(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ステビオール配糖体高純度物を分別結晶によって精製する時に生成される副産物を出発物質として精製する段階と、
ｉｉ）前記精製された副産物を酵素転換反応し、副産物中のレバウディオサイドＡの含量を５０重量％〜６０重量％の水準に調節する段階と、
ｉｉｉ）前記ｉｉ）段階で得られた生成物を単独で、またはステビオール配糖体高純度物と混合した後に分別結晶し、レバウディオサイドＡを製造する段階と、
を含む、高収率のレバウディオサイドＡの製造方法。
【請求項２】
前記ｉ）段階の副産物は、ステビオール配糖体を８０重量％以上含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素転換反応は、前記精製された副産物をβ−１、３−グルコシルオリゴ糖化合物、当該化合物に対してβ−１、３糖の分解能力を有したβ−１、３−グルカナーゼ及びβ−１、３−グルコシル転移酵素の存在下で反応させるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酵素転換反応は、５０℃の温度で５時間行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステビオール配糖体高純度物を分別結晶によって精製する時に生成される副産物を出発物質として酵素転換反応した後、レバウディオサイドＡの製造過程中に再循環させることを特徴とする、副産物の利用方法。
【請求項６】
前記酵素転換反応は、前記精製された副産物をβ−１、３−グルコシルオリゴ糖化合物、当該化合物に対してβ−１、３糖の分解能力を有したβ−１、３−グルカナーゼ及びβ−１、３−グルコシル転移酵素の存在下で反応させるものである、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レバウディオサイドＡの生産工程で発生する副産物を再使用して高収率かつ高純度のレバウディオサイドＡを製造する方法に関する。より詳細には、レバウディオサイドＡの結晶化工程で発生する副産物を再加工して原料として再使用することにより、従来の製造方法より高収率かつ高純度のレバウディオサイドＡを提供する。さらに詳細には、レバウディオサイドＡの結晶母液中に存在するステビオール配糖体以外の物質である塩類（ｍｉｎｅｒａｌ）、灰分、その他の有機物を再精製してその純度を高めた後、β−１、３−グルコシル転移活性を有する生物または酵素転換方法を利用して主成分であるステビオサイドをレバウディオサイドＡに転換し、これを原料として再使用可能に加工する製造方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ステビア植物に含有されたステビオサイド（Ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ、ＳＴ）はステビオールをアグリコンとするジテルペン配糖体であり、ステビオサイドの他にも甘味成分としては、レバウディオサイドＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びズルコサイドＡ（Ｄｕｌｃｏｓｉｄｅ  Ａ、ＤＡ）などがある。これら甘味成分は、甘味度において差異を有し、各成分の甘味度と化学構造上の特徴との関係については未だ明瞭になっていないが、配糖体の糖結合位置や官能基（特に−ＯＨ基）の配列及びその配置上の相互距離によって、甘味度及び甘味質が大きく左右されると知られている。ステビオサイドは砂糖の約２００倍、レバウディオサイドＡ（β−１、３−ｍｏｎｏｇｌｕｃｏｓｙｌ  ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）は約２５０倍の甘味度を有する天然高甘味料である。ステビオサイドは後味がすこし苦いが、レバウディオサイドＡは苦味が殆どなく、優れた甘味成分を有する。このように甘味度と甘味成分に優れたレバウディオサイドＡは、現在、既存の合成高甘味料を代替することができる天然高甘味料として高い関心を集めている。