(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の群から選択される少なくとも１つの配列を含む二量体又は単量体ＶＨＨドメイン。
【請求項２】
ロタウイルスのＡ群中に存在するＶＰ６抗原のリニアエピトープに結合する、請求項１に記載のドメイン。
【請求項３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の群から選択される２つの、同一の又は異なる配列を含む、請求項１に記載の二量体ドメイン。
【請求項４】
配列番号１３の連結をさらに含む、請求項３に記載の二量体ドメイン。
【請求項５】
前記「２つの、同一の又は異なる配列」が配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２の群から選択される、請求項３に記載の二量体ドメイン。
【請求項６】
ａ）ロタウイルス含有試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又はこれらの組合せの群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体又は単量体ドメインと接触させるステップ、及びｂ）発色させるステップを含む、ロタウイルス免疫検出方法。
【請求項７】
免疫捕捉による試験ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、競合ＥＬＩＳＡ、磁気ビーズ又は任意の他のクロマトグラフ免疫測定技術の群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物に受動免疫を与えるように設計された組成物であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又はこれらの組合せの群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体又は単量体ドメイン、賦形剤及び免疫調節剤を含む組成物。
【請求項９】
請求項１から５までに記載の単量体又は二量体ドメインのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む受託番号ＣＥＣＴ７４３１株に含まれるプラスミドｐＦＢＭｅｌＶＨＨ。
【請求項１０】
請求項９に記載のプラスミドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１１】
前記ベクターがウイルス、特にバキュロウイルスである、請求項１０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載のベクターで形質転換又はトランスフェクト又は感染されたトランスジェニック細胞であって、請求項９に記載のプラスミドに含まれるＤＮＡを発現するトランスジェニック細胞。
【請求項１３】
請求項１から５までに記載のドメインの製造方法であって、
ａ）培養物又は昆虫の幼虫の宿主細胞を請求項１０又は１１に記載の組換えベクターで形質転換又はトランスフェクト又は感染させるステップ、
ｂ）適切な条件下で前記細胞の増殖を維持するステップ、
ｃ）前記ドメインを単離及び精製するステップ
を含む方法。
【請求項１４】
請求項１から５までに記載のドメインのいずれかを含む抗体。
【請求項１５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又はこれらの組合せの群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体又は単量体ドメインを含む、ロタウイルスの免疫検出キット。
【請求項１６】
ロタウイルスにより引き起こされる感染の予防又は治療方法において使用するための、配列番号２、配列番号４、又はこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む二量体又は単量体ドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＶＰ６ラクダ抗体由来の単量体ＶＨＨドメイン、二量体ドメイン、免疫法、ロタウイルス検出法、組成物、ロタウイルス感染の予防及び治療方法に関する。より具体的には、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示すアミノ酸配列のいずれであってもよく、Ａ群ロタウイルスのタンパク質ＶＰ６に結合する、ラクダ抗体由来の単量体ドメイン（ＶＨＨ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ａ群ロタウイルス（ＲＶ）は、小児において及び経済的に注目される多くの動物種（ウシ、ブタ、ウマ、南米ラクダなど）の子において重症の下痢の主要因である。公衆衛生上の問題として、ＲＶは、発展途上国において重症の下痢に関連する第３の主要な死因である（年間２００万人が死亡）。一方、消費用の動物、例えば若齢のウシなどにおけるＲＶ起因性の下痢は、予防又は治療に関するコストの増加を招く。
【０００３】
Ａ群ＲＶは、３つ組のタンパク質カプシドからなる粒子である。外側のカプシド表面はタンパク質ＶＰ４及びＶＰ７からなり、これらはともに高度に可変性の抗原であるため、これまで少なくとも２７個のＶＰ４変異体（Ｐ型）及び１６個のＶＰ７変異体（Ｇ型）が記述されている。各Ｇ−Ｐ型の組合せは、他のＧ−Ｐ型との交差反応性が低い抗体の中和を誘導する。このため、標的種において循環する異なる株をワクチンに含めることが必要である。
【０００４】
中間のカプシドは三量体タンパク質ＶＰ６からなり、これはビリオン質量の５１％に相当する。タンパク質ＶＰ６における２つの異なるエピトープの有無（モノクローナル抗体ｍＡｂ２５５／６０及び６３１／９により認識される）によって、Ａ群ＲＶ株はさらに亜群（Ｓｂ）Ｉ、ＩＩ、Ｉ＋ＩＩ及び非Ｉ非ＩＩに分類される。ヒトＲＶは通常ＳｂＩＩであるが、動物ＲＶは主としてＳｂＩである。タンパク質ＶＰ６は高度に免疫原性であるため、自然感染したヒト及び動物はＶＰ６エピトープに対して強力な体液性応答を発生させる。上述した亜群にかかわらず、ＶＰ６は全てのＡ群ＲＶ内で高度に保存されたタンパク質であり（アミノ酸相同性＞９０％）、共有されている共通抗原は、広く反応するポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体により検出することができる。したがって、ＶＰ６は、Ａ群ＲＶを検出するために設計された大部分の免疫診断試験において標的抗原である。このタンパク質に対する抗体は、インビトロで中和活性を有さない。しかしながら、ＩｇＡモノクローナル抗体は、マウスにおいて細胞内でウイルスの複製をうまく妨害する。
【０００５】
現在、動物におけるＲＶ起因性の下痢の予防は受動免疫に基づいているのに対して、能動免疫はヒトにおいて使用される。動物において、初乳及び乳を介する母体抗体の移行により新生児を防御するために、非経口の不活化ウイルスワクチンが妊娠中のメスに適用される。この戦略は、重症の下痢症状を予防するのに及び感染した家畜の罹患率及び死亡率を低下させるのに非常に有効であるが、感染動物により排出されるウイルスの量を大幅に減少させることはないのでＲＶ感染を予防することはできない（Ｐａｒｒｅｎｏ，Ｖ．Ｃ．ら、Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １００：７〜２４頁、２００４年）。腸管腔に高力価の受動抗ＲＶ抗体が持続して存在する（自然に産生される又は人工的に乳に添加される）だけで、下痢を完全に防御し、ウイルス排出を大幅に減少させる（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：５０７〜１６頁、１９９８年；Ｓａｉｆ，Ｌ．Ｊら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ４１：１１１８〜３１頁、１９８３年、及びＳａｉｆ，Ｌ．Ｊ．ら、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ２１６Ｂ：１８１５〜２３頁、９８７年）。
【０００６】
小児において、遺伝子再結合により弱毒化された２つの生ウイルスワクチンが承認されている。両製品は重症のＲＶ起因性の下痢に対して良好な有効性が証明されている。しかしながら、以前にヒトに使用されたワクチンに関連する腸重積症（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｔ．Ｖ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８７：１３０９〜１３頁、２００３年）の歴史及び最近の自然感染した小児におけるＲＶウイルス血症の発見（Ｒａｙ，Ｐ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９４：５８８〜９３頁、２００６年、及びＢｌｕｔｔ，Ｓ．Ｅ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  ３６２：１４４５〜９頁、２００３年）を考慮すれば、前記ワクチンの無害性は、特に未熟な免疫不全及び栄養不良の小児において疑問視されてきた。したがって、ＲＶ起因性の下痢の予防及び治療のために、代替の補完的な戦略が必要とされている。
