(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポロキサマー・タンパク質粒子の分散物を調製するための方法であって、該方法が、以下の工程：
ｉ）タンパク質およびポロキサマーを含む水溶液を調製する工程；
ｉｉ）得られた溶液を、十分な量において水混和性タンパク質非溶媒と接触させて、ポロキサマー・タンパク質粒子の分散物を形成する工程；ならびに、必要に応じて
ｉｉｉ）得られたポロキサマー・タンパク質粒子を回収する工程、
を含む、方法。 
【請求項２】
ポロキサマーが、ポロキサマー１８８、４０７、３３８および２３７からなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。 
【請求項３】
水溶液が塩をさらに含有する、請求項１または２記載の方法。 
【請求項４】
塩が０．０１〜３Ｍの範囲の濃度において存在する、請求項３記載の方法。 
【請求項５】
塩がＮａＣｌである、請求項３または４記載の方法。 
【請求項６】
タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１〜５のいずれか記載の方法。 
【請求項７】
タンパク質が、酵素、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントまたは凝固因子である、請求項６記載の方法。 
【請求項８】
水混和性タンパク質非溶媒がグリコフロールである、請求項１〜７のいずれか記載の方法。 
【請求項９】
ポロキサマー・タンパク質粒子が遠心分離後に回収される、請求項１〜８のいずれか記載の方法。 
【請求項１０】
水混和性タンパク質非溶媒が溶解した壁形成性ポリマーをさらに含有する、請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポロキサマー・タンパク質粒子を調製するための方法に関する。
【０００２】
また、本方法により得られうるポロキサマー・タンパク質粒子、その分散物、ならびに、カプセル化、特にマイクロカプセル化の方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）等の生分解性ポリマーから構成されるマイクロ粒子からのタンパク質の送達は、タンパク質のタンパク分解を回避し、かつその持続性放出を完了するために、非常に興味深い。したがって、この処方物は、広く研究されている。それにもかかわらず、ＰＬＧＡマイクロ粒子からのタンパク質の首尾の良い送達は、依然として達成されていない。最も重要な障害は、一方では処方プロセスの間における、および他方では放出期間の間におけるタンパク質安定性の事項に関する（非特許文献１〜５）。処方プロセスの間におけるタンパク質安定化は、添加剤の使用のおかげで達成されているが（非特許文献６、７）、ゼロ次プロフィールにしたがい、かつ変性を伴わないタンパク質放出は、殆ど報告されていなかった（非特許文献８〜１０）。
【０００４】
ＰＬＧＡマイクロスフェアからの疎水性低分子の放出は、初期段階における水溶性の孔を介した薬物拡散によって、かつ後の段階でのポリマー分解によって左右される。タンパク質については、初期の大規模な放出（バースト効果）、続いて不完全な放出が、不安定性の問題に起因して頻繁に観察された（非特許文献１１、１２）。水分誘導性の凝集およびイオン性相互作用は、マイクロスフェア水和の初期段階において生じると思われる。その後、ポリマー侵食の間に、分解している表面領域上への非特異的タンパク質吸着および酸性ＰＬＧＡ分解産物の形成に起因する共有結合／非共有結合の凝集が、この不完全な放出を担う因子として報告された（非特許文献１３）。
【０００５】
安定化添加剤の使用は、分解しているＰＬＧＡの直接的な環境に伴うタンパク質分解を最小にするために最も広く用いられたストラテジーである（非特許文献１４）。しかしながら、安定化剤は、マイクロスフェアからのそれらの急速な拡散のために、初日の放出にしか影響を及ぼさなかった（非特許文献１５）。あるいは、複雑な方法、即ち、タンパク質化学修飾（非特許文献１６）、不均一に構成されたマイクロスフェアの調製（非特許文献１７）、および多孔性マイクロスフェアの形成（非特許文献８）が、タンパク質の完全かつ持続的な放出を可能にするために設計された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，Ｓ．Ｐ．Ｃａｒｄａｍｏｎｅ，Ｍ．Ｋｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．およびＢｒａｎｄｏｎ，Ｍ．Ｒ．，１９９６．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−４９．
【非特許文献２】Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｅｒｔ，Ｍ．Ｈｅｎｎｉｎｋ，Ｗ．Ｅ．およびＪｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．，２０００．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１７，１０，１１５９−６７．
【非特許文献３】Ｂｉｌａｔｉ，Ｕ．Ａｌｌｅｍａｎｎ，Ｅ．およびＤｏｅｌｋｅｒ，Ｅ．，２００５．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，５９，３，３７５−８８．
【非特許文献４】Ｔａｍｂｅｒ，Ｈ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｍｅｒｋｌｅ，ＨＰ．およびＧａｎｄｅｒ，Ｂ．，２００５．，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５７，３  ＳＰＥＣ．ＩＳＳ．，３５７−３７６．
【非特許文献５】Ｗａｎｇ，Ｗ．，２００５．，ｌｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２８９，１−２，１−３０．
【非特許文献６】Ｐｅａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｎｉｅｒ−Ｊｕｌｉｅｎｎｅ，Ｍ．Ｃ．Ｂｏｕｒｙ，Ｆ．Ｍｅｎｅｉ，Ｐ．Ｄｅｎｉｚｏｔ，Ｂ．およびＢｅｎｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．，１９９８．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５６，１−３，１７５−８７．
【非特許文献７】Ｐｅａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｂｏｕｒｙ，Ｆ．Ｖｅｎｉｅｒ−Ｊｕｌｉｅｎｎｅ，Ｍ．Ｃ．Ｍｅｎｅｉ，Ｐ．Ｐｒｏｕｓｔ，Ｊ．Ｅ．およびＢｅｎｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．，１９９９．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１６，８，１２９４−９．
【非特許文献８】Ｋｉｍ，Ｈ．Ｋ．Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．およびＰａｒｋ，Ｔ．Ｇ．，２００６．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１２，２，１６７−１７４．
【非特許文献９】Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈ．Ｙｅ，Ｍ．Ｙｅｏ，Ｙ．Ｌｅｅ，Ｗ．Ｋ．Ｐａｕｌ，Ｃ．およびＰａｒｋ，Ｋ．，２００６．，ＭｏＩ  Ｐｈａｒｍ，３，２，１３５−４３．
【非特許文献１０】Ｌｅｅ，Ｅ．Ｓ．Ｋｗｏｎ，Ｍ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｈ．およびＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，２００７．，ｌｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，３３１，１，２７−３７．
【非特許文献１１】Ｃｒｏｔｔｓ，Ｇ．およびＰａｒｋ，Ｔ．Ｇ．，１９９８．，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ，１５，６，６９９−７１３．
