(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＯＣｌ又はＮａＯＣｌを用いた処理による酸化により活性化されたアンチトロンビンＩＩＩ（ＩＤＡＡＴ）を含有する医薬品。
【請求項２】
組み換えＩＤＡＡＴを含有する、請求項１記載の医薬品。
【請求項３】
他の製薬学的に認容性の補助物質及び／又は担体物質を含有する、請求項１または２記載の医薬品。
【請求項４】
局所的、皮膚内、表面、腹腔内、静脈内、経口又は筋内の投与のために配合されているか、又はベシクルを介して投与される、請求項１から３までのいずれか１項記載の医薬品。
【請求項５】
抗生物質、免疫抑制剤又はＴＳＰ−１を含有する、請求項１から４までのいずれか１項記載の医薬品。
【請求項６】
ＨＯＣｌ又はＮａＯＣｌを用いた処理により酸化を行う、酸化により活性化されたアンチトロンビンＩＩＩ（ＩＤＡＡＴ）の製造方法。
【請求項７】
急性の感染、敗血症、急性、慢性及び／又はアレルギー性の炎症反応の予防又は治療のための、腫瘍増殖及び腫瘍転移の予防又は治療のための、不所望の血管新生の克服のための、白血病のための、創傷治癒の改善のための、神経系の損傷の治療のための、止血の改善のための、炎症に限定される組織傷害の阻害のための、免疫防御の一般的向上のための、又は炎症反応の抑制のための、請求項１から５までのいずれか１項記載の医薬品。
【請求項８】
急性の感染としてＨＩＶ感染を治療する、請求項７記載の医薬品。
【請求項９】
慢性のリンパ性白血病を治療する、請求項７記載の医薬品。
【請求項１０】
感染リスクの高い患者において使用する、請求項７記載の医薬品。
【請求項１１】
止血のために使用する、請求項７記載の医薬品。
【請求項１２】
再潅流、器官移植又はアレルギー性反応の場合に使用する、請求項７記載の医薬品。
【請求項１３】
寄生性疾患を治療する、請求項７記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明はそのコンホメーションにおいて変化したアンチトロンビンＩＩＩ（本願で活性化アンチトロンビンＩＩＩ（ＩＤＡＡＴ＝免疫防御活性化アンチトロンビン）と呼称される）の医薬品としての使用に関する。
【０００２】  アンチトロンビンＩＩＩは、事前の活性化を必要とせずに循環性のセリンプロテアーゼを阻害する重要な生理学的な血液凝固インヒビターである。
【０００３】  錯形成により該プロテアーゼはアルギニン３９３−セリン３９４結合を分解し、それによってアンチトロンビンのコンホメーションに変化が生じ、かつプロテアーゼ−インヒビター錯形成がもたらされる。ヘパリンはアンチトロンビンＩＩＩのアミノ末端領域での結合によってアンチトロンビン−プロテアーゼ錯形成を本質的に加速する。インビボでのグリコサミノグリカン、例えば硫酸ヘパリンは内皮表面でヘパリンの役割を担うと思われる。
【０００４】  アンチトロンビンＩＩＩは１００グループより多くを含むセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン）のファミリーに属し、かつ糖タンパク質である。セリン４２３アミノ酸を含むポリペプチド鎖は５８０００の分子量を有する。該タンパク質は３つの分子内ジスルフィド結合を有し、かつ４つのグリコシル化位置を有する。非生理学的な極めて高い用量を投与することにおいて、アンチトロンビンＩＩＩは動物実験において敗血症の致死率を低減する（Dickneite and Paques,1993）。敗血症を患うヒトでは、しかしながら慣用のアンチトロンビン−ＩＩＩ−調製物によって致死率又はらかん率の大きな改善を得ることができない。
【０００５】  セリンプロテアーゼ阻害作用、特にトロンビン阻害作用の他に、ヒト及びウシの内皮細胞においてアンチトロンビンＩＩＩによってプロスタサイクリン合成の増大が観察された（Yamauchi et al., 1989）。この増大は白血球の抑制をもたらし（Kainoh et al., 1990）かつヘパリンによって加速され（Uchiba et al., 1996）、これから前記のアンチトロンビンＩＩＩの作用はヘパリン様グリコサミングリカン−受容体への結合によって媒介されることが推測される。Ｓｔａｎｇｌ他（１９９９）は更にラットの肺組織からのエンドセリン−１もしくはビッグエンドセリン１の遊離がアンチトロンビンＩＩＩによって軽度に増大する（１．３〜１．７倍）ことを記載している。
【０００６】  アンチトロンビンＩＩＩは炎症を誘発するプロセスによってその形に変更が生じる。いわゆる“天然の”、“先天的な”又は“構成的な”免疫防御は“侵入物”、例えば細菌、ウイルス、寄生虫などに対する第一の防御戦略であり、かつ全動物界で知られている。前記の最初の防御の重要な部分は、食細胞、特に単球及びＰＭＮＬ（中性顆粒球）、また樹状細胞、好酸球、血小板及びマスト細胞が単独又は別の細胞との随伴として病原の侵入部位に移動し（走化性）、かつその際に上皮及び内皮を貫通する（漏出）ことにある。
【０００７】  炎症の部位で、“外来細胞／侵入物”はファゴサイトシスによって中和される。炎症細胞はその際に、プロテアーゼ、例えばエラスターゼ及びカテプシンＧ及びメタロプロテアーゼ及び、脂質、タンパク質及びペプチドの酸化を引き起こす物質を遊離する。
【０００８】  前記の物質には、Ｏ２、スーパーオキシド、過酸化水素、ペルオキシニトレート、ＯＨ-−ラジカル、次亜塩素酸ＨＯＣｌ、Ｃｌ２ガス、クロラミンが該当する。ハロゲン化（主に塩素化）はこの場合に、細胞を殺す重要な過程である。炎症の領域において、ｐＨ値は乳酸の遊離によってｐＨ４．０未満まで低減される。
【０００９】  防御細胞は特定の防御のためのタンパク質及びペプチド、例えば“殺細菌性／透過性増大”（ＢＰＩ）タンパク質を栓球及び顆粒球から遊離し、かつデフェンシンを顆粒細胞から遊離する。
【００１０】  創傷及びその他の止血の活性化が存在するのであれば、この場合にトロンビン、因子Ｘａ及び別のセリンプロテアーゼが存在する。更に、補体の活性化（選択的な経路、プロパージン経路）及びいわゆる“急性期タンパク質”、フィブリノゲン、Ｃ−反応性タンパク質、マンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）、いわゆる“前初期遺伝子”の産物、例えばトロンボスポンジン−１などの増大された合成をもたらし、かつ遊離をもたらす。活性化されたマスト細胞は、アンチトロンビンに結合できる可溶性のヘパリン−プロテオグリカンを遊離する（Linstedt et al., 1992）。アンチトロンビンＩＩＩは前記の過程によって間接的又は直接的に変更され、かつ完全な新規の機能が得られることが保証される。
【００１１】  本発明の範囲において、前記の過程によって直接又は間接的に変更されるアンチトロンビンＩＩＩが新しいと思われる機能を得ることが確認された。
【００１２】
本発明の範囲において、更にアンチトロンビンＩＩＩはインビトロでも前記の活性化された形に、特に酸化、尿素及びグアニジン塩酸での処理、タンパク質分解、６０℃への加熱、ｐＨ４．０への低下又は配列ＳＥＡＡＡＳを有するＡＴＩＩＩペプチドの添加によって変換できる。アンチトロンビンの潜在配列は前記タンパク質にトロンボスポンジン、ビトロネクチン、ＣＤ３６、ｏｘＬＤＬ、αIIbβ3−インテグリン、αｖβ５−インテグリンなどとの相互作用をあらわにし、かつ可能にする。
【００１３】  本発明の範囲において更に、活性化アンチトロンビンＩＩＩ（ＩＤＡＡＴ）が自己会合によって重合することが保証された。このポリマーは付着するタンパク質のための反復結合部位を有し、これを固定する。付着するタンパク質は、これらが可溶性タンパク質として血漿、血清又は別の体液中に有さない機能を得て、かつ膜タンパク質がそれによってシグナル伝達をもたらすことができる。ＩＤＡＡＴのための重要な相互作用パートナーはトロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）である。ＴＳＰ−１は複数のドメインからなる、多くの細胞から遊離し、かつ細胞外マトリクス中に組み込まれるモジュールの糖タンパク質である。特定の血小板は高濃度のＴＳＰ−１（Flicker und Kehrel, 1993）をそのα−顆粒中に有し、かつその活性化の間に遊離する。
【００１４】  この場合、局所的なＴＳＰ−１濃度は１０００倍より大だけ増大する（Flicker und Kehrel, 1993）。また内皮細胞、平滑筋細胞、グリア細胞及び白血球はＴＳＰ−１を分泌する。ＴＳＰ−１は付加的にＴＳＰ−２、ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４及び軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質（ＣＯＭＰ）に属するトロンボスポンジンファミリーのグループ（Lawler et al., 1993）である。ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２は幾らかの範囲で同一であるが、但し、幾つかのＴＳＰ−１機能はＴＳＰ−２によっても受け取ることができる。ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２は同一のドメイン構造を有し、かつホモマー及びヘテロマーとして発現しうる（Bornstein et al 1991）。ＴＳＰ−１は４２００００Ｄａの見掛けの質量を有する三量体の糖タンパク質である。その３つのサブユニットはラムリのＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（Lawler and Hynes 1986）で１８００００Ｄａのモル質量を有する。電子顕微鏡像は、ポリペプチド鎖のアミノ末端及びカルボキシ末端に球状の末端を有するボーラ（Bola）のように見える三次構造を示す（Galvin et al. 1985）。球状アミノ末端の付近に、３つの鎖がジスルフィド結合によって互いに結合している。各ＴＳＰ−１サブユニットは６９個のシステイン残基を有するので、各鎖は少なくとも１つの遊離ＳＨ基を有する。ＴＳＰ−１及びＴＳＰ−２はＮ−末端領域、プロコラーゲン相同領域、タイプ１のＴＳＰ“リピート”（反復領域）、タイプ２のＴＳＰ“リピート”、タイプ３のカルシウムに結合する“リピート”及びカルボキシ末端領域と類似した機能的ドメインを有する（Bornstein et al., 1992）。
