(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
αｖβ６に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
（ａ）重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３であって、該重鎖ＣＤＲ１は、配列番号３に示すアミノ酸配列を含み、該重鎖ＣＤＲ２は、配列番号６に示すアミノ酸配列を含み、そして、該重鎖ＣＤＲ３は、配列番号９に示すアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３；ならびに
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３であって、該軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１４に示すアミノ酸配列を含み、そして、該軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１８に示すアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３
を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
αｖβ６に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
（ａ）重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３であって、該重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１に示すアミノ酸配列を含み、該重鎖ＣＤＲ２は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含み、そして、該重鎖ＣＤＲ３は、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３；ならびに
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３であって、該軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含み、そして、該軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１５に示すアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３
を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
αｖβ６に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体は、以下：
（ａ）重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３であって、該重鎖ＣＤＲ１は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、該重鎖ＣＤＲ２は、配列番号４６に示すアミノ酸配列を含み、そして、該重鎖ＣＤＲ３は、配列番号４７に示すアミノ酸配列を含む、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３；ならびに
（ｂ）軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３であって、該軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号４８に示すアミノ酸配列を含み、該軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１３に示すアミノ酸配列を含み、そして、該軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１６に示すアミノ酸配列を含む、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３
を含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
（ｉ）αｖβ６に特異的に結合し；（ｉｉ）αｖβ６への結合について６．８Ｇ６（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３６４５）と競合し；そして、（ｉｉｉ）重鎖のＣＤＲ３内にＦＸＹモチーフを含む、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）へのαｖβ６の結合を、１０Ｄ５のＩＣ５０値未満のＩＣ５０値で阻害する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
αｖβ６に特異的に結合する抗体であって、
（ｉ）ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４７を有するハイブリドーマ６．１Ａ８、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４９を有するハイブリドーマ６．３Ｇ９、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４５を有するハイブリドーマ６．８Ｇ６、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４６を有するハイブリドーマ６．２Ｂ１、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９８を有するハイブリドーマ７．１Ｇ１０、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９９を有するハイブリドーマ７．７Ｇ５、および、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３９００を有するハイブリドーマ７．１Ｃ５からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される抗体のヒト化形態であり；そして、
（ｉｉ）ハイブリドーマ６．１Ａ８、ハイブリドーマ６．３Ｇ９、ハイブリドーマ６．８Ｇ６、ハイブリドーマ６．２Ｂ１、ハイブリドーマ７．１Ｇ１０、ハイブリドーマ７．７Ｇ５、および、ハイブリドーマ７．１Ｃ５からなる群から選択されるハイブリドーマによって産生される抗体のグリコシル化部位であるアミノ酸残基に変異を含み、その結果、該グリコシル化部位が除去されている、
抗体。
【請求項６】
請求項５に記載の抗体であって、
（ｉ）ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４９を有するハイブリドーマ６．３Ｇ９によって産生される抗体のヒト化形態であり；そして、
（ｉｉ）ハイブリドーマ６．３Ｇ９によって産生される抗体のグリコシル化部位であるアミノ酸残基に変異を含み、その結果、該グリコシル化部位が除去されている、
抗体。
【請求項７】
細胞傷害性薬剤、放射性化合物、または抗癌剤に結合体化される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
ポリエチレングリコールに結合体化される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
蛍光部分に結合体化される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒトにおいてにαｖβ６よって媒介される疾患を予防または処置するための組成物であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１１】
前記疾患が線維症である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記線維症が肺線維症である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記疾患が急性肺傷害である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記疾患が癌である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記癌が、口腔癌、皮膚癌、頸部癌、卵巣癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌または結腸直腸癌である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒト被験体由来の組織サンプルにおいてαｖβ６をインビトロ検出する方法であって、該組織サンプルを、請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体と接触させる工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子生物学の分野に関し、詳細には、αｖβ６インテグリンに対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インテグリンは、細胞間接着および細胞−マトリクス接着を媒介する、細胞表面レセプターのスーパーファミリーである。これらのタンパク質は、足場、ならびに発生および組織修復の間の細胞の増殖、移動および分化のためのシグナルを提供することが公知である。インテグリンはまた、細胞の分化および侵入（特に、細胞がその特化された形態を失い、転移癌細胞となる場合）に関与している。
【０００３】
インテグリンは、非共有結合的に連結された２つのサブユニット（αおよびβ）から構成される、ヘテロダイマータンパク質である。インテグリンの結合特異性は、およそ１８の異なるα鎖と、およそ８の異なるβ鎖との組み合わせによって支配される。αｖβ６インテグリンは、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、および近年同定された潜伏関連ペプチド「ＬＡＰ」（前駆体ＴＧＦ−βタンパク質の一部として合成される、２７８アミノ酸のペプチド（非特許文献１）を含め、多数のリガンドに結合し得る。ＬＡＰは、分泌の間に、成熟形態のＴＧＦ−βからＮ末端ペプチドとして切断されるが、ＴＧＦ−βと非共有結合的に会合したままであり、その潜在的状態を維持する。この複合体は、ＴＧＦ−βレセプターに結合できず、それゆえ、生物学的に活性ではない。αｖβ６インテグリンは、ＬＡＰ内に含まれるＲＧＤモチーフに直接的に結合して、ＬＡＰの遊離およびＴＧＦ−βの活性化をもたらし得る。ＬＡＰに対するαｖβ６の結合は、ＴＧＦ−βのその活性状態への変換に重要であり得るので、この結合をブロックすることは、ＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化および関連の線維性病状の阻害をもたらし得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｕｎｇｅｒら，Ｃｅｌｌ  ９６（３）：３１９−３２８（１９９９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、例えば、以下を提供する：
（項目１）
モノクローナル抗体であって、（ａ）αｖβ６に特異的に結合し；かつ（ｂ）潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）へのαｖβ６の結合を、１０Ｄ５のＩＣ５０値未満のＩＣ５０値で阻害する、抗体。
（項目２）
前記抗体が、ハイブリドーマ６．１Ａ８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４７）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体が、ハイブリドーマ６．３Ｇ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４９）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体が、ハイブリドーマ６．８Ｇ６（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４５）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
前記抗体が、ハイブリドーマ６．２Ｂ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４６）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記抗体が、ハイブリドーマ７．１Ｇ１０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９８）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体が、ハイブリドーマ７．７Ｇ５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９９）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目８）
前記抗体が、ハイブリドーマ７．１Ｃ５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３９００）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目１に記載の抗体。
（項目９）
前記抗体とαｖβ６との間での結合が、二価カチオン依存性である、項目１に記載の抗体。
（項目１０）
前記二価カチオンが、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋である、項目９に記載の抗体。
（項目１１）
前記抗体とαｖβ６との間での結合が、二価カチオン非依存性である、項目１に記載の抗体。
（項目１２）
抗αｖβ６抗体であって、重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ、配列番号１、４および７の配列から本質的になり、そして軽鎖ＣＤＲが、必要に応じて、それぞれ、配列番号１０、１３および１５の配列から本質的になる、抗αｖβ６抗体。
（項目１３）
抗αｖβ６抗体であって、重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ、配列番号３、５および８の配列から本質的になり、そして軽鎖ＣＤＲが、必要に応じて、それぞれ、配列番号１１、１４および１７の配列から本質的になる、抗αｖβ６抗体。
（項目１４）
抗αｖβ６抗体であって、重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ、配列番号３、６および９の配列から本質的になり、そして軽鎖ＣＤＲが、必要に応じて、それぞれ、配列番号１２、１４および１８の配列から本質的になる、抗αｖβ６抗体。
（項目１５）
抗αｖβ６抗体であって、重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ、配列番号２、４６および４７の配列から本質的になり、そして軽鎖ＣＤＲが、必要に応じて、それぞれ、配列番号４８、１３および１６の配列から本質的になる、抗αｖβ６抗体。
（項目１６）
抗αｖβ６抗体であって、重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ、配列番号４９、５１および５３の配列から本質的になり、そして軽鎖ＣＤＲが、必要に応じて、それぞれ、配列番号５５、５７および５９の配列から本質的になる、抗αｖβ６抗体。
（項目１７）
抗αｖβ６抗体であって、重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ、配列番号５０、５２および５４の配列から本質的になり、そして軽鎖ＣＤＲが、必要に応じて、それぞれ、配列番号５６、５８および６０の配列から本質的になる、抗αｖβ６抗体。
（項目１８）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号１９〜３６および６１〜６２のいずれか１つの重鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目１９）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号１９の重鎖可変ドメイン配列および配列番号３７の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２０）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号２０または２１の重鎖可変ドメイン配列および配列番号３８の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２１）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号２２の重鎖可変ドメイン配列および配列番号４３の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２２）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号２３の重鎖可変ドメイン配列および配列番号４４の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２３）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号２４の重鎖可変ドメイン配列および配列番号４５の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２４）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号２５または２６の重鎖可変ドメイン配列および配列番号４２の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２５）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号２７、２８または２９の重鎖可変ドメイン配列および配列番号３９の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２６）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号３４または３５の重鎖可変ドメイン配列および配列番号４０の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２７）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号３６の重鎖可変ドメイン配列および配列番号４１の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２８）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号６１の重鎖可変ドメイン配列および配列番号６３の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目２９）
