを増加させることを示す図である。グラフＡ：野生型（ＷＴ）またはＨｓｐ７０トランスジェニック（ＴＧ）の不死化マウス胎児線維芽細胞（ｉＭＥＦ）を、２０μｇ／ｍＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８標識ＢＳＡ（ＢＳＡ＊）と共に２４時間インキュベートした。エンドサイトーシスによる取り込みを、蛍光顕微鏡検査によって検証した（不図示）（実施例２を参照）。次いで、細胞を収集し、ＢＳＡ＊の取り込みについて分析した。図から分かるように、Ｈｓｐ７０−トランスジェニックｉＭＥＦは、野生型ｉＭＥＦよりも有意に多くＢＳＡ＊を取り込んでいた。グラフＢ：Ｕ２ＯＳ骨肉腫細胞を、示されているように３０００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０を用いてまたは用いずに２０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ＊と共に２４時間インキュベートした。エンドサイトーシスによる取り込みを、蛍光顕微鏡検査によって検証した（不図示）（実施例２を参照）。次いで、細胞を収集し、ＢＳＡ＊の取り込みについて分析した。図から分かるように、ＢＳＡ＊およびｒＨｓｐ７０が一緒に添加されたＵ２ＯＳ細胞は、ＢＳＡ＊のみと共にインキュベートした細胞よりも有意に多くＢＳＡ＊を取り込んでいた。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
本発明者らによって実証されるように、Ｈｓｐ７０は、エンドリソソーム膜との直接的な相互作用；特定のリン脂質、すなわちＢＭＰ（ビス（モノアシルグリセロ）リン酸）によって構成される相互作用による細胞保護効果の主要部分を担う。ＢＭＰは、後期エンドソームおよびリソソームのみに存在する。本発明者らは、Ｈｓｐ７０−ＢＭＰ相互作用が、Ｈｓｐ７０のＮ末端ＡＴＰアーゼドメイン、特にトリプトファン９０に依存すること、およびこの相互作用がｐＨ依存性であることも示す。Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用は、特定のサブセットのリソソーム酵素の安定性を調節するためのプラットフォームを提供し、かつリソソーム酵素の放出を確実にしてリソソーム膜の不安定化を防止するため、Ｈｓｐ７０の膜安定効果に必須である。これらの知見は、本明細書に開示されるリソソーム蓄積障害に対する新規かつ有望な治療方法の基礎を構成する。
【００８２】
リソソーム
１９５５年のｄｅ  Ｄｕｖｅによるリソソームの発見以来、この細胞小器官の見方は、単に動物細胞におけるエンドサイトーシス経路の終点、すなわち細胞質ゾル内に放出されると壊死おび組織の炎症を引き起こす様々な加水分解酵素を収容する区画であるというドグマによって支配されてきた。良くてもゴミ箱、悪いと曖昧な「自殺バッグ」というリソソームに対する見方は、リソソームおよびその内容物の様々なより明確な役割についての証拠を提供する最近の発見によって劇的に変化した。
【００８３】
リソソーム加水分解酵素
細胞内の分解およびそれに続く細胞成分の再利用のための主な区画として、リソソームは、この細胞小器官の内腔で最終目的地を見つける異種および自己貪食カーゴの両方を受け取る。分解は、全ての主な細胞巨大分子を消化することができる多数の酸性加水分解酵素（ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、スルファターゼ、リパーゼなど）によって行われる。この中で最も研究されたリソソームプロテアーゼは、カテプシンプロテアーゼのファミリーである。カテプシンは、それらの活性部位のアミノ酸によって３つのサブグループ、すなわちシステイン（Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｆ、Ｋ、Ｌ、Ｏ、Ｓ、Ｖ、Ｗ、およびＸ／Ｚ）、アスパラギン酸（ＤおよびＥ）、およびセリン（Ｇ）カテプシンに分けられる。カテプシンは、リソソームの酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）で最適に機能し、中性ｐＨのリソソームの外部でも、安定性の低下および／または特異性の変更があるがなお機能することができる。
【００８４】
最近まで、カテプシンの機能は、リソソーム内タンパク質の代謝回転、および分泌された後の細胞外マトリックスの分解に限定されていると思われていた。しかし、過去２、３年の間に、多くのカテプシンは、プログラム細胞死（ＰＣＤ）はもちろん、骨リモデリング、抗原提示、表皮恒常性、プロホルモンのプロセシング、脱顆粒後の自己破壊からの細胞傷害性リンパ球の保護、マウスにおける中枢神経系の維持、脈管形成、癌細胞の侵入における役割を含め、より明確な機能を持つと見なされている。
【００８５】
タンパク質の分解とは別に、リソソームおよび後期エンドソームは、適切な機能がイントラリソソーム膜（ｉｎｔｒａ−ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）の脂質組成に依存する一連のエンドリソソーム酵素（ｅｎｄｏｌｙｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ）および補酵素（ｃｏ−ｅｎｓｙｍｅ）によってスフィンゴ糖脂質などの細胞内脂質の代謝にも関与する。機能性エンドリソソーム脂質代謝の重要性は、臨床疾患が、スフィンゴ脂質の代謝のいずれかの段階で機能障害の場合に、テイサックス病（Ｔａｙ−Ｓａｃｈｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、サンドホフ病（Ｓａｎｄｈｏｆｆ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ファーバー病、ファブリー病、ゴーシェ病、クラッベ病、およびニーマンピック病などの疾患を生じさせることが明らかであるという事実によって容易に理解され得る。
【００８６】
リソソームの内外への輸送
細胞内膜の輸送は、膜構成成分、様々な溶質分子、および受容体結合リガンドの様々な細胞内区画への送達によって哺乳動物細胞に必須の役割を果たす。主な経路がリソソームで１つになり、そこで分解され場合によっては原形質膜に戻り再利用が行われるため、様々なエンドサイトーシス経路が最近まで単純であると思われていたが、最近の証拠は、これらの経路が初めに考えられていたよりも複雑であることを示している。
【００８７】
エンドサイトーシス経路
エンドサイトーシスは、クラスリン被覆ピットの形成による分子の受容体媒介エンドサイトーシスに関して最もよく理解されているが、様々な非クラスリン媒介エンドサイトーシス経路（例えば、マクロピノサイトーシス、食作用、カベオラ形成および非クラスリン被覆ピット形成による取り込み）も同定された。エンドサイトーシス系の命名法は、完全に標準化されているものではなく、一般的に使用される用語「初期エンドソーム」は、実際は、ソーティングエンドソーム区画およびエンドサイトーシス再利用区画（ＥＲＣ）の２つの異なるエンドソーム区画を表す。従来の受容体媒介エンドサイトーシス経路では、トランスフェリン受容体、低密度リポタンパク質受容体、およびマンノース６−リン酸受容体（ＭＰＲ）などの受容体は、それらの細胞質尾部の配列モチーフとクラスリン被覆の要素との間の相互作用によって原形質膜の表面におけるクラスリン被覆ピット内に集中する。クラスリン被覆の脱落後、新規に形成されたエンドソームが、他のエンドソームおよび既存のソーティングエンドソームに融合してソーティングエンドソームになる。この名称が示唆するように、その主な役割は、新規に得た構成成分を正しい位置に振り分けることである。３つの既知の目的地には、原形質膜、後期エンドソーム、およびＥＲＣが含まれる。ソーティングエンドソームが成熟すると、そのｐＨが低下し、これにより受容体結合リガンドのエンドソームの内腔内への放出が促進される。しかし、ソーティングエンドソームが後期エンドソームに完全に成熟する前に、再利用される運命の分子は選別されなければならない。このプロセスは、微細管の表面積と容積の比が小胞ソーティングエンドソームの表面積と容積の比よりも大きいため、膜タンパク質の溶質分子からの選別を好むプロセスである微細管の締め付けによって起こると考えられている。締め付けられた微細管は、膜タンパク質を原形質膜に直接戻す（直接戻し経路）かまたはＥＲＣに送ることができる。ＥＲＣは、主に、細胞型間で局在化が異なる管状細胞小器官の集まりである。ＥＲＣは、分子をいくつかの異なる目的地に振り分けることができるが、ＥＲＣを介して送られる分子の殆どは原形質膜に戻る。
【００８８】
ソーティングエンドソームが成熟すると、主に液胞型プロトンＡＴＰアーゼ（Ｖ−ＡＴＰａｓｅ）の作用によって、その内腔のｐＨが確実に低下し、膜脂質およびタンパク質組成の変化も起こる。ソーティングエンドソームから後期エンドソームを経たリソソームへの膜の輸送は論議を呼んでいる。この論争は、この輸送が、小胞輸送によって、またはソーティングエンドソームの成熟によって最もよく説明されるかについてのものである。両方のモデルは、ソーティングエンドソームと後期エンドソームの間の中間体を提供する。成熟モデルは、後期エンドソームに達する小胞が、前ソーティングエンドソームからの構成成分の除去後に残る物であることを主張し、既存の区画モデルは、分子の後期エンドソームへの輸送が、既存のソーティングエンドソーム区画と後期エンドソーム区画との間の特定の輸送小胞であるエンドサイトーシスキャリア小胞（ＥＣＶ）によって起こることを主張している。ソーティングエンドソーム区画および後期エンドソーム区画の両方は、キャリア小胞よりも構造的に複雑であり、かつより特殊化した機能を有すると考えられている。しかし、最近の生細胞の画像研究により、動的な初期エンドソームネットワークから生じる小胞が、低分子量ＧＴＰアーゼＲＡＢ５を放ち後期エンドソームのマーカーであるＲＡＢ７を補充する転換を受け得るため、両方のモデルの機構的な側面が一致した。エンドサイトーシス経路の機構は、機能的には十分に定義されているが、この命名法は混乱を招き得る。機能上、エンドサイトーシス経路は、ハウスキーピング受容体（例えば、トランスフェリン受容体）と、タンパク質分解が起こり得る後期エンドソームではなく受容体−リガンド脱共役が起こる初期エンドソーム／ソーティングエンドソームによって循環される他の脂質およびタンパク質によって規定されている。しかし、これらの機能基準を超越して、命名法になると、特に、初期エンドソームで始まり、後期エンドソームへの成熟の際にますます顕著になる内腔小胞の産生が、用語「多小胞体」（ＭＶＢ）を生んでいるため、概念が不透明になる。この用語は、リソソームが後期エンドソーム（多小胞体構造を含む）に融合すると形成するハイブリッド細胞小器官を含め、多小胞体領域または要素を含むすべてのエンドサイトーシス小胞はもちろん、ＥＣＶおよび後期エンドソームの別名として同義的に使用されている。しかし、後期エンドソームは、初期エンドソームよりも多くの内腔膜小胞を含むため、この区画は、しばしば用語「多小胞体」を用いて表現される。
【００８９】
最終的に、後期エンドソームのリソソームに対する定義から、いやむしろその定義の不足から、当分野でかなりの混乱が生じている。両方の区画は、同等に酸性であり、リソソーム内に存在するすべてではないにしても殆どのタンパク質が、後期エンドソームにも見られる。成熟モデルによると、後期エンドソームは、恐らくリソソームの前駆体であるが、理論が示すように徐々に発生するため、厳密な分類を実現することは非常に困難であろう。しかし、最近、リソソームと後期エンドソームが別個の区画であり、これらの区画が、「キッシング（ｋｉｓｓｉｎｇ）」事象（一過性の融合）および完全な融合事象の両方を経て、リソソームがハイブリッド細胞小器官から再形成され得る証拠が提示された。
【００９０】
生合成経路
エンドサイトーシスとは別に、後期エンドソームも、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）からＭＰＲ経路を介してカーゴを受け取る（生合成経路）。陽イオン依存性ＭＰＲおよび陽イオン非依存性ＭＰＲ／インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）受容体は、新規に合成された酸性加水分解酵素のＴＧＮからリソソームへの送達の役割を共有する。ＭＰＲによる酸性加水分解酵素の認識には、小胞体における糖の付加およびこれに続く修飾、ならびにシスゴルジにおけるマンノース６−リン酸部分に対する糖残基のリン酸化が必要である。ＭＰＲ結合加水分解酵素は、まずエンドソームに送達され、そこで内腔ｐＨの低下により受容体から解離し、これにより受容体がＴＧＮに戻り再利用可能となる。ＴＧＮにおけるクラスリン被覆ピットにＭＰＲをふるい分けることに主に関与するこのタンパク質は、アダプタータンパク質−１（ＡＰ−１）であるが、ゴルジ局在性γ−ｅａｒ含有ＡＤＰリボシル化因子結合タンパク質（ＧＧＡ）も役割を果たす。ＡＰ−１およびＧＧＡが、協働するか、または実際に２つのＭＰＲを細胞内の異なる場所に局在化させるか否かは、現在は未知である。ＡＰ−１は、４つのメンバーからなるアダプタータンパク質ファミリーの一部であり、メンバーのすべては、分泌経路およびエンドサイトーシス経路で広範に利用されているヘテロ四量体タンパク質である。ＴＧＮで形成されるクラスリン被覆ピットにおけるＡＰ−１の上述の役割に加えて、ＡＰ−１およびＡＰ−２は、原形質膜でのエンドサイトーシス中にクラスリン被覆ピットで使用される一方、ＡＰ−３およびＡＰ−４は、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ）の輸送において機能する。
【００９１】
自己貪食経路
自己貪食は、巨大分子をリソソームに到達させる第３の十分に特徴付けられた経路である。自己貪食は、長寿のタンパク質および細胞小器官の代謝回転に関与する進化的に保存された経路である。自己貪食は、通常は低い基礎レベルで機能するが、例えば、栄養飢餓の条件下で誘導され得る。これらの条件下では、マクロオートファジーは、物質のリソソームへの送達に関与する主経路である。マクロオートファジーは、細胞質小器官および／または細胞質ゾルの一部の回りを覆って閉じた二重膜結合液胞、すなわちオートファゴソームを形成する平坦な膜の槽によって特徴付けられる。オートファゴソームは、最終的にリソソームに融合して、飲み込まれた巨大分子の分解および再利用が行われるオートファゴリソソーム／オートリソソームを形成する。オートファゴソーム膜の起源は、いまだ解明されていない。小胞体、ゴルジ、デノボ合成と同様、ファーゴフォア（ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ）と呼ばれる十分には特徴付けられていない膜画分は、すべて、オートファゴソーム膜の起源として提唱された。酵母遺伝学による最近の進歩および続く哺乳動物相同体の発見により、自己貪食プロセスの理解が急速に深まり、近い将来、オートファゴソーム膜の起源が明らかになることが望まれる。
【００９２】
また、リソソームが自己貪食カーゴを受け取る他の経路も存在する。ミクロオートファジーと呼ばれるかなり無差別的なプロセスは、リソソーム膜の陥入によるリソソームの細胞質ゾルの飲み込みによって特徴付けられる。飲み込まれた細胞質内に存在する巨大分子に加えて、このプロセスは、ペルオキシソームなどの細胞小器官の取り込みにも関与し得る。最終的に、細胞質ゾルタンパク質のリソソーム内腔へのシャペロン媒介輸送は、より直接的かつ選択的な自己貪食の形態である。この経路は、リソソーム膜の両側における、熱ショックタンパク質７０ファミリーの恒常的に発現されるメンバー、Ｈｓｃ７０の存在に依存する。このプロセスは、ＬＡＭＰ−２ａによる標的タンパク質におけるＫＤＥＬ配列モチーフの認識にさらに依存する。
【００９３】
リソソームの再構築およびリソソーム分泌
リソソームの後期エンドソームまたはオートファゴソームとの融合後、リソソームは、膜タンパク質の隔離および内腔内容物の凝縮によって得られるハイブリッド細胞小器官から再構築される。ハイブリッド細胞小器官から除去または再利用される必要がある膜タンパク質のうち、最も明白なものは、定義によるとＭＰＲはリソソームに存在しないためＭＰＲである。しかし、リソソームは、造血起源の分泌細胞で最初に認められたＣａ２＋依存性のプロセスである、分泌顆粒との融合によって分泌リソソームを形成することもできるため、エンドサイトーシス経路の終点として見ることができない。しかし、非分泌細胞でエキソサイトーシスに関与するＣａ２＋調節膜−近位リソソーム画分の証拠も存在する。エキソサイトーシスのプロセスは、６０を超えるメンバーを数えるＲａｂタンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質Ｒａｂ２７ａに依存する。Ｒａｂは、小胞形成、運動性、ドッキング、および融合を含む殆どの膜−輸送ステップにおいて重要な調節の役割を有する低分子量ＧＴＰアーゼである。少なくとも１３のＲａｂタンパク質が、様々なエンドサイトーシスされた分子およびそれらの小胞の運命を決定するためにエンドサイトーシス経路で利用される。
【００９４】
プログラム細胞死
全細胞数および様々な組織を構成する細胞の量の調節は、不要な細胞を除去する機構の必要性と共に、多細胞生物において根本的に重要である。プログラム細胞死は、この目的を達成するための手段であり、細胞成分を漏らさず、このためプログラム細胞死に対する概念的な対応物であるネクローシスに関連した炎症をおこさせることなく、不要な細胞を除去する潜在能力を多細胞生物に付与する。
【００９５】
アポトーシス
アポトーシスという語は、花から花弁または樹木から葉の「脱落」または「落下」を表現するためにギリシャ語で使用されており、多数の組織および細胞型で観察した一般的なタイプのプログラム細胞死を表現するために１９７２年にＣｕｒｒｉｅおよび同僚らによって最初に作成された。作成者らは、観察した事象が、病理学的なネクローシスで死ぬ細胞を特徴付ける形態学的特徴とは異なる有意な形態学的類似性を有することに気付き、これらの一般的な形態学的特徴が同一の基本的なプロセスによるものであり得ることを提唱した。
【００９６】
細胞がアポトーシスによって死ぬ場合、細胞は、一連の転換事象を受ける。これらの事象の中で、特徴的なアポトーシス表現型に必須な事象は、名称のように、特定のアスパラギン酸残基で基質を切断するシステインエンドペプチダーゼのファミリーであるカスパーゼの活性化である。カスパーゼの活性化により、他のカスパーゼのタンパク質分解プロセシングおよび細胞内のすべてのタンパク質活性の多数の他の変化が起こり、最終的にカスパーゼ活性化に関連した特徴的な形態学的特徴が形成され、従って定義通りにアポトーシスがもたらされる。古典的なアポトーシスの特徴には、細胞収縮および細胞質膜の小疱形成、明確な幾何学的形状での核内でのクロマチンの凝縮、約２００塩基対の整数倍の長さへのＤＮＡの断片化、いわゆるヌクレオソームラダー、隣接細胞からの細胞の解離、およびアポトーシス小体と呼ばれる微小の閉じた小胞への細胞の分解が含まれる。多細胞環境では、これらのアポトーシス小体は、マクロファージまたは隣接する細胞によって最終的に取り込まれ、これにより不要な細胞の除去が完了する。
【００９７】
プログラム細胞死
プログラム細胞死（ＰＣＤ）はアポトーシスと同義ではないが、これらを区別しないで使用する大量の文献に基づいて、これらを同義と見なす傾向にある。用語ＰＣＤは、徐々に取って代わってきているが、用語アポトーシスは今なお、カスパーゼ、特にカスパーゼ３の活性化によって構成される細胞死プログラムを表現するために使用されている。しかし、カスパーゼ活性化が全く存在しないＰＣＤおよび非アポトーシスＰＣＤをもたらすカスパーゼ活性化はもちろん、プロアポトーシスカスパーゼの活性化から生き延びる特定の細胞の能力が、細胞死プログラム（複数可）の顕著な柔軟性を明らかにしたため、ＰＣＤは、死ぬ細胞内のシグナルまたは活性化に依存する細胞死としてより正確に定義され得る。それぞれの定義が固有の形態学的特徴によって作られた死ぬ細胞の核の形態、クロマチン凝縮の形状である主な特徴、またはクロマチン凝縮の非存在に従って、ＰＣＤをアポトーシス、アポトーシス様ＰＣＤ、およびネクローシス様ＰＣＤに細かく分類され得ることが提唱されたが、ＰＣＤに導く所与のセットの条件下で関与するシグナル伝達経路に基づいてＰＣＤを区別することが好ましいであろう。しかし、ＰＣＤの異なるモデル間でのこの区別の方法は、なお適切ではなく、様々な種類の細胞死に導く経路は、まだ判明していない。
【００９８】
ネクローシス
ネクローシスは、ネクローシスをもたらす刺激を除去する以外の他の手段によって防止することができないため、ＰＣＤに対する概念的な対応物である。通常、この細胞死のモデルは、生物体に対する病理学的傷害の際に見られる。
【００９９】
プログラム細胞死の分子機構
アポトーシス
前節で述べたように、アポトーシスは、カスパーゼとして知られているシステインエンドペプチダーゼのファミリーのメンバーの活性化およびその活性化に関連した形態学によって定義される。カスパーゼは、タンパク質分解プロセシングによって急速に活性化され得る不活性のチモーゲンとして細胞内に存在する。このプロセシングは、階層カスケードに進み、そこでアポトーシス刺激がイニシエーターカスパーゼ（例えば、カスパーゼ８および９）を活性化させ、次にこのイニシエーターカスパーゼが、次のレベルの階層でエフェクターカスパーゼ（例えば、カスパーゼ３、６、および７）を活性化させる。後者は、多数の基質を切断するためアポトーシスの実行者と見なされ、このプロセシングが、最終的にアポトーシスに関連した表現型をもたらす。アポトーシスプログラムは、細胞外刺激および細胞内刺激に大きく分類され得る様々な刺激によって活性化され得、細胞内刺激は、ミトコンドリアを必須のプレーヤーとしている。細胞外刺激およびこれに続くアポトーシスをもたらす応答は、外因性シグナル伝達経路とも呼ばれ、Ｆａｓ／Ａｐｏ−１／ＣＤ９５、ＴＮＦＲ、またはＴＲＡＩＬなどの様々な死受容体の１つの活性化で始まる一連の事象からなる。それらの適切なリガンドの結合時に、これらの受容体が、受容体内に存在する死ドメイン（ＤＤ）との相互作用によって、ＴＲＡＤＤ（ＴＮＦＲ１−関連死ドメインタンパク質）およびＦＡＤＤ（死ドメインを持つＦａｓ関連タンパク質）などのＤＤ含有アダプター分子を補充する。次いで、これらのアダプター分子は、受容体複合体にカスパーゼ８を補充し、カスパーゼが、場合によっては近接誘導自己触媒プロセシングによって活性化される。次いで、特定の細胞（いわゆるＩ型細胞）では、カスパーゼ８がプロカスパーゼ３を直接切断して活性化する一方、ＩＩ型細胞では、カスパーゼ８の基層（ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ）が、細胞質タンパク質Ｂｉｄである。Ｂｉｄの切断により、断片（切断型Ｂｉｄ（ｔＢｉｄ））が形成され、この断片が、２つのプロアポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー、ＢａｘおよびＢａｋのオリゴマー化、転位置、および外側ミトコンドリア膜への挿入を誘導する。この挿入は、多数の他のタンパク質と共に電子キャリアシトクロムｃ（ＣｙｔＣ）のミトコンドリア内膜空間からの放出を媒介し、これらのタンパク質の最も顕著なものには、アポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）、アポトーシス阻害（ＩＡＰ）タンパク質として知られるタンパク質の効果を無効にするＳｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯ、およびデオキシリボヌクレアーゼであるエンドヌクレアーゼＧが含まれる。これは、ミトコンドリアによるカスパーゼ活性化の理論において極めて重要な点であるが、ＢａｘおよびＢａｋの挿入がどのようにシトクロムｃの放出を促進するかについての決定的な証拠は提示されていないことに留意されたい。ミトコンドリアからの放出時に、ＣｙｔＣが細胞質内に蓄積し、そこでＣｔｙＣがタンパク質Ａｐａｆ−１（アポトーシスプロテアーゼ−活性化因子１）に結合し、Ａｐａｆ−１のオリゴマー化を促進する構造変化が起こる。次いで、このオリゴマーが、カスパーゼリクルートメントドメイン（ＣＡＲＤ）間の同型相互作用によってプロカスパーゼ９に結合し、アポトソーム（ａｐｏｐｔｏｓｏｍｅ）と呼ばれる複合体が形成される。この複合体の形成により、プロカスパーゼ９の酵素活性が大幅に上昇し、この活性がカスパーゼ３のタンパク質分解活性をもたらす。
【０１００】
アポトーシスはまた、内因性経路として知られるプロセスであるミトコンドリア外膜の透過化（ＭＯＭＰ）を誘発する細胞内因子によって引き起こされ得る。これらの因子には、ビリルビン、胆汁酸塩、ならびにタンパク質の変性、核ＤＮＡ損傷、およびミトコンドリアＤＮＡ損傷を生じさせ得る刺激、例えば、電離放射線、熱ストレス、活性酸素種（ＲＯＳ）、および化学療法剤はもちろん、Ｃａ２＋、ＮＯ、およびアラキドン酸などの細胞ストレスに関連した第２のメッセンジャーが含まれる。核ＤＮＡ損傷の事象では、これは、ＤＮＡ損傷の形態だけではなくＤＮＡ損傷を誘発する病毒にも依存する様々なプロテインキナーゼによって検出される。これらのキナーゼの活性は、ｐ５３の蓄積を誘導し、ｐ５３は、すべてがＭＯＭＰを誘導し得るＢａｘ、Ｎｏｘａ、およびＰＵＭＡなどのプロアポトーシス遺伝子の転写を促進させる転写因子として機能し得る。ミトコンドリアレベルにおいて、ｐ５３は、過剰発現がミトコンドリア膜電位の消失およびアポトーシスを引き起こすミトコンドリアマトリックスタンパク質（ｐ５３ＡＩＰ１）はもちろん、ＲＯＳを局所的に産生するミトコンドリア酵素の発現を誘導する。
【０１０１】
ｐ５３または上述の内因性刺激の作用によるＭＯＭＰの誘導は、内因性経路および外因性経路が１つになる時点であり、内因性経路のルートは、シトクロムｃの放出、アポトソームの形成、および不要な細胞の死を目的とする最終ステップを構成するカスパーゼ３の活性化を用いて既に説明した外因性経路のルートの後である。
【０１０２】
アポトーシス代替物
過去１０年間、ＰＣＤの実行者としてのカスパーゼの独占的な役割に疑問が持たれ、多くの証拠が、カスパーゼのみに帰するのではなく、細胞の生命、特に細胞の死にはもっと多くが存在することを示唆している。
【０１０３】
エネルギー枯渇、ニトロ化／酸化ストレス、およびアポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーなどの因子によるカスパーゼ経路の不活化はもちろん、新規に開発されたカスパーゼ特異的な薬理学的な阻害剤は、死に向かった進行を常に停止するものではなく、基本的なカスパーゼ依存性死プログラムのサブセットを明らかにし、促進さえもした。これらのプログラムには、抗癌剤、成長因子欠乏、スタウロスポリン、Ｂａｘ関連タンパク質、およびＨｓｐ７０の欠乏によって誘導される経路はもちろん、死受容体開始経路が含まれる。これらのカスパーゼ依存性死プログラムの形態学的特徴は、しばしば、古典的なアポトーシスで観察されるプログラムを連想させ、カスパーゼの上流または下流の必須の補助因子としてのカテプシン、カルパイン、およびセリンプロテアーゼなどの他のプロテアーゼの役割についての実験的裏付けが急速に増えている。この根拠は、多くの非カスパーゼプロテアーゼが、古典的カスパーゼ基質の少なくとも一部を切断でき、これが、カスパーゼ依存性死プログラムとカスパーゼ非依存性死プログラムとの間で観察される類似点の一部を説明し得るという知見によって補強される。
【０１０４】
このような死プログラムの関連性を主張することができるが、死プログラムはカスパーゼの効力によって隠れているものの、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの死受容体、低酸素、酸化ストレス、浸透ストレス、熱、および抗癌剤などの様々な刺激に対する応答として開始される細胞死プログラムにおけるリソソームカテプシンプロテアーゼの進化的に保存された役割についての証拠が集まっている。
【０１０５】
プログラム細胞死におけるリソソームの関与
ＰＣＤの除去段階、すなわちアポトーシス細胞およびアポトーシス小体の近接細胞または貪食細胞による飲み込みにおけるリソソームおよびその加水分解酵素の役割は十分に確立されているが、ＰＣＤの直近の事象でのリソソームおよびリソソーム加水分解酵素の重要性を認識するには長い時間がかかった。この遅れの１つの理由は、ＰＣＤにおけるカスパーゼの役割を評価するために一般的に使用されるメチルケトンペプチド阻害剤（例えば、ｚＶＡＤ−ｆｍｋ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ、Ｂｏｃ−Ｄ−ｆｍｋなど）も、いくつかのシステインカテプシンを含む他のシステインプロテアーゼを阻害するという事実によるものであり得る。この交差反応の認識から９年経っても、非カスパーゼプロテアーゼを阻害できる濃度でのこれらの阻害剤による保護効果は、しばしば、カスパーゼ媒介死経路の証拠としてなお理解され、従ってＰＣＤにおける他のシステインプロテアーゼの役割が、過小評価され続けている。リソソームＰＣＤの発見は、リソソームの超微細構造が、電子顕微鏡法によって分析されたアポトーシス細胞で無傷であるように見えたためにさらに遅れたのであろう。したがって、リソソーム破裂は、制御されていないネクローシス細胞死および組織自己分解の後期段階中の全か無かのスイッチとして最近まで見なされていた。しかし、リソソーム膜完全性のより正確な評価を可能にする新規な技術は、正常な超微細構造を持つリソソームが、その酵素の一部を漏洩させ得ること、および部分的なリソソーム膜透過化（ＬＭＰ）が多くの死プログラムの初期で起こるだけではなく、実際にアポトーシスおよびアポトーシス様ＰＣＤを引き起こし得るということを明らかにした。
【０１０６】
リソソーム膜透過化（ＬＭＰ）およびその結果
リソソーム膜の完全性を直接標的とする様々な複合物、例えば、Ｈ２Ｏ２、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンメチルエステル、浸透ストレス、スフィンゴシン、リソソーム向性抗生物質（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）ノルフロキサシンおよびシプロフロキサン、ならびに光酸化リソソーム損傷（光分解）を用いた研究が、適度なリソソーム透過化がＰＣＤをもたらし得ることを納得できるように証明した。リソソーム破裂の量と細胞死のモデルとの間の量的関係が、ＬＭＰの後の大きく異なる形態学的結果を説明すると提唱された。このモデルによると、低いストレス強度が、リソソーム内容物の細胞質への限定的な放出を引き起こし、アポトーシスまたはアポトーシス様細胞死が起こるが、高強度ストレスは、全体的なリソソーム破裂および急速な細胞ネクローシスをもたらす。したがって、低いｐＨで界面活性剤様の特性を持つセラミドの酸性セラミダーゼによって生成される代謝産物である、低濃度のスフィンゴシンは、部分的なＬＭＰおよびカスパーゼ媒介アポトーシスを誘導する一方、高濃度では、広範囲のＬＭＰおよびカスパーゼ非依存性ネクローシス細胞死となる。このモデルでは、部分的なＬＭＰによって引き起こされる細胞死は、システインカテプシンおよびアスパラギン酸カテプシンの薬理学的阻害剤によって阻害することができ、細胞質ゾルカテプシン活性の上昇により、カスパーゼの活性化、および細胞死プロセスにおける細胞質ゾルカテプシンの直接的な役割を示唆するミトコンドリア膜電位の変化が起こる。重要なことに、細胞死におけるＬＭＰおよびカテプシンの役割は、直接のリソソーム破裂物質を利用する実験的なモデルに限定されるものではない。ＬＭＰはまた、様々な古典的なアポトーシス刺激、例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリー、インターロイキン１の死受容体の活性化、ｐ５３の活性化、成長因子飢餓、微小管安定化剤、エトポシド、σ−２受容体の活性化、合成レチノイドＣＤ４３７、Ｂ細胞受容体の活性化、スタウロスポリン、浸透ストレス、およびｐ５３非依存性アポトーシスを誘導する新規な抗癌剤のスクリーニングで同定された小分子に応答した細胞死の実行に寄与する。
【０１０７】
ミトコンドリアアポトーシス経路のトリガーとしてのＬＭＰ
ＬＭＰの細胞傷害効果は、しばしば、ミトコンドリア死経路の活性化に少なくとも部分的に依存する。的確な微量注入研究により、細胞質ゾルに局在すると、１つのリソソーム加水分解酵素、カテプシンＤは、全細胞カテプシンＤ活性の半分に相当する細胞用量でヒト線維芽細胞におけるミトコンドリア外膜透過化およびアポトーシスを引き起こすのに十分であることが実証された。しかし、カテプシンＤは、ＬＭＰが関与するすべての細胞死モデルにおいてＰＣＤを引き起こすには十分でない。文書で十分に立証された他のＬＭＰ誘発ＰＣＤのメディエーターには、活性酸素種はもちろん、システインカテプシンＢおよびＬが含まれる。しかし、他のリソソーム加水分解酵素、リソソーム由来の第２のメッセンジャー、および細胞質ゾルのＬＭＰ誘発酸性化の役割がこれまで適切に除外されていないことを重視されたい。カテプシンとミトコンドリア膜透過化との間の関連の１つは、細胞質ゾルｐＨで、いくつかのシステインカテプシンによって処理および活性化され得るがカテプシンＤによっては処理および活性化されないＢｃｌ−２ファミリーのプロアポトーシスＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、Ｂｉｄであり得る。しかし、カテプシンＤは、ＴＮＦ受容体１（ＴＮＦ−Ｒ１）の内在化の後にエンドリソソーム画分の酸性環境でＢｉｄを切断し活性化させることが示唆された。このモデルによると、リガンド活性化ＴＮＦ−Ｒ１のエンドサイトーシスが、酸性スフィンゴミエリナーゼを介したセラミドの産生をもたらし、このセラミドが、不活性カテプシンＤに結合し、不活性カテプシンＤを自己触媒的プロセシングによって活性化させる。カテプシンＤはまた、スタウロスポリン処理Ｔ細胞で実証されたように、Ｂｉｄに依存しないでＢａｘを活性化させ得る。また、シプロフロキサシンで処理した線維芽細胞でも、ＬＭＰが、ＢａｘおよびＢａｋのＢｉｄに依存しない活性化によってミトコンドリア膜透過化を引き起こす。このモデル系では、Ｂａｘの活性化は、カテプシンＤに依存しないが、代わりに活性酸素種に依存する。シプロフロキサシン誘導ミトコンドリア膜透過化が、ＢａｘおよびＢａｋの両方が欠如している細胞で完全には阻害されないことに留意されたい。ＬＭＰをミトコンドリア膜透過化につなげる代替機構には、活性酸素種および／またはカテプシンＢ依存的に生成され得るアラキドン酸などの脂質メディエーターの直接の効果が含まれ得る。
【０１０８】
個々のカテプシンが欠損したマウス由来の不死化マウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を利用する研究により、様々なカテプシンが、ＬＭＰを引き起こす刺激に依存する細胞死の実行に関与することが明らかになった。カテプシンＤ欠損マウス由来ではなく、カテプシンＢおよびＬ欠損マウス由来の不死化ＭＥＦは、ＴＮＦに対して高い耐性を有するが、細胞がスタウロスポリンで処理されると反対の状況が現れる。ＴＮＦ誘導細胞死経路に対する広範囲な研究により、ＰＣＤにおける個々のカテプシンの役割が、研究された細胞型によって決まることがさらに明らかにされた。上記したように、不死化ＭＥＦのＴＮＦ誘導死は、カテプシンＤではなくシステインカテプシンに依存する。しかし、カテプシンＤの欠乏は、ＨｅＬａ頸癌細胞をＴＮＦ誘導細胞傷害性およびシスプラチン誘導細胞傷害性から効果的に保護する。この差異は、ヒト細胞とマウス細胞との間の一般的な差異によるものであるとは思えない。なぜなら、単独のカテプシンＢまたは他のシステインカテプシンと合わせたカテプシンＢは、ヒト頸癌細胞系（ＭＥ−１８０）および乳癌細胞系（ＭＣＦ−７）における事実上のＴＮＦ誘導死にとっても極めて重要である。この多様性の意味は、まだ分かっていないが、異なる細胞系における個々のカテプシンおよびそれらの阻害剤の様々な発現レベルがある役割を果たし得るということである。したがって、個々のカテプシンまたはそれらの阻害剤の発現レベルを調節する異なる死刺激の様々な能力が、異なる刺激に対する応答の差異を説明し得る。例えば、アドリアマイシンおよびエトポシドは、ｐ５３の活性化によってカテプシンＤの発現を促進することが知られている。あるいは、様々な刺激によって誘導される他のシグナル伝達経路は、特定のカテプシンと協働し得る。
【０１０９】
ＬＭＰによって誘導されるミトコンドリア非依存死経路
重要なことに、ＬＭＰおよび細胞質カテプシンの致死効果は、内因性アポトーシス経路の活性化に限定されるものではない。微小管安定化剤（パクリタキセル、エポチロンＢ（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ  Ｂ）、およびディスコデルモライド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ））で処理した小細胞性肺癌細胞では、ＬＭＰは、死プロセスの初期で起こり、システインカテプシンが、カスパーゼ非依存的に微小核生成および細胞死を媒介する。ＴＮＦ処理ヒト癌細胞系では、ＬＭＰは、ミトコンドリア外膜透過化の下流で起こる。しかし、システインカテプシンの活性または発現の阻害は、エフェクターカスパーゼの活性化を有意に阻害することなく、ＴＮＦ誘導細胞死に対して優位な防御を与える。さらに、カテプシンＢは、ＴＮＦ処理マウスＷＥＨＩ−Ｓ線維肉腫細胞において、カスパーゼ活性の非存在下で、クロマチン凝縮、ホスファチジルセリン曝露、および原形質膜小疱形成などのアポトーシス様変化に関与する。さらに、Ｔ細胞の最適上の活性化はもちろん、様々なヒト癌細胞における熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）の欠乏は、内因性アポトーシス経路を活性化することなく、ＬＭＰおよびカテプシン媒介アポトーシス様ＰＣＤを引き起こす。これらのデータに一致して、カテプシンＢは、単離された核で核アポトーシスを誘導し得る。したがって、カテプシンは、刺激および細胞の状況に依存するプログラム細胞死のイニシエータープロテアーゼおよびエフェクタープロテアーゼの両方として機能する能力を有するようである。特に、ミトコンドリア死経路が、例えば、Ｂｃｌ−２の過剰発現によって遮断される癌細胞においてＰＣＤを媒介するカテプシンの能力は、ＬＭＰを誘導する治療が、古典的なアポトーシスの誘導物質に対して耐性がある癌の治療で有効性を証明できるという希望をもたらす。この考えは、不死化および形質転換が、リソソーム細胞死に対して感作させ得ることを示すデータによってさらに裏付けられる。
【０１１０】
ＬＭＰへのシグナル伝達
上記したように、リソソーム内容物、特にカテプシンの細胞質への放出の前のＬＭＰは、リソソーム死経路の重要な活性化ステップであると見なされる。しかし、ＬＭＰをもたらすシグナル伝達経路は、出現の始まりに過ぎない。最も良く研究された機構の１つは、腫瘍壊死因子受容体１からのシグナル伝達であるが、このＬＭＰへのシグナル伝達経路の解明は、異なる標的細胞での多様な応答により非常に複雑である。
