(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と配列番号：２９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含んでなる単離された多重特異性抗体であって、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合し、ＶＨとＶＬは共同して対になって、単一の抗原結合ドメインを形成する抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなり、ＶＨとＶＬは共同して対になって、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する単一の抗原結合ドメインを形成し、抗原結合ドメインが、
（ａ）ＬＳＧＤＷＩＨ（配列番号：４８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＶＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤ（配列番号：５１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び
（ｃ）ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：５３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；及び
（ｄ）ＮＩＡＴＤＶＡ（配列番号：５５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦ（配列番号：５６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む多重特異性抗体。
【請求項３】
（ａ）ＶＨが配列番号：３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか；
（ｂ）ＶＬが配列番号：２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、又は
（ｃ）ＶＨが配列番号：３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、且つＶＬが配列番号：２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する
請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＶＨが配列番号：３０のアミノ酸配列を含んでなる請求項２又は３に記載の抗体。
【請求項５】
ＶＬが配列番号：２９のアミノ酸配列を含んでなる請求項２又は３に記載の抗体。
【請求項６】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなり、ＶＨとＶＬは共同して対になって、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する単一の抗原結合ドメインを形成し、抗原結合ドメインが、
（ａ）ＬＳＧＤＷＩＨ（配列番号：４８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＬＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤ（配列番号：５０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び
（ｃ）ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：５３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；及び
（ｄ）ＤＬＡＴＤＶＡ(配列番号：５４)のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦ（配列番号：５６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む多重特異性抗体。
【請求項７】
重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含んでなり、ＶＨとＶＬは共同して対になって、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する単一の抗原結合ドメインを形成し、抗原結合ドメインが、
（ａ）ＬＳＧＤＷＩＨ（配列番号：４８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｂ）ＬＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤ（配列番号：５０）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び
（ｃ）ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：５３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；及び
（ｄ）ＮＩＡＴＤＶＡ（配列番号：５５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｅ）ＳＡＳＦ（配列番号：５６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び
（ｆ）ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む多重特異性抗体。
【請求項８】
配列番号：２８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と配列番号：２７の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含んでなる単離された多重特異性抗体であって、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合し、ＶＨとＶＬは共同して対になって、単一の抗原結合ドメインを形成する抗体。
【請求項９】
配列番号：２８の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と配列番号：２９の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含んでなる単離された多重特異性抗体であって、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合し、ＶＨとＶＬは共同して対になって、単一の抗原結合ドメインを形成する抗体。
【請求項１０】
抗体が完全長ＩｇＧ１抗体である請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
抗体がＡＤＣＣ活性を阻害する請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が腫瘍細胞の成長を阻害する請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体がＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合する請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体がＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体がＥＧＦＲのドメインＩＩＩとＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合する請求項１から１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が１０−６Ｍ未満のＫｄでＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合する請求項１から１５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体が１０−６Ｍ未満のＫｄでＥＧＦＲに結合し、１０−７Ｍ未満のＫｄでＨＥＲ３に結合する請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体がＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の少なくとも一方の生物学的活性を阻害する請求項１から１７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体がＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の両方の生物学的活性を阻害する請求項１から１８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体がＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害する請求項１から１９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体がＴＧＦ-α誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害する請求項１から２０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
抗体がＨＥＲ３へのヘレグリン結合を阻害する請求項１から２１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
抗体がヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化を阻害する請求項１から２２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体がヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化及びＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害する請求項１から２３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含んでなる宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の宿主細胞を、抗体が生産されるように培養することを含んでなる抗体の生産方法。
【請求項２８】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体と細胞傷害性剤を含んでなるイムノコンジュゲート。
【請求項２９】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体と薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的製剤。
【請求項３０】
癌の個体を治療するための医薬において、請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体の有効量を含有してなる医薬。
【請求項３１】
癌が、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３を発現する細胞を含む請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、及び非小細胞肺癌からなる群から選択される請求項３０に記載の医薬。
【請求項３３】
個体におけるＨＥＲレセプターの生物学的活性を阻害するための医薬において、ＨＥＲレセプターの生物学的活性を阻害するための請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体の有効量を含有してなる医薬。
【請求項３４】
医薬として使用するための請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３５】
癌の治療に使用するための請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小細胞肺癌である請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
ＨＥＲレセプターの生物学的活性の阻害に使用するための請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３８】
医薬の製造における請求項１から２４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項３９】
医薬が癌の治療のためのものである請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小細胞肺癌である請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
医薬がＨＥＲレセプターの生物学的活性を阻害するためのものである請求項４０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、その開示の全体が出典明示によりここに援用される２００９年３月２０日に出願された米国仮出願第６１／２１０５６２号の米国特許法１１９条(ｅ)項に基づく優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、少なくとも二の異なるＨＥＲレセプターに対して結合特異性を有する多重特異的抗ＨＥＲ抗体を含む抗ＨＥＲ抗体と、疾病又は疾患を治療するための該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
レセプターチロシンキナーゼのＨＥＲファミリーは、細胞増殖、分化及び生存の重要なメディエーターである。該レセプターファミリーは、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦＲ又はＥｒｂＢ１又はＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２又はｐ１８５ｎｅｕ）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４又はｔｙｒｏ２）を含む４つの区別できるメンバーを含む。
【０００４】
ヒト悪性腫瘍の原因として、ｅｒｂＢ１遺伝子によってコードされるＥＧＦＲが関係付けられている。特にＥＧＲＦの発現の増加は、乳房、膀胱、肺、頭部、頸部及び胃癌並びに膠芽細胞腫で観察されている。増大したＥＧＦＲ発現は、自己分泌刺激経路によるレセプター活性化を生じる、同じ腫瘍細胞によるＥＧＦＲリガンドのトランスフォーミング増殖因子−アルファ(ＴＧＦ-α)の産生増加にしばしば関連している。Baselga及びMendelson Pharmac Ther., 64:127-154 (1994)。ＥＧＦＲ又はそのリガンドＴＧＦ-α及びＥＧＦに対して産生されるモノクローナル抗体は、そのような悪性腫瘍の治療における治療剤として評価されている。例えば、上掲のBaselga及びMendelson；Masui等 Cancer Research, 44:1002-1007(1984)；及びWu等 J. Clin. Invest., 95:1897-1905 (1995)を参照。
【０００５】
ＨＥＲファミリーの第二のメンバーであるｐ１８５ｎｅｕは、元々は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞種由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として同定された。ｎｅｕプロト癌遺伝子の活性化型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域の点突然変異（バリンからグルタミン酸へ）から生じる。ｎｅｕのヒト相同体の増幅は、乳房及び卵巣癌で観察され、乏しい予後と相関している（Slamon等, Science, 235:177-182 (1987)；Slamon等, Science, 244:707-712 (1989)；及び米国特許第４９６８６０３号）。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅のためしばしば見られるが均一にではない）が、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓及び膀胱の癌腫を含む他の癌腫においても観察されている。特に、King等, Science, 229:974 (1985)；Yokota等, Lancet, 1:765-767 (1986)；Fukushige等, Mol Cell Biol., 6:955-958 (1986)；Guerin等, Oncogene Res., 3:21-31 (1988)；Cohen等, Oncogene., 4:81-88(1989)；Yonemura等, Cancer Res., 51:1034 (1991)；Borst等, Gynecol.Oncol., 38:364 (1990)；Weiner等, Cancer Res., 50:421-425 (1990)；Kern等, Cancer Res., 50:5184 (1990)；Park等, Cancer Res., 49:6605 (1989)；Zhau等, Mol. Carcinog., 3:354-357 (1990)；Aasland等, Br. J. Cancer 57:358-363 (1988)；Williams等, Pathobiology, 59:46-52 (1991)；及びMcCann等, Cancer, 65:88-92 (1990)を参照。ＨＥＲ２は前立腺癌で過剰発現されうる（Gu等 Cancer Lett. 99:185-9(1996)；Ross等 Hum. Pathol. 28:827-33(1997)；Ross等 Cancer 79:2162-70(1997)；及びSadasivan等 J. Urol. 150:126-31(1993)）。
【０００６】
ラットｐ１８５ｎｅｕ及びヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が開示されている。Drebinとその同僚は、ラットｎｅｕ遺伝子産物であるｐ１８５ｎｅｕに対する抗体を産生させた。例えば、Drebin等, Cell 41:695-706(1985)；Myers等, Meth. Enzym. 198:277-290(1991)；及び国際公開第９４／２２４７８号を参照。Derbin等, Oncogene 2:273-277(1988)は、ｐｐ１８５ｎｅｕの２つの別個の領域と反応性である抗体の混合物が、ヌードマウス中に移植されたｎｅｕ形質転換ＮＩＨ-３Ｔ３細胞に対して相乗的な抗腫瘍効果を生じることを報告している。また１９９８年１０月２０日発行の米国特許第５８２４３１１号を参照のこと。
【０００７】
Hudziak等, Mol. Cell. Biol. 9(3):1165-1172(1989)には、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳＫ-ＢＲ-３を使用して特徴付けられるＨＥＲ２抗体のパネルの作製が記載されている。抗体への曝露に続いてＳＫ-ＲＢ-３細胞の相対的細胞増殖が、７２時間後の単層のクリスタルバイオレット染色により測定された。このアッセイを使用して、４Ｄ５と呼ばれる抗体で最大の阻害が達成され、これは細胞増殖を５６％阻害した。パネル中の他の抗体は、このアッセイではより少ない度合いで細胞増殖を減少させた。抗体４Ｄ５は、ＴＮＦ-αの細胞傷害性効果に対してＨＥＲ２過剰発現乳腺腫瘍株化細胞を感作させることが更に見出されている。また、１９９７年１０月１４日に発行された米国特許第５６７７１７１号を参照のこと。Hudziak等において検討されたＨＥＲ２抗体は、Fendly等 Cancer Research 50:1550-1558(1990)；Kotts等 In Vitro 26(3):59A(1990)；Sarup等 Growth Regulation 1:72-82(1991)；Shepard等 J. Clin. Immunol. 11(3):117-127(1991)；Kumar等 Mol. Cell. Biol. 11(2):979-986(1991)；Lewis等 Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263(1993)；Pietras等 Oncogene 9:1829-1838(1994)；Vitetta等 Cancer Research 54:5301-5309(1994)；Sliwkowski等 J. Biol. Chem. 269(20):14661-14665(1994)；Scott等 J. Biol. Chem. 266:14300-5(1991)；D'souza等 Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206(1994)；Lewis等 Cancer Research 56:1457-1465(1996)；及びSchaefer等 Oncogene 15:1385-1394(1997)においても更に特徴付けられている。
【０００８】
マウスＨＥＲ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化型（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８、ｒｈｕＭＡｂ ＨＥＲ２、トラスツズマブ又はハーセプチン(登録商標)；米国特許第５８２１３３７号）は、広範な抗癌治療を先に受けたＨＥＲ２過剰発現転移性乳癌を持つ患者において臨床的に活性である（Baselga等, J. Clin. Oncol. 14:737-744(1996)）。トラスツズマブは、腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の治療のために、１９９８年９月２５日、食品医薬品局から販売認可を受けた。
【０００９】
様々な特性を有する他のＨＥＲ２抗体は、Tagliabue等 Int. J. Cancer 47:933-937(1991)；McKenzie等 Oncogene 4:543-548(1989)；Maier等 Cancer Res. 51:5361-5369(1991)；Bacus等 Molecular Carcinogenesis 3:350-362(1990)；Stancovski等 PNAS(USA)88:8691-8695(1991)；Bacus等 Cancer Research 52:2580-2589(1992)；Xu等 Int. J. Cancer 53:401-408(1993)；国際公開第９４／００１３６号；Kasprzyk等 Cancer Research 52:2771-2776(1992)；Hancock等 Cancer Res. 51:4575-4580(1991)；Shawver等 Cancer Res. 54:1367-1373(1994)；Arteaga等 Cancer Res. 54:3758-3765(1994)；Harwerth等 J. Biol. Chem. 267:15160-15167(1992)；米国特許第５７８３１８６号；及びKlapper等 Oncogene 14:2099-2109(1997)に記載されている。
【００１０】
相同性スクリーニングは、２つの他のＨＥＲレセプターファミリーメンバーの同定に至った；ＨＥＲ３（米国特許第５１８３８８４号及び第５４８０９６８号、並びにKraus等 PNAS(USA) 86: 9193-9197(1989)）、及びＨＥＲ４（欧州特許出願第５９９２７４号；Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750(1993)；及びPlowman等, Nature 366: 473-475(1993)）である。これらのレセプターの双方とも、少なくとも幾つかの乳癌細胞株で増加した発現を示す。
【００１１】
ＨＥＲレセプターは一般に細胞内で様々な組合わせで発見され、ヘテロ二量体化は様々なＨＥＲリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Earp等 Breast Cancer Research and Treatment 35:115-132(1995)）。ＥＧＦＲには６つの異なるリガンド；上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)；トランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ-α)、アンフィレグリン、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子(ＨＢ-ＥＧＦ)、ベータセルリン及びエピレグリンが結合する（Groenen等 Growth Factors 11:235-257(1994)）。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヘレグリンタンパク質のファミリーはＨＥＲ３及びＨＥＲ４のリガンドである。ヘレグリンファミリーは、α、β及びγヘレグリン（Holmes等, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第５６４１８６９号；及びSchaefer等 Oncogene 15:1385-1394(1997))；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)、グリア増殖因子(ＣＧＦ)；アセチルコリンレセプター促進活性（ＡＲＩＡ）；及び感覚及び運動神経由来因子(ＳＭＤＦ)を含む。概説については、Groenen等 Growth Factors 11:235-257(1994)；Lemke, G. Molec. &amp; Cell. Neurosci. 7:247-262(1996)及びLee等 Pharm. Rev. 47:51-85(1995)を参照。更に３つのＨＥＲリガンドが同定されている；ＨＥＲ３又はＨＥＲ４の何れかに結合することが報告されているニューレグリン-２(ＮＲＧ-２)（Chang等 Nature 387 509-512(1997)；及びCarraway等 Nature 387:512-516(1997)）；ＨＥＲ４に結合するニューレグリン-３（Zhang等 PNAS(USA)94(18):9562-7(1997)）；及びＨＥＲ４に結合するニューレグリン-４（Harari等 Oncogene 18:2681-89(1999)）。ＨＢ-ＥＧＦ、ベータセルリン及びエピレグリンもまたＨＥＲ４に結合する。
【００１２】
ＥＧＦ及びＴＧＦαはＨＥＲ２に結合しないが、ＥＧＦはＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を刺激してヘテロ二量体を形成し、それがＥＧＦＲを活性化させ、テロ二量体におけるＨＥＲ２のトランスリン酸化を生じる。二量体化及び／又はトランスリン酸化はＨＥＲ２チロシンキナーゼを活性化するように見える。上掲のEarp等を参照。同様に、ＨＥＲ３がＨＥＲ２と共発現される場合、活性シグナル伝達複合体が形成され、ＨＥＲ２に対する抗体はこの複合体を破壊する能力がある（Sliwkowski等, J. Biol. Chem., 269(20):14661-14665(1994)）。加えて、ヘレグリン（ＨＲＧ）に対するＨＥＲ３の親和性は、ＨＥＲ２と共発現される場合に更に高い親和性にまで増大する。また、ＨＥＲ２-ＨＥＲ３タンパク質複合体に関しては、Levi等, Journal of Neuroscience 15:1329-1340(1995)；Morrissey等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1431-1435(1995)；及びLewis等, Cancer Res., 56:1457-1564(1996)を参照。ＨＥＲ３と同様に、ＨＥＲ４はＨＥＲ２と活性なシグナル伝達複合体を形成する（Carraway and Cantley, Cell 78:5-8(1994)）。
【００１３】
ＨＥＲ経路を標的とする治療剤は、乳癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、頭頸部癌及び膵臓癌のような疾患の治療に現在は使用されている。これらの治療剤はある程度の成功を収めているものの、天然及び誘導耐性及び毒性に関した問題が残ったあままである。Arteaga CL. J Clin Oncol 21:289-91s (2003)；Hoshi S等, Gan To Kagaku Ryoho 31:1209-13 (2004)；Viloria-Petit AM,及びKerbel RS. Int J Radiat Oncol Biol Phys 58:914-26 (2004)；Bianco R等, Endocr Relat Cancer 12:S159-71 (2005)；Engelman JA,及びJanne PA., Clin Cancer Res 14:2895-9 (2008)；Davoli A等, Cancer Chemother Pharmacol. 65(4):611-23 (2010)；Pohlmann PR等, Clin Cancer Res. 15(24):7479-7491 (2009)。特に、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）を標的とする治療剤は、有意なレベルの皮膚毒性のように、望ましくない副作用をしばしば伴う。Robert等 Lancet Oncology 6:491-500 (2005)。
従って、ＨＥＲ経路を標的とする改良された治療剤を開発する必要性が存在している。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、（ａ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｂ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、及び（ｃ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４からなる群から選択される少なくとも二つのＨＥＲレセプターに特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体を提供する。抗体はＨＥＲレセプターの少なくとも一つの生物学的活性を阻害する。特定の実施態様では、多重特異性抗体はその標的ＨＥＲレセプターに特異的に結合し、非標的ＨＥＲレセプターには特異的に結合しない。従って、一実施態様では、抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合するが、ＨＥＲ２又はＨＥＲ４には特異的に結合しない。他の実施態様では、抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合するが、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４には特異的に結合しない。他の実施態様では、抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合するが、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３には特異的に結合しない。本発明は標的ＨＥＲレセプターに特異的に結合する単一特異性抗体をまた提供する。
【００１５】
本発明の一態様は、セツキシマブのような伝統的なＥＧＦＲアンタゴニストよりも毒性が少ない、ＥＧＦＲ及び他のＨＥＲレセプターに特異的に結合可能な多重特異性抗体を提供する。一実施態様では、毒性は皮膚科学的毒性である。一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
【００１６】
一態様では、本発明は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体を提供する。一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲアンタゴニストよりも毒性が少ない。一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の少なくとも一方の生物学的活性を阻害する。一実施態様では、抗体はＥＧＦＲへのＥＧＦの結合を阻害する。他の実施態様では、抗体はＴＧＦ-α誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害する。ある実施態様では、抗体は腫瘍細胞増殖を阻害する。一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合するが、ＨＥＲ２又はＨＥＲ４には特異的に結合しない。
【００１７】
一実施態様では、多重特異性抗体は、１０−６Ｍ未満のＫｄでＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、１０−６Ｍ未満のＫｄでＥＧＦＲに特異的に結合し、１０−７Ｍ未満のＫｄでＨＥＲ３に特異的に結合する特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
【００１８】
一実施態様では、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結語する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体は、(ａ)ＬＳＧＤＷＩＨ（配列番号：４８）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；(ｂ)ＶＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤ（配列番号：５１）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び(ｃ) ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：５３）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；及び（ｄ）ＮＩＡＴＤＶＡ（配列番号：５５）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）ＳＡＳＦ（配列番号：５６）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００１９】
一実施態様では、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体は、（ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン；（ｂ）配列番号：２９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン；又は（ｃ）（ａ）の重鎖可変ドメイン配列と（ｂ）の軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体は、配列番号：３０の重鎖可変ドメイン配列を含む。一実施態様では、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体は、配列番号：２９の軽鎖可変ドメイン配列を含む。他の実施態様では、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体は、配列番号：３０の重鎖可変ドメイン配列及び配列番号：２９の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００２０】
一実施態様では、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体は完全長ＩｇＧ１抗体である。
【００２１】
本発明の一態様は、多重特異性ＨＥＲ抗体をコードする単離された核酸を提供する。他の態様は、多重特異性ＨＥＲ抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞を提供する。更に他の態様は、抗体が生産されるように多重特異性ＨＥＲ抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞を培養することを含む多重特異性ＨＥＲ抗体を生産する方法を提供する。
【００２２】
本発明の一態様は、多重特異性ＨＥＲ抗体及び細胞傷害剤を含んでなるイムノコンジュゲートを提供する。他の態様は、多重特異性ＨＥＲ抗体及び薬学的に許容可能な担体を含有する薬学的製剤を提供する。
【００２３】
本発明の一態様は、癌の個体を治療する方法において、多重特異性ＨＥＲ抗の有効量を個体に投与することを含んでなる方法を提供する。
【００２４】
一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体によって治療される癌が、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３を発現する細胞を有する。一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体によって治療される癌が、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小肺細胞癌である。
【００２５】
本発明の他の態様は、個体におけるＨＥＲレセプターの生物学的活性を阻害する方法において、多重特異性ＨＥＲ抗体の有効量を個体に投与することを含む。一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
【００２６】
本発明の一態様は、医薬として使用するための多重特異性ＨＥＲ抗体を提供する。
【００２７】
他の態様は、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小肺細胞癌などの癌の治療に使用するための多重特異性ＨＥＲ抗体を提供する。他の態様は、ＨＥＲレセプターの生物学的活性の阻害に使用するための多重特異性ＨＥＲ抗体を提供する。一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。
【００２８】
本発明の他の態様は、医薬の製造において使用するための多重特異性ＨＥＲ抗体を提供する。該医薬は、一実施態様では、乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、頭頸部癌、メラノーマ、卵巣癌、前立腺癌、又は非小肺細胞癌などの癌を治療するために使用されうる。一実施態様では、該医薬はＨＥＲレセプターの生物学的活性の阻害するためのに使用される。一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施態様では、多重特異性ＨＥＲ抗体はセツキシマブのような伝統的なＥＧＦＲアンタゴニストよりも毒性が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１はＡ４３１異種移植モデルにおける抗ＥＧＦＲ抗体Ｄ１．５による腫瘍増殖の阻害を示す。
【図２】図２は二重特異性を有するクローンの結合特異性を示す。
【図３】図３は二重特異性を有する選択された抗体（抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及び抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２抗体）を使用するＴＧＦ-α誘導ＥＧＦＲリン酸化の阻害を示す。
【図４】図４は抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ抗体がＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃへのヘレグリン結合をブロックすることを示す。
【図５】図５は抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二重特異性結合抗体によるＭＣＦ７細胞におけるＨＲＧ誘導レセプターリン酸化の阻害を示す。
【図６】図６は抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３によるＭＣＦ７細胞の細胞増殖の阻害を示す。
【図７】図７は４Ｄ５−Ｆｖ構造にマッピングされたＤ１．５−１００のホットスポットを示す画像である。
【図８】図８はショットガンライブラリーを使用するＤ１．５−１００ＥＧＦＲ−ＨＥＲ３抗体の親和性成熟のためのストラテジーの概略を示す。
【図９】図９は２つの選択された親和性成熟抗体（ＤＬ７及びＤＬ１１）がＥＧＦＲ及びＨＥＲ３双方に対して特異的であることを示す。
【図１０】図１０Ａは親和性成熟抗体ＤＬ７及びＤＬ１１、及び親抗体Ｄ１．５のＥＧＦＲに対する阻害機能の比較を示す。図１０Ｂは親和性成熟抗体ＤＬ７及びＤＬ１１、及び単一特異性抗ＨＥＲ３抗体ＤＬ３．６のＨＥＲ３トランス活性化に対する阻害機能の比較を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａはペルツズマブ、抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体、又はＤＬ３．６、Ｄ１．５、又はＤ１．５とＤ３．６の組合せと比較したＨ１６６６細胞でのＤＬ１１の増殖阻害機能の比較を示すグラフを提供し、Ｈ１６６６細胞はＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、及びＥＧＦＲリガンドを発現するＮＳＣＬＣ細胞株であり、増殖はＨＲＧで刺激した。
【図１１Ｂ】図１１Ｂはペルツズマブ、抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体、又はＤＬ３．６、Ｄ１．５、又はＤ１．５とＤ３．６の組合せと比較したＨ１６６６細胞でのＤＬ１１の増殖阻害機能の比較を示すグラフを提供し、Ｈ１６６６細胞はＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ、及びＥＧＦＲリガンドを発現するＮＳＣＬＣ細胞株であり、増殖はＨＲＧ及びＴＧＦαで刺激した。
【図１２Ａ】図１２Ａは、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲを発現する結腸直腸癌細胞株であるＨＣＡ−７細胞のＤＬ１１による増殖の阻害を、ｐＭａｂ、抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ抗体と比較して示すグラフを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、細胞増殖がＨＲＧ及びＴＧＦαで刺激されたこと以外は、図１２ＡのようにＨＣＡ−７細胞の増殖の阻害を示すグラフを提供する。
【図１３】図１３は、ＨＥＲ２を過剰発現し正常レベルのＨＥＲ及びＥＧＦＲを有するＣａｌｕ−３細胞の増殖の阻害を示す。細胞増殖はＨＲＧで刺激し、抗体は用量依存的様式で検査した。
【図１４】図１４はＤ１．５−２０１の親和性成熟のためのソーティングストラテジーの概略を示す。
【図１５】図１５はＤＬ１１、ＤＬ１１ｂ及びＤＬ１１ｆによるＭＤＡ−１７５細胞増殖の阻害を示す。
【図１６】図１６は、ＤＬ１１ｆがヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化及びＴＧＦα誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害することを示す。
【図１７】図１７はＨＣＡ−７腫瘍移植モデルでのＤＬ１１及びＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示す。
【図１８】図１８はＨ３５８ ＮＳＣＬＣ異種移植モデルでのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示す。
【図１９】図１９はＤＬ３−１１ｂ、ＤＬ３．６ｂ、及びＤＬ３．６によるＨＲＧ誘導ＨＥＲ３リン酸化の阻害を示す。
【図２０】図２０はＤＬ３−１１ｂ、ＤＬ３．６ｂ、及びＤＬ３．６によるＭＤＡ−１７５細胞増殖の阻害。
【図２１】図２１はＦａＤｕ癌モデルでのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。
【図２２】図２２はＢｘＰＣ３脾臓癌でのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。
【図２３】図２３はＣａｌｕ−３非小細胞肺癌でのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。
【図２４】図２４はＡ４３１表皮癌でのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。
【図２５】図２５はＭＡＸＦ４４乳癌モデルでのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。
【図２６】図２６はＤＵ１４５前立腺癌モデルでのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。
【図２７】図２７はＯＶＸＦ５５０卵巣癌モデルでのＤＬ１１ｆによる腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。
【図２８】図２８は幾つかの細胞株でＤＬ１１ｆがＡＤＣＣを誘導することを示す。
【図２９】図２９はＤＬ１１ｆ−Ｎ２９７ＡがＡＤＣＣ活性を欠くことを示す。
【図３０】図３０はＨ２９２ ＮＳＣＬＣ癌モデルでのＤＬ１１ｆ及びＤＬ１１ｆ−Ｎ２９７Ａによる腫瘍増殖の阻害を示す。
【図３１Ａ】図３１ＡはＥＧＦＲアンタゴニスト治療法に対する観察された非臨床及び臨床毒性に関する情報を提供する表である。
【図３１Ｂ】図３１ＢはＥＧＦＲアンタゴニスト治療法に対する観察された非臨床及び臨床毒性に関する情報を提供する表である。
【図３１Ｃ】図３１ＣはＥＧＦＲアンタゴニスト治療法に対する観察された非臨床及び臨床毒性に関する情報を提供する表である。
【図３２】図３２は発疹／落屑及び挫瘡／挫瘡様発疹に対するグレード付けに関する情報を提供する表である。
【図３３Ａ】図３３はカバット番号付けを用いた幾つかの抗ＨＥＲ抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸アラインメントを提供する。図３３Ａは以下の抗体の軽鎖可変ドメインを示す：Ｄ１（配列番号：５８）；Ｄ１．５（配列番号：２４）；Ｄ１．５−１００（配列番号：４０）；ＤＬ１１（配列番号：２７）；ＤＬ１１ｂ（配列番号：２９）；ＤＬ１１ｆ（配列番号：２９）。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは以下の抗体の重鎖可変ドメインを示す：Ｄ１（配列番号：２５）；Ｄ１．５（配列番号：２５）；Ｄ１．５−１００（配列番号：２５）；ＤＬ１１（配列番号：２８）；ＤＬ１１ｂ（配列番号：２８）；ＤＬ１１ｆ（配列番号：３０）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
