(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コラーゲン／ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）複合骨格を生成する方法であって、酸性溶液中でコラーゲン及びＨＡを機械的に混合して酸性溶液中でコラーゲン及びＨＡの均質な懸濁液を形成するステップと、−１０℃〜−７０℃の間の最終凍結温度に到達するまで懸濁液を一定の冷却速度で凍結させるステップと、凍結した懸濁液を、凍結した懸濁液中の氷相を適切な時間減圧下で昇華させる昇華温度まで加熱して複合骨格を生成するステップとを含み、
懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比が１：１０〜５０：１０（ｗ／ｗ）であり、
懸濁液中のコラーゲンの量が３ｇ／Ｌ〜８ｇ／Ｌ（ｗ／ｗ）であり、
コラーゲン／ＨＡの均質な懸濁液が、コラーゲンの均質な酸性懸濁液を形成するステップと、その後、混合条件下でＨＡをコラーゲン懸濁液に加えて、コラーゲン懸濁液中で確実にＨＡの分布が均一になるようにするステップとによって形成され、
ＨＡが酸性ＨＡ懸濁液の形で添加される方法。
【請求項２】
酸性懸濁液ＨＡが一定分量で添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一定分量が３０〜２４０分間の間隔でコラーゲン懸濁液に加えられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
酸性溶液中の有機酸の濃度が少なくとも０．１Ｍのモル濃度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比が５：１０〜３０：１０（ｗ／ｗ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
凍結が０．５℃／分〜１．５℃／分の間の一定の冷却速度で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
所望の最終凍結温度が−３０℃〜−５０℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
最終凍結温度に到達した後、凍結乾燥チャンバー内の温度を、最終凍結温度と昇華温度との中間であるアニーリング温度に上昇させ、昇華温度まで温度を上昇させる前にしばらくの間温度をアニーリング温度に保持することを含むアニーリングステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
本発明で使用されるＨＡが粉末状である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
本発明で使用されるコラーゲンがコラーゲン線維である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
複合骨格が、脱水熱架橋及び化学架橋からなる群から選択される手段によって架橋される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、コラーゲン／ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）複合骨格。
【請求項１３】
前記ＨＡの粉末は、１０ｎｍ〜１００μｍの間の粒径を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比が１０：１０〜３０：１０（ｗ／ｗ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項１５】
前記有機酸は酢酸である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、コラーゲン／ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）複合骨格、及び本発明の方法によって得られるコラーゲン／ＨＡ複合骨格の生成方法に関する。そのような骨格は、骨再生及び組織工学への適用で用いることができる。
【０００２】
［背景技術］
移植骨片は、世界中で移植される材料のリストで、輸血に次いで２番目である。さらに、移植骨片材料の推定される世界市場は、毎年約６５０，０００，０００ユーロである。毎年、移植骨片又は骨格の使用を必要とする最高４，０００，０００の骨置換処置が、世界中で実施される。最も一般的な臨床治療は、骨を患者自身の体からとって再移植する、自家移植である。しかし、特定のドナー部位から取り出すことができる骨の量は限定され、再移植のためにさらに侵襲性の手術が必要とされる。別の選択肢は、骨を臓器提供者から取り出す、同種異系移植の使用である。この手法に伴う問題点は、骨が別のドナーに由来することから生じる。感染性疾患の伝染のより高いリスクが、そのような材料に付随する。さらに、そのようなドナーの骨は生細胞を含まないので、そこには成長因子が少量しか存在しない。これらの成長因子は、新しい骨の増殖を助ける。耐負荷性を促進しつつ、骨形成を促進する理想的な移植可能な骨格は、同種異系移植又は自家移植の必要性を低減させるであろう。しかし、現在、これらの従来の手法は、全ての骨移植処置の９０％以上を構成する。上記の問題点にもかかわらずこの普及率が低い理由は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨を生成するか、ｉｎ  ｖｉｖｏで完全な骨形成を引き起こすために用いることができる、血管形成され、物理的にコンピテントな骨伝導性の骨格が開発されていないことである。そのような製品は、かなりの商業的潜在性を有するであろう。
【０００３】
骨移植のために生存可能な骨格を生成するために、多数の合成材料を用いて様々な試みがなされた。例として、ポリスチレン、チタン、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及び乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃｃｏｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（ＰＬＧＡ）がある。しかし、これらの材料はすべて、感染症のリスク、並びに血管新生及び新骨の内殖を促進するために十分な再吸収を可能にすることの困難を含む、付随する問題点及び欠点を有する。コラーゲン、ゼラチン、キトサン、アガロース及びグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）をベースにした基質などの生体物質も用いられた。しかし、これらの物質は、移植後の耐負荷を可能にするのに十分な物理特性を有しない。
【０００４】
［発明の記載］
本発明によれば、コラーゲン／ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）複合骨格を生成する方法であって、酸性溶液中でコラーゲン及びＨＡの均質な懸濁液を形成するステップと、所望の最終凍結温度に到達するまで懸濁液を凍結乾燥して複合骨格を生成するステップと、任意選択で複合骨格を架橋するステップとを含み、懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比が少なくとも１：１０（ｗ／ｗ）である方法が提供される。
【０００５】
一般的に、酸性溶液は少なくとも０．０５Ｍのモル濃度を有する。本発明の好ましい実施形態では、懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比は１：１０（ｗ／ｗ）を超え、酸性溶液のモル濃度は、０．０５Ｍを超える。一般的に、懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比は、少なくとも２：１０（ｗ／ｗ）、３：１０（ｗ／ｗ）、４：１０（ｗ／ｗ）、５：１０（ｗ／ｗ）である。本発明の好ましい一実施形態では、ＨＡ対コラーゲンの比は、１：１０（ｗ／ｗ）〜５０：１０（ｗ／ｗ）、好適には５：１０（ｗ／ｗ）〜３０：１０（ｗ／ｗ）である。好適には、酸性溶液のモル濃度は、少なくとも０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１０Ｍ、０．２０Ｍ、０．３０Ｍ、０．４０Ｍ又は０．５０Ｍである。理想的には、酸性溶液のモル濃度は、０．４Ｍ〜０．６Ｍである。
【０００６】
本発明の好ましい一実施形態では、懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比は少なくとも５：１０（ｗ／ｗ）であり、酸性溶液のモル濃度は少なくとも０．１０Ｍである。一般的に、酸性溶液のモル濃度は、少なくとも０．５０Ｍである。
