(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を再生することのできるアダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化非感受性制限酵素と同じ認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素で消化する工程
を含むことを特徴とする、分析対象ＤＮＡのメチル化分析方法。
【請求項２】
更に、
請求項１の工程（３）で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として、請求項１の工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、
請求項１の工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、請求項１の工程（１）に記載のメチル化非感受性制限酵素と同じ認識配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
前記工程で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として、請求項２に記載の増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
更に、
請求項１の工程（２）で得られたＤＮＡ構築物、あるいは、前記ＤＮＡ構築物を鋳型として、請求項２に記載の増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程を含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１の工程（２）に記載のアダプターが、選択的結合が可能な物質で標識されたアダプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
更に、
（４ａ）請求項１の工程（３）で得られた消化処理物を、前記標識の有無に基づいて、分離する工程、
（５ａ）分離したいずれか一方又は両方のＤＮＡ断片を分析する工程
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１の工程（３）に記載の酵素消化処理を、ＤＮＡ構築物が前記標識物質を介して担体に捕捉された状態で実施し、更に、
（４ｂ）工程（３）の酵素消化処理を実施した固定化担体を洗浄し、担体に捕捉されたＤＮＡ断片と、担体から遊離するＤＮＡ断片とに分離する工程、
（５ｂ）分離したいずれか一方又は両方のＤＮＡ断片を分析する工程
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
更に、
請求項１の工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、メチル化依存性制限酵素で消化する工程、
前記工程で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として、請求項２に記載の増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程で得られる各ＤＮＡ断片について、請求項８に記載の方法により、
（ａ）両端の制限酵素認識配列の両方にメチル化シトシンが存在し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して感受性を示すＤＮＡ、
（ｂ）両端の制限酵素認識配列の両方にメチル化シトシンが存在し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して消化抵抗性を示すＤＮＡ、
（ｃ）両端の制限酵素認識配列の一方のみにメチル化シトシンが存在するか、あるいは、いずれの両端にもメチル化シトシンが存在するものではなく、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して感受性を示すＤＮＡ、
（ｄ）両端の制限酵素認識配列の一方のみにメチル化シトシンが存在するか、あるいは、いずれの両端にもメチル化シトシンが存在するものではなく、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して消化抵抗性を示すＤＮＡ
のいずれであるかを決定する方法。
【請求項１０】
工程（１）で用いる分析対象ＤＮＡとして、一本鎖特異的ヌクレアーゼで予め処理したＤＮＡを使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（Ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により、
（ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、
（ii）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、及び／又は
（iii）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群
を取得する工程、並びに
（Ｂ）取得した各ＤＮＡ断片群について、請求項１に記載のメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、末端のアダプターを全て切断排除した後、ライゲーションする工程を含むことを特徴とする、
（Ｉ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、
（II’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、及び／又は
（III’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群
の製造方法。
【請求項１２】
請求項１１の工程（Ｂ）の後に、更にエキソヌクレアーゼ処理を実施する、
（Ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、
（II）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、及び／又は
（III）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群
の製造方法。
【請求項１３】
（Ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法により、
（ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、
（iiａ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、
（iiｂ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、及び／又は
（iii）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群
を取得する工程、並びに
（Ｂ）取得した各ＤＮＡ断片群について、請求項１に記載のメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、末端のアダプターを全て切断排除した後、ライゲーションする工程を含むことを特徴とする、
（Ｉ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、
（IIａ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、
（IIｂ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、及び／又は
（III’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群
の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３の工程（Ｂ）の後に、更にエキソヌクレアーゼ処理を実施する、
（Ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、
（IIａ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、
（IIｂ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、及び／又は
（III）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群
の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等生物のゲノムＤＮＡはシトシンの一部がメチル化されており、このＤＮＡ修飾はヒストン修飾と共に、個体発生に極めて重要な役割を演じている。これらのエピジェネティックな制御は受精などによりリプログラミングされ、細胞は再び個体を発生する能力、即ち、多能性を獲得する。最近、高橋らにより、このリプログラミングを人為的にも引き起こす方法が開発され、作成された細胞はｉＰＳ細胞（induced pluripotent cell）と呼ばれている（非特許文献１）。ほ乳類の精子や卵子のＤＮＡメチル化レベルはおおよそ生体組織に近いレベルであるが、受精直後には精子由来のＤＮＡは極めて短時間のうちに能動的に脱メチル化される。その一方、卵子のＤＮＡも精子ＤＮＡと一体になり、細胞分裂に伴って着床前までの間に徐々に脱メチル化され、着床直前には最低レベルとなる。このようにしてＤＮＡの初期化が完了する。昨今、人為的変異動物の作成において盛んに利用される胎児性幹細胞（ＥＳ細胞）は、この初期化が完了した受精卵から単離した細胞で、それ自体は個体にまで分化する多能性を有している。【０００３】
この多能性の能力を持つＥＳ細胞は培養系の環境において、様々に分化誘導させる事ができる。従って、ヒトＥＳ細胞から目的細胞ができれば、それを人体へ移植して疾患を根本的に治療する事も可能となる。しかしながら、個体毎に組織適合性が異なる為、特定のＥＳ細胞から分化誘導して作成した細胞を患者へ移植する場合には、細胞移植後に薬物投与による継続的な免疫抑制が必要不可欠となる。一方、ｉＰＳ細胞は、患者自身の組織から多能性幹細胞を作成できるため、免疫的問題も回避でき、細胞移植医療の実現に向けた様々な試みが盛んに行われ始めている（非特許文献２、非特許文献３）。【０００４】
一般的に、正常細胞を培養環境に暴露して継代を繰り返すと、細胞は個体と同じように老化していく。具体的な現象としては、テロメアの短縮や、ＤＮＡのメチル化異常が観察される。例えば、ＤＮＡメチル化異常ががん関連遺伝子上で起きると、細胞の腫瘍化が引き起こされる。勿論、このような細胞の変化は塩基配列の変異や染色体の転座によっても起きる確立がある。細胞移植医療を実現する為には、このような培養系で起きる望まれないゲノムＤＮＡ上の変化を予防したり、あるいはこのような変化が起きた細胞を移植対象細胞から除去しなければならない。その為にはゲノム全体のＤＮＡのメチル化を細胞作成の要所要所で分析し、安全性を確かめる必要がある。例えばｉＰＳ細胞では、ヒトの正常組織から分離した細胞に３乃至４種類の遺伝子を導入して作成するが、分離されたｉＰＳ細胞が完全な多能性を獲得しているかどうかを認識する事は、従来の技術では困難であった。例えばマウスｉＰＳ細胞の全能性を確認するには、作成されたｉＰＳ細胞をマウス受精卵に注射し、ｉＰＳ細胞が、発生したマウス個体の全組織に行き渡ってキメラ状態になっているかを確認する事によって確かめる事ができる。また、多能性が完全に保証されるものではないが、ｉＰＳ細胞をヌードマウスに投与し、テラトカルシノーマの形成能で多能性を評価する事も行われている。しかしながら、ヒト由来のｉＰＳ細胞の多能性を確認する為に、マウスの場合と同様に動物とのキメラ形成能によって分析することは、倫理上の問題点から実施不可能な分析手法である。このような場面において、ゲノムワイドなＤＮＡメチル化解析は極めて重要な分析法であり、代替法は今のところないといっても過言ではない。多能性幹細胞は分化の過程において、ＤＮＡメチル化パターンを正確に制御し、様々な細胞種を規定している。従って、逆にこのメチル化パターンを分析すれば、細胞の種類も同定可能であるし、細胞の完全な多能性を有するか否かも分析することが可能である。即ち、細胞の表現型はＤＮＡメチル化パターンによって詳しく知る事ができるのである。【０００５】
細胞は培養環境で継代していくと、ある頻度で変異を起こす事が知られている。例えばマウスの正常細胞を継代していくと、ある一定の頻度で不死化する細胞が出現する。これは一種のがん化とも言える。このような細胞の出現には、染色体異常、がん関連遺伝子の塩基レベルの変異、あるいは、ＤＮＡメチル化の異常が関与していると考えられている。このうちＤＮＡメチル化については、細胞のがん化の初期の段階において、ＣｐＧアイランドやがん関連遺伝子のコアプロモーター領域に高頻度に異常が観察されるため、細胞のがん化の早期診断には鋭敏な分析法とも言える。【０００６】
前述の様に、ゲノムワイドなＤＮＡメチル化分析は、細胞の状態を知る上で極めて有用な分析法であり、他の分析手法では代替できない領域を有する。従って、細胞移植医療分野においては必要不可欠の分析法である。従って、本分析法の臨床応用に向けて、分析操作が簡単で、なおかつ、ゲノム全体に渡って詳細に分析できる分析法が期待されている。【０００７】
ＤＮＡアレイを用いたＤＮＡメチル化分析法には、ＭｅＤＩＰ法（非特許文献４）やＭＯＮＩＣ（特許文献１）法など、抗５−メチルシトシン抗体を用いた幾つかの公知技術が報告されている。また、抗体を用いた方法に対し、制限酵素の性質を用いた方法も報告されており、例えば、ＤＭＨ法（非特許文献５）やＭＩＡＭＩ法（非特許文献６）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００５／０８０５６５号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】「セル（Cell）」，（米国），２００６年，１２６巻，６６３−６７６頁
【非特許文献２】「セル（Cell）」，（米国），２００７年，１３１巻，８６１−８７２頁
【非特許文献３】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature biotechnology）」，（米国），２００８年，２６巻，１０１−１０６頁
【非特許文献４】「ネイチャー・ジェネティックス（Nature genetics）」，（米国），２００５年，３７巻，８５３−８６２頁
【非特許文献５】「キャンサー・リサーチ（Cancer research）」，（米国），２００１年，６１巻，８３７５−８３８０頁
【非特許文献６】「オンコジーン（Oncogene）」，（英国），２００６年，２５巻，３０５９−３０６４頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、抗５−メチルシトシン抗体を用いた前記公知方法は、全分析に数日を要する事、抗体などの特殊な試薬が必要である事、更には、これらの方法は抗体による免疫沈降法を用いている為、標的ＤＮＡの回収効率が低く、分析には多くのサンプルＤＮＡ量が必要であるという欠点があった。幹細胞を培養系で分化誘導し、その一部の細胞を分析に使用する場合には、分析に使用できる細胞数が限られているため、高感度な分析法が必要とされている。従って、ナノグラムオーダーのＤＮＡ量でも分析可能な方法が望まれる。【００１１】
また、制限酵素の性質を用いた前記公知方法では、標的ＤＮＡの回収効率が高いため、微量なサンプルから分析が可能である。しかし、これらの従来法ではメチル化感受性制限酵素を初段階で使用しているため、ゲノムの切断箇所がメチル化に依存し、ゲノム上の切断箇所が少ない。従って、これが従来の分析法の分析解像度を規定する事となる。ＤＮＡアレイを用いた方法はこの他にも亜硫酸水素イオン（Bisulfite）によりＤＮＡを化学処理した後にアレイ分析を行う方法もあるが、ＤＮＡ中の非メチル化シトシンはウラシルに変化し、これをＰＣＲ増幅反応時にチミンに変換されるため、ＤＮＡの塩基配列の複雑性が低下し、それにより、ゲノム上の特定の領域に他の領域とのホモロジーが高くなってしまい、ＤＮＡアレイに用いられる短いオリゴＤＮＡでは、特定の遺伝子断片の特異的検出が不可能な場合が頻出するといった欠点があった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従来技術における前述のような課題に鑑み、本発明者はゲノムＤＮＡメチル化を高解像度に、また、高感度で分析する方法の開発に鋭意努力し、本発明の技術を開発する事ができた。本発明の特徴は、非メチル化感受性制限酵素によって細かく断片化された（高解像度を意味する）ＤＮＡ断片の両突出末端のメチル化についてのみならず、ＤＮＡ断片内部領域のメチル化についても分析できる能力を有していることである。従来法ではメチル化感受性制限酵素を最初に用いてＤＮＡを断片化し、両端にアダプターを連結した後にメチル化非感受性制限酵素で更に消化し、メチル化部位を同定している。従って、従来法では分析不可能な遺伝子のプロモータ領域が多数発生する。従って、全ての遺伝子について分析する事ができなかった。本発明では高解像度分析を実現するため、先ず最初にメチル化非感受性制限酵素でゲノムＤＮＡを細かく断片化しており、これらのＤＮＡ断片の両端のメチル化を分析できるように工夫した。これにより、従来法に比べて分析解像度を飛躍的に向上する事ができ、殆ど全ての遺伝子のコアプロモーター領域やＣｐＧアイランドについて、分析が可能となった。また本発明では、アダプター連結後にメチル化感受性制限酵素で再消化すると同時に、同サンプルをメチル化非感受性制限酵素で同様に消化し、これらの両者をＬＭ−ＰＣＲ（Ligation-mediated PCR）後に電気泳動で比較する事により、アダプターの完全除去を確認する事ができる。即ち、分析結果が制限酵素のメチル化感受性のみで正確に判別されたかどうかを評価する事が可能となっている。この技術は公知の従来法には含まれていない。臨床サンプルを分析評価する場合には、各分析ステップ毎のクオリティーチェックを行える分析系である事が極めて重要であるため、本発明ではそのような社会的ニーズに鑑み、改良されている。【００１３】
