(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体又はゲル洗剤組成物であって、サブチリシンＫＬ（subtilisin KL）又はその変異体と、少なくとも１のリパーゼ；アミラーゼ；セルラーゼ；又はマンナナーゼとの組み合わせを含んでなり、
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はマンナナーゼの含有量に対する、サブチリシンＫＬ又はその変異体の含有量の重量比が、０．００１から１００である、前記組成物。
【請求項２】
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はマンナナーゼの含有量に対する、サブチリシンＫＬ又はその変異体の含有量の重量比が、０．０１から１０である、請求項１記載の洗剤組成物。
【請求項３】
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はマンナナーゼの含有量に対する、サブチリシンＫＬ又はその変異体の含有量の重量比が、０．５から５である、請求項１記載の洗剤組成物。
【請求項４】
リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はマンナナーゼの含有量に対する、サブチリシンＫＬ又はその変異体の含有量の重量比が、１から３である、請求項１記載の洗剤組成物。
【請求項５】
前記リパーゼが、フミコラ（Humicola）（サーモマイシス（Thermomyces））由来のリパーゼ、シュードモナス（Pseudomonas）リパーゼ、バチルス（Bacillus）リパーゼ及びこれらの化学的変異体又はタンパク質設計された変異体からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか１項記載の洗剤組成物。
【請求項６】
前記リパーゼが、Ｈ.ラヌギノサ（H. lanuginosa）（Ｔ.ラヌギノサス（T. lanuginosus））又はＨ.インソレンス（H. insolens）由来のリパーゼ、Ｐ.アルカリゲネス（P. alcaligenes）、Ｐ.シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）、Ｐ.セパシア（P. cepacia）、Ｐ.スツッツェリ（P. stutzeri）、Ｐ.フルオレセンス（P. fluorescens）、シュードモナス種SD705株又はＰ.ウィスコンシネンシス（P. wisconsinensis）由来のリパーゼ、Ｂ.サブチリス（B. subtilis）、Ｂ.ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）又はＢ.プミルス（B. pumilus）由来のリパーゼ及びこれらの化学的変異体又はタンパク質設計された変異体からなる群から選択される、請求項５記載の洗剤組成物。
【請求項７】
前記アミラーゼが、バチルス（Bacillus）由来のアミラーゼを含んでなる群から選択される、請求項１から６のいずれか１項記載の洗剤組成物。
【請求項８】
前記アミラーゼが、Ｂ.リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のアミラーゼを含んでなる群から選択される、請求項７記載の洗剤組成物。
【請求項９】
前記セルラーゼが、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、マイセリオフソラ（Myceliophthora）属、フミコラ（Humicola）属、フザリウム（Fusarium）属、チエラビア（Thielavia）属、アクレモニウム（Acremonium）属由来のセルラーゼを含んでなる群から選択される、請求項１から８のいずれか１項記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
前記セルラーゼが、フミコラインソレンス（Humicola insolens）、マイセリオフソラサーモフィラ（Myceliophthora thermophila）及びフザリウムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）由来のセルラーゼを含んでなる群から選択される、請求項９記載の洗剤組成物。
【請求項１１】
サブチリシンＫＬ又はその変異体の含有量が０．００１から５重量％であり、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、又はマンナナーゼが存在する場合は、各含有量が０．００１から５重量％である、請求項１から１０のいずれか１項記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
