(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載のアミノ酸配列を有する自己組織化ペプチドおよびｂＦＧＦを含有する創傷治癒・皮膚再建材。
【請求項２】
前記創傷治癒・皮膚再建材が、皮膚陥凹、にきび、にきび跡陥凹、肥厚性瘢痕、ケロイド、母斑、色素性母斑治療における陥凹部の新たな皮膚の形成のためのものである請求項１記載の創傷治癒・皮膚再建材。
【請求項３】
さらに、ヨウ素、塩化リゾチーム、ジメチルイソプロピルアズレン、トレチノイントコフェリル、精製白糖・ポピドンヨード、アルプロスタジルアルファデクス、アニスアルコール、サリチル酸イソアミル、α，α−ジメチルフェニルエチルアルコール、バグダノール、ヘリオナール、スルファジン銀、ブクラデシンナトリウム、アルプロスタジルアルファデクス、硫酸ゲンタマイシン、塩酸テトラサイクリン、フシジン酸ナトリウム、ムピロシンカルシウム水和物および安息香酸イソアミルからなる群から選択される低分子薬剤、血清、血漿、血小板、多血小板血漿、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミンおよびコレステロールからなる群から選択される血液成分、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ  ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)および成長分化因子（ＧＤＦ)からなる群から選択される生理活性物質を含む請求項１または２記載の創傷治癒・皮膚再建材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己組織化ペプチドハイドロゲルを含有することを特徴とする創傷治癒・皮膚再建材に関する。本発明はまた、自己組織化ペプチドハイドロゲルを用いた実験皮膚モデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、創傷の治療として、滲出液を吸収し、創傷面を湿潤状態で保護することが外傷の治療において効果的であることが知られるようになり、創傷面を湿潤状態で保護できる創傷被覆材の開発が広くなされている。たとえば、アルギン酸に代表される天然の親水性高分子、ハイドロコロイドと呼ばれる吸水性の合成樹脂、多孔質ポリウレタンなどをフィルム状にした創傷被覆材が開発されている。また、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドなどの水溶性有機モノマーの重合体と水膨潤性粘土鉱物から構成される三次元網目構造を有する高分子ヒドロゲルからなる創傷被覆材が、滲出液の吸収能力が高く、柔軟性に優れた創傷被覆材として報告されている（特表２００７−１１７２７５号公報参照）。【０００３】
しかしながら、これまでのアルギン酸製、人工ポリマー製創傷被覆材は創傷面の保護作用のみで、創傷治癒にかかわる細胞の創傷面への浸潤を促す効果はほとんど見られなかった。一方、真皮欠損用グラフトに用いられるコラーゲン製創傷被覆材は創傷治癒にかかわる細胞の創傷面への浸潤の足場を提供することで創傷治癒効果を示すが、動物由来成分を含むため、ウイルスなどの感染の危険がある。【０００４】
また近年美容外科分野において、レーザーを使用した皮膚陥凹、にきび、にきび跡陥凹、肥厚性瘢痕、ケロイド、母斑、色素性母斑治療が盛んになりつつある。現在レーザー治療では、レーザー照射直後の皮膚は軟膏を塗布し、創傷部を適当な被覆材で覆い、新しい皮膚の形成まで約１週間の時間を必要とする。レーザー治療の需要が伸びてきている近年、皮膚再建に要する時間を短縮する皮膚再建材の出現が望まれている。【０００５】
また、これまで医薬、化粧品開発において、実験動物皮膚モデルが使用されてきたが、近年、動物虐待の問題からその使用が制限されるようになってきている。２００９年には、ＥＵにおいて動物実験を行って開発された化粧品の販売禁止が決まっている。そのため、薬理作用、化粧品の安全性を評価するための動物実験代替法の開発が全世界的に取り組まれている。こうした情勢の中、現在動物モデルに替わる人工皮膚モデルの開発が望まれている。（「動物代替のためのバイオマテリアル・デバイス」、２００７年、シーエムシー出版参照）【０００６】
