(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性抗体であって、フローサイトメトリーアッセイにおいて１時間後に計測した場合に、ＯＶＣＡＲ−８細胞上で、当該二重特異性抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して１５％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示すと共に、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する１つ若しくは２つの抗原結合部位及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する３つ目の抗原結合部位を含んでなり、二価又は三価であることを特徴とする前記二重特異性抗体。
【請求項２】
以下の：
ａ）ＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの一本鎖Ｆａｂフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、当該全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合されていることを特徴とする、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号１５のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号１８のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ領域を含んでなり；そして
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号２１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号２３のＣＤＲ１Ｈ領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号２４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２５のＣＤＲ２Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ１Ｌ領域を含んでなること、を特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
以下の：
ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号１の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号２の配列を含んでなり；そして
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号３の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号４の配列を含んでなること、を特徴とする、請求項３に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの定常領域を含んでなることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
前記抗体がＡｓｎ２９７にて糖鎖でグリコシル化されていることで、当該糖鎖内のフコース量が６５％以下であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含んでなる医薬組成物。
【請求項９】
癌治療のための請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
癌治療のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
癌の治療薬の製造のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに対する二重特異性抗体、それらの製造方法、前述の抗体を含む医薬組成物、並びにその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥｒｂＢファミリー・タンパク質
ＥｒｂＢタンパク質ファミリーは、４種類のメンバーであるＥｒｂＢ−１（別名、上皮生長因子受容体（ＥＧＦＲ））、ＥｒｂＢ−２（ヒトではＨＥＲ２、齧歯動物ではｎｅｕ）、ＥｒｂＢ−３（別名、ＨＥＲ３）及びＥｒｂＢ−４（別名、ＨＥＲ４）から成る。ＥｒｂＢファミリー・タンパク質は、受容体チロシンキナーゼであって、細胞増殖、分化、及び生存の重要な伝達物質となっている。
【０００３】
ＥｒｂＢ−２と抗ＥｒｂＢ−２抗体
ＥｒｂＢタンパク質ファミリーの第２のメンバーであるＥｒｂＢ−２（ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２；ＣＤ３４０、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂ Ｂ２／ｎｅｕタンパク質、神経芽細胞腫／神経膠芽腫由来癌遺伝子相同体｜ｖ−ｅｒｂ−ｂ２ 鳥類赤血球性白血病ウイルス癌遺伝子相同体２；配列番号１４としても知られている）は、それ自身のリガンド結合ドメインを持たないタンパク質であるため、成長因子に結合することができない。しかしながら、他のリガンド結合ＥＧＦ受容体ファミリーメンバーに強く結合してヘテロ二量体を形成し、リガンド結合を安定させ、そして下流のシグナル伝達経路のキナーゼ媒介型活性化を促進する、例えばそれらはマイトジェン活性化プロテインキナーゼやホスファチジルイノシトール−３キナーゼに関与している。本明細書中に示した最も頻度の高い対立遺伝子Ｉｌｅ６５４／Ｉｌｅ６５５を含めて、第６５４及び６５５位アミノ酸における対立遺伝子変異のアイソフォームａ（第６２４及び６２５位のアイソフォームｂ）が報告されている。この遺伝子の増幅、及び／又は過剰発現は、乳房及び卵巣の腫瘍を含めた多数の癌で報告されている。選択的スプライシングはいくつかのさらなる転写物変異体をもたらすが、一部のものは異なるアイソフォームをコードし、他のものは完全に特徴づけされていない。ＥｒＢ−２は、元々、形質変換遺伝子の産物として化学物質で処理されたラットの神経芽細胞腫から同定された。ｎｅｕ癌原遺伝子の活性型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異から得られた（Semba, K., et al., PNAS 82 (1985) 6497-501；Coussens, L., et al., Science 230 (1985) 1132-9；Bargmann, C.I., et al., Nature 319 (1986) 226-30；Yamamoto, T., et al., Nature 319 (1986) 230-4）。
【０００４】
ｎｅｕのヒト相同体の増幅は、乳癌及び卵巣癌で観察され、且つ、予後不良と相関する（Slamon, D.J, et al. Science 235 (1987) 177-182；Slamon, D.J., et al., Science 244 (1989) 707-712；及びUS 4,968,603）。これまで、ｎｅｕ癌原遺伝子に対する点突然変異相同体は、ヒトの腫瘍については報告されていない。（一様でないが高い頻度で遺伝子増幅による）ＨＥＲ２の過剰発現は、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓及び膀胱の癌腫を含めた他の癌腫においても観察されている。特に、King, C.R., et al., Science 229 (1985) 974-976；Yokota, J, et al., Lancet 1 (1986) 765-767；Fukushige, S., et al., Mol Cell Biol. 6 (1986) 955-958；Guerin, M., et al., Oncogene Res. 3 (1988) 21-31；Cohen, J.A., et al., Oncogene, 4 (1989) 81-88；Yonemura, Y., et al., Cancer Res. 51 (1991) 1034-1038；Borst, M.P., et al., Gynecol. Oncol. 38 (1990) 364-366；Weiner, D.B., et al., Cancer Res. 50 (1990) 421-425；Kern, J.A., et al., Cancer Res. 50 (1990) 5184-5187；Park, J.B., et al, Cancer Res. 49 (1989) 6605-6609；Zhau, H.E., et al., Mol. Carcinog. 3 (1990) 254-257；Aasland, R., et al., Br. J. Cancer 57 (1988) 358-363；Williams, T.M, et al, Pathobiology 59 (1991) 46-52；及びMcCann, A, et al. Cancer 65 (1990) 88-92を参照のこと。ＨＥＲ２は、前立腺癌において過剰発現されることもある（Gu, K, et al., Cancer Lett. 99 (1996) 185-189；Ross, J.S, et al. Hum. Pathol. 28 (1997) 827-833；Ross, J.S, et al. Cancer 79 (1997) 2162-2170；及びSadasivan, R, et al, J. Urol. 150 (1993) 126-131）。
【０００５】
ヒトＨＥＲ２タンパク質産物に対する抗体が、例えばHudziak, R.M, et al, Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172によって作出された（前記文献は、ヒト乳房腫瘍細胞株ＳＫ−ＢＲ−３を使用して特徴づけされた抗ＨＥＲ２抗体のパネルの作出について記載している）。この抗ＨＥＲ２抗体のパネルには、とりわけ、（ＨＥＲ２の細胞外ドメインの異なるエピトープに向けられている）２Ｃ４（パーツズマブ）及び４Ｄ５（トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））抗体が含まれる。前記抗体への暴露後のＳＫ−ＢＲ−３細胞の相対細胞増殖は、７２時間後の単分子層のクリスタルバイオレット染色によって測定された。このアッセイを使用すると、細胞増殖を５６％阻害した４Ｄ５（トラスツズマブ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））と呼ばれる抗体で、最大の阻害が得られた。前記パネル中の他の抗体は、このアッセイにおいて細胞増殖をある程度減少させた。抗体４Ｄ５については、ＴＮＦ−αの細胞傷害効果に対するＨＥＲ２過剰発現乳房腫瘍細胞株の感受性を高めることがさらに見出された（US5,677,171）。Hudziak, R.M.らが議論しているＨＥＲ２抗体は、例えばFendly, B.M, et al. Cancer Research 50 (1990) 1550-1558においてさらに特徴づけされている。
【０００６】
ｃ−Ｍｅｔと抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
ＭＥＴ（間葉−上皮移行因子）は、タンパク質ＭＥＴをコードする癌原遺伝子であり、（ｃ−Ｍｅｔ、肝細胞増殖受容体ＨＧＦＲ；ＨＧＦ受容体；細胞分散因子受容体；ＳＦ受容体；配列番号１５としても知られている）（Dean, M., et al., Nature 318 (1985) 385-8；Chan, A.M., et al., Oncogene 1 (1987) 229-33；Bottaro, D.P., et al., Science 251 (1991) 802-4；Naldini, L., et al.5 EMBO J. 10 (1991) 2867-78；Maulik, Gautam., et al., Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2002) 41-59）。ＭＥＴは、胚発生と創傷治癒に不可欠な膜受容体である。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、ＭＥＴ受容体の唯一の既知のリガンドである。ＭＥＴは通常、上皮起源の細胞によって発現されるが、ＨＧＦの発現は間葉起源の細胞に限られている。ＨＧＦ刺激により、ＭＥＴは浸潤性増殖として知られているプログラムをまとめて引き起こす数個の生物反応を誘発する。癌における異常なＭＥＴ活性化は、異常な活性のＭＥＴが腫瘍増殖や、腫瘍に栄養を供給する新生血管の形成（血管新生）や、他の臓器への癌の分散（転移癌）を引き起こす、予後不良と関連がある。ＭＥＴは、腎臓、肝臓、胃、乳房、及び脳の癌を含めた多くのタイプのヒト悪性腫瘍において無秩序である。本来なら、幹細胞と始原細胞だけがＭＥＴを発現しており、それが胎児において新しい組織を作り出したり、成人において損傷した組織を再生するために、これらの細胞が侵襲的に増殖することを可能にしている。しかしながら、癌幹細胞は、ＭＥＴを発現する正常幹細胞の能力を乗っ取り、それによって癌持続性と体内の他の部位への分散の原因となっている。
【０００７】
癌原遺伝子ＭＥＴ産物は、肝細胞増殖因子受容体であり、チロシンキナーゼ活性をコードしている。初期一本鎖前駆タンパク質は、翻訳後に分割されて、α及びβサブユニットを生じ、それがジスルフィド結合して成熟受容体を形成する。ＭＥＴの遺伝子内の様々な突然変異は乳頭状腎癌に関連している。
【０００８】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、例えば、US5,686,292、US7,476,724、WO2004/072117、WO2004/108766、WO2005/016382、WO2005/063816、WO2006/015371、WO2006/104911、WO2007/126799、又はWO2009/007427により知られている。
【０００９】
ｃ−Ｍｅｔ結合ペプチドは、例えば、Matzke, A., et al., Cancer Res 65 (14) (2005) 6105-10及びTam, Eric, M., et al., J. Mol. Biol. 385 (2009)79-90により知られている。
【００１０】
多特異性抗体
広範な種類の組換え抗体フォーマットが最近開発されてきている、例えば、ＩｇＧ抗体フォーマットと一本鎖ドメインの融合による、例えば、四価二重特異性抗体が開発された（例えば、Coloma M. J. et al., Nature Biotech. 15（1997）159-163；WO2001077342；及びMorrison S. L. Nature Biotech. 25（2007）1233-1234を参照のこと）。
【００１１】
また、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）がもはや保持されていないいくつかの新しいフォーマット、例えば、２つ以上の抗原に結合できる、ジ抗体、トリ抗体又はテトラ抗体、ミニ抗体、いくつかの一本鎖フォーマット（ｓｃＦｖ、ビス−ｓｃＦｖ）が開発された（Holliger P. et al., Nature Biotech. 23（2005）1126-1136；Fischer N., Leger O. Pathobiology 74（2007）3-14；Shen J. et al., J. Immunol. Methods 318（2007）65-74；Wu C. et al., Nature Biotech. 25（2007）1290-1297）。
【００１２】
すべてのこのようなフォーマットはリンカーを使用して抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）を更なる結合性タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）に融合するか、あるいは、例えば、２つのＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖを融合する（Fischer N., Leger O. Pathobiology 74（2007）3-14）。天然に存在するものに対して高度の類似性を維持することによって、Ｆｃ受容体結合を通して介在される、エフェクター機能、例えば、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）又は抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を保持することが望まれることもあり得ることに留意すべきである。
【００１３】
WO2007/024715では、改変多価及び多特異性結合タンパク質として二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物学的に活性な抗体二量体の調製方法は、US6,897,044に報告されている。ペプチド・リンカーを介して互いに連結されている少なくとも４つの可変ドメインを持つ多価性Ｆｖ抗体構築物が、US7,129,330で報告されている。二量体及び多量体の抗原結合構築物は、US2005/0079170で報告されている。（天然の免疫グロブリンでない）結合構造によって互いに共有結合した３つ又は４つのＦａｂフラグメントを含んでなる三又は四価の単一特異性抗原結合性タンパク質が、US6,511,663で報告されている。WO2006/020258では、原核生物及び真核生物細胞で効率的に発現され、治療薬や診断法に有用である四価の二重特異性抗体が報告されている。２つのタイプのポリペプチド二量体を含んでなる混合物からの少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結されず二量体からの少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される二量体を分離するか、又は優先的には合成する方法が、US2005/0163782で報告されている。二重特異性の四価の受容体が、US5,959,083で報告されている。三重機能性以上の抗原結合部位を持つ改変抗体が、WO2001/077342で報告されている。
【００１４】
多特異性、且つ、多価の抗原結合性ポリペプチドが、WO1997/001580で報告されている。WO1992/004053では、通常、同じ抗原決定基に結合するＩｇＧクラスのモノクローナル抗体から調製されたホモ接合体が合成架橋によって共有結合で連結されていることが報告されている。２つ以上の免疫グロブリンモノマーが共に四価又は六価のＩｇＧ分子を形成するのに関係している、（通常ＩｇＧクラスのオリゴマーが分泌されることよって）抗原に対して高い親和性を有するオリゴマーモノクローナル抗体が、WO1991/06305で報告されている。ヒツジ由来抗体及び改変抗体構築物が、US6,350,860で報告されていて、それは、インターフェロンγ活性が病因である疾患を治療するのに使用される。US2005/0100543では、二重特異性抗体の多価担体である標的を設定可能な、すなわち、標的を設定可能な構築物の各分子が２以上の二重特異性抗体の担体として機能することができる、構築物が報告されている。遺伝的に改変された二重特異性四価抗体は、WO1995/009917で報告されている。安定しているWO2007/109254には、安定化ｓｃＦｖから成るか、又はそれを含んでなる安定化結合分子が報告されている。US2007/0274985は、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）フラグメントを含んでなる抗体フォーマットに関する。
【００１５】
WO2008/140493は、抗ＥＧＦＲファミリーメンバー抗体及び１若しくは複数の抗ＥＧＦＲファミリーメンバー抗体を含んでなる二重特異性抗体に関する。US2004/0071696は、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーのメンバーに結合する二重特異性抗体分子に関する。
【００１６】
WO2009111707（A1）は、Ｍｅｔ及びＨＥＲ拮抗薬を用いた併用療法に関する。WO2009111691（A2A3）は、Ｍｅｔ及びＥＧＦＲ拮抗薬を用いた併用療法に関する。
【００１７】
WO2004072117は、ｃ−Ｍｅｔの下方制御／内部移行を誘発するｃ−Ｍｅｔ抗体、及び特に第２抗原としてＥｒｂＢ−２を用いた二重特異性抗体におけるそれらの使用可能性に関する。
【発明の概要】
【００１８】
この発明の第一の態様は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位とヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体は、フローサイトメトリーアッセイにおいて１時間後に計測した場合に、ＯＶＣＡＲ−８細胞上での、抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して１５％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示すことを特徴とする。
【００１９】
本発明の一実施形態では、前記抗体は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する１又は２つの抗原結合部位、及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの抗原結合部位を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二価又は三価の二重特異性抗体である。
【００２０】
本発明の一実施形態では、前記抗体は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する２つの抗原結合部位、及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する３つ目の抗原結合部位を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する三価の二重特異性抗体である。
【００２１】
本発明の一実施形態では、前記抗体は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する１つの抗原結合部位、及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの抗原結合部位を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二価の二重特異性抗体である。
【００２２】
本発明の一態様は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位、及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性抗体であって、以下の：
前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号１５のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号１６のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号１７のＣＤＲ１Ｈ領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号１８のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号１９のＣＤＲ２Ｌ領域、及び配列番号２０のＣＤＲ１Ｌ領域を含んでなり；そして
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン内に配列番号２１のＣＤＲ３Ｈ領域、配列番号２２のＣＤＲ２Ｈ領域、及び配列番号２３のＣＤＲ１Ｈ領域を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメイン内に配列番号２４のＣＤＲ３Ｌ領域、配列番号２５のＣＤＲ２Ｌ領域、配列番号２６のＣＤＲ１Ｌ領域を含んでなる、
を特徴とする前記二重特異性抗体である。
【００２３】
前記二重特異性抗体は、好ましくは、以下の：
ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号１の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号２の配列を含んでなり；そして
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号３の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号４の配列を含んでなる、
を特徴とする。
【００２４】
本発明の更なる態様は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの定常領域を含んでなることを特徴とする本発明による二重特異性抗体である。
【００２５】
一実施形態では、本発明による前記二重特異性抗体は、前記抗体がＡｓｎ２９７にて糖鎖でグリコシル化されていることで、前記糖鎖内のフコース量が６５％以下であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の更なる態様は、前記二重特異性抗体の鎖をコードする核酸分子である。
【００２７】
本発明のより更なる態様は、前記二重特異性抗体を含んでなる医薬組成物、癌治療のための前記組成物、癌治療薬の製造のための前記二重特異性抗体の使用、そのような処置を必要としている患者に前記二重特異性抗体を投与することを含めた癌に罹患している患者の治療法である。
【００２８】
乳房の腫瘍は高レベルのＥｒｂＢ２を発現していることが多く、そしてＥｒｂＢ２陽性腫瘍のうちのかなりの割合がさらにｃ−Ｍｅｔ陽性でもある。乳房の腫瘍におけるｃ−Ｍｅｔ発現が予後不良と相関があることは、これまで多くの研究で示されてきた（Kang, L, Y., et al., Cancer Res. 63 (2003) 1101-1105；Lengyel, E., et al., Int. J. Cancer 113 (2005) 678-82）。そのため、本発明による二重特異性＜ＥｒｂＢ−２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体は、抗腫瘍効果や癌細胞阻害のような価値のある特性を有する。
【００２９】
本発明による抗体は、例えば、とりわけＥｒｂＢ２とｃ−Ｍｅｔの両受容体が発現されている癌細胞の増殖阻害や癌に罹患している患者に有益な抗腫瘍効果といった、非常に価値のある特性を示す。本発明による二重特異性＜ＥｒｂＢ２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体は、ＥｒｂＢ２とｃ−Ｍｅｔの両受容体を発現している癌細胞に対してそれらの親である単一特異性の二価＜ｃ−Ｍｅｔ＞抗体と比較すると、低いｃ−Ｍｅｔ受容体の内部移行を示す。
