(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化粧品の組成物の調製における、生物接着ペプチドの発現の増加による皮膚の細胞の接着を促す一般化学式ＩのＸＩＫＶＡＶペプチド：Ｘは水素、アミノ酸、アシル基により形成される群から選択され、Ｙはアミノ基または水酸基である、の使用。
【化１】
0005384824.tif 000003
【請求項２】
Ｘは水素またはセリンであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｘはパルミトイル基またはデカノイル基であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
Ｙはアミノ基であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
Ｙは水酸基であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項６】
生物接着ペプチドはアルファ６インテグリン及びラミニンＶであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記化粧品の組成物が、ジェル、乳液、クリーム、化粧水、シャンプー、または美容液（serum）の形態で提供されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項８】
皮膚の細胞の前記接着は、皮膚の細胞の相互の、及び基底膜との接着であることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項９】
ＸＩＫＶＡＶペプチドの量が前記化粧品の組成物において１２重量％以下であることを特徴とする請求項１から８のいずれか1つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の細胞の相互、及び基底膜の接着性を増加させることにより皮膚の弾力（firmness）の改善を図る化粧品の組成物に関する。当該組成物は、化粧品として有効量のペプチド、化学式Ｉの一般化学式Ｘ−イソルシル−リシル−バリル−アラニル−バリン−Ｙ（以下、ＸＩＫＶＡＶという）を有する。Ｘは水素、アミノ酸、直鎖型若しくは分岐型のアシル基とすることができ（図１参照）、Ｙはアミノ基、水酸基、チオール基とすることができ、これらには脂肪酸を置換したものと、置換していないものとがある。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は人間の体の最も大きな組織である。表皮と真皮の２つの層に区別することができる。これら二つの層は異なる高分子（コラーゲン、ラミニン、プロテオグリカンなど）により形成されるマトリックスである、基底膜を介して結合される。
【０００３】
基底膜はＩＶ型のコラーゲンやプロテオグリカン、糖タンパクであるエンタクチンやラミニンが豊富である。
【０００４】
これらの分子は細胞結合のための生体接着性に加えて、構造上の網状組織を提供する。ラミニン配列は、ＩＶ型コラーゲン、ペルレカン（heparan sulphate proteoglycan）、エンタクチン、細胞表面のレセプターのための幾つかの結合ドメインを含む。
【０００５】
この基底膜は、３層により形成される分化した細胞外マトリックスである。
【０００６】
透明層（Lamina lucida）：この層は直接的に基底ケラチノサイトと接しており、その主な組成物成分はラミニンである。
【０００７】
緻密層（Lamina densa）:透明層の下に位置し、ほぼ同じ厚さで後者と平行に伸びる。ＩＶ型コラーゲンが主である不定形の物質であり、基底膜の大きな牽引力と柔軟性に関与する。
【０００８】
網様膜（Reticular lamina）:前述の層の下にあるが、その位置はより定かでなく、真皮の線維芽細胞に由来する。固着線維と緻密層に挿入される弾性微小線維により形成され、基底膜を保持し、皮膚組織への接着を提供する。固着線維はＩＶ型コラーゲンにより形成される構造物である。
【０００９】
ラミニンは上述した透明層で最初に発見され、その主組成物成分である。
【００１０】