【０００７】
母乳養育、ウシ初乳又は卵から精製した抗ＲＶ抗体（ヒト及びウシ抗ＲＶ  ＩｇＧ及び鶏卵黄ＩｇＹ）の投与などの受動免疫戦略が、ヒト及び動物の両方において下痢性疾患を減少させることが示された。しかし、費用効率がよく再現性のある抗体の大量生産の見込みは低い。したがって、動物及びヒトにおける受動抗ＲＶ免疫化のために設計された抗体、特に、工業規模で生産することができ、免疫反応を引き起こさず、保存された内部タンパク質エピトープに効率良く到達するように十分に小さく、且つ異なる遺伝子型（多反応性）からの株の複製を認識及び阻害することができる抗体を作出することが必要である。
【０００８】
ラクダ抗体重鎖のＶＨＨドメインは、１５ｋＤａの分子量を有しており、完全な抗原結合能を有する最小の既知の天然ドメインであり、自然抗原認識能を有する一本鎖断片のコードＤＮＡライブラリーを作製するのに理想的である。さらに、ラマを免疫化する戦略を、対象とする抗原に対する戦略においてＶＨＨライブラリーを充実させるために使用することができる。その特殊な性質のため、ラマ抗体重鎖由来のＶＨＨドメインは、ＲＶ起因性の下痢を予防又は治療するために設計された診断用試薬及び製品の開発のための、非常に用途の広いツールである。例えば、酵母において産生されるＧ３Ｇ型ＲＶ株に対するＶＨＨは、インビトロで中和活性を示し、この精製ＶＨＨは泌乳マウスにおいてＲＶ起因性の下痢の発生及び期間を減少させることができたことが最近報告された（Ｐａｎｔ，Ｎ．ら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １９４：１５８０〜８頁、２００６年及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖａａｒｔ  Ｊ．Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ、５月８日、２４（１９）：４１３０〜７頁、２００６年）。しかしながら、これらの著者らは、得られたＶＨＨがどのウイルスタンパク質に対するものなのかを特定することができず、外部タンパク質のコンフォメーショナルエピトープに対するものではないかと推測している。
【０００９】
特許文献ＷＯ２００６／０５６３０６は、腸管病原性微生物、例えば、ＲＶなどにより引き起こされる感染の療法として、ＶＨＨドメイン又はその断片の製造及び使用を開示する。この文献は、特異的部位放出系における前記ＶＨＨの製造又はその使用を示す。例えば、この文献は、アルギン酸塩中へのカプセル化による胃腸管系における特異的ＶＨＨの放出を開示する。さらに、この文献は、放出方法として、特異的ＶＨＨ抗体を放出するトランスジェニックプロバイオティック微生物の使用であって、前記微生物がヒトの腸にコロニーを形成することができる使用を提案する。この文献は、カプセル化される又はプロバイオティック微生物により発現されるＶＨＨ抗体を使用する、薬物又は食物を調製するための異なる戦略を提案する。製造されるＶＨＨはＶＰ６に結合せず、中和性ではないはずであり、また単独で使用されないが、放出制御系内で使用される。
【００１０】
Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓｅｒｇｅによる特許文献ＵＳ  ２００５００５４００１は、ある特定の修飾又は突然変異アミノ酸配列を含む重鎖抗体、重鎖抗体の機能的ドメイン、機能的ＶＨドメイン又はその断片を開示する。この文献は、ＲＶ  ＶＰ６に結合するＶＨＨドメインに対応する配列を開示しない。
【００１１】
特許文献ＷＯ００／６５０５７は、単一の可変ドメインを含む一価タンパク質を開示し、これはウイルス抗原、特に乳酸球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）のバクテリオファージＰ２に結合する。この文献は、前記バクテリオファージを阻害するＶＨＨ配列を開示するのみである。
【００１２】
Ｈａｍｅｒｓらによる特許文献ＵＳ２００７／０００９５１２、及び同じ発明者らによる以前の文献は、獣医学的治療、例えば、受動免疫療法又は血清療法などのための免疫グロブリンの重鎖断片及びその使用を開示する。記載のＶＨＨは破傷風毒素を認識するのみである。ＶＨＨを得るために使用された方法は、免疫化ラクダｍＲＮＡからのものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の一目的は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示すアミノ酸配列の１つであってもよく、Ａ群ＲＶのタンパク質ＶＰ６に結合する、ラクダ抗体由来の単量体ドメイン（ＶＨＨ）を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、Ａ群ＲＶのタンパク質ＶＰ６に結合する二量体ドメインであって、前記融合タンパク質が配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に示す少なくとも１つの単量体配列を含むドメインを提供することである。好ましい実施形態において、融合タンパク質は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１及び配列番号１２に示すアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明の別の目的は、ＲＶ含有試料を、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９又はこれらの組合せに示すアミノ酸配列の１つと接触させるステップ、及び発色させるステップを含む、ロタウイルス免疫検出方法を提供することである。
【００１６】
前記免疫検出方法は、当技術分野において既知の技術、例えば、免疫捕捉による試験、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、競合ＥＬＩＳＡ、磁気ビーズ又はペンサイドなどのいずれかにより実施することができる。
【００１７】
本発明の別の目的は、哺乳動物に受動免疫を与える組成物であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９に示す配列のいずれか、賦形剤及び免疫調節剤を含む組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、ＲＶにより引き起こされる感染に対する予防方法であって、それを必要とする哺乳動物に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又はこれらの組合せに示す有効量の配列を投与するステップを含み、前記配列が、単独で又はカプセル化して胃腸管における分解から自身を保護する物質と組み合わせられる方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、ＲＶにより引き起こされる感染の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びこれらの組合せに示す有効量のアミノ酸配列を単独で又はカプセル化して胃腸管内における分解から抗体を保護する物質と組み合わせて投与するステップを含む方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ラマ免疫化を示す図である。免疫化経過中の免疫化のスケジュール、試料採取、最後の採血及び血清中のロタウイルス抗体反応の評価：（ｉ）組換えＶＰ６を使用したＥＬＩＳＡ（ｉｉ）ロタウイルス（ＩＮＤ；Ｓｂ  Ｉ  Ｐ［５］Ｇ６）を使用したＥＬＩＳＡ（ｉｉｉ）ウイルス中和、及び（ｉｖ）同じロタウイルス（ＩＮＤ；Ｓｂ  Ｉ  Ｐ［５］Ｇ６）を使用したＥＬＩＳＰＯＴにより測定した抗体力価。ワクチン接種時点を矢印で表す。
【図２】ウェスタンブロット分析による天然及び組換えＶＰ６タンパク質の検出を示す図である。還元条件下で；又は非還元条件下で泳動し、レーン１及び８−ウシポリクローナル血清抗Ａ群ＲＶ；２及び９−抗ＶＰ６Ｍａｂ（ＲＧ２５Ａ１０）；３及び１０−ＶＨＨ  ２ＫＡ４抗ＶＰ６；４及び１１−ＶＨＨ  ２ＫＤ１抗ＶＰ６；５及び１２−ＶＨＨ  ３Ｂ２抗ＶＰ６；６及び１３  ＶＨＨ  ３Ａ６抗ＶＰ６；７及び１４−非関連ＶＨＨで検出したＢＲＶ  ＩＮＤ（Ａ）又は組換えＶＰ６（Ｂ）。
