(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物の合成方法であって：
【化１】
0005616628.tif 000103
〔上記式中、
Ｒ１は‐ＯＨ、‐ＯＲａから選択され、ここでＲａは置換もしくは非置換アルキルから選択され、
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、または酸性条件下において加水分解する窒素保護基から選択され、
Ｘは臭化物アニオンであり、および
Ｙは、下記式VIａのＮ含有基：
【化２】
0005616628.tif 000104
上記式中、
点線は窒素原子と共に非置換ピリジンを形成し、および
Ｘは前記と同義であり、
ａ）下記式IVのエナンチオ純粋化合物：
【化３】
0005616628.tif 000105
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である）またはその混合物を下記式Ｖの化合物：
【化４】
0005616628.tif 000106
（上記式中、Ｒ４は前記と同義である）と反応させて、下記式IIIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体：
【化５】
0005616628.tif 000107
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）またはその混合物を生じさせ、
ｂ）前記式IIIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を、下記式IIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体：
【化６】
0005616628.tif 000108
〔上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義であり、
Ｒ５は負電荷またはＲ３から選択され、ここでＲ３は前記と同義であり、およびＹは以下から選択されるＮ含有有機残基である：
（ｉ）Ｒ５が負電荷である場合、Ｙは下記式VIIａのＮ含有有機残基である：
【化７】
0005616628.tif 000109
（上記式中、点線は窒素原子と共に非置換ピリジンを形成する）、または
（ii）Ｒ５がＲ３である場合、Ｙは
下記式VIIｃのＮ含有有機残基：
【化８】
0005616628.tif 000110
（上記式中、点線は窒素原子と共に非置換ピリジンを形成し、および
Ｚは臭化物アニオンである）〕
またはその混合物へ変換し、そして
ｃ）前記式IIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を、式ＨＸの酸（Ｘは前記と同義である）を含んでなる酸媒体と接触させて、前記式Ｉの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を生じさせることを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記式IVの化合物が、Ｓ異性体およびＲ異性体から選択されるエナンチオ純粋化合物の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記式IVの化合物が、５Ｒ‐４‐メチレン‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステルまたは５Ｓ‐４‐メチレン‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記式Ｖの化合物がＮ‐トシルイミノベンジルヨージナンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記式IIIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を下記式VIIIａの窒素含有求核剤：
【化９】
0005616628.tif 000111
（上記式中、点線は窒素原子と共に非置換ピリジンを形成する）と反応させることにより、式IIIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物が、Ｒ５が負電荷でかつＹが式VIIａのＮ含有有機残基である式IIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体へ変換される、または
前記式IIIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物が、Ｒ５がＲ３でかつＹが式VIIｂのＮ含有有機残基である式IIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体へ変換される、または
前記式IIIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物を、下記式VIIIａの窒素含有求核剤：
【化１０】
0005616628.tif 000112
（上記式中、点線は窒素原子と共に非置換ピリジンを形成する）および下記式Ｘの化合物：
Ｒ３Ｚ        （Ｘ）
（上記式中、Ｒ３およびＺは前記と同義である）と反応させることにより、前記式IIIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体またはその混合物が、Ｒ５がＲ３でかつＹが式VIIｃのＮ含有有機残基である式IIの化合物の９５％以上の純度を有する立体異性体へ変換される、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記式IIIの化合物が、９５％以上の純度を有する立体異性体（３Ｒ，５Ｒ）、（３Ｓ，５Ｓ）、（３Ｒ，５Ｓ）、または（３Ｓ，５Ｒ）の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
下記である、化合物：
９５％以上の純度を有する３Ｓ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩。
【請求項８】
薬学上許容可能な担体と、請求項７に記載の化合物とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の化合物または請求項８に記載の組成物と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項１０】
下記からなる群より選択される、式IIIの化合物：
ａ）下記式IIIａの９５％以上の純度を有する化合物：
【化１１】
0005616628.tif 000113
（上記式中、
Ｒ１は‐ＯＨ、‐ＯＲａから選択され、ここでＲａは置換もしくは非置換アルキルから選択され、
Ｒ２およびＲ４は、独立して、水素、または酸性条件下において加水分解する窒素保護基から選択される）、
ｂ）下記式IIIｂの化合物：
【化１２】
0005616628.tif 000114
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）、
ｃ）下記式IIIｃの化合物：
【化１３】
0005616628.tif 000115
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）、
ｄ）下記式IIIｄの化合物：
【化１４】
0005616628.tif 000116
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）、および
ｅ）それらの混合物。
【請求項１１】
下記式ＩＩｄの化合物：
【化１５】
0005616628.tif 000117
（上記式中、
Ｒ１は‐ＯＨ、‐ＯＲａから選択され、ここでＲａは置換もしくは非置換アルキルから選択され、
Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５は、独立して、水素、または酸性条件下において加水分解する窒素保護基から選択され、および
Ｙは、下記式VIａのＮ含有基：
【化１６】
0005616628.tif 000118
上記式中、点線は窒素原子と共に非置換ピリジンを形成し、および
Ｘは臭化物アニオンである）、
を、式ＨＸの酸を含んでなる酸媒体と接触させることを含んでなり、ここでＸが臭化物アニオンである、請求項７に記載の化合物の合成方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の式IIIの化合物を生じさせるために、下記式IVのエナンチオ純粋化合物：
【化１７】
0005616628.tif 000119
（上記式中、
Ｒ１は‐ＯＨ、‐ＯＲａから選択され、ここでＲａは置換もしくは非置換アルキルから選択され、および
Ｒ２は水素、または酸性条件下において加水分解する窒素保護基である）またはその混合物を、
下記式Ｖの化合物：
【化１８】
0005616628.tif 000120
（上記式中、Ｒ４は水素、または酸性条件下において加水分解する窒素保護基である）と反応させることを含んでなる方法。
【請求項１３】
請求項７に記載の化合物と、薬学上許容可能な担体とを含んでなる、腫瘍の治療のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ピログルタミン酸誘導体、それらの単離された光学活性立体異性体およびその混合物の新規合成およびそれらの使用、並びにそれの合成に向けた新規中間体に関する。本発明は、前記ピログルタミン酸誘導体、それらの光学活性立体異性体、およびその混合物の治療上の使用にも関する。
【０００２】
背景技術
欧州特許ＥＰ０７６８３０８Ｂ１号は、免疫生物学的応答を賦活させる、下記一般式を有したピログルタミン酸誘導体の立体異性体の混合物について開示している：
【化１】
0005616628.tif 000002
上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、水素または‐Ｃ（＝Ｏ）Ｍｅであり、ＡはＣｌ‐、ＣＨ３ＣＯＯ‐、またはＨＯ‐でもよい。前記化合物の合成についてそこで開示された工程では、加熱下においてＬ‐セリンをモル過剰の無水酢酸およびピリジンと反応させている。したがって、前記書類で開示されているように、異なる立体異性体が単離されたことはなく、そこで開示されたインビボおよびインビトロアッセイはすべて一緒に４種の可能な光学活性立体異性体の混合物において行われる。個別的立体異性体の純粋または富化混合物に関する記述は開示されていない。更に、開示された混合物から異なる光学活性立体異性体の単離に関する記述もない。
【０００３】
化合物の異なる光学活性立体異性体が異なるまたは正反対の効果すら有しうることは、当業者に知られている。例えば、ある化合物は治療効果を有するが、そのエナンチオマーは毒性がある。このような状況の例は当業者に周知である。デキストロメトルファンは鬱血除去剤であるが、レボメトルファンは強い麻薬である。
【化２】
0005616628.tif 000003
【０００４】
ペルヘキシリンのエナンチオマーの異なるインビボ挙動も知られている。
【化３】
0005616628.tif 000004
それらは双方とも心調律のモジュレーターであるが、エナンチオマーの一方はゆっくり代謝されて体に蓄積し、そうした状況が８０年代に多くの死亡を招いた。
【０００５】
おそらく最も悲劇的な周知の例がサリドマイドであり、これはつわりを治療するために妊娠女性へラセミ混合物として投与された。
【化４】
0005616628.tif 000005
Ｒ‐サリドマイドは有効であったが、Ｓ‐サリドマイドの催奇作用が後に見出された。
【０００６】
したがって、有益な治療効果をもつ新規化合物の研究では、最も活性なエナンチオマーを選択しおよび／または最終的に毒性を有するものを放棄するのに際して、エナンチオ純粋立体異性体においてアッセイを行うことが通常必要となる。そのため、ピログルタミン酸誘導体の単離立体異性体を提供することが求められている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ピログルタミン酸誘導体、それらの光学活性立体異性体およびその混合物を得るための工程を提供する。本工程は、望ましい光学活性立体異性体を得るために容易に分割し、その後に変換される、ピログルタミン酸誘導体の前駆体の光学活性立体異性体の使用を伴う。
【０００８】
特に、本発明者らは、所望であれば望ましい立体化学をもつ異なる中間体が単離される合成を構想した。これらの中間産物は、望ましい実質的に純粋な立体異性体の形態でまたは立体異性体の混合物の形態で望ましいピログルタミン酸誘導体を提供するために、更に変換されてもよい。本発明者らは式IVのエナンチオ純粋化合物から出発して、容易に分割および精製されうるジアステレオマー中間体および最終産物を生産する。望ましい立体化学をもつ式IVの化合物を用いると、実質的に純粋な立体異性体の形でまたは立体異性体の混合物の形で中間体を得ることが可能である。前記式IVの該化合物はエナンチオ純粋グルタミン酸を用いて合成されてもよい。
【０００９】
したがって、ある態様によると、本発明は、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を得るために式IVの化合物を式Ｖの化合物を反応させ、前記式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物へ変換し、および、最後に、実質的に純粋な立体異性体またはその混合物として式Ｉの望ましいピログルタミン酸誘導体を生じさせるために前記式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を、式ＨＸの化合物と反応させることを含んでなる、式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を得るための工程に関する。
【００１０】
本発明の別な態様によれば、式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体（即ち、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、またはＩｄ）に関する。式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、および／またはＩｄの化合物の実質的に純粋な立体異性体の混合物を含んでなるある組成物、例えば式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、および／またはＩｄの立体異性体を含んでなるが、但し下記化合物：
（ｉ）１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩または
（ii）１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩
の全４種立体異性体の混合物を同時に含有しない組成物が、本発明の別の態様を構成する。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物に関する。上記化合物を得るための工程が本発明の追加的態様を構成する。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体または前記式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体を得るための工程に関する。式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体（即ち、IIａ、IIｂ、IIｃ、またはIIｄ）が本発明の追加的態様を構成する。式IIａ、IIｂ、IIｃ、および／またはIIｄの実質的に純粋な立体異性体の混合物を含んでなるある組成物も、本発明の別の態様を構成する。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄの化合物およびその混合物の群から選択される化合物と、薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなるある医薬組成物に関する。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、腫瘍を予防または治療するための組成物の製造に際する、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄの化合物およびそのある混合物の群から選択される化合物の使用に関する。
【発明の具体的説明】
【００１５】
定義
本発明の理解を促すために、本発明に関連して用いられているようなある用語および表現の意味がここでは含まれる。
【００１６】
“アルキル”とは、炭素および水素原子からなり、不飽和を含まず、１〜１２、好ましくは１〜８の炭素原子を有し、単結合で分子の残部へ結合される、直鎖状または分岐状炭化水素鎖基、例えばメチル、エチル、ｎ‐プロピル、ｉ‐プロピル、ｎ‐ブチル、ｔ‐ブチル、ｎ‐ペンチルなどに関する。アルキル基は、一以上の置換基、例えばハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｏ‐プロピル、Ｏ‐ベンジル、Ｏ‐ベンゾエート、カルボキシ、シアノ、カルボニル、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、ニトロ、メルカプト、およびアルキルチオによって場合により置換されていてもよい。
【００１７】
“アルケニル”とは、炭素および水素原子からなり、少なくとも一つの不飽和を含み、１〜１２、好ましくは１〜８の炭素原子を有し、単結合により分子の残部へ結合される、直鎖状または分岐状炭化水素鎖基、例えばメチル、エチル、ｎ‐プロピル、ｉ‐プロピル、ｎ‐ブチル、ｔ‐ブチル、ｎ‐ペンチルなどに関する。アルキル基は、一以上の置換基、例えばハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｏ‐プロピル、Ｏ‐ベンジル、Ｏ‐ベンゾエート、カルボキシ、シアノ、カルボニル、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、ニトロ、メルカプト、およびアルキルチオによって場合により置換されていてもよい。
【００１８】
“アルコキシ”とは式‐Ｏ‐アルキルの基（ここで、アルキルは前記と同義である）、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシなどに関する。
【００１９】
“アリール”とは芳香族炭化水素基、例えばフェニル、ナフチル、またはアントラシルに関する。アリール基は、一以上の置換基、例えばここで定義されているようなヒドロキシ、メルカプト、ハロ、アルキル、フェニル、アルコキシ、ハロアルキル、ニトロ、シアノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシル、およびアルコキシカルボニルによって場合により置換されていてもよい。
【００２０】
“アリールオキシ”とは式‐Ｏ‐アリールの基に関し、ここでアリールは前記と同義である。アラルオキシ化合物のある例は‐Ｏ‐フェニル、‐Ｏ‐ｐ‐トリル、‐Ｏ‐ｍ‐トリル、‐Ｏ‐ｏ‐トリル、または‐Ｏ‐ナフチルである。
【００２１】
“アミノ”とは式‐ＮＨ２‐、‐ＮＨＲａ、‐ＮＲａＲｂの基に関し、ここでＲａおよびＲｂは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換シクロアルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、または置換もしくは非置換ヘテロシクリルから選択され、またはＲａおよびＲｂは一緒になって、置換もしくは非置換ヘテロ環、置換もしくは非置換シクロアルキル、または置換もしくは非置換シクロアルケニルを形成する。
【００２２】
“アラルキル”とは、アルキル基へ結合されたアリール基、例えばベンジルおよびフェネチルに関する。
【００２３】
“カルボキシエステル”とは‐ＣＯ２Ｒａ‐に関し、ここでＲａは置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換シクロアルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、または置換もしくは非置換ヘテロシクリルから選択される。
【００２４】
“シクロアルキル”とは３〜８の炭素原子を有する飽和炭素環式環に関する。
【００２５】
“シクロアルケニル”とは３〜８の炭素原子と少なくとも一つの不飽和を有する炭素環式環に関する。
【００２６】
“ヘテロシクリル”とは、炭素原子と窒素、酸素、およびイオウからなる群より選択される１〜５のヘテロ原子からなる安定３〜１５員環、好ましくは１以上のヘテロ原子を有する４〜８員環、更に好ましくは１以上のヘテロ原子を有する５または６員環に関する。本発明の目的にとり、ヘテロ環は単環式、二環式、または三環式環系であり、それは縮合環系を含んでもよく、ヘテロシクリル基における窒素、炭素、またはイオウ原子は場合により酸化されてもよく、窒素原子は場合により四級化されてもよく、およびヘテロシクリル基は部分的または完全な飽和でもまたは芳香族でもよい。このようなヘテロ環の例にはアゼピン類、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、フラン、イソチアゾール、イミダゾール、インドール、ピペリジン、ピペラジン、プリン、キノリン、チアジアゾール、テトラヒドロフランが含まれるが、それらに限定されない。
【００２７】
“ヘテロアリール”とは、環の少なくとも一つが芳香環であるヘテロ環式基に関する。
【００２８】
“保護基”とは、有機官能基をブロックして、制御条件下で除去されうる基に関する。保護基、それらの相対的反応性およびそれらが不活性で留まる条件は当業者に知られている。Greene and Wuts,”Protective Groups in Organic Synthesis“,John Wiley & Sons,Inc.,New York,1999が参考にされる。
【００２９】
本発明の化合物における置換基へのここでの言及は、一以上の適切な基、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードのようなハロゲン、シアノ、ヒドロキシル、ニトロ、アジド、アルカノイル、例えばＣ１‐Ｃ６アルカノイル基、例えばアシルなど、１〜約１２の炭素原子または１〜約６の炭素原子、更に好ましくは１〜３の炭素原子を有する基を含めたアルキル基、一以上の不飽和結合と２〜約１２の炭素または２〜約６の炭素原子を有する基を含めたアルケニルおよびアルキニル基、一以上の酸素結合と１〜約１２の炭素原子または１〜約６の炭素原子を有するアルコキシ基、フェノキシのようなアリールオキシ、一以上のチオエーテル酸素結合と１〜約１２の炭素原子または１〜約６の炭素原子を有する部分を含めたアルキルチオ基、一以上のスルフィニル結合と１〜約１２の炭素原子または１〜約６の炭素原子を有する部分を含めたアルキルスルフィニル基、一以上のスルホニル結合と１〜約１２の炭素原子または１〜約６の炭素原子を有する部分を含めたアルキルスルホニル基、一以上のＮ原子と１〜約１２の炭素原子または１〜約６の炭素原子を有する基のようなアミノアルキル基、６以上の炭素を有する炭素環式アリール、特にフェニルまたはナフチル、ベンジルのようなアラルキルにより、一以上の利用可能位置で置換されうる、特記部分に関する。別記されない限り、場合により置換された基は基の各置換可能位置で置換基を有するが、各置換は他とは独立である。
【００３０】
“薬学上許容可能なアニオン”という用語は、適切な対カチオンの存在下において薬学上許容可能な塩を形成しうるアニオンに関する。薬学上許容可能なアニオンの例はＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、ＳＯ４２−、酢酸、マレイン酸、フマル酸、クエン酸、シュウ酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ｐ‐トルエンスルホン酸などである。薬学上許容可能なアニオンの他の例は当業者に明らかであろう。
【００３１】
