(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニンまたはリシンによるＧｌｕ５７３置換、アラニンまたはリシンによるＧｌｕ５７８置換およびアラニンまたはリシンによるＧｌｕ５７９置換からなる非保存性アミノ酸置換を有するシステインリッチドメインを備え、それにより野性型ＡＤＡＭ１０プロテアーゼに比べて基質タンパク質を認識、結合かつ／またはタンパク質分解的に切断する能力が低下されている、哺乳類修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼまたは当該哺乳類修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼの前記システインリッチドメインを備えるフラグメント。
【請求項２】
ヒト由来のものである、請求項１に記載の哺乳類修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼまたはフラグメント。
【請求項３】
前記システインリッチドメインがＡＤＡＭ１０の５５２−６４６残基を備える、請求項２に記載の哺乳類修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼまたはフラグメント。
【請求項４】
請求項１に記載の哺乳類修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼまたはフラグメントをコードする単離核酸。
【請求項５】
前記哺乳類修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼがヒト由来のものである、請求項４に記載の単離核酸。
【請求項６】
請求項４に記載の単離核酸を備える遺伝子構築物。
【請求項７】
前記単離核酸が、発現ベクターの１つ以上の調節配列に作動可能に連結または結合されている、請求項６に記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
請求項７に記載の遺伝子構築物を有する、単離宿主細胞及び非ヒト宿主細胞からなる群から選択される宿主細胞。
【請求項９】
哺乳類ＡＤＡＭ１０プロテアーゼのシステインリッチドメインの残基Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９の１つ以上に結合する抗体。
【請求項１０】
ＡＤＡＭ１０プロテアーゼの基質に対する親和性を低下させ、基質切断を阻止し得る、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
１種以上の細胞表面タンパク質のＡＤＡＭ１０認識、結合、タンパク質分解的切断のうちの１つ以上に対する阻害剤である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１２】
エフリンＡ５、エフリンＡ２、プロＥＧＦ、プロベータセルリンのＡＤＡＭ１０認識、結合、タンパク質分解的切断のうちの１つ以上に対する阻害剤である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１３】
ＡＤＡＭ１０プロテアーゼがヒト由来のものである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１４】
システインリッチドメインが、ＡＤＡＭ１０プロテアーゼの５５２−６４６残基を備える、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
野性型ＡＤＡＭ１０プロテアーゼに比べて基質タンパク質を認識、結合かつ／またはタンパク質分解的に切断する能力が低下されている哺乳類修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼまたはその機能性フラグメントを産生させる方法であって、
（ｉ）  ＡＤＡＭ１０プロテアーゼのもしくは当該ＡＤＡＭ１０プロテアーゼのシステインリッチドメインを備えるフラグメントの、Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９に、またはそれをコードする核酸に、非保存性アラニンまたはリシン置換を導入して、修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼまたはその機能性フラグメントを産生させるステップと、
（ｉｉ）  前記修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼが基質タンパク質を認識、結合かつ／またはタンパク質分解的に切断する能力が、野性型ＡＤＡＭ１０プロテアーゼに比べて低下されているかどうかを測定するステップと
を備える方法。
【請求項１６】
前記ＡＤＡＭ１０プロテアーゼがヒト由来のものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
システインリッチドメインがＡＤＡＭ１０プロテアーゼの５５２−６４６残基を備える、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳類ＡＤＡＭ１０プロテアーゼの抗体阻害剤を産生させる方法であって、哺乳類ＡＤＡＭ１０プロテアーゼのシステインリッチドメインのＧｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９を備えるタンパク質構築物を用いて前記システインリッチドメインのＧｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９に結合するＡＤＡＭ１０プロテアーゼの抗体阻害剤を同定、設計、スクリーニングまたは生産するステップを備える、哺乳類ＡＤＡＭ１０プロテアーゼの抗体阻害剤を産生させる方法。
【請求項１９】
前記哺乳類ＡＤＡＭ１０プロテアーゼがヒト由来のものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記システインリッチドメインがＡＤＡＭ１０の５５２−６４６残基を備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質構築物がさらに前記ＡＤＡＭ１０プロテアーゼのディスインテグリンドメインを備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体阻害剤は、前記ＡＤＡＭ１０プロテアーゼによる１種以上の細胞表面タンパク質の基質認識、結合および／またはタンパク質分解的切断を低減、阻止またはブロックし得る、請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）解析を用いて、前記抗体阻害剤の存在下に、Ｅｐｈ、エフリンおよび前記構築物を備える単離タンパク質複合体の形成をモニターするステップをさらに備える、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡＤＡＭ１０プロテアーゼのシステインリッチドメインの分子モデリングにより前記抗体阻害剤を生産する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体阻害剤が、エフリンＡ５、エフリンＡ２、プロＥＧＦ、プロベータセルリンのＡＤＡＭ１０認識、結合および／またはタンパク質分解的切断の阻害剤である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体阻害剤が、ＡＤＡＭ１０プロテアーゼのシステインリッチドメイン内のＧｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９からなる群から選択されるアミノ酸残基が並ぶタンパク質表面に特異的に結合する、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞表面に位置するタンパク質のタンパク質分解的切断を媒介するメタロプロテアーゼに関する。さらに具体的に言えば、本発明は、基質タンパク質、例えば、Ｅｐｈレセプターおよび上皮増殖因子（ｅｒｂＢ）レセプターのリガンドなどのＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７メタロプロテアーゼ媒介タンパク質分解的切断、ならびに、そのようなタンパク質の認識やそのようなタンパク質との相互作用に必須のＡＤＡＭメタロプロテアーゼドメインおよびアミノ酸残基の解明に関する。さらに、本発明は、基質タンパク質のＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７媒介タンパク質分解的切断を調節する分子の設計および発見に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭ（Ａ  Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ａｎｄ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ）メタロプロテアーゼは、膜結合型タンパク質の細胞外ドメインを、調節的で基質特異的な様態で、但し切断配列特徴を明らかに選択することなく切断する。いくつかある基質の中でも特にＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７は、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、エピレグリンを含めたいくつかのレセプター型チロシンキナーゼのリガンドや、ＴＮＦ−レセプターリガンドＴＮＦ−αおよびＥｐｈｒｉｎ（エフリン）を切断する。例えば、非特許文献１参照。ＡＤＡＭ１０でエフリンを切断して、Ｅｐｈおよびエフリン発現細胞間の細胞接触反発を進めることができる（例えば、非特許文献２参照）が、これがどのように調節されるかは未だ解明されていない。
【０００３】
Ｅｐｈレセプターおよびそれらの膜結合型エフリンリガンドは、発生過程における細胞のポジショニングおよびパスファインディングを媒介する。対向細胞上でのエフリン−Ｅｐｈ相互作用により双方向シグナル伝達が生じ、典型的には、細胞間反発を引き起こす。細胞間接触が生じると、相互作用するＥｐｈとエフリンはヘテロ四量体を形成し、これらがさらに集って、大きなシグナル伝達クラスターとなる。例えば、非特許文献３および４参照。
【０００４】
これによって、相互作用細胞の対向細胞表面間に、細胞反発とシグナル停止を可能にするためにはどうしても克服しなければならない多価分子鎖が形成される。
現在までに、Ｅｐｈ／エフリン媒介細胞接触を終結させ得る２つの一般的機構が提案されている。ＥｐｈＢ４−エフリンＢ２相互作用は、各細胞に、エフリンとＥｐｈ両方の細胞内ドメインに依存する形（例えば、非特許文献５参照）、およびＲａｃシグナル伝達に依存する形（例えば、非特許文献６参照）でエフリン−Ｅｐｈ複合体全体のトランスエンドサイトーシスを引き起こすと考えられている。
【０００５】
別の代替機構は、最初にＧＰＩ（グリコシルホスファチジルイノシトール）アンカー型エフリンＡ２に関して観察された、膜貫通型プロテアーゼによるエフリン切断を必要とし、エフリンＡ２はメタロプロテアーゼＡＤＡＭ１０で切断される。この切断はＥｐｈ／エフリン細胞鎖を断つのに不可欠であるので、切断できないエフリン−Ａ２突然変異体の発現は神経細胞の軸索反発作用を阻害する。例えば、非特許文献２参照。エフリン−Ａ２の切断は、ＥｐｈＡ３細胞外ドメインの存在によって促進されることが判明し、ＡＤＡＭ１０による切断を促進すると思われるエフリンのＥｐｈ結合ドメイン内の保存領域（例えば、非特許文献７参照）が、相互作用インターフェースの候補として提案された。しかし、その後解明された２種のＥｐｈ／エフリン複合体の構造（例えば、非特許文献７；非特許文献８参照）は、このエフリン領域がレセプター結合に関与しており、Ｅｐｈ／エフリン複合体形成時のＡＤＡＭ相互作用には利用できないであろうことが明らかになった。
【非特許文献１】スチールスおよびコートニージー、２００３年、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．７−３０
【非特許文献２】ハットリら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２８９巻、ｐ．１３６０
【非特許文献３】ヒマネン  ＆  ニコロフ、２００３年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第２６巻、ｐ．４６−５１
【非特許文献４】ビマー・クライカンプら、２００４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１６４巻、ｐ．６６１−６６６
【非特許文献５】ツィマーら、２００３年、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第５巻、ｐ．８６９−７８
【非特許文献６】マーストンら、２００３年、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第５巻、ｐ．８７９−８８
【非特許文献７】ヒマネンら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  第３９６巻、ｐ．４８６−９１
【非特許文献８】ヒマネンら、２００４年、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第７巻、ｐ．５０１−５０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＡＤＡＭプロテアーゼがどのようにエフリンと相互作用するのか、またＥｐｈ結合エフリン分子のみを確実に切断するためにこの相互作用をどのように調節し得るかはまだ解明されていない。
【０００７】
本発明は、広義には、例えば、Ｅｐｈおよび上皮増殖因子レセプターのリガンドなどの基質、ならびに上記リガンドとレセプターを含むタンパク質複合体を含むがそれらには限定されない基質タンパク質との相互作用を媒介するＡＤＡＭプロテアーゼのドメインおよび／またはアミノ酸残基の同定、単離および利用に関する。
【０００８】
１つの特定の広義形態において、本発明は、基質タンパク質のＡＤＡＭ認識、結合および／またはタンパク質分解的切断のモジュレーターを同定、設計または生産するための、基質タンパク質との相互作用を媒介するＡＤＡＭプロテアーゼのシステインリッチドメインおよび／または上記システインリッチドメイン内のアミノ酸残基の利用に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの好ましい形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼはＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７である。
第１態様において、本発明は、野生型ＡＤＡＭプロテアーゼに比べ、基質タンパク質の認識、結合および／またはタンパク質分解的切断能が改変されているＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントを提供する。
【００１０】
修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントは、基質タンパク質を認識、結合、および／またはタンパク質分解的に切断し得ないか、野生型ＡＤＡＭプロテアーゼに比べて能力が低下しているのが好ましい。
【００１１】
１つの好ましい実施形態において、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントは、ＡＤＡＭプロテアーゼの細胞外ドメインに１つ以上の非保存性アミノ酸置換を有する。
【００１２】
１つ以上のアミノ酸置換はＡＤＡＭプロテアーゼ細胞外ドメインのシステインリッチドメインにあるのが好ましい。
ＡＤＡＭ１０プロテアーゼに関する特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｇｌｕ５７３置換、Ｇｌｕ５７８置換およびＧｌｕ５７９置換からなる群から選択される。
【００１３】
ＡＤＡＭ１７プロテアーゼに関する特定の実施形態において、１つ以上のアミノ酸置換は、Ｇｌｕ５８３置換、Ｇｌｕ５８９置換およびＳｅｒ５９０置換からなる群から選択される。
【００１４】
ＡＤＡＭ１０に関する実施形態において、基質タンパク質は、さらにＡ型Ｅｐｈレセプターを含むタンパク質複合体中に存在するＡ型エフリンであるのが好ましい。
ＡＤＡＭ１０に関する他の実施形態において、基質タンパク質は、さらにＥＧＦレセプターを含むタンパク質複合体中に存在するＥＧＦ型リガンド前駆体タンパク質であるのが好ましい。
【００１５】
ＡＤＡＭ１０に関する１つの特定実施形態において、Ａ型エフリンはエフリンＡ５またはエフリンＡ２であり、Ａ型ＥｐｈはＥｐｈＡ３である。
ＡＤＡＭ１０に関する別の特定実施形態において、ＥＧＦ型リガンド前駆体はプロＥＧＦまたはプロベータセルリンである。
【００１６】
ＡＤＡＭ１７に関する１つの特定実施形態において、エフリンはエフリンＢ２であり、ＥｐｈはＥｐｈＢ２またはＥｐｈＢ４である。
ＡＤＡＭ１７に関する別の特定実施形態において、ＥＧＦ型リガンド前駆体はプロＨｂ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたはＴＧＦ−αである。
【００１７】
第２態様において、本発明は、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントまたは第１態様の修飾ＡＤＡＭプロテアーゼと、基質タンパク質とを含む単離タンパク質複合体を提供する。
ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、ＡＤＡＭプロテアーゼ細胞外ドメインのシステインリッチ領域であるのが好ましい。
【００１８】
１つの実施形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、ヒトＡＤＡＭ１０プロテアーゼのＰｈｅ５５２−Ａｒｇ６４６残基を含む。
別の実施形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、ヒトＡＤＡＭ１７プロテアーゼのＡｓｐ５６４−Ａｒｇ６４４残基を含む。
【００１９】
ＡＤＡＭ１０に関する１つの特定実施形態において、基質タンパク質は、エフリンＡ５、エフリンＡ２、プロＥＧＦおよび／またはプロベータセルリンである。
エフリンＡ５またはエフリンＡ２は、ＥｐｈＡ３をさらに含む単離タンパク質複合体中に存在するのが好ましい。
【００２０】
プロＥＧＦまたはプロベータセルリンは、ＥＧＦレセプターｅｒｂＢ１をさらに含む複合体中に存在するのが好ましい。
ＡＤＡＭ１７に関する１つの特定実施形態において、基質タンパク質は、エフリンＢ２、プロＨｂ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたはプロＴＧＦ−αである。
【００２１】
エフリンＢ２は、ＥｐｈＢ２またはＥｐｈＢ４を含む単離タンパク質複合体中に存在するのが好ましい。
プロＨｂ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたはプロＴＧＦ−αは、ＥＧＦレセプターｅｒｂＢ１を含む単離タンパク質複合体中に存在するのが好ましい。
【００２２】
第３態様において、本発明は、第１態様の修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントをコードする単離核酸を提供する。
第４態様において、本発明は、第３態様の単離核酸を含む遺伝子構築物を提供する。
【００２３】
第５態様において、本発明は、第４態様の遺伝子構築物を有する宿主細胞を提供する。
第６態様において、本発明は、ＡＤＡＭプロテアーゼのシステインリッチドメイン内の基質認識部位に対して産生されるか、基質認識部位と結合し得る抗体を提供する。
【００２４】
抗体は、ＡＤＡＭプロテアーゼの基質認識部位と結合することにより、基質に対する親和性を低下させ、基質切断を阻止し得るのが好ましい。
基質認識部位は、ヒトＡＤＡＭ１０プロテアーゼのＰｈｅ５５２−Ａｒｇ６４６残基を含むＡＤＡＭプロテアーゼのシステインリッチドメイン内またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼのＡｓｐ５６４−Ａｒｇ６４４残基を含むシステインリッチ領域内にあるのが適当である。
【００２５】
別の実施形態において、抗体は、第１態様の修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントに対して産生されるか、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントと結合し得る。
【００２６】
抗体は、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントに比べて比較的低い親和性で野生型ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントと結合する。