一方で、近年、そのアミノ酸配列により、多数のペプチド分子が規則正しく並んだ自己会合体を形成する自己組織化ペプチドが発見され、その物理、化学、生物的性質から、新規のマテリアルとして注目を浴びている。たとえば、電荷を有する親水性アミノ酸と、中性の疎水性アミノ酸とが交互に並び、正電荷と負電荷が交互に分布するような構造を有する自己組織化ペプチドは、生理的条件のｐＨと塩濃度により、低濃度でβシート構造をとり、太さ１０ｎｍ〜２０ｎｍ程の極細繊維が、網目上に集合し、ゲル化することが報告されている。この網目構造は、ファイバーサイズおよびポアサイズなどが天然の細胞間マトリックス（ＥＣＭ）と非常に似ており、細胞培養の足場としての利用が研究されている。このペプチドハイドロゲルは、生分解性であり、分解産物が組織に悪影響を与えず、生体吸収性が高いことや、細胞の生着や増殖に適していることに加え、化学合成品であり動物由来の感染症などの心配がないため、近年狂牛病など、動物からのウイルスやそのほか未知の感染症への懸念が高まったことから、コラーゲンなどの代替品として、さらに注目されるようになった（再生歯誌、２００５年、第３巻、第１号、ｐ１−１１および「動物代替のためのバイオマテリアル・デバイス」、２００７年、シーエムシー出版参照）。【０００７】
しかしながら、これまで、治療のために皮膚創傷に適用された例や、美容外科に伴う皮膚再建に適用された例は全く報告されていない。また、実験皮膚モデルとしての使用も全く報告されていない。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、哺乳動物の創傷部を自然治癒よりも早く、かつ瘢痕を残さずに治癒させる、生体吸収性の創傷治癒・皮膚再建材であって、ウイルスなどの感染性の懸念のない創傷治癒・皮膚再建材を提供することにある。本発明のもう１つの目的は、医薬品、化粧品、美容外科治療法開発に使用される実験動物の代替となる実験皮膚モデルを提供することにある。
【０００９】
細胞培養の足場として利用されている自己組織化ペプチドハイドロゲルを創傷面に適用することにより創傷治癒・皮膚再建効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、ペプチドを含有する創傷治癒・皮膚再建材であって、該ペプチドが、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す自己組織化ペプチドである創傷治癒・皮膚再建材に関する。
【００１１】
前記創傷治癒・皮膚再建材において、前記ペプチドが、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニンの繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドであることが好ましく、配列番号１記載のアミノ酸配列を有する自己組織化ペプチドであることがより好ましい。
【００１２】
本発明はまた、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に結合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す自己組織化ペプチドを含有する哺乳動物の実験皮膚モデルに関する。
【００１３】
前記創傷治癒・皮膚再建材及び実験皮膚モデルは、さらに、低分子薬剤、血液成分および／または生理活性物質を含有することが好ましい。
【００１４】
前記低分子薬剤は、ヨウ素、塩化リゾチーム、ジメチルイソプロピルアズレン、トレチノイントコフェリル、精製白糖・ポピドンヨード、アルプロスタジルアルファデクス、アニスアルコール、サリチル酸イソアミル、α，α−ジメチルフェニルエチルアルコール、バグダノール、ヘリオナール、スルファジン銀、ブクラデシンナトリウム、アルプロスタジルアルファデクス、硫酸ゲンタマイシン、塩酸テトラサイクリン、フシジン酸ナトリウム、ムピロシンカルシウム水和物および安息香酸イソアミルからなる群から選択されることがさらに好ましい。
