(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるアルツハイマー病の病態を認定するためのデータを収集する方法であって、該方法は、以下：
該被験体由来のＣＳＦサンプル中のバイオマーカーを測定する工程であって、該バイオマーカーが、ヘモペキシンである、工程、を包含し、
ここで、該ＣＳＦサンプル中の該バイオマーカーの測定から得られた測定値は、アルツハイマー病の病態と相関関係付けされ得；そして
該ヘモペキシンは、Ｍ６０９７６．２またはＭ６０４６４．７である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーを測定する工程をさらに包含し、該少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーが、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ６４４６．３（アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ１１．１Ｋ、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）からなる群から選択される、方法。
【請求項３】
少なくとも以下の各バイオマーカー：
Ｍ６０９７６．２（ヘモペキシン）およびＭ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）
が、測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも以下の各バイオマーカー：
Ｍ６０９７６．２（ヘモペキシン）、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）およびＭ１１．１Ｋ
が、測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも以下の各バイオマーカー：
Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）およびＭ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）
が、測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも以下の各バイオマーカー：
Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）およびＭ３５１３．９（神経内分泌タンパク質７Ｂ２  ＣＴ断片）
が、測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーが、
ＳＥＬＤＩプローブの吸着剤表面上の該バイオマーカーを捕捉し、レーザー脱離イオン化質量分析法によって該捕捉されたバイオマーカーを検出すること
によって測定される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記相関関係付けが、ソフトウェア分類アルゴリズムにより実行される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記データは、前記病態に基づいて被験体の治療を管理することにおける使用が意図される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
アルツハイマー病の病態がアルツハイマー病、非痴呆、および非アルツハイマー性痴呆から選択される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
アルツハイマー病の病態がアルツハイマー病および非アルツハイマー性痴呆から選択される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
非アルツハイマー性痴呆がレヴィー小体を伴う痴呆および前頭側頭型痴呆から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記吸着剤が陽イオン交換吸着剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
前記吸着剤が生体特異的吸着剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記吸着剤が疎水性吸着剤である、請求項７に記載の方法。
【請求項１７】
前記バイオマーカーが、質量以外の検出手段により測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記バイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定値がアルツハイマー病と相関する場合に、被験体の治療の管理が、該被験体へのコリンエステラーゼ阻害剤の投与を包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
被験体の管理の後にヘモペキシンを測定する工程、をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
ソフトウェアであって、以下：
（ａ）サンプルに起因するデータにアクセスするコードであって、該データは該サンプル中のバイオマーカーの測定値を含み、該バイオマーカーは、ヘモペキシンである、コード；ならびに
（ｂ）該サンプルのアルツハイマー病の病態を該サンプル中の該バイオマーカーの測定から得られた測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行するコード、
を備え；
該ヘモペキシンは、Ｍ６０９７６．２またはＭ６０４６４．７である、ソフトウェアであって、
ここで、該サンプルが脳脊髄液（ＣＳＦ）である、ソフトウェア。
【請求項２２】
請求項２１に記載のソフトウェアであって、前記分類アルゴリズムが、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４
バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ６４４６．３（アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ１１．１Ｋ、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）からなる群から選択される少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーの測定値の関数として前記サンプルの前記アルツハイマー病の病態を分類する、ソフトウェア。
【請求項２３】
被験体の痴呆の病態を認定するためのデータを収集する方法であって、該痴呆の病態は非痴呆および非アルツハイマー性痴呆から選択され、該方法は、
該被験体由来の生体サンプル中のヘモペキシンを測定する工程、
を包含し、
ここで、該生体サンプル中の該ヘモペキシンの測定から得られた測定値は、非アルツハイマー性痴呆の病態と相関関係付けされ得；そして
該ヘモペキシンは、Ｍ６０９７６．２またはＭ６０４６４．７である、方法であって、
ここで、該サンプルが脳脊髄液（ＣＳＦ）である、方法。
【請求項２４】
前記生体サンプルが脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は２００３年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８，３６０号；２００３年１２月２日に出願された米国仮特許出願第６０／５２６，７５３号、；２００４年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／５４６，４２３号；２００４年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／５４７，２５０号；２００４年４月２日に出願された米国仮特許出願第６０／５５８，８９６号；２００４年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／５７２，６１７号；および２００４年７月８日に出願された米国仮特許出願第６０／５８６，５０３号の利益を主張し、参照によりその全文を本明細書に組み入れるものとする。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
アルツハイマー病は、ひとたび失われると置き換えができない脳細胞の死滅を導く進行性神経疾患の１種である。ＡＤの手がかりとなる神経病理学的な２つの顕著な徴候は、主として凝集したβ−アミロイドタンパク質（Ａβ）からなる老人斑、および高度にリン酸化されたタウタンパク質の蓄積により形成される神経原線維変化（ＮＦＴ）の存在である。現在、ＡＤの臨床診断は、病歴の評価および神経学的、神経心理学的および精神病理学的な評価を含む理学的診察、ならびに各種の生物学的、Ｘ線的、および電気生理学的な検査を必要とする。一連の試験にもかかわらず、定義的な診断は、死亡後の解剖脳検査によってしか達成されない。従って、早期の段階でＡＤを検知でき、その疾患の進行をモニターでき、ＡＤ、正常、非ＡＤ性痴呆およびその他の神経学的疾患を識別可能な簡単な生化学試験には、満たされないニーズが存在する。
【０００３】
脳脊髄液（ＣＳＦ）中の３つの異なるバイオマーカー：神経線維タンパク質、タウおよびアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の前駆体は特によく研究されている。
【０００４】
神経線維タンパク質は、ＡＤ患者の脳神経細胞中で過剰発現していることが知られている。ＮＹＭＯＸという企業は、ＣＳＦおよび尿中における特定のタイプの神経線維タンパク質（ＡＤ７ｃ−ＮＴＰ）の量を測定するための定量試験を開発している。多数の研究がＣＳＦ−タウをＡＤの死亡前マーカーとして評価している。このときの測定アッセイとしては、主として酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が用いられている。ＮＦＴの形成に関与する同一タンパク質のリン酸化変異体の分析を記載する多数の文献が存在するにもかかわらず、これらの研究のほとんどにおいてはタウの総量が測定されている。ＣＳＦ分析のために、４０番目のアミノ酸で終了するＡβ（Ａβ４０）と４２番目の位置で終了する老人班形成種（Ａβ４２）とを区別することができるＥＬＩＳＡも開発され、広く評価されている。個々にいずれかを使用する、またはタウおよびＡβ４２の場合には組み合わせて用いられる上記の３つのマーカーによるアッセイの全ては、日々の臨床用途に対して、特に早期の診断およびＡＤとその他の非ＡＤ性とを識別するために必要とされる感度および特異度の値を有していない。さらに、血中タウおよびＡβ４２を測定するための試みは、限られた成功しかおさめておらず、さらに臨床的な応用への広範な利用に制限がかかっている。
【０００５】
ＡＤ患者のＣＳＦ中には、ＮＴＰ、タウおよびＡβ以外のその他の広範囲な異常があることが報告されている。ＡＤ患者では、本明細書中に報告される同定されている（タンパク質配列が確認された）ＣＳＦマーカーの多くが、正常なヒトと比較して増加または減少していることが示されている。例えば、タンパク質ユビキチンは、ＡＤ患者の脳内で、ＮＦＴが成熟する間に高度にリン酸化されたタウとの複合体を形成することが知られている（非特許文献１）。ＡＤおよび神経学的な対照群のＣＳＦにおけるユビキチンレベルは、非神経学的な対照群のそれよりも顕著に高いことが示されている（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００６】
急性期／炎症性タンパク質α（１）−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）はＡＤの脳内で過剰生産される。ＡＣＴはまた、神経毒性のアミロイド沈着物の形成を促進し、それと共存し得る（非特許文献４）。血清およびＣＳＦの両方におけるＡＣＴのレベルは、アルツハイマー型の痴呆を伴う患者において、対照被験体よりも顕著におよび特異的に高い（非特許文献５）。ＣＳＦ−ＡＣＴにおける増加において、遅発型ＡＤとの特に密接な関連が存在する（非特許文献６）。
【０００７】
クロモグラニンＡ（ＣｒＡ）は大型で緻密なシナプス小胞の主要なタンパク質であり、ＡＤにおけるシナプス機能の生化学的なマーカーとして価値を有し得るものである。あるレポートは、疾患を有する個人におけるＣＳＦ  ＣｒＡの統計学的有意性が確認できる増加が見られた家族性サブタイプ（ＡＤ  タイプＩ）を対照群と比較した時を除き、ＡＤ、血管性痴呆、および年齢をマッチングした対照群の間に差がなかったことを記述した（非特許文献７）。
【０００８】
β−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）は、インターフェロンおよびある種のサイトカインによりモジュレートされる炎症性応答のイニシエーターである（非特許文献８）。二次元電気泳動（２Ｄ−ゲル）によるＣＳＦのプロテオーム分析は、ＡＤ患者におけるＢ２Ｍの顕著な増加を示し（非特許文献９）、より最近、これらの結果がＳＥＬＤＩ分析により確認された（非特許文献１０）。
【０００９】
トランスサイレチン（ＴＴＲ）はＡβと相互作用し、体液中および脳内でのアミロイド形成を抑制するかもしれないことが示されている（非特許文献１１）。少数のＡＤおよび対照患者の２Ｄゲル分析を用いて、１つの同定されたＴＴＲのイソ体がＡＤ−ＣＳＦにおいて増加していることが示された（非特許文献９）。しかしこの結果は、対照と比較したＡＤ患者由来のＣＳＦにおけるＴＴＲの明白な低下を示すその他のレポートと矛盾する（非特許文献１２；非特許文献１３）。この低下は老人斑（ＳＰ）の量とも負に相関している（非特許文献１４）。
【００１０】
システインプロテアーゼインヒビターであるシスタチンＣは、神経変性および神経系の修復プロセスに関わるとみなされており、異なるタイプの痴呆において、βアミロイドペプチドと共に同タンパク質の沈着が脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）として見出された（非特許文献１５）。先のＳＥＬＤＩプロファイリング研究（非特許文献１０）においては、ＡＤのためのＣＳＦマーカーとして完全長シスタチンＣが見いだされた。相対的な血液脳関門（ＢＢＢ）機能障害は、非常に高齢の者においてＡＤと関連する。ＣＳＦ／血清アルブミン比率はＢＢＢ機能の測定値として使用され得る。ＡＤを含む研究された全ての痴呆において、非痴呆の者においてよりもＣＳＦ／血清アルブミン比率の平均値が高いことが報告されている（非特許文献１６）。
トランスフェリン（ＴＦ）は血清中の抗酸化防御において役割を果たし、また、酸化的ストレスにおけるその役割は不明であるが脳においても生産される。進行性痴呆を患うダウン症患者における研究は、神経学的疾患を有さない年齢をマッチングした対照群と比較して、ＴＦのレベルが低下していることを示した（非特許文献１７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｉｑｂａｌら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９８年、５３：１６９−８０
【非特許文献２】Ｗａｎｇら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ（Ｂｅｒｌ）．１９９１年、８２（１）：６−１２
【非特許文献３】Ｋｕｄｏら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９４年、６３９（１）：１−７
【非特許文献４】Ｐｏｔｔｅｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ．２００１年、２２（６）：９２３−３０
【非特許文献５】Ｍａｔｓｕｂａｒａら、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９０年、２８（４）：５６１−７
【非特許文献６】Ｈａｒｉｇａｙａら、Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１９９５年、３４（６）：４８１−４
【非特許文献７】Ｂｌｅｎｎｏｗら、Ｄｉｍｅｎｔｉａ．１９９５年、６（６）：３０６−１１
【非特許文献８】Ｈｏｅｋｍａｎら、Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｍｅｄ．１９８５年、２８：５５１−５５７
【非特許文献９】Ｄａｖｉｄｓｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、２００２年、１３：６１１−６１５
【非特許文献１０】Ｃａｒｒｅｔｔｅ、Ｏ．ら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００３年、３：１４８６−１４９４
【非特許文献１１】Ｔｓｕｚｕｋｉら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ、２０００年、１０：１７１−１７４
【非特許文献１２】Ｓｅｒｏｔら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１９９７年、６３（４）：５０６−８
【非特許文献１３】Ｒｉｉｓｏｅｎら、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ．１９９８年、７８（６）：４５５−９
【非特許文献１４】Ｍｅｒｃｈｅｄら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９８年、４２５（２）：２２５−８
【非特許文献１５】Ｌｅｖｙら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．６０：９４−１０４
【非特許文献１６】Ｓｋｏｏｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９９８年、５０：９６６−７１
【非特許文献１７】Ｅｌｏｖａａｒａ  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ．１９９４年、６９（５）：３０２−５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
痴呆患者のＣＳＦにおける異なる生化学的マーカーを評価するこれまでの研究は、対象分析物の間接的な測定手段を使用するＥＬＩＳＡ等のアッセイ方法を利用してきた。これらの方法は、他のプロセスに見られる種々の処理形態のタンパク質を識別することができない。さらに、従来のアッセイ方法は、異なる処理がなされた形態のタンパク質に関する処置手段を開拓していない。従って、顕著なニューロンの欠損が起こる前にアルツハイマー病を診断する方法、および上記疾患の進行を抑制するための治療上の処置に対するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）  被験体におけるアルツハイマー病の病態を認定するための方法であって、以下：
ａ．該被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程であって、該少なくとも１種類のバイオマーカーが、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、およびＭ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）からなる群から選択される、工程、ならびに
ｂ．該測定値をアルツハイマー病の病態と相関させる工程、
を包含する、
方法。
（項目２）  項目１に記載の方法であって、前記被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーを測定する工程をさらに包含し、該少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーが、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）からなる群から選択される、方法。
（項目３）  被験体のアルツハイマー病の病態を認定するための方法であって、以下：
ａ．該被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程であって、該少なくとも１種類のバイオマーカーが、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−ＣＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４からなる群から選択される、工程、ならびに
ｂ．該測定値をアルツハイマー病の病態と相関させる工程、
を包含する、
方法。
（項目４）  項目３に記載の方法であって、前記被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーを測定する工程をさらに包含し、該少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーが、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）からなる群から選択される、方法。
（項目５）  前記少なくとも１種類のバイオマーカーが、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）を含む、項目１または３のいずれかに記載の方法。
（項目６）  前記少なくとも１種類のバイオマーカーが、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）を含む、項目３に記載の方法。
（項目７）  前記少なくとも１種類のバイオマーカーが、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）を含む、項目１または３のいずれかに記載の方法。
（項目８）  以下の各バイオマーカー：
Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）およびＭ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）を測定する工程をさらに包含する、項目３に記載の方法。
（項目９）  以下の各バイオマーカー：
Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）およびＭ６０４６４．７（ヘモペキシン）を測定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１０）  以下の各バイオマーカー：
Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）およびＭ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）を測定する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目１１）  前記少なくとも１種類のバイオマーカーが、ＳＥＬＤＩプローブの吸着剤表面上の該バイオマーカーを捕捉し、レーザー脱離イオン化質量分析法によって該捕捉されたバイオマーカーを検出することによって測定される、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１２）  前記少なくとも１種類のバイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１３）  前記サンプルがＣＳＦである、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１４）  前記サンプルが血清である、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１５）  前記相関させる工程が、ソフトウェア分類アルゴリズムにより実行される、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）  アルツハイマー病の病態がアルツハイマー病および非痴呆から選択される、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１７）  （ｃ）前記病態に基づいて被験体の治療を管理する工程、をさらに包含する、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１８）  アルツハイマー病の病態がアルツハイマー病、非痴呆、および非アルツハイマー性痴呆から選択される、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目１９）  アルツハイマー病の病態がアルツハイマー病および非アルツハイマー性痴呆から選択される、項目１、２、３または４のいずれかに記載の方法。
（項目２０）  非アルツハイマー性痴呆がレヴィー小体を伴う痴呆および前頭側頭型痴呆を伴う痴呆から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）  前記吸着剤が陽イオン交換吸着剤である、項目１１に記載の方法。
（項目２２）  前記吸着剤が生体特異的吸着剤である、項目１１に記載の方法。
（項目２３）  前記吸着剤が疎水性吸着剤である、項目１１に記載の方法。
（項目２４）  前記少なくとも１種類のバイオマーカーが、質量以外の検出手段により測定される、項目１に記載の方法。
（項目２５）  前記少なくとも１種類のバイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）  前記測定値がアルツハイマー病と相関する場合に、被験体の治療を管理する工程が、該被験体へコリンエステラーゼ阻害剤を投与する工程を包含する、項目１６に記載の方法。
（項目２７）  （ｄ）被験体の管理の後に前記少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程、をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（項目２８）  キットであって、以下：
（ａ）固体支持体であって、該固体支持体は、そこに接着される少なくとも１種類の捕捉試薬を含み、該捕捉試薬が、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４からなる第１の群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーと結合する、固体支持体、ならびに
（ｂ）該固体支持体を使用して表ＩＩ、表ＩＶ−Ａまたは表ＩＶ−Ｂに示されるバイオマーカーを検出するための、説明書、
を含む、キット。
（項目２９）  項目２８に記載のキットであって、前記捕捉試薬が、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、およびＭ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）を含む第１の群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーと結合する、キット。
（項目３０）  項目２８に記載のキットであって、第２の固体支持体をさらに含み、該固体支持体は、そこに接着される捕捉試薬を含み、該捕捉試薬が、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）バイオマーカー  シスタチンＣ（Ｍ１３３９１）からなる群から選択される少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーと結合する、キット。
（項目３１）  アルツハイマー病の病態を認定するための説明書をさらに含む、項目２８に記載のキット。
（項目３２）  前記捕捉試薬を含む固体支持体が、ＳＥＬＤＩプローブである、項目２８、２９または３０のいずれかに記載のキット。
