(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５〜１０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を含むことを特徴とする、紫外線照射２〜１５日後の中期ないし後期における紫外線依存的な皮膚の硬化もしくは肥厚または発毛不全を予防および／または治療するための薬学的組成物。
【請求項２】
皮膚表面に塗布可能な形態であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
皮膚におけるケラチノサイトの増殖を阻害するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
発毛を促進するためのものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−１８レセプターアンタゴニスト、および当該アンタゴニストを含む薬学的組成物に関するものである。より詳細には、本発明は、インターロイキン−１８レセプターαサブユニットに対する抗体および／またはβサブユニットに対する抗体を含むインターロイキン−１８関連障害、特に、紫外線による皮膚肥厚を予防および／または治療するための薬学的組成物、ならびにストレス関連疾患を処置するための薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
紫外線による皮膚障害は、美容の観点からも制癌の観点からも注目されている。上皮の大半を占める上皮角化細胞（ケラチノサイト）は、乾癬、魚鱗癬、膠原病などにおいて併発する種々の皮膚炎において、その増殖および／または分化の異常が観察される。これらのことから、ケラチノサイトの増殖および／または分化の制御は、生体の健康に取って極めて重要であると考えられる。【０００３】
皮膚は、重層した上皮細胞からなる表皮、および密な結合組織からなる真皮から構成される、外部環境と身体の内側の間の障壁を形成する器官である。表皮は、皮膚の最外層を形成する厚さ約１ｍｍの組織であり、直接外気と接して種々の刺激（例えば、太陽光線、乾燥、埃など）から皮膚内部を保護する。【０００４】
皮膚の弾力性およびバリヤー特性を付与するヒトの皮膚の上部層、すなわち表皮は、４つの明確な分化段階によって規定される細胞型（真皮と表皮の接合部の境界である基底細胞層、有棘細胞層、顆粒層、および角化層）からなる。【０００５】
表皮を構成する細胞は、その８０％が角化細胞（ケラチノサイト）である。分裂能を有するケラチノサイトは、基底細胞層に存在し、分化に伴って有棘細胞層、顆粒層、角化層へ移動する。コルネオサイトと呼ばれる角質層の末期細胞はもはや死んでいる。表皮は常に更新される組織であり、細胞分割と最終分化したコルネオサイトへの進行のプログラムは非常に厳密に制御されている。基底細胞層では、常に細胞分裂が行なわれており、生じた細胞は形を変えて移動し、約２８日後に角質層から垢として剥がれ落ちる。【０００６】
このような２８日周期でターンオーバーする表皮の分化は、皮膚の本質的機能の付与、すなわち、外部環境に対する保護バリヤーの付与、および身体からの水分の損失の防止に重要である。【０００７】
皮膚は、温湿度、紫外線、化粧品、加齢、疾病、ストレス、食習慣等により微妙な影響を受け、その結果、上述した皮膚機能の減退、皮膚の老化など、種々のトラブルが発生する。【０００８】
紫外線（ＵＶ）は、殺菌作用を有するとともに、ビタミンＤによる骨形性を促進させたり皮膚の免疫機能を改善する効果をもたらす一方、皮膚肥厚、しわまたはたるみの形成、色素沈着等をもたらす。【０００９】
皮膚における紫外線による急性反応としては、日焼け、光線過敏性皮膚炎が挙げられ、慢性反応としては、皮膚の色素異常（シミ、ソバカスの悪化）、皮膚老化の促進が挙げられる。皮膚が紫外線を浴びると、皮膚の細胞中にアラキドン酸回路の酵素系が誘導され、プロスタグランジンＥ２が生成する。プロスタグランジンＥ２は、皮膚細胞に炎症を起こさせる機能を有し、赤く腫れ上がらせて（紅斑）、日焼けを引き起こす。日焼けは、さらに、しみを生じさせるとともに、表皮細胞を肥厚させる。このような表皮肥厚は、ひいては皮膚癌の原因になる。【００１０】
表皮肥厚はケラチノサイトの異常増殖であるので、この増殖を抑制して分化を促進することによって、表皮肥厚を抑制することができる。【００１１】
皮膚に生じるトラブルを予防、改善する主たる試みとしては、合成あるいは天然の保湿成分の塗布により皮膚の乾燥を防ぎ皮膚の保湿能を高める方法、血行促進剤の塗布により血行促進を改善する方法等がなされてきた。【００１２】
しかし、これらの方法は種々の皮膚トラブルの予防、改善効果、その持続性、薬剤の安定性・安全性等の点で、種々の問題を有している。すなわち、これらの方法は、一般に、表皮、特に角層表面の水分を補給するものまたは保湿成分の一部を補うものであることから、その効能および効果は一時的なものであり、永続的な皮膚の改善は期待できないものであった。【００１３】
そこで、表皮肥厚、皮膚の不全角化、脂質代謝異常等に対し顕著な抑制作用を有する物質の開発が望まれている。【００１４】
一般に、細胞の増殖または分化には、特定の増殖因子または分化因子が必要とされる。また、細菌および／またはウィルスの感染、腫瘍ならびに細胞障害に対して、生体が呈する免疫反応は、免疫担当細胞間の直接的または間接的な相互作用によって調節されている。サイトカイン（例えば、インターロイキン類、コロニー刺激因子類、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）類、インターフェロン類）は、細胞の分化、増殖および免疫反応に関与していることが明らかになっている。【００１５】
インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）は、免疫担当細胞においてＩＦＮ−γの産生を誘導する新規な蛋白質として同定された（例えば、特許文献１を参照のこと）。現在、ＩＬ−１８は、炎症性サイトカインであるインターフェロン−γの産生を誘導するだけでなく、抗炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキン−４、インターロイキン−５、およびインターロイキン−１３）の産生を誘導することが知られている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。【００１６】
ＩＬ−１８タンパク質は、２４ｋＤａの不活性型（前駆体）として産生されてカスパーゼ−１によって切断されて１８ｋＤａの活性型に変換された後、細胞外へ放出される（例えば、非特許文献４を参照のこと）。培養細胞において、ＩＬ−１８前駆体は、活性化マクロファージ、脳ミクログリア、皮膚角化細胞、ランゲルハンス細胞、角膜上皮細胞、腸上皮細胞、子宮腺細胞および骨芽細胞などに発現する（例えば、非特許文献５を参照のこと）。また、ＩＬ−１８タンパク質は、アルツハイマー病、シューグレン症候群、クローン病、変形性関節症、リウマチ関節炎、接触性皮膚炎、乾癬、アテローム性動脈硬化症などにおいて、病変局所に増加することが知られている（例えば、非特許文献６を参照のこと）。【００１７】
ＩＬ−１８レセプターは、αサブユニットおよびβサブユニットからなり（例えば、非特許文献７を参照のこと）、アミノ酸配列に基づいてＩＬ−１βレセプター／ＴＬＲファミリーに分類される（例えば、非特許文献５、６、８を参照のこと）。ＩＬ−１８活性化型タンパク質は、ＩＬ−１８レセプターを介して、ＮＦ−κＢ依存的転写活性、ならびにＡＰ−１依存的転写活性を上昇させることが知られている（例えば、非特許文献５を参照のこと）。後者は、ＪＮＫおよびｐ３８  ＭＡＰＫが関与することが知られている（例えば、非特許文献９を参照のこと）。ＩＬ−１８レセプターαサブユニットのｍＲＮＡは、脳、胸腺、子宮、副腎、肝臓、膵臓、肺、脾臓、骨格筋、ＮＫ細胞およびＴ細胞などに発現する（例えば、非特許文献６を参照のこと）。【００１８】
ＩＬ−１８と疾患との関係について、統合失調症、新生児脳低形成、パニック障害、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アレルギー性喘息、甲状腺機能亢進症、Ｉ型糖尿病、肝硬変、腎不全、敗血症、アトピー性皮膚炎、前期破水、ＨＩＶ感染、マラリア感染などにおいて、患者血清中のＩＬ−１８タンパク質が高値を示すことが知られており（例えば、非特許文献６を参照のこと）、慢性期の子宮内膜症患者において、腹水中のＩＬ−１８タンパク質濃度が上昇することが知られている（例えば、非特許文献１０を参照のこと）。動物モデルを用いた解析によると、多発性硬化症またはリウマチ関節炎のモデルにおいて、ＩＬ−１８投与は病態を悪くし、抗ＩＬ−１８抗体の投与は病態を改善または軽減する（例えば、非特許文献１１、１２を参照のこと）。一方、急性の移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）のモデルにおいて、ＩＬ−１８投与は、ＴＮＦα産生を低下させて死亡率を低減するが、抗ＩＬ−１８抗体の投与は死亡率を増加させる（例えば、非特許文献１３を参照のこと）。【００１９】
このように、ＩＬ−１８と疾患との間には、一定の関係が存在しない。このことは、ＩＬ−１８の多機能性を示し、生体内でのＩＬ−１８の機能を理解することをより困難にさせている。
【特許文献１】特開平８−２７１８９号公報（平成８年１月３０日公開）
【非特許文献１】救急医学、第２６巻、１８２３−１８２６頁、２００２年１２月
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１６３巻、第１２３０〜１２３６頁、１９９９年
【非特許文献３】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１９巻、第４１３１〜４１３８ページ、１９９９年
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５巻、第２０６〜２０９頁、１９９７年
【非特許文献５】Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１９巻、第４２３〜４７４頁、２００１年
【非特許文献６】Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ）、第２巻、第７０９〜７３３頁、２００２年
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７２巻、２５７３７〜４２頁、１９９７年
【非特許文献８】Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．、第６８巻、第２４１〜５８頁、２０００年
【非特許文献９】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第２９６巻、第７４２〜８頁、２００２年
【非特許文献１０】Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．、第８０巻、第８８９〜９４頁、２００３年
【非特許文献１１】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１６１巻、第６３６８〜７４頁、１９９８年
【非特許文献１２】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第１０４巻、第１３３７〜９頁、１９９９年
【非特許文献１３】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１９４巻、第１４３３〜４０頁、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明者らは、高密度で培養したケラチノサイトの培養培地中に活性化型ＩＬ−１８を添加すると、細胞の接触阻止が阻害されて過剰増殖することを見出した。さらに、本発明者らは、分化誘導した培養ケラチノサイトの培養上清にＩＬ−１８を添加すると分化が促進され、抗ＩＬ−１８抗体をさらに添加するとこの分化促進が抑えられることを見出した。すなわち、本発明者らは、ＩＬ−１８がケラチノサイトの増殖および／または分化に関与して表皮肥厚を制御し得ることを見出した。【００２１】
しかしながら、現在入手可能なＩＬ−１８レセプターに対する抗体は、免疫組織化学に用いることができず、実際にレセプタータンパク質が発現している組織は不明であり、生体内でＩＬ−１８が実際に機能していることを確認することが困難である。これまでに行なわれたＩＬ−１８レセプターの発現に関する研究は核酸レベルの解析であり、実際にＩＬ−１８レセプタータンパク質がいかなる組織に発現しているのかを明確には示していない。【００２２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能する、免疫組織化学に使用可能なＩＬ−１８レセプター抗体を提供することである。換言すれば、本発明の目的は、生体においてＩＬ−１８レセプターと結合してＩＬ−１８の機能を阻害する抗体を供給し、当該抗体を用いてＩＬ−１８依存的な障害、特に紫外線によって生じる皮膚肥厚を予防および／または治療することである。【００２３】
さらに、本発明者らは、ストレス依存的に上昇する血中ＩＬ−１８レベルに起因して血中ＩＬ−６レベルが上昇し、その結果、ストレス関連疾患の病態／病状が悪化することを見出した。この知見に基づく本発明の目的は、生体においてＩＬ−１８レセプターと結合してＩＬ−１８の機能を阻害する抗体を供給し、当該抗体を用いてＩＬ−１８／ＩＬ−６依存的な障害、特にストレス関連疾患を処置または予防することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、ＩＬ−１８の機能を調べる目的で、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能しかつ免疫組織化学に使用可能な抗ＩＬ−１８レセプター抗体を作製した。具体的には、ＩＬ−１８レセプターαサブユニットおよびβサブユニットの膜貫通領域近傍の親水性ドメインを抗原として、ＩＬ−１８レセプターの両サブユニットに対するポリクローナル抗体（抗α抗体および抗β抗体）を作製した。【００２５】
本発明に係る抗体は、ＩＬ−１８レセプターに結合することを特徴としている。【００２６】
本発明に係る抗体において、上記ＩＬ−１８レセプターがαサブユニットであることが好ましい。【００２７】
本発明に係る抗体において、結合する上記ＩＬ−１８レセプターαサブユニットのアミノ酸配列が配列番号５〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列であることが好ましい。【００２８】
本発明に係る抗体において、上記ＩＬ−１８レセプターがβサブユニットであることが好ましい。【００２９】
本発明に係る抗体において、結合する上記ＩＬ−１８レセプターβサブユニットのアミノ酸配列が配列番号９または１０に示されるアミノ酸配列であることが好ましい。【００３０】
本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号５〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。【００３１】
本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。【００３２】
本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。【００３３】
本発明に係る抗体の生成方法は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの混合物を抗原として抗体を惹起する工程を包含することを特徴としている。【００３４】
本発明に係る抗体は、上記の生成方法によって生成されることが好ましい。【００３５】
本発明に係る薬学的組成物は、請求項１、２または７に記載の抗体を含むことを特徴としている。【００３６】
本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を処置または予防するために使用されるのが好ましい。【００３７】
