(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）異種エタノール産生遺伝子の全相補体がｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢを含有してなり、
（ｂ）ａｄｈＡ及びａｄｈＢ遺伝子がザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来であり、
（ｃ）異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現が、組み換え細菌が発酵主生成物としてエタノールを産生することをもたらす、
異種エタノール産生遺伝子の全相補体を発現する、組み換え細菌。
【請求項２】
産生されたエタノールが、嫌気性条件下の無機塩培地中での非気体状発酵生成物の全量の５０％超を構成している、請求項１に記載の組み換え細菌。
【請求項３】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体が、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来である、請求項１又は２に記載の組み換え細菌。
【請求項４】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体がリボソームＲＮＡオペロンに組み込まれている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項５】
リボソームＲＮＡオペロンが、ｒｒｎＡ、ｒｒｌＢ、ｒｒｎＣ、ｒｒｎＤ、ｒｒｎＥ、ｒｒｎＧ及びｒｒｎＨからなる群より選択される遺伝子を包含する、請求項４に記載の組み換え細菌。
【請求項６】
組み換え細菌が抗生物質マーカーを含有していない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項７】
抗生物質マーカーが、アプラマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン及びクロラムフェニコールからなる群より選択される、請求項６に記載の組み換え細菌。
【請求項８】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を阻害するか或いは産生するエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が除去又は不活性化されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項９】
除去又は不活性化されている１つ又はそれ以上の遺伝子が、
（ａ）ＮＡＤＨ酸化のための発酵経路に関与しているタンパク質をコードする遺伝子；又は、
（ｂ）ピルビン酸代謝のための代替経路に関与しているタンパク質をコードする遺伝子；
である、請求項８に記載の組み換え細菌。
【請求項１０】
除去又は不活性化されている１つ又はそれ以上の遺伝子が、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域を包含している遺伝子、ｌｄｈＡ、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄオペロン、ｃａｓＡＢ、及びｍｇｓＡからなる群より選択される、請求項８又は９に記載の組み換え細菌。
【請求項１１】
除去又は不活性化されている１つ又はそれ以上の遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項１２】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子をさらに包含する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項１３】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が、分泌タンパク質、ポリサッカラーゼ、グルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ又はペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子である、請求項１２に記載の組み換え細菌。
【請求項１４】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が、ｅｓｔＺ遺伝子である、請求項１２又は１３に記載の組み換え細菌。
【請求項１５】
ｅｓｔＺ遺伝子が、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のものである、請求項１４に記載の組み換え細菌。
【請求項１６】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が、ｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子を包含している、請求項１２又は１３に記載の組み換え細菌。
【請求項１７】
ｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子が、大腸菌（Escherichia coli）由来のものである、請求項１６に記載の組み換え細菌。
【請求項１８】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が、ｃｅｌＹ遺伝子を包含している、請求項１２又は１３に記載の組み換え細菌。
【請求項１９】
ｃｅｌＹ遺伝子が、黒脚病菌（Erwinia chrysanthemi）由来のものである、請求項１８に記載の組み換え細菌。
【請求項２０】
さらにｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域を包含しており、当該ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域が内因性の遺伝子領域であるか又は大腸菌（Escherichia coli）由来のものである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項２１】
細菌が、
（ａ）アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ザイモモナス属（Zymomonas）、ジオバクター属（Geobacter）、シェワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シトロバクター属（Citrobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、セラチア属（Serratia）、プロテウス属（Proteus）、ハフニア属（Hafnia）、エルシニア属（Yersinia）、モルガネラ属（Morganella）、エドワードジエラ属（Edwardsiella）及びクレブシエラ属（Klebsiella）からなる群より選択されるグラム陰性細菌；
（ｂ）大腸菌（Escherichia coli.）；又は、
（ｃ）バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ジオバチラス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属（Streptococcus）及びユーバクテリウム属（Eubacterium）からなる群より選択されるグラム陽性細菌；
である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項２２】
細菌が、
（ａ）大腸菌ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ５５１２４）由来である；
（ｂ）大腸菌ＳＺ１１０株（ＮＲＲＬ Ｂ−３０９５１）由来である；
（ｃ）大腸菌ＬＹ１６５株（ＮＲＲＬ Ｂ−３０９５２）である；又は
（ｄ）大腸菌ＬＹ１６８株（ＮＲＲＬ Ｂ−３０９５３）である；
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項２３】
（ａ）細菌が嫌気性条件下でエタノールを発酵主生成物として産生する；又は
（ｂ）組み換え細菌が無機塩培地で生育できる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組み換え細菌。
【請求項２４】
無機塩培地が
（ａ）キシロース；又は、
（ｂ）ベタイン；
の少なくとも１種を含有している、請求項２３に記載の組み換え細菌。
【請求項２５】
ＬＹ１６５株（ＮＲＲＬ Ｂ−３０９５２）又はＬＹ１６８株（ＮＲＲＬ Ｂ−３０９５３）。
【請求項２６】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体を宿主細菌に組み込み、それによって異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌を産生する工程を包含している、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組み換え細菌を産生する方法。
【請求項２７】
オリゴ糖源を請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組み換え細菌とエタノール産生に適した条件下で接触させ、それによりオリゴ糖源からエタノールを産生することを包含する、エタノールをオリゴ糖源から産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本発明は、２００６年８月９日出願の米国特許出願第６０／８３６，７２６号の優先権を主張し、その全ての内容を参照として本明細書に明確に組み込む。
【０００２】
（米国政府の委託研究）
本発明は、米国農務省の助成金第０１−３５５０４−１０６６９号及び同第００−５２１０４−９７０４号、並びに米国エネルギー省のＦＧ０２−９６ＥＲ２０２２２号に基づき、米国政府により一部が助成された。従って、米国政府は、本発明に対するある特定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
リグノセルロース系バイオマスは、燃料及び化学製品への生物学的変換のための再生可能な糖質源であり、石油関連技術に替わる魅力的な原料である（Arntzen and Dale,1999)。しかし最大の能力を発揮させてバイオマスからエタノール製品を生産するためには、高速及び高効率、単純な工程及び安価な媒体を必要とするであろうと認識されている（Ingram et al. 1998; Zhang & Greasham 1999）。
【０００４】
大腸菌（Escherichia coli）のような細菌は、リグノセルロースに含まれる糖成分全てを代謝する固有の能力を持っている。以前から、代謝工学における土台生命体として大腸菌を選択する重要な基準として、質的な環境耐久性、基質範囲の広さ、無機塩培地での良好な生育能力が認識されていた（Alterthum & Ingram 1989; Zhou et al. 2006a）。株ＫＯ１１（ＡＴＣＣ５５１２４）。このような大腸菌は、２つのザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の遺伝子（ｐｄｃ、ａｄｈＢ）を大腸菌のｐｆｌＢプロモータの後に組み込むことによるエタノールの産生のために設計された（Ohta et al. 1991）。しかしこの大腸菌株の原栄養菌的特性にもかかわらず、株ＫＯ１１を用いて迅速に効率的に高い力価のエタノールを産生するためには、複合的で高価な栄養素を必要とした（Asghari, et al. 1996; Martinez et al. 1999; Underwood et al. 2004; York & Ingram 1996）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでの改良培地の開発及び遺伝的改変への試みは複合的で高価な栄養素という要件を解消できず大抵成功に到っていないが、ベタインが有益であることは見出されている（Underwood et al. 2004）。最近、大腸菌株ＫＯ１１が、糖を無機塩培地で高い収率のＤ(−)−乳酸塩へ迅速に効率的に発酵させるように組み換えられている(Zhou et al. 2006a and 2006b)。しかし、組み換えエタノール産生性細菌株のエタノール源として機能する可能性を十分に発揮させるために、高価ではない栄養培地で生育させつつ効率的にエタノールを産生するような細菌の新規な改良された株が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
(発明の概要)
本発明は、少なくとも部分的に、エタノール産生に関する細菌代謝工学上の新規な戦略の発見に基づいている。特に、本発明は、以前には無機塩培地でのエタノール産生に関する細菌工学上の制限であった、低いエタノール収率及び複合培地の要件を克服する工学的戦略を提供する。
【０００７】
先行技術の組み換えエタノール産生性細菌は、迅速で効率的に高い力価のエタノールを産生するために複合栄養素を必要とする。大腸菌株ＫＯ１１(ＡＴＣＣ５５１２４)は、そのような先行技術の組み換え細菌の例である。ＫＯ１１株は、２つのザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の遺伝子（ｐｄｃ、ａｄｈＢ）を大腸菌のｐｆｌＢプロモータの後に組み込むことによりエタノール産生のために設計された（Ohta et al. 1991）。しかし原栄養菌的特性及びリグノセルロースに含まれる糖成分全てを代謝するその固有の能力にもかかわらず、ＫＯ１１株を用いて迅速に効率的に高い力価のエタノールを産生するためには、複合栄養素を必要とした（Asghari, et al. 1996; Martinea et al. 1999; Underwood et al. 2004; York & Ingram 1996）。   
【０００８】
理論にとらわれることなく、本発明者らは、無機塩培地でのＫＯ１１のような組み換え生命体の制限されている性能を助長している４つの因子：（1）ザイモモナス・モビリスアルコール産生遺伝子のＫＯ１１に組み込む部位としてのｐｆｌＢの恣意的な選択；（２）ザイモモナス・モビリスからのアルコール産生遺伝子の不完全なセット；(３)抗生物質耐性遺伝子の存在；及び(４)エタノール産生の量を減少させる或いはエタノール産生を阻害する代替的及び/又は競合的代謝経路に関与している酵素をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子の存在；を特定した。
【０００９】
本発明者らは、この４つの因子を検討した。その結果、本発明は、無機塩培地で生育及び発酵させることができ、そして高い力価のエタノールを迅速で効率的に産生する組み換え遺伝子を提供している。
【００１０】
よって一態様では、本発明は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌を提供する。
別の態様では、本発明は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体がリボソームＲＮＡオペロンに組み込まれている、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌を提供する。
【００１１】
別の更なる態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の抗生物質マーカーが除去されている、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌を提供する。
更なる別の態様では、本発明は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を阻害するか或いは産生するエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が不活性化されている、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌を提供する。
【００１２】
更なる態様では、本発明は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体、及び異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を包含する組み換え細菌を提供する。
【００１３】
本発明の上記態様の各々の実施態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現が、組み換え細菌が発酵主生成物としてエタノールを産生することをもたらす。
異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌の一態様では、１つ又はそれ以上の遺伝子は異種遺伝子である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現により組み換え細菌が発酵主生成物としてエタノールを産生することがもたらされる、リボソームＲＮＡオペロンに組み込まれている異種エタノール産生遺伝子の全相補体、及び異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を包含する組み換え細菌を提供し、ここにおいて組み換え細菌は１つ又はそれ以上の抗生物質マーカーを含有しておらず、さらに異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を阻害するか或いは産生するエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が不活性化されている。
【００１５】
いくつかの態様では、リボソームＲＮＡオペロンがｒｒｌＡ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＣ、ｒｒｌＤ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＧ及びｒｒｌｎＨからなる群より選択される遺伝子を包含している。特定の態様では、リボソームＲＮＡオペロンがｒｒｌＥ遺伝子を包含している。
【００１６】
別の特定の態様では、本発明は、本発明の何れかの態様の組み換え細菌を特徴とし、ここにおいて異種エタノール産生遺伝子の全相補体がｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢを包含している。特定の態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体がザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来である。
【００１７】
別の態様では、組み換え細菌は抗生物質耐性マーカーを除去している。特定の実施態様では、組み換え細菌から除去されている抗生物質マーカーが、アプラマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン及びクロラムフェニコールからなる群より選択される。
【００１８】
一態様では、本発明の組み換え細菌中で不活性化されている１つ又はそれ以上の遺伝子が、ＮＡＤＨ酸化のための発酵経路に関連するタンパク質をコードする。特定の態様では、不活性化されている１つ又はそれ以上の遺伝子は細菌内因性のものである。別の特定の態様では、不活性化されている１つ又はそれ以上の遺伝子は細菌に対して異種遺伝子である。
【００１９】
本発明の一態様では、不活性化されている１つ又はそれ以上の遺伝子は、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域、ｌｄｈＡ、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄオペロン、ｃａｓＡＢ及びｍｇｓＡからなる群より選択される。特定の態様では、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ｌｄｈ遺伝子及びｆｒｄオペロンは、ピルビン酸代謝のための代替経路に関与しているタンパク質をコードする。一態様では、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域、ｌｄｈＡ、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄオペロンを包含している遺伝子及びｍｇｓＡが、内因性遺伝子である。別の態様では、ｃａｓＡＢ遺伝子が異種遺伝子である。一態様では、ｌｄｈＡ遺伝子が欠失している。別の態様では、ｌｄｈＡ遺伝子が内因性遺伝子である。
【００２０】
更なる態様では、本発明の組み換え細菌は、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域をさらに包含している。一態様では、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域が内因性の遺伝子領域である。別の態様では、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域が大腸菌（Escherichia coli）由来のものである。
【００２１】
ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域は、基質としてアセチル−ｃｏＡを用いてエタノール１モル当たり２モルＮＡＤＨを消費することにより収率が減少することになる、過剰なギ酸塩及びアセチル−ｃｏＡの生成を阻止するために、初めに欠失されている。
【００２２】
さらに本発明の別の態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする遺伝子はｅｓｔＺ遺伝子を包含している。一態様では、ｅｓｔＺ遺伝子が異種遺伝子である。別の態様では、ｅｓｔＺ遺伝子がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のものである。
【００２３】
ｅｓｔ遺伝子は非常に微量な予期せぬ副産物である酢酸エチルの生成を減少させるために有用である。最終的精製の間に酢酸エチルをエタノールから分離することが工程原価に加算される。収率の変化は僅かであるが、精製に対する費用は顕著なものになってしまう。
【００２４】
本発明の別の態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子はｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子を包含している。特定の態様では、ｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子が内因性遺伝子である。別の態様では、ｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子が大腸菌（Escherichia coli）由来のものである。本発明の別の特定の態様では、ｍｇｓＡ遺伝子が欠失している。一態様では、ｍｇｓＡ遺伝子が内因性遺伝子である。
【００２５】
本発明の別の態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が、ｃｅｌＹ遺伝子を包含している。特定の態様では、ｃｅｌＹ遺伝子が異種遺伝子である。別の特定の態様では、ｃｅｌＹ遺伝子が黒脚病菌（Erwinia chrysanthemi）由来のものである。
【００２６】
本発明の多様な態様により、組み換え細菌は嫌気性条件下でエタノールを発酵主生成物として産生する。組み換え細菌を無機塩培地で生育させることもできる。特定の態様では、無機塩培地はキシロースを含有している。別の態様では、培地が少なくとも約７％のキシロースを含んでいる。さらに別の態様では、培地はベタインを含有している。一態様では、組み換え細菌より産生されたエタノールが、嫌気性条件下の無機塩培地中で非気体状発酵生成物の全量の４０％超を構成している。
【００２７】
本発明の多様な態様により、組み換え細菌はグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌に由来する細菌である。一態様では、細菌は、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ジオバクター属（Geobacter）、シェワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シトロバクター属（Citrobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、セラチア属（Serratia）、プロテウス属（Proteus）、ハフニア属（Hafnia）、エルシニア属（Yersinia）、モルガネラ属（Morganella）、エドワードジエラ属（Edwardsiella）及びクレブシエラ属（Klebsiella）からなる群より選択されるグラム陰性細菌である。特定の態様では、細菌は大腸菌（Escherichia coli.）である。別の特定の態様では、細菌はクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca.）である。
【００２８】
別の態様では、細菌は、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ジオバチラス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属（Streptococcus）及びユーバクテリウム属（Eubacterium）からなる群より選択されるグラム陽性細菌である。一態様では、組み換え細菌は大腸菌ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ５５１２４）由来である。別の態様では、組み換え細菌が大腸菌ＳＺ１１０株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５１）由来である。特定の態様では、組み換え細菌が大腸菌ＬＹ１６５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５２）である。別の特定の態様では、組み換え細菌が大腸菌ＬＹ１６８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５３）である。
【００２９】
関連する態様では、本発明は以下の新規な組み換え生命体を提供する：大腸菌ＳＺ１１０株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５１）；大腸菌ＬＹ１６５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５２）；及び大腸菌ＬＹ１６８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５３）；大腸菌ＢＷ３４株。
【００３０】
他の関連する態様では、本発明は、組み換え大腸菌：ＬＹ１４９、ＬＹ１５１、ＬＹ１５８、ＬＹ１５９、ＬＹ１６０、ＬＹ１６０ｉｍ、ＬＹ１６１、ＬＹ１６３、ＬＹ１６８ｉｍ、ＬＹ１６９、ＬＹ１７０、ＬＹ１７２、ＬＹ１７２ｉｍ、ＬＹ１７３、ＬＹ１７８、ＬＹ１８０、ＬＹ１８６、ＢＷ３４−ＸＺ１０６、ＢＷ３４−ＸＺ１０７、ＢＷ３４−ＸＺ１０８、ＢＷ３４−ＸＺ１０９、ＢＷ３４−ＸＺ１１０、ＢＷ３４−ＸＺ１１１、ＢＷ３４−ＸＺ１１２、ＢＷ３４−ＸＺ１１３、ＢＷ３４−ＸＺ１１４、ＢＷ３４−ＸＺ１１５、ＢＷ３４−ＸＺ１１６、ＢＷ３４−ＸＺ１１７、ＢＷ３４−ＸＺ１１８、ＢＷ３４−ＸＺ１１９、ＢＷ３４−ＸＺ１２０、ＢＷ３４−ＸＺ１２１、ＢＷ３４−ＸＺ１２２、ＢＷ３４−ＸＺ１２３及びＢＷ３４−ＸＺ１２４株を提供する。
【００３１】
