(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌性髄膜炎に対する免疫のための水性免疫原性組成物であって、該組成物は、被験体への投与後に、（ａ）髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の少なくとも血清群Ｗ１３５に対して殺菌性であり、かつ（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型疾患に対して防御性である、免疫応答を誘導し得、ここで、該組成物は、
（ｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；および
（ｉｉ）結合体化したインフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（「Ｈｉｂ」）莢膜サッカリド抗原
を含み、ここで、該Ｈｉｂ莢膜サッカリド抗原が、ＣＲＭ１９７ジフテリアトキシン変異体またはジフテリアトキソイドに結合体化され、該血清群Ｗ１３５サッカリドは、ジフテリアトキソイドに結合体化される、組成物。
【請求項２】
細菌性髄膜炎に対する免疫のための水性免疫原性組成物であって、該組成物は、被験体への投与後に、（ａ）髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の少なくとも血清群Ｗ１３５に対して殺菌性であり、かつ（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型疾患に対して防御性である、免疫応答を誘導し得、ここで、該組成物は、
（ｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；および
（ｉｉ）結合体化したＨｉｂ莢膜サッカリド抗原
を含み、ここで、該Ｈｉｂ莢膜サッカリド抗原が、ＣＲＭ１９７ジフテリアトキシン変異体またはジフテリアトキソイドに結合体化され、該血清群Ｗ１３５サッカリドはＣＲＭ１９７ジフテリアトキシン変異体に結合体化され、そして、該組成物は１用量につき＜３０μｇの髄膜炎菌サッカリドを含む、組成物。
【請求項３】
結合体化した血清群Ｃおよび血清群Ｙ、そして、必要に応じて血清群Ａ由来の莢膜サッカリド抗原をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
１以上の髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清群Ｂ由来のポリペプチド抗原をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記血清群Ｗ１３５サッカリドが３０未満の重合度を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
同じキャリアタンパク質が全ての血清群に使用される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記血清群Ｗ１３５サッカリドが１：５〜５：１のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記血清群Ｗ１３５サッカリドがリンカーを介して結合体化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記血清群Ｗ１３５サッカリドが直接結合体化される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
アジュバントを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
水酸化アルミニウムアジュバントを含まない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物であって、該組成物が、リン酸アルミニウムアジュバントを含む、組成物。
【請求項１３】
前記Ｈｉｂ抗原がリン酸アルミニウムに吸着される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記Ｈｉｂ抗原がリン酸アルミニウムに吸着されない、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記Ｈｉｂ抗原が最初に凍結乾燥される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
医薬として使用するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物であって、該医薬は、被験体における免疫応答を誘導する、組成物。
【請求項１７】
前記免疫応答が（ａ）髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも血清群Ｗ１３５に対して殺菌性であり、かつ（ｂ）インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型疾患に対して防御性である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫応答が、≧０．１５μｇ／ｍｌの抗ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）抗体の濃度の生成を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記結合体が１：５〜５：１のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
細菌性髄膜炎の処置または予防のための医薬の製造における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物の１以上の単位用量と、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
水性形態の請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
非経口注射に適した形態にパッケージングされた、請求項２１または請求項２２に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載される全ての文献は、それらの全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細菌性髄膜炎に対する免疫に関し、特に、複数の病原体によって引き起こされる細菌性髄膜炎に対する合わせた免疫に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、咽頭にコロニーを形成して髄膜炎（および時折、髄膜炎の不存在下で敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ））を引き起こす、非運動性のグラム陰性ヒト病原体である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、風土病および伝染病の両方を引き起こす。Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型（Ｈｉｂ）に対する結合体ワクチンの導入後、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、米国における細菌性髄膜炎の主な原因である。細菌性髄膜炎の原因である第３の病原体はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであるが、有効なワクチン（ＰｒｅｖＮａｒＴＭ［１（非特許文献１）］）が現在入手可能である。Ｈｉｂワクチンと同様に、肺炎球菌ワクチンは、結合体化した莢膜サッカリド抗原に基づく。
【０００４】
この生物の莢膜ポリサッカリドに基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺを含め、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの種々の血清群が同定されている。血清群Ａは、サハラ以南のアフリカにおける伝染病に最も頻繁に関与する病原体である。血清群Ｂおよび血清群Ｃは、米国および大部分の先進国における症例の大多数の原因である。血清群Ｗ１３５および血清群Ｙは、米国および先進国における残りの症例の原因である。莢膜ポリサッカリドは有効な防御免疫原であるが、各血清群は、別個のサッカリド抗原を必要とし、このアプローチは、血清群Ｂに対して免疫するためには不適切である。従って、血清群Ｃに対する結合体化サッカリドワクチン（ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ［２（非特許文献２）］，ＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ）に関連した近年の成功は、血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｗ１３５または血清群Ｙによって引き起こされる疾患には影響を有さない；これに対して、これらは、髄膜炎菌疾患の主な原因として、これらの血清群の出現に対する淘汰圧を表す。
【０００５】
血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｙおよび血清群Ｗ１３５由来の莢膜ポリサッカリドの注射可能四価ワクチンは、長年にわたって公知であり［３（非特許文献３），４（非特許文献４）］、ヒトでの使用に関して認可されている。このワクチンにおけるポリサッカリドは、結合体化されておらず、各精製ポリサッカリドが５０μｇで、１：１：１：１の重量比で存在する［５（非特許文献５）］。青春期および成人においては有効であるが、これは、乏しい免疫応答および短い保護持続期間を誘導し、乳児には使用できない［例えば、参考文献６（非特許文献６）］。さらに、このワクチンは、使用時に凍結乾燥形態からの再構成を必要とするという欠点を有する。
血清群Ｂについては、ワクチンはとらえどころがないことが証明されている。外膜小胞に基づくワクチンが試験されている［例えば、参考文献７（非特許文献７）］が、保護は代表的には、ワクチンを作製するために用いられた株に制限される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ＤａｒｋｅｓおよびＰｌｏｓｋｅｒ（２００２）Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｄｒｕｇｓ  ４：６０９−６３０
【非特許文献２】Ｊｏｎｅｓ（２００１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２：４７−４９
【非特許文献３】Ａｒｍａｎｄら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．１０：３３５−３３９
【非特許文献４】Ｃａｄｏｚら（１９８５）Ｖａｃｃｉｎｅ  ３：３４０−３４２
【非特許文献５】Ｂａｋｌａｉｃら（１９８３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４２：５９９−６０４
【非特許文献６】ＭＭＷＲ（１９９７）４６（ＲＲ−５）１−１０
【非特許文献７】Ｂｊｕｎｅら（１９９１）Ｌａｎｃｅｔ  ３３８（８７７５）：１０９３−９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、小児において髄膜炎菌血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対して防御するワクチン、ならびにまた、投与前に再構成を必要としないワクチンについての必要性が残っている。さらに、血清群Ｂに対して広範に防御するワクチンについての必要性が残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、これらの種々の必要性の全てを満たし、８種類の別々の知見に基づく。第１に、本発明者らは、髄膜炎菌血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ由来の結合体化莢膜サッカリドが、単回用量で組み合わせた場合、ヒトにおいて安全でかつ免疫原性であることを見出した。第２に、本発明者らは、血清群Ａ由来の結合体化莢膜サッカリドが添加される場合にこの効果が保持されることを見出した。第３に、本発明者らは、これらの結合体化した抗原が、凍結乾燥を必要とせずに、水性の単回用量において安定に組み合わされ得ることを見出した。第４に、本発明者らは、血清群Ｂ感染に対する広い保護が、少数の規定ポリペプチド抗原を用いることによって達成され得ることを見出した。第５に、本発明者らは、これらのポリペプチド抗原が、５つの血清群のいずれの防御効力をも損失することなく、サッカリド抗原と組み合わされ得ることを見出した。第６に、本発明者らは、Ｈｉｂ結合体が添加される場合でさえも効力が保持されることを見出した。第７に、本発明者らは、血清群Ｗ１３５結合体の効力が、血清群Ｂ株由来のタンパク質抗原の添加によって増強されることを見出した。最後に、本発明者らは、髄膜炎菌結合体へのＨｉｂ結合体の添加が、血清群Ｗ１３５の髄膜炎菌に対する全体的活性を増強することを見出した。
本発明は例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
被験体への投与後に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対して殺菌性である免疫応答を誘導し得る、水性免疫原性組成物であって、該組成物は、（ｉ）結合体化した血清群Ｃ莢膜サッカリド抗原；（ｉｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；（ｉｉｉ）結合体化した血清群Ｙ莢膜サッカリド抗原；および（ｉｖ）血清群Ｂ由来の１以上のポリペプチド抗原を含む、組成物。
（項目２）
（ｖ）結合体化した血清群Ａ莢膜サッカリド抗原をさらに含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記血清群Ａ莢膜サッカリドが、そのモノサッカリド単位の少なくとも２０％は３位および４位のいずれかに−ＯＨを有さないように改変される、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記組成物が、３７℃にて２８日間保存され得、この期間の後、結合体化したＭｅｎＡサッカリドの初期合計量の２０％未満が結合されていない、項目２または項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記結合体化したサッカリドがオリゴサッカリドである、項目１〜項目４のいずれかに記載の組成物。
（項目６）
前記サッカリドが、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ、およびＣＲＭ１９７から選択されるキャリアタンパク質に結合体化される、項目１〜項目５のいずれかに記載の組成物。
（項目７）
前記組成物が、１〜１０の規定された血清群Ｂポリペプチド抗原をさらに含み、該組成物が、少数の超毒性系統Ａ４、ＥＴ  ５およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの系統３に対して殺菌性である免疫応答を誘導し得る、項目１〜項目６のいずれかに記載の組成物。
（項目８）
以下の５つの抗原：（ｉ）オリゴマー形態の「ＮａｄＡ」タンパク質；（ｉｉ）「７４１」タンパク質；（ｉｉｉ）「９３６」タンパク質；（ｉｖ）「９５３」タンパク質；および（ｖ）「２８７」タンパク質のうちの１以上を含む、項目７に記載の組成物。
（項目９）
配列番号２のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド；配列番号７のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド；および配列番号８のアミノ酸配列を含む第３ポリペプチドを含む、項目８に記載の組成物。
（項目１０）
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型（Ｈｉｂ）に対して防御するサッカリド抗原をさらに含む、項目１〜項目９のいずれかに記載の組成物。
（項目１１）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対して防御する抗原をさらに含む、項目１〜項目１０のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）
リン酸アルミニウムアジュバントを含む、項目１〜項目１１のいずれかに記載の組成物。
（項目１３）
気密シールした容器に包装された、項目１〜項目１２のいずれかに記載の組成物。
（項目１４）
前記容器がバイアルまたは注射器である、項目１３に記載の組成物。
（項目１５）
医薬として使用するための、項目１〜項目１４のいずれかに記載の組成物。
（項目１６）
哺乳動物において免疫応答を惹起するための医薬の製造における、（ｉ）結合体化した血清群Ｃ莢膜サッカリド抗原；（ｉｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；（ｉｉｉ）結合体化した血清群Ｙ莢膜サッカリド抗原；（ｉｖ）血清群Ｂ由来の１以上のポリペプチド抗原；および必要に応じて（ｖ）結合体化した血清群Ａ莢膜サッカリド抗原の使用。
（項目１７）
哺乳動物において抗体応答を惹起するための方法であって、該哺乳動物に項目１〜項目１５のいずれかに記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目１８）
水性免疫原性組成物であって、該組成物は、被験体への投与後に、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも血清群Ｗ１３５に対して殺菌性であり、そして（ｂ）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型疾患に対して防御性である、免疫応答を誘導し得、ここで、該組成物は、（ｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；（ｉｉ）結合体化したＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型莢膜サッカリド抗原を含む、組成物。
（項目１９）
血清群Ｃおよび血清群Ｙ、必要に応じて血清群Ａ由来の結合体化した莢膜サッカリド抗原をさらに含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の血清群Ｂ由来の１以上のポリペプチド抗原をさらに含む、項目１８または項目１９に記載の組成物。
【０００９】
従って、本発明は、被験体への投与後に、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対して殺菌性である免疫応答を誘導し得る、水性免疫原性組成物を提供し、ここで、この組成物は、以下を含む：（ｉ）結合体化した血清群Ｃ莢膜サッカリド抗原；（ｉｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；（ｉｉｉ）結合体化した血清群Ｙ莢膜サッカリド抗原；および（ｉｖ）血清群Ｂ由来の１以上のポリペプチド抗原。この水性組成物はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａに対して殺菌性である免疫応答を誘導し得、従ってさらに（ｖ）結合体化した血清群Ａ莢膜サッカリド抗原を含み得る。
【００１０】
本発明はまた、被験体への投与後に、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの少なくとも血清群Ｗ１３５に対して殺菌性であり、そして（ｂ）Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型疾患に対して防御性である、免疫応答を誘導し得る水性免疫原性組成物を提供し、ここで、この組成物は、（ｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；（ｉｉ）結合体化したＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ型莢膜サッカリド抗原を含む。この組成物は、血清群Ｃおよび血清群Ｙ、必要に応じて血清群Ａ由来の結合体化した莢膜サッカリド抗原をさらに含み得る。この組成物はさらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の血清群Ｂ由来のポリペプチド抗原を含み得る。
【００１１】
好ましいサッカリド抗原はオリゴサッカリドである。
【００１２】
（血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ）