【００１５】  ＴＳＰ−１鎖の柱状の結合領域は構造のカルシウム依存性を示す。Ｃａ２＋の存在において、前記構造は１６〜２９．１ｎｍの長さを有し、それに対してＥＤＴＡ処理後には３８．３ｎｍの長さを示す（Lawler 1986）。
【００１６】  ＴＳＰ−１のコンホメーションはＣａ２＋濃度に大きく依存し（Lawler et al. 1988）、かつ相互作用パートナーへの結合に大きく依存する。従ってフィブロネクチン又はヘパリンへのＴＳＰ−１の結合はそこにＣａ２＋の存在下に分子を取り込むコンホメーションをＣａ２＋の不在下に付与する（Dardik and Lahav 1999）。
【００１７】  表面に吸着されて固定されたＴＳＰは内皮細胞、平滑筋細胞及び単球の付着を媒介する。この付着はＴＳＰ−１のＣａ２＋−コンホメーション状態に依存する。ＥＤＴＡ処理はこの過程を可逆的に阻害する（Lawler et al. 1988）。ＴＳＰ−１のＣａ２＋形はインテグリンによって媒介されて細胞ＲＧＤへの結合を可能にする。またＣＤ３６への結合はＴＳＰ−１分子におけるコンホメーション変化に作用する（Leung et al 1992）。ＴＳＰ−１は２段階の機構によってＣＤ３６に結合する。まず第２工程において、ＴＳＰ−１は高親和性のＣＤ３６と、プロパージン類似の“タイプ１リピート”における“細胞結合部位”を介して結合する。
【００１８】  ＣＤ３６のペプチド配列１３９〜１５５を介してのＣＤ３６への結合は、配列９３〜１１０への高親和性結合を可能にするＴＳＰ−１におけるコンホメーション変化を可能にする。前記の領域において、結合能がリン酸化／脱リン酸化（Ｔｈｒ９２）によって調節されるＣＤ３６の配列が存在する（Asch et al., 1993）。構成的にリン酸化されたＣＤ３６はコラーゲンを結合し、細胞活性化によって脱リン酸化されたＣＤ３６はトロンボスポンジンを結合する能力を得る。ＴＳＰ−１のコンホメーションはその機能能力を制御する。
【００１９】  インテグリンによって細胞に結合する能力及び細胞付着を媒介する能力の他に、例えばフィブリン溶解現象を調節する能力、エラスターゼ及びカテプシンＧを阻害する能力、創傷治癒を改善する能力及び軸索突起の成長を促進する能力もＴＳＰのコンホメーションを介して制御される。
【００２０】  ＴＳＰ−１欠損マウスは１生活週から４生活週の間に、好中球及びマクロファージの大規模の移入を伴って広範囲な急性及び慢性の組織化された細菌性の肺炎症を展開する。び慢性歯槽出血（Einblutung）が観察された。後の感染時点に、ＴＳＰ−１を有する同じ近親交配系統のコントロールマウスと比較して、気道の上皮が厚くなり、かつ壁ができる（Lawler et al. 1998）。
【００２１】  この結果は感染の防御のためのＴＳＰ−１の意義を明確に説明している。ＴＳＰ−１ネガティブマウスはコントロール動物としての極めて少ない後継をもたらす。ＴＳＰ−１“ノックアウト”は脊柱に顕著な脊椎前弯位の曲率を示す。これは、骨格の発達／安定化のためのＴＳＰ−１の意義を示している。ＴＳＰ−１欠損動物は非常に重要なより多数の白血球、特に末梢血に単球及び好酸球を有する。
【００２２】  ＴＳＰ−１は多機能性タンパク質である。表面上に固定されて、プラスミンの形成を促し（Silverstein et al. 1986）、かつα２プラスミンインヒビターによる不活性化に対して固定によってプラスミンを同時に保護する。本願（ＩＤＡＡＴの使用）は細胞表面でのＴＳＰ−１の固定に作用する。ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）及び“単鎖”ｕＰＡ（ｓｃｕＰＡ）は固定されたＴＳＰ−１に結合し、かつこの場合にタンパク質分解によって活性に保持される。固定されたＴＳＰへの結合はプラスミノゲンアクチベーターインヒビタータイプ１（ＰＡＩ−１）による阻害に対してｕＰＡを保護する（Silverstein et al., 1990）。
【００２３】  ｓｃｕＰＡがその受容体（ｓｃｕＰＡＲ）に結合する場合に、細胞随伴ＴＳＰ−１及びビトロネクチン（Ｖｎ）への結合を可能にする結合部位がフリーになる（Higazi et al., 1996）。そうして、固定されたＴＳＰ−１はフィブリンが存在していない微小環境においてもタンパク質分解プロセスを可能にする。
【００２４】  プラスミンと一緒に、固定化されたＴＳＰ−１はマクロファージ表面で“潜在的な”形質転換成長因子β１（ＴＧＦ−β−１）を活性化する（Yehualaeshet et al., 1999）。
【００２５】  内皮表面上でもＴＳＰ−１はＴＧＦ−βを活性化する（Schultz-Cherry and Murphy-Ullrich, 1993, Schultz-Cherry et al., 1994）。ＴＧＦ−βは内皮細胞の増殖を阻害し、かつ血管新生に反して作用する。ＴＳＰ−１による脈環形成の阻害は多数記載されている（Iruela-Arispe et al., 1999, Jiminez et al., 2000）。ＴＳＰ及びＦＧＦ−β１の間の錯形成（基本的な繊維芽細胞増殖因子）は前記の機能に関連している（Murphy-Ullrich, 1993）。ＴＧＦ−βの欠損は感染防御の大きな障害をもたらし、死に至らしめる（Kulkarni et al., 1993, Shull et al., 1992）。ＴＧＦ−βを欠損する動物はＭＨＣクラスＩＩ抗原発現の影響によって付加的に強い自己免疫反応性（Letterio et al., 1996）を示す（Geiser et al., 1993）。
【００２６】  細胞表面に固定されたＴＳＰ−１はＴＧＦ−βを活性化できるので、ＴＳＰ−１はＴＧＦ−βを介して感染防御及び自己免疫反応性の前記のプロセスに関与することが理解できる（Crawford et al., 1998）。固定されたＴＳＰ−１はＴＧＦ−βと一緒に“ナチュラルキラー”細胞（ＮＫ細胞）の増殖を調節する（Pierson et al., 1996）。ＴＳＰ−１を欠損する動物は、より弱く現れる場合でも相応の免疫欠損を示す。本発明で最初に記載されるＴＳＰ−１に結合する活性化されたアンチトロンビンはＴＳＰを細胞表面に固定できるので、ＩＤＡＡＴはＴＧＦ−βの活性化に間接的に影響を及ぼすことが理解できる。
【００２７】しかしながらＴＳＰ−１は別の機構を介しても免疫学的な防御関連プロセスを調節する。このように多数の微生物、例えばコアグラーゼ陰性のスタフィロコッカス（Li et al., 2000）、エンテロコッカス及びポルフィロモナス  gingivlis fimbriae(Nakamura et al., 1999）は固定化されたＴＳＰ−１に付着する。
【００２８】  熱帯性マラリアの病原体におそわれた赤血球は固定化されたＴＳＰ−１に付着し（Roberts et al., 1985）、かつＴＳＰ−１受容体ＣＤ３６に付着する。
【００２９】  寄生虫自体はＴＳＰ−１相同領域を有する膜タンパク質を有する。赤血球細胞膜中に輸送されるタンパク質ＴＲＡＰ（トロンボスポンジンに関連する無名の（付着性）タンパク質）を介して寄生虫はおそわれた赤血球の血管壁への付着を媒介することがある（Wegelnik et al., 1999, Kappe et al., 1999）。
【００３０】  また別の疾患病原体、例えばCryptosporidium parvum又はEimeria tenellaはＴＳＰ又は細胞付着のために役立つＴＳＰ−受容体相同ドメインを有する（Sulaiman et al., 1999）。
【００３１】  ＨＩＶウイルスはその表面タンパク質ＧＰ１２０中に、ＨＩＶウイルスが宿主細胞のＴＳＰにもＣＤ４にも結合できるＣＤ３６（ＴＳＰ受容体）ドメインを利用する（Crombie et al., 1998）。従って精製されたＴＳＰ−１はＨＩＶ−１感染を阻害しうる（Crombie et al., 1998）。
【００３２】  複数の補体タンパク質Ｃ９、Ｃ８α及びＣ８βはトロンボスポンジンの“リピート”モジュールに対して高いホモロジーを有するモジュールを有する（Patthy, 1988）。他のＴＳＰ相同ドメインはアンチスタチン、プロパージン及びＦ−スポンジンも有する。Ｆ−スポンジンは、トロンボスポンジン自体のように神経系の損傷の改善のための効果的な物質である（ＵＳ５７５０５０２号）。
【００３３】  同時にアポトーシス性の好中性頼粒球（ＰＭＮＬ）及びマクロファージに結合することによって、ＴＳＰはアポトーシス性のＰＭＮＬのファゴサイトーシスを調節できる。前記のプロセスのために、ＴＳＰとその受容体との同時の相互作用はαｖβ３−インテグリン、ＣＤ３６及びＣＤ４７を調節する（Savill et al., 1992）。アポトーシス性のＰＭＮＬのファゴサイトーシスは炎症反応を調整し、かつ制御されない行き過ぎ量を妨げる。壊死性ＰＭＮＬのファゴサイトーシスに対して又は分解を進行させるＰＭＮＬにおいて、ＴＳＰ−１に媒介されるアポトーシス性のＰＭＮＬのファゴサイトーシスが前炎症性メディエータの遊離なく行われる（Stern et al., 1996）。
【００３４】  早期のＴＳＰに媒介されるファゴサイトーシスは行き過ぎの炎症反応を妨げる。付加的に、前炎症性サイトカインの生産を阻害するアポトーシス性ＰＭＮＬを吸収するマクロファージによって活性になる（Fadok et al., 1998）。本発明によって達成されるようにＴＳＰ−１による単球上でのＴＳＰ受容体ＣＤ４７の交差架橋は活性インターロイキン（ＩＬ−１２）の遊離の阻害を付加的にもたらす（Armant et al., 1999, Demeure et al., 2000）。インターロイキン−１２は敗血症の重要なメディエータである（Steinhauser et al., 1999）。
【００３５】  従ってアポトーシス性ＰＭＮＬ及び単球へのＴＳＰ−１の固定は存在する慢性の炎症を伴う医学的状態によい影響を及ぼす良好な方法である。前記の疾患には、行き過ぎの炎症反応は一部の疾患自体である全ての疾患、例えば種々の再潅流障害、器官移植における拒絶反応及びリウマチ様関節炎の疾患が該当する。
【００３６】  アポトーシス性の好中性の顆粒球のみがＴＳＰを媒介し、ファゴサイトーシスされるだけでなく、老化好酸球もファゴサイトーシスされる（Stern et al., 1996）。これは、細胞表面へのＴＳＰ固定は本願で達成されるように、好酸球に媒介される疾患、例えばアレルギー、喘息、寄生疾患、規定の腫瘍及び結合組織疾患において不所望の前炎症性応答を克服する方法である。このように、高い毒性の物質を好酸球から遊離し、かつ組織を損傷もしくは崩壊させることを妨げる。
