(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース加水分解力強化酵母を作製する方法であって、
セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群をセルロース非加水分解性酵母に導入して形質転換酵母を得る工程であって、該遺伝子群が、セロビオヒドロラーゼの遺伝子、エンドグルカナーゼの遺伝子、およびβ−グルコシダーゼの遺伝子を含み、該β−グルコシダーゼの遺伝子の組み込みコピー数の１コピーに対し、該セロビオヒドロラーゼおよび該エンドグルカナーゼのそれぞれの遺伝子の組み込みコピー数が少なくとも２コピーである、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記形質転換酵母が、前記β−グルコシダーゼを表層提示するように調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記形質転換酵母が、前記セロビオヒドロラーゼおよび前記エンドグルカナーゼの少なくとも一方を表層提示するように調製される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法により得られる、セルロース加水分解力強化酵母。
【請求項５】
セロビオヒドロラーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、およびβ−グルコシダーゼ遺伝子を有し、該β−グルコシダーゼ遺伝子１コピーに対して、該セロビオヒドロラーゼ遺伝子および該エンドグルカナーゼ遺伝子のそれぞれが少なくとも２コピーで組み込まれた、セルロース加水分解力強化酵母。
【請求項６】
前記セロビオヒドロラーゼ、前記エンドグルカナーゼ、および前記β−グルコシダーゼが表層提示されている、請求項５に記載のセルロース加水分解力強化酵母。
【請求項７】
エタノールを製造する方法であって、
セルロース系物質と、請求項４から６のいずれかに記載のセルロース加水分解力強化酵母とを反応させて、エタノールを生産する工程
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース加水分解力強化酵母の作製および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食料穀物（例えば、トウモロコシ、イモ類、およびサトウキビ）からのバイオ燃料の増産が食物価格の高騰を招いており、非食用炭素源ソフトバイオマス（例えば、稲ワラ、麦ワラ、バガス、籾殻、綿、竹、紙、およびコーンストーバーのような廃棄物）からのエタノール生産が急務となっている。【０００３】
セルロースやヘミセルロースを含むバイオマスに対して酸処理または超臨界処理を施し、発酵微生物が資化できるグルコースにまで原料を処理する手法が提案されている。【０００４】
従来、セルロース材料を原料とするグルコースの製造方法としては、酸糖化法および酵素糖化法がある。酸糖化法としては、高温（２００℃以上）で希酸を用いてセルロース系物質を糖化する希酸糖化方法と、濃硫酸などでセルロース材料を糖化する方法とが知られている。しかし、いずれの方法も過激な条件下でセルロース材料を加水分解するために、セルロース材料の分解物であるグルコースの二次分解反応が起こり、糖化率は約５０％と低く、また、糖化液からグルコースの分解物を除去する必要がある。上記グルコースの分解物を除去せずに糖化液を発酵用炭素源として利用するには種々の問題がある。【０００５】
一方、酵素糖化法は、セルロース材料の糖化を温和な条件下で行うことができるが、糖化の反応速度が遅く十分な糖化には長時間を要するという問題がある。さらに、糖化に使用する市販の酵素の力価が低いことにより十分な糖化には酵素を大量に必要とするので、使用酵素のコストが高くなるという問題がある。【０００６】
ソフトバイオマスの主成分であるセルロース、ヘミセルロースなどを本来資化することができない発酵微生物を、生物工学的手法を用いて改変することにより、非食用炭素源からの直接エタノールを発酵させる試みがなされている。このような生物工学的手法として細胞表層提示技術が好適に利用されている。例えば、セルロースを加水分解する酵素群を表層提示した酵母が、細胞表層提示技術によって作製されている（特許文献１および２）。また、酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）はキシロースを代謝することができないが、キシラン分解酵素であるトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来キシラナーゼ２（ＸＹＮＩＩ）およびアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）由来β−キシロシダーゼ（ＸｙｌＡ）を表層提示し、かつキシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子（ともにピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来）ならびにキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子（サッカロマイセス・セレビシエ由来）を発現するサッカロマイセス・セレビシエが作製され、この酵母を用いて樺材のキシランからエタノールを生産する試みもなされている（非特許文献１）。【０００７】
しかし、工業上の実用性を鑑みるとさらなる検討が必要である。セルロース系バイオマスにおいては、結晶性部分と非晶性部分とが存在する。酵素による加水分解反応は、非晶性部分は結晶性部分に比較して容易であるが、結晶性部分は強固な分子内・分子間水素結合が存在しているため、加水分解速度は遅いと考えられている。このような複雑な構成を有するセルロースの加水分解をより効率的に行うことが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許出願公開第０１／７９４８３号公報
【特許文献２】特開２００８−８６３１０号公報
【特許文献３】特開２００６−２５５６７６号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】S. Katahiraら, Applied and Environmental Microbiology, 2004年, 70巻, 5407-5414頁
【非特許文献２】Appl. Microbiol. Biotech., 2002年, 60巻, 469-474頁
【非特許文献３】Applied and Environmental Microbiology, 2002年, 68巻, 4517-4522頁
【非特許文献４】R. Akadaら, Yeast, 2006年, 23巻, 399-405頁
【非特許文献５】H. Okadaら, J. Biosci. Bioeng., 1999年, 88巻, 563頁
【非特許文献６】Y. Fujitaら, Journal of molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002年, 17巻, 189-195頁
【非特許文献７】S. Katahiraら, Appl Microbiol Biotechnol., 2006年, 72巻, 1136-43頁
【非特許文献８】Roseら, Methods in Yeast genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY 1990年
【非特許文献９】P. N. Lipkeら, Mol. Cell. Biol., 1989年8月, 9(8), 3155-65頁
【非特許文献１０】Y. Fujitaら, Applied and Environmental Microbiology, 2002年, 68巻, 5136-41頁
【非特許文献１１】Y. Fujitaら, Applied and Environmental Microbiology, 2004年, 70巻, 1207-12頁
【非特許文献１２】Takahashiら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001年, 55巻, 454-462頁
【非特許文献１３】C. S. Walseth, Tech. Assoc. Pulp Paper Ind., 1952年, 35巻, 228-233頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、高いセルロース加水分解力を有する酵母を提供することを目的とする。さらに、本発明は、セルロース系物質から効率的にエタノールを生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、セルロース加水分解力強化酵母を作製する方法を提供する。この方法は、
セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群をセルロース非加水分解性酵母に導入して形質転換酵母を得る工程であって、上記遺伝子群が、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子および非晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子を含み、上記結晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子および上記非晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子が共に増大された組み込みコピー数で導入される、工程を含む。【００１２】
１つの実施態様では、上記結晶性セルロースを加水分解し得る酵素はセロビオヒドロラーゼであり、上記非晶性セルロースを加水分解し得る酵素はエンドグルカナーゼである。【００１３】
別の１つの実施態様では、上記結晶性セルロースを加水分解し得る酵素および上記非晶性セルロースを加水分解し得る酵素の少なくとも一方が表層提示されるように上記セルロース非加水分解性酵母に導入する。【００１４】
さらに別の実施態様では、上記セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群は、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子をさらに含む。【００１５】
さらなる実施態様では、上記セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子の組み込みコピー数の１コピーに対し、上記結晶性セルロースを加水分解し得る酵素および上記非晶性セルロースを加水分解し得る酵素の組み込みコピー数は少なくとも２コピーである。【００１６】
さらなる実施態様では、上記セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素はβ−グルコシダーゼである。【００１７】
さらなる実施態様では、上記セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素が表層提示されるように前記セルロース非加水分解性酵母に導入する。【００１８】
本発明はさらに、上記方法により得られる、セルロース加水分解力強化酵母を提供する。【００１９】
本発明はまた、セロビオヒドロラーゼ遺伝子、エンドグルカナーゼ遺伝子、およびβ−グルコシダーゼ遺伝子を有し、上記β−グルコシダーゼ遺伝子１コピーに対して、上記セロビオヒドロラーゼ遺伝子および上記エンドグルカナーゼ遺伝子のそれぞれが少なくとも２コピーで組み込まれた、セルロース加水分解力強化酵母を提供する。【００２０】
１つの実施態様では、上記セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、およびβ−グルコシダーゼが表層提示されている。【００２１】
さらに、本発明は、エタノールを製造する方法を提供する。この方法は、
セルロース系物質と、上記セルロース加水分解力強化酵母とを反応させて、エタノールを生産する工程
を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、セルロース加水分解力強化酵母が提供される。このセルロース加水分解力強化酵母により、セルロースからの直接エタノール生産量が高められる。さらに、このセルロース加水分解力強化酵母の利用により、セルロース系物質からの効率的で経済的なエタノール生産方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】プラスミドpRS406 EG CBH2の模式図である。
【図２】プラスミドpRS403 EG CBH2の模式図である。
【図３】プラスミドpRS405 EG CBH2の模式図である。
【図４】プラスミドpILGP3-CBH2の模式図である。
【図５】プラスミドpRS405 CBH2 CBH2の模式図である。
【図６】プラスミドpIWBGLの模式図である。
【図７】エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを種々に発現する酵母のセルロース加水分解力を示すグラフである。
