(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリカプロラクトンフマレート単位と、
ポリエチレングリコールフマレート単位と、
を含むコポリマー。
【請求項２】
下式：
【化１】
0005527968.tif 000006
（式中、ｎおよびｍは整数である）
を有する、請求項１記載のコポリマー。
【請求項３】
ポリカプロラクトンジオールと、ポリエチレングリコールと、フマル酸または塩化フマリルとを反応させることによって製造されるコポリマー。
【請求項４】
（ｉ）ポリカプロラクトンジオールとフマル酸または塩化フマリルとを反応させることによって調製される第１のポリマーと、（ｉｉ）ポリエチレングリコールとフマル酸または塩化フマリルとを反応させることによって調製される第２のポリマーとを反応させることによって製造されるコポリマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のコポリマーを含む、組織再生用足場。
【請求項６】
ポリカプロラクトンフマレート単位とポリエチレングリコールフマレート単位とを有するコポリマーと、
フリーラジカル開始剤または光開始剤と
を含む、架橋性の生分解性材料。
【請求項７】
自己架橋性である、請求項６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項８】
注入可能な代用骨である、請求項６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項９】
ポロゲンをさらに含む、請求項６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項１０】
促進剤をさらに含む、請求項６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項１１】
架橋剤を含まない、請求項６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項１２】
粒子または繊維強化材料をさらに含む、請求項６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項１３】
生理活性剤をさらに含む、請求項６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項１４】
請求項６〜１３のいずれか１項に記載の材料を含む、組織再生用のスカフォード。
【請求項１５】
ポリ（ポリカプロラクトンフマレート）と架橋するポリ（ポリエチレングリコールフマレート）を含む、生分解性材料。
【請求項１６】
ポリ（ポリエチレングリコールフマレート）と、
ポリ（ポリカプロラクトンフマレート）と、
フリーラジカル開始剤または光開始剤と
を含む混合物を架橋してなる、請求項１５に記載の生分解性材料。
【請求項１７】
自己架橋性である、請求項１６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項１８】
注入可能な代用骨である、請求項１６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項１９】
ポロゲンをさらに含む、請求項１６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項２０】
促進剤をさらに含む、請求項１６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項２１】
架橋剤を含まない、請求項１６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項２２】
粒子または繊維強化材料をさらに含む、請求項１６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項２３】
生理活性剤をさらに含む、請求項１６記載の架橋性の生分解性材料。
【請求項２４】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の材料を含む、組織再生用足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００６年４月２９日出願の米国特許仮出願第６０／６７６，１５８号の優先権を主張するものである。
【０００２】
［連邦政府の支援による研究に関する記載］
本件は、助成金番号ＡＲ４５８７１及びＥＢ０３０６０での米国国立衛生研究所による支援を受けたものである。
【０００３】
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、ポリ（エチレングリコールフマレート）を製造する改良された方法、ならびに、ポリ（エチレングリコールフマレート）と、ポリ（プロピレンフマレート）およびポリ（カプロラクトンフマレート）等の疎水性ポリマーとを化学的に架橋または光架橋して、制御可能な親水性を有する種々のヒドロゲルを生成する方法に関する。ヒドロゲルは、組織工学用途および薬剤徐放用途のための生体適合性、生体吸収性の注入可能な、ｉｎ−ｓｉｔｕで硬化するスカフォードとして有用である。
【背景技術】
【０００４】
２．関連する分野の説明