【０００７】
本発明の好ましい実施形態では、懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比は、少なくとも６：１０（ｗ／ｗ）、７：１０（ｗ／ｗ）、８：１０（ｗ／ｗ）、９：１０（ｗ／ｗ）又は１：１（ｗ／ｗ）である。本発明の一実施形態では、懸濁液中のＨＡ対コラーゲンの比は１：１（ｗ／ｗ）を超える。一般に、ＨＡのそのようなレベルを懸濁液で使用する場合、酸性溶液のモル濃度は少なくとも０．５Ｍになる。
【０００８】
好ましい実施形態では、懸濁液中のコラーゲンの量は、酸性溶液中０．５ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌ（標準コラーゲン濃度のそれぞれ１／１０及び１０倍）まで変化させることができる。好適には、懸濁液中のコラーゲンの量は、１．０ｇ／Ｌ〜１０．０ｇ／Ｌ、好ましくは３．０ｇ／Ｌ〜８．０ｇ／Ｌ、より好ましくは４．０ｇ／Ｌ〜６．０ｇ／Ｌである。
【０００９】
一般的に、酸性溶液は酢酸溶液を含む。しかし、他の有機酸を使用して酸性溶液を作製することができる。
【００１０】
好適には、コラーゲン／ＨＡの均質な懸濁液は、コラーゲンのゼラチン化を最小にするのに適する条件下で作製される。均質な懸濁液の生成の間で確実にコラーゲンのゼラチン化を最小にする１つの方法は、懸濁液を十分に低い温度、一般に１〜５℃、好適には約４℃に維持することである。
【００１１】
本発明の一実施形態では、凍結乾燥は一定の冷却速度で実施される。このことは、凍結乾燥中の冷却速度が目標冷却速度の±１０％を超えて異ならないこと、すなわち、所望の冷却速度が１．０℃／分であって実際の冷却速度が０．９℃／分〜１．１℃／分の間で変動した場合でも、これは、一定の冷却速度であると考えられるであろうことを意味する。一般的に、一定の冷却速度は、０．１℃／分〜１０℃／分の間である。好ましくは、凍結乾燥は０．５℃／分〜１．５℃／分の間の一定の冷却速度で実施される。より好ましくは、凍結乾燥は０．８℃／分〜１．１℃／分の間の一定の冷却速度で実施される。一般的に、凍結乾燥は約０．９℃／分の一定の冷却速度で実施される。凍結乾燥工程の開始時（すなわちスラリーをチャンバー内に置いたとき）の凍結乾燥チャンバーの温度は、通常０℃より高く、好ましくは周囲温度前後である。
【００１２】
一実施形態では、所望の最終凍結温度は、−１０℃〜−７０℃の間である。好適には、所望の最終凍結温度は、−３０℃〜−５０℃の間である。一般には、所望の最終凍結温度は、−３５℃〜−４５℃の間、理想的には約−４０℃である。
【００１３】
凍結乾燥工程は一般に乾燥段階を含みそれは、最終凍結温度への到達後に実施される。このステップは、好ましくは一定の加熱速度で、凍結乾燥チャンバーを昇華温度（一般に約０℃）に加熱することを含む。一般的に、この工程は、形成された骨格中の氷相を適切な時間の間減圧下（ｕｎｄｅｒ  ｖａｃｕｕｍ）で昇華させる最終昇華ステップを含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、凍結乾燥工程は、アニーリングステップを含む。一般的に、このステップは、最終凍結温度に到達した後に凍結乾燥チャンバー内の温度を上昇させることと、一般的に、上昇させた温度を乾燥段階の開始前にしばらくの間保持することを含む。例えば、最終凍結温度が−２０℃である場合、最終的に骨格を乾燥させる前に、温度を−１０℃まで上昇させ、既存の氷結晶を生長させるのに十分な時間その温度で保持することによって、アニーリングステップを実施することができる。アニーリング時間は所望の孔特性に従って変更することができるが、１５分〜１２０時間の間のアニーリング時間が好ましい。
【００１５】
一般に、本発明で使用されるＨＡは粉末状である。好適には、ＨＡ粉末は、焼結ＨＡ粉末及び非焼結ＨＡ粉末を含む群から選択される。本発明に適する好適な焼結及び非焼結のＨＡ粉末の例は、当分野の技術者には公知となるが、下記に提供する。
【００１６】
一般的に、ＨＡ粉末は、１０ｎｍ〜１００μｍの間の粒径を有する。
【００１７】
好適には、本発明で使用されるコラーゲンは、コラーゲン線維を含む。好ましくは、コラーゲン線維はミクロフィブリルコラーゲン、好ましくはミクロフィブリルのウシ腱コラーゲンを含む。
【００１８】
本発明の一実施形態では、コラーゲン／ＨＡの均質懸濁液は、
コラーゲンの酸性均質懸濁液を形成するステップと、
その後、混合条件下でＨＡをコラーゲン懸濁液に加えてコラーゲン懸濁液中で確実にＨＡの分布が均一になるようにするステップと
によって形成される。
【００１９】
好ましくは、ＨＡは酸性ＨＡ懸濁液の形で提供される。好適には、コラーゲン懸濁液は遠心分離によって混合され、ＨＡは、遠心混合の間に懸濁液の渦に加えられる。
【００２０】
一般的に、ＨＡは一定分量で加えられる。好適には、一定分量は３０〜２４０分の間隔でコラーゲン懸濁液に加えられる。好ましくは、ＨＡは２〜５つの一定量で、コラーゲン懸濁液に加えられる。
【００２１】
本発明の一実施形態では、複合骨格は架橋される。一般的に、複合骨格は、脱水熱架橋及び化学架橋を含む群から選択される手段によって架橋される。適する化学架橋剤及び方法は、当分野の技術者に公知となり、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）を含む。脱水熱架橋を使用する場合、架橋温度は１０５℃〜ｌ８０℃の間である。好適には、架橋工程は、少なくとも２４時間、４８時間、７２時間、９６時間又は１２０時間実施される。ＥＤＡＣ架橋を使用する場合、ＥＤＡＣ溶液のモル濃度は、コラーゲン／ＨＡ複合体１グラムにつき６ｍｍｏｌである
【００２２】
本発明は、本発明の方法によって得られる、コラーゲン／ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）複合骨格にも関する。
【００２３】
本発明は、多孔性コラーゲンマトリックス内にヒドロキシアパタイトの均一な分布を含むコラーゲン／ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）複合骨格にも関し、ＨＡ対コラーゲンの比は少なくとも約１：１０（ｗ／ｗ）である。
【００２４】
好ましくは、本発明の複合骨格は、少なくとも９５％（ｖ／ｖ）、９６％（ｖ／ｖ）、９７％（ｖ／ｖ）、９８％（ｖ／ｖ）、９９％（ｖ／ｖ）、９９．１％（ｖ／ｖ）、９９．２％（ｖ／ｖ）、９９．３％（ｖ／ｖ）の空隙率を有する。好適には、本発明の複合骨格は、９７％〜９９．５％（ｖ／ｖ）、好ましくは９８〜９９．５％（ｖ／ｖ）、より好ましくは９８．５〜９９．５％（ｖ／ｖ）の空隙率を有する。空隙率を判定する方法は、下記に記載する。
【００２５】
好適には、本発明の複合骨格は、少なくとも０．２ＫＰａ、０．３ＫＰａ、０．４ＫＰａ、０．５ＫＰａ、０．６ＫＰａの圧縮剛性を有する。好適には、本発明の複合骨格は、１〜５ＫＰａ、好ましくは１〜４ＫＰａの圧縮剛性を有する。ＥＤＡＣ架橋複合骨格は、少なくとも１ｋＰａ、１．５ｋＰａ、２ｋＰａ、２．５ｋＰａ、３ｋＰａ、３．５ｋＰａ、４ｋＰａの圧縮剛性を有する。圧縮剛性を判定する方法は、下記に記載する。
【００２６】
一般的に、複合骨格中のＨＡ対コラーゲンの比は、１：１０〜５０：１０（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも２：１０（ｗ／ｗ）、３：１０（ｗ／ｗ）、４：１０（ｗ／ｗ）、５：１０（ｗ／ｗ）、６：１０（ｗ／ｗ）、７：１０（ｗ／ｗ）、８：１０（ｗ／ｗ）、９：１０（ｗ／ｗ）又は１：１（ｗ／ｗ）である。本発明の特に好ましい実施形態では、複合骨格中のＨＡ対コラーゲンの比は、５：１０〜３０：１０（ｗ／ｗ）である。
【００２７】
本発明の複合骨格のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性は、インキュベーションの１日後（初期細胞接着の程度をモニタリングするため）７日後、２１日後及び２８日後（細胞増殖をモニタリングするため）の骨格中のＭＣ３Ｔ３骨芽細胞の活性をモニタリングすることによって特徴づけることができる。本発明の一実施形態では、本発明の複合骨格は、骨格上に播種した初期細胞数を超える、インキュベーションの７日後の骨格中のＭＣ３Ｔ３骨芽細胞の増殖レベルで特徴づけられる。一般的に、これは骨格の体積５００ｍｍ３につき少なくとも１×１０６個の細胞である。本発明の好ましい実施形態では、複合骨格は、インキュベーションの２８日目の骨格中のＭＣ３Ｔ３骨芽細胞の増殖レベルから７日目のレベルを引いたものが、少なくとも０．５×１０６個の細胞、好適には０．５×１０６〜１．５×１０６個の細胞であることで特徴づけられる。ＭＣ３Ｔ３骨芽細胞の増殖レベルを判定する方法は、以下の通りである。直径１２．７ｍｍの複合骨格の円柱状試料に、２×１０６個のＭＣ３Ｔ３細胞を播種する。インキュベーションの７日後に、骨格あたりの存在する細胞数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ＤＮＡアッセイを用いてモニタリングする。これは、初期細胞接着の評価を与える。インキュベーションの１４、２１及び２８日後に、骨格あたりの存在する細胞数を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８ＤＮＡアッセイを用いてモニタリングする。骨格あたりの存在する細胞数の経時変化（２８日目の細胞数から７日目の細胞数を引いたもの）を用いて、細胞増殖を評価する。