抗αｖβ６抗体であって、配列番号６２の重鎖可変ドメイン配列および配列番号６４の軽鎖可変ドメイン配列を含む、抗体。
（項目３０）
モノクローナル抗体であって、αｖβ６に特異的に結合するが、潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）へのαｖβ６の結合を阻害しない、抗体。
（項目３１）
前記抗体が、ハイブリドーマ６．２Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９６）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目３０に記載の抗体。
（項目３２）
前記抗体が、ハイブリドーマ６．２Ｅ５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９７）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、項目３０に記載の抗体。
（項目３３）
哺乳動物においてαｖβ６によって媒介される疾患を予防または処置するための組成物であって、項目１〜３２のいずれか１項に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
（項目３４）
前記抗体が、細胞傷害性薬剤に結合されている、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記抗体が、カチオン依存性抗体である、項目３３に記載の組成物。
（項目３６）
αｖβ６によって媒介される疾患を有するかまたは該疾患を有する危険性がある被験体を処置するための方法であって、該被験体に、項目３２に記載の組成物を投与し、それによって、該疾患を緩和するかまたは該疾患の発症を延期する工程を包含する、方法。
（項目３７）
前記被験体がヒトである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記疾患が、線維症である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
前記線維症が、強皮症、瘢痕、肝臓線維症、腎臓線維症、または肺線維症である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記疾患が、乾癬である、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
前記疾患が、癌である、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記癌が、上皮癌である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記癌が、口腔癌、皮膚癌、頸部癌、卵巣癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、または結腸直腸癌である、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記疾患が、アルポート症候群である、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
哺乳動物由来の組織サンプル中のαｖβ６を検出する方法であって、該組織サンプルを、項目１または３０に記載の抗体と接触させる工程を包含する、方法。
（項目４６）
前記抗体が、６．２Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ  ３８９６）および６．２Ｅ５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ  ３８９７）からなる群より選択される、項目４５に記載の方法。（項目４７）
ハイブリドーマ６．１Ａ８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４７）の細胞。
（項目４８）
ハイブリドーマ６．２Ｂ１０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４８）の細胞。
（項目４９）
ハイブリドーマ６．３Ｇ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４９）の細胞。
（項目５０）
ハイブリドーマ６．８Ｇ６（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４５）の細胞。
（項目５１）
ハイブリドーマ６．２Ｂ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４６）の細胞。
（項目５２）
ハイブリドーマ６．２Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９６）の細胞
（項目５３）
ハイブリドーマ６．２Ｅ５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９７）の細胞。
（項目５４）
ハイブリドーマ７．１  Ｇ１０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９８）の細胞。
（項目５５）
ハイブリドーマ７．７Ｇ５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３８９９）の細胞。
（項目５６）
ハイブリドーマ７．１  Ｃ５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３９００）の細胞。
（項目５７）
単離された核酸であって、配列番号１９〜４５および６１〜６４のいずれか１つについてのコード配列を含む、核酸。
（項目５８）
単離されたポリペプチドであって、配列番号１９〜４５および６１〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
（項目５９）
モノクローナル抗体であって、ハイブリドーマ６．２Ｂ１０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３６４８）によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む、抗体。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の抗αｖβ６モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）が、β６でトランスフェクトされたＦＤＣ−Ｐ１細胞（コントロールとして、トランスフェクトされていない細胞）に結合する能力を決定した、細胞捕捉アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々の抗αｖβ６モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）が、β６でトランスフェクトされたＦＤＣ−Ｐ１細胞（コントロールとして、トランスフェクトされていない細胞）に結合する能力を決定した、細胞捕捉アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、種々の精製抗αｖβ６「融合体６」モノクローナル抗体が可溶性組換えヒトαｖβ６（「ｈｓαｖβ６」）に結合する能力を決定した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。これらの抗体を、β６−／−マウスを可溶性ヒト短縮型αｖβ６で免疫することによって作製した。凡例における数字は、クローン番号を示す。対応するクローン名に関しては、表２を参照のこと。
【図２Ｂ】図２Ｂは、種々の精製抗αｖβ６「融合体７」モノクローナル抗体が可溶性組換えｈｓαｖβ６に結合する能力を決定した、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。これらの抗体を、β６−／−マウスをβ６でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞で免疫することによって作製した（融合体番号７）。
【図３】図３Ａ〜図３Ｆは、ｈｓαｖβ６への種々の抗αｖβ６モノクローナル抗体の結合の異なるカチオン依存性を示すグラフである。
【図４Ａ】図４Ａは、融合体番号６のモノクローナル抗体が、それぞれ、ＬＡＰへのビオチン−ｈｓαｖβ６の結合を阻害することを示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、融合体番号７のモノクローナル抗体が、それぞれ、ＬＡＰへのビオチン−ｈｓαｖβ６の結合を阻害することを示すグラフである。
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｂは、本発明の例示的なモノクローナル抗体が、ＬＡＰへのβ６でトランスフェクトしたＦＤＣ−Ｐ１細胞の結合を阻害することを示すグラフである。図５Ａおよび図５Ｂは、融合体番号６の抗体からの結果を提示する。
【図５Ｃ−５Ｄ】図５Ｃ〜図５Ｄは、本発明の例示的なモノクローナル抗体が、ＬＡＰへのβ６でトランスフェクトしたＦＤＣ−Ｐ１細胞の結合を阻害することを示すグラフである。図５Ｃ〜図５Ｄは、融合体番号７の抗体からの結果を提示する。
【図５Ｅ】図５Ｅは、本発明の例示的なモノクローナル抗体が、ＬＡＰへのβ６でトランスフェクトしたＦＤＣ−Ｐ１細胞の結合を阻害することを示すグラフである。図５Ｅは、融合体番号７の抗体からの結果を提示する。
【図６Ａ】図６Ａは、融合体番号６の抗体が、ＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化を阻害することを、ＴＧＦ−β活性化をモニタリングするためにＰＡＩ−１ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、融合体番号７の抗体が、ＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化を阻害することを、ＴＧＦ−β活性化をモニタリングするためにＰＡＩ−１ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いて示すグラフである。
【図７Ａ】図７Ａは、αｖβ６モノクローナル抗体６．１Ａ８、６．８Ｇ６（サブクローンＡおよびＢ）、７．７Ｇ５、６．２Ｂ１、６．３Ｇ９、６．２Ｂ１０（サブクローンＡおよびＢ）、６．２Ｇ２、６．２Ａ１、６．４Ｂ４（サブクローンＡ、ＢおよびＣ）、７．１０Ｈ２、７．９Ｈ５、７．４Ａ３（サブクローンＡおよびＢ）、７．１Ｃ５（サブクローンＡおよびＢ）および７．１Ｇ１０の重鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を示す。抗体６．１Ａ８、６．８Ｇ６および７．７Ｇ５は、αｖβ６への結合においてカチオン依存性であり、一方、抗体６．２Ｂ１、６．２Ａ１、６．３Ｇ９、６．２Ｂ１０、６．４Ｂ４、７．１Ｃ５および７．１Ｇ１０は、カチオン非依存性である（上記）。カッコ内の数字は、アミノ酸残基の位置を示す。ＣＤＲは、大きな四角内にあり、一方、斜体のアミノ酸を含む小さな四角は、特定の抗体の異なるクローンにおける多型を表す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、αｖβ６モノクローナル抗体６．１Ａ８、６．８Ｇ６、６．４Ｂ４、６．２Ａ１、７．１Ｃ５、７．１Ｇ１０、６．２Ｂ１０、７．７Ｇ５、６．２Ｂ１および６．３Ｇ９の軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、ヒト乳癌およびヒト扁平上皮癌の組織切片における、αｖβ６の発現を示す散乱プロットである。正常なヒト組織は、ほんの無視し得る発現レベルのαｖβ６を示す。
【図９】図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれ、２つの抗αｖβ６抗体である６．８Ｇ６および６．３Ｇ９の、可溶性αｖβ６に関する溶液結合親和性を示す二次曲線グラフである。
【図１０】図１０Ａおよび図１０Ｂは、精製されたモノクローナル抗体が、αｖβ６への結合に関してそれぞれビオチン化６．３Ｇ９およびビオチン化６．８Ｇ６と競合する能力を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、抗αｖβ６  ｍＡｂ処置を用いて処置したＵＵＯ動物由来の腎臓における平滑筋（ｓｍｏｏｔｈ）アクチン染色のパーセントを示す、棒グラフである。
【図１２】図１２は、ＦＡＣＳ分析（図の右側）による腫瘍細胞株におけるαｖβ６発現およびｍＡｂ  ６．３Ｇ９および６．４Ｂ４によるＬＡＰリガンドへの腫瘍細胞株の結合の阻害（図の左側）を示す。
【図１３】図１３は、抗αｖβ６  ｍａｂ  ６．３Ｇ９、６．８Ｇ６および６．４Ｂ４によるＬＡＰリガンドへの３つの腫瘍細胞株の結合の阻害を実証する棒グラフである。ｍＡｂの結合を、試験ｍＡｂを添加しない総結合（ＴＢ）およびＢＳＡコントロールのみへの非特異的結合（ＮＳＢ）に対して比較した。
【図１４Ａ】図１４Ａは、皮下に移植されたＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞からの生じた腫瘍に対する、抗αｖβ６  ｍＡｂ  ６．３Ｇ９の効果を３３日間の研究期間にわたって示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、皮下に移植されたＤｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞からの生じた腫瘍に対する、抗αｖβ６  ｍＡｂ  ６．４Ｂ４の効果を３３日間の研究期間にわたって示すグラフである。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ブレオマイシン誘発性肺線維症に対する抗αｖβ６  ｍＡｂの効果を示すグラフである。（Ａ）６．３Ｇ９  ｍＡｂを用いた抗体処置を、ブレオマイシン投与時の０日目に開始し、そして３０日間の期間にわたってモニタリングした。図１５Ａにおいて、左側の棒グラフはμｇ  ヒドロキシプロリン／肺を表し、一方、右側の棒グラフは、生理食塩水で処置したマウス（ブレオマイシンなし）よりも高い、ヒドロキシプロリンの増加％を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ブレオマイシン誘発性肺線維症に対する抗αｖβ６  ｍＡｂの効果を示すグラフである。（Ｂ）６．３Ｇ９  ｍＡｂを用いた抗体処置を、ブレオマイシン処置１５日後に開始し、そして３０日間の期間にわたってモニタリングした。図１５Ｂにおいて、左側の棒グラフはμｇ  ヒドロキシプロリン／肺を表し、一方、右側の棒グラフは、生理食塩水で処置したマウス（ブレオマイシンなし）よりも高い、ヒドロキシプロリンの増加％を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ブレオマイシン誘発性肺線維症に対する抗αｖβ６  ｍＡｂの効果を示すグラフである。（Ｃ）６．３Ｇ９  ｍＡｂ、６．８Ｇ６  ｍＡｂおよび６．４Ｂ４  ｍＡｂを用いた抗体処置を、ブレオマイシン処置１５日後に開始し、そして６０日間という長期間にわたってモニタリングした。図１５Ｃでは、このグラフは、肺あたりのヒドロキシプロリン含有量を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、αｖβ６に対する高親和性抗体の知見および特徴付け（このような抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）における重要なアミノ酸残基の同定および分析を含む）に基づく。
本発明は、モノクローナル抗体を包含し、このモノクローナル抗体は、（ａ）αｖβ６に特異的に結合し；（ｂ）そのリガンド（例えば、ＬＡＰ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびテネイシン）へのαｖβ６の結合を、１０Ｄ５（国際特許出願公開ＷＯ  ９９／０７４０５）のＩＣ５０値未満のＩＣ５０値で阻害し；（ｃ）ＴＧＦ−βの活性化をブロックし；（ｄ）αｖβ６への結合特異性を提供する、ＣＤＲ中の特定のアミノ酸配列（例えば、図７Ａおよび図７Ｂに示されるアミノ酸配列）を含み；（ｅ）β６サブユニットに特異的に結合し；そして／または（ｆ）免疫染色手順（例えば、パラフィン包埋組織の免疫染色）においてαｖβ６を認識する。
【０００８】
αｖβ６に結合する抗体が、生物物理学的に別々のクラスおよびサブクラスに分類され得ることが見出された。１つのクラスの抗体は、αｖβ６へのリガンド（例えば、ＬＡＰ）の結合をブロックする能力を示す（ブロッカー）。このクラスの抗体は、カチオン依存性ブロッカーおよびカチオン非依存性ブロッカーのサブクラスにさらに細分され得る。カチオン依存性ブロッカーのいくつかは、アルギニン−グリシン−アスパルテート（ＲＧＤ）ペプチド配列を含むのに対して、カチオン非依存性ブロッカーは、ＲＧＤ配列を含まない。別のクラスの抗体は、αｖβ６に結合する能力を示すが、リガンドへのαｖβ６の結合をブロックしない（非ブロッカー）。
【０００９】
