(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む単鎖Ｆｃポリペプチドであって、該ＣＨ２及びＣＨ３ドメインがポリペプチド鎖内で機能的Ｆｃドメインを形成し、前記ポリペプチド鎖内で、第１のＣＨ２ドメインが第２のＣＨ２ドメインと二量体化され、第１のＣＨ３ドメインが第２のＣＨ３ドメインと二量体化されることを特徴とする単鎖ポリペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端からＣ末端への配列において、第１のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と場合によってはリンカーを介して連結し、該第１のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端で第２のＣＨ２ドメインのＮ末端とリンカーを介して連結し、該第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で場合によってはリンカーを介して該第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端からＣ末端への配列において、第１のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と連結し、該第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で場合によってはリンカーを介して第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、該第１のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結している、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
互いに二量体化される２つのＣＨ４ドメインをさらに含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１又は配列番号５２に示す配列を含む、請求項１〜４までのいずれか一項に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項６】
１つ又は複数の生物学的に活性な分子と連結している、請求項１〜５までのいずれか一項に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項７】
前記生物学的に活性な分子が、抗体断片を含む、請求項６に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項８】
前記抗体断片が、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ−ＣＨ１、ＶＬ−ＣＬ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はｓｃＦｖから選択される、請求項７に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項９】
前記抗体断片がＦａｂであり、前記ＦａｂのＶＨ−ＣＨ１鎖のＣ末端が前記単鎖ＦｃポリペプチドのＮ末端と遺伝子融合し、前記ＦａｂのＶＬ−ＣＬ鎖がジスルフィド結合によって前記ＶＨ−ＣＨ１鎖と連結している、請求項８に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項１０】
前記生物学的に活性な分子が、ヒトｇｐ１３０受容体の１つ若しくは複数のドメイン又はその断片を含む、請求項６に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項１１】
前記ヒトｇｐ１３０受容体のドメイン１又はその断片を含む、請求項１０に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項１２】
１つ又は複数のエフェクター分子が結合している、請求項１〜１１までのいずれか一項に記載の単鎖Ｆｃポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２までのいずれか一項に記載の単鎖Ｆｃポリペプチドをコードする配列からなる、単離されたＤＮＡ分子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載の１つ若しくは複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２までのいずれか一項に記載の前記単鎖Ｆｃポリペプチドを産生する方法であって、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することと、前記単鎖Ｆｃポリペプチドを分離することとを含む方法。
【請求項１７】
１つ又は複数の薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて、請求項１〜１２までのいずれか一項に記載の単鎖Ｆｃポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項１８】
他の活性成分をさらに含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１つ又は複数の免疫グロブリンＦｃドメインを含む単鎖ポリペプチドに関する。詳細には、本発明は、少なくとも１つの機能的Ｆｃドメインが鎖内に形成される単鎖ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンは、２つの同一のＨ鎖及び２つの同一のＬ鎖を含む二価のＹ字型分子である。ジスルフィド結合が、Ｈ鎖及びＬ鎖の一組、並びに２つのＨ鎖を結合する。それぞれの鎖は、配列が異なり抗原結合に関与する１つの可変領域から成り、これらはそれぞれＨ鎖及びＬ鎖に対するＶＨ及びＶＬ領域として知られている。またそれぞれの鎖は、少なくとも１つの定常領域から成る。Ｌ鎖において１つの定常領域（ＣＬ）が存在し、Ｈ鎖において少なくとも３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が、時にはアイソタイプに依存して４つめの定常領域（ＣＨ４）が存在する。ヒトでは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスを含む）並びにＩｇＭを含む抗体の５つの異なるクラス又はアイソタイプが存在する。
【０００３】
抗体のＦｃドメインは、典型的にはＦｃドメインを形成するために二量体化するそれぞれの鎖の少なくとも最後の２つのＨ鎖定常領域を含む。Ｆｃドメインは、抗体半減期の決定及び体全体に及ぶ分布、補体結合能及び細胞表面Ｆｃレセプターに対する結合を含む抗体エフェクター機能を提供する役割を担っている。Ｆｃドメインのこの特性は、この領域を有用な治療剤にし、Ｆｃドメインは受容体タンパク質に、たとえばエタナーセプトなどの他の非抗体タンパク質に融合された。Ｆｃドメイン融合は、研究試薬の「Ｆｃ標識」としても使用され、これは融合タンパク質の検出と精製を容易にする。さらにＦｃドメインを含む多くの代替抗体構造も記載されている。たとえばＤｕｍｏｎｔら、２００６、Ｂｉｏｄｒｕｇｓ、２０（３）１５１〜１６０、ＷＯ２００５００１０２５、ＷＯ２００５０７７９８１、ＷＯ２００５０１７１４８及びＨａｙｄｅｎら、１９９４、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１、３〜１５を参照のこと。ＷＯ２００５０７７９８１は、それぞれの鎖が２つのＦｃドメインを含み、すなわちそれぞれの抗体鎖が直鎖状配列でＣＨ２  ＣＨ３  ＣＨ２  ＣＨ３を含み、これらの領域が、２つの機能的Ｆｃドメインを形成するために二量体化して増強されたエフェクター機能を提供する抗体を記載している。ＷＯ２００５０１７１４８及び上述のＨａｙｄｅｎらは、Ｆｃドメインの半分に融合した単鎖Ｆｖ、すなわちｓｃ−Ｆｖ−ＣＨ２  ＣＨ３を含む単鎖ポリペプチドを記載している。これらのポリペプチドは、単量体又は二量体の両方として存在し得る。
【０００４】
抗体の結合特異性はこれらを有用な治療剤にしたが、抗体などの二価の分子は特定の細胞表面抗原に対して不適切な標的化剤であることが多い。二価の結合は、標的細胞に同時刺激、活性化及び／又は抗原変調を受けさせ、これにより細胞に補体を免れる手段及び抗体のＦｃドメインによって動員される種々のエフェクター細胞を提供することができる。この代わりに、このような細胞表面抗原を標的にするために、抗体は典型的には内在化後に細胞を死滅させる薬剤又は毒素と結合している。
【０００５】
対照的に、一価の抗体断片は表面抗原の再分布を引き起こさず、したがって同時刺激及び内在化が生じないので抗原変調を生じない。したがって、このような断片中で抗体の天然のエフェクター機能を保有し、コストも時間もかかる薬剤又は毒素の結合の必要を回避することが望ましい。１つのこのような抗体断片は例として、ＧｌｅｎｎｉｅとＳｔｅｖｅＮＳ０ｎ、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９５、７１２−７１３により、ウサギＩｇＧのタンパク質分解性切断によって作製された。この断片は、１個のＦａｂ結合サイトのみを含むが、完全なＦｃドメインを保有していた。この断片は、１つの鎖上でグリコシル化してその鎖をパパイン消化に耐性にし、１つのＦａｂアームを保存させるウサギＩｇＧ抗体Ａ１２アロタイプ変異体のパパイン消化により作製された。作製された断片は、完全なＩｇＧよりも細胞の補体媒介性溶解を引き起こすのに有効であることが示された。同様な断片が、タンパク分解によって（ＭｉｃｈａｅｌｓｅｎとＮａｔｖｉｇ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９７３、２、２９９〜３１２；ＭｉｃｈａｅｌｓｅｎとＮａｔｖｉｇ、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９７２、１、２５５〜２６８）、及び化学分解によって（ＷｉｎｅｓとＥａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ−Ｓｍｉｔｈ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９１、２８、８、８５５〜８６３）、ヒトＩｇＧから作製された。タンパク質分解を用いることは、長い調製時間を必要とし低収率と混合製品をもたらすので、これらの断片は商業的規模で作製するのには実際的ではない。
【０００６】
ＷＯ２００５００１０１２５は、Ｆｃドメイン及び生物学的に活性な分子を含む第１のポリペプチド鎖、並びに第１の鎖の生物学的に活性な分子を伴わないＦｃドメインを含む第２のポリペプチド鎖の２つのポリペプチド鎖を含むハイブリッドタンパク質を記載する。この２つの鎖は別々に作製して、二量体化するか又は化学的に結合する。これは所望の機能的分子を提供するが、調製法は複雑で低収量のクロマトグラフィー法を含んでいる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
（課題を解決するための手段）
驚くべきことに、本発明者らは現在、単鎖ポリペプチドとして機能的Ｆｃドメインを作製することが可能であることを見出している。したがって本発明のポリペプチドは、多量に組換えにより作製することができ、任意の適切な手段により結合領域などのその他の分子に結合させることができるという利点を有する。さらに、抗体の定常領域は鎖内でＦｃドメインを形成するので、本発明のポリペプチドは二量体化しにくく、所望の場合には二価の結合領域を回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）〜（ｃ）：抗体Ｆａｂ断片を含み、リンカーが第１のＣＨ３ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端を結合している本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドの３つの例の線図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）：抗体Ｆａｂ断片を含み、１つのリンカーが、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端を第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に結合し、別のリンカーが、第１のＣＨ３ドメインのＣ末端を第２のＣＨ３ドメインのＮ末端に結合している単鎖Ｆｃポリペプチドの３つの例の線図である。
【図３】（ａ）〜（ｃ）：抗体Ｆａｂ断片を含む、単鎖Ｆｃポリペプチドの３つの例の線図である。（ａ）：１つのリンカーが、第１のＣＨ４ドメインのＣ末端を第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に結合する。（ｂ）：第１のリンカーが、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端を第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に結合し、第２のリンカーが第２のＣＨ２ドメインのＣ末端を第１のＣＨ３ドメインのＮ末端に結合し、第３のリンカーが第１のＣＨ４ドメインのＣ末端を第２のＣＨ３ドメインのＮ末端に結合する。（ｃ）：第１のリンカーが第１のＣＨ３ドメインのＣ末端を第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に結合し、第２のリンカーが第２のＣＨ３ドメインのＣ末端を第１のＣＨ４ドメインのＮ末端に結合し、第３のリンカーが第１のＣＨ４ドメインのＣ末端を第２のＣＨ４ドメインのＮ末端に結合する。
【図４ａ】単鎖Ｆｃポリペプチドは、組換えによりＮＳ０細胞表面上に発現した抗原と結合することを示している図である。
【図４ｂ】単鎖Ｆｃポリペプチドは、活性化Ｔ細胞表面上で自然に発現した抗原と結合することを示している図である。
【図５ａ】単鎖Ｆｃポリペプチドが、ＮＳ０細胞の細胞傷害性を補体の存在下で誘導できることを示す図である。
【図５ｂ】単鎖Ｆｃポリペプチドが、ＮＳ０細胞の細胞傷害性を補体の非存在下では誘導できないことを示す図である。
【図５ｃ】単鎖Ｆｃポリペプチドが、活性化Ｔ細胞の補体依存性細胞傷害を誘導できることを示す図である。
【図５ｄ】単鎖Ｆｃポリペプチドが、活性化Ｔ細胞の補体依存性細胞傷害を誘導する単鎖Ｆｃポリペプチドの能力を示す図である。