【００３０】
発明の詳細な説明
この発明の第一の態様は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位とヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性抗体であって、前記二重特異性抗体は、フローサイトメトリーアッセイにより１時間後に計測した場合、ＯＶＣＡＲ−８細胞上での、前記二重特異性抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して、ＯＶＣＡＲ−８細胞に対する１５％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示すことを特徴とする。
【００３１】
よって、本発明は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位とヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性抗体に関するものであり、ここで、前記二重特異性抗体は、フローサイトメトリーアッセイにより、１時間のＯＶＣＡＲ−８細胞−抗体インキュベーション後に測定した場合、前記二重特異性抗体の不存在下でのＯＶＣＡＲ−８細胞上のｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して１５％未満の、ＯＶＣＡＲ−８細胞上のｃ−Ｍｅｔの内部移行を増加させる。
【００３２】
一実施形態では、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位とヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、前記二重特異性抗体が、フローサイトメトリーアッセイにより１時間後に計測した場合、ＯＶＣＡＲ−８細胞上での、当該二重特異性抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して、１０％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示すことを特徴とする。
【００３３】
一実施形態では、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位とヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、前記二重特異性抗体が、フローサイトメトリーアッセイにより１時間後に計測した場合、ＯＶＣＡＲ−８細胞上での、当該二重特異性抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して、７％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示すことを特徴とする。
【００３４】
一実施形態では、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位とヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記二重特異性抗体は、前記二重特異性抗体が、フローサイトメトリーアッセイにより１時間後に計測した場合、ＯＶＣＡＲ−８細胞上での、当該二重特異性抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して、５％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示すことを特徴とする。
【００３５】
「ｃ−Ｍｅｔの内部移行」という用語は、抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較した場合の、ＯＶＣＡＲ−８細胞（NCI Cell Line designation；NCI（国立癌研究所）から購入したOVCAR-8-NCI；Schilder, RJ. et al., Int. J. Cancer 45 (1990) 416-422；Dcediobi, O.N. et al., Mol. Cancer. Ther. 5 (2006) 2606- 2012；Lorenzi, P.L., et al., Mol. Cancer Ther. 8 (2009) 713-724）上での、抗体誘導型のｃ−Ｍｅｔ受容体の内部移行を指す。ｃ−Ｍｅｔ受容体のそのような内部移行は、本発明による二重特異性抗体によって引き起こされ、そして実施例１１に記載のとおりフローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）によって１時間後に計測される。本発明による二重特異性抗体は、抗体の不存在下でのｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較した場合に、抗体への暴露の１時間後にＯＶＣＡＲ−８細胞における１５％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示す。一実施形態では、前記抗体は１０％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示す。一実施形態では、前記抗体は７％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示す。一実施形態では、前記抗体は５％未満のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示す。
【００３６】
この発明の別の態様は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位とヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記二重特異性抗体であって、フローサイトメトリーアッセイによって１時間後にＯＶＣＡＲ−８細胞において計測したときに、（対応する）単一特異性の二価の親ｃ−Ｍｅｔ抗体によって誘発されたｃ−Ｍｅｔの内部移行と比較して、前記二重特異性抗体が、５０％以上（一実施形態では６０％以上；他の実施形態では７０％以上、一実施形態では８０％以上）ｃ−Ｍｅｔの内部移行を減少させることを特徴とする。ｃ−Ｍｅｔの内部移行の減少は、以下のとおり計算される（ＯＶＣＡＲ−８細胞におけるフローサイトメトリーアッセイにより１時間後に計測される内部移行率（％）の値を使用しているが、０より低い内部移行率（％）の値は０％内部移行と設定する、例えばＢｓＡＢ０２に関して（−７％内部移行を０％の内部移行と設定した））：１００×（単一特異性の二価の親ｃ−Ｍｅｔ抗体によって誘発されたｃ−Ｍｅｔの内部移行率（％）−二重特異性ＥｒｂＢ−２／ｃＭｅｔ抗体によって誘発されたｃ−Ｍｅｔの内部移行率（％））／単一特異性の二価の親ｃ−Ｍｅｔ抗体によって誘発されたｃ−Ｍｅｔの内部移行率（％）。例えば：二重特異性ＥｒｂＢ２／ｃＭｅｔ抗体ＢｓＡＢ０２が（０％と設定される）−７％のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示し、且つ、単一特異性の二価の親ｃ−Ｍｅｔ抗体Ｍａｂ ５Ｄ５が３７％のｃ−Ｍｅｔの内部移行を示す。よって、前記二重特異性ＥｒｂＢ−２／ｃＭｅｔ抗体ＢｓＡＢ０２は、１００×（４０−０）／４０％＝１００％のｃ−Ｍｅｔの内部移行の減少を示す（実施例１１でのＯＶＣＡＲ−８細胞におけるフローサイトメトリーアッセイにより１時間後に計測される内部移行値を参照のこと）。
【００３７】
本明細書中に使用される場合、「抗体」は、抗原結合部位を含んでなる結合タンパク質を指す。「結合部位」又は「抗原結合部位」という用語は、本明細書中では、リガンドが実際に結合している抗体分子の（単数若しくは複数の）領域を意味し、抗体に由来する。「抗原結合部位」という用語には、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）又はＶＨ／ＶＬの対が含まれ、抗体全体又は抗体フラグメント、例えば一本鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ）２などに由来することもある。この発明の一実施形態では、それぞれの抗体結合部位が、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでなり、好ましくは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）から成る１対によって形成される。
【００３８】
抗体由来の抗原結合部位に加えて、例えばMatzke, A., et al., Cancer Res. 65 (14) (2005) 6105-10. July 15, 2005に記載された結合ペプチドもまた、抗原（例えばｃ−Ｍｅｔ）に特異的に結合し得る。よって、この発明の更なる態様は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する抗原結合部位及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する結合ペプチドを含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性結合性分子である。よってこの発明の更なる態様は、ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位及びヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する結合ペプチドを含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性結合性分子である。
【００３９】
ＥｒｂＢ−２（ＥＲＢＢ２、ＨＥＲ２；ＣＤ３４０、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂ Ｂ２／ｎｅｕタンパク質、神経芽細胞腫／神経膠芽腫由来癌遺伝子相同体｜ｖ−ｅｒｂ−ｂ２ 鳥類赤血球性白血病ウイルス癌遺伝子相同体２；配列番号１４としても知られている）は、それ自身のリガンド結合ドメインを持たないタンパク質であるため、成長因子に結合することができない。しかしながら、他のリガンド結合ＥＧＦ受容体ファミリーメンバーに強く結合してヘテロ二量体を形成し、リガンド結合を安定させ、そして下流のシグナル伝達経路のキナーゼ媒介型活性化を促進する、例えばそれらはマイトジェン活性化プロテインキナーゼやホスファチジルイノシトール−３キナーゼに関与している。本明細書中に示した最も頻度の高い対立遺伝子Ｉｌｅ６５４／Ｉｌｅ６５５を含めて、第６５４及び６５５位アミノ酸における対立遺伝子変異のアイソフォームａ（第６２４及び６２５位のアイソフォームｂ）が報告されている。この遺伝子の増幅、及び／又は過剰発現は、乳房及び卵巣の腫瘍を含めた多数の癌で報告されている。選択的スプライシングはいくつかのさらなる転写物変異体をもたらすが、一部のものは異なるアイソフォームをコードし、他のものは完全に特徴づけされていない。ＥｒＢ−２は、元々、形質変換遺伝子の産物として化学物質で処理されたラットの神経芽細胞腫から同定された。ｎｅｕ癌原遺伝子の活性型は、コードされたタンパク質の膜貫通領域における（バリンからグルタミン酸への）点突然変異から得られた（Semba, K., et al., PNAS 82 (1985) 6497-501；Coussens, L., et al., Science 230 (1985) 1132-9；Bargmann, C.I., et al., Nature 319 (1986) 226-30；Yamamoto, T., et al., Nature 319 (1986) 230-4）。
【００４０】
ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する抗原結合部位、特に重質鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ａ）例えば２Ｃ４（パーツズマブ；パーツズマブは、マウス抗ＨＥＲ２抗体２Ｃ４の遺伝子組み換えヒト化バージョンである、そしてそれぞれの調製方法と共にWO01/00245及びWO2006/007398に記載されている）及び４Ｄ５（トラスツズマブ（マウス抗ＨＥＲ２抗体４Ｄ５の遺伝子組み換えヒト化バージョン、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）；トラスツズマブ及びその調製方法はUS5,821,337に記載されている））抗体（Hudziak, R., M, et al, Mol. Cell. Biol. 9 (1989) 1165-1172；Fendly, B., M., et al., Cancer Research 50 (1990) 1550-1558）のような既知の抗ＥｒｂＢ−２抗体、あるいは、ｂ）とりわけヒトＥｒｂＢ−２タンパク質又は核酸若しくはその断片のいずれかを使用したデノボ免疫法によって、又はファージ提示法によって得られた新しい抗ＥｒｂＢ−２抗体、に由来することができる。
【００４１】
ＭＥＴ（間葉−上皮移行因子）は、タンパク質ＭＥＴをコードする癌原遺伝子であり、（ｃ−Ｍｅｔ、肝細胞増殖受容体ＨＧＦＲ；ＨＧＦ受容体；細胞分散因子受容体；ＳＦ受容体；配列番号１３としても知られている）（Dean, M., et al., Nature 318 (1985) 385-8；Chan, A.M., et al., Oncogene 1 (1987) 229-33；Bottaro, D.P., et al., Science 251 (1991) 802-4；Naldini, L., et al.5 EMBO J. 10 (1991) 2867-78；Maulik, G., et al., Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2002) 41-59）。ＭＥＴは、胚発生と創傷治癒に不可欠な膜受容体である。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、ＭＥＴ受容体の唯一の既知のリガンドである。ＭＥＴは通常、上皮起源の細胞によって発現されるが、ＨＧＦの発現は間葉起源の細胞に限られている。ＨＧＦ刺激により、ＭＥＴは浸潤性増殖として知られているプログラムをまとめて引き起こす数個の生物反応を誘発する。癌における異常なＭＥＴ活性化は、異常な活性のＭＥＴが腫瘍増殖や、腫瘍に栄養を供給する新生血管の形成（血管新生）や、他の臓器への癌の分散（転移癌）を引き起こす、予後不良と関連がある。ＭＥＴは、腎臓、肝臓、胃、乳房、及び脳の癌を含めた多くのタイプのヒト悪性腫瘍において無秩序である。本来なら、幹細胞と始原細胞だけがＭＥＴを発現しており、それが胎児において新しい組織を作り出したり、成人において損傷した組織を再生するために、これらの細胞が侵襲的に増殖することを可能にしている。しかしながら、癌幹細胞は、ＭＥＴを発現する正常幹細胞の能力を乗っ取り、それによって癌持続性と体内の他の部位への分散の原因となっている。
【００４２】
ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位、特に重質鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び／又は抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、ａ）例えばUS5,686,292、US7,476,724、WO2004/072117、WO2004/108766、WO2005/016382、WO2005/063816、WO2006/015371、WO2006/104911、WO2007/126799、又はWO2009/007427に記載の既知の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、あるいは、ｂ）例えば、とりわけヒト抗−Ｍｅｔタンパク質又は核酸若しくはその断片のいずれかを使用したデノボ免疫法によって、又はファージ提示法によって得られた新しい抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、に由来することができる。
【００４３】
本発明の更なる態様は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する第１の抗原結合部位及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する第２の抗原結合部位を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性抗体であって、以下の：
ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号１の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号２の配列を含んでなり；そして
ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインとして配列番号３の配列を含んでなり、且つ、軽鎖可変ドメインとして配列番号４の配列を含んでなる、
を特徴とする前記二重特異性抗体である。
【００４４】
抗体の特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば、天然抗体は単一特異性である。本発明による「二重特異性抗体」は、２つの異なった抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が２以上の特異性を有する場合には、認識されたエピトープは単一の抗原又は２以上の抗原と結合することもできる。本発明の抗体は、２つの異なった抗原、すなわち第１の抗原としてのＥｒｂＢ−２及び第２の抗原としてのｃ−Ｍｅｔに特異的である。
【００４５】
用語「単一特異性」抗体は、本明細書中で使用される場合、そのそれぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する１以上の結合部位を持つ抗体を意味する。
【００４６】
用語「価」は、本明細書中で使用される場合、抗体分子内に存在している一定数の結合部位を意味する。同様に、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗体分子内にそれぞれ２つの結合部位、４つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を意味する。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、そして「三価」又は「多価」（例えば「四価」若しくは「六価」）でもあり得る。
【００４７】
本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に多かれ少なかれ貢献する６つの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）を含むことができる。３つの重鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）と３つの軽鎖可変ドメインＣＤＲｓ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）がある。ＣＤＲとフレームワーク領域（ＦＲ）の程度は、配列内での可変性によってそれらの領域が規定されたコンパイルされたアミノ酸配列のデータベースとの比較によって決定される。いくつかのＣＤＲを含んでなる（すなわち、結合特異性が３、４又は５つのＣＤＲによって決定される）機能性抗原結合部位もまた、本発明の範囲内に含まれる。例えば、６つのＣＤＲの完全セット以下でも結合に十分であり得る。場合によっては、ＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒト起源の１若しくは複数の免疫グロブリンクラスの免疫グロブリン定常領域を更に含む。免疫グロブリンクラスには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥアイソタイプ、そしてＩｇＧとＩｇＡの場合には、それらのサブタイプが含まれる。好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧタイプ抗体の定常ドメイン構造を有するが、４つの抗原結合部位を有する。これは、例えば、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つ（若しくは２つ）の完全抗原結合部位（例えば一本鎖Ｆａｂフラグメント若しくは一本鎖Ｆｖ）を、ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する完全な抗体の重鎖又は軽鎖のＮ又はＣ末端のいずれかに連結して、三価の二重特異性抗体（又は四価の二重特異性抗体）を得ることによって達成される。あるいは、例えばEP出願番号第07024867.9号、EP出願番号第07024864.6号、EP出願番号第07024865.3号又はRidgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；WO96/027011；Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681；Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35及びEP1870459ALに記載のとおり、免疫グロブリン定常領域を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに対する、ＩｇＧのような二重特異性の二価抗体を使用できる。
【００４９】
用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を意味する。
【００５０】
用語「キメラ抗体」とは、通常組換えＤＮＡ技術により調製される、可変領域、すなわち１つの源又は種からの結合領域、及び異なった源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部を含んでなる抗体を意味する。ネズミ可変領域及びヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される他の好ましい形の「キメラ抗体」は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明の性質を生じるように、修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されているそれらの抗体である。そのようなキメラ抗体はまた、「クラス−スイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするＤＮＡセグメント、及び免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡセグメントを含んでなる免疫グロブリン遺伝子が発現された生成物である。キメラ抗体を生成するための方法は、当業界において現在良く知られている、従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術を包含する。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81（1984）6851-6855；US 5,202,238及びＵＳ 5,204,244を参照のこと。
【００５１】
用語「ヒト化抗体」とは、そのフレームワーク又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が、親イムノグロブリンのＣＤＲに比較して、異なった特異性の免疫グロブリンのＣＤＲを含んでなるよう修飾されている抗体を意味する。好ましい実施形態では、ネズミＣＤＲは、「ヒト化抗体」を調製するために、ヒト抗体のフレームワーク領域中に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332（1988）323-327；及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314（1985）268-270を参照のこと。特に好ましいＣＤＲは、キメラ抗体に関して上記に示される抗原を認識する配列を表すものに対応する。本発明により包含される他の形の「ヒト化抗体」とは、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明の性質を生じるように、更に修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されている抗体である。
【００５２】
用語「ヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を包含することを意図する。ヒト抗体は技術的に良く知られている（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5（2001）368-374）。ヒト抗体はまた、免疫化に基づいて、内因性免疫グロブリン生成の不在下でヒト抗体の全レパートリー又は選択物を生成できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においても生成され得る。そのような生殖系変異マウス内へのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原攻撃に基づくヒト抗体の生成をもたらすであろう（例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）2551-2555；Jakobovits, A., et al., Nature 362（1993）255-258；Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7（1993）33-40を参照のこと）。ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリーにおいても生成され得る（Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388；Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222（1991）581-597）。Cole, S.P.C.ら及びBoerner, Pらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用できる（Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Liss, A. L.（1985） 77-96；及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147（1991）86-95）。本発明のキメラ及びヒト化抗体についてすでに言及されたように、用語「ヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、また、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃＲ結合に関して、例えばＦｃ部分の「クラススイッチ」、すなわち変更又は突然変異誘発（ＩｇＧ１からＩｇＧ４への及び／又はＩｇＧ１／ＩｇＧ４突然変異）により、本発明の性質を生じるように定常領域において修飾されているそのような抗体も含んでなる。
