(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ポリメラーゼ、及び両性イオン洗剤を含み、前記両性イオン洗剤が、ＣＨＡＰＳＯ（登録商標）、ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフェート（Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）／Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標） ３−１０）、もしくはｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）／Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標） ３−１２）、又はそれらの組み合わせであり、非洗浄性界面活性剤をさらに含み、前記非洗浄性界面活性剤が、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） １０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ４２０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ４４０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ４６５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ４８５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ５０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＰＳＡシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＳＥシリーズ、Ｄｙｎｏｌ（登録商標） ６０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＤＦシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＣＴシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＥＰシリーズ、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ２５０２から成る群から選択される、ポリメラーゼの保存又は核酸増幅反応用の組成物。
【請求項２】
検出用ラベルをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリメラーゼが熱安定性である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記熱安定性ポリメラーゼが熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ融合タンパク質である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物と、そのためのパッケージング材料とを含むキット。
【請求項６】
標的核酸を検出する方法であって、
精製ポリメラーゼ、プライマー、両性イオン洗剤、ヌクレオシド−５’−トリホスフェート、及び検出用ラベルを含む反応混合物を形成すること、
前記反応混合物を、前記標的核酸を増幅する核酸増幅反応条件に曝すこと、及び
前記サンプル中の前記標的の存在及び／又は量の指標となる前記検出用ラベルから生じたシグナルを検出することを含み、
前記両性イオン洗剤が、ＣＨＡＰＳＯ（登録商標）、ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフェート（Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）／Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標） ３−１０）、もしくはｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）／Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標） ３−１２）、又はそれらの組み合わせであり、
前記反応混合物が、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）１０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ４２０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ４４０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ４６５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）４８５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ５０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＰＳＡシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）ＳＥシリーズ、Ｄｙｎｏｌ（登録商標） ６０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＤＦシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）ＣＴシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標） ＥＰシリーズ、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）２５０２から成る群から選択される非洗浄性界面活性剤をさらに含む、標的核酸を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅に係り、特に、ＤＮＡポリメラーゼの保存及び使用のための両性イオン洗剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の増幅は、増幅された標的核酸を生成するための核酸ポリメラーゼを含有する反応混合物の温度サイクリングを伴う。例えば、この温度サイクリングプロセスは、反応混合物をオリゴヌクレオチド変性、プライマーアニーリング、及びプライマー伸長の反応温度に曝すポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で起こる。一般的に熱安定性ポリメラーゼは、これらの温度サイクリング反応における標的核酸配列を増幅するのに使用される。
【０００３】
特許文献１は、非イオン性洗剤ＮＰ−４０及びＴｗｅｅｎが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを安定化することを開示している。
【０００４】
特許文献２は、反応混合物を加熱するのに、電磁エネルギーを熱エネルギーに変換する色素を利用して、増幅反応を行う方法を開示している。両性イオン界面活性剤を反応混合物に添加し、色素が核酸ポリメラーゼの機能を妨げるのを緩和する。
【０００５】
特許文献３は、高Ｇ＋Ｃの核酸増幅を改善するのに、塩基対合を破壊する化合物（例えばＤＭＳＯ）と組合せた両性イオンの使用を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，１２７，１５５号
【特許文献２】米国特許公開第２００３／００１７５６７号
【特許文献３】米国特許公開第２００２／０１６８６５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ポリメラーゼ、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む組成物、キット及び方法を提供する。具体的には、このような組成物、キット及び方法は、ＰＣＲ、ＱＰＣＲ、シークエンシング及び突然変異生成に有用である。本発明は、両性イオン洗剤及び非洗浄性界面活性剤が安定性を増大させ、熱安定性ポリメラーゼの活性を高めるという驚くべき発見に一部基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプローブ、及び両性イオン洗剤を含む反応混合物を提供する。検出用ラベルがオリゴヌクレオチドプローブと操作可能に連結する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、検出用ラベル及び２つ以上の両性イオン洗剤の組合せを含む反応混合物を提供する。幾つかの実施の形態では、検出用ラベルは、オリゴヌクレオチドプローブと操作可能に連結する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、標識ヌクレオチド、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む反応混合物に関する。
【００１１】
別の態様において、反応混合物は、精製ポリメラーゼ、蛍光ＤＮＡ結合色素、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含み、当該蛍光ＤＮＡ結合色素が、ＤＮＡと結合すると検出シグナルを生じる。
【００１２】
さらに別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ及び両性イオン洗剤を有する保存組成物に関する。保存組成物は、検出用ラベルを含有しない。
【００１３】
さらに別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ及び２つ以上の両性イオン洗剤の組合せを含む保存組成物を提供する。保存組成物は、検出用ラベルを含有しない。
【００１４】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、標識ヌクレオチド、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む保存組成物に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、蛍光ＤＮＡ結合色素、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む保存組成物に関し、当該蛍光ＤＮＡ結合色素が、ＤＮＡと結合すると検出シグナルを生じる。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、ヌクレオシド−５’−トリホスフェート、プライマー、プライマー伸長が起こり得る緩衝液、ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプローブ及び両性イオン洗剤を含む反応混合物に関する。この態様では、オリゴヌクレオチドプローブは検出用ラベルと操作可能に連結する。
【００１７】
本発明は、本発明の組成物を含有するキットにも関する。一態様では、キットはポリメラーゼ及び両性イオン洗剤を含むが、検出用ラベルを含まない。
【００１８】
別の態様において、キットはポリメラーゼ及び２つ以上の両性イオン洗剤を含むが、検出用ラベルを含まない。
【００１９】
さらに別の態様において、キットはポリメラーゼ及び両性イオン洗剤を有する保存緩衝液を含む。保存緩衝液は、検出用ラベルを含有しない。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、ポリメラーゼ及び２つ以上の両性イオン洗剤の組合せを有する保存緩衝液を含むキットを提供する。保存緩衝液は、検出用ラベルを含有しない。
【００２１】
幾つかの実施の形態のキットにおいて、ＰＣＲを行うために、両性イオン洗剤が、１０×ストック反応緩衝液中に含まれる。
【００２２】
本発明は、本発明の組成物を利用する方法にも関する。一態様では、本発明は、ポリメラーゼの効率を増大させる方法を提供する。この方法は、標的核酸をポリメラーゼ、プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、検出用ラベル、ｄＮＴＰ及び両性イオン洗剤と混合することによって反応混合物を形成することを伴う。検出用ラベルは、オリゴヌクレオチドプローブと操作可能に連結する。幾つかの実施の形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ポリメラーゼの効率を増大させる方法を提供する。反応混合物が、標的核酸をポリメラーゼ、検出用ラベル、プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、ｄＮＴＰ及び２つ以上の両性イオン洗剤の組合せと混合することによって形成される。幾つかの実施の形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。