【００３７】  ＴＳＰはケモカイン、例えばＲＡＮＴＥＳを結合し、かつケモカインをその受容体に結合することを阻害する（Barnes et al., 1998）。またその経路を介してＴＳＰは炎症反応及び免疫防御を調節する。
【００３８】  ＴＳＰが、コンホメーションを変化させるか、又は免疫能のある細胞の細胞表面上に固定を促すことでその機能に影響を及ぼす医薬品は、疾患（制限されないが）、リウマチ様関節炎、グッドパスチャー症候群、インスリン依存性糖尿病、天疱瘡、類天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、潰瘍性大腸炎、紅斑性狼瘡、移植片対宿主疾患、敗血症における不所望の免疫応答を制限する。
【００３９】  細胞表面でのＴＳＰの固定はその受容体ＣＤ４７の交差架橋をもたらす。慢性リンパ性白血病細胞（ＣＬＬ細胞）でのＣＤ４７の交差架橋は特異的に前記の腫瘍細胞の細胞死を引き起こす（Mateo et al., 1999）。
【００４０】  ＴＳＰの白血病細胞への結合に作用する物質は従ってＣＬＬ、依然として特異的な有効な医薬品が存在しない致死性疾患の克服のための効果的な医薬品であると思ゎれる。
【００４１】  トロンボスポンジンは血管新生をＴＧＦ−βへの作用を介するだけでなく、ＣＤ３６への固定及び結合並びにＣＤ３６の活性化を介しても阻害する。
【００４２】  マウスの腫瘍のＴＳＰ−１での処理は血管新生の阻害及び内皮細胞のアポトーシスをもたらす（Jiminez et al., 2000）。
【００４３】  腫瘍血管新生の阻害は、医学的に腫瘍の成長を制限する良好な方法である（Roberts et al., 1996）。腫瘍中の内皮細胞へのＴＳＰの結合を媒介する物質は抗血管新生特性及び従って癌克服特性を示す。
【００４４】  血管新生は、例えば糖尿病に限定して盲目（Kaplan et al., 1999, Shafiee et al., 2000）、老年斑点性変性又は乳児の早熟のための原因である。また前記の血管新生の克服のためにもＴＳＰの内皮細胞への結合を媒介する物質を医学的に使用できる。
【００４５】  負傷の後に、負傷した領域の周りの組織中のＴＳＰの濃度が大きく増大する。バルーンカテーテル挿入の後に、例えば負傷の１時間後に既に細胞表面上にＴＳＰが検出できる（Watkins et al., 1990, Munjal et al., 1990）。細胞表面上のＴＳＰはその翌日になおも増大し、かつ次いでマトリクス中でますます増大する。
【００４６】  創傷治癒に従ってＴＳＰは再び、負傷した組織の細胞膜から消失する。
【００４７】  ＴＳＰを創傷中に認める課題の１つは創傷治癒の改善（米国特許５，１５５，０３８号）である。ＴＳＰ−１を創傷中に固定する物質は創傷治癒を改善するはずである。
【００４８】  創傷中のＴＳＰは組織細胞から発現されるが、また血小板からもその活性化の間に遊離される。
【００４９】  全血小板タンパク質の約１％及び血小板α顆粒のタンパク質含量の約１／４はトロンボスポンジン−１である（Kehrel, et al., 1996）。遊離されたトロンボスポンジンはコラーゲンに誘発される血小板凝固を促す（Kehrel, et al., 1988）。Ｃ末端においてＴＳＰはＣＤ４７を介して血小板を活性化する配列ＲＦＹＶＶＭＷＫを有する（Chung et al., 1999 und 1997）。血液、血小板懸濁液又は血小板豊富な血漿に添加される可溶性ＴＳＰは凝集物を引き起こさない。
【００５０】  血小板は懸濁液中でＴＳＰをＣａ２＋形で結合できるが、血小板はマトリクスに固定されたトロンボスポンジンの“高”又は“低”Ｃａ２＋形に付着する。
【００５１】  従って本発明の課題は以前に話題にされた機能を果たし、期待される作用を満たしうる医薬品を調製することである。
【００５２】  前記課題は活性化アンチトロンビンＩＩＩ（ＩＤＡＡＴ）、ＩＤＡＡＴペプチド、ＩＤＡＡＴ類似体又はＩＤＡＡＴ擬態を含有する医薬品によって解決される。
【００５３】  本発明の範囲において、前記に既に挙げたように活性化ＩＤＡＡＴは本発明の範囲において新規に確認された特性及び機能によって活性化ＩＤＡＡＴが身体に、疾患の治療のために利用できる多くの反応を引き起こすか、又は媒介することが判明した。前記の機能及び特性を、治療される疾患又は疾患状態と同様に以下に更に説明する。また予防法は多くの場合にＩＤＡＡＴを用いて行うことができる。
【００５４】  本発明の範囲において、医薬品は、例えば実施例に記載される方法により製造できる完全なＩＤＡＡＴを含有してよい。理輪的には身体から防御反応の後に形成されるＩＤＡＡＴを単離できる。更に、タンパク質、例えばトロンボスポンジン、ビトロネクチン、ＣＤ３６、ｏｘＬＤＬ、αＩＩｂβ３−インテグリン、αｖβ３−インテグリンなどとの相互作用を媒介するＩＤＡＡＴペプチドを使用することが考えられる。そのような適当なペプチドは、予め用意された試験によって、例えば前記のタンパク質とのその相互作用を試験することによって容易に見出すことができる。
【００５５】  またＩＤＡＡＴの類似体は本発明の範囲において、これらが同様に前記のタンパク質との相互作用を媒介する場合に適当である。最後に、その構造及び官能基に基づいてＩＤＡＡＴと同じ作用及び相互作用を示しうるＩＤＡＡＴ擬態を使用することもできる。
【００５６】  本発明の範囲において組み換えＩＤＡＡＴを使用し、そのために組み換え的に製造されるアンチトロンビンＩＩＩを適当な様式で処理して、活性化アンチトロンビンを得ることが有利である（実施例及び明細書を参照のこと）。またＩＤＡＡＴのペプチド又は類似体は有利には組み換え形で合成し、かつ次いで活性化させる。
【００５７】  本発明による医薬品はもちろん、他の製薬学的に採用可能な補助物質及び／又は担体物質を含有してよく、その際、該医薬品を局所、腸内、表面、腹腔内、静脈内又は筋内又は経口投与のために配合するか、又はべシクルを介する投与を可能にする。本発明による医薬品は従って有利にはそれぞれ有利な適用種類を可能にするかかる補助物質及び担体物質を含有する。
【００５８】  本発明による医薬品はＩＤＡＡＴ又はその一部又は類似体又は擬態の他に更なる物質、例えば抗生物質、免疫抑制剤などを含有してよい。処理されるべき疾患に応じて、公知の医薬品の補助で処理することが有利なことがある。ＩＤＡＡＴ又はその類似体を有する前記の医薬品の相応の組合せは従って場合により本発明の有利な実施形である。
【００５９】  本発明の範囲で確認される身体内での、活性化アンチトロンビンＩＩＩによって作用される現象によって、本発明による医薬品は多くの指標のために使用できる。以下に、アンチトロンビン調製物及び特に従来のアンチトロンビン調製物を有さないＩＤＡＡＴの新規の機能についての例を挙げるべきである：
１）ＩＤＡＡＴは特異的かつ用量に依存して単球、単球性細胞系統及び単球性細胞、例えばマクロファージへのＴＳＰ−１の結合を媒介する。
【００６０】  精製されたＴＳＰ−１を添加せず、かつＩＤＡＡＴを添加しないで、わずか〜１％の溶出されたヒトの単球が、細胞表面上のＴＳＰ−１を認識する抗体（クローンＰ１０）によってフローサイトメーターによって検出できるが、その数は１０μｇ／ｍｌの精製されたＴＳＰ−１の添加によって約５％にまで増加する。ＩＤＡＡＴの添加（精製されたＴＳＰ−１を添加しない）は外因性ＴＳＰの単球へのＴＳＰ−１結合を媒介する。約１８％の単球はＴＳＰ−１陽性になった。
【００６１】  ＴＳＰ及びＩＤＡＡＴの同時の添加によって、ほとんど全部の（＞９０％）使用される末梢血単球がＴＳＰに対して強く陽性になった（図１参照）。
【００６２】  ２）ＩＤＡＡＴはアポトーシス性ＰＭＮＬへのＴＳＰ結合を媒介する。前記の現象はＩＤＡＡＴの添加によって用量に依存して、特異的に増大する（図２参照）。精製されたＴＳＰ＋ＩＤＡＡＴの同時の添加は該作用を更に増大する。
【００６３】  ３）ＩＤＡＡＴはＴＳＰを介してアポトーシス性ＰＭＮＬを単球と交差架橋する。ＴＳＰ及びＩＤＡＡＴの添加は用量に依存してアポトーシス性ＰＭＮＬと単球との会合をもたらす（図３参照）。
【００６４】  ４）ＩＤＡＡＴは用量に依存して単球の内皮経由の移行を促す。
【００６５】  移行試験をKielbassa et al., 1998に記載のように実施した。ＩＤＡＡＴを移行試験の間に単球の培養培地に添加することは、用量に依存して単球の内皮経由の移行を２〜３倍だけ促す（図４参照）。
【００６６】  精製されたＴＳＰの添加（２５μｇ／ｍｌ）は単球の移行も促す。ＴＳＰ＋ＩＤＡＡＴの添加は低濃度のＴＳＰ及びＩＤＡＡＴにおいて、個々の物質の添加だけよりも大きい移行の増大に導く。
【００６７】  ５）ＩＤＡＡＴは単球を活性化する。
【００６８】  ＩＤＡＡＴは用量に依存して単球におけるＣａ２＋フラックスを誘発する。Ｃａ２＋測定をSorrani et al., 1993に従って実施した。溶出された単球（５×１０８／ｍｌ）を室温でＨｅｐｅｓ−タイロードバッファー（ｐＨ７．４）を用いて洗浄し、引き続き１μＭのＦｕｒａ２／ＡＭを用いて３７℃で１５分間標識し、Ｈｅｐｅｓ−タイロードバッファー中でＣａ２＋不在で洗浄し、次いで１ｍＭのＣａ２＋を有するＨｅｐｅｓ−タイロード中に取った。
【００６９】  ＩＤＡＡＴ、ＴＳＰペプチドＲＦＹＶＶＭＷＫ及びポジティブコントロール又はネガティブコントロールとして作用する物質によって誘導されるＣａ２＋シグナルをＨｉｔａｃｈｉ  Ｆ−２０００中で蛍光測定的に測定した。
【００７０】  ＩＤＡＡＴ（１００μｇ／ｍｌ）は単球を活性化し、かつ明らかなＣａ２＋シグナルをもたらした（図５参照）。
【００７１】  ６）ＩＤＡＡＴはＴＳＰ−１のＴ細胞及び樹状細胞への結合を媒介する。
【００７２】  ＩＤＡＡＴはＴ細胞から分泌されるＴＳＰ及び外因的に添加されるＴＳＰのヒトのＴ細胞への結合を媒介する（ここでは例としてジャーカット細胞）（図６参照）。
【００７３】  ７）ＩＤＡＡＴは用量に依存してＰＭＮＬによる酸化的バーストに対するｆＭＬＦによる活性化作用を強化する。
【００７４】  酸化的バーストの誘導は実質的に製造元の作業指示に従ってＯｒｐｅｇｅｎ（ハイデルベルク）のファゴテスト／バーストテスト（Phagotest/BurstTest）によってフローサイトメーターによって実施するが、まずＰＭＮＬを基質ＤＨＲ１２３と一緒にインキュベートし、かつ引き続きＰＭＮＬを活性化する。
【００７５】  ＩＤＡＡＴはその際に、用量に依存して酸化的バーストに対するｆＬＭＦによる活性化作用を増大させる。ＩＤＡＡＴ及びｆＬＭＦは両者とも相加作用を有する。ＩＤＡＡＴはＰＭＮＬの酸化的バーストに対する別のアゴニストによる活性化作用はもはや増大しないが、独立の無関係のアゴニストとしても作動する（図７参照）。従ってＩＤＡＡＴは感染防御の増大のための有用な道具である。