【００２８】
一実施形態では、本発明の複合骨格は、少なくとも１×１０−１０ｍ４／Ｎｓ、好適には６×１０−１０ｍ４／Ｎｓ〜１．４×１０−９ｍ４／Ｎｓ、好ましくは８×１０−１０ｍ４／Ｎｓ〜１．２×１０−９ｍ４／Ｎｓの、骨格を通る圧力下でのフロー伝導度を有することで特徴づけられる。一般的に、骨格を通る圧力下のフロー伝導度は、少なくとも１０×１０−１０ｍ４／Ｎｓである。
【００２９】
理想的には、本発明の複合骨格は、高い程度の孔相互接続性を有する。好ましくは、骨格は均一な孔分布を有する。一般的に、骨格は均一な孔径を有する。一実施形態では、骨格はシート状に生成される。一般的に、シートは少なくとも１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ又は１０ｍｍの平均厚を有する。
【００３０】
本発明は、本発明の、又は本発明の方法によって得られる、細胞を播種した複合骨格にも関する。一般的に、細胞は未分化の、部分的に分化した、又は完全に分化した幹細胞である。一実施形態では、細胞は、骨芽細胞及び間葉性幹細胞からなる群から選択される。
【００３１】
本発明は、本発明による複合骨格を含む骨伝導骨インプラントにも関する。
【００３２】
本発明は、本発明による複合骨格を含む組織工学インプラントにも関する。したがって、本発明の骨格は、その上に組織を工学的に作製することができる基礎を形成することができる。この適用例としては、例えば、それらに限定されないが、軟骨、靭帯、筋肉及び臓器を含む様々な形態の組織が想定される。
【００３３】
本発明は、本発明による複合骨格を含む顎顔面移植骨片代替物にも関する。
【００３４】
本発明は、本発明による複合骨格を含む歯科用移植骨片代替物にも関する。
【００３５】
本発明は、本発明による複合骨格を含む軟骨欠損修復インプラントにも関する。
【００３６】
本発明は、本発明による複合骨格を含む骨軟骨欠損修復インプラントにも関する。
【００３７】
提案されている発明は、骨の２つの主な構成要素、すなわち、ミネラル相、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）及び有機相、コラーゲンから生成される。このように、それは、骨形成を促進するすでに記載の物質のいずれよりも天然の基質である。さらに、ＨＡの高い物理的剛性を、本発明の特定の工程を用いて製造されるコラーゲン骨格の生体適合性、生分解性及び孔構造と組み合わせることによって、優れた圧縮剛性（取扱い及びｉｎ  ｖｉｖｏ充填を容易にするため）並びに高い多孔度、孔相互接続性及び透過性を含む、骨伝導性の骨格として用いるのに要求される全基準を有する製造品が開発されている。
【００３８】
ヒドロキシアパタイトは、セラミック材である。セラミックは、イオン結合及び共有結合を形成する、無機の非金属化合物である。それらは、高い物理的剛性、非常に低い弾性及び硬くてもろい表面を特徴とする。生組織では、ＨＡはコラーゲンと組み合わさって骨の主な構成要素を形成する。物質として、それは、骨ミネラルとの化学的及び結晶的類似性も示す。しかし、純粋なＨＡ構築物は、いくつかの理由、最も著しくは材の剛性、もろい性質及び乏しい再吸収性のために魅力がない［１］。したがって、構築物分解速度の安定性及び制御には問題があり［２］、最適な再吸収、以降の組織内殖及び欠陥部位の物理的統合性の修復を強く阻害するが、それらのすべては移植の成功の重要な決定因子である。
【００３９】
ＨＡと対照的に、本発明の第二の構成要素であるコラーゲンは、移植の成功のために必要とされる生物学的決定因子のすべてをすでに満たす。それは、ヒトの体全体の多数の組織に存在する天然の重合体であり、したがって、優れた生体適合性を示す。その結果、コラーゲンは細胞の接着、増殖及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の形成を促進し、その分解速度は、架橋結合密度を変化させることによってｉｎ  ｖｉｖｏで制御できる。架橋は、コラーゲン分子間の化学結合である。それらは、長いロッド様コラーゲン分子が応力下で互いにスライドすることを阻止することによって、コラーゲンの物理的強度を提供し、コラーゲン線維を安定させる［３］。骨格を分解することができる前に架橋を破壊しなければならないので、架橋はコラーゲン骨格の分解速度を制御する有効な手段でもある。コラーゲン骨格の架橋レベルを増加させる、様々な方法がある。別の重要な属性は、皮膚及び神経再生のために用いられるコラーゲンをベースにした骨格の最近のＦＤＡ承認、及び臨床上の成功である［４］。骨格としてのコラーゲンと関連する主要な欠点は、その固有の物理的強度の欠如である。したがって、本発明は、両構成要素の利点を有し、いずれの欠点も有しない複合三次元構築物を形成するために、コラーゲン及びＨＡを組み合わせる。
【００４０】
実際の構成要素材自体に加えて、骨格製作工程及び以降の構築物の形態は、骨格インプラントのｉｎ  ｖｉｖｏでの成功を決定する上で重要である。本発明の製造は、凍結乾燥／フリーズドライを一般に含む、専門のコラーゲン骨格製作技術の使用を含む。伝統的に、凍結乾燥を用いた多孔性骨格の製造は、スラリーで一緒に混合した構成要素骨格材の急速凍結又は急冷を含んだ。これは、極めて不規則な孔分布及び大きな孔径変動をもたらす。さらに、急冷は作製された孔のアスペクト比を変化させ、全体的に非等軸の孔形を生じる。本発明のフリーズドライ製造工程は、骨格の生存能力の主な形態学的決定因子のすべての包括制御を容易にする。それは、工程の凍結段階及び乾燥段階の間、フリーズドライチャンバー内の温度と圧力を正確に制御することによって行われる。製造工程の間の任意の点での制御されない凍結又は乾燥は、不均一な孔分布、形及びサイズをもたらすことが示されているが、そのすべては播種した細胞の生存能力の重要な決定因子である。制御されたフリーズドライ工程を用いて、多孔性で、再現性のある、均一な、コラーゲンをベースにした骨格を、高い孔相互接続性、空隙率及び表面積で繰り返し製造することができるが、そのすべては骨格及び周囲の宿主組織の中での細胞の大量輸送の成功のために不可欠であり、血管新生及び新組織の内殖のための空間を提供する。さらに、本発明の方法は、構築物孔径の広範な制御を可能にし、細胞特異的機能性を促進する。本開示は、高い空隙率、高い孔相互接続性及びコラーゲンマトリックスの中で均一なＨＡ分布を有する多孔性の三次元骨格をもたらす本発明の工程の使用を通した、複合骨格の製作を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】骨格型の関数としての非ＥＤＡＣ架橋骨格圧縮剛性を示す図である。（コラーゲン＝０．０５Ｍ酢酸に混合したコラーゲン対照骨格、１０ｗｔ％ＨＡ＝０．０５Ｍ酢酸に混合したコラーゲン＋１０重量％ＨＡ、５０ｗｔ％ＨＡ（Ｌ）＝０．１Ｍ酢酸に混合したコラーゲン＋５０重量％ＨＡ、５０ｗｔ％ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したコラーゲン＋５０重量％ＨＡ）。
【図２】骨格型の関数としてのＥＤＡＣ架橋骨格圧縮剛性を示す図である。（コラーゲン＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン対照骨格、５０ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋５０重量％ＨＡ、１００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋１００重量％ＨＡ、２００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋２００重量％ＨＡ）。
