(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
デサチュラーゼ活性を有するポリペプチド（前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。）をコードするヌクレオチド配列を含むまたは前記ヌクレオチド配列に対して相補的である単離核酸。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むまたは前記ヌクレオチド配列に対して相補的であり、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項３】
前記単離核酸が、基質としてモノ不飽和または多価不飽和脂肪酸を使用する機能活性デサチュラーゼをコードする請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項４】
前記単離核酸が真菌から単離される請求項１または２に記載の単離核酸。
【請求項５】
前記真菌がデラクロイキシア・コロナタ（Ｄｅｌａｃｒｏｉｘｉａ  ｃｏｒｏｎａｔａ）である請求項４に記載の単離核酸。
【請求項６】
請求項１または２に記載の単離核酸によってコードされている精製ポリペプチド。
【請求項７】
多価不飽和脂肪酸を炭素６で不飽和化し、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。
【請求項８】
ａ）
ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするまたは
ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する
ヌクレオチド配列を含むまたは前記ヌクレオチド配列に対して相補的な核酸を単離する段階；
ｂ）ｉ）前記単離核酸がｉｉ）制御配列に作動的に結合されている前記単離核酸を有するベクターを構築する段階；
ｃ）前記デサチュラーゼを発現させるのに十分な時間および条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階
を有するデサチュラーゼの製造方法。
【請求項９】
ａ）
ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするまたは
ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する
ヌクレオチド配列を含むまたは前記ヌクレオチド配列に対して相補的である、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸
ｂ）前記単離核酸に作動的に結合されている制御配列
を有するベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
前記ベクターの前記単離核酸の発現が植物細胞、植物または植物組織による多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす、請求項９に記載のベクターを含む単離植物細胞、植物または植物組織。
【請求項１２】
前記多価不飽和脂肪酸がγ−リノレン酸およびステアリドン酸からなる群から選択される請求項１１に記載の植物細胞、植物または植物組織。
【請求項１３】
前記ベクターの前記単離核酸の発現がトランスジェニック植物の種子における多価不飽和脂肪酸の産生をもたらす、請求項９に記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項１４】
ａ）
ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするかまたは
ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する
ヌクレオチド配列を含むまたは前記ヌクレオチド配列に対して相補的な核酸を単離する段階；
ｂ）前記単離核酸を含むベクターを構築する段階；
ｃ）Δ６−デサチュラーゼの発現に十分な時間および条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階；および
ｄ）前記発現Δ６−デサチュラーゼを基質多価不飽和脂肪酸に曝露して前記基質を生成物多価不飽和脂肪酸に変換する段階
を有する多価不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項１５】
前記基質多価不飽和脂肪酸がリノール酸またはα−リノレン酸であり；前記生成物多価不飽和脂肪酸がγ−リノレン酸またはステアリドン酸である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物多価不飽和脂肪酸をエロンガーゼに曝露して、前記生成物多価不飽和脂肪酸を他の多価不飽和脂肪酸に変換する段階をさらに有する請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生成物多価不飽和脂肪酸がγ−リノレン酸またはステアリドン酸であり；前記他の多価不飽和脂肪酸がジホモ−γ−リノレン酸またはエイコサテトラエン酸である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）基質モノ不飽和または多価不飽和脂肪酸をデサチュラーゼに曝露して、前記基質を生成物多価不飽和脂肪酸に変換する段階；および
ｂ）段階ａ）の前記生成物多価不飽和脂肪酸を、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するΔ６−デサチュラーゼに曝露して前記生成物多価不飽和脂肪酸を最終生成物多価不飽和脂肪酸に変換する段階
を有する多価不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項１９】
前記基質モノ不飽和脂肪酸がオレイン酸であり；前記多価不飽和脂肪酸がリノール酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記最終生成物多価不飽和脂肪酸がγ−リノレン酸またはステアリドン酸である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）
ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするまたは
ｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する
ヌクレオチド配列を含むまたは前記ヌクレオチド配列に対して相補的である核酸を単離する段階、ここで、単離された核酸は、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする；
ｂ）
ｉ）前記単離核酸、
ｉｉ）エロンガーゼをコードする単離核酸および
ｉｉｉ）Δ５−デサチュラーゼをコードする単離核酸
を含むベクターを構築する段階；
ｃ）Δ６−デサチュラーゼ、前記エロンガーゼおよび前記Δ５−デサチュラーゼを発現させる上で十分な時間および条件下で、宿主細胞に前記ベクターを導入する段階；および
ｄ）前記発現Δ６−デサチュラーゼ、前記発現エロンガーゼおよび前記発現Δ５−デサチュラーゼを基質多価不飽和脂肪酸に曝露して、前記基質を生成物多価不飽和脂肪酸に変換し、前記生成物多価不飽和脂肪酸を他の多価不飽和脂肪酸に変換し、前記他の多価不飽和脂肪酸を最終生成物多価不飽和脂肪酸に変換する段階
を有する多価不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項２２】
前記基質多価不飽和脂肪酸がリノール酸であり；前記生成物多価不飽和脂肪酸がγ−リノレン酸であり；前記他の多価不飽和脂肪酸がジホモ−γ−リノレン酸であり；前記最終生成物多価不飽和脂肪酸がアラキドン酸である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記基質多価不飽和脂肪酸がα−リノレン酸であり；前記生成物多価不飽和脂肪酸がステアリドン酸であり；前記他の多価不飽和脂肪酸がエイコサテトラエン酸であり；前記最終生成物多価不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
高ストリンジェント条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される核酸にハイブリダイズする、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項２５】
高ストリンジェント条件下で、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする単離核酸にハイブリダイズする、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価不飽和脂肪酸の合成に関与する酵素（すなわち、Δ６−デサチュラーゼ）をコードする遺伝子の特定および単離ならびにこれの使用に関するものである。詳細には、Δ６−デサチュラーゼは、例えばリノール酸（Ｃ１８：２ｎ−６）からγ−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−６）への変換およびα−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ−３）からステアリドン酸（Ｃ１８：４ｎ−３）への変換を触媒する。次に変換生成物を、他の多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の製造における基質として利用することができる。この生成物又は他の多価不飽和脂肪酸は、医薬組成物、栄養組成物、動物飼料ならびに化粧品などの他の製品に加えることができる。
【背景技術】
【０００２】
デサチュラーゼは多くの重要な機能を有する長鎖ポリ不飽和脂肪酸の生成において不可欠である。例えば、ポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）はリン脂質の形態で存在する細胞の原形質膜の重要な成分である。ＰＵＦＡは、哺乳動物プロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエンおよびプロスタグランジンへの前駆体としても機能する。
【０００３】
さらに、ＰＵＦＡは発達中の乳児の脳の適切な発達や組織の形成および修復のために必要である。ＰＵＦＡの生物学的重要性に鑑みて、ＰＵＦＡおよびＰＵＦＡを製造するための中間体を効率的に生成することが試みられている。
【０００４】
多数の酵素がＰＵＦＡ生合成に関与しており、中でもデサチュラーゼおよびエロンガーゼが注目されている（図１参照）。例えば、エロンガーゼ（ｅｌｏ）はγ−リノレン酸（ＧＬＡ）のジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）への変換およびステアリドン酸（Ｃ１８：４ｎ−３）の（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−３）への変換を触媒する。リノール酸（ＬＡ，Ｃ１８：２ｎ−９，１２またはＣ１８：２ｎ−６）はΔ１２−デサチュラーゼによりオレイン酸から生成される。ＧＬＡ（Ｃ１８：３ｎ−６，９，１２）はΔ６−デサチュラーゼによりリノール酸から生成される。
【０００５】
動物はΔ９位以外を不飽和化できず、よってオレイン酸をリノール酸に変換できないことに注目すべきである。同様に、γ−リノレン酸（ＡＬＡ，Ｃ１８：３ｎ−９，１２，１５）は哺乳動物により合成され得ない。しかしながら、γ−リノレン酸は哺乳動物および藻類においてΔ６−デサチュラーゼ によりステアリドン酸（ＳＴＡ，Ｃ１８：４ｎ−６，９，１２，１５）に変換され（ＰＣＴ公開９６／１３５９１およびThe FASEB Journal, Abstracts, Part I, Abstract 3093, page A532 (Experimental Biology 98, San Francisco, CA, April 18-22, 1998)、および米国特許第５５５２３０６号参照）、その後（ｎ−３）−エイコサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｎ−８，１１，１４，１７）に延長され得る。このポリ不飽和脂肪酸（すなわち、Ｃ２０：４ｎ−８，１１，１４，１７）はその後Δ５−デサチュラーゼによりエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ，Ｃ２０：５ｎ−５，８，１１，１４，１７）に変換され得る。また、ＥＰＡはエロンガーゼによりω３−ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５ｎ−３）に変換され得る。
【０００６】
真菌および植物を含めた他の真核生物は炭素１２（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１１５１６および米国特許第５４４３９７４号参照）および炭素１５（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１１２４５参照）で不飽和化する酵素を有する。従って、動物の主要なポリ不飽和脂肪酸は食餌からおよび／またはリノール酸またはγ−リノレン酸の不飽和化および延長から誘導される。これらの困難さから、元々これら脂肪酸を生成する種からＰＵＦＡ合成に関与する遺伝子を単離し、前記遺伝子を１つ以上のＰＵＦＡを大量に生産するように改変され得る微生物、植物または動物系において発現させることは特に興味深い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の議論を考慮すると、Δ６−デサチュラーゼ酵素、この酵素をコードする各遺伝子およびこの酵素を産生するための組換え方法が明らかに必要とされている。さらに、天然に存在する以上の量のＰＵＦＡを含む油および新規ＰＵＦＡを多く含む油が要望されている。こうした油はΔ６−デサチュラーゼ 遺伝子を単離、発現させることによってのみ製造され得る。
【０００８】
本明細書で言及される米国特許明細書および刊行物は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるものとする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列またはこの断片を含むものであり、このポリペプチドは配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。
【００１０】
さらに本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するまたはこのヌクレオチド配列に対して相補的である単離核酸配列またはこの断片を包含するものである。
【００１１】
上記のヌクレオチド配列は、基質としてモノ不飽和または多価不飽和脂肪酸を用いる機能活性デサチュラーゼをコードする。そのヌクレオチド配列は例えば、デラクロイキシア・コロナツス(Delacroixia coronatus）由来ものものであることができる。本発明はまた、上記のヌクレオチド配列によってコードされる精製タンパク質およびそれの断片をも含むものである。
【００１２】
特に、本発明は、炭素６で多価不飽和脂肪酸を不飽和化するおよび配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する精製ポリペプチドをも含むものである。
【００１３】
さらに、本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離する段階；ｉ）前記単離ヌクレオチド配列がｉｉ）プロモーターに作動的に結合している前記単離ヌクレオチド含むベクターを構築する段階；およびデサチュラーゼを発現させるのに十分な時間および条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階を含むデサチュラーゼの生成方法を含むものである。宿主細胞は、例えば真核細胞または原核細胞であることができる。特に、原核細胞は例えば大腸菌、シアノバクテリアまたは枯草菌であることができる。真核細胞は例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞、例えばサッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、カンジダ属種（Candida spp．）、リポミセス・スターキー（Lipomyces starkey）、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）、クルイベロミセス属種（Kluyveromyces spp.）、ハンゼヌラ属種（Hansenula spp.）、トリコデルマ属種（Trichoderma spp.）またはピチア属種（Pichia spp.）のような真菌細胞であることができる。クモノリゾプス属種（Rizopus spp.）、アスペルギルス属種（Aspergillus spp.）およびムコール属種（Mucor spp.）などの他の真菌宿主も利用可能である。
【００１４】
さらに、本発明は、制御配列（例：プロモーター）に作動的に結合している、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的な単離ヌクレオチド配列を含むベクターをも包含する。本発明はまた前記ベクターを含む宿主細胞をも包含する。この宿主細胞は例えば真核細胞または原核細胞であることができる。好適な真核細胞および原核細胞は上記の通りである。
【００１５】
さらに、本発明は前記ベクターを含む単離植物細胞、植物または植物組織を包含し、このベクターのヌクレオチド配列を発現させると、前記の植物細胞、植物または植物組織により多価不飽和脂肪酸が生成される。多価不飽和脂肪酸は例えば、γ−リノレン酸またはステアリドン酸からなる群から選択される。本発明は、上記植物細胞、植物または植物組織により発現される１以上の植物油または酸をも包含する。
【００１６】
さらに、本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物を包含し、このベクターのヌクレオチド配列を発現させるとトランスジェニック植物の種子において多価不飽和脂肪酸が生成される。
【００１７】
本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチドに対して少なくとも９０％ヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたは前記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を単離する段階；前記単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階；Δ６−デサチュラーゼを発現させるのに十分な時間および条件下で前記ベクターを宿主細胞に導入する段階；および発現させたΔ６−デサチュラーゼを基質の多価不飽和脂肪酸に曝露して、前記基質を生成物の多価不飽和脂肪酸に変換させる段階を含む多価不飽和脂肪酸の生産方法（第１方法）を包含する。基質の多価不飽和脂肪酸は、例えばリノレン酸またはα−リノレン酸であることができ、生成物の多価不飽和脂肪酸は、例えばそれぞれγ−リノレン酸またはステアリドン酸であることができる。この方法は、さらに生成物の多価不飽和脂肪酸を別の酵素（例えば、エロンガーゼ）に曝露して、前記生成物の多価不飽和脂肪酸を他の多価不飽和脂肪酸に変換させる段階を含む（すなわち、「第２」方法）。追加段階を含むこの方法（すなわち、「第２」方法）において、生成物の多価不飽和脂肪酸は例えばγ−リノレン酸またはステアリドン酸であることでき、「他の」多価不飽和脂肪酸は、例えばジホモ−γ−リノレン酸またはエイコサテトラエン酸であることができる。
【００１８】
また、本発明は、基質のモノ不飽和もしくは多価不飽和脂肪酸を酵素（例：エロンガーゼまたはデサチュラーゼ）に曝露して、前記基質を生成物の多価不飽和脂肪酸に変換させる段階；および前記生成物の多価不飽和脂肪酸を配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むΔ６−デサチュラーゼに曝露して、前記生成物の多価不飽和脂肪酸を最終生成物の多価不飽和脂肪酸に変換させる段階；を含む多価不飽和脂肪酸の生成方法を包含する。
【００１９】