【非特許文献１２】Ａｕｂｅｒｔ−Ｐｏｕｅｓｓｅｌ，Ａ．Ｖｅｎｉｅｒ−Ｊｕｌｉｅｎｎｅ，Ｍ．Ｃ．Ｃｌａｖｒｅｕｌ，Ａ．Ｓｅｒｇｅｎｔ，Ｍ．Ｊｏｌｌｉｖｅｔ，Ｃ．Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｍｅｎｅｉ，Ｃ．Ｎ．Ｇａｒｃｉｏｎ，Ｅ．Ｂｉｂｂｙ，Ｄ．Ｃ．Ｍｅｎｅｉ，Ｐ．およびＢｅｎｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．，２００４．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９５，３，４６３−７５．
【非特許文献１３】Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｇ．Ｙｏｎｇ  Ｌｅｅ，Ｈ．およびＳｕｎｇ  Ｎａｍ，Ｙ．，１９９８．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５５，２−３，１８１−９１．
【非特許文献１４】Ｍｏｒｌｏｃｋ，Ｍ．ＫｏＩＩ，Ｈ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＫｉｓｓｅｌ，Ｔ．，１９９７．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈ，４３，２９−３６．
【非特許文献１５】Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．Ｖｉｌｌａｍａｙｏｒ，Ｂ．Ｇｕｏ，Ｙ．Ｍｃｌｖｅｒ，Ｊ．およびＡｌｏｎｓｏ，Ｍ．Ｊ．，１９９９．，ｌｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，１８５，２，２５５−６６．
【非特許文献１６】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ，Ｉ．Ｊ．Ａｌ−Ａｚｚａｍ，Ｗ．およびＧｒｉｅｂｅｎｏｗ，Ｋ．，２００５．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９４，２，３２７−４０．
【非特許文献１７】Ｊｉａｎｇ，Ｇ．Ｑｉｕ，Ｗ．およびＤｅＬｕｃａ，Ｐ．Ｐ．，２００３．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２０，３，４５２−９．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
生物学的に活性な形態におけるタンパク質の完全かつ連続的な放出を達成することを可能にする、マイクロカプセル化タンパク質を調製するための新規方法が、今や開発された。有利なことに、この方法は、広い範囲のタンパク質に容易に適用できる。
【０００８】
より具体的には、タンパク質をポロキサマーの存在下において沈殿させた場合、タンパク質／ポロキサマーの粒子が形成されることが発見された。今では、これらのポロキサマー・タンパク質粒子は、とりわけ、ｓ／ｏ／ｗ方法によって、または造粒によって、タンパク質をロードしたマイクロスフェアを調製するために、特に有利である。固体状態のタンパク質が、放出工程の間において、そのタンパク質の安定化を可能にすることにより、アルブミンまたはトレハロース等の安定化剤の使用が必要とされないことが実際に観察されている。さらに、ポロキサマーによるタンパク質の沈殿は、マイクロスフェアからのタンパク質の放出プロフィールを改善すること、とりわけ、生物学的に活性な形態におけるタンパク質の連続的かつ持続的放出を、とりわけ、少なくとも２０日間にわたり達成することを可能にする。したがって、有利なことに、ポロキサマーの存在は、バースト効果を誘導しない。ポロキサマーは界面活性剤であるので、その存在は、タンパク質と、タンパク質をカプセル化するポリマーとの間の相互作用を制限し、それによりタンパク質の放出を改善できると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】リゾチーム沈殿の最適化：実験設計。表は、１５の実験についての各因子（Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３）の値を表す。
【図２】リゾチーム沈殿の最適化：実験設計の結果の空間的表示。丸中の数は、各実験について、沈殿および溶解後に、生物学的に活性な形態下で回収されたリゾチームの百分率を示す。
【図３】溶液中にポロキサマー１８８を添加した場合におけるリゾチームのゼータ電位の評価。
【図４】ポロキサマー１８８を有しない（２バッチを２回）、およびポロキサマー１８８を有する（実施例７）（３バッチ）ＰＬＧＡマイクロスフェア（ＭＳ）からの、ならびにポロキサマー１８８を含有するＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡマイクロスフェア（実施例９）（７バッチ）からのリゾチームのインビトロ放出プロフィール（平均±ＳＤ）。
【図５】ＥＬＩＳＡにより評価された、ＰＬＧＡマイクロスフェアからの、ポロキサマー１８８によるＴＧＦベータ３のインビトロ放出プロフィール、およびバイオアッセイにより評価された、放出ＴＧＦベータ３の生物学的活性。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ポロキサマー・タンパク質粒子
したがって、一局面では、本発明は、ポロキサマー・タンパク質粒子の分散物を調製するための方法に関し、当該方法は、以下の工程を含む：
ｉ）タンパク質およびポロキサマーを含む水溶液を調製する工程；
ｉｉ）得られた溶液を、十分な量において水混和性タンパク質非溶媒と接触させて、ポロキサマー・タンパク質粒子の分散物を形成する工程；ならびに、必要に応じて
ｉｉｉ）得られたポロキサマー・タンパク質粒子を回収する工程。
【００１１】
本方法は、その後のカプセル化に特に有用である小さいポロキサマー・タンパク質粒子として、非変性の固体状態のタンパク質を調製するために特に有利である。有利なことに、本方法は、高収率で、広い範囲のタンパク質に適用できる。
【００１２】
本明細書中で用いられる場合、用語「粒子」とは、固体材料の凝集した物理ユニットをいう。
【００１３】
本明細書中で用いられる場合、表現「ポロキサマー・タンパク質粒子（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」とは、ポロキサマーとの組合せにおいて沈殿タンパク質を含む粒子、とりわけ、ポロキサマーの１以上の分子と組み合された沈殿タンパク質の１以上の分子を含む粒子をいう。
【００１４】
本発明の粒子は、好ましくはナノ粒子である。
【００１５】
ナノ粒子は、１μｍ未満のメジアン径ｄ５０を有する粒子として理解される。
【００１６】
好ましくは、本発明のポロキサマー・タンパク質粒子のメジアン径は、５０〜２００ｎｍの範囲にあり、とりわけ、約１５０ｎｍである。
【００１７】
本明細書中で用いられる場合、用語「メジアン径ｄ５０」とは、粒子集団の総計のうちの５０％がより小さな直径を有する粒子直径である。
【００１８】
本発明によれば、メジアン径ｄ５０は、光回折に基づく方法にしたがって、懸濁物に対して行われる粒子サイズの測定によって決定される。
【００１９】
本明細書中で用いられる場合、用語「ポロキサマー」とは、ポリオキシプロピレンの疎水性鎖およびポリオキシエチレンの親水性鎖を含む非イオン性ブロックコポリマーをいう。このようなポロキサマーは、直線状であっても分岐していてもよく、とりわけ、トリブロックまたはテトラブロックコポリマーが挙げられる。それらは、とりわけ、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）１１０７（ＢＡＳＦ）等のポロキサミンが挙げられる。特に好ましいポロキサマーは、１０以上、好ましくは１８以上、最も好ましくは２４以上の親水性・親油性バランス（ＨＬＢ）を有するものである。最も好ましいポロキサマーは、タンパク質粒子の投与の意図された経路について医薬として受容可能なものである。
【００２０】
好ましいポロキサマーは、ポリオキシエチレンの２つの親水性鎖に隣接したポリオキシプロピレンの中心的な疎水性鎖から構成される。
【００２１】
好ましくは、ポロキサマーは、ポロキサマー１８８、４０７、３３８および２３７からなる群より選ばれる。
【００２２】
ポロキサマー／タンパク質のモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は、タンパク質の沈殿に重要ではなく、広い範囲において変動してもよい。