莢膜ポリサッカリドを髄膜炎菌から調製するための技術は、長年にわたって公知であり、代表的には、以下の工程を含むプロセスを含む：（例えば、カチオン性界面活性剤を用いる）ポリサッカリド沈澱、エタノール分画、（タンパク質を除去するための）冷フェノール抽出および（ＬＰＳを除去するための）超遠心分離［例えば、参考文献８を参照のこと］。
【００１３】
より好ましいプロセス［９］は、ポリサッカリド沈澱、続いて低級アルコールを用いた沈澱したポリサッカリドの可溶化を含む。沈澱は、カチオン性界面活性剤（例えば、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）またはヘキサジメトリンブロミド（ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  ｂｒｏｍｉｄｅ）塩およびミリスチルトリメチルアンモニウム塩）を用いて達成され得る。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）は、特に好ましい［１０］。沈澱した物質の可溶化は、低級アルコール（例えば、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなど）を用いて達成され得るが、ＣＴＡＢ−ポリサッカリド複合体を可溶化するためにはエタノールが特に適切である。エタノールは、（エタノールおよび水の総含量に基づいて）５０％と９５％との間の最終エタノール濃度になるように、沈澱したポリサッカリドに添加され得る。
【００１４】
再可溶化後、このポリサッカリドは、夾雑物を除去するためにさらに処理され得る。微量の夾雑物でさえも受け入れられない状況（例えば、ヒトのワクチン生産）では、これは特に重要である。これは代表的に、１以上の濾過工程（例えば、深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、活性炭を通した濾過が用いられ得る、サイズ濾過および／または限外濾過）を含む。
【００１５】
一旦濾過されて夾雑物が除去されると、ポリサッカリドは、さらなる処理および／または加工のために沈澱され得る。これは、（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加により）カチオンを交換することにより、便利に達成され得る。
【００１６】
精製後、莢膜サッカリドは、以下に記載される通り、キャリアタンパク質に結合体化される。
【００１７】
髄膜炎菌サッカリドの精製および結合体化のためのさらなる方法および代替方法は、参考文献１１および参考文献１２に開示される。
【００１８】
精製に対する代替法として、本発明の莢膜サッカリドは、全合成または部分合成によって入手され得る。例えば、Ｈｉｂ合成は、参考文献１３に開示され、そしてＭｅｎＡ合成は参考文献１４に開示される。
【００１９】
サッカリドは、化学的に改変され得、例えば、Ｏ−アセチル化または脱Ｏ−アセチル化され得る。任意のこのような脱−Ｏ−アセチル化または超アセチル化は、このサッカリド中の特定の位置に存在し得る。例えば、大部分の血清群Ｃ株は、Ｏ−アセチル基をシアル酸残基のＣ−７位および／またはＣ−８位に有するが、臨床単離株の約１５％は、これらのＯ−アセチル基を欠く［１５，１６］。このアセチル化は、防御効力に影響を与えるようには見えない（例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ製品とは異なり、ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ製品は、脱Ｏ−アセチル化サッカリドを使用するが、両方のワクチンが有効である）。血清群Ｗ１３５のサッカリドは、シアル酸−ガラクトースジサッカリド単位のポリマーである。血清群Ｙのサッカリドは、ジサッカリド反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むこと以外は、血清群Ｗ１３５のサッカリドに類似する。血清群Ｃのサッカリドのように、ＭｅｎＷ１３５サッカリドおよびＭｅｎＹサッカリドは、種々のＯ−アセチル化を有するが、シアル酸の７位および９位に有する［１７］。任意のこのような化学的改変は好ましくは、結合体化の前に起こるが、あるいは、またはさらに、結合体化の間に起こり得る。
【００２０】
異なる血清群由来のサッカリドは、好ましくは別々に精製され、次いで結合体化の前または後のいずれかに合わされ得る。
【００２１】
（血清群Ａ）
本発明の組成物は、結合体化した血清群Ａ莢膜サッカリド抗原を含み得る。このサッカリドは、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて（上記を参照のこと）と同じように、精製および結合体化され得るが、これは、構造的に異なる−一方、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの莢膜は、周囲のシアル酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、ＮｅｕＡｃ）に基づき、血清群Ａの莢膜はＮ−アセチル−マンノサミンに基づき、Ｎ−アセチル−マンノサミンは、天然のシアル酸前駆体である。血清群Ａのサッカリドは、特に加水分解感受性であり、水性媒体中でのその不安定性は、（ａ）血清群Ａに対する液体ワクチンの免疫原性が経時的に減少すること、および（ｂ）サッカリド加水分解産物のワクチン中への放出に起因して、品質制御がより困難であることを意味する。
【００２２】
ネイティブなＭｅｎＡ莢膜サッカリドは、（α１→６）結合型Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーであり、Ｃ３およびＣ４に部分的Ｏ−アセチル化を有する。主なグリコシド結合は、Ｃ１のヘミアセタール基およびＤ−マンノサミンのＣ６のアルコール基を含む１−６ホスホジエステル結合である。平均鎖長は９３モノマーである。これは、以下の式を有する：
【００２３】
【化１】
0005618842.tif 000002
本発明者らは、ネイティブな血清群Ａサッカリドの免疫原性活性を保持するが、水中でずっと安定である改変サッカリド抗原を調製した。モノサッカリド単位の３位の炭素および４位の炭素に結合した基は、ブロッキング基によって置換される［参考文献１８］。
【００２４】
ヒドロキシルの代わりにブロッキング基を有するモノサッカリド単位の数は、変動し得る。例えば、全てまたは実質的に全てのモノサッカリド単位は、ブロッキング基を有し得る。あるいは、モノサッカリド単位の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、ブロッキング基を有し得る。少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９または少なくとも３０のモノサッカリド単位は、ブロッキング基を有し得る。
【００２５】
同様に、モノサッカリド単位上のブロッキング基の数は、変動し得る。例えば、任意の特定のモノサッカリド単位の数は、１または２であり得る。
【００２６】
末端モノサッカリド単位は、そのネイティブヒドロキシルの代わりにブロッキング基を有しても有さなくてもよい。さらなる反応（例えば、結合体化）のためのハンドルを提供するために、遊離のアノマー性ヒドロキシル基を末端モノサッカリド単位に保持することが好ましい。アノマー性ヒドロキシル基は、（例えば、ＮａＢＨ３ＣＮ／ＮＨ４Ｃｌを用いる）還元的アミノ化によってアミノ基（−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｅ、ここでＥは窒素保護基）に変換され得、次いで他のヒドロキシル基がブロッキング基に変換された後に再生され得る。
【００２７】
ヒドロキシル基を置換するためのブロッキング基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応によって、すなわち、ヒドロキシル基の水素原子を別の基に置き換えることによって、直接的にアクセス可能であり得る。ブロッキング基として作用するヒドロキシル基の適切な誘導体は、例えば、カルバメート、スルホネート、カルボネート、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）およびアセタールである。このようなブロッキング基のいくつかの具体例は、アリル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰなどである。直接的にはアクセス可能でなく、ヒドロキシル基を完全に置き換える他のブロッキング基としては、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキル、ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は、以下の段落で定義される）、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＣｌ３などが挙げられる。
【００２８】
好ましいブロッキング基は、以下の式のものである：−Ｏ−Ｘ−Ｙまたは−ＯＲ３、ここで：ＸはＣ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）またはＳＯ２であり；ＹはＣ１−１２アルキル、Ｃ１−１２アルコキシ、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、これらの各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣｌ３から独立して選択される１、２または３個の基で必要に応じて置換され得るか；あるいはＹは、ＮＲ１Ｒ２であり；Ｒ１およびＲ２は、Ｈ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−ｌ２アリール−Ｃ１−６アルキルから独立して選択されるか；またはＲ１およびＲ２は一緒になって、Ｃ３−１２飽和複素環式基を形成し得；Ｒ３は、Ｃ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルであり、これらの各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣｌ３から１、２または３個の基で必要に応じて置換され得るか；あるいはＲ３は、Ｃ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、これらの各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣ１３から選択される１、２、３、４または５個の基で必要に応じて置換され得る。Ｒ３が、Ｃ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルである場合、これは代表的に、上記に定義した通りの１、２または３個の基で置換される。Ｒ１およびＲ２が一緒になってＣ３−１２飽和複素環式基を形成する場合、Ｒ１およびＲ２が窒素原子と一緒になって、３と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含む飽和複素環式環を形成することが意図される。この複素環式基は、窒素原子以外に１または２個のヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を含み得る。Ｃ３−１２飽和複素環式基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジル、アゼチジニルおよびアジリジニルである。
【００２９】
ブロッキング基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ３は、標準的誘導体化手順（例えば、ヒドロキシル基とアシルハライド、アルキルハライド、スルホニルハライドなどとの反応）により−ＯＨ基から調製され得る。それゆえ、−Ｏ−Ｘ−Ｙにおける酸素原子は好ましくは、ヒドロキシル基の酸素原子であり、一方、−Ｏ−Ｘ−Ｙにおける−Ｘ−Ｙ基は好ましくは、ヒドロキシル基の水素原子と置き換わる。
【００３０】
あるいは、このブロッキング基は、置換反応（例えば、Ｍｉｔｓｏｎｏｂｕ型置換）によって接近可能であり得る。ヒドロキシル基からブロッキング基を調製するこれらの方法および他の方法は、周知である。
【００３１】
より好ましくは、ブロッキング基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３［１９］、またはカルバメート基−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２であり、ここでＲ１およびＲ２は、Ｃ１−６アルキルから独立して選択される。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、両方ともメチルである、すなわち、ブロッキング基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ２である。カルバメートブロッキング基は、グリコシド結合に対して安定化効果を有し、穏やかな条件下で調製され得る。
【００３２】
好ましい改変ＭｅｎＡサッカリドは、ｎ個のモノサッカリド単位を含み、ここで、モノサッカリド単位の少なくともｈ％は、３位および４位の両方において−ＯＨ基を有さない。ｈの値は、２４以上（例えば、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００）であり、好ましくは５０以上である。存在しない−ＯＨ基は、好ましくは上記に定義した通りのブロッキング基である。
【００３３】
他の好ましい改変ＭｅｎＡサッカリドは、モノサッカリド単位を含み、ここで、モノサッカリド単位少なくともｓ個は、３位に−ＯＨを有さず、４位に−ＯＨを有さない。ｓの値は、少なくとも１（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０）である。存在しない−ＯＨ基は、好ましくは上記に定義した通りのブロッキング基である。
【００３４】
本発明での使用に適切な改変ＭｅｎＡサッカリドは、以下の式を有する：
【００３５】
【化２】
0005618842.tif 000003
ここで、ｎは、１〜１００の整数（好ましくは、５〜２５、より好ましくは１５〜２５の整数）であり；
Ｔは式（Ａ）または（Ｂ）であり：
【００３６】
【化３】
0005618842.tif 000004
各Ｚ基は、ＯＨまたは上記で定義した通りのブロッキング基から独立して選択され；そして
各Ｑ基は、ＯＨまたは上記で定義した通りのブロッキング基から独立して選択され；
Ｙは、ＯＨまたは上記で定義した通りのブロッキング基から選択され；
Ｅは、Ｈまたは窒素保護基であり；ここでＱ基の約７％より多く（例えば、８％、９％、１０％以上）がブロッキング基である。
【００３７】
ｎ＋２個のＺ基の各々は、互いに同じであっても異なっていてもよい。同様に、ｎ＋２個のＱ基の各々は、互いに同じであっても異なっていてもよい。Ｚ基の全ては、ＯＨであってもよい。あるいは、Ｚ基の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％は、ＯＡｃであってもよい。好ましくは、Ｚ基の約７０％はＯＡｃであり、Ｚ基の残りはＯＨまたは上記で定義したブロッキング基である。Ｑ基の少なくとも約７％は、ブロッキング基である。好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または１００％までもがブロッキング基である。
【００３８】
好ましいブロッキング基は、電子吸引基である。理論によって束縛されることを望まないが、グリコシド結合が、グリコシド結合におけるサッカリドヒドロキシル基の分子内求核攻撃からの補助に起因して（すなわち、環状中間体の形成によって）、加水分解に不安定であると考えられる。ヒドロキシル基の求核性が高くなるほど、分子内求核攻撃の傾向が高くなる。電子吸引ブロッキング基は、酸素孤立電子対を脱局在化し、それによって酸素求核性を低減して分子内求核攻撃の傾向を低下させる効果を有する。
【００３９】
それゆえ、血清群Ａを保護するために、水性組成物は、上記に定義した通りのＭｅｎＡ改変サッカリドを含み得る。
【００４０】
本発明の好ましい組成物は、３７℃にて２８日間保存され得、その期間の後、結合体化したＭｅｎＡサッカリドの初期合計量のｆ％未満が未結合であり、ここでｆは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５またはそれ未満である。
【００４１】
（共有結合体化）
本発明の組成物における莢膜サッカリドは、通常、キャリアタンパク質へと結合体化される。一般に、結合体化は、サッカリドの免疫原性を増強する。なぜなら、これらをＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原へと変換し、従って免疫記憶をプライミングさせるからである。結合体化は、小児用ワクチンに特に有用であり、周知の技術である［例えば、参考文献２０〜２９に概説される］。
【００４２】
好ましいキャリアタンパク質は、細菌性トキシンまたは細菌性トキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドもしくは破傷風トキソイド）、またはＣＲＭ１９７ジフテリアトキシン変異体［３０〜３２］である。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［３３］、合成ペプチド［３４，３５］、熱ショックタンパク質［３６，３７］、百日咳菌タンパク質［３８，３９］、サイトカイン［４０］、リンホカイン［４０］、ホルモン［４０］、増殖因子［４０］、種々の病原体由来抗原由来の複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［４１］（例えば、Ｎ１９タンパク質［４２］）、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のプロテインＤ［４３，４４］、ニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）［４５］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［４６］、鉄取り込みタンパク質［４７］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来のトキシンＡまたはトキシンＢ［４８］、変異体細菌毒素（例えば、コレラ毒素「ＣＴ」またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素「ＬＴ」（例えば、Ｇｌｕ−２９における置換を有するＣＴ［４９］））などが挙げられる。好ましいキャリアは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅプロテインＤ、特にＣＲＭ１９７である。
【００４３】
本発明の組成物内で、例えば、キャリア抑制の危険性を減らすために、１種より多いキャリアタンパク質を使用することが可能である。従って、異なるキャリアタンパク質が、異なる血清群のために使用され得る（例えば、血清群Ａサッカリドは、ＣＲＭ１９７に結合され得、一方、血清群Ｃサッカリドは、破傷風トキソイドに結合体化され得る）。特定のサッカリド抗原のために１種より多いキャリアタンパク質を使用することもまた、可能である（例えば、血清群Ａサッカリドは、２種の群で存在し得、いくつかは、ＣＲＭ１９７に結合体化され得、そして、その他は、破傷風トキソイドに結合体化され得る）。しかし、一般的に、すべての血清群について同じキャリアタンパク質を使用することが好ましく、ＣＲＭ１９７は好ましい選択である。
【００４４】
単一のキャリアタンパク質は、１種より多いサッカリド抗原を保有し得る［５０］。例えば、単一のキャリアタンパク質は、血清群Ａ由来のサッカリドおよび血清群Ｃ由来のサッカリドに結合体化していてもよい。この目的を達成するために、サッカリドは、結合体化反応の前に混合され得る。しかし、一般的に、各々の血清群に対して別々の結合体を有することが好ましい。
【００４５】
１：５（すなわち、タンパク質過剰）と５：１（すなわち、サッカリド過剰）との間のサッカリド：タンパク質比（ｗ／ｗ）を有する結合体が、好ましい。１：２と５：１との間の比が好ましく、１：１．２５と１：２．５との間の比がより好ましい。過剰なキャリアタンパク質は、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＣについて好適であり得る。
【００４６】
結合体は、遊離のキャリアタンパク質とともに使用され得る［５１］。所定のキャリアタンパク質が、本発明の組成物において遊離形態および結合体化形態の両方で存在する場合、非結合体化形態は、好ましくは、全体として、この組成物におけるキャリアタンパク質総量の５重量％以下であり、そしてより好ましくは、２重量％未満で存在する。