【００７６】  ８）ＩＤＡＡＴは特異的かつ用量に依存して、活性化された単球による活性インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の遊離を阻害する。
【００７７】  活性ＩＬ−１２は炎症反応及び敗血症でのネガティブな重要な役割を担う。インターフェロンγ（ＩＮＦγ）及びスタフィロコッカス  アウレウスで活性化された単球はＩＬ−１２を生産し、かつそれを遊離する。
【００７８】  前記の反応はＩＤＡＡＴによって用量に依存して阻害できる。単球の培養培地中の活性化ＩＬ−１２の濃度はＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７９】  単球とＩＤＡＡＴとのインキュベーションによって、ＩＬ−１２遊離は完全に阻害された（図８参照）。
【００８０】  ＩＬ−１２の分泌に対して、敗血症において保護作用を有するＩＬ−１０の分泌はＩＤＡＡＴによって用量に依存して増大される（図９参照）。これはＩＤＡＡＴによる感染防御を調節する作用を示し、かつ敗血症反応でのＩＤＡＡＴの利用性を理解できる。他の“障害”インターロイキン、ＴＮＦαの遊離はＩＤＡＡＴによって阻害される（図１０参照）。
【００８１】  ９）ＩＤＡＡＴは炎症反応をインビボで阻害する。
【００８２】  Ｂａｌｂ−Ｃマウスの耳で、時点０までの抗ＢＳＡの局所注入及びＦＩＴＣ結合ＢＳＡの同時の注入によって腹膜中にアルサス反応を引き起こした。対照動物（ネガティブコントロール）にＦＩＴＣ（ＢＳＡ不含）を腹腔内に注入した。約６時間後に抗ＢＳＡ−ＦＩＴＣ及びＢＳＡ−ＦＩＴＣで処理された動物において、明らかに顕著な耳の腫れを伴う（浮腫）炎症反応、ＦＩＴＣ付着、ＰＭＮＬの移入及び組織への点状出血を示した。
【００８３】  ８匹のマウスを時点０及び０＋３時間後にバッファー中のそれぞれ５０μｇのＩＤＡＡＴを腹腔内に注入した。
【００８４】  ６匹の対照マウスに時点０及び０＋３時間にＩＤＡＡＴの代わりにＩＤＡＡＴが通常溶解されているバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌを有する５０ｍＭのトリス／ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．４）を与えた。
【００８５】  アルサス反応をＩＤＡＡＴによってほぼ完全に阻害した。ＩＤＡＡＴで処理されたマウスは“バッファー”で処理された動物と比較して極めて低いＦＩＴＣ侵入、極めて薄い耳厚を示し、かつ殆ど点状出血を示さなかった（図１１）。
【００８６】  １０）ＩＤＡＡＴは末梢血からの単球細胞（ＰＢＭＣ）のＨＩＶ−１感染を阻害する。
【００８７】  ＰＨＡ活性化されたＰＢＭＣをネガティブなヒト血清１：１００（ネガティブコントロール）、中和性Ｖ３ループ特異的抗体（ポジティブコントロール）、ＩＤＡＡＴ（１５０μｇ／ｍｌ）及び患者からのＣＣＲ５親和性のＨＩＶ−１一次単離物（９０３）と一緒にインキュベートし、かつ５日後にウイルス産生をｐ２４−ＥＬＩＳＡで調査した。このためにＲＰＭＩ１６４０培地＋２０％ＦＫＳ＋１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２中にＰＨＡ−活性化されたＰＢＭＣを新たに２×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度で供給し、かつそれぞれ２０００００細胞／ウェル／１００μｌで９６ウェル平板プレートに分配した。
【００８８】  阻害を試験すべき物質、
ポジティブコントロール：中和性のヒト抗Ｖ３ループ抗体１：１００、
ネガティブコントロール：ネガティブなヒト血清１：１００及び
Verum：ＩＤＡＡＴ（１５０μｇ／ｍｌ）、
にＲＰＭＩ培地中で細胞を添加し、かつ３７℃／５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。引き続きＨＩＶ−１ウイルスをバッチ中に添加した：２００００ＴＣＩＤ５０（５０％の組織培養感染用量）／ｍｌを有するＨＩＶ−１一次単離物９０３上清（ＣＣＲ５親和性）からのそれぞれ１０μｇ／ｍｌ（約１０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌウェル中）。これらのバッチを３７℃／５％ＣＯ２において一晩インキュベートした。翌日にこれらの細胞をＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄し、新たな培養培地を添加した。感染後５日目にｐ２４−ＥＬＩＳＡ試験を実施した。
【００８９】  ｐ２４−ＥＬＩＳＡ：
使用されるα−ｐ２４抗体（１１−Ｇ７［Niedrig, Berlin］及びＤ７３２０［Biochrom  ］）は使用される一次単離変異体９０３のｐ２４タンパク質を認識する。Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｂ−ＥＬＩＳＡプレート（Nunc）を抗体で一晩被覆した。阻害試験からのウイルス上清を１％のトライトンＸ−１００で不活性化した。不活性化されたウイルス上清及びアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート検出抗体（ＢＣ１０７１−ＡＰ［Aalto］）を被覆されたウェルのＰＢＳでの洗浄の後に一緒にウェルに移し、かつそこで３７℃において５時間インキュベートした。これらのウェルを再びＰＢＳで洗浄し、アルカリ性ホスファターゼｐ−ニトロフェニルホスフェート［Sigma］のための溶解された基質をウェル中に添加し、かつ呈色を２０分後に４０５ｎｍでＥＬＩＳＡホトメー夕中で測定した。使用されるｐ２４−ＥＬＩＳＡにおける平行値は０．０２光学密度（ｏＤ）単位まで共通の平均値の周辺を変動した。
【００９０】  ネガティブコントロール≒阻害なしについてのｏＤ４０５ｎｍが０．８であるが、中和性抗体（ポジティブコントロール）はｏＤを０．１２に低下させた。１５０μｇ／ｍｌのＩＤＡＡＴはｏＤを０．１０に低下させた。
【００９１】  ＩＤＡＡＴの添加によってＰＢＭＣのＨＩＶ−１感染を効果的に阻害できた。
【００９２】  １１）ＩＤＡＡＴは食細胞及び細菌防御可能な細胞（血小板、単球、ＰＭＮＬ）に対するＳ．アウレウスの結合を媒介する。
【００９３】  血小板を血小板特異的なフィコエリスリンコンジュゲート抗ＧＰＩＸ抗体（クローンＢｅｂ１）で標識した。これらの細菌（種々のＳ．アウレウス株）をトリス緩衝された塩溶液（ＴＢＳ）で２５００００菌／μｌの数に調整し、かつＲＮＡ色素Ｓｙｔｏ１３[MoBiTec, Goettingen]を用いて２μＭの濃度で標識した。標識された細菌及び標識された血小板を１０：１の比で１０分間一緒にインキュベートした。細胞ポピュレーションをフローサイトメーターによって分析した。両者の蛍光色素について陽性の細胞を会合物として評価した（図１２ａ参照）。トロンビン刺激及び血小板α顆粒からのＴＳＰの遊離は細菌担持された血小板のパーセント割合を血小板全数に対して２．５倍だけ高めた。この増大は、血小板がＴＳＰを欠損する灰色血小板症候群を患う２人の患者の血小板の使用において観察されなかった（図１２ｂ参照）。ＩＤＡＡＴは用量に依存してＳ．アウレウスの血小板への結合を促す（図１２ｃ参照）。
【００９４】  血小板が細菌を壊滅させるいわゆる“殺菌タンパク質”を有するのであれば、このＩＤＡＡＴの機能は感染防御のために有用に寄与すると評価される。
【００９５】  １２）ＩＤＡＡＴは止血を改善する。
【００９６】  ａ）ＩＤＡＡＴはトロンボスポンジンの血小板への結合を媒介する。
【００９７】  精製されたＴＳＰ−１をＦＩＴＣで標識し、かつ５０μｇ／ｍｌの濃度にゲル濾過された血小板（５００００／μｌ）の濃度でＢＳＡを有するＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーに添加した。ＩＤＡＡＴを増大する濃度で添加し、かつ血小板と一緒に室温で６０分間インキュベートした。血小板表面に結合したＴＳＰ−ＦＩＴＣをフローサイトメーター中で定量した。ＩＤＡＡＴはトロンボスポンジンの血小板への結合を媒介した（図１３参照）。
【００９８】  ｂ）ＩＤＡＡＴは血小板へのフィブリノゲン結合を促す。
【００９９】  Ｈｅｐｅｓ−タイロードＢＳＡバッファー中のゲル濾過された血小板又はＰＰＡＣＫで解凝集された血小板豊富な血漿（５００００／μｌ）にＦＩＴＣコンジュゲートフィブリノゲン（１５０μｇ／ｍｌ）を添加した。血小板懸濁液をKehrel et al., 1998に記載されるようなメタノール性コラーゲンタイプＩで活性化させた。試料の一部を増大する濃度のＩＤＡＡＴを添加した。室温での３０分間のインキュベートの後に、血小板を固定し、洗浄し、かつフィブリノゲン形成をフローサイトメーター中で定量的に測定した。ＩＤＡＡＴはコラーゲン活性化によって誘導される血小板へのフィブリノゲン結合を強化する（図１４ａ参照）。
【０１００】  増大する量での精製されたトロンボスポンジン＋ＩＤＡＡＴの添加は血小板活性化特性さえも有し、かつ血小板膜へのフィブリノゲン結合をもたらす（図１４ｂ参照）。
【０１０１】  ｃ）ＩＤＡＡＴは接着タンパク質、例えばトロンボスポンジン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びコラーゲンへの血小板の接着を促す。
【０１０２】  血小板の接着をSantoro et al., 1994に従って実施した。マイクロタイタープレート（９６ウェル）を接着タンパク質を用いて２５μｇ／ｍｌの濃度で４℃において一晩“コート”し、かつ該プレートをＢＳＡでブロッキングした。１００μｌのゲル濾過された血小板又はヒルジンで解凝集された血小板豊富な血漿（３０００００Ｐｌｔ／μｌ）を室温で１時間、温室中でウェルにおいてインキュベートした。接着されない血小板を入念に洗出した。接着した血小板の数をトライトンＸ−１００での血小板の溶解によって測定し、かつリソソーム酵素ヘキソサミニダーゼの検出を測定した。
【０１０３】  接着アッセイの較正のためにマイクロタイタープレート上で既知数の増大する血小板を有する較正列を添加し、かつ変換された基質Ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドの吸光を血小板数に比例して規定した。ＩＤＡＡＴは用量に依存して試験される接着タンパク質への血小板接着を高めた（図１５ａ参照）。従来のＡＴＩＩＩ調製物はこの作用を示さなかった（図１５ｂ参照）。