【図６】ＩｇＧ１由来の単鎖Ｆｃポリペプチドの配列例である。ヒンジ配列はイタリック体で示し、リンカーは下線で示す。（ａ）図１（ａ）で示す形式（ｂ）図１（ｂ）で示す形式（ｃ）図１（ｃ）で示す形式（ｄ）図２（ａ）で示す形式（ｅ）図２（ｂ）で示す形式（ｆ）図２（ｃ）で示す形式
【発明を実施するための形態】
【０００９】
したがって、本発明は、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む単鎖ポリペプチドであって、前記ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが鎖内で機能的Ｆｃドメインを形成することを特徴とする単鎖ポリペプチドを提供する。本発明の単鎖ポリペプチドの機能的Ｆｃドメインは、２つの鎖の二量体化によって形成されない。すなわち２つのＣＨ２領域及び２つのＣＨ３領域は単鎖中に存在し、単鎖中で機能的Ｆｃドメインを形成する。したがって本発明は、ＣＨ２及びＣＨ３領域は、別のポリペプチド鎖との二量体化によってではなく鎖内で機能的Ｆｃドメインを形成することを特徴とする前記２つのＣＨ２領域並びに２つのＣＨ３領域を含む単鎖ポリペプチドを提供する。したがって、本発明の単鎖ポリペプチドでは、ポリペプチド鎖内で第１のＣＨ２領域は第２のＣＨ２領域と二量体化され、第１のＣＨ３領域は第２のＣＨ３領域と二量体化される。
【００１０】
本明細書で用いる用語「機能的」とは、通常はＦｃドメインに関与する１つ又は複数のエフェクター機能を提供するために単鎖ポリペプチド中に形成されるＦｃドメインの能力を意味するが、他の機能をこのような領域に作製し得ることは理解されるであろう。エフェクター機能の例には、体全体に及ぶＦｃポリペプチドの半減期及び／又は分布の決定、補体を固定するＦｃポリペプチドの能力並びに細胞表面Ｆｃレセプターに結合するＦｃポリペプチドの能力が含まれる。このようなエフェクター機能の例には、限定されるものではないが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が含まれる。
【００１１】
本発明のＦｃドメインは、抗体の任意の適切な種類及び／又はクラスに由来し得る４つ又はそれ以上の定常領域を含む。定常領域はヒトであることが好ましい。ヒトでは、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む）並びにＩｇＭを含む抗体の５つの異なるクラス又はアイソタイプが存在する。任意の適切なＦｃドメインを、必要なエフェクター機能に応じて使用することができる。典型的には本明細書で用いるＦｃドメインという用語は、ＩｇＡ、ＩｇＤとＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにＩｇＥとＩｇＭの最後の３つの定常領域ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４）を意味するが、特定の状況下においてはドメイン全てが必要とされないことは理解されるであろう。たとえばＩｇＥ又はＩｇＭの場合、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのみで十分であり得る。１つ以上のＦｃドメインが、単鎖Ｆｃポリペプチド中に形成され得ること、及びこれらのＦｃドメインは、同じ又は異なるアイソタイプに由来し得ることも理解されるであろう。
【００１２】
抗体ドメインの残基には、Ｋａｂａｔらによって考案された方式に従って慣例通りに番号付けされている。この方式は、Ｋａｂａｔら、１９８７、免疫学的に重要なタンパク質の配列、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ、米国（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ）（以下、Ｋａｂａｔら（上述））に記載されている。特に示さない限り本明細書でこの番号付け方式が用いられる。
【００１３】
一つの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＡに由来し、単鎖Ｆｃポリペプチドは２つのＣα２ドメイン及び２つのＣα３ドメインを含む。
【００１４】
一つの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＭに由来し、単鎖Ｆｃポリペプチドは２つのＣμ２ドメイン、２つのＣμ３ドメイン及び２つのＣμ４ドメインを含む。
【００１５】
一つの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＤに由来し、単鎖Ｆｃポリペプチドは２つのＣδ２ドメイン及び２つのＣδ３ドメインを含む。
【００１６】
一つの実施形態では、ＦｃドメインはＩｇＥに由来し、単鎖Ｆｃポリペプチドは２つのＣε２ドメイン、２つのＣε３ドメイン及び２つのＣε４ドメインを含む。
【００１７】
本発明のＦｃドメインはＩｇＧに由来し、単鎖Ｆｃポリペプチドは２つのＣγ２及び２つのＣγ３ドメインを含むことが好ましい。本発明に使用するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣγ２ドメインのための好ましい配列は、それぞれ配列番号２、１５、２８及び４１で提供され、本発明に使用するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のＣγ３ドメインのための好ましい配列は、それぞれ配列番号３、１６、２９及び４２で提供される。
【００１８】
したがって一つの実施形態では、本発明はＧγ２及びＧγ３ドメインが、鎖内で機能的Ｆｃドメインを形成することを特徴とする、すなわちポリペプチド鎖中で、第１のＣγ２ドメインが第２のＣγ２ドメインと二量体化し、第１のＣγ３ドメインが第２のＣγ３ドメインと二量体化することを特徴とする、前記２つのＣγ２ドメイン及び２つのＣγ３ドメインを含む単鎖ポリペプチドを提供する。
【００１９】
本発明のＦｃドメインの作製に用いる定常領域ドメインは、上述した天然の定常ドメインの変異体を含み得ることが理解されよう。このような変異体は、野生型定常ドメインと比べ１つ又は複数のアミノ酸変異を含み得る。一例では、本発明のＦｃドメインは、配列が野生型定常ドメインと異なる少なくとも１つの定常ドメインを含む。変異体定常ドメインは、野生型定常ドメインより長く又は短くすることができることが理解されよう。変異体定常ドメインは、野生型定常ドメインと少なくとも５０％同一であるか又は類似していることが好ましい。本明細書で用いる用語「同一」とは、整列配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。本明細書で用いる用語「類似」とは、整列配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。たとえばロイシンが、イソロイシン又はバリンで置換され得る。しばしば互いに置換され得るその他のアミノ酸には、
−フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
−リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；及び
−システイン及びメチオニン（硫黄を含む側鎖を有するアミノ酸）が含まれるが、これらに限定されない。
同一性と類似性の程度は、容易に算出することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．と  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）。一例では、変異体定常ドメインは、野生型定常ドメインと少なくとも６０％同一であるか又は類似している。別の例では、変異体定常ドメインは、少なくとも７０％同一であるか又は類似している。別の例では、変異体定常ドメインは、少なくとも８０％同一であるか又は類似している。別の例では、変異体定常ドメインは、少なくとも９０％同一であるか又は類似している。別の例では、変異体定常ドメインは、少なくとも９５％同一であるか又は類似している。
【００２０】
一つの実施形態では、変異体定常ドメインは、野生型Ｆｃドメインと比べて等価なＦｃエフェクター機能を提供する。一つの実施形態では、変異体定常ドメインは、改善されたエフェクター機能を提供する。一つの実施形態では、変異体定常ドメインは、変更されたエフェクター機能を提供する。一例では、Ｆｃドメインは、延長された半減期以外のエフェクター機能を提供しない。一例では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲ結合を提供するが、Ｃ１ｑ結合は提供しない。一例では、Ｆｃドメインは、Ｃｌｑ結合を提供するが、ＦｃＲ結合は提供しない。
【００２１】
多くのＦｃ変異体ポリペプチドが当技術分野で公知であり、たとえばＩｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０００、１６４、４１７８〜４１８４及びＳｈｉｅｌｄｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１、２７６、９、６５９１〜６６０４を参照のこと。Ｆｃ変異体の包括的なリストが、ＷＯ２００５０７７９８１により提供され（特に段落番号８０を参照のこと）、これらは本明細書中に参考として援用される。
【００２２】
Ｆｃ変異体の例には、ＩｇＧ１におけるＮ３１４Ｑ（若しくはＮ２９７Ｑ）、Ｔ３１８Ａ（Ｔ２９９Ａ）、Ｐ３５０Ａ（Ｐ３３１Ａ）を伴うＡ３４９Ｓ（Ａ３３０Ｓ）、Ｌ２４８Ａ（Ｌ２３５Ａ）を伴うＬ２４７Ａ（Ｌ２３４Ａ）又はＰ３４８Ａ（Ｐ３２９Ａ）（括弧中の番号は、ＥＵ番号付けである）が含まれる。ＩｇＧ４  Ｆｃドメインが使用される場合には、Ｓ２４１Ｐ（Ｓ２２８Ｐ）突然変異を使用し得る（Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０  （１）、１０５〜１０８）。当技術分野で知られている慣用的方法を使用して、任意の適切な変異体が作製でき試験できることは理解されよう。
【００２３】
本発明の単鎖ＦｃポリペプチドのＣＨ２、ＣＨ３及び存在する場合にはＣＨ４ドメインが、これらドメインが鎖内で機能的Ｆｃドメインを依然として形成することができるように、単一のポリペプチド鎖内で連結している。したがって任意の適切なアミノ酸リンカーが、単鎖ポリペプチド内で機能的Ｆｃドメインを形成できるならば、これらのアミノ酸リンカーを使用して、これらの定常ドメインを連結することができる。本発明のリンカーに用いられる適切なアミノ酸には、限定されるものではないが、小さな可撓性アミノ酸、たとえばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒが含まれる。一つの実施形態では、このリンカーはグリシン残基を含むか又はグリシン残基から成る。一つの実施形態では、このリンカーはセリン残基を含むか又はセリン残基から成る。一つの実施形態では、このリンカーはアラニン残基を含むか又はアラニン残基から成る。一つの実施形態では、このリンカーはスレニオン残基を含むか又はスレオニン残基から成る。一つの実施形態では、このリンカーはグリシン及びセリン残基を含むか又はグリシン及びセリン残基から成る。一つの実施形態では、このリンカーはグリシン、セリン及びアラニン残基を含むか又はグリシン、セリン及びアラニン残基から成る。一つの実施形態では、このリンカーはグリシン、セリン、アラニン及びスレオニン残基を含むか又はグリシン、セリン、アラニン及びスレオニン残基から成る。疑義を回避するため、グリシン及び／又はセリン及び／又はアラニン及び／又はスレオニン残基の全ての置換を含むことが理解されよう。一例では、このリンカーは３０〜８０％のグリシン残基及び２０〜７０％のセリン残基を含むか又は３０〜８０％のグリシン残基及び２０〜７０％のセリン残基から成る。一例では、このリンカーは３５〜５０％のグリシン残基、３０〜４０％のセリン残基、５〜１５％のスレオニン残基及び１０〜２０％のアラニン残基を含むか、又は３５〜５０％のグリシン残基、３０〜４０％のセリン残基、５〜１５％のスレオニン残基及び１０〜２０％のアラニン残基から成る。一例では、このアミノ酸残基はリンカー中にランダムに分布している。適切なリンカーの具体例には、たとえばＧＳ、ＧＳＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ及びＧＧＧＳなどの配列の繰り返しを含むグリシン−セリンポリマーが含まれる。
【００２４】
一つの実施形態では、本発明の単鎖ポリペプチドのＦｃドメインは、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む。
【００２５】
一つの実施形態では、本発明は、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む単鎖Ｆｃポリペプチドであって、（図１で示すように）Ｎ末端からＣ末端への配列において、第１のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、前記第１のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端で第２のＣＨ２ドメインのＮ末端とリンカーを介して連結し、第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結している単鎖Ｆｃポリペプチドを提供する。
【００２６】
一つの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインが、第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と直接連結している、すなわちそのＣ末端で遺伝子融合している。
【００２７】
一つの実施形態では、第２のＣＨ２ドメインが、第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と直接連結している、すなわちそのＣ末端で遺伝子融合している。
【００２８】
ＣＨ３ドメイン（複数可）と遺伝子融合した適切なＣＨ２ドメインの例を、配列番号５、１８、３１及び４４に示す。
【００２９】
一つの実施形態では、リンカーを使用して、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端を第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結する。
【００３０】
