(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号７又は配列番号８を含む請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
保存的置換によって別のアミノ酸残基で各々最大３残基置換された配列番号２又は配列番号４の修飾配列を含み、前記修飾ポリペプチドは非修飾ポリペプチドと比較して生物学的特性に有意な影響を及ぼさないことを特徴とし、
前記生物学的特性は、
（ａ）ＩＬ−１７、ＩＮＦ−γ、及びＴＮＦ−αから選択される一つ以上のサイトカインを分泌するためにヒト末梢白血球（ｐＷＢＣ）を刺激すること、
（ｂ）Ｕ９３７急性骨髄性白血病細胞及びＰＣ３前立腺癌細胞から選択される生存癌細胞の有意な減少を起こすこと、及び、
（ｃ）インビボでＵ９３７細胞の腫瘍の増殖を抑えること、
から選択される、単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号５及び配列番号６から選択された配列からなる単離核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項６】
細胞性免疫反応の活性化に関連する疾患、感染性疾患、急性及び慢性炎症性疾患、癌、自己免疫性疾患、及び糖質代謝障害の群から選択される疾患を治療するための、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
癌が白血病；前立腺癌；急性リンパ性白血病；及び急性骨髄性白血病を含む、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
配列番号４をコードする核酸配列の単離核酸分子又は配列番号５若しくは配列番号６の核酸配列により表される単離核酸分子を含む物質との接触を含む、特定のヒトＤＮＡ及びｃＤＮＡ配列の特定方法。
【請求項９】
配列番号７又は配列番号８からなる単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質及びその治療上の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトに影響を及ぼす疾患は、それらの原因機序により分類され得る。例えば、免疫学的要素又は病因を有する疾患としては、感染性疾患、急性及び慢性炎症性疾患、癌、移植及び自己免疫性疾患が挙げられる。
【０００３】
自己免疫性疾患の例としては、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性ブドウ膜強膜炎、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、膵島炎、シェーグレン症候群、自然流産、実験的自己免疫性心筋炎、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、狼瘡（ＳＬＥ）、乾癬及び糖尿病（特にＩ型）が挙げられる。
【０００４】
自己免疫性疾患の追加例としては、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性形成不全貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂質血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、軸索および神経細胞ニューロパチー、Ｂａｌ病、Ｂｅｈｎｅｔ病、水疱性類天疱瘡、心筋ミオパチー、キャッスルマン病、セリアック病（非熱帯性）、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性ポリニューロパチー（ＣＩＤＰ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素疾患、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト疾患、本態混合性クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、皮膚筋炎、デビック病、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、溶血性貧血、ヘノッホ・シェ−ライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫調節リポタンパク質、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（I型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発動脈炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、骨関節炎、回帰性リウマチ、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、免疫脳脊髄炎、有害な貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ型自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心筋切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、精子および精巣自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、トローザハント症候群、横断性脊髄炎および壊死性ミエロパシー、潰瘍性大腸炎、未分化型結合組織病（ＵＣＴＤ）、脈管炎、水泡性皮膚病、白斑及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０００５】