骨再生に関する臨床的要求は多岐にわたっており、米国では、癒合を達成するために骨移植処置を必要とする骨格欠損を有する患者が、毎年、おおよそ１，０００，０００人いる。これらは、原発性および転移性腫瘍の切除、骨格傷害後の骨量減少、骨欠損に伴う初回および修正全関節形成術、脊髄関節固定術、ならびに骨粗しょう症性不全骨折後の骨梁の空隙から生じる申請を含む。骨移植材料の選択、作製および適用の際に行う現行の臨床上の決定は、しばしば多くの要素を含む。構造的展望から、外科的処置計画を決定する前に幾つかの決定に取り組む必要がある。
【０００５】
骨格欠損を治療する現行の臨床上の方法は、骨の移植、または連続性を回復させるための他の材料の使用を含む。自己骨移植は、骨形成原細胞、骨誘導因子および治癒のための骨伝導マトリックスなどの必須要素をもたらすため、骨置換術のゴールドスタンダードになっている。しかし、自己移植骨の限られた供給量とドナー部位の病的状態の両方により、単独で用いることができるケースの範囲が制限される。同種移植骨は、豊富な供給量で利用できるが、自己移植骨と比較して低い移植片組み込み率、およびドナーからホスト（宿主）への病原体移行の可能性を含む欠点を有する。
【０００６】
金属は、欠損部位での即時的な機械的支持を実現するが、宿主組織との理想的な全体にわたる一体化と言えるほどのものは示さず、金属の疲労破損前に骨が治癒しなければ疲労荷重のために結局失敗することもある。セラミック、例えば、β−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）およびハイドロキシアパタイトは、両方とも、骨伝導性であり、ならびに金属プロステーシスの表面コーティングとして骨へのそれらプロステーシスの結合を強化するために臨床使用されている。粒子形態で、それらは、主として圧縮状態のポリマー複合材料に機械強度増加をもたらすが、ねじり力および曲げ力への抵抗性の強化にはあまり有効でない。ポリ（メチルメタクリレート）骨セメントは、注入または成形することができ、時には、空洞性欠損および分節性欠損（例えば、各々、巨細胞腫瘍の掻爬に起因するもの、または脊椎の転移性疾患における椎体の切除に起因するもの）の両方を充填するために使用される。しかし、発熱性重合反応中に温度が１００℃まで上昇することがあり、放出される熱により局所組織は損傷の危険にさらされる。加えて、ポリ（メチルメタクリレート）は非生分解性であり、それ故、時間が経つにつれて疲労損傷が蓄積し、結局、機械的破損を被ることもある。
【０００７】
合成生分解性ポリマーは、現在利用することができない治療選択肢を与えることができる。これらの材料は、事実上無限の供給量で製造することができ、それらの設計の自由度により、様々な機械的、生物学的、分解、および流動学的特性を有する広範なポリマーを合成することができる。例えば、それらの機械的特性および分解特性は、合成中にポリマーの分子量を変えることにより操作することができ、従って、特定の用途に合うように調整することができる。骨格再生用生体材料の注入可能な性質は、限られた接近容易性または不規則な形を有する欠損を充填するために理想的であろう。例えば、現在臨床使用されている低侵襲性内視鏡法により、注入可能な形態の生体材料を後側面横突間プロセスの脊椎固定のために挿入することができる。これは、移植材料を所定の位置に置くために現在は行わなければならない広範囲の露出および筋肉剥離からの外科的外傷を減少させるであろう。注入可能な材料は、周囲の皮質骨に大きな進入路用の穴を作らずに関節周囲骨折、骨粗しょう症性脊髄骨折又は骨嚢胞からの海綿状空隙に配置することができよう。これらの臨床の状況が、骨組織工学用の注入可能な生分解性ポリマー複合材料の開発の動機付けを表している。
【０００８】
薬剤および成長因子等の生理活性分子の徐放(controlled  release)は、疾患部位における細胞の機能および組織の形成を調節することができることから、組織工学の重要な側面となってきている。生分解性材料内への薬剤、タンパク質および他の生理活性剤の封入は、含有物質の放出プロファイルを制御する効果的な方法である。
【０００９】
近年、開発されている注入可能な材料およびヒドロゲルは、これらの多岐にわたる医学的用途のための多くの設計基準を満たしている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導性ポリ（エチレングリコールフマレート）（ＰＥＧＦ）は、注入可能なｉｎ−ｓｉｔｕで架橋性の生分解性ヒドロゲルとして開発された（Ｊｏ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，３４，２８３９；米国特許第６，８８４，７７８号および米国特許出願第２００２／００２８１８９号を参照）。ＰＥＧＦは、ポリエチレングリコールとフマル酸クロリドとの縮重合によって合成されるフマレート部分を有するＰＥＧの親水性オリゴマーである。このマクロマー中のフマレート基は、ｉｎ−ｓｉｔｕで架橋、ならびに加水分解による生分解を可能にする。過硫酸アンモニウムとアスコルビン酸とから成る化学開始系を用いて、紫外光を必要とすることなくヒドロゲルを形成する（Ｔｅｍｅｎｏｆｆ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，２００１，５９，４２９を参照）。ＰＥＧＦヒドロゲル上の骨髄ストローマ細胞（ＭＳＣ）の付着は、モデル細胞接着特異的なペプチドを用いて研究された（Ｓｈｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，２００２，６１，１６９を参照）。