(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物から調製される抗新生物抽出物の精製された主成分のうちの１つまたは該成分の組み合わせを含み、前記主成分が、イソスウェルチアジャポニン（（７−Ｏ−メチルオリエンチン）２”−Ｏ−β−アラビノピラノシド）およびオリエンチン２”−β−アラビノピラノシドである、抗新生物用組成物。
【請求項２】
植物がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育され、植物組織のポリフェノール含量を増加させる物理的または化学的プロセスで処理される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
物理的プロセスがＵＶ照射である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
植物に対して、４５〜７５μＷ／ＵＶ照射ｃｍ２を２時間行なう、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
化学的プロセスが塩溶液中でのインキュベーションである、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
塩溶液が２〜４Ｍ  ＮａＣｌである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
植物を前記溶液に３０分間浸漬する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
患者における癌細胞の増殖を防止するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
患者における癌細胞の生長の増殖を防止するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
患者に経口投与する、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
細胞が大腸癌細胞である、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞が肝臓癌細胞である、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が錠剤であり、該錠剤が５００ｍｇの前記抽出物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
錠剤が、５００ｍｇの前記抽出物、Ｄ−グルコース一水和物５９７．６ｍｇ、クロスカルメロースナトリウム３５．２ｍｇ、微結晶性セルロース１６０．０ｍｇ、無水クエン酸３５．２ｍｇ、顆粒化ソルビトール１６０．０ｍｇ、アスパルテーム２８．８ｍｇ、サッカリンナトリウム１４．４ｍｇ、ジベヘン酸グリセロール１６．０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム６．４ｍｇ、およびオレンジ香料４６．４ｍｇを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
組成物が錠剤であり、該錠剤が７．５ｇの前記抽出物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
錠剤が、７．５ｇの前記抽出物、噴霧乾燥マンニトール７１．０ｇ、微結晶性セルロース１５．０ｇ、クロスカルメロースナトリウム３．０ｇ、グリシルリチン酸アンモニウム０．３ｇ、アスパルテーム１．０ｇ、Ｌ−メントール０．２ｇ、ミント香料１．０ｇ、およびステアリン酸マグネシウム１．０ｇを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
組成物がペレット剤であり、該ペレット剤が９００ｇの前記抽出物を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
ペレット剤が、９００ｇの前記抽出物、８００ｇの微結晶性セルロース、１２ｇのコロイド状二酸化ケイ素、６８４ｇの塩化ナトリウムおよび３６ｇの塩化カリウムを含む、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトに使用するための、具体的には癌状態および腫瘍状態を治癒および予防するための、治療用化合物の供給源としての天然抽出物に関する。より具体的には、本発明は、癌を予防するためのナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）由来の抽出物、該抽出物の組成物、および該抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、先進国では第２の死亡原因である。この疾患の発生率の増加は、国民の余命の増加と比較して同傾向にあるので、この病理には、大きな医学的かつ社会的な関心が払われている。世界で最も一般的な５つのタイプの癌は、肺癌、胃癌、乳癌、結腸直腸癌、および子宮癌である。
【０００３】
癌の発生率および死亡率は、多くの国々で増加してきた。世界保健機関（ＷＨＯ）によれば、毎年１０００万人を超える人々が癌に罹患する。その数は、毎年２．４％ずつ増加して２０２０年までに年間１５００万人になると予想される。