第７態様において、本発明は、野生型ＡＤＡＭプロテアーゼに比べて基質タンパク質認識、結合および／またはタンパク質分解的切断能が改変されている修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントを産生させる方法であって、（ｉ）  ＡＤＡＭプロテアーゼもしくはそのフラグメントまたはＡＤＡＭプロテアーゼもしくはそのフラグメントをコードする核酸に１つ以上のアミノ酸置換を導入して、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントを産生させるステップと、（ｉｉ）  修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントが、基質タンパク質をタンパク質分解的に切断するか、かつ／もしくは基質タンパク質と結合するか、または野生型ＡＤＡＭプロテアーゼに比べて改変された能力を有するかどうかを測定するステップとを含む方法を提供する。
【００２７】
修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントは、基質タンパク質を認識、結合かつ／またはタンパク質分解的に切断し得ないか、または野生型ＡＤＡＭプロテアーゼに比べて能力が低下しているのが好ましい。
【００２８】
１つの実施形態において、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、ヒトＡＤＡＭ１０プロテアーゼのＰｈｅ５５２−Ａｒｇ６４６残基を含む。
別の実施形態において、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼのＡｓｐ５６４−Ａｒｇ６４４残基を含む。
【００２９】
第８態様において、本発明は、ＡＤＡＭプロテアーゼのモジュレーターを産生させる方法であって、第１態様の修飾ＡＤＡＭプロテアーゼもしくはそのフラグメント、またはＡＤＡＭプロテアーゼのシステインリッチドメインを含むタンパク質構築物を用いて、ＡＤＡＭプロテアーゼのモジュレーターを同定、設計、スクリーニングまたは生産するステップを含む方法を提供する。
【００３０】
１つの形態において、この態様は、ＡＤＡＭプロテアーゼのシステインリッチドメイン、またはその１つ以上のアミノ酸残基を用いて、ＡＤＡＭプロテアーゼのモジュレーターを同定、設計、スクリーニングまたは生産するステップを含むＡＤＡＭプロテアーゼのモジュレーター産生法を提供する。
【００３１】
ＡＤＡＭ１０のアミノ酸残基は、Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９からなる群から選択するのが好ましい。
ＡＤＡＭ１７のアミノ酸残基は、Ｇｌｕ５８３、Ｇｌｕ５８９およびＳｅｒ５９０からなる群から選択するのが好ましい。
【００３２】
１つの特定実施形態において、モジュレーターは、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼの阻害剤であり、阻害剤は、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼによる１つ以上の細胞表面タンパク質の基質認識、結合および／またはタンパク質分解的切断を低減、阻止またはブロックし得る。
【００３３】
第９態様において、本発明は、ＡＤＡＭプロテアーゼのモジュレーターと、医薬上有効な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
モジュレーターは、１つ以上の細胞表面タンパク質のＡＤＡＭプロテアーゼ認識、結合および／またはタンパク質分解的切断を阻止するのが好ましい。
【００３４】
１つの特定実施形態において、モジュレーターは、エフリンＡ５、エフリンＡ２、プロＥＧＦおよび／またはプロベータセルリンのＡＤＡＭ１０切断阻害剤である。
別の特定実施形態において、モジュレーターは、エフリンＢ２、プロＨｂ−ＥＧＦ、プロアンフィレグリンまたはプロＴＧＦ−αのＡＤＡＭ１７切断阻害剤である。
【００３５】
この実施形態によるＡＤＡＭ阻害剤の１つの非限定例は、実質的にＡＤＡＭ１０プロテアーゼ細胞外ドメインのシステインリッチ領域からなるＡＤＡＭ１０プロテアーゼフラグメントである。
【００３６】
この実施形態によるＡＤＡＭ阻害剤の別の非限定例は、実質的にＡＤＡＭ１７プロテアーゼ細胞外ドメインのシステインリッチ領域からなるＡＤＡＭ１７プロテアーゼフラグメントである。
【００３７】
阻害剤のさらに別の非限定例は、第７態様の抗体または小分子阻害剤である。
第１０態様において、本発明は、動物のＡＤＡＭ活性の調節に反応する病気または症状を予防または治療する方法であって、動物にＡＤＡＭモジュレーターを投与してＡＤＡＭ活性を調節するステップを含む方法を提供する。
【００３８】
モジュレーターは、動物の１つ以上の細胞表面タンパク質のＡＤＡＭ認識、結合かつ／またはタンパク質分解的切断を阻止するのが好ましい。
特定の実施形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼ活性の負の調節に反応する病気および症状は、腫瘍成長、腫瘍浸潤および／または転移、神経突起伸長（例えば、脊髄損傷からの潜在的回復）、慢性関節リウマチや心臓肥大などの炎症症状である。
【００３９】
他の実施形態で、本発明は、ＡＤＡＭプロテアーゼ活性の正の調節に反応する病気、例えば、アルツハイマー病の治療法を提供する。
動物は、ヒト、家畜、パフォーマンス・アニマル、コンパニオン・アニマルなどを含めた哺乳動物であるのが好ましい。
【００４０】
動物はヒトであるのが好ましい。
本明細書において、特段の指示がない限り、「備える」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、排他的というより包括的に用いられ、したがって、記載されている整数または整数群は、記載されていない１つ以上の他の整数または整数群を含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、少なくとも部分的には、ＡＤＡＭ１０がＥｐｈＡ３リガンド結合ドメインとの相互作用を介してＥｐｈＡ３レセプターと構造的に結合するという発見に基づく。細胞と細胞が接触すると、高親和性ＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体が形成されて、ＡＤＡＭ１０のシステインリッチドメイン用の新規結合部位ができ、結果として生じる相互作用により、ＡＤＡＭ１０プロテイナーゼドメインがリガンド発現細胞からエフリンＡ５を切断し得るコンホメーションに配置される。同様に、ＥｐｈＡ３／エフリンＡ２複合体は、エフリンＡ２の切断を容易にするＡＤＡＭ１０結合部位を提供する。同じように、ＡＤＡＭ１７のシステインリッチドメインは、ＡＤＡＭ１０には認識されないＥｐｈＢ４またはＥｐｈＢ２とエフリンＢ２との高親和性複合体に結合するが、これは、それぞれ、Ａ型およびＢ型エフリンに対するＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７の特異性を示している。基質認識およびプロテイナーゼ位置決定モジュールを含むＡＤＡＭ１０のシステインリッチドメインとディスインテグリンドメインの分子構造がＸ線結晶構造解析により解明された。変異ＡＤＡＭタンパク質の構造ベース突然変異誘発および機能解析によって、ＡＤＡＭ１０とＡＤＡＭ１７との間に保存され、それぞれのシステインリッチドメイン内に配置された酸性ポケットが基質認識部位を構成することが明らかにされている。必須表面残基の突然変異による基質認識部位の変化が基質認識の低下をもたらし、それによって、ＡＤＡＭ１０によるその基質、この場合はエフリンＡ５またはエフリンＡ２の切断が阻止される。
【００４２】
これは、細胞に結合したレセプターリガンドのＡＤＡＭ切断を制御する新規方法を提供するものであり、この方法は、ＡＤＡＭメタロプロテアーゼによる機能性レセプター／リガンド複合体の特異的認識を有効に生かしている。この概念は、エフリンは別としても、ｅｒｂＢレセプターファミリー（ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、エピレグリン）およびＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−α）のリガンドを含めた他の細胞膜結合型ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７ターゲットの切断調節にも密接な関係を有する。実際、本発明者らは、基質認識部位が変異したＡＤＡＭ１０は、その細胞表面ｐｒｅ−ＥＧＦ切断能が大幅に低下していることを確認した。
【００４３】
したがって、Ｅｐｈレセプターおよびエフリンに関する特定実施形態において、本発明は、小分子で基質特異性のＡＤＡＭ阻害剤の構造に基づくコンピュータ利用およびハイスループットスクリーニングのターゲットとして、エフリン認識および切断を媒介するＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７の細胞外ドメイン内表面ポケットを利用することを企図している。具体的に言えば、ＡＤＡＭ１０ポケットの内側表面残基Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９は、（それらの突然変異がＡＤＡＭ１０活性の阻害をもたらすので）特異的相互作用部位を規定する。あるいは、表面ポケットとそのレセプター／リガンド複合体認識を、ＡＤＡＭ基質との相互作用を阻止するシステインリッチドメインに対して産生されるモノクローナル抗体のスクリーニングに利用することもできる。ＡＤＡＭ１０によるエフリンとｅｒｂＢリガンドの切断をターゲットとすることは、腫瘍の成長、浸潤および／または転移、炎症性疾患および心臓肥大の重要な治療的介入を提供し得る。
【００４４】
他の実施形態において、本発明は、膜結合型タンパク質の切断におけるＡＤＡＭ１０活性の阻害剤の設計および／またはスクリーニングを企図している。これらの膜結合型タンパク質としては、ケモカインリガンドＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ１６や、接着分子Ｌ１およびＣＤ４４などがあり、これらは、エフリンと同様に、細胞の移動および／または接着の制御に関与している。他のＡＤＡＭ１０／１７機能には、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａおよびレセプター、例えば、ｅｒｂＢ４、ＩＬ−６ＲおよびＮｏｔｃｈの脱落、細胞性プリオンタンパク質前駆体およびアミロイド前駆タンパク質のプロセシングが含まれる（シールスおよびコートニージー、２００３年、前掲）。
【００４５】
本発明が提供する特定の利点は、基質認識および／または結合に干渉して、ＡＤＡＭ活性をターゲットとする療法の特異性を改善することにより、特定のＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７基質の切断をターゲットとするようにＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７阻害剤を特異的に設計し得るという点である。これは、メタロプロテアーゼまたはＡＤＡＭ触媒活性自体の阻害剤に依存し、したがって、特定のＡＤＡＭファミリーメンバーの特定基質を選択的に切断することができない従来技術の方法を有意に改善するものとなろう。
【００４６】
当然のことながら、本明細書に記載の発明は、ヒト細胞が発現するかヒト細胞由来の基質タンパク質のヒトＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７媒介切断を対象とするのが好ましい。
【００４７】
しかし、本発明は、さらに、哺乳動物種間で実質的に相同であるという理由で、他の種由来のＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７および基質タンパク質にも容易に拡大適用し得ることが分かるであろう。
【００４８】
必須残基を含むヒトＡＤＡＭ１０タンパク質配列はＥＫＹＧＬＥＥ（５７３−５７９残基、配列番号１）である。
必須残基を含むヒトＡＤＡＭ１７タンパク質配列はＥＲＥＱＱＬＥＳ（５８３−５９０残基、配列番号２）である。
【００４９】
例えば、ヒトＡＤＡＭ１０の残基Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９はウシＡＤＡＭ１０と同一である。
マウスにおいて、対応残基はＧｌｕ５７４、Ｇｌｕ５７９およびＧｌｕ５８０である。
【００５０】
本明細書に用いたアミノ酸残基のナンバリングシステムは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号で入手可能な配列に基づいている：ＮＭ＿００１１１０（ヒト  ＡＤＡＭ１０）、ＮＭ＿１７４４９６（マウス  ＡＤＡＭ１０）、ＮＭ＿００７３９９（ウシ  ＡＤＡＭ１０）、ＮＭ＿００３１８３（ヒト  ＡＤＡＭ１７）およびＮＭ＿００９６１５（マウス  ＡＤＡＭ１７）。
【００５１】
上記説明から分かるように、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７の「基質タンパク質」は、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼによりタンパク質分解的に切断される任意のタンパク質である。
【００５２】
通常、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７の基質タンパク質は、細胞膜結合型タンパク質であり、本発明においては、天然状態では、細胞表面に、発現、結合、連結または位置するタンパク質クラスを指す。
【００５３】
このタンパク質クラスには、細胞表面レセプター、膜結合型リガンドおよび接着分子が含まれるが、それらには限定されない。
当然のことながら、本発明は、細胞表面に存在するか、膜結合状態にある細胞膜結合タンパク質には限定されず、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現させ得るか、任意の他の人工形態または環境で存在する単離形態の細胞膜結合タンパク質も考慮に入れている。
【００５４】
本発明において、「単離」とは、その天然状態から分離されるか、ヒトの操作にかけられた物質を意味する。単離物は、その天然状態でその物質に通常付随する成分を実質的または本質的に有していないか、人工状態では、その天然状態でその物質に通常付随する成分と共にあるように操作し得る。単離物は、天然、化学合成または組換え形態であり得る。
【００５５】
「タンパク質」とは、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は天然または非天然アミノ酸、当技術分野では周知のようなＤ−またはＬ−アミノ酸であり得る。
「ペプチド」とは、５０個以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００５６】
「ポリペプチド」とは、５０個を超えるアミノ酸を有するタンパク質である。
ペプチドやポリペプチドを含めたタンパク質は、ビオチンやジゴキシゲニンなどの他の部分、ホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素、ラジオランタニド、蛍光色素、およびペプチド−核酸複合体中にあるような核酸に結合し得るが、それらには限定されない。
【００５７】
本明細書において、用語「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡおよびＲＮＡｉ、ならびにｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含めたＤＮＡを示す。
「ポリヌクレオチド」は、８０個以上の連続ヌクレオチドを有する核酸であるのに対し、「オリゴヌクレオチド」は８０個未満の連続ヌクレオチドを有する。
【００５８】
「プローブ」は、例えば、ノーザンブロッティングまたはサザンブロッティングで相補配列を検出するのに適した標識を付けた一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであり得る。
【００５９】
「プライマー」は、通常、好ましくは１５〜５０個の連続ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチドであり、相補的な核酸の「鋳型」にアニーリングすることができ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）などのＤＮＡポリメラーゼの作用により鋳型依存的に延長し得る。
【００６０】
本発明は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、欠失および／または挿入を含む修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはその細胞外ドメインを提供する。
したがって、１つの特定形態において、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはその細胞外ドメインは「突然変異体」と称され得る。
【００６１】
本明細書において、用語「突然変異体」、「突然変異」および「突然変異型」は、概して、ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントに導入されて、ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントの基質タンパク質または基質タンパク質を含むタンパク質複合体認識、結合、または相互作用能を改変する、非保存性アミノ酸置換、付加、欠失および／または挿入を包含するように用いられる。
【００６２】
修飾ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはそのフラグメントは、基質タンパク質を認識、結合および／またはタンパク質分解的切断し得ないか、野生型ＡＤＡＭプロテアーゼに比べて能力が低下しているのが好ましい。
【００６３】
また、用語「突然変異体」は、本明細書では、同じように、変異ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはその細胞外ドメインをコードする単離核酸を表すのにも用いられる。
【００６４】
これに関して、本発明は、修飾ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはそのフラグメントをコードする単離核酸を提供する。
特定の実施形態において、ウシＡＤＡＭ１０の１７３３−１７５４位のヌクレオチド配列ＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧ（配列番号３）は、ＧＣＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧ（配列番号４）に改変されている。
【００６５】
あるいは、マウスＡＤＡＭ１０の１７４５−１７６６位のヌクレチオド配列ＧＡＡＡＡＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧ（配列番号５）は、ＧＣＡＡＡＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧ（配列番号６）に改変されている。
【００６６】
ヒトＡＤＡＭ１０ヌクレオチド配列ＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号７）は、ＧＣＧＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＴＡＧＣＧＧＣＧ（配列番号８）に改変し得る。
ヒトＡＤＡＭ１７ヌクレオチド配列ＧＡＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＣＣ（配列番号９）は、ＧＣＧＡＧＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣ（配列番号１０）に改変し得る。
【００６７】
本明細書において、用語「フラグメント」は、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼ細胞外ドメインの任意の部分、領域またはドメインを包含する。
１つの特定形態において、本発明は、基質タンパク質または基質タンパク質を含むタンパク質複合体と結合または相互作用し、かつ全長または野生型ＡＤＡＭプロテアーゼ（例えば、内因性ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼ）と競合して、基質認識、結合および／またはタンパク質分解的切断を実質的に低下させるか、阻害するＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントを提供する。