“薬学上許容可能な塩”という用語は、レシピエントへの投与に際してここで記載されているような化合物を（直接的または間接的に）供しうる、薬学上許容可能な塩に関する。しかしながら、薬学上許容されない塩も本発明の範囲内に属することは明らかであり、それらが薬学上許容可能な塩の製造に有用なこともあるからである。塩の製造は当業界で公知の方法により行われる。
【００３２】
例えば、ここで提供される化合物の薬学上許容可能な塩は酸付加塩、塩基付加塩、または金属塩であり、それらは塩基性または酸性部分を含有する親化合物から慣用的化学法により合成される。通常、このような塩は、例えば水、有機溶媒またはこれら二種の混合液中でこれら化合物の遊離酸または塩基形を化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることにより製造される。通常、非水性媒体、例えばエーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルが好ましい。酸付加塩の例としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩のような鉱酸付加塩、および例えば酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、およびｐ‐トルエンスルホン酸塩のような有機酸付加塩がある。アルカリ付加塩の例としては、例えばアンモニウムのような無機塩、および例えばエチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ‐ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、グルカミンおよび塩基性アミノ酸塩のような有機アルカリ塩がある。金属塩の例としては、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、およびリチウム塩がある。
【００３３】
“エナンチオ富化”とは、一方が他のエナンチオマーより多い量で存在する、化合物のエナンチオマーの混合物に関する。したがって、エナンチオ富化混合物は、そのエナンチオマーの一方に関して０％以上、好ましくは２０％以上、好ましくは４０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上のエナンチオマー過剰率を有している。
【００３４】
“エナンチオ純粋”化合物は、９５％以上、好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは９９．５％以上のエナンチオマー過剰率を有する二種エナンチオマーの混合物とみなされる。
【００３５】
本特許出願において、“実質的に純粋な”化合物とは、９５％以上、好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上、更に好ましくは９９．５％以上の純度を有する化合物に関する。
【００３６】
本特許出願において、“立体異性体”とは、同一の結合順序で結合された同一原子から構成されるが、互換性でない異なる三次元構造を有した化合物に関する。
【００３７】
“窒素含有求核剤”とは、少なくとも一つの遊離電子対をもつ少なくとも一つの窒素を有した分子に関し、前記電子対は他分子または同一分子内の求電子（電子欠乏）部分と結合を形成しうる。窒素含有求核剤の例は一級、二級または三級アミンであり、ヘテロ環の一部を形成する非置換窒素原子、アミド部分の窒素原子であっても、ある状況下においては求核剤として作用してもよい。
【００３８】
ＥＰ０７６８３０８Ｂ１号はピログルタミン酸誘導体の立体異性体の混合物を生じる
ＥＰ０７６８３０８Ｂ１号において開示された立体異性体の混合物をその実質的に純粋な化合物へ分割させるすべての試みが失敗に終わった。本発明者らの実験セクションによれば、上記欧州特許でＢＬＡＳ‐２３６（Ｃｌ）（１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩）：
【化５】
0005616628.tif 000006
として特記される化合物の５％が、全４種の可能な立体異性体の混合物として得られた。
【００３９】
しかも、その中間前駆体ＢＬＡＳ‐３２０（Ａｃ）（１‐（１‐アセチル‐３‐アセチルアミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩）：
【化６】
0005616628.tif 000007
が、異なる操作を用いて合成された。式ＢＬＡＳ‐３２０（Ａｃ）の化合物は、主に溶解性の問題により、精製が不可能な立体異性体の混合物として得られた（化合物ＢＬＡＳ‐３２０（Ａｃ）は水およびメタノールのみに可溶性であった）。
【００４０】
更に、他のアニオンによる酢酸対イオンの置換が式ＢＬＡＳ‐３２０（Ａｃ）の化合物において試みられたが、失敗に終わった。加えて、式ＢＬＡＳ‐３２０（Ａｃ）の化合物からそのエステル誘導体への変換（または直接合成）と更なる精製が試みられた。得られた黒色粗製混合物はすべての場合において、精製が不可能であった。
【００４１】
上記の事実からみて、ＥＰ０７６８３０８Ｂ１号の開示はそこで言及されたピログルタミン酸誘導体の望ましい実質的に純粋な立体異性体を得るために不十分であることを見出した。したがって、全体的に異なるアプローチが開発された。
【００４２】
式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体およびその混合物の合成
ある態様において、本発明は、本発明の工程として以下で言及される、下記式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物の合成のための工程に関し：
【化７】
0005616628.tif 000008
〔上記式中、
Ｒ１は‐ＯＨ、‐ＯＲａから選択され、ここでＲａは置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換シクロアルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換、または非置換アラルキルもしくは置換または非置換ヘテロシクリルから選択され、
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、水素、酸性条件下において加水分解する窒素保護基またはフタルアミドから選択され、
Ｘは薬学上許容可能なアニオンであり、および
Ｙは以下から選択される有機残基である：
（ｉ）下記式VIａのＮ含有基：
【化８】
0005616628.tif 000009
上記式中、
点線は、窒素原子と共に置換または非置換ヘテロアリールを形成し、および
Ｘは前記と同義であり、または
（ii）下記式VIｂのＮ含有基：
【化９】
0005616628.tif 000010
上記式中、
Ｘは前記と同義であり、および
ＲａおよびＲｂは、独立して、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換シクロアルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換アラルキル、または置換もしくは非置換ヘテロシクリルから選択され、または
ＲａおよびＲｂは、それらが結合している窒素原子と共に、置換または非置換ヘテロ環を形成する〕、
ａ）下記式IVのエナンチオ純粋化合物：
【化１０】
0005616628.tif 000011
（上記式中、Ｒ１およびＲ２は前記と同義である）またはその混合物を下記式Ｖの化合物：
【化１１】
0005616628.tif 000012
（上記式中、Ｒ４は前記と同義である）と反応させて、下記式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体：
【化１２】
0005616628.tif 000013
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）またはその混合物を生じさせ、
ｂ）前記式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を下記式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体：
【化１３】
0005616628.tif 000014
〔上記式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義であり、
Ｒ５は負電荷またはＲ３から選択され、ここでＲ３は前記と同義であり、および
Ｙは以下から選択されるＮ含有有機残基である：
（ｉ）Ｒ５が負電荷である場合、Ｙは下記式VIIａのＮ含有有機残基である：
【化１４】
0005616628.tif 000015
（上記式中、点線は窒素原子と共に置換または非置換ヘテロアリールを形成する）、または
（ii）Ｒ５がＲ３である場合、Ｙは以下から選択されるＮ含有有機残基である：
（ii.ａ）下記式VIIｂのＮ含有基：
【化１５】
0005616628.tif 000016
（上記式中、ＲａおよびＲｂは前記と同義である）、または
（ii.ｂ）下記式VIIｃのＮ含有有機残基：
【化１６】
0005616628.tif 000017
（上記式中、点線は窒素原子と共に置換または非置換ヘテロアリールを形成する、および
Ｚは薬学上許容可能なアニオンである）〕
またはその混合物へ変換し、および
ｃ）前記式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を、式ＨＸの酸（Ｘは前記と同義である）を含んでなる酸媒体と接触させて、式Ｉの化合物の前記実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を生じさせることを含んでなる。
【００４３】
酸性条件下において加水分解する窒素保護基（Ｒ２、Ｒ３、および／またはＲ４）の役割は、工程ｃ）（式IIの化合物を式ＨＸの化合物と反応させることにより式IIの化合物を式Ｉの化合物へ変換する）まで窒素官能基を保護することである。工程ｃ）まで窒素原子を保護しうるいかなる窒素保護基も本発明に適する。酸性条件下において加水分解する好ましい窒素保護基は、工程ｃ）に際して式Ｉの化合物を得るために塩または二塩が形成されるのと同時に加水分解されるものである。こうして、工程ｃ）に際して分子の窒素原子が脱保護され、塩または二塩が単一合成工程で形成される。しかしながら、本発明によると、窒素原子が脱保護されるのと同時に塩または二塩が形成されることは必須でない。したがって、本発明の態様によると、塩または二塩の形成と窒素原子の脱保護に二以上の工程を要してもよい。
【００４４】
好ましい態様によると、酸性条件下において加水分解する窒素保護基は、式‐（Ｏ＝）Ｃ‐Ｏ‐Ｒａのカルバメート（ここで、Ｒａは前記と同様の意味を有し、好ましくはＲａはベンジル、‐Ｃ（ＣＨ３）３、または‐ＣＨ２ＣＨ３である）または式‐（Ｏ＝）Ｓ（＝Ｏ）‐Ｒａのスルホネート（ここで、Ｒａは前記と同様の意味を有し、好ましくはＲａは‐ＣＨ３またはトシレートである）から選択される。
【００４５】
酸性条件下において加水分解する他の保護基も当業者に知られている、Greene and Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley & Sons,Inc.,New York,1999などの参考本参照。
【００４６】
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも一つがフタルアミドである場合、塩または二塩形成前（工程ｃ）前）に、還元またはヒドラジンとの反応を含んでなる別な工程を行うことが必要である（フタルアミド基を除去する方法の更なる詳細に関してはGreene and Wuts,”Protective Groups in Organic Synthesis“,John Wiley & Sons,Inc.,New York,1999参照）。
【００４７】
本発明の工程の式IVの出発化合物は、エナンチオ純粋化合物（即ち、ＲまたはＳ）の形態でも、または場合によりそれらの一方で富化されたエナンチオマーの混合物（ＲおよびＳ）の形態でもよい。ここで用いられている“エナンチオマーの混合物”という用語には等モル比またはそれ以外の二種エナンチオマーの混合物を含み、そのため前記二種エナンチオマーのラセミ混合物のみならず、前記エナンチオマーのいずれかで富化された混合物も含む。
【００４８】
式IVの化合物がエナンチオ純粋化合物の形態である場合、上記の反応は二種の生成物（立体異性体）を生じることがあり、一方はβ面からの攻撃に相当し、他方はα面からの攻撃に相当する。この場合に、前記反応は低い立体選択性を示し、二種の可能な化合物（立体異性体）の混合物が式IVの化合物のエナンチオマーの各々から得られる。
【００４９】
このように、具体的態様によると、式IVの化合物はエナンチオ純粋化合物の形である。式IVの化合物のＳ異性体が出発物質として用いられると、前記反応は一般的に下記式IIIａの化合物：
【化１７】
0005616628.tif 000018
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）および下記式IIIｂの化合物：
【化１８】
0005616628.tif 000019
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）の混合物を生じる。
【００５０】
こうして、用いられる式IVの化合物の異性体がＳ立体異性体である場合、得られる式IIIの化合物は一般的に式IIIａおよびIIIｂのその立体異性体の混合物の形態である。所望であれば、立体異性体の前記混合物の形態である前記式IIIの化合物は、等モル割合またはそれ以外のIIIａおよびIIIｂの混合物を得るために、常法（例えば、シリカ、再結晶化など）で単離される。一方、所望であれば、式IIIａおよびIIIｂの立体異性体の前記混合物は、各立体異性体を分割して、エナンチオ純粋化合物として式IIIａおよびIIIｂの立体異性体を得るために、常法（例えば、再結晶化、クロマトグラフィーなど）により処理してもよい。
【００５１】
しかも、式IVの化合物のＲ異性体が出発物質として用いられると、前記反応は一般的に下記式IIIｃの化合物：
【化１９】
0005616628.tif 000020
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）および下記式IIIｄの化合物：
【化２０】
0005616628.tif 000021
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４は前記と同義である）の混合物を生じる。
【００５２】
こうして、用いられる式IVの化合物の異性体がＲ立体異性体である場合、得られる式IIIの化合物は一般的に式IIIｃおよびIIIｄの立体異性体の混合物の形態である。上記のように、所望であれば、立体異性体の前記混合物の形態である前記式IIIの化合物は、等モル割合またはそれ以外のIIIｃおよびIIIｄの混合物を得るために常法で単離しても、または一方で立体異性体の前記混合物は、各立体異性体を分割して、エナンチオ純粋化合物として式IIIｃおよびIIIｄの立体異性体を得るために常法により処理してもよい。
【００５３】
これは不都合であると思われる可能性があるが、式IVの化合物と式Ｖの化合物との反応から最終的に得られる混合物の化合物が、式III、即ちIIIａ、IIIｂ、IIIｃ、またはIIIｄの化合物の対応する実質的に純粋な立体異性体へ容易に分割されうることを、本発明者らは見出したのである。これは、本発明の一つの態様である、式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体の合成を可能にする。
【００５４】
他の具体的態様によると、式IVの化合物は、場合によりエナンチオマーの一方に関してエナンチオ富化された、二種の可能なエナンチオマー（ＲまたはＳ）の混合物の形態である。このような場合に、得られる式IIIの化合物は（等モル比またはそれ以外の）IIIａ、IIIｂ、IIIｃ、およびIIIｄの混合物、等モル比もしくはそれ以外のIIIａおよびIIIｃの混合物、または等モル比もしくはそれ以外のIIIｂおよびIIIｄの混合物から選択される。
【００５５】
式IVの化合物は当業界で公知の工程により得られる。例えば、本発明者らにより用いられる合成アプローチの一つがスキーム１において記載されている。Silverman,R.B.,Levy.M.A.,J.Org.Chem.,1980,45,815において記載されているように、グルタミン酸１（この場合、Ｄ‐グルタミン酸）が式２の化合物へ変換されてもよい。第二工程は、式３の化合物を得るために公知の方法（Flyn,D.L.,et al.,J.Org.Chem.,1983,48,2424）を用いる、アミド窒素の保護である。次いで、次の二工程として、最初に、ジメチルアミノメチル基による２‐ピロリドンの３位の置換により、４〔３位のキラル中心は前記工程で制御されないため、実際には二種ジアステレオマーの混合物である〕を得、ＭｅＩでの四級化と脱離により、Panday,S.K.,Griffart-Brunel,D.,Langlois,N.,Tetrahedron Lett.,1994,35,6673で既に記載されていた式５の化合物（Ｒ１が‐ＯＥｔおよびＲ２がＢＯＣである、式IVの化合物）を得る。この場合、得られる式IVの化合物はＲ立体配置を有する。Ｓ立体配置が望まれた場合は、Ｌ‐グルタミン酸が出発物質として用いられた（一般概念として、５は出発グルタミン酸と同一の立体配置を有する）。
【化２１】
0005616628.tif 000022
【００５６】
化合物５の合成のための上記方法の第一変法は、Lennox,J.R.,Turner.S.C.,Rapoport,H.,J.Org.Chem.,2001,66,7078-7083において記載されているような、グルタミン酸１（この場合、Ｄ‐グルタミン酸）から式１′のピログルタミン酸への変換を含んでなる。式１′の前記ピログルタミン酸は次いで、エタノールおよびＳＯＣｌ２の存在下におけるエステル化により、上記式２の化合物へ変換される（スキーム２参照）。
【化２２】
0005616628.tif 000023
【００５７】
化合物５の合成のための上記方法の第二変法は、塩基としてＤＭＡＰおよび溶媒としてアセトニトリル（ＭｅＣＮ）を用いる、式２の化合物から式３の化合物への変換を含んでなる。
【００５８】
化合物５の合成のための上記方法の第三変法は、ｔＢｕＯＣＨ（ＮＭｅ２）２（Bredereck試薬）との反応による、式３の化合物から式４′の化合物への変換を含んでなる。前記式４′の化合物は二工程順序により式５の化合物へ変換される。最初に、式４′の化合物を希ＨＣｌと反応させることによる。次いで、ＷＯ２００４０３９３１４号において記載されているように、無機塩基の存在下において、得られた化合物を水性ＨＣＨＯ（３７％）と反応させることによる（スキーム３参照）。
【化２３】
0005616628.tif 000024
【００５９】
アジリジン環の形成を行うために、当業者に知られているいくつかの試薬がある。しかしながら、炭素‐炭素二重結合からスピロ‐アジリジン類の合成のための試薬の選択は容易でない。例えば、ＨＢｒ／Ｈ２Ｏ２の存在下においてクロラミンＴの使用（L.J.Suman,B.S.Sharma,S.Bir.,Tetrahedron Letters,2004,45,8731）は望ましいアジリジンを生じず、下記一般式の塩素化誘導体を生じた。
【化２４】
0005616628.tif 000025
【００６０】
何回かの実験後、前記反応に最も適した試薬は式Ｖのベンジルヨージナンであることを見出した。具体的態様によると、Ｒ４は‐（Ｏ＝）Ｃ‐Ｏ‐Ｃ（ＣＨ３）３、‐（Ｏ＝）Ｃ‐Ｏ‐ＣＨ２ＣＨ３、‐（Ｏ＝）Ｓ（＝Ｏ）‐トシル、またはフタルアミドから選択される。好ましい態様において、式Ｖの化合物はＮ‐トシルイミノベンジルヨージナンであり（Baron E.,O’Brien P.,Towers T.D.,Tetrahedron Lett.,2002,43,723）、これはGillepia,K.,Synthetic Comunn.,2001,123において記載された方法に従い合成される。
【００６１】
式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を生じさせるために式IVのエナンチオ純粋化合物またはその混合物と式Ｖの化合物との反応は、所望であれば、触媒、好ましくは銅ベースの、更に好ましくはＣｕ（fｔ）２またはＣｕ（ａｃａｃ）２（ここで、“ｆｔ”はフタロシアニンであり、“ａｃａｃ”はアセトアセテートである）から選択される触媒の存在下において行われる。触媒および条件の更なる詳細に関してはBaron,E.,O’Brien,P.,Towers,T.D.,Tetrahedron Lett.,2002,43,723およびS.L.Jain,B.Sain,Journal of molecular catalysis A:Chemical,2003,195,283参照。この反応は典型的には適切な有機溶媒中適切な温度、好ましくは０〜１００℃の温度で行われる。実際上いかなる適切な有機溶媒（例えば、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドなど）も前記反応において用いられるが、具体的態様において、式IVの化合物が４‐メチレン‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステル、式Ｖの化合物がＮ‐トシルイミノベンジルヨージナン（ＰｈＩ＝ＮＴｓ）〔実施例３．１および４．１〕、有機溶媒がアセトニトリルである場合、反応は０℃〜室温（約１８℃〜２４℃）の温度において行われる。
【００６２】
更に、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を経て、式Ｉのピログルタミン酸誘導体の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を得るために用いられる。
【００６３】
このように、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、次のようにＲ５およびＹの性質に依存する戦略により、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物へ更に変換される：
（Ａ）Ｒ５が負電荷でかつＹが式VIIａのＮ含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を製造するために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が下記式VIIIａの窒素含有求核剤と反応される：
【化２５】
0005616628.tif 000026
（上記式中、点線は窒素原子と共に置換または非置換ヘテロアリールを形成する）、または
（Ｂ）Ｒ５がＲ３でかつＹが式VIIｂのＮ含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を製造するために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が下記式VIIIｂの窒素含有求核剤と反応され：
【化２６】
0005616628.tif 000027
（上記式中、ＲａおよびＲｂは前記と同義である）、
所望であれば、得られた混合物が下記式Ｘの化合物により急冷される(quenched)：
Ｒ３Ｚ        （Ｘ）
（上記式中、Ｒ３およびＺは前記と同義である）、または
（Ｃ）Ｒ５がＲ３でかつＹが式VIIｃのＮ含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を製造するために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が式VIIIａのＮ含有求核剤と反応され、得られた混合物が前記式Ｘの化合物で処理される。
【００６４】
簡単には、上記のように、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物の合成は、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を、
‐式VIIIａの化合物と、または一方で