【００４７】
必要な場合は任意の適切なリンカーを用いて、任意の適切な結合体化反応が使用され得る。
【００４８】
このサッカリドは、代表的に、結合体化前に活性化されるかまたは官能基化される。活性化は、例えば、シアン化試薬（例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート［５２，５３など］））を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する；参考文献２７のイントロダクションもまた参照のこと。
【００４９】
リンカー基を介した結合が、任意の公知の手順（例えば、参考文献５４および参考文献５５に記載の手順）を用いて作製され得る。結合の１種は、ポリサッカリドを還元的アミノ化すること、得られるアミノ基をアジピン酸リンカー基の一端とカップリングすること、次いで、タンパク質をアジピン酸リンカー基の他端とカップリングすることを含む［２５，５６，５７］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［５８］、ニトロフェニル−エチルアミン［５９］、ハロアシルハライド［６０］、グリコシド結合［６１］、６−アミノカプロン酸［６２］、ＡＤＨ［６３］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［６４］などが挙げられる。リンカーの使用の代替としては、直接結合が使用され得る。タンパク質への直接結合は、ポリサッカリドの酸化、その後のタンパク質による還元的アミノ化（例えば、参考文献６５および参考文献６６に記載される通り）を含み得る。
【００５０】
このサッカリドへのアミノ基の導入（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ２に置換することによる）、その後のアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化およびキャリアタンパク質との反応を含むプロセスが、好ましい。別の好ましい反応は、例えば、ＭｅｎＡまたはＭｅｎＣについてのプロテインＤキャリアを用いたＣＤＡＰ活性化を使用する。
【００５１】
結合体化後、遊離のサッカリドおよび結合体化されたサッカリドは、分離され得る。多くの適切な方法が存在し、これらの方法としては、疎水性クロマトグラフィー、接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる［参考文献６７および６８などもまた参照のこと］。
【００５２】
本発明の組成物が、結合体化されたオリゴサッカリドを含む場合、オリゴサッカリド調製が結合体化の前に行われることが好ましい。
【００５３】
結合体化後、本発明の方法は、結合体化していないキャリアタンパク質のレベルを測定する工程を包含し得る。この測定を行う１つの方法は、キャピラリー電気泳動［６９］（例えば、遊離溶液中）またはミセル界面動電（ｍｉｃｅｌｌａｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）クロマトグラフィー［７０］を含む。
【００５４】
結合体化後、本発明の方法は、結合体化していないサッカリドのレベルを測定する工程を包含し得る。この測定を行う１つの方法は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ［６７］を含む。
【００５５】
結合体化後、本発明の方法は、結合体化したサッカリドを結合体化していないサッカリドから分離する工程を包含し得る。これらのサッカリドを分離する１つの方法は、１つの成分を選択的に沈澱させる方法を使用することである。結合体化していないサッカリドを溶液中に残すために、例えば、デオキシコレート処理［６７］による、結合体化したサッカリドの選択的沈澱が好ましい。
【００５６】
結合体化後、本発明の方法は、結合体の分子の大きさおよび／またはモル量を測定する工程を包含し得る。特に、分布が測定され得る。これらの測定を行う１つの方法は、多角度光散乱測光法（ｍｕｌｔｉａｎｇｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）および示差屈折率測定法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙ）（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ／ＲＩ）［７１］による検出を用いるサイズ排除クロマトグラフィーを含む。
【００５７】
（オリゴサッカリド）
莢膜サッカリドは、一般的に、オリゴサッカリドの形態で使用される。これらは、精製莢膜ポリサッカリドの（例えば、加水分解による）フラグメント化により都合よく形成され、通常、その後に、所望される大きさのフラグメントが精製される。
【００５８】
ポリサッカリドのフラグメント化は、好ましくは、オリゴサッカリドにおいて３０未満（例えば、血清群Ａについては、１０と２０との間、好ましくは、約１０；血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについては、１５と２５との間、好ましくは、約１５〜２０；血清群Ｃについては、１２と２２との間；など）の最終平均重合度（ＤＰ）を与えるように実施される。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色定量アッセイ［７２］により、都合よく測定され得る。
【００５９】
加水分解が実施される場合、その加水分解物は、一般的に、短い長さのオリゴサッカリドを除去するために、大きさが調整される［７３］。これは、種々の方法（例えば、限外濾過、その後のイオン交換クロマトグラフィー）により達成され得る。血清群Ａについては、約６以下の重合度を有するオリゴサッカリドが好ましくは除去され、そして血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについては、約４未満の重合度を有するオリゴサッカリドが好ましくは、除去される。
【００６０】
サッカリドの化学的加水分解は一般に、当該分野で標準的である条件下での酸または塩基のいずれかでの処理を含む。莢膜サッカリドのそれらの構成モノサッカリドへの脱重合のための条件は、当該分野で公知である。１つの脱重合方法は、過酸化水素の使用を含む［１１］。過酸化水素は、サッカリドに（例えば、１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度を与えるように）添加され、次いで所望の鎖長の減少が達成されるまで、混合物が（例えば、約５５℃で）インキュベートされる。経時的な減少は、混合物からサンプルを取り出し、次いでこのサンプル中のサッカリドの（平均）分子サイズを測定することによって追跡され得る。次いで、一旦所望の鎖長に達したら、脱重合は、迅速な冷却によって停止され得る。
【００６１】
（血清群Ｂ）
病原体（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ジフテリアおよび破傷風）に対するワクチンは、代表的に単一のタンパク質抗原（例えば、ＨＢＶ表面抗原または破傷風トキソイド）を含む。対照的に、無細胞百日咳ワクチンは代表的に、少なくとも３種のＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓタンパク質を含み、そしてＰｒｅｖＮａｒＴＭ肺炎球菌ワクチンは、７種類の別個の結合体化サッカリド抗原を含む。他のワクチン（例えば、細胞性百日咳ワクチン、麻疹ワクチン、不活化ポリオワクチン（ＩＰＶ）および髄膜炎菌ＯＭＶワクチン）は、まさにその性質から、多数の抗原の複雑な混合物である。それゆえ、１種の抗原、少数の規定された抗原、または規定されていない抗原の複雑な混合物によって防御が惹起され得るか否かは、問題となっている病原体に依存する。
【００６２】
上記で言及した通り、血清群Ｂの髄膜炎菌に対するワクチンは、逃げられやすい（ｅｌｕｓｉｖｅ）ことが証明されている。ＯＭＶに基づくワクチンは、狭い効力を示す。さらに、ＯFF2DＶ中に存在する規定されていない多数の抗原は、それらの可変の性質と合わせて、ＯＭＶが種々の品質制御の問題を有することを意味する。
【００６３】
本発明者らは、血清群Ｂ感染に対する広い防御が達成され得ること、および少数の規定された血清群Ｂポリペプチド抗原を用いることによってこれが達成され得ることを見出した。それゆえ、本発明の組成物は、この組成物が、２以上（すなわち、２または３）の超毒性（ｈｙｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｔ）系統Ａ４、ＥＴ−５およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの系統３に対して殺菌性である免疫応答を誘導し得るように、１以上のポリペプチド抗原を含む。
【００６４】
髄膜炎菌血清群Ａ［７４］および髄膜炎菌血清群Ｂ［７５，７６］についてのゲノム配列が報告されており、そして適切な抗原が、これらのコードされるポリペプチドから選択され得る［例えば、参考文献７７〜８２］。候補抗原を操作して、異種発現が改善されている［参考文献８３〜８５］。
【００６５】
１つの好ましい組成物は、Ｔｂｐタンパク質およびＨｓｆタンパク質を含む［８６］。Ｈｓｆは、自己トランスポーター（ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）タンパク質であり［８７−８９］、ｎｈｈＡ［８９］、ＧＮＡ０９９２［７７］またはＮＭＢ０９９２［７５］としても公知である。Ｔｂｐは、トランスフェリン結合タンパク質であり［９０〜９３］、ＴｂｐＡおよびＴｂｐＢの両方、ならびにＴｂｐＡおよびＴｂｐＢの高分子量形態および低分子量形態を包含する。Ｔｂｐは、上記の個々のタンパク質およびこれらのタンパク質の複合体、ならびにトランスフェリンを結合し得る、他の任意のタンパク質およびそれらの複合体を包含する。ＴｂｐはＴｂｐＡまたはＴｂｐＢの高分子形態または低分子形態のいずれをも言及し得るが、高分子量形態および低分子量形態の両方のＴｂｐＡおよび／またはＴｂｐＢが存在することが好ましい。最も好ましくは、高分子量および低分子量のＴｂｐＡが存在する。
【００６６】
別の好ましい組成物は、血清群Ｂリポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）［９４］を包含する。ＬＯＳは、血清群Ｂポリペプチドに加えて用いられてもよく、またはその代わり／それらの代わりに用いられてもよい。
【００６７】
別の好ましい組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ内の異なる機能を有する少なくとも２つの異なるカテゴリーのタンパク質の各々から選択された少なくとも１つの抗原を含む。このようなカテゴリーのタンパク質の例としては、以下が挙げられる：付着因子、自己トランスポータータンパク質、毒素、内在性外膜タンパク質および鉄捕獲タンパク質（ｉｒｏｎ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。これらの抗原は、参考文献９５の命名法を用いて、以下の通りに選択され得る：ＦｈａＢ、ＮｓｐＡ  ＰｉｌＣ、Ｈｓｆ、Ｈａｐ、ＭａｆＡ、ＭａｆＢ、Ｏｍｐ２６、ＮＭＢ０３１５、ＮＭＢ０９９５、ＮＭＢ１１１９およびＮａｄＡからなる群より選択される少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ付着因子；Ｈｓｆ、Ｈａｐ、ＩｇＡプロテアーゼ、ＡｓｐＡ、およびＮａｄＡからなる群より選択される少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ自己トランスポーター；ＦｒｐＡ、ＦｒｐＣ、ＦｒｐＡ／Ｃ、ＶａｐＤ、ＮＭ−ＡＤＰＲＴ（ＮＭＢ１３４３）およびＬＰＳ免疫型Ｌ２およびＬＰＳ免疫型Ｌ３のいずれかまたは両方からなる群より選択される少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ毒素；ＴｂｐＡ、ＴｂｐＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＨｐｕＡ、ＨｐｕＢ、Ｌｉｐｏ２８（ＧＮＡ２１３２）、Ｓｉｂｐ、ＮＭＢ０９６４、ＮＭＢ０２９３、ＦｂｐＡ、Ｂｃｐ、ＢｆｒＡ、ＢｆｒＢおよびＰ２０８６（ＸｔｈＡ）からなる群より選択される少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｆｅ捕獲タンパク質；ＰｉｌＱ、ＯＭＰ８５、ＦｈａＣ、ＮｓｐＡ、ＴｂｐＡ、ＬｂｐＡ、ＴｓｐＡ、ＴｓｐＢ、ＴｄｆＨ、ＰｏｒＢ、ＭＩｔＡ、ＨｐｕＢ、ＨｉｍＤ、ＨｉｓＤ、ＧＮＡ１８７０、ＯｓｔＡ、ＨｌｐＡ（ＧＮＡ１９４６）、ＮＭＢ１１２４、ＮＭＢ１１６２、ＮＭＢ１２２０、ＮＭＢ１３１３、ＮＭＢ１９５３、ＨｔｒＡ、およびＰＬＤＡ（ＯＭＰＬＡ）からなる群より選択される少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ膜会合タンパク質（好ましくは外膜タンパク質、特に内在性外膜タンパク質）。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原のこれらの組合せは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対するワクチンの効力の驚くべき増強につながるといわれる［９５］。
【００６８】
特に好ましい組成物は、以下の５つの抗原のうちの１以上を含む［９６］：（１）「ＮａｄＡ」タンパク質（好ましくはオリゴマー形態（例えば、トリマー形態））；（２）「７４１」タンパク質；（３）「９３６」タンパク質；（４）「９５３」タンパク質；および（５）「２８７」タンパク質。
【００６９】
ＭｅｎＢ由来の「ＮａｄＡ」（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの付着因子Ａ）は、参考文献８０においてタンパク質「９６１」として開示されており（配列番号２９４３および配列番号２９４４）、そして参考文献７５において「ＮＭＢ１９９４」として開示されている（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号１１３５２９０４および７２２７２５６もまた参照のこと）。このタンパク質の詳細な研究は、参考文献９７において見出され得る。本発明に従って使用される場合、ＮａｄＡは、種々の形態をとり得る。ＮａｄＡの好ましい形態は、トランケーション（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）改変体または欠失改変体（例えば、参考文献８３〜８５に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、そのＣ末端膜アンカーを有さないＮａｄＡ（例えば、本明細書中の配列番号１を与える、２９９６株についての残基３５１〜残基４０５の欠失）が好ましく、これは本明細書中で、時に、例えば上付き「Ｃ」の使用（例えば、ＮａｄＡ（Ｃ））により区別される。その膜アンカードメインを有さないＮａｄＡのＥ．ｃｏｌｉにおける発現は、培養上清へのこのタンパク質の分泌をもたらし、同時にその２３マーリーダーペプチドの除去が生じる（例えば、２９９６株については３２７マーを残す［本明細書中で、配列番号２］）。そのリーダーペプチドを有さないポリペプチドは、本明細書中で、時に、上付き「ＮＬ」の使用（例えば、ＮａｄＡ（ＮＬ）またはＮａｄＡ（Ｃ）（ＮＬ））により区別される。好ましいＮａｄＡポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号２に対して５０％以上の（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより高い）同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号１の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより大きい）であるアミノ酸配列。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、配列番号１のＣ末端および／またはＮ末端から、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個またはそれより多く）のアミノ酸が欠けている（例えば、ＮａｄＡ（Ｃ）、ＮａｄＡ（ＮＬ）、ＮａｄＡ（Ｃ）（ＮＬ））。他の好ましいフラグメントは、配列番号１由来のエピトープを含み、そして配列番号１の特に好ましいフラグメントは、配列番号２である。これらの種々の配列は、ＮａｄＡ改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、パラログ（ｐａｒａｌｏｇ）、変異体など）を包含する。種々のＮａｄＡ配列は、参考文献９８の図９に示される。
【００７０】
ＭｅｎＢ由来の「７４１」タンパク質は、参考文献８０（配列番号２５３５および配列番号２５３６）において開示され、そして参考文献７５において「ＮＭＢ１８７０」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７１２８もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［７４］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９３２２を有する。７４１は、本来、リポタンパク質である。本発明に従って使用される場合、７４１タンパク質は、種々の形態をとり得る。７４１の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体である（例えば、参考文献８３〜８５に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）。特に、７４１のＮ末端は、そのポリグリシン配列まで欠失されても、およびポリグリシン配列を含めて欠失されてもよく（すなわち、ＭＣ５８株の残基１〜残基７２の欠失［本明細書中で、配列番号３］）、この配列は、時に、本明細書中で、接頭辞「ΔＧ」の使用により区別される。この欠失は、発現を増強し得る。この欠失はまた、７４１の脂質化部位を除去する。好ましい７４１配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号３に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより高い）の同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号３由来の少なくともｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であって、ここで、ｎは、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多く）である、アミノ酸配列。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、７４１由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号３のＣ末端および／またはＮ末端から、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個またはそれより多く）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、７４１改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など）を包含する。種々の７４１配列は、参考文献８５の配列番号１〜配列番号２２、参考文献９９の配列番号１〜配列番号２３および参考文献１００の配列番号１〜配列番号２９９において見出され得る。
【００７１】