【００６８】
１つの特定実施形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、エフリンＡ５、エフリンＡ２またはエフリンＢ２などのエフリンが、それぞれＥｐｈＡ３またはＥｐｈＢ２／ＥｐｈＢ４などのＥｐｈレセプターを含むタンパク質複合体中に存在するとき、エフリンと結合し得る。
【００６９】
ＡＤＡＭ１０に関する別の特定実施形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、プロＥＧＦまたはプロアンフィレグリンなどのＥＧＦ型リガンド前駆体と結合し得る。
【００７０】
ＡＤＡＭ１７に関する別の特定実施形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、プロＨｂ−ＥＧＦ、プロベータセルリンまたはＴＧＦ−αなどのＥＧＦ型リガンド前駆体と結合し得る。
【００７１】
プロＨｂ−ＥＧＦ、プロベータセルリンまたはプロＴＧＦ−αは、ＥＧＦレセプターｅｒｂＢ１を含む単離タンパク質複合体中に存在するのが好ましい。
これらの実施形態の１形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、ヒトＡＤＡＭ１０またはヒトＡＤＡＭ１７プロテアーゼのシステインリッチドメインと、場合により、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７細胞外ドメインのディスインテグリンドメインである。
【００７２】
システインリッチドメインとディスインテグリンドメインとを有するフラグメントの例は、（本明細書では、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋ＣまたはＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃタンパク質構築物と称される）ヒトＡＤＡＭ１０の４８３−６４６残基またはヒトＡＤＡＭ１７の５０１−６４４残基を含むフラグメントである。
【００７３】
システインリッチドメインは有するがディスインテグリンドメインが無いフラグメントの例は、ＡＤＡＭ１０の５５２−６４６残基またはＡＤＡＭ１７の５６４−６４４残基を含むフラグメントである。
【００７４】
これらのフラグメントは、それぞれ、ヒトＡＤＡＭ１０核酸の２０９８−２３８２残基およびヒトＡＤＡＭ１７核酸の１８７３−２１６１残基でコードされる。
当然のことながら、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼのシステインリッチドメインからなるか、場合により、上記システインリッチドメインとＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７細胞外ドメインのディスインテグリンドメインとからなり得る。
【００７５】
また、ＡＤＡＭプロテアーゼフラグメントは、本質的にＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼからなるか、場合により、上記プロテアーゼとＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７細胞外ドメインのディスインテグリンドメインとからなり得る。
【００７６】
「本質的に〜からなる」とは、そのフラグメントが、さらに、そのＮおよび／またはＣ末端に１、２または３個の追加アミノ酸残基を含むことを意味する。
本発明はさらに、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７細胞外ドメインのシステインリッチドメインに１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼフラグメントを提供する。
【００７７】
アミノ酸置換は、当技術分野では周知のように、保存性または非保存性であり得る。
ＡＤＡＭ１０に関する特定実施形態において、１つ以上の非保存性置換アミノ酸は、ヒトまたはウシＡＤＡＭ１０のＧｌｕ５７３置換、Ｇｌｕ５７８置換およびＧｌｕ５７９置換からなる群から選択される。
【００７８】
ヒトＡＤＡＭ１７に関する特定実施形態において、１つ以上の非保存性置換アミノ酸は、Ｇｌｕ５８３置換、Ｇｌｕ５８９置換およびＳｅｒ５９０置換からなる群から選択される。
【００７９】
ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７の上記残基はアラニンで置換するのが好ましい。
別の実施形態において、「フラグメント」は、単離ＡＤＡＭプロテアーゼの細胞外ドメインの１００％未満、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７５％を構成するアミノ酸配列を含む。
【００８０】
さらに別の実施形態において、「フラグメント」は、例えば長さが少なくとも６個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸からなる小ペプチドである。また、２個以上のペプチドを含む大きなフラグメントも企図されており、これらのフラグメントは、標準組換え技術を用いて得るか、従来の液相または固相合成技術を用いて合成し得る。あるいは、ペプチドは、本発明のポリペプチドを、ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−ＣおよびスタフィロコッカスＶ８プロテアーゼなどのプロテイナーゼで消化して産生させることができる。消化フラグメントは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術を用いて精製し得る。
【００８１】
当然のことながら、（例えば、長さがアミノ酸１５−５０個などの）短いフラグメントは、以下にさらに詳細に説明するように抗体の調製に有用であり得る。
本明細書において、本発明の「誘導体」タンパク質は、例えば、他の化学部分との結合もしくは複合体形成によるか、当技術分野では周知のような翻訳後修飾技術を用いて変性させたタンパク質である。
【００８２】
本発明が企図する誘導体の非限定例としては、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成時における側鎖修飾、非天然アミノ酸および／もしくはその誘導体の組み込み、ならびに架橋剤や本発明のポリペプチド、フラグメントおよび突然変異体に構造制約を課す他の方法の利用が挙げられるが、それらには限定されない。本発明が企図する側鎖修飾の例としては、例えば無水酢酸によるアシル化などのアミノ基修飾、無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、メチルアセトイミデートによるアミド化、シアネートによるアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサ−ル−５−ホスフェートによるリシンのピリドキシル化とその後のＮａＢＨ４による還元、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化とその後のＮａＢＨ４による還元、および２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化などがある。
【００８３】
カルボキシル基は、Ｏ−アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化、その後の例えば対応アミドへの誘導体化により修飾し得る。
アルギニン残基のグアニジン基は、例えば、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬を用いて複素環縮合物を形成することにより修飾し得る。
【００８４】
スルフヒドリル基は、過ギ酸のシステイン酸への酸化、４−クロロマーキュリフェニルスルホン酸、４−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、フェニルマーキュリクロリドおよび他の水銀剤を用いた水銀誘導体の形成、マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化、およびアルカリ性ｐＨのシアネートによるカルバモイル化などの方法で修飾し得る。
【００８５】
トリプトファン残基は、例えば、インドール環を２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルホニルでアルキル化するか、Ｎ−ブロモスクシンイミドで酸化して修飾し得る。
【００８６】
チロシン残基は、テトラニトロメタンでニトロ化して３−ニトロチロシン誘導体を形成することにより修飾し得る。
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカーボネートでＮ−カルボエトキシル化するか、ヨード酢酸誘導体でアルキル化して修飾し得る。
【００８７】
ペプチド合成時に組み込む非天然アミノ酸および誘導体の例としては、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ異性体の使用が挙げられるが、それらには限定されない。
【００８８】
（フラグメントおよび誘導体を含めた）本発明の修飾ＡＤＡＭプロテアーゼおよびフラグメントは、化学合成や組換えＤＮＡ技術を含めた当業者には周知の任意の適当な手順を用いて調製し得る。
【００８９】
当然のことながら、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼ、特に、最大約１００個のアミノ酸からなるそのフラグメントは、固相および液相合成を含めた化学合成により調製し得る。そのような方法は当技術分野では周知であり、例として、ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ニコルソン編（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）の第９章およびＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ  コリガンら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ  ＵＳＡ  １９９５−２００１年）の第１５章に記載されているような化学合成技術が挙げられる。
【００９０】
あるいは、組換えタンパク質は、例えば、本明細書に文献援用されるサムブルックら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）、特に第１６および第１７節；本明細書に文献援用されるＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、アウスベルら編、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５−１９９９年）、特に第１０および第１６章；および本明細書に文献援用されるＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、コリガンら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５−１９９９年）、特に第１、第５および第６章に記載されているような標準プロトコルを用いて当業者が適宜調製し得る。
【００９１】
例えば、修飾ＡＤＡＭプロテアーゼまたはフラグメントは、以下のステップを含む手順により組換えタンパク質として調製し得る：
（ｉ）  発現ベクター中の１つの以上の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結したＡＤＡＭプロテアーゼまたはフラグメントをコードする単離核酸を含む発現構築物を宿主細胞に導入するステップ、および
（ｉｉ）  組換え修飾ＡＤＡＭプロテアーゼを単離し得る上記宿主細胞中で組換え修飾ＡＤＡＭプロテアーゼを発現させるステップ。
【００９２】
本発明との関連において、いくつかの実施形態では、発現構築物が、その後で基質結合を特性決定するために、ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはフラグメントをコードする突然変異核酸を含むことが分かるであろう。
【００９３】
他の実施形態において、発現構築物は、基質タンパク質と結合できないか、対応する野生型ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼに比べて結合親和性が低下している修飾ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはフラグメントをコードする核酸を含む。
【００９４】
この実施形態によれば、組換え修飾ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはそのフラグメントは、その後で、例えば、構造解析〔例えば、Ｘ線結晶構造解析、多波長異常分散（ＭＡＤ）またはＮＭＲ〕を含むが、それには限定されない用途に用いるために、単独で、または基質タンパク質と複合体を形成した状態で精製し得る。
【００９５】
本明細書に一般に用いられている「遺伝子構築物」とは、ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼ、そのフラグメントまたは本発明のこれらの突然変異型をコードする核酸を組み込み、かつその使用を容易にする任意の人工的に創出された核酸である。
【００９６】
そのような構築物は、細菌増殖および／もしくは核酸の増幅、核酸突然変異誘発ならびに／またはコードされるタンパク質の組換え発現に有用であり得る。
本明細書において、タンパク質発現に用いる遺伝子構築物は「発現構築物」と称し、発現構築物中、発現させる単離核酸は発現ベクター中の１つ以上の調節配列に作動可能に連結または作動可能に結合している。
【００９７】
「発現ベクター」とは、プラスミドなどの自律複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合されるベクターである。
発現ベクターはプラスミドベクターであるのが好ましい。
【００９８】
「作動可能に連結」または「作動可能に結合」とは、１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列が、発現させる核酸に関して、核酸の発現を開始、調節または制御するように配置されていることを意味する。
【００９９】
調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に用いる宿主細胞に適切なものであろう。当技術分野では、多様な宿主細胞に関して、多くのタイプの適切な発現ベクターや適当な調節配列が周知である。
【０１００】
通常、上記１つ以上の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始および終結配列、スプライスドナー／アクセプター配列ならびにエンハンサーまたはアクチベータ配列が含まれ得るが、それらには限定されない。
【０１０１】
本発明では、当技術分野では周知の構成的または誘導的プロモーターが企図され、それらのプロモーターには、例えば、テトラサイクリン抑止可能プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーターおよび金属誘導性プロモーターが含まれる。これらのプロモーターは、天然プロモーター（例えば、αクリスタリンプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ヒト伸長因子αプロモーターおよびウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ由来プロモーター）、または２種以上のプロモーターの要素を組み合せた合成ハイブリッドプロモーター（例えば、ＳＲαプロモーター）であり得る。
【０１０２】
１つの好ましい実施形態において、発現ベクターは、選択可能マーカー遺伝子を含む。選択可能マーカーは、（例えば、ｂｌａ、ｋａｎＲおよびｔｅｔＲなどの）形質転換菌の選択のためであるか、（例えば、ヒグロマイシン、Ｇ４１８およびピュロマイシンなどの）形質転換哺乳動物細胞の選択のためであるかを問わず有用である。
【０１０３】
発現に適した宿主細胞は、原核または真核生物細胞、例えば、エスケリチア・コリ（例えば、ＤＨ５α）、酵母細胞、バキュロウイルス発現系に利用されるＳＦ９細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ、ＣＶ−１、Ｊｕｒｋａｔ、ＰＣ１２およびＨＥＫ２９３であり得るが、それらには限定されない。
【０１０４】
発現ベクターは、例えば、（通常、発現ベクターによって供給される）エピトープ標識または融合パートナーなどの少なくとも１つの追加アミノ酸配列を含み得るので、本発明の組換えタンパク質は、融合パートナーとの融合タンパク質として発現される。融合パートナーの利点は、それらが融合タンパク質の同定および／または精製を支援することである。
【０１０５】
融合パートナーの周知例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃおよびヒンジ部、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６）が挙げられるが、それらには限定されず、これらの融合パートナーは、アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティークロマトグラフィーによる融合タンパク質精製のためのアフィニティークロマトグラフィー関連マトリックスは、それぞれ、グルタチオン−、アミロース−、およびニッケル−またはコバルト−結合樹脂である。そのようなマトリックスの多くは、例えば、（ＨＩＳ６）融合パートナーに関して有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（キアゲン社）や、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ精製システムなどの「キット」形態で入手し得る。
【０１０６】
場合により、融合パートナーは、例えば、Ｘａまたはトロンビンなどのプロテアーゼ切断部位をさらに有し、これらの部位は、関連プロテアーゼで本発明の融合タンパク質を部分消化して、本発明の修飾レセプタータンパク質を遊離させ得る。次いで、遊離した修飾レセプタータンパク質を、その後でクロマトグラフィー分離して融合パートナーから単離することができる。
【０１０７】
本発明の融合パートナーは、その範囲内に、通常、特異的抗体が得られる短いペプチド配列である「エピトープ標識」をさらに含む。特異的モノクローナル抗体が容易に得られるエピトープ標識の周知例としては、ｃ−ｍｙｃ、インフルエンザウイルスヘマグルチニンおよびＦＬＡＧ標識などがある。
【０１０８】
別の融合パートナーはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。この融合パートナーは、蛍光顕微鏡検査またはフローサイトメトリーによる本発明の融合ポリペプチドの同定を可能にする蛍光「標識」としての役割を果たす。ＧＦＰ標識は、本発明の融合ポリペプチドの細胞内局在性を評価する際または本発明の融合タンパク質を発現する細胞を単離するのに有用である。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー法がこの後者の用途には特に有用である。
【０１０９】
組換えタンパク質発現全般に関しては、標準プロトコルが、本明細書に文献援用される、サムブルックら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）、特にその第１６および第１７節；本明細書に文献援用される、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、アウスベルら編、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５−１９９９年）、特に第１０および第１６章；および本明細書に文献援用される、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、コリガンら編（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５−１９９９年）、特に第１、第５および第６章に記載されている。
【０１１０】
突然変異誘発および発現スクリーニング
本発明は、少なくとも部分的に、突然変異ＡＤＡＭ１０プロテアーゼ、または、より具体的に言えば、その細胞外のシステインリッチドメインおよびそのさまざまな突然変異体の基質タンパク質結合特性の解析に基づいている。
【０１１１】
