(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レシチン、コレステロールを含むソルビタンモノオレエートから調製したソルビタンモノオレエートベシクルで、その表面に癌細胞の標的・攻撃物質を固定化しておらず、
Ａ．そのソルビタンモノオレエートベシクルが、癌細胞に対してのみ特異的に膜融合し、
Ｂ．さらには癌細胞にのみアポトーシス誘導機能を発現する、
上記Ａ及びＢの性質を持つソルビタンモノオレエートベシクルを有する抗癌剤。
【請求項２】
請求項１に記したＡ及びＢの性質を持つソルビタンモノオレエートベシクル中に内包させた生理活性物質を、目的癌細胞への導入に用いるためのソルビタンモノオレエートベシクルを有するベクター。
【請求項３】
請求項２のソルビタンモノオレエートベシクル膜中に、カチオニックペプチド脂質（ＣＰＬ）を所定の濃度で混入させて、請求項２の性質Ｂのアポトーシス誘導機能の強さを制御できるＣＰＬをベシクル膜中に含有するソルビタンモノオレエートベシクルを調製し、そのべシクルに内包させた生理活性物質を目的癌細胞へ導入するために用いるＣＰＬの膜含有ソルビタンモノオレエートベシクルを有するベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、腫瘍細胞内への薬物導入用ベクターに関する。すなわち、癌細胞のみに融合して癌細胞を殺傷する機能を有する界面活性剤ベシクル、およびそのベシクルをベクターとして用いる癌治療方法に関する
【背景技術】
【０００２】薬物送達システム（ＤＤＳ）の癌治療において、癌細胞などを特異的に殺傷させる目的で、抗癌剤などの薬物をマイクロカプセル（ベシクル）に内包させ、その薬物を目的細胞部位にのみ送達させて癌細胞を特異的に殺傷させる方法がある。特にリン脂質を基本とする脂質二重層からなる閉鎖型小胞体のリポソームがそのベシクルの代表格として用いられてきた。しかし、従来のベシクルでは目的細胞に対する標的・攻撃機能が無いために、癌細胞を攻撃、殺傷するためにはベシクル表面上に目的細胞へ特異的に結合する物質を固定化し、さらには目的細胞を殺傷させるための抗癌剤などをベシクルに内包させることが必要とされてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許公開２００３−００１０９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】従来、癌治療などのＤＤＳキャリアとして多く用いられるリポソームなどでは、リポソーム表面上に目的癌細胞に対する標的物質を固定化し、さらにそのリポソーム内に抗癌剤などの薬物を内包させることにより、はじめて癌細胞特異標的機能や、癌細胞殺傷機能を付与することができる。このようにリポソームそれ自身では、癌細胞特異標的機能や癌細胞殺傷機能は有しておらず、目的細胞へのリポソーム内包物の導入効率にも問題がある。そこで、簡便な調製法によるベシクルを用いて、副作用を軽減し、ベシクル内包物を癌細胞との融合により効率よく癌細胞に導入する、ＤＤＳ癌治療法の開発が望まれる。また癌細胞にベシクルに内包した生理活性物質を、癌細胞との融合により効率良く導入できるベクターの開発も望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】本発明は、レシチンやコレステロールを含むソルビタンモノオレエートより調製した、相転移温度が非常に低く（−４０℃近傍）、かつ膜流動性の高いソルビタンモノオレエートベシクル（以下の文中では図を含めて全て、ソルビタンモノオレエートベシクルを「Ｓｐａｎ８０ベシクル」と略記した）が、癌細胞に対して強い膜融合機能、癌細胞殺傷機能を有することを示し、さらにそれらの機能を癌治療の抗癌剤あるいは癌細胞へのベクターとして利用することにある。
【発明の効果】
【０００６】この非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクルを人体に投与すると、このベシクルは癌細胞にのみ特異的に結合して正常細胞には結合しにくい。したがって、抗癌剤を使用することなく、その癌細胞のみを殺傷することができ、抗癌剤を使用しなくてもそのベシクル自身でも癌治療ができる。これまでのマウス実験でも、そのＳｐａｎ８０ベシクルの体内毒性は無く、さらにこのベシクルの構成成分であるソルビタンモノオレエートは、既に薬物安定化剤としての投与例もあり安全であり、今後のヒト癌治療への使用が期待出来る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】癌細胞、正常細胞に対して、リポソームおよびＳｐａｎ８０ベシクルをそれぞれ添加した時のそれらの細胞生存率を示す。