【図３】ＶＨＨ−ＥＬＩＳＡ：異なる動物種とは異なる亜群反応性及びＧ／Ｐ型特異性を有するロタウイルス株の検出を示す図である。  Ａ）抗体に捕捉された単量体ＶＨＨ２ＫＡ４、２ＫＤ１、３Ａ６（２μｇ／ウェル）。  Ｂ）二価ＶＨＨ二価２ＫＡ４、二価２ＫＤ１、二価３Ａ６（１μｇ／ウェル）による直接被覆。ウシロタウイルスＩＮＤ（ＳｂＩ；Ｐ［５］Ｇ６）、Ｃ４８６（ＳｂＩ；Ｐ［１］Ｇ６）及びＢ２２３（ＳｂＩ；Ｐ［１１］Ｇ１０）の組織培養上清；ヒトロタウイルスＷａ（ＳｂＩＩ；Ｐ［８］Ｇ１）及びウマロタウイルスＨ２（Ｓｂ非Ｉ非ＩＩ；Ｐ［１２］Ｇ３）；陽性糞便：ウシロタウイルスＩＮＤに実験的に感染させた仔ウシのウイルス排出のピークに対応する糞便試料；ＭＡ−１０４：擬似感染細胞の上清。ＰＢＳ：（反応のブランク）、陰性糞便：ロタウイルス陰性の仔ウシ糞便試料。エラーバーは２回の独立した測定の標準偏差を示した。
【図４】インビトロのロタウイルス蛍光焦点抑制アッセイを示す図である。各一価ＶＨＨ２ＫＡ４、２ＫＤ１、３Ａ６及び３Ｂ２の４倍希釈物を、同量のロタウイルス含有１００ＦＦＵと混合した。８０％を超える感染率抑制をもたらすＶＨＨ濃度が、防御するとみなされる。  Ａ．ウシロタウイルスＣ４８６（ワクチン接種及びマウス抗原投与で使用されたＡｇに相同）；  Ｂ．ウシロタウイルスＩＮＤ（結合剤選択で使用されたＡｇに相同）；  Ｃ．ウシロタウイルスＢ２２３；  Ｄ．ヒトロタウイルスＷａ；  Ｅ．ウマロタウイルスＨ２。グラフは、２回の独立したアッセイの要約結果を表す。
【図５】ロタウイルスを投与された新生仔マウスにおいて一価ＶＨＨ２ＫＡ４、２ＫＤ１、３Ａ６及び３Ｂ２により達成される下痢に対する防御率を示す図である。仔マウスに、各ＶＨＨ１００μｇ（１００μｌ）を０日目から５日目まで、１日１回、胃内経路によって与えた。１日目に、仔マウスに通常の給餌の２時間後にＲＶを胃内投与した。投与後９６時間まで毎日下痢を追跡した。  Ａ．投与：ウシロタウイルスＣ４８６の３０  ＤＤ５０（６×１０５ＦＦＵ）。実験は１群当たり５匹のマウスの３回の独立したアッセイで実施した。  Ｂ．投与：マウスロタウイルスＥＣｗの３１６  ＤＤ５０。実験は１群当たり５匹のマウスの２回の独立したアッセイで実施した。  Ｃ．１０ｗ／ｖ％小腸ホモジネートにおけるＥＬＩＳＡにより定量化したウイルス排出。記号＃は、非処理／投与群とは顕著に異なる罹患動物の割合を意味する、フィッシャーの正確確立検定、ｐ＜０．０５。バーは、４０５ｎｍのＥＬＩＳＡ吸光度の１群毎の平均を表す。エラーバーは±標準偏差を示す。ＥＬＩＳＡカットオフ値：０．２００。
【図６】Ａは、Ｔ．ｎｉ幼虫のＶＨＨの発現を示す図である。発現レベルは、クマシー染色において予想分子量の２つのバンドを検出するのに十分なほど高い。Ｂは、幼虫系において発現されるＶＨＨの定量化を示す図である。
【図７】幼虫のＶＨＨを使用したＥＬＩＳＡ技術を示す図である。ＶＰ６を発現する幼虫［Ａｇ（＋）］又は非挿入組換えバキュロウイルス［Ａｇ（−）］を有する感染幼虫からの全可溶性タンパク質（ＴＳＰ、ｔｏｔａｌ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）抽出物を使用して、ＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｐｏｌｙｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸／重炭酸緩衝液中に４０μｇ／ウェルから段階希釈して被覆し、４℃で一晩インキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本出願の目的のために、用語「ドメイン」は、残りのタンパク質鎖とは独立して生成、機能及び存在できる、タンパク質（抗体）配列及び構造の一部である。各ドメインはコンパクトな３次元構造を形成し、独立して安定及び折り畳みが可能であることが多い。多くのタンパク質はいくつかの構造ドメインからなる。１つのドメインは、進化的に関連した様々なタンパク質中に出現し得る。ドメインは、長さ約２５アミノ酸から５００アミノ酸まで長さが異なる。ドメインは、エピトープに結合することができる。本出願のドメインは、Ａ群ＲＶのタンパク質ＶＰ６に結合する。
【００２２】
本出願の目的のために、用語「ＶＨＨ」、「ＶＨＨドメイン」、「単量体ＶＨＨ」及び「ＶＨＨ単量体」は同じ意味を有し、交換可能であるとみなされる。
【００２３】
本出願の目的のために、用語「タンパク質ＶＰ６」、「抗原ＶＰ６」及び「ＶＰ６」は同じ意味を有し、交換可能であるとみなされる。
【００２４】
本出願の目的のために、用語「二量体ドメイン」、「ＶＨＨ二量体」及び「二量体ＶＨＨ」は同じ意味を有し、交換可能であるとみなされる。
【００２５】
用語「ホモ二量体」は、連結配列の有無にかかわらず、２つの同一の単量体ドメインにより形成されるタンパク質又はポリペプチドと定義される。
【００２６】
用語「ヘテロ二量体」は、連結配列の有無にかかわらず、２つの異なる単量体ドメインにより形成されるタンパク質又はポリペプチドと定義される。
【００２７】
発現「適切生育条件」とは、（本発明において定義されるベクターにより形質転換、トランスフェクト又は感染された）トランスジェニック細胞の増殖を改良するために確立された適当な環境のことをいう。例えば、感染幼虫は２８℃でグロースチャンバー中に保ち、所定の時間に収集する。
【００２８】
本発明の目的のために、「ワクチン」は、特定の疾患に対する免疫を取り込むために使用される調剤である。哺乳動物に受動免疫を与えるように設計された組成物であって、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列、賦形剤及び免疫調節剤を含むことを特徴とする組成物。
【００２９】
ＲＶにより引き起こされる感染を予防するために哺乳動物に投与される発現「有効量のアミノ酸配列（ポリペプチド）」とは、エピトープに結合し、最終的に宿主生物を感染させる病原体（ウイルス）の作用を妨害するために必要とされる、事前に推定されたアミノ酸配列（ポリペプチド）の量をいう。
【００３０】
ＲＶにより引き起こされる感染の治療のために哺乳動物に投与される発現「有効量のアミノ酸配列（ポリペプチド）」とは、エピトープに結合し、既に宿主生物に感染した病原体の作用を妨害するために必要とされる、アミノ酸配列（ポリペプチド）の量をいう。
【００３１】
本発明の目的のために、用語「哺乳動物」とは一般に、哺乳綱の動物、例えば、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマなどをいう。
【００３２】
連結配列は、２つの単量体ドメインに連結するアミノ酸配列であると定義される。
【００３３】
Ａ群ＲＶ、ＶＰ６の中間カプシドタンパク質に対するＶＨＨ抗体の選択、入手及び特徴付けを説明する。本発明のＶＨＨは、Ａ群ＲＶ検出のための普遍的な免疫診断アッセイにおいて使用するために処理することができる、広く反応するタンパク質であることが示される。さらに、選択された抗ＶＰ６ＶＨＨの一部はインビトロで広い中和活性を有すること、及び前記ＶＨＨの一部はインビボでウイルス投与から防御することが示される。本発明者らの知識に基づいて、本発明者らは、本発明のＶＨＨが、タンパク質ＶＰ６に結合し中和活性を有する、記述される最初の分子であると考える。
【００３４】
本発明のＶＨＨドメインを得るために、図１に示す動物免疫化スケジュールを実施した。ラマの免疫応答を評価するために、抗ＲＶ及び抗ＶＰ６抗体力価をＥＬＩＳＡ、ウイルス中和（ＶＮ）アッセイにより分析し、末梢血中に循環する特異的抗体分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。予想通り、接種後０日目に（ＤＰＩ）、ラマは抗ＲＶ抗体陽性であり、それ以前の抗原との接触を示した。しかしながら、血液中に循環する抗体分泌細胞は存在しなかった。注射後７日目、ＥＬＩＳＡにより測定された抗ＩＮＤ−ＲＶ又は抗ＶＰ６抗体力価は高く、ＲＶ特異的抗体分泌細胞のピークが末梢血中に検出された（１６個の抗ＲＶ  ＩｇＧ産生細胞／５×１０５単核細胞）。体液性応答は注射後１４日目からプラトーに達し、全ウイルス及びタンパク質ＶＰ６の抗体力価はともに高いものだった。一方、中和抗体力価は、試験した全ての異なるＲＶ（ＩＮＤ、Ｂ２２３、Ｗａ及びＨ２）に関して同様且つ非常に低いままであった。血清において非常に高い抗体力価が得られたが、血液中に検出された抗ＲＶ抗体分泌細胞の量はブースターごとに減少した（図１）。このため、また抗体親和性成熟を有利にするための十分な時間を提供するため、かなり後の注射後２４６日目（４回目投与の約７カ月後）になるまでラマに最終ＶＰ６用量を投与しなかった。