(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させ、超音波感受性であることを特徴とする超音波治療用リポソーム。
【請求項２】
体積平均分散粒径が、２０ｎｍ〜２０μｍである請求項１に記載の超音波治療用リポソーム。
【請求項３】
気体が、酸素、窒素、二酸化炭素、キセノン、クリプトン、アルゴン、ハイドロフルオロカーボン類、及びパーフルオロカーボン類から選択される少なくとも１種である請求項１から２のいずれかに記載の超音波治療用リポソーム。
【請求項４】
フラーレンが、Ｃ６０、Ｃ７０、及びそれらの誘導体から選択される少なくとも１種である請求項１から３のいずれかに記載の超音波治療用リポソーム。
【請求項５】
更に、特定の組織を特異的に認識するレセプターを結合乃至含有する請求項１から４のいずれかに記載の超音波治療用リポソーム。
【請求項６】
超音波感受性が、超音波照射によってリポソームに加熱、機械的振動、又はキャビテーション効果を発現する請求項１から５のいずれかに記載の超音波治療用リポソーム。
【請求項７】
固形がん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、白血病、及び血管狭窄病変から選択される少なくともいずれかの治療に用いられる請求項１から６のいずれかに記載の超音波治療用リポソーム。
【請求項８】
固形がんの治療に用いられる請求項７に記載の超音波治療用リポソーム。
【請求項９】
内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させ、超音波感受性であることを特徴とする超音波治療促進用リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させたリポソーム、並びに該リポソームを用いた診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、光増感剤として知られているフラーレンを利用して、がんなどの治療の検討が進められている。これは、フラーレンなどの光増感剤に、可視光を照射することにより、又は、超音波を照射することにより、生成するヒドロキシラジカル、スーパーオキシドアニオン、一重項酸素などの活性酸素種の酸化力を利用するものである。特に超音波照射法は、光照射法と比較して水相中の浸透（作用）距離が大きいという特長を有しており、光照射が不可能な身体深部の疾患への適用が期待されている（例えば、非特許文献１〜２、特許文献１参照）。
【０００３】
また、超音波を利用したがんなどの治療には、生体組織の超音波吸収による加熱作用を用いたものや、超音波振動による機械作用を用いたもの、超音波が引き起こすキャビテーション効果を利用して生体に投与した物質に化学反応を起こさせる音響化学療法などがあり、がん細胞に超音波を照射すると、アポトーシスを誘導してがん細胞の増殖を抑制するという報告がされている（例えば、非特許文献３〜４、特許文献２参照）。
【０００４】
フラーレンを医療材料として生体において適用する場合、表面が疎水性のため、そのままでは水媒体中への分散ができないのでカリックスアレーンやシクロデキストリンを用いて分散したり、水溶性高分子でその表面を修飾するなど、各種の工夫がなされている（例えば、特許文献３〜６参照）。
しかしながら、中性付近の生理的条件下における分散安定性が不十分なため、粒子が凝集を生じ、血液中での流動性を確保することが困難であるという問題がある。そのため、フラーレン分散液を注射液として直接血管内に投与するという行為は不可能であるのが現状である。
【０００５】
一方、細胞内への粒子取込み方法としてリポソームを利用する試みがなされている。リポソームとは、生体膜の構成成分であるリン脂質により形成される、生体適合性に優れた小胞であり、その小胞内に様々な薬物を封入できることから、薬剤のキャリアーとして広く利用されている。更に、リポソームの荷電、粒子径、脂質成分を変えたり、リポソーム表面に抗原、抗体、糖などの特異的リガンドを結合させたりすることで、細胞あるいは組織に対して特異性を持たせることが出来ることから、ターゲティング可能な薬剤キャリアーとして注目を集め、抗ガン剤をはじめとした副作用が強い化学療法剤の運び屋として臨床応用されている（例えば、非特許文献５、特許文献７〜９参照）。
しかしながら、リポソームに微粒子を封入することにより、超音波を照射した際の治療効果が小さくなることが予想される。
【０００６】
また、近年、リポソームに不活性ガスであるペルフルブタンを内包したものが超音波造影剤（製品名：ソナゾイド、第一三共（株）製）として上市されたが、治療目的としては認可されていないのが現状である。
【０００７】
また、リポソームに温度により活性化される気体プレカーサーを含有させ、超音波照射による温度上昇を利用して画像診断や温熱療法を行うことが提案されている（例えば、特許文献１０参照）。
この方法は簡便ではあるが、急激な加熱により組織全体に損傷を与える危険性があるという問題がある。
【０００８】
したがって、中性付近の生理的条件下における分散安定性に優れ、診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物として利用可能なリポソームの速やかな開発が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−２４１３０７号公報
【特許文献２】特開平１１−９２３６０号公報
【特許文献３】特開２００１−３４８２１４号公報
【特許文献４】特開２００６−６９８１２号公報
【特許文献５】特開２００７−１７６８９９号公報
【特許文献６】特開２００８−２５５１０７号公報
【特許文献７】特開平５−５８８７９号公報
【特許文献８】特開２０００−３１９１６５号公報
【特許文献９】特開２００６−２７３７４０号公報
【特許文献１０】米国特許７，０７８，０１５号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊ．Ｗ．Ａｒｂｏｇａｓｔ，  Ａ．Ｐ．Ｄａｒｍａｎｙａｎ，  Ｃ．Ｓ．Ｆｏｏｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，９５，１１−１２
【非特許文献２】山田正敏、田畑泰彦、生体医工学  ２００５、４３、２３８−２４６
【非特許文献３】Ｑ．Ｌｉｕ，  Ｘ．Ｗａｎｇ，  Ｐ．Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  ２００６；  ４５，  ５６−６０
【非特許文献４】Ｈ．Ｈｏｎｄａ，  Ｑ．Ｌ．Ｚｈａｏ，  Ｔ．Ｋｏｎｄｏ，  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  Ｍｅｄ．  ＆  Ｂｉｏｌ．  ２８  （２００２）  ６７３−６８２
【非特許文献５】Ａ．Ｉｋｅｄａ，  Ｙ．Ｄｏｉ，  Ｋ．Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ.，  Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，５，１１５８−１１６０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、中性付近の生理的条件下における分散安定性に優れ、診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物として利用可能なリポソーム、並びに該リポソームを用いた診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させたリポソームが、中性付近の生理的条件下における分散安定性に優れ、診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物として利用可能であるという知見である。
【００１３】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させたことを特徴とするリポソームである。
＜２＞  体積平均分散粒径が、２０ｎｍ〜２０μｍである前記＜１＞に記載のリポソームである。
＜３＞  気体が、酸素、窒素、二酸化炭素、キセノン、クリプトン、アルゴン、ハイドロフルオロカーボン類、及びパーフルオロカーボン類から選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載のリポソームである。
＜４＞  フラーレンが、Ｃ６０、Ｃ７０、及びそれらの誘導体から選択される少なくとも１種である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のリポソームである。
＜５＞  誘導体が、Ｃ６０にＯＨ基及びＣＯＯＨ基の少なくともいずれかが１つ以上付加したもの、及びＣ７０にＯＨ基及びＣＯＯＨ基の少なくともいずれかが１つ以上付加したものから選択される少なくとも１種である前記＜４＞に記載のリポソームである。
＜６＞  更に、特定の組織を特異的に認識するレセプターを結合乃至含有する前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のリポソームである。
＜７＞  超音波感受性である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載のリポソームである。
＜８＞  医療用である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載のリポソームである。