一つの実施形態では、リンカーを使用して、第２のＣＨ２ドメインのＣ末端を第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結する。
【００３１】
リンカーを使用して、（ｉ）第１のＣＨ２ドメインのＣ末端を第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と、且つ／又は（ｉｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端を第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結する場合、このリンカーは、鎖内中で機能的Ｆｃドメインの形成を可能にするのに十分な長さとなる。典型的には、このリンカーは、長さがわずか数個のアミノ酸であり、好ましくは長さが１０個のアミノ酸未満となる。リンカーが、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方で使用される場合、上記２つのリンカーは、同一か又は異なり得る。リンカーはほぼ同じ長さとなることが好ましい。
【００３２】
第１のＣＨ３ドメインのＣ末端を、第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と連結するために使用するリンカーは、鎖内で機能的Ｆｃドメインの形成を可能にするのに十分に長くする、すなわち、ポリペプチド鎖内で第１のＣＨ２ドメインが第２のＣＨ２ドメインと二量体化し、第１のＣＨ３ドメインが第２のＣＨ３ドメインと二量体化することを可能にするのに十分に長くする。一つの実施形態では、リンカーは長さが約３０〜１００アミノ酸であり、別の実施形態では、リンカーは長さが約４０〜１００アミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーは長さが約４０〜９０アミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーは、長さが約４０〜８０アミノ酸であり、好ましくは長さが４０〜７０アミノ酸である。これらのリンカーに使用する適切なアミノ酸は、本明細書の上記に記載されている。一例では、リンカーは、３５〜５０％のグリシン残基、３０〜４０％のセリン残基、５〜１５％のスレオニン残基及び１０〜２０％のアラニン残基を含むか又は３５〜５０％のグリシン残基、３０〜４０％のセリン残基、５〜１５％のスレオニン残基及び１０〜２０％のアラニン残基から成る。一例では、アミノ酸残基は、リンカー中にランダムに分布している。適切なリンカーの例は、配列番号６２において提供される。一つの実施形態では、リンカーは、好ましくはそのＣ末端に向かって１つ又は複数のシステイン残基を含み得る。一つの実施形態では、リンカーは、そのＣ末端に１つ若しくは複数のシステイン残基を含む抗体又はその変異体のヒンジ領域の全部若しくは一部の配列を含み得る。本発明のリンカーに使用する適切なヒンジ配列の例は、米国特許第５，６７７，４２５号、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１において提供され、これらは本明細書中に参考として援用される。適切なヒンジの他の例は、配列番号５３〜５７において提供される。したがって一例では、配列番号６２のリンカーは、そのＣ末端にさらに配列番号５３〜５７で提供される配列のいずれか１つを含む。この実施形態において、リンカーは長さが約３０〜１３０個のアミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーは長さが約５０〜１００個のアミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーは長さが約５０〜８０個のアミノ酸である。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、２つのＣＨ２ドメイン及び２つのＣＨ３ドメインを含む単鎖Ｆｃポリペプチドであって、（図２で示すように）Ｎ末端からＣ末端への配列において、第１のＣＨ２ドメインが、リンカーを介してそのＣ末端で第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と連結し、前記第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、前記第１のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結している単鎖Ｆｃポリペプチドを提供する。
【００３４】
一つの実施形態では、第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と遺伝子融合している。
【００３５】
一つの実施形態では、第２のＣＨ２ドメインのＣ末端が、リンカーによって第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と結合している。
【００３６】
リンカーを使用して、第２のＣＨ２ドメインのＣ末端を第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結する場合、このリンカーは、鎖内で機能的Ｆｃドメインの形成を可能にするのに十分な長さとなる。典型的には、このリンカーは、長さがわずか数個のアミノ酸となり、好ましくは長さが１０個未満のアミノ酸となる。
【００３７】
第１のＣＨ２ドメインのＣ末端を、第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と連結するために使用されるリンカー、及び第１のＣＨ３ドメインのＣ末端を、第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結するために使用されるリンカーは、鎖内で機能的Ｆｃドメインを形成することを可能にするのに十分に長くする。これらの２つのリンカーは、組成及び／又は長さの両方で同じか又は異なり得ることが理解されよう。一つの実施形態では、リンカーの一方又は両方は、長さが１５個と５０個の間のアミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーの一方又は両方は、長さが１５個と４０個の間のアミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーの一方又は両方は、長さが２０個と４０個の間のアミノ酸である。別の実施形態においては、リンカーの一方又は両方は、長さが２０個と３５個の間のアミノ酸である。これらのリンカーに使用する適切なアミノ酸は、本明細書の上記に記載されている。一例では、リンカーの一方又は両方は、５０〜８０％のグリシン残基及び１０〜３０％のセリン残基を含むか又は５０〜８０％のグリシン残基及び１０〜３０％のセリン残基から成る。一例では、アミノ酸残基はリンカー中にランダムに分布している。一例では、リンカーは配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎ＝３〜８である。一つの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端の間のリンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎ＝５（配列番号６３）である。一つの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインのＣ末端と第２のＣＨ３ドメインのＮ末端との間のリンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎ＝５（配列番号６３）である。
【００３８】
一つの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインと第２のＣＨ２ドメイン間のリンカーは、好ましくはそのＣ末端に向かって１つ又は複数のシステイン残基を含む。一つの実施形態では、リンカーは、上述の抗体ヒンジ配列又はその変異体の全部若しくは一部を含む。したがって一つの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端と配列番号６３に示す配列を有する第２のＣＨ２ドメインのＮ末端との間のリンカーは、そのＣ末端にさらに配列番号５３〜５７で提供されるヒンジ配列のいずれか１つを含む。この実施形態において、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端との間のリンカーは、長さが２５から９０アミノ酸である。一つの実施形態では、このリンカーは長さが２５から８０アミノ酸である。一つの実施形態では、このリンカーは長さが２５から７０アミノ酸である。一つの実施形態では、このリンカーは長さが２５から６０アミノ酸である。一つの実施形態では、このリンカーは長さが２５から５０アミノ酸である。一つの実施形態では、このリンカーは長さが２５から４０アミノ酸である。
【００３９】
一つの実施形態では、本発明の単鎖ＦｃポリペプチドのＦｃドメインは、２つのＣＨ２ドメイン、２つのＣＨ３ドメイン及び１つ又は２つのＣＨ４ドメイン、好ましくは２つのＣＨ４ドメインを含む。
【００４０】
一つの実施形態では、本発明は、２つのＣＨ２ドメイン、２つのＣＨ３ドメイン及び２つのＣＨ４ドメインを含む単鎖Ｆｃポリペプチドを提供し、Ｎ末端からＣ末端への配列において、第１のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、前記第１のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と連結し、前記第１のＣＨ４ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と連結し、この第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、この第２のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端で第２のＣＨ４ドメインのＮ末端と連結している（たとえば図３ａを参照）。
【００４１】
一つの実施形態では、１つ又は複数の以下のドメインが直接連結している。すなわち（ｉ）第１のＣＨ２ドメインのＣ末端が第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端が第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉｉ）第１のＣＨ３ドメインのＣ末端が第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と、（ｉｖ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端が第２のＣＨ４ドメインのＮ末端と遺伝子融合している。
【００４２】
一つの実施形態では、１つ又は複数の以下のドメインがリンカーにより結合される。すなわち（ｖ）第１のＣＨ２ドメインのＣ末端が第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｖｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端が第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と（ｖｉｉ）第１のＣＨ３ドメインのＣ末端が第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と、（ｖｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端が第２のＣＨ４ドメインのＮ末端と結合している。
【００４３】
リンカーが（ｖ、ｖｉ、ｖｉｉ又はｖｉｉｉ）のいずれか１つの間に存在する場合、このリンカーは、鎖内で機能的Ｆｃドメインの形成を可能にするのに十分な長さとなる。典型的には、リンカーは長さがわずか数個のアミノ酸となる。１つ以上のリンカーがある場合、これらは同じか又は異なり得ることが理解されよう。リンカーはほぼ同じ長さであることが好ましい。
【００４４】
第１のＣＨ４ドメインのＣ末端を第２のＣＨ２ドメインのＮ末端に結合するために使用されるリンカーは、鎖内で機能的Ｆｃドメインを形成することを可能にするのに十分に長くする。一つの実施形態では、リンカーは長さが約５０〜１００個のアミノ酸であり、別の実施形態においては、リンカーは長さが約６０〜１００個のアミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーは長さが約７０〜１００個のアミノ酸であり、好ましくは長さが８０〜１００個のアミノ酸である。これらのリンカーに使用する適切なアミノ酸は、本明細書の上記に記載されている。一つの実施形態では、リンカーは、好ましくはそのＣ末端に向かって、１つ又は複数のシステイン残基を含み得る。一つの実施形態では、リンカーは、上述の抗体ヒンジ配列又はその変異体の全部又は一部を含む。
【００４５】
別の実施形態においては、本発明は、２つのＣＨ２ドメイン、２つのＣＨ３ドメイン及び２つのＣＨ４ドメインを含む単鎖Ｆｃポリペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端への配列において、第１のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と連結し、前記第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、前記第１のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と連結し、この第１のＣＨ４ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、この第２のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端で第２のＣＨ４ドメインのＮ末端に結合と連結している単鎖Ｆｃポリペプチドを提供する（たとえば図３ｂを参照）。
【００４６】
一つの実施形態では、１つ又は複数の以下のドメインが直接連結している。すなわち（ｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端が第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉ）第１のＣＨ３ドメインのＣ末端が第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と、（ｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端が第２のＣＨ４ドメインのＮ末端と遺伝子融合している。
