(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
【化１】
0005595920.tif 000010
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ７は独立にＨ、−ＯＨまたは−ＯＲであり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキルであり；
ＸはＨ、−ＯＨまたはグルコピラノシル部分である］
を有する、単離された化合物またはその塩（ただし、該化合物はモントブレチンＡまたはモントブレチンＢではない）。
【請求項２】
Ｘが構造：
【化２】
0005595920.tif 000011
を有する、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
Ｒ３’およびＲ７が−ＯＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３’、Ｒ５’、Ｒ５およびＲ７がそれぞれ−ＯＨである、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ２が独立にＨまたは−ＯＨである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ２が−ＯＨである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１が−ＯＨである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
化合物またはその生理学上許容される塩が、食品、飲料、栄養補助剤、医薬製剤、洗口剤、歯磨き剤またはチューインガム中に、哺乳類被験体において唾液または膵臓α−アミラーゼの阻害に有効な量で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物またはその生理学上許容される塩と、１以上の生理学上許容される担体または賦形剤とを含んでなる、組成物。
【請求項１０】
哺乳類α−アミラーゼ阻害剤として用いるための組成物であって、構造：
【化３】
0005595920.tif 000012
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ７は独立にＨ、−ＯＨまたは−ＯＲであり、ここでＲはＣ１−Ｃ６アルキルであり；かつ、ＸはＨ、−ＯＨまたはグルコピラノシル部分である］
を有する化合物またはその生理学上許容される塩を含んでなる、組成物。
【請求項１１】
Ｒ３’およびＲ７が−ＯＨである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ３’、Ｒ５’、Ｒ５およびＲ７がそれぞれ−ＯＨである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｒ１およびＲ２が独立にＨ、−ＯＨまたは−ＯＭｅである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ１およびＲ２が独立にＨまたは−ＯＨである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒ２が−ＯＨである、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｒ１が−ＯＨである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｘが
【化４】
0005595920.tif 000013
である、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
化合物がモントブレチンＡである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１９】
前記化合物またはその塩がクロコスミア種の球茎からの抽出液中に存在する、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
化合物またはその塩が、食品、飲料、栄養補助剤、医薬製剤、洗口剤、歯磨き剤またはチューインガム中に存在する、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
糖尿病前症、糖尿病および／または肥満に関して被験体を治療するためのものである、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
齲歯および／または歯垢の治療または予防において用いるためのものである、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願
本願は２００７年１０月１６日に出願された米国仮特許出願６０／９６０，８４３に対する優先権を主張するものであり、その内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、哺乳類α−アミラーゼの阻害剤に関する。
【０００３】
背景
膵臓α−アミラーゼは、食事中のグルコースの主要な供給源であるデンプンの加水分解における最初の段階を触媒する消化系の酵素である。小腸におけるヒト膵臓α−アミラーゼ（ＨＰＡ）の活性は食後のグルコースレベルに関連し、その制御は糖尿病および肥満における重要な因子である。また唾液α−アミラーゼもデンプンの消化および口腔歯垢に関与する細菌の維持にも関与している。よって、阻害剤の治療的使用によるα−アミラーゼ活性の調整は医学的に大きな関連がある。２つのα−グルコシダーゼ阻害剤、アカルボース(Acarbose)（Precose（商標））とミグリトール（Glyset（商標））が医学的に用いられているが、それらの有効性は、他のα−グリコシダーゼの非特異的阻害であり得る望ましくない副作用によって制限される場合がある。これらの副作用はまた、これらの薬剤の全身吸収および従ってそれらの体内分布によっていっそう大きなものとなり得る。著しくは経口薬剤では、吸収の低さが膵臓α−アミラーゼ阻害剤にとっての望ましい品質であり、それはこの効果が局部的に（例えば、消化管または口腔に）必要とされるだけで、低い全身アベラビリティーは望ましくない副作用を軽減するからである。
【０００４】