【０１１１】
要約すれば、ＴＮＦは、細胞の状況によってカスパーゼ依存性ＬＭＰまたはカスパーゼ非依存性ＬＭＰを誘導することができる。加えて、ＴＮＦ関連リガンドＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ、およびＴＷＥＡＫも、アポトーシス形態またはネクローシス形態のカスパーゼ非依存性ＰＣＤに関連している。薬理学的および遺伝学的研究により、ＴＮＦからＬＭＰに至るカスパーゼ媒介経路が、カスパーゼ８および９に依存するが、カスパーゼ９の活性化が、ヒト細胞とマウス細胞との間で大きく異なっていることが示された。カスパーゼとＬＭＰとの間の関連性は、なお不明であり、ＢｉｄのＴＮＦ誘導カスパーゼ８媒介切断がＬＭＰに寄与することが提唱されているが、これらの知見は、Ｂｉｄ欠損ｉＭＥＦにおけるＴＮＦ誘導ＬＭＰによって検証することができない。さらに、Ｂｉｄが、ＬＭＰの上流ではなくＢｉｄの下流に関係するリソソーム死経路におけるカテプシンの標的であることが提唱されている。
【０１１２】
また、ＴＮＦは、原形質膜における中性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭａｓｅ）およびリソソーム画分内の酸または酸性ＳＭａｓｅ（ａＳＭａｓｅ）を活性化することによってスフィンゴミエリンのホスホリルコリンおよびセラミドへの分解を刺激する。両方の事象は、ＴＮＦ誘導細胞死経路に関係しているが、これまでのところ、中性ＳＭａｓｅのみが、中性ＳＭａｓｅに関連した因子（ＦＡＮ）によってＬＭＰに関係している。ドミナントネガティブ型のＦＡＮを発現するヒト線維芽細胞はもちろん、ＦＡＮ欠損ｉＭＥＦに基づいた研究により、ＦＮＡがＴＮＦ誘導セラミド産生を媒介するだけではなく、カスパーゼ８プロセシングおよび細胞死にも寄与することが示された。マウス肝細胞におけるＴＮＦ誘導ＬＭＰがカスパーゼ８に依存するため、カスパーゼ８のプロセシングの減少が、ドミナントネガティブＦＡＮを発現するＴＮＦ処理肝細胞におけるＬＭＰの低下を説明し得る。しかし、セラミドおよびその代謝産物の役割は除外することはできない。ＴＮＦ誘導死シグナル伝達におけるそれらの役割は、カスパーゼ８の下流で活性化されるａＳＭａｓｅが欠損したマウスにおけるＴＮＦおよびＦａｓ誘導肝毒性の減少によって裏付けられている。特に、リソソーム酵素酸性セラミダーゼによって触媒される反応においてセラミドから生成されるスフィンゴシンは、セラミドとは反対に、リソソーム膜を直接不安定化する界面活性剤として機能し得るため魅力的な候補である。ＳＭａｓｅを活性化することによってスフィンゴシン前駆体、セラミドの産生を増大させることに加えて、ＴＮＦは、プロアポトーシススフィンゴシンを抗アポトーシススフィンゴシン１−リン酸に変換する酵素であるスフィンゴシンキナーゼ１のカテプシンＢ媒介ダウンレギュレーションによってスフィンゴシンのレベルも調節する。このカテプシンＢの活性化は、リソソームにおけるスフィンゴシンの蓄積をもたらし得るため、ＴＮＦ処理肝細胞における効率的なＬＭＰに対するカテプシンＢの必要性を少なくとも部分的に説明し得る。
【０１１３】
ＴＮＦはまた、カスパーゼ阻害剤の存在下で、ＬＭＰおよび細胞死を引き起こすこともできる。この経路は、カスパーゼ８に依存しないが、死ドメイン含有受容体相互作用タンパク質１（ＲＩＰ−１）を必要とし、活性酸素種の生成に関与する。酸化ストレスは、リソソーム内の鉄と共に、Ｆｅｎｔｏｎ型化学種によって酸素ラジカルを生成し、これによりリソソーム膜脂質の酸化を引き起こし、膜の不安定化およびリソソーム内容物の放出がもたらされ得る。しかし、ＲＩＰ−１、酸化ストレス、およびＬＭＰ間の分子リンクは、なお不明である。
【０１１４】
いくつかの古典的なアポトーシス誘導物質（例えば、ｐ５３、エトポシド、およびスタウロスポリン）による細胞死の誘導は、ＬＭＰの後のカテプシン依存性ミトコンドリア膜透過化も伴う。しかし、これらの刺激からＬＭＰへのシグナル伝達経路は、まだ明らかになっていない。
【０１１５】
ＬＭＰに対する細胞防御機構
ＬＭＰの潜在的な致死的結果から、ＬＭＰ自体を阻害することによって、またはＬＭＰの結果として細胞質ゾルに漏れる酸性加水分解酵素から細胞を保護することによって、細胞がＬＭＰに対抗する様々な戦略を立てることは驚きではない。その多くの他の機能の中で、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、リソソームを不安定化から保護することが報告されている。ヒト血管内皮細胞におけるＰＩ３Ｋの阻害は、リソソーム膜完全性の維持におけるＰＩ３Ｋのかなり直接的な役割を立証するカテプシンＢの細胞質ゾルへの放出を誘導する。さらに、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＴＮＦ誘導およびインターロイキン１−誘導リソソーム死経路に対して細胞を感作させる。癌細胞における変更されたリソソーム機能およびカテプシンの発現レベルの上昇は、リソソームの安定性の低下という形で脅威を与え得る。したがって、ヒト癌細胞で一般に活性化されるＰＩ３Ｋは、腫瘍細胞のリソソーム安定性にも寄与し、これにより腫瘍細胞の細胞死耐性を高め得る。腫瘍細胞のリソソームの安定性に対するＰＩ３Ｋの役割は単に推測であるが、最近のデータは、膜破壊刺激からのリソソームの保護におけるＨｓｐ７０の役割を支持する。この研究は、主に腫瘍細胞で行われ、しばしば、エンドリソソーム区画内はもちろん、原形質膜におけるＨｓｐ７０の局在化も実証する。
【０１１６】
ＬＭＰ時のリソソームプロテアーゼの細胞質ゾルへの放出の事象では、細胞質ゾルプロテアーゼ阻害剤が、その有害な結果に対する防御手段となる。カテプシンＤの内因性阻害剤は一切知られていないが、システインカテプシンは、少なくとも３つの細胞質ゾルプロテアーゼ阻害剤、すなわちシスタチンＡおよびＢ、ならびにいくつかのシステインカテプシン（Ｂ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、およびＶ）およびカテプシンＧに対しても強力な阻害活性を有することが最近分かったセリンプロテアーゼ阻害剤２Ａ（Ｓｐｉ２Ａ）によって効果的に阻害され得る。生理的および病的状態でのＰＣＤの防止におけるこれらの阻害剤の重要性は、小脳顆粒細胞のアポトーシスの増加を示すシスタチンＢ欠損マウスによって実証された。さらに、Ｓｐｉ２Ａの発現が、ＮＦ−κＢ経路を介したＴＮＦ処理時に誘導され、ＭＥＦにおけるＴＮＦ誘導細胞質ゾルカテプシンＢ活性および細胞死を効果的に阻害する。興味深いことに、Ｃ．Ｅｌｅｇａｎｓでは、細胞質ゾルセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）６は、低浸透ストレスおよび様々な他のリソソームストレスによって引き起こされるリソソーム傷害による致死効果および誘導の両方から保護することができ、ＬＭＰからの保護が進化的に保存された機構であることを実証している。
【０１１７】
リソソーム蓄積症
リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、リソソーム機能の異常から起こる約４０の稀な一群の遺伝性代謝障害である。ＬＳＤは、通常は、脂質、糖タンパク質、またはムコ多糖の代謝に必要な１つの酵素の欠損の結果としてのリソソーム機能不全によって引き起こされる。それぞれの障害は、酵素活性の欠損に翻訳される様々な遺伝子の突然変異から生じるが、これらはすべて、共通の生化学的特徴を共有する、すなわちすべてのリソソーム障害は、リソソーム内の物質の異常な蓄積に起因する。
【０１１８】
ＬＳＤは、個々としては、１：１００，０００未満の発生率であるが、群とすると、発生率は、約１：５，０００〜１：１０，０００である。これらの障害の殆どは、常染色体劣性遺伝であるが、ファブリー病などの２、３は、Ｘ連鎖劣性遺伝である。
【０１１９】
リソソーム蓄積症は、一般に、関係する主に蓄積された物質の性質によって分類され、以下に示すように大きく分けることができる。
−脂質蓄積障害（またはリピドーシス）、主にスフィンゴリピドーシス（ゴーシェ病およびニーマンピック病を含む）
・ガングリオシドーシス（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｏｓｉｓ）（テイサックス病を含む）
・白質ジストロフィー（ｌｅｕｋｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ）
−ムコ多糖症（ハンター症候群（Ｈｕｎｔｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）およびハーラー病（Ｈｕｒｌｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）を含む）
−糖タンパク質蓄積障害（糖タンパク質異常症）
−ムコリピドーシス
【０１２０】
疾患の重症度によって、患者は、多くが生後２、３ヶ月または若い予測不可能な年齢で死亡するが、成人早期まで生存する者もあり、最終的にそれらの特定の障害の様々な病状で死亡する。ＬＳＤの症状は、特定の障害によって様々であり、軽度から重度まであり得る。ＬＳＤの症状には、発育遅延、運動障害、発作、痴呆、難聴、および／または失明が含まれ得る。一部のＬＳＤ患者は、肝臓肥大（肝腫）および脾臓肥大（脾腫）、肺および心臓の問題、ならびに異常な骨成長を伴う。
【０１２１】
患者の大半は、確実な診断に至る最も効率的な方法である酵素アッセイによってまず検査される。疾患による突然変異（複数可）が知られている一部のファミリーおよび特定の遺伝子単離では、突然変異分析が行われることがある。多数の異なる突然変異が存在し得るため、特に影響を受ける酵素をコードする遺伝子の配列決定が、診断を確定するために時には必要である。出生前診断は、既知の遺伝子リスク因子がある場合に有用であり得る。
【０１２２】
本発明は、一実施形態では、リソソーム蓄積障害を治療するための方法に関する。
【０１２３】
リソソームスフィンゴ脂質加水分解
多数の酵素が、スフィンゴ脂質（またはフィンゴ糖脂質（ｇｌｙｃｏｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ））のリソソーム異化作用に関与する（図４を参照）。これらの酵素、より具体的には加水分解酵素はそれぞれ、特定のスフィンゴ脂質の分解に関与する。
【０１２４】
リソソームスフィンゴ脂質加水分解酵素は、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（ＳＡＰまたはサポシン）と相互作用して前記加水分解酵素の活性を刺激する。ＳＡＰは、水溶性酵素と膜結合基質との間の酵素／基質相互作用を促進すると考えられる。
【０１２５】
さらに、後期エンドソーム区画およびリソソーム区画の脂質成分は、一部の加水分解酵素の活性も刺激するＢＭＰおよびＰＩ（ホスファチジルイノシトール）などの負に帯電したリン脂質の存在によって特徴付けられる。ＢＭＰ依存性リソソーム加水分解酵素には、シアリダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、グルコシルセラミダーゼ、β−ガラクトシルセラミダーゼ、アリールスルファターゼＡ、酸性セラミダーゼ、およびスフィンゴミエリナーゼが含まれる。
【０１２６】
補助因子サポシン
サポシンは、様々なリソソーム脂質分解酵素の活性化因子として機能する低分子リソソームタンパク質である。サポシンは、恐らく、脂質基質を膜周囲から分離することによって機能するため、可溶性分解酵素にアクセスしやすくする。すべての哺乳動物サポシンは、タンパク質分解による切断後に活性化サポシンを生成する４つのサポシンＢドメイン、および活性化反応で除去される２つのサポシンＡドメインを含む１つの前駆体分子（プロサポシン）として合成される。サポシンＢドメインは、他のタンパク質でも生じ、それらの多くは、膜の溶解に活性がある。
【０１２７】
プロサポシン（ＰＳＡＰ）は、ＰＳＡＰ遺伝子によってコードされるヒトのタンパク質である。この遺伝子は、サポシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤの４つの切断産物の前駆体である高度に保存された糖タンパク質をコードする。サポシンは、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（Ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＳＡＰの頭字語である。前駆タンパク質の各ドメインは、約８０のアミノ酸残基の長さであり、システイン残基およびグリコシル化部位がほぼ同一の配置である。サポシンＡ〜Ｄは、リソソーム画分に主に局在し、そこで短いオリゴ糖基を有するスフィンゴ糖脂質の異化作用を促進する。前駆タンパク質は、分泌タンパク質および膜内在性タンパク質の両方として存在し、神経栄養活性を有する。サポシンＡ〜Ｄは、特異的なリソソーム加水分解酵素による特定のスフィンゴ脂質の加水分解に必要である。
【０１２８】
サポシンは、シアリダーゼ（ＳＡＰ−Ｂ）、α−ガラクトシダーゼＡ（ＳＡＰ−Ｂ）、グルコシルセラミダーゼ（ＳＡＰ−Ｃ）、β−ガラクトシルセラミダーゼ（ＳＡＰ−Ｃ）、アリールスルファターゼＡ（ＳＡＰ−Ｂ）、および酸性セラミダーゼ（ＳＡＰ−Ｄ）の重要な活性化補助因子である。酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭａｓｅ）は、既知の活性化タンパク質のいずれにも大きくは依存していないが、サポシンの存在が、この酵素の活性を高める。第５のサポシン；ＧＭ２−活性化タンパク質も特徴付けられた。
【０１２９】
ＢＭＰ
リゾビスホスファチジン酸としても知られるビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）は、後期エンドソーム区画およびリソソーム区画の脂質組成の主な部分である。ＢＭＰは、負に帯電したリン脂質、より具体的にはグリセロール−リン脂質である。
【０１３０】
ＢＭＰは、ウサギ肺から初めに単離されたが、現在は、すべての動物組織の微量成分なら一般的であることが知られている。ＢＭＰの立体化学構造は、ホスホジエステル部分が、グリセロールの位置ｓｎ−３ではなくｓｎ−１およびｓｎ−１’に結合されているという点で他の動物グリセロ−リン脂質の立体化学構造とは異なっている。グリセロール部分における位置ｓｎ−３および３’またはｓｎ−２およびｓｎ−２’が脂肪酸でエステル化されるか否かはなお不明である。グリセロール分子における脂肪酸の位置がどこであろうと、それらの組成は、１８：１（ｎ−９）および１８：２（ｎ−６）、２０：４および２２：６（ｎ−３）が豊富で特徴的であり得るが、これは、特定の組織、細胞型、または細胞小器官に大きく依存する。このような特有の組成は、かなり特殊な機能を意味するが、それらの一部はまだ解明されていない。
【０１３１】
ＢＭＰは、通常は、動物組織のかなり微量な成分である。しかし、ＢＭＰは、肝臓組織および他の組織のリソソームでかなり豊富であり、そこでは膜リン脂質の１５％以上に達することがあり、現在は、この細胞小器官のマーカーとして認められている。独特の脂質、ＢＭＰを含むのは後期エンドソームおよびリソソームである。実際、ＢＭＰとして７０％ものリン脂質含むのは後期エンドソームの内膜であるようである。
【０１３２】
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の一部の好アルカリ性菌株におけるＢＭＰの報告された存在が確認できたら、この脂質が、厳密に哺乳動物起源であり、原核生物、酵母、および高等植物に存在しないという規則の唯１つの既知の例外となる。
【０１３３】
ＢＭＰが、主にエンドソーム系でホスファチジルグリセロールから合成されるという十分な証拠が存在する。主経路であると考えられる経路では、ホスホリパーゼＡ２が、第１のステップでホスファチジルグリセロールの位置ｓｎ−２から脂肪酸を除去する。第２のステップで、リゾホスファチジルグリセロールが、頭部基グリセロール部分のｓｎ−２’位置でアシル化されて、アシル供与体およびアシル受容体の両方としてのリゾホスファチジルグリセロールとのトランスアシラーゼ反応によってｓｎ−３：ｓｎ−１’リゾビスホスファチジン酸を産生する。第３のステップは、十分に説明されるべきであるが、主たるグリセロール単位（ｐｒｉｍａｒｙ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｕｎｉｔ）の位置ｓｎ−１からの脂肪酸の除去、およびｓｎ−３からｓｎ−１位置へのホスホリルエステルの再配列を伴わなければならない。最後に、主たるグリセロール単位の位置ｓｎ−２が、恐らく、供与体としての別のリン脂質とのアシル基転移反応によってエステル化される（従って、独特の脂肪酸組成）。他の生合成経路も可能であろう。
【０１３４】
リソソームにおけるＢＭＰの機能は、積極的に研究中である。ＢＭＰは、二重層を形成しない性質によって助けられる、複合腔内膜系の発生において構造的役割を有し得る。ＢＭＰは、円錐型の分子であり、エンドソーム内のｐＨで膜の融合を促進する。さらに、その独特な立体化学は、ホスホリパーゼに対して耐性があるため、リソソーム膜の自己消化を妨げる、または防止する。脂肪酸成分は、アシル基転移によって迅速に代謝回転し得るが、グリセロリン酸骨格は安定である。さらなる可能性として、この脂質が、ラフト（ｒａｆｔ）に機能的に類似した膜ドメインにおける特定のタンパク質に結合し得る。多小胞後期エンドソーム内に含まれるＢＭＰリッチ膜の特徴的なネットワークが、収集および再分配点として作用することによってコレステロール輸送を調節することが示唆されている。例えば、リソソーム膜が、ＢＭＰの抗体と共にインキュベートされると、コレステロールが蓄積する傾向にある。このプロセスは、ＢＭＰと特異的に相互作用し、かつ多小胞エンドソーム内への選別に関与するタンパク質であるＡｌｉｘ／ＡｌＰ１の制御下である。ＢＭＰは、サポシンのようなスフィンゴ脂質活性化タンパク質などのグリコシルセラミドの分解に関与する酵素を大きく刺激することが知られている。この場合、ＢＭＰは、スフィンゴ糖脂質加水分解酵素とそれらの活性化因子の相互作用に適した環境を提供するように単純に機能し得る。加えて、ＢＭＰは、肺胞マクロファージにおけるエイコサノイド産生のためのアラキドン酸の提供において動的な役割を有する。
【０１３５】
ＢＭＰ依存性酵素の場合、加水分解の速度は、ａＳＭａｓｅでは、サポシンなどの活性化タンパク質が存在しなくても、ＢＭＰが膜に存在すると劇的に上昇する。図４では、点線の円は、酵素、またはＢＭＰ依存を示すこの酵素に欠陥がある疾患を示している。
【０１３６】
ＢＭＰは、ニーマンピックＣ病（コレステロール蓄積）および特定の薬物誘導リピドーシスなどのリソソーム蓄積症の病理に関与する。これらの場合には、ＢＭＰの組成は、少ないポリ不飽和成分を含む分子種を好むように変化する傾向にある。ＢＭＰは、抗リン脂質症候群として知られる稀であまり理解されていない疾患の患者に由来する自己免疫血清によって認識される抗原であるため、ＢＭＰは、恐らく、この疾患の病理学的根拠における因子である。
【０１３７】
本発明は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用を利用することによってリソソーム蓄積障害を治療するための方法に関する。
【０１３８】
脂質蓄積障害
脂質蓄積障害（またはリピドーシス）は、脂質を代謝するために必要な酵素の発現または機能の低下によって有害な量の脂質が細胞内空間に蓄積するリソソーム蓄積障害のサブグループである。時間が経つと、この過剰な脂質の蓄積が、特に、脳、末梢神経系、肝臓、脾臓、および骨髄で永久的な細胞および組織の損傷を引き起こし得る。
【０１３９】
脂質は、脂肪、ろう、ステロール、脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫなど）、モノグリセリド、ジグリセリド、およびリン脂質他を含む天然分子の広範なグループである。脂質の主な生物学的機能には、細胞膜の構造成分として、および重要なシグナル伝達分子としてのエネルギーの貯蔵が含まれる。
【０１４０】
脂質は、疎水性または両親媒性の低分子として広く定義され得；一部の脂質の両親媒性の性質により、水溶性環境で小胞、リポソーム、または膜などの構造を形成することが可能である。生物学的脂質は、２つの異なるタイプの生化学的サブユニット：ケトアシル基およびイソプレン基に完全または部分的に由来する。このアプローチを用いると、脂質は、８つのカテゴリー：脂肪アシル、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄ）およびポリケチド（ケトアシルサブユニットの凝縮に由来）；ならびにステロール脂質およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの凝縮に由来）に分類され得る。
【０１４１】
用語、脂質は、時には脂肪の同義語として用いられるが、脂肪は、トリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質には、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、およびモノグリセリド、ならびにリン脂質を含む）ならびにコレステロールなどの他のステロール含有代謝産物も含まれる。
【０１４２】
脂質の蓄積によって特徴付けられるいくつかのリソソーム蓄積障害（すなわち、脂質蓄積障害）は、以下に概略が示されるように特徴付けられた。
【０１４３】
本発明は、一実施形態では、脂質蓄積障害を治療するための方法に関する。
【０１４４】
ニーマンピック病
ニーマンピック病（ＮＰＤ）は、系統名がスフィンゴミエリンホスホジエステラーゼである酸性スフィンゴミエリナーゼ酵素（ａＳＭａｓｅ）の欠損によって引き起こされる。大量の膜スフィンゴミエリンが、リソソーム酵素ａＳＭａｓｅによって加水分解されてセラミド（およびホスホコリン）が生成される。スフィンゴミエリンは、短い親水性ホスホリルコリン部分に結合されたセラミド膜アンカーからなる。
【０１４５】
スフィンゴミエリナーゼは、既知の活性化タンパク質のいずれにも大きく依存していないため、ａＳＭａｓｅの推定分子内活性化ドメインおよびリソソーム中の負に帯電した脂質の存在が、スフィンゴミエリンの代謝に十分である。したがって、ａＳＭａｓｅは、補助因子としてサポシンの存在を必要としないが；サポシンの存在は、この酵素の活性を一定にさらに刺激する（Ｆｅｒｌｉｎｚら、１９９９）。ａＳＭａｓｅ活性は、ＢＭＰによって刺激される。
【０１４６】
スフィンゴミエリンを適切に代謝できない場合は、スフィンゴミエリンが細胞内に蓄積され、最終的に細胞死および主な器官系の機能不全が起きる。症状には、筋肉協調運動の欠如、脳の変性、学習障害、筋緊張の喪失、接触に対する感度の上昇、痙縮性、摂食および嚥下困難、不明瞭言語、ならびに肝臓および脾臓の肥大が含まれ得る。角膜の曇り、および網膜の中心の周りの特徴的なチェリーレッドの輪（ｃｈｅｒｒｙ−ｒｅｄ  ｈａｌｏ）が生じることがある。
【０１４７】
ニーマンピック病（ＮＰＤ）には、４つの関連型；Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型がある。すべての型のＮＰＤは、常染色体劣性パターンで遺伝し、男性および女性の両方で発症し得る。Ａ型およびＢ型では、酵素ａＳＭａｓｅの不十分な活性が、有毒量のスフィンゴミエリンを蓄積させる。この疾患は、個人のａＳＭａｓｅ遺伝子の両方のコピー（両方の対立遺伝子）に突然変異があると起こる。
【０１４８】
最も一般的な型であるニーマンピックＡ型（ＮＰＤＡ）は乳児に起きる。ＮＰＤＡは、黄疸、肝臓肥大、および深刻な脳損傷によって特徴付けられる。現在、Ａ型の患者の有効な治療は存在せず、Ａ型の患者は、通常は１８ヶ月になる前に乳児で死亡する。
【０１４９】
ニーマンピックＢ型（ＮＰＤＢ）は、通常は１３歳未満で肝臓および脾臓の肥大が起き、呼吸困難が一般的である。器官の肥大および呼吸困難は、心血管ストレスを引き起こし得、後年に心疾患をもたらし得る。ＮＰＤＢの患者は、通常は、殆どまたは全く神経障害が起きない。骨髄移植が少数のＢ型患者で行われ、様々な結果が報告された。酵素補充療法および遺伝子療法の今後の開発も、Ｂ型の患者に有効であろう。Ｂ型の子供は、比較的長生きし得るが、肺機能障害のために酸素補給を必要とし得る。
【０１５０】
ＮＰＤＡおよびＮＰＤＢは共に、同じ酵素の欠損で起こり、これら２つが連続体の正反対の位置を表すという証拠が増えている。ＮＰＤＡの患者は、通常は、ａＳＭａｓｅを殆どまたは全く産生しないが（正常の１％未満）、ＮＰＤＢの患者は、ａＳＭａｓｅの正常レベルの約１０％を有する。
【０１５１】
世界中で、約１，２００のＮＰＡおよびＮＰＢの症例が存在し、その殆どはＢ型または中間型である。
【０１５２】
ＮＰＤＡおよびＮＰＤＢは、血液サンプルの白血球におけるａＳＭａｓｅの活性レベルを測定することによって診断される。この試験は、Ａ型およびＢ型の患者を同定するが、キャリア（ＡＳＭ遺伝子の機能しないコピーの一方のみを有する）の検出についての信頼性はそれほど高くない。さらに、この試験は、ａＳＭａｓｅの活性の低下を示すが、個体が、Ａ型、Ｂ型、または個体の臨床評価を必要とする疾患の中間型を有するか否かを常に推定できるものではない。
【０１５３】
ある集団では、特定の突然変異は、ａＳＭａｓｅ欠損の症例が高率である原因である。ＮＰＤＡの場合、突然変異Ｒ４９６Ｌ、ｆｓＰ３３０、およびＬ３０２Ｐは、アシュケナージ系ユダヤ人集団における９５％以上の疾患を引き起こす遺伝子の変化の原因である。これらの３つの変化についてのこの集団での個体の直接的な試験が、キャリアの同定に用いられる。他の集団では、これらの突然変異は、ＤＮＡキャリア試験を家族に対して行う前に、まず発症した個体で同定されなければならない。
【０１５４】
ＮＰＤＢの場合、Ｈ４２１ＹおよびＫ５７６Ｎ  ａＳＭａｓｅ突然変異は、サウジアラビア人ＮＰＤＢ集団の８５％の原因であり；Ｌ１３７Ｐ、ｆｓＰ１８９、およびＬ５４９Ｐ突然変異は、トルコ人ＮＰＤＢ集団の７５％の原因であり；Ｓ３７９Ｐ、Ｒ４４１Ｘ、およびＲ４７４Ｗ突然変異は、ポルトガル人ＮＰＤＢ集団の５５％の原因であり；Ａ１９６Ｐ突然変異は、イギリス人／スコットランド人ＮＰＤＢ集団の４２％の原因であり、そして突然変異Ｆ４８０ＬおよびＤｅｌｔａＲ６０８も、ＮＰＤＢ患者における病原として同定された。
【０１５５】
ニーマンピックＣ型（ＮＰＤＣ）は、Ａ型やＢ型とは著しく異なる。ＮＰＤＣ患者は、細胞内のコレステロールおよび他の脂質を適切に代謝することができず、脳細胞間でのコレステロールの輸送を妨げる欠損によって特徴付けられる。結果として、過剰な量のコレステロールおよび他の脂質が、肝臓、脾臓、および脳内に蓄積する。ＮＰＤＣは、ａＳＭａｓｅ活性の二次的な減少を引き起こし、これにより３つすべての型が同じ疾患の形態と見なされる。
【０１５６】
Ｃ型の症状がいつ最初に現れるか、および疾患の進行において、かなりのばらつきが存在する。症状は、早ければ生後２、３ヶ月で現れ、遅ければ成人してから現れることもある。幼児における垂直注視まひ（眼を上下に動かせなくなること）、肝臓肥大、脾臓肥大、または黄疸が、ＮＰＣと見なす強力な指標である。疾患の早期には唯１つまたは２つの症状が現れるのが一般的である。大抵の場合、神経症状は、４〜１０歳の間に現われ始める。一般に、神経症状の始まりが遅ければ遅いほど、疾患の進行が遅い。
【０１５７】
Ｃ型ニーマンピック病は、世界中で約５００件の診断がある。しかし、ＮＰＤＣを発症した患者数はもっと多いと思われるが、診断の困難さから、発生率の正確な評価ができない。ＮＰＤＣは、当初は学習障害、中程度の遅滞、不器用、および微細運動技能の発達の遅れとして診断される。
【０１５８】
ニーマンピックＤ型は、現在は、Ｃ型の変形と見なされている。Ｄ型は、通常は、祖先がノバスコシア州出身である人々に起きる。Ｃ型およびＤ型の患者は、コレステロールの低い食事を摂らせられる場合が多いが、その臨床効果は説得力がない。Ｃ型およびＤ型の患者の平均余命にはばらつきがあるが、この疾患は常に致死性である。大多数の子供は、２０歳前に死亡する。
【０１５９】
ＮＰＤＣは、稀で極めて変わりやすい状態であるため、一部の医療従事者は、見分けることができないことがある。患者にこの疾患を疑う専門医の場合は、ＮＰＤＣは、皮膚生検、線維芽細胞の培養、およびコレステロールの輸送および貯蔵能力の検査を行うことによって判定され得る。細胞におけるコレステロールの輸送が、コレステロールのある型から別の型への転換（エステル化）を測定することによって検査された。コレステロールの貯蔵は、紫外線下で光る化学物質（フィリピン）で細胞を染色することによって評価される。
【０１６０】
１９９７年に、ＮＰＣ１遺伝子が同定された。この遺伝子の突然変異または疾患を引き起こす変化が、すべてのＮＰＤＣの症例の約９５％に関与する。それ以来、ＮＰＤＣに関連する２５０を超える異なる遺伝子の突然変異が、この遺伝子、およびＮＰＣ２と呼ばれる第２のＮＰＤＣ遺伝子で同定された。全体として、約９５％の症例で、ＮＰＣの診断が概略を上述した試験によって最初に確認された場合は、この疾患を引きこした遺伝子の変化を同定することが可能である。しかし、これらの遺伝子にはあまりにも多くの固有の突然変異があり、かつ突然変異が同定されていない古典的なＮＰＣの患者が存在するため、ＮＰＤＣの一般的な診断ツールとして遺伝子試験を使用することは最良ではない。
【０１６１】
ニーマンピック病は、北米、南米、欧州、アフリカ、アジア、およびオーストラリアから症例が報告された集団のすべての区分で発症する。しかし、特定の集団で高い発生率が見られた。
・アシュケナージ系ユダヤ人集団（ＮＰＤＡおよびＮＰＤＢ）
・ノバスコシア州のフランス系カナダ人集団（Ｄ型−現在はＮＰＤＣの変形と見なされている）
・北アフリカのマグレブ地域（チュニジア、モロッコ、およびアルジェリア）（ＮＰＤＢ）
・南部のニューメキシコ州およびコロラド州のスペイン系アメリカ人集団（ＮＰＤＣ）
【０１６２】
本発明は、一実施形態では、酸性スフィンゴミエリナーゼ酵素（ａＳＭａｓｅ）活性の調節によってニーマンピック病を治療するための方法に関する。
【０１６３】
ファーバー病
ファーバー病は、酸性セラミダーゼ酵素の欠陥によって引き起こされる。酸性セラミダーゼは、セラミドのスフィンゴシン（および脂肪酸）への変換に関与し；従ってこの欠陥は、セラミドの蓄積をもたらす。その活性は、ＢＭＰによって刺激され、サポシンに依存する。
【０１６４】
酸性セラミダーゼは、Ｎ−アシルスフィンゴシンアミドヒドロラーゼとしても知られ、遺伝子ＡＳＡＨ１によってコードされる。酸性セラミダーゼは、非グリコシル化αサブユニットおよび翻訳後に成熟酵素に切断されるグリコシル化βサブユニットからなるヘテロ二量体タンパク質である。
【０１６５】
ファーバー病は、ファーバーの脂肪肉芽腫症、セラミダーゼ欠損、線維芽細胞ムコ多糖異常症（Ｆｉｂｒｏｃｙｔｉｃ  ｄｙｓｍｕｃｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏｓｉｓ）、および脂肪肉芽腫症としても知られている。ファーバー病は、関節、肝臓、喉、組織、および中枢神経系の異常によって特徴付けられる非常に稀な常染色体劣性疾患である。肝臓、心臓、および腎臓も影響を受け得る。症状は、典型的には、生後２、３週間の内に現れ、運動および知能の障害ならびに嚥下困難を伴う。他の症状には、関節炎、リンパ節および関節の腫大、嗄声、皮膚（ならびに、時には肺および体の他の部分）の下の小結節、関節周囲の筋肉または腱の慢性収縮、ならびに嘔吐が含まれ得る。発症した患者は、呼吸管の挿入を必要とすることがある。重度の症例では、肝臓および脾臓が肥大する。現在、ファーバー病の専用の治療は存在しない。コルチコステロイドは、痛みの緩和に役立ち得る。結節は、場合によっては、骨髄移植で治療することができ、外科的に縮小または除去してもよい。古典的な型のファーバー病の殆どの子供は、通常は肺疾患で２歳までに死亡する。軽い型のファーバー病の患者は、１０代まで生存し得る。
【０１６６】
本発明は、一実施形態では、酸性セラミダーゼ酵素活性の調節によってファーバー病を治療するための方法に関する。
【０１６７】
クラッベ病
クラッベ病は、β−ガラクトシルセラミダーゼ酵素の欠陥によって引き起こされる。β−ガラクトシルセラミダーゼは、ガラクトシルセラミドのセラミドへの変換に関与し；従ってその欠陥は、ガラクトシルセラミドの蓄積をもたらす。その活性は、ＢＭＰによって刺激され、サポシンに依存する。
【０１６８】
クラッベ病は、グロボイド細胞白質ジストロフィーまたはガラクトシルセラミドリピドーシスとしても知られている。クラッベ病は、稀であり、しばしば、神経系のミエリン鞘に影響を与える致死性の変性常染色体劣性疾患である。クラッベ病は、出生数１００，０００に対して約１の割合で起きる。６，０００に約１の高い有病率が、イスラエルの一部のアラブ地域社会で報告されている。
【０１６９】
クラッベ病は、ガラクトシルセラミダーゼ酵素の欠損を引き起こすＧＡＬＣ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。脂質の蓄積は、神経を保護するミエリン鞘（多くの神経を隔離する覆い）の成長に影響を与え、いくつかの運動技能の深刻な退化をもたらす。
【０１７０】
クラッベ病の乳児は、誕生時は正常である。症状は、生後３〜６ヶ月の間に、被刺激性、発熱、手足の硬直、発作、摂食困難、嘔吐、ならびに精神および運動の発達の遅れから始まる。疾患の第１期では、医師は、しばしば、脳性まひの症状と取り違えることがある。他の症状には、筋力低下、痙性、難聴、視神経萎縮および失明、麻痺、および嚥下困難が含まれる。長期に渡る体重減少も起こり得る。症状は類似しているが進行が遅い若年および成人発症クラッベ病も存在する。乳児では、この疾患は、一般的に２歳前に死亡する。後期発症クラッベ病の患者は、疾患の進行が遅く、かなり長生きである。
【０１７１】
クラッベ病の治癒法は存在しないが、骨髄移植が、疾患の過程の初期の症例では有効であることが示されている。一般に、障害の治療は、対症および支持性である。理学療法は、筋緊張および循環の維持または上昇に役立ち得る。最近の研究により、臍帯血移植が、明らかな症状が現れる前に行われれば、この疾患の進行停止に成功することが報告されている。
【０１７２】
本発明は、一実施形態では、β−ガラクトシルセラミダーゼ酵素活性の調節によってクラッベ病を治療するための方法に関する。
【０１７３】
ファブリー病
ファブリー病は、α−ガラクトシダーゼＡ酵素の欠陥によって引き起こされる。α−ガラクトシダーゼＡは、グロボトリアオシルセラミドのラクトシルセラミドへの変換に関与し；従ってこの欠陥は、グロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３、ＧＬ−３、またはセラミドトリヘキソシド（ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｔｒｉｈｅｘｏｓｉｄｅ）とも略される）の蓄積をもたらす。その活性は、ＢＭＰによって刺激され、サポシンに依存する。
【０１７４】
ファブリー病は、アンダーソンファブリー病、びまん性体部被角血管腫、ロイターポンペンワイヤーズ症候群（Ｒｕｉｔｅｒ−Ｐｏｍｐｅｎ−Ｗｙｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、セラミドトリヘキソシドーシス（Ｃｅｒａｍｉｄｅ  ｔｒｉｈｅｘｏｓｉｄｏｓｉｓ）、およびスウィーリークリオンスキー病（Ｓｗｅｅｌｅｙ−Ｋｌｉｏｎｓｋｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）としても知られている。ファブリー病は、ヘテロ接合およびホモ接合女性の両方はもちろん、半接合男性が発症するＸ連鎖劣性（先天性）疾患であり；男性は、最も重度の臨床症状を経験する傾向にあるが、女性は、実質的に無症状から男性と同じほど重症の症状まで様々である。このばらつきは、女性の胚発生中のＸ染色体不活性化パターンによるものであると思われる。
【０１７５】
症状には、無汗症（発汗欠如）、疲労、角化血管腫（毛細管の良性皮膚傷害）、焼け付く極度の痛み、および眼の病変が含まれる。角化血管腫は、体のあらゆる部位に現れる小さい無痛の丘疹であるが、大腿、臀部、下腹部、および鼠径部で顕著である。渦巻状角膜（渦角膜症としても知られる）を示す表面的な眼の病変が現れることがある。角膜症は、無症状性キャリアの特徴を現すものであり得、渦角膜症の他の原因（例えば、角膜における薬物沈着）とは区別されなければならない。見ることができる他の眼の知見には、結膜動脈瘤、後放射状白内障（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｓｐｏｋｅ−ｌｉｋｅ  ｃａｔａｒａｃｔ）、乳頭浮腫、黄斑浮腫、視神経萎縮、および網膜血管拡張が含まれる。腎合併症は、この疾患の一般的かつ重大な影響であり；腎不全および腎機能不全が、一生を悪化させ得る。タンパク尿は、しばしば、腎機能障害の最初の徴候である。心合併症も起きることがあり；心臓に関連した影響が年齢と共に悪化し、心疾患のリスクの増加をもたらすことがある。脳血管の影響は、卒中のリスクの増加をもたらす。他の症状には、耳鳴り、眩暈、悪心、および下痢が含まれる。
【０１７６】
症状は、典型的には、幼少期に最初に現われ、理解することが非常に困難であり得；ファブリー病の希少性から、多くの医師が、時には誤診または無視をすることがある。疾患の症状は、通常は、年齢が上がるにつれて数および重症度が増す。
【０１７７】
つい最近まで、ファブリー病の治療は、対症効果に的を絞っていた。しかし、ファブリー病は、現在は、アガルシダーゼα（Ｒｅｐｌａｇａｌ）およびアガルシダーゼβ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ）を用いる酵素補充療法（ＥＲＴ）によって細胞レベルで治療される。これらの薬物のコストは、問題であり（患者１人当たり年に約２５０，０００ＵＳドル）、一部の国々では多くの患者の障壁となっている。酵素補充療法（典型的には、２週間ごとの注入）は、患者自身によって患者の自宅で行うことができる。酵素補充療法は、治癒法ではなく、最大の効果を得るために繰り返し注入しなければならない。
【０１７８】
本発明は、一実施形態では、α−ガラクトシダーゼＡ酵素活性の調節によってファブリー病を治療するための方法に関する。
【０１７９】
ゴーシェ病
ゴーシェ病は、グルコシルセラミダーゼ酵素（グルコセレブロシダーゼおよび酸性β−グルコシダーゼとしても知られる）；５５．６ＫＤ、４９７のアミノ酸長のタンパク質の欠陥によって引き起こされる。グルコシルセラミダーゼは、グリコシルセラミド（またはグルコセレブロシド）のセラミドへの変換に関与し；従ってこの欠陥は、グリコシルセラミドの蓄積をもたらす。その活性は、ＢＭＰによって刺激され、サポシンに依存する。