【００１５】
前記血液成分は、血清、血漿、血小板、多血小板血漿、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミンおよびコレステロールからなる群から選択されることがさらに好ましい。
【００１６】
前記生理活性物質は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ  ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)および成長分化因子（ＧＤＦ）からなる群から選択されることがさらに好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の創傷治癒・皮膚再建材による処置前の０日目のマウスにおける創傷部を示す写真である。（ａ）は対照群、（ｂ）は処置群−１、（ｃ）は処置群−２に用いたマウスにおける創傷部の一例であり、それぞれ、約１ｃｍ2の皮下組織が露出した創傷が確認できる。
【図２】本発明の創傷治癒・皮膚再建材による処置７日目のマウスにおける創傷部を示す写真である。（ａ）は対照群、（ｂ）は処置群−１、（ｃ）は処置群−２に用いたマウスにおける創傷部の一例であり、それぞれ図１のマウスに対応する。図１と比較して、すべての群において創傷部の面積の減少がみられるが、（ａ）の対照群と比較して、本発明の創傷治癒・皮膚再建材で処置した処置群−１（ｂ）および処置群−２（ｃ）のマウスでは、創傷面積が大幅に減少し、治癒効果が高いことがわかる。
【図３】本発明の創傷治癒・皮膚再建材による処置１４日目のマウスの創傷部を示す写真である。（ａ）は対照群、（ｂ）は処置群−１、（ｃ）は処置群−２に用いたマウスにおける創傷部の一例であり、それぞれ図１のマウスに対応する。本発明の創傷治癒・皮膚再建材で処置した処置群−１（ｂ）および処置群−２（ｃ）のマウスでは、ほぼ創傷部がふさがっていることがわかる。（ａ）の対照群においても創傷部の面積が大きく減少しているが、わずかに上皮層形成が不十分な術部が観察される。
【図４】本発明の創傷治癒・皮膚再建材による処置２１日目のマウスの創傷部を示す写真である。（ａ）は対照群、（ｂ）は処置群−１、（ｃ）は処置群−２に用いたマウスにおける創傷部の一例であり、それぞれ図１のマウスに対応する。すべての群で創傷部の治癒が観察されたが、本発明の創傷治癒・皮膚再建材で処置した処置群−１（ｂ）および処置群−２（ｃ）では、対照群に比べて治癒部のゆがみが小さいことがわかる。
【図５】本発明の創傷治癒・皮膚再建材による処置２８日目のマウスの創傷部を示す写真である。（ａ）は対照群、（ｂ）は処置群−１、（ｃ）は処置群−２に用いたマウスにおける創傷部の一例であり、それぞれ図１のマウスに対応する。本発明の創傷治癒・皮膚再建材で処置した処置群−２（ｃ）のマウスにおける創傷部は、皮膚のゆがみもなく、理想的な治癒像を呈していることがわかる。
【図６】創傷作製時の面積を基準とし、基準からの創傷部の面積の変化率を表すグラフである。本発明の創傷治癒・皮膚再建材を用いた処置群−１および処置群−２は、対照群と比較して治癒速度が速いことがわかる。
【図７】処置２８日目の対照群における創傷部組織の典型的な状態を示す病理切片写真である。真皮層２で血管形成がやや多く見られ（１本矢印は血管形成を示す）、わずかに炎症反応も見られる（２本矢印）。
【図８】本発明の創傷治癒・皮膚再建材による処置２８日目の処置群−１における創傷部組織の典型的な状態を示す病理切片写真である。図７の対照群と比較してコラーゲン密度が高いため、真皮層２がやや濃く染まっている。
【図９】本発明の創傷治癒・皮膚再建材による処置２８日目の処置群−２における創傷部組織の典型的な状態を示す病理切片写真である。図７の対照群と比較してコラーゲン密度が高いため、真皮層２が濃く染まっている。１箇所多核巨細胞が見られるが（矢印）、正常範囲である。