上記の関連特許出願の出願に次いで、ミリセチンを含む種々のフラボノイドがヒト唾液α−アミラーゼを、約９または１０μＭを超えるＩＣ５０値で阻害することが報告された(Lo Piparo, E. et al. "Flavonoids for Controlling Starch Digestion: Structural Requirements for Inhibiting Human α- Amylase"; J. Med. Chem.; ２００８年５月２９日公開)。この文献に報告されているように、アカルボースはヒト唾液α−アミラーゼを、およそ１μＭのＩＣ５０で阻害した。これまでに、ミリセチンはブタ膵臓α−アミラーゼを０．３８ｍＭのＣ５０値で阻害することが報告されている(Taderal, K. et al. (2006) J. Nutr. Sc., Vitaminol 52:149-153)。
【０００５】
Asada, Y. et al. (1988) Phytochemistry 27, 1497-1501には、下記の構造：
【化１】
0005595920.tif 000002
を有するミリセチン部分を含む天然のグリコシル化化合物が記載されている。
【０００６】
モントブレチンＡおよびＢは、日本の民間療法における抗腫瘍治療薬として用いられてきた「モントブレチア属」として知られる一般的な園芸植物から単離された。しかしながら、モントブレチンＡまたはＢに関する生物活性は報告されていない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、哺乳類膵臓および唾液α−アミラーゼ阻害剤としてのある種のグリコシル化アシルの使用を含む。このような化合物（またはその製造のための出発化合物）は、アヤメ科(Iridaceae)の多年生植物クロコスミア属のいずれの種、雑種または栽培品種からも容易に単離することができる。この属は南アフリカ原産であるが、今や世界中に見られる。クロコスミアは比較的少数のメンバーを含み、雑種は一般に「モントブレチア属」として知られている。これらの化合物は上記に示されるモントブレチンＡとＢを含み、本明細書ではひとまとめに「モントブレチン」または「モントブレチン化合物」と呼ばれ得る。モントブレチン化合物は現在、デンプン消化の制御において（例えば、糖尿病前症または糖尿病被験体において食後血糖を管理するため、および／またはいずれの被験体においても肥満の倫理のため）、または齲歯および／または歯垢の形成を阻害するために有用であることが示されている。この被験体はヒトまたはその他の哺乳類であり得る。
【０００８】
本発明はまた、カフェイン酸部分にメチルエステルを有し、モントブレチンＣと呼称される新規な化合物ならびに三糖部分の末端グルコースが存在しない天然モントブレチンの新規な末端切断型誘導体も含む。
【０００９】
モントブレチンＡは、モントブレチンの最も強力なα−アミラーゼ阻害剤である。モントブレチンＡの詳細な動態分析は、それが、一連の他のグリコシダーゼに対して試験した際に高レベルの選択性を有するＨＰＡの強固な結合競合阻害剤であることを示す。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本明細書に直接定義されていない用語は、本発明の技術分野内で理解されているような、それらに一般に関連する意味を有するものと理解すべきである。ある特定の用語を、本発明の実施形態の組成物、デバイス、方法など、また、どのようにしてそれらを製造または使用するかを記載する上で医師へさらなる指針を提供するために、以下にまたは本明細書の他所に述べる。当然のことながら、同じものを１を超える方法で言うこともできる。結局、本明細書に述べられている１以上のいずれの用語に別の言葉および別称を用いてもよい。ある用語が本明細書で詳説または記述されているかどうかには重きが置かれない。いくつかの別称または置換可能な方法、材料などが示される。特に明示されない限り、１つまたはいくつかの別称または等価物の詳説は、その他の別称または等価物の使用を排除するものではない。用語の例を含め、本明細書での例の使用は単に例示のためであり、本明細書において本発明の実施形態の範囲および意味を限定するものではない。
【００１１】
本発明は、糖尿病前症、糖尿病もしくは肥満の治療における、または齲歯もしくは口腔歯垢の予防もしくは治療のため、またはこのような使用のための組成物の製造における、α−アミラーゼ阻害剤としての式Ｉの化合物またはその薬学上許容される塩の使用を提供する。
【００１２】
【化２】
0005595920.tif 000003
【００１３】
式Ｉにおいて、ＸはＨ、ＯＨまたはグルコピラノシル部分である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ３’およびＲ５’はＨ、ＯＨおよびＯＲ（ここで、Ｒは、メチルを含め、炭素長１〜６の非置換アルキルである）から独立に選択される。いくつかの実施態様において、Ｒ１およびＲ２は、それらが結合している炭素原子が構造（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）を有する架橋により連結されるように置き換えられてもよい。
【００１４】
本明細書において、「アルキル」は一価、または１本の鎖に配置された炭素と水素原子だけを含むフリーラジカルである。この鎖は分枝型であっても非分枝型であってもよい。非置換、非分枝型アルキルは一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有する。
【００１５】
式Ｉの化合物を含むいくつかの実施態様において、Ｒ７はＯＨであり、かつ／またはＲ３’はＯＨである。これらの実施態様のいくつかでは、Ｒ３’、Ｒ５’、Ｒ５およびＲ７はそれぞれＯＨである。
【００１６】
本発明はまた、糖尿病前症、糖尿病もしくは肥満の治療における、または齲歯もしくは口腔歯垢の予防もしくは治療のため、またはこのような使用のための組成物の製造における、α−アミラーゼ阻害剤としての式ＩＩの化合物またはその薬学上許容される塩の使用を提供する。式ＩＩにおいて、Ｒ１およびＲ２およびＸは式Ｉに関して上記した通りであり、Ｒ３’、Ｒ５、Ｒ５’およびＲ７は−ＯＨである。
【００１７】
式ＩまたはＩＩの化合物を含む特定の実施態様では、Ｒ１はＯＨまたは−ＯＣＨ３であり、かつ／またはＲ２はＯＨである。これらの実施態様のいくつかでは、Ｒ１はＯＨであり、かつ、Ｒ２はＯＨである。上述の実施態様のいずれかまたは総てにおいて、Ｘは−ＯＨまたはＤ−グルコピラノシル部分である。特定の実施態様では、Ｘは以下の構造：
【化３】
0005595920.tif 000004
を有する。
【００１８】
本発明の別の態様では、式ＩＩＩの新規な化合物またはその塩が提供される。この化合物は、例えば、それを高温、ＤＭＦ中でＢｒ−ＣＨ２−ＣｌおよびＣｓＣＯ３と反応させることによって天然モントブレチンを変換することにより製造することができる。
【００１９】
【化４】
0005595920.tif 000005