本発明の別の態様は、本明細書に記述されるような本発明の組み換え細菌を産生する方法を特徴とする。方法は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を宿主細菌に組み込むことにより、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌を産生する工程を包含している。
【００３２】
一態様では、方法は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体をリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）オペロンに組み込むことを特徴とする。特定の態様では、このＲＮＡオペロンがｒｒｌＡ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＣ、ｒｒｌＤ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＧ及びｒｒｌＨからなる群より選択される遺伝子を包含する。さらに別の特定の態様では、リボソームＲＮＡオペロンがｒｒｌＥ遺伝子を包含している。
【００３３】
本発明の別の態様は、本明細書に記述されるような、抗生物質耐性マーカーを含有していない組み換え細菌を特徴とする。一態様では、方法は、１つ又はそれ以上の抗生物質マーカーを除去する工程をさらに提供する。
【００３４】
さらに別の態様では、方法は、エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を阻害するか或いは産生するエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を不活性化させることを特徴とする。更なる態様では、方法は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか或いは産生するエタノールの量を増大させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の異種遺伝子を組み込むことを特徴とする。
【００３５】
別の態様では、方法は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を宿主細菌のｒｒｌＥ遺伝子内に組み込むこと、１つ又はそれ以上の抗生物質マーカーを除去すること、及びエタノール産生のために必要ではない、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を阻害するか或いは産生するエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を不活性化することの工程をさらに包含している。
【００３６】
本発明の方法の特定の態様では、組み込まれる異種エタノール産生遺伝子の全相補体がｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢを包含している。方法の更なる態様では、ｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢ遺伝子がザイモモナス・モビリス由来である。別の態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体がプロモーターを持たないオペロンに含まれている。更なる態様では、プロモーターを持たないオペロンが、ｐｄｃとａｄｈＢの間のＳｐｅＩ部位にライゲートされるａｄｈＡ遺伝子を含有している。更なる別の態様では、プロモーターを持たないオペロンが、除去可能な抗生物質マーカーを含有している。更なる別の態様では、プロモーターを持たないオペロンが、Ｔｎ５トランスポゾンを用いて組み込まれている。方法の一態様では、抗生物質マーカーがリコンビナーゼで除去される。別の態様では、抗生物質マーカーがアプラマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン及びクロラムフェニコールからなる群より選択される。
【００３７】
方法の別の態様では、１つ又はそれ以上の遺伝子が欠失又は突然変異により不活性化される。特定の態様では、１つ又はそれ以上のエタノール産生遺伝子が欠失により不活性化される。別の態様では、ピルビン酸代謝の代替経路に関与しているタンパク質をコードする遺伝子が不活性化される。更なる態様では、本発明の何れかの態様の遺伝子は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を組み込む前に不活性化される。
【００３８】
方法の一態様では、宿主細菌が大腸菌ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ５５１２４）である。特定の態様では、組み換え細菌がＳＺ１１０（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５１）由来である。
【００３９】
方法の別の態様では、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域を包含している遺伝子が欠失により不活性化される。別の特定の態様では、ピルビン酸代謝の代替経路に関与しているタンパク質をコードする遺伝子が欠失している。一態様では、遺伝子がａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡ及びｍｇｓＡを含有する。別の態様では、内因性ｌｄｈＡ遺伝子が欠失により不活性化される。別の態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を組み込む前にｌｄｈＡ遺伝子が欠失される。更なる態様では、異種ｃａｓＡＢ遺伝子が欠失により不活性化される。別の態様では、ｃａｓＡＢ遺伝子がクレブシエラ・オキシトカ由来である。別の特定の態様では、方法は、ｃａｓＡＢ遺伝子をｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子で置換する工程をさらに包含する。特定の態様では、ｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子が大腸菌由来である。別の特定の態様では、方法はｅｓｔＺ遺伝子を組み込む工程をさらに包含している。特定の態様では、ｅｓｔＺ遺伝子がシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来である。一態様では、エタノール産生遺伝子の全相補体を組み込んだ後にｅｓｔＺ遺伝子を組み込む。方法の別の特定の態様では、内因性ｍｇｓＡ遺伝子が欠失により不活性化される。
【００４０】
一態様では、ｌａｃオペロンは除去されるか又は不活性化される。方法の別の態様では、ｌａｃオペロンを回復させる。更なる態様では、ｌａｃオペロンから回復した遺伝子がｌａｃＡ、ｌａｃＹ及びｌａｃＺを包含している。別の態様では、ｌａｃオペロンを包含している遺伝子が大腸菌由来のものである。方法の別の特定の態様では、ｆｒｄＢ遺伝子を欠失させる。別の態様では、ｃｅｌＹ遺伝子が組み込まれる。関連する一態様では、ｃｅｌＹ遺伝子が黒脚病菌（E.chrysanthemi）由来である。
【００４１】
方法の別の態様では、ｃａｓＡＢ遺伝子が組み込まれる。更なる態様では、ｃａｓＡＢ遺伝子がｌｄｈＡ遺伝子に組み込まれる。別の態様では、ｃａｓＡＢ遺伝子がクレブシエラ・オキシトカ由来である。
【００４２】
別の態様では、方法はｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域の機能を回復させることをさらに包含する。特定の態様では、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域の機能をｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域の相同的組み換えによって回復させる。別の特定の態様では、エタノール産生遺伝子の全相補体の組み込みの前にｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域の機能を回復させる。
【００４３】
方法の一態様では、宿主細菌が大腸菌ＳＺ１１０株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５１）である。別の態様では、組み換え細菌が大腸菌ＬＹ１６５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５２）である。さらに別の態様では、組み換え細菌が大腸菌ＬＹ１６８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５３）である。関連する態様では、組み換え細菌を無機塩培地で生育させることができる。特定の態様では、無機塩培地がキシロースを含有している。
【００４４】
本発明の上記方法の一態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現により組み換え細菌が発酵主生成物としてエタノールを産生することがもたらされる。
【００４５】
本発明の別の態様は、オリゴ糖を上述のような、本発明の組み換え細菌とエタノール産生に適した条件下で接触させて、それによりオリゴ糖源からエタノールを産生することを包含する、エタノールをオリゴ糖源から産生する方法を特徴とする。方法の特定の態様では、オリゴ糖は、リグノセルロース、ヘミセルロース、セルロース及びペクチン又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。方法の別の態様では、産生されたエタノールが、非気体状発酵生成物の全量の４０％超を構成している。
一態様では、方法は、本発明の組み換え細菌を提供することをさらに包含する。別の態様では、本発明は、本発明の組み換え細菌を得ることをさらに包含する。
【００４６】
本発明の別の態様では、オリゴ糖を組み換え細菌と無機塩培地で接触させることをさらに包含する。一態様では、無機塩培地が、１リットル当たり３．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、５．０ｇのＫ２ＨＰＯ４、３．５ｇの(ＮＨ４)２ＨＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇのチアミン、及び１ｍＬの微量金属ストックを、２〜９（ｗ／ｖ）％のキシロースを補完して含有している。別の特定の態様では、無機塩培地にベタインが添加される。別の態様では、無機塩培地にＭＯＰＳが添加される。
【００４７】
別の態様では、無機塩培地ＡＭ１培地が、（１リットル当たり）２．６３ｇの(ＮＨ４)２ＨＰＯ４、０．８７ｇのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、０．３７５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１４９ｇのＫＣＬ、０．１６３ｇのベタインＨＣＬ（ｐＨ７．４）及び１．５ｍＬの微量金属ストックを含有して、２〜１４（ｗ／ｖ）％の糖を補完している。更なる態様では、ＡＭ１培地がキシロースを含有している。別の態様では、ＡＭ１培地が少なくとも約９％のキシロースを含んでいる。更なる態様では、微量金属ストックが、０．１ＭのＨＣＬ（１リットル当たり１．６ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＺｎＣｌ２、０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＨ３ＢＯ３、０．３３ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）に調製することができる。
【００４８】
エタノールをオリゴ糖源から産生する上記方法の一態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現により組み換え細菌が発酵主生成物としてエタノールを産生することがもたらされる。
【００４９】
本発明の更なる態様は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を包含する組み換え細菌を提供し、その組み換え細菌は、本明細書に記載されているような本発明の方法の何れか１つの工程を包含する手順により作成される。一態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現により組み換え細菌が発酵主生成物としてエタノールを産生することがもたらされる。
【００５０】
本発明の別の態様は、上記のような本発明の組み換え細菌及び使用のための説明書を包含しているキットを提供する。一態様では、使用のための説明書がオリゴ糖源からエタノールを産生するための本発明の何れかの方法に従っている。別の態様では、キットは糖源をさらに包含している。さらに別の態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現により組み換え細菌が発酵主生成物としてエタノールを産生することがもたらされる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１−１】図１（Ａ−Ｌ）は、本発明による株の構築に用いたプラスミド及びＤＮＡ断片を図式的に描いている。プラスミドｐＬＯＩ３４９７、ｐＬＯＩ３９０１及びｐＬＯＩ３４９１をそれぞれ図Ａ〜Ｃに示す。エタノール遺伝子（ｐｄｃ、ａｄｈＡ、ａｄｈＢ）及び組み込み部位を図Ｄに示す。プラスミドｐＬＯＩ３９２４及びｐＬＯＩ３９２０をそれぞれ図Ｅ及びＦに示す。２４５６ｂｐｓのｐＬＯＩ３９４０  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を図Ｇに示す。４，０８２ｂｐｓのゲノムＰＣＲ断片を図Ｈに示す。プラスミドｐＥＬ０４、ｐＬＯＩ３９６１、ｐＬＯＩ４１６２及びｐＬＯＩ３９７６Ｅをそれぞれ図Ｉ〜Ｌに示す。
【図１−２】図１（Ａ−Ｌ）は、本発明による株の構築に用いたプラスミド及びＤＮＡ断片を図式的に描いている。プラスミドｐＬＯＩ３４９７、ｐＬＯＩ３９０１及びｐＬＯＩ３４９１をそれぞれ図Ａ〜Ｃに示す。エタノール遺伝子（ｐｄｃ，ａｄｈＡ，ａｄｈＢ）及び組み込み部位を図Ｄに示す。プラスミドｐＬＯＩ３９２４及びｐＬＯＩ３９２０をそれぞれ図Ｅ及びＦに示す。２４５６ｂｐｓのｐＬＯＩ３９４０  ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を図Ｇに示す。４，０８２ｂｐｓのゲノムＰＣＲ断片を図Ｈに示す。プラスミドｐＥＬ０４、ｐＬＯＩ３９６１、ｐＬＯＩ４１６２及びｐＬＯＩ３９７６Ｅをそれぞれ図Ｉ〜Ｌに示す。
【図２】図２（Ａ及びＢ）は、株を向上させるための生育に基づく選択を明示しているグラフである。ランダムＴｎ−５ベースの挿入（Ｚ．モビリスｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ）を担持しているＬＹ１５１の集団は、エタノール産生性についての生育に基づく選択として、連続して３８回ＮＢＳ無機塩培地（９％キシロース）に転移させた。ＬＹ１５８及びＬＹ１５９株を最終転移物から単離した。転移をグループ化して平均した：（■）、転移１〜９（４８時間間隔、１６ｍｇ  ｄｃｗ／ｌの接種材料）；（▲）、転移１０〜１４（４８時間間隔、１ｍＭベタイン、１６ｍｇ  ｄｃｗ／ｌの接種材料）；（▼）、転移１５〜２４（２４時間間隔、１ｍＭベタイン、１０ｍｇ  ｄｃｗ／ｌの接種材料）；（□）、転移２４〜３４（２４時間間隔、１ｍＭベタイン、１０ｍｇ  ｄｃｗ／ｌの接種材料）；（◆）、転移３５〜３８（２４時間間隔、１ｍＭベタイン、１０ｍｇ  ｄｃｗ／ｌの接種材料）；図Ａ。Ｙ軸は、産生したエタノール（ｇ／リットル）を示す。図Ｂ。Ｙ軸は、細胞質量を示す。
【図３】図３（Ａ〜Ｄ）は、組み換え大腸菌による９（Ｗ／Ｖ）％キシロースの発酵を表しているグラフである。図Ａ及びＢは、培地組成物（ルリアブロス及びＮＢＳ無機塩培地＋１ｍＭベタイン）の影響を示す。図Ｃ及びＤは、メチルグリオキサルシンターゼ突然変異（ＮＢＳ無機塩＋１ｍＭベタイン）の影響を示す。全てに対するシンボル：（*）、ＫＯ１１、ＮＢＳ培地にて生育；（□）、ＫＯ１１、ルリアブロスにて生育；（▲）、ＬＹ１６８、ＮＢＳ培地にて生育；（●）、ＬＹ１６８、ルリアブロスにて生育；（△）、ＬＹ１６５、ＮＢＳ培地にて生育。
【図４】図４（Ａ〜Ｄ）は、９（Ｗ／Ｖ）％キシロースを含有しているＮＢＳ無機塩培地におけるキシロース発酵の産物を示すグラフである。図Ａ、ＫＯ１１株、１ｍＭベタイン添加；図Ｂ、ＬＹ１６５株、ベタイン無し；図Ｃ、ＬＹ１６５株、１ｍＭベタイン添加；図Ｄ、ＬＹ１６８株、１ｍＭベタイン添加。
【図５】図５（Ａ及びＢ）は、株を向上させるための生育に基づく選択を明示しているグラフである。ＬＹ１６８は、２４時間隔で連続して２９回転移させた、エタノール産生性についての生育に基づく選択としてのＡＭ１培地（９％キシロース）中の１０ｍｇ乾燥細胞重量（ｄｃｗ）／ｌの接種材料であった。ＬＹ１６８ｉｍ株を最終転移物から単離した。転移をグループ化して平均した：（○）、転移１〜５；（■）、転移６〜１０；（▲）、転移１１〜１５；（▼）、転移１５〜２０；（◆）、転移２０〜２５；（●）、転移２６〜２９；図Ａ。Ｙ軸は、産生したエタノール（ｇ／リットル）を示す。図Ｂ。Ｙ軸は、細胞質量を示す。
【図６】図６（Ａ及びＢ）は、株を向上させるための生育に基づく選択を明示しているグラフである。ＬＹ１７２は、２４時間隔で連続して１５回転移させた、エタノール産生性についての生育に基づく選択としてのＡＭ１培地（９％キシロース）中の１０ｍｇ乾燥細胞重量（ｄｃｗ）／ｌの接種材料であった。ＬＹ１７２ｉｍ株を最終転移物から単離した。転移をグループ化して平均した：（○）、転移１〜５；（■）、転移６〜１０；（◆）、転移１１〜１５；図Ａ。Ｙ軸は、産生したエタノール（ｇ／リットル）を示す。図Ｂ。Ｙ軸は、細胞質量を示す。
【図７】図７（Ａ及びＢ）は、株を向上させるための生育に基づく選択を明示しているグラフである。ＬＹ１７８は、２４時間隔で連続して１２回転移させた、エタノール産生性についての生育に基づく選択としてのＡＭ１培地（１０％キシロース）中の１０ｍｇ乾燥細胞重量（ｄｃｗ）／ｌの接種材料であった。ＬＹ１８０株を最終転移物から単離した。転移をグループ化して平均した：（○）、転移１〜５；（■）、転移６〜１０；（◆）、転移１１〜１２；図Ａ。Ｙ軸は、産生したエタノール（ｇ／リットル）を示す。図Ｂ。Ｙ軸は、細胞質量を示す。
【図８】図８（Ａ及びＢ）は、株を向上させるための生育に基づく選択を明示しているグラフである。ＬＹ１８０は、２４時間隔で連続して２５回転移させた、エタノール産生性についての生育に基づく選択としてのＡＭ１培地（１４％キシロース）中の１０ｍｇ乾燥細胞重量（ｄｃｗ）／ｌの接種材料であった。ＬＹ１８６株を最終転移物から単離した。転移をグループ化して平均した：（○）、転移１〜５；（■）、転移６〜１０；（▲）、転移１１〜１５；（▼）、転移１５〜２０；（◆）、転移２０〜２５；図Ａ。Ｙ軸は、産生したエタノール（ｇ／リットル）を示す。図Ｂ。Ｙ軸は、細胞質量を示す。
【図９】図９（Ａ及びＢ）は、Ｋ．オキシトカ株ＢＷ２１（○）、ＢＷ３４（●）、ＢＷ３５（■）及びＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６（□）による、生育（Ａ）及びＯＵＭ１における９０ｇ／Ｌグルコースからのエタノール産生（Ｂ）を明示しているグラフである。
【図１０】図１０（Ａ〜Ｃ）は、エタノール産生性のＫ．オキシトカ株Ｐ２（■）；ＳＺ２２（□）；ＢＷ２１（●）、ＢＷ３４（○）、及びＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６（▲）による、（Ａ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０／セルロースｇ、（Ｂ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／セルロースｇ及び（Ｃ）１００  ５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／セルロースｇを用いる、１００ｇ／Ｌ  ＳｉｇｍａｃｅｌｌのＳＳＦにおける、エタノール産生を明示しているグラフである。
【図１１】図１１（Ａ〜Ｃ）は、（Ａ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇ、（Ｂ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇ及び（Ｃ）１００μｌ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇを用いる、ＳｉｇｍａｃｅｌｌのＳＳＦにおける残余糖類（１４４時間）を明示しているグラフである。＊キシロースとして暫定的に同定した。
【図１２】図１２（Ａ〜Ｃ）は、（Ａ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０／セルロースｇ、（Ｂ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／セルロースｇ及び（Ｃ）１００μｌのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／セルロースｇを用いる、１００ｇ／Ｌ  Ｓｉｇｍａｃｅｌｌからの、ＳＳＦにおける、産物形成（１４４時間）を明示しているグラフである。
【図１３】図１３（Ａ及びＢ）は、Ｋ．オキシトカ株ＢＷ２１（■）、ＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６（●）及びＢＷ３４（○）による、５０μＬのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇ（Ａ）及び５０μＬのＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇ（Ｂ）を用いる、４０ｇ／Ｌキシロース及び４５ｇ／ＬＳｉｇｍａｃｅｌｌのＳＳＣＦにおける、エタノール産生（実線）並びにキシロースの消費（点線）を明示しているグラフである。
【図１４】図１４（Ａ及びＢ）は、（Ａ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇ及び（Ｂ）５０μｌのＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇを用いる、４０ｇ／Ｌキシロース及び４５ｇ／Ｌ  ＳｉｇｍａｃｅｌｌのＳＳＣＦにおける、エタノール産生性のＫ．オキシトカのｂｕｄＡＢ株による、産物形成（１４４時間）を明示しているグラフである。
【図１５】図１５（Ａ及びＢ）は、（Ａ）５０μＬのＳｐｅｚｙｍｅＣＥ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇ及び（Ｂ）５０μＬのＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ｇを用いる、４０ｇ／Ｌキシロース及び４５ｇ／ＬＳｉｇｍａｃｅｌｌのＳＳＣＦにおける、残余糖類を明示しているグラフである。＊キシロースとして暫定的に同定した。
【図１６】図１６は、Ｋ．オキシトカＢＷ３４によるＳＳＦ（１００ｇ／Ｌ  Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ）及びＳＳＣＦ（４０ｇ／Ｌキシロース及び４５ｇ／ＬＳｉｇｍａｃｅｌｌ）における単位酵素当たりの、セルロースからの、エタノール産生を明示しているグラフである。ＳＳＣＦでは、添加したキシロースからの９５％の理論的収量（１９．４ｇ／Ｌ）が見なされた。Ｓｐｅｚｙｍｅタイプ及び酵素の負荷は指定される。
【図１７】図１７は、Ｋ．オキシトカ株による酸加水分解バガスのＳＳＦ間のエタノール産生を明示しているグラフである。
【図１８】図１８（Ａ〜Ｃ）は、３つの概略図である。Ａ及びＢは、ｃａｔ欠失（１回目）のために用いたプラスミドを示す。図Ｃは、ｃａｔ欠失（１回目）の地図である。
【図１９】図１９（Ａ〜Ｃ）は、３つの概略図である。Ａ及びＢは、ｃａｔ欠失（２及び３回目）のために用いたプラスミドを示す。図Ｃは、ｃａｔ欠失（２及び３回目）の地図である。
【図２０】図２０は、大腸菌のｐｆｌＢ部位へのアルコール遺伝子の組み込みのために用いたプラスミドを示す図式である。
【図２１】図２１は、大腸菌のｒｒｌＥ部位へのアルコール遺伝子の組み込みのために用いたプラスミドを示す図式である。
【図２２】図２２は、クレブシエラ菌のｐｆｌＢ部位へのアルコール遺伝子の組み込みのために用いたプラスミドを示す図式である。
【図２３】図２３は、クレブシエラ菌のｒｒｌＥ部位へのアルコール遺伝子の組み込みのために用いたプラスミドを示す図式である。
【図２４】図２４は、クレブシエラ菌のｐｆｌＢ部位でのアルコール遺伝子の組み込みを示す地図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
（発明の詳細な説明）
本発明の全範囲を明確に理解するために、以下に定義を示す。
Ｉ．定義
「宿主」及び「宿主細菌」という用語は、互換可能に用いられ、例えば天然の細菌又は組み換え細菌のような細菌を含有することを意図していて、そこから本発明の組み換え細菌が生成される宿主細胞として働くものである。従って、本発明の組み換え細菌はこの宿主細菌に「由来する」と言える。
【００５３】
「細菌に由来するポリヌクレオチド又は遺伝子」にあるような、用語「由来する」は、指定の供給源（即ち、細菌）からのポリヌクレオチド断片の（全体的又は部分的）単離、又は指定供給源（即ち、細菌）からのポリペプチドの精製を含有することを意図している。これに関して、この用語は、例えば直接的クローニング、ＰＣＲ増幅、又は指定のポリヌクレオチド源に関連する配列由来の若しくはそれに基づく人工的な合成を含むことを意図している。
【００５４】
本明細書に用いる用語「組み換え細菌」、「組み換え宿主細胞」、「組み換え微生物」等は、遺伝子操作に適している若しくはそれを受ける、又はトランスフェクションにより異種ポリヌクレオチド配列を組み込むための細胞を含有することを意図している。細胞は微生物又は高等真核細胞であってよい。この用語は、元来トランスフェクトされている宿主細胞の子孫を含むことを意図している。いくつかの態様では、宿主細胞は、例えばグラム陽性細菌細胞又はグラム陰性細菌細胞のような細菌細胞である。グラム陽性細菌宿主細胞は、例えばバチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、ザイモモナス属（Zymomonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ジオバチラス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属（Streptococcus）及びユーバクテリウム属（Eubacterium）を含有する。グラム陰性細菌宿主細胞は、エシェリキア属（Escherichia）、シゲラ属（Shigella）、シトロバクター属（Citrobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クルイヴェラ属（Kluyvera）、セラチア属（Serratia）、セデセア属（Cedecea）、モルガネラ属（Morganella）、ハフニア属（Hafnia）、エドワードジエラ属（Edwardsiella）、プロビデンシア属（Providencia）、プロテウス属（Proteus）、及びエルシニア属（Yersinia）のような、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）ファミリーの全ての条件的嫌気性グラム陰性細胞を含有する。好ましい組み換え宿主は、大腸菌（Escherichia coli.）及びクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca.）細胞である。