【００２３】
好ましくは、タンパク質は、治療用タンパク質である。適切なタンパク質の例としては、とりわけ、酵素、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体のフラグメントまたは凝固因子が挙げられる。増殖因子としては、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン３、形質転換増殖因子ベータファミリー、グリア細胞株由来神経栄養因子ファミリー、線維芽細胞増殖因子、内皮増殖因子、血小板由来増殖因子に対して言及がなされる。インターフェロンα、β、γ等のサイトカイン、ヒト成長ホルモン等のホルモン、エリスロポエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−２等のインターロイキン、ケモカイン、抗原およびそれらの混合物が、他の例である。タンパク質はまた、診断剤、化粧用または栄養用サプリメントであり得る。
【００２４】
本発明によれば、タンパク質の沈殿収率は、一般的には、タンパク質の分子量とともに増加する。したがって、本発明の方法は、広い範囲のタンパク質分子量に対して適用されてもよい。
【００２５】
好ましくは、タンパク質の分子量は、８ｋＤａ以上であり、より好ましくは１０ｋＤａ以上である。
【００２６】
例として、タンパク質分子量は、１０〜９５０ｋＤａ、とりわけ、１０〜２００ｋＤａの範囲であってもよい。
【００２７】
水混和性タンパク質非溶媒（ｗａｔｅｒ−ｍｉｓｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｏｎ  ｓｏｌｖｅｎｔ）は、小さな粒子としてタンパク質を沈殿させるために、十分な量において使用される。
【００２８】
５〜１００の範囲にある水混和性溶媒／水溶液の容量比は、一般的に、ポロキサマーの存在下においてタンパク質の沈殿を誘導するのに十分である。
【００２９】
タンパク質・ポロキサマー粒子の形成は、広い範囲の温度において生じ得る。したがって、好ましくは、水混和性タンパク質非溶媒は、１〜２５℃の範囲にある温度にて、タンパク質およびポロキサマーを含む当該溶液と接触される。より好ましくは、それは、２〜１０℃の範囲にある温度で、最も好ましくは約４℃の温度で接触される。実際、タンパク質・ポロキサマー粒子の形成は、低い温度でより再現性がある。これは、ポロキサマー・タンパク質粒子がカプセル化されることが意図される場合、このようなポロキサマー・タンパク質粒子がマイクロスフェアまたはマイクロ粒子からのタンパク質の放出プロフィールを改善することを可能にする限り、特に有利であり得る。
【００３０】
好ましくは、水混和性タンパク質非溶媒はまた、ポロキサマーの非溶媒である。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「タンパク質非溶媒（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｏｎ  ｓｏｌｖｅｎｔ）」または「ポロキサマー非溶媒（ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  ｎｏｎ  ｓｏｌｖｅｎｔ）」とは、タンパク質、ポロキサマーがそれぞれ沈殿する溶媒を意味する。
【００３２】
水混和性タンパク質非溶媒は、好ましくは生体適合性である。
【００３３】
本明細書中で用いられる場合、「生体適合性」とは、ゾンデ（ｓｏｕｎｄ）による医学的鑑定の範囲内において、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または合理的な利益／危険比に釣り合う他の問題となる合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織との接触に適切である溶媒をいう。
【００３４】
好ましくは、水混和性非溶媒は、テトラグリコール、またはテトラヒドロフルフリルポリエチレン−グリコールもしくはテトラヒドロフルフリルアルコールとも呼ばれる、あるいはポリエチレン−グリコール  エーテルとも呼ばれるグリコフロールである（ＣＡＳ：９００４−７６−６）。
【００３５】
グリコフロールの容量は、水溶液の容量のうちの８０％〜９９％を占めていてもよい。
【００３６】
好ましくは、水溶液は、塩をさらに含有する。
【００３７】
有利なことに、タンパク質の水混和性非溶媒との組合せにおける塩の使用は、タンパク質の沈殿を促進および／または向上させる。それは、とりわけ、沈殿のより良好な収率を達成することを可能にする。さらに、タンパク質活性は、沈殿および再溶解後に保存される。これは、塩誘導性沈殿では殆ど観察されない。
【００３８】
水溶液の塩濃度は、広い範囲において変動してもよい。それは、一般的には、タンパク質の性質にしたがって予め決定される。
【００３９】
所定の量の一つのタンパク質、固定した溶液ｐＨ、固定した温度および水／水混和性非溶媒の固定した容量比について、当業者は、慣用的な作業により、典型的には、漸増量の塩をタンパク質の沈殿が観察されるまで添加することによって、最小の適切な塩濃度を決定し得る。この観点では、ポロキサマーの存在がタンパク質沈殿の形成に影響しないことが留意され得る。
【００４０】
好ましくは、塩の濃度は、０．０１Ｍ〜３Ｍの範囲である。
【００４１】
好ましくは、塩は、水溶性電解質である。トリス〔ヒドロキシメチル〕−アミノメタン、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４またはそれらの混合物が使用されてもよい。これらの中でも、ＮａＣｌが特に好ましい。
【００４２】
タンパク質の沈殿収率は、３つのパラメータ（水相の容量と水混和性タンパク質非溶媒の容量との間の比率、イオン強度およびタンパク質の質量）によってさらに至適化されてもよい。
【００４３】
例として、至適化条件を使用することにより、９５％を超える沈殿収率が、リゾチームについて達成され得る。
【００４４】
粒子は、任意の従来の方法を使用すること、とりわけ、遠心分離によって回収されてもよい。
【００４５】
本発明の特定の局面では、水混和性タンパク質非溶媒は、溶解した壁形成性ポリマーをさらに含有する。この観点では、水混和性タンパク質非溶媒は、好ましくはグリコフロールである。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、語「壁形成性ポリマー」とは、個別に、または組合せにおいて、基質（ｍａｔｒｉｘ）の構成実体を形成し得るポリマーをいう。生分解性かつ生体適合性の壁形成性ポリマーが好ましく、特に注射可能な適用についてのものが好ましい。このようなポリマーの例としては、とりわけ、ポリラクチド（ＰＬＡ）等のポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー（ＰＬＧＡ’ｓ）、乳酸およびグリコール酸のコポリマーに結合したポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ’−ＰＥＧ’ｓ）、または乳酸のポリマーに結合したポリエチレングリコール、ポリ−ε−カプロラクトン等のポリエステル、ポリ（オルトエステル）およびトリグリセリド、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【００４７】
好ましくは、ポロキサマー／ポリマーのモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は、１〜３０の範囲であり、より好ましくは２〜１０であり、最も好ましくは約５である。
【００４８】
この実施形態は、得られた分散物が、形成されたポロキサマー・タンパク質粒子を回収することなく、造粒等のカプセル化方法に直接的に提供されてもよいので、特に有利である。
【００４９】
ポロキサマー・タンパク質粒子のカプセル化、とりわけ、マイクロスフェアまたはマイクロカプセルからのタンパク質の放出プロフィールの改善の観点では、１〜３０、より好ましくは２〜２０、最も好ましくは約１７の範囲においてポロキサマー／タンパク質のモル比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を使用することが特に好ましい。
【００５０】
さらなる局面では、本発明は、本発明の方法により得られうるポロキサマー・タンパク質粒子の分散物に関する。
【００５１】
なおさらなる局面では、本発明は、本発明の方法によって得られうるポロキサマー・タンパク質粒子に関する。
【００５２】
カプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子
本発明のポロキサマー・タンパク質粒子は、壁形成性ポリマーの基質内でさらにカプセル化されて、カプセル化粒子を形成できる。カプセル化は、乳化／溶媒抽出プロセスまたは造粒方法等の、当該分野において公知である任意のプロセスによって成し遂げられてもよい。乳化／溶媒抽出プロセスに関しては、参照は、とりわけ、Ｐｅａｎら（１９９８）に対してなされ得る。
【００５３】
好ましい局面では、本発明の粒子の（マイクロ）カプセル化は、乳化／溶媒抽出プロセスによって成し遂げられる。
【００５４】
したがって、本発明は、以下を含む、ポロキサマー・タンパク質粒子をカプセル化するための方法に関する：
ｉ）以下を含有するｓ／ｏ／ｗ乳剤を調製する工程：
連続相として、水相、および
不連続相として、先に定義したような分散したポロキサマー・タンパク質粒子および壁形成性ポリマーを含有する有機溶媒であって、該壁形成性ポリマーが該有機溶媒に可溶性であり、かつ該連続相に不溶性である、有機溶媒、
ｉｉ）該不連続相を固形化して、それによりカプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子を形成する工程；ならびに、必要に応じて
ｉｉｉ）得られたカプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子を回収する工程。
【００５５】
本明細書中で用いられる場合、用語「乳剤」は、別の液体（連続相）中に小滴の形態において分散した一つの非混和性の液体（不連続相）の不均一な系をいう。乳剤の小滴のサイズは、１μｍ〜数百μｍ（例えば〜１００μｍ）の範囲であってもよい。
【００５６】
本明細書中で用いられる場合、「ｓ／ｏ／ｗ乳剤」とは、水中油中固体の乳剤を意味し、ポロキサマー・タンパク質粒子が不連続相を形成する有機溶媒中に分散している乳剤をいう。
【００５７】
乳剤は、任意の従来の方法によって調製されてもよい。このような方法としては、とりわけ、せん断（ｓｈｅａｒｉｎｇ）、高圧ホモジナイゼーション、静的混合、超音波処理、温度または／および圧力により誘導される相転換が挙げられ得る。
【００５８】
好ましくは、ｓ／ｏ／ｗ乳剤は、攪拌下で、連続相中に不連続相を注ぐことにより形成される。
【００５９】
例として、不連続相を形成する有機溶媒は、ジクロロメタン、アセトン、酢酸エチルおよびクロロホルムまたはそれらの混合物からなる群より選ばれてもよい。
【００６０】
好ましくは、壁形成性ポリマーは、乳酸のポリマー、乳酸およびグリコール酸のコポリマー、特にポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、またはトリブロックコポリマーＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ等のポリエチレングリコール結合ＰＬＧＡ’ｓ（ＰＬＧＡ’−ＰＥＧ’ｓ）である。
【００６１】
好ましくは、連続相は、ポリ（ビニルアルコール）等の界面活性剤をさらに含む。
【００６２】
好ましい局面では、不連続相の固形化は、不連続相から有機溶媒を抽出し、それにより壁形成性ポリマーを不溶化させ、不連続相を固形化することにより行われる。
【００６３】
好ましくは、溶媒は、第２の溶媒（当該第２の溶媒は、不連続相の溶媒と混和性であり、かつ不連続相中に含有される壁形成性ポリマーの溶媒と混和性ではない）を添加し、それにより、連続相中で混和性である溶媒の混合物を形成することによって抽出される。
【００６４】
例として、第２の溶媒は、水、エタノール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールであってもよい。
【００６５】
得られたカプセル化粒子は、濾過または遠心分離等の任意の従来の方法によって回収されてもよく、そして、それらの洗浄後に凍結乾燥できる。
【００６６】
さらなる好ましい局面では、本発明の粒子の（マイクロ）カプセル化は、特に有利である層噴射ブレイクアップ（ｌａｍｉｎａｒ  ｊｅｔ  ｂｒｅａｋ−ｕｐ）または「造粒（ｐｒｉｌｌｉｎｇ）」として知られている技術によって成し遂げられる。なぜならば、それは、産業上実行可能であり、かつ単分散したマイクロ粒子の形成を誘導するからである（Ｓｅｒｐら，２０００）。
【００６７】
したがって、本発明は、以下を含む、ポロキサマー・タンパク質粒子をカプセル化するための方法に関する：
ｉ）先に定義されたような壁形成性ポリマーを含有するポロキサマー・タンパク質粒子の分散物を提供する工程、または先に定義されたようなポロキサマー・タンパク質粒子を、溶媒中に溶解した壁形成性ポリマーの溶液中に分散させる工程；
ｉｉ）工程ｉ）の分散物の小滴を形成する工程；
ｉｉｉ）当該小滴を固形化する工程；ならびに、必要に応じて
ｉｖ）得られたカプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子を回収する工程。
【００６８】
好ましくは、小滴は、分散物の溶媒を抽出することにより固形化される。
【００６９】
分散物の溶媒は、とりわけ、第２の溶媒（当該第２の溶媒は、分散物の溶媒と混和性であり、かつ当該壁形成性ポリマーの非溶媒である）で抽出されて、それによりカプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子を形成してもよい。
【００７０】
カプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子は、とりわけ、工程ｉ）において規定されたように、分散物の層噴射物（ｌａｍｉｎａｒ  ｊｅｔ）を粉々にして、振動ノズルデバイスによってモノサイズの小滴にすることにより、本方法にしたがって調製されてもよい。次いで、得られた小滴は、固形化浴、とりわけ、壁形成性ポリマーの非溶媒であり、かつ分散物の溶媒と混和性である第２の溶媒の浴中に落下させることにより固形化される。
【００７１】
好ましくは、分散物の溶媒は、グリコフロールであり、壁形成性ポリマーは、ＰＬＧＡである。本状況では、分散物の小滴は、とりわけ、水、エタノール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロパン−２−オール、プロピレングリコールまたはそれらの混合物のＰＧＬＡ非溶媒浴中で固形化されてもよい。この実施形態は、如何なる毒性溶媒も使用されないので、特に有利である。
【００７２】
なおさらなる局面では、本発明はまた、本発明にしたがって得られうるカプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子に関する。
【００７３】
カプセル化粒子は、とりわけ、マイクロカプセル化粒子であり、マイクロカプセルまたはマイクロスフェアであってもよい。本明細書中で用いられる場合、「マイクロスフェア」は、ポロキサマー・タンパク質の組合せが分散される基質の系である。「マイクロカプセル」は、ポリマーの層でコーティングされた、ポロキサマー・タンパク質の組合せの核から構成される。
【００７４】
マイクロカプセルは、造粒方法で得られてもよく、一方で、マイクロスフェアは、ｓ／ｏ／ｗ乳化溶媒抽出プロセスで、または造粒により得られてもよい。
【００７５】
有利なことに、ポロキサマー・タンパク質の組合せは、タンパク質が壁形成性ポリマーの基質中に均一に分散しているマイクロスフェアを得ることにより、カプセル化タンパク質の放出プロフィールを改善することを可能にする。
【００７６】
好ましくは、カプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子は、１〜１０００μｍの範囲であるメジアン径を有する。
【００７７】
有利なことに、カプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子は、タンパク質がポロキサマーで沈殿しなかったカプセル化タンパク質粒子と比較して、タンパク質の放出プロフィールの改善を示す。より具体的には、本発明のカプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子は、２０日間にわたって、如何なるバースト効果も伴わずに、タンパク質の連続的放出を可能にすることが観察されている。
【００７８】
本発明はまた、本発明のカプセル化ポロキサマー・タンパク質粒子を含む医薬組成物に関する。
【実施例】
【００７９】
材料