【図８】エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼのコピー数を順次増大させた３種のセルラーゼ表層提示酵母によるリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）を材料とする発酵で生成されるエタノール量の経時変化を示すグラフである。
【図９】セルラーゼ表層提示酵母およびセルラーゼ分泌酵母のリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）からのエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
（セルロース加水分解力強化酵母およびその作製）
本発明においては、本来セルロースを加水分解する能力がないかまたはほとんどない酵母（野生型酵母など）（本明細書中では、「セルロース非加水分解性酵母」ともいう）に対して、セルロースを加水分解し得る酵素群を発現するように遺伝子組換えを行うことにより、セルロース加水分解力が強化された形質転換酵母が作製される。
【００２５】
セルロースを加水分解し得る酵素は、任意のセルロース加水分解酵素生産菌に由来し得る。セルロース加水分解酵素生産菌としては、代表的には、アスペルギルス属（例えば、アスペルギルス・アクレアータス(Aspergillus aculeatus)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)、およびアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)）、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)）、クロストリディウム属（例えば、クロストリディウム・テルモセラム(Clostridium thermocellum)、セルロモナス属（例えば、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)およびセルロモナス・ウダ(Cellulomonas uda)）、シュードモナス属（例えば、シュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluorescence)）などに属する微生物が挙げられる。
【００２６】
セルロースを加水分解し得る酵素とは、β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素であり得る。β１，４−グルコシド結合を切断し得る酵素としては、代表的には、エンドβ１，４−グルカナーゼ（以下、単に「エンドグルカナーゼ」という）、セロビオヒドロラーゼ、およびβ−グルコシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
エンドグルカナーゼは、通常、セルラーゼと称される酵素であり、セルロースを分子内部から切断し、グルコース、セロビオース、およびセロオリゴ糖（重合度が３以上であり、そして通常、１０以下であり得るが、これに限定されない）を生じ得る（「セルロース分子内切断」）。エンドグルカナーゼは、非結晶化されたセルロース、可溶性セロオリゴ糖、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性が高いが、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルへの反応性は低い。エンドグルカナーゼは、非晶性セルロースを加水分解し得る酵素（以下、「非晶性加水分解酵素」ともいう）の代表例である。エンドグルカナーゼには５種類あり、それぞれエンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼII、エンドグルカナーゼIII、エンドグルカナーゼIV、およびエンドグルカナーゼＶと称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子内切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（特に、ＥＧII）が用いられ得るが、これに限定されない。
【００２８】
セロビオヒドロラーゼは、セルロースの還元末端または非還元末端のいずれかから分解してセロビオースを遊離し得る（「セルロース分子末端切断」）。セロビオヒドロラーゼは、結晶構造を有するセルロースミクロフィブリルのような結晶性セルロースを分解し得るが、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）のようなセルロース誘導体などの結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースに対する反応性は低い。セロビオヒドロラーゼは、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素（以下、「結晶性加水分解酵素」ともいう）の代表例である。結晶性セルロースの分子間および分子内の密な水素結合による強固な構造に起因して、セロビオヒドロラーゼによる結晶性セルロースの加水分解は、エンドグルカナーゼによる非晶性セルロースの加水分解に比較して遅くなり得る。セロビオヒドロラーゼには２種類あり、それぞれセロビオヒドロラーゼ１およびセロビオヒドロラーゼ２と称される。これらの区別は、アミノ酸配列の差異であるが、セルロース分子末端切断作用を有する点では共通する。例えば、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（特に、ＣＢＨ２）が用いられ得るが、これに限定されない。
【００２９】
β−グルコシダーゼは、セルロースにおいては、非還元末端からグルコース単位を切り離していくエキソ型の加水分解酵素である。β−グルコシダーゼは、アグリコンまたは糖鎖とβ−Ｄ−グルコースとのβ１，４−グルコシド結合を切断し得、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解してグルコースを生成し得る。β−グルコシダーゼは、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の代表例である。β−グルコシダーゼは現在、１種類知られており、β−グルコシダーゼ１と称される。例えば、アスペルギルス・アクレアータス由来β−グルコシダーゼ（特に、ＢＧＬ１）が用いられ得るが、これに限定されない。
【００３０】
本発明においては、以下に詳述するように、セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群を導入することで、形質転換酵母が作製され得る。セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群は、結晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子および非晶性セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子を含む。結晶性セルロースを加水分解し得る酵素（「結晶性加水分解酵素」）とは、ミクロフィブリルのような結晶構造を有するセルロースを加水分解し得る任意の酵素をいい、例えば、セロビオヒドロラーゼが挙げられるがこれに限定されない。非晶性セルロースを加水分解し得る酵素（「非晶性加水分解酵素」）とは、結晶構造を有するセルロースは分解しないが、非結晶化されたセルロースのような結晶化度の低いまたは非晶性のセルロースの鎖を加水分解し得る任意の酵素をいい、例えば、エンドグルカナーゼが挙げられるがこれに限定されない。好ましくは、セルロースを加水分解し得る酵素の遺伝子群には、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子がさらに含まれ得る。セロオリゴ糖については上述の通りである。セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素としては、例えば、β−グルコシダーゼが挙げられるがこれに限定されない。
【００３１】
本発明においては、セルロース非加水分解性酵母（野生型酵母など）に対して、結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素の発現が共に増大されるように遺伝子組換えを行うことにより、形質転換酵母が作製される。すなわち、それぞれの酵素の遺伝子のコピー数を共に増大させた組み込みコピー数でセルロース非加水分解性酵母に導入し、形質転換酵母を得る。結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素の発現様式は、発現された酵素がセルロース基質に対して作用する限り問わない。例えば、発現様式は、表層提示または分泌発現であり得る。結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素は、少なくとも一方、または両方が共に、表層提示または分泌され得る。結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素の表層提示と分泌とを同時に生じるように、酵母を形質転換してもよい。
【００３２】
形質転換酵母には、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子が組み込まれていることが好ましい。それにより、セルロースからのグルコースの生産能を高め得る。この酵素もまた、表層提示または分泌させ得るが、好ましくは表層提示される。セルロースからのエタノール発酵をさらに効率的に行うために、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素もまた酵母で発現されることが好ましい。
【００３３】
セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素の遺伝子の組み込みコピー数が１コピーに対し、結晶性加水分解酵素および非晶性加水分解酵素のそれぞれの遺伝子の組み込みコピー数は少なくとも２コピーであり得る。
【００３４】
一例として、結晶性加水分解酵素としてセロビオヒドロラーゼ、そして非晶性加水分解酵素としてエンドグルカナーゼが用いられ得る。これらの酵素の発現を共に増大させるために、これらの酵素の遺伝子の発現カセット（以下に詳述する）を一緒に含む少なくとも２つのベクターで単一の酵母を形質転換し得る。これらの各酵素の遺伝子の発現カセットを単独で含むそれぞれのベクターの組み合わせの少なくとも２組で単一の酵母を形質転換してもよい。実用酵母を形質転換する場合は、以下に詳述するように、実用酵母は、栄養要求性マーカーを本来有しておらず、栄養要求性マーカーを付与することが望ましいので、これらの酵素の遺伝子の発現カセットを一緒に含むベクター（ベクターの例としては、以下の実施例に説明するベクターが挙げられる）を調製することが操作の効率上好ましい。
【００３５】
形質転換酵母は、セロビオースまたはセロオリゴ糖を加水分解し得る酵素として、β−グルコシダーゼがさらに組み込まれたものであり得る。
【００３６】
β−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みコピー数に対してセロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼの組み込みコピー数を増大させることにより、エタノール生産量を増大させ得る。したがって、β−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みコピー数１コピーに対して、セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼのそれぞれの該遺伝子が少なくとも２コピーが組み込まれ得る。セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼのそれぞれの該遺伝子は、β−グルコシダーゼ遺伝子の組み込みコピー数１コピーに対して３コピーまたはそれ以上でも、組み込まれ得る。セルロース非加水分解性酵母（野生型酵母など）にこのような遺伝子組換えを行うことにより、エタノール生産量を増大した酵母が得られ得る。
【００３７】
１つの実施態様としては、セロビオヒドロラーゼおよびエンドグルカナーゼの少なくとも一方、または両方ともに表層提示または分泌され、そしてβ−グルコシダーゼが表層提示されるように組み込まれる。好ましくは、セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、およびβ−グルコシダーゼが表層提示され得る。
【００３８】
上述のようにして得られた形質転換酵母は、セルロースを加水分解する能力が付与され、そして強化された酵母となる。本明細書中では、このようなセルロースを加水分解する能力が付与され、そして強化された形質転換酵母を、「セルロース加水分解力強化酵母」ともいう。
【００３９】
以下、セルロース加水分解力強化酵母の作製（すなわち、形質転換酵母の作製）について説明するが、これらに限定されない。
【００４０】
発現を目的とする酵素の遺伝子は、酵素を産生する微生物から、既知の配列情報に基づいてプライマーまたはプローブを設計してＰＣＲまたはハイブリダイゼーション法などによって取得し得る。
【００４１】