【０１０４】  ＩＤＡＡＴによる血小板接着の増大はインテグリン（αｖβ３、αｌｌｂβ３）−及びＣＤ３６に媒介される反応である（図１６及び１７参照）。
【０１０５】  ＩＤＡＡＴに媒介される血小板付着はトロンビン媒介性でなく、かつ従ってヒルジンで解凝集された血液においても行われる（図１８参照）。
【０１０６】  ヘパラン硫酸塩（０〜１０μｇ／ｍｌ）及びスルファチド（０〜２０μｇ／ｍｌ）はＩＤＡＡＴに媒介される接着を阻害しない。
【０１０７】  ＩＤＡＡＴに媒介される血小板付着は二価のイオンに依存している。５ｍＭのＥＤＴＡはトロンボスポンジン及びコラーゲンへのその接着を完全に阻害した（図１９参照）。２０μＭのＭｇ２＋、１ｍＭのＣａ２＋又は別の２価のイオンはＩＤＡＡＴに媒介されるコラーゲンへの血小板接着を増大させる。
【０１０８】  可溶のＴＳＰ−１はＩＤＡＡＴに媒介されるコラーゲン又は固定化ＴＳＰ−１への血小板の接着を阻害する（図２０参照）。
【０１０９】  単球の血小板への添加はトロンボスポンジン及びコラーゲンへの血小板の接着を増大させるが、一方で赤血球の添加はＴＳＰ及びコラーゲンへの血小板の接着を阻害する（図２１参照）。
【０１１０】  ＩＤＡＡＴに媒介されるトロンボスポンジンへの血小板の接着はＰＩ−３−キナーゼインヒビターのウォルトマンニン及びＬＹ２９４００２によって完全に阻害できる（図２２参照）。
【０１１１】  ｄ）ＩＤＡＡＴは血小板のＴＳＰに誘発される凝集を媒介する。
【０１１２】  フィブリノゲン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４中のゲル濾過された血小板（２０００００／μｌ）をボルン（Born）による血小板凝集計中で調査した。精製されたトロンボスポンジン（２５μｇ／ｍｌ）は単独で凝集を引き起こさない一方で、ＩＤＡＡＴの添加は用量に依存して凝集をもたらし、該凝集はＴＳＰ及びＩＤＡＡＴの同時の添加によって明らかに強化された（図２３参照）。
【０１１３】  ｅ）ＩＤＡＡＴは血小板のマイクロ粒子形成を媒介する。
【０１１４】  ゲル濾過された血小板はＴＳＰ−１ペプチドＲＦＹＶＶＭＷＫ（４０μＭ）で活性化された。マイクロ粒子形成は血小板特異的な抗ＧＰＩＸフィコエリトリンコンジュゲート抗体での標識の後にDoermann et al., 1999に従ってフローサイトメーター中で測定された。ＩＤＡＡＴの添加は用量に依存して活性化された血小板のマイクロ粒子形成をもたらした（図２４参照）。
【０１１５】  ｆ）ＩＤＡＡＴは血小板及び白血球の会合を媒介する。
【０１１６】  流動サイトメトリーによる血小板−白血球会合の検出のために血小板を、血小板特異的な抗原ＧＰＩＸに対するＦＩＴＣコンジュゲートモノクローナル抗体（クローンＢｅｂ１）で、かつ単球をＣＤ１４に対するＰＥコンジュゲートモノクローナル抗体（クローン：ＭφＰ９）で飽和濃度において細胞活性化及び細胞固定の後に標識した。会合物の定量をＣＤ１４及びＧＰＩＸ陽性粒子の検出によって実施した。血小板と会合して存在する白血球のパーセント割合は白血球全ポピュレーションに比例した。血小板（２５０００／μｌ）及び単球（３０００／μｌ）を３０分間互いにインキュベートした。血小板を事前に３０分間ＩＤＡＡＴで前インキュベートし、かつ引き続き洗浄した。ＩＤＡＡＴは１１．７％の凝集速度を１７．３％（５μｇ／ｍｌＩＤＡＡＴ）もしくは２０．５％（１０ｍｇ／ｍｌＩＤＡＡＴ）に増大した。
【０１１７】  １３）ＩＤＡＡＴは内皮細胞へのＴＳＰ結合を媒介／強化する。
【０１１８】  ＲＰＭＩ１６４０培地中のヒトの微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）．（３０００／μｌ）を室温で３０分間、ＩＤＡＡＴ又はＴＳＰ−１（２５μｇ／ｍｌ）＋ＩＤＡＡＴとインキュベートした。内皮細胞を固定し、洗浄し、かつＴＳＰをモノクローナルＰＥコンジュゲート抗ＴＳＰ抗体（クローンＰ１０）を用いてフローサイトメーター中で検出した。抗ＴＳＰ抗体の結合を反映する蛍光の平均値は７９（ＩＤＡＡＴ不含）から１３８（５μｇ／ｍｌＩＤＡＡＴ）に増大した。外因性ＴＳＰ−１（２５μｇ／ｍｌ）の添加は蛍光の平均値を同時にＩＤＡＡＴを添加（５μｇ／ｍｌ）することで２６８に高めた（図２５参照）。
【０１１９】  １４）ＩＤＡＡＴはビトロネクチンで覆われたラテックス−“ビーズ”への血小板の結合を媒介する。
【０１２０】  ラテックスビーズ（３．２μｍ）を４℃で一晩、活性ビトロネクチン（２５μｇ／ｍｌ）で覆い、かつ次いで洗浄した。ビトロネクチンを担持するビーズをゲル濾過された血小板（２５０００／μｌ）と一緒に増大する濃度のＩＤＡＡＴの不在及び存在下に室温で１時間インキュベートした。
【０１２１】  血小板をＧＰＩＸ（クローンＢｅｂ１）で標識し、かつビトロネクチンで覆われたビーズと血小板との凝集物をフローサイトメーター中で定量した。ＩＤＡＡＴは用量に依存して、ビトロネクチンで覆われたビーズへの血小板の結合を増大させた（図２６参照）。
【０１２２】  １５）ＩＤＡＡＴは重合されたＡＴＩＩＩからなる。
【０１２３】  ＩＤＡＡＴ、ＩＤＡＡＴ−ＴＳＰ−１凝集物、従来のＡＴＩＩＩ及び従来のＴＳＰ−１添加を有するＡＴＩＩＩを電子顕微鏡によってJander et al(1984)による“ロータリーシャドーイング”法によって表した。ＩＤＡＡＴはポリマーのＡＴＩＩＩ分子からなるが、一方で従来のＡＴＩＩＩ生成物はモノマー構造を有する（図２７ａ及びｂ参照）。ＴＳＰ−１のＩＤＡＡＴへの添加は大きなＩＤＡＡＴ−ＴＳＰ−１複合体の形成をもたらすが、一方でこれは従来のＡＴＩＩＩでは観察できない（図２７ｃ及びｄ参照）。
【０１２４】  １６）ＩＤＡＡＴは新規のタンパク質結合特性を得る。
【０１２５】  ＩＤＡＡＴは不活性化アンチトロンビンが結合できないタンパク質、例えばＣＤ４（例えばＴ細胞）（図２８）、ＨＩＶウイルスのＧＰ１２０（図２９）、トロンボスポンジン（図３０）、活性化ビトロネクチン（図３１）、ＣＤ３６、αｖβ３−インテグリンに直接結合する。ＩＤＡＡＴの前記タンパク質への結合はＥＬＩＳＡを用いて、精製された又は組み換えのタンパク質で行った。ＴＳＰ−１、活性ビトロネクチン、αｌｌｂβ３−インテグリン及びＣＤ３６の精製は、Kehrel et al. 1993、Yatohgo et al. 1988及びKronenberg, Grahl und Kehrel 1998に記載されるように行った。
【０１２６】  ＩＤＡＡＴの製造は本発明の範囲においては、例えば以下のように実施した：
従来のアンチトロンビンＩＩＩをＮａＯＣｌで酸化し、かつセファデックスカラム上に添加した（例１）。酸化の前にアンチトロンビンＩＩＩを有利にはなおも好中性の顆粒球エラスターゼと一緒にインキュベートしてよい（例２参照）。
酸化の前にアンチトロンビンＩＩＩはまたマトリクスメタロプロテイナーゼでも分解できる（例３参照）。アンチトロンビンＩＩＩはデフェンシン２との反応によっても活性化できる（例４参照）。
【０１２７】  ＩＤＡＡＴの製造のための前記の方法は本発明の更なる対象である。
【０１２８】  他方で本発明の更なる対象は、以下に挙げられるヒト又は動物における疾患又は疾患状態を治療できる本発明による医薬品の使用である。本発明による医薬品は、この場合予防法のためにも治療薬としても使用できる。指標は、急性の感染、特にＩＤＡＡＴ又は相互作用パートナーと直接又は間接的に結合する病原体、より特にＨＩＶウイルス、寄生虫、例えばプラスモジウム  ファルシパルム及びニューモシスティス  カリニ及び細菌、例えばスタフィロコッカス  アウレウスによる感染であり；免疫防御の改善及び高い感染リスクを有する患者、例えば高い感染リスクを有する術後の患者、多発外傷、火傷を有する患者、化学療法での中毒を伴う患者、免疫抑制された患者及び罹患しやすい防御の欠点を有する患者の敗血症の予防のための薬剤として；急性、慢性及び／又はアレルギー性の炎症反応の予防又は治療のため、特にアポトーシス性のＰＭＮＬ及び好酸性の顆粒球が害を及ぼさないようにすべきである炎症反応の調節のため；腫瘍増殖及び腫瘍転移の克服のための治療薬として；例えば腫瘍又は網膜疾患を有する患者における不所望の血管新生の克服のための血管新生インヒビターとして；白血病、特に慢性リンパ性白血病のための治療薬として；創傷治癒の改善のため、特に悪く治癒している創傷及び形成外科での改善のため；特に軸索突起の成長が望まれる疾患での神経系における外傷の治療のため；特に先天性又は後天性の血液凝固障害又は先天性又は後天性の血小板病を有する患者における、抗凝集治療下での又は人工心肺下の手術の場合の止血の改善のための；例えばａ）再潅流（例えば卒中発作、心筋梗塞、結紮）ｂ）器官移植（移植片拒絶の抑制）及びｃ）アレルギー反応（神経皮膚炎、気管支喘息）における炎症性に限定される組織傷害の抑制のためである。
【０１２９】  本発明による医薬品を疾患の予防のために使用する場合に、単独又は相互作用パートナー又は別の医薬品と組み合わせて、例えば口、膣、肛門及び目のための添加物として、性的接触での感染による感染に対する予防措置（例えばコンドーム、隔膜）のための添加物として洗浄液中でも、かつ創傷のケアのために溶液、絆創膏及び創傷被覆において使用してよい。
【０１３０】  本発明による医薬品の使用は局所、腸内、表面、腹腔内、静脈内、筋内、経口で又はべシクルを介して前記の適用形の１つで考えられている。
【０１３１】  場合により他の適用種も同様に本発明によって包含されている。
【０１３２】  本発明を以下になおも図面及び記載によって詳説する：
図１：ＩＤＡＡＴは単球へのＴＳＰ−１結合を媒介する。
【０１３３】  ＴＳＰ−１陽性の単球を、フィコエリトリンとコンジュゲートしたモノクローナル抗ＴＳＰ抗体クローンＰ１０で標識し、かつ単球の蛍光をフローサイトメーターで測定した。
【０１３４】  ａ）３０００個の測定された単球：単球をＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４で３０分間インキュベートし；洗浄し、かつＰ１０−ＰＥで標識した
ｂ）３０００個の測定された単球：ＴＳＰ−１（１０μｇ／ｍｌ）を有する単球をＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４中で室温でインキュベートし；洗浄し、かつＰ１０−ＰＥで標識した