ラミニンは約８５０ＫＤaの糖タンパクであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の中でコラーゲンの次に豊富に含まれるタンパクである。ラミニンは通常、基底膜で見つかり、十字架形状内に分布する３つの長いポリペプチド鎖により形成され、ジスルフィド架橋により結合される。
【００１１】
３つの鎖は異なるラミニンのサブタイプに存在しており、それらの組合せにより１２種類の異なるラミニンのアイソフォームが存在する。そのうち、ラミニン−１がもっとも研究されている。
【００１２】
インテグリンはラミニンの認識に関与する最も重要なレセプターであり、それらは発見された最初のＥＣＭレセプターである。それらは細胞と細胞、細胞とＥＣＭの相互作用を受け持つ膜貫通細胞の表面レセプターの１つである。
【００１３】
細胞はレセプターであるインテグリンを介してラミニンの結合ドメインを認識し、その結果、ラミニンを多く含む基底膜と結合する。レセプターであるインテグリンはまた、分化したリガンドを介して細胞間の結合を媒介する。
【００１４】
皮膚の老化は皮膚が経験する真皮の過程の１つであり、すべての生物について共通する生物的過程である。
【００１５】
皮膚の老化過程が起こるとき、皮膚の機能的能力が失われるとともに、乾燥、しわ、染みを伴う黄化、白髪、加えて細胞組織の緩み（tissue slackness）や弛緩（relaxation）などにより特徴付けられるぼう弱性の増加が通常観察される。
【００１６】
表皮細胞の基底膜への接着は３０歳を過ぎた後に低下し始めることが観察される。このように真皮と表皮の接触が失われることにより皮膚は構造的、及び機能的に変化する。これは老化過程の一部を形成している[J. Investing. Dermatol. Symp.Proc. 1998; 3 (2):172-9]。
【００１７】
それゆえに、細胞と基底膜の間の接着性を増加して皮膚の老化を遅らせることにより、皮膚の弛緩、弾力の喪失を防ぎ、そして改善することは可能である。
【００１８】
このような点について、皮膚の弾力を増加し、その老化を遅らせるための、化粧品の組成物における一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドの使用に関する発明は、先行技術においては未だ記載されていない。
【００１９】
米国特許５，７４４，５１５号[内皮形成促進のための方法と移植可能な物（implantable article）]は、表面がフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、そしてそのドメインのような接着性の分子に覆われたポリマーや、セラミックや、金属製の移植物に関する。ＳＩＫＶＡＶは記載されたドメインの中の１つであり、タンパクであるフィブロネクチンのドメインとして明確に記載されている。その接着性の分子は移植物の内皮形成、および細胞への接着の促進に関与するとともに、多孔質の生体材料からなる移植物は、その物質を介しての毛細血管の成長を可能とする。
【００２０】
一方、米国特許６，４２８，５７９号[生体分子に覆われた移植可能な人工器官]は、金に覆われ、細胞修飾、走化性、抗凝固、抗血栓、抗腫瘍、抗感染、成長促進、抗炎症などの異なる特性を有する生物活性を有するペプチドが接着された移植物質に関する。ＳＩＸＶＡＶは、その中で、インテグリン結合ペプチドの中の細胞修飾ペプチドの例として記載されている。これらの移植物質の適した使用は外科手術後の骨の成長を促進させることにあり、インテグリン基質ペプチド、例えばＳＩＫＶＡＶは、骨組織へのペプチド接着の改善のために使用される。
【００２１】
米国特許６，６７３，１０８号[特定の空隙内の貫壁性同心多層成長マトリックス]は、幾つかの合成の、又はタンパク質性の層を有するマトリックスに関する。各層は特有の機能を有している。ペプチドや成長因子により誘導体化されたフィブリン層、特にＳＩＫＶＡＶのようなラミニン由来のペプチドを含むフィブリン層は、タンパク質性の層の例として名付けられている。
【００２２】
これらの特許文献は化粧品の組成物における一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドの使用については言及していない。
【００２３】