酵素遺伝子を用いて発現カセットを構築し得る。発現カセットは、その遺伝子の発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節因子を含み得る。プロモーターまたはターミネーターは、発現を目的とする遺伝子自身のものであっても、他の遺伝子由来のものを利用してもよい。プロモーターおよびターミネーターとしては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３’−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＧＡＰ（グリセルアルデヒド３’−リン酸）などのプロモーターおよびターミネーターを利用し得るが、プロモーターおよびターミネーターの選択は、目的の酵素遺伝子の発現に依存し、当業者によって適宜選択され得る。必要に応じて、さらなる発現を調節する因子（例えば、オペレーターおよびエンハンサー）などをさらに含み得る。オペレーター、エンハンサーなどの発現調節因子についても、当業者によって適宜選択され得る。発現カセットは、この遺伝子の発現の目的に応じて、必要な機能配列をさらに含むこともできる。発現カセットは、必要に応じてリンカーも含み得る。
【００４２】
酵母への酵素の表層提示発現のために、細胞表層工学の技術を利用し得る。例えば、（ａ）細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを介して細胞表層に提示する方法、（ｂ）細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメインを介して細胞表層に提示する方法、および（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を介して細胞表層に提示する方法があるが、これらに限定されない。細胞表層工学の技術は、例えば、特許文献１および２にも記載される。
【００４３】
用いられ得る細胞表層局在タンパク質としては、酵母の性凝集タンパク質であるα−またはａ−アグルチニン（ＧＰＩアンカーとして使用）、Ｆｌｏ１タンパク質（Ｆｌｏ１タンパク質は、Ｎ末端側のアミノ酸長を種々改変して、ＧＰＩアンカーとして使用し得る：例えば、Ｆｌｏ４２、Ｆｌｏ１０２、Ｆｌｏ１４６、Ｆｌｏ３１８、Ｆｌｏ４２８など；非特許文献２：なお、Ｆｌｏ１３２６とは、全長Ｆｌｏ１タンパク質を表す）、Ｆｌｏタンパク質（ＧＰＩアンカー機能を有さず凝集性を利用する、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇ；非特許文献３）、ペリプラズム局在タンパク質であるインベルターゼ（ＧＰＩアンカーを利用しない）などが挙げられる。
【００４４】
まず、（ａ）ＧＰＩアンカーを利用する方法について説明する。ＧＰＩアンカーにより細胞表層に局在するタンパク質をコードする遺伝子は、Ｎ末端側から順に、分泌シグナル配列、細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質ドメイン）、およびＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をそれぞれコードする遺伝子を有している。細胞内でこの遺伝子から発現された細胞表層局在タンパク質（糖鎖結合タンパク質）は、分泌シグナルにより細胞膜外へ導かれ、その際、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列は、選択的に切断されたＣ末端部分を介して細胞膜のＧＰＩアンカーと結合して細胞膜に固定される。その後、ＰＩ−ＰＬＣにより、ＧＰＩアンカーの根元付近で切断され、細胞壁に組み込まれて細胞表層に固定され、細胞表層に提示される。
【００４５】
ここで、分泌シグナル配列とは、一般に細胞外（ペリプラズムも含む）に分泌されるタンパク質（分泌性タンパク質）のＮ末端に結合している、疎水性に富んだアミノ酸を多く含むアミノ酸配列をいい、通常、分泌性タンパク質が細胞内から細胞膜を通過して細胞外へ分泌される際に除去される。発現産物を細胞膜へ導くことができる分泌シグナル配列であれば、どのような分泌シグナル配列でも用いられ得、起源は問わない。例えば、分泌シグナル配列としては、グルコアミラーゼの分泌シグナル配列、酵母のα−またはａ−アグルチニンのシグナル配列、発現産物自身の分泌シグナル配列などが好適に用いられる。細胞表層結合性タンパク質に融合している他のタンパク質の活性に影響を及ぼさないのであれば、分泌シグナル配列およびプロ配列の一部または全部がＮ末端に残ってもよい。
【００４６】
ここで、ＧＰＩアンカーとは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）と呼ばれるエタノールアミンリン酸−６マンノースα１−２マンノースα１−６マンノースα１−４グルコサミンα１−６イノシトールリン脂質を基本構造とする糖脂質をいい、ＰＩ−ＰＬＣとは、ホスファチジルイノシトール依存性ホスホリパーゼＣをいう。
【００４７】
ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列とは、ＧＰＩアンカーが細胞表層局在タンパク質と結合する際に認識される配列であり、通常、細胞表層局在タンパク質のＣ末端あるいはその近傍に位置する。ＧＰＩアンカー付着シグナル配列としては、例えば酵母のα−アグルチニンのＣ末端部分の配列が好適に用いられる。上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列のＣ末端側には、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列が含まれるので、上記方法に使用する遺伝子としては、このＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列が特に有用である。
【００４８】
したがって、例えば、分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子−ＧＰＩアンカー付着認識シグナルをコードするＤＮＡ配列を有する配列において、この細胞表層局在タンパク質をコードする構造遺伝子の全部または一部の配列を、目的とする酵素をコードするＤＮＡ配列に置換することにより、ＧＰＩアンカーを介して目的の酵素を細胞表層に提示するための組換えＤＮＡが得られる。細胞表層局在タンパク質がα−アグルチニンである場合、上記α−アグルチニンのＣ末端から３２０アミノ酸の配列をコードする配列を残すように、目的の酵素をコードするＤＮＡを導入することが好ましい。このため、「α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域」が利用され得る。このようなＤＮＡを酵母に導入して発現させることによって細胞表層に提示された酵素は、そのＣ末端側が表層に固定されている。
【００４９】
次に、（ｂ）糖鎖結合タンパク質ドメインを利用する方法について説明する。細胞表層局在タンパク質が糖鎖結合タンパク質である場合、その糖鎖結合タンパク質ドメインは、複数の糖鎖を有し、この糖鎖が細胞壁中の糖鎖と相互作用または絡み合うことによって、細胞表層に留まることが可能である。例えば、レクチン、レクチン様タンパク質などの糖鎖結合部位などが挙げられる。代表的には、ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメイン、ＦＬＯタンパク質の凝集機能ドメインが挙げられる。ＧＰＩアンカータンパク質の凝集機能ドメインとは、ＧＰＩアンカリングドメインよりもＮ末端側にあり、複数の糖鎖を有し、凝集に関与していると考えられているドメインをいう。
【００５０】
この細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）と目的の酵素とを結合することにより、細胞表層に酵素が提示される。目的の酵素の種類により、細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）の（１）Ｎ末端側に酵素を結合させる、（２）Ｃ末端側に酵素を結合させる、および（３）Ｎ末端側およびＣ末端側の両方に、同一または異なる酵素を結合させることができる。本発明においては、（１）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子；あるいは（２）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする遺伝子；あるいは（３）分泌シグナル配列をコードするＤＮＡ−目的とする酵素をコードする第一の遺伝子−細胞表層局在タンパク質の糖鎖結合タンパク質ドメイン（または凝集機能ドメイン）をコードする構造遺伝子−目的とする酵素をコードする第二の遺伝子（但し、第一の遺伝子と第二の遺伝子とは同じでも異なっていてもよい）、を作成することにより、細胞表層に目的の酵素を提示するための組換えＤＮＡが得られる。凝集機能ドメインを利用する場合、ＧＰＩアンカーは細胞表層の提示には関与しないので、組換えＤＮＡ中に、ＧＰＩアンカー付着認識シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、一部のみ存在してもよいが、存在しなくてもよい。また、凝集機能ドメインを用いる場合は、ドメインの長さを調節しやすいため（例えば、ＦｌｏｓｈｏｒｔまたはＦｌｏｌｏｎｇのいずれかを選択できる）、より適切な長さで酵素を細胞表層に提示できる点で、ならびに酵素のＮ末端またはＣ末端のどちらの側でも結合させることが可能な点で、非常に有用である。
【００５１】
次に、（ｃ）ペリプラズム遊離型タンパク質（他のレセプター分子または標的レセプター分子）を利用する方法について説明する。この場合は、目的とする酵素を、ペリプラズム遊離型タンパク質との融合タンパク質として細胞表層に発現させ得ることに基づく。ペリプラズム遊離型タンパク質としては、例えば、インベルターゼ（Ｓｕｃ２タンパク質）が挙げられる。目的の酵素は、これらのペリプラズム遊離型タンパク質に応じて、適宜Ｎ末端またはＣ末端側に融合され得る。
【００５２】
酵母にて酵素を細胞外に分泌して発現させる方法は、当業者には周知である。上記分泌シグナル配列をコードするＤＮＡに、目的の酵素の構造遺伝子を連結した組換えＤＮＡを作成し、酵母に導入すればよい。
【００５３】
酵母の細胞内にて遺伝子を発現させる方法もまた当然、当業者には周知である。この場合、上記細胞表層提示技術や上記分泌シグナルを用いることなく、目的の構造遺伝子を連結した組換え遺伝子を作成し、酵母に導入すればよい。
【００５４】
各種配列を含むＤＮＡの合成および結合は、当業者が通常用い得る技術で行われ得る。例えば、分泌シグナル配列と目的酵素の構造遺伝子との結合は、部位特異的突然変異法を用いて行うことができる。この方法を用いることにより、正確な分泌シグナル配列の切断および活性な酵素の発現が可能である。
【００５５】
酵素遺伝子または発現カセットは、プラスミドの形態のベクターに挿入され得る。ＤＮＡの取得の簡易化の点からは、酵母と大腸菌とのシャトルベクターであることが好ましい。必要に応じて、ベクターは、上述したような調節配列を含み得る。ベクター作製の出発材料としては、例えば、酵母の２μｍプラスミドの複製開始点（Ori）とColE1の複製開始点とを有しており、酵母選択マーカー（例えば、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子（例えば、イミダゾールグリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ３）をコードする遺伝子、リンゴ酸ベータ−イソプロピルデヒドロゲナーゼ（ＬＥＵ２）をコードする遺伝子、トリプトファンシンターゼ（ＴＲＰ５）をコードする遺伝子、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＲＧ４）をコードする遺伝子、Ｎ−（５'−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラーゼ（ＴＲＰ１）をコードする遺伝子、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ＨＩＳ４）をコードする遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼ（ＵＲＡ３）をコードする遺伝子、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ１）をコードする遺伝子、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）をコードする遺伝子、およびアルファ−アミノアジピン酸レダクターゼ（ＬＹＳ２）をコードする遺伝子など）および大腸菌の選択マーカー（薬剤耐性遺伝子など）を有することがさらに好ましい。
【００５６】
本明細書で遺伝子またはＤＮＡの「導入」とは、細胞の中に遺伝子またはＤＮＡを導入するだけでなく、発現させることも意味する。遺伝子またはＤＮＡの導入には、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクション、エレクトロポレーションなどの方法がある。酵母細胞への導入の場合、具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法、プロトプラスト法などがある。導入されるＤＮＡは、プラスミドの形態で存在してもよく、あるいは宿主の遺伝子に挿入して、または宿主の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。