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、糖尿病前症、糖尿病もしくは肥満の治療における使用のため、または齲歯もしくは口腔歯垢の予防もしくは治療のための、１以上の生理学上許容される担体および／または賦形剤と少なくとも１種類のモントブレチン化合物またはその薬学上許容される塩とを含んでなる組成物が提供される。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、モントブレチンＡおよびモントブレチンＢを除く、新規な単離されたモントブレチン化合物またはその塩もしくはその構造類似体が提供される。
【００２２】
本明細書におけるモントブレチンに関して「単離された」とは、天然モントブレチン化合物が、クロコスミア種の球茎中の重量当たりのモントブレチンよりも高い純度で調製物中に存在している状態を含む。合成化合物（天然モントブレチンの変換産物など）では、「単離された」とは、純度にはかかわらず、その産物のいずれの調製物も含む。よって、本明細書におけるモントブレチンに関して「単離された」とは、天然源と比較して特定のモントブレチンが富化された調製物を含む。例としては、植物組織と比較してモントブレチンの純度が少なくとも約１．５倍、２．０倍または少なくとも約２．５倍高い調製物を含む。精製または富化のレベルを決定するためには、例えば本明細書に記載の手順を用いてモントブレチンのα−アミラーゼ阻害活性をアッセイすればよい。
【００２３】
単離された天然モントブレチンはクロコスミア種植物組織からの抽出液、好ましくはこのような植物の球茎の抽出液の形態で提供することができる。クロコスミア球茎は一般に約８００ｍｇ／ｋｇ（組織１ｋｇ当たりのモントブレチンＡ）を含んでなる。本明細書で開示されているように、モントブレチン（特にモントブレチンＡ）は球茎組織から良好な収率で容易に精製される。モントブレチンは一般に水溶性であり、このような抽出液の調整には極性溶媒が遊離に使用できる。水とメタノールおよびエタノールを含む短鎖アルコールで抽出することにより良好な結果が得られる。単離されたモントブレチンはこのような植物抽出液中に見られる他の化合物とともに動物被験体に投与してもよいが、副作用の最小化は、医薬処方物および／または食品および飲料配合物にとって一般に許容される純度を含む実質的に精製されたモントブレチン化合物を用いることで見られる。
【００２４】
天然源からフラボノイドなどを得るために当技術分野で公知の種々の方法を植物組織からのモントブレチン化合物の単離に使用することができる。特定の方法論が以下の実施例に開示されている。さらに、図１は球茎組織からのモントブレチンの単離に有用な簡略法の概要を示す。一般に、球茎をスライスまたは細断し、一晩メタノールで抽出した後に組織の真空濾過を行う。一般に抽出を２回行った後、３０℃の水浴中でメタノールの回転蒸発を行う。得られた生成物の長期保存は−２０℃以下で行うのが最も良い。その後、この粗抽出液を、疎水性／有機材料の排除に適当なカラム上での吸着クロマトグラフィーに付す。良好な樹脂としては、商標Ｄｉａｉｏｎｓとして販売されているものなど、ＨＰ−２０として知られているものがある。回転蒸発メタノール抽出液を水に溶かし、カラムにのせ、まず、蒸留水中３０％のアセトン、その後、５０％アセトン：水、そして１００％アセトン：水で溶出させる。大部分のモントブレチン化合物は５０％アセトン画分に見られる。溶出物は一般にその元の容量の約１％まで蒸発させた後、例えば以下の実施例に記載されているような手順を用いて、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付す。この単離手順は、例えば超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）および／またはα−アミラーゼ阻害活性に関するアッセイの使用によってモニタリングすることができる。図２は、モントブレチンＡピークが同定されたＨＰＬＣ調製物の出力を示す。
【００２５】
天然モントブレチンにはまた、当技術分野で公知の手順を用いて種々の変換を行うことができる。例えば、酵素的にまたは加水分解によって糖を除去してもよく、例としては、本明細書の例に記載されているような酵素を用いてモントブレチンＡ〜Ｃの三糖部分の末端グルコースに除去がある。そのグルコシル部分の除去はα−アミラーゼ活性に影響を及ぼさない。別の例としては、上述のような式ＩＩＩの化合物の調製がある。さらなる変換の例としては、モントブレチンＡ〜Ｃのミリセチン部分などのヒドロキシル基のアシル化が挙げられる。次のチャートは実施可能な慣例の化学変換を示す。
【００２６】
【化５】
0005595920.tif 000006
【００２７】
本発明の組成物は一般に被験体に経口投与され、経口用として当技術分野で公知のいずれの手段によって処方されてもよい。腸内投与を含む経口投与に好適な組成物は、液体、錠剤または散剤、丸剤またはカプセル剤、懸濁液またはゲルなどの固体などを含む種々の形態で提供することができる。このような組成物は時限放出または徐放用に処方可能である。種々の技術は経口医薬組成物を処方する分野の熟練者に知られており、例えば、Remington: the Science & Practice of Pharmacy by Alfonso Gennaro, 第20版, Williams & Wilkins, (2000)に見出せる。
【００２８】
本発明で用いるための化合物および組成物はまた、被験体により摂取されることを意図した食品、飲料、キャンディーまたはその他の「処置」または栄養補助剤などに投与可能である。本発明で用いるための化合物または組成物は特に動物に投与するために飲用水に加えることができる。
【００２９】
歯垢、齲歯（caries）などの治療または予防のため、本発明で用いるための化合物または組成物は口腔において唾液α−アミラーゼを阻害するのに有効な量でチューインガム、口腔洗浄剤もしくはその他の洗口剤、歯磨き剤または口腔もしくは歯に施されることを意図した他のいずれかの組成物中に含むことができる。
【００３０】
本発明のいくつかの実施態様において、天然モントブレチンは植物製品の分野で公知の種々の手段に従って調製および投与することができる。例の非網羅的リストとしては、植物抽出液および処方物、茶、チンキ、ビネガーチンキ、シロップおよび軟膏を含む経口局所用調製物がある。種々の技術が医療用植物抽出液の分野の熟練者に知られており、例えば、Linda PageによるHow to be Your Own Herbal Pharmacist by, 第2版. Healthy Healing Publications (1997)に見出せる。
【００３１】