制限酵素の消化やアダプターの連結効率は一般的には１００％ではなく、未消化やアダプターが連結できなかったＤＮＡ末端も分析系に混入してくる。このような不完全処理物の混入は、一般的な分子生物学的実験では問題とはならないが、メチル化分析のように、ＤＮＡのメチル化を定量的に分析する場面においては、その分析結果を修飾してしまう事となる。即ち、メチル化部位を非メチル化部位であると評価してしまったり、逆に非メチル化部位をメチル化部位と評価してしまう事となる。本発明ではこのような問題点にも注目し、解決の方策を開発している。【００１４】
また、本発明ではＬＭ−ＰＣＲという公知技術を使用しているが、アダプターが連結したＤＮＡの特異的増幅においても最適の条件を見出している。公知技術の場合、その多くは２本鎖のアダプターのうちの一方のオリゴＤＮＡをＬＭ−ＰＣＲ用のプライマーとして実施している場合が多い。しかし、本発明者の検討では、その殆どの場合、アダプターが連結していないＤＮＡをも非特異的に増幅してしまっている事を確認している。これは恐らく、ＬＭ−ＰＣＲが十数から二十数塩基からなる１つのオリゴＤＮＡプライマーのみでＰＣＲにおける特異性を確保しなくてはならない為であると考えられる。即ち、ゲノム上の多彩な塩基配列に鑑みると、前記のような短いプライマーとホモロジーを有する箇所がゲノム上に数多く存在している為に、アダプターが連結していなくても、プライマーとのホモロジーが高い領域とプライマーがハイブリダイズし、非特異的な増幅産物が観察されているものと推察される。【００１５】
本発明の更なる特徴の一つとして、このような非特異的増幅の発生を分析途中で確認できる事にあり、このようなクオリティーチェックが可能になった為、本発明に記載の実施態様が初めて可能となった。前述した公知の技術では、このようなＬＭ−ＰＣＲの特異性の検証工程が含まれていないため、最終分析結果を見るまでは、分析結果の信頼性を判断する材料がない。即ち、ＬＭ−ＰＣＲなどの増幅工程において非特異的増幅の発生をモニターする工程が設定できない。これは、メチル化感受性制限酵素を最初に用いているためで、このようにメチル化感受性制限酵素で得られたＤＮＡ断片はその内部にメチル化非感受性制限酵素により切断される部位を含む確立が高いため、アダプターを当該発明と同様にメチル化非感受性制限酵素で消化後にＬＭ−ＰＣＲにおける増幅特異性を検証する事は原理的に不可能である。
このような問題点は本発明の技術により初めて解決できたものであり、公知技術の単純は組み合わせでは解決できない課題であった。【００１６】
本発明は、
［１］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を再生することのできるアダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化非感受性制限酵素と同じ認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素で消化する工程
を含むことを特徴とする、分析対象ＤＮＡのメチル化分析方法、
［２］更に、
［１］の工程（３）で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として、［１］の工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、［１］の方法、
［３］更に、
［１］の工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、［１］の工程（１）に記載のメチル化非感受性制限酵素と同じ認識配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
前記工程で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として、［２］に記載の増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、［２］の方法、
［４］更に、
［１］の工程（２）で得られたＤＮＡ構築物、あるいは、前記ＤＮＡ構築物を鋳型として、［２］に記載の増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、［２］又は［３］の方法、
［５］［１］の工程（２）に記載のアダプターが、選択的結合が可能な物質で標識されたアダプターである、［１］の方法、
［６］更に、
（４ａ）［１］の工程（３）で得られた消化処理物を、前記標識の有無に基づいて、分離する工程、
（５ａ）分離したいずれか一方又は両方のＤＮＡ断片を分析する工程
を含む、［５］の方法、
［７］［１］の工程（３）に記載の酵素消化処理を、ＤＮＡ構築物が前記標識物質を介して担体に捕捉された状態で実施し、更に、
（４ｂ）工程（３）の酵素消化処理を実施した固定化担体を洗浄し、担体に捕捉されたＤＮＡ断片と、担体から遊離するＤＮＡ断片とに分離する工程、
（５ｂ）分離したいずれか一方又は両方のＤＮＡ断片を分析する工程
を含む、［５］の方法、
［８］更に、
［１］の工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、メチル化依存性制限酵素で消化する工程、
前記工程で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として、［２］に記載の増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、［１］〜［７］の方法、
［９］［１］の工程（１）で得られる各ＤＮＡ断片について、［８］の方法により、
（ａ）両端の制限酵素認識配列の両方にメチル化シトシンが存在し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して感受性を示すＤＮＡ、
（ｂ）両端の制限酵素認識配列の両方にメチル化シトシンが存在し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して消化抵抗性を示すＤＮＡ、
（ｃ）両端の制限酵素認識配列の一方のみにメチル化シトシンが存在するか、あるいは、いずれの両端にもメチル化シトシンが存在するものではなく、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して感受性を示すＤＮＡ、
（ｄ）両端の制限酵素認識配列の一方のみにメチル化シトシンが存在するか、あるいは、いずれの両端にもメチル化シトシンが存在するものではなく、且つ、メチル化依存性制限酵素に対して消化抵抗性を示すＤＮＡ
のいずれであるかを決定する方法、
［１０］工程（１）で用いる分析対象ＤＮＡとして、一本鎖特異的ヌクレアーゼで予め処理したＤＮＡを使用する、［１］〜［９］の方法、
［１１］（Ａ）［１］〜［１０］の方法により、
（ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、
（ii）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、及び／又は
（iii）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群
を取得する工程、並びに
（Ｂ）取得した各ＤＮＡ断片群について、［１］に記載のメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、末端のアダプターを全て切断排除した後、ライゲーションする工程
を含むことを特徴とする、
（Ｉ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、
（II’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、及び／又は
（III’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群
の製造方法、
［１２］前記ライゲーションの後に、更にエキソヌクレアーゼ処理を実施する、
（Ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、
（II）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、及び／又は
（III）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群
の製造方法、
［１３］（Ａ）［１］〜［１０］の方法により、
（ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、
（iiａ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、
（iiｂ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群、及び／又は
（iii）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片のみを含むＤＮＡ断片群
を取得する工程、並びに
（Ｂ）取得した各ＤＮＡ断片群について、［１］に記載のメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、末端のアダプターを全て切断排除した後、ライゲーションする工程
を含むことを特徴とする、
（Ｉ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、
（IIａ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、
（IIｂ’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群、及び／又は
（III’）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群
の製造方法、
［１４］前記ライゲーションの後に、更にエキソヌクレアーゼ処理を実施する、
（Ｉ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、
（IIａ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、
（IIｂ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群、及び／又は
（III）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡのみを含む環状ＤＮＡ群
の製造方法、
［１５］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ、
（２）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ、又は
（３）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ
のいずれか１つのＤＮＡのみを含むことを特徴とする、ＤＮＡ群、
［１６］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ、
（２ａ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ、
（２ｂ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ、又は
（３）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ
のいずれか１つのＤＮＡのみを含むことを特徴とする、ＤＮＡ群、
［１７］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡ、
（２）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、一方の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡ、又は
（３）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡ
のいずれか１つの環状ＤＮＡのみを含むことを特徴とする、環状ＤＮＡ群、
［１８］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列にメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡ、
（２ａ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡ、
（２ｂ）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡ、又は
（３）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、両方の認識配列のいずれにもメチル化シトシンが存在しない前記ＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られる環状ＤＮＡ
のいずれか１つの環状ＤＮＡのみを含むことを特徴とする、環状ＤＮＡ群、
［１９］メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、上流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片、又は
メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む認識配列を両端に有するＤＮＡ断片であって、下流側の認識配列のみにメチル化シトシンが存在する前記ＤＮＡ断片
のいずれか一方のＤＮＡ断片のみを含むことを特徴とする、直鎖状ＤＮＡ群、
［２０］前記ＤＮＡ断片の両端に、同一又は異なるアダプターが連結されている、［１９］の直鎖状ＤＮＡ群、
［２１］［１９］又は［２０］のＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸が担体上に配置されていることを特徴とする、ＤＮＡアレイ、
［２２］［１７］又は［１８］の環状ＤＮＡ群を鋳型として、ランダムプライマーを使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅し、得られたＤＮＡ増幅産物を分析することを特徴とする、分析対象ＤＮＡのメチル化分析方法、
［２３］［９］に記載のＤＮＡ（ａ）〜（ｄ）の全部又は一部とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸が担体上に配置されていることを特徴とする、ＤＮＡアレイ、
［２４］制限酵素の認識配列を両端に有し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対する耐性を示すＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ群であって、前記認識配列が全て同一配列である、前記ＤＮＡ群、
［２５］（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）アダプターを、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、メチル化依存性制限酵素で消化する工程
を含むことを特徴とする、分析対象ＤＮＡのメチル化分析方法、
［２６］更に、
［２５］の工程（３）で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として、［２５］の工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いて増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、［２５］の方法、
［２７］鋳型として用いる前記消化処理物を、二重鎖ＤＮＡ消化性５’→３’エキソヌクレアーゼで、あるいは、二重鎖ＤＮＡ消化性５’→３’エキソヌクレアーゼ及び一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼで前処理する、［２６］の方法、
［２８］［２５］の工程（１）で得られる各ＤＮＡ断片について、［２６］又は［２７］に記載の方法により、
（ａ）メチル化依存性制限酵素に対して消化抵抗性を示すＤＮＡ、
（ｂ）メチル化依存性制限酵素に対して感受性を示すＤＮＡ
のいずれであるかを決定する方法、
［２９］［２５］の工程（１）で得られる各ＤＮＡ断片について、［２６］又は［２７］に記載の方法により、少なくとも内部領域のメチル化の程度を決定する方法、
［３０］［２５］に記載のアダプターとして、ＤＮＡ断片の末端領域にメチル化依存性制限酵素の認識部位を形成させないアダプターを使用することにより、内部領域のみについて、メチル化の程度を決定する、［２９］の方法、
［３１］［２５］に記載のアダプターとして、ＤＮＡ断片の末端領域にメチル化依存性制限酵素の認識部位を形成させるアダプターを使用することにより、内部領域および末端領域の総合的なメチル化の程度を決定する、［２９］の方法、
［３２］［２８］に記載のＤＮＡ（ａ）及び（ｂ）の全部又は一部とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸が担体上に配置されていることを特徴とする、ＤＮＡアレイ、
