(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、２、および４〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるペプチドであるプレクチン−１結合部分を含む第一部分と、
前記第一部分に結合される第二部分であって、検出可能部分または治療剤を含む第二部分と、を含む、ペプチドリガンド。
【請求項２】
前記検出可能部分が、放射性同位元素、磁性化合物、Ｘ線吸収剤、化学的化合物、生物学的標識および蛍光分子からなる群より選択される、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項３】
前記治療剤が、細胞毒性部分または免疫調節性部分である、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項４】
前記第一部分と前記第二部分との間にリンカーをさらに含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項５】
前記リンカーが、可動性のアミノ酸配列である、請求項４に記載のペプチドリガンド。
【請求項６】
前記リンカーが、フォトリンカーである、請求項４に記載のペプチドリガンド。
【請求項７】
前記第二部分が、生理学的に不活性なナノ粒子をさらに含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、磁性、蛍光性または放射性である、請求項７に記載のペプチドリガンド。
【請求項９】
前記第二部分が、蛍光色素を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項１０】
前記蛍光色素が、近赤外蛍光色素である、請求項９に記載のペプチドリガンド。
【請求項１１】
前記第二部分が、ＮＩＲＦとコンジュゲートされた架橋酸化鉄ナノ粒子を含む、請求項１に記載のペプチドリガンド。
【請求項１２】
ナノ粒子と結合された、配列番号１のアミノ酸からなるペプチドを含む、ペプチドリガンド。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素（ＮＩＲＦ）を含む磁性蛍光ナノ粒子である、請求項８に記載のペプチドリガンド。
【請求項１４】
膵管腺癌の診断または治療のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドリガンドを含む医薬組成物。
【請求項１５】
膵管腺癌の診断または治療用の薬剤製造における、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のペプチドリガンドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２００８年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／０４４，８１８号の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に参照により援用する。
【０００２】
政府支援
本発明は、助成番号Ｐ５０−ＣＡ８６３５５、ＰＯ１−ＣＡ１１７９６９−０１、Ｋ０１ＣＡ１０４６４７−０３、ＥＢ００４６２６、ＲＯＩ−ＨＬ０７８６４１、ＲＯＩ−ＨＬ３６４３６、ＨＬ０８０７３１およびＰ０１−ＡＩ０５４９０４の下、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）からの政府支援により成されたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、診断および治療のための、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞バイオマーカーのような癌細胞バイオマーカーおよび結合分子を提供するための組成物および方法に関する。具体的には、ＰＤＡＣ同定用のプレクチン−１のようなバイオマーカーを提供するための「利用可能な」プロテオーム同定法が開示される。さらに、ペプチドリガンドとコンジュゲートされた磁性蛍光ナノ粒子を含む、ＰＤＡＣ同定用のイメージング組成物が提供される。最後に、ＰＤＡＣの治療法も論じられる。
【背景技術】
【０００４】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、米国における癌死亡の主な原因の第４位であり、急速な臨床経過を示して死に至る。一度診断されれば、ＰＤＡＣの平均生存期間は６ヶ月であり、５年生存率はわずか３％である（Ｌｉら，Ｌａｎｃｅｔ  ３６３：１０４９−１０５７（２００４））。
【０００５】
化学療法および放射線療法はあまり効果的ではなく、手術は患者のわずか２０％においてのみ可能であるため、外科的切除を可能にする早期検出が長期生存の望みが最も高い（Ｙｅｏら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２２２：５８０−５８８（１９９５）；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ５８８−５９２）。実際、高リスク患者群（例えば、遺伝性癌症候群、慢性膵炎および新規発症糖尿病）におけるＰＤＡＣまたは高悪性度の前駆の検出が、癌診断ポートフォリオにおいて満たされていない大きな必要性として存在する（Ｂｒｅｎｔｎａｌｌら，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３１：２４７−２５５（１９９９）；Ｃａｎｔｏら，Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２：６０６−６２１（２００４））。
【０００６】
現在のところ、血清ＣＡ−１９−９が臨床的に使用されているバイオマーカーである。しかし、血清ＣＡ−１９−９は、早期段階のＰＤＡＣを検出するために必要な感度が不足している（Ｇｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：４５２４−４５３１（２００５））。さらに、腹部横断画像は、高リスク患者において早期段階のＰＤＡＣを検出するためには信頼性に欠けることが判明している（Ｐｅｌａｅｚ−Ｌｕｎａら，Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １０２：２１５７−２１６３（２００７））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当該医学分野における最優先事項は、前腫瘍性／初期浸潤性病変検出用のイメージングプローブのような診断法としての結合リガンド開発のためのおよび治療で使用するためのバイオマーカーの同定である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、少なくとも部分的には、診断および治療のための、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞バイオマーカーのような癌細胞バイオマーカーおよび結合分子を提供するための組成物および方法に関する。具体的には、ＰＤＡＣ同定用のプレクチン−１のようなバイオマーカーを提供するための「利用可能な」プロテオーム同定法が開示される。さらに、ペプチドリガンドとコンジュゲートされた磁性蛍光ナノ粒子を含む、ＰＤＡＣ同定用のイメージング組成物が提供される。
【０００９】
診断および治療で使用するため、例えば、ペプチド、小分子、ペプチド模倣物、非ペプチド模倣物、抗体などのような結合パートナー（すなわち、リガンド）を提供するための、非癌細胞に対する癌細胞同定用のバイオマーカーが本明細書に記載されている。
【００１０】
一態様において、本発明は癌細胞のバイオマーカーを提供し、ここでこのバイオマーカーは、プレクチン−１フラグメントを含みかつ癌細胞の外膜上に局在する。いくつかの実施形態において、バイオマーカーフラグメントは、配列番号９〜２３で記述される配列のいずれか１つを含む。さらに、本発明は、癌細胞の型により制限されない。実際、様々な癌細胞の型が意図され、胃腸管癌細胞、肝胆道癌細胞、胆嚢癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞、中皮腫癌細胞、膀胱癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、頭部癌細胞、頸部癌細胞、甲状腺癌細胞、子宮癌細胞、子宮体−頸部癌細胞、血液癌細胞、白血癌細胞、骨髄癌細胞、胸膜癌細胞、胸水癌細胞、前立腺癌細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌細胞は、膵臓癌細胞および膵管腺癌細胞（ＰＤＡＣ）からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、配列番号２４またはそのアイソフォームを含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいてアクセッション番号ＮＭ＿０００４４５．２；同ＮＭ＿２０１３７８．１；同ＮＭ＿２０１３７９．１；同ＮＭ＿２０１３８０．２；同ＮＭ＿２０１３８１．１；同ＮＭ＿２０１３８２．１；同ＮＭ＿２０１３８３．１；および／または同ＮＭ＿２０１３８４．１に記載されているような、ヒトｍＲＮＡ配列によりコードされるペプチドまたはそのフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、ファージディスプレイペプチドと結合する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、検出可能部分または治療剤を含む第二部分と結合したプレクチン−１結合部分を有する第一部分を含む、プレクチン−１リガンドを特徴とする。いくつかの実施形態において、プレクチン−１結合部分は、配列番号１、２、または４〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列またはそのペプチド模倣物である。いくつかの実施形態において、プレクチン−１結合部分は、抗プレクチン−１抗体またはその抗原結合フラグメント、小分子あるいはアプタマーである。いくつかの実施形態において、プレクチン−１結合部分は、ナノ粒子、微粒子または固相化試薬と結合している。検出可能部分は、放射性同位元素、磁性化合物、Ｘ線吸収剤、化学的化合物、生物学的標識および蛍光分子からなる群より選択され得る。治療剤は、例えば、細胞毒性部分または免疫調節性部分（例えば、腫瘍に対する免疫応答を増強させる化合物、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α））であり得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、第一部分と第二部分との間にリンカー、例えば可動性のアミノ酸配列、例えばフォトリンカーが存在し得る。
いくつかの実施形態において、第二部分は、例えば、検出可能部分または治療剤に加えてあるいはそれら自体として生理学的に不活性なナノ粒子を含む。
【００１３】
ナノ粒子が、磁性、蛍光性または放射性である、請求項８に記載のペプチドリガンド。ナノ粒子の例として、架橋酸化鉄ナノ粒子（ＣＬＩＯ）、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰ
ＩＯＮ）および架橋超常磁性酸化鉄ナノ粒子が挙げられる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、第二部分は、例えば、最大励起波長の範囲が５００ｎｍ〜１０００ｎｍである蛍光色素を含む。いくつかの実施形態において、蛍光色素は、例えば、最大励起波長の範囲が６５０〜６８０ｎｍである近赤外蛍光色素（例えば、シアニン５．５のようなシアニン誘導体）である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第二部分は、ＮＩＲＦ（例えば、シアニン５．５）とコンジュゲートされた架橋酸化鉄ナノ粒子（ＣＬＩＯ−Ｃｙ５．５）を含む。
いくつかの実施形態において、本発明は、ナノ粒子と（任意でリンカー、例えば、蛍光標識リンカーにより）結合された配列番号１およびナノ粒子（例えば、磁性蛍光ナノ粒子）を含むかまたは基本的にそれらからなる、ペプチドリガンドを特徴とする。いくつかの実施形態において、リンカーおよび粒子の一方または両方が蛍光性である。いくつかの実施形態において、磁性蛍光ナノ粒子は、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素（ＮＩＲＦ）を含む。
【００１６】
別の態様において、本発明は、バイオマーカーに対するリガンドを提供し、ここではこのリガンドは、ペプチドリガンド、模倣物、小分子および抗体からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、リガンドはペプチドである。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１〜８のアミノ酸のいずれか１つを含む、膵管腺癌細胞と結合するためのペプチドリガンドを提供する。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、プレクチン−１のような、膵管腺癌細胞分子に対するバイオマーカーと結合する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸を含む、膵管腺癌細胞と結合するためのペプチドリガンドを提供する。いくつかの実施形態において、リガンドは膵臓癌細胞上の受容体と結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは膵臓癌細胞のバイオマーカーと結合する。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、癌細胞において非癌細胞とは異なる形で発現する。いくつかの実施形態において、リガンドは、癌細胞の受容体との結合パターンが非癌細胞と異なる。いくつかの実施形態において、リガンドは、癌細胞において非癌細胞内とは異なる位置でバイオマーカーと結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは、非癌細胞の受容体よりも多い数の癌細胞の受容体と結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは、非癌細胞よりも多い数の癌細胞と結合する。いくつかの実施形態において、リガンドは癌細胞のバイオマーカーを同定する。いくつかの実施形態において、リガンドは癌細胞のバイオマーカーと結合する。いくつかの実施形態において、バイオマーカーはプレクチン−１である。いくつかの実施形態において、リガンドは、ファージディスプレイランダムペプチドライブラリー由来である。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、ファージディスプレイランダムペプチドライブラリー由来である。いくつかの実施形態において、リガンドは、ファージディスプレイペプチド由来である。いくつかの実施形態において、リガンドは合成物である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、膵管腺癌細胞に結合するペプチドリガンドをディスプレイするバクテリオファージを提供する。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、蛍光分子、例えば、フルオレセインイソチオシアナートを含む。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、膵管腺癌細胞から溶出されたペプチドリガンドをディスプレイする単離されたバクテリオファージ、例えば、配列番号１を含むペプチドリガンドをディスプレイする単離されたバクテリオファージを特徴とする。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、診断用ペプチド、例えば、配列番号１を含むペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、診断用ペプチドは、標識、例えば、放射性同位元素、化学的化合物、生物学的標識および蛍光分子からなる群より選択される標識と
結合している。いくつかの実施形態において、標識は、Ｉ１２５、ビオチン、ヒスタジン（ｈｉｓｔａｄｉｎｅ）タグ、蛍光色素−ヒドロスクシンイミドエステル由来の蛍光色素およびフルオレセインイソチオシアナートからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、診断用ペプチドはリンカーをさらに含む。いくつかの実施形態において、リンカーはフォトリンカーである。いくつかの実施形態において、フォトリンカーは、スルホスクシンイミジル−２−［７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−ｌ，３−ジチオプロピオナートである。いくつかの実施形態において、リンカーは標識、例えば、蛍光標識されている。いくつかの実施形態において、蛍光標識リンカーはＧＧＳＫ（フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ））Ｃリンカーである。
【００２０】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、生理学的に不活性なナノ粒子とコンジュゲートされている。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、架橋酸化鉄ナノ粒子（ＣＬＩＯ）、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）、架橋超常磁性酸化鉄ナノ粒子などからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、フルオロフォア、例えば、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素（例えば、７８５ｎｍ／８１０ｎｍの最大励起／発光波長または６７５ｎｍ／６９４ｎｍの最大励起／発光波長を有する）をさらに含む。いくつかの実施形態において、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素は、シアニン５．５またはその誘導体である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、診断用ペプチドは、磁性蛍光ナノ粒子、例えば、シアニン５．５（ＣＬＩＯ−Ｃｙ５．５）とコンジュゲートされた架橋酸化鉄ナノ粒子と連結されている。
【００２２】
別の態様において、本発明は、配列番号１と任意で蛍光標識リンカーおよび磁性蛍光ナノ粒子の一方または両方とを含むペプチドを含有する、診断用組成物を提供する。いくつかの実施形態において、診断用組成物は、架橋酸化鉄ナノ粒子とコンジュゲートされた蛍光標識リンカー分子と結合した配列番号１を含むペプチドリガンドを含有し、ここでは当該ナノ粒子は、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素（ＮＩＲＦ）とコンジュゲートされている。
【００２３】
さらなる態様において、本発明はペプチド、例えば、配列番号２（すなわち、ＫＴＬＬＰＴＰＧＧＳＫ）、例えば、架橋酸化鉄ナノ粒子とコンジュゲートされた配列番号２を含むＦＩＴＣ標識ペプチド（すわなち、ＫＴＬＬＰＴＰＧＧＳＫ（フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ））Ｃ）を含有する診断用組成物を提供し、ここでは当該ナノ粒子は蛍光色素、例えばＮＩＲＦ、例えばシアニン５．５（ＣＬＩＯ−Ｃｙ５．５）のようなシアニン誘導体と、さらにコンジュゲートされている。
【００２４】
また、膵管腺癌の診断または治療用のならびに膵管腺癌の診断または治療用の薬剤製造における、本明細書に記載のプレクチン−１結合化合物の使用が本明細書に提供される。
別の態様において、本発明は、被検体における癌細胞の検出のための方法を提供する。これらの方法には、被検体由来の細胞または組織（例えば、生検由来、あるいは血漿または血液由来、すなわち、被検体由来の循環腫瘍細胞）の提供；および細胞または組織におけるプレクチン−１タンパク質の存在または細胞内局在の検出が含まれ、ここでは、プレクチン−１の細胞膜発現が癌細胞の存在を示す。いくつかの実施形態において、プレクチン−１の非存在あるいはプレクチン−１の細胞質および／または核発現のみの存在は、その細胞または組織に癌細胞が存在しないことを示す。
【００２５】
いくつかの実施形態において、試料中でのプレクチン−１の細胞内局在の検出には、プレクチン−１タンパク質と結合し任意に検出可能部分を含む薬剤と試料とを接触させること；および薬剤の細胞内局在を検出することが含まれ、ここでは、薬剤の細胞内局在がプレクチン−１発現の細胞内局在を示す。いくつかの実施形態において、プレクチン−１タ
ンパク質と結合する薬剤は、本明細書に記載のようなペプチドリガンドあるいはプレクチン−１に対して特異的な抗体またはその抗原結合部分である。いくつかの実施形態において、細胞内局在は、レーザー走査顕微鏡法、免疫組織化学法、蛍光顕微鏡法および／または放射線写真撮影を用いて検出される。その他の方法として、ラマン分光法、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、放射線（例えば、Ｘ線）散乱または吸収の検出ならびにアイソトープ検出を含めた方法も使用され得る。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、被検体における膵管腺癌（ＰＤＡＣ）または前駆病変膵上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）をインビボで検出するための方法を提供する。これらの方法には、ＰＤＡＣのリスクがあるかまたはＰＤＡＣを有する疑いのある被検体を同定すること；被検体に本明細書に記載のような診断用組成物を投与すること；および被検体の膵臓中のペプチドリガンドの存在をインビボイメージング装置を用いて検出することが含まれる。膵臓中のペプチドリガンドの存在は、被検体がＰＤＡＣを有することを示す。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口および／または胃経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、インビボイメージング装置は、磁気共鳴イメージング装置（ＭＲＩ）、レーザー走査生体顕微鏡、内視鏡および放射線画像装置からなる群より選択される。
【００２７】
また、被検体における膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療法が本明細書において提供される。これらの方法には、ＰＤＡＣのリスクがあるかまたはＰＤＡＣを有する疑いのある被検体を同定すること；被検体に本明細書に記載のような診断用組成物を含む診断用組成物を投与すること；被検体の膵臓中のペプチドリガンドの局在をインビボイメージング装置を用いて検出すること（ここでは、ペプチドリガンドの局在がＰＤＡＣ細胞の局在を示す）；およびＰＤＡＣ細胞を外科的に除去することが含まれる。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、被検体における膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の治療法を提供する。これらの方法には、ＰＤＡＣのリスクがあるかまたはＰＤＡＣを有する疑いのある被検体を同定すること；被検体に本明細書に記載のような治療用組成物（例えば、治療剤と結合したプレクチン−１結合部分を含む）の治療有効量を投与することが含まれる。いくつかの実施形態において、組成物は、真皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口および／または胃経路を介して投与される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、治療剤は、治療薬、放射性同位元素、植物、真菌または細菌起源の分子ならびに生体タンパク質からなる群より選択される細胞毒性または細胞分裂阻害性部分である。いくつかの実施形態において、治療剤は、光毒性または免疫調節性化合物である。
【００３０】
また、配列番号９〜２３のいずれかからなる群より選択されるアミノ酸配列で基本的に構成されるペプチドが、本明細書において提供される。
さらに別の態様において、本発明は、膵臓癌細胞ペプチドリガンドの同定法を提供する。これらの方法には、ａ）ｉ）ファージディスプレイランダムコンビナトリアルペプチドライブラリーであって、当該ペプチドが７〜１２ｍｅｒの範囲にあるライブラリー、ｉｉ）ペプチドに対する受容体であって、当該受容体が膵臓癌細胞の「利用可能な」プロテオーム由来である受容体およびｉｉｉ）ファージディスプレイペプチド−受容体結合アッセイの提供；ｂ）ファージディスプレイペプチド−受容体結合アッセイの実施；ならびにｃ）膵臓癌細胞バイオマーカーの同定が含まれる。いくつかの実施形態において、癌細胞は膵管腺癌細胞である。いくつかの実施形態において、ファージディスプレイランダムコンビナトリアルペプチドライブラリーは、配列番号１のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、ファージは蛍光標識をさらに含む。いくつかの実施形態において、標識は、蛍光色素−ヒドロスクシンイミドエステル、シアニン５．５およびフルオレセインイソチ
オシアナートからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、膵臓癌細胞の「利用可能な」プロテオームは、タンパク質、細胞成分分画、細胞溶解物および全細胞からなる群より選択される成分を含む。いくつかの実施形態において、受容体はプレクチン−１である。いくつかの実施形態において、ペプチド−受容体結合アッセイは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）アッセイ、競合結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、放射アッセイ、インタクト細胞結合アッセイ、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルアッセイ、蛍光顕微鏡アッセイおよびフローサイトメトリーアッセイからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、同定の段階には、差次的遺伝子発現、タンパク質プロセシング、炭水化物プロセシング、輸送、細胞内局在、細胞表面発現、結合パターンおよび結合量の検出が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、膵臓癌細胞に対するペプチドリガンドの同定法を提供する。これらの方法には、ａ）ｉ）受容体を発現する膵臓癌細胞、ｉｉ）非癌細胞、ｉｉｉ）ファージディスプレイペプチドリガンドおよびｉｖ）ペプチドリガンド−受容体結合アッセイの提供；ｂ）癌細胞および非癌細胞へのペプチドリガンドの添加；ならびにｃ）癌細胞と非癌細胞を識別するためのペプチド結合アッセイの実施が含まれる。いくつかの実施形態において、この方法は、受容体からのペプチドの溶離をさらに含む。いくつかの実施形態において、この方法には、ファージディスプレイペプチドの配列決定がさらに含まれる。いくつかの実施形態において、受容体は、固定化受容体結合パートナーである。いくつかの実施形態において、固定化受容体は、生検標本、ビーズ、膜、ゲル、膜およびプラスティックからなる群より選択される支持体材料上に固定化されている。
【００３２】
