(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＦＭＲ（女性に限られた癲癇及び精神遅滞）の診断、又は、ＥＦＭＲの素因の評価、又は、ＥＦＭＲの保因者を同定するためのデータを収集する方法であって、対象者からの適切な生物学的試料において、プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質をコードする変異ＰＣＤＨ１９遺伝子を検出することを含み、
前記コードされたＰＣＤＨ１９タンパク質が、（ｉ）細胞外ドメインにおける変異、及び、（ii）ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を有する、方法。
【請求項２】
ＰＣＤＨ１９タンパク質が、配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
変異ＰＣＤＨ１９遺伝子が、以下のヌクレオチド配列変化のうち１又は２以上を含む、請求項１又は２に記載の方法：
１３２２Ｔ＞Ａ、２５３Ｃ＞Ｔ、２０１２Ｃ＞Ｇ、２０３０＿２０３１ｉｎｓＴ、１６７１Ｃ＞Ｇ、３５７ｄｅｌＣ、及び１０９１＿１０９２ｉｎｓＣ。
【請求項４】
ＥＦＭＲ（女性に限られた癲癇及び精神遅滞）の診断、又は、ＥＦＭＲの素因の評価、又は、ＥＦＭＲの保因者を同定するためのキットであって、以下のもののうち１又は２以上を含むキット：ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドと特異的に結合する抗体又はその断片；及び、ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子と、高ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ／プライマー分子。
【請求項５】
対象者におけるＥＦＭＲ（女性に限られた癲癇及び精神遅滞）を治療するための薬剤の製造における、以下のものの使用：
（ｉ）配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、前記ヌクレオチド配列がＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；或いは、
（ii）配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる、ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチド。
【請求項６】
ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
以下のステップを含む、ＥＦＭＲ（女性に限られた癲癇及び精神遅滞）を治療可能な薬剤の同定方法：
（ｉ）配列番号１に示されるプロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列の変異配列を含むポリヌクレオチド分子を有する細胞又は非ヒト動物を提供するステップ；
（ii）被検物質を前記細胞に接触させる、又は、被検物質を前記非ヒト動物に投与するステップ；及び
（iii）前記細胞又は非ヒト動物における応答を対照応答と比較するステップ。
【請求項８】
配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質若しくはポリペプチド。
【請求項９】
Ｖ４４１Ｅ、Ｑ８５Ｘ、Ｓ６７１Ｘ、Ｌ６６７ｆｓＸ７１７、Ｎ５５７Ｋ、Ｉ１１９ｆｓＸ１２２、及びＰ３６４ｆｓＸ３７５から選択されるアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する変異体である、請求項８に記載の単離されたタンパク質若しくはポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列又はその相補配列と、少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
ヌクレオチド配列が、以下の変異：１３２２Ｔ＞Ａ、２５３Ｃ＞Ｔ、２０１２Ｃ＞Ｇ、２０３０＿２０３１ｉｎｓＴ、１６７１Ｃ＞Ｇ、３５７ｄｅｌＣ、及び１０９１＿１０９２ｉｎｓＣの１又は２以上を含む、請求項１０に記載の分子。
【請求項１２】
請求項８又は９に記載のタンパク質又はポリペプチドと特異的に結合する抗体又はその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）に相当するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、並びに、ヒト対象者におけるＰＣＤＨ１９タンパク質の欠損又は機能改変に関連する疾患、特にＥＦＭＲ（女性に限られた癲癇及び精神遅滞（Epilepsy and Mental Retardation limited to Females））をもたらしうる非機能的若しくは改変ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ又は非機能的若しくは改変ＰＣＤＨ１９タンパク質をコードする変異ヌクレオチド配列に関する。
［参照による組み込み］
【０００２】
本特許出願は、以下の出願から得られる優先権を主張する：
・「治療化合物」と題された２００８年１月４日出願の米国特許出願第６１／０１０１７６号。
かかる出願の内容全体が、ここに参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
Ｘ染色体上の変異により引き起こされる遺伝性疾患は一般に、保因男性に症状が現れ、保因女性に症状が現れないことにより特徴付けられる。ＥＦＭＲ（女性に限られた癲癇及び精神遅滞）は対照的に、保因男性に症状が現れずに女性が発症する、珍しいＸ連鎖疾患である（Ryan SG et al., 1997）。ＥＦＭＲは、認知障害及び幼少期（６カ月〜３６カ月）の癲癇発作開始により特徴付けられる稀有な疾患である。かかる表現型は女性に限られる一方で、男性には症状が現れないようであり、男性の認知機能は正常で癲癇発作も男性には生じない。
【０００４】
本明細書に記載の研究より前には、ＥＦＭＲの原因は知られておらず、ＥＦＭＲの発病は以前はいかなる特定の遺伝的素因にも帰されていなかった。本明細書に記載の研究によってここに、プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）遺伝子がＥＦＭＲの原因として同定される。
【０００５】
７３７個のＸ連鎖遺伝子の体系的なリシークエンシングにより、ＥＦＭＲに罹患している互いに血縁関係のない７つの親族において、ＰＣＤＨ１９遺伝子における７つの異なる変異が同定された。これら変異のうち５つにより中途終止コドンが導入され、ナンセンス変異依存分解（non-sense mediated decay、ＮＭＤ）プロセスにより分解される非機能的ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡをもたらす。残り２つの変異はミスセンス変異であることが特定されており、カルシウム結合を損なうことで、ＰＣＤＨ１９タンパク質の接着性に影響している可能性が高い。
【０００６】
ＰＣＤＨ１９は、癲癇及び精神遅滞に関与する初めてのカドヘリンである。本明細書に記載の発現分析が、正常神経細胞発達におけるＰＣＤＨ１９の役割を示している。関連する男性特異的ヒト遺伝子であるプロトカドヘリン１１Ｙ（ＰＣＤＨ１１Ｙ）を通して、臨床的に疾患を発症することから伝達男性（すなわち保因男性）を救う、表現型レスキュー機序があると推測されている（Blanco P et al., 2000）。かかる機序は、ＥＦＭＲにおいて観察される注目すべき遺伝様式と整合的である。
【０００７】
本明細書に記載の研究により、完全ＰＣＤＨ１９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相当するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列が、非機能的ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ又は非機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質をコードする変異配列と共に同定された。これらの配列は、癲癇及び精神遅滞等の、ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損又は機能改変と関連する疾患、特にＥＦＭＲと関係することが示される。さらに、ＰＣＤＨ１９欠損遺伝子型の男性保因者は、男性特異的プロトカドヘリンＰＣＤＨ１１Ｙにより疾患表現型からレスキューされることが示された。
【０００８】
完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦの同定及び病態を引き起こすヌクレオチド配列の変異の同定により、ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の診断方法、かかる疾患の素因の同定方法、かかる疾患の保因者を同定するスクリーニング方法、並びに、ＰＣＤＨ１９欠損の治療薬又は予防薬が提供される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ryan SG, Chance PF, Zou CH, Spinner NB, Golden JA, Smietana S. Epilepsy and mental retardation limited to females: an X-linked dominant disorder with male sparing. Nature Genet 17, 92-95 (1997).
【非特許文献２】Blanco P, Sargent CA, Boucher CA, Mitchell M, Affara NA. Conservation of PCDHX in mammals; expression of human X/Y genes predominantly in brain. Mamm Genome 11, 906-14 (2000).
【発明の概要】
【００１０】
したがって、第１の態様において本発明は、機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の診断方法、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の素因の評価方法、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の保因者を同定するスクリーニング方法を提供し、これら方法は以下のステップを含む：
（ｉ）対象者からの適切な生物学的試料において、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を検出するステップ。
【００１１】
第２の態様において本発明は、機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の診断キット、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の素因の評価キット、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の保因者を同定するためのスクリーニングキットを提供し、これらキットは、以下のもののうち１又は２以上を含む：ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドと、又は、その断片若しくは変異体と、特異的に結合する抗体又はその断片；及び、ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドを、又は、その断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド分子と、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ／プライマー分子。
【００１２】
第３の態様において本発明は、対象者におけるＰＣＤＨ１９タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の治療における、以下のものの使用を提供する：配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性（sequence identity）を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドを、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体をコードするヌクレオチド配列である、ポリヌクレオチド分子。
【００１３】
第４の態様において本発明は、対象者におけるプロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の治療方法又は予防方法を提供し、これら方法は以下のステップを含む：
（ｉ）前記対象者に、以下のものを投与するステップ：配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、前記ヌクレオチド配列が、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドを、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体をコードするヌクレオチド配列である、ポリヌクレオチド分子；配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体；並びに／或いは、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失を補完する薬剤；任意で、薬学的に許容可能な担体と組み合わされる。
【００１４】
第５の態様において本発明は、対象者における機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を治療可能な薬剤を提供する。
【００１５】
第６の態様において本発明は、機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を治療可能な薬剤の同定方法を提供し、かかる方法は以下のステップを含む；
（ｉ）配列番号１に示されるＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含むポリヌクレオチド分子を有する細胞又は動物を提供するステップ；