従って、本発明のいくつかの実施形態では、本発明の一部の抗体は、αｖβ６への結合に関して二価カチオン依存性であり、一方、他の抗体は、二価カチオン非依存性である。例示的なカチオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、この抗体は、ハイブリドーマ６．１Ａ８、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、６．２Ｂ１、６．２Ｂ１０、６．２Ａ１、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５、または７．１Ｃ５によって産生される抗体と同じ重鎖ポリペプチド配列および軽鎖ポリペプチド配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、この抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３が、それぞれ、配列番号１、４および７の配列から本質的に（すなわち、いくつかの保存的バリエーションを除いて）なる重鎖、ならびに／またはＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号１０、１３および１５の配列から本質的になる軽鎖を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、この抗体は、ＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号３、５および８の配列から本質的になる重鎖、ならびに／またはＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号１１、１４および１７の配列から本質的になる軽鎖を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、この抗体は、ＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号３、６および９の配列から本質的になる重鎖、ならびに／またはＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号１２、１４および１８の配列から本質的になる軽鎖を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、この抗体は、ＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号２、４６および４７の配列から本質的になる重鎖、ならびに／またはＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号４８、１３および１６の配列から本質的になる軽鎖を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この抗体は、ＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号４９、５１および５３の配列から本質的になる重鎖、ならびに／またはＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号５５、５７および５９の配列から本質的になる軽鎖を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、この抗体は、ＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号５０、５２および５４の配列から本質的になる重鎖、ならびに／またはＣＤＲ１、２および３が、それぞれ、配列番号５６、５８および６０の配列から本質的になる軽鎖を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この抗体は、配列番号１９〜３６および６１〜６２のうちのいずれか１つの重鎖可変ドメイン配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、この抗体は、それぞれ、以下の重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む：
（１）配列番号１９および３７；
（２）配列番号２０または２１、および配列番号３８；
（３）配列番号２２および４３；
（４）配列番号２３および４４；
（５）配列番号２４および４５；
（６）配列番号２５または２６、および配列番号４２；
（７）配列番号２７、２８、または２９、および配列番号３９；
（８）配列番号３４または３５、および配列番号４０；
（９）配列番号３６および４１；
（１０）配列番号６１および６３；あるいは
（１１）配列番号６２および６４。
【００１９】
いくつかの実施形態では、この抗体は、αｖβ６に特異的に結合するが、潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）へのαｖβ６の結合を阻害しない。これらの抗体のうちの少なくともいくつかは、パラフィン包埋組織切片においてαｖβ６に結合し得、それゆえ、診断目的に使用され得る。例示的な抗体としては、６．２Ａ１および６．２Ｅ５が挙げられる。
【００２０】
本発明はまた、上記の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する抗体を包含する。
【００２１】
本発明はまた、本発明の１以上の抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を包含する。これらの組成物のうちのいくつかでは、これらの抗体は、細胞傷害性薬剤（すなわち、細胞の生存力および／または機能を損なう薬剤）（例えば、毒素または放射性核種）へと結合体化される。これらの組成物におけるこれらの抗体は、カチオン依存性抗体であり得る。これらの組成物は、αｖβ６によって媒介される疾患を処置する（例えば、緩和する、軽減する、低減する、予防する、発症を延期する）ために、この疾患を有するかまたはこの疾患を有する危険性がある被験体（例えば、ヒトのような哺乳動物）へと投与され得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：線維症（例えば、強皮症、瘢痕（ｓｃａｒｒｉｎｇ）、肝臓線維症、肺線維症、および腎臓線維症）；乾癬；癌（例えば、上皮癌；口腔癌、皮膚癌、頸部癌、卵巣癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、肺癌、乳癌、腎臓癌、または結腸直腸癌）；アルポート症候群；肺、肝臓、腎臓および他の内部器官の急性傷害および慢性傷害；ならびに肺、肝臓、腎臓および他の内部器官の硬化症。このような疾患を有する危険性は、遺伝的素因；特定のライフスタイル（例えば、喫煙およびアルコール中毒）；環境汚染物質（例えば、石綿）への曝露；生理学的状態（例えば、糖尿病、肝炎ウイルス感染（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス感染）、自己免疫疾患）；ならびに医療処置（例えば、放射線治療）から生じ得る。
【００２２】
本発明はまた、哺乳動物（例えば、ヒト）由来の組織サンプル中のαｖβ６を検出する方法であって、この組織サンプルを、本発明の抗体（例えば、６．２Ａ１および６．２Ｅ５）と接触させる工程を包含する方法を包含する。
【００２３】
本発明はまた、ハイブリドーマ６．１Ａ８、６．２Ｂ１０、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、６．２Ｂ１、６．２Ａ１、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５、および７．１Ｃ５の細胞；配列番号１９〜４５および６１〜６４のうちのいずれか１つについてのコード配列を含む、単離された核酸；配列番号１９〜４５および６１〜６４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドを包含する。
【００２４】
本発明の抗体とは、完全な抗体（例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体）、または完全な抗体の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントまたはＦ（ｖ）フラグメント）をいう。本発明の抗体は、マウス抗体もしくはそのホモログ、または完全ヒト抗体であり得る。本発明の抗体はまた、ヒト化抗体、キメラ抗体または単鎖抗体であり得る。本発明の抗体は、任意のアイソタイプおよびサブタイプの抗体（例えば、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ）であり得、ここで、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型またはλ型の軽鎖であり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、抗体のエフェクター機能（例えば、抗体がＦｃレセプターまたは補体因子に結合する能力）が、抗体の抗原結合能力に影響を与えないように変更されるように、変異（例えば、欠失、置換または付加）を、重鎖における特定の位置の１以上（例えば、２、３、４、５、または６）において含み得る。他の実施形態では、本発明の抗体は、グリコシル化部位が除去されるように、変異を、グリコシル化部位であるアミノ酸残基において含み得る。このような抗体は、その抗原結合親和性を保持しながら、臨床的に有利な低下したエフェクター機能または他の所望でない機能を有し得る。グリコシル化部位の変異もまた、プロセスの開発（例えば、タンパク質の発現および精製）に有利であり得る。なお他の実施形態では、重鎖または軽鎖は、親和性または効力を増大させる変異を含み得る。
【００２６】
融合体番号６および融合体番号７のハイブリドーマのうちのいくつかを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １５４９，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１０８，ＵＳＡ）に、ブダペスト条約の下で寄託した。ハイブリドーマクローン６．１Ａ８、６．２Ｂ１０、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、および６．２Ｂ１を、２００１年８月１６日に寄託した。そしてこれらはそれぞれ、登録番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６４７、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６４８、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６４９、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６４５、およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３６４６を有する。ハイブリドーマクローン６．２Ａ１、６．２Ｅ５、７．１Ｇ１０、７．７Ｇ５、および７．１Ｃ５を、２００１年１２月５日に寄託した。そしてこれらは、それぞれ、登録番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３８９６、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３８９７、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３８９８、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３８９９、およびＡＴＣＣ  ＰＴＡ−３９００を有する。以下の表１を参照のこと。
【００２７】
本発明の抗体は、αｖβ６のそのリガンド（例えば、ＬＡＰおよびフィブロネクチン）へのαｖβ６の結合によって媒介される任意の臨床的に望ましくない状態または疾患（本明細書中で考察される通り）を処置するために有用である。これらの抗体は、より高い親和性またはアビディティ、ならびにリガンドへの結合のカチオン依存性またはカチオン非依存性を介して、これまでに公知のαｖβ６抗体よりも、強力であり得る。
【００２８】
本発明の抗体（特に、ブロッカー）の治療適用に加えて、非ブロッカークラスの抗体は、（例えば、抗原捕捉アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学などにおいて）診断目的に用いられ得る。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかである。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インテグリンαｖβ６に特異的であるクラスおよびサブクラスの抗体を特徴とする。少なくとも１つのクラスの抗体（ブロッカー）は、ＬＡＰに対するαｖβ６の結合をブロックし得るか、またはＴＧＦ−βの活性化を防止し得る。
【００３１】
以下は、本発明の抗体を作製する種々の方法を記載する。当該分野で公知であるが本明細書中に具体的に記載されない方法もまた、本発明の範囲内にある。例えば、本発明の抗体はまた、ファージディスプレイ抗体ライブラリー（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−７（１９８５）；米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，７３３，７４３号、同第６，２９１，６５０号、および同第６，３０３，３１３号に記載されるライブラリー）を用いて同定され得る。本発明のさらなる抗体は、本明細書中で同定される重鎖を、非コグネイト軽鎖（例えば、ファージディスプレイ技術によって同定される軽鎖）とカップリングすることにより作製され得る。
【００３２】
（非ヒトハイブリドーマ抗体）
本発明のモノクローナル抗体は、周知のハイブリドーマ技術によって生成され得る。こそのためには、β６−／−動物（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）を、精製または粗製のαｖβ６調製物、αｖ、β６または両方の抗原をコードするｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトした細胞、αｖβ６を構成的に発現する細胞などで免疫する。この抗原は、精製タンパク質、細胞上に発現されたタンパク質、タンパク質フラグメントもしくはそのペプチド、またはこのタンパク質、タンパク質フラグメントもしくはペプチドをコードする、裸のＤＮＡもしくはウイルスベクターとして送達され得る。次いで、免疫された動物の血清が、抗αｖβ６抗体の存在に関して試験される。Ｂ細胞は、試験してポジティブである動物から単離され、そしてハイブリドーマが、これらのＢ細胞を用いて作製される。
【００３３】
これらのハイブリドーマによって分泌される抗体は、αｖβ６に特異的に結合する（例えば、β６でトランスフェクトした細胞への結合であって、トランスフェクトしていない親細胞へは結合しない）能力に関して、そして任意の他の所望の特徴（例えば、所望のＣＤＲコンセンサス配列を有すること、ＬＡＰとαｖβ６との間の結合を、公知の抗αｖβ６抗体１ＯＤ５のＩＣ５０値よりも低いＩＣ５０値にて阻害すること（または非ブロッカーの場合、阻害しないこと）、またはＴＧＦ−βの活性化を阻害すること）に関して、スクリーニングされる。
【００３４】
スクリーニングアッセイにおいて試験してポジティブであるハイブリドーマ細胞は、栄養培地中で、これらの細胞がモノクローナル抗体を培養培地中に分泌するのを可能にする条件下で培養される。次いで、馴化ハイブリドーマ培養上清が収集され、そして上清中に含まれる抗体が精製される。あるいは、所望の抗体は、これらのハイブリドーマ細胞を、免疫していない動物（例えば、マウス）の腹膜腔内に注射することにより生成され得る。これらのハイブリドーマ細胞は、腹膜腔中で増殖し、抗体を分泌し、これらの抗体は、腹水として蓄積する。次いで、この抗体は、腹水を腹膜腔からシリンジで採取することによって収集され得る。
【００３５】
これらのモノクローナル抗体はまた、抗体をコードするｃＤＮＡを、所望のハイブリドーマから単離し、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）をこのｃＤＮＡでトランスフェクトし、トランスフェクトされた宿主細胞を培養し、そして抗体を培養培地から回収することによって生成され得る。
【００３６】
（キメラ抗体）
本発明のモノクローナル抗体はまた、コグネイトハイブリドーマ（例えば、マウス、ラットまたはウサギ）抗体を操作することによって作製され得る。例えば、コグネイト抗体は、重鎖および／または軽鎖のヒンジ領域および／または定常領域の一部または全体が、別の種（例えば、ヒト）由来の抗体の対応する成分で置換されることを意図して、組換えＤＮＡ技術によって改変され得る。一般に、操作された抗体の可変ドメインは、コグネイト抗体の可変ドメインに対して同一のままであるかまたは実質的に同一のままである。このような操作された抗体は、キメラ抗体と呼ばれ、そしてヒンジ領域および／または定常領域を誘導した種（例えば、ヒト）の個体に投与された場合、コグネイト抗体よりも抗原性が低い。キメラ抗体を作製する方法は、当該分野で周知である。
【００３７】
本発明に包含されるキメラ抗体は、配列番号１９〜３６のいずれか１つに対して同一である（または実質的に同一である）配列を有する重鎖可変ドメインおよび／または配列番号３７〜４５のいずれか１つに対して同一である（または実質的に同一である）配列を有する軽鎖可変ドメインを含み得る。
【００３８】
好ましいヒト定常領域としては、ＩｇＧ１由来の定常領域およびＩｇＧ４由来の定常領域が挙げられる。
【００３９】
（完全ヒト抗体）
本発明のモノクローナル抗体としてはまた、完全ヒト抗体が挙げられる。これらは、Ｂｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５（１９９１）によって記載されたように、インビトロで初回免疫されたヒト脾細胞を用いて、または例えば、米国特許第６，３００，０６４号に記載されたように、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを用いて、調製され得る。
【００４０】
