(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
直鎖型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその修飾物とラクトフェリンとがアミド結合により共有結合されているＰＥＧ化ラクトフェリン複合体の製造方法であって、ラクトフェリンとパラニトロフェニル基を有する直鎖型ＰＥＧ誘導体とを含む反応液を、上記パラニトロフェニル基とラクトフェリンとの間でアミド基が形成される条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記反応工程が、ｐＨ４〜５．５の条件下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記反応工程が、ラクトフェリン：直鎖型ＰＥＧ誘導体のモル比が１：１〜１：５、ラクトフェリンの最終濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、反応時間が２４〜４８時間の条件下で行われる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載の方法により製造された、直鎖型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその修飾物とラクトフェリンとがアミド結合により共有結合されていることを特徴とするＰＥＧ化ラクトフェリン複合体。
【請求項５】
請求項４記載のＰＥＧ化ラクトフェリン複合体及び治療上不活性な基剤及び／又は添加物を含む医薬品組成物。
【請求項６】
経口投与用である、請求項５記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトフェリンとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非ペプチド性親水性高分子との生物学的に活性な複合体、その製造方法及びその用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体高分子の性質の調節などの目的のため、生体高分子とＰＥＧなどの非ペプチド性親水性高分子とをコンジュゲート化すること（以下「複合体化」、ＰＥＧ又はその類似化合物を用いる場合については「ＰＥＧ化」ということがある）が行われている。より具体的には、複合体化は、一般に、非ペプチド性親水性高分子の末端に活性基を付けてタンパク質等の分子表面に存在する官能基と反応させることにより行われる。
特に、タンパク質及びペプチドの複合体化は重要であり、非ペプチド性親水性高分子鎖でタンパク質の分子表面を部分的に覆うことにより、エピトープをシールドすることによる抗原性・免疫原性の低減、細網内皮系等による取り込みの低減、及びタンパク分解酵素による認識及び分解の防止などが研究されている。また、複合体化された物質について、生体内でのクリアランスが遅延し、体内寿命が延びることが知られている。その一方で、複合体化されたタンパク質などでは、非ペプチド性親水性高分子の存在によって活性部位が影響を受け、生物活性が低減されることも頻繁に観察されている。
例えば、インターフェロンは、ＰＥＧ化することによって、体内寿命が約７０倍に延びる一方、抗ウイルス活性のような生物活性が約１／１０に低下する。しかし、総合的にはＰＥＧ化によって治療効果が大幅に改善されることが知られており、これはＣ型肝炎の治療に役立っている。
タンパク質の複合体化という概念自体は、白血病治療薬としてアスパラギナーゼのＰＥＧ化が成功して以来、古い歴史がある。現在までにＰＥＧなどの複合体化試薬自体の構造（活性基のタイプ、分子の大きさと分布、分岐型の開発など）の改良がなされ、技術的に進歩している。
分岐型のＰＥＧといくつかのタンパク質との複合体については、直鎖型ＰＥＧを用いた場合と比較して、プロテアーゼ耐性が高くなり、タンパク質によってはｐＨ及び熱に対する安定性が増大することが知られている（非特許文献１：Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９５  ６（１）：６２−９）。また、インターフェロンについては、分岐型ＰＥＧとの複合体が他のＰＥＧとの複合体及びインターフェロン自体よりも高い抗増殖活性を有することが観察されている（特許文献１：特開平１０−６７８００）。
しかし、複合体化による個々のタンパク質の活性の変動は、タンパク質ごとに異なっている。さらに、例えばインターフェロンについてはＰＥＧ化によってインビトロの抗ウイルス活性が減少する一方、ヒト腫瘍細胞における抗増殖活性が増加するというように、ＰＥＧ化によって、あるタンパク質が有する複数の特性について一律ではない影響が生じうる。したがって、望ましい特性を備えた複合体を得るための最適な条件等については、各タンパク質ごとに充分に検討されなければならない。
また、タンパク質などの複合体化に関しては、非ペプチド性親水性高分子鎖の構造（直鎖型か分岐型か、分子の大きさと分布など）、反応部位及び反応分子数によって、抗原性、プロテアーゼ抵抗性、体内寿命及び熱安定性などの生化学的・薬剤学的性質、及び薬効に関わる生物活性への影響が大きく異なることが容易に予想される。したがって、このような複合体を医薬品として開発する場合、一定の品質を保証するため非ペプチド性親水性高分子鎖の付加が一定の部位であることが求められる。
ラクトフェリン（以下、「ＬＦ」と略すことがある）は、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、精液などにも見出されている、分子量約８０，０００の糖タンパク質である。ラクトフェリンは、鉄を結合することから、トランスフェリンファミリーに属する。ラクトフェリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、最近、ラクトフェリンが脂質代謝改善作用、鎮痛・抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている。このように、ラクトフェリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タンパク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラクトフェリンを含む食品は既に市販されている。
ラクトフェリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテアーゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、ラクトフェリン分子としてはほとんど腸管まで到達することができない。しかし、ラクトフェリン受容体は消化管では小腸粘膜に存在することが知られており、最近、ラクトフェリンが腸管から体内に取り込まれて、生物活性を発現していることが明らかにされている。そのため、ラクトフェリンの持つ生物活性を発揮させるには、ラクトフェリンを胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態で腸管まで到達させることが重要である。
ラクトフェリンに関しても、ＰＥＧ化された複合体についての報告がある（非特許文献２：Ｃ．Ｏ．Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５−３３（１９８３））。ここでＰＥＧ化反応に使用されたＰＥＧは、モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）のＯＨ基が１，１’−カルボニルイミダゾールで活性化されたものであった。しかし、この文献には、直鎖型のＰＥＧとＬＦとの複合体が５〜２０倍延長された体内寿命を有していたことが記載されているだけであり、ＰＥＧ化されたＬＦの生物活性、ＰＥＧ化の程度、均一性などについては何ら記載されていない。
そこで、以前、本発明者らは、鋭意検討した結果、分岐型の非ペプチド性親水性高分子を用いることにより、このような分子をラクトフェリン分子表面の限定された部位に結合させ、天然ラクトフェリンの３０％以上の鉄キレート能を保持した生物学的に活性なラクトフェリン複合体を得ることに成功した（特許文献２）。しかし、直鎖型のものについては成功していなかった。
【特許文献１】特開平１０−６７８００号公報
【特許文献２】特開２００７−７０２７７号公報
【非特許文献１】Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１９９５  ６（１）：６２−９
【非特許文献２】Ｃ．Ｏ．Ｂｅａｕｃｈａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５−３３（１９８３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、抗原性を低減し、ペプシン耐性を付与し、体内寿命を延ばした、臨床的有用性の高い直鎖型非ペプチド性親水性高分子とラクトフェリンとの複合体及びその製造方法を提供することを目的とする。さらに、天然ラクトフェリンの生物活性を一定割合保持し、体内寿命が有意に延長されており、臨床的有用性が天然ラクトフェリンよりも優れたラクトフェリン複合体及びその製造方法等を提供することを目的とする。
特に、短時間で効率的に上記の特性を有するラクトフェリン複合体を大量調製するのに適した方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、ラクトフェリンを生物活性が保たれた状態で最も均一に直鎖型ＰＥＧのような非ペプチド性親水性高分子と複合体化するための反応条件等を検討し、ラクトフェリン分子表面の限定された部位に特定の構造のこのような高分子を結合させることを可能にした。また、このような複合体の大量調製又は工業的生産に適した条件及び方法を見出した。さらに、そのようにして製造されたラクトフェリン複合体はペプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有し、最も重要な生物活性である鉄キレート能、さらには炎症性サイトカイン産生調節（抑制）能も保存されているという結果を得、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
〔１〕  直鎖型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその修飾物とラクトフェリンとがアミド結合により共有結合されているＰＥＧ化ラクトフェリン複合体の製造方法であって、ラクトフェリンとパラニトロフェニル基を有する直鎖型ＰＥＧ誘導体とを含む反応液を、上記パラニトロフェニル基とラクトフェリンとの間でアミド基が形成される条件下で反応させる工程を含むことを特徴とする方法；
〔２〕  上記反応工程が、ｐＨ４〜５．５の条件下で行われる、前記〔１〕記載の方法；
〔３〕  上記反応工程が、ラクトフェリン：直鎖型ＰＥＧ誘導体のモル比が１：１〜１：５、ラクトフェリンの最終濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、反応時間が２４〜４８時間の条件下で行われる、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法；
〔４〕  前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法により製造された、直鎖型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はその修飾物とラクトフェリンとがアミド結合により共有結合されていることを特徴とするＰＥＧ化ラクトフェリン複合体；
〔５〕  前記〔４〕記載のＰＥＧ化ラクトフェリン複合体及び治療上不活性な基剤及び／又は添加物を含む医薬品組成物；及び、
〔６〕  経口投与用である、前記〔５〕記載の医薬品組成物、
を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明のＰＥＧ化ラクトフェリン複合体の製造方法は、直鎖型のＰＥＧ誘導体を用いて、短時間で容易に効率よく、均一にＰＥＧ化された目的のラクトフェリン複合体を製造することを可能にする。本発明の製造方法によれば、反応性の高い限定的な部位のみが均一に反応しているものと推定され、その結果、非常に均一な複合体が得られる。
本発明の複合体は、ラクトフェリンが有する鉄の結合能を保持しており、したがって、少なくとも鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている。また、直鎖型ＰＥＧ誘導体の結合によって、ペプシンなどのプロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内寿命が長く、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができる。さらに、複合体化によって胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなっているため、さらなる腸溶化のための製剤的な処理を行わなくても、充分に腸内に到達しうる。本発明の複合体は、炎症性サイトカインの産生を調節する活性もまた、充分に保持している。