本発明に係る薬学的組成物において、上記ＩＬ−１８関連障害がＩＬ−１８／ＩＬ−６関連障害であることが好ましい。【００３８】
本発明に係る薬学的組成物において、上記ＩＬ−１８関連障害がストレス関連疾患であることが好ましい。【００３９】
本発明に係る薬学的組成物において、上記ストレス関連疾患が、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、尋常性挫創、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、シェーグレン症候群、鬱病、および心身症からなる群より選択されることが好ましい。【００４０】
本発明に係る薬学的組成物において、上記障害が皮膚肥厚によって特徴付けられることが好ましい。【００４１】
本発明に係る薬学的組成物において、上記障害が紫外線依存的な皮膚の脱落、硬化または肥厚であることが好ましい。【００４２】
本発明に係る薬学的組成物において、上記障害が発毛不全であることが好ましい。【００４３】
本発明に係る薬学的組成物は、皮膚表面に塗布可能な形態であることが好ましい。【００４４】
本発明に係る薬学的組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含むことが好ましい。【００４５】
本発明に係るヒトの皮膚におけるケラチノサイトの分化を増強する方法は、上記の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴としている。【００４６】
本発明に係るヒトの皮膚におけるケラチノサイトの増殖を阻害する方法は、上記の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴としている。【００４７】
本発明に係る発毛を促進する方法は、上記の薬学的組成物を皮膚に適用する工程を包含することを特徴としている。【００４８】
本発明に係る薬学的組成物は、アポトーシスによる細胞死を予防および／または治療するために活性化型ＩＬ−１８を含むことを特徴としている。【００４９】
本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞がケラチノサイトであることが好ましい。【００５０】
本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにスーパーオキシドジスムターゼを含むことを特徴としている。【００５１】
本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターを含むことを特徴としている。【００５２】
本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにカスパーゼ−１インヒビターを含むことを特徴としている。【００５３】
本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにカスパーゼ−１１インヒビターを含むことを特徴としている。【００５４】
本発明に係る薬学的組成物において、上記ＩＬ−１８関連障害がＩＬ−１８／ＩＬ−６関連障害であることが好ましい。【００５５】
本発明に係る薬学的組成物において、上記ＩＬ−１８関連障害がストレス関連疾患であることが好ましい。
【発明の効果】
【００５６】
本発明に係る抗体は、生体においてＩＬ−１８レセプターαサブユニットと結合してＩＬ−１８の機能（例えば、ＩＦＮ−γの産生）を阻害するという効果を奏する。また、本発明に係る抗体は、生体においてＩＬ−１８レセプターβサブユニットと結合してＩＬ−１８の機能（例えば、ＩＦＮ−γの産生）を阻害するという効果を奏する。また、本発明に係る抗体は、組織標本に対する免疫組織化学、フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡの種々の実験のいずれにも用いることができるという効果を奏する。【００５７】
本発明に係るＩＬ−１８を含有する薬学的組成物は、ストレス関連疾患を予防および／または治療するという効果を奏する。また、本発明に係る薬学的組成物は、ケラチノサイト分化誘導を促進し、表皮肥厚を抑制するという効果を奏する。すなわち、本発明に係る薬学的組成物は、皮膚の表皮細胞の異常角化を正常化する作用を有しているので、角化改善剤として使用できるという効果を奏する。さらに、本発明に係る薬学的組成物は、紫外線による表皮肥厚に対し顕著な抑制作用を有しているので、皮膚の正常な機能を回復させることができるという効果を奏する。【００５８】
本発明を用いれば、ケラチノサイトの分化を増強することができる。また、本発明を用いれば、ケラチノサイトの増殖を阻害することができる。さらに、本発明を用いれば、発毛を促進することができる。【００５９】
表皮肥厚はケラチノサイトの異常増殖であり、特に、紫外線（ＵＶ）依存的な表皮肥厚は、表皮の癌化であると考えられている。すなわち、本発明に係る薬学的組成物を用いれば、ケラチノサイトの異常増殖を抑制して分化を促進することによって、表皮肥厚を抑制して皮膚癌を予防および／または処置することができる。【００６０】
本発明に係るＩＬ−１８を含有する薬学的組成物を用いれば、アポトーシスによる細胞死を予防および／または治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、ＵＶ照射されたマウス表皮におけるＩＬ−１８またはＩＬ−１８レセプターの発現過程を示す免疫組織化学標本である。
【図２】図２は、ＵＶ照射されたマウス表皮における表皮肥厚の経過を示す図である。
【図３】図３は、ＵＶ照射されたマウス表皮における表皮肥厚に対する抗ＩＬ−１８抗体（抗α抗体および／または抗β抗体）の効果を示す図である。
【図４】図４は、ＵＶ照射されたマウス表皮におけるｐ３８  ＭＡＰＫの活性化を示す図である。
【図５】図５は、ＵＶ照射されたマウス表皮におけるＭＥＫ３／６の活性化を示す図である。
【図６】図６は、ＵＶ照射されたマウス表皮におけるサイクリンＤ１の発現を示す図である。
【図７】図７は、ＵＶ照射されたマウス表皮において生じる発毛に対する抗ＩＬ−１８抗体の効果を示す図である。
【図８】図８は、培養ヒトケラチノサイトの分化過程に対する抗ＩＬ−１８抗体の効果を示す図である。
【図９】図９は、培養ヒトケラチノサイトの分化段階で生じるアポトーシスに対するＩＬ−１８または抗ＩＬ−１８抗体の効果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＵＶ照射されたマウス表皮において生じるケラチノサイトのアポトーシスを示す免疫組織化学標本である。
【図１１】図１１は、ＵＶ照射されたマウス表皮におけるケラチノサイトのアポトーシスに対するＩＬ−１８の効果を示す図である。
【図１２】図１２は、ストレス負荷時のマウス血漿ＩＬ−１８濃度に対するＮＡＤＰＨオキシダーゼアンタゴニストの効果を示す図である。
【図１３】図１３は、ストレス負荷時の血清ＩＬ−６レベル上昇に対する抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果を示す図である。
【図１４】図１４は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的な血清ＩＬ−１８レベルの上昇を示す図である。
【図１５】図１５は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的な血漿ＩＬ−６レベルの上昇に対する抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果を示す図である。
【図１６】図１６は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的な尿中アルブミンレベルの上昇に対する抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果を示す図である。
【図１７】図１７は、全身性エリテマトーデスモデルマウスにおけるストレス依存的なＢＵＮの上昇に対する抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
〔１：ＩＬ−１８レセプターアンタゴニスト〕
本発明者らは、ＩＬ−１８関連シグナル伝達経路を介して表皮肥厚が制御され得るか否かをＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを用いて検討した。【００６３】
具体的には、本発明者らは、ＩＬ−１８依存的インターフェロンγ産生を顕著に阻害するＩＬ−１８レセプターに対する抗体を作製し、この抗体をＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして用いてＩＬ−１８と表皮肥厚との関係を解析した。【００６４】
（ａ）ＩＬ−１８レセプター抗体
本発明は、ＩＬ−１８レセプターαサブユニットに特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＩＬ−１８レセプターαサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４３６７２（配列番号１））の１２０〜１４０位（配列番号５）もしくは１４２〜１６２位（配列番号６）、またはマウスＩＬ−１８レセプターαサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４３６７３（配列番号２））の９９〜１１６位（配列番号７）もしくは２５２〜２７０位（配列番号８）からなるポリペプチドに特異的に結合することが好ましい。【００６５】
本発明はさらに、ＩＬ−１８レセプターβサブユニットに特異的に結合する抗体を提供する。一実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＩＬ−１８レセプターβサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７７３４６（配列番号３））の２１〜４２位（配列番号９）もしくは１６４〜１９０位（配列番号１０）からなるポリペプチドに特異的に結合することが好ましい。【００６６】
本発明に係る抗体は、上述のペプチドを抗原として用いて惹起されることが好ましいが、これらのペプチドを混合して抗原として用いることもまた好ましい。【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、ＩＬ−１８レセプターを発現する生物材料を選択するに有用であり得る。【００６８】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製することができる。【００６９】
ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＬ−１８レセプターと特異的に結合する抗体」は、ＩＬ−１８レセプターに特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。用語「Ｉ
Ｌ−１８レセプター」は、本明細書において他で言及されない限り、レセプターのαサブユニットおよびβサブユニットの両方またはいずれか一方が意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅
速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。【００７１】
さらに、ＩＬ−１８レセプターのペプチド抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、ＩＬ−１８レセプターと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、ＩＬ−１８レセプターと特異的に結合する抗体に結合する能力がＩＬ−１８レセプターペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、ＩＬ−１８レセプターと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるＩＬ−１８レセプターと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。【００７２】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、ＩＬ−１８レセプター結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。【００７３】
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るＩＬ−１８レセプターペプチド抗原を認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係るＩＬ−１８レセプターペプチド抗原を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。【００７４】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るＩＬ−１８レセプターを認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【００７５】
（ｂ）抗原ペプチド
本発明者らは、ＩＬ−１８レセプタータンパク質の特定領域からなるポリペプチドが、ＩＬ−１８の免疫組織化学に使用可能でありかつＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を惹起することを見出し、本発明を完成するに至った。【００７６】
本発明は、ヒトＩＬ−１８レセプターαサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ
アクセッション番号Ｕ４３６７２（配列番号１））の１２０〜１４０位（配列番号５）もしくは１４２〜１６２位（配列番号６）、またはマウスＩＬ−１８レセプターαサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ４３６７３（配列番号２））の９９〜１１６位（配列番号７）もしくは２５２〜２７０位（配列番号８）からなるポリペプチド、またはヒトＩＬ−１８レセプターβサブユニットのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０７７３４６（配列番号３））の２１〜４２位（配列番号９）もしくは１６４〜１９０位（配列番号１０）からなるポリペプチドを提供する。【００７７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、組換え生成されても、化学合成されてもよい。【００７８】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。【００７９】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。【００８０】
本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。【００８１】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。【００８２】
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。【００８３】
本発明に係るポリペプチドは、免疫組織化学に有効でありかつＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を作製するための方法およびキットにおいて有用である。【００８４】
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号５〜１０のいずれか１つからなるペプチドを含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号５〜１０のいずれか１つからなるペプチドと、特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号５〜１０のいずれか１つからなるペプチドおよび当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。【００８５】