（ii）被検物質を前記細胞に接触させる、又は、被検物質を前記動物に投与するステップ；及び
（iii）前記細胞又は動物における応答を対照応答と比較するステップ。
【００１６】
第７の態様において本発明は、第６の態様の方法における使用のためのキットを提供し、かかるキットは、配列番号１に示されるプロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含むポリヌクレオチド分子を有する１又は２以上の細胞又は動物を含む１又は２以上の容器及び／又は入れ物と共に、方法操作の指示書を含む。
【００１７】
第８の態様において本発明は、機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を治療可能な薬剤を同定するためのキットを提供し、かかるキットは以下のものを含む；
（ｉ）配列番号１に示されるＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含むポリヌクレオチド分子を有する細胞又は動物；及び、任意で、
（ii）配列番号１に示される完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の野生型を含むポリヌクレオチド分子を有する対照細胞又は動物であって、前記野生型が機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドを、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体をコードする、対照細胞又は動物。
【００１８】
第９の態様において本発明は、配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは変異体を提供する。
【００１９】
第１０の態様において本発明は、配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）ＯＲＦヌクレオチド配列又はその相補配列と、少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２０】
第１１の態様において本発明は、第１０の態様のポリヌクレオチド分子で形質転換された細胞を提供する。
【００２１】
第１２の態様において本発明は、第１０の態様のポリヌクレオチド分子を含む非ヒト動物を提供する
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１が示すのは、本明細書に記載の研究において評価された７つのＥＦＭＲ親族の家系図である。それぞれの親族においてＥＦＭＲの原因となっている、ＰＣＤＨ１９遺伝子の特定の変異が、かかる変異の位置を示す対応する配列クロマトグラムセクションと共に示される。ＥＦＭＲを発症している女性は黒丸で示されており、保因男性は四角の中に小さな丸で示されている。
【図２】図２が示すのは、ＰＣＤＨ１９タンパク質の概要図であり、シグナルペプチド、細胞外カドヘリン（extracellular cadherin、ＥＣ）、膜貫通（transmembrane、ＴＭ）領域、及び細胞質（cytoplasmic、ＣＭ）ドメインが示されている。ＥＦＭＲ親族に見出される変異の相対位置も示されている。
【図３】図３が示すのは、ヒトＰＣＤＨ１９を他種のＰＣＤＨ１９オルソログ及び他のヒトプロトカドヘリンと部分的に配列比較したものである。Ｖ４４１Ｅ（上パネル）及びＮ５５７Ｋ（下パネル）という２つのミスセンス変異の影響を受けた残基の高度保存が、長方形のボックスにより示されている。カルシウムイオン結合酸性残基もまた、両配列比較に対して括弧で示されている。
【図４】図４が示すのは、様々なヒト脳組織におけるＰＣＤＨ１９及びＰＣＤＨ１１Ｘ／Ｙのノーザンブロット（Clontech Laboratories, Inc.社、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）分析である。〜９．８ｋｂのＰＣＤＨ１９転写産物の位置がアスタリスクにより示されており、一方でより小さい〜９．５ｋｂのＰＣＤＨ１１Ｘ／Ｙ  ｍＲＮＡの位置は矢印で示されている。括弧が示すのは、ＰＣＤＨ１９プローブ又はＰＣＤＨ１９分解産物の非特異的結合である。
【図５】図５が示すのは、ＥＦＭＲ発症女性のヌクレオチド配列クロマトグラムのセクションであり、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）における２５３Ｃ＞Ｔの変異の検出（上パネル）、線維芽細胞ｃＤＮＡにおける変異配列の非存在（中パネル）、並びに、線維芽細胞をシクロヘキシミド処理した後の変異型及び野生型ｃＤＮＡ両方の存在（下パネル）を示している。変異の位置をボックスで囲んでいる。
【図６】図６が示すのは、交尾後１５．５日目（ａ〜ｆ）及び生後２日目（ｇ〜ｌ）のマウス中枢神経系（central nervous system、ＣＮＳ）におけるＰＣＤＨ１９の発現である。（ａ、ｂ）は隣接切片をそれぞれ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色したもの、並びに、インサイチューでＰＣＤＨ１９に関して処理したものである。（ｃ、ｄ、ｅ）は、ｂでボックスに囲われた領域のより高倍率の画像である。ｃにおける矢印は、皮質内でのＰＣＤＨ１９発現細胞を示す。ｅにおけるアスタリスクは、側脳室の背外側壁を示す。（ｇ、ｈ）は隣接切片をそれぞれ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色したもの、並びに、インサイチューでＰＣＤＨ１９に関して処理したものである。（ｉ）は、ＰＣＤＨ１９発現を示す（ｈの）後方脳切片である。（ｊ、ｋ、ｌ）は、（ｇ、ｈそれぞれ）でボックスに囲われた領域のより高倍率の画像である。Ｃｘ／Ｐ、皮質板（cortical plate）；Ｈｎ、海馬神経上皮（Hippocampal neuroepithelium）；ｌｖ、側脳室（lateral ventricle）；Ｔｈ、視床（thalamus）；Ｈｙ、視床下部（hypothalamus）；ｉｃｆ、大脳半球間裂（intercerebral fissure）；Ｏｂ、嗅球（olfactory bulbs）；Ｎｅ、鼻上皮（nasal epithelium）。倍率バーは（ａ、ｂ、ｆ〜ｉ）で２００μＭを表し、（ｃ〜ｅ；及びｊ〜ｌ）で５０μＭを表す。
【図７】図７が示すのは、ＥＦＭＲの遺伝の基礎をなすと予測される機序を図示化したものであり、かかる機序によりＰＣＤＨ１１Ｙは伝達男性におけるＰＣＤＨ１９変異を機能的にレスキューする。
【図８】図８が示すのは、様々な成人ヒト脳組織領域における、ＰＣＤＨ１９（上パネル）、ＰＣＤＨ１１Ｙ（中パネル）、及びＰＣＤＨ１１Ｘ（下パネル）の発現プロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は全般に、ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の診断のための方法及びキット、かかる疾患の素因を同定するための方法及びキット、かかる疾患の保因者を同定するための対象者のスクリーニング方法、並びに、ＰＣＤＨ１９欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の治療又は予防のための方法及びキットに関する。本発明はまた、完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦに相当するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列、ヒト対象者においてＰＣＤＨ１９タンパク質欠損又は機能改変と関連する疾患の原因である非機能的ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ（例えば、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解（ＮＭＤ）プロセスにより分解されうるもの）若しくは改変ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ又は非機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくは改変ＰＣＤＨ１９タンパク質をコードする変異配列、並びに、野生型又は変異型ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列を有する形質転換細胞及び非ヒトトランスジェニック動物に関する。
【００２４】
したがって、第１の態様において本発明は、機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の診断方法、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の素因の評価方法、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の保因者を同定するためのスクリーニング方法を提供し、これらの方法は以下のステップを含む：
（ｉ）対象者からの適切な生物学的試料において、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を検出するステップ。
【００２５】
ＰＣＤＨ１９欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変により生じる疾患は、癲癇及び／又は精神遅滞、特にＥＦＭＲを含む。したがって、好ましくは、第１の態様の方法は、ＥＦＭＲの診断方法、ＥＦＭＲの素因の評価方法、又はＥＦＭＲの保因者、特にＥＦＭＲの男性保因者のスクリーニング方法を提供する。特に好ましい方法には、ＥＦＭＲの出生前診断又はスクリーニングが含まれる。
【００２６】
以前にＥＦＭＲと診断されていない対象者の場合には、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の検出が、かかる検出のみで、又は、その他の検査と組み合わせて、対象者におけるＥＦＭＲ診断のために用いられうる。以前にＥＦＭＲと診断されておらず、ＥＦＭＲによる健康障害のいかなる兆候も示していない対象者には、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨタンパク質機能改変の検出が、ＥＦＭＲの素因又はＥＦＭＲの保因状態の評価に用いられうる。
【００２７】
ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の検出は、非機能的若しくは改変ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ又は非機能的若しくは改変ＰＣＤＨ１９タンパク質をコードする、或いは、ＰＣＤＨ１９タンパク質発現減少を引き起こす（例えば、ＰＣＤＨ１９遺伝子発現制御配列の変異等）、対象者のＰＣＤＨ１９ＯＲＦにおける変異配列の（例えば、対象者の遺伝子型決定による）検出を１又は２以上含みうる。簡便には、このことは、適切な生物学的試料内のＰＣＤＨ１９ヌクレオチド配列（又はその標的領域）を増幅し、しかる後に増幅産物を配列決定することにより達成されうる。好ましくは、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失の検出は、例えば、カルシウムイオン結合部位内で、又は、それに隣接する部位（例えば、カルシウムイオン結合部位から２０アミノ酸以内）で、カルシウムイオン結合を損なうようにアミノ酸置換を引き起こす変異配列、或いは、中途終止コドン（premature termination codon、ＰＴＣ）を含む変異配列等の、対象者のＰＣＤＨ１９ＯＲＦの細胞外（ＥＣ）ドメインをコードする領域における変異配列の検出を含む。
【００２８】
ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の検出はまた、例えば、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドのアッセイを実施することにより間接的に達成されてもよい。機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドを検出するアッセイは、好ましくは、対象者から採取された適切な生物学的試料中に存在するかかるタンパク質又はポリペプチドの相対量を決定するための、ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドと、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体と特異的に結合可能な抗体又はその断片の使用を含む。このことは、当業者によく知られたあらゆる方法（例えば、標準的なＥＬＩＳＡ法に基づく方法又は組織切片試料を用いたインサイチュー免疫蛍光法）の使用を含みうる。かかるものとして、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドの相対量は、検出可能標識が直接結合されているか、さもなければ、検出可能標識が直接結合されている二次抗体又はその断片を介して検出される、特異的抗体又はその断片（すなわち、一次抗体）が結合したかかるタンパク質又はポリペプチドを定量的に検出することにより決定されうる。適切な検出可能標識には、発色団、蛍光団（例えば、フルオレセイン又はＦＩＴＣ）、放射標識（例えば、１２５Ｉ）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素が含まれる。これらの標識は、（例えば、マイクロプレートリーダーによる、又は、フローサイトメーターの使用による）機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチド検出工程の自動化又は部分的自動化を提供する、当業者によく知られた方法及びシステムにおいて用いられうる。一般に、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質の相対量は、「正常試料」（例えば、正常な対象者から採取された等価な生物学的試料からの試料）に存在する量又は量の範囲との比較により決定される。
【００２９】
機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドは、以下に示す完全ＰＣＤＨ１９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示すヌクレオチド配列によりコードされるものとして特徴付けられてもよい：
atggagtcgc tcctgctgcc ggtgctgctg ctgctggcca tactgtggac gcaggctgcc     60