完全ヒト抗体を産生するための他のいくつかの方法は、不活化した内因性Ｉｇ遺伝子座を有し、かつ、再配置されていないヒト抗体重鎖遺伝子およびヒト抗体軽鎖遺伝子についてトランスジェニックである非ヒト動物の使用を含む。このようなトランスジェニック動物は、αｖβ６を用いて免疫され得、次いでハイブリドーマが、これらに由来するＢ細胞から作製される。これらの方法は、例えば、以下に記載される：ヒトＩｇミニ遺伝子座を含むトランスジェニックマウスに関するＧｅｎＰｈａｒｍ／Ｍｅｄａｒｅｘ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）の種々の刊行物／特許（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ米国特許第５，７８９，６５０号）；ＸＥＮＯＭＩＣＥに関するＡｂｇｅｎｉｘ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の種々の刊行物／特許（例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ米国特許第６，０７５，１８１号、同第６，１５０，５８４号および同第６，１６２，９６３号；Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）；およびＭｅｎｄｅｚら，１５（２）：１４６−５６（１９９７））；ならびに「トランソミック（ｔｒａｎｓｏｍｉｃ）」マウスに関するキリン（日本）の種々の刊行物／特許（例えば、ＥＰ  ８４３  ９６１、およびＴｏｍｉｚｕｋａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６：１３３−１４４３（１９９７））。
【００４１】
（ヒト化抗体）
本発明のモノクローナル抗体はまた、他の種由来のコグネイト抗αｖβ６抗体のヒト化版を包含する。ヒト化抗体は、抗原結合に必要ではないヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸（例えば、定常領域および可変ドメインのフレームワーク領域）の一部または全てが、コグネイトの非ヒト抗体の軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸について置換されている、組換えＤＮＡ技術によって生成される抗体である。例えば、所定の抗原に対するマウス抗体のヒト化版は、その重鎖および軽鎖の両方に、以下を有する：（１）ヒト抗体の定常領域；（２）ヒト抗体の可変ドメイン由来のフレームワーク領域；および（３）マウス抗体由来のＣＤＲ。必要な場合、ヒトフレームワーク領域における１以上の残基は、その抗原に対するヒト化抗体の結合親和性を保存するために、マウス抗体中の対応する位置における残基へと変更され得る。この変更は、時々、「復帰変異」と呼ばれる。ヒト化抗体は一般に、キメラヒト抗体と比較して、ヒトにおいて免疫応答を惹起する可能性がより低い。なぜなら、前者は、かなりより少ない非ヒト成分を含むからである。
【００４２】
ヒト化抗体を作製する方法は、例えば、以下に記載される：Ｗｉｎｔｅｒ  ＥＰ  ２３９  ４００；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９（１９８９）；米国特許第６，１８０，３７０号；およびＯｒｌａｎｄｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３８３３（１９８９）。一般に、ヒト抗体へのマウス（または他の非ヒト）ＣＤＲの移植は、以下の通りに達成される。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡは、ハイブリドーマから単離される。ＣＤＲを含め、可変ドメインのＤＮＡ配列は、配列決定により決定される。ＣＤＲをコードするＤＮＡは、ヒト抗体重鎖可変ドメインコード配列またはヒト抗体軽鎖可変ドメインコード配列の対応領域に、部位特異的変異誘発により移入される。次いで、所望のアイソタイプ（例えば、ＣＨについてのγ１およびＣＬについてのｋ）のヒト定常領域の遺伝子セグメントが付加される。このヒト化重鎖遺伝子およびヒト化軽鎖遺伝子は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞）において共発現されて、可溶性ヒト化抗体を生成する。抗体の大規模生成を容易にするために、抗体発現細胞を含むバイオリアクターにおいてこのようなヒト化抗体を生成すること、または乳汁中に抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物（例えば、ヤギ、ウシ、またはヒツジ）を生成すること（例えば、米国特許第５，８２７，６９０号を参照のこと）がしばしば望ましい。
【００４３】
時々、ヒトフレームワークへのＣＤＲの直接的移入は、得られる抗体の抗原結合親和性の喪失をもたらす。これは、いくつかのコグネイト抗体においては、フレームワーク領域内の特定のアミノ酸が、このＣＤＲと相互作用し、従って、この抗体の全体的な抗原結合親和性に影響を及ぼすからである。このような場合、このコグネイト抗体の抗原結合活性を保持するために、「復帰変異」（前出）をアクセプター抗体のフレームワーク領域内に導入することが重要である。
【００４４】
復帰変異を作製する一般的アプローチは、当該分野で公知である。例えば、Ｑｕｅｅｎら（前出）、Ｃｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３（１９９１）、およびＷＯ  ９０／０７８６１（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｃ．）は、２つの重要な工程を含むアプローチを記載する。第１に、ヒトＶフレームワーク領域は、コグネイトマウス抗体のＶ領域フレームワークに対する最適なタンパク質配列相同性についてコンピュータ分析により選択される。次いで、マウスＶ領域の三次構造が、マウスＣＤＲと相互作用するようであるフレームワークアミノ酸残基を可視化するために、コンピュータによりモデリングされ、次いで、これらのマウスアミノ酸残基は、相同なヒトフレームワークにスーパーインポーズされる。
【００４５】
この２工程アプローチの下では、ヒト化抗体を設計することに関していくつかの基準が存在する。第１の基準は、ヒトアクセプターとして、非ヒトドナー免疫グロブリンに対して通常相同である、特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを用いること、または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを用いることである。第２の基準は、ヒトアクセプター残基が以上であり、そしてドナー残基がそのフレームワークの特定の残基においてヒト配列に関して代表的であるならば、アクセプターよりもむしろ、ドナーのアミノ酸を用いることである。第３の基準は、ＣＤＲに直接隣接する位置においては、アクセプターよりもむしろ、ドナーのフレームワークアミノ酸残基を用いることである。
【００４６】
例えば、Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１（１９９１）に記載されるような異なるアプローチもまた用い得る。このアプローチの下では、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの重鎖および軽鎖に由来するＶ領域フレームワークは、それぞれ、マウス残基の過激な導入を伴うことなく、ＣＤＲグラフト化に用いられる。このアプローチを用いることの利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの可変領域の三次元構造がＸ線結晶学から公知であり、従って、ＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用が容易にモデリングされ得ることである。
【００４７】
（他の部分）
本発明のモノクローナル抗体は、所望の機能をもたらすために他の部分をさらに含み得る。例えば、これらの抗体は、これらの抗体によって標的化される細胞の殺傷のための、毒素部分（例えば、破傷風トキソイドまたはリシン）または放射性核種（例えば、１１１Ｉｎまたは９０Ｙ）を含み得る（例えば、米国特許第６，３０７，０２６号を参照のこと）。これらの抗体は、容易な単離または検出のための部分（例えば、ビオチン、蛍光部分、放射性部分、ヒスチジンタグまたは他のペプチドタグ）を含み得る。これらの抗体はまた、それらの血清半減期を延長し得る部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分）を含み得る。
【００４８】
（罹患状態および動物モデル）
本発明の抗体は、αｖβ６媒介疾患の処置（予防を含む）において有用である。例えば、これらの抗体を用いて、ＴＧＦ−βの活性化をブロックすることにより、または任意の他のリガンド（例えば、フィブロネクチン、ビトロネクチン、およびテネイシン）へのαｖβ６の結合をブロックすることにより、線維症（例えば、肺線維症、急性肺傷害、腎臓線維症、肝臓、肝臓線維症、アルポート症候群、および強皮症）を処置し得る。このアプローチの新規性としては、以下が挙げられる：（１）これは、ＴＧＦ−βのレセプターへのＴＧＦ−βの結合よりむしろ、ＴＧＦ−βの活性化をブロックする、（２）これは、ＴＧＦ−βを局所的に（すなわち、αｖβ６のアップレギュレーション部位において）阻害し得る、そして（３）これは、リガンドへのαｖβ６の結合を阻害する。線維症疾患または線維症状態以外に、本発明の抗体は、癌または癌転移（腫瘍増殖および侵襲を含む）（特に、上皮癌）を処置する際に有用である。上皮癌の１つのサブセットは、扁平上皮癌（例えば、頭部および頸部の癌、口腔癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、頸部癌、咽頭癌、結腸癌、膵臓癌および卵巣癌）である。新たなαｖβ６モノクローナル抗体を用いた本発明者らの研究は、αｖβ６が多くの上皮癌において、特に、腫瘍のリーディングエッジにおいて高度に発現されることを実証した。この新たな抗体はまた、乾癬を含め、αｖβ６により媒介される任意の他の疾患に対して用いられ得る。
【００４９】
本発明の処置は、これらの状態に罹患した、ヒトおよび動物の両方の被験体に対して有効である。本発明が適用可能である動物被験体は、ペットとして、または商業的目的でのいずれかで生じた、家庭用動物および家畜の両方に及ぶ。例は、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギである。
【００５０】
本発明の抗体の効力は、種々の動物モデルにおいて試験され得る。肺線維症に関するマウスモデルとしては、ブレオマイシン誘発性肺線維症（Ｐｉｔｔｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７（１２）：１５３７−１５４４（２００１）；およびＭｕｎｇｅｒら，前出）および照射誘発性肺線維症（Ｆｒａｎｋｏら，Ｒａｄ．Ｒｅｓ．１４０：３４７−３５５（１９９４））が挙げられる。ブレオマイシン処置マウスにおいては、αｖβ６の発現は、肺の上皮肺胞細胞において増大する。しかし、β６ノックアウトマウスは、ブレオマイシン誘発性傷害および線維症から保護される。
【００５１】
腎臓線維症に関するマウスモデルとしては、ＣＯＬ４Ａ３−／−マウス（例えば、Ｃｏｓｇｒｏｖｅら，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５７：１６４９−１６５９（２０００）を参照のこと）、アドリアマイシン誘発性傷害を有するマウス（Ｗａｎｇら，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ５８：１７９７−１８０４（２０００）；Ｄｅｍａｎら，Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １６：１４７−１５０（２００１））、ｄｂ／ｄｂマウス（Ｚｉｙａｄｅｈら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９７：８０１５−８０２０（２０００））、および片側性尿管閉塞を有するマウス（Ｆｏｇｏら，Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ８１：１８９Ａ（２００１）；およびＦｏｇｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ  １２：８１９Ａ（２００１））が挙げられる。これらのモデルの全てにおいて、これらのマウスは、腎不全へと進行し得る、腎臓傷害および線維症を発症する。αｖβ６は、ＣＯＬ４Ａ３−／−マウス、アドリアマイシン処置マウス、および片側性尿管閉塞を受けたマウスの腎臓の上行細管および下行細管の上皮内層においてアップレギュレートされる。αｖβ６発現はまた、種々の腎臓傷害モデルにおいて増大するようである。
【００５２】
抗αｖβ６モノクローナル抗体はまた、インビボでの腫瘍増殖および転移モデルにおける標準として、このような動物モデルにおいて腫瘍の増殖、進行、および転移を阻害する能力に関して試験され得る。例えば、Ｒｏｃｋｗｅｌｌら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．４９：７３５（１９７２）；Ｇｕｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：９５４（１９９２）；Ｗｙｃｋｏｆｆら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２５０４（２０００）；およびＯｆｔら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：１２４３（１９９８）を参照のこと。癌における重要なαｖβ６リガンドとしては、ＴＧＦ−β（これは、転移に関与する）（概説に関しては、Ａｋｈｕｒｓｔら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：Ｓ４４−Ｓ５１（２００１）を参照のこと）、フィブロネクチンおよびビトロネクチンが挙げられ得る。
【００５３】
本発明の処置の効力は、多数の利用可能な診断ツール（身体検査、血液試験、タンパク質尿測定、クレアチニンレベルおよびクレアチニンクリアランス、肺機能試験、血漿血尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、瘢痕性または線維症傷害の診察およびスコア付け、細胞外マトリクスの沈着（例えば、コラーゲン、平滑筋アクチンおよびフィブロネクチン、腎臓機能試験、超音波、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、およびＣＴスキャンが挙げられる）によって測定され得る。
【００５４】
（薬学的組成物）
本発明の薬学的組成物は、必要に応じて任意の薬学的に受容可能なキャリアとともに、本発明の１以上の抗体またはその薬学的に受容可能な誘導体を含む。用語「キャリア」は、本明細書中で用いられる場合、公知の受容可能なアジュバントおよびビヒクルを包含する。
【００５５】
本発明によれば、この薬学的組成物は、無菌の注射可能組成物の形態（例えば、無菌の注射可能な水性懸濁物または油性懸濁物）であり得る。この懸濁物は、当該分野で公知の技術に従って、適切な分散剤、湿潤剤、および懸濁剤を用いて処方され得る。
【００５６】
本発明の薬学的組成物は、所望により、経口に、局所的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、筋肉内に、髄内に、関節内に、滑膜内に、胸骨内に、髄腔内に、肝臓内に、もしくは頭蓋内に、または炎症もしくは腫瘍増殖の部位にてまさに局所に、与えられ得る。本発明の薬学的組成物はまた、例えば、ネブライザー、乾燥粉末吸入器または定量吸入器の使用により、吸入によって投与され得る。
【００５７】
所望の効果を生じるに有効な本発明の抗体の投薬量および投与速度は、種々の要因（例えば、処置されるべき疾患の性質、被験体のサイズ、処置目的、用いられる特定の薬学的組成物、および処置医の判断）に依存する。１日当り約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重と約１００ｍｇ／ｋｇ体重との間（例えば、１日当り約０．１ｍｇ／ｋｇ体重と約５０ｍｇ／ｋｇ体重との間）の投薬量レベルの活性成分の化合物が有用である。例えば、本発明の抗体は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲にわたる用量（例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重／日と約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日との間の範囲にわたる用量）にて、そして毎日〜１４日の間隔で投与される。別の実施形態では、この抗体は、腹腔内に投与される場合、約０．３〜１ｍｇ／ｋｇ体重の用量にて投与される。なお別の実施形態では、この抗体は、静脈内に投与される場合、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１２．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量にて投与される。１つの実施形態では、抗体組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの血漿レベルの抗体を提供するに有効な量で投与される。
【００５８】
（診断方法）
本発明の抗体を用いて、変化したαｖβ６発現レベルに関連した疾患状態を診断し得る。被験体由来の組織サンプル（例えば、組織生検、体液サンプルまたは洗浄液（例えば、肺胞洗浄液））は、抗原捕捉アッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学アッセイなどにおいて、この抗体を用いて試験され得る。正常個体由来の組織サンプルは、コントロールとして用いられる。
【００５９】
本発明の実施は、そうでないと示さない限り、当該分野の技術範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の従来技術を用いる。このような技術は、文献に記載される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編），１９８９；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編），１９８４；Ｍｕｌｌｉｓらに対する米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ），１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ），１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編），１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ），１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編），１９８７；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編），１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第Ｉ巻〜第ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編），１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，１９８６を参照のこと。
