(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
空気中の微生物を収集するための装置であって、
−空気収集モジュールであって、
ｉ．前記モジュールへの空気の流れの進入を可能にする空気進入ダクトを有し、前記ダクトの底部に空気の流れを乱す手段が設けられている上部部材、及び
ｉｉ．生成される空気の流れを外へと出すことができる排気手段を有している下部部材
を備え、前記空気収集モジュールの内部に空気の流れが生じるように前記上部部材と前記下部部材とを互いに一体化させることができる、空気収集モジュールと、
−おおむね円筒形であって、微生物保持ゾーンを有し、前記保持ゾーンが微生物の溶解手段を有しているカートリッジであって、前記空気収集モジュールの内部に配置されるカートリッジと
を有し、
前記空気の流れを乱す手段によって乱された前記空気の流れが前記微生物保持ゾーンに接触することを特徴とする装置。
【請求項２】
前記カートリッジの微生物保持ゾーンが、微生物を保持することができ、溶解手段を所定の位置に保持することができ、かつ液体の存在下において溶解することができる物質をさらに含んでいる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記空気の流れを乱す手段が、前記空気進入ダクトの腔の中心に配置された累積度数分布曲線の形状の円錐３０と、前記累積度数分布曲線の形状の部品を前記空気進入ダクトの内面へと接続する少なくとも１枚のブレードとを備えている、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記空気収集モジュールが、空気循環回路または空気吸引装置へと接続されるように意図されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置で収集した微生物の溶解装置であって、
−微生物保持ゾーンを有するおおむね円筒形の前記カートリッジであって、ステータの役割を実行するカートリッジと、
−前記カートリッジ内に配置することができるロータであって、回転手段を有するロータと
を有している装置。
【請求項６】
前記ロータを前記カートリッジと一体に保つためのキャップをさらに有している、請求項５に記載に装置。
【請求項７】
前記回転手段が前記ロータのダクトの一方の端部の壁に形成された溝で構成されており、前記溝が、前記端部上で正反対に向かい合っており、かつ前記ロータを回転させる手段の伝達シャフトの端部を受け入れるように意図されている、請求項５または６に記載の装置。
【請求項８】
前記カートリッジの内径が前記ロータの外径よりも大きいことにより、前記ロータが前記カートリッジに取り付けられたときに、前記カートリッジの内壁から前記ロータの外壁までの距離が、前記溶解手段が前記すき間空間内に位置するために充分に大きく、かつ前記溶解手段が前記壁の一方または他方に接触するために充分に小さい、請求項５〜７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
微生物の溶解および前記微生物の核酸の精製のためのシステムであって、
−請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置を位置決めする手段と、
−前記溶解装置が前記位置決め手段上に配置されたときに前記ロータを回転させる手段と、
−核酸を受け入れるための少なくとも１つの容器と、
−液体の吸引／排出のための少なくとも１つの手段と、
−前記微生物の溶解装置、精製された核酸を受け入れるための容器、および液体の吸引／排出手段に流体連通する多方向バルブと
を有している溶解システム。
【請求項１０】
磁化手段をさらに有している請求項９に記載の溶解システム。
【請求項１１】
加熱手段をさらに有している請求項９または１０に記載の溶解システム。
【請求項１２】
前記多方向バルブが吸引−排出手段を備えている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の溶解システム。
【請求項１３】
空気中の微生物の収集方法であって、
ａ）空気収集モジュールの内側にカートリッジを配置することにより請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物収集装置を得て、前記カートリッジの保持ゾーンを前記空気収集モジュールの空気進入ダクトに連絡させる段階と、
ｂ）任意の適切な手段によって空気を前記空気収集モジュールへと進入させる段階と、
ｃ）空気中の微生物を前記カートリッジの保持ゾーンに集める段階と
を含んでいる方法。
【請求項１４】
空気中の微生物の溶解方法であって、
ａ）カートリッジを空気収集モジュールの内側に配置することにより請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物収集装置を得て、前記カートリッジの保持ゾーンを前記空気収集モジュールの空気進入ダクトに連絡させる段階と、
ｂ）任意の適切な手段によって空気を前記空気収集モジュールへと進入させる段階と、
ｃ）空気中の微生物を前記カートリッジの保持ゾーンに集める段階と、
ｄ）前記空気収集モジュールから前記カートリッジを取り出す段階と、
ｅ）前記カートリッジに前記ロータを配置することにより請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置を得る段階と、
ｆ）前記微生物の溶解装置を、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムに配置する段階と、
ｇ）前記カートリッジに溶出液を導入し、前記カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｈ）前記ロータの回転手段によって前記カートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが前記微生物の溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と
を有している方法。
【請求項１５】
空気中の微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）カートリッジを空気収集モジュールの内側に配置することにより請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物収集装置を得て、前記カートリッジの保持ゾーンを前記空気収集モジュールの空気進入ダクトに連絡させる段階と、
ｂ）任意の適切な手段によって空気を前記空気収集モジュールへと進入させる段階と、
ｃ）空気中の微生物を前記カートリッジの保持ゾーンに集める段階と、
ｄ）前記空気収集モジュールから前記カートリッジを取り出す段階と、
ｅ）前記カートリッジに前記ロータを配置することにより請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置を得る段階と、
ｆ）前記吸引−排出手段によって前記カートリッジに溶出液を導入し、前記カートリッジに含まれる溶解手段を懸濁させる段階と、
ｇ）前記ロータの回転手段によって前記カートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが前記溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と、
ｈ）溶解の際に放出される前記微生物の核酸を含んでいる溶出液を吸引する段階と、
ｉ）核酸を受け入れて精製するための容器に前記溶出液を送出する段階と
を有している方法。
【請求項１６】
核酸の洗浄および精製を行う段階をさらに含んでいる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記カートリッジの保持ゾーンに集められた微生物を増殖させることからなる段階ｄ’）をさらに有している請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
増殖が、２〜２４時間の範囲内の時間にわたるストーブでの前記カートリッジの培養によって達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
段階ｆ）〜ｉ）が、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムにおいて使用される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
微生物の溶解方法であって、
ａ）微生物がその保持ゾーンに集められているカートリッジを入手する段階と、
ｂ）前記カートリッジに前記ロータを配置することにより請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置を得る段階と、
ｃ）前記カートリッジに溶出液を導入し、前記カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｄ）前記カートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが前記微生物の溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と
を有している方法。
【請求項２１】
微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンに集められているカートリッジを入手する段階と、
ｂ）前記カートリッジに前記ロータを配置することにより請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置を得る段階と、
ｃ）前記カートリッジに溶出液を導入し、前記カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｄ）前記カートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが前記微生物の溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と、
ｅ）溶解の際に放出される前記微生物の核酸を含んでいる溶出液を吸引する段階と、
ｆ）核酸を受け入れて精製するための容器に前記溶出液を送出する段階と
を有している方法。
【請求項２２】
核酸の洗浄および精製を行う段階をさらに含んでいる請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
液体サンプルに含まれる微生物の溶解方法であって、
ａ）前記微生物を含んでいる液体サンプルをカートリッジの前記保持ゾーンの近傍に導入することにより、前記液体サンプルが前記カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｂ）前記カートリッジに前記ロータを配置することにより請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置を得る段階と、
ｃ）前記カートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが、微生物を保持している前記溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と