【００５３】
用語「組換えヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製され、発現され、作出され、又は単離されるすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞、例えばＮＳ０又はＣＨＯ細胞から又はヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体、又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を意味する。そのような組換えヒト抗体は、再配置された形で、可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、生体内における体細胞超突然変異にゆだねられている。従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系ＶＨ及びＶＬ領域に由来し、そしてその配列に関連しているが、天然においては、ヒト抗体生殖系レパートリー内で生体内には存在することができない配列である。
【００５４】
「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の結合において直接関与する軽鎖及び重鎖の対の各々を示す。ヒト可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、そして各々のドメインは４個のフレームワーク（ＦＲ）領域を含んで成り、それらの配列は広く保存され、３個の「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）により結合される。フレームワーク領域は、β−シートコンホメーションを採用し、そしてＣＤＲはβ−シート構造体を結合するループを形成することができる。各々の鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によりそれらの立体構造を保持され、そして他の鎖からのＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖ＣＤＲ3領域は、本発明の抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を演じ、従って、本発明の更なる目的を提供する。
【００５５】
用語「超可変領域」又は「抗体の抗原−結合部分若しくは抗原結合部位」とは、本明細書において使用される場合、抗原結合を担当できる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書において定義されるように超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖は、N末端からC末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含んでなる。各々の鎖上のＣＤＲはそのようなフレームワークアミノ酸により分離される。特に、重鎖のＣＤＲ３は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）の標準的な定義に従って決定される。
【００５６】
本明細書において使用される場合、用語「結合」又は「特異的に結合」とは、試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore、GE-Healthcare Uppsala, Sweden）における抗体の抗原（ヒトＥｒｂＢ−２又はヒトｃ−Ｍｅｔのいずれか）のエピトープへの結合を指す。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋD（解離定数）、及びＫD（ｋD／ｋａ）によって規定される。結合又は特異的に結合は、１０-8ｍｏｌ／ｌ以下、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫD）を意味する。よって、本発明による二重特異性＜ＥｒｂＢ−２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体は、各抗原に対して１０-8ｍｏｌ／ｌ、好ましくは１０-9Ｍ〜１０-13ｍｏｌ／ｌの結合親和性（ＫD）を有する特異性をもって特異的に結合する。
【００５７】
ＦｃγＲＩＩＩへの抗体の結合は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ（GE-Healthcare Uppsala, Sweden）により調査され得る。結合の親和性は、用語ｋａ（抗体／抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数）、ｋD（解離定数）、及びＫD（ｋD／ｋａ）により規定される。
【００５８】
用語「エピトープ」とは、抗体に対して特異的に結合できるいずれかのポリペプチド決定基を包含する。ある実施形態においては、エピトープ決定基は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリン又はスルホニルなどの化学的活性表面群を包含し、そしてある実施形態においては、特定の立体構造特性及び／又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
【００５９】
ある実施形態においては、抗体は、それがタンパク質及び／又は高分子の複合混合物中でその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【００６０】
用語「定常領域」は、本明細書中で使用される場合、可変領域以外の抗体のドメインの集合を意味する。定常領域は、抗原の結合に直接的にかかわらないが、様々なエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体は以下のクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分類され、そしてそのいくつか、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２などは、サブクラスに更に分類されることもできる。異なった抗体クラスに該当する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。全部で５つの抗体クラスで見ることができる軽鎖定常領域は、κ（カッパ）及びλ（ラムダ）と呼ばれる。定常領域は、好ましくはヒト起源に由来する。
【００６１】
用語「ヒト起源由来の定常領域」は、本願で使用される場合、ヒト抗体のサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、及び／又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域を規定する。そのような定常領域は、当技術分野の現状において周知であり、例えば、Kabat, E.A.によって説明されている（例えばJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28（2000）214-218；Kabat, E.A., et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 72（1975）2785-2788を参照のこと）。
【００６２】
一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラス（好ましくはＩｇＧ１サブクラス）の定常領域を含んでなり、それは好ましくはヒト起源に由来する。一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラス（好ましくはＩｇＧ１サブクラス）のＦｃ部分を含んでなり、それは好ましくはヒト起源に由来する。
【００６３】
ＩｇＧ４サブクラスの抗体がＦｃ受容体（ＦｃｙＲＩＩＩａ）結合の低減を示している一方で、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示している。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の欠如）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、及びＨｉｓ４３５は、変更された場合には、同様に低減されたＦｃ受容体結合性を示す残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604；Lund, J., et al., FASEB J. 9（1995）115-119；Morgan, A., et al., Immunology 86（1995）319-324；EP 0 307 434）。
【００６４】
１つの実施形態では、本発明による抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較してＦｃＲ結合が低減されているので、全長親抗体は、ＦｃＲ結合に関して、ＩｇＧ４サブクラスのもの、あるいはＳ２２８、Ｌ２３４、Ｌ２３５及び／又はＤ２６５に突然変異を伴う、及び／又はＰＶＡ２３６突然変異を含むＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスのものである。１つの実施形態では、全長親抗体内の突然変異は、Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、及び／又は、ＰＶＡ２３６である。他の実施形態では、全長親抗体内の突然変異は、ＩｇＧ４ではＳ２２８ＰそしてとＩｇＧ１ではＬ２３４ＡとＬ２３５Ａにある。
【００６５】
抗体の定常領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞毒性）及びＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスの定常領域への補体Ｃ１ｑ因子の結合により開始する。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質−タンパク質相互作用により起きる。そのような定常領域の結合部位は、当技術分野の現状において公知であり、例えばLukas, T.J., et al., J. Immunol. 127（1981）2555-2560；Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16（1979）907-917；Burton, D.R., et al., Nature 288（1980）338-344；Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37（2000）995-1004；Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164（2000）4178-4184；Hezareh, M., et al., J. Virol. 75（2001）12161-12168；Morgan, A., et al., Immunology 86（1995）319-324；及びEP 0 307 434により記載されている。そのような定常領域の結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）を特徴とする。
【００６６】
用語「抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）」は、エフェクター細胞の存在下での、本発明よる抗体によるヒト標的細胞の溶解を指す。ＡＤＣＣは、好ましくは、新たに単離されたＰＢＭＣ、又は単球若しくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は恒久的に増殖しているＮＫ細胞株のような精製された軟膜由来エフェクター細胞等のエフェクター細胞の存在下で、本発明よる抗体を用いて、ＥｒＢ−１及びｃ−Ｍｅｔ発現細胞の調製物を処理することにより測定される。
【００６７】
用語「補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）」は、大部分のＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部への補体Ｃ１ｑ因子の結合により開始する過程と規定される。抗体へのＣ１ｑの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質−タンパク質相互作用により起きる。そのようなＦｃ部の結合部位は、当技術分野の現状において公知である（前記を参照のこと）。そのようなＦｃ部の結合部位は、例えばアミノ酸Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１、及びＰ３２９（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）を特徴とする。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、通常はＣ１ｑ及びＣ３の結合を含めた補体活性化を示し、一方でＩｇＧ４は補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及びＣ３と結合しない。
【００６８】
モノクローナル抗体の細胞媒介型エフェクター機能は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17（1999）176-180及びUS 6,602,684に記載されているように、それらのオリゴ糖構成要素を操作することによって増強することができる。癌免疫療法において最もよく使用される抗体であるＩｇＧ１型抗体は、保存されたＮ結合型グリコシル化部位を各ＣＨ２ドメイン中のＡｓｎ２９７において有する糖タンパク質である。Ａｓｎ２９７に結合した２つの複合型二分岐オリゴ糖は、ＣＨ２ドメインの間に埋もれて、ポリペプチド骨格との広範囲の接触面を形成し、それらの存在は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）のようなエフェクター機能を抗体が媒介するために不可欠である（Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5（1995）813-822；Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163（1998）59-76；Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15（1997）26-32）。Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17（1999）176-180及びWO 99/54342は、２つに分岐したオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（「ＧｎＴＩＩＩ」）がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において過剰発現されると、抗体の生体内でのＡＤＣＣ活性が有意に増大することを示した。また、Ａｓｎ２９７炭水化物の組成の改変又はその除去も、ＦｃγＲ及びＣ１ｑへの結合に影響を及ぼす（Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17（1999）176-180；Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74（2001）288-294；Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）45539-45547；Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）16478-16483；Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604；Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277（2002）26733-26740；Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263（2002）133-147）。
【００６９】
フコースの量を減少させることによってモノクローナル抗体の細胞媒介型エフェクター機能を高める方法は、例えば、WO2005/018572、WO2006/116260、WO2006/114700、WO2004/065540、WO2005/011735、WO2005/027966、WO1997/028267、US2006/0134709、US2005/0054048、US2005/0152894、WO2003/035835、WO2000/061739、Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160；Shinkawa, T., et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473；WO03/055993又はUS2005/0249722に記載されている。
【００７０】
本発明の一実施形態では、本発明による二重特異性抗体は、（ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ３サブクラス）Ａｓｎ２９７にて糖鎖を用いてグリコシル化され、それによって、前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下になる（付番はKabatに準じる）。他の実施形態では、前記糖鎖内のフコースの量が、５％〜６５％、好ましくは２０％〜４０％である。本発明による「Ａｓｎ２９７」は、Ｆｃ領域内の約２９７位に見られるアミノ酸であるアスパラギンを意味する。抗体のわずかな配列変化により、Ａｓｎ２９７はまた、２９７位の数アミノ酸（通常、±３アミノ酸以下）上流又は下流、すなわち、２９４位から３００位の間でも見られることがある。
【００７１】
ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、最大２つのＧａｌ残基で終わるコアフコース化二本鎖複合型オリゴ糖グリコシル化としてＡｓｎ２９７で起こる。ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスのヒト重鎖定常領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.（1991）、及びBruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166（1987）1351-1361；Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178（1989）515-527によって詳細に説明されている。これらの構造は、終末のＧａｌ残基の量に依存して、Ｇ０、Ｇ１（α−１，６−若しくはα−１，３−）又はＧ２グリカン残基として指定される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1（2003）44-53）。抗体Ｆｃ部分のＣＨＯタイプのグリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14（1997）201-207によって説明されている。非糖修飾ＣＨＯ宿主細胞において組換え発現される抗体は、通常少なくとも８５％の量がＡｓｎ２９７においてフコース化されている。全長親抗体の修飾オリゴ糖は、ハイブリッドであっても複合体であってもよい。好ましくは、分枝、還元／非フコース化オリゴ糖がハイブリッドされる。他の実施形態において、分枝、還元又は非フコース化オリゴ糖が複合体化される。
【００７２】
本発明による「フコースの量」は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定し、平均値として算出した、Ａｓｎ２９７に結合したすべての糖残基（例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物、及び高マンノース構造物）の合計に対するＡｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの量を意味する。フコースの相対量は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって測定した、N-グリコシダーゼFで処理したサンプルにおいて同定された全糖構造物（例えば、それぞれ複合体構造物、ハイブリッド構造物、並びにオリゴマンノース構造物及び高マンノース構造物）に対するフコース含有構造物のパーセンテージである（例えばWO2008/077546（A1）を参照のこと）。
【００７３】
一実施形態は、WO2005/044859、WO2004/065540、WO2007/031875、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、WO99/154342、WO2005/018572、WO2006/116260、WO2006/114700、WO2005/011735、WO2005/027966、WO97/028267、US2006/0134709、US2005/0054048、US2005/0152894、WO2003/035835又はWO2000/061739に記載の手順を用いた、Ａｓｎ２９７にて糖鎖を用いて（糖鎖が）グリコシル化され、それによって、前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下になる、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの二重特異性抗体の調製法である。
【００７４】
一実施形態は、Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160；Shinkawa, T. et al, J Biol Chem, 278 (2003) 3466-3473；WO03/055993又はUS2005/0249722に記載の手順を用いた、Ａｓｎ２９７にて糖鎖を用いて（糖鎖が）グリコシル化され、それによって、前記糖鎖内のフコースの量が６５％以下になる、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの二重特異性抗体の調製法である。
【００７５】
二重特異性抗体フォーマット
本発明の抗体は、２個以上の結合部位を持つので、多特異性であり、好ましくは二重特異性である。すなわち、抗体は、２以上の結合部位がある場合でさえ、二重特異性であり得る（すなわち、抗体は三価又は多価性である）。本発明の二重特異性抗体には、例えば多価性一本鎖抗体、二重特異性抗体、及び三重特異性抗体、並びに１若しくは複数のペプチド・リンカーを介して連結された更なる抗原結合部位（例えば一本鎖Ｆｖ、ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメイン、Ｆａｂ、又は（Ｆａｂ）２）を持つ全長抗体の定常ドメイン構造を有する抗体が含まれる。抗体は、単一種からの全長であることも、又はキメラ化若しくは又はヒト化されることもできる。３つ以上の抗原結合部位を有する抗体に関しては、タンパク質に２つの異なった抗原のための結合部位がある限り、いくつかの結合部位が同一のであることもあり得る。すなわち、第１の結合部位がＥｒｂＢ−２に特異的である一方で、第２の結合部位はｃ−Ｍｅｔに特異的であり、そして逆もまた同様である。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明によるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する二重特異性抗体は、（好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３サブクラスの）抗体のＦｃ領域を含んでなる。
【００７７】
二価の二重特異性フォーマット
免疫グロブリン定常領域を含んでなるヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに対する二重特異性の二価抗体は、例えば、WO2009/080251、WO2009/080252、WO2009/080253若しくはRidgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621；WO96/027011；Merchant, A.M., et al. Nature Biotech 16 (1998) 677-681；Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35及びEP1870459A1に記載のように使用できる。
【００７８】
よって、本発明の一実施形態では、本発明による二重特異性＜ＥｒｂＢ−２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体は、以下の：
ａ）ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖；
を含んでなり、ここで、定常ドメインＣＬとＣＨ１、及び／又は可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている二価の二重特異性抗体である。
【００７９】
本発明の他の実施形態において、本発明による二重特異性＜ＥｒｂＢ−２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体は、以下の：
ａ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖；並びに
ｂ）ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖；
を含んでなり、ここで、定常ドメインＣＬとＣＨ１、及び／又は可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられている二価の二重特異性抗体である。
【００８０】
以下で記載する「ホール−ｉｎｔｏ−ノブ」技術を用いた代表的な図式的構造については、図２ａ〜ｃを参照のこと。
【００８１】