【００４７】
一つの実施形態では、１つ又は複数の以下のドメインが、リンカーにより結合している。すなわち（ｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端が第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉ）第１のＣＨ３ドメインのＣ末端が第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と、（ｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端が第２のＣＨ４ドメインのＮ末端と結合している。
【００４８】
リンカーが１つ又は複数の（ｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端と第１のＣＨ３ドメインのＮ末端との間、（ｉｉ）第１のＣＨ３ドメインのＣ末端と第１のＣＨ４ドメインのＮ末端との間、（ｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端と第２のＣＨ４ドメインのＮ末端との間に存在する場合、このリンカーは鎖内で機能的Ｆｃドメインの形成を可能にするのに十分な長さとなる。典型的には、リンカーは長さがわずか数個のアミノ酸となる。複数のリンカーが存在する場合、これらは同じか又は異なり得ることが理解されよう。リンカーはほぼ同じ長さであることが好ましい。
【００４９】
第１のＣＨ２ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端との間のリンカー及び第１のＣＨ４ドメインのＣ末端と第２のＣＨ３ドメインのＮ末端との間のリンカーは、鎖内で機能的Ｆｃドメインを形成することを可能にするのに十分に長くする。これらのリンカーに適切なアミノ酸は、本明細書の上記に記載されている。
【００５０】
第１のＣＨ２ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端との間のリンカーは、典型的には長さが１５から４０のアミノ酸である。別の実施形態においては、リンカーは、長さが２０から３５アミノ酸である。一つの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端との間のリンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎ＝５（配列番号：６３）である。
【００５１】
一つの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインと第２のＣＨ２ドメイン間のリンカーは、好ましくはそのＣ末端に向かって１つ又は複数のシステイン残基を含む。一つの実施形態では、リンカーは、１つ又は複数のシステイン残基を含み得る上述の抗体ヒンジ配列又はその変異体の全部又は一部を含む。適切なヒンジ配列は、配列番号５３〜５７に提供される配列を含む。
【００５２】
第１のＣＨ４ドメインのＣ末端と第２のＣＨ３ドメインのＮ末端との間のリンカーは、典型的には長さが約３０〜１００アミノ酸であり、別の実施形態においては、リンカーは、長さが約４０〜１００アミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーは、長さが約４０〜８０アミノ酸であり、好ましくは長さが４０〜７０アミノ酸である。適切なリンカーの例は配列番号６２において提供される。
【００５３】
別の実施形態においては、本発明は２つのＣＨ２ドメイン、２つのＣＨ３ドメイン及び２つのＣＨ４ドメインを含む単鎖Ｆｃポリペプチドを提供し、Ｎ末端からＣ末端への配列において、第１のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、前記第１のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と連結し、前記第２のＣＨ２ドメインが、そのＣ末端で第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と連結し、この第２のＣＨ３ドメインが、そのＣ末端で第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と連結し、この第１のＣＨ４ドメインが、そのＣ末端でリンカーを介して第２のＣＨ４ドメインのＮ末端と連結している（例えば図１ｃを参照）。
【００５４】
一つの実施形態では、１つ又は複数の以下のドメインが直接連結している。すなわち（ｉ）第１のＣＨ２ドメインのＣ末端が第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端が第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端が第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と遺伝子融合している。
【００５５】
一つの実施形態では、１つ又は複数の以下のドメインが、リンカーにより結合している。すなわち（ｉ）第１のＣＨ２ドメインのＣ末端が第１のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端が第２のＣＨ３ドメインのＮ末端と、（ｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端が第１のＣＨ４ドメインのＮ末端と結合している。
【００５６】
リンカーが１つ又は複数の（ｉ）第１のＣＨ２ドメインのＣ末端と第１のＣＨ３ドメインのＮ末端との間、（ｉｉ）第２のＣＨ２ドメインのＣ末端と第２のＣＨ３ドメインのＮ末端との間、（ｉｉｉ）第２のＣＨ３ドメインのＣ末端と第１のＣＨ４ドメインのＮ末端との間に存在する場合、このリンカーは鎖内で機能的Ｆｃドメインの形成を可能にするのに十分な長さとなる。典型的には、リンカーは長さがわずか数個のアミノ酸となる。複数のリンカーが存在する場合、これらは同じか又は異なり得ることが理解されよう。リンカーはほぼ同じ長さであることが好ましい。
【００５７】
第１のＣＨ３ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端との間のリンカー及び第１のＣＨ４ドメインのＣ末端と第２のＣＨ４ドメインのＮ末端との間のリンカーは、鎖内で機能的Ｆｃドメインの形成を可能にするのに十分な長さとなる。
【００５８】
第１のＣＨ４ドメインのＣ末端と第２のＣＨ４ドメインのＮ末端との間のリンカーは、典型的には長さが１５から４０アミノ酸である。別の実施形態においては、リンカーは長さが２０から３５アミノ酸である。一つの実施形態では、第１のＣＨ４ドメインのＣ末端と第２のＣＨ４ドメインのＮ末端との間のリンカーは、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、ここでｎ＝５（配列番号６３）である。
【００５９】
第１のＣＨ３ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端との間のリンカーは、典型的には長さが約３０〜１００アミノ酸であり、別の実施形態においては、リンカーは長さが約４０〜１００アミノ酸である。一つの実施形態では、リンカーは長さが約４０〜８０アミノ酸であり、好ましくは長さが４０〜７０アミノ酸である。適切なリンカーの例は配列番号６２において提供される。
【００６０】
一つの実施形態では、第１のＣＨ３ドメインと第２のＣＨ２ドメインとの間のリンカーは、好ましくはそのＣ末端に向かって１つ又は複数のシステイン残基を含む。一つの実施形態では、このリンカーは、１つ又は複数のシステイン残基を含み得る上述の抗体ヒンジ配列又はその変異体の全部若しくは一部を含む。適切なヒンジ配列は、配列番号５３〜５７を含む。
【００６１】
一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、第１のＣＨ２ドメインのＮ末端と遺伝子融合したアミノ酸リンカーをさらに含む。このリンカーは、任意の適切なアミノ酸を含み、任意の適切な長さであり得る。一つの実施形態では、リンカーは１つ又は複数のシステイン残基を含む。一つの実施形態では、第１のＣＨ２ドメインのＮ末端に遺伝子融合したリンカーは、上述の抗体ヒンジ配列又はその変異体の全部又は一部を含む。一つの実施形態では、リンカーは配列番号５３〜５７のいずれか１つに示す配列を含む。一つの実施形態では、リンカー中に存在する１つ又は複数のシステイン残基が、以下のリンカーのいずれか１つに存在する１つ又は複数のシステイン残基にジスルフィド結合しており、（ｉ）第１のＣＨ３ドメインのＣ末端と第２のＣＨ２ドメインのＮ末端を結合するリンカー（たとえば図１ａを参照）、（ｉｉ）第１のＣＨ２ドメインのＣ末端を第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と結合するリンカー（たとえば図２ａを参照）又は（ｉｉｉ）第１のＣＨ４ドメインのＣ末端を第２のＣＨ２ドメインのＮ末端と結合するリンカーが存在する。
【００６２】
別の実施形態においては、Ｎ末端に融合されたリンカーは、１つ又は複数のシステインが別のアミノ酸を、好ましくはセリンを置換している抗体のヒンジ領域又はその変異体の全部又は一部を含み得る。このタイプの適切なリンカーの例は、配列番号５８〜６１において提供される。
【００６３】
本発明による単鎖Ｆｃポリペプチドの例は、ＩｇＧ１、２、３及び４に対して、それぞれ配列番号８〜１３、２１〜２６、３４〜３９及び４７〜５２において提供される。たとえばＩｇＧ１配列の例については図６も参照されたい。本発明はまた、上述したようにこれらの配列の変異体にも拡張される。一例では、本発明は、配列番号８〜１３、２１〜２６、３４〜３９及び４７〜５２に示す配列のいずれか１つと少なくとも７０％の同一性又は類似性を有する配列を含む単鎖Ｆｃポリペプチドを提供する。別の例では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、配列番号８〜１３、２１〜２６、３４〜３９及び４７〜５２に示す配列のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。別の例では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、配列番号８〜１３、２１〜２６、３４〜３９及び４７〜５２に示す配列のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する配列を含む。別の例では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、配列番号８〜１３、２１〜２６、３４〜３９及び４７〜５２に示す配列のいずれか１つと少なくとも９５％若しくは９８％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
【００６４】
一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、第１のＣＨ２ドメインのＮ末端と、場合によってはヒンジを介して融合したＣＨ１ドメインをさらに含む。適切なＣＨ１ドメインの例は、配列番号１、１４、２７及び４０において提供される。
【００６５】
本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、治療、診断及び研究用途を含む多くの用途に使用することができる。本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、さらにＮ末端及び／又はＣ末端及び／又はポリペプチド上の他の場所で融合するか又は結合され得る１つ若しくは複数のその他の分子を含むことが好ましい。このような分子には、限定されるものではないが、核酸、小分子、炭水化物、タンパク質並びにたとえば受容体タンパク質、抗体及び抗体断片を含むペプチドが含まれる。単鎖Ｆｃポリペプチドは、たとえば化学的結合、化学的架橋結合又は遺伝子融合を含む当技術分野で知られている任意の適当な手段により、場合によってはリンカー（アミノ酸又は化学物質）を介して別の分子と連結することができる。一つの実施形態では、単鎖Ｆｃポリペプチドは、そのＮ末端に抗体ヒンジなどのシステインを含むリンカーを含み、これらの遊離システインの１つが、別の分子、好ましくは後述するように生物学的に活性な分子に対する結合部位として使用される。
【００６６】
一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、たとえばタンパク質の精製及び／又はタンパク質の検出を助けるＦｃ標識として使用される。したがって１つの実施形態では、単鎖Ｆｃポリペプチドは、さらにそのＮ末端に別のタンパク質の全部又は一部を含む。このようなＦｃ融合は、一般に利用できるＦｃ融合とは異なり好都合にも二量体化せず、これによって融合タンパク質は単量体のままであることを確実にする。たとえば精製後に、Ｆｃドメインを除去できることが望まれる特定の適用例では、単鎖Ｆｃポリペプチドは、切断可能なリンカーを介して別のタンパク質と連結することができる。
【００６７】
一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、そのＮ末端及び／又はＣ末端で生物学的に活性な分子と連結している。この生物学的に活性な分子は、核酸、小分子、炭水化物、受容体タンパク質又は免疫グロブリンを含む任意のタンパク質又は他の適切な分子であり得る。生物学的に活性な分子のいくつかの例には、酵素、抗体断片、ドメイン抗体、単鎖抗体、アプタマー、ミクロボディ（商標）、タンパク質骨格に基づく結合剤（たとえば、ＮｙｇｒｅｎとＵｈｌｅｎ、１９９７、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、７、４６３〜４６９を参照のこと）、バーサボディ（ｖｅｒｓａｂｏｄｉｅｓ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、アドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、フィロマー（ｐｈｙｌｏｍｅｒｓ）、アプタマー、環状ペプチド、ペプチド、抗ウイルス剤、止血剤及びサイトカイン及び増殖因子、たとえばＥＰＯ、ＲＡＮＴＥＳ、インターロイキン、たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７、インターフェロン、たとえばインターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、たとえばＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦが含まれる。
