(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの塩基配列からなる、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１８に示される、塩基配列；
（ｂ）配列番号１８に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、塩基配列；
（ｃ）配列番号１９に示される、塩基配列；
（ｄ）配列番号１９に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、塩基配列；
（ｅ）配列番号２０に示される、塩基配列；
（ｆ）配列番号２０に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、塩基配列；ならびに
（ｇ）配列番号１３、１５、１６、２１〜２６のいずれか１つに示される塩基配列。
【請求項２】
以下の（Ｉ）〜（ＶＩ）のいずれかである、ポリヌクレオチド：
（Ｉ）配列番号１８に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；
（ＩＩ）配列番号１８に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；
（ＩＩＩ）配列番号１９に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；
（ＩＶ）配列番号１９に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；
（Ｖ）配列番号２０に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；ならびに
（ＶＩ）配列番号２０に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド
ただし、以下の（ＶＩＩ）〜（ＩＸ）のいずれかであるポリヌクレオチドを除く：
（ＶＩＩ）以下の塩基配列からなるポリヌクレオチド：
ggatcctccc ctcctagcct atacctcttc gctcagagat ctagggctcg cagggcggac ctagctgcac acagaggctg ttaactctca tttgagaagc cataagccat tagagcaaac gcagtcataa cttcattcaa ctcaagccgc ttgagagctt ggcttacacc ggttcctgtg ggcaactagt ggctcgcccg ggtgcctctc gcctagtcat cagtccctaa gaggaaaagg gaaagttgtg gggctgatgc gctcttcgat tcacgcagtt gttccctaga acaagtcact cctgctccat cacccctccc ccccccattt gatcatcact cacgaccacg tccgctggag acccttagtc atggtggggg aggggcacga acttttctaa gaagtttcct ttttaccaag ggagtcacag tgagttggtc acgtaactgg ctcagagagg ctgccctggc cccctccccc cgccccctcc ccccgccccc tcgcgctgcg cttttctggt attcttatta aagcggtagc cggctggtgc aggaaagcaa caagttcccc agcggtcttc ccgccctagc ctgacaaggc gaagcttttc ttacctggcg acagggaaat ctcctgagcc gagctcatct ttgccacagc cccaggtgtg acctgagcag tgggcaaagg agcggcgtgc aaattggatt atttgtatgg gggtactctg aaactccctc actttttctg ggaacttttt gtgctagggc gcagtgacag gcgttgagaa agctgcttca ggaaacgccc gctatatagc agggcagttg gacagtcatt ggtaacctcg ctcattcatt agaatcacgt aagaactcaa agggaaacgt gtctctcaga atgagggcgt ttgcgtaaat ctataggttt ttcaacatcg atgccagttg ctttgtcttc tgtaatcgcc aaggtggatg agagttgaag cttgcgatat tgctttgggt tattagattc ataagtcaca ccaagtggtg ggcgatccac tgagcaaagc caacttctca catgatgact tcaaacaaga cacattacct tccagcatct gttggggaga cgagatttta agacactgag tctccaggac agcaaagcca caatggtgag tagcaataaa ccctgcatta taattgaaaa aaaatcttga catgttgcct aacaacaggc atatcacggc tcttcctagc acttcacacg ccaaagaaca gcagctattc aggccaggga atcgggttta cccactgcaa ctttaattgg aatcatttga gatttaatac agcagcatga tactggcgtg gaacaaactt gggactggag ggggttgtta tactggcttt tcaaagctga tgcttgtctg acaaccgtct tgtattgcat tctttgcttt actgtatggt gtgtgagcat attgtatgat ttatatgtgg gcatataatt gacatccgca agggggttaa tttcaatcta aaaacattaa tgttcttaga gtttggggct agggggtgga gagggtaaga gtggagtaga gactaagagt ttaggtgagg ataggggtgg agttaggggg agagaggaat aagtcagaag tgcctatcta taatgaaatg ggtaatgctc tcatacatgg aaagggtctc atcaacatgt gtacaactat taacaggatg gctttggcaa agccatccgc acgtgacaaa acgtaaggaa gtggaagaaa ccgtctagag caatatcaag taccacttaa ttagagaata tttttttaac cttttcctcc tgctgcgccg ggtgtgtgat ccgggcgagc agagtccatt cagcaccttg gacagagcca gcggatttgt ccgaggtggt agtacttcat ccaggtattc ttttcctcgc tgtcaagcca acccggtgtc gcccttaaaa agcgtctttt ccgaggttcg gctcacactg agatcggggc tggagagaga gtcagatttt ggagcggagc gtttggagag ccagccccag tttggtcccc tcattgagct cgctgaagtt ggcttcctag cggtgtaggc tggaatagac tcttggcaag ctccgggttg gtatactggg ttaactttgg gaaatgcaag tgtttatctc caggatctag ccaccggggt ggtgtaagcc gcaaagaagg taagcaccgg ggcggggacc ctgcatcccc aattcttgag ctattttgat actcgatctt ccggaaagga cgcgtagtgg agcggaggaa gtggagggag agcctgagaa atggttgttt cttggtattt gtctagaaat ttaagaccta ggtgagaacc tggggcaaat cgaggttggg gaagctcaag ctt；