【図３】骨格型の関数としての骨格空隙率を示す図である。（コラーゲン＝０．５Ｍ酢酸に混合した非ＥＤＡＣ架橋骨格コラーゲン対照骨格、５０ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合した非ＥＤＡＣ架橋骨格コラーゲン＋５０重量％ＨＡ、１００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合した非ＥＤＡＣ架橋骨格コラーゲン＋１００重量％ＨＡ、２００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合した非ＥＤＡＣ架橋骨格コラーゲン＋２００重量％ＨＡ）。
【図４】骨格型の関数としてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性（ｔ＝７、１４、２１、２８日）を示す図である。すべての骨格で、２，０００，０００個の細胞の初期播種密度を用いた。（コラーゲン＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン対照骨格、５０ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋５０重量％ＨＡ、１００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋１００重量％ＨＡ、２００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋２００重量％ＨＡ）。
【図５】骨格型の関数としてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性（ｔ＝２８日−７日）を示す図である。７日目と２８日目の間の骨格の新しい生物活性（コラーゲン＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン対照骨格、５０ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋５０重量％ＨＡ、１００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋１００重量％ＨＡ、２００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋２００重量％ＨＡ）。
【図６】本発明による複合骨格のＭｉｃｒｏＣＴスキャンを示す図である。
【図７】図６の骨格の断面を示す図である。
【図８】均一で相互接続した多孔構造を鮮明に表す５０重量％ＨＡ骨格ＳＥＭ画像を示す図である。
【図９】図８で明確にされる関心領域のミネラル粒子分布を示す図である。
【図１０】１０倍の倍率による非ＥＤＡＣ架橋５０重量％ＨＡ複合骨格のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１１】１００倍の倍率による非ＥＤＡＣ架橋５０重量％ＨＡ複合骨格のＳＥＭ画像を示す図である。
【図１２】骨格型の関数としての骨格透過性を示す図である。（コラーゲン＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン対照骨格、５０ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋５０重量％ＨＡ、１００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋１００重量％ＨＡ、２００ＨＡ＝０．５Ｍ酢酸に混合したＥＤＡＣ架橋コラーゲン＋２００重量％ＨＡ）。
【図１３】ラット頭蓋冠骨のＸ線並びに欠損の位置及びＣＴスキャン画像のためにとった断面位置を示す概略図を示す図である。
【図１４】空の欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＭｉｃｒｏＣＴスキャン画像を示す図である。
【図１５】ラットＭＳＣ細胞を播種した本発明のＥＤＡＣ架橋５０重量％ＨＡ複合骨格で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＭｉｃｒｏＣＴスキャン画像を示す図である。
【図１６】ラットＭＳＣ細胞を播種した本発明のＥＤＡＣ架橋５０重量％ＨＡ複合骨格で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＭｉｃｒｏＣＴスキャン画像を示す図である。
【図１７】ラットＭＳＣ細胞を播種した本発明のＥＤＡＣ架橋２００重量％ＨＡ複合骨格で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＭｉｃｒｏＣＴスキャン画像を示す図である。
【図１８】ラットＭＳＣ細胞を播種した本発明のＥＤＡＣ架橋２００重量％ＨＡ複合骨格で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＭｉｃｒｏＣＴスキャン画像を示す図である。
【図１９】本発明のＥＤＡＣ架橋５０重量％ＨＡ複合骨格（細胞を播種していない）で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＭｉｃｒｏＣＴスキャン画像を示す図である。
【図２０】本発明のＥＤＡＣ架橋５０重量％ＨＡ複合骨格（細胞を播種していない）で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＭｉｃｒｏＣＴスキャン画像を示す図である。
【図２１】本発明のＥＤＡＣ架橋２００重量％ＨＡ複合骨格（細胞を播種していない）で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＣＴスキャン画像を示す図である。
【図２２】本発明のＥＤＡＣ架橋２００重量％ＨＡ複合骨格（細胞を播種していない）で満たされた欠損を有するラット頭蓋冠骨の断面のＣＴスキャン画像を示す図である。
【００４２】
［本発明の詳細な説明］
本発明の製作
コラーゲン対照骨格及び１０重量％ＨＡ骨格は、実施形態１に記載のプロトコルを用いて、特に０．０５Ｍの初期酢酸濃度を用いて製造した。ＨＡの割合を５０重量％ＨＡまで増加させるに従い、２つの主成分（コラーゲン及びＨＡ）の均一な混合がより問題となった。初期酢酸濃度の増加が、この問題を軽減することが見出された。この増加した酢酸濃度の影響を、酢酸濃度の２つの異なる増加、具体的には０．１Ｍ及び０．５Ｍを用いて調査した。これらの実施形態を、それぞれ実施例２及び３に記載する。ＥＤＡＣ架橋コラーゲン対照骨格並びに５０重量％、１００重量％及び２００重量％のＨＡを有する複合骨格の製造を、実施例４に記載する。
【００４３】
実施例１
４００ｍｌの０．０５Ｍ酢酸溶液（ｐＨ３．０５）を、蒸留した脱イオン水（１．１６ｍｌ氷酢酸を、３９８．８４ｍｌの蒸留した脱イオン水に加えた）を用いて調製した。ＷＫ１２５０水冷系（Ｌａｕｄａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて、４℃の一定温度で１時間ガラス反応容器を冷却した。この反応容器を用いて骨格構成要素を混合し、その間、スラリーを４℃の一定温度に維持した。これにより、混合工程の間の発熱の結果としてのコラーゲン線維の変性が避けられた。
【００４４】
１．８ｇｍのミクロフィブリルウシ腱コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘ社、ＮＪ、ＵＳＡ）を、３２０ｍｌの０．０５Ｍ酢酸溶液に加えた。ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ１８オーバーヘッドブレンダー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）を用いて４℃で９０分間、１５，０００ｒｐｍでこの懸濁液を混合した。酢酸溶液の４０ｍｌを、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粉末（Ｂｉｏｔａｌ、ＵＫ）、特に１０重量％コラーゲン（０．１８ｇｍのＨＡ）と混合した。９０分の時に、この酢酸／ＨＡ溶液の１０ｍｌの一定分量を、冷却反応容器内のコラーゲン／酢酸スラリーに加えた。ＨＡ懸濁液の送達方法は、注射器によるブレンダーの渦中央への注入の直前の、懸濁液の激しい振盪（確実にミネラル粒子の懸濁液が均質となるようにする）を含んだ。ブレンダーの渦中央への直接注入を容易にするために、柔軟なゴム管を注射器ノズルに取り付けた。その後、１０ｍｌの一定分量（全体で３つ）を、１時間ごとにスラリーに加えた。酢酸ＨＡ溶液の最後の一定分量を加えた後、以後の６０分間スラリーを混合し、総混合時間は３３０分間（５時間半）になった。
【００４５】