【０００４】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）の特定症例では、世界で毎年約１００万例の新規症例および５０万例の死亡例が発生し、世界の死亡率は８．１人／１００，０００人である。このタイプの癌は、より先進的な地域で多く見られ（２５．１人／１００，０００人）、欧州および米国では癌の第２の死亡原因になっている。米国単独では毎年１３０，０００例を超える新規症例および欧州では３７０，０００例を超える新規症例が診断されている。アルゼンチンでは、新規症例の数は、米国で発生する数と同程度である。
【０００５】
チリでは、癌は、第２の死亡原因である。腸癌は、この病理の死亡例の４６．２％を占める。その数のうち、結腸直腸癌は、第３位の死亡原因であり、頻度が絶えず増加し続けている。この疾患の死亡率は、１９９０年〜２００３年の期間で有意な上昇傾向を示した。
【０００６】
結腸直腸癌に罹患した患者の７０％近くは、外科的切除を受けなければならないが、３０％〜４０％は、再発を起こす。肝臓は、ＣＲＣ転移が最も頻発する部位であり、肝転移の完全切除が唯一の選択肢の治癒法である。しかしながら、手術は、診断の時点で患者のわずか２０％で可能であるにすぎず、５年間の平均生存率は、化学療法を行っても２５％〜４０％である。
【０００７】
実際のＣＲＣ治療は、疾患の進行した段階では有効でない。第一選択の治療の一部としてＥｒｂｉｔｕｘやＡｖａｓｔｉｎのような最新の医薬を投与された転移性結腸直腸癌の患者の平均生存率は、わずか１５〜２０．５ヵ月間にすぎない。このことは、患者の生存の可能性を増大させるためのより有効な療法を探索する必要性を実証する。
【０００８】
一方、結腸内視鏡検査は、前癌性病変の検出および除去を可能にする唯一のスクリーニングである。しかしながら、この検査は、患者の準備および不便ならびに患者の不快感の観点から、非常に煩雑である。したがって、比較的初期のＣＲＣ診断は、稀なイベントであり、治癒の可能性がより大きい疾患の第１期では、患者のわずか９％が検出されるにすぎない。したがって、栄養医薬化合物を用いてＣＲＣの発症を予防する可能性は、きわめて重要である。
【０００９】
一方、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica Desv.）は、南極地方に集落を形成することに成功した２種の顕花植物のうちの１つである。それは、南方のいくつかの海洋島に見いだされ、南極地方の南極半島および沖合の島に限られる。この分類群は、厳しい条件で生存し続けるように適応してきた。不利な南極の環境でのこのイネ科草本の生存に関与する可能性がある特性としては、細胞外の氷に対する耐性、０℃で最適光合成の３０％を保持する光合成器官、およびフルクタンおよびサッカロースとしての炭水化物の蓄積が挙げられる。南極地方は、維管束植物の成長に不利な地域である。ナンキョクコメススキ（D. antarctica）は、夏季にのみ生育するにすぎない。この時季には、光合成有効放射量（ＰＡＲ）は、２０００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１に達する可能性があり、かつ温度は、通常−２〜５℃である。
【００１０】
ヒトに使用するための治療用化合物の供給源としての天然物に関する研究は、８０年代にそのピークに達した。１９８１年〜２００２年に市場に導入された８７７種の小分子のうちの４９％は、天然物またはその合成誘導体に由来した（Newman, DJ; J. Nat. Prod. 66: 1002-1037 (2003)）。それにもかかわらず、天然物に関する薬学的研究は、過去１０年間でわずかな減少を示した。これは、本質的には、コンビナトリアルライブラリーの開発および分子生物学の進歩に基づく新規化合物の探索によるものであり、そのような探索が、表皮増殖因子受容体を標的とすることが意図されたＩｒｅｓｓａ／Ｉｍａｎｉｔｉｂのような「洗練された」化学分子の設計につながった。しかしながら、近年の経験から、天然物に由来する化合物に対する製薬会社の関心が復活してきた。なぜなら、そうした化合物は、いかなる合成品または組換えライブラリーよりも多くのキラル中心および立体的複雑性を有することが実証されてきたからである（Free M.J. Chem. Inf. Comput. Sci. 43: 218-227 (2003)）。この失敗の主な理由は、組換えライブラリーでは、本質的に化学的利用可能性に基づいて化合物が探索されるが、増大する化学的多様性の点で制約があることである（Martin Y.C.J. Comb. Chem.1:32-45 (1999)）。
【００１１】
果物および野菜の摂取が結腸直腸癌をはじめとする種々の癌の危険性を低減する有益な効果があることを示唆する文献が存在する。Ｋａｕｒらは、ブドウ種子果実の化学予防効果を示すデータを提供している（Kaur M, Clin Cancer Res 12(20): 6194-6202 (2006)）。Ｌｕらは、肺癌に及ぼす緑茶の化学予防効果を示唆するデータを示している（Lu Y, Cancer Res. 66 (4): 1956-1963 (2006)）。コンビナトリアルケミストリーでの予測に合致しない化学予防効果を有する天然成分の提供から、天然化合物に対する薬学的関心が復活してきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Newman, DJ; J. Nat. Prod. 66: 1002-1037 (2003)