【符号の説明】
【００１８】
１  表皮層
２  真皮層
３  皮下組織
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の創傷治癒・皮膚再建材について詳細に説明する。【００２０】
本明細書において、「創傷」という用語は、たとえば擦り傷、やけど、あかぎれ、挫滅、切り傷、糖尿病性下肢潰瘍、裂傷、深い切り傷、臓器移植、銃創、切開、下肢潰瘍、圧迫性潰瘍、焦げ傷、引掻き傷、皮膚やけど、ただれ、圧迫傷、刺し傷、移植、静脈潰瘍、または外科もしくは形成外科に伴う傷を意味する。【００２１】
本明細書において、「皮膚再建」という用語は、美容外科における、たとえば皮膚陥凹、にきび、にきび跡陥凹、肥厚性瘢痕、ケロイド、母斑、色素性母斑治療における陥凹部の新たな皮膚の形成を意味する。なお、本明細書においては、これら美容外科における皮膚陥凹、にきび、にきび跡陥凹、肥厚性瘢痕、ケロイド、母斑、色素性母斑治療における陥凹部などは、広く創傷の定義にも包含されるものとする。【００２２】
本発明の創傷治癒・皮膚再建材は、親水性アミノ酸と疎水性アミノ酸とが交互に会合し、アミノ酸残基８〜２００を有する両親媒性のペプチドであり、一価のイオンの存在下、水溶液中で安定なβシート構造を示す自己組織化ペプチドを主要成分とする。【００２３】
本発明において用いられる自己組織化ペプチドは、たとえば、以下の４つの一般式で表すことができる。
（（ＸＹ）l−（ＺＹ）m）n      （Ｉ）
（（ＹＸ）l−（ＹＺ）m）n      （II）
（（ＺＹ）l−（ＸＹ）m）n      （III）
（（ＹＺ）l−（ＹＸ）m）n      （IV）
（式（Ｉ）〜（IV）中、Ｘは酸性アミノ酸、Ｙは疎水性アミノ酸、Ｚは塩基性アミノ酸を表し、ｌ、ｍおよびｎは共に整数（ｎ×（ｌ＋ｍ）＜２００）である。）
また、そのＮ末端はアセチル化されていてもよく、Ｃ末端はアミド化されていてもよい。【００２４】
ここで、親水性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸から選択される酸性アミノ酸およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチンから選択される塩基性アミノ酸を使用することができる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、スレオニンまたはグリシンを使用することができる。【００２５】
これらの自己組織化ペプチドの中でも、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸およびアラニン（ＲＡＤＡ）の繰り返し配列を有する自己組織化ペプチドを好ましく使用することができ、そのようなペプチドの配列は、Ａｃ−（ＲＡＤＡ）p−ＣＯＮＨ2（ｐ＝２〜５０）で表される。【００２６】
本発明における自己組織化ペプチドの好ましい具体例としては、（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドＲＡＤ１６−Ｉが挙げられ、PuraMatrix（登録商標）としてその１％水溶液が、株式会社スリー・ディー・マトリックスから市販されている。PuraMatrix（登録商標）には、１％の（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）配列（配列番号：１）を有するペプチドの他、水素イオン、塩化物イオンが含まれる。【００２７】