癌の種類の例としては、限定しないが、副腎皮質癌、悪性メラノーマ、非メラノーマ皮膚癌、皮膚反応性Ｔ細胞リンパ腫、カポジ肉腫、膀胱癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、神経管外胚葉及び松果体癌、小児脳幹神経膠腫、小児小脳アストロチトーム、小児脳アストロチトーム、小児髄芽腫、小児視路グリオーマ、髄膜腫、混合性神経膠腫、乏突起膠腫、アストロチトーム、上衣細胞腫、下垂体腺腫、転移性腺癌、聴神経腫、傍脊椎悪性奇形腫、乳癌、腺管癌腫、乳腺腫瘍、卵巣癌、カルチノイド腫瘍、子宮頚管癌、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、妊娠性栄養膜癌、卵管癌、子宮肉腫、白血病、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟組織肉腫、ウィルムス腫瘍、ファンコーニ貧血、ランゲルハンス細胞組織球症、腎臓の悪性横紋筋様腫瘍、肝臓癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、絨毛癌腫、内分泌癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、消化管癌、胃腸癌、泌尿生殖器癌、神経膠腫、女性生殖器癌、頭頸部癌、肝細胞癌、下咽頭癌、膵島細胞癌、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、リンパ腫、男性乳癌、メラノーマ、中皮腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非メラノーマ皮膚癌、食道癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、腎細胞癌腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、扁平上皮細胞癌腫、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌、栄養膜癌、子宮癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌腫、肛門癌、骨癌、腸癌、腺管癌腫、脂肪肉腫、神経芽細胞腫、腎芽腫及び骨肉腫が挙げられる。
【０００６】
炎症性疾患としては、敗血症、内毒素血症、膵炎、ブドウ膜炎、肝炎、腹膜炎、角膜炎、ＳＩＲＳ及び損傷誘発性炎症が挙げられる。
【０００７】
生殖能力に関連する疾患としては、男性不妊症及び女性不妊症が挙げられる。
【０００８】
男性不妊症は、様々な障害によって生じ得る。より一般的な障害のいくつかを下記に挙げる。
【０００９】
・精子産生不足：男性不妊症の９０％は、十分な精子を産生出来ないことにより生じる。無精子症は精子がまったく産生されなかった場合に起こり、一方、精子減少症は精子がほとんど産生されない場合に診断される。ほとんどの精子が卵細胞に到達前に破壊されるため、精子が多いほど卵細胞の受胎に成功する可能性が高くなる。しかし、男性の有する精子が健康であり、適切に形成され、且つ可動である場合、精子数が少ないこと又は精子総数が５百万／ｍＬ未満であることは必ずしも男性が不妊であることを意味しない。
【００１０】
・精索静脈瘤：２つの精索のうち１つの周囲の精索静脈瘤は、精巣内鬱血を起こし得る、これは、続いて、この場所の温度を高める。より高い温度は精子産生を低減し、不妊症に至らせ得る。幸いなことに、本障害は外科手術によって治療し得る。
【００１１】
・他の障害：男性不妊症を起こし得る他の障害としては、精巣の発育異常又は損傷（内分泌障害又は炎症により起きる）、付属腺障害、性交障害、男性生殖器官における嚢胞の原因となる１９５０年代及び１９６０年代に使用された合成エストロゲンであるジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）への曝露、停留精巣、並びに稀なケースでは染色体異常などの遺伝的障害が挙げられる。
【００１２】
女性不妊症も様々な問題によって起こされ得る。より一般的な障害のいくつかを下記に挙げる。
【００１３】