そのようなヘテロ二量体の二価の二重特異性抗ＥｒｂＢ−２／抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の収率を改善するために、前記全長抗体のＣＨ３ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway, J., B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A., M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681中にいくつかの実施例を用いて詳細に説明されている「ホール−ｉｎｔｏ−ノブ」技術によって変更され得る。この方法では、２種のＣＨ３ドメインの相互作用表面が、それらの２種のＣＨ３ドメインを含む両重鎖のヘテロダイマー化を高めるために変更される。（２種の重鎖の）２種のＣＨ３ドメインの個々が「ノブ」であり、そして他が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマーを安定化し（Merchant, A..M., et al, Nature Biotech 16（1998）677-681；Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、そして収率を高める。
【００８２】
従って、本発明の１つの態様では、前記二価の二重特異性抗体は、１つの重鎖のＣＨ３ドメイン及び他の重鎖のＣＨ３ドメインが、抗体ＣＨ３ドメイン間に本来の界面を含んでなる界面で各々接触し；
ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が：
ａ）二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔に位置決定できる、一方の重鎖ＣＨ３ドメインの界面内に隆起部を生じるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更され、そして
ｂ）二価の二重特異性抗体内の第１ＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、第２ＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第１ＣＨ３ドメインの界面内の隆起部が位置決定できる第２ＣＨ３ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されることにより更に特徴づけられる。
【００８３】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）から成る群から選択される。
【００８４】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）から成る群から選択される。
【００８５】
本発明の１つの態様においては、両ＣＨ３ドメインは更に、それらの両ＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るよう、各々のＣＨ３ドメインのその対応する位置のアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により変更される。
【００８６】
好ましい実施形態では、前記二価の二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＴ３６６Ｗ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる。例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＹ３４９Ｃ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＥ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を導入することによって、ＣＨ３ドメイン間の追加的な鎖間ジスルフィド架橋もまた使用できる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16（1998）677-681）。よって、別の好ましい実施形態では、前記二価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなるか、又は前記二価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる（鎖間ジスルフィド架橋を形成する、一方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＹ３４９Ｃ突然変異ともう片方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異）（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。しかし、EP1870459A1によって記載される他のノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術もまた代替的に又は追加的に使用できる。前記二価の二重特異性抗体の好ましい例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異である（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。
【００８７】
別の好ましい実施形態では、前記二価の二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｗ突然変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異、そして追加的に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０突然変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７ＫＥ突然変異を含んでなる。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、前記二価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなるか、又は前記二価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなり、そして追加的に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含んでなる。
【００８９】
三価の二重特異性フォーマット
この発明の別の好ましい態様は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの一本鎖Ｆａｂフラグメント
を含んでなり、ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合される、三価の二重特異性抗体である。
【００９０】
以下で記載する「ホール−ｉｎｔｏ−ノブ」技術を用いた代表的な図式的構造は、図５ａを参照のこと。
【００９１】
この発明の別の好ましい態様は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの一本鎖Ｆｖフラグメント
を含んでなり、ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆｖフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合される、三価の二重特異性抗体である。
【００９２】
以下で記載する「ホール−ｉｎｔｏ−ノブ」技術を用いた代表的な図式的構造は、図５ｂを参照のこと。
【００９３】
１つの好ましい実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔに結合する前記一本鎖Ｆａｂ又はＦｖフラグメントは、前記の全長抗体に、前記全長抗体の重鎖のＣ末端のペプチドコネクタを介して融合される。
【００９４】
この発明の別の好ましい態様は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖及び２つの抗体軽鎖から成る全長抗体； 
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されていて、
【００９５】
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されている、
を含んでなり；そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
【００９６】
好ましくは、前記ｂ）及びｃ）のペプチドコネクタは、同一であり、且つ、少なくとも２５個のアミノ酸、好ましくは３０〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである。
【００９７】
代表的な図式的構造については、図３ａ〜ｃを参照のこと。
【００９８】
任意には、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、連結され、そして下記の位置の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド架橋によって安定化させる：
ｉ）重鎖可変ドメインの第４４位〜軽鎖可変ドメインの第１００位
ｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０５位〜軽鎖可変ドメインの第４３位、又は、
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０１位〜軽鎖可変ドメインの第１００位（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。
【００９９】
安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入する技術は、例えば、WO94/029350、Rajagopal, et al., Prot Engin. (1997) 1453-59；Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, 25, (1998) 387-393；又はSchmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721に記載されている。１つの実施形態では、ｂ）とｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第４４位と軽鎖可変ドメインの第１００位の間にある。１つの実施形態では、ｂ）とｃ）のポリペプチドの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第１０５位と軽鎖可変ドメインの第４３位の間にある（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。１つの実施形態では、一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬの間の前記任意のジスルフィドによる安定化のない、三価の二重特異性抗体が好まれる。
【０１００】
一方の重鎖への一本鎖Ｆａｂ、Ｆｖフラグメントの融合によって（図５ａ又は５ｂ）又は全長抗体の両方の重鎖への別個のポリペプチドの融合によって（図３ａ〜ｃ）、ヘテロ二量体の三価の二重特異性抗体がもたらされる。そのようなヘテロ二量体の三価の二重特異性抗ＥｒｂＢ−２／Ｍｅｔ抗体の収率を高めるために、前記全長抗体のＣＨ３ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway, J., B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621；及びMerchant, A., M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681中にいくつかの実施例を用いて詳細に説明されている「ホール−ｉｎｔｏ−ノブ」技術によって変更され得る。この方法では、２種のＣＨ３ドメインの相互作用表面が、それらの２種のＣＨ３ドメインを含む両重鎖のヘテロダイマー化を高めるために変更される。（２種の重鎖の）２種のＣＨ３ドメインの個々が「ノブ」であり、そして他が「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマーを安定化し（Merchant, A..M., et al, Nature Biotech 16（1998）677-681；Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）、そして収率を高める。
【０１０１】
従って、本発明の１つの態様では、前記三価の二重特異性抗体は、全長抗体の１つの重鎖のＣＨ３ドメイン及び全長抗体の他の重鎖のＣＨ３ドメインが、抗体ＣＨ３ドメイン間に本来の界面を含んでなる界面で各々接触し；
ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が：
ａ）二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインの界面内の腔に位置決定できる、一方の重鎖ＣＨ３ドメインの界面内に隆起部を生じるように、一方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更され、そして
ｂ）三価の二重特異性抗体内の第１ＣＨ３ドメインの本来の界面と接触する、第２ＣＨ３ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第１ＣＨ３ドメインの界面内の隆起部が位置決定できる第２ＣＨ３ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のＣＨ３ドメインが変更されることにより更に特徴づけられる。
【０１０２】
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（R）、フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）から成る群から選択される。
【０１０３】
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）、バリン（V）から成る群から選択される。
【０１０４】
本発明の１つの態様においては、両ＣＨ３ドメインは更に、それらの両ＣＨ３ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るよう、各々のＣＨ３ドメインのその対応する位置のアミノ酸としてのシステイン（C）の導入により変更される。
【０１０５】
好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＴ３６６Ｗ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる。例えば、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＹ３４９Ｃ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＥ３５６Ｃ突然変異又はＳ３５４Ｃ突然変異を導入することによって、ＣＨ３ドメイン間の追加的な鎖間ジスルフィド架橋もまた使用できる（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16（1998）677-681）。よって、別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなるか、又は前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる（鎖間ジスルフィド架橋を形成する、一方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＹ３４９Ｃ突然変異ともう片方のＣＨ３ドメイン内の追加的なＥ３５６Ｃ又はＳ３５４Ｃ突然変異）（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。しかし、EP1870459A1によって記載される他のノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術もまた代替的に又は追加的に使用できる。前記三価の二重特異性抗体の好ましい例は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異である（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。
【０１０６】
別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｗ突然変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異、そして追加的に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内のＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０突然変異及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内のＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７ＫＥ突然変異を含んでなる。
【０１０７】
別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなるか、又は前記三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなり、そして追加的に「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異、及び「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含んでなる。
【０１０８】
この発明の他の実施形態は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの抗体軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの一本鎖Ｆａｂフラグメント、
ここで、前記一本鎖Ｆａｂフラグメントが、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成り、且つ、ここで、前記抗体ドメインと前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：
ｂａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、又は
ｂｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、
のうちの一方を有し、
ここで、前記リンカーが少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、
を含んでなり、そして
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖ののＣ又はＮ末端の（好ましくは重鎖のＣ末端の）ペプチドコネクタを介して融合されている；
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは１０〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、三価の二重特異性抗体である。
【０１０９】
この実施形態の中で、好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＴ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなり、より好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのなかのもう片方にＳ３５４Ｃ（又はＥ３５６Ｃ）、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる。任意に、前記実施形態では、三価の二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を含んでなり、且つ、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含んでなる。
【０１１０】
この発明の他の実施形態は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの抗体軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの一本鎖Ｆｖフラグメント、
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆｖフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖ののＣ又はＮ末端の（好ましくは重鎖のＣ末端の）ペプチドコネクタを介して融合され；そして
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは１０〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、三価の二重特異性抗体である。
【０１１１】
この実施形態の中で、好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＴ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなり、より好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのなかのもう片方にＳ３５４Ｃ（又はＥ３５６Ｃ）、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる。任意に、前記実施形態では、三価の二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を含んでなり、且つ、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含んでなる。
【０１１２】
よって好ましい実施形態は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの抗体軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する１つの一本鎖Ｆｖフラグメント、
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆｖフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖のＣ末端のペプチドコネクタを介して融合され（２つの抗体重鎖−一本鎖Ｆｖ融合ペプチドをもたらし）；そして
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも５個のアミノ酸である、三価の二重特異性抗体である。
【０１１３】
本発明の他の実施形態は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの抗体軽鎖；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、ＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されて（抗体重鎖−ＶＨ融合ペプチドをもたらし）、
ここで、前記ペプチドコネクタが５つのアミノ酸、好ましくは２５〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、
【０１１４】
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）；又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されて（抗体重鎖−ＶＬ融合ペプチドをもたらし）、
ここで、前記ペプチドコネクタがｂ）のペプチドコネクタと同一である、
を含んでなり；そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。
【０１１５】
この実施形態の中で、好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＴ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方にＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなり、より好ましくは三価の二重特異性抗体は、２つのＣＨ３ドメインのうちの一方にＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異、そして２つのＣＨ３ドメインのなかのもう片方にＳ３５４Ｃ（又はＥ３５６Ｃ）、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる。任意に、前記実施形態では、三価の二重特異性抗体は、「ノブ鎖」のＣＨ３ドメイン内にＲ４０９Ｄ；Ｋ３７０Ｅ突然変異を含んでなり、且つ、「ホール鎖」のＣＨ３ドメイン内にＤ３９９Ｋ；Ｅ３５７Ｋ突然変異を含んでなる。
【０１１６】
本発明の別の態様では、本発明による三価の二重特異性抗体は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に結合し、２つの抗体重鎖、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３及び２つの抗体軽鎖ＶＬ−ＣＬから成る全長抗体；
（ここで、好ましくは２つのＣＨ３ドメインのうちの一方がＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含んでなり、そして２つのＣＨ３ドメインのうちのもう片方がＳ３５４Ｃ（又はＥ３５６Ｃ）、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ突然変異を含んでなる）；
ｂ）以下の：
ｂａ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；又は
ｂｂ）抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、
から成るポリペプチド；
ここで、前記ポリペプチドはＶＨドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちの一方のＣ末端に融合されている；
【０１１７】
ｃ）以下の：
ｃａ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は
ｃｂ）抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、から成るポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドはＶＬドメインのＮ末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の２つの重鎖のうちのもう片方のＣ末端に融合されている；
を含んでなり、そして