【００５５】
本明細書で用いる「遺伝子」は、例えば、ポリペプチドをコードする連続オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のようなコーディング配列を包含してもよく、又はそれ自身が生命体内で機能を有していてもよい、酵素又は他のポリペプチド分子を直接合成することができる核酸である。生命体内の遺伝子は、本明細書で定義されるように、オペロンに集合させることができ、ここにおけるオペロンは、遺伝子間ＤＮＡによって他の遺伝子及び／又はオペロンから分離される。オペロン中に含まれる個々の遺伝子は、個々の遺伝子の間にある遺伝子間ＤＮＡなしで、重なり合うことができる。更に、「遺伝子」という用語は、選択された目的のための特定の遺伝子を含むことを意図している。遺伝子は、宿主細胞に内因性であってもよいし、例えばエピソームに保持されたプラスミド又はゲノムに安定に組み込まれたプラスミド（又はその断片）のように、宿主細胞に組み換え技術によって導入されていてもよい。異種遺伝子は、細胞内に導入される遺伝子であり、その細胞自生のものではない。本発明によれば、異種遺伝子は、細胞のゲノム内にその天然の部位以外の部位で細胞に導入されている内因性遺伝子も含有している。
【００５６】
用語「異種エタノール産生遺伝子」は、何れかの供給源、例えば真核生物、原核生物、ウィルス、又は合成ポリヌクレオチド断片に由来して、発酵主生成物としてのエタノールの産生に関与するポリペプチドをコードして、及び遺伝子がその自生ではない宿主細胞に組み込まれる、遺伝子またはその部分を含有することを意図している。用語「異種エタノール発酵遺伝子」は、糖質の発酵、例えば生命体が産生するエタノールを発酵主生成物として産生するような生命体の代謝経路に関与するポリペプチドをコードして、生命体に自然に存在していない、例えば生命体に組み込まれる遺伝子のような、遺伝子も意味している。用語「異種エタノール産生遺伝子」及び「異種エタノール発酵遺伝子」は、互換可能に用いることができて、糖質のエタノールへの生物変換の少なくとも一工程に関与する遺伝子を含有することを意図している。従って、この用語は、アルコールデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、分泌タンパク質（複数を含む）、又はポリサッカラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ又はエクソグルカナーゼのようなグルカナーゼ）、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルクロニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドロラーゼ、又はペクチン酸リアーゼのような、ポリペプチドをコードする遺伝子の何れかを含むことを意図している。
【００５７】
語句「異種エタノール産生遺伝子の全相補体」は、異種エタノール産生遺伝子がそこから得られる／それに由来しているエタノール産生性の生命体中で発達して、その生命体の天然のエタノール産生性経路を含有している遺伝子の全てを実質的に含むことを意味している。異種エタノール産生遺伝子の全相補体は、発酵主生成物としてエタノールを産生しない酵素に関与する代謝経路（「代替代謝経路」）から離れた発酵を指示するエタノール産生性の生命体の遺伝子の全てを実質的に含有している。そのような代替代謝経路は、ピルビン酸代謝の代替経路及びＮＡＤＨ酸化の発酵経路を含んでいる。例えば、１つのエタノール産生性細菌である、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）の異種エタノール産生遺伝子の全相補体は、ｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢ遺伝子を含有している。１つのエタノール産生性酵母である、サッカロミセス・セレビジア（Saccharomyces cerevisiae）の異種エタノール産生遺伝子の全相補体は、４つ又は５つの異なるａｄｈ遺伝子、例えばアルコールデヒドロゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ（ａｄｈＩ〜ＩＶ）（Drewke et al. 1988; Reid et al. 1994）及び２つの異なるｐｄｃ遺伝子を含有している。本発明の実施態様に従い、組み換え大腸菌ＫＯ１１（ＡＴＣＣ５５１２４）（Ohta et al. 1991）を宿主細胞として用いることができる。ＫＯ１１は、ｐｄｃ及びａｄｈＢ遺伝子のみをコードして、本発明の異種エタノール産生遺伝子の全相補体を有していない、Ｚ．モビリスカセットを含有していている。対照的に、ＫＯ１１に由来する本発明の新規の組み換え大腸菌株ＬＹ１６５（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５２)及びＬＹ１６８（ＮＲＲＬ  Ｂ−３０９５３)は、ｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢをコードするので本発明による異種エタノール産生遺伝子の全相補体を有しているＺ．モビリスカセットを含有していている。
【００５８】
語句「ピルビン酸代謝の代替経路」は、ＮＡＤＨ酸化の発酵経路のサブセットを含むこと意図している。この語句は、発酵主生成物としてエタノールを産生しない酵素に関与する代謝経路を含むことを意味している。そのような代替経路の１つの例は、発酵主生成物として乳酸塩及びコハク酸塩を産生する経路を含んでいる。そのような経路の他の例は、無駄な経路である。１つの浪費的経路は、本発明の好ましい経路にあるように、エタノール１モル当たり１モルではなく、２モルのＮＡＤＨを酸化して、最終的収率を減少させる。ピルビン酸代謝の無駄な代替経路の例は、アルコールデヒドロゲナーゼＥ（ａｄｈＥ）及び酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）のような酵素に関与する経路を含有する。ピルビン酸代謝の代替経路の更なる例は、ｌｄｈＡ（乳酸デヒドロゲナーゼ）によってコードされる経路を含んでいる。ｌｄｈＡは、ＮＡＤ＋乳酸塩を産生するＮＡＤＨ＋ピルビン酸の代謝の１つの酵素経路をコードする。ピルビン酸代謝の代替経路の更に別の例は、ピルビン酸塩からの最終生成物がコハク酸塩であるときに、共にＮＡＤＨをＮＡＤ＋に酸化するＮＡＤＨ及びピルビン酸に加えて、フマル酸還元酵素複合体（ＦＲＤオペロン）の４つのサブユニットをコードする遺伝子に関与する経路を含んでいる。用語「ピルビン酸代謝の代替経路」は、ある特定の態様において、ＮＡＤＨ酸化の発酵経路のサブセットを包含している。
【００５９】
用語「リボソームＲＮＡオペロン」は、群及びその関連プロモーター及びオペレータとして発現されるリボソームＲＮＡ遺伝子のクラスターを示すことを意図している。７つのリボソームＲＮＡオペロンがあって、ｒｒｌＡ、ｒｒｌＢ、ｒｒｌＣ、ｒｒｌＤ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＧ、及びｒｒｌＨと称される（Lindhal et al. 1986; Nomura et al. 1984）。変換により、用語「ｒｒｌＥ」は、３つのリボソームＲＮＡｓの全てをコードする遺伝子の１つのセットを示し、一方用語「ＲＲＬＥ」は、ｒｒｌＥ遺伝子産物、即ち２３Ｓ、１６Ｓ、５ｓのｒｒｌＥリボソームＲＮＡ分子を示す。ｒｒｌＥ等価物は全てではないがほとんどの生命体に存在する。例示的なｒｒｌＥ配列は、ＧｅｎｅＩＤ番号９８４５０９に特定されるものである。各々のｒＲＮＡオペロンは、多種ｔＲＮＡ遺伝子を組み込んだ、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子及び５ＳｒＲＮＡ遺伝子を含有する。ｒｒｌＤオペロンは２つの５ＳｒＲＮＡを含有している。「ｒｒｓ」遺伝子は１６ＳｒＲＮＡをコードし、「ｒｒｌ」遺伝子は２３ｒＲＮＡをコードし、そして「ｒｒｆ」遺伝子は５ＳｒＲＮＡをコードする。
【００６０】
用語「不活性化される」「不活性化する」は、それにより遺伝子がその意図とするポリペプチドをコードすること又はその意図とするポリペプチドの活性形態をコードすることを停止する何れかの手段を含むことを意図している。従って、この用語は、例えば突然変異、欠失、挿入、複製、ミスセンス、フレームシフト、反復、ナンセンス突然変異、又は遺伝子の活性（即ち、転写）を阻害するような他の改変及び修飾を含んでいる。例えば、本発明の一態様に従って、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を阻害するか或いは産生するエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が、欠失により不活性化される。
【００６１】
用語「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」（ｐｄｃ）は、発酵中のピルビン酸をエタノールへ誘導するよう機能する酵素を包含するように意図されている。変換により、用語「ｐｄｃ」は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの遺伝子を示し、一方用語「ＲＤＣ」は、ｐｄｃ遺伝子産物、即ちピルビン酸デカルボキシラーゼポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｐｄｃ配列は、Conway et al.によって記述されている、Ｚ.モビリスｐｄｃであり（J. Bacteriol. 169(3) 949-954(1987)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＡＡ２７６９６に示される。
【００６２】
用語「アルコールデヒドロゲナーゼＡ」（ａｄｈＡ）、「アルコールデヒドロゲナーゼＢ」（ａｄｈＢ）及び「アルコールデヒドロゲナーゼＥ」（ａｄｈＥ）は、発酵条件下でアセトアルデヒドをエタノールに変換する酵素を含むことを意図している。変換により、用語「ａｄｈＡ」「ａｄｈＢ」又は「ａｄｈＥ」は、アルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子を示し、一方用語「ＡＤＨＡ」「ＡＤＨＢ」又は「ＡＤＨＥ」は、それぞれ、ａｄｈＡ、ａｄｈＢ又はａｄｈＥの遺伝子産物、即ちアルコールデヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なａｄｈＡ配列は、Keshav et al.によって記述されているＺ.モビリスａｄｈＡであり（J. Bacteriol. 172(5), 2491-2497(1990)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＡＡ２７６８２に示される。例示的なａｄｈＢ配列は、Conway et al.によって記述されているＺ.モビリスａｄｈＢであり（J. Bacteriol. 169(6), 2591-2597(1987)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＡＡ２７６８３に示される。例示的なａｄｈＥ配列は、Kessler et al.によって記述されている大腸菌ａｄｈＥであり（FEBS Lett. 281(1-2), 59-63(1991)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＣＡＡ４１９５５に示される。
【００６３】
用語「ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域」（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域）は、ピルビン酸代謝に関与するｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ遺伝子を含有することを意図している。用語「ピルビン酸ギ酸リアーゼ」（ｐｆｌＢ）は、発酵条件下でピルビン酸をアセチルＣｏＡ及びギ酸塩に変換する酵素を含むことを意図している。変換により、用語「ｐｆｌＢ」は、ピルビン酸ギ酸リアーゼの遺伝子を示し、一方用語「ＰＦＬ」は、ｐｆｌ遺伝子産物、即ちピルビン酸ギ酸リアーゼのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｐｆｌＢ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２ｐｆｌＢであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１５４２４に示される。
【００６４】
用語「乳酸デヒドロゲナーゼ」（ｌｄｈＡ）は、発酵条件下でピルビン酸を乳酸塩に変換する酵素を含むことを意図している。変換により、用語「ｌｄｈＡ」は、乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子を示し、一方用語「ＬＤＨＡ」は、ｌｄｈＡ遺伝子産物、即ち乳酸デヒドロゲナーゼのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｌｄｈＡ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２ｌｄｈＡであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１５８９８に示される。
【００６５】
用語「酢酸キナーゼ」（ａｃｋＡ）は、ピルビン酸代謝の代替経路をコードする酵素を含むことを意図している。変換により、用語「ａｃｋＡ」は、酢酸キナーゼの遺伝子を示し、一方用語「ＡＣＫＡ」は、ａｃｋＡ遺伝子産物、即ち酢酸キナーゼのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なａｃｋＡ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２ａｃｋＡであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１６７９９に示される。
【００６６】
用語「ｆｒｄオペロン」は、フマル酸還元酵素複合体（Ａ−Ｄ）を含有している４つのサブユニットを含むことを意図している。変換により、用語「ｆｒｄオペロン」は、４つのサブユニットをコードする遺伝子を示し、一方用語「ＦＲＤオペロン」は、４つのサブユニットをコードするタンパク質を示す。例示的なフマル酸還元酵素Ａ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２フマル酸還元酵素Ａであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１８５７８に示される。例示的なフマル酸還元酵素Ｂ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２フマル酸還元酵素Ｂであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１８５７７に示される。例示的なフマル酸還元酵素Ｃ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２フマル酸還元酵素Ｃであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１８５７６に示される。例示的なフマル酸還元酵素Ｄ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２フマル酸還元酵素Ｄであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１８５７５に示される。
【００６７】
用語「ｃａｓＡＢ」（ｃａｓＡＢ）は、セロビオースを発酵させる、酵素ＥｎｚｙｍｅＩＩセロビオース及びホスホβグルコシダーゼを含有することを意図している。変換により、用語「ｃａｓＡＢ」は、ｃａｓＡＢ遺伝子を示し、一方用語「ＣＡＳＡＢ」は、ｃａｓＡＢ遺伝子産物、即ちｃａｓＡＢ酵素を示す。例示的なｃａｓＡ及びｃａｓＢの配列は、Lai et al.によって記述されているＫ.オキシトカｃａｓＡ（セロビオースに特異的なＰＴＳペルメアーゼ）であり（Appl. Environ. Microbiol. 63(2), 355-363(1997)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＡＢ５１５６３に示され、そしてLai et al.によって記述されているＫ.オキシトカｃａｓＢ（ホスホ−セロビオース）であり（Appl. Environ. Microbiol. 63(2), 355-363(1997)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＡＢ５１５６４に示される。ある特定の態様では、ｃａｓＡＢ遺伝子はクレブシエラ・オキシトカ由来である。
【００６８】
用語「ｃｅｌＹ」（ｃｅｌＹ）は、酵素エンドグルカナーゼＹを含むことを意図している。変換により、用語「ｃｅｌＹ」は、ｃｅｌＹ遺伝子を示し、一方用語「ＣＥＬＹ」は、ｃｅｌＹ遺伝子産物、即ちｃｅｌＹ酵素を示す。例示的なｃｅｌＹ配列は、Guiseppi et al.によって記述されている黒脚病菌（E.chrysanthemi）ｃｅｌＹ（エンドグルカナーゼＹ）であり（Gene 106(1), 109-114(1991)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号Ｍ７４０４４に示される。
【００６９】
用語「メチルグリオキサルシンターゼＡ」（ｍｇｓＡ）は、メチルグリオキサルバイパス経路の第一段階で酵素ｍｇｓＡをコードする酵素を含むことを意図している。変換により、用語「ｍｇｓＡ」は、メチルグリオキサルシンターゼの遺伝子を示し、一方用語「ＭＧＳＡ」は、ｍｇｓＡ遺伝子産物、即ちメチルグリオキサルシンターゼＡのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｍｇｓ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２ｍｇｓであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１５４８３に示される。
【００７０】
用語「短鎖エステラーゼ」（ｅｓｔＺ）は、シュードモナス・プチダ(Psedomonas putida)（ＮＲＲＬ Ｂ−１８４３５）からの短鎖エステラーゼをコードする酵素を含有することを意図している。変換により、用語「ｅｓｔＺ」は、短鎖エステラーゼ遺伝子を示し、一方用語「ＥＳＴＺ」は、ｅｓｔＺ遺伝子産物、即ち短鎖エステラーゼのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｅｓｔＺ配列は、Hasona et al.によって記述されているＰ.プチダｅｓｔＺであり（Appl. Environ. Microbiol. 68(6), 2651-2659(2002)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＡＡＭ１６２６９に示さる。
【００７１】
用語「ｌａｃオペロン」は、１つの調節遺伝子（ｉ遺伝子）及び３つの構造遺伝子（ｚ、ｙ及びａ）を含有することを意図している。変換により、用語「ｌａｃオペロン」は、それらの遺伝子を示し、一方用語「ＬＡＣオペロン」は、４つの遺伝子をコードするタンパク質を示す。ｉ遺伝子はｌａｃオペロンのリプレッサーをコードする。ｚ遺伝子はβ−ガラクトシダーゼをコードし、ｙ遺伝子はペルメアーゼをコードし、そしてａ遺伝子はトランスアセチラーゼをコードする。
【００７２】
用語「ｌａｃＡ」（ｌａｃＡ）は、乳酸代謝に関与する酵素である、ガラクトーストランスアセチラーゼを含有することを意図している。変換により、用語「ｌａｃＡ」は、ガラクトーストランスアセチラーゼ遺伝子を示し、一方用語「ＬＡＣＡ」は、ｌａｃＡ遺伝子産物、即ちガラクトーストランスアセチラーゼ遺伝子のポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｌａｃＡ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２ｌａｃＡであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１４８７６に示される。
【００７３】
用語「ｌａｃＹ」（ｌａｃＹ）は、乳酸代謝に関与する酵素である、ペルメアーゼを含有することを意図している。変換により、用語「ｌａｃＹ」は、ペルメアーゼ遺伝子を示し、一方用語「ＬＡＣＹ」は、ｌａｃＹ遺伝子産物、即ちペルメアーゼのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｌａｃＹ配列は、Riley et al.によって記述されている大腸菌Ｋ−１２ｌａｃＹであり（Nucleic Acids Res. 34(1), 1-9(2006)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿４１４８７７に示される。
【００７４】
用語「クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ」（ｃａｔ）は、クロラムフェニコールに対する抗生物質耐性をもたらす酵素を含有することを意図している。変換により、用語「ｃａｔ」は、クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ遺伝子を示し、一方用語「ＣＡＴ」は、ｃａｔ遺伝子産物、即ちクロラムフェニコールトランスアセチラーゼのポリペプチド又は酵素を示す。例示的なｃａｔ配列は、Parkhill et al.によって記述されているＳ.エンテリカｌａｃＹであり（Nature 413(6858), 848-852(2001)）、ＧｅｎＢａｎｋアセッション番号ＮＰ＿５６９４０６示される。
【００７５】
用語「発酵（fermentation)」及び「発酵する(fermenting)」は、嫌気性条件下で複合糖を分解又は解重合して、この糖残渣をエタノール、乳酸塩、酢酸塩及びコハク酸塩に生物変換することを含むことを意図している。この用語は、エタノールが、特に発酵主生成物として糖質から産生される、酵素の処理工程（例えば、細胞性又は無細胞性（例えば、溶解又は精製されたポリペプチド混合物）を包含することを意図している。
【００７６】
用語「無機塩培地」は、最小量の栄養素、例えば本質的に無機塩及び他の必須栄養素からなるが、本発明の組み換え生命体、例えば組み換え細菌が複合栄養素の添加を必要とせずに嫌気性条件下で成長して発酵主生成物としてエタノールを産生することを可能にするもの、を含有する培地を含むことを意図している。具体的には、本発明の新規な大腸菌ＬＹ１６５組換え細菌は、複合栄養素を含まない無機塩培地中で生育したときに約４４．９ｇ／Ｌの率でエタノールを産生し、そして本発明の新規な大腸菌ＬＹ１６８組換え細菌は、複合栄養素を含まない無機塩培地中で生育したときに約４５．５ｇ／Ｌの率でエタノールを産生するであろう。対照的に、ＫＯ１１は無機塩培地中で生育したときに約２６．９ｇ／Ｌの率で、複合栄養素を添加した後にのみ４３．２ｇ／Ｌの率でエタノールを産生する。（下記の実施例を参照されたい。）
【００７７】
用語「グラム陰性細菌」は、この用語の当該技術分野で認識されている定義のものを含むことを意図している。例示的なグラム陰性細菌は、アシネトバクター属（Acinetobacter）、グルコノバクター属（Gluconobacter）、エシェリキア属（Escherichia）、ザイモモナス属（Zymomonas)、ジオバクター属（Geobacter）、シェワネラ属（Shewanella）、サルモネラ属（Salmonella）、シゲラ属（Shigella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、シトロバクター属（Citrobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、セラチア属（Serratia）、プロテウス（Proteus）、ハフニア属（Hafnia）、エルシニア属（Yersinia）、モルガネラ属（Morganella）、エドワードシエラ属（Edwardsiella）及びクレブシエラ属（Klebsella）を包含する。
【００７８】
用語「グラム陽性細菌」は、この用語の当該技術分野で認識されている定義のものを含むことを意図している。例示的なグラム陽性細菌は、バチルス属（Bacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）、オエノコッカス属（Oenococcus）、連鎖球菌属（Streptococcus）及びユーバクテリウム属（Eubacterium）を包含する。
【００７９】
用語「エタノール産生性」は、糖質から発酵主生成物としてエタノールを産生する能力を有する細胞を含むことを意図している。この用語は、天然のエタノール産生性の生命体、天然の又は導入された突然変異を有するエタノール産生性の生命体、及び糖質から発酵主生成物としてエタノールを産生するように遺伝子を組み換えた生命体を含むことを意図している。
【００８０】
用語「エタノール非産生性」は、糖質から非気体状発酵主生成物としてエタノールを産生できない細胞；すなわち、エタノールを少量発酵生成物として産生する細胞、を含むことを意図している。
【００８１】
用語「発酵主生成物」は、総非気体状生成物の約４０％、５０％，６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％超を構成する非気体状発酵生成物（例えば、エタノール）を含むことを意図している。発酵主生成物は、最も大量の非気体状生成物である。本発明のある特定の態様では、発酵主生成物がエタノールである。更なる態様では、発酵主生成物は、無機塩培地中で生育する宿主によって産生される。
【００８２】
本明細書で用いられている用語「少量発酵生成物」は、総非気体状生成物の４０％未満、例えば、２０％、３０％、４０％を構成する発酵非気体状生成物（例えば、エタノール）を含むことを意図している。
【００８３】
用語「嫌気性条件」は、有酸素環境に存在するよりも有意に少ない酸素がある条件を含むことを意図している。特定な態様では、有酸素環境に存在しているものよりも４０％、５０％，６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％少ない酸素が存在している。
【００８４】
用語「同時糖化発酵」又は「ＳＳＦ」は、複合糖の分解又は解重合、及び発酵によるその糖残基のエタノールへの生物変換を同時に行うための、１つ又はそれ以上の組み換え宿主（又は、それらの抽出物（精製又は未精製の抽出物を含む））の使用を含むことを意図している。ＳＳＦは、バイオマスを分解して、最終的に細菌でエタノールに変換されるポリサッカライドにすることができる、公知の方法である。バイオマスの分解が自然に起こるものと見なすと、ＳＦＦは、菌類（又は菌類から抽出されるセルラーゼのような酵素）の活性と、エタノール産生性の細菌（又はそれから誘導される酵素）の活性を組み合わせて、リグノセルロースのような糖源をエタノールに最終的に変換可能な単糖に分解する。ＳＳＦ反応は一般に、高価な菌体酵素の使用を最適化するために酸性のｐＨで実施される。
【００８５】
用語「相同的組み換え」は、２つの相同ＤＮＡ分子間で生じるＤＮＡの遺伝交差を示す。本発明によると、相同的組み換え（すなわち、ｐｆｌＢ機能を修復する相同的組み換え）は遺伝子の間で生じて、遺伝子機能を修復することができる。その他の態様では、相同的組み換えを抗生物質耐性マーカーを除去するために用いることができる。
【００８６】
用語「サッカライド」、「サッカライド源」、「オリゴサッカライド源」、「オリゴサッカライド」、「複合セルロース」、「複合糖質」、「複合糖」、「ポリサッカライド」、「糖源」、「発酵性糖源」などは、１個又はそれ以上の糖分子を含有する何れかの糖質源を含むように意図されている。