血清群Ｂ由来の「９３６」タンパク質は、参考文献８０（配列番号２８８３および配列番号２８８４）に開示され、「ＮＭＢ２０９１」は、参考文献７５に開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７３５３もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応する遺伝子［７４］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９０９３を有する。本発明に従って使用される場合、９３６タンパク質は、種々の形態をとり得る。９３６の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体（例えば、参考文献８３〜８５に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、９３６のＮ末端リーダーペプチドが、欠失され得る（例えば、９３６（ＮＬ）［本明細書中で、配列番号４］を与える、ＭＣ５８株の残基１〜残基２３の欠失）。好ましい９３６配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号４に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより高い）の同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号４由来の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多く）である、アミノ酸配列。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、９３６由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号４のＣ末端および／またはＮ末端由来の１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個またはそれより多く）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、９３６改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など）を包含する。
【００７２】
血清群Ｂ由来の「９５３」タンパク質は、参考文献８０（配列番号２９１７および配列番号２９１８）に開示され、参考文献７５において「ＮＭＢ１０３０」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２６２６９もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［７４］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３８０１０８を有する。本発明に従って使用される場合、９５３タンパク質は、種々の形態をとり得る。９５３の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体（例えば、参考文献８３〜８５に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、９５３のＮ末端リーダーペプチドが、欠失され得る（例えば、９５３（ＮＬ）［本明細書中で、配列番号５］を与える、ＭＣ５８株の残基１〜残基１９の欠失）。好ましい９５３配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号５に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより高い）の同一性を有するアミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号５由来の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多く）である、アミノ酸配列。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、９５３由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号５のＣ末端由来および／またはＮ末端由来の１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個またはそれより多く）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、９３６改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など）を包含する。９５３の対立遺伝子形態は、参考文献８２の図１９において見られ得る。
【００７３】
血清群Ｂ由来の「２８７」タンパク質は、参考文献８０（配列番号３１０３および配列番号３１０４）に開示され、参考文献７５において「ＮＭＢ２１３２」として開示され、そして参考文献７７において「ＧＮＡ２１３２」として開示される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＧＩ：７２２７３８８もまた参照のこと）。血清群Ａにおける対応するタンパク質［７４］は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号７３７９０５７を有する。本発明に従って使用される場合、２８７タンパク質は、種々の形態をとり得る。２８７の好ましい形態は、トランケーション改変体または欠失改変体（例えば、参考文献８３〜８５に開示されているトランケーション改変体または欠失改変体）である。特に、２８７のＮ末端は、そのポリ−グリシン配列までおよびポリ−グリシン配列を含めて欠失され得る（例えば、ΔＧ２８７［本明細書中で、配列番号６］を与える、ＭＣ５８株についての残基１〜残基２４の欠失）。この欠失は、発現を増強し得る。好ましい２８７配列は、以下のアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号６に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより高い）の同一性を有する、アミノ酸配列；および／または（ｂ）配列番号６由来の少なくともｎ個連続したアミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列であって、ここで、ｎが、７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多く）である、アミノ酸配列。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、２８７由来のエピトープを含む。他の好ましいフラグメントは、配列番号６のＣ末端由来および／またはＮ末端由来の１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個またはそれより多く）のアミノ酸が欠けている。これらの配列は、２８７改変体（例えば、対立遺伝子改変体、ホモログ、オルソログ、パラログ、変異体など）を包含する。２８７の対立遺伝子形態は、参考文献８２の図５および図１５、ならびに参考文献８０の実施例１３および図２１において見られ得る（配列番号３１７９〜配列番号３１８４）。
【００７４】
好ましいＭｅｎＢ抗原は、２９９６株、ＭＣ５８株、９５Ｎ４７７株および３９４／９８株のうちの１種において見出されるアミノ酸配列を含む。タンパク質２８７は、好ましくは、２９９６株由来であるか、または、より好ましくは、３９４／９８株由来である。タンパク質７４１は、好ましくは、血清群ＢのＭＣ５８株、２９９６株、３９４／９８株もしくは９５Ｎ４７７株由来であるか、または、血清群Ｃの９０／１８３１１株由来である。ＭＣ５８株が、より好ましい。タンパク質９３６、タンパク質９５３およびタンパク質ＮａｄＡは、好ましくは、２９９６株由来である。組成物が、特定のタンパク質抗原（例えば、７４１または２８７）を含有する場合、その組成物は、１種より多い改変体の形態で（例えば、同じタンパク質であるが、１種より多い株由来である）、その抗原を含有し得る。これらのタンパク質は、縦列タンパク質または別個のタンパク質として含まれ得る。
【００７５】
しかし、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じタンパク質であるが１種より多い株由来であるタンパク質を含む。このアプローチは、７４１タンパク質について有効であることが見出されている。このタンパク質は、抗髄膜炎菌抗体応答を惹起するために極めて有効な抗原であり、全ての髄膜炎菌血清群にわたって発現されている。系統発生的分析は、これらのタンパク質が２つの群に分かれること、およびそれらの分けられたもののうちの一方が、合計３つの改変体をさらに与え［１０１］、そして一方で、所定の改変体に対して惹起された血清は、同じ改変体群内においては殺菌性であり、他の２つの改変体のうちの１つを発現する株に対しては活性ではないこと（すなわち、改変体内の交差防御は存在するが、改変体間の交差防御は存在しないこと）を示している［９９，１０１］。従って、最大の株にまたがった（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｉｎ）効力のためには、組成物が、タンパク質７４１の１種より多い改変体を含有すべきことが好ましい。各々の改変体由来の例示的配列を、本明細書中で、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２に与え、これらの配列は、天然のリポタンパク質形態では脂質が共有結合するＮ末端システイン残基で始まる。従って、この組成物が、以下のうちの少なくとも２種を含有すべきことが好ましい：（１）配列番号１０に対して少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１０由来の少なくともｘ個連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質；（２）配列番号１１に対して少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１１由来の少なくともｙ個連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質；ならびに（３）配列番号１２に対して少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして／または配列番号１２由来の少なくともｚ個連続するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む、第３のタンパク質。ａの値は、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれより大きい）である。ｂの値は、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれより大きい）である。ｃの値は、少なくとも８５（例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５またはそれより大きい）である。ａの値、ｂの値およびｃの値は、本質的に、互いに関連しない。ｘの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は、少なくとも７（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘの値、ｙの値およびｚの値は、本質的に、互いに関連しない。いずれの所定の７４１アミノ酸配列も、分類（１）、分類（２）および分類（３）のうちの１種よりも多くに分類されないことが好ましい。従って、いずれの所定の７４１配列も、分類（１）、分類（２）および分類（３）のうちのただ１種にのみ分類される。従って、以下が好ましい：タンパク質（１）が、タンパク質（２）に対してｉ％未満の配列同一性を有すること；タンパク質（１）が、タンパク質（３）に対してｊ％未満の配列同一性を有すること；およびタンパク質（２）が、タンパク質（３）に対してｋ％未満の配列同一性を有する。ｉの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、最大がａである。ｊの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、最大がｂである。ｋの値は、６０以上（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０など）であり、最大がｃである。ｉの値、ｊの値およびｋの値は、本質的に、互いに関連しない。
【００７６】
本発明の組成物は、少数（例えば、ｔ種より少ない抗原、ここで、ｔは、１０、９、８、７、６、５、４または３である）の精製された血清群Ｂ抗原を含む。この組成物が複雑な抗原混合物も規定されていない抗原混合物も含まないことが特に好ましい。例えば、外膜小胞を組成物中に含まないことが好ましい。この抗原は好ましくは、異種宿主において組換えにより発現され、次いで精製される。ｔ種のＭｅｎＢ抗原を含む組成物については、ｔ種の別個のポリペプチドが存在し得るが、複雑さをなおさらに減らすために、これらの抗原のうちの少なくとも２種を単一のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」タンパク質［参考文献８３〜８５］）として発現することが好ましい。すなわち、その結果、ｔ種の抗原は、ｔよりも少ない種類のポリペプチドを形成する。ハイブリッドタンパク質は、２つの主な利点を提供する：第１に、不安定であり得るかまたはそのままではほとんど発現されないかもしれないタンパク質が、この問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを付加することによって補助され得る；第２に、２つの別々に有用なタンパク質を産生するためにたった１種の発現および精製を用いることが必要とされるので、商業的製造が単純化される。本発明の組成物中に含まれるハイブリッドタンパク質は、上記に列挙した抗原のうちの２以上（すなわち、２、３、４または５）を含み得る。５種の抗原の２種からなるハイブリッドが好ましい。
【００７７】
５種の基本抗原（ＮａｄＡ、７４１、９５３、９３６および２８７）の組み合わせ内で、ある抗原は、１種より多いハイブリッドタンパク質において存在し得るか、および／または非ハイブリッドタンパク質として存在し得る。しかし、抗原は、ハイブリッドとして存在するかまたは非ハイブリッドとして存在するかのいずれかが好ましいが、両方として存在することは好ましくない。しかし、ハイブリッド抗原および非ハイブリッド（好ましくは、リポタンパク質）抗原の両方としてタンパク質７４１を含むことは、有用であり得る（特に、１種より多い７４１改変体が使用される場合）。
【００７８】
ハイブリッドタンパク質は、式ＮＨ２−Ａ−［−Ｘ−Ｌ−］ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨにより表され得、ここで：Ｘは、５種の基本抗原のうちの１種のアミノ酸配列であり；Ｌは、必要に応じたリンカーアミノ酸配列であり；Ａは、必要に応じたＮ末端アミノ酸配列であり；Ｂは、必要に応じたＣ末端アミノ酸配列であり；そしてｎは、２、３、４または５である。
【００７９】
最も好ましくは、ｎは２である。本発明において使用するための２抗原ハイブリッドとしては、以下が挙げられる：ＮａｄＡおよび７４１；ＮａｄＡおよび９３６；ＮａｄＡおよび９５３；ＮａｄＡおよび２８７；７４１および９３６；７４１および９５３；７４１および２８７；９３６および９５３；９３６および２８７；９５３および２８７。２種の好ましいタンパク質は、以下である：Ｘ１が９３６であり、かつＸ２が７４１である；Ｘ１が２８７であり、かつＸ２が９５３である。
【００８０】
−Ｘ−部分が、その野生型形態においてリーダーペプチド配列を有する場合、これは、ハイブリッドタンパク質に含まれてもよくまたは削除されてもよい。いくつかの実施形態において、このリーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のリーダーペプチドを除いて、欠失される（すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは維持されるが、Ｘ２．．．Ｘｎのリーダーペプチドは、削除される）。このことは、全てのリーダーペプチドを削除し、かつＸ１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として使用することと等価である。
【００８１】
［−Ｘ−Ｌ−］の各々のｎの場合について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してもよく、存在しなくてもよい。例えば、ｎ＝２である場合、上記ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、代表的に、短い（例えば、２０以下（すなわち、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）のアミノ酸）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリ−グリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎを含有する（ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きい））およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きい））が挙げられる。他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限酵素部位から形成されていてクローニングおよび操作が容易になるＧＳＧＧＧＧ（配列番号９）であり、そして（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは、代表的なポリ−グリシンリンカーである。Ｘｎ＋１が、ΔＧタンパク質であり、かつＬｎがグリシンリンカーである場合、これは、Ｘｎ＋１が、ΔＧタンパク質ではなく、かつＬｎが存在しないことと等価であり得る。
【００８２】
−Ａ−は、任意のＮ末端アミノ酸配列である。−Ａ−は、代表的に、短い（例えば、４０以下（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）のアミノ酸）。例としては、タンパク質輸送をもたらすリーダー配列またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きい））が挙げられる。他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１が、それ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）である。
【００８３】
−Ｂ−は、必要に応じたＣ末端アミノ酸配列である。−Ｂ−は、代表的に、短い（例えば、４０以下（すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）のアミノ酸）。例としては、タンパク質輸送をもたらす配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより大きい）を含む）またはタンパク質安定性を増強する配列が挙げられる。他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【００８４】
２種の特に好ましい本発明のハイブリッドタンパク質は、以下のとおりである：
【００８５】
【表１】
0005618842.tif 000005
これらの２種のタンパク質は、（特に、配列番号２を有する）ＮａｄＡと組み合わせて使用され得る。従って、本発明について使用するためのＭｅｎＢ抗原の好ましい組成物は、従って、配列番号２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、配列番号７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドおよび配列番号８のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドを含む。これは、本発明について使用するためのＭｅｎＢ抗原の好ましい群である。
【００８６】
上述のように、本発明の組成物は、ＭｅｎＢの超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ−５および系統３のうちの２種または３種に対して有効な血清殺菌性抗体応答を誘導し得る。それらは、超毒性系統のサブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１またはＥＴ−３７複合体の１種以上に対する殺菌性抗体応答および他の系統（例えば、超侵襲性系統）に対する殺菌性抗体応答をさらに誘導し得る。これらの抗体応答は、マウスにおいて都合よく測定され、そしてワクチン効力の標準的な指標である［例えば、参考文献７７の巻末の注１４を参照のこと］。血清殺菌活性（ＳＢＡ）は、補体によって媒介される細菌殺傷を測定し、そしてヒトまたはウサギ乳仔の補体を用いてアッセイされ得る。ＷＨＯ基準は、ワクチンが、レシピエントの９０％より多くにおいて、少なくとも４倍のＳＢＡ上昇を誘導することを要求している。
【００８７】