例えば、基質の多価不飽和脂肪酸（例：リノール酸）をω３−デサチュラーゼ（例：δ１５−デサチュラーゼ）に曝露して、前記基質を「生成物」の多価不飽和脂肪酸（例えば、α−リノレン酸）に変換させることができる。生成物の多価不飽和脂肪酸はその後本発明のΔ６−デサチュラーゼに曝露することにより「最終」生成物の多価不飽和脂肪酸（例えば、ステアリドン酸）に変換することができる（図１参照）。あるいは、オレイン酸などの基質モノ不飽和脂肪酸をデサチュラーゼ（例：Δ１２−デサチュラーゼ）に曝露することで、その基質をリノール酸などの生成物多価不飽和脂肪酸に変換することができる。次に、その生成物多価不飽和脂肪酸を、本発明のΔ６−デサチュラーゼに曝露することで、最終生成物多価不飽和脂肪酸、γ−リノレン酸に変換することができる。従って、Δ６−デサチュラーゼは「最終」所望生成物を生成するために方法の最後の段階で使用される。別の例として、リノール酸をΔ６−デサチュラーゼに曝露するとγ−リノレン酸（ＧＬＡ）が生成され、その後ＧＬＡをエロンガーゼに曝露することでジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ）を生成し、ＤＧＬＡをΔ５−デサチュラーゼに曝露することでアラキドン酸（ＡＡ）を生成させることができる。ＡＡをその後エロンガーゼに曝露することで、アドレン酸に変換することができる。最後に、アドレン酸をΔ４−デサチュラーゼに曝露することで、それをω６−ドコサペンタエン酸に変換することができる（図１参照）。従って、その方法では、Δ６−デサチュラーゼに加えてリノール酸基質と一連のデサチュラーゼおよびエロンガーゼを用いることで所望の生成物を得る(可能な基質には、図１に示されているもの、例えばリノール酸およびα−リノレン酸などがある。）。
【００２０】
本発明は、上記方法により生成した「生成物」多価不飽和脂肪酸および上記方法により生成した「他の」多価不飽和脂肪酸からなる群から選択される多価不飽和脂肪酸を少なくとも１つ含む組成物をも包含する。生成物の多価不飽和脂肪酸は、例えばγ−リノレン酸またはステアリドン酸であることができる。前記他の多価不飽和脂肪酸は、例えばジホモ−γ−リノレン酸またはエイコサテトラエン酸であることができる。
【００２１】
さらに、本発明は、多価不飽和脂肪酸の摂取が不十分なために生ずる状態の予防または治療方法であって、患者に対して前記予防または治療に十分な量の組成物を投与する段階を含む方法を包含するものである。
【００２２】
さらに本発明は、多価不飽和脂肪酸を生成する別の方法も包含する。この方法は、ａ）ｉ）配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするまたはｉｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むまたはこのヌクレオチド配列に対して相補的である核酸配列を単離する段階；ｂ）ｉ）前記単離ヌクレオチド配列、ｉｉ）エロンガーゼをコードする単離ヌクレオチド配列およびｉｉｉ）Δ５−デサチュラーゼをコードする単離ヌクレオチド配列を含むベクターを構築する段階；ｃ）前記Δ６−デサチュラーゼ、前記エロンガーゼおよび前記Δ５−デサチュラーゼを発現させる上で十分な時間および条件下で宿主細胞に前記ベクターを導入する段階；およびｄ）前記発現Δ６−デサチュラーゼ、前記発現エロンガーゼおよび前記発現Δ５−デサチュラーゼを基質多価不飽和脂肪酸に曝露して、その基質を生成物多価不飽和脂肪酸に、その生成物多価不飽和脂肪酸を他の多価不飽和脂肪酸に、および他の多価不飽和脂肪酸を最終生成物多価不飽和脂肪酸に変換する段階を有する。例えば、基質多価不飽和脂肪酸はリノール酸であることができ、生成物多価不飽和脂肪酸はγ−リノレン酸であることができ、他の多価不飽和脂肪酸はジホモ−γ−リノレン酸であることができ、最終生成物多価不飽和脂肪酸はアラキドン酸であることができる。あるいは、基質多価不飽和脂肪酸はα−リノレン酸であることができ、生成物多価不飽和脂肪酸はステアリドン酸であることができ、他の多価不飽和脂肪酸はエイコサテトラエン酸であることができ、最終生成物多価不飽和脂肪酸はエイコサペンタエン酸であることができる。さらに本発明は、中等度もしくは高ストリンジェント条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７からなる群から選択される核酸配列にハイブリダイズする単離核酸配列またはそれの断片を包含するものである。本発明はまた、中等度もしくは高ストリンジェント条件下で、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチド（前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２、配列番号４、配列番号６および配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。）をコードする単離核酸配列にハイブリダイズする単離核酸またはそれの断片をも包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は真菌デラクロイキシア・コロナタ（Delacroixia coronata）由来のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチドおよび翻訳されたアミノ酸配列に関する。さらに、本発明は前記遺伝子およびこの遺伝子によりコードされる酵素の使用をも包含する。例えば、遺伝子およびコードされた相当する酵素は、医薬組成物、栄養組成物および他の有用な製品に添加することができるγ−リノレン酸およびステアリドン酸などの多価不飽和脂肪酸の製造に用いることができる。
【００２４】
Δ６−デサチュラーゼ遺伝子およびこれによってコードされる酵素
上記のように、本発明のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子によりコードされる酵素は、多価不飽和脂肪酸の生成において必須である。図２に、デラクロイキシア・コロナツスからの推定Δ６−デサチュラーゼのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号１）を示してあり、図３には、デラクロイキシア・コロナツスからの推定Δ６−デサチュラーゼのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号２）を示してある。形成されるプラスミドに基づいて異なっていた単離デラクロイキシア・コロナツスΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（実施例ＩＩ参照）を、図６（配列番号３）、図８（配列番号５）および図１０（配列番号７）に示してあり、相当する精製タンパク質のアミノ酸配列を、図７（配列番号４）、図９（配列番号６）および図１１（配列番号８）にそれぞれ示してある。
【００２５】
留意すべき点として、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号７に対して少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するか、それに相当するか、それと同一であるか、それに対して相補的である配列を有する単離ヌクレオチド配列（および相当するコードタンパク質）をも包含する（７０％〜１００％の全ての整数(およびそれの部分）も、パーセント同一性に関して本発明の範囲内にあると考えられる。）。このような配列は、天然入手源から単離されるか、または半合成経路を介して製造されるか、またはデノボで合成される入手源由来のものであることができる。特に、このような配列は、単離することができるか、または実施例に記載のもの以外の入手源由来のものであることができる（例：細菌、真菌、藻類、線虫、マウスまたはヒト）。
【００２６】
さらに本発明は、本発明の核酸配列（すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７）ならびに他の入手源由来であって上記の相補性、同一性もしくは対応性を有する配列の断片および誘導体をも包含するものである。上記全長配列および断片（すなわち、適宜にΔ６−デサチュラーゼ活性を有する配列）の機能的等価物も、本発明によって包含される。
【００２７】
本発明に関して、ヌクレオチド配列の「断片」は、指定のヌクレオチド配列の領域に相当するほぼ少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの隣接配列と定義される。
【００２８】
本発明は炭素６の位置で多価不飽和脂肪酸を不飽和化し、上記ヌクレオチド配列によりコードされる上記タンパク質の配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、好ましくは少なくとも約８０％のアミノ酸類似性もしくは同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸類似性もしくは同一性を有する精製ポレペプチドをも含む。
【００２９】
「同一性」という用語は、特定の比較窓またはセグメントの範囲でのヌクレオチド−ヌクレオチド基準での２つの配列の相関性を指す。よって、同一性は２つのＤＮＡセグメント（または、２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センスまたはアンチセンス）間の同一性、相当性または等価性の程度として定義される。「配列同一性の％」は、特定領域の範囲の２つの最適にアラインしている配列を比較し、両配列中に同一の塩基またはアミノ酸が存在する位置の数を調べて整合位置の数を求め、前記位置の数を比較するセグメント中の位置の総数で割り、結果に１００を掛けることにより計算される。配列の適正アライメントは、スミスらの報告（Smith & Waterman, Appl. Math., 2:482 (1981)）のアルゴリズム、ニードルマンらの報告（Needleman & Wunsch, J. MoI. Biol. 48:443 (1970)）のアルゴリズム、ピアソンらの報告（Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988)）の方法、および関連アルゴリズム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｍａｃａｗ  Ｐｉｌｅｕｐ（http://cmgm.Stanford.edu/biochem218/llMultiple.pdf；Higgins et al., CABIOS. 5L151-153 (1989)）、ＦＡＳＴＤＢ（Intelligenetics）、ＢＬＡＳＴ（National Center for Biomedical Information；Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997)）、ＰＩＬＥＵＰ（Genetics Computer Group, Madison, WI）またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, WI）を実行するコンピュータープログラムにより実施することができる（米国特許第５９１２１２０号参照。）。
【００３０】
本発明において、「相補性」は２つのＤＮＡセグメント間の関係性の度合いと定義される。１つのＤＮＡセグメントのセンス鎖が適当な条件下で他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズして二重らせんを形成する能力を測定することにより決定される。「相補体」は標準の塩基対規則に基づいて所定の配列に対して対をなす配列と定義される。例えば、一方のヌクレオチド鎖中の配列Ａ−Ｇ−Ｔは他方の鎖中のＴ−Ｃ−Ａに相補的である。
【００３１】
二重らせんにおいて、アデニンは１つの鎖中に見られ、チミンは他の鎖中に見られる。同様に、グアニンが一方の鎖中に存在する場合、シトシンが他方の鎖中に存在する。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の相関度が高いほど、これら２つのＤＮＡセグメントの鎖間でハイブリッド二重鎖を形成する能力が高い。
【００３２】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は両配列の一連の同一保存アミノ酸残基の存在と定義される。２つのアミノ酸配列間の類似度が高いほど、これら２つの配列の相当性、同一性または等価性が高い。２つのアミノ酸配列間の「同一性」は両配列中の一連のほぼ類似または不可変アミノ酸残基の存在と定義される。「相補性」、「同一性」および「類似性」の定義は当業者に公知である。
【００３３】
「によってコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、前記ポリペプチド配列またはその一部は前記核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも８アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明はまた、ＰＵＦＡデサチュラーゼ活性（すなわち、Δ６−デサチュラーゼ活性）をコードし、上記ヌクレオチド配列（配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号７）を含むかまたは上記ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する核酸に中等度のストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能な単離ヌクレオチド配列を包含する。核酸分子は、核酸分子の１本鎖形態が適正な温度およびイオン強度条件下で他の核酸分子にアニーリングし得るときに別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Sambrook et al., ″Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York参照）。温度およびイオン強度の条件はハイブリダイゼーションの「ストリンジェント性」を決定する。
【００３５】
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、プローブ配列および標的配列の性質に応じて、当業者には容易に理解されると考えられる適切なストリンジェント条件での核酸のハイブリダイゼーションを意味するように使用される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は当業界において公知であり、インキュベーション時間、温度 および／または溶液のイオン強度を変えることによる所望のストリンジェント性に応じた条件の調節は用意に行われる。例えば、上記で記載し、参照によって本明細書に組み込まれるサムブロックらの著作（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring harbor Press, Cold Spring harbor, N.Y., 1989）を参照する（Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al. and Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)［いずれも参照によって本明細書に組み込まれる。］も参照する。）。具体的には、条件の選択は、ハイブリダイズされる配列の長さ、特にはプローブ配列の長さ、核酸の相対的Ｇ−Ｃ含有量および許容されるミスマッチの量によって決まる。相補性の程度が相対的に低い鎖間の部分的ハイブリダイゼーションが望まれる場合、低ストリンジェント条件が好ましい。完全もしくはほぼ完全な相補性が望まれる場合、高ストリンジェント条件が好ましい。代表的な高ストリンジェント条件の場合、ハイブリダイゼーション溶液は、６×Ｓ．Ｓ．Ｃ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１×デンハート液および０．５％ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーションは、約６８℃にて、クローニングＤＮＡの断片の場合は約３〜４時間、総真核生物ＤＮＡの場合は約１２〜約１６時間行う。中等度のストリンジェント性の場合、３×塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド（ｐＨ７．５の０．１Ｍのこの緩衝液）および５×デンハート液の溶液で前ハイブリダイズおよびハイブリダイズを行うフィルターを用いることができる。次に、３７℃で４時間前ハイブリダイズさせ、次に合計で３、０００、０００ｃｐｍに等しい量の標識プローブで１６時間にわたり３７℃でハイブリダイズさせ、次に２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液での洗浄、すなわちそれぞれ室温での１分間にわたって４回およびそれぞれ６０℃での３０分間にわたって４回の洗浄を行うことができる。乾燥後、フィルムに露光する。相対的に低ストリンジェント性の場合、ハイブリダイゼーションの温度を、二本鎖の融点（Ｔｍ）より約１２℃下まで下げる。Ｔｍは、Ｇ−Ｃ含有量および二本鎖長さならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００３６】
「ハイブリダイゼーション」では、２つの核酸が相補配列を含むことが必要である。しかしながら、ハイブリダイゼーションのストリンジェント性に応じて、塩基間のミスマッチが生じる可能性がある。上記のように、核酸をハイブリダイズさせるための適当なストリンジェント性は核酸の長さおよび相補度によって決まる。上記変数は当業界で公知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似度または相同度が高いほど、前記配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は高い。１００以上のヌクレオチド長を有するハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（上記のサムブロック（Sambrook）らの報告参照）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションでは、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のサムブロック（Sambrook）らの報告参照）。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「単離核酸断片または配列」は、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含んでいても良い一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡポリマー形態の単離核酸断片はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る（指定のポリヌクレオチドの「断片」は、その指定されたヌクレオチド配列の領域に対して同一または相補的な大体少なくとも約６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの隣接配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。）。ヌクレオチド（通常５′−モノホスフェートの形態で存在する。）は、以下のように１文字表記で表される。すなわち、アデニレートまたはデオキシアデニレート（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに関して）を「Ａ」、シチジレートまたはデオキシシチジレートを「Ｃ」、グアニレートまたはデオキシグアニレートを「Ｇ」、ウリジレートを「Ｕ」、デオキシチミジレートを「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）を「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）を「Ｙ」、ＧまたはＴを「Ｋ」、Ａ、ＣまたはＴを「Ｈ」、イノシンを「Ｉ」、任意のヌクレオチドを「Ｎ」と略記する。
【００３８】
「機能的に等価である断片または細断片」および「機能的等価断片または細断片」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は、断片または細断片が活性酵素をコードしているか否かを問わず、遺伝子発現を変える能力またはある表現型を発現する能力が保持されている単離核酸の配列またはその一部を指す。例えば、断片または細断片は所望表現型を形質転換植物において発現させるべくキメラ構築物の設計において使用することができる。キメラ構築物は、それが活性酵素をコードしているか否かを問わず、核酸断片またはその細断片を植物プロモーター配列に対して適当な配向で連結することにより、共抑制またはアンチセンスで用いるよう設計することができる。
【００３９】
「相同性」、「相同的な」、「実質的に類似」および「実質的に相当」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は１つ以上のヌクレオチド塩基中の変化が核酸断片の遺伝子発現に介在する能力またはある表現型を発現する能力に影響を与えない核酸断片を指す。これらの用語はまた、本発明の核酸断片の修飾、例えば生じる核酸断片の機能的特性を当初の非修飾断片に比して実質的に変えない１つ以上のヌクレオチドの欠失または挿入を指す。従って理解しておくべき点として、当業者には明らかなように、本発明は具体的な例示配列より多くのものを包含するものである。
【００４０】
「遺伝子」は、コード配列の前（５′非コード配列）および後（３′非コード配列）の調節配列を含む特定タンパク質を発現する核酸断片を指す。