【００６８】
一つの実施形態では、生物学的に活性な分子を、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドを所望の標的、たとえば標的タンパク質と接触させる。一つの実施形態では、生物学的に活性な分子が、タンパク質を所望の標的に結合する。一例では、標的タンパク質は、細胞結合性タンパク質、たとえば細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞若しくは腫瘍細胞などの細胞上の細胞表面タンパク質であり、又は可溶タンパク質であり得る。また標的タンパク質は、病気又は感染の間にアップレギュレートされているタンパク質、たとえば受容体及び／又はこの受容体に対応するリガンドなどの任意の医学的に関連するタンパク質であり得る。細胞表面タンパク質の具体例には、接着分子、たとえばβ１インテグリンなどのインテグリン、たとえばＶＬＡ−４、Ｅセレクチン、Ｐセレクチン又はＬセレクチン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ４０Ｌ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２２、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ジュジュリン２（ｄｕｄｕｌｉｎ２）、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１と２）、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、及びＶＥＧＦ、及び適切な場合にはこれらの受容体が含まれる。
【００６９】
一つの実施形態では、標的タンパク質は可溶性タンパク質である。可溶性タンパク質には、インターロイキン、たとえばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６又はＩＬ−１７、ウイルスタンパク質、たとえば呼吸系発疹ウイルス又はサイトメガロウィルスタンパク質、免疫グロブリン、たとえばＩｇＥ、インターフェロン、たとえばインターフェロンα、インターフェロンβ又はインターフェロンγ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、コロニー刺激因子、たとえばＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦ、並びに血小板由来成長因子、たとえばＰＤＧＦ−α、及びＰＤＧＦ−β及び適切な場合にはこれらの受容体が含まれる。
【００７０】
一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、生物学的に活性な分子が結合する特定のタンパク質の活性を機能的に変更するために使用され得る。たとえば単鎖Ｆｃポリペプチドは、タンパク質の活性を中和、拮抗又は作動し得る。一つの実施形態では、生物学的に活性な分子を介する細胞に対する単鎖Ｆｃポリペプチドの結合により、たとえば補体依存性細胞傷害を介して細胞が死滅する。
【００７１】
一つの実施形態では、生物学的に活性な分子は、一価の結合ドメインであり、特に一価のタンパク質、たとえば受容体若しくはこれらの断片又は免疫グロブリン若しくはこれらの断片である。
【００７２】
一つの実施形態では、生物学的に活性な分子は、細胞表面上又は細胞内で天然に発現され得る受容体である。適切な受容体の例には、限定されるものではないが、ウイルス受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体、ホルモン受容体及び細菌受容体が含まれる。本明細書中で用いる用語「受容体」はまた、このような受容体の適切な断片も含み、この一つの例には受容体の細胞外ドメインが含まれることが理解されよう。一例では、受容体は、ヒトｇｐ１３０受容体又はそのサイトカイン結合断片、たとえばドメイン１、２及び／若しくは３である。一例では、生物学的に活性な分子は、ｇｐ１３０受容体のドメイン１又はその断片を含む。一例では、生物学的に活性な分子は、配列番号９１のアミノ酸１〜１２５を含む。一例では、生物学的に活性な分子は、ｇｐ１３０受容体のドメイン２及びドメイン３を含む。一例では、生物学的に活性な分子は、ｇｐ１３０受容体のドメイン１、ドメイン２及びドメイン３を含む。本明細書中で用いる用語「受容体」は、たとえばアミノ酸の置換、付加又は欠失を含む天然の受容体の改変された形態を含むことも理解されるであろう。一例では、２つの鎖を含む受容体を、単鎖として作製し、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドと連結することができる。一例では、受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ及びベータ鎖の細胞外のドメインの全部又は一部を含み得る。これらのアルファ及びベータ細胞外ドメインは、適切なリンカーによって単鎖中で連結し、そのリンカーが本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドと連結することが好ましい。
【００７３】
一価の結合タンパク質は、抗体断片であることが好ましい。適切な抗体断片の例には、限定されるものではないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ＶＨＨ、Ｆｖ、Ｖκ、ＶＨ、Ｖλ、上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。適切な抗体断片の例には、ＡｄａｉｒとＬａｗｓｏｎ、２００５．「治療抗体（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３）：２０９〜２１７、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０及びＷＯ２００５００３１７１に記載のものが含まれる。
【００７４】
本発明において使用される抗体断片は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（たとえばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ若しくはＩｇＡ）又はサブクラスに由来し得て、たとえばマウス、ラット、サメ、ウサギ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ、ヤギ又はヒトを含む任意の生物種から得ることができる。
【００７５】
一つの実施形態では、抗体断片は、モノクローナル、ヒト化及び／又はキメラ抗体断片である。
【００７６】
ヒト化抗体は、ヒト以外の生物種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び場合によってはヒト以外の生物種由来の１つ又は複数のドナー残基を含むヒト免疫グロブリン分子由来の骨格領域を有する抗体分子である（たとえば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと）。
【００７７】
キメラ抗体は、Ｌ及びＨ鎖遺伝子が異なる生物種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから成るように遺伝子操作されている。Ｈ及びＬ鎖定常領域はヒトであり、可変領域は別の生物種に由来することが好ましい。
【００７８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５、２５６、４９５〜４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３、４、７２）並びにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体及び癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、ｐｐ．７７〜９６、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの任意の当技術分野で知られている方法により作製できる。
【００７９】
また抗体は、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３（１５）、７８４３〜７８４８、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７に記載されている他の任意の適切な方法により得ることができる。
【００８０】
本発明において使用される抗体断片は、任意の適切な酵素的切断及び／又は消化技法を用いて、たとえばペプシンで処理することによって、任意の完全な抗体、特に完全なモノクローナル抗体から得ることができる。あるいは抗体断片は、可変領域及び／又は定常領域をコードするＤＮＡの操作並びに再発現を含む組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。標準的な分子生物学的な手法を使用して、所望によりアミノ酸若しくはドメインを変更、付加又は欠失することができる。可変又は定常領域に対するいかなる改変も、本明細書で用いる「可変」及び「定常」領域という用語によって依然として包含される。
【００８１】
抗体及び抗体断片の作製並びに製造方法は、当技術分野では周知である（たとえば、Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第６，３３１，４１５号；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４１、５４４；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、３８３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ、３２２、３２３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２、４２３；Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；ＭｏｕｎｔａｉｎとＡｄａｉｒ、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０、１〜１４２；Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１を参照のこと）。
【００８２】
本発明において使用される抗体断片は、１つ若しくは複数のシステインを含む天然又は改変されたヒンジ領域を有し得る。天然のヒンジ領域は、通常は抗体分子のＣＨ１ドメインと結合したヒンジ領域である。改変されたヒンジ領域は、長さ及び／又は組成において天然のヒンジ領域とは異なる任意のヒンジである。このようなヒンジは、他の生物種由来のヒンジ領域、たとえばヒト、マウス、ラット、ウサギ、サメ、ブタ、ハムスター、ラクダ、ラマ又はヤギのヒンジ領域を含むことができる。他の改変されたヒンジ領域は、ＣＨ１ドメインのクラス又はサブクラスからの異なるクラス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含み得る。したがって、たとえばクラスγ１のＣＨ１ドメインが、クラスγ４のヒンジ領域に結合し得る。あるいは、改変されたヒンジ領域は、天然のヒンジの部分又はそれぞれの反復単位が天然のヒンジ領域に由来する反復単位を含み得る。さらに別の方法では、天然のヒンジ領域を１つ若しくは複数のシステイン又は他の残基をセリン又はアラニンなどの中性残基に変換することにより、或いは適切に配置された残基をシステイン残基に変換することにより変更し得る。このような方法によって、ヒンジ領域のシステイン残基の総数を増減し得る。他の改変されたヒンジ領域は、完全に合成のものでもよく、長さ、システイン組成及び可撓性などの所望の特性を有するように設計することもできる。
【００８３】
多くの改変されたヒンジ領域が、たとえば米国特許第５，６７７，４２５号、ＷＯ９９１５５４９、ＷＯ９８２５９７１及びＷＯ２００５００３１７１に既に記載されており、これらは本明細書中に参考として援用される。一例では、本発明において使用されるタンパク質は、天然又は改変されたヒンジ領域を有するＦａｂ’断片である。
【００８４】
一例では、本発明の抗体断片中に、たとえばシステイン（複数可）が露出した面を作り出すために１つ又は複数のシステインを工学的に作製できる（米国特許第５，２１９，９９６号）。したがって適当な工学的技術を用いることにより、たとえばエフェクター分子の結合に対する特定の数の部位を提供するために、抗体断片中のシステインの数を変更し得る。
【００８５】
一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、さらに抗体断片を含む。
【００８６】
一つの実施形態では、抗体断片は、単鎖Ｆｖポリペプチドである。一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、さらに単鎖Ｆｖポリペプチドを含む。一つの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメインのＣ末端が、場合によっては上述したリンカーの１つを介して第１のＣＨ２ドメインのＮ末端と遺伝子融合している。一つの実施形態では、ｓｃＦｖのＶＬドメインのＣ末端が、場合によっては上述したリンカーの１つを介して第１のＣＨ２ドメインのＮ末端と遺伝子融合している。
【００８７】