（項目３３）  （ｃ）表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに記載のバイオマーカーのうちの少なくとも１種類を含む容器、をさらに含む、項目２８、２９または３０のいずれかに記載のキット。
（項目３４）  前記捕捉試薬が陽イオン交換吸着剤である、項目２６に記載のキット。
（項目３５）  （ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー吸着剤、をさらに含む、項目２８、２９または３０のいずれかに記載のキット。
（項目３６）    キットであって、以下：
（ａ）固体支持体であって、該固体支持体は、そこに接着される少なくとも１種類の捕捉試薬を含み、前記捕捉試薬が、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４からなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーと結合する、固体支持体、ならびに
（ｂ）少なくとも１種類のバイオマーカーを含む容器、
を含む、キット。
（項目３７）  項目３６に記載のキットであって、前記捕捉試薬が、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、およびＭ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）からなる第１の群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーと結合する、キット。
（項目３８）  項目３６に記載のキットであって、第２の固体支持体をさらに含み、該固体支持体はそこに接着される捕捉試薬を含み、該捕捉試薬が、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）からなる群から選択される少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーと結合する、キット。
（項目３９）  前記捕捉試薬を含む固体支持体が、ＳＥＬＤＩプローブである、項目３６、３７または３８のいずれかに記載のキット。
（項目４０）  （ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー吸着剤、をさらに含む、項目３６、３７または３８のいずれかに記載のキット。
（項目４１）  前記捕捉試薬が陽イオン交換吸着剤である、項目３４に記載のキット。
（項目４２）  ソフトウェア製品であって、以下：
ａ．サンプルに起因するデータにアクセスするコードであって、該データは該サンプル中の少なくとも１種類のバイオマーカーの測定値を含み、該バイオマーカーは、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４からなる群から選択される、コード；ならびに
ｂ．該サンプルのアルツハイマー病の病態を該測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行するコード、
を備える、
ソフトウェア製品。
（項目４３）  項目４２に記載のソフトウェア製品であって、前記分類アルゴリズムは、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、およびＭ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）からなる群から選択されるバイオマーカーの該測定値の関数として該サンプルのアルツハイマー病の該病態を分類する、ソフトウェア製品。
（項目４４）  項目４２に記載のソフトウェア製品であって、前記分類アルゴリズムが、Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）からなる群から選択される少なくとも１種類のさらなるバイオマーカーの前記測定値の関数として前記サンプルの前記アルツハイマー病の病態を分類する、ソフトウェア製品。
（項目４５）  項目４２に記載のソフトウェア製品であって、前記分類アルゴリズムが、以下の各バイオマーカー：
Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ１０３７９．８（１０．３  ｋＤａ）およびＭ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）の前記測定値の関数として前記サンプルの前記アルツハイマー病の病態を分類する、ソフトウェア製品。
（項目４６）  単離された改変シスタチンＣポリペプチドであって、該改変シスタチンＣポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離された改変シスタチンＣポリペプチド。
（項目４７）  被験体のアルツハイマー病の病態を認定するための方法であって、以下：
ａ．該被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類の改変シスタチンＣバイオマーカーを測定する工程であって、該少なくとも１種類の改変シスタチンＣバイオマーカーが配列番号２のアミノ酸配列を有する、工程、および
ｂ．該測定値をアルツハイマー病の病態と相関させる工程、
を包含する、
方法。
（項目４８）  シスタチン（Ｍ１３４１６）を測定する工程をさらに包含する、項目４７に記載の方法。
（項目４９）  項目４７に記載の方法であって、前記少なくとも１種類の改変シスタチンＣバイオマーカーは、ＳＥＬＤＩプローブの吸着剤表面上の該バイオマーカーを捕捉し、レーザー脱離イオン化質量分析法によって該捕捉されたバイオマーカーを検出することによって測定される、方法。
（項目５０）  前記少なくとも１種類の改変シスタチンＣバイオマーカーが、イムノアッセイにより測定される、項目４７に記載の方法。
（項目５１）  前記サンプルがＣＳＦである、項目４７に記載の方法。
（項目５２）  前記サンプルが血清である、項目４７に記載の方法。
（項目５３）  前記相関付けはソフトウェア分類アルゴリズムにより実行される、項目４７に記載の方法。
（項目５４）  アルツハイマー病の病態が、アルツハイマー病および非アルツハイマー性痴呆から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目５５）  前記非アルツハイマー性痴呆が、レヴィー小体痴呆（ＬＢＤ）および前頭側頭型痴呆（ＦＴＤ）からなる群から選択されるメンバーである、項目５４に記載の方法。
（項目５６）  （ｃ）前記病態に基づいて被験体の治療を管理する工程、をさらに包含する、項目４７に記載の方法。
（項目５７）  前記吸着剤が疎水性吸着剤である、項目４７に記載の方法。
（項目５８）  前記吸着剤が生体特異的吸着剤である、項目４７に記載の方法。
（項目５９）  前記測定値がアルツハイマー病と相関する場合に、前記被験体の治療を管理する工程が、該被験体へコリンエステラーゼ阻害剤を投与する工程を包含する、項目５４に記載の方法。
（項目６０）  （ｄ）被験体の管理の後に前記少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程、をさらに包含する、項目５６に記載の方法。
（項目６１）  前記少なくとも１種類の改変シスタチンバイオマーカーが、抗体により捕捉される、項目４７に記載の方法。
（項目６２）  シスタチンＣ  ΔＮ１−８と相互作用する化合物を同定するための方法であって、
ａ）シスタチンＣ  ΔＮ１−８を試験化合物と接触させる工程、および
ｂ）該試験化合物がシスタチンＣ  ΔＮ１−８と相互作用するか否かを判断する工程、を包含する、
方法。
（項目６３）  シスタチンＣと相互作用する化合物を同定するための方法であって、
ａ）シスタチンＣを試験化合物と接触させる工程、および
ｂ）該試験化合物がシスタチンＣと相互作用するか否かを判断する工程、を包含する、
方法。
（項目６４）  細胞中のシスタチンＣの濃度を調節するための方法であって、該方法は、以下：
該細胞をプロテアーゼインヒビターと接触させる工程を包含し、該プロテアーゼインヒビターは、Ａｒｇ８とＬｅｕ９との間でのシスタチンＣの切断を防ぐ、方法。
（項目６５）  被験体のアルツハイマー病を処置する方法であって、該方法は、以下：
Ａｒｇ８とＬｅｕ９との間でシスタチンＣを切断するプロテアーゼの発現または活性を調節する化合物の治療的有効量を、被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目６６）  被験体の痴呆の病態を認定するための方法であって、該痴呆の病態は非痴呆および非アルツハイマー性痴呆から選択され、
ａ．該被験体由来の生体サンプル中のβ２ミクログロブリンを測定する工程、および
ｂ．該測定値を非アルツハイマー性痴呆の病態と相関させる工程、
を包含する、
方法。
（項目６７）  被験体のアルツハイマー病の病態を認定するための方法であって、以下：
ａ．該被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程であって、該少なくとも１種類のバイオマーカーが、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに記載のバイオマーカーからなる群から選択される、工程、および
ｂ．該測定値をアルツハイマー病の病態と相関させる工程、
を包含する、
方法。
（項目６８）  被験体のアルツハイマー病の病態を認定するための方法であって、以下：
ａ．Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４からなる群から選択されるバイオマーカーを検出可能に標識する工程、ならびに
ｂ．該標識したバイオマーカーを用いて被験体を処置する工程、
ｃ．該被験体における該バイオマーカーの局在パターンを可視化させるために陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を利用する工程、
ｄ．該局在パターンをアルツハイマー病の病態と相関させる工程、
を包含する、
方法。
（項目６９）  前記バイオマーカーがアルツハイマー病患者の脳内のβ−アミロイド沈着物とともに局在する、項目６８に記載の方法。
（発明の概要）
本発明は、アルツハイマー病を有しない被験体、および／または非アルツハイマー性痴呆（例えば、ＬＢＤ，ＦＴＤ等）を患う被験体と比較してアルツハイマー性痴呆を伴う被験体において異なる量で存在するポリペプチドをベースとするバイオマーカーを提供する。さらに、本発明は、ポリペプチドをベースとするバイオマーカーを用いて被験体のアルツハイマー病を認定する（ｔｏ  ｑｕａｌｉｆｙ）方法を提供する。また本発明は、アルツハイマー病の治療薬の同定方法およびアルツハイマー病と認定されたヒトの治療方法を提供する。
【００１４】
したがって、１つの態様において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病の病態を認定する方法であって、（ａ）被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程であって、上記少なくとも１種類のバイオマーカーが、上掲の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーからなる群から選択される、測定する工程；および（ｂ）測定値をアルツハイマー病の病態と相関させる工程、を包含する方法を提供する。１つの実施形態において、サンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）である。その他の実施形態において、サンプルは血清である。別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは表ＩＩ，表ＩＶ−Ａ、および表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは、表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーからなる群から選択される。
【００１５】
好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは、表ＩＩまたは表ＩＶ−Ａまたは表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーから選択される。
１実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは以下のバイオマーカー：Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４、から選択される。別の好ましい実施形態において、この方法はＮ−アセチル化チモシンβ−４を測定する工程を包含する。さらに別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは表Ｖに名前が付けられている表ＩＩまたは表ＩＶ−Ａまたは表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーのひとつから選択される。
【００１６】
好ましい実施形態において、この方法は、以下のバイオマーカー：Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）の１以上を測定する工程をさらに包含し、またはさもなければ、これらのさらなる各バイオマーカーを測定する工程を包含する。別の好ましい実施形態において、この方法は、以下の２セットのバイオマーカー：Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ  二量体）、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、およびＭ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）；およびＭ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）およびＭ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）からなる上記セットに由来する少なくとも各種類のバイオマーカーを測定する工程を包含する。別の好ましい実施形態において、この方法は、以下のバイオマーカー：１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ２０８３９．２、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ７８７８．７、７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、およびＭ４４５５．４．からなるセットからの少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程を包含する。
【００１７】
ある実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは、ＳＥＬＤＩプローブの吸着剤上のバイオマーカーを捕捉し、レーザー脱離イオン化質量分析法により捕捉されたバイオマーカーを検出することにより測定する。ある種の実施形態において、吸着剤は陽イオン交換吸着剤、陰イオン交換吸着剤、金属キレートまたは疎水性吸着剤である。その他の実施形態において、吸着剤は生体特異的吸着剤である。別の実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーはイムノアッセイにより測定される。
【００１８】
別の実施形態において、相関付けはソフトウェア分類アルゴリズムにより実行される。ある種の実施形態において、アルツハイマー病の病態は、アルツハイマー病、非痴呆、および非アルツハイマー性痴呆から選択される。ある実施形態において、非アルツハイマー性痴呆は、レヴィー小体痴呆（ＬＢＤ）および前頭側頭型痴呆（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）（ＦＴＤ）を含む。
【００１９】
さらにその他の実施形態において、この方法は（ｃ）上記病態に基づいて被験体の治療を管理する工程をさらに包含する。測定値がアルツハイマー病と相関しているとき、被験体の治療の管理は上記被験体へのコリンエステラーゼ阻害剤の投与を含む。
【００２０】
さらなる実施形態において、この方法は、（ｄ）被験体の管理の後に上記少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程をさらに包含する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、被験体由来の生体サンプル中の少なくとも１種類のバイオマーカーを測定する工程を包含する方法であって、この少なくとも１種類のバイオマーカーが表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａまたは表ＩＶ−Ｂに示されるバイオマーカーのセットからなる群から選択される、または上記に論じられた任意のバイオマーカーである、上記方法を提供する。ある実施形態において、サンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）である。別の実施形態において、サンプルは血清である。好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは表ＩＩのバイオマーカーからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは表ＩＶ−Ａまたは表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、この方法はＮ−アセチル化チモシンβ−４を測定する工程を包含する。さらに別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは表Ｖに名前が付けられている表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーのひとつから選択される。
【００２２】
ある実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは以下のバイオマーカー：Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４から選択される。別の実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは以下のバイオマーカー：Ｍ１１７２８．３（β２ミクログロブリン）、Ｍ６０９７６．２（ヘモペキシン）、Ｍ１１１２７．８およびＭ９７４２．３から選択される。好ましい実施形態において、この方法は、シスタチンＣ（Ｍ１３３９１）を測定する工程をさらに包含する。さらにその他の実施形態において、この方法は、例えば、完全長ＣｙｓＣのＮ末端から８アミノ酸を欠失したＣｙｓＣの短縮された形態物であるＣｙｓＣΔ１−８等のシスタチンＣ（ＣｙｓＣ）改変体をさらに測定する工程を包含する。さらにその他の実施形態において、この方法は以下のさらなるバイオマーカー：Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）の少なくとも１種類を測定する工程、またはさもなければ、これらのさらなるバイオマーカーの各々を測定する工程をさらに包含する。別の好ましい実施形態において、この方法は、Ｎ−アセチル化チモシンβ−４を測定する工程を包含する。さらに別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバ��オマーカーは、表Ｖに名前が付けられている表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーのひとつから選択される。
【００２３】
ある実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは、ＳＥＬＤＩプローブの吸着剤上のバイオマーカーを捕捉し、レーザー脱離イオン化質量分析法により捕捉されたバイオマーカーを検出することにより測定する。ある種の実施形態において、吸着剤は陽イオン交換吸着剤、陰イオン交換吸着剤、金属キレートまたは疎水性吸着剤である。その他の実施形態において、吸着剤は生体特異的吸着剤である。別の実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーはイムノアッセイにより測定される。
【００２４】
さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）固体支持体であって、該固体支持体は、そこに接着される少なくとも１種類の捕捉試薬を含み、上記捕捉試薬が、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに示されるバイオマーカーからなる第１の群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーと結合する、上記固体支持体；および（ｂ）表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａまたは表ＩＶ−Ｂに示されるバイオマーカーを検出するための上記固体支持体を使用するための説明書、を含むキットを提供する。好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは、表ＩＩのバイオマーカーからなる群から選択される。さらに別の好ましい実施形態において、少なくとも１種類のバイオマーカーは、表Ｖに名前が付けられている表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーのひとつから選択される。別の好ましい実施形態において、バイオマーカーはＮ−アセチル化チモシンβ−４である。
【００２５】
ある実施形態において、キットは以下のバイオマーカー：Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４から選択されるバイオマーカーを検出するために固体支持体を使用するための説明書を提供する。別の実施形態において、このキットは以下のバイオマーカー：Ｍ１１７２８．３（β２ミクログロブリン）、Ｍ６０９７６．２（ヘモペキシン）、Ｍ１１１２７．８およびＭ９７４２．３から選択されるバイオマーカーを検出するために固体支持体を使用するための説明書を提供する。好ましい実施形態において、上記キットは、シスタチンＣ（Ｍ１３３９１）を検出するための上記固体支持体を使用するための説明書、をさらに含む。さらにその他の実施形態において、このキットは、以下のさらなるバイオマーカー：Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）の少なくとも１種類を検出するために固体支持体を使用するための説明書、または、さもなければこれらの各バイオマーカーをさらに検出する工程をさらに包含する。さらにその他の実施形態において、このキットは、表Ｖに名前が付けられている表ＩＩ、表ＩＶに記載のバイオマーカーの少なくとも１種類を検出するために固体支持体を使用するための説明書をさらに含む。
【００２６】
別の実施形態において、捕捉試薬を含む固体支持体はＳＥＬＤＩプローブである。ある種の実施形態において、吸着剤は陽イオン交換吸着剤、陰イオン交換吸着剤、金属キレートまたは疎水性吸着剤である。いくつかの好ましい実施形態において、捕捉試薬は陽イオン交換吸着剤である。その他の実施形態において、このキットは、（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー溶媒、をさらに含む。その他の実施形態において、キットは（ｃ）表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに示される少なくとも１種類のバイオマーカーを含む容器、をさらに含む。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）固体支持体であって、該固体支持体は、そこに接着される少なくとも１種類の捕捉試薬を含み、上記捕捉試薬が、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂからなる第１の群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーと結合する、上記固体支持体；および
（ｂ）表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに示される少なくとも１種類のバイオマーカーを含む容器、を含むキットを提供する。好ましい実施形態において、上記少なくとも１種類のバイオマーカーは表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーからなる群から選択される。別の好ましい実施形態において、上記少なくとも１種類のバイオマーカーはＮ−アセチル化チモシンβ−４である。さらに別の好ましい実施形態において、上記少なくとも１種類のバイオマーカーは、表Ｖに名前が付けられている表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーのひとつから選択される。
【００２８】
ある実施形態において、このキットは、以下のバイオマーカー：Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４から選択されるバイオマーカーを検出するために固体支持体を使用するための説明書を提供する。好ましい実施形態において、このキットは、シスタチンＣ（Ｍ１３３９１）を検出するために固体支持体を使用するための説明書をさらに含む。さらにその他の実施形態において、キットは、以下のバイオマーカー：の１つをさらに測定するための説明書を提供する。さらにその他の実施形態において、キットは、以下のさらなるバイオマーカー：Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）の少なくとも１種類を検出するために固体支持体を使用するための説明書、または、さもなければこれらの各バイオマーカーをさらに検出する工程、をさらに包含する。さらにその他の実施形態において、キットは、表Ｖに名前が付けられている表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーのひとつから選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを検出するために固体支持体を使用するための説明書をさらに含む。
【００２９】
別の実施形態において、捕捉試薬を含む固体支持体はＳＥＬＤＩプローブである。ある種の実施形態において、吸着剤は陽イオン交換吸着剤、陰イオン交換吸着剤、金属キレートまたは疎水性吸着剤である。その他の実施形態において、吸着剤は生体特異的吸着剤である。いくつかのその他の実施形態において、捕捉試薬は陽イオン交換吸着剤である。その他の実施形態において、このキットは、（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー溶媒、をさらに含む。
【００３０】
さらなる態様において、本発明は、ソフトウェア製品であって、以下の（ａ）および（ｂ）：（ａ）サンプルに起因するデータにアクセスするコードであって、上記データは上記サンプル中の少なくとも１種類のバイオマーカーの測定値を含み、上記バイオマーカーは、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーからなる群から選択される、上記コード；および（ｂ）上記サンプルのアルツハイマー病の病態を測定値の関数として分類する分類アルゴリズムを実行するコード、を備える、ソフトウェア製品を提供する。好ましい実施形態では、上記バイオマーカーは、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーからなる群から選択される。
【００３１】