さらに、本発明の複合体は、特定の位置に一定の数のＰＥＧが結合するため、品質が均一であり、製造管理・品質管理の点でも有利である。これらの利点によって、本発明の複合体は、医薬品成分、特に経口投与用医薬品成分としての使用に特に適している。即ち、本発明にしたがった複合体及び複合体製造方法により、ラクトフェリンを医薬品成分としてさらに有用性の高い形とすることができる。ラクトフェリンは、安全性が非常に高く、多様な生物活性を有するので、本発明により、有効な治療薬がない疾患又は症状の治療薬又は予防薬として、さらに有利に適用が可能となる。例えば、生活習慣病（動脈硬化、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、糖尿病、脂肪肝など）、がん（発がん予防、がんの二次予防、転移抑制、制癌剤の作用増強など）、自己免疫疾患（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎、悪性関節リウマチ、膠原病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデスなど）、精神神経疾患（痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、テンカン、うつ病、ヒキコモリ、統合失調症、各種ストレス性疾患など）、疼痛緩和（モルヒネ等のオピオイド増強作用、がん性疼痛、神経因性疼痛、ヘルペス後疼痛、線維筋痛症、術後疼痛、舌痛症、生理痛、歯痛、関節痛など）、肝炎（各種ウィルス性肝炎、非アルコール性肝炎、肝硬変など）、炎症性腸疾患（大腸性潰瘍炎、クローン病など）、過敏性腸症候群、前立腺肥大、頻尿、不眠症、便秘などへ適応を拡大できる。
さらに、本発明の複合体に含まれるラクトフェリンは、抗菌・抗ウィルス作用及び免疫能賦活作用があるので、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、各種感染症及びそれに基づく炎症、例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌の胃粘膜感染、歯周病、歯槽膿漏、口臭、口腔カンジダ症、口内炎、口角炎、鼻炎、食道炎、胆嚢炎、尿路感染症、膣感染症、水虫、ニキビ、ヘルペス属ウィルスの感染症、老人性肺炎、術後感染症などへの適用も可能であり、また、抗生物質の作用を増強する作用がある。
一方、ラクトフェリンは免疫的な寛容をもたらす作用もあり、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、脂漏症、蕁麻疹等のアレルギー性疾患にも適用可能である。注目すべきことは、ラクトフェリンには鉄キレート作用に基づく強い抗酸化ストレス作用があり、本発明の複合体又はそれを含む医薬品組成物は、ウィルソン病、劇症肝炎などや、肌や眼の抗加齢・若返り作用、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、粘膜上皮細胞の角化抑制・若返り作用などへの適用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、官能基にパラニトロフェニル基を有する直鎖型ＰＥＧ誘導体と、ｂＬＦとの反応の模式図である。パネルＡは反応前の直鎖型ＰＥＧ誘導体及びＬＦ、パネルＢは反応後の複合体及び副生成物を表す。
図２は、ＮＨＳエステルを官能基に有する直鎖型ＰＥＧ誘導体とｂＬＦとの複合体の形成を解析したゲルの写真を示す図である。矢印で示したバンドは未修飾のウシラクトフェリンを示す。パネルＡは、Ｓｉｇｍａ社製ＰＥＧ試薬（「Ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」、ＭＷ＝５ｋＤａ）、パネルＢは、日油株式会社製ＰＥＧ試薬（「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＧＣ−３０ＴＳ」、ＭＷ＝３０ｋＤａ）、パネルＣは、日油株式会社製ＰＥＧ試薬（「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＴＲ」、ＭＷ＝２０ｋＤａ）をそれぞれ用いた場合の結果である。
図３は、異なるｐＨ条件下でのパラニトロフェニル基を有する直鎖型ＰＥＧ誘導体（「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（５ｋＤａ））とｂＬＦとの複合体（５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ）の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
図４は、異なるｐＨ条件下でのパラニトロフェニル基を有する直鎖型ＰＥＧ誘導体（「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（３０ｋＤａ））とｂＬＦとの複合体（３０Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ）の形成を解析したゲルの写真を示す図である。
図５は、２５℃で異なる反応時間条件下での５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの形成を解析したゲルの写真を示す図である。
図６は、２５℃で異なる反応時間条件下での３０Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの形成を解析したゲルの写真を示す図である。
図７は、５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆを、陽イオン交換体で精製した後、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したゲルの写真を示す図である。
図８は、３０Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆを、陽イオン交換体で精製した後、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したゲルの写真を示す図である。
図９は、未修飾ラクトフェリン（ｂＬｆ）、精製３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆを、ペプシンで消化後、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したゲルの写真を示す図である。