一つの実施形態では、生物学的に活性な分子は、Ｆａｂ又はＦａｂ’である（たとえば図１を参照のこと）。一つの実施形態では、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、さらに抗体Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を含む。一つの実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’のＶＨ−ＣＨ１鎖のＣ末端が、本発明の単鎖ＦｃポリペプチドのＮ末端と遺伝子融合している。この実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’のＶＬ−ＣＬ鎖が、ジスルフィド結合によって、好ましくは天然の鎖間ジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１鎖に結合される。一つの実施形態では、Ｆａｂ又はＦａｂ’のＶＬ−ＣＬ鎖のＣ末端は、本発明の単鎖ＦｃポリペプチドのＮ末端と遺伝子融合している。この実施形態において、Ｆａｂ又はＦａｂ’のＶＨ−ＣＨ１鎖は、ジスルフィド結合によって、好ましくは天然の鎖間ジスルフィド結合によってＶＬ−ＣＬに結合される。
【００８８】
本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、１つ又は複数のエフェクター分子が結合していてよい。エフェクター分子は、任意の適切な方法によって、たとえば化学的結合又は遺伝子融合によって結合することができる。
【００８９】
本明細書中で用いる用語「エフェクター分子」には、たとえば抗悪性腫瘍薬、薬剤、毒素（たとえば細菌又は植物起源の酵素的に活性な毒素並びにその断片、たとえばリシン及びその断片）、生物学的に活性なタンパク質、たとえば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成若しくは天然のポリマー、核酸及び核酸の断片、たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子並びに蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法で検出し得る化合物などのレポーター基が含まれる。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子又は本発明の方法を用いてタンパク質に結合することができる単一部分を形成するように連結した２つ若しくはそれ以上のこのような分子を含み得ることが理解されよう。
【００９０】
特定の抗悪性腫瘍薬には、細胞毒性及び細胞増殖抑制性薬剤、たとえばアルキル化剤、たとえばナイトロジェンマスタード（たとえばクロラムブシル、メルファラン、メクロレタミン、シクロフォスファミド、若しくはウラシルマスタード）及びこれらの誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスルファン、又はシスプラチン；代謝拮抗剤、たとえばメトトレキセート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルオロ酢酸、又はフルオロクエン酸、抗生物質、たとえばブレオマイシン（たとえば硫酸ブレオマイシン）、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン（たとえばマイトマイシンＣ）、アクチノマイシン（たとえばダクチノマイシン）プリカマイシン、カリケアマイシン及びこれらの誘導体、又はエスペラミシン及びこれらの誘導体；有糸分裂阻害剤、たとえばエトポシド、ビンクリスチン若しくはビンブラスチン及びこれらの誘導体；アルカロイド、たとえばエリプチシン；ポリオールたとえばタクシン−Ｉ（ｔａｘｉｃｉｎ−Ｉ）若しくはタクシン−ＩＩ（ｔａｘｉｃｉｎ−ＩＩ）；ホルモン、たとえばアンドロゲン（たとえばドロモスタノロン若しくはテストラクトン）、プロゲスチン（たとえば酢酸メゲストロール若しくは酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（たとえばジメチルジエチルスチルベストロールジホスフェート、リン酸ポリエストラジオール若しくはエストラムスチンホスフェート）又は抗エストロゲン（たとえばタモキシフェン）；アントラキノン、たとえばミトキサントロン、ウレア、たとえばヒドロキシウレア；ヒドラジン、たとえばプロカルバジン；又はイミダゾール、たとえばダカルバジンが含まれる。
【００９１】
キレート化金属には、２から８（それぞれを含む）までの配位数を有するジポジティブ金属又はトリポジティブ金属（ｄｉ−ｏｒ  ｔｒｉｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔａｌｓ）のキレートが含まれる。このような金属の具体例には、テクネチウム（Ｔｃ）、レニウム（Ｒｅ）、コバルト（Ｃｏ）、銅（Ｃｕ）、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）、ビスマス（Ｂｉ）、インジウム（Ｉｎ）、ガリウム（Ｇａ）、イットリウム（Ｙ）、テルビウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、及びスカンジウム（Ｓｃ）が含まれる。一般に金属は、放射性核種であることが好ましい。特定の放射性核種には、９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５８Ｃｏ、６０Ｃｏ、６７Ｃｕ、１９５Ａｕ、１９９Ａｕ、１１０Ａｇ、２０３Ｐｂ、２０６Ｂｉ、２０７Ｂｉ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８８Ｙ、９０Ｙ、１６０Ｔｂ、１５３Ｇｄ及び４７Ｓｃが含まれる。
【００９２】
キレート化金属は、たとえば任意の適切な多座キレート剤、たとえば非環式又は環式ポリアミン、ポリエーテル、（たとえばクラウンエーテル及びその誘導体）；ポリアミド；ポルフィリン；並びに炭素環式誘導体とキレート化した上記のタイプの金属の１つであり得る。
【００９３】
一般にキレート剤のタイプは、使用する金属に依存する。しかし本発明の複合体中のキレート剤の特に有用なグループの１つは、非環式及び環式ポリアミン、特にポリアミノカルボン酸、たとえばジエチレントリアミンペンタ酢酸及びその誘導体、並びに大環状アミン、たとえば環式トリアザ及びテトラアザ誘導体（たとえば国際特許出願第ＷＯ９２／２２５８３号に記載されているように）、並びにポリアミド、特にデスフェリオキサミン及びその誘導体である。
【００９４】
他のエフェクター分子には、他のタンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。重要な酵素には、限定されるものではないが、プロテアーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。重要なタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、限定されるものではないが、免疫グロブリン、アルブミン、毒素、たとえばアブリン、リシンＡ、シュードモナスエキソトキシン、若しくはジフテリアトキシン、タンパク質たとえばインシュリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子若しくは組織プラスミノーゲンアクティベーター、血栓性因子若しくは抗血管新生因子、たとえばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又は生体応答調整物質たとえばリンフォカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）若しくは他の成長因子が含まれる。
【００９５】
他のエフェクター分子には、たとえば診断に有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセンス物質、生物発光物質、放射性核種、ポジトロン放射金属（ポジトロン放出断層撮影用）、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。一般的には、診断に使用する抗体と結合できる金属イオンに関しては米国特許第４，７４１，９００号を参照のこと。適切な酵素には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ；適切な蛍光物質には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、ローダミンレッド、ローダミングリーン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、アロフィコシアニン、テキサスレッド、パシフィックブルー、マリーナブルー、オレゴングリーン及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒシリーズ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６４７、６６０、６８０、７００及び７５０が含まれ；適切なルミネセンス物質には、ルミノールが含まれ；適切な生物発光物質には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ；並びに適切な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが含まれる。
【００９６】
エフェクター分子に使用する合成又は天然のポリマーには、たとえば場合によっては置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレン、又はポリオキシアルキレンポリマー又は分枝状若しくは非分枝状多糖、たとえばラクトース、アミロース、デキストラン、デンプン又はグリコーゲンなどのホモ若しくはヘテロ多糖が含まれる。上述の合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意の置換基には、１つ若しくは複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が含まれる。合成ポリマーの具体例には、場合によっては置換された直鎖若しくは分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピルエングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）又はこれらの誘導体、特に場合によっては、置換されたポリ（エチレングリコール）たとえばメトキシポリ（エチレングリコール）又はこれら誘導体が含まれる。
【００９７】
本明細書中で用いる「誘導体」とは、反応性誘導体、たとえばα−ハロカルボン酸又はエステル、たとえばヨードアセトアミド、イミド、たとえばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドマレイミドその他などのチオール選択的反応基を含むことを意図している。反応基は、ポリマーに直接に又はリンカーセグメントを介して結合され得る。このような基の残基は、ある場合にはタンパク質とポリマー間の連結基としての産物の一部を形成することが理解されよう。
【００９８】
１つ又は複数の他のドメイン又は生物学的に活性な分子は、単鎖ポリペプチドのＣ末端に遺伝子融合し、又は結合することができることが理解されよう。
【００９９】
一つの実施形態では、単鎖Ｆｃポリペプチドは、単鎖ＦｃポリペプチドのＣ末端と融合した膜貫通ドメインをさらに含む。膜貫通ドメインは、単鎖Ｆｃポリペプチドが細胞の表面上で発現することを可能にする。したがって、適切な膜貫通ドメインを、目的とする細胞型に応じて使用することができる。いくつかの異なる膜貫通ドメインが記載されおり、たとえばＷＯ９７／２３６１３、ＷＯ９９／００４９４、ＷＯ９９／５７２６８、ＷＯ００／６３３７４及びＷＯ００／６３３７３を参照されたい。適切な膜貫通ドメインの他の例には、免疫グロブリンがＢ細胞表面上に発現される天然の膜貫通ドメインが含まれ、たとえば配列番号６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３及び８６に示す配列を参照されたい。一つの実施形態では、膜貫通ドメインは、リンカーを介して単鎖ＦｃポリペプチドのＣ末端と結合する。一つの実施形態では、これは免疫グロブリンがＢ細胞表面上に発現される天然のリンカーであり、たとえば配列番号６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２及び８５に示す配列を参照されたい。
【０１００】
一つの実施形態では、本発明は、膜貫通ドメイン及び１つ又は複数の情報伝達ドメインをさらに含む単鎖Ｆｃポリペプチドを提供する。一つの実施形態では、本発明は場合によってはリンカーを介してＣ末端と融合した膜貫通ドメインをさらに含む単鎖Ｆｃポリペプチドを提供し、このドメインはそのＣ末端で１つ又は複数の情報伝達ドメインと融合している。適切な情報伝達ドメインは、当技術分野では周知であり、適切な情報伝達及び膜貫通ドメインを、単鎖Ｆｃが発現される細胞で所望の発現及び／又は情報伝達が得られるように選択することができる。
【０１０１】
一例では、細胞内ドメインは、免疫グロブリンがＢ細胞表面上で発現される天然の細胞内ドメインであり、たとえば配列番号６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４及び８７に記載の配列を参照のこと。
【０１０２】
また適切な情報伝達ドメインの例は、ＷＯ９７／２３６１３、ＷＯ９９／００４９４、ＷＯ９９／５７２６８、ＷＯ００／６３３７２、ＷＯ００／６３３７４、ＷＯ００／６３３７３、ＷＯ０１／３２７０９、ＷＯ０１／３２８６６、ＷＯ０１／３２８６７、ＷＯ０２／３３１０１及びＷＯ２００４／０３９８４０に記載されている。
【０１０３】
一つの実施形態では、単鎖Ｆｃポリペプチドがまた、そのＮ末端に融合された上述の生物分子を含む場合、単鎖Ｆｃポリペプチドは、キメラ受容体タンパク質として用いることができる。このような単鎖Ｆｃポリペプチドは、これらが細胞表面上で二量体化せず、したがって結合したリガンドがない状態で不適切な情報伝達を回避する有利な特性を有する。
【０１０４】
本発明はまた、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドのいずれか１つをコードする、単離されたＤＮＡ配列を提供する。本発明のＤＮＡ配列は、たとえば化学的処理、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はこれらの任意の組合せにより作製された合成ＤＮＡを含み得る。
【０１０５】
本発明の単鎖ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、当業者によく知られた方法によって得ることができる。たとえば、抗体Ｆｃドメインの一部又は全部をコードするＤＮＡ配列は、所望により決定したＤＮＡ配列又は対応するアミノ酸配列に基づいて合成し得る。抗体Ｆｃ定常ドメインをコードするＤＮＡは、当業者には広く入手可能であり、その既知のアミノ酸配列に基づき容易に合成することができる。