を有している方法。
【請求項２４】
液体サンプルに含まれる微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）前記微生物を含んでいる液体サンプルをカートリッジの前記保持ゾーンの近傍に導入することにより、前記液体サンプルが、前記カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｂ）前記カートリッジに前記ロータを配置することにより請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置を得る段階と、
ｃ）前記カートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが前記溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と、
ｄ）溶解の際に放出される前記微生物の核酸を含んでいる液体サンプルを吸引する段階と、
ｅ）核酸を受け入れて精製するための容器に前記液体サンプルを送出する段階と
を有している方法。
【請求項２５】
細胞組織のサンプルから核酸を抽出するための方法であって、
ａ）細胞組織のサンプルを、溶出液の存在下において前記カートリッジへと導入する段階と、
ｂ）前記カートリッジに前記ロータを配置することにより請求項５〜８のいずれか一項に記載の溶解装置を得る段階と、
ｃ）前記カートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが前記カートリッジ内に含まれる溶解手段を回転させることによって、細胞組織の細胞の機械的溶解を行う段階と、
ｄ）溶解の際に放出される前記細胞に由来する核酸を含んでいる溶出液を吸引する段階と、
ｅ）核酸を受け入れて精製するための容器に前記溶出液を送出する段階と
を有している方法。
【請求項２６】
核酸の洗浄および精製を行う段階をさらに含んでいる請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
細胞組織のサンプルの細胞を溶解させるための、請求項５〜８のいずれか一項に記載の微生物の溶解装置の使用。
【請求項２８】
細胞組織のサンプルの細胞を溶解させるための、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の、微生物の溶解、および前記微生物に由来する核酸の精製のためのシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、生物学的分析の分野である。より詳しくは、本発明は、第１に、環境サンプルまたは臨床サンプルに存在する微生物の溶解、ならびにこの微生物の核酸の抽出および精製のための装置に関する。さらに本発明は、分析を目的とする微生物の溶解、ならびにこの微生物の核酸の抽出および精製のための自動システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
病院における院内感染の急増が、ここ数年にわたって見られる。これらの感染は、病院の環境に存在し、設備および表面の殺菌ならびに空気の処理に常に振り向けられている多大な注意にもかかわらず撲滅されない病原微生物による入院患者（したがって、当然ながら免疫が低下している）の汚染によって説明される。これらのますます頻繁になる環境の微生物による汚染の事例に鑑みて、環境の管理を改善および促進する装置および方法の開発が、医療従事者にとって大きな課題となっている。
【０００３】
院内感染の問題に加えて、環境条件の管理も、長年にわたって産業（特には、食品業界ならびに医薬または化粧品業界）において繰り返されている懸案事項である。食品業界において、病原微生物による製品（あるいは、原料）の汚染によって生じうる消費者の健康への破滅的な結果は、周知のとおりである。実際、リステリア菌またはサルモネラ菌などといった種類の細菌に起因する食中毒が、今や頻発している。空気の品質の管理も、医薬または化粧品業界の品質アプローチにおける重要なプロセスである。
【０００４】
さらには、これらの管理は、規制がどんどん厳格になってきているため、ますます増える要件に従わなければならない。
【０００５】
医療従事者または製造者が環境の管理の実行において利用することができるツールの中でも、微生物エアサンプラが、空気中の微生物を検出するための最適な技術的解決策である。これらの装置は、微生物による空気の汚染の測定が必要とされる場所の適切な地点に配置される。これらの装置は、一般に、エアサンプラを培地に組み合わせて構成されている。エアサンプラによって採取された空気が、培地に接触させられ、採取された空気に含まれる微生物が、培地に付着する。次いで、培地が回収され、微生物の増殖を促進するためにストーブに配置される。このようにして、それらの微生物を、従来からの微生物学的技法によって検出および特定することが可能である。
【０００６】
しかしながら、これらの装置は、使用される技術に関連した大きな欠点を抱えている。この欠点は、分析結果を得るために要する時間である。実際、微生物学（特には、細菌学）の従来からの技法を使用することで、細胞の増殖に必要な培養時間が必要であり、あるいは特定を可能にするための特定の培地への植え直しの段階さえ必要である。結果として、院内感染または食中毒の原因である病原菌の検出および特定を試みるとき、結果を得るために要する時間が比較的長く、場合によっては長すぎる。
【０００７】
この種の装置のもう１つの欠点は、培地を使用することによって細菌の属および種の間の区別は可能であるが、１つの同じ細菌種の株の区別が、通常は不可能である点にある。今や、微生物の病原性が、前記当の株に応じて大きく変化しうることが知られている。
【０００８】
さらに、この種の装置は、生存能力を有するが、培養することが不可能である空気中の微生物を、検出できないという欠点を抱えている。
【０００９】
さらには、空気中の粒子、特には微生物を回収する目的の装置が存在する。すなわち、特許文献ＧＢ２２５４０２４が、空気中の粒子を集めるための装置を記載しており、その原理は、サイクロン効果に基づいている。そのような装置は、微生物を含む空気中の粒子の収集に適することが明らかになっているが、そのようにして得られるサンプルの処理については研究されておらず、特には分析に使用する目的の遺伝物質の抽出について、研究されていない。
【００１０】
より一般的には、臨床サンプルであっても、あるいは環境サンプルであっても、微生物の特定および／または結果をもたらす速度に関して最も適切な技法が、分子診断の技法であることは明らかである。微生物の遺伝物質の分析にもとづき、特には対象の一定の特定配列の分析に基づくこれらの技法は、培養段階の省略を可能にするため、記録的な速さで微生物のきわめて正確な特定を得ることを可能にする。
【００１１】
しかしながら、そのような技法の使用は、幾つかの限界を抱えており、そのうちで最も重要なものは、空気中に存在しており、したがって分析の実行のために回収することができる微生物の量が、おそらくは限られている点にある。実際、環境サンプルならびに特定の臨床サンプルにおいて、微生物が比較的少ないことが知られている。結果として、この原料から得られる遺伝物質の量が、わずかでしかない。したがって、核酸を抽出するために使用される技法の収率に関する性能が、重要なパラメータになる。
【００１２】
さらには、微生物を溶解させるための既存の技法の多くは、すべての微生物について汎用的に適用できるものではなく、かつ／または手作業による段階を行うために有資格者の介在を必要とする。
【００１３】
特許文献ＷＯ−Ａ−２００５／０３８０２５が、特には空気サンプルからの微生物から核酸を抽出するための方法を記載している。この方法は、３つの異なる溶解方法、すなわち化学的溶解、熱衝撃による溶解、および機械的溶解の使用を含んでいる。そのような方法は、核酸の抽出効率を最適化でき、したがって分析に利用できる遺伝物質の量を増やすことができることが明らかであるが、この効率は、回収される微生物の量に依然として依存している。さらに、前記微生物の回収の最適化について、この特許文献には何も記載されていない。
【００１４】
特許文献ＵＳ５７０７８６１が、微生物などの生きた細胞を破壊するための装置を記載している。この装置は、ガラスビーズを使用し、さらには微生物を収容する管とこれらの管を保持する支持部の穴との間に存在するすき間に起因する振動の効果によって、細胞の溶解を可能にしている。このようにして、この種の装置は、細胞の溶解を最適にし、遺伝物質の抽出を最適化することを可能にしている。この装置および後者によって使用される方法は、上述の限界と同じ限界を抱えており、すなわち回収される微生物の量に依然として依存する。さらに、細胞の残り屑から核酸を単離するために、核酸の濃縮という後続の段階を必要とするというさらなる欠点を抱えている。最後に、濃縮段階の終わりにおいて、核酸を手作業で回収する必要がある。
【００１５】
これらの問題は、特許文献ＵＳ５５６７０５０に記載の装置においても生じる。
【００１６】
より一体化されたシステムも、明らかにされている。すなわち、特許文献ＷＯ−Ａ−２００４／０１８７０４が、空気から微生物を集め、それらを特定するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅技法を使用する装置および関連の方法を記載している。このシステムは、郵便仕分けセンターにおいて企てられる生物学的汚染による攻撃に対抗するために特に適している。このシステムは、郵便を運ぶための回路に沿って配置された空気サンプラと、サイクロン効果による粒子のろ過／分離のための装置と、液体サンプル内の粒子の濃縮／回収のための装置と、サンプルの一部をＣｅｐｈｅｉｄ社のＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）というＰＣＲ分析カートリッジへと移すための装置とで構成されている。次いで、カートリッジが、空気から集められた微生物の特定のために、別の自動生物学的分析器へと手作業で移される。
【００１７】
このシステムは、上述の装置および方法に関する数々の技術的問題の解決を可能にするが、それでもなお、幾つかの大きな欠点を抱えている。第１にそれらの欠点は、分析カートリッジへの移動に先立つサンプルの処理（収集、分離、濃縮／回収）のためのシステムが、比較的複雑かつ高価である点である。もう１つの欠点は、核酸の溶解および精製の両方を実行することができるＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）カートリッジが存在しない点にある。さらに、第２の欠点は、集められた微生物が液体サンプルにて回収され、その一部だけしか分析されない点にある。これは、微生物がすべては回収されず、したがって核酸がすべては回収されない恐れが極めて大であり、分析の妥当性が大きく制限されることを意味する。さらには、その複雑さにもかかわらず、このシステムでは、カートリッジをＧｅｎｅＸｐｅｒｔ（商標）自動分析器へと手動で移さなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の第１の目的は、随意により植物状態または胞子の形態にある幅広い種類の微生物に関して、それが細菌、ウイルス、または菌類のいずれであろうと、環境サンプルおよび臨床サンプルの両方について有効な溶解の装置、システム、および普遍的方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、空気などの環境サンプルまたは臨床サンプルに含まれる前記微生物を、統合されたやり方で分析の目的のために核酸を抽出して回収するために、効率的に溶解させるために適した装置を提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、空気サンプルに含まれる微生物のすべてを収集するために適した装置を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、手作業による段階の数および複雑さを最小限にする単純な設計の装置を提供することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、きわめてコンパクトな装置を提供することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、上述したさまざまな段階が外的な汚染の恐れなく行われる閉じた装置を提供することにある。