本明細書で開示されているように、唾液または膵臓α−アミラーゼの阻害により利益が得られるいずれかの症状のために、それを必要とする被験体を治療するために有効量のモントブレチンが使用可能である。例としては、膵臓α−アミラーゼの阻害による糖尿病前症、糖尿病および／または肥満の治療が挙げられる。別の例としては、唾液α−アミラーゼの阻害の結果としての齲歯および／または歯垢の予防または治療がある。動物被験体の性質および標的酵素が唾液性か膵臓性かによって「有効量」を決定することは十分医師の裁量の範囲内である。本明細書の実施例に開示されている動物試験に基づき、糖尿病において血中グルコースレベルを管理するのに用い得るモントブレチンＡの用量の例は１日当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。モントブレチンは食事毎にまたは１日に約３回投与することもできるし、あるいは連続投与用に処方することもできる。
【００３２】
モントブレチンの天然源としては、クロコスミア属（その総ての種、雑種および栽培品種を含む）のいずれのメンバーも含む。この属の植物は現在、園芸植物として世界中で一般的である。これらの植物は豊富な球茎組織を作り、種子の他に植物の繁殖に用いられることから、これらの球茎も市販されている。クロコスミア属の植物を記載している教本としては、Goldblat, P. et al. "Crocosmia and Chasmanthe" Royal Horticul tural Society; Timber Press; Oregon USAがある。
【００３３】
クロコスミア属のメンバーの例としては、クロコスミア・クロコスミーフローラ）(Crocosmia crocosmiiflora)、クロコスミア・アムボンゲンシス(Crocosmia ambongensis)、クロコスミア・アウレア(Crocosmia aurea)(Falling Stars)、クロコスミア・シンナバリナ(Crocosmia cinnabarina)、クロコスミア・フカータ(Crocosmia fucata)(Namaqualand, Cape region)、クロコスミア・ルシフェランス(Crocosmia luciferans)、クロコスミア・マクラータ(Crocosmia maculata)、クロコスミア・マソノラム(Crocosmia masonorum)(Giant Montbretia)、クロコスミア・マセウシアナ(Crocosmia mathewsiana)、クロコスミア・パニクラータ(Crocosmia paniculata)(Aunt-Eliza)、クロコスミア・パウシフローラ(Crocosmia pauciflora)、クロコスミア・ペアルセイ(Crocosmia pearsei)、クロコスミア・ポッシー(Crocosmia pottsii)、クロコスミア×クロコスモイデス、クロコスミア×ラチフォリアおよび栽培品種「His Majesty」(花が大きく、橙色）、「Jackanapes」(花が赤橙色で、内側の花弁がゴールデンイエロー）および「Solfatare」（ブロンズの葉群を持つ黄色い花）が挙げられる。
【００３４】
本発明の他の態様および特徴は添付の図面とともに以下の本発明の特定の実施態様の記載を見れば、当業者には明らかとなるであろう。ここで、本発明を以下の非限定例を参照してさらに記載する。用いられる実験手順の記載はこれらの実施例に従う。
【実施例】
【００３５】
実施例１：ＨＰＡ阻害スクリーニング
ＨＰＡ活性のアッセイは、その放出が連続的にモニタリング可能である発色生成物を生成するための合成アリールグリコシド基質の酵素的切断に基づいた。クロロニトロフェニル脱離基のｐＫａ（ｐＫａ６．４）がアッセイのｐＨ値（ｐＨ７．０）より相当低く、従って、発色団の高い吸光係数が得られることから、市販のアミラーゼ基質２−クロロ−４−ニトロフェニルα−Ｄ−マルトトリオシド（ＣＮＰ−Ｇ３）を用いる。アッセイ溶液にはまた、混入阻害剤の検出を最小限にするためにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）（０．０１％）も含んだ。最初のスクリーニングにおけるサンプルは、５ｍｇ／ｍＬの乾燥メタノール抽出液を含有するＤＭＳＯ溶液であり、最終アッセイ容量６０μＬ中６０ｎＬの希釈溶液（最終抽出液濃度５μｇ／ｍＬ）で試験した。ＨＰＡの酵素活性は、この少量のＤＭＳＯ（０．１％）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）（０．０１％）の添加によって全く影響を受けないことが分かった。各サンプルは別個のプレートで反復させることで２回行った。分析される各所定バッチに関する頑健性と完全性を保証するため、既知のＨＰＡ阻害剤アカルボースの一連の希釈液を含有する２つの試験プレート各バッチの最初と最後のプレートとして実施した。
【００３６】
スクリーニングは９６チャネルピペットヘッドと低容積９６ピンＨｉｇｈ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ（商標）を備えたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで行った。このワークステーションは、一連のアッセイプレートの処理および読み取りを可能とするＵＶ／Ｖｉｓ能を備えたＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ８８０（商標）プレートリーダーが組み込まれている。アッセイは、６０μＬ容量の５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ＣＮＰ−Ｇ３（終濃度１ｍＭ）、ＨＰＡ（終濃度１μｇ／ｍＬ）およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）（０．０１％）を含有する３８４ウェルプレートで行った。ＣＮＰ−Ｇ３基質はＫＭ濃度（ＫＭ＝３．６ｍＭ）以下で用いた。Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ（商標）ピンツールの３回の移動（移動１回当たり２０ｎＬ容量）を用いてアッセイプレートに抽出液を加えた。各サンプルを２反復で行い、その２回目は４’−Ｏ−メチル−マルトシル−α−Ｄ−フロリド（終濃度１ｍＭ）をさらに含有する別個のプレートで行った。アッセイプレートは総て、３２の高い対照（阻害剤無し）を含んだ。阻害剤および酵素は「スロー・オン(slow-on)」型阻害剤の検出を可能とするよう、室温で１０分間ともにインキュベートした。この反応は基質の添加により阻害され、その後のクロロニトロフェノレート陰イオンの放出を４０５ｎｍで７分間継続的にモニタリングした。次に、プレートリーダーソフトウエア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（商標））を用いて、各ウェルの反応率を算出した。この各抽出液の反応率を高い対照に対してノーマライズし、各サンプルのデータを％残留活性として報告した。各サンプルに関して、この２反復を互いに対してプロットし（ｘ，ｙ）、バリデーションのためにヒットウインドウ（サンプルセットの平均からの３標準偏差に設定）内にあるサンプルを選択した。各抽出液のアリコート（１μＬ）を半分の面積の６ウェルプレート（最終容量１００μＬ）で再試験し、再現性のある阻害活性が得られたサンプルを「真のヒット」とした。