サブチリシンＫＬ又はその変異体と、少なくとも１のリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はマンナナーゼとの組み合わせの使用であって、非プロテアーゼ酵素の安定性が向上した、液体又はゲル型の水性洗剤組成物の調製のための使用。
【請求項１３】
プロテアーゼと少なくとも１の非プロテアーゼ酵素を含んでなる液体又はゲル洗剤組成物において、プロテアーゼ酵素と他の酵素の組み合わせにおける、非プロテアーゼ酵素の安定性を向上させる方法であって、サブチリシンＫＬ又はその変異体をプロテアーゼ酵素として用いて液体又はゲル洗剤組成物を調製することを含んでなり、前記少なくとも１の非プロテアーゼ酵素が、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はマンナナーゼから選択される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の酵素の組み合わせを含んでなる、液体及びゲル状の水性洗剤組成物に関するものである。前記洗剤組成物はさらに、ホウ酸又は組成物中でホウ酸を形成できるホウ素化合物と、ポリヒドロキシ化合物、好適にはプロパンジオールと、プロテアーゼ酵素及び他の酵素の選択された組み合わせを安定化する比較的高レベルのカルシウムイオンとの組み合わせを含んでなるものであってもよい。本発明は、液体又はゲル状洗剤組成物における他の酵素とプロテアーゼ酵素の組み合わせにおいて、非プロテアーゼ酵素の安定性向上のための方法に関するものでもある。本発明はさらに特定のプロテアーゼ酵素及び洗剤組成物中でのそれらの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは約50年間洗剤組成物に使用されており、当該プロテアーゼの多くが、この過去10年、多数のプロテアーゼ前駆体のタンパク質設計により発展してきた。
市場で成功した前駆体プロテアーゼのほとんどが、サブチリシン309（又はサビナーゼ（サビナーゼ）（登録商標））である。サビナーゼのタンパク質設計は1898年に国際公開第89/06279号において初めて公開された。その後、サビナーゼのタンパク質設計に関連する多数の特許出願が、出願人及び他の企業、例えばジェネンコア・インターナショナル社、プロクター・アンド・ギャンブル、ユニリーバ（Unilever NV）等により出願がなされてきた。また、サビナーゼ変異体も、ノボザイムス社（Novozymes A/S）及びジェネンコア・インターナショナル社により市販されてきた。
改変Y167A+R170S+A194Pを含んでなる特定のサビナーゼ変異体は、国際公開第98/20115号で開示された。本出願では、この変異体をサブチリシンＫＬと呼ぶ。
【０００３】
例えばプロテアーゼ等の酵素を含む液体及びゲル状水性洗剤組成物は当業界では周知である。当該組成物が直面する主要な問題は、組成物における酵素の十分な保存安定性を確保することである。プロテアーゼの存在下でアミラーゼを安定化させるのは特に困難であり、プロテアーゼは液体及びゲル状水性洗剤組成物においてアミラーゼを速やかに分解するが、さらに他の酵素、例えばリパーゼ、セルラーゼ等もプロテアーゼによりしばしば分解される。
【０００４】
例えばアルファアミラーゼ等の強アルカリ性アミラーゼは、英国特許第1,296,839号明細書（British Specification No.1,296,839）に記載されている。ホウ酸又はアルカリ金属ホウ酸塩と、カルシウムイオンとの、及び好適にはポリオールとの混合物を含んでなる、酵素安定化系の使用は、Seversonにより米国特許第4,537,706号に記載されている。洗浄及び汚れ除去を改善させる具体的なa‐アミラーゼは、Baeck等により国際公開第97/32961号で、並びに国際公開第96/23873号及び米国特許第6,093,562号で開示されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、サブチリシンＫＬ及び／又はその変異体と、少なくとも１の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ；セルラーゼ；ペクチナーゼ；ペクチン酸リアーゼ；ヘミセルラーゼ、例えばマンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ；オキシダーゼ、例えばラッカーゼ；及び／又はペルオキシダーゼとの組み合わせを含んでなる洗剤組成物に関するものである。
【０００６】
本発明の洗剤組成物において使用されるアミラーゼは、Ｂ.リケニフォルミス（B. licheniformis）由来のアミラーゼ及び他のアミラーゼであり、例えば国際公開第2001/066712号、国際公開第2006/002643号、国際公開第2000/60060号で開示されたものである。