gccctcatta atctcaagta ctcggtagaa gaggagcagc gcgccgggac ggtgattgcc    120
aacgtggcca aagacgcgcg agaggcgggc ttcgcgctgg acccccggca ggcttcagcc    180
tttcgcgtgg tgtccaactc ggctccacac ctagtggaca tcaatcccag ctctggcctg    240
ctggtcacca agcagaagat tgaccgtgat ctgctgtgcc gccagagccc caagtgcatc    300
atctcgctcg aggtcatgtc cagctcaatg gaaatctgcg tgataaaggt ggagatcaag    360
gacctgaacg acaatgcgcc cagtttcccg gcagcacaga tcgagctgga gatctcggag    420
gcagccagcc ctggcacgcg catcccgctg gacagcgctt acgatccaga ctcaggaagc    480
tttggcgtgc agacttacga gctcacgccc aacgagctgt tcggcctgga gatcaagacg    540
cgcggcgacg gctcccgctt tgccgaactc gtggtggaaa agagcctgga ccgcgagacg    600
cagtcgcact acagcttccg aatcactgcg ctagacggtg gcgacccgcc gcgcctgggc    660
accgttggcc ttagtatcaa ggtgaccgac tccaatgaca acaacccggt gtttagcgag    720
tccacctacg cggtgagcgt gccagaaaac tcgcctccca acacacccgt catccgcctc    780
aacgccagcg atccagacga gggcaccaac ggccaggtgg tctactcctt ctatggctac    840
gtcaacgacc gcacgcgcga gctctttcag atcgacccgc acagtggcct ggtcactgtc    900
actggcgctt tagactacga agaggggcac gtgtacgaac tggacgtgca ggctaaggac    960
ttggggccca attccatccc ggcacactgc aaggtcaccg tcagcgtgct ggacaccaat   1020
gacaatccgc cggtcatcaa cctgctgtca gtcaacagtg agcttgtgga ggtcagcgag   1080
agcgcccccc cgggctacgt gatcgccttg gtgcgggtgt ctgatcgcga ctcaggcctc   1140
aatggacgtg tgcagtgccg tttgctgggc aatgtgccct ttcgactgca ggaatatgag   1200
agcttctcca ctattctggt ggacggacgg ctggaccgcg agcagcacga ccaatacaac   1260
ctcacaattc aggcacgcga cggcggcgtg cccatgctgc agagtgccaa gtcctttacc   1320
gtgctcatca ctgacgaaaa tgacaaccac ccgcactttt ccaagcccta ctaccaggtc   1380
attgtgcagg agaacaacac gcctggcgcc tatctgctct ctgtgtctgc tcgcgacccc   1440
gacctgggtc tcaacggcag tgtctcctac cagatcgtgc cgtcgcaggt gcgggacatg   1500
cctgtcttca cctatgtctc catcaatccc aactcaggcg acatctacgc gctgcgatcc   1560
tttaaccacg agcagaccaa ggcgttcgaa ttcaaggtgc tggccaagga cggcggcctt   1620
ccctcactgc aaagcaacgc tacggtgcgg gtcatcatcc tcgacgtcaa cgacaacacc   1680
ccggtcatca cagccccacc tctgattaac ggcactgccg aggtctacat accccgcaac   1740
tctggcatag gctacctggt gactgttgtc aaggcagaag actacgatga gggcgaaaat   1800
ggccgagtca cctacgacat gaccgagggc gaccgcggct tctttgaaat agaccaggtc   1860
aatggcgaag tcagaaccac ccgcaccttc ggggagagct ccaagtcctc ctatgagctt   1920
atcgtggtgg ctcacgacca cggcaagaca tctctctctg cctctgctct cgtcctaatc   1980
tacttgtccc ctgctctcga tgcccaagag tcaatgggct ctgtgaactt gtccttgatt   2040
ttcattattg ccctgggctc cattgcgggc atcctctttg taactatgat cttcgtggca   2100
atcaagtgca agcgagacaa caaagagatc cggacctaca actgcagtaa ttgtttaacc   2160
atcacttgtc tcctcggctg ttttataaaa ggacaaaaca gcaagtgtct gcattgcatc   2220
tcggtttctc ccattagcga ggagcaagac aaaaagacag aggagaaagt gagcctaagg   2280
ggaaagagaa ttgctgagta ctcctatggg catcaaaaga aatcaagcaa gaagaaaaaa   2340
atcagtaaga atgacatccg cctggtaccc cgggatgtgg aggagacaga caagatgaac   2400
gttgtcagtt gctcttccct gacctcctcc ctcaactatt ttgactacca ccagcagacg   2460
ctgcccctgg gctgccgccg ctctgagagc actttcctga atgtggagaa ccagaatacc   2520
cgcaacacca gtgctaacca catctaccat cactctttca acagccaggg gccccagcag   2580
cctgacctga ttatcaacgg tgtgcctctg cctgagactg aaaactattc ttttgactcc   2640
aactacgtga atagccgagc ccatttaatc aagagcagct ccaccttcaa ggacttagag   2700
ggcaacagcc tgaaggatag tggacatgag gagagtgacc aaactgacag tgagcatgat   2760
gtccagcgga gcctgtattg tgatactgct gtcaacgatg tgctgaacac cagtgtgacc   2820
tccatgggat ctcagatgcc tgatcatgat cagaatgaag gatttcattg ccgggaagaa   2880
tgccggattc ttggccactc tgacaggtgc tggatgcccc ggaaccccat gcccatccgt   2940
tccaagtccc ctgagcatgt gaggaacatc atcgcgctgt ctattgaagc tactgctgct   3000
gatgtcgagg cttatgacga ctgcggcccc accaaacgga ctttcgcaac ctttgggaaa   3060
gatgtcagcg accacccggc tgaggagagg cctaccctga aaggcaagag gactgtcgat   3120
gtgaccatct gcagccccaa ggtcaacagc gttatccggg aggcaggcaa tggctgtgag   3180
gcgattagcc ctgtcacctc ccccctccac ctcaagagct ctctgcccac caagccttcc   3240
gtgtcttaca ccattgccct ggctccccca gcccgtgatc tggagcagta tgtcaacaat   3300
gtcaacaatg gccctactcg tccctctgaa gctgagcccc gtggagctga tagcgagaaa   3360
gtcatgcatg aggtcagccc cattctgaag gaaggtcgca acaaagagtc ccctggtgtg   3420
aagcgtctga aggatatcgt tctctaa                                       3447
（配列番号１）。
【００３０】
より好ましくは、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含むことにより特徴付けられる：
MESLLLPVLLLLAILWTQAAALINLKYSVEEEQRAGTVIANVAKDAREAGFALDPRQASA         60
FRVVSNSAPHLVDINPSSGLLVTKQKIDRDLLCRQSPKCIISLEVMSSSMEICVIKVEIK        120
DLNDNAPSFPAAQIELEISEAASPGTRIPLDSAYDPDSGSFGVQTYELTPNELFGLEIKT        180
RGDGSRFAELVVEKSLDRETQSHYSFRITALDGGDPPRLGTVGLSIKVTDSNDNNPVFSE        240
STYAVSVPENSPPNTPVIRLNASDPDEGTNGQVVYSFYGYVNDRTRELFQIDPHSGLVTV        300
TGALDYEEGHVYELDVQAKDLGPNSIPAHCKVTVSVLDTNDNPPVINLLSVNSELVEVSE        360
SAPPGYVIALVRVSDRDSGLNGRVQCRLLGNVPFRLQEYESFSTILVDGRLDREQHDQYN        420
LTIQARDGGVPMLQSAKSFTVLITDENDNHPHFSKPYYQVIVQENNTPGAYLLSVSARDP        480
DLGLNGSVSYQIVPSQVRDMPVFTYVSINPNSGDIYALRSFNHEQTKAFEFKVLAKDGGL        540
PSLQSNATVRVIILDVNDNTPVITAPPLINGTAEVYIPRNSGIGYLVTVVKAEDYDEGEN        600
GRVTYDMTEGDRGFFEIDQVNGEVRTTRTFGESSKSSYELIVVAHDHGKTSLSASALVLI           660
YLSPALDAQESMGSVNLSLIFIIALGSIAGILFVTMIFVAIKCKRDNKEIRTYNCSNCLT        720
ITCLLGCFIKGQNSKCLHCISVSPISEEQDKKTEEKVSLRGKRIAEYSYGHQKKSSKKKK        780
ISKNDIRLVPRDVEETDKMNVVSCSSLTSSLNYFDYHQQTLPLGCRRSESTFLNVENQNT        840
RNTSANHIYHHSFNSQGPQQPDLIINGVPLPETENYSFDSNYVNSRAHLIKSSSTFKDLE        900
GNSLKDSGHEESDQTDSEHDVQRSLYCDTAVNDVLNTSVTSMGSQMPDHDQNEGFHCREE        960
CRILGHSDRCWMPRNPMPIRSKSPEHVRNIIALSIEATAADVEAYDDCGPTKRTFATFGK       1020
DVSDHPAEERPTLKGKRTVDVTICSPKVNSVIREAGNGCEAISPVTSPLHLKSSLPTKPS       1080
VSYTIALAPPARDLEQYVNNVNNGPTRPSEAEPRGADSEKVMHEVSPILKEGRNKESPGV       1140
KRLKDIVL                                                           1148
（配列番号２）。
【００３１】
他方で、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失を検出するアッセイは、例えば、野生型ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドとその非機能的変異体とを識別可能な抗体又はその断片の使用を含んでいてもよい。このことにより、対象者から採取された生物学的試料中に存在するＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドが特定の形であると同定されてもされなくてもよい。
【００３２】
さもなければ、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失を検出するアッセイは、対象者から採取された適切な生物学的試料中の、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）の相対量を決定することを含んでいてもよい。タンパク質又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの相対量は、ノーザンブロット法（参照試料との比較による）、及び、ＰＣＲ法に基づくｍＲＮＡ定量法（例えば、検出可能標識に結合されたプライマーを用いたＲＴ‐ＰＣＲ法の使用）を含む、当業者によく知られたどの方法により決定されてもよい。一般に、タンパク質又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡの相対量は、「正常試料」（例えば、正常対象者から採取された等価な生物学的試料からの試料）に存在する量又は量の範囲との比較により決定される。
【００３３】