モデルＲＧＤペプチドを、分子量３４００ｇ／ｍｏｌのアクリル化ＰＥＧに結合した後、ＰＥＧＦヒドロゲルに組み込んだ（Ｊｏ他、「機能化ポリマーネットワークの調製のためのＧＲＧＤペプチドによるオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）マクロマーの修飾(Modification  of  Oligo(poly(ethylene  glycol)  fumarate)  with  a  GRGD  Peptide  for  the  Preparation  of  Functionalized  Polymer  Networks)」，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００１，２，２５５を参照）。
【００１０】
ＰＥＧＦのＰＥＧ鎖長、架橋密度または初期ペプチド濃度を変えることによって、広範な物理特性を有するヒドロゲルが合成されうる。ペプチド濃度が増大すれば、９３０および２８６０ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧＦヒドロゲルへのＭＳＣの付着が高まる。しかしながら、６０９０ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧＦヒドロゲルに付着したＭＳＣの数は、ペプチド密度にかかわらず一定に保たれた。また、ＰＥＧＦのＰＥＧ鎖長は細胞付着の程度に影響を与えた。例えば、ＰＥＧＦヒドロゲル１ｇ当たり１ｍｍｏｌペプチドがＰＥＧＦに組み込まれる場合、初期播種密度に対する細胞付着の程度は、９３０、２８６０および６０９０ｇ／ｍｏｌのＰＥＧ分子量を有するＰＥＧＦについてそれぞれ、９３．９±５．９％、６４．７±８．２％、および９．３±６．６％であった。一方、ＰＥＧＦヒドロゲルの架橋密度は、細胞付着に重大な影響を与えるものではなかった。細胞播種前に可溶性ＲＧＤの存在下で細胞がインキュベートされるときにＲＧＤ修飾ヒドロゲルへのＭＳＣ付着が競合的に阻害されたため、相互作用は配列特異的であった。これらの結果は、ペプチド濃度を変えることにより、ＰＥＧＦヒドロゲルへの細胞付着が調節されることができることを示している。また、ＰＥＧＦマクロマーは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡ）により架橋されて、間葉幹細胞のための細胞キャリアとしてｉｎ−ｓｉｔｕで架橋する注入可能なスカフォードを作製する（Ｊａｂｂａｒｉ，１４ｔｈ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．Ｐｒｏｃｅｅｄ．，２０００，５４を参照）。この系は、場合によっては骨軟骨症の治療に有用である。過硫酸アンモニウムとＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤ）から成る酸化還元開始剤の新規な組み合わせをこの系において使用し、中性のｐＨを得た。間葉幹細胞（ＭＳＣ）はこの注入可能な系に首尾良く播種された。完全な骨形成培地中で培養したこの封入ＭＳＣは、アルカリ性脱リン酸酵素活性を示し、２１日までの間、ミネラル化マトリックスを増大させた。
【００１１】
ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）は、そのフマレート二重結合を通じて修飾又は架橋されうる不飽和直鎖状ポリエステルである。例えば、米国特許第５，７３３，９５１号明細書を参照。ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）は、周知の生分解性ポリマーであり、吸収性縫合糸としての使用がＦＤＡにより認可されている。卓越した生体適合性および可撓性を有する。ＰＣＬは、一時的関節スペーサー（Ｅｌｆｉｃｋ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００２，２３，４４６３−７を参照）および組織工学的皮膚(tissue-engineered  skin)（Ｎｇ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７，４４１−５５を参照）用の可能性ある材料として最近研究された。ＰＣＬセグメントおよびフマレートセグメントに基づく注入可能なコポリマー、ポリ（カプロラクトンフマレート）（ＰＣＬＦ）が研究されている。ＰＣＬ単位の存在のため、ＰＣＬＦ鎖は、ＰＰＦ鎖よりずっと可撓性である。このことにより、ＰＣＬＦは、架橋剤を一切使用せずに自己架橋することができる。ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００５／００４８１１号パンフレットを参照。
【００１２】
光架橋は、２つの高分子間または１つの高分子中の２つの異なる部分間の共有結合の形成である。光架橋は、インビボでの硬化を可能にし、これは、外科医の移植可能なポリマーの配置および取り扱いに大きな融通性をもたらす。他の架橋法を超える光架橋の主な利点は、重合の空間的および時間的制御、室温での速い硬化速度、ならびに移植中の成形の容易さおよび可撓性である（Ａｎｓｅｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９９，１７，１５６−９を参照）。