＜９＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のリポソームを含有することを特徴とする診断用造影剤である。
＜１０＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のリポソームを含有することを特徴とする治療促進剤である。
＜１１＞  前記＜１＞から＜８＞のいずれかに記載のリポソームを含有することを特徴とする医薬組成物である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、中性付近の生理的条件下における分散安定性に優れ、診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物として利用可能なリポソーム、並びに該リポソームを用いた診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態である、内部に気体を含有し、フラーレンを吸着したリポソームの模式図である。
【図２】図２は、本発明の他の一実施形態である、内部に気体を含有し、フラーレンを内包したリポソームの模式図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のリポソームにおけるリポソーム、フラーレン、及び気体の位置関係の一例を示す模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のリポソームにおけるリポソーム、フラーレン、及び気体の位置関係の一例を示す模式図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明のリポソームにおけるリポソーム、フラーレン、及び気体の位置関係の一例を示す模式図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本発明のリポソームにおけるリポソーム、フラーレン、及び気体の位置関係の一例を示す模式図である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、本発明のリポソームにおけるリポソーム、フラーレン、及び気体の位置関係の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（リポソーム）
本発明のリポソームは、少なくとも内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させてなり、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００１７】
前記リポソームの形態について、図１〜図３Ｅを参照して説明する。
図１は、本発明の一実施形態である、内部に気体を含有し、フラーレンを吸着したリポソームの模式図である。図１では、リポソームの中央部の空間に気体が保持され、疎水部にフラーレンが吸着している。更に、リポソームにはレセプターが結合している。
図２は、本発明の他の一実施形態である、内部に気体を含有し、フラーレンを内包したリポソームの模式図である。図２では、リポソームの中央部の空間に気体が保持され、フラーレンが内包されている。更に、リポソームにはレセプターが結合している。
図３Ａ〜図３Ｅは、本発明のリポソームにおけるリポソーム、フラーレン、及び気体の位置関係の一例を示す模式図である。図３Ａでは、リポソームの中央部に、脂質で被覆されたガス（気体）、フラーレンが保持され、前記中央部の残部は水溶液で満たされている。図３Ｂでは、リポソームの中央部の空間に気体が保持され、フラーレンが内包されている。図３Ｃでは、リポソームの中央部の空間に気体が保持され、疎水部にフラーレンが吸着している。図３Ｄでは、リポソームの中央部の空間に気体が保持され、フラーレンが内包されており、一部のフラーレンは、凝集体となっている。図３Ｅでは、リポソームの中央部の空間に気体が保持され、フラーレンが、内包及び吸着されており、一部のフラーレンが凝集体となっている。
前記気体は、脂質で被覆されていてもよい。また、前記気体は、リポソームの疎水部に存在していてもよい。
前記フラーレンは、表面を親水性化合物で被覆されて、リポソームの中央部の空間に内包されていてもよい。
なお、本発明のリポソームは、単層膜であってもよいし、２層以上の多層膜であってもよい。また、気体（ガス）を被覆する脂質は、リポソーム本体の脂質と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
本発明のリポソームでは、内部に気体を含有したリポソームと、フラーレンとが超音波の照射により相互作用を及ぼす距離に位置している。
前記相互作用とは、例えば、超音波吸収により気体がキャビテーション効果を発揮する領域と、フラーレンが発生させる活性酸素の存在領域が重なり、相乗効果を及ぼすことをいう。
【００１８】
＜体積平均分散粒径＞
本発明の内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させたリポソームの体積平均分散粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０ｎｍ〜２０μｍが好ましく、５０ｎｍ〜１０μｍが特に好ましい。前記体積平均分散粒径が、２０ｎｍ未満であると、リポソームそのものの合成が困難であることに加え、気体やフラーレンを安定に内包させることが困難であり、２０μｍを超えると、毛細血管や血流が遅い部位での血管の閉塞、血行障害につながり、また、癌細胞などの患部にもうまく到達できないことがある。一方、前記体積平均分散粒径が前記好ましい範囲内であると、血流などの水溶液中で十分な分散安定性、及び流動性を確保することができ、診断、及び治療の医療用に用いることができる点で、有利である。
また、前記リポソームを診断用造影剤として用いる場合のリポソームの体積平均分散粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１００ｎｍ〜２０μｍが好ましく、１μｍ〜１０μｍが特に好ましい。前記特に好ましい範囲内であると、画像にコントラストが着き易い点で、有利である。
また、前記リポソームを治療促進剤として用いる場合のリポソームの体積平均分散粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば癌治療の場合には、５０ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、６０ｎｍ〜３００ｎｍが特に好ましい。前記特に好ましい範囲内であると、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）によりがん組織に優先的に集積することが可能となり、がんの治療促進に有効である。
前記リポソームの体積平均分散粒径は、動的光散乱法による測定で求めることができ、例えば、マイクロトラック  ＵＰＡ−ＵＴ１５１粒度分布測定装置（日機装（株）製）により測定することができる。
【００１９】
前記気体と、前記フラーレンとを併用することにより、それぞれ単独で使用した場合と比べて、診断や治療で効果が大きくなる理由は明らかではないが、リポソームという閉じた空間の中で、例えば、超音波を照射することにより、気体からの浮力を受けてフラーレンがより激しく運動することに起因するのではないかと推測する。リポソームのみや気体含有のバブルリポソームと比較して、別々の作用機構が相乗して超音波治療効果が増強されるのではないかと推測している。リポソームとフラーレンと気体との位置関係としては、例えば、図３Ａ〜図３Ｅに示した。上記のような技術で超音波感受性を高めることができる。
【００２０】
＜超音波感受性＞
前記リポソームは、超音波感受性であることが、癌などの治療効果や診断効果を発揮できる点で、好ましい。
前記超音波感受性であるとは、超音波照射により、リポソームが加熱されたり、機械的振動を受けたり、キャビテーション効果などを発現することをいう。
前記気体とフラーレンとが共存するリポソームに超音波照射すると、例えば、歯科治療領域の殺菌効果やがん細胞などの殺傷効果が著しく向上する。
【００２１】
＜気体＞
前記気体としては、リポソーム内部に保持されるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、生理的条件下において気体状態で存在するものが好ましい。
なお、ここでいう生理的条件下とは、２５℃、１気圧でｐＨ７．２〜７．４のリン酸緩衝食塩水（組成：１３７ｍＭ−ＮａＣl、９．０ｍＭ−Ｎａ２ＨＰＯ４、２．９ｍＭ−ＮａＨ２ＰＯ４）中のことをいう。
前記好ましい気体としては、例えば、酸素、窒素、二酸化炭素、キセノン、クリプトン、アルゴン、ハイドロフルオロカーボン類、パーフルオロカーボン類が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、キセノン、クリプトン、アルゴン、ハイドロフルオロカーボン類、パーフルオロカーボン類が、水に不溶で、分子サイズ、及び密度が大きいため、リポソーム内に安定に保持され、かつ高感度で診断でき、さらに高い治療効果が得られる点で、有利である。
前記ハイドロフルオロカーボン類としては、例えば、１，１，１，２，２−ペンタフルオロエタン、１，１，２，２−テトラフルオロエタン、１，１，１−トリフルオロエタン、１，１−ジフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、１，１，２，２，３−ペンタフルオロプロパン、１，１，１，２，３，４，４，５，５，５−デカフルオロペンタンなどが挙げられる。