【００２４】
別の態様において、本発明は、保存組成物を調製する方法に関する。保存組成物は、最適な緩衝液中でポリメラーゼと両性イオン洗剤とを混合することによって形成される。保存緩衝液は検出用ラベルを含有しない。
【００２５】
さらに別の態様において、本発明は、保存組成物を調製する方法に関する。保存組成物は、最適な緩衝液中でポリメラーゼと２つ以上の両性イオン洗剤の組合せとを混合することによって形成される。保存緩衝液は検出用ラベルを含有しない。
【００２６】
別の態様において、本発明は、ポリメラーゼの効率を増大させる方法を提供する。この方法は、標的核酸、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ及び両性イオン洗剤を含む反応混合物を形成することによって行われる。反応混合物は検出用ラベルを含有しない。幾つかの実施の形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、ポリメラーゼの効率を増大させる方法に関する。この方法は、標的核酸、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ及び２つ以上の両性イオン洗剤の組合せを含む反応混合物を形成することによって行われる。反応混合物は検出用ラベルを含有しない。幾つかの実施の形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、標的核酸を検出する方法に関する。この方法は、ポリメラーゼ、プライマー、両性イオン洗剤、ｄＮＴＰ及び検出用ラベルを含む反応混合物を形成すること；反応混合物を、標的を増幅させる核酸増幅反応条件に曝すこと；並びに検出用ラベルから生じたシグナルを検出することを含む。検出用ラベルから生じたシグナルは、サンプル中の標的の存在及び／又は量の指標となる。
【００２９】
さらに別の態様において、本発明は、標的核酸を検出する方法に関する。この方法は、ポリメラーゼ、プライマー、両性イオン洗剤、ｄＮＴＰ及び相互作用するラベル対と操作可能に連結するオリゴヌクレオチドプローブを含む反応混合物を形成すること；反応混合物を、標的を増幅させる核酸増幅反応条件に曝すこと；並びに相互作用するラベル対の成員から生じたシグナルを検出することを含む。生じたシグナルは、サンプル中の標的の存在及び／又は量の指標となる。
【００３０】
上記態様はいずれも、両性イオン洗剤の代わりに非洗浄性界面活性剤と共に使用され得る。好適な非洗浄性界面活性剤は本明細書中に記載され、また当該技術分野で既知であり、例えば、Air ProductsのＳｕｒｆｙｎｏｌ界面活性剤シリーズ（Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  １０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４２０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４４０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４８５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ５０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＰＳＡシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＳＥシリーズ、Ｄｙｎｏｌ  ６０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＤＦシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＣＴシリーズ、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ  ＥＰシリーズ、例えばＳｕｒｆｙｎｏｌ  １０４シリーズ（１０４、１０４Ａ、１０４ＢＣ、１０４ＤＰＭ、１０４Ｅ、１０４Ｈ、１０４ＮＰ、１０４ＰＡ、１０４ＰＧ５０、１０４Ｓ）、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ  ２５０２）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】個々の両性イオン洗剤が、ＰＣＲ反応においてＰｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼの活性を高めることを示す図である。
【図２】両性イオン洗剤の組合せが、Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼの活性を高めることを示す図である。
【図３】両性イオン洗剤の組合せが、Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼの活性を高めることをさらに示す図である。
【図４】両性イオン洗剤が、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの保存安定性を高めることを示す図である。
【図５】個々の両性イオン洗剤が、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの活性を高めることを示す図である。
【図６】両性イオン洗剤が、加速安定性試験においてＰｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼを安定化することを示す図である。
【図７】両性イオン洗剤が、Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼによるＱＰＣＲ増幅を高めることを示す図である。
【図８】両性イオン洗剤が、Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼによるＱＰＣＲ増幅を高めることをさらに示す図である。
【図９】Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５が、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの活性を高めることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、ポリメラーゼ及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む組成物、キット及び方法を提供する。このような組成物及び方法は、熱サイクリング反応（例えばＰＣＲ）におけるＤＮＡポリメラーゼの保存及び使用に有用である。本発明は、両性イオン洗剤及び非洗浄性界面活性剤が安定性を増大させ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を高めるという驚くべき発見に少なくとも一部基づく。例えば、ＰＣＲ増幅反応が、１つ又は複数の両性イオン洗剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２）又は非洗浄性界面活性剤（例えば、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５）を含有する緩衝液中で行われると、産物収量が劇的に高くなる。同様に、両性イオン洗剤及び非洗浄性界面活性剤によって増幅効率が高くなれば、全蛍光が高くなり、二本鎖ＤＮＡの形成をモニタリングする、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びＳＹＢＲグリーンを利用するＱＰＣＲ反応においてＣｔ値になるのが早くなる。
【００３３】
両性イオン洗剤及び非洗浄性界面活性剤
一態様において、本発明は、ポリメラーゼ及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を有する保存組成物及び反応組成物に関する。一般的に、反応混合物は、核酸合成反応を行うのに必要な成分を全て含む。保存混合物は、核酸合成反応を行うのに必要な成分を全て含んでも、又は含んでいなくてもよい。
【００３４】
ポリメラーゼは、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む保存緩衝液中で保存し得る。本明細書中の以下で記載される本発明のポリメラーゼは、商業的に入手しても、又は当業者に既知の方法で生成してもよい。保存緩衝液及び反応緩衝液は、用いられる両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤をそれぞれ約０．００１％〜５％（体積／体積）含んでいてもよい。
【００３５】
本明細書で使用されるように、「両性イオン洗剤」は、両性イオン性を示す（例えば、正味電荷を保持せず、伝導度及び電気泳動移動度を失い、イオン交換樹脂と結合せず、タンパク質間相互作用を破壊する）洗剤を表し、ＣＨＡＰＳ及びＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）（Calbiochem, San Diego, CA）及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）（Anatrace, Inc.; Maumee, OH）という商品名で販売されるスルホベタインが挙げられるが、これらに限定されない。特に好適な洗剤は当該技術分野で既知であり、以下に記載される。
【００３６】
概して、両性イオン洗剤は一般式：
【００３７】
【化１】
0005479895.tif 000002
【００３８】
を有し得る。
【００３９】
本発明の実施に際して使用される両性イオン洗剤としては、化学名：ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、及びｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネートを有する、商品名：Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）で販売されているものが挙げられる。本発明の洗剤は、例えば、商品名：Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１４、分析グレード；Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−８、分析グレード；Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、分析グレード；Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２、分析グレード（又はそれぞれ、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−８、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１２及びｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−１４）、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ａｐｏ１０及びＡｐｏ１２で購入することができる。
【００４０】
本発明を実施するのに好ましい両性イオン洗剤としては、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２が挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用されるように、「非洗浄性界面活性剤」は、表面張力を低下させ、表面を浸潤させるのを助けるが、清浄力（洗浄力）を有しない組成物を表す。「洗剤」は、洗剤分子の比較的小さい親水性頭部基を親水性溶媒（通常、水）に向かって、及び疎水性尾部（直鎖アルキル若しくは環式及び／又は多環式のいずれかの多くの炭素間結合）を疎水性ミセル内部に向かって配向させることによって形成されたミセル内部に汚れ及び油を閉じ込めることによって清浄力を保持する。これに対して、非洗浄性界面活性剤は、比較的小さい疎水性頭部、及び２つの長い親水性エチレンオキシド尾部を有する分子である。非洗浄性界面活性剤は、より表面張力が低く、ミセル形成及び洗浄することができない。
【００４２】