最終的に、ラマは最後のブースターの４日後に採血され、２６．８個の抗ＲＶ  ＩｇＧ分泌細胞／５×１０５単核細胞の値に達した。６×１０８個の単核細胞を９００ｍｌの血液（ＥＬＩＳＰＯＴ結果によれば、少なくとも３２１６０個のＲＶ特異的ＩｇＧ抗体分泌細胞を含有していた）から抽出した。処理したＲＮＡ（２１０μｇ）から、６×１０７個のクローンを含有するＶＨＨファージライブラリーを作製した。使用したワクチン接種スキームは、本発明のＶＨＨを得るために、対象とする抗原に対する高い抗体力価よりも特異的抗体分泌細胞の高値を達成することがより重要であることを示した。使用したワクチン接種スキームにおいて、十分量の特異的抗体分泌細胞を得ることが可能であった。免疫化中に得られた結果から、本発明者らは、ＶＨＨライブラリーを構築するために免疫化したラマの免疫応答を追跡する最良の方法は、対象とする抗原に対する血清抗体力価の代わりに末梢血中を循環する特異的抗体分泌細胞の量を評価する技術を選択することであるという点に注目する。得られた抗体分泌細胞のパターンによって、最後の２回の投与間の間隔が長いワクチン接種スキームは末梢血中のより多量の特異的抗体分泌細胞の循環を促進することが示された。また、接種４日後に、接種７日後よりも多数の、対象とする抗原に対する循環抗体分泌細胞が存在することも示された。免疫化スキームは、ブースター用量が前回投与から少なくとも５カ月後にラマに適用され、末梢血中で約２０個の抗標的抗原ＩｇＧ抗体分泌細胞の量に達したときにファージコロニーが生じるような方法で実施されるべきである。好ましくは、抗ＶＰ６ＶＨＨに関して、末梢血中のＩｇＧ抗体分泌細胞の量は約３０個の抗完全ｒｔ  ＩｇＧ抗体分泌細胞でなければならない。当業者であれば、本発明の方法及び組成物に適したＶＨＨを得るために別の免疫化スキームを使用できることを理��する。
【００３５】
抗ＲＶ  ＶＨＨを発現したファージを選択するために、ＲＶ  ＩＮＤを抗原として使用して３回の選択段階をインビトロで実施した。１９２個のクローンを選択した。ＶＨＨライブラリーにおいて広いＶＰ６結合多様性（これはファージＥＬＩＳＡにより測定した）を示した全てのクローンについて、制限分析を実施した。クローンはまた、ＲＶ及びＶＰ６に結合する能力を測定するためにＥＬＩＳＡによってもアッセイした。異なる配列を有する１４個のクローンから、ＲＶ及びＶＰ６に対するより強力な特異的結合を示した１０個のクローンを選択し、それらは、その精製を容易にするカルボキシ末端ヘキサヒスチジンタグを提供する発現ベクターにサブクローニングされる。
表１
ＶＨＨドメインを選択するための定性的評価の結果の要約
【表１】
0005384495.tif 000002
１抗ヒスチジン抗体を使用したプレートに結合
【００３６】
異なる亜群に対応するＲＶ株により強力に結合する４個のクローンを選択し、これらのクローンを２ＫＡ４（配列番号１）、２ＫＤ１（配列番号２）、３Ａ６（配列番号３）及び３Ｂ２（配列番号４）と称するが、これらは組換えＶＰ６及びウェスタンブロットにより評価したそのＲＶ  ＩＮＤの天然同等物を認識し、前記ＶＨＨがこのタンパク質ＶＰ６のコンフォメーショナルエピトープに結合することを示した（図２）。以下、２ＫＡ４、２ＫＤ１、３Ａ６及び３Ｂ２と称するＶＨＨが本発明のＶＨＨドメインである。
【００３７】
各ＶＨＨドメインをコードするＤＮＡ配列は以下の通りであった。
配列番号５は配列番号１ドメインをコードする；
配列番号６は配列番号２ドメインをコードする；
配列番号７は配列番号３ドメインをコードする；
配列番号８は配列番号４ドメインをコードする；
【００３８】
当業者であれば、前記ドメインをコードする全てのＤＮＡ配列が本発明の範囲内に入ることを理解する。例えば、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号５のＤＮＡ配列又は遺伝子コードの変性のために配列番号５と異なる別のＤＮＡ配列によりコードされていてもよい。同じ例が、それぞれのＤＮＡ配列（配列番号６、７及び８）によりコードされる各アミノ酸配列（配列番号２、３及び４）に当てはまる。
【００３９】
本発明の抗ＶＰ６特異的ＶＨＨは、ＲＶの免疫診断用試薬として非常に有効であった。本発明のＶＨＨの単量体形態を、捕捉抗体として、二次抗体として、ＥＬＩＳＡにおいてアッセイし、又は抗ヒスチジン抗体を用いて固定化した。本発明のＶＨＨは、特異的亜群の異なる、異なるＧ及びＰ型のヒト又は動物由来のＲＶ株を検出することが可能であった（図３Ａ）。
【００４０】
一方、ヒトＩｇＡヒンジ配列に類似の連結配列に結合した同一のＶＨＨ遺伝子を構成する、ＶＰ６に特異的に結合する本発明の二量体ＶＨＨを産生するための発現ベクターを構築した。本発明の二量体ＶＨＨはまた、直接捕捉としてＥＬＩＳＡにおいても評価し、試験した全てのＲＶ株ではっきりとした再現可能なシグナルを示した（図３Ｂ）。本発明の二量体ＶＨＨはＥＬＩＳＡプレート感作に使用することができ、したがってＶＨＨ捕捉抗体を使用する必要性をなくし、単量体同等物よりも良好なＲＶ検出結果を示す。
【００４１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズマにおいて発現される単量体ＶＨＨの収率が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び酵母において別の著者によって報告された収率に匹敵するものであったことは注目に値する。
【００４２】
本発明の単量体及び二量体ＶＨＨは、ＲＶの診断に非常に有用であり、したがって当業者に既知の任意の免疫診断において組換えモノクローナル抗体として使用することができることが証明された。当業者には、本発明の単量体及び二量体ＶＨＨドメインがＲＶを検出するための任意の種類の免疫診断アッセイに使用でき、前記アッセイが本発明の範囲内に入ることが明らかである。
【００４３】
本発明の抗ＶＰ６ドメインを使用して本明細書に記載のものなどの二量体、例えば、ホモ二量体などを構築してもよく、又は例えば、ドメイン３Ｂ２及びドメイン３Ａ６を融合することにより若しくは任意の２つの本発明のＶＨＨ単量体を融合することにより、融合してヘテロ二量体を形成してもよい。さらに、３つ以上の本発明のＶＨＨ単量体をまた、融合又は結合してホモ三体又はヘテロ三量体を作製してもよい。本発明のＶＨＨ単量体の組合せから生じる多量体形態は全て、連結配列を含有するか否かにかかわらず、本発明の範囲内に入る。好ましい実施形態において、本発明のＶＨＨ二量体は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１又は配列番号１２に開示される配列を有する。例えば、二量体は、配列番号１３に示すもの、又はヒンジ配列として機能する任意の別の配列などのアミノ酸連結配列を含んでもよい。
【００４４】
以下の表は、本発明の二量体及び単量体ＶＨＨのいくつかの特徴を示す。
表２
特徴
【表２】
0005384495.tif 000003
１ＲＶ  ＩＮＤ及び組換えＶＰ６に対するＷＢにより測定した。
２各０．５ｌの６組の培養物に基づき、抗ヒスチジンタグカラムによって精製した。
３ＲＶ株ＳｂＩ、ＳｂＩＩ、Ｓｂ非Ｉ；非ＩＩの検出。
【００４５】
本発明の抗ＶＰ６ＶＨＨドメインは、異なるＲＶ株をインビトロで中和することが可能であった。本発明の４つの単量体のうちの３つ（２ＫＤ１、３Ａ６及び３Ｂ２）が、インビトロで広い中和活性を示した。各ＶＨＨの中和能力は評価したＲＶ株全てについて均一であった。３．９μｇ／ｍｌの単量体濃度で、１００ＦＦＵのＲＶ株Ｃ４８６（Ｐ［１］Ｇ６）、ＩＮＤ（Ｐ［５］Ｇ６）、Ｂ２２３（Ｐ［１１］Ｇ１０）、Ｗａ  Ｐ［８］Ｇ１及びＨ２（Ｐ［１２］Ｇ３）により生じる感染性をインビトロで完全に中和することが可能であった。表３は、各単量体につき２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する溶液の異なるＲＶ株に対する中和力価を列挙する。
表３
種々の単量体及び二量体ＶＨＨドメインの中和力価
【表３】
0005384495.tif 000004
１各ＲＶ株の１００ＦＦＵ当たりの、発生するフォーカス形成単位の８０％超を減少させる最大ＶＨＨ希釈度の逆数として表した、種々のＲＶ株の中和抗体力価。
【００４６】
したがってＶＨＨ単量体は、通常、交差中和を誘導しない種々のＧ／Ｐ型の組合せに属するＲＶ株を中和することが可能であった。最大の中和能力を有するＶＨＨ単量体は単量体２ＫＤ１であった。一方、単量体２ＫＡ４はＥＬＩＳＡにおいて全てのＲＶを適切に認識することが可能であったが、試験した株を１つも中和しなかった。高力価の抗原性の異なるＲＶ株を中和する本発明のＶＨＨの能力は非常に重要であり、それにより本発明のＶＨＨは多中和分子となるはずであり、この性質によって本発明のＶＨＨは、血清型（２７個のＰ型及び１６個のＧ型）にかかわらず、ＲＶ起因性の下痢の強力な予防又は治療ツールとなる。