【図２】フローサイトメトリーの二重染色法により測定したドットプロットからＣｏｌｏｎ２６細胞のアポトーシス誘導が明らかになった。
【図３】蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用した膜融合を評価する原理図
【図４】癌細胞、正常細胞に対して、リポソームおよびＳｐａｎ８０ベシクルをそれぞれ添加した時のそれらの膜融合の変化を、蛍光共鳴エネルギー移動法により測定した結果：図４−１はＳｐａｎ８０ベシクル、図４−２はＰＯＰＣリポソームの場合を示す。
【図５】Ｓｐａｎ８０ベシクルとＣｏｌｏｎ２６の融合を示す、明視野の位相差顕微鏡写真（ａ）、および位相差蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す。
【表１】
細胞生存率を測定する時に、細胞に加えるサンプル（ベシクルあるいはリポソーム懸濁液）の組成を示す。
【符号の説明】
【０００８】１．使用した癌細胞
ＯＳＴ：ヒト骨肉腫細胞
Ｈｅｌａ：ヒト子宮頸癌細胞
Ｃｏｌｏ２０１：ヒト大腸癌細胞
Ｃｏｌｏｎ２６：マウス結腸腺癌細胞
２．使用した正常細胞
Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ：ヒト正常繊維芽細胞（皮膚由来）
ＥＣＶ３０４：ヒト正常血管内皮細胞
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１：マウス由来の骨芽細胞
３．使用したベシクル：非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクル
４．使用したリポソーム：ＰＯＰＣリポソーム
ＰＯＰＣ（１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，Ｍｗ＝７６０．１，２０ｍｇ／ｍｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）
５．１ｘＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ  ＤＷ  Ｂｕｆｆｅｒ：市販のものは、１０ｘＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ  ＤＷ  Ｂｕｆｆｅｒであり、１ｘＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ  ＤＷ  Ｂｕｆｆｅｒは、市販の１０分の１濃度の意味である。
６．ＮＢＤ−ＰＥ
Ｎ−（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｙｌ）−１，２−ｄｅｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ．ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ
７．Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ
Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  １，２−ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ｔｒｉｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ
【発明を実施するための形態】
【０００９】まず、０．２ｍｏｌ％のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ、及び０．２ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥの二種の蛍光物質を内包させた、非イオン性界面活性剤Ｓｐａｎ８０ベシクル、およびＰＯＰＣリポソーム（ＰＯＰＣ：１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ，Ｍｗ＝７６０．１，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）をそれぞれ調製する。一方数種の癌細胞、正常細胞を培養する。これらの癌細胞、および正常細胞に、上記のベシクルおよびリポソームを所定量混合する。この時、▲１▼それらのベシクルやリポソームが細胞と融合した時にのみ、蛍光が低下するという現象を利用して細胞との融合状態を観察する。