【００２４】
本発明の別の目的は、上述の段階が作業者によるサンプルの移動を必要とせずに行われ、したがって作業者の汚染を防止する装置を提供することにある。
【００２５】
本発明の別の目的は、人間による介入を抑え、サンプルの処理のトレーサビリティを改善する装置およびシステムを提供することにある。
【００２６】
最後に、本発明の別の目的は、対象の核酸を、例えば増幅および検出の段階を含む分子診断の段階において遠心分離またはろ過などの追加の前処理段階を必要とせずに直接的に使用することができるバッファにて供給することができる装置および自動システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
これらの目的は、とりわけ、第１には、空気中の微生物を収集するための装置であって、
・空気収集モジュール、および
・カートリッジ
を有しており、
前記空気収集モジュールが、
ｉ．前記モジュールへの空気の流れの進入を可能にする空気進入ダクトを有しており、前記ダクトの底部に空気の流れを乱す手段が設けられている上部部材と、
ｉｉ．生成される空気の流れを外へと出すことができる排気手段を有している下部部材と
を備えており、
前記空気収集モジュールの内部に空気の流れを生じさせることができるよう、前記上部および下部部材を互いに一体化させることができ、
前記カートリッジは、おおむね円筒形であって、微生物保持ゾーンを有しており、前記保持ゾーンが、微生物の溶解手段を有しており、前記カートリッジが、前記空気収集モジュールの内部に配置される装置に関する本発明によって達成される。
【００２８】
好ましくは、微生物収集装置のカートリッジの微生物保持ゾーンが、微生物を保持することができ、溶解手段を所定の位置に保持することができ、かつ液体の存在下において溶解することができる物質をさらに含んでいる。
【００２９】
本発明による装置においては、空気の流れを乱す手段が、空気進入ダクトの腔の中心に配置された累積度数分布曲線の形状の円錐と、前記累積度数分布曲線の形状の部品を空気進入ダクトの内面へと接続する少なくとも１枚のブレードとを備える。
【００３０】
有利には、空気収集モジュールが、空気の循環のための回路または空気の吸引のための装置へと接続されるように意図されている。
【００３１】
さらに本発明は、微生物の溶解装置であって、
・おおむね円筒形の形状であり、微生物のための保持ゾーンを有しており、ステータの役割を実行するカートリッジと、
・前記カートリッジ内に配置でき、回転手段を有しているロータと
を有している装置に関する。
【００３２】
好ましい実施の形態によれば、この装置が、ロータをカートリッジと一体に保つように意図されたキャップをさらに備える。
【００３３】
有利には、回転手段が、行き止まりのダクトの壁に形成された溝で構成されており、これらの溝が、正反対に向かい合っており、前記ロータを回転させる手段の伝達シャフトの端部を受け入れるように意図されている。
【００３４】
微生物の溶解のためのこの装置の特筆すべき特徴によれば、ロータがカートリッジに取り付けられたときに、カートリッジの内壁をロータの外壁から隔てる距離が、このすき間空間に溶解手段を配置できるように充分に大きく、かつ溶解手段を前記壁の一方または他方に接触させるために充分に小さいように、カートリッジの内径がロータの外径よりも大きい。
【００３５】
さらに本発明は、微生物の溶解および前記微生物の核酸の精製のためのシステムであって、
・本発明による微生物の溶解装置を位置決めする手段と、
・前記溶解のための装置が前記位置決め手段に配置されたときにロータを回転させる手段と、
・核酸を受け入れるための少なくとも１つの容器と、
・液体の吸引／排出のための少なくとも１つの手段と、
・前記微生物の溶解装置、精製された核酸を受け入れるための容器、および液体の吸引／排出手段に連通する多方向バルブと
を有しているシステムに関する。
【００３６】
好ましくは、先行の請求項に記載のこの溶解システムが、磁化手段をさらに備えている。さらに加熱手段を備えてもよい。
【００３７】
本発明の特定の実施の形態によれば、多方向バルブが、吸引−吐出手段を備えている。
【００３８】
さらに本発明は、空気中の微生物の収集方法であって、
ａ）カートリッジを空気収集モジュールの内側に、本発明による微生物収集装置を得るように配置して、前記カートリッジの内部の保持ゾーンを空気収集モジュールの空気進入ダクトに連絡させる段階と、
ｂ）任意の適切な手段によって空気を前記空気収集モジュールへと進入させる段階と、
ｃ）空気中の微生物をカートリッジの保持ゾーンに集める段階と
を含んでいる方法に関する。
【００３９】
さらに本発明は、空気中の微生物の溶解方法であって、
ａ）カートリッジを空気収集モジュールの内側に、本発明による微生物収集装置を得るように配置して、前記カートリッジの内部の保持ゾーンを空気収集モジュールの空気進入ダクトに連絡させる段階と、
ｂ）任意の適切な手段によって空気を前記空気収集モジュールへと進入させる段階と、
ｃ）空気中の微生物をカートリッジの保持ゾーンに集める段階と、
ｄ）空気収集モジュールからカートリッジを取り出す段階と、
ｅ）微生物の溶解装置を得るために、カートリッジにロータを配置する段階と、
ｆ）前記微生物の溶解装置を、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムに配置する段階と、
ｇ）カートリッジへと溶出液を導入し、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｈ）前記ロータの回転手段によってカートリッジ内で前記ロータを回転させ、前記ロータが微生物の溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と
を有している方法に関する。
【００４０】
「溶出液」は、溶解を可能にし、あるいは良好な条件にて核酸の抽出および回収さえ可能にする任意の液体を意味する。この液体は、通常はバッファである。本発明による方法の適用の目的が、分析を目的とする核酸の抽出および回収である場合、このバッファは、それら核酸の保存を可能にするためのものである。この種の液体は、当業者にとって周知である。
【００４１】
さらに本発明は、空気中の微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）カートリッジを空気収集モジュールの内側に、本発明による微生物収集装置を得るように配置して、前記カートリッジの内部の保持ゾーンを空気収集モジュールの空気進入ダクトに連絡させる段階と、
ｂ）任意の適切な手段によって空気を前記空気収集モジュールへと進入させる段階と、
ｃ）空気中の微生物をカートリッジの保持ゾーンに集める段階と、
ｄ）空気収集モジュールからカートリッジを取り出す段階と、
ｅ）カートリッジにロータを配置する段階と、
ｆ）吸引−排出手段によってカートリッジに溶出液を導入し、カートリッジに含まれる溶解手段を懸濁させる段階と、
ｇ）前記ロータの回転手段によってカートリッジ内でロータを回転させ、前記ロータが溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と、
ｈ）溶解の際に放出される前記微生物の核酸を含んでいる溶出液を吸引する段階と、
ｉ）前記溶出液を核酸を受け入れて精製するための容器に送出する段階と
を有している方法に関する。
【００４２】
好ましくは、上述の微生物の溶解および核酸の抽出の方法が、カートリッジの保持ゾーンに集められた微生物を増殖させることからなる段階ｄ’）をさらに含む。
【００４３】
有利には、増殖が、２〜２４時間の範囲内の時間にわたるストーブでのカートリッジの培養によって達成される。
【００４４】
好ましくは、上述の微生物の溶解および核酸の抽出の方法の段階ｆ）〜ｉ）が、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムにおいて適用される。
【００４５】
さらに本発明は、微生物の溶解方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンに集められてなるカートリッジを入手する段階と、
ｂ）カートリッジにロータを配置する段階と、
ｃ）カートリッジに対象の液体を導入し、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｄ）カートリッジ内でロータを回転させ、前記ロータが微生物の溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と
を有している方法に関する。
【００４６】
さらに本発明は、微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）微生物が保持ゾーンに集められてなるカートリッジを入手する段階と、
ｂ）カートリッジにロータを配置する段階と、
ｃ）カートリッジに溶出液を導入し、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させる段階と、
ｄ）カートリッジ内でロータを回転させ、前記ロータが微生物の溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と、
ｅ）溶解の際に放出される前記微生物の核酸を含んでいる溶出液を吸引する段階と、
ｆ）前記溶出液を核酸を受け入れて精製するための容器に送出する段階と
を有している方法に関する。
【００４７】
さらに本発明は、液体サンプルに含まれる微生物の溶解方法であって、
ａ）前記微生物を含んでいる液体サンプルをカートリッジへと、カートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させるように、前記保持ゾーンの近傍に導入する段階と、
ｂ）カートリッジにロータを配置する段階と、
ｃ）カートリッジ内で前記ロータを回転させ、これによりカートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させるとともに、微生物を保持してなる溶解手段を回転させることによって、微生物の機械的溶解を行う段階と