図１０は、ペプシンによる３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの経時的な分解を、未修飾ｂＬＦの分解と比較した図である。◆はｂＬＦ、■は３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の複合体は、直鎖型ＰＥＧとラクトフェリンとの生物学的に活性な複合体である。本発明の複合体においてラクトフェリンと結合される直鎖型ＰＥＧ誘導体は、一般に、一方の末端にラクトフェリンの官能基と反応して共有結合を形成しうるパラニトロフェニル基を有し、生体に対して適合可能又は薬理学的に不活性であればよい。
本発明の複合体は、
式〔Ｉ〕：
〔ＰＥＧ〕−ＣＯＮＨ−〔ＬＦ〕
（式中、〔ＰＥＧ〕はポリエチレングリコール（ＨＯ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−）又はその修飾物の基、ＣＯＮＨはアミド結合、〔ＬＦ〕はラクトフェリンをそれぞれ表す）
で示される。
式〔Ｉ〕において〔ＰＥＧ〕部分は、ＰＥＧ又はその修飾物（例えばメトキシ化物）であり、短い分岐やペンダント基を有していてもよいが、特に直鎖状のＰＥＧ又はメトキシＰＥＧであることが好ましい。
本発明の複合体において使用される「ラクトフェリン」（ＬＦ）は、天然又は天然型のラクトフェリン分子そのもののほか、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラクトフェリン、及びラクトフェリンの活性フラグメントなどのラクトフェリンの機能的等価物であってもよく、鉄イオンの有無又はその含有量、由来する生物種などを問わない。
天然のラクトフェリンには、４４個（ヒト）〜５４個（ウシ）程度のリジン残基が存在するが、それらの反応性はその存在位置の局所的環境により異なる。本発明の方法によれば、ラクトフェリンのＮ末端側のα−アミノ基及びリジン残基のε−アミノ基がＰＥＧによって修飾されうる標的となるが、複合体において、１〜１０箇所、好ましくは１〜５箇所に、再現性よく非ペプチド性親水性高分子が共有結合される。特に、最適条件下で反応工程を行うことにより、ＬＦ１分子あたり１箇所程度の非常に均一性の高い選択的なＰＥＧ化が達成される。
本発明の複合体に関して「生物学的に活性な」とは、ラクトフェリンの生理薬理活性が保持されていることを意味する。特に、本発明の複合体は、天然ラクトフェリンとほぼ同等の鉄キレート（結合）能及び／又は炎症性サイトカイン産生調節能を有している。
具体的には、後述する実施例の方法で測定して天然ラクトフェリンの鉄結合能を１００％とした場合に、本発明の複合体は、少なくとも５０％以上（例えば約５０％〜約１５０％又は約５０％〜約１２０％）の鉄結合能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の複合体は、天然ラクトフェリンの約６０％〜約１００％又はそれ以上（例えば約６０％〜約１５０％又は約６０％〜約１２０％）に相当する鉄結合能を有する。なお、鉄結合能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、±２０％程度の誤差がありうる。
また、後述する実施例の方法で測定して天然ラクトフェリンの炎症性サイトカイン産生調節能を１００％とした場合に、本発明の複合体は、少なくとも５０％以上（例えば約５０％〜約１５０％又は約５０％〜約１２０％）の炎症性サイトカイン産生調節能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の複合体は、天然ラクトフェリンの約７０％〜約１００％又はそれ以上（例えば約７０％〜約１５０％又は約７０％〜約１２０％）に相当する炎症性サイトカイン産生調節能を有する。なお、サイトカイン産生調節能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、±２０％程度の誤差がありうる。
本発明の複合体は、プロテアーゼ耐性を有する。即ち、本発明の複合体は、少なくともペプシン及び／又はトリプシン、キモトリプシンによる消化に対して天然ラクトフェリンと比較して有意に耐性である。好ましくは、本発明の複合体は、実施例に記載した条件でのペプシンによる２０分の消化後において、天然ラクトフェリンの約１．５倍〜約２倍又はそれ以上（例えば約２倍〜約５倍）が未消化で残存する程度のペプシン耐性を有する。
本発明の複合体は、直鎖型ＰＥＧ誘導体のパラニトロフェニル基とラクトフェリンの官能基とを反応させることによって共有結合させることにより製造することができる。例えば、直鎖型ＰＥＧ誘導体としては、
式〔ＩＩ〕：
〔ＰＥＧ〕−〔ＰＮＰ〕
（式中、〔ＰＥＧ〕はポリエチレングリコール又はその修飾物、〔ＰＮＰ〕はパラニトロフェニル基をそれぞれ表す）
で示されるものを使用することができる。
官能基にパラニトロフェニル基を有する直鎖型ＰＥＧ試薬と、ウシＬＦ（ｂＬｆ）とが反応して本発明のＰＥＧ化ラクトフェリン複合体が生じる反応の模式図を図１に示す（反応前：パネルＡ；反応後：パネルＢ）。
このような直鎖型ＰＥＧ誘導体は、公知の方法で合成することもできるが、既に各種のものが市販されている。反応に使用される直鎖型ＰＥＧ誘導体の分子量（数平均分子量）としては、一般に約５００〜約２００，０００、好ましくは約２，０００〜約１００，０００、特に好ましくは約１０，０００〜約６０，０００（Ｄａ）である。
ＰＥＧ化反応の際、好ましくは、ラクトフェリンと直鎖型ＰＥＧ誘導体とが、１：０．１〜１：１００のモル比で反応液中に添加される。ラクトフェリン：直鎖型ＰＥＧ誘導体の混合モル比は、さらに好ましくは１：０．１〜１：６０、最も好ましくは１：１〜１：５の範囲内である。
また、反応工程は、一般的にｐＨ４〜５．５、温度０〜４０℃、時間１分〜７２時間の条件下で行われる。反応液のｐＨは、特に好ましくはｐＨ５±０．５、最も好ましくはｐＨ５付近（即ちｐＨ４．７５〜５．２５）である。
反応時間及び反応温度は相互に密接に関連して変化させることができるが、一般に反応温度が高い場合は時間を短く、温度が低い場合は時間を長くすることが好ましい。例えば、ラクトフェリン：直鎖型ＰＥＧ誘導体のモル比が１：１〜１：５の条件下では、２５℃において約１〜４８時間反応させることにより、特に良好な結果（均一な複合体化など）が得られる。