PuraMatrix（登録商標）等のこれら自己組織化ペプチドは明らかな生理活性モチーフを持たないペプチド配列であるので、本来の細胞機能が損なわれる心配がない。生理活性モチーフは、転写など多くの細胞内現象の制御に関与しており、生理活性モチーフが存在すると、そのモチーフを認識する酵素により細胞質内や細胞表面の蛋白質はリン酸化される。支持体中に生理活性モチーフが存在すると、各種機能蛋白質の転写活性化能が抑制される可能性がある。生理活性モチーフを持たないPuraMatrix（登録商標）等の自己組織化ペプチドではこうした心配がない。よってPuraMatrix（登録商標）等の自己組織化ペプチドは、創傷部に分泌される各種生理活性物質を担持するマトリックスとして、また遊走細胞の足場としても機能することから、創傷治癒・皮膚再建材として有効である。【００２８】
PuraMatrix（登録商標）はアミノ酸１６残基（Ａｃ−（ＲＡＤＡ）4−ＣＯＮＨ2）で長さが約５ｎｍのオリゴペプチドであって、その溶液はｐＨ５．０以下であると液状を示すが、ｐＨ５．０以上に変化させることでペプチドの自己組織化が生じ、直径１０ｎｍほどのナノファイバーを形成し、結果としてペプチド溶液はゲル化する。【００２９】
本発明に用いる自己組織化ペプチドにおいて、平均してナノファイバーは直径１０〜２０ｎｍ、ポアサイズは５〜２００ｎｍである。この数値範囲は天然の細胞間マトリックスであるコラーゲンとほぼ同じ大きさである。【００３０】
PuraMatrix（登録商標）はプラス電荷を帯びたアルギニンとマイナス電荷を帯びたアスパラギン酸、および疎水性を有するアラニンの残基が交互に繰り返すアミノ酸配列を有する両親媒性ペプチドであり、ペプチドの自己組織化はペプチドを構成するアミノ酸によるペプチド分子間の水素結合と疎水結合に起因する。【００３１】
本発明に用いる自己組織化ペプチドの自己組織化条件には、生理的条件のpHおよび塩濃度があげられる。特に１価のアルカリ金属イオンが重要である。つまり、生体内に多量に存在するナトリウムイオンおよびカリウムイオンがゲル化の促進に寄与する。一度ゲル化すると通常のタンパク質の変性条件、例えば高温、酸、アルカリ、タンパク質分解酵素、尿素、グアニジン塩酸塩等の変性剤を用いても、ゲルは分解しない。【００３２】
本発明に用いる自己組織化ペプチドは化学合成により製造されることから動物由来細胞外マトリックスに起因する未知成分を含まない。この性質はＢＳＥを始めとする感染の恐れがなく、医療用としても高い安全性を有することを示す。【００３３】
天然のアミノ酸からなる自己組織化ペプチドは生体適合性および生体内分解性も良好なことから、例えばマウスの心筋にPuraMatrix（登録商標）を注入すると注入したPuraMatrix（登録商標）に細胞が浸潤し、正常組織が形成されることが報告されている。分解時間は注入場所等の条件によって異なるが、注入後およそ２〜８週間でファイバーが分解され、排出される。【００３４】
本発明の創傷治癒・皮膚再建材には、さらに低分子薬剤、血液成分および／または生理活性物質を混合させることができる。そのような低分子薬剤としては、特に限定されるものではないが、ヨウ素、塩化リゾチーム、ジメチルイソプロピルアズレン、トレチノイントコフェリル、精製白糖・ポピドンヨード、アルプロスタジルアルファデクス、アニスアルコール、サリチル酸イソアミル、α，α−ジメチルフェニルエチルアルコール、バグダノール、ヘリオナール、スルファジン銀、ブクラデシンナトリウム、アルプロスタジルアルファデクス、硫酸ゲンタマイシン、塩酸テトラサイクリン、フシジン酸ナトリウム、ムピロシンカルシウム水和物、安息香酸イソアミルが挙げられる。またそのような血液成分としては、特に限定されるものではないが、血清、血漿、血小板、多血小板血漿（ＰＲＰ)、フィブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、トロンビン、トロンボプラスチン、プラスミノゲン、アルブミン、コレステロールなどが挙げられる。また生理活性物質としては、特に限定されるものではないが、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子−α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、インスリン、ハイドロコーチゾン、ウロガストロン、血小板由来創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板因子ＩＶ（ＰＦ  ＩＶ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ)、成長分化因子（ＧＤＦ）などが挙げられる。皮膚を構成する線維芽細胞の成長を促し、かつ塩基性で酸性自己組織化ペプチド溶液中で生理活性機能が安定的に持続可能な点からｂＦＧＦが特に好ましい。【００３５】