つまり、本発明の目的は、免疫組織化学に有効でありかつＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を作製するためのポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される免疫組織化学に有効でありかつＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を作製し得るポリペプチドも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【００８６】
（ｃ）抗原ペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明に係る上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。【００８７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ−１８レセプタータンパク質をコードするｃＤＮＡ全長からなるポリヌクレオチド）の切断フラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。本明細書を参照すれば配列番号２に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号２に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。【００８８】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。【００８９】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。【００９０】
つまり、本発明の目的は、免疫組織化学に有効でありかつＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を惹起し得る抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【００９１】
（ｄ）抗原ペプチドの生成
［１］ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。【００９２】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。【００９３】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。【００９４】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。【００９５】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。【００９６】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。【００９７】
このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、ＩＬ−１８レセプタータンパク質のアミノ酸配列、またはＩＬ−１８レセプタータンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。【００９８】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【００９９】
［２］組換え発現のためのベクターおよび細胞
本発明は、免疫組織化学に有効でありかつＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を惹起し得る抗原ポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。好ましくは、本発明に係るベクターは、組換え発現に用いるベクターであり得る。【０１００】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。【０１０１】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。【０１０２】
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。【０１０３】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよい。【０１０４】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。【０１０５】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。【０１０６】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０１０７】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【０１０８】
本発明はさらに、免疫組織化学に有効でありかつＩＬ−１８レセプターアンタゴニストとして機能し得る抗体を惹起し得る抗原ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を提供する。細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。【０１０９】
遺伝子が細胞に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換細胞からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。【０１１０】
本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した細胞も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【０１１１】
〔２：ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを含む薬学的組成物〕
本発明者らは、紫外線照射後の皮膚に対してＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの投与が表皮肥厚の回避に有効であることを見出した。本発明者らはさらに、マウスにＵＶを照射した後に肥厚したケラチノサイトにおいて、ＩＬ−１８（ＵＶ照射６〜１２日後）、ＩＬ−１８レセプターαサブユニット（ＵＶ照射９〜１２日後）、およびβサブユニット（ＵＶ照射６〜９日後）の発現量が増加することを見出した。【０１１２】
ＩＬ−１８の機能を阻害する抗体、またはＩＬ−１８レセプターアンタゴニストをＵＶ照射４日後のマウスに塗布することによって、その後５日間に形成されるＵＶ依存性のケラチノサイト肥厚が抑制された。【０１１３】
本発明は、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを含む薬学的組成物、より詳細には、ＩＬ−１８レセプターαサブユニットに対する抗体および／またはβサブユニットに対する抗体を含むＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するための薬学的組成物、特に、皮膚肥厚を予防および／または治療するための薬学的組成物を提供する。さらに本発明は、ヒトの皮膚におけるケラチノサイトの増殖を阻害する方法、およびケラチノサイトの分化を増加させる方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ＩＬ−１８関連障害」は、ＩＬ−１８依存的な細胞内シグナル伝達機構が関与して生じる疾患、障害、または疾病が意図される。従って、「ＩＬ−１８関連障害」は、活性化型ＩＬ−１８の存在によって特徴付けられる。【０１１４】
本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストは、表皮細胞ＤＮＡ合成を抑制し、分化誘導を促進し、表皮肥厚を抑制する作用を有する。すなわち、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストは、皮膚の表皮細胞の異常角化を正常化する作用を有し、角化改善剤として使用できる。角化改善剤は、内服、外用その他いずれの方法によっても投与可能であり、また有効成分として、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの他に通常使用される抗炎症剤、ビタミン類等を必要に応じ適宜配合できる。【０１１５】
（ａ）皮膚外用剤
本明細書中で使用される場合、用語「皮膚」は、顔、首、胸、背中、腕、脚、手および頭皮の皮膚が意図される。【０１１６】
一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを含む皮膚外用剤であり得る。皮膚外用剤としては、薬用皮膚外用剤、化粧薬用皮膚外用剤、化粧用組成物等の種々の使用形態をとることができる。本明細書中で使用される場合、用語「皮膚外用剤」は、薬用皮膚外用剤または化粧薬用皮膚外用剤が意図され、化粧用組成物については後で詳述される。【０１１７】
皮膚外用剤としては、経皮投与用の固体、半固体または液状の製剤、あるいは、座剤などが挙げられる。例えば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用の貼付剤などとして用いることもできる。【０１１８】
薬用皮膚外用剤および化粧薬用皮膚外用剤としては、例えば、薬効成分を含有する各種の軟膏剤が挙げられる。軟膏剤としては、油性基剤をベースとするもの、油／水、水／油型の乳化系基剤をベースとするもののいずれであってもよい。上記油性基剤としては、特に制限はなく、例えば、植物油、動物油、合成油、脂肪酸、および天然または合成のグリセライド等が挙げられる。また、上記薬効成分としては、特に制限はなく、例えば、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、皮膚軟化剤、ホルモン剤、ビタミン類等を必要に応じて適宜使用することができる。【０１１９】
本実施形態に係る皮膚外用剤は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本実施形態に係る皮膚外用剤におけるＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該皮膚外溶剤を用いて所望の投与量範囲でＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを投与できるような量であれば特に限定されない。【０１２０】
本実施形態に係る皮膚外用剤へのＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの配合量は、特に制限されないが、通常、乳化系または油性の皮膚外用剤の場合にはそれぞれ全組成量の０．０００１〜５重量％（以下、「％」で示す）、特に０．０００１〜０．１％が好ましい。【０１２１】
本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストは、紫外線その他種々の因子の影響による表皮肥厚などに対し顕著な抑制作用を有しており、しかも、皮膚の正常な機能を回復させ、更に恒常性を維持させるものである。従って、本実施形態に係る皮膚外用剤を使用すれば、皮膚の角化しやすい部分における角化を抑制することができる。【０１２２】
（ｂ）化粧用組成物
他の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、化粧用組成物であり得る。本実施形態に係る化粧用組成物は、化粧品で通常使用されるいずれの形態で存在してもよい。【０１２３】
本実施形態に係る化粧用組成物は、化粧料成分として一般に使用されている油分、保湿剤、紫外線吸収剤、美白剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、植物エキス、香料等を任意に組み合わせて配合することができる。化粧用組成物としては、種々の用途および形態、例えば、水／油または油／水型の乳化化粧料、クリーム、化粧乳液、化粧水、油性化粧料、口紅、ファンデーション、皮膚洗浄剤、ヘアートニック、整髪剤、養毛剤、育毛剤、入浴剤として用いることができる。本実施形態に係る化粧用組成物は、常用の方法により上記種々の形態のものに調製することができる。【０１２４】
本実施形態に係る化粧用組成物は、必要に応じて、ゲル化した水溶液、ローションタイプの分散物、二相ローション、水性相に脂肪相を分散することによって得られるエマルジョン（Ｏ／Ｗエマルジョン）、またはその逆のエマルジョン（Ｗ／Ｏエマルジョン）、または三重エマルジョン（Ｗ／Ｏ／Ｗ若しくはＯ／Ｗ／Ｏエマルジョン）、またはイオン性および／または非イオン性タイプのベシクル分散物の形態で存在し得る。【０１２５】
本実施形態に係る化粧用組成物は、流体であっても固体であってもよい。流体で提供される場合、白色または着色クリーム、軟膏、乳液、ローション、美容液、ペースト、またはムースの外観を有してもよい。さらに本実施形態に係る化粧用組成物は、エアロゾルの形態で適用されてもよい。本実施形態に係る化粧用組成物はまた、固体形態、特にスティックの形態で提供され得る。【０１２６】
本実施形態に係る化粧用組成物は、組成物中のＩＬ−１８レセプターアンタゴニスト（好ましくは、抗ＩＬ−１８レセプター抗体）の機能を補助する目的で、希釈剤、分散剤、または担体として機能する薬学的、特に化粧的に受容可能な賦形剤を含むことが好ましい。【０１２７】
水以外の、または水に付加される賦形剤は、液体または固体皮膚軟化剤、溶剤、湿潤剤、増粘剤、および粉末であり得る。【０１２８】
一実施形態において、本実施形態に係る化粧用組成物に使用され得る化粧的に受容可能な賦形剤は、一般に、組成物の重量の５％〜９９．９％、好ましくは２５％〜８０％を構成し、そして、他の化粧補助剤の不存在においては、組成物の残余部分を構成する。好ましくは、賦形剤の重量の少なくとも８０重量％が水である。好ましくは、水が、新規組成物の少なくとも５０重量％、最も好ましくは６０〜８０重量％を構成する。【０１２９】
好ましい局面において、本実施形態に係る化粧用組成物は、化粧品で一般に使用されるアジュバント（例えば、親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性活性剤、防腐剤、抗酸化剤、溶媒、香料、フィラー、スクリーン剤、顔料、脱臭剤、および染料など）を含み得る。これらの各種のアジュバントの量は、当該分野において通常使用される量であり、例えば組成物の全重量に対して０．０１％〜８０％、好ましくは、０．０１〜５０％、より好ましくは、０．０５〜３０％である。これらのアジュバントは、各々の性質に依存して、脂肪相中に、水性相中に、または液体ベシクル中に導入され得る。いずれの場合でも、上記アジュバントの種類およびその割合は、本実施形態に係る化粧用組成物の所望の特性を損なわないように選択され得る。【０１３０】
本実施形態に係る化粧用組成物がエマルジョンである場合、脂肪相の割合は、組成物の全重量に対して５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％の範囲であり得る。エマルジョン形態で組成物において使用される油、乳化剤、および共乳化剤は、当該分野において従来使用される公知の物質から選択される。本実施形態に係る化粧用組成物は、組成物の全重量に対して０．３〜３０重量％、好ましくは０．５〜２０重量％の範囲の割合で、乳化剤および共乳化剤を含み得る。【０１３１】
本実施形態に係る化粧用組成物において使用可能な油としては、鉱物油（流動ワセリンまたは水素化ポリイソブテン）、植物起源の油（アボカド油またはダイズ油）、鉱物起源の油（ラノリン）、シリコーン油（シクロメチコーンまたはジメチコーン）、およびフルオロ油（パーフルオロポリエーテル）が挙げられるが、これらに限定されない。脂肪アルコール（セチルアルコール）、脂肪酸、およびワックス（カルナウバワックスまたはオゾケライト）もまた、脂肪物質として使用され得る。【０１３２】