▲２▼さらに、蛍光物質Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭを内包させたソルビタンモノオレエートからなるベシクル、およびＣａｌｃｅｉｎＡＭ内包のＰＯＰＣリポソームを調製する。それらのベシクルやリポソームが生細胞と融合すると、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭが細胞内に導入され、エステラーゼにより加水分解されてＣａｌｃｅｉｎに変換され蛍光を発するようになる。この方法により、細胞との融合を位相差蛍光顕微鏡でも観察した。こうして、上記の▲１▼、▲２▼の方法で、Ｓｐａｎ８０ベシクルのみが、癌細胞に特異的に融合することを確認した。つぎに、上記のベシクルとリポソームの濃度をそれぞれ変化させ、数種の癌細胞、正常細胞に添加して、それらの細胞の生存率に及ぼす影響を調べた。その結果、Ｓｐａｎ８０ベシクルが、癌細胞のみを殺傷する機能を有していることを発見した。さらに、二種の蛍光物質ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＰＥと７ＡＡＤによるフローサイトメーターを使用した二重染色法により、前述のＳｐａｎ８０ベシクルの癌細胞特異的殺傷機能がアポトーシスによるものであることを明らかにした。
【実施例】
【実施例１】
【００１０】Ｓｐａｎ８０ベシクルの調製は次ぎのように行った。本研究ではベシクルの調製はマイクロホモジナイザーの撹拌による二段階乳化法によって行った。ソルビタンモノオレエート１３２ｍｇ、レシチン（市販の大豆レシチンを精製）１２ｍｇ、コレステロール６ｍｇを３ｍｌのヘキサンに溶解する。そのヘキサン中に、水溶液３００μｌ（ＰＢＳやＥＳＡ溶液など）を添加しながら、マイクロホモジナイザーを用いて１５０００ｒｐｍで３分間撹拌する（一次乳化）。その一次乳化液をエバポレーションしてヘキサンを除去して、クリーム状のエマルションにする。このエマルションに、親水性の界面活性剤のＴｗｅｅｎ８０４８ｍｇを溶解させたＰＢＳ溶液３ｍｌ添加して３０００ｒｐｍで１分間撹拌する（二次乳化）。その二次乳化したベシクル溶液を、超遠心器にかけ遠心管上部に集まった油玉を除去した後、そのベシクル溶液を透析チューブで透析した。
【実施例２】
【００１１】以下のような方法で、蛍光物質であるＮＢＤ−ＰＥとＲｈｏ−ＰＥをそれぞれ０．２ｍｏｌ％含むＰＯＰＣリポソームを凍結融解法により調製した。
▲１▼ナスフラスコにクロロホルムに溶解したＰＯＰＣを３ｍｌ、クロロホルムに溶解したＮＢＤ−ＰＥを６０μｌ、そしてクロロホルムに溶解したＲｈｏ−ＰＥを１２０μｌ加えた（ＮＢＤ−ＰＥとＲｈｏ−ＰＥそれぞれのリポソーム膜組成が０．２ｍｏｌ％となるように調整）。▲２▼この溶液をロータリーエバポレーターに移し、相転移温度以上の湯浴中（２８℃）で回転させながらロータリーエバポレーターで４００ｍｂａｒ、３００ｍｂａｒ、２００ｍｂａｒ、１５０ｍｂａｒ、１００ｍｂａｒ、５０ｍｂａｒ、５０ｍｂａｒ以下となるように減圧してナスフラスコ内のクロロホルムを除去し、底に脂質薄膜を作成した。１５０ｍｂａｒ以下の減圧操作は特にゆっくり行う。▲３▼ナスフラスコ内の圧力が５０ｍｂａｒ以下になったらロータリーエバポレーターからはずして、直ちにナスフラスコを真空乾燥機に接続し、真空ポンプで二晩真空状態を保ち、脂質薄膜に残存するクロロホルムを完全に除去する。▲４▼最終調製時にベシクルの外水相を構成するＰＢＳ３ｍｌを、そのナスフラスコに加えた後、そのナスフラスコ溶液をホモミキサー処理（約３５００ｒｐｍ）して、フラスコ内の薄膜がすべて剥離して、水相中に分散するようにする。▲５▼これをボルテックスして、そのベシクル懸濁液を含むナスフラスコを液体窒素につけて凍結させた後、再び容器ごと水（室温の水道水）につけて懸濁液を溶かした。この凍結融解操作（凍結３分、融解７分）を５回繰り返した。こうして、上記の蛍光物質含有のリポソームを調製した。
【実施例３】用いた癌細胞としてはマウス結腸腺癌細胞Ｃｏｌｏｎ２６、ヒト大腸癌細胞Ｃｏｌｏ２０１、ヒト子宮頸癌細胞Ｈｅｌａを使用した。また、正常細胞としてはヒト正常繊維芽細胞（皮膚由来）Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ヒト不死化正常血管内皮細胞ＥＣＶ３０４のそれぞれ２種類を用いた。