ある実施形態において、分類アルゴリズムは、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）、Ｍ８２９１．０（ユビキチン（ＣＴから−３ａａ））、Ｍ５０４４．２、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）、Ｍ９９８４．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１０２６５．６（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ９８０２．４（ＥＡ−９２（ＣｈｒＡペプチド））、９７５７．０（１０．３ｋＤａに関連する）、Ｍ１６２０７．４（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ１４０９２．７（Ｓ−グルタチオニル化トランスサイレチン）、Ｍ１３９０４．７（トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ／Ｓ−ＣｙｓＧｌｙ）、Ｍ１２５４５．９（シスタチン−Ｃ（ＮＴから−８ａａ））、Ｍ８１８３．６（ユビキチン（ＣＴから−４ａａ））、Ｍ５２２７．４、Ｍ３６８７．０（セクレトニューリン（ＣｈｒＣ／ＳＧＩＩペプチド））、Ｍ３９０６．４  バソスタチンＩＩ（ＣｈｒＡペプチド）、Ｍ３８０６．２、Ｍ８９５５．１、Ｍ５２６３．９、Ｍ１４５６５．１（膵臓リボヌクレアーゼ）、Ｍ２０８３９．２、Ｍ６５０９．６（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ４３２０．６（Ａ−β  １−４０）、Ｍ７２５８．２（クロモグラニンＢペプチド）、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ５８８４５．４、Ｍ８９３８．５（Ｃ３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ６６０８．９、Ｍ５８３８．３、Ｍ２３４７７．４（プロスタグランジン−Ｄシンターゼ）、Ｍ４３５７．０（α−１−アンチキモトリプシンＣＴ断片）、Ｍ７６５３．２（オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ１６７１６．９、Ｍ４８１２．５（ＶＧＦ（ＮＣＢＩ）ペプチド）、Ｍ４９８９．４（アセチル化チモシンβ−４）、Ｍ７８７８．７、Ｍ９２０８２．４、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）、Ｍ３９６７．６、Ｍ７７１８．８（リン酸化オステオポンチンＣＴ断片）、Ｍ８９７０７．１、Ｍ１１５７９．２、およびＭ４４５５．４からなる群から選択されるバイオマーカーの測定値の関数として、上記サンプルのアルツハイマー病の病態を分類する。さらにその他の実施形態において、分類アルゴリズムは、以下のバイオマーカー：Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）、Ｍ７８９３６．５（トランスフェリン）、Ｍ１３３４９．５（シスタチンＣ）、Ｍ６６４７９．２（アルブミン）およびＭ８５８５．９（ユビキチン）、のひとつのさらなる測定値の関数として、上記サンプルのアルツハイマー病の病態を分類する。さらにその他の実施形態において、分類アルゴリズムは、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに示されるバイオマーカーの少なくとも１種類のさらなる測定値の関数として、上記サンプルのアルツハイマー病の病態を分類する。さらにその他の実施形態において、分類アルゴリズムは、表Ｖに名前が付けられている表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、または表ＩＶ−Ｂのバイオマーカーの少なくとも１種類のさらなる測定値の関数として、上記サンプルのアルツハイマー病の病態を分類する。
【００３２】
その他の態様において、本発明は表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに示されるバイオマーカーから選択される精製された生体分子および、さらに、質量分析またはイムノアッセイによって表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−Ｂに示されるバイオマーカーを検出する方法を提供する。
本発明のその他の特徴、目的および優位性、および好ましい実施形態は後述の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲から明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｑは実施例１に記載の技法に従って同定されたバイオマーカーを示す質量スペクトルを示す。この図はまた、各バイオマーカーに対する質量対電荷比も提供する。
【図１Ｂ】図１Ａの続き。
【図１Ｃ】図１Ｂの続き。
【図１Ｄ】図１Ｃの続き。
【図１Ｅ】図１Ｄの続き。
【図１Ｆ】図１Ｅの続き。
【図１Ｇ】図１Ｆの続き。
【図１Ｈ】図１Ｇの続き。
【図１Ｉ】図１Ｈの続き。
【図１Ｊ】図１Ｉの続き。
【図１Ｋ】図１Ｊの続き。
【図１Ｌ】図１Ｋの続き。
【図１Ｍ】図１Ｌの続き。
【図１Ｎ】図１Ｍの続き。
【図１Ｏ】図１Ｎの続き。
【図１Ｐ】図１Ｏの続き。
【図１Ｑ】図１Ｐの続き。
【図２】図２は、本発明のある種のバイオマーカーを用いて、サンプルをアルツハイマー病または非アルツハイマー病に分類するための判定の樹状図を示す。
【図３】図３は、非アルツハイマー性痴呆（「非ＡＤ」）および痴呆の症状を示さない患者（「対照」）に対してアルツハイマー病（「ＡＤ」）を患う患者を識別するための手段として、ＣＳＦ中のβ２ミクログロブリンの測定値の有効性を立証するための統計学的試験の結果を示す。データは特に、アルツハイマー患者と対照群との間（「Ａ−Ｃ」）；アルツハイマー患者と非アルツハイマー性痴呆との間（「Ａ−Ｎ」）；および非アルツハイマー性痴呆と対照群との間（「Ｃ−Ｎ」）でのβ２ミクログロブリンの平均ピーク強度において統計学的に顕著な差を示唆する。ピーク強度の測定は実施例に記載されるように、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０  プロテインチップを利用して実行した。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｋは、各種の群について観察されたピーク強度の分布および観察された各差異の有意性を調べるために用いられたＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験の結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ａの続き。
【図４Ｃ】図４Ｂの続き。
【図４Ｄ】図４Ｃの続き。
【図４Ｅ】図４Ｄの続き。
【図４Ｆ】図４Ｅの続き。
【図４Ｇ】図４Ｆの続き。
【図４Ｈ】図４Ｇの続き。
【図４Ｉ】図４Ｈの続き。
【図４Ｊ】図４Ｉの続き。
【図４Ｋ】図４Ｊの続き。
【図５】図５は、完全長および短縮されたユビキチンバイオマーカーについて観察されたピーク強度の分布および観察された各差異の有意性を調べるために用いられたＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験の結果を示す。結果はまた、年齢をマッチングしたサンプルおよび特異的なＴａｕ／ＡＢ４２切断レベルにより限定されたサンプルを用いた疾患群と対照群との比較も表す。
【図６】図６は、完全長および短縮されたシスタチンＣバイオマーカーについて観察されたピーク強度の分布および観察された各差異の有意性を調べるために用いられたＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験の結果を示す。結果はまた、年齢をマッチングしたサンプルおよび特異的なＴａｕ／ＡＢ４２切断レベルにより限定されたサンプルを用いた疾患群と対照群との比較も表す。
【図７】図７は、チモシンβ−４について観察されたピーク強度の分布および観察された各差異の有意性を調べるために用いられたＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験の結果を示す。結果はまた、年齢をマッチングしたサンプルおよび特異的なＴａｕ／ＡＢ４２切断レベルにより限定されたサンプルを用いた疾患群と対照群との比較も表す。
【図８】図８は、神経内分泌タンパク質７Ｂ２、ヘモペキシン、β２−ミクログロブリンおよびトランスフェリンバイオマーカーについて観察されたピーク強度の分布を示す。図８はまた、観察された各差異の有意性を調べるために用いられたＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙまたはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験の結果を示す。
【図９−１】図９は、ＣＳＦサンプルを用いて実施例３に記載の技法に従って同定されたバイオマーカーを示す質量スペクトルを示す。
【図９−２】図９−１の続き。
【図９−３】図９−２の続き。
【図９−４】図９−３の続き。
【図９−５】図９−４の続き。
【図９−６】図９−５の続き。
【図９−７】図９−６の続き。
【図９−８】図９−７の続き。
【図９−９】図９−８の続き。
【図９−１０】図９−９の続き。
【図９−１１】図９−１０の続き。
【図９−１２】図９−１１の続き。
【図９−１３】図９−１２の続き。
【図９−１４】図９−１３の続き。
【図９−１５】図９−１４の続き。
【図９−１６】図９−１５の続き。
【図９−１７】図９−１６の続き。
【図９−１８】図９−１７の続き。
【図９−１９】図９−１８の続き。
【図９−２０】図９−１９の続き。
【図９−２１】図９−２０の続き。
【図１０】図１０は、本明細書中で同定され記載される多数のバイオマーカー間のメカニズム的な関係をまとめたものである。
【図１１】図１１は、非アルツハイマー性痴呆に対してアルツハイマー病を識別するための手段としての、短縮されたＣｙｓＣバイオマーカーの測定値における有効性を立証するための統計学的試験の結果を示す。図は特に、アルツハイマー患者と非アルツハイマー性痴呆との短縮されたＣｙｓＣ（１２５８３．８Ｄａのマーカー）の平均ピーク強度における統計学的に顕著な差を示唆する（「Ａ−Ｎ」ｐ−値＜０．０００１）。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（本発明の詳細な説明および好ましい実施形態）
（Ｉ．序文）
バイオマーカーは、ある表現型の状態（例えば、疾患を有する）にある被験体から採取したサンプル中に、その他の表現型の状態（例えば、疾患を有していない）と比較した時とは異なる量で存在する有機生体分子である。異なる表現型の各群について、あるバイオマーカーの平均値または中央値の発現レベルが統計学的に顕著であると計算されれば、そのバイオマーカーは異なる量で各表現型に存在する。それらのうち、統計学的有意性に関する一般的な試験には、ｔ−テスト、ＡＮＯＶＡ、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙおよびオッズ比が含まれる。バイオマーカーは、単独または組み合わせて、被験体がある表現型の状態またはその他の状態に属する相対的リスクの尺度を提供する。したがって、それらは疾患（診断）、薬物の治療効果（治療）、および薬物毒性のためのマーカーとして有用である。
【００３５】
（ＩＩ．アルツハイマー病のバイオマーカー）
（Ａ．バイオマーカー）
本発明は、アルツハイマー病を有しない被験体、および／または非アルツハイマー性痴呆（例えば、ＬＢ、ＦＴＤ等）を伴う被験体と比較するとアルツハイマー病の被験体では量が異なるポリペプチドをベースとするバイオマーカーを提供する。さらに、本発明は、ポリペプチドをベースとするバイオマーカーを用いて被験体のアルツハイマー病を認定する方法を提供する。それらは質量分析により決定されるような質量対電荷比により、飛行時間型質量分析におけるそれらのスペクトルピークの形状により、吸着剤表面へのそれらの結合特性により特徴付けられる。これらの特性は、特定の検出された生体分子が本発明のバイオマーカーであるか否かを決定するための方法を提供する。これらの特性は、上記生体分子が識別されるように上記生体分子の本来の特性を表すもので、プロセスを限定するものではない。１態様において、本発明はこれらのバイオマーカーの単離型を提供する。
【００３６】
これらのバイオマーカーは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）のプロテインチップアレイ（「Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ」）を利用するＳＥＬＤＩ技術を用いて発見された。アルツハイマー病と診断された被験体および正常と診断された被験体（非痴呆）からＣＳＦサンプルを採取した。いくつかの状況において、ＣＳＦサンプルを陰イオンクロマトグラフィー（例えば、実施例１）により分画した。きれいなＣＳＦサンプルを使用することができる（例えば、実施例３）。分画されたまたはきれいなサンプルのいずれかをＳＥＬＤＩバイオチップに供し、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰＢＳＩＩ質量分析機における飛行時間型質量分析により、上記サンプル中のポリペプチドのスペクトルを生成させた。このように得られた上記スペクトルを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＢｉｏｍａｒｋｅｒ  ＷｉｚａｒｄおよびＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐａｔｔｅｒｎソフトウェアを伴うＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＥｘｐｒｅｓｓｔｍＤａｔａ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアにより分析した。各群の質量スペクトルを散布図分析に供した。この散布図における各タンパク質クラスターに対して、アルツハイマー病および対照群を比較するためにＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔ分析を利用し、また、２群間で顕著に異なる（ｐ＜０．０００１）タンパク質を選択した。この方法は実施例の項目において、より詳細に記述されている。
【００３７】
アルツハイマー病を認定するために発見されたバイオマーカーの例を表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａおよび表ＩＶ−ＢおよびＶに示す。「プロテインチップアッセイ」の列は、上記バイオマーカーが見いだされたクロマトグラフィー画分を示し、バイオマーカーがそれに対し結合するバイオチップのタイプおよび洗浄条件は、本明細書中の実施例において詳細に記述される通りである。
【００３８】
本発明のバイオマーカーは、質量分析により決定されるような質量対電荷比によって特徴付けられる。各バイオマーカーの上記質量対電荷比を本明細書中の表において提供する。表Ｉにおいて、例えば、バイオマーカーの質量を「Ｍ」の後に記載する。すなわち、例えば、バイオマーカーＭ２５７９．３は測定される質量対電荷比２５７９．３を有する。その質量対電荷比はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社ＰＢＳ  ＩＩ質量スペクトロメータにより生成された質量スペクトルから決定された。この装置は約＋／−０．１５％の質量正確性を有する（例えば、５，０００Ｄａのタンパク質に対して誤差は±７．５Ｄａ）。すなわち、測定によって明らかにされた質量によって表される本明細書中のバイオマーカーは、所定のサンプル中でその存在が検出される時、常に正確に同じ重さを示すわけではない。さらに、ＰＢＳ  ＩＩ質量スペクトロメータは約４００〜１０００ｍ／ｄｍの質量解像度を有しており、ｍは質量およびｄｍはピーク高さの０．５倍における質量スペクトルピーク幅である。バイオマーカーの質量対電荷比はＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄｔｍ  ソフトウェア（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて決定した。Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｗｉｚａｒｄは、ＰＢＳＩＩにより決定される時に、分析された全スペクトルから同一のピークの質量対電荷比をクラスター化し、上記クラスター中の最大および最小質量対電荷比を取り、２で割ることによりバイオマーカーに対し質量対電荷比を与える。従って、提供される質量は上記の事項が反映されたものである。
【００３９】
本発明のバイオマーカーは、飛行時間型質量分析におけるそれらのスペクトルピークの形状により、さらに特徴づけられる。多くのバイオマーカーを表すピークを示す質量スペクトルを図１および９に示す。
【００４０】
本発明のバイオマーカーは、クロマトグラフィー表面上のそれらの結合特性により、さらに特徴づけられる。本発明のバイオマーカーは陽イオン交換吸着剤（好ましくはＣＭ−１０またはＷＣＸ−２プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））、陰イオン交換吸着剤（好ましくはＱ−１０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））、疎水性交換吸着剤（好ましくはＨ５０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））および／またはＩＭＡＣ吸着剤（好ましくはＩＭＡＣ３またはＩＭＡＣ３０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））に結合する。
【００４１】
本発明のバイオマーカーの多くのアイデンティティーが決定され、本明細書中の表中に示される。これらを決定した方法についても、例えば実施例の項目に示される。アイデンティティーが決定されているバイオマーカーについては、そのバイオマーカーの存在を当該技術で公知であるその他の方法で調べることができ、例えばイムノアッセイ、酵素活性アッセイにより、または任意のその他の検出可能なバイオマーカーの特性を測定することによって、調べることができる。
【００４２】
本発明のバイオマーカーは質量対電荷比、結合特性およびスペクトルの形状により特徴づけられるため、それらの特定のアイデンティティーを知らない状態でも質量分析によってそれらを検出することができる。しかし、所望であれば、そのアイデンティティーが決定されていないバイオマーカーを、例えば、そのポリペプチドのアミノ酸配列決定によって同定することができる。例えば、あるバイオマーカーについて、トリプシンまたはＶ８プロテアーゼなどの多数の酵素を用いてペプチドマッピングを行うことができ、その消化断片の分子量を使用して各種の酵素により生成される消化断片の分子量とマッチする配列を検索するためのデータベース検索を行うことができる。別の方法においては、タンパク質バイオマーカーはタンデムＭＳ技術を用いて配列決定することができる。この方法において、例えば、ゲル電気泳動により上記タンパク質が単離される。バイオマーカーを含むバンドを切り出し、上記タンパク質をプロテアーゼ消化に供する。個々のタンパク質断片を第１の質量スペクトロメータにより分離する。次いで、この断片を衝突誘起冷却に供し、ペプチドを断片化してポリペプチドラダーを生成させる。次いで、このポリペプチドラダーを、タンデムＭＳにおける第２の質量スペクトロメータにより分析する。上記ポリペプチドラダーのメンバーにおける質量の相違が上記配列中のアミノ酸を同定する。このようにタンパク質全体の配列が決定できるか、または配列断片を、同定候補を見つけるためのデータベース検索に供することができる。
【００４３】
上記バイオマーカーを検出するための好ましい生物学的供給源が脳脊髄液（「ＣＳＦ」）である。しかし、その他の実施形態において、上記バイオマーカーは血清から検出できる。本発明のバイオマーカーの多くはＣＳＦおよび血清の両方に見出される。例えば、アルツハイマー病バイオマーカーのβ−２−ミクログロブリンおよびシスタチンＣ（完全長および変異型の両方）はＣＳＦおよび血清の両方に見出されることが発見されている。
【００４４】
本発明のバイオマーカーは生体分子である。従って、本発明は、これら生体分子を単離された形態で提供する。上記バイオマーカーはＣＳＦまたは血清等の体液から単離され得る。バイオマーカーはそれらの質量およびそれらの結合特性の両方に基づき当該分野で公知である任意の方法で単離することができる。例えば、上記生体分子を含むサンプルを本明細書中に記述される方法によりクロマトグラフィー分画し、さらなる分離、例えばアクリルアミドゲル電気泳動等でさらに分離する。バイオマーカーのアイデンティティーを知っていれば、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるそれらの単離も可能である。
【００４５】
（Ｂ．バイオマーカー修飾型の使用）
タンパク質はしばしば、検出可能な異なる質量により特徴づけられた複数の異なる形態でサンプル中に存在することがわかっている。これらの形態は翻訳前および翻訳後のいずれか、あるいは両方での修飾による結果であり得る。翻訳前修飾型は、アレル変異体、スライス変異体、およびＲＮＡ編集体を含む。翻訳後修飾型は、タンパク質切断（例えば、親タンパク質の断片）、グリコシル化、リン酸化、脂質化、酸化、メチル化、シスチニル化、スルホン化およびアセチル化の結果生じる修飾型を含む。特定のタンパク質およびその全ての修飾型の集合を、本明細書中では「タンパク質クラスター」と呼ぶ。特定のタンパク質およびその全ての修飾型の集合のうち、当該特定のタンパク質以外のものを、本明細書中では「修飾タンパク質クラスター」と呼ぶ。本発明の任意のバイオマーカーの修飾型（表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−ＢおよびＶに示されるそれらのセットを含む）もそれら自体バイオマーカーとして使用可能である。修飾型は、診断において、タンパク質の非修飾型よりも優れた分別性能を示し得る場合もある。
【００４６】
表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−ＢまたはＶに示されるバイオマーカーなど表に示される任意のバイオマーカーを含むバイオマーカーの修飾型は、修飾型を検出し、バイオマーカーと区別できる任意の方法により最初に検出され得る。最初の検出のための好ましい方法は、まずバイオマーカーおよびその修飾型を、例えば生体特異的捕捉試薬を用いて捕捉し、次いでその捕捉されたタンパク質を質量分析により検出する工程を包含する。より具体的には、上記タンパク質を、上記バイオマーカーおよびその修飾型を認識する抗体、アプタマーまたはアフィボディ等の生体特異的捕捉試薬を用いて捕捉する。この方法によれば、タンパク質に結合しているか、そうでなければ抗体により認識され、それら自体バイオマーカーとなり得るタンパク質相互作用物が捕捉される。好ましくは、上記生体特異的捕捉試薬は固相へと結合される。次いで、その捕捉されたタンパク質をＳＥＬＤＩ質量分析により検出するか、または上記捕捉試薬から上記タンパク質を溶出させ、溶出したタンパク質を従来のＭＡＬＤＩにより、またはＳＥＬＤＩにより検出する。タンパク質の修飾型を、標識する必要なく質量に基づいて区別し、定量できるため、質量分析の使用は特に魅力的である。
【００４７】
好ましくは、上記生体特異的捕捉試薬はビーズ、プレート、膜またはチップなどの固相へと結合される。抗体等の生体分子を固相へとカップリングする方法は技術的によく知られている。それらは、例えば、二価性架橋試薬を利用することができる。または上記固相は、上記分子に触れて結合するであろうエポキシドまたはイミダゾール等の反応基により誘導体化され得る。異なる標的タンパク質に対する生体特異的捕捉試薬は同一の場所で混合することができるか、またはそれらは物理的に異なる規定可能な位置において固相に結合させることができる。例えば、誘導体ビーズを用いて、各カラムがある単一のタンパク質クラスターを捕捉できるように複数のカラムを詰めることができる。別の方法においては、各種のタンパク質クラスターに対する捕捉試薬を用いて誘導体化した、異なるビーズを用いて単一のカラムを充填することができ、それにより１箇所で全ての分析物を捕捉することができる。従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ社（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）のｘＭＡＰ技術等の抗体で誘導体化されたビーズをベースとする技術を、タンパク質クラスターを検出するために使用することができる。しかし、このような生体特異的捕捉試薬は、タンパク質クラスターを区別するために、クラスターのメンバーに対し特異的に用いられねばならない。
【００４８】
さらに別の実施形態において、バイオチップの表面は、タンパク質クラスターに対する捕捉試薬により、同一の場所で、または物理的に異なる規定可能な位置においてのいずれかにより誘導体化することができる。異なるクラスターを異なる規定可能な位置において捕捉することのひとつの有利な点は、分析がより単純になることである。
【００４９】
タンパク質の修飾型を同定し、対象の臨床パラメーターと相関させた後、上記の修飾型を本発明の任意の方法におけるバイオマーカーとして使用することができる。この時点で、修飾されたｆｒｏｍの検出は、アフィニティー捕捉後の質量分析、または特定の修飾型に対する従来のイムノアッセイを含む任意の特定の検出方法により達成できる。イムノアッセイは、分析物を捕捉するために、抗体等の生体特異的捕捉試薬を必要とする。さらに、上記アッセイは、タンパク質およびタンパク質の修飾型を特異的に区別するように設計されねばならない場合。このことは、例えば、ひとつの抗体が１以上の形態を捕捉し、はっきりと標識された第２の抗体が、各種形態と特異的に結合し、明確な検出を提供するサンドイッチアッセイを利用することにより行われる。抗体は上記生体分子で動物を免疫することにより生産できる。本発明はＥＬＩＳＡまたは蛍光をベースとするイムノアッセイ並びにその他の酵素イムノアッセイを含む、サンドイッチイムノアッセイ等の従来のイムノアッセイを意図する。
【００５０】
（ＩＩＩ．アルツハイマー病のバイオマーカーの検出）
本発明のバイオマーカーは任意の好適な方法により検出できる。この分野に利用され得る検出の実例は、光学的方法、電気化学的方法（ボルタンメトリーおよびアンペロメトリー技法）、原子間力顕微鏡、および無線周波数法、例えば、多極化共鳴スペクトル法を含む。光学的方法の実例は、顕微鏡法に加えて、共焦点および非共焦点の、蛍光、発光、化学発光、吸収、反射率、透過率、および複屈折または屈折率検出法（例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、グレーチングカプラー導波管法または干渉法）の検出がある。
【００５１】
ある実施形態において、サンプルをバイオチップにより分析する。バイオチップは通常固体の基質を含み、通常平面的な表面を有して、そこに捕捉試薬（吸着剤またはアフィニティー試薬とも称する）が付着する。しばしば、バイオチップの表面は複数の規定可能な配置を含み、その各々が、そこに結合した捕捉試薬を有する。
【００５２】
「プロテインバイオチップ」は、ポリペプチドの捕捉に対し適合したバイオチップをいう。多くのプロテインバイオチップが技術的に記述されている。これらは例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ  ＣＴ）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）、Ｐｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）およびＢｉａｃｏｒｅ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により生産されるプロテインバイオチップを含む。プロテインバイオチップの例は以下の特許または公開された特許出願において記述されている：米国特許第６，２２５，０４７号；国際公開第９９／５１７７３号パンフレット；米国特許第６，３２９，２０９号、国際公開第００／５６９３４号パンフレットおよび米国特許第５，２４２，８２８号。