【００３７】
National Cancer Institute U.S.A. (NCI)からの３０，０００の抽出液を、上記の手順を用いてスクリーニングした。各プレートのデータを高い対照に対してノーマライズし、データの質を評価した。対照サンプルの質を表し、アッセイの妥当性の指標となる平均Ｚ’統計値は０．８６であると決定された。さらに、このライブラリーがどれだけ許容されるかを表す平均Ｚ値０．８２は、このアッセイが極めてロバストであり、そのデータが信頼できるものであったことを示した。ヒット閾値はサンプルセットの平均から３標準偏差に設定し（残留活性８１％に相当）、双方ともヒット境界内にあるサンプルをさらなる検討のために選択した。
【００３８】
大部分のサンプルは、抽出液が主として非阻害的であるサンプルセットに関して予測されるように、両反復に関して１００％前後の残留活性を示した。両反復がヒット境界内にあるサンプルのみをさらなるバリデーションのために選択した。一次スクリーニングから３０の抽出液がヒットとして同定され、各ヒットを標準的なＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計にて手動で再評価した。二次スクリーニングでは、２５の抽出液が再現性のある阻害を示し、それらが「真のヒット」であることが確認され、一方、５つの抽出液は有意なＨＰＡ阻害を示さず、従って、それらは偽陽性であると同定された。
【００３９】
実施例２：ＨＰＡ阻害剤のバイオアッセイにより導かれる単離
最も有意な阻害活性（残留活性２％）を有する実施例１からの抽出液をさらなる検討のために選択した。有効成分の詳細な検討の前に、粗抽出液に対してＨＰＡ阻害の予備動態分析を行った。希釈シリーズは「挙動の良い」阻害剤に典型的なＳ字用量反応曲線を示し、０．５４±０．０１μＬ／１００μＬ（抽出液容量／アッセイ容量）という極めて低いＩＣ５０値が明らかになった。さらに、この粗抽出液は、時間依存的なＨＰＡの不活性化を示さず、阻害レベルは４時間にわたって一定のままであった。これらの試験は、酵素変性または共有結合的酵素修飾などの望ましくない作用様式が存在しないことを示す。この抽出液はクロコスミア種の球茎の乾燥メタノール抽出液であった。
【００４０】
この抽出液の複雑な混合物から主要な生物活性成分を単離するため、ＮＣＩ公開植物保管所から入手した多数の粗材料に対して下記のような一連のバイオアッセイにより導かれる精製工程を行った。各工程で、上記のアッセイを用い、カラム画分をＨＰＡ阻害に関してアッセイし、活性画分を次に進めた。
【００４１】
粗材料（２ｇ）を酢酸エチルと水とで分液し、次に、その水性画分をブタノールに対して分液した。ブタノール画分をサイズ排除クロマトグラフィーのため、メタノールで予め膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）ＬＨ−２０を充填したカラムにのせた（この時１５０ｍｇ）。得られた画分を生物活性に基づいて分類した。活性画分を、２２％アセトニトリル水溶液を用いたＨＰＬＣにより精製し、３つの画分を得た。主要画分を３０分にわたって３０％〜４０％アセトニトリル水溶液の勾配を用いてさらに精製すると、モントブレチンＡ（１５分、８．４ｍｇ）が黄色粉末として得られた。２番目の画分に対する３０分にわたって３０％〜７０％アセトニトリル水溶液の勾配により、モントブレチンＢが黄色粉末として得られた（１６分、０．９ｍｇ）、３番目の画分に対して２０％〜３０％アセトニトリル水溶液の勾配を用い、モントブレチンＣ（２０分、１．６ｍｇ）が黄色粉末として得られた。
【００４２】
本方法の精製の各工程からのカラム画分の一部のサンプルを９６ウェルプレートに採取し（１００μＬ）、その後、蒸発乾固させた。Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ（商標）を用い、これらの画分を水に溶かし、種々のアリコート（１〜１０μＬ）を３８４ウェルプレートに移し、実施例１に記載されているプロトコールを用いてそれらのＨＰＡ阻害活性を分液した。
【００４３】
旋光度は、ハロゲンランプ（５８９ｎｍ）と１０ｍｍのマイクロ電池を備えたＪＡＳＣＯ  Ｊ−１０１０（商標）偏向計を用いて測定した。ＵＶスペクトルは、Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７（商標）分光光度計で記録した。１Ｈ、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹおよびＲＯＥＳＹスペクトルは、クリオプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＡＶ６００（商標）ＮＭＲ分光光度計で記録した。化学シフトは溶媒ピークを参照した（δＨ３．３１、δＣ、４９．１５  ＣＤ３ＯＤ）。ＥＳＩ質量スペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＴ（商標）質量分析計を用いて記録した。ＨＰＬＣ分離は、Ｗａｔｅｒｓ  ６００（商標）ポンプおよびＷａｔｅｒｓ  ＰＤＡ９００（商標）検出器にて、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  Ｃ１８（商標）カラム９．４×２５０ｍｍ、流速１ｍＬ／分を用いて行った。溶媒は総てＨＰＬＣ級（Ｆｉｓｈｅｒ）とし、使用前に濾過した後、ヘリウムでスパージした。
【００４４】
精製後、一連の３つの関連化合物が得られた。２Ｄ−ＮＭＲ分光法と質量分析の組合せにより、これらの化合物の２つをモントブレチンＡおよびＢと同定した。残りの系列メンバーを桂皮酸部分のメチルエーテルとして同定し、モントブレチンＣと呼称した（表１）。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
モントブレチンＡは、ＭＳデータ、１および２Ｄ  ＮＭＲ技術の組合せと先行文献データ（Asada, et al.［前掲］）との比較を用いて同定された。標準的技術（ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣおよびＲＯＥＳＹ）を用いて糖および芳香性部分と結びつけた。モントブレチンＡの芳香性部分は、ＨＭＢＣおよびＣＯＳＹデータを用いて完全に解明された。糖残基の同定はＩＤ−ＴＯＣＳＹおよびＲＯＥＳＹデータを用いて取得および確認し、文献における割り当てと一致していることが分かった。モントブレチンＢも、１および２Ｄ  ＮＭＲ技術ならびにモントブレチンＡのスペクトルおよび文献データとの比較によって同定された。