【００１３】
これまでのポリ（エチレングリコールフマレート）（ＰＥＧＦ）合成方法の主な欠点は、暗色のＰＥＧＦ生成物、および重縮合におけるプロトンスカベンジャートリエチルアミンによる比較的低い反応効率である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、ポリ（エチレングリコールフマレート）を製造する改良された方法が必要とされる。また、ポリ（エチレングリコールフマレート）と、ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）およびポリ（カプロラクトンフマレート）（ＰＣＬＦ）等の疎水性ポリマーとを化学的に架橋または光架橋して、制御可能な親水性、ならびに制御される膨潤特性および機械特性を有する種々のヒドロゲルを生成する。
【００１５】
［発明の概要］
本発明では、金属塩プロトンスカベンジャー、好ましくはアルカリ金属炭酸塩プロトンスカベンジャー、最も好ましくは炭酸カリウムを用いて、ポリ（エチレングリコールフマレート）を調製する。本発明は、時間消費を大幅に減少させ、かつ最終生成物の分子量をより大きくする修飾ＰＥＧＦ合成プロセスを有する。例えば、この方法は、５０００ｇ／ｍｏｌを超える重量平均分子量を有するポリ（エチレングリコールフマレート）を調製することができる。
【００１６】
新たに合成されたＰＥＧＦは、それ自体、またはポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）およびポリ（カプロラクトンフマレート）（ＰＣＬＦ）等の不飽和疎水性ポリマーと、化学的に架橋または光架橋され、制御可能な親水性、ならびに膨潤特性および機械特性を有する種々のヒドロゲルを生成することができる。ヒドロゲルは、骨格再構築用途のための注入可能なｉｎ−ｓｉｔｕで硬化するスカフォードを作製するのに有用でありうる。
【００１７】
また、本発明は、カプロラクトンフマレート単位とエチレングリコールフマレート単位とを含むコポリマー（ＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦ）を製造するプロセスを提供する。
【００１８】
ヒドロゲルを含む注入可能な材料はまた、種々の研究および臨床的側面、特に、薬剤徐放において有用でありうる。例えば、１つまたは複数の生理活性剤が、ヒドロゲルに添加されるか、またはヒドロゲル粒子内に取り込まれる。生理活性剤（複数可）は、所望の生理学的効果に応じて選択される。
【００１９】
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様、および利点は、以下の詳細な説明、図面、および添付の特許請求の範囲に鑑みて、より理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
１つの態様において、本発明は、ポリ（エチレングリコールフマレート）を製造する方法を提供する。本方法において、ポリエチレングリコールは、金属塩の存在下でフマル酸またはその塩（例えば、フマル酸クロリド）と反応する。この金属塩は、アルカリ金属塩、好ましくはアルカリ金属炭酸塩、最も好ましくは炭酸カリウムであってもよい。本方法は、従来の方法のような暗色の生成物の形成を防ぐ。また、本方法は、５０００ｇ／ｍｏｌを超える重量平均分子量を有するポリ（エチレングリコールフマレート）を調製することができる。
【００２１】
別の態様において、本発明は、カプロラクトンフマレート単位とエチレングリコールフマレート単位とを含むコポリマー、およびＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦコポリマーを製造するプロセスを提供する。エチレングリコールフマレート単位は親水性であり、カプロラクトンフマレート単位は疎水性であるため、ＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦコポリマーは両親媒性となる。これにより、親水性成分および親水性成分の両方の組成およびブロック長を調節することによってヒドロゲルの膨潤率を制御する１つのアプローチが提供される。例示的なコポリマーは、式
【化１】
0005527968.tif 000002
（式中、ｎおよびｍは整数である）を有する。
【００２２】
ＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦは、ポリカプロラクトンジオールと、ポリエチレングリコールと、フマル酸またはその塩とを反応させることによって調製することができる。ＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦはまた、（ｉ）ポリカプロラクトンジオールとフマル酸またはその塩とを反応させることによって調製される第１のポリマーと、（ｉｉ）ポリエチレングリコールとフマル酸またはその塩とを反応させることによって調製される第２のポリマーとを反応させることによって調製することができる。コポリマーは、組織再生用のスカフォードを調製するのに有用な架橋性の生分解性材料に組み込むことができる。