【０１８０】
ゴーシェ病は、最も一般的なリソソーム蓄積症である。脂肪質が、脾臓、肝臓、腎臓、肺、脳、および骨髄に集まり得る。症状には、脾臓および肝臓の肥大、肝機能不全、痛みを伴い得る骨障害および骨病変、重度の神経系の合併症、リンパ節および（時には）近接する関節の腫れ、腹部膨張、茶色くなった皮膚、貧血、低血小板、および強膜における黄色脂肪の蓄積が含まれ得る。最も重度の患者は、感染症にも罹りやすいであろう。
【０１８１】
この疾患は、常染色体劣性遺伝を示すため、男性および女性の両方で発症する。グルコシルセラミダーゼの異なる突然変異が、残存する酵素活性と、かなりの程度、表現型を決定する。研究により、特定のグルコシルセラミダーゼ突然変異のヘテロ接合体が、パーキンソン病および特定の悪性腫瘍（非ホジキンリンパ腫、黒色腫、および膵臓癌）のリスクが高いことが示された。
【０１８２】
グリコシルセラミドは、赤血球および白血球の細胞膜成分である。これらの細胞を除去するマクロファージは、原繊維に蓄積して、光学顕微鏡検査では丸めた紙のように見えるゴーシェ細胞になる老廃物を除去することができない。
【０１８３】
ゴーシェ病は、３つの一般的な臨床サブグループを有する。各型は、特定の突然変異に関係している。全体で、約８０の既知の突然変異が存在する。
・Ｉ型（または非神経病型）は、この疾患の最も一般的な型であり、出生数５０，０００に対して約１の割合で発生する。Ｉ型は、アシュケナージ系ユダヤ人を先祖に持つ人々で最もよく発生し、一般的な民衆の１００倍の発生率である。症状は、人生の初期または成人期に始まり、肝臓肥大および著しい脾臓肥大（肝脾腫を伴う）を含み；脾臓が破裂して別の合併症を引き起こし得る。骨格の弱さおよび骨疾患が、広範囲に及び得る。脾臓肥大および骨髄置換は、貧血、血小板減少、および白血球減少を引き起こす。脳は冒されないが、肺および稀に腎障害が起こり得る。この群の患者は、通常は、あざができやすく（低レベルの血小板のため）、赤血球の数が少ないため疲れやすい。疾患の発症および重症度によって、Ｉ型患者は、成人まで十分に生存し得る。多くの患者は、軽症型の疾患であるか、または全く症状を示さないこともある。
・ＩＩ型（または急性乳児神経障害性ゴーシェ病）は、典型的には、生後６ヶ月で発症し、出生数１００，０００に対して約１の発症率を有する。症状には、肝臓および脾臓の肥大、広範かつ進行性の脳損傷、眼球運動障害、痙性、発作、手足の硬直、ならびに吸引力および嚥下力の低下が含まれる。発症した子供は、通常は２歳までに死亡する。
・ＩＩＩ型（慢性神経障害型）は、小児期の任意の時期、または成人期でさえも発症し得、出生数１００，０００に対して約１の割合で発症する。ＩＩＩ型は、遅い進行性によって特徴付けられるが、急性または２型に比べて神経症状が軽度である。主な症状には、脾臓および／または肝臓の肥大、発作、協調運動不全、骨格異常、眼球運動障害、貧血を含む血液疾患、および呼吸障害が含まれる。患者は、しばしば、１０代前半および成人期まで生存する。
【０１８４】
国立ゴーシェ基金（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇａｕｃｈｅｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によると、発症率が４０，０００人に１人とすると、米国の一般的な集団の約１００人に１人が１型ゴーシェ病のキャリアであり、アシュケナージ系ユダヤ人では、キャリアの割合が、約１５人に１人とかなり高い。２型ゴーシェ病は、どの民族集団に対しても特定の優先傾向を示さない。３型ゴーシェ病は、５０，０００人に１人の発症率であるノルボッテンの北スウェーデン人地域の集団で特に一般的である。
【０１８５】
１型患者および殆どの３型患者では、静脈内組換えグルコシルセラミダーゼを用いる酵素補充療法は、肝臓および脾臓の大きさを縮小し、骨格異常を減少させ、そして他の発現を逆転させることができる。この疾患の希少性は、用量設定試験の実施が困難であるため、最適な用量および投与頻度をめぐる論争が続いていることを意味する。発症率の低さから、これは、多くの国々でオーファンドラッグとなっている。ゴーシェ病の既存の治療薬、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（注射用のイミグルセラーゼ）は、１人の患者に付き年間最大５５０，０００ドルかかり、この治療を生涯続けなければならない。ミグルスタットは、２００３年にこの疾患のために承認された別の薬物である。
【０１８６】
骨髄移植の成功は、活性なグルコシルセラミダーゼを有する単球集団を導入するため、この疾患の非神経学的症状を治癒する。しかし、この方法は、重大なリスクを伴い、ゴーシェ患者では稀にしか行われない。患者が貧血性であるか、または肥大した器官が患者の快適性を損なう場合は、稀に、脾臓を除去する外科手術（脾臓摘出）を必要とすることもある。輸血は、一部の貧血患者に有効な場合がある。他の患者は、運動性および生活の質を改善するために関節置換手術が必要な場合もある。他の治療選択肢には、感染用の抗生物質、発作用の抗てんかん薬、骨病変用のビスフォスフォネート、および肝臓移植が含まれる。
【０１８７】
基質抑制療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、脳内への血液障壁を通過できるため、２型の阻止に有効であることを証明することができる。現在は、２型および３型ゴーシェ病の患者に起こり得る重度の脳損傷の有効な治療が存在しない。
【０１８８】
本発明は、一実施形態では、グルコシルセラミダーゼ酵素活性の調節によってゴーシェ病を治療するための方法に関する。
【０１８９】
シアリドーシス
シアリドーシスまたはムコリピドーシスＩ型（ＭＬ  Ｉ）は、シアリダーゼ酵素（またはα−ノイラミニダーゼ）の欠陥によって引き起こされる。シアリダーゼは、ＧＭ３のラクトシルセラミドへの変換に関与し；従ってこの欠陥は、ＧＭ３の蓄積をもたらす。その活性は、ＢＭＰによって刺激され、サポシンに依存する。
【０１９０】
シアリドーシスは、常染色体劣性的に遺伝する。症状は、出生時に現れるか、または生後１年以内に発生する。多くの発症した乳児では、出生時に体中の過剰な腫れが顕著である。これらの乳児は、しばしば、平坦な鼻梁、目蓋浮腫、歯茎の腫脹、および過剰に大きい舌（巨大舌）などの粗雑な顔の特徴を持って誕生する。多くの乳児はまた、股関節脱臼などの骨格奇形で誕生する。乳児は、しばしば、突然の不随意筋の収縮（ミオクローヌスと呼ばれる）を発症し、眼に赤色斑（チェリーレッドの斑点）を有する。乳児は、しばしば、随意運動を調整することができない（運動失調と呼ばれる）。振戦、視力障害、および発作も起こす。試験は、異常な肝臓肥大（肝腫（ｈｅｐｔｏｍｅｇａｌｙ））および脾臓肥大（脾腫）、ならびに極度の腹部膨張を明らかにする。乳児は、一般的に、筋緊張が欠如し（筋緊張低下）、初期から重度であるか、または徐々に重度になる精神遅滞を有する。多くの患者は、成長障害および再発性呼吸器感染症を患う。ＭＬ  Ｉの殆どの乳児は、１歳前に死亡する。
【０１９１】
シアリドーシスは、症状が始まる年齢および現れた症状の種類によって下位分類することができる。この疾患の影響は、軽度から重度までの範囲であり得る。
【０１９２】
シアリドーシスは、人種で偏向がない希少な障害である。ほんの僅かな集団データしか利用可能でないが、オランダの研究は、出生数２，１７５，０００に対して約１の症例の頻度であることを報告している。しかし、この割合は、すべての集団に当てはまるものではなく、一部はより高い発生率を有し得；さらに、新生児のスクリーニングという選択肢がない場合は、臨床的認知のミスは、重要な因子である。
【０１９３】
シアリドーシスの治療の選択肢は、限られたままであり、主に支持療法および症状軽減に向けられている。
【０１９４】
本発明は、一実施形態では、シアリダーゼ活性の調節によってシアリドーシスを治療するための方法に関する。
【０１９５】
異染性白質ジストロフィー
異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）またはアリールスルファターゼＡ欠損は、アリールスルファターゼＡ酵素（またはセレブロシド−スルファターゼ）の欠陥によって引き起こされる。アリールスルファターゼＡは、スルファチド（またはセレブロシド３−硫酸）のガラクトシルセラミドへの変換に関与し；従ってこの欠陥は、スルファチドの蓄積をもたらす。その活性は、ＢＭＰによって刺激され、サポシンに依存する。
【０１９６】
ＭＬＤは、白質ジストロフィーのファミリーによく列記されるリソソーム蓄積症である。白質ジストロフィーは、中枢神経系および末梢神経系全体に渡る神経線維の周りのインシュレーターとして機能する脂肪の覆いであるミエリンの成長および／または発生に影響を及ぼす。
【０１９７】
脂質の代謝に影響を及ぼす多くの他の遺伝障害と同様に、幼児後期型、若年型、および成人型などのいくつかのＭＬＤの型が存在する。
・最も一般的な型のＭＬＤである幼児後期型では、発症した子供は、生後１年で歩行困難が始まる。症状には、筋肉の疲労および衰弱、筋肉の硬直、発育遅延、失明をもたらす進行性の視力低下、痙攣、嚥下障害、麻痺、および痴呆が含まれる。子供は、昏睡状態になることがある。治療しないと、この型のＭＬＤの殆どの子供は、５歳までに死亡し、それよりも遥か前に死亡する場合が多い。
・若年型のＭＬＤ（３〜１０歳で発症）の子供は、通常は、学業困難、知能の低下、および痴呆で始まり、そして幼児後期型に類似しているが進行が遅い症状を起こす。死亡する年齢は様々であるが、通常は発症から１０〜１５年以内である。
・成人型は、一般に、精神障害または進行性認知症として１６歳以降に始まる。成人発症ＭＬＤは、幼児後期型および若年型よりも進行が遅く、１０年以上の長期に渡る。
【０１９８】
稀な症例では、体がその欠損を補って、患者が症状を示さないこともある。
【０１９９】
ＭＬＤの治癒法および標準的な治療が存在しないため、ＭＬＤは末期疾患である。若年後期または成人で発症する子供、および症状を示す幼児後期の患者は、治療が痛みと症状の管理に限定されている。発症前または軽度から中程度の症状を示す若年または成人ＭＬＤ患者はもちろん、発症前の幼児後期ＭＬＤ患者は、研究中の骨髄移植（幹細胞移植を含む）の選択肢がある。
【０２００】
本発明は、一実施形態では、アリールスルファターゼＡ酵素活性の調節によって異染性白質ジストロフィーを治療するための方法に関する。
【０２０１】
サポシン欠損
ヒトおよびマウスの両方において、プロサポシン／サポシン欠損は、重度の神経障害をもたらす。
【０２０２】
サポシンＡ、Ｂ、およびＣに点突然変異を持つヒト患者は、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、およびゴーシェ病の表現型を示し、サポシンＡ、Ｂ、およびＣの主なｉｎ  ｖｉｖｏ基質がそれぞれ、ガラクトシルセラミド、スルファチド、およびグルコシルセラミドであることを示唆している。
【０２０３】
サポシンＡの欠損による異型クラッベ病：生後２、３ヶ月以内に神経退行をもたらす遺伝性生化学的障害。通常は、生後２、３年で死亡する。この障害は、クラッベ病に類似しているが、生化学的欠陥の遺伝子起源によって区別される。クラッベ病は、ガラクトセレブロシダーゼ遺伝子の欠陥を伴い、異型クラッベ病は、サポシンＡの欠損をもたらすプロサポシン遺伝子の欠陥を伴う。
【０２０４】
以前はＳＡＰ−１およびスルファチド活性化因子として知られていたサポシンＢは、セレブロシド硫酸、ＧＭ１ガングリオシド、およびグロボトリアオシルセラミドを含む様々な基質の加水分解を、アリールスルファターゼＡ、酸性β−ガラクトシダーゼ、およびα−ガラクトシダーゼのそれぞれによって刺激する。常染色体劣性遺伝するヒトサポシンＢの欠損は、正常のアリールスルファターゼ活性を有するが、セレブロシド硫酸の組織蓄積および異染性白質ジストロフィーに似た臨床像（活性化因子欠損異染性白質ジストロフィー）をもたらす。サポシンＢの欠損は、スペクトルが異染性白質ジストロフィーのスペクトルに類似した異種疾患（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）である。
【０２０５】
サポシン（ＳＡＰ−）Ｃは、グルコシルセラミドの分解に必要であり、その欠損は、変異型のゴーシェ病；ＳＡＰ−Ｃの欠損による非ニューロノパシーゴーシェ病（ｎｏｎ−ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｉｃ  Ｇａｕｃｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）を引き起こす。血漿中の非常に高いレベルのキトトリオシダーゼ活性、ケモカインＣＣＬ１８、およびグルコシルセラミドの濃度の上昇、ならびに皮膚線維芽細胞における正常なβ−グルコシダーゼ活性が患者で観察された。ＳＡＰ−Ｃドメインに位置するミスセンス突然変異、ｐ．Ｌ３４９Ｐおよびプロサポシン前駆タンパク質の開始コドンに位置する別の突然変異、ｐ．Ｍ１Ｌが同定された。
【０２０６】
２、３の非ニューロノパシーゴーシェ患者では、サポシンＣおよびサポシンＤの両方で突然変異が同定された。
【０２０７】
マウスにおけるサポシンＣおよびＤの同時欠損は、グルコシルセラミドおよびα−ヒドロキシセラミドが蓄積するニュロノパシー表現型をもたらす。
【０２０８】
マウスでは、サポシンＤの欠損は、セラミドの蓄積、プルキンエ細胞の部分喪失、および泌尿系機能障害に関連する。この表現型は、サポシンＤの同種酵素である酸性セラミダーゼが完全に欠損したマウスが示す胚死亡率に類似していない。
【０２０９】
４つすべてのサポシンおよびプロサポシンの完全な不活性化をもたらす２つの突然変異がヒトで知られている。完全なサポシンの欠損は、複数の器官および複数のスフィンゴ脂質が関係する破壊的な疾患である。複合サポシン欠損（またはプロサポシン欠損）が、新生児としての死を引き起こす重度の内臓神経ジストロフィーを示す症例で報告された。複数のスフィンゴ脂質が尿中で上昇し、グロボトリアオシルセラミドが最大の上昇を示した。エキソン１０の２塩基上流のスプライス受容部位突然変異に対してホモ接合性であるＰＳＡＰ遺伝子の新規な突然変異が同定された。この突然変異は、中途終止コドンの原因となり、低レベルの転写をもたらす。
【０２１０】
本発明は、一実施形態では、サポシン欠損を治療するための方法に関する。前記サポシン欠損は、サポシンＡ欠損、サポシンＢ欠損、サポシンＣ欠損、サポシンＣ欠損、および複合サポシン欠損（またはプロサポシン欠損）からなる群から選択され得る。
【０２１１】
残存酵素活性
リソソーム蓄積症は、概略を上述したように、欠陥酵素によって引き起こされる。前記欠陥酵素は、残存活性を有していないか、または一定の残存活性を有し得る。
【０２１２】
本明細書で使用される残存酵素活性は、酵素が、例えば、突然変異によって欠陥があるが、その酵素活性が完全には無効にはならず、病理学的レベルまでかなり低下したことを意味する。
【０２１３】
本発明は、一態様では、リソソーム蓄積症の治療に使用するための生理活性剤、およびリソソーム蓄積症の患者の治療方法に関する。
【０２１４】
本発明の一実施形態では、本発明によって治療されるリソソーム蓄積症は、この疾患の病理に関与する欠陥酵素の残存酵素活性を有するとして特徴付けられる。
【０２１５】
一実施形態では、前記残存酵素活性は、０．１％〜５０％の範囲であり、例えば、０．１〜１％、例えば、１〜２％、例えば、２〜３％、例えば、３〜４％、例えば、４〜５％、例えば、５〜６％、例えば、６〜７％、例えば、７〜８％、例えば、８〜９％、例えば、９〜１０％、例えば、１０〜１１％、例えば、１１〜１２％、例えば、１２〜１３％、例えば、１３〜１４％、例えば、１４〜１５％、例えば、１５〜２０％、例えば、２０〜２５％、例えば、２５〜３０％、例えば、３０〜３５％、例えば、３５〜４０％、例えば、４０〜４５％、例えば、４５〜５０％の範囲の残存酵素活性である。
【０２１６】
ＬＳＤの現在の治療方式
リソソーム蓄積症の治癒法は存在せず、骨髄移植および酵素補充療法（ＥＲＴ）が試され、ある程度の成功を収めているが、治療は殆どが対症である。加えて、臍帯血移植は、多数のこれらの疾患用の専門センターで行われている。しかし、移植療法は、大きな副作用を伴い、しばしば、患者に合併症をもたらす。加えて、基質抑制療法、すなわち貯蔵物質の蓄積を減少させるために使用される方法は、現在、これらの一部の疾患に対して評価されている。
【０２１７】
殆どのリソソーム蓄積症には、有効な治療方式を提供するという、満たされていない重要な要求が残っている。
【０２１８】
酵素補充療法は、一部のリソソーム蓄積症に対して開発され、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）が、ゴーシェ病の治療のために何年も前から市販されている。欠陥酵素、グルコセレブロシダーゼは、組換え技術によって作製され、２、３時間に渡って静脈内注射によって投与される。治療は、治癒ではなく、患者は、疾患の進行を止めるために生涯の治療を必要とする。一部の症状は、ＥＲＴによって改善することができる。
【０２１９】
しかし、殆どのＬＳＤでは、有効なＥＲＴが開発されていない。これは、欠陥酵素の複雑なサブユニット構造のために活性酵素の生産が困難な課題であることが立証されたためであろう。実際、酵素は、生産時に不正確に折り畳まれることがある。
【０２２０】
ＥＲＴが利用可能なそれらのＬＳＤでは、この治療形態の価値を下げる欠点が存在する。第１に、ＥＲＴは、極めて高価な治療形態であり、社会に財政負担をかけ、一部の患者には手が届かない。また、ＥＲＴは、明確に１つの疾患のみを標的とする。Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）に対して、免疫応答の発生、悪心、嘔吐、腹痛、下痢、発疹、疲労、頭痛、発熱、眩暈、悪寒、背痛、および頻脈、ならびにアレルギー反応を示す症状を含む一部の副作用が報告されている。
【０２２１】
したがって、本発明で行う開示は、リソソーム蓄積症の新規かつ革新的な治療法を提供する。この治療法は、有効な療法が開発されていないリソソーム蓄積症、安価な治療の恩恵を受け得るリソソーム蓄積症、および本発明の生理活性剤を含む併用療法の恩恵を受け得るリソソーム蓄積症に特に適している。
【０２２２】
上記開示したように、本発明による方法は、製造がＥＲＴよりもかなり安価であり、かつ２つ以上の特定のリソソーム蓄積障害を標的にする治療方式を提供する。
【０２２３】
本発明者らが、熱ショックタンパク質７０とリソソームＢＭＰとの間の相互作用が、上で紹介したようにリソソーム酵素活性の調節のための基礎を形成し、本発明によってリソソーム蓄積障害を治療できることを見出したため、分子シャペロンまたは熱ショックタンパク質を以下に紹介する。
【０２２４】
分子シャペロン
ＤＮＡの遺伝子コードをまず転写し、次いで翻訳する際に大量のエネルギーを消費して、細胞は、その時点で細胞の生存に必要と推定される機能を持つポリペプチドを最終的に産生する。しかし、これらの１つがこの未完成ポリペプチド鎖の正しい折り畳みである最終的な障害の一部を、完全に機能的なタンパク質を得るために乗り越えなければならない。正しい折り畳みを達成するための進化的な指令は、疑う余地がないほど明白である。なぜなら、適切な構造、従って機能を持たないペプチドを合成するためにはエネルギーをひどく無駄に浪費するだけではなく、細胞の内腔内でのこのようなタンパク質の凝集が細胞に有害であることを証明できるからである。この凝集は、実際、高いタンパク質濃度の細胞内環境を考慮すると、非常に起こりそうな結果であるため、タンパク質の複雑かつ高度な機構が、タンパク質の折り畳みを助けるために存在し、このような条件下でタンパク質の機能的な状態を維持可能であることは驚きではない。これらのタンパク質は、人間の場合と同様に、未成熟のクライアント（ｃｌｉｅｎｔ）間の不所望の相互作用を防止するため、まとめて分子シャペロンと呼ばれる。分子シャペロンは、タンパク質の構造の再構成が起こる細胞のすべての区画内で見られ、タンパク質合成が、細胞内の折り畳まれていないペプチドの主な源であるが、タンパク質を構造的に不安定にする、従って折り畳みがほどけて凝集させ得る高温または他の刺激への細胞の曝露によって、防御タンパク質の産生に関係する特定の細胞応答が行われる。この応答は、原核細胞から真核細胞に渡るどの細胞型でも観察される現象であり、熱ショック応答またはストレス応答と呼ばれる。この応答によって誘導されるタンパク質は、いくつかのファミリーが存在する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）として知られている。これらのファミリーは、経時的、構造的、および機能的にも関連したタンパク質から構成される一方、異なるファミリーのシャペロンは、構造および細胞機能の両方で大きく異なり得る。シャペロンファミリーの主な例は、真核細胞の殆どの区画、真正細菌、および多くの古細菌に存在する遍在性シャペロン系の中心部分を構成するＨｓｐ７０タンパク質である。このファミリーは、その抗アポトーシス特性、免疫におけるその機能、および癌細胞のＨｓｐ７０のアップレギュレーションへの明白な依存という最も際立ったシャペロンとしての役割に加えて、最近、細胞恒常性の他の側面にも関係していると見なされた。
【０２２５】
熱ショックタンパク質７０ファミリー
Ｈｓｐ７０タンパク質は、タンパク質の折り畳み、不安定な細胞タンパク質の分解、および他の細胞防御の役割を果たすことを含め、多様な細胞プロセスに関与する。これらのプロセスにおけるＨｓｐ７０の一般的な機能は、部分的に折り畳まれたポリペプチドの短い疎水性セグメントを結合して、これにより適切な折り畳みを促進し、凝集を防止することであると思われる。真核生物では、Ｈｓｐ７０シャペロンは、それらの機能的なサイクルの重要なステップを調節する働きをする異なるクラスのタンパク質；特にＪドメインファミリータンパク質Ｈｓｐ４０とｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用する。さらに、別のパートナータンパク質も同定され、その一部は、Ｈｓｐ７０をＨＳＰ９０系などの他のシャペロン系に結合している。
【０２２６】
ヒトＨｓｐ７０ファミリーのメンバー
分子シャペロンによる重要な機能の一部には、タンパク質の細胞区画内への輸入、細胞質ゾル、小胞体、およびミトコンドリア内でのタンパク質の折り畳み、タンパク質凝集の防止、ならびに誤って折り畳まれたタンパク質の再折り畳みが含まれる。現在、ヒトＨｓｐ７０ファミリーには、異なる遺伝子によってコードされる１０のメンバーが含まれ、この節は、機能、発現パターン、および相同性に関するこれらのファミリーメンバーの概略を説明するものとする。異なるヒトＨｓｐ７０ファミリーメンバーの命名法にはある種の混同が存在するが、遺伝子座名、遺伝子、およびタンパク質の間の論理的な関連性を提供する一連の一般ガイドラインがＴａｖａｒｉａらによって示されている。しかし、一部の種間の混同がなお存在するため、Ｈｓｐ７０遺伝子およびタンパク質は、本明細書では遺伝子座名で呼ばれる。名称Ｈｓｐ７０は、遺伝子座名がＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂである２つの誘導性Ｈｓｐ７０ファミリーメンバー、またはテキストの一致から明らかなように、一般にＨｓｐ７０ファミリー全般を指すことがある。しかし、本発明中で用いられる場合は、Ｈｓｐ７０は、遺伝子座名がＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂである２つの誘導性Ｈｓｐ７０ファミリーメンバーのいずれかを指すこと意味する。
【０２２７】
ＨｓｐＡ１ＡおよびＨｓｐＡ１Ｂ
遺伝子座ＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂから転写される遺伝子は、２つの熱／ストレス誘導性Ｈｓｐ７０遺伝子であり、ヒトＨｓｐ７０に関する文献の殆どは、それらの２つの遺伝子によってコードされるタンパク質に言及する。これらの遺伝子は、互いに９９％の相同性を有し、かつ最初にクローニングされ特徴付けられたヒトＨｓｐ７０ファミリーメンバーである、６４１のアミノ酸からなるタンパク質を産生する。これらの遺伝子は、６ｐ２１．３でＭＨＣクラスＩＩＩ複合体に結合され、イントロンが無く、プロモーター領域がＨＳＥを含み、これにより遺伝子をＨＳＦへ結合することが可能であり、様々な細胞攻撃に応答して転写を誘導する。
【０２２８】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）のタンパク質配列は、（配列番号１）（受託番号ＮＭ＿００５３４５．５）：
ＭＡＫＡＡＡＩＧＩＤＬＧＴＴＹＳＣＶＧＶＦＱＨＧＫＶＥＩ  ＩＡＮＤＱＧＮＲＴＴＰＳＹＶＡＦＴＤＴＥＲＬＩＧＤＡＡＫＮＱＶＡＬＮＰＱＮＴＶＦＤＡ  ＫＲＬＩＧＲＫＦＧＤＰＶＶＱＳＤＭＫＨＷＰＦＱＶＩＮＤＧＤＫＰＫＶＱＶＳＹＫＧＥＴＫＡＦＹＰＥＥＩＳＳＭＶＬＴＫＭＫＥＩＡＥＡＹＬＧＹＰＶＴ  ＮＡＶＩＴＶＰＡＹＦＮＤＳＱＲＱＡＴＫＤＡＧＶＩＡＧＬＮＶＬＲＩＩＮＥＰＴＡＡＡＩＡＹＧＬＤＲＴＧＫＧＥＲＮＶＬＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ  ＴＩＤＤＧＩＦＥＶＫＡＴＡＧＤＴＨＬＧＧＥＤＦＤＮＲＬＶＮＨＦＶＥＥＦＫＲＫＨＫＫＤＩＳＱＮＫＲＡＶＲＲＬＲＴＡＣＥＲＡＫＲＴＬＳＳＳＴＱＡ  ＳＬＥＩＤＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴＳＩＴＲＡＲＦＥＥＬＣＳＤＬＦＲＳＴＬＥＰＶＥＫＡＬＲＤＡＫＬＤＫＡＱＩＨＤＬＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＶＱＫＬＬ  ＱＤＦＦＮＧＲＤＬＮＫＳＩＮＰＤＥＡＶＡＹＧＡＡＶＱＡＡＩＬＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬＧＬＥＴＡＧＧＶＭＴＡＬＩＫＲＮＳＴＩ  ＰＴＫＱＴＱＩＦＴＴＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲＡＭＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧＩＰＰＡＰＲＧＶＰＱＩＥＶＴＦＤＩＤＡＮＧＩＬＮＶＴＡ  ＴＤＫＳＴＧＫＡＮＫＩＴＩＴＮＤＫＧＲＬＳＫＥＥＩＥＲＭＶＱＥＡＥＫＹＫＡＥＤＥＶＱＲＥＲＶＳＡＫＮＡＬＥＳＹＡＦＮＭＫＳＡＶＥＤＥＧＬＫＧ  ＫＩＳＥＡＤＫＫＫＶＬＤＫＣＱＥＶＩＳＷＬＤＡＮＴＬＡＥＫＤＥＦＥＨＫＲＫＥＬＥＱＶＣＮＰＩ  ＩＳＧＬＹＱＧＡＧＧＰＧＰＧＧＦＧＡＱＧＰＫＧＧ  ＳＧＳＧＰＴＩＥＥＶＤ
【０２２９】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ（ＨＳＰＡ１Ａ）の核酸（ＤＮＡ）配列は、（配列番号２）（受託番号ＮＭ＿００５３４５．５）：
１  ａｔａａａａｇｃｃｃ  ａｇｇｇｇｃａａｇｃ  ｇｇｔｃｃｇｇａｔａ  ａｃｇｇｃｔａｇｃｃ  ｔｇａｇｇａｇｃｔｇ  ｃｔｇｃｇａｃａｇｔ
６１  ｃｃａｃｔａｃｃｔｔ  ｔｔｔｃｇａｇａｇｔ  ｇａｃｔｃｃｃｇｔｔ  ｇｔｃｃｃａａｇｇｃ  ｔｔｃｃｃａｇａｇｃ  ｇａａｃｃｔｇｔｇｃ  
１２１  ｇｇｃｔｇｃａｇｇｃ  ａｃｃｇｇｃｇｃｇｔ  ｃｇａｇｔｔｔｃｃｇ  ｇｃｇｔｃｃｇｇａａ  ｇｇａｃｃｇａｇｃｔ  ｃｔｔｃｔｃｇｃｇｇ
１８１  ａｔｃｃａｇｔｇｔｔ  ｃｃｇｔｔｔｃｃａｇ  ｃｃｃｃｃａａｔｃｔ  ｃａｇａｇｃｇｇａｇ  ｃｃｇａｃａｇａｇａ  ｇｃａｇｇｇａａｃｃ  
２４１  ｇｇｃａｔｇｇｃｃａ  ａａｇｃｃｇｃｇｇｃ  ｇａｔｃｇｇｃａｔｃ  ｇａｃｃｔｇｇｇｃａ  ｃｃａｃｃｔａｃｔｃ  ｃｔｇｃｇｔｇｇｇｇ
３０１  ｇｔｇｔｔｃｃａａｃ  ａｃｇｇｃａａｇｇｔ  ｇｇａｇａｔｃａｔｃ  ｇｃｃａａｃｇａｃｃ  ａｇｇｇｃａａｃｃｇ  ｃａｃｃａｃｃｃｃｃ
３６１  ａｇｃｔａｃｇｔｇｇ  ｃｃｔｔｃａｃｇｇａ  ｃａｃｃｇａｇｃｇｇ  ｃｔｃａｔｃｇｇｇｇ  ａｔｇｃｇｇｃｃａａ  ｇａａｃｃａｇｇｔｇ
４２１  ｇｃｇｃｔｇａａｃｃ  ｃｇｃａｇａａｃａｃ  ｃｇｔｇｔｔｔｇａｃ  ｇｃｇａａｇｃｇｇｃ  ｔｇａｔｔｇｇｃｃｇ  ｃａａｇｔｔｃｇｇｃ
４８１  ｇａｃｃｃｇｇｔｇｇ  ｔｇｃａｇｔｃｇｇａ  ｃａｔｇａａｇｃａｃ  ｔｇｇｃｃｔｔｔｃｃ  ａｇｇｔｇａｔｃａａ  ｃｇａｃｇｇａｇａｃ
５４１  ａａｇｃｃｃａａｇｇ  ｔｇｃａｇｇｔｇａｇ  ｃｔａｃａａｇｇｇｇ  ｇａｇａｃｃａａｇｇ  ｃａｔｔｃｔａｃｃｃ  ｃｇａｇｇａｇａｔｃ
６０１  ｔｃｇｔｃｃａｔｇｇ  ｔｇｃｔｇａｃｃａａ  ｇａｔｇａａｇｇａｇ  ａｔｃｇｃｃｇａｇｇ  ｃｇｔａｃｃｔｇｇｇ  ｃｔａｃｃｃｇｇｔｇ
６６１  ａｃｃａａｃｇｃｇｇ  ｔｇａｔｃａｃｃｇｔ  ｇｃｃｇｇｃｃｔａｃ  ｔｔｃａａｃｇａｃｔ  ｃｇｃａｇｃｇｃｃａ  ｇｇｃｃａｃｃａａｇ
７２１  ｇａｔｇｃｇｇｇｔｇ  ｔｇａｔｃｇｃｇｇｇ  ｇｃｔｃａａｃｇｔｇ  ｃｔｇｃｇｇａｔｃａ  ｔｃａａｃｇａｇｃｃ  ｃａｃｇｇｃｃｇｃｃ
７８１  ｇｃｃａｔｃｇｃｃｔ  ａｃｇｇｃｃｔｇｇａ  ｃａｇａａｃｇｇｇｃ  ａａｇｇｇｇｇａｇｃ  ｇｃａａｃｇｔｇｃｔ  ｃａｔｃｔｔｔｇａｃ
８４１  ｃｔｇｇｇｃｇｇｇｇ  ｇｃａｃｃｔｔｃｇａ  ｃｇｔｇｔｃｃａｔｃ  ｃｔｇａｃｇａｔｃｇ  ａｃｇａｃｇｇｃａｔ  ｃｔｔｃｇａｇｇｔｇ
９０１  ａａｇｇｃｃａｃｇｇ  ｃｃｇｇｇｇａｃａｃ  ｃｃａｃｃｔｇｇｇｔ  ｇｇｇｇａｇｇａｃｔ  ｔｔｇａｃａａｃａｇ  ｇｃｔｇｇｔｇａａｃ
９６１  ｃａｃｔｔｃｇｔｇｇ  ａｇｇａｇｔｔｃａａ  ｇａｇａａａａｃａｃ  ａａｇａａｇｇａｃａ  ｔｃａｇｃｃａｇａａ  ｃａａｇｃｇａｇｃｃ
１０２１  ｇｔｇａｇｇｃｇｇｃ  ｔｇｃｇｃａｃｃｇｃ  ｃｔｇｃｇａｇａｇｇ  ｇｃｃａａｇａｇｇａ  ｃｃｃｔｇｔｃｇｔｃ  ｃａｇｃａｃｃｃａｇ
１０８１  ｇｃｃａｇｃｃｔｇｇ  ａｇａｔｃｇａｃｔｃ  ｃｃｔｇｔｔｔｇａｇ  ｇｇｃａｔｃｇａｃｔ  ｔｃｔａｃａｃｇｔｃ  ｃａｔｃａｃｃａｇｇ
１１４１  ｇｃｇａｇｇｔｔｃｇ  ａｇｇａｇｃｔｇｔｇ  ｃｔｃｃｇａｃｃｔｇ  ｔｔｃｃｇａａｇｃａ  ｃｃｃｔｇｇａｇｃｃ  ｃｇｔｇｇａｇａａｇ
１２０１  ｇｃｔｃｔｇｃｇｃｇ  ａｃｇｃｃａａｇｃｔ  ｇｇａｃａａｇｇｃｃ  ｃａｇａｔｔｃａｃｇ  ａｃｃｔｇｇｔｃｃｔ  ｇｇｔｃｇｇｇｇｇｃ
１２６１  ｔｃｃａｃｃｃｇｃａ  ｔｃｃｃｃａａｇｇｔ  ｇｃａｇａａｇｃｔｇ  ｃｔｇｃａｇｇａｃｔ  ｔｃｔｔｃａａｃｇｇ  ｇｃｇｃｇａｃｃｔｇ
１３２１  ａａｃａａｇａｇｃａ  ｔｃａａｃｃｃｃｇａ  ｃｇａｇｇｃｔｇｔｇ  ｇｃｃｔａｃｇｇｇｇ  ｃｇｇｃｇｇｔｇｃａ  ｇｇｃｇｇｃｃａｔｃ
１３８１  ｃｔｇａｔｇｇｇｇｇ  ａｃａａｇｔｃｃｇａ  ｇａａｃｇｔｇｃａｇ  ｇａｃｃｔｇｃｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｇａｃｇｔ  ｇｇｃｔｃｃｃｃｔｇ
１４４１  ｔｃｇｃｔｇｇｇｇｃ  ｔｇｇａｇａｃｇｇｃ  ｃｇｇａｇｇｃｇｔｇ  ａｔｇａｃｔｇｃｃｃ  ｔｇａｔｃａａｇｃｇ  ｃａａｃｔｃｃａｃｃ
１５０１  ａｔｃｃｃｃａｃｃａ  ａｇｃａｇａｃｇｃａ  ｇａｔｃｔｔｃａｃｃ  ａｃｃｔａｃｔｃｃｇ  ａｃａａｃｃａａｃｃ  ｃｇｇｇｇｔｇｃｔｇ
１５６１  ａｔｃｃａｇｇｔｇｔ  ａｃｇａｇｇｇｃｇａ  ｇａｇｇｇｃｃａｔｇ  ａｃｇａａａｇａｃａ  ａｃａａｔｃｔｇｔｔ  ｇｇｇｇｃｇｃｔｔｃ
１６２１  ｇａｇｃｔｇａｇｃｇ  ｇｃａｔｃｃｃｔｃｃ  ｇｇｃｃｃｃｃａｇｇ  ｇｇｃｇｔｇｃｃｃｃ  ａｇａｔｃｇａｇｇｔ  ｇａｃｃｔｔｃｇａｃ
１６８１  ａｔｃｇａｔｇｃｃａ  ａｃｇｇｃａｔｃｃｔ  ｇａａｃｇｔｃａｃｇ  ｇｃｃａｃｇｇａｃａ  ａｇａｇｃａｃｃｇｇ  ｃａａｇｇｃｃａａｃ
１７４１  ａａｇａｔｃａｃｃａ  ｔｃａｃｃａａｃｇａ  ｃａａｇｇｇｃｃｇｃ  ｃｔｇａｇｃａａｇｇ  ａｇｇａｇａｔｃｇａ  ｇｃｇｃａｔｇｇｔｇ
１８０１  ｃａｇｇａｇｇｃｇｇ  ａｇａａｇｔａｃａａ  ａｇｃｇｇａｇｇａｃ  ｇａｇｇｔｇｃａｇｃ  ｇｃｇａｇａｇｇｇｔ  ｇｔｃａｇｃｃａａｇ
１８６１  ａａｃｇｃｃｃｔｇｇ  ａｇｔｃｃｔａｃｇｃ  ｃｔｔｃａａｃａｔｇ  ａａｇａｇｃｇｃｃｇ  ｔｇｇａｇｇａｔｇａ  ｇｇｇｇｃｔｃａａｇ
１９２１  ｇｇｃａａｇａｔｃａ  ｇｃｇａｇｇｃｇｇａ  ｃａａｇａａｇａａｇ  ｇｔｇｃｔｇｇａｃａ  ａｇｔｇｔｃａａｇａ  ｇｇｔｃａｔｃｔｃｇ
１９８１  ｔｇｇｃｔｇｇａｃｇ  ｃｃａａｃａｃｃｔｔ  ｇｇｃｃｇａｇａａｇ  ｇａｃｇａｇｔｔｔｇ  ａｇｃａｃａａｇａｇ  ｇａａｇｇａｇｃｔｇ
２０４１  ｇａｇｃａｇｇｔｇｔ  ｇｔａａｃｃｃｃａｔ  ｃａｔｃａｇｃｇｇａ  ｃｔｇｔａｃｃａｇｇ  ｇｔｇｃｃｇｇｔｇｇ  ｔｃｃｃｇｇｇｃｃｔ
２１０１  ｇｇｇｇｇｃｔｔｃｇ  ｇｇｇｃｔｃａｇｇｇ  ｔｃｃｃａａｇｇｇａ  ｇｇｇｔｃｔｇｇｇｔ  ｃａｇｇｃｃｃｃａｃ  ｃａｔｔｇａｇｇａｇ
２１６１  ｇｔａｇａｔｔａｇｇ  ｇｇｃｃｔｔｔｃｃａ  ａｇａｔｔｇｃｔｇｔ  ｔｔｔｔｇｔｔｔｔｇ  ｇａｇｃｔｔｃａａｇ  ａｃｔｔｔｇｃａｔｔ
２２２１  ｔｃｃｔａｇｔａｔｔ  ｔｃｔｇｔｔｔｇｔｃ  ａｇｔｔｃｔｃａａｔ  ｔｔｃｃｔｇｔｇｔｔ  ｔｇｃａａｔｇｔｔｇ  ａａａｔｔｔｔｔｔｇ
２２８１  ｇｔｇａａｇｔａｃｔ  ｇａａｃｔｔｇｃｔｔ  ｔｔｔｔｔｃｃｇｇｔ  ｔｔｃｔａｃａｔｇｃ  ａｇａｇａｔｇａａｔ  ｔｔａｔａｃｔｇｃｃ
２３４１  ａｔｃｔｔａｃｇａｃ  ｔａｔｔｔｃｔｔｃｔ  ｔｔｔｔａａｔａｃａ  ｃｔｔａａｃｔｃａｇ  ｇｃｃａｔｔｔｔｔｔ  ａａｇｔｔｇｇｔｔａ
２４０１  ｃｔｔｃａａａｇｔａ  ａａｔａａａｃｔｔｔ  ａａａａｔｔｃａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａ
【０２３０】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）のタンパク質配列は、（配列番号３）（受託番号ＮＭ＿００５３４６）：
ＭＡＫＡＡＡＩＧＩＤＬＧＴＴＹＳＣＶＧＶＦＱＨＧＫＶＥＩ  ＩＡＮＤＱＧＮＲＴＴＰＳＹＶＡＦＴＤＴＥＲＬＩＧＤＡＡＫＮＱＶＡＬＮＰＱＮＴＶＦＤＡ  ＫＲＬＩＧＲＫＦＧＤＰＶＶＱＳＤＭＫＨＷＰＦＱＶＩＮＤＧＤＫＰＫＶＱＶＳＹＫＧＥＴＫＡＦＹＰＥＥＩＳＳＭＶＬＴＫＭＫＥＩＡＥＡＹＬＧＹＰＶＴ  ＮＡＶＩＴＶＰＡＹＦＮＤＳＱＲＱＡＴＫＤＡＧＶＩＡＧＬＮＶＬＲＩＩＮＥＰＴＡＡＡＩＡＹＧＬＤＲＴＧＫＧＥＲＮＶＬＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ  ＴＩＤＤＧＩＦＥＶＫＡＴＡＧＤＴＨＬＧＧＥＤＦＤＮＲＬＶＮＨＦＶＥＥＦＫＲＫＨＫＫＤＩＳＱＮＫＲＡＶＲＲＬＲＴＡＣＥＲＡＫＲＴＬＳＳＳＴＱＡ  ＳＬＥＩＤＳＬＦＥＧＩＤＦＹＴＳＩＴＲＡＲＦＥＥＬＣＳＤＬＦＲＳＴＬＥＰＶＥＫＡＬＲＤＡＫＬＤＫＡＱＩＨＤＬＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰＫＶＱＫＬＬ  ＱＤＦＦＮＧＲＤＬＮＫＳＩＮＰＤＥＡＶＡＹＧＡＡＶＱＡＡＩＬＭＧＤＫＳＥＮＶＱＤＬＬＬＬＤＶＡＰＬＳＬＧＬＥＴＡＧＧＶＭＴＡＬＩＫＲＮＳＴＩ  ＰＴＫＱＴＱＩＦＴＴＹＳＤＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹＥＧＥＲＡＭＴＫＤＮＮＬＬＧＲＦＥＬＳＧＩＰＰＡＰＲＧＶＰＱＩＥＶＴＦＤＩＤＡＮＧＩＬＮＶＴＡ  ＴＤＫＳＴＧＫＡＮＫＩＴＩＴＮＤＫＧＲＬＳＫＥＥＩＥＲＭＶＱＥＡＥＫＹＫＡＥＤＥＶＱＲＥＲＶＳＡＫＮＡＬＥＳＹＡＦＮＭＫＳＡＶＥＤＥＧＬＫＧ  ＫＩＳＥＡＤＫＫＫＶＬＤＫＣＱＥＶＩＳＷＬＤＡＮＴＬＡＥＫＤＥＦＥＨＫＲＫＥＬＥＱＶＣＮＰＩ  ＩＳＧＬＹＱＧＡＧＧＰＧＰＧＧＦＧＡＱＧＰＫＧＧ  ＳＧＳＧＰＴＩＥＥＶＤ
【０２３１】
ホモサピエンス熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ｂ（ＨＳＰＡ１Ｂ）の核酸（ＤＮＡ）配列は、（配列番号４）（受託番号ＮＭ＿００５３４６）：
１  ｇｇａａａａｃｇｇｃ  ｃａｇｃｃｔｇａｇｇ  ａｇｃｔｇｃｔｇｃｇ  ａｇｇｇｔｃｃｇｃｔ  ｔｃｇｔｃｔｔｔｃｇ  ａｇａｇｔｇａｃｔｃ
６１  ｃｃｇｃｇｇｔｃｃｃ  ａａｇｇｃｔｔｔｃｃ  ａｇａｇｃｇａａｃｃ  ｔｇｔｇｃｇｇｃｔｇ  ｃａｇｇｃａｃｃｇｇ  ｃｇｔｇｔｔｇａｇｔ
１２１  ｔｔｃｃｇｇｃｇｔｔ  ｃｃｇａａｇｇａｃｔ  ｇａｇｃｔｃｔｔｇｔ  ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃ  ｇｔｃｃｇｃｃｇｔｔ  ｔｃｃａｇｃｃｃｃｃ
１８１  ａｇｔｃｔｃａｇａｇ  ｃｇｇａｇｃｃｃａｃ  ａｇａｇｃａｇｇｇｃ  ａｃｃｇｇｃａｔｇｇ  ｃｃａａａｇｃｃｇｃ  ｇｇｃｇａｔｃｇｇｃ
２４１  ａｔｃｇａｃｃｔｇｇ  ｇｃａｃｃａｃｃｔａ  ｃｔｃｃｔｇｃｇｔｇ  ｇｇｇｇｔｇｔｔｃｃ  ａａｃａｃｇｇｃａａ  ｇｇｔｇｇａｇａｔｃ
３０１  ａｔｃｇｃｃａａｃｇ  ａｃｃａｇｇｇｃａａ  ｃｃｇｃａｃｃａｃｃ  ｃｃｃａｇｃｔａｃｇ  ｔｇｇｃｃｔｔｃａｃ  ｇｇａｃａｃｃｇａｇ
３６１  ｃｇｇｃｔｃａｔｃｇ  ｇｇｇａｔｇｃｇｇｃ  ｃａａｇａａｃｃａｇ  ｇｔｇｇｃｇｃｔｇａ  ａｃｃｃｇｃａｇａａ  ｃａｃｃｇｔｇｔｔｔ
４２１  ｇａｃｇｃｇａａｇｃ  ｇｇｃｔｇａｔｃｇｇ  ｃｃｇｃａａｇｔｔｃ  ｇｇｃｇａｃｃｃｇｇ  ｔｇｇｔｇｃａｇｔｃ  ｇｇａｃａｔｇａａｇ
４８１  ｃａｃｔｇｇｃｃｔｔ  ｔｃｃａｇｇｔｇａｔ  ｃａａｃｇａｃｇｇａ  ｇａｃａａｇｃｃｃａ  ａｇｇｔｇｃａｇｇｔ  ｇａｇｃｔａｃａａｇ
５４１  ｇｇｇｇａｇａｃｃａ  ａｇｇｃａｔｔｃｔａ  ｃｃｃｃｇａｇｇａｇ  ａｔｃｔｃｇｔｃｃａ  ｔｇｇｔｇｃｔｇａｃ  ｃａａｇａｔｇａａｇ
６０１  ｇａｇａｔｃｇｃｃｇ  ａｇｇｃｇｔａｃｃｔ  ｇｇｇｃｔａｃｃｃｇ  ｇｔｇａｃｃａａｃｇ  ｃｇｇｔｇａｔｃａｃ  ｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃ
６６１  ｔａｃｔｔｃａａｃｇ  ａｃｔｃｇｃａｇｃｇ  ｃｃａｇｇｃｃａｃｃ  ａａｇｇａｔｇｃｇｇ  ｇｔｇｔｇａｔｃｇｃ  ｇｇｇｇｃｔｃａａｃ
７２１  ｇｔｇｃｔｇｃｇｇａ  ｔｃａｔｃａａｃｇａ  ｇｃｃｃａｃｇｇｃｃ  ｇｃｃｇｃｃａｔｃｇ  ｃｃｔａｃｇｇｃｃｔ  ｇｇａｃａｇａａｃｇ
７８１  ｇｇｃａａｇｇｇｇｇ  ａｇｃｇｃａａｃｇｔ  ｇｃｔｃａｔｃｔｔｔ  ｇａｃｃｔｇｇｇｃｇ  ｇｇｇｇｃａｃｃｔｔ  ｃｇａｃｇｔｇｔｃｃ