他に定義されていない限り、ここで使用される全ての技術専門用語、表記及び他の科学的用語は、この発明に関連する当業者に共通して理解される意味を持つものである。幾つかの場合には、共通して理解される意味を持つ用語を明確化のため及び／又は参照を容易にするためにここで定義するが、ここにそのような定義を含めることが、当該分野で一般的に理解されることに対して実質的な差異を表すものと必ずしも解釈されるものではない。ここに記載され又は参照される技術及び手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当業者による一般的な方法論を用いて通常行われるものである。適切ならば、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、製造者が定めたプロトコール及び／又はパラメータに従って一般的に実施される。
【００３１】
従って、本方法、キット及び用途を記載する前に、本発明が、記載されたような特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物の種又は属、コンストラクト、及び試薬に限定されず、当然変わりうることが理解されなければならない。ここで使用される専門用語は、特定の実施態様を記載する目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の定義を意味しないならば、複数の指示対象も含む。
本明細書及び特許請求の範囲を通して、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」なる語、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形語は、記載された整数又は整数群を含むことを意味するが、如何なる他の整数又は整数群も除外するものではないことが理解されるであろう。
【００３３】
ここでの「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片を包含する。「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特にポリエピトープ特異性を有する（つまり、一生物学的分子にある二以上の異なるエピトープに特異的に結合しうる、又は二以上の異なる生物学的分子にあるエピトープに特異的に結合しうる）抗原結合ドメインを含んでなる抗体を包含する。抗原結合ドメインの一具体例は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ)からなるＶＨＶＬユニットである。このような多重特異性抗体は、完全長抗体、二以上のＶＬ及びＶＨドメインを有する抗原、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（diabodies）、二重特異性ダイアボディ及びトライアボディ（triabodies）、共有結合又は非共有結合した抗体断片を含むが、これらに限定されない。「二重特異性抗体」は、一つの生物学的分子にある２つの異なるエピトープに特異的に結合できるか、又は２つの異なる生物学的分子にあるエピトープに特異的に結合できる抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体である。二重特異性抗体はまた「二重特異性」を有するか、又は「二重特異的」であるとも称される。
【００３４】
ある実施態様では、本発明の抗体は、その標的ＨＥＲ又はＨＥＲｓに対して≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有している。
【００３５】
基本的な４-鎖抗体ユニットは２つの同一の軽(Ｌ)鎖と２つの同一の重(Ｈ)鎖から構成されるヘテロ四量体の糖タンパクである(ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と称される付加的なポリペプチドの５つからなり、よって１０の抗原結合部位を有するが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、基本的４-鎖ユニットとそれ付随するＪ鎖のうち２-５つを含む多価集合を形成可能である)。ＩｇＧの場合、４-鎖ユニットは一般的に約１５００００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合するが、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに結合している。それぞれのＨ及びＬ鎖はまた規則的な間隔を持った鎖内ジスルフィド結合を持つ。それぞれのＨ鎖は、α及びγ鎖の各々に対しては３つの定常ドメイン(ＣＨ)が、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)をＮ末端に有する。それぞれのＬ鎖は、その他端に定常ドメイン(ＣＬ)が続く可変ドメイン(ＶＬ)をＮ末端に有する。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)と整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。ＶＬとＶＨは共同して対になって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性は、例えばBasic and Clinical Immunology, ８版, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow(編), Appleton ＆ Lange, Norwalk, CT, 1994, ７１頁及び６章を参照のこと。
【００３６】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に区別される型の一つを割り当てることができる。また、その重鎖の定常ドメイン(ＣＨ)のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには異なったクラス又はアイソタイプを割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる重鎖を有する。さらにγ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能等の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えば、ヒトにおいては次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２が発現する。
【００３７】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なることを意味する。Ｖドメインは抗原結合性を媒介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定める。しかし、可変性は可変ドメインの１１０-アミノ酸スパンを通して均等には分布されていない。代わりに、Ｖ領域は、「高頻度可変領域」又はＨＶＲと称される極度の可変性を有するより短い領域によって分離された１５−３０アミノ酸のフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる比較的不変の伸展からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々は、大きなβ-シート配置をとり、３つの高頻度可変領域により接続された４つのＦＲ領域を含み、それはループ状の接続を形成し、β-シート構造の一部を形成することもある。各鎖の高頻度可変領域はＦＲにより他の鎖からの高頻度可変領域とともに極近傍に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ED. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係ないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害(ＡＤＣＣ)における抗体の寄与を示す。
【００３８】
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含む；つまり、ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲの最大の多様性を示し、特にＨ３は抗体に微細な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられている。例えばXuら, Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu, Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。確かに、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ抗体は軽鎖の不存在下で機能的で安定である。例えば、Hamers-Castermanら, Nature 363:446-448 (1993)及びSheriffら, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。
【００３９】
ＨＶＲは高頻度可変ループ及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を一般に含み、後者は最も高い配列多様性であり、及び／又は抗原認識に関与する。多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに包含される。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列多様性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している（Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ ＨＶＲは、カバットＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の解析に基づく。これらのＨＶＲｓのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループ  カバット   AbM        Chothia      接触
----     -----       ---         -------        -------
L1     L24-L34     L24-L34     L26-L32      L30-L36
L2     L50-L56     L50-L56     L50-L52      L46-L55
L3     L89-L97     L89-L97     L91-L96      L89-L96
H1     H31-H35B    H26-H35B    H26-H32      H30-H35B
(Kabat番号付け)
H1     H31-H35     H26-H35     H26-H32      H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2     H50-H65     H50-H58     H53-H55      H47-H58
H3     H95-H102    H95-H102    H96-H101     H93-H101
【００４０】
ＨＶＲは次の通り「伸展ＨＶＲ」を含みうる：ＶＬ中の２４-３６又は２４-３４（Ｌ１）、４６-５６又は５０-５６（Ｌ２）及び８９-９７又は８９-９６（Ｌ３）と、ＶＨ中の２６-３５（Ｈ１）、５０-６５又は４９-６５（Ｈ２）及び９３-１０２、９４-１０２又は９５-１０２（Ｈ３）。これらの伸展ＨＶＲの定義の各々に対して上掲のKabat等に従って、可変ドメイン残基は番号付けされる。
【００４１】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここに定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００４２】
「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる表現は、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列と抗体配列の相同領域でアライメントすることによって、与えられた抗体について決定されうる。
【００４３】
可変ドメイン（およそ軽鎖の残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）中の残基に言及するとき、カバットの番号付けシステムが一般に使用される(例えばKabat等, Sequences of Immunological Interest. 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基に言及するとき、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」が一般に使用される（例えば上掲のＫａｂａｔ等に報告されているＥＵインデックス）。「カバットにおけるようなＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを意味する。ここで別の定義を述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基番号の参照は、カバット番号付けシステムによる残基番号付けを意味する。ここで別の定義を述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基番号の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する（例えば、ＰＣＴ公開第２００６／０７３９４１号を参照）。
【００４４】
「親和性」は、分子(例えば抗体)の単一の結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有相互作用の合計の強度を意味する。特に示さない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、会合定数（Ｋａ）の逆数である解離定数(Ｋｄ)により表すことができる。親和性は、ここに開示されたものを含む、当該分野で知られている一般的な方法により測定することができる。
【００４５】
「親和性成熟」抗体は、その一又は複数のＨＶＲ又はそのフレームワーク領域に一又は複数の変更を有するものであって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が改善される。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の又は更にはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当該分野において既知の方法により生産される。Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992)は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を記載している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas等, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００４６】
抗体の「クラス」はその重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを意味する。５つの主要な抗体のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４７】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、一般的に少量で存在しうる突然変異などの、モノクローナル抗体の生成中に生じる可能性のある突然変異体を除いて、集団を含む個々の抗体が、同一及び／又は同じエピトープに結合する。このようなモノクローナル抗体には典型的には、標的を結合するポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれ、この標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含む方法によって入手されたものである。例えば、選別方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組み換えＤＮＡクローンのプールなどの複数のクローンからの特定のクローンの選別でもよい。選別した標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養物内での産生を改善するため、インビボの免疫原性を低減するため、多特異性抗体を作製するなどのためにさらに変更することができること、並びに変更した標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調整物は、典型的に他のイムノグロブリンが混入することがない点で有利である。「モノクローナル」との修飾詞は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の性質を示すものであり、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において用いられるモノクローナル抗体は、様々な技術、例えばハイブリドーマ法(例えばKohler 等, Nature, 256:495 (1975)；Harlow 等, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)；Hammerling 等, : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)、組み換えＤＮＡ法(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)、ファージディスプレイ技術(例えばClackson 等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks 等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu 等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee 等, J.Mol.Biol.340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee 等 J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)を参照)、及び一部ないしはすべてのヒトイムノグロブリン遺伝子座又はヒトイムノグロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物からヒトないしはヒト様抗体を生成するための技術(例えば、国際公開第９８／２４８９３号、同第９６／３４０９６号、同第９６／３３７３５号、及び同第９１／１０７４１号、Jakobovits 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits 等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann 等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５５５９１６６９号(すべてGenPharm)；同第５５４５８０７号；国際公開第９７／１７８５２号、米国特許第５５４５８０７号；同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；及び同第５６６１０１６号、及びMarks 等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Lonberg 等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild 等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995))によって作製してもよい。
【００４８】
「インタクト」な抗体は、抗原-結合部位、並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそれらのアミノ酸配列変異体であってよい。好ましくは、インタクトな抗体は一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００４９】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)を参照）；単鎖抗体分子(例えばscFv)を含む。本発明において、明細書の全体を通じて、同じ開示が機能的抗体断片、例えば二重作用Ｆａｂ断片にも当てはまる。
【００５０】
「線状抗体」との表現は、Zapata等(1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)に記載の抗体を一般に意味する。これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対の直列のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。好ましい実施態様では、断片は「機能的」である、つまり標的ＨＥＲレセプターに結合する対応するインタクトな抗体の能力を定性的に保持し、インタクトな抗体はＨＥＲ活〜性化又は機能をまた阻害するならば、そのような疎外特性をまた定性的に保持する。定性的な保持とは、同じ種の活性が保持されるが、結合親和性及び／又は活性の度合いは異なるかも知れないことを意味する。
【００５１】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して命名された残りの「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は全長Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域ドメイン(ＶＨ)、及び一つの重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)からなる。各Ｆａｂ断片は抗原結合性に関して一価である、すなわち単一の抗原-結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、単一の大きなＦ(ａｂ')２断片が生じ、これは２価の抗原結合部位を持つ２つのジスルフィド結合されたＦａｂ断片にほぼ対応し、抗原を交差結合させることができるものである。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここでは定常ドメインのシステイン残基(類)が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、通常はＦａｂ'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００５２】
Ｆｃ断片はジスルフィドにより一緒に保持されている双方のＨ鎖のカルボキシ末端部位を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列により決定され、その領域は、所定の型の細胞に見出されるＦｃレセプター(ＦｃＲ)によって認識される部位である。
【００５３】
「Ｆｖ」は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。これら２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの高頻度可変ループ(Ｈ及びＬ鎖から、それぞれ３つのループ)が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００５４】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；Borrebaeck 1995, 参照のこと。
【００５５】
「ダイアボディ(diabodies)」という用語は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に、短いリンカー(約５-１０残基)を持つｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００５６】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、５０％又はそれ以上で、参照抗体の抗原への結合を遮断する抗体を意味し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、５０％又はそれ以上で、該抗体が抗原に結合するのを遮断する。
【００５７】
「キメラ化」抗体なる用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来する一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を意味する。
【００５８】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞から生産され、又はヒト抗体レパートリー又は他のヒト抗体コード配列を活用する非ヒト供給源から得られた抗体のものに対応するアミノ酸配列を有しているものである。ヒト抗体のこの定義は非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体は特に除外する。
【００５９】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。一般に、配列のサブグループは、Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、サブグループはKabat等におけるサブグループκＩである。一実施態様では、ＶＨについて、サブグループは上掲のKabat等におけるサブグループＩＩＩである。
【００６０】
非ヒト（例えば齧歯類）抗体の「ヒト化」型とは、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの変更は、抗体の性能を更に洗練させるために行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる（Jones等 Nature、321:522-525(1986)；Riechmann等 Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596(1992)）。
【００６１】
対象の抗原に「結合する」この発明の抗体は、当該抗原を発現する細胞又は組織を標的とする上で、抗体が診断及び／又は治療剤として有用であるように十分な親和性をもって抗原に結合するものである。標的分子への抗体の結合に関して、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープ「(に対する)特異的結合」、「に特異的に結合する」又は「に特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、コントロール分子の結合と比較したある分子の結合を決定することにより測定することができる。例えば、特異的結合は、標的と類似のコントロール分子との競合、例えば、過剰の非標識標的により定量することができる。この場合、標識した標的のプローブに対する結合が、過剰の非標識標的により競合的に阻害されると、特異的結合が示される。特定の一実施態様では、「特異的に結合する」は、他の特定された非標的ＨＥＲレセプターではなくその特定された標的ＨＥＲレセプターへの抗体の結合を意味する。例えば、抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合するが、ＨＥＲ２又はＨＥＲ４に特異的には結合せず、又は抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合するが、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４に特異的には結合せず、又は抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合するが、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３に特異的には結合しない。
【００６２】
「ＨＥＲレセプター」は、ＨＥＲレセプターファミリーに属するレセプタープロテインチロシンキナーゼであり、ＥＧＲＦ（ＥｒｂＢ１，ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）レセプターを含む。ＨＥＲレセプターは、ＨＥＲリガンドと結合し、及び／又は他のＨＥＲレセプター分子と二量体化しうる細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存された細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化されうる幾つかのチロシン残基を内部に有するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを一般に含む。ＨＥＲレセプターは「天然配列」ＨＥＲレセプター又はその「アミノ酸配列変異体」でありうる。好ましくは、ＨＥＲレセプターは天然配列ヒトＨＥＲレセプターである。
【００６３】
「ＨＥＲ経路」はＨＥＲレセプターファミリーによって媒介されるシグナル伝達ネットワークを意味する。
【００６４】
「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」「上皮増殖因子レセプター」及び「ＥＧＦＲ」という用語は、ここでは互換的に使用され、例えばCarpenter等, Ann. Rev. Biochem. 56:881-914(1987)に開示されているＥＧＦＲを意味し、その天然に生じる突然変異体（例えば、Ullrich等, Nature (1984) 309:418425 及びHumphrey等, PNAS(USA) 87:4207-4211(1990)に記載されているような欠失変異体ＥＧＦＲ）、並びにその変異体、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩを含む。ＥＧＦＲの変異体はまた欠失、置換及び挿入変異体、例えばLynch等（New England Journal of Medicine 2004, 350:2129）、Paez等（Science 2004, 304:1497）、及び Pao等（NAS 2004, 101:13306）に記載されているものを含む。
【００６５】
ここでは、「ＥＧＦＲ細胞外ドメイン」又は「ＥＧＦＲ ＥＣＤ」は、細胞の外にあるＥＧＦＲのドメインを意味し、細胞膜に固定されるかもしくは循環し、その断片を含む。一実施態様では、ＥＧＦＲの細胞外ドメインは４つのドメイン：「ドメインＩ」（約１−１５８からのアミノ酸残基）、「ドメインＩＩ」（アミノ酸残基１５９−３３６）、「ドメインＩＩＩ」（アミノ酸残基３３７−４７０）、及び「ドメインＩＶ」（アミノ酸残基４７１−６４５）を含み得、ここで、境界はおおよそであり、約１−３のアミノ酸だけ変わりうる。
【００６６】
「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」なる表現は、ここで互換的に使用され、例えばSemba等, PNAS(USA)82:6497-6501(1985)及びYamamoto等, Nature 319:230-234(1986)（Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号Ｘ０３３６３）に記載されているヒトＨＥＲ２タンパク質を意味する。「ｅｒｂＢ２」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２をコードする遺伝子を意味し、「ｎｅｕ」はラットｐ１８５ｎｅｕをコードする遺伝子を意味する。好ましくは、ＨＥＲ２は天然配列ヒトＨＥＲ２である。
【００６７】
ここでは、「ＨＥＲ２細胞外ドメイン」又は「ＨＥＲ２ ＥＣＤ」は、細胞の外にあるＨＥＲ２のドメインを意味し、細胞膜に固定されるかもしくは循環し、その断片を含む。一実施態様では、ＨＥＲ２の細胞外ドメインは４つのドメイン：「ドメインＩ」（約１−１９５からのアミノ酸残基）、「ドメインＩＩ」（約１９６−３１９からのアミノ酸残基）、「ドメインＩＩＩ」（約３２０−４８８からのアミノ酸残基）、及び「ドメインＩＶ」（約４８９−６３０からのアミノ酸残基）（シグナルペプチドを除く残基番号付け）を含みうる。Garrett等 Mol. Cell.. 11: 495-505 (2003), Cho等 Nature 421: 756-760 (2003), Franklin等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)、及びPlowman等 Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993)を参照のこと。
【００６８】
「ＥＲｒＢ３」及び「ＨＥＲ３」は、例えば米国特許第５１８３８８４号及び第５４８０９６８号並びにKraus 等 PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)に開示されているレセプターポリペプチドを意味する。
ここで、「ＨＥＲ３細胞外ドメイン」又は「ＨＥＲ３ＥＣＤ」は、細胞の外にあるＨＥＲ３の細胞外ドメインを意味し、細胞膜に固定されるかもしくは循環し、その断片を含む。一実施態様では、ＨＥＲ３の細胞外ドメインは４つのドメイン：ドメインＩ、ドメインＩＩ、ドメインＩＩＩ、及びドメインＩＶを含みうる。一実施態様では、ＨＥＲ３ＥＣＤはアミノ酸１−６３６を含む（シグナルペプチドを含む番号付け）。一実施態様では、ＨＥＲ３ドメインＩＩＩはアミノ酸３２８−５３２を含む（シグナルペプチドを含む番号付け）。
【００６９】
ここでの「ＥｒｂＢ４」及び「ＨＥＲ４」なる用語は、例えば、欧州特許出願公開第５９９２７４号；Plowman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750(1993)；及びPlowman等, Nature 366:473-475(1993)に開示されたレセプターポリペプチドを意味し、例えば１９９９年４月２２日公開の国際公開第９９／１９４８８号に開示されているそのアイソフォームを含む。
【００７０】
「ＨＥＲリガンド」とは、ＨＥＲレセプターに結合し、及び／又は活性化するポリペプチドを意味する。ここで特に対象とするＨＥＲリガンドは、例えば上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)(Savage等, J. Biol. Chem. 247:7612-76721(1972))；トランスフォーミング増殖因子-α(ＴＧＦ-α)(Marquardt等, Science 223:1079-1082 (1984))；シュワン細胞腫由来増殖因子又はケラチノサイト自己分泌増殖因子としても知られているアンフィレグリン(Shoyab等, Science 243:1074-1076(1989)；Kimura等, Nature 348:257-260(1990)；及びCook等, Mol. Cell. Biol. 11:2547-2557(1991))；ベーターセルリン(Shing等, Science 259:1604-1607(1993)；及びSasada等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 190:1173(1993))；ヘパリン結合上皮細胞成長因子(ＨＢ-ＥＧＦ)(Higashiyama等, Science 251:936-939(1991))；エピレグリン(Toyoda等, J. Biol. Chem. 270: 7495-7500(1995)；及びKomurasaki等, Oncogene 15:2841-2848(1997))；ヘレグリン(以下参照)；ニューレグリン-２(ＮＲＧ-２)(Carraway等, Nature 387: 512-516(1997))；ニューレグリン-３(ＮＲＧ-３)(Zhang等, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 9562-9567(1997))；及びニューレグリン-４(ＮＲＧ-４)(Harari等 Oncogene 18:2681-89(1999))又はクリプト(ＣＲ-１)(Kannan等 J. Biol. Chem. 272(6):3330-3335(1997))のような天然配列ヒトＨＥＲリガンドである。ＥＧＦＲに結合するＨＥＲリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦ-α、アンフィレグリン、ベータセルリン、ＨＢ-ＥＧＦ及びエピレグリンを含む。ＨＥＲ３に結合するＨＥＲリガンドは、ヘレグリン及びＮＲＧ-２を含む。ＨＥＲ４に結合可能なＨＥＲリガンドはベータセルリン、エピレグリン、ＨＢ-ＥＧＦ、ＮＲＧ-２、ＮＲＧ-３、ＮＲＧ-４、及びヘレグリンを含む。
【００７１】
ここで使用される「ヘレグリン」(ＨＲＧ)は、米国特許第５６４１８６９号又はMarchionni等, Nature, 362:312-318(1993)に開示されているようなヘレグリン遺伝子産物にコードされるポリペプチドにを意味する。ヘレグリンの例は、ヘレグリン-α、ヘレグリン-β１、ヘレグリン-β２、及びヘレグリン-β３（Holmes等, Science, 256:1205-1210(1992)；米国特許第５６４１８６９号）；ｎｅｕ分化因子(ＮＤＦ)（Peles等, Cell 69:205-216(1992)）；アセチルコリンレセプター誘発活性(ＡＲＩＡ)（Falls等, Cell, 72:801-815(1993)）；グリア細胞増殖因子(ＧＧＦ)（Marchionni等, Nature, 362:312-318(1993)）；感覚及び運動神経由来因子(ＳＭＤＦ)（Ho等, J. Biol. Chem. 270:14523-14532(1995)）；γ-ヘレグリン（Schaefer等, Oncogene 15:1385-1394(1997)）含む。
【００７２】
ここでの「ＨＥＲ二量体」は、少なくとも２つのＨＥＲレセプターを含んでなる非共有結合的に結合する二量体である。このような複合体は、２以上のＨＥＲレセプターを発現する細胞がＨＥＲリガンドに曝される場合に形成され得、免疫沈降によって単離され、例えばSliwkowski 等, J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)に記載のようにＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析されうる。サイトカインレセプターサブユニット(例えばｇｐ１３０)などの他のタンパク質は該二量体と結合されうる。
【００７３】
ここでの「ＨＥＲヘテロ二量体」は、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ-ＨＥＲ４、ＨＥＲ２-ＨＥＲ３又はＨＥＲ２-ＨＥＲ４ヘテロ二量体のような少なくとも２つの異なるＨＥＲレセプターを含んでなる非共有結合的に結合するヘテロ二量体である。
【００７４】
「ＨＥＲ阻害剤」は、ＨＥＲ活性化又は機能を妨げる薬剤である。ＨＥＲ阻害剤の例としては、ＨＥＲ抗体（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４抗体）；ＥＧＦＲ標的薬；小分子ＨＥＲアンタゴニスト；ＨＥＲチロシンキナーゼ阻害剤；ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６等のＨＥＲ２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ阻害剤；アンチセンス分子（例えば国際公開第２００４／８７２０７号参照）；及び／又は、ＭＡＲＫ又はＡｋｔ等の下流のシグナル伝達分子に結合するか、又はこれらの機能を妨害する薬剤が含まれる。好ましくは、該ＨＥＲ阻害剤は、ＨＥＲレセプターに結合する抗体である。
【００７５】
「ＨＥＲ二量体化阻害剤」又は「ＨＤＩ」は、ＨＥＲホモ二量体又はＨＥＲヘテロ二量体の形成を阻害する薬剤である。好ましくは、ＨＥＲ二量体化阻害剤は抗体である。しかしながら、ＨＥＲ二量体化阻害剤は、ＨＥＲホモ又はヘテロ二量体の形成を阻害するペプチド及び非ペプチド小分子、及び他の化学物質もまた含む。
【００７６】
「ＨＥＲ二量体化を阻害する」抗体は、根底にある機序にかかわらず、ＨＥＲ二量体の形成を阻害するか又は妨害する抗体である。一実施態様では、このような抗体は、ＨＥＲ２のそのヘテロ二量体結合部位に結合する。二量体化阻害抗体の特定の一例は、ペルツズマブ（Ｐｍａｂ）又はＭＡｂ ２Ｃ４である。ＨＥＲ二量体化阻害剤の他の例は、ＥＧＦＲに結合し一又は複数の他のＨＥＲレセプターとのその二量体化を阻害する抗体（例えば、活性化された又は「非テザー」ＥＧＦＲに結合するＥＧＦＲモノクローナル抗体８０６、ＭＡｂ８０６；John等 J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)を参照）；ＨＥＲ３に結合し一又は複数の他のＨＥＲレセプターとの二量体化を阻害する抗体；ＨＥＲ４に結合し一又は複数の他のＨＥＲレセプターとの二量体化を阻害する抗体；ペプチド二量体化阻害剤（米国特許第６４１７１６８号）；アンチセンス二量体化阻害剤等である。
【００７７】
ここで使用される場合、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」又は「ＥＧＦＲ阻害剤」は、ＥＧＦＲに特異的に結合し、そのシグナル伝達活性を妨げるか又は減少させ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４に特異的には結合しない化合物を意味する。このような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体及び小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４９４３５３３号，Mendelsohn等を参照）及びその変異体、例えばキメラ化２２５（Ｃ２２５又はセツキシマブ；ＥＲＢＩＴＵＸ(登録商標)）及び再形成ヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公開第９６／４０２１０号, Imclone Systems Inc.を参照）；ＩＭＣ−１１Ｆ８，完全ヒトＥＧＦＲ標的抗体 (Imclone)；タイプＩＩ変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５２１２２９０号）；米国特許第５８９１９９６号に記載されているようなＥＧＦＲに結合するヒト化及びキメラ化抗体；及びＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えばＡＢＸ−ＥＧＦ又はパニツムマブ（国際公開第９８／５０４３３，Abgenix/Amgenを参照）；ＥＭＤ５５９００（Stragliotto等 Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)）；ＥＭＤ７２００（マツズマブ），ＥＧＦＲ結合についてＥＧＦ及びＴＧＦ-α双方と競合するＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ（EMD/Merck）；ヒトＥＧＦＲ抗体，ＨｕＭａｘ−ＥＧＦＲ（GenMab）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３及びＥ７．６．３として知られ、米国特許第６２３５８８３号に記載されている完全なヒト抗体；ＭＤＸ−４４７（Medarex Inc）；及びｍＡｂ８０６又はヒト化ｍＡｂ８０６（Johns等, J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)）を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は細胞傷害剤とコンジュゲートされ得、よってイムノコンジュゲートを生じる（例えば、欧州特許出願公開第６５９４３９Ａ２号, Merck Patent GmbHを参照）。ＥＧＦＲアンタゴニストは小分子、例えば米国特許第５６１６５８２号、同第５４５７１０５号、同第５４７５００１号、同第５６５４３０７号、同第５６７９６８３号、同第６０８４０９５号、同第６２６５４１０号、同第６４５５５３４号、同第６５２１６２０号、同第６５９６７２６号、同第６７１３４８４号、同第５７７０５９９号、同第６１４０３３２号、同第５８６６５７２号、同第６３９９６０２号、同第６３４４４５９号、同第６６０２８６３号、同第６３９１８７４号、同第６３４４４５５号、同第５７６００４１号、同第６００２００８号、及び同第５７４７４９８、並びに次のＰＣＴ公報：国際公開第９８／１４４５１号、国際公開第９８／５００３８号、国際公開第９９／０９０１６号、及び国際公開第９９／２４０３７号に記載されている化合物を含む。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＯＳＩ-７７４(ＣＰ-３５８７７４、エルロチニブ，タルセバ(登録商標)Genentech/OSI Pharmaceuticals)；ＰＤ １８３８０５(ＣＩ １０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３-(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]-，二塩酸塩，Pfizer Inc.)；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（IRESSA(登録商標)）４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)キナゾリン, AstraZeneca)；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン、Zeneca)；ＢＩＢＸ-１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン，Boehringer Ingelheim)；ＰＫＩ-１６６（(Ｒ)-４-[４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール）；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ-３８７７８５（Ｎ-[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチナミド）；ＥＫＢ-５６９（Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キノリニル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテナミド）(Wyeth)；ＡＧ１４７８(Sugen)；及びＡＧ１５７１(SU 5271; Sugen)を含む。