【００４１】
「天然遺伝子」はそれ自身の調節配列を有する天然に存在する遺伝子を指す。対照的に、「キメラ構築物」は通常天然に存在しない核酸断片の組合せを指す。従って、キメラ構築物は異なるソースから誘導される調節配列およびコード配列からなるか、または同一ソースから誘導されるが天然には通常見られるものとは異なる形で配置されている調節配列およびコード配列を有することができる。「単離」という用語は、配列が天然環境から取り出されることを意味する。
【００４２】
「外来」遺伝子は宿主生物中に通常存在しないが、遺伝子移入により宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は非天然生物に挿入される天然遺伝子またはキメラ構築物を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換法によりゲノムに導入された遺伝子である。
【００４３】
「コード配列」は特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」はコード配列の上流（５′非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３′非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡのプロセッシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル化認識配列などがあり得るが、これらに限定されない。
【００４４】
「プロモーター」はコード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流成分から構成され、後者の成分はしばしばエンハンサーと称される。したがって、「エンハンサー」はプロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有成分またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入される異種成分であることができる。プロモーター配列は遺伝子の転写部分および／または転写配列の下流にも位置することができる。プロモーターは天然遺伝子から全体を誘導することができるか、または天然に存在する各種プロモーターから誘導される各種成分から構成することができるか、または合成ＤＮＡセグメントから構成することができる。当業者であれば、各プロモーターが異なる組織または細胞型中、または異なる発達段階、または異なる環境条件に応答して遺伝子を発現させ得ることは明らかである。遺伝子を多くの宿主細胞タイプで高頻度で発現させるプロモーターは通常、「構成的プロモーター」と称される。植物細胞において有用な各種の新しいプロモーターが常に発見されている。多数の例が、オカムロらによる編著に記載されている（Okamuro and Goldberg, Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989)）。さらに、多くの場合で調節配列の正確な境界が完全には規定されていないので、幾つかの変異のＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有し得ることも明らかである。
【００４５】
「イントロン」はタンパク質配列の一部をコードしない遺伝子中の介在配列である。よって、この配列はＲＮＡに転写されるが、その後切断されて、翻訳されない。この用語は切断されたＲＮＡ配列に対しても使用される。「エクソン」は転写される遺伝子配列の一部であり、遺伝子から誘導される成熟メッセンジャーＲＮＡ中に存在するが必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部であるとは限らない。
【００４６】
「翻訳リーダー配列」は遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置するＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の上流の完全にプロセッシングされるｍＲＮＡ中に存在する。翻訳リーダー配列は一次転写物のｍＲＮＡへのプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に影響を与えることがある。翻訳リーダー配列は公知である（Turner, R. and Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225）。
【００４７】
「３′非コード配列」はコード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼし得る調節シグナルをコードする他の配列を含む。前記ポリアデニル化シグナルは通常ｍＲＮＡ前駆体の３′末端へのポリアデニル酸トラクト（tracts）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。異なる３′非コード配列の使用はインゲルブレヒトらの報告（Ingelbrecht et al., Plant Cell 1:671-680 (1989)）に例示されている。
【００４８】
「ＲＮＡ転写物」はＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写により生ずる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全相補性コピーであるときには、一次転写物と称され、または一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列である場合があり、これは成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」はイントロンが存在せず、細胞によりタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡ鋳型に対して相補的であり、逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを指す。このｃＤＮＡは一本鎖であるかまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて二本鎖形態に変換され得る。「センス」ＲＮＡはｍＲＮＡを含み、細胞またはインビトロでタンパク質に転写され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５１０７０６５号）。アンチセンスＲＮＡは特定遺伝子転写物の一部、すなわち５′非コード配列、３′非コード配列、イントロンまたはコード配列で相補性であり得る。「機能的ＲＮＡ」はアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されないが細胞プロセスに影響を有する他のＲＮＡを指す。「相補体」および「逆相補体」という用語はｍＲＮＡ転写物に関して本明細書において同義的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義するための意味を有する。
【００４９】
「内在性ＲＮＡ」という用語は、天然あるか非天然（すなわち、組換え手段、突然変異等により導入される）を問わず、本発明の組換え構築物での形質転換前に宿主のゲノム中に存在する核酸配列によりコードされるＲＮＡを指す。
【００５０】
「非天然」という用語は、人工的なものであって、通常天然に存在するものではないことを意味する。
【００５１】
「作動的に結合」という用語は、一方の核酸配列の機能が他方の配列により調節されるような１つの核酸断片への核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節することができるとき（すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある。）コード配列と作動的に結合している。コード配列は調節配列に対してセンスまたはアンチセンス配向で作動的に結合され得る。別の例で、本発明の相補的ＲＮＡ領域は標的ｍＲＮＡに対して５′に、標的ｍＲＮＡに対して３′に、または標的ｍＲＮＡ内に作動的に結合され得るものであり、また第一の相補領域が標的ｍＲＮＡに対して５′、その祖補体は標的ｍＲＮＡに対して３′である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、機能性最終産物の産生を指す。遺伝子の発現には、遺伝子の転写、ｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳が含まれる。「アンチセンス抑制」は標的タンパク質の発現を抑えることができるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」は同一または実質的に同一の外来または内在性遺伝子の発現を抑制し得るセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５２３１０２０号）。
【００５３】
「成熟」タンパク質は翻訳後プロセッシングされたポリペプチド、すなわち一次翻訳産物中に存在するプレ−またはプロ−ペプチドを除去したものを指す。「前駆体」タンパク質はｍＲＮＡの翻訳の一次産物を指す。この場合、プレ−またはプロ−ペプチドが依然として存在する。プレ−またはプロ−ペプチドは細胞内局在化シグナルであることができるが、それに限定されない。
【００５４】
「安定的形質転換」は遺伝的に安定な相続がもたらせれるような核酸断片の宿主生物のゲノムへの移入を指す。対照的に、「一過性形質転換」は組込みまたは安定な遺伝物相続なしに遺伝子発現するような宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラへの核酸断片の移入を指す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニック」生物と称する。コメ、トウモロコシまたは他の単子葉植物の細胞形質転換の好ましい方法では、粒子加速すなわち「遺伝子銃」形質転換方法の使用（Klein et al., (1987) Nature (London) 327:70-73；米国特許第４９４５０５０号）、または導入遺伝子を含む適当なＴｉプラスミドを用いるアグロバクテリウム介在の方法（Ishida Y. et al., 1996, Nature Biotech. 14:745-750）である。本明細書で使用される場合の「形質転換」という用語は、安定的形質転換および一過性形質転換の両方を指す。
【００５５】
本明細書中で使用される一般的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング方法は当業界で公知であり、サムブロックらの著作（Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989；以下、サムブロックと称する）に詳しく記載されている。
【００５６】
「組換え体」という用語は、配列の２つのばらばらのセグメントの、例えば化学合成によるかまたは遺伝子工学技術による核酸の単離セグメントの操作により人工的に組合せたものを指す。
【００５７】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、大量の特定ＤＮＡセグメントを合成する方法であり、一連の反復サイクルから構成される（Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT）。通常、二本鎖ＤＮＡを熱変性し、標的セグメントの３′境界に相補的な２つのプライマーを低温度でアニーリングし、その後中間温度で延長する。前記した３つの連続段階の１組を１サイクルと称する。
【００５８】
ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）はＤＮＡを短期間に鋳型の反復複製により数百万倍に増幅させるために使用される有力な方法である（Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986)；エルリッヒ（Erlich）らの欧州特許出願第５０４２４号；欧州特許出願第８４７９６号；欧州特許出願第２５８０１７号、欧州特許出願第２３７３６２号；ムリス（Mullis）の欧州特許出願第２０１１８４号；ムリス（Mullis）の米国特許第４６８３２０２号；エルリッヒ（Erlich）米国特許第４５８２７８８号；およびサイキ（Saiki）らの米国特許第４６８３１９４号）。この方法は特定のインビトロ合成したオリゴヌクレオチドの組をＤＮＡ合成を始めるために使用する。プライマーの設計は分析したいＤＮＡ配列によって決まる。前記方法は鋳型を高温で溶融し、プライマーを前記鋳型内で相補配列にアニーリングし、その後前記鋳型をＤＮＡポリメラーゼを用いて複製する多くの（通常２０〜２５）サイクルにより実施する。
【００５９】
ＰＣＲ反応の産物をアガロースゲル上で分離した後臭化エチジウム染色し、ＵＶ透視で可視化することにより分析する。あるいは、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに添加して産物中に標識を取り込むこともできる。この場合、ＰＣＲ産物はゲルをＸ線フィルムに曝露することにより可視化される。ＰＣＲ産物を放射線標識することの更なる利点は、各増幅産物の量を定量化できる点である。
【００６０】
「組換え構築物」、「発現構築物」および「組換え発現構築物」という用語は、本明細書において同義的に使用される。これらの用語は当業界で公知の一般的方法を用いて細胞のゲノムに挿入され得る遺伝子材料の機能単位を指す。前記構築物はそれ自体でされても良く、またはベクターと組み合わせて使用することもできる。ベクターを使用するとき、ベクターは当業者に公知のように宿主植物を形質転換するために使用する方法に応じて選択される。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者には、本発明の単離核酸断片を含む宿主細胞を良好に形質転換し、選択し、増殖させるためにベクターに存在させなければならない遺伝子成分は明らかである。当業者にはさらに、異なる独立形質転換事象により発現のレベルおよびパターンが異なり（Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418；De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86）、従って、所望の発現レベルおよびパターンを示す株を得るためには多数の事象をスクリーニングしなければならないことも明らかである。前記スクリーニングはＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタン分析または表現型分析によって実施することができる。
【００６１】
Δ６−デサチュラーゼ酵素の産生
Δ６−デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子が単離されたら、その遺伝子はベクターまたは構築物を用いて原核または真核宿主細胞に導入することができる。ベクター（例えば、バクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド）は、Δ６−デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、および宿主細胞において機能し、前記ヌクレオチド配列によりコードされるデサチュラーゼの発現を誘発することができる調節配列（例えば、プロモーター）を含むことができる。調節配列（例えば、プロモーター）は、前記ヌクレオチド配列に作動可能に組み合わされているか、または作動的に結合している。プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼすならば、プロモーターはコード配列に作動的に結合していると言われる。好適なプロモーターの例には、アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、酸ホスファターゼ、Ｔ７、ＴＰＩ、ラクターゼ、メタロチオネイン、最初期サイトメガロウイルス、ホエー酸性タンパク質、グルコアミラーゼをコードする遺伝子由来のもの、およびガラクトース（例えば、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０）の存在下で活性化されるプロモーターが含まれる。他のタンパク質、オリゴサッカライド、脂質等をコードするヌクレオチド配列もベクターおよび他の調節配列、例えばＳＶ−４０Ｔ−抗原、卵白アルブミンまたはウシ成長ホルモンのポリ−Ａ−シグナルのようなポリアデニル化シグナルの中に含まれ得る。構築物中に存在させる配列の選択は、所望の発現産物および宿主細胞の種類によって決まる。例えば、ベクターに本発明のΔ６−デサチュラーゼ遺伝子配列、エロンガーゼ遺伝子配列およびΔ５−デサチュラーゼ遺伝子配列を含めることで、コードされたΔ６−デサチュラーゼ、コードされたエロンガーゼ、ならびにコードされたΔ５−デサチュラーゼをそれぞれ同時に発現して、例えば、ＬＡをＡＲＡに、そしてＡＬＡをＥＰＡに変換することができる。
【００６２】
上記のように、ベクターを構築したら、そのベクターは例えばトランスフェクション、形質転換およびエレクトロポレーションを含めた当業者に公知の方法により選択された宿主細胞に導入され得る（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)参照）。その後、宿主細胞を遺伝子を発現させて所望のＰＵＦＡを生成し得る適当な条件下で培養する。生成したＰＵＦＡはその後回収、精製される。
【００６３】
好適な原核宿主細胞の例には細菌、例えば大腸菌、枯草菌およびシアノバクテリア、例えばスピルリナ属（すなわち、藍藻）などがある。好適な真核宿主細胞の例には、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞［例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ、サッカロミセス・カールスベルゲンシス、リポミセス・スターキー、カンジダ属種（例えば、ヤロウィア（カンジダ）・リポリチカ）、クルイベロミセス属種、ピチア属種、トリコデルマ属種またはハンゼヌラ属種］、真菌細胞［例えば、アスペルギルス、パンカビ属種およびアオカビ属種のような線状真菌細胞］などがある。好ましくは、サッカロミセス・セレヴィシエ（ベーカー酵母）細胞を使用する。
【００６４】
宿主細胞での発現は一過的または安定的に実施することができる。一過性発現は、宿主細胞において機能的な発現シグナルを含むが宿主細胞において複製せず、まれにしか組込まれない、または宿主細胞が増殖していないときに、導入構築物から生じ得る。一過性発現は、その遺伝子に作動的に結合した調節可能なプロモーターの活性を誘発することによっても実施することができるが、前記誘発システムは多くの場合低基礎レベルの発現しか示さない。好適な発現は、宿主ゲノムに組込まれ得るかまたは宿主細胞中で自律複製する構築物を導入することによって達成することができる。遺伝子の安定的発現は、発現構築物上に位置するかまたは発現構築物をトランスフェクトした選択マーカーを使用し、前記マーカーを発現する細胞を選択することにより選択することができる。組込みにより安定な発現が生ずるとき、構築物組込みの部位は宿主ゲノム内でランダムに生じ得るか、宿主座との組換えをターゲティングするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含む構築物を使用することによりターゲティングすることができる。構築物を内在性座にターゲティングするとき、転写および翻訳領域の全部または一部が、内在性座によって得られる。
【００６５】
当該酵素（すなわち、Δ６−デサチュラーゼ ）および最終的には当該ＰＵＦＡを発現させるためにトランスジェニック哺乳動物も使用され得る。より具体的には、上記構築物を作成したら、その構築物を胚の前核に挿入することができる。この胚はその後受容者の雌に移植することができる。あるいは、核移植法も使用可能である（Schnieke et al., Science 278:2130-2133 (1997)）。その後、妊娠および誕生が起こり得る（例えば、米国特許第５７５０１７６号および同第５７００６７１号参照）。子孫の乳汁、組織または他の流体サンプルは、非トランスジェニック動物中に通常存在するレベルとは異なるレベルのＰＵＦＡを含むはずである。後続の世代について、変化または向上したレベルのＰＵＦＡの産生および所望デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子のゲノムへの組込みをモニタリングすることができる。宿主として使用される哺乳動物は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマおよびウシからなる群から選択することができる。しかしながら、哺乳動物が当該酵素をコードするＤＮＡをそのゲノムに組み込む能力を有するならば、いずれの哺乳動物も使用可能である。
【００６６】