８４１  ａｔｃｃｔｇａｃｇａ  ｔｃｇａｃｇａｃｇｇ  ｃａｔｃｔｔｃｇａｇ  ｇｔｇａａｇｇｃｃａ  ｃｇｇｃｃｇｇｇｇａ  ｃａｃｃｃａｃｃｔｇ
９０１  ｇｇｔｇｇｇｇａｇｇ  ａｃｔｔｔｇａｃａａ  ｃａｇｇｃｔｇｇｔｇ  ａａｃｃａｃｔｔｃｇ  ｔｇｇａｇｇａｇｔｔ  ｃａａｇａｇａａａａ
９６１  ｃａｃａａｇａａｇｇ  ａｃａｔｃａｇｃｃａ  ｇａａｃａａｇｃｇａ  ｇｃｃｇｔｇａｇｇｃ  ｇｇｃｔｇｃｇｃａｃ  ｃｇｃｃｔｇｃｇａｇ
１０２１  ａｇｇｇｃｃａａｇａ  ｇｇａｃｃｃｔｇｔｃ  ｇｔｃｃａｇｃａｃｃ  ｃａｇｇｃｃａｇｃｃ  ｔｇｇａｇａｔｃｇａ  ｃｔｃｃｃｔｇｔｔｔ
１０８１  ｇａｇｇｇｃａｔｃｇ  ａｃｔｔｃｔａｃａｃ  ｇｔｃｃａｔｃａｃｃ  ａｇｇｇｃｇａｇｇｔ  ｔｃｇａｇｇａｇｃｔ  ｇｔｇｃｔｃｃｇａｃ
１１４１  ｃｔｇｔｔｃｃｇａａ  ｇｃａｃｃｃｔｇｇａ  ｇｃｃｃｇｔｇｇａｇ  ａａｇｇｃｔｃｔｇｃ  ｇｃｇａｃｇｃｃａａ  ｇｃｔｇｇａｃａａｇ
１２０１  ｇｃｃｃａｇａｔｔｃ  ａｃｇａｃｃｔｇｇｔ  ｃｃｔｇｇｔｃｇｇｇ  ｇｇｃｔｃｃａｃｃｃ  ｇｃａｔｃｃｃｃａａ  ｇｇｔｇｃａｇａａｇ
１２６１  ｃｔｇｃｔｇｃａｇｇ  ａｃｔｔｃｔｔｃａａ  ｃｇｇｇｃｇｃｇａｃ  ｃｔｇａａｃａａｇａ  ｇｃａｔｃａａｃｃｃ  ｃｇａｃｇａｇｇｃｔ
１３２１  ｇｔｇｇｃｃｔａｃｇ  ｇｇｇｃｇｇｃｇｇｔ  ｇｃａｇｇｃｇｇｃｃ  ａｔｃｃｔｇａｔｇｇ  ｇｇｇａｃａａｇｔｃ  ｃｇａｇａａｃｇｔｇ
１３８１  ｃａｇｇａｃｃｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｃｔｇｇａ  ｃｇｔｇｇｃｔｃｃｃ  ｃｔｇｔｃｇｃｔｇｇ  ｇｇｃｔｇｇａｇａｃ  ｇｇｃｃｇｇａｇｇｃ
１４４１  ｇｔｇａｔｇａｃｔｇ  ｃｃｃｔｇａｔｃａａ  ｇｃｇｃａａｃｔｃｃ  ａｃｃａｔｃｃｃｃａ  ｃｃａａｇｃａｇａｃ  ｇｃａｇａｔｃｔｔｃ
１５０１  ａｃｃａｃｃｔａｃｔ  ｃｃｇａｃａａｃｃａ  ａｃｃｃｇｇｇｇｔｇ  ｃｔｇａｔｃｃａｇｇ  ｔｇｔａｃｇａｇｇｇ  ｃｇａｇａｇｇｇｃｃ
１５６１  ａｔｇａｃｇａａａｇ  ａｃａａｃａａｔｃｔ  ｇｔｔｇｇｇｇｃｇｃ  ｔｔｃｇａｇｃｔｇａ  ｇｃｇｇｃａｔｃｃｃ  ｔｃｃｇｇｃｃｃｃｃ
１６２１  ａｇｇｇｇｃｇｔｇｃ  ｃｃｃａｇａｔｃｇａ  ｇｇｔｇａｃｃｔｔｃ  ｇａｃａｔｃｇａｔｇ  ｃｃａａｃｇｇｃａｔ  ｃｃｔｇａａｃｇｔｃ
１６８１  ａｃｇｇｃｃａｃｇｇ  ａｃａａｇａｇｃａｃ  ｃｇｇｃａａｇｇｃｃ  ａａｃａａｇａｔｃａ  ｃｃａｔｃａｃｃａａ  ｃｇａｃａａｇｇｇｃ
１７４１  ｃｇｃｃｔｇａｇｃａ  ａｇｇａｇｇａｇａｔ  ｃｇａｇｃｇｃａｔｇ  ｇｔｇｃａｇｇａｇｇ  ｃｇｇａｇａａｇｔａ  ｃａａａｇｃｇｇａｇ
１８０１  ｇａｃｇａｇｇｔｇｃ  ａｇｃｇｃｇａｇａｇ  ｇｇｔｇｔｃａｇｃｃ  ａａｇａａｃｇｃｃｃ  ｔｇｇａｇｔｃｃｔａ  ｃｇｃｃｔｔｃａａｃ
１８６１  ａｔｇａａｇａｇｃｇ  ｃｃｇｔｇｇａｇｇａ  ｔｇａｇｇｇｇｃｔｃ  ａａｇｇｇｃａａｇａ  ｔｃａｇｃｇａｇｇｃ  ｇｇａｃａａｇａａｇ
１９２１  ａａｇｇｔｔｃｔｇｇ  ａｃａａｇｔｇｔｃａ  ａｇａｇｇｔｃａｔｃ  ｔｃｇｔｇｇｃｔｇｇ  ａｃｇｃｃａａｃａｃ  ｃｔｔｇｇｃｃｇａｇ
１９８１  ａａｇｇａｃｇａｇｔ  ｔｔｇａｇｃａｃａａ  ｇａｇｇａａｇｇａｇ  ｃｔｇｇａｇｃａｇｇ  ｔｇｔｇｔａａｃｃｃ  ｃａｔｃａｔｃａｇｃ
２０４１  ｇｇａｃｔｇｔａｃｃ  ａｇｇｇｔｇｃｃｇｇ  ｔｇｇｔｃｃｃｇｇｇ  ｃｃｔｇｇｃｇｇｃｔ  ｔｃｇｇｇｇｃｔｃａ  ｇｇｇｔｃｃｃａａｇ
２１０１  ｇｇａｇｇｇｔｃｔｇ  ｇｇｔｃａｇｇｃｃｃ  ｔａｃｃａｔｔｇａｇ  ｇａｇｇｔｇｇａｔｔ  ａｇｇｇｇｃｃｔｔｔ  ｇｔｔｃｔｔｔａｇｔ
２１６１  ａｔｇｔｔｔｇｔｃｔ  ｔｔｇａｇｇｔｇｇａ  ｃｔｇｔｔｇｇｇａｃ  ｔｃａａｇｇａｃｔｔ  ｔｇｃｔｇｃｔｇｔｔ  ｔｔｃｃｔａｔｇｔｃ
２２２１  ａｔｔｔｃｔｇｃｔｔ  ｃａｇｃｔｃｔｔｔｇ  ｃｔｇｃｔｔｃａｃｔ  ｔｃｔｔｔｇｔａａａ  ｇｔｔｇｔａａｃｃｔ  ｇａｔｇｇｔａａｔｔ
２２８１  ａｇｃｔｇｇｃｔｔｃ  ａｔｔａｔｔｔｔｔｇ  ｔａｇｔａｃａａｃｃ  ｇａｔａｔｇｔｔｃａ  ｔｔａｇａａｔｔｃｔ  ｔｔｇｃａｔｔｔａａ
２３４１  ｔｇｔｔｇａｔａｃｔ  ｇｔａａｇｇｇｔｇｔ  ｔｔｃｇｔｔｃｃｃｔ  ｔｔａａａｔｇａａｔ  ｃａａｃａｃｔｇｃｃ  ａｃｃｔｔｃｔｇｔａ
２４０１  ｃｇａｇｔｔｔｇｔｔ  ｔｇｔｔｔｔｔｔｔｔ  ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ  ｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔ  ｇｇｃｇａａａａｃａ  ｃｔａｃａａａｇｇｃ
２４６１  ｔｇｇｇａａｔｇｔａ  ｔｇｔｔｔｔｔａｔａ  ａｔｔｔｇｔｔｔａｔ  ｔｔａａａｔａｔｇａ  ａａａａｔａａａａｔ  ｇｔｔａａａｃｔｔｔ
２５２１  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａａａａａａａａａａ  ａ
【０２３２】
ＨｓｐＡ１ＬおよびＨｓｐＡ２
２つのＨｓｐ７０ファミリーメンバーは、雄生殖細胞が強い偏見でそれらの発現を優先するため、「優越主義遺伝子（ｃｈａｕｖｉｎｉｓｔ  ｇｅｎｅ）」と呼ばれる。ｈｓｐＡ１Ｌ遺伝子は、第６染色体上の同じＭＨＣクラスＩＩＩ複合体におけるＨＳＰＡ１Ａ遺伝子座の４ｋｂテロメア側に位置する、恒常的に発現される無イントロンＨｓｐ７０ファミリーメンバーである。ｈｓｐＡ１Ｌ遺伝子は、熱ショックの前後で低量発現されるが、その発現パターンが、マウス、ラット、およびヒトの精巣に有利に働き、その６４１のアミノ酸（ａａ）タンパク質が、ＨｓｐＡ１Ａに対して９０％相同である。ｈｓｐＡ２遺伝子は、マウスゲノムライブラリーから最初に単離され、骨格筋、卵巣、小腸、結腸、脳、胎盤、および腎臓を含むヒトの体の様々な組織で低レベルであるが、精巣では高レベルで恒常的に発現されることが後に示された。その発現または逆にその欠如は、異常なヒト精子形成と関連があり、雄ｈｓｐＡ２（−／−）マウスは、生殖不能である。この遺伝子は、第１４染色体に位置し、ＨｓｐＡ１Ａに対して８４％相同の６３９ａａのタンパク質を産生するが、正確な位置は、２つの研究論文が異なる遺伝子座位置１４ｑ２４．１と１４ｑ２２を示しているため議論が必要である。
【０２３３】
ＨｓｐＡ６およびＨｓｐＡ７
ｈｓｐＡ６およびｈｓｐＡ７遺伝子は、マウスには明確な対応物がないＨｓｐ７０ファミリーの熱誘導性メンバーである。ｈｓｐＡ６およびｈｓｐＡ７遺伝子は、プロモーター部位にＨＳＥを含み、これらの遺伝子はイントロンが無い。ｈｓｐＡ６およびｈｓｐＡ７遺伝子は、第１染色体上に共局在化し、互いにヌクレオチド配列が９４％相同である。しかし、ｈｓｐＡ７遺伝子が、＋１３２４に中途終止コドンを生成する１つのヌクレオチド挿入を有するため、ＨｓｐＡ６のみが機能的である。ＨｓｐＡ６タンパク質は、６４３ａａの長さであり、ＨｓｐＡ１ＡおよびＨｓｐＡ１Ｂに対して７７％の相同性を示す。
【０２３４】
ＨｓｐＡ５およびＨｓｐＡ９
ｈｓｐＡ５およびｈｓｐＡ９遺伝子は、Ｈｓｐ７０ファミリーの２つの区画特異的メンバーである。６５５ａａのＨｓｐＡ５タンパク質は、小胞体（ＥＲ）内に位置し、この区画内で新規に合成されたタンパク質の折り畳みおよび輸送を促進する。このタンパク質は、ＨｓｐＡ１Ａに対して６４％相同であり、この遺伝子は、９ｑ３４に位置している。６７９ａａのＨｓｐＡ９タンパク質は、ミトコンドリア内に位置し、ミトコンドリア膜を渡って輸送されたタンパク質の折り畳みを助ける。ＨｓｐＡ９は、５ｑ３１．１に位置し、このタンパク質は、ＨｓｐＡ１Ａに対して５２％相同である。
【０２３５】
ＨｓｐＡ８
Ｈｓｃ７０として知られる同種Ｈｓｐ７０メンバーは、ＨｓｐＡ１Ａに対して８６％相同の６４６ａａのタンパク質を産生する、１１ｑ２４にあるｈｓｐＡ８という名称の遺伝子によってコードされ、すべての組織および細胞系で恒常的に発現される。このタンパク質は、細胞機能がＨｓｐ７０に類似し、通常の状況下で必要なシャペロン機能を提供するが、クラスリン被覆小胞の脱被覆およびシャペロン媒介自己貪食における役割も果たす。
【０２３６】
ＨｓｐＡ３およびＨｓｐＡ４
ＨＳＰＡ４がＨｓｐ１１０ファミリーのメンバーである可能性が高く、これまでのところ、その染色体の位置が５ｑ３１．１−２であることを除き何も知られておらず、ＨＳＰＡ３がそもそも存在するかさえも疑わしいため、これらは本明細書では説明しない。
【０２３７】
【表２】
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【０２３８】
Ｈｓｐ７０の転写調節
ヒトＨｓｐ７０プロモーターのゲノムフットプリント法により、熱ショック／ストレスが、熱ショック要素（ＨＳＥ）という名称のｎＧＡＡｎ配列を含む領域への熱ショック転写因子（ＨＳＦ）の迅速な結合を誘導することが明らかにされた。通常の条件下では、Ｈｓｐ７０は、細胞質ゾル内に存在するＨＳＦに結合するが、ストレスの間は、ＨＳＦは、Ｈｓｐ７０から分離し、ＰＫＣまたは他のセリン／トレオニンキナーゼによってリン酸化されてホモ三量体構造をとる。このＨＳＦ三量体は、核内に侵入して、そこで、Ｈｓｐ７０遺伝子のプロモーター領域に位置するＨＳＥに結合し、ＨＳＦキナーゼによってさらにリン酸化される。
【０２３９】
３つのＨＳＦは、これまでのところヒトで特徴付けられた（ＨＳＦ１、ＨＳＦ２、およびＨＳＦ４）。ＨＳＦ１は、殆どのストレス条件下で活性化される主な転写因子であり、様々な刺激に応答し、ストレス条件は、生理学的条件（例えば、細胞分裂、ホルモン刺激）、病理学的条件（例えば、感染、発熱、炎症、悪性腫瘍）、および環境条件（例えば、熱ショック、重金属、エタノール）に分類することができる。ＨＳＦ２は、ヘミンのみに応答するが、ＨＳＦ４は、ヒトの心臓、膵臓、脳、および骨格筋で優先的に発現され、すべての脊椎動物ＨＳＦ間で共有されるＣ末端疎水性反復が欠損し、かつＨＳＰの発現を抑制するようである。恒常的に発現されるＨｓｐ７０（Ｈｓｃ７０）の合成に関与するＨｓｐ７０遺伝子調節は、明確には理解されていないが、ＨＳＦは関与していないようである。
【０２４０】
ＨＳＦは、ＨＳＰの発現を調節する最も顕著な因子であるが、他の転写因子も、同じ能力を有することが示された。特異的なＣＣＡＡＴボックス結合因子（ＣＢＦ）は、Ｈｓｐ７０の転写を誘導することが示され、腫瘍抑制因子ｐ５３は、Ｈｓｐ７０のプロモーター領域に結合し、ＣＢＦを中和することによって転写を抑制することができ、ＨＳＦは、熱ショック因子結合タンパク質１（ＨＳＢＰ１）によってアンタゴナイズされ得、このようにＨｓｐ７０の転写が抑制される。
【０２４１】
Ｈｓｐ７０の構造的および機能的特性
Ｈｓｐ７０系の構造および機能は、真正細菌Ｈｓｐ７０、ＤｎａＫ、そのＨｓｐ４０コシャペロンＤｎａＪ、およびヌクレオチド交換因子ＧｒｐＥに関して最もよく理解されている。しかし、その機構は、一般的に真核生物では類似していると考えられるが、証拠がＧｒｐＥの分離を示唆している。この節は、真核生物Ｈｓｐ７０系に焦点を当てるが、適切であると考えられる場合は、真正細菌系に対する論評も含む。
【０２４２】
Ｈｓｐ７０は、Ｎ末端ＡＴＰアーゼドメインおよび比較的小さいＣ末端ペプチド結合ドメインの２つの機能単位から構成されている。ＡＴＰアーゼドメインは、ヌクレオチド結合部位を含むクレフト（ｃｌｅｆｔ）によって分離された２つのサブドメインから構成され、このヌクレオチド結合部位が、Ｃ末端ドメインのペプチド結合特性を決定する。ＡＴＰが結合すると、ペプチド基質が、低親和性であるが迅速に結合および解離し、ヌクレオチドまたはＡＤＰのいずれもがＮ末端ドメインに結合していない状態では、ペプチドの結合率および解離率が低下し、親和性が上昇する。したがって、ＡＴＰ加水分解は、Ｈｓｐ７０の２つの状態間の分子スイッチとして機能し、そのサイクリングは、真核生物のＪドメインファミリータンパク質Ｈｓｐ４０ならびに真正細菌のＤｎａＪおよびＧｒｐＥによって調節される。Ｈｓｐ４０のＮ末端Ｊドメインが、ＡＴＰ加水分解を促進するＨｓｐ７０に結合し、これによりペプチドの捕捉を促進する一方、Ｈｓｐ４０のＣ末端部分が、疎水性ペプチドを認識することによってシャペロンとして機能し、これによりＨｓｐ７０が新生ポリペプチド鎖に補充される。分子シャペロンは、結合したタンパク質の折り畳みについての特定の立体情報は提供しないが、非生産的な相互作用を阻害し、これによりタンパク質がその天然構造により効率的な折り畳み可能となることに留意することが重要である。
【０２４３】
真正細菌では、ＧｒｐＥが、ＡＤＰのＤｎａＫ（細菌Ｈｓｐ７０）からの放出を誘導するが、真核生物Ｈｓｐ７０タンパク質では、このＡＴＰアーゼサイクルの律速段階が、結合ＡＤＰの解離ではなく、むしろＡＴＰ加水分解自体であるため、このような因子は重要ではないと思われる。しかし、別のタンパク質が、真核生物でＨｓｐ７０の機能を調節するように役割を果たし；ホモオリゴマータンパク質ヒップ（Ｈｉｐ）（Ｈｓｐ７０相互作用タンパク質）が、Ｈｓｐ７０のＡＤＰ結合状態を安定させることによって正の調節因子として役割を果たすが、Ｈｓｐ７０結合タンパク質（ＣＨＩＰ）およびＢｃｌ−２関連アタノジーン−１（Ｂｃｌ−２−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ−１）（Ｂａｇ−１）の両方のタンパク質カルボキシ末端が、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼ活性を阻害することによるＣＨＩＰの阻害効果、およびＨｓｐ７０の再折り畳み活性をアンタゴナイズすることによるＢａｇ−１の阻害効果を有する。２つのヒトＨｓｐ４０タンパク質Ｈｄｊ１とＨｄｊ２によってさらなる相互作用が起こり、これらのタンパク質は、Ｈｓｐ４０機能（上述）に加えて、Ｈｏｐ（Ｈｓｐ−組織化タンパク質）によるＨｓｐ７０とＨｓｐ９０の結合を促進することが示され、Ｈｏｐは、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０の延長Ｃ末端配列のそれぞれに結合するその２つのテトラトリコペプチド反復（ＴＰＲ）ドメインによってシャペロン同士を物理的に連結するアダプタータンパク質である。一部の上述のタンパク質は、非天然または不可逆的に誤って折り畳まれたタンパク質のシャペロンからユビキチン−プロテアソーム機構への輸送において調節機能を果たすことが最近示された。タンパク質ＣＨＩＰは、Ｈｓｐ７０に対する負の調節の役割とは別に、Ｎ末端ＴＰＲドメインを介してＨｓｐ９０と結合することができ、Ｃ末端ユビキチンリガーゼドメインによる分解のためにＨｓｐ９０基質を標的とするが、ＢＡＧ−１と機能的に協働することもでき、ＢＡＧ−１は、Ｈｓｐ７０（およびプロテアソーム）に結合する。これらの知見は、細胞質ゾルにおけるタンパク質の質の管理の２つ主な構成要素である、シャペロン支援折り畳みとタンパク質分解を統合する機構間のリンクを可能にする。
【０２４４】
Ｈｓｐ７０による細胞保護
分子シャペロンであることの結果としてのＨｓｐ７０の抗アポトーシス能力、すなわち通常であれば変性する条件下でタンパク質の折り畳みを促進することは別として、Ｈｓｐ７０は、虚血再灌流傷害後のミトコンドリア機能の保護、初代線維芽細胞のＴＮＦでの刺激時にストレスキナーゼｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化の阻害を含む様々な他の方法で細胞の生存に影響を与えることもでき、Ｈｓｐ７０／Ｂａｇ−１複合体が、細胞ストレスの状態の際に細胞増殖および有糸分裂誘発を調節することが示されている。ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、酸化ストレス、ＵＶ照射、ならびに抗癌剤ドキソルビシン、エトポシド、およびタキソールなどの様々な刺激によって誘導される細胞死から細胞を保護するＨｓｐ７０の能力は、その抗アポトーシス特性をさらに強める。最後に、研究報告により、Ｈｓｐ７０がアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）をアンタゴナイズし、カスパーゼ３の下流の抗アポトーシス機能を働かせるため、Ｈｓｐ７０とアポトーシス機構との間のより直接的な相互作用の証拠も示された。
【０２４５】
最近の証拠は、Ｈｓｐ７０の強力な細胞保護効果の一部がリソソーム膜の安定化によるものであることも示唆している。この証拠から、Ｈｓｐ７０の欠乏が、癌細胞におけるリソソーム膜の早期透過化およびカテプシン媒介細胞死を引き起こし、外来性Ｈｓｐ７０が、様々なストレスによって誘導されるリソソームの不安定化を効果的に抑制する。さらに、Ｈｓｐ７０が欠損したマウスは、リソソームプロテアーゼの細胞質ゾル内への漏出によって引き起こされる膵炎に罹病する。これらの事象のすべては、ＰＣＤの重要な制御因子、従って細胞の生存因子としてのＨｓｐ７０の役割を強調する。
【０２４６】
癌におけるＨｓｐ７０
Ｈｓｐ７０は、しばしば、ヒト悪性腫瘍で過剰に発現され、その発現が、乳房腫瘍および子宮内膜腫瘍の芳しくない予後に相関する。このため、Ｈｓｐ７０は、免疫不全または同種の動物に移植されたげっ歯類細胞の腫瘍形成の可能性を上昇させる。
【０２４７】
癌細胞生存の必須の因子としてのＨｓｐ７０の役割は、Ｗｅｉらによる研究報告からさらに立証され、Ｗｅｉらは、癌細胞でのＨｓｐ７０の欠乏の研究を初めに行った。この結果は、Ｈｓｐ７０の発現が、アンチセンスオリゴマーの使用によって様々な癌細胞系で阻害されると、細胞増殖およびその後のアポトーシスの阻害が誘導されることを示唆した。この研究は、Ｈｓｐ７０のアデノウイルスアンチセンスによる欠乏が、腫瘍細胞特異的リソソーム死プログラムを引き起こす一連の実験で立証された。
【０２４８】
免疫不全マウスにおける結腸癌の皮下異種移植はもちろん、グリア芽細胞腫および乳癌の同所異種移植を利用するｉｎ  ｖｉｖｏ研究が、上述のアデノウイルス構築物が局所的に導入されたマウスの腫瘍が大量のアポトーシス様細胞死およびマクロファージの動員を示したため、Ｈｓｐ７０欠乏による抗癌の可能性をさらに実証した。これらの研究は、一部の腫瘍がＨｓｐ７０の存在に依存することを明確に実証するが、他の研究は、Ｈｓｐ７０のアデノウイルスによる欠乏時に細胞培養で観察される細胞毒性が、ウイルス媒介細胞ストレスとＨｓｐ７０のダウンレギュレーションの組み合わせによるものであることを主張する。この議論にもかかわらず、Ｈｓｐ７０の欠乏によって誘導された細胞培養における細胞毒性は、Ｂｃｌ−２の過剰発現もカスパーゼの薬理学的阻害も細胞を助けることができなかったため、カスパーゼに依存していなかった。むしろ、ＬＭＰの誘発およびカテプシンの細胞質ゾルへの放出は、システインカテプシンの阻害が有意な細胞保護をもたらすため、起こり得る死誘導事象であった。さらに、前述のマウスの腫瘍異種移植におけるＨｓｐ７０の欠乏は、カテプシンの放出および腫瘍細胞死をもたらした。
【０２４９】
既に述べたように、多くの癌細胞が適応したように思われるＨｓｐ７０の細胞保護機構の１つは、Ｈｓｐ７０のエンドリソソーム区画へ転位であり、そこで、Ｈｓｐ７０は、膜保護の役割を果たす。この転位は、研究により、５０％を超える腫瘍が原形質膜表面、すなわち既に述べたようにエンドサイトーシスおよび分泌事象によってエンドリソソーム区画に直接結合された領域へのＨｓｐ７０の局在化を示すことが示されたため、リソソーム膜を保護する必要性のみによって駆動されるものではないであろう。表面露出Ｈｓｐ７０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の認識構造として機能し得る特異エピトープを提示し、それらの増殖および細胞溶解活性を刺激する。このＨｓｐ７０ペプチド配列によって活性化されたＮＫ細胞は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）のマウスの腫瘍の成長を阻害することを示し、このための可能な機構は、細胞表面結合Ｈｓｐ７０が、パーフォリンに依存しない、グランザイムＢの特異的な結合および取り込みによってアポトーシスを媒介するものであろう。
【０２５０】
既に記載したように、エンドリソソーム膜および原形質膜は、絶えず入れ替わる。したがって、癌細胞の表面におけるＨｓｐ７０の存在は、腫瘍の進行を促進する２つの事象；侵入および血管形成を促進するカテプシンの分泌、およびシステインカテプシンの細胞質ゾルへの偶発的な放出及びその後の細胞死を防止するリソソーム膜へのＨｓｐ７０の局在化の「不幸な」結果であろう。
【０２５１】
細胞外Ｈｓｐ７０
前の段落から明らかなように、Ｈｓｐ７０の細胞内機能は、適切な細胞恒常性、特に有害な攻撃の際に必須である。しかし、特に、免疫および炎症応答に関して、細胞外Ｈｓｐ７０（ｅＨｓｐ７０）の興味深い役割も浮上し、ｅＨｓｐ７０は、癌細胞の除去に重要な役割も有するであろう。さらに、ストレスおよび細胞損傷に対する保護への一般的な生理学的適応への関与も、ｅＨｓｐ７０の新しいテーマである。
【０２５２】
細胞外Ｈｓｐ７０および神経保護
ｅＨｓｐ７０の存在についての最初の証拠は、温度の上昇が、一連の熱ショックタンパク質を、軸索内に移送される軸索を取り囲んでいるグリア鞘に誘導したことを示すイカ巨大軸索の研究からもたらされた。これらの知見は、培養ラット胚細胞ですぐに再現され、そして重要なことに既にこの時点で、共に古典的な分泌経路の阻害剤であるモネンジンもコルヒチンもＨｓｐ７０の分泌を阻害できないため、Ｈｓｐ７０の放出に関与するエキソサイトーシスの非古典的経路に関する証拠が示された。これらが公表されてから、他の研究報告が、カエル、ザリガニ、およびラットなどの様々な動物モデル系におけるグリアによるＨｓｐｓの放出およびニューロンによる取り込みの例を提供した。ヒトにおけるｅＨｓｐ７０の源としてのグリア細胞の役割の裏づけが、培養ヒトグリア芽細胞腫細胞の研究によって示された。この研究は、コントロール条件下で、細胞が、２４時間の期間に１００万細胞当たり約１０ｐｇのＨｓｐ７０を培地に放出したことを示した。この放出は、この期間の初めに２０分間の熱ショックを与えられると２．５〜５倍に増加した。重要なことに、この研究は、ｅＨｓｐ７０の放出が細胞死によって説明できる放出よりも多いことも示した。これらのデータはすべて、Ｈｓｐｓのグリア放出が、代謝ストレス中のニューロンの機能を支持する方法であり得るというＴｙｔｅｌｌらによって初めに提唱された仮説を裏付ける。
【０２５３】
急性ストレス中の神経保護の役割を有するｅＨｓｐ７０のｉｎ  ｖｉｖｏでの証拠は、様々な研究から得られたものである。Ｔｉｄｅｗｅｌｌらによる研究は、軸索切断後にｅＨｓｐ７０がゲルスポンジによって加えられると、ｅＨｓｐ７０が、軸索切断後の運動ニューロンの細胞死の量を減少させることができることを見出した。同じ研究で、Ｈｓｐ７０投与時に、後根神経節感覚ニューロン細胞の生存率の上昇も観察されたが、これは、運動ニューロンよりもやや高いＨｓｐ７０の用量に依存する。加えて、ｅＨｓｐ７０は、通常であればニワトリ胚発生中に死亡する運命にある運動ニューロンを保護し、栄養素欠乏時にニワトリ脊髄から分離される運動ニューロンも保護することを示した。ｅＨｓｐ７０のｉｎ  ｖｉｖｏでの保護の役割も、網膜の光損傷に関して説明されている。この研究では、Ｙｕらが、損傷誘発光に曝露した後の組換えＨｓｐ７０とＨｓｃ７０を組み合わせた溶液を、広範な光受容体の変性を引き起こすことが既に説明された用量で硝子体内注射した。興味深いことに、右眼の硝子体腔におけるｅＨｓｐ７０混合物の存在により、網膜に有意に多い光受容体の生存がもたらされた。さらに、蛍光標識Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０の取り込みの評価により、投与から６時間後に蛍光標識Ｈｓｃ／Ｈｓｐ７０が網膜に存在することが実証された。鼻腔内治療により投与された細胞外Ｈｓｐ７０は、ラットにおける不可避のストレスの影響を防止することを示し、腹膜内注射された組換えヒトＨｓｐ７０は、筋萎縮性側索硬化症のマウスモデルの寿命の延長、症状の発症の遅延、運動機能の維持、および運動ニューロンの生存の延長に有効であることが最近示された。ニューロン系でのＨｓｐ７０またはＨｓｃ／Ｈｓｐ７０混合物を用いた別のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究により、ｅＨｓｐ７０が、ニューロン細胞ストレス耐性を向上させ、ポリグルタミン毒性および凝集を減少させ得ることがさらに示された。
【０２５４】
細胞外Ｈｓｐ７０および免疫
細胞保護の役割に加えて、原形質膜結合ｅＨｓｐ７０および遊離全身ｅＨｓｐ７０の両方が、免疫において役割を果たすことが立証された。Ｈｓｐ７０の主な機能の１つが、細胞内タンパク質をシャペロンすることを考慮すると、Ｈｓｐ７０が、免疫原性ペプチドの結合に関与し、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラス１分子によるこれらの提示を助け得ることは驚きではない。さらに、腫瘍由来ｅＨｓｐ７０は、免疫原性ペプチドをシャペロンし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に選択的に結合することが示された。受容体媒介エンドサイトーシスの後、これらのＨｓｐ７０−ペプチド複合体が、ＭＨＣクラス１分子に提示され、細胞傷害性Ｔ細胞の応答がもたらされる。自己抗原のシャペロニング（ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎｇ）に加えて、Ｈｓｐ７０は、微生物ペプチドと細菌ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフを結合させることもできる。
【０２５５】
ｅＨｓｐ７０は、その抗原提示シャペロンとしての役割に加えて、先天免疫の刺激にも関係している。多数の細胞型がＨｓｐ７０を放出することが示されているが、ｅＨｓｐ７０は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、および樹状細胞を含む様々な白血球亜集団の多数の受容体に結合することも示された。ｅＨｓｐ７０の認識に関与する受容体は、主にパターン認識受容体（ＰＲＲ）を含み、トール様受容体（ＴＬＲ）、スカベンジャー受容体、およびＣ型レクチン等の異なる受容体ファミリーからの様々な受容体から構成される。受容体が結合すると、ｅＨｓｐ７０は、ＮＦ−ｋＢの核への転位によって引き起こされるプロセスである、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦなどの前炎症性サイトカインの放出を含む多様なサイトカイン反応を誘発することができ、ｅＨｓｐ７０のサイトカイン作用を示唆し、これにより、シャペロンおよびサイトカインの両方としてのｅＨｓｐ７０の固有の機能をより良く説明するために、ｅＨｓｐ７０に対して用語、シャペロカイン（ｃｈａｐｅｒｏｋｉｎｅ）を当てる提案がなされた。
【０２５６】
免疫におけるｅＨｓｐ７０の役割に関するｉｎ  ｖｉｖｏでの研究の殆どが、げっ歯類モデルで行われた。例えば、尾部ショックに応答したｅＨｓｐ７０の濃度の上昇は、皮下大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）注射後の炎症の減少および迅速な回復時間に関係している。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨｓｐ７０のマウスへの送達は、傷口が閉じるのを早くし、これは、傷口の壊死組織片のマクロファージの食作用の促進による可能性が高い特徴である。
【０２５７】
ヒトにおけるＨｓｐ７０の免疫調節の役割の証拠は十分ではないが、研究により、ｅＨｓｐ７０の上昇と脳損傷の予後／結果の改善との間の関係が実証されたが、反論も示されている。しかし、ｅＨｓｐ７０の濃度が加齢と共に減少することも知られており、これは、完全なストレス応答を開始する能力の加齢に関連した低下を示唆し得、また、全く推測の域を出ないが、加齢で見られる罹患率および死亡率の上昇を説明し得る。
【０２５８】
Ｈｓｐ７０の放出
グリア／軸索モデルなどにおける隣接細胞間のｅＨｓｐ７０の転移を実証するデータとは別に、いくつかの研究報告が、循環中における遊離ｅＨｓｐ７０の存在を立証している。この区画内に存在するＨｓｐ７０の場合、Ｈｓｐ７０は、器官／細胞から放出されなければならない。通常は、これを達成する２つの主な経路が考えられる。１つは、末梢循環中のｅＨｓｐ７０の観察が、細胞溶解または細胞死によるＨｓｐ７０の細胞内プールからの放出の結果である受動経路である。あるいは、または場合によってはこれに加えて、Ｈｓｐ７０は、非古典的なエキソサイトーシス経路によって能動的に放出される。
【０２５９】
Ｈｓｐ７０が、他の熱ショックタンパク質と共に、壊死をもたらす生理学的条件下でのみ放出され、プログラム細胞死の際には放出されないことが示唆された。間違いなく、重度の損傷および壊死を引き起こす重度の外傷および生理学的条件が、Ｈｓｐ７０の血中への放出をもたらし得る。これは、十分に立証され、理論的にも予想される。しかし、最近の研究により、Ｈｓｐ７０が、能動機構によって無傷の細胞から放出され得ること、および刺激の程度が放出の方式を決定することが示された。Ｈｓｐ７０の非壊死放出の強力な証拠が、ｅＨｓｐ７０の末梢血流への運動誘導放出に関する研究から得られた。運動の方式によって（肉体的緊張が大きければ大きいほど、多く放出される）、ｅＨｓｐ７０の主な増加を、末梢血流中で検出することができ、重要なことに、ｅＨｓｐ７０と筋肉損傷のマーカーとの間の直接的な相関関係を報告した既知の研究は知られていない。細胞または組織の損傷にかかわらずｅＨｓｐ７０が放出され得ることが、さらに、Ｆｌｅｓｈｎｅｒおよび同僚らによってすっきりと実証された。Ｆｌｅｓｈｎｅｒおよび同僚らは、捕食される恐れおよび電気ショックなどの心理的ストレスが、カテコールアミンシグナル伝達に依存することが示唆されているプロセスであるストレス誘導ｅＨｓｐ７０放出を引き起こし得ることを示した。
【０２６０】
ｈｓｐ７０が細胞を離れる経路はまだ不明確であるが、特に、Ｈｓｐ７０が、古典的なペプチドリーダー配列を一切含まないためであり、ペプチドリーダー配列は、分泌のためにそれを標的にすることができる。加えて、古典的な分泌が既に以前から疑問を持たれているため、これは、ｅＨｓｐ７０の放出の代替の機構が存在するはずであることを示唆している。ｅＨｓｐ７０は、エキソソームとして特徴付けられた小胞で放出され得ることが実証されたが、ｅＨｓｐ７０が細胞系およびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で遊離ｅＨｓｐ７０として放出され得る証拠も提示された。脂質ラフトがｅＨｓｐ７０の放出に必要であることが示唆されたが、これも論争中である。さらに、機能的なリソソーム区画が、ｅＨｓｐ７０の放出に必要であること、およびこの放出が、細胞の表面におけるリソソームマーカータンパク質の存在を伴うことが示され、分泌が原形質膜とリソソーム膜の融合に依存することを示唆している。放出がエキソソームを介するか、またはリソソームからの直接の放出であるかにかかわらず、ある種の分泌ＭＶＢ／後期エンドソーム／リソソーム区画が、一見したところすべての放出方式に関与することは興味深い。
【０２６１】
α１−アドレナリン受容体を経由するカテコールアミンが、細胞内カルシウム流入を導くことができ、そして同じカルシウム流入が、エキソソーム、多小胞体、およびリソソームのエキソサイトーシスを引き起こすことを示唆しているため、現行の仮説は、ストレスを受けると、α１−アドレナリン受容体に作用するノルアドレナリンの上昇が、細胞内でのカルシウム流入およびこれに続くエキソソーム内でのＨｓｐ７０の放出をもたらすというものである。
【０２６２】
本発明による生理活性剤
本発明は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用による、ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性の調節に関する。
【０２６３】
本発明による酵素活性の調節は、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させる、以下に示す種類の化合物または療法の１つを提供することによって達成することができる。
−Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体
−Ｈｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質（ｃｏ−ｉｎｄｕｃｅｒ）
・ビモクロモル（Ｂｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）およびアリモクロモル（Ａｒｉｍｏｃｌｏｍｏｌ）などの低分子薬物
・ベンジルアルコールなどの膜流動化剤
・亜致死温熱療法（ｓｕｂ−ｌｅｔｈａｌ  ｈｅａｔ−ｔｈｅｒａｐｙ）（≦４２℃）または温熱療法
・抗炎症薬および抗腫瘍薬からなる特定の薬物
・細胞ストレス
・活性酸素種（ＲＯＳ）
・アドレナリン、ノルアドレナリン
・ＵＶ光
・放射線療法
【０２６４】
したがって、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させる任意の作用物質、化学物質、または化合物であり；この生理活性剤には、ＨＳＰ７０自体またはその機能的断片もしくは機能的変異体、および当業者に既知の任意のＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質が含まれ、これらにより、前記生理活性剤がＢＭＰと相互作用する酵素の活性を調節できる。
【０２６５】
結果として、生理活性剤は、直接または間接的にＨｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる。
【０２６６】
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体である。
【０２６７】
別の実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質である。
【０２６８】
別の実施形態では、本発明による生理活性剤には、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体とＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質の組合せが含まれる。
【０２６９】
薬剤として使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の一態様である。
【０２７０】
リソソーム蓄積障害の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２７１】
リソソーム蓄積障害の薬剤として使用するため、または治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２７２】
一実施形態では、前記治療は、予防、治癒、または改善であり得る。特定の一実施形態では、前記治療は予防である。別の実施形態では、前記治療は治癒である。さらなる実施形態では、前記治療は改善である。
【０２７３】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択される。
【０２７４】
特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病Ａ型またはＢ型である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ファーバー病である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、クラッベ病である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、異染性白質ジストロフィーである。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、シアリドーシスである。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ファブリー病である。なお別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ゴーシェ病である。なお別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、サポシン欠損症である。
【０２７５】
また、リソソーム蓄積障害の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することも本発明の態様であり、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択される、１つ、例えば、２つ、例えば、３つ、例えば、４つ、例えば、５つ、例えば、６つ、例えば、７つの障害である。
【０２７６】
結果として、本発明による生理活性剤は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択されるリソソーム蓄積障害の亜集団の治療のために使用することができる。
【０２７７】
特定の一実施形態では、本発明による生理活性剤は、ニーマンピック病Ａ型またはＢ型およびファーバー病の治療のために使用することができる。
【０２７８】
一実施形態では、本発明による生理活性剤には、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体と、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用を増大させる物質の組合せが含まれる。
【０２７９】
リソソーム蓄積障害の治療のための薬剤の製造のための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用を提供することも本発明のなおさらなる態様である。
【０２８０】
生理活性剤−Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体
本発明は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の使用による、ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性の調節に関する。
【０２８１】
薬剤として使用するためのＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を提供することが本発明の態様である。
【０２８２】