【００７８】
「ＨＥＲ抗体」は、ＨＥＲレセプターに結合する抗体である。場合によっては、該ＨＥＲ抗体はＨＥＲ活性化又は機能を更に妨害する。特定のＨＥＲ２抗体はペルツズマブ及びトラスツズマブを含む。特定のＥＧＦＲの例はセツキシマブ及びパニツムマブを含む。
【００７９】
ＨＥＲ抗体に関連した特許公報は、米国特許第５６７７１７１号、米国特許第５７２０９３７号、米国特許第５７２０９５４号、米国特許第５７２５８５６号、米国特許第５７７０１９５号、米国特許第５７７２９９７号、米国特許第６１６５４６４号、米国特許第６３８７３７１号、米国特許第６３９９０６３号、米国特許出願公開第２００２／０１９２２１１Ａ１号、米国特許第６０１５５６７号、米国特許第６３３３１６９号、米国特許第４９６８６０３号、米国特許第５８２１３３７号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第６４０７２１３号、米国特許第６７１９９７１号、米国特許第６８００７３８号、米国特許出願公開第２００４／０２３６０７８Ａ１号、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第６２６７９５８号、米国特許第６６８５９４０号、米国特許第６８２１５１５号、国際公開第９８／１７７９７号、米国特許第６３３３３９８号、米国特許第６７９７８１４号、米国特許第６３３９１４２号、米国特許第６４１７３３５号、米国特許第６４８９４４７号、国際公開第９９／３１１４０号、米国特許出願公開第２００３／０１４７８８４Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１７０２３４Ａ１号、米国特許出願公開第２００５／０００２９２８Ａ１号、米国特許第６５７３０４３号、米国特許出願公開第２００３／０１５２９８７Ａ１号、国際公開第９９／４８５２７号、米国特許出願公開第２００２／０１４１９９３Ａ１号、国際公開第０１／００２４５号、米国特許出願公開第２００３／００８６９２４号、米国特許出願公開第２００４／００１３６６７Ａ１号、国際公開第００／６９４６０号、国際公開第０１／００２３８号、国際公開第０１／１５７３０号、米国特許第６６２７１９６Ｂ１号、米国特許第６６３２９７９Ｂ１号、国際公開第０１／００２４４号、米国特許出願公開第２００２／００９０６６２Ａ１号、国際公開第０１／８９５６６号、米国特許出願公開第２００２／００６４７８５号、米国特許出願公開第２００３／０１３４３４４号、国際公開第０４／２４８６６号、米国特許出願公開第２００４／００８２０４７号、米国特許出願公開第２００３／０１７５８４５Ａ１号、国際公開第０３／０８７１３１号、米国特許出願公開第２００３／０２２８６６３号、国際公開第２００４／００８０９９Ａ２号、米国特許出願公開第２００４／０１０６１６１号、国際公開第２００４／０４８５２５号、米国特許出願公開第２００４／０２５８６８５Ａ１号、米国特許第５９８５５５３号、米国特許第５７４７２６１号、米国特許第４９３５３４１号、米国特許第５４０１６３８号、米国特許第５６０４１０７号、国際公開第８７／０７６４６号、国際公開第８９／１０４１２号、国際公開第９１／０５２６４号、欧州特許出願第４１２１１６Ｂ１号、欧州特許出願第４９４１３５Ｂ１号、米国特許第５８２４３１１号、欧州特許出願第４４４１８１Ｂ１号、欧州特許出願第１００６１９４Ａ２号、米国特許出願公開第２００２／０１５５５２７Ａ１号、国際公開第９１／０２０６２号、米国特許第５５７１８９４号、米国特許第５９３９５３１号、欧州特許出願第５０２８１２Ｂ１号、国際公開第９３／０３７４１号、欧州特許出願第５５４４４１Ｂ１号、欧州特許出願第６５６３６７Ａ１号、米国特許第５２８８４７７号、米国特許第５５１４５５４号、米国特許第５５８７４５８号、国際公開第９３／１２２２０号、国際公開第９３／１６１８５号、米国特許５８７７３０５号、国際公開第９３／２１３１９号、国際公開第９３／２１２３２号、米国特許第５８５６０８９号、国際公開第９４／２２４７８号、米国特許第５９１０４８６号、米国特許第６０２８０５９号、国際公開第９６／０７３２１号、米国特許第５８０４３９６号、米国特許第５８４６７４９号、欧州特許出願第７１１５６５号、国際公開第９６／１６６７３号、米国特許第５７８３４０４号、米国特許第５９７７３２２号、米国特許第６５１２０９７号、国際公開第９７／００２７１号、米国特許第６２７０７６５号、米国特許第６３９５２７２号、米国特許第５８３７２４３号、国際公開第９６／４０７８９号、米国特許第５７８３１８６号、米国特許第６４５８３５６号、国際公開第９７／２０８５８号、国際公開第９７／３８７３１号、米国特許第６２１４３８８号、米国特許第５９２５５１９号、国際公開第９８／０２４６３号、米国特許第５９２２８４５号、国際公開第９８／１８４８９号、国際公開第９８／３３９１４号、米国特許第５９９４０７１号、国際公開第９８／４５４７９号、米国特許第６３５８６８２Ｂ１号、米国特許出願公開第２００３／００５９７９０号、国際公開第９９／５５３６７号、国際公開第０１／２００３３号、米国特許出願公開第２００２／００７６６９５Ａ１号、国際公開第００／７８３４７号、国際公開第０１／０９１８７号、国際公開第０１／２１１９２号、国際公開第０１／３２１５５号、国際公開第０１／５３３５４号、国際公開第０１／５６６０４号、国際公開第０１／７６６３０号、国際公開第０２／０５７９１号、国際公開第０２／１１６７７号、米国特許第６５８２９１９号、米国特許出願公開第２００２／０１９２６５２Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０２１１５３０Ａ１号、国際公開第０２／４４４１３号、米国特許出願公開第２００２／０１４２３２８号、米国特許第６６０２６７０Ｂ２号、国際公開第０２／４５６５３号、国際公開第０２／０５５１０６号、米国特許出願公開第２００３／０１５２５７２号、米国特許出願公開第２００３／０１６５８４０号、国際公開第０２／０８７６１９号、国際公開第０３／００６５０９号、国際公開第０３／０１２０７２号、国際公開第０３／０２８６３８号、米国特許出願公開第２００３／００６８３１８号、国際公開第０３／０４１７３６号、欧州特許出願第１３５７１３２号、米国特許出願公開第２００３／０２０２９７３号、米国特許出願公開第２００４／０１３８１６０号、米国特許第５７０５１５７号、米国特許第６１２３９３９号、欧州特許出願第６１６８１２Ｂ１号、米国特許出願公開第２００３／０１０３９７３号、米国特許出願公開第２００３／０１０８５４５号、米国特許第６４０３６３０Ｂ１号、国際公開第００／６１１４５号、国際公開第００／６１１８５号、米国特許第６３３３３４８Ｂ１号、国際公開第０１／０５４２５号、国際公開第０１／６４２４６号、米国特許出願公開第２００３／００２２９１８号、米国特許出願公開第２００２／００５１７８５Ａ１号、米国特許第６７６７５４１号、国際公開第０１／７６５８６号、米国特許出願公開第２００３／０１４４２５２号、国際公開第０１／８７３３６号、米国特許出願公開第２００２／００３１５１５Ａ１号、国際公開第０１／８７３３４号、国際公開第０２／０５７９１号、国際公開第０２／０９７５４号、米国特許出願公開第２００３／０１５７０９７号、米国特許出願公開第２００２／００７６４０８号、国際公開第０２／０５５１０６号、国際公開第０２／０７０００８号、国際公開第０２／０８９８４２号、及び国際公開第０３／８６４６７号を含む。
【００８０】
「ＨＥＲ活性化」は、任意の一又は複数のＨＥＲレセプターの、活性化又はリン酸化を意味する。一般的に、ＨＥＲ活性化はシグナル伝達を生じる（例えば、ＨＥＲレセプター又は基質ポリペプチドのチロシン残基をリン酸化するＨＥＲレセプターの細胞内キナーゼドメインにより引き起こされるもの）。ＨＥＲ活性は、対象のＨＥＲレセプターを含んでなるＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドによって媒介されうる。ＨＥＲ二量体に結合するＨＥＲリガンドは、二量体中の一又は複数のＨＥＲレセプターのキナーゼドメインを活性化し得、これにより一又は複数のＨＥＲレセプター中のチロシン残基のリン酸化、及び／又は例えばＡｒｋ又はＭＡＲＫ細胞内キナーゼ等の更なる基質ポリペプチド中のチロシン残基のリン酸化を生じる。
【００８１】
「リン酸化」は、ＨＥＲレセプター又はその基質等のタンパク質への一又は複数のホスフェート基の付加を意味する。
ＨＥＲ２上の「ヘテロ二量体結合部位」は、それとの二量体形成の際にＥＧＦＲ、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４の細胞外ドメイン中の領域と接触又は干渉するＨＥＲ２の細胞外ドメイン中の領域を意味する。該領域はＨＥＲ２のドメインＩＩに見出される。Franklin等Cancer Cell 5:317-328 (2004)。
ＨＥＲ２の「ヘテロ二量体結合部位に結合する」ＨＥＲ２抗体は、ドメインＩＩの残基に結合し（また場合によってはＨＥＲ２細胞外ドメインの他のドメイン、例えばドメインＩ及びＩＩＩの残基にも付加的に結合し）、ＨＥＲ２−ＥＧＦＲ，ＨＥＲ２−ＨＥＲ３、又はＨＥＲ２−ＨＥＲ４ヘテロ二量体の形成を、少なくともある程度は立体的に妨げることが可能である。Franklin等 Cancer Cell 5:317-328 (2004)は、ＲＣＳＢタンパク質データバンク(IDコードIS78)に寄託されたＨＥＲ２−ペルツズマブ結晶構造を特性化しており、ＨＥＲ２のヘテロ二量体結合部位に結合する例示的な抗体を示している。
【００８２】
ＨＥＲ２の「ドメインＩＩに結合する」抗体は、ドメインＩＩの残基及び場合によってはＨＥＲ２の他のドメイン、例えばドメインＩ及びＩＩＩの残基に結合する。
【００８３】
「単離された」とは、ここで開示された様々な抗体を記述するために使用される場合、それが発現された細胞又は細胞培養物から同定され分離され及び／又は回収された抗体を意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。単離された抗体には、ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一つの精製工程により調製される。幾つかの実施態様では、多重特異的抗ＨＥＲ抗体は単離された抗体である。
【００８４】
「コントロール配列」なる用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード化配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適なコントロール配列は、例えば、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、一般的な手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００８５】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば公に利用できるコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技量の範囲にある様々な方法で達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、パーセントアミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用して得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、そのソースコードが米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニアから公的に入手可能であるか、又はソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムで使用するようにコンパイルされなければならない。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され、変動しない。
【００８６】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対してある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に別の定義がなされない限り、ここで使用される全ての％アミノ酸配列同一性は、ＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを使用して直ぐ前の段落に記載されたようにして得られる。
【００８７】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングに必要な温度が高くなる一方、プローブが短くなるとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望される相同性の程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向がある一方、低い温度はストリンジェントを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００８８】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度にストリンジェントな条件」は、（１）例えば５０℃の０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムと、洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる；（２）例えば４２℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドに０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムと、ホルムアミド等の変性剤をハイブリダイゼーションに用いる；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液を４２℃で用い、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）での４２℃での洗浄と５０％のホルムアミドでの５５℃での洗浄に、５５℃でのＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄が続くものによって特定されうる。
【００８９】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように特定され得、上述のものより低いストリンジェンシーの洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で３７℃での終夜インキュベーションの後、１×ＳＳＣ中で約３７−５０℃でのフィルターの洗浄が続くものである。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させるために必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかは分かるであろう。
【００９０】
抗体「エフェクター機能」は抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰因するその生物学的活性を意味する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ＡＤＣＣ)；食作用；細胞表面レセプターのダウンレギュレーション(例えばＢ細胞レセプター)；及びＢ細胞活性化を含む。
【００９１】
「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)に結合した分泌Ｉｇはこれらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒で標的細胞を死滅させ得る細胞傷害性の形態を意味する。抗体は細胞傷害性細胞を「武装し」、そのような死滅に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ及びＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の４６４ページの表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば米国特許第５５００３６２号又は５８２１３３７号に記載されているもののようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）95:652-656(1998)に開示されているもののような動物のモデルにおいて、インビボで評価されうる。
【００９２】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述する。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。更に、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）を含み、それらは主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)の概説を参照）。ＦｃＲは、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。該用語は胎児への母性ＩｇＧｓの移動の原因である新生児レセプターＦｃＲｎもまた含む（Guyer等, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００９３】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を果たす白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦＣγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む；ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、その天然源、例えば血液から、単離することができる。
【００９４】
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的補体経路の活性化は、その同族抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体への補体系の第１の成分(Ｃｌｑ)の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J.Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施することができる。
【００９５】
ここで使用される場合、「治療」（及び「治療する」又は「治療している」のようなその文法的変形語）とは、治療される個体の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望される効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は、疾病の発症を遅延させるため、又は疾病の進行を遅延化させるために使用される。
【００９６】
「治療的に有効な量」なる用語は、被験者における疾病又は疾患を治療するための抗体又は抗体断片の量を意味する。腫瘍（例えば癌性腫瘍）の場合、抗体又は抗体断片の治療的に有効な量は、癌細胞の数を減少させ；原発性腫瘍サイズを減少させ；周辺器官への癌細胞の浸潤を阻害し（つまり、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を阻害し（つまり、ある程度まで遅くさせ、好ましくは停止させ）；ある程度まで腫瘍増殖を阻害し；及び／又は疾患に伴う徴候の一又は複数をある程度軽減しうる。抗体又は抗体断片が増殖を防止し、及び／又は存在する癌細胞を死滅させうる程度まで、それは細胞分裂阻害性及び／又は細胞毒性でありうる。癌治療法では、インビボの効能は、例えば生存期間、無増悪期間（ＴＴＰ）、奏功率（ＲＲ）、応答期間、及び／又は生活の質を評価することにより測定することができる。
【００９７】
「低減又は阻害する」とは、好ましくは２０％又はそれ以上、より好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の全体的な減少を生じる能力を意味する。低減又は阻害は、治療されている疾患の症状、転移の存在又はサイズ、原発性腫瘍のサイズ、又は血管新生疾患における血管のサイズ又は数を意味しうる。
【００９８】
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞増殖により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を意味し又は記述する。この定義に含まれるものは良性及び悪性癌である。「早期癌」とは、非浸潤又は非転移又はステージ０、Ｉ、又はＩＩの癌として分類される癌を意味する。
「前癌性」なる用語は、典型的には癌に先行又は発展する状態又は増殖を意味する。
「非転移」とは、良性であるか、又は原発部位にとどまっており、かつリンパ管系又は血管系、又は原発部位以外の組織中に侵入していない癌を意味する。一般的に、非転移癌は、ステージ０、Ｉ、又はＩＩの癌の何れのか癌、及び場合によってはステージＩＩＩの癌である。
「薬学的に許容可能な担体」とは、活性成分以外の、被験者に非毒性である薬学的製剤中の成分を意味する。薬学的に許容可能な担体は、限定しないが、バッファー、賦形剤、安定剤、又は保存料を含む。
【００９９】
「抗癌療法」なる用語は、癌の治療に有用な治療法を意味する。抗癌治療剤の例は、限定しないが、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、放射線療法で使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及び癌を治療するための他の薬剤、抗ＣＤ２０抗体、血小板由来増殖因子阻害剤（例えば、ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、次の標的ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ-β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプターの一又は複数に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、及び他の生理活性及び有機化学薬剤等々を含む。それらの組合せもまた本発明に含まれる。
【０１００】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパ及びシクロホスファミド(ＣＹＴＯＸＡＮ(登録商標))；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン(piposulfan)；アジリジン類、例えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)；アルトレトアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）を含む）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン（ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標）、リポソームドキソルビシンＴＬＣＤ-９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグ化リポソームドキソ��ビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標）、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン(lonidainine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン類(ansamitocins)のようなメイタンシノイド類(maytansinoids)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン(losoxantron)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANETM)、及びドキセタキセル(ＴＡＸＯＴＥＲＥ(登録商標))；クロランブ���ル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン（例えばＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））及びカルボプラチン；ビンカ類でチューブリン重合の微小管形成を阻害するもの、例えばビンブラスチン(ＶＥＬＢＡＮ(登録商標)、ビンクリスチン(ＯＮＣＯＶＩＮ(登録商標))、ビンデシン(ＥＬＤＩＳＩＮＥ(登録商標)、ＦＩＬＤＥＳＩＮ(登録商標))、及びビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボビン(leucovovin)；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド、例えば、ベキサロテン(ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ(登録商標))；ビスホスホネート、例えばクロドロネート(例えばＢＯＮＥＦＯＳ(登録商標)又はＯＳＴＡＣ(登録商標))、エチドロン酸(ＤＩＤＲＯＣＡＬ(登録商標))、ＮＥ-５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ＺＯＭＥＴＡ(登録商標))、アレンドロネート(ＦＯＳＡＭＡＸ(登録商標))、パミドロン酸(ＡＲＥＤＩＡ(登録商標))、チルドロン酸(ＳＫＥＬＩＤ(登録商標))、又はリセドロン酸(ＡＣＴＯＮＥＬ(登録商標))；トロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；ＴＨＥＲＡＴＯＰＥ(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害薬(例えばＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標))；ＢＡＹ４３９００６(ソラフェニブ；Bayer)；ＳＵ-１１２４８(スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)、Pfizer)；ペリフォシン(perifosine)、ＣＯＸ-２阻害剤(例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ)、プロテオゾーム阻害剤(例えばＰＳ３４１)；ボルテゾミブ(ＶＥＬＣＡＤＥ(登録商標))；ＣＣＩ-７７９；チピファルニブ(tipifarnib)(Ｒ１１５７７)；オラフィニブ(orafenib)、ＡＢＴ５１０；ＢＣＬ-２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム(oblimersen sodium)(GENASENSE(登録商標))；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤；セリン-スレオニンキナーゼ阻害剤、例えばラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ(登録商標)）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファーニブ（ＳＣＨ６６３６，ＳＡＲＡＳＡＲＴＭ）；及び上述したものの何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組合せ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロンの併用療法の略称であるＣＨＯＰ；及び５−ＦＵ及びロイコボリンとオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組合せた治療法の略称であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。
【０１０１】
ここで定義された化学療法剤には、癌の増殖を促進しうるホルモンの効果を調節、低減、ブロック、又は阻害するように働く「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療剤」が含まれる。それらはそれ自体がホルモンであってもよく、限定するものではないが、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ(登録商標)）、４-ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ(登録商標)）、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)（ＥＶＩＳＴＡ(登録商標)）、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、及びＳＥＲＭ３などの選択的なエストロゲンレセプター調節因子(ＳＥＲＭ)；アゴニスト特性を有さない純粋な抗エストロゲン類、例えばフルベストラント(ＦＡＳＬＯＤＥＸ(登録商標))、及びＥＭ８００(このような薬剤はエストロゲンレセプター(ＥＲ)二量体化をブロックし、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、及び／又はＥＲレベルを抑制しうる)；アロマターゼインヒビター、例えば、ホルメスタン及びエキセメスタン(ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標))などのステロイド系アロマターゼインヒビター、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))、レトロゾール(ＦＥＭＡＲＡ(登録商標))及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼインヒビター、及びボロゾール(ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標))、メゲストロールアセテート(ＭＥＧＡＳＥ(登録商標))、ファドロゾール及び４(５)-イミダゾールを含む他のアロマターゼインヒビター；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド(ＬＵＰＲＯＮ(登録商標)及びＥＬＩＧＡＲＤ(登録商標))、ゴセレリン、ブセレリン、及びトリプトレリン；性ステロイド、例えばプロゲスチン、例えばメゲストロールアセテート及びメドロキシプロゲステロンアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びプレマリン、及びアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、全てのトランスレチオニン酸及びフェンレチニド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方制御因子(ＥＲＤ)；抗アンドロゲン類、例えばフルタミド、ニルタミド及びビカルタミド；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体；並びに、上記のうちの２以上の組合せを含む。
【０１０２】
「被験者」とは、脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定しないが、ヒト、非ヒト高等霊長類、霊長類、家畜（例えばウシ）、競技動物、ペット（例えば、ネコ、イヌ、及びウマ）、及び実験動物（例えば、マウス及びラット）を含む。
【０１０３】
ＩＩ．詳細な説明
本発明は、少なくとも二の異なるＨＥＲレセプター、特にＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、又はＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に対して結合特異性を有する少なくとも一の抗原結合ドメインを含んでなる抗体、及び機能的抗体断片を提供する。これらの多重特異性抗体は、異なる結合特異性を有する（通常は二の）抗原結合ドメインを持つ伝統的な多重特異性抗体とは異なる。ある実施態様では、ここで記載される多重特異性抗体は、ＩｇＧ（又はＦａｂ）の分子構造を持ち、よって治療法の開発のためのＩｇＧの好ましい属性、例えば、予想可能な薬物動態特性、十分に確立された製造プロトコル、Ｆｃ媒介エフェクター機能の選択、及び二価又は一価の価数を保持している。これらの好ましい属性は、二の異なる抗体断片を一分子に組立てることにより得られる伝統的な多重特異性抗体ではしばしば欠如する。
【０１０４】
ここで記載される多重特異性抗体及びその機能的抗体断片は、ＨＥＲレセプター経路に関わりがある、癌などの病気又は症状の治療のために有用である。特定の一実施態様では、多重特異性抗体の抗原結合ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ３双方に特異的に結合する。他の実施態様では、多重特異性抗体の抗原結合ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する。他の実施態様では、抗原結合ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する。
【０１０５】
本発明の特定の一態様は、各々が同じ結合特異性を有する二（又はそれ以上）の抗原結合ドメインを含んでなる抗体を提供する。
一実施態様は、各抗原結合ドメインが同じ特異性を持ち、二の異なるＨＥＲレセプターに特異的に結合する、二の抗原結合ドメインからなる多重特異性抗体を提供する。特定の一実施態様では、各抗原結合ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ３双方に特異的に結合する。他の実施態様では、各抗原結合ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ２双方に特異的に結合する。他の実施態様では、各抗原結合ドメインはＥＧＦＲ及びＨＥＲ４双方に特異的に結合する。更に他の実施態様では、各抗原結合ドメインはＥＧＦＲのドメインＩＩＩに特異的に結合する。他の実施態様では、各抗原結合ドメインはＨＥＲ３のドメインＩＩＩに特異的に結合する。更に他の実施態様では、各抗原結合ドメインはＥＧＦＲのドメインＩＩＩ及びＨＥＲ３のドメインＩＩＩに結合することが可能である。
【０１０６】
特定の実施態様では、多重特異性抗体は、その標的ＨＥＲレセプター又はＨＥＲレセプター群に特異的に結合し、非標的ＨＥＲレセプターに特異的に結合しない。従って、一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合するが、ＨＥＲ２又はＨＥＲ４には特異的に結合しない。他の実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合するが、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４には特異的に結合しない。他の実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合するが、ＨＥＲ２又はＨＥＲ３には特異的に結合しない。
ある実施態様では、各抗原結合ドメインは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。一実施態様では、ＶＨＶＬユニットは、二の異なるＨＥＲレセプターに特異的に結合する。特定の一実施態様では、ＶＨＶＬユニットは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する。他の実施態様では、ＶＨＶＬユニットは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する。他の実施態様では、ＶＨＶＬユニットは、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する。
【０１０７】
特定の実施態様では、多重特異性抗体のその標的ＨＥＲレセプター又はレセプター群への親和性は、１０−５Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、又は１０−１２Ｍ未満のＫｄで示される。一実施態様では、その標的レセプターの一つへの抗体のＫｄは、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、又は１０−１２Ｍ未満である。別の実施態様では、その標的レセプターの全てに対する多重特異性抗体のＫｄは、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、又は１０−１２Ｍ未満である。
【０１０８】
幾つかの実施態様では、その標的レセプターの一つに対する多重特異性抗体の親和性は、その他の標的ＨＥＲレセプター又はレセプター群に対してより大きい。一実施態様では、一つの標的ＨＥＲレセプターに対する多重特異性抗体の親和性は、別の標的ＨＥＲレセプターへのその親和性より少なくとも２、３、４、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、５０、１００倍大きい。一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及び別のＨＥＲレセプターに特異的に結合し、その別のＨＥＲレセプターへの結合親和性はＥＧＦＲへのその親和性より少なくとも２、３、４、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、５０、又は１００倍大きい。一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合し、ＨＥＲ３へのその結合親和性はＥＧＦＲへのその結合親和性より少なくとも２、３、４、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、５０、又は１００倍大きい。別の実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合し、ＨＥＲ２へのその結合親和性はＥＧＦＲへのその結合親和性より２、３、４、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、５０、又は１００大きい。別の実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合し、ＨＥＲ４へのその結合親和性はＥＧＦＲへのその結合親和性より２、３、４、５、８、１０、１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、５０、又は１００大きい。
【０１０９】
幾つかの実施態様では、本発明の多重特異性抗体は、それらが特異的に結合するＨＥＲレセプターの少なくとも一の生物学的活性を阻害する。幾つかの実施態様では、本発明の多重特異性抗体は、それらが特異的に結合するＨＥＲレセプターの双方の生物学的活性を阻害する。よって、例えば、本発明の多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４レセプターの生物学的活性を阻害する。
一実施態様では、多重特異性抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ３に特異的に結合し、少なくともＥＧＦＲの生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、多重特異性抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ３に特異的に結合し、少なくともＨＥＲ３の生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、多重特異性抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ３に特異的に結合し、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３双方の生物学的活性を阻害する。
【０１１０】
別の実施態様では、多重特異性抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、少なくともＥＧＦＲの生物学的活性を阻害する。更に別の実施態様では、抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、少なくともＨＥＲ２の生物学的活性を阻害する。更に別の実施態様では、抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ２に特異的に結合し、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２双方の生物学的活性を阻害する。
別の実施態様では、抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ４に特異的に結合し、少なくともＥＧＦＲの生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ４に特異的に結合し、少なくともＨＥＲ４の生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、抗体はヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥ４に特異的に結合し、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４双方の生物学的活性を阻害する。
ある実施態様では、ここに記載される抗体は、少なくとも部分的には、それらが結合しないＨＥＲレセプターに動因される生物学的活性を阻害する。例えば、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合する抗体はＨＥＲ２動因の生物学的活性を阻害することができるかも知れない。
【０１１１】
生物学的活性の阻害は当該分野で周知のアッセイで計測が可能である。よって、例えば、ここでの抗体は、一又は複数のＨＥＲレセプターのリン酸化を阻害し得、及び／又はＨＥＲリガンドのそのレセプターへの結合を阻害し得、及び／又はリガンド誘導によるＨＥＲレセプター発現細胞の増殖を阻害し得、及び／又はＨＥＲレセプターを介して活性化される下流のシグナル伝達経路を阻害しうる。
ＥＧＦＲのリン酸化を受けて活性化される二の主要な下流のシグナル伝達経路はＲａｓ／ＭＡＰＫ及びホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路である。従って、ＨＥＲレセプターの生物学的活性を阻害するここでの抗体の能力は、例えばＮＲ６細胞で、これらの経路の活性を遮断可能かどうか評価することによって測定することができる。このように、該抗体が、リガンド誘導によるｐ４４／４２ＭＡＰＫ、ｐＡＫＴ、又は他の下流のシグナル伝達分子のリン酸化をブロックする能力を測定することが可能である。ＨＥＲ３シグナル伝達は、ｃ−ｍｅｔ及びＦＧＦＲを含む幾つかの他の経路にも関与している。ここでの抗体のＨＥＲレセプターの生物学的活性を阻害する能力は、これらの経路の活性化を遮断可能かどうかを評価することにより測定することができる。
【０１１２】
本発明の一態様は、一のＨＥＲレセプターに対して特異性を持つ抗体を、それが第一のＨＥＲレセプターに対して特異性を保ちながら第二のＨＥＲレセプターに対して特異性を発現するように多様化することによって産生される多重特異性抗体を提供する。上位概念の用語では、該方法は、（１）抗体の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を多様化し、ここでは、多様化に先立って、抗体は第一のＨＥＲレセプター上のエピトープに結合可能であるＶＬ及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、（２）第一のＨＥＲレセプター上のエピトープ及び第二のＨＥＲレセプター上のエピトープに結合可能である多様化された抗体を選択する工程を含む。これらの工程は、多重特異性抗体を産生するために繰り返すことができる。該方法の詳細な説明は、米国特許出願公開第２００８００６９８２０号に提供されており、その全開示を出典明示により明示的にここに援用する。該方法は実施例で更に例証する。実施例に記載された方法では、抗ＥＧＦＲ抗体が多様化のための鋳型として、よって多重特異性抗ＨＥＲ抗体の調製のために使用されるが、しかし、他の抗ＨＥＲ抗体、例えば抗ＨＥＲ２、抗ＨＥＲ３、又は抗ＨＥＲ４抗体もまた鋳型となりうる。
【０１１３】
本発明は、一ＨＥＲレセプターに特異的に結合可能であるが他のＨＥＲレセプターには特異的に結合しない単一特異性抗体を提供する。一実施態様では、抗体はＥＧＦＲに特異的に結合する。一実施態様では、抗体はＥＧＦＲのドメインＩＩＩに特異的に結合する。幾つかの実施態様では、抗体はＥＧＦＲに特異的に結合し、ＥＧＦＲの生物学的活性を阻害する。別の実施態様では、抗体はＨＥＲ３に特異的に結合する。一実施態様では、抗体はＨＥＲ３のドメインＩＩＩに特異的に結合する。幾つかの実施態様では、抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ＨＥＲ３の生物学的活性を阻害する。
単一特異性抗体は、更なる多様化のために鋳型抗体として使用されることが可能であり、他のＨＥＲレセプター又は他の標的抗原に対する結合特異性を付与する。
【０１１４】
毒性
ＥＧＦＲアンタゴニストの毒性は、前臨床及び臨床試験双方において十分に文献化されている。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブは治療上有効なレベルで様々な形態の毒性を示す。セツキシマブ（ERBITUX(登録商標), Imclone）に伴う最も一般的な副作用は（発生率≧２５％）、皮膚副作用（発疹、掻痒、及び爪の変化を含む）、頭痛、下痢、及び感染症である。セツキシマブ治療に伴う最も深刻な副作用は、注入反応、心肺停止、皮膚科学的毒性及び放射線皮膚障害、敗血症、腎不全、間質性肺疾患、及び肺動脈塞栓である。Biologics License Agreement (BLA) for cetuximab (出願番号：１２５０８４) (出典明示によりここに援用)を参照。同様の毒性問題がパニツムマブ (VECTIBIX(登録商標) Amgen)に観察され、該抗体を投与された患者の８９％に皮膚科学的毒性が生じた。これらの毒性は深刻であり、ＣＴＣグレード３以上であった。(VECTIBIX(登録商標) FDA label.)