を有している方法に関する。
【００４８】
「液体サンプル」は、微生物を含むことができる任意の液体サンプルを意味する。人間または動物を由来とする液体サンプルであってよい。このサンプルは、例えば尿、全血、血漿、または任意の他の体液であってよい。液体サンプルは、飲料など、食物由来の液体サンプルであってもよい。水など、環境由来液体サンプルであってもよい。さらには、液体サンプルが、いわゆる移送液（綿棒式の表面サンプリング装置（ＣＯＰＡＮ社によってｆｌｏｃｋｅｄＳＷＡＢＳという名前で市販されているものなど）に存在する微生物が、この移送液中で前記綿棒を揺り動かすことによって再懸濁させられる）であってもよい。
【００４９】
さらに本発明は、液体サンプルに含まれる微生物から核酸を抽出する方法であって、
ａ）前記微生物を含んでいる液体サンプルをカートリッジへと、カートリッジの微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させるように、前記保持ゾーンの近傍に導入する段階と、
ｂ）カートリッジにロータを配置する段階と、
ｃ）カートリッジ内でロータを回転させることによって、前記カートリッジの前記微生物保持ゾーンに位置する溶解手段を懸濁させるとともに、微生物が保持された溶解手段を回転させ、微生物の機械的溶解を行う段階と、
ｄ）溶解の際に放出される前記微生物の核酸を含んでいる液体サンプルを吸引する段階と、
ｅ）核酸を受け入れるための容器に前記液体サンプルを送出する段階と
を有している方法に関する。
【００５０】
さらに本発明は、細胞組織のサンプルから核酸を抽出する方法であって、
ａ）細胞組織のサンプルを溶出液の存在下においてカートリッジへと導入する段階と、
ｂ）カートリッジにロータを配置する段階と、
ｃ）カートリッジ内でロータを回転させ、前記ロータがカートリッジ内に含まれる溶解手段を回転させることによって、細胞組織の細胞の機械的溶解を行う段階と、
ｄ）溶解の際に放出される前記細胞に由来する核酸を含んでいる溶出液を吸引する段階と、
ｅ）核酸を受け入れるための容器に前記溶出液を送出する段階と
を有している方法に関する。
【００５１】
「組織サンプル」は、人間または動物から由来し、核酸の抽出が可能である任意の組織サンプルを意味する。そのようなサンプルを、例えば臓器、筋肉、または皮膚の生検によって得ることができる。これらの組織は、健康であっても、病的（とりわけ、腫瘍）であってもよい。
【００５２】
本発明による核酸の抽出方法のすべてが、好都合な実施の形態によれば、増幅などの後の処理に鑑みて、これらの核酸の追加の精製段階を有することができることに、注意すべきである。この精製段階は、核酸と溶解段階において塩析された他の細胞構成要素との間の分離を可能にする。この段階は、一般に、核酸の濃縮を可能にし、ＤＮＡおよびＲＮＡの精製に適合させることができる。この段階は、磁性粒子によって実行することが可能である。例として、随意により吸着または共有結合によってオリゴヌクレオチドでコートされた磁性粒子（米国特許第４，６７２，０４０号および第５，７５０，３３８号を参照）を使用し、洗浄段階においてこれらの磁性粒子に付着した核酸を精製することが可能である。この核酸の精製の段階は、これらの核酸の後の増幅が必要とされる場合に、特に有用である。これらの磁性粒子の特に興味深い実施の形態が、特許出願ＷＯ−Ａ−９７／４５２０２およびＷＯ−Ａ−９９／３５５００に記載されている。核酸の精製方法の他の興味深い例は、カラムの形態または不活性粒子の形態のいずれかのシリカを使用（Ｂｏｏｍ  Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９０、Ｎｏ．２８（３）、ｐ．４９５−５０３）し、あるいは磁性粒子（Ｍｅｒｃｋ社：ＭａｇＰｒｅｐ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ、Ｐｒｏｍｅｇａ社：ＭａｇｎｅＳｉｌ（商標）Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を使用することである。他の幅広く使用されている方法は、カラムまたは常磁性粒子の形式のイオン交換樹脂に基づく（Ｗｈａｔｍａｎ社：ＤＥＡＥ−Ｍａｇａｒｏｓｅ）（Ｌｅｖｉｓｏｎ  ＰＲら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１９９８、ｐ．３３７−３４４）。本発明にきわめて関係するが、本発明専用ではない別の方法は、金属酸化物の支持体（Ｘｔｒａｎａ社のＸｔｒａ−Ｂｉｎｄ（商標）ｍａｔｒｉｘ）への吸着である。
【００５３】
さらに、上述のさまざまな方法において、微生物の溶解装置の再構成に続くすべての段階、すなわちいったんカートリッジにロータが配置されると、すべての段階を、有利には、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムにおいて使用することができる。
【００５４】
さらに本発明は、本発明による微生物の溶解装置を、細胞組織のサンプルの細胞の溶解に使用することに関する。
【００５５】
さらに本発明は、本発明による微生物の溶解および前記微生物に由来する核酸の精製のためのシステムを、分析の目的のための細胞組織のサンプルからの細胞の溶解および前記細胞の核酸の精製に使用することに関する。
【００５６】
微生物は、細菌、ウイルス、イースト、かび、および寄生虫を含むグループから取られる。
【００５７】
微生物の単離が行われるサンプルは、環境由来のサンプルである。したがって、空気または液体（水など）のサンプルや、表面サンプルであってよい。サンプルは、微生物（随意により、病原性の微生物）の検出および特定のための分析の対象となることができる臨床由来のサンプル、すなわち人間または動物由来の任意のサンプルであってよい。
【００５８】
目標の核酸の存在を、ハイブリダイゼーション反応の視覚化によって実証することができる。ハイブリダイゼーション反応は、捕捉された核酸と、単離もしくは転写、逆転写、あるいはＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）式の増幅またはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）の段階によって生成された対象の核酸との間のあらゆる反応を意味する。
【００５９】
核酸は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、およびリボ核酸、ならびにその誘導体を意味する。オリゴヌクレオチドは、適切なハイブリダイゼーション条件のもとで少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドへとハイブリダイズすることができる天然または修飾された少なくとも２つのヌクレオチド（デオキシリボ核酸、またはリボ核酸、あるいは両方）の配列を指す。修飾されたヌクレオチドは、例えば、修飾塩基を有しており、さらには／あるいはヌクレオチド間の結合および／または骨格に修飾を有しているヌクレオチドを意味する。修飾塩基の例として、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、およびブロモ−５−デオキシウリジンを挙げることができる。
【００６０】
修飾されたヌクレオチド間結合の例示として、ホスホロチオエート、Ｎ−アルキルホスホルアミダート、アルキルホスホネート、およびアルキルホスホジエステル結合を挙げることができる。
【００６１】
ＦＲ−Ａ−２６０７５０７に記載されているようなアルファ−オリゴヌクレオチド、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌｕｍｅ  ８、Ｉｓｓｕｅ  １６、１８  Ａｕｇｕｓｔ  １９９８、ｐａｇｅｓ  ２２１９−２２２２に記載のホスホロチオエート−ＬＮＡおよび２’−チオ−ＬＮＡなどのＬＮＡ、ならびにＭ．Ｅｇｈｏｌｍらの論文（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２）、１１４、１８９５−１８９７）で考察されているＰＮＡが、修飾された骨格を有するヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチドの例である。
【００６２】
ハイブリダイゼーション反応を、直接的または間接的な手段など、任意の検出手段によって視覚化することができる。
【００６３】
直接的、すなわちラベリングを使用しない検出の場合には、ハイブリダイゼーション反応が、プラズモン共鳴または導電ポリマーを保持する電極におけるサイクリックボルタンメトリによって観察される。
【００６４】
間接的な検出、すなわちラベリングによる検出の場合には、ラベリングを、目標の核酸へと直接的に実行することができ、あるいはこの核酸の特有の結合相手（事前にラベル付けされている）を介して実行することができる。
【００６５】
対象の核酸の特有の結合相手は、対象の核酸へと結合することができる任意の相手を意味し、例として、核酸、オリゴヌクレオチド、あるいはポリヌクレオチドおよび酵素基質を挙げることができる。
【００６６】
「ラベリング」は、検出可能な信号を直接的または間接的に生成することができるマーカーを取り付けることを意味する。これらに限られるわけではないが、そのようなマーカーとして、例えば電気化学、比色分析、蛍光、および発光によって検出できる信号を生成する酵素、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、α−ガラクトシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼなどの酵素、酵素阻害剤、酵素補助因子、金粒子、磁性ラテックス、およびリポゾームなどの粒子、発光化合物などの発色団、染料、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性分子、ならびにフルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ（登録商標）、ウンベリフェロン、ルミノール、またはフィコシアニンなどの蛍光分子が挙げられる。蛍光の場合には、酵素基質反応の蛍光生成物、蛍光プローブ−消光剤の組み合わせ、蛍光の消滅、または蛍光の特性に基づく他の任意の系であってよい。
【００６７】
例えば他のリガンド／アンチリガンドのペアによる間接的なシステムも使用することができる。リガンド／アンチリガンドのペアは、当業者にとって周知であり、例えば以下のペア、すなわちビオチン／ストレプトアビジン、糖／レクチン、ポリヌクレオチド／相補的なポリヌクレオチドを挙げることができる。この場合、リガンドが結合剤を保持する。アンチリガンドを、先の段落に記載したマーカーによって直接的に検出することができ、あるいはそれ自身をリガンド／アンチリガンドによって検出することができる。
【００６８】
これらの間接的な検出システムは、特定の条件において、信号の増幅につながることができる。信号増幅のこの技法は、当業者にとって周知であり、本出願の出願人による以前の特許出願ＦＲ−Ａ−２  ７８１  ８０２またはＷＯ−Ａ−９５／０８０００、あるいは論文（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：４８１−４９１、１９９７）を参照することができる。