【００５３】
（Ａ．質量分析法による検出）
好ましい実施形態において、本発明のバイオマーカーは、気相のイオンを検出するために質量スペクトロメータを利用する方法である質量分析により検出される。質量スペクトロメータの例は、飛行時間型、磁場型、四重極フィルター型、イオン捕捉型、イオンサイクロトロン共鳴、静電場分析機およびこれらの融合型である。
【００５４】
さらに好ましい方法において、上記質量スペクトロメータはレーザー脱離／イオン化質量スペクトロメータである。レーザー脱離／イオン化質量分析において、質量スペクトロメータのプローブインターフェースを連動させるため、および検体にイオン化のためのイオン化エネルギーを与えて質量スペクトロメータ中に導入するために適合させたデバイスである質量分析プローブの表面に分析物を設置する。レーザー脱離質量スペクトロメータは、典型的には紫外線レーザー由来であるが、赤外線レーザーにも由来するレーザーエネルギーを利用し、表面から分析物を脱離させ、揮発させ、およびそれらをイオン化して質量スペクトロメータのイオンを光学的に捕えることを可能にさせる。
【００５５】
（１．ＳＥＬＤＩ）
本発明で使用するための好ましい質量スペクトルの技法は、例えば、ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐの両者により米国特許第５，７１９，０６０号および同第６，２２５，０４７号に記載されるような「表面増強レーザー脱離およびイオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）」または「ＳＥＬＤＩ」である。これは、脱離／イオン化気相イオン質量スペクトル法（例えば、質量分析）の１方法で、検体（ここでは、１以上の上記バイオマーカー）がＳＥＬＤＩ質量分析プローブの表面上に捕捉されるものをさす。ＳＥＬＤＩにはいくつかの種類が存在する。
【００５６】
ＳＥＬＤＩの１つの種類は「アフィニティー捕捉質量分析」と称される。これはまた「表面増強アフィニティー捕捉法（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ）」または「ＳＥＡＣ」とも称する。この方法は、物質と検体との間の非共有結合的な親和性相互作用（吸着）を通じて検体を捕捉する該物質をプローブ表面に有するプローブの使用を含む。この物質は「吸着剤」「捕捉試薬」「親和性試薬」または「結合部分」など、様々に称される。このようなプローブは「アフィニティー捕捉プローブ」として、および「吸着剤表面」を有するものとして言及され得る。上記捕捉試薬は検体と結合可能な任意の物質であり得る。この捕捉試薬は選択的表面の基質に直接的に結合することができ、または上記基質は、例えば、共有結合または配位的共有結合を形成するための反応を通じて、捕捉試薬と結合可能な反応分子を有する反応表面を有することができる。エポキシドおよびカルボジイミドは、抗体等のポリペプチド捕捉試薬または細胞レセプターと共有結合するための有用な反応部分である。ニトロ酢酸およびイミノ２酢酸は、ヒスチジン含有ペプチドと非共有結合的に相互作用する金属イオンと結合するキレート剤として機能する、有用な反応部分である。吸着剤は通常、クロマトグラフィー吸着剤および生体特異的吸着剤として分類される。
【００５７】
「クロマトグラフィー吸着剤」は、通常クロマトグラフィーで使用される吸着剤物質をさす。クロマトグラフィー吸着剤には、例えば、イオン交換物質、金属キレート物質（例えば、ニトロ酢酸またはイミノ２酢酸）、固定化金属キレート、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、単純な生体分子（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、単純な糖類および脂肪酸）および混合モードの吸着剤（例えば、疎水性吸引力／静電反発力吸着剤）を含む。
【００５８】
「生体特異的吸着剤」は、例えば、ヌクレオチド分子（例えば、アプタマー）、ポリペプチド、ポリサッカライド、脂質、ステロイドまたはこれらのコンジュゲート（結合体）（例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸（例えば、ＤＮＡ）−タンパク質コンジュゲート）等の生体分子を含む吸着剤をいう。ある種の例においては、上記生体特異的吸着剤は、複数タンパク質複合体、生体膜またはウイルス等の巨大分子構造であり得る。生体特異的吸着剤の例は抗体、レセプタータンパク質および核酸である。生体特異的吸着剤は、通常、標的の検体に対し、クロマトグラフィー吸着剤よりも高い特異性を有する。ＳＥＬＤＩにおいて使用するための吸着剤のさらなる例は、米国特許第６，２２５，０４７号中にある。「生物選択的吸着剤」とは、少なくとも１０−８Ｍの親和性で検体と結合する吸着剤をいう。
【００５９】
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社により生産されるプロテインバイオチップは、規定可能な配置でそれらに付着したクロマトグラフィー的な、または生体特異的な吸着剤を有する表面を含む。Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎプロテインチップ（登録商標）アレイは、ＮＰ２０（疎水性）；Ｈ４およびＨ５０（疎水性）；ＳＡＸ−２、Ｑ−１０およびＬＳＡＸ−３０（インイオン交換）；ＷＣＸ−２、ＣＭ−１０およびＬＷＣＸ−３０（陽イオン交換）；ＩＭＡＣ−３、ＩＭＡＣ−３０およびＩＭＡＣ４０（金属キレート）；およびＰＳ−１０、ＰＳ−２０（カルボジイミド、ｅｘｐｏｘｉｄｅとの反応表面）およびＰＧ−２０（カルボジイミドを通じてカップリングしたプロテインＧ）を含む。疎水性プロテインチップアレイは、イソプロピルまたはノニルフェノキシ−ポリ（エチレングリコール）メタクリレート機能性を有する。陰イオン交換プロテインチップアレイは、第４級アンモニウム機能性を有する。陽イオン交換プロテインチップアレイは、カルボン酸機能性を有する。固定化された金属キレートプロテインチップアレイは、銅、ニッケル、亜鉛およびガリウム等の遷移金属イオンをキレート化により吸着するニトロ酢酸機能性を有する。予め活性化したプロテインチップアレイは、共有結合のためにタンパク質上の基と反応し得るカルボジイミドまたはエポキシド官能基を有する。
【００６０】
このようなバイオチップは、：米国特許第６，５７９，７１９号（ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ、「Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（保持クロマトグラフィー）」、２００３年６月１７日）；国際公開第００／６６２６５（Ｒｉｃｈら、「Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｇａｓ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（気相イオンスペクトロメータのためのプローブ）」、２０００年１１月９日）；米国特許第６，５５５，８１３号（Ｂｅｅｃｈｅｒら、「Ｓａｍｐｌｅ  Ｈｏｌｄｅｒ  ｗｉｔｈ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｃｏａｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｇａｓ  Ｐｈａｓｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（気相質量スペクトロメータのための疎水性コーティングを有するサンプルホルダー）」、２００３年４月２９日）；米国特許出願公開第２００３００３２０４３Ａ１号（ＰｏｈｌおよびＰａｐａｎｕ、「Ｌａｔｅｘ  Ｂａｓｅｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｎｔ  Ｃｈｉｐ（ラテックスをベースとして吸収剤チップ）」、２００２年７月１６日）；および国際公開第０３／０４０７００号（Ｕｍら、「Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｈｉｐ（疎水性表面チップ）」、２００３年５月１５日）；米国特許仮出願第６０／３６７，８３７号（Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉら、「Ｂｉｏｃｈｉｐｓ  Ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ（ポリサッカライドをベースとしたヒドロゲルにより被覆された表面を有するバイオチップ）」、２００２年５月５日）および「Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ」と題された米国特許出願第６０／４４８，４６７号（Ｈｕａｎｇら、２００３年２月２１日出願）においてさらに記述されている。
【００６１】
通常、吸着剤表面を有するプローブを、サンプル中に存在するであろう単数または複数のバイオマーカーを上記吸着剤へと結合させ得るために十分な時間、サンプルと接触させる。インキュベーション時間終了後、非結合物質を除去するために基質を洗浄する。任意の好適な洗浄溶液を使用することができ、好ましくは水性溶液を利用する。洗浄のストリンジェンシーを調整することにより、どの分子が結合を維持するかという範囲を操作することができる。洗浄溶液の溶出特性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピック性、界面活性剤強度および温度に依存する。上記プローブがＳＥＡＣおよびＳＥＮＤ特性（本明細書中に記述されるような）の両者を有しない場合は、結合したバイオマーカーを伴う基質に対してエネルギー吸収分子が適用される。
【００６２】
上記基質へと結合したバイオマーカーを、飛行時間型質量スペクトロメータなどの気相イオンスペクトロメータにおいて検出する。このバイオマーカーをレーザー等のイオン源によりイオン化し、生成されたイオンをイオン光学アセンブリにより回収し、次いで質量分析器が通過するイオンを分散させて分析する。検出器は次いで、検出されたイオンの情報を質量対電荷比に変える。バイオマーカーの検出は、通常シグナル強度の検出を含む。従って、バイオマーカーの量および質量の両者が決定され得る。
【００６３】
ＳＥＬＤＩのその他の種類は、プローブ表面に化学的に結合しエネルギー吸着分子を有するプローブ（「ＳＥＮＤプローブ」）の使用を含む表面増強ニート脱離（ＳＥＮＤ）である。この文言「エネルギー吸着分子」（ＥＡＭ）とは、レーザー脱離／イオン化源からのエネルギーを吸着でき、その後に検体分子と接触し、それと共に、その脱離およびイオン化に寄与することができる分子を意味する。上記ＥＡＭの区分はＭＡＬＤＩにおいてしばしば「マトリックス」と称され使用される分子を含み、桂皮酸誘導体、シナピン酸（ＳＰＡ）、シアノヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）およびジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、およびヒドロキシアセトフェノン誘導体により例示される。ある種の実施形態において、上記エネルギー吸着分子は、直鎖上、または、例えばポリメタクリレート等の架橋された重合体へと取り込まれる。例えば、この組成物は、α−シアノ−４−メタクリロイルオキシ桂皮酸およびアクリラートの共重合体であり得る。別の実施形態において、上記組成物は、α−シアノ−４−メタクリロイルオキシ桂皮酸、アクリラート、および３−（トリエトキシ）シリルプロピルメタクリレートの共重合体である。別の実施形態において、上記組成物は、α−シアノ−４−メタクリロイルオキシ桂皮酸およびオクタデシルメタクリレート（「Ｃ１８  ＳＥＮＤ」）の共重合体である。ＳＥＮＤは、米国特許第６，１２４，１３７号および国際公開第０３／６４５９４号パンフレット（Ｋｉｔａｇａｗａ、「Ｍｏｎｏｍｅｒｓ  Ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｈａｖｉｎｇ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  Ｍｏｉｅｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｉｎ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ（検体の脱離／イオン化において使用されるエネルギー吸着分子を有するモノマーおよびポリマー）」、２００３年８月７日）においてさらに記述されている。
【００６４】
ＳＥＡＣ／ＳＥＮＤは、捕捉試薬およびエネルギー吸着分子の両方が、サンプルが存在する表面へと付着するＳＥＬＤＩの１種類である。従って、ＳＥＡＣ／ＳＥＮＤプローブは、外部マトリックスを適用する必要なしに、アフィニティー捕捉およびイオン化／脱離を通じて分析物を捕捉することを可能にする。Ｃ１８ＳＥＮＤバイオチップは、捕捉試薬として機能するＣ１８部分およびエネルギー吸着分子として機能するＣＨＣＡ部分を含むＳＥＡＣ／ＳＥＮＤの１種である。
【００６５】
表面増強不耐光性付着離脱（Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（ＳＥＰＡＲ）と称される、ＳＥＬＤＩのその他の種類は、分析物に共有結合的に結合し、次いで例えばレーザー等の光に曝した後にこの部分の不耐光性の結合が破壊されることを通じて分析物を遊離させることができる表面付着部分を有するプローブを含む（米国特許第５，７１９，０６０号参照）。ＳＥＰＡＲおよびその他の形態のＳＥＬＤＩは、単数または複数のバイオマーカープロファイルの検出に対し容易に適合し、本発明に準拠する。
【００６６】
（２．その他の質量分析方法）
その他の質量分析方法において、上記バイオマーカーを最初に、上記バイオマーカーに結合するクロマトグラフィー特性を有するクロマトグラフィー樹脂上に捕捉する。本発明の実施例において、これは多様な方法を含み得る。例えば、上記バイオマーカーはＣＭ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ樹脂等の陽イオン交換樹脂上に捕捉することができ、樹脂を洗浄し、ＭＡＬＤＩによって上記バイオマーカーを溶出させ検出することができる。別の方法においては、この方法は、陽イオン交換樹脂に供する前に陰イオン交換樹脂上でのサンプル分画を先に行うことができる。別の方法においては、陰イオン交換樹脂およびＭＡＬＤＩによる検出を直接的に行うことができる。さらにその他の方法においては、上記バイオマーカーに結合する抗体を含むイムノクロマトグラフィー樹脂上に上記バイオマーカーを捕捉し、非結合物質を除去するために上記樹脂を洗浄し、上記樹脂から上記バイオマーカーを溶出させて、上記の溶出したバイオマーカーをＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩにより検出することができる。
【００６７】
（３．データ分析）
飛行時間型質量分析による検体の分析は、飛行時間型スペクトルを生成する。最終的に分析される飛行時間型スペクトルは、通常、サンプルに対するイオン化エネルギーの単パルス由来のシグナルを示さず、むしろ多数のパルス由来シグナルの合計を示す。このことがノイズを減らし、ダイナミックレンジを増加させる。この飛行時間型データを、次いでデータ処理に供する。ＣｉｐｈｅｒｇｅｎのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアにおいて、データプロセスは通常、質量スペクトルを生成するためのＴＯＦからＭ／Ｚへの変換と、装置上の補正値を消去するためのベースライン減算、および高頻度なノイズを低減するためのフィルタリングを含む。
【００６８】
脱離およびバイオマーカーの検出によって生成したデータは、プログラムされたデジタルコンピュータの使用により分析され得る。上記コンピュータプログラムは、検出されたバイオマーカーの数と、所望により、検出された各バイオマーカーのシグナルの強度および決定された分子質量とを示すためにデータを分析する。データ分析は、バイオマーカーのシグナル強度を決定するステップおよび、予め決められた統計学的な分布から逸脱したデータを除去するステップを包含し得る。例えば、いくつかの参照値に対し各ピークの高さを計算することで、観察されたピークを標準化することができる。参照値は装置およびエネルギー吸着分子等の化学薬品等により生じるバックグラウンドノイズであり得、尺度においてそれをゼロに設定する。
【００６９】
上記コンピュータは、得られたデータを表示用の多様な形態に変換することができる。標準的なスペクトルを表示することができるが、１つの有用な形態では、スペクトル画面からピーク高さおよび質量情報のみを保持し、よりはっきりとしたイメージが得られるようにし、ほぼ同じ分子量をもつバイオマーカーがよりわかるようになっている。その他の有用な形式においては、２またはそれ以上のスペクトルが比較され、サンプル間で正に調節されているまたは負に調節されている固有の単一または複数のバイオマーカーが簡便に強調される。これらの任意の形式を用いて、サンプル中に特定のバイオマーカーが存在するか否かを迅速に調べることができる。
【００７０】
分析は、通常、分析物からのシグナルを表すスペクトル中のピークの同定を伴う。ピークの選択は視覚的に行うことができるが、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）ソフトウェアパッケージの一部として、ピークの検出を自動化できるソフトウェアを利用することができる。一般にこのソフトウェアは、選択された閾値を越えるシグナル対ノイズ比を有するシグナルを同定し、上記のピークシグナルの質量中心においてピーク質量をラベルすることにより機能する。１つの有用な応用において、上記質量スペクトルにおいて選択されたパーセンテージで存在する同一のピークを同定するために、多くのスペクトルが比較される。このソフトウェアの１つのバージョンは、定義された質量範囲内の各種のスペクトル中に現れる全てのピークをクラスター化し、全てのそのピークに、質量（Ｍ／Ｚ）クラスターの質量中心付近の質量（Ｍ／Ｚ）を割り振る。
【００７１】
データを分析するために使用するソフトウェアは、そのシグナルが本発明のバイオマーカーに相当するシグナル中のピークを表しているか否かを調べるための、シグナルを分析するためのアルゴリズムを使用するコードを含み得る。上記ソフトウェアはまた、実験下で特定の臨床パラメーターの状態を示すバイオマーカーピークまたはバイオマーカーピークの組み合わせが存在するか否かを調べるために、観察されるバイオマーカーのピークを分類ツリーまたはＡＮＮ分析に供することができる。データの分析は、サンプルの質量スペクトル分析から直接的または間接的に得られる各種のパラメーターに「入力され得る」。これらのパラメーターは、以下に限定されるものではないが、１以上のピークの存在下または非存在下、ピークまたはピーク群の形状、１以上のピークの高さ、１以上のピークの高さの対数、およびその他のピーク高さデータの算術的操作を含む。
【００７２】
（４．アルツハイマー病バイオマーカーのＳＥＬＤＩ検出のための一般的プロトコール）
本発明のバイオマーカーを検出するための好ましいプロトコールは以下である。試験するサンプルを、表ＩおよびＩＩにも示すような、陽イオン交換吸着剤（好ましくはＣＭ−１０またはＷＣＸ−２プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））、陰イオン交換吸着剤（好ましくはＱ−１０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））、疎水性交換吸着剤（好ましくはＨ５０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））および／またはＩＭＡＣ吸着剤（好ましくはＩＭＡＣ３０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社））を含むアフィニティー捕捉プローブと接触させる。非結合分子を洗い落とす間に、バイオマーカーを保持するであろうバッファーで上記プローブを洗浄する。各バイオマーカーに対し好適な洗浄の例は、実施例および表Ｉにおいて同定されたバッファーである。上記バイオマーカーはレーザー脱離／イオン化質量分析により検出される。
【００７３】
いくつかの例において、例えば血清等の上記サンプルを、ＳＥＬＤＩ分析前に予備的分画に供する。このことはサンプルを単純化し、また感度を向上させる。予備的分画の好ましい方法は、サンプルをＱ  ＨｙｐｅｒＤ（ＢｉｏＳｅｐｒａ、ＳＡ）等の陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させる工程を包含する。次いで、上記結合物質をｐＨ９、ｐＨ７、ｐＨ５およびｐＨ４のバッファーを用いてステップワイズなｐＨ溶出に供する（実施例１−バッファーリスト）。（バイオマーカーが溶出する画分を例えば表Ｉ中に示す）。上記バイオマーカーを含む各種画分を回収する。その後、上記バイオマーカーを含む上記の各種画分を上述のＳＥＬＤＩ分析に供する。
【００７４】
別の方法においては、上記バイオマーカーを認識する抗体を入手できる場合、例えばβ２−ミクログロブリン、シスタチン、トランスフェリン、トランスサイレチン、ヘモペキシン、ＷＴ  ＡＢｒｉ／ＡＤａｎアミロイドペプチド、完全長シスタチンＣ、シスタチンＣΔＮ１−８、神経分泌タンパク質ＶＧＦのＮ−末端断片、補体３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ、神経内分泌タンパク質７Ｂ２のＣ−末端断片、およびセクレトニューリンの場合、これらは予め活性化したＰＳ１０またはＰＳ２０プロテインチップアレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）等のプローブ表面に付着し得る。これらの抗体はサンプル由来のバイオマーカーを上記プローブ表面へと捕捉することができる。次いで、上記バイオマーカーを、例えばレーザー脱離／イオン化質量分析により検出し得る。
【００７５】
（Ｂ．イムノアッセイによる検出）
別の実施形態において、本発明のバイオマーカーはイムノアッセイにより測定することができる。イムノアッセイは、上記バイオマーカーを捕捉するために抗体等の生体特異的捕捉試薬を必要とする。抗体は、技術的によく知られた方法により、例えば、動物を上記バイオマーカーで免疫することにより生産することができる。バイオマーカーは、それらの結合特性に基づいてサンプルから単離することができる。別の方法においては、ポリペプチドバイオマーカーのアミノ酸配列が未知である場合、上記ポリペプチドを技術的によく知られた方法により合成し、また抗体を生成するために使用することができる。
【００７６】
本発明は、例えば、ＥＬＩＳＡまたは蛍光をベースとするイムノアッセイならびにその他の酵素イムノアッセイを含むサンドイッチイムノアッセイ等を含む従来のイムノアッセイを意図する。上記ＳＥＬＤＩをベースとするイムノアッセイにおいて、上記バイオマーカーのための生体特異的捕捉試薬は予め活性化されたプロテインチップアレイ等のＭＳプローブの表面に付着される。上記バイオマーカーは次いで、この試薬を通じてバイオチップ上に特異的に捕捉され、上記の捕捉されたバイオマーカーは質量分析により検出される。
【００７７】
（ＩＶ．被験体のアルツハイマー病における状態の判定）
（Ａ．単独マーカー）
本発明のバイオマーカーは、例えばアルツハイマー病を診断するために、被験体におけるアルツハイマー病の病態を判断するための診断テストに使用することができる。「アルツハイマー病の病態」という語句は、とりわけ、アルツハイマー病と非アルツハイマー病、および、特に、アルツハイマー病と非アルツハイマー病の正常、またはアルツハイマー病と非アルツハイマー性痴呆を区別することを含む。この病態に基づいて、付加的な診断テストまたは治療手順または処方計画を含むさらなる方法が示され得る。
【００７８】
正確に病態を予測するための診断テストの検出力は、上記アッセイの感度、上記アッセイの特異度、または受信者動作特性（「ＲＯＣ」）曲線下面積として共通に測定される。感度は、試験により陽性であると予測される真の陽性の割合であり、一方、特異度は、試験により陰性であると予測される真の陰性の割合である。ＲＯＣ曲線は、１−特異度の関数により、テストの感度を提供する。ＲＯＣ曲線下面積が大きくなるほど、テストの予想される値は説得力が増す。テストの有効性を測定するその他の有用な測定は、陽性予測値および陰性予測値である。陽性予測値は陽性としてテストしたものにおける実際の陽性の割合である。陰性予測値は陰性としてテストしたものにおける実際の陽性の割合である。
【００７９】
本発明のバイオマーカーは、異なるアルツハイマー病の病態において、少なくともｐ≦０．０５、ｐ≦１０−２、ｐ≦１０−３、ｐ≦１０−４またはｐ≦１０−５の統計学的に有意な差異を示す。これらのバイオマーカーを単独または君合わせで使用する診断テストは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％および約１００％の感度および特異度を示す。
【００８０】
表Ｉ、ＩＩおよびＩＶに列挙されたバイオマーカーは、アルツハイマー病において異なる量で存在し、したがってそれぞれが個々に、アルツハイマー病の病態の診断を助けるのに有用である。上記方法は、第１に、例えば、ＳＥＬＤＩバイオチップ上へ捕捉し、それに次いで質量分析により検出する等の本明細書中に記述された方法を用いて被験体サンプル中の選択されたバイオマーカーを測定すること、および、第２に、診断的な量により、または陽性なアルツハイマー病の病態を陰性なアルツハイマー病の病態から区別するカットオフにより、測定値を比較する工程、を包含する。上記の診断的な量は、被験体が特定のアルツハイマー病の病態を有するとして分類されるよりも多いまたは少ないバイオマーカーの測定量を表す。例えば、上記バイオマーカーが、アルツハイマー病との間に正常と比較して正に調節されている場合、診断的カットオフを超える量の測定量はアルツハイマー病の診断を提供する。別の方法においては、上記バイオマーカーが、アルツハイマー病の間に正常と比較して負に調節されている場合、診断的カットオフを下回る量の測定量はアルツハイマー病の診断を提供する。
【００８１】
同様に、上記バイオマーカーが、非アルツハイマー性痴呆との間に正常と比較して正に調節されている場合、診断的カットオフを超える量の測定量は非アルツハイマー性痴呆の診断を提供する。別の方法においては、上記バイオマーカーが、非アルツハイマー性痴呆との間に正常と比較して負に調節されている場合、診断的カットオフを下回る量の測定量は非アルツハイマー性痴呆の診断（すなわち、アルツハイマー病は陰性であるという診断）を提供する。
【００８２】
当該分野でよく理解されているように、アッセイにおいて使用される特定の診断的カットオフを調整することにより、診断医の好みに応じて診断的アッセイの感度または特異度を増加させることができる。上記の特定の診断的カットオフを、例えば、ここで行われたように、異なるアルツハイマー病の病態を伴う被験体由来の統計学的に顕著な多数のサンプルにおいてバイオマーカーの量を測定することにより、および、診断医の所望するレベルの特異度および感度へと適合させるためにカットオフを引き下げることにより、決定することができる。
【００８３】
（Ｂ．マーカーの組み合わせ）
個々のバイオマーカーが有用な診断用バイオマーカーである一方で、バイオマーカーの組み合わせが、単独のバイオマーカーよりも大きい、特定の状態における予測値を提供し得ることが見出されている。具体的には、サンプル中の複数のバイオマーカーの検出が、テストの感度および／または特異度を増加させ得る。
【００８４】