【００４７】
モントブレチンＣの構造は、ＭＳ、１および２Ｄ  ＮＭＲデータ、また、モントブレチンＡのスペクトルとの比較に基づいて割り当てた。モントブレチンＣのスペクトルは、１Ｈスペクトルにおける３．７１ｐｐｍの付加的な強い一重線と１３Ｃスペクトルにおける５５．８ｐｐｍの新たな炭素以外は同一であることが明らかとなった。さらに、モントブレチンＣはモントブレチンＡよりも高い１４質量単位であり、モントブレチンＣはモントブレチンＡのメチルエーテルであるという結論に至った。２Ｄ  ＨＭＢＣおよび２Ｄ  ＲＯＥＳＹデータを調べたところ、このメチルエーテルはＣ６上であるという結論に至った。
【００４８】
ミリセチンフラボノール核を含むこれらの天然モントブレチンは３位および４’位でグリコシル化されている。この３ヒドロキシルはＤ−グルコピラノシル−（β１→２）−Ｄ−グルコピラノシル−（β１→２）−Ｌ−ラムノピラノース（中央のＤ−グルコシル糖がこれらの系列メンバー間で違った置換を示す６−Ｏ−桂皮酸エステルを有している）からなるα結合直鎖三糖を有する。４’位はβ結合Ｄ−キシロース単位を有し、それ自体、その４−ヒドロキシル上にα結合Ｌ−ラムノピラノシル部分が付加されている。
【００４９】
実施例３：動態分析
モントブレチンＡ、ミリセチンおよびカフェイン酸エチルのＫ１値および阻害様式を、一連の基質濃度に対して種々の阻害濃度で反応率を測定することにより決定した。反応は４００ｎｍにてＶａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ３００（商標）またはＣａｒｙ４０００（商標）ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計のいずれかで行った。基質濃度（ＣＮＰ−Ｇ３）は一般にＫＭ値の１／５〜５倍まで変えた。同様の阻害剤濃度範囲を試みたが、いくつかの制限があった。測定可能なモントブレチンＡの最低濃度は、阻害剤濃度より有意に下に維持するのに必要とされる酵素濃度が極めて低いために、４ｎＭ（Ｋｉ値の１／２）であった。逆に、ミリセチンおよびカフェイン酸エチルの限定された水溶解度は、これらの化合物に関して測定された最高阻害剤濃度がＫｉ値の１．５倍であったことを意味する。モントブレチンＡおよびミリセチンに関するデータの二重逆数プロットは、両化合物がＨＰＡの競合阻害剤であることを示した。分析プログラムＧｒａＦｉｔ（商標）を用い、それぞれＫｉ値８．１±０．５ｎＭおよび１１０±１５μＭが決定された。カフェイン酸エチルで得られたデータの二重逆数プロットは、ＧｒａＦｉｔ（商標）プログラムを用いて決定されたようなＫｉ値１．３±０．１ｍＭを有するＨＰＡの非競合阻害剤であることを示した。
【００５０】
モントブレチンＢおよびＣのＫｉ値はレンジファインダー法(range finder method)によって決定した。一連の異なる阻害剤濃度に対する反応率を固定された基質濃度で測定した。データのＤｉｘｏｎプロットから、これらの点を通って１／Ｖｍａｘ直線と最も良く一致する直線の切片は−Ｋｉ値に等しい。これらのデータからモントブレチンＢおよびＣに関してそれぞれＫｉ値３．６±０．１μＭおよび６．１±０．１μＭが得られた。
【００５１】
単離されたこれら３つの系列メンバーの動態分析は、モントブレチンＡがモントブレチンＢおよびＣ（マイクロモル範囲のＫｉ；表２参照）よりも著しく強力なＨＰＡ阻害剤であることを示した（ナノモル範囲のＫｉ）。桂皮酸部分に遊離のメタ−ヒドロキシル基が存在することは、その除去またはメチル化（それぞれモントブレチンＢおよびＣ）がＨＰＡ阻害活性を低下させることから、モントブレチンＡの強固な結合に重要であることが明らかである。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
さらに、モントブレチンＡは、他のＧＨ１３酵素を含む一連のグリコシダーゼに対して試験したところ、ＨＰＡに対して高レベルの選択性を示した（表３）。
【００５４】
【表３】
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【００５５】
フラボノイドが抗酸化特性と酸化促進特性の双方を有することが知られていることを考えれば、第一の懸念は、モントブレチンＡはレドックスの改変によりＨＰＡを不活性化し得るということであった。この可能性を論破するため、モントブレチンＡによるＨＰＡの阻害を５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在および不在下の双方で測定した。ＤＴＴは酵素および試薬を還元環境で維持し、それにより、溶液中または酵素活性部位内でのレドックス化学の発生防ぐ。ＤＴＴを含めてもＨＰＡ阻害に対する影響は見られなかった。
【００５６】
さらに、フラボノイドはまた、阻害剤が不可欠なＨＰＡカルシウムイオンを抽出しているという可能性を浮上させる金属陽イオンを封鎖することができる。この作用機序を考慮するため、１ｍＭ塩化カルシウムの存在下で動態研究を行ったところ、阻害に変化は見られなかった。
【００５７】
α−アミラーゼ阻害に寄与するモントブレチンの構造モチーフを調べるため、２つの芳香部分フラボノール核（ミリセチン）および６−Ｏ−アシル基（カフェイン酸）に相当する市販の化合物をそれぞれＨＰＡ阻害剤として検討した。ミリセチンは、モントブレチンから数桁低いが、ＨＰＡ阻害剤（Ｋｉ＝１１０μＭ）であることが分かった。この阻害は競合的性質のものであることが示されたが、これは阻害が酵素活性部位における結合によるもにであることを示唆する。カフェイン酸のエチルエステルであるカフェイン酸エチルは、ＨＰＡの弱い阻害剤であることが分かった（Ｋｉ＝１．３ｍＭ）。この場合の阻害様式は非競合性のものであることが示されたが、これは阻害が活性部位から離れた相互作用によるものであることを示唆する。以下のことに縛られるものではないが、これらの知見はフラボノール核が活性部位を占め、カフェイン酸部分はリンカーとして働く糖で第二の部位と結合し、可能性としてさらなる結合相互作用も提供することを示唆する。
【００５８】
モントブレチンＡは、アグロバクテリウム（Ａｂｇ）由来のβ−グルコシダーゼに対して、経時的に阻害程度が低下するという時間依存的阻害を示した。アッセイ基質を添加する前にモントブレチンＡをＡｂｇとともにプレインキュベートしても、阻害は見られなかった。Ａｂｇは基質アグリコンに関して混合状態であり、従って、モントブレチンＡはＡｂｇの基質として働き、末端β結合グルコース残基が切断されると思われる。モントブレチンＡの次の残基はまたβ結合グルコース残基であるが、この残基は大きな６−Ｏ−カフェイン酸エステル部分を有しているのでＡｂｇによって処理されない。末端切断型のモントブレチンＡ由来化合物を再試験したところ、ＨＰＡに関する阻害作用に有意な変化は見られなかった。よって、三糖部分上の末端グルコシル残基はα−アミラーゼ活性に必要とされない。