【０１１５】
抗ＥＧＦＲ化学療法剤エルロチニブは、ある場合には、急性腎不全又は腎機能障害、肺不全及び／又は肝腎症候群、胃腸穿孔、水疱性及び剥離性皮膚疾患、及び角膜潰瘍及び角膜穿孔を引き起こすことが報告されている。FDA Warnings and Precautions safety labeling for erlotinib (TARCEVA(登録商標), Genentech, OSI Pharmaceuticals)(2009)を参照。
「毒」又は「毒性」とは、被験者に投与された場合に薬剤によって引き起こされる副作用を意味する。毒性の基準は、死亡率、体重減少、臓器不全、臓器機能の変化、中枢神経系毒性、胃腸毒性（例えば下痢に現れる）、皮膚科学的毒性（例えば、発疹、皮膚病変、落屑、又は掻痒の出現に現れる）、心毒性、感染症、敗血症、細胞毒性を含むが、これに限られない。
毒性は、臨床症状観察、体重、食事量、呼吸数、パルスオキシメータ測定、身体検査、眼科評価、神経学的評価、代謝パラメーター、循環器系パラメーター、臨床病理学（臨床化学、血液学、尿及び凝固パラメーター）、及び巨視的及び微視的病変のような当該分野において知られている方法によって判定することができる。
【０１１６】
National Cancer Instituteによって用意されたThe Common Terminology Criteria for Adverse Events v3.0 (CTCAE)（出典明示によりその全体がここに援用される）は、ヒト被験者における毒性の特定の許容指標に関する情報を提供している。図３１は、ＥＧＦＲアンタゴニスト治療に対して観察される非臨床及び臨床毒性に関する情報を提供する。
毒性は、全毒性事象又は毒性事象の重症度によって評価される。事象の重症度は、ＣＴＣＡＥにて設定されたグレーディング方式を使用して記載することが可能である。グレードは、一般的なガイドラインに基づいて重症度の独特の臨床記述を使用して各有害事象が割り当てられ、グレード１は軽度の事象、グレード２は中等度の事象、グレード３は高度の事象、グレード４は生命を脅かす又は活動不能に至る事象、及びグレード５は事象による死亡を意味する。ＣＴＣＡＥは、毒性事象に対して特定の臨床記述を提供する。皮膚科学的毒性に対する記述は、ＣＴＣＡＥ，ｖ．３のページ１４の冒頭部に提供されている。例として、図３２は、発疹／落屑及び挫瘡／挫瘡様発疹に関するグレーディングを示す（CTCAE、v.3）。毒性の潜在指標を監視するために使用される当該分野で知られたモデルは多くあり、インビトロ細胞ベースモデル及びインビボ非ヒト動物モデルを含むがこれに限定されない。毒性は臨床治験においてヒト被験者でもまたモニターされる。
【０１１７】
特定の一実施態様では、毒性はカニクイザルで評価される。カニクイザルでのＥＧＦＲアンタゴニストの毒性作用は十分に文献化されている。セツキシマブに関してBiologics License Agreement (BLA)に記載されるように（出願番号：１２５０８４）（出典明示によりここに援用される）、セツキシマブを与えられた全てのサルは、皮膚に、鱗屑形成、発赤、紅斑、皮膚炎、亀裂、創傷、及び発疹、及び／又は薄毛又は抜け毛を含む中等度から高度の病変を示した。皮膚科学的毒性は、重症度及び発生の時間双方において用量依存的であり、高用量、中用量、及び低用量に対する重症度はそれぞれ高度、中等度、及び軽度であり、発生の時間はそれぞれ実験１５、２２及び６４日目であった。高度皮膚損傷の二次性合併症は、細菌感染又は敗血症であり、高用量群の動物の５０％がその後の死亡及び安楽死を伴った。他の用量依存性毒性は、肝臓、骨髄、脾臓、及びリンパ系器官における細胞及び組織損傷の巨視的及び微視的証拠に関連する特定の臨床病理学パラメーターでの変化を含んでいた。
【０１１８】
実施例に記載されるように、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する二重特異性抗体を投与されたカニクイザルは、等量のＥＧＦＲアンタゴニストセツキシマブを投与されたカニクイザルと比較して、皮膚性病変で示されるように、より少ない毒性の発生を示した。２５ｍｇ／ｋｇの二重特異性抗体を投与されたカニクイザル三匹の内一匹は皮膚性病変を発症したが、２５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブを投与されたカニクイザル三匹の内三匹が皮膚性病変を発症した。二重特異性抗体を投与されたサルに生じた病変は、セツキシマブを投与されたサルの病変より軽度で、病変の発症は遅延された。二重特異性抗体を投与された動物は、セツキシマブを投与されたサルと比較して最終（第六）投与の１週間後に皮膚病変を発症し、皮膚性病変の発症は全ての動物において第三投与後に生じた。
セツキシマブの臨床研究において、挫瘡様発疹、皮膚の乾燥及び亀裂、及び続発性炎症及び感染症を含む皮膚科学的毒性が観察された。報告された皮膚科学的毒性の発生は８９％と高かった（進行した結腸直腸癌を持つ患者に対して）。
【０１１９】
皮膚毒性のモデルは知られており、抗体の皮膚科学的毒性を判定するために使用することができる。このようなモデルの例は、ヒト表皮角化細胞(NHEK (Clonetics, San Diego, CA;  Lonza Bioscience, Walkersville, MD)；ＨＥＫａ(Cascade Biologics, Portland, OR; Invitrogen, Carlsbad, CA)及び再構成ヒト表皮(EpiDermTM cultures (MatTek, Ashland, MA)を含む。これらのモデルは、細胞増殖、遺伝子発現、レセプターリン酸化、細胞生存率、及び組織病理学的変化に対する抗体の効果を検査するために使用可能である。Lacouture, M.E., Nature Rev. Cancer, 6:803-812 (2006)。
ＥＧＦＲ経路を標的とする低毒性抗体を提供することが望まれる。セツキシマブなどのＥＧＦＲアンタゴニストの投与は、毒性（主に皮膚科学的毒性及び注入反応）により制限される。低毒性抗体は、増大した抗腫瘍効果を生じうるより毒性のＥＧＦＲアンタゴニストより高用量で投与できるであろう。従って、本発明の一態様は、ＥＧＦＲ及び少なくとも一の他のＨＥＲレセプター（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＨＥＲ４）に特異的に結合する多重特異性抗体を提供し、ここで、該抗体及びＥＧＦＲアンタゴニストが等量で投与された場合に、抗体がＥＧＦＲアンタゴニストより低毒性である。一実施態様では、抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する。別の実施態様では、抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する。更に別の実施態様では、抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する。
【０１２０】
幾つかの実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニストと比較してインビボモデルにおいて毒性の低発生率、軽度の毒性、又は毒性の遅延された発生を生じる。本発明の一態様は、ＥＧＦＲ及び少なくとも一の他のＨＥＲレセプター（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＨＥＲ４）に特異的に結合する多重特異性抗体を提供し、ここで、抗体はＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者での毒性の発生と比較して抗体を投与された被験者にはより少ない毒性を誘発する。特定の実施態様では、抗体を投与された被験者の毒性発生は、ＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者の毒性発生の数より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％少ない。
他の実施態様では、抗体を投与された被験者における毒性の発生率は、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、又は１％未満である。
【０１２１】
特定の実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニストと比較して、インビボモデルでは、皮膚科学的毒性の低発生、軽度の皮膚科学的毒性、又は皮膚科学的毒性の遅延された発生を誘発する。本発明の一態様は、ＥＧＦＲ及び少なくとも一の他のＨＥＲレセプター（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＨＥＲ４）に特異的に結合する多重特異性抗体を提供し、ここで、ＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者での全皮膚科学的毒性発生と比較して、抗体を投与された被験者では抗体はより少ない全皮膚科学的毒性を誘発する。特定の実施態様では、抗体を投与された被験者での全皮膚科学的毒性発生は、ＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者の皮膚科学的毒性の数より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％少ない。
他の実施態様では、抗体を投与された被験者での全皮膚学的毒性発生の割合は８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、又は１％未満である。
【０１２２】
本発明の別の態様は、ＥＧＦＲ及び少なくとも一の他のＨＥＲレセプター（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及び／又はＨＥＲ４）に特異的に結合する多重特異性抗体を提供し、ここで、ＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者でのグレード３又はそれ以上の毒性発生と比較して、抗体を投与された被験者では抗体はより少ないグレード３又はそれ以上の毒性を生じる。特定の実施態様では、抗体を投与された被験者でのグレード３又はそれ以上の毒性発生の数は、ＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者でのグレード３またはそれ以上の毒性発生の数より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％少ない。
他の実施態様では、多重特異性抗体を投与された被験者でのグレード３又はそれ以上の毒性発生の割合は、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満である。
【０１２３】
特定の実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者でのグレード３又はそれ以上の皮膚科学的毒性発生と比較して、二重特異性抗体を投与された被験者では、より少ないグレード３又はそれ以上の皮膚科学的毒性発生を生じる。特定の実施態様では、多重特異性抗体を投与された被験者でのグレード３又はそれ以上の皮膚科学的毒性発生の数は、ＥＧＦＲアンタゴニストを投与された被験者でのグレード３又はそれ以上の毒性発生の数より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％少ない。
他の実施態様では、多重特異性抗体を投与された被験者でのグレード３又はそれ以上の皮膚科学的毒性発生の割合は、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満である。
【０１２４】
他の実施態様では、抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニストと比較して、インビボモデルで、より少ない臓器機能の変化の発生を生じる。他の実施態様では、抗体は、ＥＧＦＲアンタゴニストと比較して、インビボモデルで、より少ない、又はより軽度の胃腸毒性を生じる。
幾つかの実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは抗ＥＧＦＲ抗体である。一実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストはセツキシマブである。別の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストはパニツムマブである。別の実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストは小分子である。一実施態様では、ＥＧＦＲアンタゴニストはエルロチニブである。一実施態様では、インビボモデルはサルであり、例えばカニクイザルである。別の実施態様では、インビボモデルはヒトである。
【０１２５】
抗体及び抗体変異体
幾つかの実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗原結合ドメインは、他のＨＥＲレセプターを含む、他の標的に特異的には結合しない。
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ（重鎖可変ドメイン）を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：４０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ（軽鎖可変ドメイン）を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：４０のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１２６】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：４０のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：４０のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：４０のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。
【０１２７】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：６４のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２６のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：６４のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２６のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１２８】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：６４のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２６のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：６４のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２６のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：６４のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：２６のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。
【０１２９】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２７のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２７のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１３０】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２７のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２７のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：２７のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。特定の一実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＬＳＧＤＷＩＨ(配列番号：４８)を含み、ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＬＧＥＩＳＡＡＧ(配列番号：５０)を含み、ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹ (配列番号：５３)を含み、ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＤＬＡＴＤＶＡ(配列番号：５４)を含み、ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＳＡＳＦ (配列番号：５６)を含み、及びＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＳＥＰＥＰＹＴ (配列番号：５７)を含む。
【０１３１】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２８のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１３２】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。一実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＬＳＧＤＷＩＨ（配列番号：４８）を含み、ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＬＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤ（配列番号：５０）を含み、ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：５３）を含み、ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＮＩＡＴＤＶＡ（配列番号：５５）を含み、ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＳＡＳＦ（配列番号：５６）を含み、及びＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）を含む。
【０１３３】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：３０のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：３０のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１３４】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３０のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３０のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３０のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。一実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＬＳＧＤＷＩＨ（配列番号：４８）を含み、ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＶＧＥＩＳＡＡＧＧＹＴＤ（配列番号：５１）を含み、ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列ＡＲＥＳＲＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：５３）を含み、ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＮＩＡＴＤＶＡ（配列番号：５５）を含み、ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＳＡＳＦ（配列番号：５６）を含み、及びＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）を含む。
【０１３５】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。
【０１３６】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：３６、３７、又は３８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変ドメイン、及び配列番号：３６、３７、又は３８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変ドメイン含む。
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３６、３７、又は３８のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：３６、３７、又は３８のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：３６、３７、又は３８のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。
【０１３７】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：３９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：３９のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１３８】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３９のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：３９のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：３９のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。
【０１３９】
一実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：５８又は配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：５８又は配列番号：２４のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１４０】
一実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２４のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：２４のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：２４のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。特定の一実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＦＴＧＮＷＩＨ（配列番号：４７）を含み、ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＶＧＥＩＳＰＳＧＧＹＴＤ（配列番号：４９）を含み、ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列ＡＲＥＳＲＶＳＹＥＡＡＭＤＹ（配列番号：５２）を含み、ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号：７８）を含み、ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＳＡＳＦ（配列番号：５６）を含み、及びＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＳＹＰＴＰＹＴ（配列番号：７９）を含む。
【０１４１】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は配列番号：２９のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：３３、３４，又は３５のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２９のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：３３、３４、又は３５のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含む。
【０１４２】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３３、３４、又は３５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：３３、３４、又は３５のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：３３、３４，又は３５のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。一実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＦＴＧＤＷＩＨ（配列番号：６２）を含み、ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＶＧＥＩＳＰＡＧＡＹＴＤ（配列番号：６０）を含み、ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列ＡＲＥＡＫＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：６１）を含み、ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＮＩＡＴＤＶＡ（配列番号：５５）を含み、ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＳＡＳＦ（配列番号：５６）を含み、及びＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）を含む。
【０１４３】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は配列番号：３２のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：３１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：３２のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：３１のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ含む。
【０１４４】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３１のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＨ、及び配列番号：３１のアミノ酸配列のＨＶＲの１、２、及び／又は３を含んでなるＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３２のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＨ、及び配列番号：３１のアミノ酸配列の全３ＨＶＲを含んでなるＶＬを含む。幾つかの実施態様では、ＨＥＲは伸張ＨＶＲである。特定の一実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列ＦＳＧＤＷＩＨ（配列番号：５９）を含み、ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列ＶＧＥＩＳＰＡＧＡＹＴＤ（配列番号：６０）を含み、ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列ＡＲＥＡＫＶＳＦＥＡＡＭＤＹ（配列番号：６１）を含み、ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列ＤＬＡＴＤＶＡ（配列番号：５４）を含み、ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列ＳＡＳＦ（配列番号：５６）を含み、及びＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列ＳＥＰＥＰＹＴ（配列番号：５７）を含む。
【０１４５】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２、１２、又は１４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：４のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１１のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１４のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。
【０１４６】
幾つかの実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗原結合ドメインは、他のＨＥＲレセプターを含む他の標的に特異的には結合しない。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２１、２２、又は２３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。
【０１４７】
幾つかの実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗原結合ドメインは、他のＨＥＲレセプターを含む他の標的に特異的には結合しない。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１８のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。
【０１４８】
一実施態様では、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単一特異性抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗原結合ドメインは、他のＨＥＲレセプターを含む他の標的に特異的には結合しない。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１又は３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。
【０１４９】
一実施態様では、本発明は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む単一特異性抗体を提供する。幾つかの実施態様では、抗原結合ドメインは、他のＨＥＲレセプターを含む他の標的に特異的には結合しない。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１６、１７、１９、又は２０のアミノ酸配列を含んでなる重鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１３又は１５のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１６、１７、１９、又は２０のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１３又は１５のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。
【０１５０】
一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１６のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１５のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１７のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：１９のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。一実施態様では、単一特異性抗体は、ＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２０のアミノ酸配列を含んでなる重鎖、及び配列番号：１３のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖を含む。
【０１５１】
幾つかの実施態様では、ここに記載される抗体のアミノ酸配列の修飾が検討される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが所望されうる。抗体のアミノ酸配列の変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列へ適切な変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製されうる。このような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の組合せは最終コンストラクトに到達するために為すことができ、但し最終コンストラクトは所望の特性を持つ。アミノ酸の変更は、配列がなされたときに対象の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
【０１５２】
幾つかの実施態様では、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比較して、置換、挿入、又は欠失を含むが、該アミノ酸配列を含んでなる抗体は、参照配列の元の標的又は標的群に結合する能力を保持する。幾つかの実施態様では、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比較して、置換、挿入、又は欠失を含むが、該アミノ酸配列を含んでなる抗体は、参照配列の元の標的又は標的群に結合する能力を保持し、他のＨＥＲレセプターを含む何れか他の標的には特異的に結合しない。幾つかの実施態様では、参照配列のアミノ酸配列から全部で１から１０のアミノ酸が置換、挿入、又は欠失されている。幾つかの実施態様では、ＨＶＲの外領域で（つまり、ＦＲ中で）、置換、挿入、又は欠失が生じる。
【０１５３】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨを含む。
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：４０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：４０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬ及びを含む。
【０１５４】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：６４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬ及びを含む。
【０１５５】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬ及びを含む。
【０１５６】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬ及びを含む。
【０１５７】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のアミノ酸配列の内いずれか一つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：４０、４１、４２、４３、４４、４５、又は４６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬ及びを含む。
【０１５８】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：３７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。
【０１５９】
一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：３９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：３９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＬを含む。
【０１６０】
一実施態様では、本発明はＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＥＧＦＲに特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＥＧＦＲに特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：２４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。
【０１６１】
一実施態様では、本発明はＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる単一特異性抗体を提供し、ここで、抗体は配列番号：３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。
【０１６２】
一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨを含む。一実施態様では、単一特異性抗体はＨＥＲ３に特異的に結合し、ここで、抗体は配列番号：３５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＨ、及び配列番号：２９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％ 配列同一性を有するＶＬを含む。
【０１６３】
幾つかの抗ＨＥＲ抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのためのカバット番号付けを示す例示的なアラインメントを図３３に示す。
本発明の別の態様は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体を提供し、ここで、抗体は、配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含み、ここで、配列番号：２５のＶＨは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、Ｆ２９（ＶＨ）、Ｔ３０（ＶＨ）、Ｎ３２（ＶＨ）、Ｖ４８（ＶＨ）、Ｐ５２ａ（ＶＨ）、Ｓ５３（ＶＨ）、Ｔ５７（ＶＨ）、Ｓ９６（ＶＨ）、又はＹ１００（ＶＨ）にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、抗体は、一を越えるこれらの置換を含む。一実施態様では、抗体はこれらの置換の全てを含む。一実施態様では、多重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含み、配列番号：２５のＶＨは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、Ｆ２９（ＶＨ）Ｌ；Ｔ３０（ＶＨ）Ｓ；Ｎ３２（ＶＨ）Ｄ、Ｖ４８（ＶＨ）Ｌ、Ｐ５２ａ（ＶＨ）Ａ、Ｓ５３（ＶＨ）Ａ、Ｔ５７（ＶＨ）Ｓ、Ｓ９６（ＶＨ）Ａ、及びＹ１００（ＶＨ）Ｆからなる群から選択される一又は複数のアミノ酸置換を含む。一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨを含み、配列番号：２５のＶＨは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、アミノ酸置換Ｆ２９（ＶＨ）Ｌ、Ｔ３０（ＶＨ）Ｓ、Ｎ３２（ＶＨ）Ｄ、Ｐ５２ａ（ＶＨ）Ａ、及びＳ５３（ＶＨ）Ａ、及びＹ１００（ＶＨ）を含む。