糖は、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、シュクロース、及びラクトースを包含する。
本明細書で用いるような用語「サッカライド」は、例えば、ジサッカライド、トリサッカライド、オリゴサッカライド及びポリサッカライドも含む。これらの糖質は、何れかの未処理植物原料又は何れかの加工植物原料からの由来であってもよい。例としては、１つ以上の結合した糖質部分（すなわち１個の糖残基）を包含する、木材、紙、パルプ、植物由来の繊維又は合成繊維である。
一つの具体的なサッカライド源は、「リグノセルロース」であり、これは、殆どの植物材料の乾燥重量の約９０％に相当し、そして糖質、例えば、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、及び芳香族ポリマー（例えば、リグニン）を含む。セルロースは、リグノセルロースの乾燥重量の３０％〜５０％を占め、そしてセロビオース（グルコースの２量体）のホモポリマーである。同様に、ヘミセルロースは、リグノセルロースの乾燥重量の２０％〜５０％を占め、そしてアセチル及びグルクロニル側鎖を含有するペントース（キシロース、アラビノース）及びヘキソース（グルコース、マンノース、ガラクトース）糖の混合物を含む複合ポリマーである。ペクチンは、リグノセルロースの乾燥重量の１％〜２０％を占め、そしてグルクロン酸のメチル化ホモポリマーである。
その他のサッカライド源は、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、非晶性セルロース（例えば、酸膨張セルロース（acid-swollen cellulose)）、及びセロオリゴサッカライドセロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、及びセロペンタオースを含む。セルロース、例えば、非晶性セルロースは、紙又はパルプ源（例えば、それらの廃液を含む）又は例えば、トウモロコシの茎、大豆可溶分、又はビートパルプのような農業副産物からの由来であってよい。上記糖質ポリマーの何れか一つ又はそれらの組み合わせは、本発明の生成物及び方法による発酵によって、解重合及び続くエタノールへの生物変換のための糖源になり得る。
【００８７】
「組み換え細菌の取得」にあるような用語「取得」は、組み換え細菌の購入、製造（調製）、遺伝子組み換え、又はその他の入手法を含むことを意図している。
【００８８】
「組み換え細菌を提供する」にあるような用語「提供」は、組み換え細菌の販売、流通、又はその他の提供を含むことを意図している。
【００８９】
生物名の後の括弧内に現れる番号の前の「ＡＴＣＣ」は、American Type Culture Collection, 10801 University Blvd. Manassas, Va. 2011-2209 に寄託された生物を示す。
【００９０】
生物名の後の括弧内に現れる番号の前の「ＮＲＲＬ」は、National Center for Agricultural Utilization Research, 1815 North Unuversity Street, Peoria, Illinois 61604-3999 に寄託された生物を示す。
【００９１】
ＩＩ．組み換え細胞
検討したように、本発明は糖を分解するのに適している、新規で遺伝子を組み換えた細胞、特に組み換え細菌を提供する。この細胞は、特に無機塩培地中で、改良されたエタノール産生能を有している。この細胞は異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含んでいる。異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現は、組み換え細胞が発酵主生成物としてエタノールを産生することを誘発する。
【００９２】
本発明は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含有するように遺伝的に組み換えられている組み換え細胞の作成の基準として役立つ宿主細胞も提供する。従って、この宿主細胞は、線虫、昆虫、は虫類、鳥、両生動物、又は哺乳動物のような高等真核生物の細胞であってよい。細胞は、真菌、酵母、若しくは細菌のような単細胞又は多細胞微生物の細胞であってもよい。それらから由来する組み換え宿主細胞及び組み換え細胞は、遺伝子操作に、又はトランスフェクションによって異種ポリヌクレオチド配列を組み入れるのに、適しているか又はそれを受けやすい細胞を含むことを意図している。組み換え宿主細胞は最初にトランスフェクトされた宿主細胞の子孫を包含する。
【００９３】
従って、本発明の適切な組み換え宿主細胞は、例えば、サッカロミセス・セレビジアのような、酵母細胞を包含する。本発明によるその他の酵母細胞は、例えば、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、パチオソレン属、クルベロミセス属、デバリオミセス属、ヤロウイア属及びピキア属を包含する。
【００９４】
宿主細胞は非組み換え又は組み換え細菌性宿主細胞であってよい。
ある特定の態様では、本発明による細菌性宿主細胞は、グラム陽性細菌、例えば、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ゲオバチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オイネコッカス属、ストレプトコッカス属及び連鎖球菌を包含する。
別の態様では、細菌性宿主細胞はグラム陰性細菌を包含して、例えば、アシネトバクター属、グルコノバクター属、エシェリキア属、ザイモモナス属、ジオバクター属、シェワネラ属、サルモネラ属、シゲラ属、エンテロバクター属、シトロバクター属、エルウィニア属、セラチア属、プロテウス属、ハフニア属、エルシニア属、モルガネラ属、エドワードシエラ属、及びクレブシエラ属包含する。
本発明による典型的な細菌性宿主細胞は、例えばエシリシア・コリＢ（ＡＴＣＣ１１３０３）のような非組み換え細菌、及び例えば大腸菌（E.coli） ＫＯ１１（ＡＴＣＣ５５１２４）（Ohta et al., 1991）のような組み換え細菌を包含する。これらは、無機塩培地におけるキシロースからエタノールを産生する率によっても特定できる。例えば、エシリシア・コリは複合栄養素の存在下の無機塩培地中で、９．１グラム／リットルのエタノールを産生し、そして大腸菌ＫＯ１１株（ＡＴＣＣ１１３０３）は、複合栄養素の存在下の無機塩培地中で、４３．２グラム／リットルのエタノールを産生し、そして複合栄養素の非存在下の無機塩培地中で、２６．９グラム／リットルのエタノールを産生する。
【００９５】
検討したように、本発明は異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含有する組み換え細胞、特に組み換え細菌を提供する。本発明の組み換え細菌は、無機塩培地で生育すると発酵主生成物としてエタノールを産生することができる。
【００９６】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体は、生命体のエタノールを産生する天然の経路を含んでいる遺伝子が由来しているエタノール産生性生命体中で進展している、全ての遺伝子を実質的に含んでいる。本発明の範囲内に含まれるものは、酵母及びグラム陽性もしくはグラム陰性細菌に由来する異種エタノール産生遺伝子である。従って、本発明による組み換え生命体の構築に用いるための、適切な異種ポリヌクレオチド配列は、例えば、ザイモモナス・モビリス及びサッカロミセス・セレビシ、更にザイモバクター・パルマー、アセトバクター・パステウリアヌス及びサルシニア・ベンツリキュリ（Sarcinia ventriculi; 国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０２５１１７号（本明細書に参照として取り込んである）、Talarico et al. 2005）のような、天然のエタノール産生性生命体由来の、ａｄｈ及び／又はｐｄｃ遺伝子に由来する。本発明で用いるためのエタノール産生性遺伝子を得ることができるその他の天然のエタノール産生性生命体は、菌類及び殆どの植物を包含する。
【００９７】
全相補体を含むエタノール産生遺伝子の１つ又はそれ以上は、異なった生命体又は同じ生命体に由来していてもよい。有利な態様では、全相補体を含む遺伝子は同じ生命体に由来している。
【００９８】
本発明の一態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含む遺伝子は、ｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢである。有利な態様では、ｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢ遺伝子は、天然のエタノール産生性細菌である、ザイモモナス・モビリス由来である。
【００９９】
本発明の範囲内に含まれるものは、天然のエタノール産生遺伝子とは異なる異種エタノール産生遺伝子又は遺伝子産物である。これは例えば、突然変異、挿入もしくは欠失されている核酸を有しているが、本発明の天然の遺伝子産物と実質的に同様な又は機能的に同等なポリペプチド、例えば、発酵中にピルビン酸の流れをエタノールへ移動させるのに役立つピルビン酸デカルボキシレートを有する突然変異ポリペプチド、をコードする遺伝子である。
【０１００】
例えば、保存アミノ酸置換をコードする核酸を変異できる（例えば、置換により）ことは、当業者によく理解されるであろう。更に、天然の遺伝子産物中のアミノ酸を、天然の遺伝子産物と比較して、遺伝子産物の機能に実質的に影響を及ぼさずに（例えば、発酵中にピルビン酸の流れをエタノールへ移動させるのに役立つピルビン酸デカルボキシレートの生物学的機能に影響を及ぼさずに）、ある程度まで置換、付加又は欠失できるということは、当業者によく理解されるであろう。これらのよく理解できる原則は、本発明の範囲内に包含される。従って、ある態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体が、例えば、天然のザイモモナス・モビリスのｐｄｃ、ａｄｈＡ及びａｄｈＢ遺伝子を含んでいるが、全相補体の１つ又はそれ以上の遺伝子は、天然のエタノール産生遺伝子、例えばザイモモナス・モビリスのエタノール産生遺伝子の突然変異体であってもよい。
【０１０１】
本発明の特定な態様では、異種エタノール産生遺伝子の全相補体が宿主細胞のリボソームＲＮＡオペロンに組み込まれる。リボソームＲＮＡオペロンは細胞、特に微生物、特に細菌の全てとは言わないが殆どによって共有されている。上記のように、ｒｒｌＡ、ｒｒｎｌＥ、ｒｒｌＣ、ｒｒｌＤ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＧ、及びｒｒｌＨと呼ばれる、７つのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）オペロンがある（Lindhal et al., 1986; Nomura et al., 1984）。慣例によると、用語「ｒｒｎｌＥ」はリボソームＲＮＡ（２３Ｓ、１６Ｓ及び５Ｓ）をコードするｒｒｎｌＥ遺伝子を示すのに対して、用語「ＲＲＬＥ」はｒｒｎｌＥ遺伝子産物、すなわち、リボソームＲＮＡポリペプチドを示す。ｒｒｎｌＥ等価物は全てではないが殆どの生命体に存在している。典型的なｒｒｎｌＥ配列は、GeneID number ９４８５０９４で規定される。それぞれのｒＲＮＡオペロンは、多種のｔＲＮＡ遺伝子がちりばめられている、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、２３ＳｒＲＮＡ遺伝子、及び５ＳｒＲＮＡ遺伝子を含有している。ｒｒｎＤオペロンは、２つの５ＳｒＲＮＡ遺伝子を含有している。「ｒｒｓ」遺伝子は１６ＳｒＲＮＡをコードし、「ｒｒｌ」遺伝子は２３ＳｒＲＮＡをコードし、そして「ｒｒｆ」遺伝子は５ＳｒＲＮＡをコードする。有利な態様では、ＲＮＡオペロンがｒｒｌＡ、ｒｒｌＢ、ｒｒｌＣ、ｒｒｌＤ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＧ及びｒｒｌＨよりなる群から選ばれる遺伝子を含有している。
【０１０２】
別の態様では、本発明は本明細書で先に記載したような、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含む組み換え細菌を提供し、そこでは１つ又はそれ以上の抗生物質マーカーが除去されている。一般に、抗生物質マーカーをコードする遺伝子は、遺伝子組み換え技術において用いられて、特定の遺伝子型／表現型の存在を同定又はマークする。ある特定の態様では、発酵主生成物としてエタノールを産生する、本発明の組み換え生命体は抗生物質マーカーの存在によって阻害できる。従って、このような抗生物質マーカーは、有利に組み換え生命体から除去される。ある態様では、除去の標的とされる抗生物質マーカーは、例えば、アパラマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン及びクロラムフェニコールよりなる群から選ばれるようなものを包含する。ある特定の態様では、アパラマイシン及びカナマイシンのマーカーが除去される。
【０１０３】
更に別の態様では、本発明は本明細書で先に記載したような、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含む組み換え細菌を提供し、そこでは異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノー産生を抑制するか又は産生するエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子が不活性化されている。本発明によると、その転写が異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を阻害するか或いは産生するエタノールの量を減少する、宿主細胞に存在する何れかの遺伝子を不活性化の標的にできる。不活性化の標的にされうる遺伝子は、これに限定されないが、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域、ｌｄｈＡ、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄオペロン、ｃａｓＡＢ及びｍｇｓＡを含む遺伝子を包含する。
【０１０４】
従って、ある特定の態様では、ＮＡＤＨ酸化の全ての発酵経路に関わるポリペプチドをコードする遺伝子が不活性化される。特定の態様では、ピルビン酸代謝の代替経路に関わるポリペプチドをコードする遺伝子が不活性化される。そのような遺伝子は、例えば、ａｃｋＡ及びａｄｈＥを包含する。ａｃｋＡ及びａｄｈＥは一緒になって、ある態様では、ＮＡＤＨを用いる無駄な経路であるとして除去できる、無駄なエタノール産生経路を形成する。ＬＤＨＡは、ピルビン酸から乳酸への同時産生−還元によるＮＡＤＨの酸化を除去した。
【０１０５】
ある有利な態様では、ｍｓｇＡ遺伝子が欠失によって不活性化される。この遺伝子は、大腸菌における重要な乳酸源であって、解糖及び巨大分子の合成を減速する過剰な経路である、メチルグリオキサルバイパス（Methylglyoxal Bypass）に関わるタンパク質をコードする（Totemeyer et al., 1998, Zhu et al., 2001）。
【０１０６】
ある特定な態様では、この遺伝子は宿主細胞に対して内因性である。内因性遺伝子は、これに限定されないが、ｌｄｈＡ、ａｃｋＡ、ａｄｈＥ、ｆｒｄオペロンを含む遺伝子、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子領域を含む遺伝子、及びｍｇｓＡを包含する。別の態様では、この遺伝子は宿主細胞に対して異種である。異種遺伝子は、これに限定されないが、ｃａｓＡＢを包含する。
【０１０７】
別の態様では、本発明は本明細書で先に記載したような、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含む組み換え細菌を提供し、そしてそれは更に異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか、或いはエタノールの産生量を増加するポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を含んでいる。このような遺伝子は内因性であっても異種であってもよく、当業者によく知られている様々の技術によって宿主細胞に組み込まれる。
【０１０８】
別の態様では、本発明は本明細書で先に記載したような、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含む組み換え細菌を提供し、そしてこの組み換え細菌は本発明の何れかの態様に記載されているような方法の工程からなる処理過程によって作成される。
【０１０９】
異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を促進するか、或いはエタノールの産生量を増加するポリペプチドをコードする何れかの遺伝子を宿主細胞へ組み込む標的にできる。このような遺伝子は、例えば、分泌タンパク質、ポリサッカラーゼ（例えば、エンドグルカナーゼ又はエクソグルカナーゼのようなグルカナーゼ）、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、エンド−１，４−β−キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、α−グルコニダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、プルラナーゼ、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、アラビノシダーゼ、マンナナーゼ、ペクチンヒドラーゼ、及びペクチン酸リアーゼをコードするようなものを包含する。  天然の遺伝子又は天然の遺伝子由来の遺伝子を組み込むことができる。従って、本発明のこの態様は、天然の遺伝子とは異なり、例えば、突然変異、挿入又は欠失しているが、天然遺伝子産物と実質的に同様で機能的に同等なポリペプチドをコードする核酸を有する遺伝子を包含する、遺伝子又は遺伝子産物を含んでいる。
ある特定な態様では、遺伝子、例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のｅｓｔ遺伝子（ＮＲＲＬ Ｂ−１８４３５）がエステラーゼをコードする。ｅｓｔＺ遺伝子の組み込みは、エタノール産生の少量副産物である、酢酸エチル生成の減少を促進する。最終精製工程でのエタノールから酢酸エチルの分離は工程のコストを増大する。産生されるエタノールの収率の増大が顕著でなくても、酢酸エチルの生成が減少すれば、エタノールの精製コストの変化がより顕著になると言う点で、エタノールの産生は促進される。考慮すべきその他の追加の遺伝子は、これに限定されないが、例えば、低分子サッカライド及びポリサッカライドの加水分解酵素をコードする遺伝子、例えばクレブジエラ・オキシトカ（K. oxytoca）由来のｃａｓＡＢ及びエルウィニア・クリサンセミ（E. chrysanthemi）由来のエンドグルカナーゼをコードするｃｅｌＹ及びｃｅｌＺを包含する。
【０１１０】
別の態様では、遺伝子、例えば大腸菌のｌａｃＡ及びｌａｃＹ遺伝子が、それぞれ、ガラクトーストランスアセチラーゼ及びペルメアーゼをコードする。
更に別の態様では、典型的な遺伝子は、分泌タンパク質をコードするもの、例えばｐｕｌ及びｏｕｔ遺伝子（国際特許出願公開第ＷＯ２０００／０７１７２９号）、低分子サッカライド及びポリサッカライドの加水分解酵素をコードするもの、例えばクレブジエラ・オキシトカ由来のｃａｓＡＢ（米国特許第６，１０２，６９０号）、エルウィニア・クリサンセミ由来のエンドグルカナーゼをコードするｃｅｌＹ及びｃｅｌＺ（米国特許第７，０２６，１５２号）及びグルコース取り込み経路をコードする遺伝子（米国特許第５，６０２，０３０号）を包含する。
【０１１１】
本発明で提供される組み換え生命体は、発酵主生成物としてエタノールを産生するそれらの能力によって特定化される。これらは無機塩培地で生育したときの発酵主生成物としてエタノールを産生するそれらの能力によって更に特定化される。検討したように、本発明の組み換え生命体は異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含んでいるので、エタノール産生性である。エタノール産生性とは、産生されたエタノールが、総非気体状生成物の４０％、５０％，６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％以上を含むことを意図している。発酵主生成物は、嫌気性条件下、特に無機塩培地中で生育したときに生成する、最も大量の非気体状生成物である。
【０１１２】
本発明の典型的な組み換え生命体は大腸菌の新規な株、ＬＹ１６５（ＮＲＲＬＢ−３０９５２）及びＬＹ１６８（ＮＲＲＬＢ−３０９５３）である。本発明の一態様によると、これらの新規な大腸菌株は、宿主細胞として用いられる組み換え大腸菌ＫＯ１１（ＡＴＣＣ５５１２４）（Ohta et al, 1991）から作成する。本発明の別の態様によると、これらの新規な大腸菌株は、大腸菌ＳＺ１１０株（ＮＲＲＬＢ−３０９５１）から作成する。これらの新規な株を作成する方法は以下の実施例に記載されている。
【０１１３】
本発明の組み換え細菌、例えば大腸菌ＬＹ１６５株（ＮＲＲＬＢ−３０９５２）及びＬＹ１６８株（ＮＲＲＬＢ−３０９５３）は、無機塩培地中で生育すると、発酵主生成物としてエタノールを産生する。無機塩培地は、本発明に従って嫌気性条件下で、複合栄養素を添加せずに、本発明の組み換え細菌を生育することが可能な培地である。
本発明の特定な態様では、本発明の無機塩培地は、１リットル当たり：３．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、５．０ｇのＫ２ＨＰＯ４、３．５ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇのチアミン、及び１ｍＬの微量金属ストックを含有していて、２（ｗ／ｖ）％〜９（ｗ／ｖ）％のキシロースで補完してあるものと定義することができる。微量金属ストックは０．１ＭのＨＣｌ中で調製することができる（１リットル当たり：１．６ｇのＦｅＣｌ３、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣｕＣｌ２、０．２ｇのＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＮａＭｏＯ４、０．０５ｇのＨ３ＢＯ３）（Causey et al., 2003）。有利な態様では、細菌の浸透圧保護剤として公知の、ベタインを無機塩培地に添加してもよい。
別の態様では、無機塩培地を、１リットル当たり：示したように、２．６３ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８７ｇのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、０．３７５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１４９ｇのＫＣｌ、０．１６３ｇのベタインＨＣｌ（ｐＨ７．４）、及び１．５ｍＬの微量金属ストックを含有していて、２（ｗ／ｖ）％〜１４（ｗ／ｖ）％の糖で補完してある、ＡＭ１培地として定義できる。この無機塩培地は、ＡＭ１培地として文献に記載されている（Martinez et al., 2007）。更なる態様では、微量金属ストックは０．１ＭのＨＣｌ中で調製できる（１リットル当たり：１．６ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＺｎＣｌ２、０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＨ３ＢＯ３、０．３３ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）。
【０１１４】
ＩＩＩ．作成方法
本発明は前記の特性を有する組み換え生命体を作成する方法を提供する。従って、別の態様では、本発明は異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含有している組み換え細菌を作成する方法を提供し、ここでは異種エタノール産生遺伝子の全相補体の発現が、組み換え細菌に発酵主生成物としてエタノールを産生するように誘発する。この方法は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体を宿主細菌に組み込み、それによって発酵主生成物としてエタノールを産生する組み換え細菌を作成する工程を含んでいる。
【０１１５】
エタノール産生性組み換え微生物の作成方法は分子生物学の分野で公知である。適切な原料及び方法及び組み換え宿主生命体は、例えば、米国特許第７，０２６，１５２号、同第６，８４９，４３４号、同第６，３３３，１８１号、同第５，８２１，０９３号、同第５，４８２，８４６号、同第５，４２４，２０２号、同第５，０２８，５３９号、同第５，０００，０００号、同第５，４８７，９８９号、同第５，５５４，５２０号、及び同第５，１６２，５１６号及び国際特許出願公開第ＷＯ２００３／０２５１１７号（参照として本明細書に取り込まれている）に記載されていて、本発明を実施するために用いることができる。
【０１１６】
本発明の細菌は異種エタノール産生遺伝子の全相補体を含有している。遺伝子の全相補体は核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子又はその断片）、例えば、生命体内で他の遺伝子（複数を含む）から、遺伝子間のＤＮＡ（すなわち、元来生命体の染色体ＤＮＡ中で遺伝子に隣接していて、そして又は遺伝子を分離する介在又はスペーサーＤＮＡ）によって分離される、ポリペプチド又はＲＮＡをコードする核酸分子を包含する。遺伝子は、酵素又はその他のポリペプチド分子の合成を指示でき（例えば、コード配列、例えば、ポリペプチドをコードする連続したオープン・リーディング・フレームを含むことができる）、又はそれ自体が生命体中で作動できる。生命体にある遺伝子は、本明細書で定義されるように、オペロン中で密集でき、そこで遺伝子間ＤＮＡによってオペロンが別の遺伝子及び／又はオペロンから分離する。オペロン内に含まれている個々の遺伝子は遺伝子間ＤＮＡなしで、個々の遺伝子の間で重なり合うことができる。本発明の範囲内に、プロモーター部位が欠失しているオペロン（例えば、ｆｒｄオペロン）である、プロモーターを持たないオペロンも含まれる。
【０１１７】
本明細書に記載されているような単離された遺伝子は、この遺伝子が由来している生命体の染色体ＤＮＡ中の遺伝子に元来隣接している配列を本質的に有しておらず（すなわち、
第２の又は異なったポリペプチド又はＲＮＡ分子をコードする、隣接コード配列、隣接構造配列などがない）、５’及び３’調節配列、例えばプロモーター配列及び／又はターミネータ配列を任意に含んでいる遺伝子を包含する。単離された遺伝子は主にポリペプチドをコードする配列（例えば、ＰＤＣポリペプチドをコードする配列）を含んでいる。
【０１１８】
上記のように、異種エタノール産生遺伝子の全相補体は宿主細胞に取り込まれる。ある特定の態様では、この宿主細胞は細菌であって、「親株」とも呼ばれる。
ある態様では、親株が非組み換え細菌である。例えば、親株は天然のエタノール非産生性細菌、例えば大腸菌Ｗであってよい。
【０１１９】