より好ましくは、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失の検出は、配列番号２に示されるＰＣＤＨ１９アミノ酸配列の非機能的変異体をコードする変異配列を検出することを含む。前記変異配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に関して、以下のどの１又は２以上のヌクレオチド変化を含んでいてもよい：１３２２Ｔ＞Ａ、２５３Ｃ＞Ｔ、２０１２Ｃ＞Ｇ、２０３０＿２０３１ｉｎｓＴ、１６７１Ｃ＞Ｇ、３５７ｄｅｌＣ、及び１０９１＿１０９２ｉｎｓＣ。かかるヌクレオチド変化の検出方法は、高ストリンジェンシー条件下での、適切なオリゴヌクレオチドプローブ／プライマー分子の、適切な生物学的試料中に存在する変異配列とのあらゆるハイブリダイゼーションを検出するステップを含んでいてよい。高ストリンジェントな条件は、当技術分野においてよく知られており、典型的には高温（すなわち、高アニーリング温度）及び低イオン強度（すなわち、低塩濃度、特にＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、及びＮａＣｌの低濃度）により特徴付けられる。したがって、高ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーションの状況（すなわち、プローブハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅等）に応じて変化してもよい。本発明の目的のためには、「高ストリンジェントな条件」なる用語は、プローブハイブリダイゼーションに適用可能な条件を指すものとして理解されるべきである（例えば、以下の条件を０．２×  ＳＳＣ（３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸ナトリウム）及び０．１％ＳＤＳ中で使用：（１）洗浄のために低イオン強度及び高温、例えば、１５ｍＭ  ＮａＣｌ／１．５ｍＭクエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ４を５０℃で使用；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミドを、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、７５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むｐＨ６．５の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に、４２℃で使用；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストランを４２℃で使用）。本発明の変異配列の検出に有用なオリゴヌクレオチド分子は、例えば、プローブ又はプライマー配列としての使用に適していてもよい。典型的には、かかるオリゴヌクレオチド分子は、１０個〜５０個のヌクレオチドからなり、より好ましくは、約１５個〜３０個のヌクレオチドからなる。好ましくは、かかるヌクレオチド分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列若しくはその相補配列、又は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に１又は２以上の上述のヌクレオチド変化（すなわち、１３２２Ｔ＞Ａ、２５３Ｃ＞Ｔ、２０１２Ｃ＞Ｇ、２０３０＿２０３１ｉｎｓＴ、１６７１Ｃ＞Ｇ、３５７ｄｅｌＣ、及び１０９１＿１０９２ｉｎｓＣ）を組み込んだもの若しくはその相補配列に由来する。
【００３４】
ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の検出ステップに関して、対象者から採取される適切な生物学的試料は、例えば、上皮試料、塗沫試料、血液試料、糞便試料、尿試料、又は口腔試料を含む、組織生検及び組織固定切片（例えば、ホルマリン固定又はパラフィン包埋）又はそこから調製される固定細胞試料から選択されてもよい。かかる試料は、例えば、細胞、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド分子、オリゴヌクレオチド分子、又はその断片、又はこれらの要素を含む分画を、部分的に又は完全に精製又は単離するための、濾過方法、分離方法、又は抽出方法等により前処理されてもよい。
【００３５】
第２の態様において本発明は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の診断キット、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の素因の評価キット、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の保因者を同定するためのスクリーニングキットを提供し、これらキットは以下のものを１又は２以上含む：ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドと、又は、その断片若しくは変異体と、特異的に結合する抗体又はその断片；及び、ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリヌクレオチドを、又は、その断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド分子と、高ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ／プライマー分子。
【００３６】
かかるキットは、例えば、前記抗体若しくはその断片及び／又は前記オリゴヌクレオチドプローブ／プライマー分子を含む１又は２以上の容器又は入れ物と共に、方法操作の指示書及び、任意で、その後に、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患を診断するための、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク機能改変と関連する疾患の素因を評価するための、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変と関連する疾患の保因者を同定するための指示書を含んでいてもよい。
【００３７】
好ましくは、前記抗体又はその断片は、配列番号２に記載のＰＣＤＨ１９アミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドと結合する。さらに、好ましくは、前記オリゴヌクレオチドプローブ／プライマー分子は、配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子とハイブリダイズする。
【００３８】
第３の態様において本発明は、対象者におけるＰＣＤＨ１９タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の治療における、以下のものの使用を提供する：配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、前記ヌクレオチド配列が、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドを、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であるポリヌクレオチド分子；或いは、配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体。
【００３９】
好ましくは、前記ヌクレオチド配列は、配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性を示し、さらに好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を示す。
【００４０】
より好ましくは、前記機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
明瞭性を期して述べるなら、本明細書で言及されるヌクレオチド配列同一性及びアミノ酸配列同一性のパーセントレベルは、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列を用いたＥＭＢＬ‐ＥＢＩ高速フーリエ変換を用いた多重アラインメント（Multiple Alignment Using Fast Fourier Transform、ＭＡＦＦＴ）ツール（http://www.ebi.ac.uk/mafft/）及び標準デフォルト設定により計算される「一致パーセント（match percentage）」を意味するものとして理解されるべきである。
【００４２】
本明細書で用いられる「機能的断片」なる用語は、配列番号２に示される完全ＰＣＤＨ１９アミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドと実質的に等価な生物学的活性を示す断片を指すものとしてとして理解されるべきである。
【００４３】
アミノ酸配列に関して本明細書で用いられる「変異体」なる用語は、配列番号２に示される対応する完全アミノ酸配列（又は場合によってその一部）と高レベルの配列同一性を示すアミノ酸配列を含むが、かかる完全アミノ酸配列に由来するタンパク質又はポリペプチド（すなわち、配列番号２に示される完全ＰＣＤＨ１９アミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチド）の生物学的活性にいかなる有意な改変ももたらさない、さもなければ、生物学的活性の増加又は減少をもたらす（例えば、変異体は、生物学的活性を増加又は減少させる、１又は２以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失、或いは、アミノ酸配列の付加又は欠失を含んでいてもよい）、かかる完全アミノ酸配列における１又は２以上の変異を含む、タンパク質若しくはポリペプチド又はその断片を指すものとして理解されるべきである。したがって、増加又は減少した生物学的活性を有する変異体は「機能的変異体」とみなされうる一方で、生物学的活性を有しない又は最小限の生物学的活性のみを有する変異体は、「非機能的変異体」とみなされうる。生物学的活性のいかなる有意な改変ももたらさない変異は、保存アミノ酸置換を含んでいてもよい。代表的な保存アミノ酸置換を、以下の表１に記載する。想定されている特定の保存アミノ酸は以下の通りである：Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ；Ｄ、Ｅ；Ｎ、Ｑ；Ｓ、Ｔ；Ｋ、Ｒ、Ｈ；Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｈ；及び、Ｐ、Ｎα‐アルキルアミノ酸。
【００４４】
【表１】
0005624892.tif 000002
【００４５】
第４の態様において本発明は、対象者におけるプロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の治療又は予防方法を提供し、前記方法は以下のステップを含む：
（ｉ）以下のものを、任意で薬学的に許容可能な担体と組み合わせて、前記対象者に投与するステップ：配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子であって、前記ヌクレオチド配列が、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドを、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体をコードするヌクレオチド配列であるポリヌクレオチド分子；配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体；並びに／又は、ＰＣＤＨ１９タンパク質機能欠失を補完する薬剤。
【００４６】
好ましくは、かかる方法は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体を投与することを含む。
【００４７】
或いは、又はさらに、かかる方法は対象者におけるＰＣＤＨ１９機能欠失を補完する薬剤を投与することを含む。好ましくは、かかる薬剤は、他のプロトカドヘリン／カドヘリンタンパク質、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体等の、ＰＣＤＨ１９機能を補完するタンパク質又はポリペプチドである。好ましい補完薬剤の１例として、ＰＣＤＨ１１Ｙが挙げられる。
【００４８】
第４の態様の方法が、細胞全体又は組換え送達媒体（例えば、ウイルスベクター）の投与を含んでいてもよいと想定されている。適切なポリヌクレオチド分子送達ベクターには、本発明のポリヌクレオチド分子の染色体への組込みに適したもの（例えば、レトロウイルスベクター）、又は、単純にポリヌクレオチド分子の非組込み発現に適したもの（例えば、プラスミドベクター）が含まれる。代わりに、ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体をコードするポリヌクレオチド分子の投与には、「裸ＤＮＡ」の細胞への送達のための、当業者によく知られたあらゆる方法及び／又は薬剤が含まれてよい（例えば、リポソーム、リポプレックス、ポリプレックス、金微粒子、及びマンノースへの結合等）。
【００４９】
第５の態様において本発明は、対象者における機能的プロトカドヘリン（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を治療可能な薬剤を提供する。
【００５０】
第５の態様に照らして好ましい薬剤には、以下のものが含まれる：配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子；或いは、配列番号１に記載の完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも８５％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子によりコードされる機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体。最も好ましくは、かかる薬剤は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子；或いは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチドである。
【００５１】