［３３］（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記制限酵素の認識配列を再生することのできるアダプターを、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、メチル化依存性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られた消化処理物を鋳型として、前記工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いてＤＮＡを増幅する工程
を含むことを特徴とする、両端に前記工程（１）に記載の制限酵素の認識配列を有し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対する耐性を示すＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ群の製造方法、
［３４］制限酵素の認識配列を両端に有し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対する耐性を示すＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ群であって、前記認識配列が全て同一配列である、前記ＤＮＡ群、
［３５］［３４］に記載のＤＮＡ断片群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸が担体上に配置されていることを特徴とする、ＤＮＡアレイ、
［３６］前記アダプターが、エキソヌクレアーゼ抵抗性を付与したオリゴヌクレオチドと、蛍光標識及びクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドとの組合せからなり、
［２５］の工程（３）で得られた消化処理物を、二重鎖ＤＮＡ消化性エキソヌクレアーゼで処理し、その蛍光を測定することにより、メチル化率を決定する、［２５］の方法、
［３７］（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片を環状化する工程、
（３）前記工程（１）で得られた環状ＤＮＡを、ＭＤ制限酵素で消化する工程、
を含むことを特徴とする、分析対象ＤＮＡのメチル化分析方法、
［３８］更に、
［３７］の工程（３）で得られた消化処理物、あるいは、前記消化処理物を鋳型として環状ＤＮＡのみを増幅したＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む、［３７］の方法、
［３９］メチル化依存性制限酵素の認識部位を有しない環状ＤＮＡのみからなることを特徴とする、環状ＤＮＡ群、
［４０］ＰｕｍＣ配列を全く含まない環状ＤＮＡのみからなる、［３９］の環状ＤＮＡ群、
［４１］［３９］又は［４０］に記載の環状ＤＮＡ群に含まれるＤＮＡ断片の全部又は一部とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸が担体上に配置されていることを特徴とする、ＤＮＡアレイ、
［４２］（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片を環状化する工程、
（３）前記工程（１）で得られた環状ＤＮＡを、ＭＤ制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られた消化処理物を鋳型として環状ＤＮＡのみを増幅する工程
を含むことを特徴とする、［３９］又は［４０］に記載の環状ＤＮＡ群の製造方法、
［４３］工程（１）で用いる分析対象ＤＮＡとして、一本鎖特異的ヌクレアーゼで予め処理したＤＮＡを使用する、［２５］〜［３１］、［３３］、［３６］〜［３８］、［４２］のいずれか一項に記載の方法
に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】工程（２）で得られた４種類のＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ、Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ、Ａｄ＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ、Ａｄ＋Ｃ／Ｃ＋Ａｄ）の、アビジン固定化担体上での状態を示す説明図である。
【図２】各ＤＮＡ構築物における、各種操作（アダプター連結、分離、増幅等）を示す説明図である。
【図３】実施例１における、本発明の第１態様により得られたＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を示す図面である。
【図４】実施例１で得られたＰＣＲ増幅産物を蛍光標識し、ＤＮＡアレイ分析を行った結果を示すグラフである。
【図５】ＭｃＢＴ法及びＣＲＥＤ法で得られた各ＰＣＲ産物を、マウス第１１番染色体のＮｍｕｒ２遺伝子（ＮＭ＿１５３０７９）分析用ＤＮＡアレイを用いて得られた結果を示す説明図である。
【図６】ＭｃＢＴ法及びＣＲＥＤ法で得られた各ＰＣＲ産物を、マウス第１番染色体のＦｚｄ７遺伝子（ＮＭ＿００８０５７）分析用ＤＮＡアレイを用いて得られた結果を示す説明図である。
【図７】ＭｃＢＴ法及びＣＲＥＤ法で得られた各ＰＣＲ産物を、マウス第２番染色体のＰａｒｄ６ｂ遺伝子（ＮＭ＿０２１４０９）分析用ＤＮＡアレイを用いて得られた結果を示す説明図である。
【図８】図７に示すエリアＡ及びＢの拡大説明図である。
【図９】５’→３’エキソヌクレアーゼを用いる蛍光＆クエンチャー法の実施手順の概略を示す説明図である。
【図１０】３’→５’エキソヌクレアーゼを用いる蛍光＆クエンチャー法の実施手順の概略を示す説明図である。
【図１１】ＣＲＥＤ法で得られたＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
１．本発明のメチル化分析方法
本発明のメチル化分析方法は、
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素（以下、ＭＩ制限酵素と称する）で、分析対象ＤＮＡを消化する工程（以下、ＭＩ制限酵素消化工程と称する）、
（２）工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を再生することのできるアダプターを連結させる工程（以下、アダプター連結工程と称する）、
（３）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化非感受性制限酵素と同じ認識配列を認識するメチル化感受性制限酵素（以下、ＭＳ制限酵素と称する）で消化する工程（以下、ＭＳ制限酵素消化工程と称する）
を少なくとも含むことを特徴とし、得られたＤＮＡ構築物及び／又は消化処理物のその後の取り扱いや、主として得られる分析結果の違い等に基づき、複数の実施態様を包含する。以下、ＭＩ制限酵素とＭＳ制限酵素との組合せを使用する本発明のメチル化分析方法をＭｃＢＴ法と称することがある。
【００１９】
本発明のメチル化分析方法における第１の態様は、
（１）ＭＩ制限酵素で分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、ＭＩ制限酵素の認識配列を再生することのできるアダプターを連結させる工程、
（３）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記ＭＩ制限酵素と同じ認識配列を認識するＭＳ制限酵素で消化する工程、
（４）工程（３）で得られた消化処理物と、工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（５）工程（４）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含むことができる。なお、出発材料である分析対象ＤＮＡが充分量である場合には、工程（４）の増幅工程を省略して、工程（３）で得られた消化処理物を、増幅することなく、分析することもできる。
本態様によれば、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅することができ、これらを同定することができる。
【００２０】
また、本発明のメチル化分析方法では、前記第一態様の各工程に加え、所望により、更に、
（３ａ）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、メチル化依存性制限酵素（例えば、ＭｃｒＢＣ。以下、ＭＤ制限酵素と称する）で消化する工程、
（４ａ）工程（３ａ）で得られた消化処理物と、工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（５ａ）工程（４ａ）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含むことができる（以下、第１ａ態様と称する）。なお、出発材料である分析対象ＤＮＡが充分量である場合には、工程（４ａ）の増幅工程を省略して、工程（３）で得られた消化処理物を、増幅することなく、分析することもできる。
なお、第１ａ態様は、ＭｃＢＴ法と、後述のＣＲＥＤ法とを組み合わせた態様であり、その詳細は、ＣＲＥＤ法の項において説明する。
【００２１】
また、本発明のメチル化分析方法では、ネガティブコントロールとして、前記第１態様（又は第１ａ態様）の各工程に加え、更に、
（３’）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、工程（１）に記載のＭＩ制限酵素と同じ認識配列を認識するＭＩ制限酵素で消化する工程、
（４’）工程（３’）で得られた消化処理物と、工程（４）に記載の増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（５’）工程（４’）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含むことができる。なお、出発材料である分析対象ＤＮＡが充分量である場合には、工程（４’）の増幅工程を省略して、工程（３’）で得られた消化処理物を、増幅することなく、分析することもできる。
工程（３’）で使用するＭＩ制限酵素は、同じ認識配列を認識することができる限り、工程（１）で使用するＭＩ制限酵素と同じ酵素を用いることもできるし、異なる酵素を用いることもできる。以下に詳述するとおり、工程（３’）〜（５’）を実施することにより、工程（１）〜（３）の各工程が正常に進行しているか否かを判定することができる。
【００２２】
また、本発明のメチル化分析方法では、比較対象として全ＤＮＡ断片を増幅するために、前記第１態様（又は第１ａ態様）の各工程（好ましくは、更に前記ネガティブコントロールの各工程）に加え、更に、
（４”）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物と、工程（４）に記載の増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（５”）工程（４”）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含むことができる。なお、出発材料である分析対象ＤＮＡが充分量である場合には、工程（４”）の増幅工程を省略して、工程（２”）で得られたＤＮＡ構築物を、増幅することなく、分析することもできる。
【００２３】
本発明のメチル化分析方法における第２の態様は、工程（２）で用いるアダプターとして、選択的結合が可能な物質で標識されたアダプター（以下、第１アダプターと称する）を用いることを主な特徴とする。また、前記第２態様は、工程（３）のＭＳ制限酵素消化処理を、担体に捕捉させた状態で行うか否かによって、更に、２つのサブ態様（第２ａ態様、第２ｂ態様）に分けることができる。
【００２４】
工程（３）を担体に捕捉されない状態で実施する第２ａ態様は、
（１）ＭＩ制限酵素で分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、選択的結合が可能な物質で標識され、且つ、ＭＩ制限酵素の認識配列を再生することができる第１アダプターを連結させる工程、
（３）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記ＭＩ制限酵素と同じ認識配列を認識するＭＳ制限酵素で消化する工程、
（４ａ）工程（３）で得られた消化処理物を、前記標識の有無に基づいて、分離する工程、
（５ａ）分離したいずれか一方又は両方のＤＮＡ断片を分析する工程
を含むことができる。
【００２５】
一方、工程（３）を、消化対象のＤＮＡ構築物が担体に捕捉された状態で実施する第２ｂ態様は、
（１）ＭＩ制限酵素で分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、選択的結合が可能な物質で標識され、且つ、ＭＩ制限酵素の認識配列を再生することができる第１アダプターを連結させる工程、
（３）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記標識物質を介して担体に捕捉された状態で、前記ＭＩ制限酵素と同じ認識配列を認識するＭＳ制限酵素で消化する工程、
（４ｂ）工程（３）の酵素消化処理を実施した固定化担体を洗浄し、担体に捕捉されたＤＮＡ断片と、担体から遊離するＤＮＡ断片とに分離する工程、
（５ｂ）分離したいずれか一方又は両方のＤＮＡ断片を分析する工程
を含む。
【００２６】
本発明のメチル化分析方法における第２態様（第２ａ態様と第２ｂ態様を含む）によれば、少なくとも１端がメチル化されているＤＮＡ断片と、両端が共にメチル化されていないＤＮＡ断片とを分離することができ、これらを増幅・同定することができる。また、前記の少なくとも１端がメチル化されているＤＮＡ断片を、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片と、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片とに更に分離・増幅・同定することができ、更に、どちらの端部がメチル化されているかを決定することができる。
【００２７】
本発明の別のメチル化分析方法は、
（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程（以下、断片化用制限酵素消化工程と称する）、
（２）アダプターを、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に連結させる工程（以下、アダプター連結工程と称する）、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、ＭＤ制限酵素（例えば、ＭｃｒＢＣ）で消化する工程（以下、ＭＤ制限酵素消化工程と称する）
を少なくとも含むことを特徴とし、前記のＭｃＢＴ法との組合せの有無や、主として得られる分析結果の違い等に基づき、複数の実施態様を包含する。以下、ＭＤ制限酵素を使用する本発明のメチル化分析方法をＣＲＥＤ法と称することがある。
【００２８】
また、前記ＣＲＥＤ法は、更に、
（４）工程（３）で得られた消化処理物と、工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（５）工程（４）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含むことができる。なお、出発材料である分析対象ＤＮＡが充分量である場合には、工程（４）の増幅工程を省略して、工程（３）で得られた消化処理物を、増幅することなく、分析することもできる。
以下、本発明のＭｃＢＴ法について説明し、続いて、本発明のＣＲＥＤ法について説明する。
【００２９】
ＭｃＢＴ法
本発明のメチル化分析方法（以下、特に断らない限り、本項においては、ＭｃＢＴ法を意味するものとする）では、同一の認識配列を認識することのできるメチル化非感受性制限酵素（ＭＩ制限酵素）とメチル化感受性制限酵素（ＭＳ制限酵素）の組み合わせを使用する。前記ＭＩ制限酵素は、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ突出末端を生じさせる制限酵素である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ＭｓｐＩ、ＸｍａＩ、ＴａｑＩを挙げることができる。前記ＭＳ制限酵素は、ＭＩ制限酵素と同一の認識配列を認識可能であれば、切断部位や、生じる末端形状は、ＭＩ制限酵素と同一であっても、異なっていてもよく、例えば、ＭｓｐＩに対してＨｐａII、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭIV、又はＳｍａＩ、ＸｍａＩに対してＳｍａＩ、ＴａｑＩに対してＸｈｏＩ又はＣｌａＩを挙げることができる。これらの制限酵素の認識配列と切断部位を表１に示す。
【００３０】
【表１】
0005618369.tif 000002
【００３１】
なお、本発明で用いるＭＳ制限酵素は、ＭＩ制限酵素と同一の認識配列を認識することができれば、認識配列が完全一致である必要はなく、ＭＩ制限酵素の認識配列を含んでいる場合も使用可能である。例えば、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用する場合、ＭＳ制限酵素としてＮｇｏＭIV（認識配列はＧ：ＣＣＧＧＣ）、ＮａｅＩ（認識配列はＧＣＣ：ＧＧＣ）、ＳｍａＩ（認識配列はＣＣＣ：ＧＧＧ）を使用することもできる。
【００３２】