本実施形態に係る化粧用組成物において使用可能な乳化剤および共乳化剤の例としては、例えばポリエチレングルコールの脂肪酸エステル、例えばＰＥＧ−１００ステアラート、およびグリセロールの脂肪酸エステル、例えばグリセリルステアラートが挙げられる。【０１３３】
本実施形態に係る化粧用組成物において使用可能な親水性ゲル化剤としては、カルボキシビニルポリマー（カーボマー）、アクリル酸ポリマー、例えばアクリラート／アルキルアクリラートコポリマー、ポリアクリルアミド、特に架橋化ポリアクリルアミド−メチルプロパン−スルホン酸、ポリサッカリド、天然ゴムおよびクレーが挙げられるが、これらに限定されない。親油性ゲル化剤としては、変性クレー、例えばベントン、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカ、およびポリエチレンが挙げられる。【０１３４】
本実施形態に係る化粧用組成物は、日焼け止めを含有するのが好ましい。「日焼け止め」は、紫外線をブロックするために一般に使用される物質が意図される。そのような化合物の例としては、ＰＡＢＡ、シンナメート、およびサリチレートの誘導体である。日焼け止めとして、例えば、オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても既知）を使用することができる。乳化剤中における日焼け止めの正確な量は、日光の紫外線からの所望される保護の程度に依存して、変化させることができる。【０１３５】
皮膚軟化剤が、本実施形態に係る化粧用組成物に含まれ得る。そのような皮膚軟化剤のレベルは、合計組成物重量の０．５％〜５０％、好ましくは５％〜３０％である。皮膚軟化剤は、一般的化学種において、エステル、脂肪酸およびアルコール、ポリオールおよび炭化水素として分類することができる。【０１３６】
上記エステルは、モノ−またはジ−エステルであり得る。受容可能な脂肪酸ジエステルの例としては、ジブチルアジペート、ジエチルセバケート、ジイソプロピルジメレート、およびジオクチルスクシネートが挙げられる。受容可能な分岐鎖脂肪酸エステルとしては、２−エチル−ヘキシルミリステート、イソプロピルステアレート、およびイソステアリルパルミテートが挙げられる。受容可能な三塩基性酸エステルとしては、トリイソプロピルトリリノレエートおよびトリラウリルシトレートが挙げられる。受容可能な直鎖脂肪酸エステルとしては、ラウリルパルミテート、ミリスチルラクテート、およびステアリルオレエートが挙げられる。好ましいエステルとしては、ココ−カプリレート／カプレート（ココ−カプリレートおよびココ−カプレートのブレンド）、プロピレングリコールミリスチルエーテルアセテート、ジイソプロピルアジペート、およびセチルオクタノエートが挙げられる。【０１３７】
好適な脂肪アルコールおよび酸としては、１０個〜２０個の炭素原子を有する化合物が挙げられる。セチル、ミリスチル、パルミチン、ステアリルアルコールおよび酸のような化合物が特に好ましい。【０１３８】
皮膚軟化剤として機能するポリオールは、線状および分岐鎖アルキルポリヒドロキシル化合物（例えば、プロピレングリコール、ソルビトール、およびグリセリンが好ましい。ポリ−プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのようなポリマーポリオール）であり得る。ブチレンおよびプロピレングリコールも、浸透促進剤として特に好ましい。【０１３９】
皮膚軟化剤として機能する炭化水素は、１２個〜３０個の炭素原子を有する炭化水素鎖を有する炭化水素であり得る。好ましい例としては、鉱油、石油ゼリー、スクアレン、イソパラフィンが挙げられる。【０１４０】
本実施形態に係る化粧用組成物は、粉末を含み得る。これらの粉末としては、白亜、タルク、カオリン、スターチ、スメクタイトクレー、化学的修飾珪酸アルミニウムマグネシウム、有機的修飾モントモリロナイトクレー、水和珪酸アルミニウム、ヒュームドシリカ、アルミニウムスターチオクテニルスクシネート、およびそれらの混合物が挙げられる。【０１４１】
他の補助少量成分もまた、本実施形態に係る化粧用組成物に含まれ得る。これらの成分としては、着色剤、不透明剤、および香料が挙げられる。これらの他の補助少量成分の量は、組成物に対して０．００１〜２０重量％であり得る。【０１４２】
本実施形態に係る化粧用組成物は、ヒトの皮膚に局所適用される製品、特に、皮膚を整え、潤いを与え、滑らかにし、そして、線のある皮膚、シワのある皮膚、または老化した皮膚の外観を予防しまたは減少させる薬剤として使用されることが意図される。【０１４３】
本実施形態に係る化粧用組成物の使用に際して、少量の、例えば１〜１００ｍｌの組成物を、好適な容器またはアプリケーターから皮膚の露出面に適用し、必要に応じて、手または指または好適な器具を使用して、皮膚に拡げ、そして擦り込む。【０１４４】
一実施形態において、本発明に係る局所皮膚処置用の薬学的組成物は、ローション、クリーム、またはゲルとして製剤化され得る。本実施形態に係る薬学的組成物は、それの粘度および意図される使用に適した容器に包装され得る。本実施形態に係る薬学的組成物は、例えば、ローションまたはクリームは、ボトルまたはロール−ボールアプリケーター、または噴射剤被動エアゾールデバイス（ｐｒｏｐｅｌｌａｎｔ−ｄｒｉｖｅｎ  ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｅｖｉｃｅ）または指での操作に好適なポンプ付き容器に包装され得る。本実施形態に係る薬学的組成物がクリームの場合は、非変形性ボトルまたはスクィーズ容器、例えば、チューブまたは蓋付き広口瓶に収容されても、カプセルに封入されてもよい。本実施形態に係る薬学的組成物は、化粧的に受容可能な組成物を含有する密閉容器に収容された形態で提供され得る。【０１４５】
商業ベースで組成される場合、本実施形態に係る化粧用組成物は、従来の様々な着色料、香料、増粘剤（キサンタンガムなど）、防腐剤、湿潤剤、皮膚軟化剤、緩和剤、界面活性剤、分散剤、浸透促進剤などを含むことができ、さらに利点が得られ、かつ局所製剤の触り心地および／または外見が改善されるように添加可能である。同様に、この組成物は、クリーム、ローション、軟膏、石鹸または液体ソープ、シャンプー、マスクなどに組成可能である。【０１４６】
（ｃ）医薬組成物
さらに他の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、医薬組成物であり得る。医薬組成物中に使用される医薬用担体は、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。本明細書中で使用される場合、用語「医薬組成物」は、上述した皮膚外用剤および化粧用組成物として提供される薬学的組成物以外の形態を有する組成物が意図される。【０１４７】
経口剤の場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等が医薬用担体として利用される。また経口剤を調製する際、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤滑剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合してもよい。【０１４８】
非経口剤の場合、当該分野において公知の方法に従って、本発明の有効成分を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等に溶解ないし懸濁させ、所望により殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができる。【０１４９】
本実施形態に係る医薬組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本実施形態に係る医薬組成物におけるＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬組成物を用いて後述の投与量範囲でＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを投与できるような量であれば特に限定されない。【０１５０】
本実施形態に係る医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与できる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。本実施形態に係る医薬組成物は、皮膚肥厚改善剤もしくは予防剤として使用可能であるので、しわ改善剤もしくは予防剤、皮膚の弾性向上剤もしくは維持剤、またはコラーゲン産生増強剤もしくは減少抑制剤として適用可能であり、これらの用途に用いる場合、上述した皮膚外用剤として皮膚に塗布して投与するのが特に好適であり、それにより所望の効果を得ることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。【０１５１】
本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人１日当り０．１〜２０００ｍｇ／ｋｇである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本実施形態に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。【０１５２】
本実施形態に係る医薬組成物を使用すれば、ＵＶ誘導性の皮膚炎、熱傷後の皮膚の過形成、接触性皮膚炎などに伴うケラチノサイトの過剰増殖を防ぐことができる。【０１５３】
（ｄ）食用組成物
別の実施形態において、本発明は、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを含有、添加および／または希釈してなる、皮膚肥厚の改善用もしくは予防用の食用組成物（すなわち、食品、飲料または飼料）を提供する。本実施形態に係る食用組成物は、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの生理作用により、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストに感受性を示す個体における、皮膚肥厚に伴う症状改善もしくは予防に極めて有用である。【０１５４】
本実施形態において、「含有」とは、食用組成物（すなわち、食品、飲料、または飼料）中にＩＬ−１８レセプターアンタゴニストが含まれるという態様を、「添加」とは、食用組成物の原料に、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを添加するという態様を、「希釈」とはＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを、食用組成物の原料で希釈するという態様をいう。また、上述した本発明に係る化粧用組成物についての記載における「含有」の語は、本発明の態様にいう含有、添加、希釈の意を含む。【０１５５】
本実施形態に係る食用組成物の製造法は特に限定されるものではなく、調理、加工および一般に用いられている食品または飲料の製造法による製造を挙げることができ、製造された食品または飲料に本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストが含有、添加および／または希釈されていれば良い。【０１５６】
本実施形態に係る食用組成物としては特に限定はないが、例えば穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工品、プレミックス加工品、麺類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、はるさめ、包装餅等）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネーズ類、ドレッシング等）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆等）、食肉加工品（ハム、ベーコン、プレスハム、ソーセージ等）、水産製品（冷凍すりみ、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工品、水産缶詰、つくだ煮等）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チーズ、練乳、粉乳、アイスクリーム等）、野菜・果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料等）、菓子類（チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類等）、アルコール飲料（日本酒、中国酒、ワイン、ウイスキー、焼酎、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュール等）、嗜好飲料（緑茶、紅茶、ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料等）、調味料（しょうゆ、ソース、酢、みりん等）、缶詰・瓶詰め・袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、そば・うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麺類、即席カレー、インスタントコーヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープ等）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグステーキ、シュウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテル等）、固形食品、液体食品（スープ等）、香辛料類等の農産・林産加工品、畜産加工品、水産加工品等が挙げられる。【０１５７】
本実施形態に係る食用組成物における本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの含有量は特に限定されず、その官能と作用発現の観点から適宜選択できるが、例えば、食品１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部であり、たとえば、飲料１００重量部当たり好ましくは０．０００１重量部以上、より好ましくは０．００１〜１０重量部である。【０１５８】
本実施形態に係る食用組成物の製造方法に特に限定はなく、一般の食品製造方法に準じて製造することができ、製造された飼料中にＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの有効量が含有、添加および／または希釈されていればよい。【０１５９】
本発明に係る食品、飲料または飼料としては、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストが含有、添加および／または希釈されており、その生理作用を発現させるための有効量が含有されていれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状物も包含する。なお、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストは、当該生理作用と食物繊維機能とを合わせ持つ健康食品素材として、食品、飲料または飼料の製造素材として極めて有用である。【０１６０】
さらに、別の実施形態において、皮膚肥厚改善もしくは予防を行う薬剤を製造するための、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの使用が提供される。【０１６１】
なお、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストはラットへの腹腔内投与において５ｇ／ｋｇ体重を単回投与しても死亡例は認められない。また、副作用の発生も認められない。【０１６２】
（ｅ）発毛・育毛用外用剤