この組成物は、これらの超毒性系統内の各々および全てのＭｅｎＢ株に対して殺菌性抗体応答を誘導する必要はない；むしろ、特定の超毒素系統内の血清群Ｂの髄膜炎菌の４種以上のさらなる株の任意の所定の群に対して、この組成物により誘導される抗体は、この群のうちの少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれより高い）に対して殺菌性である。好ましい株群は、以下の国のうちの少なくとも４つにおいて単離された株を含む：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵ。上記血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８またはそれより高い、好ましくは、少なくとも２１４）の殺菌力価を有する。すなわち、この血清は、参考文献７７に記載されるように、１／１０２４に希釈される場合、特定の株の試験細菌の少なくとも５０％を殺傷可能である。
【００８８】
好ましい組成物は、血清群Ｂの髄膜炎菌の以下の株に対する殺菌応答を誘導し得る：（ｉ）クラスターＡ４由来の９６１−５９４５株（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／またはＧ２１３６株（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来のＭＣ５８株（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または４４／７６株（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来の３９４／９８株（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／またはＢＺ１９８株（Ｂ：ＮＴ：−）。より好ましい組成物は、９６１−５９４５株、４４／７６株および３９４／９８株に対する殺菌応答を誘導し得る。９６１−５９４５株およびＧ２１３６株は、ともにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ基準株である［参考文献１０２におけるｉｄｓ  ６３８および１００２］。ＭＣ５８株は、広範に利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３５）、そして参考文献７５において配列決定された株であった。４４／７６株は、広範に使用され、そして特徴付けられており（例えば、参考文献１０３）、そしてＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ基準株の１つである［参考文献１０２におけるｉｄ  ２３７；参考文献１０４における表２の３２行目］。３９４／９８株は、元々、ニュージーランドにおいて１９９８年に単離され、そしてこの株を用いたいくつかの公開された研究が存在している（例えば、参考文献１０５および１０６）。ＢＺ１９８株は、別のＭＬＳＴ基準株である［参考文献１０２におけるｉｄ  ４０９；参考文献１０４における表２の４１行目］。この組成物は、ＥＴ−３７複合体由来の血清群Ｗ１３５のＬＮＰ１７５９２株（Ｗ１３５：２ａ：Ｐ１．５，２）に対する殺菌応答をさらに誘導し得る。これは、フランスにおいて２０００年に単離されたＨａｊｉ株である。
【００８９】
本発明の組成物に含まれ得る他のＭｅｎＢポリペプチド抗原としては、以下のアミノ酸配列：参考文献７８からの配列番号６５０；参考文献７８からの配列番号８７８；参考文献７８からの配列番号８８４；参考文献７９からの配列番号４；参考文献８０からの配列番号５９８；参考文献８０からの配列番号８１８；参考文献８０からの配列番号８６４；参考文献８０からの配列番号８６６；参考文献８０からの配列番号１１９６；参考文献８０からの配列番号１２７２；参考文献８０からの配列番号１２７４；参考文献８０からの配列番号１６４０；参考文献８０由来の配列番号１７８８；参考文献８０由来の配列番号２２８８；参考文献８０からの配列番号２４６６；参考文献８０からの配列番号２５５４；参考文献８０からの配列番号２５７６；参考文献８０からの配列番号２６０６；参考文献８０からの配列番号２６０８；参考文献８０からの配列番号２６１６；参考文献８０からの配列番号２６６８；参考文献８０からの配列番号２７８０；参考文献８０からの配列番号２９３２；参考文献８０からの配列番号２９５８；参考文献８０からの配列番号２９７０；参考文献８０からの配列番号２９８８、のうちの１個を含むＭｅｎＢポリペプチド抗原、または（ａ）上記配列に対して５０％以上の（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれより高い）同一性を有する；および／もしくは（ｂ）上記配列由来の少なくともｎ個連続するアミノ酸のフラグメントを含み、ｎが７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより高い）である、アミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、関連配列由来のエピトープを含む。これらのポリペプチドのうちの１種より多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種またはそれより多く）が含まれ得る。
【００９０】
（さらなる抗原性成分）
非髄膜炎菌でかつ非ナイセリア属の抗原（好ましくは、髄膜炎菌成分に対する免疫応答を減少させないもの）もまた、本発明の組成物に含まれ得る。例えば、参考文献１０７は、Ｈｉｂサッカリドと一緒のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂおよび血清群Ｃ由来のオリゴサッカリドの組み合わせを開示している。特に好ましい非髄膜炎菌抗原としては、以下が挙げられる：
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）［例えば、参考文献１０８の第３章］。  
【００９１】
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）［例えば、参考文献１０８の第４章］。  
【００９２】
−Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）（ＰＴ）および糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）（必要に応じて、また、ペルタクチンならびに／または凝集原２および凝集原３と組み合わせて）［例えば、参考文献１０９および１１０］。
【００９３】
−細胞性破傷風抗原。  
【００９４】
−Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、不活性化ウイルス）［例えば、１１１，１１２］。  
【００９５】
−Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）［例えば、１１２，１１３］（表面抗原は、好ましくは、リン酸アルミニウムに吸着される［１１４］）。  
【００９６】
−ポリオ抗原（例えば、ＩＰＶ）［例えば、１１５，１１６］。
【００９７】
この混合物は、これらのさらなる抗原のうちの１種以上を含有し得、これらの抗原は、必要な場合、無毒化（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳トキシンの無毒化）され得る。
【００９８】
ジフテリア抗原がこの混合物中に含有される場合、破傷風抗原および百日咳抗原もまた含有することが好ましい。同様に、破傷風抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原もまた含有することが好ましい。同様に、百日咳抗原が含有される場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原もまた含有することが好ましい。
【００９９】
この混合物中の抗原は、代表的に、少なくとも各々１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘発するために充分である。実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は低減され得るが、これらを合わせることにより、個々のサッカリド抗原の防御効力が除去されないことが好ましい。
【０１００】
この混合物中でのタンパク質抗原の使用の代替として、この抗原をコードする核酸が使用され得る。従って、この混合物のタンパク質成分は、そのタンパク質をコードする核酸（好ましくは、（例えば、プラスミド形態の）ＤＮＡ）により置換され得る。同様に、本発明の組成物は、サッカリド抗原を模倣するタンパク質（例えば、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）［１１７］または抗イディオタイプ抗体）を含有し得る。これらは、個々のサッカリド成分を置換し得るか、または、それらを補充し得る。一例として、ワクチンは、ＭｅｎＣ［１１８］またはＭｅｎＡ［１１９］の莢膜ポリサッカリドのペプチド模倣物を、そのサッカリド自体の代わりに、含有し得る。
【０１０１】
本発明の組成物に含まれるのに好ましい２種の非髄膜炎菌抗原は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型（Ｈｉｂ）を防御するものおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを防御するものである。
【０１０２】
（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型（Ｈｉｂ））
この組成物がＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型抗原を含む場合、それは、代表的に、Ｈｉｂ莢膜サッカリド抗原である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ由来のサッカリド抗原は、周知である。
【０１０３】
有利なことに、このＨｉｂサッカリドは、（特に、子供における）その免疫原性を増強するために、キャリアタンパク質に共有結合される。一般的にポリサッカリド結合体の調製および特にＨｉｂ莢膜ポリサッカリドの調製は、良く実証されている［例えば、参考文献２１〜２９など］。本発明は、任意の適切なＨｉｂ結合体を使用し得る。適切なキャリアタンパク質は、上記に記載され、そして、Ｈｉｂサッカリドに関して好ましいキャリアは、ＣＲＭ１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風トキソイド（「ＰＲＰ−Ｔ」）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。
【０１０４】
結合体のサッカリド部分は、ポリサッカリド（例えば、全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ））であり得るが、ポリサッカリドを加水分解してオリゴサッカリド（例えば、約１ｋＤａ〜約５ｋＤａのＭＷ）を形成することが好ましい。
【０１０５】
好ましい結合体は、アジピン酸リンカーを介してＣＲＭ１９７へと共有結合されたＨｉｂオリゴサッカリドを含む［１２０，１２１］。破傷風トキソイドもまた、好ましいキャリアである。
【０１０６】
Ｈｉｂ抗原の投与は、好ましくは、０．１５μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらし、そして、より好ましくは、１μｇ／ｍｌ以上の抗ＰＲＰ抗体濃度をもたらす。
【０１０７】
組成物が、Ｈｉｂサッカリド抗原を含有する場合、組成物は、水酸化アルミニウムアジュバントをまた含有しないことが好ましい。この組成物がリン酸アルミニウムアジュバントを含有する場合、このＨｉｂ抗原は、このアジュバントに吸着されてもよく［１２２］、または吸着されなくてもよい［１２３］。吸着の防止は、抗原／アジュバント混合の間の正確なｐＨ、適切な電荷ゼロ点を有するアジュバントおよび組成物中の種々の異なる抗原に対する適切な混合順序を選択することにより、達成され得る［１２４］。
【０１０８】
本発明の組成物は、１種より多いＨｉｂ抗原を含有し得る。Ｈｉｂ抗原は、（例えば、本発明の髄膜炎菌組成物による再構成のために）凍結乾燥され得る。
【０１０９】
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）
この組成物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原を含む場合、それは、代表的に、（好ましくは、キャリアタンパク質に結合体化された）莢膜サッカリド抗原である［例えば、参考文献１２５〜１２７］。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１種より多くの血清型由来のサッカリドを含有することが好ましい。例えば、２３種の異なる血清型由来のポリサッカリドの混合物が広範に使用されており、５種と１１種との間の異なる血清群由来のポリサッカリドを用いた結合体ワクチンも同様である［１２８］。例えば、ＰｒｅｖＮａｒＴＭ［１］は、７種の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）由来の抗原を含有し、各々のサッカリドは、個々に、還元的アミノ化によりＣＲＭ１９７に結合体化され、０．５ｍｌ用量あたり２μｇの各々のサッカリド（４μｇの血清型６Ｂ）を有し、そして、結合体は、リン酸アルミニウムアジュバントに吸着される。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清型６Ｂ、血清型１４、血清型１９Ｆおよび血清型２３Ｆを含有する。結合体は、リン酸アルミニウムに吸着され得る。
【０１１０】
肺炎球菌由来のサッカリド抗原の使用の代替として、この組成物は、１種以上のポリペプチド抗原を含有し得る。肺炎球菌のいくつかの株についてのゲノム配列が利用可能であり［１２９，１３０］、そして逆ワクチン学の対象とされ［１３１〜１３４］て適切なポリペプチド抗原が同定され得る［１３５，１３６］。例えば、この組成物は、参考文献１３７で定義されたような、以下の抗原のうちの１種以上を含有し得る：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１３０およびＳｐ１３０。この組成物は、これらの抗原のうちの１種より多く（例えば、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種または１４種）を含有し得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、この組成物は、肺炎球菌由来のサッカリド抗原およびポリペプチド抗原の両方を含有し得る。これらは、単純に混合して使用されてもよく、またはこの肺炎球菌サッカリド抗原は、肺炎球菌タンパク質に結合体化されてもよい。このような実施形態に適切なキャリアタンパク質としては、前の段落において列挙した抗原が挙げられる［１３７］。
【０１１２】
肺炎球菌抗原は、例えば、髄膜炎菌抗原および／またはＨｉｂ抗原と一緒に、凍結乾燥され得る。
【０１１３】
（薬学的組成物）
本発明の組成物は、上述の成分に加えて、代表的に、１以上の「薬学的に受容可能なキャリア」を含有し、このようなキャリアとしては、それ自体ではその組成物を受容する個体に有害な抗体の生成を誘導しない、任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的に、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、スクロース［１３８］、トレハロース［１３９］、ラクトース、および脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。上記ワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含有し得る。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が存在し得る。無菌で発熱物質を含まず、リン酸緩衝化された生理食塩水は、代表的なキャリアである。薬学的に受容可能な賦形剤の徹底的な考察は、参考文献１４０において入手可能である。
【０１１４】
本発明の組成物は、水性形態（すなわち、液体または懸濁物）である。この型の液体処方物は、水性媒質中で再構成する必要性なくこの組成物がそのパッケージングされた形態から直接的に投与されることを可能にし、従って、注射に理想的である。組成物は、バイアル中に存在してもよく、またはこれらは充填済み（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ）注射器中に存在してもよい。この注射器は、針付きまたは針無しで供給され得る。注射器は、単回用量のこの組成物を含み、一方、バイアルは、単回用量または複数回用量を含み得る。
【０１１５】
本発明の液体組成物はまた、凍結乾燥形態から他のワクチンを再構成するために（例えば、凍結乾燥されたＨｉｂ抗原またはＤＴＰ抗原を再構成するために）適している。本発明の組成物がこのような即座の再構成のために用いられるべき場合、本発明は、キットを提供し、このキットは、２つのバイアルを備えてもよく、またはこのキットは、１つの充填済み注射器および１つのバイアルを備えてもよく、この注射器の内容物は、注射前にこのバイアルの内容物を再活性化するために用いられる。
【０１１６】
本発明の組成物は、単位用量形態または複数用量形態でパッケージングされ得る。複数用量形態については、バイアルが、充填済み注射器よりも好ましい。有効投薬容量は、慣用的に確立され得るが、注射用組成物の代表的なヒト用量は、０．５ｍｌの容量を有する。
【０１１７】
本発明の組成物のｐＨは、好ましくは、ｐＨ６とｐＨ８との間であり、好ましくは約７である。適切なｐＨは、緩衝剤の使用によって維持され得る。組成物が水酸化アルミニウム塩を含有する場合、ヒスチジン緩衝剤を使用することが好ましい［１４１］。この組成物は、無菌および／または発熱物質を含まないかもしれない。本発明の組成物は、ヒトに関して等張であり得る。
【０１１８】
本発明の組成物は免疫原性であり、そしてより好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐため）または治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、代表的には予防的である。ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原、ならびに必要に応じて、任意の他の成分を含有する。「免疫学的有効量」により、単回用量においてかまたはある一連のものの一部としてのいずれかでの、個体に対するその量の投与が、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体状態、年齢、処置されるべき個体の分類学群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系の抗体合成能力、所望される防御の程度、そのワクチンの処方、処置医によるその医学的状態の評価および他の関連因子に依存して変化する。この量が、慣習的な試験を通して決定され得る比較的広範な範囲にわたることが予想される。
【０１１９】
各々の用量内で、個々のサッカリド抗原の量は、一般的に、（サッカリドの質量として測定して）１μｇ〜５０μｇの間（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇまたは約１０μｇ）である。
【０１２０】
各サッカリドは、１用量あたり、実質的に同じ量で存在し得る。しかし、ＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＷ１３５サッカリドの比（ｗ／ｗ）は、１より大きくてもよく（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはそれより大きく）、そして／またはＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比（ｗ／ｗ）は、１未満（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５またはより低く）であってもよい。
【０１２１】
血清群Ａ：血清群Ｃ：血清群Ｗ１３５：血清群Ｙ由来のサッカリドについての好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１、１：１：１：２、２：１：１：１、４：２：１：１、８：４：２：１、４：２：１：２、８：４：１：２、４：２：２：１、２：２：１：１、４：４：２：１、２：２：１：２、４：４：１：２および２：２：２：１である。血清群Ｃ：血清群Ｗ１３５：血清群Ｙ由来のサッカリドについての好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１、１：１：２、１：１：１、２：１：１、４：２：１、２：１：２、４：１：２、２：２：１および２：１：１である。実質的に等価な重量の各サッカリドを用いることが好ましい。