【非特許文献２】Free M.J. Chem. Inf. Comput. Sci. 43: 218-227 (2003)
【非特許文献３】Martin Y.C.J. Comb. Chem.1:32-45 (1999)
【非特許文献４】Kaur M, Clin Cancer Res 12(20): 6194-6202 (2006)
【非特許文献５】Lu Y, Cancer Res. 66 (4): 1956-1963 (2006)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、一般に発生する癌疾患の予防および治癒に役立ちうる天然の化合物および抽出物の必要性が常に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、集団の中で高い発生率を有する疾患の治癒および予防に役立つ抗新生物活性を有する化合物を含有する天然抽出物を包含する。特に、天然物を記載するが、該天然物は、南極大陸で高放射線に耐えて生存するように適応した生物から抽出されるものである。
【００１５】
本発明は、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）由来の新規な抗新生物抽出物および該抽出物の取得方法を提供する。
【００１６】
本発明は、癌細胞の増殖を予防するための天然の抗新生物抽出物を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、天然の抗新生物抽出物の活性複合体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、既存の癌状態を有する患者を治療するための組成物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）組織中の抗新生物化合物の量を増大させる方法およびそれに応じて植物組織の化合物を抽出する方法を提供する。
【００２０】
またさらに、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物から抗新生物抽出物を取得する方法を提供する。
【００２１】
そのうえさらに、本発明は、抗新生物製剤の材料用としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで栽培されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物を準備する方法を提供する。
【００２２】
したがって、本発明はまた、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）の抽出物または該抽出物の成分を含む抗新生物製剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＵＶ−Ｖｉｓ２００〜４００ｎｍスペクトル図を示す。（Ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏで採取されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物。（Ｂ）いかなる処理も施すことなくｉｎ  ｖｉｔｒｏで栽培されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物（対照）。
【図２】ＮａＣｌ溶液で処理されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の植物のＵＶ−Ｖｉｓ２００〜４００ｎｍスペクトル図を示す。（Ａ）２Ｍ  ＮａＣｌ、（Ｂ）３Ｍ  ＮａＣｌ、および（Ｃ）４Ｍ  ＮａＣｌ。
【図３】ＵＶ線で処理されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の植物のＵＶ−Ｖｉｓ２００〜４００ｎｍスペクトル図を示す。（Ａ）４５μＷ／ｃｍ２、（Ｂ）７０μＷ／ｃｍ２。
【図４】大腸癌細胞（ＨＴ２９およびＬｏＶｏ）、肝臓癌細胞（Ｈｅｐ３Ｂ）、および対照細胞（ｗｉ３８）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に及ぼす１００μｇ／ｍｌの濃度でのナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）の抽出物画分の効果を示す。ＧＣＢ１、ＧＣＢ２、およびＧＣＢ３は、南極産のナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物の３種の異なる採取物の抽出物に対応する。抽出物は、水を用いて調製し、次に乾燥させ、そしてメタノール中に溶解させたものである。対照は、添加された抽出物を含有しておらず、メタノール対照は、乾燥水性抽出物を溶解させるために使用したのと同じくメタノールを５％含有する対照である。