【００６９】
対象の核酸を、ポリメラーゼにより、キナーゼにより、無作為または特定的に、端部にマーカーを直接的または間接的に取り入れることによって、あるいは分子の「内部」へと取り入れることによって、前もってラベル付けすることができる。
【００７０】
分析対象の特有の結合相手のラベリングは、当業者に広く知られており、例えばＧｒｅｇ  Ｔ．ＨｅｒｍａｎｓｏｎによってＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ、５２５Ｂ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１０１  ＵＳＡに記載されている。
【００７１】
使用される共役のラベリングの種類（例えば、酵素を使用する）に応じて、当業者であれば、ラベリングの視覚化を可能にする試薬を添加できるであろう。この段階は、検出に相当する。これに先立ち、背景雑音を抑えるために、検体または元素のうちの反応に関与しなかった部分、結合の弱い部分、または非特定的な結合の部分を取り除くために、洗浄バッファが使用される。
【００７２】
本発明による装置の目的および利点が、図面を参照して以下に提示される例（ただし、決して本発明を限定するものではない）から、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】微生物の収集および溶解に使用されるカートリッジの縦断面図を示している。
【図２】空気中の微生物を収集するための特定の実施の形態による装置の縦断面図を示している。
【図３】図１に示した微生物収集装置の部分拡大の縦断面図を示している。
【図４】微生物収集装置の上部部材の内部の斜視図を示している。
【図５】図３に示した微生物収集装置の上部部材の内部の一部分の斜視図を示している。
【図６】微生物の溶解装置の縦断面図を示している。
【図７】微生物の溶解装置と多方向バルブとで構成された集合体の縦断面図を示している。
【図８Ａ】第１の設定にある多方向バルブのレベルにおける微生物の溶解のためのシステムの一部分の縦断面図を示している。
【図８Ｂ】第２の設定にある多方向バルブのレベルにおける微生物の溶解のためのシステムの一部分の縦断面図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
図１に縦断面にて示されているカートリッジ１０は、おおむね円形の断面の円筒形の全体形状を有している。円筒の上端が開いている一方で、下端は、中心に穴を有する壁で構成されており、その延長に、カートリッジ１０の内部へと延びるダクト１２が存在している。ダクトの内部の断面が、上端に近付くにつれて減少する傾向にあることを、見て取ることができる。
【００７５】
図１に示すように、カートリッジ１０の底壁１４の内面は傾けられており、傾斜の最下点が、ダクト１２に連絡する場所に位置し、最高点が、カートリッジ１０の垂直壁１６との接点にある。この壁１４が、溶解手段１８のための支持体として機能し、微生物保持ゾーンを構成する。これらの溶解手段は、この場合には、同一のサイズのビーズで構成されている。好ましい実施の形態によれば、これらのビーズは、ガラスである。しかしながら、鉄など、他の任意の同等の材料で構成されてもよい。これらのビーズは、有利には、２００〜８００マイクロメートル（μｍ）の間の直径を有している。
【００７６】
好都合な実施の形態によれば、ビーズが、異なるサイズであってよい。すなわち、２００〜３００μｍの間の直径を有するビーズの直径が４００〜６００μｍの間であるビーズとの混合物を使用することが、特に適切であるかもしれない。そのようなビーズは、例えばＳＩＧＭＡ社によってｔｈｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｃｉｄ−ｗａｓｈｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄｓ、４２５〜６００μｍ、型番Ｇ８７７２で市販されている。
【００７７】
ビーズは、好ましくはビーズ上に配置されるゼリー状物質１９の層によって重ね合わせられた１つ以上の層の形態で、所定の位置に保持される。ゼリー状物質は、幾つかの要件を満たさなければならない。第１には、カートリッジ内で使用される手順に影響を及ぼすことがないように、不活性でなければならない。第２に、微生物の溶解の応用のために、液体に溶ける能力を有さなければならない。上記物質は、例えばアガロースゲルであってよい（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社のＡｇａｒｏｓｅ−Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｂ  Ｌｏｗ  ＥＥＯ、型番Ａ０５７６−２５Ｇ）。さらに、ゼリー状物質が、グリセロールを含んでもよい。
【００７８】
あるいは、ゼリー状物質が、有利には、微生物のための培地であってよい。実際、寒天培地が、体外診断の分野において、従来から長きにわたって使用されてきている。上記培地の使用は、幾つかの利点をもたらす。主たる利点は、溶解の実行に先立つ微生物の増殖の段階を可能にできる点にある。たとえ本発明による装置が、病原微生物の迅速な検出に関するニーズを満たすことを目的としていても、数分から数時間の増殖段階が、微生物の増加を可能にすると考えられ、より大量の核酸を利用することができるという直接的な効果を有すると考えられる（これは、適切な分析の開始まで、管理を必要とする部屋において集められる空気サンプルの回収および移動における固有の遅延を活用できるようにする）。培地の使用の第２の利点は、培地が、所与の１つ以上の種について選択的であってよい点にある。結果として、そのような培地を使用することで、選択的な増殖が可能になり、したがって対象外の他の微生物（おそらくは、分析を妨げかねない）を犠牲にし、特定の病原微生物を検出することが可能になる。このように、それぞれが微生物の特定の種の検出に合わせて構成された幾つかの異なるカートリッジを用意することが考えられる。
【００７９】
カートリッジ１０の寸法は、例えば、内径に関して８〜１６ｍｍ、好ましくは１２ｍｍであってよい。ビーズの層の全体としての厚さは、典型的には、１〜２ｍｍの間であり、これは０．１〜１ｇ、好ましくは０．３ｇのガラスビーズの量に相当する。
【００８０】
カートリッジ１０は、有利には、射出成型の技法によって製作される。使用される材料は、例えばポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、環状シクロオレフィン（ＣＣＯ）、またはＰＭＭＡであるが、ポリカーボネートが好ましい。
【００８１】
微生物収集装置２０が、図２に示されている。この装置は、カートリッジ１０が配置される空気収集モジュールで構成されている。この空気収集モジュールは、上部部材２２および下部部材２４で構成される。
【００８２】
上部部材２２は、おおむね円筒形である。さらに、上部部材２２の斜視図が、図４および５に示されている。この円筒の下端が、開いている一方で、上端は、水平壁２６によって部分的に封じられている。この壁２６は、ダクト２８によって上部部材２２の中へと延びている穴を、中心に有している。この部分は、実際に、空気収集モジュール２０への空気の進入を可能にするダクトを構成している。特定の実施の形態によれば、この空気進入ダクトを、任意の適切な手段によって空気循環回路のチャネルへと接続することができる。累積度数分布曲線のような形状の円錐３０が、このダクトの底部の中央に配置されている。この円錐３０は、ブレード３２によってダクト２８の壁へと接続されている。これらのブレード３２を、図４および５にはっきりと見て取ることができる。これらの図に示した実施の形態においては、ブレード３２の数が３である。しかしながら、ブレード３２の数は、さまざまであってよい。図２に示されるように、円錐３０−ブレード３２の集合体の役割は、ダクト２８の底部に、微生物収集装置に進入する空気の流れの乱れを生じさせることにあり、この乱された流れが、微生物保持ゾーンのゼリー状物質に接触し、微生物保持ゾーンの空洞化をもたらす。この空洞化は、空気中の微生物の捕捉を大きく改善する。
【００８３】
図２および４に示されるとおり、上部部材２２は、３つの心出しピン３４および３つのロックピン３８をさらに有している。心出しピン３４は、カートリッジ１０の上部部材２２に対する適切な心出しを保証する。ロックピン３８は、上部部材２２において心出しされた位置へのカートリッジの固定をもたらす。これが、図２に明確に示されている。
【００８４】
上部部材２２は、その下部に、垂直壁の全周に形成され、上部部材２２と下部部材２４との結合を容易にする目的を有している段差および溝を有している。
【００８５】
下部部材２４も、おおむね円筒形である。この円筒の上端が、開いている一方で、下端は、空気を排出するためのおおむね円柱形の開口４２を中心部に有している水平壁４０によって部分的に封じられている。さらに下部部材２４は、カートリッジ１０の支持および配置のためのピン４４を備えている。したがって、下部部材２４は、上部部材２２へと配置される。カートリッジ１０も、ピン４４によって下部部材２４に当接して配置される。実際、カートリッジ１０が下部部材２４に配置されるとき、部材４４がカートリッジのダクト１２に進入し、カートリッジを正しい位置に配置および固定する。
【００８６】
下部部材２４の垂直な円筒壁の上端が、その内面に、この壁の全周に形成されるリップを有することができる。このリップは、上部部材２２と下部部材２４との間の固定をもたらすために、上部部材２２に設けられた段差および溝と相互作用するように意図されている。上部部材２２および下部部材２４の一体化が、それぞれの下端および上端の対をなす形状によって可能にされる。この結合は、可逆である必要がある。
【００８７】
部材２２および２４の他の結合手段は、一方の部材を他方の部材へとねじ込むことによる結合であってよい。この目的のために、一方の部材２２または２４の壁の端部が、雄ねじを有することができ、第２の部材の壁の端部が、対応する雌ねじを有することができる。
【００８８】
いかなる寄生の空気の進入もないように、収集手段が気密に封じられることが重要である。
【００８９】
空気収集手段の使用の特定のやり方によれば、空気排出ダクト２２の下端を、空気吸引ポンプ（図示されていない）または任意の同等のポンプ手段へと接続することができる。このポンプは、例えば病室や、調合薬または食料品の製造のための部屋など、特定の環境内の周囲空気の分析の実行が所望される場合に、周囲空気を空気収集手段へと吸引するために使用される。この目的のために、自律的かつ連続的に動作するポンプ手段を有することが好ましいかもしれない。
【００９０】
空気収集モジュール２２および２４は、例えば、１０〜４０ｍｍの間の外径を有することができ、好ましくは２０ｍｍの外径を有することができる。空気進入ダクトの内径は、例えば６ｍｍである。
【００９１】
この空気収集モジュール１０を、有利には、特にはオートクレーブ処理による殺菌が可能な材料で製作することができる。すなわち、アルミニウムまたは鋼などの金属であってよい。ポリカーボネート、環状シクロオレフィン（ＣＣＯ）、またはＰＭＭＡなどのポリマーであってもよい。
【００９２】