・多嚢胞卵巣疾患：本疾患は女性における排卵障害の最も一般的な原因であり、卵巣内の多数の微小嚢胞の存在、アンドロゲン過剰産生、及び過少月経（ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｐｅｒｉｏｄｓ）（過少月経（ｏｂｌｉｏｍｅｎｏｒｒｈｏｅａ））又は無月経（ａｂｓｅｎｔ  ｐｅｒｉｏｄｓ）（無月経（ａｍｅｎｏｒｒｈｏｅａ））により特徴付けられる。排卵機能不全は女性不妊症の最も一般的な原因であり、明白な理由なく、又はストレス、ホルモン不均衡、及び生殖系の様々な疾患及び障害（いくつかは下記に記載する）の結果として生じ得る。
【００１４】
・骨盤内炎症性疾患：本生殖器官感染症は卵管の閉塞又は損傷に到り得、通常、性感染症、流産、中絶、分娩、又は子宮内避妊器具によって起こされる。
【００１５】
・排卵機能障害：本障害は、年齢、ホルモン不均衡、又は他の障害のために女性の卵巣が卵細胞を産生しないとき又は通常より少ない卵細胞を産生するときに生じる。
【００１６】
・子宮筋腫：これらの良性子宮腫瘍は女性の４０％に生じ、胚の着床又は胎児の成長に干渉し得る。
【００１７】
・子宮内膜症：本障害は、子宮の内側を覆う組織（子宮内膜）が増殖して子宮外（通常、卵巣、卵管、及び子宮を支える靱帯、膣と直腸間の領域、子宮外表面、骨盤腔内面、膀胱、腸、膣、頚部、外陰、及び腹部の外科的瘢痕内における）の腫瘍又は病巣となる場合に生じる。本組織は月経周期と同期して、毎月蓄積し、壊れ、そして剥がれ落ちる。しかし残念ながら、体外への排出手段はない。その結果、内出血、病巣由来の血液及び組織の崩壊、並びにほとんどの場合、疼痛、不妊、瘢痕組織形成、癒着、及び腸障害を起こし得る炎症を引き起こす。
【００１８】
・免疫性不妊症：本障害は女性のシステムがパートナーの精子を破壊する抗精子抗体を産生するときに生じる。
【００１９】
糖質代謝障害は多くの形で生じる。最も一般的な障害は後天性である。後天性又は続発性糖質代謝異常、例えば糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性昏睡、及び低血糖症などは、すべて中枢神経系に影響を及ぼす。末梢神経疾患の多くの形及び変異形もまた糖尿病において見られる。その他の糖質代謝障害は稀な先天性代謝異常（すなわち遺伝的欠損）である。
【００２０】
糖質代謝の後天性障害は、米国において及び国際的にかなり一般的である。アルコール依存症及びインスリン治療を受けている糖尿病患者において、低血糖症は神経疾患、特に急性精神機能低下、記憶喪失、失見当識、知覚鈍磨、及び昏睡の一般的な原因である。他の原因による高インスリン血症は稀であるが、膵臓腫瘍は原因となり得る。様々な神経合併症を伴う糖尿病は、成人患者において治療される最も一般的な障害の１つである。糖尿病性ケトアシドーシスは、教育及び精密な医学的追跡調査によって、数十年前よりも一般的ではなくなっているが、未だに生じる。高浸透圧性昏睡も、Ｐｌｕｍ及びＰｏｓｎｅｒによる伝統的モノグラフであるＤｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｕｐｏｒ  ａｎｄ  Ｃｏｍａ（知覚麻痺及び昏睡の診断）によって初めて内科医の注目を浴びたときほど問題ではなくなっている。高浸透圧性昏睡は未だに生じ、昏迷患者の評価中に留意する必要がある。
【００２１】
糖質代謝の遺伝的障害は稀である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）複合体の重度欠陥及び五炭糖尿症と呼ばれる良性化学的異常がごくわずかな患者（２〜６人）において報告されてきている。
【００２２】
低血糖症、糖尿病性ケトアシドーシス、及び高浸透圧性昏睡はすべて潜在的に致死的だが、潜在的に治療可能な疾患である。
【発明の概要】
【００２３】
ＫＴＰＡＦ５０と名付けられた新規タンパク質が新規ｃＤＮＡに基づき現在見出されている。該ｃＤＮＡによってコードされたペプチドは７４アミノ酸の長さであり、そのＮ末端上に２４アミノ酸のシグナルペプチドを含む。ＫＴＰＡＦ５０のｃＤＮＡ配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）は下記のとおりである：
【００２４】
ａｔｇｃｃａｇｇｃ  ｃａｔｔｃｔａｇｇ  ｃｔｔｃｔｇｔｃｔ  ａｔｃｃｔｇｇｔｔ  ｔｃｔｇｇｔｃｔｇ  ｔｇｃｇｔｔｇｔｇ  ｇｇｔａｇｃａｇｃ  ａｔｔｇｇｃｇｔａ  ｔｔａｃｇｃｃｇｇ  ａｇｇｇａｇｃａｇ  ｇｃｔｇａｇｃｇａ  ｇｇｃｔｃｃａｇａ  ａｇｇｔｇｃｇｃａ  ａｔａｇｃｃｇｇａ  ｇａｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｔｇｃｔｇ  ｔｃａｃｃｔａｇｃ  ｃｃｃｃｔｃｃｃｔ  ｇａｇａｃｔｃｃａ  ｔｔｃａｇｃｃｃａ  ｇａａａａａｇｇａ  ｇｃｔｇｃｔｔｔｃ  ｔｃｃｃｃｃａｔｃ  ｔａｃｃｃｔａｇｇ  ａｇａａａａ（配列番号１）
【００２５】
ＭＰＧＨＳＲＬＬＳＩＬＶＳＧＬＣＶＶＧＳＳＩＧＶＬＲＲＲＥＱＡＥＲＧＳＲＲＣＡＩＡＧＥＥＲＡＭＬＳＰＳＰＬＰＥＴＰＦＳＰＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ（配列番号２）