【００５７】
宿主の酵母は、セルロース非加水分解性酵母であり、これは、野生型酵母であり得る。酵母の種類は特には限定されないが、特に、サッカロマイセス属に属する酵母が好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）が好ましい。好ましくは、実用酵母の野生型酵母である。野生型酵母は、基質である単糖（例えば、グルコース）からのアルコールの発酵能を高めるように遺伝子組換えされていてもよい。
【００５８】
「実用酵母」とは、従来エタノール発酵に用いられる任意の酵母（例えば、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、ビール酵母、パン酵母など）をいう。実用酵母の中でも、高いエタノール発酵能および高いエタノール耐性を有し、遺伝学的にも安定した清酒酵母が好ましい。「実用酵母」は、高いエタノール耐性を有する酵母であり、好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる酵母である。さらに耐酸性、耐熱性などを有することが好ましい。さらに好ましくは、凝集性であり得る。例えば、このような性質を有する実用酵母としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構により入手可能であるサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１４４０株（ＭＡＴα、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性あり）およびＮＢＲＣ１４４５株（ＭＡＴａ、１倍体酵母、耐熱性・耐酸性あり、凝集性なし）が挙げられる。
【００５９】
実用酵母は、エタノールに極めて高い耐性を有するため、単糖を生産した後、そのままエタノール発酵に供することができる。中でも、各種培養ストレスに強いことから、厳密な制御が難しく過酷な培養条件になる場合もある工業生産においても安定した細胞増殖を示す点で好ましい。また実用酵母は多倍体となるため、相同染色体に複数の遺伝子構築物（発現ベクター）を組み込むことが可能であり、その結果一倍体であることが多い実験室酵母に組み込む場合に較べて、目的タンパク質の発現量が高くなる。
【００６０】
実用酵母は、多くの場合原栄養体であって形質転換体を選抜するための適切な栄養要求性マーカーを有しない。したがって目的の遺伝子を導入するに適した特定の栄養要求性マーカーを、実用酵母（特に、栄養要求性を有しない酵母であって、エタノール耐性の高い（好ましくは、エタノール濃度１０％以上でも生存できる）酵母）に付与することにより、目的の遺伝子の導入が容易になる。栄養要求性マーカーとしては、その遺伝子操作上の利用から、ウラシル要求性、トリプトファン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性などが挙げられるがこれらに限定されない。ウラシル要求性に関しては、ウラシル要求性変異株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエＭＴ−８株）から獲得したｕｒａ３−断片を実用酵母の正常ｕｒａ３遺伝子と乗り換えさせることによって付与することができる。ウラシル要求性以外の栄養要求性（例えば、トリプトファン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性など）に関しては、例えば、非特許文献４に記載の方法に準じて、これらの遺伝子を破壊するようにフラグメントを設計して付与することができる。
【００６１】
上記発現カセットが組み込まれて発現を目的とする遺伝子が導入された実用酵母は、上で説明したように、酵母選択マーカー（例えば、上述した栄養要求性マーカー）で選択され得る。さらに、発現されたタンパク質の活性を測定することによって確認され得る。タンパク質が細胞表層に固定されていることは、例えば、抗タンパク質抗体とＦＩＴＣ標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認し得る。
【００６２】
（エタノールの製造）
上述したようなセルロース加水分解力強化酵母は、エタノールの生産に好適に使用され得る。エタノールの生産のために、セルロース加水分解力強化酵母をセルロース基質（例えば、以下に説明するようなセルロース系物質）に反応させ得る。
【００６３】
用語「セルロース系物質」は、本明細書中においては、セルロースを含有する任意の物質、産物、および組成物をいう。用語「セルロース」とは、β１，４−グルコシド結合によりグルコピラノースが連なった繊維状高分子をいうが、その誘導体または塩、あるいは分解により重合度が低下したものもまた含む。
【００６４】
「セルロース系物質」には、例えば、紙の製造または再生において生じる紙粕、古着および廃タオルなどの綿製品、ならびに農業上収穫されずにまたは食品製造の過程で廃棄される木材の木質部もしくは草本性植物の茎葉部および皮部（特に非可食部）のような、セルロースが含まれている任意の材料をも包含される。「セルロース系物質」には、セルロースがカルボキシメチル化されたカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、リン酸膨潤セルロース、および結晶性セルロース（例えば、アビセル）などのセルロース化合物もまた含まれ得る。セルロース化合物の中でも、リン酸膨潤セルロースは、セルロースを加水分解し得る酵素のセルロース加水分解力を測定するために、実際のバイオマスのセルロースの代替基質としてよく用いられるセルロースである。
【００６５】
上記で例示したセルロースが含まれている材料（特に、木材の木質部、ならびに草本性植物の茎葉部および皮部）は、セルロースを主成分の１つとする植物細胞壁成分を含み得る。植物細胞壁は、通常、セルロースに加え、ヘミセルロースおよびリグニンを成分に含む。植物種（特に、木材であるかまたは草本性であるか）または植物の生育程度などに依存してそれらの成分の含有量は変動し得るが、セルロースを含む限りいずれの種でも生育の程度に関わらず用いられ得る。
【００６６】
したがって、セルロース系物質としては、上述した植物細胞壁成分を含有する任意の物質および廃棄物および産物もまた挙げられる。不溶性食物繊維もまた、「植物細胞壁成分含有物」に含まれる。上述した木材の木質部や草本性植物の茎葉部・皮部に加え、これらの部分から加工したもの（例えば、コーンファイバー）も含むが、本発明は、廃棄される不要物を用いることが再利用の点で好ましい。
【００６７】
セルロース系物質としては、セルロース化合物自体およびセルロース化合物を含む組成物に加え、籾殻、竹、バガス、ワラ類、トウモロコシ穂軸などの農産廃棄物、木材質（木材チップ、廃材）、古新聞、雑誌、段ボール、オフィス古紙、リンター、綿、パルプ及び製紙メーカーから排出する廃パルプなどが挙げられる。
【００６８】
上記反応には、セルラーゼ酵素が含まれてもよい。「セルラーゼ酵素」とは、酵素として単離された任意の形態を含む。例えば、「セルラーゼ酵素」としては、上で説明したようなセルラーゼ（すなわち、エンドグルカナーゼ）を生産する微生物から単離精製された酵素、およびセルラーゼ遺伝子を用いて遺伝子組換えにより生産された酵素が挙げられる。市販のセルラーゼ酵素も使用可能である。市販のセルラーゼ酵素としては、例えば、ジェネンコア社のCellulase SS：トリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼ：力価7.6FPU/mL（「FPU」は「Filter Paper Unit」の略であり、ろ紙から１分間に１μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量が「1FPU」とされる）が挙げられる。特に、エタノールを工業的に製造する場合、生産効率を促進するために、セルロース系物質との反応の際に、セルラーゼ酵素をさらに添加してもよい。
【００６９】
上記反応に、ヘミセルロース分解性キシロース資化性酵母をさらに添加してもよい。この酵母は、以下のように作製され得る。キシロースは、セルロースを主成分の１つとする植物細胞壁成分に含まれるヘミセルロースから、酵素分解により得られる。キシロース資化性のために、キシロース資化性遺伝子および／またはキシラン分解酵素をコードする遺伝子を発現する酵母（好ましくは、実用酵母）を別に作製することによって、ヘミセルロースに由来するキシロースをもエタノール発酵に利用し得る。ヘミセルロースを分解する酵素（例えば、キシラン分解酵素）が実用酵母の細胞表層に提示していることが好ましい。キシラン分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ（特にトリコデルマ・リーセイ由来のＸＹＬＩＩ）およびβ−キシロシダーゼ（アスペルギルス・オリゼ由来のＸｙｌＡ）が挙げられる。キシロース資化性遺伝子としては、キシロース代謝系酵素の遺伝子、例えば、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子（ともにピチア・スチピチス（Pichia stipitis）由来）ならびにキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子（サッカロマイセス・セレビシエ由来）が挙げられる。
【００７０】
例えば、キシラン分解（ヘミセルロース分解）およびキシロース資化性の両方を有する実用酵母を作製するために、キシラナーゼ（特にトリコデルマ・リーセイ由来のＸＹＬＩＩ（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ６９５７４；Ｓ５１９７５））およびβ−キシロシダーゼ（アスペルギルス・オリゼ由来のＸｙｌＡ（ＩＮＳＤアクセッション番号ＡＢ０１３８５１））を細胞表層に発現し、かつキシロース資化性遺伝子（特に、ピチア・スチピチス由来のキシロースレダクターゼ（ＸＲ）遺伝子ＸＹＬ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５９４６５）、ピチア・スチピチス由来のキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）遺伝子であるＸＹＬ２（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ５５３９２）、およびサッカロマイセス・セレビシエ由来のキシルロキナーゼ（ＸＫ）遺伝子であるＸＫＳ１（ＩＮＳＤアクセッション番号Ｘ８２４０８））を発現するように組換え調製し得る。発現ベクターの構築および形質転換に関しては、非特許文献１、および非特許文献５〜７に記載されている。この組換え調製により得られた酵母を、ヘミセルロース分解性キシロース資化性酵母ともいう。形質転換酵母の組換え調製に関しては、上述に記載したようにも実施され得る。
【００７１】
上記反応工程は、通常エタノール発酵を行う条件下で行い得る。この反応の工程を、本明細書中では、発酵工程ともいう。例えば、発酵工程は、セルロース系物質を含む培地で酵母を培養することで行われ得る。発酵工程は、通常、エタノール発酵を行う条件下で行われ得る。発酵培地には、酵母の生育に必要または望ましい成分がさらに含められ得る。この発酵工程の形式としては、回分（バッチ）工程、流加回分工程、繰り返し回分工程、連続工程などが挙げられるが、これらのいずれであってもよい。また、発酵時の温度は、通常、約30〜35℃であり得る。発酵pHは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。発酵培養は嫌気的に行われ得る（溶存酸素濃度は、例えば、約１ppm以下、より好ましくは約0.1ppm以下、よりさらに好ましくは約0.05ppm以下であり得る）。酵母の負荷量、セルロース系物質の負荷量、および発酵時間などの要因は、発酵反応の容量、エタノールの目的生産量などの要件に依存して適宜決定され得る。
【００７２】
発酵の進行とともにエタノールの発酵条件が変化するので、これらを一定の範囲に調節することが好ましい。発酵の経時変化は、例えば、ガスクロマトグラフ、ＨＰＬＣなどの当業者が通常用いる手段でモニターすればよい。
【００７３】
セルロース系物質は、発酵工程に供する前に、加圧熱水処理を行ってもよい。加圧熱水処理としては、例えば、特許文献１に記載されるような無触媒水熱法が挙げられる。この無触媒水熱法を用いて、例えば、適当な長さのセルロース単位あるいはオリゴ糖を形成する、あるいは繊維間（例えば、セルロース間）の架橋が外れ、セルロース分解酵素が作用し易くなるように、処理してもよい。特許文献１に記載の方法では、回分（バッチ）式の場合、処理する濃度にも依存するが、約１０質量％濃度の、原料のセルロース繊維を１２０〜３００℃、好ましくは１５０〜２８０℃、より好ましくは１８０〜２５０℃で処理され得、そして処理時間は、一般に、１時間〜１５秒の範囲が好ましい。連続法の場合、熱履歴時間の関係で若干温度を高くでき、約１０質量％濃度の原料のセルロース繊維を１２０〜３７３℃、好ましくは１５０〜３２０℃で、好ましくは１時間〜１秒で処理し得る。なお、加圧は、上記範囲内の温度が達成され得る程度の圧力が、装置により自動または手動で設定され得る。