上記のようにして製造された、試料中に含有される本発明の複合体は、まず陽イオン交換担体（樹脂）に吸着させて濃縮し、続いて、得られた濃縮物を分子篩クロマトグラフィ担体（樹脂）に適用することによって容易に精製することができる。具体的には、例えば最初に複合体を含有する試料を陽イオン交換カラムに適用して複合体をカラムに吸着させ、高塩濃度の緩衝液で溶出して濃縮された複合体を含有する溶出液を集める。次に、この溶出液を分子篩クロマトグラフィカラムに適用し、脱塩及び所望の緩衝液への置換を行うことができる。必要に応じて、透析、限外ろ過などの公知の方法で溶出液を適宜さらに濃縮することができる。
さらには、本発明の複合体の精製方法は、上記の二段階のカラムクロマトグラフィの代わりに、陽イオン交換体カラムのみによる一段階の精製であってもよい。例えば、本発明の複合体を含む試料を陽イオン交換カラムに適用し、複合体をカラムに吸着させた後、高塩濃度の緩衝液で溶出するのみでも、充分に未反応ラクトフェリンとの分離が可能である。
このような陽イオン交換体からの溶出において、ＰＥＧ化されたラクトフェリンは０．３Ｍ〜０．４５Ｍ）の塩濃度で選択的に溶出されることが見出された。したがって、溶出は、直線的濃度勾配を用いてもステップワイズに溶出してもよいが、溶出液としては０．３Ｍ〜０．４５Ｍの塩濃度を含むような濃度勾配又は溶液を用いる。ステップワイズ塩濃度溶出法は、直線的塩濃度勾配溶出法と比較して簡便であり、大量精製を行う際には極めて有用であると考えられる。したがって、工業的生産又は大量調製の場合は、ステップワイズ塩濃度溶出法によることが有利である。
本発明の精製法に用いることのできる陽イオン交換体の担体としては、シリカゲルが挙げられる。シリカゲルは、物理的な強度が高い点において工業的生産又は大量調製に好適である。
ラクトフェリンは、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用、脂質代謝改善作用、鎮痛作用、抗ストレス作用などを含む広範な生理活性を有しており、これらの作用によって、生活習慣病（例えば、高コレステロール血症、高脂血症など）、疼痛管理（がん性疼痛、神経因性疼痛など）、膠原病（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎など）、歯周病、Ｃ型肝炎などを含む、多くの疾患又は症状の治療（改善を含む）及び予防が可能である。
本発明の複合体は、これらの作用をもたらす鉄結合能、炎症性サイトカイン産生調節能などのラクトフェリンの生物活性を充分に保持しているうえ、細胞毒性を示さないので、治療上不活性な基剤及び／又は添加物を配合することによって医薬品組成物とすることができる。また、ラクトフェリンは腸管粘膜からとり込まれ、本発明の複合体はペプシン耐性であるので、特に経口投与用の医薬品組成物とすることが有利である。
便宜上、本発明に関して医薬品又は医薬品組成物というときは、投与対象が人の場合のほか、動物である場合（即ち、獣医薬等）も含む。このような医薬品組成物に含有させることができる各種成分及び剤型は当業者には公知である。
本発明の複合体を含む医薬品組成物の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型などによって異なり、公知の有効ラクトフェリン量を目安に適宜選択することができる。一般に、公知の有効ラクトフェリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラクトフェリン量換算で１／２〜１／２０量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。
【実施例】
【０００８】
１．ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）のＰＥＧ化
１−１．試薬
ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）は、ＭＧ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌｓ社製（オーストラリア）を用いた。ＰＥＧ化のターゲットは、ｂＬＦのリジンのε−アミノ基（ｂＬＦ１分子当たり５４個存在する）及びＮ末端のα−アミノ基とした。
使用したＰＥＧ誘導体は、官能基としてＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）活性化エステルを有する３種類の直鎖型ＰＥＧ誘導体〔以下「ＰＥＧ−ＮＨＳ誘導体」という；Ｓｉｇｍａ社、「Ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」（ＭＷ＝５ｋＤａ）、日油株式会社、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＴＲ」（ＭＷ＝２０ｋＤａ）、及び日油株式会社、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＧＣ−３０ＴＳ」（ＭＷ＝３０ｋＤａ）〕と、官能基にパラニトロフェニル基を有する２種類の直鎖型ＰＥＧ誘導体〔以下「ＰＥＧ−ＰＮＰ誘導体」という；日油株式会社、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（ＭＷ＝５ｋＤａ）及び日油株式会社、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（ＭＷ＝３０ｋＤａ）〕とを用いた。
１−２．ＰＥＧ−ＮＨＳ誘導体とｂＬＦとの反応
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１ｍｌに溶解したウシラクトフェリン（ｂＬｆ）０．５ｍｇ（６．２５μＭ）に対し、以下に示すモル比でタンパク質とＰＥＧ−ＮＨＳ誘導体とを混合し、２５℃で１時間カップリング反応を行った。ラクトフェリンの最終濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであり、リジン残基に対するＰＥＧ−ＮＨＳ誘導体のモル比は１：５（１．６９ｍＭ）〜１：１（３３７．５μＭ）、及びタンパク質に対するＰＥＧ−ＮＨＳ誘導体のモル比は１：２５（１５６．２５μＭ）〜１：１（６．２５μＭ）の範囲で変化させた。カップリング反応の評価は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色により行った。