さらに好ましい薬剤には、単離された又は組換え発現したＰＣＤＨ１１Ｙタンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体が含まれる。ＰＣＤＨ１９又はＰＣＤＨ１１Ｙのホモログ、アナログ、オルソログ、又は模倣体もまた適切でありえ、実際のところこれらは、例えば、インビボでの安定性、安全性、及び毒性、並びに、薬学的許容可能性等の、治療剤としての使用のためのさらなる望ましい特徴を有しうる。ＰＣＤＨ１９又はＰＣＤＨ１１Ｙの好ましいホモログ、アナログ、オルソログ、又は模倣体の、望ましい特徴に照らした選択は、当業者によく知られた方法により容易に決定されうる。
【００５２】
第５の態様に照らして特に好ましい薬剤は、ＥＦＭＲ治療、又は、ＥＦＭＲの素因を有する対象者に対する予防処置を提供可能な薬剤である。
【００５３】
第５の態様の薬剤は、薬学的に許容可能な担体と共に投与されること、並びに／或いは、あらゆる適切な薬学的／獣医学的組成物又は投与形態（例えば、経口投与、口腔内投与、鼻腔内投与、筋内投与、及び静脈内投与のための組成物）へと製剤されることも可能である。典型的には、かかる組成物又は投与形態は、ＥＦＭＲ治療に有効な量、又は、ＥＦＭＲの素因を有する対象者への予防の提供に有効な量で対象者へと投与され、したがって、１日当たり薬剤約０．０１μｇ／ｋｇ体重〜約１００μｇ／ｋｇ体重で、より好ましくは、１日当たり薬剤約０．０５μｇ／ｋｇ体重〜約２５μｇ／ｋｇ体重で与えられてもよい。適切な組成物は、最も有効な結果を達成する必要に応じて、１日１回投与、１日複数回投与、又は制御放出若しくは持続放出が意図されていてもよい。
【００５４】
第６の態様において本発明は、機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を治療可能な薬剤の同定方法を提供し、前記方法は以下のステップを含む；
（ｉ）配列番号１に示されるＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含むポリヌクレオチド分子を有する細胞又は動物を提供するステップ；
（ii）被検物質を前記細胞に接触させる、又は、被検物質を前記動物に投与するステップ；及び
（iii）前記細胞又は動物における応答を対照応答と比較するステップ。
【００５５】
第６の態様の方法は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変により引き起こされる疾患の治療を提供可能な薬剤、又は、機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損若しくはＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変の予防処置を提供可能な薬剤を同定してもよい。
【００５６】
かかる方法のステップ（iii）に言及されている対照応答は、被検物質に曝露されない前記細胞又は動物において検出されるベースライン応答を含んでいてもよく、代わりに、かかる対照応答は、正常又は野生型完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列を有する細胞又は動物における、被検物質への曝露後の応答であってもよい。
【００５７】
被検物質は、例えば、民間の物質ライブラリー、又は、公的にアクセス可能な物質ライブラリー（例えば、クイーンズランド化合物ライブラリー（the Queensland Compound Library）（Griffith University、豪州クイーンズランド州ネイサン）や分子ライブラリー低分子レポジトリ（the Molecular Libraries Small Molecule Repository）（NIH Molecular Libraries、米国メリーランド州ベセスダ）から供給されうる、既知及び新規の化合物、合成物、及び他の物質から選択されてもよい。したがって被検物質は、タンパク質、ポリペプチド、若しくはペプチド（例えば、組換え発現ＰＣＤＨ１９若しくはＰＣＤＨ１１Ｙタンパク質又はポリペプチド、或いは、その機能的断片又は機能的変異体）、又は、その模倣体（いわゆるペプトイド及びレトロインベルソペプチド（retro-inverso peptides）を含む）を含んでいてもよいが、より好ましくは有機低分子、特に、「薬らしさ」に関するLipinskiのルールオブファイブ（Lipinski's Rule of Five）に従う、又は、それに実質的に従う小有機分子を含む（Lipinski, CA et al., 2001）。被検物質はまた、既知又は新規の化合物の構造分析に基づいて選択されてもよく、さもなければ、ＰＣＤＨ１９又はＰＣＤＨ１１Ｙ結合部位、特にカルシウムイオン結合部位のさらなる構造分析に従って設計されてもよい。
【００５８】
第６の態様の方法を、多数の被検物質のハイスループットスクリーニングに適するものとしてもよい。
【００５９】
前記細胞又は動物における応答を対照応答と比較するステップは、１又は２以上の標準的結合アッセイフォーマット（例えば、ＥＬＩＳＡ法に基づくアッセイ又は競合法に基づくアッセイ）を用いて実施されてもよい。好ましくは、被検物質は、例えばカルシウムチャンネル受容体等への結合の検出を可能とするため、容易に検出可能な標識（例えば、蛍光色素又は放射性同位体）により標識される。活性の変化はかかるアッセイにおいて、好ましくは（例えば、マイクロプレートリーダーによる、又は、フローサイトメーターの使用による）検出工程の自動化又は部分的自動化を提供する、分光光度測定的、蛍光測定的、熱量測定的、又は化学発光的な手段を含む標準的方法を用いることにより観察されてもよい。
【００６０】
動物における応答を対照動物（すなわち、正常又は野生型完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列を有する動物）と比較するステップには好ましくは、前記動物における病態の同定、特に、疾患の神経学的指標の分析が含まれる。
【００６１】
第７の態様において本発明は、第６の態様の方法における使用のためのキットを提供し、前記キットは、配列番号１に示されるプロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含むポリヌクレオチド分子を有する１又は２以上の細胞又は動物を含む１又は２以上の容器及び／又は入れ物と共に、方法操作の指示書を含む。
【００６２】
第８の態様において本発明は、機能的プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を治療可能な薬剤を同定するためのキットを提供し、前記キットは以下のものを含む；
（ｉ）配列番号１に示されるＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含むポリヌクレオチド分子を有する細胞又は動物；及び、任意で、
（ii）配列番号１に示される完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の野生型を含むポリヌクレオチド分子を有する対照細胞又は動物であって、前記野生型が機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質若しくはポリペプチドを、又は、その機能的断片若しくは機能的変異体をコードする、対照細胞又は動物。
【００６３】
第７又は第８の態様のキットはさらに、前記変異細胞又は動物における応答を対照応答と（例えば、被検物質により引き起こされるものとして）比較するための手段、応答（例えば、ＰＣＤＨ１９の接着性又は変異細胞又は動物においてカルシウムイオン結合が損なわれていること）を検出するための手段、及び、例えば、被検物質、及び、例えば洗浄緩衝液、安定化緩衝液、又は他の試薬等を含む、当業者によく知られた他の構成要素を含んでいてもよい。
【００６４】
第９の態様において本発明は、配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは変異体を提供する。
【００６５】
本明細書において用いられる「単離された」なる用語は、タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは変異体との関連で用いされた際や、ポリヌクレオチド分子との関連で用いされた際には    、細胞全体、その成分、並びに／或いは、外来タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、及び核酸分子等の他の外来性の細胞物質又は生体物質を基本的に含まない形の、タンパク質、ポリペプチド、機能的断片、変異体、又はポリペプチド分子を指すものとして理解されるべきである。かかるものとして、本発明の単離されたタンパク質、ポリペプチド、機能的断片、変異体、又はポリヌクレオチド分子は、（重量で）１０％を決して超えない外来性の細胞物質又は生体物質を含む調製物で存在していてもよく、当業者によく知られたいかなる方法により調製されてもよい。
【００６６】
好ましくは、タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に示される完全ＰＣＤＨ１９アミノ酸配列と少なくとも７５％の配列同一性を示し、細胞外カドヘリン（ＥＣ）ドメインに相当するアミノ酸配列と少なくとも６５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【００６７】
より好ましくは、タンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは変異体は、配列番号２に示される完全ＰＣＤＨ１９アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【００６８】
第９の態様の好ましい実施形態において、本発明は、１又は２以上のアミノ酸変異を含む、配列番号２に示されるアミノ酸配列の変異体、好ましくは非機能的変異体を提供する。特に好ましくは、かかる変異体内に含まれる変異には、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する以下の変化から選択される１又は２以上のアミノ酸変異が含まれる；Ｖ４４１Ｅ、Ｑ８５Ｘ、Ｓ６７１Ｘ、Ｌ６６７ｆｓＸ７１７、Ｎ５５７Ｋ、Ｉ１１９ｆｓＸ１２２、及びＰ３６４ｆｓＸ３７５。
【００６９】
単離されたタンパク質又はポリペプチド、その機能的断片又は変異体は、生物全体に由来する組織（例えば、生検組織）、培養組織（例えば、培養線維芽細胞）、又は他の組換え発現系から単離されてもよい。これには、イオン交換、クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動、吸着クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、透析、限外濾過、ゲル電気泳動、ゲル濾過、及び超遠心分離を含む、タンパク質又はポリペプチドを単離するための、当業者によく知られたいかなる方法が関与していてもよい。
【００７０】
本発明の組換えタンパク質又はポリペプチド、その機能的断片又は変異体を発現させるための適切な技術は、当業者によく知られており、例えば、適切な宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞及びＢＬ２１細胞）を用いて適切な発現ベクター又はカセットから組換えＨｉｓタグ付加ＰＣＤＨ１９を発現させるための技術を含む。しかるのち、Ｈｉｓタグ付加発現産物は、アフィニティークロマトグラフィーを用いて（例えば、Ｎｉ‐ＮＴＡカラム（Qiagen Inc製、米国カリフォルニア州バレンシア）を用いて）容易に単離されうる。機能的断片が提供されるべき場合には、単離された組換えタンパク質又はポリペプチドは、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン）を用いて切断されてもよい。
【００７１】
本発明のタンパク質、ポリペプチド、変異体、又は、特に機能的断片は、任意で融合タンパク質等の合成タンパク質又はポリペプチドへと組み込まれてもよい。融合タンパク質は、製造又はダウンストリームプロセシングを助ける成分を含んでいてもよい（例えば、タンパク質、ポリペプチド、その機能的断片又は変異体は、分泌シグナルペプチド又はアフィニティー精製タグ等と結合されていてもよい）。
【００７２】
第１０の態様において本発明は、配列番号１に記載の完全プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）ＯＲＦヌクレオチド配列又はその相補配列と、少なくとも７０％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００７３】
好ましくは、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１に示される完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列と少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは９５％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む。最も好ましくは、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００７４】
本発明のポリヌクレオチド分子は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を、又は、その機能的断片若しくは変異体を含むタンパク質又はポリペプチドをコードしてもよい。さもなければ代わりに、本発明のポリヌクレオチド分子は、非機能的ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ（例えば、ＮＭＤプロセスによりにより分解される、中途終止コドンを含むｍＲＮＡ）又は改変ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡをコードしてもよい。本発明のポリヌクレオチド分子の他の例として挙げられるのは、配列番号１に示される完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の１０個〜５０個の連続するヌクレオチド、より好ましくは、約１５個〜３０個の連続するヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドプローブ／プライマー分子である。
【００７５】