微生物収集装置における空気の循環がオンにされるとき、空気の辿る経路が、図２に矢印によって示されている。すなわち、空気が、空気進入ダクト２８によって微生物収集装置に進入することを、見て取ることができる。カートリッジ１０のダクト１２が、空気進入ダクト２８（より詳しくは、円錐３０）へと部分的に挿入されている。ダクト２８の底部における空気の流れが、円錐３０の頂点において、周囲の流れへと変換される。さらには、円錐３０の存在が、ダクト１２への空気の進入を防止する。上述のように、乱された空気の流れが、ゼリー状物質１９（ビーズ１８は図示されていない）へと達し、この地点において、空気の流れによって運ばれる微生物の衝突による保持がもたらされる。したがって、このプロセスは、微生物学的エアサンプラにおいて生じる内容に比較的似ている。
【００９３】
空気に関しては、ポンプ手段によって吸われ、経路を進み続ける。すなわち、カートリッジ１０の垂直な壁１６の内面に沿って上昇し、この同じ壁の外面に沿って再び下降し、排出開口４２によって空気収集モジュール２０から出る。
【００９４】
空気収集モジュール１０において収集される空気の流れは、例えば２０〜１００リットル／分（ｌ／ｍｉｎ）の間であってよい。有利には、５０ｌ／ｍｉｎである。
【００９５】
ひとたびカートリッジにおける微生物の保持／濃縮の段階が完了すると、カートリッジが、上部部材２２および下部部材２４を分解またはねじを緩めることによって前記手段から取り外すことで、空気収集モジュールから取り外される。
【００９６】
この段階において、カートリッジ内に濃縮された微生物の培養を実行したい場合には、カートリッジをストーブにおいて３７℃で培養する機会が存在する。すでに上述したように、この培養は、通常は、分析時間が過度に長くなることがないように、数十分から数時間にわたって続く。しかしながら、分析結果の取得が急がれない場合には、細菌の増殖のための要件により調和するより長い時間（すなわち、約２４時間）にわたるカートリッジの培養も、考えることができる。
【００９７】
同様に、分析の延期が望まれる場合には、低温室など、保管に適した環境にカートリッジを保管することも考えられる。
【００９８】
本発明の一実施の形態によれば、カートリッジ１０を、空気収集モジュールに直接配置して、供給することが可能である。この形式の提供は、ユーザがカートリッジを空気収集モジュールに配置する必要がなく、この段階における汚染の恐れが少なくなるという利点を有している。この場合において、空気収集モジュールがカートリッジと同じ材料、すなわちポリプロピレン、ポリカーボネート、またはＰＭＭＡで製作されると、きわめて好都合である。その場合、射出成型による製造が、特に適している。
【００９９】
微生物の収集が完了し、場合によっては培養が完了すると、カートリッジ１０は、図６に示されているように、微生物の溶解装置を構成すべく、ロータ５０へと接続される。この目的のため、ロータ５０が、垂直方向の平行移動によってカートリッジの自由端からカートリッジ１０に挿入される。
【０１００】
図６に縦断面で示されているロータ５０は、円形の断面を有するおおむね円筒形の本体を有している。本体が、その外壁の上部に、フランジ５２を有しており、このフランジ５２が、ロータがカートリッジ１０へと完全に挿入されたときにカートリッジ１０の垂直な壁の上端に当接して、カートリッジ１０−ロータ５０の集合体が液体を漏らすことがないように保証する機能を有している。
【０１０１】
機密性を補強するために、キャップ５４を、ロータ５０をカートリッジと一体に保つように、任意の適切な手段によってカートリッジ１０に取り付けることができる。例えば、キャップ５４を、嵌め合わせまたはねじ込みによって取り付けることができる。キャップは、おおむね環状であり、ロータに設けられた行き止まりのダクト５６を構成しているロータの上部へとねじ込まれる。この行き止まりのダクトの上端において、対角線上で向かい合う２つの溝５７が、壁に形成されている。これらの溝は、図８Ａおよび８Ｂに示されるように、このロータを回転させる手段９２の伝達シャフト９０の端部を受け入れる機能を有している。したがって、このシャフトの端部は、これらの溝に挿入されるリブの形態で、これらの溝に対して対をなす形状を有している。駆動シャフトは、電動モータの駆動シャフトであってよい。あるいは、手動回転のための装置の一部であってよい。
【０１０２】
図６に示されるように、ロータ５０は、その下部において、カートリッジ１０の内部の形状に対して完璧に対をなす外形を有している。結果として、ダクト１２がロータ５０の底部に設けられた空洞５８に挿入されることによって案内の役割を果たしつつ、ロータ５０が完全にカートリッジ１０の内側に配置される。この空洞５８は、円形の断面を有するおおむね円筒形であり、上端がおおむね円錐形である。ロータ５０が、底壁５９がビーズ１８とゼリー状物質１９とで構成される集合体に当接するまで配置される。
【０１０３】
ロータ５０およびキャップ５４は、有利には、カートリッジと同じポリマー材料、すなわちポリプロピレン、ポリカーボネート、またはＰＭＭＡで製作される。好ましくは、これらの部品は、透明なポリカーボネート（Ｂａｙｅｒ社のＭａｋｒｏｌｏｎ（登録商標）２８５８）の射出成型によって製作される。
【０１０４】
したがって、カートリッジ１０−ロータ５０−キャップ５４の集合体が、本発明による微生物６０の溶解のための装置を構成し、以下では「溶解装置」と称される。
【０１０５】
溶解装置は、ひとたび組み立てられると、図７に示されるとおり、４方向バルブに配置される。このバルブ７０は、溶解装置６０を受け入れる目的の第１の方向７０１を有している。この装置は、カートリッジ１０のダクト１２の底部によってバルブへと接続される。第２の方向は、本発明による微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムの一部である第１の吸引−押し出し手段へと接続されるように意図された接続穴７０２を有している。有利には、この吸引−押し出し手段は、溶出バッファの溶液を収容する容器へとさらに接続されたポンプである。このポンプが、図８Ａおよび８Ｂに概略的に示されている。その動作は、後で説明される。第３の方向は、使い捨てのコーン７２が取り付けられる接続穴７０３を有している。最後に、第４の方向は、第２の吸引−押し出し手段７０４で構成されている。この第２の手段は、バルブと一体のシリンジである。このシリンジ７０４は、本発明による微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムの一部を形成し、このシリンジのピストンを動かすように意図されている並進運動駆動手段と相互作用するように意図されている。最後に、バルブ７０は、２つの流体チャネルを有する中央シャフト７４を有している。図７に示されるとおり、これら２つのチャネルは、一方では溶解装置６０と接続穴７０２との間の接続、他方ではシリンジ７０４と使い捨てコーン７２が取り付けられた接続穴７０３との間の接続を、それぞれもたらす。シャフト７４を、流体の接続が変更されるように、４分の１回転させることができる。そして、接続穴７０２が接続穴７０３へと接続され、溶解装置６０がシリンジ７０４へと接続される。
【０１０６】
溶解装置６０およびバルブ７０で構成される集合体は、消耗品部分を構成する。その後に、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムに配置される。微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムは、溶解機能、液体移動機能、および精製機能という３つの別々の主たる機能を有する自動システムである。これらの機能は、後述される。
【０１０７】
溶解装置６０−バルブ７０の集合体が、以下のやり方で、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムに配置される。第１に、この集合体を取り付けるための専用の場所が存在する。この場所は、バルブ７０を取り付ける手段を有することを特徴とする。この手段を、例えば、力を加えて間にバルブが押し込まれるアームまたは顎で構成することができる。
【０１０８】
ひとたび溶解装置６０−バルブ７０の集合体が所定の位置に位置すると、バルブへの種々の接続が行われる。これが、図８Ａおよび８Ｂに概略的に示されている。すなわち、第１の接続が、バルブ７０の接続穴７０２によって行われる。それは、接続穴７０２に接続されて自動システムに恒久的に位置する吸引−押し出し手段８０への最後の接続である。上述のように、この吸引−押し出し手段８０は、好ましくは、図８Ａおよび８Ｂには一部分しか示されていない自動システムの一体の一部分である固定のポンプの形態である。より正確には、ポンプ８０が、実際のところ、やはり自動システムに恒久的に配置されるバルブ８２へと接続される。さらに、この固定のバルブ８２は、一方では接続穴７０２を介してバルブ７０に連通し、他方ではいわゆる溶出バッファを収容するリザーバ８４に連通している。このようにして、固定のバルブ８２は、その位置に応じて、固定のポンプ８０をバルブ７０またはリザーバ８４のいずれかへと接続することを可能にする。
【０１０９】
溶解装置−バルブの集合体は、溶解装置のロータを回転させる手段９２の伝達シャフト９０にも接続される。ひとたびこの接続が行われると、伝達シャフト９０が、図８Ａの矢印Ａに従い、垂直成分に沿ってロータへと圧力を加え、この圧力が、ロータからビーズ１８およびゼリー状物質１９で構成される集合体へと伝えられる。
【０１１０】
溶解装置−バルブの集合体と自動システムとの間の第３の接続は、バルブ７０のシリンジ７０４とこのシリンジの駆動手段９４との間の接続からなる。この駆動手段は、ステッピングモータとウォームねじとで構成される集合体など、並進運動の駆動手段であり、シリンジ７０４のピストンを引き、あるいは押すことを可能にし、したがってシリンジへの液体の吸引またはシリンジ内に含まれる液体の吐出を可能にする。
【０１１１】
最後に、溶解装置−バルブの集合体と自動システムとの間の第４の接続は、バルブ７０のシャフト７４の回転駆動手段に関する。この手段は、図８Ａおよび８Ｂには示されていないが、バルブ７０のシャフト７４へと接続された伝達シャフトを回転させることができるモータである。
【０１１２】
カートリッジ１０に集められた微生物の溶解のための手順の適用時に、バルブ７０は、溶解装置６０がポンプ８０と固定のバルブ８２とで構成される集合体に連通するようなやり方に設定される。したがって、シリンジ７０４は、使い捨てのコーンが取り付けられた接続穴７０３に連通する。固定のバルブ８２が、最初は、ポンプ８０が溶出バッファリザーバ８４に連通するようなやり方に設定される。次いで、ポンプ８０が、所定の量の溶出バッファを吸引する。次いで、固定のバルブ８２の設定が、ポンプ８０がバルブ７０を介して溶解装置６０に連通するように変更される。次に、ポンプ８０が、吸引した溶出バッファを吐き出し、溶出バッファが溶解装置６０へと移動し、より詳しくはカートリッジ１０の内壁とロータ５０の外壁との間のすき間空間（図６を参照）へと移動する。そして、溶出バッファが、ゼリー状物質１９およびビーズ１８を濡らす。次に、ゼリー状物質１９が、溶出バッファおよびロータ５０の低速回転の組み合わせの作用によって溶かされる。結果として、ビーズがロータに懸濁する。この懸濁の操作が、ロータおよびロータの回転によってもたらされる圧力の効果と組み合わさり、ビーズ１８の一部を、内側のカートリッジ１０の垂直壁と外側のロータ５０の垂直壁との間のすき間空間へと移動させる。このすき間空間が、好ましくは６００〜８００μｍの間の幅を有することに注意すべきである。この幅は、使用されるビーズ１８の直径に直接関係している。実際、ビーズは、この空間を容易に循環できなければならないと同時に、ロータ５０の回転によって回転可能でなければならない。この目的のため、ロータの垂直な外壁は、ビーズの回転を促進する粗い表面を有することができる。