【０００７】
本発明の洗剤組成物において使用されるセルラーゼは、例えば国際公開第1995/024471号、国際公開第91/17244号、国際公開第2002/099091号で開示されたものである。
【０００８】
本発明の洗剤組成物において使用されるリパーゼは、例えば国際公開第2000/060063号で開示されたものである。
【０００９】
本発明の洗剤組成物において使用されるマンナナーゼは、例えば国際公開第99/64619号の例えば配列番号２で開示されたものである。
【００１０】
本発明の洗剤組成物において使用されるエンドグルカナーゼは、例えば国際公開第91/17244号で開示されたものである。
【００１１】
本発明のサブチリシンＫＬ変異体は、例えば国際公開第98/20115号に示されており、また特に表１に示されるものである：
【表１】
0005497440.tif 000002
【表２】
0005497440.tif 000003
【表３】
0005497440.tif 000004
【表４】
0005497440.tif 000005
【００１２】
驚くべきことに、サブチリシンＫＬ及びその変異体は、液体洗剤組成物において使用される他の酵素、例えばリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ及びヘミセルラーゼとの適合性に優れていることを発見した。かかる特性は、サブチリシンＫＬ及びその変異体と組み合わせた前記酵素の残存活性を、他のプロテアーゼ存在下での残存活性と比較して、長期保存の後でさえ十分に向上させるという結果をもたらす。結局、その結果、洗剤組成物の機能が改善される。また酵素量を低減しても同様の結果をもたらし得る。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明に従って作成又は意図される、種々のサブチリシンＫＬ酵素変異体を説明する場合、参照を容易にするため以下の命名及び表記を適用する：参照の枠組みは、はじめに親酵素をサブチリシンＢＰＮ'（ＢＡＳＢＰＮ）と配列比較することにより定義する。
配列比較は、ＧＣＧパッケージversion9.1のＧＡＰルーティンにより、以下のパラメータを用い変異体に番号をつけることにより得られる。ギャップ生成ペナルティ（gap creation penalty）＝８及びギャップ延長ペナルティ（gap extension penalty）＝８、並びに他のパラメータを初期値に保つ。
【００１４】
他の方法は、サブチラーゼ間における既知の認識された配列、例えば国際公開第91/00345号で示された配列を用いる。ほとんどの場合、その違いは少しも重要ではないだろう。
従って、多くの欠失及び挿入はＢＡＳＢＰＮ（配列番号１）との関係で定義される。遺伝子操作によるポリペプチドに導入された改変の命名の詳細な説明については、国際公開第00/71691号、7-12ページを引用する。これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
アミノ酸位置／残基の番号付け−別途記載しない限り本明細書におけるアミノ酸番号づけは、サブチラーゼＢＰＮ'（ＢＡＳＢＰＮ）配列に対応する。さらなるＢＰＮ'配列の説明は、Siezen等によるProtein Engng. 4 (1991 ) 719-737を参照されたい。
【００１５】
「サビナーゼ（登録商標）」−サビナーゼ（登録商標）は、ノボザイムス社により市販されている。これはＢ.レンタス（B. Lentus）由来のサブチリシン309である。
【００１６】
サブチリシンＫＬ変異体の改変−本明細書で使用される「（１又は２以上の）改変」なる語は、サブチリシンＫＬをコードするＤＮＡの化学修飾及び遺伝子操作を含むものと定義される。改変には、注目の（１又は２以上の）アミノ酸における側鎖の置換、（１又は２以上の）アミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入があり得る。
【００１７】
サブチラーゼ変異体−本発明において、サブチラーゼ変異体又は変異導入サブチラーゼなる語は、親微生物由来の変異遺伝子を発現する生物により産生されたサブチラーゼを意味する。ここで親微生物とは、元の遺伝子又は親遺伝子を有し、対応する親酵素を産生したものを言う。前記親遺伝子は、適切な宿主で発現された場合に前記変異導入サブチラーゼプロテアーゼを産生する変異遺伝子を産生するよう変異導入される。
【００１８】
相同サブチラーゼ配列−２つのアミノ酸配列間の相同性は、本明細書においてはパラメータの「同一性」で記載される。２つのサブチラーゼ間の同一度を決定するため、ＧＣＧパッケージ9.1版のＧＡＰルーティンが、（以下）同じ設定を用いて適用される。ルーティンからの出力は、アミノ酸配列比較の他に、２つの配列間の「同一性パーセント」の計算値である。本記載に基づき、当業者が適切な相同サブチラーゼを同定することは定型的な作業であり、かかる相同サブチラーゼは本発明に従って改変可能である。