混合段階が完了した後、スラリーを清潔な広口ビーカーに移動し、約４０００ｍＴｏｒｒの圧力でさらに６０分間減圧脱気した。この段階は、以降のフリーズドライ工程に有害な影響を及ぼす、スラリー中の不要の気泡を除去した。骨格は、凍結乾燥（フリーズドライ）工程を用いて生成した。コラーゲン／ＨＡスラリーの６７．５ｍｌの一定分量を、フリーズドライヤー製造業者（ＶｉｒＴｉｓ社、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）によって供給された、３０４グレードのステンレス鋼製の壁付フリーズドライヤー試料トレイに置いた。試料トレイの内側寸法は、幅１２７ｍｍ×奥行１２７ｍｍ×高さ３８ｍｍであった。トレイベースプレートの厚さは、３ｍｍである。試料トレイをフリーズドライヤーチャンバー内に入れ、２０℃の温度のフリーズドライヤー冷却棚に置いた。
【００４６】
フリーズドライ工程は、過去の試験に基づき一定の冷却速度（０．９℃／分）による、最終凍結温度（４０℃）までのフリーズドライヤーチャンバー及び冷却棚の冷却を含んだ。フリーズドライ工程中の氷晶形態の主な決定因子は、最終凍結温度である。次に、凍結過程を完了するために、棚及びチャンバー温度を６０分間最終凍結温度で一定に保持した。次に、棚温度を１６０分間かけて０℃まで段階的に上昇させた。次に、約２００ｍＴｏｒｒの減圧下で氷相を０℃で１７時間昇華させ、多孔性コラーゲン／ＨＡ骨格を生成した。
【００４７】
次に、多孔性コラーゲン／ＨＡ構築物を真空オーブン（Ｆｉｓｈｅｒ  ＩｓｏＴｅｍｐ  ２０１、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に入れ、脱水熱架橋工程によりコラーゲンを架橋した。骨格を、５０ｍＴｏｒｒの減圧下の真空オーブン中に、１２０℃の温度で２４時間置いた。
【００４８】
実施例２
４００ｍｌの０．１Ｍ酢酸溶液（ｐＨ２．９）を、蒸留した脱イオン水（２．３２ｍｌ氷酢酸を、３９７．６８ｍｌの蒸留した脱イオン水に加えた）を用いて調製した。ＷＫ１２５０水冷系（Ｌａｕｄａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて、４℃の一定温度で１時間ガラス反応容器を冷却した。１．８ｇｍのミクロフィブリルウシ腱コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘ社、ＮＪ、ＵＳＡ）を、３２０ｍｌの０．１Ｍ酢酸溶液に加えた。ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ１８オーバーヘッドブレンダー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）を用いて４℃で９０分間、１５，０００ｒｐｍでこの懸濁液を混合した。
【００４９】
酢酸溶液の４０ｍｌを、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粉末（Ｂｉｏｔａｌ、ＵＫ）、特に５０重量％コラーゲン（０．９ｇｍのＨＡ）と混合した。９０分の時に、この酢酸／ＨＡ溶液の１０ｍｌの一定分量を、冷却反応容器内のコラーゲン／酢酸スラリーに加えた。その後、１０ｍｌの一定分量（全体で３つ）を、１時間ごとにそのスラリーに加えた。酢酸ＨＡ溶液の最後の一定分量を加えた後、以後の６０分間スラリーを混合し、総混合時間は３３０分（５時間半）になった。混合段階が完了した後、スラリーを清潔な広口ビーカーに移動し、約４０００ｍＴｏｒｒの圧力でさらに６０分間減圧脱気した。
【００５０】
骨格は、凍結乾燥（フリーズドライ）工程を用いて生成した。コラーゲン／ＨＡスラリーの６７．５ｍｌの一定分量を、フリーズドライヤー製造業者（ＶｉｒＴｉｓ社、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）によって供給された、３０４グレードのステンレス鋼製の壁付フリーズドライヤー試料トレイに置いた。試料トレイの内側寸法は、幅１２７ｍｍ×奥行１２７ｍｍ×高さ３８ｍｍであった。トレイベースプレートの厚さは、３ｍｍである。試料トレイをフリーズドライヤーチャンバー内に入れ、２０℃の温度のフリーズドライヤー冷却棚に置いた。
【００５１】
フリーズドライ工程は、一定の冷却速度（０．９℃／分）による、最終凍結温度（４０℃）までのフリーズドライヤーチャンバー及び冷却棚の冷却を含んだ。次に、棚及びチャンバー温度を６０分間最終凍結温度で一定に保持した。次に、棚温度を１６０分間かけて０℃まで段階的に上昇させた。次に、約２００ｍＴｏｒｒの減圧下で氷相を０℃で１７時間昇華させた。
【００５２】
次に、多孔性コラーゲン／ＨＡ構築物を真空オーブン（Ｆｉｓｈｅｒ  ＩｓｏＴｅｍｐ  ２０１、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に入れ、脱水熱架橋工程によりコラーゲンを架橋した。骨格を、５０ｍＴｏｒｒの減圧下の真空オーブン中に、１２０℃の温度で２４時間置いた。
【００５３】
実施例３
４００ｍｌの０．５Ｍ酢酸溶液（ｐＨ２．５５）を、蒸留した脱イオン水（１１．６ｍｌ氷酢酸を、３８８．４ｍｌの蒸留した脱イオン水に加えた）を用いて調製した。ＷＫ１２５０水冷系（Ｌａｕｄａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて、４℃の一定温度で１時間ガラス反応容器を冷却した。１．８ｇｍのミクロフィブリルウシ腱コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘ社、ＮＪ、ＵＳＡ）を、３２０ｍｌの０．５Ｍ酢酸溶液に加えた。ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ１８オーバーヘッドブレンダー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）を用いて４℃で９０分間、１５，０００ｒｐｍでこの懸濁液を混合した。
【００５４】
酢酸溶液の４０ｍｌを、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粉末（Ｂｉｏｔａｌ、ＵＫ）、特に５０重量％、１００重量％及び２００重量％のコラーゲン（０．９、１．８及び３．６ｇｍのＨＡ）と混合した。９０分の時に、この酢酸／ＨＡ溶液の１０ｍｌの一定分量を、冷却反応容器内のコラーゲン／酢酸スラリーに加えた。その後、１０ｍｌの一定分量（全体で３つ）を、１時間ごとにスラリーに加えた。酢酸ＨＡ溶液の最後の一定分量を加えた後、以後の６０分間スラリーを混合し、総混合時間は３３０分間（５時間半）になった。混合段階が完了した後、スラリーを清潔な広口ビーカーに移動し、約４０００ｍＴｏｒｒの圧力でさらに６０分間減圧脱気した。
【００５５】
骨格は、凍結乾燥（フリーズドライ）工程を用いて生成した。コラーゲン／ＨＡスラリーの６７．５ｍｌの一定分量を、フリーズドライヤー製造業者（ＶｉｒＴｉｓ社、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）によって供給された、３０４グレードのステンレス鋼製の壁付フリーズドライヤー試料トレイに置いた。試料トレイの内側寸法は、幅１２７ｍｍ×奥行１２７ｍｍ×高さ３８ｍｍであった。トレイベースプレートの厚さは、３ｍｍである。試料トレイをフリーズドライヤーチャンバー内に入れ、２０℃の温度のフリーズドライヤー冷却棚に置いた。
【００５６】
フリーズドライ工程は、一定の冷却速度（０．９℃／分）による、最終凍結温度（４０℃）までのフリーズドライヤーチャンバー及び冷却棚の冷却を含んだ。次に、棚及びチャンバー温度を６０分間最終凍結温度で一定に保持した。次に、棚温度を１６０分間かけて０℃まで段階的に上昇させた。次に、約２００ｍＴｏｒｒの減圧下で氷相を０℃で１７時間昇華させ、多孔性コラーゲン／ＨＡ骨格を生成した。
【００５７】
次に、多孔性コラーゲン／ＨＡ構築物を真空オーブン（Ｆｉｓｈｅｒ  ＩｓｏＴｅｍｐ  ２０１、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に入れ、脱水熱架橋工程によりコラーゲンを架橋した。骨格を、５０ｍＴｏｒｒの減圧下の真空オーブン中に、１２０℃の温度で２４時間置いた。
【００５８】
実施例４
４００ｍｌの０．５Ｍ酢酸溶液（ｐＨ２．５５）を、蒸留した脱イオン水（１１．６ｍｌ氷酢酸を、３８８．４ｍｌの蒸留した脱イオン水に加えた）を用いて調製した。ＷＫ１２５０水冷系（Ｌａｕｄａ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて、４℃の一定温度で１時間ガラス反応容器を冷却した。１．８ｇｍのミクロフィブリルウシ腱コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｍａｔｒｉｘ社、ＮＪ、ＵＳＡ）を、３２０ｍｌの０．５Ｍ酢酸溶液に加えた。ＩＫＡ  Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ１８オーバーヘッドブレンダー（ＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）を用いて４℃で９０分間、１５，０００ｒｐｍでこの懸濁液を混合した。