ｃ）３０００個の測定された単球：ＴＳＰ−１（１０μｇ／ｍｌ）＋ＩＤＡＡＴ（１０μｇ／ｍｌ）を有する単球をＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４中で３０分間室温でインキュベートし；洗浄し、かつＰ１０−ＰＥで標識した
ｄ）ＴＳＰ−１（１０μｇ／ｍｌ）を添加する及び添加しないで単球を増大する濃度でＩＤＡＡＴと一緒にインキュベートした（前記参照）；ＩＤＡＡＴは外因性に添加されたＴＳＰ−１及び内因性で存在するＴＳＰ−１の結合を媒介した
図２：ＩＤＡＡＴはアポトーシス性の多形核の顆粒細胞（ＰＭＮＬ）へのＴＳＰ−１の結合を媒介する。
【０１３５】  ａ）ＰＭＮＬをSavill et al., 1992によるインキュベータ中での２４時間の細胞培地中でのインキュベートによってアポトーシス性にした。アポトーシス性のＰＭＮＬをＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４と３０分間インキュベートし、洗浄し、抗ＴＳＰ ＡＫ Ｐ１０−ＰＥで標識し、かつ３０００個の細胞の蛍光をフローサイトメーターで測定した
ｂ）ＰＭＮＬをSavill et al., 1992によるインキュベータ中での２４時間の細胞培地中でのインキュベートによってアポトーシス性にした。アポトーシス性のＰＭＮＬをＴＳＰ−１（５μｇ／ｍｌ）及びＩＤＡＡＴ（１０μｇ／ｍｌ）とＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４中で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＴＳＰ ＡＫ Ｐ１０−ＰＥで標識し、かつ３０００個の細胞の蛍光をフローサイトメーターで測定した
ｃ）ａ及びｂと同様に実施する：ＩＤＡＡＴを増大する濃度で使用した。ＩＤＡＡＴは内因性に存在するトロンボスポンジン及び外因性に添加された（１０μｇ／ｍｌ）のトロンボスポンジンの結合を媒介する
図３：ＩＤＡＡＴはアポトーシス性のＰＭＮＬをＴＳＰによって単球と交差架橋する。
【０１３６】  溶出されたＰＭＮＬ及び溶出された単球をＴＳＰ及びＩＤＡＡＴで種々の濃度において室温で３０分間互いにインキュベートし、かつ細胞を固定する。ＰＭＮＬをＣＤ１６ｂに対するモノクローナルのＦＩＴＣコンジュゲート抗体で標識し、かつ単球を抗ＣＤ１４−ＰＥで標識した。ＰＥ及びＦＩＴＣ陽性の会合物をフローサイトメーターで測定した。
【０１３７】  図４：“トランスウェル”細胞培養室（Coastar, Bodenheim）に２４個のウェルあたりそれぞれ１つの、細孔性ポリカーボネート膜で覆われた“トランスウェル”装入物を配置した。５μｍの細孔サイズを有するポリカーボネート膜をフィブロネクチンで被覆し、かつその上にヒトの微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ−１）を集密になるまで培養した。
【０１３８】  密度勾配遠心分離によって単離されたヒトの単球（末梢血からのＤＭＥＭ中に２×１０７細胞／ｍｌを有する２００μｌ）を１日後に前記の“トランスウェル”装入物中の培養に添加し、かつ３７℃、７％ＣＯ２において４時間ＨＭＥＣ−１単層でインキュベートした。移入速度のための尺度として、トランスウェル装入物の下方の下部“トランスウェル”区画における単球の数を測定した。
【０１３９】  種々のＡＴＩＩＩ調製物の単球の移入速度に対する影響を調査するために、単球又は内皮細胞を試験物質と１０分間、前インキュベートし、かつ洗浄するか、又は試験物質を上部“トランスウェル”室の培地に添加し、かつ該試験物質を全移入試験の間そこに保持した。ここで、移入の間の培地への添加が表される。
【０１４０】  ４時間の移入時間後に、該装入物を慎重に除去し、該細胞培養プレートを３０分間氷上において、付着された単球の剥離をおこない、移入した単球の数を数えた。
【０１４１】  図５：ＩＤＡＡＴは単球を活性化し、かつＣａ２＋シグナルをもたらす。
【０１４２】  使用される方法は例の記載において詳細に示した。
【０１４３】  図６：ＩＤＡＡＴはＴ−細胞へのＴＳＰ−１の結合を媒介する。
【０１４４】  培養されたヒトのＴ−細胞（ジャーカット細胞）を１時間室温で、ＩＤＡＡＴ又はＩＤＡＡＴ＋ＴＳＰ−１と前記の濃度でインキュベートした。Ｔ−細胞に結合されたＴＳＰ−１をモノクローナルのＰＥコンジュゲートした抗ＴＳＰ抗体（クローンＰ１０）によって標識し、かつフローサイトメーターで測定した。ＩＤＡＡＴは内因的に存在するＴＳＰ及び外因的に添加されたＴＳＰのＴ−細胞への結合を媒介する。
【０１４５】  ａ）ＴＳＰ−１を添加しない；ＩＤＡＡＴを添加しない；抗ＴＳＰ−ＡＫ−ＰＥ標織
ｂ）ＴＳＰ−１を添加（２５μｇ／ｍｌ）；ＩＤＡＡＴを添加しない；抗ＴＳＰ−ＡＫ−ＰＥ標識
ｃ）ＴＳＰ−１を添加（２５μｇ／ｍｌ）；ＩＤＡＡＴを添加（１μｇ／ｍｌ）；抗ＴＳＰ−ＡＫ−ＰＥ標識
ｄ）ＴＳＰ−１を添加（２５μｇ／ｍｌ）；ＩＤＡＡＴを添加（５μｇ／ｍｌ）；抗ＴＳＰ−ＡＫ−ＰＥ標識
ｅ）±ＴＳＰ−１（２５μｇ／ｍｌ）；ＩＤＡＡＴを増大する濃度で；抗ＴＳＰ−ＡＫ−ＰＥ標識
図７：ＩＤＡＡＴはＰＭＮＬによる酸化的バーストに対するｆＬＭＦの活性化作用を強化する。
【０１４６】  ａ）ｆＬＭＦは用量に依存してＰＭＮＬの酸化的バーストをもたらす。
【０１４７】  ｂ）ＩＤＡＡＴはｆＬＭＦによって引き起こされる酸化的バーストを増加させ、かつ別のアゴニスト自体に無関係にＰＭＮＬにおける酸化的バーストを誘発することができる。
【０１４８】  図８：ＩＤＡＡＴは活性化インターロイキン１２の遊離をインターフェロンγ＋Ｓ．アウレウスで活性化された単球によって阻害する。
【０１４９】  使用される方法は実施例の記載に詳細に記載した。
【０１５０】  図９：Ｓ．アウレウス及びインターフェロンγで活性化された単球のＩＬ−１０分泌はＩＤＡＡＴによって増大される。更にＩＤＡＡＴは動物実験においてＬＰＳに誘発される致死率に対して保護するインターロイキンの分泌を促す。使用される方法は図８と同様に実施した。ＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１５１】  図１０：Ｓ．アウレウス及びインターフェロンγで活性化された単球からのＴＮＦα−分泌はＴＳＰ−１ペプチドＲＦＹＶＶＭＷＫによって阻害される（１０ａ）。ＩＤＡＡＴはＴＳＰ−１ペプチド（２５μＭ）の阻害作用を増大させる（１０ｂ）。ＴＮＦαをＥＬＩＳＡによって測定した。使用される方法は図８と同様に実施した。
【０１５２】  図１１：ＩＤＡＡＴはＢａｌｂ−Ｃマウスの耳におけるアルサス反応を阻害する。
【０１５３】  ａ）時点０及び０＋３時間にそれぞれ５０μｇのＩＤＡＡＴで２回腹腔内処理されたマウス。左の耳でアルサス反応
ｂ）対照バッファーで２回腹腔内処理されたマウス。左の耳でアルサス反応
ｃ）耳に導入されたＢＳＡ−ＦＩＴＣを、ＩＤＡＡＴ又は対照バッファーで処理されたマウスにおけるアルサス反応についての尺度とする。左の耳においてアルサス反応
図１２：
ａ）血小板−細菌−会合のドットプロット図
Ａ：ＰＥコンジュゲート抗ＧＰＩＸ抗体（Ｂｅｂ１）で標識された血小板
Ｂ：Ｓｙｔｏ１３で標識された細菌（Ｓ．アウレウス）
Ｃ：蛍光を発する両者の細菌−血小板会合物
ｂ）Ｓ．アウレウス（Ｃｏｗａｎ１）−血小板−会合物
“灰色血小板症候群”を有する患者Ａ．Ｐ．及びＷ．Ｋ．の血小板の使用。トロンビンでの活性化による会合速度の増加はトロンボスポンジン−１が欠損する“灰色”血小板の使用においては見られない。
【０１５４】＊＊ｐ＜０．００５
＊＊＊ｐ＜０．０００１
ｃ）Ｓ．アウレウス（Ｃｏｗａｎ１）−血小板−会合物形成をＩＤＡＡＴによって増大させる。ＴＳＰ−１の付加的な添加は会合物の更なる増大をもたらす。
【０１５５】  図１３：ヒトの血小板からの精製されたＣａ２＋含有ＴＳＰ−１をＦＩＴＣ（ＴＳＰ−１−ＦＩＴＣ）とコンジュゲートさせ、かつゲル濾過されるべき血小板を添加した。このバッチを室温で１時間、ＩＤＡＡＴ（２μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ）とインキュベートし、かつフローサイトメーターで測定した（５０００個の血小板）。
【０１５６】  図１４：
ａ）ゲル濾過されたヒトの血小板（５００００／μｌ）を１５０μ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲートされたフィブリノゲンと混合し、かつ増大する濃度でコラーゲンとＩＤＡＡＴ（５μｇ／ｍｌ）の存在又は不在下にインキュベートした。３０分間のインキュベートの後に、血小板をフローサイトメーターで測定した。
【０１５７】  ｂ）ゲル濾過されたヒトの血小板（５００００／μｌ）を１５０μ／ｍｌのＦＩＴＣコンジュゲートされたフィブリノゲンと混合し、ＩＤＡＡＴをＴＳＰを添加せずに又はＴＳＰ−１（１０μｇ／ｍｌ）を添加して増大する濃度で添加した。１時間のインキュベートの後に、血小板をフローサイトメーターで測定した。
【０１５８】  図１５：
ａ）ＩＤＡＡＴは接着タンパク質：フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、トロンボスポンジン−１及びコラーゲンへの血小板の接着を増大させる。
【０１５９】  ｂ）血小板接着の作用に対するＩＤＡＡＴ及び従来のＡＴＩＩＩ調製物の比較。使用される方法は実施例の記載に詳説している。
【０１６０】  図１６：
ａ）ＩＤＡＡＴに媒介される固定されたトロンボスポンジン−１への血小板の接着を可溶性インテグリンαｌｌｂβ３（５μｇ／ｍｌ）もしくはαｖβ３（５μｇ／ｍｌ）によって完全に阻害した。使用される方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１６１】  ｂ）ＩＤＡＡＴに媒介される、固定されたビトロネクチンへの血小板の接着を部分的に可溶性インテグリンαｌｌｂβ３（５μｇ／ｍｌ）もしくはαｖβ３（５μｇ／ｍｌ）によって阻害した。使用される方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１６２】  図１７：ＩＤＡＡＴに媒介される、固定されたＴＳＰ−１への血小板の接着をＣＤ３６特異的な抗体クローン３７によって阻害し、Ｆｃ−受容体の同時の遮断の場合にはＩＶ．３によって完全に阻害した。唯一のＦｃ受容体遮断は影響を及ぼさない。使用される方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１６３】  図１８：ＩＤＡＡＴに媒介される血小板接着はヒルジン（２０Ｕ／ｍｌ）で解凝集された血小板豊富な血漿で実施した。使用される方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１６４】  図１９：ＩＤＡＡＴに媒介される、ＴＳＰ−１への血小板の接着は二価のイオンに依存している。