‐式VIIIｂの化合物と、および所望であれば、式Ｘの化合物と、または一方で
‐式VIIIａの化合物および式Ｘの化合物と
反応させることを含んでなる。
【００６５】
式IIIの出発化合物は実質的に純粋な立体異性体〔即ち、（３Ｒ，５Ｒ）、（３Ｓ，５Ｓ）、（３Ｒ，５Ｓ）、または（３Ｓ，５Ｒ）〕の形態でも、または同一または異なる割合で前記実質的に純粋な立体異性体の混合物の形態、例えばジアステレオマーなどの混合物としてでもよい。ここで用いられている“立体異性体の混合物”という用語は、等モル比またはそれ以外の、化合物の立体異性体二種以上のあらゆる混合物を含む。一般的に、出発物質（式IIIの化合物）の立体化学は得られる生成物（式IIの化合物）において維持される。
【００６６】
このように、具体的態様によると、式IIIの化合物はその本質的純粋立体異性体〔即ち、（３Ｒ，５Ｒ）、（３Ｓ，５Ｓ）、（３Ｒ，５Ｓ）、または（３Ｓ，５Ｒ）〕の形態であり、その場合に、式IIIの出発化合物の立体化学を維持した式IIの本質的純粋化合物が得られる。
【００６７】
他の具体的態様によると、式IIIの化合物は、等モル比またはそれ以外の、前記立体異性体の混合物（即ち、式IIIａ、IIIｂ、IIIｃ、およびIIIｄの化合物から選択される立体異性体二種以上の混合物）の形態である。この場合、式IIの化合物の立体異性体の混合物が、式IIIの出発立体異性体の立体化学を維持して得られる。式IIの立体異性体の混合物は、シリカゲルクロマトグラフィーまたは再結晶化のような常法に従い、その対応する実質的に純粋な立体異性体へ分割してもよい。
【００６８】
ある態様においては、Ｒ５が負電荷でかつＹが式VIIａのＮ含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を生じさせるために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が式VIIIａの化合物と反応させられる〔オプション（Ａ）〕。
【００６９】
その場合、ある態様において、窒素含有求核剤VIIIａは下記式IXのピリジンである：
【化２７】
0005616628.tif 000028
上記式中、
ｎは０、１、２、３、４、または５であり、および
Ｒ６は、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロシクリル、置換もしくは非置換アルコキシ、置換もしくは非置換アリールオキシ、ハロゲン、置換もしくは非置換カルボキシエステル、置換もしくは非置換アミノから選択され、および／または前記ピリジンが一以上の置換もしくは非置換縮合環を形成する。
【００７０】
更に、具体的態様によると、前記式IXのピリジンはピリジンおよび下記化合物の一つから選択される：
【化２８】
0005616628.tif 000029
【００７１】
他の具体的態様によると、窒素含有求核剤VIIIａは下記式の化合物である：
【化２９】
0005616628.tif 000030
【００７２】
通常、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物と、式VIIIａの化合物との反応は加熱下において行われる。実際に、式IIの化合物への式IIIの化合物の変換のような反応、即ち求核剤の存在下におけるアジリジン環の開環が通常加熱を要することは、当業者に知られている。所望であれば、マイクロ波が用いられる。具体的態様では、所望の温度へ容易に到達させうるマイクロ波下で反応混合物を照射して所望時間にわたりそれを維持することにより加熱が行われる。ある態様によると、反応は触媒、例えばモンモリロナイト、多孔質酸触媒の存在下において行われる（例えば、実施例３．２．１、３．２．２、４．２．１、および４．２．２）。
【００７３】
他の態様においては、Ｒ５がＲ３でかつＹが式VIIｂのＮ含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を生じさせるために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が式VIIIｂの化合物および場合により式Ｘの化合物と反応させられる〔オプション（Ｂ）〕。
【００７４】
その場合、ある態様において、窒素含有求核剤VIIIｂは下記化合物から選択される化合物である：
【化３０】
0005616628.tif 000031
【００７５】
オプション（Ｂ）においては、アジリジン環を攻撃する反応種に応じて本質的に二つの可能な種類の条件がある。一方では、前記式VIIIｂの化合物を強塩基（即ち、ブチルリチウムなど）と接触させることにより式VIIIｂの化合物のアニオンを生成させることが可能である。式VIIIｂの化合物のアニオンが形成されると、式IIIの化合物が加えられ、アジリジン環が式VIIIｂの化合物のアニオンにより攻撃される。反応は、式Ｘの化合物、例えばヨウ化メチルのようなアルキル化化合物（Ｒ３＝アルキル）などの添加で更に続けてもよい。式VIIIｂの化合物のアニオンを形成させるために必要な条件は当業者に知られている。前記種の一部は市販もされている。一方、式Ｘの化合物の添加前に反応を抑える(quench)ことも可能であり、その場合には得られる式IIの化合物でＲ３は水素となる。他方、式VIIIｂの化合物を直接用いることも可能である。これらの条件は通常加熱またはマイクロ波を要し、Ｒ３が水素である式IIの化合物を生じる。
【００７６】
更に他の態様においては、Ｒ５がＲ３でかつＹが式VIIｃのＮ含有有機残基である式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を生じさせるために、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が式VIIIａの化合物および式Ｘの化合物と反応させられる〔オプション（Ｃ）〕。式VIIIａおよびＸの化合物は既に定義されている。
【００７７】
式IIの化合物への式IIIの化合物の変換のような反応、即ち求核剤の存在下におけるアジリジン環の開環が通常加熱を必要とすることは、当業者に知られている。所望であれば、マイクロ波が用いられる。
【００７８】
式IIの化合物は二つのキラル中心を有している、したがって、それは本質的に純粋な立体異性体またはその混合物のいずれの形態もとることができる。具体的態様において、式IIの化合物は以下からなる群より選択される：
ａ）式IIａの実質的に純粋な化合物：
【化３１】
0005616628.tif 000032
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＹは前記と同義である）、
ｂ）式IIｂの実質的に純粋な化合物：
【化３２】
0005616628.tif 000033
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＹは前記と同義である）、
ｃ）式IIｃの実質的に純粋な化合物：
【化３３】
0005616628.tif 000034
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＹは前記と同義である）、
ｄ）式IIｄの実質的に純粋な化合物：
【化３４】
0005616628.tif 000035
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＹは前記と同義である）、および
ｅ）（等モル比またはそれ以外で）式IIａ、IIｂ、IIｃ、および／またはIIｄの上記化合物の混合物。
【００７９】
式IIの好ましい化合物は、それらの実質的に純粋な立体異性体を含めて、以下の対応見出し箇所で挙げられる。
【００８０】
得られる式IIの化合物は単離しても、または更なる精製なしに次の工程において直接用いてもよい。
【００８１】
式IIの化合物の立体異性体の混合物が得られる場合、当業者に知られている常法で望ましい立体異性体を単離することが可能である。
【００８２】
このように、本発明によると、望ましい立体化学を有する式Ｉのピログルタミン酸誘導体の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物の直前前駆体、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、式IIIの化合物の立体異性体で得られる混合物を精製し、次いで単離された立体異性体を対応試薬と反応させるか、または一方で前記式IIIの化合物と、式VIIIａまたはVIIIｂの求核剤およびＸ（所要であれば）との反応で得られる混合物を精製することにより得られる。
【００８３】
このように、本発明の工程の工程ｃ）によると、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、前記式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を、Ｘが前記と同義である式ＨＸの酸を含んでなる酸媒体と接触させることにより、式Ｉのピログルタミン酸誘導体の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物へ変換される。
【００８４】
当業者であれば、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物との反応を行うために適した式ＨＸの有機または無機酸について熟知している。具体的態様において、前記酸ＨＸは無機酸、例えばＨＣｌ、ＨＢｒなどである。好ましい態様によると、ＨＸはＨＢｒである。
【００８５】
式ＩおよびIIの化合物の性質に応じて、反応は１または２当量のＨＸを必要とする。当業者であれば、塩を形成するために必要な条件を熟知している。本発明の態様によると、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物が過剰の式ＨＸの酸と接触され、ここでＸは前記と同義である。別の態様によると、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は水性ＨＢｒに溶解されて、加熱される。
【００８６】
上記によると、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物から、段階的順序で、式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を得ることが可能である。しかしながら、one-pot戦略に従い、式IIIの化合物から式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を得ることも可能である。したがって、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を式VIIIａまたはVIIIｂの窒素含有求核剤と反応させ、次いで前工程から得られる化合物を式ＨＸの酸と反応させることを含んでなる、式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物の合成のためのone-pot工程も本発明の別の態様である。
【００８７】
式Ｉの化合物は二つのキラル中心を有する、したがって、それはその実質的に純粋な立体異性体のいずれの形態でもまたはその混合物の形態でもよい。式Ｉの好ましい化合物は、それらの本質的に純粋な立体異性体を含めて、以下の対応見出し箇所で挙げられている。
【００８８】
式Ｉの化合物
式Ｉの化合物は二つのキラル中心を有する、したがって、それらは本質的に純粋な立体異性体またはその混合物のいずれの形態もとることができる。具体的態様において、式Ｉの化合物は以下からなる群より選択される：
ａ）式Ｉａの実質的に純粋な立体異性体化合物：
【化３５】
0005616628.tif 000036
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、およびＹは前記と同義である）、
ｂ）式Ｉｂの実質的に純粋な立体異性体化合物：
【化３６】
0005616628.tif 000037
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、およびＹは前記と同義である）、
ｃ）式Ｉｃの実質的に純粋な立体異性体化合物：
【化３７】
0005616628.tif 000038
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、およびＹは前記と同義である）、
ｄ）式Ｉｄの実質的に純粋な立体異性体化合物：
【化３８】
0005616628.tif 000039
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ、およびＹは前記と同義である）、および
ｅ）等モル比またはそれ以外で式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、および／またはＩｄの上記実質的に純粋な化合物の混合物、前記混合物は下記化合物の全４種立体異性体を同時に含有しない：
（ｉ）１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩または
（ii）１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩。
【００８９】
式Ｉのある化合物、即ち（ｉ）１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩および（ii）１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩は、その全４種の可能な立体異性体の混合物として記載されてきたが、それらの実質的に純粋な立体異性体の合成は今日まで達成されていなかった。
【００９０】
具体的態様において、式Ｉの化合物では、Ｒ１は‐ＯＨまたは‐ＯＲａ（ここで、Ｒａは前記と同義である）、好ましくは‐ＯＨである。
【００９１】
他の具体的態様において、式Ｉの化合物では、Ｒ２は水素、酸性条件下において加水分解する窒素保護基またはフタルアミド、好ましくは水素である。
【００９２】
他の具体的態様において、式Ｉの化合物で、Ｒ３またはＲ４は、独立して、水素、酸性条件下において加水分解する窒素保護基またはフタルアミドであり、好ましくはそれらの双方が同時に水素である。
【００９３】
他の具体的態様において、式Ｉの化合物では、Ｘは薬学上許容可能なアニオン、好ましくは臭化物または塩化物である。
【００９４】
他の具体的態様において、式Ｉの化合物で、Ｒ１はＯＨまたはＯＲａ、好ましくはＯＨであり、Ｒ２は水素、酸性条件下において加水分解する窒素保護基またはフタルアミド、好ましくは水素であり、Ｒ３またはＲ４は、独立して、水素、酸性条件下において加水分解する窒素保護基またはフタルアミドであり、好ましくはＲ３またはＲ４は同時に水素であり、および／またはＸは薬学上許容可能なアニオン、好ましくは臭化物または塩化物である。
【００９５】
他の具体的態様において、式Ｉの化合物では、Ｙは以下から選択される有機残基である：
【化３９】
0005616628.tif 000040
【００９６】
他の具体的態様において、式Ｉの化合物で、Ｙは以下から選択される有機残基である：
【化４０】
0005616628.tif 000041
【００９７】
具体的態様によると、式Ｉの化合物は下記式Ｉ′ａの実質的に純粋な化合物である：
【化４１】
0005616628.tif 000042
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、およびｎは前記と同義である）。
【００９８】
本発明の具体的態様によると、前記式Ｉの化合物は下記式Ｉ′ｂの実質的に純粋な化合物である：
【化４２】
0005616628.tif 000043
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、およびｎは前記と同義である）。
【００９９】
本発明の具体的態様によると、前記式Ｉの化合物は下記式Ｉ′ｃの実質的に純粋な化合物である：
【化４３】
0005616628.tif 000044
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、およびｎは前記と同義である）。
【０１００】
本発明の具体的態様によると、前記式Ｉの化合物は下記式Ｉ′ｄの実質的に純粋な化合物である：
【化４４】
0005616628.tif 000045
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６、およびｎは前記と同義である）。
【０１０１】
本発明の具体的態様によると、式Ｉ′ａ、Ｉ′ｂ、Ｉ′ｃ、および／またはＩ′ｄの化合物二種以上を含んでなる混合物、例えば式Ｉ′ａおよびＩ′ｂの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ａおよびＩ′ｃの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ａおよびＩ′ｄの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ｂおよびＩ′ｃの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ｂおよびＩ′ｄの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ｃおよびＩ′ｄの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ａ、Ｉ′ｂ、およびＩ′ｃの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ａ、Ｉ′ｂ、およびＩ′ｄの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ｂ、Ｉ′ｃおよびＩ′ｄの化合物を含んでなる、または式Ｉ′ａ、Ｉ′ｂ、Ｉ′ｃ、およびＩ′ｄの化合物を含んでなる混合物が、等モル比またはそれ以外で提供される。
【０１０２】
本発明の具体的態様によると、式Ｉの化合物は以下からなる群より選択される：
３Ｓ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩、
３Ｒ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩、
３Ｒ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩、および
３Ｓ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩
【０１０３】
本発明は前記式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、および／またはＩｄの化合物の混合物を等モル比またはそれ以外で含んでなる組成物を更に提供するが、ここで前記混合物は下記化合物の全４種立体異性体を同時に含有しない：
（ｉ）１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩または
（ii）１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩。
【０１０４】
式IIの化合物
式IIのある化合物、即ち１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、１‐（１‐アセチル‐３‐アセチルアミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、または１‐（１‐アセチル‐３‐アセチルアミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム塩酸塩は、その全４種の可能な立体異性体の混合物として記載されてきたが、それらの実質的に純粋な立体異性体の合成は今日まで達成されていなかった。
【０１０５】
このように、他の態様において、本発明は式IIの実質的に純粋な化合物またはその混合物に関する。
【０１０６】
具体的態様において、本発明は式IIａ、IIｂ、IIｃ、およびIIｄの実質的に純粋な化合物に関する。
【０１０７】
具体的態様において、本発明はいずれかのモル比で式IIａ、IIｂ、IIｃ、および／またはIIｄの前記化合物の混合物に関するが、ここで前記混合物は下記化合物の全４種立体異性体を同時に含有しない：
１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、
１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、
１‐（１‐アセチル‐３‐アセチルアミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、または
１‐（１‐アセチル‐３‐アセチルアミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム塩酸塩。
【０１０８】
他の具体的態様において、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ１が‐ＯＲａであり、好ましくはＲａがアルキル基である化合物である。
【０１０９】
他の具体的態様において、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ２が‐（Ｏ＝）Ｃ‐Ｏ‐Ｒａ、好ましくはＢＯＣ基である化合物である。
【０１１０】
他の具体的態様において、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ４が‐（Ｏ＝）Ｓ（＝Ｏ）‐Ｒａ、好ましくはトシルである化合物である。
【０１１１】
他の具体的態様において、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ１が‐ＯＲａであり、好ましくはＲａがアルキル基であり、Ｒ２が‐（Ｏ＝）Ｃ‐Ｏ‐Ｒａ、好ましくはＢＯＣ基であり、およびＲ４が‐（Ｏ＝）Ｓ（＝Ｏ）‐Ｒａ、好ましくはトシルである化合物である。
【０１１２】
本発明の他の態様によると、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５が独立して水素である化合物である。
【０１１３】
本発明の他の態様によると、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ１が‐ＯＨである化合物である。
【０１１４】
本発明の他の態様によると、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ５が負電荷である化合物である。
【０１１５】
本発明は式IIａ、IIｂ、IIｃ、IIｄの前記化合物およびいずれかのモル比のその混合物からなる群より選択される化合物を含んでなる組成物にも関し、ここで前記混合物は下記化合物の全４種立体異性体を同時に含有しない：
１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、
１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、
１‐（１‐アセチル‐３‐アセチルアミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム酢酸塩、または
１‐（１‐アセチル‐３‐アセチルアミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウム塩酸塩。
【０１１６】
式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、前記のように、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を、
‐式VIIIａの化合物と、または一方で
‐式VIIIｂの化合物と、および所望であれば、式Ｘの化合物と、または一方で
‐式VIIIａの化合物および式Ｘの化合物と
反応させることを含んでなる工程により得られる。
【０１１７】
前記工程は本発明の別の態様を構成し、式IIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物の合成を可能にする。
【０１１８】