そこで、１つの特定態様において、本発明は、基質タンパク質を認識、結合かつ／またはタンパク質分解的に切断し得ないか、野生型ＡＤＡＭプロテアーゼに比べて能力が低下しているＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントを産生させる方法であって、（ｉ）  修飾ＡＤＡＭ１０プロテアーゼまたはそのフラグメントを産生させるために、ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはそのフラグメントに、あるいはＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはそのフラグメントをコードする核酸に、１つ以上のアミノ酸置換を導入するステップと、（ｉｉ）  修飾ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼまたはそのフラグメントが、基質タンパク質に結合し得ないか、かつ／もしくは基質タンパク質をタンパク質分解的に切断し得ないか、または野生型ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼに比べて能力が低下しているかどうかを測定するステップとを含む方法を提供する。
【０１１２】
ＡＤＡＭ１０に関する１つの特定実施形態において、基質タンパク質は、好ましくはＥｐｈＡ３を含むタンパク質複合体中に存在するときのエフリンＡ５である。
ＡＤＡＭ１０に関する別の実施形態において、基質タンパク質は、好ましくはＥｐｈＡ３を含むタンパク質複合体中に存在するときのエフリンＡ２である。
【０１１３】
ＡＤＡＭ１７に関するさらに別の実施形態において、基質タンパク質は、好ましくはＥｐｈＢ２またはＥｐｈＢ４を含むタンパク質複合体中に存在するときのエフリンＢ２である。
【０１１４】
しかし、当然のことながら、本発明は、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７タンパク質分解的切断により活性化または調節される他の細胞表面レセプターにも適用可能である。これらのレセプターには、ｅｒｂＢレセプターファミリー（ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリン、エピレグリン）およびＴＮＦレセプター（ＴＮＦ−α）のリガンド、ケモカインリガンドＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ１６ならびに接着分子Ｌ１およびＣＤ４４が含まれ、これらは細胞移動および／または接着の制御に関与する。他のＡＤＡＭ１０機能には、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａや、例えば、ｅｒｂＢ４（ＨＥＲ４）、ＩＬ−６ＲおよびＮｏｔｃｈなどのレセプターの脱落が含まれる。
【０１１５】
突然変異は、例えば、修飾タンパク質の化学合成、ＡＤＡＭプロテアーゼもしくはそのフラグメントの化学的突然変異誘発、またはコード核酸への１つ以上の突然変異の導入などにより、ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントに導入し得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、突然変異は、ヌクレオチド配列増幅技術を用いて単離核酸に導入する。
核酸増幅技術は当業者には周知であり、例えば、アウスベルら、前掲の第１５章に記載のようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；例えば、米国特許第５，４２２，２５２号に記載のような鎖置換増幅（ＳＤＡ）；例えば、リューら、１９９６年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１８巻、ｐ．１５８７、国際公開ＷＯ９２／０１８１３号および国際公開ＷＯ９７／１９１９３号に記載のようなローリングサークル型複製；例えば、スクナナンら、１９９４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第１７巻、ｐ．１０７７に記載のような核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）；例えば、チャギら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９３巻、ｐ．５３９５に記載のようなＱ−Ｂレプリカーゼ増幅や、例えば、国際公開ＷＯ２００４／０２０２５号に記載のようなヘリカーゼ依存性増幅などがある。
【０１１７】
本明細書において、「増幅産物」とは、核酸増幅技術により生じた核酸増幅産物を指す。
好ましい核酸配列増幅技術はＰＣＲである。
【０１１８】
突然変異は、当技術分野では周知のランダムまたは部位特異的突然変異誘発により核酸に導入し得る。核酸突然変異誘発法の非限定例は、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、アウスベルら、前掲の第９章、シュテマー、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９１巻、ｐ．１０７４７、シャフィカニら、１９９７年、Ｂｉｏｔｃｈｎｉｑｕｅｓ  第２３巻、ｐ．３０４、ジェンキンスら、１９９５年、ＥＭＢＯＪ．第１４巻、ｐ．４２７６−４２８７およびザッコロら、１９９６年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２５５巻、ｐ．５８９に記載されている。
【０１１９】
例えば、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ（商標）ランダム突然変異誘発キット（クロンテック社）などの突然変異誘発キットも市販されている。
特定の実施形態において、突然変異には、ウシＡＤＡＭ１０（アクセス番号：ＮＭ＿１７４４９６）の１７３３ＧＡＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧ１７５４から１７３３ＣＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧ１７５４へ、およびマウスＡＤＡＭ１０（アクセス番号：ＮＭ＿００７３９９）の１７４５ＧＡＡＡＡＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＧＧＡＧ１７６６から１７４５ＧＣＡＡＡＧＴＡＴＧＡＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧ１７６６へのヌクレオチド配列の変更や、マウスＡＤＡＭ１７、アクセス番号ＮＭ＿００９６１５の対応突然変異体が含まれる。
【０１２０】
ＡＤＡＭプロテアーゼの基質タンパク質との結合および／または基質タンパク質の切断に影響を与える突然変異の測定は、以下のステップを含む方法により実施し得る：
（Ａ）  組換え修飾ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７タンパク質またはそのフラグメントを精製するステップと、
（Ｂ）  修飾ＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７タンパク質またはそのフラグメントが基質タンパク質に結合かつ／または基質タンパク質を切断し得ないか、基質タンパク質に結合かつ／または基質タンパク質を切断する能力が少なくとも低下しているかどうかを測定するステップ。
【０１２１】
あるいは、突然変異型ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７タンパク質をレセプター発現細胞中で過剰発現させ、ＧＦＰ標識細胞表面基質の切断能力の変化を蛍光顕微鏡検査でモニターする。
【０１２２】
基質結合の測定は、例えば、タンパク質複合体の免疫沈降または「プルダウン」、他の表面プラズモン共鳴技術を含めたＢＩＡｃｏｒｅ解析、平衡透析、沈降および超遠心分離分析、ＥＬＩＳＡ、ＡＬＰＨＡスクリーニング技術（パーキン・エルマー社、蛍光リガンド誘導体と細胞との結合の蛍光顕微鏡解析や、より慣用的な平衡ラジオリガンド結合測定を含むがそれには限定されない、タンパク質間相互作用を測定する多様な技術のいずれかを用いて実施し得る。
【０１２３】
基質切断の測定は、任意の適当なＡＤＡＭプロテアーゼ活性アッセイを用いて実施し得る。エフリンＡ５およびエフリンＡ２の非限定実施例において、切断されたエフリンＡ５は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合ＥｐｈＡ３−Ｆｃで回収し、ウエスタンブロットで検出するか、その細胞表面または合成ビーズからの切断およびＥｐｈＡ３発現細胞へのインターナリゼーションを蛍光顕微鏡検査でモニターし得る。
【０１２４】
ＡＤＡＭモジュレーターの設計およびスクリーニング
本発明は、エフリンおよびそれらの各Ｅｐｈレセプターとの結合相互作用を媒介するために、エフリン基質のＡＤＡＭタンパク質分解的切断に必要とされるＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７プロテアーゼの必須ドメインおよびアミノ酸残基を正確に描き出した。
【０１２５】
ＡＤＡＭ１０のアミノ酸残基は、Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９からなる群から選択するのが好ましい。
ＡＤＡＭ１７のアミノ酸残基は、Ｇｌｕ５８３、Ｇｌｕ５８９およびＳｅｒ５９０からなる群から選択するのが好ましい。
【０１２６】
したがって、本発明は、基質タンパク質のＡＤＡＭプロテーゼ媒介認識、結合および／またはタンパク質分解的切断を調節する、本明細書では「ＡＤＡＭプロテアーゼモジュレーター」と称する分子の設計およびスクリーニングにおける上記タンパク質ドメインおよび／または残基の利用を企図している。
【０１２７】
具体的に言えば、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７モジュレーターは、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼ、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７の細胞外ドメインＣ末端のシステインリッチフラグメント、上記の修飾形態およびＥｐｈＡ３またはＥｐｈＢ４などの細胞表面タンパク質とで形成されたタンパク質複合体を含むがそれらには限定されないタンパク質の構造解析に基づく合理的設計により創出し得る。
【０１２８】
あるいは、ＡＤＡＭモジュレーターは、合成化学ライブラリー、コンビナトリアル・ライブラリー、天然分子と抗体のライブラリーを含めた分子ライブラリーをスクリーニングすることにより同定し得る。
【０１２９】
本明細書において、用語「ミメティック」とは、タンパク質またはペプチドの特定機能領域に似るように設計された分子を指し、ミメティックはその範囲内に、当技術分野では周知の用語「アゴニスト」、「アナログ」および「アンタゴニスト」を包含する。
【０１３０】
上記ミメティック、アゴニスト、アンタゴニストおよびアナログは、ペプチド、タンパク質、例えば、抗体（好ましくはモノクローナル抗体）または望ましい生物活性および半減期を有する他の有機分子、好ましくは有機小分子であり得る。
【０１３１】
これらは、バーチャル・コンビナトリアル・ライブラリーの設計およびスクリーニングに関するシュナイダー、２００２年、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第９巻、ｐ．２０９５、ネスラーおよびリュー、１９９８年、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、第１巻、ｐ．１１３およびカークパトリックら、１９９９年、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ、第２巻、ｐ．２１１に記載のものを含むがそれらには限定されない方法を用いて、コンビナトリアル・ライブラリーを含めた合成化学ライブラリーなどの分子ライブラリーをスクリーニングすることにより同定し得る。
【０１３２】
また、天然分子のライブラリーを、例えば、コルプ、１９９８年、Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ．Ｒｅｓ．第５１巻、ｐ．１８５に概説されているような方法またはエルドリッジら、２００２年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７４巻、ｐ．３９６３に記載のアプローチによりスクリーニングすることも企図される。
【０１３３】
より合理的なミメティック設計法は、上述し、当技術分野では周知のように、構造データベースのコンピュータ支援スクリーニング、構造生物情報学的アプローチ、コンピュータ支援モデリング、または分子結合相互作用を検出するより慣用的な生物物理学的技術を使用し得る。
【０１３４】
構造生物情報学的創薬アプローチについての最近の概説が、ファウマンら、２００３年、Ｍｅｔｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．第４４巻、ｐ．４７７に記載されている。
コンピュータ支援分子モデリングおよびデータベース検索は、ミメティックの同定および設計手順としてますます利用されるようになっている。原理上、ミメティックの同定に好適であり得るデータベース検索法の非限定例は、（ＨＩＶ抗原ミメティックの産生に関する）国際公開ＷＯ９４／１８２３２号、米国特許第５，７５２，０１９号、（ＥＰＯミメティックの同定に関する）国際公開ＷＯ９７／４１５２６号、および（薬物動態のコンピュータ内モデリングに関する）ファン  デル  ウォータービームドおよびギフォード、２００３年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．第２巻、ｐ．１９２に見られる。
【０１３５】
他の方法としては、例えば、コンペティティブラジオリガンド結合アッセイ、プロテインアレイ、分析超遠心、微小熱量測定、表面プラズモン共鳴および光バイオセンサーをベースとする方法などの分子相互作用の同定および測定に用い得る多様な生物物理学的技術が挙げられ、それらは、本明細書に文献援用されるＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ、コリガンら編、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９７年）に記載されている。
【０１３６】
１つの特定実施形態において、ＡＤＡＭプロテアーゼモジュレーターの設計および／またはスクリーニングは、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼ阻害剤の産生に関する。
【０１３７】
したがって、１つの形態において、この実施形態は、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼ阻害剤の同定法を企図し、この方法は、候補阻害剤分子が、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼのシステインリッチドメインを含むＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼフラグメントとＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７のタンパク質基質との複合体の形成を防止、低下または阻害するかどうかを判定するステップを含み、候補分子が複合体の形成を防止、低下または阻害すれば、その候補分子はＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼの阻害剤と見なされる。
【０１３８】
本発明の企図とする１つの特定の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）解析を利用して、候補阻害剤の存在下、Ｅｐｈ、エフリンおよびＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼを含む単離タンパク質複合体をモニターする。
【０１３９】
これに関して、複合体形成阻害剤のスクリーニングまたは同定は、Ｆｃ標識タンパク質に結合したドナーおよびアクセプター蛍光標識を利用するハイスループット均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（商標））をベースとする。タンパク質間相互作用により、標識が接近し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を誘発し、それによって、増幅蛍光シグナルを生成する化学反応カスケートが始動する。このアッセイの１実施例を以下に図６Ａに関して説明するが、ここでは、ＥｐｈＡ３−ＦｃとエフリンＡ５との複合体を増大濃度のＦｃ標識ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃと一緒にインキュベートし、ＥｐｈＡ３とＡＤＡＭＤ＋Ｃ−Ｆｃ上の２つの標識間のエネルギー移動をしかるべく測定した。
【０１４０】
特定の実施形態において、候補阻害剤は抗体または有機小分子である。
また、当然のことながら、ＡＤＡＭプロテアーゼ阻害剤の設計および／またはスクリーニングには、「読み出し」としてだけでなく基質結合の測定または基質結合の測定に代わるものとして、組換えまたは合成基質タンパク質のＡＤＡＭタンパク質分解的切断を利用し得る。
【０１４１】
Ｅｐｈとエフリンはどちらも、それらが（血管形成を介した）腫瘍の成長、浸潤および（細胞接着／反発の抑制による）転移を促進する可能性がある乳ガン、肺ガン、結腸ガン、前立腺ガン、腎ガン、悪性黒色腫、神経芽細胞腫を含めたさまざまなガンにおいて上方調節される。同様に、遍在的に発現されるＡＤＡＭプロテアーゼは、乳ガンおよび結腸ガンを含めた数種のガンや神経芽細胞腫で上方調節される。したがって、本発明の１つの実施形態は、エフリン切断に対するＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７の作用をターゲットとし、それによって腫瘍の成長、浸潤および転移の治療的介入を提供するＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７プロテアーゼ阻害剤を企図とする。
【０１４２】
しかし、エフリンＡ５またはエフリンＡ２のＡＤＡＭ１０切断を調節すると見なされる領域は、エフリンＢ２などの他のエフリンだけでなく、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７の他の疾患関連ターゲットにも関連を有し得る。
【０１４３】
したがって、本発明は、エフリンＡ５切断をターゲットとするＡＤＡＭ１０阻害剤の設計および／または同定には限定されない。
既に記載されているように、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７は、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ベータセルリンおよびエピレグリンの膜貫通アンカー型プロ体をも含めたさまざまな膜結合型タンパク質の切断に関係があると見なされている。これらのＥＧＦレセプターリガンドは、特に数種のガンの自己分泌増殖を支持する増殖の促進や腫瘍細胞の運動性において確立した機能を有する（スチールスおよびコートニージー、２００３年、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．第１７巻、ｐ．７−３０）。
【０１４４】
ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７媒介ＥＧＦレセプターリガンド切断も、ガン細胞増殖に重要な意味を持つクロストーク〔フィッシャーら、２００３年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、第３１巻、ｐ．１２０３−１２０８〕であり、心臓肥大や消化管肥厚の原因となる機構である「Ｇタンパク質活性化レセプターによるＥＧＦレセプターのトランス活性化」に直接関与している。ＡＤＡＭ１０による脱落（切断）は、細胞膜結合型プロＥＧＦを活性ＥＧＦ−レセプター結合型ＥＧＦに変える（実施例６参照）。
【０１４５】
重要なことには、ＡＤＡＭ１７はプロＴＮＦ−αを活性ＴＮＦレセプター結合成熟型に変える。ＡＤＡＭ１７の役割は、活性ＴＮＦ−αが関節リウマチや悪液質などの炎症性疾患に直接関与するプロ炎症性サイトカインなので治療関連性を有する。ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７は、細胞移動および／または接着の制御に関与するケモカインリガンドＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ１６や、接着分子Ｌ１およびＣＤ４４の放出にも関与する（スチールスおよびコートニージー、２００３年、前掲）。ＡＤＡＭ１０モジュレーターがターゲットとし得る他のＡＤＡＭ１０機能には、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａや、ｅｒｂＢ４、インターロイキン６レセプターおよびＮｏｔｃｈなどのレセプターの脱落がある。