ポリヌクレオチド分子が、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは８５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を示すヌクレオチド配列を含む場合には、かかるポリヌクレオチド分子は、例えば、ＤＮＡコードにおける縮重ゆえに、コードされるタンパク質又はポリペプチドにおいて有意な改変をもたらさない些細な変化においてのみ、或いは、特定の系における発現を高めるために（すなわち、好ましいコドン使用頻度に従うために）必要である些細な変化においてのみ、そのヌクレオチド配列と異なりうるということが好まれる。さらに、さもなければ、かかるポリヌクレオチド分子は、生物学的活性の増加又は減少を示す、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質又はポリペプチドの変異体（例えば、細胞外カドヘリン（ＥＣ）ドメインに１又は２以上のアミノ酸変異を含み、カルシウムイオン結合が損なわれることにより接着性の減少を示す変異体）をコードすることが好まれる。実際に、第１０の態様の実施形態において本発明は、細胞外カドヘリン（ＥＣ）ドメインに１又は２以上のアミノ酸置換、付加、又は欠失を含み、カルシウム結合が損なわれることにより接着性の減少を示す変異体、好ましくは非機能的変異体をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。かかるポリヌクレオチド分子によりコードされる特に好ましい変異には、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する１又は２以上の以下の変化が含まれる；Ｖ４４１Ｅ、Ｑ８５Ｘ、Ｓ６７１Ｘ、Ｌ６６７ｆｓＸ７１７、Ｎ５５７Ｋ、Ｉ１１９ｆｓＸ１２２、及びＰ３６４ｆｓＸ３７５。配列番号１に示される完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列に関して、かかるアミノ酸配列変化の原因となる変異は、それぞれ以下の通りでありうる；１３２２Ｔ＞Ａ、２５３Ｃ＞Ｔ、２０１２Ｃ＞Ｇ、２０３０＿２０３１ｉｎｓＴ、１６７１Ｃ＞Ｇ、３５７ｄｅｌＣ、及び１０９１＿１０９２ｉｎｓＣ。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチド分子は、適切な発現カセット又はベクターへとかかるポリヌクレオチド分子をクローニングし、しかるのちにかかる発現カセット又はベクターを適切な宿主細胞へと導入することを伴う組換え方法によって、コードされるタンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは変異体を発現させるために用いられてもよい。適切な発現ベクターは、マルチクローニングサイト、検出タグ（例えば、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ（glutathione-S-transferase、ＧＳＴ）又は緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein、ＧＦＰ））、ダウンストリーム精製のためのタグ（例えば、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ））、リンカー、及び融合配列等の機能的配列を含んでいてもよい。
【００７７】
第１１の態様において本発明は、第１０の態様のポリヌクレオチド分子で形質転換された細胞を提供する。
【００７８】
ポリヌクレオチド分子は、配列番号１に示されるＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含み、そのことにより、非機能的若しくは改変ＰＣＤＨ１９ｍＲＮＡ、非機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質、又は改変機能を有するＰＣＤＨ１９タンパク質をコードするか、さもなければ、ＰＣＤＨ１９タンパク質発現の減少を引き起こすポリヌクレオチド分子であってもよく、或いは、かかる変異配列の相補配列を含むポリヌクレオチド分子であってもよい。
【００７９】
ポリヌクレオチド分子はまた、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、又はＰＣＤＨ１９を標的とする干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）からなるか、又は、それらをコードしていてもよい。
【００８０】
形質転換細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞から選択されてもよい。かかる細胞は、直接取込み、形質導入、ｆ‐接合（f-mating）、又はエレクトロポレーションを含む、当業者によく知られたいかなる方法を用いて形質転換されてもよい。形質転換ポリヌクレオチド分子は、非組込みの形（例えば、非組込みプラスミド発現ベクター）で維持されてもよく、又は代わりに、形質転換細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００８１】
形質転換細胞は、当業者にとって容易に明らかな様々な形で応用されうるのであり、特に、本発明の単離された組換えタンパク質若しくはポリペプチド、又は、その機能的断片若しくは変異体の作製に用いられうる。
【００８２】
形質転換細胞が、ＰＣＤＨ１９タンパク質又はポリペプチド、その機能的断片又は変異体の製造及び収集が意図されるものである場合、組換え産物の発現は、例えば、タンパク質若しくはポリペプチド、その機能的断片若しくは変異体の直接検出のための、又は、発現タグ（例えば、Ｈｉｓタグ）の検出のための、ウェスタン免疫ブロットアッセイにより決定されうる。
【００８３】
第１２の態様において本発明は、第１０の態様のポリヌクレオチド分子を有する非ヒト動物を提供する。
【００８４】
ポリヌクレオチド分子は、配列番号１に示されるＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド配列の変異配列を含み、そのことにより、非機能的若しくは改変ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ、非機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質、又は改変機能を有するＰＣＤＨ１９タンパク質をコードするか、さもなければ、ＰＣＤＨ１９タンパク質発現の減少を引き起こすポリヌクレオチド分子であってもよく、或いは、かかる変異配列の相補配列を含むポリヌクレオチド分子であってもよい。
【００８５】
ポリヌクレオチド分子はまた、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡザイム、又はＰＣＤＨ１９を標的とする干渉ＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）からなるか、又は、それらをコードしていてもよい。
【００８６】
ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、動物組織を通じて均一に組み込まれる。キメラ動物が提供される場合には、ポリヌクレオチド分子は、好ましくは、動物の神経組織細胞に存在する。
【００８７】
ポリヌクレオチド分子は、当業者によく知られたいかなる形質転換又は遺伝子組換えの方法によって動物へと導入されてもよい。かかる形質転換方法には、ＤＮＡトランスフェクション（エレクトロポレーション、リポソーム融合若しくはプロトプラスト融合、又はマイクロインジェクションを介する）、ウイルス送達ベクター（すなわち、アデノウイルスベクター及びレトロウイルスベクター等の、ゲノムへの組込みを容易にするベクター）に感染させること、又はランダム変異導入法とそれに続くスクリーニングによる所望の変異の選択を介することが含まれる。しかしながら、本発明の動物は一般に、好ましくは、マイクロインジェクション法により作製される。結果としてもたらされるトランスジェニック動物の遺伝的均一性を保証するため、マイクロインジェクションは、好ましくは、１細胞期胚に当業者によく知られたあらゆる方法により実施される。好ましいトランスジェニック動物には、齧歯目動物、特にマウス及びラットが含まれる。
【００８８】
第１１の態様の動物は、当業者にとって容易に明らかな様々な形で応用されうるのであり、特に、ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損又はＰＣＤＨ１９タンパク質機能改変を補完する潜在的薬剤のスクリーニングのための方法又はキットにおける使用のための、インビトロ又はインビボ疾患モデルとしての使用に用いられうる。
【００８９】
さらなる態様において本発明は、第９の態様のタンパク質又はポリペプチド、その機能的断片又は変異体と特異的に結合する抗体又はその断片を提供する。
【００９０】
適切な抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が含まれる。適切な抗体断片には、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ´）２断片等の抗体の酵素的切断により作製される断片、並びに、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片等の組換え抗体断片が含まれる。
【００９１】
抗体又はその断片は、例えば、野生型ＰＣＤＨ１９タンパク質（すなわち、配列番号２に示される完全ＰＣＤＨ１９アミノ酸配列を含む）と、その変異体とを、特に、その非機能的変異体とを識別可能であってもよい。したがって、本発明は、配列番号２に示される完全ＰＣＤＨ１９アミノ酸配列の変異体と特異的に結合する抗体又はその断片にまで及ぶ。
【００９２】
以下の実施例及び添付の図面により、本発明を以下にさらに説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
［実施例］
［材料と方法］
【実施例１】
【００９３】
患者と親族の詳細
女性に限られた癲癇及び精神遅滞（ＥＦＭＲ）に罹患する構成員を有する７つの親族の人々が認められた。親族１〜４の医学的詳細はScheffer IE et al. (2007) に記載されている。親族５は、姉妹の１人が小児癲癇発作及びアスペルガー症候群を有し、彼女の姉妹が癲癇及び軽度の知能障害を有するためスクリーニングされた。親族６及び親族７の構成員の医学的詳細は、別に記載されている（Juberg RC and Hellman CD, 1971; Fabisiak K and Erickson RP, 1990; and Ryan SG et al., 1997）。
【実施例２】
【００９４】
ノーザンブロッティング
ヒト脳（ＭＴＮ）ブロットII及びＶ（Clontech Laboratories社より取得）を、製造者による説明書に従ってハイブリダイズした。検出アッセイには、ヒトＰＣＤＨ１９ＯＲＦのヌクレオチド２８８４〜３２５７を含むプローブ（ＮＣＢＩ受託番号９２１４７８）を使用した。かかるプローブを作製するために用いたプライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー‐5'CCGGATTCTTGGCCACTCTGAC3'（配列番号３）；及び
リバースプライマー‐5'CAATGGTGTAAGACACGGAAG3'（配列番号４）。
【００９５】
かかる３７４ｂｐプローブを、Mega primeＤＮＡ標識システム（GE Healthcare社製、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いて、放射性α３２Ｐ‐ｄＣＴＰ（Perkin Elmer社製、米国マサチューセッツ州ウォルサム）で標識した。
【実施例３】
【００９６】
ＲＴ‐ＰＣＲ分析
RNeasyミニキット（Qiagen社製、豪州ヴィクトリア州ドンカスター）を用いて線維芽細胞から完全ＲＮＡを抽出し、DNase I（Qiagen社製）で処理した。２μｇのＲＮＡを、１μｇのランダムヘキサヌクレオチドでプライムし、製造者による説明書に従ってSuperscript IIを用いて９０分間４２℃で逆転写した（Invitrogen Corporation社製、米国カリフォルニア州カールズバッド）。反応効率を、遍在的に発現するＥＳＤ遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲでテストした（Saviozzi et. al., 2006）。ｃＤＮＡを、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Roche社製、スイス、バーゼル）及び特異的単一鎖ＤＮＡプライマーで３５サイクル（変性、９４℃で３０秒間；アニーリング、プライマーの各ペアの特異的Ｔｍで３０秒間；伸長、７２℃で３０秒間）増幅した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動で分離し、ＵＶ下での可視化のため、１％エチジウムブロマイドで染色した。
【実施例４】
【００９７】
組織培養‐初代皮膚線維芽細胞株
各対象者の上腕から切除された３ｍｍ皮膚生検組織を細断し、組織培養フラスコへと移した。生検組織を、２０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ培地（さらに４ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、０．０１７ｍｇ／ｍｌベンジルペニシリンを補充）で培養し、３７℃、５％ＣＯ２で成育させた。確立後に線維芽細胞を、１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ中（上記の補充物を含む）で培養した。
【実施例５】
【００９８】
皮膚線維芽細胞株のシクロヘキシミド処理
初代線維芽細胞を、１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ中に１ｘ１０４／ｃｍ２播種し、５０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（Sigma-Aldrich Co製、米国ミズーリ州セントルイス）と共に、又は、培地のみで、６時間インキュベートした。線維芽細胞を、滅菌細胞スクレーパー（Techno Plastic Products AG社製、スイス、トラザーディンゲン）を用いて収集し、その後、上記の完全ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ作製のための逆転写前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で一度洗浄した。
【実施例６】