【００７４】
木材の木質部や草本性植物の茎葉部および皮部（バイオマス）は、リグニンのような非糖化部が予め除去され得る。リグニンの除去には、加圧熱水処理が使用され得る。加圧熱水処理は、酸またはアルカリなどの薬剤を用いることなくリグニンを除去できるので好ましい。このような加圧熱水処理としては、特許文献１に記載の方法が用いられ得る。特許文献３に記載の方法もまた用いられ得る。特許文献３の方法では、常圧以上５ＭＰａ以下、かつ１８０℃以上３７４℃以下の熱水でバイオマスを処理し、次いで１００℃以上１８０℃以下に冷却することにより、リグニンを分離することができる。
【００７５】
発酵工程に供する前に、例えば、特許文献１に記載の方法に従って、セルロース系物質を加圧熱水処理し得る。これにより、リグニン（存在する場合）は除去され、そしてセルロースは、セルロースを加水分解し得る酵素が作用し易くなるように処理され得る。
【００７６】
発酵工程終了後、エタノールを含む培地を発酵槽から抜き取り、例えば、遠心分離機による分離操作および蒸留操作などの当業者が通常用いる分離工程によって、エタノールが単離される。
【００７７】
セルロース加水分解力強化酵母（必要に応じて、およびヘミセルロース分解性キシロース資化性酵母、ならびにセルラーゼ酵素）は、好ましくは、担体に固定される。そのことにより、再使用が可能となる。
【００７８】
固定する担体および方法は、当業者が通常用いる担体および方法が用いられ、例えば、担体結合法、包括法、架橋法などが挙げられる。
【００７９】
担体としては、多孔質体が好ましく用いられる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォーム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂多孔質体、シリコンフォームなどの発泡体あるいは樹脂が好ましい。多孔質体の開口部の大きさは、用いる微生物およびその大きさを考慮して決定され得るが、実用酵母の場合、50〜1000μｍが好ましい。
【００８０】
また、担体の形状は問わない。担体の強度、培養効率などを考慮すると、球状あるいは立方体が好ましい。大きさは、用いる微生物により決定すればよいが、一般には、球状の場合、直径が2〜50ｍｍ、立方体状の場合、2〜50ｍｍ角が好ましい。
【００８１】
酵母は、発酵に供する前に好気的条件下で培養することにより、その数を増加させ得る。培地は、選択培地であっても非選択培地であってもよい。培養時の培地のｐＨは、好ましくは約４〜約６、より好ましくは約５である。好気的培養時の培地中の溶存酸素濃度は、好ましくは約0.5〜約６ppm、より好ましくは約１〜約４ppm、よりさらに好ましくは約２ppmである。また、培養時の温度は、約20〜約45℃、好ましくは約25〜約35℃、より好ましくは約30℃であり得る。培養時間は、総酵母の菌体濃度が20g（湿潤量）/L以上、より好ましくは50g（湿潤量）/L、さらに好ましくは75g（湿潤量）/L以上になるまで培養することが好ましく、約20〜約50時間程度であり得る。
【００８２】
従来、糖化に使用される市販の酵素の力価が低いことにより十分な糖化には酵素を大量に必要とするので、使用酵素のコストが高くなるという問題があった。セルロース加水分解力強化酵母を用いることにより、特に工業的製造において好適なエタノール生産量または速度を達成するのに要するセルラーゼ酵素の量を削減することができる。さらに、ヘミセルロース分解性キシロース資化性酵母を併用して、エタノール生産量を高め得る。
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００８４】
本実施例で用いた菌株サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）およびサッカロマイセス・セレビシエMT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）は、独立行政法人製品評価技術基盤機構から入手した。【００８５】
本実施例に示す全てのＰＣＲ増幅は、KOD-Plus-DNAポリメラーゼ（東洋紡社）を用いて実施した。【００８６】
本実施例に示す全ての酵母形質転換は、YEAST MAKER酵母形質転換システム（Clontech Laboratories, Palo Alto, California, USA）を用いて酢酸リチウムによって実施した。【００８７】
（調製例１：ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２の栄養要求性マーカーを付与した酵母の調製）
（調製例１−１：ＵＲＡ３マーカーの付与）
変異ＵＲＡ３断片を、サッカロマイセス・セレビシエMT8-1（MATa ade his3 leu2 trp1 ura3）から、配列番号１および配列番号２で示されるプライマー対を用いてＰＣＲにより取得した。この断片をサッカロマイセス・セレビシエNBRC1440（MATα）株に形質転換し、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地でＵＲＡ３変異株を選択し、ＵＲＡ３マーカーが付与されたNBRC1440株を得た。【００８８】
なお、５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）培地は以下のように調製した。50mg/Lウラシル酸および２％（w/v）寒天を添加したウラシルドロップアウト合成デキストロース（ＳＤ）培地（非特許文献８）をオートクレーブ処理し、６５℃を維持した。ＦＯＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に100mg/mLの濃度で溶解し、約６５℃の上記オートクレーブした培地に添加し、ＦＯＡの最終濃度を1mg/mLとした。【００８９】
（調製例１−２：ＨＩＳ３マーカーの付与）
以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、HIS3-Green U（配列番号３；Forward）およびHIS3-Green R（配列番号４；Reverse）プライマーを用いて、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いてＨＩＳ３上流部分配列を増幅した；
ＰＣＲ２、URA3 fragment（配列番号５；Forward）およびHIS3-40Uc（配列番号６；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてｐＲＳ４０６プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いてＵＲＡ３を増幅した；
ＰＣＲ３、HIS3-Green U（配列番号３；Forward）およびHIS3-40Uc（配列番号６；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合することにより融合フラグメントを増幅した。【００９０】
この得られた融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３マーカーが付与されたNBRC1440株を相同組換えにより形質転換した。ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。この構築物が上記実用酵母NBRC1440の染色体に組み込まれると同時にＨＩＳ３遺伝子破壊が生じ、ＵＲＡ３マーカーおよびその両側の反復配列とが染色体内に組み込まれる。【００９１】
引き続き、この形質転換体を３０℃にて２４時間、ＹＰＤ培地中で増殖させた。次いで５−ＦＯＡ培地プレート上で1.0×107細胞／200μLまで増殖させた。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した全てのコロニーは、ウラシル要求性（Ｕｒａ−）の表現型であり、これを選択した。５−ＦＯＡ培地プレート上で増殖した形質転換体では、ＵＲＡ３マーカーの両側にある反復配列により生じた相同組換えのため、形質転換により導入されたはずのＵＲＡ３マーカーが染色体上から除去され、ウラシル栄養要求性（Ｕｒａ−）の表現型を示していた。【００９２】
最終的に、ＨＩＳ３遺伝子およびＵＲＡ３遺伝子が欠失してこれらの栄養要求性を有する株、すなわち、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３マーカーが付与されたNBRC1440株が得られた。【００９３】
（調製例１−３：ＴＲＰ１マーカーの付与）
以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、TRP1-988（配列番号７；Forward）およびRP1-28r（配列番号８；Reverse）プライマーを用いて、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いてＴＲＰ１上流部分配列を増幅した；
ＰＣＲ２、TRP1-URA3（配列番号９；Forward）およびTRP1-40r（配列番号１０；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてｐＲＳ４０６プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いてＵＲＡ３を増幅した；
ＰＣＲ３、TRP1-988（配列番号７；Forward）およびTRP1-40r（配列番号１０；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合することにより融合フラグメントを増幅した。【００９４】
この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＨＩＳ３およびＵＲＡ３マーカーが付与されたNBRC1440株を、調製例１−２と同様にして形質転換し、最終的に、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１マーカーが付与されたNBRC1440株を得た。【００９５】
（調製例１−４：ＬＥＵ２マーカーの付与）
以下のようにして融合ＰＣＲを実施した：
ＰＣＲ１、LEU2-UP 3rd（配列番号１１；Forward）およびLEU2-down 3rd（配列番号１２；Reverse）プライマーを用いて、サッカロマイセス・セレビシエNBRC1440株の染色体ＤＮＡを鋳型として用いてＬＥＵ２上流部分配列を増幅した；
ＰＣＲ２、LEU2-URA3 3rd（配列番号１３；Forward）およびLEU2-40r（配列番号１４；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてｐＲＳ４０６プラスミド（Stratagene社）を鋳型として用いてＵＲＡ３を増幅した；
ＰＣＲ３、LEU2-UP 3rd（配列番号１１；Forward）およびLEU2-40r（配列番号１４；Reverse）プライマーを用いて、鋳型としてＰＣＲ１およびＰＣＲ２での産物を混合することにより融合フラグメントを増幅した。【００９６】
この融合フラグメントを用いて、上記のように調製されたＵＲＡ３、ＨＩＳ３、およびＴＲＰ１マーカーが付与されたNBRC1440株を、調製例１−２と同様にして形質転換し、最終的に、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、およびＬＥＵ２マーカーが付与されたNBRC1440株を得た。この株を、便宜上、「NBRC1440/UHWL」と表す。
【００９７】
（調製例２：pRS406 EG CBH2の調製）
まず、ウラシル遺伝子（ＵＲＡ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）由来エンドグルカナーゼII（ＥＧII）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK406 EGを構築した。【００９８】
リゾプス・オリゼ（Rhizopus oryzae）由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列とＥＧII遺伝子とα−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域（非特許文献９）をコードする2719bp DNAフラグメントを、鋳型としてpEG23u31H6（非特許文献１０）を用い、配列番号１５（Forward）および配列番号１６（Reverse）のプライマー対を用いるＰＣＲによって調製した。【００９９】
２つのＤＮＡ断片、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターおよびＰＧＫターミネーターを、サッカロマイセス・セレビシエBY4741ゲノムＤＮＡを鋳型として、それぞれ設計したＰＧＫプロモーター用プライマー対（配列番号１７；Forwardおよび配列番号１８；Reverse）およびＰＧＫターミネーター用プライマー対（配列番号１９；Forwardおよび配列番号２０；Reverse）を用いてＰＣＲ増幅した。マルチクローニングサイトを、設計したマルチクローニングサイト用プライマー対（配列番号２１；Forwardおよび配列番号２２；Reverse）をアニーリングすることにより調製した。ＰＧＫプロモーターをXhoIおよびNheIで、マルチクローニングサイトをNheIとBglIIで、ＰＧＫターミネーターをBglIIおよびNotIでそれぞれ消化し、pTA2ベクター（TOYOBO, Osaka, Japan）のXhoI−NotI部位にクローニングした。得られたベクターをXhoIおよびNotIで消化し、その断片をpRS406（Stratagene）へクローニングし、得られたベクターをpGK406とした。【０１００】