前記パーフルオロカーボン類としては、例えば、超音波造影剤として公知である、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロペンタン、ヘキサフルオロ−１，３−ブタジエンなどが挙げられる。
【００２２】
前記気体のリポソームにおける含有容量としては、特に制限はなく、空孔の容積以下で適宜選択することができるが、容積に対し、１０％〜１００％が好ましく、２０％〜９５％がより好ましく、２５％〜９０％が特に好ましい。前記気体のリポソームにおける含有容量が、１０％未満であると、診断および治療効果が小さく、１００％を超えると、リポソームが不安定になる。一方、前記気体のリポソームにおける含有容量が前記特に好ましい範囲内であると、診断の感度が上がり、また、大きな治療促進効果が得られる点で、有利である。
前記気体のリポソームにおける含有容量は、例えば、気体の含有量をガスクロマトグラフ分析などで求め、光学顕微鏡や電子顕微鏡などで測定されるリポソームのサイズと比較することにより推定することができる。
【００２３】
また、本発明のリポソームを含有する分散液中の気体の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１ｍＬ当り０．１μＬ〜１００μＬが好ましい。前記リポソームを含有する分散液中の気体の含有量が、０．１μＬ未満であると、診断及び治療促進の効果がなく、また、フラーレン入りのリポソームが保管容器内で沈殿し均一な薬物濃度の投与ができず重大な事故につながることがある。１００μＬを超えると、分散液が不安定でリポソームが容器内で浮いてしまい均一な薬物濃度の投与ができず重大な事故につながることがある。一方、前記リポソームを含有する分散液中の気体の含有量が、前記好ましい範囲内であると、リポソームは安定で、診断の感度が上がり、また、大きな治療促進効果が得られる点で、有利である。
【００２４】
前記気体は、脂質で被覆されていてもよい。
また、前記気体は、リポソームの疎水部に存在していてもよい。
【００２５】
＜フラーレン＞
本発明のフラーレンとは、Ｃｎ（炭素）クラスターの総称をいう。
前記フラーレンとしては、特に制限はなく、公知のフラーレンを適宜選択することができ、例えば、Ｃ６０、Ｃ７０、Ｃ７６、Ｃ７８、Ｃ８２などの純炭素物質；金属（又は金属酸化物）を内包した炭素クラスター；ＯＨ基などを付与して水溶性を高めたものなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、Ｃ６０、Ｃ７０、及びそれらの誘導体が、入手しやすい点で、好ましい。
前記誘導体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｃ６０にＯＨ基及びＣＯＯＨ基の少なくともいずれかが１つ以上付加したもの、Ｃ７０にＯＨ基及びＣＯＯＨ基の少なくともいずれかが１つ以上付加したものなどが挙げられる。
【００２６】
前記フラーレンは、凝集したものであってもよいし、凝集していないものであってもよい。凝集していない場合、前記フラーレンの体積平均粒径は、１ｎｍ程度である。
前記フラーレンが凝集した場合における体積平均粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１００ｎｍ以下が好ましく、５０ｎｍ以下がより好ましい。前記フラーレンが凝集した場合における体積平均粒径が１００ｎｍを超えると、リポソームに内包もしくは吸着されにくいことがある。一方、前記フラーレンが凝集した場合における体積平均粒径が前記より好ましい範囲内であると、リポソームに内包もしくは吸着されやすく、気体との相乗効果が発揮されて、超音波治療が促進される点で、有利である。
前記体積平均粒径の判断には、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いることができる。
前記体積平均粒径とは、フラーレンの凝集体の電子顕微鏡写真画像を同面積の円とした時の直径を意味する。
【００２７】
通常フラーレン自体は水不溶性であるため、生体内への投与が困難であるため、前記フラーレンは、親水化処理して用いることが好ましい。
前記親水化処理の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、特開２００１−３４８２１４号公報、特開２００６−６９８１２号公報、特開２００７−１７６８９９号公報、特開２００８−２５５１０７号公報に記載の方法を用いることができる。
【００２８】
リポソームの全脂質に対する前記フラーレンの添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、質量比｛（フラーレン／リポソームの全脂質）×１００｝で０．１％〜１０，０００％が好ましく、１％〜２，０００％がより好ましい。前記添加量が、０．１％未満であると、前記気体と前記フラーレンとの併用効果が得られないことがあり、１０，０００％を超えると、フラーレンをリポソームに安定に内包乃至吸着させることが困難となることがある。一方、前記添加量が前記より好ましい範囲内であると、気体との相乗効果が得られ、超音波治療が促進される点で、有利である。
【００２９】
前記フラーレンは、リポソームに内包されていてもよいし、吸着されていてもよいし、内包及び吸着されていてもよい。
特に、治療促進剤や医薬組成物としてリポソームを用いる場合において、例えば、発生するヒドロキシラジカルや一重項酸素を利用する場合には、発生するヒドロキシラジカルや一重項酸素がリポソームの壁面で遮蔽されるので、リポソームの外側にフラーレンを吸着させる態様が、超音波照射によりこれらの活性酸素が患部に直接作用しやすいことで治療促進効果が出やすい点で、好ましい。
また、例えば、キャビテーション効果や機械的作用を期待する場合には、前記フラーレンは、リポソームに内包されている態様が、ソノポレーションによりリポソームの開孔が期待でき、治療促進効果も出やすい点で、好ましい。
【００３０】
前記フラーレンは、酸化鉄などの金属酸化物と比べて、比重が非常に小さいので沈降しにくいという点で、有利である。
【００３１】
＜リポソーム＞
本発明の内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させるリポソームに用いるリポソームとは、中性脂質、及び、負荷電脂質及び／又は正荷電化合物を含有する閉鎖小胞である。前記脂質には、更に非イオン性水溶性高分子やタンパク質が結合していてもよい。
【００３２】
前記中性脂質とは、生理的ｐＨ、即ち約ｐＨ６．５〜７．５の水性媒体中において等しい正電荷数と負電荷数を有する脂質を意味する。
前記中性脂質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチド酸誘導体；ジガラクトシルグリセリド、ガラクトシルグリセリドなどの糖脂質；スフィンゴミエリンなどのスフィンゴシン誘導体；コレステロール、エルゴステロール、ラノステロールなどのステロール類；が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ホスファチド酸誘導体、糖脂質、ステロール類が好ましく、ホスファチド酸誘導体、ステロール類がより好ましく、ホスファチド酸誘導体が更に好ましい。
前記ホスファチド酸誘導体の中でも、ジ（炭素数１０〜２２のアルカノイル又はアルケノイル）ホスファチジルコリン誘導体が好ましく、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリンが特に好ましい。
前記「炭素数１０〜２２のアルカノイル又はアルケノイル」基としては、例えば、デシリル、ウンデシリル、ドデシル、トリデシリル、テトラデシリル、ペンタデシリル、ヘキサデシリル、へプタデシリル、オクタデシリル、ノナデシリル、イコシル、へニコシル、ドコシル、デセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、オクタデセニル、イコセニル、ドコセニル基などが挙げられる。
前記「ジ（炭素数１０〜２２のアルカノイルまたはアルケノイル）」とは、ホスファチジルコリンの２つの水酸基に、それぞれ炭素数１０〜２２のアルキル基及び／又はアルケニル基を有するカルボン酸がエステル結合していることを意味する。
コレステロールなどのステロール類は、それ自体リポソームの構成成分として使用されるが、他の中性脂質に加えて必要に応じて使用することができる。
【００３３】
前記負荷電脂質とは、生理的ｐＨの水性媒体中において正荷電より多くの負荷電を有する脂質を意味する。
前記負荷電脂質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水素添加卵黄ホスファチジルセリンナトリウム；ジパルミトイルホスファチジルグリセロールなどのホスファチジルグリセロール類；ジパルミトイルホスファチジルセリンなどのホスファチジルセリン類；ジパルミトイルホスファチジルイノシトールなどのホスファチジルイノシトール類が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ホスファチジルグリセロール類が好ましく、ジパルミトイルホスファチジルグリセロールが特に好ましい。
【００３４】
前記正荷電化合物とは、生理的ｐＨの水性媒体中において負荷電より多くの正荷電を有する化合物を意味する。