リソソーム蓄積障害の治療に使用するためのＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０２８３】
リソソーム蓄積障害の治療用の薬剤の製造のための、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の使用を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０２８４】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択される。
【０２８５】
本発明によるＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、任意の天然産物または合成生成物とすることができ、当業者に既知の任意の従来の技術によって生産することができることを理解されたい。
【０２８６】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、天然源から精製される。前記天然源は、それを必要とする個体に投与するのに適した形態のＨｓｐ７０を発現する、または発現するように誘導することができる任意の植物、動物、または細菌とすることができる。
【０２８７】
しかし、好適な実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は合成的に生産される。結果として、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、好適な一実施形態では、従来の技術によって作製された組換えタンパク質とすることができ、従ってｒＨｓｐ７０と呼ばれる。
【０２８８】
合成または天然の本発明によるＨｓｐ７０は、任意の適した種の植物、動物、または細菌に由来する配列を有することができる。一実施形態では、前記ｒＨｓｐ７０は、哺乳動物に由来する。前記哺乳動物は、ヒト（ホモサピエンス）、マウス（ハツカネズミ）、ウシ、イヌ、ラット、フェレット、ブタ、ヒツジ、およびサルからなる群から選択することができる。別の実施形態では、前記Ｈｓｐ７０は、細菌に由来する。
【０２８９】
Ｈｓｐ７０は、非常に高度の種間の配列保存性を有することによって部分的に特徴付けられるため、有害な免疫応答を引き起こすことなく、ある種に由来するＨｓｐ７０の別の種への使用を可能にする可能性がある。
【０２９０】
特定の一実施形態では、前記ｒＨｓｐ７０は、ヒトＨｓｐ７０に由来する配列を有する。
【０２９１】
特定の一実施形態では、前記ｒＨｓｐ７０は、２種以上に由来する配列を有する。前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、一実施形態では、キメラとすることができる。
【０２９２】
組換えタンパク質は、組換えＤＮＡに由来するタンパク質である。組換えＤＮＡは、天然には存在しないＤＮＡの型であり、恐らく通常は一緒に発生しないＤＮＡ配列を結合することによって作製される。遺伝子改変に関しては、組換えＤＮＡが、特定の目的のために異なる形質をコードするために、細菌のプラスミドなどのように、既存の生物ＤＮＡ内への関連ＤＮＡの追加により導入される。これは、細胞内のプロセスによって起こるものではなく人間によって操作されるため、遺伝子組換えとは異なる。
【０２９３】
一実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０は、野生型Ｈｓｐ７０タンパク質に対して１００％の相同性を有する。別の実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０は、野生型Ｈｓｐ７０タンパク質に対して１００％未満、例えば、野生型タンパク質に対して９９．９〜９５％の相同性、例えば、９５〜９０％の相同性、例えば、９０〜８５％の相同性、例えば、８５〜８０％の相同性、例えば、８０〜７５％の相同性、例えば、７５〜６０％の相同性を有する。相同性の程度にかかわらず、ＢＭＰに結合する酵素の酵素活性を調節する能力を維持するＨｓｐ７０の任意の変異体も本発明に包含される。
【０２９４】
一実施形態では、生理活性剤は、Ｈｓｐ７０である。一実施形態では、前記Ｈｓｐ７０は、完全長Ｈｓｐ７０である。
【０２９５】
また、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体を提供することも実施形態である。本明細書で定義されているように、機能的断片または機能的変異体は、本発明では、ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性を調節する能力である所望の機能を有するＨｓｐ７０の任意の断片である。
【０２９６】
一実施形態では、生理活性剤は、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体である。
【０２９７】
一実施形態では、生理活性剤は、Ｈｓｐ７０が、野生型Ｈｓｐ７０の欠失（複数可）、付加（複数可）、または置換（複数可）によって改変されたＨｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体である。
【０２９８】
野生型Ｈｓｐ７０タンパク質は、６４１のアミノ酸の全長を有する。Ｈｓｐ７０の断片は、一実施形態では、６４１のアミノ酸の野生型タンパク質よりも短い全長の任意の断片、例えば、６２５未満のアミノ酸、例えば、６００未満のアミノ酸、例えば、５７５未満のアミノ酸、例えば、５５０未満のアミノ酸、例えば、５２５未満のアミノ酸、例えば、５００未満のアミノ酸、例えば、４７５未満のアミノ酸、例えば、４５０未満のアミノ酸、例えば、４２５未満のアミノ酸、例えば、４００未満のアミノ酸、例えば、３７５未満のアミノ酸、例えば、３５０未満のアミノ酸、例えば、３２５未満のアミノ酸、例えば、３００未満のアミノ酸、例えば、２７５未満のアミノ酸、例えば、２５０未満のアミノ酸、例えば、２２５未満のアミノ酸、例えば、２００未満のアミノ酸、例えば、１７５未満のアミノ酸、例えば、１５０未満のアミノ酸、例えば、１２５未満のアミノ酸、例えば、１００未満のアミノ酸、例えば、７５未満のアミノ酸、例えば、５０未満のアミノ酸、例えば、２５未満のアミノ酸の断片を含むことを意味する。
【０２９９】
野生型Ｈｓｐ７０タンパク質は、６４１のアミノ酸の全長を有する。Ｈｓｐ７０の断片は、一実施形態では、１０のアミノ酸よりも長い全長の任意の断片、例えば、２６以上のアミノ酸、例えば、５１以上のアミノ酸、例えば、７６以上のアミノ酸、例えば、１０１以上のアミノ酸、例えば、１２６以上のアミノ酸、例えば、１５１以上のアミノ酸、例えば、１７６以上のアミノ酸、例えば、２０１以上のアミノ酸、例えば、２２６以上のアミノ酸、例えば、２５１以上のアミノ酸、例えば、２７６以上のアミノ酸、例えば、３０１以上のアミノ酸、例えば、３２６以上のアミノ酸、例えば、３５１以上のアミノ酸、例えば、３７６以上のアミノ酸、例えば、４０１以上のアミノ酸、例えば、４２６以上のアミノ酸、例えば、４５１以上のアミノ酸、例えば、４７６以上のアミノ酸、例えば、５０１以上のアミノ酸、例えば、５２６以上のアミノ酸、例えば、５５１以上のアミノ酸、例えば、５７６以上のアミノ酸、例えば、６０１以上のアミノ酸、例えば、６２６以上のアミノ酸の断片を含むことを意味する。
【０３００】
結果として、本発明によるＨｓｐ７０の断片の全長は、一実施形態では、５〜２５のアミノ酸、例えば、２５〜５０のアミノ酸、例えば、５０〜７５のアミノ酸、例えば、７５〜１００のアミノ酸、例えば、１００〜１２５のアミノ酸、例えば、１２５〜１５０のアミノ酸、例えば、１５０〜１７５のアミノ酸、例えば、１７５〜２００のアミノ酸、例えば、２００〜２２５のアミノ酸、例えば、２２５〜２５０のアミノ酸、例えば、２５０〜２７５のアミノ酸、例えば、２７５〜３００のアミノ酸、例えば、３００〜３２５のアミノ酸、例えば、３２５〜３５０のアミノ酸、例えば、３５０〜３７５のアミノ酸、例えば、３７５〜４００のアミノ酸、例えば、４００〜４２５のアミノ酸、例えば、４２５〜４５０のアミノ酸、例えば、４５０〜４７５のアミノ酸、例えば、４７５〜５００のアミノ酸、例えば、５００〜５２５のアミノ酸、例えば、５２５〜５５０のアミノ酸、例えば、５５０〜５７５のアミノ酸、例えば、５７５〜６００のアミノ酸、例えば、６００〜６２５のアミノ酸、例えば、６２５〜６４０のアミノ酸の範囲内とすることができる。
【０３０１】
特定の一実施形態では、Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインのすべてまたは一部を含む。結果として、本発明によるＨｓｐ７０の断片または変異体は、一実施形態では、アミノ酸番号３０〜３８２のすべてまたは一部を含む。
【０３０２】
別の特定の実施形態では、Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインのアミノ酸位置９０にトリプトファンを含む。
【０３０３】
Ｈｓｐ７０の断片は、野生型タンパク質の切り詰め型、つまり短い型とすることができる。断片は、タンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかからタンパク質を短くすることによって切り詰めるか、またはタンパク質の任意のサイズの１つまたは複数の内部領域の欠失によって切り詰めることができる。
【０３０４】
Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、一実施形態では、野生型タンパク質に対して１００％の相同性を有する。別の実施形態では、Ｈｓｐ７０の断片または変異体は、野生型タンパク質に対して１００％未満の相同性、例えば、野生型タンパク質に対して９９．９〜９５の相同性、例えば、９５〜９０％の相同性、例えば、９０〜８５％の相同性、例えば、８５〜８０％の相同性、例えば、８０〜７５％の相同性、例えば、７５〜６０％の相同性を有するＨｓｐ７０の変異体とすることもできる。
【０３０５】
リソソーム酵素活性を調節する能力を維持したＨｓｐ７０の任意の断片または変異体が本発明に包含されることを理解されたい。
【０３０６】
ＢＭＰと相互作用する能力を維持したＨｓｐ７０の任意の断片または変異体が本発明に包含されることを理解されたい。
【０３０７】
機能的断片または機能的変異体の正確な定量的効果が、完全長の分子の効果とは異なり得ることを理解されたい。場合によっては、機能的断片または機能的変異体は、完全長の分子よりも実際により効果的であり得る。さらに、完全長の分子の代わりに断片を使用することは、より小さいサイズの断片の点から有利であり得る。
【０３０８】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体は、１つまたは複数のアミノ酸が置換されたＨｓｐ７０の変異体とすることができる。前記置換（複数可）は、等価もしくは保存的置換（複数可）または非等価もしくは非保存的置換（複数可）とすることができる。
【０３０９】
一実施形態では、野生型Ｈｓｐ７０の、０．１〜１％のアミノ酸残基、例えば、１〜２％のアミノ酸残基、例えば、２〜３％のアミノ酸残基、例えば、３〜４％のアミノ酸残基、例えば、４〜５％のアミノ酸残基、例えば、５〜１０％のアミノ酸残基、例えば、１０〜１５％のアミノ酸残基、例えば、１５〜２０％のアミノ酸残基、例えば、２０〜３０％のアミノ酸残基、例えば、３０〜４０％のアミノ酸残基、例えば、４０〜５０％のアミノ酸残基、例えば、５０〜６０％のアミノ酸残基、例えば、６０〜７０％のアミノ酸残基、例えば、７０〜８０％のアミノ酸残基、例えば、８０〜９０％のアミノ酸残基、例えば、９０〜１００％のアミノ酸残基が置換されている。
【０３１０】
一実施形態では、野生型Ｈｓｐ７０の、１〜５のアミノ酸残基、例えば、５〜１０のアミノ酸残基、例えば、１０〜１５のアミノ酸残基、例えば、１５〜２０のアミノ酸残基、例えば、２０〜３０のアミノ酸残基、例えば、３０〜４０のアミノ酸残基、例えば、４０〜５０のアミノ酸残基、例えば、５０〜７５のアミノ酸残基、例えば、７５〜１００のアミノ酸残基、例えば、１００〜１５０のアミノ酸残基、例えば、１５０〜２００のアミノ酸残基、例えば、２００〜３００のアミノ酸残基、例えば、３００〜４００のアミノ酸残基、例えば、４００〜５００のアミノ酸残基が置換されている。
【０３１１】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０の機能的断片または機能的変異体は、融合タンパク質である。一実施形態では、Ｈｓｐ７０の前記機能的断片または機能的変異体は、タグに融合されている。
【０３１２】
Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を使用することの利点
上記したように、リソソーム蓄積症の治癒法は存在せず、治療は、ゴーシェ病およびファブリー病に対する酵素補充療法（ＥＲＴ）の開発を除き、殆どが対症療法である。上述したように、ＥＲＴは、１つの特定の疾患のみに対して有効な非常に高価な形態の療法である。
【０３１３】
本発明者らの知る限りでは、現在まで、脂質の蓄積に関連した残りのリソソーム蓄積症に対するＥＲＴは、成功した試しがないため、これらのＬＳＤの有効かつ特異的な治療に対する満たされていない重要な要求が現在も残っている。
【０３１４】
それを必要とする個体へのＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の投与は、リソソーム蓄積障害のための従来の治療方式に対して多数の利点を有する。
【０３１５】
まず、ｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体などの組換えタンパク質の作製は、最新技術を用いた、十分な量のｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を作製する単純で簡単な方法である。組換え酵素を作製する従来の技術は、当業者には周知である。
【０３１６】
さらに、ｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体などの組換えタンパク質の作製は、十分な量のｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を作製するための安価な方法である。ＥＲＴの酵素の作製と比較して、コストが大幅に削減される。
【０３１７】
また、ｒＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の使用は、２つ以上の特定のリソソーム蓄積障害の治療に使用することができる。これは、本発明のＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質にも当てはまる。実際、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤は、関係する欠陥酵素の酵素活性を調節することによって回復され得る任意のリソソーム蓄積症の治療に使用することができ、前記酵素はＢＭＰと相互作用する。
【０３１８】
最後に、Ｈｓｐ７０は、内因性に発生する分子、すなわち生物、組織、または細胞内を起源とする分子であるため、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を投与しても全くまたは非常に限られた免疫応答しか引き起こされないと期待されている。これは、個体に投与した際に治療を促進し、副作用の可能性を低減するため大きな利点である。
【０３１９】
Ｈｓｐ７０の異所性発現
一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、ベクターから発現させることができる。したがって、本発明は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターに関する。
【０３２０】
本発明の一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、それを必要とする個体にベクターの形態で投与することができる。
【０３２１】
Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の発現に使用されるベクターは、ウイルスベクター（レトロウイルスおよびアデノウイルス）または非ウイルスベクター（プラスミド、コスミド、バクテリオファージ）からなる群から選択することができる。
【０３２２】
一実施形態では、前記ベクターは、１つまたは複数の複製起点、選択用のマーカー、および制限エンドヌクレアーゼ用の１つまたは複数の認識部位を含む。別の実施形態では、前記ベクターは、適した宿主細胞における前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の転写を制御する調節配列に機能的に連結されている。
【０３２３】
本発明は、一実施形態では、本明細書に記載された、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体の作製方法に関し；前記方法は、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターを用意するステップと、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは適した宿主生物のｉｎ  ｖｉｖｏで前記ベクターを発現させて前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を作製するステップを含む。
【０３２４】
本発明はさらに、本発明による、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターを含む、単離された組換えまたはトランスジェニック宿主細胞に関する。
【０３２５】
本発明はまた、組換えまたはトランスジェニック宿主細胞を作製するための方法に関し、前記方法は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体をコードするベクターを用意するステップと、前記ベクターを前記組換えまたはトランスジェニック宿主細胞に導入するステップと、前記ベクターを前記組換えまたはトランスジェニック宿主細胞で発現させて、前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を産生する組換えまたはトランスジェニック宿主細胞を作製する任意選択のステップを含む。
【０３２６】
別の実施形態では、本発明は、上記した宿主細胞を含むトランスジェニック哺乳動物に関する。
【０３２７】
さらなる実施形態では、本発明による組換えまたはトランスジェニック宿主細胞を含むトランスジェニック哺乳動物はヒトではない。
【０３２８】
トランスジェニック宿主細胞は、哺乳動物、植物、細菌、酵母、または真菌宿主細胞からなる群から選択することができる。
【０３２９】
ＤＮＡの細胞内への送達を改善するために、ＤＮＡは、損傷から保護されなければならず、その細胞内への侵入が促進されなければならない。トランスフェクションプロセスの際に不所望の分解からＤＮＡを保護する能力を有するリポプレックスおよびポリプレックスが考案された。プラスミドＤＮＡは、ミセルまたはリポソームのような組織構造に脂質で覆うことができる。組織構造がＤＮＡと複合体を形成すると、リポプレックスと呼ばれる。リポソームの形成に利用できる３種類の脂質；陰イオン性（負に帯電した）脂質、中性脂質、または陽イオン性（正に帯電した）脂質が存在する。ポリマーとＤＮＡの複合体はポリプレックスと呼ばれる。殆どのポリプレックスは、陽イオン性ポリマーからなり、これらの形成は、イオン相互作用によって調節される。
【０３３０】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体を含むベクターは、遺伝子療法に使用することができる。遺伝子療法は、有害な変異対立遺伝子が機能的な遺伝子と置換される遺伝病などの疾患を治療するために個体の細胞および組織に遺伝子を挿入する。
【０３３１】
別の実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、裸のＤＮＡとして投与することができる。これは、非ウイルストランスフェクションの単純な形態である。裸のＤＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、または高圧ガスを用いて細胞内にＤＮＡ被覆金粒子を打ち込む「遺伝子ガン」の使用によって行うことができる。
【０３３２】
生理活性剤−Ｈｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質
本発明は、一実施形態では、Ｈｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質の使用による、ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性の調節に関する。
【０３３３】
Ｈｓｐ７０誘導物質は、それ自体によって、同時ストレスを起こさずにＨｓｐ７０の遺伝子発現およびタンパク質発現を増幅できる化合物である。
【０３３４】
Ｈｓｐ７０共誘導物質は、同時（軽度）ストレスを起こさずにＨｓｐ７０の遺伝子発現およびタンパク質発現を増幅できない化合物であるが、Ｈｓｐ７０レベルのストレスによる上昇が、これらの存在によってさらに上昇または促進される。
【０３３５】
薬剤として使用するためのＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明の態様である。
【０３３６】
リソソーム蓄積障害の治療に使用するためのＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明のさらなる態様である。
【０３３７】
リソソーム蓄積障害の治療用の薬剤の製造のためのＨｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質の使用を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０３３８】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択される。
【０３３９】
特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病Ａ型またはＢ型である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ファーバー病である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、クラッベ病である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、異染性白質ジストロフィーである。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、シアリドーシスである。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ファブリー病である。なお別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ゴーシェ病である。なお別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、サポシン欠損症である。
【０３４０】
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質およびＨｓｐ７０共誘導物質である。特定の実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質である。別の特定の実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０共誘導物質である。
【０３４１】
低分子薬物−ヒドロキシルアミン誘導体
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０共誘導物質である。さらなる実施形態では、前記Ｈｓｐ７０共誘導物質は低分子薬物である。
【０３４２】
特定の実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０共誘導物質は、ヒドロキシルアミン誘導体である。前記ヒドロキシルアミン誘導体は、さらなる実施形態では、ビモクロモル（ＢＲＬＰ−４２）、アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）、ＢＲＸ−３４５、およびＢＧＰ−１５からなる群から選択することができる。
【０３４３】
特定の実施形態では、前記ヒドロキシルアミン誘導体は、アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）である。
【０３４４】
ビモクロモル（［２−ヒドロキシ−３−（１−ピペリジニル）プロポキシ］−３−ピリジン−カルボキシイミドイル−マレイン酸クロライド）（［２−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−（１−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｒｏｐｏｘｙ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｃａｒｂｏｘｉｍｉｄｏｙｌ−ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｍａｌｅａｔｅ）は、元々は神経障害などの糖尿病合併症の治療のために開発された非毒性化合物である。ビモクロモルは、ＨＳＦ−１の活性化によってＨｓｐ７０を含む細胞内熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）を増加させることによって、実験ストレス条件下で部分的に細胞の生存率を改善することが示された。ビモクロモルが、折り畳まれていないタンパク質の非存在下でＨｓｐ７０共誘導の能力を有すること、およびビモクロモルが、相互作用して負に帯電した膜脂質の流動性を高めることが示された。ＢＲＸ−３４５は、ＨＳＰを誘導する能力がやや低いビモクロモルの構造類似体である。
【０３４５】
アリモクロモル（ＢＲＸ−２２０）は、同様に相互作用して熱ショック応答を増幅するビモクロモルの類似体である。アリモクロモルは、現在、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症）；進行性の神経変性障害の治療のために臨床試験中である。アリモクロモルは、ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって所有されている。
【０３４６】
したがって、リソソーム蓄積障害の治療に使用するためのヒドロキシルアミン誘導体Ｈｓｐ７０共誘導物質を提供することが本発明の態様である。
【０３４７】
リソソーム蓄積障害の治療用の薬剤の製造のためのヒドロキシルアミン誘導体Ｈｓｐ７０共誘導物質の使用を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０３４８】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択される。
【０３４９】
膜流動化剤
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０誘導物質である。さらなる実施形態では、前記Ｈｓｐ７０誘導物質は、膜流動化剤である。
【０３５０】
膜流動化剤を用いた治療も、脂質療法と呼ぶことができる。
【０３５１】
特定の実施形態では、本発明によるＨｓｐ７０誘導物質は、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、および麻酔薬、例えば、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカイン、ならびに当業者に既知の他の物質からなる群から選択される膜流動化剤である。
【０３５２】
加熱中の一定の割合の細胞タンパク質の変性（タンパク質毒性（ｐｒｏｔｅｏｔｏｘｉｃｉｔｙ））に加えて、膜の流動性の変化も、熱ショック応答を開始してＨＳＰを誘導する細胞内熱センサであると提唱された。実際、熱誘導される原形質膜の流動化に類似した化学的に誘導される膜の撹乱は、タンパク質の変性を引き起こさずにＨＳＰを活性化することができる。
【０３５３】
膜流動性は、細胞膜の脂質二重層の粘度を指す。膜リン脂質は、様々な長さおよび飽和度の脂肪酸を取り込む。
【０３５４】
膜流動化剤は、膜脂質間に入ることによって作用するため、脂質アシル鎖間のファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａａｌｓ）相互作用の弱体化による障害効果を誘導する。
【０３５５】
したがって、リソソーム蓄積障害の治療に使用するための、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、および麻酔薬、例えば、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカイン、ならびに当業者に周知の他の物質からなる群から選択される膜流動化剤を提供することが本発明の態様である。
【０３５６】
リソソーム蓄積障害の治療用の薬剤の製造のための、ベンジルアルコール、ヘプタノール、ＡＬ７２１、ドコサヘキサエン酸、脂肪族アルコール、オレイルアルコール、ジメチルアミノエタノール、Ａ２Ｃ、ファルネソール、および麻酔薬、例えば、リドカイン、ロピバカイン、ブピバカイン、およびメピバカイン、ならびに当業者に周知の他の物質からなる群から選択される膜流動化剤の使用法を提供することが本発明のなおさらなる態様である。
【０３５７】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択される。
【０３５８】
Ｈｓｐ７０を誘導するための他の手段
以下に一部の概要を説明するＨｓｐ７０の発現を誘導するためのどの手段も、本発明に包含されるものとする。
【０３５９】
個体の温度を上昇させるのは、Ｈｓｐ７０を含むＨＳＰの強力な誘導物質であるため、亜致死温熱療法は、本発明の態様である。一実施形態では、亜致死温熱療法は、個体の温度を、約３８℃、例えば、約３９℃、例えば、約４０℃、例えば、約４１℃、例えば、約４２℃、例えば、約４３℃の中核体温まで上昇させることを含む。
【０３６０】
したがって、リソソーム蓄積障害の治療に使用するための亜致死温熱療法を提供することが本発明の態様である。
【０３６１】
捕食される恐れおよび電気ショックなどの心理的ストレスが、カテコールアミンシグナル伝達に依存することが提唱されているプロセスであるストレス誘導ｅＨｓｐ７０放出を引き起こすことができる。さらに、アドレナリンおよびノルアドレナリンも、Ｈｓｐ７０の放出を引き起こすことができる。
【０３６２】
以下に示す化合物は、Ｈｓｐ７０を含むＨＳＰを誘導（または共誘導）することが示された：膜相互作用化合物アルキルリゾリン脂質エデルホシン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３または１−オクタデシル−２−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン）；セレコキシブおよびロフェコキシブなどのシクロオキシゲナーゼ１／２阻害剤ならびにアセチル−サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、およびインドメタシンなどのＮＳＡＩＤを含む抗炎症薬；プロスタグランジン（ｐｒｏｄｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）ＰＧＡ１、ＰＧｊ２、および２−シクロペンテン−１−オン；ペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体−γ作動薬；ビンクリスチンおよびパクリタキセルを含むチューブリン相互作用抗癌剤；インスリン増感剤ピオグリタゾン；カルボプラチン、ドキソルビシン、フルダラビン、イホスファミド、およびシタラビンなどの抗腫瘍薬；Ｈｓｐ９０阻害剤ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、１７−ＤＭＡＧ、ラジシコール、ハービマイシン−Ａ、およびアラキドン酸；プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２およびラクタシスチン；セリンプロテアーゼ阻害剤ＤＣＩＣ、ＴＬＣＫ、およびＴＰＣＫ；抗潰瘍薬ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）、レバミピド、カルベノキソロン、およびポラプレジンク（亜鉛Ｌ−カルノシン）；重金属（亜鉛および錫）；抗炎症薬デキサメタゾン；コカイン；ニコチン；アルコール；α−アドレナリン作動薬；シクロペンテノンプロスタノイド；ならびに漢方薬ペオニフロリン、グリチルリジン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、２酢酸ジヒドロセラストロール、およびクルクミン。
【０３６３】
したがって、リソソーム蓄積障害の治療に使用するための、エデルホシン（ＥＴ−１８−ＯＣＨ３または１−オクタデシル−２−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン）、セレコキシブ、ロフェコキシブ、アセチル−サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、インドメタシン、ＰＧＡ１、ＰＧｊ２  ２−シクロペンテン−１−オン、ペルオキシダーゼ増殖因子活性化受容体−γ作動薬、ビンクリスチン、パクリタキセル、ピオグリタゾン、カルボプラチン、ドキソルビシン、フルダラビン、イホスファミド  シタラビン、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、１７−ＤＭＡＧ、ラジシコール、ハービマイシン−Ａ、アラキドン酸、ＭＧ１３２、ラクタシスチン、ＤＣＩＣ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）、レバミピド、カルベノキソロン、ポラプレジンク（亜鉛Ｌ−カルノシン）、デキサメタゾン、コカイン、ニコチン、アルコール、α−アドレナリン作動薬、シクロペンテノンプロスタノイド、ペオニフロリン、グリチルリジン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、２酢酸ジヒドロセラストロール、およびクルクミン、ならびに当業者に既知の他のＨＳＰ誘導物質からなる群から選択される化合物を提供することが本発明の態様である。
【０３６４】
本発明による医薬組成物
本発明は、Ｈｓｐ７０の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤の使用により、ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性を調節して、リソソーム蓄積症の患者に恩恵をもたらすことに関する。
【０３６５】
本発明の生理活性剤を原料化学物質として投与することが可能であるが、医薬製剤の形態で提供することが好ましい。したがって、本発明は、本明細書で定義された本発明の生理活性剤またはその薬学的に許容される塩と、その薬学的に許容される担体を含む医療用の医薬組成物をさらに提供する。
【０３６６】
それを必要とする個体に投与することができる本明細書で定義された生理活性剤を含む医薬組成物などの組成物を提供することが本発明の態様である。
【０３６７】
一実施形態では、本発明は、本発明による生理活性剤を含む組成物に関する。本明細書に開示されたこの組成物は、一実施形態では、生理学的に許容される担体と組み合わせて製剤することができる。本明細書に開示されたこの組成物は、一実施形態では、薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤することができる。
【０３６８】
本発明の生理活性剤を含む医薬組成物は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９５、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第１９版、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａに開示されている従来の技術によって調製することができる。
【０３６９】
本発明の生理活性剤は、非経口投与用に製剤することができ、アンプル、充填済み注射器、少量の注入液、または保存剤が添加された複数の用量容器の単位用量形態で提供することができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルジョン、担体、希釈剤、または無機塩もしくは他の水溶解性分子の水性溶液を含む溶媒、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、動物油、合成油、注射用有機エステルなどの形態をとり得、そして保存剤、湿潤剤、乳化剤または懸濁剤、安定剤および／または分散剤、着色剤、緩衝剤、増粘剤、および可溶化剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。あるいは、活性成分は、適したビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水と共に使用する前に合わせるために、滅菌固形物（ｓｔｅｒｉｌｅ  ｓｏｌｉｄ）の無菌分離または溶液の凍結乾燥により得られる粉末形態をとり得る。
【０３７０】
調製できる生理活性剤の薬学的に許容される塩も、塩の特定の水和形態であるため、本発明に包含されるものとする。これらの塩は、薬学的使用への適用で許容される塩である。このため、塩が親化合物の生理活性を維持し、その塩がその適用および疾患の治療での使用において予期しないまたは有害な影響を与えないことを意味する。
【０３７１】
薬学的に許容される塩は、標準的な方法で調製される。親化合物が塩基である場合は、適当な溶媒に溶解された過剰な有機酸または無機酸で処理される。親化合物が酸である場合は、適当な溶媒に溶解された無機塩基または有機塩基で処理される。
【０３７２】
当業者に周知の本発明による生理活性剤のあらゆる適当な製剤を利用することができる。
【０３７３】
一実施形態では、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体は、リポソームなどの生分解性マイクロスフェアに製剤される。
【０３７４】
投与