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、本発明は配列番号１の核酸分子及び配列番号２のペプチドを提供する。配列番号２のポリペプチドは本明細書において「完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド」と表す。
【００２７】
完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチドは２４アミノ酸で構成されると考えられるシグナル配列も含む。したがって、本発明は、下記配列（配列番号４）からなる、シグナルペプチドを含まない完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド配列を含むペプチドも提供する：
【００２８】
ＬＲＲＲＥＱＡＥＲＧＳＲＲＣＡＩＡＧＥＥＲＡＭＬＳＰＳＰＬＰＥＴＰＦＳＰＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ（配列番号４）
【００２９】
シグナル配列（配列番号４）を欠くＫＴＰＡＦ５０ペプチドは本明細書において「ＫＴＰＡＦ５０ペプチド」又は「ＫＴＰＡＦ５０」と表す。
【００３０】
また、本発明はＫＴＰＡＦ５０ペプチドをコードする配列を含む核酸分子も提供する。これは下記配列（配列番号３）を含む：
【００３１】
ｔｔａｃｇｃｃｇｇ  ａｇｇｇａｇｃａｇ  ｇｃｔｇａｇｃｇａ  ｇｇｃｔｃｃａｇａ  ａｇｇｔｇｃｇｃａ  ａｔａｇｃｃｇｇａ  ｇａｇｇａａａｇｇ  ｇｃｇａｔｇｃｔｇ  ｔｃａｃｃｔａｇｃ  ｃｃｃｃｔｃｃｃｔ  ｇａｇａｃｔｃｃａ  ｔｔｃａｇｃｃｃａ  ｇａａａａａｇｇａ  ｇｃｔｇｃｔｔｔｃ  ｔｃｃｃｃｃａｔｃ  ｔａｃｃｃｔａｇｇ  ａｇａａａａ（配列番号３）
【００３２】
本発明は、配列番号１又は配列番号３の修飾核酸分子および配列番号２又は配列番号４の修飾ペプチドも提供する。その場合、非修飾分子と比較して修飾分子の生物学的特性に有意な影響を及ぼさずに、１つ以上のヌクレオチド又はアミノ酸残基がそれぞれ付加、欠失又は置換される。
【００３３】
「ペプチド」という用語は本明細書において、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を指すために使用される。ペプチドは、遺伝子工学的方法、宿主細胞内発現、又は他の任意の適した手段を通して合成的に得られる。別段の定めがない限り、ペプチドは通常、天然に生じるＬ−アミノ酸からなる。
【００３４】
「生物学的特性」という用語は、ペプチド分子に関して、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドによって発揮され得るインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）効果の少なくとも１つを発揮するペプチドの能力を指し、限定しないが、本明細書に記載された生物学的活性を含む。例えば、生物学的特性としては、癌、免疫系関連疾患、ウイルス性疾患及び炎症性疾患の治療能力が挙げられる。「生物学的特性」という用語は、核酸分子に関して、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドの生物学的特性に類似した生物学的特性を有するペプチドをコードする特性を指し、該特性としては、特に、（ｉ）遺伝暗号の冗長性によって、配列番号１又は配列番号３の配列とは異なる配列を有するが、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドをそれぞれコードする核酸分子、及び（ｉｉ）完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドとは異なる配列のアミノ酸分子をコードするが、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドそれぞれの生物学的特性と類似した生物学的特性を有するアミノ酸分子をコードする核酸分子、とが挙げられる。
【００３５】
「非修飾分子と比較して修飾分子の生物学的特性に有意な影響を及ぼさない」という用語は、非修飾分子の生物学的特性に定性的に類似した生物学的特性を保持する修飾分子を示すことを意味する。修飾ペプチドに関して、これは配列番号２又は配列番号４のペプチドの生物学的特性の１つ以上を保持することを意味し、特に下記のように、本明細書に記載されたそのインビトロ及びインビボ活性と同様に、その診断的及び治療的適用を含む。ペプチドが非修飾分子に類似した生物学的活性を定性的に保持するか決定するために、１つ以上の試験、例えば並行して試験された、対応する非修飾ペプチド（すなわち完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチド）と修飾ペプチドを比較するインビトロ、インビボ又は臨床的実験、又は修飾ペプチドが、別に行った実験によって分かった非修飾ペプチドの生物学的効果に類似した生物学的効果を有するかどうか調べるために検討した実験、を実行し得る。そのような実験は、例えば、下記の実施例に記載された方法で実行され得る。修飾核酸分子に関して、「非修飾分子と比較して修飾分子の生物学的特性に有意な影響を及ぼさない」という用語は上記の任意の特徴の修飾ペプチドをコードする特性を示す。