別の態様において、本発明は、被検体における癌の診断法を提供する。これらの方法には、患者由来の試料（例えば、生検試料）およびペプチドリガンド（ここでは当該ペプチドリガンドは、任意に検出可能部分とコンジュゲートされた配列番号１を含む）を含有する診断用組成物の提供、試料へのペプチドの添加ならびに診断用組成物の検出（例えば、試料中の検出可能部分の検出による）が含まれる。いくつかの実施形態において、イメージング法としてレーザー走査顕微鏡法、免疫組織化学法、蛍光顕微鏡法、放射線イメージングなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、インビボでの癌の診断法を提供する。これらの方法には、膵臓細胞癌のリスクがあるかまたは膵臓細胞癌を有する疑いのある被検体の同定；イメージング分子とコンジュゲートされた配列番号１のペプチドリガンドを含む診断用組成物の被検体への投与；およびインビボイメージングを用いた被検体内のイメージング分子の画像化が含まれる。いくつかの実施形態において、膵臓細胞癌は膵管腺癌である。いくつかの実施形態において、イメージング分子は磁性蛍光ナノ粒子である。いくつかの実施形態において、磁性蛍光粒子は近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素（ＮＩＲＦ）を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、真皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、経口および胃経路からなる群より選択される経路を介して投与される。いくつかの実施形態において、インビボイメージング法として、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、レーザー走査生体顕微鏡法、内視鏡法および放射線イメージングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
別の実施形態において、本発明は、膵臓癌細胞の外科的除去法を提供する。これらの方法には、ａ）ｉ）膵臓癌細胞と膵臓非癌細胞を識別するためのペプチドを含む組成物であって、当該ペプチドが配列番号１である組成物、ｉｉ）膵臓癌を有することが既知である被検体、ｉｉｉ）インビボイメージング装置の提供およびｂ）組成物の被検体への投与、ｃ）イメージング装置によるインビボでの膵臓癌細胞のイメージングおよびｄ）被検体からの膵臓癌細胞の除去が含まれる。いくつかの実施形態において、投与は３０ｍｇＦｅ／ｋｇ（ミリグラム鉄／キログラム）の静脈内注射である。いくつかの実施形態において、投与は２．６ｍｇ／ｋｇの静脈内注射である。
【００３５】
本発明は、癌を有する患者の治療法を提供し、この方法は、ａ）ｉ）治療を必要とする癌患者、ｉｉ）リガンドを含む医薬組成物であって、当該リガンドが本発明のバイオマーカーと結合する医薬組成物の提供およびｂ）治療用組成物の患者への投与を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、治療剤は、融合タンパク質、毒素、薬剤からなる群より選択される。本発明は、癌の種類により制限されない。実際、本発明の検出方法が使用される様々な種類の癌が意図され、肺癌、膀胱癌、頭部および／または頸部癌、乳癌、食道癌、口腔癌、舌癌、歯肉癌、皮膚癌（例えば、黒色腫、基底細胞癌、カポジ肉腫など）、筋肉癌、心臓癌、肝臓癌、気管支癌、軟骨癌、骨癌、胃癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌；子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮癌、膵臓癌、大腸癌、結腸直腸、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、リンパ腫癌、脾臓癌、胸腺癌、甲状腺癌、脳癌、神経癌、中皮腫、胆嚢癌、眼癌（例えば、角膜の癌、ブドウ膜の癌、脈絡膜の癌、黄斑の癌、硝子体液の癌など）、関節癌（滑膜癌など）、膠芽腫、白血球癌（例えば、リンパ腫、白血病など）、遺伝性非ポリポーシス癌、大腸炎関連癌などが挙げられるが、これらに限定されない。癌の例として、さらに肉腫（骨肉腫およびカポジ肉腫など）がある。
【００３６】
本発明は、膵臓癌を有する患者の治療法を提供し、この方法は、ａ）治療を必要とする癌患者、ｉｉ）リガンドを含む医薬組成物であって、当該リガンドがプレクチン−１またはそのフラグメントと結合する医薬組成物の提供およびｂ）治療用組成物の患者への投与を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、治療剤は、融合タンパク質、毒素、薬剤からなる群より選択される。
【００３７】
さらなる態様において、本発明は、膵臓癌を有する被検体の治療法を提供する。これらの方法には、治療を必要とする被検体の同定（例えば、膵臓癌を有することに基づく）および細胞毒性剤（例えば、毒素または薬剤）と連結された配列番号１を含むペプチドを含有する医薬組成物の治療有効量の投与が含まれる。
【００３８】
別の態様において、本発明は、ペプチドリガンドに対して選択的親和性を有する癌細胞結合パートナー（受容体）の同定法を提供する。これらの方法には、多様な結合分子群を固体支持体へ選択的に固定化すること、固体支持体上に固定化された多様な集団を１つまたは複数のペプチドリガンドと接触させること（例えば、同時に接触させること）ならびにバクテリオファージにより発現されたものを含めた１つまたは複数のペプチドリガンドと選択的に結合する結合分子を少なくとも１つ決定することが含まれる。また、腫瘍抗原（結合分子）に対する選択的親和性を有するペプチドリガンドの同定法が提供される。これらの方法には、腫瘍抗原を固体支持体へ選択的に固定化すること、固体支持体上に固定化された腫瘍抗原を１つまたは複数のペプチドリガンドと接触させること（例えば、同時に接触させること）ならびに１つまたは複数の腫瘍抗原と選択的に結合するペプチドリガンドを少なくとも１つ同定することが含まれる。また、腫瘍抗原に対して選択的である単離された結合ペプチド（「ペプチドリガンド」）、具体的には、プレクチン−１に対するペプチドリガンドが提供される。
【００３９】
また、対象とする１つまたは複数のペプチドリガンドに対して選択的親和性を示す結合分子同定のための迅速かつ効率的な方法が、本明細書に記載されている。これらの方法は、対象とする複数のペプチドリガンドに対する複数の結合分子を同時にスクリーニングすることを可能にするという点で有利である。さらに、本発明で使用するための結合分子またはリガンドの独自性または機能に関して必要とされる情報が非常に少ない。例えば、多様なペプチドリガンド集団に対して多様な結合分子群を同時にスクリーニングして、所望の結合特異性を示す多数の分子を迅速に同定することができる。したがって、本明細書に記載の方法は、ペプチドリガンドおよびバイオマーカーのような、ヒト疾患の診断および
治療用の特異的試薬の発見に有利に応用することができる。
【００４０】
定義
本発明の理解を容易にするために、数多くの用語および語句を以下に定義する。
冠詞「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」の使用は、１つまたは複数を包含するものとする。本願で使用される単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈から明らかにそうでないことが示されない限り、複数形の指示対象を包含するものとする。例えば、「ａｎ  ａｇｅｎｔ（１つの薬剤）」という用語は、複数の薬剤およびそれらの混合物を包含する。
【００４１】
本明細書で使用される「患者」または「被検体」という用語は、膵臓癌またはその他の悪性腫瘍の症状を有するかまたはそのリスクのある個体のことである。患者は、ヒトまたは非ヒトであってもよく、例えば、本明細書に記載されているマウスモデルのような研究目的で「モデル系」として使用される動物系統または種を包含し得る。患者は、成体または幼若体（例えば、子供）のいずれも包含し得る。「患者」という用語は、本明細書で意図される組成物の投与が有効であり得る任意の生物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト）をさらに指す。
【００４２】
本明細書で使用される「動物」という用語は、任意の動物、好ましくは哺乳動物を指し、より好ましくは、哺乳動物は、ヒトおよび非ヒト動物、例えばサル類、齧歯類、ヒツジ類、ウシ類、反芻動物類、ウサギ類、ブタ類、ヤギ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、鳥類などのような動物を非限定的に包含する。好ましい非ヒト動物は、齧歯目（例えば、マウスおよびラット）、ヒツジ、ブタ、ウサギまたはウシの仲間である。
【００４３】
本明細書で使用される「利益」という用語は、診断分析法、診断法、手術道具などを非限定的に指す。
本明細書で使用される「癌を有する疑いのある被検体」という用語は、癌を示唆する１つまたは複数の症状（例えば、顕著なしこりまたは腫瘤）を示すかあるいは癌検診が行われている（例えば、通常健診中の）被検体を指す。癌を有する疑いのある被検体は、１つまたは複数の危険因子も有し得る。癌を有する疑いのある被検体は、一般に癌の検査を受けていない。しかし、「癌を有する疑いのある被検体」は、初期診断を受けているが、癌の段階が未知の個体を包含する。この用語は、かつて癌を有した人（例えば、寛解期の個人）をさらに含む。
【００４４】
本明細書で使用される「癌のリスクがある被検体」という用語は、特定の癌を生じる１つまたは複数の危険因子を有する被検体を指す。危険因子として、性別、年齢、遺伝的素因、環境曝露および癌の病歴、既存の非癌疾患および生活様式が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用される「疾患に罹患している」という用語は、特定の疾患を経験している被検体（例えば、ヒト）を指す。本発明は、いかなる特定の徴候または症状あるいは疾患にも限定されないものとする。したがって、本発明は、潜在的な疾患から末期の疾患までの任意の範囲の疾患を経験している被検体を包含し、ここでは当該被検体は、特定の疾患と関連した兆候（例えば、徴候および症状）の少なくとも一部を示すものとする。
【００４６】
本明細書で使用される「試料」および「標本」という用語は、それらの広義において使用され、緩衝液、生理食塩水、細胞培養液などを含めた任意の供給源から得られた試料または標本を包含する。
【００４７】
本明細書で使用される「生体試料」という用語は、動物（ヒト、家畜ならびに有蹄類、
クマ、サカナ、ウサギ類、齧歯類のような野生化したまたは野生種の動物を包含する）から得られた試料または標本を指し、細胞、液体、固体、組織および気体を包含する。本発明の好適な実施形態において、生体試料は、組織（例えば、生検材料）、細胞株、組織から単離された細胞（組織から単離後に培養されたか否かは問わない）、固定された（例えば、組織学的および／または免疫組織化学的解析用に固定された）細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、漿液、血液および血漿、血清などの血液産物を包含する。しかし、これらの例は、本発明での使用が見出される試料の種類を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４８】
本明細書で使用される「生検組織」という用語は、その試料が癌性組織を含むか否かを判定する目的で被検体から取り出された組織試料を指す。ある実施形態において、被検体が癌を有する疑いがあるという理由で生検組織を採取する。次いでこの生検組織を、癌の存在または非存在について検査する。
【００４９】
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はすべて、共有結合である「ペプチド結合」により連結されたアミノ酸の一次配列を指す。一般に、ペプチドは、完全長のタンパク質よりも少ないアミノ酸、通常は２〜５０個のアミノ酸からなる。
【００５０】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含し得る。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、合成、組換えまたは天然のものであり得る。合成ペプチドは、人工的な方法によりインビトロで製造される（例えば、インビボで産生されなかった）ペプチドである。「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」のアミノ酸配列は、化学的化合物も含み得る。
【００５１】
本明細書で使用される「ファージ」または「φ」は、「バクテリオファージ」と同義であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌に感染する、例えば、Ｍ１３、Ｔ４などのウイルスを指す。ファージは、個々のウイルス粒子も指し得る。
【００５２】
本明細書で使用される「ファージディスプレイペプチド（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」または「バクテリオファージディスプレイペプチド」または「ファージディスプレイペプチド（ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」という用語は、１つのペプチド核酸配列を発現し、当該ペプチドがウイルス粒子の外表面上にあるバクテリオファージ粒子を指す。１つのウイルス粒子は、１つのペプチドまたはそのペプチドの複数コピー、例えば５コピー、７コピーなどをディスプレイし得る。
【００５３】
本明細書で使用される、ライブラリーに関連した「ファージディスプレイ」という用語は、ペプチドまたはタンパク質あるいはそれらのバリアントのライブラリーがファージ粒子の外面上に発現され、それに対し、各バリアントをコードする遺伝物質が内側のバリアント上に存在する選択手法を指し、例えば、市販のＰｈ．Ｄ．（商標）−７Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、２０億を超える独立したクローンの７ｍｅｒペプチドを提供し、Ｐｈ．Ｄ．−１２Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）は、１２ｍｅｒペプチドを提供し、非市販のファージディスプレイペプチドライブラリーは、特定の細胞型またはリガンドなどに対するような、複数の供給源由来のランダムに生成または選択された様々なペプチドサイズを提供する。
【００５４】
「ペプチド配列」に関連した「単離（された）」および「精製（された）」という用語は、非所望のペプチド配列およびその他の夾雑物（例えば、所望のペプチド配列を発現していないファージ粒子、不完全なまたは歪んだ合成ペプチド、脂質、炭水化物、核酸など）から，所望の１つまたは複数のペプチド配列を分離することを指す。「単離（された）
」および「精製（された）」という用語は、１００％の均質性まで単離および精製されていることも意図されるが、必ずしもそのことを意味するわけではない。むしろ、これらの用語は、少なくとも５０％の均質性まで単離または精製されていることを意味する。好適な一実施形態においては、ペプチド配列は、少なくとも７５％の均質性まで単離または精製されている。より好適な一実施形態においては、ペプチド配列は、少なくとも９０％の均質性まで単離または精製されている。単離および／または精製後、ペプチド配列は、他の化合物または分子とコンジュゲートされるか、混合されるか、またはそれらに添加される。
【００５５】
本明細書で使用される、「ファージ」または「ファージ粒子」に関連した「単離（された）」という用語は、本発明のペプチド−受容体スクリーニングアッセイのような１つまたは複数のスクリーニングアッセイの後に得られるペプチドをディスプレイするファージを指し、このアッセイでは、ファージディスプレイライブラリーのファージディスプレイペプチド群を癌細胞受容体との結合に関してスクリーニングし、その結果、結合したファージは癌細胞分子との結合に関してファージライブラリーから「単離」される。「単離ファージ」は、結合したファージから溶出されるファージ粒子も指す。
【００５６】
本明細書で使用される、ペプチドリガンドに関連した「単離（された）」という用語は、そのペプチドを発現する単離ファージによりコードされるペプチドリガンドを指し、したがってこの用語は、表される通りのペプチドリガンドならびにファージディスプレイペプチド、単離ペプチドの核酸配列、単離ペプチドのアミノ酸配列、天然および合成形態の単離ペプチドリガンドなどを含めたペプチドリガンドを非限定的に包含する。したがって、本発明の典型的な「単離ペプチドリガンド」は、クローン４、１５および２７のいずれか１つにより発現されるペプチドを非限定的に包含する。
【００５７】
本明細書で使用される、ペプチドリガンド、特に単離ペプチドリガンドに関連した「由来する」または「由来の」という用語は、そのペプチドをディスプレイする単離ファージ粒子から得られるペプチドリガンド配列を指す。しかし、ペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド模倣物、アナログおよび模倣化合物もこの用語の定義内に包含されるものとする。
【００５８】
本明細書で使用される「模倣物」という用語は、リガンドのバイオマーカー（受容体）との結合を模倣する分子を指し、ペプチド、非ペプチド模倣物、小分子模倣物などを包含する。
【００５９】
本明細書で使用される「有機小分子」という用語は、本明細書で使用される場合、医薬品において一般に使用される有機分子と同等の大きさの任意の分子を指す。この用語は、生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）は除外する。好ましい有機小分子の大きさの範囲は、約１０Ｄａから約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、そして最も好ましくは約１０００Ｄａまでである。
【００６０】
本明細書で使用される、ペプチドリガンドに関連した「所望の」という用語は、癌細胞の同定が可能なペプチドリガンドを指す。本明細書で使用される、ペプチドリガンドに対する結合パートナーに関連した「所望の」という用語は、癌細胞バイオマーカーを非限定的に含めたバイオマーカーを指す。
【００６１】
本明細書で使用される蛍光色素に関連した「由来の蛍光色素」という用語は、類似の構造を有する任意の蛍光色素、例えば、エステル基を有する蛍光色素およびペプチドとの共有結合中に荷電エステル基を遊離した後の蛍光色素、フルオレセイン（ＩＵＰＡＣ：３’，６’−ジヒドロキシスピロ［２−ベンゾフラン−３，９’−キサンテン］−１−オン）
化合物のファミリーのような任意の蛍光色素化合物のファミリーを指し、非限定的にフルオレセインイソチオシアナート、フルオレセインイソチオシアナート異性体Ｉなど、関連したおよび類似の化合物を包含する。
【００６２】
本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、一般に生物学的状態の指標である分子または物質、例えば、特定の発生段階を識別する（例えば、多能性細胞、幹細胞、分化した細胞（神経細胞など）を他の細胞から識別する）ためのタンパク質または化学物質などを指す。バイオマーカーは、成熟のような通常の生物学的過程、癌細胞発生のような発病過程または治療的介入に対する薬理学的反応の指標となるものであり、例えば、バイオマーカーが減少または増加した可能性がある場合、疾患の消散または癌細胞の消失を示すものとなる。具体的には、本発明のバイオマーカーは、同系列の非癌細胞に比べて癌細胞において発現の増加のような発現の変化、位置の変化が見られる分子を指す。「癌細胞を識別すること」、特に、非癌細胞から癌細胞をという場合、識別とは、各細胞型における１つまたは複数のタンパク質、ペプチドまたは遺伝子の発現を検出するために使用される試薬およびアッセイ（例えば、本発明の癌マーカーを非限定的に含む）を指す。適切な試薬の例として、ペプチドリガンド、対象とする遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブ、アプタマー、対象とする遺伝子を特異的に増幅することができるＰＣＲプライマーおよび対象とする遺伝子により発現されるタンパク質（バイオマーカーを非限定的に含む）と特異的に結合できる抗体が挙げられるが、これらに限定されない。その他の非限定的な例は、以下の説明および実施例において見出すことができる。細胞分子に関連した「バイオマーカー」という用語は、細胞のサブセットを同定するための本発明の分子、例えば、プレクチン−１のような、膵臓非癌細胞から膵臓癌を同定するためのバイオマーカーを指す。
【００６３】
本明細書で使用される「プレクチン−１」という用語は、プレクチン−１のフラグメントまたは一部分を含む任意の分子、例えば、プレクチン−１アミノ酸配列のフラグメント、例えば、配列番号８〜２３または２４のいずれか１つならびにそのフラグメントのみならず、これらのアミノ酸配列をコードする単離された核酸なども指す。
【００６４】
本明細書で使用される「ペプチドリガンド」（またはペプチドに関連した「リガンド」という語）は、タンパク質、炭水化物などのような分子と特異的に結合するタンパク質フラグメントを指す。受容体は基本的に、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質または任意の有機化合物のような任意の分子種であり得る。リガンドの具体的な例は、本発明のペプチドリガンドである。
【００６５】
本明細書で使用される「選択的な」または「選択的に」という用語は、受容体分子とリガンドとの結合に言及する場合、所望でないまたは非特異的な相互作用から識別される相互作用を指す。識別には、例えば、ファージディスプレイペプチドリガンド−細胞結合アッセイのようなリガンド−受容体結合アッセイにより判定される、受容体分子に対するリガンドの親和性、ファージディスプレイペプチドリガンドの生検スクリーニング、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのようなアフィニティー精製、競合結合アッセイ、パニングアッセイ、アフィニティーアッセイ、結合活性アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなど、定性的または定量的なものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、親和性は、ヒートマップにより示されるように、パニングアッセイ、ＥＬＩＳＡなどにより定性的に測定され得る。ヒートマップでは、ＥＬＩＳＡアッセイにおける表示のクローンの平均吸光度値として親和性が描写され）、クローンの腫瘍細胞に対する親和性と正常導管細胞に対する親和性との比により特異性が判定される。例えば、特異的なペプチドリガンド結合相互作用では、ＰＤＡＣ細胞対正常導管細胞に関して２倍高い吸光度の比を示した。
【００６６】
さらに、親和性は、複合体中の構成要素の結合力を測定することにより、親和性定数（結合定数）（Ｋα）を以下のように計算して定量的に測定され得る：結合平衡がＡ（リガンド）＋Ｂ（受容体分子）＝ＡＢで表される構成要素ＡおよびＢにおいて、結合定数が［ＡＢ］／［Ａ］［Ｂ］で与えられ、この値は、Ａ−Ｂ間の結合が強くなるほど大きくなり、Ａ−Ｂ間の結合が弱くなるほど小さくなる。これとは対照的に、解離定数（Ｋｄ）は、複合体が解離する傾向の尺度を示すものであり、解離定数は［Ａ］［Ｂ］／［ＡＢ］で表され、強い結合ほどＫｄは小さくなるのに対し、弱い結合ほどＫｄは大きくなる。例えば、結合分子とリガンドとの選択的相互作用に対する結合定数Ｋｄは、１０−３Ｍからピコモルの値までの範囲であり得、例えば、選択的結合相互作用に対する結合定数Ｋｄは、一般に１０−３Ｍよりも大きく、好ましくは１０−４Ｍより大きく、より好ましくは１０−５Ｍよりも大きく、さらにより好ましくは１０−６Ｍよりも大きい。高親和性相互作用では、一般に１０−８Ｍ〜１０−９Ｍよりも大きく、より好ましくは１０−９Ｍよりも大きい。
【００６７】
本明細書で使用される「結合活性」という用語は、リガンドと受容体分子との結合力の合計を指し、したがって相互作用の強さは、複数の低親和性相互作用または少数の高親和性相互作用から生じ得る、パートナー間の複数の独立した結合相互作用を含む。
【００６８】
本明細書で使用される「付着する／させる」または「付着」または「付着させた」または「付着している」という用語は、「結合する／させる（ｂｉｎｄ）」または「結合」または「結合する／させる（ｂｉｎｄｓ）」または「結合した」と互換的に使用され、安定な複合体の形成を生じる分子間の任意の物理的関係、例えば、ペプチドまたは小分子のようなリガンドと「結合パートナー」または「受容体分子」との間の物理的関係などを指す。この関係は、選択的非共有結合、イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス力または疎水結合を非限定的に含む、物理化学的相互作用により媒介される。
【００６９】
ペプチド（リガンド）と受容体（分子）との相互作用に関連した「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、特定の構造（すなわち、リガンドのアミノ酸配列またはタンパク質内のリガンド結合ドメイン）に依存する相互作用も指す；言い換えれば、ペプチドは、結合パートナー内の特定のタンパク質構造を認識し、一般の分子ではなく前者と結合することを可能にする構造を含む。例えば、リガンドが結合ポケット「Ａ」に対して特異的である場合、標識ペプチドリガンド「Ａ」（単離されたファージディスプレイペプチドまたは単離合成ペプチドなど）および非標識ペプチドリガンドを含み、結合ポケット「Ａ」を含むタンパク質が存在する反応において、非標識ペプチドリガンドは、結合パートナーと結合する標識ペプチドリガンドの量を減少させることになる（つまり、競合結合アッセイのこと）。
【００７０】
「特異的に結合する」は、結合部分（例えば、オリゴヌクレオチドまたは抗体）のような分子が、試料中に他の分子が存在する中で、標的分子（例えば、核酸またはタンパク質）のような別の分子と優先的に結合することを意味する。
【００７１】
本明細書で使用される「アミノ酸配列」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの一次（すなわち、直線状の）構造を指し、ここでは個々のアミノ酸は、ペプチド結合により連結されている。
【００７２】
本明細書で使用される「受容体」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の「結合分子」または「結合パートナー」（例えば、癌細胞タンパク質に「認識される」または「結合する」あるいはペプチドリガンド「から溶出される」）を指し、本発明のアミノ酸ペプチド配列が相互作用するまたは特異的に結合すると考えられるペプチド、タンパク質または糖タンパク質を非限定的に含む。例えば、結合分子は、細胞表面上または細胞内
に存在し得る。結合分子の一例は、本発明の配列番号１と相互作用するプレクチン−１分子である。本明細書で使用される「結合分子」という用語は、癌細胞または腫瘍細胞により発現されペプチドリガンドと選択的に結合することができる、十分な大きさおよび複雑性を有する分子を指す。このような分子は、一般にはポリペプチドのような高分子であるが、核酸、炭水化物および脂質を包含する。結合分子の大きさは、その分子がペプチドリガンドとの結合活性を示すかまたは示させることができる限り重要ではない。
【００７３】
本明細書で使用される、「癌細胞」または「細胞」または「宿主細胞」に関連した「標的細胞」という用語は、本発明の任意のアッセイにおいてペプチドリガンドの標的として使用される任意の細胞または分子を指す。「標的細胞」は、対象とする特定のバイオマーカーを天然に発現するか、あるいは通常のまたは変異したバイオマーカーを産生するように遺伝的に変化させた、任意の細胞も指す。
【００７４】
本明細書で使用される「標的結合分子」または「標的受容体」という用語は、単離ペプチドリガンドのような対象とするペプチドリガンドの結合パートナー分子である、既知および未知の両方の分子を指す。