式IIIの化合物
他の態様において、本発明は式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物に関する。前記式IIIの化合物は二つのキラル中心を有し、したがって、それは実質的に純粋な立体異性体またはその混合物のいずれの形態をとることもできる。
【０１１９】
具体的態様において、式IIIの化合物は式IIIａ、IIIｂ、IIIｃ、IIIｄの化合物およびその混合物からなる群より選択される。
【０１２０】
他の具体的態様において、本発明は式IIIａ、IIIｂ、IIIｃ、およびIIIｄの化合物二種以上を含んでなる混合物に関する。前記混合物の非限定的な実例には、前記化合物の二種の混合物（例えば、IIIａおよびIIIｂ、IIIａおよびIIIｃ、IIIａおよびIIIｄ、IIIｂおよびIIIｃ、IIIｂおよびIIIｄ、もしくはIIIｃおよびIIIｄの混合物）、または前記化合物の三種の混合物（例えば、IIIａ、IIIｂ、およびIIIｃ、IIIａ、IIIｂ、およびIIIｄ、またはIIIｂ、IIIｃ、およびIIIｄの混合物）、または前記四種化合物の混合物（例えば、IIIａ、IIIｂ、IIIｃ、およびIIIｄの混合物）がある。各具体的化合物（IIIａ〜IIIｄ）は、いずれかの割合または比により、例えば等モル割合または比により、または前記化合物の一種以上が他より過剰である異なる割合または比により、前記混合物中に存在してもよい。
【０１２１】
他の具体的態様において、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ１が‐ＯＲａであり、好ましくはＲａがアルキル基である化合物である。
【０１２２】
他の具体的態様によると、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ２が‐（Ｏ＝）Ｃ‐Ｏ‐Ｒａ、好ましくはＢＯＣ基である化合物である。
【０１２３】
他の具体的態様によると、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ４が‐（Ｏ＝）Ｓ（＝Ｏ）‐Ｒａ、好ましくはトシルである化合物である。
【０１２４】
他の具体的態様によると、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ１が‐ＯＲａであり、好ましくはＲａがアルキル基であり、Ｒ２が‐（Ｏ＝）Ｃ‐Ｏ‐Ｒａ、好ましくはＢＯＣ基であり、およびＲ４が‐（Ｏ＝）Ｓ（＝Ｏ）‐Ｒａ、好ましくはトシルである化合物である。
【０１２５】
他の具体的態様によると、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５が独立して水素である化合物である。
【０１２６】
式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、前記のように、エナンチオ純粋形態でまたはエナンチオマーの混合物の形態により式IVの化合物を式Ｖの化合物と反応させることを含んでなる工程により得られる。前記工程は本発明の別の態様を構成する。前記工程によれば、式IIIの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物を得ることも可能である。
【０１２７】
式Ｉの化合物の使用および医薬組成物
式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物は、対象者におけるある症状、例えば腫瘍、免疫不全症、感染症などの治療および／または予防のための薬剤の活性成分として用いられてもよい。
【０１２８】
式Ｉの化合物の実質的に純粋な立体異性体またはその混合物で治療されうる症状の非限定的な実例としては以下がある：
Ａ）癌または腫瘍関連症状：実際上すべての癌および腫瘍種、例えば急性リンパ芽球性白血病、成人急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連癌、肛門癌、星状細胞腫、小児小脳星状細胞腫、基底細胞癌腫、胆管癌、肝外胆嚢癌、胆嚢癌、骨癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹部神経膠腫、脳腫瘍、悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、乳癌、メイト(mate)気管支腺腫／カルチノイド、小児バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明の胃腸癌腫、中枢神経系リンパ腫、原発性小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頚癌、小児癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖障害、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮体癌、食道癌、小児ユーイングファミリー腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫眼癌、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、胃癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胚細胞腫瘍、卵巣妊娠性絨毛性腫瘍神経膠腫、成人神経膠腫、脳幹部神経膠腫、大脳星状細胞腫神経膠腫、ヘアリーセル白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝）癌、成人（原発性）肝細胞（肝）癌、小児（原発性）ホジキンリンパ腫、成人ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌腫（膵臓内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓（腎細胞）癌、腎臓癌、喉頭癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル、口唇および口腔癌、小児（原発性）肺癌、非小細胞肺癌、小細胞性リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞、ホジキン成人リンパ腫、ホジキン小児リンパ腫、非ホジキン成人リンパ腫、非ホジキン小児リンパ腫、原発性中枢神経系、マクログロブリン血症、骨のワルデンシュトレーム型悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、眼内（目）メルケル細胞癌腫、中皮腫、成人悪性中皮腫、原発不明の小児転移性扁平上皮頸部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、小児多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍菌状息肉症骨髄異形性症候群、骨髄異形性／骨髄増殖疾患骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、成人急性骨髄性白血病、小児急性骨髄腫、多発性骨髄増殖障害、慢性鼻腔および副鼻腔癌鼻咽頭癌、鼻咽頭癌、小児神経芽腫、口腔癌、小児口腔癌、口唇および中咽頭癌、骨肉腫／骨卵巣癌の悪性線維性組織球腫、小児卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、小児膵臓癌、膵島細胞副鼻腔および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、褐色細胞腫、松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎細胞（腎臓）癌、小児腎盂および尿管、移行上皮細胞癌網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、小児唾液腺癌、唾液腺癌、小児肉腫、腫瘍のユーイングファミリー、肉腫、カポジ肉腫、軟部組織、成人肉腫、軟部組織、小児肉腫、子宮セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫）、小児皮膚癌（黒色腫）、皮膚癌腫、メルケル細胞小細胞肺癌小腸癌軟質組織肉腫、成人軟質組織肉腫、小児扁平上皮細胞癌腫、原発不明の扁平上皮頸部癌、転移性、胃癌、小児テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児Ｔ細胞リンパ腫、睾丸癌、胸腺腫、小児胸腺腫および胸腺癌腫甲状腺癌、甲状腺癌、腎盂の小児移行上皮細胞癌および尿管絨毛性腫瘍、妊娠性不明原発部位、移行上皮細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、小児外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症型ウィルムス腫瘍などを含む、
Ｂ）感染症：実際上、全種類の感染症、例えば細菌、真菌、およびウイルス源の感染症を含む、または
Ｃ）自己免疫疾患：”American Autoimmune Related Diseases Association”[http://www.aarda.org]のウェブサイトにおいて挙げられた実際上すべての自己免疫疾患、例えば多発性硬化症（ＭＳ）、クローン病、リウマチ様関節炎、１型糖尿病、乾癬、狼瘡、潰瘍性大腸炎、白斑、シリアック病、血管炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、甲状腺炎（橋本、Graves）、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、ブドウ膜炎、扁平苔癬、側頭動脈炎、サルコイドーシス、乾燥症候群（シェーグレン）、気管支喘息、天疱瘡、硬直性脊椎炎、強皮症、線維筋痛症、リウマチ熱などを含む。
【０１２９】
このように、別の態様によると、本発明は、本発明の医薬組成物として以下で言及されている、式Ｉの化合物、その実質的に純粋な立体異性体Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、またはＩｄ、または等モル比またはそれ以外のその混合物と、薬学上許容可能な担体を含んでなる医薬組成物に関するが、但し前記混合物は次の化合物：（ｉ）１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩または（ii）１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩の全４種の立体異性体を同時に含有しない。
【０１３０】
具体的態様において、本発明の医薬組成物は、活性成分として、式Ｉ、即ちＩａ、Ｉｂ、Ｉｃ、またはＩｄの化合物の少なくとも一種の実質的に純粋な立体異性体、または等モル比またはそれ以外のその混合物を治療有効量で含んでなるが、但し前記混合物は上記化合物（ｉ）または（ii）の全４種立体異性体を同時に含有しない。この記載で用いられている意味において、“治療有効量”という表現は望ましい効果を発揮するように計算された活性成分の量に関し、通常は他の理由の中においても、用いられる活性成分自体の特性および得られる治療効果により決められる。具体的態様において、上記症状の治療および／または予防のために処置の必要な対象者へ投与される活性成分の用量は、１０−１０〜１０１０ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には１０−３〜１０３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。
【０１３１】
“担体”という用語は、活性成分と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルに関する。このような製剤用担体は無菌液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物、または合成源のもの、例えばピーナツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などである。水または水溶液塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、特に注射液で、担体として好ましく用いられる。適切な製剤用担体はE.W.Martinによる”Remington’s Pharmaceutical Sciences”において記載されている。更に、“薬学上許容可能な”という用語は、ヒトへ投与された場合に、生理学的に耐えられて、典型的にはアレルギーまたは類似の不都合な反応、例えば胃部不快感、眩暈などを生じない、分子実体および組成物に関する。好ましくは、ここで用いられているような“薬学上許容可能な”という用語は、動物、更に好ましくはヒトでの使用向けに、連邦または州政府の監督官庁により認可されていること、または米国薬局方または他の通常承認された薬局方に掲載されていることを意味する。
【０１３２】
治療の必要な対象者、例えば哺乳類、例えばヒトへのその投与の場合、本発明の医薬組成物はいずれか適切な経路、例えば経口（例えば、経口、舌下など）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、筋肉内など）、膣、直腸、鼻、局所、目などで投与されてもよい。
【０１３３】
活性成分を適切な薬学上許容可能な担体と混合することで得られる本発明の医薬組成物は、多数の投与剤形、例えば固体、液体などで投与されてもよい。本発明の医薬組成物の前記投与剤形の非限定的な実例としては、経口滴剤（溶液、懸濁液、乳濁液など）、経口処方剤（液体、溶液、懸濁液、乳濁液、ゲル、ペースト、粉末など）、経口凍結乾燥剤、オーラルガム、経口溶液または懸濁液用の粉末、顆粒、胃耐性顆粒、持続性放出顆粒、放出調節顆粒、経口懸濁液用の顆粒、経口溶液または懸濁液用の粉末および溶媒、シロップ、シロップ用の粉末、シロップ用の顆粒、錠剤（例えば、可溶性錠剤、分散性錠剤、被覆錠剤、フィルムコーティング錠、発泡錠、口腔内崩壊錠、胃耐性錠剤、持続性放出錠剤、放出調節錠剤、バッカル錠、チュアブル錠など）、ハーブティー、インスタントハーブティー、発泡性粉末または顆粒、サシェイ、カプセル（例えば、硬、軟、胃耐性硬または軟カプセル、持続性放出硬または軟カプセル、放出調節硬または軟カプセルなど）、小丸薬、連続放出管腔内デバイス、拍動性放出管腔内デバイス、リク・ブロック（lick blok）、薬剤強化飼料用のプレミックス、ペレット、うがい薬、うがい薬用の濃縮液、うがい薬（溶液用の粉末または錠剤）、口腔粘膜用溶液、懸濁液、液滴、スプレー、ゲル、ペースト、カプセルなど、舌下スプレー、錠剤など、洗口液、歯茎用溶液、ゲル、ペーストなど、ロゼンジ、圧縮ロゼンジ、芳香錠、デンタルゲル、スティック、インサート、粉末、溶液、懸濁液、乳濁液など、練り歯磨き、クリーム、ゲル、軟膏、皮膚用パスタ、フォーム、スプレー、溶液、懸濁液、粉末、液体、溶液、皮膚溶液、懸濁液、乳濁液用の濃縮液、スティック、スポンジなど、硬膏、シャンプー、イオントフォレシス用の溶液、経皮マッチ、湿布剤、浸漬溶液、懸濁液、乳濁液、浸漬溶液、懸濁液または乳濁液用の濃縮液、プアー・オン（pour-on）溶液、懸濁液または乳濁液、スポット・オン（spot-on）溶液、スポット・オン懸濁液、スポット・オン乳濁液、乳頭浸漬溶液、乳頭浸漬懸濁液、乳頭浸漬乳濁液、乳頭スプレー溶液、眼クリーム、眼ゲル、眼軟膏、点眼剤（溶液、懸濁液、粉末および溶液用の溶媒、懸濁液用の粉末および溶媒、再調製用の溶媒、ローション、ローション再調製用の溶媒など）、眼用インサート、耳クリーム、耳ゲル、耳軟膏、点耳剤（溶液、懸濁液、乳濁液、粉末など）、耳スプレー（溶液、懸濁液など）、耳洗浄剤（溶液、懸濁液など）、耳タンポン、耳スティック、鼻クリーム、鼻ゲル、鼻軟膏、点鼻剤（溶液、懸濁液、乳濁液など）、鼻粉末、鼻スプレー（溶液、懸濁液、乳濁液など）、鼻洗浄剤、鼻スティック、膣クリーム、膣ゲル、膣軟膏、膣フォーム、膣溶液、膣懸濁液、膣乳濁液、膣溶液用の錠剤、膣硬または軟カプセル、膣錠剤、発泡性膣錠剤、膣デリバリーシステム、直腸クリーム、直腸ゲル、直腸軟膏、直腸フォーム、直腸溶液、直腸懸濁液、直腸乳濁液、直腸溶液用の濃縮液、直腸溶液用の粉末、直腸懸濁液用の粉末、直腸懸濁液用の錠剤、坐剤、直腸カプセル、直腸タンポンネブライザー溶液、ネブライザー懸濁液、ネブライザー懸濁液用の粉末、ネブライザー溶液用の粉末、ネブライザー乳濁液、加圧吸入剤（溶液、懸濁液、乳濁���など）、吸入粉末、吸入粉末（硬カプセル）、吸入粉末、既分配、吸入蒸気（粉末、カプセル、溶液、錠剤、軟膏、液体など）、吸入ガス、注射用のゲル、注射用の溶液、注射用の懸濁液、注射用の乳濁液、注射溶液用の粉末、注射懸濁液用の粉末、注射溶液用の粉末および溶媒、注射懸濁液用の粉末および溶媒、注射溶液用の濃縮液、注入用の溶液、注入用の乳濁液、注入溶液用の粉末、注入溶液用の濃縮液、注入溶液用の粉末および溶媒、インプラント錠剤、腹膜透析用の溶液、血液濾過用の溶液、血液透析濾過用の溶液、血液透析用の溶液、血液透析溶液用の濃縮液、膀胱内用の溶液、膀胱洗浄液、粉末膀胱洗浄剤、尿道ゲル、尿道スティック、気管肺内注入液（溶液）、気管肺内注入液（溶液用の粉末）、気管肺内注入液（懸濁液）、気管肺内注入液（溶液用の粉末および溶媒）、頚管内ゲル、頚管内ゲル用の粉末および溶媒、乳房内溶液、乳房内懸濁液、乳房内乳濁液、乳房内軟膏、乳首スティック、子宮内デリバリーシステムなどがある。
【０１３４】
本発明の医薬組成物の望ましい投与剤形を製造するために必要な担体および補助物質は、他の要因の中でも、選択される投与剤形に依存する。医薬組成物の前記投与剤形は、当業者に知られている常法に従い製造される。異なる活性成分投与法、用いられる賦形剤およびそれらの製造工程の総説は”Tratado de Farmacia Galenica”,C.Fauli i Trillo,Luzan 5,S.A.de Ediciones,1993においてみられる。
【０１３５】
他の態様において、本発明は、対象者において免疫応答を賦活させる医薬組成物の製造のための、または抗腫瘍医薬組成物の製造のための、または細菌、真菌、もしくはウイルス源の感染症を治療する医薬組成物の製造のための、または自己免疫疾患を治療する医薬組成物の製造のための、式Ｉ、即ちＩａ、Ｉｂ、Ｉｃ、またはＩｄの化合物の実質的に純粋な立体異性体、または等モル比またはそれ以外のその混合物の使用に関するが、但し前記混合物は次の化合物：（ｉ）１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩または（ii）１‐（１‐アセチル‐３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムクロリド塩酸塩の全４種立体異性体を同時に含有しない。
【０１３６】
好ましい態様によると、本発明は癌の治療および／または予防用医薬組成物の製造のための前記使用に関する。
【０１３７】
別の好ましい態様によると、本発明は結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、肥満細胞腫、肺癌、および直腸癌からなる群より選択される疾患または症状の治療および／または予防用医薬組成物の製造のための前記使用に関する。
【０１３８】
好ましい態様によると、本発明はＡＩＤＳおよび関連疾患の治療および／または予防用医薬組成物の製造のための前記使用に関する。
【０１３９】
本発明により提供される医薬組成物で治療されうる症状の非限定的な実例としては、前記のものがある。
【０１４０】
下記実施例は本発明を実証するために用いられ、その範囲を限定するものとみなしてはならない。
【実施例】
【０１４１】
一般操作。全ての融点はキャピラリーチューブで測定し、未補正である。ＩＲスペクトルはNicolet Impact ４１０スペクトロメーターを用いてＫＢｒディスクで調べた。１Ｈ ＮＭＲスペクトルはVARIAN UNITYおよびUNITYPLUS装置において３００または５００ＭＨｚで得た。化学シフト（δ）は内部標準としてＴＭＳを用いて調べ、多重度（ｓ，シングレット、ｄ，ダブレット、ｄｄ，ダブルダブレット、ｔ，トリプレット、ｑ，カルテット、ｍ，マルチプレット）はシグナル毎に示される。ＨＰＬＣ‐ＭＳ分析はAgilent １１００装置で行った。クロマトグラフカラムLuna Ｃ１８（１５０×４．６ｍｍ）５μｍ Phenomenexが、４％水性ギ酸（Ａ）、水（Ｂ）およびアセトニトリル（Ｃ）のトリプル勾配により形成される移動相で用いられた。勾配はＡ（２．５％）、Ｂ（９３％）、およびＣ（４．５％）として開始し、３０分間でＡ（２．５％）、Ｂ（４．５％）およびＣ（９３％）に達した。質量検出器では、フラグメンターを７０ｅＶで操作した。元素分析はＬＥＣＯ ＣＨＮＳ‐９３２装置により行った。すべての収率は単離された純粋化合物に相当する。
【０１４２】
実施例１は、（２Ｒ‐４‐メチレン‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステル）、本発明の工程の出発物質（式IVの化合物）の合成に関する。
【０１４３】
実施例２は、本発明の工程の出発物質、式Ｖの化合物の合成に関する。
【０１４４】
実施例３および４は、one-pot順序を用いて、式Ｉの化合物である（３Ｒ，５Ｒ）、（３Ｓ，５Ｓ）、（３Ｒ，５Ｓ）、および（３Ｓ，５Ｒ）‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩の合成に関する。
【０１４５】
実施例５は、段階的合成に従う３Ｓ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩のone-pot合成に関する。
【０１４６】
実施例６は、腫瘍増殖に及ぼす、式Ｉの化合物の異なる異性体の効果について解析している（検定される腫瘍：RENCA）。
【０１４７】
実施例１
式IVの化合物：（Ｒ）‐５‐（２Ｒ‐４‐メチレン‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステル）の合成
標題化合物の合成がスキーム１において示される。
１．１  化合物２：２Ｓ‐５‐オキソピロリジン‐２‐カルボン酸エチルエステルの合成
１０Ｌリアクターを無水エタノール（５．０Ｌ）中、Ｄ‐グルタミン酸１（１ｋｇ，６．８０ｍｏｌ）で充填し、−１０℃に冷却し、滴下漏斗から塩化チオニル（２．０ｋｇ，１４．９ｍｏｌ）を２時間かけてゆっくり加えた。添加が完了した後、混合液を室温において１時間攪拌し、次いで更に１時間８０℃に加熱した。得られた溶液を濃縮乾固させた（注意：ＨＣｌおよびＳＯ２ガスが発生した）。残渣をエタノール（２．５Ｌ）で希釈し、エタノール中水酸化カリウムの溶液（１０％ｗｔ，約２．０Ｌ）の添加によりｐＨ＝７に中和した。形成された固体物を濾去し、溶液を濃縮して、ロウ様固体物として１のジエチルエステルを得た。
残渣を次いで真空下（９０℃，３．１ｍｂａｒ）において２時間蒸留し、残留物を更に５．２ｍｂａｒにおいて２時間にわたり１５０℃に加熱した。室温において、残渣は固化した。ＭＴＢＥ／ヘキサン（２：１）からの再結晶化で、褐色様固体物として２の望ましい生成物を得た（９６０ｇ，９０％）。ｍ．ｐ．４９‐５１℃．
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：６．８２（ｂｓ，１Ｈ）；４．２９‐４．２３（ｍ，１Ｈ）；４．２１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）；２．４８‐２．１７（ｍ，４Ｈ）；１．２８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）ｐｐｍ．
【０１４８】
１．２  ３：２Ｒ‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステルの合成