実施例に記述されるプロトコールが、アルツハイマー病および非痴呆と診断された患者サンプル由来の質量スペクトルを生成させるために使用された。そのピーク質量および高さを見出されたデータセットへと抽出した。分類および回帰ツリー（Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｒｅｅ）分析（ＣＡＲＴ）（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐａｔｔｅｒｎｓ  ＳｏｆｔｗａｒｅＴＭ）を利用するアルゴリズムの学習を訓練するために、このデータセットを使用した。特に、ＣＡＲＴは、多くのピークのサブセットをランダムに選択した。各サブセットに関して、ＣＡＲＴは、アルツハイマー病または非アルツハイマー病としてサンプルを分類するための最良のまたは最良に近い判定の樹状図を生成した。ＣＡＲＴにより生成される多くの判定の樹状図において、いくつかのものは、アルツハイマー病を非アルツハイマー病から区別することにおいて優れた感度および特異度を有していた。
【００８５】
事例としての判定の樹状図を図２に示す。この樹状図はＭ１１７５３．４（β２ミクログロブリン、図中「Ｂ２Ｍ」）、Ｍ６０９７６．２（ヘモペキシン、図中「ＨＰＸ」）、Ｍ１３３９１（シスタチンＣ、図中「ＣｙｓＣ」）、Ｍ１１．１ＫおよびＭ９．７Ｋを使用する。従って、これらのバイオマーカーは、互いに組み合わせて、および、所望によりその他のバイオマーカーと組み合わせて使用されたときに、アルツハイマー病に対する強力な分類要因として認識される。特に、例えば、Ｍ７８６７７．３（トランスフェリン）、Ｍ２４３２．２（ＷＴ  ＡＢｒｉ／ＡＤａｎアミロイドペプチド）、Ｍ１２５８３．４（シスタチンＣΔＮ１−８）、Ｍ３６８７．７（神経分泌タンパク質ＶＧＦのＮ−末端断片）；Ｍ３９５１．６（神経分泌タンパク質ＶＧＦのＮ−末端断片）、Ｍ８９３３．２（補体３ａ  ｄｅｓ−Ａｒｇ）、Ｍ３５１４．５（神経内分泌タンパク質７Ｂ２のＣ−末端断片）およびＭ３６８０．７（セクレトニューリン）と共に、またはさらにそれらと組み合わせて使用されるとき、これらのマーカーは、少なくとも８９％の感度と少なくとも８６％の特異度を伴ってアルツハイマー病を非アルツハイマー病から識別できる。
【００８６】
判定の樹状図における詳細、特に分岐の決定に使用するカットオフ値は、見出されるデータセットを生成するために使用されるアッセイの詳細に依存することは特筆すべきでもある。本分析に用いられ、データを生成したアッセイのデータ取得パラメーターを実施例３に提供する。例えば、新たなサンプルセットまたは異なるアッセイプロトコールから分類アルゴリズムを開発することにおいて、オペレーターは、これらのバイオマーカーを検出するプロトコールを使用し、また、それらを含むための学習アルゴリズムを打ち込む。
【００８７】
図２に示される判定の樹状図において、Ｍ１１７５３．４（β２ミクログロブリン、図中「Ｂ２Ｍ」）、Ｍ６０９７６．２（ヘモペキシン、図中「ＨＰＸ」）、Ｍ１３３９１（シスタチンＣ、図中「ＣｙｓＣ」）、Ｍ１１．１ＫおよびＭ９．７Ｋは、アルツハイマー病と非アルツハイマー病とを分類するために組み合わせたとき特に有用である。この組み合わせは、図２に示す帰納的分配プロセスにおいて得に有用である。再び、各カットオフ測定値は、当然ながら個々のアッセイプロトコールに依存する。この場合において上記カットオフは、実施例３に示されるプロトコールに基づく。
【００８８】
この判定の樹状図において、Ｂ２Ｍは根となるノードである。カットオフを超える（すなわち、Ｍ１１７５３．４≦１．４８２）一定量のこのバイオマーカーを有する被験体はＣｙｓＣに基づいてノード４へと送られる。
【００８９】
カットオフを下回る量（すなわち、ＣｙｓＣ≦２．０７１）のＭ１３３９１を有する被験体は、アルツハイマーとして分類される。カットオフを超える量（すなわち、ＣｙｓＣ≦２．０７１）のＭ１３３９１を有する被験体は、Ｍ９．７Ｋに基づいてノード５へと送られる。
【００９０】
カットオフを下回る量（すなわち、Ｍ９．７Ｋ≦０．２９３）のＭ９．７Ｋを有する被験体は、正常として分類される。カットオフを超える量（すなわち、Ｍ９．７Ｋ≦０．２９３）のＭ９．７Ｋを有する被験体は、アルツハイマー病として分類される。
【００９１】
カットオフを下回る量（すなわち、Ｍ１１７５３．４≦１．４８２）のＢ２Ｍを有する被験体は、ＨＰＸに基づいてノード２へと送られる。
【００９２】
カットオフを超える量（すなわち、Ｍ６０９７６．２≦０．０６３）のＨＰＸを有する被験体は、アルツハイマーとして分類される。カットオフを下回る量（すなわち、Ｍ６０９７６．２≦０．０６３）のＨＰＸを有する被験体は、Ｍ１１．１Ｋに基づいてノード３へと送られる。
【００９３】
カットオフを下回る量（すなわち、Ｍ１１．１Ｋ≦２．６５９）のＭ１１．１Ｋを有する被験体は、正常と分類される。カットオフを下回る量（すなわち、Ｍ１１．１Ｋ≦２．６５９）のＭ１１．１Ｋを有する被験体は、アルツハイマー病として分類される。
【００９４】
図２に示されるように、この判定の樹状図は約８９％の感度、および約８６％の特異度を有する。
【００９５】
（Ｃ．進行性疾患のリスク判定）
ある実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病の進行のリスクを調べるための方法を提供する。バイオマーカーの量またはパターンは、例えば高い、中程度の、低い等の各種のリスク状態において特徴的である。アルツハイマー病の進行リスクは、適切な単一のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーを測定すること、および、次いでそれらを分類アルゴリズムへと供し、または特定のリスクレベルと関連している対照量のバイオマーカーおよび／またはバイオマーカーのパターンと比較することにより、決定される。
【００９６】
（Ｄ．疾患における段階の判定）
ある実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病の段階を調べるための方法を提供する。上記疾患の各段階は、特徴的な量のバイオマーカーまたはバイオマーカーのセットの相対量（パターン）を有する。疾患の上記段階は、適切な単数のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーを測定すること、および次いでそれらを分類アルゴリズムへと供し、または特定の段階と関連している対照量のバイオマーカーおよび／またはバイオマーカーのパターンと比較することにより、決定される。
【００９７】
（Ｅ．疾患における経過（進行／寛解）の判定）
ある実施形態において、本発明は、被験体におけるアルツハイマー病の経過を調べるための方法を提供する。疾患の経過は、疾患の進行（悪化）および疾患の逆行（改善）を含む、長期にわたる疾患状態の変化をさす。長期にわたり、バイオマーカーの量又相対量（例えば、パターン）は変化する。例えば、バイオマーカーＭ９９８４．６およびＭ１０２６５．６（表ＩＶ−Ｂ）の濃度はアルツハイマーの患者由来のサンプルにおいて増加し、一方、ヘモペキシンの濃度はアルツハイマーの患者由来のサンプルにおいて減少する。したがって、疾患または非疾患に向かう長期的な増加または減少のいずれかのこれらのマーカーの傾向は、上記疾患の経過を示す。従って、この方法は被験体における１以上のバイオマーカーを少なくとも２つの異なる時点、例えば、最初の時と２度目の時に測定する工程を包含し、および量における変化があればそれを比較する工程を包含する。疾患の経過はこれらの比較に基づいて調べられる。同様に、この方法は、治療に対する応答を調べるために有用である。治療が効果的である場合、上記バイオマーカーは正常に近づくであろうし、一方、治療が効果的でない場合、上記バイオマーカーは疾患を示す方へと向かうであろう。
【００９８】
（Ｆ．被験体の管理）
アルツハイマー病の病態の認定における上記方法のある種の実施形態において、上記方法は被験体の治療を管理する工程をさらに包含する。このような管理には、内科医または臨床医学者の行為と、それに続くアルツハイマー病の病態の決定を含む。例えば、内科医がアルツハイマー病の診断を行い、次いでコリンエステラーゼインヒビターの処方または投与等のある種の治療計画を立てる場合、抗グルタミン酸作動性治療または酸化防止剤がそれに続き得る。別の方法においては、非アルツハイマー病または非アルツハイマー性痴呆の診断は、患者が患うであろう特定の痴呆を調べるためのさらなるテストが続き得るだろう。診断テストがアルツハイマー病の病態における最終的な結果を与えない場合にも、更なるテストが要求され得るだろう。
【００９９】
本発明のさらなる実施形態は、例えば技術者、内科医または患者に対しての、アッセイ結果または診断または両方におけるコミュニケーションに関連する。ある種の実施形態において、例えば内科医および彼らの患者等の当事者にアッセイ結果または診断または両方を情報伝達するためにコンピュータが使用される。いくつかの実施形態において、結果または診断が情報伝達される国または管轄とは異なる国または管轄において上記アッセイが実行され、または上記アッセイ結果が分析される。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態において、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、Ｂおよび表Ｖにおける任意の上記バイオマーカーのテスト被験体における存在または非存在に基づく診断は、上記診断が得られた後、できる限り早く被験体へと情報伝達される。上記診断は、被験体の治療をする内科医により、上記被験体へと情報伝達され得る。別の方法においては、診断はテストの被験体へと送付され、電子メールまたは電話により被験体への情報伝達がなされる。コンピュータは、電子メールまたは電話により診断を情報伝達するために使用することができる。ある種の実施形態において、診断テストの結果を含むメッセージを生成し、およびテレコミュニケーションにおける当業者になじみ深いであろうコンピュータハードウエアおよびソフトウェアの組み合わせを用いて、自動的に被験体に届けることができる。ヘルスケア指向のコミュニケーションシステムの１例が米国特許第６，２８３，７６１号に記述されている；しかし、本発明はこの特定のコミュニケーションシステムを利用する方法に限定されない。本発明の方法におけるある種の実施形態において、サンプルをアッセイし、疾患を診断しおよびアッセイ結果または診断を情報伝達することを包含する上記方法のステップの全てまたはいくつかは、様々な方法（例えば、外国）範囲で実行され得る。
【０１０１】
（Ｖ．アルツハイマー病の病態を認定するための分類アルゴリズムの生成）
いくつかの実施形態において、「既知のサンプル」等のサンプルを用いて生成されたスペクトル（例えば、質量スペクトルまたは飛行時間型スペクトル）に由来するデータを、分類モデルを「訓練する」ために使用することができる。「既知のサンプル」は、予め分類されているサンプルである。上記スペクトルに由来し、また上記分類モデルを形成するために使用されるデータは、「トレーニングデータ」として参照される。ひとたび訓練されると、分類モデルは、未知のサンプルを使用して生成されたスペクトル由来のデータにおけるパターンを認識できるようになる。上記分類モデルを次いで、未知のサンプルを階級に分類するために使用することができる。このことは、例えば、特定の生体サンプルがある種の生物学的状態（例えば、疾患状態と非疾患状態）に関連しているか否かを予測することにおいて有用であり得る。
【０１０２】
分類モデルを形成するために使用される上記のトレーニングデータのセットは、生データまたは前処理されたデータを含み得る。いくつかの実施形態において、生データは飛行時間型スペクトルまたは質量スペクトルから直接的に得ることができ、および次いで所望により、上述のように「前処理」され得る。
【０１０３】
分類モデルは、データ中の目的パラメーターに基づいてデータの実体を階級へと分離することを試みる任意の好適な統計学的分類（または「訓練」）方法を用いて形成することができる。分類方法は監視することもでき、または監視しないこともできる。監視するおよび監視しない分類プロセスの例は、Ｊａｉｎ、「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ（統計学的パターン認識：総説）」、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２２、Ｎｏ．１、Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００、中に記載され、ここにおける教示を参照により組み込むものとする。
【０１０４】
監視された分類において、既知の階級のそれぞれを定義する１以上のセットの関係を学習する訓練メカニズムへ、既知のカテゴリーの例を含むトレーニングデータが与えられる。新たなデータは上記訓練メカニズムへと適用され得、それは次いでその新たなデータを学習した関係を用いて分類する。監視された分類プロセスの例には、直線回帰プロセス（例えば、複数直線回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗法（ＰＬＳ）回帰および第一成分回帰（ＰＣＲ））、二分決定木（例えば、ＣＡＲＴ分類および回帰決定木等の再帰的区分プロセス）、人工神経ネットワーク等のバックプロパゲーションネットワーク、判別分析（例えば、Ｂａｙｅｓｉａｎ分類子またはフィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）分析）、ロジスティック分類子、およびサポートベクター分類子（サポートベクター装置）を含む。
【０１０５】
好ましい監視された分類方法は、再帰的区分プロセスである。再帰的区分プロセスは未知のサンプル由来のスペクトルを分類するために再帰的区分ツリーを使用する。再帰的区分プロセスに関するさらなる詳細は、米国特許出願シリアル番号第２００２  ０１３８２０８  Ａ１号、Ｐａｕｌｓｅら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ（質量スペクトルの分析方法」により提供される。
【０１０６】
その他の実施形態において、上記分類モデルは監視されない学習方法を使用して形成することができる。監視されない分類は、上記トレーニングデータセットがそれに由来するスペクトルを予め分類することなく、上記トレーニングデータのセットにおける類似性に基づいて分類を学習することを試みる。監視されない学習方法はクラスター分析を含む。クラスター分析は、理想的には、互いに非常に類似のメンバーを有するもの、およびその他のクラスターのメンバーと非常に似ていないメンバーを有しているべきである「クラスター」またはグループへと上記データを分割することを試みる。次いで、データ項目間の距離を測定するいくつかの距離測定を使用して類似性を測定し、および、互いにより近いデータ項目をまとめる。クラスター化の技法はＭａｃＱｕｅｅｎ’ｓ  Ｋ−平均アルゴリズムおよびＫｏｈｏｎｅｎ’ｓ  Ｓｅｌｆ−Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ  Ｍａｐアルゴリズムを含む。
【０１０７】
生物学的情報を分類するために使用するために行われる学習アルゴリズムは、例えば、国際公開第０１／３１５８０号パンフレット（Ｂａｒｎｈｉｌｌら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ（生物学的システムにおけるパターンを同定するための方法およびデバイスおよびその使用方法）」）、米国特許出願番号第２００２  ０１９３９５０  Ａ１号（Ｇａｖｉｎら、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ（方法または質量スペクトルを分析すること）」）、米国特許出願番号第２００３  ０００４４０２  Ａ１号（Ｈｉｔｔら、「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｔｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｉｄｄｅｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄａｔａ（生物学的データ由来の隠されたパターンに基づいて生物学的状態の間を区別するプロセス）」）、および米国特許出願番号第２００３  ００５５６１５  Ａ１号（ＺｈａｎｇおよびＺｈａｎｇ、「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ（生物学的発現データを処理するためのシステムおよび方法）」）において記述されている。
【０１０８】
上記分類モデルを、任意の好適なデジタルコンピュータを用いて形成することができる。好適なデジタルコンピュータは、Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）またはＬｉｎｕｘＴＭをベースとしたオペレーティングシステム等の任意の標準または特定のオペレーティングシステムを使用した、マイクロ、ミニ、または大型のコンピュータを含む。使用される上記デジタルコンピュータは、質量スペクトロメータから物理的に分離されて使用されることができ、それは対象のスペクトルを作りだすために使用され、またはそれを質量スペクトロメータとカップリングさせることができる。
【０１０９】
本発明の実施形態に従う上記トレーニングデータのセットおよび上記分類モデルを、デジタルコンピュータによって実行されまたは使用されるコンピュータコードによって具現化できる。上記コンピュータコードは任意の好適な読み取り可能な媒体、光学または磁気ディスク、スティック、テープ他において保存することができ、および任意の好適なＣ、Ｃ＋＋、ビジュアルベーシック等のコンピュータ言語で書き込むことができる。
【０１１０】
すでに見出されたバイオマーカーに対する、またはアルツハイマー病について新たなバイオマーカーを見出すための分類アルゴリズムを開発するために、上述される学習アルゴリズムは有用である。上記分類アルゴリズムは、順に、単独でまたは組み合わせて使用されるバイオマーカーに関する診断値を提供することにより、診断用テストの基礎（例えば、カットオフ値）を形成する。
【０１１１】
（ＶＩ．アルツハイマー病のバイオマーカーを検出するキット）
別の実施形態において、本発明はアルツハイマー病の病態を認定するためのキットを提供し、上記キットは本発明によりバイオマーカーを検出するために使用される。ある実施形態において、上記キットは、捕捉試薬をその上に付着させ、上記捕捉試薬が本発明のバイオマーカーと結合しているチップ、マイクロタイタープレートまたはビーズまたは樹脂等の固体の支持体を含む。したがって、例えば、本発明のキットは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ等のＳＥＬＤＩのための質量分析プローブを含み得る。生体特異的捕捉試薬の場合、上記キットは、反応表面を伴う固相支持体および生体特異的捕捉試薬を含む容器を含み得る。
【０１１２】
上記キットは、洗浄溶液または洗浄溶液を作製するための説明書を含み、そこにおいて捕捉試薬および洗浄溶液の組み合わせが固相支持体上の単独のバイオマーカーまたは複数のバイオマーカーの捕捉を可能にし、それに続く、例えば質量分析による検出を可能にする。上記キットは１種以上の吸着剤を含み、各々は異なる固相支持体上に存在する。
【０１１３】
さらなる実施形態において、このようなキットは、ラベルの形式で、または分離した挿入物の形式で、好適な操作パラメーターに対する説明書を含み得る。例えば上記説明書は、消費者に、どのようにサンプルを回収し、どのようにプローブを洗浄し、または特定のバイオマーカーを検出するかを知らせることができる。
【０１１４】
さらにその他の実施形態において、上記キットは、キャリブレーション用の単数または複数の標準品として使用するためのバイオマーカーサンプルを有する１以上の容器を含むことができる。
【０１１５】
（ＶＩＩ．イムノアッセイキャリブレーターの品質判定）
イムノアッセイのキャリブレーションは、イムノアッセイにおいて生じる結果の品質を保証するために重要である。キャリブレーションは一般的に、予め決められた量または濃度の標的分析物を含むイムノアッセイキャリブレーターの使用を含む。イムノアッセイにおいて上記キャリブレーターにより生じたシグナルは、上記キャリブレーター中の標的分析物の量に相関する。このキャリブレーションは、順に、テストサンプル中で測定されるシグナルの量を、テストサンプル中の標的分析物の量と相関させるために使用される。しかし、キャリブレーターにより生じたシグナルは、例えば、キャリブレーター中の標的分析物が分解されたり、シグナルを弱めるように修飾されたりした場合には、キャリブレーター中における真の分析物の量を表さない。
【０１１６】
例えば、ある実施形態において、本発明は、シスタチンイムノアッセイキャリブレーターの品質を調べるための方法を提供する。上記方法は、シスタチンを捕捉する抗体を用いたシスタチンに対するイムノアッセイにおいて使用されるイムノアッセイキャリブレーター由来の分子を捕捉して、および上記抗体により捕捉されるシスタチンまたは１以上のシスタチン修飾型の量を特異的に測定することを含む。別の方法においては、上記イムノアッセイは特定のシスタチン修飾型を測定することに向けられ得、およびこの形態に対する抗体と、この形態を含むキャリブレーターを含む。
【０１１７】
上記されたように、ひとたびキャリブレートされると、例えばシスタチンＣΔＮ１−８などの修飾シスタチンポリペプチドの量を正確に測定することができるイムノアッセイを、痴呆と診断された被験体が、非アルツハイマー性痴呆のいくつかの形態と対立するものとしてアルツハイマー病を患っている可能性を調べるために使用することができる。
【０１１８】
同様に、本発明はまた、シスタチンイムノアッセイキャリブレーターについて上記された同様のステップを含む、本明細書中に開示されるバイオマーカーに対するイムノアッセイに使用する任意のイムノアッセイキャリブレーターの品質を調べるための方法をも提供する。
【０１１９】
（ＶＩＩＩ．イムノアッセイに使用する抗体試薬中の抗体の品質判定）
イムノアッセイは、標的分析物に対し生成した抗体を含むイムノアッセイ試薬の使用を含む。このようなアッセイの正確性は、上記イムノアッセイ試薬中の抗体の強度および純度に依存する。抗体試薬中の夾雑物の存在は、抗体試薬中における抗体の量の正確な測定を妨げ得る。例えば、本発明は、イムノアッセイ試薬として使用されるＡＤバイオマーカーに対する抗体の品質を、例えば試薬中で抗体が分解されたものなどの修飾物を特異的に検出することにより調べるための方法を提供する。
【０１２０】
例えば痴呆患者を診断し、患者の治療をモニターするために、上記アッセイの性能が単独であるいはその他のマーカーと組み合わせてテストされるだろう。最初に、ＡＤおよび非ＡＤ性痴呆などの異なるタイプの痴呆サンプルが、高齢の正常サンプルと並行して分析され、アッセイ感度および特異度が調べられるだろう。アッセイの有用性は、脳脊髄液およびマッチングさせた血清サンプルの両者について調べられるだろう。最終的な目的は、ＡＤ患者の早期診断を向上させ、記録のための患者の階層化を助け、臨床試験および薬物治療応答についての代理マーカーを提供するテストを創り出すことである。
【０１２１】
（ＩＸ．アッセイおよび治療方法のスクリーニングにおけるアルツハイマー病バイオマーカーの使用）
本発明の上記方法は、その他の応用をさらに有する。例えば、上記バイオマーカーは、上記バイオマーカーの発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで調節する化合物を探索するために使用することができ、その化合物は順に、患者におけるアルツハイマー病の治療または抑制において有用であり得る。その他の例において、上記バイオマーカーは、アルツハイマー病に対する治療への応答をモニターするために使用できる。さらにその他の例においては、被験体がアルツハイマー病を進行するリスクを有しているかについて
調べるための遺伝的研究において、上記バイオマーカーを使用することができる。
【０１２２】
従って、例えば本発明のキットは、プロテインバイオチップ（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＷＣＸ２  プロテインチップアレイ、例えば、プロテインチップアレイ）等の陽イオン交換機能を有する固相基質、および上記基質を洗浄するための酢酸ナトリウムバッファー、ならびに本発明のバイオマーカーをチップ上で測定するためのプロトコールを提供する説明書、およびこれらの測定値をアルツハイマー病の診断に使用することを含む。
【０１２３】
治療的テストにとって好適な化合物を、まず表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−Ｂまたは表Ｖに挙げられる１以上のバイオマーカーと相互作用する化合物を同定することによって探索することができる。例に挙げた方法により、探索は、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−Ｂまたは表Ｖに挙げられるバイオマーカーを組換え発現すること、上記バイオマーカーを精製すること、および上記バイオマーカーを基質へと付着させることを含み得る。試験化合物を次いで、通常水系条件下で上記基質と接触させ、および試験化合物と上記バイオマーカーとの間の相互作用を、例えば、塩濃度の関数として溶出速度を測定することにより、測定する。ある種のタンパク質は、シスタチンＣ等の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−Ｂまたは表Ｖに示される１以上のバイオマーカーを認識し、および切断することができ、その場合において上記タンパク質は、例えばタンパク質ゲル電気泳動等の標準的アッセイにおいて、１以上のバイオマーカーの消化をモニターすることによって検出され得る。
【０１２４】
関連する実施形態において、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−Ｂまたは表Ｖに示される１以上のバイオマーカーの活性を阻害する試験化合物の能力を測定することができる。当業者のある者は、特定のバイオマーカーの活性を測定するために使用される技術が上記バイオマーカーの機能および特性に依存するであろうことを認識するであろう。例えば、あるバイオマーカーの酵素活性は、好適な基質が入手可能であり、かつ基質濃度または反応産物の出願が迅速に測定できる場合に、アッセイすることができる。所定のバイオマーカーの活性を阻害または促進する潜在的に治療的な試験化合物は、上記試験化合物の存在または非存在下での触媒速度を測定することにより調べることができる。非酵素的な（例えば、構造的な）機能または表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−Ｂまたは表Ｖに示されるバイオマーカーの１つの活性に干渉する化合物の能力を測定することもできる。例えば、表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−Ｂまたは表Ｖに示されるバイオマーカーのひとつを含む複数タンパク質複合体の自己組織化は、試験化合物の存在または非存在下での分光によりモニターすることができる。別の方法においては、上記バイオマーカーが非酵素的な転写のエンハンサーである場合、転写を促進するための上記バイオマーカーの能力に干渉する試験化合物を、試験化合物の存在または非存在下での、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバイオマーカー依存的な転写レベルを測定することにより同定することができる。
【０１２５】
表Ｉにおける任意のバイオマーカーの活性をモジュレートできる試験化合物を、アルツハイマー病またはその他の痴呆を患う、または進行するリスクを有している患者に投与することができる。例えば、特定のバイオマーカーの活性がアルツハイマー病に関するタンパク質の蓄積をｉｎ  ｖｉｖｏで抑制する場合には、特定のバイオマーカーの活性を増加させる試験化合物の投与は患者におけるアルツハイマーのリスクを低減し得る。逆にいえば、特定のバイオマーカーの活性を低減させる試験化合物の投与は、そのバイオマーカーの活性の増加がアルツハイマー病の発症の少なくとも部分的な原因である場合には、患者におけるアルツハイマー病のリスクを低減することができる。