それゆえに、本発明の基礎は、皮膚の弾力を増加させてその老化を遅らせることができる、化粧品の組成物を提供することにある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドはラミニンに走化性の領域、すなわち細胞を引きつける領域を形成する。これは、これらのペプチドが細胞接着、成長、移動、さらに基底膜の再生を促進するからである。これらのペプチドについては、内皮細胞の増殖と分化を促進するという血管形成（Angiogenesis）促進の性質についても知られている[Journal of Cellular Physiol. 1992 Dec; 153(3): 614-25]。
【００２５】
ＸＩＫＶＡＶの構造のペプチドとレセプターであるインテグリンの間の相互作用は知られており、それらの使用は欧州特許番号１  ３２５  ７３９[抗がん剤を封入するリポソームと悪性腫瘍の処置におけるその使用]に記載されており、腫瘍細胞の膜におけるラミニンレセプターの過剰発現は、抗腫瘍物質を含みＸＩＫＶＡＶペプチドに覆われているリポソームの方向へ移動させるために使用される。
【００２６】
ＸＩＫＶＡＶペプチド、例えばＸが水素ラジカル、セリルラジカル、またはパラミトイルラジカルであるＩＫＶＡＶ、ＳＩＫＶＡＶ、Ｐａｌ−ＩＫＶＡＶのような、の存在下におけるケラチノサイト接着の促進という、皮膚の細胞レベルでの、ＸＩＫＶＡＶペプチドの化粧品として活用できる、異なる機能が解明された（図８参照）。
【００２７】
線維芽細胞のα６インテグリンの発現促進については、図３において観察されるように、また、ＸＩＫＶＡＶが加えられていない対照サンプルにおいて起こっていることを示す図２を対照として、ＸＩＫＶＡＶペプチドの存在下においてα６インテグリンが発現するときの蛍光の発生がどのようになるかについて観察された。
【００２８】
線維芽細胞におけるラミニンＶの発現促進は、図５で観察されるように、ＸＩＫＶＡＶの存在下での蛍光の発生により観察される。ＸＩＫＶＡＶペプチドを加えない対照サンプルは、ラミニンＶの発現の効果を観察するために使用される（図４参照）。
【００２９】
本発明では、皮膚の弾力を増加させることができ、さらにはその老化を遅くすることができる一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドを含む化粧品の組成物が設計される。
【００３０】
インテグリンやラミニンなどの生成と同様に、ケラチノサイトと繊維芽細胞の細胞接着の増加を測定するために活性試験が行われた。
【００３１】
簡潔に述べると、ＸＩＫＶＡＶペプチドは、ケラチノサイトの接着を促進するとともに、表皮と真皮の接合に欠くことのできない組織である半接触班（hemidesmosomes）に関連するラミニンＶとα６インテグリン（生物接着ペプチド）の線維芽細胞によるケラチノサイトの生成を促進することができる。
【００３２】
同様に、基底膜の良好な状態に伴う上記の微小循環の促進は、抵抗力と弾力とともに、酸素と代謝物の好適な輸送と、排出生成物の除去と、表皮細胞の機能的能力の改善とを助ける。
【００３３】
それゆえに、局所的に使用する化粧品の組成物に組み込まれる、ＸＩＫＶＡＶペプチドの使用は、皮膚の老化を防ぐこと、真皮と表皮の間の接触が失われるのを遅くすること、老化過程の一部を形成する構造的及び機能的変化を防ぐことに直接的な効果がある。
【００３４】
それゆえに、本発明の第１の態様は、生物接着ペプチドの発現の増加により皮膚の細胞の生物接着の促進のための、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドの使用に関する。Ｘは水素、アミノ酸、アシル基により形成される群から選択されるとともに、Ｙはアミノ基、水酸基、チオール基から選択され、これらには脂肪酸を置換したものと、置換していないものとがある。
【００３５】
好ましくは、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドにおいて、Ｘは水素、セリン、パラミトイル基、デカノイル基であり、Ｙはアミノ基、水酸基、もしくはチオール基である。これらには脂肪酸を置換したものと、置換していないものとがある。
【００３６】