【０１０６】
本発明の単鎖ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を作製するために、生物学の標準的な技法を使用し得る。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技法を用いて完全に又は部分的に合成し得る。適切ならば、部位特異的変異導入及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用し得る。
【０１０７】
また本発明は、本発明の１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニング又は発現ベクターに関する。したがって、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドをコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含むクローニングベクター又は発現ベクターが提供される。一つの実施形態では、クローニング又は発現ベクターは、完全な単鎖Ｆｃポリペプチド及び場合によっては生物学的に活性な分子の全部又は一部、たとえばｓｃＦｖ又はＶＨＨをコードする単一なＤＮＡ配列を含む。別の実施形態においては、クローニング又は発現ベクターは、２つのＤＮＡ配列、たとえば単鎖Ｆｃポリペプチドをコードする第１のＤＮＡ配列及び生物学的に活性な分子の１つの鎖、たとえばＶＨ−ＣＨ１並びに生物学的に活性な分子ドメイン、たとえばＶＬ−ＣＬの第２の鎖をコードする第２のＤＮＡ配列を含む。本発明によるベクターは、抗体リーダー配列などの適切なリーダー配列を含むことが好ましい。
【０１０８】
ベクターを構築し得る一般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者によく知られている。この点について、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編集）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇから出版されているＭａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌを参照することができる。
【０１０９】
また、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドをコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の単鎖ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現のために使用し得る。細菌、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の微生物系を使用でき、又は真核生物たとえば哺乳動物の宿主細胞発現系も使用し得る。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＮＳ０、ＣＨＯ、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０１１０】
本発明はまた、本発明による単鎖Ｆｃポリペプチドを産生する方法であって、適切な条件下で本発明の単鎖ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡからタンパク質の発現を誘導するのに適した条件下で本発明のベクターを含む宿主細胞を培養することと、単鎖Ｆｃポリペプチドを単離することとを含む方法も提供する。
【０１１１】
単鎖Ｆｃポリペプチドは、単鎖のみを含み得て、これが単独で又は生物学的に活性な分子への遺伝子融合として発現される場合、単一のポリペプチドをコードする配列のみを、たとえばｓｃＦｖｓｃＦｃを、宿主細胞にトランスフェクトするために使用する必要がある。２つ又はそれ以上の鎖を含む生物学的に活性な分子を含む単鎖Ｆｃポリペプチドの産生のために、細胞系は２つ又はそれ以上のベクターであって、生物学的に活性な分子の第１の鎖（たとえばＶＨ−ＣＨ１）に融合された単鎖Ｆｃポリペプチドをコードする第１のベクター及び生物学的に活性な分子の第２の鎖（たとえばＶＬ−ＣＬ）をコードする第２のベクターでトランスフェクトし得る。あるいは単一のベクターであって、鎖の１つが単鎖Ｆｃポリペプチドに融合されている場合、生物学的に活性な分子の両方の鎖をコードする配列を含むベクターを使用し得る。
【０１１２】
作製した後、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、必要であればたとえばイオン交換、サイズ排除、プロテインＡ又は疎水性相互作用クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を含む当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて精製することができる。
【０１１３】
単鎖Ｆｃポリペプチドの大きさは、サイズ排除クロマトグラフィー及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの当技術分野で知られている通常の方法によって確認し得る。このような技術を、ｓｃＦｃが二量体化しなかったことを確かめるために用いることができる。二量体が検出される場合には、上記のように通常のクロマトグラフィー法を用いて、単量体の単鎖Ｆｃポリペプチドを二量体種から分けて精製し得る。
【０１１４】
本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドの機能は、実施例で提供される方法を含む必要なエフェクター機能に応じて、当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて測定され得る。適切なアッセイには、補体結合アッセイ、同時刺激アッセイ、細胞死滅アッセイ、細胞傷害性アッセイ及びサイトスタシス（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｓ）アッセイが含まれる。さらに当技術分野で知られている適切な薬物動態学的方法を用いて、半減期を測定することができる。
【０１１５】
さらに生物学的に活性な分子が表面タンパク質に結合し、この表面発現タンパク質に対して単鎖Ｆｃポリペプチドを標的化する場合、細胞死滅アッセイなどの他の機能的なアッセイ（たとえば補体依存性細胞傷害アッセイ）も使用し得る。したがって、所望の機能が達成されるかどうかを測定するために、当業者により適切な機能的アッセイを容易に確立し得る。
【０１１６】
本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、疾患の治療及び／又は予防に有用である。したがって本発明はまた、１つ又は複数の薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドを含む、医薬組成物又は診断用組成物を提供する。したがって、医薬品の製造のための本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドの使用が提供される。薬学的に許容し得る担体を通常は含む無菌の医薬組成物の一部として、組成物は通常供給される。本発明の医薬組成物は、さらに薬学的に許容し得るアジュバントを含み得る。
【０１１７】
本発明はまた、１つ若しくは複数の薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤又は担体と共に、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドを添加し混合することを含む、薬学的又は診断用又は研究用試薬組成物を調製する方法を提供する。
【０１１８】
単鎖Ｆｃポリペプチドは、薬学的又は診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、或いはたとえば他の抗体又はたとえば抗炎症薬及び化学療法剤を含む非抗体成分を含む他の活性成分を伴っていてもよい。
【０１１９】
医薬組成物は、本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドの治療有効量を含むことが好ましい。本明細書で用いる用語「治療有効量」とは、対象とする疾病若しくは症状を治療、改善又は予防するために必要な、或いは検出し得る治療又は予防効果を顕在化させるために必要な治療剤の量を意味する。いずれの単鎖Ｆｃポリペプチドについても、初めに細胞培養アッセイ又は動物モデルで、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類のいずれかで評価することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用し得る。このような情報は、次いでヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定するために使用できる。
【０１２０】
ヒト対象に関する正確な治療有効量は、疾患状態の重篤度、対象の健康状態、年齢、対象の体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤（複数可）、反応感受性並びに治療法に対する寛容性／応答性に依存するであろう。この量は、日常的な実験法によって決定することができ、医師の判断の範囲内である。一般に治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇであろう。医薬組成物は、１投与量当たり所定量の本発明の活性因子を含む便利な単位投与剤形で提供し得る。
【０１２１】
組成物は、個々に患者に投与されてもよく、或いは他の物質、薬剤又はホルモンと組み合わせて（たとえば同時に、経時的に又は別々に）投与されてもよい。
【０１２２】
本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドが投与される用量は、治療される症状の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に使用されるか又は既存の症状を治療するために使用されるかどうかに依存する。
【０１２３】
投与頻度は、単鎖Ｆｃポリペプチドの半減期及びその効果の持続期間に依存する。単鎖Ｆｃポリペプチドが短い半減期（たとえば２〜１０時間）を有する場合、１日に１回又は複数回の投与が必要である可能性がある。あるいは単鎖Ｆｃポリペプチドが長い半減期（たとえば２〜１５日）を有する場合、１日に１回、１週間に１回又は１〜２ヵ月毎に１回のみの投与しか必要でない可能性がある。
【０１２４】
薬学的に許容し得る担体は、それ自体はその組成物を投与された患者に有害な抗体産生を誘導してはならず、毒性であってはならない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの大きな、ゆっくり代謝される巨大分子であってよい。
【０１２５】
薬学的に許容し得る塩、たとえば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸塩を使用することができる。
【０１２６】
治療的組成物中の薬学的に許容し得る担体はさらに、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体を含み得る。さらに湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝化物質などの補助物質が、このような組成物中に存在し得る。このような担体は患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤及び懸濁剤として製剤化することを可能にする。
【０１２７】
投与に好ましい形態には、非経口投与、たとえば注射又は注入、たとえばボーラス注射又は連続注入によるものに適した形態が含まれる。産物が注射又はインフュージョン用である場合、これは油性若しくは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳液の形態をとることができ、懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化剤を含み得る。あるいは単鎖Ｆｃポリペプチドは、使用前に適切な滅菌液体を用いて再調製する乾燥形態であってもよい。
【０１２８】
本発明の組成物は、製剤化された後、対象に直接投与することができる。治療する対象は動物であってもよい。しかしこの組成物は、ヒト対象に投与するために適合されることが好ましい。
【０１２９】
本発明の医薬組成物は、経口、肺、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮、経皮膚（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸的、局所的、舌下、腟内又は直腸経路を含むがこれに限定されない種々の経路によって投与されてもよい。またハイポスプレー及びネブライザも本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる。典型的にはこの治療的組成物は注射可能薬物として、液体液剤又は懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射に先立つ液状ビヒクル中の溶液又は懸濁液のために適切な固体形態も調製することができる。
【０１３０】
この組成物の直接的な送達は、一般には皮下、腹膜内、静注、若しくは筋肉内注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。この組成物はまた病巣部へ投与することもできる。投薬治療は単回投与スケジュールであっても多回投与スケジュールであってもよい。
【０１３１】
この組成物の活性成分は単鎖Ｆｃポリペプチドであることが理解されるであろう。したがってこれは消化管での分解に感受性である。したがってこの組成物が消化管を利用した経路によって投与される場合、この組成物は単鎖Ｆｃポリペプチドを分解から保護するが、消化管から吸収されたならば単鎖Ｆｃポリペプチドを放出する物質を含む必要があろう。
【０１３２】
薬学的に許容し得る担体についての詳細な説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）から得ることができる。