本発明のメチル化分析方法における工程（１）、すなわち、ＭＩ制限酵素消化工程では、ＭＩ制限酵素で分析対象ＤＮＡを消化する。本発明のメチル化分析方法を適用することのできるＤＮＡは、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む可能性のあるＤＮＡである限り、特に限定されるものではなく、例えば、細胞（例えば、動物細胞又は植物細胞）のゲノムＤＮＡ、あるいは、生体試料又はそれに由来する試料（例えば、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液、唾液、腹水、羊水、粘液、乳汁、胆汁、胃液、又は透析実施後の人工透析液など）に存在する遊離ＤＮＡ断片混合物、人工的に合成したＤＮＡを挙げることができる。細胞のゲノムＤＮＡを用いる場合には、一本鎖特異的ヌクレアーゼ、例えば、マングビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼで予め処理することにより、生物の内因性の現象、あるいは人為的操作の途中で生じた１本鎖領域あるいはループ領域を除去することができ、分析の正確性を飛躍的に向上させることができると共に、ＭＩ制限酵素による消化効率を飛躍的に向上させることができる。
【００３３】
工程（１）で用いるＭＩ制限酵素は、認識配列中に含まれるシトシンのメチル化の有無に関係なく、全ての認識部位を切断可能であるため、本工程を実施することにより、両端に生じる突出末端のメチル化の有無（すなわち、メチル化シトシンの存在の有無）に基づいて、４種類の異なるＤＮＡ断片の混合物を生じる。４種類のＤＮＡ断片とは、上流端および下流端の両端がメチル化されているＤＮＡ断片（ｍＣ／ｍＣ）、上流端がメチル化され、下流端がメチル化されていないＤＮＡ断片（ｍＣ／Ｃ）、上流端がメチル化されておらず、下流端がメチル化されているＤＮＡ断片（Ｃ／ｍＣ）、両端がメチル化されていないＤＮＡ断片（Ｃ／Ｃ）である［記号「ｍＣ」はシトシンがメチル化されていることを示し、記号「Ｃ」は、シトシンがメチル化されていないことを示す］。なお、本明細書において、ＤＮＡ断片の上流端および下流端とは、特定の方向を意図したものではなく、本発明を説明する上で便宜上、導入した概念であり、本発明の実施者が適宜、規定することができる。例えば、構造遺伝子であれば、それぞれ、遺伝子の上流方向および下流方向に対応する末端と規定することが一般的である。
【００３４】
本発明のメチル化分析方法における工程（２）、すなわち、アダプター連結工程では、工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、アダプターを連結させる。本工程では、一方の端部が、工程（１）で得られたＤＮＡ断片の突出末端と相補的に結合可能である限り、もう一方の端部の構造も含め、特に限定されるものではない。例えば、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用し、後述するＭＳ制限酵素としてＨｐａII（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用する場合、以下に示すように、生じるＤＮＡ断片の両末端は、５’−ＣＧがオーバーハングする構造を有するため、用いるアダプターの一方の端部も、５’−ＣＧがオーバーハングする構造を有するアダプターを使用することができる。また、後述するように、ＤＮＡ断片とアダプターとをライゲーション反応により連結する場合に、ＤＮＡ断片センス鎖の５’末端がアダプターと共有結合を形成し、ＤＮＡ断片アンチセンス鎖の３’末端がアダプターとは共有結合を形成させないこともできる。この場合、ＤＮＡ断片アンチセンス鎖の３’末端とアダプターとの間に間隙が生じるように、アダプターを設計しても構わない。
【化１】
0005618369.tif 000003
【００３５】
なお、ＭＩ制限酵素とＭＳ制限酵素の認識配列が完全一致しない場合、例えば、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用し、ＭＳ制限酵素としてＳｍａＩ（認識配列はＣＣＣ：ＧＧＧ）を使用する場合には、例えば、以下に示すように、ＭＳ制限酵素の認識配列を考慮してアダプターを設計することができる。
【化２】
0005618369.tif 000004
以下、特に断らない限り、ＭＩ制限酵素とＭＳ制限酵素の認識配列が完全一致する場合に主に基づいて、本発明のメチル化分析方法を説明するが、ＭＩ制限酵素とＭＳ制限酵素の認識配列が完全一致しない場合についても、当業者であれば、本明細書の記載と本技術分野の技術常識に基づいて、適宜変更を加えることにより実施することができる。
【００３６】
工程（１）で得られたＤＮＡ断片の５’末端はリン酸化されているため、工程（２）で用いるアダプターとして、アダプターのアンチセンス鎖用オリゴヌクレオチドの５’末端はリン酸化されていないものを使用することができる。工程（２）では、工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物に対して、過剰量のアダプターを添加し、ＤＮＡ断片混合物とアダプターとの相補的水素結合が形成されたところで、ライゲーション反応を実施することができる。アダプターのアンチセンス鎖用オリゴヌクレオチドの５’末端がリン酸化されていないものを使用する場合、ＤＮＡ断片センス鎖の５’末端はリン酸化されているため、ＤＮＡ断片センス鎖とアダプターのセンス鎖用オリゴヌクレオチドの３’末端とは、前記ライゲーション反応により共有結合を介して連結されるが、ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖３’末端とアダプターのアンチセンス鎖用オリゴヌクレオチドの５’末端とは、共有結合で連結されない。一方、アダプターのアンチセンス鎖用オリゴヌクレオチドの５’末端がリン酸化されているアダプターを使用する場合にはアダプターのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両鎖はともに前記ライゲーション反応によりＤＮＡ断片と共有結合を介して連結される。従って、この場合、フィルインの工程が不要となり、簡略化できる。
【００３７】
工程（２）では、続いて、アダプターのＴｍ又はそれ以上まで加熱すること、あるいは、ＤＮＡが含まれる溶液中のＴｍを低下させることにより、アダプターのアンチセンス鎖用オリゴヌクレオチドを除去した後、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡのアンチセンス鎖を伸長させることにより、両端にアダプター配列を連結させたＤＮＡ構築物を得ることができる。工程（１）では、両端のメチル化の有無に基づいて分類される４種類のＤＮＡ断片が混合物の状態で得られており、工程（２）で得られるＤＮＡ構築物も、４種類のＤＮＡ構築物、すなわち、上流端および下流端の両端がメチル化されているＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）、上流端がメチル化され、下流端がメチル化されていないＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ）、上流端がメチル化されておらず、下流端がメチル化されているＤＮＡ構築物（Ａｄ＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）、両端がメチル化されていないＤＮＡ構築物（Ａｄ＋Ｃ／Ｃ＋Ａｄ）の混合物である［記号「Ａｄ」はアダプターを意味する］。これらの各ＤＮＡ構築物の両端には、ＭＩ制限酵素の認識配列（例えば、ＭｓｐＩの場合には、Ｃ：ＣＧＧ）が再生されている。
【００３８】
なお、再生された制限酵素認識配列は、ｄＮＴＰｓ存在下で伸長反応を実施する場合、新たに合成されたＤＮＡ鎖中のシトシンは全て非メチル化シトシンである。次の工程（３）、すなわち、ＭＳ制限酵素消化工程において、センス鎖／アンチセンス鎖のいずれか一方の鎖のシトシンがメチル化されていれば、メチル化感受性を示す（すなわち、メチル化により切断が阻害される）ＭＳ制限酵素を使用する場合、新たに合成されたＤＮＡ鎖中のシトシンが非メチル化シトシンであっても、メチル化感受性は、分析対象ＤＮＡの最初のメチル化状態がそのまま反映される。一方、センス鎖／アンチセンス鎖の両方のシトシンがメチル化された場合にメチル化感受性を示すＭＳ制限酵素を使用する場合、アダプターのアンチセンス鎖中のシトシンをｄＣＴＰの代わりに５−メチル−ｄＣＴＰを用いて伸長反応を実施することにより、分析対象ＤＮＡの最初のメチル化状態を反映させることができる。
【００３９】
本発明のメチル化分析方法の工程（２）においては、前記アダプターとして、選択的結合が可能な物質で標識（又は修飾）されたアダプター（以下、標識化アダプター）を使用することができる。このような標識化アダプターを使用すると、以下に詳述するとおり、両端に生じる突出末端のメチル化の有無に基づいて、ＤＮＡ断片を分離精製することができる。
【００４０】
本発明のメチル化分析方法における工程（３）、すなわち、ＭＳ制限酵素消化工程では、工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、ＭＳ制限酵素で消化する。工程（２）で得られたＤＮＡ構築物の混合物には、両端のメチル化の有無に基づいて分類される４種類のＤＮＡ構築物が含まれており、いずれのＤＮＡ構築物に関しても、その両端には、ＭＳ制限酵素の認識部位が存在する。
４種類のＤＮＡ構築物の内、両端がメチル化されているＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）は、ＭＳ制限酵素による切断を全く受けないため、消化処理物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）が得られる。一方の端部のみがメチル化されているＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ、Ａｄ＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）では、メチル化されている端部は、ＭＳ制限酵素による切断を受けないが、メチル化されていない端部は、ＭＳ制限酵素による切断を受けるため、アダプター配列が除去され、消化処理物（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ、Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）が得られる。両端がメチル化されていないＤＮＡ構築物（Ａｄ＋Ｃ／Ｃ＋Ａｄ）は、両端ともＭＳ制限酵素による切断を受けるため、両端からアダプター配列が除去され、消化処理物（Ｃ／Ｃ）が得られる。
【００４１】
続いて、工程（４）では、工程（３）で得られた消化処理物と、工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する。工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマー１種類を用いてＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）を実施する場合、両端にアダプターが連結しているＤＮＡ断片のみが増幅され、一方の端部からアダプター配列が除去されたＤＮＡ断片、あるいは、両端からアダプター配列が除去されたＤＮＡ断片は増幅されない。従って、工程（５）において、増幅されたＤＮＡ産物を分析することにより、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片を同定することができる。
また、本発明では、前記増幅用プライマーとして、アダプターにハイブリダイズ可能な塩基配列と、前記アダプターに隣接する遺伝子配列（すなわち、ＤＮＡ断片の末端側配列）とハイブリダイズ可能な塩基配列とからなるプライマーを使用することができる。このようなプライマーを使用すると、前記遺伝子配列を有する特定のＤＮＡ断片についてのみ、増幅対象とすることができ、その増幅産物を分析することにより、特定ＤＮＡ断片の両端が共にメチル化されているか否かを同定することができる。
一方、選択的結合が可能なアダプターを用いてＤＮＡのメチル化よってＤＮＡ群を分離精製可能な場合には、固相に捕捉あるいは捕捉されない画分に精製された各々の画分中の対象ＤＮＡ断片の有無を分析することができればよいので、アダプターの一部の配列を含まずとも、分析対象ＤＮＡ断片内部の領域にハイブリダイズ可能な塩基配列からなるプライマーを使用することができる。
【００４２】
なお、工程（３）において、認識配列が完全一致しないＭＳ制限酵素を用いる場合［例えば、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用し、ＭＳ制限酵素としてＳｍａＩ（認識配列はＣＣＣ：ＧＧＧ）を使用する場合］、アダプターを結合する直前の末端構造が、例えば、下記構造：
【化３】
0005618369.tif 000005
をとるため、端部がメチル化されていない場合であっても、ＤＮＡ断片側の上記塩基ＮがＧ（センス鎖）／Ｃ（アンチセンス鎖）である場合にのみ、ＭＳ制限酵素による切断を受け、従って、上記塩基Ｎがそれ以外の塩基である場合には、アダプターが除去されない。この場合には、ＭＳ制限酵素の認識配列（例えば、ＳｍａＩを使用する場合には、ＣＣＣ：ＧＧＧ）とハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを使用することにより、所望のＤＮＡ断片、すなわち、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅することができる。
【００４３】
工程（５）では、工程（４）で得られたＤＮＡ増幅産物、あるいは、工程（３）で得られた消化処理物を分析する。工程（５）で用いることのＤＮＡ増幅産物又は消化処理物の分析方法としては、公知の各種ＤＮＡ分析方法を適宜使用することができ、例えば、電気泳動法、ＤＮＡアレイ分析、シークエンサーによる配列解析などを挙げることができる。また、工程（３）で得られた消化処理物の分析方法としては、ＰＣＲ増幅を用いない、後述の蛍光＆クエンチャー法を使用することができる。なお、本発明における分析工程における用語「分析」には、ＤＮＡのメチル化状態、塩基配列、配列方向などの同定に加え、それに必要な各種操作［例えば、ＤＮＡ修飾（例えば、アダプター付加）、分離、増幅、酵素処理など］の実施を含む。
【００４４】
これまで説明したように、工程（１）〜（５）を含む、本発明方法の第１の態様によれば、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅することができ、これらを同定することができる。本発明のメチル化分析方法では、前記第１態様を実施する際に、工程（３’）〜（５’）を含むネガティブコントロール、及び／又は、工程（４”）〜（５”）を含む全ＤＮＡ断片増幅を行うことができる。
【００４５】
ネガティブコントロールにおける工程（３’）では、工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、工程（１）に記載のＭＩ制限酵素と同じ認識配列を認識するＭＩ制限酵素で消化する。工程（３’）で用いるＭＩ制限酵素は、工程（１）で用いるＭＩ制限酵素と同一酵素であることもできるし、同一認識配列を認識する別の酵素であることもできる。工程（２）で得られるＤＮＡ構築物には、４種類のＤＮＡ構築物、すなわち、上流端および下流端の両端がメチル化されているＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）、上流端がメチル化され、下流端がメチル化されていないＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ）、上流端がメチル化されておらず、下流端がメチル化されているＤＮＡ構築物（Ａｄ＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）、両端がメチル化されていないＤＮＡ構築物（Ａｄ＋Ｃ／Ｃ＋Ａｄ）が含まれており、いずれのＤＮＡ構築物に関しても、その両端には、ＭＩ制限酵素の認識部位を介して、アダプター配列が存在する。これらのＤＮＡ構築物をＭＩ制限酵素で消化すると、全てのＤＮＡ構築物に関して、両端のアダプター配列が共に除去され、各消化処理物（ｍＣ／ｍＣ、ｍＣ／Ｃ、Ｃ／ｍＣ、Ｃ／Ｃ）が得られる。
【００４６】
ネガティブコントロールにおける工程（４’）では、工程（３’）で得られた消化処理物と、工程（４）に記載の増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅し、工程（５’）では、工程（４’）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する。工程（１）〜（３）の各工程が正常に進行していた場合、ネガティブコントロールにおける工程（３’）で得られた消化処理物は、全て、両端からアダプター配列が除去されている。従って、前記アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いてＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）を実施しても、ＤＮＡは全く増幅されず、工程（５’）ではＤＮＡが検出されない。
一方、工程（１）〜（３）の各工程が正常に進行せず、例えば、制限酵素消化が不完全である場合、アダプターのライゲーション反応時にミスマッチが生じる場合、あるいは、分析対象ＤＮＡに損傷があり、意図しない形式でアダプターが連結した場合、工程（３）におけるＭＳ制限酵素消化が不完全となるため、工程（４’）のＤＮＡ増幅により意図しないＤＮＡ増幅産物が生じ、工程（５’）でＤＮＡが検出されることになる。
従って、工程（３’）〜（５’）を含むネガティブコントロールを実施して、ＤＮＡが検出されないことを確認することにより、第１態様の工程（１）〜（３）の各工程が正常に進行しており、得られた分析結果が信頼できるものであることの確信を得ることができる。
【００４７】