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、ポリ（プロピレンフマレート）と架橋するポリ（エチレングリコールフマレート）を含む生分解性材料を提供し、これは組織再生用のスカフォードとして有用である。本材料は、ポリ（エチレングリコールフマレート）、ポリ（プロピレンフマレート)およびフリーラジカル開始剤または光開始剤を含む、架橋性の生分解性材料から生成することができる。好ましくは、本材料は自己架橋性である。本材料は光架橋性であってもよい。１つの形態において、本材料は注入可能な代用骨である。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、ポリ（カプロラクトンフマレート）と架橋するポリ（エチレングリコールフマレート）を含む生分解性材料を提供し、これは組織再生用のスカフォードとして有用である。本材料は、ポリ（エチレングリコールフマレート）、ポリ（カプロラクトンフマレート）およびフリーラジカル開始剤または光開始剤を含む、架橋性の生分解性材料から生成することができる。好ましくは、本材料は自己架橋性である。本材料は光架橋性であってもよい。１つの形態において、本材料は注入可能な代用骨である。
【００２５】
従って、本発明は、組織再生用のスカフォードを調製するのに有用な光架橋性の生分解性材料を提供する。上記のように、本発明による例示的な材料としては、（ｉ）カプロラクトンフマレート単位とエチレングリコールフマレート単位とを含むコポリマー、（ｉｉ）ポリ（エチレングリコールフマレート）とポリ（カプロラクトンフマレート）との配合物、または（ｉｉｉ）ポリ（エチレングリコールフマレート）とポリ（プロピレンフマレート)との配合物が挙げられる。光架橋性の生分解性材料は、光開始剤、例えば、ベンゾインおよびベンゾインエーテル化合物、ベンジルケタール化合物、アセトフェノン化合物、アミノアルキルフェノン化合物、ヒドロキシアルキルフェノン化合物、アシルホスフィンオキシド、アシルホスフィンスルフィド、フェニルグリオキシル酸化合物、ベンゾフェノン化合物、チオキサントン化合物、およびそれらの混合物を含む。１つの例示的な材料において、光開始剤はビスアシルホスフィンオキシドである。
【００２６】
本材料は、注入可能な代用骨または注入可能な骨セメントであり得る。本材料の注入可能な性質により、限られた接近容易性または不規則な形の欠損を充填することができる。例えば、現在臨床使用されている低侵襲性内視鏡法により、注入可能な形態の本材料を後側面横突間プロセスの脊椎固定のために挿入することができる。注入可能な材料は、周囲の皮質骨に大きな進入路用の穴を作ることなく関節周囲骨折、骨粗しょう症性脊髄骨折または骨嚢胞からの海綿状空隙に配置することができる。
【００２７】
本発明の材料の注入可能な性質に関して、注入の温度範囲は広く、混合物の融点と混合物に使用される溶媒の沸点との間であり得る。通常、ポリマー混合物は、便宜上、室温で注入される。
【００２８】
本発明に係る生分解性材料は、自己架橋性でありうるため、架橋剤を含む必要がない。一般に、架橋剤は、架橋中、隣接する二重結合の架橋を助長するために使用される。本発明の自己架橋性および／または光架橋性の生分解性材料は、架橋剤を一切必要としないため、生物医学的用途における毒性の懸念を最小にする。しかし、架橋剤を使用することもできる。架橋剤の例としては、アクリレートモノマーがある。
【００２９】
本発明の架橋性材料は、組織再生用のスカフォードの形成に適する。１つの形態において、本架橋性材料は、多孔性スカフォードの形成を可能にするポロゲンを含む。適するポロゲン類としては、多孔性スカフォードを形成するソルトリーチング(salt  leaching)法において使用することができる塩結晶（例えば、塩化ナトリウム）が挙げられる。このタイプの粒子リーチング(particle  leaching)法の例は、米国特許第６，４３６，４２６号、同第６，３７９，９６２号および同第５，５１４，３７８号において見出すことができる。ポロゲンは、ＰＣＴ国際公開第２００５／０２０８４９号パンフレットに記載されているようなヒドロゲルポロゲンであってもよい。ポロゲンの選択は、架橋プロセスにより左右されることがある。ポロゲンは、架橋フィルムの製造に用いることができるが、それは、ポロゲンの物理的性質および色に依存する。また、一部のポロゲンは、ＵＶ光を遮断し、その結果、光架橋手順を非効率にすることがある。従って、本発明の光架橋性の生分解性材料は、所望の最終製品に依存して、ポロゲンを含むこともあり、含まないこともある。
【００３０】
本架橋性材料は、粒子または繊維強化材料をさらに含むことがある。ハイドロキシアパタイトが強化材料としての役割を果たすのが、特に有利である。骨無機質の組成に関する類似性、細胞機能の生理活性および促進、ならびに骨伝導性のためである。これらの強化材料は、単層カーボンナノチューブを含むこともある。
【００３１】
本架橋性材料は、１つ以上の生理活性剤をさらに含むことがある。本明細書において用いる場合の「生理活性剤」は、限定ではないが、体内で局所的または全身的に作用する生理または薬理学的活性物質を包含する。生理活性剤は、疾病または疾患の治療、予防、診断、治癒または緩和のために使用される物質、または身体の構造もしくは機能に影響を及ぼす物質、または所定の生理環境に置かれた後、生理活性になるか、より活性になる物質である。生理活性剤としては、限定ではないが、酵素、有機触媒、リボザイム類、有機金属化合物、タンパク質、糖タンパク類、ペプチド類、ポリアミノ酸、抗体、核酸、ステロイド性分子、抗生物質、抗菌剤、サイトカイン類、成長因子、炭水化物、疎油性物質、脂質、細胞外基質、並びに／又はその個々の成分、製剤および治療薬が挙げられる。