【００４７】
二量体ＶＨＨは、単量体同等物よりも少ない中和活性を示した。
【００４８】
ＲＶ感染により引き起こされる下痢を治療及び予防する本発明のＶＨＨ単量体の能力を評価した。この目的のため、新生仔マウスにＶＨＨの１日の胃内用量を５日間（０日目から４日目）投与した。１日目に、また胃内経路によってマウスにウイルス株Ｃ４８６を投与した（図５）。本発明の単量体ＶＨＨ３Ｂ２で処理したマウスの６０％が、ＲＶ起因性の下痢から防御された。この防御は、処理マウス及び全てのマウスが下痢に罹患した未処理マウス又は非関連ＶＨＨ処理マウス間で比較した場合に顕著に強力であった（ｐ＝０．０１０８）（表４及び図５）。さらに、本発明のＶＨＨで処理された動物の下痢の重症度及び期間は、対照群と比較して顕著に減少した。
表４
泌乳マウスにおけるロタウイルス投与に対する防御
【表４】
0005384495.tif 000005
ｎａ：該当なし
【００４９】
アルファベットの異なる同列の平均値は顕著に異なる（クラスカルワリス、ｐ＜０．０５）。
【００５０】
アルファベットの異なる罹患動物の割合は顕著に異なる（フィッシャーの正確確率検定、ｐ＜０．０５）。
【００５１】
注目すべきは、世界中で小児の胃腸炎に最も多くみられる株であると考えられるヒト異種ＲＶ株（Ｗａ、ＳｂＩＩ、Ｐ［８］Ｇ１）に対して最大中和力価が得られたことである。
【００５２】
これらの抗体断片の製造及び精製は、高収率で実施することができ、製造コストの低下をもたらす。このことは、ＲＶによる感染の規模及び罹患率／死亡率が非常に大きい、且つ治療費及び予防費が重大な制限因子である発展途上国において、特に有意義である。
【００５３】
当業者であれば、本明細書に開示されるものに基づいて、本発明のＶＨＨドメインは、ファージライブラリーを作る必要なく、対応するヌクレオチド配列の合成及び任意の宿主細胞におけるその発現によって製造することができることを理解する。
【００５４】
本発明のＶＨＨ単量体、ＶＨＨ二量体又はＶＨＨ多量体の種々の組合せ及び混合物が、本発明の精神を変更することなく、免疫診断、ＲＶ感染の予防及びＲＶに感染した哺乳動物の治療のために使用でき、全ての可能な組合せ及び混合物が本発明の範囲内に入ることが当業者に明らかである。
【００５５】
前述されたものだが、種々の亜群に対応するＲＶ株により強力に結合する４つのクローンを選択した。これらのクローンを２ＫＡ４（配列番号１）、２ＫＤ１（配列番号２）、３Ａ６（配列番号３）及び３Ｂ２（配列番号４）と称するが、これらは組換えＶＰ６及びウェスタンブロットにより評価したそのＲＶ  ＩＮＤの天然同等物を認識し、前記ＶＨＨがこのタンパク質ＶＰ６のリニアエピトープに結合することを示した。
【００５６】
前記本発明のドメイン（配列番号１〜４）又はそれらをコードするヌクレオチド配列（配列番号５〜８）は、発現ベクターなどの適切な組換えベクターに挿入することができる。したがって、本発明は、前記配列を含む発現ベクターにさらに関する。ベクターの選定は、ベクターが導入される宿主細胞の種類の相関的要素である。例証として、ベクターは、一度宿主細胞に導入されると前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれる又は組み込まれないプラスミド又はベクターであってもよい。前記ベクターは、当技術分野の技術水準［Ｓａｍｂｒｏｋら、１９８９年］に含まれる任意の既知の方法を使用することによって得ることができる。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、植物又は動物細胞のゲノム中に挿入するために使用することができる。したがって、本発明のベクターは、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又は植物又は動物細胞において発現可能なウイルスベクターとすることができる。特定の実施形態において、本発明において使用されるウイルスベクターはバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）である（例５参照）。
【００５７】
ベクターは、形質転換、トランスフェクト、又は感染植物、藻類又は動物細胞、好ましくは昆虫又は幼虫細胞に使用することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のベクターによって形質転換、トランスフェクト又は感染された細胞に関する。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態において、トランスジェニック細胞は、動物細胞、好ましくは昆虫細胞、より好ましくは前記昆虫細胞の幼虫である。したがって本発明は、配列番号１〜４により特徴付けられるペプチドを高収率で発現するトランスジェニック昆虫又はトランスジェニック幼虫などのトランスジェニック非ヒト動物にさらに関する。
【００５９】
したがって、本発明のベクターは、配列番号１〜４及び／又は９〜１２により特徴付けられる本発明のドメインを製造及び／又は保存するために使用することができる。したがって、本発明はさらに、本発明のドメインを製造するための方法であって、前記ドメインの製造を可能にする条件下で、本発明のベクターによってトランスフェクト、形質転換又は感染された細胞又は生物を増殖させるステップを含む方法に関する。トランスジェニック細胞又は生物の培養を最適化するための条件は、使用する細胞又は生物の種類に依存する。必要であれば、本発明のドメインを製造するための方法は、当技術分野において既知の任意の方法の後に単離及び精製することをさらに含む。
【００６０】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の任意のドメインを含むことを特徴とする抗体に関する。
・ラクダ抗体由来の単量体ＶＨＨドメインであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４から形成される群から選択される配列を含み、Ａ群ロタウイルス（ＲＶ）のタンパク質ＶＰ６に結合することを特徴とするドメイン。
・Ａ群ＲＶのタンパク質ＶＰ６に結合する二量体ＶＨＨであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４に示す配列から構成される群から選択される少なくとも１つの単量体配列を含むことを特徴とするドメイン。
【００６１】
本発明の別の態様は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＲＶの免疫検出キットに関する。
【００６２】
本発明はさらに、ＲＶにより引き起こされる感染の予防方法において使用するための、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列に関する。言い換えれば、本発明は、ＲＶにより引き起こされる感染の予防のための組成物の製造のための、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列の使用に関する。
【００６３】
さらに、本発明は、ＲＶにより引き起こされる感染の治療方法において使用するための、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列にさらに関する。言い換えれば、本発明は、ＲＶにより引き起こされる感染を治療するための組成物の製造のための、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及びこれらの組合せから構成される群から選択されるアミノ酸配列の使用に関する。
【００６４】
最後に、本発明は、有効量の上記で定義された抗体をヒト又は動物の体内へ接種することを含む、受動免疫方法に関する。
【００６５】
ブダペスト条約による微生物の寄託
【００６６】
プラスミドｐＦＢＭｅｌＶＨＨ（例５参照）は、スペインタイプカルチャーコレクション（ＣＥＣＴ）；バレンシア大学、スペインに、受託番号ＣＥＣＴ７４３１として２００８年２月７日に寄託された。
【実施例】
【００６７】
本発明を、以下の実施例により最も良く示すが、これらは本発明の範囲に制限を課すとは解釈されるべきではない。一方、本発明及び／又は添付の特許請求の範囲の精神を逸脱することなく、この説明が当業者に示し得る別の実施形態、変更形態及びその等価物が使用されてもよいことが明確に理解されなければならない。
【００６８】
（例１）
本発明の単量体及び二量体ＶＨＨの入手及び精製
本発明のＶＨＨライブラリーの入手