デサチュラーゼポリペプチドを発現させるには、機能的転写および翻訳開始および停止領域をデサチュラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡに作動的に結合させる。転写および翻訳開始および停止領域は、発現させるＤＮＡ、所望の系において発現可能であることが知られているか推定される遺伝子、発現ベクター、化学合成または宿主細胞中の内在性座を含めた各種の非特定ソースから誘導される。植物組織および／または植物部分での発現は確実に有効であり、この発現は組織または部分が種子、葉、果実、花、根等のような早期に収穫されるものの場合に特に見られる。発現は、米国特許第５４６３１７４号、同第４９４３６７４号、同第５１０６７３９号、同第５１７５０９５号、同第５４２００３４号、同第５１８８９５８号および同第５５８９３７９号に記載されているような特定の調節配列を用いて植物の上記位置にターゲティングすることができる。あるいは、発現タンパク質は、直接的または更なる修飾時に宿主植物由来の流体画分に組み込むことができる産物を産生する酵素であることができる。デサチュラーゼ遺伝子またはアンチセンスデサチュラーゼ転写物の発現により、植物部分および／または植物組織中に存在する特定ＰＵＦＡまたはその誘導体のレベルを変えることができる。デサチュラーゼポリペプチドコード領域は、それ自体または他の遺伝子を用いて発現することで、比較的高い割合で所望のＰＵＦＡを含む組織および／または植物部分を作ることができ、ＰＵＦＡ組成はヒト母乳に非常に似ている（プリエト（Prieto）らのＰＣＴ公開第９５／２４４９４号）。停止領域は開始領域を導いた遺伝子の３′領域または異なる遺伝子から誘導することができる。多数の停止領域が公知であり、同一または異なる属および種由来の各種宿主において満足できるものであることが認められている。停止領域は通常、特定の特性ではなく簡便性を考慮して選択される。
【００６７】
上記のように、植物（例えば、Glycine max（大豆）、棉、紅花、ひまわり、ヤシ、ココナッツ、トウモロコシ、ナッツ類、豆類、エンドウマメ類またはBrassica nups（アブラナ））または植物組織も、多価不飽和脂肪酸の生成に利用可能なデサチュラーゼ酵素を発現させるために、それぞれ宿主または宿主細胞として使用することができる。より具体的には、所望のＰＵＦＡを種子において発現させることができる。種子油の単離方法は当業界で公知である。すなわち、ＰＵＦＡソースを提供することに加えて、デサチュラーゼ遺伝子、恐らくは他のデサチュラーゼ遺伝子およびエロンガーゼ遺伝子を発現させることで種子油成分を操作して、栄養組成物、医薬組成物、動物飼料および化粧品に添加可能な種子油を得ることができる。プロモーターに作動的に結合したデサチュラーゼをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを植物組織または植物にデサチュラーゼ遺伝子を発現させるのに十分な時間および条件下で導入する。ベクターは他の酵素、例えばΔ５−デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、Δ１７−デサチュラーゼおよび／またはΔ１９−デサチュラーゼをコードする１以上の遺伝子をも含むことができる。植物組織または植物は、酵素が作用する関連する基質（例：リノール酸またはα−リノレン酸）を生成することができ、前記基質を産生する酵素をコードするベクターを植物組織、植物細胞または植物に導入することができる。さらに、基質を適当な酵素を発現する植物組織に噴霧することもできる。こうした各種方法により、植物細胞、植物組織または植物を用いてＰＵＦＡ（例えば、ω６−ドコサペンタエン酸のようなｎ−６不飽和脂肪酸、またはドコサヘキサエン酸のようなｎ−３脂肪酸）を生成することができる。本発明は上記ベクターを含むトランスジェニック植物をも包含し、そのベクターのヌクレオチド配列を発現させると、例えばトランスジェニック植物の種子において多価不飽和脂肪酸が生成される。
【００６８】
単一植物プロトプラスト形質転換体または各種形質転換外植片からの植物の再生、発達および栽培は当業界で公知である（Weissbach and Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988)）。この再生および成長プロセスは代表的には、形質転換細胞の選択、各細胞を通常の胚発達から定着小植物までの通常段階を経て培養する段階を含む。トランスジェニック胚および種子も同様に再生される。生じたトランスジェニック定着根をその後土壌のような適当な植物成長培地に植える。
【００６９】
当該タンパク質をコードする外来の外因性遺伝子を含む植物の発達または再生は当業界で公知である。好ましくは、再生した植物を自家受粉すると、同型接合トランスジェニック植物が得られる。あるいは、再生した植物から得た花粉を栽種的に重要な系の種子から成長させた植物と交配させる。逆に、再生植物を受粉するために前記の重要な系の植物からの花粉を用いる。所望のポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物を当業界で公知の方法を用いて栽培する。
【００７０】
植物細胞から植物を再生するには多くの方法がある。特定の再生方法は、出発の植物組織および再生しようとする特定の植物種によって決まる。
【００７１】
双子葉植物を主にアグロバクテリウム-ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いて形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法は、棉（米国特許第５００４８６３号；同第５１５９１３５号；同第５５１８９０８号）、大豆（米国特許第５５６９８３４号；同第５４１６０１１号；McCabe et. al., BiolTechnology 6:923 (1988)；Christou et al. , Plant Physiol. 87:671-674 (1988)）、アブラナ（米国特許第５４６３１７４号）、落花生（Cheng et al., Plant Cell Rep. 15:653-657 (1996)；McKently et al., Plant Cell Rep. 14:699-703 (1995)）、パパイヤおよびエンドウ豆（Grant et al., Plant Cell Rep. 15:254-258, (1995)）について公知である。
【００７２】
単子葉植物のエレクトロポレーション、微粒子銃およびアグロバクテリウムを用いる形質転換は既に報告されている。形質転換および植物再生はアスパラガス（Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 84:5354, (1987)）、大麦（Wan and Lemaux, Plant Physiol 104:37 (1994)）、トウモロコシ（Rhodes et al., Science 240:204 (1988)；Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990)；Fromm et al., BiolTechnology 8:833 (1990)；Koziel et al., BiolTechnology 11:194, (1993)；Armstrong et al., Crop Science 35:550-557 (1995)）、オート麦（Somers et al., BiolTechnology 10:1589 (1992)）、カモガヤ（Horn et al., Plant Cell Rep. 7:469 (1988)）、コメ（Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 205:34 (1986)；Part et al., Plant Mol. Biol. 32:1135-1148, (1996)；Abedinia et al., Aust. J. Plant Physiol. 24:133-141 (1997)；Zhang and Wu, Theor. Appl. Genet. 76:835 (1988)；Zhang et al . Plant Cell Rep. 7:379, (1988)；Battraw and Hall, Plant Sci. 86:191-202 (1992)；Christou et al., Bio/Technology 9:957 (1991)）、ライムギ（De Ia Pena et al., Nature 325:274 (1987)）、サトウキビ（Bower and Birch, Plant J. 2:409 (1992)）、ヒロハノウシノケグサ（Wang et al., Biol. Technology 10:691 (1992)）、および小麦（Vasil et al., Biol. Technology 10:667 (1992)；米国特許第５６３１１５２号）において実施されている。
【００７３】
クローン化核酸構築物の一過性発現に基づく遺伝子発現のアッセイは、核酸分子をポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーションまたは微粒子銃により植物細胞に導入することにより開発された（Marcotte et al., Nature 335:454-457 (1988)；Marcotte et al., Plant Cell 1:523-532 (1989)；McCarty et al., Cell 66:895-905 (1991)；Hattori et al., Genes Dev. 6:609-618 (1992)；Goff et al., EMBO J. 9:2517-2522 (1990)）。
【００７４】
一過性発現系を用いて、遺伝子構築物を機能的に分析することができる（Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)参照）。本発明の核酸分子は他の遺伝子成分（例えば、ベクター、プロモーター、エンハンサー等）と組み合わせて、永久的または一時的に植物細胞に導入可能であることは明らかである。
【００７５】
上記の方法に加えて、当業者は、マクロ分子（例えば、ＤＮＡ分子、プラスミド等）の構築、操作および単離、組換え生物の形成、およびクローンのスクリーニングおよび単離についての特定条件および方法を記載している標準的な資料は熟知している（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989)；Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995)；Birren et al., Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, New York (1998)；Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor, New York (1998)；Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, New York (1997)参照）。
【００７６】
天然またはトランスジェニックにより宿主細胞により産生され得る基質およびその後宿主細胞に導入されるベクター中に存在するＤＮＡ配列によりコードされ得る酵素を図１に示す。
【００７７】
Δ６−デサチュラーゼ遺伝子の使用およびそれによってコードされる酵素
上記のように、単離したデサチュラーゼ 遺伝子および該遺伝子によりコードされるデサチュラーゼ酵素は多くの用途を有する。例えば、前記遺伝子および対応の酵素は多価不飽和脂肪酸の生産において直接的および間接的に使用可能である。例えば、Δ６−デサチュラーゼは、γ−リノレン酸またはステアリドン酸の製造において使用可能である。「直接的」は、酵素がある酸を組成物中に使用される別の酸に直接変換する（例えば、リノール酸からγ−リノレン酸への変換）状況を包含することを意味する。「間接的」は、デサチュラーゼにより、ある酸（例：リノレン酸）を他の酸（すなわち、ステアリドン酸などの経路の中間体）に変換し、その後後者の酸をデサチュラーゼまたは非デサチュラーゼ酵素を用いて他の酸へ変換する（例えば、エロンガーゼによって、ステアリドン酸をエイコサテトラエン酸に変換）状況を包含することを意味する。また、本発明は、ＰＵＦＡを非−６４−デサチュラーゼ酵素（例えば、エロンガーゼまたは別のデサチュラーゼ ）により他の多価不飽和脂肪酸に変換し、その後Δ６−デサチュラーゼを用いて最終生成物に変換する「間接的」状況をも含む。例えば、リノール酸をデサチュラーゼ（すなわち、Δ１５−デサチュラーゼ）によってα−リノレン酸に変換し、次にΔ６−デサチュラーゼによってステアリドン酸に変換することができる。これらの多価不飽和脂肪酸（すなわち、Δ６−デサチュラーゼ酵素の活性により直接または間接的に生成されるもの）は、例えば栄養組成物、医薬組成物、化粧品および動物飼料に添加することができ、これらはすべて本発明に包含される。これらの使用を以下に詳細に説明する。
【００７８】
栄養組成物
本発明は栄養組成物を包含する。本発明において、前記組成物には経腸または非経口消費を含めてヒトが消費する食品または製剤が含まれ、これらは体内に取り込まれたとき（ａ）栄養を与えたり、組織を構築したり、エネルギーを補給するように機能するおよび／または（ｂ）適正な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支持する。
【００７９】
本発明の栄養組成物は、本発明に従ってデサチュラーゼ遺伝子を用いて直接または間接的に生成される油または酸の少なくとも１つを含み、固体または液体のいずれの形態であってもよい。また、前記組成物は食用多量栄養素、ビタミンおよびミネラルを特定用途のために所望量含むことができる。そのような成分の量は、組成物がある代謝状態（例えば、代謝疾患）を伴う場合のような、特殊なニーズを有する正常で健康な乳児、小児または成人で使用するか否かに応じて変動するものである。
【００８０】
組成物に添加可能な主要栄養素の例には、食用脂肪、炭水化物およびタンパク質などがあるが、これらに限定されない。食用脂肪の例には、ヤシ油、ルリヂサ油、真菌油(fungal oil)、クロフサスグリ油、大豆油、モノおよびジグリセリドなどがあるが、これらに限定されない。炭水化物の例には、グルコース、食用ラクトースおよび水解スターチなどがあるが、これらに限定されない。さらに、本発明の栄養組成物中に使用し得るタンパク質の例には、大豆タンパク質、電気透析ホエー、電気透析スキムミルク、乳漿またはこれらのタンパク質の加水分解物などがあるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明の栄養組成物に添加され得るビタミンおよびミネラルとしては、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロリド、マグネシウム、マンガン、鉄、銅、亜鉛、セレン、ヨウ素ならびにビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、ＣおよびＢ複合体が例示され得る。他のビタミンおよびミネラルも添加可能である。
【００８２】
本発明の栄養組成物に使用される成分は半精製でも精製でもよい。半精製または精製とは、天然材料の精製または合成により製造された材料を意味する。
【００８３】
本発明の栄養組成物の例には、調製乳、栄養補助食品（例えば、成人栄養食品および油）、代用食品および再水和組成物などがあるが、これらに限定されない。特に興味深い栄養組成物には、乳児に対して経腸および非経口栄養補給するために使用されるもの、特殊な乳児用調製乳、高齢者向けサプリメント、および胃腸障害および／または吸収不良を有する患者に対するサプリメントなどがあるが、これらに限定されない。
【００８４】
本発明の栄養組成物は、食事の追加を必要としないときでも食物に添加してもよい。例えば、組成物を任意のタイプの食物に添加することができ、その食物の例にはマーガリン、改質バター、チーズ、ミルク、ヨーグルト、チョコレート、キャンディー、スナック、サラダ油、料理油、料理脂、肉、魚および飲料などがあるが、これらに限定されない。
【００８５】
本発明の好ましい実施態様では、栄養組成物は経腸栄養品、より好ましくは成人または小児用経腸栄養品である。この組成物はストレスを受けているかまたは慢性または急性の病状のために特殊な要求を有している成人または小児に投与され得る。前記組成物は、本発明に従って生成される多価不飽和脂肪酸に加えて、上記の主要栄養素、ビタミンおよびミネラルを含むことができる。主要栄養素は、人乳中に存在する主要栄養素に等しい量またはエネルギー基準（すなわち、カロリー基準）の量存在し得る。
【００８６】
液体または固体の経腸および非経口栄養調製乳の調製方法は当業界で公知である（下記実施例も参照）。
【００８７】
経腸調製乳は、例えば滅菌し、その後、インスタント食品（ＲＴＦ）基準で使用されるかまたは濃縮液体または粉末の形で貯蔵される。粉末は、上記のように調製した調製乳を噴霧乾燥し、濃縮物を再水和して再生することにより調製することができる。成人および小児栄養調製乳は当業界で公知であり、市販もされている（例えば、Ｓｉｍｉｌａｃ（登録商標）、Ｅｎｓｕｒｅ（登録商標）、Ｊｅｖｉｔｙ（登録商標）およびＡｌｉｍｅｎｔｕｍ（登録商標）（Ross Products Division, Abbott Laboratories, Columbus, Ohioから））。本発明に従って生成される油および酸は、いずれの調製乳にも添加可能である。
【００８８】
本発明の栄養組成物のエネルギー密度は、液体形態のときには約０．６〜約３ｋｃａｌ／ｍｌである。固体または粉末形態のときには、栄養サプリメントのエネルギー密度は、約１．２〜９ｋｃａｌ／ｇ以上、好ましくは約３〜７ｋｃａｌ／ｇである。通常、液体製品のオスモル濃度は、７００ｍＯｓｍ未満、より好ましくは６６０ｍＯｓｍ未満でなければならない。
【００８９】
栄養調製乳は本発明に従って生成されるＰＵＦＡに加えて、上記した主要栄養素、ビタミンおよびミネラルを含むことができる。前記追加成分の存在により、ヒトが前記成分の最低１日必要量を摂取するのを助ける。ＰＵＦＡに加えて、亜鉛、銅、葉酸および酸化防止剤を組成物に添加することも望ましいことがある。前記物質はストレスを受けた免疫系を増強し、組成物を服用しているヒトに対して更なる効果を与えるであろうと考えられる。医薬組成物は前記成分を補充してもよい。
【００９０】
より好ましい実施態様では、栄養組成物は酸化防止剤および少なくとも１つのＰＵＦＡに加えて、少なくとも５重量％が非消化性オリゴ糖である炭水化物源を含む。より好ましい実施態様では、栄養組成物はさらにタンパク質、タウリンおよびカルニチンを含む。
【００９１】
上記のように、本発明に従って生成したＰＵＦＡまたはその誘導体は静脈栄養補給を受けている患者に対して、また栄養不良または他の状態もしくは病状を予防または治療するために代用食品またはサプリメント、特に乳児用調製乳に添加することができる。なお、留意すべき点として、ヒト母乳は約０．１５〜約０．３６％のＤＨＡ、約０．０３〜約０．１３％のＥＰＡ、約０．３０〜約０．８８％のＡＡ、約０．２２〜約０．６７％のＤＧＬＡおよび約０．２７〜約１．０４％のＧＬＡからなる脂肪酸プロフィールを有する。よって、本発明に従って生成されるＡＡ、ＥＰＡおよび／またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）のような脂肪酸は、例えば乳児用調製乳の組成を変化させてヒト母乳のＰＵＦＡ含量により良好に近づけたり、またはヒト母乳以外のミルク中に通常存在するＰＵＦＡの存在を変えるのに使用することができる。特に、医薬品または保健食品、特に母乳代用品またはサプリメント中に使用される組成物が１以上のＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡを含むことが好ましい。より好ましくは、油は約０．３〜３０％のＡＡ、約０．２〜３０％のＤＧＬＡおよび／または約０．２〜約３０％のＧＬＡを含む。
【００９２】
本発明には、トリグリセリド換算で約２〜約３０重量％の脂肪酸を含む非経口栄養組成物が包含される。好ましい組成物は全ＰＵＦＡ組成物の約１〜約２５重量％のＧＬＡを含む（米国特許第５１９６１９８号）。場合により、他のビタミン、特にビタミンＡ、Ｄ、ＥおよびＬ−カルニチンのような脂溶性ビタミンを配合することができる。所望により、α−トコフェロールのような保存剤を約０．１重量％の量添加することができる。
【００９３】
さらに、ＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡの比率は特定の所与最終用途に適合させることができる。母乳代用品またはサプリメントとして調製する場合、１以上のＡＡ、ＤＧＬＡおよびＧＬＡを、それぞれ約１：１９：３０〜約６：１：０．２の比率で組成物中に存在させることができる。例えば動物の母乳の場合、ＡＡ：ＤＧＬＡ：ＧＬＡの比率は１：１９：３０〜６：１：０．２の範囲であり、この範囲には中間比も含まれ、好ましくは約１：１：１、１：２：１、１：１：４である。宿主細胞において一緒に産生されるとき、ＧＬＡやＤＧＬＡのような前駆体基質のＡＡへの変換率、変換％を調節することによりＰＵＦＡ比を正確に制御できる。例えば、ＤＧＬＡからＡＡの変換率を５〜１０％とすると約１：１９のＡＡ：ＤＧＬＡ比が生じ、変換率を約７５〜８０％にすると約６：１のＡＡ：ＤＧＬＡ比が生ずる。従って、細胞培養系でも宿主細胞でも、ＰＵＦＡレベルおよび比を調節するためにはデサチュラーゼ 発現の時間、程度および特異性ならびに他のデサシュラーゼおよびエロンガーゼの発現の調節を使用することができる。その後、本発明に従って生成されるＰＵＦＡ（例えば、ＡＡおよびＥＰＡ）は他のＰＵＦＡ／酸（例えば、ＧＬＡ）と所望の濃度および比率で混合することができる。