さらに別の実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、発毛・育毛用外用剤であり得る。剃毛後にＵＶ照射した野生型マウスケラチノサイトの照射部位において、再発毛が照射１２日後以降に観察される。しかし、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを塗布または腹腔内投与すると、照射７日後に再発毛が観察された。【０１６３】
本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤は、外用剤として従来から公知の剤形とすることができる。特に、パスタ剤、軟膏剤、クリーム剤、液剤、ゲル剤、散剤、粉末剤、浴剤などの剤形とすることが好ましい。また、上記剤形を利用した、例えば、シャンプー、リンス、コンディショナー、ヘアートニック、ヘアークリーム、ヘアーリキッド、ヘアーミルク、ヘアーミスト、ヘアーフォーム、ヘアージェル、ヘアースプレー等の態様で使用することができる。【０１６４】
本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤の調製は、上記の剤形に応じ、ＩＬ−１８と、製剤学的に慣用されている外用剤成分とを、常法により混合、均一化することにより行うことができる。【０１６５】
本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤の調製において用いられる外用剤成分のうち、基剤成分の具体例としては、例えば以下の成分が挙げられる。【０１６６】
脂肪類としては、例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド、ハードファット等の合成油、オリブ油、ダイズ油、ナタネ油、ラッカセイ油、ベニバナ油、ヌカ油、ゴマ油、ツバキ油、トウモロコシ油、メンジツ油、ヤシ油等の植物油、豚脂、牛脂等の動物油及びこれらの硬化油等を挙げることができ、これらの一種を単独で、または二種以上を組み合わせて使用することができる。【０１６７】
ロウ類としては、例えば、ラノリン、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ等の天然ロウや、モンタンロウ等の鉱物ロウ、合成ロウ等を使用することができ、炭化水素としては、例えば、ワセリン（白色ワセリン、黄色ワセリン）、パラフィン、流動パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、スクワラン、ポリエチレン末、ゲル化炭化水素等を使用することができる。これらは一種を単独で使用してもよく、または二種以上を組み合わせて使用することができる。【０１６８】
高級脂肪酸としては、例えば、ステアリン酸、ベヘニン酸、パルミチン酸、オレイン酸等が使用することができる。また、高級アルコールとしては、例えば、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール等を使用することができ、さらに、多価アルコールとしては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール等を使用することができる。これらは一種を単独で使用してもよく、または二種以上を組み合わせて使用することができる。【０１６９】
合成及び天然高分子としては、例えば、カラギーナン、デンプン、デキストリン、デキストリンポリマー（カデキソマー）、トラガント、アラビアゴム、ローカストビーンガム、ペクチン、ゼラチン、キサンタンガム、プルラン、アルギン酸塩、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー等を使用することができる。また、界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ショ糖脂肪酸エステル等を使用することができる。また、これらは一種を単独で使用してもよく、または二種以上を組み合わせて使用してもよい。【０１７０】
低級アルコールとしては、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール等を使用することができる。ケトン類としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン等を使用することができる。粉体としては、例えば、カオリン、タルク、酸化亜鉛、酸化チタン、ステアリン酸マグネシウム、無水ケイ酸、デンプン等を使用することができる。セルロース誘導体としては、例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース等を使用することができる。無機塩類としては、例えば、硫酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硫酸アルミニウム、ポリリン酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸鉄、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、硫化ナトリウム、ホウ砂、酸化カルシウム、炭酸マグネシウム、塩化カリウム等を使用することができる。また、これらは一種を単独で使用してもよく、または二種以上を組み合わせて使用してもよい。【０１７１】
より具体的に、各剤形と添加成分の関係を示せば、以下のとおりである。【０１７２】
パスタ剤は、油性パスタ剤あるいは水性パスタ剤の剤形で使用することができ、油性パスタ剤の場合には、基剤成分として例えば脂肪類、ロウ類、炭化水素等を使用することができる。また、水性パスタ剤には、基剤成分として例えば合成及び天然高分子、多価アルコール、界面活性剤等を使用することができる。【０１７３】
軟膏剤の場合には、基剤成分として、例えば、脂肪類、多価アルコール、炭化水素等を使用することができる。【０１７４】
クリーム剤の場合には、基剤成分として、例えば、界面活性剤、高級アルコール、高級脂肪酸、炭化水素、多価アルコール、水（精製水を含む）等を使用することができる。【０１７５】
液剤及びゲル剤の場合には、基剤成分として、例えば、水（精製水を含む）、低級アルコール、ケトン類、脂肪類、多価アルコール、界面活性剤、炭化水素、合成及び天然高分子等を使用することができる。【０１７６】
散剤及び粉末剤の場合には、基剤成分として、例えば、粉体成分、セルロース誘導体、合成及び天然高分子等を使用することができる。【０１７７】
浴剤の場合には、有効成分であるホスホエノールピルビン酸成分を単独で使用してもよく、更に構成成分として、無機塩類等を配合して使用することができる。【０１７８】
本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤には、必要に応じてｐＨ調整剤として、例えば水酸化ナトリウム等のアルカリ金属の水酸化物等を使用してもよく、また、防腐・保存剤として、例えば、安息香酸ナトリウム等の安息香酸アルカリ金属塩、パラオキシ安息香酸エステル、ソルビン酸等を配合してもよい。さらに、これも必要により、抗酸化剤として、例えばトコフェロール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソ−ル等を用いてもよい。【０１７９】
また、本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤には、更に発毛・育毛効果を増強させるために、必要に応じて育毛促進効果が期待される他の化合物を配合してもよい。このような化合物としては、例えば、ビタミン類（レチノール、レチナール、レチノイン酸などのビタミンＡ類、レチノール脂肪酸エステルなどのビタミンＡエステル類、酢酸レチノール、パルミチン酸レチノール、α−カロチン、β−カロチン、γ−カロチン、リコペン、チアミン硝酸塩、チアミン塩酸塩、チアミンジスルフィド化合物、リボフラビン、フラビンヌクレオチド、フラビンテトラブチレート、リボフラビンテトラニコチネート、塩酸ピリドキシン、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキサミン、シアノコバラミン、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ニコチン酸メチル、ニコチン酸ベンジル、パントテン酸、パントテン酸塩、パントテニルアルコール、パントテニルエチルエーテル、ビオチン、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、アスコルビン酸エステル、ビタミンＤ類、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ユビキノン、プラストキノン、ビタミンＫ類等）、コリン、必須脂肪酸（リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸）、エイコサトリエン酸、女性ホルモン、副腎皮質ホルモン、抗高血圧剤（ミノキシジル、ジアゾキサイド等）、ＴＣＡ回路関連物質（ｃ−ＡＭＰ、コハク酸、クエン酸、ＡＴＰ、ＦＡＤ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、Ｌ−リンゴ酸、メチルマロニルＣｏＡ、フマル酸、サクシニルＣｏＡ、コエンザイムＡ、ＧＤＰ、ＧＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、オキザロ酢酸、アセチルＣｏＡ等）、植物抽出物（ヒノキチオール、チョウジ抽出物、アロエ抽出物、カンゾウ抽出物、サンショウ抽出物、アカヤジオウ抽出物、センブリ抽出液、ホップ抽出液、ローズマリー抽出液、セージ抽出液、タイム抽出液、人参抽出液、ニンニク抽出液等）及び合成薬効成分（塩化カプロニウム等）等が挙げられ、これらの一種を単独で、または二種以上を組み合わせて使用してもよい。【０１８０】
本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤は、エマルション型の製剤とすることもでき、この場合のエマルションの形態はＷ／Ｏ型、Ｏ／Ｗ型、Ｗ／Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｗ／Ｏ型のいずれの形態であっても構わない。【０１８１】
また、本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤自体をそのまま患部に塗布してもよいが、例えば、この外用剤を、伸縮性を有する布や不織布あるいはプラスチックシート等に塗布した、いわゆるパップ剤やプラスター剤等の貼付剤として患部に適用してもよい。【０１８２】
本実施形態に係る発毛・育毛用外用剤は、皮膚に対して安全であり、使用感も良好で、臨床的に優れ、かつ優れた発毛・育毛作用を発揮することができるものである。従って、本発明の発毛・育毛用外用剤は、発毛・育毛の促進や薄毛・脱毛（抜け毛）の予防、あるいは男性型脱毛症、病後・産後の脱毛、円形脱毛症、発毛不全、粃糠性脱毛症、脂漏性脱毛症、びまん性脱毛症、若禿（壮年性脱毛症）および老人禿（老人性脱毛症）等の治療に十分な効果を発揮することができるものである。【０１８３】
このように、本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを含めばよいといえる。すなわち、他の成分を含有する薬学的組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０１８４】
（ｆ）ストレス関連疾患におけるＩＬ−１８の関与
神経系、内分泌系および免疫系が互いに相互作用して大きな宿主防御ネットワークを構成するということが、これまでに示されている。これらの相互作用を制御することが、自己免疫疾患および炎症性疾患に対する重要な治療戦略となり得ることが提唱されている。【０１８５】
本発明者らは、上述したように、ＵＶ照射、すなわち、酸化ストレスによって、照射部位にＩＬ−１８の発現が亢進し、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストによって当該酸化ストレスによってもたらされる障害を抑制することを見出した。このことは、ＵＶ照射に限らない種々のストレスに応じてＩＬ−１８の発現が増大し、ＩＬ−１８の発現に起因してストレス関連疾患が発症することを示唆する。【０１８６】
従って、本発明者らは、種々のストレス負荷にＩＬ−１８がどのように関与するのかを調べた。その結果、本発明者らは、神経系、内分泌系および免疫系の間での相互作用に、ＩＬ−１８が関与することを見出した。具体的には、本発明者らは、固定化ストレスに曝されたマウスの血漿中に多量の活性化型ＩＬ−１８（１８ｋＤタンパク質）が分泌されることを見出した。【０１８７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストレス関連疾患」は、外界からの非感染性、非化学性、非傷害性の侵襲、およびそれらに対する個体の反応（すなわち、ストレス）に起因する疾患または障害が意図され、物理的、生理学的、心理的、精神的、年齢的な侵襲によって惹起、悪化および／または進行し得る疾患、ならびにこれらの侵襲によって発症の危険性が増大する疾患が意図される。【０１８８】
ストレスとの関連が示唆されている疾患としては、心身症、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性、偽膜性、急性および虚血性の大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、臓器の虚血、再灌流傷害、臓器の壊死、枯草熱、セプシス、敗血症、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、肺炎、肺塵症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、じんま疹、いぼ、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈、硬化症、血栓性静脈炎、心外膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳卒中、ギラン−バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎疹、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、滑膜炎、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ＩＩ型糖尿病、強直性脊椎炎、バーガー病、ライター症候群、ホジキン病、ＳＬＥ、肝硬変、腎不全、アレルギー性喘息、腎炎、心筋梗塞、シェーグレン症候群、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、鬱病、摂食障害、異食症、味覚障害、尋常性坐瘡、天疱瘡、魚鱗癬、乾癬、熱傷、光線過敏症、紫外線皮膚障害、または放射性障害、一酸化炭素中毒、低酸素症もしくはそれらの二次性障害などが挙げられる。【０１８９】
このようなストレス関連疾患において、特に、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、尋常性挫創、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、シェーグレン症候群、鬱病、および心身症において、サイトカインの一種であるＩＬ−６が関与することが示唆されている。これらの疾患において、ストレスに応じて血清中のＩＬ−６濃度が上昇する。このうち、リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症においては、それぞれのモデル動物を用いる実験において、抗ＩＬ−６レセプター抗体を用いることによって疾患が改善することが報告されている。しかし、人間（患者）において抗ＩＬ−６レセプター抗体を適用した場合、効果が持続しないばかりか効果が一定しないという不具合を生じる。【０１９０】