【０１６４】
本発明の別の態様は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含んでなる多重特異性抗体を提供し、ここで、抗体は配列番号：５８のアミノ酸配列を含んでなるＶＬ含み、配列番号：５８のＶＬは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｖ２９（ＶＬ）、Ｓ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｖ３３（ＶＬ）、Ｓ５０（ＶＬ）、Ａ５１（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｓ９１（ＶＬ），Ｙ９２（ＶＬ）、Ｔ９３（ＶＬ）、Ｔ９４（ＶＬ）、又はＰ９６（ＶＬ）にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、抗体は、一を越えるこれらの置換を含む。一実施態様では、抗体はこれらの置換の全てを含む。一実施態様では、抗体はアミノ酸３１及びアミノ酸３２の間にアミノ酸挿入を含む。
【０１６５】
一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：５８のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含み、配列番号：５８のＶＬは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、Ｄ２８（ＶＬ）Ｎ、Ｖ２９（ＶＬ）Ｉ、Ｖ２９（ＶＬ）Ｌ、Ｓ３０（ＶＬ）Ａ、Ａ３２（ＶＬ）Ｄ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｅ、Ｔ９３（ＶＬ）Ｐ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｅ、及びＰ９６（ＶＬ）Ｙからなる群から選択される一又は複数のアミノ酸の置換を含む。一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：５８のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含み、配列番号：５８のＶＬは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、アミノ酸置換Ｄ２８（ＶＬ）Ｎ、Ｖ２９（ＶＬ）Ｉ、Ｓ３０（ＶＬ）Ａ、Ａ３２（ＶＬ）Ｄ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｅ、Ｔ９３（ＶＬ）Ｐ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｅ、及びＰ９６（ＶＬ）Ｙを含む。
【０１６６】
一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：５８のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含み、配列番号：２５のＶＨは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、Ｆ２９（ＶＨ）、Ｔ３０（ＶＨ）、Ｎ３２（ＶＨ）、Ｖ４８（ＶＨ）、Ｐ５２ａ（ＶＨ）、Ｓ５３（ＶＨ）、Ｔ５７（ＶＨ）、Ｓ９６（ＶＨ）、又はＹ１００（ＶＨ）にアミノ酸置換を含み、配列番号：５８のＶＬは、Ｄ２８（ＶＬ）、Ｖ２９（ＶＬ）、Ｓ３０（ＶＬ）、Ｔ３１（ＶＬ）、Ａ３２（ＶＬ）、Ｖ３３（ＶＬ）、Ｓ５０（ＶＬ）、Ａ５１（ＶＬ）、Ｆ５３（ＶＬ）、Ｓ９１（ＶＬ），Ｙ９２（ＶＬ）、Ｔ９３（ＶＬ）、Ｔ９４（ＶＬ）、又はＰ９６（ＶＬ）にアミノ酸置換を含む。一実施態様では、抗体は、一を越えるこれらの置換を含む。一実施態様では、抗体はこれらの置換の全てを含む。
【０１６７】
一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：５８のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含み、配列番号：２５のＶＨは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、Ｆ２９（ＶＨ）Ｌ；Ｔ３０（ＶＨ）Ｓ；Ｎ３２（ＶＨ）Ｄ、Ｖ４８（ＶＨ）Ｌ、Ｐ５２ａ（ＶＨ）Ａ、Ｓ５３（ＶＨ）Ａ、Ｔ５７（ＶＨ）Ｓ、Ｓ９６（ＶＨ）Ａ、及びＹ１００（ＶＨ）Ｆからなる群から選択される一又は複数のアミノ酸置換を含み、配列番号：５８のＶＬはＤ２８（ＶＬ）Ｎ、Ｖ２９（ＶＬ）Ｉ、Ｖ２９（ＶＬ）Ｌ、Ｓ３０（ＶＬ）Ａ、Ａ３２（ＶＬ）Ｄ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｅ、Ｔ９３（ＶＬ）Ｐ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｅ、及びＰ９６（ＶＬ）Ｙからなる群から選択される一又は複数のアミノ酸の置換を含む。
【０１６８】
一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含み、ここで、抗体は配列番号：２５のアミノ酸配列を含んでなるＶＨ、及び配列番号：５８のアミノ酸配列を含んでなるＶＬを含み、配列番号：２５のＶＨは、カバット番号付け方式に従って番号を付して、アミノ酸の置換Ｆ２９（ＶＨ）Ｌ、Ｔ３０（ＶＨ）Ｓ、Ｎ３２（ＶＨ）Ｄ、Ｐ５２ａ（ＶＨ）Ａ、及びＳ５３（ＶＨ）Ａ、及びＹ１００（ＶＨ）Ｆを含み、配列番号：５８のＶＬはアミノ酸置換Ｄ２８（ＶＬ）Ｎ、Ｖ２９（ＶＬ）Ｉ、Ｓ３０（ＶＬ）Ａ、Ａ３２（ＶＬ）Ｄ、Ｙ９２（ＶＬ）Ｅ、Ｔ９３（ＶＬ）Ｐ、Ｔ９４（ＶＬ）Ｅ、及びＰ９６（ＶＬ）Ｙを含む。
【０１６９】
突然変異誘発に対して好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Cunningham及びWells (1989) Science, 244:1081-1085に記載されたような「アラニンスキャニング突然変異誘発法」と呼ばれる。ここでは、残基又は標的残基群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕのような荷電残基）、中性の又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置換され、抗原とのアミノ酸の相互作用に影響を及ぼす。置換に対して機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置を、ついで、置換部位に又は置換部位のために、更に又は他の変異を導入することによって洗練される。よって、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定されているが、変異自体の性質は予め決定される必要はない。例えば、任意の部位での変異の性能を分析するために、アラニンスキャニング又は無作為突然変異誘発法が、標的コドン又は領域で実施され、発現された免疫グロブリンが所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１７０】
アミノ酸配列挿入は、長さが１残基から百以上の残基を含むポリペプチドまで及ぶ、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を増加させる酵素（例えばＡＤＥＰＴ）又はポリペプチドへの抗体のＮ又はＣ末端の融合を含む。
【０１７１】
グリコシル化変異体
ある実施態様では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される度合いを増大又は減少させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。よって、ポリペプチド中のこれらトリペプチド配列の何れかの存在は潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合グリコシル化は、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられるが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへのＮ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つの糖の結合を意味する。
【０１７２】
抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、アミノ酸配列を、上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)の一又は複数が作製され又は除去されるように改変させることによって、簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされうる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。
抗体がＦｃ領域を含む場合、そこに結合される炭水化物が改変されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に対するＮ結合により一般的に結合される分枝状、二分岐のオリゴ糖を含む。例えば、Wright等 (1997) TIBTECH 15:26-32を参照。オリゴ糖は種々の炭水化物、例えばマンノース、Ｎ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)、ガラクトース、及びシアル酸を含み得、並びにフコースが二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合される。幾つかの実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾が、ある種の改善された特性を有する抗体変異体を生じせしめるために、なされうる。
【０１７３】
一実施態様では、Ｆｃ領域に(直接又は間接的に)結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。例えば、かかる抗体におけるフコースの量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％でありうる。フコースの量は、例えば国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析法によって測定して、Ａｓｎ２９７（例えば複合のハイブリッド及び高マンノース構造）に結合した全ての糖構造の合計に対してＡｓｎ２９７の糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７はＦｃ領域内の薬２９７位（Ｆｃ領域のＥｕ番号付け）に位置したアスパラギン残基を意味する；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体中のマイナーな配列変異のために、２９７位から約±３アミノ酸上流又は下流に、つまり２９４位と３００位の間に位置している場合がありうる。そのようなフコシル化変異体は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)を参照。「脱フコシル化された」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連した刊行物の例には、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；国際公開第２０００／６１７３９号；国際公開第２００１／２９２４６号；米国特許出願公開第２００３／０１１５６１４号；米国特許出願公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；国際公開第２００３／０８５１１９号；国際公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)が含まれる。脱フコシル化抗体を生産可能な細胞株の例には、タンパク質フコシル化に欠けているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ripka等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８Ａ１号, Presta, L；及び国際公開第２００４／０５６３１２Ａ１号, Adams等，特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y等, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）が含まれる。
【０１７４】
例えば抗体のＦｃ領域に結合した二分オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分される二分オリゴ糖を有する抗体変異体が更に提供される。そのような抗体変異体は、フコシル化が低減され、及び／又はＡＤＣＣ機能が改善されている場合がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号(Jean-Mairet等)；米国特許第６６０２６８４号(Umana等)；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号(Umana等)に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖に少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有している場合がある。このような抗体変異体は、例えば国際公開第１９９７／３００８７号(Patel等)；国際公開第１９９８／５８９６４号(Raju, S.)；及び国際公開第１９９９／２２７６４号(Raju, S.)に記載されている。
【０１７５】
Ｆｃ領域変異体
ある実施態様では、一又は複数のアミノ酸修飾が、ここに提供される抗体のＦｃ領域に導入されてもよく、これによりＦｃ領域変異体が生成される。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含んでなるヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１７６】
ある実施態様では、本発明は、幾つかであるが全てではないエフェクター機能を持つ抗体変異体を考察し、これは、抗体を、インビボでの抗体の半減期は重要であるが、あるエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣ）は不要か又は有害である用途のために望ましい候補とする。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／喪失を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイが実施されうる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（よってＡＤＣＣ活性を欠くと思われる）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確かめるために実施されうる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγＩＩ及びＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するための非限定的なインビトロアッセイが米国特許第５５００３６２号(例えばHellstrom, I.等 Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)を参照)及びHellstrom, I等, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；5,821,337 (Bruggemann, M.等, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照)に記載されている。別法では、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ(商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA；及びＣｙｔｏ Ｔｏｘ９６(登録商標)非放射性細胞傷害性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照）。このようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)に記載されているような動物モデルにおいてインビボで評価されうる。Ｃｌｑ結合アッセイが、抗体がＣｌｑに結合できず、よってＣＤＣ活性を欠くことを確認するためにまた実施されうる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（Gazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S.等, Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期定量も当該分野で知られている方法を使用して実施することがまたできる（例えば、Petkova, S.B.等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)を参照）。
【０１７７】
減少したエフェクター機能を有する抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一又は複数の置換を有するものを含む（米国特許第６７３７０５６号）。このようなＦｃ変異体は、二又はそれ以上のアミノ酸位２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７に置換を有するＦｃを含み、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む（米国特許第７３３２５８１）。
ＦｃＲへの改良又は縮小された結合を有するある種の抗体変異体が記載されている（米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照）。
ある実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する一又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４での置換(残基のＥＵ番号付け)を有するＦｃ領域を含む。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、例えば米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)に記載されているように、改変された（つまり、改善又は縮小）Ｃｌｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を生じる改変がＦｃ領域に改変がなされる。
増加した半減期及び胎児への母性ＩｇＧｓの移動に関与する新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))への改善された結合性を有する抗体が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４Ａ１（Hinton等)に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一又は複数での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７３７１８２６号）。
Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、Duncan及びWinter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１７９】
システイン操作抗体変異体
ある実施態様では、システイン操作抗体、例えば抗体の一又は複数の残基がシステイン残基で置換される「ｔｈｉｏＭＡｂｓ」を作ることが望ましいことがある。特定の実施態様では、置換される残基が抗体の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインと置換することによって、反応性チオール基が抗体の接近可能な部位に位置させられ、抗体を他の部分、例えば薬剤部分又はリンカー薬剤部分に結合させ、ここで更に説明されるようにイムノコンジュゲートを作るために使用されうる。ある実施態様では、以下の残基の任意の一又は複数がシステインと置換されうる：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作抗体は、例えば米国特許第７５２１５４１号に記載されるようにして、産生されうる。
【０１８０】
抗体誘導体
ある実施態様では、ここに提供される抗体は、当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定しないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利でありうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１８１】
他の実施態様では、放射線への暴露によって選択的に加熱されうる非タンパク質様部分及び抗体のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである(Kam等 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005))。放射線は任意の波長のものであってよく、限定するものではないが、通常の細胞に害を与えないが、抗体-非タンパク質様部分に近位の細胞が死滅させられる温度まで非タンパク質様部分を加熱する波長が含まれる。例えば、Petkova, S.B.等, Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))を参照のこと。
【０１８２】
一又は複数のアミノ酸置換を有する他の抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発について関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ改変もまた考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。「例示的置換」と名前を付けたより実質的な変化が表４に提供され、又はアミノ酸クラスに関連して以下に更に記載される。アミノ酸置換を、対象の抗体中に導入し、例えば所望される活性、例えば改善された抗原結合性、減少した免疫原性、改善されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ等について生成物をスクリーニングすることができる。
【０１８３】
0005624114.tif 000002
【０１８４】
抗体の生物学的性質における修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす置換を選択することにより達成されうる。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(A. L. Lehninger, Biochemistry, 2版, pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975))：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｌｅｕ（Ｌ），Ｉｌｅ（Ｉ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），Ｔｒｐ（Ｗ），Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）未電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ），Ｓｅｒ（Ｓ），Ｔｈｒ（Ｔ），Ｃｙｓ（Ｃ），Ｔｙｒ（Ｙ），Ａｓｎ（Ｎ），Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ），Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ），Ａｒｇ（Ｒ），Ｈｉｓ（Ｈ）
別法では、天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１８５】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを他のクラスに交換することを必要とするであろう。このような置換残基も、保存的置換部位か、残存する(非保存的)部位に、導入することができる。
【０１８６】
一つの種類の置換変異体は、親抗体(例えばヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基を置換することを含む。一般に、更なる開発用に選択される得られた変異体は、それらが産生される親抗体に対して変更された（例えば改善された）生物学的特性を有しているであろう。例示的な置換変異体は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟法を使用して簡便に生産されうる親和性成熟抗体である。簡単に述べると、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６〜７の部位)を変異させることにより、各部位に可能な全てのアミノ酸置換を生じさせる。このようにして産生される抗体は、各粒子内にパッケージされるファージコートタンパク質(例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物)の少なくとも一部への融合物として、糸状ファージ粒子からディスプレイされる。ついで、ファージディスプレイされた変異体は、その生物的活性(例えば結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、スキャニング変異誘導法(例えばアラニンスキャニング)を実施して、抗原結合に有意に貢献する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又は付加的に、抗原抗体複合体の結晶構造を分析することにより、抗体と抗原との接触点を同定することが有効である。このような接触残基及び隣接残基は、ここに説明するものを含む当該分野で知られている技術による置換の候補である。そのような変異体がひとたび生成されれば、ここに記載のものを含む当該分野で知られている技術を用いて変異体パネルのスクリーニングを行い、更なる開発のために一又は複数の関連アッセイで優れた特性を有する抗体を選択することができる。
【０１８７】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当該分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又はオリゴヌクレオチド媒介性(又は部位特異的)突然変異誘発法による調製、ＰＣＲ突然変異誘発法、及び前もって調製された変異体又は抗体の非変異型のカセット変異導入法を含むが、これらに限定されない。
【０１８８】
免疫コンジュゲート
本発明は、また化学療法剤、薬剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素的に活性な毒素、又はその断片)、又は放射性同位体、例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート)などの一又は複数の細胞傷害剤にコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲート（交換可能に「抗体-薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」とも称される）を提供する。
【０１８９】
免疫コンジュゲートは、細胞傷害剤、すなわち癌治療において腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局所的デリバリーに使用されている(Lambert, J. (2005) Curr. Opinion in Pharmacology 5:543-549；Wu 等 (2005) Nature Biotechnology 23(9):1137-1146；Payne, G. (2003) i 3:207-212；Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614；Niculescu-Duvaz及びSpringer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第４９７５２７８号)。免疫コンジュゲートは、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積を可能とするものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05；Thorpe (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」 Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera等編, pp. 475-506)。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であると報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体-毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、リシンのような植物毒素、ゲルダナマイシン(Mandler等(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandler等(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandler等(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(欧州特許出願公開第１３９１２１３号；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等 (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等 (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などの小分子毒素が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞傷害性効果を奏しうる。ある種の細胞傷害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１９０】
トラスツズマブ−ＤＭ１（又はＴ−ＤＭ１）はＨＥＲ２過剰発現癌のトラスツズマブ感受性及びトラスツズマブ非感受性モデルに効果があることが示されている（米国特許第７０９７８４０号）。ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体-放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等 (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等 (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等 (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第４９７０１９８号；同第５０７９２３３号；同第５５８５０８９号；同第５６０６０４０号；同第５６９３７６２号；同第５７３９１１６号；同第５７６７２８５号；同第５７７３００１号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)を、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として結腸、膵臓、胃などの治療について試験する第二相治験に入っている。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ-２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療用に開発中である。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等 (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療薬開発段階にある。
【０１９１】
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは抗体と化学療法剤又は他の毒素を含有する。免疫コンジュゲートの生成に有用な化学治療薬を本明細書中(上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例えば１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
【０１９２】
抗体と一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン及びＣＣ１０６５のコンジュゲート、並びに毒素活性を有するこれら毒素の誘導体もまたここで検討される。
【０１９３】
メイタンシン及びメイタンシノイド
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートした抗体（完全長又は断片）を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及びアナログは、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
【０１９４】
メイタンシノイド薬剤部分は、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である、（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、（ｉｉｉ）血漿中で安定、（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤部分である。
【０１９５】
メイタンシノイドを含む免疫コンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５２０８０２０号、同５４１６０６４号、欧州特許第０４２５２３５号Ｂ１に開示されており、その開示は出典を明示してここに援用される。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞傷害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞傷害性は、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原を発現するヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞傷害度が達成され、該細胞傷害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加し得た。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞傷害性を示した。
【０１９６】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子の何れかの生物学的活性を有意に低減させることなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５２０８０２０号(この開示内容は出典明示により明示的にここに援用される)を参照。１分子の毒素／抗体は、ネイキッド抗体の使用に対して細胞傷害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞傷害性を向上させる効力を示した。メイタンシノイドは当該分野でよく知られており、既知の技術によって合成することも、又は天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した非特許刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール及び様々なメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノールアナログである。
【０１９７】
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び２００４年１０月８日に出願の米国特許出願第１０／９６０６０２号(その開示内容は出典明示により明示的に援用される)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該分野で知られている多くの連結基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、２００４年１０月８日に出願の米国特許出願第１０／９６０６０２号に開示されるようにして調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる連結基をここに記載し、例示する。
【０１９８】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合をよもたらすためにＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737(1978))が含まれる。
【０１９９】
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、常套的なカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様では、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールアナログのＣ-３位で形成される。
【０２００】
アウリスタチン類及びドラスタチン類
ある実施態様では、免疫コンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号)にコンジュゲートした抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第５６６３１４９号)及び抗真菌性活性(Pettit 等(1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開第０２／０８８１７２号)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、その開示の全体が明示的に出典明示により援用される「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」、２００４年１１月５日に出願の米国特許出願第１０／９８３３４０号に開示されるＮ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含む。
【０２０１】
典型的には、ペプチドベースの薬剤部分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野においてよく知られている液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder及びK. Lubke, 「The Peptides」 1巻, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、出典明示によってその全体がここに援用されるDoronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; 「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」、２００４年１１月５日に出願の米国特許出願第１０／９８３３４０号も参照のこと（例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調製方法を開示している)。
【０２０２】
カリケアマイシン
他の実施態様では、免疫コンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブピコモル濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。従って、抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞傷害効果が大きく向上する。