【００９４】
加えて、本発明に従って生成されるＰＵＦＡまたはこれを含む宿主細胞は、動物飼料サプリメントとして用いて、動物の組織または乳の脂肪酸組成をヒトまたは動物が消費するのにより望ましい組成に変化させることもできる。
【００９５】
医薬組成物
本発明はまた、本明細書に記載されている方法に従ってデサチュラーゼを用いて得られる酸および／または油の１以上を含む医薬組成物を包含する。より具体的には、前記医薬組成物は、１以上の酸および／または油に加えて標準的な公知の無毒性で製薬上許容され得る担体、助剤または媒体、例えばリン酸緩衝食塩液、水、エタノール、多価アルコール、植物油、湿潤剤または乳濁液（例えば、水／油乳濁液）を含むことができる。前記組成物は液体でも固体のいずれの形態も取り得る。例えば、組成物は、錠剤、カプセル剤、摂取可能な液体もしくは粉剤、注射剤、または局所投与用軟膏またはクリームの形態を取ることができる。適切な流動性は、例えば分散液の場合には必要な粒径を維持したり、界面活性剤を使用することによって維持することができる。糖、塩化ナトリウム等の等張剤を配合することが望ましいことがある。不活性希釈剤に加えて、組成物は、助剤、例えば湿展剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤および芳香剤を配合することもできる。
【００９６】
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤（例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカントガムおよびこれらの混合物）を含むことができる。
【００９７】
錠剤やカプセル剤のような固体製剤は当業界で公知の方法を用いて製造することができる。例えば、本発明に従って製造されるＰＵＦＡは、従来の錠剤基材（例えば、ラクトース、スクロースおよびコーンスターチ）と共に結合剤（例えば、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン）、崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉またはアルギン酸）および潤滑剤（例えば、ステアリン酸またはステアリン酸マグネシウム）とともに打錠することができる。カプセル剤は、上記賦形剤を酸化防止剤およびＰＵＦＡと共にゼラチンカプセルに挿入することにより製造することができる。酸化防止剤およびＰＵＦＡ成分は、上記ガイドラインの範囲で適合しなければならない。
【００９８】
静脈投与の場合には、本発明に従って製造したＰＵＦＡまたはその誘導体を、市販の製剤（例えば、イントラリピッズ（Intralipids；商品名））中に組み込むことができる。代表的な成人正常血漿脂肪酸プロファイルは、６．６４〜９．４６％のＡＡ、１．４５〜３．１１％のＤＧＬＡおよび０．０２〜０．０８％のＧＬＡを含む。これらのＰＵＦＡまたはその代謝前駆体を、単独でまたは他のＰＵＦＡと一緒に投与すると、患者において正常な脂肪酸プロファイルが達成される。所望により、製剤の各成分を一回または複数回使用するために、個別にキットの形態で提供してもよい。特定の脂肪酸の代表的な用量は、１日あたり０．１ｍｇ〜２０ｇ（最高１００ｇまで）、好ましくは１日あたり１０ｍｇ〜１、２、５または１０ｇである。
【００９９】
本発明の医薬組成物の考えられる投与経路の例には、経腸（例えば、経口または直腸）および非経口などがある。例えば、液体製剤は、経口または直腸投与することができる。さらに、均質混合物を水に完全に分散し、滅菌条件下で生理的に許容される希釈剤、保存剤、緩衝剤または噴射剤と混合して噴霧剤または吸入剤を製造することができる。
【０１００】
当然のことながら、投与経路は所望の効果によって決まる。例えば、組成物を、荒れた皮膚、乾燥した皮膚または老化した皮膚の治療、病気または状態に冒されている皮膚または毛髪の治療に使用するときには、その組成物を局所的に塗布しても良い。
【０１０１】
患者に投与する組成物の用量は当業者が決定することができ、患者の体重、患者の年令、患者の免疫状態等のような各種要素によって決まる。
【０１０２】
組成物の剤型としては、例えば液剤、分散液、乳濁液または後に再生する滅菌粉末を挙げることができる。
【０１０３】
本発明は、本明細書に記載されている医薬および／または栄養組成物を用いる各種疾患の治療をも包含する。特に、本発明の組成物は、血管形成術後の再狭窄治療に使用することができる。さらに、炎症、関節リウマチ、喘息および乾癬の症状も、本発明の組成物を用いて治療することができる。ＰＵＦＡがカルシウム代謝に関与している可能性を示す証拠もある。従って、本発明の組成物は恐らく、骨粗鬆症、腎結石および尿路結石の治療または予防に使用することができる。
【０１０４】
さらに、本発明の組成物は、癌の治療にも使用することができる。悪性細胞では、脂肪酸組成が変化していることが分かっている。脂肪酸を添加すると、細胞の増殖を遅らせ、細胞死を引き起こし、化学療法薬に対する感受性を高めることが明らかになっている。また、本発明の組成物は癌関連の悪液質の治療にも有用である可能性がある。
【０１０５】
本発明の組成物は、糖尿病の治療にも使用可能である（米国特許第４８２６８７７号およびHorrobin et al., Am. J. Clin. Nutr. Vol. 57 (Suppl.) 732S- 737S参照）。脂肪酸代謝および組成の変化が、糖尿病動物で確認されている。
【０１０６】
また、デサチュラーゼ酵素を用いて直接または間接的に生成されるＰＵＦＡを含む本発明の組成物は、湿疹の治療、血圧の低下および数学試験の点数の向上にも使用することができる。さらに、本発明の組成物は、血小板凝集の抑制、血管拡張の誘発、コレステロールレベルの低下、血管壁平滑筋および繊維組織の増殖の抑制（Brenner et al., Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 83, p.85-101, 1976）、非ステロイド抗炎症薬の胃腸出血および他の副作用の低減または予防（米国特許第４６６６７０１号参照）、子宮内膜症および月経前症候群の予防または治療（米国特許第４７５８５９２号参照）、およびウイルス感染後の筋肉脳脊髄炎および慢性疲労の治療（米国特許第５１１６８７１号参照）に使用可能である。
【０１０７】
本発明の組成物のさらに別の用途には、ＡＩＤＳ、多発性硬化症および炎症性皮膚疾患の治療における使用および全身の健康維持のための使用などがある。
【０１０８】
加えて、本発明組成物は化粧目的に利用可能である。それは、混合物を形成するかまたは単一組成物として使用できるように、既存の化粧品組成物に添加することができる。
【０１０９】
動物での用途
留意すべき点として、動物はヒトと同じニーズおよび状態を多く経験することから、上記の医薬組成物および栄養組成物を、ヒトだけでなく、動物（すなわち、家畜および家畜以外の動物）で利用することができる。例えば、本発明の油または酸は、動物飼料サプリメント、動物飼料代用品、動物ビタミンまたは動物局所軟膏に利用することができる。
【０１１０】
栄養組成物
詳細な説明に記載されているＰＵＦＡは、各種栄養サプリメント、乳児用製剤、栄養代用品および他の栄養溶液中に使用することができる。
【０１１１】
Ｉ．乳児用製剤
Ａ．鉄強化アイソミル（Isomil；登録商標）大豆調合乳
使用
牛乳に対してアレルギーまたは感受性を有する乳幼児および成人に対する飲料として。ラクトースが禁忌な疾患、すなわちラクターゼ欠乏、ラクトース不耐性およびガラクトース血症を有する患者に対する栄養補給。
【０１１２】
特徴
−牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を避けるために、大豆タンパク質単離物；
−ラクトース関連の下痢を回避するために、ラクトースを含まない製剤；
−浸透性下痢の危険を減らすために、低オスモル濃度（２４０ｍＯｓ／ｋｇ水）；
−炭水化物吸収を高め、ダメージを受けている腸の吸収能力を超える危険を減らすように設計された２成分炭水化物（コーンシロップおよびショ糖）；
−鉄欠乏の予防を助けるために１．８ｍｇ／１００ｃａｌの鉄（硫酸第一鉄として）；
−推奨レベルのビタミンおよびミネラル；
−推奨レベルの必須脂肪酸を与えるために植物油；
−乳白色でミルクに似た濃さおよび心地良い香り。
【０１１３】
成分
（パルヴェ）水８５％、コーンシロップ４．９％、糖（ショ糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆タンパク質単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム１．５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ−およびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１１４】
Ｂ．下痢用のアイソミル（登録商標）ＤＦ大豆調合乳
使用
小児および幼児における下痢の食事管理のための短期間栄養補給として。
【０１１５】
特徴
−特に下痢管理のための添加された大豆繊維由来の食物繊維を含むために、第１の幼児調合乳；
−臨床的に小児が中程度ないし重度の下痢を起こしている間のゆるい水様便の期間を短縮することが判明している；
−乳児の栄養要求量を満たすために栄養的に完全である；
−Ｌ−メチオニンを添加した大豆タンパク質単離物はすべての必須アミノ酸についての乳児の要求量を満たすかまたは超える；
−ラクトース関連下痢を避けるためにラクトース非含有製剤；
−浸透性下痢の危険を減らすために低オスモル濃度（２４０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）；
−炭水化物吸収を高め、損傷を受けている腸の吸収能力を超える危険を減らすように設計された２成分炭水化物（コーンシロップおよびショ糖）；
−米国小児科学会栄養委員会が推奨し、乳児用調整乳法（Infant Formula Act）が要求しているビタミンおよびミネラルレベルを満たすかまたは超える；
−鉄欠乏予防のために、１．８ｍｇ／１００ｃａｌの鉄（硫酸第一鉄として）；
−推奨レベルの必須脂肪酸を提供するために植物油。
【０１１６】
成分：
（パルヴェ）水８６％、コーンシロップ４．８％、糖（ショ糖）２．５％、大豆油２．１％、大豆タンパク質単離物２．０％、ヤシ油１．４％、大豆繊維０．７７％、クエン酸カルシウム０．１２％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム０．１０％、塩化カリウム、第一リン酸カリウム、モノ−およびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１１７】
Ｃ．アイソミル（登録商標）ＳＦショ糖非含有鉄強化大豆調乳
使用
牛乳タンパク質に対してアレルギーまたは感受性またはショ糖に対して不耐性を有する乳幼児および成人に対する飲料として。ラクトースおよびショ糖が禁忌な疾患を有する患者に対する栄養補給。
【０１１８】
特徴
−牛乳タンパク質アレルギーまたは感受性の症状を避けるために大豆タンパク質単離物；
−ラクトース関連下痢を避けるためにラクトースを含まない処方（炭水化物源はポリコース（Polycoase；登録商標）グルコースポリマーである）；
−ショ糖を耐容できない患者のためにショ糖を含まない；
−浸透性下痢の危険を減らすために低オスモル濃度（１８０ｍＯｓｍ／ｋｇ水）；
−鉄欠乏の予防のために１．８ｍｇ／１００ｃａｌの鉄（硫酸第一鉄として）；
−推奨レベルのビタミンおよびミネラル；
−推奨レベルの必須脂肪酸を与えるために植物油；
−乳白色でミルクに似た濃さおよび心地良い臭い。
【０１１９】
成分
（パルヴェ）水７５％、水解コーンスターチ１１．８％、大豆油４．１％、大豆タンパク質単離物４．１％、ヤシ油２．８％、改質コーンスターチ１．０％、第三リン酸カルシウム０．３８％、クエン酸カリウム０．１７％、塩化カリウム０．１３％、モノ−およびジグリセリド、大豆レシチン、塩化マグネシウム、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩化コリン、カラゲナン、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１２０】
Ｄ．アイソミル（登録商標）鉄強化大豆調乳インスタント品２０Ｃａｌ／ｆｌｏｚ
使用
大豆栄養補給が所望されるとき。
【０１２１】
成分
（パルヴェ）水８５％、コーンシロップ３．６％、糖（ショ糖）２．６％、大豆油２．１％、大豆タンパク質単離物１．９％、ヤシ油１．４％、クエン酸カルシウム０．１５％、第三リン酸カルシウム０．１１％、クエン酸カリウム、第一リン酸カリウム、塩化カリウム、モノ−およびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、アスコルビン酸、Ｌ−メチオニン、塩化マグネシウム、第二リン酸カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、Ｌ−カルニチン、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、ヨウ化カリウム、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１２２】
Ｅ．シミラック（Similac；登録商標）乳児用調整乳
使用
乳児用調整乳が必要な時；１才前に母乳の断乳を決断するとき、母乳への補充が必要なとき、または母乳を与えていないときの日常的な栄養補給として。
【０１２３】
特徴
−良好な成長のために適切な品質および量のタンパク質；ミルク関連の腸失血の危険を減らすために熱変性；
−容易に吸収される必須リノール酸を与える（二重ホモジナイズした）植物油混合物由来の脂肪；
−母乳に類似の比率のラクトースとしての炭水化物；
−発達中の臓器に対するストレスを最小限とするために腎臓溶質負荷が低い；
−粉剤、濃縮液体およびインスタント品の形態。
【０１２４】
成分
（−Ｄ）水、脱脂乳、ラクトース、大豆油、ヤシ油、モノ−およびジグリセリド、大豆レシチン、アスコルビン酸、カラゲナン、塩化コリン、タウリン、ｍ−イノシトール、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、硫酸第一鉄、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１２５】
Ｆ．鉄強化シミラック（登録商標）ネオケア（NeoCare）乳児用調整乳
使用
未熟児の退院後の特殊栄養要求量のため。シミラック・ネオケアは、成長の取り戻しを促進し、発達を支持するために必要な追加のカロリー、タンパク質、ビタミンおよびミネラルを未熟児に与えるように開発された栄養的に完全な調製乳である。
【０１２６】
特徴
カロリーおよびビタミン補給のための必要量を減らす。標準的調製乳（２０Ｃａｌ／ｆｚｏｚ）よりも高カロリー（２２Ｃａｌ／ｆｚ ｏｚ）；
−未熟児の特殊な消化要求量を満たすのを助けるために中鎖トリグリセリド（ＭＣＴｏｉｌ）を含む高吸収脂肪の混合物；
−病院内で開始される栄養支援を延長するために１００カロリーあたり高レベルのタンパク質、ビタミンおよびミネラル；
−骨石灰化を改善するためにより多くのカルシウムおよびリン。
【０１２７】
成分
−Ｄコーンシロップ固体、脱脂乳、ラクトース、ホエータンパク質濃縮物、大豆油、高オレフィン紅花油、分画化ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ヤシ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、アスコルビン酸、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、タウリン、硫酸第一鉄、ｍ−イノシトール、塩化コリン、パルミチン酸アスコルビル、Ｌ−カルニチン、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、混合トコフェロール、クエン酸ナトリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、β−カロテン、リボフラビン、ピリドキシン塩酸塩、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビオチン、亜セレン酸ナトリウム、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１２８】
Ｇ．シミラック・ナチュラルケア（Natural Care）低鉄母乳強化剤インスタント品、２４Ｃａｌ／ｆｌ ｏｚ
使用
低出生時体重乳児に対して人乳と混合するかまたは人乳と一緒に供給するように設計。
【０１２９】
成分
−Ｄ水、脱脂乳、水解コーンスターチ、ラクトース、分画化ヤシ油（中鎖トリグリセリド）、ホエータンパク質濃縮物、大豆油、ヤシ油、第三リン酸カルシウム、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、炭酸カルシウム、モノ−およびジグリセリド、大豆レシチン、カラゲナン、塩化コリン、ｍ−イノシトール、タウリン、ニコチンアミド、Ｌ−カルニチン、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、塩化カリウム、パントテン酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸第二銅、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、ビオチン、葉酸、硫酸マンガン、フィロキノン、ビタミンＤ３、亜セレン酸ナトリウムおよびシアノコバラミン。
【０１３０】
本発明の各種ＰＵＦＡは、上記乳児用調整乳および当業界で公知の他の乳児用調整乳に置き換えおよび／または添加することができる。
【０１３１】
ＩＩ．栄養製剤
Ａ．エンシュア（ＥＮＳＵＲＥ；登録商標）
使用
エンシュアは、代用食品として食事と一緒または食事の間に適量使用される経口栄養サプリメントとして主に設計された低残渣液体食である。エンシュアは、ラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。主として経口サプリメントであるが、経管栄養補給することもできる。
【０１３２】
患者の条件
−調整食を摂っている患者；
−栄養的に危険な状態の高齢患者；
−不随意体重減少の患者；
−病気または手術からの回復期の患者；
−低残渣食を必要とする患者。
【０１３３】
成分
−Ｄ水、糖（ショ糖）、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸カルシウムおよびナトリウム、高オレイン紅花油、大豆タンパク質単離物、大豆油、カノラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工香料、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ゲランガム、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム（プロシュア（Prosure）も参照）。
【０１３４】
Ｂ．エンシュア（登録商標）バー
使用
エンシュア・バーは、食間または食事と一緒に栄養補給の目的で使用される完全なバランスの取れた栄養物である。他のスナックに対する、美味で高栄養分の代用品である。エンシュア・バーは、＜１ｇ／バーのラクトースを含み、チョコレートファッジブラウニーフレバーはグルテンを含まない（ハニーグラハムクランチフレバーはグルテンを含む）。
【０１３５】
患者の条件
−追加のカロリー、タンパク質、ビタミンおよびミネラルを必要とする患者；
−十分なカロリーおよび栄養分を摂取しない患者に対して特に有用；
−咀嚼および嚥下ができる患者；
−ピーナッツアレルギーやナッツに対してアレルギーを有する患者には使用不可。
【０１３６】
成分
ハニーグラハムクランチ−−高フルクトースコーンシロップ、大豆タンパク質単離物、ブラウンシュガー、蜂蜜、マルトデキストリン（コーン）、クリスプライス［（粉砕したコメ）、糖（ショ糖）、塩（塩化ナトリウム）および麦芽］、オート麦ふすま、部分水素化綿実油および大豆油、大豆多糖、グリセリン、ホエータンパク質濃縮物、ポリデキストロース、フルクトース、カゼイン酸カルシウム、ココア粉末、人工フレーバー、菜種油、高オレイン紅花油、脱脂粉乳、ホエー粉末、大豆レシチンおよびコーン油。ナッツ加工施設で製造。
【０１３７】
ビタミンおよびミネラル