【０１２２】
本発明の好ましい組成物は、１用量あたり５０μｇ未満の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、１用量あたり４０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、１用量あたり３０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、１用量あたり２５μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、１用量あたり２０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有する。他の好ましい組成物は、１用量あたり１０μｇ以下の髄膜炎菌サッカリドを含有するが、理想的には、本発明の組成物は、１用量あたり少なくとも１０μｇの総髄膜炎菌サッカリドを含有する。
【０１２３】
本発明の組成物は、特に、複数用量様式でパッケージングされる場合、抗菌剤を含有し得る。
【０１２４】
本発明の組成物は、洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０））を含有し得る。洗浄剤は、一般に、低いレベル（例えば、０．０１％未満）で存在する。
【０１２５】
本発明の組成物は、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含有して張度を与え得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌの濃度が、代表的である。
【０１２６】
本発明の組成物は、一般的に、緩衝剤を含有する。リン酸緩衝剤が、代表的である。
【０１２７】
本発明の組成物は一般に、他の免疫調節剤とともに投与される。特に、組成物は通常、１以上のアジュバントを含む。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：
（Ａ．無機質含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な無機質含有組成物としては、無機塩（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。本発明は、無機塩（例えば、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など）［例えば、参考文献１４２の第８章および第９章を参照のこと］、または異なる無機化合物の混合物を含み、この組成物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、そして、吸着が好ましい。この無機質含有組成物はまた、無機塩の粒子として処方され得る［１４３］。
【０１２８】
（Ｂ．油エマルジョン）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン（例えば、ＭＦ５９）が挙げられる［参考文献１４２の第１０章；参考文献１４４もまた参照のこと。］（５％スクアレン、０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．５％  Ｓｐａｎ  ８５、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、サブミクロン粒子に処方される）。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた、使用され得る。
【０１２９】
（Ｃ．サポニン処方物［参考文献１４２の第２２章］）
サポニン処方物はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえ見られる、不均一な群のステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドである。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ（モリナの木（Ｍｏｌｉｎａ  ｔｒｅｅ））の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライドベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から市販され得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）および液体処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販される。
【０１３０】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いて特定の精製フラクションが同定されており、これらのフラクションとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、このサポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献１４５に開示されている。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含有し得る［１４６］。
【０１３１】
サポニンとコレステロールとの組み合わせが使用されて、免疫刺激複合体（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特な粒子を形成し得る［参考文献１４２の第２３章］。ＩＳＣＯＭとしてはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、このＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献１４６〜１４８にさらに記載されている。必要に応じて、このＩＳＣＯＭは、さらなる洗剤を含まなくてもよい［１４９］。
【０１３２】
サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献１５０および１５１に見られ得る。
【０１３３】
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造体は、一般的に、必要に応じてリン脂質と組み合わされるかまたはリン脂質とともに処方されたウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。それらは、一般的に、非病原性で非複製性であり、そして一般的に、あらゆる天然ウイルスゲノムを含まない。このウイルスタンパク質は、組換え的に生成されてもよく、またはウイルス全体から単離されてもよい。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用のために適切なこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（例えば、コアタンパク質またはキャプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒトパピローマウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡファージ由来のタンパク質、Ｑβファージ由来のタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージ由来のタンパク質、ｆｒファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質およびＴｙ由来のタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献１５２〜１５７においてさらに考察されている。ビロソームは、例えば、参考文献１５８においてさらに考察されている。
【０１３４】
（Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明における使用のために適切なアジュバントとしては、細菌誘導体または微生物誘導体（例えば、腸内細菌リポポリサッカリド（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰリボシル化トキシンおよびそれらの無毒性誘導体）が挙げられる。
【０１３５】
ＬＰＳの無毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３  脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５または６アシル化鎖との混合物である。３  脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」形態は、参考文献１５９に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小さい粒子」は、０．２２μｍメンブレンを通って滅菌濾過されるために充分小さい［１５９］。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、ＲＣ−５２９））が挙げられる［１６０，１６１］。
【０１３６】
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体（例えば、ＯＭ−１７４）が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献１６２および１６３に記載されている。
【０１３７】
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な免疫刺激性オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（グアノシンへのホスフェート結合により連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。パリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含む、二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【０１３８】
ＣｐＧは、ヌクレオチド改変体／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変体）を含み得、そして、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献１６４、１６５および１６６は、可能なアナログ置換（例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換）を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１６７〜１７２において、さらに考察されている。
【０１３９】
このＣｐＧ配列（例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフ）は、ＴＬＲ９に導かれ得る［１７３］。このＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ）は、Ｔｈ１免疫応答誘導に特異的であってもよく、または、このＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）は、Ｂ細胞応答誘導に、より特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１７４〜１７６において考察されている。好ましくは、このＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【０１４０】
好ましくは、このＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識のために接近可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がそれらの３’末端で結合されて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。例えば、参考文献１７３および１７７〜１７９を参照のこと。
【０１４１】
細菌ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用され得る。好ましくは、このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ由来（「ＣＴ」）または百日咳由来（「ＰＴ」）である。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、参考文献１８０に記載されており、そして、非経口的アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、参考文献１８１に記載されている。このトキシンまたはトキソイドは、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロトキシンの形態である。好ましくは、このＡサブユニットは、無毒化変異を含み；好ましくは、このＢサブユニットは、変異していない。好ましくは、このアジュバントは、無毒化ＬＴ変異体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２）である。ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）のアジュバントとしての使用は、参考文献１８２〜１８９において見出され得る。アミノ酸置換についての多くの参考文献は、好ましくは、参考文献１９０に記載のＡＤＰ−リボシル化トキシンのＡサブユニットおよびＢサブユニットの整列に基づく。参考文献１９０は、特に、本明細書中で、その全体が参考として援用される。
【０１４２】
（Ｆ．ヒト免疫調節因子）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なヒト免疫刺激因子としては、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［１９１］など）［１９２］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子）が挙げられる。
【０１４３】
（Ｇ．生体接着因子および粘膜接着因子）
生体接着因子および粘膜接着因子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着因子としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア［１９３］または粘膜接着因子（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリドおよびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る［１９４］。
【０１４４】
（Ｈ．微粒子）
微粒子もまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）と、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）とから形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして、最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、必要に応じて処理されて、（例えば、ＳＤＳによって）負に荷電した表面または（例えば、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）によって）正に荷電した表面を有する。
【０１４５】
（Ｉ．リポソーム（参考文献１４２の第１３章および第１４章））
アジュバントとしての使用のために適切なリポソーム処方物の例は、参考文献１９５〜１９７に記載されている。
【０１４６】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明における使用のために適切なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［１９８］。このような処方物は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［１９９］、ならびに少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤［２００］をさらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ  ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１４７】
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献２０１および２０２において記載されている。
【０１４８】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１４９】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献２０３および２０４にさらに記載される、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびそのホモログ（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる。
【０１５０】
本発明はまた、上に同定されるアジュバントの１つ以上の局面の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［２０５］；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［２０６］：（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）［２０７］；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［２０８］；（６）マイクロフルイダイズされてサブミクロンエマルジョンにされるか、またはボルテックスされてより大きい粒子サイズのエマルジョンを生じるかのいずれかの、１０％  スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、５％  プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋ）ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（７）２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））；ならびに（８）１つ以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。
【０１５１】
免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献１４２の第７章に開示されている。
【０１５２】
アルミニウム塩アジュバントの使用が特に好ましく、そして抗原は一般に、このような塩に吸着される。ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ結合体およびＮｅｉｓＶａｃＴＭ  ＭｅｎＣ結合体は、水酸化物アジュバントを使用し、一方、ＭｅｎｉｎｇｉｔｅｃＴＭは、ホスフェートを使用する。一部の抗原を水酸化アルミニウムに吸着するが、他の抗原はリン酸アルミニウムに会合させることが本発明の組成物において可能である。しかし、一般に、単一の塩のみ（水酸化物またはリン酸塩であって、両方ではない）を使用することが好ましい。水酸化アルミニウムは好ましくは、アジュバントとしては避けられる。特に、この組成物がＨｉｂ抗原を含む場合には、アジュバントとしては避けられる。水酸化アルミニウムを含まない組成物は、このように好ましい。むしろ、リン酸アルミニウムが用いられ得、そして代表的アジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌにて含まれる、０．８４と０．９２との間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。低用量のリン酸アルミニウムの吸着が、例えば、５０μｇ／結合体／用量と１００μｇ／結合体／用量との間のＡｌ３＋で使用され得る。リン酸アルミニウムが使用され、抗原をこのアジュバントに吸着しないことが所望される場合、これは、（例えば、リン酸緩衝液の使用により）遊離のリン酸イオンを溶液中に含むことによって促進される。