ここで、ｂ）のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とｃ）のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が一緒になって、ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する。
【０１１８】
四価の二重特異性フォーマット
一実施形態では、本発明による多特異性抗体は四価であり、ここで、ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する（単数若しくは複数の）抗原結合部位は、（例えばWO2009/007427に記載のように）ｃ−Ｍｅｔの二量化を阻害する。
【０１１９】
本発明の一実施形態では、前記抗体は、ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する２つの抗原結合部位及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する２つの抗原結合部位を含んでなる、ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する四価の二重特異性抗体であって、ここで、ここで、ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する前記抗原結合部位は、（例えばWO2009/007427に記載のように）ｃ−Ｍｅｔの二量化を阻害する。
【０１２０】
そのため、この発明の別の態様は、以下の：
ａ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；並びに
ｂ）ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
【０１２１】
そのため、この発明の別の態様は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する２つの同一の一本鎖Ｆａｂフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
【０１２２】
代表的な図式的構造は、図６ａを参照のこと。
【０１２３】
そのため、この発明の別の態様は、以下の：
ａ）ＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する２つの同一の一本鎖Ｆｖフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆｖフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
【０１２４】
そのため、この発明の別の態様は、以下の：
ａ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合し、且つ、２つの抗体重鎖と２つの抗体軽鎖から成る全長抗体；並びに
ｂ）ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する２つの同一の一本鎖Ｆｖフラグメント、
を含んでなり、
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆｖフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合されている、四価の二重特異性抗体である。
【０１２５】
代表的な図式的構造は、図６ｂを参照のこと。
【０１２６】
好ましい一実施形態では、ヒトｃ−Ｍｅｔ又はヒトＥｒｂＢ−２に結合する一本鎖Ｆａｂ又はＦｖフラグメントが、前記全長抗体に、その全長抗体の重鎖のＣ末端のペプチドコネクタを介して融合されている。
【０１２７】
この発明の他の実施形態は、以下の：
ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合し、且つ、以下の：
ａａ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成る２つの同一の抗体重鎖；及び
ａｂ）Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成る２つの同一の抗体軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）；
から成る全長抗体；並びに
ｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する２つの一本鎖Ｆａｂフラグメント、
ここで、前記一本鎖Ｆａｂフラグメントが、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成り、且つ、ここで、前記抗体ドメインと前記リンカーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：
ｂａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、又は
ｂｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、
のうちの一方を有し、
ここで、前記リンカーが少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、
を含んでなり；そして
ここで、前記のｂ）の一本鎖Ｆａｂフラグメントが、前記のａ）の全長抗体に、その全長抗体の重鎖又は軽鎖ののＣ又はＮ末端のペプチドコネクタを介して融合されている；
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは１０〜５０個のアミノ酸から成るペプチドである、四価の二重特異性抗体である。
【０１２８】
三価又は四価フォーマットのいずれかで使用される場合に、用語「全長抗体」は、２つの「全長抗体重鎖」と２つの「全長抗体軽鎖」から成る抗体を意味する（図１を参照のこと）。「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）から成り、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略記される、ポリペプチドであり、更に任意に、ＩｇＥサブクラスの抗体の場合には、抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）から成るポリペプチドである。好ましくは「全長抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ、ＣＨ１、ＨＲ、ＣＨ２及びＣＨ３から成るポリペプチドである。「全長抗体軽鎖」は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）から成り、ＶＬ−ＣＬと略記される、ポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）であり得る。２つの全長抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間、及び全長抗体重鎖のヒンジ領域の間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒につながっている。典型的な全長抗体の例は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、並びにＩｇＥのような天然抗体である。本発明による全長抗体は、単一種、例えばヒトからのものであることができ、又はそれらは、キメラ化若しくはヒト化抗体であることもできる。本発明による全長抗体は、一対のＶＨとＶＬによってそれぞれ形成された抗原結合部位を２つ含んでなるが、それらは、ともに同じ抗原に特異的に結合する。前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＣ末端における最後のアミノ酸を意味する。前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端は、前記重鎖又は軽鎖のＮ末端における最後のアミノ酸を意味する。
【０１２９】
本発明の中で使用される場合、「ペプチドコネクタ」という用語は、アミノ酸配列を有するペプチドを意味し、それは、好ましくは合成起源のものである。本発明によるこれらのペプチドコネクタは、一本鎖Ｆａｂフラグメントを、全長抗体のＣ又はＮ末端に融合して、本発明による多特異性抗体を形成するのに使用される。好ましくは、前記ｂ）のペプチドコネクタは、少なくとも５個のアミノ酸の長さ、好ましくは５〜１００個、より好ましくは１０〜５０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を持つペプチドである。一実施形態では、前記ペプチドコネクタは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであって、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５若しくは６、及びｍ＝０、１、２若しくは３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４若しくは５及びｍ＝０、１、２若しくは３）、好ましくはｘ＝４及びｎ＝２又は３、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝２を示す。好ましくは、三価の二重特異性抗体（ここで、ＶＨ若しくはＶＨ−ＣＨ１ポリペプチドとＶＬ若しくはＶＬ−ＣＬポリペプチド（図７ａ〜ｃ）が全長抗体のＣ末端に２つの同一のペプチドコネクタを介して融合されている）において、前記ペプチドコネクタは、少なくとも２５個のアミノ酸のペプチドであり、好ましくは３０〜５０個のアミノ酸のペプチド、そしてより好ましくは、前記ペプチドコネクタは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであって、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、及び（ｘ＝３、ｎ＝６、７若しくは８、及びｍ＝０、１、２若しくは３）又は（ｘ＝４、ｎ＝５、６、若しくは７及びｍ＝０、１、２、若しくは３）、好ましくはｘ＝４及びｎ＝５、６、７を示す。
【０１３０】
「一本鎖Ｆａｂフラグメント」（図２ａを参照のこと）は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーから成るポリペプチドであって、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちのいずれか１つであり；且つ、ここで、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸から成るポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂフラグメントａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間の天然のジスルフィド結合によって安定化される。「Ｎ末端」という用語は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を意味し、「Ｃ末端」という用語は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を意味する。
【０１３１】
「リンカー」という用語は、本発明の中で一本鎖Ｆａｂフラグメントに関して使用され、そして（好ましくは合成起源のものである）アミノ酸配列を持つペプチドを意味する。本発明によるこれらのペプチドは、ａ）ＶＨ−ＣＨ１をＶＬ−ＣＬと、ｂ）ＶＬ−ＣＬをＶＨ−ＣＨ１と、ｃ）ＶＨ−ＣＬをＶＬ−ＣＨ１と又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１をＶＨ−ＣＬと連結して、以下の本発明による一本鎖Ｆａｂフラグメントａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬを形成するのに使用される。一本鎖Ｆａｂフラグメントの中の前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸の長さ、好ましくは３２〜５０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を持つペプチドである。一実施形態では、前記リンカーは、（ＧｘＳ）ｎであって、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８、９若しくは１０及びｍ＝０、１、２若しくは３）又は（ｘ＝４、ｎ＝６、７若しくは８及びｍ＝０、１、２若しくは３）を示し、好ましくはｘ＝４、ｎ＝６若しくは７及びｍ＝０、１、２若しくは３を示し、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝７及びｍ＝２を示す。一実施形態では、前記リンカーは（Ｇ4Ｓ）6Ｇ2である。
【０１３２】
好ましい実施形態では、前記一本鎖Ｆａｂフラグメントの中の前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からにＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、又はｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１のいずれか一方であり、より好ましくはＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１である。
【０１３３】
別の好ましい実施形態では、前記一本鎖Ｆａｂフラグメントの中の前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのいずれか一方である。
【０１３４】
任意には、前記一本鎖Ｆａｂフラグメントにおいて、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間の天然のジスルフィド結合に加えて、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）にも、以下の位置間のジスルフィド結合の導入によってジスルフィドにより安定化される：
ｉ）重鎖可変ドメインの第４４位〜軽鎖可変ドメインの第１００位
ｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０５位〜軽鎖可変ドメインの第４３位、又は、
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０１位〜軽鎖可変ドメインの第１００位（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。
【０１３５】
一本鎖Ｆａｂフラグメントのそういった更なるジスルフィドによる安定化は、その一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬの間のジスルフィド結合の導入によって達成される。一本鎖Ｆａｂフラグメントの安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入する技術は、例えば、WO94/029350、Rajagopal, et al., Prot Engin. (1997) 1453-59；Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, 25, (1998) 387-393；又はSchmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721に記載されている。１つの実施形態では、本発明による抗体内に含まれている一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第４４位と軽鎖可変ドメインの第１００位の間にある。１つの実施形態では、本発明による抗体内に含まれている一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第１０５位と軽鎖可変ドメインの第４３位の間にある（付番は常にKabatのＥＵインデックスに準じる）。
【０１３６】
一実施形態では、一本鎖Ｆａｂフラグメントの可変ドメインＶＨとＶＬの間の前記任意のジスルフィドによる安定化のない一本鎖Ｆａｂフラグメントが好まれる。
【０１３７】
「一本鎖Ｆｖフラグメント」（図２ｂを参照のこと）は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び一本鎖Ｆｖリンカーから成るポリペプチドであって、ここで、前記抗体ドメイン及び前記一本鎖Ｆｖリンカーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−一本鎖Ｆｖリンカー−ＶＬ、ｂ）ＶＬ−一本鎖Ｆｖリンカー−ＶＨであり；好ましくは、ａ）ＶＨ−一本鎖Ｆｖリンカー−ＶＬであり；且つ、ここで、前記一本鎖Ｆｖリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸の長さを有し、一実施形態では、少なくとも２０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドである。「Ｎ末端」という用語は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を意味し、「Ｃ末端」という用語は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を意味する。
【０１３８】
一本鎖Ｆｖフラグメントの中で使用される「一本鎖Ｆｖリンカー」という用語は、（好ましくは合成起源のものである）アミノ酸配列を持つペプチドを意味する。前記一本鎖Ｆｖリンカーは、少なくとも１５個のアミノ酸の長さを有し、一実施形態では、少なくとも２０個のアミノ酸の長さ、好ましくは１５〜３０個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を持つペプチドである。一実施形態では、前記一本鎖リンカーは、（ＧｘＳ）ｎであって、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３及びｎ＝４、５若しくは６）又は（ｘ＝４及びｎ＝３、４、５若しくは６）を示し、好ましくはｘ＝４、ｎ＝３、４若しくは５を示し、より好ましくはｘ＝４、ｎ＝３若しくは４を示す。一実施形態では、前記一本鎖Ｆｖリンカーは（Ｇ4Ｓ）3又は（Ｇ4Ｓ）4である。
【０１３９】
更に、前記一本鎖Ｆｖフラグメントは、好ましくは、ジスルフィドにより安定化されている。一本鎖抗体のこうした更なるジスルフィドによる安定化は、その一本鎖抗体の可変ドメインの間のジスルフィド結合の導入によって達成され、そしてそれは、例えば、WO 94/029350、Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. 10 (1997) 1453-59；Kobayashi, R, et al., Nuclear Medicine & Biology 25 (1998) 387-393；又はSchmidt, M., et al., Oncogene 18 (1999) 1711-1721に記載されている。
【０１４０】
ジスルフィドにより安定化した一本鎖Ｆｖフラグメントの一実施形態では、本発明による抗体に含まれている一本鎖Ｆｖフラグメントの可変ドメインの間のジスルフィド結合は、各一本鎖Ｆｖフラグメントごとに独立に、以下のものから選択される：
ｉ）重鎖可変ドメインの第４４位〜軽鎖可変ドメインの第１００位
ｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０５位〜軽鎖可変ドメインの第４３位、又は、
ｉｉｉ）重鎖可変ドメインの第１０１位〜軽鎖可変ドメインの第１００位。
【０１４１】
一実施形態では、本発明による抗体に含まれている一本鎖Ｆｖフラグメントの可変ドメインの間のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第４４位と軽鎖可変ドメインの第１００位の間にある。
【０１４２】
本発明に記載の抗体は、リコンビナント手段により産生される。よって、本発明の１つ態様は、本発明による抗体をコードする核酸であり、そして更なる態様は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含んでなる細胞である。リコンビナント産生のための方法は、当技術分野の現状において広く公知であり、抗体ポリペプチドのその後の単離及び通常は医薬として許容され得る純度への精製を伴う、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現を含む。宿主細胞における前述の抗体の発現のために、個別に改変した軽鎖及び重鎖をコードする核酸が、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母、又はＥ．コリ（E. coli）細胞などの適切な原核又は真核宿主細胞において行われ、そして抗体は、その細胞から回収される（上清又は細胞溶解後に）。抗体のリコンビナント産生のための一般的な方法は、当技術分野の現状において周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17（1999）183-202；Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8（1996）271-282；Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16（2000）151-160；Werner, R.G., Drug Res. 48（1998）870-880の総説に記載されている。
【０１４３】
二重特異性抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製手順により培養液から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、通常の手順を使用して容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡ及びＲＮＡの起源として役立つことができる。いったん単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いでそれをＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、この宿主細胞におけるリコンビナントモノクローナル抗体の合成を達成することができ、この宿主細胞は、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない。
【０１４４】
二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体（突然変異体）は、抗体のＤＮＡ内に適切なヌクレオチドの変更を導入することによって、又はヌクレオチド合成によって調製される。しかし、そのような改変は、例えば上記のように非常に限られた範囲内でのみ行うことができる。例えば、改変は、ＩｇＧアイソタイプ及びエピトープの結合などの前述の抗体の特徴を変化させるのではなく、リコンビナント産生の収率又はタンパク質の安定性を改善することがあり、精製を容易にすることもある。
【０１４５】
用語「宿主細胞」は、本願で使用される場合、本発明による抗体を産生するために設計され得るあらゆる種類の細胞系を意味する。１つの実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が宿主細胞として使用される。本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培地」とは、互換的に使用され、そしてすべてのそのような名称は子孫も包含する。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」とは、トランスファーの数に関係なく、それらに由来する初代対象細胞及び培養物を包含する。すべての子孫は、故意の又は偶然な突然変異のために、ＤＮＡ含有において正確には同一でないこともまた理解されている。元の形質転換された細胞についてスクリーンされる場合、同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。
【０１４６】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32（2000）109-123；Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73（2001）261-270により記載されている。一過性発現が、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30（2002）E9により記載される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）3833-3837；Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289；及びNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204（1997）77-87により記載されている。好ましい一過性発現システム（ＨＥＫ２９３）は、Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30（1999）71-83 及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194（1996）191-199により記載される。
【０１４７】
原核生物のために適切である制御配列には、例えばプロモーター、任意にはオペレーター配列及びリボソームに結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。
【０１４８】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関連性をもって配置されるとき、「操作可能な形で連結され」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチドに関してＤＮＡと操作可能な形で連結している；プロモーター又はエンハンサーは、それがその配列の転写に影響するとき、コード配列と操作可能な形で連結されている；又は、リボソーム結合部位は、それが転写を促進するように配置されているとき、コード配列に操作可能な形で連結されている。一般的に、「操作可能な形で連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が隣接し、そして、分泌リーダーの場合は、隣接し、且つ、読み枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要は無い。連結は、都合の良い制限部位でライゲーションを行うことにより達成される。そのような部位が存在しなければ、確立された手段に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【０１４９】