参照ウシＩＮＤ  ＲＶ株をバイオパニングプロセスの抗原として使用して（ＳｂＩ；Ｐ［５］Ｇ６）ＶＨＨを選択した。種々の動物種由来及びヒト由来のＧ及びＰ型の種々の組合せとの種々の亜群反応性を表すＲＶパネルを得るために、表４に列挙したＲＶ参照株を、ＶＨＨを製造するために実施した種々のアッセイに含めた。ウイルスを、サル腎臓細胞（ＭＡ−１０４）中で増殖させた。接種前及びウイルス拡散ピーク時のＩＮＤ株に感染した初乳未摂取新生仔ウシの糞便試料も含めた。
表５
本発明のＶＨＨの製造及び特徴付けの間に実施した種々の手順で使用した参照ロタウイルス株
【表５】
0005384495.tif 000006
ラマの免疫化：ウシＲＶ株由来タンパク質ＶＰ６
【００６９】
Ｃ４８６（ＳｂＩＰ［１］Ｇ６）が組換えバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞において産生された。１年齢の雄ラマに、５回用量の、ＩＮＴＡ油性アジュバント（Ｍａｒｃｏｌ：Ａｒｃｅｌ：Ｓｐａｎ：Ｔｗｅｅｎ）と混合した５００μｇのＶＰ６を含有する細胞粗抽出物を０、２１、２８、３５及び２４６日目に投与した。各接種後０、４及び７日目に血清及び血液試料を採取した。体液性応答を、ＥＬＩＳＡ及びウイルス中和（ＶＮ）（さらに以下を参照）により評価した。エフェクターＢ細胞応答を評価するために、ブタ及び仔ウシにおいて実施された以前のＥＬＩＳＰＯＴアッセイに基づいて、接種されたラマの末梢血中のＲＶ特異的抗体分泌細胞数を測定するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを適合させた（本明細書に参照としてのみ組み込まれる、Ｐａｒｒｅｎｏ，Ｖ．Ｃ．ら、Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １００：７〜２４頁、２００４年、及びＰａｒｒｅｎｏ，Ｖ．Ｖ．ら、Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ｂ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｖｅｔ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ４８：７１３〜２０頁、２００１年）。手短に述べると、ＢＲＶ  ＩＮＤに感染（免疫蛍光により検出された感染が８０％を超える）したＭＡ−１０４細胞を固定し、７０％アセトンとともに９６ウェルプレート中で増殖させ、風乾し使用されることになるまで、−２０℃で保存した。接種されたラマの末梢血（ＰＢ）由来の単核細胞（ＭＮＣ）の懸濁液をウェルに加えた（１×１０６；５×１０５；２．５×１０５及び１．２５×１０５細胞／ウェル）。５００ｇで５分間遠心分離後、プレートを５％ＣＯ２中で１２〜１４時間、３７℃でインキュベートした。付着細胞を除去するためにプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、ＥＬＩＳＡで使用した同じコンジュゲートを１／１５００希釈で２時間、３７℃で加えることによってスポットを生じさせ、その後に５０μｌのＴＭＢペルオキシダーゼ基質システム（ＫＬＰ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）を続けた。
【００７０】
ラマ試料の取扱い、接種及び収集は、ＩＮＴＡの動物福祉倫理委員会に承認されているプロトコールに従って、訓練された要員が獣医の管理のもとで行った。
【００７１】
ＶＨＨライブラリーの製造及び本発明のＶＰ６結合ＶＨＨの選択：前回の注射から４日後に採取された血液の計９００ｍｌから、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離により６×１０８単核細胞を抽出した；これらを次いで遠心分離し、液体窒素中で凍結し、その後−８０℃に保った。ＲＮＡ抽出装置（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ）を使用して全ＲＮＡを抽出して、２５０μｇのＲＮＡを得た。その後、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＯｌｉｇｏｄＴ（１２〜１８）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて第１のｃＤＮＡ鎖を合成した。２０μｌの反応混合物において、０．２、１又は５μｇの全ＲＮＡを使用した。ＶＨＨ及びＶＨコードｃＤＮＡを、リーダー及びＣＨ２配列にアニールするプライマーＣＡＬＬ０１（配列番号１４）及びＣＡＬＬ０２（配列番号１５）を使用してＰＣＲによって特異的に増幅した。６００ｐｂ断片（エクソンＣＨ１のないエクソンＶＨＨ−ＣＨ２）を、９００ｐｂ断片（エクソンＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２）から分離した後に１．６％アガロースゲルから溶出した。次いでＶＨＨを、フレームワーク領域１（配列番号１６）及びフレームワーク領域４（配列番号１７）にアニールするプライマーを用いて、及びその後のクローニング段階のための制限部位を含むプライマー：ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩの制限部位を有するＶＨＨｆｏｒ２（配列番号１８）、及びＮｏｔＩの制限部位を有するＶＨＨｒｅｖ２（配列番号１９）を用いて、さらなるネステッドＰＣＲにより増幅した。最終的なＰＣＲ断片を、上流の制限部位ＮｃｏＩ又はＰｓｔＩ及び下流の制限部位ＮｏｔＩを使用して、ＶＨＨインサートを有さないベクターの可能な増殖を遅らせるような方法でＶＨＨ挿入後に除去される無関係の長い配列を含む、改良型ｐＨＥＮ４（Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  Ｍ、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  Ａ、Ｗｙｎｓ  Ｌ、Ｈａｍｅｒｓ  Ｒ、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．ラクダ重鎖抗体由来の単一ドメイン抗体断片の選択及び同定（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｃａｍｅｌ  ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９７年９月、１５；４１４（３）：５２１〜６頁）であるファージミドベクターｐＡＯ−Ｌｉｂ中でライゲートさせた。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＴＧ１）細胞を、ライゲートした材料で形質転換し、細胞を播種した。コロニーをプレートからかき取り、洗浄し、グリセロール（最終濃度５０％）を添加したＬＢ培地中に−８０℃で保った。
【００７２】
ファージディスプレイ技術を使用して、特異的ＶＨＨをライブラリーから選択した。ＶＨＨライブラリーをＭ１３ヘルパーファージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で感染させ、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．、Ｂｏｎｎｅｒｔ，Ｔ．Ｐ．、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ＪＭＢ、１９９１年により記載された通り、ＶＨＨレパートリーを発現するファージ粒子を回収しＰＥＧで沈殿させた。インビトロでの２〜３回の選択過程により、即ち、バイオパニングとして知られる技術により、特異的ＶＨＨの濃縮を実施した。免疫チューブを、ｐＨ９．６の炭酸塩緩衝液中の１／５０希釈の半精製ＢＲＶ  ＩＮＤ（ＳｂＩ；Ｐ［５］Ｇ６）で、又は１／５０００希釈のモルモット由来の抗ＲＶポリクローナル抗血清で一晩４℃で被覆し、その後ブロッキング段階を続け、１／５０希釈の同じＢＲＶ  ＩＮＤを捕捉した。回収したファージを直接又は事前に捕捉したものを用いてＢＲＶ  ＩＮＤでインキュベートし、洗浄し、結合ファージ粒子をｐＨ１０．０の１００ｍＭトリエチルアミンで溶出し、ｐＨ７．４のＴｒｉｓでただちに中和した。溶出したファージを使用して、指数関数的に増殖しているＴＧ１細胞を感染させた。２回目又は３回目のバイオパニング過程の後、個々のコロニーを増殖させ、対応するＶＨＨクローンをファージＥＬＩＳＡにより分析した。
【００７３】