【００１９】
単離ポリヌクレオチド−「単離（isolated）」なる語をポリヌクレオチドに適用する場合は、当該ポリヌクレオチドは、その天然の遺伝的環境から取り出されたものであり、それ故、他の外来の又は不所望のコード配列がなく、また遺伝的に設計されたタンパク質産生系内での使用に適切な状態にあることを意味する。かかる単離分子は、天然の環境から隔離され、ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを含むものである。本発明の単離ＤＮＡ分子は、それらが通常関連する他の遺伝子はないが、例えばプロモータやターミネーターなどの天然の５'及び３'の非翻訳領域を含んでもよい。関連領域の同定は当該分野における当業者にとって明らかであろう（例えば、Dynan及びTijan, Nature 316:774-78, 1985を参照されたい）。「単離ポリヌクレオチド」なる語は、「クローンポリヌクレオチド」なる語と言い換えてもよい。
【００２０】
単離タンパク質−タンパク質に適用した場合「単離（isolated）」なる語は、かかるタンパク質がその本来の環境から取り出されたことを示す。好ましい状態としては、単離タンパク質は、実質的に他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（即ち、「相同不純物」（下記参照））がない状態である。単離タンパク質は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥでの決定により、10％超、好ましくは20％超、さらに好ましくは30％超の純度を有する。さらに高精製状態、すなわちＳＤＳ‐ＰＡＧＥでの決定により40％超、60％超、80％超、さらに好ましくは95％超、最も好ましくは99％超の純度を有するタンパク質を提供することが好ましい。「単離タンパク質」なる語は、「精製タンパク質」なる語と言い換えてもよい。
【００２１】
相同不純物−「相同不純物」なる語は任意の不純物（例えば、本発明のサブチラーゼでない他のポリペプチド）を意味し、それは本発明のサブチラーゼがもともと得られる（obtained from）同種細胞に由来するものである。
【００２２】
得られる（obtained from）−本明細書で特定の微生物源に関連して使用される「得られる（obtained from）」なる語は、ポリヌクレオチド及び／又はサブチラーゼが、特定の微生物源により、又は当該微生物源由来の遺伝子が挿入された細胞により作成されたことを意味する。
【００２３】
基質−本明細書でプロテアーゼ用の基質に関連して使用される「基質」なる語は、その最も広い形態としてはサブチリシンプロテアーゼにより加水分解を受け易い、少なくとも１つのペプチド（アミド）結合を含む化合物を含んでなるものと解釈されるべきである。
【００２４】
産物−プロテアーゼ酵素反応に由来する産物に関連して使われる「産物」なる語は、本発明においては、サブチラーゼプロテアーゼを含む加水分解反応の産物を含むと解釈されるべきである。産物は続く加水分解反応の基質となってもよい。
【００２５】
洗浄能力−本明細書中で「洗浄能力」は、例えば洗浄又は硬表面洗浄の間、洗浄する対象物に存在するタンパク又は有機物による汚れを除去する酵素の能力として使用する。
【００２６】
本発明の洗剤組成物は、例えば、手洗濯又は機械洗濯用洗剤組成物として製剤されるものであり、例えばシミが付いた布の適切な事前処置用の洗濯添加組成物、及びリンス添加した布柔軟化組成物がある。又は一般的な家庭用硬表面洗浄操作に使用するための洗剤組成物として、又は手又は機械での食器洗い操作用に製剤される。
【００２７】
ある具体的な態様によれば、本発明は、本発明の酵素を含んでなる洗剤添加物を提供するものである。当該洗剤添加物及び洗浄組成物は、少なくとも１つの他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ；クチナーゼ；アミラーゼ；カルボヒドラーゼ；セルラーゼ；ペクチナーゼ；ペクチン酸リアーゼ；ヘミセルラーゼ、例えばマンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ；オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、及び／又はペルオキシダーゼを含んでなる。
【００２８】
一般的に選ばれる酵素の特徴は、選択された洗剤と適合性がある（即ち、最適ｐＨであり、他の酵素及び非酵素成分との適合性がある）べきで、当該酵素は有効量で存在すべきである。
【００２９】
リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌及び真菌起源のものがある。化学修飾又はタンパク質設計された変異（protein engineered mutants）が含まれる。有用なリパーゼの例は、フミコラ（Humicola）（サーモマイス（Thermomyces）と同義）、例えば国際公開第96/13580記載のＨ.インソレンス（H. insolens）由来、シュードモナスリパーゼ、例えばシュードモナス属ＳＤ705株（Pseudomonas sp. strain SD 705）（国際公開第96/13580号及び国際公開第96/27002号）、Ｐ.ウィスコンシネンシス（P. wisconsinensis）（国際公開第96/12012号）、又は国際公開第2000/060063号記載のバチルスリパーゼが挙げられる。
【００３０】
他の例はリパーゼ変異体で、例えば国際公開第92/05249号、国際公開第94/01541号、欧州特許第407225号、欧州特許第260105号、国際公開第95/35381号、国際公開第96/00292号、国際公開第95/30744号、国際公開第94/25578号、国際公開第95/14783号、国際公開第95/22615号、国際公開第97/04079号、国際公開第97/07202号に記載されている。商業的に使用されるリパーゼ酵素、例えばLipolase（登録商標）、Lipolase Ultra（登録商標）、又はLipex（登録商標）（ノボザイムス社）が好ましい。
【００３１】
アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α及び／又はβ）には、細菌及び真菌起源のものがある。化学修飾又はタンパク質設計による変異が含まれる。アミラーゼは、例えば、バチルス（Bacillus）から得られる（obtained from）α‐アミラーゼである。有用なアミラーゼの例としては、国際公開第94/02597号、国際公開第94/18314号、国際公開第96/23873号、国際公開第2000/60060、及び号国際公開第97/43424号に記載される変異体、特に以下の１又は複数の位置（position）における置換を伴う変異：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、及び444が挙げられる。商業的に使用されるアミラーゼはDuramyl（登録商標）、Termamyl（登録商標）、Stainzyme（登録商標）、Stainzyme Plus（登録商標）、Stainzyme ultra（登録商標）、Fungamyl（登録商標）、及びBAN（登録商標）(ノボザイムス社)、Rapidase（商標）、Purastar（商標）、及びPurastar OxAm（商標）(ジェネンコア・インターナショナル社)がある。
【００３２】
セルラーゼ：適切なセルラーゼは、細菌及び真菌起源のものがある。化学修飾又はタンパク質設計による変異が含まれる。セルラーゼは、例えば、バチルス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、フミコラ（Humicola）、チエラビア（Thielavia）、アクレモニウム（Acremonium）、例えば、フミコラインソレンス（Humicola insolens）、マイセリオフソラサーモフィラ（Myceliophthora thermophila））、及びフザリウムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）から産生される。真菌セルラーゼは、米国特許第5,648,263号、米国特許第5,691,178号、米国特許第5,776,757号、及び国際公開第89/09259号で開示されている。特に適切なセルラーゼは、色保護及び白色保持の利点を有するアルカリ性又は中性のセルラーゼである。かかるセルラーゼの例としては、欧州特許第0 531 372号、国際公開第96/11262号、国際公開第96/29397号、国際公開第98/08940号記載のセルラーゼがある。他の例は、セルラーゼ変異体で、国際公開第94/07998号、欧州特許第0 531 315号、米国特許第5,457,046号、米国特許第5,686,593号、米国特許第5,763,254号、国際公開第95/24471号、国際公開第98/12307号、及びPCT/DK98/00299に記載されている。商業的に使用されるセルラーゼは、例えばRenozyme（登録商標）、Celluzyme（登録商標）、Celluclean（登録商標）、Endolase（登録商標）、及びCarezyme（登録商標）(ノボザイムス社)、Clazinase（商標）及びPuradax HA（商標）(ジェネンコア・インターナショナル社)、並びにKAC-500(B)（商標）(花王株式会社)がある。