【００６０】
そうでないと定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての専門用語および科学用語は、本発明が関連する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。例示的な方法および材料は、以下に記載されるが、本明細書中に記載された材料および方法と類似であるかまたは等価な材料および方法もまた、本発明の実施において用いられ得る。本明細書中で言及される全ての刊行物および他の参考文献は、その全体が、参考として援用される。矛盾がある場合、本明細書（定義を含む）が支配する。材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図しない。本明細書を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変化形は、示した整数または整数の群を含むが、あらゆる他の整数も整数群も排除しないことを意味することが理解される。
【実施例】
【００６１】
以下の実施例は、本発明の方法および材料を例示することを意味する。当業者に明らかである、抗体の分野で通常遭遇する記載された条件およびパラメーターの適切な改変および適応は、本発明の趣旨および範囲内にある。
【００６２】
以下の実施例では、β６−／−マウスを、Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１３３：９２１（１９９６）に記載される通りに作製した。組換えヒトＬＡＰを、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。抗体１０Ｄ５を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。Ｌ２３０ハイブリドーマを、ＡＴＣＣから購入し、そして分泌された抗体を、飽和培養物の上清から、固定化プロテインＡでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抗体のアイソタイプ決定を、ＩＳＯＳＴＲＩＰキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、製造業者の指示書に従って実施した。β６でトランスフェクトしたＳＷ４８０細胞株を、Ｗｅｉｎａｃｋｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：６９４０−６９４８（１９９４）に記載される通りに調製した。
【００６３】
（実施例１：β６でトランスフェクトした安定な細胞株の作製）
β６でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞およびＦＤＣ−Ｐ１細胞を、親細胞株に、全長マウスβ６  ｃＤＮＡおよびネオマイシン選択マーカーを含むＤＮＡ構築物をエレクトロポレーションすることによって作製した。Ｇ４１８を含む培養培地中で１４日間細胞を継代し、続いて蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって最大レベルの表面β６を発現する細胞を単離することにより、安定にトランスフェクトされた細胞を選択した。トランスフェクトされたＦＤＣ−Ｐ１細胞を、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／ｌグルコース、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０％  ＦＢＳ、２．５％  マウスＩＬ−３培養上清、および１．５ｍｇ／ｍｌの活性なＧ４１８を含むように調整した、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。トランスフェクトされたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、および１ｍｇ／ｍｌの活性なＧ４１８を補充したＤＭＥＭ中で培養した。
【００６４】
（実施例２：ヒト可溶性αｖβ６の精製）
αｖβ６タンパク質を、Ｗｅｉｎａｃｋｅｒ（上記）に本質的に記載される通りに精製した。ｈｓαｖβ６を発現するＣＨＯ細胞株を培養し、そして得られる上清を遠心分離により収集した。このインテグリンを、抗αｖ抗体Ｌ２３０を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製したＬ２３０を、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｓｉｇｍａ）に、４．８ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂の割合で架橋した。αｖβ６上清を０．５ｍｇ抗体／ｍｌ樹脂にてＬ２３０アフィニティーカラムにローディングし、そしてこのカラムを、各々以下である１０カラム容量を用いて洗浄した：（１）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；（２）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；および（３）１０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４（ｐＨ７．０）。ｈｓαｖβ６を、１００ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）を用いて１：１０容量の１Ｍ  Ｎａ３ＰＯ４（ｐＨ８．０）中に溶出させた。このタンパク質を、数回交換しながらリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、そして−２０℃にて保存した。
【００６５】
（実施例３：β６−／−マウスの免疫）
β６−／−マウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に１：１の容量比で合計２００μｌにて乳化した２５μｇの精製組換えヒトαｖβ６を用いた腹腔内（ＩＰ）注射によって免疫した。あるいは、β６−／−マウスを、１ｍｇ／ｍｌのＣａＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌ  ＭｇＣｌ２を含む１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁したβ６でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（４×１０６個）を用いてＩＰ注射によって免疫し、そして同じマウスに、１００μｌのＣＦＡを隣接部位に注射した。最初の免疫の２週間後および４週間後、これらのマウスに、不完全フロイントアジュバントをＣＦＡの代わりに用いたこと以外は同じ試薬を同様に追加免疫した。これらのマウスから、最後の追加免疫の７日後に採血し、抗β６力価を、精製した組換えヒトαｖβ６への血清の結合またはβ６でトランスフェクトした細胞への結成の結合によって決定した。精製組換えヒトαｖβ６で免疫したマウスの場合、マウスを３ヶ月間休養させ、そしてＩｍｍｕｎＥａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合した同じ抗原を用いて再度免疫した。ハイブリドーマ融合のために脾臓を単離する３日前に、これらのマウスに、１２．５μｇの精製組換えヒトαｖβ６タンパク質を、ＩＰ注射および静脈内注射の両方によって免疫した。融合日に、これらの動物を屠殺し、そしてそれらの脾臓を取り出し、そして梳いて単細胞懸濁物にした。これらの脾細胞を、薬物選択可能な細胞融合パートナーへの融合によって不死化した。
【００６６】
（実施例４：ハイブリドーマのスクリーニング）
２群の抗体を、β６−／−マウスの免疫によって作製した。１セットの抗体（融合体番号６）を、可溶性ヒト短縮型αｖβ６を用いた免疫によって作製した。他のセットの抗体（融合体番号７）を、マウスβ６でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を用いた免疫によって作製した。抗αｖβ６抗体についてのスクリーニングを、以下に記載の通りに、細胞ベースおよび無細胞の両方の結合アッセイおよび機能アッセイを用いて実施した。ポジティブクローンの最初の選択は、精製ｈｓαｖβ６、ならびにβ６でトランスフェクトされたヒト細胞およびマウス細胞（コントロールとしての、トランスフェクトしていない細胞）への結合に基づいた。選択されたクローンを増大させ、そして最終的な培養物を、β６でトランスフェクトされた細胞およびトランスフェクトされていない細胞の両方に対する結合について、細胞捕捉アッセイ（以下の実施例５ｂ）において再評価した（代表例は図１Ａおよび図１Ｂに示され、ここで、融合体６および融合体７をそれぞれ示すｍＡｂの名称の接頭語「６．」または「７．」は、省略される；以下の表２もまた参照のこと）。いくつかの抗体は、β６でトランスフェクトした細胞に優先的に結合し、一方、他の抗体は、トランスフェクトした細胞およびトランスフェクトしていない細胞の両方に結合した。このことは、これらの抗体のサブセットのみが、β６についての選択性を有することを示す（図１Ａおよび図１Ｂ）。さらなる選択は、これらの抗体が、ＬＡＰへのビオチン化ｈｓαｖβ６およびβ６でトランスフェクトされたマウス細胞の両方の結合をブロックする能力に基づいた。選択クローンをＦＡＣＳを用いてサブクローニングし、そして使用するまで凍結保存した。
【００６７】
モノクローナル抗体を、β６でトランスフェクトした細胞に結合する能力およびトランスフェクトされていない親細胞に結合しない能力に基づいて、αｖβ６に対する結合の特異性に関してスクリーニングした。モノクローナル抗体を、αｖβ３、αｖβ８、α５β１、αｖβ１またはα５β１を発現する細胞株に結合しないことに基づいて、αｖβ６の特異的バインダーであって、他のαｖインテグリンのバインダーでも非特異的インテグリン（すなわち、ＲＧＤ含有リガンドに結合する非αｖインテグリン）のバインダーでもないことをさらに確認した。これらには、安定にトランスフェクトされた細胞ならびにトランスフェクトされていない、ＪＹ細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＳＷ４８０細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３細胞株、およびＦＤＣＰ１細胞株が含まれた。
【００６８】
ＡＴＣＣに寄託した抗体のいくつかを以下に表１に列挙する。
【００６９】
【表１】
0005616932.tif 000002
（実施例５：スクリーニングおよび特徴付けに関するアッセイ）
（ａ．αｖβ６  ＥＬＩＳＡ）
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣＯＳＴＡＲ  ＥＡＳＹ−ＷＡＳＨ）を、５０μｌ／ウェルの５μｇ／ｍｌ  ｈｓαｖβ６を用いて４℃で一晩コーティングした。このプレートを、自動プレート洗浄器中で洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０）を用いて４回洗浄した。次いで、ＴＢＳ中３％  ＢＳＡ（１８０μｌ／ウェル）を添加し、そして２５℃にて１時間インキュベートして、非特異的結合をブロックした。このプレートを上記の通りに洗浄し、そしてハイブリドーマ上清（スクリーニングアッセイに関して）または精製抗体（特徴付けに関して）のいずれかのＴＢＳ（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有）中希釈物を添加した（５０μｌ／ウェル）。このプレートを２５℃にて１時間インキュベートし、洗浄し、次いで５０μｌ／ウェルのペルオキシド結合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）を用いて１時間インキュベートした。結合した抗体を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて検出した。結合は、４５０ｎｍにて測定される吸光度によって示された。
【００７０】
（ｂ．細胞捕捉アッセイ）
９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０μｌ／ウェルの二次抗体（ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）；５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ  ９．２）中に希釈した５μｇ／ｍｌ）を用いて４℃にて一晩コーティングした。プレートを、１００μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ＋２％  ＢＳＡ）を用いて２回洗浄し、次いで１００μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液を用いて３７℃にて１時間ブロッキングした。ＦＤＣ−Ｐ１細胞およびβ６でトランスフェクトしたＦＤＣ−Ｐ１細胞に関して、プレートを、抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；２０μｇ／ｍｌ）を用いて室温で１０分間ブロッキングして、二次抗体による非特異的Ｆｃレセプター結合を減少させた（他の細胞型については省略した）。これらのプレートをブロッキングしている間に、細胞を、５×１０６細胞／ｍｌにて、アッセイ緩衝液中の２μＭ蛍光色素（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて標識した。これらの細胞を、穏やかに攪拌しながら３７℃の水浴中で１５分間、アッセイ緩衝液中のこの色素と共にインキュベートし、遠心分離によって収集し、そして５×１０６細胞／ｍｌになるようにアッセイ緩衝液中に再懸濁させた。ブロッキング工程の後、このプレーとを軽く叩くことによってこの緩衝液を捨て、そして２５μｌ／ウェルの上清または精製抗体をこのプレートに添加した。３７℃での１５分間のインキュベーション後、２５μｌ／ウェルの標識細胞を添加し、そしてこのプレートを３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをアッセイ緩衝液（１００μｌ／ウェル）を用いて３〜５回洗浄し、そしてプレート上の捕捉細胞によって発光される蛍光を記録した。結合パーセントを、最終洗浄工程の前（すなわち、添加した総細胞）の蛍光を、洗浄後（すなわち、結合細胞）の蛍光に対して比較することにより決定した。
【００７１】
（ｃ．ＦＡＣＳ）
細胞を、トリプシン処理により収集し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、次いでＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、０．１％  ＮａＮ３、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に再懸濁し、次いで、０．２×１０５細胞を、氷上で１時間、ハイブリドーマ上清を含むＦＡＣＳ緩衝液（１００μｌの総容積）中でインキュベートした。インキュベーション後、これらの細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液を用いて２回洗浄し、５μｇ／ｍｌロバ抗マウスＩｇＧ  ＰＥ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を含む１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液を用いて２回洗浄し、そして２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。ＰＥ標識二次抗体の結合を、フローサイトメトリーによってモニタリングした。
【００７２】
（ｄ．ＬＡＰへのビオチン−ｈｓαｖβ６の結合）
９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣＯＳＴＡＲ  ＥＡＳＹ−ＷＡＳＨ）を、ＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）中に希釈した０．３μｇ／ｍｌの組換えヒトＬＡＰ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，カタログ番号２４６−ＬＰ）を用いて４℃にて一晩コーティングした。コーティング溶液を除去した後、これらのプレートを、１８０μｌ／ウェルの３％  ＢＳＡ／ＴＢＳを用いて２５℃にて１時間ブロッキングした。別個の９６ウェル丸底プレートにおいて、６０μｌ／ウェルの２×ストック（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むＴＢＳ中、０．５μｇ／ｍｌ（１．２５ｎＭ）のビオチン−αｖβ６、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および２ｍＭ  ＭｇＣ１２）を、ハイブリドーマ上清（スクリーニングに関して）または精製抗体（これもまた、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含むＴＢＳ中）のいずれかの６０μｌ／ウェルの２×ストックと合わせ、そして２５℃にて１時間インキュベートした。ＬＡＰでコーティングしたプレートを、自動プレート洗浄器において洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０．１％  ＴＷＥＥＮ−２０）を用いて４回洗浄した後、１００μｌの抗体−αｖβ６混合物をこのプレートに移し、そして２５℃にて１時間インキュベートした。このプレートを上記の通りに洗浄し、そしてエクストラアビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体（Ｓｉｇｍａ）のＴＢＳ（１  ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中１：１０００希釈物（５０μｌ／ウェル）を用いて２５℃にて１時間インキュベートした。結合したタンパク質を、ＴＭＢ基質を用いて検出した。