本発明による有効量の生理活性剤を哺乳動物、好ましくはヒトに送達するために投与のあらゆる適当な経路を利用することができ、前記生理活性剤は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体することができる。
【０３７５】
それを必要とする個体への生理活性剤または医薬組成物の投与は、３つの主な送達経路；（１）局所（皮膚または粘膜などの体の表面への塗布）、（２）経腸（胃腸管または消化管を経由）、および（３）非経口（胃腸管または消化管以外の経路）を介して行うことができる。
【０３７６】
局所投与には、経皮（皮膚に塗布）、吸入、浣腸、点眼（結膜への）、点耳、鼻腔内経路、および膣内投与が含まれる。
【０３７７】
経腸投与は、胃腸管の任意の一部が関与するあらゆる形態の投与であり、経腸投与には、胃または十二指腸摂食チューブに加えて、経口投与（口から、例えば、タブレット、カプセル、または液滴）、直腸内（例えば、坐剤または浣腸）投与が含まれる。
【０３７８】
注射または注入などによる非経口投与は、生理活性剤を標的部位に送達する、または薬物を血流に導入するのに有効であり、そして非経口投与には、静脈内（静脈の中）、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉の中）、心臓内（心臓の中）、皮下（皮膚の下）、骨内（骨髄の中）、皮内（皮膚自体の中）、クモ膜下または脊髄内（脊柱管の中）、腹膜内（腹膜の中）、経皮（無傷の皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散、例えば、吸入（鼻から）、舌下、口腔、および膣座剤）、吸入、硬膜外（硬膜外腔の中）、および硝子体内（眼の中）が含まれる。舌下投与（舌の下側）も、非経口投与の一形態であり、生理活性剤が舌の下側の粘膜組織を介して血流内に拡散される。本発明の生理活性剤は、送達のあらゆる非経口経路、好ましくは上記のいずれかの経路によって投与することができる。
【０３７９】
非経口送達は、腸内送達に関連した胃腸管内での分解を回避するという利点を有する。
【０３８０】
非経口送達は、化合物が体循環に直接吸収されるのを可能にするため、腸内送達に関連した初回通過代謝を無効にするというさらなる利点を有する。
【０３８１】
初回通過代謝は、体循環に達する前に薬物の濃度が大幅に低下する薬物代謝の現象である。初回通過代謝は、一般に肝臓および腸壁に関連した吸収のプロセスの際の薬物の僅かな消失である。
【０３８２】
薬物が嚥下されると、薬物は、消化系によって吸収され、肝門脈系に進入する。薬物は、他の体の部位に達する前に門脈を通って肝臓内に送達される。肝臓は、多くの薬物を代謝し、時にはほんの少量の活性薬物しか肝臓を出て循環系の他の部位に達しない程度まで代謝する。したがって、この初回の肝臓の通過は、薬物のバイオアベイラビリティーを大幅に低下させる。
【０３８３】
薬物の初回通過効果に影響を与える４つの主な系は、胃腸管腔の酵素、腸壁酵素、細菌酵素、および肝酵素である。
【０３８４】
このような投与に適した剤形は、従来の技術によって調製することができる。エアロゾル剤形または定量吸入器などの吸入によって投与するのに適した剤形は、従来の技術によって調製することができる。
【０３８５】
一実施形態では、本発明による生理活性剤の投与の特定方式は、非経口投与によるものである。
【０３８６】
一実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の特定の方式は、静脈内、皮下、粘膜内、動脈内、皮下、または腹膜内注射によるものである。
【０３８７】
一実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の特定の方式は、吸入によるものである。
【０３８８】
一実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の特定の方式は、静脈内注入によるものである。
【０３８９】
本発明による静脈内注射は、一実施形態では、１０〜２０分、例えば、２０〜３０分、例えば、３０〜４０分、例えば、４０〜５０分、例えば、５０〜６０分、例えば、６０〜９０分、例えば、９０〜１２０分、例えば、２〜３時間、例えば、３〜４時間、例えば、４〜５時間、例えば、５〜６時間、例えば、６〜７時間、例えば、７〜８時間の期間に渡って行うことができる。
【０３９０】
特定の実施形態では、本発明の生理活性剤の非経口投与の方式は、経粘膜送達によるものである。前記経粘膜送達は、一実施形態では、舌下送達であり、別の実施形態では、前記経粘膜送達は、口腔送達であり、なお別の実施形態では、前記経粘膜送達は、吸入または鼻腔内送達である。
【０３９１】
剤形には、タブレット、トローチ、分散液、懸濁液、溶液、カプセル、クリーム、軟膏、エマルジョン、ゲル、ローション、ペースト、エアロゾル、または当技術分野で既知の他の形態が含まれる。
【０３９２】
利用される活性成分の有効量は、利用される特定の組成、投与の方式、治療される状態、および治療される状態の重症度によって異なり得る。このような有効量は、当業者が容易に確認することができる。
【０３９３】
一実施形態では、本発明の生理活性剤は、毎日１回の投与または分割投与、または持続放出形態で、動物の体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１００ｍｇの１日の投与量で投与される。投与計画は、最適な治療応答を提供するために、この範囲内またはこの範囲外でも調整することができる。
【０３９４】
一実施形態では、本発明の生理活性剤は、体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜約１０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約５０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約１００μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１００μｇ〜約２５０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約２５０μｇ〜約５００μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約５００μｇ〜約７５０μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約７５０μｇ〜約１０００μｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ、例えば、体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇ〜約１００ｍｇの用量で投与される。
【０３９５】
前記用量は、一定の時間間隔で投与することができ、単位時間当たり、体重１ｋｇ当たりｍｇとして表すことができる。前記単位時間は、一実施形態では、１分当たり、例えば、１時間当たり、例えば、１日当たり、例えば、１週間当たりとすることができる。
【０３９６】
併用治療
他の治療方式と共に、リソソーム蓄積障害の治療に使用するための、Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を提供することが本発明の態様である。
【０３９７】
本発明は、一態様では、少なくとも１つの他の治療方式と併用する、本発明による生理活性剤を投与することを含むリソソーム蓄積症の治療方法に関する。
【０３９８】
したがって、一実施形態では、本発明による生理活性剤は、ＬＳＤの従来または既知の治療方式などの少なくとも１つの他の治療方式と併用して、それを必要する個体に投与される。
【０３９９】
本発明による生理活性剤は、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体、あるいはＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質であることを理解されたい。
【０４００】
併用する２つ以上の治療方式の実施は、同時または連続的に行うことができる。同時実施は、同じ組成物または別個の組成物に含められた２つの化合物とするか、または必然的に同時に行われる１つの組成物および他の治療方式とすることができる。連続実施は、まず１つの治療方式を実施、次いで第２の治療方式を実施するなど、異なる時点で２つの治療方式が実施されることを意味する。２つ以上の治療方式を連続的に実施するための時間枠は、最適な効果を得るために当業者が判定することができ、一実施形態では、３０分〜７２時間とすることができる。
【０４０１】
化学化合物の形態の治療方式は、それぞれその最も有効な量で、一緒または別個に実施することができる。２つ以上の化合物の投与は、相乗効果を有することができるため、各薬物の必要な用量が効果的に低減することができる。
【０４０２】
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、酵素補充療法（ＥＲＴ）と併用して、それを必要とする個体に投与される。前記ＥＲＴは、一実施形態では、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（注射用のイミグルセラーゼ）、Ｍｉｇｌｕｓｔａｔ、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（アガルシダーゼベータ）、およびＲｅｐｌａｇａｌ（アガルシダーゼアルファ）からなる群から選択することができる。
【０４０３】
一実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標）（注射用のイミグルセラーゼ）またはＭｉｇｌｕｓｔａｔと組み合わせて、ゴーシェ病の個体に投与される。
【０４０４】
別の実施形態では、本発明による生理活性剤は、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（アガルシダーゼベータ）またはＲｅｐｌａｇａｌ（アガルシダーゼアルファ）と組み合わせて、ファブリー病の個体に投与される。
【０４０５】
別の実施形態では、本発明による生理活性剤は、鎮痛剤と組み合わせて、それを必要とする個体に投与される。
【０４０６】
なお別の実施形態では、本発明による生理活性剤は、コルチコステロイドと組み合わせて、それを必要とする個体に投与される。
【０４０７】
本発明による生理活性剤は、一実施形態では、骨髄移植、臍帯血移植、または幹細胞移植などの移植と併用して、それを必要とする個体に投与することができる。
【０４０８】
本発明による生理活性剤は、別の実施形態では、基質抑制療法と併用して、それを必要とする個体に投与することができる。
【０４０９】
別の実施形態では、本発明による生理活性剤は、理学療法などの対症および支持療法と併用して、それを必要とする個体に投与される。
【０４１０】
Ｈｓｐ７０は化合物の取り込みを増加させる
本発明者らは、Ｈｓｐ７０が他の分子のエンドサイトーシスによる取り込みを増加させることをさらに示した（図１６）。この取り込みの増加は、Ｈｓｐ７０の存在下で化合物が細胞により容易に取り込まれるようにする受動機構によってＨｓｐ７０に依存しないで起こり得る、またはＨｓｐ７０との直接的な関連によってＨｓｐ７０に依存して起こり得る。
【０４１１】
細胞の化合物の取り込みを増加させるＨｓｐ７０の能力は、細胞に投与されるＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体が細胞に容易に取り込まれるようにするという点で有利である。
【０４１２】
さらに、細胞の化合物の取り込みを増加させるＨｓｐ７０の能力は、Ｈｓｐ７０の存在が、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ７０と組み合わせて与えられる化合物の両方の取り込みを増加し得るため、併用治療計画で有利である。
【０４１３】
１つの化合物がＥＲＴ用の酵素であり、もう１つがＨｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体である併用療法では、これは、有効な細胞内用量を達成するために必要なＥＲＴ用の酵素の量を効果的に低減するのに役立ち得る。これは、ＥＲＴが非常に高価であるため適切である。
【０４１４】
したがって、本発明による生理活性剤が、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片もしくは機能的変異体とＨｓｐ７０誘導物質またはＨｓｐ７０共誘導物質の組合せを含む場合は、Ｈｓｐ７０の存在が、前記Ｈｓｐ７０誘導物質または前記Ｈｓｐ７０共誘導物質の取り込みを増加させ得る。
【０４１５】
酵素の酵素活性を調節するための方法
本発明は、一態様では、酵素活性の調節に関する。前記酵素は、リソソーム物質の異化に関与する酵素とすることができる。そして前記調節は、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用に由来し得る。
【０４１６】
したがって、本発明者らは、Ｈｓｐ７０がＢＭＰと相互作用するかまたは一定の親和性でＢＭＰに結合する、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用を説明した。分子Ｘに対して「親和性」を有する分子とは、本明細書では、分子Ｘに対して親和性を有する分子が、一定の条件下で一定の検出可能な量の分子Ｘに結合するが、同一の条件下で他の異なる分子（分子Ｘがこの分子に対して親和性を有していない）に同程度までは（任意選択で検出可能に）結合しないことを意味する。分子の別の分子に対する親和性を示す１つの指標は、解離定数Ｋｄである。Ｋｄが小さければ小さいほど、親和性が強い。解離定数は、表面プラズモン共鳴分析などの当技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。本明細書では、別の分子Ｘに対して「親和性」を有する分子は、１００ｍＭ未満、例えば、１０ｍＭ未満、例えば、５ｍＭ未満、例えば、１ｍＭ未満、例えば、０．１ｍＭ未満、例えば、０．０１ｍＭ未満、例えば、１μＭ未満、例えば、１００ｎＭ未満、例えば、１０ｎＭ未満、例えば、１ｎＭ未満、例えば、１００ｐＭ未満、例えば、１０ｐＭ未満、例えば、１ｐＭ未満である前記分子Ｘに対するＫｄを有するのが好ましい。さらに、本明細書では、分子Ｘに対して「親和性を有していない」分子は、分子Ｘに対して親和性を有する分子の（分子Ｘに対する）結合のＫｄよりも、少なくとも１０倍、例えば、少なくとも２０倍、例えば、少なくとも３０倍、例えば、少なくとも４０倍、例えば、少なくとも５０倍、例えば、少なくとも６０倍、例えば、少なくとも７０倍、例えば、少なくとも８０倍、例えば、少なくとも９０倍、例えば、少なくとも１００倍大きい、結合している分子Ｘに対する解離定数Ｋｄを有するのが好ましい。最も好ましくは、分子Ｘに対して親和性を有すると見なされる分子と親和性を有していないと見なされる分子との間に少なくとも１０倍のＫｄの差が存在する。
【０４１７】
酵素の酵素活性を調節するための方法であって、前記酵素がＢＭＰ（ビス（モノアシルグリセロ）リン酸）と相互作用し、前記方法が、
（ｉ）Ｈｓｐ７０の細胞内の濃度および／または活性を上昇させることができる生理活性剤を投与するステップと、
（ｉｉ）ＢＭＰとＨｓｐ７０との間の相互作用を可能にするステップと、
（ｉｉｉ）ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性を調節するステップと、を含む、方法を提供することが本発明の態様である。
【０４１８】
前記相互作用は、一実施形態では、直接的とすることができ、または前記相互作用は、別の実施形態では、間接的とすることができる。
【０４１９】
一実施形態では、本発明は、酵素の酵素活性を調節するための方法であって、前記酵素がＢＭＰ（ビス（モノアシルグリセロ）リン酸）と相互作用し、前記方法が、
（ｉ）本発明による生理活性剤を投与するステップと、
（ｉｉ）ＢＭＰとＨｓｐ７０との間の相互作用を可能にするステップと、
（ｉｉｉ）ＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性を調節するステップと、を含む、方法に関する。
【０４２０】
一実施形態では、前記Ｈｓｐ７０は、ＢＭＰと共有結合または非共有結合複合体を形成する。
【０４２１】
一実施形態では、前記ＢＭＰは、サポシンと相互作用する。さらなる実施形態では、前記サポシンは、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、およびサポシンＤからなる群から選択することができる。
【０４２２】
さらなる実施形態では、前記酵素は、スフィンゴミエリナーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭａｓｅ）、酸性セラミダーゼ、β−ガラクトシルセラミダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコシルセラミダーゼ、シアリダーゼ、およびアリールスルファターゼからなる群から選択される。
【０４２３】
ある特定の一実施形態では、酵素活性の調節は、酵素活性の増加である。
【０４２４】
一実施形態では、前記酵素活性の増加は、１〜５％の範囲、例えば、５〜１０％の範囲、例えば、１０〜１５％の範囲、例えば、１５〜２０％の範囲、例えば、２０〜２５％の範囲、例えば、２５〜３０％の範囲、例えば、３０〜３５％の範囲、例えば、３５〜４０％の範囲、例えば、４０〜４５％の範囲、例えば、４５〜５０％の範囲、例えば、５０〜６０％の範囲、例えば、６０〜７０％の範囲、例えば、７０〜８０％の範囲、例えば、８０〜９０％の範囲、例えば、９０〜１００％の範囲、例えば、１００〜１２０％の範囲、例えば、１２０〜１４０％の範囲、例えば、１４０〜１６０％の範囲、例えば、１６０〜１８０％の範囲、例えば、１８０〜２００％の範囲、例えば、２００〜２５０％の範囲、例えば、２５０〜３００％の範囲、例えば、３００〜４００％の範囲、例えば、４００〜５００％の範囲、例えば、５００〜７５０％の範囲、例えば、７５０〜１０００％の範囲、例えば、１０００〜１５００％の範囲、例えば、１５００〜２０００％の範囲、例えば、２０００〜５０００％の範囲の増加である。
【０４２５】
本発明は、別の態様では、Ｈｓｐ７０−ＢＭＰ複合体の結合パートナーを同定する方法であって、前記Ｈｓｐ７０−ＢＭＰ複合体を抽出するステップおよび前記結合パートナーを単離するステップを含む、方法に関する。一実施形態では、前記結合パートナーは、作動薬である。別の実施形態では、前記結合パートナーは、拮抗薬である。
【０４２６】
本発明は、別の態様では、Ｈｓｐ７０−ＢＭＰ複合体、およびリソソーム蓄積症の治療のためなどの薬剤としてのその使用に関する。
【０４２７】
一実施形態では、本発明は、Ｈｓｐ７０−ＢＭＰ複合体を特異的に認識する抗体に関する。
【０４２８】
治療方法
本発明は、一態様では、それを必要とする個体を治療するための方法に関する。
【０４２９】
したがって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含むリソソーム蓄積症の治療方法を提供することが本発明の態様である。
【０４３０】
結果として、一実施形態では、前記治療は、予防、治癒、または改善することができる。特定の一実施形態では、前記治療は予防である。別の実施形態では、前記治療は治癒である。さらなる実施形態では、前記治療は改善である。
【０４３１】
本発明にしたがって使用される生理活性剤は、一実施形態では、医薬組成物として製剤することができる。
【０４３２】
一実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、ゴーシェ病、異染性白質ジストロフィー、シアリドーシス、およびサポシン欠損症からなる群から選択される。
【０４３３】
特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ニーマンピック病Ａ型またはＢ型である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ファーバー病である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、クラッベ病である。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、異染性白質ジストロフィーである。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、シアリドーシスである。別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ファブリー病である。なお別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、ゴーシェ病である。なお別の特定の実施形態では、前記リソソーム蓄積障害は、サポシン欠損症である。
【０４３４】
一実施形態では、前記リソソーム病は、スフィンゴ脂質の細胞内の蓄積の増加によって特徴付けられる。
【０４３５】
一実施形態では、前記治療は、それを必要とする個体における細胞内の物質の蓄積を減少させる。前記物質は、通常はリソソーム内で分解される物質とすることができる。一実施形態では、前記物質は、スフィンゴ脂質である。
【０４３６】
一実施形態では、本発明による治療は、スフィンゴ脂質の細胞内の蓄積を、蓄積された量の１００％未満、例えば、蓄積された量の９０％未満、例えば、蓄積された量の８０％未満、例えば、蓄積された量の７０％未満、例えば、蓄積された量の６０％未満、例えば、蓄積された量の５０％未満、例えば、蓄積された量の４０％未満、例えば、蓄積された量の３０％未満、例えば、蓄積された量の２０％未満、例えば、蓄積された量の１０％未満、例えば、蓄積された量の５％未満まで減少させる。
【０４３７】
一実施形態では、本発明による治療は、スフィンゴ脂質などのリソソーム分解性物質の細胞内の蓄積を、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％、例えば、少なくとも２０％、例えば、少なくとも２５％、例えば、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３５％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも４５％、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、例えば、少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも１００％減少させる。
【０４３８】
一実施形態では、前記蓄積スフィンゴ脂質は、スフィンゴミエリン、セラミド、ガラクトシルセラミド、グロボトリアオシルセラミド、グリコシルセラミド、ＧＭ３、およびスルファチドからなる群から選択される。
【０４３９】
スフィンゴ脂質などのリソソーム分解性物質の細胞内の濃度の低下速度は、投与形態および投与計画などの因子によって左右され得る。
【０４４０】
一実施形態では、前記治療は、それを必要とする前記個体の寿命を延ばす。
【０４４１】
結果として、寿命は、一実施形態では、６ヶ月〜１年、例えば、１〜２年、例えば、２〜３年、例えば、３〜４年、例えば、４〜５年、例えば、５〜６年、例えば、６〜７年、例えば、７〜８年、例えば、８〜９年、例えば、９〜１０年、例えば、１０〜１２年、例えば、１２〜１４年、例えば、１４〜１６年、例えば、１６〜１８年、例えば、１８〜２０年、例えば、２０〜２５年、例えば、２５〜３０年、例えば、３０〜４０年、例えば、４０〜５０年、例えば、５０〜６０年、例えば、６０〜７０年、例えば、７０〜８０年、例えば、８０〜９０年、例えば、９０〜１００年延び得る。
【０４４２】
一実施形態では、寿命は、少なくとも６ヶ月、例えば、少なくとも１年、例えば、少なくとも２年、例えば、３年、例えば、少なくとも４年、例えば、５年、例えば、少なくとも６年、例えば、７年、例えば、少なくとも８年、例えば、９年、例えば、少なくとも１０年、例えば、１２年、例えば、少なくとも１４年、例えば、１６年、例えば、少なくとも１８年、例えば、２０年、例えば、少なくとも２５年、例えば、３０年、例えば、少なくとも４０年、例えば、５０年、例えば、少なくとも６０年、例えば、７０年、例えば、少なくとも８０年、例えば、９０年、例えば、少なくとも１００年延びる。
【０４４３】
リソソーム蓄積症の患者の寿命を延ばす方法であって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法を提供することも本発明の態様である。
【０４４４】
一実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積症の患者の寿命を延ばす方法であって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含み、前記寿命が、６ヶ月〜１年、例えば、１〜２年、例えば、２〜３年、例えば、３〜４年、例えば、４〜５年、例えば、５〜６年、例えば、６〜７年、例えば、７〜８年、例えば、８〜９年、例えば、９〜１０年、例えば、１０〜１２年、例えば、１２〜１４年、例えば、１４〜１６年、例えば、１６〜１８年、例えば、１８〜２０年、例えば、２０〜２５年、例えば、２５〜３０年、例えば、３０〜４０年、例えば、４０〜５０年、例えば、５０〜６０年、例えば、６０〜７０年、例えば、７０〜８０年、例えば、８０〜９０年、例えば、９０〜１００年延びる、方法に関する。
【０４４５】
一実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積症の患者の寿命を延ばす方法であって、本発明による生理活性剤を、それを必要とする個体に投与することを含み、前記寿命が、少なくとも６ヶ月、例えば、少なくとも１年、例えば、少なくとも２年、例えば、３年、例えば、少なくとも４年、例えば、５年、例えば、少なくとも６年、例えば、７年、例えば、少なくとも８年、例えば、９年、例えば、少なくとも１０年、例えば、１２年、例えば、少なくとも１４年、例えば、１６年、例えば、少なくとも１８年、例えば、２０年、例えば、少なくとも２５年、例えば、３０年、例えば、少なくとも４０年、例えば、５０年、例えば、少なくとも６０年、例えば、７０年、例えば、少なくとも８０年、例えば、９０年、例えば、少なくとも１００年延びる、方法に関する。
【０４４６】
＜実施例＞
実施例１：Ｈｓｐ７０とビス（モノアシルグリセロ）リン酸との間の相互作用がリソソームを安定させ細胞の生存を向上させる
要約
リソソーム膜透過化は、ストレス誘導細胞死の進化的に保存された特徴である。ここで、本発明者らは、主なストレス誘導熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）が、エンドリソソーム陰イオン性リン脂質ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ；リゾビスホスファチジン酸とも呼ばれる）に対するｐＨ依存性の高親和性結合によってリソソームを安定化させることによって細胞の生存を向上させることを示す。Ｈｓｐ７０の正に帯電したＡＴＰアーゼドメインは、結合に関与するが、基質結合ドメインも、リソソームの効果的な安定化に必要である。重要なことに、細胞保護効果は、組換えＨｓｐ７０のエンドサイトーシスによる送達によって得ることができ、そして、特に、ＢＭＰ抗体またはＨｓｐ７０阻害剤の細胞外投与によって元に戻すことができる。したがって、このタンパク質と脂質の相互作用は、変性疾患および癌のそれぞれの治療に対する細胞保護および細胞傷害性リソソーム特異的療法の開発の刺激的な可能性を開く。
【０４４７】
はじめに
リソソームは、生合成（トランスゴルジネットワーク）経路、エンドサイトーシス経路、食作用経路、および自己貪食作用経路からの膜輸送入力を受け取る高度に動的な細胞質ゾル細胞小器官である。リソソームは、細胞のすべての主要な巨大分子を代謝再利用に利用可能な分解産物に処理できる５０を超える酸性加水分解酵素を含む。リソソームの異化ハウスキーピング機能（ｃａｔａｂｏｌｉｃ  ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に加えて、リソソームプロテアーゼ、カテプシンが、例えば、腫瘍壊死因子受容体ファミリーの死受容体、低酸素、酸化ストレス、浸透ストレス、熱、および抗癌剤によって誘導される進化的に保存された細胞死プログラムにおける重要なエフェクターとして近年同定された。カテプシン依存性細胞死は、初期リソソーム膜透過化およびこれに続くカテプシンの細胞質ゾルへの転位によって特徴付けられ、細胞質ゾルで、カテプシンが、カスパーゼ依存性および非依存性の細胞死経路を開始することができる。したがって、リソソーム膜完全性は、様々なストレス状態中の細胞生存の重要な制御因子として浮上する。細胞質ゾルシステインプロテアーゼ阻害剤が、哺乳動物細胞および線虫シノラブディスエレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）の両方におけるカテプシン誘導細胞損傷に対して保護を与えることが報告されたが、細胞がリソソーム膜安定性を調節する機構は、殆どが不透明なままである。しかし、最近の間接的な証拠は、主なストレス誘導性Ｈｓｐ７０の強力な細胞保護効果がリソソーム膜の安定化によるものであることを示唆している。Ｈｓｐ７０の欠乏が、癌細胞におけるリソソーム膜の早期透過化およびカテプシン媒介細胞死を引き起こし、外来性Ｈｓｐ７０が、様々なストレスによって誘導されるリソソームの不安定化を効果的に阻害する。さらに、Ｈｓｐ７０欠損マウスは、リソソームプロテアーゼの細胞質ゾルへの漏出によって引き起こされる膵炎に罹る。
【０４４８】
Ｈｓｐ７０のリソソーム保護の潜在能力の基礎をなす分子機構は、分かりにくいままであるが、その作用機構の手がかりが、Ｈｓｐ７０の小部分のエンドリソソーム区画へのストレスおよび癌に関連した転位にある可能性がある。この研究の主な目的は、リソソーム局在化が、実際にＨｓｐ７０の細胞保護効果にとって非常に重要であるか否かを明らかにすることであった。注目すべきことに、本明細書に提示されたデータは、Ｈｓｐ７０がリソソーム特異的脂質ＢＭＰに高親和性に結合すること、およびこのタンパク質と脂質の相互作用がリソソームを安定させることを立証している。重要なことに、この新規な細胞保護機構は、細胞保護Ｈｓｐ７０自体、または特にリソソーム区画内でのＨｓｐ７０とＢＭＰの結合またはＨｓｐ７０の機能を阻害する化合物の細胞外投与によって利用することができる。
【０４４９】
結果および考察
リソソーム局在化がＨｓｐ７０の細胞保護効果に非常に重要であるか否かを調べるために、本発明者らは、組換えＨｓｐ７０（ｒＨｓｐ７０）を作製し、細胞のエンドサイトーシス機構を利用してｒＨｓｐ７０をリソソーム内腔内に送達した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ｒＨｓｐ７０と共にインキュベートされたＵ−２−ＯＳ骨肉腫細胞の免疫細胞化学分析により、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０と後期エンドソームおよびリソソームマーカータンパク質（リソソーム結合膜タンパク質１および２ならびにリソソーム内在性膜タンパク質１（ＬＩＭＰ−１））ならびにエンドリソソーム特異的脂質（ＢＭＰ）との明確な共局在化が明らかにされたが、小胞体（小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ））、ゴルジ装置（ｇｏｌｇｉｎ−９７）、またはミトコンドリア（シトクロムｃ（ｃｙｔ  ｃ））のマーカーとの共局在化は確認されなかった。リソソーム局在化は、生細胞でも観察され、生細胞では、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０がリソトラッカー  レッド（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）（登録商標）と共局在化するがＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄとは共局在化しない。エンドサイトーシスされたＨｓｐ７０の量を決定するために、ｒＨｓｐ７０＊添加細胞からの蛍光シグナルを定量し、これにより平均７０ｎｇのｒＨｓｐ７０が１×１０５の細胞に取り込まれたことが明らかになった。エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０＊が内腔に単に局在化したのか、またはエンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０＊がエンドリソソーム膜に直接付着したのかを判定するため、ｒＨｓｐ７０＊添加Ｕ−２−ＯＳ細胞を部分的に分画して、軽い膜画分（ＬＭＦ）中に存在するｒＨｓｐ７０＊の量を測定した（初期および後期エンドソームおよびリソソームを含む細胞小器官）。液体窒素中での繰り返しの凍結／解凍サイクルによるＬＭＦ中の細胞小器官の凍結破壊により、カテプシンＢは、上清中に完全に放出されたが、リソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ−２は、ペレット化され破砕された膜画分に残った。エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０＊の定量により、全ｒＨｓｐ７０＊の約１／３がペレットに残ったことが判明し、ｒＨｓｐ７０＊がエンドリソソーム膜に結合されたことを強く示唆した。エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０がリソソーム膜を安定化させことができるか否かを評価するために、細胞の酸性区画、すなわち後期エンドソームおよびリソソームに蓄積する異染性弱塩基であるアクリジンオレンジを細胞に添加し、これらを、青色光に曝露時に光酸化に対して感作させる（Ｂｒｕｎｋら、１９９７；Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄら、２００４）。光酸化は、リソソームｐＨ勾配の消失およびアクリジンオレンジの細胞質ゾルへの漏出をもたらす。これは、アクリジンオレンジが、細胞の酸性区画内で濃縮されると赤色蛍光を発し、細胞質ゾルで濃度が低下すると緑色蛍光を発するため、容易に可視化および定量することができる。注目すべきことに、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０は、青色光誘導光酸化からリソソームを保護したが、それぞれがＨｓｐ７０に対して８６％および８４％のアミノ酸配列相同性を有する組換えＨｓｃ７０およびＨｓｐ７０−２��添加された細胞では保護が観察されなかった。さらに、Ｈｓｐ７０に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、Ｕ−２−ＯＳ細胞のリソソームを光酸化に対して感作させたが、この効果は、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０によって完全に元に戻され、内在性Ｈｓｐ７０の保護効果が、細胞質ゾル中に存在する大きなプールではなくリソソーム内腔に局在化されたタンパク質の小さい画分によって媒介されることを適切に実証した。上記実証したＨｓｐ７０の有効なエンドサイトーシスによる取り込みおよびリソソーム安定化は、リソソーム細胞死経路、すなわち網膜の光損傷および坐骨神経軸索切断を引き起こすことが知られている様々な治療の後の傷害の部位に投与された細胞外Ｈｓｐ７０の最近報告された驚くべき神経保護効果を説明し得る。
【０４５０】
Ｈｓｐ７０の保護効果が、Ｈｓｐ７０とリソソーム膜の直接的な結合の結果であり得るか否かを調べるために、本発明者らは、様々な膜結合陰イオン性脂質、すなわちパルミトイル−オレオイルーホスファチジルセリン（ＰＯＰＳ；主に原形質膜の内葉に存在）、カルジオリピン（主にミトコンドリア）、およびＢＭＰ（主に後期エンドソームおよびリソソームに存在）を含むパルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）大型単層小胞（ＬＵＶ）とＨｓｐ７０の相互作用を調べた。リソソームへの成熟の際のエンドリソソーム区画の酸性環境の増大を考慮して、中性（ｐＨ７．４）および酸性（ｐＨ６．０）条件でタンパク質と脂質の相互作用を比較した。ｐＨ７．４では、ｒＨｓｐ７０は、ＰＯＰＣリポソームでの９０度光散乱で僅かな相対変化を引き起こし、ＰＯＰＣ二重層に対する非常に弱い結合を示唆する。ＰＯＰＳに関して過去に報告されたように、すべての負に帯電した脂質は、中性ｐＨで、ｒＨｓｐ７０のリポソームに対する結合を促進した。この促進は、リポソーム表面における負の脂質または電荷密度（ＰＯＰＳは、−１の正味電荷を有し、カルジオリピンおよびＢＭＰは、−２の正味電荷を有する）に関係なく約４倍であった。注目すべきことに、７．４から６．０へのｐＨの低下は、ｒＨｓｐ７０の脂質結合プロフィールを劇的に変化させた。ＰＯＰＳに対する結合は、酸性化時に僅かに増加しただけであるが、ＢＭＰに対する結合は、中性ｐＨと比較すると酸性ｐＨで約２０倍強かった。Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対するｐＨ依存性の高親和性結合を、独立した一連のＢＩＡｃｏｒｅ実験で確認した。
【０４５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたＨｓｐ７０とＢＭＰとの間のｐＨ依存性の高親和性相互作用が、生細胞におけるリソソームのＨｓｐ７０媒介安定化に必要であるか否かを調べるために、本発明者らは、既に実証されているようにＢＭＰ抗体をＵ−２−ＯＳ細胞のエンドリソソーム区画に添加することによって細胞ＢＭＰを標的にした（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９８）。注目すべきことに、ＢＭＰ抗体は、ｒＨｓｐ７０の能力を効果的に阻害して光酸化誘導リソソーム漏出から保護した。さらに重要なことには、ＢＭＰ抗体は、シスプラチンに対してＵ−２−ＯＳ骨肉腫細胞を著しく感作させ、これによりＵ−２−ＯＳ細胞およびこの研究に使用される他のシスプラチン感作細胞系に初期リソソーム膜透過化を誘導する。したがって、ＰＣ−３およびＤＵ−１４５前立腺癌細胞も、抗ＢＭＰ抗体での治療時にシスプラチン誘導細胞死に対して著しく感作された。
【０４５２】