比較対象として使用する全ＤＮＡ断片増幅における工程（４”）では、工程（２）で得られたＤＮＡ構築物と、工程（４）に記載の増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅し、工程（５”）では、工程（４”）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する。工程（２）で得られるＤＮＡ構築物には、４種類のＤＮＡ構築物が含まれており、いずれのＤＮＡ構築物に関しても、その両端には、ＭＩ制限酵素の認識部位を介して、アダプター配列が存在する。従って、前記アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いてＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）を実施すると、全てのＤＮＡ構築物が増幅される。得られたＤＮＡ増幅産物は、第１態様における比較対象として使用することができる。
【００４８】
先述したとおり、工程（１）〜（５）を含む、本発明方法の第１態様によれば、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅することができ、これらを同定することができる。本発明のメチル化分析方法では、前記第１態様を改変することにより、両端のメチル化の有無に基づいて分類される４種類のＤＮＡ断片、すなわち、上流端および下流端の両端がメチル化されているＤＮＡ断片（ｍＣ／ｍＣ）、上流端がメチル化され、下流端がメチル化されていないＤＮＡ断片（ｍＣ／Ｃ）、上流端がメチル化されておらず、下流端がメチル化されているＤＮＡ断片（Ｃ／ｍＣ）、両端がメチル化されていないＤＮＡ断片（Ｃ／Ｃ）の各々を、それぞれ別々に、分離することができ、更に、これらを同定することができる。以下、本発明方法における第２ａ態様、第２ｂ態様について、更に説明する。
【００４９】
本発明のメチル化分析方法における第２ａ態様では、工程（２）で用いるアダプターとして、標識化アダプターを使用すること以外は、第１態様の工程（１）〜（３）を実施し、その結果得られた消化処理物を、標識の有無に基づいて分離し［工程（４ａ）］、分離したＤＮＡ断片を分析する［工程（５ａ）］ことにより、少なくとも１端がメチル化されているＤＮＡ断片と、両端が共にメチル化されていないＤＮＡ断片とを分離することができ、これらを同定することができる。
【００５０】
標識化アダプター、すなわち、選択的結合が可能な物質で標識（又は修飾）されたアダプターとしては、例えば、特異的結合可能な一対のパートナー物質（例えば、ビオチンとアビジンとの組み合わせ、抗原と抗体との組み合わせ）の一方で標識されたアダプター、あるいは、選択的に共有結合を形成可能な反応官能基（例えば、アミノ基と共有結合を形成するＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide）基、チオール基と共有結合を形成するマレイミド基、アルデヒド基と共有結合を形成するヒドラジド基）を有するアダプターを挙げることができる。また、これらの架橋剤の分子構造中に、化学的処理により切断可能な構造を含む架橋剤を使用することもできる。
【００５１】
以下、アダプターの標識物質としてビオチンを使用する場合を例にとって、説明する。工程（４ａ）で分離操作を実施する消化処理物には、４種類の消化処理物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ、Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ、Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ、Ｃ／Ｃ）が含まれている。工程（４ａ）では、例えば、アビジン（ビオチンと特異的に結合）を固定化した不溶性担体（例えば、ラテックス粒子、磁性粒子、カラム用担体）と接触させた後、不溶性担体を反応系から分離すると、不溶性担体に捕捉される消化処理物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ、Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ、Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）画分と、不溶性担体に捕捉されない消化処理物画分（Ｃ／Ｃ）とに分離することができる。
工程（５ａ）では、常法、例えば、工程（５）において先述した各種ＤＮＡ分析方法を用いることにより、あるいは、以下に具体的に説明する各種工程を実施することにより、分離したＤＮＡ断片、すなわち、両端が共にメチル化されていないＤＮＡ断片と、少なくとも一端がメチル化されているＤＮＡ断片とを分析することができる。
【００５２】
本発明のメチル化分析方法における第２ａ態様の工程（５ａ）では、工程（４ａ）において不溶性担体に捕捉されなかった、両端が共にメチル化されていないＤＮＡ断片（Ｃ／Ｃ）は、工程（３）のＭＩ制限酵素処理により生じる突出末端を両端に有するため、適当なアダプター［例えば、工程（２）で用いたアダプター］を連結させた後、前記アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いることにより、前記ＤＮＡ断片のみを増幅することができる。
【００５３】
また、本発明のメチル化分析方法における第２ａ態様の工程（５ａ）では、工程（４ａ）において不溶性担体に捕捉された、少なくとも一端がメチル化されているＤＮＡ断片のみを含む画分から、所望により、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅したり、あるいは、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅することができる。
両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）は、工程（３）のＭＳ制限酵素処理によっても、両端にアダプターが連結した状態にあるため、前記画分をそのまま鋳型とし、前記アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いることにより、前記ＤＮＡ断片のみを増幅することができる。
【００５４】
一方、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ、Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）は、工程（３）のＭＳ制限酵素処理により、一方の末端は突出末端に、もう一方の末端にはアダプター（第１アダプター）が残った状態にあるため、前記突出末端に適当な第２アダプターを連結させることができる。この状態で、前記画分を鋳型とし、第１アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーと、第２アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとの組合せを用いることによりＤＮＡ増幅を実施すると、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片（すなわち、両端に第１アダプターが連結したＤＮＡ断片）も含まれているため、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片と、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片の両方が増幅されてしまう。従って、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅するためには、前記第２アダプターを、第１アダプターの標識物質とは別の標識物質（第２標識物質）で標識しておき、第２標識物質を利用して、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片を除去した後、第１アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーと、第２アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとの組合せを用いることにより、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片のみを増幅することができる。また、いずれか一方のプライマーを予め蛍光標識しておくことにより、後述の第２ｂ態様において詳述するように、どちらの端部がメチル化されているか（すなわち、Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ、Ｃ／ｍＣ＋Ａｄのどちらであるか）を同定することができる。
なお、第２標識物質を利用して除去した、両端が共にメチル化されているＤＮＡ断片は、第１アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いることにより、前記ＤＮＡ断片のみを増幅することができる。
【００５５】
本発明のメチル化分析方法の第２ｂ態様では、工程（２）で用いるアダプターとして、選択的結合が可能な物質で標識されたアダプターを使用すること、そして、工程（３）のＭＳ酵素消化処理を、担体にＤＮＡ構築物が捕捉された状態で実施すること以外は、第１態様の工程（１）〜（３）と同じ操作を実施する。続いて、ＭＳ酵素消化処理を実施した固定化担体を洗浄することにより、担体に捕捉されたＤＮＡ断片と、担体から遊離するＤＮＡ断片とを分離し［工程（４ｂ）］、分離したＤＮＡ断片を分析する［工程（５ｂ）］ことにより、少なくとも１端がメチル化されているＤＮＡ断片と、両端が共にメチル化されていないＤＮＡ断片とを分離することができ、これらを同定することができる。前記工程（５ｂ）では、工程（５ａ）で説明した各種工程を実施することもできるし、あるいは、
（ｂ１）前記洗浄後の固定化担体に捕捉されたＤＮＡ断片の自由末端側に、選択的結合が可能な物質で標識され、且つ、ＭＩ制限酵素の認識配列を再生することができる第２のアダプターを連結させる工程、
（ｂ２）固定化担体に捕捉されていたＤＮＡ断片を、前記の第２標識の有無に基づいて、分離する工程、
（ｂ３）前記第１アダプターにハイブリダイズ可能な第１の増幅用プライマーと、前記第２アダプターにハイブリダイズ可能な第２の増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する工程、及び
（ｂ４）前記工程（ｂ３）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含む分析方法を実施することもできる。
【００５６】
工程（２）で得られた４種類のＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ、Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ、Ａｄ＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ、Ａｄ＋Ｃ／Ｃ＋Ａｄ）を、アビジン固定化担体に捕捉させた状態を、図１のＡ）に、その状態でＭＳ制限酵素で消化処理した際の反応中の状態を、図１のＢ）に、前記酵素消化処理を終了した後の状態を、図１のＣ）に、それぞれ示す。
図１において、各ＤＮＡ構築物１〜４中の星印は、シトシンがメチル化されていることを示し、ＤＮＡ構築物中の矢印は、遺伝子の方向（すなわち、上流から下流に向かう方向）を示し、ＤＮＡ構築物の両端の黒丸は、標識物質（ビオチン）を示す。なお、図１では、担体５に固定化したアビジンを省略している。
図１におけるＤＮＡ構築物１，２，３，４は、それぞれ、ＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）、ＤＮＡ構築物（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ）、ＤＮＡ構築物（Ａｄ＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）、ＤＮＡ構築物（Ａｄ＋Ｃ／Ｃ＋Ａｄ）である。
以下、第２ｂ態様について、工程（３）のＭＳ制限酵素処理を実施した後の工程を、担体上で実施する態様に基づいて説明するが、本発明の第２ｂ態様においては、工程（３）より後の工程を、担体から解離させた状態で実施することもできる。
【００５７】
第２ｂ態様における工程（３）において、図１のＡ）に示す状態でＭＳ制限酵素処理を行うと、シトシンがメチル化されている認識部位での切断は起こらず、シトシンがメチル化されていない認識部位での切断は起こるため、図１のＢ）に示すように、消化処理物１（＝ＤＮＡ構築物１）（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）、消化処理物２（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ）は担体上に捕捉された状態を維持する一方、消化処理物３（Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）、消化処理物４（Ｃ／Ｃ）は担体から遊離する。しかし、一度遊離した消化処理物３（Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）は、下流端に標識化アダプターを有するため、再度、アビジン固定化担体と結合することができ、最終的に、図１のＣ）に示すように、消化処理物１（＝ＤＮＡ構築物１）（Ａｄ＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ）、消化処理物２（Ａｄ＋ｍＣ／Ｃ）、消化処理物３（Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ）が担体上に捕捉され、消化処理物４（Ｃ／Ｃ）が担体から遊離した状態となる。
【００５８】
第２ｂ態様における工程（４ｂ）では、工程（３）の酵素消化処理を実施した固定化担体を洗浄することにより、遊離した消化処理物（Ｃ／Ｃ）、すなわち、両端がメチル化されていないＤＮＡ断片と、固定化担体に捕捉されたＤＮＡ断片、すなわち、少なくとも一端がメチル化されているＤＮＡ断片とを分離することができる。
【００５９】
続いて、工程（ｂ１）では、洗浄後の固定化担体に捕捉されたＤＮＡ断片の自由末端側に、ＭＩ制限酵素の認識配列を再生することができる第２のアダプターを連結させる。前記第２アダプターは、第１アダプターの標識物質（第１標識）とは別のパートナー物質（例えば、ジコキシゲニン）を用いて標識化することが好ましい。
図１のＣ）に示すように、両端がメチル化されているＤＮＡ断片１では、自由末端側に第１アダプターが残っているため、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片２，３にのみ、第２アダプターが連結する。各ＤＮＡ断片にアダプターを連結した状態を、図２に示す。図２において、第１アダプターを黒で示し、第２アダプターを灰色で示す。
【００６０】
続く工程（ｂ２）では、第１標識を介して固定化担体に捕捉されたＤＮＡ断片を担体から外した後、混合状態にあるＤＮＡ断片１（Ａｄ１＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ１）、ＤＮＡ断片２（Ａｄ１＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ２）、ＤＮＡ断片３（Ａｄ２＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ１）を、第２アダプターの標識物質（第２標識）の有無に基づいて分離する。例えば、第２標識としてジゴキシゲニンを使用した場合を例にとると、これらの混合物を、抗ジゴキシゲニン抗体を固定化した不溶性担体と接触させた後、不溶性担体を反応系から分離すると、不溶性担体に捕捉されるＤＮＡ断片２（Ａｄ１＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ２）、ＤＮＡ断片３（Ａｄ２＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ１）を含む画分と、不溶性担体に捕捉されないＤＮＡ断片１（Ａｄ１＋ｍＣ／ｍＣ＋Ａｄ１）とに分離することができる。
【００６１】
続いて、工程（ｂ３）では、前記第１アダプターにハイブリダイズ可能な第１の増幅用プライマー、前記第２アダプターにハイブリダイズ可能な第２の増幅用プライマーの少なくとも一方を用いてＤＮＡを増幅し、工程（ｂ４）では、工程（ｂ３）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する。
工程（ｂ３）で、第１プライマー及び第２プライマーの組み合わせを用いてＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）を行うと、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片（Ａｄ１＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ２、Ａｄ２＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ１）のみを増幅することができる。
【００６２】
また、工程（ｂ３）で、第１プライマー及び第２プライマーの組み合わせを使用し、いずれか一方のプライマーを予め蛍光標識しておくと、どちらの端部がメチル化されているか（すなわち、Ａｄ１＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ２、Ａｄ２＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ１のどちらであるか）を同定することができる。