【００５９】
実施例４：モントブレチンＡの胃安定性
人工腸液（ＳＩＦ）と人工胃液（ＳＧＦ）の双方におけるモントブレチンＡの安定性を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）によって分析した。この機器は直列のＰＤＡおよびＴＱ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ（登録商標）Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣシステムからなった。サンプル注入量２μＬをＷａｔｅｒｓ（登録商標）Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）に通し、移動相ＡおよびＢはそれぞれ０．１％ギ酸を含む水および０．１％ギ酸を含むアセトニトリルからなった。これらの移動相をカラム温度３５℃で、プログラムした直線勾配で送り込んだ。水中１０〜１００μｇ／ｍＬの範囲の濃度でモントブレチンＡ較正標準セットを用い、直線性を評価した。
【００６０】
ＳＧＦ安定性研究では、２．０ｇの塩化ナトリウムおよび３．２ｇのブタ胃粘膜由来ペプシン１：２，５００を７．０ｍＬの塩酸および２００ｍＬの脱イオン水に溶かした。得られた溶液をｐＨ１．５１の脱イオン水で１Ｌに希釈した。ＳＩＦでは、２６．８ｇの第一リン酸カリウムを２５０ｍＬの脱イオン水に溶かし、混合した後、７７ｍＬの０．２Ｎ水酸化ナトリウムと５００ｍｌの脱イオン水を加えた。次に、１０ｇのブタ膵臓パンクレアチンを加え、混合した。得られた溶液を０．２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ６．８９に調整し、脱イオン水で１Ｌに希釈した。
【００６１】
胃腸液活性を調べるため、ＳＧＦまたはＳＩＦ中０．５ｍｇ／ｍｌのオレアミド溶液（陽性対照）を、オレアミド（２−プロパノール中５０ｍｇ／ｍＬ）の１００μＬアリコートをＳＧＦまたはＳＩＦのいずれかで１０ｍＬに希釈し、３７℃の水浴中でそれぞれ１または３時間インキュベートすることにより調整した。１または３時間の時点で、水浴からサンプルを取り出し、得られた溶液の１００μＬアリコートをＵＰＬＣガラスサンプルバイアルにて脱イオン水で１ｍＬに希釈し、ＵＰＬＣでオレアミド含量を分析した。人工胃液活性を、その胃腸液の、オレアミドからオレイン酸への分解能に対してクロマトグラフィー分析を行った。ＳＧＦまたはＳＩＦのいずれかの存在下でのオレアミドは、測定した胃安定性試験時点で比べた場合の、インキュベーション後の濃度に有意な低下を示した。
【００６２】
モントブレチンの安定性は、水中モントブレチンＡの５ｍｇ／ｍｌの適当なアリコートをＳＧＦまたはＳＩＦで希釈することにより、ＳＧＦまたはＳＩＦのいずれか中モントブレチンＡの０．５ｍｇ／ｍｌ溶液を作製することで調べた。ＳＧＦ中のモントブレチンＡの安定性に関しては、ＳＧＦ中モントブレチンＡの１ｍＬアリコート５つを個々のガラスバイアルに移し、３７℃の水浴中に入れた。０、１５、３０、４５および６０分の時点で、１本のバイアルを水浴から取り出し、その溶液に１ｍＬのメタノールを加え、ボルテックスにかけた。得られた溶液２００μｌをガラスＵＰＬＣサンプルバイアルに移し、脱イオン水で１ｍＬに希釈し、ＵＰＬＣでモントブレチンＡ含量を分析した。ＳＩＦ中での安定性に関しては、ＳＩＦ中のモントブレチンＡ溶液の１ｍＬアリコート４つを３７℃の水浴中に０、１、２および３時間入れ、上記と同様に分析した。
【００６３】
ＳＧＦ中でのモントブレチンＡの安定性は０、１５、３０、４５および６０分の時点で調べ、ＳＩＦでの安定性は０、１、２および３時間の時点で調べた。人工胃環境ではモントブレチンＡの若干の低下が見られたが、人工腸環境では有意な低下は見られなかった。ＳＧＦ中でのモントブレチンＡの分解または損失のレベルは１時間の時点で約１０％であったが、ＳＩＦ中では、３７℃で３時間のインキュベーション内に有意な分解は見られなかった。
【００６４】
実施例５：植物供給源およびその抽出液
主要なクロコスミア原種の総ておよびそれらの雑種の断片からの球茎組織をモントブレチンの存在に関して調べた。これらの試験には、クロコスミア×クロコスミーフローラ［クロコスミア・ポッシー×クロコスミア・アウレア］；クロコスミア×クロコスミーフローラ「Ｅｍｉｌｙ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ」［クロコスミア・ポッシー×クロコスミア・アウレア］；クロコスミア「Εｍｂｅｒｇｌｏｗ」［クロコスミア・ポッシー×クロコスミア・パニクラータ］；クロコスミア「Ｌｕｃｉｆｅｒ」［クロコスミア・マソニオラム×クロコスミア・パニクラータ］が含まれた。各場合において、少なくともモントブレチンＡおよびＢを見出し、Ａが主要化合物であった。さらに、球茎組織の種々の液体抽出液のモントブレチン濃度を調べた。球茎組織の水性スラリー、水性抽出、メタノール抽出次いでエタノール抽出を用いた場合に収量の点で最良の結果が得られた。
【００６５】
実施例６：急性デンプン耐性試験（アカルボース）
対照およびＳＴＺ糖尿病ラットにおいて、デンプン投与に応答した血漿グルコースレベルに対するアカルボースの影響を調べるための試験を行った。体重２００〜２５０ｇの２４匹の動物を入手し、対照および糖尿病群に無作為に分けた。糖尿病は、０．９％生理食塩水中ストレプトゾトシン６０ｍｇ／ｋｇの単回の尾静脈注射によって誘発させた。対照ラットには生理食塩水のみを注射した。次に、動物をアカルボース処理無しと処理有りに分けた。４つの処理群は、対照ｎ＝６、対照＋アカルボースｎ＝６、糖尿病ｎ＝６および糖尿病＋アカルボースｎ＝６であった。デンプンはFisher Scientificから入手し、蒸留水で１７．５％懸濁液を作製した。得られたデンプン用量は２ｋｇ／ｇであった。アカルボースを蒸留水に１０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶かし、１ｍｌ／ｋｇ容量とした。得られたアカルボース用量は１０ｍｇ／ｋｇであった。
【００６６】