前記正荷電化合物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、正荷電脂質、カチオン性界面活性剤、カチオン性水溶性高分子が挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３５】
前記正荷電脂質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミンのような鎖状炭化水素系アミン類；３−β−[Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロールのようなコレステロールのアミン誘導体；Ｎ−α−トリメチルアンモニオアセチルジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライドのようなＮ−α−トリメチルアンモニオアセチルジ（炭素数１０〜２０のアルキル又はアルケニル）−Ｄ−グルタメートクロライド類；Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライドのようなＮ−［１−（２、３−ジ（炭素数１０〜２０のアルキル又はアルケニル）オキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド類などが挙げられる。
前記アルキル基としては、例えば、ペンチル、へキシル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、イコシル、ドコシル、テトラコシル、ヘキサコシル、オクタコシル、トリアコンタシル基などが挙げられる。これらのアルキル基の中でも、炭素数５〜３０のアルキル基が好ましく、炭素数１０〜２０のアルキル基がより好ましい。
前記「炭素数１０〜２０のアルキル又はアルケニル」基としては、例えば、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシリル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシル、デセニル、デシニル、ウンデシニル、ドデシニル、トリデシニル基などが挙げられる。
これらの正荷電脂質の中でも、アルキルアミン、Ｎ−α−トリメチルアンモニオアセチルジ（炭素数１０〜２０のアルキル又はアルケニル）−Ｄ−グルタメートクロライドが好ましく、Ｎ−α−トリメチルアンモニオアセチルジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライドがより好ましい。
【００３６】
前記カチオン性界面活性剤としては、特に制限はなく、公知のカチオン性界面活性剤を適宜選択することができ、例えば、Ｍ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎ（著）、坪根および坂本（監訳）「界面活性剤と界面現象」、ｐｐ．１６−２０、フレグランスジャーナル社（１９９５）に記載のカチオン性界面活性剤を挙げることができる。前記カチオン性界面活性剤は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記カチオン性界面活性剤の中でも、長鎖アルキルアミン又はその塩、長鎖アルキル又は長鎖アラルキル第４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン付加長鎖アルキルアミン又はその塩、ポリオキシエチレン付加長鎖アルキル第４級アンモニウム塩、長鎖アルキルアミンオキシドが好ましく、長鎖アルキルアミン又はその塩、長鎖アルキル又は長鎖アルケニル第４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン付加長鎖アルキルアミン又はその塩がより好ましく、長鎖アルキルアミン又はその塩が特に好ましい。
これらのカチオン性界面活性剤は高濃度においてリポソームを崩壊させるが、少量であればリポソームに包含され構成成分とすることができる（Ｕｒｂａｎｅｊａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，２７０、３０５−３０８（１９９０）参照）。従って、リポソームの形成を阻害しない量のカチオン性界面活性剤を配合するか、又は形成されたリポソームを崩壊させない量のカチオン性界面活性剤を配合するか、あらかじめ製造されたリポソームの分散液中にカチオン性界面活性剤を添加しリポソーム表面に吸着させることによって、該リポソームの構成成分のひとつとし、高分子修飾リポソームの負の帯電状態を小さくすることができ、生体の毒性が軽減されるので好ましい。
【００３７】
前記カチオン性水溶性高分子としては、特に制限はなく、公知のカチオン性水溶性高分子を適宜選択することができ、例えば、Ｇ．Ａｌｌｅｎら（編）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ」ｖｏｌ．６、ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ（１９８９）に記載のカチオン性水溶性高分子を挙げることができる。前記カチオン性水溶性高分子は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記カチオン性水溶性高分子の中でも、カチオン性水溶性ビニル系合成高分子、カチオン性水溶性ポリアミノ酸、カチオン性水溶性合成ポリペプチド、カチオン性水溶性天然高分子、カチオン性水溶性改変天然高分子が好ましく、カチオン性水溶性ビニル系合成高分子、カチオン性水溶性ポリアミノ酸、カチオン性水溶性合成ポリペプチドがより好ましく、カチオン性水溶性ビニル系合成高分子が特に好ましい。
これらカチオン性水溶性高分子の吸着は、低分子化合物の吸着とは異なり、高分子の固体表面への吸着は安定であり不可逆である（Ｇ．Ａｌｌｅｎら（編）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃｉｅｎｃｅ」ｖｏｌ．２、ｐｐ．７３３−７５４、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）参照）。従って、カチオン性水溶性高分子は負に帯電したリポソームに吸着することによって該リポソームの負の帯電状態を小さくすることができ、生体の毒性が軽減されるので好ましい。
【００３８】
本発明において、前記各脂質には非イオン性水溶性高分子を結合させてもよい。
前記非イオン性水溶性高分子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ポリエチレングリコールなどの非イオン性ポリエーテル、モノメトキシポリエチレングリコール、モノエトキシポリエチレングリコールなどの非イオン性モノアルコキシポリエーテル、非イオン性ポリアミノ酸、非イオン性合成ポリペプチドなどが好ましい。
前記非イオン性水溶性高分子の重量平均分子量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１，０００〜１２，０００が好ましく、１，０００〜５，０００がより好ましい。
【００３９】
前記リポソーム（気体を含有する前のリポソーム）の直径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記直径は、そのサイズ調節法の種類により異なるが、体積平均粒子径として１０ｎｍ〜５００ｎｍが好ましく、２０ｎｍ〜２００ｎｍがより好ましく、２０ｎｍ〜１００ｎｍが特に好ましい。
ここで、前記体積平均粒子径とは、複数の粒子の平均体積から算定される粒子径の平均値を意味し、粒子径測定機を使用して当業者周知の方法（例えば、Ｒ．Ｒ．Ｃ．Ｎｅｗ、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、ｐｐ．１５４−１６０、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））によって算定することができる。
【００４０】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、レセプターが挙げられる。
【００４１】
−レセプター−
本発明のリポソームは、更に、特定の組織を特異的に認識するレセプターを結合乃至含有することが、超音波による腫瘍の診断又は治療に有益であり、キラー細胞誘導効果をもたらす可能性がある点で、好ましい。
前記レセプターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、腫瘍などの異常細胞への集積特異性を有する種々のレセプターが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記レセプターの具体例としては、種々のモノクロナール抗体、種々の蛋白質、ペプチド、ステロイド、免疫関連剤（免疫細胞賦活、活性化材料）などが挙げられる。
【００４２】
前記レセプターは、前述の脂質、水溶性高分子若しくは界面活性剤の末端のアミノ基、ヒドロキシル基又はカルボキシル基を介してリポソームに結合乃至含有される。
前記レセプターは、リポソームの表面全体を被覆していてもよいし、その一部を被覆していてもよい。
【００４３】
＜製造方法＞
本発明の内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させたリポソームの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