第三リン酸カルシウム、第二リン酸カリウム、酸化マグネシウム、塩（塩化ナトリウム）、塩化カリウム、アスコルビン酸、ｏ−リン酸第二鉄、α−トコフェニルアセテート、ニコチンアミド、酸化亜鉛、パントテン酸カルシウム、グルコン酸銅、硫酸マンガン、リボフラビン、β−カロテン、ピリドキシン塩酸塩、モノ硝酸チアミン、葉酸、ビオチン、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、モリブデン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１３８】
タンパク質
ハニーグラハムクランチ−−タンパク質源は、大豆タンパク質単離物および乳タンパク質の混合物である。
大豆タンパク質単離物：７４％
乳タンパク質：２６％。
【０１３９】
脂肪
ハニーグラハムクランチ−−脂肪源は、部分水素化綿実および大豆、菜種、高オレイン紅花、オイルおよび大豆レシチンの混合物である。
部分水素化綿実油および大豆油：７６％
菜種油：８％
高オレイン紅花油：８％
コーン油：４％
大豆レシチン：４％。
【０１４０】
炭水化物
ハニーグラハムクランチ−−炭水化物源は、高フルクトースコーンシロップ、ブラウンシュガー、マルトデキストリン、蜂蜜、クリスプライス、グリセリン、大豆多糖およびオート麦ふすまの混合物である。
高フルクトースコーンシロップ：２４％
ブラウンシュガー：２１％
マルトデキストリン：１２％
蜂蜜：１１％
クリスプライス：９％
グリセリン：９％
大豆多糖：７％
オート麦ふすま：７％。
【０１４１】
Ｃ．エンシュア（登録商標）ハイ・プロテイン（HIGH PROTEIN）
使用
エンシュア・ハイ・プロテインは、食事にカロリー、タンパク質、ビタミンおよびミネラルを追加する必要がある患者に対して設計された濃厚な高タンパク質液体食である。代用食品として食事と一緒にまたは食事の間に適量経口栄養サプリメントとして使用することができる。エンシュア・ハイ・プロテインは、ラクトースもグルコースも含まず、通常の手術または股関節骨折からの回復期の患者および圧迫潰瘍の危険のある患者が使用するのに適している。
【０１４２】
患者の条件
カロリー、タンパク質、ビタミンおよびミネラルを追加する必要がある患者、例えば通常の手術または股関節骨折からの回復期の患者；圧迫潰瘍の危険のある患者；および低コレステロール食を使用している患者。
【０１４３】
特徴
−飽和脂肪が少ない；
−一人分あたり６ｇの総脂肪および＜５ｍｇのコレステロール；
−濃厚でクリーミーな味；
−タンパク質、カルシウムおよび他の必須アミノ酸およびミネラルの優れたソース；
−低コレステロール食；
−ラクトースを含まず、簡単に消化。
【０１４４】
成分
バニラシュプリーム：
−Ｄ水、糖（ショ糖）、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸カルシウムおよびナトリウム、高オレイン紅花油、大豆タンパク質単離物、大豆油、カノラ油、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、塩化マグネシウム、第二リン酸マグネシウム、人工フレーバー、塩化ナトリウム、大豆レシチン、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−コフェリルアセテート、ゲランガム、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ビオチン、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１４５】
タンパク質
タンパク質源は、２種の生物学的価値の高いタンパク質、すなわちカゼインおよび大豆の混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム：８５％
大豆タンパク質単離物：１５％。
【０１４６】
脂肪
脂肪源は、３種の油、すなわち高オレイン紅花、カノラおよび大豆の混合物である。
高オレイン紅花油：４０％
カノラ油：３０％
大豆油：３０％。
【０１４７】
エンシュア・ハイ・プロテイン中の脂肪レベルは、米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに適合している。エンシュア・ハイ・プロテイン中の脂肪６ｇは総カロリーの２４％にあたり、脂肪の２．６％は飽和脂肪酸、７．９％は多価不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来の総カロリーの＜３０％、飽和脂肪酸由来のカロリーの＜１０％、多価不飽和脂肪酸由来の総カロリーの＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０１４８】
炭水化物
エンシュア・ハイ・プロテインは、マルトデキストリンおよびショ糖の組合せを含む。マイルドな甘味料およびフレーバー（バニラシュプレーム、チョコレートロイヤル、ワイルドベリーおよびバナナ）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモンおよびオレンジ中のバリ−フレーバーズ（VARI-FLAVORS；登録商標）フレーバー・パクス（Flavor Pacs）はフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０１４９】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
ショ糖：６０％
マルトデキストリン：４０％。
【０１５０】
チョコレート：
ショ糖：７０％
マルトデキストリン：３０％。
【０１５１】
Ｄ．エンシュア（登録商標）ライト（LIGHT）
使用
エンシュア・ライトは、食事と一緒または食事の間に経口栄養サプリメントとして使用するように設計された低脂肪液体食である。エンシュア・ライトは、ラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
【０１５２】
患者の条件
−５０％未満の脂肪およびエンシュアよりも２０％少ないカロリーを含むサプリメント中に過度の栄養を必要としている正常体重および過体重の患者；
−適正に摂食せず、追加の栄養を必要としている健康な成人。
【０１５３】
特徴
−脂肪および飽和脂肪が少ない；
−一人分あたり３ｇの総脂質および＜５ｍｇのコレステロールを含む；
−濃厚でクリーミーな味；
−カルシウムおよび他の必須ビタミンおよびミネラルの優れたソース；
−低コレステロール食；
−ラクトースを含まず、簡単に消化する。
【０１５４】
成分
フレンチバニラ：
−Ｄ水、マルトデキストリン（コーン）、糖（ショ糖）、カゼイン酸カルシウム、高オレイン紅花油、カノラ油、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、第二リン酸カリウム、第二リン酸マグネシウム、天然および人工フレーバー、第三リン酸カルシウム、セルロースゲル、塩化コリン、大豆レシチン、カラゲナン、塩（塩化ナトリウム）、アスコルビン酸、セルロースガム、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、塩酸チアミン、パルミチン酸ビタミンＡ、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、塩化クロム、葉酸、モリブデン酸ナトリウム、ビオチン、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１５５】
タンパク質
タンパク質源は、カゼイン酸カルシウムである。
カゼイン酸カルシウム：１００％。
【０１５６】
脂肪
脂肪源は、２種の油、すなわち高オレイン紅花油およびカノラの混合物である。
【０１５７】
高オレイン紅花油：７０％
カノラ油：３０％。
【０１５８】
エンシュア・ライト中の脂肪レベルはアメリカン・ハート・アソシエーション（ＡＨＡ）ガイドラインに適合している。エンシュア・ライト中の脂肪３ｇは総カロリーの１３．５％にあたり、脂肪の１．４％は飽和脂肪酸、２．６％は多価不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来の総カロリーの＜３０％、飽和脂肪酸由来のカロリーの＜１０％、多価不飽和脂肪酸由来の総カロリーの＜１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０１５９】
炭水化物
エンシュア・ライトは、マルトデキストリンおよびショ糖の組合せを含む。チョコレートフレバーはコーンシロップも含む。マイルドな甘味料およびフレーバー（フレンチバニラ、チョコレートシュプレーム、ストロベリースウィール）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモンおよびオレンジ中のバリ−フレーバーズ（登録商標）フレーバー・パクスはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０１６０】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
ショ糖：５１％
マルトデキストリン：４９％。
【０１６１】
チョコレート
ショ糖：４７．０％
コーンシロップ：２６．５％
マルトデキストリン：２６．５％。
【０１６２】
ビタミンおよびミネラル：
一人分のエンシュア・ライト（８ｆｌｏｚ）は２４個の主要ビタミンおよびミネラルに関するＲＤＩの少なくとも２５％を提供する。
【０１６３】
カフェイン：
カフェインフレーバーは、８ｆｌ ｏｚあたり２．１ｍｇのカフェインを含む。
【０１６４】
Ｅ．エンシュア・プラス（エンシュア PLUS；登録商標）
使用
エンシュア・プラスは、タンパク質は正常濃度であるが過剰のカロリーおよび栄養分が必要であるときに使用するための高カロリーの低残渣液体食である。代用食品として食事と一緒または食事の間に適量使用する経口栄養サプリメントとして主に設計されている。エンシュア・プラスは、ラクトースもグルコースも含まない。主として経口栄養サプリメントあるが、経管栄養補給することもできる。
【０１６５】
患者の条件
−限られた容量でタンパク質は正常濃度であるが過剰のカロリーおよび栄養分が必要である患者；
−健康体重を得るかまたは保持することが必要な患者。
【０１６６】
特徴
−濃厚でクリーミーな味；
−必須ビタミンおよびミネラルの良好なソース。
【０１６７】
成分
バニラ：
−Ｄ水、コーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、コーン油、カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム、糖（ショ糖）、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然および人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、カラゲナン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０１６８】
タンパク質：
タンパク質源は、２種の生物学的価値の高いタンパク質、すなわちカゼインと大豆の混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム：８４％
大豆タンパク質単離物：１６％。
【０１６９】
脂肪：
脂肪源は、コーン油である。
コーン油：１００％。
【０１７０】
炭水化物：
エンシュア・プラスは、マルトデキストリンおよびショ糖の組合せを含む。マイルドな甘味料およびフレーバー（バニラ、チョコレート、ストロベリー、コーヒー、バターピーカンおよびエッグノッグ）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモンおよびオレンジ中のバリ−フレーバーズ（登録商標）フレーバー・パクスはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０１７１】
バニラ、ストロベリー、バターピーカンおよびコーヒーフレーバー：
コーンシロップ：３９％
マルトデキストリン：３８％
ショ糖：２３％。
【０１７２】
チョコレートおよびエッグノッグフレーバー：
コーンシロップ：３６％
マルトデキストリン：３４％
ショ糖：３０％。
【０１７３】
ビタミンおよびミネラル：
一人分のエンシュア・プラス（８ｆｌｏｚ）は２５個の主要ビタミンおよびミネラルに関するＲＤＩの少なくとも１５％を与える。
【０１７４】
カフェイン：
チョコレートフレーバーは８ｆｌｏｚあたり３．１ｍｇのカフェインを含む。コーヒーフレーバーは微量のカフェインを含む。
【０１７５】
Ｆ．エンシュア・プラス（登録商標）ＨＮ
使用：エンシュア・プラスＨＮは高いカロリーおよびタンパク質を必要とするかまたは限定量のトレランスを有する患者に対して設計された栄養的に完全な高カロリー／高窒素液体食である。経口栄養補給または経管による完全栄養サポートのために使用することができる。エンシュア・プラスＨＮはラクトースもグルテンも含まない。
【０１７６】
患者の条件
−術後か負傷後のような多量のカロリーおよびタンパク質を必要とする患者；
−耐容容量が限られており、早期満腹を有する患者。
【０１７７】
特徴
−栄養補給または完全栄養のため；
−経口または経管栄養補給；
−１．５ＣａＶｍＬ；
−高窒素；
−カロリー的に濃い。
【０１７８】
成分
バニラ：
−Ｄ水、マルトデキストリン（コーン）、カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム、コーン油、糖（ショ糖）、大豆タンパク質単離物、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、第三リン酸カルシウム、大豆レシチン、天然および人工フレーバー、クエン酸ナトリウム、塩化コリン、アスコルビン酸、タウリン、Ｌ−カルニチン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、カラゲナン、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第二銅、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、塩化クロム、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、亜セレン酸ナトリウム、フィロキノン、シアノコバラミンおよびビタミンＤ３。
【０１７９】
Ｇ．エンシュア（登録商標）粉末
使用
（水で再生）エンシュア粉末は、食事と一緒または食事の間に使用される経口栄養サプリメントとして主に設計された低残渣液体食である。エンシュア粉末は、ラクトースもグルテンも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
【０１８０】
患者の条件
−調整食を摂取している患者；
−栄養的に危険な状態にある高齢患者；
−病気／手術からの回復期の患者；
−低残渣食を必要としている患者。
【０１８１】
特徴
−便利で簡単に混合される；
−飽和脂肪が少ない；
−一人分あたり９ｇの総脂肪および＜５ｍｇのコレステロール；
−ビタミンおよびミネラルが豊富；
−低コレステロール食；
−ラクトースを含まず、簡単に消化。
【０１８２】
成分
−Ｄコーンシロップ、マルトデキストリン（コーン）、糖（ショ糖）、コーン油、カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム、大豆タンパク質単離物、人工フレーバー、クエン酸カリウム、塩化マグネシウム、クエン酸ナトリウム、第三リン酸カルシウム、塩化カリウム、大豆レシチン、アスコルビン酸、塩化コリン、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、ニコチンアミド、パントテン酸カルシウム、硫酸マンガン、塩酸チアミン、硫酸第二銅、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、パルミチン酸ビタミンＡ、葉酸、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、塩化クロム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１８３】
タンパク質：
タンパク質源は、２種の生物学的価値の高いタンパク質、すなわちカゼインおよび大豆の混合物である。
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム：８４％
大豆タンパク質単離物：１６％。
【０１８４】
脂肪：
脂肪源は、コーン油である。
コーン油：１００％。
【０１８５】
炭水化物：
エンシュア粉末は、コーンシロップ、マルトデキストリンおよびショ糖の組合せを含む。エンシュア粉末のマイルドな甘味料に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモンおよびオレンジ中のバリ−フレーバーズ（登録商標）フレーバー・パクスは、フレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０１８６】
バニラ：
コーンシロップ：３５％
マルトデキストリン：３５％
ショ糖：３０％。
【０１８７】
Ｈ．エンシュア（登録商標）プリン
使用：エンシュア・プリンは食事と一緒または食事の間に使用される非液体形態でバランスのとれた栄養を与える栄養分に富むサプリメントである。濃さ調整食（例えば、ソフト、ピューレまたは完全な液体）のため、または嚥下困難な患者のために適当である。エンシュア ・プリンはグルテンを含まない。
【０１８８】
患者の条件
−濃さ調整食（例えば、ソフト、ピューレまたは完全な液体）を使用している患者；
−嚥下困難な患者。
【０１８９】
特徴
−濃厚ででクリーミー、美味；
−必須ビタミンおよびミネラルの良好なソース；
−冷凍する必要がなく便利；
−グルテンを含まない。
【０１９０】
５オンスあたりの栄養分プロファイル
カロリー２５０、タンパク質１０．９％、総脂質３４．９％、炭水化物５４．２％。
【０１９１】
成分：
−Ｄ脱脂乳、水、糖（ショ糖）、部分水素化大豆油、改質食用スターチ、硫酸マグネシウム、ナトリウムステアロイルラクチレート、第二リン酸ナトリウム、人工フレーバー、アスコルビン酸、硫酸亜鉛、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、塩化コリン、ニコチンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、ＦＤ＆Ｃイエロー＃５、クエン酸カリウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、ＦＤ＆Ｃイエロー＃６、葉酸、ビオチン、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０１９２】
タンパク質：
タンパク質源は脱脂乳である。
−脱脂乳１００％。
【０１９３】
脂肪：
脂肪源は、水素化大豆油である。
−水素化大豆油１００％。
【０１９４】
炭水化物：
エンシュア ・プリンはショ糖および改質食用スターチの組合せを含む。マイルドな甘味料およびフレーバー（バニラ、チョコレート、バタースコッチおよびタピオカ）はフレーバー疲労を予防するのを助ける。製品は一人分あたり９．２ｇのラクトースを含む。
【０１９５】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
ショ糖：５６％
ラクトース：２７％
改質食用スターチ：４９％。
【０１９６】
チョコレート：
ショ糖：５８％
ラクトース：２６％
改質食用スターチ：１６％。
【０１９７】
Ｉ．ファイバー入りエンシュア（登録商標）
使用：ファイバー入りエンシュアは、食物繊維および栄養分を多く取りたい人のために設計された繊維を含む栄養的に完全な液体食である。ファイバー入りエンシュアは、低残渣食を必要としない人に適している。経口または経管により栄養補給することができ、規則的な食事への栄養補給としてまたは適量で代用食品として使用することができる。ファイバー入りエンシュアは、ラクトースもグルコースも含まず、低コレステロール食を含めた調整食中に使用するのに適している。
【０１９８】
患者の条件
−食物繊維および栄養分を多く取りたい患者。
【０１９９】
特徴
−飽和脂肪が少量で、ビタミンおよびミネラルが多い新しい調製乳；
−一人分あたり６ｇの総脂質および＜５ｍｇのコレステロールを含む；
−濃厚でクリーミーな味；
−繊維の良好なソース；
−必須ビタミンおよびミネラルの優れたソース；
−低コレステロール食；
−ラクトースもグルテンも含まない。
【０２００】
成分：
−Ｄ水、マルトデキストリン（コーン）、糖（ショ糖）、カゼイン酸カルシウム、オート麦繊維、高オレフィン紅花油、カノラ油、大豆タンパク質単離物、コーン油、大豆繊維、第三リン酸カルシウム、塩化マグネシウム、クエン酸カリウム、セルロースガム、大豆レシチン、第二リン酸カリウム、クエン酸ナトリウム、天然および人工フレーバー、塩化コリン、リン酸マグネシウム、アスコルビン酸、セルロースガム、塩化カリウム、カラゲナン、硫酸第一鉄、α−トコフェリルアセテート、硫酸亜鉛、ニコチンアミド、硫酸マンガン、パントテン酸カルシウム、硫酸第二銅、パルミチン酸ビタミンＡ、塩酸チアミン、ピリドキシン塩酸塩、リボフラビン、葉酸、塩化クロム、ビオチン、モリブデン酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、セレン酸ナトリウム、フィロキノン、ビタミンＤ３およびシアノコバラミン。