リソソームＨｓｐ７０とＢＭＰの相互作用がＨｓｐ７０の細胞保護効果に必須であることを確認したため、本発明者らは、次に、Ｈｓｐ７０タンパク質のどの部分が脂質結合に関与するかを調べた。これを決定するために、ｐＨ６．０でのｒＨｓｐ７０のＢＭＰ含有リポソーム内のドッキング時のトリプトファン（Ｗ９０およびＷ５８０）の蛍光シフトを測定した。本発明者らは、そのタンパク質の２つの主な機能的ドメイン、すなわちアミノ末端ＡＴＰアーゼドメイン（ｒＨｓｐ７０−ΔＡＴＰ；アミノ酸１１９〜４２６の欠失）およびカルボキシ末端ペプチド結合ドメイン（ｒＨｓｐ７０−ΔＰＢＤ；アミノ酸４３７〜６１７）が欠失したｒＨｓｐ７０変異タンパク質を作製した。Ｈｓｐ７０−ΔＡＴＰの相対ピーク蛍光強度におけるシグナルの消失は、ＡＴＰアーゼドメインが、Ｈｓｐ７０のＰＯＰＣ／ＢＭＰ二重層に対する高親和性結合に必要であることを示唆した。次に、どのトリプトファンが脂質結合および蛍光シフトに関与しているかを調べるために、Ｈｓｐ７０における２つのトリプトファンをフェニルアラニンで置換した（Ｗ９０ＦおよびＷ５８０Ｆ）。ＡＴＰアーゼドメインでトリプトファンが欠失しているｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ（ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ）でのシグナルの低減およびペプチド結合ドメインでトリプトファンが欠失しているｒＨｓｐ７０−Ｗ５８０Ｆでのシグナルの不変は、位置９０のトリプトファンが脂質層内にドッキングしたことを示唆した。上記使用された方法は、トリプトファンの親油性環境内への組み込み時の蛍光の相対シフトのみを測定したため、本発明者らは、ｐＨ４．５のＬ１センサーチップの表面にＢＭＰ含有ＬＵＶが固定されたＢＩＡｃｏｒｅ２０００システムを利用したより定量的な方式でｒＨｓｐ７０およびその変異体の脂質結合も分析した。ｒＨｓｐ７０およびｒＨｓｐ７０−ΔＰＢＤの両方は、ＢＭＰとの強力な相互作用を示したが、ｒＨｓｐ７０−ΔＡＴＰの結合は、著しく減少し、Ｈｓｐ７０が主にそのＡＴＰアーゼドメインを介してＢＭＰと相互作用することが確認された。驚くべきことに、トリプトファン変異体は、ＢＭＰと相互作用する能力において著しい差異を示した。ｒＨｓｐ７０−Ｗ５８０Ｆ変異体は、必然的にｒＨｓｐ７０と同じ相互作用プロフィールを有していたが、ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ変異体の結合は劇的に減少した。ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆは、遠紫外線および近紫外線円形二色性測定によって分析されたように適切に折り畳まれており、ルシフェラーゼの折り畳みおよびＡＴＰの加水分解を行うことができるため、Ｗ９０Ｆ変異体は、Ｈｓｐ７０シャペロンの構造的および機能的側面を維持したまま、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用を特異的に消失させた。したがって、ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ変異体は、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の直接的な相互作用がＨｓｐ７０にリソソーム保護特性を付与するか否かをさらに調べる貴重なツールを思いがけず我々に提供した。実際、ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ変異体は、光酸化からリソソーム膜を保護する能力およびシスプラチン誘導リソソーム細胞死から細胞を保護する能力を完全に失ったが、ｒＨｓｐ７０−Ｗ５８０Ｆ変異体は、野生型タンパク質と同じ効果を有することを示した��ＢＭＰリッチ膜に対して不変の結合能力を示したｒＨｓｐ７０−ΔＰＢＤ変異体も、光酸化およびシスプラチンから保護する能力を失った。これらの知見は、Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対する結合が、リソソーム膜に保護を提供するために必要であるが十分ではないことを実証している。加えて、無傷のカルボキシ末端ペプチド結合ドメインは、生細胞におけるリソソーム膜の安定化に必要である。
【０４５３】
Ｈｓｐ７０阻害剤は、長い間、興味深い抗癌剤として見なされてきた。しかし、注意は、細胞質ゾルＨｓｐ７０を阻害することに集中しており、薬物送達に関する問題およびＨｓｐ７０ファミリーメンバーの中での特殊性の欠如が、適切なＨｓｐ７０拮抗薬の開発の乗り越えられない障害となっている。ＢＭＰに対する結合および無傷のペプチド結合ドメインの両方がＨｓｐ７０の細胞保護効果に必要であることを確立し、Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用を標的とすることの可能性を検証し、本発明者らは、次に、エンドリソソームＨｓｐ７０の保護効果が、Ｈｓｐ７０シャペロン活性の阻害剤によって阻害され得るか否かについて調べた。これは、細胞をアポトーシス誘導因子由来ペプチド（ＡＤＤ７０）と共にインキュベートすることによって達成され、このペプチドは、そのペプチド結合ドメインに結合することによってＨｓｐ７０のシャペロン機能を阻害する。この大きいペプチド（３８８のアミノ酸）は、原形質膜を通過しないため、エンドリソソームＨｓｐ７０を特異的に標的とする別のツールを我々に提供することに留意されたい。注目すべきことに、細胞のＡＤＤ７０ペプチドとのインキュベーションは、Ｕ−２−ＯＳ細胞におけるエンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０のリソソーム保護効果を完全に阻止した。ＡＤＤ７０が、Ｈｓｐ７０を有する細胞の細胞保護効果も抑制し得るか否かを調べるために、本発明者らは、トランスジェニックＨｓｐ７０がシスプラチン誘導細胞死に対してほぼ完全な耐性を付与する、Ｈｓｐ７０トランスジェニック不死化マウス胎児線維芽細胞（ｉＭＥＦ）におけるシスプラチン誘導細胞傷害に対する効果を調べた。注目すべきことに、Ｈｓｐ７０トランスジェニックｉＭＥＦのＡＤＤ７０処理が、Ｈｓｐ７０媒介保護効果を効果的に無効にし、野生型ｉＭＥＦと同程度のシスプラチンに対する感受性を付与した。野生型ｉＭＥＦは、非常に低レベルのＨｓｐ７０を発現するため、ＡＤＤ７０がシスプラチンに対してそれらをさらに感作させることができないことが、ＡＤＤ７０媒介感作が、実際にＨｓｐ７０の阻害によるものであるという考えを支持する。抗ＢＭＰ処理と同様に、ＡＤＤ７０処理も、シスプラチン誘導細胞傷害に対してＰＣ−３およびＤＵ−１４５前立腺癌細胞を感作させた。
【０４５４】
本明細書に提示されたデータは、Ｈｓｐ７０がエンドリソソーム陰イオン性リン脂質ＢＭＰと直接相互作用すること、およびこの相互作用がエンドリソソーム膜を安定させることを示している。ＢＭＰの濃度が、エンドソームが成熟して多小胞体、後期エンドソーム、およびリソソームを形成する際にエンドサイトーシス小胞で上昇するため、ｐＨ調節が、Ｈｓｐ７０の標的をＢＭＰおよびリソソームにする方法であろう。Ｈｓｐ７０のサブドメインは、それらのｐｌ値が著しく異なり、ＡＴＰアーゼドメインは、ペプチド結合ドメインよりも１．７２単位高いｐｌ値を有する。この特徴は、酸性ｐＨで、ＡＴＰアーゼドメインが優先的に正に帯電し、これがその陰イオン性脂質との相互作用を促進し得ることを示唆している。ｐＨが、エンドサイトーシス成熟の際に低下するため、正の電荷が蓄積し、どの陰イオン性相互作用も、恐らくさらに促進される。Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用が酸性ｐＨおよびＡＴＰアーゼドメインに依存することを実証している本明細書に提示されたデータは、この理論を裏付ける。さらに、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインの静電表面の分子モデリングは、それが、ｐＨ７．０であってもウェッジの底部で主に正に帯電したほぼウェッジ様構造を形成することを明らかにした。興味深いことに、Ｗ９０が、この正に帯電したドメイン内に存在し、これが、なぜＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ変異体が、ＢＭＰと相互作用してリソソームを安定させるＨｓｐ７０の能力に対してこのような大きな影響を与えるかの手がかりを与える可能性がある。ＢＭＰは、エンドリソソーム区画の内膜のみに局在し、この内膜では、ＢＭＰが、スフィンゴ脂質活性化タンパク質および酸性スフィンゴミエリナーゼによる脂質小胞からの脂質の除去および分解を助け、膜の不安定化および細胞死に関係しているセラミドおよびスフィンゴシン１−リン酸などの代謝産物が生成される。リソソーム内膜は、初期および後期エンドソームのレベルでの外周膜の陥入によって到達することができ、このためそれぞれの小胞は、Ｈｓｐ７０も含む可能性が高いことに留意されたい。したがって、Ｈｓｐ７０は、スフィンゴ脂質の加水分解の補助因子としてのＢＭＰの役割を阻害し、これによりリソソームの脂質組成を変更し得る。この仮説を検証するために、本発明者らは、現在、リソソームスフィンゴ脂質代謝産物の定量のための質量分光法をベースとした技術を開発中である。
【０４５５】
蓄積したデータは、リソソームプロテアーゼの発現の増加および輸送の変更が、腫瘍細胞をリソソーム膜透過化に対して感作させることによって腫瘍細胞の「アキレス腱」を形成し得ることを示唆している。したがって、エンドリソソーム膜におけるＢＭＰとＨｓｐ７０の相互作用およびこの結果として起こるエンドリソソーム区画の安定化が、癌細胞を、通常なら細胞死への直接的な経路であるリソソーム透過化から保護する。この細胞保護効果の基礎をなす分子機構は、現在、Ｈｓｐ７０のリソソーム安定化機能の特異的な阻害によってリソソーム細胞死経路を誘導する作用物質に対する癌細胞の感作の新たな刺激的な可能性を開く。逆に、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用は、膵炎、運動および感覚神経病変、ならびに光誘導網膜損傷などの幅広い攻撃に対して外部から投与されるＨｓｐ７０のリソソーム安定化機能によって与えられる細胞保護に依存した新たな治療戦略を提供する可能性がある。
【０４５６】
材料および方法
細胞培養および試薬
ヒトＵ−２−０Ｓ骨肉腫細胞系を、６％熱不活化ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。Ｈｓｐ７０トランスジェニックｉＭＥＦおよび適切なコントロールｉＭＥＦを作製し、上記のように維持した（Ｎｙｌａｎｄｓｔｅｄら、２００４）。すべての細胞を、ＣＯ２が５％の加湿大気中で、３７℃で増殖させ、マイコプラズマについて繰り返し試験し、陰性であることを確認した。
【０４５７】
特に明記されていない限り、すべての化学種は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ）から購入した。
【０４５８】
組換えタンパク質
組換えＨｓｐ７０およびその変異体を、ｐＥＴ−１６ｂベクター系（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、タンパク質の発現の誘導およびこれに続く製造業者のプロトコルに従って最適化されたＮｉ２＋アフィニティ精製によって作製した。
【０４５９】
ｒＨｓｐ７０のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８での標識化を、製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のプロトコルに従って行った。
【０４６０】
組換えタンパク質および抗体の細胞取り込み
サブコンフルエント細胞を、６％熱不活化ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。この培地に、組換えタンパク質または網状赤血球溶解物を直接添加して最終濃度にした。次いで、細胞を、タンパク質／溶解物の存在下でさらに２０時間増殖させた。
【０４６１】
ＢＭＰ（ＬＢＰＡ）（６Ｃ４）に対する抗体の細胞への添加を当技術分野の技術に従って行った。
【０４６２】
エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０＊の定量を、ｒＨｓｐ７０＊の存在下で細胞を２０時間増殖させ、次いで細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、そしてカウントすることによって行った。全細胞取り込みでは、１×１０５の細胞を使用した。細胞を、ジギトニン−ＰＢＳ  １００μＬ（２００μｇ／ｍＬ）に入れて氷上で３０分インキュベートすることによって溶解した。蛍光を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で測定した。軽い膜画分（ＬＭＦ）の場合は、１０×１０６の細胞のすべてを回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、トリパンブルー染色による測定で膜の分解が９０％に達するまでＤｏｕｎｃｅホモジナイズした。次いで、まず原形質膜、核、および重い膜画分を除去して細胞を膜分画し、次いで１７０００×ｇで２０分間遠心分離してＬＭＦを回収した。次いで、ＬＭＦを２つに分割し、第１の画分を「完全」ＬＭＦとして保存した。第２の画分を、液体窒素中で冷凍／解凍を５サイクル行って膜を分解し、膜を内腔内容物から分離するために２００００×ｇで２０分間遠心分離した。収集後のすべての細胞の作業は、最大４℃で行った。
【０４６３】
リソソーム完全性および細胞の生存についてのアッセイ
２μｇ／ｍｌアクリジンオレンジと共に３７℃で１５分間インキュベートしたサブコンフルエントＵ−２−ＯＳ細胞を洗浄し、照射し、そして３％ＦＣＳを添加したハンクス平衡塩溶液中で分析した。１つの細胞イメージングのための細胞を、透過光モードの各ウェルの８つの所定の領域から選択し、次いで同じ細胞を、Ｕ−ＵＬＳ１００ＨＧハウジング（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に装着したＵＳＨ１０２  １００Ｗ水銀アークバーナー（Ｕｓｈｉｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ）からの青色光に２０秒間曝露して迅速に可視化した。蛍光顕微鏡検査を、ＮＡ＝０．４０のＬＣＰｌａｎＦ１×２０対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立顕微鏡で行った。リソソームのｐＨ勾配の消失を、強い赤色染色の消失をカウントすることによって定量した。
【０４６４】
アポトーシス様細胞死を、０．０５μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞を染色して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立蛍光顕微鏡（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕ−ＭＷＵ  ３３０−３８５ｎｍ）で核が凝縮した細胞をカウントすることによって評価した。各実験では、最少で８つの無作為に選択した領域をカウントした。細胞の生存を、既に説明した３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）減少アッセイによって分析した。細胞を３７℃で１０分間、２．５μＭ  ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、次いでフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のＦＬ１チャンネルにおける蛍光強度によって明確に染色された細胞を測定して、フローサイトメトリーによってネクローシス細胞を定量した。
【０４６５】
細胞を、示されたようにシスプラチンで処理し、ジギトニン処理によって細胞質ゾル画分を得て、細胞質ゾルシステインカテプシン（ｚＦＲａｓｅ）およびカスパーゼ３様（ＤＥＶＤａｓｅ）活性を決定した。
【０４６６】
ＲＮＡ干渉
使用するｓｉＲＮＡには、Ｈｓｐ７０（ＨＳＰＡ１ＡおよびＨＳＰＡ１Ｂ）をコードする２つの遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ；５’−ＧＣＣＡＵＧＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＵＣＵＧＵ−３’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および既に説明したコントロールＨｓｐ７０  ｓｉＲＮＡが含まれていた。オリゴフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクション剤として使用した。
【０４６７】
免疫検出
使用する一次抗体には、Ｈｓｐ７０に対するマウスモノクローナル抗体（２Ｈ９；Ｂｏｒｉｓ  Ｍａｒｇｕｌｉｓ、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｒｕｓｓｉａによって提供された）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＢＭＰ（６Ｃ４；（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９８））、ＬＩＭＰ−１（Ｈ５Ｃ６；Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ  ＡｕｇｕｓｔおよびＪａｍｅｓ  Ｅ．Ｋ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈによって開発され、ＮＩＣＨＤの主催で設立され、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＵＳＡによって維持されているＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから入手した）、ｃｙｔ  ｃ（クローン６Ｈ２．Ｂ４、ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＳＥＲＣＡ（ＩＩＤ８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、およびｇｏｌｇｉｎ−９７（ＣＤＦ４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）が含まれる。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離してニトロセルロース膜に移したタンパク質を、示された一次抗体、Ｄａｋｏからの適切なペルオキシダーゼ共役二次抗体、ＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、およびＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＬＡＳ−１０００Ｐｌｕｓ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて検出した。
【０４６８】
トリプトファン蛍光スペクトルおよびリポソーム９０度光散乱
トリプトファン蛍光スペクトル（ＲＦＩ）およびリポソーム９０度光散乱（ＲＳＩ）を、既に説明したように、示された脂質から本質的になるＬＵＶを利用するＨＥＰＥＳ緩衝液（示されているように、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４または６．０）中で分析した。ＲＦＩでは、ＬＵＶを１０μＭアリコートで添加し、２０分の安定化期間の後にスペクトルを記録した。ＲＳＩでは、組換えタンパク質を０．１２ｎモルのアリコートで添加した。
【０４６９】
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）
ＬＵＶの調製のために、有機溶媒に溶解した１０モル％スフィンゴミエリン、５０モル％ホスファチジルコリン、２０モル％コレステロール、および２０モル％ＢＭＰからなる脂質混合物を、アルゴン流下で乾燥させ、トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で再水和した（Ｋｏｌｚｅｒら、２００４）。この混合物を、液体窒素中で凍結−解凍を９回繰り返してから３７℃のインキュベーターに入れた。１５分間の超音波槽の後、混合物を、孔径が１００ｎｍのポリカーボネート膜を２１回通過させた。表面プラズモン共鳴測定を、２５℃で、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００システムを用いて行った。ＬＵＶ（全脂質濃度０．１ｍＭ）をＰＢＳ（ローディング緩衝液）中のＬ１センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）の表面に固定した。使用したランニング緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５）であった。コントロールとして、ランニング緩衝液に溶解した酸性スフィンゴミエリナーゼ（０．２μＭ、６０μｌ）をリポソーム表面に直接注入した。４１００ＲＵ〜５２５０ＲＵの反応単位が得られた。目的のタンパク質を、示された濃度で、２０μｌ／分の流速でランニング緩衝液に注入した。注入後、１０分間の解離相を追加した。
【０４７０】
分子モデリング
一次構造分析および分子モデリングを、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）のＥｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＸＰａＳｙ）プロテオミクスサーバーから入手可能なソフトウエアで行った。分子モデリングは、ＤｅｅｐＶｉｅｗ−Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて、ヒトＨｓｐ７０−ＡＴＰアーゼドメイン（ｐｄｂコード：１Ｓ３Ｘ）およびヒトＨｓｃ７０基質結合ドメイン（ｐｄｂコード：７ＨＳＣ）の結晶構造に基づいて行った。表面モデルは、溶媒誘電率８０（Ｈ２Ｏ）を用いたｐＨ７．０でのクーロン相互作用に基づいていた。
【０４７１】
統計分析
帰無仮説を評価するために、対応のあるスチューデントの両側ｔ検定を用いて統計分析を行った。統計的有意性のためのカットオフレベルは、５％に設定し、すべての群のデータを、Ｆ検定を用いてそれらの分散の比較可能性について調べた。すべての統計は、最少でｎ＝３の独立した実験で行った。
【０４７２】
考察
Ｈｓｐ７０が、腫瘍細胞の原形質膜上およびエンドリソソーム系内に存在し得る証拠が文献に示されている。さらにＨｓｐ７０は、最も典型的には発熱、外傷、および激しい運動であり、最も興味深いものが恐らく心理的ストレスから起きる事象を含む様々なストレス誘導事象の際に血流に放出され得ることが分かったが、この働きは、主に免疫の分野で行われる。エンドリソソーム区画内のＨｓｐ７０種の存在が、Ｈｓｐ７０ファミリーの別のメンバー；恒常的に発現されるＨｓｃ７０についても記載されている。この位置にあるＨｓｃ７０の機能により、実際に、シャペロン媒介自己貪食として知られるプロセスに名前が付けられた。
【０４７３】
しかし、文献からは、Ｈｓｐ７０の原形質膜およびエンドリソソーム膜との結合の分子基盤について何も分からないため、本発明者らが、このプロジェクトを立ち上げた。
【０４７４】
実施例１に提示されたデータは、Ｈｓｐ７０が、中性ｐＨで、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、カルジオリピン、およびビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）などの負に帯電した膜脂質と相互作用できることを示している。しかし、初期エンドリソソーム系で予想され得る酸性（ｐＨ６．０）を模すと、相互作用のプロフィールが劇的に変化し、Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対する親和性が中性ｐＨの２０倍になり、ＰＳに対する親和性の約９倍である。このＨｓｐ７０とＢＭＰの相互作用を、殆どの細胞ＢＭＰにとって主な部位である後期エンドソームおよびリソソームで予想されるｐＨ（ｐＨ４．５）にｐＨが設定された精巧なＢＩＡｃｏｒｅシステムで検証した。興味深いことに、補助因子としてＢＭＰに依存する既知のＢＭＰ相互作用タンパク質；酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭａｓｅ）は、Ｈｓｐ７０の親和性と比較して、ＢＭＰに対する親和性が僅か半分であることを示し、Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対する高い相対親和性を示している。
【０４７５】
Ｈｓｐ７０のＰＳとの相互作用が、マウスＨｓｐ７０と酸性グリコセラミドとの間の相互作用を有するとして他者によって報告され、この相互作用は、Ｎ末端ＡＴＰアーゼドメインに依存し、場合によってはペプチド結合ドメイン（ＰＢＤ）にも依存する。しかし、本明細書で利用する系とは反対に、これらの知見は、真核細胞で予想されるどの限界複合脂質環境にも類似しそうにない基本的に唯１つの脂質からなる系（それぞれ、９０〜１００％および１００％の純度の脂質）で確認された。しかし、Ｈａｒａｄａらによって示された、酸性脂質の結合におけるＨｓｐ７０のＮ末端領域の重要性は、Ｈｓｐ７０のＢＭＰとの相互作用が、そのＮ末端ＡＴＰアーゼドメインに依存するという本発明者らの知見と一致する。本発明者らは、Ｈｓｐ７０のトリプトファン９０（Ｗ９０）が、その突然変異がＨｓｐ７０とＢＭＰの相互作用を有意に低下させるため極めて重要なアミノ酸であることをさらに示す。仮説モデルは、Ｈｓｐ７０が、ＡＴＰアーゼおよびペプチド結合ドメイン（ＰＢＤ）の両方における酸性糖脂質の親水性部分および疎水性部分に対する特異的結合部位を含むことを主張している。
【０４７６】
このモデルは、恐らく、酸性糖脂質に結合するＨｓｐ７０に適用可能であるが、本発明者らは、Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用に対する別のモデルを提案するであろう。本明細書に提示されたデータ；（Ｉ）ＰＢＤのみが、ＢＭＰとの非常に弱い相互作用をすることができる；（ＩＩ）Ｗ９０の重要性；（ＩＩＩ）ＡＴＰアーゼドメインの結合特性；および（ＩＶ）Ｈｓｐ７０の表面静電電位の分子モデリングに基づいて、本発明者らは、Ｈｓｐ７０が、ＡＴＰアーゼクレフトの底部における静電気的に正に帯電したウェッジ様サブドメインを介してＢＭＰと相互作用することを提唱している。しかし、Ｗ９０のフェニルアラニンへの保存的な突然変異が、Ｈｓｐ７０の再折り畳みまたはＡＴＰアーゼ活性に影響を与えることなく、Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用を有意に減少させ、そしてこの１つのアミノ酸の突然変異が静電プロフィールを変更しないため、２つのモデルの中間が、Ｈｓｐ７０のより一般的な陰イオン性脂質モチーフとの相互作用の説明により適切であると考えられる。このようなモデルでは、正の表面電荷は、静電相互作用を促進することができ、Ｗ９０などの特定の残基が、陰イオン性脂質結合パートナー、この場合はＢＭＰの結合特性の決定に関与する可能性がある。興味深いことに、これは、細胞における脂質恒常性のより一般的な制御因子としてＨｓｐ７０を関係付ける可能性がある。この裏づけは、細胞の脂質膜が、発熱および酸化ストレスなどのストレスの一次センサとして、従ってストレス応答の初期誘導因子として機能し得ることを実証するデータである。ストレスに際して、細胞の脂質膜が、恒常性を維持するため、または細胞の曝露に対する応答としての特定のシグナル伝達事象を引き起こすべく実際に変更するために極めて重要な区画であろうと主張する者もいる。したがって、Ｈｓｐ７０のＢＭＰなどの脂質への結合およびこれに続くリソソーム膜の安定性の上昇、ならびに恐らく他の細胞脂質の事象が、一般的な細胞のストレス応答の一部を示すものであろう。癌の場合には、このような応答は、癌自体の最後の寄与のために奪われる可能性があるが、幅広い進化的な視点から、細胞ストレスに際した協調されたタンパク質−脂質応答は意味をなすであろう。
【０４７７】
Ｈｓｃ７０およびＨｓｐ７０−２ではなくＨｓｐ７０のみがリソソーム膜を直接保護できることを示す本明細書に提示されたデータは、潜在的な脂質ストレス応答が、他のＨｓｐ７０種ではなく主なストレス誘導Ｈｓｐ７０自体によって特異的に調節され得ることを示している。しかし、同様に示されているように、Ｈｓｐ７０−２の欠乏も、リソソーム膜透過化および細胞死をもたらすが、この場合、この経路はＬＥＤＧＦに依存するため間接的である。しかし、ＬＥＤＧＦがどのようにリソソーム膜に影響を及ぼすかの機序は未解明のままである。
【０４７８】
Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用のｉｎ  ｖｉｖｏでの妥当性を評価するために、本発明者らは、エンドサイトーシスされた抗体によってＢＭＰを標的にし、他の細胞不透過性ＡＩＦ由来ポリペプチドＡＤＤ７０のエンドサイトーシスによってリソソームＨｓｐ７０を標的にした。これは、細胞がその後に、直接的なリソソーム膜の破壊的な刺激およびＬＭＰ誘導化学療法剤シスプラチンの効果に対して有意に感作され、プログラム細胞死のプロフィールがこの研究課題の一部として特徴付けられたため、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用が、リソソーム膜を安定させるのに役立つことを立証した。ＡＤＤ７０の発現は、過去に、癌細胞を様々な死刺激に対して感作させ、同系動物におけるラット結腸腫瘍細胞およびマウスメラノーマ細胞の腫瘍形成能を低下させることを示した。この方法と本明細書に提示された方法との間の大きな違いは、本発明者らが、ＡＤＤ７０のエンドサイトーシスによってリソソームＨｓｐ７０を特異的に標的にすることを目指したが、過去の研究は、より豊富な細胞質Ｈｓｐ７０を標的にするためにＡＤＤ７０の細胞質ゾルの発現を利用したことである。エンドリソソームＨｓｐ７０とＢＭＰの相互作用の標的化の成功は、例えば、Ｈｓｐ７０のリソソーム安定化機能の特異的な阻害によってリソソーム細胞死経路を誘導する作用物質に対して癌細胞を感作させることを想像させ得るため、治療手段のためにエンドサイトーシスによってリソソーム成分を標的にするというある概念実証の考え、すなわち幅広い治療との関係を有し得る概念も提供する。逆に、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用は、膵炎、運動および感覚神経病変、ならびに光誘導網膜損傷に至る幅広い攻撃に対して外部から投与されるＨｓｐ７０のリソソーム安定化機能によって提供される細胞保護に依存する新たな治療戦略を提供する可能性がある。実際、特定の細胞傷害性化合物の導入のためにエンドサイトーシス機構を利用するという概念は、プロアポトーシスＢＨ３相互作用ドメイン死作動薬、Ｂｉｄに基づいた炭化水素が連結されたＢＨ３ヘリックスのエンドサイトーシス送達が白血病細胞でアポトーシスを誘導することを示したため、既に研究されている。このプロセスは、ＢＨ３ヘリックスが、エンドサイトーシス区画を無傷で離れて、シトクロムｃの放出を誘導してアポトーシスのミトコンドリアプログラムを活性化するためにＢａｘおよびＢａｋを活性化させることに依存していた。しかし、エンドサイトーシス系から逃げる機構は、残念ながら、本明細書では取り上げられなかった。
【０４７９】
本明細書に示されているように、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用は、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインに依存する。興味深いことに、Ｈｓｐ７０コシャペロン、Ｈｓｐ７０結合タンパク質１（ＨｓｐＢＰ１）に関する最近の報告は、このＨｓｐ７０の正に帯電した領域の重要性を強調するであろう。Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインの一部と複合体を形成したＨｓｐＢＰ１の結晶構造の研究により、これら２つの間の相互作用が、４つのアルマジロ様反復を含むＨｓｐＢＰ１における曲線状のすべてのα螺旋状折り畳みによって媒介されることが明らかにされた。この曲線状の折り畳みの凹面が、ＡＴＰアーゼドメインの葉ＩＩ、すなわちＨｓｐ７０  ＡＴＰアーゼドメインの静電気的に正に帯電した体積の大部分をなす同一の葉を取り囲んでおり、本発明者らは、これが、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用を媒介すると提唱している。これについてのさらなる展望が、１４の癌細胞系がそれらの関連するＨｓｐ７０／ＨｓｐＢＰ１のレベルに対して特徴付けられた別の研究によってもたらされた。この他の研究は、ＨｓｐＢＰ１／Ｈｓｐ７０のモル比が高い細胞系が、モル比が低い細胞系よりも抗癌剤の影響を受けやすいこと、およびＨｓｐＢＰ１の過剰発現が、リソソーム膜透過化を促進することを見出した。これらの報告およびこの実施例で提示されるデータに基づいて、ＨｓｐＢＰ１が、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインの正に帯電した領域に結合することによって、そのＢＭＰとの相互作用、従ってエンドリソソーム膜に対するその安定効果を阻害し、ＬＭＰ誘導刺激に対する感度が上昇するモデルを主張する者もいるであろう。したがって、ＨｓｐＢＰ１のアルマジロ反復ドメインは、ＡＤＤ７０の場合と殆ど同様に、インテリジェント薬設計の基礎をなす可能性がある。このようなＨｓｐＢＰ１由来分子の効果は、本明細書に記載される系で容易に試験することができ、本明細書に記載される分子機構のさらなる適用への興味深い道筋を提示する。
【０４８０】
本発明者らが本明細書に示すように、Ｈｓｐ７０は、酸性ｐＨ４．５で、「古典的な」ＢＭＰ結合パートナー酸性スフィンゴミエリナーゼ（ａＳＭａｓｅ）の場合よりもほぼ２倍高い高親和性でＢＭＰに結合する。興味深いことに、ＢＭＰは、スフィンゴ脂質活性化タンパク質（ＳＡＰ／サポシン）Ａ〜Ｄの補助因子としても機能するため、ａＳＭａｓｅによるスフィンゴミエリンだけではなく、殆どの膜結合スフィンゴ脂質の酵素加水分解の刺激補助因子として機能する。したがって、明白な疑問は、Ｈｓｐ７０が、ＢＭＰに対するその結合によって、ａＳＭａｓｅおよびサポシンの結合特性をどうにかして変更し、これにより膜スフィンゴ脂質およびスフィンゴ糖脂質の異化、ならびにすべてが細胞の生存および死の両方に関係しているセラミドおよびその代謝産物、セラミド１−リン酸、スフィンゴシン、およびスフィンゴシン１−リン酸などの下流のエフェクター分子の産生を変更するか否かについてであろう。実際、本発明者らは、Ｈｓｐ７０が、その濃度に依存して、ｐＨ４．５で、ａＳＭａｓｅのＢＭＰ含有リポソームへの結合を調節できることを見出した。以上から分かるように、低濃度（３〜１５０ｎＭ）のＨｓｐ７０は、ａＳＭａｓｅのＢＭＰ−Ｈｓｐ７０リポソームとの相互作用を促進するが、高濃度のＨｓｐ７０（３００〜１５００ｎＭ）は、逆の効果を有する。エンドサイトーシスのためにＨｓｐ７０が添加されると、培地の作業濃度は３００ｎＭであるが、これに基づいた所定のリソソーム内の濃度の推定が困難であり、Ｈｓｐ７０がｉｎ  ｖｉｖｏでａＳＭａｓｅ活性に対してどんな影響を与えるかについての結論は、推測の域を出ない。しかし、セラミドに対するモノクローナル抗体でのＨｓｐ７０−トランスジェニック（Ｈｓｐ７０−ＴＧ）および野生型（ＷＴ）ｉＭＥＦの染色により、Ｈｓｐ７０−トランスジェニックマウスが、細胞の周辺および細胞の核の近傍における特徴的なビーズオンストリングパターン（ｂｅａｄｓ−ｏｎ−ａ−ｓｔｒｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ）中に存在するセラミドの明確なアップレギュレーションを示すことが明らかになった。脂質抽出によるｉＭＥＦのセラミドプロフィールのさらなる分析およびこれに続く脂質の質量分析により、セラミドの蓄積レベルが、ｉＭＥＦ−ＷＴの平均１０．２ｎｇセラミド／ｍｇタンパク質からＨｓｐ７０トランスジェニックｉＭＥＦの１４．９ｎｇ／ｍｇまで上昇したため、これらの知見が裏付けられた。本発明者らは、ｒＨｓｐ７０が添加された我々のＵ−２−ＯＳ細胞もプロファイルしたため（すなわち、本明細書に提示されたすべての他のＨｓｐ７０−エンドサイトーシス実験に類似した、３００ｎＭ  ｒＨｓｐ７０を完全培地中で２４時間）、この効果がＨｓｐ７０の作用が要因であり得ることをさらに立証した。Ｈｓｐ７０添加Ｕ−２−ＯＳ細胞におけるセラミドの定量により、コントロール細胞の２．９９ｎｇセラミド／ｍｇタンパク質からＨｓｐ７０添加細胞の５．１０ｎｇ／ｍｇへのセラミドの蓄積レベルの上昇が示された（この実験は、書いている時点で一度のみ行った）。しかし、総合すると、これらはすべて、細胞におけるセラミドレベルの調節におけるＨｓｐ７０の役割を支持するが、過程のさらなる評価が必要である。なお、これらのデータが検証できたとしても、セラミド種の区画化、特定のセラミド種（少なくとも５０の異なる分子種が存在）の定量、様々なストレスに直面したセラミドレベルのプロファイリング、細胞の形質転換状態などの一連の疑問がそれら自体を提起する。
【０４８１】
興味深いことに、過去の研究は、これらの疑問の１つに取り組み、熱ショック（４２．５℃で２時間）が、Ｍｏｌｔ−４急性白血病リンパ球におけるセラミドの蓄積を引き起こすことを示している。この蓄積は、薬理学的阻害剤フモニシンＢ１およびミリオシンによって妨げることができ、ミリオシンは、セリンおよびパルミトイル−ＣｏＡから新たなスフィンゴ脂質のデノボ合成を開始する酵素であるセリンパルミトイルトランスフェラーゼの作用を阻害するためセラミド合成のデノボ経路の特異的な阻害剤と見なされる。セラミドのデノボ合成におけるこの増加の部分的な機構が、熱ストレスがデノボ合成を駆動するＥＲへのセリンの急な流入を誘導する酵母で説明された。ｒＨｓｐ７０のエンドサイトーシス時に観察されるセラミドレベルの上昇がこれらの薬理学的な阻害剤によって調節され得るか否か、またはこの観察された上昇が、スフィンゴ脂質分解の異化経路およびＨｓｐ７０のＢＭＰへの結合によるこれらの刺激から生じるか否かを調べることは面白いであろう。もちろん、化合物モデルも仮定することができる。このモデルでは、最初の熱ストレスが、膜流動化、セリン流入、およびデノボスフィンゴ脂質合成の迅速な開始をもたらし得る。次に、熱ストレスの結果であるＨｓｐ７０の誘導が、細胞におけるＨｓｐ７０のレベルの上昇、Ｈｓｐ７０のＢＭＰとの相互作用、ａＳＭａｓｅ活性および場合によってはＳＡＰ活性の増加をもたらし、異化経路によってセラミドが産生される。この二次応答は、連続的なデノボ応答がセリンおよびパルミトイル−ＣｏＡの連続的な供給に依存し得るため、最初のデノボ誘導を補完するか、またはデノボ誘導に取って代わり得る。しかし、細胞保護が、セラミド自体における増加の結果であるか、またはその上流および下流の代謝産物のレベルを変更することに寄与する可能性があるかについての試験がまだ行われていない。