【０１６５】  ＥＤＴＡ（５ｍＭ）は前記のＩＤＡＡＴ作用を完全に阻害する。１ｍＭのＣａ２＋は前記のＩＤＡＡＴ作用を明らかに増大する。使用される方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１６６】  図２０：可溶性ＴＳＰ−１の添加はコラーゲンへの血小板の付着を用量に依存して阻害するが、一方でＴＳＰ−１を固定するＩＤＡＡＴはコラーゲンへの血小板の接着を用量に依存して増大させる。使用される方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１６７】  図２１：血小板（３０００００／μｌ）への単球（１００／μｌ）の添加はＴＳＰ−１への血小板の接着を増大させるが、一方で赤血球の添加（２００００／μｌ）は阻害作用を有する。使用される方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１６８】  図２２：ＩＤＡＡＴに誘発される血小板接着をＰＩ−３キナーゼのインヒビターのウォルトマンニン（２０ｎＭ）及びＬＹ２９４００２（５０μＭ）によって阻害した。ウォルトマンニン及びＬＹ２９４００２をこのためにＩＤＡＡＴ添加の前に１０分間、前インキュベートした。
【０１６９】  図２３：ＩＤＡＡＴはトロンボスポンジンに誘発される血小板凝集を媒介する。
【０１７０】  血小板凝集をBorn 1962に従って実施した。１００μｇ／ｍｌのフィブリノゲンを有するＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４中のゲル濾過された血小板（２０００００／μｌ）に凝集キュベット中でＴＳＰ−１（２５μｇ／ｍｌ）をピペット導入した。可溶性のＴＳＰ−１は凝集を引き起こさない。ＩＤＡＡＴの添加は弱い凝集反応をもたらす。ＩＤＡＡＴ及び可溶性ＴＳＰ−１の同時の添加は強い凝集物形成をもたらす。
【０１７１】  図２４：ＩＤＡＡＴは血小板のマイクロ粒子形成を媒介する。
【０１７２】  ゲル濾過された血小板（５００００／μｌ）をＴＳＰ−１ペプチドＲＦＹＶＶＭＷＫ（４０μＭ）で活性化し、かつＩＤＡＡＴを増大する濃度で添加した。３０分間のインキュベーションの後に、血小板及び血小板から生じるマイクロ粒子を抗ＧＰＩＸ−ＰＥで標識し、かつ生じたマイクロ粒子の数を５０００個の数えられた血小板に関してフローサイトメーターで測定した。
【０１７３】  図２５：ＩＤＡＡＴは内皮細胞へのＴＳＰ−１結合を媒介する。
【０１７４】  該方法は実施例の記載に詳細に示した。ＩＤＡＡＴは内皮細胞へのＴＳＰ−１結合を強化する。
【０１７５】  図２６：ＩＤＡＡＴはビトロネクチンに覆われたラテックスビーズへの血小板の結合を増大する。該方法は実施例の記載に詳細に示した。
【０１７６】  図２７：
ａ）ＩＤＡＡＴは“ロータリーシャドーイング”電子検鏡法で示されるポリマーのＡＴＩＩＩからなる
ｂ）従来のＡＴＩＩＩはモノマーの球状の分子からなる；回転気相メッキ後の電子顕微鏡写真
ｃ）ＩＤＡＡＴ（１ｍｇ／ｍｌ）及びＴＳＰ−１（２００μｇ／ｍｌ）を室温で互いに１時間インキュベートした。ＩＤＡＡＴ及びＴＳＰ−１は一緒になって大きな会合物を形成する；回転気相メッキ後の電子顕微鏡写真
ｄ）従来のＡＴＩＩＩ（１ｍｇ／ｍｌ）及びＴＳＰ−１（２００μｇ／ｍｌ）を互いに室温で１時間インキュベートした。従来のＡＴＩＩＩ及びＴＳＰ−１は互いに反応しなかった；回転気相メッキ後の電子顕微鏡写真
図２８：ＩＤＡＡＴはＣＤ４に直接結合する。
【０１７７】  組み換えＣＤ４（１μｇ／１００μｌ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Maxisorb）の床に結合させた。該プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で入念に洗浄し、かつプラスチック表面上の開放箇所を３％ＢＳＡで１時間室温でブロッキングした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続きＩＤＡＡＴもしくは従来のＡＴＩＩＩを０〜５μｇ／ｍｌの増大する濃度で室温で１時間添加した。ＡＴＩＩＩ溶液を除去し、該プレートを入念に洗浄し、かつウサギからのＡＴＩＩＩに対するポリクローナルの単一特異性抗体（ＤＡＫＯ、ハンブルク）でＰＢＳ、１％ＮＧＳ（正常ヤギ血清）中で１：１５０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続き親和性精製された、ウサギＩｇＧに対するヤギからの抗体（ペルオキシダーゼとコンジュゲートされた）（ＢＩＯＲＡＤ、ミュンヘン）と一緒に１：３０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び複数回洗浄し、かつ基質溶液（１００μｌ／ウェル）（２０ｍｇのｏ−フェニルジアミン、１２．１５ｍｌの０．１Ｍのクエン酸及び１２．８５ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋２５ｍｌの蒸留水からなるバッファー中の５％のＨ２Ｏ２）を添加した。
【０１７８】  ＥＬＩＳＡホトメーター中で測定される４０５ｎｍでの吸光は結合したアンチトロンビンの量を再び反映する。該反応を５０μｌ／ウェルの４ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、かつ４９０ｎｍでの吸光を測定した。該反応は明らかに、ＩＤＡＡＴがＴＳＰ−１を媒介するだけでなく、ＣＤ４にも直接的に結合できることを示している。
【０１７９】  図２９：ＩＤＡＡＴはＨＩＶ−ＧＰ１２０に直接的に結合する。
【０１８０】  組み換えＨＩＶ−ＧＰ１２０（１μｇ／１００μｌ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Maxisorb）の床に結合させた。該プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で入念に洗浄し、かつプラスチック表面上の開放箇所を３％のＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続きＩＤＡＡＴもしくは従来のＡＴＩＩＩを０〜５μｇ／ｍｌの増大する濃度で室温で１時間添加した。ＡＴＩＩＩ溶液を除去し、該プレートを入念に洗浄し、かつウサギからのＡＴＩＩＩに対するポリクローナルの単一特異性抗体（ＤＡＫＯ、ハンブルク）でＰＢＳ、１％ＮＧＳ（正常ヤギ血清）中で１：１５０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続き親和性精製された、ウサギＩｇＧに対するヤギからの抗体（ペルオキシダーゼとコンジュゲートされた）（ＢＩＯＲＡＤ、ミュンヘン）と一緒に１：３０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び複数回洗浄し、かつ基質溶液（１００μｌ／ウェル）（２０ｍｇのｏ−フェニルジアミン、１２．１５ｍｌの０．１Ｍのクエン酸及び１２．８５ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋２５ｍｌの蒸留水からなるバッファー中の５％のＨ２Ｏ２）を添加した。
【０１８１】  ＥＬＩＳＡホトメーター中で測定される４０５ｎｍでの吸光は結合したアンチトロンビンの量を再び反映する。該反応を５０μｌ／ウェルの４ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、かつ４９０ｎｍでの吸光を測定した。該反応は明らかに、ＩＤＡＡＴがＴＳＰ−１を媒介するだけでなく、ＨＩＶ−ＧＰ１２０にも直接的に結合できることを示している。
【０１８２】  図３０：ＩＤＡＡＴはトロンボスポンジンに直接的に結合する。
【０１８３】  精製されたトロンボスポンジン−１（１μｇ／１００μｌ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Maxisorb）の床に結合させた。該プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で入念に洗浄し、かつプラスチック表面上の開放箇所を３％のＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続きＩＤＡＡＴもしくは従来のＡＴＩＩＩを０〜５μｇ／ｍｌの増大する濃度で室温で１時間添加した。ＡＴＩＩＩ溶液を除去し、該プレートを入念に洗浄し、かつウサギからのＡＴＩＩＩに対するポリクローナルの単一特異性抗体（ＤＡＫＯ、ハンブルク）でＰＢＳ、１％ＮＧＳ（正常ヤギ血清）中で１：１５０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続き親和性精製された、ウサギＩｇＧに対するヤギからの抗体（ペルオキシダーゼとコンジュゲートされた）（ＢＩＯＲＡＤ、ミュンヘン）と一緒に１：３０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び複数回洗浄し、かつ基質溶液（１００μｌ／ウェル）（２０ｍｇのｏ−フェニルジアミン、１２．１５ｍｌの０．１Ｍのクエン酸及び１２．８５ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋２５ｍｌの蒸留水からなるバッファー中の５％のＨ２Ｏ２）を添加した。
【０１８４】  ＥＬＩＳＡホトメーター中で測定される４０５ｎｍでの吸光は結合したアンチトロンビンの量を再び反映する。該反応を５０μｌ／ウェルの４ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、かつ４９０ｎｍでの吸光を測定した。該反応は明らかに、ＩＤＡＡＴがＴＳＰ−１に直接的に結合できることを示している。
【０１８５】  図３１：ＩＤＡＡＴはビトロネクチン（活性形）に直接的に結合する。