ストレスによって放出される血中ＩＬ−１８濃度の上昇は副腎を起源とする。上記ストレス関連疾患の患者において、ストレスとは関係なく、ＩＬ−１８が上昇（アトピー性皮膚炎はまれに低下）していることが報告されている。ストレスによって放出されるＩＬ−１８上昇と炎症または感染によって放出されるＩＬ−１８上昇では、ＩＬ−１８産生を活性化するプロモーター部位が異なることが示されており、よって、ストレス関連疾患において見られるＩＬ−１８上昇がストレスに起因するものかどうかは全く不明であった。【０１９１】
（ｇ）ストレス関連疾患に対するＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの効果
本発明者らは、動物モデル（野生型、コラーゲン誘発性リウマチ様関節炎または全身性エリテマトーデスのモデルマウス）にさらにストレスを加えた場合、血漿中ＩＬ−１８の有意な上昇が数時間以内に観察され、この上昇が、活性酸素を除去する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター、カスパーゼ−１１インヒビター、カスパーゼ−１インヒビターによって抑制されることを見出した。このことは、ＩＬ−１８を上方制御する特定の経路が存在し、炎症性原疾患の程度に関係なくこの経路が活性化することを示す。また、この結果は、ＡＣＴＨ分泌能、副腎皮質機能、および／または一般的なタンパク質合成能がもともと障害されていない限り、どの疾患においてもストレスによって血中ＩＬ−１８濃度が上昇することを示す。【０１９２】
多発性硬化症、シューグレン症候群、リウマチ様関節炎（ＲＡ）または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のモデルマウスにおいて、病勢悪化前に血中ＩＬ−１８濃度の上昇、引き続く血中ＩＬ−６濃度の上昇が認められた。特に、コラーゲン誘発性のリウマチ様関節炎または全身性エリテマトーデスのモデルマウスに対して、１日おきに３時間のストレスを負荷した場合、病態の完成が早まるとともに病勢が悪化した。また、ストレスの直前（１０分前）にＩＬ−１８レセプターアンタゴニスト（抗α抗体＋抗β抗体）を腹腔内へ２５μｇ／ｋｇ（各抗体を１２．５μｇずつ）投与した群においては、ＲＡにおいて運動および／または歩行の改善、ＳＬＥにおいてループス腎炎（ＢＵＮおよび尿中アルブミン）の有意な改善がみられ、ストレス性の悪化が回避された。この結果は、市販の抗ＩＬ−６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  １２６５）、抗ＩＬ−６レセプター抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ６６０）を用いた場合においても観察されたが、これらの抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６レセプター抗体よりも有効であった。【０１９３】
また、野生型、全身性エリテマトーデスモデルマウスを用いた実験において、ストレス開始３０分後にＩＬ−１８レセプターアンタゴニスト（抗α抗体＋抗β抗体）を投与した場合に血中ＩＬ−６濃度上昇の抑制が観察された。【０１９４】
以上の結果より、ストレス関連疾患において、ストレスに起因する血中ＩＬ−１８濃度の上昇、引き続く血中ＩＬ−６濃度の上昇が生じて病勢が悪化すること、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニスト（特に、抗レセプター抗体）を用いるとＩＬ−１８だけでなくＩＬ−６の血中濃度を抑えることができること、ならびに、ＩＬ−１８またはＩＬ−６のレセプターアンタゴニストを用いるとこれらの血中濃度を抑えて、その結果、病勢の悪化を抑えることができることが示された。【０１９５】
血中ＩＬ−１８は、血中ＩＬ−６と比較して半減期が非常に長い。よって、ストレス関連疾患の治療標的をＩＬ−１８にすること（すなわち、抗ＩＬ−１８レセプター抗体を用いて処置すること）によって、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６レセプター抗体を用いてストレス関連疾患を処置する場合よりも有効である。このことは、抗ＩＬ−６抗体または抗ＩＬ−６レセプター抗体より抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体＋抗β抗体）の方がストレス関連疾患の治療において効果的であったことと一致する。【０１９６】
上述したように、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストは、ストレス関連疾患を処置することができる。従って、本発明はまた、本発明に係るＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを含むストレス関連疾患を処置するための薬学的組成物を提供する。【０１９７】
本発明に係る薬学的組成物は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物であってもよい。本発明に係る薬学的組成物の剤型、投与形態、および組成物中に含まれる担体は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物の項に記載されているものを適宜選択すればよい。【０１９８】
本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１８／ＩＬ−６関連障害」は、ストレス関連疾患のような血中ＩＬ−１８レベルの上昇および血中ＩＬ−６レベルの上昇によって特徴付けられる疾患、障害、または疾病が意図される。【０１９９】
〔３：ＩＬ−１８を含む薬学的組成物〕
（ａ）アポトーシスに対するＩＬ−１８の効果
本発明者らは、インターフェロンγ誘導因子として同定されたＩＬ−１８の新たな機能としてアポトーシスを抑制および／または阻害する機能を見出した。【０２００】
通常、正常な培養細胞は、単層培養を行なうと、細胞の接触阻止によって増殖が阻害されるが、癌細胞のような細胞周期が異常な細胞では、細胞の接触阻止が生じず増殖し続ける。【０２０１】
本発明者らは、高密度で培養したケラチノサイトの培養培地中に活性化型ＩＬ−１８を添加すると、細胞の接触阻止によるアポトーシスが抑制されることを見出した。さらに、本発明者らは、分化誘導した培養ケラチノサイトの培養上清に抗ＩＬ−１８抗体を添加すると分化過程において生じるアポトーシスが抑制されることを見出した。そこで、本発明者らは、アポトーシスがＩＬ−１８関連シグナル伝達経路を介して制御され得るか否かを検討した。【０２０２】
ＵＶ照射後の皮膚障害としては、急性期の炎症反応、表皮遺伝子の障害、ケラチノサイトの過剰増殖による皮膚肥厚および落屑の発生、組織免疫の抑制が挙げられる。上記障害に対して、ＩＬ−１８は、以下の効果を有することが見出された：
・急性期においては、過剰なアポトーシスによる上皮の脱落を防いだ；
・中期、後期においては、ケラチノサイトの過剰増殖を引き起こし、皮膚組織中の免疫抑制を惹起した（ＩＬ−４およびＩＬ−１０の誘導）。【０２０３】
培養ケラチノサイトを用いた実験結果より、ＩＬ−１８は、分化誘導初期の細胞に対してｐ３８  ＭＡＰＫ、ＭＥＫ３／６を介するシグナル伝達を引き起こす。ＩＬ−１８は、分化の各段階において、生存因子、分化誘導因子、増殖誘導因子としての機能を発揮する。一方、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストを用いてＩＬ−１８を阻害することによって、皮膚の過形成またはケロイド形成が防がれた。【０２０４】
本発明に係るＩＬ−１８を含む薬学的組成物は、皮膚の角化を促す作用があることから、日焼けなどにより引き起こされる皮膚の色素沈着の原因物質であるメラニン代謝を早めることによって皮膚の色素沈着の改善効果（美白効果）を有し、美白剤として使用できる。角化改善剤および美白剤は、内服、外用その他いずれの方法によっても投与可能であり、また有効成分として、ＩＬ−１８の他に通常使用される抗炎症剤、ビタミン類等を必要に応じ適宜配合できる。【０２０５】
一実施形態において、本発明は、ＩＬ−１８を含む抗アポトーシス作用を有する組成物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗アポトーシス作用」は、アポトーシスを生じる細胞が減少すること、すなわち、アポトーシスを抑制および／または阻害することが意図される。【０２０６】
本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、ＩＬ−１８を含めばよいといえる。すなわち、他の成分を含有する薬学的組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０２０７】
〔４：ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するための薬学的組成物〕
上述したように、本発明者らは、動物モデル（野生型、コラーゲン誘発性リウマチ様関節炎または全身性エリテマトーデスのモデルマウス）にさらにストレスを加えた場合、血漿中ＩＬ−１８の有意な上昇が数時間以内に観察され、この上昇が、活性酸素を除去する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター、カスパーゼ−１１インヒビター、カスパーゼ−１インヒビターによって抑制されることを見出した。さらに、ＩＬ−１８レセプターアンタゴニストによって、ストレス依存的な血中ＩＬ−１８濃度の上昇が抑えられた。これらのことより、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター、カスパーゼ−１１インヒビター、またはカスパーゼ−１インヒビターが、ＩＬ−１８関連障害、好ましくは、ストレス関連疾患を処置するために有効であることがわかった。【０２０８】
１つの局面において、本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにスーパーオキシドジスムターゼを含むことを特徴としている。【０２０９】
他の局面において、本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにｐ３８  ＭＡＰＫインヒビターを含むことを特徴としている。【０２１０】
さらに他の局面において、本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにカスパーゼ−１インヒビターを含むことを特徴としている。【０２１１】
なおさらなる局面において、本発明に係る薬学的組成物は、ＩＬ−１８関連障害を予防および／または治療するためにカスパーゼ−１１インヒビターを含むことを特徴としている。【０２１２】
本発明に係る薬学的組成物は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物であってもよい。本発明に係る薬学的組成物の剤型、投与形態、および組成物中に含まれる担体は、上述した皮膚外用剤、化粧用組成物、またはその他の医薬組成物の項に記載されているものを適宜選択すればよい。【０２１３】
本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター、カスパーゼ−１１インヒビター、またはカスパーゼ−１インヒビターを含めばよいといえる。すなわち、他の成分を含有する薬学的組成物も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【０２１４】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらに限定されるべきではない。
【実施例】
【０２１５】
（実施例１：抗ＩＬ−１８レセプター抗体の生成）
抗ペプチド抗体実験プロトコール（秀潤社、１９９４年）に従って、ＩＬ−１８レセプターαサブユニットおよびβサブユニットに対する抗体を作製した。具体的には、配列番号５〜１０に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを作製（ＭＢＬ社）し、これらの合成ペプチドをＭＢＳ法を用いてＫＬＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（３７４８０５））とカップリングした後、カップリングした抗原（２００μｇ）をフロイント完全アジュバンド（ヤトロン）１．５ｍｌと混濁させて抗原液を調製し、この抗原液を背部への皮下注射によってウサギ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｗｈｉｔｅ）を免疫した。
（表１：抗レセプター抗体を生成するためのペプチド抗原）【０２１６】
【表１】
0005595632.tif 000002
【０２１７】
続いて、上記カップリング抗原（２００μｇ）とフロイント不完全アジュバント（ヤトロン）１．５ｍｌとを混濁させてさらなる抗原液を調製した。最初の抗原液注射の１週間後以降にこのさらなる抗原液を追加免疫として１週間ごとに５回皮下注射した。その１週間後に２２Ｇの留置針を用いて耳下静脈より静脈血（２０ｍｌまたは１００ｍｌ）を採取した。採取した静脈血は３７℃、一時間静置した後に３，０００ｒｐｍで３０分間（４℃）で遠心分離を行なって、血清画分を抽出して目的の抗体を含む抗血清を得た（抗α抗血清（Ａ〜Ｄ）および抗β抗血清（ＥおよびＦ））。【０２１８】
必要に応じて、各抗原ペプチドを結合させたＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）カラムを用いて、抗血清から抗体をアフィニティ精製した。【０２１９】
（実施例２：抗ＩＬ−１８レセプター抗体の検討）
抗ＩＬ−１８レセプターαサブユニット抗体としてＡＣＲＩＳ社のＭｓＡｇＧ１（Ｈ４４クローン：抗ヒト）、ＧＴ社の７０６２５  １４−Ｐ３９８（抗ヒト）および１１２６２４  １４−Ｐ３９８（抗ヒト）が現在市販されているが、抗ＩＬ−１８レセプターβサブユニット抗体は、市販されていない。【０２２０】
実施例１で得られた抗α抗血清（Ａ〜Ｄ）を、市販の抗ＩＬ−１８レセプターαサブユニット抗体と比較した。【０２２１】
上記の市販の抗ＩＬ−１８レセプターαサブユニット抗体は、培養ＫＧ−１細胞サンプルでのフローサイトメトリー、培養ＫＧ−１細胞サンプルでのウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、培養ＫＧ−１細胞の分泌するＩＬ−１８によるＩＦＮ−γの産生能の中和などに用いられているが、組織標本に対する免疫組織化学、および組織抽出物に対するウエスタンブロットに用いることができない。【０２２２】
１×１０５細胞／プレートの市販のヒトのケラチノサイトＫＧ−１細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社、米国）の培養培地に組換えヒトＩＬ−１８（４０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。組換えヒトＩＬ−１８として、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２７４−９（１９９６）およびＮａｔｕｒｅ  ３７８：８８−９１（１９９５）に記載の組換えタンバク質を使用した。【０２２３】
市販の抗ＩＬ−１８レセプターαサブユニット抗体（ＡＣＲＩＳ社のＭｓＡｇＧ１）と実施例１で得られた抗α抗血清（Ａ〜Ｄ）とを同一タンパク質量で用いて、ＫＧ−１細胞に対する組換えＩＬ−１８依存的なＩＦＮ−γの産生能の中和を比較した。【０２２４】
実施例１で得られた抗α抗血清の中和活性はいずれも、市販のαサブユニット抗体とほど同程度であった。この抗α抗血清（Ａ〜Ｄ）は、αサブユニット抗体以外の抗体も含んでいるため、市販のαサブユニット抗体より十分強い中和活性を有することがわかった。また、実施例１で得られた抗β抗血清（ＥおよびＦ）のいずれも、抗α抗血清（Ａ〜Ｄ）と同程度の中和活性を有した。【０２２５】
次いで，これらの抗α抗血清（Ａ〜Ｄ）および抗β抗血清（ＥおよびＦ）を用いて，フローサイトメトリー、免疫沈降、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（脳ホモジネート可溶性画分、培養ＫＧ−１細胞、およびマウス腹腔マクロファージ）、免疫組織化学（ＯＣＴ凍結、新鮮凍結、パラフィン包埋切片）を行った。いずれの抗血清を用いても、上記実験において明瞭な結果を得ることができた。【０２２６】