本発明の創傷治癒・皮膚再建材の形態としては、溶液、ゲルなどがあげられる。自己組織化ペプチドは、溶液のｐＨの変化によりゲル化するため、適用時に生体と接触させることによりゲル化する液剤として流通させることもできる。またこの分野で通常用いられるガーゼ、包帯などの支持体や裏打ちの上にゲルを固定することも可能である。【００３６】
その他の態様としては、自己組織化ペプチド水溶液を充填した噴霧式スプレーを作製することができる。このようなスプレーは、患部に噴霧すると、生体との接触によりｐＨが上昇し、ゲル化するため、ゲルの状態で取り扱うよりも様々な部位や状態に適用することができる。【００３７】
天然の細胞間マトリックスと似通った性質を有し、細胞の足場としても使用できる自己組織化ペプチドハイドロゲルが良好な皮膚再建能を示したことから、この自己組織化ペプチドハイドロゲルは、実験皮膚モデルとしても有効に使用できる。【００３８】
培養皮膚モデルとしては、マルチウェル培養プレート内、もしくはマルチウェル培養プレート用セルカルチャーインサート内で自己組織化ペプチドをゲル化させたところへ表皮組織のみを培養、または表皮組織と真皮組織を培養し、人為的に組織を再構成させたものがある。培養皮膚モデルに開発段階の化合物、化粧品を添加し、培養細胞の増殖や形態をみることで安全性を評価することができる。【００３９】
また、本発明の培養皮膚モデルには、必要に応じて、前述した低分子薬剤、血液成分および／または生理活性物質を混合させることができる。【００４０】
以下、実施例によって、本発明の創傷治癒・皮膚再建材をさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲に逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
実施例１
（ａ）マウス皮膚創傷モデルの作製
実験動物として、ＮＴａＣ：ＮＩＨＳ−Ｆｏｘｎ１＜ｎｕ＞系ヌードマウス（雌性、体重〜２０ｇ）３０匹を用いた。マウスは、本実験中、約１７〜２６℃、湿度３０〜７０％、１２時間の明暗サイクル、最低１時間に１０回の換気、１日１回の給餌と、自由に飲水できる条件下で飼育した。【００４２】
マウスを２．５〜４％のイソフルランを充満させたチャンバーに入れ麻酔を誘導し、０．５〜２．５％でイソフルランを、ノーズコーンを通して送達することにより維持した。【００４３】
残っている毛をすべて右上の背中から除去し、手術領域をポビドンヨードスクラブと７０％アルコールの３回交互スクラブで清潔にした。一旦交互スクラブが完了したら、最後にポビドンヨードスクラブを適用し、乾燥させた。その領域を無菌手術のために覆った。【００４４】
右上の背中の胸郭の上に、ピンセットを用い、皮膚の折り目（創傷の右下角になる）をつまみ上げ、はさみで皮膚を剥離して１ｃｍ×１ｃｍの創傷を作製した。出血は滅菌ガーゼパッドで吸収した。【００４５】
（ｂ）本発明の創傷治癒・皮膚再建材の調製
（ｂ−１）遠心チューブを冷水浴に置き、３０分間超音波処理し、１分間ボルテックスミキサーにかけ、室温で遠心分離（３０００ｒｐｍ、１分）して気泡を除去した。すべての気泡を除去できるまで、ボルテックス処理と遠心分離を繰り返すことにより、１％PuraMatrix（登録商標）の水溶液を調製し、処置群−１に用いた。【００４６】
（ｂ−２）５ｎｇ／μＬ  ｈｂＦＧＦのＰＢＳ溶液（２０μＬ）を、あらかじめ１％ PuraMatrix  １ｍＬを入れた滅菌遠心チューブに添加した。ついで混合物をボルテックスミキサーで均質化した。遠心チューブを冷水浴に置き、３０分間超音波処理し、１分間ボルテックスミキサーにかけ、室温で遠心分離（３０００ｒｐｍ、１分）して気泡を除去した。すべての気泡を除去できるまで、ボルテックス処理と遠心分離を繰り返した。得られたPuraMatrix＋ｈｂＦＧＦの溶液を処置群−２に用いた。【００４７】