好ましくは、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドにおいて、Ｘはセリンであり、Ｙは水酸基である、すなわちＳＩＫＶＡＶペプチドである。
【００３７】
好ましくは、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドにおいて、Ｘは水素であり、Ｙは水酸基である、すなわちＩＫＶＡＶペプチドである。
【００３８】
好ましくは、生物接着が促進される皮膚の細胞はケラチノサイト（keratinocytes）であり、生物接着ペプチドはα６インテグリン及びラミニンＶである。
【００３９】
本発明の第２の態様は、化粧品に適用可能な媒体（medium）と、生物接着ペプチドの発現を増加させることにより、皮膚の細胞の生物接着を促進するための、化粧品として有効量の一般化学式ＸＩＫＡＶを有するペプチドとを含む化粧品の組成物である。
【００４０】
好ましくは、前記組成物は表皮に使用される。
【００４１】
好ましい実施形態によれば、前記組成物は皮膚の弾力を増加させるが、この効果は皮膚の細胞の相互の、及び基底膜との接着を増加させることにより引き起こされる。
【００４２】
好ましくは、本発明においては、ＸＩＫＶＡＶペプチド（図１参照）は、化粧品の組成物の中に１２％以下で含まれる。
【００４３】
好ましくは、本発明においては、ＸＩＫＶＡＶペプチド（図１参照）は、化粧品の組成物の中に好ましくは５％含まれる。
【００４４】
好ましい賦形剤は、化粧品において通常用いられている、水、アルコール、レシチン、天然若しくは人工ポリマー、界面活性剤（surfactants）や活性表面剤（active surface agents）、保存剤などである。
【００４５】
好ましい化粧品の形態は通常用いられている、クリーム、化粧水、乳液、シャンプー、美容液（serum）、ジェルなどである。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、組成物は以下の成分を以下の重量％で含む。
【００４７】
【表１】
0005384824.tif 000002
【００４８】
アンチエイジング、抗脂肪沈着、保湿、再生、成分再活性化（revitalizing ingredients）などの化粧品の調整において多用されている、ビタミン、天然抽出物、酵素や他の通常の活性成分といった他の活性成分を、化粧品の組成物の一部として使用することができる。
【００４９】
他の態様によれば、本発明は皮膚の弾力を増加させる化粧品の組成物の調整における、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドの使用に関する。
【００５０】
細胞はラミニンを認識するためにインテグリンを使用し、ラミニンはインテグリンを介して細胞を結合させるので、本発明による化粧品の組成物は細胞の接着及びそれらの基底膜への結合を促進する。ＸＩＫＶＡＶペプチドはインテグリンとラミニンの生成を増加させるとともに、化粧品の中の成分として使用するのに適しているからである。
【００５１】
下記の実施例に反映されているように、活性試験は、細胞増殖の増加が観察されるかに加えて、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドの存在による皮膚の細胞の接着の効果について行った。
【００５２】
それゆえに、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドの使用により得られる接着の効果に伴う細胞増殖の増加は、結果として、皮膚の老化においてまさに特徴的である弾力の喪失を防ぐ、より小さな表皮を得ることが可能となる。
【００５３】
皮膚の老化の他の特徴的な面は細胞間の接触の喪失であり、それにより栄養が喪失するようになったり、例えば乾燥や、黄化や機能喪失のように皮膚が変化したりする。
【００５４】
本発明に従って作られた、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドを含む化粧品の組成物の使用は、これらの老化の徴候への処置に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