【０１４６】
医薬組成物および治療法
本発明は、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７のモジュレーターと、医薬上有効な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【０１４７】
本発明はさらに、動物のＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７活性の調節に反応する疾患または症状を予防または治療する方法に関し、この方法は、動物にＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７のモジュレーターを投与してＡＤＡＭ１０活性を調節するステップを含む。
【０１４８】
モジュレーターは、動物の１つ以上の細胞表面タンパク質のＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７認識、結合かつ／またはタンパク質分解的切断を阻害、低下または阻止するのが好ましい。
【０１４９】
特定の実施形態において、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７活性の調節に反応する疾患または症状は、腫瘍の成長、浸潤および／または転移である。
さらなる実施形態において、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７活性の調節に反応する疾患または症状は、関節リウマチや悪液質などの炎症性症状である。
【０１５０】
さらなる実施形態において、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７活性の調節に反応する疾患または症状は心臓肥大である。
当然のことながら、本発明のＡＤＡＭプロテアーゼモジュレーターは、（Ｅｐｈ／エフリン系を含むがそれらには限定されない）特定のＡＤＡＭプロテアーゼ基質の結合および／または切断をターゲットとするのに用い、それによってＡＤＡＭプロテアーゼ活性をターゲットとする療法を改善し得る。これは、ＡＤＡＭプロテアーゼ触媒活性自体の阻害剤に依存し、特定ＡＤＡＭプロテアーゼ基質の切断を選択的にターゲットとし得ず、その結果、他のタイプのメタロプロテアーゼに悪影響を与えるので、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７活性の選択的阻害には使用できない従来技術の方法と比較するに値する。
【０１５１】
これは、ＡＤＡＭ１０および関連プロテアーゼにより切断される多様な基質タンパク質、したがって、これらのプロテアーゼによって調節される多様な生物活性に起因する特定の問題であり、従来の臨床実験ではかなり不本意な結果に終った問題である。
【０１５２】
特定の実施形態において、本発明は、ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７のエフリン切断を阻害することによる腫瘍細胞転移の予防、阻害または遅延に関する。
ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼによるエフリン切断および腫瘍細胞転移の阻害効果は、細胞間反発を低下させるか、かつ／またはＥｐｈ／エフリンおよび／またはＥＧＦレセプターシグナル伝達に起因する細胞運動性を低下させることにより達成し得る。
【０１５３】
上記に照らして、腫瘍細胞の転移は、腫瘍細胞の原発部位からの広がり、新規腫瘍部位の定着および関係細胞型による新血管形成を含めた種々のレベルでコントロールし得ることが分かるであろう。
【０１５４】
そのような腫瘍細胞の非限定例としては、白血病やリンパ腫、肺および結腸のガン、神経芽細胞腫、脳、腎性および腎臓の腫瘍、前立腺ガン、肉腫、黒色腫が挙げられる。
潜在的に関連する腫瘍のより包括的な概説としては、当業者は、ナカモトおよびベルゲマン、２００２年、Ｍｉｃｒｏｓｃ．Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈ．第５９巻、ｐ．５８−６７、ビマー−クライカンプおよびラックマン、２００５年、ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ  第５７巻、ｐ．４２１−４３１、およびフィッシャーら、２００３年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２００３年、第３１巻、ｐ．１２０３−８を参照されたい。
【０１５５】
ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７プロテアーゼのモジュレーターは、上述のように、同定、スクリーニング、設計または生産し得る。
１つの特定実施形態において、ＡＤＡＭ１０阻害剤は、本質的にＡＤＡＭ１０プロテアーゼ細胞外ドメインのシステインリッチドメインからなるが、触媒能はないＡＤＡＭ１０プロテアーゼフラグメントである。
【０１５６】
例えば、本質的にＡＤＡＭ１０プロテアーゼの５５２−６４６残基からなるＡＤＡＭ１０プロテアーゼフラグメントは、例えば、ＥｐｈＡ３と複合体を形成したエフリンＡ５などの基質と結合するが、基質をタンパク質分解的に切断しないので、内因性ＡＤＡＭ１０の競合阻害剤としての働きをするであろう。
【０１５７】
別の特定実施形態において、ＡＤＡＭ１７阻害剤は、本質的にＡＤＡＭ１７プロテアーゼ細胞外ドメインのシステインリッチドメインからなるが、触媒能はないＡＤＡＭ１７プロテアーゼフラグメントである。
【０１５８】
例えば、本質的にＡＤＡＭ１７プロテアーゼの５６４−６４４残基からなるＡＤＡＭ１７プロテアーゼフラグメントは、ＥｐｈＢ２またはＥｐｈＢ４と複合体を形成したエフリンＢ２などの基質と結合するが、基質をタンパク質分解的に切断しないので、内因性ＡＤＡＭ１７プロテアーゼと競合するであろう。
【０１５９】
さらに別の特定実施形態において、モジュレーターはＡＤＡＭ１０もしくはＡＤＡＭ１７の小分子阻害剤または阻害抗体である。
「医薬上許容し得る担体、希釈剤または賦形剤」とは、安全に全身投与し得る固体または液体の充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。特定の投与経路に応じて、当技術分野では周知の多様な担体を用い得る。これらの担体は、糖、スターチ、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝液、乳化剤、等張食塩水や、塩酸塩、臭化物および硫酸塩を含めた鉱酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩およびマロン酸塩などの有機酸塩ならびにパイロジェンフリー水からなる群から選択し得る。
【０１６０】
医薬上許容し得る担体、希釈剤および賦形剤についての記載がある有用な参考文献は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．米国ニュージャージー州、１９９１年）であり、これは本明細書に文献援用される。
【０１６１】
本発明の組成物を患者に投与する際には、任意の安全な投与経路を用い得る。例えば、経口、経腸、非経口、舌下、口腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮などを用い得る。例えば、免疫療法組成物、タンパク質ワクチンや核酸ワクチンの投与には、筋肉注射や皮下注射が適している。
【０１６２】
剤形としては、錠剤、分散剤、懸濁剤、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、座剤、エアゾール剤、経皮パッチ剤などがある。これらの剤形はさらに、このために特異的に設計された注入または移植用制御放出装置またはさらにこの方式で作用するように改変された他の形態の移植片を含み得る。治療剤の制御放出は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高脂肪アルコール、ポリ乳酸およびポリグリコール酸を含めた疎水性ポリマーや、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの特定のセルロース誘導体で治療剤をコーティングすることにより達成し得る。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを用いて達成し得る。
【０１６３】
経口または非経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれ、所定量の１種以上の本発明治療剤を、粉末状もしくは顆粒状で、または水性液、非水性液、水中油滴エマルションもしくは油中水滴エマルション中の溶液もしくは懸濁液として含むカプセル剤、サシェ剤または錠剤などの離散単位として提示し得る。そのような組成物は、任意の調剤法で調製可能であるが、いずれの方法も、上述のような１種以上の薬剤を、１種以上の必要な成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、本発明の組成物は、本発明の薬剤を液体担体もしくは微紛化固体担体またはその両方と均一かつ均質に混ぜて調製し、次いで、必要に応じ、生成物を所望の形状に成形する。
【０１６４】
上記組成物は、用量設計に適合する方法および医薬上有効な量で投与し得る。患者に投与する１回量は、本発明のコンテキストでは、適切な時間にわたって患者に有益な応答をもたらすのに十分でなければならない。投与薬剤の量は、患者の年齢、性別、体重および一般的な健康状態を含めた治療を受ける患者によって異なり、医師の判断にゆだねられる。
【０１６５】
本発明の方法および組成物は、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１７またはそれらのオソログが存在する任意の動物に適用可能である。
特定の実施形態において、動物は、ヒト、パフォーマンス・アニマル（例えば、ウマ、ラクダ、グレイハウンド）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ウマ）やコンパニオン・アニマル（例えば、ネコおよびイヌ）を含むが、それらには限定されない哺乳動物である。
【０１６６】
他の実施形態において、家禽や他の鳥類を含むがそれらには限定されない非哺乳類脊椎動物も企図される。
抗体
本発明はさらに、ＡＤＡＭプロテアーゼのシステインリッチドメイン内の基質認識部位に対して産生されるか、基質認識部位に結合し得る抗体を提供する。
【０１６７】
抗体は、野生型ＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７のシステインリッチ細胞外ドメイン内の表面ポケットに高親和性で結合して、この認識部位とＡＤＡＭ１０またはＡＤＡＭ１７基質との結合または相互作用を防止、阻害または低下させ、基質切断をブロックまたは阻害するのが適当である。
【０１６８】
基質認識部位は、ＡＤＡＭ１０プロテアーゼの５５２−６４６残基を含むＡＤＡＭプロテアーゼのシステインリッチドメイン、もしくはＡＤＡＭ１７プロテアーゼの５６４−６４４残基を含むシステインリッチ領域に存在するか、または第１態様の修飾ＡＤＡＭプロテアーゼもしくはそのフラグメントに接触しているのが適当である。
【０１６９】
別の実施形態において、抗体は、修飾もしくは突然変異型ＡＤＡＭプロテアーゼまたはそのフラグメントに対して産生されるか、それらに結合し得る。
そのような実施形態において、抗体は、野生型ＡＤＡＭプロテアーゼよりも修飾または突然変異型ＡＤＡＭプロテアーゼに対して高い親和性を有するのが好ましい。
【０１７０】
そのような抗体は、例えば、修飾または突然変異型ＡＤＡＭプロテアーゼと対応野生型ＡＤＡＭプロテアーゼとを区別するのに有用であり得る。
本発明の抗体は、ポリクローナルであってもよいが、モノクローナルであるのが好ましい。抗体の産生、精製および利用に適用できる周知プロトコルは、例えば、コリガンら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１−１９９４年）の第２章や、ハーロー  イーおよびレイン  ディー、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８年に記載されており、上記文献はいずれも本明細書に文献援用される。
【０１７１】
一般に、本発明の抗体は、本発明のポリペプチド、フラグメント、異性体または誘導体に結合またはそれらと複合体を形成する（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ）。例えば、本発明の抗体はポリクローナル抗体を含み得る。そのような抗体は、例えば、マウスまたはウサギを包含し得る産生種に、本発明のポリペプチド、フラグメント、異性体または誘導体を注入して、ポリクローナル抗血清を得ることにより調製し得る。ポリクローナル抗体産生法は当業者には周知である。使用可能な例となるプロトコルは、例えば、コリガンら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、前掲、およびハーローおよびレイン、１９８８年、前掲に記載されている。
【０１７２】
ポリクローナル抗体の代わりに、例えば、本明細書に文献援用される、ケーラーおよびミルシュタイン、１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５の論文に記載されているような標準法、または、例えば、より最近、コリガンら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、前掲に記載された上記方法の改良版を用いて、本発明の１つ以上のポリペプチド、フラグメント、変異体または誘導体を接種した産生種由来の脾細胞または他の抗体産生細胞を不死化させて、モノクローナル抗体を産生させ得る。
【０１７３】
具体的に言えば、本発明は、システインリッチ細胞外ドメイン内の基質認識表面ポケットに結合させることにより、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７基質タンパク質の認識および切断を防止する阻害抗体を含む。
【０１７４】
本発明は、その範囲内に、上記ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のＦｃまたはＦａｂフラグメントを有する抗体をさらに含む。あるいは、これらの抗体は、本発明のＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７に対する一本鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖｓ）を含み得る。そのようなｓｃＦｖｓは、例えば、それぞれ、米国特許第５，０９１，５１３号、ヨーロッパ特許第２３９，４００号またはウインターおよびミルシュタイン、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、第３４９巻、ｐ．２９３による論文に記載の方法に従って調製可能であり、上記文献はいずれも本明細書に文献援用される。
【０１７５】
標識は、以下の方法で本発明の抗体または抗体フラグメントと結合させ得る：
（Ａ）  標識を抗体または抗体フラグメントと直接結合させる方法；
（Ｂ）  標識を抗体または抗体フラグメントと間接的に結合させる方法：すなわち、標識を別のアッセイ試薬に結合した後で抗体または抗体フラグメントに結合する方法；および
（Ｃ）  後発抗体または抗体フラグメント反応産物に結合させる方法。
【０１７６】
標識は、色素原、触媒、酵素、フルオロフォア、化学発光分子、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ（Ｅｕ３４）などのランタニドイオン、放射性同位体および直接可視標識を含む群から選択し得る。直接可視標識の場合、コロイド状金属粒子または非金属粒子、染料粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル生成物質などを含む他のベシクルを用い得る。
【０１７７】
標識として有用な多数の酵素が、米国特許明細書ＵＳ４，３６６，２４１号、同ＵＳ４，８４３，０００号、同ＵＳ４，８４９，３３８号に開示されており、これらの特許文献はいずれも本明細書に文献援用される。本発明において有用な酵素標識としては、例えば、アルカリフォスファターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。酵素標識は、溶液中で、単独または第２酵素と組み合せて用い得る。
【０１７８】
フルオロフォアは、例えば、当技術分野では周知のような、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ａｌｅｘａ染料、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ５、Ｃｙ３、またはＲ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＲＰＥ）であり得る。
【０１７９】
本発明の理解を深め、かつ本発明を実行しやすくするために、当業者は以下の非限定実施例を参照されたい。
【実施例】
【０１８０】
発現構築物
部位特異的突然変異誘発〔Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＸＩ、ストラタジーン社〕を用いて、ｍＡＤＡＭ１０ΔＭＰ−ＨＡおよび全長ｂＡＤＡＭ１０−ＨＡ構築物に突然変異を導入した。既に記載されている可溶性ＥＣＤ突然変異体〔ラックマンら、１９９８年、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７３巻、ｐ．２０２２８−２０２３７〕をＥｐｈＡ３膜貫通および細胞質ドメインに連結してＥｐｈＡ３  ＥＣＤ欠失突然変異体を産生させた。それぞれ、Ｙ５７０およびＫ９９７に終止コドンを導入して、ＥｐｈＡ３  ΔｃｙｔｏおよびΔＰＤＺｂ構築物を産生させた。ヒトＩｇＧ１のヒンジ部およびＦｃ領域に融合したエフリンＡ５およびＥｐｈＡ３細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を記載のように産生させた（ラックマンら、１９９７年、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、ｐ．１６５２１−１６５３０）。公開されているエフリンＡ２構築物（ハットリら、２０００年、前掲）に基づいて、Ｍｙｃ標識エフリンＡ５およびＧＦＰ−エフリンＡ５を構築した。ＥｐｈＡ３−ＧＦＰ中のＧＦＰ〔ビマークライカンプら、２００４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第１６４巻、ｐ．６６１−６〕を、ＨｃＲｅｄのタンデムリピート〔ロックスら、２００５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第３０７巻、ｐ．１７４６−５２〕で置換して、ＥｐｈＡ３−ｄｉＨｃＲｅｄを構築した。本発明の実施例（図６）に用いたＥＧＦＰ標識ＥＧＦレセプターおよびＮ末端ＨＡ標識プロＥＧＦ構築物は既に公開されている〔クレイトンら、２００５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２８０巻、ｐ．３０３９２；ル・ゴールら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７８巻、ｐ．４５２５５〕。
【０１８１】
構造アッセイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイのために、ウシＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメインおよびシステインリッチドメインをコードする配列（４５５−６４６残基）をＦｃ融合物として修飾ｐｃＤＮＡ３．１ベクター〔インビトロジェン社〕にサブクローン化した。この遺伝子のＣ末端、次いでＦｃドメインにトロンビン切断部位を作った。このタンパク質のＮ末端をプロラクチンシグナル配列に融合させた。このタンパク質を安定にトランスフェクトしたヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で発現させ、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ〔アマーシャム社〕を用いて培地から抽出した。トロンビン切断によりＦｃ標識を除去し、ゲル濾過クロマトグラフィーによりＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを均質になるように精製した。このタンパク質の部位特異的クラスター突然変異体を２段階ＰＣＲで調製して、Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９をアラニンに、またはＡｒｇ５２５、Ａｓｐ５２６およびＡｓｐ５２７をアラニンに変えた。ＰＣＲにより、ディスインテグリンドメイン（４５５−５７０残基）およびシステインリッチドメイン（５７１−６４６残基）を包含するＡＤＡＭ１０の欠失突然変異体を調製した。これらのフラグメントを同一発現ベクターにクローン化した。不当な突然変異がないかどうかを見つけるためにクローンを配列決定し、野生型ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃと同じ方法で精製した。