【図５】ＬｏＶｏ結腸直腸癌細胞（ａおよびｃ）ならびにｗｉ３８ヒト胎児線維芽細胞（ｂおよびｄ）に及ぼす７５μｇ／ｍｌの濃度での酢酸エチル抽出物（ａおよびｂ）ならびにメタノール抽出物（ｃおよびｄ）の効果を示す。
【図６】結腸直腸癌細胞ＬｏＶｏの細胞生存率に及ぼすさまざまな濃度（０．０１７、０．１７、および１．７ｍＭ）でのナンキョクコメススキ（Deschampsia antaractica）植物の抽出物から得られたルテオリン誘導体（ピーク１およびピーク２）の効果を示す。（ａ）は、ピーク２の誘導体の効果を示し、（ｂ）は、ピーク１およびピーク２の誘導体の組合せの効果を示す。
【図７】ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物のセミ分取ＨＰＬＣ分析を示す。
【図８】ナンキョクコメススキ（Deschamcpisa antarcitca）抽出物の主化合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。（Ａ）ピーク１および（Ｂ）ピーク２。
【図９】ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物の主化合物のＵＶ−可視スペクトル、すなわち、（ａ）ピーク１のスペクトルおよび（ｂ）ピーク２のスペクトルを示す。
【図１０】ナンキョクコメススキ（Deschampisa antarctica）抽出物から単離された（ａ）ピーク１および（ｂ）ピーク２の質量スペクトルを示す。
【図１１】（Ａ）ピーク１の化合物および（Ｂ）ピーク２の化合物の化学構造を示す。
【図１２】オリエンチンの化学構造を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica Desv.）（イネ科（Poacea））は、南極半島沿岸に天然で集落を形成した２種の維管束植物のうちの１つである。近年、基本的には、南極領域に存在するオゾン層のホールが原因で、ナンキョクコメススキ（D. antarctica）は、増大する紫外線曝露を受けてきた。したがって、この植物種は、光防御過程に介入する二次代謝産物の産生を増大させるようにその代謝を改変してきた。
【００２５】
ナンキョクコメススキ（D. antarctica）が酸化ストレス（強い光および低い温度）への曝露条件に天然で順化されているという事実から、我々は、この植物が抗酸化性化合物の供給源であると考えるに至った。南極大陸で野生で生育する植物から抗酸化性化合物を取得することは可能であったが、その特性は、植物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで栽培した場合には実用上失われた。本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育された植物中で抗酸化性化合物を誘導する方法を提供する。さらにまた、本開示に記載の本発明は、該植物から得られる抗新生物抽出物を提供する。
【００２６】
本発明は、ナンキョクコメススキ（D. antarctica）から得られる抽出物の抗腫瘍原効果およびその疾患予防能をそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果に関する研究により信頼性をもって確証する。
【００２７】
本発明はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育された植物中で抗新生物化合物を誘導する方法および該化合物の単離さらにはその潜在的用途を記述する。
【００２８】
本発明に係る生成物は、ナンキョクコメススキ（D. antarctica）中に存在する抗新生物活性を有する代謝物に基づく。
【実施例】
【００２９】
本発明を実施例により以下で説明する。実施例は、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００３０】
実施例１
天然で生育された植物の抽出物とストレス誘導を行わずにｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育された植物の抽出物との吸収ピークの比較
ロバート島のカッパーマイン半島（南緯６２°２２’、西経５９°４３’）からナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）材料を採取し、プラスチックバッグに入れて運んだ。殺菌剤（ベノミルおよびカプタン）ならびに次亜塩素酸ナトリウムを用いて材料を殺菌した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで植物材料を微細繁殖させた。ムラシゲ・スク−グ（ＭＳ）培地に基づいて培養培地を調製した。１ｍｇ／ｌのＢＡＰホルモン（Ｎ６ベンジルアミノプリン）さらには３５ｍｇ／ｌのサッカロースおよび９ｇ／ｌの寒天を５．７の最終ｐＨで添加した。１６／８時間（明／暗）の光周期および２０００μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の光子流量を用いて２２℃の生育チャンバー内にｉｎ  ｖｉｔｒｏ生育植物を保持した。
【００３１】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの生育植物の地上部を採取し、５ｍｌの蒸留水中で浸軟させた。その後、浸軟物を１０分間超音波処理し、１，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。