本発明の実施に際して使用される非洗浄性界面活性剤としては、商品名：Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  １０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４２０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４４０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４８５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ５０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＰＳＡシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＳＥシリーズ、Ｄｙｎｏｌ  ６０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＤＦシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＣＴシリーズ、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ  ＥＰシリーズ、例えばＳｕｒｆｙｎｏｌ  １０４シリーズ（１０４、１０４Ａ、１０４ＢＣ、１０４ＤＰＭ、１０４Ｅ、１０４Ｈ、１０４ＮＰ、１０４ＰＡ、１０４ＰＧ５０、１０４Ｓ）、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ  ２５０２で販売されているものが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。非洗浄性界面活性剤は商業メーカー（例えば、airproducts.comのワールドワイドウェブ上）から容易に入手可能である。
【００４３】
本発明の実施に際して使用される非洗浄性界面活性剤としては、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）を同分子に重合させることにより製造される、非イオン界面活性剤のＤＯＷＦＡＸシリーズが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。例えば、商品名：ＤＯＷＦＡＸ  ６３Ｎ１０、ＤＯＷＦＡＸ  ６３Ｎ１３、ＤＯＷＦＡＸ  ６３Ｎ３０、ＤＯＷＦＡＸ  ６３Ｎ４０、ＤＯＷＦＡＸ  ８１Ｎ１３、ＤＯＷＦＡＸ  ８１Ｎ１５、ＤＯＷＦＡＸ  ９２Ｎ２０、ＤＯＷＦＡＸ  １００Ｎ１５、ＤＯＷＦＡＸ  ＥＭ−５１、ＤＯＷＦＡＸ  ２０Ａ４２、ＤＯＷＦＡＸ  ２０Ａ６４、ＤＯＷＦＡＸ  ２０Ａ６１２、ＤＯＷＦＡＸ  ２０Ｂ１０２、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１０１、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１１１、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１１２、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１１３、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１１４、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１１７、ＤＯＷＦＡＸ  ＷＰ−３１０、ＤＯＷＦＡＸ  ５０Ｃ１５、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１２１、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１２２、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１３３、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１４１、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１４２、ＤＯＷＦＡＸ  ＤＦ−１６（Dow Chemical Company, Midland, Michigan）で販売されているものが挙げられる。
【００４４】
本発明の実施に際して使用される非洗浄性界面活性剤としては、一般構造（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ  を有するＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ブロック共重合体界面活性剤シリーズが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。例えば、商品名：ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ブロック共重合体界面活性剤シリーズ（Ｌ３５、Ｐ６５、Ｐ７５、Ｐ８５、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０８）（BASF Corporation; Mount Olive, NJ）で販売されているものが挙げられる。
【００４５】
他の非洗浄性界面活性剤としては、ジメチルエチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート、３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート、ジメチル−２−ヒドロキシエチル−１−プロパンスルホネート、３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）モルホリニウム及びジメチルベンジルアンモニウム−１−プロパンスルホネートが挙げられる。
【００４６】
両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤は、所望の結果を誘導する（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを安定化する及び／又はその活性を高める）のに効果的な量で使用される。組成物及び方法における使用に対する両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤の最適濃度は、ポリメラーゼ間で異なることが多い。当業者は、特定のポリメラーゼによる使用に対する両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤の最適濃度を求めるのに、定期試験を行ってもよい。例えば、洗剤の濃度のみが異なる（例えば０．０５％〜１％のＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０）一連のＰＣＲ反応を実施することができる。したがって、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される方法で増幅産物を検出及び／又は定量することによって、ポリメラーゼ活性を求めることができる（例えば、増幅産物のリアルタイムＰＣＲ又はゲル電気泳動による定量、実施例１〜実施例５を参照されたい）。ポリメラーゼによる使用に対する両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤の最も効果的な濃度は、最も多くの増幅産物が得られる濃度である。
【００４７】
同様に、上記のアッセイを行い、試験両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む組成物で生成される増幅産物の量と、全く界面活性剤を含まない陰性対照の増幅産物の量とを比較することによって、増幅反応におけるこれらの有効性に関して、試験両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を評価することができる。
【００４８】
保存組成物中のポリメラーゼの安定化における両性イオン界面活性剤及び非洗浄性界面活性剤の有効性を同様の方法で評価することができる。例えば、−２０℃で或る期間（例えば１週間）、両性イオン界面活性剤又は非洗浄性界面活性剤でポリメラーゼを保存することによって、保存安定性試験を実施し得る。それから、上記のように標的核酸を増幅する能力に関してポリメラーゼを評価する。代替的に、ポリメラーゼ、及び試験両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を６時間９５℃に曝す、加速安定性試験を実施し得る。それから、標的核酸を増幅する能力に関してポリメラーゼを評価し、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を用いた反応における増幅産物の量と、界面活性剤を含まない反応混合物中の増幅産物の量との比較を行う。試験界面活性剤を用いると、増幅産物が界面活性剤を含まない反応よりも多くなる場合、両性イオン洗剤／非洗浄性界面活性剤は、保存組成物中でポリメラーゼを安定化させるという点で効果的である（実施例３を参照されたい）。
【００４９】
一実施形態において、両性イオン洗剤はＣＨＡＰＳである。さらなる実施形態では、ＣＨＡＰＳは、全組成物の約０．０５％〜１．０％（体積／体積）の濃度で存在する。さらなる実施形態では、ＣＨＡＰＳは、全組成物の約０．２％〜０．８％（体積／体積）の濃度で存在する。またさらなる実施形態では、ＣＨＡＰＳは、全組成物の約０．２％〜０．４％（体積／体積）の濃度で存在する。
【００５０】
別の実施形態において、ＣＨＡＰＳＯは、全組成物の約０．０５％〜１．０％（体積／体積）の濃度で存在する。さらに別の実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは、全組成物の約０．１％〜０．４％（体積／体積）の濃度で存在する。さらなる実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは、全組成物の約０．１５％〜０．３５％（体積／体積）の濃度で存在する。
【００５１】
さらに別の実施形態において、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０は、全組成物の約０．１％〜１．０％（体積／体積）の濃度で存在する。さらなる実施形態において、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０は、全組成物の約０．４％〜０．８％（体積／体積）の濃度で存在する。
【００５２】
さらに別の実施形態において、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２は、全組成物の約０．０５％〜１．０％（体積／体積）の濃度で存在する。さらに別の実施形態において、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２は、全組成物の約０．１％〜０．４％（体積／体積）の濃度で存在する。さらなる実施形態において、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２は、全組成物の約０．１％〜０．２％（体積／体積）の濃度で存在する。
【００５３】
本発明での使用に適合性がある両性イオン洗剤を共に混合して、本発明での使用に必須な洗剤を提供することができることも想定される。一般的に、任意の２つの異なる両性イオン界面活性剤又は非洗浄性界面活性剤は、１：１、１：２、１：５、１：１０、１：１００、１００：１、１０：１、５：１又は２：１の比で存在し得る。例えば、組成物は、ＣＨＡＰＳ及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２、ＣＨＡＰＳ及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、ＣＨＡＰＳＯ及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２、又はＣＨＡＰＳＯ及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０の組合せを含み得る。
【００５４】
一実施形態において、ＣＨＡＰＳは約０．１％の濃度で存在し、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２は０．１％〜０．５％の濃度で存在する。さらに別の実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは０．１％の濃度で存在し、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０は０．０５％〜０．５％の濃度で存在する。さらなる実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは０．１％の濃度で存在し、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０は０．０５％〜０．４％の濃度で存在する。さらに別の実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは０．０５％〜０．１％の濃度で存在し、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２は０．０５％〜０．５％の濃度で存在する。さらなる実施形態では、ＣＨＡＰＳＯは０．０５％〜０．１％の濃度で存在し、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２は０．０５％〜０．４％の濃度で存在する。さらなる両性イオン洗剤濃度は実施例で示される。