【実施例４】▲１▼癌細胞（ＯＳＴ・Ｃｏｌｏ２０１・Ｈｅｌａ）・正常細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ・ＥＣＶ３０４）の入ったシャーレを必要量準備する。▲２▼シャーレの上清を取り除き、トリプシンでピペッティングにより回収する。▲３▼遠心分離にかけ、▲４▼上清をアスピレ−ターで吸引し、▲５▼ＤＭＥＭ培地で懸濁して、血球計算板で細胞数を数える。▲６▼各ｗｅｌｌに細胞数が２×１０５（ｃｅｌｌｓ／／ｍｌ）になるように細胞密度を調整し、１２穴シャーレに細胞を撤く。▲７▼シャーレに細胞を接着させるためにインキュベーターに入れて１６時間培養する。▲８▼培地をアスピレーターで取り除き（接着していない細胞を除き、接着している細胞のみで測定を行う）、それに種々の濃度のサンプル（Ｓｐａｎ８０ベシクルやリポソーム懸濁液）を表１に示したような割合で添加する。（ＣｏｎｔｒｏｌではＰＢＳを添加した）▲９▼４８時間後、ベシクルおよびリポソーム（濁度０．２９５）をそれぞれ添加した各濃度（ベシクルおよびリポソームの）の細胞数を血球計算板で数える。この際に４％トリパンブルー／ＰＢＳで１５分間インキュベートして死細胞を染色し、総細胞数と死細胞数を数える。
細胞生存率（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＝（総細胞数−死細胞数）／総細胞数となる。【００１２】図１に示すように、種々の癌細胞と正常細胞に対して、それぞれリポソームとＳｐａｎ８０ベシクルを添加して、その生存率を調べた。その結果、Ｓｐａｎ８０ベシクルの添加量に相関して、癌細胞が死滅していくことが明らかになった。一方正常細胞に対してはそのような死滅現象はほとんど見られなかった。またＰＯＰＣリポソーム添加の場合についても、癌細胞、正常細胞ともにそのような死滅現象は見られなかった。結局Ｓｐａｎ８０ベシクルのみが、癌細胞に対して殺傷機能を有していると言える。
【実施例５】二重染色法のフローサイトメトリーは次ぎのように行った。
例えば、▲１▼Ｃｏｌｏｎ２６細胞の入ったシャーレを必要量準備（培養）した。▲２▼シャーレの上清（培地、血清）を取り除き、０．０２％ＥＤＴＡ−ＰＢＳでピペッティングにより細胞を回収した。▲３▼遠心分離にかけ、上清をアスピレーターで吸引し、ＤＭＥＭ培地で懸濁して血球計算板で細胞数を数え、細胞数が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように細胞濃度を調整し、１２ｗｌｌ  ｐｌａｔｅに細胞をプレーティングした。▲４▼細胞を接着させるために２０時間インキュベートした。▲５▼その後、接着していない細胞を除き、接着している細胞のみで測定をするため、培地を交換した。この時使用したものは５％ＦＢＳ−ＤＭＥＭである。▲６▼Ｓｐａｎ８０ベシクル懸濁液（濁度０．２４６）を１００μｌ加えて１２、２４、４８時間それぞれ培養した。▲７▼各時間経過後、細胞を０．０２％  ＥＤＴＡ−ＰＢＳで回収、遠心（１０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ）し、１×Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ溶液１００ｍｌに懸濁させた。▲８▼ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＰＥと７ＡＡＤを５μｌずつ▲７▼に添加し、１５分放置した。▲９▼放置後、更に１×Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを４００μｌ加えた。▲１０▼Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  （ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を用いて測定し、ＷｉｎＭＤＩ（ｆｒｅｅ  ｓｏｆｔ）を用いてアポトーシスの程度を解析した。その結果、図２に示すようなドットプロットが得られ、Ｓｐａｎ８０ベシクルの添加によりＣｏｌｏｎ２６細胞にアポトーシスが発現し、それによってＣｏｌｏｎ２６細胞が殺傷されたことが解る。このような現象はＯＳＴ、ＥＲＭ５−１、Ｈｅｌａ細胞など多くの癌細胞で見られた。【００１３】また、カチオニックペプチド脂質（ＣＰＬ）をＳｐａｎ８０ベシクル膜に添加するに連れて、この癌細胞へのアポトーシス誘導機能は減少し、ＣＰＬにアポトーシス抑制機能があることが判明した。