特に、２００８年からアメリカＦＤＡでは、レバウディオサイドＡの含量が９５％以上であるステビオサイドに対してのみ高甘味料としての食品添加物の承認を出している。その後、アメリカの大型食品企業らはレバウディオサイドＡを積極的に使用しており、ＰｕｒｅＶｉａとＴＲＵＶＩＡという名前ですでに販売されている。このうち先頭に立っているＴＲＵＶＩＡは、カーギル（Ｃａｒｇｉｌｌ）とコカコーラ（Ｃｏｃａ−Ｃｏｌａ）の製品で、ステビア市場の５８％を占めている。しかし、ＴＲＵＶＩＡが全体の人工砂糖市場で占めている比率はまだ６％に過ぎない。その理由は、ＴＲＵＶＩＡの製造にはコストが高くかかり、非常に独特の香を有しているためである。従って、多くの食品企業らは、このような問題を解決するために努力している。
【０００３】
既存のレバウディオサイドＡの生産工程は大きく二つの段階に分けられる。第１段階は、高い含量のステビオール配糖体の精製物を得る段階で、第１段階で精製されたステビオール配糖体は通常的に東南アジア市場で高甘味料として用いられている。このような第１段階の工程は、ステビア乾葉を熱水、エタノール、メタノールまたはポリアルコール類を利用して抽出した後、抽出液中に存在する色素などを脱色し、脱塩、マイクロ濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、吸着樹脂を利用したステビオール配糖体の高純度精製、噴霧乾燥などの工程を順に経て、製品を生産している（図１参照）。
【０００４】
しかし、この段階で生産される製品は、ステビア乾葉原料中に存在する総ステビオール配糖体の成分含量比を殆どそのまま維持しているため、実質的に最終製品中のレバウディオサイドＡの含量は低くは２０％、高くは６０％水準に生産されており、このような製品中の含量比の差は、原料として栽培されるステビアの種子、耕作形態によって依存的に変化する特徴を有している。通常、このように生産されたステビオール配糖体の高純度精製品は、その自体が高甘味料として用いられたり、これを糖化酵素反応によって純化させた酵素処理製品に加工されて用いられている状況である。
【０００５】
第２段階の生産工程は、レバウディオサイドＡの純度を高める選択的分離精製段階で、通常、アメリカ、ヨーロッパなど、高純度品のみが食品添加物として使用許可されている国での販売を目的として限定的に生産、販売されている。このような第２段階工程は、前記第１段階の生産工程によって生産（もしくは販売）されたステビオール配糖体高純度物を原料とし、これを選択的分別結晶の原理を利用した工程によって製品を生産する。一般的に用いられている工程の一方法は、レバウディオサイドＡ５０〜６０％の原料にアルコール類（ＥｔＯＨ）を一部混合した液条件で結晶化を通じてレバウディオサイドＡ８０〜８５％の結晶化一次調剤物を回収した後、これをより高いアルコール（ＥｔＯＨ）含量の溶媒に再溶解させた後、これを再結晶化する方法を用いて、最終的に高純度の製品であるレバウディオサイドＡ９５％以上の純品を製造する（図１参照）。
【０００６】
しかし、分別結晶法はその技術の特性上、類似する物性の物質から高純度の単一素材を精製する方法として長所を有しているが、一回の結晶回収によって得られる目的物の収率が低いという物理的限界性を有している。特に、レバウディオサイドＡの高純度製品の場合は、二回の結晶法のみを主要工程として用いる典型的な工程の特性上、通常的な収率がレバウディオサイドＡを基準として５０％水準を越えることが困難であるという特性を有する。
【０００７】
結局、前記方法によって高純度のレバウディオサイドＡ製品を生産する過程では、当該製品より多い量の副産物が余剰に得られる。この副産物は、低価の酵素処理製品の１次原料として低い商品価値で販売されている状況であり、このような余剰副産物がステビア乾葉から出発するレバウディオサイドＡの全体生産工程段階において収益性を制限する主要原因となっている。
【０００８】