【００３６】
修飾ペプチドは、ＫＴＰＡＦ５０ペプチドにおいて少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は少なくとも４５アミノ酸残基の対応配列と一定の同一性を有する少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は少なくとも４５アミノ酸残基の連続配列を含むペプチドを含み得、一定の同一性とは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％及び特に好ましくは少なくとも９５％である。
【００３７】
本発明は、少なくとも８アミノ酸残基を含む完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチドからの一部の連続配列を含むペプチドをさらに提供し、該連続配列は前記の完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチドにおける連続配列として含まれる。そのようなペプチドは、本明細書において「一部のＫＴＰＡＦ５０ペプチド」と表す。一部のＫＴＰＡＦ５０ペプチドの例としては、限定しないが、下記実施例ＶＩに記載された配列番号７及び配列番号８が挙げられる。
【００３８】
本発明は、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド、ＫＴＰＡＦ５０ペプチド、修飾ペプチド又は一部ＫＴＰＡＦ５０ペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド（そのようなタンパク質又はポリペプチドは本明細書において「ＫＴＰＡＦ５０含有タンパク質」と表す）をさらに提供する。該ＫＴＰＡＦ５０含有タンパク質は、例えば、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド、ＫＴＰＡＦ５０ペプチド、修飾ペプチド又は一部のＫＴＰＡＦ５０ペプチドを含む融合タンパク質の場合がある。また、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド、ＫＴＰＡＦ５０ペプチド、修飾ペプチド又は一部のＫＴＰＡＦ５０ペプチドを伴う、タンパク質又は他のペプチド又はポリペプチドとの複合体である場合などがある。
【００３９】
本発明は、（ｉ）配列番号１に含まれる連続する２４核酸配列を含み得る、少なくとも８アミノ酸残基を含むＫＴＰＡＦ５０ペプチドの一部の連続配列をコードするオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にて配列番号１のヌクレオチド配列へハイブリダイズし得るヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％及び特に好ましくは少なくとも９５％の配列番号１に含まれる連続するヌクレオチド配列に対応する配列と一定の同一性を示す、少なくとも２４連続ヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドも提供する。
【００４０】
本発明は、核酸分子、例えば上記の任意の核酸分子を含むトランスファーベクター又は発現ベクターも提供する。
【００４１】
また、本発明は、上記に定義した任意のペプチドから派生した修飾ペプチド、例えば、保存的置換によって１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸に置換された修飾ペプチドも提供する。本明細書で使用されるように、「保存的置換」とは、同一クラスのアミノ酸による１つのクラスのアミノ酸置換を示し、該クラスは一般的な物理化学的なアミノ酸側鎖の特性及び自然界で見出される相同タンパク質における高頻度の置換によって定義される。アミノ酸側鎖は、クラスＩ（Ｃｙｓ）、クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）、クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）、クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）、及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む６つの一般的なクラスに分類される。例えば、Ａｓｐを、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕなどの他のクラスＩＩＩの残基に置換することは保存的置換である。
【００４２】
一実施形態では、アミノ酸配列において置換は１つのみ行われる。別の実施形態では、２つの置換が行われる。さらなる実施形態では、３つの置換が行われる。置換の最大数は、置換されていない配列における少なくとも７０％、望ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を残すようにし、そのアミノ酸数を超えるべきではない。好ましい一実施形態では、他によって置換されたアミノ酸残基を最大３つ、時に、最大６つ含む置換は保存的置換である。