以下に記載する実験は本発明のある特定の面を支持するものであり、その範囲を限定するものではない。
【００５６】
（実験１）
免疫染色活性試験は、ＳＩＫＶＡＶがα６インテグリンとラミニンＶの発現を促進する活性があるかどうかを決定するために、人間の線維芽細胞とケラチノサイトで行われた（図３、４、５、及び６２、３、４、及び５）。
【００５７】
細胞がラミニンを認識するためにインテグリンを使用し、ラミニンがインテグリンを介して細胞と基底膜を接着する場合、インテグリンとラミニンの生成を促進させることができるペプチドは細胞接着とそれらの基底膜への接着を促進する。
【００５８】
活性試験は、（インテグリンまたはラミニン）を検出するタンパク質と結合する第１の（モノクロナール）抗体と、タンパク質と第１の抗体の複合体に結合する第２の（ポリクロナール）抗体とを使用する。第２の抗体は、蛍光化合物（ＦＩＴＣ−Fluorescein Isothiocyanate）が結合している。
【００５９】
ＦＩＴＣは、フィルター処理された４９５nm（吸収波長）の光により照射され、色素により放出された光が５２８nm（放出波長）で検出される。
【００６０】
これらの態様については図２、３、４、５において観察することができる。
【００６１】
図２においては、免疫蛍光放出により、ＳＩＫＶＡＶが処理されていない人間の線維芽細胞のα６インテグリンの発現を観察することができる。一方、図３においては、免疫蛍光放出により、ＳＩＫＶＡＶが処理された人間の線維芽細胞のα６インテグリンの発現の増加を観察することができる。
【００６２】
ＳＩＫＡＶの存在下と非存在下でのラミニンの発現の違いは、同じ活性試験で特定することができる。
【００６３】
発現の違いは図４及び図５で観察される。図４においては、免疫蛍光放出により、ＳＩＫＶＡＶが処理されていない人間の線維芽細胞のラミニンＶの発現が観察され、図５においては、免疫蛍光放出により、ＳＩＫＶＡＶが処理された人間の線維芽細胞のラミニンＶの発現の増加を観察することができる。
【００６４】
結論として、ラミニンＶとα６インテグリンの顕著な増加がケラチノサイトではなく、ＳＩＫＶＡＶが処理された人間の線維芽細胞において観察された。ベータ１インテグリンの生成の変化がないことについてはどちらにおいても検出されなかった。
（実施例２）
細胞レベルでの接着の過程は、第２の実施例の活性試験における、実験室内の線維芽細胞の培養物により解明される。
【００６５】
この事実は図６及び図７に示される。
【００６６】
図６は処理されていない人間の線維芽細胞の細胞接着を示し、図７はＳＩＫＶＡＶが処理された線維芽細胞の細胞接着を示す。
【００６７】
図６及び図７はマイクロウェル（Microwell）活性試験の均一な被覆、および細胞増殖よりも細胞接着に関連する線維芽細胞の成長と分化を示す。
【００６８】
細胞の接着と移動の促進に加えて、ＳＩＫＶＡＶを含む化粧品は、血管の形成と、微小循環の改善を促進する。
（実施例３）
この実施形態は、ガラス器内の、ケラチノサイトの一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドへの細胞接着の評価と、それらの間の比較評価を示す。
【００６９】
この実施形態はＸＩＫＶＡＶペプチドの存在下において皮膚の細胞接着がどのように増加するのか、及びその変異型、ＳＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶ、Ｐａｌ−ＩＫＶＡＶ、ＳＩＫＶＡＶ−ＯＨ、ＳＩＫＶＡＶ−ＮＨ２（図８、９、１０参照）の違いの比較を示す。
【００７０】
下記の例で使用される細胞培養は、ケラチノサイトの特有の成長因子の存在下における人間の表皮のケラチノサイト（human epidermal keratinocytes, ＨＥＫａ）である。
【００７１】
まず、９６のマイクロウェルがプレート上に乗せられ、それらは一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドを含む滅菌水５０μＬにより覆われて（マイクロウェル当たり０．５−２５０  μg/ml）、室温で一晩乾燥される。
【００７２】