【００７３】
（ｅ．ＬＡＰへのβ６−ＦＤＣ−Ｐ１細胞の接着）
９６ウェルマイクロタイタープレートを、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．２）中に希釈した０．５μｇ／ｍｌ組換えヒトＬＡＰ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（５０μｌ／ウェル）を用いて４℃にて一晩コーティングした。このプレートを、ＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）を用いて２回洗浄し、そしてＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中の１％  ＢＳＡを用いて２５℃にて１時間ブロッキングした。このプレートを、１００μｌ／ウェルのアッセイ緩衝液（ＴＢＳ完全＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を用いて２回洗浄した。次に、このプレートの個々のウェルに対して、２５μｌのハイブリドーマ上清（または精製抗体）および２５μｌのβ６−ＦＤＣ−Ｐ１細胞（５×１０６細胞／ｍｌ、上記の通りにＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭで標識した）を添加した。このプレートを２５℃で１時間インキュベートし、次いでこのアッセイ緩衝液（１００μｌ／ウェル）を用いて４〜６回洗浄した。このプレート上に捕捉された細胞から発光された蛍光を記録した。結合百分率を、最終洗浄工程の前（すなわち、添加した総細胞）の蛍光シグナルを、洗浄後（すなわち、結合した細胞）の蛍光シグナルに対して比較することにより決定した。
【００７４】
（ｆ．ＴＧＦ−βバイオアッセイ）
本明細書中で用いたＴＧＦ−βバイオアッセイは、Ａｂｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：２７６−２８４（１９９４）において記載されるミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）ＰＡＩ−１ルシフェラーゼ共存培養アッセイの変法であり、ここでは、β６でトランスフェクトした細胞をレポーター細胞と共に共存培養して、αｖβ６によるＴＧＦ−βの活性化（Ｍｕｎｇｅｒ，前出）をモニタリングした。これは、プラスミノゲンアクチベーターインヒビター−１（ＰＡＩ−１）の発現を誘導する能力に基づく、ＴＧＦ−βに関する定量的バイオアッセイである。このアッセイにおいて、ＭＬＥＣ細胞は、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合された短縮型ＰＡＩ−１プロモーターを含む発現構築物を用いて安定にトランスフェクトされている。トランスフェクトされたＭＬＥＣ細胞を活性なＴＧＦ−β（０．２〜＞３０ｐＭ）に曝露することにより、細胞溶解産物におけるルシフェラーゼ活性の用量依存性増加がもたらされる。
【００７５】
このアッセイを実施するために、ＴＭＬＣ（ミンク肺上皮細胞株Ｍｖ  １  Ｌｕ）細胞を、ＰＡＩ−１−ルシフェラーゼ構築物を用いてトランスフェクトした。これらのトランスフェクトされた細胞を、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび２００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含むＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で増殖させた。インテグリンβ６構築物（「β６−ＳＷ４８０」または「ＳＷ４８０  β６」細胞）を用いてトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞を、Ｌ−ＧｌｎおよびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ中で増殖させた。細胞を、ＰＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてフラスコから取り出し、ＰＢＳ＋０．５％  ＢＳＡ中で洗浄し、血球計算板によって計数し、そして９６ウェルプレート中にプレーティングした。ＳＷ４８０−β６細胞を、洗浄緩衝液中に４×１０４細胞／ウェルにてプレーティングした。モノクローナル抗体をＤＭＥＭ（無血清）中に希釈し、ＳＷ４８０−β６細胞に添加し、そして室温にて２０分間プレインキュベートした。次いで、ＴＭＬＣ細胞を２×１０４細胞／ウェルにて添加して、最終容積を１００μｌにした。これらのプレートを、加湿したＣＯ２富化インキュベーター中で２０時間インキュベートした。これらのプレート由来の上清を捨て、そして１００μｌのＰＢＳ＋１ｍＭ  Ｃａ２＋および１ｍＭ  Ｍｇ２＋に置き換えた。次いで、これらのプレート中の細胞を溶解し、そしてルシフェラーゼ活性のレベルを、グロー型（ｇｌｏｗ−ｔｙｐｅ）反応Ｐａｃｋａｒｄ  ＬＵＣＬＩＴＥキット（＃６０１６９１１）およびＴＲＯＰＩＸマイクロプレートルミノメーターを用いて検出した。
【００７６】
（実施例６：抗体精製）
融合体番号６由来の８個のハイブリドーマクローン（接頭語「６．」により示す）および融合体番号７由来の１４個のハイブリドーマクローン（接頭語「７．」により示す）を、さらなる大規模化および特徴付けのために選択した（表２）。
【００７７】
各ハイブリドーマの小規模培養物（１５０ｍｌ）を調製し、そして上清を遠心分離により収集した。抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いてこれらの上清から精製した。ＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体に関しては、この上清をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（１ｍｌ沈降床容積）に直接ローディングした。このカラムを、ＰＢＳを用いて洗浄し、そしてＩｇＧ画分を、２５ｍＭリン酸、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ２．８）を用いて、１：２０容積の０．５Ｍ  Ｎａ３ＰＯ４（ｐＨ８．６）中に溶出させた。マウスＩｇＧ１抗体に関して、この上清を、１．５Ｍグリシン、３Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．９）に調整した後にローディングし、そしてこのカラムを、２５ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、３Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．６）を用いて洗浄した後に溶出させた。これらの調製物を、本明細書中に記載されるインビトロでの生化学的特徴付けに用いた。
【００７８】
【表２】
0005616932.tif 000003
＊：ブロッカーは、精製ｈｓαｖβ６またはβ６発現細胞のいずれかに対するリガンド結合のブロッキングによって決定した場合に、ＬＡＰに対するαｖβ６の結合をブロックする抗体と定義される。
【００７９】
動物モデルにおける使用のために、ハイブリドーマクローンを２Ｌの培地に規模拡大し、そしてＬｉｆｅｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂａｇｓ−ＰＬ７３２（Ｎｅｘｅｌｌ，カタログ番号Ｒ４Ｒ２１１３）中で４週間増殖させた。これらのハイブリドーマ由来の抗体を、まず、上記の通りのプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、続いてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）におけるイオン交換工程によって精製した。プロテインＡクロマトグラフィー工程からの溶出物を、２Ｍ  Ｔｒｉｓベースを用いてｐＨ８．６に調整し、水で１０倍希釈し、そして１０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．６）中で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２０ｍｇタンパク質／ｍｌ樹脂）にローディングした。このカラムを、５カラム容積の平衡化緩衝液を用いて洗浄し、そして結合したタンパク質を、２５ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）を用いて溶出させた。溶出させたタンパク質を濾過滅菌（０．４５μｍ）し、そして使用するまで−７０℃にて保存した。
【００８０】
（実施例７：精製抗体の特徴付け）
精製抗体（表２、前出）を、以下の能力に関して定量的に特徴付けした：（１）ｈｓαｖβ６を結合する能力、（２）β６でトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞およびＦＤＣ−Ｐ１細胞を結合する能力、（３）ＬＡＰに対するビオチン−αｖβ６の結合を阻害する能力、（４）ＬＡＰへの、β６でトランスフェクトされたＦＤＣ−Ｐ１細胞の結合を阻害する能力、ならびに（５）ＭＬＥＣアッセイ（前出）においてＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化をブロックする能力。これらのアッセイの各々における相対的効力を、公知のαｖβ６抗体１０Ｄ５（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１１：２１８９（１９９８））の相対的効力およびいくつかの場合には抗αｖ抗体Ｌ２３０の相対的効力に対して比較した。融合体番号７の抗体の特徴付けに関して、融合体番号６の抗体６．８Ｇ６をまた、ポジティブコントロールとして用いた。
【００８１】
１ｍＭ  Ｃａ２＋および１ｍＭ  Ｍｇ２＋の存在下で実施した最初の結合実験（実施例５ａ、前出）は、精製抗体の大部分がｈｓαｖβ６に結合することを示した（図２Ａおよび図２Ｂ）。しかし、予想外に、１０Ｄ５ならびにクローン７．２Ｆ５およびクローン７．１０Ｄ７に関しては結合が観察されなかった。その後の実験は、１０Ｄ５（図３Ｅ）、７．２Ｆ５、および７．１０Ｄ７の結合が、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋によってごくわずかに支持されているが、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２によってずっと強く支持されていることを証明した。新たなクローンの中でも、３つ（６．１Ａ８（図３Ａ）、７．７Ｇ５、および６．８Ｇ６（図３Ｃ））は、二価カチオンについての必要性を示したが、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件とＭｎ２＋結合条件との間で違いは観察されなかった。
【００８２】
残りのクローンは、二価カチオンについての必要性を示さなかった。すなわち、１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下でこの抗原に対して結合し得た（図３Ｂ、図３Ｄおよび図３Ｆ）。β６でトランスフェクトしたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞またはＳＷ４８０細胞への抗体結合のＦＡＣＳ分析は、この状況では、１０Ｄ５が、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件とＭｎ２＋条件とで同等に結合したことを除いて同様であるパターンを明らかにした。可溶性αｖβ６への結合に関する必要性は、タンパク質のコンホメーションまたはアビディティ効果における違いに起因して、細胞表面に発現されたαｖβ６への結合に関する必要性とは異なり得る。
【００８３】
これらの結果は、少なくとも３つの異なるクラスのβ６ブロッキング抗体がこの群に存在することを示唆する。これらのクラスのうちの１つ（１０Ｄ５）は、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋条件とＭｎ２＋条件とを識別する。別のクラス（６．１Ａ８、７．７Ｇ５、および６．８Ｇ６を含む）は、カチオンを必要とするが、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋とＭｎ２＋とを識別しない。最後のクラス（抗αｖ抗体Ｌ２３０、６．２Ｂ１０、６．３Ｇ９（図３Ｂ）、および６．２Ｂ１（図３Ｄ）、７．１Ｃ５、および７．１Ｇ１０を含む）は、カチオン非依存性である。
【００８４】
精製抗体を次に、αｖβ６−ＬＡＰ相互作用を阻害する能力について評価した。実施例５ｄ（前出）の無細胞アッセイにおいて、抗体６．１Ａ８、６．２Ｂ１、６．３Ｇ９、および６．８Ｇ６は、１０Ｄ５のＩＣ５０値よりも低いＩＣ５０値を示した（図４Ａ；表３）。６．２Ｂ１０は、より高いＩＣ５０を示したが、なお完全な阻害を与えた（図４Ａ）。６．４Ｂ４は、ごく部分的な阻害を示し、一方、６．６Ｂ５および６．８Ｂ４は、阻害を示さなかった（図４Ａ）。同じアッセイ系を用いて、抗体７．１Ｃ５、７．１Ｇ１０、７．２Ａ１、７．４Ａ３、７．７Ｇ５、７．９Ｇ８、７．９Ｈ５、および７．１０Ｈ２は、１０Ｄ５のＩＣ５０値よりも低いＩＣ５０値を示した（図４Ｂ；表３）。抗体７．２Ｆ５、７．２Ｈ２および７．８Ｈ１２は、ほぼ同一またはより高いＩＣ５０値を示したが、それでもなお完全な阻害を与えた（図４Ｂ）。
【００８５】
実施例５ｅ（前出）に記載される細胞アッセイでは、６．１Ａ８、６．２Ｂ１０および７．９Ｄ４（これらは、細胞に対する効力が、精製タンパク質に対してよりもずっと低かった）の例外を除いて、同様の傾向が観察された（図５Ａ〜Ｅ；表３）。
【００８６】
集合的に、これらの結果は、ヒトおよびマウスの両方のαｖβ６とＬＡＰとの相互作用を特異的に阻害する抗体を本発明者らが成功裏に生成したことを示す。これらの抗体のうちのいくつかは、αｖβ６に高親和性（フローサイトメトリーによって決定したところ、見かけのＫｄ≧０．３ｎＭ）で結合し、ＬＡＰに対する、β６でトランスフェクトした細胞の結合を、≧０．０５ｎＭ（８ｎｇ／ｍＬ）のＩＣ５０で阻害し、そしてＴＧＦ−β１のαｖβ６媒介活性化を≧０．５８ｎＭ（８７ｎｇ／ｍＬ）のＩＣ５０で防止した。
【００８７】
最後に、精製抗体を、ＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化をブロックする能力に関して、ＰＡＩ−１／ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（実施例５ｆ、前出）において評価した。再度、６．３Ｇ９、６．８Ｇ６、６．２Ｂ１、７．１Ｇ１０、および７．７Ｇ５は、ＴＧＦ−βのαｖβ６媒介活性化を、１０Ｄ５よりも低いＩＣ５０値で阻害し得、残りの抗体は、このアッセイにおいて、顕著により効力が低いようであった（図６Ａおよび６Ｂ；表３）。従って、ＬＡＰとのαｖβ６の相互作用をブロックする能力は、インビトロでＴＧＦ−βの活性化を阻害する能力と相関する。
【００８８】
【表３】
0005616932.tif 000004
＊：別個の実験から得たデータ。
＊＊：試験せず。
＊＊＊：表３にまとめた全ての実験を、１ｍＭ  Ｃａ２＋および１ｍＭ  Ｍｇ２＋の存在下で行った。
＊＊＊＊：太字の抗体は、先行技術の抗体１０Ｄ５およびＬ２３０、およびαｖβ６について特に高い阻害効力の新たな抗体である。
【００８９】
次に、可溶性αｖβ６に関する６．３Ｇ９および６．８Ｇ６の溶液親和性を、反応速度排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ）を用いることによって決定した。可溶性インテグリンの一連の希釈物（１×１０−８Ｍ〜２．４×１０−１２Ｍ）を、１×１０−１０Ｍのこの抗体と共に３時間インキュベートした。次いで、これらのサンプルを、ＫｉｎＥｘＡ機器（ＳａｐｉｄｙｎｅＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ）を用いて、インテグリンでコーティングしたポリメチルメタクリレートビーズに通過させた。６．８Ｇ６の場合、１ｍＭ  ＣａＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を、インキュベーション緩衝液およびアッセイ緩衝液中に含めた。結合した抗体および遊離の抗体の量を、Ｃｙ５標識抗マウス二次抗体を用いて決定した。二次曲線の当てはめを、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを用いて実施して、各相互作用に関して解離定数（Ｋｄ）を得た。この方法を用いて決定したＫｄは、６．３Ｇ９に関して１５．６ｐＭであり、そして６．８Ｇ６に関して２２．８ｐＭであった（図９Ａおよび図９Ｂ）。従って、これらの抗体は両方とも、αｖβ６に関して非常に高い親和性を有していた。
【００９０】
本発明者らは、「活性化」状態のインテグリンを認識するクラスの抗αｖβ６抗体をさらに同定した。αｖβ６には、２つの潜在的活性化状態が存在する。第１の状態では、活性化インテグリンは、そのリガンドに関してより高い親和性を有すると同定される。この活性化状態に関して特異的な抗体は、活性化カチオン（例えば、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２）の存在下で、インテグリンに対して増強された結合を示した。フローサイトメトリーによる１ｍＭ  ＭｎＣｌ２および１ｍＭ  ＭｇＣｌ２（非活性化カチオン）中での結合の程度の比較は、本明細書に記載したαｖβ６抗体（６．１Ａ８および６．６Ｂ５を含む）のうちのいくつかが、ＭｎＣｌ２の存在下で、顕著に増強された結合を示すことを示した。
【００９１】
αｖβ６の第２の活性化状態では、このインテグリンは、上記の通り、潜在ＴＧＦ−βを活性化し得る。短縮型αｖβ６を発現する細胞株（ＳＷ４８０（β６−７７０Ｔ））を調製した。この細胞株は、ＬＡＰに結合し得たが、ＴＭＬＣルシフェラーゼアッセイにおいてＴＧＦ−βを活性化できなかった（Ｍｕｎｇｅｒら，前出）。従って、全長β６でトランスフェクトされたＳＷ４８０細胞に結合するが７７０Ｔ短縮型でトランスフェクトされた細胞には結合しない抗体は、ＴＧＦ−βを活性化し得るαｖβ６形態に特異的であった。抗体７．８Ｂ３および抗体７．８Ｃ９は、この基準を満たした。
【００９２】
（実施例８：抗体競合によるエピトープマッピング）