上記2719bp ＤＮＡフラグメントをNheIおよびXmaIで消化し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、ＰＧＫターミネーターを含むプラスミドpGK406のNheI部位とXmaI部位との間に挿入し、ＵＲＡ３遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、エンドグルカナーゼ（ＥＧII）遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＰＧＫターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpGK406 EGと命名した。【０１０１】
プラスミドpFCBH2w3（非特許文献１１）を鋳型とし、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を、プライマー対（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）によりＰＣＲで増幅した。得られた断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpGK406 EGにクローニングした。得られたプラスミドをpRS406 EG CBH2とし、その模式図を図１に示す。図１中、「ＵＲＡ３」はウラシル遺伝子マーカー、「ＧＡＰＤＨ」はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、「ＰＧＫ」はホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、「s.s.」は、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、「ＡＧ」は、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、「ＥＧ」は、トリコデルマ・リーセイ由来ＥＧII遺伝子、「ＣＢＨ２」は、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ２遺伝子、「ｔＧＡＰ」はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼターミネーター、そして「ｔＰＧＫ」はホスホグリセリン酸キナーゼターミネーターを表す。【０１０２】
（調製例３：pRS403 EG CBH2の調製）
まず、ヒスチジン遺伝子（ＨＩＳ３）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII（ＥＧII）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK403 EGを構築した。【０１０３】
pGK406から、ApaIおよびNotIで、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を切り出し、同様にpRS403（Stratagene）をApaIおよびNotIで消化して上記した断片をクローニングした。得られたプラスミドをpGK403 EGとした。【０１０４】
プラスミドpFCBH2w3をテンプレートとし、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を、プライマー（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）によりＰＣＲで増幅した。得られた断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpGK403 EGにクローニングした。得られたプラスミドをpRS403 EG CBH2とし、その模式図を図２に示す。図２中、「ＨＩＳ３」はヒスチジン遺伝子マーカーを表し、それ以外の表記は図１と同様である。【０１０５】
（調製例４：pRS405 EG CBH2の調製）
まず、ロイシン遺伝子（ＬＥＵ２）マーカーを有し、かつトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼII（ＥＧII）遺伝子を表層提示されるように組み込むためのプラスミドpGK405 EGを構築した。【０１０６】
pGK406から、ApaIおよびNotIで、ＰＧＫプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、ＥＧII遺伝子、およびＰＧＫターミネーターを含む断片を切り出し、同様にApaIおよびNotIで消化したpRS405（Stratagene）にクローニングした。得られたプラスミドをpGK405 EGとした。【０１０７】
プラスミドpFCBH2w3をテンプレートとし、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を、プライマー（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）によりＰＣＲで増幅した。得られた断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpGK405 EGにクローニングした。得られたプラスミドをpRS405 EG CBH2とし、その模式図を図３に示す。図３中、「ＬＥＵ２」はロイシン遺伝子マーカーを表し、それ以外の表記は図１と同様である。【０１０８】
（調製例５：pILGP3-CBH2の調製）
pUGP3（非特許文献１２）を鋳型として、XYL2c-XhoI(F)（配列番号２５；Forward）およびXYL2c-NotI(R)（配列番号２６；Reverse）のプライマー対を用いて、ＧＡＰＤＨプロモーター、マルチクローニングサイト（SalI, XbaI, BamHI, SmaI, XmaI）、およびＧＡＰＤＨターミネーターをコードする遺伝子配列をＰＣＲ増幅した。その断片をpRS405（Stratagene）のXhoI/NotIサイトに導入してプラスミドpILGP3を得た。【０１０９】
上記調製例２から４に記載のように調製したプラスミドpFCBH2w3由来の2816bp ＤＮＡフラグメントをXmaIおよびXbaIで消化し、ＧＡＰＤＨプロモーターおよびＧＡＰＤＨターミネーターを含むプラスミドpILGP3のXmaI部位とXbaI部位との間に挿入し、ＬＥＵ２遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ２）遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpILGP3-CBH2と命名し、その模式図を図４に示す。図４中、「ＬＥＵ２」はロイシン遺伝子マーカーを表し、それ以外の表記は図１と同様である。【０１１０】
（調製例６：pRS405 CBH2 CBH2の調製）
プラスミドpFCBH2w3をテンプレートとし、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列とトリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子とα−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、ＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片をプライマー（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）によりＰＣＲで増幅した。得られた断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpILGP3-CBH2にクローニングした。得られたプラスミドをpRS405 CBH2 CBH2とし、その模式図を図５に示す。図５中、「ＬＥＵ２」はロイシン遺伝子マーカーを表し、それ以外の表記は図１と同様である。【０１１１】
（調製例７：pIWBGLの調製）
アスペルギルス・アクレアタス（Aspergillus aculeatus）由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）遺伝子をコードする2.5kbp NcoI-XhoI DNAフラグメントを、プラスミドpBG211（京都大学より贈与戴いた）を鋳型として使用し、bgl1プライマー１（配列番号２７；Forward）およびbgl1プライマー２（配列番号２８；Reverse）のプライマー対を用いてＰＣＲによって調製した。このＤＮＡフラグメントをNcoIおよびXhoIで消化し、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびα−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域（非特許文献９）を含有する細胞表層発現プラスミドpIHCS（非特許文献１０）のNcoI-XhoI部位に挿入した。得られたプラスミドをpIBG13と命名した。【０１１２】
このpIBG13をテンプレートにしてプライマー対（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）を用いてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ分泌シグナル配列、ＢＧＬ１遺伝子、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を得た。この断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpRS 404にクローニングした。得られたプラスミドをpIWBGLとし、その模式図を図６に示す。図６中、「ＴＲＰ１」はトリプトファン遺伝子マーカーを表し、「ＧＡＰＤＨ」はグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、「s.s.」は、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、「ＡＧ」は、α−アグルチニン遺伝子の３’側半分の領域、そして「ＢＧＬ」は、アスペルギルス・アクレアタス由来β−グルコシダーゼ１（ＢＧＬ１）遺伝子を表す。【０１１３】
（調製例８：コピー数１のエンドグルカナーゼIIを組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素NdeIで切断して直線状にしたpGK406 EGで、NBRC1440/UHWLを形質転換し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。pGK406 EGでの形質転換により、NBRC1440/UHWLの破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pGK406 EG」と命名した。本調製例８では、コピー数１のエンドグルカナーゼIIの表層提示株を作製した。【０１１４】
（調製例９：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素NdeIで切断して直線状にしたpRS406 EG CBH2で、NBRC1440/UHWLを形質転換し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。pRS406 EG CBH2での形質転換により、NBRC1440/UHWLの破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-1c」とも表記する。本調製例９では、コピー数１のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の表層提示株を作製した。【０１１５】
（調製例１０：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数２で組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素NdeIで切断して直線状にしたpRS403 EG CBH2で、NBRC1440/pRS406 EG CBH2を形質転換し、ヒスチジンドロップアウト（ヒスチジン不含培地）プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。pRS403 EG CBH2での形質転換により、NBRC1440/pRS406 EG CBH2の破壊されたＨＩＳ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-2c」とも表記する。本調製例１０では、コピー数２のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の表層提示株を作製した。【０１１６】