【０１１３】
ひとたびビーズがカートリッジの保持ゾーンにおいてロータの垂直壁に沿って分布すると、ロータをカートリッジへと完全に挿入することができる。
【０１１４】
当然ながら、ゼリー状物質およびビーズの両方に保持された微生物は、溶出バッファの流れによってビーズ１８と同じやり方ですき間空間へと移される。
【０１１５】
ひとたびビーズ１８がロータ５０の垂直な外壁に沿って分布すると、厳密な意味での溶解段階が開始される。ロータ５０が、回転手段／モータ９２および伝達シャフト９０の手段によって回転させられる。しかしながら、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムを使用しない簡略化された手順においては、ロータを手動で回転させることが考えられる。
【０１１６】
例として、回転速度の値は、毎分２００〜３０００回転の間であってよい。好ましくは、ロータが、すき間空間におけるビーズおよび溶出バッファの分散および均一化の目的のために、最初は毎分２００回転の低速で回転させられる。この低速回転が、約１５秒続く。
【０１１７】
その後に、回転速度が高められ、１〜５分の間の時間にわたって毎分１０００〜３０００回転の間の値に達する。この期間において、空気から集められた微生物の溶解が実行される。
【０１１８】
ロータの回転の速度および時間の選択が、溶解すべき微生物の種類に依存することは、かなり明確である。
【０１１９】
この段階において、ビーズ１８は、ロータの垂直な外表面およびカートリッジの垂直な内表面に対する摩擦によって、自身の対称の軸を中心にして回転する。この二重の回転が、ビーズ１８とロータまたはカートリッジのそれぞれの表面との間に捕捉された微生物の機械的な溶解をもたらす。これが、結果として、溶出バッファへの核酸の放出につながる。
【０１２０】
ひとたび溶解の段階が完了し、核酸が放出されると、核酸を含んでいる溶出バッファを吸引しなければならない。したがって、バルブ７０の設定が、図８Ｂに示されるように溶解装置６０とシリンジ７０４とが再び連通するように、バルブのシャフト７４を回転させることによって変更される。次いで、シリンジ７０４のピストンが、核酸を含む溶出バッファをこのシリンジ７０４へと吸引するために、駆動手段９４によって平行移動させられる。この吸引段階は、ロータ５０を依然として、しかしながら低速（およそ毎分２００回転）で、回転させつつ行われる。
【０１２１】
次いで、バルブ７０が、シリンジ７０４が接続穴７０３に連通するように、図８Ａに示したとおり最初の設定へと戻される。これにより、核酸を含む溶出バッファを、この核酸の精製の目的のために、コーン７２を介して管へと送り出すことができる。実際、溶出バッファに含まれる溶解物は、核酸を効果的に含んでいるが、細胞の残り屑全てをも含んでいる。
【０１２２】
これを行うために、分析管９６が、コーン７２に近付けられる。有利には、自動システムが、この管を受け入れるためのホルダを有している。この場合に、このホルダを、管をホルダへと挿入することができる下方位置または休止位置と、管をコーン７２の近く（図８Ａおよび８Ｂに示されるとおり）に位置させる上方位置または作業位置との間を移動させることができるアームに接続することができる。当然ながら、コーン７２が管９６へと進入することが好ましい。管９６は、核酸の精製に必要とされるいわゆる溶解バッファおよび磁気シリカ粒子を有している。これらの粒子は、１〜３μｍの間の直径を有している。さらに、あらかじめ穿刺された隔膜（図示されていない）が、管９６の汚染を回避するために、管９６の開口に配置される。管９６が上昇するにつれて、コーン７２が、あらかじめ穿刺された穴によって隔膜を通過する。次いで、溶解物を含む溶出バッファが、分析管へと送り出される。この段階において、溶解物を溶解バッファおよび磁性粒子と均質化するために、数回の吸引／押し出しを実行するようにシリンジ７０４を使用することが好ましい。溶解バッファの機能は、核酸を安定させること（ヌクレアーゼに対する保護）、およびｐＨを捕捉段階にとって最適な値に調節することである。
【０１２３】
混合物が正しく均質化される場合、管を、磁性粒子による核酸の受動的な捕捉を可能にするために、静止させておくことができる。静止の時間は、例えば２分間であってよい。均質化が正しくなく、あるいは均質化が存在しない場合、核酸の捕捉を、能動的に行うことができる。実際、管および管に含まれる磁性粒子に、さまざまな向きの磁界を加えることができる。これを行うために、管が下方位置に配置され、管を保持するアームによって磁石に接触させられる。これらの磁石を、管を保持するアームと一体の２枚の平行なプレートに配置することができる。これら２枚のプレートは、アドホック変位手段によって水平方向の平行移動にて運動でき、すなわち管がこれらのプレートの間にあるように変位させられる。各々のプレート上の磁石の数は、さまざまであってよい。磁石が、プレートにおいて異なる高さにあると好都合である。さらに、一方のプレートの磁石が、他方のプレートの磁石に対向しておらず、所定の並びに従って管の変位の方向に関してずれていることが重要である。結果として、プレートの変位の際に、管が徐々に第１のプレートの磁石の磁界または第２のプレートの磁石の磁界に曝される。これらの磁界を、プレートの軌跡に対して異なる高さに配置することができる。結果として、これらの磁石に引き付けられた磁性粒子がクラスタを形成し、このクラスタが、磁石によってもたらされる引き付けの関数（特には、管に対する磁石の位置の関数）として、管内で動かされる。この分析管に対する磁石の相対位置を、垂直軸に沿った管の変位によって得ることも可能であり、その場合には、磁石がすべて所定の並びに従って同じ高さに配置されることに、注意すべきである。核酸の能動的捕捉の場合には、この捕捉に捧げられる時間は、より長くなるであろう（４〜６分の間）。
【０１２４】
ひとたび核酸の捕捉が達成されると、洗浄という１つ以上の連続する段階が加えられる。この目的のために、核酸を保持する磁性粒子を管の上部において垂直壁に対して集めるために、管が高い位置の磁石に対向して配置される。次いで、管が、コーン７２が管に含まれる液体に触れるように、高い位置へと動かされる。次いで、管に含まれる液体が、シリンジ７０４のピストンを動かすことによってシリンジ７０４へと吸引される。したがって、シリンジ７０４が、管において吸引された液体廃棄物の貯蔵容器として機能する。核酸の洗浄を開始するために、バルブ７４が、接続穴７０２（したがって、ポンプ８０）が接続穴７０３に連通する設定とされる。バルブ８２が、ポンプ８０による溶出バッファの吸引を可能にする位置におかれる。吸引される溶出バッファの量は、例えば３００μｌである。次いで、バルブ８２の位置が、ポンプ８０による管９６への溶出バッファの送出を可能にするように変更される。最適な洗浄を保証するために、管が下方位置に戻され、磁石を保持するプレートが、粒子と溶出バッファとの間の交換を最適にすべく再び動かされる。プレートは、要件に応じて変更できる速度で、数回の往復運動を達成することができる。次いで、管に含まれる溶出バッファが、上述のようにシリンジ７０４によって吸引される。新たな洗浄段階を、随意により同一のやり方で実行することができる。シリンジ７０４のピストンが、シリンジ７０４が分析管において吸引される液体（溶解バッファであっても、あるいは洗浄に使用される溶出バッファであっても）で徐々に満たされるよう、段階的に動かされることに、注意すべきである。ひとたび核酸が分析管に移されたならば、シリンジ７０４には液体廃棄物の貯蔵という役割だけが割り当てられ、このことがかなりの利点を呈する。さらには、ポンプ８０が、溶出バッファの送出だけを行い、決して「汚染された」物質に触れることがない。この態様も、ポンプ８０およびバルブ８２が、バルブ７４の一体の一部分であって１回だけしか使用されないように意図されているシリンジ７０４と対照的に、自動システムに恒久的に位置し続けるため、きわめて重要である。
【０１２５】
ひとたび核酸の洗浄が実行されると、管７２の溶出バッファの最後の吸引は、途中までになる。実際、所定の量の溶出バッファが管に残され、核酸を溶出させ、すなわち磁性粒子から引き離す溶出体積を構成する。溶出体積は、５〜１５０μｌの間でさまざまであってよく、好ましくは２５または４０μｌである。この最後の吸引のために、磁性粒子のクラスタが、管を下方位置の磁石に対向させることによって、管の底に形成される。対照的に、吸引は、粒子を吸引することがないよう、液体の表面から行われる。
【０１２６】
次いで、残りの体積において、核酸の溶出が行われる。これを行うために、管が、約５分間にわたって液体において６５℃の温度に達するまで、管ホルダと一体の加熱モジュールによって７５℃まで加熱される。加熱の段階と同時に、管は、溶出の促進のために下方位置に位置する磁石に曝される。
【０１２７】
ひとたび核酸が精製され、溶出体積に溶出させられると、分析の目的で増幅を行うことができる。このために、溶出体積の一部またはすべてを、増幅用のいわゆる調整バッファ（４０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．５、１２ｍＭのＭｇＣｌ２、７０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのジチオスレイトール、１５％  ｖ／ｖのＤＭＳＯ、１ｍＭのｄＮＴＰ、２ｍＭの各ＮＴＰ、０．２μＭのプライマ、０．１μＭの分子ビーコン）に接触させなければならない。この接触を、自動システムにおいて利用できる機能に応じて、２つの異なる手順に従って達成することができる。
【０１２８】
第１の手順によれば、溶出および増幅のための調整が、２つの異なる管において実行される。この場合、精製された核酸を含んでいる溶出体積の所定の一部を、分析管から取り出す必要がある。次いで、この部分が、第２の管に送出され、第２の管（増幅のための調整のためのバッファを必要量すでに含んでいる）において、増幅のための調整が実行される。次いで、この管が、核酸の増幅が行われる器具へと移される。次いで、反応体積の一部が、固定のポンプ８０によって採取される。この場合、バルブ７０および８２が、ポンプ８０と接続穴７０３との間の連通を可能にするように設定されている。分析管が、コーンが溶出体積に沈められるよう、高い位置に配置される。次いで、一部がポンプ８０によって吸引される。このポンプ８０（より一般的には、採取される溶出体積の一部が使用する流体回路）が、溶解および精製の手順の全体を通して、溶出バッファだけにしか触れていないことを思い出されたい。したがって、核酸の増幅に使用される部分の汚染の可能性がない。ひとたびこの部分が採取されると、分析管を、増幅のための調整のための管で置き換えることができる。この目的のため、分析管が下方位置へと下げられ、分析管をホルダから引き出し、増幅のための調整のための管を所定の位置に置くことができる。次いで、この管が、コーンを管へと進入させるべく高い位置へと持ち上げられ、次いで溶出体積の一部が、ポンプ８０によって送出される。