【００３３】
ペルオキシダーゼ／オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ／オキシダーゼは、植物、細菌、又は真菌起源のものがある。化学修飾又はタンパク質設計による変異が含まれる。有用なペルオキシダーゼの例としては、コプリナス（Coprinus）由来、例えばＣ.シネレウス及びそれらの変異体で、国際公開第93/24618号、国際公開第95/10602号、及び国際公開第98/15257号に記載のペルオキシダーゼがある。商業的に使用されるペルオキシダーゼは、Guardzyme（商標）(ノボザイムス社)がある。
【００３４】
ヘミセルラーゼ：適切なヘミセルラーゼは、細菌又は真菌起源のものがある。化学修飾又はタンパク質設計による変異が含まれる。適切なヘミセルラーゼは、マンナナーゼ、リケナーゼ（lichenase）、キシラナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、グルコリニダーゼ（glucorunidase→glucorinidase？）、フェルラ酸エステラーゼ、クマル酸エステラーゼ、及びアルビノフラノシダーゼで、国際公開第95/35362号に記載されている。適切なマンナナーゼは、国際公開第99/64619号に記載されている。商業的に使用されるヘミセルラーゼはMannaway（登録商標）(ノボザイムス社)がある。
【００３５】
洗剤組成物への（１又は２以上の）洗剤酵素の導入は、１又は複数の酵素を含有する個別の添加剤を添加することによって行ってもよく、又はこれら全ての酵素を含んでなる組み合わせの添加剤を添加することにより行ってもよい。本発明の洗剤組成物、即ち別々の添加剤又は組み合わせの添加剤は、例えばゲル、液体、スラリー等として製剤することができる。好ましい洗剤添加物の剤型は、液体で、特に安定化された液体又はスラリーである。
【００３６】
液体酵素調製物は、従来手法に従い、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール、糖もしくは糖アルコール、乳酸、又はホウ酸の添加により安定化してもよい。保護された酵素は、欧州特許第238,216号に開示された手法に従い調製してもよい。
【００３７】
本発明の洗剤組成物は任意の従来形態、例えばペースト、ゲル、又は液体であってもよい。液体洗剤は水性、典型的には70％以下の水と０−30％の有機溶剤を含むものでも、非水性であってもよい。
【００３８】
洗剤組成物は１又は複数の界面活性剤を含んでなり、これは非イオン性（半極性を含む）及び／又はアニオン性及び／又はカチオン性及び／又は双性イオンであってもよい。典型的には、界面活性剤は重量で0.1％から60％のレベルで存在する。
【００３９】
前記組成物中に含まれる場合、洗剤は通常約１％から40％のアニオン性界面活性剤を含み、例としては、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、アルファ−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、２級アルカンスルホネート、アルファ−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキルスクシン酸もしくはアルケニルスクシン酸、又はセッケンがある。
【００４０】
前記組成物中に含まれる場合、洗剤は通常約0.2％から40％の非イオン性界面活性剤を含み、例としては、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシ化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルカミド」）がある。
【００４１】
洗剤は、０−65％の洗剤原料又は錯化剤を含んでいてもよく、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスホネート、カルボネート、シトレート、ニトリロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、アルキルスクシン酸もしくはアルケニルスクシン酸、可溶性シリケート、層状シリケート（例えば、Hoechst製のSKS-6）がある。
【００４２】
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んでもよい。例としてはカルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、マレイン酸／アクリル酸共重合体、及びラウリルメタクリレート／アクリル酸共重合体がある。
【００４３】