さらに、ペプチドα−Ａとペプチドα−Ｂとの混合抗原、ペプチドα−Ｃとペプチドα−Ｄとの混合抗原、およびペプチドβ−Ｅとペプチドβ−Ｆとの混合抗原を用いて免疫して得た抗血清をさらにアフィニティ精製した（それぞれ、抗ヒトα抗体、抗マウスα抗体および抗β抗体）。これらの抗体を用いて，上述の抗血清と同様に、上記実験において明瞭な結果を得ることができた。特に、ウエスタンブロット解析において、上記抗血清を用いる場合よりもバックグラウンドが低く、解析に用いるサンプルのタンパク質量が１／１０であっても明瞭な結果を得ることができた。ＥＬＩＳＡ解析において、上記抗血清を用いる場合よりも、解析に用いるサンプルのタンパク質量が１／５〜１／２であっても明瞭な結果を得ることができた。さらに、抗ヒトα抗体、抗マウスα抗体および抗β抗体はいずれも、抗原との親和性が市販の抗体よりの５倍以上高く、ＫＧ−１細胞におけるＩＬ−１８によるインターフェロンγ産生を有意に阻害した（ＮＤ５０（５０％中和用量）：０．０７５〜０．２μｇ／ｍｌ：市販の抗体の３倍以上）。【０２２７】
最近、ＩＬ−１８レセプターβサブユニットに対する抗体が、市販された（ＧＴ社の１３２０１６  １４−Ｐ３９８（抗ヒト）。データシートには、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、およびＩＬ−１８依存的なＩＦＮ−γの産生能の中和が可能と記載され、ＮＤ５０が０．３〜１．０μｇ／ｍｌであると記載される。【０２２８】
しかし、中和活性（ＮＤ５０）の測定時に本発明者らが使用した組換えヒトＩＬ−１８は、市販のラットＩＬ−１８（ＧＴ社）と比べて５倍以上のＩＦＮ−γ産生効果を有することに注意しなければならない（データは示さず）。このことは、組換えＩＬ−１８生成時に起こるタンパク質のフォールディングの差に起因すると考えられる。従って、本発明者らが使用した組換えヒトＩＬ−１８を使用して行えば、ＧＴ社の抗ＩＬ−１８レセプターβサブユニット抗体によるＮＤ５０の値は、データシートに記載されている値よりもさらに大きくなるはずである。【０２２９】
以上のように実施例１で作製した抗α抗血清および抗β抗血清は、いずれもＩＬ−１８によるＩＦＮ−γの産生能の中和、組織標本に対する免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降、培養細胞サンプルおよび組織抽出物に対するウエスタンブロットに用いることができた。さらに、複数のペプチドを混合して免疫することによって惹起した抗α抗体および抗β抗体は、実施例１で作製した抗α抗血清および抗β抗血清よりも優れていることがわかった。【０２３０】
（実施例３：ＵＶ照射したマウスケラチノサイトにおけるＩＬ−１８およびＩＬ−１８レセプターの発現）
以下の実施例において、上述の抗α抗体および抗β抗体を用いた。【０２３１】
野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）の背部を剃毛した後、紫外線（ＵＶ）３００ｍＪを照射した。ＵＶ照射後のマウス背部における皮膚の厚さの変化を調べるとともに、抗ＩＬ−１８抗体（ＭＢＬ）および実施例２で作製した抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体および抗β抗体）を用いた免疫組織科学によって、ＩＬ−１８およびＩＬ−１８レセプターの発現を調べた。【０２３２】
マウスをジエチルエーテルで麻酔した後、頸動脈を切断して失血死させた。４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝化水溶液（ｐＨ７．４）で灌流固定した後、マウス背部の皮膚（真皮層および皮下組織を含む）を採取した。皮膚を、４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝化水溶液（ｐＨ７．４）中に４８時間浸潤して固定した後に脱水し、バラフィンに浸潤してパラフィン包埋した。【０２３３】
包埋した皮膚組織を、断面が皮膚表面に対して垂直になるように４μｍ厚の切片にスライスし、シランコートしたスライドガラス上に固着させた。以下の操作を、スライドガラス上に固着した切片に対して行った。【０２３４】
切片を、キシレン、１００％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノール、８０％エタノール、および７０％エタノール中に順々に浸潤させて、切片の脱パラフィン処理および親水化を行った。続いて、この切片について、０．０１％過酸化水素水中にて内因性ペルオキシダーゼを失活させ、蒸留水で洗浄した後、５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝化水溶液（Ａ液）中に１時間ブロッキングした。【０２３５】
次いで、この切片を、上記Ａ液を用いて作製した各一次抗体反応液（５μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１８抗体、抗α抗体または抗β抗体をそれぞれ含む）中にて、４℃で２４時間インキュベートした。一次抗体反応後にリン酸緩衝化水溶液で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結合体化した抗ヤギＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ、または抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）をＡ液中に含む二次抗体反応液（１μｇ／ｍｌ）中にて室温で３時間インキュベートした。二次抗体反応後にリン酸緩衝化水溶液で洗浄した。【０２３６】
２０ｍｇの３−３ジアミノベンチジン（ＤＡＢ、片山化学）を含む０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水を用いて、上記反応後の切片を発色させた。発色を停止した後に切片を洗浄し、エタノール（７０％、８０％、９０％、９５％および１００％）およびキシレンに順々に浸潤して脱水し、ソフトマウント（和光純薬）を用いてカバーガラスで封入した。【０２３７】
得られた免疫組織標本を光学顕微鏡を用いて観察した結果を、図１に示す。免疫組織化学の結果、ＵＶ照射部位において、ケラチノサイトが高度に増殖しており、ＩＬ−１８だけでなくＩＬ−１８レセプターαサブユニットおよびβサブユニットの発現量が増加した（それぞれ、６〜１２日後、９〜１２日後、６〜９日後）。【０２３８】
（実施例４：ＵＶ照射によるマウスの皮膚障害に対する抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果）
野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）の背部を剃毛し、紫外線（ＵＶ）３００ｍＪを照射した４日後に、抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体と抗β抗体を混合して用いた）をＵＶ照射部位に塗布し（２５０ｐｇ／ｃｍ２）、その５日後の皮膚の厚みを測定した。
未処置のマウスにおいてＵＶ照射４日後以降に観察される表皮肥厚が、抗ＩＬ−１８レセプター抗体の塗布によって抑制された（図２Ａ）。【０２３９】
ＩＬ−１８ノックアウト（ＫＯ）マウスに対して同様にＵＶ照射を行ったところ、野生型で観察されるＵＶ照射４日後以降の表皮肥厚が見られなかった（図２Ｂ）。【０２４０】
これらの結果は、ＵＶ照射後の表皮肥厚にはＩＬ−１８が関与し、抗ＩＬ−１８レセプター抗体はＵＶ照射後の表皮肥厚を抑制することを示す。【０２４１】
次に、抗α抗体と抗β抗体のいずれが上記の結果をもたらすのかを検討した。【０２４２】
上述したように、野生型マウスの背部を剃毛し、紫外線（ＵＶ）３００ｍＪを照射した４日後に、抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体、抗β抗体、または混合）をＵＶ照射部位に塗布した（２５０ｐｇ／ｃｍ２）。マウス照射部位における皮膚肥厚は、いずれの
抗ＩＬ−１８レセプター抗体を用いても抑制されたが抗α抗体の方が抗β抗体より効果的であった（図３）。抗α抗体と抗β抗体との混合適用ではＵＶ照射前の厚みを維持しており、混合適用が最も効果的であることがわかった。【０２４３】
（実施例５：紫外線照射によるマウスケラチノサイトにおける変化）
マウス背部を剃毛した後、紫外線（ＵＶ）３００ｍＪを照射し、照射後の皮膚の脱落、肥厚、修復の過程を、ケラチノサイトに注目して観察した。【０２４４】
野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）に紫外線を照射すると、表皮において以下のような変化が観察された：
１）早期変化（２４時間以内に観察される）
（ａ）表皮の腫脹と発赤
（ｂ）アポトーシス性の表皮ケラチノサイト層脱落
２）中期変化（２〜５日目に観察される）
（ｃ）表皮の角化および落屑の発生
（ｄ）ＩＬ−１８レセプタータンパク質およびＩＬ−１８タンパク質の発現量の亢進
（ｅ）ケラチノサイトの増殖および／または分化の活性化、ならびにこれに伴う上皮肥厚３）後期変化（５〜１５日目に観察される）
（ｆ）上皮肥厚（１０日目にピーク）
（ｇ）再発毛（１２日目以降）。【０２４５】
同様にＩＬ−１８（−／−）マウス（Ｃ５７／Ｂ６バックグラウンド：オス）に対して紫外線を照射した場合、上記（ｂ）が顕著に亢進したが、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）は軽度であり、（ｇ）は、４〜６日目に観察された。【０２４６】
（実施例６：ＵＶ照射部位における細胞内シグナル伝達分子の活性化）
ＵＶ照射後の野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）の皮膚において、皮膚の肥厚とともに、増殖および／または分化に関与するシグナル伝達分子（ＭＥＫ３／６およびｐ３８  ＭＡＰＫ）が集積する。また、ＵＶ照射後の皮膚において、細胞周期のマーカータンパク質であるサイクリンＤ１が、高度に産生される。しかし、ＩＬ−１８（−／−）マウス（Ｃ５７／Ｂ６バックグラウンド：オス）においては、このような現象が観察されない（図４Ａ、図５Ａおよび図６Ａ）。これらのことは、ＵＶ照射後のケラチノサイトにおいて、ＩＬ−１８依存的にＭＥＫ３／６およびｐ３８  ＭＡＰＫを介するシグナル伝達経路が活性化されてサイクリンＤ１を発現し、ケラチノサイトの増殖および／または分化が制御されていることが示唆された。そこで、ＵＶ照射した野生型およびＩＬ−１８  ＫＯマウスにおいて、ＭＥＫ３／６に対する抗体、ｐ３８  ＭＡＰＫに対する抗体（ともに活性化型を認識するリン酸化抗体）、およびサイクリンＤ１に対する抗体を用いて、ＵＶ照射部位のケラチノサイトにおけるこれらシグナル伝達分子の活性化を調べた。【０２４７】
実施例３と同様にＵＶ照射後のマウス背部における皮膚の厚さの変化を調べるとともに、上記シグナル伝達分子に関する免疫組織化学標本を作製した。【０２４８】
具体的には、抗サイクリンＤ１抗体（４００倍、ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン酸化型ＭＥＫ３／６抗体（４００倍、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）、抗ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体（１００倍、ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および抗リン酸化型ｐ３８  ＭＡＰＫ抗体（４００倍、ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を一次抗体に用いた以外は、実施例３で行った手法と同様に免疫組織標本を作製した。【０２４９】
野生型では、ＭＥＫ３／６、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化が生じたが、ＩＬ−１８  ＫＯマウスでは、ＭＥＫ３／６、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化が生じておらず、サイクリンＤ１の発現量も野生型と比較して低下していた（図４Ｂ、図５Ｂおよび図６Ｂ）。【０２５０】
さらに、ＵＶ照射部位によるＩＬ−１８依存的なＭＥＫ３／６、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化、サイクリンＤ１の発現は、照射部位への抗ＩＬ−１８レセプター抗体の塗布によって抑制された（図４Ｂ、図５Ｂおよび図６Ｂ）。【０２５１】
以上の結果より、マウスケラチノサイトのＵＶ照射部位では、ＩＬ−１８依存的なＭＥＫ３／６、ｐ３８  ＭＡＰＫの活性化、サイクリンＤ１の発現が生じ、その結果、ケラチノサイトの増殖および／または分化が生じることが示された。【０２５２】
（実施例７：ＵＶ照射部位における再発毛に対するＩＬ−１８レセプターアンタゴニストの効果）
実施例３と同様に野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）およびＩＬ−１８（−／−）マウス（Ｃ５７／Ｂ６バックグラウンド：オス）の背部を剃毛した後、紫外線（ＵＶ）３００ｍＪを照射し、ＵＶ照射直後に照射部位または腹腔内に抗ＩＬ−１８抗体を塗布または投与した。【０２５３】
ＵＶ照射後のマウス背部の皮膚（２×２．６ｃｍ）を経時的に採取した。採取した皮膚標本を実体顕微鏡下で２ｍｍ四方に区分し、それぞれの区分における発毛域の割合を顕微鏡的に観察した。全区分における発毛域の割合を統計学的に処理して、その皮膚標本における発毛域の割合として評価した。【０２５４】
ＵＶ照射直後に抗ＩＬ−１８レセプター抗体を塗布（２５０ｐｇ／ｃｍ２）したマウスのＵＶ照射部位において、再発毛が促進された。具体的には、ＵＶ照射１２日後以降に観察される再発毛が、抗ＩＬ−１８レセプター抗体の塗布によってＵＶ照射７日後に観察された。同様の結果を、２０００ｐｇ／マウスでの腹腔内投与によって得た（図７）。【０２５５】
以上の結果は、ＩＬ−１８の機能阻害によって発毛が促進されることを示す。【０２５６】
本実施例における塗布と腹腔内投与とによる効果を比較した場合、腹腔内投与の方がやや効果的であったが、塗布に用いる基剤を変更することによって効果が異なった。このことから、基剤を選択すれば塗布の場合でも腹腔内投与の場合と同様の効果が期待できる。【０２５７】
（実施例８：培養ヒトケラチノサイトに対するＩＬ−１８の効果）
市販のヒトのケラチノサイトＫＧ−１細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ社、米国）を、ケラチノサイト増殖培地（クラボウ）を分注した直径６ｃｍのプレート中に播種した（２×１０５細胞／プレート）。細胞を１０日間増殖させた後、培地に組換えＩＬ−１８を添加した（最終濃度５００ｐｇ／ｍｌ）。組換えＩＬ−１８として、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２７４−９（１９９６）およびＮａｔｕｒｅ  ３７８：８８−９１（１９９５）に記載の組換えタンバク質を使用した。無添加またはＰＢＳ添加の場合、ケラチノサイトは接触阻止によるアポトーシスが誘導された。しかし、ＩＬ−１８を添加した場合、接触阻止によるアポトーシスは、少なくともさらに１０日間抑制された（結果は示さず）。【０２５８】
次に、分化したケラチノサイトに対するＩＬ−１８の効果を観察した。上述したようにＫＧ−１細胞を、ケラチノサイト増殖培地（クラボウ）を分注した直径６ｃｍのプレート中に播種した（２×１０５細胞／プレート）。細胞が７０％コンフルエントに達するまで６日間増殖させた後、１．２ｍＭ  ＣａＣ１２を培地に添加して細胞を分化させた。分化誘導時に抗ＩＬ−１８抗体（ＭＢＬ社）を培地に添加（最終濃度１μｇ／ｍｌ）すると、抗ＩＬ−１８抗体無添加時に観察される分化ケラチノサイトのアポトーシスが抑制された（図８）。【０２５９】