【００７５】
ポリペプチドと関連した「バリアント」および「変異体」という用語は、別のポリペプチド、通常は関連するポリペプチドと１つまたは複数のアミノ酸が異なっているアミノ酸配列を指す。バリアントは、置換アミノ酸が類似の構造的または化学的特性を有するような、「保存的」変化を有し得る。１つのタイプの保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；ならびに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換のグループは：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリンおよびアスパラギン−グルタミンである。より稀には、バリアントは、「非保存的」変化（例えば、グリシンとトリプトファンの置換）を有し得る。同様な少数のバリアントはまた、アミノ酸の欠失または挿入（すなわち、追加）あるいはその両方を有し得る。いずれのおよび何個のアミノ酸残基が生物学的活性を失うことなく置換、挿入または欠失され得るかを決定する際の手引きは、当該分野で公知のコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを用いて見出し得る。バリアントは、機能アッセイにおいて試験し得る。好ましいバリアントは、１０％未満、好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満の変化を（置換、欠失などを問わず）有する。
【００７６】
本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、核酸を含有する任意の分子を指し、ＤＮＡまたはＲＮＡを非限定的に包含するが、これらに限定されない。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の既知の塩基類似体を含む配列を包含し、既知の塩基類似体としては、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ−６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメ
チル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシンおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、前駆体またはＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなど）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を指す。ポリペプチドは、完全長またはフラグメントの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達、免疫原性など）が保持される限り、完全長のコード配列によりまたはコード配列の任意の部分によりコードされ得る。この用語は、構造遺伝子のコード領域ならびにこのコード領域の５’および３’両末端側に隣接して位置し両端約１ｋｂまたはそれを超える距離にわたる配列も包含し、したがってこの遺伝子は完全長のｍＲＮＡの長さに相当する。コード領域の５’側に位置しかつｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３’側または下流に位置しかつｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。
【００７８】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡおよびゲノム両形態の遺伝子を包含する。ゲノム形態またはクローンの遺伝子は、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で隔てられたコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーのような調節エレメントを含み得る。イントロンは、核または一次転写産物から除去または「スプライスアウト」され；したがってイントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中に新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を指定するよう機能する。
【００７９】
本明細書で使用される「遺伝子発現」という用語は、遺伝子中にコードされている遺伝情報を、遺伝子の「転写」により（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｓｎＲＮＡ）に変換する、およびタンパク質をコードする遺伝子に関してはｍＲＮＡの「翻訳」によりタンパク質へ変換する過程を指す。遺伝子発現は、この過程において多くの段階で制御される。「上方制御」または「活性化」は、遺伝子発現産物（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させる制御を指すのに対し、「下方制御」または「抑制」は、産生を減少させる制御を指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）は、それぞれ「アクチベーター」および「レプレッサー」と呼ばれることが多い。
【００８０】
本明細書で使用される「標識」という用語は、本明細書で使用される場合、検出可能な（好ましくは定量化できる）シグナルをもたらすために使用され得る、および核酸またはタンパク質に付着させ得る、任意の原子または分子を指す。標識は、蛍光、放射活性、比色分析、重量分析、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性などにより検出可能なシグナルをもたらし得る。標識は、荷電部分（正または負荷電）であり得るか、あるいは荷電中性であり得る。標識は、その標識を含む配列が検出可能である限り、核酸またはタンパク質配列を含むかまたはこれらから構成され得る。
【００８１】
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、架橋という形で１つの分子または配列と別の分子または配列とを付着させる、分子またはアミノ酸配列のような配列を指す。「架橋された」、「コンジュゲートされた」または「結合された」は、共有結合または非
共有結合またはファンデルワールス力のようなその他の結合により付着または結合されていることを意味する。
【００８２】
本明細書で使用される「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養を指す。この用語には、連続細胞株（例えば、不死化表現型）、初代細胞培養物、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）およびインビトロで維持されるその他の任意の細胞集団が包含される。
【００８３】
本明細書で使用される「上皮細胞」という用語は、膵管細胞のような、立方形で一般に組織表面上に位置する有核細胞を指す。上皮細胞層は一般に、輸送過程にも関与し得る保護的な内層および／または表面を形成するよう機能する。上皮細胞は、当該分野で公知の組織学的方法を用いて非上皮細胞（例えば、筋細胞、神経細胞、分泌細胞など）と容易に区別される。
【００８４】
本明細書で使用される「内皮細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、管腔を含む身体器官（例えば、血管、腸管、リンパ管または導管など）の内層を形成し得る任意の細胞を指す。通常、内皮細胞は、物理的および化学的保護をもたらし、さらに栄養分またはその他の代謝的に活性な化合物の選択的吸収ももたらす。
【００８５】
本明細書で使用される、膵臓に関連した「導管細胞」は、膵臓内のまたは膵臓から出る導管の導管内層を形成する能力を有するかまたは導管内層に由来する任意の細胞を指す。
本明細書で使用される、器官に関連した「膵臓」は、結合組織により結び付いた複数の細胞型の集まりを指し、これら複数の細胞には、腺房細胞、導管細胞および島細胞が包含されるが、これらに限定されない。「腺房」は、十二指腸内の食物を消化するのに必要とされる、リパーゼのような多くの酵素を産生する。腺房により産生された酵素は、導管と呼ばれる細い管により十二指腸へ運ばれる。通常、導管細胞は、結合組織により血管細胞および神経細胞に近接した位置に保持されている。ランゲルハンス島は通常、膵臓の外分泌腺房単位の間に埋め込まれている。内分泌細胞の例は、インスリンの働きを抑えるグルカゴンを分泌するアルファ細胞であり、これに対してベータ細胞は、糖質代謝の調節を助けるインスリンを分泌する。
【００８６】
本明細書で使用される「膵臓癌」は、膵臓を含む組織内で発生する、膵管腺癌細胞のような癌を指す。
本明細書で使用される「腺癌」は、腺（空間を取り囲む細胞の集まり）を形成する細胞からなる良性（非癌性）腫瘍を指す「腺腫」に対して、癌性腫瘍を指す。
【００８７】
本明細書で使用される「膵管腺癌細胞」は、膵臓の導管内層を形成する能力を有していたまたは導管内層に由来する癌性細胞を指す。膵管腺癌細胞は、腺を形成する膵臓内に見られるか、またはあらゆる転移細胞として器官内に見られるか、またはリンパ系の血流中に見られ得る。
【００８８】
本明細書で使用される「被検体中の癌の特徴付け」という用語は、良性、前癌性または癌性の組織の存在、癌の段階および被検体の予後を非限定的に含む、被検体中の癌試料の１つまたは複数の特性の同定を指す。癌は、本明細書に開示される癌マーカーを非限定的に含めた１つまたは複数の癌マーカー遺伝子の発現を同定することにより特徴付けられ得る。
【００８９】
本明細書で使用される「幹細胞癌マーカー」という用語は、単独または他の遺伝子と組み合わせた発現レベルが腫瘍化癌細胞の存在と相関している遺伝子またはその遺伝子により発現されるペプチドを指す。その相関関係は、その遺伝子発現の減少または増加（例え
ば、ｍＲＮＡレベルまたはその遺伝子にコードされるペプチドレベルの増加または減少）と関連し得る。
【００９０】
本明細書で使用される「被検体中の癌検出用キット使用のための説明書」という用語は、被検体由来の試料中における癌の検出および特徴付け用キットに含まれる試薬を使用するための説明書を包含する。
【００９１】
本明細書で使用される「予後診断を提供する」という用語は、癌の存在（例えば、本発明の診断法により判定されるような）が被検体の将来の健康状態に与える影響に関する情報（例えば、予想される罹患率または死亡率、癌に罹患する可能性および転移のリスク）を提供することを指す。
【００９２】
本明細書で使用される「術後腫瘍組織」という用語は、（例えば手術中に）被検体から除去された癌性組織（例えば生検組織）を指す。
本明細書で使用される「癌を有すると診断された被検体」という用語は、検査され癌性細胞を有することが判明した被検体を指す。癌は、生検、Ｘ線、血液検査および本発明の診断法を非限定的に含めた適切な任意の方法を用いて診断され得る。
【００９３】
本明細書で使用される、膵臓細胞に関連した「非癌性」という用語は、その発生段階および活性に応じた制御可能な細胞増殖および機能的生理を示す細胞を指す。
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、無制御かつ進行性である過剰な細胞分裂により生じる異常な組織の塊を指す。腫瘍は新生物とも呼ばれる。腫瘍は、良性（癌性でない）または悪性であり得る。
【００９４】
本明細書で使用される「腫瘍細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の無制御な増殖パターンまたは変化した生理機能を示す任意の細胞の塊を指す。腫瘍細胞は、生物体内のあらゆる組織に由来し得る（例えば、膵管腫瘍細胞）。
【００９５】
本明細書で使用される「癌」という用語は、無制御で異常な細胞増殖により特徴付けられる１００を超える疾患の総称である。癌細胞は、局所的に拡散し得るか、または血管内に侵入し血流およびリンパ系を経て体の他の部分へ拡散し転移を形成し得る。拡散する癌細胞は「悪性」と呼ばれる。
【００９６】
本明細書で使用される、哺乳動物における生理的状態に関連した「癌」および「癌性」という用語は、通常、無制御な細胞増殖により特徴付けられる。癌の例として、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより詳細な例として、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌腫、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫ならびに様々な型の頭部および頸部癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９７】
本明細書で使用される「悪性」という用語は、退形成、近接領域または血管系などへの浸透ならびに転移という特性を有することを指す。
本明細書で使用される「浸潤性」または「転移」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞、特に浸潤性の癌細胞または腫瘍細胞の任意の移動を指す。この用語は、創傷治癒線維芽細胞のような正常な浸潤性の細胞および異常に移動する細胞にも適用される。この用語は、いかなる機構原理にも制限されるべきではないが、このような細胞は、体がそれらを正常に機能するよう十分に「適切な位置に」保つ手段を打ち破ることにより移動すると考えられている。このような細胞が組織または腫瘍内を異常に移動するか、あるい
は組織から逸脱するか、あるいは他の組織に浸潤する場合、それらは「浸潤性」である。
【００９８】
本明細書で使用される「細胞の移動」という用語は、ある細胞集団が１つの場所から別の場所へ移動することを指す。このような細胞の移動は、形態形成中の神経冠細胞の移動のような場合は正常であり得、あるいは原発部位から近接領域、血管系へ、そしてそこから元のまたは他の器官の新たなまたは二次部位へ悪性癌細胞が移動する場合は正常であり得ない。
【００９９】
本明細書で使用される「インビトロ」という用語は、人工環境ならびに人工環境内で起こる過程または反応を指す。インビトロ環境は、制御された実験室環境からなるが、これに限定されない。
【０１００】
本明細書で使用される「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、生体内または細胞内）ならびに天然環境内で起こる過程または反応を指す。あるいは、「インビトロ」という用語は、実験用ペトリ皿内での実験のような、所与の実験を生体外の制御された環境内で行うことを指す。
【０１０１】
本明細書で使用される、ペプチドリガンドに関連した「阻害する」という用語、例えば「悪性細胞の移動を阻害するペプチドリガンド」または「癌細胞の増殖を阻害するペプチドリガンド」は、それぞれ移動または増殖の部分的または全体的な阻害を指す。
【０１０２】
本明細書で使用される、治療に関連した「患者における癌の縮小」という用語は、患者における癌細胞数の減少、患者における癌細胞増殖の低下、患者における癌細胞転移の減少のための任意の治療を指し、癌症状の軽減または患者の寿命延長のための任意の対応形式を包含する。
【０１０３】
本明細書で使用される「ＥＬＩＳＡ」という用語は、酵素結合免疫測定法を指す。ＥＬＩＳＡを行うための数多くの方法および応用法が当該分野で公知であり、多くの情報源にて提供されている（例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，「Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）」，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒａｐｌｅｙら，［ｅｄｓ．］，ｐｐ．５９５−６１７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．［１９９８］；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ［１９８８］；ならびにＡｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ［１９９４］；ならびにＮｅｗｔｏｎら，（２００６）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．８：７７２−７８０を参照されたい）。本発明のいくつかの実施形態において、「直接ＥＬＩＳＡ」のプロトコールが提供され、ここでは、最初に細胞、細胞溶解物または単離されたタンパク質のような標的結合分子を、マイクロタイタープレートウェルに結合させて固定化しておく。別の実施形態において、「サンドイッチＥＬＩＳＡ」が提供され、ここでは、予めマイクロタイタープレートウェルに結合させておいた抗体で標的結合分子を捕捉することにより、これを基質を付着させる。ＥＬＩＳＡ法では、蛍光標識したリガンドまたは抗体−酵素コンジュゲートの蛍光検出を用いて固定化されたリガンド−受容体複合体（結合）を検出し、ここでは、抗体がファージ粒子のような対象とする抗原に対して特異的であり、一方、酵素部分が、呈色したまたは蛍光を発する反応産物の生成により可視化および定量化を可能にする。ＥＬＩＳＡで一般に用いられるコンジュゲートされた酵素として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコアミラーゼまたはＯ−ガラクトシダーゼが挙げられる。発色強度は、反応ウェルに存在する抗原の量に比例する。
【０１０４】
本明細書で使用される「医薬組成物」は、ある配列または本発明の配列を含む組成物である。医薬組成物は、担体、薬学的に許容される添加剤などをさらに含み得る。「医薬組成物」および「治療用組成物」という用語は、本明細書において互換的に使用される。医薬組成物は、いかなる特定の担体または添加剤またはその他の成分にも限定されないものとする。
【０１０５】
本明細書で使用される「治療剤」という用語は、細胞機能を阻害する、細胞複製を阻害する、または哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞を殺すことができる、化学物質または薬物またはタンパク質を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される、「キット」という用語は、試薬、特に本発明のペプチドリガンドとその他の材料との組合せに関して使用される。キットは、試薬、例えばファージディスプレイペプチド、単離ペプチドリガンド、任意の１つの蛍光マーカーとコンジュゲートされたペプチドリガンド、ナノ粒子、ＭＲＩ用コンジュゲート、治療用コンジュゲート、抗体、対照タンパク質などおよび検査容器（例えば、マイクロタイタープレートなど）を含み得ることが意図される。「キット」という用語は、試薬および／またはその他の材料の特定の組み合わせに限定されないものとする。
【０１０７】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用するために、方法および材料が本明細書に記載されているが、当該分野で公知である他の適切な方法および材料も使用され得る。材料、方法および実施例は、単に例示的なものであって、限定することを意図したものではない。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録物およびその他の参照物は、その内容全体が参照により援用される。矛盾が生じた場合は、定義を含めた本明細書が統制する。
【０１０８】
本発明のその他の特長および利点は、以下の詳細な説明および図からならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】選択されたクローンの親和性（表示のクローンのＥＬＩＳＡアッセイにおける平均吸光度値）および特異性（クローンの腫瘍細胞に対する親和性と正常導管細胞に対する親和性との比）を表すヒートマップである。データは、高順位（緑色）から低順位（赤色）へと表示されている。
【図１Ｂ】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により検証された、クローン２７の膵管腺癌細胞に対する特異性を表すヒストグラムである。ＦＩＴＣ−標識クローン２７がマウスＰＤＡＣ細胞と特異的に結合したことを示している（ＦＩＴＣ−２７をＰＤＡＣまたは正常マウス導管細胞と共にインキュベートし、次いでＦＡＣＳにより解析した）。
【図１Ｃ】ＦＩＴＣ−２７またはＦＩＴＣ−無関係ファージクローン（ネガティブ対照）と表示の細胞との結合のＦＡＣＳ解析を表す棒グラフである。プロットされているデータは、ＦＡＣＳ解析から得られた平均蛍光単位である。
【図２】ヒトおよびマウス膵管腺癌細胞（ＰＤＡＣ）のクローン２７によるインビボ検出の例を表す一連の１５枚のパネルである。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）標識クローン２７または野生型ファージ（非ペプチド挿入）を表示の組織（マウスおよびヒト）の凍結切片と共にインキュベートし、膵臓切片をヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）クローン２７（ＰＤＡＣ−２７）で染色した。
【図３】（Ａ）−（Ｃ）それぞれクローン−２７のインビボ検証の例を表す４枚のパネルである。野生型（３Ａ）；２９週齢のＫｒａｓ／ｐ１６＋／−（３Ｂ）；および１２週齢のＫｒａｓ／ｐ５３Ｌ／＋（３Ｃ）のマウスにシアニン５．５標識ファージクローン２７およびＳＹＴＯＸグリーン（非特異的な細胞標識剤）を注射し、次いで共焦点生体顕微鏡法によりイメージングを行った。相関的組織学：生体内イメージング実験からの膵臓を最適切削温度（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）コンパウンドで包埋して、凍結し、抗Ｍ１３抗体（３列目）ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）（４列目）で染色した。黒枠は、ＰａｎＩＮ（３Ｂ）またはＰＤＡＣ（３Ｃ）に相当し、抗Ｍ１３の顕微鏡写真では拡大されている。３Ｂおよび３Ｃ（ＨＥ）中の上方の枠および抗Ｍ１３抗体顕微鏡写真中の挿入図（３列目および４列目）は、健常な隣接部位に相当する。
【図４Ａ】２枚のパネルである。左のパネルが表すのは、スルホ−ＳＡＥＤコンジュゲートファージクローン２７およびビオチン修飾ファージクローン２７あるいは対照ファージとインキュベートしたマウスＰＤＡＣ細胞の銀染色ゲルであり、光に当て、溶解物をストレプトアビジンコーティングしたビーズと共にインキュベートしたものである。沈降したタンパク質を（ジチオスレイトール）ＤＴＴで溶出し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。右のパネルはファーウェスタンであり、ＰＤＡＣ溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷し、次いで転写して、クローン−２７または対照（非挿入）ビオチン化ファージで解析したものである。
【図４Ｂ】トリプシン消化産物の一覧表である。４Ａからクローン２７でアフィニティー精製されたタンパク質に対応するバンドをゲルから切り出し、トリプシンで消化して、質量分析法により解析した（配列番号９〜２３）。
【図４Ｃ】４Ａからアフィニティー精製されたタンパク質のブロットである。タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド（ＳＤＳ）ＰＡＧＥゲル上で泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写して、プレクチン−１の存在に関して解析した。
【図４Ｄ】２９３Ｔ細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、マウスＰＤＡＣ細胞、マウス正常導管細胞、Ｐａｃａ−２細胞（ヒトＰＤＡＣ）および正常ヒト導管細胞の一連の６つのブロットである。これらの細胞の細胞成分分画を行い、その成分をプレクチン−１の存在に関してプローブした。
【図４Ｅ】野生型（左）、２９週齢のＫｒａｓ／ｐ１６＋／−マウス（中央）および１２週齢のＫｒａｓ／ｐ５３（右）マウスからの膵臓組織の一連の３枚の顕微鏡写真である。組織をＯＣＴで包埋し、凍結して、抗プレクチン−１抗体で染色した。
【図４Ｆ】競合実験の結果を表すヒストグラムである。マウスＰＤＡＣ細胞をＦＩＴＣ標識クローン２７ならびにプレクチン−１またはビークルと共にインキュベートし、次いでＦＡＣＳによる解析を行った。
【図５Ａ】ＰＴＰとＮＰとのコンジュゲーションの模式図である。対照−ＮＰは、対照ペプチドのＰＴＰへの置換と同じ方法で合成した。
【図５Ｂ】ＰＴＰ−ＮＰ（上）または対照−ＮＰ（下）ならびにＡＦ７５０−標識血液プール剤を用いてイメージングを行った、初期膵臓病変の共焦点生体顕微鏡画像の一連の４つの例である。
【図５Ｃ】膵臓の異なる領域におけるＰＴＰ−ＮＰの分布を表す膵臓蛍光の一対の低倍率写真である。白色光オーバーレイは解剖学的相関を表す（左）。点線は膵臓の輪郭を描いたものである。
【図５Ｄ】ＰＴＰ−ＮＰおよび対照−ＮＰの生体内分布を表したヒストグラムである。
【図６Ａ】注射された９週齢のＫｒａｓ／ｐ５３Ｌ／＋動物の腹腔の解剖学的詳細を表す白色光画像である。
【図６Ｂ】血管系とは異なる局所的取込みを表した、ＰＴＰ−ＮＰ（濃灰色）およびＡＦ７５０−標識血液プール剤（淡灰色）を用いた膵臓初期病変の共焦点生体顕微鏡画像である。
【図６Ｃ】膵臓の異なる領域におけるＰＴＰ−ＮＰの分布を表わす膵臓蛍光の低倍率写真である。
【図６Ｄ】解剖学的相関を表す白色光オーバーレイである。点線は膵臓の輪郭を描いたものである。
【図７】（Ａ）−（Ｃ）磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）および相関的組織学の例を表す図である。７Ａ：９週齢のＫｒａｓ／ｐ５３Ｌ／＋マウス由来の膵臓のエキソビボＭＲＩから得られた３つの隣接する切片は、病巣のナノ粒子取込み（黄色矢印）を示し、これは関連するヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）切片に見られる腫瘍（７Ｂ）と対応するが、導管化生または正常な膵臓部位（ラベル部分）とは対応しない。（７Ｃ）隣接切片の蛍光顕微鏡法により、Ｃｙ５．５−標識プレクチン−１標的化ペプチドコンジュゲートナノ粒子（ＰＴＰ−ＮＰ）の取込みが、腫瘍部位（左）においては示されたが、隣接組織（右）においては示されなかった。
【図８Ａ】Ｃｙ５．５／ナノ粒子値の定量に用いたＣＬＩＯ−Ｃｙ５．５の吸光度分光法を表す線グラフである。
【図８Ｂ】光散乱法によるＣＬＩＯのサイズ分布の点グラフである。
【図８Ｃ】ペプチド／ナノ粒子値の定量に用いたＰＴＰ−ＮＰ−Ｃｙ５．５の吸光度分光法の結果を表す線グラフである。その寄与分を未反応ＣＬＩＯを基準として差し引いた、５００ｎｍ未満のナノ粒子によるバックグラウンド吸光度に注目されたい。
【図９】ＥＬＩＳＡによるファージクローン検証の例を表す棒グラフである。選択および除去後、３０の個々のファージクローンを採取して増幅し、ＥＬＩＳＡにより親和性および特異性に関して解析した。
【図１０Ａ】Ｋｒａｓ／ｐ５３Ｌ／Ｌ内に同時に注射し、腫瘍結合性を共焦点生体顕微鏡法により解析した、Ｃｙ５．５−標識ファージクローン２７およびＲＩＴＣ−標識ファージクローン１５の一連の３枚の顕微鏡写真である。
【図１０Ｂ】Ｋｒａｓ／ｐ５３Ｌ／ 内に注射し、共焦点生体顕微鏡法により解析した、無関係ファージクローンの顕微鏡写真である。
【図１０Ｃ】野生型マウス内に注射し、共焦点生体顕微鏡法により解析した、Ｃｙ５．５−標識ファージクローン２７の顕微鏡写真である。
【図１１Ａ】ヒトプレクチン−１のアミノ酸配列の例である、配列番号２４を表した図である。