精製したモノクローナル抗体をまた、ＥＬＩＳＡ形式において、ビオチン化αｖβ６への結合に関して６．８Ｇ６と競合する能力について試験した。このアッセイにおいて、６．８Ｇ６をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、そして競合抗体とビオチン化αｖβ６との混合物を、各々１ｍＭのＣａ２＋およびＭｇ２＋を含む緩衝液に添加した。結合したインテグリンを、エクストラアビジン−ＨＲＰ結合体を用いて検出し、そして競合抗体を、結合をブロックする能力に関してスコア付けした。６．２Ｂ１０（弱いブロッカー）以外の全てのコンセンサスブロッカー（表２）は、６．８Ｇ６と種々の程度に競合し得ることが示された（表４）。これらのデータは、これらのコンセンサスブロッカーが、６．８Ｇ６と同じかまたは重複するエピトープに結合することを確認する。
【００９３】
【表４】
0005616932.tif 000005
精製したモノクローナル抗体を、ＥＬＩＳＡにおいてαｖβ６への結合に関してビオチン化６．３Ｇ９またはビオチン化６．８Ｇ６と競合する能力に関して試験した。このアッセイにおいて、未標識のαｖβ６を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、そして競合抗体およびビオチン化抗体の混合物を、各々１ｍＭのＣａ２＋およびＭｇ２＋を含む緩衝液に添加した。結合したビオチン化抗体を、ニュートラアビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ結合体を用いることにより検出した。このデータは、最も強力なブロッキング抗体（例えば、６．２Ｂ１、７．１Ｃ５、および７．１Ｇ１０）が、６．３Ｇ９および６．８Ｇ６の両方と、αｖβ６への結合に関して競合することを示した（表４．１、ならびに図１０Ａおよび図１０Ｂ）。抗体６．１Ａ８および７．７Ｇ５は、αｖβ６に関する親和性がより低いことにおそらく起因する、より少ない競合を示した。非ブロッキング抗体または抗αｖ抗体Ｌ２３０のいずれも、このアッセイにおいて６．３Ｇ９または６．８Ｇ６との競合を示さなかった。これらの結果は、αｖβ６特異的ブロッキング抗体が、αｖβ６上の同じかまたは重複するエピトープと結合することを示す。
【００９４】
【表４．１】
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（実施例９：ＣＤＲ配列）
精製モノクローナル抗体のいくつかについてのｃＤＮＡを、Ｃｏｌｉｇａｎら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｍｅｄｉａ，ＰＡ（２００１）に記載される通りの標準的な技術を用いて、単離し、そして配列決定した。推定アミノ酸配列を、図７Ａおよび図７Ｂに示す。
【００９５】
高親和性バインダー６．８Ｇ６、６．１Ａ８、６．２Ｂ１、６．３Ｇ９および６．２Ａ１の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、ならびに非ブロッカー６．２Ｇ２の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、以下の通りに比較される（ダッシュはギャップを示す）。
【００９６】
【表４．２】
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配列番号７では、太字の「Ｒ」（１２番目の残基）は、これが多型に供されており、例えば、Ｑであり得ることを示す。
【００９７】
これらの４つの高親和性バインダーの軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列および非ブロッカー６．２Ｇ２の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を、以下の通りに比較する。
【００９８】
【表４．３】
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図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、二価カチオン依存性クラスに入るｍＡｂ（例えば、６．１Ａ８および６．８Ｇ６）は、ＣＤＲ内に非常に類似したアミノ酸配列を含むようであり、一方、二価カチオン非依存性ｍＡｂ（例えば、６．２Ｂ１および６．３Ｇ９）は、そのＣＤＲ内に別のセットのモチーフを含む。
【００９９】
抗αｖβ６モノクローナル抗体の効力および特異性は、わずかに異なるアミノ酸残基によって支配され得る。６．１Ａ８および６．８Ｇ６の場合、可変ドメインのアミノ酸配列は、重鎖における１０アミノ酸の相違（これらのうちの３つは保存的である）および軽鎖における１１アミノ酸の相違を含め、非常に類似する。だが、これらの抗体は、インビトロアッセイにおいて、ほぼ１００倍の活性の相違を有する。アミノ酸の相違は、ポリペプチド鎖の可変ドメイン全体に分散し、そしてこれらの残基は、単独で、または同じ鎖もしくはパートナー鎖上の残基と相乗的に機能して、この抗体の効力に影響を与え得る。重鎖において、７つの残基が、αｖβ６に近接するように、またはαｖβ６への結合において活性な役割を果たすように、位置する。
【０１００】
ＲＧＤモチーフは、多数のインテグリン結合タンパク質（リガンド）において見出される。このモチーフは、インテグリン上の結合ポケットと直接的に接触することにより、インテグリンとのそれらの相互作用を媒介することが示されている。ＲＧＤ自体は、インテグリン結合タンパク質の間で完全に共通であるので、このモチーフ外の隣接残基は、インテグリン−リガンド相互作用に対して結合特異性を付与する際に役割を果たさねばならない。６．１Ａ８および６．８Ｇ６において、１つのこのような隣接残基は、重鎖においてＣＤＲ３内の１０１位にある。このアミノ酸残基は、ＲＧＤモチーフと隣接し、そして抗原認識部位に位置して、結合効力および結合特異性に寄与し得る。
【０１０１】
６．１Ａ８および６．８Ｇ６の同じ重鎖ＣＤＲ内の他の異なる残基としては、以下が挙げられる：３３（ＣＤＲ１）位の残基；５２位、５７位、および６５位の残基（ＣＤＲ２）；ならびに１１５位の残基（ＣＤＲ３）。重鎖における別の相違は、フレームワーク１内の４位に存在し、これは、Ｎ末端付近にある。この残基は、結晶学的モデルによって、抗体のＣＤＲ付近に折り畳まれ、そしてαｖβ６結合において重要な役割を果たし得ると推定される。６．１Ａ８と６．８Ｇ６との間での残りの３つの相違は、２０位（フレームワーク１）、４４位（フレームワーク２）および８２位（フレームワーク３）における保存的相違である。
【０１０２】
カチオン非依存性抗体のアミノ酸配列はまた、高度に相同である。これらは、２つのクラスに分けられ得る：ＲＧＤ含有抗体６．８Ｇ６と競合するクラス（すなわち、６．２Ｂ１、６．３Ｇ９、７．１０Ｈ２、７．９Ｈ５、７．１Ｃ５、７．１Ｇ１０、および７．４Ａ３）；ならびに競合しないクラス（すなわち、６．２Ａ１、６．２Ｂ１０および６．４Ｂ４）。６．８Ｇ６と競合するクラスは、重鎖のＣＤＲ３中にＦＸＹモチーフを含み、一方、非競合クラスは含まない。この相違は、ＦＸＹモチーフが、αｖβ６へのカチオン非依存性結合を媒介することに関して重要であることを示唆する。さらに、このＦＸＹ含有クラスの抗体は、αｖβ６における、ＲＧＤ結合ポケットと重複するが異なるエピトープにおそらく結合する。抗体６．２Ｂ１０および６．４Ｂ４は、ＦＸＹモチーフを含まず、そして弱いαｖβ６ブロッカーである。これらは、αｖβ６  Ｉドメイン様部分に結合し、かつ抗αｖβ６抗体が結合するなお別のエピトープを規定することが示された。興味深いことに、モノクローナル抗体６．２Ａ１は、カチオン非依存性クラスに属するが、他のカチオン非依存性ｍＡｂと同様に、ＲＧＤ配列を含まない。
【０１０３】
モノクローナル抗体７．７Ｇ５は、カチオン依存性クラスに属する。しかし、７．７Ｇ５の軽鎖配列は、カチオン非依存性Ｉドメイン結合抗体６．２Ｂ１０に対して高度に相同性である。７．７Ｇ５の重鎖もまた、ＣＤＲ１においてカチオン非依存性抗体に類似する。だが、そのＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、カチオン依存性クラスのＣＤＲ２およびＣＤＲ３により類似する。この観察は、特異的ＣＤＲが、抗体に対する特異性を付与することを示唆する。これは、重鎖のＣＤＲ３に関して特に当てはまる。これはおそらく、抗体のうちのこの部分における高度の可変性に起因する。実際、３つのカチオン依存性抗体のうちの２つおよび９つのカチオン非依存性抗体のうちの７つは、αｖβ６の認識において重要な役割を果たすようである重鎖ＣＤＲ３配列を含む。注目すべきこととして、７．７Ｇ５は、その重鎖ＣＤＲ２において、ＲＧＤモチーフを欠くが、ＸＧＤモチーフを含む。このＸＧＤモチーフは、ＲＧＤと同様の様式で機能し得、そして結合親和性／結合特異性を７．７Ｇ５に付与し得る。
【０１０４】
上記の配列の観察およびそこから導かれた推測は、特異的結合特性を付与する特定の可変領域アミノ酸配列の合理的設計に関する基礎を提供する。
【０１０５】
（実施例１０：診断抗体）
パラフィン包埋組織切片または他の組織サンプル中のαｖβ６発現を検出し得る抗体は、診断物として有用であり得る。これらの診断ツールを用いて、例えば、癌または線維症のような適応症に関して組織切片中のアップレギュレートされたαｖβ６を検出し得る。
【０１０６】
パラフィン包埋組織中のαｖβ６を検出する抗体を同定するために、本発明者らは、まず、抗体のパネルをＨＰＬＣで精製されたβ６サブユニットへの結合に関してスクリーニングした。このサブユニットを結合する抗体は、直鎖状ペプチドエピトープを認識するようであり、それゆえ、パラフィン包埋組織においてより高い成功確率を有すると期待される。プレート上に固定された（αｖβ６タンパク質ではなく）精製されたβ６インテグリンを用いたこと以外は、精製β６サブユニットへの結合を、αｖβ６結合を測定すること（前出）に関して記載されたＥＬＩＳＡ形式と同じＥＬＩＳＡ形式を用いて実施した。この方法を用いて、精製αｖβ６タンパク質および精製β６サブユニットの両方に結合し得る多数の融合体６抗体が同定された。以下の表５を参照のこと。ここで、クローン名における接頭語「６．」は、省略される。
【０１０７】
【表５】
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上記に示すように、いくつかの抗体は、精製β６サブユニットに結合した。これらは、変性したαｖβ６に結合する高い可能性を有し、従って、パラフィン包埋組織切片においてαｖβ６を検出する際に有用であり得る。他の抗体は、可溶性αｖβ６に結合したが、β６サブユニットに結合しなかった。両方の型の抗体を用いて、パラフィン包埋した変性β６トランスフェクトＳＷ４８０細胞およびトランスフェクトしていない親細胞を染色した。これらのデータを表６に示す。
【０１０８】
パラフィン包埋組織または細胞を染色するために、サンプルスライドを、以下の溶液中でインキュベーションすることにより、最初に脱パラフィン処理した：（１）キシレン、５分間、２回；（２）１００％エタノール、２分間、２回；（３）９５％エタノール、２分間、２回；（４）５０％エタノール、２分間、１回；および（５）蒸留水、２分間、１回。次いで、これらのスライドを、２００ｍｌのメタノールおよび３ｍｌの３０％  Ｈ２Ｏ２からなる溶液中で１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼをブロックした。これらのスライドを、ＰＢＳ中で２回、それぞれ２分間づつリンスした。次いで、スライド上のパラフィン切片を、ペプシン（Ｚｙｍｅｄ  ００−３００９）を用いて３７℃で５分間露出させた。これらのスライドを、ＰＢＳ中でさらに２回、それぞれ２分間づつリンスした。次に、これらのスライドを、アビジン、次いでビオチン（Ｖｅｃｔｏｒ  ＳＰ−２００１；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）をそれぞれ１０分間、室温で用いてブロッキングした。それぞれのインキュベーションの間に、上記の通りに洗浄を行った。ブロッキング溶液をスライドから排水した後、ＰＢＳ／０．１％  ＢＳＡ中に希釈した一次抗体（ハイブリドーマ培養上清）を、スライドに適用し、そして４℃にて一晩インキュベートした。
【０１０９】
翌日、これらのスライドを、上記の通りにＰＢＳ中でリンスした。その間に、アビジン−ビオチン複合体−西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液（ＡＢＣ試薬）を、以下の通りに調製した：１ｍｌのＰＢＳを、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  ＰＫ−６１０２からの２０μｌの溶液Ａ（１：５０）および２０μｌの溶液Ｂ（１：５０）と混合した；そしてこれらの混合物を、使用前に３０分間、室温でインキュベートした。この間に、これらのスライドを、１５μｌ／ｍｌ正常血清とともにＶｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔからの抗マウス−ビオチン化抗体（１：２００）を用いて３０分間、室温でインキュベートした。次いで、これらのスライドを、ＰＢＳ中で２回、それぞれ２分間リンスした。次いで、上記のＡＢＣ試薬をこれらのスライドに適用し、そして室温で３０分間インキュベートした。これらのスライドを上記の通りに再度リンスした。次いで、基質（Ｖｅｃｔｏｒ  ＳＫ−４１００）、１００μｌのＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）をこれらのスライドに適用し、そして室温で５分間インキュベートした。ＤＡＢを以下の通りに調製した：５ｍｌのＨ２Ｏに、２滴の緩衝液ストック溶液を添加し、充分に混合する；次いで、４滴のＤＡＢストック溶液を添加し、充分に混合する；次いで２滴のＨ２Ｏ２溶液を添加し、充分に混合する。次いで、これらのスライドを、流水中で２分間リンスした。次に、ＤＡＢシグナルを、全てのスライドに関して以下の通りに増感した：パラフィン切片を０．０５Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中で１０分間リンスする；過剰な緩衝液をブロットする；ＤＡＢ増感溶液を１５秒間適用する；次いで、水を用いて１分間迅速にリンスして、反応を停止させる。次いで、これらのスライドを、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリシン（核対比染色剤）中で１分間染色した。これらのスライドを、流水中で１分間リンスし、次いでＰＢＳ中に１分間浸漬し、その結果、ヘマトキシリンは青色になった。次いで、これらのスライドを流水中で１分間再度リンスし、そして以下の通りに脱水および浄化した：（１）９５％エタノール中に１分間、２回浸漬する；（２）１００％エタノール中に１分間、２回浸漬する；そして（３）キシレン中に２分間、２回浸漬する。次いで、パーマウント（ｐｅｒｍｏｕｎｔ）を用いて、これらのスライドにカバーガラスを適用した。
【０１１０】
これらの結果は、融合体６抗体１Ａ１、２Ｃ４、３Ｂ２、３Ｂ１１、５Ｄ６、５Ｇ９、５Ｈ３、６Ｄ１２、７Ｃ７、９Ｂ５、９Ｂ７、９Ｄ１１、９Ｆ５、１０Ｅ４、１０Ｈ１１、６Ｈ８、７Ａ５、７Ｇ９、９Ａ３、２Ａ１、２Ｅ５、４Ｅ４、４Ｈ４、８Ｂ４、２Ｇ２、および４Ｅ６（これらは全て、精製β６サブユニットに結合し得る（表５））が、実際に、パラフィン包埋されたβ６トランスフェクトＳＷ４８０細胞を強く染色し、一方、トランスフェクトされていない親細胞を染色しないことを示唆した（表６）。
【０１１１】
【表６】
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（実施例１１：癌の診断）
αｖβ６は、通常、健常成体組織において、無視し得るレベルから低いレベルで発現される。しかし、αｖβ６発現は、傷害、線維症、および癌においてアップレギュレートされる  （例えば、ＴｈｏｍａｓらＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １１７：６７−７３（２００１）；Ｂｒｕｎｔｏｎら，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ３：２１５−２２６（２００１）；Ａｇｒｅｚら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：９０−９７（１９９９）；Ｂｒｅｕｓｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １０８：２２４１−２２５１（１９９５）を参照のこと）。従って、パラフィン包埋組織上に発現される、αｖβ６に特異的に結合する抗体を標準的免疫組織化学技術において用いて、線維症、癌およびαｖβ６がアップレギュレートされる任意の他の疾患の診断のためにαｖβ６発現を検出し得る。
【０１１２】
上記のように、本発明の特定の抗体は、ＨＰＬＣで精製したβ６インテグリンおよびパラフィン包埋して固定したβ６トランスフェクト細胞に結合する。これらの抗体はまた、免疫染色において、代表的な扁平上皮組織および乳癌組織に結合することが示された。例えば、図８（ここで、モノクローナル抗体６．２Ａ１を用いて、パラフィ包埋した乳癌および扁平上皮癌の相対的染色を示す）を参照のこと。従って、これらの新たな抗体は、診断ツールとして有用である。
【０１１３】
（実施例１２：Ａｌｐｏｒｔマウスにおける抗αｖβ６ブロックｍＡｂの効果）
コラーゲン４Ａ３（ＣＯＬ４Ａ３）ノックアウト（Ａｌｐｏｒｔ）マウスは、腎臓線維症に関するインビボモデルとして確立されており、そして薬理学的薬剤の治療効果を試験するために用いられている（前出）。本発明者らは、ＡｌｐｏｒｔマウスにおいてｍＡｂ  ６．８Ｇ６（カチオン依存性）および６．３Ｇ９（カチオン非依存性）を試験して、これらが、７週齢のＡｌｐｏｒｔマウスにおいて通常観察される線維症を阻害するか否かを決定した。上記に示すように、これらの２つの抗体は、バイオアッセイにおいて、ＬＡＰに対するαｖβ６結合を阻害することおよびＴＧＦ−βの活性化を阻害することが見出された。抗体１Ｅ６を、ネガティブコントロールとして用いた。
【０１１４】
３週齢のＡｌｐｏｒｔマウスに、１週間に３回、以下の抗体のうちの１つの腹腔内注射を与えた：（１）６．８Ｇ６、４ｍｇ／ｋｇ（７匹のマウス）；（２）６．３Ｇ９、４ｍｇ／ｋｇ（４匹のマウス）；および（３）１Ｅ６、１ｍｇ／ｋｇ（６匹のマウス）。注射を４週間続けた。次いで、これらのマウスを屠殺し、これらの腎臓を取り出した。
【０１１５】
これらの腎臓のパラフィン包埋切片を上記の通りに作製し、次いで染色して、腎臓線維症における筋芽細胞およびマトリクス沈着のマーカーである、平滑筋アクチンを検出した。本発明者らは、１Ｅ６で処置したマウスと比較しての平滑筋アクチン染色における顕著な減少を、ｍＡｂ  ６．８Ｇ６または６．３Ｇ９で処置したＡｌｐｏｒｔマウス由来の腎臓の間質領域および糸球体領域の両方において見出した。