本発明の単量体及び二量体ＶＨＨの発現及び精製：ＥＬＩＳＡで陽性であったクローンのＶＨＨ  ｃＤＮＡを、制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩを使用して、ペリプラズマ及びカルボキシ末端６×ヒスチジンタグのｐｅｌＢ標的配列を提供する発現ベクターｐＨＥＮ６（本明細書中に参照によってのみ組み込まれる、Ｃｏｎｒａｔｈ，Ｋ．Ｅ．Ｍ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：２８０７〜１２頁、２００１年）において再度クローニングした。ヒトＩｇＡヒンジに関連するリンカーをコードするプライマーＢｉｖｆｏｒ２（配列番号２０）及びＢｉｖｒｅｖ２（配列番号２１）を使用して、ＶＨＨ配列のＰＣＲ増幅によって、二価ＶＨＨを構築した。ＰＣＲ産物及びＶＨＨ鋳型を含むｐＨＥＮ６ベクターをＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化し、ライゲートさせて二価ＶＨＨを含むベクターｐＡＯ−ｂｉｖを製造した。一価又は二価ＶＨＨを製造するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１  Ｂｌｕｅ細胞を異なるプラスミド構築体で形質転換させた。ＶＨＨ発現は、１ｍＭイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより１６時間、２７℃で誘導された（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．、２００１年、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ））。細胞を遠心分離後、ペリプラズマタンパク質を浸透圧ショックによって抽出した。ＶＨＨを、Ｎ−Ｈｉｇｈ−Ｔｒａｐ  ＨＰキレートカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してペリプラズマ抽出物から精製した。
【００７４】
（例２）
本発明のＶＨＨの特徴付け
ウェスタンブロット：バキュロウイルス系において発現されたＶＰ６濃縮物及びＢＲＶ  ＩＮＤ濃縮物をＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中に再懸濁し、１０分間沸騰させた。これらを次いで、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥカラムに流し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｒｄｆｏｒｄ、ＭＡ）に移した。膜を１０％スキムミルク含有ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で４５分間ブロックし、各ＶＨＨ（４μｇ／ｍｌ）を２時間周囲温度でインキュベートした。次いで膜をＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）で洗浄し、抗５×ヒスチジン抗体（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）、ＢＳＡ（３％）中に１／５００希釈）とともに４℃で一晩インキュベートした。最後に、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（１／５０００希釈）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに４０分間、周囲温度でインキュベートした。アッセイはＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により発色させた。
【００７５】
本発明のＶＨＨのシーケンシング：ＶＨＨをシーケンスするために、以下の方法の後に「Ｍ１３フォワード」及び「Ｍ１３リバース」オリゴヌクレオチドを使用した：ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ  ３７７  ＤＮＡ自動シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるＢｉｇ  Ｄｉｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）。
【００７６】
（例３）
本発明のＶＨＨを使用したＲＶ免疫検出アッセイ
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）及びウェスタンブロット：ＥＬＩＳＡ実験をＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）で、ＲＶによる直接感作により、又はＲＶ若しくはノトバイオートブタにおいて産生されたポリクローナル抗体を有する組換えＶＰ６の捕捉によって実施した。陰性対照の抗原として、偽感染ＭＡ−１０４細胞及びバキュロウイルスにおいて発現された非関連タンパク質（ウシ下痢ウイルスのタンパク質Ｅ２）を使用した。ＰＢＳをブランクとして使用し、非免疫化モルモット血清を陰性捕捉物として使用した。
【００７７】
ラマ血清中の抗ＲＶ抗体の存在を、Ｐａｒｒｅｎｏ，Ｖ．Ｃら、Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １００：７〜２４頁、２００４年、に記載の通り分析し、及び抗ＶＰ６抗体の存在をＦｅｒｎａｎｄｅｚら（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．Ｍ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：５０７〜１６頁、１９９８年から適合させたプロトコールによって分析した。１／２０００希釈でペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラマＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｔｈｙｌ，ｌａｂ  ｉｎｃ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ラマＩｇＧを検出した。バイオパニングにより得られた個々のクローン由来のファージを、ファージＥＬＩＳＡによって分析した。手短に述べると、ベクターｐｈｅｎ４中に種々のＶＨＨ遺伝子を含む指数関数的に増殖しているＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１クローンを、表面タンパク質に融合したＶＨＨを発現するファージ粒子を産生するためにＭ１３ヘルパーファージで感染させ、ファージ子孫を含む培養上清を、ＢＲＶ  ＩＮＤ又はＶＰ６で感作したＥＬＩＳＡプレートにおいてアッセイした。結合したファージを、１／５０００希釈のＨＲＰコンジュゲート抗Ｍ１３ｐ８抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、４０分間、周囲温度で検出した。アッセイはＨ２Ｏ２／ＡＢＴＳ（Ｚｙｍｅｄ）を使用して発色させた。
【００７８】
最初に、カルボキシ末端６−Ｈｉｓタグにより精製した一価又は二価ＶＨＨを、ＥＬＩＳＡによりＲＶ又はＶＰ６を検出するための試薬として上述の通り試験し、抗５×ヒスチジンモノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ、１／５０００）及びＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体により発色させた。次に、１０μｇ／ｍｌのＶＨＨ直接ＥＬＩＳＡプレート感作並びに１０μｇ／ｍｌ、抗ヒスチジンモノクローナル抗体、及び続いて２０μｇ／ｍｌのＶＨＨによる捕捉の両方によって、これらをＲＶ捕捉試薬として分析した。アッセイは、ＢＲＶ  ＩＮＤ（１／２０００希釈）により過免疫化された初乳未接種仔ウシ由来ＲＶポリクローナル抗血清及び１／５０００希釈のペルオキシダーゼ標識抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ）を使用して発色させた。
【００７９】
二量体ＶＨＨを１０μｇ／ｍｌでＲＶ捕捉試薬としてＥＬＩＳＡにより試験した。
【００８０】
単量体ＶＨＨも、二次抗体としてアッセイし、ＥＬＩＳＡを抗５×ヒスチジンモノクローナル抗体及びＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（１：１０００希釈）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｂｉｏｔｅｃｈ）により発色させた。
【００８１】