抗体の精製は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野において周知な他の方法を含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために実行される。Ausubel, F., et al. （ed.）, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）を参照のこと。別の方法、例えば、微生物タンパク質を用いた親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換性（アミノエチル樹脂）及び混合モード交換）、thiophilic吸着（例えば、β−メルカプトエタノールと他のＳＨリガンド類を用いて）、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を用いて）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例えば、ニッケル（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料を用いて）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法（ゲル電気泳動、毛細管電気泳動など）などが、確立されており、そしてタンパク質精製のために幅広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 （1998） 93-102）。
【０１５０】
本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培地」とは、互換的に使用され、そしてすべてのそのような名称は子孫も包含する。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」とは、トランスファーの数に関係なく、それらに由来する初代対象細胞及び培養物を包含する。すべての子孫は、故意の又は偶然な突然変異のために、ＤＮＡ含有において正確には同一でないこともまた理解されている。元の形質転換された細胞についてスクリーンされる場合、同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。異なった命名法が意図される場合は、その内容から明白であろう。
【０１５１】
用語「形質転換」とは、本明細書において使用される場合、宿主細胞中へのベクター／核酸のトランスファー工程を指す。強い細胞壁バリアを有さない細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションが、例えばGraham, F.L., and van der Ed, A.J. Virology 52（1978）456-467により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿方法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合による細胞中へのＤＮＡの導入のための他の方法がまた使用され得る。原核細胞、又は実質的な細胞壁構造を含む細胞が使用される場合、１つのトランスフェクション方法は、Cohen, S.N, et al, PNAS 69（1972）2110-2114により記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法である。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、「発現」とは、核酸がｍＲＮＡに転換される方法、及び／又は転写されたｍＲＮＡ（転写体とも呼ばれる）がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に連続的に翻訳される過程を指す。転写体及びコードされるポリペプチドは、集合的には、遺伝子生成物とも呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞における発現は、ｍＲＮＡのスプライシングを含む。
【０１５３】
「ベクター」とは、挿入される核酸分子を、宿主細胞中に及び／又は宿主細胞間にトランスファーする、核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。この用語は、ＤＮＡの細胞中への挿入（例えば、染色体組込み）のために主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製のために主に機能するベクターの複製、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。記載されるような機能のうちの２つ以上を提供するベクターもまた包含される。
【０１５４】
「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入される場合、転写され、そしてポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現システム」とは、所望する発現生成物を生成するために機能することができる発現ベクターを含んでなる適切な宿主細胞を通常指す。
【０１５５】
医薬組成物
本発明の１つの態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物の製造のための方法である。別の態様では、本発明は、医薬担体と一緒に処方される本発明による抗体を含んでなる組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【０１５６】
本発明の１つの態様は、癌治療のための本発明による二重特異性抗体である。
【０１５７】
本発明の別の態様は、癌治療のための前記医薬組成物である。
【０１５８】
本発明の別の態様は、癌処置用の治療薬の製造のための本発明による抗体の使用である。
【０１５９】
本発明の別の態様は、本発明による抗体をそういった処置を必要としている患者に投与することによる、癌に罹患している患者の処置方法である。
【０１６０】
本明細書中で使用されるとき、「医薬担体」には、生理学的に適合する任意の及びすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、前記担体は、（例えば注射又は点滴による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与又は上皮投与に適切である。
【０１６１】
本発明の組成物は、当該技術分野において知られる様々な方法により投与され得る。当業者に認識されるように、投与の経路及び／又は様式は、所望される結果に依存して異なる。ある投与径路により本発明の組成物を投与するためには、その組成物を、その不活性化を防止する材料で被覆し、又はその組成物と共に同時に投与する必要がある。例えば、前記組成物は、例えばリポソーム、又は希釈剤などの適切な担体に加えられて対象に投与され得る。医薬として許容される希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝溶液が含まれる。医薬として許容される担体には、滅菌水性溶液又は分散剤、滅菌済みの注射可能な溶液又は分散剤を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。そのような医薬活性物質のための媒体及び薬剤は、当該技術分野において知られている。
【０１６２】
「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、本明細書中で使用される場合、腸内投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射により、これだけに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴を含む。
【０１６３】
用語「癌」は、本明細書中で使用される場合、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、細気管支肺胞細胞性肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃せん癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は輸尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞性癌、胆管癌、中枢神経系（CNS）の新生物、脊椎軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、脳下垂体腺腫及びユーイング肉腫、そして前記癌のうちのいずれかの難治性バーション、又は前記癌のうちの１つ若しくは複数の組合せを含めたものであり得る。
【０１６４】
本発明の別の態様は、血管新生阻害剤としての本発明による二重特異性抗体又は前記医薬組成物である。そのような血管新生阻害剤は、癌、特に固形腫瘍、及び他の血管疾患の治療に使用できる。
【０１６５】
本発明の１つの態様は、血管疾患の治療のための本発明による二重特異性抗体である。
【０１６６】
本発明の別の態様は、血管疾患処置用の治療薬の製造のための本発明による抗体の使用である。
【０１６７】
本発明の別の態様は、本発明による抗体をそういった処置を必要としている患者に投与することによる、血管疾患に罹患している患者の処置方法である。
【０１６８】
「血管疾患」という用語には、癌、炎症性疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、外傷、敗血症、ＣＯＰＤ、喘息、糖尿病、ＡＭＤ、網膜障害、脳卒中、肥満症、急性肺傷害、出血、血管漏出、例えばサイトカイン誘発性血管漏出、アレルギー、グレーブス病、橋本の自己免疫性甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、巨細胞性動脈炎、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、クローン病、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、特に固形腫瘍、眼内の新生血管症候群、例えば増殖性網膜症又は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）など、関節リウマチ、及び乾癬が含まれる（Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934；Klagsbrun, et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239；及びGarner, A., Vascular diseases, In: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K., (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994) 1625-1710）。
【０１６９】
これらの組成物は更に、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含むこともできる。微生物の存在の予防は、前掲の殺菌手段によって、及び様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有によって確保できる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましいこともある。加えて、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの吸収を遅らせる作用物質の含有によって引き起こすこともできる。
【０１７０】
選択した投与経路にかかわらず、（好適な水和形態で使用することもできる）本発明の化合物、及び／又は本発明の医薬組成物を、当業者に知られている従来の方法によって医薬的に許容し得る剤形に処方する。
【０１７１】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与様式について、その患者にとって有毒であることなしに、所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分量を得るように変更することもできる。選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いられる特定の組成物と組合せて使用されるその他の薬物、化合物及び／又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、身体状態、健康全般、及び前病歴、並びに医療分野で周知の要因など、を含めた様々な薬物動態学的要因に依存するであろう。
【０１７２】
組成物は、それがシリンジによって提出できる程度に無菌であり、且つ、液状でなければならない。水に加えて、好ましくは、担体は等張緩衝生理食塩溶液である。
【０１７３】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には所望の粒度の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが望ましい。
【０１７４】
ヒトＥｒｂＢ−２及びヒトｃ−Ｍｅｔに対するこの発明による二重特異性抗体が、価値のある特徴、例えば生物学的又は薬理学的な活性などを有することがここでわかった。
【０１７５】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の要旨から逸脱することなしに、示された手順に改変を加えることができると理解されている。
【０１７６】
アミノ酸配列の説明
配列番号１  重鎖可変ドメイン＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号２  軽鎖可変ドメイン＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号３  重鎖可変ドメイン＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号４  軽鎖可変ドメイン＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号５  重鎖＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号６  軽鎖＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号７  重鎖＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｆａｂ ５Ｄ５
配列番号８  軽鎖＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｆａｂ ５Ｄ５
配列番号９  ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域
配列番号１０  ヒトＩｇＧ３の重鎖定常領域
配列番号１１  ヒト軽鎖カッパ定常領域
配列番号１２  ヒト軽鎖ラムダ定常領域
配列番号１３  ヒトｃ−Ｍｅｔ
配列番号１４  ヒトＥｒｂＢ−２
配列番号１５  重鎖ＣＤＲ３Ｈ、＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号１６  重鎖ＣＤＲ２Ｈ、＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号１７  重鎖ＣＤＲ１Ｈ、＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号１８  軽鎖ＣＤＲ３Ｌ、＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号１９  軽鎖ＣＤＲ２Ｌ、＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号２０  軽鎖ＣＤＲ１Ｌ、＜ＥｒｂＢ−２＞トラスツズマブ
配列番号２１  重鎖ＣＤＲ３Ｈ、＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号２２  重鎖ＣＤＲ２Ｈ、＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号２３  重鎖ＣＤＲ１Ｈ、＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号２４  軽鎖ＣＤＲ３Ｌ、＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号２５  軽鎖ＣＤＲ２Ｌ、＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
配列番号２６  軽鎖ＣＤＲ１Ｌ、＜ｃ−Ｍｅｔ＞Ｍａｂ ５Ｄ５
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】典型的な順序で可変ドメインと定常ドメインを含んでなる２対の重鎖と軽鎖を持ち、第１の抗原１に特異的に結合するＣＨ４ドメインを含まない全長抗体の図式的構造。
【図２ａ】以下の：ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖；並びにｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖を含んでなり、ここで、前記可変ドメインＶＬ及びＶＨ、及び／又は前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられ、それらがノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術で修飾されている、二価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の図式的構造。
【図２ｂ】以下の：ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖；並びにｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖を含んでなり、ここで、前記可変ドメインＶＬ及びＶＨ、及び／又は前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられ、それらがノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術で修飾されている、二価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の図式的構造。
【図２ｃ】以下の：ａ）ヒトＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖；並びにｂ）ヒトｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する全長抗体の軽鎖及び重鎖を含んでなり、ここで、前記可変ドメインＶＬ及びＶＨ、及び／又は前記定常ドメインＣＬ及びＣＨ１が互いによって置き換えられ、それらがノブ−ｉｎｔｏ−ホール技術で修飾されている、二価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の図式的構造。
【図３ａ】ａ）図３ａ：２つのポリペプチドＶＨとＶＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する）；  ｂ）図３ｂ：２つのポリペプチドＶＨ−ＣＨ１とＶＬ−ＣＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する）、ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の略図。
【図３ｂ】ａ）図３ａ：２つのポリペプチドＶＨとＶＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する）；  ｂ）図３ｂ：２つのポリペプチドＶＨ−ＣＨ１とＶＬ−ＣＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になって、ｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する）、ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の略図。
【図３ｃ】図３ｃ：「ノブとホール」を備えた２つのポリペプチドＶＨとＶＬがそこに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になってｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する）、ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。
【図３ｄ】図３ｄ：「ノブとホール」を備えた２つのポリペプチドＶＨとＶＬがそれに融合されている（ＶＨドメインとＶＬドメインは両方が一緒になってｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、ここで、それらのＶＨドメイン及びＶＬドメインはＶＨ４４位とＶＬ１００位の間に鎖間ジスルフィド架橋を含んでなる）、ＥｒｂＢ−２に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。
【図４ａ】４ａ：４種類の考えられる一本鎖Ｆａｂフラグメントの図式的構造。
【図４ｂ】４ｂ：２種類の一本鎖Ｆｖフラグメントの図式的構造。
【図５ａ】１つの一本鎖Ｆａｂフラグメント（図５ａ）又は１つの一本鎖Ｆｖフラグメント（図５ｂ）と全長抗体を含んでなる三価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の図式的構造−ノブとホールを備えた二重特異性三価の例。
【図５ｂ】１つの一本鎖Ｆａｂフラグメント（図５ａ）又は１つの一本鎖Ｆｖフラグメント（図５ｂ）と全長抗体を含んでなる三価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の図式的構造−ノブとホールを備えた二重特異性三価の例。
【図６ａ】２つの一本鎖がＦａｂフラグメント（図６ａ）又は２つの一本鎖Ｆｖフラグメント（図６ｂ）と全長抗体を含んでなる四価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の図式的構造−ｃ−Ｍｅｔ結合部位はｃ−Ｍｅｔ二量化阻害抗体に由来する。
【図６ｂ】２つの一本鎖がＦａｂフラグメント（図６ａ）又は２つの一本鎖Ｆｖフラグメント（図６ｂ）と全長抗体を含んでなる四価の二重特異性＜ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の図式的構造−ｃ−Ｍｅｔ結合部位はｃ−Ｍｅｔ二量化阻害抗体に由来する。
【図７ａ】類上皮腫癌細胞株Ａ４３１におけるＥｒｂＢ２／２／３及びｃ−Ｍｅｔの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。
【図７ｂ】卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ−８におけるＥｒｂＢ２／２／３及びｃ−Ｍｅｔの細胞表面発現のフローサイトメトリー分析。
【図８】０、３０、６０及び１２０分（＝０、０．５、１、及び２時間）に計測したＯＶＣＡＲ−８癌細胞における内部移行アッセイ。
【図９ａ】ＯＶＣＡＲ−８癌細胞における増殖アッセイ。単一特異性の親＜ＨＥＲ２＞及び＜ｃ−Ｍｅｔ＞抗体と比較した、本発明による二重特異性＜ＨＥＲ２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体ＢｓＡＢ０２（ＢｓＡｂ）の癌細胞増殖の阻害。
【図９ｂ】ＨＧＦの存在下での癌細胞株Ｏｖｃａｒ−８における増殖アッセイ。単一特異性の親＜ＨＥＲ２＞及び＜ｃ−Ｍｅｔ＞抗体と比較した、本発明による二重特異性＜ＨＥＲ２／ｃ−Ｍｅｔ＞抗体ＢｓＡＢ０２（ＢｓＡｂ）の癌細胞増殖の阻害。
【実施例】
【０１７８】
実験手順
材料と方法
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載の標準的な方法を、ＤＮＡを操作するために使用した。分子生物学的試薬を製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【０１７９】
ＤＮＡとタンパク質の配列分析、及び配列データ・マネジメント
以下でヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する概説は：Kabat, E.A. et al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242にある。抗体鎖のアミノ酸には、ＥＵナンバリングに従って付番した（Edelman, G.M., et al., PNAS 63（1969）78-85；Kabat, E.A., et al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242）。ＧＣＧ（Genetics Computer Group、Madison, Wisconsin）のソフトウェアパッケージ バージョン１０．２及びInfomaxのVector NTI Advance suiteバージョン８．０を、配列新規作成、マッピング、分析、アノテーション及び図示に使用した。
【０１８０】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を、SequiServe（Vaterstetten, Germany）及びGeneart AG（Regensburg, Germany）にて実施された二本鎖配列決定法によって決定した。
【０１８１】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ産物からGeneart AG（Regensburg, Germany）で調製された。１つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接した遺伝子セグメントを、ｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミド内にクローン化した。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、そしてＵＶ分光法によって濃度決定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定法で確認した。同じように、ペプチドコネクタで連結されているＣ末端＜ｃ−Ｍｅｔ＞５Ｄ５ ｓｃＦａｂ ＶＨ領域を持つ／持たないＣＨ３ドメイン内にＳ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗが突然変異を保有する改変「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」＜ＥｒｂＢ−２＞抗体重鎖、並びにペプチドコネクタで連結されているＣ末端＜ｃ−Ｍｅｔ＞５Ｄ５ ｓｃＦａｂ ＶＬ領域を持つ／持たない、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を保有する「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」＜ＥｒｂＢ−２＞抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を、隣接するＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位を用いて遺伝子合成によって調製した。最後に、＜ＥｒｂＢ−２＞抗体及び＜ｃ−Ｍｅｔ＞５Ｄ５抗体の無改変重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、隣接するＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位によって合成した。すべての構築物をリーダーペプチド（ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ）をコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計し、そして真核細胞内での分泌のためのタンパク質を目的とした。