【実施例６】ベシクルあるいはリポソームと生細胞間の膜融合に関しては、以下のような原理の下に行った。ベシクルが融合する際には、まずベシクルの膜を構成する脂質分子と細胞膜の混合が起こり（ｈｅｍｉｆｕｓｉｏｎ）、その後両者の内水相の混合が起こると完全な融合となる（ｆｕｓｉｏｎ）。そこで、ベシクルの融合を評価する方法として膜構成脂質の混合、および内水相の混合の二つの観点から評価する必要がある。本実験では膜構成脂質の混合を測定した。膜構成脂質の混合の評価方法としてよく用いられるのが、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；ＦＲＥＴ）を利用した方法である。ＦＲＥＴは色素二分子の電子励起状態間の相互作用によって生じ、その効率は両分子間距離の６乗に反比例する。ＦＲＥＴが起きるには、供与体分子と受容体分子が近接していること（１０〜１００Å以内）、受容体分子の吸収スペクトルと供与体分子の蛍光スペクトルが重なっていることが要求され、蛍光物質Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＮＢＤを用いたＦＲＥＴによる分析法が用いられている。本実験ではベシクル膜及びリポソーム膜に、０．２ｍｏｌ％のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ、及び０．２ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥを含有させた。
膜構成脂質の混合の程度は、蛍光性脂質Ｒｈｏ−ＰＥ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥの略称）、ＮＢＤ−ＰＥによる蛍光共鳴エネルギー移動を利用して評価した。ベシクルと細胞及びリポソームと細胞の混合では、蛍光物質内包ベシクルあるいは蛍光物質内包リポソームと、所定の細胞懸濁液を、それぞれ等量ずつ加えた。波長４７２ｎｍにより励起した時の５２４、５７２ｎｍの蛍光強度ＦＮＢＤ、ＦＲｈｏを測定し、エネルギー移動効率をＥＴを下記の式で算出した。
ＥＴ＝ＦＲｈｏ／ＦＮＢＤ【００１４】ここでＥＴ（Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）とはＦＲｈｏ／ＦＮＢＤのことであり、ＦＮＢＤは励起波長：蛍光波長が（４７２：５２４）ｎｍ、ＦＲｈｏは励起波長：蛍光波長が（４７２：５７２）ｎｍの時の蛍光強度である。ＥＴ（ｔ）とはＲｈｏ−ＰＥとＮＢＤ−ＰＥを各０．２ｍｏｌ％含むベシクルと細胞を混合後、０，３０，６０，１２０，１８０分の時間経過のＥＴである。図３に上記の原理を模式化して説明する。０．２ｍｏｌ％の蛍光物質を内包したベシクルあるいはリポソームと、細胞懸濁液を等量ずつ混合し融合させる。融合初期ではベシクル上及びリポソーム上の試薬同士の距離が近いため、エネルギー移動がよく起こり、ＮＢＤの値は小さく、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの値は大きくなる。また融合が進み粒径が大きくなることで、試薬同士の距離が離れ、エネルギー移動が生じにくくなり、結果としてＮＢＤの値は大きく、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅの値は小さくなる。この変化を融合の進行として測定した。図４に示すように、Ｓｐａｎ８０ベシクルを添加した場合にのみ（図４−１（ａ））、蛍光強度が低下している。このことから、Ｓｐａｎ８０ベシクルは癌細胞にのみ融合することが明らかになった。
【実施例７】蛍光試薬内包ベシクル膜およびリポソーム膜内では、蛍光試薬の量がそれぞれ０．２ｍｏｌ％のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−ＰＥ、及び０．２ｍｏｌ％のＮＢＤ−ＰＥになるように含有させた。調製の際には逐次アルミホイルをかぶせて蛍光試薬が消光するのを防ぎ、調製後はアルミホイルを巻いた試験管に入れて保存した。
【実施例８】細胞調製・サンプル調製法：滅菌ＰＢＳ中に細胞が１０７ｃｅｌｌｓになるように調整し、細胞懸濁液を作成した。用いた細胞は、癌細胞では、マウス結腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６、ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０１、ヒト子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａ、正常細胞ではマウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、ヒト線維芽細胞（皮膚由来）、ヒト血管内皮細胞ＥＣＶ３０４のそれぞれ３種類である。▲１▼１．５ｍｌエッペンドルフチューブに１５０μｌの細胞懸濁液を加え、▲２▼さらに前述のように調製した蛍光試薬含有ベシクルあるいは蛍光試薬含有リポソームをそれぞれ１５０μｌずつ加え、懸濁してサンプル調製した。▲３▼サンプルは３７℃下でインキュベートし、基本的に０，３０，６０，１２０，１８０分で蛍光分光光度計を用いて測定した。