【０１２６】
さらなる態様において、本発明は、シスタチンＣ等の表Ｉ、表ＩＩ、表ＩＶ−Ａ、表ＩＶ−Ｂまたは表Ｖに示されるバイオマーカーにおける任意の修飾型における量の増加に関連するアルツハイマー病等の疾患を治療するために有用な化合物を同定する方法を提供する。例えば、ある実施形態において、例えばシスタチンＣ等の完全長バイオマーカーの切断を触媒し、シスタチンＣΔＮ１−８のような上記バイオマーカーの短縮型を形成するための化合物を、細胞抽出物または発現ライブラリーから探索することができる。例えば、このようなスクリーニングアッセイのある実施形態において、シスタチンＣの切断は、シスタチンＣに対しシスタチンＣが切断されないときには光らないが、このタンパク質が８位と９位の間で切断されたときには蛍光を発するような蛍光プローブを結合することにより検出することができる。別の方法においては、修飾された完全長シスタチンの８位と９位のアミノ酸との間のアミド結合が切断されないように修飾された完全長シスタチンＣを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで完全長シスタチンＣのその部位を切断する細胞性プロテアーゼと選択的に結合するまたはそれを「捕捉」するように使用することができる。プロテアーゼを探索して同定する方法、および彼らのターゲットが、Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｔｉｎらの（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、３：５０９−５１９（２００２））もの等の科学文献中によく記載されている。
【０１２７】
さらに異なる実施形態において、本発明は、例えばアルツハイマー病の疾病の進行または可能性を治療または低減させるための方法を提供する。それは例えばシスタチンＣΔ１−８等の、本明細書中に記述された１以上のバイオマーカーの増加量と関連している。例えば、完全長シスタチンＣの間の８位と９位のアミノ酸の間を切断する１以上のタンパク質が同定された後で、上記同定されたタンパク質の切断活性を阻害する化合物について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることができる。このような化合物を化学物質ライブラリーからスクリーニングする方法は技術的によく知られている。Ｌｏｐｅｚ−Ｏｔｉｎら（２００２）参照。別の方法においては、シスタチンＣの構造に基づいてインヒビター化合物を合理的に設計することができる。
【０１２８】
例えばシスタチンＣと短縮型のシスタチンＣΔ１−８等のように、モジュレーターとし
て完全長に対する短縮型バイオマーカーの相対レベルをテストされる化合物は、任意の低分子化合物またはタンパク質、糖、核酸または脂質等の生物学的物質であり得る。別の方法においては、モジュレーターはプロテアーゼまたは遺伝子組換えプロテアーゼである。通常、試験化合物は小さな化学分子およびペプチドであろう。ほとんどの場合、化合物は水系または有機系（特にＤＭＳＯをベースとする）溶液に溶解されるが、原則的には任意の化合物を潜在的なモジュレーターまたは結合化合物として本発明のアッセイにおいて使用できる。上記アッセイは、アッセイステップを自動化することにより、およびアッセイのための任意の簡便な供給源から化合物を提供することにより、大きな化学物質ライブラリーをスクリーニングするように設計され、それらは通常、並行して行われる（例えば、ロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレート上のマイクロタイターフォーマット）。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｋａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｂｕｃｈｓ、スイス）等を含む化学物質の供給者が多く存在することが理解されるだろう。
【０１２９】
特定のバイオマーカーの修飾がアルツハイマー病または非アルツハイマー性痴呆と関連し、又、上記修飾が例えば、非タンパク質分解的である場合、例えば、上記バイオマーカーがグリコシル化、アセチル化またはリン酸化されている場合、酵素を調節することは、酵素活性を調節することを特異的にまたは一般的に阻害する化合物により同様に標的とされ得る。同様に、非修飾型の特定バイオマーカーにおける濃度の増加がアルツハイマー病または非アルツハイマー性痴呆と関連している場合、適切に酵素を調節する活性は、酵素を調節する活性を直接的にまたは間接的に増大させる外因性化合物の添加により、または、適切に酵素を調節することの組み換えによる付加により増加させることができる。バイオマーカーの量に対して、または修飾型として見つけられるバイオマーカーの程度に対して影響を与える実質的にあらゆる活性が標的とされ得ることに注意されたい。例えば、疾患によって制御されたプロホルモン転換酵素（ＰＣ）により生成されるクロモグラニンペプチド断片は、プロホルモン転換酵素の活性を標的とすることにより調節することができる。
【０１３０】
好ましい実施形態において、ハイスループットなスクリーニング方法は、多数の潜在的治療化合物（潜在的モジュレーターまたは結合化合物）を含むコンビナトリアルな化学物質ライブラリーまたはペプチドライブラリーを含む。このような「コンビナトリアルケミカルライブラリー」を、次いで、本明細書中に記述されるように、所望の特徴的活性を呈するそれらのライブラリーメンバー（特定の化学物質種またはサブクラス）を同定するために１以上のアッセイにおいてスクリーニングする。このようにして同定された化合物は、従来型の「リード化合物」またはそれら自体潜在的なまたは実際の治療薬として使用され得る。
【０１３１】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学合成または生物学的合成のいずれかにより、試薬等の多数の化学的な「基礎的要素」を組み合わせることにより生成させた多様な化合物の集合である。例えば、ポリペプチドライブラリー等の直線的コンビナトリアルケミカルライブラリーは、１組の基礎的要素（アミノ酸）を、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）だけ、可能なあらゆる方法で組み合わせることにより形成される。数百万の化合物がこのような基礎的要素のコンビナトリアルな混合によって合成され得る。
【０１３２】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの調製およびスクリーニングは当業者にはよく知られている。このようなコンビナトリアルケミカルライブラリーには、限定するものではないが、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）およびＨｏｕｇｈｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８８（１９９１）を参照されたい）が含まれる。化学的多様性を示すライブラリーの作製のためのその他の化学も利用することができる。そのような化学には、限定するものではないが：ペプトイド（例：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５）、コード化ペプチド（例：ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（例：米国特許５，２８８，５１４号）、ヒダイントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド等のダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３（１９９３））、ビニロガスポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、グルコースの足場を有する非ペプチド性ペプチド擬似体（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））、小さな化合物ライブラリーの類似有機合成（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３（１９９３））、および／またはペプチジルホスフェート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（１９９４））、核酸ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ、ＢｅｒｇｅｒおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、全て上掲、参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号参照）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４（３）：３０９−３１４（１９９６）およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、糖質ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４：１５２０−１５２２（１９９６）および米国特許第５，５９３，８５３号参照）、小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン類、Ｂａｕｍ  Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ  １８、ｐａｇｅ  ３３（１９９３）；イソプレノイド類、米国特許第５，５６９，５８８号；チアゾリジノン類およびメタチアザノン類、米国特許第５，５４９，９７４号；ピロリジン類、米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号；モルホリノ化合物、米国特許第５，５０６，３３７号；ベンゾジアゼピン類、米国特許第５，２８８，５１４号等を参照されたい）。
【０１３３】
コンビナトリアルライブラリーの調製のための装置は市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ、３９０  ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ、Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ケンタッキー州、Ｓｙｍｐｈｏｎｙ、Ｒａｉｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、マサチューセッツ州、４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州、９０５０  Ｐｌｕｓ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、を参照されたい）。さらに、多数のコンビナトリアルライブラリーそれ自体が市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ニュージャージー州、Ｔｒｉｐｏｓ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州、３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｅｘｔｏｎ、ペンシルベニア州、Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、メリーランド州等、を参照されたい）。
【０１３４】
完全長シスタチンＣはヒトリソソームプロテアーゼ（例えば、カテプシンＢおよびＬ）と結合して、その活性を阻害すると信じられている。シスタチンＣのＮ末端の短縮は、シスタチンＣのプロテアーゼインヒビター活性を減少させると考えられる。例えば、Ａｂｒａｈａｍｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７３：６２１−６２６（１９９１））を参照されたい。短縮型シスタチンＣに完全長シスタチンＣの機能を付与する化合物は、したがって、短縮された形態のシスタチンＣが関連しているアルツハイマー病等の症状を治療するのに有用であると思われる。したがって、さらなる実施形態において、本発明は、平滑末端化シスタチンＣのその標的とするプロテアーゼ（例えば、各種カテプシン類）に対する親和性を増大させる化合物を同定するための方法を提供する。例えば、短縮型シスタチンＣに完全長シスタチンＣのプロテアーゼインヒビター活性を付与する能力について化合物をスクリーニングすることができる。次に、シスタチンＣのインヒビター活性またはシスタチンＣと相互作用する分子の活性をモジュレートし得る試験化合物を、被験体のアルツハイマー病の進行を遅らせるまたは停止させる能力についてｉｎ  ｖｉｖｏにおいて調べることができる。
【０１３５】
臨床レベルにおいては、試験化合物のスクリーニングには、被験体が試験化合物に曝露される前および後で、試験被験体からサンプルを取得することが含まれる。表Ｉに列記した１以上のバイオマーカーのサンプル中におけるレベルを、試験化合物への曝露後に該バイオマーカーのレベルが変化するか否かを調べるために、測定および分析することができる。サンプルは、本明細書中に記載するような質量分析法により分析してもよく、あるいは、当業者に公知の任意の適切な手段により分析してもよい。例えば、表Ｉに列記した１以上のバイオマーカーのレベルは、該バイオマーカーと特異的に結合する放射標識または蛍光標識した抗体を用いるウェスタンブロッティングにより直接測定してもよい。あるいは、該１以上のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡのレベル変化を測定し、所定の試験化合物の被験体への投与と相関付けてもよい。さらなる実施形態において、該１以上のバイオマーカーの発現レベルの変化を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法および材料を用いて測定してもよい。例えば、表Ｉ、ＩＩ、ＩＶ−Ａ、ＩＶ−ＢまたはＶの１以上のバイオマーカーを発現する、または発現し得るヒト組織培養細胞を試験化合物と接触させてもよい。試験化合物を用いて処置した被験体については、その処置から生じ得るあらゆる生理学的影響について定期的に調べる。特に、被験体の罹患可能性を減少させる能力について試験化合物を評価する。あるいは、これまでにアルツハイマー病と診断されている被験体に試験化合物を投与する場合には、疾患の進行を遅らせるまたは停止させる能力について試験化合物をスクリーニングする。
【０１３６】
具体的な実施例により本発明をより詳細に説明する。以下の実施例は例示の目的で提供するものであり、いかなる様式においても本発明を限定することを意図するものではない。当業者であれば、本質的に同じ結果を得るために変更し得るまたは改変し得る様々な重要ではないパラメーターを容易に認識するであろう。
【０１３７】
（Ｘ．イメージングのためのバイオマーカーの使用）
ポジトロン放出断層撮影法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ  Ｅｍｉｓｓｏｎ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＰＥＴ）またはシングルフォトン放出コンピュータ化断層撮影法（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）（ＳＰＥＣＴ）イメージング等の、非侵襲性の医療診断画像技術は、癌、冠動脈疾患および脳疾患を検出するために特に有用である。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージングは器官および組織の化学的機能を示すものであり、一方で、Ｘ線、ＣＴおよびＭＲＩ等のその他の画像技術は構造を示す。ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージングの使用は、アルツハイマー病等の脳疾患の進行における特定およびモニタリングのために、次第に有用性を増してきている。いくつかの例において、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージングの使用は、症状が発現するより数年早くアルツハイマー病を検出することを可能にする。
【０１３８】
ヒト脳中のアミロイド沈着物のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングのために好適な化合物を開発するために、異なる戦略が用いられている。Ａ−βに対するモノクローナル抗体およびペプチド断片は、ＡＤを伴う患者においてテストしたとき、脳により限定的に取り込まれた。アミロイドイメージングのための低分子のアプローチは、例えば、Ｎｏｒｄｂｅｒｇ  Ａ、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．、３（９）：５１９−２７（２００４）；Ｋｕｎｇ  ＭＰら、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、１０２５（１−２）：９８−１０５（２００４）；Ｈｅｒｈｏｌｚ  Ｋら、Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ．、６（４）：２３９−６９（２００４）；Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ  Ｒｅｖ．、Ｚａｋｚａｎｉｓ  Ｋ  Ｋら、１３（１）：１−１８（２００３）；Ｈｅｒｈｏｌｚ  Ｋ、Ａｎｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．、１７（２）：７９−８９（２００３）により記述されたように、大きな成功からはかけ離れている。
【０１３９】
本明細書中に開示されるペプチドバイオマーカー、またはその断片は、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴイメージング応用の状況において使用され得る。ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ応用のために適当なトレーサー残基を用いて修飾後、アルツハイマー患者におけるアミロイド斑の沈着を画像化するために、アミロイド斑タンパク質と相互作用するペプチドバイオマーカーを使用することができる。例えば、ＡＤバイオマーカーのα（１）−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）は、神経毒アミロイド沈着と関連を有する。表ＩＶ−Ｂ中に記述されるＭ４３５７ＡＣＴ  ＣＴ断片、またはそのサブ断片は、したがって、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴイメージング応用のためのプローブとして使用され得る。
【実施例】
【０１４０】
（ＸＩ．実施例）
（実施例１．アルツハイマー病のためのバイオマーカーの発見）
以下の実施例に記載されるプロトコールを用いて６５名のスウェーデン人の患者サンプルからマススペクトルを生成した。そのうち３０名はアルツハイマー病と診断され、３５名は痴呆を呈しなかった。この調査のために、認識力テスト、一般的な血液検査および尿検査、利用可能な場合にはＭＲＩまたはＣＴ画像検査、およびＣＳＦ中のタウおよびＡ−β（４２）の測定を含むＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準にしたがって、患者をＡＤ患者として診断した。痴呆の重篤度はミニメンタルステート試験（ＭＭＳＥ）を用いて評価した。３０のアルツハイマー病サンプルを平均ＭＭＳＥスコア２１（５〜３０の範囲）を示す患者群から採取した。３５名の対照患者は年齢をマッチングさせてあり、平均ＭＭＳＥスコア２９（２５〜３０の範囲）を示した。１８より高いＭＭＳＥスコアは軽度の痴呆の証拠とみなされており、２４より高いＭＭＳＥスコアは非常に軽度なケースとみなされている。
【０１４１】
（１．陰イオン交換分画）
陰イオン交換分画のためのバッファーのリスト：
Ｕ１（１Ｍ  尿素、０．２２％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９）
０．１％  ＯＧＰ含有５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９（洗浄バッファー１）
０．１％  ＯＧＰ含有５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７（洗浄バッファー２）
０．１％  ＯＧＰ含有１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ５（洗浄バッファー３）
０．１％  ＯＧＰ含有１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４（洗浄バッファー４）
３３．３％  イソプロパノール／１６．７％  アセトニトリル／０．１％  トリフルオロ酢酸（洗浄バッファー５）
注記：洗浄バッファー４を樹脂に適用するまでは洗浄バッファー５をバッファートレイに等分しないこと。これによって揮発性有機溶媒の蒸発という問題が生じないようにする
材料リスト：
フィルタープレート
５枚のｖ字ウェル型９６穴ウェルディッシュ（Ｆ１〜Ｆ５とラベルする）
ａ．樹脂を洗浄する
Ｈｙｐｅｒ  Ｑ  ＤＦ  樹脂（ＢｉｏＳｅｐｒａ、Ｃｅｒｇｙ、フランス）を５倍ベッド容量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９で３回洗浄することにより樹脂を調製する。次に、５０％懸濁液として５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９中に保存する
ｂ．樹脂を平衡化する
フィルタープレートの各ウェルに１２５μＬのＨｙｐｅｒ  Ｑ  ＤＦを添加する
バッファーをフィルターに通す
１５０μＬのＵ１を各ウェルに添加する
バッファーをフィルターに通す
１５０μＬのＵ１を各ウェルに添加する
バッファーをフィルターに通す
１５０μＬのＵ１を各ウェルに添加する
バッファーをフィルターに通す
ｃ．樹脂とＣＳＦを結合させる
各チューブから１５０μＬのサンプルをフィルタープレートの適当なウェル内にピペッティングする
４℃の状態で３０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける。
【０１４２】
ｄ．画分を回収する
フィルタープレートの下にｖ字ウェル型９６穴ウェルプレートＦ１を配置する
プレートＦ１中の流入物を回収する
１００μＬの洗浄バッファー１をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
プレートＦ１中のｐＨ９溶離液を回収する
画分１は流入物とｐＨ９溶離液を含む
１００μＬの洗浄バッファー２をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
フィルタープレートの下にｖ字ウェル型９６穴ウェルプレートＦ２を配置する
プレートＦ２中の画分２を回収する
１００μＬの洗浄バッファー２をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
プレートＦ２中の画分２の残りを回収する
画分２はｐＨ７溶離液を含む
１００μＬの洗浄バッファー３をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
フィルタープレートの下にｖ字ウェル型９６穴ウェルプレートＦ３を配置する
プレートＦ３中の画分３を回収する
１００μＬの洗浄バッファー３をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
プレートＦ３中の画分３の残りを回収する
画分３はｐＨ５溶離液を含む
１００μＬの洗浄バッファー４をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
フィルタープレートの下にｖ字ウェル型９６穴ウェルプレートＦ４を配置する
プレートＦ４中の画分４を回収する
１００μＬの洗浄バッファー４をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
プレートＦ４中の画分４の残りを回収する
画分４はｐＨ４溶離液を含む
１００μＬの洗浄バッファー５をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
フィルタープレートの下にｖ字ウェル型９６穴ウェルプレートＦ５を配置する
プレートＦ５中の画分５を回収する
１００μＬの洗浄バッファー５をフィルタープレートの各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）の状態で１０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
プレートＦ５中の画分５の残りを回収する
画分５は有機溶媒溶離液を含む
チップ結合プロトコールを開始するまで凍結する。
【０１４３】
（２．チップ結合プロトコール）
ＣＳＦ画分をチップと結合させる
６０μＬの対応するバッファーを各ウェルに添加する
２０μＬのＱカラム画分を添加する。
【０１４４】
チップ洗浄バッファーリスト：
ＩＭＡＣ３アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
１００ｍＭ  ＣｕＳＯ４
１００ｍＭ  リン酸ナトリウム＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７
ＷＣＸ２アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４
Ｈ５０アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）
１０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ
アレイの調製
アレイをバイオプロセッサー中に配置する
ＩＭＡＣアレイに銅をロードする
ＩＭＡＣ３アレイの各スポットに５０μｌのＣｕＳＯ４をロードする
室温（ＲＴ）の状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
ＣｕＳＯ４を除去し、繰り返す
水ですすぐ
アレイを平衡化する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
ＣＳＦ画分をアレイと結合させる
アレイに適した６０μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
２０μｌのＣＳＦ画分を添加する
ＲＴの状態で３０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
水で２回すすぐ
基質を添加する
バイオプロセッサーの上部およびガスケットを取り除く
アレイを乾燥させる
ＳＰＡ：
５０％ＳＰＡ（シナピン酸）を含む５０％アセトニトリルおよび０．５％ＴＦＡ  １μｌを添加する
空気乾燥させる
１μｌの５０％ＳＰＡを添加する
空気乾燥させる。
【０１４５】
（３．データ取得設定）
エネルギー吸収分子：５０％ＳＰＡ
質量上限を１０００００  ダルトン、最適範囲を２０００  ダルトン〜１０００００  ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を２００に設定する
開始時検出装置感度を８に設定する
焦点を質量８０００ダルトンに合わせる
質量偏向を１０００ダルトンに合わせる
データ取得方法をＳｅｌｄｉ定量法に合わせる
Ｓｅｌｄｉ捕捉パラメーターを２０に、Δを４に合わせる
ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ｐｅｒを１０に、終了ポジションを８０に合わせる