以下に前記製造方法の一実施形態を示す。
（１）  フラーレン分散液を調製する。
（２）  ２種以上の脂質の組み合わせによりリポソーム粒子を作製する。これによりリポソーム膜の柔らかさを変えたり（相転移点の差の利用）、二次元的に膜面内に柔らかさの異なる島状形態を形成する（相分離現象の利用）。これらの性質は、外部からの電磁気的刺激、音波的刺激により、温度変化を与えることによりコントロールできる。
（３）  脂質の他に必要により荷電調整剤やタンパク質、非イオン性水溶性高分子などを組み合わせたリポソーム粒子を作製する。これによりリポソーム膜の表面電荷や分子透過性を制御すると同時に付着性や凝集性をなくし分散安定性を向上させることができる。
（４）  種々のイオンによる静電気的引力やタンパク質による接着力を利用して、フラーレンとリポソーム粒子との粒子間接合を促進してフラーレンを内包乃至吸着させたリポソームを作製する。
（５）  気体を充満した容器に前記フラーレンを内包乃至吸着させたリポソームを入れ、加圧状態で超音波を照射することによりリポソーム内に気体を内包させる。
以上により、本発明のリポソームを作製することができる。
【００４４】
前記本発明のリポソームは、医療用として、好適に用いることができる。
【００４５】
例えば、本発明のリポソームは、超音波照射により惹起される機械的作用や一重項酸素、ヒドロキシラジカルなどの活性酸素の発生を利用して、がんを含む各種疾患の治療に使用することができる。
前記照射する超音波の周波数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、約２０ＫＨｚ〜２０ＭＨｚが好ましく、約６００ＫＨｚ〜３ＭＨｚが特に好ましい。
前記照射の出力としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、約０．１Ｗ／ｃｍ２〜１００Ｗ／ｃｍ２が好ましく、約０．５Ｗ／ｃｍ２〜１０Ｗ／ｃｍ２がより好ましい。
前記超音波のＤｕｔｙ  ｃｙｃｌｅとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、約１％〜１００％が好ましく、約１０％〜５０％がより好ましい。
前記超音波の照射時間としては、特に制限はなく、用いる周波数、照射出力により適宜選択することができるが、約５秒間〜６００秒間が好ましく、約３０秒間〜３００秒間がより好ましい。
【００４６】
前記本発明のリポソームは、あらゆる種類のがん、ウイルス感染症、細胞内寄生性感染症、肺線維症、肝硬変、慢性腎炎、動脈硬化、白血病、及び血管狭窄病変などの治療に有効に用いることができる。
前記がんとしては、例えば、肺がん、肝がん、膵がん、胃腸がん、膀胱がん、腎がん、脳腫瘍のような臓器の表層及びその内部に発生するあらゆる固形がんを挙げることができる。これらの中でも、光線力学的治療などが不可能である身体深部のがんの治療に有効に用いることができる。
また、その他の疾病については、その病巣又は感染細胞（罹患細胞）が臓器内部に位置しているので、本発明のリポソームをその部位に適当な方法によって集積させた後、そこに外部より超音波照射することによって治療を行うことができる。
【００４７】
（診断用造影剤、治療促進剤、医薬組成物）
＜診断用造影剤＞
本発明の診断用造影剤は、少なくとも本発明のリポソームを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４８】
前記診断用造影剤中の本発明のリポソームの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記診断用造影剤は、本発明のリポソームそのものであってもよい。
【００４９】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプン、糖類、デキストランなどが挙げられる。前記診断用造影剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、リポソームの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記診断用造影剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記診断用造影剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００５０】
＜治療促進剤＞
本発明の治療促進剤は、少なくとも本発明のリポソームを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
前記治療促進とは、本発明のリポソームのように単独では治療薬としての効果はない乃至非常に弱いが、例えば、超音波や電場や磁場などの物理的エネルギーを加えることにより治療効果を発現すること、または、超音波や電場や磁場などの物理的エネルギーのみでは治療効果はない乃至非常に弱いが本発明のリポソームのような薬剤を併用することにより大きな治療効果が得られることをいう。
【００５１】
前記治療促進剤中の本発明のリポソームの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記治療促進剤は、本発明のリポソームそのものであってもよい。
【００５２】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプン、糖類、デキストランなどが挙げられる。前記治療促進剤中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、リポソームの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記治療促進剤は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記治療促進剤は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００５３】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、少なくとも本発明のリポソームを含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００５４】
前記医薬組成物中の本発明のリポソームの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬組成物は、本発明のリポソームそのものであってもよい。
【００５５】
前記その他の成分としては、特に制限はなく、例えば、薬理学的に許容され得る担体の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エタノール、水、デンプン、糖類、デキストランなどが挙げられる。前記医薬組成物中の、前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、リポソームの効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができる。
なお、前記医薬組成物は、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬と併せて使用されてもよい。また、前記医薬組成物は、他の成分を有効成分とする医薬中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００５６】
−剤型−
前記診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物の剤型としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤（静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、皮内など）、分散剤、流動性剤とすることができる。これらの剤型の前記診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物は、常法に従い製造することができる。例えば、注射剤として投与する場合には、本発明のリポソームを、注射剤に一般に用いられる緩衝剤、生理食塩水、保存剤、注射用蒸留水などの各種添加剤と配合して注射剤とすることができる。
【００５７】
−投与−
前記診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物の投与方法としては、特に制限はなく、前記剤型などに応じて適宜選択することができる。
前記診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物の投与量としては、特に制限はなく、投与経路、患者の年齢、性別、疾患の種類及び状態など、様々な要因を考慮して適宜選択することができ、例えば、成人１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇを１回〜数回に分けて投与することができる。
前記診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物の投与対象となる動物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、トリなどが挙げられる。
【００５８】