【００３２】
この架橋性の生分解性材料は、促進剤も含むことがある。促進剤の非限定的な例としては、トルイジン類（例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−トルイジン（「ＤＥＴ」）およびＮ，Ｎ−ジメチル−ｏ−トルイジン（「ＤＭＴ」））、アセチルフェニルヒドラジン、マレイン酸、キニン類（例えば、ナフタキノンおよびアントラキノン）、ならびにアルキルメルカプタン類が挙げられる。多くの場合、光架橋プロセスでは促進剤が必要とされない。全ての手順が相当短い（例えば、３０分未満）であるためである。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「生体適合性」材料は、重度のまたは漸増的反応とは対照的に、軽度の、多くの場合一時的な、移植反応しか誘発しないものである。本明細書において用いる場合、「生分解性」材料は、正常なインビボ生理条件下で、代謝または排泄され得る成分に分解するものである。本明細書において用いる場合、「生体吸収性」材料は、身体の化学的／生物学的作用に起因して、限られた期間をかけて分解するものである。「注入可能な」とは、本コポリマーを医療用注射器により一定部位に送達することができることを意味する。「自己架橋性」とは、本発明のポリマーの官能基と本発明の同じまたは別のポリマーの官能基との間の架橋を形成する架橋剤を用いることなく、本発明のポリマーの官能基が、本発明の同ポリマーまたは別のポリマーの官能基と架橋できることを意味する。「光架橋性」とは、光開始剤の存在下、光子（例えば、ＵＶ光）の適用により、本発明のコポリマーの官能基が、本発明の同じポリマーまたは別のポリマーの官能基と架橋できることを意味する。
【００３４】
本明細書における用語「分子量」は、「重量平均分子量」（Ｍw＝ΣiＮiＭi2／ΣiＮiＭi）を指す。様々な方法で重量平均分子量（Ｍw）を決定することができるとはいえ、利用する方法に依存して結果は多少異なり、ゲル透過クロマトグラフィーを利用するのが適便である。本明細書において用いる場合、用語「数平均分子量」（Ｍn）は、存在する全モル数で割った、ポリマーサンプル中の全ての分子の合計重量を指す（Ｍn＝ΣiＮiＭi／ΣiＮi）。様々な方法で数平均分子量を決定することができるとはいえ、利用する方法に依存して結果は多少異なり、ゲル透過クロマトグラフィーを利用するのが適便である。本明細書において用いる場合、用語「多分散性」は、材料の「重量平均分子量」を「数平均分子量」で割った比（Ｍw／Ｍn）を指す。
【実施例】
【００３５】
以下の実施例は、本発明をさらに例証するために提示したものであり、いかなる点においても本発明を制限するためのものではない。
【００３６】
Ａ．ポリ（エチレングリコールフマレート）（ＰＥＧＦ）マクロマーの合成
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ、Aldrich）を、トルエン中で共沸蒸留によって乾燥させた後、減圧下で排水して残存する微量の水を除去した。フマル酸クロリド、ＰＥＧおよび炭酸カリウムを、１：１：１．５のモル比となるように測った。ＰＥＧ３．４Ｋのポリマー密度は、１．０９２６ｇ／ｃｍ3である。ＰＥＧを塩化メチレンに溶解し（１：２（体積））、粉末炭酸カリウムと共に２Ｌの三つ口フラスコに入れた。この混合物を、オーバーヘッド機械式攪拌機を用いて攪拌し、スラリーを形成した。塩化メチレンに溶解したフマル酸クロリド（１：１体積比）をスラリーに滴下した。反応混合物を窒素ブランケット下で（フマル酸クロリド添加速度を変えることによって)５０℃に維持した。さらなるフマル酸クロリドを随時添加して、攪拌を促した。フマル酸クロリド添加の完了後、混合物を、遠心分離管に移し、炭酸カリウムが完全に除去されるまで１５分間４０００ｒｐｍで遠心沈殿させた。その後、上澄みを石油エーテルに滴下して溶液からポリマーを取り除き、沈殿物を回転蒸発して、琥珀色の粘稠液を得た。表１は、ＰＥＧＦを重合するための組成(formulations)を示す。
【００３７】
【表１】
0005527968.tif 000003
【００３８】
Ｂ．ポリ（エチレングリコールフマレート）−ｃｏ−ポリ（カプロラクトンフマレート）の合成
５０ｇ等量のＰＥＧ３．４ＫおよびＰＣＬ１２５０を共に、トルエン中で共沸蒸留によって乾燥させた後、減圧下で排水して残存する微量の水を除去した。フマル酸クロリド、ＰＥＧとＰＣＬとの混合物中のヒドロキシル官能基の総量、ならびにＫ2ＣＯ3を、１：１：１．５のモル比となるように測った。予め生成したＰＣＬジオールとＰＥＧとの混合物を塩化メチレンに溶解し（１：２（体積））、粉末Ｋ2ＣＯ3と共に２Ｌの三つ口フラスコに入れた。この混合物を、オーバーヘッド機械式攪拌機を用いて攪拌し、スラリーを形成した。塩化メチレンに溶解したフマル酸クロリド（１：１体積比）をスラリーに滴下した。反応混合物を窒素と共に５０℃に維持した。さらなるフマル酸クロリドを随時添加して、攪拌を促した。
【００３９】
Ｃ．特性決定
ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）を用いて、本明細書中のポリマーの分子量および多分散性を求めた。ＧＰＣは、Ｍｏｄｅｌ  ５１５  ＨＰＬＣポンプおよびＭｏｄｅｌ  ２４１０示差屈折率検出器に接続したＷａｔｅｒｓ  ７１７  ＰｌｕｓオートサンプラーＧＰＣシステム（Waters，Milford，MA，USA）を用いて実施した。フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）スペクトルをＮｉｃｏｌｅｔ  ５５０分光計により得た。亜鉛セレン化物ＡＴＲ結晶を用いて、全てのポリマーを分析した。機器の解像度は、１０００ｃｍ-1の波数で４ｃｍ-1として規定された。プロトンおよび炭素核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）スペクトルは、ＴＭＳを含有するＣＤＣｌ3溶液を用いて、Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｐｌｕｓ  ＮＭＲ分光計（1Ｈ＝４００．１  ＭＨｚ、13Ｃ＝１００．６  ＭＨｚ）により得られた。窒素雰囲気下、加熱速度１０℃／分でＴＡ機器ＤＳＣ  Ｑ１０００示差走査熱量測定機により示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を測定した。同じ熱履歴を維持するために、各試料を、室温から１００℃に予備加熱し、５℃／分の冷却速度で−９０℃まで冷却した。その後、−９０℃から１００℃までの加熱の間にＤＳＣ走査を記録した。ＴＡ  ｍｏｄｅｌ  Ｑ５００サーマルアナリストを用いて熱重量分析（ＴＧＡ）を行った。２０℃／分の加熱速度で窒素を流しながら、ＴＧＡデータを得た。ポリマーの分子特性および物理特性を表２に示す。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
Ｄ．架橋プロセスおよびスカフォードの作製
１．熱架橋プロセス
過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）をフリーラジカル開始剤として、Ｎ−ジメチルトルイジン（ＤＭＴ）を促進剤として用いた。スカフォードを作製する一般的な手順は以下の通りである。１００μＬの開始剤溶液（２５０μＬのＮＶＰ中に５０ｍｇのＢＰＯ）および４０μＬの促進剤溶液（９８０μＬの塩化メチレン中に２０μＬのＤＭＴ）を１．５ｇのＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦ（またはＰＥＧＦ／ＰＣＬＦ、ＰＥＧＦ／ＰＰＦ配合物）の塩化メチレン（５００μＬ）溶液に添加し、十分混合した。マルチチャネル型チューブ形態等の種々のテフロン型に、重合させるスカフォードを移した。型を対流式オーブンに一晩入れて、架橋を促進させた。架橋後、型を周囲温度に冷却する前に、シリンダーまたはチューブを型から取り外した。
【００４２】
２．光架橋プロセス
光架橋を、光開始剤ビスアシルホスフィンオキシド（ＢＡＰＯ、Ciba  Geigy）を用いて、紫外線（ＵＶ）（λ＝３８０〜３１５ｎｍ）により開始した。約７５μＬのＢＡＰＯの塩化メチレン溶液（１．５ｍＬの塩化メチレンに３００ｍｇのＢＡＰＯ）を１．５ｇのＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦ（またはＰＥＧＦ／ＰＣＬＦ、ＰＥＧＦ／ＰＰＦ配合物）の塩化メチレン（５００μＬ）溶液に添加し、十分混合した。この混合物を２つのガラスプレートおよび１ｍｍ厚のテフロンスペーサーによって形成される型に注ぎ入れ、型を３０分間ＵＶ光の真下に置いて、架橋を促進させた。これにより、このような自己架橋性コポリマーおよび光架橋性コポリマーは、立体リソグラフィ等の様々な作製方法を用いて組織工学的なスカフォードを構築するのに有用である。
【００４３】
３．スカフォード作製
ＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦ（またはＰＥＧＦ／ＰＣＬＦ、ＰＥＧＦ／ＰＰＦ配合物）とポロゲン（種々の粒度分布を有する塩）との混合物に対して、同様の架橋プロセスを行い、異なる多孔性を有するスカフォードを作製することができる。この多孔性はポロゲン含量によって制御することができる。架橋後、塩を、蒸留水中でスカフォードから３日間浸出させ、その間中、水を頻繁に換えた。スカフォードを真空中、少なくとも１２時間乾燥させた。また、固体作製方法および光立体画法を使用して、ＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦ（またはＰＥＧＦ／ＰＣＬＦ、ＰＥＧＦ／ＰＰＦ）スカフォードを作製することができる。
【００４４】
Ｅ．膨潤試験
架橋したＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦ（またはＰＥＧＦ／ＰＣＬＦ、ＰＥＧＦ／ＰＰＦ配合物）フィルムを上記の化学架橋プロセスにより、２つのガラスプレートおよび１ｍｍ厚のテフロンスペーサーから成る型で作製した。フィルムをいくつかの小さい長方形キューブ（１０ｍｍ×５ｍｍ）に切り取った。２つのキューブを塩化メチレンおよび水にそれぞれ浸漬させた。１週間後、キューブを溶媒から取り出し、それらの表面を重量測定前に吸い取ることによって乾燥させた。その後、キューブ中の溶媒を真空オーブン内で２時間排水して、乾燥したキューブを秤量した。膨潤率は、以下の式：