このような現在の問題点を解決するために、高含量のレバウディオサイドＡの植物品種を育種して、大量のレバウディオサイドＡを生産しようと試されており、現在報告されているところによると、韓国特許出願第１０−２００８−００５８２３６号（発明の名称：高含量レバウディオサイドＡを含む新品種ステビア植物及びその育種方法）、海外特許ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３０３９９２、ＵＳ００ＰＰ１０５６２Ｐ（発明の名称：Ｓｔｅｖｉａ  ｐｌａｎｔ  ｎａｍｅｄ  「ＲＳＩＴ９４−１３０６」、ＵＳ００ＰＰ１０５６３Ｐ（発明の名称：Ｓｔｅｖｉａ  ｐｌａｎｔ  ｎａｍｅｄ  「ＲＳＩＴ９５−１６６−１３」、ＵＳ００ＰＰ１０５６４Ｐ（発明の名称：Ｓｔｅｖｉａ  ｐｌａｎｔ  ｎａｍｅｄ  「ＲＳＩＴ９７−７５１」）などの多様な先行事例を介して部分的に効果的な種子についての報告が確認されている。
【０００９】
しかし、ステビア植物は、播種から収穫まで５〜６ヶ月程度の多くの時間が必要であり、広い面積を要する。特に、毎年の気象条件によって収穫に差があり、栽培地の人件費などによって生産単価が決められるなど、生産が一定ではなく、品質にも差が多いという欠点を有しているため、植物育種によって高含量のレバウディオサイドＡを生産することは、生産コスト、生産量、品質などの側面において限界がある。
【００１０】
一方、一連の研究者、特に日本を中心とした研究者らは、ステビオール配糖体中のレバウディオサイドＡの含量を高めるために、酵素転換技術についての多数の研究を行った経験がある。
【００１１】
このような研究者らの研究目的は、ステビオール配糖体中で甘味質及び甘味度の特性に優れたレバウディオサイドＡの含量を人為的に高めることにより、製品の付加価置を高めることにある。より最近の研究者らは、ステビオサイドを主に含む１次原料を酵素転換技術によって加工してレバウディオサイドＡの収率を向上させ、窮極的には製造原価を低減させることを目的とした一部研究開発を行っており、特に、Ｄａｉｎｐｐｏｎ  Ｉｎｋ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃは、このような研究開発の内容に対してアメリカ特許登録（第４５９０１６０号）を受けた。前記アメリカ特許は、β−１、３−グルコシル転移活性を有する微生物または酵素の存在下で水性溶液中または水性懸濁液中のβ−１、３−グルコシル糖化合物をステビオサイドと反応させることによりレバウディオサイドＡを製造する方法を開示している。
【００１２】
しかし、前記方法も純度の側面において満足できるような水準ではない。従って、高純度のレバウディオサイドＡの製造方法を開発することが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、高純度かつ高収率のレバウディオサイドＡを製造する方法を提供することにあり、特に、従来のレバウディオサイドＡの生産工程で得られる余剰副産物、特に分別工程中に母液として得られる余剰副産物を出発物質とし、これを一連の加工工程によって第２段階生産工程（高純度のレバウディオサイドＡの製造工程）の原料として使用できる水準に品質を変化させた後、これを再循環させる製造工程の発明である。特に、余剰副産物中の副産物を一連の精製工程によって加工し、酵素転換法を利用して結晶化工程で再使用できる水準まで経済的にレバウディオサイドＡの含量を高めるなどの技術により、発明を完成しようとする。
【００１４】
従来の発明は、単純にステビア原料中のレバウディオサイドＡの含量を高める目的、またはステビオサイド製品中のレバウディオサイドＡの含量を単純上昇させる目的で開発及び応用されたことに対し、本発明は、結晶母液副産物を再使用可能な品質に加工し、その製造工程の収率を高めようとする再循環工程の開発及び高純度製品の提供を目的とすることに技術的特徴がある。本発明によると、ステビオサイド製品中のＲＡ含量を増加させることより、ステビオサイド製品を１次分別結晶させ、その副産物を再利用してＲＡ含量を増加させることが、その収率及び純度面においてより効果的であるということが明らかになった。
【００１５】