【０１８２】
発現プラスミドの構築
Roche発現ベクターを、すべての重及び軽鎖ｓｃＦｖ融合タンパク質をコードする発現プラスミドの構築に使用した。ベクターは、以下の要素：
−  選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
−  エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の複製開始点、ｏｒｉＰ、
−  Ｅ．コリ内でのこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製開始点、
−  Ｅ．コリ内でアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
−  ヒト・サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）からの前初期エンハンサー及びプロモーター
−  ヒト１−免疫グロブリン・ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列、及び
−  固有のＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限部位、
から構成される。
【０１８３】
記載したように、重鎖又は軽鎖構築物、並びにＣ末端ＶＨ及びＶＬドメインを持つ「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」構築物を含んでなる免疫グロブリン融合遺伝子を、遺伝子合成によって調製し、そしてｐＧＡ１８（ａｍｐＲ）プラスミド内にクローン化した。合成ＤＮＡセグメントとRoche発現ベクターを保有するｐＧ１８（ａｍｐＲ）プラスミドを、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ制限酵素（Roche Molecular Biochemicals）によって消化し、そしてアガロースゲル電気泳動法にかけた。次いで、精製した、重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡセグメントを、単離したRoche発現ベクターＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片に連結して、最終的な発現ベクターを得た。最終的な発現ベクターをＥ．コリ細胞内に形質転換し、発現プラスミドＤＮＡを単離し（Miniprep）、そして制限酵素分析とＤＮＡ配列決定にかけた。正しいクローンを、１５０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地中で培養し、再びプラスミドＤＮＡを単離し（Maxiprep）、そして配列完全性をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１８４】
ＨＥＫ２９３細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
遺伝子組み換え免疫グロブリン変異体を、製造業者の取扱説明書（Invitrogen, USA）に従ってFreeStyle（商標）２９３発現系を使用したヒト胎児腎臓２９３−Ｆ細胞の一過性トランスフェクションによって発現した。簡単に言えば、懸濁液FreeStyle（商標）２９３−Ｆ細胞を、３７℃／８％のＣＯ2にてFreeStyle（商標）２９３発現培地中で培養し、そしてその細胞をトランスフェクションの日に１〜２×ｌ０6生存細胞／ｍｌの密度で新しい培地中に植え付けた。ＤＮＡ−２９３fectin（商標）複合体を、２５０ｍｌの最終的なトランスフェクション体積に対して１：１モル比で、３２５μｌの２９３fectin（商標）（Invitrogen, Germany）と２５０μｇの重鎖又は軽鎖プラスミドＤＮＡを使用したOpti-MEM（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, USA）中で調製した。「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」ＤＮＡ−２９３fectin複合体を、２５０ｍｌの最終的なトランスフェクション体積に対して１：１：２モル比で、３２５μｌの２９３fectin（商標）（Invitrogen, Germany）と、２５０μｇの「ノブ−ｉｎｔｏ−ホール」重鎖１及び２と、軽鎖プラスミドＤＮＡを使用したOpti-MEM（登録商標）Ｉ培地（Invitrogen, USA）中で調製した。抗体を含有している細胞培養上清を、１４０００ｇで３０分間の遠心分離及び滅菌濾紙（０．２２μｍ）を通して濾過してトランスフェクションの７日後に採取した。上清を−２０℃にて精製まで保存した。
【０１８５】
二重特異性抗体と対照抗体の精製
三価の二重特異性抗体及び対照抗体を、Protein A-Sepharose（商標）（GE Healthcare、Sweden）を使用した親和性クロマトグラフィーとSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。簡単に言えば、滅菌濾過した細胞培養上清を、PBSバッファー（１０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ、７．４）で平衡化したHiTrap ProteinA HP（５ｍｌ）カラムにかけた。非結合タンパク質を平衡化バッファーで洗い落とした。抗体と抗体変異体を、０．１Ｍのクエン酸バッファー、ｐＨ２．８で溶出し、そしてタンパク質含有画分を０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分を貯留し、Ａｍｉｃｏｎの超遠心濾過機デバイス（MWCO:30K、Millipore）を用いて３ｍｌの体積まで濃縮し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare、Sweden）に投入した。高分子量集合体が５％未満しかない、精製された二重特異性抗体と対照抗体を含有する画分を貯留し、そして１．０ｍｇ／ｍｌのアリコートとして−８０℃にて保存した。Ｆａｂフラグメントを、精製した５Ｄ５モノクローナル抗体のパパイン消化と、それに続くプロテインＡクロマトグラフィーによる夾雑Ｆｃドメインの除去によって作り出した。非結合Ｆａｂフラグメントを、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム（GE Healthcare、Sweden）で更に精製し、貯留し、そして１．０ｍｇ／ｍｌのアリコートとして−８０℃にて保存した。
【０１８６】
精製タンパク質の分析
精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用し、２８０ｎｍにて吸光度（ＯＤ）を計測することによって測定した。二重特異性抗体及び対照抗体の純度と分子量を、還元剤（５ｍＭの１，４−ジチオスレイトール）の存在下と不存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、そしてクーマシーブリリアントブルーでの染色によって分析した。NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen, USA）を、製造業者の取扱説明書に従って使用した（４−２０％のトリスグリシン・ゲル）。二重特異性抗体及び対照抗体サンプルの凝集体量を、２００ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０の泳動バッファー中、２５℃にてSuperdex200分析用サイズ排除カラム（GE Healthcare、Sweden）を使用した高性能SECによって分析した。２５μｇのタンパク質を、０．５ｍｌ／分の流量にてカラム上に注入し、そして５０分間かけて定組成で溶出した。安定性分析のために、１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製タンパク質を、４℃と４０℃にて７日間インキュベートし、その後、高性能SECによって評価した。還元した二重特異性抗体軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（Roche Molecular Biochemicals）での酵素的処理によるＮ−グリカンの除去後のNanoElectrospray Q-TOF質量分析によって確認した。
【０１８７】
ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイ
６ウェルプレートの１ウェルあたり５ｘ１０ｅ５個のＡ５４９細胞を、０．５％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＲＰＭＩ中、ＨＧＦ刺激の前日に植え付けた。翌日に、成長培地を、０．２％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＲＰＭＩで一時間、置き換えた。次いで、５μｇ／ｍＬの二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、ＨＧＦを加えるまで１０分間インキュベートし、５０ｎｇ／ｍｌの終濃度で更に１０分間インキュベートした。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を１ｍＭのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、そしてそれらを、１００μＬの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％のＤＯＣ、アプロチニン、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム）を用いて細胞培養プレート内で溶解した。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で３０分間進めた。タンパク質濃度を、ＢＣＡ方法（Pierce）を使用して測定した。３０〜５０μｇの溶解物を、４−１２％のBis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、５％のＢＳＡを含有するＴＢＳ−Ｔで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Ｙ１２３０、１２３４、１２３５（44-888、Biosource）に対するリン酸化部位特異的ｃ−Ｍｅｔ抗体を用いて現像した。免疫ブロットを、非リン酸化ｃ−Ｍｅｔに結合する抗体（AF276、R&D）で再検出した。
【０１８８】
ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２リン酸化アッセイ
６ウェルプレートの１ウェルあたり５ｘ１０ｅ５個のＳｋ−Ｂｒ３細胞を、１０％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＲＰＭＩ中、抗体追加の前日に植え付ける。翌日に、５μｇ／ｍＬの対照又は二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、更に１時間インキュベートする。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を１ｍＭのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、そしてそれらを１００μＬの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％のＤＯＣ、アプロチニン、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム）を用いて細胞培養プレート内で溶解する。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で３０分間進める。タンパク質濃度を、ＢＣＡ方法（Pierce）を使用して測定する。３０〜５０μｇの溶解物を、４−１２％のBis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移す。膜を、５％のＢＳＡを含有するＴＢＳ−Ｔで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Ｙ１２２１／２２（Cell Signaling、2243）に対するリン酸化部位特異的Ｈｅｒ２抗体を用いて現像する。免疫ブロットを、非リン酸化Ｈｅｒ２に結合する抗体（Cell Signaling、2165）で再検出する。
【０１８９】
ＡＫＴリン酸化アッセイ
６ウェルプレートの１ウェルあたり５ｘ１０ｅ５個のＡ４３１細胞を、１０％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＲＰＭＩ中、抗体追加の前日に植え付ける。翌日に、５μｇ／ｍＬの対照又は二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、更に１時間インキュベートする。次いで、一部の細胞を、２５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（R&D、294-HGN）で更に１５分間刺激する。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を１ｍＭのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、そしてそれらを１００μＬの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％のＤＯＣ、アプロチニン、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム）を用いて細胞培養プレート内で溶解する。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で３０分間進める。タンパク質濃度を、ＢＣＡ方法（Pierce）を使用して測定する。３０〜５０μｇの溶解物を、４−１２％のBis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移す。膜を、５％のＢＳＡを含有するＴＢＳ−Ｔで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Ｔｈｒ３０８（Cell signaling、9275）に対するリン酸化部位特異的ＡＫＴ抗体を用いて現像する。免疫ブロットを、アクチンに結合する抗体（Abcam、ab20272）で再検出する。
【０１９０】
ＥＲＫ１／２リン酸化アッセイ
６ウェルプレートの１ウェルあたり５ｘ１０ｅ５個のＡ４３１細胞を、１０％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＲＰＭＩ中、抗体追加の前日に植え付ける。翌日に、５μｇ／ｍＬの対照又は二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、更に１時間インキュベートする。次いで、一部の細胞を、２５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（R&D、294-HGN）で更に１５分間刺激する。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を１ｍＭのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷ＰＢＳで一度洗浄し、そしてそれらを１００μＬの溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％のＤＯＣ、アプロチニン、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウム）を用いて細胞培養プレート内で溶解する。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で３０分間進める。タンパク質濃度を、ＢＣＡ方法（Pierce）を使用して測定する。３０〜５０μｇの溶解物を、４−１２％のBis-Tris NuPageゲル（Invitrogen）により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移す。膜を、５％のＢＳＡを含有するＴＢＳ−Ｔで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４（CellSignaling、Nr.9106）に対するリン酸化部位特異的Ｅｒｋ１／２抗体を用いて現像する。免疫ブロットを、アクチンに結合する抗体（Abcam、ab20272）で再検出する。
【０１９１】
細胞−細胞播種（dissemination）（分散アッセイ）
化合物処置の前日に、Ａ５４９（１ウェルあたり４０００個の細胞）又はＡ４３１（１ウェルあたり８０００個の細胞）を、０．５％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ中、９６ウェルのE-Plate（Roche、05232368001）内の２００μＬの全容量の中に植え付けた。接着と細胞成長を、電気抵抗を観察する１５分毎のスイープによりReal Time Cell Analyzer機器で一晩観察した。翌日、細胞を、５分毎にスイープしながらＰＢＳ中のそれぞれの抗体希釈物５μＬと共にプレインキュベートした。３０分後に、２０ｎｇ／ｍＬの終濃度をもたらす２．５μＬのＨＧＦ溶液を加え、そして実験を更に７２時間続けた。急激な変化を、１８０分間の１分毎のスイープで観察し、続いて残りの期間、１５分毎のスイープで観察した。
【０１９２】
ＨＵＶＥＣ増殖検定
ＨＵＶＥＣ細胞（Promocell、C-12200）を、０．５％ ＦＣＳ含有ＥＢＭ−２培地（Promocell、C-22211）中でコラーゲンコートした９６ウェル内に植え付ける。翌日、対照又は二重特異性抗体の希釈系列をその細胞に加える。３０分のインキュベーションの後に、２５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（R&D、294-HGN）を加え、そして細胞をさらに７２時間インキュベートした後に、cell titer glowアッセイ（Promega、G7571/2/3）を用いて、ＡＴＰ量の形で細胞増殖を製造業者の助言に従って測定する。
【０１９３】
Ｓｋ−Ｂｒ３増殖アッセイ
ａ）増殖研究のために、９６ウェル細胞培養プレートの１ウェルあたり１００００個の細胞を、血清削減培地（ＲＰＭＩ １６４０＋４％のＰＣＳ）中で植え付けた。翌日、親Ｈｅｒ２又はｃ−Ｍｅｔ抗体、並びに二重特異性抗体を加え、そして細胞をさらに４８時間培養した後に、細胞増殖の指標としてＡＴＰを、cell titer glowアッセイ（Promega）を用いて測定する。
【０１９４】
ｂ）ＨＧＦ存在下での増殖研究のために、９６ウェル細胞培養プレートの１ウェルあたり１００００個の細胞を、血清削減培地（ＲＰＭＩ １６４０＋４％のＰＣＳ）中で植え付けた。翌日、親Ｈｅｒ２又はｃ−Ｍｅｔ抗体、並びに二重特異性抗体のほかに、２５ｎｇ／ｍＬのＨＧＦ（R&D、294-HGN）も加え、そして細胞をさらに４８時間培養した後に、細胞増殖の指標としてＡＴＰを、cell titer glowアッセイ（Promega）を用いて測定する。
【０１９５】
フローサイトメトリーアッセイ（ＦＡＣＳ）
ａ）結合アッセイ
ｃ−Ｍｅｔ及びＥｒｂＢ−２発現性細胞を剥離し、そしてカウントした。９６ウェルのコニカルプレートの１ウェルあたり１．５×１０ｅ5個の細胞を植え付けた。細胞を、遠沈し（１５００ｒｐｍ、４℃、５分間）、そして２％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＰＢＳ中のそれぞれの二重特異性抗体の希釈系列５０μＬ中で、氷上において３０分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、そして２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ２００μＬで洗浄し、続いて２％のＦＣＳ（Jackson Immunoresearch、109116098）を含有するＰＢＳに希釈した、ヒトＦｃに対するフィコエリトリン結合抗体と一緒に３０分間の２回目のインキュベーションを行った。細胞を、２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ２００μＬで２回、遠沈洗浄し、BD CellFix溶液（BD Biosciences）で再懸濁し、そして氷上で少なくとも１０分間インキュベートした。細胞の平均蛍光強度（ｍｆｉ）を、フローサイトメトリー（FACS Canto、BD）によって測定した。Ｍｆｉを、少なくとも２つの独立した染色の二重反復試験で決定した。フローサイトメトリースペクトルを、FlowJoソフトウェア（TreeStar）を使用して更に加工した。最大半減結合を、XLFit4.0（IDBS）及び用量応答ワンサイトモデル205を使用して決定した。
【０１９６】
ｂ）内部移行アッセイ
細胞は、剥離し、そしてカウントした。５×１０ｅ5個の細胞を、エッペンドルフチューブ内の５０μＬの完全培地中に入れ、５μｇ／ｍＬのそれぞれの二重特異性抗体と一緒に３７℃にてインキュベートした。表示した時点で細胞を氷上に保存し、タイムコースが完了するまで保存した。その後、細胞を、ＦＡＣＳチューブに移し、遠沈し（１５００ｒｐｍ、４℃、５分間）、ＰＢＳ＋２％のＦＣＳで洗浄し、そして２％のＦＣＳ（Jackson Immunoresearch、109116098）を含有したＰＢＳ中に希釈した、ヒトＦｃに対するフィコエリトリン結合二次抗体５０μＬと一緒に３０分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、ＰＢＳ＋２％のＦＣＳで洗浄し、そして蛍光強度をフローサイトメトリー（FACS Canto、BD）によって測定した。
【０１９７】
Cell Titer Glowアッセイ
細胞生存率と増殖をcell titer glowアッセイ（Promega）を使用することで定量化した。製造業者の取扱説明書に従ってアッセイを実施した。簡単に言えば、細胞を、９６ウェルプレート内の１００μＬの全容量中で所望の期間、培養した。増殖アッセイのために、細胞を、インキュベーターから取り出し、そして室温にて３０分間、静置した。１００μＬのcell titer glow試薬を加え、そしてマルチウェルプレートを２分間、オービタル振盪機にかけた。発光をマイクロプレートリーダー（Tecan）により１５分後に定量化した。
【０１９８】
Ｗｓｔ−１アッセイ
Ｗｓｔ−１生存率と細胞増殖アッセイをエンドポイント分析として実施し、代謝的に活性な細胞の数を検出した。簡単に言えば、２０μＬのＷｓｔ−１試薬（Roche、1164480700）を２００μＬの培地に加えた。色素の完全な現像まで、９６ウェルプレートを更に３０分間〜１時間インキュベートした。染色強度を、４５０ｎｍの波長にてマイクロプレートリーダー（Tecan）により定量化した。
【０１９９】
二重特異性＜ＥｒｂＢ２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体の設計
以下に発現され、そして精製された二重特異性＜ＥｒｂＢ２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体はすべて、以下に示すように最終的に修飾されたＩｇＧ１サブクラスの定常領域又は少なくともＦｃの一部（配列番号９のヒトＩｇＧ１定常領域）を含んでなる。
【０２００】
表１において：表１に示したそれぞれの特徴を有する、全長ＥｒｂＢ−２抗体（トラスツズマブ）とｃ−Ｍｅｔ抗体由来の１つの一本鎖Ｆａｂフラグメント（ｃＭｅｔ ５Ｄ５）（基本的な構造スキームについては図５ａを参照のこと）に基づく三価の二重特異性＜ＥｒｂＢ２−ｃ−Ｍｅｔ＞抗体は、先に記載した一般的な方法に従って発現及び精製されるか、又は発現及び精製できる。トラスツズマブ及びｃＭｅｔ ５Ｄ５の対応するＶＨ及びＶＬを、配列表に示す。
【０２０１】
【表１】
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【０２０２】
実施例１：
ＥｒｂＢ−２及びｃ−Ｍｅｔへの二重特異性抗体の結合（表面プラズモン共鳴法）
結合親和力を、２５℃にて標準的な結合アッセイ、例えば表面プラズモン共鳴法などによって測定した（BIAcore（登録商標）、GE-Healthcare、Uppsala, Sweden）。親和性測定のために、３０μg／ｍｌの抗Ｆｃγ抗体（ヤギ由来、Jackson Immuno Research）を、標準的なアミン・カップリングによってＣＭ−５センサーチップの表面に結合させ、そしてＳＰＲ器具（Biacore T100）により化学的にブロッキングした。結合後に、単一又は二重特異性ＥｒｂＢ２／ｃＭｅｔ抗体を、２５℃、５μＬ／分の流速にて注入し、続いて３０μＬ／分にてヒトＥｒｂＢ２又はｃ−Ｍｅｔ ＥＣＤの希釈系列（０ｎＭ〜１０００ｎＭ）を注入した。結合実験のためのランニングバッファーとしてＰＢＳ／０．１％ ＢＳＡを使用した。次いで、前記チップを、１０ｍＭのグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．０溶液の６０秒パルスを用いて再生した。
【０２０３】
【表２】
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【０２０４】
実施例２： 
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化の阻害