（ｃ）創傷部の処置と患部の観察
（ａ）で作製した皮膚創傷モデルマウス３０匹を各群１０匹の３群にわけ、外科処置後に表１の設定で処置を行った。外科手術（創傷作製）の日を０日目とした。創傷部の観察は、０日目の処置直前（図１）、７日目（図２）、１４日目（図３）、２１日目（図４）および２８日目（図５）に行なった。【００４８】
【表１】
0005497451.tif 000002
【００４９】
創傷測定の基準面積は、最初の塗布の適用前に記録した。週間測定は、被覆している自己組織化ハイドロペプチドゲル（対照群はワセリンガーゼのみ）を取り除き、創傷面をあらわにして行った。定規を創傷領域に隣接しておき、デジタル写真を撮り、創傷面を再度自己組織化ペプチドハイドロゲル（対照群はワセリンガーゼのみ）で被覆した。創傷面積は、ＮＩＨウェブサイト（ＵＲＬ：http://rsb.info.nih.gov/ij/）のＩｍａｇｅＪ  バージョン１．３７を用いて計算した。結果を図６に示す。【００５０】
図６より、経過観察７日目、１４日目において、処置群−１および処置群−２は、対照群に比べて治癒速度が速いことがわかる。処置群−１、すなわちPuraMatix（登録商標）単独でも目に見えた有意な治癒効果が得られた。【００５１】
経過観察７日目には、０日目（図１）と比較して、すべての群において創傷部の面積の減少がみられたが、対照群と比較して、本発明の創傷治癒・皮膚再建材で処置した処置群−１および処置群−２のマウスでは、創傷面積が大幅に減少した（図２）。【００５２】
経過観察１４日目には、本発明の創傷治癒・皮膚再建材で処置した処置群−１および処置群−２のマウスでは、ほぼ創傷部がふさがっていた。対照群においても創傷部の面積が大きく減少していたが、わずかに上皮層形成が不十分な術部が観察された（図３）。【００５３】
経過観察２１日目において、すべての群で創傷部の治癒が見られたが、処置群−１および２では、対照群に比べて治癒部のゆがみが小さかった（図４参照）。【００５４】
また、２８日目の解剖前の観察では、全個体で瘢痕が確認できたが、瘢痕部の萎縮がみられたのは、対照群では全個体、処置群−１では１０個体中８個体、処置群−２では１０個体中４個体であった（図５）。【００５５】
これらの結果から、治癒効果は処置群−２、すなわちPuraMatix（登録商標）＋ｈｂＦＧＦで最も高く、処置群−１のPuraMatix（登録商標）単独でも、目に見えた有意な治癒効果が得られることが明らかとなった。よって、PuraMatix（登録商標）＋ｈｂＦＧＦの組み合わせは、非常によい創傷治癒効果を与えると考えられる。【００５６】
（ｄ）組織病理観察
３群のヌードマウスの皮膚の創傷治癒のパラメーターを評価するために、組織病理学試験を行った。【００５７】
各マウスを処置２８日目の観察後、安楽死させ、創傷の中心を通って長軸に垂直な、創傷部を含むパラフィン片を作製した。パラフィン片から、ヘマトキシリン・エオジン染色組織切片およびトリクロム染色組織切片を作製した。ヘマトキシリン・エオジン染色切片から、創傷部の上皮化、血管新生および炎症を評価し、トリクロム染色片から創傷部のコラーゲンの量および質を評価した。結果を、表２−１（対照群）、表２−２（処置群−１）および表２−３（処置群−２）に示す。【００５８】
各スコアの基準は次のとおりである。【００５９】
＜上皮化＞
０＝再上皮化なし。
１＝部分的な再上皮化。（創傷表面は上皮によって完全に覆われてはいない。）
２＝全創傷面にわたる再上皮化であるが、上皮組織は、多重層（基底層、有棘層、顆粒層）を有する重層扁平上皮ではない。
３＝重層扁平上皮および角質化を伴う全創傷面にわたる再上皮化であるが、アポトーシス細胞または壊死細胞または異常角化症の形態の出現頻度が高い組織修復の跡、または多重有糸分裂像、または不規則な厚さまたは不規則な層（過形成）がみられる。