【０１５３】
全ての結合体が吸着される必要はない。すなわち、一部または全てが溶液中に遊離していてもよい。
【０１５４】
リン酸カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。
【０１５５】
（処置の方法）
本発明はまた、本発明の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する、哺乳動物において抗体応答を惹起するための方法を提供する。
【０１５６】
本発明は、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する、哺乳動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。この免疫応答は好ましくは防御性であり、好ましくは抗体を含む。この方法は、追加免疫応答を惹起し得る。
【０１５７】
この哺乳動物は好ましくはヒトである。ワクチンが予防的用途のためのものである場合、ヒトは好ましくは小児（例えば、よちよち歩きの幼児または乳児）または十代の少年少女である；このワクチンが治療用途のためのものである場合、ヒトは好ましくは成人である。小児が意図されるワクチンはまた、例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人にも投与され得る。
【０１５８】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明の組成物を提供する。この医薬は好ましくは、哺乳動物において免疫応答を惹起し得（すなわち、これは、免疫原性組成物である）、そして好ましくはワクチンである。
【０１５９】
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造における以下の使用を提供する：（ｉ）結合体化した血清群Ｃ莢膜サッカリド抗原；（ｉｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原；（ｉｉｉ）結合体化した血清群Ｙ莢膜サッカリド抗原；（ｉｖ）血清群Ｂ由来の１以上のポリペプチド抗原；および必要に応じて（ｖ）結合体化した血清群Ａ莢膜サッカリド抗原。
【０１６０】
これらの使用および方法は、以下によって引き起こされる疾患の予防および／または処置のために好ましい：Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎、敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、菌血症、淋病など）。細菌性および／または髄膜炎菌性の髄膜炎の予防および／または処置が好ましい。
【０１６１】
治療処置の効力をチェックする１つの方法は、本発明の組成物の投与後にＮｅｉｓｓｅｒｉａの感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の効力をチェックする１つの方法は、この組成物の投与後に５つの基本抗原に対する免疫応答をモニタリングすることを含む。本発明の組成物の免疫原性は、この組成物を、試験被験体（例えば、１２ヶ月齢〜１６ヶ月齢の小児、または動物モデル［２０９］）に投与し、次いで抗莢膜ＩｇＧ全体および高アビディティ抗莢膜ＩｇＧの血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメータを決定することにより、決定され得る。これらの免疫応答は、一般的に、この組成物の投与後約４週間で決定され、そして、この組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。１用量より多くのこの組成物が投与される場合、１回より多くの投与後決定が行われ得る。
【０１６２】
本発明の好ましい組成物は、患者において、容認可能な百分率のヒト被験体に対して各々の抗原成分についての血清防御基準より優れた抗体力価を与え得る。宿主がその力価より上ではその抗原に対してセロコンバージョンされると考えられる関連する抗体力価を有する抗原は周知であり、そしてこのような力価は、ＷＨＯのような機関により公開されている。好ましくは、被験体の統計学的に有意なサンプルのうちの８０％より多く、より好ましくは９０％より多く、さらにより好ましくは９３％より多く、そして最も好ましくは９６〜１００％が、セロコンバージョンされる。
【０１６３】
本発明の組成物は一般に、患者に直接的に投与される。直接的な送達は、非経口注射（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、または組織の間隙空間への）、または直腸投与、経口投与、膣投与、局所投与、経皮投与、鼻腔内投与、眼内投与、耳投与、肺投与もしくは他の粘膜投与によって達成され得る。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介し得るが、針なしでの注射が、代替的に使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【０１６４】
本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために用いられ得る。
【０１６５】
投与量処置は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。複数回用量は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられ得る。初回投与スケジュールには、追加免疫投与スケジュールが続き得る。初回免疫投与の間（例えば、４〜１６週間の間）および初回免疫投与と追加免疫投与との間の適切なタイミングは、慣用的に決定され得る。
【０１６６】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染は、身体の種々の領域に罹患し得、それゆえ、本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、この組成物は、液体溶液または液体懸濁物のいずれかとしての、注射可能物として調製され得る。この組成物は、微細粉末またはスプレーを用いて（例えば、吸入器として）肺投与のために調製され得る。この組成物は、坐剤またはペッサリーとして調製され得る。この組成物は、例えば、スプレー、点滴剤、ゲルまたは散剤として、鼻腔投与、耳投与または眼投与のために調製され得る［例えば、参考文献２１０および２１１］。肺炎球菌サッカリド［２１２，２１３］、肺炎球菌ポリペプチド［２１４］、Ｈｉｂサッカリド［２１５］、ＭｅｎＣサッカリド［２１６］、およびＨｉｂサッカリド結合体およびＭｅｎＣサッカリド結合体の混合物［２１７］の鼻投与に関する成功が報告されている。
【０１６７】
（保存安定性）
本発明の組成物は、特に、血清群Ａサッカリド成分に関して、改善された安定性を提供する。本発明は、ワクチン組成物を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、以下の工程を包含する：（１）（ｉ）結合体化した血清群Ｃ莢膜サッカリド抗原、（ｉｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原、（ｉｉｉ）結合体化した血清群Ｙ莢膜サッカリド抗原、および（ｉｖ）血清群Ｂ由来の１以上のポリペプチド抗原を混合する工程；（２）工程（１）から得られる組成物を少なくとも１週間保存する工程；（３）工程（２）からの保存された組成物を含む、患者への注射の準備ができた注射器を調製する工程；ならびに必要に応じて、（４）この組成物をこの患者に注射する工程。
【０１６８】
工程（１）はまた、（ｖ）結合体化した血清群Ａ莢膜サッカリド抗原を混合することを包含し得る。工程（１）はまた、（ｖｉ）結合体化したＨｉｂ抗原を混合することを包含し得る。工程（１）はまた、（ｖｉｉ）肺炎球菌抗原を混合することを包含し得る。工程（２）は好ましくは、少なくとも２週間、少なくとも４週間、少なくとも６週間、少なくとも８週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間またはそれよりも長期の保存を含む。保存工程（２）は、室温（例えば、１０±１０℃）未満であってもよく、またはそうでなくてもよい。
【０１６９】
本発明はまた、ワクチン組成物を調製するためのプロセスを提供し、このプロセスは、以下の工程を包含する：（１）（ｉ）結合体化した血清群Ｃ莢膜サッカリド抗原、（ｉｉ）結合体化した血清群Ｗ１３５莢膜サッカリド抗原、（ｉｉｉ）結合体化した血清群Ｙ莢膜サッカリド抗原、および（ｉｖ）血清群Ｂ由来の１以上のポリペプチド抗原を混合する工程；ならびに（２）この混合した抗原から単位用量体積を抽出する工程；ならびに（ｃ）この抽出された単位用量を、気密シールした容器にパッケージングする工程。
【０１７０】
工程（１）はまた、（ｖ）結合体化した血清群Ａ莢膜サッカリド抗原を混合することを包含し得る。工程（１）はまた、（ｖｉ）結合体化したＨｉｂ抗原を混合することを包含し得る。工程（１）はまた、（ｖｉｉ）肺炎球菌抗原を混合することを包含し得る。この気密シールした容器は、バイアルまたは注射器であり得る。
【０１７１】
本発明は、本発明の組成物を含む、気密シールした容器を提供する。
【０１７２】
（一般論）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味する（例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなってもよく、またはさらなる何かを含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ））。
【０１７３】
数値ｘに関する用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１７４】
単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を除外しない（例えば、「実質的に」Ｙを含まない組成物は、Ｙを完全に含まなくてよい）。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から除外され得る。
【０１７５】
２つのアミノ酸配列の間での配列同一性百分率に対する言及は、整列した場合に、その百分率のアミノ酸が、これらの２つの配列を比較して同一であることを意味する。この整列および相同性パーセントまたは配列同一性は、当該分野で公知のソフトウェアプログラム（例えば、参考文献２１８のセクション７．７．１８に記載されるもの）を用いて決定され得る。好ましい整列は、ギャップオープンペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）１２およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）２、ＢＬＯＳＵＭマトリクス６２でアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献２１９において教示される。
【０１７６】
用語「アルキル」とは、直鎖形態および分枝鎖形態の両方のアルキル基をいう。このアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−より選択される、１個、２個または３個のヘテロ原子によって中断され得る。このアルキル基はまた、１個、２個または３個の二重結合および／または三重結合によって中断され得る。しかし、用語「アルキル」は、通常、ヘテロ原子による中断も二重結合もしくは三重結合による中断も有さないアルキル基をいう。Ｃ１〜１２アルキルに対して言及がなされる場合、そのアルキル基は、１と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含み得ることが意味される。同様に、Ｃ１〜６アルキルに対して言及がなされる場合、そのアルキル基は、１と６との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）を含み得ることが意味される。
【０１７７】
用語「シクロアルキル」は、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基およびシクロアルケニル基、ならびにこれらとアルキル基との組み合わせ（例えば、シクロアルキルアルキル基）を包含する。このシクロアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−より選択される、１個、２個または３個のヘテロ原子によって中断され得る。しかし、用語「シクロアルキル」は、通常、ヘテロ原子による中断を有さないシクロアルキル基をいう。シクロアルキル基の例としては、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロへキセニル基、シクロヘキシルメチル基およびアダマンチル基が挙げられる。Ｃ３〜１２シクロアルキルに対して言及がなされる場合、そのシクロアルキル基は、３と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含み得ることが意味される。
【０１７８】
用語「アリール」とは、芳香族基（例えば、フェニルまたはナフチル）をいう。Ｃ５〜１２アリールに対して言及がなされる場合、そのアリール基は、５と１２との間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含み得ることが意味される。
【０１７９】
用語「Ｃ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキル」とは、ベンジル、フェニルエチルおよびナフチルメチルのような基をいう。
【０１８０】
窒素保護基としては、シリル基（例えば、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、ＴＩＰＳ）、アシル誘導体（例えば、フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ））、スルホニル誘導体（例えば、β−トリメチルシリルエタンスルホニル（ＳＥＳ））、スルフェニル誘導体、Ｃ１〜１２アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、９−フェニルフルオレニルなどが挙げられる。好ましい窒素保護基は、Ｆｍｏｃである。
【０１８１】
クローニングまたは精製などを容易にするために含まれる配列は、本発明に必ずしも寄与せず、そして、除外または除去されてもよい。
【０１８２】
糖環が開環形態および閉環形態で存在し得ること、ならびに閉環形態が本明細書中の構造式で示されるが、開環形態もまた本発明に含まれることが理解される。
【０１８３】
本発明のポリペプチドは、種々の手段（例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、（少なくとも部分的な）化学合成など）により、種々の形態（例えば、天然、融合体、非グリコシル化、脂質付加（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）など）で調製され得る。本発明のポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓタンパク質も宿主細胞タンパク質も実質的に含まない）。このポリペプチドの発現はＮｅｉｓｓｅｒｉａにおいて起こり得るが、異種宿主が好ましい。異種宿主は、原核生物性（例えば、細菌）または真核生物性であり得る。異種宿主は好ましくはＥ．ｃｏｌｉであるが、他の適切な宿主としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、マイコバクテリア（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
【０１８４】
本発明に従う核酸は、多くの方法（例えば、（少なくとも部分的な）化学合成により、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、生物自体からなど）で調製され得、そして種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プローブなど）を採り得る。これらは、好ましくは、実質的に純粋な形態で調製される（すなわち、他のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ核酸も宿主細胞核酸も実質的に含まない）。用語「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにまた、それらのアナログ（例えば、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエートなど）を含むＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など）を包含する。本発明は、（例えば、アンチセンス目的またはプロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）目的で）上に記載されている配列に対して相補的な配列を含む核酸を包含する。
【０１８５】
血清群に続いて、髄膜炎菌分類は、血清型、血清サブタイプ（ｓｅｒｏｓｕｂｔｙｐｅ）を、次いで免疫型（ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ）を含み、そして、標準的な命名法は、血清群、血清型、血清サブタイプおよび免疫型を列挙し、各々は、コロンにより隔てられる（例えば、Ｂ：４：Ｐ１．１５：Ｌ３，７，９）。血清群Ｂにおいて、いくつかの系統が、しばしば、疾患を引き起こし（超侵襲性）、いくつかの系統は、他よりも重篤な疾患形態を引き起こし（超毒性）、そして、その他は、ほとんど稀にしか疾患を引き起こさない。７種の超毒性系統、すなわち、サブグループＩ、サブグループＩＩＩおよびサブグループＩＶ−１、ＥＴ−５複合体、ＥＴ−３７複合体、Ａ４クラスターおよび系統３が認識されている。これらは、マルチローカス酵素電気泳動（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＭＬＥＥ）により規定されているが、マルチローカス配列分類（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ）（ＭＬＳＴ）もまた、髄膜炎菌を分類するために使用されている［参考文献１０４］。
【実施例】
【０１８６】
（発明を実施する形態）
（ΔＧ２８７−９５３ハイブリッドタンパク質）
髄膜炎菌血清群Ｂの３９４／９８株由来のタンパク質２８７および髄膜炎菌血清群Ｂの２９９６株由来のタンパク質９５３をコードするＤＮＡを消化し、そして短いリンカー配列と一緒に連結して、配列番号７のアミノ酸配列をコードするプラスミドを得た。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、そして細菌を増殖させてこのタンパク質を発現させた。適切な増殖の後に、細菌を収集し、そしてこのタンパク質を精製した。培養物から、細菌を遠心分離し、そしてペレットを、ペレット：緩衝液の体積比が１：８で、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）の存在下で均質化した。高圧ホモジナイザー（ＡＶＥＳＴＩＮ、１４０００ｐｓｉにて４サイクル）を用いて溶解を行った。溶解後、尿素を５Ｍの最終濃度で添加し、続いて室温にて１時間攪拌した。２００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４）＋５Ｍ尿素を用いて、ｐＨを６から５へと低下させた。混合物を１６８００ｇにて６０分間、２〜８℃において遠心分離した。上清を収集し、そしてＳＡＲＴＯＢＲＡＮ  Ｐ（０．４５〜０．２２μｍ  ＳＡＲＴＯＲＩＵＳ）によって濾過した。濾過した上清中のタンパク質は、−２０℃にて少なくとも３０日間、そして２〜８℃にて少なくとも１５日間安定であった。
【０１８７】
タンパク質を、溶出に３５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋５０ｍＭアセテート＋５Ｍ尿素（ｐＨ５．００）を用いたカチオン交換カラム（ＳＰＦＦ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にてさらに精製した。大部分の不純物は素通り画分（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｕ）に存在した。より低いＮａＣｌ濃度（１８０ｍＭ）を用いた事前溶出洗浄は、夾雑する２つのＥ．ｃｏｌｉタンパク質を有利に除去した。
【０１８８】