結果を図２に示す。パネルＡは、Ｓｉｇｍａ社製ＰＥＧ試薬（「Ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」、ＭＷ＝５ｋＤａ）、パネルＢは、日油株式会社製ＰＥＧ試薬（「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＧＣ−３０ＴＳ」、ＭＷ＝３０ｋＤａ）、パネルＣは、日油株式会社製ＰＥＧ試薬（「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＴＲ」、ＭＷ＝２０ｋＤａ）を用いた場合の、それぞれ結果である。Ｓｉｇｍａ社製「Ｍｅｔｈｏｘｙ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ」（パネルＡ）及び日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＧＣ−３０ＴＳ」（パネルＢ）を用いてカップリング反応を行うと、数個から無数のＰＥＧで修飾されたラクトフェリンが生成する。一方、日油株式会社製「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＴＲ」を用いた場合は、反応性が悪く、クマシー染色によりＰＥＧ化ラクトフェリンは確認されなかった（パネルＣ）。
したがって、ＰＥＧ−ＮＨＳ誘導体の反応選択性は低く、ＮＨＳ活性化エステルを官能基とする直鎖型ＰＥＧ試薬では、選択的なＰＥＧ化ラクトフェリンの合成は困難であった。
１−３．ＰＥＧ−ＰＮＰ誘導体とｂＬＦとの反応
ＰＥＧ−ＰＮＰ誘導体とｂＬＦとの反応を種々の条件下で検討した。ｂＬＦの最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌ、ｂＬＦ：ＰＥＧ誘導体との混合モル比を１：５、反応温度を２５℃とし、反応時間は１時間又は２４時間、ＰＥＧ化反応液のｐＨを４〜９の範囲で変化させて、カップリング反応を行った。使用緩衝液は、ｐＨ４〜５については酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６〜８についてはリン酸バッファー、ｐＨ９はホウ酸バッファーとした（各緩衝液の最終濃度は５０ｍＭとした）。反応後、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色により反応生成物を解析した。
ＰＥＧ試薬として「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（５ｋＤａ）を用いた結果を図３に、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（３０ｋＤａ）を用いた結果を図４に、それぞれ示す。反応時間１時間では、すべてのｐＨでほとんど反応が進んでいないことがわかる。一方、反応時間２４時間では、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（５ｋＤａ）、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（３０ｋＤａ）共に、ｐＨ５の反応において、特に選択的かつ収量の高いＰＥＧ化反応が確認された。
なお、以下、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（５ｋＤａ）でＰＥＧ化したラクトフェリンを「５ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ」、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（３０ｋＤａ）でＰＥＧ化したラクトフェリンを「３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ」と呼ぶ。
２．  ｂＬＦとＰＥＧ試薬との混合モル比、反応時間の検討
上記１−３．におけるＰＥＧ化反応の最適ｐＨが５であることが明らかとなったので、次に、反応時におけるｂＬＦ：ＰＥＧ−ＰＮＰ誘導体のモル比を１：１、１：３、１：５とし、ｂＬＦの最終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌとし、さらに反応時間を２４時間、４８時間、７２時間として、ＰＥＧ化の最適化条件の検討を行った。なお、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（５ｋＤａ）を用いた実験では５０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（３０ｋＤａ）を用いた実験では１０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）を、反応液としてそれぞれ使用した。
「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（５ｋＤａ）の結果を図５、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（３０ｋＤａ）の結果を図６にそれぞれ示す。ｂＬＦの最終濃度の検討では、０．５ｍｇ／ｍｌと比較して、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌで収量の高いＰＥＧ化産物が得られた。また、いずれの試薬についても、反応時間２４時間と比較して、４８時間、７２時間で更なる反応の進行が確認できる。しかし、４８時間と７２時間とで反応産物を比較すると、反応産物であるバンドの濃さはほぼ同じであることから、ＰＥＧ化反応は４８時間までに完了していることが推察された。
以上の結果から、最適なＰＥＧ化反応のｐＨ以外の条件は、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ」（５ｋＤａ）、「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ」（３０ｋＤａ）ともに、ｂＬＦ：ＰＥＧ誘導体のモル比が１：１〜１：５、ｂＬＦの最終濃度が５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、反応時間は２４〜４８時間と考えられる。
３．  ５ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの精製
陽イオン交換カラム担体（「ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ」（ＧＥヘルスケア社製））を用いて、ＰＥＧ化ｂＬＦ反応液中のＰＥＧ化ラクトフェリン（５ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ）を精製した。