【００５９】
酢酸溶液の４０ｍｌを、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粉末（Ｂｉｏｔａｌ、ＵＫ）、特に５０重量％、１００重量％及び２００重量％のコラーゲン（０．９、１．８及び３．６ｇｍのＨＡ）と混合した。９０分の時に、この酢酸／ＨＡ溶液の１０ｍｌの一定分量を、冷却反応容器内のコラーゲン／酢酸スラリーに加えた。その後、１０ｍｌの一定分量（全体で３つ）を、１時間ごとにスラリーに加えた。酢酸ＨＡ溶液の最後の一定分量を加えた後、以後の６０分間スラリーを混合し、総混合時間は３３０分（５時間半）になった。混合段階が完了した後、スラリーを清潔な広口ビーカーに移動し、約４０００ｍＴｏｒｒの圧力でさらに６０分間減圧脱気した。
【００６０】
骨格は、凍結乾燥（フリーズドライ）工程を用いて生成した。コラーゲン／ＨＡスラリーの６７．５ｍｌの一定分量を、フリーズドライヤー製造業者（ＶｉｒＴｉｓ社、Ｇａｒｄｉｎｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）によって供給された、３０４グレードのステンレス鋼製の壁付フリーズドライヤー試料トレイに置いた。試料トレイの内側寸法は、幅１２７ｍｍ×奥行１２７ｍｍ×高さ３８ｍｍであった。トレイベースプレートの厚さは、３ｍｍである。試料トレイをフリーズドライヤーチャンバー内に入れ、２０℃の温度のフリーズドライヤー冷却棚に置いた。
【００６１】
フリーズドライ工程は、一定の冷却速度（０．９℃／分）による、最終凍結温度（４０℃）までのフリーズドライヤーチャンバー及び冷却棚の冷却を含んだ。次に、棚及びチャンバー温度を６０分間最終凍結温度で一定に保持した。次に、棚温度を１６０分間かけて０℃まで段階的に上昇させた。次に、約２００ｍＴｏｒｒの減圧下で氷相を０℃で１７時間昇華させ、多孔性コラーゲン／ＨＡ骨格を生成した。
【００６２】
次に、多孔性コラーゲン／ＨＡ構築物を真空オーブン（Ｆｉｓｈｅｒ  ＩｓｏＴｅｍｐ  ２０１、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）に入れ、脱水熱架橋工程によりコラーゲンを架橋した。骨格を、５０ｍＴｏｒｒの減圧下の真空オーブン中に、１２０℃の温度で２４時間置いた。
【００６３】
ＤＨＴ架橋手順に従い、架橋剤としてエチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）を用いて、骨格を化学的に架橋した。骨格１グラムにつき６ｍｍｏｌ  ＥＤＡＣの濃度のＥＤＡＣを、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと５：２のモル比（ＥＤＡＣ：ＮＨＳ＝５：２）で混合した。このＥＤＡＣ／ＮＨＳ溶液に骨格を浸し、室温で２時間インキュベートした。その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用いて骨格を２回洗浄し、ＰＢＳを攪拌するために回転振盪機を用いてＰＢＳ中で２時間インキュベートした。
【００６４】
複合骨格の特徴づけ
本研究の目的で、作製されたすべてのコラーゲン／ＨＡ骨格を、本研究室で用いられる標準プロトコルを用いて、特に０．５Ｍの酢酸溶液で作製され、４０℃の最終凍結温度まで一定の冷却速度で凍結乾燥されたコラーゲン製の対照骨格と比較した。
【００６５】
１．物理的剛性
骨欠損部へ移植後に確実に生存するように、移植骨片代替物は、影響を受ける欠損部位内で荷重を通してそれが受ける力に耐えるのに十分な内在性強度を有しなければならない。荷重欠損部への移植を可能にするのに十分な内在性強度を有する骨伝導性の移植骨片代替物を特注製作する能力が、この研究の主要目標であった。両材料の利点のすべてを有するがそれらの欠点のいずれも有しない移植骨片代替物を開発するために、複合技術を用いることにより、極めて生体適合性の高いコラーゲンベースの構築物をより強いセラミックヒドロキシアパタイトと組み合わせる。すべての試験は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液で水和した骨格で実施した。骨格試料の圧縮試験は、５−Ｎ負荷セルを付けたＺｗｉｃｋ物理試験機を用いて実施した。丸い金属やすりで研いだ革用パンチを用いて、直径８ｍｍ（高さ４ｍｍ）の試料をシートから切り出した。次に、２４ウェル培養プレートでの試験の１時間前に、試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で前水和した。試験プロトコルは、２サイクルから、すなわち、事前調整サイクル及び試験サイクルからなった。どちらのサイクルでも、０．１５ｍＮの前負荷を加え、位置を１分間保持した。この力が選択されたのは、それが試験前に試料を圧縮することなく確実に試料と接触させるのに十分に低かった（１０％の歪み時に負荷の０．５％）からである。骨格の高さを測定するために、この前負荷時の頭部の位置を用いた。水和された骨格を乾燥プラテン上に置き、次に、頭部を下げる前にそれを沈めた。頭部と骨格の間でバブルを捉えないように注意した。事前調整のために、試料を５％まで負荷した。試験のためには、骨格を１０％まで負荷し、脱負荷した。１分につき１０％の歪み速度を用いた。試験後、ノギスを用いて試料の直径を３つの別個の位置で測定した。モジュラスは、２〜５％の歪みにわたる応力−歪曲線への線形適合度の傾きと定義された。
【００６６】
図１は、ＨＡを非ＥＤＡＣ架橋骨格に加えることの圧縮剛性に及ぼす影響を示す。５０重量％ＨＡの添加は、非拘束圧縮での物理的試験で測定された圧縮剛性をかなり増加させることが見出された。コラーゲン骨格生成物対照と比較して、ほぼ３００％の圧縮剛性の増加が見られた。特に興味があったものは、構築物中へのＨＡの組込み効率に及ぼす酢酸濃度の影響であった。これは、標準のコラーゲンスラリー中へ１０重量％のＨＡを組み込むこと、また、それに応じる酢酸濃度の増加をさせないことによる剛性の比較的小さな増加を説明すると考えられる。結論として、わずか５０重量％のＨＡを加えることで、３倍を超える剛性の増加が達成され、酢酸濃度の小さな調整によって、比較的少ない量のＨＡの添加で構築物の剛性の最大の増加を達成することができる。したがって、このことは、将来の研究でしかるべく初期酢酸濃度を変化させることによって、加えるＨＡの割合のかなりの増加を可能にする。
【００６７】
図２は、ＨＡをＥＤＡＣ架橋骨格に加えることの圧縮剛性に及ぼす影響を示す。ベースライン骨格であるコラーゲンは、図１の０．２ｋＰａから図２の約１．５ｋＰａに剛性が増加する。意図通りＨＡの添加はまだ骨格の剛性を増加させるが、５０重量％ＨＡなどより少ない量のＨＡでは、ＥＤＡＣ架橋の影響がこれに勝る。しかし、２００重量％ＨＡでは、前と同様に剛性のかなりの増加が見られる。ＨＡのすべての量の添加は、架橋骨格の生体適合性態様をかなり改善することがわかり、これらを下記のセクション５及び７で述べる。
【００６８】
２．発明空隙率
多孔性骨格の空隙率は、開放した多孔性空間で構成される骨格体積の割合の、百分率で表される尺度である。より簡略には、それは多孔性構築物の空隙容積率である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの、細胞に出入りする栄養素／老廃物の拡散には、高い骨格空隙率が必要とされる。人工組織骨格の開発における主な制約の１つは、栄養送達及び構築物の中央からの老廃物の除去がないことから生じるコア分解の問題である。その結果、骨格中央の無血管壊死のために、移植後、構築物はしばしば失敗する。本発明のコラーゲンベースの骨格の大きい利点の１つは、それらの高い空隙率である。骨格空隙率は、質量秤を用いた、乾燥した８ｍｍ、４ｍｍの深さの骨格試料の精密測定によって判定した。円柱の容積の式πｒ２ｈを用い、質量を容積で割ることによって各試料の密度を計算した。空隙率は、式１００−［１００（ρ骨格／ｐ材料）］を用いて計算し、上式で、ρ骨格は所与の試料の密度であり、ρ材料は骨格構成要素の加重密度である（すなわち、ρ１０重量％ＨＡ骨格＝［ｍコラーゲン＋ｍ１０重量％ＨＡ］／［ｍコラーゲン／ρコラーゲン＋ｍ１０重量％ＨＡ／ρ１０重量％ＨＡ］）
【００６９】