【０１２９】
あるいは、自動システムに、増幅のための調整のための管の管理および運搬のための特定のモジュールを備えてもよい。
【０１３０】
この第１の手順は、シリカ粒子と増幅のための調整のためのバッファとの間の接触が回避されるという利点を提供する。実際、そのような粒子が、核酸の増幅の反応を妨げる可能性があることが知られている。
【０１３１】
第２の手順によれば、増幅のための調整のためのバッファおよび溶出体積が、分析管において直接接触させられ、この場合には、増幅のための調整のためのバッファが、分析管へと添加される。この添加は、手動または自動で実行することができる。この場合、自動システムに、第２の送出システム、すなわち増幅のための調整のためのバッファを含んでいる容器と、このバッファの吸引および押し出しのためのシリンジと、バルブ８２と同等のバルブと、分析管に取り付けられた隔膜を通過することができる針またはコーンとが、恒久的に備えられなければならない。
【０１３２】
使用される手順にかかわらず、最終的に増幅のために用いられる部分を採取する前に、シリカ粒子のクラスタを、単独の溶出体積、あるいは、分析管に収容された溶出体積と増幅のための調整のためのバッファとの混合物の外部へと取り除くことが、好都合かもしれない。これを、管を高い位置に位置する磁石による磁化に曝すことによって、行うことができる。
【０１３３】
さらに、上述した本発明によるシステムおよび装置のすべては、微生物の溶解および核酸の精製のための手順の全体を通しての完全なトレーサビリティを可能にするのに適している。実際、第１に、すべての消耗品（カートリッジ、ロータ、多方向バルブ、管）が、識別のためのアドホック手段（１Ｄまたは２Ｄのバーコード、ＲＦＩＤタグ、など）によって特定される。さらには、微生物が空気吸引手段によって集められる場合、空気吸引手段は、微生物の溶解および核酸の精製のためのシステムとの通信を可能にする無線通信手段を有することができなければならない。この無線通信手段は、例えば、ＷｉＦｉ（規格８０２．１１ｂ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（規格８０２．１５）、またはＺｉｇＢｅｅ（規格８０２．１５．４）の各システムである。これらの無線接続システムを介して転送することができるデータは、例えば場所（収集の部屋／地点）、サンプリング条件（時間、流量、湿度、温度、気圧）、および作業者の特定に関係することができ、当然ながら消耗品を特定する要素に関係することができる。
【０１３４】
さらに、本発明による装置およびシステムは、全血または組織生検からのサンプルなど、臨床サンプルの分析にも完全に適している。この場合、カートリッジが、空気収集モジュールなしで使用される。全血などの液体サンプルの場合には、この液体サンプルがカートリッジに配置され、カートリッジが、微生物の溶解装置を構成するためのキャップの中でロータと組み合わされる。次いで、この装置が、微生物の溶解および核酸の回収のために、自動システムに配置される。組織生検の場合には、サンプルが最初に数ミリメートルのスライスへと切断された後で、カートリッジに配置され、次いでカートリッジが、微生物の溶解装置を構成するためのキャップの中でロータに組み合わされる。次いで、この装置が、細胞の溶解および核酸の回収のために、自動システムに配置される。
【実施例１】
【０１３５】
基準となる手順
−消耗品の準備：
・カートリッジの準備：
カートリッジが、所定の量のガラスビーズおよびアガロースゲルで満たされる。
−０．３〜０．４５ｇのガラスビーズ（直径４２０〜６００μｍ）
−ゲルの組成：１％のアガロース−１％のグリセロール
微生物の溶解の実行に使用される溶出バッファの量は、３００μｌである。
・分析管の準備：
自動システムに配置され、溶解物を回収するように意図された分析管が、３０μｌの磁性シリカ粒子および２００μｌの溶解バッファ（チオシアン酸グアニジン）で満たされる。
−溶解パラメータ：
溶解時間：４分間
ロータの回転速度：毎分２００回転（低速）；毎分２０００回転（高速）
−溶解パラメータ：
カートリッジから多方向バルブのシリンジへの溶解物の吸引：
シリンジの吸引の体積＝１０００μｌ
シリンジの吸引の速度＝７０ｍｍｓ−１
吸引の際のロータの回転時間＝９秒
吸引の際のロータの回転速度＝毎分２００回転
多方向バルブのシリンジから分析管への溶解物の送出：
多方向バルブのシリンジからの吸引の体積＝１０００μｌ
シリンジの吸引の速度＝７０ｍｍｓ−１
−核酸の精製のパラメータ：
精製は、３つの段階を含む：
−核酸の単離
−溶出バッファによる洗浄（３回）
−溶出バッファにおける溶出（ｐＨ  ８．５）
【０１３６】
溶解物を分析管（０．５ｍｌ）へと移した後で、分析管は、３０μｌのシリカビーズ、２００μｌの溶解バッファ、および１２０〜１５０μｌの溶解物を含む。
【０１３７】
シリカ粒子の２種類の振動が、磁石によって加えられる：
・高い位置の磁石の間で生成される高い振動。
・低い位置の磁石の間で生成される低い振動。
高い振動は、磁性粒子による核酸の捕捉を達成するために使用され、さらには洗浄段階（浮遊物の除去）においても使用される。低い振動は、溶出段階のために使用され、管の加熱と組み合わせられる。
−核酸の捕捉のためのパラメータ：
振動の速度＝５ｍｍｓ−１
振動の回数＝１１２
振動の振幅＝２７ｍｍｓ−１
−洗浄のためのパラメータ：
振動の速度＝５ｍｍｓ−１
振動の回数＝１０
振動の振幅＝２７ｍｍｓ−１
−浮遊物の除去のためのパラメータ：
多方向バルブのシリンジによる吸引＝６００μｌ
ポンプ速度＝１００ｍｍｓ−１
−分析管に取り付けられたポンプによる溶出バッファの分配のパラメータ：
分配の体積＝４００μｌ
ポンプ速度＝１００ｍｍｓ−１
−溶出のためのパラメータ：
振動の速度＝５０ｍｍｓ−１
振動の振幅＝９ｍｍｓ−１
目標温度＝７５℃
加熱時間＝３００ｓ
溶出バッファの体積＝４５μｌ
【実施例２】
【０１３８】
組織の機械的溶解
微生物の生きている細胞の壁を破壊してｔＲＮＡを放出させる目的のための本発明による溶解装置における機械的溶解の性能を評価するために、検討を行った。これらの試験を、固形の腫瘍サンプルについて行った。
−考案および試験された手順：
・試薬および設備：
−Ｑｉａｇｅｎ社によって市販されているＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）という設備であらかじめの脱脂および安定化を行った乳ガンの腫瘍。
−ペトリ皿
−無菌の２ｍＬ管
−プラスチック製のピンセットおよび使い捨ての外科用メス
−Ａｃｔｒｉｌで浄化した本発明による溶解装置（カートリッジおよびロータ）
−４００〜６００μｍのガラスビーズ
−Ｑｉａｇｅｎ社によって市販されているＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓキット＋Ｑｉａｃｕｂｅ自動抽出システム
・準備：
−抽出の開始前に、ＲＮＡｓｅ  Ｚａｐでベンチおよびピペットを清掃。
−−８０℃で凍結させた腫瘍を、解凍のために放置。
−ＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）の採取を避けつつ、腫瘍をペトリ皿に配置。
−残余のＲＮＡｌａｔｅｒを取り除くために、３００μｌのＲＬＴバッファ（Ｑｉａｇｅｎ社）で２回の洗浄。
・腫瘍の粉砕：
−腫瘍を外科用メスで細かく切断（直径約４ｍｍ）。
−プラスチック製のピンセットを使用して腫瘍片を回収し、３００μｌのＲＬＴ（＋３μｌのβ−メルカプトエタノール）を含む２ｍＬの管へと移す。
−腫瘍片を以下のいずれかで粉砕。
・Ｑｉａｇｅｎ社のＴｉｓｓｕｅ  Ｒｕｐｔｏｒ：２分間にわたって速度２、または
本発明による微生物の溶解装置：０．４〜０．５ｇのガラスビーズ（４００〜６００μｍ）、毎分２０００回転、２×２０秒
・サンプルを回収し、精製前に３００μＬの体積を有するようにＲＬＴバッファで量を調節。
・Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  ＭｉｎｉキットでのｔＲＮＡの精製：
１．粉砕後に回収された３００μＬのＲＬＴバッファを、腫瘍の残り屑を含まずに２ｍＬの管に配置。
２．ＲＮＡの精製および固定のための２種類のカラムを作成：カラムｇＤＮＡ  ＥｌｉｍｉｎａｔｏｒおよびＲＮＡ  ｓｐｉｎ。
３．バッファ、Ｑｉａｇｅｎ抽出シャトル、および溶出管を準備。
４．Ｑｉａｃｕｂｅテスタをロボットの指示に従って準備し、動作を開始させる。
５．８０μｌの溶出液を回収し、精製したｔＲＮＡを−８０℃で凍結。
６．用量：Ｎａｎｏｄｒｏｐごとに１μＬの薄めていない溶出液。
７．抽出されたｔＲＮＡの品質の測定：品質の分析が、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにおいて手順ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏに従って実行される。
従来からの電気泳動とちょうど同じように、１８ｓおよび２８ｓ  ｒＲＮＡの２つの主たるピークを有する複写の分布が観察される。
【０１３９】
結果：
まったく同一に準備および保存した２つの生検試料を、この検討に使用した。これらの生検試料は円形であり、約４ｍｍの直径および１．５ｍｍの厚さを有する。それらの質量は、約１０ｍｇであると評価される。これらの生検試料を、２種類の機械的溶解（基準溶解Ｔｉｓｓｕｅ  ＲｕｐｔｏｒおよびＰＰＭ）を並行して実行するために、２つに大まかに分割した。しかしながら、使用された組織の量が、一方の試験と他方の試験とで同一ではなく、目的が、基準技法と本発明による手順との間の性能の比較よりもむしろ試験の適切な実行を保証することにあることに、注意すべきである。
【０１４０】
純度の分析は、異なる波長における吸収の値の間の比に基づく。核酸についての２６０ｎｍ、塩についての２３０ｎｍ、およびたんぱく質についての２８０ｎｍである。２に近い比の値が、核酸の良好な純度を反映している。
【０１４１】
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【０１４２】
生検試料１の場合において、抽出されたｔＲＮＡの量がきわめて少ないことを、見て取ることができる。これは、生検試料が材料の損失につながるが劣化を被ったという事実によって説明することができる。
【０１４３】
生検試料２の場合には、両方の技法によって大量のｔＲＮＡが抽出されたことを、見て取ることができる。さらに、純度が良好であることも、見て取ることができる。
【０１４４】
したがって、これらの実施例から、本発明による装置が、空気のサンプルに含まれる細菌の収集および溶解、ならびに分析を目的とするこれらの細菌からの核酸の回収について、良好な性能を提供することが明らかである。このために、使用される装置は、第１に、空気収集モジュールに挿入されるカートリッジで構成され、第２に、収集された細菌を収容しているカートリッジを核酸の回収手段に組み合わせることで構成される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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