二重特異性抗体のｃ−Ｍｅｔ部分の機能性を確認するために、ｃ−Ｍｅｔリン酸化アッセイを実施する。この実験では、Ａ５４９肺癌細胞又はＨＴ２９大腸癌細胞を、二重特異性抗体又は対照抗体で処理した後にＨＧＦに晒した。次いで、細胞を溶解し、そしてｃ−Ｍｅｔ受容体のリン酸化を調べる。両細胞株は、免疫ブロットにおけるリン酸化ｃ−Ｍｅｔに特異的なバンドの出現によって観察できるように、ＨＧＦで刺激され得る。親又は二重特異性抗体の結合が、受容体リン酸化の阻害につながる。あるいは、当業者は、オートクリンＨＧＦループを有する細胞、例えばＵ８７ＭＧを使用して、親又は二重特異性抗体の不存在下又は存在下でのｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化を評価できる。
【０２０５】
実施例３：
Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ二重特異性抗体での処置後のＨｅｒ２受容体リン酸化の分析
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ抗体Ｓｋ−Ｂｒ３のＨｅｒ２結合部分の機能性を確認するために、Ａ４３１を、親ＥＧＦＲ抗体又は二重特異性Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ抗体のいずれかと一緒にインキュベートする。親又は二重特異性抗体が結合して、関係のないＩｇＧ対照抗体が結合しないことで、受容体リン酸化の阻害につながる。あるいは、当業者は更に、親又は二重特異性抗体の存在又は不存在下、ＮＲＧで刺激されてＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２受容体リン酸化を引き起こす細胞も使用できる。
【０２０６】
実施例４：
Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ二重特異性抗体での処置後のＰＩ３Ｋシグナル伝達の分析
Ｈｅｒ２並びにｃ−Ｍｅｔ受容体は、細胞増殖シグナルを伝えるＰＩ３Ｋ経路を介してシグナル伝達できる。ＡＫＴのＨｅｒ２及びｃ−Ｍｅｔ受容体リン酸化の同時標的化を実証するために、ＰＩ３Ｋ経路の下流標的を観察することもできる。このために、非刺激細胞、ＮＲＧ若しくはＨＧＦで処理した細胞又は両サイトカインで処理した細胞を、非特異的、親対照又は二重特異性抗体と一緒に並行してインキュベートした。あるいは、当業者は更に、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２を過剰発現する細胞、及び／又はｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を活性化するオートクリンＨＧＦループを有する細胞を評価することもできる。ＡＫＴはＰＩ３Ｋ経路の主要な下流シグナル伝達成分であり、そしてこのタンパク質のリン酸化はこの経路を介したシグナル伝達の重要な指標である。
【０２０７】
実施例５：
Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ二重特異性抗体での処置後のＭＡＰＫシグナル伝達の分析
ｃ−Ｍｅｔ受容体は、ＭＡＰＫ経路を介してシグナル伝達できる。ｃ−Ｍｅｔ受容体の標的化を実証するために、ＭＡＰＫ経路の主要な下流標的であるＥＲＫ１／２のリン酸化を観察することができる。このために、非刺激細胞又はＨＧＦで処理した細胞を、非特異的、親対照又は二重特異性抗体と一緒に並行してインキュベートした。あるいは、当業者は更に、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を活性化するオートクリンＨＧＦループを有する細胞を評価することもできる。
【０２０８】
実施例６：
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖の阻害
ＨＵＶＥＣ増殖検定は、ＨＧＦの血管新生及び細胞分裂効果を実証するために実施することができる。ＨＵＶＥＣに対するＨＧＦの添加は、ｃ−Ｍｅｔ結合抗体によって用量依存様式で阻害され得る細胞増殖の増加をもたらす。
【０２０９】
実施例７：
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体によるＳｋ−Ｂｒ３増殖の阻害
ａ）フローサイトメトリーにより独立に確認されているように、Ｓｋ−Ｂｒ３細胞は、高いＨｅｒ２の細胞表面レベル及び中程度に高いｃ−Ｍｅｔの細胞表面発現を示している。親Ｈｅｒ２結合抗体又は二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体の添加が増殖の減少につながったのに対して、ｃ−Ｍｅｔ結合抗体は増殖に対してわずかな効果しか持っていなかった。
【０２１０】
ｂ）活性なＨｅｒ２−ｃ−Ｍｅｔ受容体シグナル伝達ネットワークが増殖を起こす状況をシミュレートするために、アッセイを、ＨＧＦ条件培地の存在下ではあるが、記載のとおり行う。この状況において、いずれか一方の親抗体の添加がcell titer glow分析によって測定されるように、細胞増殖に対してわずかな効果しか持っていない一方で、二重特異性抗体又は親抗体の組合せ物の添加は細胞増殖の減少につながる。
【０２１１】
実施例８：
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体フォーマットによる癌細胞株ＤＵ１４ＳにおけるＨＧＦ誘発細胞−細胞播種（分散）阻害の分析
細胞のＨＧＦ誘発分散は細胞の形態学的変化を誘導し、そして細胞の円形化、糸状仮足様の突起、紡錘状の構造、及び細胞の特定の運動性をもたらす。二重特異性Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ抗体は、ＨＧＦ誘発細胞−細胞播種を抑制した。
【０２１２】
実施例９：
二重特異性ＨＥＲ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体フォーマットによるＨＧＦ誘発ＨＵＶＥＣ増殖の阻害
ＨＵＶＥＣ増殖検定は、ＨＧＦの細胞分裂効果を実証するために実施することができる。ＨＵＶＥＣに対するＨＧＦの添加は、増殖の二倍の増加につながる。二重特異性抗体と同じ濃度領域でのヒトＩｇＧ対照抗体の添加が細胞増殖に対して影響を持たなかった一方で、５Ｄ５ ＦａｂフラグメントはＨＧＦ誘発増殖を阻害する。
【０２１３】
実施例１０：
二重特異性ＨＥＲ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体による癌細胞株Ａ４３１におけるＨＧＦ誘発細胞−細胞播種（分散）阻害の分析
ＨＧＦ誘導分散には細胞の形態学的変化が含まれ、細胞の円形化、糸状仮足様の突起、紡錘状の構造、及び細胞の特定の運動性をもたらす。Real Time Cell Analyzer（Roche）は、所定の細胞培養ウェルのインピーダンスを計測し、それにより細胞の形態と増殖の変化を間接的に観察することができる。Ａ４３１及びＡ５４９細胞に対するＨＧＦの添加は、時間の関数として観察されるインピーダンスの変化をもたらす。
【０２１４】
実施例１１：
ＥｒｂＢ−２及びｃ−Ｍｃｔ発現癌細胞株における抗体媒介型受容体内部移行の分析
細胞の、Ｈｅｒ２又はｃ−Ｍｅｔに特異的に結合する抗体とのインキュベーションが、受容体の内部移行を引き起こすことを示した。二重特異性抗体の内部移行能力を評価するために、抗体誘発受容体内部移行を検討するために実験構成を設計する。このために、ＯＶＣＡＲ−８細胞（（NCI Cell Line designation；NCI（国立癌研究所）から購入したOVCAR-8-NCI；Schilder RJ, et al Int J Cancer, 1990 Mar 15;45(3):416-22；Ikediobi ON, et al, Mol Cancer Ther. 2006;5;2606-12；Lorenzi, P.L., et al., Mol Cancer Ther. 2009；8(4):713-24））（フローサイトメトリーで確認されたとおり、この細胞はＨｅｒ２並びにｃＭｅｔを発現する−図７ｂを参照のこと）を、３７℃にてそれぞれの一次抗体と一緒に異なった期間（例えば０、３０、６０、１２０分＝０、０．５、１、２時間（ｈ））インキュベートした。細胞プロセスは、細胞を４℃に急速に冷やすことによって停止する。一次抗体のＦｃに特異的に結合する蛍光体を結合した二次抗体を、細胞表面に結合した抗体を検出するのに使用した。抗体−受容体複合体の内部移行は、細胞表面の抗体−受容体複合体を激減させるので、平均蛍光強度の減少を結果的にもたらす。内部移行はＯｖｃａｒ−８細胞において検討した。結果を以下の表及び図８に示す。それぞれの受容体の内部移行率（％）を、それぞれの抗体の内部移行を介して計測する（図８において、二重特異性＜ＥｒｂＢ２−ｃＭｅｔ＞抗体ＢｓＡＢ０２はｃＭｅｔ／ＨＥＲ２と示されており、親単一特異性の二価抗体は＜ＨＥＲ２＞及び＜ｃＭｅｔ＞と示されている）。
【０２１５】
【表３】
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【０２１６】
実施例１２
糖鎖操作されたバージョンの二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体の調製
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体のＤＮＡ配列を、各ベクターがＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を担持している、ＭＰＳＶプロモーター及び合成ポリＡ部位の上流の制御下にある哺乳動物発現ベクター内にサブクローニングする。
【０２１７】
リン酸カルシウムトランスフェクション・アプローチを使用した、哺乳動物二重特異性抗体発現ベクターでのＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞の同時トランスフェクションによって、二重特異性抗体を作り出す。対数増殖期のＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞をリン酸カルシウム法によってトランスフェクトする。糖鎖操作された抗体の製造のために、前記細胞を、１つが融合ＧｎＴＩＩＩポリペプチド発現のためのもの（ＧｎＴ−ＩＩＩ発現ベクター）であり、１つがマンノシダーゼＩＩ発現のためのもの（ゴルジマンノシダーゼＩＩ発現ベクター）である、２つの追加のプラスミドを用いて、それぞれ１：１：４：４の比で同時トランスフェクトした。細胞を、１０％のＰＣＳを補ったＤＭＥＭ培地を使用してＴフラスコ内で接着性単層培養として培養し、そしてそれらが５０〜８０％集密になるとトランスフェクトする。Ｔ１５０フラスコのトランスフェクションのために、トランスフェクションの２４時間前に、１５００万個の細胞を、（最終的に１０％Ｖ／Ｖに）ＦＣＳを補った２５ｍｌのＤＭＥＭ培地中に植え付け、そして細胞を３７℃、５％のＣＯ2雰囲気のインキュベーター内に一晩置く。トランスフェクトされるそれぞれのＴ１５０フラスコについて、ＤＮＡの溶液、ＣａＣｌ2、及び水を、軽鎖及び重鎖発現ベクターの間で等しく分配される９４μｇの総プラスミドベクタＤＮＡ、４６９μlの終量までの水、及び４６９μｌの１Ｍ ＣａＣｌ2溶液を混合することによって調製する。この溶液に、９３８μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4溶液、ｐＨ７．０５を加え、すぐに１０秒間混合し、そして室温にて２０秒間静置する。その懸濁液を、２％のＰＣＳを補った１０ｍｌのＤＭＥＭで希釈し、そして既存の培地に代えてＴ１５０に加える。更に１３ｍｌのトランスフェクション培地を加える。細胞を、３７℃、５％のＣＯ2にて約１７〜２０時間インキュベートし、次いで、培地を２５ｍｌのＤＭＥＭ、１０％のＦＣＳで置き換える。条件培養培地を、２１０×ｇにて１５分間の遠心分離によってトランスフェクトの７日後に回収し、その溶液を濾過滅菌（０．２２μｍフィルター）し、０．０１％ｗ／ｖの終濃度にアジ化ナトリウムを加え、そして４℃に保った。
【０２１８】
分泌された二重特異性の非フコシル（afocusylated）糖鎖操作された抗体を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーとそれに続く、陽イオン交換クロマトグラフィー、そしてSuperdex 200カラム（Amersham Pharmacia）による最終的なサイズ排除クロマトグラフィーステップによって精製し、バッファーを２５ｍＭのリン酸カリウム、１２５ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン溶液、ｐＨ６．７に交換し、且つ、純粋な単量体のＩｇＧ１抗体を回収した。抗体濃度を、２８０ｎｍの吸光度から分光光度計を使用して推定した。
【０２１９】
抗体のＦｃ領域に結合されたオリゴ糖を、記載したようにＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳによって分析する。ＰＶＤＦ膜に固定されるか又は溶液中の抗体を用いて、ＰＮＧａｓｅＦ消化によって、抗体からオリゴ糖を酵素的に放出させる。放出されたオリゴ糖を含む得られた消化産物溶液を、最高ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析法のためにそのまま調製するか、又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ−ＭＳ分析法のためのサンプル調製前にＥｎｄｏＨグリコシダーゼで更に消化する。
【０２２０】
実施例１３：
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体の糖構造の分析
フコース及び非フコース（ａ−フコース）含有オリゴ糖構造の相対比の測定のために、精製した抗体材料の放出されたグリカンをＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ−質量分析法によって分析する。今回、タンパク質骨格からオリゴ糖を放出するために、抗体サンプル（約５０μｇ）を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中の５ｍＵ Ｎ−グリコシダーゼＦ（Prozyme# GKE-5010B）と一緒に３７℃にて一晩インキュベートする。それに続いて、放出されたグリカン構造物を、NuTip−Carbonピペットチップ（Glygenから入手：NuTip１〜１０μｌ、Cat.Nr#NTlCAR）を使用して分離し、そして脱塩する。第１ステップとして、NuTip−Carbonピペットチップを、３μｌの１Ｍ ＮａＯＨに続き、２０μＬの純水（例えばBaker製のＨＰＬＣグラジエントグレード、#4218）、３μＬの３０％ 酢酸、そして再び２０μＬの純水で洗浄することによって、オリゴ糖の結合に向けて準備する。今回、それぞれの溶液を、NuTip−Carbonピペットチップ内のクロマトグラフィー材料の上部に添加し、そして圧力をかけてそれを通過させる。その後、１０μｇの抗体に相当するグリカン構造物を、先に記載のＮ−グリコシダーゼＦ消化産物を４〜５回ほど吸い上げたり吸い出したりすることによって、NuTip−Carbonピペットチップ内の材料に結合させる。NuTip−Carbonピペットチップ内の材料に結合したグリカンを、先に記載したやり方で２０μＬの純水で洗浄し、そしてそれぞれ０．５μＬの１０％と２．０μＬの２０％ アセトニトリルを用いて段階的に溶出する。このステップのために、溶出溶液を、０．５ｍＬの反応ベイル（reaction vails）内に充填し、そして各回毎に４〜５回吸い上げたり吸い出したりする。ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析法による分析のために、両方の溶出液を組合せる。この計測において、０．４μＬの組合せた溶出液を、ＭＡＬＤＩ標的上で１．６μＬのＳＤＨＢマトリックス溶液（５ｍｇ／ｍｌで２０％のエタノール／５ｍＭのＮａＣｌ中に溶解した２．５−ジヒドロキシ安息香酸／２−ヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸［Bruker Daltonics#209813］）と混合し、そして、適当に調整したBruker Ultraflex TOF/TOF装置で分析した。日常的には、５０〜３００ショットが、記録され、そして１回の実験にまとめられる。得られたスペクトルを、フレックス分析ソフトウェア（Bruker Daltonics）によって評価し、そして質量を検出したピークのそれぞれについて決定する。それに続いて、計算した質量を、それぞれの構造物（例えばそれぞれフコースを含む及び含まない複合体、ハイブリッド、及びオリゴ又は高マンノース）について理論的に予想した質量を比較することによって、ピークをフコース又はａ−フコース（非フコース）含有グリコール構造物に割り当てる。
【０２２１】
ハイブリッド構造物の比の測定のために、抗体サンプルを、Ｎ−グリコシダーゼＦとエンド−グリコシダーゼＨを併用して消化する。Ｎ−グリコシダーゼＦは、タンパク質骨格からすべてのＮ結合型グリカン構造（複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ及び高マンノース構造）を放出し、そしてエンド−グリコシダーゼＨは、グリカンの還元末端の２つのＧｌｃＮＡｃ残基の間で更にすべてのハイブリッドタイプのグリカンを開裂する。この消化産物は、Ｎ−グリコシダーゼＦ消化したサンプルについて先に記載したのと同様のやり方で、続けて処理し、そしてＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分析法によって分析する。Ｎ−グリコシダーゼＦ消化産物からのパターンと、併用Ｎ−グリコシダーゼＦ／エンドＨ消化産物からのパターンを比較することによって、糖構造に特異的なシグナルの減少度が、ハイブリッド構造の相対内容を推測するのに使用される。
【０２２２】
それぞれの糖構造の相対量は、個々のグリコール構造のピークの高さと、検出したすべての糖構造のピークの高さの比から計算される。フコースの量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理サンプルにおいて特定した全糖構造（例えば、それぞれ複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ及び高マンノース構造）に対するフコース含有構造のパーセンテージである。非フコース化の量は、Ｎ−グリコシダーゼＦ処理サンプルにおいて特定した全糖構造（例えば、それぞれ複合体、ハイブリッド、並びにオリゴ及び高マンノース構造）に対するフコースを欠く構造のパーセンテージである。
【０２２３】
実施例１４：
Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ二重特異性抗体での処置後の細胞遊走の分析
活性なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達の１つの重要な側面は、遊走と侵襲的なプログラムの誘導である。ｃ−Ｍｅｔ阻害抗体の有効性は、ＨＧＦ誘発細胞遊走の阻害を計測することによって測定できる。このために、ＨＧＦ誘導性癌細胞株Ａ４３１を、二重特異性抗体又はＩｇＧ対照抗体の存在下又は不存在下、ＨＧＦで処理し、そして８μｍの細孔を遊走して通過した細胞の数を、インピーダンス読み出しを備えたＣＩＭプレートを使用するＡｃｅａリアルタイム細胞分析装置により時間依存様式で計測する。
【０２２４】
実施例１５：
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体のインビトロＡＤＣＣ
本発明によるＨｅｒ２／ｃＭｅｔ二重特異性抗体は、両受容体を発現している細胞において少ない内部移行を示す。少ない内部移行は、細胞表面の抗体−受容体複合体の長期暴露がＮｋ細胞により認識されやすいので、これらの抗体を糖鎖操作することの理論的根拠を大いに裏付けている。少ない内部移行と糖鎖操作は、親抗体と比較して高い抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に置き換えられる。これらの効果を実証するインビトロ実験構成は、細胞表面にＨｅｒ２とｃＭｅｔの両方を発現する癌細胞、例えばＡ４３１、及びＮｋ細胞株又はＰＢＭＣのもののようなエフェクター細胞を使用して設計できる。腫瘍細胞を、親単一特異性抗体又は二重特異性抗体と一緒に最長２４ｈプレインキュベートし、続いてエフェクター細胞株を加える。細胞溶解物を定量し、そして単一特異性抗体と二重特異性抗体の識別を可能にする。
【０２２５】
標的細胞、例えばＰＣ−３（DSMZ#ACC465、前立腺腺癌、Ham’s F12 Nutrient mixture＋２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン＋１０％のＰＣＳ中で培養）を、指数増殖期にトリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco#25300-054）を用いて回収する。洗浄ステップ、及び細胞数と生存率の確認ステップの後に、必要とされるアリコートを、細胞インキュベーター内で３７℃にて３０分間、カルセイン（Invitrogen#C3100MP；５ｍｌの培地中の５Ｍｉｏ細胞に対して、１バイアルを５０μｌのＤＭＳＯ中に再懸濁した）で標識する。その後、細胞を、ＡＩＭ培地で３回洗浄し、そして、細胞数と生存率を確認し、そして細胞数を０．３Ｍｉｏ／ｍｌに調整する。
【０２２６】
その間に、エフェクター細胞としてのＰＢＭＣを、製造業者のプロトコール（洗浄ステップ、１×４００ｇにて、そして２×３５０ｇにて、それぞれ１０分間）に従って密度勾配遠心分離法（Histopaque-1077、Sigma#H8889）によって調製する。細胞数と生存率を確認し、そして細胞数を１５Ｍｉｏ／ｍｌに調整する。
【０２２７】
１００μｌのカルセイン染色標的細胞を、丸底９６ウェルプレート内に入れ、５０μｌの希釈した抗体を加え、そして５０μｌのエフェクター細胞を加える。いくつかの実験では、標的細胞を、１０ｍｇ／ｍｌ Redimuneの濃度にてRedimune（登録商標）NF Liquid（ZLB Behring）と混合する。
【０２２８】
抗体なしで同時培養される標的及びエフェクター細胞によって測定される自然発生的溶解、及び標的細胞だけを溶解する１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００によって測定される最大溶解が、対照の役割を担う。プレートを、加湿した細胞インキュベーター内で３７℃にて４時間インキュベートする。
【０２２９】
標的細胞の殺滅を、製造業者の取扱説明書に従って細胞毒性検出キット（LDH Detection Kit、Roche#1 644 793）を使用して、損傷細胞から放出されるＬＤＨを計測することによって評価する。簡単に言えば、各ウェルからの１００μｌの上清を、透明な平底９６ウェルプレート内で、キットからの１００μｌの基質と混合する。基質の呈色反応のＶｍａｘ値を、少なくとも１０分間、４９０ｎｍにてＥＬＩＳＡリーダーにより測定する。特有の抗体媒介型殺滅のパーセンテージを、以下のとおり計算する：（（Ａ−ＳＲ）／（ＭＲ−ＳＲ）×１００、式中、Ａは特定の抗体濃度におけるＶｍａｘの平均であり、ＳＲは自然発生的放出のＶｍａｘの平均であり、そしてＭＲは最大放出のＶｍａｘの平均である。
【０２３０】
実施例１６：
パラクリンＨＧＦループを有する皮下異種移植モデルにおける二重特異性Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ抗体のインビボ有効性
Ｍｒｃ−５細胞と同時注入される皮下のＫＰＬ４モデルは、ｃ−Ｍｅｔのパラクリン活性化ループによく似ている。ＫＰＬ４は、細胞表面にｃ−Ｍｅｔ並びにＨｅｒ２をある程度発現する。ＫＰＬ４及びＭｒｃ−５細胞は、対数増殖期において標準的な細胞培養条件下で維持される。ＫＰＬ４とＭｒｃ−５細胞は、１０００万個のＫＰＬ４細胞と１００万個のＭｒｃ−５による１０：１の比で注射される。細胞を、ＳＣＩＤベージュマウスに移植する。腫瘍が定着し、そして１００〜１５０ｍｍ３のサイズに達した後、処置を始める。マウスを、２０ｍｇ／ｋｇの抗体／マウスの負荷量で処置し、その後毎週一回、１０ｍｇ／ｋｇの抗体／マウスで処置する。腫瘍体積を１週間に二度計測し、そして動物の体重を平行して観察する。単一抗体の単独処置と組合せを、二重特異性抗体での治療法と比較する。
【０２３１】
実施例１７：
二重特異性Ｈｅｒ２／ｃＭｅｔ抗体によるＯＶＣＡＲ−８増殖の阻害
ａ）フローサイトメトリーにより独立に確認されているように、ＯＶＣＡＲ−８細胞（NCI Cell Line designation；NCI（国立癌研究所）から購入したOVCAR-8-NCI；Schilder, RJ. et al., Int. J. Cancer 1990 Mar 15;45(3): 416-422；Ikediobi, O.N., et al., Mol. Cancer. Ther. 2006;5;2606- 2012；Lorenzi, P.L., et al., Mol. Cancer Ther. 2009; 8(4): 713-724）は、顕著なＨｅｒ２及びｃ−Ｍｅｔの細胞表面レベルを示している（図７ｂを参照のこと）。二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体によるＯＶＣＡＲ−８細胞増殖の阻害は、４８時間後にCell Titer Glow（商標）アッセイにより計測した。結果を図９ａに示す。対照はＰＢＳバッファー（リン酸緩衝生理食塩水）であった。
【０２３２】
計測では、（０％の阻害に設定したバッファー対照と比較して）６％の阻害というＨＥＲ２抗体トラスツズマブの阻害が明らかになった。二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ ＢｓＡＢ０２（ＢｓＡｂ）抗体は、癌細胞増殖のより顕著な阻害を導いた（１１％の阻害）。一価のｃ−Ｍｅｔ抗体である片腕５Ｄ５（ＯＡ５Ｄ５）は、増殖に対して効果がないことが明らかになった。ＨＥＲ２抗体トラスツズマブと一価のｃ−Ｍｅｔ抗体の片腕５Ｄ５（ＯＡ５Ｄ５）の組合せは、それほど顕著ではない減少しか導かなかった（６％の阻害）。
【０２３３】
ｂ）ＯＶＣＡＲ−８細胞はＨＥＲ２シグナル伝達に依存している。活性なＨＥＲ−ｃ−Ｍｅｔ受容体シグナル伝達ネットワークが更なる増殖を起こす状況をシミュレートするために、アッセイをａ）（４８時間後のCell Titer Glow（商標）アッセイ）で記載したように、しかしＨＧＦ条件培地の存在下で行った。結果を図９ｂに示す。
【０２３４】
計測では、０％の阻害に設定したＨＧＦ処理細胞と比較すると、Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブ（２％の阻害）と一価のｃ−Ｍｅｔ抗体の片腕５Ｄ５（ＯＡ５Ｄ５）（３％の阻害）の阻害効果はほとんどないことが明らかになった。二重特異性Ｈｅｒ２／ｃ−Ｍｅｔ抗体ＢｓＡＢ０２（ＢｓＡｂ）は、Ｏｖｃａｒ−８細胞の癌細胞増殖に対して顕著な阻害を示した（１７％の阻害）。Ｈｅｒ２抗体のトラスツズマブと一価のｃ−Ｍｅｔ抗体の片腕５Ｄ５（ＯＡ５Ｄ５）の組合せは、細胞増殖のそれほど顕著ではない減少につながった（１０％の阻害）。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【配列表】
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