ウイルス中和アッセイ：ラマ血清試料中のウイルスＩＮＤ、Ｃ４８６、Ｂ２２３、Ｗａ及びＨ２の中和抗体力価及び精製ＶＨＨを、Ｔｏ，Ｔ．Ｌら、（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７９  （Ｐｔ１１）：２６６１〜７２頁、１９９８年に記載の通り、蛍光焦点中和（ＦＦＮ）により測定した。手短に述べると、１００フォーカス形成単位（ＦＦＵ）／１００μｌの混合物を得るために、ラマ血清１００μｌの段階希釈、選択した精製ＶＨＨ単量体又は二量体を等量のウイルスと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。１００μｌの抗体−ウイルス混合物をＭＡ−１０４単層にプレーティングし（４回反復）、４８時間、３７℃でインキュベートした。プレートを７０％アセトンで固定し、アッセイを、ＲＶで過免疫された初乳未摂取仔ウシ由来のＦＩＴＣ標識抗ＲＶ抗体を使用して発色させた。ＶＮ力価は、蛍光フォーカスにおいて８０％を超える減少をもたらす試料中の最大希釈度の逆数として表した。
【００８２】
（例４）
哺乳動物の予防及び／又は治療のための本発明の単量体及び二量体ＶＨＨの使用
新生仔マウスにおけるＲＶ防御アッセイ
１００μｌ中１００μｇの各抗ＶＰ６ＶＨＨ単量体を、胃内プローブを使用して４日齢のＢａｌｂ／ｃマウスに１日１回、０日目から開始して５日間投与した。泌乳マウスに、２×１０６ＦＦＵ／ｍｌを含む１００μｌのＢＲＶ  Ｃ４８６（ＳｂＩ；Ｐ［１］Ｇ６）を１日目に通常のＶＨＨ投与の２時間後に、次いで２０μｌの５％重炭酸溶液を、これもまた胃内経路により投与した。接種は、未処理対照マウスの１００％において下痢を引き起こすことが可能であった。実験で使用された対照群は、（ｉ）ＲＶを接種され、抗体で処理されていないマウス（ｉｉ）細胞タンパク質に対する同量の非関連ＶＨＨで処理されたマウス（ｉｉｉ）同種ＲＶに対するＶＮ力価が２０４８のモルモットポリクローナル抗血清由来の親和性精製ＩｇＧ４５０μｇで処理されたマウス（ｉｖ）同量の血清陰性対照モルモット由来のＩｇＧで処理したマウス（ｖ）非感染及び未処理マウス、であった。ＲＶ起因性の下痢を、試験の５日間、マウス腹部の直接の触診によって臨床的に評価した。下痢の重症度を、ＶａｎＣｏｔｔ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：４９４９〜６１、２００６年に記載の通り、日常的に便の色及び軟度に基づいて数値を割り当てることによって分析した。フィッシャーの正確確率検定を使用して、下痢のマウスの割合を群間で比較した。クラスカルワリス・ノンパラメトリック検定を使用して、下痢の平均発症、期間及び重症度を処理群間で比較した。
【００８３】
（例５）
組換えバキュロウイルス作製
ＶＨＨ３Ｂ２完全配列を含むｐｈｅｎ６プラスミドから、組換えバキュロウイルスＢａｃＭｅｌＶＨＨを作製した。以下のプライマー：配列番号２３及び配列番号２４を使用して、このタンパク質をｐｈｅｎ６プラスミドからＰＣＲ増幅した。このアンプリコンを次いで、ミツバチメリチン由来の昆虫シグナル配列により、対応するプライマーに含まれるＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位を使用して、ｐＦａｓｔＭｅｌＢ２ベクターにインフレームでクローニングした。得られたｐＦＢＭｅｌＶＨＨプラスミドを、自動シーケンシングにより特徴付けし、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、組換えバキュロウイルスＢａｃＭｅｌＶＨＨを作製するために使用した。組換えバキュロウイルスを増殖させ、ｓｆ２１昆虫細胞において増幅し、１０７〜１０９ｐｆｕ／ｍｌで感染力価に達し、ストックを日常使用のために４℃に、長期保存のために−８０℃に保った。
【００８４】
昆虫増殖条件及び接種
発現実験のために、約２５０ｍｇ重の５齢の幼虫（蛹化前の終齢幼虫）に、既知の用量ｐｆｕ／幼虫を使用して、組換えバキュロウイルスを前脚近く（体腔前方）に注射した。感染した幼虫を、２８℃でグロースチャンバー中に保ち、所定の時間に収集した。次いで幼虫をただちに凍結し、処理されるまで−２０℃に保った。
【００８５】
昆虫細胞培養物もまた、既知の用量を使用して感染させた。感染した細胞を２８℃で７２時間保った。最後に、感染した培養物を回収し、細胞ペレットもただちに凍結し、処理されるまで−２０℃に保った。
【００８６】
タンパク質抽出物の調製
Ｔ．ｎｉ幼虫の全可溶性タンパク質（ＴＳＰ）を、１×ＰＢＳ中にトリトン０．０１％；ＤＴＴ  ２５ｍＭ及びタンパク質阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）含有する抽出緩衝液中で凍結幼虫を潰すことによって得た。
【００８７】
タンパク質抽出物の分析
ＴＳＰに含まれる特異的ＶＨＨタンパク質の定量及び検出のために、クマシーブルー染色及び免疫ブロッティング分析を実施した。したがって、レーン当たり２０μｇのＴＳＰを１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードした。電気泳動後、ゲルをクマシーブルー溶液で染色し、又はニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）に移してウェスタンブロットを実施した。
【００８８】
ウェスタンブロットアッセイのために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）上に移した。膜をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）４％スキムミルク（ブロッキング緩衝液ＢＦ）で一晩、４℃でブロックし、次いでウサギ抗ＶＨＨ血清（ＢＦ中に１：１００）を使用して室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。膜をＰＢＳＴで３回洗浄し、最後に抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ標識コンジュゲート（ＢＦ中に１：２０００、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）を二次抗体として１時間加えた。ＰＢＳＴによる長い洗浄の後、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬフィルム上でのＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）を使用してタンパク質バンドを検出した（図６Ａ参照）。
【００８９】
機能分析
幼虫を発現する［Ａｇ（＋）］ＶＰ６（ウシロタウイルスタンパク質）から、又は非挿入組換えバキュロウイルス［Ａｇ（−）］を有する感染幼虫からのＴＳＰ抽出物を使用して、ＥＬＩＳＡマイクロプレート（Ｐｏｌｙｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸／重炭酸緩衝液中に４０μｇ／ウェルから段階希釈して被覆し、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。その後プレートを一定に撹拌しながら１時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳＴ−２％ＢＳＡ、１００μｌ／ウェル）とともに３０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、ブロッキング緩衝液中に２．５μｇ／ウェル希釈でＶＨＨ発現幼虫からのＴＳＰ抽出物を用いて、１時間。次いでプレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、再度３０分間ブロックした。次いで、ウサギで製造したＶＨＨに対するポリクローナル抗体（１：１００希釈）１００μｌ／ウェルを加え、１時間、３７℃でインキュベートした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。最後に、ブロッキング溶液中に１：２０００希釈した１００μｌ／ウェルの抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ標識コンジュゲートを加えた。基質反応では、プレートを４回洗浄し、１００μｌ／ウェルの１ｍＭ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ＡＢＴＳ（ＫＰＬ、ＵＳＡ）をプレートに加えた。ペルオキシダーゼ反応は、室温で５〜１０分間発色でき、反応をＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ、ＵＳＡ）の４０５ｎｍで読み取った（図７参照）。
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【図６−２】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【配列表】
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