【実施例９】Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭは、元々親水性のＣａｌｃｅｉｎの４つのＣＯＯＨ基をＡＭエステル基で修飾することで、疎水性の高い、脂溶性非荷電分子にしたものである。脂溶性非荷電物質のＣａｌｃｅｉｎＡＭは、生細胞の細胞膜の選択的透過性によって取り込まれ、細胞内のエステラーゼによって加水分解されて、ＡＭエステル基がカルボキシル基になって、親水性のＣａｌｃｅｉｎに戻る機構に基づき蛍光を発し、細胞外に漏出することなく、生細胞を染色する事ができる。また、ＣａｌｃｅｉｎＡＭを無水ＤＭＳＯで溶解し、１×Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ  ＤＷ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解する事で、２μＭ  ＣａｌｃｅｉｎＡＭ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製した。この溶液は大過剰の蒸留水にＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭが溶解しているので、親水性に限りなく近く、これによりＳｐａｎ８０ベシクルに内包することができた。【００１５】ＣａｌｃｅｉｎＡＭ内包ベシクルの調製は以下のようにした。▲１▼一次乳化：Ｗ（ｗａｔｅｒ）／Ｏ（ｏｉｌ）型エマルションの調製：ベシクルの主成分となる６６ｍｇのソルビタンモノオレエートにｎ−ヘキサン３ｍｌを加え、ホモミキサー（１５０００ｒｐｍ）で３０秒間撹拌した。その後、ＣａｌｃｅｉｎＡＭ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴＲＥＶＩＧＥＮ，Ｉｎｃ．コードＮｏ．４８９２−０１０−Ｋ）を用いて調製した３３．３ＭのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ水溶液０．１５ｍｌを滴下しながら、３分間撹拌した。▲２▼有機溶媒の除去（Ｗ／Ｌ（ｌｉｐｉｄ）型エマルションの調製）：（▲１▼）で調製したＷ／Ｏ型エマルションをナスフラスコに移し、恒温槽中約３０℃で、ロータリーエバポレーターで減圧し、ｎ−ヘキサンを除去した。▲３▼二次乳化（Ｗ／Ｌ／Ｗ型エマルションの調製）：（▲２▼）で調製したＷ／Ｌ型エマルション中に、２４ｍｇのＴｗｅｅｎ８０を溶解したＰＢＳ溶液（外水）３ｍｌを添加し、ホモミキサー（３５００ｒｐｍ）で撹拌した。この二段階乳化法により調製されたベシクルは、その構成成分によっては多くが凝集している場合があるため、以下の手順でベシクルの再分散を行った。（ａ）調製したベシクルを、マグネチックスターラーを用いて気泡が出なくなるまで（約３時間）撹拌し、その後、冷蔵庫内で撹拌しながら一昼夜放置した。（ｂ）その懸濁液を遠心分離し，一昼夜透析を行い、内水層から漏出したＣａｌｃｅｉｎＡＭ溶液を除去した。
【実施例１０】ＣａｌｃｅｉｎＡＭ内包のＳｐａｎ８０ベシクルと細胞間の融合に関する位相差・蛍光顕微鏡観察の観察は以下のように行った。マウス結腸腺癌細胞株Ｃｏｌｏｎ２６、ヒト子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａ、ヒト正常線維芽細胞（皮膚由来）、ヒト正常血管内皮細胞株ＥＣＶ３０４を培養シャーレから回収した。培地に含まれているフェノールレッドのバックグラウンドを除去するため、またＦＢＳに含まれているエステラーゼを除去するために、脱気した滅菌ＰＢＳに上記の細胞をそれぞれ再懸濁した。それぞれの細胞懸濁液に対して２０％の量の上記Ｓｐａｎ８０ベシクル懸濁液を添加し、インキュベーター内で放置して、１〜３時間経過後に採取して、位相差顕微鏡および位相差蛍光顕微鏡による観察を行った。
図５に、ＣａｌｃｅｉｎＡＭ内包のＳｐａｎ８０ベシクルと  Ｃｏｌｏｎ２６細胞の内水相どうしの融合が生じ（図５−ａ）、ベシクル内のＣａｌｃｅｉｎＡＭがＣｏｌｏｎ２６細胞内に導入されて、加水分解されたＣａｌｃｅｉｎが蛍光を発している様子を示す（図５−ｂ）蛍光顕微鏡写真を示す。このような様子は、Ｈｅｌａ細胞などでも観察された。こうして、Ｓｐａｎ８０ベシクルが癌細胞と融合する様子が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−（１）】
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【図４−（２）】
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【図５】
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