（調製例１１：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数３で組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素HpaIで切断して直線状にしたpRS405 EG CBH2で、NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2を形質転換し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。pRS405 EG CBH2での形質転換により、NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS403 EG CBH2/pRS405 EG CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-3c」とも表記する。本調製例１１では、コピー数３のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の表層提示株を作製した。【０１１７】
（調製例１２：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込み、さらにコピー数１のセロビオヒドロラーゼ２を組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素HpaIで切断して直線状にしたpILGP3-CBH2で、NBRC1440/pRS406 EG CBH2を形質転換し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。pILGP3-CBH2での形質転換により、NBRC1440/pRS406 EG CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pILGP3-CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-1c-CBH2」とも表記する。本調製例１２では、コピー数１のエンドグルカナーゼIIおよびコピー数２のセロビオヒドロラーゼ２の表層提示株を作製した。
【０１１８】
（調製例１３：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込み、さらにコピー数２のセロビオヒドロラーゼ２を組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素HpaIで切断して直線状にしたpRS405 CBH2 CBH2で、NBRC1440/pRS406 EG CBH2を形質転換し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。pRS405 CBH2 CBH2での形質転換により、NBRC1440/pRS406 EG CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/pRS406 EG CBH2/pRS405 CBH2 CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/EG-CBH2-1c-CBH2×2」とも表記する。本調製例１３では、コピー数１のエンドグルカナーゼIIおよびコピー数３のセロビオヒドロラーゼ２の表層提示株を作製した。
【０１１９】
（調製例１４：表層提示β−グルコシダーゼ１遺伝子の組み込み）
Bst1107Iで切断して直線状にしたpIWBGLで、NBRC1440/EG-CBH2-1c（調製例９）、NBRC1440/EG-CBH2-2c（調製例１０）、およびNBRC1440/EG-CBH2-3c（調製例１１）のそれぞれを形質転換した。トリプトファンドロップアウト（トリプトファン不含培地）プレート上でトリプトファン要求性を持たない株を選択した。pIWBGLでの形質転換により、各々の破壊されたＴＲＰ１遺伝子が復活することで、β−グルコシダーゼ１遺伝子の導入を確認した。したがって、コピー数１、２、または３のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の表層提示株にさらにβ−グルコシダーゼ１を表層提示した株が得られた。得られたそれぞれの形質転換株を、簡略化して、「NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL」、「NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL」、および「NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL」と表記する（便宜上、これらの形質転換株を「セルラーゼ表層提示酵母」ともいう）。【０１２０】
（実施例１：セルロース加水分解力評価）
上記調製例８から１３で得られた各種酵母を、リン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ；非特許文献１３により調製）と反応させることにより、それらのセルロース加水分解力を測定した。反応条件は次の通りである：50mM クエン酸緩衝液、10mg/mL ＰＳＣ、酵母OD600=3.0、反応時間２４時間。活性測定は、ＰＳＣを分解させ生じた還元糖をソモギ・ネルソン法により定量した。酵母１ｇ当たり、１分間に１μモルのグルコースに相当する還元力を生成する活性を１Ｕとした。【０１２１】
図７は、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを種々に発現する酵母のセルロース加水分解力を示すグラフである。図中、縦軸は、酵母細胞１ｇ当たりの酵素活性（ｍＵ／ｇ cell）を表す。図中、横軸の左から、以下の酵母株の結果を示す：
NBRC1440（図中「1440」）、
NBRC1440/pGK406 EG（図中「EG」；調製例８：コピー数１のエンドグルカナーゼIIを組み込んだ酵母株）、
NBRC1440/EG-CBH2-1c（図中「EG CBH2」；調製例９：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込んだ酵母株）、
NBRC1440/EG-CBH2-1c-CBH2（図中「EG CBH2」の「CBH2」；調製例１２：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込み、さらにコピー数１のセロビオヒドロラーゼ２を組み込んだ酵母株）、
NBRC1440/EG-CBH2-1c-CBH2×2（図中「EG CBH2」の「CBH2×2」；調製例１３：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込み、さらにコピー数２のセロビオヒドロラーゼ２を組み込んだ酵母株）、
NBRC1440/EG-CBH2-2c（図中「EG CBH2」の「×2」；調製例１０：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数２で組み込んだ酵母株）、および
NBRC1440/EG-CBH2-3c（図中「EG CBH2」の「×3」；調製例１１：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数３で組み込んだ酵母株）。【０１２２】
セルロース加水分解力の強化のために、最も加水分解が困難であると思われる結晶性部分の加水分解を高めるように、ＣＢＨ（結晶性セルロースに作用する）のコピー数を増加させることを図った。しかし、それよりもＣＢＨのコピー数を増加させると共にＥＧのコピー数を同時に増加させる方が、はるかにＰＳＣの分解力が向上することが分かった。【０１２３】
（実施例２：エタノール発酵試験）
実施例１では、「EG CBH2」の組み合わせでコピー数を増加させるごとにＰＳＣ分解活性が上昇した。よって、本実施例では、「EG CBH2」の２カセット（EGおよびCBH2の２つの遺伝子カセット）のベクターを１コピー、２コピー、および３コピー組み込んだ株をそれぞれ用いてＰＳＣからのエタノール発酵を行った。【０１２４】
本実施例では、調製例１４に記載したように、これら３種の株（NBRC1440/EG-CBH2-1c、NBRC1440/EG-CBH2-2c、NBRC1440/EG-CBH2-3c）にそれぞれpIWBGL（β-グルコシダーゼ表層提示発現ベクター）の組み込みを行った株を用いた。すなわち、「NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL」、「NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL」、および「NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL」の３種のセルラーゼ表層提示酵母を用いた。【０１２５】
酵母を、必須アミノ酸を添加したＳＤ培地（合成デキストロース培地：6.7g/Lのアミノ酸以外の酵母窒素源（yeast nitrogen base without amino acids）［Difco社製］と適切な補充物を含む；20g/Lのグルコースが単一炭素源として添加されている）中で２４時間、pH 約5.0で約３０℃にて好気的（溶存酸素濃度：約２ppm）に前培養し、次いで４８時間、ＹＰＤ培地（酵母エキス・ポリペプトン・デキストロース培地：10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、20g/Lのグルコースを含む）中で同様の条件下で培養した。培養上清と細胞ペレットとを４℃にて１０分間６，０００×ｇの遠心分離によって分離し、細胞ペレットを得た。【０１２６】
この細胞ペレットを、11.2g/LのＰＳＣ、10g/Lの酵母エキス、20g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種した。続く発酵は、約３０℃にて嫌気的（溶存酸素濃度：約0.05ppm）に実施した。発酵開始時には細胞濃度を75g/L（湿潤細胞）に調整した。加えたＰＳＣが11.2g/Lであることより、エタノールの理論収率は5.7g/Lとなる。【０１２７】
発酵中のエタノール濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ分析は、屈折率（ＲＩ）検出器（L-2490 RI detector、日立製作所）を用いることによって実施した。分離に用いたカラムは、Shim-pack SPR-Pb Column（島津製作所）であった。移動相として0.6mL/分の流速の水を用いてＨＰＬＣを８０℃にて操作した。【０１２８】
この結果を図８に示す。図８は、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼのコピー数を順次増大させた３種のセルラーゼ表層提示酵母NBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL、NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL、NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGLによるＰＳＣを材料とする発酵で生成されるエタノール量の経時変化を示すグラフである。図８において、左の縦軸はエタノール濃度（g/L）、そして横軸は経過時間（時間）を表す。黒丸はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とが共に３コピー）、黒三角はNBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL（エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とが共に２コピー）、そして黒四角はNBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL（エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とが共に１コピー）を組み込んだ酵母の産生エタノール量を表す。【０１２９】
１コピーのβ−グルコシダーゼに対し、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼのコピー数の増加と共にＰＳＣからのエタノール発酵収率が高くなることが示された。NBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL（これは、１コピーのβ−グルコシダーゼに対してエンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを３コピーで組み込んだ酵母である）は、48hでは、理論収率に対して52.6％の収率であった。【０１３０】
（調製例１５：セルラーゼ分泌酵母）
以下に、β−グルコシダーゼを表層提示するが、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼを分泌するように組み込んだ酵母（これを、便宜上、「セルラーゼ分泌酵母」ともいう）の調製手順を説明する。【０１３１】
（調製例１５−１：pRS403/ssEG2-CBH2プラスミド）