【００３２】
薄層クロマトグラフィーを行った。６０  Ｆ２５４シリカゲルスライド（ＭＥＲＣＫ）上に抽出物を接種し、存在する化合物を可視化した。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６０分光光度分析を用いて抽出物を分析した。したがって、２００〜４００ｎｍで吸光度スクリーニングを行って、抽出物中に存在する化合物類に特有な吸収極大の存在を決定した（図１）。
【００３３】
フラボノイドをメタノール中に溶解させた場合、フラボンおよびフラボノールは、ＵＶ分光および可視光により調べると、２４０〜４００ｎｍの領域に２つの主吸収ピークを呈する。これらのピークは、一般に、バンドＩ（３００〜４００ｎｍ）およびバンドＩＩ（２４０〜２８０ｎｍ）を表す。ＵＶ−可視２００〜４００ｎｍスペクトル分析によれば（図１）、フラボノイドは、南極地方でｉｎ  ｖｉｖｏで採取された植物の代謝抽出物中に見られた。それらは、実験室でｉｎ  ｖｉｔｒｏで栽培された植物の抽出物中には実質的に不在である。フラボノイドは、特徴的なピークを呈する。
【００３４】
実施例２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ植物中でのポリフェノールの誘導
前の実施例に示されるように、フラボノイドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育された植物中には実質的に不在であった。この実施例では、種々のストレス条件によりナンキョクコメススキ（Deschampisa antarctica）植物中でフラボノイド産生を誘導可能であることを示す。
【００３５】
塩による誘導
５０日後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで繁殖されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物を寒天から完全に取り出し、根からすべての寒天を除去した。
【００３６】
寒天から取り出した後、３０分間にわたりさまざまな濃度のＮａＣｌ水溶液（２Ｍ、３Ｍ、および４Ｍ）中に植物を浸漬した。その後、植物の地上部を５ｍｌの蒸留水中で浸軟させる。その後、浸軟物を１０分間超音波処理し、１，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する。
【００３７】
ＵＶ線への曝露による誘導
寒天中で生育された幼植物に、生育に用いたのと同じジャー中で４５μＷ／ｃｍ２および７０μＷ／ｃｍ２の強度でＵＶ光を２時間照射した。次に、幼植物を寒天から取り出し、そしてサンプルの地上部を切り離し、５ｍｌのメタノールで浸軟させ、１０分間超音波処理し、さらに１０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。抽出されたサンプルを濃縮し、凍結乾燥させ、そして−２０℃で貯蔵した。
【００３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生育された植物の抽出物中のポリフェノール濃度
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで栽培されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物とは異なり、自然条件で栽培された植物は、その全発育段階にわたりポリフェノールの連続的誘導を示した。０．５Ｍの濃度（海水の濃度）を有する食塩溶液の一定のリスクおよび南極大陸の自然放射条件に植物を曝露する。
【００３９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで栽培されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）の植物から得られた抽出物をＵＶ−Ｖｉｓ２００〜４００ｎｍスペクトルによる分析に付して、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６０分光光度計によりメタノールと対比して抽出物中に存在する化合物のピーク吸光度を決定した。１００μｌの抽出物（浸軟）、具体的には上清からの抽出物を使用し、１０ｍｌのメタノール中に溶解させた。
【００４０】
処理の効果を評価するために、いかなる処理も施すことなくｉｎ  ｖｉｔｒｏで栽培されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物を対照として使用した。
【００４１】
植物が受けたすべてのストレス処理によりポリフェノールの濃度が対照と比較して増加することは、スペクトルからはっきりとわかる（図１〜３）。
【００４２】
ポリフェノールの濃度の最大の増加をもたらすＮａＣｌ溶液による処理は、３Ｍ  ＮａＣｌ中に植物を浸漬した時に観測されたが、２Ｍおよび４Ｍの濃度のＮａＣｌも類似の効果を呈した（図２）。また、本データから、３Ｍ  ＮａＣｌは、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）が最も高いポリフェノール濃度を呈する濃度であることが実証された。さまざまな濃度のＮａＣｌの存在下でのポリフェノール産生に関するナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）の応答は、３Ｍ＞４Ｍ＞２Ｍである。