分化誘導時にＩＬ一１８（最終濃度５００ｐｇ／ｍｌ）、抗ＩＬ−１８抗体（最終濃度５００ｐｇ／ｍｌ）を培地に添加して、１２日後にＴＵＮＥＬ染色した細胞を計数し、アポトーシスが誘導された細胞数を算出した。結果を図９に示す。【０２６０】
無添加またはＰＢＳ添加（ネガティブコントロール）の場合、分化したケラチノサイトにおいて、分化誘導１２日目以降にもさらにアポトーシスが誘導される細胞（アポトーシス細胞）が観察されるが、ＩＬ−１８を添加した場合は、観察されるアポトーシス細胞の数が有意に減少した。【０２６１】
また、抗ＩＬ−１８抗体を添加した場合は、観察されるアポトーシス細胞の数が有意に増加した。ケラチノサイトの分化を誘導すると、ＩＬ−１８が大量に産生されて培養上清中に分泌される（結果は示さず）。よって、抗ＩＬ−１８抗体が、ケラチノサイト分化誘導に伴って分泌されたＩＬ−１８の機能を阻害したと考えられる。【０２６２】
以上の結果より、ＩＬ−１８は、未分化状態または分化した状態に関わらず、ヒトケラチノサイトにおいて誘導されるアポトーシスを阻害するということが示された。【０２６３】
（実施例９：ＵＶ依存的または放射線依存的なケラチノサイトのアポトーシスに対するＩＬ−１８の効果）
実施例８に示したように、培養ケラチノサイトにおけるアポトーシスがＩＬ−１８によって抑制された。そこで、ＵＶ照射したマウスケラチノサイトにおけるＵＶによるＤＮＡ損傷依存的なアポトーシスに対するＩＬ−１８の効果を調べた。【０２６４】
実施例３と同様に作製した皮膚切片に対して、プロテイナーゼＫ液を用いて３７℃で５分間タンパク質分解処理を施した。ＰＢＳ（−）で洗浄した後、アポトーシスによる断片化によって露出しているＤＮＡ末端を、ＴｄＴ液中で標識した（３７℃で２時間）。この切片を洗浄した後、ＨＲＰを結合体化した抗ＴｄＴ抗体を含む反応液中でインキュベートし（３７℃で３０分）、アボトーシスによるＤＮＡ断端にペルオキシダーゼを結合させた。インキュベート後に洗浄し、実施例３と同様に発色させた後、脱水および封入した。【０２６５】
アボトーシス細胞数の評価を、ＴＵＮＥＬ染色によって行った。アポトーシス検出キット（和光純薬）をその指示書に従って用いて、ＴＵＮＥＬ染色を行った。アポトーシス細胞数はＴＵＮＥＬ染色陽性細胞として計数できる。アポトーシス細胞の数は光学顕微鏡下（×１００）にて同一切片中の６視野を計数し、６視野の平均数をその切片中のアボトーシス細胞数とした。【０２６６】
実施例５に示したように、野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）に紫外線を照射すると、表皮における早期変化（２４時間以内に観察される）としてアポトーシス性の表皮ケラチノサイト層脱落（上記（ｂ））が観察されるが、ＩＬ−１８（−／−）マウス（Ｃ５７／Ｂ６バックグラウンド：オス）に対して紫外線を照射した場合は、この現象が顕著に亢進した（図１０）。【０２６７】
ＵＶ照射直後にＩＬ−１８を塗布（５００ｐｇ／ｃｍ２）したマウスにおいて、アポトーシス細胞は優位に減少していた（図１１Ａ）。同様の結果を、２５０ｐｇ／ｃｍ２での塗布および２０００ｐｇ／マウスでの腹腔内投与によって得た。また、ＩＬ−１８  ＫＯマウスにおいては、ＵＶ照射によるアポトーシスの誘導は高度に生じた（図１１Ａ）。【０２６８】
ＵＶの代わりに放射線（４Ｇｒａｙ）を照射して、同様にアポトーシス細胞を観察した。放射線照射直後にＩＬ−１８を塗布（５００ｐｇ／ｃｍ２）したマウスにおいて、アポトーシス細胞は優位に減少していた（図１１Ｂ）。同様の結果を、１５００ｐｇ／マウスでの腹腔内投与によって得た。また、ＩＬ−１８  ＫＯマウスにおいては、ＵＶ照射によるアポトーシスの誘導は高度に生じた（図１１Ｂ）。【０２６９】
以上の結果は、ＩＬ−１８を用いれば、皮膚に対するＵＶまたは放射線によってもたらされる上皮皮膚障害（特に、上皮のアポトーシス性脱落）を、予防および／または処置できることを示す。【０２７０】
ＵＶ照射後のマウス皮膚障害に対して、組換えＩＬ−１８を塗布または腹腔内投与して、その効果を調べた。具体的には、ＵＶ照射した直後のマウスに対して、皮膚にＩＬ−１８を塗布（２５０ｐｇ／ｃｍ２）または腹腔内投与（１０００ｐｇ／マウス）した場合、実施例６に示した（ａ）〜（ｇ）の変化のうち、落屑の発生以外が緩和した。【０２７１】
上記濃度のＩＬ−１８を長期（３週間以上）塗布すると、皮膚の硬化を伴わない経度の皮膚肥厚が生じた（ケラチノサイト分化促進による落屑は多い）。しかし、ＵＶ照射に起因する皮膚障害はやや緩和された。【０２７２】
以上の結果より、低濃度のＩＬ−１８を、ＵＶまたは放射線の照射直後に塗布または腹腔内投与することが適切であることが示された。【０２７３】
（実施例１０：ストレス関連疾患に対するＩＬ−１８の効果）
神経系、内分泌系および免疫系が互いに相互作用して大きな宿主防御ネットワークを構成するということが、これまでに示されている。これらの相互作用を制御することが、自己免疫疾患および炎症性疾患に対する重要な治療戦略となり得ることが提唱されている。神経系、内分泌系および免疫系の間での相互作用に、ＩＬ−１８が関与することを見出した。【０２７４】
マウスの血漿ＩＬ−１８に対する一酸化窒素（ＮＯ）の関与を調べた。マウス（野生型またはｉＮＯＳ（ＮＯ合成酵素）ノックアウトマウスに固定化ストレスを与えて、血漿中のＮＯ２／３レベルおよびＩＬ−１８レベルを調べた。また、組換えＩＬ−１８を注射したｉＮＯＳノックアウトマウスにおける血漿ＩＬ−１８レベルの時間経過を観察した。野生型マウスにおいて、血漿中のＮＯ２／３濃度が上昇したが、ｉＮＯＳノックアウトマウスにおいては、上昇しなかった。野生型マウスにおいて、血漿中のＩＬ−１８レベルが５０ｐｇ／ｍｌ→１０００ｐｇ／ｍｌへ上昇したが、ｉＮＯＳノックアウトマウスにおいては、３０００ｐｇ／ｍｌにまで上昇した。イムノブロッティングの結果より、血漿中のＩＬ−１８タンパク質は、１８ｋＤの活性化型であった。ｉＮＯＳノックアウトマウスと野生型マウスとの間で血漿ＩＬ−１８レベルの変化を比較したところ、血漿ＩＬ−１８レベルの減少において差異が存在した。【０２７５】
以上の結果より、（１）固定化ストレスに曝露されたマウスにおいて、血漿中のＮＯ２／３濃度が上昇すること、（２）固定化ストレスに曝露されたマウスにおいて、血漿中の活性化型ＩＬ−１８レベルが上昇すること、が示された。ｉＮＯＳは、ストレス誘導性の血漿ＩＬ−１８レベルの上方制御を特に阻害することがわかった。【０２７６】
さらに、マウスの血漿ＩＬ−１８レベルに対する固定化ストレスの影響を調べた。ストレスを受けたマウスでの血漿ＩＬ−１８レベルに対するＡＣＴＨおよび抗ＡＣＴＨ抗体の影響もまた調べた。イムノブロッティング法を用いて血漿中および副腎中のＩＬ−１８タンパク質の特徴付けを行った。固定化ストレスによって、血漿中および副腎中のＩＬ−１８タンパク質レベルが増加した（＞１０００ｐｇ／ｍｌ）。抗ＡＣＴＨ抗体は、上記増加レベルのＩＬ−１８タンパク質を有意に抑制した。ＡＣＴＨ投与によって、副腎中のＩＬ−１８タンパク質レベルが増加したが、ＡＣＴＨ自体の誘導では血漿中のＩＬ−１８タンパク質レベルは上昇しなかった。イムノブロッティングの結果より、副腎中のＩＬ−１８タンパク質は、主に２４ｋＤの不活性化型であり、血漿中のＩＬ−１８タンパク質は、１８ｋＤの活性化型であった。【０２７７】
以上の結果より、固定化ストレスに曝露したマウスにおいて、（１）血漿において活性化型のＩＬ−１８ＨＰＡ軸を介して上方制御されること、（２）副腎において不活性化型（２４ｋＤ）のＩＬ−１８が誘導され、そして切断されて１８ｋＤの活性化型として血中に分泌されること、（３）不活性化型から活性化型への切断が、血漿中のＩＬ−１８の上方制御に関する重要な要因であること、が示された。すなわち、神経系、内分泌系および免疫系の間での相互作用にＩＬ−１８が関与することが示された。【０２７８】
（実施例１１：ストレス負荷時の血漿ＩＬ−１８濃度に対するＮＡＤＰＨオキシダーゼアンタゴニストの効果）
野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）、ＣＹＢＢ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ遺伝子）（−／−）マウス（Ｃ５７／Ｂ６バックグラウンド：オス）を、２７ミリ径のプラスティックチューブ中に６時間拘束した後、麻酔下で心臓採血した。遠心分離を行って血漿を採取し、血漿中のＩＬ−１８濃度をＥＬＩＳＡ法（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｒ＆Ｄ社）を用いて測定した。野生型マウスの１群に対して、ストレス開始１時間後にＤＩＰＨＥＮＹＬＥＮＥＩＯＤＮＩＵＭ（ＤＰＩ：ＮＡＤＰＨオキシダーゼインヒビター）を３０μｇ／匹腹腔内投与してその効果を検討した（図１２）。【０２７９】
血漿中のＩＬ−１８濃度の上昇は、野生型ではＤＰＩ投与によって４００ｐｇ／ｍｌに抑制され、ＣＹＢＢ遺伝子欠損マウスでは３００ｐｇ／ｍｌにとどまった。これらの結果は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼを抑制することによって、ストレス依存的な血漿ＩＬ−１８の上昇を抑制することができることを示す。また、ストレスによる血漿ＩＬ−１８の上昇に関しては、活性酸素のアンタゴニストであるＮＡＤＰＨオキシダーゼアンタゴニストが抑制剤として機能することが示された。
（＊＊；ｐ＜０．００１（ストレスなしのコントロールに対して）、＃；ｐ＜０．０１（ストレス負荷野生型に対して）、ｎ＝９）。【０２８０】
また、同様の実験を静脈内注射によって行ったが、同様の結果を得た（データは示さず）。【０２８１】
（実施例１２：ストレス依存的な血清ＩＬ−６レベル上昇に対する抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果）
野生型マウス（Ｃ５７／Ｂ６：オス）、ＩＬ−１８（−／−）マウス（Ｃ５７／Ｂ６バックグラウンド：オス）を実施例１１と同様の方法で拘束した後、１匹ずつのケージに解放した。解放６時間後に実施例１１と同様の方法で血清を採取して、血清中のＩＬ−６濃度を測定した（図１３）。【０２８２】
ＩＬ−１８（−／−）マウスでは血清中ＩＬ−６の上昇が極めて低レベルであり、ストレス依存的な血清中ＩＬ−６レベルの上昇に対してＩＬ−１８が関与していることが示された。【０２８３】
なお、図中には示していないが、３時間のストレスに起因するＩＬ−６レベルの上昇は、ストレス負荷の１０分前に抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体＋抗β抗体）を２５μｇ／ｋｇ腹腔内投与することによって抑制された。
（＊＊；ｐ＜０．００１、＊；ｐ＜０．０１（ストレスなしの野生型に対して）、＃＃；ｐ＜０．００１、＃；ｐ＜０．０１（同一時間点におけるストレスなしの野生型に対して）、ｎ＝４〜９）。【０２８４】
（実施例１３：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的な血清ＩＬ−１８レベルの上昇）
腎炎および／または関節炎などを自然発症するマウスとして、全身性エリテマトーデスのモデルマウスと広く認知されているＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本チャールス・リバー、１２週）に対して、実施例１１と同様にストレスを負荷した後の血清中ＩＬ−１８レベルを調べた（図１４）。【０２８５】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、ストレス依存的な血清中ＩＬ−１８レベルの上昇が認められた。図には示していないが、この上昇は、野生型マウスと同様に、ＳＯＤ、ＤＰＩ、ｐ３８  ＭＡＰＫインヒビター、カスパーゼ１インヒビター、カスパーゼ１１インヒビターによって抑制された。
（＊＊；ｐ＜０．０１（ストレスなしのコントロールに対して）、ｎ＝６）
（実施例１４：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的な血漿ＩＬ−６レベルの上昇）
実施例１３で用いたＭＲＬ／ｌｐｒマウス（１２週）に３時間のストレスを負荷した後の血漿中ＩＬ−６レベルを調べた。さらに、拘束開始１０分前に種々の抗ＩＬ−１８レセプター抗体を投与して、これらの抗体の効果を調べた。抗ＩＬ−１８レセプター抗体としては、抗α抗体、抗β抗体、およびこれらの混合物を用いた（図１５）。【０２８６】
ストレスに起因して血漿中ＩＬ−６レベルは上昇したが、ストレス負荷の１０分前に抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体＋抗β抗体）を２５μｇ／ｋｇ腹腔内投与することによってこの血漿中ＩＬ−６レベルの上昇は抑制された。抗α抗体または抗β抗体のみの投与によっても抑制されたが、混合物の投与の方が効果的であった。【０２８７】
（実施例１５：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的な尿中アルブミンレベルの上昇に対する抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果）
実施例１３で用いたＭＲＬ／ｌｐｒマウスに（１２週）に対して、隔日で３時間づつのストレス負荷を３週間にわたって行い、ストレス負荷後の一日尿中のアルブミン量を測定した。また、拘束開始１０分前に抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体＋抗β抗体）を２５μｇ／ｋｇ腹腔内投与して抗体の効果を調べた。さらに、抗ＩＬ−６抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社、ＳＣ１２６５）を投与して、その効果を調べた（図１６）。【０２８８】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、ストレス負荷により尿中アルブミン量は上昇しており、抗体投与群の尿中アルブミン量は抑制されていた。抗ＩＬ−１８レセプター抗体投与群のける尿中アルブミン量は、抗ＩＬ−６抗体投与群のものよりも低値であり、これは非ストレス負荷群のレベルと同程度であった。
（＊＊；ｐ＜０．０１、＊；ｐ＜０．０５（ストレスなしのコントロールと比較して）＃＃；ｐ＜０．０１、＃；ｐ＜０．０５（ストレス負荷群に対して）、＋；ｐ＜０．０５（抗ＩＬ−６抗体投与群に対して）、ｎ＝９）。【０２８９】
（実施例１６：疾患モデルマウスにおけるストレス依存的なＢＵＮの上昇に対する抗ＩＬ−１８レセプター抗体の効果）
実施例１５と同様に、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスに（１２週）におけるＢＵＮ（血中尿素窒素）を測定した（図１７）。【０２９０】
ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおいて、ストレス負荷群ではＢＵＮは上昇したが、抗体投与群ではＢＵＮ上昇は抑制された。ストレス負荷の１０分前に抗ＩＬ−１８レセプター抗体（抗α抗体＋抗β抗体）を２５μｇ／ｋｇ腹腔内投与した群におけるＢＵＮは、抗ＩＬ−６抗体投与群のものよりも低値であり、これは非ストレス負荷群のレベルと同程度であった。（＊＊；ｐ＜０．０１、＊；ｐ＜０．０５（ストレスなしのコントロールに対して）、＃＃；ｐ＜０．０１、＃；ｐ＜０．０５（ストレス負荷群に対して）、＋；ｐ＜０．０５（抗ＩＬ−６抗体投与群に対して）、ｎ＝９）。【０２９１】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０２９２】
本発明に係る薬学的組成物は、皮膚の表皮細胞の異常角化を正常化する角化改善剤として使用できる。また、本発明に係る薬学的組成物は、紫外線による表皮肥厚に対する顕著な抑制作用によって皮膚の正常な機能を回復させることができる。さらに、本発明に係る薬学的組成物は、ケラチノサイトの異常増殖を抑制して分化を促進することによって、表皮肥厚を抑制して皮膚癌を予防および／または処置することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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