【００９９】
マウスのインサイチューハイブリダイゼーション分析
ｃ５７ｘＣＢＡＦ１マウスの交尾後１５．５日目（days postcoital、ｄｐｃ）の胚頭部及び解剖された生後２日目（postnatal day 2、Ｐ２）の脳を、４％パラホルムアルデヒド中で４℃で固定し、３０％スクロース中で凍結保護し、最適切削温度（optimal cutting temperature、ＯＣＴ）で凍結した。１６μＭ切片のインサイチューハイブリダイゼーションを、以前に記述された通り調製されたジゴキシゲニン標識化ＰＣＤＨ１９アンチセンスＲＮＡプローブ（Gaitan Y and Bouchard M, 2006）を用いて、以前に記述された通り実施した（Wilson LD et al., 2005）。全部で３つの新生仔及び２つの胚を分析し、代表切片を記録した。コントロールセンスプローブを利用したネガティブコントロールにはいかなるシグナルも検出されなかった。画像はZeiss社製Axiophot顕微鏡で撮影し、Adobe社製Photoshop CS（登録商標）を用いて編集及び最低限の処理（色及び明暗の調整）を施した。
【実施例７】
【０１００】
半定量ＲＴ‐ＰＣＲ
遺伝子発現プロファイルを、ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから調製された第１鎖ｃＤＮＡを含むRapid-Scan Gene Expression Human Brain cDNAパネル（Origene Technologies, Inc社製、米国メリーランド州ロックビル）を用いて作製した。かかるｃＤＮＡパネルでは、ｃＤＮＡの４‐ｌｏｇの希釈系列により、半定量分析が可能である。かかるプロファイルを、約１ｎｇの第１鎖ｃＤＮＡを含むパネルから得た。ＰＣＲプライマーのペア；
Ｘ‐ＲＴ４Ｆ２‐5' GTA ACA AGT GTA CCT GGT ATG GAC T 3'（配列番号５）及び
Ｘ‐ＲＴ５Ｒ２‐5' TCA ACC TTT ACT TTC ATC ACG 3'（配列番号６）を、ＰＣＤＨ１１Ｘ配列を増幅して６８３ｂｐの産物をもたらすのに用い、プライマーペア；
Ｙ‐ＲＴ４Ｆ‐5' TAC AAC AAA CTG TCA CAA GTG TTT 3'（配列番号７）及び
Ｙ‐ＲＴ５Ｒ２‐5' TCA ACC TTT ACT TTC ATC ACA 3'（配列番号８）を、ＰＣＤＨ１１Ｙを増幅して６８１ｂｐの産物をもたらすのに用いた。プライマー；
ＷＬＦ‐5' AAC CAG AAT ACC CGC AAC AC 3'（配列番号９）及び
ＷＬＲ‐5' CTG CAG ATG GTC ACA TCG AC 3'（配列番号１０）を、ＰＣＤＨ１９を増幅して６２６ｂｐの産物をもたらすのに用いた。
【０１０１】
ＰＣＤＨ１９産物を増幅するのに用いられたＰＣＲ条件には、９４℃で３分間の初期工程が含まれ、その後に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で２分間が３５サイクル続く。ＰＣＤＨ１１Ｘ及びＰＣＤＨ１１Ｙ産物を、Hotstar Taq（Qiagen社製）を用いて、Hotstarの推奨サイクル条件（９４℃で１５分間の後、［９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間］が１０サイクル続き、その後［９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間］を３０サイクルの後、７２℃で１０分間が続く）に従い増幅した。
【実施例８】
【０１０２】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号
入手可能な場合には、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の一部を、ＧｅｎＢａｎｋライブラリーにアクセスして得た。これら配列に相当する受託番号は、以下の通りである：
不完全ヒトＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ  受託番号ＮＭ＿０２０７６６．１；
不完全ヒトＰＣＤＨ１９タンパク質  受託番号ＮＰ＿０６５８１７．１；及び
完全ヒトＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ及びタンパク質  受託番号ＧｅｎＢａｎｋ  ＥＦ６７６０９６。
【０１０３】
ＧｅｎＢａｎｋライブラリーには以下のＵＲＬからアクセスできる；
ＮＣＢＩ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、又は、Ｅｎｓｅｍｂｌ：http://www.ensembl.org/。
【０１０４】
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol 1, 2, 3 (1989) に記載の標準的なジデオキシ鎖終結シークエンシング法（di-deoxy chain termination sequencing methods）により決定された。
［結果と考察］
【実施例９】
【０１０５】
遺伝的連鎖分析及びＥＦＭＲ遺伝子の同定
ＥＦＭＲを有する単一の大規模なアメリカ人親族を記述した先行研究（Juberg RC and Hellman CD, 1971; Fabisiak K and Erickson RP, 1990; and Ryan SG et al., 1997）の追跡研究として、ＥＦＭＲの遺伝パターン、親族構成員の電気臨床的特徴、及びＥＦＭＲ原因遺伝子の局在に基づいて、４つの新たなＥＦＭＲ親族を同定した（Scheffer IE et al., 2004; Scheffer IE et al., 2007）。
【０１０６】
全部で７つのＥＦＭＲ親族の家系図が作成され、発症女性及び伝達男性の特徴的な遺伝パターンが示された（図１）。親族内でのさらなる連鎖分析により、各親族における疾患条件は一貫してＸｑ２２に局在することが示された。
【０１０７】
ＥＦＭＲ遺伝子は、３つの親族の発端者において、リシークエンシングされたＶＥＧＡとしてアノテートされた７３７個のＸ染色体遺伝子から同定された。すべての３つの親族において、それぞれのＸ染色体が、プロトカドヘリン１９（ＰＣＤＨ１９）変異（Ｘｍ）をコードしており、かかる変異がＥＦＭＲ臨床表現型と共分離することが見出された。ＰＣＤＨ１９遺伝子は、Ｘｑ２２（Ｅｎｓｅｍｂｌ）に位置することが知られていた（Ryan SG et al., 1997）。各親族の発症女性において検出されたＰＣＤＨ１９変異の配列クロマトグラムの一例が、家系図と共に図１に示される。
【０１０８】
親族構成員の配列分析により、親族３のＰＣＤＨ１９遺伝子における単一ナンセンスヌクレオチド変化２０１２Ｃ＞Ｇ（残基Ｓ６７１Ｘ）が示された一方で、親族１及び２は、最初はいかなる変化も示さなかった（図１）。他の７３６の遺伝子がスクリーニングされた３つの家族において、その他の有害なヌクレオチド変化は同定されなかった。引き続いて行われた、アノテートされたＰＣＤＨ１９オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（受託番号ＮＭ＿０２０７６６．１）の比較配列分析により、それが不完全なものであることが明らかとなった。このことから、さらにＰＣＤＨ１９ＯＲＦのＮ末端１．５ｋｂのシークエンシングが動機付けられた。
【０１０９】
親族構成員のＮ末端シークエンシングにより、親族１においてミスセンス変化である１３２２Ｔ＞Ａ（残基Ｖ４４１Ｅ）、親族２においてナンセンス変化である２５３Ｃ＞Ｔ（残基Ｑ８５Ｘ）、親族４においてフレームシフト変化と推定される２０３０＿２０３１ｉｎｓＴ（残基Ｌ６６７ｆｓＸ７１７）が同定された。未報告のアイルランド人ＥＦＭＲ親族（親族５）の発症女性のＮ末端ＰＣＤＨ１９領域もまたシークエンシングされ、結果としてフレームシフト変化である３７５ｄｅｌＣ（残基Ｉ１１９ｆｓＸ１２２）が同定された。アメリカ人の大規模ＥＦＭＲ親族（親族６）のＰＣＤＨ１９Ｎ末端領域がリシークエンシングされ、結果としてさらなるフレームシフト変異である１０９１＿１０９２ｉｎｓＣ（残基Ｐ３６４ｆｓＸ３７５）が同定された（Juberg RC and Hellman CD, 1971; Fabisiak K and Erickson RP, 1990; Ryan SG et al., 1997）（図１）。最後に、アミノ酸置換Ｎ５５７Ｋをコードするヌクレオチド変化１６７１Ｃ＞Ｇが親族７において同定された。
【０１１０】
配列比較により、親族構成員間のサイレントヌクレオチド変化がさらに同定され、位置番号６（Ｇ＞Ａ）、３４８（Ｇ＞Ａ）、４０２（Ｃ＞Ａ）、１１３７（Ｃ＞Ｔ）、１６２７（Ｃ＞Ｔ）、及び１６８３（Ｇ＞Ａ）に位置特定された（頻度は表２に示す）。
【０１１１】
【表２】
0005624892.tif 000003
【０１１２】
ヒトＰＣＤＨ１９アミノ酸配列を、他のヒトＰＣＤＨ配列及び他種のＰＣＤＨ１９オルソログと部分的に配列比較することにより、２つのミスセンス変異、Ｖ４４１Ｅ及びＮ５５７Ｋによる影響を受けた残基の、他種との間及び他の機能的に類似したタンパク質との間での高度保存が示された（図３）。Ｖ４４１Ｅ変異は親族１に観察され、Ｎ５７７Ｋ変異は親族７に観察された。
【０１１３】
したがって、ＰＣＤＨ１９ＯＲＦヌクレオチド変化は評価された７つのＥＦＭＲ親族のすべてにおいて同定された。７つのヌクレオチド変化のすべてが、各ＥＦＭＲ親族における臨床表現型と共分離し、Ｘ連鎖精神遅滞（X-linked mental retardation、ＸＬＭＲ）を有すると推定される親族の２５０人の男性発端者、又は、７５０の対照Ｘ染色体においては同定されなかった。ＰＣＤＨ１９変異の位置は、２つのミスセンス変異の位置及び保存を示す配列比較と併せて、一層、ＰＣＤＨ１９変異がＥＦＭＲの原因であることを示す。
【実施例１０】
【０１１４】
ＰＣＤＨ１９変異とレット症候群又は自閉症との関係。ＰＣＤＨ１９変異がまた、ＥＦＭＲと類似した表現型を有する疾患の発症にも寄与するかどうかを決定するため、原因が未知で特定されていないレット症候群又は自閉症を発症する対象者を、ＰＣＤＨ１９の変異に関してテストした。
【０１１５】
レット症候群は、ＥＦＭＲと類似した表現型を呈することが知られている、女性に特異的な疾患である。２つのレット関連遺伝子、ＭＥＣＰ２及びＣＤＫＬ５の変異が陰性であったレット症候群と見られる４６人の女性が調査された。レット症候群コホートにはヌクレオチド変化が見出されず、ＰＣＤＨ１９変異が通常はレット症候群に寄与する可能性が低いことを示唆する。
【０１１６】
自閉症の特徴がＥＦＭＲ発症女性によく見られることから、自閉症及び癲癇発作を発症している５５人の女性からなるコホートが、ＰＣＤＨ１９の変化に関してスクリーニングされた。このコホートにおいて変異が存在しなかったことは、ＰＣＤＨ１９変異が自閉症に対しても通常は寄与しないことを示唆する。
【実施例１１】
【０１１７】
ＰＣＤＨ１９遺伝子の特徴
６つのエキソンからなるＰＣＤＨ１９遺伝子の完全３．４７７ｋｂＯＲＦはアノテートされている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ６７６０９６）。完全長のプロセシングされたＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡは９．７６５ｋｂ長であり、このことは、成人ヒト脳の様々な領域に由来する男性及び女性のｍＲＮＡを混合したものに対してＰＣＤＨ１９特異的プローブを用いた、約９．８ｋｂの転写物サイズを示したノーザンブロット分析により確認された（図４、ＰＣＤＨ  ｍＲＮＡはアスタリスクで示されている）。ＰＣＤＨ１９エキソン２は、選択的にスプライシングされることが見出された（結果は図示せず）。
【０１１８】
ＰＣＤＨ１９は、カドヘリンスーパーファミリー内のプロトカドヘリン（ＰＣＤＨ）δ２サブクラスに属する、１１４８アミノ酸からなるタンパク質をコードする。ＰＣＤＨ１９タンパク質には、シグナルペプチド、６つの細胞外カドヘリン（ＥＣ）リピート、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、並びに、保存されたＣＭ１及びＣＭ２を有する細胞質領域が含まれる。図２には概要図が示されており、ＰＣＤＨ１９タンパク質のシグナルペプチド、細胞外カドヘリンドメイン（ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５、及びＥＣ６を含む）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質（ＣＭ１及びＣＭ２）ドメインに関して、各親族のＰＣＤＨ１９アミノ酸配列変化の位置を図示している。同定された７つのＥＦＭＲ変異のすべてが、大きな細胞外ドメイン内に局在していた。
【０１１９】
ＰＣＤＨ１９の生物学的役割は知られていない；しかしながら、ＰＣＤＨファミリーのメンバーは主に神経系に発現しており、神経細胞結合の確立及びシナプス膜におけるシグナル伝達に関与していると想定されている（Wu Q and Maniatis T, 1999; Yagi T and Takeichi M, 2000）。
【０１２０】
図３に示されるヒトＰＣＤＨ及び他種のＰＣＤＨ１９オルソログの部分的な配列比較により、２つのミスセンス変異、Ｖ４４１Ｅ（上パネル）及びＮ５５７Ｋ（下パネル）の影響を受けた残基の高度保存が示される。Ｎ５５７Ｋ変異は、ＥＣ５ドメイン内の不変異体アスパラギン（Ｎ）残基に影響を与える（図２）。古典的カドヘリンのＥＣ１の対応アスパラギン残基（例えば、Ｎ‐カドヘリンのＮ１００；Patel SD et al., 2006）及びプロトカドヘリンのＥＣ１の対応アスパラギン残基（例えば、ＣＮＲ／ＰｃｄｈαのＮ１０１；Morishita H et al., 2006）は、ＥＣ１ドメインのカルシウムイオン結合及び接着機能に不可欠である。したがって、ＰＣＤＨ１９陰性細胞及びＰＣＤＨ１９野生型細胞による組織モザイクは、細胞間伝達を混乱させ、臨床的にはＥＦＭＲとして発症すると予測される。位置番号４４１のバリン残基（図２のＥＣ４、又は、対応残基であるＮ‐カドヘリンのＥＣ１のＶ９６；Patel SD et al., 2006；又は、対応残基であるＣＮＲ／ＰｃｄｈαのＥＣ１のＶ９７；Morishita H et al., 2006）もまた高度に保存されており（図３）、カルシウム結合部位（両配列比較に対する括弧で示される）にきわめて近接する。したがって、２つのミスセンス変異、Ｖ４４１Ｅ及びＮ５５７Ｋは、ＰＣＤＨ１９機能欠失をもたらすと予測される。
【０１２１】