動物を一晩絶食させた。基準血液サンプルを採取し（５０μｌ容量）、その後、薬剤投与後３０、６０、９０および１２０分で採取した。デンプンおよびデンプン＋アカルボースは経口強制栄養法によって投与した。血液を１０，０００ｇｘにて２５分遠心分離し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩ（商標）を用いてグルコースレベルの測定のために血漿を採取した。結果を図３に示す。群間で体重の差は無かった。糖尿病非処理群だけで、デンプン投与３０分および６０分後に血漿グルコースの有意な増加が見られた。よって、ラットに対する１０ｍｇ／ｋｇ用量でのアカルボースの急性投与は、デンプン投与後の血漿グルコースの増加を防ぐのに有効である。
【００６７】
実施例７：急性デンプン耐性試験（モントブレチンＡ）
対照およびＳＴＺ糖尿病ラットにおいて、デンプン投与に応答した血漿グルコースレベルに対するモントブレチンＡの影響を調べるための第二の試験を行った。
【００６８】
実施例６の２４匹の動物を、１週間のウォッシュアウト期間の後に用いた。動物をモントブレチンＡ処理無しと処理有りに分けた。４つの処理群は、対照ｎ＝６、対照＋モントブレチンＡｎ＝６、糖尿病ｎ＝６および糖尿病＋モントブレチンＡｎ＝６であった。実施例６で用いた手順を用いた。モントブレチンＡを蒸留水に１０ｍｇ／ｍｌ濃度で溶かし、１ｍｌ／ｋｇ容量とした。得られたモントブレチンＡの用量は１０ｍｇ／ｋｇであった。結果を図４に示す。群間で体重の差は無かった。糖尿病非処理群のデンプン投与３０分および６０分後に血漿グルコースレベルの有意な増加が見られた。よって、ラットに対する１０ｍｇ／ｋｇ用量でのモントブレチンＡの急性投与は、デンプン投与後の血漿グルコースの増加を防ぐのに有効である。
【００６９】
実施例８：急性デンプン耐性試験（植物抽出液およびモントブレチンＡ）
ＳＴＺ糖尿病ラットにおいて、デンプン投与に応答した血漿グルコースレベルに対する種々の量のモントブレチンＡおよびモントブレチン抽出液の影響を調べるための試験を行った。従前の実施例で用いた糖尿病動物を、１週間のウォッシュアウト期間の後に用いた。６つの試験群は、糖尿病（Ｄ、ｎ＝３）糖尿病＋モントブレチンＡ（５ｍｇ／ｋｇ）（ＤＴ５、ｎ＝３）、糖尿病性＋モントブレチンＡ（１ｍｇ／ｋｇ）（ＤＴ１、ｎ＝３）、糖尿病＋モントブレチンＡ（０．５ｍｇ／ｋｇ）（ＤＴ０．５、ｎ＝３）、糖尿病＋クロコスミア球茎メタノール抽出液（５ｍｇ／ｋｇ）（ＤＭ、ｎ＝３）および糖尿病＋クロコスミア球茎エタノール抽出液（５ｍｇ／ｋｇ）（ＤＥ、ｎ＝２）であった。
【００７０】
モントブレチンＡを蒸留水に５、１または０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶かし、１ｍｌ／ｋｇの容量とした。メタノール抽出液はモントブレチンＡを３．２ｍｇ／ｍｌ濃度で含み、エタノール抽出液は１．６ｍｇ／ｍｌ濃度で含んだ。これらの抽出液を乾燥させ、蒸留水に再懸濁させた。実施例６および７の手順に従った。結果を図５および６に示す。群間で体重の差は無かった。モントブレチンＡの５ｍｇ／ｋｇでの急性投与は、デンプン投与後の血漿グルコースの増加を防いだ。ラットに対してより低用量で影響が示されたが、これは曲線下面を求めると、特に有意ではなかった。メタノール抽出液では３匹中２匹に、エタノール抽出液では２匹中１匹に下痢が見られた。下痢はメタノール抽出液（３匹中１匹）およびエタノール抽出液の両群の動物で６０分および９０分時点では軽度であった。下痢は１２０分の時点までに消散していたことが明らかであった。精製モントブレチンを投与した動物では下痢は見られなかった。
【００７１】
実施例９：味覚嫌悪
飲用水に溶かしたモントブレチンＡの味覚に対して動物が嫌悪するかどうかを調べるための試験を行った。体重５００〜６５０ｇの雄ウイスターラット６匹をケージ当たり２匹で飼育した。毎日各ケージのフードホッパーに３００ｇの標準ラット餌を(Purnia)入れた。１日当たりケージ当たりの食物消費量３日間、２４時間毎に調べた。液体容量９００ｍｌの飲用水を毎日各ケージに入れた。１日当たりケージ当たりの液体消費量を３日間、２４時間おきに調べた。各動物の体重を２４時間おきに測定した。
【００７２】
得られた予備飲用水値に基づき、モントブレチンＡを１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で送達されるように飲用水に溶かした。体重および食物消費の測定は上記のように行った。液体容量２５０ｍｌの、０．０９ｍｇ／ｍｌ濃度のモントブレチンＡ溶液を各ケージに毎日入れた。液体消費量を３日間、２４時間おきに調べた。
【００７３】
食物および液体消費と体重を分析した。モントブレチンＡの用量を、体重および消費値に基づいて決定した。体重、液体摂取または食物摂取に対して、飲用水に溶かしたモントブレチンＡの影響は見られず、およそ１０ｍｇ／ｋｇの用量が達成された。この期間または試験の副作用の明らかな示唆はなかった。
【００７４】
以上、発明を理解を鮮明にするために例示および実施例によりある程度詳細に記載してきたが、当業者ならば、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずに、これらに対して変更および改変が行えることが容易に分かるであろう。本明細書に引用された特許、特許出願および刊行物は総て引用することにより本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】メタノール（ＭｅＯＨ）抽出液を用いた天然供給源からのモントブレチンの単離、アセトン：水移動相を用いたＨＰ−２０吸収クロマトグラフィー、分取高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、および超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を用いたモニタリングのプロトコールを示すフローチャートである。
【図２】６０ｍｌ／分で３０ｍＭにわたって５％〜９０％水性アセトニトリルの勾配で実施した図１に示されるようなＨＰ−２０精製サンプルのWaters Autopurification System（商標）を用いたＨＰＬＣ出力を示すチャート。モントブレチンＡ画分が表示されている。
【図３】アカルボース、モントブレチンＡおよびクロコスミア種の球茎のアルコール抽出液を用いたデンプン耐性試験のグラフ。
【図４】アカルボース、モントブレチンＡおよびクロコスミア種の球茎のアルコール抽出液を用いたデンプン耐性試験のグラフ。
【図５】アカルボース、モントブレチンＡおよびクロコスミア種の球茎のアルコール抽出液を用いたデンプン耐性試験のグラフ。
【図６】アカルボース、モントブレチンＡおよびクロコスミア種の球茎のアルコール抽出液を用いたデンプン耐性試験のグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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