構築物へのＨＡの添加は骨格空隙率の低下をもたらしたが、図３からわかるように、これは絶対的には無視できた。したがって、本発明の骨格は、以降の細胞増殖を促進するために骨格中心への細胞の移動を向上させるために非常に高い空隙率を保持しながら、ＨＡを構築物に組み込む。このことは、下記に示すｉｎ  ｖｉｖｏ動物研究データで真実であることが示された。
【００７０】
具体的には、実際に生じた骨格中の空隙率の範囲は、純粋なコラーゲンで９９．５％から２００重量％ＨＡ骨格で９９％の範囲である。
【００７１】
３．ミネラル構造
骨格全体へのミネラル粒子の分布は、定量化が困難なパラメータ／属性である。それは、視覚化する方がずっと簡単な属性であり、したがって、保護する値域を規定するのが困難である。それは、２つの異なる方法を用いて視覚化した。１つ目は、下の図６に示すｍｉｃｒｏＣＴであった。この分析で用いるｍｉｃｒｏＣＴスキャナは、ミネラル組織を検出するためにＸ線を用いる。したがって、図６は、１００重量％ＨＡ骨格中のミネラル粒子だけを示す。コラーゲンを可視化できないことがわかると、ミネラル粒子は骨格全体に完全に、均一に分布していることがわかる。骨格が９９％空であるならば、この画像は、ＨＡがコラーゲン線維と緊密に関連している確証を示す。図７は、別の視点から見た分布を図示する、同じ骨格の二次元の断片を示す。
【００７２】
図８及び９は、異なる画像化ツールである走査電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）を用いた、５０重量％ＨＡ骨格全体のミネラル粒子の分布を図示する。両画像は、５０重量％ＨＡ骨格中の同じ関心領域を示す。図８は、コラーゲン及びＨＡの両相を示す。ミネラル粒子は、肉眼では区別できない。しかし、エネルギー分散型Ｘ線分析を用いて、同一の関心領域（ＲＯＩ）についてミネラル粒子を検出することができる。これは、図９でミネラル粒子を表す白色のピクセルとして示される。ｍｉｃｒｏＣＴデータと一緒に、これらの画像は、ミネラル粒子が骨格全体に均等、均一に分布し、コラーゲン支柱と緊密に関連していることを決定的に証明する。
【００７３】
４．孔相互接続性
孔相互接続性は、生体物質で主に構成される骨格で定量的に規定するのが非常に困難な、別の重要な骨格属性である。しかし、孔相互接続性は、骨格の透過性に強く関係する。透過性については下記で述べるが、流れの伝導度は空隙率、孔径及び孔相互接続性に一緒に依存する。したがって、透過性は、孔径及び空隙率が規定されるときの孔相互接続性の指標を与える。
【００７４】
本発明の骨格のＳＥＭ画像は、容易に見ることができる極めて高いレベルの孔相互接続性を図示するために提供される。図１０は、１０倍の倍率における５０重量％ＨＡ骨格、及び明らかに相互接続した表面の多孔構造を示す。これは、そのような試料からとられた薄切片を用いて同一であることが示されている。図１１は、１００倍の倍率における同じ５０重量％骨格を示す。この画像は、孔相互接続性を図示する。この倍率では、多孔構造は決定的に相互接続している。
【００７５】
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性
インキュベーションの７、１４、２１及び２８日後に骨格中のＭＣ３Ｔ３Ｅ１骨芽細胞の増殖を定量化することによって、コラーゲン骨格へのＨＡの添加の影響を評価した。骨格へのＨＡの添加は、細胞活性にいかなる有害な影響も及ぼさないことが見出された。実際、その反対が真であることが、播種から２８日後に見出された。２００重量％ＨＡにＨＡの割合を増加させることは、対照の純粋なコラーゲン骨格よりもさらに細胞増殖を促進することが見出された。図４は、骨格上に保持される細胞の絶対数を示す。
【００７６】
見てわかるように、５０重量％ＨＡ骨格は、実験的制限のために、かなりより少ない数の細胞を保持した。したがって、図４は、生物活性の最良の指標を与えない。したがって、図５は、２８日目に骨格型中に残された正味の平均細胞数を図示する。細胞増殖の５００，０００個の正味の減少が純粋なコラーゲン構築物で見られ（約２０％の減少）たが、純粋なコラーゲン構築物は骨芽細胞に好ましいが最適化されていないことを考慮すると、それは驚くべきことである。しかし、５０重量％、１００重量％及び２００重量％のＨＡの添加は、それぞれ約５００％、５０％及び３０％の細胞増殖の増加をもたらした（図４）。
【００７７】
６．発明透過性
多孔性骨格の透過性は、本質的にはその多孔媒体を通しての圧力下のフロー伝導度である。高い骨格透過性はｉｎ  ｖｉｖｏでの骨格の長期生存度のために必須であるが、その理由は、細胞が骨格中心に移動することをそれが可能にし、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を促進するからである。５０重量％、１００重量％及び２００のＨＡ骨格は、対照コラーゲン骨格と比較してかなり増加した平均組織透過性を示した。このことはこの研究の驚くべきことであるがプラスともなる知見であったが、その理由は、ＨＡの添加が骨格全体への流体の流れを実際に支援することをそれが示すからである。多孔性骨格を通してのフロー伝導度のこの増加は、骨格剛性の増大に起因すると考えられる。骨格透過性を定量化するために用いられる実験プロトコルが、参考文献で詳述されている［５］（Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００７、Ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．２、７〜１０頁）。
【００７８】
７．ｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験
骨中の危機的に大きな欠損の骨形成及びミネラル化を促進する本発明の可能性を判定するために、小動物試験を実施した。試験では、９頭のウィスターラットを用いた。危機的に大きな欠損を、ラット頭蓋冠に形成した。対照として、１頭の動物を空の欠損のまま残した。他の８頭の動物を群に分けた。具体的には、欠損のうちの４つには５０重量％ＨＡ骨格を満たし、そのうちの２つにはラット間葉性幹細胞（ＭＳＣ）を播種し、２つは播種せずにそのままにした。これは、既製の骨格型に対する組織工学による骨格型の可能性を調査するためであった。残りの４つの欠損試料には２００重量％ＨＡ骨格を満たし、同じく、播種するものと播種しない骨格にこれらの４つを均等に分割した。ラット頭蓋冠中で２８日後に、動物を屠殺し、頭蓋冠骨を取り出した。欠損中の骨格の存在を調査し、治癒過程、骨形成及びミネラルマトリックス生成に及ぼす骨格型の影響を観察するために、ｍｉｃｒｏＣＴを用いてこれらを処理、分析した。以下のセクションの図は、空欠損ラットからとられた二次元の断面を示す。断面は、頭蓋冠骨を通しての冠状断面であった。欠損は直径５ｍｍで、完全に円形であった。ｍｉｃｒｏＣＴデータに示す断面は、図１３の下の略図で表す。
【００７９】
空の欠損（図１４）
空欠損動物のデータは、欠損が治癒過程の一部として線維状軟組織で満たされていることを示した。これは予想されたことであり、本発明者らの組織工学グループで以前に行われた動物試験で見られている。２８日間の試験後、欠損全体のいくつかの点で高密度材の小粒子が空の欠損中で観察されたが、これらは滅多に観察されず、空の欠損試料中でかなりの治癒を示すのに十分高密度ではなかった。これらの例を、下記で示すｍｉｃｒｏＣＴ  Ｘ線像に示す。
【００８０】
５０重量％播種１（図１５）
５０重量％ＨＡ細胞播種骨格は、より有望な結果を示した。これらの骨格には、移植前にラット間葉性幹細胞を播種した。下の代表的なｍｉｃｒｏＣＴ  Ｘ線像からわかるように、多少ミネラル化した材料の小さな不均一なポケットが、欠損−骨境界面の周辺だけでなく骨格中心にも見られた。空欠損データと比較してこれらのミネラル化ポケットの有意により多くの数の例が見られ、それらは、空欠損で見られる例と比較してそれらの強度はより明るいようであった。
【００８１】
５０重量％播種２（図１６）
本発明者らの第二の細胞播種５０重量％ＨＡ骨格は、第一の細胞播種５０重量％ＨＡ骨格及び、したがって空の欠損と比較して大きく向上した結果を示した。かなりミネラル化した組織のかなりの例が、骨格で満たされた欠損全体を通して数点で見られた。これは、骨格骨境界面の周辺で特に明白であった。ミネラル化のレベルは、周囲の骨で見られるものほど高くなかったが、非常に類似していた。これは、骨格で満たされた欠損中に見られるミネラル化組織、及び周囲の骨のそれのほとんど同一の強度レベルとみなすことができる。
【００８２】
２００重量％播種１（図１７）