【０２０１】
タンパク質：
タンパク質源は、２種の生物学的価値の高いタンパク質−カゼインおよび大豆の混合物である。
【０２０２】
カゼイン酸ナトリウムおよびカルシウム：８０％
大豆タンパク質：２０％。
【０２０３】
脂肪：
脂肪源は、３種の油、すなわち高オレイン紅花、カノラおよびコーンの混合物である。
【０２０４】
高オレイン紅花油：４０％
カノラ油：４０％
コーン油：２０％。
【０２０５】
ファイバー入りエンシュア中の脂肪レベルは、米国心臓協会（ＡＨＡ）ガイドラインに適合している。ファイバー入りエンシュア中の脂肪６ｇは、総カロリーの２２％にあたり、脂肪の２．０１％は飽和脂肪酸、６．７％は多価不飽和脂肪酸に由来する。これらの値は脂肪由来の総カロリーの≦３０％、飽和脂肪酸のカロリーの＜１０％、多価不飽和脂肪酸由来の総カロリーの≦１０％というＡＨＡガイドラインの範囲内である。
【０２０６】
炭水化物：
ファイバー入りエンシュアは、マルトデキストリンおよびショ糖の組合せを含む。マイルドな甘味料およびフレーバー（バニラ、チョコレートおよびバターピカン）に加えてペカン、チェリー、ストロベリー、レモンおよびオレンジ中のバリ−フレーバーズ（登録商標）フレーバー・パクスはフレーバー疲労を予防するのを助け、患者コンプライアンスを助ける。
【０２０７】
バニラおよび他の非チョコレートフレーバー：
マルトデキストリン：６６％
ショ糖：２５％
オート麦：７％
大豆繊維：２％。
【０２０８】
チョコレート：
マルトデキストリン：５５％
ショ糖：３６％
オート麦繊維：７％
大豆繊維：２％。
【０２０９】
ファイバー：
ファイバー入りエンシュア中に使用される繊維混合物は、オート麦繊維および大豆多糖から構成される。この混合物により、８ｆｌ．ｏｚ缶あたり全部で約４ｇの食物繊維が提供される。不溶性繊維／溶解性繊維の比率は９５：５である。
【０２１０】
上記で記載し、当業者に公知の各種栄養サプリメントを本発明により生成したＰＵＦＡで置換してもおよび／または各種栄養サプリメントに本発明により生成したＰＵＦＡを補充してもよい。
【０２１１】
Ｊ．オキセパ（Oxepa；商標名）栄養製品
オキセパは、ＡＲＤＳの危険があるかまたはその状態にある患者の食事管理のために設計された低炭水化物でカロリー的に濃い経腸栄養品である。エイコサペンタエン酸（漁油由来のＥＰＡ）、γ−リノレン酸（ルリヂサ油由来のＧＬＡ）および高い酸化防止剤レベルを含む油ブレンドを含めた諸成分の固有の組合せを有する。
【０２１２】
カロリー分布：
カロリー密度は、エネルギー必要量を満たすのに必要な容量を最小限とするために１．５Ｃａｌ／ｍｌ（３５５Ｃａｌ／８ｆｌｏｚ）ほど高い。オキセパ中のカロリー分布を表Ａに示す。
【０２１３】
【表１】
0005616571.tif 000002
【０２１４】
脂肪：
−オキセパは一人分（８ｆｌｏｚ）あたり２２．２ｇの脂肪を含む（９３．７ｇ／Ｌ）；
−脂肪源は、カノラ油３１．８％、中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）２５％、ルリヂサ油２０％、魚油２０％および大豆レシチン３．２％の油混合物である；オキセパの典型的な脂肪酸プロファイルを表Ｂに示す；
−オキセパは表ＩＶに示すように多価不飽和、モノ不飽和および飽和脂肪酸をバランスよく含む；
−脂肪ブレンドの２５％を占める中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）は胆汁酸により乳化されることなく腸管に吸収されるので胃内容物排泄を助ける。
【０２１５】
オキセパ（商標）栄養品の各種脂肪酸成分を本発明により生成したＰＵＦＡで置換してもおよび／または本発明により生成したＰＵＦＡを補充してもよい。
【０２１６】
【表２】
0005616571.tif 000003
【０２１７】
【表３】
0005616571.tif 000004
【０２１８】
炭水化物：
−炭水化物含量は、一人分（８ｆｌ ｏｚ）あたり２５．０ｇである（１０５．５ｇ／Ｌ）；
−炭水化物源は、マルトデキストリン（複雑な炭水化物）４５％およびショ糖（単純な炭水化物）５５％であり、これらはいずれも容易に消化、吸収される；
−オキセパの高脂肪および低炭水化物含量は、二酸化炭素（ＣＯ２）発生を最小限とするように設計されている。高いＣＯ２レベルは人工呼吸器を付けている患者において人工呼吸器の離脱を悪化させる恐れがある；
−低レベルの炭水化物はストレスによる過血糖を発症している患者にも有用であることができる；
−オキセパはラクトースを含まない。
【０２１９】
食物炭水化物、タンパク質由来のアミノ酸および脂肪のグリセロール部分は体内でグルコースに変換することができる。この過程で、グルコース依存組織（例えば、中枢神経系および赤血球）の炭水化物要求量が満たされる。しかしながら、炭水化物を含まない食事はケトーシス、組織タンパク質の過剰異化作用、および流体と電解質の損失を招くおそれがある。これらの影響は、カロリー摂取が十分ならば消化可能な炭水化物を１日５０〜１００ｇ摂取することにより防ぐことができる。オキセパ中の炭水化物レベルはエネルギー要求量を満たしているならば糖新生を低減するのに十分でもある。
【０２２０】
タンパク質：
−オキセパは、一人分（８ｆｌｏｚ）あたり１４．８ｇのタンパク質を含む（６２．５ｇ／Ｌ）；
−総カロリー／窒素比率（１５０：１）は、ストレスを受けている患者の要求量を満たす；
−オキセパは同化作用および呼吸器の問題を呈することなくやせた体を維持するのに十分なタンパク質を与える。高いタンパク質摂取は呼吸不全の患者には問題である。タンパク質はＣＯ２発生に対して殆ど影響を与えないが、高タンパク質食は換気駆動力を高める；
−オキセパのタンパク質源は、カゼイン酸ナトリウム８６．８％およびカゼイン酸カルシウム１３．２％である；
−オキセパ中のタンパク質系のアミノ酸プロファイルは全米科学アカデミーが設定している高品質タンパク質の基準を満たすかまたはその基準を超えている；
−オキセパはグルテンを含まない。
【０２２１】
以下の実施例を用いることで、本発明を説明することができるが、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０２２２】
（実施例Ｉ）
デラクロイキシア・コロナタ（ＡＴＣＣ２８５６５）からのデサチュラーゼ単離およびｃＤＮＡ合成のための縮重オリゴヌクレオチドの設計
真菌デラクロイキシア・コロナタ（Ｄ．コロナタ）（ＡＴＣＣ２８５６５）の脂肪酸組成分析を検討して、これが産生した多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の種類および量を確認した。この真菌は、かなりの量（総脂質の約１９％）のＰＵＦＡアラキドン酸（ＡＲＡ、Ｃ２０：４ｎ−６）を含むことが認められた（図１参照）。こうして、Ｄ．コロナタが恐らくリノール酸（ＬＡ、Ｃ１８：２ｎ−６）をγ−リノレン酸（ＧＬＡ、Ｃ１８：３ｎ−６）に変換するΔ６−デサチュラーゼおよびジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、Ｃ２０：３ｎ−６）をＡＲＡに変換するΔ５−デサチュラーゼを含むことが明らかにされた。従って目標は、Ｄ．コロナタから予測されるデサチュラーゼ遺伝子を単離し、中間宿主での発現によってその酵素の機能性を検証することにあった。
【０２２３】
採用した手法は、既知のフロントエンド（front-end）デサチュラーゼで保存されているアミノ酸モチーフを代表する縮重オリゴヌクレオチド（プライマー）を設計するというものであった。次に、これらのプライマーをＰＣＲ反応で用いて、デラクロイキシアからの推定デサチュラーゼ遺伝子に存在する保存領域を含む遺伝子断片を同定することができた。その時点で同定されていた唯一の真菌デサチュラーゼがモルティエラ・アルピナからのΔ５−およびΔ６−デサチュラーゼ遺伝子（それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ０６７６５０、ＡＢ０２００３２）であったことから、植物ならびに動物からのデサチュラーゼ配列を、これら縮重プライマーの設計時に考慮に入れた。特に、モルティエラ・アルピナ、ルリヂサ、ヒマワリ、セイヨウアブラナ、キイロタマホコリカビ、ドブネズミ、マウス、ヒト、シノラブディス・エレガンス、シロイヌナズナおよびトウゴマという生物からの既知のΔ５−およびΔ６−デサチュラーゼ配列を、これら縮重プライマーの設計に用いた。使用した縮重プライマーは、ＣＯＤＥＨＯＰ（商標名）ブロックメーカー（Blockmaker）プログラム（http://blocks.fhcrc.org/codehop.html）を用いて下記のものとした。
ａ．タンパク質モチーフ１（配列番号９）：ＮＨ３−ＶＹＤＶＴＥＷＶＫＲＨＰＧＧ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ８３４（配列番号１０）：５′−ＧＴＢＴＡＹＧＡＹＧＴＢＡＣＣＧＡＲＴＧＧＧＴＢＡＡＧＣＧＹＣＡＹＣＣＢＧＧＨＧＧＨ−３′。
ｂ．タンパク質モチーフ２（配列番号１１）：ＮＨ３−ＧＡＳＡＮＷＷＫＨＱＨＮＶＨＨ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ８３５（順方向）配列番号１２）：
５′−ＧＧＨＧＣＹＴＣＣＧＣＹＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＡＹＣＡＧＣＡＹＡＡＣＧＴＢＣＡＹＣＡＹ−３′
プライマーＲＯ８３６（逆方向）（配列番号１３）：
５′−ＲＴＧＲＴＧＶＡＣＧＴＴＲＴＧＣＴＧＲＴＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＧＴＴＲＧＣＧＧＡＲＧＣＤＣＣ−３′
ｃ．タンパク質モチーフ３（配列番号１４）：
ＮＨ３−ＮＹＱＩＥＨＨＬＦＰＴＭ−ＣＯＯＨ
プライマーＲＯ８３８（逆方向）（配列番号１５）：  ５′−ＴＴＧＡＴＲＧＴＣＴＡＲＣＴＹＧＴＲＧＴＲＧＡＳＡＡＲＧＧＶＴＧＧＴＡＣ−３′。
【０２２４】
全ての既知デサチュラーゼアミノ酸配列は、８個の保存ヒスチジンの群からなる３連モチーフを有する；ＨＸ（３−４）ＨＸ（７−４１）ＨＸ（２−３）ＨＨＸ（６１−１８９）ＨＸ（２−３）ＨＨ（配列番号１６）。多くの場合、３ヒスチジンボックスが、推定デサチュラーゼの確認に用いられる。その上、さらに２つのプライマーを既知のΔ６−デサチュラーゼで認められる第２および第３の保存「ヒスチジン−ボックス」に基づいて設計した。これらは、下記のものであった。
プライマーＲＯ７５３（配列番号１７）：
５′−ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＮＧＧＲＡＡＮＡＲＲＴＧＲＴＧ−３′プライマー
ＲＯ７５４（配列番号１８）：
５′−ＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＡＹＣＡＹＡＣＮＴＡＹＡＣＮＡＡＹ−３′。
【０２２５】
オリゴヌクレオチド配列についての縮重コードは、Ｂ＝Ｃ、Ｇ、Ｔ；Ｈ＝Ａ、Ｃ、Ｔ；Ｓ＝Ｃ、Ｇ；Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｖ＝Ａ、Ｃ、Ｇ；Ｙ＝Ｃ、Ｔ；Ｄ＝Ａ、Ｔ、Ｃ；Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔであった。
【０２２６】
機能性デサチュラーゼ酵素をコードする遺伝子を単離するため、最初にＲＮＡを作った。Ｄ．コロナタ（ＡＴＣＣ２８５６５）細胞を、光存在下および一定攪拌（２５０ｒｐｍ）下に、室温で４日間にわたってＢＹ＋培地（＃７９０、Difco, Detroit, MI）中で増殖させて、最大バイオマスを得た。これらの細胞を、５０００ｒｐｍで１０分間遠心することで回収し、氷冷したＲＮａｓｅ非含有水で洗った。これらの細胞を１００００ｐｓｉのフレンチプレスで溶解させ、溶解細胞をＴＥ緩衝フェノール中に直接回収した。細胞溶解物からのタンパク質を、繰り返しフェノール：クロロホルム（１：１体積比）抽出、とそれに続くクロロホルム抽出によって除去した。水相からの核酸を、０．３Ｍ（最終濃度）酢酸ナトリウム（ｐＨ５．６）および１容量のイソプロパノールを用いて−７０℃にて３０分間沈澱させた。沈澱核酸を、４℃で１５０００ｒｐｍにて３０分間遠心することで回収し、５分間真空乾燥し、１×ＤＮａｓｅ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中ＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅを含まない）で室温にて１５分間処理した。５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応停止し、キアゲン（Qiagen）ＲＮｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（Qiagen, Valencia, CA）を用い、製造者のプロトコールに従ってＲＮＡをさらに精製した。
【０２２７】
ｃＤＮＡを調整するため、２つのＰＣＲ反応を実施した。第１のＰＣＲ反応は、製造者の説明に従って、オリゴｄＴプライマー０．５μｇおよびＲＮＡ（１μｇ／Ｌ）５μＬを用いるファーストストランドｃＤＮＡ合成キット用スーパースクリプト予備増幅システム（Life Technologies, Rockville, MD）を使用して行った。第２のＰＣＲ反応は、パーキン・エルマー（Perkin Elmer）９６００において、標的として縮重プライマーＲＯ８３４／ＲＯ８３８（ブロックメーカープログラムで設計）およびファーストストランドｃＤＮＡを用いて行った。ＰＣＲ成分は、ファーストストランドｃＤＮＡ鋳型２μＬ、５０×ｄＮＴＰミックス１μＬ、最終濃度０．２ｐＭの各プライマー、１０×クレンタク（KlenTaq）ＰＣＲ反応緩衝液５μＬ、およびアドバンテージ（Advantage）・クレンタクポリメラーゼ（Clonetech, Palo Alto, CA）１μＬであった。熱サイクルは、９４℃で３分間の初回変性、次に９４℃で３０秒間の変性サイクル３５回；６０℃で３０秒間のアニーリング；および７２℃で７分間の伸長で行った。この次に、７２℃で７分間の最終伸長を行った。反応液を１％アガロースゲル上で分離し、約１．３ＫｂのＤＮＡ断片を切り取り、キアクイック・ゲル抽出キット（QiaQuick Gel Extraction Kit；Qiagen, Valencia, CA）で精製した。この断片上の付着末端を、製造者の仕様書に従ってＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies, Rockville, MD）を用いて「補完」し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ−平滑末端ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングした。その組換えプラスミドを、ＴＯＰ１０スーパーコンピテント細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）に形質転換し、９個のクローンを部分的に配列決定した。３つの別個の重複クローンをアライメントして、約１０８０ｂｐの配列を得た（図２）。
【０２２８】
この断片に相当する翻訳配列（図３）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを検索した。この断片は、モルティエラ・アルピナΔ６−デサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１１０５１０）と最も高い配列相同性を共有していることが認められた（約５３％の配列同一性）（図４）。従って、この推定デサチュラーゼをコードする全長遺伝子を単離して、酵母で発現された場合のそれの活性を求めた。
【０２２９】
（実施例ＩＩ）
ＲＡＣＥｃＤＮＡの作製およびデラクロイキシア・コロナタ（ＡＴＣＣ２８５６５）からの全長遺伝子配列の単離
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端迅速増幅）レディ（ready）ｃＤＮＡを反応の標的として用いて、全長ｃＤＮＡを単離した。ＲＡＣＥレディｃＤＮＡを作成するため、逆転写によってｃＤＮＡ標的を製造するためのジーン・レーサー（GeneRacer；商標名）キット（Invitrogen, Carlsbad, CA）およびスーパースクリプト（Superscript）ＩＩ（商標名）酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、製造者の指示に従って、総ＲＮＡ約５μｇを用いた。末端の初回増幅のため、パーキン・エルマー９６００で、９４℃で２分間の初回溶融とそれに続く９４℃で３０秒間および７２℃で３分間の５サイクル、９４℃で３０秒間、７０℃で３０秒間および７２℃で３分間の１０サイクル、次いで９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間および７２℃で３分間の２０サイクル、次に７２℃で１０分間の伸長という熱サイクルプロトコールを用いた。
【０２３０】
最初のＰＣＲ反応は、１０ｐｍｏｌのＲＯ１５２６（配列番号１９）（５′−ＴＧＣＣＴＣＣＧＴＡＴＴＣＴＣＣＣＴＴＡＡＣＣＡＣＡＡＣ−３′）またはＲＯ１５２８（配列番号２０）（５′−ＣＴＴＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧ−３′）および３０ｐｍｏｌのジーン・レーサー（商標名）３主（prime）プライマー（配列番号２１）（５′−ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ−３′）；またはＲＯ１５２４（配列番号２２）（５′−ＴＧＡＡＴＣＣＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＴＧＡＡＧＡＣＡＧ−３′）またはＲＯ１５２５（配列番号２３）（５′−ＣＧＧＡＧＧＧＧＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＴＡＧＡＧＣ−３′）およびジーン・レーサー（商標名）５主プライマー（配列番号２４）（５′−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３′）を用いて行った。各反応液には、製造者の指示に従って、ＭｇＳＯ４を用いるプラチマム・タク（Platimum Taq；商標名）ＰＣＲｘ（Clonetech, Palo Alto, CA）とともに容量５０μＬ中にｃＤＮＡ  １μＬを含有させた。初回反応と同じ条件を用い、初回反応液１μＬ、分岐プライマーＲＯ１５２４またはＲＯ１５２５  １０ｐｍｏｌおよびジーン・レーサー（商標名）分岐（nested）５主プライマー（配列番号２５）（５′−ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３′）３０ｐｍｏｌ；または分岐プライマーＲＯ１５２６またはＲＯ１５２８およびジーン・レーサー（商標名）分岐３主プライマー（配列番号２６）（５′−ＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ−３′）で分岐反応を行った。ＰＣＲ産物のアガロースゲル分析は、４つの反応について約４００ｂ〜１．３Ｋｂの帯域を示した。その後のｐＣＲ平滑末端（Invitrogen, Carlsbad, CA）へのクローニング、Ｔｏｐ１０コンピテント細胞（Invitrogen, Carlsbad, CA）への形質転換、ならびに配列決定によって、４６６アミノ酸の読み取り枠が明らかになった。Ｍ．アルピナΔ６−デサチュラーゼを用いたアライメントに基づくと、この配列は全遺伝子を含み、これはΔ６−デサチュラーゼである可能性が非常に高いものと考えられた。しかしながら、その翻訳アミノ酸配列は、Ｍ．アルピナΔ６−デサチュラーゼまたは何らかの他の真菌Δ６−デサチュラーゼでアライメントした場合に、適切な部位に開始コドンメチオニン（Ｍｅｔ−ＡＴＧ）を含まなかった。
【０２３１】
この推定デサチュラーゼ遺伝子上の各種部位で、３つの代替的開始コドンがあった（図５）。これら選択的開始コドンを有する全長遺伝子を、ｐＲＤＣ８、ｐＲＤＣ１０およびｐＲＤＣ１２と称した（図５）。ｐＲＤＣ８を作るため、次のプライマー：（停止−Ａｌａ、ＤｒａＩ）−順方向プライマー（配列番号２７）：（５′−ＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＣＧＡＴＡＡＡＡＧ−３′）および逆方向プライマー（配列番号２８）：（５′−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣ−３′）を用い、ＲＡＣＥｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。
【０２３２】