強度２２５において２ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する。
【０１４６】
（４．バイオマーカー特性の決定）
得られたスペクトルは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＩｎｃのＢｉｏｍａｒｋｅｒ  ＷｉｚａｒｄおよびＢｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅと共にＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＥｘｐｒｅｓｓＴＭ  ＤａｔａＭａｎａｇｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより分析した。各グループについてのマススペクトルを散布図分析に供した。散布図中の各タンパク質クラスターに関しアルツハイマー病および対照グループを比較するためにＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテスト分析を利用し、およびタンパク質は上記の２群の間で顕著に異なるもの（ｐ＜０．０００１）を選択した。
【０１４７】
このようにして発見されたバイオマーカーの例を以下の表Ｉに示す。「プロテインチップアッセイ」の列は、そのバイオマーカーが見いだされたクロマトグラフィー画分を指し、バイオマーカーが結合するバイオチップのタイプ、およびその洗浄条件を指す。
【０１４８】
（表Ｉ）
【０１４９】
【表１−１】
0005479379.tif 000002
【０１５０】
【表１−２】
0005479379.tif 000003
【０１５１】
【表１−３】
0005479379.tif 000004
バイオマーカーの特性は以下の様にして決定した。タンパク質をアクリルアミドゲル上で分離し、バイオマーカーを含むバンドをゲルから切り出した。バンド中のタンパク質を脱色した。アセトニトリルを用いてゲルを乾燥し、次いで、トリプシン溶液中で消化した。消化断片をＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰＢＳＩＩ質量分析計にて分析した。測定された質量を同様のトリプシン消化パターンを有するタンパク質を同定するタンパク質データベースの照会に使用した。これらの同定の全てをさらにタンデムＭＳ分析で確認した。最終的に、βミクログロブリンのアイデンティティーが抗体捕捉により調べられた。抗体を、エポキシド表面を有するＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰＳ２０  プロテインチップアレイに結合した。バイオマーカーを含むサンプルを上記抗体スポットに供した。結合していないタンパク質を除去し、および上記アレイをＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＰＢＳＩＩ  リーダーにより読んだ。標的の質量を有するタンパク質の検出が単一性を確認した。
【０１５２】
Ｍ８６２３．２４のものの本質はアナフィラトキシンＣ４ａの切断産物であるＣ４ａｄｅｓ−Ａｒｇ  タンパク質であることがわかった。アナフィラトキシンＣ４ａは、補体Ｃ４（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０１０２８  ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｉｃｅｐｒｏｔ．ｐｌ？Ｐ０１０２８）の生物学的に活性な断片である。血清ならびにＣＳＦにおいて、カルボキシペプチダーゼＮは迅速にＣ−末端のアルギニンを切り落とし、それにより比較的安定なタンパク質Ｃ４ａｄｅｓ−Ａｒｇを生成する。Ｃ４ａｄｅｓ−Ａｒｇのアミノ酸配列を直接配列決定により決定した。Ｃ４ａｄｅｓ−Ａｒｇのアミノ酸配列は以下である：
ＮＶＮＦＱＫＡＩＮＥＫＬＧＱＹＡＳＰＴＡＫＲＣＣＱＤＧＶＴＲＬＰＭＭＲＳＣＥＱＲＡＡＲＶＱＱＰＤＣＲＥＰＦＬＳＣＣＱＦＡＥＳＬＲＫＫＳＲＤＫＧＱＡＧＬＱ（配列番号１）
（理論的分子量は８６０７．８８  Ｄａである）。
【０１５３】
イムノアッセイ実験において、ヒトＣ４ａｄｅｓ−Ａｒｇに対する抗体、すなわちアフィニティー精製された抗Ｃ４ａｄｅｓ−Ａｒｇ抗体は、ＣＳＦから８６０７Ｄａのタンパク質を特異的に沈降させることが見出された。
【０１５４】
（実施例２．アルツハイマー病のためのマーカーとしてのＢ２ミクログロブリンの検証的研究）
アルツハイマー病のためのマーカーとしてのβ２ミクログロブリンの使用を検証するために、１５８の脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルを３つのグループ：（１）アルツハイマー病（ＡＤ）、（２）対照、および（３）非アルツハイマー性痴呆（非ＡＤ）として予め診断された被験体から採取した。これらのグループにおけるサンプルの分布を以下の表ＩＩＩに示す。
【０１５５】
（表ＩＩＩ．β２ミクログロブリン検証調査における被験体の分布）
【０１５６】
【表３】
0005479379.tif 000005
簡潔にいえば、１５８のサンプルのうち６６は軽度のアルツハイマー病（身にメンタルステート試験（ＭＭＳＥ）スコアが２４を超える）を患う患者から採取し、またはより重度のアルツハイマー病の型を患う患者から採取した。５１の「対照」サンプルは、「うつ」と診断された６名の患者を含む非痴呆の患者から得た。非アルツハイマー性痴呆を患う患者から採取した４１のサンプルは、レヴィー小体痴呆（ＬＢＤ）を患う患者から採取した２０のサンプルおよび前頭側頭型痴呆（ＦＴＤ）を患う患者から採取した２１のサンプルを含んでいた。
【０１５７】
各サンプル中のβ２ミクログロブリンのＳＥＬＤＩ−ＭＳによる測定値は、チップの読み取りのためのＥＡＭとして５０％ＳＰＡを使用する以下の結合プロトコールに従い、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プロテインチップを使用して取得した：
５０％アセトニトリル中で３０分間Ｈ５０アレイをバルク洗浄し、次いで、３０分間空気乾燥する。
【０１５８】
１００μＬの結合バッファー（１０％アセトニトリル＋０．１％トリフルオロ酢酸）を各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）にて５分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
１００μＬの結合バッファーを各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）にて５分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
４５μＬの結合バッファーを各ウェルに添加する
５μＬのニート（ｎｅａｔ）なＣＳＦサンプルを添加する
室温（ＲＴ）にて３０分間振盪する
振盪後にサンプルバッファーを除去する
１００μＬの結合バッファーを各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）にて５分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
１００μＬの結合バッファーを各ウェルに添加する
室温（ＲＴ）にて５分間振盪する
振盪後にバッファーを除去する
１μｌの５０％ＳＰＡ（シナピン酸）を含む５０％アセトニトリルおよび０．５％ＴＦＡを添加する
空気乾燥させる
１μｌの５０％ＳＰＡを添加する
空気乾燥させる
アレイを分析する
結果（図３）は（１）アルツハイマー病を患う被験体におけるβ２ミクログロブリンのレベルが非アルツハイマー性痴呆を患う被験体のレベルよりも顕著に高いこと；（２）アルツハイマー病を患う被験体におけるβ２ミクログロブリンのレベルが痴呆の症状を示さない被験体のレベルよりも顕著に高いこと；および（３）非アルツハイマー性痴呆を患う被験体におけるβ２ミクログロブリンのレベルは痴呆の症状を示さない被験体のレベルよりも顕著に低いことを示す。
【０１５９】
（実施例３．アルツハイマー病のためのさらなるバイオマーカーの発見）
本実施例のために、スウェーデン人およびフィンランド人の患者からの２３７のＣＳＦサンプルを使用した。これらのサンプルには以下のものが含まれた：アルツハイマー病患者由来の９８サンプル（ＭＭＳＥ＞２４を示す８３の非常に軽度のケースを含む）、前頭側頭型痴呆（ＦＴＤ）患者由来の３１サンプル、レヴィー小体痴呆（ＤＬＢ）患者由来の２９サンプル、および９のうつ病対照を含む７９の年齢マッチングさせた正常個体由来サンプル。診断は上記実施例中で論じたＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ基準に従って行った。２３７のサンプルを訓練のための群（２／３）および盲検試験のための群（１／３）に無作為に分けた。
【０１６０】
上記実施例１において利用した陰イオン交換予備分画化ステップは、これらのＣＳＦサンプルについては省略した（血清サンプルについては、予備分画化ステップの利用が好ましいことに注意されたい）。そのかわり、５μＬのきれいなＣＳＦサンプルを各チップのウェルに使用した。使用したチップは、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ社のＩＭＡＣ３０（銅またはニッケルにより活性化されている）、Ｑ１０、ＣＭ１０およびＨ５０プロテインチップであった。サンプルは、２つの異なるタイプのエネルギー吸収分子（ＥＡＭ）を用いて複数データ収集設定を利用し、３連で実行した。プールされた正常参照ＣＳＦサンプルを内部アッセイおよび外部アッセイ再現性をモニターするために臨床サンプルと並行で実行した。全てのサンプルは、Ｂｉｏｍｅｋ（登録商標）２０００液体操作ロボットおよびチップ自動搭載機つきのＰｒｏｔｅｉｎ  ＣｈｉｐＴＯＦ−ＭＳ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＰＢＳ  ＩＩＣ）を含むＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｉｐ  Ａｕｔｏ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて処理し、分析した。サンプルは何らのシステム的な偏りをも排除するために異なるバイオプロセッサーにランダムにかけた。
【０１６１】
（１．一般的チップ結合プロトコール．）
ＣＳＦ画分をチップと結合させる
４５μＬの対応するバッファーを各ウェルに添加する
５μＬのニートなＣＳＦを添加する
チップ洗浄バッファーリスト：
ＩＭＡＣ３０アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
適宜、１００ｍＭ  ＣｕＳＯ４またはＮｉＳＯ４
１００ｍＭ  リン酸ナトリウム＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７
Ｈ５０アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
１０％アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ
Ｑ１０アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９．０
ＣＭ１０アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）：
１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４
アレイの調製
アレイをバイオプロセッサー中に配置する
適宜、ＩＭＡＣ３０アレイに銅またはニッケルをロードする
ＩＭＡＣ３０アレイの各スポットに５０μｌのＣｕＳＯ４（またはＮｉＳＯ４）をロードする
室温（ＲＴ）の状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
ＣｕＳＯ４（またはＮｉＳＯ４）を除去し、繰り返す
水ですすぐ
アレイを平衡化する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
ＣＳＦ画分をアレイと結合させる
アレイに適した４５μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
５μｌのＣＳＦ画分を添加する
ＲＴの状態で３０分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
アレイに適した１００μｌのチップ洗浄バッファーを各ウェルに添加する
ＲＴの状態で５分間Ｖｏｒｔｅｘにかける
Ｖｏｒｔｅｘ後にバッファーを除去する
水で２回すすぐ
基質を添加する
バイオプロセッサーの上部およびガスケットを取り除く
アレイを乾燥させる
ＳＰＡ：
１μｌの５０％ＳＰＡ（シナピン酸）を含む５０％アセトニトリルおよび０．５％ＴＦＡを添加する
空気乾燥させる
１μｌの５０％ＳＰＡを添加する
空気乾燥させる
ＣＨＣＡ
１μｌの５０％ＣＨＣＡを溶解させた５０％アセトニトリル＋０．２５％ＴＦＡを添加する
空気乾燥させる
１μｌの５０％ＣＨＣＡを添加する
空気乾燥させる
（２．特定のチップの結合プロトコール）
Ｑ１０チップ
アレイを平衡化する
１．１００μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９を各ウェルに添加する
２．室温にて５分間混合する
３．混合後にバッファーを除去する
４．１００μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９を各ウェルに添加する
５．室温にて５分間混合する
６．混合後にバッファーを除去する
サンプルをアレイに添加する
１．５０μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９を各ウェルに添加する
２．５μＬのＣＳＦを添加する
３．室温にて３０分間混合する
４．サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
１．１００μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９を各ウェルに添加する
２．室温にて５分間混合する
３．混合後にバッファーを除去する
４．１００μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９を各ウェルに添加する
５．室温にて５分間混合する
６．混合後にバッファーを除去する
７．１００μＬの１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ９を各ウェルに添加する
８．室温にて５分間混合する
９．混合後にバッファーを除去する
１０．脱イオン水で２回すすぐ
ＥＡＭを添加する
１．バイオプロセッサーのリザーバーおよびガスケットを取り除く
２．直ちにアレイを乾燥させる
３．ＥＡＭを適用する：
ＳＰＡに対して
ａ．４００μＬの５０％  アセトニトリル、０．５％  ＴＦＡをＳＰＡチューブに添加する
ｂ．室温にて５分間混合する
ｃ．１μＬを各スポットに添加する
ｄ．空気乾燥させる
ｅ．１μＬを各スポットに添加する
ｆ．空気乾燥させる
ＣＨＣＡに対して
ａ．２００μＬの５０％  ＡＣＮ、０．５％  ＴＦＡをＣＨＣＡチューブに添加する
ｂ．室温にて５分間混合する
ｃ．室温にて１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離にかける
ｄ．上清を除去し、等量の５０％アセトニトリル、０．２５％ＴＦＡで希釈する
ｅ．１μＬを各スポットに適用する
ｆ．空気乾燥させる
ｇ．１μＬを各スポットに適用する
ｈ．空気乾燥させる
ＣＭ１０
アレイを平衡化する
１．１００μＬの１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４を各ウェルに添加する
２．室温にて５分間混合する
３．混合後にバッファーを除去する
４．１００μＬの１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４を各ウェルに添加する
５．室温にて５分間混合する
６．混合後にバッファーを除去する
サンプルをアレイに添加する
１．５０μＬの１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４を各ウェルに添加する
２．５μＬのＣＳＦを添加する
３．室温にて３０分間混合する
４．サンプルおよびバッファーを除去する
アレイを洗浄する
１．１００μＬの１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４を各ウェルに添加する
２．室温にて５分間混合する
３．混合後にバッファーを除去する
４．１００μＬの１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４を各ウェルに添加する
５．室温にて５分間混合する
６．混合後にバッファーを除去する
７．１００μＬの１００ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ４を各ウェルに添加する
８．室温にて５分間混合する
９．混合後にバッファーを除去する
１０．脱イオン水で２回すすぐ
ＥＡＭを添加する
１．バイオプロセッサーのリザーバーおよびガスケットを取り除く
２．直ちにアレイを乾燥させる
３．ＥＡＭを適用する：
ＳＰＡに対して
ａ．４００μＬの５０％  アセトニトリル、０．５％  ＴＦＡをＳＰＡチューブに添加する
ｂ．室温にて５分間混合する
ｃ．１μＬを各スポットに添加する
ｄ．空気乾燥させる
ｅ．１μＬを各スポットに添加する
ｆ．空気乾燥させる
ＣＨＣＡに対して
ａ．２００μＬの５０％  ＡＣＮ、０．２５％  ＴＦＡをＣＨＣＡチューブに添加する
ｂ．室温にて５分間混合する
ｃ．室温にて１０，０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行う
ｄ．上清を除去し、等量の５０％アセトニトリル、０．２５％ＴＦＡで希釈する
ｅ．１μＬを各スポットに適用する
ｆ．空気乾燥させる
ｇ．１μＬを各スポットに適用する
ｈ．空気乾燥させる
ＩＭＡＣ３０およびＨ５０プロテインチップ
ＩＭＡＣ３０およびＨ５０プロテインチップのプロトコールについては、それぞれ実施例１および２のプロトコールを参照されたい。ＩＭＡＣ３０プロテインチップに対するプロトコールは、陰イオン交換分画ステップを除外した点を除き、本実施例における全てのチップと同様に、ＩＭＡＣ３プロテインチップに対して行われるものと本質的に同じである。ＩＭＡＣ３０プロテインチップはサンプル閉じ込めのための疎水性バリアという付加的特徴を有するＩＭＡＣ３アレイに対する代替となるものである。ＩＭＡＣ３アレイと同様に、ＩＭＡＣ３０アレイは使用する前に遷移金属（例えば、銅またはニッケル）を用いて活性化する。
【０１６２】
（３．データ取得設定）
以下の条件をデータ取得のために使用した。
【０１６３】
ＩＭＡＣ３０  Ｃｕ：ＣＨＣＡ、ＳＰＡ  低、ＳＰＡ  高（エネルギー吸収分子として５０％  ＳＰＡ使用）
ＩＭＡＣ３０  Ｎｉ：ＣＨＣＡ；ＳＰＡ  低、ＳＰＡ  高
Ｑ１０：  ＣＨＣＡ、ＳＰＡ  低、ＳＰＡ  高
ＣＭ１０：  ＣＨＣＡ；ＳＰＡ  低、ＳＰＡ  高
Ｈ５０：  ＣＨＣＡ；ＳＰＡ  低、ＳＰＡ  高
ＣＨＣＡ
検出器電圧を２８５０ボルトに設定する
１０００ダルトン〜２０００００ダルトンの範囲で最適化し、最大質量２０００００ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を１７０に設定する
検出器感度を７に設定する
４０００ダルトンの質量に焦点を合わせる
質量ディフレクターを１０００ダルトンに設定する
データ取得方法をＳｅｌｄｉ定量法に設定する
Ｓｅｌｄｉ捕捉パラメーターを２２、Δを５、ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ｐｅｒを５、終了ポジションを８２に合わせる
強度２２０において２ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する
ＳＰＡ低
検出器電圧を２８５０ボルトに設定する
１０００ダルトン〜２０００００ダルトンの範囲で最適化し、最大質量２０００００ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を１９４に設定する
検出器感度を８に設定する
４０００ダルトンの質量に焦点を合わせる
質量ディフレクターを１０００ダルトンに設定する
データ取得方法をＳｅｌｄｉ定量法に設定する
Ｓｅｌｄｉ捕捉パラメーターを２２、Δを５、ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ｐｅｒを５、終了ポジションを８２に合わせる
強度２２０において２ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する
ＳＰＡ高
検出器電圧を２８５０ボルトに設定する
１００００ダルトン〜２０００００ダルトンの間で最適化し、最大質量２０００００ダルトンに設定する
開始時レーザー強度を１９９に設定する
検出器感度を８に設定する
１２０００ダルトンの質量に焦点を合わせる
マスディフレクターを４０００ダルトンに設定する
データ取得方法をＳｅｌｄｉ定量法に設定する
Ｓｅｌｄｉ捕捉パラメーターを２２、Δを５、ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ  ｐｅｒを５、終了ポジションを８２に合わせる
強度２２０において２ショットの加温ポジションに合わせ、加温ショットを含まない
サンプルを処理する
（４．データ分析）
スペクトルデータは、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓＴＭ  Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｒ  ２．１．を使用して大規模データ処理および単変量解析を行うＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  バージョン  ３．１．を用いて収集した。スペクトルの前処理工程には、ベースライン減算を含むスペクトルの前処理、および、内生分析物由来の既知の質量サンプルを使用した内部分子量キャリブレーションを含んでいた。ピーク強度の標準化は外部係数０．２を用いて総イオン電流により実行した。ピークラベリングおよび異なるスペクトルにわたるクラスター化はユーザーが定義して設定を利用し、ソフトウェアによって自動的に行った。各グループにわたる個々のピークについてのピーク強度  Ｐ値は、２群比較についてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストを用いて、および３以上の群についてＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテストを用いて計算した。サンプルを最も良好に分類するように予め定義した表現型に基づき、多変量データ分析をＢｉｏｍａｒｋｅｒ  ＰａｔｔｅｒｎｓＴＭ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ５．０を用いて実行した。
【０１６４】
（結果）
上記プロテインチップおよび条件を使用して、トレーニング群（「調査２」、すなわち、上記サンプル群の２／３）の解析の後に、単変量バイオマーカー群（Ｐ＜０．００５）について全条件下で同定した。結果を以下の表ＩＩにまとめる。
【０１６５】
（表ＩＩ）
【０１６６】
【表２−１】
0005479379.tif 000006
【０１６７】
【表２−２】
0005479379.tif 000007
【０１６８】
【表２−３】
0005479379.tif 000008
さらなる分析を全サンプル群（すなわち、９８のＡＤ（ＭＭＳＥ＞２４を示す非常に軽度な８３のケースを含む）、７８の正常、３１のＦＴＤおよび２９のレヴィー小体痴呆のケースを含む２３６サンプル）を用いて行った。この全サンプル群を用いて、Ｐ値＜０．００１でＡＤサンプルとその他のグループとを区別し得る固有のピーク群が見つけられた。該バイオマーカーのサイズは２〜９０ｋＤａの範囲に及ぶ。これらのピークを以下の表ＩＶ−Ａに示す。表ＩＶ−Ａに列記された質量は表ＩＩのものとは若干異なることに注意されたい。表ＩＶ−Ａ中の質量は、初期の研究において同定されたバイオマーカーの理論的分子量を用いて付加的な計器による較正を反映している。
【０１６９】
さらなる分析をＧｏｔｈｅｎｂｕｒｇ  ｓｉｔｅ（すなわち、６４のＡＤ（ＭＭＳＥ＞２４を示す非常に軽度な４９のケースを含む）および４９の臨床的に正常な個体を含む１１３サンプル）にのみ由来するサンプル群を用いて行った。Ｐ値＜０．００５でＡＤサンプルと臨床的に正常なサンプルとを区別し得る固有のピーク群が見つけられた。該バイオマーカーのサイズは３．５〜９２．１ｋＤａの範囲に及ぶ。これらのピークを以下の表ＩＶ−Ｂに示す。この表に記載したのは内部スペクトル較正を用いた質量（較正基準として既知のタンパク質およびペプチドの質量を利用）および利用可能な配列から予測された理論的質量である。
【０１７０】
（表ＩＶ−Ａ）
【０１７１】
【表４−１】
0005479379.tif 000009
【０１７２】
【表４−２】
0005479379.tif 000010
説明：ＩＣ−Ｃｕで活性化したＩＭＡＣチップ；ＩＮ−Ｎｉで活性化したＩＭＡＣチップ；Ｈ−Ｈ５０チップ；Ｃ−ＣＭ１０チップ；Ｑ−Ｑ１０チップ；下側にある場合の“ｃ”および“ｓ”はそれぞれエネルギー吸収分子ＳＰＡおよびＣＨＣＡの使用を意味する
（表ＩＶ−Ｂ）
【０１７３】
【表４−３】
0005479379.tif 000011
【０１７４】
【表４−４】
0005479379.tif 000012
図４Ａ〜Ｋは各種グループについて観察されたピーク強度の分布および観察された任意の相違についての有意性を調べるために用いられたＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ試験またはＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験の結果を示す。さらに、図５〜８は、（１）症例群−対照群である、年齢をマッチングさせたＡＤ群対正常サンプル群（ｎ＝８６）および（２）６９のＡＤ例および３５の正常例（Ｔａｕ＞４５０＋Ａｂ４２＜５５０を示すＡＤ群、およびその逆の値を示す正常群）を含む、Ａｂ４２／Ｔ−Ｔａｕに関して予め選択したサンプル群（ｎ＝１０４）の分析から得られた結果を示す。図９は表ＩＶ−ＡおよびＩＶ−Ｂの多くのバイオマーカーについて得られたマススペクトルの例を示す。
【０１７５】
この試験において検出された多くのピークの特性は上述した方法と同様の方法を用いて規定した。バイオマーカーは、一連のＢｉｏｓｅｐｒａ溶媒を使用するクロマトグラフィー技法の組み合わせを用いて、次いで１Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより精製した。精製スキームは対象のバイオマーカーを追跡するためにプロテインチップを使用してモニタリングした。３０ｋＤａより小さいタンパク質については、対象の損なわれていないバンドをゲルから抽出し、次に、オリジナルのバイオマーカーと適合する質量を確認するためにプロテインチップリーダーを用いて再び分析した。ゲル抽出したタンパク質はトリプシンを用いて溶液内で消化し、３０ｋＤａより大きいタンパク質はゲル内で消化した。プロテインチップリーダーを用いたペプチドマッピングにより、および、ＰＣＩ−１０００プロテインチップインターフェースを装備したＱ−ＳＴＡＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）装置を用いたタンデムＭＳにより、トリプシン消化物は分析した。４ｋＤａより小さいバイオマーカーはクロマトグラフィー技法の組み合わせにより濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製および／またはトリプシン消化を行わずにタンデムＭＳにより直接同定した。