より詳細には、本発明の構成は、結晶後の母液の原料を精製して物質中のステビオール配糖体の含量を９０％以上で得る段階と、このように前処理された物質中にもっとも多く存在するステビオサイドにカードラン（ｃｕｒｄｌａｎ）のような不溶性β−１、３グルカン（ｇｌｕｃａｎ）を含ませてβ−１、３結合を切って単糖化させるβ−１、３−グルカナーゼ（ｇｌｕｃａｎａｓｅ）酵素を利用してグルコースを製造し、このグルコースを特異的な糖転移酵素を利用して連結させてレバウディオサイドＡを製造し、このように得られたレバウディオサイドＡ含量が５０％以上になるように調整する段階と、このように加工された製造物の全量、あるいは既存原料と混合した物質から、高含量レバウディオサイドＡを製造する工程を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
そこで、本発明者らは、抽出されたレバウディオサイドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ、ＲＡ）を精製、結晶後に余剰に得られる副産物に含有されたステビオサイドを受容体として糖を転移させ、レバウディオサイドＡを生成させるにもっとも適した酵素であるβ−１、３−グルコシル転移酵素とβ−１、３−グルコシルオリゴ糖化合物中のβ−１、３糖分解能力を有したβ−１、３−グルカナーゼを適用して、実質的に高純度のレバウディオサイドＡを製造することにより、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１７】
本発明による製造方法は、抽出されたレバウディオサイドＡ（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ  Ａ、ＲＡ）を精製、結晶後に生成される副産物、即ち、余剰に得られる副産物を原料として再使用することにより、全体の製造工程の収率を向上させ、これにより、価格競争力を有する製品を提供することができる利点がある。また、本発明は分別工程中に母液として得られる余剰副産物を出発物質とし、これを一連の加工工程によって第２段階生産工程（高純度のレバウディオサイドＡの製造工程）の原料として使用できる水準に品質を変化させる、副産物を高付加価値の品質の商品に改質させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施例によるレバウディオサイドＡの製造工程の流れを図示する図面である。
【図２】従来のＲＡ６０製品のＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ）成分分析データである。
【図３】本発明による製造方法で原料として用いられる副産物サンプルの製品のＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ）成分分析データである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明による高収率かつ高純度のレバウディオサイドＡの製造方法は、ｉ）ステビオール配糖体高純度物を分別結晶によって精製する時に生成される副産物を精製する段階と、ｉｉ）前記精製された副産物を酵素転換反応し、副産物中のレバウディオサイドＡの含量を５０重量％あるいは６０重量％の水準に調節する段階と、ｉｉｉ）前記ｉｉ）段階で得られた生成物を単独またはステビオール配糖体高純度物と混合した後、分別結晶してレバウディオサイドＡを製造する段階と、を含む。
【００２０】
前記ｉ）段階の副産物は、ステビオール配糖体を８０重量％以上、好ましくは９０重量％以上含むことを特徴とする。前記ｉ）段階の副産物は、ステビオサイドを４０〜５０重量％で含む。
【００２１】
本発明において、酵素転換反応は、前記精製された副産物をβ−１、３−グルコシルオリゴ糖化合物、当該化合物に対してβ−１、３糖の分解能力を有したβ−１、３−グルカナーゼ及びβ−１、３−グルコシル転移酵素の存在下で、５０℃の温度で約５時間反応させることを特徴とする。
【００２２】
本発明において、β−１、３−グルコシルオリゴ糖化合物は、カードラン（ｃｕｒｄｌａｎ）、ラミナリン（ｌａｍｉｎａｒｉｎ）などのように当業者に公知された微生物から誘導された化合物である。
【００２３】
本方法で、前記副産物の精製はこれに制限されるものではないが、脱塩、マイクロ濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、吸着樹脂を利用した精製などを利用する。