【０１８６】  ビトロネクチン（１μｇ／１００μｌ／ウェル）をＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Maxisorb）の床に結合させた。該プレートをＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で入念に洗浄し、かつプラスチック表面上の開放箇所を３％のＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続きＩＤＡＡＴもしくは従来のＡＴＩＩＩを０〜５μｇ／ｍｌの増大する濃度で室温で１時間添加した。ＡＴＩＩＩ溶液を除去し、該プレートを入念に洗浄し、かつウサギからのＡＴＩＩＩに対するポリクローナルの単一特異性抗体（ＤＡＫＯ、ハンブルク）でＰＢＳ、１％ＮＧＳ（正常ヤギ血清）中で１：１５０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び洗浄し、かつ引き続き親和性精製された、ウサギＩｇＧに対するヤギからの抗体（ペルオキシダーゼとコンジュゲートされた）（ＢＩＯＲＡＤ、ミュンヘン）と一緒に１：３０００の希釈でインキュベートした。これらのプレートを再び複数回洗浄し、かつ基質溶液（１００μｌ／ウェル）（２０ｍｇのｏ−フェニルジアミン、１２．１５ｍｌの０．１Ｍのクエン酸及び１２．８５ｍｌの０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４＋２５ｍｌの蒸留水からなるバッファー中の５％のＨ２Ｏ２）を添加した。
【０１８７】  ＥＬＩＳＡホトメーター中で測定される４０５ｎｍでの吸光は結合したアンチトロンビンの量を再び反映する。該反応を５０μｌ／ウェルの４ＮのＨ２ＳＯ４で停止させ、かつ４９０ｎｍでの吸光を測定した。該反応は明らかに、ＩＤＡＡＴが活性ビトロネクチンに直接的に結合できることを示している。
【０１８８】  ＩＤＡＡＴの製造：
例１
前記の観点で機能を有さず、活性化されていないアンチトロンビンＩＩＩをCalbiochem,Sigma, Enzyme Research Laboratories, Pharmacia & Upjohn, Aventis, Baxter又はGrifolsから購入するか、又はヒトの血漿から精製した。アンチトロンビン調製物をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４に対して再緩衝した。３４８μｇの純粋なアンチトロンビンをＰＢＳ（ｐＨ７．４）及び０．１ｍＭのＥＤＴＡを用いて１ｍｌの容量にし、かつ該溶液を氷上で冷却した。冷却されたＮａＯＣｌ（８３２μｇ）を１０μｌの容量で添加し、該バッチを１０分間氷上でインキュベートした。該反応を４℃でのセファデックスＧ２５（ＰＤ１０カラム）を介した即座のゲル濾過によって停止させた。
【０１８９】  例２
従来の活性化されていないアンチトロンビンＩＩＩをＰＢＳ（ｐＨ８．０）に対して再緩衝した。５００μｇの純粋なアンチトロンビンＩＩＩを５０μｇの好中性の顆粒球エラスターゼ（ＨＮＥ）（ヒト、５０μｌのバッファーに溶解されている）を添加し、かつ該バッチ（５００μｌの容量）を３７℃で１６時間インキュベートした。これらの反応を１ｍＭ（最終濃度）のフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で停止させ、かつアンチトロンビンＩＩＩをセントリコン法を用いてＰＢＳ／０．１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）に対して再緩衝した。引き続き例１に記載のようにＮａＯＣｌで酸化を行った。
【０１９０】  例３
従来の活性化されていないアンチトロンビンＩＩＩをＰＢＳ（ｐＨ８．０）に対して再緩衝した。５００μｇの純粋なアンチトロンビンＩＩＩを２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ／３０ｍＭのＮａＣｌ／１０ｍＭのＣａ２＋バッファー中の１２．４μｇのマトリクスメタロプロティナーゼ−２（ＭＭＰ−２）（０．９％のＮａＣｌ中に溶解されている）と混合した。ＭＭＰ−２を活性化させるために、これを室温で２時間、１ｍＭのＡＰＭＡ（４−アミノフェニル水銀酢酸塩）で前処理した。該バッチ（５００μｌ容量）を１６時間３７℃でインキュベートした。アンチトロンビンＩＩＩをセントリコン法でＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して再緩衝した。
【０１９１】  例４
従来の活性化されていないアンチトロンビンＩＩＩをＰＢＳ（ｐＨ８．０）に対して再緩衝した。２００μｇの純粋なアンチトロンビンＩＩＩをデフェンシン２（ＨＮＰ−２、０．９％のＮａＣｌ中に溶解されている、最終濃度１０μＭ）と一緒にＰＢＳ（ｐＨ８．０）中で室温で１時間インキュベートした。
【０１９２】［外１］
0005517387.tif 000002
【０１９３】［外２］
0005517387.tif 000003
【０１９４】［外３］
0005517387.tif 000004
【０１９５】［外４］
0005517387.tif 000005
【０１９６】［外５］
0005517387.tif 000006
【０１９７】［外６］
0005517387.tif 000007
【０１９８】［外７］
0005517387.tif 000008
【０１９９】［外８］
0005517387.tif 000009
【０２００】［外９］
0005517387.tif 000010
【０２０１】［外１０］
0005517387.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はＴＳＰ−１陽性の単球を、フィコエリトリンとコンジュゲートしたモノクローナル抗ＴＳＰ抗体クローンＰ１０で標識し、かつ単球の蛍光をフローサイトメーターで測定した結果を示している。
【図２】  図２はアポトーシス性のＰＭＮＬをＨｅｐｅｓ−タイロードバッファーｐＨ７．４と３０分間インキュベートし、洗浄し、抗ＴＳＰ  ＡＫ  Ｐ１０−ＰＥで標識し、かつ３０００個の細胞の蛍光をフローサイトメーターで測定した結果を示している。
【図３】  図３はＰＭＮＬをＣＤ１６ｂに対するモノクローナルのＦＩＴＣコンジュゲート抗体で標識し、かつ単球を抗ＣＤ１４−ＰＥで標識した。ＰＥ及びＦＩＴＣ陽性の会合物をフローサイトメーターで測定した結果を示している。
【図４】  図４は種々のＡＴＩＩＩ調製物の単球の移入速度に対する影響を表すグラフを示している。
【図５】  図５はＩＤＡＡＴが血小板中にＣａ２＋シグナルを誘発することを示すグラフを示している。
【図６】  図６はＴ−細胞に結合されたＴＳＰ−１をモノクローナルのＰＥコンジュゲートした抗ＴＳＰ抗体（クローンＰ１０）によって標識し、かつフローサイトメーターで測定した結果を示している。
【図７】  図７はＩＤＡＡＴがＰＭＮＬによる酸化的バーストに対するｆＬＭＦの活性化作用を強化することを示すグラフである。
【図８】  図８はＩＤＡＡＴが活性化インターロイキン１２の遊離をインターフェロンγ＋Ｓ．アウレウスで活性化された単球によって阻害することを示すグラフである。
【図９】  図９は、Ｓ．アウレウス及びインターフェロンγで活性化された単球のＩＬ−１０分泌がＩＤＡＡＴによって増大されることを示すためのＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって測定したグラフを示す。
【図１０】  図１０は、Ｓ．アウレウス及びインターフェロンγで活性化された単球からのＴＮＦα−分泌がＴＳＰ−１ペプチドＲＦＹＶＶＭＷＫによって阻害、ＩＤＡＡＴがＴＳＰ−１ペプチド（２５μＭ）の阻害作用を増大させることを示すグラフである。
【図１１】  図１１はＩＤＡＡＴがＢａｌｂ−Ｃマウスの耳におけるアルサス反応を阻害することを示した写真である。
【図１２】  図１２は、ＩＤＡＡＴが食作用及び細菌防御可能な細胞へのＳ．アウレウス結合を媒介することを示すグラフである。
【図１３】  図１３はＩＤＡＡＴが血小板にトロンボスポンジンを結合することを示すグラフである。
【図１４】  図１４はＩＤＡＡＴが血小板にフィブリノゲン結合を促すことを示すグラフである。
【図１５】  図１５はＩＤＡＡＴが接着タンパク質への血小板の接着を強化することを示すグラフである。
【図１６】  図１６はＩＤＡＡＴに媒介される血小板の接着がインテグリンに依存することを示すグラフである。
【図１７】  図１７はＩＤＡＡＴによる血小板接着の増大がＣＤ３６に媒介されることを示すグラフである。
【図１８】  図１８はＩＤＡＡＴの作用がトロンビンに無関係であることを示すグラフである。
【図１９】  図１９はＩＤＡＡＴに媒介される血小板の接着が二価のイオンに依存することを示すグラフである。
【図２０】  図２０は可溶性トロンボスポンジン−１がコラーゲンへの血小板接着を阻害することを示すグラフである。
【図２１】  図２１はＩＤＡＡＴへの血液細胞の影響が血小板の接着を媒介することを示すグラフである。
【図２２】  図２２はＩＤＡＡＴに媒介される血小板接着がＰＩ−３キナーゼのインヒビターによって阻害されることを示すグラフである。
【図２３】  図２３は、ＩＤＡＡＴがトロンボスポンジンに誘発される血小板凝集を媒介することを示すグラフである。
【図２４】  図２４はＩＤＡＡＴが血小板のマイクロ粒子形成を媒介することを示すグラフである。
【図２５】  図２５はＩＤＡＡＴが内皮細胞へのトロンボスポンジン−１結合を媒介することを示すグラフである。
【図２６】  図２６はビトロネクチンに覆われたラテックスビーズへの血小板の結合を増大させることを示すグラフである。
【図２７】  図２７はＩＤＡＡＴが重合されたアンチトロンビンからなり、ＩＤＡＡＴがトロンボスポンジンに結合することを示す回転気相メッキ後の電子顕微鏡写真である。
【図２８】  図２８はＩＤＡＡＴが組み換えＣＤ４に結合することを示すグラフである。
【図２９】  図２９はＩＤＡＡＴが組み換えＨＩＶ−ＧＰ１２０に結合することを示すグラフである。
【図３０】  図３０はＩＤＡＡＴがトロンボスポンジンに直接的に結合することを示すグラフである。
【図３１】  図３１はＩＤＡＡＴがビトロネクチンに直接的に結合することを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ＡＢ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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