【００５５】
一態様において、本発明は、ポリメラーゼ及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を有する保存組成物に関する。別の態様では、本発明は、ポリメラーゼ及び２つ以上の両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤の組合せを含む保存組成物を提供する。これらの態様では、保存組成物は、検出用ラベルを含有しない。
【００５６】
一実施形態において、保存緩衝液は、トリスＨＣｌ又はトリスＳＯ４を含み、ｐＨは約８〜１０である。さらなる実施形態では、保存緩衝液は、５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、及び１ｍＭのジチオスレイトールを含む。
【００５７】
別の実施形態において、保存緩衝液は、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４及び１００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡを含む。さらに別の実施形態では、保存緩衝液は、４０ｍＭのトリスＳＯ４（ｐＨ１０）、１５ｍＭのＫ２ＳＯ４、８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む。さらに別の実施形態では、保存緩衝液は、３０ｍＭのトリスＳＯ４（ｐＨ１０）、４０ｍＭのＫ２ＳＯ４、１．５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む。他の好適な保存緩衝液が本発明での使用に関して意図され、当該技術分野で既知である。
【００５８】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、標識ヌクレオチド、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む保存組成物に関する。一実施形態では、標識ヌクレオチドは単一の検出用ラベルを有する。例えば、単一の検出用ラベルはフルオロフォアであり得る。別の実施形態では、標識ヌクレオチドは、相互作用するラベル対を有する。好適な相互作用するラベル対は、消光因子及びフルオロフォアを含む。
【００５９】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、蛍光ＤＮＡ結合色素、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む保存組成物に関し、当該蛍光ＤＮＡ結合色素は、ＤＮＡと結合すると検出シグナルを生じる。好適なＤＮＡ結合色素は当該技術分野で既知であり、本明細書で記載される。例えば、ＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン又はＥｖａグリーンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
別の態様において、本発明は、ポリメラーゼ及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む反応混合物を提供する。反応緩衝液は、標的核酸の増幅に有用である。反応緩衝液は、用いられる両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤をそれぞれ約０．００１％〜５％（体積／体積）（Ｖ／Ｖとも書く）を含む。
【００６１】
一態様において、本発明は、ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプローブ、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む反応混合物を提供する。
【００６２】
別の態様において、本発明は、ポリメラーゼ、検出用ラベル、及び２つ以上の両性イオン洗剤若しくは非洗浄性界面活性剤の組合せ、又はそれらの組合せを含む反応混合物を提供する。
【００６３】
一実施形態において、検出用ラベルはオリゴヌクレオチドプローブと操作可能に連結する。
【００６４】
別の実施形態において、検出用ラベルは相互作用するラベル対を含む。
【００６５】
さらに別の態様において、本発明は、ヌクレオシド−５’−トリホスフェート、プライマー、プライマー伸長が起こり得る緩衝液、ポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプローブ及び両性イオン洗剤を含む反応混合物に関する。
【００６６】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブは検出用ラベルと操作可能に連結する。別の実施形態では、検出用ラベルは相互作用するラベル対を含む。
【００６７】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、標識ヌクレオチド、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を有する反応混合物に関する。一実施形態では、標識ヌクレオチドは単一の検出用ラベルを有する。例えば、単一の検出用ラベルはフルオロフォアであり得る。別の実施形態では、標識ヌクレオチドは、相互作用するラベル対を有する。好適な相互作用するラベル対は、消光因子及びフルオロフォアを含む。
【００６８】
別の態様において、反応混合物は、精製ポリメラーゼ、蛍光ＤＮＡ結合色素、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含み、当該蛍光ＤＮＡ結合色素は、ＤＮＡと結合すると検出シグナルを生じる。好適なＤＮＡ結合色素は当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される。例えば、ＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン又はＥｖａグリーンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
一実施形態では、反応混合物はトリスＨＣｌ又はトリスＳＯ４、ＫＣｌ又はＫ２ＳＯ４（ｐＨ約８．０〜ｐＨ１０）、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＭｇＳＯ４を有する緩衝液を含む。さらなる実施形態では、反応混合物はトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４及びＭｇＳＯ４を含む。
【００７０】
別の実施形態では、反応緩衝液は２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４及び１００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡを含む。また別の実施形態では、反応緩衝液は４０ｍＭのトリスＳＯ４（ｐＨ１０）、１５ｍＭのＫ２ＳＯ４、８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む。さらに別の実施形態では、反応緩衝液は３０ｍＭのトリスＳＯ４（ｐＨ１０）、４０ｍＭのＫ２ＳＯ４、１．５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、及び２ｍＭのＭｇＳＯ４を含む。
【００７１】
本発明の実施に際して有用な、さらなる保存緩衝液及び反応緩衝液は、当該技術分野で既知であり（例えば、２００４年３月１４日付で出願された米国特許公開第２００５／００４８５３０号、２００６年６月１５日付で出願された米国特許出願第１１／１５２，７７３号、及び２００６年１月６日付で出願された米国特許出願第６０／７５７，１２０号（各々の開示全体が参照により本明細書中に援用される）に記載のもの）、また実施例に記載される。
【００７２】
例えば、組成物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、米国特許出願第１１／１５２，７７３号に記載される緩衝液（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）又は同様のホスフィン化合物を含む）、及び非イオン性界面活性剤を含み得る。この実施形態では、非イオン性界面活性剤は、Ｓｕｒｆｙｎｏｌシリーズの界面活性剤のような非洗浄性非イオン性界面活性剤である。
【００７３】
別の実施形態において、組成物は、熱安定性ポリメラーゼ、米国特許出願第６０／７５７，１２０号に記載される緩衝液、両性イオン界面活性剤又は非洗浄性界面活性剤（例えば、Ｓｕｒｆｙｎｏｌシリーズ）、及び硫酸カリウムと硫酸アンモニウムとを含む緩衝液（硫酸カリウム：硫酸アンモニウムのモル比が５：１〜５０：１である）を含む。幾つかの実施形態では、硫酸カリウム濃度は、２０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、硫酸アンモニウム濃度は、１ｍＭ〜５ｍＭの範囲である。
【００７４】
本発明の組成物及び方法での使用に関する緩衝液は、特定のポリメラーゼに好適である。好適な緩衝液は当該技術分野で既知であり、ポリメラーゼの市販元で与えられる資料に記載されている。
【００７５】
上記の態様はいずれも、非洗浄性界面活性剤又は両性イオン洗剤を用いて実施されてもよい。好適な非洗浄性界面活性剤としては、Air ProductsのＳｕｒｆｙｎｏｌ界面活性剤シリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  １０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４２０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４４０、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４８５、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ５０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＰＳＡシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＳＥシリーズ、Ｄｙｎｏｌ  ６０４、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＤＦシリーズ、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ＣＴシリーズ、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ  ＥＰシリーズ、例えばＳｕｒｆｙｎｏｌ  １０４シリーズ（１０４、１０４Ａ、１０４ＢＣ、１０４ＤＰＭ、１０４Ｅ、１０４Ｈ、１０４ＮＰ、１０４ＰＡ、１０４ＰＧ５０、１０４Ｓ）、及びＳｕｒｆｙｎｏｌ  ２５０２が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。非洗浄性界面活性剤は商業メーカー（例えば、airproducts.comのワールドワイドウェブ上）から容易に入手可能である。
【００７６】
ポリメラーゼ
両性イオン洗剤／非洗浄性界面活性剤を核酸ポリメラーゼと組合せて使用する。本明細書で使用されるように、「核酸ポリメラーゼ」又は「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を表す。一般的に、酵素は、核酸鋳型（テンプレート）配列とアニーリングするプライマーの３’末端で合成を開始させ、鋳型に沿って５’方向へと進む。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオチドの重合を触媒する。既知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（ＵｌＴｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、及びパイロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００７７】