本発明の別の態様では、親株が組み換え生命体であってよい。このような態様では、親株は、例えば無機塩培地で生育したときに、この株によって産生されるエタノールの量を減少させるポリペプチドをコードする野生型及び異種の遺伝子を含んでいてよい。野生型の遺伝子は親株に存在している遺伝子を包含する。異種の遺伝子は親株に加えられた外来遺伝子を包含する。
【０１２０】
本発明の方法で用いられる典型的な宿主細胞は、例えば、大腸菌株ＫＯ４（ＡＴＣＣ５５３１２３）、ＫＯ１１（ＡＴＣＣ５５１２４）及びＫＯ１２（ＡＴＣＣ５５１２５）、及びクレブジエラ・オキシトカＰ２株（ＡＴＣＣ５５３０７）（米国特許第５，８２１，０９３号）を包含する。適切な宿主細胞のその他の例は、大腸菌（ＡＴＣＣ１１３０３）、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＫＯ４（ＡＴＣＣ５５３１２３）、大腸菌ＬＹ０１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３４６６）、大腸菌Ｗ（ＡＴＣＣ９６３７）、及びＫ．オキシトカＭ５Ａ１（ＡＴＣＣ６８５６４）を包含する。
【０１２１】
本発明は、本明細書に記載されている組み換え生命体を作成する方法の多種の態様も包含する。従って、一態様では、この方法は、異種エタノール産生遺伝子の全相補体をリボソームＲＮＡオペロンへ取り込むことを更に含む。有利な態様では、リボソームＲＮＡオペロンは、ｒｒｌＡ、ｒｒｌＥ、ｒｒｎＣ、ｒｒｌＤ、ｒｒｌＥ、ｒｒｌＧ及びｒｒｌｎＨよりなる群から選ばれる遺伝子を含んでいる。別の有利な態様では、リボソームＲＮＡオペロンはｒｒｌＥを含んでいる。
【０１２２】
更に別の態様では、方法は更に、１つ又はそれ以上の抗生物質マーカーを除去することを含む。一態様では、抗生物質マーカーは、アプラマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン及びクロラムフェニコールよりなる群から選ばれる。抗生物質マーカーは当該技術分野で公知の多種の方法の何れかによって、マーカーをコードする遺伝子を不活性化して（例えば、欠失して）除去することができる。有利な態様では、抗生物質マーカー、例えば、カナマイシン及びアプラマイシン、をコードする遺伝子が、リコンビナーゼを用いる、相同的組み換えによって除去される。
【０１２３】
更に別の態様では、方法は更に、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノール産生を阻害するか或いはエタノールの産生量を減少させるポリペプチドをコードする１つ又はそれ以上の遺伝子を不活性化することを含む。本発明によると、遺伝子が対象とするポリペプチドを発現すること、又はその対象とするポリペプチドの活性形態を発現することを妨げることによる、当業者に公知の、多くの方法の何れかでこのような遺伝子を不活性化する。従って、このような遺伝子を、例えば、突然変異、欠失、挿入、重複、ミスセンス、フレームシフト、反復、ナンセンス突然変異、又は遺伝子活性（すなわち、転写）を阻害するか、又は転写が機能的に不活性なポリペプチドをもたらすようにする改変もしくは修飾によって、不活性化する。本発明の有利な態様によれば、遺伝子は欠失によって不活性化される。
【０１２４】
更なる態様では、本発明は更に、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を促進するか若しくは産生されるエタノールの量を増加させるポリペプチドをコードする、１つ又はそれ以上の異種遺伝子を組み込むことを含んでいる。異種エタノール産生遺伝子の全相補体を組み込むために用いられる前記の方法と全く同じ方法を、異種エタノール産生遺伝子の全相補体によるエタノールの産生を促進するか若しくは産生されるエタノールの量を増加させるポリペプチドをコードする、１つ又はそれ以上の異種遺伝子を組み込むために用いることができる。
【０１２５】
当業者は、前記の例に基づき、そして細菌株に共通する相同性に基づくと、本発明の方法は本願中で教示されているものに限定されないということを認識できるだろう。
【０１２６】
ＩＶ．使用方法−エタノールを産生する方法
本発明の組み換え細菌はオリゴ糖源からエタノールを産生する。従って本発明は、当該オリゴ糖を、エタノール産生に適切な条件下で、本発明の組み換え細菌と接触させ、それによってオリゴ糖源からエタノールを産生する方法を提供する。一態様では、オリゴ糖及び組み換え細菌を、ベタインを含有していてもよい無機塩培地中で接触させる。特定の有利な態様では、組み換え細菌は無機塩培地で生育して、発酵主生成物として高力価でエタノールを産生する。
【０１２７】
本発明の方法によれば、本明細書に記載の組み換え細菌は複合サッカリドを分解若しくは解重合して、単糖類にする。その後、この組み換え細菌は、それらが担持している異種エタノール産生遺伝子の全相補体により、単糖類を発酵によって異化してエタノールにする。複合サッカリドの低分子糖残基への解重合、それに続く発酵の一連の工程を、同時糖化発酵（ＳＳＦ）と称する。
【０１２８】
一般的に、発酵条件は、産生宿主細胞株の最大生育速度を促進するのに最適なｐＨ及び温度、及び培養によって産生する酵素の触媒条件をもたらすように選択される（Doran et al., (1993) Biotechnol. Progress. 9:533-538）。様々な発酵条件の例が、米国特許第５，４８７，９８９号及び同第５，５５４，５２０号に開示されている。ある特定の態様では、最適な条件は、約２５℃〜約４３℃の範囲の温度及び約４．５〜８．０の範囲のｐＨを包含する。その他の条件は実施例で検討されている。更に、本発明の発酵反応を最適化するためには、当該技術分野で公知の技術を用いる、通常の実験のみが必要であるということを、当業者は当然理解できるであろう。
【０１２９】
現在、リグノセルロースのような複合サッカリドの変換は、非常に複雑で多段階の工程である。例えば、リグノセルロースは最初に酸加水分解を用いて分解又は解重合しなければならない。続いて固体から液体を分離する工程があって、これらの産物を次いで洗浄して中和してセルロースを得て、これは更に解重合できて最終的に適当なエタノール産生性宿主細胞によって発酵される。一方、トウモロコシの発酵は、実質的に１段階の工程で、エタノール産生性宿主による迅速な生体変換するためにコーンスターチを分解するのにアミラーゼを用いることができるとういう点で、非常に単純である。
【０１３０】
従って、本発明の組み換え宿主及び方法を、リグノセルロースを発酵する、同様により単純且つより効率的な工程で使用できることを当業者は当然理解できるだろう。例えば、本発明の方法は、酸加水分解を完全に避ける方法を包含するように意図されている。更に、本発明の宿主は、次の長所を有している：１）ペントースとヘキソースを共発酵する能力；２）耐毒素性；３）同時糖化発酵のための酵素の産生；及び４）環境耐性。従って、リグノセルロースを解重合する複雑さを、本発明の改善された生体触媒を用いることによって単純化することができる。実際に、本発明の好ましい一態様では、反応を、例えば、ＳＳＦ工程として、単一の反応容器中で、酸加水分解せずに実施することができる。
【０１３１】
本発明の一つの長所は、今まで活用されていなかったサッカリド源を使用できることである。その結果、多数の複合サッカライド物質を、本発明の組み換え細菌及び方法を用いる、解重合及びそれに続く発酵のための出発物質として用いことができる。理想的には、再生可能な資源をＳＳＦ工程で使用できる。混合廃棄事務用紙は好ましい基質であって（Brooks et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625; Ingram et al., (1995) 米国特許第５，４２４，２０２号）、酸で前処理したサトウキビの搾りかす（バガサス紙）（Doran et al., (1994) Bitech. Bioeng. 44:240-247）又は高度に精製した結晶セルロース（Doran et al., (1993) Biotecnol. Progress. 9:533-538）よりも容易に分解される。グルカナーゼ（エンドグルカナーゼ及びエクソグルカナーゼの両方）はセルロース結合ドメインを含有していて、分解されなかったセルロース残基を遠心分離を用いて採集することによる再発酵に、これらの酵素を容易に再利用することができる（Brooks et al., (1995) Biotechnol. Progress. 11:619-625）。再利用工程の数は高リグニン含量の基質によって制限される得るが、精製したセルロースによってこの手法は功を奏する。本発明の範囲内であるその他の基質原料は、処理済み又は未処理の植物性材料、例えば、芝生の切り落とし、トウモロコシの皮、トウモロコシの穂軸、茎、葉、繊維、パルプ、麻、おがくず、新聞紙などを包含する。
【０１３２】
上で述べたように、本発明で提供される組み換え生命体は、特に無機塩培地中で生育したときに、発酵主生成物としてエタノールを産生する。無機塩培地中で、本発明の新規な組み換え大腸菌ＬＹ１６８は複合栄養素の不存在下で、４５．５ｇ／Ｌの率でエタノールを産生し、そして新規な組み換え大腸菌ＬＹ１６５は複合栄養素の不存在下で、４４．９ｇ／Ｌの率でエタノールを産生する。これに対して、大腸菌ＫＯ１１は無機塩培地で複合栄養素の不存在下で、２６．９ｇ／Ｌの率で、そして複合栄養素の添加後に４３．２ｇ／Ｌの率でエタノールを産生する。従って、本発明の大腸菌ＬＹ１６８及びＬＹ１６５は無機塩培地中でそして添加が不要でコストが高い複合栄養素なしで、大腸菌ＫＯ１１より多くのエタノールを産生する。
【０１３３】
本発明を以下の実施例を参照して更に説明するが、これは限定するものとして解釈されるものではない。
（実施例）
材料及び方法
以下の材料及び方法は以下の実施例を通して用いられる。
１．生命体及び培養条件
株及びプラスミド
以下の表１は、本発明の組み換え微生物を構築するために使用される生命体及びプラスミドを記載する。
【０１３４】
【表１】
0005616061.tif 000002
0005616061.tif 000003
0005616061.tif 000004
【０１３５】
大腸菌ＤＨ５α、Ｓ１７−１λpir、及びＴＯＰ１０Ｆ’は構築の宿主として用いて、ＬＢ培地中で生育させた。アンピシリン（５０ｍｇ／リットル）、カナマイシン（５０ｍｇ／リットル）、クロラムフェニコール（４０ｍｇ／リットル）及びアプラマイシン（５０ｍｇ／リットル）を選択のために適切に添加した。温度条件付きプラスミドを３０℃で生育させ、他の全ては３７℃で生育させた。
【０１３６】
組み換えエタノール産生性株を、１リットル当たり３．５ｇのＫＨ２ＰＯ４、５．０ｇのＫ２ＨＰＯ４、３．５ｇの(ＮＨ４)２ＨＰＯ４、０．２５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇのチアミン及び１ｍＬの微量金属ストックを、２〜９（ｗ／ｖ）％のキシロースを補完して含有している、ＮＢＳ無機塩培地（Causey et al., 2003）中で生育させた。ベタイン（１ｍＭ）及びＭＯＰＳ（４−モルホリンプロパンスルホン酸）緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）を、記述（Underwood et al. 2004）のように、指示されるときに添加した。
【０１３７】
ＬＹ１６８をより経済的な無機塩培地中で発育させた後、１リットル当たり２．６３ｇの(ＮＨ４)２ＨＰＯ４、０．８７ｇのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、０．３７５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１４９ｇのＫＣＬ、０．１６３ｇのベタインＨＣＬ（ｐＨ７．４）及び１．５ｍＬの微量金属ストックを、２〜１４（ｗ／ｖ）％の糖を指示されるように補完して含有している、ＡＭ１培地を用いた（Martinez et al., 2007）。微量金属ストックは、０．１ＭのＨＣＬ（１リットル当たり１．６ｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＺｎＣｌ２、０．２ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０５ｇのＨ３ＢＯ３、０．３３ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）に調製できる。
【０１３８】
エタノール産生性株は、既述のように（Conway et al. 1987）、アルコールデヒドロゲナーゼ活性についてアルデヒド指標プレート上でスクリーニングした。エステラーゼ活性を、既述のように（Hasona et al. 2002）、メチルレッドアッセイを用いて試験した。セロビオースの利用は、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天を用いて２％のセロビオースで評価した。エンドグルカナーゼ活性を、ＣＭＣ寒天プレート上で評価した（Wood et al. 1997）。
【０１３９】
２．遺伝子法
他に規定のない限り、プラスミド構築、形質転換、電気穿孔、接合及びＰＣＲ増幅について標準的方法を用いた（Miller, 1992; Sambrook & Russell 2001）。
【０１４０】
ｃａｔ−ｓａｃＢ手順
ｃａｔ−ｓａｃＢのカセットを用いる最初の組み換えでは、標的遺伝子の一部を、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）及びレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有しているＤＮＡカセットに置き換えた。第２の組み換えでは、ｃａｔ−ｓａｃＢのカセットを、スクロース耐性の選択によって除去して、次いでクロラムフェニコール感受性についてテストした。ｓａｃＢ遺伝子を含有している細胞を、スクロースでの培養の間にレバンを蓄積して、殺生する。生存する組み換え細胞は、ｃａｔ−ｓａｃＢのカセットの欠失に対して高度に富化されている。
【０１４１】
新たなカセットを、遺伝子欠失を促進するためのテンプレートとして構築した。ｃａｔ−ｓａｃＢ領域を、ｐＥＬ０４（Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005）からプライマー対ＪＭｃａｔｓａｃＢＮｈｅＩ（表２）を用いてＰＣＲにより初めに増幅し、ＮｈｅＩで消化し、改変して、そして改変されたｐＵＣ１９ベクター中に挿入されカセットに隣接するＰａｃＩ部位と連結させて、ｐＬＯＩ４１６２を作成した。ｃａｔ−ｓａｃＢのカセットは、ＰａｃＩで消化して、続くライゲーションに用いることができる。
記述する方法に用いるプライマーを以下の表２に記載する。
【０１４２】
【表２】
0005616061.tif 000005
【０１４３】
ＴａｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（QIAGEN, Inc., Valencia, CA）を欠失を構築して分析するために用いた。プラチナＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）及びＥａｓｙ−Ａ高適合ＰＣＲクローニング酵素（Stratagene, La Jolla, CA）を、染色体への組み込みのための機能遺伝子を増幅するために用いた。線形化したＤＮＡの組み込みは、プラスミドｐＫＤ４６（Datsenko & Wanner 2000）を用いて促進させた。ＦＲＴに隣接する抗生物質遺伝子を、続くリコンビナーゼでの除去を促進するための選択に用いた（Martinez-Morales et al. 1999; Posfai et al. 1997）。染色体の構築を、ＰＣＲ分析及び表現型により検証した。
【０１４４】
本発明のある特定の態様では、抗生物質マーカー、例えば抗生物質遺伝子マーカーを、相同的組み換えによって除去することができる。相同的組み換えは、標的ＤＮＡに部位特異的ブレークを導入するリコンビナーゼ、例えばｆｌｐリコンビナーゼを用いて実施される。
【０１４５】
３．発酵
発酵テストは、ＮＢＳ無機塩培地（指示される場合、９％キシロース及び１ｍＭベタイン）又は指示される場合９５若しくは１４％のキシロース中のＡＭ１培地を用いて、Underwood et al. 2004に記述のように、自動ｐＨ調整の発酵容器中（３７℃、ｐＨ６．５及び１５０ｒｐｍ；可動容量３５０ｍｌ）で実施された。プレ接種材料は、固定ねじ蓋式チューブ内の、９．０（Ｗ/Ｖ)％キシロース及び１ｍＭベタインを含有するＮＢＳ無機塩培地中で、２４〜４８時間３７℃で生育して、小さい発酵容器に移した。２４時間培養の後、ブロスを用いてテスト発酵のための接種を行った（１０〜１６ｍｇ  ｄｃｗ／ｌ接種材料）。場合によっては、向上した生育及びエタノール産生を共に選択するために、２４又は４８時間後、小規模発酵に連続的に移行した。播種及び発酵テストのブロスには抗生物質を添加しなかった。
【０１４６】
４．分析方法
細胞質量を、Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ（登録商標）７０分光光度計を用いて、５５０ｎｍでの最適密度から見積もった。エタノールは、ガスクロマトグラフィーで測定した（Ohta et al. 1991）。有機酸は、既述（Causey et al. 2003）のように、ＨＰＬＣによって確認した。
【実施例１】
【０１４７】
Ｚ．モビリスのエタノール遺伝子のための新規な宿主株の構築
エタノール産生（ｐｄｃ、ａｄｈＢ、ｃａｔ）遺伝子をコードするＺ．モビリスカセットをｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ領域（Zhou et al. 2005）を欠失することによってＫＯ１１から除去した。ａｃｋＡ及びａｄｈＥを含有している、ピルビン酸代謝の代替経路をコードする更なる遺伝子も、Ｄ（−）−乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）のみを残して欠失させた。得られた株、ＳＺ１１０及びその更なる派生物は、１ｍＭベタインを含む無機塩培地中で乳酸を高収率で産生した（Zhou et al. 2005, Zhou et al. 2006）。
【０１４８】
図１Ａを参照して、ＳＺ１１０株を、最初のｌｄｈＡの欠失によって、Ｚ．モビリス由来の新規なエタノール遺伝子を挿入するための宿主として組み換えた。表２に記載のプライマーを用いるｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへのクローニングの後、中央のＭｆｅＩからＳａｌＩの断片（４８４ｂｐ、Ｋｌｅｎｏｗで処理）を、ｐＬＯＩ３４２１（Wood et al. 2005）由来のＦＲＴに隣接するａａｃ遺伝子を含有している、Ｋｌｅｎｏｗで処理したＳｍａＩからＥｃｏＲＩの断片（１９４２ｂｐ）と置き換えて、ｐＬＯＩ３４９７を産生した。得られたカセット（ｌｄｈＡ’−ＦＲＴ−ａａｃ−ＦＲＴ−ｌｄｈＡ’）を、ＳＺ１１０へ組み込むための２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片として除去した。ａａｃのリコンビナーゼでの除去後に、得られた株をＬＹ１４９と称した。
【０１４９】
ＬＹ１４９株は、嫌気性ＮＡＤＨ酸化の主要経路全てを欠失していて、富化培地中でさえも糖類の発酵性生育を可能にしない。ＬＹ１４９におけるａｄｈＥ及びａｃｋＡの欠失によりｐｆｌＢの欠失が不要になるので、この領域を、大腸菌由来のｙｃａＮ’−ｆｏｃＡ領域を含有しているｐＬＯＩ３９０１（図１Ｂ）由来の９ｋｂ断片を用いる相同的組み換えにより回復させた。
【０１５０】
このプラスミドを構築するために、ｐｆｌＢ領域（ｙｃａＯ−ｙｃａＮ’）を、２ＰＣＲ断片として増幅させて、次の３つのピースのｐＬＯＩ３４９５中にアセンブルした：１）固有のＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結されるＨｉｎｄＩＩＩからＳｆｃＩ（Klenow）の断片（ｙｃａＮ'−ｙｃａＫ；７６４ｂｐ）；２）Ｋｌｅｎｏｗで処理したＳｐｅＩ部位に連結されるＫｌｅｎｏｗで処理したＳｆｃＩ断片（ｐｆｌＡ−ｐｆｌＢ；２，０８４ｂｐ）；３）ｐＬＯＩ３４９５の対応する部位に連結されるＡｓｃＩからＮｏｔＩの断片（ｐｆｌ'−ｙｃａＯ；４，６５７ｂｐ）。ｐＬＯＩ３９０１において、選択のためのＦＲＴに隣接するａａｃ遺伝子を、ｙｃａＫ及びｐｆｌＡ間に位置付けた。
【０１５１】
ＬＹ１４９株において、ｐｆｌＢの機能を、アプラマイシン耐性の選択でＮｏｔＩからＨｉｎｄＩＩＩの断片（ｙｃａＯ−ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ−ｐｆｌＡ−ＦＲＴ−ａａｃ−ＦＲＴ−ｒｒｎＢＴ１ターミネータ−ｙｃａＫ−ｙｃａＮ’）を用いる、相同的組み換えにより回復させた。得られた株をＬＹ１５１と称し；この株はピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）活性の指標となる、ギ酸を産生した。
【実施例２】
【０１５２】
Ｚ．モビリス由来のエタノール遺伝子の完全セットを含有するトランスポゾームの構築
以前の検討において、ＫＯ１１（Ohta et al. 1991）を構築するために大腸菌のｐｆｌＢプロモータの後にＺ．モビリス由来の遺伝子の無機セットを組み込んだ。対照的に、図１Ｃに示すように、新規なベクターｐＬＯＩ３４９１を用いて除去可能な抗生物質マーカーでの、エタノール遺伝子の完全セット（ｐｄｃ、ａｄｈＡ、及びａｄｈＢ）を含有するプロモータ無しのオペロンをランダムに組み込むための、Ｔｎ５トランスポゾンを用いる異なる取り組みを行った。
【０１５３】
プラスミドｐＬＯＩ３４９１は、Ｚ．モビリスａｄｈＡ遺伝子（リボソーム結合部位、及び隣接するＳｐｅＩ部位を含んでいる翻訳終結部位を含有するＰＣＲ産物；１,１５７ｂｐ、表２）をｐＬＯＩ２９５中のｐｄｃ及びａｄｈＢ間の固有のＳｐｅＩ部位に連結することにより構築した。得られたプロモータの無いオペロン（４，３５２ｂｐ）を、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化して除去して、ｐＬＯＩ３４７２中のＦＲＴ隣接ｋａｎ遺伝子に近接する対応部位に連結させた。この作成した５，５８７ｂｐのＰａｃＩに隣接するカセット（ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ）を、続いてｐＬＯＩ３４６９の固有のＰａｃＩ部位（直列のＴｎ５組み込み部位の間）に挿入して、ｐＬＯＩ３４９１を生成した（図１Ｃ)。この結合プラスミドも、組み込みの標的セグメントに対してトランスにＴｎ５トランスポザーゼ（ｔｎｐ）、ｂｌａ及び条件付きレプリコン（Ｒ６Ｋ）を含有していた。
【実施例３】
【０１５４】
新規なエタノール産生性大腸菌の組み込み及び選択
ドナー株Ｓ１７−λｐｉｒは、プロリンを要求する栄養要件のために、無機塩培地で生育できない。レシピエント株ＬＹ１５１は、ＮＡＤＨ酸化経路の欠失のために、発酵性生育ができない。ともにこれらは、抗生物質無しでの機能的選択を誘導するための固有の機会を提供している。グリコリシスによるＡＴＰ産生と生育が発酵経路の機能的発現と無条件に関連しているので、ＮＢＳ無機塩培地中の生育の選択を、エタノール産生カセットを担持しているランダムＬＹ１５１接合完了体のライブラリーからの、エタノール産生のための最適株（挿入の部位、発現レベル）を共に選択するために用いた。
【０１５５】
Ｓ１７−１λｐｉｒ（ｐＬＯＩ３４９１）及びＬＹ１５１を、ＬＢプレート（２％グルコース）上で結合させた。プールした結合完了体を、１リットルの容器中に接種して、縁までＮＢＳ無機塩培地（５％キシロース、１００ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ７．４）で満たして、３７℃（１５０ｒｐｍ）で培養した。培養の３日後に明らかな生育が見られ、この時点で１５−ｍｌねじ蓋培養チューブ中で４８時間間隔にて連続転移を開始して（０．１ｍｌ接種材料）、続いて小さいｐＨ調整発酵容器（３３ｍｇ  ｄｃｗ/ｌの接種材料）中で連続転移（ＭＯＰＳは除外）を実施した。
【０１５６】
この検討の工程中に、ベタインを補完することが、ＫＯ１１によるキシロースの発酵において有益であることが見出され（Underwood et al. 2004)、初めの１０回の転移の後に補完として含めた。ベタイン（１ｍＭ)を加えた培養物は、より迅速な生育のために２４時間間隔で転移させた。３８回の転移からなるこの富化工程を通して、細胞収率及びエタノール産生が安定して向上した。
【０１５７】
コロニーを最終転移物から単離した。全てが、アンピシリンに対して感受性であり、ベクターの欠如、アパマイシン耐性（レシピエント中で切断されたｌｄｈＡ遺伝子を確認している）、及びカナマイシン耐性（エタノールカセットに存在）を確認した。６つのクローンに小規模発酵における性能試験を施して、全てが非常に似ていた。２つのクローンを選択して、ＬＹ１５８及びＬＹ１５９と称した。
【０１５８】
リコンビナーゼを、両方の抗生物質マーカーを同時に除去するために用いた。ＬＹ１５８及びＬＹ１５９から得られたクローンの９９％超が、カナマイシン及びアパラマイシンの両方によって阻害された。それぞれからの１０クローンをプールして、更なる生育に基づく選択用の小さい発酵容器に接種するために用いた。ＮＢＳ−９％キシロース培地（１ｍＭベタイン）中で２４時間間隔の７回の転移の後に、１２クローンを単離して、小規模発酵で個別に試験した。全てが類似していて、２つを選択して、ＬＹ１６１及びＬＹ１６０と称した。ＬＹ１６０での更なる一連の３２回連続の転移（２４時間間隔）により、継続して能力が向上したことが示された。最終転移物から１クローンを選択して、ＬＹ１６０ｉｍと称した。
【実施例４】
【０１５９】
大腸菌ＬＹ１６０ｉｍ株におけるエタノール遺伝子の組み込み部位
遺伝子ライブラリーを、ＬＹ１６０ｉｍ株由来のＥｃｏＲＩで消化したＤＮＡを用いてｐＵＣ１８中に構築して、組み込まれたＺ.モビリス遺伝子を含有する断片を同定するために、アルデヒド指標プレート上でレッドコロニーに対するスクリーニングを実施した。１０．２ｋｂ挿入部（ｐＬＯＩ３９５１）を含有する１つのプラスミドを、サブクローニング及び部分的配列決定のために選択した。配列決定により、ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴカセットが、高度に発現するｒｒｎＢ遺伝子（２３ＳリボソームＲＮＡ）内に組み込まれたことが、転写の方向と共に明らかになった（図１Ｄに示されるように）。表２に示されるプライマーは、挿入部位が確認されたものを示した。
【実施例５】
【０１６０】
ｃａｓＡＢの欠失
キシロース−ＮＢＳ無機塩培地上の選択並びにＬＹ１６０及びＬＹ１６１の構築の工程中に、クレブシエラ・オキシトカｃａｓＡＢ遺伝子はｌａｃオペロンに組み込まれたままであったが、セロビオースの利用能力が低下した（Zouh et al. 2005）。図１Ｅに示すように、プラスミドｐＬＯＩ３９２４を、相同的組み換えによりこれらの乏しい機能遺伝子を欠失させるように構築した。
【０１６１】
ｌａｃＡ及びｌａｃＹの両方を、表２に示されるプライマーを用いて、及びテンプレートとしてＫＯ１１ＤＮＡを用いてＰＣＲにより別々に増幅させて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。プラスミドｐＬＯＩ３９２４を、以下の連続する３工程にて構築した：１）クローンｌａｃＡ断片（ＢａｍＨＩからＮｏｔＩまで；６４４ｂｐ）をｐＬＯＩ３４７０の対応する部位に連結すること；２）ｌａｃＹ（ＸｈｏＩからＫｌｅｎｏｗで処理したＢａｍＨＩまで；１，２９２ｂｐ）をＸｈｏＩ及びＫｌｅｎｏｗで処理したＥｃｏ０１０９Ｉ部位に連結すること；３）ｐＬＯＩ２５１１由来のＳｍａＩ断片（ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ；１，２２８ｂｐ）をＫｌｅｎｏｗで処理したＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩ（ｌａｃＹ内）部位に挿入すること。得られたプラスミドは、ＰａｃＩに隣接するｌａｃＹ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ−ｌａｃＡカセット（２，９８４ｂｐ）を含有していて、相同的組み換えによってＬＹ１６０ｉｍ中のｃａｓＡＢ遺伝子を置き換えるために用いた。リコンビナーゼでのｋａｎの欠失後、得られた株をＬＹ１６３と称した。