リアクター中におけるジクロロメタン（８．０Ｌ）中ピログルタミン酸エチル２（９００ｇ，５．７３ｍｏｌ）の攪拌溶液に、ジ-tert-ブチルジカーボネート（２．５ｋｇ，１１．５ｍｏｌ）、トリエチルアミン（８００ｍＬ，５．７３ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７００ｇ，５．７３ｍｏｌ）を加え、反応液を２時間攪拌した。赤褐色溶液を濃縮乾固させ、酢酸エチル（１０．０Ｌ）で希釈し、３Ｎ水性ＨＣｌ（４×２．５Ｌ）で洗浄した。合わせた有機層を水（６×２．５Ｌ）および塩水（１．０Ｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。反応混合液を濃縮乾固させ、氷で冷却し、ＭＴＢＥおよびヘキサン（１：１）で摩砕して、褐色固体物（３９０ｇ）を得た。母液の濃縮により油状物（６００ｇ）を得、クロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン／酢酸エチル３：１）後に無色固体物（３８６ｇ）３を得た。全収率（７７６ｇ，５４％）．ｍ．ｐ．４８‐４９℃．
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：４．５７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）；４．２０（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）；２．７２‐１．７７（ｍ，４Ｈ）；１．４６（ｓ，９Ｈ）；１．２６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）ｐｐｍ．
【０１４９】
１．３  ４：シス‐およびトランス‐２Ｒ‐４‐ジメチルアミノ‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステルの混合物の合成
−７８℃でＴＨＦ中ＬｉＨＭＤＳ（１Ｍ，０．２４Ｌ，０．２４ｍｏｌ）の攪拌溶液に、乾燥ＴＨＦ（１．０Ｌ）中３（３０ｇ，０．１２ｍｏｌ）の溶液をゆっくり加えた。−７８℃において４０分間攪拌後、Eschenmoser塩（４５．５ｇ，０．２４ｍｏｌ）を加え、攪拌を更に２０分間続けた。反応混合液を室温まで加温し、更に１６時間攪拌した。混合液を濃縮し、残渣を酢酸エチル（３００ｍＬ）と水（３００ｍＬ）に分配した。水層を再び酢酸エチル（２×３００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出液を１Ｍ水性ＨＣｌ（３×１５０ｍＬ）で洗浄した。酸性層を直ちに重炭酸ナトリウムで中和し、酢酸エチル（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機相を水（３００ｍＬ）、塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固させ、淡褐色油状物として望ましい生成物４を得（２６．９ｇ，７２％）、これを次の工程において直接用いた。
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：４．６２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）；４．２１（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）；４．１８‐４．０７（ｍ，１Ｈ）；２．５７‐２．２０（ｍ，３Ｈ）；２．２２（ｓ，３Ｈ）；２．１７（ｓ，３Ｈ）；１．４７（ｓ，９Ｈ）；１．２４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）ｐｐｍ．
【０１５０】
１．４  （Ｒ）‐５：２Ｒ‐４‐メチレン‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステルの合成
オートクレーブ（４Ｌ）をＭｅＯＨ（２．５Ｌ）中４（２４４．９ｇ，０．７４ｍｏｌ）およびヨードメタン（１３８．２ｍＬ，２．２２ｍｏｌ）で充填した。反応混合液を室温で４８時間攪拌した。溶媒を除去し、残渣を酢酸エチル（２Ｌ）と１０％ＮａＨＣＯ３（１Ｌ）に分配した。水相を再び酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮乾固させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル４：１→酢酸エチル）で精製し、無色油状物として（Ｒ）‐５を得た（５５．１ｇ，２７％）。
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：６．２３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）；５．５１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ）；４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）；４．２２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；３．１７‐３．０５（ｍ，１Ｈ）；２．７５‐２．６４（ｍ，１Ｈ）；１．４７（ｓ，９Ｈ）；１．２３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）ｐｐｍ．
【０１５１】
実施例２
式IVの化合物：（Ｒ）‐５（２Ｒ‐４‐メチレン‐５‐オキソピロリジン‐１，２‐ジカルボン酸  １-tert-ブチルエステル  ２‐エチルエステル）の合成
標題化合物の合成が下記スキーム４において示されているが、記載の中で開示された式５の化合物の合成には三つの変法がある。
【化４５】
0005616628.tif 000046
【０１５２】
２．１  （２Ｒ）‐ピログルタミン酸（２′）の合成
Lennox,J.R.,Turner,S.C.,Rapoport,H.,J.Org.Chem.2001,66,7078-7083において記載された方法
水（４００ｍＬ）中Ｄ‐グルタミン酸（１）（１００ｇ，６７９．７ｍｍｏｌ）を加熱還流しながら、７２時間攪拌した。得られた透明溶液をDowex ５０ｗＸ８樹脂カラム（酸性形のイオン交換樹脂，１３５ｇ）に通し、溶出液がもはや酸性でなくなるまで水洗した。３００ｍＬの留出液が集められるまで、合わせた水性溶出液を５０℃において濃縮した。残留水の除去を助けて固体物の凝集を避けるために、メタノール（５００ｍＬ）を加えた。得られた固体物を真空下において乾燥させ、白色固体物として化合物２′を得た（７４．６３ｇ，８５％）。
ｍ．ｐ．１５７℃，〔α〕Ｄ２２＋１０．５°（ｃ２．０，Ｈ２Ｏ）．
【０１５３】
２．２  （２Ｒ）‐ピログルタミン酸エチル（２）の合成
ＥｔＯＨ（２ｍＬ／ｍｍｏｌ，８ｍＬ）中（２Ｒ）‐ピログルタミン酸２′（１当量，２．０１７ｇ，１５．６２ｍｍｏｌ）の攪拌懸濁液に、ＳＯＣｌ２（０．１当量，１１５μＬ，１．５６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を室温において１６時間攪拌した。反応混合液を水性１Ｍ ＨＣＯ３Ｎａで中和した。溶媒を真空下において濃縮し、残渣をＡｃＯＥｔ（３×２５ｍＬ）で抽出した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４において乾燥させ、真空下において濃縮した。化合物２を無色油状物として得、これを更なる精製なしに次の工程で用いた（７９％）。
【０１５４】
２．３  （２Ｒ）‐Ｎ‐（tert‐ブトキシカルボニル）ピログルタミン酸エチル（３）の合成
ＭｅＣＮ（０．３ｍＬ／ｍｍｏｌ，１８０ｍＬ）中エステル２（１当量，７８．６ｇ，０．５０ｍｏｌ）および４‐ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．１当量，６．１０ｇ，５０ｍｍｏｌ）の冷（５〜１０℃）攪拌溶液に、ｔ‐ブチルジカーボネート（Ｂｏｃ）２Ｏ（１．２当量，１３１ｇ，０．６０ｍｏｌ）を少しずつ加えた（３０分間）。得られた赤色溶液を室温において３時間攪拌した。次いで、混合液を真空下において濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ：ＣＨ２Ｃｌ２，１：４）で精製し、黄色様固体物として３を得た（９５％）。ｍ．ｐ．４８‐４９℃
【０１５５】
２．４  エナミノン（４′）の合成
Dieterich,P.,Young,D,W.,Org.Biomol.Chem.2006,4,1492-1496において記載された方法
１，２‐ジメトキシエタン（２．３ｍＬ／ｍｍｏｌ，７３６ｍＬ）中ピログルタメート３（１当量，８３．１ｇ，０．３２ｍｏｌ）の溶液にｔＢｕＯＣＨ（ＮＭｅ２）２（Bredereck試薬，１．５当量，１００ｍＬ，０．４８ｍｏｌ）を加え、得られた混合液を８５℃において１５時間加熱した。反応混合液を室温まで冷却し、真空下において蒸発させた。得られた粗油状物を最少量のＭＴＢＥで摩砕し、得られた固体物を濾過した。化合物４′を橙色固体物として得た（５９．４８ｇ，５９％）。母液を再び真空濃縮し、連続再結晶化で全収率を８４％（８４．２６ｇ）に高めた。
【０１５６】
２．５  アルケン（５）の合成
ＷＯ２００４０３９３１４号において記載された方法
ＴＨＦ（１．５６ｍＬ／ｍｍｏｌ，３００ｍＬ）中、４′（５９．４８ｇ，０．１９ｍｏｌ）の溶液に、水性１Ｍ ＨＣｌ（１．１当量，２１０ｍＬ）を加えた。混合液を室温において２時間攪拌した。水層および油層を分離し、水相を捨て、Ｋ２ＣＯ２（１．４当量，３７ｇ，０．２７ｍｏｌ）および水性ＨＣＨＯ（３７％）（１ｍＬ／ｍｍｏｌ，１９０ｍＬ）を有機層へ加えた。得られた混合液を室温において４５分間攪拌した。二相を分離し、有機層を集め、真空下において濃縮した。得られた粗生成物を（ＭＴＢＥ）メチルブチルエーテル（４００ｍＬ）に溶解し、水（２００ｍＬ）、Ｎａ２ＳＯ３（水性２０％，２００ｍＬ）、および水（２００ｍＬ）により洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥させ、濾過し、真空下において蒸発させた。化合物５をショートフラッシュクロマトグラフィーによる精製後に無色油状物として得た（２０．８ｇ，４０％）。
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：６．２３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）；５．５１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ）；４．６１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ）；４．２２（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；３．１７‐３．０５（ｍ，１Ｈ）；２．７５‐２．６４（ｍ，１Ｈ）；１．４７（ｓ，９Ｈ）；１．２３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）ｐｐｍ．
【０１５７】
実施例３
３．１  式Ｖの化合物：Ｎ‐トシルイミノベンジルヨージナンの合成
標題化合物の合成が下記スキーム５において示される。
【化４６】
0005616628.tif 000047
ｐ‐トルエンスルホンアミド（５．１３ｇ）、水酸化カリウム（４．２０ｇ）、およびメタノール（１２０ｍＬ）を氷浴内の三角フラスコ中において攪拌し、確実に反応混合液を１０℃以下とした。ヨードベンゼンジアセテート（９．６０ｇ）を攪拌混合液へ加え、得られた黄色溶液を室温において３．５時間攪拌した。反応混合液を大過剰の氷水へ注ぎ、１時間撹拌した。黄色固体物を一晩放置することにより沈殿させた。薄黄色固体物を濾過により単離し、ブフナー漏斗で気流により乾燥させた。生成物が不溶性であるエーテルを何回かに分けて用い、存在するヨードベンゼンを洗い流した。黄色固体物を最少可能量の沸騰メタノールに溶解した。溶液をフリーザーに一晩入れ、オフホワイト色固体物を濾過により回収した（５．１ｇ，４６％）。
【０１５８】
３．２  式Ｖの化合物：Ｎ‐トシルイミノベンジルヨージナンの合成
ＫＯＨ（２．５当量，３９３ｇ，７．００ｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１１Ｌ）中ｐ‐トルエンスルホンアミド（１当量，４８０ｇ，２．８０ｍｏｌ）の溶液へ加え、混合液を完全溶解まで室温において攪拌した。混合液を０℃に冷却し、ヨードベンゼンジアセテート（１当量，９０３ｇ，２．８０ｍｏｌ）を加え、０℃において４０分間攪拌した。反応液を２２℃へゆっくり加温し、一晩攪拌した。形成された固体物を濾過し、Ｅｔ２Ｏ（２５０ｍＬ）により洗浄し、真空下室温において乾燥させた（２８５ｇ）。母液を０℃に冷却してＨ２Ｏ／氷の混合液（５Ｌ）をゆっくり加えた場合、追加のフラクションを得た。得られた混合液を５℃において一晩保存した。次いで沈殿物を濾過し、Ｅｔ２Ｏ（２５０ｍＬ）で洗浄し、真空下室温において乾燥させた（４７９ｇ，７３％全収率）。
【０１５９】
実施例４
（３Ｒ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩）９ｃおよび（３Ｓ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩）９ｄの合成
標題化合物（９ｃおよび９ｄ）の合成が下記スキーム６において示される。
【化４７】
0005616628.tif 000048
４．１．１  ３Ｒ，６Ｒ‐４‐オキソ‐１‐（４‐トルエンスルホニル）‐１，５‐ジアザスピロ〔２．４〕ヘプタン‐５，６‐ジカルボン酸  ５-tert-ブチルエステル  ６‐エチルエステル７ｃおよび３Ｓ，６Ｒ‐４‐オキソ‐１‐（４‐トルエンスルホニル）‐１，５‐ジアザスピロ〔２．４〕ヘプタン‐５，６‐ジカルボン酸  ５-tert-ブチルエステル  ６‐エチルエステル７ｄの合成
乾燥アセトニトリル（１２ｍＬ）中、（Ｒ）‐５（３．０２ｇ，１１．２１ｍｍｏｌ）の冷溶液（０℃，氷水浴）に、ＰｈＩ＝ＮＴｓ（実施例２参照）（６．２７ｇ，１６．８ｍｍｏｌ）を一度に加え、次いでＣｕ（ａｃａｃ）２（２９３ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた不均質混合液を０℃で１５分間撹拌し、それを室温まで加温し、一晩攪拌した。得られた混合液に１Ｍ ＮａＯＨ（５０ｍＬ）を加え、混合液をＥｔＯＡｃ（３×２５ｍＬ）により抽出した。有機層を次いで塩水（２５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固させた。粗油状物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ：２／１）で精製し、白色固体物としてアジリジン７ｃ（７３０ｍｇ）および７ｄ（２８７ｍｇ）を得た（全収率：２３％）。
７ｃ：
ｍ．ｐ．９４‐９５℃
〔α〕Ｄ２５℃＝＋４２°（０．０３２，ＣＨＣｌ３）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：２９７７，２９２８，１８０８，１７４６，１３５２，１２９８，１２５１，１１９２，１１６１，９８８，６９０．
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）（７ｃ）：７．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）；７．３１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）；４．７４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｊ＝２．０２Ｈｚ）；４．２５‐４．２２（ｍ，２Ｈ）；３．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，Ｊ＝９．７Ｈｚ）；２．７８（ｓ，１Ｈ）；２．５７（ｓ，１Ｈ）；２．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，Ｊ＝２．０２Ｈｚ）；２．４２（ｓ，３Ｈ）；１．４９（ｓ，９Ｈ）；１．２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）（７ｃ）：１７０．５，１６６．９，１４８．７，１４５．１，１３５．２，１２９．６，１２７．９，８４．５，６２．０，５５．５，４７．１，３８．３，２７．７，２５．３，２１．５，１４．０ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：３３９（Ｍ＋１−Ｂｏｃ）
７ｄ：
ｍ．ｐ．５５‐５６℃
〔α〕Ｄ２５℃＝＋１１°（０．０３６，ＣＨＣｌ３）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：２９８１，２９３６，１７９９，１７４９，１３７１，１３３０，１２５３，１２０３，１１５６，１０９４，９８９，６８７．
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）（７ｄ）：７．７９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）；７．３０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）；４．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）；４．３０‐４．２２（ｍ，２Ｈ）；３．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）；２．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）；２．８２（ｓ，１Ｈ）；２．６３（ｓ，１Ｈ）；２．４１（ｓ，３Ｈ）；１．４９（ｓ，９Ｈ）；１．２８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）（７ｄ）：１６９．５，１６７．１，１４８．９，１４５．０，１３５．７，１２９．６，１２７．９，８４．５，６２．１，５６．１，４７．０，３７．１，２７．８，２４．５，２１．６，１４．０ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：３３９（Ｍ＋１−Ｂｏｃ）
【０１６０】
４．１．２  後処理を改良した３Ｓ，６Ｒ‐４‐オキソ‐１‐（４‐トルエンスルホニル）‐１，５‐ジアザスピロ〔２．４〕ヘプタン‐５，６‐ジカルボン酸  ５-tert-ブチルエステル  ６‐エチルエステル７ｄの合成
乾燥アセトニトリル（７ｍＬ）中（Ｒ）‐５（１．８４ｇ，６．８２ｍｍｏｌ）の冷溶液（０℃，氷水浴）に、ＰｈＩ＝ＮＴｓ（３．８２ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を一度に加え、次いでＣｕ（ａｃａｃ）２（１７８ｍｇ，０．６８２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を０℃において１５分間撹拌し、次いでそれを室温まで加温し、一晩攪拌した。得られた混合液を真空下において蒸発させた。粗油状物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ：９／１）により精製し、ｐ‐ＴｓＮＨ２不純物のないアジリジン類の混合物を得た（ＨＰＬＣ‐Ｍｓで調べた）。シス‐アジリジン７ｄが純粋白色泡状物（８％）として得られるまで、混合物を再びクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ：２／１）に付した。
【０１６１】
４．２．１  ３Ｒ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩９ｃのone-pot合成
アジリジン７ｃ（２００ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、モンモリロナイトＭＫ１０（２０重量％，４０ｍｇ）、およびピリジン（３７μＬ，０．４６ｍｍｏｌ）の混合物をマイクロ波（３００Ｗ）下１００℃において１０分間照射した。粗製混合物を酢酸エチル〔ＥｔＯＡｃ〕（１０ｍＬ）で希釈し、濾過し、ＨＰＬＣ分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン８ｃを更なる精製なしに次の工程で用いた（ＨＰＬＣによる純度９３％）。粗褐色油状物を水性４８％ＨＢｒ（２０ｍＬ）に溶解し、還流下において１８時間加熱した。混合液を水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末：ＳｉＯ２：セルロース粉末：活性炭（１ｃｍ：０．５ｃｍ：０．５ｃｍ：２ｃｍ）を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として９ｃを得た（５１ｍｇ，２８％）。ｍ．ｐ．＞２００℃．
〔α〕Ｄ２５℃＝＋４０°（０．０４１，ＣＨ３ＯＨ）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４３４，３０５１，１７２５，１６３３，１４８８，１４２０，１３８４，１２８０，１１８８，１１４５，１０８３，６８３．
１Ｈ‐ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：８．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；８．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）；８．０９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．２４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；３．０１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；２．１１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７３．２，１７３．１，１４７．１，１４５．６，１２８．６，６４．４，６４．２，４９．３，３３．０ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：２３６（Ｍ＋１−２Ｂｒ）
【０１６２】
４．２．２  ３Ｓ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩９ｄのone-pot合成
アジリジン７ｄ（２００ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、モンモリロナイトＭＫ１０（２０重量％，４０ｍｇ）、およびピリジン（３７μＬ，０．４６ｍｍｏｌ）の混合物をマイクロ波（３００Ｗ）下１００℃において１０分間照射した。粗製混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）により希釈し、濾過し、ＨＰＬＣ分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン８ｄを更なる精製なしに次の工程で用いた（ＨＰＬＣによる純度９３％）。粗褐色油状物を水性４８％ＨＢｒ（２０ｍＬ）に溶解し、還流下において１８時間加熱した。混合液を水により希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末：ＳｉＯ２：セルロース粉末：活性炭（１ｃｍ：０．５ｃｍ：０．５ｃｍ：２ｃｍ）を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として９ｄを得た（５２ｍｇ，２８％）。ｍ．ｐ．＞２００℃．
〔α〕Ｄ２５℃＝＋４０°（０．０３８，ＣＨ３ＯＨ）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４３５，３０５１，１７２１，１６３１，１５０９，１４７５，１４２２，１３８４，１２８０，１１９０，１１４４，６８３．