【０２０３】
他の細胞傷害剤
抗体とコンジュゲートされうる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として知られている薬剤ファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
【０２０４】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートを更に考察する。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、様々な放射性同位体が利用できる。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ｍｒｉとしても知られている)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射性又は他の標識が、既知の方法でコンジュゲートに導入されうる。例えば、ペプチドは生合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。ＩＯＤＯＧＥＮ法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０２０５】
抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは細胞中の細胞傷害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」でありうる。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用されうる(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
該化合物は、限定するものではないが、架橋剤：(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ-ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ-ＥＭＣＳ、スルホ-ＧＭＢＳ、スルホ-ＫＭＵＳ、スルホ-ＭＢＳ、スルホ-ＳＩＡＢ、スルホ-ＳＭＣＣ、及びスルホ-ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ (スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)で調製されるＡＤＣが明示的に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
【０２０６】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)はリンカー(Ｌ)を介して、一又は複数の薬剤部分(Ｄ)、例えば１抗体につき約１から約２０の薬剤部分にコンジュゲートされる。式ＩのＡＤＣは、（１）抗体の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してＡｂ-Ｌを形成した後、薬剤部分Ｄと反応させること；及び（２）薬剤部分の求核基を二価のリンカー試薬と反応させて共有結合を介してＤ-Ｌを形成した後、抗体の求核基と反応させることを含み、当業者に知られている有機化学反応、状態及び試薬を用いる幾つかの手段によって調製されうる。ＡＤＣを調製するための更なる方法はここに記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ                      Ｉ
【０２０７】
リンカーは、一又は複数のリンカー成分から構成されうる。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「ｖａｌ−ｃｉｔ」)、アラニン-フェニルアラニン(「ａｌａ−ｐｈｅ」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当該分野で知られており、その幾つかはここに記載される。また、その内容の全体が出典明示によりここに援用される「Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands」、２００４年１１月５日に出願された米国特許出願公開第１０／９８３３４０号もまた参照のこと。
【０２０８】
ある実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ)、アラニン-フェニルアラニン(ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ)及びグリシン-グリシン-グリシン(ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設計され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性で最適化できる。
【０２０９】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核性であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。よって、各々のシステイン架橋は、理論的には２の反応性のチオール求核基を形成する。更なる求核基は、チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又はその断片)に導入されうる。
【０２１０】
また、抗体薬剤コンジュゲートは、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応しうる求電子性の部分を導入する抗体の修飾によって生産してもよい。グリコシル化された抗体の糖鎖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan及びStroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応させることができる。
【０２１１】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基で、リンカー部分上の求電子性の基及び（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含むリンカー試薬と反応して共有結合を形成可能なもの。
【０２１２】
別法として、抗体及び細胞傷害剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製されうる。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含みうる。
また他の実施態様では、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートしてもよく、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与した後、清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞傷害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０２１３】
組換え法及び組成物
抗体は、組換え法及び組成物を使用して製造されてもよく、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されている。一実施態様では、ここに記載されている抗ＨＥＲ抗体をコードする単離核酸を提供する。このような核酸は、ＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードしてもよい（例えば、抗体の軽及び／重鎖）。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様では、このような核酸を含んでなる宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなるベクター、又は（２）抗体のＶＬを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第一ベクター、及び抗体のＶＨを含んでなるアミノ酸配列をコードする核酸を含んでなる第２ベクターを含む（例えば、これらによって形質転換される）。一実施態様では、宿主細胞は真核細胞であり、例えばチャイニーズハムスター（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ球細胞（例えばＹ０，ＮＳ０，Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、上述したように、抗ＨＥＲ抗体を作成する方法が提供され、該方法は、抗体をコードする核酸を含んでなる宿主細胞を培養することを含み、抗体の発現に適した状態で実施され、任意で宿主細胞（又は宿主細胞培養地）から抗体を回収する。
【０２１４】
抗ＨＥＲ抗体の組換え生産のために、抗体をコードした核酸、例えば上述したようなものが単離され、宿主細胞での更なるクローニング及び／又は発現のために、一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、直ちに単離され一般的手順を使用して配列決定されうる（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。
【０２１５】
抗体をコードするベクタークローニング又は発現のために最適な宿主細胞は、本明細書に記載されるような原核細胞又は真核細胞である。例えば、抗体は、細菌で生産されてもよく、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合に適する。細菌での抗体断片及びポリペプチドの発現については、米国特許第５６４８２３７号、米国特許第５７８９１９９号、及び米国特許第５８４０５２３号を参照のこと。（また大腸菌での抗体断片の発現を記載するCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254を参照のこと。）発現後、抗体を、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離することができ、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、抗体をコードするベクターのためのクローニング又は発現宿主として適切であり、グリコシル化経路が「ヒト化」され、部分的に又は完全なヒトグリコシル化パターンでの抗体の生産となる菌及び酵母株を含む。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、及びLi等, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照。
【０２１６】
グリコシル化抗体の発現のために適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からもまた得られる。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫の細胞を含む。昆虫細胞と併用されてもよく、特にヨウトガ細胞のトランスフェクションに使用されうる多くのバキュロウィルス株が同定されている。米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（遺伝子導入植物中において抗体を生産するためのPLANTIBODIESTM技術を記載）を参照のこと。
【０２１７】
脊椎動物細胞がまた宿主細胞として使用されうる。例えば、懸濁状態で増殖するよう適合された哺乳類動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳類動物細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（Graham等, J. Gen Virol. 36:59 (1977)に記載された２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞(例えばMather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)に記載されたＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)に記載されたようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞(Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；及びＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株を含む。抗体生産のために適した哺乳類動物宿主細胞株の概説には、Yazaki及びWu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248（B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), pp255-268(2003)を参照。
【０２１８】
治療用途
ここに記載される抗体及び抗体断片は、前癌性、非転移性、及び癌性の腫瘍（例えば、早期癌）を含む癌の治療のため、又は例えば乳癌など進行する危険性のある患者の治療のために使用できる。抗体及び抗体断片は、例えば神経変性疾患、精神障害、又は自己免疫疾患などの非悪性疾病を治療又は予防するために使用されうる。
【０２１９】
癌なる用語は、増殖性疾患の集合を包含し、前癌成長、良性腫瘍、及び悪性腫瘍を含むがこれに限らない。良性腫瘍は原発部位にとどまり、離れた部位に浸潤、侵入、又は転移する能力を持たない。悪性腫瘍は、それらの周りの他の組織に侵入し損傷するだろう。悪性腫瘍は、それらが始まった場所から離れ、体の他の部分に広がる（転移性）能力を得ることもでき、通常は、血流、又はリンパ節が存在するリンパ系を通る。原発腫瘍は、発現した組織のタイプによって分類され；転移性腫瘍は癌細胞が由来する組織のタイプによって分類される。時間とともに、悪性腫瘍の細胞はより異常になり、正常細胞と異って見える。癌細胞の形態における変化は腫瘍悪性度と呼ばれ、癌細胞は、高分化型、中分化型、低分化型、又は未分化型であると記載される。高分化型細胞は、非常に正常な形態であり、起因する正常細胞に似ている。未分化細胞は、細胞の由来を決定できない程に異常となっている細胞である。
【０２２０】
腫瘍は、固形腫瘍、又は非固形又は軟部腫瘍である。軟部腫瘍の例は、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、成人急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、成熟Ｂ細胞リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、前リンパ球性白血病、又はヘアリーセル白血病）、又はリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、又はホジキン病）を含む。固形腫瘍は、血液、骨髄、又はリンパ系以外の体組織の何れの癌を含む。固形腫瘍は、更に、上皮性細胞由来及び非上皮性細胞由来に分けられる。上皮性細胞固形腫瘍の例は、消化管、結腸、乳房、前立腺、肺、肝臓、腎臓、膵臓、卵巣、 頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、大腸、肛門、胆嚢疾患、口唇、上咽頭、皮膚、子宮、男性生殖器器官、尿路、膀胱、及び皮膚（メラノーマを含む）である。非上皮性由来の固形腫瘍は、肉腫、脳腫瘍、及び骨腫瘍を含む。
上皮癌は一般的に良性腫瘍から前浸潤ステージ（例えば、上皮内癌）、基底膜を突き抜け上皮下間質に侵入した転移性癌に発展する。
【０２２１】
一実施態様では、多重特異性抗体はＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４などの少なくとも一つの他のＨＥＲレセプターに特異的に結合し、固形腫瘍、特に結腸直腸、肺（例えば非小細胞肺癌及び扁平上皮癌）、頭頸部癌、卵巣、皮膚、膵臓、及び／又は乳腺腫瘍の予防及び／又は治療において有用である。
多重特異性抗体はまたＨＥＲ経路標的治療に対する耐性を低減又は防止するのにも有用である。ＨＥＲ経路を標的とする治療をする際に重大な制限は、治療の治療効果に多くの癌患者が見せる耐性である。ある患者はＨＥＲ経路標的治療に何の反応も示さない。他の癌患者は初期反応は示すが、治療に対して耐性を持つようになる。癌が治療を受けている間に進行（不応）し、又は癌が治療計画を完了後１２ヶ月以内に進行（再発）した場合、癌は治療に耐性である。
一実施態様では、ＨＥＲ経路標的治療は、ＨＥＲ経路を標的をした抗体（例えば、ＥＧＦＲ抗体、ＨＥＲ２抗体、ＨＥＲ３抗体、及び／又はＨＥＲ４抗体）での治療を含む。別の実施態様では、ＨＥＲ経路標的治療は化学療法剤での治療を含む。
【０２２２】
投薬量及び製剤
ここでの抗体又は抗体断片組成物は、良好な医療行為と一致した様式で、処方され、用量決定され、投与されるであろう。この文脈で考慮される要因には、治療される特定の疾患、治療される特定の被験者、患者個人の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、組合せられる薬剤の薬物-薬物相互作用、及び医師に知られている他の要因が含まれる。投与される抗体又は抗体断片の「治療的に有効な量」は、それらの考慮によって支配され、癌を予防し、寛解させ、又は治療するのに必要な最小量である。抗体又は抗体断片は、癌又は癌を発症するリスクを予防又は治療するのに現在使用されている一又は複数の薬剤と共に製剤する必要はないが、場合によってはそのようにされる。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体又は抗体断片の量、疾患又は治療の種類、及び上で検討された他の因子に依存する。これらは、一般に、これまでに使用されるものと同じ用量及び投与経路で、又はこれまでに用いられた用量の約１から９９％で、用いられる。一般に、癌の寛解又は治療は、癌に伴う一又は複数の症状又は医療的問題を減少させることを含む。治療的に有効な量の薬剤により、次のものの一つ又は組合せを達成することができる：癌細胞の数の減少（少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％又はそれ以上）；腫瘍サイズ又は腫瘍負荷の減少；癌細胞の周辺器官への浸潤の阻害(すなわち、ある程度に減少させ、及び／又は停止させる)；腺腫の場合はホルモン分泌の減少；血管密度の減少；腫瘍転移の阻害；腫瘍増殖の減少又は阻害；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状のある程度の緩和。幾つかの実施態様では、抗体又は抗体断片は、患者における癌の発症又は再発を予防するために使用される。
【０２２３】
一実施態様では、本発明は癌であることが疑われるか又は診断されたヒト患者の生存期間を増加させるために使用することができる。生存期間は薬剤の最初の投与から死までの期間として定義される。生存期間はまた治療中の患者の死亡リスクを表す治療群対コントロール群の層化ハザード比（ＨＲ）によって測定することもできる。
更に他の実施態様では、本発明の治療法は、様々な抗癌治療で治療される癌であると疑われるか診断された一群のヒト患者において奏効率を有意に増加させる。奏効率は治療に反応した治療された患者の割合と定義される。一態様では、抗体又は抗体断片と外科手術、放射線療法、又は一又は複数の化学療法剤を使用する本発明の併用治療法は、外科手術、放射線療法、又は化学療法単独で治療された群と比較して治療患者群において奏効率を有意に増大させ、該奏効率は０．００５未満のχ二乗ｐ値を有する。
癌の治療における治療効果の更なる測定法は米国特許出願公開第２００５０１８６２０８号に記載されている。
【０２２４】
治療用製剤は、任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と共に、所望の純度を有する活性成分とを混合することにより、当該分野で知られている標準的な方法を使用して調製される(Remington's Pharmaceutical Sciences(第20版), A. Gennaro編, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA)。許容可能な担体は、生理食塩水、又はバッファー、例えばホスファート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭化水素；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーン(TWEEN)ＴＭ、プルロニクス(PLURONICS)ＴＭ又はＰＥＧを含む。
【０２２５】
場合によっては、しかし好ましくは、製剤は薬学的に許容可能な塩、好ましくは塩化ナトリウムを、好ましくは生理学的濃度で含有する。場合によっては、本発明の製剤は、薬学的に許容可能な保存料を含有することができる。幾つかの実施態様では、保存料濃度は、典型的には０．１〜２．０％ｖ／ｖの範囲である。適切な保存料には、製薬分野でよく知られているものが含まれる。ベンジルアルコール、フェノール、ｍ-クレゾール、メチルパラベン、及びプロピルパラベンが、好ましい保存料である。場合によっては、本発明の製剤は０．００５〜０．０２％の濃度で薬学的に許容可能な界面活性剤を含有することができる。
ここでの製剤は、治療される特定の徴候に応じて、必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを更に含有可能である。このような分子は、意図する目的にとって効果的な量で組合せて、適切に存在する。
また、活性成分は、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルションにおいて、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに包括されていてもよい。このような技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciencesに開示されている。
【０２２６】
徐放性調製物を調製することもできる。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフェア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物活性の喪失及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の使用、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２２７】
ここに記載される抗体及び抗体断片は、既知の方法、例えばボーラス、もしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、ヒトの患者に投与される。大きい副作用又は毒性がＨＥＲ（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４等）拮抗作用を伴う場合、局所投与が特に望まれるだろう。エクスビボストラテジーも治療への応用に使用できる。エクスビボストラテジーは患者から得られた細胞を、抗体又は抗体断片をコードしたポリヌクレオチドで形質移入又は形質導入することを含む。形質移入又は形質導入された細胞はついで患者に戻される。細胞は、広範なタイプの何れのものが可能であり、造血性細胞（例えば、骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞）、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、又は筋細胞を含むが、これに限定されない。
一例では、障害又は腫瘍の位置が許せば、抗体又は抗体断片は、例えば直接注入により局所投与され、注入は周期的に繰り返されうる。抗体又は抗体断片はまた患者に全身性に又は腫瘍細胞に例えば腫瘍の外科的切除後に局所再発又は転移を防止又は低減するために腫瘍又は腫瘍床に直接的に送達させることが可能である。
【０２２８】
疾病の予防又は治療のための、本発明の抗体の適切な投与量（単独で、又は一又は複数の更なる治療薬との組合せで使用される場合）は、治療される疾病のタイプ、抗体のタイプ、疾病の重症度及び経過、抗体が予防目的又は治療目的のための投与かどうか、過去の治療法、患者の臨床歴及び抗体への反応、及び主治医の裁量に依存する。抗体は、一度で、又は一連の治療にわたって患者に適切に投与される。疾病のタイプ及び重症度によって、約１μｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ−１５ｍｇ／ｋｇ）の抗体が患者への投与として初回候補投与量となり、例えば、一又は複数の別個の投与か、連続投与かによる。典型的な一日投与量は、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上であり、上述の要因に依存する。何日か又はより長期にわたる反復投与では、状態に依存して、治療は、疾患徴候の望まれる抑制が生じるまで一般的に維持される。抗体の一つの例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、又は２０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの何れかの組合せ）の一又は複数用量が患者に投与されうる。このような用量は断続的に投与され得、例えば、毎週、２週毎、又は３週毎（例えば、患者は約２から約２０、又は例えば約６用量の抗体投与を受けるように）。初回のより高い負荷用量の後、一又は複数の低用量が投与されうる。例示的な投与レジメンは約４ｍｇ／ｋｇの初回負荷用量と、続く約２ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投与レジメンが有用でありうる。この治療の進行は、一般的な技術及びアッセイで容易にモニターされる。
【０２２９】
併用療法
本発明の抗体は、抗癌性を有する第２の化合物と、併用治療法として、薬学的併用製剤又は投与レジメンで組合せることができる。薬学的併用製剤又は投与レジメンの第２の化合物は、互いに悪影響を及ぼさないように、組合せの抗体に対して相補活性を有しうる。一実施態様では、多重特異性抗体は他の抗ＨＥＲ抗体、例えばハーセプチン（登録商標）、ペルツズマブ、及び／又はセツキシマブと組合わせて使用される。本発明の抗体はまた放射線療法と組合わせて使用されうる。
【０２３０】
第２の化合物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤でありうる。このような分子は、意図する目的に対して有効な量で組合せて、適切に存在する。本発明の抗体を含む薬学的組成物は、治療的有効量の化学療法剤、例えばチューブリン形成インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、ＤＮＡ干渉物質、又はＤＮＡバインダーを含有可能である。
他の治療レジメンは、この発明に従って同定された抗癌剤の投与と組合せることができる。併用療法は同時の又は逐次的レジメンとして投与されうる。逐次的に投与される場合、組合せは２又はそれ以上の投与で投与されうる。組合せ投与には、別々の製剤又は単一の薬学的組成物を使用した同時投与、及び何れかの順序での連続投与が含まれ、ここで、双方(又は全ての)活性剤がその生物活性を同時に奏する期間がある。
【０２３１】
かかる併用療法の例は、化学療法剤、例えばエルロチニブ(Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、スーテント（ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ，ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，Ｇｌａｘｏ Ｓｍｉｔｈ Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ）、及びゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、アルキル化剤、例えばチオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロホスファミド；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパ；エチレンイミン及びメチラメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン（ranimnustine）；抗生物質、例えばエネジン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１；ダイネミシン、例えばダイネミシンＡ；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ���５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダラルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾトシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート、プリンアナログ、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎薬、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えばメイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン、スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（無Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドセタキセル；Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）；６−チオグアニ��；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金アナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））；イバンドロネート；ＣＰＴ−Ｉ１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；及び上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸及び誘導体との組合せを含む。
【０２３２】
そのような併用療法は、また、(ｉ)腫瘍に対するホルモン作用を調節し又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節薬(ＳＥＲＭ)、例えばタモキシフェン(例えばNOLVADEX(登録商標)；タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びFARESTON・トレミフィン(toremifine)；(ｉｉ)副腎においてエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター、例えば、４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロール酢酸エステル、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニ(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；(ｉｉｉ)抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；(ｉｖ)プロテインキナーゼ阻害剤；(ｖ)脂質キナーゼインヒビター；(ｖｉ)アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に例えばＰＫＣ-アルファ、Ｒａｌｆ及びＨ-Ｒａｓのような異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；(ｖｉｉ)リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えば、ANGIOZYME(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現インヒビター；(ｖｉｉｉ)ワクチン、例えば遺伝子療法ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；(ｉｘ)抗血管新生剤、例えばベバシズマブ(AVASTIN(登録商標)，Genentech)；及び(ｘ)上記の何れかの薬学的に許容可能な塩、酸又は誘導体を含む。
【０２３３】
このような化学療法剤の調製及び投与スケジュールは、製造者の使用説明書に従うか、又は当業者により経験的に決定されるようにして使用することができる。また、このような化学療法の調製及び投与スケジュールは、Chemotherapy Service, (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Mdに記載されている。
併用療法は、併せて使用される活性成分が化合物を別個に使用して得られた効果の合計よりも大きい場合に「相乗効果」をもたらし、「相乗的」、つまり効果が達成されることが分かる。相乗効果は、活性成分が、（１）同時処方され、併用された単位投薬製剤として同時に投与又は送達され；（２）別個の製剤として交互に又は平行して送達される場合；又は（３）ある種の他のレジメンによって、達成することができる。交互療法で送達される場合、相乗効果は、化合物が、例えば別個にシリンジで、異なった注射によって逐次的に投与され又は送達されるときに達成できる。一般に、交互療法の間、各活性成分の有効用量が逐次的、つまり連続的に投与される一方、併用療法では二又はそれ以上の活性成分の有効用量が併せて投与される。
【０２３４】
製造品及びキット
本発明の他の実施態様は、癌の治療に有用な物質を含む製造品である。製造品は、容器と容器上の又は容器に付随されるラベル又はパッケージ挿入物を含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等を含む。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療に効果的な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の多重特異性抗体又は抗体断片抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状を治療するために使用されることを示す。ラベル又はパッケージ挿入物は、患者に抗体組成物を投与するための注意書きを更に含む。ここに記載された併用療法剤を含む製造品及びキットもまた考えられる。
【０２３５】
パッケージ挿入物は、効能、用途、投薬量、投与、かかる治療製品の使用に関する禁忌及び／又は警告についての情報を含む治療製品の市販パッケージに常套的に含められる指示書を意味する。一実施態様では、パッケージ挿入物は、組成物が、固形腫瘍、例えば結腸直腸、肺及び／又は乳癌を治療するために使用されることを示している。
加えて、製造品は、更に、薬学的に許容可能なバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を更に具備しうる。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を更に含むこともできる。
【０２３６】
様々な目的、例えば細胞からのＨＥＲレセプターの精製又は免疫沈降のために有用なキットもまた提供される。ＥＧＦＲ及び／又はＨＥＲ２及び／又はＨＥＲ３及び／又はＨＥＲ４の単離及び精製のために、キットはビーズ（例えばセファロース(登録商標)ビーズ）にカップリングしたＥＧＦＲ／ＨＥＲ２及び／又はＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及び／又はＥＧＦＲ／ＨＥＲ４抗体を含みうる。例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットにおけるようなインビトロでの所望のＨＥＲレセプターの検出と定量のために抗体を含むキットが提供されうる。製造品と同様に、キットは、容器と、容器上に又は容器に付随してラベル又はパッケージ挿入物を含む。容器は本発明の少なくとも一の多重特異性抗体又は抗体断片を含有する組成物を収容する。例えば希釈剤及びバッファー又はコントロール抗体を含む更なる容器が含められうる。ラベル又はパッケージ挿入物は組成物の記述並びに意図されたインビトロ又は診断用途のための指示書を提供しうる。
【０２３７】
前記の書面による明細書は当業者に発明を実施させるのに十分であると考えられる。次の実施例は単に例示目的で提供されるもので、本発明の範囲を決して限定する意図はない。実際、ここに示され説明されたものに加えて本発明の様々な変形が前記明細書から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に入る。
【０２３８】
実施例中で言及される市販の試薬は、特に記載がない限り製造者の取扱説明書に従って使用している。次の実施例、及び本明細書全体を通じて、ＡＴＣＣ登録番号によって特定されている細胞の入手源は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を使用する：上掲のSambrook等; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology（Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989）；Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications（Academic Press, Inc.; N.Y.., 1990)；Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor 1988)；Gait, Oligonucleotide synthesis（IRL Press, Oxford, 1984）；Freshney, Animal Cell Culture, 1987；Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【実施例】
【０２３９】
実施例１
ヒトＥＧＦＲに結合する抗体の単離及び特徴付け
材料
酵素及びＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅはＳｔｒａｔａｇｅｎｅからである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、及びＴｗｅｅｎ２０はＳｉｇｍａから購入した。ニュートラアビジン、カゼイン及びＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋはＰｉｅｒｃｅから購入した。抗Ｍ１３コンジュゲート西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。マキシソープイムノプレートはＮＵＮＣ（Roskilde, Denmark）から購入した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質はＫｉｒｋｅｇａａｒｄ及びＰｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Gaithersburg, MD）から購入した。
【０２４０】
ライブラリー構築
ファージディスプレイ抗体ライブラリーを、ヒト化４Ｄ５（ｈ４Ｄ５，トラスツズマブ）からのヒト抗体フレームワークに基づいて生成させ、そこで、側鎖及び鎖長多様性を、第一ライブラリー（ライブラリー１）中の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，ＣＤＲ３）中に、また第二ライブラリー（ライブラリー２）中の重鎖ＣＤＲｓ及び軽鎖ＣＤＲ３中に導入し、記載されたように（Lee等, J. Mol. Biol, 340:1073-1093 (2004)）、重鎖中の多様化になお焦点を当てた。ライブラリーは、使用した縮重オリゴヌクレオチドを適度に修飾した点を除いて、記載されたようにして（Lee等, J. Mol. Biol, 340:1073-1093 (2004)）構築した。
【０２４１】
二つのライブラリーのソーティング