【実施例６】
【０１６２】
エステラーゼの付加
以前の検討では、ＫＯ１１由来の蒸留液中に低い濃度の酢酸エチルが存在していて、この問題はシュードモナス・プチダＮＲＲＬ  Ｂ−１８４３５由来の短鎖エステラーゼをコードするｅｓｔＺ遺伝子を機能的に組み込むことにより改善された（Hasona et al. 2002）。ＬＹ１６３への可能性のある損傷を最少限にするために、プローモーター選択を促進してｅｓｔＺを部分的に欠失したａｄｈＥ遺伝子への組み込みを可能にする新規なプラスミドを構築した。プロモータの無いａｄｈＥ（２，７１５ｂｐ）及びｅｓｔＺ（１，０８３ｂｐ）遺伝子を、表２に示されるプライマーを用いて、及びテンプレートとしてそれぞれにＮＣ３  ＤＮＡ及びｐＡＨ１８１を用いて増幅して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。ａｄｈＥの中央領域（ＢｇｌＩＩからＫｌｅｎｏｗで処理したＳａｌＩまで；１，４０８ｂｐ）を、ｅｓｔＺを含有しているＢｇｌＩＩからＫｌｅｎｏｗで処理したＥｃｏＲＩの断片（１，０８３ｂｐ）（リボソーム結合部位、コーディング領域及びターミネータ領域）と置き換えた。得られたａｄｈＥ'−ｅｓｔＺ'−ａｄｈＥカセット（Ｋｌｅｎｏｗで処理したＮｏｔＩからＢａｍＨＩの断片；２，４７１ｂｐ）を、ｐＬＯＩ３４７０のＫｌｅｎｏｗで処理したＨｉｎｄＩＩＩ（平滑）からＢａｍＨＩの領域（２０４ｂｐ）に連結した。ｐＬＯＩ３４２１由来のＦＲＴに隣接するａａｃ遺伝子を含有しているＳｍａＩ断片（１，９５６ｂｐ）を、Ｋｌｅｎｏｗで処理したＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。ＰａｃＩで消化した後、ａｄｈＥ'−ｅｓｔＺ−ＦＲＴ−ａａｃ−ＦＲＴ−ａｄｈＥ'カセット（４，４８４ｂｐ）をｐＬＯＩ３９１８のＰａｃＩ部位に移動させた。得られたプラスミドｐＬＯＩ３９２０（図１Ｆ)は、ｅｓｔＺリボソーム結合部位の上流のプロモーター断片及び温度感受性ｐＳＣ１０１レプリコンの挿入のための固有のＢｇｌＩＩ部位を含有する。
【０１６３】
Ｓａｕ３Ａで消化したＺ.モビリス由来の染色体ＤＮＡを、ｐＬＯＩ３９２０のＢｇｌＩＩ部位に連結して、ＮＣ３株のプロモーター（エステラーゼ）活性に対してスクリーニングを実施した。２つのプラスミドを３００の陽性クローンから選択して、ｐＬＯＩ３９２５Ａ及びｐＬＯＩ３９２５Ｃと称した。機能的エステラーゼカセット（ａｄｈＥ'−Ｚｍプロモータ−ｅｓｔＺ−ＦＲＴ−ａａｃ−ＦＲＴ−ａｄｈＥ'）を含有しているＰａｃＩ断片を、アパラマイシン耐性についての選択を用いてＬＹ１６３に組み込んだ。リコンビナーゼでのａａｃの欠失後、得られた株をそれぞれＬＹ１６５Ａ及びＬＹ１６５Ｃと称した。
【実施例７】
【０１６４】
ｍｇｓＡの欠失
メチルグリオキサル・バイパスは、大腸菌における乳酸塩の可能な供給源である（Zhu et al. 2001）。この望ましくない産物を除去するために、最初の確定された工程で、メチルグリオキサルシンターゼをコードするｍｇｓＡを欠失した。ｍｇｓＡ遺伝子を、表２に示されるプライマー（配列番号９及び配列番号１０）を用いて、及びテンプレートとしてＮＣ３ゲノムＤＮＡで増幅して、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングした。中央のＢｓｔＥＩＩからＡｇｅＩ（Ｋｌｅｎｏｗで処理）の断片（６６ｂｐ）を、ｐＬＯＩ３９４０を産生するためにＦＲＴに隣接するａａｃ遺伝子を輸送する、ｐＬＯＩ３４２１由来の、平滑ＳｍａＩからＥｃｏＲＩ（Ｋｌｅｎｏｗで処理）の断片（１，９４２ｂｐ）で置き換えた。ｍｇｓＡ'−ＦＲＴ−ａａｃ−ＦＲＴ−ｍｇｓＡ'カセット（２，４５６ｂｐ）を、クローニングのために用いるプライマーで増幅させて、ＬＹ１６５Ｃに組み込んだ。リコンビナーゼでのａａｃの除去後、得られた株をＬＹ１６８と称した。
【実施例８】
【０１６５】
無機塩培地におけるキシロースの発酵
図２及び３に示されるグラフのように、株ＬＹ１６１及びＬＹ１６５Ｃは、Ｚ．モビリス由来のエタノール遺伝子の完全セットを含有していて、１ｍＭのベタインを含む及び含まないＮＢＳ無機塩培地において、ＫＯ１１よりもはるかに効率的に９％キシロースを発酵した。しかし図４に示されるように、副産物として低濃度の乳酸塩及び酢酸塩が残った。
【０１６６】
メチルグリオキサルシンターゼ（ｍｇｓＡ）の除去によりこの問題は改善されたという知見が立証したように、この乳酸塩の供給源はメチルグリオキサル・バイパスであった。ＬＹ１６８株では、乳酸塩の濃度は検出できないほど低かった。この発酵で添加したキシロースの総量に基づくエタノールの収率は、０．５エタノールｇ／キシロースｇであり、理論最大値に近似していた。メチルグリオキサルシンターゼを除去したことが、生育及び細胞収率を向上させて、完全にキシロースを発酵させるために要する時間も減少させた（図４）。少ない出発接種材料でのエタノールの容量産生性は、発酵の２番目の２４時間の間にＬＹ１６５及びＬＹ１６８に対して、最も高かった（約１．３ｇ／ｌｈ）。２４時間後の、ＮＢＳ無機塩培地（１ｍＭベタイン）での発酵は、ルリアブロスでの発酵と同等であった。
【実施例９】
【０１６７】
ＡＭ１培地における発酵
新規な培地である９％キシロースを加えたＡＭ１培地中（Martinez et al.，2007）のＬＹ１６８に、更に一連の２９回連続のＦｌｅａｋｅｒ転移（２４時間間隔）を施した（図５Ａ及びＢ)。転移２１回目辺りの発酵ブロス中にコハク酸塩が出現し始めて、これはｆｒｄオペロンが回復したことの指標であった。最終転移物から１つのクローンを単離して、更なる改変に用いるためのＬＹ１６８ｉｍと称した（ＡＭ１培地における生育を向上させた）。
【実施例１０】
【０１６８】
ｌａｃ領域の回復
ｃａｓＡＢ遺伝子を欠失する際に、ｌａｃＹ遺伝子の一部も欠失させて、ラクトースを発酵する株の能力を除去した。この領域を回復させるために、プライマー対ｌａｃＺ−ｃｙｎＸを用いて（上記の表２）、ｌａｃＺからｃｙｎＸの領域（４，０８２ｂｐ）をつないでいる大腸菌ＷゲノムＤＮＡ断片をＰＣＲを使用してクローニングした（図１Ｈ）。このｌａｃＺ−ｃｙｎＸ領域をＬＹ１６８ｉｍ株に組み込んだ。この領域へのカセットの相同的組み換えのための選択を、ＡＭ１培地及び５％ラクトースを含有する固定ねじ蓋チューブ中で実施した。コロニーを、ｌａｃＹ'のプライマー対（表２）を用いるＰＣＲでスクリーニングして、ｌａｃオペロンの回復を確認するために用いた。ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレート（２％ラクトースを含有する）上でのラクトースの発酵に対して陽性であった、２２のコロニーのＰＣＲスクリーニングにより、２０コロニーがその領域を回復したことが示された。１つのコロニーを選択してＬＹ１６９と称した。
【実施例１１】
【０１６９】
ｆｒｄオペロンの欠失及びｃｅｌＹの再組み込み
９％キシロースを加えたＡＭ１培地を含有するＦｌｅａｋｅｒｓにおけるＬＹ１６８ｉｍ株の一連の転移の間に、問題が起きた。発酵ブロスにコハク酸塩が蓄積し始め、これは、株が初めにｆｒｄＢＣ領域に作成した点突然変異を回復させることができたという推測を導くものである。黒脚病菌（Erwinia chrysanthemi）３９３７由来のｃｅｌＹ遺伝子は以前にｆｒｄＡ遺伝子の前面に組み込まれている（Zhou et al., 2005）。ｆｒｄＡの前面にｃｅｌＹを保持したままで、ｆｒｄＢ遺伝子を完全に欠失させｆｒｄＣ遺伝子を部分的に欠失させる取り組みが行われた。
【０１７０】
ｆｒｄＢ'−ｆｒｄＣ'断片（９４８ｂｐ）を、プライマー対ｆｒｄＢ'−ｆｒｄＣ'（表２）を用いてゲノム大腸菌Ｗからクローニングして、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへ連結して、ｐＬＯＩ３９５８を作成した。
【０１７１】
次の工程で、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、ＰＣＲを用いて遺伝子の中央に移動させて、クロラムフェニコールマーカーを供給した。テンプレートとしてｐＥＬ０４（Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005;  図１Ｉ）及びプライマー対Ｊｍｃａｔｓａｃ  ＢＮｈｅＩ（表２）を用いて、ｃａｔ−ｓａｃＢ断片（３，２４７ｂｐ）をＮｈｅＩ部位に隣接してクローニングした。この断片を、プライマー対ＮｈｅｆｒｄＢ−Ｃ（表２）及びテンプレートとしてｐＬＯＩ３９５８を用いて、ｐＬＯＩ３９５８からのＰＣＲ産物のＮｈｅＩ部位に連結して、ｐＬＯＩ３９５９（ｆｒｄＢ'−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｆｒｄＣ'）を作成した。’ｆｒｄＢ'−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｆｒｄＣ'カセット（３，６０１ｂｐ）を、選択のためのクロラムフェニコールを用いて、元の断片をクローニングしてＬＹ１６９に組み込むために使用するプライマーで増幅させた。３９コロニーを選択して、ＰＣＲでスクリーニングして正確な領域に組み込まれているか確認して、その内２０が正確に組み込まれていた。１つのコロニーを選択して、ＬＹ１７０と称した。
【０１７２】
次に、ｆｒｄＡ'−Ｚ.モビリス断片−ｃｅｌＹ−ｆｒｄＣ'を含有しているプラスミドが必要となり、プラスミドｐＬＯＩ３９５９をＮｈｅＩ及びＸｈｏＩで消化して、ｐＬＯＩ２７２６由来の同様に消化させたＰＣＲ産物（ＸｈｏｆｒｄＡ−ＮｈｅｃｅｌＹプライマー対；表２）にテンプレートとしてｆｒｄＡ'−Ｚｍｆｒｇ−ｃｅｌＹで連結して（Zhou et al., 2005）、プラスミドｐＬＯＩ３９６１（ｆｒｄＡ'−Ｚｍｆｒｇ−ｃｅｌＹ−ｆｒｄＣ’；図１Ｊ）を作成した。ｃｅｌＹ遺伝子の活性をＣＭＣ寒天プレート上で確認した。ｆｒｄＡ'−Ｚｍｆｒｇ−ｃｅｌＹ−’ｆｒｄＣ'カセット（３，１５７ｂｐ）を、プライマーＸｈｏｆｒｄＡ及びｆｒｄＣ'（表２）で増幅させて、ＬＹ１７０に組み込んだ。これの２２５コロニーを、ｃｅｌＹ活性に対するＣＭＣプレート上の活性、そしてマーカー欠失に対するＬＢ及びクロラムフェニコール上の活性にについてスクリーニングした。その内の１１を選択して、ＰＣＲスクリーニングを施して領域への組み込みを確認した。１１コロニー全てが正確に組み込まれていて、１つをＬＹ１７２と称した。
【０１７３】
９％キシロースを加えたＡＭ１培地中のＬＹ１７２に、更に一連の１５回連続のＦｌｅａｋｅｒ転移（２４時間間隔）を施した（図６Ａ及びＢ)。最終転移物から１つのクローンを単離して、ＬＹ１７２ｉｍと称した
【実施例１２】
【０１７４】
クレブシエラオキシトカ由来のｃａｓＡＢ遺伝子の組み込み
クレブシエラオキシトカＭ５Ａ１ｃａｓＡｃａｓＢ遺伝子が株に組み込まれていることがさらに好ましかったので、既に部分的に欠失しているｌｄｈＡ遺伝子にｌａｃオペロンの代わりにその遺伝子を組み込むことにした（ラクトースを発酵する能力は無傷のままで）。プローモーターのないｌｄｈＡ遺伝子をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに表２に記載のプライマーを用いてクローニングした後、遺伝子をＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩでｐＬＯＩ３４７０の同じ部位に移動させて、ｐＬＯＩ３９７１（ＰａｃＩ部位が遺伝子に隣接している）を作成した。ｐＬＯＩ１９１０由来の天然のリボソーム結合部位を持つｃａｓＡｃａｓＢ遺伝子(Monirezzaman et al., 1997)を、ＡＭ1培地、５％セロビオースに移して、１．５週間、毎日の転移をねじ蓋チューブ中で行った。ＰＣＲを用いて、ｃａｓＡＢ遺伝子（３，４０６ｂｐ）をプライマー対ＢｇｌＩＩｃａｓＡ−ＭｆｅＩｃａｓＢでクローニングして、ＢｇｌＩＩ及びＭｆｅＩ（ｌｄｈＡの天然ＭｆｅＩ部位）で消化した後に、ベクターｐＬＯＩ３９７１のＰＣＲ産物中にプライマー対ＢｇｌＩＩｌｄｈＡ−ｌｄｈＡ（表２）でクローニングして、ｐＬＯＩ３９７２（ｌｄｈＡ'−ｃａｓＡ−ｃａｓＢ−ｌｄｈＡ'）を作成した。コロニーをＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上２％のセロビオースで試験して、セロビオースの発酵を確認した。次の工程は、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットをｃａｓＡ遺伝子の後ろに挿入して、クロラムフェニコール及び選択可能マーカーとしてスクロース上の生育不能性を供給することである。
【０１７５】
プラスミドｐＬＯＩ４１６２ＰａｃＩ断片ＰａｃＩ部位に隣接するカセットで改変したｐＵＣ１９のｃａｔ−ｓａｃＢカセット；２，９６０ｂｐ；図１Ｋ）を、ｐＬＯＩ３９７２ＢｇｌＩＩ部位に連結して、ｐＬＯＩ３９７３（ｌｄｈＡ'−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｃａｓＡ−ｃａｓＢ−ｌｄｈＡ'−ＮｏｔＩ部位に隣接する）を作成した。ｐＬＯＩ３９７３からのカセットをもたらすＮｏｔＩ断片（７，０７７ｂｐ）を、ＬＹ１７２ｉｍにクロラムフェニコールの選択を用いて組み込んだ。ＰＣＲで組み込みを確認して、新規の株をＬＹ１７３と称した。
【０１７６】
プラスミドｐＬＯＩ３９７２を用いてｌｄｈＡ−ｃａｓＡ−ｃａｓＢ−ｌｄｈＡカセット（４，１６１ｂｐ）を、ＰａｃＩ断片としてｐＬＯＩ３９１８ＰａｃＩ部位に連結して、ｐＬＯＩ３９７５を作成した。ｐＬＯＩ３９７５中にｃａｓＡに対するリボソーム結合部位のちょうど後ろに固有のＢｇｌＩＩ部位が存在して、ここにＺ．モビリスＣＰ４Ｓａｕ3ＡゲノムＤＮＡ断片が連結していた。コロニーをＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上２％のセロビオースで、ｃａｓＡＢ遺伝子の発現を指標する赤色の変化の度合いについて試験した。プレート上で陽性であった１５コロニーからのプラスミドを単離して、ｐＬＯＩ３９７６Ａ〜Ｋ（ｌｄｈＡ'−Ｚｍｆｒｇ−ｃａｓＡ−ｃａｓＢ−ｌｄｈＡ）と称し、ＬＹ１７３における活性について比較した。プラスミドｐＬＯＩ３９７６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ（図１Ｌに示すように）を更なる検討のために選択した。４つのｌｄｈＡ'−Ｚｍｆｒｇ−ｃａｓＡ'断片（ｃａｓＡのＮｏｔＩ/ＮｃｏＩ−内部部位）を、ＬＹ１７３にＡＭ1培地＋５％セロビオース固定液状培養物における選択を用いて組み込み、５日間３７℃で連続的に転移させた。得られた株ＬＹ１７８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ（それぞれ）を、１０ｍＬ固定液状培養物中の５％キシロース又はセロビオースを含有するＡＭ１培地における生育及びエタノール産生について比較した。ＬＹ１７８Ｅ株が、最もエタノールを産生して、最高Ｏ．Ｄ．５５０まで生育して、ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上２％のセロビオースでの比較において最良であると見られた。
【０１７７】
１０％キシロースを加えたＡＭ１培地中のＬＹ１７８Ｅで更に１２回の一連のセットのＦｌｅａｋｅｒ転移（２４時間間隔）を施した。安定なｃａｓＡＢ遺伝子の選択を向上させるために、Ｆｌｅａｋｅｒｓにおける一連の転移を連続する４日間、５％セロビオースを補完したＡＭ１培地中の１０ｍＬ液状培養物においての転移の３日間と交互に実施した（図７Ａ及びＢ、Ｆｌｅａｋｅｒｓのみ示される）。最終転移物から１つのクローンを単離して、ＬＹ１８０と称した。１０％キシロースを加えたＡＭ１培地中のＬＹ１８０での更に２５回の一連のセットのＦｌｅａｋｅｒ転移（２４時間間隔）を施した。Ｆｌｅａｋｅｒｓにおける一連の転移は、連続する４日間、１０％セロビオースを補完したＡＭ１培地中の１０ｍＬ液状培養物においての転移の３日間と交互に実施した（図８Ａ及びＢ、Ｆｌｅａｋｅｒｓのみ示される）。最終転移物から１つのクローンを単離して、ＬＹ１８６と称した。
【実施例１３】
【０１７８】
改良されたエタノール産生性組み換え細菌
前記の検討により、無機塩培地での組み換え大腸菌による迅速で効率的なキシロースの発酵に対する固有障壁が存在しないことが明らかにされた。これまでの改変株に見られた改良は、いくつかの因子の組み合わせによるものであり、その１つは、エタノール産生のためのＺ．モビリス遺伝子の染色体組み込みの最適部位を決定するために、生育に基づく選択でのランダムな組み込みである。別の因子は、能力を妨害する可能性のある抗生物質遺伝子の欠失である。最後の因子は、解糖及び高分子合成を減速させる副次的経路である、メチルグリオキサルバイパスの除去である（Zhu et al. 2001）。
【０１７９】
ベタインの付加により生育が増大して能力が向上したことが見出されたが、本質的な特徴ではない。ベタインは、初期高濃度の糖の存在下で生育を向上させ、グルタミン酸塩及びトレハロースに対する生合成の要件を低減する、保護的な浸透圧調節物質である（Underwood et al. 2004; Zhou et al. 2006a and 2006b）。
【実施例１４】
【０１８０】
ＢＷ３４の改変
市販のセルラーゼに対する要件を低減するために細菌性エンドグルカナーゼの副産物を使用することは以前に記述されている（Wood and Ingram, 1992; Wood, 1997; Wood et al. 1997b）。これらの最大の効果は、黒脚病菌（Erwinia chrysanthemi）由来のものに見出された（Wood et al. 1997b, Zhou et al. 2001）。相乗的に機能するＣｅｌＹ及びＣｅｌＺの組み合わせにより、非結晶セルロースのエタノールへの直接変換が可能となった（Zhou and Ingram, 2001）。ＣｅｌＹ単独では、市販のセルロース調製物と併用した場合に（Zhou et al. 2001）、結晶性セルロースの同時糖化及び発酵（ＳＳＦ）において最大の利益を提供することが示された。
本明細書に記述する検討において用いた株及びプラスミドを下記の表３に示す。
【０１８１】
【表３】
0005616061.tif 000006
【０１８２】
株は糖類を添加せずにルリア寒天プレート上に保持した。抗生物質を以下のように選択のために加えた：アンピシリン５０ｍｇ／Ｌ；アプラマイシン５０ｍｇ／Ｌ；カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ；テトラサイクリン１２．５ｍｇ／Ｌ；及びスペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌ。エタノール産生株を、２％グルコース及び４０又は６０ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール（アルゴン下で毎日交換）も含有させたルリア寒天プレート上に保持した。エンドグルカナーゼ産生のスクリーニングに用いた寒天プレートは、３ｇ／Ｌの低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）も含有していた。ＣＭＣプレートは、一晩３７℃で生育させた後にコンゴレッドで染色した（Wood et al. 1988）。ｐＬＯＩ３４２０を含有している株を３０℃で培養して、他は全て３７℃で保持した。
【０１８３】
当該技術分野で公知の標準的方法を、ＰＣＲベースの遺伝子クローニング、プラスミド構築及び遺伝子分析に関して用いた。組み込みに関する方法、染色体欠失、組み込み、及び除去可能な抗生物質耐性遺伝子の使用については既述されている（Datsenko and Wanner, 2000; Martinez-Morales et al. 1999; Zhou et al. 2003; Causey et al. 2004）。大腸菌ＤＨ５”を最も多くの構築のために用いた。大腸菌Ｓ１７をＲ６Ｋ複製起点を含有しているプラスミドの構築のために用いた。ファージＰ１をSilhavay et al.(1984)によって記述されている方法に従い、普遍形質導入のために用いた。
【０１８４】
黒脚病菌由来のエンドグルカナーゼＣｅｌＹをコードする遺伝子ｃｅｌＹの直接組み込みのために用いたプラスミドは、代用プロモータの後ろのｃｅｌＹを含有しているｐＬＯＩ２３４８からの５．７ｋｂｐＡｓｃＩ断片、及びＫ．オキシトカＭ５ａ１由来の染色体断片を、組み込みを標的とするために（グリコーゲン合成経路中の遺伝子ｇｌｇＰを含有することは既に確認されている、Zhou et al. 2001）、除去し、次いでｐＬＯＩ２２２４のＡｓｃＩ部位に連結してｐＬＯＩ３２９３を作成することにより構築した。ｐＬＯＩ３２９３のｂｕｄＡＢ株Ｋ．オキシトカＢＷ２１への組み込みを、ｐＬＯＩ３４２０からのλレッドリコンビナーゼの発現により促進させた。得られた組み込み物は、３９℃での生育によりｐＬＯＩ３４２０を回復して、カナマイシン耐性に対して選択されて、次いでエンドグルカナーゼ産生及び高レベルのクロラムフェニコール耐性（６００ｍｇ/Ｌ）に対する耐性の保持に関してスクリーニングした。幾つかの単離株を、９０ｇ／Ｌグルコースを含有しているＯＵＭ１（詳示せず、Wood 2005）中のｐＨ調整された発酵におけるエタノール産生について更にテストして、全てが類似することを見出した。１つを更なる検討のために選択してＢＷ３２と称した。
【０１８５】
黒脚病菌由来の２つのエンドグルカナーゼ遺伝子、ｃｅｌＹｃｅｌＺ及びｂｕｄＡＢを含有する株を、以下のように構築した。即ち、Ｋ.オキシトカ株ＢＷ１５を、ブタンジオールオペロン（ｂｕｄＡ’−ＦＲＴ−ｔｅｔ−ＦＲＴ−'ｂｕｄＢ’）中でのＳＺ２１株（Zhou et al. 2001）への欠失のＰ１ファージ形質導入のためのドナー株として用いた。形質導入物の単離及びスクリーニングは、テトラサイクリンを選択のために用いた以外は、上記に用いたものと同一であった。株ＢＷ３３を更なる検討のために持続させた。
【０１８６】
ＢＷ３２株からのｋａｎの除去を促進するために、ｐＦＴ−Ａ（ＦＬＰリコンビナーゼ）をアパラマイシン耐性遺伝子ａａｃを付加して改変した。プラスミドｐＦＴ−ＡをＣｌａＩでの制限消化によって、次いで大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片での処理によって線形化した。ｐＬＯＩ３４２０からのａａｃを含有している１．６ｋｂｐ断片を、線形化したｐＦＴ−Ａと連結してｐＬＯＩ３４２０を作成した。ＢＷ３３株からのｔｅｔの除去には既述のｐＦＴ−Ｋ（Posafi et al. 1997）を用いた。Ｋａｎｓ及びＴｅｔｓ株は、上記のようにエンドグルカナーゼ産生、クラムフェニコール耐性及びエタノール産生に関して再スクリーニングを行い、得られた株をそれぞれＢＷ３４及びＢＷ３５と称した。組み込みをＰＣＲを用いて確認した。
【０１８７】
種培養（２５０ｍｌのフラスコ中に１５０ｍｌ）を、ｐＨ調整された発酵に用いたものと同じ培地に５０ｇ/Ｌグルコースを含有させて３５℃で１６時間（１２０ｒｐｍ）生育させた。細胞を遠心分離（５０００ｘｇ、５分）により採取して、３３ｍｇ/Ｌ乾燥細胞重量の初期濃度（ＯＤ５５０ｎｍ＝０．１）を供給するための接種材料として用いた。発酵容器は既述（Beall et al. 1991）のもので、初期容量３５０ｍＬを含有していた。グルコース発酵は９０ｇ/Ｌの糖類を含有して、ＯＵＭ１（Wood 2005）で行った。ＳＳＦｓは、ルリア培地に１００ｇ/ＬのＳｉｇｍａｃｅｌｌ  ５０を含有して、ＳＳＦｓは、ＯＵＭ１に４５ｇ/ＬのＳｉｇｍａｃｅｌｌ  ５０＋４０ｇ／Ｌのキシロースを含有していた。培養物は３５℃で培養した（１５０ｒｐｍ）。ＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６株での発酵では、スペクチノマイシンをプラスミドの保持のために添加した。他の全ての発酵には抗生物質を添加しなかった。グルコース発酵及びＳＳＦｓのブロスは、２ＮのＫＯＨを自動的に添加してｐＨ５．２で保持した。キシロース発酵を向上させるために、ＳＳＣＦｓをｐＨ５．８で保持した。
【０１８８】
最終株をＯＵＭ１中の９０ｇ／Ｌグルコースの発酵に用いて、組み換えエンドグルカナーゼ（複数も含む）を発現する株の発酵能力を比較した。ＣｅｌＹ産生株ＢＷ３４は、生育及びエタノール産生の両方において株ＢＷ２１と同等であった（図９）。ＣｅｌＹ及びＣｅｌＺを発現する株ＢＷ３５は、向上した生育に関する、ｐＣＰＰ２００６由来の黒脚病菌アウト遺伝子の共発現を含有していた。ＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６株は、初めからＢＷ２１及びＢＷ３４の両方に類似するエタノール産生性を有していた。最終エタノール濃度はＢＷ３５において減少したが、これはｐＣＰＰ２００６の不安定性による可能性がある。株ＢＷ２１、ＢＷ３４及びＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６による、９０ｇ／Ｌグルコースからの最大エタノール収率は、それぞれに理論上の９２．７、９１．４及び８０．５％であった。副産物を分析すると（下記、表４）、株ＢＷ２１及びＢＷ３４は再び近似していたが、株ＢＷ３５は乳酸塩の産生においてわずかに増加していた。
【０１８９】
表４に ｂｕｄＡＢ、エタノール産生性、Ｋ．オキシトカの株を産生するエンドグルカナーゼによるＯＵＭ１の９０ｇ／Ｌグルコースからの７２時間後の産生物の構成及び炭素収支を示す。
【０１９０】
【表４】
0005616061.tif 000007
【０１９１】
ＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６では増加した乳酸塩産生物が残留していた。酢酸塩の産生は、組み換えタンパク質を高レベルに発現する株に共通して見られた（Aristidou et al. 1995; Farmer and Liao, 1997）。
【０１９２】
２つの市販セルラーゼ調製物は、ＣｅｌＹ（及びＣｅｌＺ）との併用が評価されている。ＳｐｅｚｙｍｅＣＥ（GENECOR INT、既に市販されていない）及びＧＣ２２０の両方は、カルボキシメチルセルロースにおけるその活性に基づき標準化されていて、ヒドロラーゼ活性と共存することが報告されている。培地による潜在的影響の何れもを排除するために、ルリアブロスを各々の酵素混合を評価することに用いた。３８ｇ／Ｌの最高エタノール濃度（図１０Ｃ）は、ＳｐｅｚｙｍｅＣＥの最高濃度（１００μＬ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌｇ）で得られた。これは、理論値の６７％のエタノール収率に対応している。
【０１９３】
Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ及びＳｐｅｚｙｍｅＣＥでの以前の検討と対照的に、ＳｐｅｚｙｍｅＣＥと併用したＣｅｌＹ（ＢＷ３４対ＢＷ２１）又はＣｅｌＺ（ＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６対ＢＷ２１）からは利点は見出せなかった（Zhou et al. 2001）。より低い酵素負荷での結果は、ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０がＳｐｅｚｙｍｅＣＥより優れていることを明示した（図１０Ａ及び１０Ｃ）。同等の酵素濃度（５０μＬ／セルロースｇ）では、ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０を用いた場合に、ＳｐｅｚｙｍｅＣＥと比較して、初期産生率及び最終エタノール濃度がそれぞれ２６％及び２１％まで増加した（株ＢＷ３４で）。５０μＬ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌｇを負荷する酵素でＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０を用いた場合のエタノール産生は、１００μＬ／Ｓｉｇｍａｃｅｌｌｇを負荷する酵素でＳｐｅｚｙｍｅＣＥを用いた場合とほぼ同等であった。ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０（５０μＬ／Sigmacellｇ）を用いた場合、ＣｅｌＹの発現（株ＢＷ３４において）が最大の利点を有していることを示した。ＳＳＦｓは（ＢＷ３４株で）、ＢＷ２１株よりも１５％高く、Ｐ２株よりも７０％高い最終エタノール濃度を産生した。