リゾチーム（ニワトリ卵白）およびその基質：マイクロコッカス  リゾデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）、グリコフロール（テトラグリコールまたはα−［テトラヒドロ−２−フラニル］メチル−ω−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル）および緩衝液化合物を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（サンカンタン，ファラヴィエ（Ｆａｌｌａｖｉｅｒ），フランス）から得た。ＴＧＦベータ３を、Ａｂｃｙｓ（パリ，フランス）から購入した。ＴＧＦベータ３  ＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（リール，フランス）からであった。ポロキサマーは、ＢＡＳＦ（ルバロアペレ（Ｌｅｖａｌｌｏｉｓ−Ｐｅｒｒｅｔ），フランス）によって快く供給された。Ｐｈｕｓｉｓ（サン・ティスミエ（Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｍｉｅｒ），フランス）によって提供されたキャップ化７５／２５  ＰＬＧＡは、サイズ排除クロマトグラフィー（標品：ポリスチレン）により決定した場合、平均分子量２７，０００Ｄａ（多分散指数，Ｉ＝１．９）を有していた。ＰＬＧＡ５０：５０−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ５０：５０（ＲＧＰ  ｔ  ５０１０６、６，０００Ｄａを有する１０％  ＰＥＧ，ｉ．ｖ．０．７５）は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（インゲルハイム，ドイツ）から購入した。ポリビニルアルコール（Ｍｏｗｉｏｌ（登録商標）４−８８）は、Ｋｕｒａｒａｙ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ（フランクフルト、ドイツ）からであった。
【００８０】
タンパク質粒子を調製するための方法
先ず、タンパク質を、非緩衝化生理食塩水溶液中に溶解し、次いで、グリコフロールと室温で混合した。３０分後、タンパク質粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分，４℃）により回収した。沈殿収率を最適化するために、混合および３０分の遠心分離時間を選んだ。
【００８１】
タンパク質・ポロキサマー粒子を調製するための方法
先ず、タンパク質およびポロキサマー１８８を、生理食塩水溶液中に共に溶解した。次いで、このタンパク質・ポロキサマー溶液を、グリコフロールと混合して、タンパク質・ポロキサマー分散物を調製した。３０分後、ポロキサマー・タンパク質粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分，４℃）により回収した。沈殿収率を最適化するために、混合および３０分の遠心分離時間を選んだ。
【００８２】
リゾチーム等の広く利用可能なタンパク質の沈殿収率の最適化
リゾチームの沈殿の最適条件を規定するために、実験を設計した。記載された技術を使用した予備的な研究（示さず）は、３つのパラメータがタンパク質の沈殿収率に影響を及ぼすことを示した（水相の容量とグリコフロールの容量との間の比率、イオン強度およびタンパク質の質量）。ポロキサマーの存在は、タンパク質の沈殿に影響しなかった。
【００８３】
これらの３つの変動因子を研究するため、Ｄｏｅｈｌｅｒｔマトリクスを選択した。１５の実験を行なった。各実験を、３回繰り返した。各因子についての実験範囲は、以下に記載されるとおりである：
−水相のイオン強度（Ｕ１）：０．０１〜０．５９Ｍ（５段階）
−水相の容量（Ｕ２）：２５〜１５５μｌ（７段階）
−タンパク質の量（Ｕ３）：０．１〜０．９ｍｇ（３段階）
グリコフロールの容量は、１ｍｌの懸濁物を補充するものであった。
実験設計を、図１に報告する。
【００８４】
測定した応答は、収集された可逆的リゾチーム粒子の百分率（沈殿収率）であった（図２）。その決定については、その活性質量を決定するために、グリコフロール中のタンパク質粒子の分散物を遠心分離し、上清を除き、タンパク質粒子のペレットを、０．０１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解した。リゾチームの生物学的活性を、マイクロコッカス  リゾデイクティカス細菌細胞懸濁物における濁度変化を測定することにより決定した。
【００８５】
Ｎｅｍｒｏｄ（登録商標）Ｗソフトウェア（２０００，ＬＰＲＡＩ，マルセイユ）を、統計学的な実験の設計の生成および利用のために使用した。
【００８６】
殆ど利用可能でないタンパク質（ＴＧＦ−β３）の沈殿収率の最適化
塩およびグリコフロールの存在下におけるタンパク質の挙動を規定するために、急速な塩のスクリーニングを用いてもよい。沈殿することが望まれるタンパク質の量（２０〜１０００μｇ）を含有するタンパク質水溶液（５０μｌ）を、９６ウェルプレートのウェル中に堆積させた。次いで、漸増濃度（０〜３Ｍ）の塩を含む生理食塩水溶液（５０μｌ）を、各ウェル中に添加する。最後に、グリコフロール（３００μｌ）を加えて、吸光度を、３５０ｎｍで測定する。吸光度の増加は、タンパク質粒子の形成に関連する。ポロキサマーの存在は、タンパク質粒子の形成に影響しない。
【００８７】
リゾチーム−ポロキサマー１８８粒子のサイズ
グリコフロール中に分散した、リゾチーム・ポロキサマー１８８粒子のサイズを、光回折（Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ（登録商標）２０００，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ウースターシャー，イギリス）により決定した。
【００８８】
ゼータ電位
溶液中のリゾチ−ムとポロキサマー１８８との間の組合せの形成をモニターするために、漸増量のポロキサマー１８８を含有する０．１Ｍ酢酸のリゾチーム溶液を調製した。タンパク質濃度を、１０ｍｇ／ｍｌに維持した。対応するゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ウースターシャー，イギリス）を使用して、ポロキサマーに対するタンパク質の比率の関数として測定した。
【００８９】
ＦＴＩＲ
マイクロスフェアの内側における、ポロキサマー１８８を有する、または有しないリゾチームの二次構造を、ＦＴＩＲ分光測定によって決定した。タンパク質を検出するために、（ＰＬＧＡの量に対して）５％（ｗ／ｗ）のタンパク質をロードしたマイクロスフェアを研究した。ＦＴＩＲ研究を、ＤＴＧＳ検出器を備えたＢｕｃｋｅｒ  ＩＦＳ２８で実施した。２ｃｍ−１解像度での５００回のスキャン（４０００〜４００ｃｍ−１）を平均化して、各スペクトルを得た。凍結乾燥したマイクロスフェアを、ＫＢｒペレットとして測定した（２００ｍｇのＫＢｒあたり４〜５ｍｇのマイクロスフェア）。全てのスペクトルを、プログラムＯＰＵＳバージョン２．０を使用して、アミドＩ領域（１７００〜１６００ｃｍ−１）において解析した。全ての場合において、２０００−１８００ｃｍ−１間の線形ベースラインを差し引いた。アミドＩ領域における赤外線バンドの位置およびバンドの数を、プログラムＯＰＵＳを使用してＬｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔアルゴリズムにより算定した。二次構造の内容を、個々の割り当てられたバンドの面積およびアミドＩ領域における総面積のそれらの割合から算定した。
【００９０】
マイクロスフェア中のＢＳＡ−ＦＩＴＣ分布
マイクロスフェアに、上記のようなＢＳＡ−ＦＩＴＣまたはＢＳＡ−ＦＩＴＣ／ポロキサマー１８８をロードした。レーザ走査共焦点画像化システム（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｌｉｇｈｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ＦＵ３００，パリ，フランス）を用いて、マイクロスフェア中のＢＳＡ−ＦＩＴＣ分布を観察した。乾燥マイクロスフェアをガラススライド上に分散した；断面の蛍光画像を、光学的な区分化により撮影した。全ての画像を、単一の解像度を使用して得た。
【００９１】
マイクロカプセル化リゾチーム・ポロキサマー１８８粒子の調製