ライブラリー１及びライブラリー２に、標的（ｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン）及びＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｆｃ）結合選別を直接施した。ＧＦＲｖＩＩＩ−Ｆｃタンパク質は、ｈＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した（Ｅ１−Ｐ３５３（シグナルペプチドは含まない））殆どのドメインＩＩを失ったＥＧＦＲの変異体である。Kuan, C-T等, Endocrine-Related Canc. 8:83-96 (2001)；Bigner, S H等, Cancer Research , 50:8017-8022 (1990)を参照。９６ウェルＮｕｎｃマキシソーププレートにＰＢＳ（０．０５Ｍの炭酸ナトリウムバッファー，ｐＨ９．６）中の１００μｌ／ウェルの標的抗原（ｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ，ＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｆｃ）（５μｇ／ｍｌ）を、４℃で一晩又は室温で２時間、コートした。プレートを交替遮断薬でブロックした。選別の第一ラウンドでは、１０１３ファージ／ｍｌ（３−５ＯＤ／ｍｌ）のファージ溶液を、コートされた抗体と共に１８時間インキュベートした。ファージの投入は、以下のように、各選別ラウンドで減少させた：第一ラウンド３〜５ＯＤ／ｍｌ、第二ラウンド３ＯＤ／ｍｌ、第三ラウンド０．５〜１ＯＤ／ｍｌ及び第四ラウンド投入０．１〜０．５ＯＤ／ｍｌ。希釈したファージを氷上で３０分間インキュベートした。１μＭのＦｃ融合タンパク質を、Ｆｃ結合剤を除去するために第三ラウンドから遮断ファージに加えた。イムノプレート上で固定化抗体結合させるためファージ溶液をインキュベートした後（８の標的抗原コートウェル及び２つの未コートウェルに対して１００μｌ／ウェル）、イムノプレートをＰＢＳ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で少なくとも１０回連続的に洗浄した。結合ファージを、２０分間室温で１００ｕｌ／ウェルの１００ｍＭＨＣＬで溶出させた。（コートウェルからの）溶出ファージ及び（未コートウェルからの）バックグラウンドファージを、１／１０体積の１ＭのＴｒｉｓ，ｐＨ１１．０及びＢＳＡを最終０．１％まで加えることにより中和させた。標的抗原に特異的に結合したＦａｂをディスプレイするファージクローンの豊富化を研究するために、抗原コートイムノプレートウェル当たりのファージの回収を算出し、コート抗原無しのブロックされたウェルのものと比較した。溶出されたファージは、大腸菌で増殖させ、選別のさらなるラウンドに使用した。
【０２４２】
ｈＥＧＦＲ結合クローンのハイスループット特徴付け
スクリーニングのためにラウンド４からランダムクローンを選別し、ファージＥＬＩＳＡを使用してアッセイし、標的及び抗ｇＤへの結合を、無関係のタンパク質（ＢＳＡ、ＨＥＲ２，抗ＥＧＦＲ抗体、トラスツマブ）の結合と比較した。
３８４ウェル型イムノプレートに、４℃で一晩又は室温で２時間、１μｇ／ｍｌの標的抗ｇＤ及び無関係タンパク質をコートし、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間ブロックした。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ中のファージミドクローンを、カルベニシリン及びＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージが添加された１５０μｌの２ＹＴ中で増殖させた；培養物は９６ウェル型中で３７℃で一晩振とうさせながら増殖させた。ファージを含む培養上清を、ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳ）で５倍に希釈した。３０μｌの混合物を３８４ウェルのコートプレートの４ウェル毎に加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳＴ中に１ｎＭまで５０００倍希釈した抗Ｍ１３抗体西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲートと共に３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、およそ５分間ＴＭＢ基質と反応させ、１．０ＭのＨ３ＰＯ４でクエンチし、４５０ｎｍで分光光度計により読み取った。
抗ｇＤ抗体及び標的に結合するが非特定タンパク質には結合しないクローンが特異性陽性であると考えられた。ＶＨライブラリーは、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ及びＥＧＦＲｖＩＩＩ−Ｆｃ双方のための特異性結合剤の単離を可能にした。
【０２４３】
溶液結合競合ＥＬＩＳＡ
選択された結合クローンの結合親和性を、溶液結合競合ＥＬＩＳＡによって決定した。
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ中の選択されたファージミドクローンを、カルベニシリン、カナマイシン、及びＸＬ１−Ｂｌｕｅヘルパーファージが添加された２０ｍｌの２ＹＴ培養液で培養され、培養は３０℃で一晩培養された。ファージの上清は、２０％ＰＥＧ／２．５ＭＮａＣｌでダブルの沈殿によって精製し、ＰＢＳに再懸濁させ、濃度決定（ＯＤ／ｍｌ）のために分光光度計によって２６８ｎＭで読み取った。
精製ファージを溶液競合ＥＬＩＳＡの最適濃度を決定するために１ｍｇ／ｍｌのｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃでコーティングされたイムノプレートでタイターした。
４５０ｎＭで１ＯＤ／ｍｌのシグナルを与えた希釈を溶液結合アッセイにおいて使用し、ファージを１時間、増加濃度の抗原（ｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ）と共に最初にインキュベートし、ついで１５分間、抗原被覆免疫プレートに移し、未結合ファージを捕捉した。ＩＣ５０を、５０％のファージが固定化抗原へ結合するのを阻害した溶液結合段階における抗原濃度として計算した。溶液結合競合ＥＬＩＳＡを室温で実施した。選択されたクローンに対するＩＣ５０値は３６．２ｎＭから＞１０００ｎＭの範囲であった。
【０２４４】
ヒトＩｇＧにＦ（ａｂ）ｚｉｐをディスプレイするファージの転換
親和性、特異性及び他の特性を精確に決定するために、選択されたクローンを遊離のｈＩｇＧとして発現させた。
軽鎖及び重鎖の可変ドメインを、哺乳動物細胞中における一過性のヒトＩｇＧ発現のために過去に設計されたベクター中にクローニングした。（Leet等, J. Mol. Biol. 23:340:1073-1093 (2004)）。
ファージミドＤＮＡのＶＬ領域を制限酵素で消化し、ＤＮＡを、ＣＤＲ Ｌ１（ＥｃｏＲＶ）をコードする領域の上流とＣＤＲ Ｌ３（ＫｐｎＩ）をコードする領域の下流で切断した。ファージミドＤＮＡのＶＨ領域を制限酵素で消化し、ＤＮＡを、ＣＤＲ Ｈ１（ＡｐａＩ）をコードする領域の上流とＣＤＲ Ｈ３（ＢｓｉｗＩ）をコードする領域の下流で切断した。
分泌された遊離のＩｇＧをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製し、ｈＥＧＦＲ被覆免疫プレートでの直接結合ＥＬＩＳＡで試験した。
【０２４５】
抗ｈＥＧＦＲエピトープの比較
ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合することが知られている他の抗ｈＥＧＦＲ抗体と競合する単離抗ＥＧＦＲ抗体の能力を、抗ｈＥＧＦＲ抗体により認識されるエピトープを決定するために研究した。
アッセイを競合ＥＬＩＳＡ形式で実施した。競合的ＥＬＩＳＡでは、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃを２μｇ／ｍｌでマキシソープ免疫プレートで固定化した。固定濃度の抗ＥＧＦＲ抗体（又は非特異的抗体コントロール）を被覆ＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃによって捕捉し、精製した選択抗ＥＧＦＲファージ−Ｆａｂｓを添加し、α−Ｍ１３−コンジュゲートＨＲＰを用いて検出した。ＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ被覆プレートへの結合をブロックされた抗体はオーバーラップするエピトープを共有する可能性が高い。
ＴＧＦ−α競合ＥＬＩＳＡでは、被覆抗ヒトＦｃ抗体によってＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃを最初に捕捉し、ついで固定濃度のＴＧＦ−αをＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃによって捕捉した。精製されたファージ−Ｆａｂｓを加え、α−Ｍ１３コンジュゲートＨＲＰで検出した。
最後に、ＥＧＦＲの露出し欠失されたドメインを持つコンストラクトへの選択クローンの結合を評価して過去の競合ＥＬＩＳＡを確認した。Ｄ１と標記されたクローンは抗ＥＧＦＲ抗体と競合し、ドメインＩＩＩでＥＧＦＲと結合する可能性が高い。
【０２４６】
実施例２
ヒト上皮増殖因子レセプターに対する抗体の特徴付け
リガンド結合の阻害
選択された抗ＥＧＦＲ抗体Ｄ１が、Ｈ１６６６細胞（ATCC CRL-5885, Manassas, Va.）への１２５Ｉ−ＥＧＦ結合を阻害するかどうかを決定するために、Ｄ１の精製されたＩｇＧｓ型を次のようにリガンド結合アッセイにおいて試験した。Ｈ１６６６細胞を１２ウェルプレートに播種した。次の日に増殖培地を取り除き、細胞を室温で２時間、２００ｎＭの抗体で予め処理した。２０μｌ／ウェルの放射標識ＥＧＦを加え（細胞株のＫｄ以下の濃度を使用）、細胞を室温で更なる２時間処理した。細胞を結合バッファーで洗浄し、可溶化し、移し、試料をアイソデータγカウンターを使用して計数した。未標識ＥＧＦを非放射性競合体として使用した。該結果は、Ｄ１がＨ１６６６細胞への１２５Ｉ−ＥＧＦリガンド結合を阻害することを証明している。
【０２４７】
安定に形質移入されたＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞におけるＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化の阻害
抗ＥＧＦＲ抗体Ｄ１がＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化を選択的にブロックするかどうかを決定するために、安定に形質移入されたＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞について２−３時間、血清を枯渇させ、様々な濃度のＤ１で２時間プレインキュベートした。細胞を１ｎＭのＴＧＦ−αで刺激した。全細胞可溶化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、免疫ブロットを、抗ホスホチロシン及び抗ＥＧＦＲを負荷コントロールとして用いてプロービングした。市販の抗ＥＧＦＲ抗体をポジティブコントロールとして使用した。データは、Ｄ１が細胞ベースアッセイにおいてＴＧＦ-α誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害することを証明している。
【０２４８】
実施例３
Ｄ１の親和性成熟化
ライブラリー構築
記載されたようにして(Lee等, Blood, 108, 3103-3111, 2006)オリゴヌクレオチド指定突然変異を使用して二つのファージディスプレイライブラリー（Ｌ３／Ｈ３及びＬ３／Ｈ１Ｈ２ライブラリー）を作製した。ライブラリー鋳型ベクターはＣＤＲ−Ｌ３に埋め込まれた停止コドン（ＴＡＡ）を含み、これは、ＣＤＲ−Ｌ３（全ライブラリー）、ＣＤＲ−Ｈ３（Ｌ３／Ｈ３ライブラリー）、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ Ｈ１（Ｌ３／Ｈ１Ｈ２ライブラリー）をコードする配列に対してアニールされた縮重オリゴヌクレオチドを使用して突然変異誘発反応中に修復された。ライブラリー突然変異誘発反応はKunkel 等(Methods Enzymol. 1987;154:367-82)の方法に従って実施した。オリゴヌクレオチドは、選択された位置における天然レパートリーにおけるアミノ酸頻度を反映する多様性を微細に調整するために様々な比率で組合せた。突然変異誘発産物を、ライブラリー当たり一反応にプール化し、大腸菌ＳＳ３２０細胞中に電気穿孔し、記載されたように（上掲のLee等, 2004）ＫＯ７ヘルパーファージを補填して増殖させた。
【０２４９】
ライブラリー選別及びスクリーニング
アフィニティー改善選別に対しては、ファージライブラリーに第一ラウンドではｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃに対してプレートソーティングし、続いて３ラウンドの溶液選別を続けた。
３ラウンドの溶液選別を、選別のストリンジェンシーを増加させて実施した。免疫プレートに４℃で一晩、５ｕｇ／ｍｌのニュートラアビジンを被覆し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ (Pierce)及びＰＢＳＴでブロックした。３−５ＯＤ／ｍｌの増殖したファージを、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ中の１００ｎＭのビオチン化ＥＧＦＲ−ＥＣＤと共にプレインキュベートし、ついで、１０×希釈し、５−１０分、ブロックされた免疫プレートに加えた。 プレートを８回洗浄し、ファージを溶出させ、次の溶液選別ラウンドのために増殖させ、ファージ入力（０．５ＯＤ／ｍｌ）及びビオチン化ＥＧＦＲ−ＥＣＤの濃度を１ｎＭまで減少させた。
【０２５０】
高スループットアフィニティースクリーニングＥＬＩＳＡ（単一スポット競合）
溶液選別の最終ラウンドからの無作為なクローンをスクリーニングのために拾い上げ、ｈＥＧＦＲ−ＥＣＤと共にプレインキュベートした（又はしなかった）ファージ上清の標的に対する結合を比較するファージ単一ポイント競合ＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ中のファージミドクローンを、カルベニシリン及びＭ１３−ＫＯ７ヘルパーファージを補填した１５０ｕｌの２ＹＴブロス中で増殖させ；培養物を９６ウェル形式で３７℃にて一晩振とうしながら増殖させた。ファージを含む培養上清をＰＢＳＴ（５ｎＭのＥＧＦＲ−ＥＣを伴うか又は伴わないで０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳ）に５倍希釈した。ＯＤ減少（％）は次の式によって計算した：
ＯＤ４５０ｎｍ減少（％）＝（競合体を含むウェルのＯＤ４５０ｎｍ）／（競合体を含まないウェルのＯＤ４５０ｎｍ）＊１００
２５％より大きいＯＤ減少のクローンを、溶液結合競合ＥＬＩＳＡのために選択した。
【０２５１】
溶液結合競合ＥＬＩＳＡ
単一スポットＥＬＩＳＡによる選択された結合クローンの結合親和性は上述のように溶液結合競合ＥＬＩＳＡによって定量した。
Ｄ１親クローン親和性成熟から選択された一つのクローン（Ｄ１．５）のファージＩＣ５０を上述のようにして定量した。Ｄ１．５のＩＣ５０は０．３９ｎＭであった。上述のものと同じ制限部位及び哺乳動物細胞中における一過性マウスＩｇＧ発現のために設計されたベクターを使用して、更なる特徴付けのために、Ｄ１．５をｍＩｇＧ２Ａ中に再編成した。
【０２５２】
実施例４
遊離ｍＩｇＧとしての抗ＥＧＦＲ改善抗体の特徴付け
バイアコア測定
バイアコア(BIAcore)TM-２０００での表面プラズモン共鳴アッセイを抗ＥＧＦＲｍＩｇＧ２Ａの親和性を決定するために使用した。〜１５０応答単位（ＲＵ）でＣＭ５チップ上に固定されたｍＩｇＧＤ１．５をバイアコアアッセイで使用した。１２．５ｎＭから２００ｎＭの増加濃度のＥＧＦＲ−ＥＣＤを２５℃で３０μｌ／分で注入した。結合応答を、ブランクフローセルからのＲＵを減算することにより修正した。動態解析のために、ｋｏｎ及びｋｏｆｆの同時フィッティングの１：１ラングミュアモデルを使用した。この方法で決定されたＤ１．５に対するＫＤは１．２ｎＭであった。
【０２５３】
エピトープマッピング
親抗体からの遺伝結合エピトープを確認するために、ＥＧＦＲの露出及び欠失ドメインを有するコンストラクトに対する選択クローンの結合を評価した。Ｄ１ソーティングから選択された親和性改善クローンであるＤ１．５は、ＥＧＦＲのドメインＩＩＩに結合した。
【０２５４】
ＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞におけるＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化の阻害
ＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化を親抗体と比較してより高い効力で阻害したかどうかを決定するためにＤ１．５を試験した。抗体をＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞で試験し、アッセイを、実施例２において上述されたようにして実施した。市販の抗ＥＧＦＲ抗体をポジティブコントロールとして使用した。
結果は、Ｄ１．５が親クローンＤ１と比較した場合、リガンド誘導ＥＧＦＲリン酸化のより高い阻害を示すことを実証した。
【０２５５】
Ｈ１６６６細胞における細胞増殖の阻害
中等度レベルで、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３を発現するＮＨＣＬＣ癌細胞株Ｈ１６６６の細胞増殖をＤ１．５が阻害するか決定するために、アッセイが実施された。Ｈ１６６６細胞(ATCC CRL-5885, Manassas, Va.) は、９６ウェルプレートに５０００細胞の密度でシードされた。翌日、細胞は１％血清含有培地で、様々な濃度の抗体（５０ｕｇ／ｍｌまで）で同時に処理された。３日後、アラマーブルーが添加され、蛍光光度計を使用して蛍光性が検出された。結果はＲＦＵに表されている。
結果は、Ｄ１．５はＤ１より細胞成長のより大きい阻害を示すことを実証した。
【０２５６】
Ａ４３１異種移植片研究
親和性成熟抗ＥＧＦＲ抗体Ｄ１．５のインビボ効果を立証するために、Ａ４３１異種移植片モデルが使用された。Ａ４３１細胞は増幅型ＥＧＦＲであり、抗ＥＧＦＲ抗体に非常によく反応する。該研究は、ｎｕ／ｎｕマウスでなされ、市販の抗ＥＧＦＲ抗体が基準として使用された。
第一行程では、マウスＥＧＦＲを有するＤ１．５の交差反応が競合ＥＬＩＳＡで査定された。イムノプレートは、ｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃでコートされた。ｍＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃの連続希釈が一定濃度のＤ１．５で培養された。結果は、Ｄ１．５はマウスＥＧＦＲと交差反応したことを示した。インビボでの有効性研究のために必要な投与を査定するために、Ｄ１．５が単回投与（５０ｍｇ／ｋｇ）で注入され、血清ＩｇＧ濃度はＥＬＩＳあで測定された。Ｄ１．５は、より早く消え、濃度の減少が注入７日後に見られた。有効性研究（Ａ４３１異種移植片モデル）は、Ｄ１．５が腫瘍増殖を完全に阻害したことを示した。Ｄ１．５は、５０ｍｇ／ｋｇで、抗ＥＧＦＲ抗体と同じ程度に有効であった。低用量群（２５ｍｇ／ｋｇ）での減少有効性は、抗体のより早いクリアランスに起因する（図１）。
【０２５７】
実施例５
軽鎖ライブラリー設計及び二重特異性抗体のスクリーニング
ライブラリー設計及び構築
Ｄ１．５鋳型に基づくライブラリは、アミノ酸構成及び抗体軽鎖のＣＤＲ長を多様化するために設計された。ランダム位置のサブセットは、これらの部位で天然のレパートリーの一部であるアミノ酸を表すように調節されたが、残りの部位は天然に生じる全２０アミノ酸含むようランダム化された。更に、ＣＤＲはＤ１．５の結合に重要であるとかんがえられるため、ＣＤＲＬ３のランダム化位置は鋳型の天然配列に偏るよう調節された。ＣＤＲＬ１のために、各長さは位置２８−３３のコドンを含む３オリゴヌクレオチドの混合であった。長Ｌ１のために、ＮＮＫが位置３０及び３１の間に挿入された。
【０２５８】
位置          28        29     30     31      32       33
CDR-L1      G70A70C70     RTT   NNK   NNK    TAC     STA
G70A70C70      RTT   NNK   NNK    DGG     STA
G70A70C70      RTT   NNK   NNK    NMT     STA
ＣＤＲ Ｌ２に対しては、４つのオリゴヌクレオチドを１：１：２：１０で混合した。
50        51      52        53
CDR-L2      NKK      GST     TCC     NNK
TGG       GST     TCC     NNK
KGG       GST     TCC     TMT
NKK       GST     TCC     TMT
N=A/C/G/T, D=A/G/T, V=A/C/G, B=C/G/T, H=A/C/T, K=G/T, M=A/C, R=A/G, S=G/C, W=A/T, Y=C/T。
* G70A70C70 は標記されたヌクレオチドの７０％及びそれぞれ１０％の他の３つがおよそ５０％のＧｌｕ及び５０％の他のアミノ酸をコードすることを許容する。米国特許出願公開第２００８００６９８２０号及びBostrom, J.等, Science 323:1610-1614(2009)を参照のこと。
【０２５９】
ＣＤＲ Ｌ３に対する多様性は次のオリゴヌクレオチドの混合物から派生している。Ｄ１．５ＣＤＲ＿Ｌ３オリゴヌクレオチド
F693 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号： 70)
F694 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 TAC 776 RST CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号： 71)
F695 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号： 72)
F696 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK 776 577 CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号： 73) 
F697 ACTTATTAC TGT CAG CAA 878 NNK 776 NNK CCT TAC ACG TTC GGA (配列番号： 74)
F698 ACTTATTAC TGT CAG CAA DGG NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA  (配列番号： 75)
F699 ACTTATTAC TGT CAG CAA KMT NNK NNK RST CCT TAC ACG TTC GGA  (配列番号： 76)
5=70%A, 6=70%G, 7=70%C, 8=70%T (残りの３つのヌクレオチドに対して１０％)
【０２６０】
全てのライブラリーにおいて、重鎖は親クローン配列と一定に保たれた。全ライブラリ鋳型はＣＤＲＬ１に組み込まれた停止コドンを含み、ファージディスプレイのライブラリメンバーの中で鋳型軽鎖の存在を妨げた。
ＣＤＲＬ１、Ｌ２、及びＬ３のための３組のオリゴヌクレオチドとアニールするために、停止コドンを含む一本鎖ＤＮＡ鋳型を使用してライブリは突然変異生成法（Kunkel mutagenesis）により構築された。突然変異生成法からのライブラリＤＮＡは、エレクトロポレーションによって細菌細胞株ＳＳ３２０に変形導入され、ヘルパーファージＫＯ７で成長された。構築されたライブラリーからの単一コロニーを、軽鎖のｃ末端におけるｇＤタグの検出によってディスプレイレベルについて、また単一ポットＥＬＩＳＡ形式での一次抗原（ＥＧＦＲ）げの結合性の保持について評価した。Ｄ１．５ライブラリーからの評価された単一コロニーの平均３５％が高レベルのディスプレイを示しＥＧＦＲ結合特性を保持していた。
【０２６１】
二重特異性クローンの単離のためのライブラリー選別及びスクリーニング
ライブラリーを、Ｆａｂ遺伝子が欠失されているか又は発現されていないクローンを除去するための捕捉標的として抗ｇＤ抗体を用いて結合選択し、ｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃを用いて結合選択する最初のラウンドと、続いて４ラウンドの播種された抗原選択（ＨＥＲ２−ＥＣＤ、ＨＥＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ、ＨＥＲ２−Ｉ−ＩＩＩ−Ｆｃ、ＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ、ＨＥＲ４−ＥＣＤ−Ｆｃ（それぞれの場合、融合コンストラクト中のＦｃはｈＩｇＧ１の相補鎖結合断片である）に供した。別法では、それらを、ｔ抗ｇＤ及びｈＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃでの事前の選択なしに標的結合選択に直接供した。
【０２６２】
プレート選択の各ラウンドは実施例３において先に記載されたようにして実施した。ラウンド３及び４からの無作為なクローンをスクリーニングのために選択し、ファージＥＬＩＳＡを使用してアッセイし、標的及び抗ｇＤへの結合性を、非特異的結合をチェックするために無関係のタンパク質（ＢＳＡ）の結合性と比較した。抗ｇＤ抗体及び標的に結合するが非標的タンパク質コントロール（例えばウシ血清アルブミン、他のＩｇＧｓ）には結合しなかったクローンが特異的な陽性と考えられた。
【０２６３】
陽性クローンの軽鎖可変ドメイン領域をＰＣＲによって増幅させ、配列決定した。陽性の特異的バインダーのＤＮＡ配列解析は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２の双方に対して１つの独特なバインダー（Ｄ１．５−２０１（配列番号：３６））、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の双方に対して７つの独特なバインダー（Ｄ１．５−１００（配列番号：４０）、Ｄ１．５−１０３（配列番号：４１）、Ｄ１．５−１１３（配列番号：４２）、Ｄ１．５−１１５（配列番号：４３）、Ｄ１．５−１１６（配列番号：４４）、Ｄ１．５−１２１（配列番号：４５）、Ｄ１．５−１２２（配列番号：４６））、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４の双方に対して１つの独特なバインダー（Ｄ１．５−４００，（配列番号：３９））を明らかにした。
【０２６４】
９つの二重特異性クローンから８つが、ＨＶＲ Ｌ３の９３位にプロリンを保持していた。この位置におけるプロリンの採用（９６位のチロシンと共に）はその親クローンＤ１と比較してＥＧＦＲに対してＤ１．５親和性を劇的に増加させたので、それがＥＧＦＲに対しての結合性の保持における寄与体である可能性が高い。
【０２６５】
二重特異性ｈＥＧＦＲ／ＨＥＲ２，ｈＥＧＦＲ／ＨＥＲ３，ｈＥＧＦＲ／ＨＥＲ４ファージクローンの評価
二重活性を有する９つのクローンがその同族の標的に対して特異的であるかどうかを決定するために、直接的プレートＥＬＩＳＡ形式における抗原パネルへのその結合を評価した。
２μｇ／ｍｌの幾つかのタンパク質を４℃で一晩免疫プレート上にコートした。プレートをＰＢＳＴ中の１％ＢＳＡでブロックし、実施例１に記載されたようにして増殖させたファージ−Ｆａｂ上清の希釈物を３０分間プレートに適用した。
そのプレートを洗浄し、結合シグナルを記録し、実施例１に記載されたようにして分析した。結果は、二重特異性を有する全てのクローンがその同族標的に特異的であったことを示している。クローンＤ１．５−４及び親クローンＤ１．５をコントロールとして使用した。（図２。）
【０２６６】
実施例６
遊離ｍＩｇＧとしての二重特異性を有する抗体の特徴付け
二重特異性を有する全てのクローンを、上述したものと同じ制限部位と、哺乳動物細胞中における一過性のマウスＩｇＧ発現のために過去に設計されたベクターを使用して、更なる特徴付けのためにｍＩｇＧ２Ａ中に再編成した。
【０２６７】
ＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞におけるＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化の阻害
二重特異性を有する７つの選択された抗体がＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化をブロックするかどうかを決定するために、安定に形質移入したＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞を実施例２に記載されているようにして処理した。図３のデータは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及びＥＧＦＲ／ＨＥＲ２抗体が高濃度でＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害したことを実証している。市販の抗ＥＧＦＲ抗体をポジティブコントロールとして使用した。
クローンＤ１．５−１００及びＤ１．５−１０３に対する用量応答は、クローンＤ１．５−１００がＥＦＧＲリン酸化を阻害するその親クローン（Ｄ１．５）の高い効力を失ったことを示している。しかしながら、Ｄ１．５−１０３はこのアッセイにおいてＤ１．５に対して類似の効力を有していた。
【０２６８】
抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体によるＨＥＲ３へのヘレグリン結合の阻害
分泌された抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体がＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質へのヘレグリンの結合を阻害しうるかどうかを決定するために、精製したＩｇＧｓを放射標識リガンド結合アッセイにおいて試験した。
結合アッセイをＮｕｎｃ分解式ストリップウェルにおいて実施した。プレートを４℃で一晩、５０ｍＭのカーボネートバッファー（ｐＨ９．６）中の１００μｌの５ｍｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＡｂで被覆した。プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）で二回すすぎ、１００μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで３０分間ブロックした。バッファーを取り除き、各ウェルを１．５時間、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中２００ｎｇのＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃと共にインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回すすぎ、１％のＢＳＡ／ＰＢＳ中の抗体を４℃で一晩、ＨＥＲ３−ＩｇＧに予め結合させた。１２５Ｉ−ＨＲＧを添加し、プレートを室温で２時間、インキュベートした。プレートを３回すすぎ、個々のウェルを、１００ＳｅｒｉｅｓのＩｓｏデータγ−カウンターを使用して計数した。（図４。）結果は、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対して二重特異性を有する７つの抗体全てがＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃへのヘレグリンの結合を阻害できることを証明している。
【０２６９】
抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ４抗体によるＨＥＲ４へのヘレグリン結合の阻害
分泌された抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ４抗体Ｄ１．５−４００がＨＥＲ４−ＥＣＤ−Ｆｃへのヘレグリンの結合を阻害しうるかどうかを決定するために、上述のリガンド結合アッセイを実施した。２５ｎｇのＨＥＲ４−ＥＣＤ−ＦｃをＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃの代わりに使用した。結果は、Ｄ１．５−４００がＨＥＲ４へのヘレグリンの結合を阻害したことを証明している。
【０２７０】
ＭＣＦ７細胞におけるヘレグリン誘導ＨＥＲ２／ＨＥＲ３リン酸化の阻害
ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対して二重特異性を有する７つの選択された抗体がＭＣＦ７細胞においてヘレグリン誘導ＨＥＲ２／ＨＥＲ３リン酸化を阻害できたかどうかを決定するために、それらをレセプターリン酸化アッセイにおいて試験した：ＭＣＦ−７細胞（ＡＴＴＣ ＨＴＢ２２, Manassas, Va.)を１２のウェルプレートに播種した。血清枯渇後に、細胞を標示の抗体（７５ｕｇ／ｍｌ又は１５０ｕｇ／ｍｌ）と共に２時間インキュベートした。細胞を０．５ｎＭのＨＲＧで８分間刺激し、全細胞可溶化液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに流し、ウェスタンブロットを、抗ホスホ−ＨＥＲ３、抗−ｐＴｙｒ又は抗チューブリンを負荷コントロールとして用いてプロービングした。（図５。）結果は、全ての抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体が高濃度でヘレグリン誘導ＨＥＲ２／ＨＥＲ３リン酸化を阻害したことを実証している。ペルツズマブ（Ｐｍａｂ）をポジティブコントロールとして使用した。
【０２７１】
ＭＤＡ−１７５細胞増殖の阻害
ＨＲＧ作動性細胞増殖に対する抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体の増殖阻害性潜在性を決定するために、ＭＤＡ−１７５細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ２５, Manassas, Va.)（２００００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。次の日に細胞を、１％の血清を含有する培地中の様々な濃度の抗体（５０ｕｇ／ｍｌまで）で同時に処理した。４日か又は５日後に、アラマーブルーを添加し、蛍光を、蛍光光度計を使用して検出した。結果をＲＦＵｓで表した。その増殖がＨＲＧによる自己分泌刺激の結果であるのでＭＤＡ−１７５細胞を選択した。抗ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体Ｄ１．５−１００、及びクローンＤ１．５−１２２がＭＤＡ−１７５細胞増殖の阻害を示した。ペルツズマブ（Ｐｍａｂ）をポジティブコントロールとして使用した。（図６。）
【０２７２】
実施例７
抗ｈＥＧＦＲ／ＨＥＲ３二重特異性抗体Ｄ１．５−１００及びＤ１．５−１０３の変異誘発マッピング実験
アラニン及びホモログショットガンスキャニング分析を、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを使用して実施し(Vajdos等, J. Biol. Biol. 320:415-28 (2002))、 各抗体とその二つの抗原、つまりＥＧＦＲ及びＨＥＲ３との間の相互作用を研究した。
機能的クローンを単離するために抗原（ｈＥＧＦＲ及びＨＥＲ３）に対しての結合選別と続くＤＮＡ配列決定により、それぞれの変化する位置での野生型／変異体比の計算が可能になった。ついで、これらの比を使用して、各スキャンされた側鎖のＥＧＦＲ及びＨＥＲ３結合への寄与を決定した。
該結果はＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に結合するための機能的なパラトープのマッピングを可能にした。
【０２７３】
Ｄ１．５−１００及びＤ１．５−１０３ショットガンライブラリーの設計
ＣＤＲｓ中の溶媒露出残基を、ファージディスプレイライブラリーを使用してスキャンし、野生型残基をアラニンか又は野生型（アラニンスキャン）としてあるいはホモログ残基又は野生型（ホモログスキャン）として変化させた。遺伝コードの性質から、Ｗｔ／アラニン又はＷｔ／ホモログ残基に加えて、幾つかの他の置換がライブラリーに含められることが必要となった。別個の重鎖及び軽鎖アラニン及びホモ路津スキャニングライブラリーを構築した。縮重は１．３×１０５から７．５×１０７の範囲であった。
【０２７４】
ショットガンスキャニングライブラリーの構築
ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発による元々のプラスミドからのロシシンジッパーの除去後に、Ｍ１３遺伝子−３マイナーコートタンパク質のＣ末端ドメインに融合したバクテリオファージの表面に単一Ｆａｂを発現させたことを除いて、過去に記載されたようにしてライブラリーを構築した（オリゴＦ２２０：TCT TGT GAC AAA ACT CAC AGT GGC GGT GGC TCT GGT)。（配列番号：７７）
軽鎖アラニン及びホモログスキャニングライブラリーは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３に停止コドンを有しており、重鎖アラニン及びホモログライブラリーは各重鎖ＨＶＲｓに停止コドンを含んでいた。ライブラリーは、過去に記載された方法(Sidhu等, J. Mol. Biol. 338:299-310 (2004))によって、各停止鋳型についてＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発(上掲のKunkel等, 1987)を使用して構築した。アラニンスキャニングライブラリーは、選択された側鎖を野生型又はアラニンとして変化させることを可能にするファージディスプレイライブラリーである。ホモログスキャンは、そのファージディスプレイライブラリーが選択された側鎖を野生型又は類似のアミノ酸として変化させることを可能にすることを意味する。
【０２７５】
ライブラリー選別
ＮＵＮＣ９６ウェルマキシソープ免疫プレートを５μｍｇ／ｍｌの捕捉標的（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ，ＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ又はプロテイン−Ｌ）で被覆し、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）でブロックした。上述のライブラリーからのファージを、記載されたようにして（上掲のLee等, 2004）ＫＯ７ヘルパーファージ（ＮＥＢ）を用いて増幅させた。ライブラリーファージ溶液を１０１３ファージ粒子／ｍｌの濃度で被覆プレートに加え、ＲＴで１−２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで８回洗浄した後、０．１ＭのＨＣｌを用いて３０分、結合ファージを溶出させた。各選別ラウンド後の濃縮は過去に記載されたようにして決定した。２ラウンドの標的選別後、各ライブラリーからの多くの無作為なクローンを、記載されたようにして（上掲のSidhu等, 2004）配列決定のために選択した。
【０２７６】
結合クローンのＤＮＡ配列を使用して、それぞれの様々な位置で野生型／変異体比を決定した。その比を使用して、それぞれの選択された側鎖の抗原に対する結合寄与を評価した。抗原選別からのＷＴ／ｍｕｔ比をディスプレイ選別からのｗｔ／ｍｕｔで割ると、抗原結合親和性に対する各変異の効果の定量的推定値が得られる（関数比Ｆｗｔ／ｍｕｔ）。その比が１より大きい場合は、変異は有害である。比が１未満である場合は、変異は有益である。２５００クローンを配列決定した。
【０２７７】
アラニン及びホモログのスキャン結果に基づいて、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３への結合のための抗体Ｄ１．５−１００のホットスポットを既知の抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５−Ｆｖの構造上にマッピングした。図７に示されるように、マッピングは、ＥＧＦＲ結合に対して、重鎖が支配し、重鎖及び軽鎖がＨＥＲ３の結合に対して協働することを示唆している。酸性（Ｅ，Ｄ）残基は、ＥＧＦＲとＨＥＲ３の双方、特にＨＥＲ３への結合において重要な役割を果たしている。
【０２７８】
親和性成熟