【０１９４】
市販の酵素は、活性が混合されているので、使用者の特定要件に合致するように定期的に改変されて、よって数年にわたって一定したものではないと考えられる。更に以前に開発されたＰ２株の相対的に乏しい能力はＳｐｅｚｙｍｅＣＥの処方における変化に伴うものであった（Doran and Ingram, 1993）。以前に開発されたＳＺ２２株は、ＣｅｌＹを発現する（Zhou et al.2001）が、これも比較のために含有させた。どちらかの酵素を用いて(何れかの負荷で）発酵の終了時に存在するセルロース分解産物（糖類）の量（図１１）は、エタノール産生と相関すると見られ、用いるセルラーゼの有効性に関連して生命体の代謝活性を反映しているかもしれない。Ｓｉｇｍａｃｅｌｌは精製されたセルロース産物であると報告されてる一方で、キシロースの検出は少ないキシラン成分を示唆するものである。或いは、キシロースとして同定されたＨＰＬＣのピークは、市販のセルラーゼに存在している構成要素（防腐剤、安定化剤等）由来の別の代謝産物であるかもしれない。この不確実性を理由に、残余のキシロースは収率計算に含めていない。加水分解がより迅速な（１セルロースｇ当たり  ５０μｌＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０及び１００μｌＳｐｅｚｙｍｅＣＥ）ＳＳＦｓでは、ＢＷ３５株におけるｐＣＰＰ２００６の安定性が再度最終エタノール濃度の減少をまねく可能性がある。
【０１９５】
一般に、２,３−ブタンジオール発酵経路の遺伝子（ｂｕｄＡＢ）を欠失している株はそれらの遺伝子を保持するものよりも優れた能力を有する。ｂｕｄＡＢの除去はその上、他の副産物の減少ももたらす（図１２）。ＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６株ではこの例外であって、グルコース発酵において見られるように（上記の表４に示す）、酢酸塩及び乳酸塩の両方の産生が増加した。２,３−ブタンジオール発酵経路の産物は、株Ｐ２及びＳＺ２２においては、Ｋ.エロゲネス（K.aerogenes）でのグルコース制限ケモスタット培養における検討（Teixeira de Mattos and Tempest, 1983）と反して、セルロース加水分解の速度、即ちグルコース制限と相関すると見られる（１セルロースｇ当たり  ５０μｌＣＥ＞５０μｌＧＣ２２０＞１００μｌＣＥ）。コハク酸塩のレベルは、相対的に能力が低い株Ｐ２を除いて、酵素のタイプ及び濃度にかかわらず、全ての株で一貫していた。
【０１９６】
広範囲の液体−固体分離の必要性を取り除くことにより、リグノセルロースのエタノールへの工程を簡素化できる（Wright et al. 1988）。ＳＳＦに用いた同じ酵素（ＳｐｅｚｙｍｅＣＥ及びＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０）を、４５ｇ／ＬのＳｉｇｍａｃｅｌｌ及び４０ｇ／Ｌのキシロースを含有するＳＳＣＦｓにおけるそれらの使用について再び評価した。５０μｌ／セルロースｇを負荷する酵素を各々の酵素に用いた。全てのＯＵＭ１を用いるＳＳＣＦｓ（Wood 2005）、ｂｕｄＡＢのみの株ＢＷ２１、ＢＷ３４及びＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６をテストして、工業的適用に関する可能性を完全に評価した。
【０１９７】
ＳＳＣＦにおいて、ＳｐｅｚｙｍｅＣＥによる加水分解速度の低減はキシロースの迅速な完全な使用に対する実質的な利点であると見られる（図１３）。ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０を用いた、グルコースのレベルは、低かったが（２４時間で、〜1ｍＭ）、キシロース代謝が抑制され始める時点の閾値を最初に越えている可能性がある。このことの更なる証として、エンドグルカナーゼ産生株ＢＷ３４及びＢＷ３５ｐＣＰＰ２００６においてキシロース消費速度の低減が見られ、ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０を用いたＳＳＦｓに見られる向上した加水分解の結果であると推測される。キシロース消費を向上させるためにＰＦＬ（又はＡＣＫ）活性を増加させる（ｐＨを上昇させて）ための要件は以前に示されている（Wood 2005）。ｐＨ６．０のＯＵＭ１において、ＢＷ２１株は、９０ｇ／Ｌキシロースから４４．３ｇ／Ｌ、理論上の収率の９６．４％のエタノールを産生した。ｐＨ５．８のＳＳＣＦにおける、セルロース収率計算では、キシロース変換に関して、わずかに控えめに９５％と仮定した（下記の表５）。
【０１９８】
【表５】
0005616061.tif 000008
【０１９９】
ＳＳＦの場合のように、形成された副産物はＳＳＣＦにおける株間で類似していて（図１４）、大部分はＳＳＦに見られるものと一致していた。ｐＨ５．８でのＡＣＫ（ＰＦＬ）活性の増大は、グルコース又はＳＣＦにおいて見られるものと比較した、酢酸塩産生の増大に起因していた。ＳＳＣＦにおけるキシロースの含有が、向上したセルロース変換をもたらした。
【０２００】
表５は、ｂｕｄＡＢ株によるＳＳＦとＳＳＣＦ（５０μＬ／Sigmacellｇの酵素負荷）からのエタノール収率を比較したものである。最も有意な増加は、見積もりのセルロース変換がＳＳＣＦにおいてＳＳＦ単独よりも＞５５％より高い場合にＳｐｅｚｙｍｅＣＥにおいて見られた。ＳＳＣＦにおいてＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０を用いても、セルロースからの増加したエタノール収率がもたらされた（１４〜１９％）。両方の酵素を用いて、最大の増加は、ＳＳＦ又はＳＳＣＦのどちらかでのＢＷ３４に見られた。ＳＳＣＦにおける、セルロース分解産物の代謝の向上は、発酵終了時に検出された糖類のレベルが低かったことに反映された（図１５）。ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０を用いた場合に、株ＢＷ３４及びＢＷ３５ｐＣＣＰ２００６による、キシロース使用の速度の及び全体的なエタノール産生性の低減が、検出された残余糖類の増加に変換された。
【０２０１】
市販のセルラーゼの選択がセルロース加水分解の程度に影響を及ぼし得ることは明らかである。キシロースの含有又は可能性のある他の遊離糖類が、ＳＳＣＦにおいて用いるセルラーゼの有効性を増加させた。これは増加した生体触媒の濃度に起因すると見られ、セロビオース及びグルコースの副阻害性濃度をよりよく保持できるものであった。増加した生体触媒濃度を付加的エンドグルカナーゼ活性の産生と組み合わせた場合、真菌セルラーゼ活性に対する最適条件よりも劣る発酵条件であっても、セルロース変換は優れたものであった。セルロースからのエタノール産生における漸進的な改善を図１６に示した。酵素１ユニット当たりのエタノールの量は、セルラーゼを用いるセルロースからのエタノール産生の経費に直接影響を及ぼす。ＳＳＦにおいて、ＳｐｅｚｙｍｅＣＥ負荷を５０％減少させると、エタノール１ｇ当たりの酵素費用が５０％相当に削減されるであろう。ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０がＳｐｅｚｙｍｅＣＥの経費と同等であると見積もると、ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０の使用により、さらに２１％まで酵素費用が削減されるだろう。ＳＳＣＦにおいては、セルロースからのエタノール産生の酵素費用は、ＳＳＦに使用する酵素負荷と同等の負荷（５０μＬ／Sigmacellｇ）で、ＳｐｅｚｙｍｅＧＣ２２０（１４％）又はＳｐｅｚｙｍｅＣＥ（６０％）の使用によって更に削減することができるだろう。
【実施例１５】
【０２０２】
エタノール産生性ＫＯ１１−ＲＤ１及びＢＷ３４におけるクラムフェニコール耐性の除去
株、プラスミド、培地及び生育条件
本検討で用いた株及びプラスミドを下記表６に記載する。
【０２０３】
【表６】
0005616061.tif 000009
0005616061.tif 000010
【０２０４】
ＫＯ１１−ＲＤ１及びＢＷ３４はもともとエタノール産生株であり、６００ｍｇｌ−ｌクロラムフェニコールに耐性であった。本検討で用いたプライマーを下記の表７に記載する。
【０２０５】
【表７】
0005616061.tif 000011
0005616061.tif 000012
【０２０６】
株構築の間、培養物は２％（Ｗ／Ｖ)のグルコース又はアラビノースを含有するルリアブロス（１０ｇｌ−ｌのＤｉｆｃｏ ｔｒｙｐｔｏｎ、５ｇｌ−ｌのＤｉｆｃｏ酵母エキス及び５ｇｌ−ｌのＮａＣｌ）中に、３０、３７又は３９℃にて好気的に生育させた。アンピシリン（５０ｍｇｌ−ｌ）；アプラマイシン（５０ｍｇｌ−ｌ）；テトラサイクリン（１２．５ｍｇｌ−ｌ）又はカナマイシン（５０ｍｇｌ−ｌ）を必要な場合に添加した。発酵性エタノール産生のために、株は、抗生物質を添加せずに、３７℃の、ルリアブロス又はＡＭ１無機塩培地（Alfredo et al., 2007）の何れかに、１０％（Ｗ/Ｖ)キシロースとともに生育させた。
【０２０７】
遺伝子法
ゲノムＤＮＡ抽出（Qiagen）、ＰＣＲ増幅（Stratagene and Invitrogen）、形質転換、プラスミド抽出（Qiagen）及び制限エンドグルカナーゼ消化（New England Biolabs）、について標準的方法を用いた。
【０２０８】
ｃａｔ遺伝子欠失のためのプラスミド構築（第１回目）
クラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を欠失させる方法を、相同的組み換え（Thomason et al., 2005）の２つの工程に基づき、遺伝子欠失の後に抗生物質遺伝子及び外来性遺伝子の傷跡を残さないように改変した。最初の組み換えでは、ｃａｔ遺伝子の中間に位置している２００ｂｐのＤＮＡ断片を、カナマイシン耐性遺伝子（Kan）及びルバンスクラーゼ遺伝子（sacB）を含有しているＤＮＡカセットによって置き換えた（図１８Ｃ）。第２の組み換えでは、最初の２００ｂｐ断片の外側のＤＮＡ断片を組み換え標的として用いて（図１８Ｃ）、Ｋａｎ−ｓａｃＢカセットをスクロース感受性に基づき除去した。ｓａｃＢ遺伝子を有するこれらのコロニーは、細胞を殺すであろうルバンスクラーゼをスクロースと共に蓄積するので、Ｋａｎ−ｓａｃＢカセットを除去したこれら組み換え体のみが生存できる。
【０２０９】
Ｋａｎ遺伝子は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯからプライマーセットＫａｎ−ｕｐ/Ｋａｎ−ｄｏｗｎ（上記表７）を用いて増幅させ、次いでＸｈｏＩ及びＡｃｃＩで消化して、ｃａｔ遺伝子を置き換えるようにｐＬＯＩ４１６２中にクローニングして（ＸｈｏＩ及びＡｃｃＩ）、ｐＬＯＩ４２９２を得た。Ｋａｎ−ｓａｃＢカセット（２８９９ｂｐ）は、ｐＬＯＩ４２９２をＰａｃＩで消化し、次いでＴ４で処理することにより得られ、これを更なるライゲーションに用いた。
【０２１０】
初めは、ＫＯ１１−ＲＤ１及びＢＷ３４の染色体にただ１つのｃａｔ遺伝子が存在していて、１回のｃａｔ遺伝子欠失によってｃａｔ耐性が除去されると考えていた。ｃａｔ遺伝子の中間に位置している４００ｂｐのＤＮＡ断片（図１８Ｃ）を、プライマーセットＪＭｃａｔＵＰ/ＪＭｃａｔＤＯＷＮ（表７）を用いてＫＯ１１−ＲＤ１から増幅させて、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングしてｐＬＯＩ４６５７を得た。その後このプラスミドをＳｆｏＩで消化して、カナマイシン耐性を不活性化するために自己連結させて、ｐＬＯＩ４６５８を得た。ｐＬＯＩ４６５８のプラスミドＤＮＡを１０００倍に希釈して、ＰＣＲ（プライマーセットｃａｔ−１／ｃａｔ−２を使用、外部増幅）用のテンプレートとして用いた。増幅したＤＮＡ断片（ｃａｔ'−ｃａｔ'−ＴＯＰＯ、３８６８ｂｐ）を、Ｋａｎ−ｓａｃＢカセット（２８９９ｂｐ）と連結してプラスミドｐＬＯＩ４６５９（図１８Ａ、６７６７ｂｐ）を作成するために用いた。ｃａｔ−１／ｃａｔ−２のＰＣＲ産物も、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）で断片の端にリン酸塩を付加するよう処理して、自己連結させてプラスミドｐＬＯＩ４６６０（図１８Ｂ、４９５８ｂｐ）を作成した（図１８Ｂ、４９５８ｂｐ）。プラスミドｐＬＯＩ４６５９及びｐＬＯＩ４６６０を、ＸｂａＩで消化して、１０００倍に希釈して、相同的組み換え（プライマーセットＪＭｃａｔＵＰ/ＪＭｃａｔＤＯＷＮを使用する）の第一工程のＤＮＡ断片Ｉ（ｃａｔ'−Ｋａｎ−ｓａｃＢ−ｃａｔ'）及び第二工程のＤＮＡ断片ＩＩ（ｃａｔ'−ｃａｔ''）を増幅するためのテンプレートとして用いた（図１８Ｃ）。
【０２１１】
ｃａｔ遺伝子欠失のためのプラスミド構築（２回目及び３回目）
ｃａｔ遺伝子を欠失させた後、得られた株は未だ高いクロラムフェニコール濃度に対して耐性であった。原始株の染色体に１つ以上のｃａｔ遺伝子コピーが存在すると考察した。更なる組み換えのために、ｐＬＯＩ４６５９由来のこれまでのＤＮＡ断片Ｉ（ｃａｔ'−Ｋａｎ−ｓａｃＢ−ｃａｔ'）を用いるとすれば、新たなｃａｔ遺伝子部位に又は欠失したｃａｔ遺伝子部位に組み込む同じ機会を持つことになるだろう。更にｃａｔ遺伝子欠失を新たな部位で生じさせるために、新たなプラスミドを構築した。ｃａｔ遺伝子の中間に位置している２００ｂｐのＤＮＡ断片を、プライマーセットｃａｔ２−ｕｐＰｓｔＩ／ｃａｔ２−ｄｏｗｎＰｓｔＩ（表７）を用いてＫＯ１１−ＲＤ１から増幅し、ＰｓｔＩで消化し、ｐＢＲ３２２のＰｓｔＩ部位にクローニングして、ｐＬＯＩ４６６１を得た。このプラスミドＤＮＡを１０００倍に希釈して、ＰＣＲ（プライマーセットｃａｔ−２−３／ｃａｔ２−４を使用、外部増幅）用のテンプレートとして用いた。増幅したＤＮＡ断片（ｃａｔ'''−ｃａｔ''''−ＴＯＰＯ、４５２１ｂｐ）を、Ｋａｎ−ｓａｃＢカセット（２８９９ｂｐ）と連結してプラスミドｐＬＯＩ４６６２（図１９Ａ、７４２０ｂｐ）を作成するために用いた。このプラスミドＤＮＡを、ＸｂａＩで消化し、１０００倍に希釈して、相同的組み換えの第一工程（プライマーセットｃａｔ２−ｕｐ/ｃａｔ２−ｄｏｗｎを使用する）のＤＮＡ断片ＩＩＩ（ｃａｔ'''−Ｋａｎ−ｓａｃＢ−ｃａｔ''''）を増幅するためのテンプレートとして用いた。ｐＬＯＩ４６６０由来のＤＮＡ断片ＩＩは、組み換えの第二工程にそのまま用いた（図１９Ｃ）。
【０２１２】
ｃａｔ遺伝子欠失
ｃａｔ遺伝子欠失の最初の組み換えでは、ＤＮＡ断片Ｉ（ｃａｔ'−Ｋａｎ−ｓａｃＢ−ｃａｔ'）を、プラスミドｐＫＤ４６（Datsenko and Wanner 2000）又はｐＬＯＩ３４２０（Brent et al., 2005）を発現するレッドリコンビナーゼを有しているＫＯ１１−ＲＤ１又はＢＷ３４に電気穿孔して、次いで３０℃で２時間アウトグロース（out−growth）に培養して、その後アンピシリン及びカナマイシン（ＫＯ１１−ＲＤ１に対して）又はプラマイシン及びカナマイシン（ＢＷ３４に対して）を有しているＬＢプレートに延展した。カナマイシンは正確な組み換えの選択のために、アンピシリン又はアプラマイシンは組み換え第２工程のためにｐＫＤ４６又はｐＬＯＩ３４２０を保持するためのものである。３０℃にて約１８時間の培養の後、３コロニーを選択して、ＤＮＡ断片ＩＩ（ｃａｔ'−ｃａｔ''）が電気穿孔されている、コンピテント細胞を作成するために用いた。その後、培養物を３０℃にて４時間アウトグロース（out−growth）に培養し、次いで１００ｍｌのＬＢ培地（塩化ナトリウム無し）及び１０％のスクロースを含有している２５０ｍｌフラスコに転移した。培養物を、３０℃にて一晩培養し、次いで６％のスクロースを含むＬＢプレート（塩化ナトリウム無し）に画線化(streaked)させて、３０又は３９℃の何れかにて１６時間培養した。更なるｃａｔ遺伝子欠失のためにレッドリコンビナーゼを保持するように、３０℃で培養した。プレートからコロニーを選択して、それらのアンピシリン又はアプラマイシン、及びカナマイシン感受性についてテストした。それらは、異なるクラムフェニコール濃度に対する耐性についてもテストして、異なるプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を施した。
【０２１３】
アルコール遺伝子の再組み込み
全てのｃａｔ遺伝子を欠失させた後に、得られた株は、エタノール産生能力も損失している。ｐｄｃ遺伝子をＰＣＲにより検出することができなかった。エタノールを産生するために、アルコール遺伝子をｐｆｌＢ部位又はｒｒｌＥ部位のどちらかに再度組み込みんだ。
【０２１４】
アルコール遺伝子をクレブシエラｐｆｌＢ部位に組み込むためのプラスミドを、下記のように構築した。ｐｆｌＢ遺伝子を、プライマーセットｐｆｌＢ−ｕｐ２−Ｍ５Ａ１／ｐｆｌＢ−ｄｏｗｎ２−Ｍ５Ａ１を用いてクレブシエラオキシトカＭ５Ａ１から増幅し、次いでｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングして、ｐＬＯＩ４６３７を得た。ｐｆｌＢ遺伝子を、ｐＬＯＩ４６３７（ＫｐｎＩ−ＸｂａＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化されている）からｐＬＯＩ２３９４のＥｃｏＲＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗにより平滑化されている）にサブクローニングして、ｐＬＯＩ４６４５を得た。このプラスミドＤＮＡを１０００倍に希釈して、ＰＣＲ（プライマーセットｐｆｌＢ−２−Ｍ５Ａ１／ｐｆｌＢ−３-Ｍ５Ａ１を使用、外部増幅）用のテンプレートとして用いた。増幅したＤＮＡ断片を、ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴカセット（ＰａｃＩ消化によりｐＬＯＩ３４９１から得られ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化されている）と連結して、プラスミドｐＬＯＩ４６４６を作成するために用いた。Ｋ.ｐｆｌＢ'−ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴ−Ｋ.ｐｆｌＢ''カセットを、次いでｐＬＯＩ４６４６（ＡｓｃＩ消化）からｐＬＯＩ２２２５のＡｓｃＩ部位にサブクローニングして、ｐＬＯＩ４６４９を得て（図５）、これはＲ６Ｋ複製起点を有していた。プラスミドｐＬＯＩ４６４９を、ＡｓｃＩで消化し、アルコール遺伝子（Ｋ.ｐｆｌＢ'−ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−Ｋａｎ−ＦＲＴ−Ｋ.ｐｆｌＢ''）を含有している大きなＤＮＡ断片を、ゲル精製を施し、次いでＢＷ３４−ＸＺ１０６（レッドリコンビナーゼｐＬＯＩ４６４９を伴う）に電気穿孔して、組み込み物を選択するためにＬＢｋａｎプレートに延展させた。ＬＢｋａｎプレートからコロニーを選択して異なるプレート（ＬＢ２％グルコース（ＬＢＧ)、ＬＢアプラマイシン（ＬＢ  Ａａｃ）、ＬＢカナマイシン（ＬＢ  Ｋａｎ）及びＬＢ ｃａｔ４０を含有している）上に塗付した。
【０２１５】
アルコール遺伝子をクレブシエラｒｒｌＥ部位に組み込むためのプラスミドの構築は、少し異なった。ｒｒｌＥ遺伝子を、プライマーセットＫ.ｒｒｌＥ−ｕｐ−ＥｃｏＲＩ／Ｋ.ｒｒｌＥ−ｄｏｗｎ−ＥｃｏＲＩを用いてクレブシエラオキシトカＭ５Ａ１から増幅し、次いでＥｃｏＲＩで消化し、ｐＬＯＩ２３９４のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＬＯＩ４６７３を得た。続く工程は、ｐｆｌＢの場合と同じであった。そして構築したプラスミドを表６に示した。
【０２１６】
アルコール遺伝子を大腸菌ｒｒｌＥ及びｐｆｌＢ部位に組み込むためのプラスミドを構築する方法は、アルコール遺伝子をクレブシエラｒｒｌＥ部位に組み込む場合と同様であった。それぞれの工程で構築されたプラスミドを表６に示した。
【０２１７】
ｆｌｉｐａｓｅによるｋａｎ遺伝子の除去
ＲＤ１−ＸＺ０２７株を、ｐＦＴ−Ａを用いて最初に形質転換した。これはｆｌｉｐａｓｅ遺伝子を有していて、ＬＢ Ａｍｐプレート上に延展した。幾つかのコロニーを選択して、アンピシリンと共に１０ｍｌのＬＢ培地を含む２５０ｍｌフラスコに接種した。ＯＤが０．１まで生育した後、１ｍｌのクロロテトラサイクリン株（２０ｍｇ/１００ｍｌ ＬＢ）を添加して、ｆｌｉｐａｓｅ遺伝子の発現を誘発させた。３０℃にて６時間生育後、培地をＬＢＧプレート上に画線化(streaked)して、３９℃にて一晩培養した。コロニーを選択して、ＬＢＧ、ＬＢＫａｎ、ＬＢＡｍｐ及びＬＢｃａｔ４０を含有している、異なるプレート上に塗付した。
【０２１８】
ｋａｎ遺伝子を、ｆｌｉｐａｓｅ遺伝子を有してアプラマイシン耐性であるプラスミドｐＬＯＩ３４０９を用いたこと以外は、クレブシエラ株ＢＷ３４−ＸＺ１１８の場合と同様にして除去した。
【０２１９】
発酵  
全ての株のエタノール産生について、１２５ｍＬフラスコ中の１０％キシロースを含む５０ｍｌＬＢ培地で３７℃にて及び１００ｒｐｍでｐＨ調整せずに、テストを実施した。最終のエタノール産生性株は、１０％のキシロース又はグルコースのどちらかを含むＡＭ１培地においてもテストした。２Ｎ水酸化カリウムを自動的に添加することによりｐＨを７．０に調整した。
【０２２０】
分析
細胞質量を、５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での最適密度を測定することにより見積もった。エタノール濃度はＧＣにより測定した。有機酸及び糖濃度はＨＰＬＣ（Underwood et al., 2002）により測定した。
【０２２１】
ＫＯ１１−ＲＤ１における１回目のｃａｔ遺伝子欠失
２工程の相同的組み換え法をＫＯ１１−ＲＤ１におけるｃａｔ遺伝子の欠失に用いた。第２の組み換えでは、ＬＢ６％スクロースプレート上に画線培養（streaking）する場合に、３０℃及び３９℃の両方の温度を用いた。３０℃の温度は、更なるｃａｔ遺伝子欠失のために用いることができるレッドリコンビナーゼプラスミドｐＫＤ４６を保持するためである。両方の条件において幾つかのコロニーを選択して、ＬＢＧ、ＬＢＫａｎ、ＬＢＡｍｐ及びＬＢＣａｔ４０を含有している、異なるプレート上に塗付した（４０、１００、２００、４００、６００ｍｇｌ−ｌ）。３０℃の条件から選択したこれらのコロニーに関しては、その生育はより遅く、アンピシリン感受性でもあった。２つのコロニーを選択して、ＲＤ１−ＸＺ００１及びＲＤ１−ＸＺ００２と称した。それらは共に、ｃａｔ４００感受性である一方、ｃａｔ２００に耐性であった（表８に示す）。３９℃の条件から選択したコロニーは、生育がより早かった。２つのコロニーを選択して、ＲＤ１−ＸＺ００３及びＲＤ１−ＸＺ００４と称した。それらは共に、ｃａｔ６００に感受性である一方、ｃａｔ４００に耐性であった（下記の表８）。
【０２２２】
【表８】
0005616061.tif 000013
【０２２３】
表８において、プライマーセットｃａｔＵ/Ｄ（ｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎ）は、天然のｃａｔ遺伝子における、全ｃａｔ遺伝子（６６０ｂｐ）に近似する、６３５ｂｐＤＮＡ断片を増幅するはずである。この場合、ＰＣＲの結果をＮ（天然）とマークした。ｃａｔ遺伝子の中間部分が欠失された場合、より短いＤＮＡ断片（４６２ｂｐ）を増幅するはずである。この場合、ＰＣＲ結果をＤ（欠失）とマークした。ｐｄｃ−ａｄｈＢ−ｃａｔカセットの直列重複を検出するために、ｃａｔ−１／ｃａｔ−２及びｐｆｌＢ−２／ｐｆｌＢ−５の両方のプライマーセットを用いた。
【０２２４】
全てのコロニーが未だに高いクロラムフェニコール濃度に耐性であり、これは染色体中にｃａｔ遺伝子コピーが未だ残っていることを示唆する。高いクロラムフェニコール濃度に耐性であるための選択によって、原始株ＫＯ１１−ＲＤ１がエタノール産生性を増大させることについて長期間最適化されているので、これは合理的である。ｃａｔ遺伝子及びアルコール遺伝子（ｐｄｃ−ａｄｈＢ）の両方が染色体内で重複していると考えられた。
【０２２５】
ｃａｔ遺伝子を、これら４つの株においてＰＣＲによりテストした。プライマーセットｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎは、天然のｃａｔ遺伝子における、全ｃａｔ遺伝子（６６０ｂｐ）に近似する、６３５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するはずである。ｃａｔ遺伝子の中間部分が欠失された場合、より短いＤＮＡ断片（４６２ｂｐ）を増幅するはずである。しかし、４つの株全てで、６３０ｂｐのＤＮＡ断片のみが増幅された一方で、短い４６２ｂｐ断片は得られなかった。これは、ｃａｔ'及びｃａｔ''部位で第２の組み換え工程が起こらなかったためであるかもしれない。染色体には複数のアルコール遺伝子が存在する可能性があるので、第２の組み換え工程がｐｄｃ部位及びａｄｈＢ部位で起こる機会は、ｃａｔ遺伝子よりのはるかに多く、大いにある。そのことは、ｃａｔ'−Ｋａｎ−ｓａｃＢ−ｃａｔ''カセットを含有している、それらの間の全てのＤＮＡ断片を除去することとなり、結果として短い４６２ｂｐ断片の増幅をもたらさなかった。
【０２２６】
プライマーセットｐｆｌＢ−２／ｐｆｌＢ−５を、ｐｄｃ−ａｄｈＢ−ｃａｔカセットの直列重複を確認するために用いた。ＰＣＲ産物は、原始株ＫＯ１１−ＲＤ１及びＲＤ１−ＸＺ００４の両方において得られた。増幅した２．５ｋｂのＤＮＡ断片は、重複体の間の配列情報を獲得するために配列決定された。プライマーセットｃａｔ−１／ｃａｔ−２も、ｐｄｃ−ａｄｈＢ−ｃａｔカセットの直列重複を検出するために用いた。しかし、増幅されたＤＮＡ断片は存在しなかった。これは、プライマーｃａｔ−１及びｃａｔ−２の間のＤＮＡ断片が大きくて、現存のＰＣＲキットが何れかの増幅を獲得するのに十分ほど有効なものではなかったためであるかもしれない。
【０２２７】
４つの株全てを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。株ＲＤ１−ＸＺ００１及びＲＤ１−ＸＺ００２は、生育がはるかに遅く、ほとんど全てのエタノール産生能力を損失した。２日後の細胞生育及びエタノール産生は、株ＲＤ１−ＸＺ００３及びＲＤ１−ＸＺ００４において、原始株ＫＯ１１−ＲＤ１の４０ｇ／ｌから３０ｇ／ｌ近くまで、わずかに減少した（表８）。ＲＤ１−ＸＺ００４株を更なるｃａｔ遺伝子欠失のために選択した。
【０２２８】
ＲＤ１−ＸＺ００４における２回目のｃａｔ遺伝子欠失