【０４８２】
この時点で、Ｈｓｐ７０が細胞外環境およびエンドリソソーム区画内でどのように終わりを迎えるか、Ｈｓｐ７０が分泌されてエンドサイトーシスによって取り込まれるか、またはＨｓｐ７０がストレスの形態の放出シグナルを待ってリソソームもしくはより特殊化された分泌リソソーム内に存在するか、そして恐らくより重要なことに、細胞外環境におけるＨｓｐ７０の存在の生物学的重要性が何であるかの一部の重要な疑問の答えがまだ出ていない。
【０４８３】
この研究で提示された課題は、これらの複雑な疑問に答えることができないが、ある種の推論は行うことができる。まず、Ｈｓｐ７０は、このプロジェクトで試験したすべての細胞系でエンドサイトーシスされ得、細胞外Ｈｓｐ７０（ｅＨｓｐ７０）を認識する一般的な方法を示している。これは、ｅＨｓｐ７０が異なる白血球亜集団における多数の受容体に結合できることを示すデータに一致している。細胞外Ｈｓｐ７０（ｅＨｓｐ７０）の認識に関与する受容体は、主にパターン認識受容体（ＰＲＲ）を含み、トール様受容体（ＴＬＲ）、スカベンジャー受容体、およびＣ型レクチンなどの異なる受容体ファミリーの様々な受容体からなる。このプロジェクトの研究は、初期機構Ｈｓｐ７０がどのようにエンドサイトーシス（受容体媒介、ラフト依存性、クラスリン依存性など）されるかについて取り組まなかったため、ＰＲＲが我々の系で見られるｅＨｓｐ７０のエンドサイトーシスに関与するか否かについて述べることができない。しかし、１０倍過剰の未標識Ｈｓｐ７０は、Ｕ−２−ＯＳ細胞またはｉＭＥＦにおけるＡＦ４８８標識Ｈｓｐ７０の取り込みと競合せず、逆に、エンドサイトーシスが、過剰な未標識Ｈｓｐ７０の存在下で有意に促進され、これは、ある程度取り込みの飽和機構に反する。
【０４８４】
免疫学の分野の焦点は、主に、サイトカイン応答、およびｅＨｓｐ７０のＰＲＲへの結合によって引き起こされる先天免疫防御の活性化に関するため、受容体の結合およびシグナル伝達開始後のｅＨｓｐ７０の効果があまり考慮されていない。
【０４８５】
Ｈｓｐ７０の細胞外環境への放出機構およびＨｓｐ７０の効果は、本明細書では、ある程度まで取り組んだが、これらの刺激的な機構への満足のいく分子的洞察は不十分である。それにもかかわらず、ストレス後の循環系におけるＨｓｐ７０の存在についての多数の証拠が存在し、累積データが、ストレス誘導または外部送達にかかわらず、神経保護および一次免疫防御系の惹起におけるｅＨｓｐ７０の役割を裏付けている。Ｈｓｐ７０の放出に関して、Ｈｓｐ７０のある細胞から別の細胞への移動の最初の証拠は、イカ巨大軸索の研究から得られたものであり、培養ラット胚細胞でのこれらの結果の再現の際に、エキソサイトーシスの非古典的な経路がＨｓｐ７０の放出に関与し得るという証拠が示された。
【０４８６】
Ｈｓｐ７０および他の熱ショックタンパク質のみが、プログラム細胞死の際ではなく、ネクローシス死をもたらす病理学的状況下で放出されることが示唆された。しかし、最近の研究により、Ｈｓｐ７０が能動機構によって無傷の細胞から放出され得ること、および刺激の程度が放出方式を決定することが示された。重要なことに、既知の研究は、ｅＨｓｐ７０と筋肉損傷のマーカーとの間の直接的な相関性を報告していないが、ｅＨｓｐ７０の大幅な増加を、運動時に末梢血流中で検出することができる。最も説得力があり、そして恐らく最も興味深くもあるものは、捕食の恐れおよび電気ショックなどの心理的ストレスが、ストレス誘導ｅＨｓｐ７０放出、すなわちカテコールアミンのシグナル伝達に依存することが示唆されているプロセスを引き起こし得ることを示す発見である。これは、α１−アドレナリン受容体を介したカテコールアミンが、細胞内のカルシウム流入をもたらし、カルシウム流入が、エキソソーム、多小胞体、およびリソソームのエキソサイトーシスを引き起こし得るため特に興味深い。したがって、ストレス時に、α１−アドレナリン受容体に作用するノルアドレナリンの増加が、Ｈｓｐ７０のエキソソーム内への放出を引き起こす細胞内へのカルシウムの流入をもたらし得る。この仮説の証拠は、ｅＨｓｐ７０がエキソソームとして特徴付けられた小胞内に放出され得ることの実証からきているが、ｅＨｓｐ７０が、細胞系およびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で遊離ｅＨｓｐ７０として放出され得るという証拠も提示された。脂質ラフトがｅＨｓｐ７０の放出に必要であることも示唆されたが、これも論争中である。さらに、機能的リソソーム区画がｅＨｓｐ７０の放出に必要であること、およびこの放出には、細胞の表面のリソソームマーカータンパク質の存在が伴うことが示され、原形質膜とリソソーム膜の融合に依存する分泌を示唆している。
【０４８７】
放出されたＨｓｐ７０がエキソソーム内に存在するかまたは遊離ｅＨｓｐ７０として存在するか否かにかかわらず、興味深いことに、ある種の分泌ＭＶＢ／後期エンドソーム／リソソーム区画が、明らかにすべての方式の放出に関与する。これらのデータおよび本明細書で得られた結果に基づいて、Ｈｓｐ７０が細胞質ゾルから細胞外の環境に逃げる方法についてのより複雑な仮説を立てることができる。Ｈｓｐ７０の放出は、細胞内カルシウムの増加がエンドリソソームのエキソサイトーシスのシグナルとして役立つため、なお細胞内カルシウムの増加に依存するであろう。しかし、Ｈｓｐ７０が、後期エンドソーム／ＭＶＢ／リソソームのＢＭＰ含有内膜に効果的に凝集し得るため、この区画内のＨｓｐ７０の存在は、本明細書に記載されているようにＨｓｐ７０とＢＭＰとの相互作用に依存するであろう。Ｈｓｐ７０は、同様に本明細書に記載されているようにエンドサイトーシスなどの細胞外取り込みから、または細胞内Ｈｓｐ７０およびＢＭＰを近接させ得る初期および後期エンドソームならびにリソソームの周辺膜の陥入によって、後期エンドソームおよびリソソームに到達し得る。区画の酸性は、Ｈｓｐ７０のＢＭＰ含有膜への局在化の強い優先傾向を維持するであろう。エキソサイトーシス時に、一部のＨｓｐ７０が、なおＢＭＰ含有エキソソームに結合され得るが、細胞外環境で遭遇する中性ｐＨが、ここで、恐らく、より結合していないＨｓｐ７０に向かって有意にシフトされたＨｓｐ７０とＢＭＰの平衡を好むため、遊離Ｈｓｐ７０およびエキソソーム結合Ｈｓｐ７０の両方が生じ、これが、それらの細胞外機能を付与し得る。
【０４８８】
要約すると、本明細書に提示されたデータは、Ｈｓｐ７０が、エンドリソソーム陰イオン性リン脂質ＢＭＰと直接およびｐＨ依存的に相互作用することを示している。本発明者らは、Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対する結合が、トリプトファン９０に関するＨｓｐ７０  ＡＴＰアーゼドメインによって媒介されること、およびこの相互作用が、可能性として他のＢＭＰ結合タンパク質の活性に影響を与えることによってエンドリソソーム膜の安定化をもたらすことを実証する。本発明者らはまた、この分子機構の解明が、Ｈｓｐ７０のリソソーム安定化機能の特異的な阻害によってリソソーム細胞死経路を誘導する作用物質に対する癌細胞の感作の新たな刺激的な可能性を開くことも示す。逆に、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用は、外部から投与されるＨｓｐ７０のリソソーム安定化機能によって提供される細胞保護に依存する新たな治療戦略を提供する可能性がある。
【０４８９】
実施例２：Ｈｓｐ７０とビス（モノアシルグリセロ）リン酸との間の相互作用が酸性スフィンゴミエリナーゼを活性化し、リソソーム膜を安定させ、細胞の生存を向上させる
熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）は、ストレス誘導細胞死の特徴であるリソソーム膜の透過化を阻害することによってストレスを受けた細胞の生存を向上させる進化的に高度に保存された分子シャペロンである。その分子機構の動作の手がかりは、最近報告されたＨｓｐ７０の小部分のリソソーム区画へのストレスおよび癌に関連した転位にあり得る。ここで、我々は、Ｈｓｐ７０が、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）、すなわちスフィンゴミエリンをセラミドおよびホスホリルコリンに加水分解するリソソームリパーゼの活性を促進することによってリソソームを安定させることを示す。酸性環境では、Ｈｓｐ７０は、ＡＳＭの必須の補助因子であるエンドリソソーム陰イオン性リン脂質ビス（モノアシルグリセロ）リン酸（ＢＭＰ）に対して高親和性かつ特異的に結合し、これによりＡＳＭのＢＭＰに対する結合を促進し、ＡＳＭ活性を刺激する。ＢＭＰ抗体またはＨｓｐ７０における点突然変異（Ｗ９０Ａ）によるＨｓｐ７０とＢＭＰの相互作用の阻害およびデシプラミンによるＡＳＭ活性の阻害は、Ｈｓｐ７０媒介リソソーム安定化を効果的に元に戻す。注目すべきことに、ＡＳＭ遺伝子の突然変異によって引き起こされる重度のリソソーム蓄積障害であるニーマンピック病Ａ型（ＮＰＤＡ）の患者由来の細胞におけるＡＳＭ活性の低下は、リソソーム安定性の劇的な低下にも関係しており、この表現型は、組換えＨｓｐ７０またはＡＳＭでの処理によってリソソームＡＳＭ活性を回復させることによって効果的に修正することができる。総合すると、これらのデータは、エンドサイトーシス送達経路によってリソソーム内腔内に侵入する細胞透過化合物を一切用いない、リソソーム蓄積障害および癌の治療の刺激的な可能性を開く。
【０４９０】
リソソームプロテアーゼ、カテプシンは、様々なストレスによって誘導される進化的に保存された細胞死プログラムにおける重要なエフェクターである。カテプシン依存性細胞死は、初期リソソーム膜透過化、およびこれに続くカテプシンがカスパーゼ依存性および非依存性細胞死経路を開始することができる細胞質ゾルへのカテプシンの転位によって特徴付けられる。リソソーム局在化が、リソソーム膜を安定化させてストレス誘導細胞死から細胞を保護することが報告されたＨｓｐ７０の能力にとって極めて重要であるか否かを調べるために、我々は、細胞のエンドサイトーシス機構を利用して組換えＨｓｐ７０（ｒＨｓｐ７０）をリソソームに送達した。フルオロクロム標識ｒＨｓｐ７０と共にインキュベートしたＵ−２−ＯＳ骨肉腫細胞の免疫細胞化学および生化学分析により、ｒＨｓｐ７０の効果的な取り込み、後期エンドソームおよびリソソームマーカーとのその特異的な共局在化、およびリソソーム膜への結合が明らかにされた（図５ａ、図５ｂ、および図９）。リソソーム膜完全性を観察するためにリアルタイムイメージング（図５ｃ）を用いて、我々は、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０が、光酸化からリソソームを保護することを示した（図５ｄ）。さらに、Ｈｓｐ７０に特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、光酸化に対してリソソームを感作させ、この効果が、エンドサイトーシスされたｒＨｓｐ７０によって完全に元に戻され、内在性Ｈｓｐ７０の保護効果がリソソーム内腔のタンパク質の小画分によって媒介されることを適切に実証している（図５ｅ）。同様の取り込み量にもかかわらず（データは不図示）、Ｈｓｐ７０とそれぞれ８６％および８４％のアミノ酸配列相同性を有する組換えＨｓｃ７０およびＨｓｐ７０−２では、リソソーム安定化が全く観察されなかった（図５ｄ）。
【０４９１】
リソソーム膜におけるＨｓｐ７０の存在および加水分解性リソソーム環境で生存するその能力は、Ｈｓｐ７０がリソソーム膜脂質に結合することを示唆する。したがって、我々は、様々な膜結合陰イオン性脂質、すなわちパルミトイル−オレオイル−ホスファチジルセリン（ＰＯＰＳ；主に原形質膜に存在）、カルジオリピン（主にミトコンドリア）、およびＢＭＰ（主に後期エンドソーム／リソソームに存在）を含むパルミトイル−オレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）大型単層小胞（ＬＵＶ）とＨｓｐ７０の相互作用を調べた。リソソームへの成熟の際のエンドリソソーム区画の酸性環境の増大を考慮して、我々は、中性（ｐＨ７．４）および酸性（ｐＨ６．０）の条件でタンパク質と脂質の相互作用を比較した（図６ａ）。ｐＨ７．４では、ｒＨｓｐ７０は、ＰＯＰＣリポソームでの９０度光散乱で僅かな相対変化を引き起こし、非常に弱い結合を示唆する。ＰＯＰＳに関して過去に報告されたように、すべての負に帯電した脂質は、リポソーム表面の電荷密度（−１〜−２の範囲）にかかわらず、中性ｐＨで、ｒＨｓｐ７０のリポソームに対する結合を約４倍に促進した（図６ａ）。注目すべきことに、ＢＭＰに対する結合は、中性ｐＨと比較すると酸性ｐＨで約２０倍強いが、ＰＯＰＳに対する結合は、酸性化時に僅かに上昇しただけであった（図６ａ）。酸性ｐＨでのＨｓｐ７０のＢＭＰに対する高親和性結合が、独立した一連のＢＩＡｃｏｒｅ実験で確認された（図６ｅおよび図７ａ）。重要なことに、エンドサイトーシスによってエンドリソソーム区画に送達されたＢＭＰ抗体は、生細胞におけるリソソームを安定させるｒＨｓｐ７０の能力を効果的に阻害し（図６ｂ）、そしてリソソーム漏出を誘導する抗癌剤であるシスプラチンに対して細胞を感作させた（図６ｃ）。
【０４９２】
Ｈｓｐ７０タンパク質のどの部分がＢＭＰとの結合に関与しているかを調べるために、我々は、ｒＨｓｐ７０およびその変異体のＢＭＰ含有リポソームへのドッキング時のトリプトファンの蛍光シフトを測定した。カルボキシ末端ペプチド結合ドメイン（ｒＨｓｐ７０−ΔＰＢＤ）のアミノ酸４３７〜６１７が欠失したＨｓｐ７０変異体ではなく、アミノ末端ＡＴＰアーゼドメイン（ｒＨｓｐ７０−ΔＡＴＰ）のアミノ酸１１９〜４２６が欠失したＨｓｐ７０変異体の相対ピーク蛍光強度におけるシグナルの消失は、ＡＴＰアーゼドメインが、Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対する高親和性結合に必要であることを示唆した（図６ｄ）。次に、我々は、Ｈｓｐ７０の２つのトリプトファンをフェニルアラニン（Ｗ９０ＦおよびＷ５８０Ｆ）で置換し、どのトリプトファンが脂質結合によって誘導される蛍光シフトに関与するかを調べた。ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆのみでのシグナルの低下は、タンパク質のＮＨ２末端が脂質層内にドッキングしたことを示唆した（図６ｄ）。ＢＭＰとｒＨｓｐ７０の相互作用のより定量的なＢＩＡｃｏｒｅ分析により、Ｈｓｐ７０が、主にそのＡＴＰアーゼドメインによってＢＭＰと相互作用することが確認された（図６ｅ）。驚くべきことに、Ｗ９０Ｆ突然変異は、Ｈｓｐシャペロンの構造的（遠紫外線および近紫外線円形二色性測定によって分析される折り畳み）および機能的（ルシフェラーゼ折り畳みおよびＡＴＰ加水分解）側面を維持したまま、ｒＨｓｐ７０とＢＭＰとの間の相互作用を明確に消失させた（図６ｅ、データは不図示）。したがって、ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ突然変異は、Ｈｓｐ７０とＢＭＰとの間の直接的な相互作用がそのリソソーム保護特性をＨｓｐ７０に付与するか否かについてさらに調べるための貴重なツールを我々に提供した。実際、ｒＨｓｐ７０−Ｗ９０Ｆ突然変異は、光酸化からリソソーム膜を保護してシスプラチン誘導リソソーム細胞死から細胞を保護するその能力を完全に失ったが、ｒＨｓｐ７０−Ｗ５８０Ｆ突然変異は、野生型タンパク質と同じ保護効果を示した（図６ｆおよび図６ｇ）。重要なことに、突然変異Ｈｓｐ７０タンパク質は、野生型Ｈｓｐ７０と同程度に効果的に本質的にエンドサイトーシスされた（データは不図示）。したがって、我々は、Ｈｓｐ７０のＢＭＰに対する結合が、Ｈｓｐ７０のリソソーム安定効果に必須であると結論した。
【０４９３】
エンドソームが成熟してリソソームを形成する際にエンドサイトーシス小胞におけるＢＭＰの濃度が上昇するため、ｐＨ調節は、Ｈｓｐ７０をリソソームに送達する方法であり得る。計算（ＰＲＯＴＰＡＲＡＭ、ＥＸＰａＳｙプロテオミクスサーバー、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）により、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインが、ペプチド結合ドメインよりも１．７２単位高い理論ｐｌを有することが明らかにされた（６．６２対４．９）。この特徴は、酸性ｐＨで、ＡＴＰアーゼドメインが優先的に正に帯電され、これによりＡＴＰアーゼドメインの陰イオン性脂質との相互作用が促進され得ることを示唆する。Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用の酸性ｐＨおよびＡＴＰアーゼドメインへの依存を実証する我々のデータは、この理論を支持する。さらに、Ｈｓｐ７０のＡＴＰアーゼドメインの静電表面の分子モデリングは、ＢＭＰと相互作用してリソソームを安定化させるＨｓｐ７０の能力に対するＷ９０Ｆ突然変異の重大な影響を場合によっては説明する、Ｗ９０を含むウェッジの底部に主に正の電荷を有するほぼウェッジ様の構造を形成することを明らかにした（図６ｈ）。
【０４９４】
ＢＭＰは、高い親和性でＡＳＭに結合し、スフィンゴミエリンをセラミドおよびホスホリルコリンに加水分解するその能力を刺激する。ＢＩＡｃｏｒｅ分析により、等モル濃度以下でのｒＨｓｐ７０を用いたＢＭＰ含有ＬＵＶの前処理は、後のＡＳＭの結合を促進するが、より高い濃度のｒＨｓｐ７０は、阻害効果を示すことが明らかにされた（図７ａおよび図１０）。注目すべきことに、ストレス誘導リソソーム損傷から保護されたＨｓｐ７０トランスジェニックマウス胎児線維芽細胞（Ｈｓｐ７０−ＭＥＦ）（図７ｅ）は、野生型ＭＥＦ（ＷＴ−ＭＥＦ）よりも有意に高いＡＳＭ活性を示し、細胞保護濃度（３００ｎＭ）でのｒＨｓｐ７０を用いたＷＴ−ＭＥＦの処理により、ＡＳＭ活性が、Ｈｓｐ７０−ＭＥＦにおけるレベルに匹敵するレベルまで上昇した（図７ｂ）。ＡＳＭがリソソーム安定効果に関与するか否かを調べるために、我々は、十分に特徴付けられた薬理学的ＡＳＭ阻害剤であるデシプラミンで細胞を処理した。デシプラミンは、ＭＥＦの生存度を用量依存的に低下させ、この細胞死は、リソソームカテプシンの細胞質ゾルへの漏出によって実証されるようにリソソームの広範囲の透過化に関係していた（図７ｃおよび図７ｄ）。注目すべきことに、デシプラミン誘導細胞死およびリソソーム漏出は、ＷＴ−ＭＥＦと比較するとＨｓｐ７０−ＭＥＦで有意に減少した。さらに、毒性水準以下の濃度のデシプラミンでのＡＳＭの阻害により、Ｈｓｐ７０−ＭＥＦのリソソームストレス耐性が、光酸化時のリソソーム膜完全性の加速度的な低下からも分かるようにＷＴ−ＭＥＦのレベルまで戻った（図７ｅ）。ＡＳＭのリソソーム保護の役割は、ＡＳＭ遺伝子における突然変異によって引き起こされる致死性のリソソーム蓄積障害であるＮＰＤＡの患者由来の線維芽細胞におけるリソソームが、光酸化誘導損傷に対して極端な感受性を有することを示すデータによってさらに裏付けられた（図８ａ）。注目すべきことに、ｒＨｓｐ７０は、患者の細胞における内在性突然変異ＡＳＭおよび同時に添加されたｒＡＳＭの酵素活性を促進することもできた（図８ｂ）。ｒＨｓｐ７０、ｒＡＳＭ、またはこれら２つの組合せをリソソームに添加することによって得られるＡＳＭ活性の上昇は、リソソームを安定させて、ＮＰＤＡ細胞における劇的に拡大したリソソーム区画の体積を標準化するそれらの能力に相関していた（図８ｂ〜図８ｄ）。ｒＨｓｐ７０と同様に、ｒＡＳＭも、リソソームに局在したことに留意されたい（図８ｂ）。
【０４９５】
総合すると、我々のデータは、Ｈｓｐ７０とＢＭＰの相互作用が、膜の直接的な物理的安定化ではなく、スフィンゴミエリン代謝の調節に関係する機構によってリソソームを安定化させることを示唆している。このような間接的な効果は、ＢＭＰが、エンドリソソーム区画の内膜のみに局在し、この内膜で、ＢＭＰの重要な機能が、ＡＳＭおよびスフィンゴ脂質活性化タンパク質による分解および脂質小胞からの脂質の抽出を助けるという事実によって裏付けられる。興味深いことに、ＡＳＭによって媒介されるリソソームセラミド濃度の上昇は、リソソーム膜の立体配座を変更して、リソソーム膜の他の細胞内小胞および原形質膜との融合を促進する。したがって、セラミドに誘導された融合能力の向上の結果としてのリソソーム膜の組成および体積の変化が、Ｈｓｐ７０によって媒介されるリソソーム安定性の上昇に寄与し得る。他方、様々なアポトーシス刺激が、原形質膜の外側小葉へのＡＳＭの転位を誘導し、そこで、セラミドが、アポトーシスシグナル伝達に関与する膜結合シグナル伝達分子の活性化の部位として機能する脂質微小ドメインを形成することができる。したがって、セラミドは、リソソームの内側で産生されるかまたは原形質膜上で産生されるかによって細胞の生存に対して反対の効果を有し得る。Ｈｓｐ７０の細胞保護効果の基礎をなす上記の分子機構は、Ｈｓｐ７０のリソソーム安定化機能の特異的な阻害によってリソソーム細胞死経路を誘導する作用物質に対する癌細胞の感作の新たな刺激的な可能性を開く。逆に、単独またはｒＡＳＭと組み合わせて外部から投与されるｒＨｓｐ７０の能力は、現在は治療選択肢が遺伝子療法および幹細胞療法に限定されているＮＰＤ患者の新規な治療として直接試すことができる。
【０４９６】
方法の要約
ＷＴ−ＭＥＦおよびＨｓｐ７０−ＭＥＦは、当技術分野で述べられているように作製し、不死化し、そして維持した。ヒトＮＰＤＡ線維芽細胞（８３／２４）は、生後５ヶ月の肝脾腫の患者の皮膚生検に由来する。組換えタンパク質は、ｐＥＴ−１６ｂベクター系およびＮｉ２＋アフィニティ精製（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて作製し、製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）のプロトコルに従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で標識した。リソソーム完全性を分析するために、我々は、リソソームを赤色に染色して光酸化に対して感作させる細胞の酸性区画内に蓄積する異染性弱塩基であるアクリジンオレンジで染色した細胞のリアルタイムイメージング法を開発した。リソソームｐＨ勾配の光酸化に誘導された消失およびアクリジンオレンジの個々のリソソームから細胞質ゾルへの漏出を、Ｕ２−Ｏ−Ｓ細胞における「赤色点の消失」として、および線維芽細胞におけるＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＤＵＯソフトウエアによる赤色蛍光の減少および緑色蛍光の増加として視覚的に定量した。全カテプシン活性および細胞質（ジギトニン抽出）カテプシン活性を、当技術分野で述べられているようにｚＦＲ−ＡＦＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）プローブを用いてジギトニン処理サンプルで測定した。トリプトファン蛍光スペクトルおよびリポソーム９０度光散乱を、本質的に当技術分野で述べられているようにＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、示されているｐＨ）で分析した。表面プラズモン共鳴測定を、当技術分野で述べられているようにＢＩＡｃｏｒｅ２０００システムを用いて固定したＬＵＶで行った。Ｈｓｐ７０  ｓｉＲＮＡ（５’−ＧＣＣＡＵＧＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＡＣＡＡＵＣＵＧＵ−３’）およびコントロールＨｓｐ７０  ｓｉＲＮＡをＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクトした。標準的なプロトコルで免疫検出を行った。アポトーシス様細胞死およびリソソーム膜透過化を、本質的に当技術分野で述べられているように分析した。当技術分野で述べられているように変更を加えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓからのＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａ１２２２０）によってＡＳＭ活性を分析した。対応のあるスチューデントの両側ｔ検定を用いて統計分析を行い、すべての群のデータを、Ｆ検定を用いてそれらの分散の比較可能性について調べた。
【０４９７】
方法
細胞培養および試薬。ヒトＵ−２−ＯＳ骨肉腫細胞を、６％熱不活化ウシ血清およびペニシリン−ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。Ｈｓｐ７０トランスジェニックＭＥＦおよび適切なコントロールＭＥＦを、当技術分野で述べられているように作製し維持した。ヒト一次ＮＰＤＡ線維芽細胞を、１％Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ、１％ＨＥＰＥＳ、１％Ｌ−グルタミンをさらに添加したＭＥＦ培地で増殖させた。すべての細胞を、ＣＯ２が５％の加湿大気中で、３７℃で増殖させ、マイコプラズマについて繰り返し試験し、陰性であることを確認した。特に明記されていない限り、すべての化学種は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｄｅｎｍａｒｋ  Ａ／Ｓ）から購入した。
【０４９８】
リソソーム完全性についてのアッセイ。２μｇ／ｍｌアクリジンオレンジと共に３７℃で１５分間インキュベートしたサブコンフルエント細胞を、洗浄し、照射し、そして３％ウシ胎児血清を添加したハンクス平衡塩溶液で分析した。１つの細胞イメージングのための細胞を、透過光モードの各ウェルの８つの所定の領域から選択し、次いで同じ細胞を、Ｕ−ＵＬＳ１００ＨＧハウジング（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に装着したＵＳＨ１０２  １００Ｗ水銀アークバーナー（Ｕｓｈｉｏ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ）からの青色光に２０秒間曝露して迅速に可視化した。蛍光顕微鏡検査を、ＮＡ＝０．４０のＬＣＰｌａｎＦ１×２０対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立顕微鏡で行った。リソソームのｐＨ勾配の消失を、強い赤色染色の消失をカウントすることによって定量した。この研究で使用される様々な線維芽細胞の大きなリソソーム区画に対応するために、リソソーム完全性をアッセイするためのより精密な方法を開発した。１つの細胞イメージングのための細胞を、透過光モードの各ウェルの８つの所定の領域から選択し、次いで同じ細胞を、１００ｍＷダイオードレーザーからの４８９ｎｍの光に迅速かつ連続的に曝露する一方で、レーザー走査顕微鏡写真を、４９５〜５５５ｎｍ（緑色）およびＬＰ６５０ｎｍ（赤色）の光のバンドパスフィルターによって画定された２つのチャンネルで、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＬＩＶＥ  ＤＵＯ共焦点系で３３０ミリ秒毎に撮影した。次いで、得られた低速度撮影映画を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＤＵＯ統合ソフトウエアによって分析した。全カテプシン活性および細胞質（ジギトニン抽出）カテプシン活性を、当技術分野で述べられているようにｚＦＲ−ＡＦＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）プローブを用いてジギトニン処理サンプルで測定した。
【０４９９】
細胞の生存についてのアッセイ。細胞密度を、本質的に当技術分野で述べられている３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾディウムブロミド（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌｅ−２−ｙ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｓｏｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）（ＭＴＴ  ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ）減少アッセイによって評価した。０．０５μｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で細胞を染色して、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７０倒立蛍光顕微鏡（Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕ−ＭＷＵ  ３３０−３８５ｎｍ）で核が凝縮した細胞をカウントすることによってアポトーシス様細胞死を評価した。各実験では、最少で８つの無作為に選択した領域をカウントした。
【０５００】
免疫検出および顕微鏡検査。使用した一次抗体には、Ｈｓｐ７０に対するマウスモノクローナル抗体（２Ｈ９；Ｂｏｒｉｓ  Ｍａｒｇｕｌｉｓ、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、Ｒｕｓｓｉａによって提供された）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＢＭＰ（６Ｃ４）、リソソーム内在性膜タンパク質１（Ｈ５Ｃ６；Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ  ＡｕｇｕｓｔおよびＪａｍｅｓ  Ｅ．Ｋ．Ｈｉｌｄｒｅｔｈによって開発され、ＮＩＣＨＤの主催で設立され、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｗａ  Ｃｉｔｙ、ＵＳＡによって維持されているＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋから入手した）が含まれる。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してニトロセルロース膜に移したタンパク質を、示された一次抗体、Ｄａｋｏからの適切なペルオキシダーゼ共役二次抗体、ＥＣＬウエスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、およびＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＬＡＳ−１０００Ｐｌｕｓ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を用いて検出した。免疫細胞化学では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５７６またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８共役二次抗体を使用した。リソトラッカー  レッド（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ）（登録商標）を、リソソーム区画のライブの可視化に使用した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ１００Ｍレーザー走査顕微鏡で蛍光画像を撮影した。リソソームの完全性についてのリソトラッカー（Ｌｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ）定量および低速度撮影映画を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ＬＩＶＥ  ＤＵＯシステムで行った。
【０５０１】
トリプトファン蛍光スペクトルおよびリポソーム９０度光散乱。トリプトファン蛍光スペクトル（ＲＦＩ）およびリポソーム９０度光散乱（ＲＳＩ）を、本質的に当技術分野で述べられているように、示された脂質からなるＬＵＶを利用するＨＥＰＥＳ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、示されたｐＨ７．４または６．０）で分析した。ＲＦＩでは、ＬＵＶを１０μＭアリコートで添加し、２０分の安定化時間の後にスペクトルを記録した。ＲＳＩでは、組換えタンパク質を０．１２ナノモルのアリコートで添加した。
【０５０２】
表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）。ＬＵＶの調製のために、有機溶媒に溶解した１０モル％スフィンゴミエリン、５０モル％ホスファチジルコリン、２０モル％コレステロール、および２０モル％ＢＭＰからなる脂質混合物を、アルゴン流下で乾燥させ、トリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中で再水和した。この混合物を、液体窒素中で凍結−解凍を９回繰り返してから３７℃のインキュベーターに入れた。１５分間の超音波槽の後、混合物を、孔径が１００ｎｍのポリカーボネート膜を２１回通過させた。表面プラズモン共鳴測定を、２５℃で、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００システムを用いて行った。ＬＵＶ（全脂質濃度０．１ｍＭ）をＰＢＳ（ローディング緩衝液）中のＬ１センサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ）の表面に固定した。使用したランニング緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ４．５）であった。コントロールとして、ランニング緩衝液に溶解した酸性スフィンゴミエリナーゼ（０．２μＭ、６０μｌ）をリポソーム表面に直接注入した。４１００ＲＵ〜５２５０ＲＵの反応単位が得られた。目的のタンパク質を、示された濃度で、２０μｌ／分の流速でランニング緩衝液に注入した。注入後、１０分間の解離相を追加した。ｒＡＳＭがｒＨｓｐ７０の後に続く場合は、この１０分のｒＨｓｐ７０の解離相の後のさらなる１０分間の解離相の後にｒＡＳＭを１８０秒間加えた。
【０５０３】
分子モデリング。一次構造分析および分子モデリングを、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）のＥｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＥＸＰａＳｙ）プロテオミクスサーバーから入手可能なソフトウエアで行った。分子モデリングは、ＤｅｅｐＶｉｅｗ−Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒを用いて、ヒトＨｓｐ７０−ＡＴＰアーゼドメイン（ｐｄｂコード：１Ｓ３Ｘ）およびヒトＨｓｃ７０基質結合ドメイン（ｐｄｂコード：７ＨＳＣ）の結晶構造に基づいて行った。表面モデルは、溶媒誘電率８０（Ｈ２Ｏ）を用いたｐＨ７．０でのクーロン相互作用に基づいていた。
【０５０４】
統計分析。帰無仮説を評価するために対応のあるスチューデントの両側ｔ検定を用いて統計分析を行った。統計的有意性のためのカットオフレベルは、５％に設定し、すべての群のデータを、Ｆ検定を用いてそれらの分散の比較可能性について調べた。すべての統計は、最少でｎ＝３の独立した実験で行った。
【０５０５】
実施例３：ベンジルアルコールのリソソーム蓄積症に対する効果
Ｈｓｐ７０が、ＢＭＰとの相互作用によるリソソーム安定効果を有することが実施例２および３に示されている。細胞がＨｓｐ７０化学誘導物質に曝露された時にこの効果が同様に観察されるか否かを評価するために、ニーマンピックＡ型（ＮＰＤＡ）患者の線維芽細胞を、低分子Ｈｓｐ７０誘導物質；ベンジルアルコール（ＢＡ）で処理した。結果は図１１に示されている。まず、ＮＰＤＡ細胞を、増加する用量のＢＡ（０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ）で処理し、溶解し、そしてウエスタンブロッティングによって分析した。同量のタンパク質を各ウェルに添加した。Ｈｓｐ７０タンパク質の発現を各条件に対して評価し、ＢＡが、用量依存的にＨｓｐ７０の発現を誘導したことを示す（一次抗体：Ｈｓｐ７０に特異的なＳｔｒｅｓｓｇｅｎ  ＳＰＡ−８１０）。次に、４０ｍＭ  ＢＡで処理した後のＮＰＤＡ  Ｇｏｔｚリソソームの安定性を、実施例２で説明した方法と同じ方法で評価した。リソソーム安定性の上昇は、ＢＡに応答して観察された。最後に、４０ｍＭ  ＢＡで処理した後のＮＰＤＡ  Ｇｏｔｚ細胞のリソソーム断面積を、実施例２で説明した方法と同じ方法で評価した。病変の減少が観察された。
【０５０６】
項目
１．酵素の酵素活性を調節するための方法であって、前記酵素がＢＭＰと相互作用し、前記方法が、Ｈｓｐ７０またはその機能的断片を、ＢＭＰとＨｓｐ７０またはその前記機能的断片との間の相互作用を可能にするのに適した形態で投与して、これによりＢＭＰと相互作用する酵素の酵素活性を調節するステップを含む、方法。
２．Ｈｓｐ７０またはその機能的断片が、ＢＭＰと共有結合または非共有結合複合体を形成する、項目１に記載の方法。
３．ＢＭＰがサポシンと相互作用する、項目１または２に記載の方法。
４．前記サポシンが、サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＣ、およびサポシンＤからなる群から選択される、項目３に記載の方法。
５．前記酵素が、スフィンゴミエリナーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、シアリダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシルセラミダーゼ、グルコシルセラミダーゼ、および酸性セラミダーゼからなる群から選択される、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．薬剤として使用するためのＨｓｐ７０またはその機能的断片。
７．リソソーム蓄積障害の治療、軽減、または予防に使用するためのＨｓｐ７０またはその機能的断片。
８．前記リソソーム蓄積障害が、ニーマンピック病、ゴーシェ病、ファーバー病、クラッベ病、ファブリー病、およびシアリドーシスからなる群から選択される、項目７に記載の使用。
９．化合物の取り込みを増加させるための方法であって、前記化合物をＨｓｐ７０またはその機能的断片と共に投与するステップを含む、方法。
１０．前記Ｈｓｐ７０またはその機能的断片が、前記化合物に共有結合している、項目９に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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