【０１１６】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、Ａｌｐｏｒｔ腎臓の糸球体領域および間質領域における平滑筋アクチン染色のドットプロットを示す。６．８Ｇ６で処置したＡｌｐｏｒｔマウスおよび６．３Ｇ９で処置したＡｌｐｏｒｔマウスの腎臓において、ネガティブコントロールの１Ｅ６処置マウスと比較して顕著に減少した平滑筋アクチン染色が存在した。
【０１１７】
（実施例１３：片側性尿管閉塞誘発性腎硬化症を予防する際の抗αｖβ６  ｍＡｂの有効性）
本発明者らは、腎線維症進行に関する別のマウスモデルを用いて、６．８Ｇ６および６．３Ｇ９の抗線維症効力を試験した。このマウスモデルでは、この動物の尿管を結紮し、片側性尿管閉塞（ＵＵＯ）をもたらした。ＵＵＯは、マウスにおいて近い将来の腎不全を引き起こさずに進行性腎硬化症を引き起こす。なぜなら、閉塞していない腎臓は、比較的正常な腎機能を維持し得るからである。閉塞した腎臓は迅速な全般的線維症を受ける一方で、閉塞していない腎臓は、順応性肥大を受ける。
【０１１８】
本研究は、ＵＵＯ誘発性腎線維症に対する抗αｖβ６処置の影響を体型測定的に定量した。雄性の８〜１２週齢のウイルス抗原を含まないＣ５７ＢＬマウス（体重２５．５±０．２ｇ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を用いた。これらのマウスを、本研究の開始前に７日間順応させた。これらのマウスは、順応期間および実験期間の間を通して、照射された標準的なマウス餌および滅菌水を自由に利用できた。体重を、動物の健康状態のモニタリングの一部として、間隔をおいて測定した。これらの結果は、齢が一致した未手術のマウスが、２週間の研究期間にわたって、約１０％の体重増加をすることを示した。ＵＵＯマウスは、２日目までに約９％の体重が減少したが、失った体重が１４日目までに徐々に再度増加した。この体重変化のパターンは、治療処置に関係なく生じた。
【０１１９】
腎線維症を誘発するために、左の尿管を、ケタミン：キシラジン（１００：１０ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）麻酔下での正中線左側の側腹切開によって無菌的に単離した。２本の堅固な閉鎖性６−０絹結紮糸を、尿管上に、腎臓の下極のレベルに配置し、そして尿管を結紮糸の間で切除した。腹部壁を４−０  Ｖｉｃｒｙｌ縫合糸で閉鎖し、そして皮膚を４−０ナイロンで閉鎖した。これらの動物を、加熱パッド上で回復させ、そして０．０５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．のブプレノルフィンを１日２回、０日目および１日目にを与えた。この手順は、Ｍａら，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５３（４）：９３７−９４４（１９９８）から適応させた。
【０１２０】
次いで、これらのマウスを、以下の研究群に分けた：
【０１２１】
【表７】
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５群における動物以外の全ての動物に、手術前日から開始して、週に２回投与した。
【０１２２】
次いで、これらの動物を、結紮後１０日目に二酸化炭素を用いて安楽死させ、そして切開した。ＵＵＯマウスでは、腎盂および尿管は顕著に腫脹しており、閉塞している結紮糸より上には液体が充填されていた。腫脹の程度および残りの腎臓組織量の程度は、処置群の間で変化した。２群は、ネガティブコントロール群の約半分の腫脹を示した。結紮した腎臓は、色が薄かった。反対側の腎臓は、明るい赤色であり、約３分の１拡大していた。
【０１２３】
次に、これらの動物の両方の腎臓（左を結紮し、右側を結紮しなかった）を取り出し、そして腎盂の中心を通るように横に半分に切った。各腎臓の半分を、固定組織染色のために１０％中性緩衝化ホルマリン中に配置した。各腎臓の他方の半分を、免疫組織化学染色のために、１５％スクロース、続いて３０％スクロース中に配置した。
【０１２４】
ホルマリン固定腎臓切片を、線維症のマーカーである、筋線維芽細胞（平滑筋アクチン）に関して免疫染色した。画像を、標準化した照明条件およびディジタルカメラ露出設定を用いて捕捉し、バックグラウンドに関して補正し、そして距離の標準に対して較正した。左腎臓切片全体を含む連続視野の画像を、定量のために各動物から撮影した。
【０１２５】
平滑筋アクチンを、測定した視野内の総組織面積のパーセントとして表現した。これらは、腎乳頭以外の切片由来の全ての皮質組織および髄質組織を含んでいた。
【０１２６】
結論として、６．３Ｇ９で処置したマウスおよび６．８Ｇ６で処置したマウスは、線維症における顕著な減少を示す。
【０１２７】
（実施例１４：マウスにおけるブレオマイシン誘発性肺線維症に対する抗αｖβ６ブロッキングｍＡｂの有効性）
マウスにおけるブレオマイシン誘発性肺線維症は、肺線維症に関するインビボモデルとして確立されており、そして薬理学的薬剤の治療効果を試験するために用いられている。炎症が、ブレオマイシン処置の５〜１５日後に通常明らかである。１２９系統マウスでは、肺線維症の程度は、ブレオマイシン処置６０日後まで徐々に増大する。マトリクス蓄積は、通常、１５日目あたりで検出可能になる。この例では、ｍＡｂ  ６．３Ｇ９を、０日目または１５日目に開始して、１週間に３回、ブレオマイシン誘発性肺線維症を有するマウス中に４ｍｇ／ｋｇ／用量の濃度で腹腔内注射した。肺線維症を、５０μｌの無菌生理食塩水中０．０３単位／ｋｇの濃度での１回の気管内用量のブレオマイシンの投与によって０日目に誘発した。これらの動物を３０日目に屠殺し、そして肺線維症の程度を評価した。抗体１Ｅ６を、ネガティブコントロールとして用いた。
【０１２８】
肺を各動物から収集し、そしてヒドロキシプロリン含有量を、Ｍｕｎｇｅｒら（前出）に記載される通りに、肺コラーゲン沈着指数として測定した。図１５Ａに示すように、０日目に開始した、６．３Ｇ９を用いた処置は、肺ヒドロキシプロリン含有量におけるブレオマイシン誘発性増加を有意に阻害した。重要なことに、６．３Ｇ９処置は、ブレオマイシン投与１５日後（コラーゲン沈着が既に始まった時点）に開始した場合、少なくとも同等に有効であった。
【０１２９】
本発明者らはまた、長期化したブレオマイシン誘発性線維症プロトコル（６０日間続く）において、より実質的な程度の肺線維症を阻害する際の６．３Ｇ９、カチオン依存性６．８Ｇ６、および非ブロッキング抗体６．４Ｂ４の効果を調べた。これを行うために、本発明者らは、ブレオマイシン投与後１５日目（１５日目）に抗体処置を開始した。次いで、肺を６０日目に収集して、ヒドロキシプロリン含有量を決定した。図１５Ｃに示すように、６．８Ｇ６を用いた処置は、ブレオマイシン誘発性線維症を有意に阻害した（ブレオマイシンおよび生理食塩水で処置した動物と比較して、ヒドロキシプロリン含有量の７０％を超える減少）。６．３Ｇ９を用いた処置はまた、防御の傾向を示したが、これらの結果は統計学的有意性には至らなかった（図１５Ｃ）。
【０１３０】
結論として、カチオン依存性抗αｖβ６ブロッキングｍＡｂおよびカチオン非依存性抗αｖβ６ブロッキングｍＡｂは両方とも、ブレオマイシンを用いて処置されたマウスにおいて肺線維症を減少させた。さらに、この介入は、抗体処置を線維症の最初の発症後まで開始しなかった場合でさえも有効であった。
【０１３１】
（実施例１５：ヒト乾癬損傷におけるαｖβ６のアップレギュレーション）
αｖβ６が乾癬に関与するか否かを決定するために、５人の乾癬患者および４人の正常個体由来のαｖβ６発現を損傷皮膚生検および損傷していない皮膚生検について調べた。ｍＡｂ  ６．２Ａ１免疫染色を用いて、本発明者らは、乾癬患者および正常コントロール由来の損傷していない皮膚と比較して、乾癬損傷におけるαｖβ６発現の顕著な増大を見出した。従って、乾癬損傷におけるαｖβ６のアップレギュレーションは、抗αｖβ６抗体の使用に関する診断的関連および治療的関連の両方を示唆する。
【０１３２】
（実施例１６：胆管疾患を有するマウスおよびヒトの肝臓におけるαｖβ６のアップレギュレーション）
以前に考察した通り、αｖβ６発現は、組織損傷に関連している。本研究において、αｖβ６の発現を、胆管疾患によって損傷を受けたマウスおよびヒトの肝臓において調査した。
【０１３３】
マウスにおける肝臓傷害を、胆管の結紮により誘発した。例えば、Ｇｅｏｒｇｅら，ＰＮＡＳ  ９６：１２７１９−２４（１９９９）；Ｇｅｏｒｇｅら，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５６：１１５−２４（２０００）を参照のこと。ｍＡｂ  ６．２Ｇ２を用いて、本発明者らは、αｖβ６の発現が、胆管結紮後９日目、１４日目および１６日目に有意に上昇することを見出した。
【０１３４】
同様に、胆管疾患を有する患者由来のヒト肝臓切片は、ｍＡｂ  ６．２Ｇ２を用いた免疫組織化学によって決定したところ、αｖβ６のアップレギュレートされた発現を示した。αｖβ６の上昇した発現は、例えば、急性胆汁うっ血を有する４４歳男性、急性胆管閉塞を有する手術後の５９歳男性、胆道閉鎖症を有する２２歳男性、および慢性胆管閉塞を有する２４歳男性に由来する肝臓サンプルにおいて観察された。
【０１３５】
まとめると、新たな抗αｖβ６抗体は、肝臓疾患に関する有用な診断ツールおよび治療ツールである。
【０１３６】
（実施例１７：種々のヒト癌におけるαｖβ６のアップレギュレーション）
インテグリンαｖβ６は、通常、無視し得るレベルから低いレベルで、健常な成体組織にいて発現される。種々のヒト腫瘍組織を、抗体６．２Ａ１および本明細書中に一般的に記載される方法を用いて、αｖβ６発現に関して評価した。これらの結果は、αｖβ６インテグリン発現が、いくつかのヒト上皮癌において顕著にアップレギュレートされることを示した。顕著なことに、免疫組織学は、αｖβ６が、多くの上皮癌において腫瘍島の縁部に特に顕著に発現されることを示した。上皮癌細胞におけるαｖβ６の発現をさらに研究するために、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞（咽頭癌）およびＳＣＣ−１４細胞（舌扁平上皮癌）ならびにＳＷ４８０β６細胞（前出）を、６．３Ｇ９および６．４Ｂ４で染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１３７】
図１２の右側は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）において６．３Ｇ９結合によって示された場合の、異なる腫瘍細胞株についてのαｖβ６発現を示す。黒塗りのピークは、６．３Ｇ９結合を示し、一方、白塗りのピークは、二次ｍＡｂ単独でのバックグラウンド結合を表す。図１２の左側の折れ線グラフは、漸増濃度の６．３Ｇ９または６．４Ｂ４による、ＬＡＰリガンドに対する腫瘍細胞株の結合の阻害を示す。６．４Ｂ４は、６．３Ｇ９と比較して、ＬＡＰに対するαｖβ６結合の、有意に効力が低いインヒビターであった（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２に関して１０倍を超えるＩＣ５０、ＳＷ４８０β６に関して３０倍を超えるＩＣ５０、そしてＳＣＣ−１４に関して１００倍を超えるＩＣ５０）。これは、以前のインビトロでの結果と一貫しており、６．３Ｇ９が強力なブロッキングｍＡｂであり、そして６．４Ｂ４が弱いブロッキングｍＡｂであることを示す。このデータはまた、Ｄｅｔｒｏｉｔ異種移植片モデルにおける６．４Ｂ４の無視し得る阻害活性と一貫している（図１４Ｂ）。図１３は、種々の抗αｖβ６  ｍＡｂによる、ＬＡＰに対する腫瘍細胞株の結合の相対的阻害をさらに示す。６．３Ｇ９および６．８Ｇ６は両方とも、等価な阻害活性を提示し（全ての以前のデータと一貫している）、一方、６．４Ｂ４は、ＬＡＰに対するαｖβ６結合の有意に効力の低いインヒビターであった。
【０１３８】
（実施例１８：ヒト腫瘍異種移植片モデルにおける抗αｖβ６ブロッキングｍＡｂの効果）
ヒト腫瘍異種移植片を移植した免疫不全動物（例えば、ヌードマウスおよびＳＣＩＤマウス）は、抗癌剤の治療効果を試験するための有用なインビボモデル系として確立されている（例えば、ｖａｎ  Ｗｅｅｒｄｅｎら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４３（４）：２６３−７１（２０００）；Ｂａｎｋｅｒｔら，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ７：ｃ４４−６２（２００２）を参照のこと）。従って、本発明のブロッキング抗αｖβ６モノクローナル抗体は、異種移植片モデルにおいて、腫瘍増殖を阻害する能力に関してインビボで試験され得る。この実験において、本発明者らは、新たなαｖβ６抗体のうちのいくつかを、癌性ヒト咽頭（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞株）異種移植片を移植した無胸腺ヌード雌性マウスにおいて、腫瘍増殖を阻害する能力に関して試験した。
【０１３９】
これを行うために、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞（ＡＴＣＣ）を、インビトロにおいて、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ならびに１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むように調整したＥａｒｌｅのＢＳＳ、ならびに１０％ウシ胎仔血清を含み抗生物質を含まない最小必須培地（Ｅａｇｌｅ）中で継代した。約５×１０６細胞／０．２ｍｌ培地（血清を含まない）を、ヌードマウスの右側腹部に皮下移植した。３〜４日後、腫瘍サイズの測定を開始し、腫瘍が約５ｍｍ（長さ）×５ｍｍ（幅）になるまで継続した。これらのマウスを無作為化し、そして１日目に試験抗体またはコントロール溶液を腹腔内注射し、続いて毎週３回、３３日間の期間にわたって注射した。試験抗体およびコントロール溶液は以下の通りであった：（１）６．３Ｇ９、１ｍｇ／ｋｇ、１０匹のマウス；（２）６．３Ｇ９、４ｍｇ／ｋｇ、１０匹のマウス；（３）６．３Ｇ９、１０ｍｇ／ｋｇ、１０匹のマウス；（４）６．４Ｂ４、１ｍｇ／ｋｇ、１０匹のマウス；（５）６．４Ｂ４、４ｍｇ／ｋｇ、１０匹のマウス；（６）６．４Ｂ４、１０ｍｇ／ｋｇ、１０匹のマウス；および（７）ビヒクルコントロール（ＰＢＳ）、０．２ｍｌ／マウス、３０匹のマウス。さらに、シスプラチンを、化学療法剤コントロールとして、１０匹のマウスに２ｍｇ／ｋｇ皮下注射した。シスプラチン注射を１日目、次いで２日毎に合計６回の処置で行った。３３日間の期間の終わりに、動物の体重および腫瘍サイズを測定し、αｖβ６発現を免疫組織学によって評価し、そして血清抗αｖβ６レベルを測定した。
【０１４０】
免疫組織学的染色は、移植した腫瘍細胞がαｖβ６をインビボで強く発現することを示した。腫瘍重量のデータはさらに、ブロッキングｍＡｂ  ６．３Ｇ９が、試験した全ての濃度において腫瘍増殖を有効に阻害することを示した（図１４Ａ）。対照的に、弱いブロッキングｍＡｂ  ６．４Ｂ４は、腫瘍増殖を阻害しなかった（図１４Ｂ）。
【０１４１】
まとめると、ブロッキング抗体は、処置したマウスにおいて、腫瘍増殖を４０％〜５０％阻害した。対照的に、弱いブロッキング抗αｖβ６抗体は、腫瘍増殖を阻害しなかった。
【０１４２】
（実施例１９：αｖβ６抗体のインターナリゼーション）
細胞によってインターナリゼーションされる抗体は、特定の臨床的適応症（例えば、癌）に関して利点を提供する。なぜなら、これらの抗体は、次いで、癌細胞を選択的に標的かして癌細胞の増殖を選択的に阻害するために、毒素、放射性化合物または他の抗癌剤と結合体化され得るからである。抗αｖβ６抗体がインターナリゼーションされる能力を、ＳＷ４８０β６（前出）およびＳＣＣ−１４細胞において試験した。
【０１４３】
細胞を１：５に分け、そして３７℃、５％  ＣＯ２における一晩のインキュベーションのために、４室ガラススライドにプレーティングした。翌日、ｍＡｂ  ６．８Ｇ６、６．１Ａ８、６．３Ｇ９、７．１Ｃ５、６．４Ｂ４、１０Ｄ５、および８Ｂ３を２０μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈した。これらのｍＡｂまたは培地単独を、適切なウェルに添加した。インターナリゼーションの時間経過を、０時間〜４８時間にて行った。含まれる時点は、０分間、５分間、１０分間および３０分間、ならびに１時間、４時間、２４時間および４８時間であった。二次抗体（抗マウス−Ａｌｅｘａ  ５９４）をネガティブコントロールとして添加した。インターナリゼーションを、抗体を除去し、そして細胞層を緩衝液で洗浄することにより各時点で停止させた。小麦胚芽凝集素−Ａｌｅｘａ−４８８を１８℃にて２０分間添加して、細胞の外側縁部を緑色蛍光により染色した。細胞を洗浄した後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液を１８℃にて２０分間添加し、そして細胞を同定および透過化した。細胞を再度洗浄し、そして二次抗マウス−Ａｌｅｘａ  ５９４（赤色蛍光）を１８℃にて２０分間添加して、結合またはインターナリゼーションされたαｖβ６抗体を標識した。次いで、これらの細胞を洗浄し、そして２％パラホルムアルデヒドの添加により固定し、そして共焦点顕微鏡法により調べた。次いで、Ｌｅｉｔｚ  Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ６３×（１．３２開口数、油（ａｉｌ）浸）対物レンズ（Ｌｅｉｃａ）を２×ディジタルズームにて用いて画像を得た。各フレームは、全ての条件下で、インターナリゼーションについて観察された細胞の中央セクションから単一の光学切片を提示した。核においては染色は観察されなかった。
【０１４４】
インターナリゼーションは、カチオン依存性ｍＡｂ（ＲＧＤ含有リガンド模倣物）（例えば、６．８Ｇ６および６．１Ａ８）に関して観察された。インターナリゼーションは、カチオン非依存性ｍＡｂ（例えば、６．３Ｇ９、７．１Ｃ５、および６．４Ｂ４）に関して観察されなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図５Ｃ−５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【配列表】
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