ヒスチジン遺伝子（HIS3）マーカーを有し、かつエンドグルカナーゼII（EGII）およびセロビオヒドロラーゼ２（CBH２）を分泌させるように組み込むためのプラスミドpRS403/ssEG2-CBH2を構築した。【０１３２】
pUGP3（非特許文献１２）を鋳型として、XYL2c-XhoI(F)（配列番号２５；Forward）およびXYL2c-NotI(R)（配列番号２６；Reverse）のプライマー対を用いて、ＧＡＰＤＨプロモーター、マルチクローニングサイト（SalI, XbaI, BamHI, SmaI, XmaI）、ＧＡＰＤＨターミネーターをコードする遺伝子配列をＰＣＲ増幅した。その断片をpRS403（Stratagene）のXhoI/NotIサイトに導入してプラスミドpIHGP3を得た。
【０１３３】
リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびトリコデルマ・リーセイ由来エンドグルカナーゼ（EGII）遺伝子を含む1308bp DNAフラグメントを、鋳型としてpEG23u31H6（非特許文献１０）を用い、配列番号２９（Forward）および配列番号３０（Reverse）のプライマー対を用いるPCRによって調製した。【０１３４】
上記1308bpDNAフラグメントをSmaIで消化し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、GAPDHターミネーターを含むプラスミドpIHGP3のSmaI部分に挿入し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、EGII遺伝子およびGAPDHターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpRS403/ssEG2と命名した。【０１３５】
リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列およびトリコデルマ・リーセイ由来CBH２遺伝子を含む1416bp DNAフラグメントを、プラスミドpFCBH2w3（非特許文献１１）を鋳型とし、配列番号３１（Forward）および配列番号３２（Reverse）のプライマー対を用いるPCRによって調製した。【０１３６】
上記1416bpDNAフラグメントをSmaIで消化し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、GAPDHターミネーターを含むプラスミドpIHGP3のSmaI部分に挿入し、HIS3遺伝子およびそのプロモーターおよびターミネーター、GAPDHプロモーター、グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、CBH２遺伝子およびGAPDHターミネーターを含むプラスミドが得られた。得られたプラスミドをpRS403/ssCBH2と命名した。【０１３７】
プラスミドpFCBH2w3をテンプレートとし、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド三リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、トリコデルマ・リーセイ由来ＣＢＨ２遺伝子、およびＧＡＰＤＨターミネーターを含む断片を、プライマー（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）によりＰＣＲで増幅した。得られた断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpRS403/ssEG2にクローニングした。得られたプラスミドをpRS403/ssEG2-CBH2と命名した。【０１３８】
（調製例１５−２：pRS405/ssEG2-CBH2プラスミド）
GAPDHプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、セロビオヒドロラーゼ２（CBH２）遺伝子およびGAPDHターミネーターを含む断片を、pRS403/ssCBH2をApaIおよびNotIで消化することで得た。【０１３９】
LEU2遺伝子マーカーを持つpRS405（Stratagene）をApaIおよびNotIで消化し、上記で得た断片を挿入した。得られたプラスミドをpRS405/ssCBH2と命名した。【０１４０】
プラスミドpRS403/ssEG2をテンプレートにして、プライマー（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）によりＰＣＲで増幅した。得られた断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpRS405/ssCBH2にクローニングした。得られたプラスミドをpRS405/ssEG2-CBH2と命名した。【０１４１】
（調製例１５−３：pRS406/ssEG2-CBH2プラスミド）
GAPDHプロモーター、リゾプス・オリゼ由来グルコアミラーゼ遺伝子の分泌シグナル配列、セロビオヒドロラーゼ２（CBH２）遺伝子およびGAPDHターミネーターを含む断片を、pRS403/ssCBH2をApaIおよびNotIで消化することで得た。【０１４２】
URA3遺伝子マーカーを持つpRS406（Stratagene）をApaI, NotIで消化し、上記で得た断片を挿入した。得られたプラスミドをpRS406/ssCBH2と命名した。【０１４３】
プラスミドpRS403/ssEG2をテンプレートにして、プライマー（配列番号２３；Forwardおよび配列番号２４；Reverse）によりＰＣＲで増幅した。得られた断片をNotIで消化し、そしてNotIで消化したpRS406/ssCBH2にクローニングした。得られたプラスミドをpRS406/ssEG2-CBH2と命名した。【０１４４】
（調製例１５−４：分泌型エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数１で組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素NdeIで切断して直線状にしたpRS406/ssEG2-CBH2で、NBRC1440/UHWLを形質転換し、ウラシルドロップアウト（ウラシル不含培地）プレート上でウラシル要求性を持たない株を選択した。pRS406/ssEG2-CBH2での形質転換により、NBRC1440/UHWLの破壊されたＵＲＡ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/ss-EG-CBH2-1c」とも表記する。本調製例では、コピー数１のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の分泌株を作製した。【０１４５】
（調製例１５−５：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数２で組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素NdeIで切断して直線状にしたpRS403/ssEG2-CBH2で、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2を形質転換し、ヒスチジンドロップアウト（ヒスチジン不含培地）プレート上でヒスチジン要求性を持たない株を選択した。pRS403/ssEG2-CBH2での形質転換により、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2の破壊されたＨＩＳ３遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c」とも表記する。本調製例では、コピー数２のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の分泌株を作製した。
【０１４６】
（調製例１５−６：エンドグルカナーゼIIとセロビオヒドロラーゼ２とを共にコピー数３で組み込んだ酵母株の調製）
制限酵素HpaIで切断して直線状にしたpRS405 ssEG2-CBH2で、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2を形質転換し、ロイシンドロップアウト（ロイシン不含培地）プレート上でロイシン要求性を持たない株を選択した。pRS405 ssEG2-CBH2での形質転換により、NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2の破壊されたＬＥＵ２遺伝子が復活することで、遺伝子の導入を確認した。この株を「NBRC1440/ pRS406/ssEG2-CBH2/ pRS403/ssEG2-CBH2/ pRS405 ssEG2-CBH2」と命名し、簡略化して「NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c」とも表記する。本調製例では、コピー数３のエンドグルカナーゼIIおよびセロビオヒドロラーゼ２の分泌株を作製した。【０１４７】
（調製例１５−７：β−グルコシダーゼ１遺伝子の組み込み）
Bst1107Iで切断して直線状にしたpIWBGLで、NBRC1440/ss-EG-CBH2-1c、NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c、およびNBRC1440/ss-EG-CBH2-3cを形質転換した。トリプトファンドロップアウト（トリプトファン不含培地）プレート上でトリプトファン要求性を持たない株を選択した。pIWBGLでの形質転換により、各々の破壊されたＴＲＰ１遺伝子が復活することで、β−グルコシダーゼ１遺伝子の導入を確認した。これらの株を簡略化して、それぞれ、「NBRC1440/ss-EG-CBH2-1c/BGL」、「NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c/BGL」、および「NBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL」とも表記する。本調製例では、調製例１５−４から１５−６の分泌株においてさらに、１コピーのβ−グルコシダーゼを表層提示するようにした株を作製した。【０１４８】
（実施例３：リン酸膨潤セルロースからのエタノール生産に関するセルラーゼ表層提示酵母およびセルラーゼ分泌酵母の比較）
セルラーゼ表層提示酵母（調製例１４）のNBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL、NBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL、およびNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGL、ならびにセルラーゼ分泌酵母（調製例１５）のNBRC1440/ss-EG-CBH2-1c/BGL、NBRC1440/ss-EG-CBH2-2c/BGL、およびNBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGLのいずれかの細胞ペレットを、7.8g/LのＰＳＣ、10g/Lの酵母エキス、10g/Lのポリペプトン、50mM クエン酸緩衝液（pH 5.0）、および0.5g/Lの二亜硫酸カリウムを含有する発酵培地に接種した。続く発酵は、約３０℃にて嫌気的（溶存酸素濃度：約0.05ppm）に実施した。発酵開始時には細胞濃度を75g/L（湿潤細胞）に調整した。加えたＰＳＣが7.8g/Lであることより、エタノールの理論収率は4.0g/Lとなる。実施例２と同様にして、発酵中のエタノール濃度の測定を行った。【０１４９】
この結果を図９に示す。図９は、セルラーゼ表層提示酵母およびセルラーゼ分泌酵母のリン酸膨潤セルロース（ＰＳＣ）からのエタノール生産量の経時変化を示すグラフである。本グラフの横軸に発酵時間（時間）を示し、縦軸にエタノール生産量（g/L）を示す。図中、黒丸はNBRC1440/ss-EG-CBH2-1c/BGL、黒三角はNBRC1440/ss-EG-CBH2-2c/BGL、黒四角はNBRC1440/ss-EG-CBH2-3c/BGL、白丸はNBRC1440/EG-CBH2-1c/BGL、白三角はNBRC1440/EG-CBH2-2c/BGL、そして白四角はNBRC1440/EG-CBH2-3c/BGLの結果を表す。【０１５０】
その結果、セルラーゼ表層提示酵母およびセルラーゼ分泌酵母のいずれにおいても、１コピーのβ−グルコシダーゼに対し、エンドグルカナーゼおよびセロビオヒドロラーゼのコピー数の増加と共に、ＰＳＣからのエタノール発酵収率が高くなることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明によれば、セルロースの加水分解力が向上し、エタノール生産を増強し得る発酵用酵母が得られる。したがって、セルロース系物質から効率よくエタノールが生産でき、さらにコストの低減につながり得る。このような酵母は、ソフトバイオマスのような廃棄物からのエタノール生産への利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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