本発明のリポソームは、内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させたことにより、中性のｐＨ領域における水系溶媒中での分散安定性が極めて良好であり、かつ、超音波などによる高い診断、及び治療効果を有する。更に、超音波診断装置で気体の分布を正確に視覚化することができるため、がんなどの病変部を高精度で検出（超音波診断）しながら、治療を同時に行うことが可能であるため、患者のＱＯＬ向上に貢献することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、下記実施例は本発明を制限するものではなく、前・後記の趣旨を逸脱しない範囲で変更実施することは全ての本発明の技術的範囲に包含される。
【００６０】
（比較例１−１）
フラーレンＣ７０１００ｍｇ、γ−シクロデキストリン７００ｍｇ、及びジルコニアビーズ（直径１ｍｍ）２０ｇを混合して、遊星ボールミルＰＭ１００（Ｒｅｔｓｃｈ製）を用いて３０分分散した。前記分散物に４０ｍＬの水を加えて、Ｃ７０の水分散物を得た。
日油（株）製コートソーム  ＥＬ−０１−Ｎ（Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）５４μｍｏｌ、コレステロール（ＣＨＯＬ）４０μｍｏｌ、Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）６μｍｏｌ含有）に、上記Ｃ７０の水分散物を０．２μｍのフィルターでろ過後、２ｍＬ添加、振とうして弱負荷電型リポソーム分散液（Ｃ７０の含有量は０．３４ｍｇ／ｍＬ）を調製し、比較例１−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル１Ａ」と称することがある。）とした。
前記サンプル１Ａの体積平均分散粒径を、マイクロトラック  ＵＰＡ−ＵＴ１５１粒度分布測定装置（日機装（株）製）を用いて測定したところ、２１０ｎｍであった。
前記サンプル１Ａは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中（生理的条件下）で安定であった。なお、前記安定とは、２５℃の生理的条件下に２４時間静置した時に、凝集や沈殿を生じない状態をいう。
【００６１】
（実施例１−１）
前記比較例１−１で得られたサンプル１Ａをバイアル瓶に入れパーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを充満させ、さらにバイアル瓶に対して１．５倍容量のガスを加圧充填した後、２０ｋＨｚ、５０Ｗの超音波を１５分照射した。その後、更に８００ｋＨｚ、３０Ｗの超音波を６０分照射し、実施例１−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル１Ｂ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル１Ｂの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、２８０ｎｍであった。
また、前記サンプル１Ｂ中のパーフルオロプロパンガスの濃度を、ガスクロマトグラフＧＣ−２０１４型（島津製作所社製）により分析したところ、２．８μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル１Ｂは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６２】
（比較例１−２）
日油（株）製コートソーム  ＥＬ−０１−Ｎに純水２ｍＬを添加、振とうして弱負荷電型リポソーム（サンプル１Ｃとする）分散液を調製し、比較例１−２のリポソーム分散液（以下、「サンプル１Ｃ」と称することがある。）とした。
前記サンプル１Ｃの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、２７０ｎｍであった。
前記サンプル１Ｃは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６３】
（比較例１−３）
前記比較例１−２で得られたサンプル１Ｃをバイアル瓶に入れパーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを充満させ、さらにバイアル瓶に対して１．５倍容量のガスを加圧充填した後、２０ｋＨｚ、５０Ｗの超音波を１５分照射した。その後、更に８００ｋＨｚ、３０Ｗの超音波を６０分照射し、比較例１−３のリポソーム分散液（以下、「サンプル１Ｄ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル１Ｄの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３００ｎｍであった。
また、前記サンプル１Ｄ中のパーフルオロプロパンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．６μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル１Ｄは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６４】
（比較例２−１）
前記比較例１−１において、コートソーム  ＥＬ−０１−Ｎを用いていた点を、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）９４μｍｏｌと１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジル−エタノールアミン−メトキシ−ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）６μｍｏｌとを混合して作製したリポソームを用いた以外は、比較例１−１と同様にして、比較例２−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル２Ａ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル２Ａの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３４０ｎｍであった。
前記サンプル２Ａは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６５】
（実施例２−１）
前記比較例２−１で得られたサンプル２Ａをバイアル瓶に入れパーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを充満させ、さらにバイアル瓶に対して１．５倍容量のガスを加圧充填した後、２０ｋＨｚ、５０Ｗの超音波を１５分照射した。その後、更に８００ｋＨｚ、３０Ｗの超音波を６０分照射し、実施例２−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル２Ｂ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル２Ｂの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３７０ｎｍであった。
また、前記サンプル２Ｂ中のパーフルオロプロパンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．５μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル２Ｂは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６６】
（実施例２−２）
前記実施例２−１において、パーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを用いていた点を、空気に代えた以外は、実施例２−１と同様にして、実施例２−２のリポソーム分散液（以下、「サンプル２Ｃ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル２Ｃの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３９０ｎｍであった。
また、前記サンプル２Ｃ中の空気の濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．４μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル２Ｃは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６７】
（実施例２−３）
前記実施例２−１において、パーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを用いていた点を、キセノン（Ｘｅ）ガスに代えた以外は、実施例２−１と同様にして、実施例２−３のリポソーム分散液（以下、「サンプル２Ｄ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル２Ｄの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３７０ｎｍであった。
また、前記サンプル２Ｄ中のキセノン（Ｘｅ）ガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．８μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル２Ｄは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６８】