【数１】
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により求めることができ、式中、ＷdおよびＷsはそれぞれ、乾燥キューブおよび膨潤キューブの重量である。
【００４５】
架橋したＰＥＧＦを検査して、水性環境中の膨潤特性を示した。図８ａに示されるように、膨潤率は、ＰＥＧＦを作製するのに用いられるＰＥＧの長さに従って増大する。ＰＣＬＦは疎水性であるため、水を吸収することはできないが、塩化メチレンおよびテトラヒドロフラン等の有機溶媒中で著しく膨潤する。ＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦの両親媒性は、水中で１０６％（図８ａ）および塩化メチレン中で５０８％の平均膨潤率により立証することができる。また、これにより、親水性成分および親水性成分の両方の組成およびブロック長を調節することによってヒドロゲルの膨潤率を制御する１つのアプローチが提供される。図８ｂにおいて様々なＰＥＧＦ３．４Ｋ組成を有するＰＥＧＦ３．４ＫとＰＣＬＦ５３０との配合物によって形成されたハイブリッドポリマーネットワークは、ＰＣＬＦ５３０ネットワークに関して０からＰＥＧＦ３．４Ｋネットワークに関して４．５までの範囲の膨潤率の制御性を示した。これらのコポリマーは全て、異なる物理特性を有する様々な材料を調製するために、他の不飽和モノマー、マクロマーおよびポリマーとの共重合（または架橋）に適する。
【００４６】
従って、ポリ（エチレングリコールフマレート）を製造する改良された方法、およびポリ（エチレングリコールフマレート）と、ポリ（プロピレンフマレート）およびポリ（カプロラクトンフマレート）等の疎水性ポリマーとを化学的に架橋または光架橋して、制御可能な親水性を有する種々のヒドロゲルを生成する方法を提供する。ヒドロゲルは、組織工学用途および薬剤徐放用途のための生体適合性、生体吸収性、注入可能な、ｉｎ−ｓｉｔｕで硬化するスカフォードとして有用である。
【００４７】
一定の実施態様を参照しながら相当詳細に本発明を説明したが、制限のためにではなく、例証のために提供した記載の実施態様以外によって本発明を実施することができることが、当業者には理解されるであろう。従って、添付の請求項の範囲は、本明細書に含まれている実施態様の記載に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】ポリ（カプロラクトンフマレート）（ＰＣＬＦ）、ポリ（エチレングリコールフマレート）（ＰＥＧＦ）およびＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦの合成スキームを示す図である。
【図２】ポリ（エチレングリコールフマレート）（ＰＥＧＦ）およびポリ（カプロラクトンフマレート）（ＰＣＬＦ）の概略的な架橋および膨潤プロセスを示す図である。
【図３】ＰＣＬ５３０、ＰＣＬＦ５３０、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧＦ３．４ＫおよびＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦのフーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）スペクトルを示す図である。
【図４】ＰＣＬ５３０、ＰＣＬＦ５３０、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧＦ３．４ＫおよびＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦの1Ｈ  ＮＭＲ（４００．１ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、基準  ＴＭＳ）スペクトルを示す図であり、図中、Ｓは溶媒であり、およびアスタリスクは塩化メチレンによるシグナルを示す。
【図５】ＰＣＬ５３０、ＰＣＬＦ５３０、ＰＥＧ３．４Ｋ、ＰＥＧＦ３．４ＫおよびＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦの13Ｃ  ＮＭＲ（１００．６ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、基準  ＴＭＳ）スペクトルを示す図であり、図中、Ｓは溶媒である。
【図６】本明細書中に記載の例示的なポリマーの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）曲線を示す図である。
【図７】ＰＥＧＦ、ＰＥＧおよびＰＥＧＦ−ｃｏ−ＰＣＬＦの熱重量分析（ＴＧＡ）サーモグラムである。
【図８ａ】時間の関数である水中における種々のポリマーネットワークの膨潤率を示す図である（２５％、５０％および７５％はハイブリッドネットワーク中のＰＥＧＦ３．４Ｋ組成物を表す）。
【図８ｂ】ＰＥＧＦ３．４ＫおよびＰＣＬＦ５３０と、種々のＰＥＧＦ３．４Ｋ組成物との配合物によって形成されるハイブリッドネットワークの膨潤率を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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