リゾチーム・ポロキサマー１８８粒子をロードしたＰＬＧＡマイクロスフェアを、Ｐｅａｎら（Ｐｅａｎら，１９９８）から採用したｓ／ｏ／ｗ乳剤溶媒抽出・蒸発プロセスを使用して調製した。簡潔には、０．９ｍｇのタンパク質・ポロキサマー１８８粒子（ＰＬＧＡの量に対して０．６％（ｗ／ｗ））を、沈殿の最適条件において調製し、上記のように収集した。次いで、それらを、１５０ｍｇのＰＬＧＡを含有する有機溶液（２ｍｌ；３：１の塩化メチレン：アセトン）中に注意深く分散した。次いで、生じた有機懸濁物を、１℃で維持されたポリ（ビニルアルコール）水溶液（９０ｍｌ，４％（ｗ／ｖ））中で乳化し、５５０ｒｐｍで１分間、機械的に攪拌した（ｈｅｉｄｏｌｐｈ  ＲＺＲ  ２０４１，Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ，パリ、フランス）。１００ｍｌの脱イオン水を添加し、１０分間攪拌した後に、生じたｓ／ｏ／ｗ乳剤を脱イオン水（５００ｍｌ）に添加し、２０分間さらに攪拌して、有機溶媒を抽出した。最後に、形成されたマイクロ粒子を、５μｍフィルター（ＨＶＬＰ型，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＡ，ギュイアンクール（Ｇｕｙａｎｃｏｕｒｔ）、フランス）上で濾過し、１００ｍｌの脱イオン水で５回洗浄し、凍結乾燥した。生じたマイクロスフェアの平均的な容積の直径およびサイズ分布を、ＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒＴＭ  ３  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｒｏｉｓｓｙ  ＣＤＧ，フランス）を使用して評価した。
【００９２】
リゾチームのカプセル化効率
タンパク質のカプセル化収率を、生物学的に活性な封入タンパク質を考慮して決定した。リゾチームＰＬＧＡマイクロスフェア（１０ｍｇ，３バッチ）を、シラン処理されたガラスチューブにおいて、０．９ｍｌ  ＤＭＳＯ中に溶解した。１時間後、３ｍｌの０．０１Ｍ  ＨＣｌを添加した。溶液をさらに１時間静置したままにし、次いで、リゾチーム活性の決定のために、マイクロコッカス  リゾデイクティカス懸濁物とインキュベートした。
【００９３】
マイクロスフェアからのリゾチームのインビトロ放出プロフィール
０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含有する５００μＬの０．０１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を、遠心分離管中の１０ｍｇのマイクロスフェアに添加することにより、ＰＬＧＡマイクロスフェアからのリゾチームのインビトロ放出プロフィールを決定した。チューブを閉めて、３７℃の水浴中でインキュベートし、１２５ｒｐｍで攪拌した。決定された時間間隔で、チューブを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５００μｌの上清を解析のために収集し、新鮮な緩衝液と交換した。生物学的に活性な放出されたリゾチームの百分率を、酵素アッセイによって測定した。
【００９４】
結果
実施例１．ポロキサマー１８８とカップリングした９００μｇのリゾチーム粒子の調製
０．３Ｍ  ＮａＣｌ中に９００μｇのリゾチームおよび９ｍｇのポロキサマー１８８を含有する４５μｌの溶液をグリコフロールに添加して、室温で１ｍｌの懸濁物を形成させた。複合粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分，４℃）によって回収し、上清を除いた。
【００９５】
実施例２．ポロキサマー１８８とカップリングした３００μｇのリゾチーム粒子の調製
０．３Ｍ  ＮａＣｌ中に３００μｇのリゾチームおよび３ｍｇのポロキサマー１８８を含有する１０μｌの溶液をグリコフロールに添加して、１ｍｌの懸濁物を形成させた。ポロキサマー・タンパク質粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分，４℃）によって回収し、上清を除いた。
【００９６】
実施例３．ポロキサマー１８８とカップリングした９ｍｇのリゾチーム粒子の調製
０．３Ｍ  ＮａＣｌ中に９ｍｇのリゾチームおよび９０ｍｇのポロキサマー１８８を含有する４５０μｌの溶液をグリコフロールに添加して、１０ｍｌの懸濁物を形成させた。複合粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分，４℃）によって回収し、上清を除いた。
【００９７】
実施例４．溶解後における、ポロキサマー１８８とカップリングしたリゾチーム粒子の活性
実施例１および２に記載されるポロキサマー・タンパク質粒子のペレットを、その活性質量を決定するために、適切な溶媒中に溶解する（０．０１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））。リゾチームの生物学的活性を、マイクロコッカス  リゾデイクティカス細菌細胞懸濁物における濁度変化を測定することにより決定する。８０％を超えるタンパク質が、活性形態で回収される。
【００９８】
実施例５．リゾチーム／ポロキサマー１８８粒子のサイズ
グリコフロール中に懸濁したポロキサマー・タンパク質粒子（実施例１に記載される）のサイズを、光回折によって決定した。平均的な粒子サイズは、約１００ｎｍであり、分布は狭かった。
【００９９】
実施例６．ポロキサマー１８８の存在下におけるリゾチームのゼータ電位の評価
水溶液中における漸増量のポロキサマー１８８とのリゾチームの相互作用を、ゼータ電位測定によって制御した。ポロキサマー１８８を添加した場合、リゾチームのゼータ電位は、１５から５ｍＶに移った（図３）。リゾチーム上の正味の表面電荷のこの減少は、ポロキサマー１８８とのリゾチームの分子組合せの結果であると考慮し得る。
【０１００】
実施例７．ＰＬＧＡマイクロスフェアにおけるリゾチーム／ポロキサマー１８８粒子のマイクロカプセル化
リゾチーム／ポロキサマー１８８粒子をロードしたＰＬＧＡマイクロスフェアの調製
リゾチームをロードしたＰＬＧＡマイクロスフェアを、水中油中固体（ｓ／ｏ／ｗ）乳剤溶媒抽出・蒸発プロセスを用いて調製した。簡潔には、ポロキサマー１８８とカップリングした９００μｇのタンパク質粒子（ＰＬＧＡの量に対して０．６％タンパク質（ｗ／ｗ））を、実施例１に記載されるように調製し、上記のように収集した。次いで、それらを、１５０ｍｇのキャッピングしていない７５／２５  ＰＬＧＡ（平均分子量２７，０００Ｄａ、多分散指数１．９）を含有する有機溶媒（２ｍｌ；３：１  塩化メチレン：アセトン）中に注意深く分散させた。次いで、生じた有機懸濁物を、１℃で維持されたポリ（ビニルアルコール）水溶液（９０ｍｌ，４％（ｗ／ｖ））中で乳化させ、５５０ｒｐｍで１分間、機械的に攪拌した。１００ｍｌの脱イオン水の添加および１０分の攪拌後に、生じたｓ／ｏ／ｗ乳剤を脱イオン水（５００ｍｌ）に添加して、さらに２０分間攪拌して、有機溶媒を抽出した。最後に、形成されたマイクロスフェアを、５００ｍｌの脱イオン水で洗浄された５μｍフィルター上で濾過し、凍結乾燥した。生じたマイクロスフェアは、約６０μｍの平均容積直径を有していた。
【０１０１】
インビトロ放出研究
０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡおよび０．０９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含有する５００μＬの０．０１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７．４）を、エッペンドルフチューブ中の１０ｍｇのマイクロスフェアに添加することにより、ＰＬＧＡマイクロスフェアからのリゾチームのインビトロ放出プロフィールを決定し、水浴中で３７℃でインキュベートし、１２５ｒｐｍで攪拌した。決定された時間間隔で、チューブを、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５００μｌの上清を、解析のために収集し、新鮮な緩衝液と交換した。放出された生物学的に活性なリゾチームの百分率を、酵素活性により測定した。インビトロ放出プロフィールに対するポロキサマー１８８の効果を、図４に示す。
【０１０２】
実施例８