１Ｈ‐ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：８．７６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；８．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）；８．０７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．１９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．３３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；２．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；２．４６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７３．３，１７２．４，１４７．０，１４５．１，１２８．５，６５．６，６４．７，４９．３，３３．９ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：２３６（Ｍ＋１−２Ｂｒ）
【０１６３】
４．２．３  結晶化を改良した３Ｓ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩９ｄのone-pot合成
アジリジン７ｄ（１００ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）、モンモリロナイトＭＫ１０（２０重量％，２０ｍｇ）、およびピリジン（１８μＬ，０．２３ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃において３時間加熱した。粗製混合物をＥｔＯＡｃ（３ｍＬ）で希釈し、濾過し、真空下において蒸発させた。残渣をＥｔ２Ｏで摩砕し、濾過し、ベタイン８ｄを褐色固体物として得た。この化合物を水性４８％ＨＢｒ（１０ｍＬ）に溶解し、還流下において１８〜７２時間加熱した。反応をＨＰＬＣ‐Ｍｓ分析により測定した。粗油状物をアセトンで摩砕して、褐色固体物を得た。この固体物を最少量のＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、沈殿が観察されるまでＥｔ２Ｏまたはアセトンを加えた。固体物を次いで濾過し、真空下において乾燥させた（注意：生成物は高吸湿性である）。前記工程を２回繰返し、生成物の純度をＨＰＬＣ分析により調べた（８０％収率）。
【０１６４】
実施例５
（３Ｓ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩）９ａおよび（３Ｒ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩）９ｂの合成
標題化合物（９ａおよび９ｂ）の合成が下記スキーム７において示されている。
【化４８】
0005616628.tif 000049
５．１  ３Ｓ，６Ｓ‐４‐オキソ‐１‐（４‐トルエンスルホニル）‐１，５‐ジアザスピロ〔２．４〕ヘプタン‐５，６‐ジカルボン酸  ５-tert-ブチルエステル  ６‐エチルエステル７ａおよび３Ｒ，６Ｓ‐４‐オキソ‐１‐（４‐トルエンスルホニル）‐１，５‐ジアザスピロ〔２．４〕ヘプタン‐５，６‐ジカルボン酸  ５-tert-ブチルエステル  ６‐エチルエステル７ｂの合成
乾燥アセトニトリル（７ｍＬ）中、（Ｓ）‐５（１．８４ｇ，６．８２ｍｍｏｌ）の冷溶液（０℃，氷水浴）に、ＰｈＩ＝ＮＴｓ（実施例２参照）（３．８２ｇ，１０．２ｍｍｏｌ）を一度に加え、次いでＣｕ（ａｃａｃ）２（１７８ｍｇ，０．６８２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた不均質混合液を０℃において１５分間撹拌し、それを室温まで加温し、一晩攪拌した。得られた混合液に１Ｍ ＮａＯＨ（２０ｍＬ）を加え、混合液をＥｔＯＡｃ（３×２５ｍＬ）により抽出した。有機層を次いで塩水（２５ｍＬ）により洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４により乾燥し、蒸発乾固させた。粗油状物をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン／ＥｔＯＡｃ：２／１）で精製し、白色固体物としてアジリジン７ａ（６４１ｍｇ）および７ｂ（４７８ｍｇ）を得た（全収率：３７％）。
７ａ：
ｍ．ｐ．９５‐９６℃
〔α〕Ｄ２５℃＝−５７°（０．０２９，ＣＨＣｌ３）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：２９７７，２９２８，１８０８，１７４６，１３５２，１２９８，１２５１，１１９２，１１６１，９８８，６９０．
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）（７ａ）：７．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）；７．２７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）；４．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，Ｊ＝２．０２Ｈｚ）；４．２１‐４．１７（ｍ，２Ｈ）；３．２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，Ｊ＝９．７Ｈｚ）；２．７５（ｓ，１Ｈ）；２．５１（ｓ，１Ｈ）；２．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．４Ｈｚ，Ｊ＝２．０２Ｈｚ）；２．３７（ｓ，３Ｈ）；１．４５（ｓ，９Ｈ）；１．２７（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）（７ａ）：１７０．５，１６６．９，１４８．７，１４５．１，１３５．２，１２９．６，１２７．９，８４．５，６２．０，５５．５，４７．１，３８．３，２７．７，２５．３，２１．５，１４．０ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：３３９（Ｍ＋１−Ｂｏｃ）
７ｂ：
ｍ．ｐ．５７‐５８℃
〔α〕Ｄ２５℃＝−１３°（０．０６８，ＣＨＣｌ３）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：２９８２，２９３６，１７９９，１７４９，１３７１，１３３０，１２５２，１２０３，１１５４，１０９３，９８９，６８７．
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，５００ＭＨｚ）（７ｂ）：７．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）；７．２９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）；４．７０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）；４．２９‐４．２０（ｍ，２Ｈ）；３．０４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．１Ｈｚ，Ｊ＝４．３Ｈｚ）；２．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）；２．８２（ｓ，１Ｈ）；２．６３（ｓ，１Ｈ）；２．４０（ｓ，３Ｈ）；１．４８（ｓ，９Ｈ）；１．２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（ＣＤＣｌ３，１２５ＭＨｚ）（７ｂ）：１６９．５，１６７．１，１４８．９，１４５．０，１３５．７，１２９．６，１２７．９，８４．５，６２．１，５６．１，４７．０，３７．１，２７．８，２４．５，２１．６，１４．０ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：３３９（Ｍ＋１−Ｂｏｃ）
【０１６５】
５．２．１  ３Ｓ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩９ａのone-pot合成
アジリジン７ａ（３１１ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）、モンモリロナイトＭＫ１０（２０重量％，６０ｍｇ）、およびピリジン（５８μＬ，０．７１ｍｍｏｌ）の混合物をマイクロ波（３００Ｗ）下１００℃において１０分間照射した。粗製混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、濾過し、ＨＰＬＣ分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン８ａを更なる精製なしに次の工程で用いた（ＨＰＬＣによる純度９３％）。
粗褐色油状物を水性４８％ＨＢｒ（３０ｍＬ）に溶解し、還流下において１８時間加熱した。混合液を水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）により洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末：ＳｉＯ２：セルロース粉末：活性炭（１ｃｍ：０．５ｃｍ：０．５ｃｍ：２ｃｍ）を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として９ａを得た（１１０ｍｇ，４０％）。
ｍ．ｐ．＞２００℃
〔α〕Ｄ２５℃＝−４９°（０．０６９，ＣＨ３ＯＨ）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４３３，３０５１，１７２４，１６３３，１４８８，１４２０，１３８４，１２８１，１１８８，１１４４，１０８３，６８３．
１Ｈ‐ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：８．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；８．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）；８．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；３．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；２．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７３．１，１７２．６，１４７．２，１４５．６，１２８．６，６３．９，６３．７，４９．２，３２．７ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：２３６（Ｍ＋１−２Ｂｒ）
【０１６６】
５．２．２  ３Ｒ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩９ｂのone-pot合成
アジリジン７ｂ（２００ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、モンモリロナイトＭＫ１０（２０重量％，４０ｍｇ）、およびピリジン（３７μＬ，０．４６ｍｍｏｌ）の混合物をマイクロ波（３００Ｗ）下１００℃において１０分間照射した。粗製混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、濾過し、ＨＰＬＣ分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン８ｂを更なる精製なしに次の工程において用いた（ＨＰＬＣによる純度９３％）。粗褐色油状物を水性４８％ＨＢｒ（２０ｍＬ）に溶解し、還流下において１８時間加熱した。混合液を水により希釈し、ＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）により洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末：ＳｉＯ２：セルロース粉末：活性炭（１ｃｍ：０．５ｃｍ：０．５ｃｍ：２ｃｍ）を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として９ｂを得た（４４ｍｇ，２４％）。ｍ．ｐ．＞２００℃．
〔α〕Ｄ２５℃＝−０９°（０．１２，ＣＨ３ＯＨ）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４３５，３０４９，１７２４，１６３１，１５１３，１４７５，１４２０，１３８４，１２８０，１１９０，１１４４，６８３．
１Ｈ‐ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：８．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；８．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）；８．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；３．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；２．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７３．４，１７２．４，１４７．０，１４５．０，１２８．５，６５．７，６４．８，４９．３，３３．９ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：２３６（Ｍ＋１−２Ｂｒ）
【０１６７】
実施例６
３Ｓ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩の段階的合成
６．１  ベタイン８ａの合成
実施例５の場合と同様の操作に従い、アジリジン７ａ（３１１ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）、モンモリロナイトＭＫ１０（２０重量％，６０ｍｇ）、およびピリジン（５８μＬ，０．７１ｍｍｏｌ）の混合物をマイクロ波（３００Ｗ）下１００℃において１０分間照射した。粗製混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）により希釈し、濾過し、ＨＰＬＣ分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。ベタイン８ａをジエチルエーテルでの処理により精製し、白色固体物として生成物を単離した。
ｍ．ｐ．１２７‐１２８℃
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４３４，２９８０，１７８６，１７４６，１４８９，１３７０，１３１１，１２８７，１１９９，１１５３，１１２１，５５５．
１Ｈ‐ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，３００ＭＨｚ）：９．２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ）；８．３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ）；７．８９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ）；７．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）；７．１０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）；５．０７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．０Ｈｚ）；４．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ）；４．２７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；４．２０‐４．１３（ｍ，２Ｈ）；２．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）；２．３１（ｓ，３Ｈ）；２．０４‐１．９８（ｍ，１Ｈ）；１．３８（ｓ，９Ｈ）；１．２５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ）ｐｐｍ．
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：５１８（Ｍ＋１）
【０１６８】
一方、同反応混合物（アジリジン７ａ（３１１ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）、モンモリロナイトＭＫ１０（２０重量％，６０ｍｇ）、およびピリジン（５８μＬ，０．７１ｍｍｏｌ））を９０℃で７時間加熱することによりベタイン８ａを得た。粗製混合物をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）により希釈し、濾過し、ＨＰＬＣ分析が残留ピリジンを示さなくなるまで真空下において蒸発させた。得られた収率は、マイクロ波を用いて得られた収率と同様であった。
【０１６９】
６．２  ３Ｓ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩９ａの合成
前工程で得られた純粋ベタイン８ａを水性４８％ＨＢｒ（３０ｍＬ）に溶解し、還流下において１８時間加熱した。混合液を水によって希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）により洗浄し、水相を蒸発乾固させた。固定相としてセルロース粉末：ＳｉＯ２：セルロース粉末：活性炭（１ｃｍ：０．５ｃｍ：０．５ｃｍ：２ｃｍ）を用いるクロマトグラフィーにより粗油状物を精製し、固体物として９ａを得た（１１０ｍｇ，４０％）。ｍ．ｐ．＞２００℃．
〔α〕Ｄ２５℃＝−４９°（０．０６９，ＣＨ３ＯＨ）
ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４３３，３０５１，１７２４，１６３３，１４８８，１４２０，１３８４，１２８１，１１８８，１１４４，１０８３，６８３．
１Ｈ‐ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，５００ＭＨｚ）：８．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ）；８．５９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）；８．０８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）；５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．３Ｈｚ）；４．２８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；３．０６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）；２．１３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）ｐｐｍ．
１３Ｃ（Ｄ２Ｏ，１２５ＭＨｚ）：１７３．１，１７２．６，１４７．２，１４５．６，１２８．６，６３．９，６３．７，４９．２，３２．７ｐｐｍ
ＭＳ（ＥＳＩ＋）：ｍ／ｚ：２３６（Ｍ＋１−２Ｂｒ）
【０１７０】
実施例７
腫瘍増殖に及ぼす異なる異性体（９ａ，９ｂ，９ｃおよび９ｄ）の効果。検定される腫瘍：Renca
このアッセイは、Renca細胞で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす各立体異性体の効果を調べるために行った。それらの効果をプラセボと比較した。検定された立体異性体は以下であった：
異性体１：３Ｒ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩（９ｂ）
異性体２：３Ｒ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩（９ｃ）
異性体３：３Ｓ，５Ｓ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩（９ａ）
異性体４：３Ｓ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩（９ｄ）
これらの異性体は実施例４、５および６で開示された工程に従い得られる。
【０１７１】
材料および方法
腫瘍
RencaはＢａｌｂ／ｃマウス株に由来する腎臓細胞癌腫であり、したがってＢａｌｂ／ｃ遺伝的背景をもつマウスと同系である（Melder RJ et al.,Cancer Immunol.Immunother.,2005,54:535-547、Felluga B et al.,1969,J,Natl.Cancer Inst.43:319-333）。Rencaは中度の免疫原性腫瘍とみなされ、免疫介在アプローチを試験するための適切なモデルとして用いられる（Salup RR,et al.,1992,The Journal of Urology,147:1120-1123）。
【０１７２】
Renca細胞（ＣＬＳ,Eppelheim,Germany）を３〜４日毎の連続継代によりインビトロにおいて維持した。５×１０６細胞を７５ｃｍ２培養フラスコへ接種することによりＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡから購入した）において培養を行った。トリプシン（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）処理した４８時間培養物から集められた腫瘍細胞を下記研究用のRenca細胞源として用いた。
【０１７３】
研究薬物
活性成分
無菌生理食塩水中２．８１５ｍｇ／ｍＬの異性体１（９ｂ）
無菌生理食塩水中２．５２０ｍｇ／ｍＬの異性体２（９ｃ）
無菌生理食塩水中２．０８０ｍｇ／ｍＬの異性体３（９ａ）
無菌生理食塩水中３．０４０ｍｇ／ｍＬの異性体４（９ｄ）
プラセボ
生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）
【０１７４】
【表１】
0005616628.tif 000050
【０１７５】
サンプルサイズ
先のデータに従い、有意水準に達する上で必要なサンプルサイズは１群当たり動物２６匹であった。Epi-info ｖ６．０ソフトウェア（Fleiss.Statistical Methods for rates and Proportions.2nd Ed,Wiley,1981:38-45）を用いてこのサンプルサイズを計算し、０．８検定力、腫瘍面積１／２減少で０．９５の信頼レベルおよび１‐１コントロール‐ケース比により評価した。
【０１７６】
装置
層状フラッドフード、浴槽、倒立顕微鏡、計数板、ＣＯ２インキュベーター、遠心機、キャリパー、バランス、アジャスタブルピペット、窒素容器、冷蔵庫／フリーザー、および免疫不全マウスラック。
【０１７７】
試薬
トリパンブルー（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）
無菌ＰＢＳ（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）
生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）
【０１７８】
投与の用量、ビヒクル、経路、および容量
用量
腫瘍接種後、６、７、および１４日目に投与される２６０ｎｇの用量レベルで各異性体を試験した。
ビヒクル
異性体が希釈されるビヒクルは生理食塩水であった。
投与経路および容量
処理は腹腔内経路（ｉ．ｐ．）により行った。接種される用量は０．２ｍＬ／動物であった。この経路がオリジナル方法（Perez S,et al.,2003,Clinical Cancer Research,9;5776-5785）で記載されたものであるため、それを選択した。
【０１７９】
研究デザイン
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を１０５Renca生細胞含有０．２ｍＬで接種した。皮下接種の日が試験の０日目とみなされる。
【表２】
0005616628.tif 000051