４＝重層扁平上皮の角質化による組織修復、再構成を伴った正常範囲内での完全な再上皮化（ただ正常でない点としては治癒部真皮内に毛包および腺組織がみられない点がある）。【００６０】
＜血管新生＞
０＝正常真皮と比較して減少した血管分布像。
１＝正常範囲内の真皮血管分布像。
２＝真皮または創傷部の毛細血管の突出の極わずかな増加。この突出の増加は、おそらく、数の増加、膨張（うっ血または充血）およびサイズの増大による。
３＝真皮または創傷部におけるよく発達した毛細血管の軽度の増加。
４＝真皮または創傷部におけるよく発達した毛細血管の中程度の増加。【００６１】
＜炎症＞  炎症は、上皮下の真皮および瘢痕組織における好中球およびマクロファージの増加から構成された。いくつかの試料において、多核巨細胞が創傷瘢痕内に観察されたが、これは創傷への外来物質が混入したことによる反応を示唆する。
０＝炎症細胞の増加なし（ヌードマウスの真皮での正常範囲内）。
１＝炎症細胞の極少ない増加。炎症は多発性で血管周囲にある傾向。
２＝炎症細胞の軽度の増加。炎症は多発性で血管周囲にある傾向。
３＝炎症細胞の中程度の増加。
４＝炎症細胞の顕著な増加。【００６２】
＜コラーゲンの質＞
０＝創傷における線維増殖および／またはコラーゲンなし。
１＝創傷の肉芽組織における最小から軽度の線維増殖。
２＝創傷全体に渡って中程度の線維増殖およびコラーゲンが存在
３＝創傷の浅部に正常な真皮コラーゲンに類似した密度の高いコラーゲンが存在
４＝創傷全体に渡って密度の高いコラーゲン。相対的にわずかな線維芽細胞があり、コラーゲンがわずかに正常真皮よりも密度が高い。【００６３】
＜コラーゲン厚＞
創傷部の上皮下のコラーゲンの厚さ（μｍ）は、対物マイクロメータ（×１０）で校正した接眼マイクロメータを用いてコラーゲンの最も厚い部分で測定した。【００６４】
【表２−１】
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【００６５】
【表２−２】
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【００６６】
【表２−３】
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【００６７】
評価スコアは、最も良好な創傷治癒が観察された場合、上皮化＝４、血管新生＝１、炎症＝０、コラーゲンの質＝４となる。このスコアを示した個体は、対照群では０、処置群−１および処置群−２では各１個体観察された。【００６８】
各評価における３群間の比較を行ったところ、上皮化および血管新生については、３群間で差異はあまり見られなかった。【００６９】
炎症については、全く炎症が見られなかった個体の数が、対照群と比較して、処置群−１および処置群−２において多く見られた。【００７０】
コラーゲン密度の高い個体の数が、対照群と比較して、処置群−１および処置群−２において多く見られた。【００７１】
以上、対照群と比較して、処置群−１および処置群−２では炎症が少なく、コラーゲン密度も高いという結果から、これらの処置によって、よりきれいな皮膚再生が促されると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明の創傷治癒・皮膚再建材は、その主要成分である自己組織化ペプチドが被覆材としての役割以外にも、遊走細胞の足場になることができ、単に被覆しただけよりもより高い治癒促進効果をもたらすことができる。【００７３】
また、本発明の創傷治癒・皮膚再建材の主要成分である自己組織化ペプチドは、合成により製造することができるため、従来の生体由来材料と比べてウイルス等の感染の危険もないうえ、それ自身は生体吸収性であるため、炎症等を懸念する必要もない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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