（実施例２−４）
前記実施例２−１において、パーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを用いていた点を、クリプトン（Ｋｒ）ガスに代えた以外は、実施例２−１と同様にして、実施例２−４のリポソーム分散液（以下、「サンプル２Ｅ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル２Ｅの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３６０ｎｍであった。
また、前記サンプル２Ｅ中のクリプトン（Ｋｒ）ガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．７μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル２Ｅは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００６９】
（実施例２−５）
前記実施例２−１において、パーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを用いていた点を、アルゴン（Ａｒ）ガスに代えた以外は、実施例２−１と同様にして、実施例２−５のリポソーム分散液（以下、「サンプル２Ｆ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル２Ｆの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３７０ｎｍであった。
また、前記サンプル２Ｅ中のアルゴン（Ａｒ）ガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．６μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル２Ｆは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７０】
（実施例２−６）
前記実施例２−１において、パーフルオロプロパン（ＰＦＰ）ガスを用いていた点を、１，１，１，２，３，４，４，５，５，５−デカフルオロペンタンに代えた以外は、実施例２−１と同様にして、実施例２−６のリポソーム分散液（以下、「サンプル２Ｇ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル２Ｇの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３６０ｎｍであった。
また、前記サンプル２Ｇ中の１，１，１，２，３，４，４，５，５，５−デカフルオロペンタンの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．４μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル２Ｇは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７１】
（比較例３−１）
前記比較例１−１において、フラーレンＣ７０を用いていた点を、フラーレンＣ６０に代えた以外は、比較例１−１と同様にして、比較例３−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル３Ａ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル３Ａの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、２２０ｎｍであった。
前記サンプル３Ａは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７２】
（実施例３−１）
前記実施例１−１において、サンプル１Ａを用いていた点を、サンプル３Ａに代えた以外は、実施例１−１と同様にして、実施例３−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル３Ｂ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル３Ｂの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、２６０ｎｍであった。
また、前記サンプル３Ｂ中のパーフルオロプロパンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．９μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル３Ｂは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７３】
（比較例４−１）
特開２００７−１７６８９９号公報の実施例１の記載に従って、水溶性水酸化フラーレン（Ｃ６０）２の水分散物を調製した。前記水分散物中の水溶性水酸化フラーレン２の含有量は２ｍｇ／ｍＬであった。
前記比較例１−１と同様にして、コートソーム  ＥＬ−０１−Ｎに、前記水溶性水酸化フラーレン２の水分散物２ｍＬを添加、振とうして弱負荷電型リポソーム散液（水溶性水酸化フラーレン２の含有量は、０．５２ｍｇ／ｍＬ）を調製し、比較例４−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル４Ａ」と称することがある。）とした。
前記サンプル４Ａの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、２２０ｎｍであった。
前記サンプル４Ａは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７４】
（実施例４−１）
前記実施例１−１において、サンプル１Ａを用いていた点を、サンプル４Ａに代えた以外は、実施例１−１と同様にして、実施例４−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル４Ｂ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル４Ｂの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、２９０ｎｍであった。
また、前記サンプル４Ｂ中のパーフルオロプロパンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２.５μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル４Ｂは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７５】
（比較例５−１）
特開２００５−２９８４８６の実施例１において、２５０ｍＭの硫酸アンモニウム含有水溶液６．０ｍＬを用いていた点を、前記サンプル１Ａ（０．０３４質量％Ｃ７０分散液）６．０ｍＬに変更した以外は、特開２００５−２９８４８６の実施例１の記載に従って、ＤＴＰ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニトリル）−ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）含有ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）修飾リポソームにＣ７０を含ませた。
前記Ｃ７０を含むＤＴＰ−ＤＯＰＥ含有ＰＥＧ修飾リポソームに、該特開２００５−２９８４８６の実施例１に従って、ｒＨＳＡ（遺伝子組換え型ヒト血清アルブミン）をリポソームと結合させて、比較例５−１のＣ７０を含むＰＥＧ・ｒＨＳＡ修飾リポソーム（以下、「サンプル５Ａ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル５Ａの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、１７０ｎｍであった。
前記サンプル５Ａは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７６】
（実施例５−１）
前記実施例１−１において、サンプル１Ａを用いていた点を、サンプル５Ａに代えた以外は、実施例１−１と同様にして、実施例５−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル５Ｂ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル５Ｂの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、２１０ｎｍであった。
また、前記サンプル５Ｂ中のパーフルオロプロパンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、２．５μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル５Ｂは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００７７】
前記実施例１−１〜５−１、及び比較例１−１〜５−１で得られたリポソームの構成を表１にまとめて示す。
【００７８】
【表１】