ＤＮＡポリメラーゼ及びその特性は、特に「ＤＮＡ複製  第２版（DNA Replication 2nd edition）」Kornberg and Baker, W. H. Freeman, New York, N.Ｙ.（1991）に詳述される。既知の従来のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, California, USAにより提供されるLundberg et al., 1991, Gene 108:1）、バイロコッカス・ヴェッセイ（Pyrococcus woesei）（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ（Hinnisdaels et al., 1996, Biotechniques 20：186-8）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Myers and Gelfand 1991, Biochemistry 30:7661）、バチルス・ステアロサーモフィルスＤＮＡポリメラーゼ（Stenesh and McGowan, 1977, Biochim. Biophys. Acta 475:32）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Cariello et al., 1991, Polynucleotide Res. 19:4193、例えばNew England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USAより入手可能）、９°Ｎｍ  ＤＮＡポリメラーゼ、サーモトガ・マリティマ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Diaz and Sabino, 1998. Braz. J. Med. Res. 31:1239）、サーマス・アクアティカス（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Chien et al., 1976, J. Bacteoriol. 127:1550）、パイロコッカス・コダカラエンシス(Pyrococcus kodakaraensis)ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Takagi et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:4504）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（サーモコッカス種ＪＤＦ−３由来、国際公開第０１／３２８８７号）、パイロコッカスＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ−Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される、Juncosa-Ginesta et al., 1994, Biotechniques 16:820、例えばNew England Biolabs, Beverly, Massachusetts, USAより入手可能）、ＵｌＴｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ（好熱菌サーモトガ・マリティマ由来、Diaz and Sabino, 1998, Braz. J. Med. Res. 31:1239、例えばPE Applied Biosystems, Foster City, California, USAより入手可能）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（サーモコッカス・ゴルゴナリアス（Thermococcus gorgonarius）由来、例えば、Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana, USAより入手可能）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（Lecomte and Doubleday, 1983, Polynucleotide Res. 11:7505）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Nordstrom et al., 1981, J. Biol. Chem. 256:3112）、及び古細菌ＤＰ１／ＤＰ２  ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Cann et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14250-5）が挙げられる。
【００７８】
一実施形態において、ポリメラーゼは精製ポリメラーゼである。本明細書で使用されるように、「精製ポリメラーゼ」は、自然状態ではポリメラーゼと共にある成分から分離されたポリメラーゼを表す。
【００７９】
用語「核酸ポリメラーゼ」は逆転写酵素、例えば、限定されるものではないが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶ、ＭｏＭｕＬＶ及び他のレトロウイルスに由来する逆転写酵素も包含する（詳細は、例えばLevin, 1997, Cell 88:5-8；Verma, 1977, Biochim. Biophys. Acta 473:1-38；Wu et al., 1975, CRC Crit. Rev. Biochem. 3:289-347参照）。
【００８０】
（例えばＰＣＲ技法中で）高温に曝した反応混合物における対象の組成物を使用する場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの使用が好ましい。本明細書で使用されるように、「熱安定性」は、酵素が高温でも活性があり、且つ約９３℃〜約１００℃の範囲の核酸二本鎖変性温度に耐性があるというような核酸ポリメラーゼの特性を表す。「活性がある」とは、二本鎖核酸の変性を起こすのに必要な時間、高温又は変性温度に曝したときに、酵素がプライマー伸長反応を行う能力を維持するという意味である。本明細書で使用される高温は約７０℃〜約１００℃の範囲を表す一方で、本明細書で使用される非高温は約３５℃〜約５０℃の範囲を表す。
【００８１】
本発明で使用され得る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、ＶＥＮＴ（商標）及びＤＥＥＰＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ、Ｔｇｏ、ＪＤＦ３、並びにこれらの突然変異体、変異体及び誘導体が挙げられる（米国特許第５，４３６，１４９号、米国特許第４，８８９，８１８号、米国特許第４，９６５，１８Ｓ号、米国特許第５，０７９，３５２号、米国特許第５，６１４，３６５号、米国特許第５，３７４，５５３号、米国特許第５，２７０，１７９号、米国特許第５，０４７，３４２号、米国特許第５，５１２，４６２号、国際公開第９２／０６１８８号、国際公開第９２／０６２００号、国際公開第９６／１０６４０号、Barnes, W. M., Gene 112:29-35 （1992）、Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 （1993）、Flaman, J. -M, et al., Nuc. Acids Res. 22(15):3259-3260 (1994)）。
【００８２】
一実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ又はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼである。さらなる実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｖ９３位に変異を有するＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼであり、このポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ欠損である（例えば、Ｐｆｕ  Ｖ９３、ｅｘｏ−）。Ｐｆｕ  Ｖ９３、ｅｘｏ−  ＤＮＡポリメラーゼを作製及び使用する方法は、２００２年１１月１８日に出願された米国特許出願第１０／２９８，６８０号に記載され、その全体が参照により本明細書中に援用される。別の実施形態では、ポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性を有する融合タンパク質である（例えば、２００５年７月１５日に出願された米国特許出願第６０／６９９，９３７号及び２００４年３月１４日に出願された米国特許公開第２００５／００４８５３０号（両方ともその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されたＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ−Ｓｓｏ７）。
【００８３】
用途
本明細書に記載される両性イオン洗剤／非洗浄性界面活性剤及びポリメラーゼ組成物は、ポリメラーゼが使用されることが既知のいずれの用途（例えば核酸増幅、ＰＣＲ、ＱＰＣＲ、シークエンシング突然変異生成）で使用してもよい。
【００８４】
本明細書で使用されるように、「核酸増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産生を表し、一般的に当該技術分野で既知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又はリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）技術を用いて行う（Dieffenbach, C. W. and G. S. Dveksler（1995）「ＰＣＲプライマー、実験マニュアル（PCR Primer, a Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.）。
【００８５】
本明細書で使用されるように、「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」という用語は、特定のポリヌクレオチド鋳型（テンプレート）配列を増幅するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を表す。ＰＣＲ技法は、多くの刊行物、例えばM. J. McPherson, et al.「ＰＣＲ：実践的アプローチ（PCR: A Practical Approach）」IRL Press (1991)、Innis, et al.「ＰＣＲプロトコル：方法及び利用の手引（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications）」Academic Press (1990)、及びH. A. Erlich「ＰＣＲ技術：ＤＮＡ増幅の原理及び応用（PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification）」Stockton Press (1989）に記載されている。ＰＣＲは多くの米国特許、例えば米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号、同第４，８８９，８１８号、同第５，０７５，２１６号、同第５，０７９，３５２号、同第５，１０４，７９２号、同第５，０２３，１７１号、同第５，０９１，３１０号、及び同第５，０６６，５８４号（各々が参照により本明細書中に援用される）にも記載されている。
【００８６】
本発明で与えられる利点を容易に理解できるように、ＰＣＲの概要が与えられる。ＰＣＲ反応は、一連の反復温度サイクルを伴い、典型的には５０ｕｌ〜１００ｕｌの容量で行われる。反応混合物は、ｄＮＴＰ（各４つのデオキシヌクレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ、及びポリヌクレオチド鋳型を含む。ＰＣＲには、増幅する二本鎖標的ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする２つのプライマーが必要である。ＰＣＲでは、この二本鎖標的配列を変性させ、変性された標的のそれぞれの鎖に１つのプライマーをアニーリングする。プライマーは、互いに取り除かれた部位で、及び１つのプライマーの伸長産物がその相補体から分離すると、他のプライマーとハイブリダイズすることができるような方向で標的ポリヌクレオチドとアニーリングする。所定のプライマーが標的配列とハイブリダイズすると、そのプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの作用により伸長する。それから、標的配列から伸長産物を変性させ、このプロセスが繰り返される。