【００４３】
さらなる実施形態では、１つ以上のアミノ酸をＤ−アミノ酸、好ましくは対応するＤ−アミノ酸によって置換し得る。好ましい実施形態では、全アミノ酸がＤ−アミノ酸である。
【００４４】
さらなる実施形態では、上記配列の逆順配列も本発明に含まれる。
【００４５】
したがって、本発明は、１つ以上の保存的置換によって修飾した配列番号２の完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド又は好ましくは配列番号４のＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はその一部ＫＴＰＡＦ５０配列も提供する。
【００４６】
したがって、少なくとも１０、又は１５、又は２０、又は２５、又は３０、又は３５、又は４０アミノ酸残基又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドの完全な配列を含むペプチドを提供する。
【００４７】
本発明はまた、ＫＴＰＡＦ５０ペプチド、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド、一部のＫＴＰＡＦ５０ペプチド、修飾ペプチド若しくはＫＴＰＡＦ５０を含むタンパク質又は上述した任意の核酸分子を使用した、治療方法、診断方法及び医薬組成物をも含む。治療方法、診断方法及び医薬組成物は、上記の背景の部に挙げた１つ以上の疾患及び障害に対して使用し得る。
【００４８】
本発明による医薬組成物としては、薬学的に許容可能な担体と組み合わせたＫＴＰＡＦ５０ペプチド、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド、一部のＫＴＰＡＦ５０ペプチド、修飾ペプチド若しくはＫＴＰＡＦ５０を含むタンパク質又は上述した任意の核酸分子が挙げられる。
【００４９】
「薬学的に許容可能な担体」という用語によって、有効成分に反応しない不活性、無毒性材料の任意の１つを意味する。担体は時々、製剤の望ましい剤形に基づき選択される。担体は時々、薬物安定性の改良、クリアランス率の遅延化、徐放特性の付与、望ましからぬ副作用の低減など、標的組織までの有効成分の送達又は浸透を改良する効果を有する場合がある。担体は食用香味剤などと共に製剤化するため、剤形を安定させる物質（例えば保存料）でもよい。担体は従来使用されている任意のものでよく、溶解度及びポリペプチドとの反応性欠如などの物理化学的考慮、及び投与経路によってのみ限定される。担体は添加剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存料、香料剤、及び薬理学的に適合する担体を含んでよい。加えて、担体は予測可能な方法で有効成分の作用に影響を及ぼす物質と定義されるアジュバントでよい。担体の典型例としては、（ａ）水、生理食塩水、天然果汁、アルコール、シロップなどの、希釈剤に有効量の活性物質が溶解されている溶液、（ｂ）カプセル（例を挙げると、例えば界面活性剤、滑剤及び不活性の増量剤を含む、普通の硬膜又は軟膜のゼラチン型）、錠剤、薬用キャンディー（該活性物質は、スクロース及びアカシア又はトラガカントなどの香味剤の中、又は該活性物質はゼラチン及びグリセリンなどの不活性な基剤の中である）及びトローチであり、各々は所定量の活性剤を固体又は顆粒として含む、（ｃ）粉末、（ｄ）適切な液体中の懸濁液、（ｅ）適切な乳剤、（ｆ）リポソーム製剤、などが挙げられる。
【００５０】
ＫＴＰＡＦ５０ペプチドの潜在的診断適応及び治療適応は下記の１つ以上を含み得る。
【００５１】
１．ＫＴＰＡＦ５０は、異なる生物由来の毒素の皮下注射後の免疫能力欠如の診断手段としての役割を果たし得る。
【００５２】
２．血中ＫＴＰＡＦ５０レベル検査は、免疫系活性レベルの指標としての役割を果たし得る。
【００５３】
３．ＫＴＰＡＦ５０レベルは、自己免疫性疾患の指標としての役割を果たし得る。
【００５４】
４．ＫＴＰＡＦ５０は免疫系の刺激剤としての役割を果たし得る。例えば、ＫＴＰＡＦ５０は細菌、寄生生物及びウイルス毒素に対する免疫能力欠如の治療に使用し得る。
【００５５】
５．ＫＴＰＡＦ５０はアレルギー性及び炎症性応答を低減する治療手段として利用し得る。例えば、ＫＴＰＡＦ５０は喘息又はその症状の発生を低減するために使用し得る。
【００５６】
６．ＫＴＰＡＦ５０はＡＩＤＳ及び合併免疫不全などの免疫不全疾患を治療する治療手段として使用し得る。
【００５７】
７．ＫＴＰＡＦ５０はグルコース代謝障害を治療する治療手段として使用し得る。
【００５８】
９．ＫＴＰＡＦ５０は他のいくつかの疾患の治療に使用し得る。例えば、ＫＴＰＡＦ５０はＢＤＩ、筋無力症、多発性硬化症、糖尿病Ｉ型、関節リウマチ、系統的狼瘡、強皮症、慢性自己免疫性溶血性貧血、結腸炎及びクローン病などの自己免疫性病変を治療する免疫系の抑制剤としての役割を果たし得る。
【００５９】
１０．ＫＴＰＡＦ５０は、肺癌、喉頭癌腫、頭頸部及び乳癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、乳癌、肝細胞癌、メラノーマなどの癌疾患を治療する免疫系刺激剤としての役割を果し得る。