【０１８２】
ＲＮＡ干渉によるＡＤＡＭ１０ノックダウン
解析の４８時間前に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社）を用い、ＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＤＡＭ１０特異的ｓｉＲＮＡデュプレックス  ５′ＵＧＧＧＣＡＡＵＧＵＧＣＡＧＧＵＵＣＵＴＴ３′（配列番号１１）〔ＳＫＩ−ＲＳＩ−７７２２、スローン・ケタリングガンセンターＨＴＳコア施設）または５′ＡＡＵＧＡＡＧＡＧＧＧＡＣＡＣＵＵＣＣＣＵｄＴｄＴ３′（配列番号１２）と５′ＡＡＧＵＵＧＣＣＵＣＣＵＣＣＵＡＡＡＣＣＡｄＴｄＴ３′（配列番号１３）とのミックス〔フィッシャーら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．第２４巻、ｐ．５１７２−８３〕４０ｎＭでトランスフェクトした。平行細胞培養物を、同濃度のコントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＲＴ−ＰＣＲ分析を用い、細胞を抗ＡＤＡＭ１０マウスモノクローナル抗体で染色し、ＡＤＡＭ１０免疫沈降物の抗ＡＤＡＭ１０ウエスタンブロットにより、特異的ＡＤＡＭ１０サイレンシングを確認した。
【０１８３】
細胞操作、免疫沈降およびウエスタンブロッティング
細胞をＤＭＥ／１０％ＦＣＳ中で培養し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社）でトランスフェクトし、いくつかの実験では、メタロプロテアーゼ阻害剤、１，１０−Ｏ−フェナントロリン〔ＯＰＮ、４時間、ＩｍＭ；マムら、２０００年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、第５巻、ｐ．１９７−２０６〕およびＴＡＰＩ１〔１時間、５０μＭ；ヤンら、２００２年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１５８巻、ｐ．２２１−６〕で処理した。ＨＥＫ２９３細胞を、それぞれ、ピューロマイシンまたはゲンタマイシン耐性遺伝子を含むｐＥｆＢｏｓベクター中のＥｐｈＡ３〔ビックスら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８９巻、ｐ．１６１１−１６１５〕またはエフリンＡ５〔ウィンスローら、１９９５年、Ｎｅｕｒｏｎ  第１４巻、ｐ．９７３−８１；ラックマンら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第９３巻、ｐ．２５２３−２５２７〕で処理して、安定なＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９４またはエフリンＡ５／ＨＥＫ２９３クローンを得た。血清飢餓細胞を１．５μｇ／ｍｌのプレクラスター化エフリンＡ５−Ｆｃで刺激（１０分）し、先に記載のように収穫した。ビーズに結合させた抗ＥｐｈＡ３  ｍＡｂ  ＩＩＩＡ４〔ボイドら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７巻、ｐ．３２６２−３２６７〕または抗ＨＡ  ｍＡｂ  ３Ｆ１０〔ロシュ社〕を用いて免疫沈降させ、抗ＡＤＡＭ１０抗体〔バイオジェネシス社、ＵＫ〕、抗エフリンＡ５抗体〔アール・アンド・ディー・システムズ社〕および抗ＥｐｈＡ３抗体（ラックマンら、１９９７年、前掲）を用いてウエスタンブロッティングを実施した。
【０１８４】
Ａｌｅｘａ標識エフリンＡ５−Ｆｃビーズの産生およびＨｅＣｄレーザー（４４２ｎｍ）、Ａｒイオンレーザー（４８８ｎｍ）、ＨｅＮｅレーザー（５４３ｎｍ）およびＨｅＮｅレーザー（６３３ｎｍ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ５００顕微鏡での共焦点顕微鏡検査を既に記載のように（ビマー−クライカンプら、２００４年、前掲）実施した。細胞間相互作用時のＡＤＡＭ１０媒介切断をモニターするために、エフリンＡ５／ＨＥＫ２９３細胞を、どちらかの細胞系がｍＡＤＡＭ１０ΔＭＰ−ＨＡを過剰発現するようにトランスフェクトされたＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９３細胞の半融合性単層上で丁寧に攪拌しながらインキュベート（３０分）した。非接着細胞を吸引した後、残りの細胞を、マウス抗ＥｐｈＡ３モノクローナル抗体（ＩＩＩＡ４）と結合した発現タンパク質について分析し、ラット抗ＨＡ抗体（ロシュ社）およびヤギ抗エフリンＡ５抗体（アール・アンド・ディー・システムズ社）ならびに適切なＡｌｅｘａ標識二次抗体と共に固定（４％パラホルムアルデヒド）した。共焦点顕微鏡検査中、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ６４７およびヘキスト蛍光の画像を連続回収して、スペクトルオーバーラップ由来の「ブリードスルー」を最小限にした。ａｎａｌｙＳＩＳ〔ソフトイメージングシステム社、ドイツ、ミュエンスター所在〕を用いて共焦点画像を処理し、コーラルドローを用いて図を作成した。
【０１８５】
Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
以下のようにプルダウン実験を行った：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ、野性型ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃまたはアラニン突然変異体（〜１５μｇ）を、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ４およびエフリンＡ２、エフリンＡ５、エフリンＢ２（アール・アンド・ディー・システムズ社）のＦｃ標識細胞外ドメインと共に、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を含有する５００μｌの結合バッファー５００μｌ中、４℃で３０分間、インキュベートした。前以て形成したＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体への結合をテストするために、５μｇの非標識エフリンＡ５をＦｃ標識ＥｐｈＡ３と共に４℃で３０分間インキュベートした後、ＡＤＡＭ１０を加えた。これらのタンパク質をさらに３０分インキュベートし、反応混合物にＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アマーシャム社）ビーズを加え、４℃で２時間振盪した。次いで、ビーズを遠心分離して収穫し、５００μｌの結合バッファーで１回洗浄し、結合タンパク質を１０−２０％勾配ポリアクリルアミドゲル上で分離した。同様に、１５μｇのディスインテグリンドメインと８μｇのシステインリッチドメインを用いて個々のＡＤＡＭドメインの結合も実施した。
【０１８６】
結晶化、データ収集および構造決定
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４と１５０ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファー中で、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを２４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。このタンパク質を、０．２Ｍの硫酸アンモニウムと３０％ポリエチレングリコール  ４０００〔ハンプトンリサーチ社〕を入れた貯水部に対する室温下の蒸気拡散により、ハンギングドロップ中で結晶化させた。２ヶ月後にかなり大きな結晶（Ｉ４１３２空間群）が成長したが、ストリークシーディングを用いて２〜３日で再現させることができた。重金属を誘導体化するために、結晶を、１ｍＭの塩化第二金を含有する母液に浸し、抗凍結剤として２０％グリセロールを加えて冷凍した。
【０１８７】
多波長異常分散法（ＭＡＤ  ｐｈａｓｉｎｇ）を用いて構造を決定した。ＡＤＳＣ社製Ｑｕａｎｔｕｍ  ２１０  ＣＣＤ検出器上、ＣＨＥＳＳ  ｌｉｎｅ  Ｆ２で「ピーク」および「リモート」波長データセットを収集した。ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ〔オトイノフスキー  ゼット、マイナー  ダブリュー、Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｘ−ｒａｙ  ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  ｄａｔａ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ジェイ  シー  ダブリュー  カーターおよびアール  エム  スウィート編、Ｅｄｉｔｏｒ．１９９７年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：ニューヨーク、ｐ．３０７−３２６〕を用いて、振動写真を統合、マージ、スケーリングした。その後の計算は、ａｕｔｏＳＨＡＲＰおよびＣＣＰ４プログラムパッケージソフト（Ｐｒｏｊｅｃｔ、１９９４年、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、１９９４年、Ｄ５０  ｐ．７６０−７６３）を用いて実施し、ａｕｔｏＳＨＡＲＰは、２つの異なる金原子の位置の同定と共に位相計算をするための金原子の場所と占有率の精緻化に用いた。ＤＭで密度修正を行って２波長金誘導体のＭＡＤマップを改良したが、このマップは主鎖を明白にトレースするのに十分な品質であることが証明された。何回もの分子動力学のモデル調整〔ジョーンズら、１９９１年、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．第４７巻、ｐ．１１０−９〕、およびＣＮＳにおけるエネルギー最小化〔ブランジャーら、１９９８年、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．第５４巻、ｐ．９０５−２１〕により精緻化を進めた。
【０１８８】
第１モデルを、２．９Å分解能で、それぞれ２７．２％および３１．２％のＲ値およびフリーＲ値に精緻化する。発現構築物の最初の３９Ｎ末端残基にも５８４−５９０残基にも電子密度は観察されなかった。
【０１８９】
現在入手可能なＥｐｈ／エフリン結晶構造と、エフリン／ＡＤＡＭ１０相互作用にはレセプター結合エフリンドメインおよびプロテイナーゼドメインに対するＣ末端の細胞外ＡＤＡＭ１０領域が関与することが証明されたという事実を考慮すると、本発明者らには、機能性ＡＤＡＭ１０がエフリン発現細胞ではなくＥｐｈ発現細胞上に位置する位相配置が効率的な切断にははるかに好ましいであろうと思われた。したがって、本発明者らは、潜在的なＡＤＡＭ１０とＥｐｈＡ３およびその高親和性リガンドエフリンＡ５との相互作用およびＡＤＡＭ１０媒介エフリンＡ５切断の調節を詳細に研究した。
【０１９０】
先ず、本発明者らは、ＡＤＡＭ１０が細胞表面上でＥｐｈＡ３またはエフリンＡ５のいずれかと相互作用するかどうか、またこれらの相互作用がＥｐｈ／エフリン複合体の形成にどのような影響を与えるかを調べた。内因性ＡＤＡＭ１０を、親の（非トランスフェクト）ＨＥＫ２９３細胞（図１Ａ）の溶解物中ではなく、安定にＥｐｈＡ３トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９３）およびＥｐｈＡ３−陽性ＬｉＢｒ黒色腫細胞の細胞溶解物中でＥｐｈＡ３と共免疫沈降させた。組換えＡＤＡＭ１０ΔＭＰと共に前以てインキュベートしてイムノブロット解析時に抗ＡＤＡＭ１０抗体をブロックすることにより、バックグラウンド（図１ａ中のΔ）に対してＡＤＡＭ１０結合バンドが減少したが、これは、その特異性を裏付けるものである。プレクラスター化エフリンＡ５−ＦｃまたはエフリンＡ２−Ｆｃに暴露した細胞では、Ｅｐｈ／ＡＤＡＭ１０共免疫沈降が増加した。ＥｐｈＡ３も、一時的に発現したメタロプロテアーゼドメインＡＤＡＭ１０ΔＭＰを欠くＨＡ標識ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１０ΔＭＰと共免疫沈降した（ハットリら、２０００年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２８９巻、ｐ．１３６０−６５で検討）。それに対し、平行実験で、ＡＤＡＭ１０ΔＭＰは、エフリンＡ５を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（エフリンＡ５／ＨＥＫ２９３）中の細胞表面エフリンＡ５と相互作用しないことが分かった（図１ｂ）。
【０１９１】
さらに、本発明者らは、同じＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９３細胞を用いて、有効なエフリン切断（図１ｃ）およびインターナリゼーション（図１ｄ）の誘発には、エフリンＡ５−Ｆｃのプレクラスター化が必要であることを見出したが、これは、エフリン切断とＥｐｈ活性化がリンクしていることを裏付けるものである。切断とインターナリゼーションは、メタロプロテアーゼ阻害剤１，１０−Ｏ−フェナントロリン（ＯＰＮ、細胞生存能力を維持する条件下に使用）およびＴＡＰＩ（図１ｄ、ＩＩ、ＩＩＩ）によって阻害されたが、これは、それらがＡＤＡＭ１０などのメタロプロテアーゼの活性に依存するという仮設を裏付けるものである。同調して、ドミナント・ネガティブＡＤＡＭ１０ΔＭＰの外部発現（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）はエフリンの切断とインターナリゼーションを効率的にブロックしたが、エフリンのインターナリゼーションは、トランスフェクトされていない細胞では妨害されずに進行した（図２Ｅ、Ｆ；矢じりは、外因性ＡＤＡＭ１０ΔＭＰの検出不能発現を有する細胞を示す）。
【０１９２】
ＡＤＡＭ１０と相互作用するＥｐｈＡ３タンパク質モジュールを同定するために、野生型（ｗ／ｔ）ＥｐｈＡ３、または球状リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ、ＥｐｈＡ３エキソンＩ−ＩＩＩ）を欠くＥｐｈＡ３〔ヒマネンおよびニコロフ、２００３年、前掲；ラックマンら、１９９８年、前掲〕もしくは細胞質の一部を欠くＥｐｈＡ３をコードする発現構築物をＡＤＡＭ１０ΔＭＰと共にＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトした。注目すべきことには、球状リガンド結合ドメインの欠失によりＡＤＡＭ１０とＥｐｈＡ３との構成的かつエフリンＡ５促進的相互作用が阻止された（図１ｅ）が、Ｃ末端ＰＤＺ結合ドメインを欠くＥｐｈＡ３突然変異体（図１ｅ）または全細胞質ドメインを欠くＥｐｈＡ３突然変異体（ＥｐｈＡ３Δｃｙｔｏ、図示せず）では強力な結合が保持され、これはＥｐｈＡ３  ＬＢＤが不可欠なＡＤＡＭ１０結合インターフェースを提供することを示唆している。
【０１９３】
次に、本発明者らは、ＡＤＡＭ１０のどの領域がＥｐｈＡ３との相互作用に関与するかの決定に着手した。ＡＤＡＭは、プロテアーゼを活性化するために除去されるＮ末端プロ配列、次いで、プロテアーゼ、ディスインテグリン、およびシステインリッチドメインを含めたマルチドメイン細胞外領域（図３ａ、左側）を有する〔プリマコフ、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．第１６巻、ｐ．８３−７〕。プロテアーゼドメインはＡＤＡＭ１０−エフリン相互作用には不要であるが、ディスインテグリンおよびシステインリッチドメインは、細胞接着を媒介するタンパク質相互作用に関与し、ＡＤＡＭ特異性には不可欠である〔スミスら、２００２年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１５９巻、ｐ．８９３−９０２；レディーら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７５巻、ｐ．１４６０８−１４６１４〕。
【０１９４】
Ｅｐｈ／エフリン相互作用における貢献をテストするために、これら２つのドメイン（４５５−６４６残基）を包含する組換えＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃタンパク質を使って、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅで捕獲した可溶性Ｅｐｈ−Ｆｃ融合タンパク質およびエフリン−Ｆｃ融合タンパク質との結合を評価した。先の研究と同調して、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃは、エフリンＡ２およびエフリンＡ１には結合したが、エフリンＡ５、またはテストした他のエフリンのいずれにも結合しなかった（図２ａ）。同様に、ＥｐｈＡ３の細胞外ドメイン（図２ｂ）、またはテストした他のＥｐｈ（ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、データ示さず）のいずれとの相互作用も見られなかった。しかし、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃは、ＥｐｈＡ３とエフリンＡ５の両方と同時にインキュベートすると、容易に結合し、安定な複合体を形成した。これらの実験でＦｃドメインを欠く一本鎖エフリンＡ５を用いると、ＥｐｈＡ３結合エフリンを捕獲することができたが、これは、複合体中にＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃが存在すると、この三重複合体におけるＥｐｈＡ３／エフリンＡ５相互作用の安定性が増すためと思われるが、ＥｐｈＡ３結合エフリンＡ５が著しく増大すること（図２ｂ：レーン６＆８；ｄ：レーン１１＆１２；図４ａも参照のこと）を示している。さらなるＡＤＡＭ１０切断の解析から、ＡＤＡＭ１０とＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体との相互作用は、ディスインテグリンドメインとは対照的に、自力でＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体と結合するシステインリッチドメインにより媒介され（図２ｃ）、この場合も、複合エフリンＡ５の量を増大させることが明らかになった。ＡＤＡＭ１０Ｄ＋ＣとのＥｐｈＢ４／エフリンＢ２−Ｆｃ複合体を同じプロテインＡで捕獲した場合、ＡＤＡＭ１０はこのＥｐｈＢ／エフリンＢ複合体とはほとんど結合しないことが明らかになった（図２ｄ）。対照的に、ＡＤＡＭ１７のディスインテグリンドメインおよびシステインリッチドメイン（ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ）をテストすると、ＥｐｈＢ４−Ｆｃ、エフリンＢ２−Ｆｃおよびそれらの高親和性複合体（図２ｅ）との結合だけでなく、ＥｐｈＢ２／エフリンＢ２複合体（図２ｆ）との結合も観察された。これは、ＡＤＡＭ１０かＡＤＡＭ１７による異なるＥＧＦ−レセプターリガンドの選択的切断〔ＥＧＦおよびベータセルリンはＡＤＡＭ１０で切断され；ＨＢ−ＥＧＦ、ＴＧＦ−αおよびアンフィレグリンはＡＤＡＭ１７で切断される：ブローベル、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第６巻、ｐ．１−１２〕と同じように、ＡＤＡＭ１０もＡ型Ｅｐｈ／エフリン複合体を認識するが、ＡＤＡＭ１７はＥｐｈＢ／エフリンＢ複合体を認識することを示している。
【０１９５】
Ｅｐｈ／エフリン相互作用を媒介するＡＤＡＭ１０領域の分子構造をさらに的確にとらえるために、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを結晶化し、Ｘ線結晶構造解析を用い、多波長異常分散（ＭＡＤ）法により、その構造を決定した。温度因子をしっかり制限し、良好な化学量論を用いて、最終モデルを２．９Åで２７．２のＲ因子（３１．２のＲｆｒｅｅ）に精緻化する。
【０１９６】
ＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメインとＣｙｓリッチドメインを折りたたんで長さ約７５Åの連続的な細長い湾曲構造とする（図３）。これは、ディスインテグリンドメインの４つの短いβ鎖（図３ｂの黄色部）と、Ｃｙｓリッチドメインの４つの短い鎖および３つの短いヘリックス（図３ｂの緑色部）だけの比較的低い二次構造含量を有する。Ｃｙｓリッチドメインおよび２つのドメインのインターフェースには小さい疎水性コアが存在するが、全体構造は、大抵の場合、一連のジスルフィド結合により安定している。実際、精密化モデルに存在するすべてのシステイン残基はペアとなって、合計１０個のジスルフィド架橋を形成している。