例えば、第２プライマーをＣｙで蛍光標識した場合の決定手順の概略を図２に示す。図２におけるＤＮＡ断片２は、上流端がメチル化され、下流端がメチル化されていないＤＮＡ断片であって、上流端に第１アダプター２１、下流端に第２アダプター２２が連結したＤＮＡ断片（Ａｄ１＋ｍＣ／Ｃ＋Ａｄ２）である。第１アダプターのアンチセンス鎖にハイブリダイズする第１プライマー２３と、第２アダプターのアンチセンス鎖にハイブリダイズし、Ｃｙで蛍光標識した第２プライマー２４との組み合わせを用いてＰＣＲを実施すると、蛍光標識されたアンチセンス鎖２６と、非標識のセンス鎖２５とからなる二重鎖ＤＮＡが増幅される。増幅されたＤＮＡを変性して、センス鎖にハイブリダイズするＤＮＡプローブと、アンチセンス鎖にハイブリダイズするＤＮＡプローブとをそれぞれ配置したＤＮＡアレイにかけると、アンチセンス鎖用プローブに蛍光シグナルが検出される。
一方、図２におけるＤＮＡ断片３は、上流端がメチル化されておらず、下流端がメチル化されているＤＮＡ断片であって、上流端に第２アダプター３２、下流端に第１アダプター３１が連結したＤＮＡ断片（Ａｄ２＋Ｃ／ｍＣ＋Ａｄ１）である。第１アダプターのアンチセンス鎖にハイブリダイズする第１プライマー３３と、第２アダプターのアンチセンス鎖にハイブリダイズし、Ｃｙで蛍光標識した第２プライマー３４との組み合わせを用いてＰＣＲを実施すると、蛍光標識されたセンス鎖３５と、非標識のアンチセンス鎖３６とからなる二重鎖ＤＮＡが増幅される。増幅されたＤＮＡを変性して、センス鎖にハイブリダイズするＤＮＡプローブと、アンチセンス鎖にハイブリダイズするＤＮＡプローブとをそれぞれ配置したＤＮＡアレイにかけると、センス鎖用プローブに蛍光シグナルが検出される。
従って、第２プライマーをＣｙで蛍光標識した場合、アンチセンス鎖用プローブに蛍光シグナルが検出されれば、上流端がメチル化され、下流端がメチル化されていないＤＮＡ断片であると決定することができ、センス鎖用プローブに蛍光シグナルが検出されれば、上流端がメチル化されておらず、下流端がメチル化されているＤＮＡ断片であると決定することができる。
【００６３】
本発明のメチル化分析方法における第２ｂ態様では、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片を分離することができるだけでなく、例えば、工程（４ｂ）において、両端がメチル化されていないＤＮＡ断片を、工程（ｂ２）において、両端がメチル化されているＤＮＡ断片を、それぞれ、分離することができる。これらのＤＮＡ断片についても、適当なプライマーを選択することにより、増幅することができる。例えば、両端がメチル化されていないＤＮＡ断片は、ＭＩ制限酵素処理により生じる突出末端を両端に有するため、適当なアダプター［例えば、工程（２）で用いたアダプター］を連結させた後、前記アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いることにより、前記ＤＮＡ断片のみを増幅することができる。両端がメチル化されているＤＮＡ断片は、両端に第１アダプターが連結した状態にあるため、前記アダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いることにより、前記ＤＮＡ断片のみを増幅することができる。
【００６４】
ＣＲＥＤ法
本発明のメチル化分析方法（以下、特に断らない限り、本項においては、ＣＲＥＤ法を意味するものとする）における工程（１）、すなわち、断片化用制限酵素消化工程では、分析対象ＤＮＡを消化するために使用する制限酵素は、その実施態様に従って、所望の制限酵素を使用することができ、特に限定されるものではない。また、工程（２）、すなわち、アダプター連結工程で用いるアダプターも、その実施態様に従って、所望のアダプター配列を設計することができ、特に限定されるものではない。
本工程で使用する分析対象ＤＮＡとしては、ＭｃＢＴ法において先述したのと同じものを使用することができ、所望により、一本鎖特異的ヌクレアーゼ、例えば、マングビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼで予め処理することもできる。
【００６５】
本発明のメチル化分析方法（ＣＲＥＤ法）は、その具体的態様によって、
ＭｃＢＴ法と組み合わせて実施する態様（すなわち、前記第１ａ態様）、
ＣＲＥＤ法単独で実施する態様、
制限酵素により断片化した分析対象ＤＮＡを環状化した後、ＭＤ制限酵素で消化することを特徴とする態様（以下、第３態様と称する）
を挙げることができる。
【００６６】
ＭｃＢＴ法とＣＲＥＤ法とを組み合わせて実施する態様、すなわち、第１ａ態様では、ＭｃＢＴ法を実施し、それと並行して、ＭｃＢＴ法のＭＩ制限酵素消化工程（１）及びアダプター連結工程（２）を経て得られたＤＮＡ構築物を用いて、
（３ａ）工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、ＭＤ制限酵素（例えば、ＭｃｒＢＣ）で消化する工程、
（４ａ）工程（３ａ）で得られた消化処理物と、工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（５ａ）工程（４ａ）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を実施することができる。なお、出発材料である分析対象ＤＮＡが充分量である場合には、工程（４ａ）の増幅工程を省略して、工程（３）で得られた消化処理物を、増幅することなく、分析することもできる。
【００６７】
本発明のメチル化分析方法で用いるＭＤ制限酵素としては、例えば、ＭｃｒＢＣ、ＭｃｒＡを用いることができる。ＭｃｒＢＣは、直鎖状ＤＮＡに対しては、適当な間隔（約４０〜３０００塩基）を挟んで位置するＰｕｍＣ［式中、Ｐｕはプリン塩基（Ａ又はＧ）を意味し、ｍＣはメチル化シトシンを意味する］配列の対［５’・・・ＰｕｍＣ（Ｎ４０−３０００）ＰｕｍＣ・・・３’］を認識し、その一方のＰｕｍＣの近接部位の１箇所でＤＮＡを切断する。直鎖状１本鎖ＤＮＡ及び直鎖状２本鎖ＤＮＡのいずれも基質となり、２本鎖ＤＮＡの場合には、一方の鎖にメチル化シトシンがあれば切断することができ、ヘミメチル化を切断することができる。
一方、環状ＤＮＡに対しては、１本鎖又は２本鎖を問わず、１箇所の配列ＰｕｍＣが存在すれば、その近接部位１箇所でＤＮＡを切断する。
【００６８】
第１ａ態様の工程（３ａ）においてＭＤ制限酵素で消化するＤＮＡ構築物は、分析対象ＤＮＡをＭＩ制限酵素で消化した後、前記ＭＩ制限酵素認識配列を再生することのできるアダプターを連結させたＤＮＡ断片群である。このＤＮＡ構築物をＭｃｒＢＣで消化すると、ＤＮＡ構築物の末端領域（すなわち、ＭＩ制限酵素認識配列及びアダプター配列）にＰｕｍＣ配列が含まれていない場合［例えば、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用し、その認識配列の５’側上流の塩基がＡ又はＧでない場合］には、ＤＮＡ断片の内部領域のみのメチル化の状態によってＭｃｒＢＣに対する感受性／消化抵抗性が決定される。すなわち、内部領域に適当な間隔を挟んでＰｕｍＣ配列が２箇所以上存在する場合には、ＭｃｒＢＣにより切断される。このような切断された断片は、少なくとも一方の末端にアダプターが結合していないので、続くＤＮＡ増幅工程（４ａ）において増幅されないことになる。一方、内部領域にＰｕｍＣ配列が存在しないか、１箇所のみ存在する場合（あるいは、２箇所存在していても３０００塩基以上離れている場合）には、ＭｃｒＢＣにより切断されない。このようなＤＮＡ断片は、両端にアダプターが結合しているので、続くＤＮＡ増幅工程（４ａ）において増幅されることになる。
【００６９】
一方、ＤＮＡ構築物の末端領域にＰｕｍＣ配列が含まれている場合［例えば、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）］を使用し、その認識配列の５’側上流の塩基がＡ又はＧである場合］には、ＤＮＡ断片の内部領域及び末端領域の総合的なメチル化の状態によってＭｃｒＢＣに対する感受性／消化抵抗性が決定される。すなわち、内部領域及び／又は末端領域に、適当な間隔を挟んでＰｕｍＣ配列が２箇所以上存在する場合には、ＭｃｒＢＣにより切断される。このような切断された断片は、少なくとも一方の末端にアダプターが結合していないので、続くＤＮＡ増幅工程（４ａ）において増幅されない。一方、内部領域及び／又は末端領域にＰｕｍＣ配列が存在しないか、１箇所のみ存在する場合（あるいは、２箇所存在していても３０００塩基以上離れている場合）には、ＭｃｒＢＣにより切断されない。このようなＤＮＡ断片は、両端にアダプターが結合しているので、続くＤＮＡ増幅工程（４ａ）において増幅される。
【００７０】
続くＤＮＡ増幅工程（４ａ）では、得られた消化処理物と、ＭｃＢＴ法のアダプター連結工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーとを用いて、ＤＮＡを増幅する。末端領域にＰｕｍＣ配列が含まれているか否かにかかわらず、ＭＤ制限酵素消化工程（３ａ）においてＭｃｒＢＣにより切断されたＤＮＡ断片は増幅されず、ＭｃｒＢＣに耐性を示したＤＮＡ断片のみが増幅される。
【００７１】
ＤＮＡ分析工程（５ａ）では、前記工程（４ａ）で得られたＤＮＡ増幅産物、あるいは、工程（３）で得られた消化処理物を分析する。工程（５ａ）で用いることのＤＮＡ増幅産物又は消化処理物の分析方法としては、公知の各種ＤＮＡ分析方法を適宜使用することができ、例えば、電気泳動法、ＤＮＡアレイ分析、シークエンサーによる配列解析などを挙げることができる。また、工程（３）で得られた消化処理物の分析方法としては、ＰＣＲ増幅を用いない、後述の蛍光＆クエンチャー法を使用することができる。
ＭｃＢＴ法では、先述のとおり、ＭＳ制限酵素（例えば、ＨｐａII）に対する感受性・抵抗性に基づいて、ＤＮＡ断片の両端のメチル化を評価することができる。例えば、ＭＳ制限酵素（例えば、ＨｐａII）で消化した消化処理物をＬＭ−ＰＣＲで増幅すると、ＤＮＡ断片の両端が共にメチル化されている断片のみが増幅される。この増幅産物を蛍光標識し、ＤＮＡアレイにかけると、ＤＮＡ断片の両端が共にメチル化されている場合に蛍光シグナルが検出される。従って、ＭｃＢＴ法によれば、ＤＮＡ断片の末端領域に位置するシトシンに関してのみ、メチル化を判定することができる。
一方、ＭｃｒＢＣで消化した消化処理物をＬＭ−ＰＣＲで増幅すると、ＭｃｒＢＣに耐性を示したＤＮＡ断片のみが増幅される。ＭｃｒＢＣに対する耐性は、ＤＮＡ断片の内部領域のみ（あるいは、内部領域及び末端領域）におけるＰｕｍＣ配列の有無に依存するため、内部領域のメチル化（あるいは、内部領域と末端領域の総合的なメチル化）を評価することができる。例えば、ＭｃｒＢＣで消化した消化処理物をＬＭ−ＰＣＲで増幅し、蛍光標識後、ＤＮＡアレイにかけると、ＤＮＡ断片の内部領域（あるいは、内部領域及び末端領域）にＭｃｒＢＣの認識配列が存在しない場合に蛍光シグナルが検出される。従って、ＣＲＥＤ法によれば、ＤＮＡ断片の内部領域（あるいは、内部領域及び末端領域）に位置するシトシンのメチル化を判定することができる。
【００７２】
なお、ＣＲＥＤ法において、末端領域のシトシンを除いたＤＮＡ断片の内部領域のみに位置するシトシンを分析対象とするか、あるいは、内部領域及び末端領域に位置するシトシンを同時に分析対象とするかは、分析目的に従って、適当なアダプター配列を選択することにより適宜選択することができる。すなわち、前記工程（３ａ）で先述したように、例えば、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用し、その認識配列の５’側上流の塩基がＡ又はＧとなるようにアダプター配列を設計した場合、ＭｃｒＢＣの認識配列であるＰｕｍＣ配列が末端領域に形成されるため、内部領域及び末端領域に位置するシトシンを同時に分析対象とすることができる。一方、ＭＩ制限酵素としてＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）を使用しても、その認識配列の５’側上流の塩基がＡ又はＧとならないようにアダプター配列を設計した場合、末端領域のシトシンを除いたＤＮＡ断片の内部領域のみに位置するシトシンを分析対象とすることができる。
【００７３】
更に、ＭｃＢＴ法で得られる蛍光シグナル（Ｆ１と称する）の情報と、ＣＲＥＤ法で得られる蛍光シグナル（Ｆ２と称する）の情報とを組み合わせると、２つの酵素によって相補的に二重に評価することにより、分析対象のＤＮＡ断片のメチル化をより確実に判定することが可能となる。
例えば、Ｆ１及びＦ２の比の対数値［Ｌｏｇ（Ｆ１／Ｆ２）］をとり、その値が正である場合、ＭｃＢＴ法で使用するＭＳ制限酵素（例えば、ＨｐａII）に抵抗性を示し、且つ、ＣＲＥＤ法で使用するＭｃｒＢＣに対して感受性（被消化性）を示すＤＮＡ断片であることを意味している。すなわち、ＤＮＡ断片の両端が共にメチル化されており、且つ、内部領域にＭｃｒＢＣの認識配列が存在することを意味しているので、そのＤＮＡ断片は、メチル化率が高いＤＮＡ断片（hypermethylated DNA）として分類することができる。
また逆に、Ｌｏｇ（Ｆ１／Ｆ２）の値が負である場合には、ＭＳ制限酵素に対し感受性を示し、ＭｃｒＢＣに抵抗性を示すＤＮＡ断片であることを意味しており、すなわち、両端の制限酵素認識配列の一方のみにメチル化シトシンが存在するか、あるいは、いずれの両端にもメチル化シトシンが存在するものではなく、且つ、内部領域にＭｃｒＢＣの認識配列が存在しないことを意味しているので、そのＤＮＡ断片は、メチル化率が低いＤＮＡ断片（hypomethylated DNA）として分類することができる。
【００７４】
以上、本発明のメチル化分析方法を、その一態様である第１ａ態様（ＭｃＢＴ法とＣＲＥＤ法との組合せ）に基づいて説明したが、ＣＲＥＤ法のみを単独で実施することもできる。
また、第１ａ態様は、直鎖状ＤＮＡの状態でＭＤ制限酵素で消化するものであるが、本発明のメチル化分析方法では、環状化した状態でＭＤ制限酵素消化を実施すること（すなわち、前記第３態様）もできる。
【００７５】
本発明のメチル化分析方法における第３態様は、
（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片を環状化する工程、
（３）前記工程（１）で得られた環状ＤＮＡを、ＭＤ制限酵素（例えば、ＭｃｒＢＣ）で消化する工程、
（４）工程（３）で得られた消化処理物を用いて環状ＤＮＡを増幅する工程、
（５）工程（４）で得られたＤＮＡ増幅産物を分析する工程
を含むことができる。なお、出発材料である分析対象ＤＮＡが充分量である場合には、工程（４）の増幅工程を省略して、工程（３）で得られた消化処理物を、増幅することなく、分析することもできる。
この第３態様は、環状ＤＮＡに対するＭｃｒＢＣの特性、すなわち、１本鎖又は２本鎖を問わず、１箇所の配列ＰｕｍＣが存在すれば、その近接部位でＤＮＡを切断し、直鎖状ＤＮＡにすることを利用するものである。
【００７６】
第３態様の工程（１）で用いる制限酵素は、分析目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されるものではない。第３態様では、工程（１）において、前記制限酵素により分析対象ＤＮＡを断片化した後、工程（２）において、二重鎖のまま自己閉環させるか、あるいは、熱変性等により一本鎖化した後、ｓｓＤＮＡリガーゼ（例えば、CircLigase (TM) ssDNA ligase; EPICENTRE社）で自己閉環させる。制限酵素で一度切断された認識配列は、環状化により再生される。
【００７７】
例えば、ＭｓｐＩ（認識配列はＣ：ＣＧＧ）あるいはＴａｑＩ（認識配列はＴ：ＣＧＡ）を用いた場合には、環状ＤＮＡ中でその認識配列が再生されても、ＭｃｒＢＣで認識されない。この場合、ＭｓｐＩ消化により得られるＤＮＡ断片の内部領域のメチル化のみを分析することができる。従って、前記制限酵素により得られるＤＮＡ断片の末端領域を除く内部領域のメチル化のみを分析する場合には、ＭｃｒＢＣが基質とできない配列を認識配列とする制限酵素（例えば、ＭｓｐＩあるいはＴａｑＩ）を使用すればよい。
【００７８】
工程（３）では、工程（２）で得られた環状ＤＮＡをＭＤ制限酵素、例えば、ＭｃｒＢＣで消化する。環状ＤＮＡ中に、少なくとも１箇所の配列ＰｕｍＣが存在すれば、その環状ＤＮＡは切断されて、直鎖状ＤＮＡとなる。
続く工程（４）では、工程（３）で得られた消化処理物を用いて、環状ＤＮＡのみを環状ＤＮＡのまま増幅可能な増幅系、例えば、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを利用したローリングサークルアンプリフィケーション（Rolling circle amplification）法により、環状ＤＮＡのみを増幅する。この工程で増幅される環状ＤＮＡは、ＭｃｒＢＣで切断されずに環状化を保持しているＤＮＡであり、低メチル化状態の環状ＤＮＡのみが増幅される。
工程（５）における、増幅された環状ＤＮＡの分析は、これまで述べた、公知の各種ＤＮＡ分析方法を適宜使用することができる。
【００７９】
酵素消化された断片の選択的除去
本発明のメチル化分析方法では、ＭｃＢＴ法、ＣＲＥＤ法のいずれにおいても、制限酵素（ＭｃＢＴ法におけるＭＳ制限酵素、ＣＲＥＤ法におけるＭＤ制限酵素；以下、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素と称することがある）消化により、前記酵素に耐性のＤＮＡ断片（両端に増幅用アダプターを有する）と、前記酵素による切断産物（少なくとも一端には増幅用アダプターが存在しない）とを生じさせた後、両端に増幅用アダプターを有するＤＮＡ断片のみを、例えば、ＬＭ−ＰＣＲにより増幅させる。本発明においては、ＤＮＡ増幅を行う前に、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素消化により生じた切断断片を選択的に除去することにより、増幅行程における非特異的増幅反応を低減し、ＤＮＡ増幅の効率を向上させたり、あるいは、ＤＮＡ増幅条件を緩和しても必要なＤＮＡ増幅効率を維持することができる。
【００８０】
制限酵素消化により生じた切断断片の選択的除去方法としては、例えば、ビオチン化アダプターを用いる方法、ヌクレアーゼにより分解除去する方法などを挙げることができる。