【図１１Ｂ】ヒトプレクチン−１のアミノ酸配列の例である、配列番号２４を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
本発明は、少なくとも部分的には、癌の診断および治療のための、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞バイオマーカーのような癌細胞バイオマーカーおよび結合分子を提供するための組成物および方法に関する。「利用可能な」プロテオームおよびＰＤＡＣ同定用のプレクチン−１のようなバイオマーカーを選択するためのその使用法が開示される。ペプチドリガンドとコンジュゲートされた磁性蛍光ナノ粒子を含むイメージング組成物およびＰＤＡＣ同定のためのその使用法が記載されている。最後に、細胞毒性剤と結合したプレクチン−１と結合する抗体およびペプチドリガンドを含む治療用組成物ならびに癌（例えば、ＰＤＡＣ）治療のためのその使用法も本明細書に記載されている。
【０１１１】
具体的には、本明細書に記載のように、ファージディスプレイスクリーニング法およびマウスモデルから単離された初期継代ＰＤＡＣ細胞株を使用して、ヒトおよびマウス両方のＰＤＡＣ細胞を正常膵管細胞から区別するペプチドを同定した。
【０１１２】
ファージディスプレイペプチドを用いて同定されたペプチドリガンド、そして単離ペプチドと磁性蛍光ナノ粒子とのコンジュゲートにより開発された標的化イメージング剤が本明細書に記載され、本明細書に記載の結果は、これらの薬剤が、新生腫瘍をインビボおよびインビトロにおいて効率的に検出することが可能であることを実証する。このアプローチでは、ファージディスプレイペプチドの結合パートナーが、過剰発現された細胞タンパク質の広範なリストではなく、「利用可能な」プロテオームのスナップショットを示す。これらの方法を用いて、本発明者らは、新規なＰＤＡＣバイオマーカーとしてプレクチン
−１を同定した。つまり、プレクチン−１の発現レベルは、癌細胞において正常な細胞に比べやや上方制御されており、さらにこのタンパク質は癌性細胞の細胞膜に異常に分布しているため、本明細書に記載のようなイメージング剤でのプローブに利用できる。
【０１１３】
本明細書に記載のように、膵臓導管の正常な粘液性化生のバックグラウンド中のＰＤＡＣ細胞を同定することが可能である、マルチモーダルナノ粒子ベースの標的化イメージング剤（本明細書では「ＰＴＰ−ＮＰ」に言及する）が開発された。いくつかの実施形態において、これらのイメージング剤は、高リスク患者におけるＭＲＩおよび内視鏡法の両方での使用が意図される。
【０１１４】
I．膵臓癌細胞の同定法
膵臓癌は、米国における癌に関連した死亡の１つの主な原因である。膵臓癌が初期に発見された場合、腫瘍の外科的除去により治癒がもたらされる場合がある。残念ながら、この癌は、その初期段階において何らかの症状を引き起こすことは稀であり、それが最終的に引き起こす症状としては、黄疸、腹痛、背部痛および体重減少が挙げられるが、これらは他の病気においても見られるため、早期診断は困難である。
【０１１５】
膵臓の検査には磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）およびその他の非侵襲性イメージング技術が用いられるが、膵臓腫瘍がＭＲＩスキャンに現れる大きさに達するまでには、腫瘍がすでに拡散してしまっている場合が多い。その結果、ほとんどの患者において、診断が下されるまでには膵臓癌が進行しているため、手術はもはや有効ではない。こうした患者は放射線療法および化学療法を受けるが、これらの治療で治癒することは稀であり、ほとんどの患者が診断から１年以内に死亡する。
【０１１６】
したがって、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は困難な臨床的問題と考えられることが多く、通常、診断時には転移を伴った状態で見つかり、既存の治療法に対する強い抵抗性を示す。現在の検出法は信頼性がないため、新規なＰＤＡＣ検出バイオマーカーの同定を目標として、血清プロテオミクス、腫瘍組織の発現プロファイリング、膵液の遺伝子解析およびコンビナトリアルケミストリーを用いた方法を含む様々なアプローチを用いた多くの継続的な努力が現在行われている（例えば、Ｇｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：４５２４−４５３１（２００５）；Ｍｉｓｅｋら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１０３：１７５−１８７（２００５）；Ｂｌｏｏｍｓｔｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：２５９２−２５９９（２００６）；Ｙａｔｅｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１４２６−１４３６（１９９５）；およびＪｏｙｃｅら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４：３９３−４０３（２００３）を参照されたい）。
【０１１７】
より優れた診断用および治療用分子を開発するための初期研究では、腫瘍認識および薬物送達のための抗体使用に焦点が当てられていた（例えば、Ｆｏｌｌｉら，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５４：２６４３−２６４９（１９９４）；Ｎｅｒｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１２７１−１２７５（１９９７）を参照されたい）。しかし、分子イメージングの場合の抗体標的化は、多くの場合、望ましい薬物動態をもたず、標的対バックグラウンド比に制限があり、さらに、大幅に改変しない限り磁気共鳴（ＭＲ）検出が可能なイメージング剤を保持する能力が低い。ペプチドは標的化部分として有用であり、望ましい特異性、親和性および薬物動態を選択するために、様々なハイスループットスクリーニング法が用いられている。イメージング剤として損なわれるのは、ペプチドは一般に血中半減期が非常に短く（約５分）、その多価の相当物よりも親和性が低い点である。したがって、マルチモーダルナノ粒子と標的化ペプチドとの組合せは、最適化された薬物動態を有するプラットフォームとして設計することができ、薬物動態は、多価ペプチドの付着を可能にし、標的化可能なほど小さく、さらに細胞内に取り込まれて細胞内トラップによるシグナル増幅を生じさせることが可能であるため、こうした問題を回避し得る（例えば
、Ｋｅｌｌｙら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６：３２７−３３６（２００５）を参照されたい）。
【０１１８】
さらに、ＰＤＡＣが通常は進行期に見つかることおよびそれに付随して適切な組織標本が不足していることにより、ＰＤＡＣにおける初期の分子的変化の研究には大きな課題がある。したがって、今ある発見は、Ｋｒａｓ活性化ならびにｐ５３またはＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ腫瘍抑制因子の欠失を含めたヒト疾患の特徴遺伝子の変異を有する、一連の関連する遺伝子操作されたＰＤＡＣマウスモデルを使用したものである（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：５９４７−５９５２（２００６）；およびＡｇｕｉｒｒｅら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：３１１２−３１２６（２００３）を参照されたい）。これらのモデルにおける腫瘍は、ヒトにおけるＰＤＡＣを明確にする、特徴的な多段階の病理組織学的進行度（前駆病変膵上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）（Ｈａｎｓｅｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４：２３７−２５６（２００３））から転移性癌まで）を示し、生物学的および前臨床的研究の両方にとって扱い易いモデル系を提供する（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：５９４７−５９５２（２００６））。これらのマウスモデルにより、初代細胞株が新生ＰＤＡＣから得られた。これら初期段階の癌細胞株は、野生型マウス由来の正常膵管細胞（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７：２５０−２６０（２００４）に記載）とともに、コンビナトリアルケミストリーに基づくアプローチを用いたバイオマーカーおよびイメージング剤のスクリーニングを容易にした（本明細書の実施例を参照されたい）。
【０１１９】
これらの制限を克服するために、本発明の方法は、より早期の検出を可能にして介入的治療の開発を導く、初期ＰＤＡＣに対する新規な分子マーカーおよびイメージングプローブの使用を含む。ヒトおよびマウス両方のＰＤＡＣ細胞を正常膵管細胞からインビトロで区別するペプチドを同定するための、ペプチドファージディスプレイおよびマウスモデルから単離された初期継代ＰＤＡＣ細胞株の使用が本明細書に記載されている。イメージング剤の作成に加え、このアプローチで同定された表面タンパク質の結合パートナーは、異常な細胞中のプロテオームのスナップショットを示し、疾患進行に重要な土台となるシグナル伝達経路の描写に有用であり得る。さらに、こうしたイメージングプローブは、膵臓癌およびその他の癌の効率的治療を提供するものと考えられる。本明細書に記載の方法は、拡散する前に初期段階を含めた任意の段階にある腫瘍および膵臓癌細胞の検出に使用し得る。
【０１２０】
ＰＤＡＣ細胞に対するバイオマーカーが報告されたが、これらのマーカーは、他の細胞型と広範囲にわたり重複すると思われる点、ナノ粒子とコンジュゲートされない点、またはプレクチン−１ではないという点が問題であった。ＰＤＡＣ同定のための数多くの試みが刊行物、例えば、膵臓癌の検出法および診断法において記載され、インビボおよびインビトロ両方において癌性細胞と正常細胞を区別する膵臓関連遺伝子の発現レベルの判定、膵臓癌治療用の治療剤のスクリーニング法ならびに膵臓癌の治療法（Ｎａｋａｍｕｒａら，「Ｍｅｔｈｏｄ  Ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，」米国特許出願公開第２００５／０２６０６３９号）、少なくとも１つのバイオマーカーの測定およびその測定値と癌の状態との相関による被検体における膵臓癌の状態の認定方法（Ｃｈａｎら，「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ，」米国特許出願公開第２００５／００９５６１１号）が含まれるが、これらに限定されない。これらの参考文献はいずれもプレクチン−１を記載していない。さらに、異常な細胞増殖、具体的には、膵臓癌の存在または膵臓癌に対する罹病性の同定のための方法およびシステムにおいては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析により膵臓癌治療のための候補作用物質が同定される（Ｈｒｕｂａｎら，「Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎ
ｏｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，」米国特許出願公開第２００３／０１８０７４７号）。この最後の参考文献では、膵臓癌細胞において正常な膵臓細胞と比べ特異的に過剰発現される９７個の遺伝子の１つとしてプレクチン−１が同定されたが、この参考文献では、プレクチン−１の異常な細胞膜分布またはペプチドによるプレクチン−１の検出については論じられていない。さらに、膵臓腺癌細胞同定のためにペプチドマーカーを用いるこれまでの試みが公開されたが、そこでは、ＰＹＹ３−３６およびＹＰＩＫＰＥＡＰＧＥＤＡＳＰＥＥＬＮＲＹＹＡＳＬＲＨＹＬＮＬＶＴＲＱＲＹ（配列番号２５）を含む３６アミノ酸残基のペプチドアミドおよびそのフラグメントである、ペプチドチロシンチロシン（「ＹＹ」または「ＰＹＹ」または膵ペプチド「ＰＰ」）の合成ペプチド、特にペプチドＹＹ１４−３６（米国特許第５，５７４，０１０号）が膵臓癌細胞への高い特異的結合を示し、癌細胞に蛍光色素を送達した。ビオチン化ペプチドを用いてアビジン−色素複合体を癌細胞に送達する方法により、膵臓腫瘍のイメージングおよび治療剤の送達が可能になるであろうと考えられてはいたが、示されなかった。しかし、神経細胞同定のためのこれらのおよび類似のペプチドの使用が、さらなる刊行物に記載されており、肥満症の診断および治療（国際公開第２００４／０５６３１４号）ならびに癌（例えば、結腸腺癌、膵臓腺癌または乳癌）治療の両方に使用された。さらに、Ｙ２受容体としてＰＹＹに対する受容体が報告されており（例えば、米国特許第５，５７４，０１０号；同第５，６０４，２０３号；同第５，６９６，０９３；同第６，０４６，１６７号；Ｇｅｈｌｅｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１８：７−２２（１９９８）；Ｓｈｅｉｋｈら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２６１：７０１〜１５（１９９１）；Ｆｏｕｒｎｉｅｒら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：９３−１０１（１９９４）；Ｋｉｒｂｙら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４５７９−４５８６（１９９５）；Ｒｉｓｔら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｎａ  ２４７：１０１９−１０２８（１９９７）；Ｋｉｒｂｙら，Ｊ．Ｍｅｄ．ＣｌｚｅＴｎ．３６：３８０２−３８０８（１９９３）；Ｇｒｕｎｄｅｍａｒら，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ６２：１３１−１３６（１９９６）；米国特許第５，６９６，０９３号（ＰＹＹアゴニストの例）および米国特許第６，０４６，１６７号；これらはすべてその内容全体が参照により本明細書に援用される）。しかし、これら参考文献はいずれも、膵臓癌細胞同定のためのプレクチン−１を認識したペプチドリガンドの使用は開示していない。
【０１２１】
本明細書に記載のように、ファージディスプレイを用いて、マウスおよびヒトＰＤＡＣ細胞を正常膵管細胞からインビトロで区別するペプチドを同定した。次いで本発明者らは、ＰＤＡＣに対する高い親和性および特異性を有する２つのペプチドを磁性蛍光ナノ粒子（ＣＬＩＯ−ＶＴ６８０）とコンジュゲートし、そして、これらの薬剤が、関連するトランスジェニックマウスモデル中の新生腫瘍および前腫瘍性病変を、共焦点生体顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＶ１００）および光学／ＭＲイメージング（ＯＶ−１００，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ）により効率的に検出することができることを実証する。相関的な組織学により、ＰＤＡＣ標的化剤の特異的な時間的局在が確認された。さらに、このアプローチにより同定されたペプチド結合パートナーは、異常な細胞におけるプロテオームのスナップショットおよび潜在的なＰＤＡＣバイオマーカーも示した。アフィニティクロマトグラフィーを用いて、いくつかのファージディスプレイペプチドに対する結合パートナーを同定し、具体的にはクローン２７および１５に対するそれらのバイオマーカーとしての有効性を実証した。これら特異的かつ高感度なプローブは、ヒトにおけるＰＤＡＣの診断および管理において臨床的有用性を有するものと考えられる。
【０１２２】
ＩＩ．膵臓癌細胞プロテオーム中の「利用可能な」受容体同定のためのペプチドリガンド
差次的なタンパク質のプロセシングおよび／または輸送は、プロテオミクスアプローチを用いて同定することが可能であり、ｃＤＮＡ発現データのみ調べるかまたは細胞全体のプロテオミクス法を用いた場合には見逃す可能性のある潜在的なクラスのバイオマーカー
を示す。例えば、本明細書に記載の方法により同定された結合パートナーのクローン２７およびクローン１５は、癌バイオマーカーを示し、ＰＤＡＣ発病の一因である異常な分子経路の解明に役立ち得る。
【０１２３】
クローン２７により、ＰＤＡＣの潜在的な新規バイオマーカーとして膜局在プレクチン−１の同定が可能となった。本明細書に記載のように、プレクチン−１レベルは正常膵管細胞では低いが、ＰａｎＩＮではプレクチン−１の発現が上方制御され、ＰＤＡＣでは高い状態が続く。プレクチン−１は、正常な線維芽細胞においては明確な細胞質内および核内局在性を示したのに対し、ＰＤＡＣにおいては細胞膜上での異常な発現が観察された。いくつかの実施形態において、タンパク質上方制御、差次的輸送の機構およびバイオマーカーが疾患進行の一因であるか否かが、癌細胞のバイオマーカー診断および治療においてさらに使用されることが考えられる。この点に関して注目すべきことに、最近の刊行物により、プレクチン−１が上皮細胞の形質転換中に膜へリクルートされる可能性があることが明らかにされている（Ｒａｙｍｏｎｄら，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  １８：４２１０−４２２１（２００７））。プレクチン−１の細胞内局在の変化は、自己免疫状態である腫瘍随伴性天疱瘡において、およびそれに関連したリンパ増殖性新生物であるキャッスルマン病においても観察される（Ａｈｏら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：４２２−４２３（１９９９））。プレクチン−１は、シグナル伝達における多くの重要な役割もち、Ｒｈｏ活性に影響を与え（Ａｎｄｒａら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：３４４２−３４５１（１９９８））、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）（Ｏｓｍａｎａｇｉｃ−Ｍｙｅｒｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１８７０１−１８７１０（２００４））およびＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼシグナル伝達経路（Ｇｒｅｇｏｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１９：１８６４−１８７５（２００６））に関与するタンパク質のための足場の役割をする。したがって、ＰＤＡＣにおけるプレクチン−１は、細胞の移動、極性およびエネルギー代謝を調節するシグナル伝達経路に影響を与えている可能性がある。
【０１２４】
膵臓におけるプレクチン−１発現
プレクチン−１は、高分子量のタンパク質（５００ｋＤａ）であり、細胞骨格を細胞膜および核膜に固定することに加え、中間径フィラメントを微小管およびマイクロフィラメントと結びつけている（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．３１３：２１８９−２２０３（２００７）で概説されている）。
【０１２５】
本明細書に記載のように、プレクチン−１レベルは、正常膵管細胞では低いが、ＰａｎＩＮではプレクチン−１の発現が上方制御され、ＰＤＡＣでは高い状態が続く。プレクチン−１は、正常な線維芽細胞においては明確な細胞質内および核内局在性を示したのに対し、ＰＤＡＣにおいては細胞膜上での異常な発現が観察された。プレクチン−１の細胞内局在の変化は、自己免疫状態である腫瘍随伴性天疱瘡において、およびそれに関連したリンパ増殖性新生物であるキャッスルマン病においても観察された（Ａｈｏら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１３：４２２−４２３（１９９９））。
【０１２６】
プレクチン−１タンパク質の上方制御、差次的輸送および疾患進行への関与の機構の研究が、考えられる重要な実験である。上述のように、プレクチン−１は、シグナル伝達において重要な役割をもつ。したがって、ＰＤＡＣにおけるプレクチン−１は、発癌に関連した細胞の移動、極性およびエネルギー代謝を調節するシグナル伝達経路に影響を与えている可能性がある。
【０１２７】
さらに、非癌性の対応物と比較した様々な膵臓癌の組織および細胞におけるプレクチン−１の有意な過剰発現が刊行物に記載されおり（Ｈｒｕｂａｎら，「Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，」米国特許出願
公開第２００３／０１８０７４７号など）、そこでは、異常な細胞増殖、具体的には膵臓癌または膵臓癌感受性の存在を同定するための方法およびシステムが記載されている。この参考文献では、膵臓癌治療のための候補作用物質の同定法がさらに開示されている。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析により、膵臓癌細胞において正常な膵臓細胞と比べ特異的に過剰発現される９７個の遺伝子の１つとして、プレクチン−１が同定された。Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０（４）１２３９−１２４９（２００２））は、摘出された膵臓癌組織および膵臓癌細胞株において正常な膵臓および胃腸管粘膜細胞に比べ特異的に発現される遺伝子を同定するための、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを開示している。表１では、膵臓癌において少なくとも５倍（６．６９倍）発現される９７個の既知の遺伝子の１つとして、プレクチン−１が同定されている。Ｓａｔｏら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６４（３）：９０３−９１４（２００４））は、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮｓ）のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ解析を開示しており、そこでは、非腫瘍性膵管上皮に比べ有意に過剰発現される６７３個の転写産物の１つとしてプレクチン−１が同定されている。最後に、Ｊｏｈｎｓｏｎら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ４５：８１４−８２７（２００６））は、ＤＮＡアレイ技術を用いて、膵臓腫瘍（１１のＰＤＡＣ）において非悪性膵臓組織（１４の悪性巨大膵管標本）と比べ特異的に発現される遺伝子を同定している。Ｓａｔｏら（同上）の表２に掲載されている結果により、非癌性組織と比較したＰＤＡＣ組織におけるプレクチン−１過剰発現（４．５倍）に関するこれまでの知見が裏付けられた。さらに、プレクチンに対する潜在的な天然のリガンドが、プレクチン−ペリプラキン複合体の免疫沈降に抗プレクチン抗体を用いて同定された（Ｂｏｃｚｏｎａｄｉら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１３（１６）：３５７９−３５９１（２００７））。しかし、これらの参考文献では、プレクチン−１の異常な細胞膜分布あるいは新生ＰＤＡＣ検出のためのペプチドによるまたはプレクチン−１に特異的な蛍光標識ペプチドプローブ（例えば、ナノ粒子コンジュゲート）を使用したプレクチン−１の検出については論じられていない。
【０１２８】
ＩＩＩ．癌細胞バイオマーカー源としての「利用可能な」プロテオーム
本明細書に記載のように、ファージディスプレイ法を用いて、ＰＤＡＣ細胞上の細胞表面抗原と特異的に結合するペプチドのスクリーニングを行った。これらのスクリーニングにより、正常膵管細胞からＰＤＡＣ細胞をインビトロで区別するモチーフが得られ、これによりプロテオーム解析においてＰＤＡＣの新規バイオマーカーとしてのプレクチン−１が同定された。インビボイメージングに対するこれらの有用性を評価するために、プレクチン−１標的化ペプチド（ＰＴＰ）を磁性蛍光ナノ粒子とコンジュゲートした。共焦点生体顕微鏡法およびＭＲＩと共にこれらのナノ粒子により、遺伝子操作されたマウスモデル中の小型のＰＤＡＣおよび前駆病変を検出することができた。本発明者らは、ペプチドリガンドであるクローン２７に基づく特異的イメージングプローブを開発し、ヒトにおけるＰＤＡＣの診断、管理および治療での臨床的有用性が考えられる膵臓癌細胞のバイオマーカーとして、プレクチン−１を発見した。
【０１２９】
ファージディスプレイを用いて、マウスおよびヒトＰＤＡＣ細胞を正常膵管細胞からインビトロで区別するペプチドを同定した。高い親和性および特異性を有する２つのペプチドを磁性蛍光ナノ粒子（ＣＬＩＯ−ＶＴ６８０）とコンジュゲートし、これらが、関連するトランスジェニックマウスモデル中の新生腫瘍および前腫瘍性病変を、共焦点生体顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＶ１００）および光学／ＭＲイメージング（ＯＶ−１００，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ）により効率的に検出することができることを実証した。相関的な組織学により、ＰＤＡＣ標的化剤の特異的な時間的局在が確認された。さらに、このアプローチにより同定されたペプチド結合パートナーは、異常な細胞におけるプロテオームのスナップショットおよび潜在的なＰＤＡＣバイオマーカーも示した。アフィニティクロマトグラフィーを用いて、いくつかのペプチドに対する結合パートナーを同定
し、それらのバイオマーカーとしての有効性を実証した。これら特異的かつ高感度なプローブは、例えば、ヒトでのＰＤＡＣ診断および管理において有用である。
【０１３０】
同定された結合分子の配列を決定する方法も本明細書に記載さている。例えば、結合分子が発現ライブラリー中で産生された場合、リガンド−標的受容体結合アッセイのようなスクリーニングで同定された結合分子を発現する選択されたクローンから、コード核酸を単離し得る。次いで、標的と結合したウイルス粒子のコード核酸を、当業者に公知の方法を用いて配列決定し得る。
【０１３１】
また、ペプチドリガンドのような結合分子により選択的に結合されるバイオマーカーの特徴付けのための方法も本明細書に記載されている。バイオマーカーに対して選択的な結合パートナー（例えば、ペプチドリガンド）が一度同定されれば、次いでそのバイオマーカーを、例えば、当該分野で公知のアフィニティー法により単離して特徴付け得る。この特徴付けは、スクリーニングで使用されるバイオマーカーが十分に特徴付けられていない場合に有用であり得る。バイオマーカーの特徴付けには、ゲル電気泳動による見かけの分子量の測定のような技術が含まれる。バイオマーカーの特徴付けに適用可能なその他の方法として、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析法あるいはバイオマーカーの物理的、生化学的または機能的特性に関する情報、例えば、配列および独自性を提供するその他の方法が挙げられる。このようなバイオマーカーの特徴付けのための数多くの方法が利用可能である。
【０１３２】
好適な実施形態において、バイオマーカーは、腫瘍細胞の細胞表面に由来する。細胞表面分子は、例えば、放射性同位元素またはビオチンのような検出可能部分あるいは蛍光標識により標識され得る。この標識により、知る必要のある唯一の特徴が、それが細胞表面上に存在することであるような、バイオマーカー源が提供される。実施例に記載のように、癌細胞ペプチドリガンドを、細胞表面ペプチドを発現するバクテリオファージをＦＩＴＣで標識して調製し、癌細胞表面ポリペプチドに対して選択的な結合分子を同定するために使用した。他の細胞または細胞内区画由来のバイオマーカー群を、同様に本発明の方法で使用して、最初の群内の少なくとも１つのバイオマーカーに対して選択的親和性を示す結合パートナーペプチドリガンドを得ることができる。したがって、本発明の方法は、疾患の治療または診断用に選択的結合親和性が必要とされる多種多様なバイオマーカー群に適用可能である。