【００８７】
このプロセスの連続サイクルにおいて、前のサイクルで産生された伸長産物は、ＤＮＡ合成の鋳型（テンプレート）として働く。第２のサイクルが始まると、増幅産物は対数速度で集積し始める。増幅産物は、第１のプライマーの配列（最終的に第２のプライマーに相補的な配列が続く）を含有する第１の鎖、及び第１の鎖と相補的な第２の鎖を含む別々の二本鎖ＤＮＡ分子である。
【００８８】
一態様において、本発明は、ポリメラーゼの効率を増大させる方法を提供する。この方法は、標的核酸をポリメラーゼ、プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、検出用ラベル、ｄＮＴＰ及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤と混合することによって反応混合物を形成することを伴う。一実施形態では、検出用ラベルは、オリゴヌクレオチドプローブと操作可能に連結する。さらなる実施形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。熱サイクリングは、或る期間、２つ以上の異なるインキュベート温度に反応混合物を曝すことである。例としては、核酸増幅反応の変性（例えば、１分間、９５℃）相及びアニーリング／伸長（３０秒間、６５℃）相がある。
【００８９】
別の態様において、本発明は、標的核酸をポリメラーゼ、検出用ラベル、プライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、ｄＮＴＰ及び２つ以上の両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤の組合せと混合して反応混合物を形成することによって、ポリメラーゼの効率を増大する方法を提供する。一実施形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。
【００９０】
別の態様において、本発明は、ポリメラーゼの効率を増大する方法を提供する。この方法は、標的核酸、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む反応混合物を形成することによって行われる。この実施形態では、反応混合物は検出用ラベルを含有しない。さらなる実施形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。
【００９１】
さらに別の態様において、本発明は、標的核酸、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、及び２つ以上の両性イオン洗剤若しくは非洗浄性界面活性剤の組合せ、又はそれらの組合せを含む反応混合物を形成することによってポリメラーゼの効率を増大する方法に関する。反応混合物は検出用ラベルを含有しない。一実施形態では、反応混合物を熱サイクリングにかける。
【００９２】
さらに別の態様において、本発明は、標的核酸、精製ポリメラーゼ、プライマー、検出用ラベル、ヌクレオシド−５’−トリホスフェート、及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を含む反応混合物を形成することによってポリメラーゼの効率を増大する方法に関する。一実施形態では、検出用ラベルは標識ヌクレオチドである。さらなる実施形態では、標識ヌクレオチドは単一の検出用ラベルを有する。例えば、単一の検出用ラベルはフルオロフォアであり得る。別の実施形態では、標識ヌクレオチドは、相互作用するラベル対を有する。好適な相互作用するラベル対は、消光因子及びフルオロフォアを含む。
【００９３】
別の実施形態において、検出用ラベルは、蛍光ＤＮＡ結合色素（当該蛍光ＤＮＡ結合色素は、ＤＮＡと結合すると検出シグナルを生じる）である。好適なＤＮＡ結合色素は当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される。例えば、例えば、ＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン又はＥｖａグリーンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
別の態様において、本発明は、標的核酸を検出する方法を提供する。この方法は、ポリメラーゼ、プライマー、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤、ｄＮＴＰ及び検出用ラベルを含む反応混合物を形成すること；反応混合物を、標的を増幅させる核酸増幅反応条件に曝すこと；並びに検出用ラベルから生じたシグナルを検出することを含む。検出用ラベルから生じたシグナルは、サンプル中の標的の存在及び／又は量の指標となる。一実施形態では、反応混合物はオリゴヌクレオチドプローブをさらに含む。またさらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブ及び検出用ラベルは操作可能に連結する。別の実施形態では、検出用ラベルは、挿入検出用ラベル（例えばＳＹＢＲグリーン）である。
【００９５】
さらに別の態様において、本発明は、標的核酸を検出する方法に関する。この方法は、ポリメラーゼ、プライマー、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤、ｄＮＴＰ及び相互作用するラベル対と操作可能に連結するオリゴヌクレオチドプローブを含む反応混合物を形成すること；反応混合物を、標的を増幅させる核酸増幅反応条件に曝すこと；並びに相互作用するラベル対の成員から生じたシグナルを検出することを含む。生じたシグナルは、サンプル中の標的の存在及び／又は量の指標となる。
【００９６】
本明細書で使用されるように、「核酸増幅反応条件」は、核酸増幅を行うことが可能な、好ましくは核酸増幅を行うのに最適な、緩衝液、温度設定、インキュベート工程及び時間を表す。増幅は、特定の核酸配列の数の増加を意味し、ポリメラーゼ連鎖反応又はリガーゼ連鎖反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法（これらに限定されない）によって達成され得る。このような反応条件は当該技術分野で既知であり、本明細書に記載される。核酸反応条件はＰＣＲ反応条件を包含する。
【００９７】
一実施形態において、反応混合物を、核酸増幅反応条件に曝す工程は、標的核酸が変性するように、反応混合物を熱循環サンプルブロックで加熱する工程を含む。
【００９８】
一実施形態において、増幅反応中に５’ヌクレアーゼによってオリゴヌクレオチドプローブを切断する。またさらなる実施形態では、プローブが切断されると、相互作用するラベル対の成員が分離し、検出シグナルを生じる。このような方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第６，５２８，２５４号、同第６，５４８，２５０号及び同第５，２１０，０１５号（それぞれその全体が参照により本明細書中に援用される）に記載される。
【００９９】
別の態様において、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を突然変異生成反応に使用する。例えば、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤は、ＱＵＩＣＫＣＨＡＮＧＥ部位特異的突然変異生成キット（Stratageneのカタログ番号２００５１８）におけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の代わりに使用してもよい。
【０１００】
ラベル
本発明は検出用ラベルを含むことが多くなることを意図する。検出用ラベルは、プローブと操作可能に連結するか（例えば、ＦＡＭ及びＢＨＱ２）、溶液中に遊離状態で与えられるか（例えば、蛍光ＤＮＡ結合色素、ＳＹＢＲグリーン）、又はヌクレオチド前駆体と操作可能に連結してもよい。
【０１０１】
標的ポリヌクレオチドの増幅及び定量（例えば、ＰＣＲ）における標識プローブの使用は、多くの参考文献（例えばInnis et al.,編「ＰＣＲプロトコル（PCR Protocols）」（Academic Press, New York, 1989）、Sambrook et al.,「分子クローニング、第２版（Molecular Cloning, Second Edition）」（Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989）（これらの全てが参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０１０２】
本明細書で使用されるように、「プローブ」又は「オリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下で検出される核酸配列と安定してハイブリダイズするように、その検出される核酸配列と部分的又は完全に相補的な配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを表す。プローブは、プローブ配列がストリンジェントなハイブリダイズ条件下でプローブの所望の特異性を実質的に変えなければ、標的配列に対して相補的ではない領域を有してもよいが、有しなくてもよい。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、プローブは、「ラベル」と操作可能に連結する。本明細書で使用されるように、「ラベル」という用語は、検出（好ましくは定量）シグナルを与えるのに使用することができ、且つ核酸と操作可能に連結することができる任意の原子又は分子を表す。ラベルは、蛍光、放射能、比色分析、重量測定、Ｘ線回折又は吸収、磁性、酵素活性、質量分析、結合親和性、及びハイブリダイズ高周波等によって検出可能なシグナルを与え得る。
【０１０４】
さらなる実施形態において、プローブは、相互作用するラベル対と操作可能に連結する。本明細書で使用されるように、語句「相互作用するラベル対」及び語句「相互作用ラベル対」及び語句「第１の成員及び第２の成員」は、物理的に、光学的に、又はそうでなければ検出シグナルによってそれらが近接していることが検出されるような様式で相互作用する分子対を表す。「相互作用ラベル対」の例としては、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Stryer, L. Ann. Rev. Biochem. 47, 819-846, 1978）、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）（Hart and Greenwald, Molecular Immunology 16:265-267, 1979、米国特許出願第４，６５８，６４９号）、発光共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）（Mathis, G. Clin. Chem. 41, 1391-1397. 1995）、直接焼き入れ（Tyagi et al., Nature Biotechnology 16, 49-53, 1998）、化学発光エネルギー移動（ＣＲＥＴ）（Campbell, A. K., and Patel, A. Biochem. J. 216, 185-194, 1983）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）（Xu, Y., Piston D. W., Johnson, Proc. Natl. Acad. Sc., 96, 151-156, 1999）、又はエキシマー生成（Lakowicz, J. R.「蛍光分光法の原理（Principles of Fluorescence Spectroscopy）」Kluwer Academic/Plenum Press, New York, 1999）での使用に好適なラベルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
ラベル対は、本発明のオリゴヌクレオチドプローブと共有結合又は非共有結合することができる。
【０１０６】
本発明に有用な相互作用ラベル対は、ＦＲＥＴ−適合性検出用ラベル対又は消光因子−検出用ラベル対を含むことができる。一実施形態では、この対はフルオロフォア−消光因子対を含む。
【０１０７】