ビオチン化アダプターを用いる方法では、ＤＮＡ断片に連結するアダプターとして、ビオチン化アダプターを使用し、ＭＳ制限酵素又はＭＤ制限酵素による酵素消化を実施した後、その消化処理物をアビジン担持担体と接触（例えば、アビジンコートＰＣＲチューブで取得）させ、そのままＤＮＡ増幅を行うことができる。この方法によれば、両端にビオチン化アダプターを有しない切断断片を簡単に反応系から除去することができる。
【００８１】
ヌクレアーゼにより分解除去する方法では、制限酵素消化により生じるＤＮＡ断片の５’末端がリン酸化されていることを利用する。すなわち、アダプターとして、センス鎖の５’末端がリン酸化されていないアダプター、あるいは、センス鎖をエキソヌクレアーゼ耐性にデザインしたアダプター［ホスホロチオエート型、ＥＮＡ（Ethylene-bridged Nucleic Acids）、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）等］などを使用し、各種ヌクレアーゼ（例えば、λエキソヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼＩ）の組合せにより、除去対象であるＤＮＡ断片のみを分解除去する。
【００８２】
例えば、二重鎖ＤＮＡ消化性５’→３’エキソヌクレアーゼであるλエキソヌクレアーゼは、リン酸化された５’末端を効率的に分解するのに対して、リン酸化されていない５’末端の消化効率は低い。
センス鎖の５’末端がリン酸化されていないアダプターを使用した場合、両端にアダプターが結合している二重鎖ＤＮＡは、λエキソヌクレアーゼの基質とならない。
一方、制限酵素消化により生じた二重鎖ＤＮＡ切断断片では、両末端（ＤＮＡ断片の２箇所以上で切断された場合であって、内部領域由来の断片）の５’末端がリン酸化されているか、あるいは、いずれか一方の末端（ＤＮＡ断片の１箇所で切断された場合）がリン酸化されており、λエキソヌクレアーゼの基質となる。
両末端の５’末端がリン酸化されている二重鎖ＤＮＡ切断断片の場合には、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が分解除去される。
一方、いずれか一方の末端の５’末端のみがリン酸化されている場合（すなわち、酵素消化により生じる切断末端における５’末端がリン酸化されており、前記切断末端とは反対側の末端にアダプターが結合している場合）、アダプターセンス鎖の５’末端はリン酸化されていないため、その鎖はλエキソヌクレアーゼで分解されないが、その反対鎖は、λエキソヌクレアーゼにより分解される。この場合、一本鎖ＤＮＡが残るが、一本鎖ＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）により分解除去することができる。
なお、５’末端がリン酸化されていない場合でも、消化効率は低いものの、λエキソヌクレアーゼの分解を受けるため、完全にプロテクトするためには、エキソヌクレアーゼ耐性にデザインしたアダプターを用いることが好ましい。
【００８３】
λエキソヌクレアーゼに代えて、二重鎖ＤＮＡ特異的３’→５’エキソヌクレアーゼである大腸菌エキソヌクレアーゼIIIを用いる場合には、両端にアダプターが結合している二重鎖ＤＮＡを保護するために、アンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ耐性にデザインしたアダプターを使用する。
このようなアダプターが両端に結合している二重鎖ＤＮＡは、エキソヌクレアーゼIIIの基質とならない。
一方、制限酵素消化により生じた二重鎖ＤＮＡ切断断片の内、両末端が共に酵素消化により生じる切断末端である（すなわち、両末端にアダプターが結合していない）切断断片の場合には、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方が分解除去される。また、一方の末端が酵素消化により生じる切断末端であり、その反対側末端に前記アダプターが結合している切断断片の場合には、エキソヌクレアーゼ耐性にデザインしたアンチセンス鎖アダプターを含む鎖はエキソヌクレアーゼIIIにより分解されないが、その反対鎖はエキソヌクレアーゼIIIにより分解される。この場合、残った一本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ特異的５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、ＲｅｃＪ；ＮＥＢ社）により分解除去することができる。
【００８４】
ＤＮＡメチル化分析用制限酵素による消化処理物を、ＰＣＲ増幅を行わずに分析する方法（蛍光＆クエンチャー法）
これまで述べたように、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素（すなわち、ＭｃＢＴ法におけるＭＳ制限酵素、ＣＲＥＤ法におけるＭＤ制限酵素）で処理して得られる消化処理物は、通常、ＤＮＡ増幅を実施してから各種ＤＮＡ分析方法によりＤＮＡ増幅産物の分析を実施することが一般的である。本発明のメチル化分析方法では、ＰＣＲ増幅を行うことなく、以下に説明する蛍光＆クエンチャー法により、直接、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素による消化処理物を分析することもできる。
【００８５】
本発明における蛍光＆クエンチャー法では、「酵素消化された断片の選択的除去」欄で先述した二重鎖ＤＮＡ消化性エキソヌクレアーゼを使用し、その分解方向に応じて適宜設計したアダプターを使用する。
二重鎖ＤＮＡ消化性エキソヌクレアーゼとしては、５’→３’エキソヌクレアーゼ又は３’→５’エキソヌクレアーゼのいずれも使用可能であり、５’→３’エキソヌクレアーゼとしては、例えば、λエキソヌクレアーゼを、３’→５’エキソヌクレアーゼとしては、例えば、大腸菌エキソヌクレアーゼIIIを用いることができる。
以下、図９に沿って、５’→３’エキソヌクレアーゼを用いる場合の態様を説明し、続いて、図１０に沿って、３’→５’エキソヌクレアーゼを用いる場合の態様を説明する。
【００８６】
図９において、工程（ａ）は、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素で消化した後の消化処理物（ＤＮＡ構築物１、ＤＮＡ構築物の分解産物２ａ，２ｂ）の状態を示しており、工程（ｂ）は、前記消化処理物を５’→３’エキソヌクレアーゼで消化している途中の状態を示しており、工程（ｃ）は、５’→３’エキソヌクレアーゼ消化完了後の反応系の状態を示す。なお、工程（ｃ）では、ＤＮＡ構築物１がそのままの状態で反応系に存在するが、図面からは省略している。
【００８７】
５’→３’エキソヌクレアーゼを用いる場合には、センス側アダプター（図９におけるアダプター１５，１６，２５，２６）として、エキソヌクレアーゼ抵抗性を付与したオリゴヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート型、ＥＮＡ、ＬＮＡ）を使用し、アンチセンス側アダプター（図９におけるアダプター１７，１８，２７，２８）として、蛍光標識及びクエンチャー標識を有するオリゴヌクレオチドを使用する。
【００８８】
図９の工程（ａ）に示すように、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素で消化した後の消化処理物には、通常、ＤＮＡ構築物１と、ＤＮＡ構築物の分解産物２ａ，２ｂとが含まれる。ＤＮＡ構築物１は、分析対象ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片（センス鎖１３，アンチセンス鎖１４）の両端に、アダプター（センス側１５とアンチセンス側１８との組合せ、センス側１６とアンチセンス側１７との組合せ）を連結させたものである。なお、ＭｃＢＴ法又はＣＲＥＤ法を問わず、ＤＮＡ増幅を行う場合には、アダプターのアンチセンス側オリゴヌクレオチドとＤＮＡ断片との間は、共通結合であっても、ニックの状態にしておいても構わないが、蛍光＆クエンチャー法では、使用するエキソヌクレアーゼがニックを認識して消化する場合には、共有結合により連結しておく必要がある。ＤＮＡメチル化分析用制限酵素に対して耐性を有するものは、ＤＮＡ構築物１として、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素に対して感受性を有するものは、分解産物２ａ，２ｂとして、それぞれ、消化処理物中に存在する。
なお、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素による消化を行う前に、アダプターが結合しなかったＤＮＡ断片を除去するために、５’→３’エキソヌクレアーゼで前処理して分解除去しておくことが好ましい。
【００８９】
ＤＮＡ構築物１とＤＮＡ構築物の分解産物２ａ，２ｂを含む消化処理物に対して、５’→３’エキソヌクレアーゼを反応させると、工程（ｂ）に示すように、分解産物２ａ，２ｂの一方の鎖２２ａ，２１ｂが、その５’末端側から分解されるのに対して、残る一方の鎖２１ａ，２２ｂや、ＤＮＡ構築物１は分解を受けない。５’→３’エキソヌクレアーゼによる分解を受ける鎖２２ａ，２１ｂは、末端に連結するアダプター２８，２７がエキソヌクレアーゼ抵抗性を有しないため、ＤＮＡ断片部分２４ａ，２３ｂが分解された後、続いて、アダプター２８，２７も分解を受け、工程（ｃ）に示すように、蛍光物質１９及びクエンチャー２０が反応溶液中に遊離する。この反応溶液中の蛍光物質の量を測定することにより、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素に対する感受性を評価することができる。
【００９０】
３’→５’エキソヌクレアーゼを用いる場合には、図１０に示すように、センス側アダプター３５，３６，４５，４６として、クエンチャー２０及び蛍光標識１９を有するオリゴヌクレオチドを使用し、アンチセンス側アダプター３７，３８，４７，４８として、エキソヌクレアーゼ抵抗性を付与したオリゴヌクレオチドを使用する。
本態様においても、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素による消化を行う前に、アダプターが結合しなかったＤＮＡ断片を除去するために、３’→５’エキソヌクレアーゼで前処理して分解除去しておくことが好ましい。
【００９１】
図１０の工程（ａ）に示すＤＮＡ構築物３とＤＮＡ構築物の分解産物４ａ，４ｂを含む消化処理物に対して、３’→５’エキソヌクレアーゼを反応させると、工程（ｂ）に示すように、分解産物４ａ，４ｂの一方の鎖４１ａ，４２ｂが、その３’末端側から分解されるのに対して、残る一方の鎖４２ａ，４１ｂや、ＤＮＡ構築物３は分解を受けない。３’→５’エキソヌクレアーゼによる分解を受ける鎖４１ａ，４２ｂは、末端に連結するアダプター４５，４６がエキソヌクレアーゼ抵抗性を有しないため、ＤＮＡ断片部分４３ａ，４４ｂが分解された後、続いて、アダプター４５，４６も分解を受け、工程（ｃ）に示すように、蛍光物質１９及びクエンチャー２０が反応溶液中に遊離する。この反応溶液中の蛍光物質の量を測定することにより、ＤＮＡメチル化分析用制限酵素に対する感受性を評価することができる。
なお、工程（ｃ）では、ＤＮＡ構築物３がそのままの状態で反応系に存在するが、図面からは省略している。
【００９２】
２．本発明のＤＮＡ群（特には環状ＤＮＡ群）とその製造方法、並びに環状ＤＮＡ群を利用するメチル化分析方法（メチル化プロファイリング分析方法）
これまで述べたように、本発明のメチル化分析方法によれば、分析対象ＤＮＡを、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ突出末端を生じさせるＭＩ制限酵素で消化して得られるＤＮＡ断片の混合物を出発材料として、両端に生じる突出末端のメチル化の有無（すなわち、メチル化シトシンの存在の有無）に基づいて、３種類の異なるＤＮＡ断片群、すなわち、両端がメチル化されているＤＮＡ断片群（すなわち、両方の突出末端にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片群）、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片群（一方の突出末端のみにメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片群）、両端がメチル化されていないＤＮＡ断片群（両方の突出末端のいずれにもメチル化シトシンが存在しないＤＮＡ断片群）に分離精製することができる。
【００９３】
また、本発明のメチル化分析方法によれば、一端のみがメチル化されているＤＮＡ断片群に含まれる各ＤＮＡ断片に関して、どちらの端部がメチル化されているかを決定することができるので、その決定に利用したＤＮＡアレイでプローブとして使用したＤＮＡ配列を利用する公知ハイブリダイゼーション法により、各ＤＮＡ断片を分離精製することができる。分離精製した各ＤＮＡ断片を混合することにより、上流端のみがメチル化されているＤＮＡ断片群（上流側の突出末端のみにメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片群）や、下流端のみがメチル化されているＤＮＡ断片群（下流側の突出末端のみにメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片群）を調製することができる。
【００９４】
具体的には、第１アダプターあるいは第２アダプターの少なくともいずれかの一方で標識されたＤＮＡ断片を変性処理し、ＤＮＡを１本鎖化した後にＤＮＡアレイなどに供する方法であって、当該ＤＮＡアレイには２本鎖ＤＮＡを構成するそれぞれの鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）の塩基配列うちのいずれか一方の鎖のみを単離するためのオリゴＤＮＡプローブを配置しておけば、ＤＮＡアレイに配置したオリゴＤＮＡの塩基配列に対応する１本鎖ＤＮＡのみを取得することができる［ＤＮＡアレイを用いた特定ＤＮＡ断片群の分離精製法；Albert, T.J. et al., Nature Method, 4(11), pp903-905, 2007］。こうして得られた１本鎖ＤＮＡを常法に従って２本鎖に変換し、ＭＩ制限酵素で消化することによりアダプターを除去すれば、当該２本鎖ＤＮＡの両末端は突出末端となっているため、環状化することができる。
【００９５】
ＭｃＢＴ法により得られる本発明のＤＮＡ群（環状ＤＮＡと直鎖状ＤＮＡとが混合するＤＮＡ群、環状ＤＮＡのみからなる環状ＤＮＡ群を含む）の内、環状ＤＮＡと直鎖状ＤＮＡとが混合するＤＮＡ群は、本発明のメチル化分析方法により分離精製されたこれらの４種類のＤＮＡ断片群を、それぞれ別々に、突出末端を生じさせるＭＩ制限酵素で消化することにより、末端のアダプターを全て切断排除した後、ライゲーションすることにより取得することができる。また、前記ライゲーションの後に、更にエキソヌクレアーゼ処理を実施することにより、環状ＤＮＡのみからなる環状ＤＮＡ群を取得することができる。
あるいは、本発明のＤＮＡ群の内、両端のいずれにもメチル化シトシンが存在しないＤＮＡ断片１又はそれ以上を連結して得られるＤＮＡ群については、工程（１）〜（３）を実施した後、ライゲーションを実施すると、両端が突出末端であるＤＮＡ断片のみが、他のＤＮＡ断片と比較して効率的に連結されるため、所望のＤＮＡ群を得ることができる。
【００９６】
本発明の環状ＤＮＡ群は、環状であるため、ランダムプライマーを使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ）により増幅可能である。なお、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、環状二重鎖ＤＮＡと環状一本鎖ＤＮＡのいずれも増幅可能であり、本発明の環状ＤＮＡ群には、環状二重鎖ＤＮＡ群と環状一本鎖ＤＮＡ群との両方が含まれる。この場合、増幅時に標識ヌクレオチド（例えば、ビオチン標識ｄＵＴＰ）を取り込ませて標識された増幅産物（ＤＮＡ）を得ることもできる。ＤＮＡ鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合であって、ランダムに連結された環状ＤＮＡ混合物を鋳型として増幅する場合には、遺伝子長などによる増幅バイアスがなく、各々のＤＮＡ断片の存在比率に忠実性良く増幅することができる。従って、種々の細胞、例えば、各種組織、各種培養細胞、各種ステージにおける細胞から抽出した分析対象ＤＮＡを出発材料として、本発明の製造方法により本発明の環状ＤＮＡ群を調製し、ランダムプライマーを使用する鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによる増幅後、得られたＤＮＡ増幅産物を分析することにより、分析対象ＤＮＡのメチル化プロファイリングを行うことができる。この際、スタンダードとして使用可能な細胞から本発明の環状ＤＮＡ群を予め調製しておくと、本発明のメチル化分析方法（特にはメチル化プロファイリング分析方法）において、分析対象ＤＮＡに対する比較対象として使用することができるため、好ましい。
【００９７】
ＣＲＥＤ法により得られる本発明のＤＮＡ群（環状ＤＮＡ群を含む）の内、制限酵素の認識配列を両端に有し、且つ、メチル化依存性制限酵素に対する耐性を示すＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ群であって、前記認識配列が全て同一配列である、前記ＤＮＡ群は、
（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記制限酵素の認識配列を再生することのできるアダプターを、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、メチル化依存性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られた消化処理物を鋳型として、前記工程（２）に記載のアダプターにハイブリダイズ可能な増幅用プライマーを用いてＤＮＡを増幅する工程