【０１３３】
本発明の方法は、多様な結合分子群を固体支持体に選択的に固定化することを含む。選択的固定化のために、分子群を構成する結合分子に固有の特徴を利用して選択的固定化を提供するか、あるいは特異的特徴を含むように分子を操作して選択的固定化に使用する。例えば、結合パートナー自体が疎水性の化学基またはドメインを含んでいてもよく、あるいは結合パートナーを、それをプラスティックのような疎水性の固体支持体に固定化する疎水性の化学基またはドメインと融合していてもよい。別の例では、固体支持体を、結合パートナー群を構成する結合分子のみと結合するおよびそれらのみを選択的に固定化することができるように、化学的部分または生体分子でコーティングし得る。例えば、固体支持体を、結合分子に共通なドメインまたは配列と選択的に結合する生体分子でコーティングし得る。リンカーまたはテザーとしてのこのような生体分子の使用は、それらがバイオマーカーとペプチドリガンドとの結合を阻害しないように選択されるべきである。
【０１３４】
ＩＶ．遺伝子操作ＰＤＡＣマウスモデル
ＰＤＡＣが通常は進行期に見つかることおよびそれに付随して適切な組織標本が不足していることにより、ＰＤＡＣにおける初期の分子的変化の研究には大きな課題がある。したがって、本発明者らは、Ｋｒａｓ活性化ならびにｐ５３またはＩｎｋ４ａ／Ａｒｆ腫瘍抑制因子の欠失を含めたヒト疾患の特徴遺伝子の変異を有する、一連の関連した遺伝子操
作ＰＤＡＣマウスモデルを利用することにした（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：５９４７−５９５２（２００６）；およびＡｇｕｉｒｒｅら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：３１１２−３１２６（２００３））。これらのモデルにおける腫瘍は、ヒトにおけるＰＤＡＣを明確にする、特徴的な多段階の病理組織学的進行度（前駆病変膵上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）（Ｈａｎｓｅｌら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．４：２３７−２５６（２００３））から転移性癌まで）を示し、生物学的および前臨床的研究の両方にとって扱い易いモデル系を提供する（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，同上）。本発明者らは、これらのマウスモデルから、新生ＰＤＡＣ由来の初代細胞株を作出することができた。これら初期段階の癌細胞株は、野生型マウス由来の正常膵管細胞（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７：２５０−２６０（２００４）に記載）とともに、コンビナトリアルケミストリーに基づくアプローチを用いたバイオマーカーおよびイメージング剤のスクリーニングを容易にする。
【０１３５】
遺伝子操作ヒト癌マウスモデルは、ヒト疾患の多くの分子的、生物学的および臨床的特性を効果的に再現する（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，（２００６）同上；Ａｇｕｉｒｒｅら，（２００３）同上）。
【０１３６】
マウスおよびヒト癌に関する最近のゲノム研究では、黒色腫およびリンパ腫傾向のあるマウスの転移可能性に関連した再発性染色体異常の同定における効率的なフィルターとして、異種間でのインビボ解析が役立ち得ることが立証されている（Ｋｉｍら，Ｃｅｌｌ  １２５：１２６９−１２８１（２００６）；Ｍａｓｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ４４７：９６６−９７１（２００７））。このようなアプローチを用いて、ヒト前立腺癌細胞同定のために１５−ｍｅｒ結合プチドリガンドが、インビボスクリーニングにより得られた（Ｎｅｗｔｏｎら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８：７７２−７８０（２００６））。具体的には、Ｎｅｗｔｏｎは、１５アミノ酸ペプチドをディスプレイするファージクローンを記載しており、そこでは、ファージクローンを近赤外フルオロフォア（ＮＩＲＦ）であるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０（ＡＦ６８０）で標識し、このファージ１０９ＴＵ／ｍｌ（形質導入／形質移入単位）をマウスに注射して、マウス中のヒト前立腺癌の光学イメージングに使用した。
【０１３７】
本明細書に記載の研究は、特定の発達段階の癌細胞を提供するためにさらに開発されたマウス−ヒト癌モデルの有用性を示す。さらに、ファージクローンスクリーニング法を改変して、より小型の７−ｍｅｒペプチドをディスプレイするファージに関するアッセイの開発ならびに特定段階の癌細胞により発現される分子と結合するペプチドリガンドの配列決定および単離のための前述ファージの使用にまで拡張した。７−ｍｅｒペプチドをディスプレイするこれらのファージおよびファージ由来の単離７−ｍｅｒペプチドリガンドを分子標的化イメージング剤として使用して、対応する結合パートナーを膵管腺癌のバイオマーカーとして同定および評価した。
【０１３８】
これらの拡張されたマウスモデルおよびファージディスプレイペプチド結合スクリーニング法を用いて、本発明者らは、癌発達の初期段階および初代膵管細胞由来のマウス細胞株の利点を活用したスクリーニングにおいて、初期疾患の保存されたバイオマーカーを同定した。さらに、これらマウスモデルの腫瘍進行の既知の動態が、腫瘍形成の限定された段階でのイメージングプローブ検査を容易にした。本明細書に記載のアプローチは、疾患の段階、予後ならびに癌細胞の発達および予後に関連した特定の遺伝子異常の存在を予測する癌バイオマーカーの発見に広く適用可能であると考えられる。
【０１３９】
V．ナノ粒子ベースのイメージング標識およびＰＤＡＣの診断法
非侵襲性イメージングは、膵臓癌スクリーニングの候補である高リスク群、例えば、家
族性ＰＤＡＣ家系および新規発症糖尿病患者において特に適用される。こうした人たちにおける癌のリスクが高いにもかかわらず、実際の膵臓癌罹患率は約０．４％〜０．６％に過ぎないと推定される（Ｃｈａｒｉ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３４：２８４−２９４（２００７）ため、実質的な罹患率および死亡率に関係する予防的手術は通常行われていない。ＣＴスキャンまたはＭＲＩのような従来のイメージング法では、多くの腫瘍がすでに転移した大きさに達してからでないとＰＤＡＣ病変が検出されないことが多いため、手術が効果的でなくなる。したがって、ＰＤＡＣの存在を、手術が効果的であるその初期の発達段階で正確に同定するような新規イメージング様式が大いに必要とされている。
【０１４０】
初期癌の非侵襲性イメージングに関するその他の状況として、嚢胞性腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）および粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ）を有する患者が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明者らは、初期癌細胞のバイオマーカーに対するペプチドプローブの同定を意図する。これらの腫瘍は、多くの場合良性であるが、それらの一部はＰＤＡＣまで進行する。したがって、いくつかの実施形態において、本発明者らは、ＰＤＡＣまで進行する腫瘍性細胞のバイオマーカーに対するペプチドプローブの同定法および使用法を意図する。術後の再発スクリーニングにおいてより正確なイメージング分子を使用しかつ術前にスクリーニングを行って正確な腫瘍拡張をより的確に判定する、新規アプローチが意図される。本明細書に提供される新規イメージング分子は、鑑別診断、すなわち、膵炎、黄疸または上腹部痛を有する患者の鑑別診断において、臨床的価値を有するであろう。さらに、高リスク群のスクリーニングにおいて、本発明者は、高悪性度のＰａｎＩＮおよび癌腫から、多くの健康な人に存在する低悪性度のＰａｎＩＮをインサイチュで区別するためのイメージング分子を意図する。ＰａｎＩＮ−３以上の病変は、浸潤性ＰＤＡＣまで進行する可能性が非常に高いと考えられるため、これらを認識するプローブが意図される。トランスレーショナルな研究を含む実施形態は、本明細書に記載の分子の腫瘍への迅速なホーミングおよびそれに続く体内からの排除により技術的に可能となるため、切除術を受けている患者においてこれらを実施することが意図される。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のペプチドリガンドは、ナノ粒子ベースのイメージング標識と連結されている。数多くのタイプの磁性ナノ粒子およびそれらの磁気蛍光類似体のようなこれらのナノ粒子は、癌細胞のイメージングのために開発および使用され（例えば、Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：３１６−３１７（２００１）；ＭｃＣａｒｔｈｙら，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２：１５３−１６７（２００７）；Ｈｏｇｅｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１１：９４１−９４６（２０００）およびＪｏｓｅｐｈｓｏｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１０：１８６−１９１（１９９９）を参照されたい）、これらナノ粒子の、単離ペプチドリガンドおよびファージディスプレイペプチドとの使用が意図される。マルチモーダルナノ粒子は、同一分子内に磁性分子および蛍光分子の両方を組み込むことが知られ（例えば、本明細書に記載のような粒子、すなわち、ＰＴＰ−ＮＰ）、蛍光顕微鏡法（この非常に小さな粒子の蛍光部分を検出する）およびＭＲＩ（粒子の磁性部分を検出する）に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のイメージングプローブ／リガンドには、ＮａｎｏＳＰＡＲＫＳ（商標）（ＶｉｓＥｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ）などのような光学イメージングプローブが含まれる。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、粒子は、例えば、米国特許第５，４９２，８１４号；Ｈｏｇｅｍａｎｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１１：９４１−９４６（２０００）に記載のように、蛍光部分とコンジュゲートされている。
【０１４３】
粒子は、任意の適切な形態、例えば、凍結乾燥状態でまたは液体中、例えば、インビボ投与に適した滅菌担体（例えば、滅菌生理食塩水）中で提供される。凍結乾燥させた粒子は、例えば、通常の滅菌生理食塩水中または液体担体中で復元され得る。いくつかの実施
形態において、これらの方法では、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）より入手可能な、酸化鉄ナノ粒子からなる分子イメージング剤であるＣｏｍｂｉｄｅｘ（登録商標）（ｆｅｒｕｍｏｘｔｒａｎ−１０）を使用する。
【０１４４】
本明細書に記載のマルチモーダルナノ粒子イメージングプローブは、新生物にホーミングする一方で、近接領域または腺房管化生との感知可能な共局在性は示さない。この高レベルの特異性は、診断検査における偽陽性を減少させることが期待される。さらに、これらの新規イメージングプローブは、進行癌細胞のみならずＰａｎＩＮとも結合した。このような前癌病変を検出する能力により、この疾患の管理における新規アプローチの開発が可能となる。このプローブと共に使用される断層撮影イメージング技術（例えば、ＭＲＩ、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴ、光学など）は、肝臓および腎臓の取込みは高いが、両器官との間の区別を可能にしつつ、それらと関連させた膵臓の解像を可能にするであろう。
【０１４５】
コントラスト剤は、例えば、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、実質内、腔内、局所、眼内、経口または直腸内投与により、被検体に投与されるが、静脈内注射が好ましい。
新規分子標的化イメージング剤の開発に加え、癌細胞により発現される分子との結合に関するファージディスプレイペプチドスクリーニングおよび改変免疫沈降により、ＰＤＡＣの新規特異的バイオマーカーとしての膜局在プレクチン−１の同定が可能となった。意義深いことに、プロテオミクスアプローチを用いて同定されるプレクチン−１の差次的タンパク質プロセシングおよび／または輸送は、ｃＤＮＡ発現データのみ調べるかまたは細胞全体のプロテオミクス法を用いた場合には見逃される、潜在的なクラスのバイオマーカーを示す。具体的には、プレクチン−１の過剰発現が遺伝子チップ解析により観察されたが、それは９７個の過剰発現遺伝子の１つであったため、その癌細胞バイオマーカーとしての関係または用途はわからなかった（Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：１２３９−１２４９（２００２）；および米国特許出願公開第２００３／０１８０７４７号を参照されたい）。スクリーニング法による本明細書のさらなる結合パートナーのクローンは、ＰＤＡＣ発病の一因である異常な分子経路の解明に加えて診断法および治療法における使用が考えられる、さらなるバイオマーカーを示す。
【０１４６】
したがって、本明細書に記載のペプチドリガンドは、プレクチン−１と特異的に結合するプレクチン−１結合部分、例えば、配列番号１、２または４〜８から基本的になるペプチドと連結されている、１つまたは複数の検出可能部分を含み得る。検出可能部分は、フルオロフォア、例えば、近赤外フルオロフォア（ＮＩＲＦ）であり得るかまたはそれを含み得る。本明細書に記載の方法および組成物において有用な数多くのＮＩＲＦが当該分野で公知であり、例えば、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５およびＣｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｔｓ．，ＩＬ）；ＩＲＤ４１およびＩＲＤ７００（ＬＩ−ＣＯＲ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒ．）；ＮＩＲ−１（Ｄｅｊｉｎｄｏ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）；ＬａＪｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ（Ｄｉａｔｒｏｎ，Ｍｉａｍｉ，Ｆｌａ．）；インドシアニングリーン（ＩＣＧ）およびその類似体（Ｌｉｃｈａら，１９９６，ＳＰＩＥ  ２９２７：１９２−１９８；Ｉｔｏら，米国特許第５，９６８，４７９号）；インドトリカルボシアニン（ＩＴＣ；国際公開第９８／４７５３８号）；ならびにキレート化ランタニド化合物が挙げられる。蛍光ランタニド金属としては、ユウロピウムおよびテルビウムが挙げられる。ランタニド類の蛍光特性は、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｌａｃｋｏｗｉｃｚ（１９９９）第２版」（Ｋｌｕｗａｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。フルオロフォアは、例えば、蛍光色素上の任意の適切な反応基ならびに蛍光色素付着部分、主鎖またはスペーサー部分上の適合する官能基を用いて、蛍光色素付着部分、主鎖またはスペーサーを介してプレクチン−１結合部分またはナノ粒子と共有結合され得る。例えば、蛍光色素上のカルボキシル基（または活性エステル）を用いて、ポリリジン上のリジル側鎖のイプシロ
ン−アミノ基のような一級アミンとアミド結合を形成させ得る。あるいは、またはさらに、フルオロフォアを、主鎖と直接連結させるかまたは非生物分解性のスペーサーを介して主鎖と連結させ得る。米国付与前公開第２００６／０２７５７７５号を参照されたい。
【０１４７】
ペプチドリガンドは、例えば、タンパク質またはペプチド検出可能部分との融合タンパク質（任意の連結配列、例えば、可動性リンカー配列を有するか有しない）としてあるいは化学的結合部分を介して、検出可能部分と直接連結され得る。数多くのこのような結合部分、例えば国際特許出願公開第２００９／０３６０９２号に記載の、例えばペプチドリンカーまたは化学的リンカーが当該分野で公知である。
【０１４８】
ＶＩ．治療ペイロード送達のための標的化部分としてのリガンド
ペプチドリガンドのような治療法として用いられるリガンド組成物は、他のタイプの治療法よりも有利な点、例えば、特定タイプのペイロードの付加、膜貫透過性因子の付加のような新規な追加的要素の設計における柔軟性に加え、迅速な拡散能の保持、低免疫原性および標的細胞に対する高特異性などを有する。したがって、本明細書に記載のペプチドリガンドをディスプレイするファージおよび単離ペプチドリガンドは、放射性核種、サイトカイン、化学薬品、化学療法薬および治療遺伝子のような治療ペイロードの癌細胞への選択的送達のための標的部分として使用することが意図される。本発明の目的のために、「治療ペイロード」または「治療カーゴ」は、「治療剤」を包含し、かつ患者において、癌細胞数を減少させる、または癌細胞の増殖を低下させる、または癌細胞の転移を減少させるための細胞外または細胞内送達用の任意の化合物を包含するものとする。ペイロードのタイプの例は、薬剤、小分子、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡおよびＤＮＡであり、つまり、患者において癌を減少させる任意のペイロードである。
【０１４９】
本明細書に記載のペプチドリガンドは、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）のような毒素に付着させ得る（例えば、ＤＴフラグメントに関する米国特許出願第５８２７９３４号およびＭｉｓｈｒａら（２００３，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：１１７３−１１８０）の例示的な融合タンパク質ＤＡＢ３８９ＥＧＦを参照されたい）。
【０１５０】
本発明のペプチドに付着させる薬物はまた、宿主の生物学的過程に由来するか、またはそれを有益に調節し得る作用物質、例えば、インターフェロン、腫瘍増殖因子、腫瘍壊死因子、増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦなど）ならびにインターロイキン（例えば、インターロイキン−２、インターロイキン−６、インターロイキン−７およびインターロイキン−１２など）を包含し得る。本発明のペプチドと付着させる薬剤は、遺伝毒性物質のような、ＤＮＡを損傷するおよび／または細胞の増殖を妨げる作用物質を含み得る。遺伝毒性物質として、アルキル化剤、抗代謝剤、ＤＮＡ切断剤、ＤＮＡ結合剤、トポイソメラーゼ毒および紡錘体毒が挙げられるが、これらに限定されない。アルキル化剤の例には、ロムスチン、カルムスチン、ストレプトゾシン、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、シクロスファミド、イホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、チオテパ、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、トリエチレンメラミン、ブスルファン、ピポブロマン、ミトタンおよびその他のプラチン誘導体がある。
【０１５１】
本明細書に記載のペプチドリガンドは、様々な治療剤、例えば、細胞毒性部分、例えば、治療薬、放射性同位元素、植物、真菌もしくは細菌起源の分子または生体タンパク質（例えば、タンパク質毒素）もしくは粒子（例えば、組換えウイルス粒子、例えば、ウイルスコートタンパク質を介した）あるいはそれらの混合物を送達するために使用され得る。治療剤は、細胞内で活性な薬物またはその他の薬剤、例えば、本明細書に記載のような短距離高エネルギーα放射体を含めた短距離放射線放射体などであり得る。いくつかの実施
形態において、ペプチドリガンドは、植物または細菌起源の分子（またはその誘導体）、例えば、マイタンシノイド（例えば、マイタンシノールまたはＤＭ１マイタンシノイド）と結合され得る。ＤＭ１は、マイタンシンのスルフィドリル含有誘導体であり、例えば、標的細胞内でＤＭ１を解離するジスルフィドリンカーを介してペプチドと連結され得る。ジスルフィドリンカーは、貯蔵中および血清中において他のリンカーよりも高い安定性を示す。マイタンシンは、微小管形成および現存する微小管の脱重合を妨げることにより、殺細胞作用をもたらす細胞毒性薬である。これは、現在臨床使用されているドキソルビシン、メソトレキセートおよびビンカアルキロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋｙｌｏｉｄ）のような抗癌剤の１００〜１０００倍の細胞毒性である。あるいは、本明細書に記載のペプチドリガンドは、タキサン、カリケアマイシン、プロテオソーム阻害剤またはトポイソメラーゼ阻害剤と結合され得る。［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［（３−メルカプトアセチル）アミノ］プロピル］アミノ］ブチル］ボロン酸が適切なプロテオソーム阻害剤である。Ｎ，Ｎ’−ビス［２−（９−メチルフェナジン−１−カルボキサミド）エチル］−１，２−エタンジアミンが適切なトポイソメラーゼ阻害剤である。
【０１５２】
酵素的に活性な毒素およびそのフラグメントの例には、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、エクソトキシンＡ（緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、ある種のシナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ある種のジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトギリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシンがある。いくつかの実施形態において、ペプチドリガンドは、マイタンシノイド、例えば、マイタンシノール（米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）、ＣＣ−１０６５（米国特許第５，４７５，０９２号、同５，５８５，４９９号、同５，８４６，５４５号を参照されたい）とコンジュゲートされる。免疫毒素の酵素的に活性なポリペプチドの調製法は、国際公開第８４／０３５０８号および同８５／０３５０８号に記載されており、これらはその内容が参照により本明細書に援用される。抗体とコンジュゲートされ得る細胞毒性部分として、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メソトレキセート、ネオカルチノスタチンおよび白金が挙げられる。
【０１５３】
癌性細胞を殺すまたは除去するために、ペプチドリガンドを、プロドラッグ活性化因子に極めて接近した場合にのみ活性化されるプロドラッグとコンジュゲートさせ得る。プロドラッグ活性化因子は、第２のペプチドリガンド、例えば、本発明による第２のペプチドリガンド、好ましくは、同じ受容体（例えば、プレクチン−１）または細胞上の非競合部位と結合する第２のペプチドリガンドとコンジュゲートされる。２つのペプチドリガンドが競合結合部位または非競合結合部位のいずれと結合するかは、従来の競合結合アッセイにより判定され得る。使用に適した薬物−プロドラッグ対は当該分野で公知であり、例えば、Ｂｌａｋｅｌｙら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６：３２８７−３２９２（１９９６）において参照されたい。
【０１５４】
あるいは、ペプチドリガンドを高エネルギー放射線放射体、例えば、γ放射体である１３１Ｉのような放射性同位元素と結合させることができ、その結果、腫瘍部位に局在する場合に細胞径をいくらか消滅させる。例えば、Ｏｒｄｅｒ，「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  
ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎら（ｅｄｓ．），ｐｐ３０３−３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照されたい。その他の適切な放射性同位元素として、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔのようなα放射体ならびに１８６Ｒｅおよび９０Ｙのようなβ放射体が挙げられる。Ｌｕ１１７もイメージングおよび細胞毒性剤の両方として使用され得る。
【０１５５】
１３１Ｉ、９０Ｙおよび１７７Ｌｕで標識されたペプチドリガンドを使用する放射免疫療法（ＲＩＴ）は、盛んに臨床研究が行われている。これら３つの核種の物理的特性には大きな相違点があり、その結果、腫瘍へ最大放射線量を送達するためには、放射性核種の選択が重要となり得る。大型の腫瘍には、より高いベータエネルギー粒子の９０Ｙがよいかもしれないが、小型の腫瘍および特に骨転移（例えば、前立腺癌に共通のもの）にはそれは必要ないであろう。比較的低エネルギーのベータ粒子である１３１Ｉが望ましいが、放射ヨウ素標識分子のインビボでの脱ハロゲン化が、ペプチドリガンドの内部取込みに対して大きな不利点である。これに対して１７７Ｌｕは、わずか０．２〜０．３ｍｍの範囲の低エネルギーベータ粒子を有し、９０Ｙに比べかなり低い放射線量を骨髄に送達する。さらに、より長い物理的半減期（９０Ｙに比べ）により、腫瘍滞留時間が長い。その結果、より高活性（より多いｍＣｉ量の）１７７Ｌｕで標識された薬剤を比較的少ない放射線量で、骨髄に対して投与することができる。様々な癌治療における１７７Ｌｕ標識抗体の使用について調べた臨床研究がいくつかある（例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１４４７−１４５４（１９９５）；Ｍｅｒｅｄｉｔｈら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．３７：１４９１−１４９６（１９９６）；Ａｌｖａｒｅｚら，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６５：９４−１０１（１９９７）を参照されたい）。
【０１５６】
本発明のペプチドリガンドはまた、ウイルス粒子上に存在するウイルス表面タンパク質とコンジュゲートまたは融合され得る。例えば、ペプチドリガンドを（例えば、融合タンパク質を形成するために）、ウイルス表面タンパク質と融合させ得る。あるいは、ペプチドリガンドを（例えば、化学的リンカーを介して）、ウイルス表面タンパク質と化学的にコンジュゲートさせ得る。好ましくは、ウイルスは、エンドサイトーシス膜と融合するウイルス、例えば、インフルエンザウイルスであり、したがってウイルスは、ペプチドリガンドと共に、そしてそれにより癌細胞内部に取り込まれる。ウイルスは、細胞毒素として遺伝子操作され得る。例えば、ウイルスは、細胞毒性のある遺伝子、例えば、細胞死促進遺伝子を発現するか、またはその発現を誘導し得る。好ましくは、このようなウイルスはウイルス複製が不可能である。
【０１５７】