広範な種類の蛍光体、例えば、限定されるものではないが、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも呼ばれる；Ｓｐｉｒｏ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセイン）とも呼ばれる；５−ヘキサクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ヘキサクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，７’−テトラ−クロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン；キサンチリウム、９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン；キサンチリウム、９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；ＤＡＢＣＹＬ（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；及びＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）、Ｑｕａｓａｒ−６７０（Biosearch Technologies）、ＣａｌＯｒａｎｇｅ（Biosearch Technologies）、Ｒｏｘ、並びにこれらの好適な誘導体を使用することができる。
【０１０８】
本明細書で使用されるように、「消光因子」という用語は、蛍光ドナーと結合するか又は蛍光ドナーに近接すると、その蛍光ドナーからの発光を低減することができる、発色分子又は化合物の一部を表す。蛍光共鳴エネルギー移動、光誘導性電子移動、項間交差の常磁性増強、デクスター交換結合、及び暗複合体（dark complexes）の形成等の励起子結合を含む幾つかの機構のいずれかによって、消光が起こり得る。フルオロフォアによって発せられた蛍光が、消光因子非存在下での蛍光に比べて少なくとも１０％、例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％又はそれ以上低減すると、蛍光が「消光」する。
【０１０９】
消光因子は、アッセイで使用される励起フルオロフォアからの蛍光発光を少なくとも１つ消光させることができる任意の物質であり得る。以下の参考文献で例示されるように、特定のプローブに適切なレポーター−消光因子対を選択するための入手可能な実践的指針が文献中に数多く存在する。Clegg (1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2994-2998)；Wu et al. (1994, Anal. Biochem., 218:1-13)；Pesce et al.,編「蛍光分光法（Fluorescence Spectroscopy）」(1971, Marcel Dekker, New York)；White et al.「蛍光分析：実践的アプローチ（Fluorescence Analysis： A Practical Approach）」(1970, Marcel Dekker, New York)等。文献には、蛍光分子及び色原体分子並びにレポーター−消光因子対の選択に関連するそれらの光学特性の完全なリストを提供する引用文献、例えば、Berlman「芳香族分子の蛍光スペクトルハンドブック  第２版（Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition）」(1971, Academic Press, New York)；Griffiths「有機分子の色と構造（Colour and Constitution of Organic Molecules）」(1976, Academic Press, New York)；Bishop,編「指標（Indicators）」(1972, Pergamon Press, Oxford)；Haugland「蛍光プローブと研究用化学物質ハンドブック（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992 Molecular Probes, Eugene)；Pringsheim「蛍光及び燐光（Fluorescence and Phosphorescence）」(1949, Interscience Publishers, New York)（これらの全てが参照により本明細書中に援用される）も含まれる。さらに、以下の参考文献（例えばHaugland（上述）、Ullman et al.、米国特許第３，９９６，３４５号、Khanna et al.、米国特許第４，３５１，７６０号（全て参照により本明細書中に援用される）によって例示されるように、オリゴヌクレオチドに付加することができる一般的な反応基を介した共有結合のために、レポーター及び消光因子分子を誘導体化するための、広範囲に及ぶ指針が文献中に存在する。
【０１１０】
市販の消光因子の多くが当該技術分野で既知であり、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、及びＢＨＱ−３が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＨＱ（「ブラックホールクエンチャ」）消光因子は、ハイブリダイズが起こるまで蛍光を抑える新規の暗消光因子群である。さらに、これらの新規の消光因子は自然状態で蛍光を有せず、他の消光因子に見られるバックグラウンド問題が事実上排除される。ＢＨＱ消光因子は、ほとんど全てのレポーター検出用ラベルを消光するのに使用することができ、例えばBiosearch Technologies, Inc（Novato, CA）から市販されている。
【０１１１】
多くの検出用ラベルと、オリゴヌクレオチドとの結合に適切な結合方法が、多くの参考文献（例えば、Marshall, Histochemical J., 7:299-303（1975）、Menchen et al.、米国特許第５，１８８，９３４号、Menchen et al.、欧州特許出願第８７３１０２５６．０号、及びBergot et al.、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５号に記載されている。全てが参照により本明細書中に援用される。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、本発明の組成物は検出用ラベルを含む。検出用ラベルは、標的核酸の存在又は量の指標となるシグナルを生じる任意の検出用ラベルであり得る。このような検出用ラベルは当該技術分野で既知であり、上記される。本発明に有用な検出用ラベルは、ＳＹＢＲグリーン及びＦＡＭ等の蛍光検出用ラベルを含む。一実施形態では、ラベルは、反応混合物を加熱するために、電磁エネルギーを熱エネルギーに変換しない（例えば、米国特許公開第２００３／００１７５６７号（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されるように）。
【０１１３】
一実施形態において、ラベルはヌクレオチドと操作可能に連結する。一実施形態では、標識ヌクレオチドは、２００３年４月４日に出願された米国特許公開第２００４／００１４０９６号（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されるように、二重標識ヌクレオチドである。二重標識ヌクレオチドは、蛍光ラベル及びこの蛍光ラベルの消光因子を含む。
【０１１４】
他の好適な二重標識ヌクレオチドは、例えばRosenblum et al.（1997, Nucleic Acids Research, 25: 4500）で教示されたものを含む。Rosenblum et al.は、核酸塩基と結合した蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素対を含むヌクレオチド類似体の使用を教示している。１つの色素の励起スペクトル内であり、他の色素の励起スペクトル内ではない波長の光にヌクレオチド類似体を接触させることによって、このような類似体の成長ポリヌクレオチド鎖への組み込みを検出する。それから順に、励起フルオロフォアによって発せられた光は第２の色素を励起し、そこから蛍光発光が検出される。さらに、Williams（米国特許出願公開第２００１００１８１８４号）は、フルオロフォアがポリホスフェート部のγ−ホスフェートと結合し、消光因子がヌクレオチド類似体の他の部分と、好ましくはピリミジン塩基の５’炭素及びデアザプリン塩基の７’炭素と結合する、二重標識ヌクレオチド類似体を教示している。Williamsによって教示された類似体の成長ポリヌクレオチド鎖への組み込みの際に、蛍光部と結合するホスフェート基が切断され、蛍光部と消光因子とを分離することによって、蛍光部が検出シグナルを発するのを可能にする。
【０１１５】
キット
本発明は、本明細書に記載されるように、両性イオン洗剤／非洗浄性界面活性剤及びポリメラーゼを有する、新規の組成物及び方法を提供することを目的としている。本明細書中で本発明は、対象の組成物の１つ又は複数のコンテナ、及び幾つかの実施形態ではポリヌクレオチド合成（ＰＣＲ、シークエンシング及び突然変異生成における合成を含む）に使用される様々な試薬のコンテナを有するパッケージ単位を含むキットフォーマットも意図する。キットは、以下の要素：ポリヌクレオチド前駆体（例えば、ヌクレオシドトリホスフェート）、プライマー、プローブ、緩衝液、取扱説明書、標識ヌクレオチド、挿入色素及び対照の１つ又は複数を含有してもよい。キットは、本発明による方法を行うのに好適な割合で共に混合した試薬のコンテナを含んでいてもよい。試薬コンテナは、本方法を行う際に測定工程が省かれる単位量で試薬を含有することが好ましい。本発明による１つのキットは、染色ゲルからのＰＣＲ産物収量の定量のために、ＤＮＡ収量標準も含有する。一実施形態ではキットは、熱安定性ポリメラーゼ、両性イオン界面活性剤又は非洗浄性界面活性剤、及びポリヌクレオチド前駆体を含むマスターミックス試薬を含む。
【０１１６】
一実施形態において、キットは、ポリメラーゼ及び両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤を有する保存緩衝液及び／又は反応緩衝液を含む。保存緩衝液は検出用ラベルを含有しない。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明は、ポリメラーゼ及び２つ以上の両性イオン洗剤の組合せを有する保存緩衝液及び／又は反応緩衝液を含むキットを提供する。保存緩衝液は検出用ラベルを含有しない。
【０１１８】
さらに別の実施形態において、キットは、ｄＮＴＰを有する別のコンテナをさらに含み得る。別の実施形態では、上記のキットのいずれかが、検出用ラベルを有する別のコンテナをさらに含み得る。
【０１１９】
別の態様において、本発明は、精製ポリメラーゼ、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤、ポリヌクレオチド前駆体、及び標識ヌクレオチドを含むキットに関する。さらに別の態様では、本発明は、精製ポリメラーゼ、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤、ポリヌクレオチド前駆体、及びＤＮＡ結合色素を含むキットに関する。
【０１２０】
幾つかの実施形態のキットにおいて、両性イオン洗剤又は非洗浄性界面活性剤は、核酸増幅反応を行うのに好適な１０×ストック反応緩衝液中に１０×濃度として与えられる。
【実施例１】
【０１２１】
ポリメラーゼ及び従来の非イオン性洗剤を欠いた緩衝液の調製
非イオン性洗剤を最終保存緩衝液から除いたこと以外は標準的な製造プロトコルを使用して（洗剤非存在）、Ｐｆｕ（ｅｘｏ＋及びｅｘｏ−）融合ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、２００５年７月１５日に出願された米国特許出願第６０／６９９，９３７号（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されるような）、ｃＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Stratageneのカタログ番号６００１５４）、及びＰＥＦを精製した。酵素は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、及び５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。さらに、０．０５％〜０．５％の範囲の割合（ｖ／ｖ）で、１つ又は複数の両性イオン洗剤をＤＮＡポリメラーゼ保存緩衝液に追加した。
【０１２２】