実施例７のカプセル化タンパク質・ポロキサマー粒子を特徴付けるために、カプセル化リゾチームの二次構造を、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光測定により特徴付けた（表１）。タンパク質アミドＩ  ＩＲ赤外スペクトルを、二次構造の構成について解析し、二次構造を定量化した。先ず、ＦＴＩＲ分光測定は、僅かなタンパク質構造の摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）がカプセル化によっておよびポロキサマーの存在によって引き起こされたことを実証した。マイナーなスペクトル変化のみが、タンパク質構造に感受性であるアミドＩバンド（１７００〜１６００ｃｍ−１）中で生じた。ガウス曲線フィッティングによるスペクトルの解析は、αヘリックスおよびβ−シートの内容において僅かな変化を示した；二次構造は、カプセル化前の粉末についてのものと同じ誤差の範囲内であった。
【０１０３】
【表１】
0005487511.tif 000002
【０１０４】
実施例９．ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡマイクロスフェアにおけるリゾチーム／ポロキサマー１８８粒子のマイクロカプセル化（１５０ｍｇマイクロスフェアバッチ）
ＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡ（１０％  ＰＥＧ  ６０００Ｄａ）を用いた。機械的な攪拌を８５０ｒｐｍに調整したことを除いて、実施例７と同じ手順にしたがって、リゾチームをロードしたＰＬＧＡ−ＰＥＧ−ＰＬＧＡマイクロスフェアを調製して、６０μｍのマイクロスフェアを得た。インビトロ放出プロフィールに対するポリマーの型の効果を、図４に示す。
【０１０５】
実施例１０．ＰＬＧＡ−マイクロスフェアにおけるＢＳＡ−ＦＩＴＣ／ポロキサマー１８８の分布
ＢＳＡ−ＦＩＴＣ／ポロキサマー１８８粒子の調製
０．３Ｍ  ＮａＣｌ中に９００μｇのＢＳＡ−ＦＩＴＣおよび９ｍｇのポロキサマー１８８を含有する４５μｌの溶液をグリコフロールに添加して、室温で１ｍｌの懸濁物を形成させた。複合粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分，４℃）および上清の除去により回収した。
【０１０６】
リゾチーム／ポロキサマー１８８粒子をロードしたＰＬＧＡマイクロスフェアの調製
ＢＳＡ−ＦＩＴＣをロードしたＰＬＧＡマイクロスフェアを、実施例７に記載される手順にしたがって調製した。簡潔には、ポロキサマー１８８とカップリングした９００μｇのタンパク質粒子（ＰＬＧＡの量に対して０．６％タンパク質（ｗ／ｗ））を、１５０ｍｇのＰＬＧＡを含有する有機溶媒（２ｍｌ；３：１  塩化メチレン：アセトン）中に注意深く分散させた。生じたマイクロスフェアは、約６０μｍの平均容積直径を有していた。
【０１０７】
共焦点解析
共焦点画像システムを用いて、マイクロスフェア中のＢＳＡ−ＦＩＴＣ分布を観察した。乾燥マイクロスフェアを、ガラススライド上に分散した；断面の蛍光画像を、光学的な区分化により撮影した。ポロキサマーの存在は、マイクロスフェア内のより良好なタンパク質分布を示した。
【０１０８】
実施例１１．ポロキサマー１８８とカップリングした、１２５ｎｇのＴＧＦ−β３（形質転換増殖因子−ベータ３）粒子の調製。
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２Ｍ  ＮａＣｌ）中に、１２５ｎｇのＴＧＦ−β３および１．２５ｍｇのポロキサマー１８８を含有する１００μｌの溶液を、７４０ｍｇのグリコフロールに添加した。この複合粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分）および上清の除去によって回収した。ポロキサマー１８８の存在は、ＥＬＩＳＡ定量により決定した場合、沈殿の収率に影響しなかった。
【０１０９】
実施例１２．ポロキサマー１８８とカップリングした、５０μｇのＴＧＦ  β３粒子の調製
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４，２Ｍ  ＮａＣｌ）中に、５０μｇのＴＧＦ−ベータ３および３ｍｇのポロキサマー１８８を含有する１．２２０ｍｌの溶液を、８．６８ｇのグリコフロールに添加した。３０分後、この粒子を、遠心分離（１０，０００ｇ，３０分，４℃）および上清の除去によって回収した。
【０１１０】
実施例１３．タンパク質／ポロキサマー１８８粒子をロードした、５０ｍｇのＰＬＧＡマイクロスフェアバッチの調製
ポロキサマー１８８とカップリングしたタンパク質粒子を、５０ｍｇのキャッピングされた７５／２５  ＰＬＧＡ（平均分子量２７，０００Ｄａ，多分散指数１．９）を含有する有機溶液（６７０μｌ；３：１  塩化メチレン：アセトン）中に注意深く分散した。次いで、生じた有機懸濁物を、１℃で維持されたポリ（ビニルアルコール）水溶液（３０ｍｌ，４％（ｗ／ｖ））中で乳化させ、５５０ｒｐｍで１分間、機械的に攪拌した。３３ｍｌの脱イオン水および１０分間の攪拌後に、生じたｓ／ｏ／ｗ乳剤を脱イオン水（１６７ｍｌ）に添加して、さらに２０分間攪拌して、有機溶媒を抽出した。最後に、形成されたマイクロスフェアを、５００ｍｌの脱イオン水で洗浄した５μｍフィルター上で濾過し、凍結乾燥した。生じたマイクロスフェアは、約６０μｍの平均容積直径を有していた。
【０１１１】
実施例１４．ＴＧＦ  β３のマイクロカプセル化
ＴＧＦベータ３を、実施例１２で述べたように沈殿させた。
並行して、ＨＡＳ（ヒトアルブミン血清）粒子を調製した：２５０μｇのＨＡＳを含有する、１０μｌの０．３Ｍ  ＮａＣｌを、１．０７７ｇのグリコフロールに添加する。３０分後、ＨＡＳ粒子を、遠心分離（１００００ｇ，３０分，４℃）および上清の除去によって回収した。
【０１１２】
ＨＡＳ粒子を、３×１００μｌのポリマー有機溶液（実施例１３に記載される組成）中に分散させ、ポロキサマー・ＴＧＦ  ベータ３を、同じ条件において分散させた。双方の懸濁物を混合し、実施例１３に記載されるように、ＰＬＧＡマイクロスフェアを調製するために用いた。
【０１１３】
実施例１５．ＴＧＦ−β３（形質転換増殖因子−ベータ３）プロフィール放出
ＴＧＦベータ３を、実施例１４で述べたようにカプセル化した。
エッペンドルフチューブ中の１０ｍｇのマイクロスフェアに対する、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する５００μｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ）により、ＰＬＧＡマイクロスフェアからのＴＧＦベータ３のインビトロ放出プロフィールを決定し、水浴中で３７℃でインキュベートし、１２５ｒｐｍで攪拌した。５００μｌの上清を、解析のために収集し、新鮮な緩衝液と交換した。放出されたＴＧＦベータ３の百分率を、ＥＬＩＳＡにより決定し、放出されたＴＧＦベータ３の生物学的活性を、バイオアッセイによって評価した（図５）。
【０１１４】
参考文献
Ａｕｂｅｒｔ−Ｐｏｕｅｓｓｅｌ，Ａ．Ｖｅｎｉｅｒ−Ｊｕｌｉｅｎｎｅ，Ｍ．Ｃ．Ｃｌａｖｒｅｕｌ，Ａ．Ｓｅｒｇｅｎｔ，Ｍ．Ｊｏｌｌｉｖｅｔ，Ｃ．Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｍｅｎｅｉ，Ｃ．Ｎ．Ｇａｒｃｉｏｎ，Ｅ．Ｂｉｂｂｙ，Ｄ．Ｃ．Ｍｅｎｅｉ，Ｐ．およびＢｅｎｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．，２００４．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＧＤＮＦ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，９５，３，４６３−７５．
【０１１５】
Ｂｉｌａｔｉ，Ｕ．Ａｌｌｅｍａｎｎ，Ｅ．およびＤｏｅｌｋｅｒ，Ｅ．，２００５．Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｎａｎｏ−  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ，５９，３，３７５−８８．
【０１１６】
Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ，Ｉ．Ｊ．Ａｌ−Ａｚｚａｍ，Ｗ．およびＧｒｉｅｂｅｎｏｗ，Ｋ．，２００５．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  ｏｎ  ａｌｐｈａ−ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｕｐｏｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，９４，２，３２７−４０．
【０１１７】