【０１７６】
例えば、以下のペプチド／タンパク質が同定された：
Ｍ１１７２７：このタンパク質はβ２ミクログロブリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  登録番号Ｐ０１８８４、ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｎｉｃｅｐｒｏｔ．ｐｌ？Ｐ０１８８４）として同定された。この知見は実施例１および２の知見と一致する。β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）は、（１）主要組織適合複合体  クラスＩ分子の細胞内輸送を指令する；および（２）炎症における重要な役割も担うインターフェロンおよび特定のサイトカインによってモジュレートされるという意味において、炎症性反応の強力なイニシエーターである。ＡＤに対するＣＳＦバイオマーカーとしてのＢ２Ｍの役割は今までに議論されていた。しかし、今回、血液中のＡＤのためのバイオマーカーとしてＢ２Ｍが同定された。
【０１７７】
Ｍ３６８０．７：このペプチドはセクレトグラニンＩＩペプチド（セクレトニューリンとしても知られる）として同定され、配列番号２のイタリック体で表された配列を有する。セクレトグラニンＩＩは大きな密集した中心部を有するシナプス小胞タンパク質である。セクレトグラニンＩＩのレベルは、年齢をマッチングさせた対照群と比較して、ＡＤ患者の側頭皮質において低下していることが観察された。ＡＤの主要な特徴のひとつはシナプスの変性である。したがって、ＣＳＦ中のセクレトニューリンペプチドレベルはシナプスの損失を反映し得る。このシナプスの損失は、初期の認知障害により反映され、患者の脳内において特別な細胞限局性沈着物であるβ−アミロイドペプチドの出現につながる。
【０１７８】
Ｍ７８６７７．３：このタンパク質はトランスフェリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  登録番号  Ｐ０２７８７）として同定され、実施例１の知見と一致する。トランスフェリンは、主要な鉄輸送タンパク質であり、神経変性疾患におけるフリーラジカル生成および酸化的ストレスの主要な因子である。トランスフェリンレベルは、高齢の対照と比較して、ＡＤの前頭葉において増加している。Ｃ２アレルはＡｐｏＥ４陰性被験体のＡＤと関係した。ＡｐｏＥおよびトランスフェリンはアルツハイマー病の病因の複雑なメカニズムの一部であり得る。
【０１７９】
Ｍ２４３１．２：このペプチドは膜内在性タンパク質２Ｂ（ＭＭＰ２ＢまたはＢＲＩ）の短縮型ＡＢｒｉ／ＡＤａｎアミロイドペプチドとして同定され、配列番号３の下線が引かれた配列を有する。脳における正確な生理学的役割についてはさらに十分に理解する必要がある。ＢＲＩ遺伝子における変異は珍しい神経変性症状−−家族性英国型およびデンマーク型痴呆−−を引き起こし、該症状は広範なアミロイド生成性ペプチド（ＡＤａｎ／ＡＢｒｉ）の沈着およびＡＤとの著しい神経病理学的類似性を伴う。このペプチドは疾患に関連するより短い初めての野生型Ｃ末端ペプチドである。
【０１８０】
Ｍ１３３９１ペプチドは完全長シスタチンＣとして同定され、配列番号４のイタリック体で表された配列を有する。シスタチンＣは大部分の体液および組織中で見られ、尿中の腎機能マーカーである。シスタチンＣはリソソームのシステインプロテアーゼ（カテプシン類）の活性を阻害する。シスタチン−Ｃ／カテプシンのバランスは、炎症、癌およびＡＤを含む多くの疾患プロセスにとって重要である。シスタチンＣはＡＤと関連性を有する。例えば、ＣＳＴ３  Ｂ／Ｂホモ接合性はＡＤの発症リスク増大に関連する；シスタチンＣは、シスタチンＣの遺伝子型とは関係なく、ＡＤにおいて細胞死を最も受けやすいＡＤ脳内のニューロン部位で増加；および、シスタチンＣはＡＤ脳沈着物中にＡ−βとともに局在する。
【０１８１】
Ｍ１２５８３．４：このペプチドは短縮型シスタチンＣペプチドとして同定され、配列番号４の下線を引いた配列を有する。始めの８個のＮ末端残基を欠く、この短縮型Ｃｙｓ−Ｃは、その他のカテプシン類に対してはそうではないが、カテプシンＢに対しては２０倍低い親和性を有する。カテプシンＢはＡＤにおいてキーとなる役割を担う。カテプシンＢは多くの初期アルツハイマー病の脳内エンドソーム中に同定されるが、わずかな割合で正常の脳内エンドソーム中においても検出され得る。特定のカテプシンＢインヒビターはＡβ４２によって活性化された小グリア細胞により引き起こされる神経毒性効果を排除する。この短縮型Ｃｙｓ−ＣはＣＳＦおよび血液両方においてＡＤのためのバイオマーカーであることが見出された。この８個のアミノ酸がＮ末端で短縮されたバージョンのシスタチンＣペプチドがＣＳＦまたは血液中について記述されるのはこれが初めてである。
【０１８２】
Ｍ３９５１．６：このペプチドは神経分泌タンパク質ＶＧＦのＮ末端断片であると同定され、配列番号５においてイタリック体で表された配列を有する。同様に、Ｍ３６８７．７ペプチドは神経分泌タンパク質ＶＧＦのＮ末端断片（−３アミノ酸）であると同定され、配列番号５のボールド体で表された配列を有する。神経分泌タンパク質ＶＧＦは神経内分泌細胞および神経細胞で選択的に合成される神経成長因子である。ＶＧＦ  ｍＲＮＡレベルは長期増強、発作、および損傷を含むニューロンの活動により調節される。該配列はタンパク質分解的プロセシングが可能な部位である対になった塩基性アミノ酸残基が豊富である。このような断片は新規であると思われる。同じタンパク質の異なる断片が別のグループによって発見された。
【０１８３】
Ｍ６０９７６．２：このタンパク質はヘモペキシン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  登録番号  Ｐ０２７９０）として同定された。ヘモペキシンは、ＩＬ−６による炎症の後に誘導される急性期反応性タンパク質であり；ヘムが介在する酸化的ストレスを抑制するためのスカベンジャー／トランスポーターであり；又、神経修復における役割を担うと信じられてもいる。
【０１８４】
Ｍ８９３３．２：このペプチドはＣ３ａ  アナフィラトキシンｄｅｓＡｒｇであると同定され、配列番号６において下線を引いた配列を有する。Ｃ３ａアナラトキシンペプチドに対する完全長配列は配列番号６においてイタリック体で表された配列である。ＡＤ脳において起こることが知られている補体の活性化：（１）局所的な炎症状態の発症に寄与する；および（２）認知機能障害に相関した。ＡＤ脳におけるＣ３の局在化および潜在的なメカニズム：（１）Ａ−β合成ペプチドに対して反応してマウスの培養小グリア細胞におけるタンパク質の発現が増加する（５〜１０倍）；および（２）ｈＡＰＰマウスにおけるプラーク沈着および神経変性増大のＣ３による阻害−クリアランスにおける潜在的な役割。このペプチドはＡＤの新規補体タンパク質断片マーカーである。
【０１８５】
Ｍ３５１４．５：このペプチドは神経内分泌タンパク質７Ｂ２のＣ末端断片として同定され、配列番号７において下線を引いた配列を有する。このＣ末端断片はアミノ酸１８２−２１２に相当し；完全長タンパク質は配列番号７においてイタリック体で表された配列を有する。神経内分泌タンパク質７Ｂ２は、小胞体（ＥＲ）においてプロホルモン転換酵素２（ＰＣ２）と複合体を形成する。ＰＣ２はソマトスタチン前駆体をプロセシングする。一旦、ｐｒｏＰＣ２／７Ｂ２複合体がトランス−ゴルジネットワークに到着したら、７Ｂ２は２つのドメインに内部切断され、２１ｋＤａの断片とカルボキシ末端の３１残基ペプチドになる。ｐｒｏＰＣ２が細胞内で７Ｂ２と遭遇しなかった場合、活性成熟種を触媒的に生成することはできない。総酵素貯蔵量に対するＰＣ２前駆体の割合の顕著な減少がアルツハイマー患者の前頭葉において観察される。この減少は結合タンパク質７Ｂ２の増加と同時に起こる。ソマトスタチンの欠乏が、ソマトスタチンを含むニューロンが大きく損失することなく、アルツハイマー病患者の大脳皮質において起こる。この欠乏は、ペプチド前駆体におけるタンパク質分解的プロセシングの割合の減少と合致し得る。ＣＳＦ中における特定の形態のソマトスタチンが痴呆の重篤度と相関することを示唆する一連の証拠が存在する。
【０１８６】
Ｍ３９１２．８：このペプチドはクロモグラニンＡ（ＣＭＧＡ＿ＨＵＭＡＮ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ１０６４５））の断片として同定され、配列番号８においてイタリック体で表された配列に相当する。配列番号８において下線を引いた配列はバソスタチンＩである。下線を引いた配列およびイタリック体で表された配列からなるタンパク質は血管抑制特性を有するクロモグラニンＡの断片であるバソスタチンＩＩである。クロモグラニンＡは大型有芯シナプス小胞（ｌａｒｇｅ  ｄｅｎｓｅ−ｃｏｒｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ）の主要なタンパク質である。側頭皮質におけるセクレトグラニンＩＩに対するクロモグラニンＡの割合は、痴呆の臨床的重篤度および神経病理学的変化と顕著に相関する。ＣＳＦ中のバソスタチンＩＩペプチドレベルはシナプスの損失を反映し得る。
【０１８７】
Ｍ４３５２．４：このペプチドはα−１−アンチキモトリプシン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ０１０１１；理論的分子量  ４３５４．１９  Ｄａ；配列番号９）のＣ末端断片として同定された。これは、神経毒性アミロイド沈着物の形成を促進し得る、且つ、これと関連する、ＡＤ脳において過剰生産される急性／炎症性タンパク質である。脳内レベルの増大はＣＳＦ中よりもより高いレベルにより反映される。このペプチドは直接配列決定を行い、特性は抗−α−１−アンチキモトリプシン抗体を用いて確認した。
【０１８８】
Ｍ２１１００．１：このタンパク質は完全長レチノール結合タンパク質（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ０２７５３；理論的分子量  ２１，０７１．６０Ｄａ）として同定された。このマーカーの特性は、８つのトリプシン消化断片の直接配列決定および抗−レチノール−結合タンパク質抗体を用いるプルダウンアッセイにより規定した。
【０１８９】
Ｍ８５７５、Ｍ８２９２、Ｍ８１８４：これらのタンパク質はユビキチンおよびそのＣ末端断片として同定された。神経原線維変化（ＮＦＴ）は、過剰にリン酸化され、且つ、ユビキチン化された形態のタウタンパク質から構成される。成熟化に伴い、タウに基づく神経原線維変化は徐々にユビキチン化される。タウおよび共役するユビキチンのレベルはＡＤの脳およびＣＳＦの両方で上昇する。さらに、ＣＳＦ−ユビキチンレベルは、コンピュータ断層撮影法により測定されるような、皮層および中心部の脳における萎縮症の程度の増大に関連する。
【０１９０】
Ｍ４９７１：このタンパク質は、Ｎ−アセチル化形態のチモシンβ−４（Ｎ末端のセリンがアセチル化されている）として同定された。チモシンβ−４は、ＡＤにおける慢性の炎症性プロセスの中心的部分である、小グリア細胞の活性化のためのマーカーとして機能し得ると考えられる。このタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  登録番号Ｐ６２３２８）として示す。
【０１９１】
Ｍ１３９６０およびＭ１４１１０：これらのバイオマーカーは、それぞれ完全長トランスサイレチンＳ−Ｃｙｓ（および／またはＳ−ＣｙｓＧｌｙ）および  トランスサイレチン  Ｓ−グルタチオニル化タンパク質として同定された。トランスサイレチンは、健常対照と比較してＡＤ患者のＣＳＦ中でより低い濃度で存在する、Ａ−β捕捉タンパク質としてこれまでに特徴付けられている。この濃度の低下は老人斑の存在量とは相関しない。
【０１９２】
Ｍ６５０２および７２６２：これらのバイオマーカーはニューロンの大型有芯小胞中に見られるクロモグラニンＢ（ＣｈＢ）ペプチドの断片として同定された。ＣｈＢは前駆タンパク質からより小さなペプチドを形成するプロホルモン転換酵素（ＰＣ）酵素によって高度にプロセシングされる。ＰＣ酵素のアンバランスが関連する疾患は、クロモグラニンタンパク質のプロセシングにおける変化を生じ得る。クロモグラニンタンパク質類（ＣｈＡ、ＣｈＢおよびセクレトグラニンＩＩ）は、ＡＤ患者の脳内におけるそれらの分布の識別し得る変化を示し、アミロイド斑に関連することも多い。ＣｈＢを含むクロモグラニンペプチド類は、アルツハイマー病におけるシナプス変性のための神経マーカーとしての可能性を有する。
【０１９３】
Ｍ７６５８およびＭ７７３８：これらのバイオマーカーはオステオポンチンＣ末端断片であり、それぞれリン酸化されていない種類のものおよび一箇所だけリン酸化されている種類のものである。オステオポンチンは、神経炎症の病因においてキーとなる役割を担い得る、組織修復を調節するサイトカインである。
【０１９４】
Ｍ１７３８０：このバイオマーカーはアポリポタンパク質Ａ−ＩＩの二量体である。ＡｐｏＡ−ＩＩは、おそらくクリアランスにおける役割を担うａ−βと強力に結合するタンパク質  ＡｐｏＥと、複合体を形成する。ＡｐｏＡ−ＩＩのレベルは痴呆患者の血清において減少していることが以前から示されていた。
【０１９５】
Ｍ２３４７７：このバイオマーカーはプロスタグランジンＤ−シンターゼであり、ＰＧＨ２からプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）への形成を触媒するβ−トレースタンパク質としても知られる糖タンパク質である。
【０１９６】
７６５３Ｄａ／７７１８Ｄａ（ＩＭＡＣ−Ｃｕ  ＳＰＡ）：このタンパク質はオステオポンチン（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ１０４５１、ＭＷ７６５８．１９Ｄａ；配列番号１１）のＣ末端断片として同定された。オステオポンチンはセリン残基が広範にわたりリン酸化されていることが知られている。７６５３Ｄａはリン酸化されていない形態であるのに対して、７７１８Ｄａはリン酸化ペプチドである。配列番号１１においてボールド体で強調表示された配列は７６５３Ｄａバイオマーカーに相当する。
【０１９７】
７２５８Ｄａ（Ｑ１０  ＳＰＡ）：このタンパク質はクロモグラニンＢ（セクレトグラニンＩ；ＳＧ１＿ＨＵＭＡＮ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ０５０６０））のプロセシング断片である。配列番号１２においてボールド体で強調表示された配列は７２５８Ｄａバイオマーカーに相当する。下線を引いた３つの断片は高スコアを有するＭＳＭＳにより同定された。Ｙ３４１はスルホチロシンであるので、予測される分子量は７２６２．４２Ｄａである。このペプチドを生成するための生化学は、６５０２Ｄａペプチドのためのものと正に同じである。７２６２Ｄａペプチド配列は、プロホルモン転換酵素１／３およびプロホルモン転換酵素２のための切断配列：−ＫＫ−、−ＲＲ−、および−ＫＲ−と隣接する（そして、カルボキシペプチダーゼＨはＣ末端のＬｙｓおよびＡｒｇを切り取る）。
【０１９８】
２３ｋＤａバイオマーカー：このタンパク質はプロスタグランジン−Ｈ２  Ｄ−イソメラーゼ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ４１２２２）である。予測分子量は１８．７ｋＤａであるが、このタンパク質は非常に高度にグリコシル化されている。
【０１９９】
１７．３ｋＤａバイオマーカー：  このタンパク質はアポリポタンパク質  Ａ−ＩＩ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ０２６５２）のＣｙｓ−Ｃｙｓ二量体である。単独のモノマーの分子量は８７０７．９１Ｄａであるが、Ｎ末端Ｑはピロリドンカルボン酸（約１７Ｄａ）に改変されていることが知られている。したがって、２つの完全長モノマーからなる二量体は１７３７９．８２Ｄａである。
【０２００】
９．８ｋＤａ（Ｑ１０  ＳＰＡ）：このタンパク質はクロモグラニンＡ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ１０６４５、ＭＷ９７３０．１８Ｄａ；配列番号１３）のＥＡ−９２ペプチドとして同定された。配列番号１３においてボールド体で強調表示された配列は９７３０Ｄａのバイオマーカーに相当する。下線を引いた３つの断片は高スコアを有するＭＳＭＳにより同定された。９７３０Ｄａペプチド配列はプロホルモン転換酵素１／３およびプロホルモン転換酵素２のための切断配列と隣接している。９．８ｋＤａバイオマーカー（Ｑ１０）は、他（ＣＭ１０、Ｈ５０）のアッセイ条件下で見られる９７５０Ｄａバイオマーカーとは異なることに注意されたい。
【０２０１】
４８１２Ｄａ（Ｑ１０）：このバイオマーカーはＶＧＦ神経成長因子誘導前駆体（ＮＣＢＩ  ＃ｇｉ１７１３６０７８、ＭＷ４８０８．８０Ｄａ；配列番号１４）のプロセシング断片として同定された。配列番号１４においてボールド体で強調表示された配列は４８０８Ｄａバイオマーカーに相当する。下線を引いた２つの断片は、ＭＳＭＳにより同定され、該ペプチドの配列の全てをカバーする。４８０８Ｄａペプチド配列はプロホルモン転換酵素１／３およびプロホルモン転換酵素２のための切断配列と隣接している。
【０２０２】
４３２０（ＩＭＡＣ−Ｎｉ）：このバイオマーカーはＡ−β  １−４０ペプチド（ＭＷ４３２９．８６Ｄａ）として同定された。このピークは、ＲＰＣ、ＹＭ３０、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製され、トリプシンを用いて消化される、ＩＭＡＣ−Ｎｉアレイを用いてＱ画分３中に見られ、消化物中の主要なイオンはアミロイドβＡ４前駆体（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ０５０６７；配列番号１５）の断片として同定された。ボールド体で強調表示された配列番号１５中の配列は４３３０Ｄａのバイオマーカーに相当する。下線を引いた３つの断片がＭＳＭＳにより同定された。
【０２０３】
１６．２ｋＤａ（ＩＭＡＣ−Ｃｕ）：このバイオマーカーはグリコシル化膵臓リボヌクレアーゼ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ０７９９８）である。１６．２ｋＤａのピーク後の全ピークは、成分としてともに精製され、また、様々なグリコシル化形態であると思われる。リボヌクレアーゼはわずかに部分的にグリコシル化されていることが知られている。１４．６ｋＤａのピーク（１６．２ｋＤａのバイオマーカーと共に精製）は、シンプルな非グリコシル化形態の膵臓リボヌクレアーゼ（ＭＷ１４，５７４．３３Ｄａ）に相当する。
【０２０４】
４１４６Ｄａ（Ｑ１０）：このポリペプチドはプロテアーゼＣ１インヒビター（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ＃Ｐ０５１５５、ＭＷ４１５２．８７Ｄａ）のＣ末端断片（配列番号１６）として同定された。
【０２０５】
上記バイオマーカーはＡＤに対する多くの興味深いメカニズム的関連性を有する。例えば、以下のものは宿主応答性タンパク質タンパク質および断片である：神経内分泌タンパク質ＶＧＦ（断片）；およびβ−２−ミクログロブリン（完全長）。以下のものはプラーク“関連”タンパク質／ペプチドである：ＢＲＩ膜タンパク質（断片）；Ａ−β（断片／形態）；シスタチンＣおよび短縮型シスタチン−Ｃ（断片）；セクレトニューリン；バソスタチンＩＩ；ユビキチンおよびユビキチン断片；神経内分泌タンパク質７Ｂ２；および補体３ａタンパク質（断片）。最後に、以下のタンパク質は鉄の輸送および再利用における役割を担う：トランスフェリン（完全長）；およびヘモペキシン（完全長）。これらのバイオマーカー間のメカニズム的関連性を図１０および以下の表Ｖにまとめる。
【０２０６】
（表Ｖ）
（特性判定された神経病理学的関連性を有するマーカーのリスト）
【０２０７】
【表５】
0005479379.tif 000013
（実施例４．アルツハイマー病のためのマーカーとしてのシスタチンＣおよびその改変体）
（Ａ．サンプルプロトコール）
１．  ０．２５ｍｇ／ｍＬのシスタチンＣ抗体を含む２μＬの溶液をＰＳ−２０アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州）の各スポットに手作業で載せる。陰性対照として、同濃度のＩｇＧを別のスポットに対して使用する。
【０２０８】
２．  室温にて２時間、湿潤チャンバ内でインキュベートすることにより、上記抗体をスポットに共有結合させる。
【０２０９】
３．  バイオプロセッサーをＢｉｏｍｅｋ２０００液体処理ロボットに移す。
【０２１０】
４．  Ｂｌｏｃｋ  ｒｅｓｉｄｕａｌ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ  ２５μＬの１Ｍ  エタノールアミンを添加することにより残りの活性部位をブロックする。室温にて３０分間、湿潤チャンバ内でインキュベートする。
【０２１１】
５．  １００μＬ  ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、各５分間、３回洗浄することにより、結合していないタンパク質を除去する。
【０２１２】
６．  １００μＬのＰＢＳで５分間洗浄する。
【０２１３】
７．  ２０μＬのニートなＣＳＦを各スポットに載せ、４℃にて一晩インキュベートする。
【０２１４】
８．  １００μＬ  ＰＢＳ＋０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、各１０分間、３回スポットを洗浄する。
【０２１５】
９．  １００μＬのＰＢＳで、各１分間、３回洗浄する。
【０２１６】
１０．  １００μＬの１ｍＭ  ＨＥＰＥＳを用いてアレイをすすぐ。
【０２１７】
１１．  Ｂｉｏｍｅｋ２０００ロボットからバイオプロセッサーを取り除く。
【０２１８】
１２．  バイオプロセッサーのガスケットを取り除き、スポットを空気乾燥させる。
【０２１９】
１３．  ０．８μＬの飽和ＳＰＡ溶液を２回、アレイの各スポットに手作業で載せる。
【０２２０】
１４．  プロテインチップリーダーを使用してアレイを分析する。
【０２２１】
（Ｂ．ＣｙｓＣ  Δ１−８マーカーの検証）
ＣｙｓＣ  Δ１−８のアルツハイマー病のためのマーカーとしての使用を検証するために、１５８の脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルは、３つのグループ：（１）アルツハイマー病（ＡＤ）、対照、および非アルツハイマー性痴呆（非ＡＤ）として予め診断された被験体から採取した。これらのグループのサンプル分布は上記表ＩＩＩに示す。
【０２２２】
各サンプル中のＣｙｓＣ  Δ１−８に対するＳＥＬＤＩ−ＭＳの測定値は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｈ５０プロテインチップおよびＥＡＭとして５０％  ＳＰＡを使用する標準的プロトコールにしたがって取得した。結果を図１１の左下部のグラフに示す。完全長ＣｙｓＣの同様の測定値も同じサンプル群を使用して得られた（図１１、右下部）。結果は、アルツハイマー病を患う被験体のＣｙｓＣ  Δ１−８のレベルが非アルツハイマー性痴呆を患う被験体のレベルよりも顕著に高いことを示す。
【０２２３】
（実施例５．アルツハイマーを検出するためのマーカーの組み合わせ）
上述したように、バイオマーカーの組み合わせは、単一のバイオマーカーのみよりも特定の症状について、より大きな予測値を提供し得る。サンプル中の複数のバイオマーカーは試験の感度および／または特異度を増加させ得る。患者のアルツハイマー病の病態を認定するための好ましいバイオマーカー群は、その群の中のバイオマーカーがｉｎ  ｖｉｖｏで互いに独立して調節されるものである。好ましい試験は８０％より高い感度および特異度を有する。さらにより好ましいのは、感度および特異度の両方が９０％より高い試験である。組み合わせ試験のために好ましいバイオマーカー群のひとつの例は、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質  Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、およびＭ３５１３．９（７Ｂ２  ＣＴ断片）である。好ましいバイオマーカー群の別の例は、Ｍ１７３４９．３（アポリポタンパク質  Ａ−ＩＩ二量体）、Ｍ６０４６４．７（ヘモペキシン）、Ｍ１０３７９．８（１０．３ｋＤａ）および  Ｍ１１７２５．７（β−２−ミクログロブリン）を含む群である。
【０２２４】
本明細書中に記載された実施例および実施形態は、例示のみを目的とするものであり、それらに照らし合わせて様々な改変および変更が当業者に示唆され、また、それらは本出願の精神および範囲、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。本明細書中で引用した全ての出版物、特許、および特許出願は、全ての目的のために参照によりその全体を明細書中に組み入れるものとする。
【０２２５】
【数１】
0005479379.tif 000014
0005479379.tif 000015
0005479379.tif 000016
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0005479379.tif 000019
【図１Ｃ】
0005479379.tif 000020
【図１Ｄ】
0005479379.tif 000021
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
0005479379.tif 000024
【図１Ｈ】
0005479379.tif 000025
【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
0005479379.tif 000027
【図１Ｋ】
0005479379.tif 000028
【図１Ｌ】
0005479379.tif 000029
【図１Ｍ】
0005479379.tif 000030
【図１Ｎ】
0005479379.tif 000031
【図１Ｏ】
0005479379.tif 000032
【図１Ｐ】
0005479379.tif 000033
【図１Ｑ】
0005479379.tif 000034
【図２】
0005479379.tif 000035
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005479379.tif 000038
【図４Ｃ】
0005479379.tif 000039
【図４Ｄ】
0005479379.tif 000040
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005479379.tif 000050
【図８】
0005479379.tif 000051
【図９−１】
0005479379.tif 000052
【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図９−１４】
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【図９−１５】
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【図９−１６】
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【図９−１７】
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【図９−１８】
0005479379.tif 000069
【図９−１９】
0005479379.tif 000070
【図９−２０】
0005479379.tif 000071
【図９−２１】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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