【００４３】
４５μＷ／ｃｍ２のＵＶ線に２時間曝露された植物は、ポリフェノールの最大の増加を示した（図３）。同一の時間でより強い放射線強度（７０μＷ／ｃｍ２）に曝露された植物は、４５μＷ／ｃｍ２のときほどの増加を示さなかった。このことは、植物が、緑色物質を消滅させるなんらかのタイプの損傷を受けたか、または植物が、損傷から回復する際に資源を使い尽くすことにより、二次代謝産物の濃度が減少したためである可能性がある。
【００４４】
さまざまな処理に付されたナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）を用いて得られた結果の比較から、最良の結果すなわちポリフェノールの最大の増加は、植物を４５μＷ／ｃｍ２の強度のＵＶ線に２時間供した時に観測されたことが明確に示される（図１、２、および３）。
【００４５】
実施例３
水性抽出物の分画
ナンキョクコメススキ（Deschampia antarctica）の水性抽出物をＨＰＣＬ分析により分析した。図７は、ＨＰＬＣ分析のクロマトグラムを示している。クロマトグラムは、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）水性抽出物の主成分を示す。２つの主ピーク（１０．６６６７分の保持時間を有するピーク１および１２．０１６７分の保持時間を有するピーク２）は、注入サンプルの全量の８０％（ｗ／ｗ）を占める。
【００４６】
セミ分取カラムを用いることにより両方のピークを個別に収集した。純度評価のために、分析カラムを備えたＨＰＬＣ−ＤＡＤを使用した。単離ピークに対応するクロマトグラムを図８に示す。各クロマトグラムは、９５％超の純度を有する１つのピークだけを示すことから、ピークは、本質的に純粋であることが示唆される。
【００４７】
ダイオードアレイ分析ＨＰＬＣを用いることにより、両方の化合物のＵＶ−可視２００〜４００ｎｍスペクトルを取得することが可能であった。スペクトルを図９に示す。
【００４８】
両方のスペクトルが２４０〜４００ｎｍ領域に主吸収バンドを示した。両方とも、２６０ｎｍに第１の吸収バンドおよび３５０ｎｍに第２の吸収バンドを示した。それらのピークは、ＵＶ−可視分光法により分析した場合、フラボノイドが呈する吸収スペクトルによく一致する。フラボノイドをメタノール中に溶解させた場合、フラボンおよびフラボノールは、バンドＩ（３００〜４００ｎｍ）およびバンドＩＩ（２４０〜２８０ｎｍ）としてそれぞれ知られる２つの主ピークを示す。
【００４９】
化合物の化学構造を解明するために、我々は、ＨＰＬＣを質量分析計に連結してピーク１および２のマスクロマトグラムを取得した（図１０）。マススペクトルクロマトグラムは、ピーク１に対して５８０のｍ／ｚおよびピーク２に対して５９３のｍ／ｚに主ピークを示した。天然化合物のマススペクトルライブラリーを用いることにより、この情報を他のマススペクトルと比較し、得られた構造を図１１に示す。ピーク１は、イソスウェルチアジャポニン（（７−Ｏ−メチルオリエンチン）２”−Ｏ−β−アラビノピラノシド）に対応し、ピーク２は、オリエンチン２”−β−アラビノピラノシドに対応する。これらの化合物は、ナンキョクコメススキ（Deschampisa antarctica）の葉ですでに同定されている（Webby R. and Markham K, 1994, Isoswertijaponin 2"-O'beta-arabinopyranoisee and other flavone-C-glycosides from the Antarctic grass Deschampisa antarctica. Phytochemistry 36(5): 1323-1326）。しかしながら、同定された化合物の生物活性は、提案されていない。したがって、本開示は、これらの天然物の生物活性に関する最初の報告である。
【００５０】
両方の化合物のマススペクトルが、オリエンチンに属する４４８のｍ／ｚに現れる共通フラグメントを示した（図１２）。放射線防護、血管弛緩、抗酸化性、フリーラジカル阻害性、および抗ウイルス活性のようないくつかの生物活性が、オリエンチンで報告されている。
【００５１】
実施例４
悪性細胞増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害
全抽出物の分画
全植物抽出物をペーパークロマトグラフィーにより化合物に分画した。移動相として１５％氷酢酸を用いてサンプルをＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．３ペーパー上に接種した。さまざまな化合物をＵＶ光下で可視化した。メタノール中に浸漬することにより、Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３と呼ばれる異なる画分をペーパーから回収し、次に、ロトエバポレーターで濃縮した。スライドクロマトグラフィーを行って各画分中の単離化合物を可視化した。
【００５２】
生物活性を有する画分の化学構造