非イオン性洗剤なしで、ＰＣＲ反応緩衝液を調製した（「ＤＦ緩衝液」、洗剤無含有緩衝液）。例えば、１×ｃＰｆｕ  ＤＦ緩衝液は、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭのＭｇＳＯ４、及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡを含有する。洗剤無含有型のＰｆｕ融合緩衝液も調製し、４０ｍＭのトリスＳＯ４（ｐＨ１０）、１５ｍＭのＫ２ＳＯ４、８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４（１×Ｐｆｕ融合ＤＦ緩衝液Ｉ）、又は３０ｍＭのトリスＳＯ４（ｐＨ１０）、４０ｍＭのＫ２ＳＯ４、１．５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４（１×Ｐｆｕ融合ＤＦ緩衝液ＩＩ）から成っていた。
【０１２３】
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（非イオン性洗剤）或いは１つ又は複数の両性イオン洗剤若しくは非洗浄性界面活性剤をＰＣＲ反応緩衝液に追加した。例えば、両性イオン洗剤ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０、及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２をAnaTrace, Inc.（Maumee, OH）から得て、０．０５％〜０．５％の範囲の割合（ｖ／ｖ）でＤＦ緩衝液に添加した。非洗浄性界面活性剤Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５は、Air Productsから購入して、同様に使用した。
【実施例２】
【０１２４】
ＰＣＲの終点においてＰｆｕ及びＰｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼ活性を高めるための両性イオン洗剤の使用
０．９ｋｂ及び６ｋｂのシステムに関して、１×ｃＰｆｕ  ＤＦ緩衝液中でｃＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ４０ｎｇ、又は１×Ｐｆｕ融合ＤＦ緩衝液Ｉ若しくはＤＦ緩衝液ＩＩそれぞれの中でＰｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼ２８ｎｇ又は２２４ｎｇを使用して、ＰＣＲ反応（５０μｌ）を行った。ＰＣＲ反応物は、２Ｕ／５０μｌのパイロコッカス・フリオサスｄＵＴＰアーゼ（PEF）、ヒトゲノムＤＮＡ  １００ｎｇ、それぞれ２５０μＭのｄＮＴＰ、及び各プライマー１００ｎｇも含有していた。９ｋｂのシステムに関して、ＰＣＲ反応物（５０μｌ）は、Ｐｆｕ  ８０ｎｇ、１．５×ｃＰｆｕ  ＤＦ緩衝液、２Ｕのパイロコッカス・フリオサスｄＵＴＰアーゼ（PEF）、ヒトゲノムＤＮＡ  ２００ｎｇ、それぞれ５００μＭのｄＮＴＰ、及び各プライマー２００ｎｇから成っていた。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００又は両性イオン洗剤（複数可）をＰＣＲ反応緩衝液に追加した。反応サイクルは、以下に記載されるようなものであった。
【０１２５】
【表１】
0005479895.tif 000003
【０１２６】
図１〜図８に示される結果は、両性イオン洗剤の活性の増強及び／又は安定化を示す。洗剤の非存在下で精製及び保存したＰｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼを使用して、両性イオン洗剤を追加した融合ＰＣＲ緩衝液中でゲノムＤＮＡ標的を増幅した（図１〜図３）。洗剤の非存在下で行ったＰＣＲでは、産物が産生されなかった（図１、パネルＡ)。これに対して、ＣＨＡＰＳＯ（０．１５％〜０．３％）、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０（０．４％〜０．８％）、及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２（０．１％〜０．２％）の存在下で行った増幅によって、高い産物収量が得られた（図１）。場合によっては、両性イオン洗剤の組合せによって、個々の洗剤よりも大きいＰｆｕ融合活性の増強が与えられる。例えば、準最適量のＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０（０．１％〜０．２％、図２）又はＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２（０．０５％、図３）を準最適量のＣＨＡＰＳＯ（０．０５％）洗剤と組合せると、産物収量は劇的に向上する。
【０１２７】
また、両性イオン洗剤を酵素保存緩衝液に組み込んだ。例えば、洗剤非存在下で、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを精製した後、洗剤を欠いた（パネルＡ、図４）、又はそれぞれ０．２％の両性イオン洗剤、ＣＨＡＰＳＯ及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２を含有していた（パネルＢ、図４）保存緩衝液中で希釈した。クローン化Ｐｆｕ  ＰＣＲ緩衝液（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００含有）によるＰＣＲで使用する場合、両性イオン洗剤で調製されたＰｆｕサンプルによって、ＣＨＡＰＳＯ及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２の非存在下で希釈及び保存されたＰｆｕサンプルよりも有意に高い収量が得られた。ＰＣＲ緩衝液に組み込むと、Ｐｆｕの保存安定性が高まるのに加えて、両性イオン洗剤の収量の増大も示された（図５）。洗浄液を欠いた緩衝液中で行ったＰＣＲでは、産物が産生されなかった（パネルＣ、図５）。これに対して、両性イオン洗剤の添加によって、産物収量が劇的に向上し、ＣＨＡＰＳＯ（０．０５％〜０．２％）及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２（０．１％〜０．２％）は、ＣＨＡＰＳ及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０よりも幾らか効果的であったことが見出された（図５）。
【０１２８】
Ｐｆｕ及びＰｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼ活性を増強させることが示された洗剤としては、以下の表で列挙されるものが挙げられる。
【０１２９】
【表２】
0005479895.tif 000004
【実施例３】
【０１３０】
Ｐｆｕ融合酵素を安定化するための両性イオン洗剤の使用
両性イオン洗剤の安定化効果を示すのに、加速安定性試験を行った。洗剤非存在下で、Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼを精製した後、洗剤を欠いた保存緩衝液、又は従来の非イオン性洗剤（０．１％  Ｉｇｅｐａｌ／０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）若しくは様々な両性イオン洗剤を含有する保存緩衝液中で２８ｎｇ／μｌに希釈した。−２０℃で、タンパク質サンプルを保存するか、又は様々な時間９５℃で加熱した。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（Ａ）、又は０．１％  ＣＨＡＰＳＯ／０．１％  Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２のいずれかを追加した融合ＤＦ緩衝液中でＰＣＲにおいて０．９ｋｂのゲノム標的を増幅することによって、残存活性を評価した。
【０１３１】
図６で示される結果は、両性イオン洗剤ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、及びＡｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１２が、Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼの安定性を高めることを示す。洗剤非存在下で９５℃で加熱すると、Ｐｆｕ融合は活性を失う。従来の非イオン性洗剤に比べて、両性イオン洗剤は、失活に対してＰｆｕ融合を保護するのに等しく効果的であると考えられる（９５℃、６時間、図６）。９５℃で２４時間後、非イオン性洗剤及び両性イオン洗剤中で保存したタンパク質サンプルは完全に失活する。
【実施例４】
【０１３２】
ＱＰＣＲにおいてＰｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼ活性を高めるための両性イオン洗剤の使用
ＱＰＣＲ反応物は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ鋳型、様々な量のプライマー（以下の表２を参照されたい）、それぞれ３００μＭのｄＮＴＰ、４ｎｇ／μｌのｅｘｏ−Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼ、６ｎｇ／μｌのホットスタートＩｇＧ、０．４ｎｇ／μｌの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、１×Ｐｆｕ融合ＤＦ緩衝液ＩＩ（ｐＨ９）、４％  ＤＭＳＯ、及び８％グリセロールを含んでいた。０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００又は両性イオン洗剤、及び０．５×ＳＹＢＲグリーン（Molecular ProbesのＳ−７５６７）をＱＰＣＲ反応物に追加した。反応サイクルは、以下の条件を使用したＭＸ３０００ＰリアルタイムＰＣＲシステムで行った：（１サイクル）９５℃  ５分；（４０サイクル）９５℃  １０秒、６０℃  ３０秒。
【０１３３】
【表３】
0005479895.tif 000005
【０１３４】
図７及び図８で示される結果は、ＱＰＣＲにおける両性イオン洗剤の活性の増強を示す。洗剤無含有Ｐｆｕ融合ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＹＢＲグリーン、及び様々な両性イオン洗剤で配合されたＱＰＣＲマスターミックス（Stratageneのカタログ番号６００５８１）を使用して、増幅を行った。洗剤非存在下で行ったＱＰＣＲでは、産物が産出されなかった（図７、左上のパネル）。これに対して、０．５％  ＣＨＡＰＳ又はＣＨＡＰＳＯの存在下で行った増幅は、増幅効率、全蛍光、及びＣｔ値に関して、従来の非イオン性洗剤（０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）の存在下で行った増幅と同程度であると考えられる。両性イオン洗剤の組合せは、個々の両性イオン洗剤と同程度効果的であるか、又は個々の両性イオン洗剤よりも効果的であり得る。例えば、０．１％  ＣＨＡＰＳと、０．１５％  Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ  ３−１０との組合せは、ＱＰＣＲにおいてＰｆｕ融合活性を高めるのに特に効果的である。
【０１３５】
以下の両性イオン洗剤又は洗剤の組合せが、Ｐｆｕ融合及びＳＹＢＲグリーン検出で行われるＱＰＣＲ増幅を高める。
【０１３６】
【表４】
0005479895.tif 000006
【実施例５】
【０１３７】
ＰＣＲの終点においてＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を高めるための非洗浄性界面活性剤の使用
図９で示される結果は、Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５が、Ｐｆｕ融合（パネルＡ）及び非融合（パネルＢ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を増強及び／又は安定化させることを示す。実施例２で示された条件を用いて、ＰＣＲを行った。０．０５％〜２．５％  Ｓｕｒｆｙｎｏｌ  ４６５をＰＣＲ反応緩衝液に追加した場合、非イオン性洗剤非存在下で行った増幅によって、高い産物収量が得られた。この収量は、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００をさらに追加した洗剤無含有ＰＣＲ緩衝液を使用して得た収量と同程度であった。
【０１３８】
本明細書中で言及された全ての特許、特許出願、及び刊行された参考文献は、その全体が参照により本明細書中に援用される。本発明は、その好ましい実施形態に関して具体的に図示及び記載しているが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細において様々な変更が実施形態中で為され得ることは、当業者に理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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