【００２４】
本方法で、β−１、３−グルコシル転移酵素は、β−１、３−グルコシル転移活性を有した生物を利用したり、当該酵素自体を利用することができ、ここで、β−１、３−グルコシル転移活性を有した生物または酵素はアメリカ特許第４、５９０、１６０号に記載されたものを用いることができる。
【００２５】
また、本発明は、ステビオール配糖体高純度物を分別結晶によって精製する時に生成される副産物を酵素転換反応した後、レバウディオサイドＡの製造過程で再循環させることを特徴とする、副産物の利用方法に関する。
【００２６】
本発明で用いられた用語「ステビオール配糖体高純度物」とは、ステビア乾葉を熱水、エタノール、メタノールまたはポリアルコール類などを利用して抽出した後、抽出液を精製して得られた、ステビオール配糖体を少なくとも７０重量％含んでいる製品を意味する。
【００２７】
本発明で用いられた用語「ＲＡ  ６０」または「ＲＡ  ９７」は、夫々、レバウディオサイドＡを総質量中に６０重量％または９７重量％含む製品を意味する。
【００２８】
本発明で特に言及されない限り、「％」は重量百分率を意味する。
【００２９】
本発明は、下記の実施例によってさらに明確に理解されることができるが、これは例示として提供されるものに過ぎず、本発明の範囲をこれに限定しようとするものではない。
【００３０】
＜実施例＞
実施例１：既存のＲＡ６０製品と従来のレバウディオサイドＡの生産工程で余剰に得られる副産物、特に分別工程中に母液として得られる余剰副産物中のステビオール配糖体物質の含量及びＡｓｈ（灰分）含量の分析
【００３１】
ステビオール配糖体物質の含量を分析するために、ＨＰＬＣ分析を行った。このために、１０００ｍｌのメスシリンダに夫々のサンプル１ｇと蒸溜水１０００ｍｌを入れて掻き混ぜた後、０．４５μmの水溶液フィルタを利用して濾過した。ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｓｅｒｉｅｓ）装置を利用して２０μlの試料を注入し、分析条件は流速が０．５ｍｌ／ｍｉｎ、波長が２１０ｎｍになるようにした。図２、図３に示すように、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、及びレバウディオサイドＣの含量を測定した。
【００３２】
分析結果、既存のＲＡ６０製品中にはステビオサイド２３．３％、レバウディオサイドＡ６１．４％、及びレバウディオサイドＣ１２．７％が存在し、副産物中にはステビオサイド４２．６％、レバウディオサイドＡ２５％、及びレバウディオサイドＣ２６．９％が存在した。
【００３３】
【表１】
0005411890.tif 000002
【００３４】
既存ＲＡ６０製品と副産物中に存在するＡｓｈ（灰分）含量を分析した。分析結果、夫々の製品中にＡｓｈが７％、１５％存在した。
【００３５】
実施例２：副産物の精製加工工程
既存のＲＡ６０製品を製造して得られた余剰副産物、即ち、結晶母液副産物を再使用可能な品質に加工するために、脱色、精製工程を経た副産物中のステビオール配糖体の含量パターンを実施例１と同一の方法で分析し、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、及びレバウディオサイドＣの含量を測定した。
【００３６】
副産物の精製加工工程の後、夫々の工程で存在するＡｓｈ（灰分）含量を分析した。
【００３７】
実施例３：酵素転換工程
実施例２と同様に、結晶母液副産物を再使用可能な品質に加工し、副産物中のステビオサイドを受容体としてβ−１、３−グルコシル転移酵素とβ−１、３−グルコシルオリゴ糖化合物中のβ−１、３糖分解能力を有したβ−１、３−グルカナーゼを用いて、５０℃の温度で５時間反応してレバウディオサイドＡを生成した。
【００３８】
新たに生成されたステビオール配糖体の含量パターンを実施例１と同一の方法で分析し、ステビオサイド、レバウディオサイドＡ、及びレバウディオサイドＣの含量を測定した。
【図１】
0005411890.tif 000003
【図２】
0005411890.tif 000004
【図３】
0005411890.tif 000005