洗剤は漂白系を含んでもよく、H2O2源（例えば過ホウ酸塩又は過炭酸塩）と、過酸化状態の漂白活性剤（activator）（例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート）との組み合わせを含んでもよい。あるいは、漂白系は、例えばアミド、イミド、又はスルホン型の過酸化酸（peroxyacid）を含んでもよい。
【００４４】
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定化剤、例えばポリオール（例えばプロピレングリコール、ジエチレングリコール、メチルプロパンジオール、又はグリセロール）、糖もしくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、もしくはホウ酸誘導体（例えば芳香族ホウ酸エステル）、もしくはフェニルボロン酸誘導体（例えば４−フォルミルフェニルボロン酸）又はモノエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンを用いて安定化してもよい。また、当該組成物は、国際公開第92/19709号、国際公開第92/19708号、米国特許第5,972,873号又は欧州特許第0832174号に記載の通りに製剤されてもよい。
【００４５】
洗剤は、他の従来の洗剤成分を含んでもよく、例えば布仕上げ剤、例えばクレイ（clay）、発泡促進剤（foam booster）、泡立ち抑制剤、抗腐食剤、汚懸濁剤、抗汚沈降剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ（hydrotrope）、色褪せ防止剤、又は香料がある。
【００４６】
現在の考えとしては、洗剤組成物において、任意の酵素、特に本発明の酵素は、１Ｌの洗浄水当たりの酵素タンパク質として0.01〜100mg、好ましくは0.05〜５mg、特に0.1〜１mgに対応する量を添加してもよい。
【００４７】
地域及び地方の状況における違い、例えば水の硬度及び洗浄温度により、地域に応じた洗剤組成物が求められる。実施例１の洗剤は、種々の液体洗剤の組成物を提供ものである。
【００４８】
原料と方法
酵素
以下の実施例においては、商業的に利用可能な酵素を使用する。Alcalase（登録商標）とサビナーゼ（登録商標）を比較標準として使用する。
【表５】
0005497440.tif 000006
また、プロテアーゼとしてサブチリシンＫＬ及びその変異体を使用する。
サブチリシンＫＬはサビナーゼのY167A+R170S+A194P変異体（ＢＰＮ'番号付けを使用）である。
【００４９】
アッセイ
プロテアーゼ適合性：
酵素のプロテアーゼ適合性は、各実施例に指示される洗剤組成物の調製、及び当該実施例に指示される期間経過後の他の酵素の残存活性の測定から決定する。
酵素活性：
酵素活性は、周知の標準手法を用いて測定する。
【００５０】
洗剤組成物
実施例において用いられる洗剤組成物は、以下に提示する組成物に従うモデル洗剤であるか、又は市販の液体洗濯洗剤のいずれかであり、商業用洗剤の例としてはTide、Era、Gain、Cheer、Wisk、All、Purex、Arm & Hammer、Sun、Great Value、Ariel、Persil、Total、Skip、Dash、Dixan、Ava、又は当該液体洗剤の任意の他のブランド拡充版もしくは用濃縮版が挙げられる。使用する市販の洗濯洗剤が酵素を含む場合は、使用前に85℃で５分間電子レジにて当該洗剤を熱することで不活性化した。モデル洗剤組成物Ａは洗剤実施例１である。
【表６】
0005497440.tif 000007
【実施例１】
【００５１】
市販の洗濯用液体洗剤に市販のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、及びセルラーゼを以下の表に示す通りに添加した（洗剤が既に酵素を含む場合は、85℃以下で５分間電子レジにて当該洗剤を熱することでこれらを不活性化できる）。サブチリシンＫＬを市販のプロテアーゼと比較する場合は、同量の活性単位を使用した。
【００５２】
３０℃で１、２及び４週間保存後の残存酵素活性％で決定される酵素の安定性を表２〜５に示す。
保存条件：閉鎖ガラス瓶において、３０℃で１、２及び４週間
【表７】
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【表８】
0005497440.tif 000009
【表９】
0005497440.tif 000010
【表１０】
0005497440.tif 000011
【００５３】