Ｃｒｏｔｔｓ，Ｇ．およびＰａｒｋ，Ｔ．Ｇ．，１９９８．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：  ｒｅｌｅａｓｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｓｓｕｅｓ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ，１５，６，６９９−７１３．
【０１１８】
Ｊｉａｎｇ，Ｇ．Ｑｉｕ，Ｗ．およびＤｅＬｕｃａ，Ｐ．Ｐ．，２００３．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｐｏｌｙ（ａｃｒｙｌｏｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ）−ＰＬＧＡ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２０，３，４５２−９．
【０１１９】
Ｋｉｍ，Ｈ．Ｋ．Ｃｈｕｎｇ，Ｈ．Ｊ．およびＰａｒｋ，Ｔ．Ｇ．，２００６．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ‘‘ｏｐｅｎ／ｃｌｏｓｅｄ’’  ｐｏｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１１２，２，１６７−１７４．
【０１２０】
Ｌｅｅ，Ｅ．Ｓ．Ｋｗｏｎ，Ｍ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｈ．およびＫｉｍ，Ｊ．Ｊ．，２００７．Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｎｏｖｅｌ  ｖｉｓｃｏｕｓ  Ｓ／Ｗ／Ｏ／Ｗ  ｍｅｔｈｏｄ，ｌｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，３３１，１，２７−３７．
【０１２１】
Ｍｏｒｌｏｃｋ，Ｍ．ＫｏＩＩ，Ｈ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．およびＫｉｓｓｅｌ，Ｔ．，１９９７．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈ−  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）：  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｅｘｃｐｉｅｎｔｓ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈ，４３，２９−３６．
【０１２２】
Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｇ．Ｙｏｎｇ  Ｌｅｅ，Ｈ．およびＳｕｎｇ  Ｎａｍ，Ｙ．，１９９８．Ａ  ｎｅｗ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏａｄｅｄ  ｐｏｌｙ（Ｄ，  Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｓｔｕｄｙ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５５，２−３，１８１−９１．
【０１２３】
Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｈ．Ｙｅ，Ｍ．Ｙｅｏ，Ｙ．Ｌｅｅ，Ｗ．Ｋ．Ｐａｕｌ，Ｃ．およびＰａｒｋ，Ｋ．，２００６．Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ−ｔｙｐｅ  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ｐｒｅｐａｒｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍｅｔｈｏｄ：  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ＭｏＩ  Ｐｈａｒｍ，３，２，１３５−４３．
【０１２４】
Ｐｅａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｂｏｕｒｙ，Ｆ．Ｖｅｎｉｅｒ−Ｊｕｌｉｅｎｎｅ，Ｍ．Ｃ．Ｍｅｎｅｉ，Ｐ．Ｐｒｏｕｓｔ，Ｊ．Ｅ．およびＢｅｎｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．，１９９９．Ｗｈｙ  ｄｏｅｓ  ＰＥＧ  ４００  ｃｏ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ＮＧＦ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ＰＬＧＡ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１６，８，１２９４−９．
【０１２５】
Ｐｅａｎ，Ｊ．Ｍ．Ｖｅｎｉｅｒ−Ｊｕｌｉｅｎｎｅ，Ｍ．Ｃ．Ｂｏｕｒｙ，Ｆ．Ｍｅｎｅｉ，Ｐ．Ｄｅｎｉｚｏｔ，Ｂ．およびＢｅｎｏｉｔ，Ｊ．Ｐ．，１９９８．ＮＧＦ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ＮＧＦ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，５６，１−３，１７５−８７．
【０１２６】
Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．Ｖｉｌｌａｍａｙｏｒ，Ｂ．Ｇｕｏ，Ｙ．Ｍｃｌｖｅｒ，Ｊ．およびＡｌｏｎｓｏ，Ｍ．Ｊ．，１９９９．Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ｌｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，１８５，２，２５５−６６．
【０１２７】
Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，Ｓ．Ｐ．Ｃａｒｄａｍｏｎｅ，Ｍ．Ｋｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．およびＢｒａｎｄｏｎ，Ｍ．Ｒ．，１９９６．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．  Ｉｎ：  Ｃｏｈｅｎ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，  Ｈ．  （Ｅｄ．），  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．１−４９．
【０１２８】
Ｓｅｒｐ，Ｄ．Ｃａｎｔａｎａ，Ｅ．Ｈｅｉｎｚｅｎ，Ｃ．Ｖｏｎ  Ｓｔｏｃｋａｒ，Ｕ．およびＭａｒｉｓｏｎ，Ｉ．Ｗ．，２０００．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｂｅａｄｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，７０，１，４１−５３．
【０１２９】
Ｔａｍｂｅｒ，Ｈ．Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ｍｅｒｋｌｅ，ＨＰ．およびＧａｎｄｅｒ，Ｂ．，２００５．Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，５７，３  ＳＰＥＣ．ＩＳＳ．，３５７−３７６．
【０１３０】
Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｅｒｔ，Ｍ．Ｈｅｎｎｉｎｋ，Ｗ．Ｅ．およびＪｉｓｋｏｏｔ，Ｗ．，２０００．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，１７，１０，１１５９−６７．
【０１３１】
Ｗａｎｇ，Ｗ．，２００５．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，ｌｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ，２８９，１−２，１−３０．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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