【０１９７】
ＡＤＡＭ１０Ｄ＋ＣとＥＳＳＰ構造データベース〔ホルムおよびザンダー、１９９８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２６巻、ｐ．３１６−９〕とを比較すると、ＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメインと血液凝固阻止薬〔１ｆｖＩ；ゼンおよびクラウス、１９９３年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２３２巻、ｐ．９０７−９２５〕との弱い構造的相同性が示されるが、ＡＤＡＭ１０のＣｙｓリッチドメインは、新規かつユニークな折りたたみを有する。Ｎ末端ディスインテグリンドメインはＡＤＡＭ１０の４９３−５６９残基の範囲である。その前の２０残基もこのドメインの一部であると予想されるが、本発明の構造では乱れている。ディスインテグリンドメインは６個のジスルフィド結合を含み、そのうちの５個（Ｃｙｓ４９５−Ｃｙｓ５１５；Ｃｙｓ５０３−Ｃｙｓ５１１、Ｃｙｓ５１０−Ｃｙｓ５３６、Ｃｙｓ５３０−Ｃｙｓ５６２，Ｃｙｓ５５５−Ｃｙｓ５６７）は血液凝固阻止薬のジスルフィド結合と位相的に同一であるが、残りの１つ（Ｃｙｓ５２４−Ｃｙｓ５４３）は異なる。実際、ＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメインは、約３０％の配列同一性を共有する合計５０の直接相当残基に関して、それぞれ、１．５および２．０Åのα炭素位置間根平均二乗変位でトリメスタチンおよび血液凝固阻止薬のディスインテグリンドメインと重なり得る（図３ｃ）。
【０１９８】
ＡＤＡＭ１０Ｃ末端のシステインリッチドメイン（５５２−６４６残基）は、ほとんどドメイン内フレキシビリティーを有していないように見える連続構造を形成する小さい疎水性コアを介してディスインテグリンドメインに固定されている。Ｃｙｓリッチドメインは、４個の保存性ジスルフィド結合：Ｃｙｓ５７２−Ｃｙｓ５９８、Ｃｙｓ５８０−Ｃｙｓ６０７、Ｃｙｓ５９７−Ｃｙｓ５８２およびＣｙｓ５９４−Ｃｙｓ６３９により安定化された新規α／β折りたたみを有する。Ｃｙｓリッチドメインは、大きい方は３つのαヘリックスに固定された３つのＮ末端βシートからなり、小さい方は２つのＣ末端β鎖からなる２つのβシートを含む。システインリッチドメインの第１αへリックスも、ディスインテグリンドメインのＣ末端βシートに固定されている。ディスインテグリンドメインとのインターフェースの反対側に位置する長い表面ループは部分的に乱れており、その残基のうち６個（５８４−５９０）は最終モデルには入っていなかった。
【０１９９】
ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃはその細長い形態によって、ＡＤＡＭ基質などの他のタンパク質との相互作用を可能にする広大な分子表面（〜１０，０００Å２）をもたらす。その静電電位に従って彩色されたこの表面の配置図を図３ｄに示す。興味深いことには、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃは全体的中性電荷を有するが、Ｃｙｓリッチドメインの片側に比較的大きな負に帯電したポケットがある。負の静電表面電位は、入口のＧｌｕ５７３およびＧｌｕ５７８と空洞内のＧｌｕ５７９を含めたいくつかの溶媒暴露酸性残基に近いことに起因する。さらに、いくつかの疎水性残基が入口（Ｐｈｅ６３５、Ｐｒｏ６２８、Ｐｒｏ６３１）とポケットの底の内面（Ｖａｌ５９６、Ｌｅｕ６２６）にあるが、これは、タンパク質相互作用インターフェースを構成し得ることを示唆している。
【０２００】
このポケットが実際に本発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合実験（図２ｃ）で指定されたＣｙｓリッチドメインに対する基質結合部位を構成するかどうかをテストするために、Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９を中性アラニン（ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ［ＥＥＥ−Ａ］）に変異させた。また、多くのディスインテグリンドメインがインテグリン連結を媒介すると示唆されたＲＧＤ様配列を有しているので、ディスインテグリンドメイン内のＲＤＤ様配列（ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ［ＲＤＤ−Ａ］）も同じように変異させた。
【０２０１】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ（図４ａ）は、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ［ＥＥＥ−Ａ］突然変異体がＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体に結合せず、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ［ＲＤＤ−Ａ］がこのＡＤＡＭ基質に対する野性型結合親和性を保持していることを示している。突然変異は、変異タンパク質が、それらのＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体に対する特異的結合親和性は別として、生物化学的に、野性型ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃと区別できないので、エフリンＡ１およびエフリンＡ２との結合に影響を与えない（データは示さず）か、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃの全体的な折りたたみおよび安定性に影響を与えなかった。また、突然変異は、エフリンＡ１およびエフリンＡ２とのＥｐｈ非依存性結合にも影響を与えなかった。
【０２０２】
重要なことには、細胞表面ＡＤＡＭ１０ΔｐｒｏへのＥＥＥ−Ａアミノ酸置換の組み込みもＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体との相互作用を有意に阻害したのに対し、そのＥｐｈＡ３とのエフリン非依存性構造的結合は不変であった（図４ｂ）。これらの結果は、ＡＤＡＭ１０のＣｙｓリッチドメイン内の負に帯電したポケットがＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体の認識および結合を媒介し、ＡＤＡＭ１０のＣｙｓリッチドメインの外側の第２ＥｐｈＡ３相互作用部位が非連結ＥｐｈＡ３との弱い構造的結合を媒介することを強力に示唆している。
【０２０３】
この推定的基質認識部位とその突然変異の機能的結果の生理的関連性をさらに評価するために、全長（ｆ．ｌ．）のＡＤＡＭ１０にＧｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８およびＧｌｕ５７９のアラニン（およびリシン）置換を導入した。野性型（ｗｔ）もしくは変異ＡＤＡＭ１０［ＥＥＥ−Ａ］、または触媒的に不活性な（ドミナント・ネガティブ）ＡＤＡＭ１０ΔＭＰでトランスフェクトしたＥｐｈＡ３発現２９３細胞を、非クラスター化または抗体架橋エフリンＡ５−Ｆｃで処理した。
【０２０４】
プロテアーゼ活性をモニターするために、プールされた培地および細胞溶解物から切断されたエフリンＡ５を抽出した。注目すべきことには、３つのＧｌｕ残基のＡｌａもしくはＬｙｓ置換を有するか、プロテアーゼドメインを欠失する変異ＡＤＡＭ１０の過剰発現はエフリンＡ５切断を効率的に阻害した（図４ｃ）が、これは、ＥｐｈＡ３発現細胞表面に結合したクラスター化エフリンのＡＤＡＭ１０切断がＡＤＡＭ１０の無傷の認識ポケットに依存することを裏付けている。興味深いことには、細胞表面ＥｐｈＡ３、従って活性シグナル伝達複合体に関与するエフリンＡ５の量が切断反応に関して律速であるという概念に一致して、ｗｔ−ＡＤＡＭ１０の過剰発現はエフリン切断を制御レベル以上に増大させることはなかった。
【０２０５】
無傷細胞におけるＡＤＡＭ機能に対する基質認識部位の生理的関連性を調べるために、野性型または変異ＡＤＡＭ１０をｄｉＨｃＲｅｄ標識ＥｐｈＡ３と共発現させるようにトランスフェクトし、これをＧＦＰ標識エフリンＡ５またはＧＦＰ標識エフリンＡ２を発現する細胞と共培養したＨＥＫ２９３細胞の共焦点イメージングを実施した（ハットリら、２０００年、前掲；ビマー−クライカンプら、２００４年、前掲）（図４ｅ）。ＥｐｈＡ３発現細胞内の点状エフリン特異的染色の出現は、有効なエフリン切断とその後のインターナリゼーションを示している。ＨＡ標識ｗ／ｔまたは［ＥＥＥ−Ａ］変異ＡＤＡＭ１０の発現を確認するために、トランスフェクトｄｉＨｃＲｅｄ−ＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９３細胞を、抗ＨＡ抗体およびＡｌｅｘａ６４７標識二次抗体で染色すると、両タンパク質を共発現する細胞の紫色がかった画像が示された。ｗ／ｔＡＤＡＭ１０発現細胞ではエフリンのインターナリゼーションが直ぐ目につく（図４ｅ、白い矢じり）が、ＡＤＡＭ１０［ＥＥＥ−Ａ］突然変異体を発現する細胞には見られない。著しく対照的に、後者の細胞は、Ｅｐｈおよびエフリン発現細胞間の接触個所に非切断・非取り込みＧＦＰ−エフリンのはっきりした濃い細胞表面クラスターが出現することで認識できる（図４ｅの矢印）。総合すると、これらの実験は、細胞表面からのエフリン切断に不可欠なＥｐｈＡ３−エフリンＡ５／Ａ２基質との相互作用を媒介するＡＤＡＭ１０のＣｙｓリッチドメイン内の酸性ポケットの役割を実証している。
【０２０６】
脱落とも称されるＡＤＡＭが媒介する細胞表面からのリガンドの切断は、ＥＧＦ−レセプターリガンドのプロ体の遊離を促進する機構として広く記載されている（ブローベル、２００５年、前掲）。本発明者らは、ここに記載されているＡＤＡＭ１０の基質認識部位も、プロＥＧＦを認識し、その細胞表面からの脱落を調節するように機能するかどうかを見たいと思った。本発明者らは、ＧＦＰ標識ＥＧＦ−レセプターを発現するようにトランスフェクトし、ＨＡ標識プロＥＧＦを発現する細胞と共培養したＨＥＫ２９３細胞を用いて、同じ共焦点イメージング法を実施した。細胞を、野性型（ｗ／ｔ）ＡＤＡＭ１０または基質認識溝を欠く３ＡＡＤＡＭ１０突然変異体で共トランスフェクトした。ＥＧＦ−レセプター／ｗ／ｔＡＤＡＭ１０共発現細胞上にＥＧＦ特異的染色が出現したことは、有効なＥＧＦ切断およびその後のＥＧＦ−レセプター発現細胞への取り込みを示している（図５）。実際、３Ａ−ＡＤＡＭ１０突然変異体の過剰発現は、ＥＧＦの脱落および隣接ＥＧＦ−レセプター発現細胞への取り込みを劇的に減少させたが、これは、この重要なレセプターチロシンキナーゼシグナル伝達システムにおいても、ＡＤＡＭ１０のシステインリッチドメインの認識部位によるリガンドの認識、この場合にはプロＥＧＦの認識が、その後の脱落の生起に非常に重要であることを示唆している。
【０２０７】
本発明者らは、最近の本発明者らによるエフリンＡ５／ＥｐｈＡ３認識表面を明らかにするＡＤＡＭ１０のディスインテグリン−システインリッチドメイン構造の解明が、この接触を阻害する化合物の統合された構造ベーススクリーニングの構造基盤を提供すると提言する。提案する薬剤スクリーニング法は、Ｆｃ標識タンパク質に結合させたドナーおよびアクセプター蛍光標識を利用した均一時間分解蛍光ＨＴＲＦ（商標）技術に基づいている。ＨＴＲＦ法は、励起蛍光ドナーと近くのアクセプター分子からのエネルギー移動に依存する。ピーク励起波長３３７ｎｍのＥｕ３＋キレート  クリプテート〔シス・バイオ・インターナショナル社〕などの希土類金属キレートを蛍光ドナーとして用い、ピーク発光波長６６５ｎｍの修飾アロフィコシアニン（ＸＬ６６５）をアクセプターとして用いる。エネルギー移動が生じると、クリプテートとＸＬ６６５が近接したときにのみ６６５ｎｍ発光が観察される。タンパク質間相互作用により標識が（ナノメータ範囲内で）近接状態になって、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を誘発し、それによって増幅蛍光シグナルを生成する化学反応が始まる（図６Ａ）。このＦＲＥＴベースアッセイの実行可能性を評価するために、アクセプター標識ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃと相互作用するドナー標識エフリンＡ５／ＥｐｈＡ３複合体を用いた（図６ｂ）。結合阻害のコントロールとして、標識ターゲットタンパク質（ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ）とエフリン／Ｅｐｈ複合体との結合の競合阻害をモニターする能力を示す非標識ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを用いた平行実験を行った。
【０２０８】
ＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメインおよびシステインリッチドメインの構造の解明や、それに付随する機能的および突然変異誘発アプローチによって、エフリン／ＥｐｈＡ複合体との機能的結合およびその後の特異的部位での基質切断を可能にする立体構造におけるプロテイナーゼドメインの位置決めに不可欠な基質認識モジュールが明らかになった。本発明者らは、細胞レベルでのエフリンＡ２、エフリンＡ５およびプロＥＧＦの切断に関するこの配置構造の重要な役割を実証したが、本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合データは、ＡＤＡＭ１７のこの領域もＢ型エフリンの切断を指定することを示している。
【０２０９】
有効な結合およびタンパク質分解活性には、個々のタンパク質ではなく、Ｅｐｈ／エフリン複合体が必要であるという本発明者らの所見は、エフリン切断の調節が単純な機構であることを示している。具体的に言えば、本発明者らは、独自のデータに基づいて、有効配置でＥｐｈに結合したエフリンのみが認識・切断されて、Ｅｐｈ発現細胞へのインターナリゼーションを可能にすることを保証する以下の分子機構を提示する：第１に、細胞間接触の前に、ＡＤＡＭ１０をＥｐｈＡ３と構造的に結合させる。こうすることにより、ＥｐｈＡ３／エフリン複合体ができると、プロテイナーゼは必ずその基質に近接する。本発明者らは、場合により、ＡＤＡＭ１０が、エフリンＡ２について記載したものなどのエフリンとの構造的相互作用を介してＥｐｈ／エフリン複合体に引き寄せられる可能性を排除しない。
【０２１０】
本発明の構造に基づく突然変異誘導は、弱い構造的ＥｐｈＡ３−ＡＤＡＭ１０結合が、酸性基質結合ＡＤＡＭ１０ポケットの外側ではあるが、ＥｐｈＡ３のリガンド結合領域を含むさらなるインターフェースを介して媒介されることを示唆している。第２に、細胞間接触が生じると、新規ＡＤＡＭ１０認識表面をもたらす高親和性ＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体が形成される。ＡＤＡＭ１０は、大抵Ｅｐｈ／エフリンインターフェースで、Ｃｙｓリッチドメインの基質結合ポケットを介して、ＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体に結合する。第３に、システインリッチドメインと連続した強固な構造を形成するディスインテグリンドメインは、隣接するＮ末端プロテイナーゼドメインを、そのターゲット、すなわち、リガンド結合ドメインを膜に結合させるエフリンＡ５のステム領域を効率的に切断できるような位置に置く。第４に、エフリンＡ５のタンパク質分解的切断は、対向する細胞表面間の分子鎖を断って、シグナルの終止およびＥｐｈ発現細胞における極めて安定したＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体のインターナリゼーションを可能にする。構造的ＡＤＡＭ１０−ＥｐｈＡ３相互作用は、機能性ＡＤＡＭ１０がＥｐｈレセプターを発現する相互作用細胞上に位置し、切断されたエフリンＡ５が対向細胞上に位置することを意味する。この概念は、本発明者らが実証した、エフリン発現細胞をＡＤＡＭ発現細胞およびＥｐｈ発現細胞に付加したときの制御エフリン切断によって裏付けられたが（図５ｄ）、これは、後者細胞上のＡＤＡＭ１０Δｐｒｏの過剰発現により阻害され得る。この概念と一致して、本発明者らは、さらに、細胞内である可能性が高い、Ｅｐｈと未処理内因性ＡＤＡＭ１０とのある種の構造的結合（図１ａ）にも気付いている〔サンドバーグら、２００４年、前掲〕。しかし、Ｅｐｈ、エフリンおよびＡＤＡＭ１０間の正確な位置決めおよび相互作用についての詳細な分子的理解は、全三者複合体のさらなる結晶学的研究に待たなければならない。
【０２１１】
エフリン切断を媒介するＡＤＡＭ１０の細胞外ドメイン内のよく構成された表面ポケットを同定することにより、小分子で基質特異的なＡＤＡＭ阻害剤の構造に基づくコンピュータ利用・ハイスループットスクリーニングの理想的なターゲットが得られる。Ｅｐｈとエフリンは共にさまざまなガンで上方調節され、（血管形成による）腫瘍成長と（細胞接着／反発の抑制による）浸潤とを促進する可能性がある。例えば、ＥｐｈＡ３の発現は悪性黒色腫で上方調節され、エフリンＡ５はＥｐｈＡ３発現黒色腫細胞の脱接着および浸潤を引き起こす。したがって、エフリン切断に対するＡＤＡＭ１０の作用をターゲットとすることは、腫瘍の成長、浸潤および転移の重要な治療的介入を提供し得る。
【０２１２】
エフリンの他に、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７も一連の膜結合タンパク質の切断に関与していると見なされている。これらの膜結合タンパク質には、表皮細胞増殖因子レセプターリガンド〔サヒンら、２００４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１６４巻、ｐ．７６９−７７９〕、ケモカインリガンドＣＸＣＬ１〔フントハウゼンら、２００３年、Ｂｌｏｏｄ．第１０２巻、ｐ．１１８６−１１９５〕およびＣＸＣＬ１６〔アベルら、２００４年、Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．第１７２巻、ｐ．６３６２−６３７２〕、ならびに、接着分子Ｌ１〔グトバインら、２００３年、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．第１７巻、ｐ．２９２−２９４〕およびＣＤ４４〔ナガノら、２００４年、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第１６５巻、ｐ．８９３−９０２〕が含まれ、エフリンと同様に、細胞移動および／または接着の制御に関与している。他のＡＤＡＭ１０機能としては、ＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ〔キら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第２８３巻、ｐ．９１−９４〕、ＩＬ−６Ｒ〔マシューズら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７８巻、ｐ．３８８２９−３８８３９〕およびＮｏｔｃｈ〔パンおよびルービン、１９９７年、Ｃｅｌｌ  第９０巻、ｐ．２７１−２８０；リーバーら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．第１６巻、ｐ．２０９−２２１〕などの増殖因子の脱落が挙げられる。興味深いことには、Ｎｏｔｃｈのプロテアーゼ切断は本明細書に記載のエフリン−Ｅｐｈシステムに類似したリガンド−レセプター相互作用〔マムら、２０００年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ、第５巻、ｐ．１９７−２０６〕に依存し、これは、進化的に保存された機構を示している。さらに、上述のように、他のＡＤＡＭファミリーメンバーの調節および特異性もＡＤＡＭのシステインリッチドメインに依存している（スミスら、２００２年、前掲；レディーら、２０００年、前掲）。したがって、本発明者らがエフリン−リガンドのＡＤＡＭ１０／ＡＤＡＭ１７切断を調節すると同定した領域は、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７の他の疾患関連ターゲットにも関連を有し得る。
【０２１３】
本明細書を通して、その目的は、本発明をどれか１つの実施形態または特定の特徴群に限定することなく本発明の好ましい実施形態を説明することである。本明細書に記載かつ例示されている実施形態には、本発明の広範な精神および範囲を逸脱することなく、さまざまな変更および修正を施し得る。
【０２１４】