ｂＬＦ  １５０ｍｇ及びＰＥＧ化試薬（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−５０Ｈ）４６．９ｍｇを、３０ｍｌの５０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）中で２５℃、４８時間反応させた（タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌ、タンパク質とＰＥＧ化試薬とのモル比は１：５）。この反応液を、３ｍｌのＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰに吸着させて精製した。緩衝液としては１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）を使用し、カラム担体への吸着物の溶出は、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む上記緩衝液を用いた段階的塩濃度勾配溶出法で行った。分取した画分を、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色により確認した。
結果を図７に示す。０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．４５Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分にはＰＥＧ化ラクトフェリンのみが精製されたことが確認された。
４．  ３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの精製
陽イオン交換カラム担体（「ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ」（ＧＥヘルスケア社製））を用いて、ＰＥＧ化ｂＬＦ反応液中のＰＥＧ化ラクトフェリン（３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ）を精製した。
ｂＬＦ  ２００ｍｇ及びＰＥＧ化試薬（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＮＰ−３０Ｔ）３７５．２ｍｇを、４０ｍｌの５０ｍＭ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）中で２５℃、４８時間反応させた（タンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌ、タンパク質とＰＥＧ化試薬とのモル比は１：５）。この反応液を、３ｍｌの「ＭａｃｒｏＣａｐ  ＳＰ」に吸着させて精製した。緩衝液としては１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）を使用し、カラム担体への吸着物の溶出は、０．４Ｍ、０．４５Ｍ、１．０Ｍ  ＮａＣｌを含む上記緩衝液を用いた段階的塩濃度勾配溶出法で行った。分取した画分を、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＣＢＢ染色により確認した。
結果を図８に示す。０．４Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分にはＰＥＧ化ラクトフェリンのみが精製されたことが確認された。
５．  ５ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ、３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの抗炎症活性（ＩＬ−６産生抑制活性）
ｂＬＦの生理活性の一つに抗炎症作用がある。ｂＬＦは、ヒト単球細胞（ＴＨＰ−１）培養系においてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）のエンドトキシンショックにより産生されるＩＬ−６量を抑制することが報告されている（Ｍａｔｔｓｂｙ−Ｂａｌｔｚｅｒ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ，４０，２５７−２６２（１９９６），Ｈａｖｅｒｓｅｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２２０，８３−９５（２００２））。そこで、上記３．及び４．において作製、精製した５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ及び３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの抗炎症活性を検討した。
ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  グルタマックス（商品名；インビトロジェン社製）を添加したもの；以下「培地」と記す）で継代培養を続けているＴＨＰ−１細胞を、５×１０４個／ｍｌの細胞濃度で継代し、２４時間培養した後、ヒトＩＦＮ−γ（４０ｎｇ／ｍｌ）及びカルシトリオール（２０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、その後さらに３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養後の細胞を遠心分離で集め、培地で洗浄後、細胞を新鮮な培地に懸濁して１×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を２４ウェルプレートに４００μｌ／ｗｅｌｌで播き、３７℃、５％ＣＯ２下で１時間静置後、各ウェルにＬＰＳのみ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ｂＬＦ（１００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ（１００μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ（１００μｇ／ｍｌ）のいずれかを添加し、２４時間後に培養上清を回収した。
培養上清中のＩＬ−６量を、ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ測定キット（鎌倉テクノサイエンス（株））をキットの指示書のとおりに用いて測定した。ＩＬ−６の産生抑制活性は、ＬＰＳのみを添加した場合に産生されるＩＬ−６量と、ＬＰＳ及びｂＬＦ又はＰＥＧ化されたＬＦの共存下で産生されたＩＬ−６量とを比較し、産生が抑制されたＩＬ−６量から算出した。ｂＬＦの抑制活性を１００％として、５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ及び３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの相対活性を算出した。