【００６０】
１１．ＫＴＰＡＦ５０は高齢者若しくは若年者又は免疫不全の者の免疫応答を高め得る。
【００６１】
１２．ＫＴＰＡＦ５０は男性不妊症又は女性不妊症治療のための治療手段として用いられ得る。
【００６２】
１３．ＫＴＰＡＦ５０は異なる免疫反応の一般的な刺激剤又は阻害剤としての役割を果たし得、また心臓及び肺などのような他の臓器に直接的又は間接的に影響を及ぼし得る。
【００６３】
１４．ＫＴＰＡＦ５０は免疫系から特定細胞を特定して細胞療法用に使用するプローブとしての役割を果たし得る。
【００６４】
１５．ＫＴＰＡＦ５０又はその一部をコードする核酸配列は、特定のヒトＤＮＡ及びｃＤＮＡ配列を特定するプローブとしての役割を果たし得る。
【００６５】
上記の診断適応及び治療適応のために、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド、一部のＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０を含むタンパク質、又はその修飾ペプチドも使用し得る。
【００６６】
発明を理解し、実際にどのように実行できるかを見るために、ここで実施例のみに限定しない形で、付属の図面を参照して実施形態を下記のとおり記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＫＴＰＡＦ５０の提示した濃度（ｎｇ／ｍＬ）で処理したヒト末梢白血球由来のＩＬ−１７（ｐｇ／ｍＬ）分泌を示すグラフである。
【図２】ＫＴＰＡＦ５０の提示した濃度（ｎｇ／ｍＬ）で処理したヒト末梢白血球由来のＩＮＦ−γ（ｐｇ／ｍＬ）分泌を示すグラフである。
【図３】ＫＴＰＡＦ５０の提示した濃度（ｎｇ／ｍＬ）で処理したヒト末梢白血球由来のＴＮＦ−α（ｐｇ／ｍＬ）分泌を示すグラフである。
【図４】ＫＴＰＡＦ５０濃度（ｎｇ／ｍＬ）関数としての生存細胞％（対照量に標準化した）を示す棒グラフである。
【図５】免疫細胞傷害性応答に関連する様々な種類の細胞における一定のＫＴＰＡＦ５０  ｍＲＮＡ誘導を示す棒グラフである。
【図６】処理群（▲）及び未処理群（■）（対照）のヌードマウスのＵ９３７腫瘍体積（ｍｍ３）を時間関数として示すグラフである。
【図７】ＫＴＰＡＦ５０ペプチド及びその画分の濃度（ｎｇ／ｍＬ）関数としての生存細胞％（対照量に標準化した）を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６８】
【実施例１】
【００６９】
新規ｃＤＮＡがヒトｃＤＮＡライブラリより単離された。
ＲＴ−ＰＣＲ分析のために下記プライマーを使用した。
５’  −  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  −  ３’（配列番号５）
５’  −  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＣＴＡ  ＧＧＧ  ＴＡＧ  ＡＴＧ  ＧＧ  −  ３’（配列番号６）
【００７０】
下記ＰＣＲ条件を使用した。
９５℃を２分間
下記を４０サイクル：
９５℃を４５秒間
５９℃を４５秒間
７２℃を５分間
最終サイクル：
７２℃を５分間
ＰＣＲ産物をシーケンシングした。
アガロースゲル上のＰＣＲ分析及びＣｙｂａｒ  Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）による染色後、ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃ分析器を用いてＰＣＲ産物の強度を評価した。結果は下記のとおりである：
【表１】
0005595282.tif 000002
【表２】
0005595282.tif 000003
【表３】
0005595282.tif 000004
【表４】
0005595282.tif 000005
【００７１】
ｃＤＮＡの発現が見られ得る主な組織は、腎臓、膵臓、精巣及び胎盤である。興味深いことに、産物は白血球においても発現し、該発現は細胞の活性化に関連して変化した。
【実施例２】
【００７２】
様々な疾患におけるＫＴＰＡＦ５０の潜在的効果を決定するために、ＫＴＰＡＦ５０をヒト末梢白血球（ｐＷＢＣ）と共にインキュベートし、サイトカインのパネル量を測定した。
【００７３】
ＫＴＰＡＦ５０は、Ａｎａｓｐｅｃ社によって化学的に合成された。
【００７４】
ＰＨＡ含有培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  ＩＮＣ−カタログ番号−０１−２０１−１）（２ｍＬ培地中２百万細胞／ウェル）内で総ヒト白血球を培養した。該細胞を図に提示した濃度のＫＴＰＡＦ５０で３日間処理した。対照細胞は処理しなかった。
【００７５】
３日目、培地を採取し、ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社のキットを用いて、ヒトＩＬ−１７（カタログ番号：８８−７１７６）、ヒトＩＮＦ−γ（カタログ番号：８８−７３１６）及びヒトＴＮＦ−α（カタログ番号：８８−７３４６）のＥＬＩＳＡ分析を行った。結果を図１、２及び３に要約する。