本明細書中に引用したコンピュータプログラム、アルゴリズム、特許文献および科学文献はいずれもそのまま本明細書に文献援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２１５】
【図１】ＥｐｈＡ３−ＡＤＡＭ１０結合、エフリンＡ５切断およびエフリンインターナリゼーション。Ａ：ＬｉＢｒ黒色腫細胞および親ＨＥＫ２９３細胞または安定にトランスフェクトしたＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＤＡＭ１０とＥｐｈＡ３との結合。溶解前に、細胞をクラスター化エフリン−Ｆｃ（Ａ５またはＡ２）で処理するか、未処理（−）のままにした。溶解物由来の抗ＥｐｈＡ３免疫沈降物を内因性ＡＤＡＭ１０についてウエスタンブロットで解析した〔「ｐ」および「ｍ」は、ＡＤＡＭ１０のプロ（未処理）および成熟（処理）体を示す〕。免疫沈降物のアリコートを、ローディングを示すＥｐｈＡ３レベルについてブロットした（下のパネル）。矢じり「Δ」は、組換えＡＤＡＭ１０ΔＭＰを用いたイムノブロットにおいて抗ＡＤＡＭ１０抗体のブロッキングによりＡＤＡＭ１０検出の特異性が確認されたレーンを示す。Ｂ：ＥｐｈＡ３はドミナント・ネガティブＡＤＡＭ１０と相互作用するが、エフリンＡ５は相互作用しない。ＥｐｈＡ３／ＨＥＫ２９３細胞またはエフリンＡ５／ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＡ標識ＡＤＡＭ１０ΔＭＰを発現させるようにトランスフェクトした。抗ＨＡ免疫沈降物のウエスタンブロットは、抗エフリンＡ５および抗ＥｐｈＡ３抗体を用いて、また平行コントロールサンプルは抗ＡＤＡＭ１０抗体を用いて解析した。さらに、エフリンＡ５／ＨＥＫ２９３細胞溶解物をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ結合ＥｐｈＡ３−Ｆｃで抽出し、抗エフリンＡ５抗体を用いて解析した。Ｃ：メタロプロテアーゼ媒介切断にはエフリンＡ５のプレクラスター化が必要である。１，１０−Ｏ−フェナントロリン（ＯＰＮ）に暴露した（＋）または暴露しなかった（−）ＥｐｈＡ３／２９３細胞をクラスター化（＋）または非クラスター化（−）エフリンＡ５−Ｆｃで処理した。プールされた細胞溶解物および上澄みを、過剰なＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでプレクリアし、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合したＥｐｈＡ３−Ｆｃを用いて切断されたエフリンＡ５を抽出し、抗エフリンＡ５イムノブロットで解析した。組換え体、単量体、一本鎖エフリンＡ５〔ヒマネンら、２００４年、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第７巻、ｐ．５０１−９；エフリン  ｓｔｄ〕を平行解析した。Ｄ：エフリンＡ５切断およびインターナリゼーションはドミナント・ネガティブＡＤＡＭ１０により阻害される。ＥｐｈＡ３過剰発現ＥｐｈＡ３／２９３細胞（パネルＩ−ＶＩ）、または親ＨＥＫ２９３細胞（パネルＶＩＩ）を、３０分間、Ａｌｅｘａ５４６標識エフリンＡ５−Ｆｃビーズ（パネルＩ−ＩＩＩ、Ｖ−ＶＩＩ）もしくはＡｌｅｘａ−Ｆｃコントロールビーズ（パネルＩＶ）と共にインキュベートして、固定し、共焦点顕微鏡検査により取り込まれたエフリンＡ５について解析した。細胞を以下のように前処理した：パネルＩ、ＩＶ、ＶＩＩ：前処理なし；パネルＩＩ：１ｍＭのＯＰＮで前処理；パネルＩＩＩ：５０μＭのＴＡＰＩ１で前処理；パネルＶ、ＶＩ：ＨＡ−ＡＤＡＭ１０ΔＭＰで一時的にトランスフェクト。Ａｌｅｘａ５４６蛍光の画像をパネルＩ−Ｖに示す。抗ＨＡ抗体（α−ＨＡ）およびＡｌｅｘａ５４６結合二次抗体を用いて評価したドミナン��・ネガティブＡＤＡＭ１０ΔＭＰの発現は緑色で示す。矢じりは、検出可能なＡＤＡＭ１０ΔＭＰを発現せず、取り込まれたエフリンＡ５を含有する細胞〔（パネルＶ、ＶＩに点線で輪郭を示す〕を意味する。スケールバー：１０μｍ。エフリンＡ５を取り込んだビーズで結ばれた細胞の比率をパネルＶＩＩＩに示す。Ｅ：構造的エフリン誘導性ＡＤＡＭ結合にはＥｐｈＡ３リガンド結合ドメインが必要である。ＨＥＫ２９３細胞を、ＨＡ−ＡＤＡＭ１０ΔＭＰのみ（コントロール）、またはＨＡ−ＡＤＡＭ１０ΔＭＰと、末端リガンド結合ドメインを欠失する（ΔＬＢＤ）か、Ｃ末端ＰＤＺ結合ドメインを欠失する（ΔＰＤＺｂ）ｗｔＥｐｈＡ３もしくはＥｐｈＡ３切断突然変異体とでトランスフェクトした。抗ＨＡ免疫沈降物と、架橋エフリンＡ５−Ｆｃで処理（＋）または未処理（−）細胞由来の総溶解物とを、指示抗体を用いたウエスタンブロッティングで解析した。
【図２】ＡＤＡＭ１０とＥｐｈＡ３、エフリンＡ５およびエフリンＡ２との相互作用と、ＡＤＡＭ１７とＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ４およびエフリンＢ２との相互作用。Ａ：ＡＤＡＭ１０ディスインテグリンおよびシステインリッチドメイン（ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ）とさまざまなエフリンとのＩｎ  ｖｉｔｒｏ結合。指示エフリンのＦｃ融合タンパク質を、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃと共インキュベートし、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上でエフリンーＦｃ結合タンパク質を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により解析した。コントロールレーン（−−）は、単独でインキュベートしたＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ結合ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを示す。Ｂ：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋ＣドメインはＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体には結合するが、個々のタンパク質には結合しない。ＥｐｈＡ３−Ｆｃ、エフリンＡ５およびＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを種々に組み合せてインキュベートし（下）、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上で回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により解析した。ＥｐｈＡ３不在下にエフリンＡ５−ＦｃとＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃとの結合もテストした（レーン９および１０）。レーン１：マーカー。レーン２：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃインプット（１５μｇ）。レーン３〜１０：Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａプルダウン；３：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ；４：ＥｐｈＡ３−Ｆｃ；５：エフリンＡ５；６：ＥｐｈＡ３−Ｆｃ＋エフリンＡ５；７：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ＋ＥｐｈＡ３−Ｆｃ；８：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ＋ＥｐｈＡ３−Ｆｃ＋エフリンＡ５；９：エフリンＡ５−Ｆｃ；１０：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ＋エフリンＡ５−Ｆｃ。Ｃ：ＡＤＡＭ１０のシステインリッチドメインのみがＥｐｈＡ３／エフリンＡ５−Ｆｃ複合体に結合する。ＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメイン（Ｄ、レーン２〜６）ドメインおよびシステインリッチドメイン（Ｃ、レーン７〜１１）を単独でインキュベート（Ｄ、レーン２；Ｃ、レーン７）またはＥｐｈＡ３−ＦｃおよびエフリンＡ５と共に（以下に詳述）インキュベートし、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ結合タンパク質をパネル（ａ）、（ｂ）にあるように解析した。レーン２、７：それぞれＡＤＡＭのＤおよびＣタンパク質のインプット；レーン３、８：それぞれＡＤＡＭＤおよびＣ構築物のみ、またはＥｐｈＡ３−Ｆｃと共インキュベート（４、９）；エフリンＡ５−Ｆｃと共インキュベート（５および１０）；もしくはＥｐｈＡ３−ＦｃおよびエフリンＡ５と共インキュベート（６および１１）。レーン１２；エフリンＡ５をＥｐｈＡ３−Ｆｃと共インキュベート。Ｄ：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋ＣドメインはＥｐｈＢ２／エフリンＢ２複合体には結合しない。ＥｐｈＢ３−Ｆｃ、エフリンＢ２およびＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを種々の組み合せでインキュベートし、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａビーズ上に捕獲した：レーン１、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ単独；レーン２：ＡＤＡＭＤ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン３：ＥｐｈＢ３／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン４：エフリンＢ２−Ｆｃ、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン５：エフリンＢ２−Ｆｃ、ＥｐｈＢ４／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン６：エフリンＢ２−Ｆｃ、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン７：エフリンＢ２−Ｆｃ、ＥｐｈＢ４、ＡＤ��Ｍ１０Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン８：ＥｐｈＢ４−Ｆｃ、ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン９：ＥｐｈＢ４−Ｆｃ。Ｅ：ＡＤＡＭ１７Ｄ＋ＣドメインはＥｐｈＢ４／エフリンＢ２複合体に結合する。レーン１：ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ単独；レーン２：ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン３：ＥｐｈＢ４／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン４：エフリンＢ２−Ｆｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン５：エフリンＢ２−Ｆｃ，ＥｐｈＢ４／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン６：エフリンＢ２−Ｆｃ、ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン７：エフリンＢ２−Ｆｃ、ＥｐｈＢ４、ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン８：ＥｐｈＢ４−Ｆｃ、ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン９：ＥｐｈＢ４−Ｆｃ。Ｆ：ＡＤＡＭ１７Ｄ＋ＣドメインはＥｐｈＢ２／エフリンＢ２複合体に結合する。レーン１：ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ単独；レーン２：ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン３：ＥｐｈＢ２／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン４：エフリンＢ２−Ｆｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン５：エフリンＢ２−Ｆｃ．ＥｐｈＢ２（１μｇ）、ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン６：エフリンＢ２−Ｆｃ，ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン７：エフリンＢ２−Ｆｃ、ＥｐｈＢ２（２μｇ）、ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン８：ＥｐｈＢ２−Ｆｃ、ＡＤＡＭ１７Ｄ＋Ｃ／Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ；レーン９：ＥｐｈＢ２−Ｆｃ。
【図３】ＡＤＡＭ１０のディスインテグリンドメインおよびシステインリッチドメイン（配列番号１４−２０）の構造。Ａ：種々のＡＤＡＭのディスインテグリンドメインとＣｙｓリッチ領域の構造に基づくアラインメント。Ｂ：ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ構造の立体像。ディスインテグリンドメインは黄色、システインリッチドメインは緑色で彩色、Ｎ末端とＣ末端を示す。Ｃ：ディスインテグリントリメスタチン〔１ｊ２ｌ（２ｌ）；青色〕構造上に重ねたＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ構造の立体像（ディスインテグリンドメイン：黄色；Ｃｙｓリッチドメイン：緑色）。Ｄ：表面静電ポテンシャルに従ってカラーコード化されたＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃの分子表面、２つの１８０°回転像を示す。赤色と青色は−１２（赤）〜＋１２ｋＢＴ（青）の範囲の静電ポテンシャルを表し、ここで、ｋＢはボルツマン定数、Ｔは温度（２９３Ｋ）である。Ｅ：突然変異誘発のターゲットとされた３つのＧｌｕ残基を示す酸性ポケットのクローズアップ像。
【図４】ＡＤＡＭ１０のＣｙｓリッチドメインの酸性残基の突然変異はＥｐｈＡ３／エフリンＡ５との結合およびエフリンＡ５の切断に影響を与える。Ａ：突然変異ＡＤＡＭ１０Ｄ＋ＣとＥｐｈＡ３／エフリンＡ５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合。Ｇｌｕ５７３、Ｇｌｕ５７８、Ｇｌｕ５７９のアラニン置換を含むＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ［ＥＥＥ−Ａ］（レーン１〜４）、またはＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ［ＲＤＤ−Ａ］（Ａｒｇ５２５、Ａｓｐ５２６、Ａｓｐ５２７のＡｌａ置換、レーン５〜８）を単独で（レーン１、５）、またはＥｐｈＡ３−Ｆｃ（レーン２、６）、エフリンＡ５−Ｆｃ（レーン３、７）もしくはＥｐｈＡ３−ＦｃおよびエフリンＡ５（レーン４、８）と共にインキュベートした。複合体を形成したタンパク質をＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズで抽出し、図２のように解析した。Ｂ：野性型および突然変異ＡＤＡＭ１０ΔＭＰと細胞中のＥｐｈＡ３との結合。ＥｐｈＡ３／２９３細胞をＨＡ−ＡＤＡＭ１０ΔＭＰまたはＨＡ−ＡＤＡＭ１０ΔＭＰ［ＥＥＥ−Ａ］でトランスフェクトした。親細胞とトランスフェクト細胞を、プレクラスター化エフリンＡ５−Ｆｃを加えるか、加えずに１０分間処理し、溶解させた。抗ＨＡおよび抗ＥｐｈＡ３免疫沈降物と、総細胞溶解物を、指示抗体を用いたウエスタンブロットで解析した。Ｃ：ｗｔおよび３Ａ突然変異ＡＤＡＭ１０を発現する細胞におけるエフリンＡ５−Ｆｃ切断。ＥｐｈＡ３／２９３細胞を全長の野性型（ｗｔ）ＡＤＡＭ１０、ドミナント・ネガティブＡＤＡＭ１０ΔＭＰ、またはＧｌｕ５７３、５７８、５７９のアラニン（３Ａ）もしくは３リシン（３Ｋ）置換を有するＡＤＡＭ１０でトランスフェクトした。クラスター化（＋）または非クラスター化（−）エフリンＡ５−Ｆｃに暴露した後、切断されたエフリンを回収し、図１ｃに記載のようにウエスタンブロットで解析した。全細胞溶解物の平行抗ＨＡブロットにより、ＡＤＡＭ１０構築物の発現レベルを明らかにする。Ｄ：ＡＤＡＭタンパク質モジュールおよび切断機構のモデル。左側、ＡＤＡＭプロテイナーゼタンパク質ドメイン組織の略図；右側、制御されたエフリン切断をもたらす、相互作用細胞間のＡＤＡＭ１０、ＥｐｈＡ３およびエフリンＡ５の提案された相互作用および位置決めの略図。Ｅ：細胞表面からのエフリンの切断を３Ａ変異ＡＤＡＭ１０の過剰発現によりブロックする。ＨＥＫ２９３細胞を（赤色蛍光）ＥｐｈＡ３−ｄｉＨｃＲｅｄと、ｗｔＡＤＡＭ１０、Ｇｌｕ５７３、５７８、５７９にアラニン（３Ａ）置換を有するＡＤＡＭ１０、またはドミナント・ネガティブＡＤＡＭ１０ΔＭＰとで共トランスフェクトした。次いで、これらを、（緑色発光）ＧＦＰ−エフリンＡ５またはＧＦＰ−エフリンＡ２を発現するＨＥＫ２９３細胞（緑色蛍光）と共に４０分間共インキュベートして、固定し、抗ＨＡ抗体で染色した。ＧＦＰ−エフリン発現細胞（緑色）、ＥｐｈＡ３−ｄｉＨｃＲｅｄ発現細胞（赤色）、抗ＨＡ−ＡＤＡＭ１０染色（Ａｌｅｘａ６４７、青色）の個々の共焦点画像およびマージ画像を図のように示す。矢じりは、切断されて、取り込まれたエフリンを示し、矢印は相互作用細胞表面におけるエフリンの凝集を示す。エフリンを取り込んだエフリン／ＨＥＫ２９３細胞に接触しているＨＥＫ２９３細胞を発現するＥｐｈＡ３−およびＨＡ−ＡＤＡＭ１０の比率を右側パネルに示す。
【図５】ＥＧＦレセプターと共発現させたＡＤＡＭ１０による細胞表面プロＥＧＦの切断には、ＡＤＡＭ１０の無傷の基質認識ポケットが必要である。ＥＧＦＲ−ＧＦＰと野性型または３Ａ変異ＡＤＡＭ１０（前述）とを一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＨＡ標識プロＥＧＦを発現するＨＥＫ２９３細胞と共に１５分間共インキュベートした。次いで、細胞を洗浄、固定し、抗ＡＤＡＭ１０抗体（Ａｌｅｘａ５４６、赤色）および抗ＨＡ抗体（Ａｌｅｘａ６４７、シアン）で染色した。矢印は、結合ＨＡ−プロＥＧＦ発現細胞からＥＧＦを取り上げ得ないＥＧＦＲ／３Ａ  ＡＤＡＭ１０発現細胞（星印）を示し、矢じりは、ＥＧＦＲとｗｔＡＤＡＭ１０（下のパネル）またはＥＧＦＲだけ（内因性ＡＤＡＭ１０を含む）（上のパネル）を過剰発現するＥＧＦを取り上げた細胞を示す。
【図６】ＥｐｈＡ３／エフリンＡ５／ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃ複合体の形成をモニターする蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）解析。Ａ：提案した複合体形成阻害剤スクリーニング法は、Ｅｕ３＋キレート標識ドナーおよびＸＬ６６５標識アクセプタータンパク質を用いる均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ（商標））アッセイに基づいている。ＡＤＡＭ１０とその基質、ＥｐｈＡ３／エフリンＡ５複合体との相互作用は、６６５ｎｍの（正規化）発光を用いて測定する。相互作用により標識が近接し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が始動、それによって、増幅蛍光シグナルを生成する化学反応カスケートが開始される。相互作用に干渉する薬剤または抗体はシグナルを弱体化または阻止するであろう。Ｂ：このアッセイの実行可能性を示すために、ＸＬ６６５標識ＥｐｈＡ３−ＦｃとエフリンＡ５との複合体を、増大濃度の標識ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃと共にインキュベートした。Ｘ軸は複合体の濃度を示し、Ｙ軸は、ＥｐｈＡ３−ＦｃとＡＤＡＭＤ＋Ｃの２つの標識間のエネルギー移動の測度としてのＡ６６５／Ａ６２０比を示す（青色ダイヤ印）。この相互作用の競合的阻害剤としての能力を実証するために、非標識ＡＤＡＭ１０Ｄ＋Ｃを増大濃度で定濃度（３２０ｎＭ）のＥｐｈＡ３／エフリンＡ５−Ｆｃに加えた。
【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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