その結果、５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆは７６．８±６．０％（平均±ＳＥ、ｎ＝８）、３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆは１１５．３±３．２％（平均±ＳＥ、ｎ＝６）の残存活性を示した。
６．  ５ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ、３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの鉄結合能の測定
ラクトフェリンは分子量８万の非ヘム性の鉄結合性糖タンパク質で、Ｎローブ、Ｃローブと呼ばれる二つの領域からなり、炭酸イオン（ＣＯ３２−）の存在下でタンパク質１分子当たり２個の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を可逆的にキレート結合する能力を有する〔Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，７８４−７８（１９９０）〕。ラクトフェリンの鉄結合能の測定は、以下のように行った。
ｈｏｌｏ型ラクトフェリンから鉄イオン（Ｆｅ３＋）を遊離させ、ａｐｏ型ラクトフェリンを調製した。次いで炭酸イオン（ＣＯ３２−）存在下で鉄イオン（Ｆｅ３＋）を付加させた鉄再結合ラクトフェリンを調製した。ａｐｏ型及び鉄再結合ラクトフェリンの鉄含量及びタンパク質濃度を測定し、鉄結合量の測定を行った。詳細には、ａｐｏ型ラクトフェリンは、ｂＬｆ、５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆ及び３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆを０．１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ２．１）で２４時間、さらに蒸留水で２４時間透析を行うことにより調製した。鉄再結合型ラクトフェリンの調製は、ａｐｏ型ラクトフェリンを、０．００１％クエン酸鉄アンモニウム、５０ｍＭ  炭酸ナトリウム及び５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２４時間透析を行った後、過剰の鉄イオンを除去するため、蒸留水、次いで５０ｍＭ  塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し２４時間透析を行うことにより調製した。
タンパク質に結合している鉄イオンを比色法で測定するため、血清鉄測定キット「Ｆｅ  Ｃ−テストワコー」（和光純薬）を用いた。鉄の結合能はＢｒａｄｆｏｒｄ法で定量したタンパク質１ｍｇ当たりに結合している鉄の結合量として算出し、未修飾ｂＬＦの鉄の結合活性を１００％とした場合の相対活性（％）で示した。
その結果、ＰＥＧ修飾を行った５Ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの鉄結合活性は７８．５±４．９％（平均±ＳＥ、ｎ＝５）、３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆでは６５．６±２．７％（平均±ＳＥ、ｎ＝６）であった。
７．  ペプシン消化に対する耐性の評価
上記４．の実験で得られた精製３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆを、以下の条件によりペプシンで消化して、未修飾ｂＬＦの消化と比較検討した。
ペプシン消化は、精製した５０μｇ分の未修飾ｂＬＦ、３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの各々に、最終濃度２０ｎｇ／ｍｌになるようにペプシン（ブタ胃由来、ｃｏｄｅＮｏ．１６５−１８７１３、和光純薬工業（株）製）を加えて、１０ｍＭ  ＨＣｌ中、３７℃で反応させることにより行った。反応開始から５、１０、１５、２０、４０、６０、１００分後に、各タンパク質５μｇ分をピペットでサンプリングして、等量の氷冷した２×サンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、色素（ＢＰＢ））と混ぜて酵素反応を停止させた。
結果を図９及び図１０に示す。図９は、各サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元）で泳動後、ＣＢＢ染色したゲルの写真である。ペプシンでの消化に対して、未修飾ｂＬＦは速やかに低分子化されたのに対して、３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの消化は限定的であった。このことより、ＰＥＧ化されたＬＦは、未修飾のｂＬＦと比較して、ペプシンの作用を受けにくいことが分かる。
図１０は、インタクトな３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの経時的な分解を半定量的に示すために、図９で示した泳動像をスキャナーで取り込み、バンドの濃さを「ＮＩＨｉｍａｇｅ」ソフトウェアで解析した結果である。縦軸は、各時間におけるバンドの濃さを示しており、時間０分時の濃さを１００％とする相対値である。横軸は、各酵素での処理時間である。ペプシンによる３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆの分解は未修飾ｂＬＦの分解と比較して緩やかな傾向を示した。以上の結果から、３０ｋ−ＰＥＧ−Ｌｆは、未修飾のｂＬＦと比較して、ペプシンの作用を受けにくくなっていることが分かる。
この出願は、平成２０年３月１４日出願の日本特許出願、特願２００８−０６６６２６に基づくものであり、特願２００８−０６６６２６の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【図１】
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【図１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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