上に示される通り、サブチリシンＫＬがアルカラーゼ（Alcalase）2.5Ｌの代わりのプロテアーゼとして選択される場合、本発明の酵素適合性は明らかに改善している。サブチリシンＫＬがプロテアーゼである場合は、セルラーゼＡ 5000Ｌ、リパーゼＡ 100Ｌ、ターマミル（Termamyl） 300Ｌ及びアミラーゼＡ 12Ｌの30℃で１、２、３及び４週間後の酵素安定性は、明らかに向上している。サブチリシンＫＬプロテアーゼは参照プロテアーゼとして使用されるアルカラーゼ2.5Ｌとちょうど同じくらい安定である。
【実施例２】
【００５４】
実施例１の洗濯用市販の液体洗剤に商業用プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、及びセルラーゼを以下の表に示す通りに添加した（洗剤が既に酵素を含む場合は、85℃以下で５分間電子レジにて当該洗剤を熱することでこれらを不活性化できる）。サブチリシンＫＬを商業用プロテアーゼと比較する場合は、同量の活性単位を使用した。
【００５５】
30℃で１、２及び４週間保存後の残存酵素活性％で決定される酵素の安定性を表６〜９に示す。
【表１１】
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【表１２】
0005497440.tif 000013
【表１３】
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【表１４】
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【００５６】
上に示される通り、サブチリシンＫＬがアルカラーゼ（Alcalase）2.5Ｌの代わりのプロテアーゼとして選択される場合、本発明の酵素適合性は明らかに改善している。サブチリシンＫＬがプロテアーゼである場合は、セルラーゼＡ 5000Ｌ、リパーゼＡ 100Ｌ、ターマミル（Termamyl） 300Ｌ及びアミラーゼＡ 12Ｌの30℃で１、２、３及び４週間後の酵素安定性は、明らかに向上している。サブチリシンＫＬプロテアーゼは参照プロテアーゼとして使用されるアルカラーゼ2.5Ｌとちょうど同じくらい安定である。
【実施例３】
【００５７】
市販の洗濯用液体洗剤に市販のプロテアーゼ、アミラーゼ、及びリパーゼを以下の表に示す通りに添加した（洗剤が既に酵素を含む場合は、85℃以下で５分間電子レジにて当該洗剤を熱することでこれらを不活性化できる）。サブチリシンＫＬを市販のプロテアーゼと比較する場合は、同量の活性単位を使用した。
【００５８】
30℃で１、２、４及び８週間保存後の残存酵素活性％で決定される酵素の安定性を表１０〜１１に示す。
【表１５】
0005497440.tif 000016
【表１６】
0005497440.tif 000017
【００５９】
上に示される通り、サブチリシンＫＬがサビナーゼ 16L及びアルカラーゼ（Alcalase）2.5Ｌの代わりのプロテアーゼとして選択される場合、本発明の酵素適合性は明らかに改善している。サブチリシンＫＬが好ましい酵素として選択される場合は、リパーゼＡ 100Ｌ及びアミラーゼＡ 12Ｌの、２及び８週後の酵素安定性は、顕著に向上している。
【実施例４】
【００６０】
表１３に示す以下の組成での液体洗剤を調製する。
【表１７】
0005497440.tif 000018
【表１８】
0005497440.tif 000019
【表１９】
0005497440.tif 000020
【００６１】
洗剤組成物は30℃で２及び４週間、閉鎖ガラス瓶にて保存する。保存後の残存プロテアーゼ及びアミラーゼ活性を決定する。
【表２０】
0005497440.tif 000021
【表２１】
0005497440.tif 000022
【表２２】
0005497440.tif 000023
【００６２】
洗剤組成物は30℃で２及び４週間、閉鎖ガラス瓶にて保存する。保存後の残存プロテアーゼ、リパーゼ（Lip.)、マンナナーゼ（Man.）及びアミラーゼ（Ter.)活性を決定する。
【表２３】
0005497440.tif 000024
【表２４】
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【表２５】
0005497440.tif 000026
【表２６】
0005497440.tif 000027
【表２７】
0005497440.tif 000028
【００６３】
洗剤組成物は30℃で１、２及び３週間、閉鎖ガラス瓶にて保存する。保存後の残存プロテアーゼ、リパーゼ（Lip.)、マンナナーゼ（Man.）及びアミラーゼ（Ter.)活性を決定する。
【表２８】
0005497440.tif 000029
【表２９】
0005497440.tif 000030
【表３０】
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【表３１】
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