第一の細胞播種２００重量％ＨＡ骨格は、５０重量％ＨＡ骨格と比較して、かなり向上した結果を示した。欠損全体で試験したほとんどすべての点において、欠損の周辺から骨格で満たされた欠損中心までずっとかなりのレベルのミネラル化が見られた。この試料では、ミネラル化のレベルは、骨格で満たされた欠損中のミネラル化粒子の画像強度における相対差によって表される、周囲の骨組織のそれほど高くなかった。
【００８３】
２００重量％播種２（図１８）
第二の細胞播種２００重量％ＨＡ骨格は、前のすべての骨格と比較して、かなり向上した結果を示した。欠損全体で試験した相当数の領域において、欠損の周辺から骨格で満たされた欠損中心までずっとかなりのレベルのミネラル化が見られた。第一の２００重量％ＨＡ細胞播種骨格と異なり、形成されたミネラル化組織は本質的に粒子状でなかったが、骨格が満たされた欠損全域にわたって連続的であった。最も興味深いことに、この連続的ミネラル化は、欠損の最も広い部分で見られた。この試料では、ミネラル化のレベルは、骨格で満たされた欠損中のミネラル化物質の類似した画像強度によって表される、周囲の骨組織のそれとほぼ同一であった。
【００８４】
５０重量％非播種１（図１９）
５０重量％ＨＡ骨格についての無細胞骨格で満たされた欠損の結果は、細胞播種５０重量％ＨＡ骨格に非常に類似していた。かなりミネラル化した組織が、骨格で満たされた欠損全体に見られたが、本質的に連続的でなかった。しかし、ミネラル化した組織の強度は、細胞播種試料で見られたものよりわずかに高かった。これは、後に続くすべての細胞非播種試料で見られ、無細胞構築物がｉｎ  ｖｉｖｏでより優れた性能を発揮することができることを示した。
【００８５】
５０重量％非播種２（図２０）
この５０重量％ＨＡ細胞非播種試料は、他のすべての５０重量％ＨＡ試料に類似した結果を示した。２８日の試験の後、骨格ミネラル化の開始の証拠が骨格で満たされた欠損の周辺及び中心で見られたが、ミネラル化組織は連続的でなかった。しかし、ミネラル化粒子の強度は、周囲の骨のそれに類似したミネラル化を示した。
【００８６】
２００重量％非播種１（図２１）
２００重量％ＨＡ細胞播種試料で見られたように、非播種２００重量％ＨＡ試料は欠損全体の相当数の領域において、骨格で満たされた欠損の周辺及び中心でかなりのレベルのミネラル化を示した。このミネラル化組織は、５０重量％ＨＡ試料で見られたものと異なり、本質的に連続的であった。
【００８７】
２００重量％非播種２（図２２）
前の２００重量％ＨＡ細胞非播種試料で見られたように、この非播種２００重量％ＨＡ試料は欠損全体の相当数の領域において、骨格で満たされた欠損の周辺及び中心でかなりのレベルのミネラル化を示した。このミネラル化組織は、５０重量％ＨＡ試料で見られたものと異なり、本質的に連続的であった。
【００８８】
本発明は、本明細書に記載の実施形態に限定されない。このように、本明細書で記載の本発明の３つの実施形態は、同じコア製作プロトコルを用いて可能な骨格変異体総数の一部分を表す。構成要素自体又は特定の実施形態の段階若しくは工程のステップを変更して、出願の特定の使用のために最適化された様々な構築物を生成することができる。考えられる変形形態には以下のものが含まれる。
【００８９】
酢酸濃度：初期コラーゲンスラリー中の酢酸濃度は、特定の用途に合うように変更することができる。濃度を増加させることは、混合スラリー中でＨＡ粒子のより迅速で均一な組込みを促進する。さらに、この濃度は、骨格の物理特性及び生体適合性にもかなりの影響を及ぼす。これらの影響については、上記のセクション「発明の特徴づけ」で詳細に述べられている。好適には、酢酸濃度は、０．０５Ｍ〜５Ｍの間で変更することができる。
【００９０】
コラーゲン量：コラーゲン量は、初期コラーゲンスラリー中で変更することができる。コラーゲン量を増加させることは、生じる骨格の物理的剛性の増大をもたらす。これは、骨格生体適合性にもかなりの影響を及ぼす。好適には、コラーゲン量は、酢酸溶液の０．５ｇ／Ｌから５０ｇ／Ｌ（標準コラーゲン濃度のそれぞれ１／１０及び１０倍）まで変化させることができる。
【００９１】
ヒドロキシアパタイト量：ＨＡの量は、製造前に骨格スラリーの中で、コラーゲンの割合と比較して、指定された範囲内で変化させることができる。具体的には、好適にはＨＡの量は、用いるコラーゲンの量の１０から１０００重量パーセントまで変化させることができる。ＨＡ含有量を増加させることは、製造された骨格の物理的剛性をかなり増加させることが見出された。
【００９２】
ヒドロキシアパタイト型：本発明は、ＨＡ粉末の焼結形態、非焼結形態、及び他の形態を用いて製造することができる。
【００９３】
ヒドロキシアパタイト添加：スラリーの２つの主な構成要素の混合を促進するために、ＨＡ一定分量体積及び注射間隔を変化させることができる。一般に、注射間隔は、３０分から最高２４０分まで変化させることができる。さらに、好適には、一定分量の体積を１ｍｌから最高１００ｍｌまで変化させることができる。そのような自由は、任意の特定の発明実施形態の最適化を容易にする。
【００９４】
ヒドロキシアパタイト粒径：一般的に、特定の用途に合わせるために、ＨＡ粒径を１０ｎｍから最高１００μｍまで変化させることができる。
【００９５】
最終凍結温度：フリーズドライ工程の間に到達する最終凍結温度は、製造される骨格中の平均孔径を決定する。この最終凍結温度を変化させて、特定の用途又は細胞型に特異的である様々な平均孔径を有する骨格を生成することができる。好適には、最終凍結温度は、−１０℃から−７０℃まで変化させることができる。
【００９６】
凍結境界面：実施形態のスラリーとフリーズドライヤー冷却棚との間の凍結境界面は、変化させることができる。凍結境界面の型は、スラリー／骨格に出入りする熱エネルギー伝達に影響を及ぼし、最終骨格の孔構造を変化させることができる。４つの主な選択肢、特に、金属（１）、プラスチック（２）、薄い高分子膜（３）で作られた明確な境界面の壁に囲まれた容器又は境界面なし（４）の容器が利用可能である。
【００９７】
凍結速度：凍結速度はフリーズドライ工程の間、コラーゲン／ＨＡスラリー内の氷晶核形成の速度を決定し、孔形成工程の均一性を制御する。冷却速度は、スラリーとフリーズドライヤー冷却棚（例えば金属、プラスチック、なし）との間で可能な各種の境界面のために、凍結工程を最適化するために変更される。一般的に、凍結速度は、０．０１℃／分から１０℃／分まで変化させることができる。
【００９８】
アニーリング：アニーリング段階は、フリーズドライ工程で使用することができ、最終凍結温度を単独で変化させることによって達成できる孔径よりかなり大きな平均直径を有する孔の生成を可能にする。アニーリング時間は、１５分間から３６時間まで変化させることができる。アニーリング時間が長いほど、最終平均孔径はより大きい。
【００９９】
骨格架橋法：架橋方法は、本質的に脱水熱の又は化学的な、考えられる数の技術の１つであってもよい。さらに、両技術を連続して使用することができる。具体的な架橋選択肢には、グルタルアルデヒド、カルボジイミド（ＥＤＡＣ）、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴｇａｓｅ）、脱水熱架橋（ＤＨＴ）及び紫外線（ＵＶ）が含まれる。
【０１００】
骨格架橋温度／濃度：凍結乾燥した骨格コラーゲンは、脱水熱手段で架橋して、骨格の物理的剛性を増大させることができる。架橋温度は１０５℃から１８０℃まで変化させることができ、対応して実施形態の剛性が増大する。さらに、化学架橋方法を用いる場合、架橋溶液の濃度を変化させて化学架橋の程度を変更することができる。
【０１０１】
骨格架橋時間：骨格全体の架橋過程の程度を変化させるために、架橋曝露時間を変更することもできる。これを２４時間と１２０時間の間で変化させて、骨格の最終的な物理仕様を変更することができる。
【０１０２】
参考文献
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［６］  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，  Ｆ．Ｊ．；  Ｈａｒｌｅｙ，  Ｂ．Ａ．；  Ｗａｌｌｅｒ，  Ｍ．Ａ．；  Ｙａｎｎａｓ，  Ｉ．Ｖ；  Ｇｉｂｓｏｎ，  Ｌ．Ｊ  ａｎｄ  Ｐｒｅｎｄｅｒｇａｓｔ，  Ｐ．Ｊ．  （２００７）  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ  ｏｎ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｉｎｖｉｔｅｄ  Ａｒｔｉｃｌｅ  （１５）：３−１７．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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