ペプチドリガンドは、タンパク質毒素またはペプチド毒素との融合タンパク質（任意の連結配列、例えば、可動性リンカー配列を有するか有しない）としてあるいは化学的結合部分を介して、治療剤と直接連結され得る。数多くのこのような結合部分、例えば、国際特許出願公開第２００９／０３６０９２号に記載の、例えば、ペプチドリンカーまたは化学的リンカーが当該分野で公知である。
【０１５８】
本明細書に記載のペプチドリガンド（例えば、イメージング部分または治療剤と連結されている）は、医薬組成物に組み入れられ得る。このような組成物は通常、化合物（例えば、活性な薬剤）および薬学的に許容される担体を含有する。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、薬剤投与に適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などが包含される。
【０１５９】
医薬組成物は通常、その所望の投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例として、非経口（例えば、静脈内、真皮内、皮下）、経口（例えば、吸入）、経皮（局所的）、経粘膜および直腸内投与が挙げられる。非経口、真皮内または皮下適用に使用され
る液剤または懸濁剤は、以下の成分を含有し得る：滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたその他の合成溶媒など；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤ならびに塩化ナトリウムまたはブドウ糖のような浸透圧調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基により調整され得る。
【０１６０】
経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含有する。経口による薬剤投与目的で、活性な化合物を賦形剤と混合して、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル剤）の形態で使用し得る。経口組成物はまた、口腔洗浄剤として使用するために液体担体を用いて調製され得る。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含有し得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分または類似の性質をもつ化合物を含有し得る：微結晶性セルロース、トラガカントまたはゼラチンのような結合剤；デンプンまたはラクトースのような賦形剤；アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）またはコーンスターチのような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステローツ（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ）のような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤；ショ糖またはサッカリンのような甘味剤；あるいはハッカ油、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料のような着香剤。
【０１６１】
本明細書に記載の治療用化合物の全身投与は、経粘膜的または経皮的であり得る。経粘膜または経皮投与のために、透過すべき障壁に適した浸透剤が製剤において使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野で公知であり、例えば、経粘膜投与用として、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤により行い得る。経皮投与のために、活性な化合物が、一般に当該分野で公知の軟膏剤、塗布剤、ゲルまたはクリームに製剤化される。
【０１６２】
吸入投与のために、化合物は通常、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器またはディスペンサあるいは噴霧器からエアロゾルスプレーの形態で送達される。このような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号に記載の方法が含まれる。
【０１６３】
治療用化合物はまた、坐剤（例えば、カカオバターおよびその他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を用いた）または直腸内送達用の停留浣腸の形態に調製され得る。
一実施形態において、治療用化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含めた徐放製剤のように、体内からの迅速な排出に対して治療用化合物を保護する担体と共に調製される。生物分解性の生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などが使用され得る。このような製剤は、標準的な方法により調製されるか、または例えば、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．より購入され得る。リポソーム懸濁液（細胞抗原に対するモノクローナル抗体で選択された細胞に対して標的化されたリポソームを含む）も薬学的に許容される担体として使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の当業者に公知の方法により調製され得る。
【０１６４】
治療用化合物の用量、毒性および治療効果は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な量）を決定するための）により決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表し得る。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０１６５】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを、ヒトで使用する用量範囲を定式化するために用い得る。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を包含する循環血中濃度の範囲内にある。用量は、採用する剤形および利用する投与経路によりこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で使用される任意の化合物に関しては、治療有効量をまず細胞培養アッセイから推定し得る。動物モデルにおける用量を定式化して、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、最大半値の症状阻害が得られる試験化合物の濃度）を包含する循環血漿濃度を得てもよい。このような情報を用いて、ヒトにおける有効量をより正確に決定し得る。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１６６】
治療用化合物の治療有効量（すなわち、有効な用量）は、選択される治療用化合物による。組成物は、隔日１回を含め、１日に１回または複数回〜１週間に１回または複数回、１つ投与され得る。疾患または障害の重症度、治療歴、被検体の全般的健康状態および／または年齢ならびに罹患中の他の疾患を非限定的に含めた特定の因子が、被検体を効果的に治療するために必要とされる用量およびタイミングに影響し得ることを、当業者は理解するであろう。さらに、本明細書に記載されている治療用化合物の治療有効量による被検体の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。
【０１６７】
ペプチドリガンド標的化が、薬物の癌細胞を選択的に殺す能力を増強し得るインビトロでの薬物濃度の範囲は通常、使用される薬物による。例えば、遺伝毒性物質は通常、０．１〜１００μＭの間、好ましくは０．１５〜３０μＭ／ｋｇの間インビトロ濃度で使用される。
【０１６８】
癌細胞に薬物を送達するペプチドリガンドの治療用組成物は、さらなる抗癌治療に対する癌細胞の感受性を増加させることができ、例えば、パクリタキセルとコンジュゲートされたペプチドリガンドは、１５０ｍｇ／ｍ２（体表面）の範囲において、特定の薬物に対する癌細胞の感受性を増加させ、これに対してシスプラチンは、２０ｍｇ／ｍ２／日の範囲で、放射線に対する癌細胞の感受性を増加させる。
【０１６９】
細胞外表面に結合するペプチドリガンドは、細胞内へのペイロード輸送を促進するドメインまたは分子を含むことが意図される「膜融合成分」を含み得る。膜融合成分は、膜透過性モチーフを含み得る。膜融合成分は、天然に存在するタンパク質から単離され得るか、あるいは全体または部分的に天然に存在するドメインに基づく合成分子であり得、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）糖タンパク質−１２０（ＧＰ１２０）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）糖タンパク質−４２（ＧＰ４１）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）（転写トランスアクチベーター（Ｔａｔ））タンパク質、ヒトパラインフルエンザウイルス、インフルエンザウイルス（ＨＡ２と呼ばれる）の赤血球凝集素（ＨＡ）、エボラウイルス膜貫通融合配列（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、へリックスコイルコイル（ｈｅｌｉｃａｌ  ｃｏｉｌ−ｃｏｉｌｓ）、α溶血素、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、メリチン（ハチ毒の活性成分）、疎水性セグメント、合成膜輸送体などである。適切な膜融合成分は、当該分野で公知の、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータンまたはｈＣＴ由来細胞貫通ペプチドであり、例えば、Ｃａｒｏｎら，（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（３）：３１０−８；Ｌａｎｇｅｌ，Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  ＦＬ  ２００２）；Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら，（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１１（２８）：３５９７−６１１；およびＤｅｓｈａｙｅｓら，（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６２（１６）：１８３９−４９を参照されたい。
【０１７０】
医薬組成物は、投与のための説明書と共に容器、パックまたはディスペンサ中に含まれ得る。
ＶＩＩＩ．抗体
本発明は、癌バイオマーカーに対する親和性を有する単離抗体（例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル）を提供する。いくつかの実施形態において、癌は膵臓癌を包含する。他の実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、脳癌、肝臓癌、骨癌または腎臓癌を包含するが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明は、プレクチンバイオマーカー（例えば、配列番号１）の少なくとも５個のアミノ酸残基からなる単離ポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。これらの抗体は、本明細書に記載のイメージング法において使用される。
【０１７１】
本発明のタンパク質に対する抗体は、それがタンパク質を認識できる限り、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもあり得る。抗体は、本発明のタンパク質を抗原として用いて、従来の抗体または抗血清の調製手順に従って産生され得る。
【０１７２】
本発明は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方の使用を意図する。本発明の方法および組成物において使用される抗体を作成するために、本明細書に開示されるものを非限定的に含めた任意の適切な方法を用い得る。例えば、モノクローナル抗体の調製のために、タンパク質それのみをあるいは適切な担体または希釈剤と共に、抗体産生が可能な条件下で動物（例えば、哺乳動物）に投与する。抗体産生能を増強するために、完全または不完全フロイントアジュバントを投与し得る。通常、タンパク質を２週間〜６週間に１回、合計約２回〜約１０回投与する。このような方法での使用に適した動物として、霊長類、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
モノクローナル抗体産生細胞調製のために、抗体価が確定されている動物個体（例えば、マウス）を選択して、最後の免疫化後２日〜５日目に、その脾臓またはリンパ節を摘出し、そこに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成する。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後述の標識タンパク質と抗血清とを反応させ、次いで、抗体と結合した標識薬剤の活性を測定することにより行い得る。細胞融合は、既知の方法、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））により記載されている方法に従って行い得る。融合促進剤として、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはセンダイウイルス（ＨＶＪ）、好ましくはＰＥＧを使用する。
【０１７４】
骨髄腫細胞の例としては、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などが挙げられる。使用される抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数の比は、好ましくは、約１：１〜約２０：１である。ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）を、好ましくは、約１０％〜約８０％の濃度で添加する。細胞融合は、両細胞の混合物を約２０℃〜約４０℃、好ましくは、約３０℃〜約３７℃で、約１分〜１０分間インキュベートすることにより行い得る。
【０１７５】
様々な方法が、抗体（例えば、本発明の腫瘍抗原または自己抗体に対する）を産生するハイブリドーマのスクリーニングに使用され得る。例えば、抗体が直接または担体と共に吸着される固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマの上清を添加する場合、放射性物質または酵素で標識された抗免疫グロブリン抗体（細胞融合にマウス細胞が使用される場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が使用される）またはプロテインＡを添加して、固相に結合した、タンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。あるいは、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡが吸着された固相にハイブリドーマの上清を添加し、次いで、放射性物質または酵素で標識されたタンパク質を添加して、固相と結合した、
タンパク質に対するモノクローナル抗体を検出する。
【０１７６】
モノクローナル抗体の選択は、任意の既知の方法またはその改変に従って行い得る。通常、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用の培地を使用する。ハイブリドーマが増殖できる限り、任意の選択／増殖培地を使用し得る。例えば、１％〜２０％、好ましくは、１０％〜２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地、１％〜１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地、ハイブリドーマ培養用の無血清培地（ＳＦＭ−１０１，Ｎｉｓｓｕｉ  Ｓｅｉｙａｋｕ）などを使用し得る。通常、培養は、２０℃〜４０℃、好ましくは、３７℃で約５日〜３週間、好ましくは、１週間〜２週間、約５％ＣＯ２ガスの下で行う。ハイブリドーマ培養物上清の抗体価は、抗血清中の抗タンパク質の抗体価に関して上記のものと同様の方法に従って測定し得る。
【０１７７】
ＶＩＩＩ．模倣物の設計
プレクチン−１のようなバイオマーカーの認識およびそれとの結合に必要なコンホメーションを模倣する化合物は、本発明の範囲内にあることが意図される。例えば、いくつかの実施形態において、配列番号１〜８および本発明のすべてのペプチドの模倣物が意図される。このような模倣物の様々な設計が可能である。Ｌｏｂｌらに対する米国特許出願第５，１９２，７４６号、Ｂｕｒｋｅ，Ｊｒ．らに対する同５，１６９，８６２号、Ｂｉｓｃｈｏｆｆらに対する同５，５３９，０８５号、Ａｖｅｒｓａらに対する同５，５７６，４２３号、Ｓｈａｓｈｏｕａに対する同５，０５１，４４８号およびＧａｅｔａらに対する同５，５５９，１０３号（すべてその内容が参照により本明細書に援用される）に、このような化合物の作出方法が複数記載されている。
【０１７８】
ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物も当該分野で公知である。Ｅｌｄｒｅｄら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：３８８２（１９９４））は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を模倣する非ペプチドアンタゴニストを記載している。同様に、Ｋｕら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：９（１９９５））は、一連のこのような化合物の合成をさらに明らかにしている。例えば、ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号１）ペプチド（または本発明の任意の１つまたは複数のポリペプチド）を模倣する非ペプチド化合物が、本発明により特に意図される。
【０１７９】
本発明はまた、関連するペプチド配列を反復する多量体化合物である合成模倣化合物を意図する。当該分野で公知のように、ペプチドは、アミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカップリング剤との反応により活性化されたカルボキシル基と連結させることにより合成され得る。遊離アミノ基の活性化カルボキシルへの攻撃により、ペプチド結合が形成され、ジシクロヘキシル尿素が放出される。反応させようとするアミノ基およびカルボキシル基以外の、反応する可能性のある基を保護する必要があり得る。例えば、活性化カルボキシル基を含む構成要素のα−アミノ基を、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基でブロックし得る。次いで、ペプチドを希酸に曝露することによりこの保護基を除去し、ペプチド結合をインタクトで残し得る。
この方法を用いれば、ポリスチレンビーズのような不溶性マトリックスと連結されている伸長中のペプチド鎖への段階的なアミノ酸付加による固相法により、ペプチドを簡便に合成し得る。最初に所望のペプチド配列のカルボキシル末端アミノ酸（アミノ保護基を有する）をポリスチレンビーズに固定する。次いで、アミノ酸の保護基を除去する。次のアミノ酸（保護基を有する）を、カップリング剤と共に添加する。続いて洗浄サイクルを行う。このサイクルを必要に応じて繰り返す。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、本発明の模倣物は、上記プレクチンタンパク質リガンドと配列相同性を有するペプチドである。配列相同性およびさらに重要な統計的に有意な類
似性を評価するための１つの一般的な方法論は、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎにより書かれたアルゴリズムを使用したモンテカルロ解析を用いて、Ｚ値を得ることである。この解析によれば、６よりも大きいＺ値は可能性の高い有意性を示し、１０よりも大きいＺ値は統計的に有意であると考えられる。例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４−２４４８（１９８８）；ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１（１９８５）を参照されたい。本発明では、腫瘍治療においておよび浸潤阻止において有用な合成ポリペプチドは、統計的に有意な配列相同性および類似性を有する（モンテカルロ解析でのＬｉｐｍａｎ／ＰｅａｒｓｏｎアルゴリズムのＺ値が６を超える）ペプチドである。
【０１８１】
本発明はまた、アミノ酸対合技術（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）により同定された配列番号１〜８（または本発明の任意の１つまたは複数のポリペプチド配列）のペプチド配列誘導体を意図する。例えば、Ｒｏｏｔ−Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．９４：８８５−８５９（１９８２）；およびＳｔｅｆａｎｏｗｉｃｚら，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５：３２９−３３１（１９９８）を参照されたい。本発明において有用なペプチド配列誘導体を同定するために、この方法論を用いて、セプラーゼといくらか相補的であるが、同時にそれ自体が細胞移動を増強することなくセプラーゼ活性を特異的に阻害する配列を同定する。
【０１８２】
本発明に記載のペプチドリガンドは、プロテアーゼ耐性であり得、かつ保護基、例えばアシル基、アミド基、ベンジルまたはベンゾイル基あるいはポリエチレングリコールなどを１つまたは複数含有し得る。より具体的には、上記修飾ペプチドを含めたペプチドは、Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化されていてもよい。
【０１８３】
非天然のまたは修飾されたアミノ酸残基が含まれる場合、それらは、当該技術分野において利用可能な以下のまたは他の多くのものから選択され得る：４−ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−リン酸化セリン、Ｏ−リン酸化チロシンまたはデルタ−ヒドロキシリジン。その他の例として、ナフチルアラニン（トリトファン（ｔｒｙｔｏｐｈａｎ）と置換されて合成を促進し得る）、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、アルファ−アミノ酸（Ｌ−アルファ−ヒドロキシリシルおよびＤ−アルファ−メチルアラニル、Ｌ−アルファ−メチルアラニルなど）、ベータ−アミノ酸およびイソキノリルが挙げられる。非天然アミノ酸残基を有するペプチドは、合成ペプチドと呼ばれる場合があり、本明細書に記載のバリアントの１種を構成する。その他のバリアントとして、アミノ酸残基（Ｌ−型またはＤ−型の）の天然の側鎖が非天然の側鎖で置換されているペプチドが挙げられる。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、ペプチドは、一方（または両方）の末端に（例えば、Ｎ末端に）３個の追加のアミノ酸（Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）および一方（または両方）の末端に（例えば、Ｃ末端に）７〜８個の追加のアミノ酸（例えば、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２６））を有し得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、ペプチドを当該分野で公知の方法によりペグ化し得る。
還元／アルキル化および／またはアシル化によるペプチド修飾に関する手引きとして、Ｔａｒｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｌｉｆｔｏｎ  Ｎ．Ｊ．（１９８６）１５５〜１９４を；適切な担体への化学的結合に関する手引きとして、ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ，ｅｄｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａ
ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９８０）ならびに米国特許第４，９３９，２３９号を；弱いホルマリン処理に関する手引きとして、Ｍａｒｓｈ，Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９７１）４１：１９９〜２１５を、それぞれ参照することができる。
【０１８６】
ペプチドリガンドのペプチド模倣物も使用され得る。ペプチド模倣物作成のために、当該分野で公知の方法に従って、本明細書に開示されるペプチドリガンドを修飾し得る。例えば、Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ，Ｗ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ（Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ  １９９８）；Ｇｏｏｄｍａｎら，ｅｄｓ．，Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ，Ｔｈｉｅｌｅ  Ｖｅｒｌａｇ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００３）；およびＭａｙｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８：４５７４６，（２００３）を参照されたい。いくつかの場合において、本明細書に開示されるペプチドおよびフラグメントのこれら修飾されたペプチド模倣物型は、非ペプチド模倣物のペプチドよりも増強されたインビボでの安定性を示す。ペプチド模倣物を作出するための方法として、Ｄ−アミノ酸鏡像異性体を有するペプチド配列の１つまたは複数、例えば、すべてを置換することが挙げられる。このような配列を、本明細書では「ｒｅｔｒｏ」配列と呼ぶ。別の方法では、アミノ酸残基のＮ末端からＣ末端へ向かう順序を逆にすることにより、元のペプチドのＮ末端からＣ末端へ向かうアミノ酸残基の順序が、修飾ペプチド模倣物ではＣ末端からＮ末端に向かうアミノ酸残基の順序になる。このような配列を、「ｉｎｖｅｒｓｏ」配列と呼ぶことができる。ペプチド模倣物は、本明細書に開示されるペプチドのｒｅｔｒｏ型およびｉｎｖｅｒｓｏ型の両方、すなわち、「ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ」型となり得る。新規ペプチド模倣物は、ペプチド模倣物でのＮ末端からＣ末端に向かうアミノ酸配列の順序が、元のペプチドでのＣ末端からＮ末端に向かうアミノ酸配列の順序に対応するように配列された、Ｄ−アミノ酸から構成され得る。
【０１８７】