ＨＰＬＣ−質量分析により提供された結果によれば（上記の実施例３）、さまざまなグリコシル化度およびＣ−Ｃ結合を介するグリコシドの置換を有するルテオリン（オリエンチン化合物）は、多く存在しかつ生物活性を引き起こす分子であると推測することができる。このタイプの構造は、活性化合物の安定性を増大させる。さらに、これらの化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで生育された南極地方のコメススキ属（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓｉａ）の植物または４℃に７２時間付された植物の抽出物中には存在したが、１３℃でｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産された植物中には存在しない（データは示していない）。このことから、これら化合物は、低温または植物が野生で受ける他のタイプのストレスで誘導可能であることが示唆される。
【００５３】
フラボンは、抗酸化剤、フリーラジカルのキレート化剤、抗炎症剤、炭水化物の代謝の促進剤、および免疫系の刺激剤として人体で重要な役割を果たすことが知られている（Rahman, I., Biswas, S.K., Kirkham, P.A. 2006. Regulation of inflammation and redox signaling by dietary polyphenols. Biochem Pharmocol. 702(11): 1439-1452; Kandaswami, C. Lee, L.T. Lee, P.P, Hwang J.J.; Ke. F.C., Huang, Y.T. Lee, M.T. 2005 In Vivo 19(5) 895-909）。しかしながら、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antactica）抽出物が抗新生物性であることを示す研究も示唆も存在しない。
【００５４】
ナンキョクコメススキ（D. antarctica）から得られたメタノール抽出物がなんらかの抗新生物効果を有しうるかを調べるために、可溶性画分Ｂ１、Ｂ２、およびＢ３を試験した。これらの画分は、全画分から取得したものあり、さまざまなグルコシド置換度を有する。
【００５５】
図４は、結腸癌細胞および肝癌細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に及ぼすＢ１、Ｂ２、およびＢ３の画分の効果を示している。見てわかるように、これらの画分は、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＴ２９およびＬｏＶｏならびに肝臓癌細胞Ｈｅｐ３Ｂの増殖を効果的に阻害し、最も高いグルコシド置換度を有するＢ３画分が、悪性細胞増殖に対して最大の阻害レベルを呈する（図４のＨＴ２９、ＬｏＶｏ、およびＨｅｐ３Ｂ）。ＷＩ３８（正常肺線維芽細胞）に及ぼすその効果を最大濃度で試験して、特異性および毒性を決定した。ＷＩ３８細胞増殖に及ぼす阻害効果は、観察されなかった（図４）。
【００５６】
これらの化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで悪性細胞の増殖を阻害しうるが、正常線維芽細胞の増殖には阻害効果を示さなかったと結論付けることが可能である。このデータから、これらの画分の抗新生物効果が示唆される。
【００５７】
以上の実施例に示されるように、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）から抽出された抗新生物化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導することが可能であった。したがって、ＵＶ光、塩処理、または低温への曝露により、植物中で産生される抗酸化剤の量を調節することが可能である。さらに、植物材料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで大量に栽培することが可能であるので、抗新生物抽出物の製造は、実際に実用可能になる。
【００５８】
先に挙げた可溶性画分を扱う以外に、より高い極性を有する溶媒（酢酸エチルおよびメタノール）を用いてナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）植物材料を抽出した。この手法の目的は、抽出により植物成分をさまざまな極性の画分に分けることであった。ソックスレー装置を用いて有機溶媒抽出物を作製した。
【００５９】
図５ａは、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に及ぼす酢酸エチル抽出物の効果を示している。この腫瘍細胞の細胞増殖では５０％の阻害が観察された。同じ抽出物をＷＩ３８細胞（正常肺線維芽細胞）で試験した。ＷＩ３８細胞増殖に及ぼす阻害効果は、観察されなかった（５ｂ）。
【００６０】
一方、図５ｃは、メタノール抽出物の効果を示しており、これは、大腸腫瘍細胞（ＬｏＶｏ）の増殖に対して５０％超の阻害を引き起こした。この抽出物を非腫瘍細胞（ＷＩ３８）で試験したところ、細胞増殖に対して阻害効果を示した（図１Ｄ）。メタノール抽出物および酢酸エチル抽出物は、７５μｇ／ｍｌの最低濃度でＬｏＶｏ結腸直腸癌細胞に対して活性であった。