0005463548.tif 000002
【００７９】
（試験例１：超音波照射による癌細胞殺傷試験Ｉ）
ヒトリンパ腫細胞株Ｕ９３７を用いて、上記各サンプルに超音波を照射し、殺細胞効果について検討した。
培養液は１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０を使用し、細胞濃度を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調節した。９６ｗｅｌｌの細胞培養用プレートに１ｗｅｌｌあたり細胞浮遊液１８０μＬに、上記各サンプルをそれぞれ２０μＬ加えた。超音波発生装置ＳＰ−１００（ＳＯＮＩＤＥＬ社製）を用いて、超音波強度０．５Ｗ／ｃｍ２、Ｄｕｔｙ  ｒａｔｅ：５０％にて１０秒間超音波照射した。照射後、３７℃、ＣＯ２インキュベータ中で２時間培養し、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験法で評価した。結果を表２に示す。
【００８０】
【表２】
0005463548.tif 000003
【００８１】
表２の結果から、内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させた本発明のリポソームでは、著しい癌細胞殺傷効果が見られた。
【００８２】
（試験例２：超音波照射による癌細胞殺傷試験ＩＩ）
試験例１において、ヒトリンパ腫細胞株Ｕ９３７の代わりに、ヒト子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａ細胞を用い、培養液は、１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０の代わりに１０％ＦＢＳと１％ＮＥＡＡとを添加したＭＥＮを用いた以外は、試験例１と同様にして試験を行った。結果を表３に示す。
【００８３】
【表３】
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【００８４】
表３の結果からも、内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させた本発明のリポソームでは、著しい癌細胞殺傷効果が見られた。
【００８５】
（実施例６−１）
市販の超音波診断用造影剤ソナゾイド注射用１６μＬ（第一三共製）の調製において、添付の注射用水２ｍＬの代わりに、前記比較例１−１で調製したＣ７０の水分散物を０．２μｍのフィルターでろ過した液を２ｍＬ添加、振とうしてリポソーム分散液（Ｃ７０の含有量は０．３４ｍｇ／ｍＬ）を調製し、実施例６−１のリポソーム分散液（以下、「サンプル６Ａ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル６Ａの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３．５μｍであった。
また、前記サンプル６Ａ中のパーフルオロブタンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、７．９μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル６Ａは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００８６】
（実施例６−２）
前記実施例６−１において、Ｃ７０の水分散物の代わりに、前記比較例４−１で調製した水溶性水酸化フラーレン（Ｃ６０）２を用いた以外は、実施例６−１と同様にしてリポソーム分散液（水酸化フラーレンの含有量は０．５２ｍｇ／ｍＬ）を調製し、実施例６−２のリポソーム分散液（以下、「サンプル６Ｂ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル６Ｂの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３．４μｍであった。
また、前記サンプル６Ｂ中のパーフルオロブタンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、７．９μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル６Ｂは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００８７】
（実施例６−３）
前記実施例６−２において、水溶性水酸化フラーレン（Ｃ６０）２の含有量を１．９０ｍｇ／ｍＬとした以外は、実施例６−２と同様にしてリポソーム分散液を調製し、実施例６−３のリポソーム分散液（以下、「サンプル６Ｃ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル６Ｃの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３．２μｍであった。
また、前記サンプル６Ｃ中のパーフルオロブタンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、７．８μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル６Ｃは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００８８】
（実施例６−４）
前記実施例６−２において、水溶性水酸化フラーレン（Ｃ６０）２の含有量を０．０３ｍｇ／ｍＬとした以外は、実施例６−２と同様にしてリポソーム分散液を調製し、実施例６−４のリポソーム分散液（以下、「サンプル６Ｄ」と称することがある。）を得た。
前記サンプル６Ｄの体積平均分散粒径を、比較例１−１と同様にして測定したところ、３．８μｍであった。
また、前記サンプル６Ｄ中のパーフルオロブタンガスの濃度を、実施例１−１と同様にして分析したところ、８．０μＬ／ｍＬであった。
前記サンプル６Ｄは、ＰＢＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）中で安定であった。
【００８９】
前記実施例６−１〜６−４で得られたリポソームの構成を表４にまとめて示す。
【００９０】
【表４】
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【００９１】
（試験例３：超音波照射によるマウスのメラノーマ増殖抑制試験）
５週齢メスのヌードマウスを使用し、２×１０７ｃｅｌｌ（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ≧９８％）に調整したメラノーマ細胞（Ｃ３２細胞）を１００μＬ皮下注射した。腫瘍の直径が約５ｍｍになったところで、超音波のみ、ソナゾイド及びサンプル６Ａ〜６Ｄの６グループにランダムに分け（各グループ５匹ずつ）、治療開始とした。ジエチルエーテル吸入麻酔下に、各グループごとにサンプル１０μＬを局所注射し、超音波発生装置Ｓｏｎｉｔｒｏｎ１０００（Ｓｏｎｉｔｒｏｎ社製）を用い、周波数：１ＭＨｚ、強度：１Ｗ／ｃｍ２、Ｄｕｔｙ比：５０％の超音波を２分間照射した。また、比較のために処置を施さない腫瘍マウスも５匹用意した。
サンプル注射、超音波照射を隔日に計５回行い、さらに２週間経過後、腫瘍の大きさ（腫瘍の長径と短径を測定しその積で示す）を測定した。結果を表５に示す。
【００９２】
【表５】
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【００９３】
表４及び表５の結果から、内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させた本発明のリポソームにおいて、生理的条件下でリポソームが安定に分散され、かつ、マウスのメラノーマの増殖を抑制する効果が見られ、治療促進剤として有用であることが示された。
【００９４】
（試験例４：超音波照射によるラットの肝臓ガン造影試験）
予め癌細胞を移植したラットに、ソナゾイド及び上記サンプル６Ａ〜６Ｄをそれぞれ１０μＬ尾静脈から投与した。一定時間後、ハーモニック法（ＴＯＳＨＩＢＡ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  Ａｐｌｉｏ  ８０（東芝メディカルシステムズ社製））にて超音波検査を行ったところ、いずれのサンプルでもソナゾイドと同等の精度、コントラストで肝腫瘍が造影できた。
したがって、内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させた本発明のリポソームは、診断用造影剤として有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
内部に気体を含有し、フラーレンを内包乃至吸着させた本発明のリポソームは、中性のｐＨ領域における水系溶媒中での分散安定性が極めて良好であり、例えば、超音波を主体とした診断及び治療に用いる、診断用造影剤、治療促進剤、医薬組成物として好適に利用することができる。
また、本発明のリポソームを含有する診断用造影剤、治療促進剤、及び医薬組成物は、がんなどの病変部を高精度で検出（超音波診断）しながら、治療を同時に行うことが可能であるため、患者のＱＯＬ向上に貢献することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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