を含む、本発明の製造方法により取得することができる。
【００９８】
また、メチル化依存性制限酵素の認識部位を有しない環状ＤＮＡのみからなることを特徴とする、本発明の環状ＤＮＡ群は、
（１）制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片を環状化する工程、
（３）前記工程（１）で得られた環状ＤＮＡを、ＭＤ制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られた消化処理物を鋳型として環状ＤＮＡのみを増幅する工程
を含む、本発明の製造方法により取得することができる。
【００９９】
なお、本発明のＤＮＡ断片群において、両端にアダプターを有するものは、両端のアダプターが同一であることもできるし、異なるアダプターとすることもできる。
【０１００】
また、本発明のＤＮＡ群、あるいは、本発明のメチル化分析方法により同定された各ＤＮＡ断片又はＤＮＡ断片群に関して、これらのＤＮＡ断片の全部又は一部とそれぞれハイブリダイズ可能な核酸を担体（例えば、基板、ビーズ、中空糸、繊維など）上に配置することにより、本発明のＤＮＡアレイを得ることができる。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【０１０２】
《実施例１》
マウスＥＳ細胞（１２９／Ｏｌａ由来  ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１８２１）と、分化後のＥＳ細胞［ＯＰ９フィーダー細胞上で、ＬＩＦを含まない培地で培養：Sone et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Oct;27(10):2127-34.］とから、市販のＤＮＡ精製キット（QIAamp DNA Micro Kit; QIAGEN社）を使用し、添付のプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡを精製した。そのうちの５０ｎｇを取り、５０ユニットのマングビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼを用いて３７℃で２０分間処理した。処理後の液を再び、前記ＤＮＡ精製キットを用いて精製した。この時、カラム洗浄液中のアルコール成分が完全に除去されるように、カラムは溶出前に６０℃で５分間インキュベートし、１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）２５μＬで溶出した。次に、このうちの２０μＬに、ＭｓｐＩ消化用１０倍濃度緩衝液４μＬを加えて、蒸留水で全量を４０μＬに合わせた。これにメチル化非感受性（ＭＩ）制限酵素ＭｓｐＩ［一般的な市販の制限酵素であれば５Ｕを、FastCutter（Fermentas社）であれば酵素液１μＬ］を加え、３７℃で２時間の消化を行った。次に、消化液を、市販の精製キット（ChargeSwitch PCR Clean-Up kit; Invitrogen社）で精製した。溶出は磁性ビーズ懸濁液１０μＬの使用に対し、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ８．０）１５μＬを加えて行った。【０１０３】
溶出液にアダプター１溶液（ＬＡ１溶液）４μＬを加え、更に、市販のＤＮＡライゲーションキット溶液（DNA Ligation kit MityMix; TaKaRa社）１９μＬを加え、１２℃で３０分間インキュベートした。これにより、下記式：
【化４】
0005618369.tif 000006
で示されるＬＡ１が、ゲノムＤＮＡのＭｓｐＩの消化で得られた全てのＤＮＡ消化断片の両端に連結（ライゲーション）する。３０分のインキュベーションが終了したら、反応チューブを１２℃に放置したまま、Ｔａｑ酵素および酵素反応用緩衝液（Expand High Fidelity PCR system；ロシュ社）を添加し、その後に反応チューブの温度を７２℃に上げてＤＮＡ断片の伸長反応を行った。詳しくは、ライゲーション反応が完了した前記のライゲーション反応液に、ＰＣＲ反応用１０×緩衝液（Ｍｇ含）１１．４μＬと蒸留水１０２．６μＬの混和液を添加し、直ちに７２℃、１０分間のインキュベーションを行った。これにより、ＬＡのうちの共有結合していない鎖が熱融解でＤＮＡ断片から離脱し、形成された一本鎖部分は前記のＴａｑ酵素による伸長反応で完全な二本鎖構造になる。この伸長反応では、前記のＭｓｐＩ消化により形成された突出末端中のシトシンがメチル化されている場合であっても、ＤＮＡの伸長で新たに合成された相補鎖は非メチル化シトシンとなり、相補的二本鎖ＤＮＡのうちの片鎖のシトシンのみがメチル化されたシトシンを保持している、すなわち、ヘミメチル化状態となる。次に、前記の反応溶液を再び、市販の精製キット（ChargeSwitch PCR Clean-Up kit; Invitrogen社）で磁性ビーズ懸濁液１０μＬを用いて精製した。磁性ビーズに結合しているＤＮＡは添付の溶出液３０μＬで溶出させた。【０１０４】
次にこれを３分割し、そのうちの１つはＭｓｐＩ（Fermentas社）１μＬを用い、反応容量を３０μＬとして３７℃で１時間、消化した。もう一つは、メチル化感受性（ＭＳ）制限酵素ＨｐａII（Fermentas社）１μＬを用い、反応容量を３０μＬとして３７℃で１時間、ＭｓｐＩと同じ条件で消化（decapping）した。次に、ＭｓｐＩとＨｐａIIのそれぞれの前記酵素消化液と、酵素消化を行っていない全ＤＮＡ画分を、それぞれ、鋳型ＤＮＡとして以下の条件でＬＭ−ＰＣＲ反応を行った。【０１０５】
ＰＣＲサイクル設定：
９５℃，２分
＋(９５℃，２０秒；７１．４℃，２０秒；７３℃，３０秒)×１８サイクル
＋(９５℃，２０秒；７０．０℃，２０秒；７３℃，１０秒)×２６サイクル
＋(９５℃，２０秒；７０．０℃，２０秒；７３℃，３０秒)×  ８サイクル
＋７２℃，５分
全５２サイクル、鋳型０．５μＬ、プライマー１μＬ
ＰＣＲプライマー：５’−ＧＣＣＴＣＴＣＡＣＣＧＡＣＣＧＧ−３’（配列番号：３）
ＰＣＲ酵素（キット）：FastStart High Fidelity PCR System（ロシュ社）
使用バッファー：Ｍｇ＋添付バッファー
【表２】
0005618369.tif 000007
【０１０６】
ＰＣＲ産物は、分析装置としてバイオアナライザー（BioAnalyzer；アジレント社製）を用いて分析した。また、分析には、市販の分析試薬（Agilent DNA 1000 Reagents；アジレント社）を用いて分析した。ＰＣＲ産物の電気泳動結果を図３に示す。
図３における各レーンは、以下のとおりである：
１：ネガティブ、２：全ＤＮＡ断片、３：ＥＳ細胞、４：分化細胞（ＥＳ細胞由来）。
なお、ネガティブ（レーン１）は、ＬＡをＭｓｐＩで除去した後のサンプルを鋳型としてＰＣＲを行ったものである。全ＤＮＡ断片（レーン２）は、ＬＡを連結後のサンプルをそのまま鋳型としてＰＣＲを行ったものである。また、レーン３及び４は、ＬＡ連結後のサンプルを、ＨｐａIIで再消化したサンプルを鋳型としてＰＣＲを行ったものである。【０１０７】
《実施例２》
実施例１で得られたマウスＥＳ細胞由来のＰＣＲ産物を定法により精製して蛍光標識Ｃｙ３で標識した。また、分化後のＥＳ細胞由来のＰＣＲ産物を同様にして精製して、別の蛍光標識Ｃｙ５で標識した。これらの標識物を、マウスゲノムＤＮＡアレイ（Mouse Promoter & CpG island Tiling Array, cat#00893: NimbleGen社）を用いるＤＮＡアレイ分析にかけた。
１番染色体における分析結果を図４に示す。グラフはＣｙ３の蛍光強度（ＥＳ細胞）を分母とし、分化後ＥＳ細胞の蛍光強度を分子として比率を表したものである。ＥＳ細胞が分化後に新たにメチル化された遺伝子断片については、その遺伝子断片に対応するアレイ上のプローブのＣｙ５のシグナル強度は強くなり、グラフの上方にバーとして示される。【０１０８】
《実施例３》
２種類の異なるマウスＥＳ細胞株［２ＴＳ２２Ｃ（理化学研究所バイオリソースセンター細胞バンク  ＡＥＳ０１２５）、ＴＴ２（同バンク  ＡＥＳ００１４）］から、実施例１の手順に準じて、アダプターＬＡ１を結合したＤＮＡ断片溶液をそれぞれ調製した。【０１０９】
各ＤＮＡ断片溶液を４分割し、１つはＭＳ制限酵素であるＨｐａIIで消化し（ＭｃＢＴ法）、１つはＭＤ制限酵素であるＭｃｒＢＣ（NEB社）で消化し（ＣＲＥＤ法）、１つはＭＩ制限酵素であるＭｓｐＩで消化した（ＭｃＢＴ法におけるネガティブコントロール）。残る１つは酵素処理を行わず、トータルＤＮＡとして、ＭｃＢＴ法におけるポジティブコントロールとした。ＭｃｒＢＣによる消化は、４０μＬの反応系に２０ユニットを添加し、３７℃で３〜５時間行った。ＨｐａII及びＭｓｐＩによる消化は、実施例１に記載の条件で行った。【０１１０】
各処理液を鋳型として、実施例１に記載の手順に従って、それぞれ、ＬＭ−ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（ネガティブコントロール及びポジティブコントロールを含む）を電気泳動にかけ、反応が正しく行われていることを確認した。
続いて、ＨｐａII処理液又はＭｃｒＢＣ処理液を鋳型としてＬＭ−ＰＣＲを実施して得られた各ＰＣＲ産物を、定法に従って、それぞれ、緑色蛍光色素（Alexa 555; Invitrogen社）又は赤色蛍光色素（Alexa 647; Invitrogen社）で標識した。これらの標識物を、マウスゲノムＤＮＡアレイ（ロシュ社：cat#C4222-00-01）を用いるＤＮＡアレイ分析にかけた。【０１１１】
マウス第１１番染色体のＮｍｕｒ２遺伝子（ＮＭ＿１５３０７９）及びその上流域に関する分析結果を図５に、マウス第１番染色体のＦｚｄ７遺伝子（ＮＭ＿００８０５７）及びその上流域に関する分析結果を図６に、マウス第２番染色体のＰａｒｄ６ｂ遺伝子（ＮＭ＿０２１４０９）及びその上流域に関する分析結果を図７〜図８（図８は、図７に示すエリアＡ及びＢの拡大説明図である）に示す。
分析に用いたＤＮＡアレイでは、概して５０ｍｅｒの長さのプローブが、概して５０塩基の間隔で配置されており、図５、図６におけるレーン２の各バーの横幅及び間隔、図５、図６におけるレーン３及び４における各ドットの横幅及び間隔、図７、図８におけるｌｏｇ（Ｆ１／Ｆ２）欄の各バーの横幅及び間隔が、それぞれ、プローブ長及びプローブ間隔を示している。【０１１２】
図５、図６において、レーン１に示す逆三角形はＭｓｐＩ認識サイトを示す。レーン３及びレーン４は、それぞれ、緑色蛍光色素（ＨｐａII処理；Ｆ１）及び赤色蛍光色素（ＭｃｒＢＣ処理；Ｆ２）の蛍光強度を示し、レーン２は、それらの比の対数値［Ｌｏｇ（Ｆ１／Ｆ２）］である。
図７、図８では、緑色蛍光色素（ＨｐａII処理；Ｆ１）及び赤色蛍光色素（ＭｃｒＢＣ処理；Ｆ２）の蛍光強度を省略し、それらの比の対数値［Ｌｏｇ（Ｆ１／Ｆ２）］のみを示す。【０１１３】
ＨｐａII（ＭＳ制限酵素）によるメチル化分析では、ＤＮＡ断片の両端が共にメチル化されている断片のみが増幅されるため、ＤＮＡ断片の末端領域に位置するシトシンに関してのみ、メチル化を判定することができる。例えば、図５、図６のレーン３（緑色蛍光色素）では、ＤＮＡ断片の両端が共にメチル化されている場合に強い蛍光シグナル（Ｆ１）が検出される。
一方、ＭｃｒＢＣ（ＭＤ制限酵素）によるメチル化分析では、前記末端領域のシトシンを除いたＤＮＡ断片の内部領域に位置するシトシンのメチル化を評価することができる。例えば、図５、図６のレーン４（赤色蛍光色素）では、ＤＮＡ断片の内部領域にＭｃｒＢＣの認識配列が存在しない場合（すなわち、適当な間隔（４０〜３０００塩基）を挟んで位置する配列ＰｕｍＣ［式中、Ｐｕはプリン塩基（Ａ又はＧ）を意味し、ｍＣはメチル化シトシンを意味する］の対が存在しない場合）に、強い蛍光シグナル（Ｆ２）が検出される。【０１１４】
ここで、Ｆ１及びＦ２の比の対数値［Ｌｏｇ（Ｆ１／Ｆ２）］をとると、その値が正である場合（例えば、図５のレーン２に示すバー群の左側領域、あるいは、図８のエリアＢにおけるＴＴ２）には、ＨｐａIIに抵抗性を示し、且つ、ＭｃｒＢＣに対して感受性（被消化性）を示すＤＮＡ断片であること、すなわち、ＤＮＡ断片の両端が共にメチル化されており、且つ、内部領域にＭｃｒＢＣの認識配列が存在することを意味しているので、そのＤＮＡ断片は、メチル化率が高いＤＮＡ断片（hypermethylated DNA）として分類することができる。
また逆に、Ｌｏｇ（Ｆ１／Ｆ２）の値が負である場合（例えば、図６のレーン２に示すバー群の右側領域、あるいは、図８のエリアＡにおける２ＴＳ２２Ｃ及びＴＴ２、エリアＢにおける２ＴＳ２２Ｃ）には、ＨｐａIIに対し感受性を示し、ＭｃｒＢＣに抵抗性を示すＤＮＡ断片であること、すなわち、両端の制限酵素認識配列の一方のみにメチル化シトシンが存在するか、あるいは、いずれの両端にもメチル化シトシンが存在するものではなく、且つ、内部領域にＭｃｒＢＣの認識配列が存在しないことを意味しているので、そのＤＮＡ断片は、メチル化率が低いＤＮＡ断片（hypomethylated DNA）として分類することができる。【０１１５】
このように特定のＤＮＡ断片を上記の２つの酵素によって相補的に二重に評価することにより、分析対象のＤＮＡ断片のメチル化をより確実に判定することが可能となる。
制限酵素を用いた今までのＤＮＡメチル化分析では、メチル化感受性制限酵素の認識サイトのみのメチル化しか判定できなかったが、ＭｃＢＴ法とＣＲＥＤ法との組合せでは上記のようにＭｃＢＴ法で分析対象としたＤＮＡ断片と同一のＤＮＡ断片をＣＲＥＤ法でも同様に分析できるため、分析対象ＤＮＡの内部領域に渡ってメチル化を評価できる方法となっており、従来のように、制限酵素サイトのみのメチル化を判定する制限酵素法の欠点を克服している。【０１１６】
《実施例４》
ヒト凍結プール血清（メーカー名：日水、品名：L−コーンセーラI−EX）４ｍＬを用い、市販の精製キット［CahargeSwitch gDNA 1 mL, Serum Kit（invitrogen社）］で血清中のゲノムＤＮＡを精製した。これを常法に従い、５ユニットのＭｓｐＩ（NEB社）で１時間消化した。これを精製キット［QIAquick Nucleotide Removal Kit（QIAGEN社）］で精製し、得られたＤＮＡ断片溶液を限外濾過膜［Microcon Ultracel YM-30（MILLIPORE社）］を用いて２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）／０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡに対して平衡化（バッファー交換）を行った。溶液を１０μＬまで濃縮して該ＤＮＡ液を回収し、４μＬのアダプター液を加え、更に１４μＬのリガーゼ液（MightyMix；タカラバイオ社）を加え、１２℃で１時間のライゲーションを行った。反応液はその後、精製キット［QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）］で精製し、更に限外濾過膜［Microcon Ultracel YM-30（MILLIPORE社）］を用いて制限酵素用バッファー［No.2（NEB社）］に対して平衡化すると共に２０μＬまで濃縮した。これを１０μＬずつに２本のチューブに分け、一方のチューブのみに５ユニットのＭｃｒＢＣを加え、該溶液を３７℃で４時間インキュベートした。次に、３μＬのエキソヌクレアーゼ用１０×緩衝液［670mmol/L Glycine-KOH (pH9.4), 25mmol/L MgCl2, 10mmol/L DTT, 0.5mg/mL BSA］を加え、更に全量が３０μＬになるように蒸留水を加えるとともに、λエキソヌクレアーゼ（５ユニット）とエキソヌクレアーゼＩ（２０ユニット）を加え、３７℃で１時間、更に７５℃で２０分間インキュベートした。次に該溶液を鋳型とし、実施例１で使用したアダプター及びオリゴＤＮＡプライマーを用い、ＬＭ−ＰＣＲを行った。その結果、電気泳動（BioAnalyzerによるキャピラリー電気泳動）により充分なＤＮＡ増幅産物が確認された（図１１）。図１１において、レーン１は分子量マーカー、レーン２はトータルＤＮＡ（すなわち、ＭｃｒＢＣ消化なし）を鋳型としたＰＣＲ増幅産物、レーン３はＭｃｒＢＣ処理したＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅産物である。この量はＤＮＡアレイ分析にも充分使用できるものであった。【０１１７】
【表３】
0005618369.tif 000008
７５℃，１０分＋９５℃，２分
＋（９５℃，２０秒；７１．８℃，１５秒；７３℃，３０秒）ｘ１８サイクル
＋（９５℃，２０秒；７０．０℃，２０秒；７３℃，１０秒）ｘ２６サイクル
＋（９５℃，２０秒；６９．８℃，２０秒；７３℃，３０秒）ｘ１０サイクル
＋７２℃，５分
【産業上の利用可能性】
【０１１８】
本発明は、ＤＮＡのメチル化分析の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１９】
配列表の配列番号１又は２の配列で表される各塩基配列は、アダプター１である。配列番号３の配列で表される各塩基配列は、ＰＣＲプライマーである。
【図１】
0005618369.tif 000009
【図２】
0005618369.tif 000010
【図５】
0005618369.tif 000011
【図６】
0005618369.tif 000012
【図７】
0005618369.tif 000013
【図８】
0005618369.tif 000014
【図９】
0005618369.tif 000015
【図１０】
0005618369.tif 000016
【図３】
0005618369.tif 000017
【図４】
0005618369.tif 000018
【図１１】
0005618369.tif 000019
【配列表】
0005618369000001.app