ＰＣＲ反応は、プラチナ（Platinum）Ｐｆｘポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて、製造者の指示に従って行った。全長ＰＣＲ生成物を、ＮｈｅＩで消化させ、ｐＹＸ２４２ベクターのＥｃｏＲＩ−平滑化（５′）およびＮｈｅＩ（３′）部位にクローニングした。この配列は、停止コドンの上流に存在する「Ｍｅｔ」を開始部位として用いたものであり（配列番号４１）（ＭＮＧＮＫＩ＊ＡＩＫＥＧＡＩＬ．．．．）、その停止コドンを、「Ａｌａ」に変換することで、５′配列を得た（配列番号４２）（ＭＮＧＮＫＩＡＡＩＫＥＧＡＩＬ．．．．）（図５、図６および図７）。
【０２３３】
ｐＲＤＣ１０を作製するため、次のプライマー：（Ａｌａ−Ｍｅｔ、Ｄｒａ１）順方向プライマー（配列番号２９）：（５′−ＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣ−３′）および逆方向プライマー（配列番号３０）：（５′−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧＧＣ−３′）を用い、ＲＡＣＥｃＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。
【０２３４】
このＰＣＲ反応は、プラチナＰｆｘポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、製造者の指示に従って行った。全長ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩで消化させ、ｐＹＸ２４２ベクターのＥｃｏＲＩ−平滑化（５′）およびＮｈｅＩ（３′）部位にクローニングした。これによって、停止コドン後の最初のＡｌａ（配列番号４２）（＊ＡＩＫＥＧＡＩＬ．．．）をＭｅｔに変換し（配列番号４３）（＊ＭＩＫＥＧＡＩＬ．．．）、このクローンをｐＲＤＣ１０と称した（図５、図８および図９）。
【０２３５】
ｐＲＤＣ１２を単離するため、製造者の指示（Qiagen, Valencia, CA）に従って、ＤＮｅａｓｙ植物ミニキットを用いてゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を製造した。プライマーＲＯ１５８５（配列番号３１）（５′−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＡＴＧＴＴＡＡＴＡＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＡＧ−３′）を設計して、停止コドン後の第３のイソロイシン（配列番号４３）（＊ＡＩＫＥＧＡＩＬＴＦＩＬ．．．）をメチオニンに変化するようにした（配列番号４４）（＊ＡＩＫＥＧＡＩＬＴＦＭＬ．．．．）（図５、図１０および図１１）。全長ｃＤＮＡ配列の３′末端について、プライマーＲＯ１５８４（配列番号３２）（５′−ＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＡＴＴＧＧＴＧ−３′）を設計した。ＰＣＲ成分は、ｇＤＮＡ  ３μＬ、５０×ｄＮＴＰミックス１μＬ、最終濃度０．２ｐＭのプライマーＲＯ１５８３およびＲＯ１５８４またはＲＯ１５８５およびＲＯ１５８４、ＭｇＳＯ４  ２μＬ、１０×ＰＣＲ反応緩衝液５μＬおよびプラチナＴＡＱＨＦポリメラーゼ（Clonetech, Palo Alto, CA）０．２μＬであった。パーキン・エルマー９６００で、９４℃で２分間の初回溶融とそれに続く９４℃で３０秒および７２℃で３分の５サイクル、９４℃で３０秒、７０℃で３０秒および７２℃で３分の１０サイクルならびに９４℃で３０秒、６８℃で３０秒および７２℃で３分に２０サイクル、次に７２℃で１０分の伸長という熱サイクルプロトコールを用いた。反応液を１％アガロースゲル上で分離し、約１．４ＫｂのＤＮＡ断片を切り取り、キアクイック・ゲル抽出キット（Qiagen, Valencia, CA）で精製した。Ｄｅｌ−Ｄ６と称される全長ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで消化させ、ｐＥＳＣ−Ｕｒａベクターにクローニングした。この構築物を、ｐＲＤＣ−１２と称した（プラスミドｐＲＤＣ−１２は、２００４年５月１８日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110）に寄託し、受託番号ＰＴＡ−５９７５を与えられた。）。モルティエラ・アルピナからのΔ６−デサチュラーゼ配列を有する、ｐＲＤＣ−１２によってコードされたこの推定デサチュラーゼ（Ｄｅｌ−Ｄ６）のアミノ酸配列のアライメントから、これらタンパク質が互いに約５１％配列同一性を共有していることがわかった（図１２）。
【０２３６】
他のフロントエンドデサチュラーゼ同様、Ｄｅｌ−Ｄ６は、これらフロントエンドデサチュラーゼ酵素の触媒活性に必要であることが知られている３つの保存「ヒスチジンボックス」を含んでいる（Shanklin et al., Biochemistry 33 (43): 12787-94 (1994)；Sayanova et al., Plant Physiol. 121 (2): 641-46 (1999)；およびPeriera et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 68(2): 97-106 (2003)）。
【０２３７】
ヒスチジンボックス１（配列番号３３）：ＨＤＦＬＨ
ヒスチジンボックス２（配列番号３４）：ＨＮＴＨＨ
ヒスチジンボックス３（配列番号３５）：ＱＶＥＨＨ。
【０２３８】
さらに、この配列は、５′末端にシトクロムｂ５領域も有しており（ＨＰＧＧモチーフ（配列番号３６））（図１３）、他の真菌および藻類Δ６−デサチュラーゼの場合に認められるように、それが不飽和化反応時の電子供与体としてシトクロムｂ５を用いることが示唆された（Periera et al., Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 68(2):97-106 (2003)）。この遺伝子の全体的なＧ＋Ｃ含有率は４１．９％である。
【０２３９】
（実施例ＩＩＩ）
酵母での推定デサチュラーゼを含むプラスミドの発現
３種類全てのプラスミドを、コンピテントなサッカロマイセス・セレヴィシエ株３３４に形質転換した。酵母の形質転換は、製造者が指定した条件に従って、アルカリ−カチオン酵母形質転換キット（Alkali-Cation Yeast Transformation Kit；BIO 101, Vista, CA）を用いて実施した。形質転換体は、ウラシル欠乏培地（ＤＯＢ［−Ｕｒａ］）でのウラシル栄養要求性について選択した。これらクローンの特異的デサチュラーゼ活性を検出するため、５０μＭの下記特異的脂肪酸基質の存在下に形質転換体を増殖させた。
【０２４０】
ａ．リノール酸（ＬＡ、Ｃ１８：２ｎ−β）（α−リノレン酸への変換はΔ１５−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられ、γ−リノレン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる。）；
ｂ．α−リノレン酸（ＡＬＡ、Ｃ１８：３ｎ−３）（ステアリドン酸への変換はΔ６−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる。）；
ｃ．（Ｃ２０：２ｎ−６）（ジホモ−γ−リノレン酸への変換は、Δ８−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる。）；
ｄ．（Ｃ２０：３ｎ−３）（エイコサテトラエン酸への変換は、Δ８−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる。）；
ｅ．ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、Ｃ２０：３ｎ−６）（アラキドン酸への変換はΔ８−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる。）；
ｆ．エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、Ｃ２０：４ｎ−３）（エイコサペンタエン酸への変換は、Δ５−活性を示すものと考えられる。）；
ｇ．アドレン酸（ＡＤＡ、Ｃ２２：４ｎ−６）（ω６−ドコサペンタエン酸への変換は、Δ４−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる。）；
ｈ．ω３−ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ、Ｃ２２：４ｎ−６）（ドコサヘキサエン酸への変換はΔ４−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる。）。
【０２４１】
陰性対照株は未変化ｐＹＸ２４２ベクターを含むＳ．セレヴィシエ３３４とし、これらは同時に増殖させた。
【０２４２】
培地を高攪拌し（２５０ｒｐｍ）、接種後にウラシル欠乏培地５０ｍＬ中５０μＭ（最終濃度）の各種基質存在下に２４℃で４８時間増殖させ、３０℃で酵母ペプトンブドウ糖肉汁（ＹＰＤ）での単一コロニーを終夜増殖させた。細胞をペレット化し、そのペレットをメタノール中で渦攪拌し、トリデカノイン（内部標準として）とともにクロロホルムを加えた。これらの混合物を、室温で少なくとも１時間、４℃で終夜インキュベートした。クロロホルム層を抽出し、無水硫酸ナトリウム１ｇを加えたワットマン（Whatman）フィルターで濾過して、粒状物および残留水を除去した。有機溶媒を、窒素気流下に４０℃で留去した。閉管中にて０．５Ｎ水酸化カリウムのメタノール溶液２ｍＬを加えることで、抽出液体をガスクロマトグラフィー分析（ＧＣ）用の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に誘導体化した。サンプルを加熱して９５〜１００℃として３０分間経過させ、冷却して室温とした。１４％三フッ化ホウ素のメタノール溶液約２ｍＬを加え、加熱を繰り返した。抽出した脂質混合物を冷却した後、水２ｍＬおよびヘキサン１ｍＬを加えて、ＧＣによる分析用に脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を抽出した。得られた生成物を（得られた生成物＋加えた基質）の合計で割り、１００を掛けることで、変換パーセントを計算した。
【０２４３】
結果から、ＬＡからＧＬＡへの変換およびＡＬＡからＳＴＡへの変換が示された。これは、Δ６−デサチュラーゼ活性を示すものと考えられる（表１参照）。
【０２４４】
【表４】
0005616571.tif 000005
【０２４５】
（実施例ＩＶ）
酵母でのＤｅｌ−Ｄ６（デラクロイキシアからのΔ６−デサチュラーゼ）のモルティエラ・アルピナエロンガーゼとの共発現
プラスミドｐＲＤＣ−１２を、ｐＲＰＢＧ−２からのＭ．アルピナエロンガーゼ遺伝子を含むクローンであるｐＲＳＰ−４６で共形質転換した（米国公開特許出願第ＵＳ２００３／０１７７５０８Ａ１号（参照によって全体が本明細書に組み込まれる）参照）。表２に、５０μＭの基質ＬＡ（Ｃ１８：２ｎ−６）を加えた場合、デサチュラーゼがＬＡをＧＬＡに変換し、エロンガーゼがＧＬＡに２個の炭素を付加させて、ＤＧＬＡを産生することができたことが示されている。対照形質転換３３４（ｐＹＸ２４２／ｐＥＳＣ−Ｕｒａ）によっては、ＤＧＬＡは産生されなかった。また、５０μＭの基質ＡＬＡ（１８：３ｎ−３）を加えた場合、デサチュラーゼはＡＬＡをＳＴＡに変換し、エロンガーゼがＳＴＡに２個の炭素を付加させてＥＴＡを産生することができた。対照形質転換３３４（ｐＹＸ２４２／ｐＥＳＣ−Ｕｒａ）によって、ＥＴＡは産生されなかった。従って、Ｄ．コロナタΔ６−デサチュラーゼは、予想されるＰＵＦＡを産生するＰＵＦＡ生合成経路からの他の異種酵素（Ｍ．アルピナエロンガーゼ）の基質である異種発現系で、生成物を産生可能であった。これは、Δ６−デサチュラーゼが実際に、酵母などの異種発現系におけるＰＵＦＡ経路で他の異種酵素とともに作用可能であることを示している。
【０２４６】
【表５】
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【０２４７】
（実施例Ｖ）
他のＰＵＦＡ産生生物からのΔ６−デサチュラーゼ相同物の確認
総脂肪酸プロファイルの分析での生物におけるＧＬＡ（１８：３ｎ−６）、ＡＲＡ（２０：４ｎ−６）および／またはＥＰＡ（２０：５ｎ−３）の存在に基づいて、Δ６−デサチュラーゼは、多くのＰＵＦＡ産生性の真菌および藻類に存在すると予想されている。実施例Ｉに記載のものと同様のＰＣＲ反応において縮重プライマー集合ＲＯ８３４（配列番号８）およびＲＯ８３８（配列番号１３）を用いると、これら生物からΔ６−デサチュラーゼ遺伝子に相当する断片を単離し、次に実施例Ｉに記載のプロトコールを用いて全長遺伝子を単離することができる。Δ６−デサチュラーゼ遺伝子を単離するのに用いることが可能な生物は、クスダマカビ属（Cunninghamella）、クモノスカビ属（Rhizopus）、ゴングロネラ属（Gongronella）、アラミセス属（Allamyces）、シンキトリウム属（Synchytrium）、アクルヤ属（Achlya）、ヒゲカビ属（Phycomyces）、コウガイケカビ属（Choanephora）、マキエダカビ属（Helicostylum）、エントモプトラ属（Entomopthora）などの真菌；クロレラ属（Chlorella）、デュナリエラ属（Dunaliella）、ラウデリア属（Lauderia）、ヒバマタ属（Fucus）、ホンダワラ属（Sargassum）、ラエンガリア属（Layengaria）、コルポメニア属（Colpomenia）、プロカミウム属（Plocamium）、ロドメラ属（Rhodomella）、ゲリジウム属（Gelidium）、ポリシフォニア属（Polysiphonia）、ツノマタ属（Chondrus）（Folia Microbiol. (1992) 37: 357-359；Stredanska S. & Sajbidor J.; Appl. Microbiol. Biotechnol. (1991) 35: 421-430； Radwan S. S.; Biochum. Biophys. ACTA (1965) 98: 230-237, Shaw R.）などの微細藻類に属するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１】脂肪酸生合成経路ならびにおよびこの経路でのΔ６−デサチュラーゼの役割を示す図である。デラクロイキシアの総脂質プロファイルで認められる主要な経路中間体を四角で囲んである。
【図２】３つの別個の重複クローンのアライメントによって得られるデラクロイキシアからの推定デサチュラーゼのコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図である。
【図３】３つの別個の重複クローンのアライメントによって得られるデラクロイキシアからの推定デサチュラーゼのコンセンサスアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図４】図３の翻訳アミノ酸配列（配列番号２）およびモルティエラ・アルピナΔ６−デサチュラーゼ（配列番号４０）のギャップアライメントを示す図である。
【図５】関連する発表アミノ酸配列（コンセンサス＝配列番号４１；ｐＲＤＣ８＝配列番号４２；ｐＲＤＣ１０＝配列番号４３；ｐＲＤＣ１２＝配列番号４４）をコードするデラクロイキシアからの推定デサチュラーゼ遺伝子配列（Ｄｅｌ−Ｄ６）で形成される各種Ｍｅｔコード「ＡＴＧ」開始コドン（太字、下線）の位置の比較を示す図である。
【図６】指定の開始部位に下線を施した、構築物ｐＲＤＣ８におけるデラクロイキシア・コロナツスＡＴＣＣ２８５６５からの推定デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す図である。
【図７】構築物ｐＲＤＣ８におけるデラクロイキシア・コロナツスＡＴＣＣ２８５６５からのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図８】指定の開始部位に下線を施した、構築物ｐＲＤＣ１０におけるデラクロイキシア・コロナツスＡＴＣＣ２８５６５からの推定デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す図である。
【図９】構築物ｐＲＤＣ１０におけるデラクロイキシア・コロナツスＡＴＣＣ２８５６５からのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
【図１０】構築物ｐＲＤＣ１２におけるデラクロイキシア・コロナツスＡＴＣＣ２８５６５からのΔ６−デサチュラーゼであるＤｅｌ−Ｄ６のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す図である。
【図１１】構築物ｐＲＤＣ１２におけるデラクロイキシア・コロナツスＡＴＣＣ２８５６５からのΔ６−デサチュラーゼであるＤｅｌ−Ｄ６の推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。
【図１２】Ｄｅｌ−ＯＳ（ｐＲＤＣ１２中）によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号８参照）（すなわち、デラクロイキシア・コロナツスＡＴＣＣ２８５６５からのΔ６−デサチュラーゼ）およびモルティエラ・アルピナΔ６−デサチュラーゼ（配列番号４０参照）のアライメントを示す図である。
【図１３−１】モルティエラ・アルピナ（受託番号ＡＡＦ０８６８５）（配列番号４０）、フェオダクティラム・トリコルヌタム（Phaeodactylum tricornatum）（受託番号ＡＡＬ９２５６３）（配列番号３７）、リゾプス・オリ−ゼ（Rhizopus oryzae）（受託番号ＡＡＳ９３６８２）（配列番号３８）、ピシウム・イレギュラレ（Pythium irregulare）（受託番号ＡＡＬ１３３１０）（配列番号３９）およびムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）（受託番号ＢＡＢ６９０５５）（配列番号４５）からの公知のΔ６−デサチュラーゼ配列を有するＤｅｌ−Ｄ６（ｐＲＤＣ１２中）によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号８）のアライメントを示す図である［同一の残基には下線を施してあり、保存ヒスチジン−ボックスモチーフならびに保存シトクロムｂ５領域を四角で囲んである。］。
【図１３−２】モルティエラ・アルピナ（受託番号ＡＡＦ０８６８５）（配列番号４０）、フェオダクティラム・トリコルヌタム（Phaeodactylum tricornatum）（受託番号ＡＡＬ９２５６３）（配列番号３７）、リゾプス・オリ−ゼ（Rhizopus oryzae）（受託番号ＡＡＳ９３６８２）（配列番号３８）、ピシウム・イレギュラレ（Pythium irregulare）（受託番号ＡＡＬ１３３１０）（配列番号３９）およびムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）（受託番号ＢＡＢ６９０５５）（配列番号４５）からの公知のΔ６−デサチュラーゼ配列を有するＤｅｌ−Ｄ６（ｐＲＤＣ１２中）によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号８）のアライメントを示す図である［同一の残基には下線を施してあり、保存ヒスチジン−ボックスモチーフならびに保存シトクロムｂ５領域を四角で囲んである。］。
【図１３−３】モルティエラ・アルピナ（受託番号ＡＡＦ０８６８５）（配列番号４０）、フェオダクティラム・トリコルヌタム（Phaeodactylum tricornatum）（受託番号ＡＡＬ９２５６３）（配列番号３７）、リゾプス・オリ−ゼ（Rhizopus oryzae）（受託番号ＡＡＳ９３６８２）（配列番号３８）、ピシウム・イレギュラレ（Pythium irregulare）（受託番号ＡＡＬ１３３１０）（配列番号３９）およびムコール・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）（受託番号ＢＡＢ６９０５５）（配列番号４５）からの公知のΔ６−デサチュラーゼ配列を有するＤｅｌ−Ｄ６（ｐＲＤＣ１２中）によってコードされる推定アミノ酸配列（配列番号８）のアライメントを示す図である［同一の残基には下線を施してあり、保存ヒスチジン−ボックスモチーフならびに保存シトクロムｂ５領域を四角で囲んである。］。
【図１】
0005616571.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005616571.tif 000018
【図１３−１】
0005616571.tif 000019
【図１３−２】
0005616571.tif 000020
【図１３−３】
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【配列表】
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