溶出した物質を、（２００ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ＋５Ｍ尿素（ｐＨ９）を用いて）ｐＨ８に調整し、そして溶出に５Ｍ尿素中の１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ８．００）を用いてＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）でさらに精製した。さらに、減少した塩（９０ｍＭ）を用いた事前溶出洗浄は、不純物を除去するために有用であった。
【０１８９】
Ｑ  ＨＰカラムからの濾過した溶出物質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．００）（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．００）を用いて１：２希釈し、次いで接線方向の濾過によって１０体積のＰＢＳ（ｐＨ７．００）に対してダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの終わりに、この物質を１．６倍濃縮して、約１．２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質とした。３０，０００Ｄａカットオフメンブレン（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ５０ｃｍ２，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＬＣＴＫ  ３０）を用いて、この物質を約９０％の収率で透析することが可能であった。
【０１９０】
（９３６−ΔＧ７４１ハイブリッドタンパク質）
髄膜炎菌血清群Ｂの２９９６株由来のタンパク質９３６および髄膜炎菌血清群ＢのＭＣ５８株由来のタンパク質７４１をコードするＤＮＡを消化し、そして短いリンカー配列と一緒に連結して、配列番号８のアミノ酸配列をコードするプラスミドを得た。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、そして細菌を増殖させてこのタンパク質を発現させた。この組換えタンパク質は分泌されなかったが、この細菌内で可溶性のままであった。
【０１９１】
適切な増殖の後、細菌を遠心分離し、湿ったペーストを得て、そして以下の通りに処理した：
−  ２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．００）の存在下での、高圧システムによるホモジナイゼーション。
−  遠心分離および直交方向の（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）濾過による清澄化。
−  ２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．００）中の１５０ｍＭ  ＮａＣｌによる溶出を用いたカチオン性カラムクロマトグラフィー（ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ）。
−  素通り画分を収集する、アニオン性カラムクロマトグラフィー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ）。
−  ２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．００）による溶出を用いた疎水性カラムクロマトグラフィー（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ）。
−  １０Ｋｄのカットオフでの、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対するダイアフィルトレーション。
−  −２０℃での最終滅菌濾過および保存。
【０１９２】
最終物質中のタンパク質は、−２０℃および２〜８℃の両方において少なくとも３ヶ月間にわたって安定であった。
【０１９３】
（ＮａｄＡ（ＮＬ）（Ｃ）タンパク質）
髄膜炎菌血清群Ｂの２９９６株由来のＮａｄＡタンパク質をコードするＤＮＡを消化して、そのＣ末端をコードする配列を除去して、配列番号１のアミノ酸配列をコードするプラスミドを得た。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、そして細菌を増殖させてこのタンパク質を発現させた。組換えタンパク質を培養培地中に分泌させ、そしてリーダーペプチドは、この分泌されたタンパク質（配列番号２）中に存在しなかった。上清を以下の通りに処理した：
−  ７倍濃縮および直交流ＵＦ（カットオフ３０Ｋｄ）による緩衝液２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に対するダイアフィルトレーション。
−  ２０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中の４００ｍＭ  ＮａＣｌによる溶出を用いたアニオン性カラムクロマトグラフィー（Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ）。
−  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ（ｐＨ７．６）中の５０ｍＭ  ＮａＣｌによる溶出を用いた疎水性カラムクロマトグラフィー工程（Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｉｇｈ  Ｓｕｂ）。
−  ２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）による溶出を用いたヒドロキシルアパタイトセラミックカラムクロマトグラフィー（ＨＡ  Ｍａｃｒｏ．Ｐｒｅｐ）。
−  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対するダイアフィルトレーション（カットオフ３０Ｋｄ）。−  最終滅菌濾過および−２０℃での保存。
【０１９４】
最終物質中のタンパク質は、−２０℃および２〜８℃の両方において少なくとも６ヶ月間安定であった。
【０１９５】
ＮａｄＡタンパク質は、分解感受性であり、そして短縮形態のＮａｄＡは、ウェスタンブロットまたは質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる）によって検出されて、１０ｋＤａまでの分子量低下を示し得る。分解産物は、ネイティブＮａｄＡから（例えば、カラムＴＳＫ  ３００ＳＷＸＬ、プレカラムＴＳＫＳＷＸＬ、ＴＯＳＯＨＡＡＳを用いる）ゲル濾過によって分離され得る。このような濾過によって、以下の３つのピークが得られる：
（ｉ）保持時間１２．６３７分および見かけのＭＷ８８５．０３６Ｄａを有する第１のピーク；（ｉｉ）保持時間１３．８７１分および見かけのＭＷ５３０．３８８Ｄａを有するピーク；（ｉｉｉ）保持時間１３．８７１分および見かけのＭＷ５３０．３８８Ｄａを有するピーク。これらの３つのピークの光散乱分析は、（ｉ）２０８５００Ｄａ、（ｉｉ）９８４６０Ｄａ、（ｉｉｉ）７８７６０Ｄａという実際のＭＷ値を示す。従って、この第１のピークは、ＮａｄＡ凝集物を含み、そして第３のピークは分解産物を含む。
【０１９６】
ＮａｄＡ（ＮＬ）（Ｃ）の推定分子量は３４．１１３Ｄａであるので、ピーク（ｉｉ）は、所望の抗原である、三量体タンパク質を含む。
【０１９７】
（抗原の組合せ）
マウスを、これらの３つのタンパク質を含む組成物で免疫し、そして比較の目的のために、３のタンパク質をまた単独で試験した。１群あたり１０匹のマウスを用いた。この混合物は、種々の株に対して高い殺菌性力価を誘導し得た：
【０１９８】
【表２】
0005618842.tif 000006
個々のマウスを見ると、三重混合物は、個々の抗原を得た３つの血清群Ｂ株に対して高くかつ一貫した殺菌力価を誘導した：
【０１９９】
【表３】
0005618842.tif 000007
（組合せおよびＯＭＶとの比較）
さらなる実験では、これらの抗原（１用量あたり２０μｇの各抗原）を、Ｈ４４／７６株（Ｎｏｒｗａｙ）または３９４／９８株（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）のいずれかから調製した１０μｇのＯＭＶと組み合わせて投与した。ポジティブコントロールは、血清群Ｂについては抗莢膜ＳＥＡＭ−３  ｍＡｂまたは他の株についてはＣＲＭ１９７結合体化莢膜サッカリドであった。この混合物はほぼ常に、単独のＯＭＶよりも良好な力価を与え、そしてこの混合物をＯＭＶに添加することはほぼ常に、ＯＭＶの効力を有意に増強した。多くの場合、この抗原混合物は、ポジティブコントロールを用いて見られる応答と一致したかまたはその応答を超えた。
【０２００】
（超毒性系統試験）
以下の抗原を、種々の超毒性系統由来の種々の血清群Ｂ株に対して試験した：
（ａ）ＮａｄＡ（ＮＬ）（Ｃ）
（ｂ）ΔＧ２８７−９５３
（ｃ）９３６−ΔＧ７４１
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の混合物
（ｅ）Ｈ４４／７６株（Ｎｏｒｗａｙ）から調製したＯＭＶ
（ｆ）３９４／９８株（Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）から調製したＯＭＶ
（ｇ）ΔＧ２８７と（ｅ）との混合物
（ｈ）（ｄ）と（ｅ）との混合物
（ｉ）（ｄ）と（ｆ）との混合物。
【０２０１】
ＳＥＡＭ−３をポジティブコントロールとして用いた。
【０２０２】
結果は、以下の通りであった。結果を、示した超毒性系統における、血清殺菌性力価が１０２４を超えた株の百分率として表す：
【０２０３】
【表４】
0005618842.tif 000008
特定の参照株に対しては、殺菌性力価は以下の通りであった：
【０２０４】
【表５】
0005618842.tif 000009
それゆえ、組成物（ｄ）、組成物（ｈ）および組成物（ｉ）は、超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ−５および超毒性系統３由来の広範囲の種々の株の血清群Ｂの肺炎球菌に対して殺菌性抗体応答を誘導する。組成物（ｈ）および組成物（ｉ）を用いた力価は、一般に、（ｄ）を用いるよりも高かったが、超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ−５および超毒性系統３内での株の有効範囲はより優れているというわけではなかった。
【０２０５】
分類されていない株の有効範囲もまた、組成物（ｄ）、組成物（ｈ）および組成物（ｉ）を用いて高かった。
【０２０６】
（髄膜炎菌結合体および／またはＨｉｂ結合体との組合せ）
三重ＭｅｎＢ組成物を、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについてのオリゴサッカリド結合体の混合物と組み合わせて、以下の抗原を含むワクチンを得る：
【０２０７】
【表６】
0005618842.tif 000010
ＭｅｎＡ結合体（１０μｇサッカリド＋１２．５〜３３μｇ  ＣＲＭ１９７）および／またはＨｂＯＣ  Ｈｉｂ結合体（１０μｇサッカリド＋２〜５μｇ  ＣＲＭ１９７）を含め、類似のワクチンを調製する。
【０２０８】
１つの一連の試験において、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの結合体を組合せた。各結合体は、４０μｇ／ｍｌで存在した（サッカリドとして測定した）。ＭｅｎＢ抗原を用いた使用の前の保存については、組み合わせた結合体を、１５ｍｇスクロース、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）の存在下で［−４５℃で３時間、５０ｍＴｏｒｒ減圧での−３５℃で２０時間、５０ｍＴｏｒｒにて３０℃で１０時間、１２５ｍＴｏｒｒにて３０℃で９時間］凍結乾燥した。凍結乾燥前の最終体積は０．３ｍｌであった。それゆえ、０．６ｍｌの水溶液中での再懸濁後、このサッカリドは、１血清群あたり１２μｇで存在する。凍結乾燥を、便宜のためにのみ用いた。そして、最終産物の通常の保存の間の効力も安定性も、凍結乾燥を必要としない。
【０２０９】
第２のバッチの物質を、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについてと同じサッカリド投与量にて血清群Ａ結合体もまた含むこと以外は同様にして調製した。
【０２１０】
第３のバッチの物質を、髄膜炎菌についてと同じサッカリド投与量にてＨｉｂ−ＣＲＭ１９７結合体もまた含むこと以外は（血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙ）と同様にして調製した。
【０２１１】
比較のために、血清群Ａおよび血清群Ｃの結合体の凍結乾燥した調製物を調製した。ＭｅｎＡ物質を、上記の通り、１５ｍｇのスクロースを用いて凍結乾燥して、再構成後に１２μｇの用量のサッカリドを与えた。ＭｅｎＣ物質を、９ｍｇのマンニトールを用いて凍結乾燥して、再構成後に１２μｇの用量のサッカリドを与えた。
【０２１２】
これらの物質を６００μｌの血清群混合物（ｄ）（または、コントロールとして、すなわち、抗原を欠くこと以外は同一の組成の群２および群３）と組合せて、８つの組成物を得た：
【０２１３】
【表７】
0005618842.tif 000011
これらの組成物を、２００μｌの体積でＣＤ／１マウス（１群あたり８匹）に０日目、２１日目および３５日目に腹腔内投与し、最終的に４９日目に出血させた。４９日目の血清を、ＳＢＡアッセイにおいて、血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙにおける種々の髄膜炎菌株に対して試験した。結果は以下であった：
【０２１４】
【表８】
0005618842.tif 000012
従って、これらの髄膜炎菌タンパク質抗原は、結合体化した髄膜炎菌およびＨｉｂサッカリド抗原の添加後でさえも有効なままである。同様に、これらの髄膜炎菌結合体は、これらのタンパク質抗原の添加後でさえも、効力を保持する。実際、このデータは、これらの結合体へのこれらのタンパク質抗原の添加が抗ＭｅｎＷ１３５効力を（群２および群７と比較して）増強することを示唆する。さらに、これらのタンパク質抗原は、群４および群５がそうであるように、単独で良好な抗ＭｅｎＹ力価を与える［参考文献２２０を参照のこと］ので、特に、血清群Ｙに対して、あるレベルの交差反応性が存在する。
【０２１５】
このデータはまた、髄膜炎菌結合体へのＨｉｂ結合体の添加が抗Ｗ１３５活性を（群２および群３と比較して）増強することをを示す。
【０２１６】
（改変されたＭｅｎＡサッカリドの使用）
莢膜ポリサッカリドをＭｅｎＡから精製し、そして凍結乾燥してＭｅｎＡオリゴサッカリドを得た。このポリサッカリド（２ｇ）を、１０ｍｇ／ｍＬのポリサッカリド濃度にて、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．７５）中で５０℃にて約４時間加水分解した［７３］。加水分解後、この溶液を回転エバポレーションによって乾燥した。
【０２１７】
このオリゴサッカリドを、以下の反応スキームを用いて活性化した：
【０２１８】
【化４】
0005618842.tif 000013
このオリゴサッカリドをＤＭＳＯ中に溶解して、１０ｍｇ／ｍＬのサッカリド濃度を得た。１：２０であるオリゴサッカリド：ＣＤＩのモル比に従って、次いで、２１．２６２ｇのＣＤＩを添加し、そして反応混合物を室温にて１６時間攪拌した。得られたＭｅｎＡ−ＣＤＩ化合物を、８０：２０（ｖ／ｖ）のアセトン：ＤＭＳＯ混合物中での選択的沈澱、続いて遠心分離によって精製した。結合したイミダゾールに対する遊離イミダゾールの比を決定することによって、活性化反応の効率は、約６７．９％であると算出された。
【０２１９】
第２の反応工程において、ＭｅｎＡ−ＣＤＩオリゴサッカリドを、約１０ｍｇ／ｍＬのサッカリド濃度でＤＭＳＯ中に可溶化した。１：１００であるＭｅｎＡ−ＣＤＩ単位：ＤＭＡのモル比に従って、３６．２８８ｇの９９％塩酸ジメチルアミン（すなわち、Ｒ１およびＲ２＝Ｍｅ）を添加し、そして反応混合物を室温にて１６時間攪拌した。反応産物を凍結乾燥し、そして１０ｍｇ／ｍＬ水の溶液に再可溶化した。
【０２２０】
低分子量反応試薬（特に、ジメチルアミン（ＤＭＡ））をこのオリゴサッカリド調製物から除去するために、３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯメンブレン（Ｓｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＴＭ）を通して透析工程を行った。以下の４回の透析工程を実施した：（ｉ）２Ｌの１Ｍ塩化ナトリウムに対して１６時間（透析係数１：２０）、（ｉｉ）２Ｌの０．５Ｍ塩化ナトリウムに対して１６時間（透析係数１：２０）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）２ＬのＷＦＩに対して１６時間（透析係数１：２０）。精製を改善するために、１ｋＤａ  ＭＷＣＯメンブレン（ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＴＭ）を通したダイアフィルトレーション工程もまた実施した。
【０２２１】
精製されたＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ産物を、ｐＨ６．５において、２５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（ＦｌｕｋａＴＭ）中で緩衝化した。
【０２２２】
改変されたＭｅｎＡサッカリドの結合体（ＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ）を調製するために、プロセス全体は以下の通りであった：
−  オリゴサッカリドフラグメントを生じる、ポリサッカリドの加水分解
−  このオリゴサッカリドフラグメントのサイズ分け
−  サイズ分けしたオリゴサッカリドの末端アルデヒド基の還元的アミノ化
−  ＣＤＩ反応前の、Ｆｍｏｃ基による末端−ＮＨ２基の保護
−  ＤＭＡ反応の間の−ＮＨ２基の固有の脱保護
−  ＳＩＤＥＡ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアジピン酸）による末端−ＮＨ２基の活性化
−  ＣＲＭ１９７タンパク質への共有結合。
【０２２３】
改変されたＭｅｎＡオリゴサッカリド結合体は、上昇した温度において、その天然対応物よりもずっと加水分解耐性が高かった。例えば、３７℃において２８日後、放出されたサッカリドの百分率は、改変したオリゴサッカリドについて６．４％であり、一方、天然抗原については２３．５％である。さらに、改変されたオリゴサッカリドによって誘導された力価は、ネイティブな糖構造体を用いて得られる力価よりも有意に低くはない。
【０２２４】
改変されたＭｅｎＡ結合体を、未改変のオリゴサッカリドの結合体の代替物としてのＭｅｎＣ結合体、ＭｅｎＷ１３５結合体およびＭｅｎＹ結合体と組み合わせる。この四価混合物を３つのＭｅｎＢポリペプチドと混合して、単回用量でＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｂ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対して有効なワクチンを得る。
【０２２５】
（肺炎球菌の組合せ）
組み合わされた３つのＭｅｎＢタンパク質は肺炎球菌サッカリド結合体と混合して、各々の肺炎球菌血清群の２μｇ／用量の最終濃度を得る（血清群６Ｂについては二倍）。従って、再構成したワクチンは、以下の抗原を含む：
【０２２６】
【表９】
0005618842.tif 000014
本発明が、例示のみのために記載されており、本発明の範囲および趣旨内にあるままに改変が行われ得ることが理解される。
【０２２７】
（参考文献）（これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）
【０２２８】
【表１０】
0005618842.tif 000015
【０２２９】
【表１１】
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【０２３０】
【表１２】
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【０２３１】
【表１３】
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【０２３２】
【表１４】
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【０２３３】
【表１５】
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