図８は、上述のショットガンライブラリーを使用するＤ１．５−１００の親和性成熟化を例証している。この親和性成熟化では、Ｄ１．５−１００重鎖ホモログライブラリーを先に記載されたようにして選別した。２ラウンドのプレート選別をＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ被覆プレートにおいて実施した後、３ラウンドの溶液交替標的を、増加するストリンジェンシー下で選別した（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ及びＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ）。単一クローンを取り上げ、単一スポットＥＬＩＳＡで評価して、二重結合活性を保持していたクローンを単離した。評価したクローンのなかで、９４のうち７９が、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３双方に対する結合性を示す一方、１１がＥＧＦＲ結合性を失い、ＨＥＲ３に対して特異的結合性を示す。
【０２７９】
単一スポット競合によるクローンの単離
選別の最終ラウンドからの単一コロニーを取り上げ、実施例１に記載されたようにしてファージを増殖させた。３８４ウェルを１μｌ／ｍｌでＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃを被覆した。増殖させた各コロニーに対して、２５μｌのファージ上清又はＥＬＩＳＡバッファーを２５μｌのＥＧＦＲ−ＥＣＤ（５０ｎＭ）及びＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ（１０ｎＭ）と共にインキュベートした。４μｌのインキュベーションをＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ被覆プレートに加え、プレートを８回洗浄した。６０μｌの１／５０００の抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート抗体を加え、プレートを８回洗浄し、ＴＭＢ＋Ｈ３ＰＯ４を用いて反応させた。
【０２８０】
次の単一スポット競合プロトコールを使用して、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対してＤ１．５−１００よりも大なる阻害性を示す８つの独特なクローンを選択した：
１．  最終選別ラウンドからの単一コロニーを取り上げ、ファージを先に記載のようにして増殖させた；
２．  ３８４ウェルプレートを１μｇ／ｍｌでＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃで被覆した；
３．  増殖させた各クローンに対して、２５μｌのファージ上清又はＥＬＩＳＡバッファーを２５μｌのＥＧＦＲ−ＥＣＤ（５０ｎＭ）及びＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃ（１０ｎＭ）と共にインキュベートした；
４．  ４μｌのインキュベーションをＥＧＦＲ−ＥＣＤ−Ｆｃ被覆プレートに加えた；
５．  プレートを８回洗浄した；
６．  ６０μｌの１／５０００抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート抗体を加えた；
７．  プレートを８回洗浄した；
８．  プレートをＴＭＢ＋Ｈ３ＰＯ４と反応させた。
ＥＧＦＲとＨＥＲ３の双方に対してＤ１．５−１００よりも大なる阻害性を示す８つの独特なクローン（ＤＬ６，配列番号：６３；ＤＬ７，配列番号：６４；ＤＬ８，配列番号：６５；ＤＬ９，配列番号：６６；ＤＬ１０，配列番号：６７；ＤＬ１１，配列番号：２８；ＤＬ１２，配列番号：６８；ＤＬ１３，配列番号：６９）を選択した。抗ＨＥＲ３抗体に対しては、ＨＥＲ３に対してＤ１．５−１００よりも大なる阻害性を示す７つのクローンを選択した。
【０２８１】
親和性成熟化二重特異性抗ＨＥＲ３抗体の特徴付け
選択された親和性成熟化二重特異性抗体の結合特異性を、実施例５に記載されたようにして様々なタンパク質のパネルへの直接の結合によって評価した。図９に示されるように、選択された抗体はＥＧＦＲとＨＥＲ３の双方に対して結合特異性を示した。
ＩＣ５０値を、実施例１に記載されたようにして二つの選択された二重特異性抗体（ＤＬ７及びＤＬ１１）に対して計算し、Ｄ１．５−１００親クローンと比較した。双方の選択された二重特異性抗体は、ＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃに対して類似の親和性を、ＥＧＦＲに対して増加した親和性を示している。ＤＬ１．５−１００はＥＧＦＲ−ＥＣＤに対して４４ｎＭの、ＨＥＲ３−ＦＣに対して０．１ｎＭのＩＣ５０を有していた；ＤＬ７はＥＧＦＲ−ＥＣＤに対して６．１ｎＭの、ＨＥＲ３−ＦＣに対して０．２５ｎＭのＩＣ５０を有していた；ＤＬ１１はＥＧＦＲ−ＥＣＤに対して５．７ｎＭの、ＨＥＲ３−ＦＣに対して０．４３ｎＭのＩＣ５０を有していた。
選択された抗ＨＥＲ３抗体の結合特異性を、先に記載されたようにして様々なタンパク質のパネルへの直接の結合によって評価した。選択された抗体（ＤＬ３．５，ＤＬ３．６，ＤＬ３．７）はＨＥＲ３に対してだけ結合特異性を示す。
【０２８２】
ファージＩＣ５０値を、上述のようにして選択された抗体に対して計算し、Ｄ１．５−１００親クローンと比較した。全ての抗体（ＤＬ３．１−３．７）が、１から３．８ｎＭの間のＩＣ５０でもってＨＥＲ３−ＥＣＤ−Ｆｃに対して増加した親和性を示す。親ＤＬ１．５−１００は４．６ｎＭのＩＣ５０を有していた。
選択された二重特異性抗体及び抗ＨＥＲ３抗体の結合を、上述の競合ＥＬＩＳＡを使用してＨＥＲ３ドメインＩＩＩタンパク質（Ｎ末端Ｈｉｓタグ）の結合と比較した。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３及び単一特異的抗ＨＥＲ３抗体はＨＥＲ３ ＥＣＤ−Ｆｃ及びＨＥＲ３ドメインＩＩＩコンストラクトに対して類似の親和性を有している（ファージＩＣ５０）。
選択された親和性成熟化二重特異性抗体及び抗ＨＥＲ３抗体を、上述のように、ｍＩｇＧ２Ａに再編成し、競合ＥＬＩＳＡで検証した。ｍＩｇＧ２Ａ二重特異性抗体は、Ｄ１．５−１００親クローンと比較して、ＥＧＦＲ−ＥＣＤ及びＨＥＲ３ドメインＩＩＩ双方に対して増加した親和性を示している。
【０２８３】
親和性成熟化ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体ＤＬ７及びＤＬ１１、及び抗ＨＥＲ３特異的抗体ＤＬ３．６及びＤＬ３．７の動態解析のためにバイアコア３００２を使用して、各抗体（ＤＬ１．５−１００，ＤＬ７，ＤＬ１１，ＤＬ３．６，ＤＬ３．７）の精製されたｍＩｇＧ２ＡをＣＭ５チップにカップリングさせ、数回希釈の抗原（ＥＧＦＲ−ＥＣＤ，ＨＥＲ３ドメインＩＩＩ，ＨＥＲ３−ＥＣＤ）を、実施例４に記載された条件下で被覆チップに対して流した。ＣＭ５チップを抗原の各注入間で再生した。最後に、ＫＤを、物質移動での１：１結合解析を使用して決定した。親和性成熟化ＥＧＦＲ／ＨＥＲ３抗体ＤＬ７及びＤＬ１１は双方の標的に対して改善されたＫＤ（Ｍ）を有している。
ＥＧＦＲに対する親和性成熟抗体ＤＬ７、ＤＬ１１及び親抗体Ｄ１．５の阻害機能を評価するために、ＥＧＦＲだけを発現するＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞を１時間、様々な量の抗体（２０ｕｇ／ｍｌまで）で前処理し、続いてＥＧＦＲのリン酸化をＴＧＦα（５ｎＭ）によって誘導した。抗体によるレセプターリン酸化の阻害を、抗ホスホチロシン抗体を使用して検出した。ＭＡＰＫ活性化の阻害はまた用量依存的な形で見られた。抗体ＤＬ１１は、ＥＧＦＲ及びＥＲＫ１／２リン酸化の阻害においてＤＬ７より強力であった。（図１０Ａ。）
【０２８４】
ＤＬ７、ＤＬ１１及び単一特異的抗ＨＥＲ３抗体ＤＬ３．６のＨＥＲ３トランス活性化に対する阻害機能を比較した。（図１０Ｂ。）ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲを発現するＭＣＦ−７細胞を示された量の抗体（５０ｕｇ／ｍｌまで）で１時間、前処理し、ＨＥＲ３の活性化及びＨＥＲ３のトランスリン酸化をＨＲＧによって誘導した。ＨＥＲ３リン酸化の阻害を、抗ホスホＨＥＲ３抗体を使用して検出した。下流のシグナル伝達分子ＥＲＫ１／２並びにＡｋｔの阻害が用量依存的な形で見られた。ＤＬ１１はまたＤＬ７より強力であった。
ＤＬ１１の増殖阻害機能を、市販の抗ＥＧＦＲ抗体、ペルツズマブ、及び抗ＨＥＲ３抗体のもの、又はＤＬ３．６、Ｄ１．５、又はＤ１．５＋ＤＬ３．６の組合せのものと比較した。Ｈ１６６６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８８５，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）（ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＥＧＦＲリガンドを発現するＮＳＣＬＣ細胞株）（６０００細胞／ウェル）をＨＲＧ（３ｎＭ）で増殖刺激した。抗体を用量依存的な形で試験し、増殖阻害特性を他の全ての単一特異的抗体と比較した。図１１Ａに示されるように、ＤＬ１１は単一特異的抗体又はその組合せよりも大なる度合いで細胞増殖を阻害した。
【０２８５】
アッセイを、ＨＲＧ（３ｎＭ）＋ＴＧＦα（６ｎＭ）で刺激したＨ１６６６細胞増殖を使用して繰り返したとき、同様の結果が得られた。（図１１Ｂ）。
ＤＬ１１の増殖阻害機能を、ＨＣＡ−７細胞中においてペルツズマブ、抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体、又はＤＬ３．６、Ｄ１．５又はＤ１．５＋ＤＬ３．６の組合せと比較した。ＨＣＡ−７はＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲを発現する結腸直腸細胞株である。細胞増殖を１％の血清の存在下でＨＲＧ（３ｎＭ）で刺激した。抗体を用量依存的な形で試験し、アラマーブルー試薬を使用して、３日後に細胞生存率を検出した。図１２Ａに示されるように、ＤＬ１１は他の全ての処置と比較して優れた増殖阻害特性を示した。
【０２８６】
ＨＣＡ−７細胞増殖の阻害を、増殖をＨＲＧ（３ｎＭ）＋ＴＧＦα（５ｎＭ）で刺激した点を除いて、図１２Ｂに関連して記載したようにして研究した。図１２Ｂに示すように、ＤＬ１１は他の全ての処置と比較して優れた増殖阻害特性を示した。
抗ＥＧＦＲ抗体、ペルツズマブ、及び抗ＨＥＲ３抗体と比較したＤＬ１１によるＣａｌｕ−３増殖の阻害を調査した。ＮＳＣＬＣ細胞株Ｃａｌｕ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５５， Manassas, Va.)は ＨＥＲ２を過剰発現し、通常のレベルのＨＥＲ３及びＥＧＦＲを有している。細胞増殖（１００００細胞／ウェル）を１％の血清の存在下でＨＲＧ（３ｎＭ）で刺激し、抗体を用量依存的な形で試験した。図１３に示されるように、ＤＬ１１は単一特異性抗体と比較して優れた活性を示した。
【０２８７】
実施例８
抗ｈＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重特異性抗体のＤ１．５−２０１及びＤ１．５−２０１−２の変異誘発マッピング実験
Ｄ１．５−２０１の親和性成熟のために、軽鎖ソフト／ホモログライブラリーを、選択されたアミノ酸でデザインした。幾つかのソフト残基をソフト無作為化し、そこでは野生型残基頻度は５０％であった。幾つかの残基は、野生型残基又はホモログ残基をコードするコドンを使用して無作為化した。幾つかのホモログ無作為化は野生型及びホモログの他に１又は２の余分な残基を許容している。最後に、幾つかの残基は変わらなかった。
図１４はＤ１．５−２０１の親和性成熟のための他の選別ストラテジーを示している。このストラテジーでは、Ｄ１．５−２０１軽鎖ソフト／ホモログライブラリーを過去に記載されたようにして選別した。ストリンジェンシーを増加させてＨＥＲ２／ＥＣＤについて３ラウンドの交互プレート／溶液選別を実施した後、単一のクローンを取り上げ、単一スポットＥＬＩＳＡにおいて評価して、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２に対して二重の結合活性を保持していたクローンを単離した。評価したクローンのなかで、７７／１９２はＥＧＦＲとＨＥＲ２の双方に対して結合性を示している。
選択された親和性成熟化ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二重特異性抗体に対する軽鎖可変領域の配列を決定した（Ｄ１．５−２０１（配列番号：３６，Ｄ１．５−２０１−２（配列番号：３７，Ｄ１．５−２０１−３配列番号：３８）。ファージＩＣ５０を、過去に記載されたようにして、２つの選択された親和性成熟化二重特異性抗体（Ｄ１．５−２０１−２，Ｄ１．５−２０１−３）に対して計算し、Ｄ１．５−２０１親クローンと比較した。親和性成熟された両二重特異性抗体はＨＥＲ２−ＥＣＤ及びＥＧＦＲ−ＥＣＤに対して増加した親和性を示している。
【０２８８】
実施例９
ＤＬ１１アフィニティ成熟
ＤＬ１１を上述のように更にアフィニティ成熟させて、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３に対して特性を有する二つの更なる二重特異性抗体（ＤＬ１１ｂ及びＤＬ１１ｆ）及びＨＥＲ３に特異的な２つの抗体（ＤＬ３−１１ｆｂ及びＤＬ３−１１ｆ）を得た。ＤＬ１１ｂの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１２及び１３に示す。ＤＬ１１ｆの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１４及び１３に示す。ＤＬ３−１１ｂの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１９及び１３に示し、ＤＬ３−１１ｆａの重鎖及び軽鎖アミノ酸をそれぞれ配列番号：２０及び１３に示す。
【０２８９】
バイアコア親和性アッセイ
そのＥＧＦＲ及びＨＥＲ３標的に対するＤＬ１１ｂ及びＤＬ１１ｆの結合親和性を次のバイアコアアッセイにおいて決定した。ＤＬ１１ｂとＤＬ１１ｆの双方がＤＬ１１と比較してその標的に対して改善された親和性を示した。
測定は、バイアコア(BIAcore)TM ２０００機器(GE Healthcare, BIAcore Life Sciences, Piscataway, NJ)での表面プラズモン共鳴を使用して行った。ヒトＥＧＦＲ（アミノ酸１−６３７）及びヒトＨＥＲ３（アミノ酸１−６４０）の細胞外ドメイン（ＥＣＤｓ）をコードするｃＤＮＡｓを、ヒトＦｃ融合タンパク質を産生させるためにヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコードする配列を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。組換えヒトＥＧＦＲ−ＩｇＧ１（２．６５ｍｇ／ｍｌ）、ヒトＨＥＲ３−ＩｇＧ１（３．３５ｍｇ／ｍｌ）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞を一過性に形質移入することによって製造し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを介して精製した。ヒトＥＧＦＲの細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ（アミノ酸１−６３７）を、Ｎ末端フラグ配列を含む哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。
Ｆａｂ及びＩｇＧ抗体双方のＤＬ１１ｆに対する結合親和性を決定した。Ｆａｂアッセイでは、ＤＬ１１ｆ Ｆａｂが分析物であり、ＣＭ５チップの上に流したが、そこでは、異なったリガンド−ヒトＥＧＦＲ−Ｆｃ及びヒトＨＥＲ３−Ｆｃ−が、バイアコア・ヒト抗体捕捉キット（ＢＲ−１００８−３９，ロット１００２０６１１）を使用して最初に捕捉された。２倍希釈系列のＤＬ１１ｆ Ｆａｂを、２５℃で３０ｍｌ／分の流量で、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ中０．２４４−２５０ｎＭの範囲で注入した。Ｆｃ融合リガンド及び分析物の各注入間に、３Ｍの塩化マグネシウムを使用してセンサーチップを再生した（１０μｌ／分の流量で５μｌ）。ヒトＥＧＦＲ及びヒトＨＥＲ３ Ｆｃ融合タンパク質へのＤＬ１１ｆ Ｆａｂの親和性定数を決定するために、基準細胞からのシグナルを観察された試験センサーグラムから減算した。速度定数は、製造者によって供給されたバイアコア評価ソフトウェア(GE Healthcare)バージョン４．１を使用して１：１のラングミュア結合モデルに従ってダー他の非線形回帰フィッティングによって計算した。ＤＬ１１ｆ Ｆａｂの代表的な濃度（１２５ｎＭ）の２回の再現は全てのＦｃ融合タンパク質に対して非常に類似したフィッティングと速度定数を与えた。ＤＬ１１ｆ Ｆａｂは、１．９２ｎＭのＫＤ値でヒトＥＧＦＲ−Ｆｃに、かつ０．３９ｎＭのＫＤ値でヒトＨＥＲ３−Ｆｃに結合した。
【０２９０】
第二の実験条件は、ＩｇＧとしてのＤＬ１１ｆから結合速度を得るために調査した。ここでは、ＤＬ１１ｆヒトＩｇＧ１をセンサーチップＣＭ５に固定化し、単量体ヒトＥＧＦＲ−ｅｃｄ及びヒトＨＥＲ３−ｅｃｄを分析物として使用した。ヒトＥＧＦＲ−ｅｃｄ及びヒトＨＥＲ３−ｅｃｄの２倍希釈系列を、２５℃で３０μｌ／分の流量で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＰＢＳ中０．２４４−２５０ｎＭの範囲で注入した。結合速度をＦａｂに対するようにして決定した。ＤＬ１１ｆはヒトＥＧＦＲ−ｅｃｄ、及びヒトＨＥＲ３−Ｆｃにそれぞれ１９．９ｎＭ及び２．６３ｎＭのＫＤ値をもって結合した。双方の実験において、我々は、ＤＬ１１ｆ抗体がＥＧＦＲに対してよりもＨＥＲ３に対して一致して５−８倍高い親和性を有していることを観察した。実験１と比較した場合に双方のレセプターに対して実験２において見出された弱い親和性は、溶液中に分析物としてＥＧＦＲｅｃｄ又はＨＥＲ３ｅｃｄを有していることと、フローセルチップ上に固定化されたＦｃ融合体としてのレセプターの間の差のためであろう。遊離ＥＣＤのようなこれらの複数ドメインのレセプターは、溶液中にあり、よって弱い親和性を生じる場合によりエントロピーペナルティに遭遇しうることがありうる。
ＤＬ１１ｂは別個のバイアコア分析において類似の条件下でＥＧＦＲ及びＤＬ１１ｆのようなＨＥＲ３に対して類似の結合親和性を示した。
ＤＬ３−１１ｂ及びＤＬ３−１１ｆは、ＨＥＲ３に特異的に結合する能力を保持しながらＥＧＦＲに特異的に結合する能力を失った。
【０２９１】
ＭＤＡ−１７５細胞増殖の阻害
ＤＬ１１ｂ及びＤＬ１１ｆによるＭＤＡ−１７５細胞増殖の阻害を、上述のようにして研究した。ＤＬ１１ｂとＤＬ１１ｆの双方がＤＬ１１抗体と同様の度合いでＭＤＡ−１７５細胞の増殖を阻害した。図１５。ＤＬ１１、ＤＬ１１ｆ、及びＤＬ１１ｂのＩＣ５０は全ておよそ０．８−１．０ｕｇ／ｍｌであった。
【０２９２】
ＭＣＦ７細胞におけるヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化の阻害
ＤＬ１１ｆがＭＣＦ７細胞におけるヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化を阻害することができるかどうかを決定するために、実施例６に記載されたようにして、レセプターリン酸化アッセイを実施した。該結果は、ＤＬ１１ｆが用量依存的な形でヘレグリン誘導ＨＥＲ３リン酸化を阻害したことを証明している。図１６。
【０２９３】
安定に形質移入されたＥＧＦＲ−ＮＲ６細胞におけるＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化の阻害
ＤＬ１１ｆがＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化を選択的にブロックするかどうかを決定するために、実施例２に記載されたようにして、レセプターリン酸化アッセイを実施した。図１６のデータは、ＤＬ１１ｆがこの細胞ベースアッセイにおいて用量依存的な形でＴＧＦ−α誘導ＥＧＦＲリン酸化を阻害することを証明している。
【０２９４】
ＤＬ１１及びＤＬ１１ｆはインビボモデルにおける腫瘍増殖を阻害する
ＨＣＡ−７腫瘍移植モデルを使用して、インビボ腫瘍増殖に対するＤＬ１１及びＤＬ１１ｆの効果を決定した。該アッセイは次の通りに実施した。
ＳＣＩＤベージュマウス(Charles River Laboratories, San Diego, CA)にＨＣＡ−７腫瘍片を皮下的に移植した。腫瘍が１００から２５０ｍｍ３の平均体積に達したとき、類似したサイズの腫瘍を持つマウスを次の通り処置コホート（ｎ＝９／群）に無作為化した：ビヒクル（ＰＢＳ）、ペルツズマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ１．５（２５ｍｇ／ｋｇ）、Ｄ１．５＋ＤＬ３．６（各２５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＬ１１（２５ｍｇ／ｋｇ）、又はＤＬ１１ｆ（２５ｍｇ／ｋｇ）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（２０又は５０ｍｇ／ｋｇ）で始め、全体で３回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。マウスは標準的な齧歯類マイクロアイソレーターケージで飼育した。動物部屋の環境管理は、およそ７０ｏＦの温度、およそ４０％−６０％の相対湿度、及びおよそ１４時間の明／１０時間の暗サイクルを維持するように設定した。マウスは実験動物の管理及び使用のためのＩＬＡＲガイドに従って維持し、実験はジェネンテックの研究機関の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）によってレビューされ承認された。
ＤＬ１１及びＤＬ１１ｆはこの異種移植片モデルにおける平均腫瘍体積を減少させるのに等しく効果的であった。図１７。
【０２９５】
ＤＬ１１ｆは非小細胞肺癌モデルにおいて活性である
ヒトＮＳＣＬＣ株Ｈ３５８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８０７，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から取り出した樹立された腫瘍を持つマウスにおいて抗体を試験した。５×１０６Ｈ３５８細胞をＣＢ１７ＳＣＩＤマウスにマトリゲルと共に皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つマウスを次の通り処置コホート（ｎ＝９／群）に無作為化した：ビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）、Ｄ１．５（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＬ３．１１ｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＤＬ１１ｆ（３０ｍｇ／ｋｇ）、又はＤ１．５＋ＤＬ３．１１ｂ（各２５ｍｇ／ｋｇ）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（５０又は６０ｍｇ／ｋｇ）で始め、全体で４回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
図１８に示されるように、二重特異性抗体ＤＬ１１ｆはこのＮＳＣＬＣモデルにおいて活性であり、抗ＥＧＦＲ特異的及び抗ＨＥＲ３特異的抗体の組合せ（Ｄ１．５＋ＤＬ３．１１ｂ）よりも腫瘍増殖の阻害においてより効果的である。
【０２９６】
実施例１０
ＤＬ３．６アフィニティ成熟
ＤＬ３．６を上述のように更にアフィニティ成熟させて、更なる抗ＨＥＲ３抗体を得た。ＤＬ３．６ｂは、親抗体ＤＬ３．６と比較してその標的に対して増加した親和性を示した。ＤＬ３．６ｂの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１７及び１３に示す。
図１９及び２０に示されるように、ＤＬ３−１１ｂ、ＤＬ３．６、及びＤＬ３．６ｂは、ＨＲＧ誘導ＨＥＲ３リン酸化及びＭＤＡ−１７５細胞増殖を示した。アッセイは上述のようにして実施した。
【０２９７】
実施例１１
頭頸部扁平上皮細胞癌モデルであるＦａｄｕ異種移植片モデルにおけるインビボ活性
ＤＬ１１ｆ、市販の抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体を、Ｆａｄｕ細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−４３，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から由来した樹立腫瘍を持つマウスにおいて試験した。５×１０６ＦａＤｕ細胞にＣＢ１７ＳＣＩＤマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つマウスを次の通り処置コホート（ｎ＝９／群）に無作為化した：ビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）、抗ＥＧＦＲ抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＥＲ３抗体（５０ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＬ１１ｆ（２５ｍｇ／ｋｇ）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（それぞれ５０又は１００ｍｇ／ｋｇ）で始め、全体で４回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
図２１に示されるように、ＤＬ１１ｆはＦａＤｕ頭頸部癌モデルにおいて活性であり、抗ＥＧＦＲ特異的又は抗ＨＥＲ３特異的抗体の何れかよりも腫瘍増殖阻害においてより効果的である。
【０２９８】
実施例１２
ＨＥＲ３推進膵臓モデルであるＢｘＰＣ３異種移植片モデルにおけるインビボ活性
ＤＬ１１ｆ、抗ＥＧＦＲ抗体、ペルツズマブ、及び抗ＨＥＲ３抗体を、膵臓細胞株ＢｘＰＣ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から由来する樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。１０×１０６のＢｘＰＣ３細胞をＣＢ１７ＳＣＩＤマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート（ｎ＝８／群）に無作為化した：ビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）、抗ＥＧＦＲ抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）、ペルツズマブ（２５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＥＲ３抗体（５０ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＬ１１ｆ（２５ｍｇ／ｋｇ）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（５０又は１００ｍｇ／ｋｇ）で始め、全体で４回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
ＤＬ１１ｆはＢｘＰＣ３膵臓癌モデルにおいて活性であり、抗ＥＧＦＲ特異的又は抗ＨＥＲ３特異的抗体の何れよりも腫瘍増殖の遅延化においてより効果的である（図２２）。
【０２９９】
実施例１３
ＮＳＣＬＣ Ｃａｌｕ−３異種移植片モデルにおけるインビボ活性
ＤＬ１１ｆ、市販の抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体を、ＮＳＣＬＣ株Ｃａｌｕ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５５，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から取り出した樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。５×１０６のＣａｌｕ−３細胞をＳＣＩＤベージュマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート（ｎ＝９／群）に無作為化した：ビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）、抗ＥＧＦＲ抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＥＲ３抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＬ１１ｆ（２５ｍｇ／ｋｇ）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（５０）で始め、全体で４（８）回の処置の間、毎週続けて（抗ＨＥＲ３は週２回）、腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
ＤＬ１１ｆはＣａｌｕ−３非小細胞肺癌モデルにおいて活性であり、抗ＥＧＦＲ特異的又は抗ＨＥＲ３特異的抗体の何れよりも腫瘍増殖の遅延化においてより効果的である（図２３）。
【０３００】
実施例１４
上皮Ａ４３１異種移植片モデルにおけるインビボ活性
ＤＬ１１ｆ、市販の抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体を、類表皮細胞株Ａ４３１（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−２５９２，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から取り出した樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。５×１０６Ａ４３１細胞をＳＣＩＤベージュマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート（ｎ＝８／群）に無作為化した：ビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）、抗ＥＧＦＲ抗体（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＥＲ３抗体（５０ｍｇ／ｋｇ）、及びＤＬ１１ｆ（１２．５及び２５ｍｇ／ｋｇ）。処置剤は、無作為化の日に一回腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。
マウス中における抗ＥＧＦＲ抗体と比較したＤＬ１１ｆのより速いクリアランスのため、ＤＬ１１ｆは、比較できる曝露レベルを達成するために抗ＦＧＦＲ抗体と比較して２×濃度で投与した。総括すると、ＤＬ１１ｆは、抗ＥＧＦＲ抗体と同様に、Ａ４３１表皮癌モデルにおける腫瘍増殖を阻害する。（図２４。）
【０３０１】
実施例１５
患者由来乳癌ＭＡＸＦ４４９の異種移植片を持つヌードマウスにおけるインビボ活性
ＤＬ１１ｆ、市販の抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体をＯｎｃｏｔｅｓｔ ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙで試験した。Ｏｎｃｏｔｅｓｔは、ドナー患者からの腫瘍の直接の移植後にヌードマウス中の皮下異種移植片として乳腺癌ＭＡＸＦ４４９のような患者腫瘍を継代される。Ｏｎｃｏｔｅｓｔのプロトコルに従って、類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート（ｎ＝１０／群）に無作為化した：ＤＬ１１ｆ（３０ｍｇ）、抗ＥＧＦＲ抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＥＲ３（６０ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（それぞれ６０又は１２０ｍｇ／ｋｇ）で始め、全体で４回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。
ＤＬ１１ｆ及び抗ＨＥＲ３はＭＡＸＦ４４乳癌モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する一方、抗ＥＧＦＲ抗体は効果がない（図２５）。
【０３０２】
実施例１６
前立腺ＤＵ１４５異種移植片モデルにおけるインビボ活性
ＤＬ１１ｆ、市販の抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体を、Ｐｉｅｄｍｏｎｔのプロトコルに従って、Ｐｉｅｄｍｏｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅにおいて試験した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート（ｎ＝１０／群）に無作為化した：ＤＬ１１ｆ（２５ｍｇ）、抗ＥＧＦＲ抗体（２５ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＥＲ３（５０ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（それぞれ５０又は１００ｍｇ／ｋｇ）で始め、全体で４回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。ＤＬ１１ｆはＤＵ１４５前立腺癌モデルにおいて活性であり、抗ＥＧＦＲ特異的又は抗ＨＥＲ３特異的抗体の何れかよりも腫瘍増殖の阻害においてより効果的である。（図２６）。
【０３０３】
実施例１７
患者由来卵巣癌ＯＶＸＦ５５０の異種移植片を持つヌードマウスにおけるインビボ活性
ＤＬ１１ｆ、市販の抗ＥＧＦＲ抗体、及び抗ＨＥＲ３抗体をＯｎｃｏｔｅｓｔ ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙで試験した。Ｏｎｃｏｔｅｓｔは、ドナー患者からの腫瘍の直接の移植後にヌードマウス中の皮下異種移植片として卵巣癌ＯＶＸＦ５５０のような患者腫瘍を継代される。Ｏｎｃｏｔｅｓｔのプロトコルに従って、類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート（ｎ＝１０／群）に無作為化した：ＤＬ１１ｆ（３０ｍｇ）、抗ＥＧＦＲ抗体（３０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＨＥＲ３（６０ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）。処置剤は、無作為化の日に２×負荷用量（それぞれ６０又は１２０ｍｇ／ｋｇ）で始め、全体で５回の処置の間、毎週続けて、腹腔内投与した。
ＤＬ１１ｆはＯＶＦＸ５５０卵巣癌モデルにおいて活性である。（図２７。）
【０３０４】
実施例１８
ＤＬ１１ｆは抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をインビトロ及びインビボで媒介する
ＤＬ１１ｆは、インビトロでＡＤＣＣを媒介する。Ａ４３１，Ｈ２９２（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−１８４８，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．），ＦａＤｕ，ＢｘＰＣ３及びＭＤＡ４６８（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１３２，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）細胞（全てＡＴＣＣから）を、標記された濃度の抗体の存在下で９６ウェルプレートに播種した。３７℃で３０分のプレインキュベーション後、単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を加え、インキュベーションを３７℃で更に４時間継続した。４時間後、プレートを遠心分離し、上清を集めた。上清中のＬＤＨ活性を、Ｐｒｏｍｅｇａ ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ均一膜完全性アッセイ手順に従って決定した。細胞媒介細胞傷害性パーセントを決定するために、平均吸光係数を計算し、バックグラウンドを減算した。図２８に示されるように、ＤＬ１１ｆは用量依存的な形でＥＧＦＲ発現細胞株においてＡＤＣＣを緩和する。
Ｎ２９７Ａのアミノ酸置換を、エフェクター機能を欠失させるためにＤＬ１１ｆに導入した。Ｎ２９７はＦｃＲｇ及び／又は補体結合に必要とされる。ＤＬ１１ｆ−Ｎ２９７ＡはインビトロでのＡＤＣＣの欠如を示す。予想されたように、インビトロでのＤＬ１１ｆの増殖阻害機能は変異に影響されない。（図２９。）
ＤＬ１１ｆ及びＤＬ１１ｆ−Ｎ２９７Ａを、ＮＳＣＬＣ細胞株Ｈ２９２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８４８，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）から取り出された樹立された腫瘍を持つマウスにおいて試験した。５×１０６Ａ４３１細胞をＣ．Ｂ１７−ＳＣＩＤマウスに皮下的に接種した。類似したサイズの腫瘍を持つ動物を次の通り処置コホート（ｎ＝１０／群）に無作為化した：ビヒクル（ＤＬ１１ｆ製剤バッファー）、ＤＬ１１ｆ（６ｍｇ／ｋｇ）及びＤＬ１１ｆ−Ｎ２９７Ａ（６ｍｇ／ｋｇ）。処置剤は、無作為化の日に一回腹腔内投与した。実験の期間中、毎週二回、ノギスを用いて腫瘍を測定した。最初に、ＤＬ１１ｆ及びＤＬ１１ｆ Ｎ２９７Ａは、ＨＥＲ経路シグナル伝達を阻害することによって、腫瘍増殖を均等に阻害した。しかし、用量が減少するにつれて、ＤＬ１１ｆは、そのＡＤＣＣ能のためＤＬ１１ｆ Ｎ２９７Ａと比較して延長された抗腫瘍活性を示した。（図３０）。
【０３０５】
実施例１９
ＤＬ１１ｆはカニクイザルにおいてセツキシマブよりも毒性が少ない
ＤＬ１１ｆ及びセツキシマブの相対的毒性を決定するための実験を実施した。カニクイザルを３群に分け、次のように、６週間にわたって一週間に一回、ＤＬ１１ｆ又はセツキシマブ (Capital Wholesale Drug, Columbus, OH)の何れかを投与した：
グループ１：  セツキシマブ  ２５ｍｇ／ｋｇ；
グループ２：  ＤＬ１１ｆ  ２５ｍｇ／ｋｇ；
グループ３：  ＤＬ１１ｆ  １２．５ｍｇ／ｋｇ。
セツキシマブを投与した３匹の動物全てが、３回目及び４回目投薬の間に皮膚病変を発症し、毒性を示した。この結果は、セツキシマブのＦＤＡ承認中に実施された先のカニクイザルの実験に基づいて予想されていた。ＤＬ１１ｆが投与された動物の何れも実験のこの時点で毒性の徴候を示さなかった。
２５ｍｇ／ｋｇ用量のＤＬ１１ｆを投与された動物の一匹は６回目の投薬後の一週間で皮膚病変を発症した。この病変部はおよそ４ｃｍ×７ｃｍと測定され、非常に穏やかで、セツキシマブ処置動物において観察される病変部と比較して小領域に限られていた。
この毒性学研究における毒物動態パラメータの分析に基づくと、セツキシマブ及びＤＬ１１ｆの曝露は、２５ｍｇ／ｋｇの各試験化合物を投与した動物において同様であった。
【０３０６】
第二の大きな規模の実験は次の条件下で実施した。
カニクイザルを６群に分け、次のように、１２週間にわたって毎週一回、ＤＬ１１ｆ又はビヒクルコントロールの何れかを、静脈内投与によって投与した。
グループ１：  １０匹のサル（５匹の雄／５匹の雌）−ビヒクルコントロール
グループ２：  １０匹のサル（５匹の雄／５匹の雌）ＤＬ１１ｆ  ５ｍｇ／ｋｇ
グループ３：  １０匹のサル（５匹の雄／５匹の雌）ＤＬ１１ｆ  １５ｍｇ／ｋｇ
グループ４：  １０匹のサル（５匹の雄／５匹の雌）ＤＬ１１ｆ  ３０ｍｇ／ｋｇ  
グループ５：  ４匹のサル（２匹の雄／２匹の雌）ビヒクルコントロール
グループ６：  ４匹のサル（２匹の雄／２匹の雌）ＤＬ１１ｆ  ３０ｍｇ／ｋｇ
【０３０７】
実験中又はＤＬ１１ｆの最終投薬後の回復期間中に何れの動物も如何なる明らかな皮膚毒性も示さなかった。
単一用量のＩＶ投与ＰＫ実験をまたカニクイザルにおいて実施した。この実験では、一群当たり３匹のサルに１、１０、又は３０ｍｇ／ｋｇのＤＬ１１ｆを静脈内投与した。調査した用量範囲に対するＰＫは非線形で、他のＥＧＦＲ標的化抗体に見られた飽和クリアランスと一致していた。
【０３０８】
この明細書中において引用され又は言及されている全ての特許、特許出願、特許出願公報、及び他の刊行物を、あたかも各独立の特許、特許出願、特許出願公報又は刊行物が特にかつ個々に出典明示により援用されることが示されているのと同じ度合いで、出典明示によりその全体をここに援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【配列表】
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