【０１３３】
また本発明の単鎖Ｆｃポリペプチドは、遺伝子治療の利用によって投与することができることも予測される。これを達成するためには、適切なＤＮＡ要素の制御下にある単鎖ＦｃポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を患者に導入し、単鎖Ｆｃポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕでＤＮＡ配列から発現させ構築する。あるいは単鎖Ｆｃポリペプチドは、Ｔ細胞などの適切な細胞にｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクトし得る。ｅｘ  ｖｉｖｏでトランスフェクションする適切な方法の例は、ＷＯ２００４／０３９８４０に記載されている。
【０１３４】
本発明はまた、感染症（ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、及び寄生生物感染）、感染症と関連する内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、喘息、骨盤腹膜炎、アルツハイマー病、クローン病、ペーロニー病、小児脂肪便症、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、血管炎、手術に起因する癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病関節炎、髄膜脳炎、多発性硬化症及びギランバレー症候群などの中枢神経系及び末梢神経系の免疫性媒介炎症性疾患、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植拒絶反応、癌（両方の固形癌、たとえば黒色腫、肝芽腫、肉腫、扁平上皮癌、移行細胞癌、卵巣癌及び血液学的悪性腫瘍及び特に急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、胃癌及び大腸癌）、心筋梗塞などの虚血性疾患を含む心臓疾患、及びアテローム性動脈硬化、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、歯周炎及びヒポクロリジア（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｈｙｄｉａ）から成る群から選択される病理学的障害の治療又は予防に使用するための単鎖Ｆｃポリペプチドも提供する。
【０１３５】
本発明は、炎症性疾患の制御に用いる単鎖Ｆｃポリペプチドを提供することが好ましい。単鎖Ｆｃポリペプチドは、炎症過程若しくは癌を低減するために又は炎症過程若しくは癌を予防するために用いることができることが好ましい。
【実施例】
【０１３６】
次に、図面を参照して、本発明を一例として説明する。
【０１３７】
（実施例１）
Ｎ末端に、生物学的に活性な分子が抗体Ｆａｂ断片である生物学的に活性な分子を含む、３つのマウスの単鎖Ｆｃポリペプチドを設計した。Ｆａｂ断片の可変領域は、細胞表面タンパク質抗原に結合するマウス抗体のＭｏｘ４６に由来した。Ｆｃドメインは、マウスのＩｇＧ２ａに由来し、これらのドメインの３つの異なるバージョンを以下に示す。リンカー配列には下線を付した。ヒンジ配列はイタリック体で示し、これらがリンカー配列の一部を構成する場合、ヒンジ配列はイタリック体で示し且つ下線を付した。
バージョン１  配列番号８８（図２ｂに示した形式）。ＣＨ１とＣＨ２間のヒンジのシステインが、セリンを置換している。
【化１】
0005384338.tif 000002
バージョン２  配列番号８９（図２ａに示した形式）
【化２】
0005384338.tif 000003
バージョン３  配列番号９０（図１ａに示した形式）。リンカーは、短縮したヒンジ’ＰＣＰ’を含む。
【化３】
0005384338.tif 000004
【０１３８】
単鎖ＦｃポリペプチドのそれぞれをコードするＤＮＡを、Ｎ末端で同じ生物学的に活性な分子、すなわち抗体ＭＯＸ４６由来のＶＨＣＨ１ドメインを用いて合成した。
【０１３９】
上述のバージョン１、２及び３を含む単鎖Ｆｃポリペプチドは、抗体リーダー配列（マウス抗体Ｂ７２．３由来（Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１（６）４９９〜５０５））を用いて、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚性腎臓上皮細胞系）において、ｐＶＡＸベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で発現した。ＭＯＸ４６  Ｆａｂ断片のＶＬＣＬ鎖は、同じ細胞で、しかし別々のベクターで作製した。得られた単鎖Ｆｃポリペプチドを、プロテインＡを用いて精製した。
【０１４０】
（実施例２）
抗原結合
抗原に結合する単鎖Ｆｃポリペプチド（バージョン１及び３）の能力を、マウスＩｇＧ１骨格及び無関係なＩｇＧで発現された同じ抗体可変領域（ＭＯＸ４６抗体由来の）と比較した。その表面上に抗原を発現する組換えＮＳ０細胞（５×１０５）を、１００μｌの単鎖Ｆｃポリペプチドと共に４℃で３０分間インキュベートした。対照は、５μｇ／ｍｌから下方へ１／３希釈で滴定したＭＯＰＣ２１であった。ＭＯＸ４６  ＩｇＧ及び単鎖Ｆｃ構築物を、１／３希釈で滴定した。細胞を、５％のＦＣＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のＰＢＳで２回洗浄し、次いで１／２５０希釈の抗マウスＨ鎖及びＬ鎖ＰＥ標識化（Ｊａｃｋｓｏｎ）抗体１００μｌを、４℃で３０分間添加した。細胞を前述のように再度洗浄し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１４１】
調べた単鎖Ｆｃ構築物の両方とも、ＭＯＸ４６  ＩｇＧと同様に抗原に結合した（１．１及び３．１）。無関係な対照は、抗原に結合しなかった。図４ａを参照のこと。
【０１４２】
また抗原に結合する単鎖Ｆｃポリペプチド（バージョン１、２及び３）の能力も、上記の方法を用いて調べたが、その表面上に抗原を天然に発現する一次活性化Ｔ細胞を、組換えＮＳ０細胞の代わりに使用した。一次活性化Ｔ細胞は、以下の通りに作製した。１×１０６のＤ０１１脾細胞を、２００ｎｇ／ｍｌのオバルブミンペプチド３２３〜３２９と共に３日間培養し、洗浄して２倍容量の培地にさらに２日間再懸濁した。次いでＣＤ４  Ｔ細胞を除外する分離によって、活性化細胞を精製した。
【０１４３】
全ての３つの単鎖Ｆｃ構築物は、ＭＯＸ４６  ＩｇＧと同様に抗原に結合した。無関係な対照は、抗原と結合しなかった。図４ｂを参照のこと。
【０１４４】
（実施例３）
Ｆｃレセプター結合
ＦｃレセプターＣＤ６４（ＦｃγＲＩＩ）及びＣＤ３２（ＦｃγＲＩ）に結合する単鎖Ｆｃバージョン１及び３の能力を、ＢＩＡｃｏｒｅにより測定した。ＣＤ６４及びＣＤ３２を、アミンカップリング化学により、標準的なＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップのフローセル２及び３（それぞれ）の上に固定（それぞれ約１０００ＲＵ）した。フローセル１を、バックグラウンドの結合を調べるために参照フローセルとして設置した。次いで結合活性を探るため、単鎖Ｆｃタンパク質を順番にチップ上に注入した。全てのサンプルは、原液、１：２希釈及び１：５希釈で流した。バックグラウンドの結合は、全てのサンプルでの有意でなかった。
【０１４５】
単鎖Ｆｃのバージョン１及び３の両方が、ＣＤ６４及びＣＤ３２の両方に結合することが明らかになった。
【０１４６】
（実施例４）
組換えＮＳ０細胞を用いる補体依存性細胞傷害アッセイ
単鎖Ｆｃバージョン１及び３を、これらが結合した細胞で補体介在性細胞傷害を生じる能力に関して調べた。
【０１４７】
その表面上に適切な抗原を発現する組換えＮＳ０系（５×１０６細胞／ｍｌ培地）を、５０μｌ／ｍｌ幼令ウサギ補体（Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｃ１２ＣＡ）と混合した。使用の前に、補体を２ｍｌの氷冷した組織培養グレードの蒸留水を用いて再構成した。補体は再構成から１時間以内に使用し、使用まで氷上に保持した。試験する物質は、２μｇ／ｍｌの濃度であり、２回繰り返して１００μｌの容量で９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）へ播種した。ウェル当り１００μｌの細胞／補体混合物を添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。細胞傷害性は、生体染色のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の取込みをＦＡＣＳで評価した。２０ｍｇ／ｍｌのＰＩストック溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐ−１３０４ＭＰ）を蒸留水で調製し、次いでＲＰＭＩ  １６４０で希釈してウェル中３μｇ／ｍｌの最終濃度を与えた。フローサイトメトリーにより分析する前に、細胞を暗所でＲＴで１０分間インキュベートした。
【０１４８】
図５ａ（補体有り）及び図５ｂ（補体なし）は、単鎖Ｆｃポリペプチドのバージョン１及び３の両方（１．１及び３．１）が、補体依存性細胞傷害を誘導することを示している。
【０１４９】
（実施例５）
活性化Ｔ細胞を用いる補体依存性細胞傷害アッセイ
（ｉ）単鎖Ｆｃバージョン１、２及び３を、その表面上でＭＯＸ４６抗体により結合される抗原を発現する活性化Ｔ細胞の補体介在性細胞傷害を生じるこれら単鎖Ｆｃバージョンの能力について試験した。使用した方法は、一次活性化Ｔ細胞をＮＳ０細胞の代わりに使用した点を除けば、実施例４に記載したとおりであり、これらは実施例２に記載のように作製された。
【０１５０】
特異的細胞溶解の％は、以下の通りに算出した。
実験条件におけるＰＩ陽性細胞の％  −  ＰＩ陽性細胞のバックグラウンド％
ＰＩ陽性細胞の最大％（細胞溶解緩衝液）  −  ＰＩ陽性細胞のバックグラウンド％
【０１５１】
単鎖Ｆｃポリペプチドの全て３つのバージョンは、補体依存性細胞傷害を誘導することが明らかになった（図５ｃ）。
【０１５２】
（ｉｉ）異なる細胞表面タンパク質抗原に結合するマウス抗体４９５に由来する抗体Ｆａｂ断片を含む別の単鎖Ｆｃポリペプチド（バージョン３）を、マウスのＦｃ領域を用いてＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ形式の両方で作製した。その表面上で４９５抗体により結合される抗原を発現する活性化Ｔ細胞の補体介在性細胞傷害を生じるこれらのｓｃＦｃタンパク質の能力を試験した。使用した方法は、実施例２に記載のように作製された一次活性化Ｔ細胞を使用した点を除けば、実施例４に記載したとおりであった。
【０１５３】
図５ｄは、予期したように、単鎖ＦｃのＩｇＧ２ａ形式及び完全な抗体４９５のＩｇＧ２ｂ形式のみが、補体依存性細胞傷害を誘導することができたことを明らかに示している。ＩｇＧ１形式は、補体依存性細胞傷害を誘導することができなかった。
【０１５４】
（実施例６）
受容体−ｓｃＦｃ融合
ヒトｇｐ１３０受容体ドメイン１を、図１ａに示した単鎖Ｆｃ形式を用いて、単鎖Ｆｃ（マウスガンマ１）融合タンパク質としてクローニングした。融合タンパク質の配列を、以下に示す。
【０１５５】
Ｇｐ１３０ドメイン１  ｓｃＦｃ融合タンパク質（配列番号９１）
【化４】
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【０１５６】
太字の配列は、ｇｐ１３０受容体ドメイン１を示す（配列番号９１のアミノ酸１〜１２５）。リンカー配列には、下線を付している。ヒンジ配列はイタリック体であり、ヒンジ配列がリンカーの一部を構成する場合、これらにイタリック体で下線を付している。ｇｐ１３０ドメイン１と第１のヒンジ配列のＣ末端間の配列「ＳＳＡ」は、クローニングのために必要なＸｈｏ１制限酵素認識部位を導入するために必要とされるアミノ酸である。
【０１５７】
構築物は、ｐＶＡＸベクター及びＢ７２．３マウスシグナル配列を用いて、哺乳動物細胞系（ＣＨＯ  Ｌ７６１）で一過性に発現した。得られたｓｃＦｃタンパク質を用いてウェスタンブロットを調製し、ブロットを、抗マウスＦｃ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  １１５−０３５−０７１）及びさらにビオチン化ポリクローナル抗ｇｐ１３０（Ｒ＆Ｄ  ＢＡＦ２２８）を用いて探査し、ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰで顕在化させた。ｇｐ１３０ドメイン１融合タンパク質の予測された大きさに対応するタンパク質が、ウェスタンブロットで検出された。単独で又は付着したｈｉｓ標識を用いてｇｐ１３０ドメイン１を発現させる以前の試みは、うまく成功していなかった。単鎖Ｆｃポリペプチドへのｇｐ１３０ドメイン１の融合は、ｇｐ１３０ドメイン１が発現されることを可能にした。
【０１５８】
本発明を実施例のみにより説明したが、いささかも限定することを意味するものではなく、詳細の改変が特許請求の範囲内になされることが当然理解されるであろう。それぞれの他の実施形態に関しては、本発明の各実施形態の好ましい特徴を準用する。本明細書で引用した特許及び特許出願を含むがこれに限定されるものではない全ての文献の内容は、個々の文献のそれぞれの内容が、具体的且つ個別的に十分に記載されているかのように本明細書中に参考として援用されるように、本明細書中で参考として援用されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ）】
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【図６ｂ）】
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【図６ｃ）】
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【図６ｄ）】
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【図６ｅ）】
0005384338.tif 000019
【図６ｆ）】
0005384338.tif 000020
【配列表】
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