ペプチド模倣物を作成するための他の方法として、ペプチド中の１つまたは複数のアミノ酸残基を、化学的には異なるが、機能的であると認められるアミノ酸の類似体、すなわち、人工のアミノ酸類似体に置換することが挙げられる。人工のアミノ酸類似体として、β−アミノ酸、β−置換β−アミノ酸（「β３−アミノ酸」）、アミノ酸の亜リン酸類似体（α−アミノホスホン酸およびα−アミノホスフィン酸など）ならびに非ペプチド結合を有するアミノ酸が挙げられる。人工アミノ酸を用いて、ペプチド模倣物、例えばペプトイドオリゴマー（例えば、ペプトイドアミドまたはエステル類似体）、β−ペプチド、環状ペプチド、オリゴウレアまたはオリゴカルバマートペプチド；または複素環分子などを作出し得る。これらの配列は、例えば、アミノ末端のビオチン化およびカルボキシ末端のアミド化により修飾され得る。
【０１８８】
本明細書に記載のバリアント形態を含めた、本明細書に記載の任意のペプチドは、異種ポリペプチドをさらに含み得る。異種ポリペプチドは、それが付着している（例えば、融合タンパク質中のように融合している）ペプチドの循環血中半減期を増加させるポリペプチドであり得る。異種ポリペプチドは、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンまたはその一部分）あるいは免疫グロブリンの一部分（例えば、ＩｇＧのＦｃ領域）であり得る。異種ポリペプチドは、ミトコンドリアの貫通部分であり得る。
【０１８９】
本明細書に記載のペプチドの必要とされるコンホメーションを模倣する化合物は、本発明の範囲内にあるものとして意図される。このような模倣物の様々な設計が可能である。米国特許第５，１９２，７４６号；同第５，１６９，８６２号；同第５，５３９，０８５号；同第５，５７６，４２３号；同第５，０５１，４４８；および同第５，５５９，１０３号（すべてその内容が参照により本明細書に援用される）には、このような化合物を設
計するための複数の方法が記載されている。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物が当該分野で公知である（例えば、シェファーディンの非ペプチド小分子模倣体の同定法を記載している、Ｍｅｌｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９：７７２１−７７３０（２００６）を参照されたい）。ペプチド配列を模倣する非ペプチド化合物の合成も当該分野で公知である（例えば、Ｅｌｄｒｅｄら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：３８８２（１９９４）；Ｋｕら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８：９（１９９５）；Ｍｅｌｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４９：７７２１−７７３０（２００６）を参照されたい）。プレクチン−１と結合する本明細書に記載の配列を模倣するこのような非ペプチド化合物が、本発明により特に意図される。
【０１９０】
本発明はまた、合成模倣化合物を意図する。当該分野で公知のように、ペプチドは、アミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のようなカップリング剤との反応により活性化されたカルボキシル基と連結させることにより合成され得る。遊離アミノ基の活性化カルボキシルへの攻撃により、ペプチド結合が形成され、ジシクロヘキシル尿素が放出される。反応させようとするアミノ基およびカルボキシル基以外の、反応する可能性のある基を保護する必要があり得る。例えば、活性化カルボキシル基を含む構成要素のα−アミノ基を、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基でブロックし得る。次いで、ペプチドを希酸に曝露することによりこの保護基を除去し、ペプチド結合をインタクトで残し得る。この方法を用いれば、ポリスチレンビーズのような不溶性マトリックスと連結されている伸長中のペプチド鎖への段階的なアミノ酸付加による固相法により、ペプチドを簡便に合成し得る。最初に所望のペプチド配列のカルボキシル末端アミノ酸（アミノ保護基を有する）をポリスチレンビーズに固定する。次いで、アミノ酸の保護基を除去する。次のアミノ酸（保護基を有する）を、カップリング剤と共に添加する。続いて洗浄サイクルを行う。このサイクルを必要に応じて繰り返す。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、本発明の模倣物は、本明細書に記載のシャペロン阻害剤ペプチドと配列相同性を有するペプチドである。これらの模倣物は、Ｌ−アミノ酸がそれらのＤ−異性体で置換されているペプチドを非限定的に含む。配列相同性およびさらに重要な統計的に有意な類似性を評価するための１つの一般的な方法は、ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎにより書かれたアルゴリズムを使用したモンテカルロ解析を用いて、Ｚ値を得ることである。この解析によれば、６よりも大きいＺ値は可能性の高い有意性を示し、１０よりも大きいＺ値は統計的に有意であると考えられる（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：２４４４−２４４８（１９８８）；ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１（１９８５））。より一般的には、本明細書に記載のペプチドリガンドおよび上記模倣物は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１：５０２０−５０３１（１９８２）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  Ｗｅｌｌｉｎｇｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８２：５１３１−５１３５（１９８５）；Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８９：４４−６６，（１９９７）あるいはＧｕｙおよびＦｉｅｌｄｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２８９：６７−８３（１９９７）に記載されている、ティーバッグ法または固相ペプチド合成法を含めた、任意の既知の方法を用いて、あるいは市販の自動合成装置を用いて合成され得る。
【０１９２】
ＩＸ．小分子薬物
いくつかの実施形態において、本発明は、癌バイオマーカー（例えば、プレクチン）と結合することにより癌を縮小させるかまたは除去する薬物（例えば、小分子薬物）を提供する。いくつかの実施形態において、小分子薬物は、本明細書に記載の薬剤スクリーニング法を用いて同定される。好適な実施形態において、本発明の小分子薬物は、癌細胞は殺すが正常な細胞は殺さない。いくつかの実施形態において、小分子薬物は、本明細書に（
例えば、上記ＩＩＩ節に）記載の薬物スクリーニングを用いて同定される。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、本発明は、薬剤スクリーニングアッセイ（例えば、抗癌剤をスクリーニングするための）を提供する。本発明は特定の機構に限定されない。実際、本発明を実施するために機構の理解は必要ではない。本発明は、細胞表面膜（例えば、腫瘍組織）上で発現される癌バイオマーカーと結合する化合物の同定のための薬剤スクリーニング法を提供する。本発明は、プレクチン−１を発現する癌において活性な化学療法剤の同定法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、小分子のような候補化合物は、プレクチン−１に対するものである。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、本発明は、癌バイオマーカー（例えば、プレクチン）を阻止する／抑制する／妨げる／破壊する効果的な非ペプチド小分子阻害因子の同定法を意図する。これらの分子は、いくつかあるハイスループットスクリーニング法のいずれを用いても発見され得る。例えば、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：８４６−８５４（２００４）；Ｋａｙら，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  １：１３９−１４０（１９９６）；Ｐｆｌｅｇｅｒら，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  １８：１６６４〜１６７０（２００６）；Ｊｕｎｇら，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：４４２７〜４４３１（２００５）；Ｎｉｅｕｗｅｎｈｕｉｊｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ  ８：６７６〜６８４（２００３）；およびＢｅｒｇ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４２：２４６２〜２４８１（２００３）を参照されたい。
【実施例】
【０１９５】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を説明するためのものであり、それらの範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
以下の実験の開示において、次の略語が適用される：Ｎ（正常な）；Ｍ（モラー）；ｍＭ（ミリモラー）；μＭ（マイクロモラー）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｐｍｏｌ（ピコモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｎｇ（ナノグラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；ｍｉｎ（分）；ｓおよびｓｅｃ（秒）；ｋ（キロメートル）；ｄｅｇ（度）；℃（セ氏／セルシウス度）、コロニー形成単位（ｃｆｕ）、プラーク形成単位（ＰＦＵ）、吸光度（ＯＤ；ｏ．ｄ．）、内径（ｉ．ｄ．）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。
【０１９６】
実施例I
この実施例では、本発明の開発中に用いられたアッセイの典型的な材料および方法を説明する。
【０１９７】
細胞培養
野生型マウス由来の初代マウス膵管細胞を、公開されている方法（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら，（２００４）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７：２５０〜２６０）を用いて単離および培養した。Ｐｄｘｌ−Ｃｒｅ  ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｐ５３Ｌ／Ｌマウス（Ｋｒａｓ／ｐ５３Ｌ／Ｌと呼ぶ）で発生する腫瘍から、初期継代ＰＤＡＣ細胞株を単離した（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：５９４７〜５９５２）。ファージディスプレイ実験用に、最初にＰＤＡＣ細胞を初代導管細胞培地（Ｄ−グルコース（Ｓｉｇｍａ）５ｍｇ／ｍＬ  、ダイズトリプシンインヒビター・タイプI（Ｓｉｇｍａ）０．１ｍｇ／ｍＬ、インスリン−トラ
ンスフェリン−セレン（ＩＴＳ＋；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）５ｍＬ／Ｌ、ウシ下垂体抽出物（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２５μｇ／ｍ
Ｌ、上皮成長因子（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）２０ｎｇ／ｍＬ  、３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン（Ｓｉｇｍａ）５ｎｍｏｌ／Ｌ、デキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）１μｍｏｌ／Ｌ、コレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）１００ｎｇ／ｍＬ、ニコチンアミド（Ｓｉｇｍａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ、５％Ｎｕ−血清IV培養添加物（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）および抗生物質（ペニシリンＧ１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００ｇ／ｍＬ、アンホテリシンＢ０．２５μｇ／ｍＬ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）を添加したＦ１２培地）中で増殖させた。ヒトＰＤＡＣ細胞株（ＭＮＡ，８９８８，ＳＷ１９９０，ＭＩＡ−ＰａＣａ−２，ＡＳＰＣ）をＡＴＣＣより購入し、確立されているプロトコールに従って培養した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（マウス線維芽細胞）はＡＴＣＣより購入する。マウス心内皮細胞（ＭＨＥＣ）を、すでに公開されているプロトコール（Ａｌｌｐｏｒｔら，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７１：８２１−８２８（２００２））に従ってマウスから単離し、２次継代培養後に使用した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓより購入し、製造者のプロトコールに従って培養した。
【０１９８】
マウスコホート
Ｐｄｘｌ−Ｃｒｅ  ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄｐ５３Ｌ／＋（Ｋｒａｓ／ｐ５３Ｌ／＋）、Ｐｄｘｌ−Ｃｒｅ  ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ  ｐｌ６＋／−（Ｋｒａｓ／ｐｌ６＋／−）、Ｐｄｘｌ−Ｃｒｅ  ＬＳＬ−ＫｒａｓＧ１２Ｄ（Ｋｒａｓ）および野生型マウスにおけるイメージング研究を行った（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：５９４７−５９５２（２００６））。育種、遺伝子型同定および解析を、すでに公開されている通りに行った（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：５９４７−５９５２（２００６）；およびＡｇｕｉｒｒｅら，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：３１１２−３１２６（２００３））。マウスをマサチューセッツ総合病院（ＭＧＨ）において無菌環境中で飼育した。マウスは、実験動物福祉部門（Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ
Ｗｅｌｆａｒｅ）の定める動物管理基準（ｇｏｏｄ  ａｎｉｍａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に厳密に従って管理し、動物研究はすべて動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けて行った。
【０１９９】
ファージ選択
Ｋｒａｓ／ｐ５３マウスから単離されたマウスＰＤＡＣ細胞を、ランダム化された直鎖状７アミノ酸ペプチドライブラリー（ｐｈＤ７，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）をディスプレイするファージと共に、ファージがＰＤＡＣ細胞内に取り込まれる時間を考慮して、３７℃で１時間インキュベートすることにより、ファージのポジティブ選択およびネガティブ選択を達成した。細胞に取り込まれたファージのスクリーニングでは、イメージング剤を細胞内に濃縮させることによる一種のシグナル増幅と共に、薬剤がｋｏｆｆ（オフ速度）に影響されず、さらに、有効な親和性を増加させるという追加的効用が得られる（Ｋｅｌｌｙら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６：３２７−３３６（２００５））。非結合ファージおよび非特異的結合ファージを除去するために、１％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＤＰＢＳで最初に細胞を洗浄した。０．１Ｍグリシン（ｐＨ２）で８分間洗浄することにより、細胞表面に結合したファージを除去した。２回目のグリシン洗浄に続き、細胞を、０．１％トリエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．６）で５分間、室温で溶解させることにより、取り込まれたファージを回収した。取り込まれたファージのプールを、１００μＬの０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）で中和した。取り込まれたファージのプールを正常な膵臓細胞と共に３０分間のインキュベートを３サイクル行うことで対抗選択を行い、正常膵管細胞およびＰＤＡＣの両方と結合する全てのクローンを効率的に取り去った（Ｋｅｌｌｙら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ５：４３７−４４４（２００３））
。取り込まれたファージを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内で増幅し、力価を測定し、ＰＤＡＣ細胞について計４回のラウンドになるようさらに３回のラウンドのポジティブ選択にかけた。この選択から、３０クローンを配列決定のために選択して、ＥＬＩＳＡにより解析した（以下を参照）。
【０２００】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および多次元解析
さらなる研究に適したクローンの選択を容易にするために、ＥＬＩＳＡおよび多次元解析を用いた（Ｋｅｌｌｙら，Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ５：２４−３０（２００６））。具体的には、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）および正常な細胞（非癌性）を、９６ウェルプレート中で１００％のコンフルエンスまで増殖させ、順次、三重反復で３０のファージクローンと共に３７℃でインキュベート（１０７および１０１０ＰＦＵ、１時間）を行い、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄し、ビオチン化抗Ｍ１３抗体と共にインキュベート（１：４０、１時間）して、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１：５００）で検出を行い、テトラ−メチル−ベンジジンで発色させて、６５０ｎｍでの吸光度を測定した（Ｅｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）。
【０２０１】
ＰＤＡＣまたは正常な導管細胞に対応するプレートリーダーの未処理の結果を非ピボット化して値の非正規化表を作成し、次いで各ウェルの位置をメタデータラベルの類似した配列と関連付けた。各ウェルからの値を、各アッセイプレートからの偽処理ウェル（野生型ファージ）の中央値を用いてバックグラウンドを差し引いた。バックグランドを差し引いた（Ｂｓｕｂ）偽処理ウェルに対する値を複数のアッセイプレートにわたって累算し、１つがＰＤＡＣ細胞に対応し、１つが正常OLE_LINK1導OLE_LINK1管細胞に対応する、アッセイノイズを反映した２つの偽処理分布を得て、Ｃｈａｕｖｅｎｅｔの基準（Ｃｈａｕｖｅｎｅｔ’ｓ  ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ）により、すでに記載されている通りに調整した（Ｋｅｌｌｙら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６：３２７−３３６（２００５））。これらの偽処理分布を用いて、ファージ処理ウェルに対応する各値を独立に正規化し、各ウェルに対するＺ正規化（Ｚｎｏｒｍ）値を得た。全データの初期化、操作および正規化は、Ｐｉｐｅｌｉｎｅ  Ｐｉｌｏｔ（Ｓｃｉｔｅｇｉｃ）を用いて行い、データ可視化（ヒートマップ）は、ＤｅｃｉｓｉｏｎＳｉｔｅ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ）を用いて行った。
【０２０２】
ファージ標識
インビトロおよびインビボでの検証実験のために、すでに記載されている通りにファージを蛍光色素標識した（Ｋｅｌｌｙら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８：１０１１−１０１８（２００６））。簡潔に述べれば、約１×１０１２ＰＦＵのファージを０．３ＭＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．６）１００μＬ中に懸濁し、次いで、実験に応じて、ＮａＨＣＯ３溶液に以下の色素のうちの１つを加えた：１ｍｇ／ｍＬの蛍光色素−ヒドロスクシンイミドエステル（Ｃｙ５．５またはＡＦ７５０とコンジュゲートされている）、０．２５ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ、０．２５ｍｇ／ｍＬのＲＩＴＣ（ローダミンイソチオシアナート）。穏やかに攪拌しながら、室温（ＲＴ）下、暗黒中で標識反応を続けた。１時間後、反応混合物をＤＰＢＳ中で１ｍＬまで希釈し、標識ファージをＰＥＧ沈殿（３回）により精製した。蛍光色素標識ファージを２００μＬのＤＰＢＳ中で再懸濁した。力価分析によりプラーク形成単位を測定し、分光測光により（Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ  １１，Ｖａｒｉａｎ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃ．Ａ．）蛍光色素濃度を測定した。
【０２０３】
蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリーによるファージ検出
マウス膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞、ヒトＰＤＡＣ細胞（すなわち、ＭＮＡ、８９８８、ＳＷ１９９０、ＰａＣａ−２、ＡＳＰＣ）、正常ヒト導管細胞および正常な膵臓細胞を、１ｍＭ（ＦＩＴＣ）ＦＩＴＣ−標識ファージクローン２７または無関係ファージクローン（アミノ酸配列ＳＮＬＨＰＳＤ、ネガティブ対照（配列番号XX））と共に３７℃で１時間インキュベートし、ＤＰＢＳで３回洗浄し、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  
ＴＥ２０００−Ｓ，Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＱＥ，４０×対物レンズ）により可視化した。次いで、トリプシンとのインキュベーションにより細胞を回収して、遠心分離し、Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でのフローサイトメトリーにより解析した（１０，０００細胞／試料）。ＰＤＡＣ細胞の試料は、正常な細胞由来の試料よりも高い、狭い単一ピークの蛍光強度を示した（例えば、図１Ｂ）。細胞数に対する平均蛍光度をプロットして、細胞型間の相対的取込みを表した。
【０２０４】
エキソビボ生検標本
ファージ試験により同定された膵管腺癌（ＰＤＡＣ）特異的ペプチドを、組織切片上で結合について検査した。具体的には、生検標本からのマウスおよびヒトのエキソビボ組織切片を急速凍結して、ＯＣＴで包埋し、５μｍの切片を切削し、次いでスライドに付着させた。組織の付着したスライドを、１μＭのＦＩＴＣ標識ファージクローン２７またはＦＩＴＣ標識対照ファージ（無挿入）と共に３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄して、２％パラホルムアルデヒドで固定し、次いで蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｓ，Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＱＥ，４０×対物レンズ）により可視化した。
【０２０５】
ファージ発現ペプチドに対する結合パートナー同定
蛍光色素とファージとをコンジュゲートするために使用したものと同じＮＨＳ化学を使用して、ファージをフォトリンカー（スルホ−ＳＡＥＤ（スルホスクシンイミジル２−［７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセトアミド］エチル−１，３ジチオプロピオナート）；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）およびビオチンタグで標識した（Ｋｅｌｌｙら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８：１０１１−１０１８（２００６））。２つのペトリ皿（１０ｃｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で標的細胞株を平板培養し、細胞がプレートを覆う培養密度になるまで増殖させた。１つのコンフルエントなプレートを、１ｍＬの改変ファージ（およそ１０１０ＰＦＵ／ｕＬ）と共にインキュベートした。ネガティブ対照用に、２つ目のプレートを、対照（無挿入）ファージと共にインキュベートとした。両プレートを４℃で１時間、暗黒中でインキュベートした。次いで、細胞をＤＰＢＳで数回、再び洗浄して、氷上に置き、１５ワット３６５ｎｍのＵＶランプ（Ｓｐｅｃｔｒｏｌｉｎｅ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて３０分間光分解し、哺乳動物プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＰＢＳ中の１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて溶解させた。細胞溶解物を、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで予めブロックしたＤｙｎａｌ  Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１００μＬと共に１時間インキュベートした。ビーズを１０×ＰＢＳ中の１％ｔｒｉｔｏｎＸ−１００で２回洗浄し、次いで、ＤＴＴを含む緩衝液で４℃で一晩インキュベートして、化学的架橋を分解し、沈降したタンパク質を解離させた。溶出物の半分をＰＶＤＦ膜に転写し、プレクチン−１抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）でプローブした。別の半分の溶出物をＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に負荷し、マススペクトル用銀染色試薬（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｓｉｌｖｅｒ  ｓｔａｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｅｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて染色した。
【０２０６】
次に、銀染色したバンドを切り出し、トリプシン消化／マススペック解析（Ｔｕｆｔｓ
Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）に供した。カラム先端が１５ｍｍの開口部に向かって先細りになる、外径３６０ｍｍ、内径７５ｍｍのフューズドシリカキャピラリーから、ナノボアエレクトロスプレーカラムを作製した。カラムに、逆相充填材である２００Ａ°Å  ５ｕｍ  Ｃ１８ビーズ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ．）を、１０ｃｍの長さまで充填した。カラム内の流れは、流速３５０ｎＬ／分を得るためにカラムの前でスプリットにした。勾配溶離のために使用した移
動相は、（Ａ）酢酸０．３％水９９．７％および（Ｂ）酢酸０．３％アセトニトリル９９．７％で構成された。Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＴＱイオントラップ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によりタンデム質量スペクトルを得た。ニードル電圧は３ｋＶに設定した。イオンシグナルが所定の閾値を超えると、機器が質量分析（ＭＳ）モードからタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）モードへと自動的に切り替わり、断片化スペクトルが生成された。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＳＥＱＵＥＳＴコンピュータアルゴリズム（Ｙａｔｅｓら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１４２６−１４３６（１９９５））を用いて、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質配列データベースに対して検索した。
【０２０７】
プレクチン−１と結合するクローン２７（Ｐａｎｃ２７）の検証
細胞成分分画：ＰＤＡＣ、ＰａＣａ−２、ＮＩＨ−２９３Ｔおよび正常導管細胞を、６ウェルプレートの２つのウェルで一晩培養した。細胞溶解緩衝液（ＣＬＢ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４Ｊ  ５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３／１ｍＭ  ＣａＣｌ２／０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）／５ｍＭ  ＥＤＴＡ／１０μｇ／ｍｌアプロチニン＋１０μｇ／ｍｌロイペプチン＋１ｕｇ／ｍｌペプスタチン５００μＬで掻爬して回収した。回収した細胞を、５分間膨潤させて、５０回ホモジナイズし、次いで７５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿物を１ｍｌのＴＳＥ／０．１％ＮＰ４０／ＰＩ中で懸濁して、３０分間ホモジナイズし、次いで５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。沈殿物を２回洗浄し、ＴＳＥ／０．１％／ＮＰ４０／ＰＩ５０μｌ中で懸濁して、純粋な核を残した。細胞膜と共に細胞質ゾルを含む上清を、ＳＷＴ０ローター中で、７０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離した。沈殿物を再懸濁し、ＣＬＢで２回洗浄して夾雑物である細胞質タンパク質を除去した。各画分のタンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＰＩＥＲＣＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により測定し、各画分からの等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分離した。ウェスタンブロット法により、プレクチン−１発現に関して画分を解析した。
【０２０８】
競合実験：マウスＰＤＡＣ細胞を、ＦＩＴＣ標識ファージクローン２７ならびに抗プレクチン−１抗体またはビークルと共に３７℃で１時間インキュベートし、洗浄、剥離を行い、次いで、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣｓＣａｌｉｂｕｒ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））により解析した。
【０２０９】
ペプチド合成
プレクチン−１標的化ペプチド（ＰＴＰ）（アミノ酸配列：ＫＴＬＬＰＴＰ（配列番号１））および対照ペプチド（上記参照）を、ペプチドとモデル蛍光ナノ粒子（架橋化酸化鉄［ＣＬＩＯ］−Ｃｙ５．５）とのコンジュゲーションにＧＧＳＫ（ＦＩＴＣ）Ｃリンカーを用いて合成した。
【０２１０】
確立された手順を用いてＣＬＩＯ−Ｃｙ５．５を大量に合成し（Ｍｏｎｔｅｔら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１７：９０５−９１１（２００６）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１６：１２４０−１２４５（２００５）；Ｗｕｎｄｅｒｂａｌｄｉｎｇｅｒら，Ａｃａｄ．Ｒａｄｉｏｌ．９  Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ３０４−Ｓ３０６（２００２）；およびＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１５：１０６２−１０６７（２００４）を参照されたい）、様々なナノ粒子コンジュゲートの合成に一定分量を使用した。簡潔には、塩化第二鉄を混合した水にＴ−１０デキストランを溶かし、窒素パージにより脱気した。塩化第二鉄溶液を混合物に加え、水酸化アンモニウムによりｐＨを１０にした。得られた粒子をエピクロロヒドリンおよびアンモニアで架橋し、安定性ならびに蛍光色素およびペプチドとのコンジュゲーションのためのアミン基を与えた。ＮＨＳ−Ｃｙ５．５をＰＢＳ中でアミノ−ＣＬＩＯと４℃で一晩反応させ、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。ＣＬＩＯのＣｙ５．５担持の判定を、未反応ＣＬＩＯを基準として用いた、６８０ｎｍでの吸光分光測定により行った（
図８Ａ）。ＣＬＩＯ−Ｃｙ５．５は、以下の物理的特性を有していた：（ａ）大きさ３８．７ｎｍ（図８Ｂ）、（ｂ）緩和時定数Ｒ１−２１．１およびＲ２−６２．６ｍＭ／ｓならびに（ｃ）ＣＬＩＯナノ粒子当たり平均２．３Ｃｙ５．５。
【０２１１】
プレクチン−１標的化または対照ナノ粒子を作成するために、ヨード酢酸スクシンイミジルをＣＬＩＯ−Ｃｙ５．５と１５分間反応させ、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、次いでペプチジル−システインと１時間反応させた。ペプチドコンジュゲートナノ粒子（ＰＴＰ−ＮＰ）または対照（対照ＮＰ）をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて再び精製し、ナノ粒子に対するペプチドの比を、未反応ＣＬＩＯを基準として用いた４９７ｎｍでの吸光分光測定により定量化した（図８Ｃ）。
【０２１２】
レーザー走査生体顕微鏡法
遠赤色および近赤外イメージング性能を有するレーザー走査顕微鏡（ＩＶ１００，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ）が他所に詳細に記載されている（例えば、Ａｌｅｎｃａｒら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１７：３３５−３３９（２００５）を参照されたい）。すべてのイメージングセッションの間、マウスを麻酔し（２％イソフルランを２ｌ／分Ｏ２で）、小さな正中切開を行い膵臓を露出させた。インビボスクリーニング法として、本発明者らは、ファージコートタンパク質を近赤外蛍光色素で標識することにより、ファージをイメージング用の標的化ナノ粒子として使用した（Ｋｅｌｌｙら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ
８：１０１１−１０１８（２００６）；およびＮｅｗｔｏｎら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８：７７２−７８０（２００６））。Ｃｙ５．５標識ファージを、分布および腫瘍の両イメージング試験の４時間前に静脈内注射した。イメージングの１０分前にＳＹＴＯＸグリーンを注射した（図３）。イメージングの後に、組織学的解析のために腫瘍を除去した。ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で連続凍結切片を染色し、Ｍ１３ファージの存在に対する染色も行った。ＰＴＰ−ＮＰイメージング（図５および６）のために、ＩＶ１００によるイメージングの２４時間前に薬剤を注射した。イメージングの１０分前にＡｎｇｉｏｓｅｎｓｅ（Ｖｉｓｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）を注射して、毛細血管系を可視化した。適当な二重励起（ＲＩＴＣに対しては５６１ｎｍ、Ｃｙ５．５に対しては６３３ｎｍおよびＡｎｇｉｏｓｅｎｓｅ−７５０に対しては７４８ｎｍ）を用いて画像を得た。蛍光イメージングの後、膵臓を除去し、後のＭＲＩイメージングでの感受性相互作用を防止するために、ＰＢＳ中の１％低融点寒天で包埋した。
【０２１３】
生体内分布
イメージング前の３日間、マウスを無蛍光飼料（Ｈａｒｌｅｎ−Ｔｅｋｌａｄ）で維持し、生体内分布試験を実施する２４時間前に、蛍光イメージング用にＣｙ５．５と結合させたＰＴＰ−ＮＰまたは対照プローブ（１５ｍｇＦｅ／ｋｇ体重）の静脈内注射をマウスに行った。摘出組織をＰＢＳ中で洗浄し、Ｃｙ５．５フィルターを用いて、Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＢｏｎｓａｉシステムおよびＯｌｙｍｐｕｓ  ＯＶ１００でイメージングを行った。組織中のプローブ集積を遊離プローブと比較し、生体内分布データを注入量の百分率として表した。プローブを注射していない動物からの組織／器官をイメージングし、次いでこのバックグラウンドを総シグナルから差し引くことにより、組織間の蛍光差を補正した。
【０２１４】
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）
次に、インビボで光学的にイメージングされた膵臓を包埋し、エキソビボでのＭＲＩ試験を行い、膵臓内でのシグナル強度変化を組織学と直接相関させた。直径３８ｍｍの送受信高周波コイルを有するＢｒｕｋｅｒ  ４．７Ｔ  Ｐｈａｒｍａｓｃａｎ  ｍａｇｎｅｔを用いて、摘出標本および寒天包埋標本のイメージングを行った。スカウトおよびローカライザー画像を得た後、高解像度の高速スピンエコー（ＦＳＥ）およびグラディエントエコーシーケンス（ＧＥ）を行った。具体的には、Ｔ２強調ＦＳＥシーケンスに対しては、以下のパラメーターを使用した：ＦＯＶが４．９４×５．４６ｃｍ、マトリックスサイズ
が５１２×５１２、スライス厚が０．５ｍｍ、ＲＡＲＥファクターが８、ＴＥ（有効）が４０ｍｓ、ＴＲが２８１１ｍｓ、全収集時間２時間２９分に対するＮＥＸが５０。Ｔ２＊強調ＧＥシーケンスに対するパラメーターは：ＦＯＶが３×３ｃｍ、マトリックスサイズが５１２×５１２、スライス厚が０．５ｍｍ、ＴＥが６．８ｍｓ、ＴＲが３９８ｍｓ、フリップ角が３０度、全収集時間２時間４９分に対するＮＥＸが５０であった。次いで、基準マーカーを含めて高解像度のＭＲＩデータのセットと組織切片とを共記載した。
【０２１５】
組織学および免疫組織化学
すでに記載されている通りに（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：５９４７−５９５２（２００６））、膵臓およびＰＤＡＣの標本を単離して、１０％パラホルムアルデヒドで固定するか、または最適切削温度（Ｏ．Ｃ．Ｔ．）コンパウンド中で凍結させた。組織学的および免疫組織化学的解析を、すでに記載されている通りに行った（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，（２００６）同上）。
【０２１６】
連続凍結切片を、Ｈ＆ＥであるいはＭ１３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（図３）およびプレクチン−１（図４）の存在の有無に関して染色した。Ｉｎｓｉｇｈｔカラーカメラを装着したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ
Ｅ４００正立顕微鏡（×２０および×４３対物レンズ）を用いてデジタル画像を撮影した。連続凍結切片をＨＥで染色するか、または５１２  Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｃａｓｃａｄｅ  ＣＣＤカメラ（Ｎｉｋｏｎ）を装着したＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ８０ｉ倒立顕微鏡（２０３対物レンズ）を用いてＰＴＰＮＰ−Ｃｙ５．５の存在の有無に関して蛍光顕微鏡でイメージングした。
【０２１７】
実施例II
ＰＤＡＣ特異的ペプチドのインビトロでの選択および検証
ヒト疾患の多くの病理組織学的、ゲノム的および分子的な特徴を再現する遺伝子操作ＰＤＡＣマウスモデルを使用した（Ｃａｒｒｉ閧窒・轣CＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０４（１１）：４４３７〜４２（２００７）；およびＢａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：５９４７−５９５２（２００６））。Ｋｒａｓ／ｐ５３  Ｌ／Ｌモデル（Ｂａｒｄｅｅｓｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：５９４７−５９５２（２００６））および野生型対照はそれぞれ、ＰＤＡＣ細胞に特異的なファージペプチドプールを同定するためのファージディスプレイ選択および除去手順での使用のための、明確な初期継代ＰＤＡＣ細胞および正常膵管細胞の供給源として役立った。選択手順に続いて、本発明者らは、３０の個々のファージプラークを単離し、ＥＬＩＳＡを行ってＰＤＡＣ細胞に対して最も選択的なファージを同定した。三重反復で行われた２つの実験の結果を、図１Ａで示されるヒートマップおよび図９で示される棒グラフで表す。ヒートマップは、親和性（表示のクローンのＥＬＩＳＡアッセイによる平均吸光度値）および特異性（ＰＤＡＣ細胞対正常導管細胞の吸光度比）を表す。解析した３０個のファージクローンのうち、１６個のファージクローン（５３％）がＰＤＡＣ細胞に対して２倍を超える特異性を有した。ＥＬＩＳＡおよび多次元解析に基づき、７個のクローン（番号１、５、９、１５、１７、２２および２７）が配列決定用に選択された。ＥＬＩＳＡおよび配列決定法の例に関しては、例えば、Ｋｅｌｌｙら，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６：３２７−３３６（２００５）；Ｋｅｌｌｙら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８：１０１１−１０１８（２００６）を参照されたい。配列決定の結果により、クローン２７および５が同一のペプチド配列（ＫＴＬＬＰＴＰ、配列番号１）を共有することが示され、かつ標的ＰＤＡＣ細胞に対する望ましい高い親和性および特異性が実証された。
【０２１８】
クローン１（ＳＧＶＥＦＬＨ、配列番号４）、９（ＳＫＫＤＴＨＨ、配列番号５）、１５（ＴＭＡＰＳＩＫ、配列番号６）、１７（ＴＱＨＱＶＴＡ、配列番号７）および２２（
ＶＮＤＲＮＶＫ、配列番号８）の試験に加え、ＰＤＡＣマーカーとしてのクローン２７の検証（図１Ｂ）を本明細書に記載の実験において行った。ファージコートタンパク質をフルオレセイン標識し、次いでフローサイトメトリーによりマウスＰＤＡＣおよび正常導管細胞に対するファージクローンの結合および特異性の程度を定量化した（図１Ｂ）。この結果により、クローン２７がマウスＰＤＡＣ細胞に対して高度に特異的であり、正常導管細胞よりも１１２倍高い特異性を有することが示された（図１Ｃ）。このように、クローン２７（配列番号１−ＫＴＬＬＰＴＰ）は、標的ＰＤＡＣ細胞に対する望ましい親和性および特異性を明確に示した（Ｋｅｌｌｙら，（２００６）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ８：１０１１−１０１８；Ｋｅｌｌｙら，（２００５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９６：３２７−３３６、これらは、すべてその内容が参照により本明細書に援用される）。ファージクローン１５は２番目に高い親和性であり、残りはほぼ同じ特異性を有していた。
【０２１９】
同時に、これらのデータは、本明細書に記載の癌モデルに基づくファージスクリーニングが、マウスＰＤＡＣのような癌細胞に高い親和性および特異性を有するファージクローンの同定および検証に有用であることを実証している。
【０２２０】
実施例III
ペプチドのヒトＰＤＡＣに対する特異性の判定
クローン２７のヒトＰＤＡＣ細胞に対する特異性を、この実施例に記載されている通りに評価した。クローン２７および無関係ファージクローンをＦＩＴＣで標識して、ＦＩＴＣ−２７およびＦＩＴＣ−無関係ファージクローン（ネガティブ対照）を作成した。５つのヒトＰＤＡＣ細胞株および正常ヒト導管細胞に加え、ポジティブ対照としてのマウスＰＤＡＣ細胞を、各タイプのクローンと共にインキュベートし、次いで、クローンの取込みを蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により解析した。ＦＩＴＣ−２７（クローン２７）は、無関係ファージと比べた場合、ＰＤＡＣ細胞株に対して平均１４１（平均蛍光度のクローン２７／無関係クローン比）の特異性を有していた。さらに、この２つのファージクローン（ＦＩＴＣ−２７およびＦＩＴＣ−無関係）は、正常ヒト導管細胞に対してほぼ同じ弱い結合（特異性＝０．８５）を示した（図１Ｃ）。
【０２２１】
実施例IV
ヒトＰＤＡＣ同定のためのペプチドの使用
マウスおよびヒトＰＤＡＣの検出に対する同定されたファージの有用性を以下のように実証した。蛍光色素で標識したファージ２７をプローブとして用いて、正常な膵臓、局所性ＰａｎＩＮを含む膵臓およびＰＤＡＣを有する膵臓の凍結切片との結合を試験した。野生型マウス膵臓においてまたは病変に隣接する正常な領域においては結合が全く見られなかったのに対し、ＰａｎＩＮおよびＰＤＡＣ病変においては顕著な結合が見られた。対照ファージは病変を全く検出できなかった（図２、最下列）。意義深いことに、ファージクローン２７がヒトＰＤＡＣを特異的に検出できたのに対し、対照ファージはヒトＰＤＡＣ標本を染色することができなかった（図２、右端）。これらの結果は、ファージプローブが、発達中のマウスおよびヒトＰＤＡＣと結合することを実証し、ＰＤＡＣ特異的診断の候補剤を作成するための本発明者らのマウスモデルに基づくスクリーニング法の有用性を支持するものである。
【０２２２】
実施例V
ＰＤＡＣ標的化ファージの腫瘍局在性
ファージクローン２７および１５は、インビトロにおいて最も好ましい結合特性を有したため、野生型動物、ＰａｎＩＮを有する動物および触知可能な膵臓腫瘍を有する動物におけるインビボでの結合に関して、これらのクローンをさらに試験した。蛍光標識したファージクローン２７およびファージクローン１５（単独または組み合わせたもの）１ナノモルを、上記動物に尾部から注射し、注射の４時間後に共焦点生体顕微鏡によりイメージ
ングを行った（図１０Ａ）。クローン２７は、ＰａｎＩＮおよびＰＤＡＣで強い蛍光シグナルを発して、ファージと腫瘍細胞との結合を示唆したのに対し、野生型マウスの膵臓においては、散在する弱いシグナルのみ見られた（図３Ａ、３Ｂおよび図１０Ｃ）。新生および進展したＰＤＡＣを有する動物に対照ファージを注射した場合、蛍光シグナルは実質的に存在しなかった（図１０Ｂ）。クローン１５および２７は、明確に異なる膵臓内分布をまた異なるペプチド配列を示し（図１０Ａ）、これらが固有のタンパク質を標的にすることを示唆していた。しかし、クローン１５が確かに膵臓に局在したのにもかかわらず、総シグナルはクローン２７のものよりも少なかったため、さらなる実験ではクローン２７に焦点を当てた。
【０２２３】
インビボでのファージクローン２７の結合特異性をさらに考証するために、クローン２７を注射した動物からの膵臓を固定し、ファージコートタンパク質に特異的な抗体を用いた免疫組織化学による解析を行った（図３）。ＰａｎＩＮまたはＰＤＡＣを有する領域（図３Ｂおよび３Ｃの黒枠）では、顕著なファージの取込みがあったのに対し、導管化生または正常な膵臓部位（図３Ｂおよび３Ｃの赤枠）では、ファージは検出されなかった。これらの実験は、クローン２７の癌細胞に対する特異性を支持するものであり、ファージクローン２７がＰａｎＩＮおよびＰＤＡＣに局在するのに対し、正常な膵臓組織あるいは低悪性度の新生物または膵臓損傷と関連した反応性病変である導管化生部位には存在しないことを示していた（図３）（Ｍｕｒｔａｕｇｈら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １１：２１１−２１３（２００７））。
【０２２４】
実施例VI
ペプチド２７に対する結合パートナーとしてのプレクチン−１同定
クローン２７がインビトロおよびインビボでのヒトおよびマウスＰＤＡＣに対する特異性を示したため、次の段階はその細胞結合パートナーを決定することであった。ファージをアフィニティーリガンドとして用いて、プルダウンアッセイによりマウスＰＤＡＣ細胞溶解物中に固有の５００ｋＤａバンドを同定した（図４Ａ、左パネル）。さらに、ビオチン化ファージをプローブとしたＰＤＡＣ溶解物のファーウェスタン解析では、対照ファージでは認識されなかったものと同程度の分子量のバンドが同定された（図４Ａ、右パネル）。単離したバンドの質量分光分析では、細胞骨格の、介在する、線維状の重要な架橋の要素である、プレクチン−１が明らかとなった。（図４Ｂ）（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら，（２００７）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．３１３：２１８９〜２２０３）。ファージプルダウンからの溶解物を用いたウェスタンブロットにより、プレクチン−１抗体と交差反応するバンドの存在が確認された（図４Ｃ）。プレクチン−１は、マウスおよびヒトＰＤＡＣ細胞両方の核および細胞質のみならず、細胞膜中にも存在することがわかった（図４Ｄ）。正常マウス膵管細胞が低レベルのプレクチン−１発現を示したのに対し、正常ヒト膵管細胞は、細胞質および核においてプレクチン−１発現を示したが、膜上では示さなかった（図４Ｄ）。これに対し、ＨＵＶＥＣは核において非常に低レベルのプレクチン−１発現を示した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、プレクチン−１を細胞質および核内に有するが、細胞表面には有しないことが知られている（Ｓｏｎｎｅｎｂｅｒｇら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．３１３：２１８９−２２０３（２００７））ため、これらをプレクチン−１発現の細胞内位置の対照として使用した。予期されたように、対照細胞において、プレクチン−１は線維芽細胞の膜の画分には存在しなかったが、細胞質および核の画分には存在していた（図４Ｄ）。
【０２２５】
正常マウス、ＰａｎＩＮを有するマウスおよびＰＤＡＣを有するマウスからの切片の免疫組織化学的解析は、ウエスタン解析の所見を裏付けるものであった。正常な動物が散在性のプレクチン−１染色を有したのに対し、ＰａｎＩＮおよびＰＤＡＣでは、プレクチン−１は病変部においては発現されたが、周囲の組織では発現されなかった（図４Ｅ）。プレクチン−１の染色パターンは、図３および図４Ｅで示されるＰＤＡＣ標的化ファージに
よる観察とほぼ同じであった。最後に、競合実験である、抗プレクチン−１抗体およびＦＩＴＣ標識ファージクローン２７のＰＤＡＣ細胞との共インキュベーションでは、９６．９％の結合阻害という結果が得られた（図４Ｆ）。
【０２２６】
実施例VII
プレクチン−１標的化ＰＤＡＣイメージング剤の開発
トランスレーショナルな可能性を有する非生物学的な合成イメージング剤を開発するために、本発明者らは、ＰＴＰを化学的に合成して、磁性蛍光ナノ粒子に付着させた（ＰＴＰ−ＮＰ）（図５Ａ、模式図）。
【０２２７】
得られたＭＲＩ／光学的に検出可能な薬剤を、９週齢のＫｒａｓ／ｐ５３Ｌ／ マウス
において試験した（図６Ａ）。この週齢では、これらのマウスは疾患の外的徴候を示さないが、通常、正常な膵臓、導管化生および線維症の部位のみならず、小型の病巣ＰＤＡＣも有する。標的化ナノ粒子静注投与の２４時間後、これらのマウスの腹部領域において、薬剤取り込みを示唆する分散した蛍光領域が共焦点生体顕微鏡により検出された（図５Ｂ左上および図６Ｂ左）。薬剤は腫瘍組織に特異的に存在していたが、注射の１０分前に投与された血管系薬剤は共存できなかった（図５Ｂ右上および図６Ｂ右）。インビボでの蛍光は、分散した病巣シグナルが見られる摘出膵臓の表面反射イメージングと相関していた（図５Ｃ、６Ｃおよび６Ｄ）。これに対し、対照−ＮＰは、これらの腫瘍が同様に血管新生されていたにもかかわらず（図５Ｂ、右下）、膵臓のどの部位も表示できなかった（図５Ｂ、左下）。
【０２２８】
生体内分布試験により、腫瘍内に特異的に取り込まれ、プレクチン−１発現が報告されている２つの組織である筋肉または皮膚内には取込みが極わずかであることが明らかとなった（図５Ｄ）。さらに、腫瘍の取込みは、正常な膵臓に比べ１０．１倍高かった。
【０２２９】
同様に、ＭＲＩでは、膵臓の病巣部位での薬剤の存在を示す共鳴（ＭＲ）シグナルの減少が見られた（図７Ａ）。生体内分布データから、物質注入量の３．１３％が腫瘍内に存在していた。すでに確立されている直接ＭＲＩ感度の閾値である１０ｎｇ（鉄）／ｇ（組織）（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒら，（１９９７）Ｊ，Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ７：２５８−２６３（１９９７））を用いて、得られたシグナルを検出閾値の２０倍で計算した。さらに、現在の感度は、利用可能な運動補正およびマルチエコーによる化学的シーケンスを考慮すれば、以前公開されたものよりも高いと考えられる。
【０２３０】
組織学的解析により、ＰＴＰ−ＮＰ取込みに関連したシグナル減少が、主としてＰＤＡＣ部位に存在するが、正常部位または導管化生部位には存在しないことが確認された（図７Ｂ）。切片の蛍光顕微鏡法により、ＰＴＰ−ＮＰ集積がＰＤＡＣ領域で示されたが（図７Ｃ、左）、正常な膵臓領域では示されなかった（図７Ｃ、右）。
【０２３１】
その他の実施形態
上記明細書で挙げられたすべての刊行物および特許は、その内容全体が参照により本明細書に援用される。記載されている本発明の方法およびシステムの様々な修正および変更が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者には明白であろう。本発明は、特定の好適な実施形態と関連して記載されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないということを理解するべきである。実際、医学、治療学、製薬、ＭＲＩ、インビボイメージング、分子生物学、生化学、化学および細胞生物学あるいは関連分野の当業者には明らかである、本発明を実施するための記載された様式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。本明細書に引用されるすべての参考文献は、その内容全体が本明細書に援用される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【配列表】
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