一方、対照の活性試験は、特有でない細胞接着を評価するために４０μＭのＢＳＡ（bovine serum albumin）に覆われたマイクロウェルを用いて行われる。
【００７３】
すべてのマイクロウェルは２００μＬのＰＢＳ（phosphate buffered saline）で洗われ、３７℃のＰＢＳの中で１％ＢＳＡとともに１時間固定された。
【００７４】
トリプシンが人間の皮膚のケラチノサイトに加えられ、それらは５μＭの濃度のcalcein-AM中、３７度で３０分マークされ、最後にＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地で３回洗われた。
【００７５】
標識された細胞（4.5×１０4/microwell）はＸＩＫＶＡＶペプチドに前もって覆われたプレートに加えられ、５％の二酸化炭素を含む加湿された空気中において、３７℃で２時間培養された。
【００７６】
細胞接着は洗いの前後のcalceinの蛍光を測定することにより評価された。
【００７７】
細胞接着の割合は、接着された細胞の蛍光を、各マイクロウェルに加えられた細胞の全ての蛍光で割ることにより決定された。
【００７８】
ＸＩＫＶＡＶペプチドにより促進された細胞接着は細胞のＢＳＡへの特有でない接着に対して計算された。
【００７９】
ＸＫＩＶＡＶペプチドは用量依存的にケラチノサイトの接着を促進することが結果として示される（図８、９、１０参照）。
【００８０】
ＸＩＫＶＡＶペプチドにより促進された細胞接着は、研究での最高濃度における特有でない接着に対して６５％であった。
【００８１】
これらの結果は、細胞表面の特異的なレセプターによりＸＩＫＶＡＶペプチドが認識されていることを示す。
【００８２】
これらの結果は、一般化学式ＸＩＫＶＡＶのペプチドが、皮膚の弾力の再構築と増加のための化粧品の一部を形成するための良好な候補であることを示唆する。
【００８３】
図８、９、１０を観察、および比較したとき、ペプチドの量が増加するにしたがって（用量依存的に）細胞接着の増加が観察される。
【００８４】
図９から推定される結果を比較したとき、すべての例においてケラチノサイトの細胞接着の大きな増加が観察されるが、ＳＩＫＶＡＶペプチド、すなわちＸがセリンであるペプチドがより接着させる。
【００８５】
図１０はＳＩＫＶＡＶ−ＯＨとＳＩＫＶＡＶ−ＮＨ２の細胞接着のレベルを示すものであり、小さい量ではＳＩＫＶＡＶ−ＮＨ２による接着のほうがより観察され、大きい量ではＳＩＫＶＡＶ−ＯＨによる接着のほうがより観察される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】本実施形態のＸＩＫＶＡＶペプチドの一般化学式を示す図である。
【図２】ＳＩＫＶＡＶペプチドが処理されていない人間の線維芽細胞のα６インテグリンの発現を、免疫蛍光放出により示す図である。
【図３】ＳＩＫＶＡＶペプチドが処理された人間の線維芽細胞のα６インテグリンの発現を、免疫蛍光放出により示す図である。
【図４】ＳＩＫＶＡＶペプチドが処理されていない人間の線維芽細胞のラミニンＶの発現を、免疫蛍光放出により示す図である。
【図５】ＳＩＫＶＡＶペプチドが処理された人間の線維芽細胞のラミニンＶの発現を、免疫蛍光放出により示す図である。
【図６】ＳＩＫＶＡＶペプチドが処理されていない人間の線維芽細胞の細胞接着を示す図である。
【図７】ＳＩＫＶＡＶペプチドが処理された人間の線維芽細胞の細胞接着を示す図である。
【図８】ＸＩＫＶＡＶペプチドが処理されたケラチノサイトの細胞接着の増加を示すグラフである。
【図９】ＳＩＫＶＡＶペプチド、ＩＫＶＡＶペプチド、Ｐａｌ−ＩＫＶＡＶペプチドが処理されたケラチノサイトの細胞接着の増加を示すグラフである。
【図１０】ＳＩＫＶＡＶ―ＯＨペプチド、ＳＩＫＶＡＶ―ＮＨ２ペプチドが処理されたケラチノサイトの細胞接着の増加を示すグラフである。
【図１】
0005384824.tif 000004
【図２】
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【図３】
0005384824.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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