【００６１】
最も活性な画分をさらなる分画工程に使用した。この手順により純粋化合物の単離がもたらされた（上記の実施例３を参照されたい）。本発明者らはまた、これらの純粋化合物（上記の実施例３のピーク１およびピーク２）ならびにそれらの組合せを腫瘍細胞および非腫瘍細胞で試験した。
【００６２】
図６ａおよび６ｂは、大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）に及ぼす単独のおよび組み合わされた純粋化合物（ピーク２およびピーク１とピーク２との組合せ）の阻害効果を示している。これらの化合物は、上記の実施例３に記載されるようにナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物から単離されたものである。
【００６３】
細胞増殖に対する阻害効果は、１０００μｇ／ｍｌに相当する１．７ｍＭの濃度でピーク２を用いた場合およびピーク１と２との組合せを用いた場合に観察された。この濃度は、酢酸エチル抽出物およびメタノール抽出物の阻害濃度の１０倍である。この結果から、ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）のメタノール抽出物および酢酸エチル抽出物は、精製化合物の１／１０の濃度で有効であることが実証される。
【００６４】
実施例５
５００ｍｇのナンキョクコメススキ（Despchampsia antarcica）抽出物を含む経口投与用速溶性錠剤の調製
本発明者らは、ここで、癌性および腫瘍性の疾患に罹患しているかまたは罹患しやすい患者に対して予防および治癒の目的でナンキョクコメススキ（Deschampsia antarcica）抽出物を経口投与するための組成物を提供する。それぞれ以下の定性的組成および定量的組成を呈する錠剤である：
ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物５００ｍｇ、Ｄ−グルコース（D-glucosa）一水和物５９７．６ｍｇ、クロスカルメロースナトリウム３５．２ｍｇ、微結晶性セルロース１６０．０ｍｇ、無水クエン酸３５．２ｍｇ、顆粒状ソルビトール１６０．０ｍｇ、アスパルテーム２８．８ｍｇ、サッカリンナトリウム１４．４ｍｇ、ジベヘン酸グリセロール１６．０ｍｇ、ステアリン酸マグネシウム６．４ｍｇ、オレンジ香料４６．４ｍｇを次のように調製する：滑沢剤（ステアリン酸マグネシウムおよびジベヘン酸グリセロール）を除くすべての成分を完全な均一物が得られるまでタンブラーにより混合し、ステアリン酸マグネシウムおよびジベヘン酸グリセロールを添加し、再度、均一になるまで混合を行い、次に、直径２０ｍｍおよび高さ４．５の大きさの単位重量１．６ｇを呈する錠剤を得るべく、得られた混合物を錠剤化に付す。こうして調製された錠剤は、３０秒間で口内で崩壊する。
【００６５】
実施例６
７．５ｇのナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物を含む速溶性錠剤の調製
１００ｇに対して以下の定性的組成および定量的組成を呈する錠剤である：
成分量：ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物７．５ｇ、噴霧乾燥マンニトール７１．０ｇ、微結晶性セルロース１５．０ｇ、クロスカルメロースナトリウム３．０ｇ、グリシルリチン酸アンモニウム０．３ｇ、アスパルテーム１．０ｇ、Ｌ−メントール０．２ｇ、ミント香料１．０ｇ、ステアリン酸マグネシウム１．０ｇを次のように調製する：ステアリン酸マグネシウムを除くすべての成分を完全な均一物が得られるまでタンブラーにより混合し、ステアリン酸マグネシウムを添加し、再度、均一になるまで混合を行い、次に、混合物を錠剤化に付す。こうして調製された錠剤は、２０秒間で口内で崩壊する。
【００６６】
実施例７
ナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物を含有するペレット剤の調製
９００ｇのナンキョクコメススキ（Deschampsia antarctica）抽出物、８００ｇの微結晶性セルロース、１２ｇのコロイド二酸化ケイ素、６８４ｇの塩化ナトリウム、および３６ｇの塩化カリウムを混合した。混合物を流動化ロートグラニュレーターに移し、４０ｇの３５％ジメチルポリシロキサンエマルジョンと２０００ｍｌのイオン交換水との混合物をその上にスプレーした。ペレット化用液体のスプレー速度を５０ｍｌ／分に設定した。スプレー空気の圧力は２．５ｂａｒであった。ローターの速度をペレット化の最初の１５分間で４５０ｒｅｖ／分に設定し、その後、６００ｒｅｖ／分に保持した。流動化空気の体積速度をペレット化の最初の１５分間で６０ｍ３／時に保持し、その後、９０ｍ３／時に保持した。流動化空気の温度をペレット化の最初の部分で２５℃に設定し、乾燥手順に対しては４０℃に設定した。乾燥ペレットを１．６ｍｍの篩に通した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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