マウスを毎日観察し、腫瘍サイズを週に２回記録した。これはキャリパーで２垂直径（Ｌ／Ｗ）を測定することにより行った。腫瘍面積および容積の双方を得るためにこれらの測定を用いた：
腫瘍面積＝Ｌ×Ｗ（ｍｍ２）
腫瘍容積＝Ｌ×Ｗ２×１／２（ｍｍ３）
結果は各実験群から単一値としておよび／または平均±ＳＤまたはメジアンとして表示した。
【０１８０】
統計
異性体とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスにおいてケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ（腫瘍面積および容積）を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定ｐ＜０．０５。異性体が腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのＵ検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis２群検定の双方に相当する。
データの高分散により、範囲逸脱動物（２５日目に腫瘍面積で２５パーセンタイルまたは７５パーセンタイルから外れる動物）は研究から除外した。
用いられた統計ソフトウェアはＳＰＳＳｖ１２．０であった。
【０１８１】
結果
Renca腫瘍細胞増殖に及ぼす異性体の阻害効果
３０匹マウス／群（プラセボ群３１匹）を研究に用いた。異性体２群のマウス２匹は腫瘍接種後２週目に未知の原因で死亡したため、除外した。
表１および２はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日で異性体またはＰ．Ｓ．マウス群における面積（表１）または容積（表２）のメジアンを要約する。
【表３】
0005616628.tif 000052
【０１８２】
【表４】
0005616628.tif 000053
【０１８３】
表３および４は平均値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日において異性体またはＰ．Ｓ．マウス群における面積（表３）または容積（表４）の平均を要約する。
【表５】
0005616628.tif 000054
【０１８４】
【表６】
0005616628.tif 000055
【０１８５】
異性体３ vs.プラセボを受けたマウス間においてRenca腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１８および２５日目に統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０１８６】
異性体４ vs.プラセボを受けたマウス間においてRenca腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定により計算すると、腫瘍成長の１４日目以後に評点されたすべての日において統計学上有意（ｐ＜０．０１）であった。
【０１８７】
図１は腫瘍面積のメジアンのグラフを表し（群Ａ１、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）、一方図２は腫瘍容積のメジアンのグラフを表す（群Ａ１、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）。これらの図においてみられるように、異性体３および異性体４ vs.プラセボを受けたマウス間においてRenca腫瘍増殖率に差異があった。
【０１８８】
図３は平均腫瘍面積のグラフを表し（群Ａ１、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）、一方図４は平均腫瘍容積のグラフを表す（群Ａ１、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）。これらの図においてみられるように、異性体３および異性体４ vs.プラセボをうけたマウス間でRenca腫瘍増殖率に差異があった。
【０１８９】
結果は異性体３および異性体４が腎臓細胞癌腫（Renca）のインビボ増殖を阻害することを示し、異性体４がRenca腫瘍増殖において最大阻害効果を示す。
【０１９０】
実施例８
異なる異性体（９ａ，９ｂ，９ｃおよび９ｄ）とＢＬＡＳの混合物との腫瘍増殖の比較
検定される腫瘍：ＡＳＢ XIV
このアッセイは、ＡＳＢ XIV腫瘍で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす各立体異性体の効果をそれらすべての混合物の効果と比較するために行った。検定された立体異性体は前記実施例７の場合と同一のもの＋それらすべての混合物（ＢＬＡＳ）であった。装置（所要時）、試薬、投与の用量、ビヒクル、経路、および容量は実施例７の場合と同一であった。
【０１９１】
材料および方法
腫瘍
ＡＳＢ XIVはＢａｌｂ／ｃマウス株に由来する肺扁平上皮細胞癌腫であり、したがってＢａｌｂ／ｃ遺伝的背景をもつマウスと同系である。
ＡＳＢ XIV細胞（ＣＬＳ,Eppelheim,Germany）を３〜４日毎の連続継代によりインビトロにおいて維持した。５×１０６細胞を７５ｃｍ２培養フラスコへ接種することによりＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡから購入した）において培養を行った。トリプシン（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）処理した４８時間培養物から集められた腫瘍細胞を本実施例でＡＳＢ XIV細胞源として用いた。
【０１９２】
研究薬物
活性成分
無菌生理食塩水中濃度６５μｇ／ｍＬのＢＬＡＳ（異性体１、２、３、および４の混合物）
無菌生理食塩水中濃度６５μｇ／ｍＬの異性体１（９ｂ）
無菌生理食塩水中濃度６５μｇ／ｍＬの異性体２（９ｃ）
無菌生理食塩水中濃度６５μｇ／ｍＬの異性体３（９ａ）
無菌生理食塩水中濃度６５μｇ／ｍＬの異性体４（９ｄ）
プラセボ
生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）
【０１９３】
【表７】
0005616628.tif 000056
【０１９４】
サンプルサイズ
先のデータに従い、有意水準に達する上で必要なサンプルサイズは１群当たり動物２６匹であった。Epi-info ｖ６．０ソフトウェアを用いてこのサンプルサイズを計算し、０．８検定力、腫瘍面積１／２減少で０．９５の信頼レベルおよび１‐１コントロール‐ケース比で評価した。
【０１９５】
研究デザイン
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を２×１０５ＡＳＢ XIV生細胞含有０．２ｍＬで接種した。皮下接種の日が試験の０日目とみなされる。
【表８】
0005616628.tif 000057
マウスを毎日観察し、腫瘍サイズを週に２回記録した。これはキャリパーで２垂直径（ｄ１／ｄ２）を測定することにより行った。腫瘍面積および容積の双方を得るためにこれらの測定を用いた：
腫瘍面積＝ｄ１×ｄ２（ｍｍ２）
腫瘍容積＝ｄ１×ｄ２２×１／２（ｍｍ３）
結果は各実験群から単一値としておよび／または平均±ＳＤまたはメジアンとして表示した。
【０１９６】
統計
ＢＬＡＳまたは異なる各立体異性体とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ（腫瘍面積および容積）を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定ｐ＜０．０５。ＢＬＡＳが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのＵ検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis２群検定の双方に相当する。
データの高分散のせいで、範囲逸脱動物（３３日目に腫瘍面積で１０パーセンタイルまたは９０パーセンタイルから外れる動物）は研究から除外した。
用いられた統計ソフトウェアはＳＰＳＳｖ１２．０であった。
【０１９７】
結果
ＡＳＢ XIV腫瘍細胞増殖に及ぼすＢＬＡＳまたは各異性体の阻害効果
３１匹マウス／群（プラセボ群３２匹）を研究に用いた。異性体４（９ｄ）群のマウス２匹は腫瘍接種後１週目に未知の原因で死亡したため、除外した。
表５および６はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日でＢＬＡＳ、異性体またはＰ．Ｓ．マウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
【表９】
0005616628.tif 000058
【０１９８】
【表１０】
0005616628.tif 000059
【０１９９】
表７および８は平均値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日においてＢＬＡＳ、異性体またはＰ．Ｓ．マウス群における面積または容積の平均を要約する。
【表１１】
0005616628.tif 000060
【０２００】
【表１２】
0005616628.tif 000061
【０２０１】
ＢＬＡＳ vs.プラセボを受けたマウス間においてＡＳＢ XIV腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の２６日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２０２】
異性体３ vs.プラセボを受けたマウス間においてＡＳＢ XIV腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の２６日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２０３】
異性体４ vs.プラセボを受けたマウス間においてＡＳＢ XIV腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の２６日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２０４】
ＢＬＡＳ、異性体３、および異性体４は肺癌腫ＡＳＢ XIVのインビボ増殖を阻害する。ＡＳＢ XIV腫瘍増殖に及ぼす各々の阻害効果間に差異はなかった。
【０２０５】
実施例９
異なる異性体（９ａ，９ｂ，９ｃおよび９ｄ）と、ＢＬＡＳの混合物との腫瘍増殖の比較。検定される腫瘍：Ehrlich
このアッセイは、Ehrlich腫瘍で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす各立体異性体の効果をそれらすべての混合物の効果と比較するために行った。実施例８の場合と同一の生成物、装置、試薬、投与の用量、ビヒクルおよび経路が用いられた。
【０２０６】
材料および方法
腫瘍
マウスをEhrlich腫瘍細胞で接種した。それはネズミ哺乳類腺癌として記載されていた。Ehlrich腫瘍は異系交配マウスで当初作製されたネズミ哺乳類癌腫であり、したがってそれはいわゆる非特異的腫瘍に属する（Subiza JL,Vinuela JE,Rodriguez R,Gil J,Figueredo MA,de la Concha.EG.Development of splenic natural suppressor(NS)cells in Ehrlich tumor bearing mice.,Int.J.Cancer,44:307-315,1989）。それは組織適合性障壁を越えて増殖してもよく、したがってマウス株特異性ではない（Carry PJ,Prescott DM,Ogilvie GK,Resistance to Ehrlich ascites tumor in a strain of dystrophic mice,Cancer Res.,39;2139-2140,1979）。
Ehrlich細胞を３〜４日毎の連続継代によりインビトロにおいて維持した。５×１０６細胞を７５ｃｍ２培養フラスコへ接種することによりＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡから購入した）において培養を行った。４８時間培養物から集められた腫瘍細胞を下記研究で細胞源として用いた。
【０２０７】
【表１３】
0005616628.tif 000062
【０２０８】
研究デザイン
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を２×１０５Ehrlich生細胞含有０．２ｍＬで接種した。皮下接種の日が試験の０日目とみなされる。
【表１４】
0005616628.tif 000063
マウスを毎日観察し、腫瘍サイズを週に２回記録した。これはキャリパーで２垂直径（Ｌ／Ｗ）を測定することにより行った。腫瘍面積および容積の双方を得るためにこれらの測定を用いた：
腫瘍面積＝Ｌ×Ｗ（ｍｍ２）
腫瘍容積＝Ｌ×Ｗ２×１／２（ｍｍ３）
結果は各実験群から単一値としておよび／または平均±ＳＤまたはメジアンとして表示した。
【０２０９】
統計
ＢＬＡＳまたは異なる各立体異性体とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ（腫瘍面積および容積）を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定ｐ＜０．０５。ＢＬＡＳが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのＵ検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis２群検定の双方に相当する。
用いられた統計ソフトウェアはＳＰＳＳｖ１２．０であった。
【０２１０】
結果
Ehrlich腫瘍細胞増殖に及ぼすＢＬＡＳの阻害効果
１６匹マウス／群を研究に用いた。
表９および１０はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す（ｎ（初日）は全ケースで１６であり、用量は２６０ｎｇ／マウスである）。これらの表は、評点された各日でＢＬＡＳ、異性体またはＰ．Ｓ．マウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
【表１５】
0005616628.tif 000064
【０２１１】
【表１６】
0005616628.tif 000065
【０２１２】
表１１および１２は平均値として表示された各実験群の結果を示す（ｎ（初日）は全ケースで１６であり、用量は２６０ｎｇ／マウスである）。これらの表は、評点された各日でＢＬＡＳ、異性体、またはＰ．Ｓ．マウス群における面積または容積の平均を要約する。
【表１７】
0005616628.tif 000066
【０２１３】
【表１８】
0005616628.tif 000067
【０２１４】
ＢＬＡＳ vs.プラセボを受けたマウス間においてEhrlich腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１６日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。３５および３８日目に、傾向が面積で観察された（各々、ｐ＝０．０５６およびｐ＝０．０８）。１３、１６、２０、および３８日目に、傾向が容積で観察された（各々ｐ＝０．０８、ｐ＝０．０５６、ｐ＝０．０５１およびｐ＝０．０６７）。
【０２１５】
異性体１ vs.プラセボを受けたマウス間においてEhrlich腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１３日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２１６】
異性体２ vs.プラセボを受けたマウス間においてEhrlich腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１３日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２１７】
異性体３ vs.プラセボをうけたマウス間においてEhrlich腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の８日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２１８】
異性体４ vs.プラセボを受けたマウス間においてEhrlich腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の８日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。面積および容積で、傾向が３５および３８日目に観察された（各々ｐ＝０．０６１およびｐ＝０．０８、それらの双方でｐ＝０．１０２）。
【０２１９】
ＢＬＡＳ vs.異性体３を受けたマウス間においてEhrlich腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１３、１６、２０、および２３日目で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２２０】
ＢＬＡＳ、異性体１、異性体２、異性体３、および異性体４は、Ehrlich腫瘍細胞のインビボ増殖を阻害する。異性体３はEhrlich腫瘍増殖において最大阻害効果を示す。
【０２２１】
実施例１０
異なる腫瘍の増殖に及ぼす異性体４（９ｄ）の効果
実施例８および９において用いられたものと同様の方法および材料に従い、異なる腫瘍に及ぼす異性体４（９ｄ）の効果を調べるために、以下のアッセイを行った。すべてのケースで、無菌生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）をプラセボとして用いた。腫瘍接種後６、７、および１４日目に表１３で示された用量レベルで異性体４（９ｄ）を試験した。すべてのケースにおいて、ビヒクルは生理食塩水であり、処理は腹腔内経路によるものであった。接種された容量は０．２ｍＬ／動物であった。結果が表１３において示される。
【表１９】
0005616628.tif 000068
【０２２２】
実施例１１、１２、および１３
異性体４（９ｄ） vs プラセボおよび９ｄ＋シスプラチンの組合せの効果検定される腫瘍：ＫＬＮ２０５およびLewis肺細胞
このアッセイは、ＫＬＮ２０５腫瘍およびLewis肺細胞で感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす異性体４（９ｄ）の効果を異性体４（９ｄ）＋シスプラチンの混合物の効果と比較するために行った。実施例７で用いられたものと同様の装置、試薬、ビヒクルと、投与の経路および用量とが用いられた。
【０２２３】
研究薬物
実施例１１、１２、および１３では下記薬物が研究で用いられた：
活性成分
無菌生理食塩水中、シスプラチン（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）
無菌生理食塩水中、異性体（９ｄ）（３Ｓ，５Ｒ‐１‐（３‐アミノ‐５‐カルボキシ‐２‐オキソピロリジン‐３‐イルメチル）ピリジニウムブロミド臭化水素酸塩）
プラセボ
生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）
【０２２４】
実施例１１、１２、および１３においてはマウスを毎日観察し、腫瘍サイズを週に２回記録した。これはキャリパーで２垂直径（ｄ１／ｄ２）を測定することにより行った。腫瘍面積および容積の双方を得るためにこれらの測定を用いた：
腫瘍面積＝ｄ１×ｄ２（ｍｍ２）
腫瘍容積＝ｄ１×ｄ２２×１／２（ｍｍ３）
結果は各実験群から単一値としておよび／または平均±ＳＤまたはメジアンとして表示した。
【０２２５】
実施例１１
腫瘍増殖に及ぼすシスプラチンとの組み合わせた９ｄの効果
検定される腫瘍：ＫＬＮ２０５
このアッセイは、ＫＬＮ２０５細胞により感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす効果を調べるために行った。それらの効果をシスプラチン＋９ｄの組合せおよび／またはプラセボと比較した。
【０２２６】
材料および方法
腫瘍
ＫＬＮ２０５はＤＢＡ／２マウス株に由来する肺細胞癌腫であり、したがってＤＢＡ／２遺伝的背景をもつマウスと同系である（Kaneko T and LePage GA.Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo.Cancer Res.38:2084-2090,1978）。
【０２２７】
ＫＬＮ２０５細胞（ＣＬＳ,Eppelheim,Germany）を３〜４日毎の連続継代によりインビトロにおいて維持した。５×１０６細胞を７５ｃｍ２培養フラスコへ接種することによりＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡから購入した）において培養を行った。トリプシン‐ＥＤＴＡ（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）による処理後に離脱細胞を集めることにより継代培養を行った。４８時間培養物から集められた腫瘍細胞を下記研究用のＫＬＮ２０５細胞源として用いた。
【０２２８】
【表２０】
0005616628.tif 000069
【０２２９】
用量
腫瘍接種後３週間にわたり週２回投与される６５μｇの用量レベルでシスプラチンを試験した。
腫瘍接種後３週間にわたり週２回投与される２５０ｎｇの用量レベルで異性体４（９ｄ）を試験した。
【０２３０】
研究デザイン
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウス（ＤＢＡ／２）を２×１０５ＫＬＮ２０５生細胞含有０．２ｍＬで接種した。皮下接種の日が試験の０日目とみなされる。
【表２１】
0005616628.tif 000070
【０２３１】
統計
プラセボ、９ｄ、シスプラチン、または９ｄ＋シスプラチン間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ（腫瘍面積および容積）を各群内で正規分布について検定した‐Kolmogorov Smirnov検定ｐ＜０．０５。９ｄおよび／またはシスプラチンが腫瘍増殖に相乗作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてｔ検定を選択した。
用いられた統計ソフトウェアはＳＰＳＳｖ１２．０であった。
【０２３２】
結果
ＫＬＮ２０５腫瘍細胞増殖に及ぼす９ｄおよび／またはシスプラチンの阻害効果
１６または１５匹マウス／群を研究に用いた。
表１４および１５はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日で９ｄ、シスプラチン、９ｄ＋シスプラチン、またはＰ．Ｓ．マウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
【表２２】
0005616628.tif 000071
【０２３３】
【表２３】
0005616628.tif 000072
【０２３４】
表１６および１７は平均値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日において９ｄ、シスプラチン、９ｄ＋シスプラチン、またはＰ．Ｓ．マウス群における面積または容積の平均を要約する。
【表２４】
0005616628.tif 000073
【０２３５】
【表２５】
0005616628.tif 000074
【０２３６】
９ｄ＋シスプラチン vs.プラセボを受けたマウス間においてＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、ｔ検定により計算すると、腫瘍成長の１７日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２３７】
シスプラチン vs.プラセボを受けたマウス間においてＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、ｔ検定により計算すると、腫瘍成長の２０日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２３８】