１回目のｃａｔ遺伝子欠失の第２の組み換えの間に、プライマーセットｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎにより増幅された短いＤＮＡ断片（４６２ｂｐ）が存在しなかったので、全てのｃａｔ'−Ｋａｎ−ｓａｃＢ−ｃａｔ''カセットが除去されたと考えた。しかし、ネガティブなＰＣＲ結果が常に十分強力なものではなかったので、未だに２つの交差型組み換えがｃａｔ'及びｃａｔ''部位で起こった可能性があった。そうであるならば、ｃａｔ'及びｃａｔ''が染色体に残っていたことになる。さらにｃａｔ遺伝子を欠失させるために、最初の組み換え工程に未だＤＮＡ断片Ｉ（ｃａｔ'−Ｋａｎ−ｓａｃＢ−ｃａｔ'）を用いるとすれば、２つの交差型組み換えが、新たな手付かずのｃａｔ部位又は既に欠失しているｃａｔ部位のどちらかを標的にして起こる可能性は同じである。既に欠失しているｃａｔ部位で組み換えが起こることを避けるために、新たなＤＮＡ断片ＩＩＩを作成した（図１９Ｃ）。この断片では、Ｋａｎ−ｓａｃＢカセットを、ｃａｔ遺伝子中のｃａｔ'及びｃａｔ''断片の内部のｃａｔ'''及びｃａｔ''''断片の間に挿入した。それらは一回のｃａｔ遺伝子欠失の後に除去した。組み換え第一工程にＤＮＡ断片ＩＩＩを用いた場合、２つの交差型組み換えは、新たな手付かずのｃａｔ部位のみで起こり得る。組み換え第二工程に関して、ｃａｔ'''及びｃａｔ''''断片が除去されるようにＤＮＡ断片ＩＩを用いたが（図１９Ｃ）、これは更なる回で新たな手付かずのｃａｔ部位を欠失させることの助けとなる。この戦略により、染色体にｃａｔ遺伝子がどれだけ重複していても、全てのｃａｔ遺伝子を１つづつ欠失させることができる。
【０２２９】
第２の組み換えでは、ＬＢ６％スクロースプレート上に画線培養する場合に、３０℃及び３９℃の両方を用いた。両方の条件において幾つかのコロニーを選択して、ＬＢＧ、ＬＢＫａｎ、ＬＢＡｍｐ及びＬＢｃａｔを異なる濃度（４０、１００、２００、４００、６００ｍｇｌ−ｌ）で含有している、異なるプレート上に塗付した。１回目のｃａｔ遺伝子欠失の間に、３０℃の条件から選択したこれらのコロニーは、生育がより遅く、未だアンピシリンに感受性であった。２つのコロニーを選択して、ＲＤ１−ＸＺ００９及びＲＤ１−ＸＺ０１０と称した。それらは共に、ｃａｔ４０感受性であった（下記の表９に示す）。３９℃の条件から選択したコロニーは、生育がより早かった。２つのコロニーを選択して、ＲＤ１−ＸＺ０１１及びＲＤ１−ＸＺ０１２と称した。それらは共に、ｃａｔ２００に感受性である一方、ｃａｔ１００に耐性であった（表９）。
【０２３０】
【表９】
0005616061.tif 000014
【０２３１】
表９において、プライマーセットｃａｔＵ/Ｄ（ｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎ）は、天然のｃａｔ遺伝子における、全ｃａｔ遺伝子（６６０ｂｐ）に近似する、６３５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するはずである。この場合、ＰＣＲの結果をＮ（天然）とマークした。ｃａｔ遺伝子の中間部分が欠失された場合、より短いＤＮＡ断片（４６２ｂｐ）が増幅されるはずである。この場合、ＰＣＲ結果をＤ（欠失）とマークした。プライマーセットｃａｔＵ/Ｄ（ｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎ）を、ｃａｔ遺伝子の中間を増幅させるために用いた。天然のｃａｔ遺伝子に対して、増幅したＰＣＲ産物は２００ｂｐである。それらの欠失したｃａｔに対して、ＤＮＡ断片は増幅されるはずはない；プライマーセットｐｄｃｕｐ／１（ｐｄｃ−ｕｐ／ｐｄｃ−１）を、ｐｄｃ遺伝子を検出するために用いた；プライマーセットｃａｔ−ｕｐ／ｐｄｃ−１を、ｐｄｃ−ａｄｈＢ−ｃａｔカセットの直列重複を検出するために用いた。
【０２３２】
ｃａｔ遺伝子をこれら４つの株においてＰＣＲによりテストした。プライマーセットｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎを用いた場合、ＲＤ１−ＸＺ００９及びＲＤ１−ＸＺ０１０からの天然の６３５ｂｐＤＮＡ断片が未だ増幅され、これは染色体中に少なくとも１つのｃａｔ遺伝子が残っていることを示唆している。しかしそれら２つの株は全て、ｃａｔ４０に感受性であった。これは、レッドリコンビナーゼｐＫＤ４６を３０℃に保持していた延長された時間によって染色体内で起こった組み換えに起因するかもしれなく、これは細胞生育及び抗生物質耐性のための主要な幾つかの遺伝子を除去してしまったのかもしれない。従って、３９℃の培養条件から選択した株のみを用いた。１回目のｃａｔ遺伝子欠失の間に、株ＲＤ１−ＸＺ０１１及びＲＤ１−ＸＺ０１２に対して、天然の６３５ｂｐのＤＮＡ断片のみが、プライマーセットｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎを用いて増幅された一方で、短い４６２ｂｐのＤＮＡ断片は増幅されなかった。
【０２３３】
天然のｃａｔ遺伝子の１９０ｂｐＤＮＡ断片を増幅するはずである、プライマーセットｃａｔ２−ｕｐ/ｃａｔ２−ｄｏｗｎについてもテストを実施した。１回のｃａｔ遺伝子の欠失の後にＤＮＡ断片は増幅されるはずはない。１９０ｂｐのＤＮＡ断片は４つの株全てから増幅された。プライマーセットｐｄｃ−ｕｐ／ｐｄｃ−１は、ｐｄｃ遺伝子をテストするために用いて、これもまた４つの株全てから増幅された。プライマーセットｃａｔ−ｕｐ／ｐｄｃ−１を、ｐｄｃ−ａｄｈＢ−ｃａｔカセットの直列重複を確認するために用いた。ＰＣＲ産物は、原始株ＫＯ１１−ＲＤ１から、親株ＲＤ１−ＸＺ００４から、及びＲＤ１−ＸＺ０１１株から得られた。しかし、ＲＤ１−ＸＺ０１２からは増幅されなかった。これは、ＲＤ１−ＸＺ０１２株において、プライマーセットｃａｔ−ｕｐ／ｐｄｃ−１によるＤＮＡ断片の増幅をもたらされず、少なくとも２つの隣接するｃａｔ遺伝子が共に２回目に除去されたことを示唆している。
【０２３４】
４つの株全てを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。全ての株は、生育がはるかに遅く、そして、期待に反して、ｐｄｃ遺伝子は未だ検出されたが、ほとんど全てのエタノール産生能力を損失していた（表９）。
【０２３５】
ＲＤ１−ＸＺ０１２における３回目のｃａｔ遺伝子欠失
ＲＤ１−ＸＺ０１２において、ｃａｔ遺伝子を２回目と同じ戦略を用いて再度欠失させた。第２の組み換えでは、ＬＢ６％スクロースプレート上に画線培養する場合に、３９℃の温度点のみを用いた。幾つかのコロニーを選択して、ＬＢＧ、ＬＢＫａｎ、ＬＢＡｍｐ及びＬＢｃａｔを異なる濃度（４０、１００、２００、４００、６００ｍｇｌ−ｌ）で含有している、異なるプレート上に塗付した。全ての株が、ｋａｎ、ａｍｐ及びｃａｔ４０に感受性であった。
【０２３６】
ｃａｔ遺伝子をＰＣＲによりテストした。プライマーセットｃａｔ２−ｕｐ／ｃａｔ２−ｄｏｗｎを用いた場合、全てのコロニーからＤＮＡ断片は増幅されず、染色体に活性ｃａｔ遺伝子が残っていなかったことを示した（下記の表１０）。プライマーセットｃａｔ−ｕｐ／ｐｄｃ−１を用いた場合も、全てのコロニーに増幅されたＤＮＡ断片は存在しなかった。プライマーセットｃａｔ−ｕｐ／ｃａｔ−ｄｏｗｎを用いた場合、短い４６２ｂｐのＤＮＡ断片が幾つかのコロニーから増幅される一方で、他のコロニーからＤＮＡ断片は増幅されなかった（表１０）。
【０２３７】
【表１０】
0005616061.tif 000015
【０２３８】
表１０において、プライマーセットｃａｔＵ/Ｄ（ｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎ）は、天然のｃａｔ遺伝子における、全ｃａｔ遺伝子（６６０ｂｐ）に近似する、６３５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するはずである。この場合、ＰＣＲの結果をＮ（天然）とマークした。ｃａｔ遺伝子の中間部分が欠失された場合、より短いＤＮＡ断片（４６２ｂｐ）が増幅されるはずである。この場合、ＰＣＲ結果をＤ（欠失）とマークした。プライマーセットｃａｔ２Ｕ/Ｄ（ｃａｔ２−ｕｐ/ｃａｔ２−ｄｏｗｎ）を、ｃａｔ遺伝子の中間を増幅させるために用いた。天然のｃａｔ遺伝子に対して、増幅したＰＣＲ産物は２００ｂｐである。それらの欠失したｃａｔに対して、ＤＮＡ断片は増幅されるはずはない；プライマーセットｐｄｃｕｐ／１（ｐｄｃ−ｕｐ／ｐｄｃ−１）をｐｄｃ遺伝子を検出するために用いた。
【０２３９】
各タイプから２つのコロニーを選択して、プライマーセットｐｄｃ−ｕｐ／ｐｄｃ−１によりテストした。ＲＤ１−ＸＺ０１６及びＲＤ１−ＸＺ０１７に対して、ｐｄｃ遺伝子断片が増幅された。しかし、ＲＤ１−ＸＺ０１８及びＲＤ１−ＸＺ０１９に対しては、ＤＮＡ断片は増幅されなかった。これは、ＲＤ１−ＸＺ０１８及びＲＤ１−ＸＺ０１９に関して、第２工程組み換えの間に、ｐｄｃ−ａｄｈＢ−ｃａｔカセットの外側の部位では起こったが、ｃａｔ'及びｃａｔ''部位では２つの交差組み換えが起こらず、内側の全てのＤＮＡ断片が除去されたと考えた。
【０２４０】
４つの株全てを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。全ての株は、生育がより遅かった。株ＲＤ１−ＸＺ０１６及びＲＤ１−ＸＺ０１７は、ｐｄｃ遺伝子が未だ検出されたが、非常に僅かなエタノールしか産生しなかった（１ｇ／ｌ未満）。株ＲＤ１−ＸＺ０１８及びＲＤ１−ＸＺ０１９はエタノールを産生しなかった（表１０）。
【０２４１】
ＲＤ１−ＸＺ０１８へのアルコール遺伝子の再組み込み
エタノール産生能を獲得するために、アルコールカセット（ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ）の株ＲＤ１−ＸＺ０１８への再組み込みを行った。ｐｆｌＢ及びｒｒｌＥの両方の遺伝子を組み込み部位として選択した。
【０２４２】
ｐｆｌＢ'−ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ−ｐｆｌＢ''カセット（図２０）をＲＤ１−ＸＺ０１８株に電気穿孔して、ＬＢｋａｎプレート上に延展した後に、コロニーは生育しなかった。しかし、ｒｒｌＥ'−ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ−ｒｒｌＥ''カセット（図２１）を用いた場合、コロニーがちょうど８時間後にＬＢ  Ｋａｎプレート上に出現した。２つのタイプのコロニーが存在した。１つは厚く、隆起していた。このタイプの６つのコロニーを選択して、ＲＤ１−ＸＺ０２０、ＲＤ１−ＸＺ０２１、ＲＤ１−ＸＺ０２２、ＲＤ１−ＸＺ０２３、ＲＤ１−ＸＺ０２６及びＲＤ１−ＸＺ０２７と称した。他のタイプは、薄く平坦であった。このタイプの２つのコロニーを選択して、ＲＤ１−ＸＺ０２４及びＲＤ１−ＸＺ０２５と称した。８つの株全てを、プライマーセットｒｒｌＥ−ｕｐ／ｐｄｃ−１を用いてＰＣＲによりテストして、全て陽性であった。
【０２４３】
８つの株を、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。ＲＤ１−ＸＺ０２４及びＲＤ１−ＸＺ０２５は、薄く平坦なコロニーを有していて、他よりも生育がはるかに遅く、ほんの僅かしかエタノールを産生しなかった。厚く隆起したコロニーを有する他の株は、原始株ＫＯ１１−ＲＤ１よりさえも生育が早かった。それらは、ＫＯ１１−ＲＤ１と近似する量のエタノールを、４８時間後に約４０ｇ／ｌも産生した（下記の表１１）。ＲＤ１−ＸＺ０２７は、２４時間後に最大量のエタノールを産生して、これが最大エタノール産生能を有することを示した。この株を、ｆｌｉｐａｓｅ処理による更なるｋａｎ遺伝子の除去に用いた。
【０２４４】
【表１１】
0005616061.tif 000016
【０２４５】
ＲＤ１−ＸＺ０２７からｆｌｉｐａｓｅ処理によりｋａｎ遺伝子を除去した後に、４つのコロニーを選択して、ＲＤ１−ＸＺ０２８、ＲＤ１−ＸＺ０２９、ＲＤ１−ＸＺ０３０及びＲＤ１−ＸＺ０３１と称した。それらを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。細胞生育及びエタノール産生については、これら４つの株は同様であった。ＲＤ１−ＸＺ０２８が、最大のエタノールを産生して（４８時間後に４３．６ｇ／ｌ）、これは原始株ＫＯ１１−ＲＤ１より少し高かった。
ＫＯ１１−ＲＤ１におけるｃａｔ遺伝子欠失及びアルコール遺伝子再組み込みの全工程を、表１６に要約している。
【０２４６】
ＢＷ３４におけるｃａｔ遺伝子欠失
ｃａｔ遺伝子を、クレブシエラ・オキシトカＢＷ３４においても２工程の相同的組み換え法を用いて欠失させた。第２の組み換えでは、ＬＢ６％スクロースプレート上に画線培養（streaking）する場合に、３０℃及び３９℃の両方の温度を用いた。両方の条件において幾つかのコロニーを選択して、ＬＢＧ、ＬＢＫａｎ、ＬＢＡａｃ及びＬＢｃａｔを異なる濃度（４０、１００、２００、４００、６００ｍｇｌ−ｌ）で含有している、異なるプレート上に塗付した。３０℃の条件から選択したこれらのコロニーに関して、その生育はより遅く、予想外にアンピシリン感受性でもあった。２つのコロニーを選択して、ＢＷ３４−ＸＺ１０１及びＢＷ３４−ＸＺ１０２と称した。それらは共に、ｃａｔ４００に感受性である一方、ｃａｔ２００に耐性であった（表１２）。３９℃の条件から選択したコロニーは、生育がより早かった。殆どの３９℃コロニーは、ｃａｔ４００に感受性である一方、ｃａｔ２００に耐性であった。２つのコロニーを選択して、ＢＷ３４−ＸＺ１０３及びＢＷ３４−ＸＺ１０４と称した。しかし、１つのコロニーは未だｃａｔ６００に耐性であり、これをＢＷ３４−ＸＺ１０５と称し、そして１つのコロニーは未だｃａｔ４０に感受性であり、これをＢＷ３４−ＸＺ１０６と称した。
【０２４７】
【表１２】
0005616061.tif 000017
【０２４８】
表１２において、プライマーセットｃａｔＵ/Ｄ（ｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎ）は、天然のｃａｔ遺伝子における、全ｃａｔ遺伝子（６６０ｂｐ）に近似する、６３５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅するはずである。この場合、ＰＣＲの結果をＮ（天然）とマークした。ｃａｔ遺伝子の中間部分が欠失された場合、より短いＤＮＡ断片（４６２ｂｐ）が増幅されるはずである。ｃａｔ−１/ｃａｔ−２のプライマーセットを、ｃａｔ遺伝子の直列重複を検出するために用いた。
【０２４９】
ｃａｔ遺伝子を６つの株全てにおいてＰＣＲによりテストした。プライマーセットｃａｔ−１/ｃａｔ−２を、ｃａｔ遺伝子の重複を検出するために用いた。ほぼ１．８ｋｂのＤＮＡ断片が原始株ＢＷ３４から増幅され、ＫＯ１１−ＲＤ１の場合と同様に、Ｋ.ｐｆｌＢ'−ｐｄｃ−ａｄｈＢ−ｃａｔ−Ｋ.ｐｆｌＢ''カセット全体に対して直列重複が起こらなかったことを示唆した。対照的に、ｃａｔ遺伝子のみが重複していた。増幅された１．８ｋｂのＤＮＡ断片に配列決定を施して、この重複間の配列情報を得た。ｃａｔ遺伝子の欠失後、１．８ｋｂのＤＮＡ断片を株ＢＷ３４−ＸＺ１０５からのみ増幅することができた。他の５つの株全てからはそれは増幅されず、両方のｃａｔ遺伝子が共に欠失されたことを示唆している。
【０２５０】
プライマーセットｃａｔ−ｕｐ/ｃａｔ−ｄｏｗｎを用いた場合、６３５ｂｐのＤＮＡ断片（天然）が、ＢＷ３４−ＸＺ１０６を除く全ての株に増幅された。短い４６２ｂｐ断片が得られなかった理由としては、ＫＯ１１−ＲＤ１の場合と同じであると考えた。ｃａｔ−１／ｃａｔ−２のＰＣＲの結果に起因して、２つのｃａｔ遺伝子は共に欠失されたのだから、ＢＷ３４の染色体には少なくとも３つのｃａｔ遺伝子コピーが存在したと考えた。
【０２５１】
驚くべきことに、ＢＷ３４−ＸＺ１０６からはＤＮＡ断片が増幅されず、この株はｃａｔ４０に感受性であった。これは、第２工程の２つの交差組み換えが、全てのｃａｔ遺伝子の外側で起こり、結果的にこの遺伝子が共に除去されたためであるかもしれない。
【０２５２】
６つの株全てを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。ＢＷ３４−ＸＺ１０５の細胞生育及びエタノール産生は原始株ＢＷ３４と近似していた。しかし、他の５つの株全ては、生育が非常に遅く、エタノール産生能を全て失っていた（表７）。
【０２５３】
ＢＷ３４−ＸＺ１０６のｐｆｌＢ部位へのアルコール遺伝子の再組み込み
エタノール産生能を獲得するために、アルコールカセット（ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ）のＢＷ３４−ＸＺ１０６株への再組み込みを行った。ｐｆｌＢ及びｒｒｌＥの両方の遺伝子を組み込み部位として選択した。
【０２５４】
Ｋ.ｐｆｌＢ'−ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ−Ｋ.ｐｆｌＢ''カセット（図２２）をＢＷ３４−ＸＺ１０６株に電気穿孔して、ＬＢｋａｎプレート上に延展した後、２つのタイプのコロニーが存在した。１つは薄く平坦であって、プレートの９９％を占めていた。２つのコロニーを選択して、ＢＷ３４−ＸＺ１０７及びＢＷ３４−ＸＺ１０８と称した。他のタイプは、厚く隆起していて、プレートの僅か１％に過ぎないものであった。２つのコロニーを選択して、ＢＷ３４−ＸＺ１０９及びＢＷ３４−ＸＺ１１０と称した。
【０２５５】
プライマーセットＫ.ｆｏｃＡ−ｕｐ／ｐｄｃ−１を用いて組み換えを確認した。前方プライマー（Ｋ.ｆｏｃＡ−ｕｐ）が染色体のｐｆｌＢ遺伝子の上流であった。株ＢＷ３４−ＸＺ１０９及びＢＷ３４−ＸＺ１１０に関しては、これらはほぼ１．５ｋｂの産物を増幅した。しかし、ＢＷ３４−ＸＺ１０７及びＢＷ３４−ＸＺ１０８に関しては、ＤＮＡ断片は増幅されなかった。これは、ＢＷ３４−ＸＺ１０６における以前のｃａｔ遺伝子欠失の間に、天然のｐｆｌＢ３'−末端が欠失されたものと考えられる。ＢＷ３４−ＸＺ１０９及びＢＷ３４−ＸＺ１１０に関しては、２つの交差組み換えが、クレブシエラ染色体の天然のｐｆｌＢ５'−末端部位に起こり、他の部位に重複したｐｆｌＢ３'−末端が生じた（図２４Ａ）。しかし、ＢＷ３４−ＸＺ１０７及びＢＷ３４−ＸＺ１０８に関しては、２つの交差組み換えが、ｐｆｌＢ部位で全て起こり、後で染色体の他の部位に重複が生じた（図２４Ｂ）。後者の方法で生じる可能性がより高く、なぜこのタイプのコロニーが９９％存在していたかが説明できた。
【０２５６】
４つの株全てを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。ＢＷ３４−ＸＺ１０９及びＢＷ３４−ＸＺ１１０における４８時間後のエタノール産生は、ＢＷ３４−ＸＺ１０７及びＢＷ３４−ＸＺ１０８よりも少し高く、これらの全てが原始株ＢＷ３４より優れていた（下記の表１３）。ＢＷ３４−ＸＺ１１０が最も多くエタノールを産生したので（４８時間後に２２．４ｇ/ｌ）、これを更なるｋａｎ遺伝子の除去に用いた。
【０２５７】
【表１３】
0005616061.tif 000018
【０２５８】
表１３では、プライマーセットｐｄｃ−ｕｐ／ｐｄｃ−１を、ｐｄｃ遺伝子を確認するために用いた。プライマーセットＫ.ｆｏｃＡ−ｕｐ／ｐｄｃ−１を、２つの交差組み換え部位を確認するために用いた。
【０２５９】
ｋａｎ遺伝子をｆｌｉｐａｓｅ処理によりＢＷ３４−ＸＺ１１０から除去した後に、４つのコロニーを選択してＢＷ３４−ＸＺ１１３、ＢＷ３４−ＸＺ１１４、ＢＷ３４−ＸＺ１１５及びＢＷ３４−ＸＺ１１６と称した。これらを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてもテストした。これら４つの株における細胞生育及びエタノール産生は近似していた。ＢＷ３４−ＸＺ１１３が最もエタノールを産生した（４８時間後に２２．２ｇ／ｌ）。この株を、１０％グルコース又は１０％キシロースのどちらかを含むＡＭ１培地におけるエタノール産生についてもテストした。キシロース発酵における４８時間後のエタノール産生（３６．４ｇ／ｌ）は、グルコースの場合（２８．７ｇ／ｌ）よりも高く、この両方がＬＢ培地の場合（２２．２ｇ／ｌ）より優れていた（下記の表１４）。乳酸塩、コハク酸塩及び酢酸塩のようないくらかの副産物の形成も見られた（表１４）。特にグルコース発酵では、２９４ｍＭの乳酸塩の産生が見られた。これらの副産物は、ピルビン酸に対するピルビン酸デカルボキシラーゼと競合する、他の発酵酵素（乳酸脱水素酵素、フマル酸還元酵素及び酢酸キナーゼ）の活性に起因していた。
【０２６０】
【表１４】
0005616061.tif 000019
【０２６１】
ＢＷ３４−ＸＺ１０６のｒｒｌＥ部位へのアルコール遺伝子の再組み込み
Ｋ.ｒｒｌＥ'−ｐｄｃ−ａｄｈＡ−ａｄｈＢ−ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ−Ｋ.ｒｒｌＥ''カセット（図２３）を株ＢＷ３４−ＸＺ１０６に電気穿孔して、ＬＢＫａｎプレート上に延展した後、２つのタイプのコロニーが存在した。１つは厚く隆起していた。２つのコロニーを選択して、ＢＷ３４−ＸＺ１１７及びＢＷ３４−ＸＺ１１８と称した。他のタイプは、薄く平坦であった。２つのコロニーを選択して、ＢＷ３４−ＸＺ１１９及びＢＷ３４−ＸＺ１２０と称した。
【０２６２】
４つの株全てを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてテストした。ＢＷ３４−ＸＺ１１７及びＢＷ３４−ＸＺ１１８における４８時間後のエタノール産生は、アルコール遺伝子をｐｆｌＢ部位に組み込んだＢＷ３４−ＸＺ１１０と同様であった。対照的に、ＢＷ３４−ＸＺ１１９及びＢＷ３４−ＸＺ１２０におけるエタノール産生は、非常に低かった（下記の表１５）。ＢＷ３４−ＸＺ１１８が最もエタノールを産生したので（４８時間後に２２．５ｇ/ｌ）、これを更なるｋａｎ遺伝子の除去に用いた。
【０２６３】
【表１５】
0005616061.tif 000020
【０２６４】
ｋａｎ遺伝子をｆｌｉｐａｓｅ処理によりＢＷ３４−ＸＺ１１８から除去した後に、４つのコロニーを選択してＢＷ３４−ＸＺ１２１、ＢＷ３４−ＸＺ１２２、ＢＷ３４−ＸＺ１２３及びＢＷ３４−ＸＺ１２４と称した。これらを、ＬＢ及び１０％キシロースを含む１２５ｍＬフラスコ発酵におけるエタノール産生についてもテストした。これら４つの株における細胞生育及びエタノール産生は近似していた。ＢＷ３４−ＸＺ１２３が最もエタノールを産生し（４８時間後に２３．２ｇ／ｌ）、アルコール遺伝子をｐｆｌＢ部位に組み込んだＢＷ３４−ＸＺ１１３の場合（２２．２ｇ／ｌ）よりも少し高かった。
【０２６５】
下記の表１６は、ＫＯ１１−ＲＤ１におけるｃａｔ遺伝子の欠失及びアルコール遺伝子の再組み込みの要約を示していて、下記の表１７は、ＢＷ３４におけるｃａｔ遺伝子の欠失及びアルコール遺伝子の再組み込みの要約を示している。
【０２６６】
【表１６】
0005616061.tif 000021
【０２６７】
【表１７】
0005616061.tif 000022
【０２６８】
要約すると、幾つかのＫ．オキシトカの株が、抗生物質耐性マーカーを使用せずに、エタノール産生性についてリエンジニア（re-engineered）されている。それらを下記の表１８に要約した。
【０２６９】
【表１８】
0005616061.tif 000023
【０２７０】
これらのリエンジニアされた株を、酸加水分解バガス繊維を用いた同時糖化発酵（ＳＳＦ）のための標準的手順を使用してテストした。下記の表１９は、これらの検討に用いたベルトケーキ（belt cakes）の組成分析を示す。
【０２７１】
【表１９】
0005616061.tif 000024
【０２７２】
株ＸＺ１１２、１１３、１１５のＳＳＦは、バガスのＶＯＰ＃12−ＳＳＦを用いて、以下の例外で実施した：乾燥重量１００ｇのバガスを６００ｍＬの水道水を入れた発酵容器中に置き、３０分間１２１℃にて加圧減菌した。制限基質に依存して、株ＸＺ１１２、１１３のＳＳＦをＳｃｒｅｗ  Ｐｒｅｓｓ  ｂａｇａｓｓｅ「ＳＰ５Ｃ＿Ｃ２」で、株ＳＺ１１５のＳＳＦはＣａｋｅ＃０７０２０７Ｔ１５０−ＢＷ−ＣＡＫＥ−ＲＯＬＬで実施した。ＳＰ５Ｃ＿Ｃ２（ｐＨ６．４６）は、以前のＢＷ３４の発酵が７２時間で７２％の変換に到達していたので、さらに洗浄はしなかった。Ｃａｋｅ＃０７０２０７Ｔ１５０−ＢＷ−ＣＡＫＥ−ＲＯＬＬは、ＶＯＰ＃２８−Ｂｉｏｍａｓｓ  Ｆｉｂｅｒ  Ｗａｓｈｉｎｇを用いてｐＨ４．９６に洗浄した。
【０２７３】
図１７に示すように、新たなアームレス（armless）株、ＸＺ１１２及び１１３（７２時間で７６％変換）は、原始株ＢＷ３４（７２時間で７２％）に関して最高に機能した。ＸＺ１１５及びコントロールＢＷ３４の両方は、ｃａｋｅ０７０２０７Ｔ１５０発酵に問題があったが、恐らく酵素の攻撃又はその阻害剤濃度に対する基質の感受性に起因していた。１つの可能性は、ｐＨ（４．９６）洗浄がＳＰ５Ｃ＿Ｃ２（ｐＨ６．４６）と比較して低い側の洗浄であったためにより徹底した洗浄が必要になるということである。更なる２４時間で有利にもこのｃａｋｅは７０％の変換に到達したので、後者の可能性：阻害化合物の存在が速度を減少させる；を示唆した。ＸＺ１１５は、全般的変換の測定において約１０％低い効率で機能したものの、阻害化合物がこのｃａｋｅ全体に均一に分散されていなかったかもしれないので、この株が原始株ＢＷ３４と同じレベルであるかないかについての結論はでない。
【０２７４】
下記の表２０は、組み換え生体触媒によるキシロースからエタノールを産生することについての最近の文献を要約したものである。これらの多くは複合栄養素を必要とすることが知られている。複合培地で又は無機塩培地で比較しても、本明細書に記述する新規の大腸菌組み換え株よりも高い収率又は力価を持ってキシロースをエタノールへ発酵させるものはない。
【０２７５】
【表２０】
0005616061.tif 000025
【０２７６】
略語：ＬＢ、酵母抽出物＋トリプトン；Ｍｉｎ、無機物＋1ｍＭベタイン；ＹＥ、リン酸塩を補完した酵母抽出物；ＹＥＰ、酵母抽出物及びペプトンを補完した；Ｓｙｎｔｈ、ビタミン混合物を補完した無機物；８Ｇ、１リットル当たり８ｇのグルコースを添加した。
【０２７７】
参照文献
【０２７８】
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【０２７９】
参照による取り込み
本明細書に開示された全ての特許、公開された特許出願及び他の引例は、それらの全てを参照して本明細書に明確に取り込まれている。
【０２８０】
均等物
本明細書に記述する本発明の具体的な態様の多くの均等物を、当業者は認識できるであろう、又は単なる通常の実験を用いて確認できるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるように意図されている。
【図１−１】
0005616061.tif 000026
【図１−２】
0005616061.tif 000027
【図２】
0005616061.tif 000028
【図３】
0005616061.tif 000029
【図４】
0005616061.tif 000030
【図５】
0005616061.tif 000031
【図６】
0005616061.tif 000032
【図７】
0005616061.tif 000033
【図８】
0005616061.tif 000034
【図９】
0005616061.tif 000035
【図１０】
0005616061.tif 000036
【図１１】
0005616061.tif 000037
【図１２】
0005616061.tif 000038
【図１３】
0005616061.tif 000039
【図１４】
0005616061.tif 000040
【図１５】
0005616061.tif 000041
【図１６】
0005616061.tif 000042
【図１７】
0005616061.tif 000043
【図１８】
0005616061.tif 000044
【図１９】
0005616061.tif 000045
【図２０】
0005616061.tif 000046
【図２１】
0005616061.tif 000047
【図２２】
0005616061.tif 000048
【図２３】
0005616061.tif 000049
【図２４】
0005616061.tif 000050
【配列表】
0005616061000001.app