したがって、両方のＰＣＤＨ１９ミスセンス変異体が、カルシウム接合を損なうことによってＰＣＤＨ１９接着機能に悪影響を及ぼすと予測される。７つのＰＣＤＨ１９変異それぞれと関連する臨床表現型が類似することを考慮すると、それらすべての変異を機能欠失変異として提示するのは合理的である。
【実施例１２】
【０１２２】
変異ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ転写物の安定性
ＰＣＤＨ１９変異２５３Ｃ＞Ｔ、Ｑ８５Ｘ（親族２）及び２０１２Ｃ＞Ｇ、Ｓ６７１Ｘ（親族３）は、中途終止コドン（ＰＴＣ）をＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡに導入する。かかるＰＴＣを含むｍＲＮＡは、通常はＮＭＤ監視複合体により認識され、効率的に分解される（Maquat LE, 2004）。ＰＣＤＨ１９変異２５３Ｃ＞Ｔ、Ｑ８５Ｘ（親族２）及び２０１２Ｃ＞Ｇ、Ｓ６７１Ｘ（親族３）の帰結を、それらの各ｍＲＮＡの安定性に関して、ＲＴ‐ＰＣＲで生検患者から収集された初代皮膚線維芽細胞におけるＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡを検出することにより検査した。
【０１２３】
図５が示すのは、親族２のＥＦＭＲ発症女性に由来する配列クロマトグラムであり、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（上パネル）における２５３Ｃ＞Ｔ、Ｑ８５Ｘ変異の検出、線維芽細胞ｃＤＮＡにおける変異配列の非存在（中パネル）、並びに、線維芽細胞のシクロヘキシミド処理後の変異体及び野生型ｃＤＮＡ両方の存在（下パネル）を示している。シクロヘキシミドは、パイオニアラウンド（pioneer round）の翻訳及びＮＭＤがもたらされることを阻害する。同様の結果が親族３のＥＦＭＲ発症構成員（２０１２Ｃ＞Ｇ変異、Ｓ６７１Ｘ）から収集された組織に見出された（データは示されていない）。皮膚線維芽細胞のシクロヘキシミド処理によるＮＭＤの阻害は、ＰＴＣ変異を含むｍＲＮＡを保存することが見出された。
【０１２４】
変異ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡの非存在がＸ染色体不活性化のゆがみの結果でないことを確証するため、入手可能な各発症女性の血液及び皮膚線維芽細胞培養物から単離されたＤＮＡにおけるランダムなＸ染色体不活性化が評価された（データは示されていない）。Ｘ染色体不活性化のゆがみの非存在は、刊行されているデータと一致する（Ryan SG et al., 1997; Scheffer IE et al., 2007）。
【０１２５】
結果が示すのは、親族２及び親族３におけるＰＴＣ変異が、ＮＭＤによるｍＲＮＡ除去をもたらすということである。親族４に見出される２０３０＿２０３１ｉｎｓＴ（残基Ｌ６６７ｆｓＸ７１７）の変異、親族５に見出される３７５ｄｅｌＣ（残基Ｉ１１９ｆｓＸ１２２）の変異、及び親族６に見出される１０９１＿１０９２ｉｎｓＣ（残基Ｐ３６４ｆｓＸ３７５）の変異もまた、それらそれぞれのＰＴＣを含むｍＲＮＡのＮＭＤ分解の結果として、機能的ｍＲＮＡの完全欠損をもたらすと予測される。
【実施例１３】
【０１２６】
発生中の脳におけるＰＣＤＨ１９発現
発生中のマウスＣＮＳにおけるＰＣＤＨ１９発現を検討するため、胚組織（交尾後１５．５日目（ｄｐｃ））及び生後２日目の組織のＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーション分析が行われた。図６が示すのは、１５．５ｄｐｃ（図６ａ〜図６ｆ）及びＰ２（図６ｇ〜図６ｌ）の発生中のマウスＣＮＳにおけるＰＣＤＨ１９発現である。図６ａ及び図６ｂが示すのは、隣接切片をそれぞれ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色したもの、並びに、インサイチューでＰＣＤＨ１９に関して処理したものである。ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡは胚前脳において広範かつ対称的なパターンで発現し、多くの場合皮質（ＣｘＰ、皮質板）内、視床（Ｔｈ）内、及び視床下部（Ｈｙ）内の分散した細胞集合に局在していた。側脳室（ｌｖ）及び海馬神経上皮（Ｈｎ）にもまた発現が示された。図６ｃ、図６ｄ、及び図６ｅが示すのは、図６ｂでボックスに囲われた領域のより高倍率の画像である。図６ｃの矢印は、皮質内のＰＣＤＨ１９発現細胞を示す。皮質では、発現は皮質板に限られ、大脳半球間裂（ｉｃｆ）へと内側に延びていた（図６ｄ）。図６ｅのアスタリスクは、側脳室の背外側壁を示し、側脳室の背外側壁と隣接する神経節隆起にもまた強い発現が検出された。
【０１２７】
この段階で海馬での発現は、予定海馬における側脳室の内側端では観察されなかった（図６ｂ及び図６ｅ）。しかしながら、引き続いて行われた前脳前側切片の分析により、鼻腔の上皮層（以前の報告と一致（Gaitan Y and Bouchard M, 2006））及び嗅球におけるＰＣＤＨ１９発現が明らかとなった（図６ｆ参照、嗅球はＯｂで、鼻上皮はＮｅで示される）。
【０１２８】
図６ｇ及び図６ｈが示すのは、隣接切片をそれぞれ、ヘマトキシリン及びエオシンで染色したもの、並びに、インサイチューハイブリダイゼーションによりＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡに関して処理したものである。図６ｉが示すのは、図６ｈに示された脳切片の後側に位置する脳切片であり、それぞれＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡ発現を示している。図６ｊ、図６ｋ、及び図６ｌが示すのはそれぞれ、図６ｇ及び図６ｈでボックスに囲われた領域の、より高倍率の画像である。
【０１２９】
生後２日目、ＰＣＤＨ１９発現は皮質及び視床の分散した領域に維持されていたが、胚脳と異なり、海馬にも発現が観察された（図６ｇ、図６ｈ、及び図６ｉ）。皮質では、発現は第II層から第IV層に広がる細胞帯に限られ（図６ｊ及び図６ｋに矢印で示される）、一方で最も顕著なＰＣＤＨ１９シグナルは、海馬のＣＡ１及びＣＡ３領域に観察された（図６ｈ及び図６ｌ）。
【０１３０】
前のノーザンブロット分析（図２）と一致して、ＰＣＤＨ１９転写物は脳梁を含む白質路には検出されなかった（図６ｈ）。これらのデータは併せて、ＰＣＤＨ１９が、発生中の皮質及び海馬を含む胚脳並びに成体脳の両方において広範な発現を有することを示しており、ヒトにおけるこの遺伝子の変異が認知障害と関連するという発見と一致する。
【実施例１４】
【０１３１】
観察された疾患遺伝パターンの機序
ＥＦＭＲ親族家系図の分析により、７つのＥＦＭＲ親族内に、ＥＦＭＲと診断されていない２人の絶対保因女性（親族６、個人III．２及び親族７、個人IV．１５）がいることが示され、疾患の浸透率（penetrance）が不完全であることが示された。ＰＣＤＨ１９変異を同定した後、ＥＦＭＲに観察される注目すべき遺伝パターンに関して、機序の説明が追求された。
【０１３２】
Ryan SG et al., 1997により検討された仮説の一つは、女性における変異タンパク質の野生型タンパク質に対する優性阻害効果が、女性に限られた表現型の発現の原因であるかもしれないと示唆する。本実施例では、発症女性及び保因男性において変異ＰＣＤＨ１９  ｍＲＮＡがＮＭＤにより除去されることが示され（図２及び示されていないデータ）、このことは優性阻害仮説と一致する。しかしながら、伝達男性をＥＦＭＲ表現型からレスキューするＹ染色体上の補完遺伝子に関するある代替仮説（Ryan SG et al., 1997）を検討する中で、ヒトＹ染色体上にはＰＣＤＨ１９パラログが存在しない一方で、Ｘｑ２２とのＸ‐Ｙ相同ブロック内に関連プロトカドヘリン遺伝子ＰＣＤＨ１１Ｙが存在することに着目した。ＰＣＤＨ１１Ｙ遺伝子は、チンパンジーとヒトの分岐後にＸｑからの転移により生じたと考えられており（Lambson B et al., 1992; Page DC et al., 1984）、したがって、ＰＣＤＨ１１Ｙ遺伝子はヒトの男性にのみ見出される。
【０１３３】
ＰＣＤＨ１９及びＰＣＤＨ１１Ｘ／Ｙのノーザンブロット分析を、ヒトの小脳、大脳皮質、髄質、脊髄、後頭極、前頭葉、側頭葉、被殻、扁桃体、尾状核、脳梁、海馬、視床、及び全脳組織について実施した。図６ｃが示すのは、ＰＣＤＨ１９転写物の存在（アスタリスクで示されている、約９．８ｋｂバンド）及びＰＣＤＨ１１Ｘ／Ｙ  ｍＲＮＡの存在（矢印で示されている、約９．５ｋｂバンド）である。図８もまた、ヒト成人の前頭葉、側頭葉、小脳、海馬、黒質（substantial nigra）、尾状核、扁桃体、視床、視床下部、脳橋、髄質、及び脊髄におけるＰＣＤＨ１９、ＰＣＤＨ１１Ｘ、及びＰＣＤＨ１１Ｙの発現プロファイルを示している。プロトカドヘリンファミリーの他のメンバーの多くと同じように（Kim SY et al., 2007）、ＰＣＤＨ１９、ＰＣＤＨ１１Ｙ、及びＰＣＤＨ１１Ｘはヒト脳に発現している。ＰＣＤＨ１１Ｘ及びＰＣＤＨ１１Ｙは高い配列類似性を示し、ヌクレオチドレベルで９８．１％同一、アミノ酸レベルで９８．３％同一であり（Blanco P et al., 2000）、脳領域において類似した発現プロファイルを示す（Blanco P et al., 2000及び図８）。しかしながら、ＰＣＤＨ１１Ｘ及びＰＣＤＨ１１Ｙは、それらのＯＲＦ配列の５´末端及び３´末端で配列多様性が生じ、異なる形で調節され、脳におけるそれらの発現領域にわずかな違いが見られる（Blanco P et al., 2000）。したがって、ＰＣＤＨ１１Ｘ及びＰＣＤＨ１１Ｙが異なる機能を進化させたということはありうる。
【０１３４】
配列比較が示すのは、ＰＣＤＨ１１Ｘ及びＰＣＤＨ１１Ｙの両方の細胞外カドヘリン（ＥＣ）ドメインが、ＰＣＤＨ１９のＥＣドメインとある程度の類似性を有するということである；それは、ＰＣＤＨ１９のＥＣドメインと、同じＰＣＤＨｄ２サブクラスのメンバー（ＰＣＤＨ‐８、１０、１７、及び１８）との間に見られるよりも高いレベルの類似性である。
【０１３５】
ＰＣＤＨ１１ＸとＰＣＤＨ１１Ｙとの間の高度の配列同一性及び発現パターンの重複は、ＰＣＤＨ１１Ｘが女性におけるＰＣＤＨ１９機能欠失変異を補完し、ＰＣＤＨ１１Ｘ及びＰＣＤＨ１１Ｙの両方が男性におけるＰＣＤＨ１９変異を補完するという仮説に裏付けを提供する。
【０１３６】
ＰＣＤＨ１１Ｙの独自に進化した機能は、このタンパク質がＰＣＤＨ１１Ｘよりも大きくＰＣＤＨ１９変異のレスキューを提供することを可能としたかもしれず、このことは、ＥＦＭＲを発症する女性よりも症状が現れない男性保因者の頻度が大きいことに理論的根拠を提供する。
【０１３７】
ＥＦＭＲ遺伝の背景にある機序として提示したものを図示化したものが、図７に描かれている。ＰＣＤＨ１９遺伝子はＸｑ２２．１に位置し、現在ではＥＦＭＲ変異を抱えると知られている。Ｘ染色体及びＹ染色体の相同領域内には２つのかなり類似したＰＣＤＨ遺伝子、Ｘ染色体上のＰＣＤＨ１１Ｘ及びＹ染色体上のＰＣＤＨ１１Ｙが存在する。本明細書に提供されている結果が示すのは、ＰＣＤＨ１１Ｙが伝達男性においてＰＣＤＨ１９変異を機能的にレスキューするかもしれず、一方で女性においてＰＣＤＨ１１Ｘはレスキューを行うことができず、ＥＦＭＲ表現型が女性に限られることを説明する。
【０１３８】
本明細書において特徴づけられた７つのＰＣＤＨ１９変化すべての機能欠失、それら変化の対照染色体における非存在、Ｘ染色体上の他所における潜在的病原変異体の証拠の非存在、及びｍＲＮＡ研究により、同定されたＰＣＤＨ１９変異がＥＦＭＲの原因であることが決定的に示される。完全ＰＣＤＨ１９ＯＲＦに相当するヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同定により、ＥＦＭＲ及び機能的ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損と関連する類似疾患の診断薬及び治療薬の開発が提供される。さらに、ＰＣＤＨ１１ＹによるＰＣＤＨ１９レスキュー機序と考えられるものの解明により、ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損と関連する疾患の代替治療薬の同定及び開発の可能性が提供される。
【０１３９】
特徴付けられた７つのＥＦＭＲ変異すべてが大きな細胞外ドメインに位置し、これら変異のうち５つが、それらそれぞれのＰＴＣを含むｍＲＮＡのＮＭＤ分解の結果としての、完全機能欠失変異と予測される。残り２つのミスセンス変異、Ｖ４４１Ｅ及びＮ５５７Ｋは、ＰＣＤＨ１９機能欠失をもたらすと予測される。機能欠失は、ＰＣＤＨ１９接着性の欠如によりカルシウムイオン結合が損なわれた結果かもしれない。したがって、遺伝的及び機能的標的が、ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損と関連する疾患の診断方法、かかる疾患の素因の同定方法、及び、かかる疾患の保因者を同定するためのスクリーニング方法、並びに、ＰＣＤＨ１９タンパク質欠損と関連する疾患の治療において治療的使用の可能な候補物質をスクリーニングするための方法及びキットにおける使用のために提供される。
【０１４０】
以上の詳細な説明において本発明の方法の好ましい実施形態が記述されたとはいえ、本発明は開示された実施形態に限られず、本発明の範囲を出ることなく、数多くの再構成、修正、及び置換が可能であることが理解される。
【０１４１】
本明細書を通じて、「含む」なる用語、又は「含み」若しくは「含んだ」等の語形変化形は、物であろうが工程であろうが、述べられた要素、又は、物であろうが工程であろうが、述べられた要素の集合を含むが、物であろうが工程であろうが、その他のいかなる要素、又は、物であろうが工程であろうが、その他のいかなる要素の集合も排除しないことを示すものと理解される。
【０１４２】
本明細書において言及された刊行物はすべて、本明細書に参照により組み込まれる。本明細書に含まれた書類、文書、資料、図案、又は記事等に関するあらゆる議論が、本発明の文脈を提供する目的でのみなされたものである。これらの文献の一部又は全部が豪州又は他の場所に本願の各請求項の優先日よりも前に存在していたからという理由で、それが先行技術基盤の一部を形成するということ、或いは、本発明に関係する技術分野において共有される一般的知識であったということを認めることになるとは、理解されるべきではない。
【０１４３】
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【図１】
0005624892.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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