９ｄ vs.プラセボを受けたマウス間においてＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異がなかった。ｔ検定により計算すると腫瘍成長の３１日目以後に評点されたすべての日において、面積または容積に有意な傾向があった。
【０２３９】
このように、シスプラチンおよび９ｄまたはシスプラチンはＫＬＮ２０５細胞のインビボ増殖を阻害する。９ｄおよびシスプラチンは相乗効果を有している。
【０２４０】
実施例１２
皮下、皮内、または筋肉内接種により腫瘍増殖に及ぼすシスプラチンと組み合わせた異性体（９ｄ）の効果。検定される腫瘍：ＫＬＮ２０５
このアッセイは、ＫＬＮ２０５細胞により感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす効果を調べるために行った。腫瘍は皮下、皮内、または筋肉内接種により定着させた。
【０２４１】
シスプラチンおよび／または異性体（９ｄ）の組合せの効果を皮内感作マウスにおいてプラセボと比較した。更に、筋肉内または皮内経路で感作されたマウスでインビボ腫瘍増殖に及ぼす９ｄの効果をプラセボと比較した。
【０２４２】
材料および方法
腫瘍
ＫＬＮ２０５はＤＢＡ／２マウス株に由来する肺細胞癌腫であり、したがってＤＢＡ／２遺伝的背景をもつマウスと同系である（Kaneko T and LePage GA.Growth characteristics and drug responses of a murine lung carcinoma in vitro and in vivo.Cancer Research.38:2084-2090,1978）。
【０２４３】
ＫＬＮ２０５細胞（ＣＬＳ,Eppelheim,Germany）を３〜４日毎の連続継代によりインビトロで維持した。５×１０６細胞を７５ｃｍ２培養フラスコへ接種することによりＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡから購入した）において培養を行った。トリプシン‐ＥＤＴＡ（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）で処理後に離脱細胞を集めることにより継代培養を行った。４８時間培養物から集められた腫瘍細胞を下記研究用のＫＬＮ２０５細胞源として用いた。
【０２４４】
【表２６】
0005616628.tif 000075
【０２４５】
用量
腫瘍接種後７、１１、１４、１８、２１、２５、および２８日目に投与される６５μｇの用量レベルでシスプラチンを試験した。
腫瘍接種後７、１１、１４、１８、２１、２５、および２８日目に投与される２５０ｎｇの用量レベルで異性体（９ｄ）を試験した。
【０２４６】
研究デザイン
右後肢脇腹で皮下および皮内接種、並びに右後肢で筋肉内により腫瘍を定着させた。マウス（ＤＢＡ／２）を２×１０５ＫＬＮ２０５生細胞含有０．０５ｍＬで接種した。皮下、皮内および筋肉内接種の日が試験の０日目とみなされる。
【表２７】
0005616628.tif 000076
【０２４７】
統計
プラセボ、９ｄ、シスプラチン、または９ｄ＋シスプラチン間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスにおいてケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ（腫瘍面積および容積）を各群内で正規分布について検定した（Kolmogorov Smirnov検定ｐ＜０．０５）。９ｄ、シスプラチン、または９ｄ＋シスプラチンが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルにおいてノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのＵ検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis２群検定の双方に相当する。
すべての統計解析はＳＰＳＳ（Statistical Package for Social Sciences）ｖ１３．０で行った。
【０２４８】
結果
ＫＬＮ２０５腫瘍細胞増殖に及ぼす異性体４（９ｄ）の阻害効果
１０匹マウス／群を研究に用いた。
表１８および１９はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日で面積または容積のメジアンを要約する。
【表２８】
0005616628.tif 000077
【０２４９】
【表２９】
0005616628.tif 000078
【０２５０】
表２０および２１は平均値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日における面積または容積の平均を要約する。
【表３０】
0005616628.tif 000079
【０２５１】
【表３１】
0005616628.tif 000080
【０２５２】
９ｄ vs.プラセボを受けたマウス間において皮下ＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定により計算すると、腫瘍成長の２０日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２５３】
９ｄ vs.プラセボを受けたマウス間において皮内ＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異はなかった。Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると腫瘍成長の１７日目以後に評点されたすべての日で、面積または容積に有意な傾向があった。
【０２５４】
シスプラチン vs.プラセボを受けたマウス間において皮内ＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１７、２０、および３１日目で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２５５】
９ｄ＋シスプラチン vs.プラセボを受けたマウス間において皮内ＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定により計算すると、腫瘍成長の１３日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２５６】
Mann-Whitney Ｕ検定により計算すると、９ｄ vs.プラセボをうけたマウス間において筋肉内ＫＬＮ２０５腫瘍増殖率に差異はなかった。
【０２５７】
異性体４（９ｄ）は皮下ＫＬＮ２０５細胞のインビボ増殖を阻害する。９ｄ＋シスプラチンまたはシスプラチンは皮内ＫＬＮ２０５細胞のインビボ増殖を阻害する。
【０２５８】
実施例１３
腫瘍増殖に及ぼすシスプラチンと組み合わせた９ｄの効果。検定される腫瘍：Lewis
このアッセイは、Lewis肺細胞により感作されたマウスのインビボ腫瘍増殖に及ぼす効果を調べるために行った。それらの効果が化学療法剤＋９ｄの組合せおよび／またはプラセボと比較される。
【０２５９】
材料および方法
腫瘍
Lewis LungはＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス株に由来する肺細胞癌腫であり、したがってＣ５７ＢＬ／６Ｊ遺伝的背景をもつマウスと同系である（Rodrigo Garzon M,Tirapu Fernandez de la Cuesta I,Arina Iraeta A,Noel Centelles Llorente M and Zulueta Frances J.Use of Gene Therapy in a Subcutaneous Murine Model of Lung Cancer,Arch Bronconeumology.42:526-532,2006）。
【０２６０】
Lewis肺細胞（ＣＬＳ,Eppelheim,Germany）を３〜４日毎の連続継代によりインビトロで維持した。５×１０６細胞を７５ｃｍ２培養フラスコへ接種することによりＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ、１０％牛胎児血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン、非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、８０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、それらのすべてはSigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡから購入した）において培養を行った。トリプシン‐ＥＤＴＡ（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）による処理後に離脱細胞を集めることにより継代培養を行った。４８時間培養物から集められた腫瘍細胞を下記研究用のLewis肺細胞源として用いた。
【０２６１】
【表３２】
0005616628.tif 000081
【０２６２】
用量
腫瘍接種後７、１１、１４、１８、２１、２４、および２７日目に投与される６５μｇの用量レベルでシスプラチンを試験した。
腫瘍接種後７、１１、１４、１８、２１、２４、および２７日目に投与される２５０ｎｇの用量レベルで異性体４（９ｄ）を試験した。
【０２６３】
研究デザイン
右後肢脇腹で皮下接種により腫瘍を定着させた。マウスを２×１０５生細胞含有０．２ｍＬで接種した。皮下接種の日が試験の０日目とみなされる。
【表３３】
0005616628.tif 000082
マウスを毎日観察し、腫瘍サイズを週に２回記録した。これはキャリパーで２垂直径（ｄ１／ｄ２）を測定することにより行った。腫瘍面積および容積の双方を得るためにこれらの測定を用いた：
腫瘍面積＝ｄ１×ｄ２（ｍｍ２）
腫瘍容積＝ｄ１×ｄ２２×１／２（ｍｍ３）
結果は各実験群から単一値としておよび／または平均±ＳＤまたはメジアンとして表示した。
【０２６４】
統計
プラセボ、９ｄ、シスプラチン、または９ｄ＋シスプラチン間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスにおいてケース‐コントロール研究を行った。得られたデータ（腫瘍面積および容積）を各群内で正規分布について検定した（Kolmogorov Smirnov検定ｐ＜０．０５）。９ｄ、シスプラチン、または９ｄ＋シスプラチンが腫瘍増殖に有害作用を有するか否かを比較するために、対応のないサンプルでノンパラメトリック仮説検定を行なった。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのＵ検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis２群検定の双方に相当する。
我々は腫瘍接種後３１日目に非検出または非評点腫瘍を有する研究動物を除外した。データの高分散により、範囲逸脱動物は研究から除外した。
すべての統計解析はＳＰＳＳ（Statistical Package for Social Sciences）ｖ１３．０で行った。
【０２６５】
結果
Lewis肺腫瘍増殖に及ぼす異性体４（９ｄ）の効果
１５匹マウス／群を研究に用いた。プラセボ群のマウス１匹は腫瘍接種後２週目に未知の原因で死亡したため、除外した。
表２２および２３はメジアン値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日においてＰ．Ｓ．、９ｄ、シスプラチン、または９ｄ＋シスプラチンマウス群における面積または容積のメジアンを要約する。
【表３４】
0005616628.tif 000083
【０２６６】
【表３５】
0005616628.tif 000084
【０２６７】
表２４および２５は平均値として表示された各実験群の結果を示す。これらの表は、評点された各日でＰ．Ｓ．、９ｄ、シスプラチン、または９ｄ＋シスプラチンマウス群における面積または容積の平均を要約する。
【表３６】
0005616628.tif 000085
【０２６８】
【表３７】
0005616628.tif 000086
【０２６９】
９ｄ vs.プラセボを受けたマウス間においてLewis肺腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１３日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２７０】
シスプラチン vs.プラセボを受けたマウス間においてLewis肺腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定で計算すると、腫瘍成長の１０、１３、および１７日目で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２７１】
９ｄ＋シスプラチン vs.プラセボを受けたマウス間においてLewis肺腫瘍増殖率に差異があった。面積または容積におけるこれらの差異は、Mann-Whitney Ｕ検定により計算すると、腫瘍成長の１７日目以後に評点されたすべての日で統計学上有意（ｐ＜０．０５）であった。
【０２７２】
９ｄ、シスプラチン、および９ｄ＋シスプラチンは、近交系マウスで増殖させるLewis肺腫瘍のインビボ増殖を阻害する。
【０２７３】
実施例１４
毒性
このアッセイは、マウスでＢＬＡＳおよびＩＬ‐２処理の耐性（致死性／毒性）を調べるために行った。
【０２７４】
材料および方法
研究薬物
無菌生理食塩水中１．２５ｍｇ／ｍＬのＢＬＡＳ（異性体１、２、３、および４の等モル混合物）
１８×１０６ＩＵ／ｍＬのヒト組換えＩＬ‐２（Proleukin；Chiron Iberia,Madrid,Spain）
【０２７５】
【表３８】
0005616628.tif 000087
【０２７６】
投与の用量、ビヒクル、経路、および容量
【表３９】
0005616628.tif 000088
【０２７７】
ビヒクル
ＢＬＡＳおよびＩＬ‐２が希釈されるビヒクルは、注射用無菌生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）および注射用無菌蒸留水（Grifols,Barcelona,Spain）であった。
【０２７８】
投与経路
処理はｉ．ｐ．により行った。
【０２７９】
研究デザイン
全マウスを３０日間にわたり毎日観察した。
２回の測定を行った：
１．致死性．これは生存率として表示した。
２．毒性．これは下記パラメーターおよびスコア基準下において生育マウスで調べた：
【表４０】
0005616628.tif 000089
【０２８０】
結果
ＢＬＡＳおよびＩＬ‐２処理による致死性および毒性
表２６は両処理において観察される致死性を示す。結果は生存率により表示される。この表においてみられるように、最高用量のＩＬ‐２をうけたＢ２群のマウス２匹が初回投与後６および７日目に死んだ。それ以上の死亡は、ＩＬ‐２（低用量）またはどの用量のＢＬＡＳで処理された、他のいずれのマウス群においても観察されなかった。
【表４１】
0005616628.tif 000090
【０２８１】
表２７は、上記基準で評点した、両処理によるマウスにおいて観察された毒性を示す。結果は、処理群当たりで累積された毒性スコアとして表示される。
【表４２】
0005616628.tif 000091
【０２８２】
この表においてみられるように、毒性はＩＬ‐２処理マウス（Ｂ１＆Ｂ２群）のみで観察された。Ｂ２群（最高ＩＬ‐２用量）はより顕著な有害作用を示したが、Ｂ１群（低用量）のマウスも評点してみると、低度であった。有害作用がＩＬ‐２処理中および後（２〜１５日目）にみられた。予想されたように、後にこれらの作用は、ＩＬ‐２が初回投与後６日目に中止されたため消失した。ＢＬＡＳは見掛け上全く毒性がなく、追跡時にどのマウスにおいてもポイントが加算されなかったことに注目すべきである。この研究で用いられた用量が前記実施例のほとんどで用いられた治療用量の１０００倍を超えていたため、これは注目に値する。
ＢＬＡＳはＩＬ‐２と対照的に、その治療範囲を大きく超えた用量でも、マウスにおいて非常に耐えることができる。
【０２８３】
実施例１５
異性体４（９ｄ）の毒性
このアッセイは、健常マウスにおいて高用量で用いられた異性体４（９ｄ）の毒性効果を扱う予備研究を実施するために行った。その最終毒性がプラセボと比較される。
【０２８４】
材料および方法
研究薬物
活性物質
無菌生理食塩水中、０．７ｍｇ／ｍＬの異性体４（９ｄ）
プラセボ
注射用無菌生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）
【０２８５】
【表４３】
0005616628.tif 000092
【０２８６】
投与の用量、ビヒクル、経路、および容量
【表４４】
0005616628.tif 000093
【０２８７】
ビヒクル
異性体４が希釈されるビヒクルは、注射用無菌生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）および注射用無菌蒸留水（Grifols,Barcelona,Spain）であった。
【０２８８】
投与経路
処理はｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．により行った。
【０２８９】
研究デザイン
全マウスを１０日間にわたり毎日観察した。
３回の測定を行った：
３．体重．これはグラムで測定および表示した。
４．致死性．これは生存率として表示した。
５．毒性．これは下記パラメーターおよびスコア基準下において生育マウスで調べた：
【表４５】
0005616628.tif 000094
【０２９０】
【表４６】
0005616628.tif 000095
【０２９１】
統計
異性体４とプラセボの投与間に差異が存在するか否かを調べるために、処理およびコントロールマウスでケース‐コントロール研究を行った。よく知られているノンパラメトリック検定の一つであるとしてMann WithneyのＵ検定を選択したが、とにかくこの検定の結果はWilcoxon順位和検定およびKruskal-Wallis２群検定の双方に相当する。
用いられた統計ソフトウェアはＳＰＳＳｖ１２．０であった。
【０２９２】
結果
異性体４処理による致死性および毒性
表２８および２９は、評点された各日における各Ｃ５７ＢＬ／６マウスの体重と、平均、標準偏差およびメジアンを示す。Mann Withney Ｕ検定で調べたところ、各群間で体重の差異が観察されなかった（ｐ＞０．０５）。
【表４７】
0005616628.tif 000096
【０２９３】
【表４８】
0005616628.tif 000097
【０２９４】
異性体４（Ａ１群）または生理食塩水（Ｂ１群）により処理されたどのマウス群においても死亡または毒性が観察されなかった。全身毒性に用いられた用量が治療用量の全量の５０，０００倍を超えていたことに注目される。
【０２９５】
局所毒性は異性体４（Ｃ１群）またはプラセボ（Ｄ１群）処理マウスで観察されなかった。この研究で局所毒性に用いられた用量が治療用量の標準濃度の５００倍を超えていたことに注目される。
【０２９６】
このように、異性体４はその治療範囲を大きく超えた用量でもマウスにおいて非常に耐えることができる。接種部位の局所毒性は感作されたどのマウスでも観察されない。
【０２９７】
実施例１６
表現型白血球解析
この実施例は、フローサイトメトリーにより、処理マウス間における白血球群パーセンテージの最終的差異を評価する目的で行った。膜タンパク質（ＣＤ１１ＢおよびＬｙ６Ｇ）を前記タンパク質に対する特異的抗体で標識した後、フローサイトメトリーを用いることにより、カウントを行った。ＣＤ１１Ｂ（Ｍａｃ‐１としても知られる）マーカーは単球群で発現され、一方Ｌｙ６Ｇ（ＧＲ‐１としても知られる）は顆粒球群で発現される。両マーカー（ＣＤ１１ＢおよびＬｙ６Ｇ）が好中球群で発現される。このアッセイは、対象者、例えばＡＩＤＳに罹患した患者で免疫応答の賦活を必要とする場合に重要である、特に骨髄細胞系からの白血球群を検定化合物が増加させることを示す。
【０２９８】
材料および方法
研究薬物
無菌生理食塩水中６５μｇ／ｍＬの異性体４（化合物９ｄ）
プラセボ
生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）
【０２９９】
【表４９】
0005616628.tif 000098
【０３００】
装置
層状フラッドフード、フローサイトメーター、アジャスタブルピペット、無菌シリンジ、無菌針、ＥＤＴＡ無菌チューブ、プラスチックチューブ
【０３０１】
試薬
・麻酔溶液
・無菌ＰＢＳ（Sigma,St.Louis,ＭＯ,ＵＳＡ）
・生理食塩水（Grifols,Barcelona,Spain）
・ラット抗マウスＣＤ１１ｂ‐ＰＥ（Beckman Coulter,Fullerton,ＣＡ,ＵＳＡ）
・ラット抗マウスＬｙｓ６Ｇ‐ＦＩＴＣ（Beckman Coulter,Fullerton,ＣＡ,ＵＳＡ）
・Optylise Ｃ（Beckman Coulter,Fullerton,ＣＡ,ＵＳＡ）
【０３０２】
投与の用量、ビヒクル、経路、および容量
用量
０および７日目に投与される２５０ｎｇの用量レベルで異性体４（化合物９ｄ）を試験した。
ビヒクル
異性体４が希釈されるビヒクルは生理食塩水である。
投与経路および容量
処理は腹腔内経路で行った。接種される容量は２００μＬ／動物であった。
【０３０３】
研究デザイン
【表５０】
0005616628.tif 000099
【０３０４】
処理の最終投与後３日目にネズミ血液を採取した。心臓内穿刺で直接それを得た。先に、マウスを筋肉内麻酔した。
血液を前記のモノクローナル抗体と混ぜた。
２０分間のインキュベート後、赤血球群を溶解させるためにOptylise Ｃ溶液をサンプルへ加えた。
最後に、サンプルを１×無菌ＰＢＳで１／２希釈し、フローサイトメトリーにより調べた。
解析される各群のパーセンテージは、各実験群から単一値としておよび平均±ＳＤとして表示した。
【０３０５】
【表５１】
0005616628.tif 000100
【０３０６】
【表５２】
0005616628.tif 000101
【０３０７】
【表５３】
0005616628.tif 000102
【０３０８】
これらの結果によると、化合物９ｄの２回投与（週１回）により処理されたマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ）は、コントロールマウス（生理食塩水）と比較して、末梢血におけるＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６ＧおよびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ陽性細胞の増加を示す。これらの細胞は処理の最終投与後３日目にフローサイトメトリーにより調べた。
【図面の簡単な説明】
【０３０９】
【図１】図１は、腫瘍面積の平均として表示される、プラセボ（Ｐ．Ｓ．）と比較してRenca腫瘍細胞増殖について検定された異性体（１‐４）の阻害効果〔実施例６〕を示したグラフである。
【図２】図２は、腫瘍容積のメジアンとして表示される、プラセボ（Ｐ．Ｓ．）と比較してRenca腫瘍細胞増殖について検定された異性体（１‐４）の阻害効果〔実施例６〕を示したグラフである。
【図３】図３は、腫瘍面積の平均として表示される、プラセボ（Ｐ．Ｓ．）と比較してRenca腫瘍細胞増殖について検定された異性体（１‐４）の阻害効果〔実施例６〕を示したグラフである。
【図４】図４は、腫瘍容積の平均として表示される、プラセボ（Ｐ．Ｓ．）と比較してRenca腫瘍細胞増殖について検定された異性体（１‐４）の阻害効果〔実施例６〕を示したグラフである。
【図１】
0005616628.tif 000121
【図２】
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【図３】
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【図４】
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