【００７６】
ＫＴＰＡＦ５０がｐＷＢＣを刺激し、測定した全３サイトカインを分泌することが見られる場合がある。ＩＬ−１７の分泌は、ＫＴＰＡＦ５０が炎症促進の役割を有し得ることを示す。ＩＮＦ−γの分泌は、ＫＴＰＡＦ５０が抗ウイルス、抗癌及び炎症促進の役割を有し得ることを示す。ＴＮＦ−αの分泌は、ＫＴＰＡＦ５０が免疫系を刺激する役割を有し得ることを示す。
【実施例３】
【００７７】
癌に対するＫＴＰＡＦ５０の効果をさらに決定するために、ＫＴＰＡＦ５０を癌細胞株と共にインキュベートした。
【００７８】
Ｕ９３７急性骨髄性白血病細胞及びＰＣ３前立腺癌細胞を１０％ＦＣＳ＋ＲＰＭＩ培地で増殖させ、９６ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで四重に播種した。
【００７９】
ＫＴＰＡＦ５０を１日間、細胞と共にインキュベートし、レサズリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）及び分光光度計を用いて生存細胞を検出した。結果を図４に提示する。
【００８０】
ＫＴＰＡＦ５０が、２種類の癌由来の生存細胞の有意な減少を起こすことが見られる場合がある。
【実施例４】
【００８１】
免疫応答におけるＫＴＰＡＦ５０の役割をさらに調べるために、様々な免疫細胞傷害性細胞におけるＫＴＰＡＦ５０の存在を決定した。
【００８２】
下記の細胞のヒトｃＤＮＡライブラリをＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した。
１．単球−静止期（Ｒ）及び活性化（Ａ）単球（細胞はＬＰＳ又はＰＨＡを用いて活性化した）
２．ＣＤ８−Ｒ及びＡ細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞
３．ＣＤ１９−Ｒ及びＡ  ＣＤ１９  Ｂ細胞
４．ＣＤ４−Ｒ及びＡ  ＣＤ４  Ｔヘルパー細胞
【００８３】
これらの細胞におけるＫＴＰＡＦ５０  ｍＲＮＡの定量分析をＫＴＰＡＦ５０の特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ法によって実行した。結果を図５に要約する。
【００８４】
Ｂ細胞の活性化がＫＴＰＡＦ５０の発現の減少を引き起こす一方、単球及び細胞傷害性Ｔ細胞の活性化が、ＫＴＰＡＦ５０の発現の有意な増加をもたらす場合がある。Ｔヘルパー細胞の活性化又は非活性化は、ＫＴＰＡＦ５０の発現に対して無効であった。したがって、ＫＴＰＡＦ５０は、細胞の免疫応答の活性化のマーカーとして、及びＴＨ１対Ｔｈ２経路を識別するために用いてよい。
【実施例５】
【００８５】
癌細胞におけるＫＴＰＡＦ５０の効果はインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも試験した。
【００８６】
８〜９週齢の１４匹の胸腺欠損雌ヌードマウスをＨａｒｌａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｓｒａｅｌから購入した。マウスに１５ｘ１０６個のＵ９３７細胞を皮下注射により接種した。腫瘍は増殖し始め、９日目にマウスを２群に分けた。
・生理食塩水を注射した対照群。
・ＫＴＰＡＦ５０を注射した処置群（２５μｇ／マウス）
【００８７】
２０日目に、対照群マウス４匹が巨大な腫瘍を有していたため、倫理上の理由から屠殺した。結果を図６に提示する。
【００８８】
顕著な結果は、ＫＴＰＡＦ５０が完全に腫瘍の増殖を抑えたことを示す。
【実施例６】
【００８９】
完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチドを活性に必要とするか判断するため、上記実施例ＩＩＩに記載された実験を、Ｕ９３７細胞を使用して、完全なＫＴＰＡＦ５０ペプチド及びその断片を用いて反復した。
下記ＫＴＰＡＦ５０ペプチドを使用した。
Ａ−ＫＴＰＡＦ５０ペプチド（５０アミノ酸）
Ｂ−ＫＴＰＡＦ５０のＮ末端３６アミノ酸（ＬＲＲＲＥＱＡＥＲＧＳＲＲＣＡＩＡＧＥＥＲＡＭＬＳＰＳＰＬＰＥＴＰＦＳＰ）（配列番号７）
Ｃ−ＫＴＰＡＦ５０のＣ末端１４アミノ酸（ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ）（配列番号８）
【００９０】
結果を図７に要約する。
【００９１】
ＫＴＰＡＦ５０画分が、ＫＴＰＡＦ５０ペプチドに類似した抗癌活性を有することが見られる場合がある。
【図１】
0005595282.tif 000006
【図２】
0005595282.tif 000007
【図３】
0005595282.tif 000008
【図４】
0005595282.tif 000009
【図５】
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【図６】
0005595282.tif 000011
【図７】
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