（ＶＩＩＩ）以下の塩基配列からなるポリヌクレオチド：
ggatcctccc ctcctagcct atacctcttc gctcagagat ctagggctcg cagggcggac ctagctgcac acagaggctg ttaactctca tttgagaagc cataagccat tagagcaaac gcagtcataa cttcattcaa ctcaagccgc ttgagagctt ggcttacacc ggttcctgtg ggcaactagt ggctcgcccg ggtgcctctc gcctagtcat cagtccctaa gaggaaaagg gaaagttgtg gggctgatgc gctcttcgat tcacgcagtt gttccctaga acaagtcact cctgctccat cacccctccc ccccccattt gatcatcact cacgaccacg tccgctggag acccttagtc atggtggggg aggggcacga acttttctaa gaagtttcct ttttaccaag ggagtcacag tgagttggtc acgtaactgg ctcagagagg ctgccctggc cccctccccc cgccccctcc ccccgccccc tcgcgctgcg cttttctggt attcttatta aagcggtagc cggctggtgc aggaaagcaa caagttcccc agcggtcttc ccgccctagc ctgacaaggc gaagcttttc ttacctggcg acagggaaat ctcctgagcc gagctc；および
（ＩＸ）以下の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
ggatcctccc ctcctagcct atacctcttc gctcagagat ctagggctcg cagggcggac ctagctgcac acagaggctg ttaactctca tttgagaagc cataagccat tagagcaaac gcagtcataa cttcattcaa ctcaagccgc ttgagagctt ggcttacacc ggttcctgtg ggcaactagt ggctcgcccg ggtgcctctc gcctagtcat cagtccctaa gaggaaaagg gaaagttgtg gggctgatgc gctcttcgat tcacgcagtt gttccctaga acaagtcact cctgctccat cacccctccc ccccccattt gatcatcact cacgaccacg tccgctggag acccttagtc atggtggggg aggggcacga acttttctaa gaagtttcct ttttaccaag ggagtcacag tgagttggtc acgtaactgg ctcagagagg ctgccctggc cccctccccc cgccccctcc ccccgccccc tcgcgctgcg cttttctggt attcttatta aagcggtagc cggctggtgc aggaaagcaa caagttcccc agcggtcttc ccgccctagc ctgacaaggc gaagcttttc ttacctggcg acagggaaat ctcctgagcc gagctcatct ttgccacagc cccaggtgtg acctgagcag tgggcaaagg agcggcgtgc aaattggatt atttgtatgg gggtactctg aaactccctc actttttctg ggaacttttt gtgctagggc gcagtgacag gcgttgagaa agctgcttca ggaaacgccc gctatatagc agggcagttg gacagtcatt ggtaacctcg ctcattcatt agaatcacgt aagaactcaa agggaaacgt gtctctcaga atgagggcgt ttgcgtaaat ctataggttt ttcaacatcg atgccagttg ctttgtcttc tgtaatcgcc aaggtggatg agagttgaag ctt
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドと対合するポリヌクレオチドとを含む、二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載の二本鎖ポリヌクレオチドを含有している、疼痛の治療剤。
【請求項５】
発症前の疼痛を予防するための、請求項４に記載の治療剤。
【請求項６】
発症後の疼痛を予防するための、請求項４に記載の治療剤。
【請求項７】
請求項１もしくは２に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３に記載の二本鎖ポリヌクレオチドを備えている、疼痛の治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛を治療するための技術に関するものであり、より詳細には、疼痛の治療に使用し得るポリヌクレオチドおよびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
痛みは持続期間によって、急性疼痛と慢性疼痛に分類される。急性疼痛は組織障害に伴う痛みでその持続期間は限られる。慢性疼痛は組織障害の治癒後にも続き、はっきりとした器質的原因を有さないことが多い。慢性疼痛における急性増悪期の痛みは急性疼痛と類似しており、内因性発痛物質が深く関わると考えられている。慢性疼痛として、交通事故または手術後の後遺症、末期癌または糖尿病などの堪え難い慢性的な痛みが挙げられる。また、痛みは原因によって、侵害受容性疼痛、神経因性疼痛、心因性疼痛に分類される。これらの独立した痛みは時間の経過とともに徐々に融合し、分類が困難な慢性の難治性疼痛となる。【０００３】
神経因性疼痛（neuropathic pain）は１９９４年のＩＡＳＰ（International Association for the Study of Pain）の慢性痛分類において、末梢神経および中枢神経の障害または機能異常による難治性の痛みであると定義されている。神経因性疼痛は、末梢神経および中枢神経系の圧迫、変性、損傷に起因しているが、単一の病理学的プロセスでは説明し得ない複雑な症候群から成り立っており、その発生機序はまだ解明されていない。よって、神経因性疼痛に関する治療効果に基づく指針も、一部を除いて有効性が保障されていない。【０００４】
神経因性疼痛は、創傷などによる初期の痛み（急性痛）とは異なり、創傷が治癒した後に新たに発生する痛みである。神経因性疼痛としては、通常であれば痛みを引き起こさない程度の刺激によっても激烈な痛みを誘発する症状（「アロディニア」とよばれる。）が知られている。急性痛に対して有効な非ステロイド系消炎鎮痛剤および麻薬系鎮痛薬などは、神経因性疼痛には効果を示さず、神経因性疼痛に対する決定的な治療法は未だ知られていない。神経因性疼痛を抑制することができれば、臨床面において患者の肉体的苦痛の緩和およびＱＯＬの向上をもたらすことが可能となる。【０００５】
末梢に加えた痛みは、後根神経節（dorsal root ganglion：ＤＲＧ）に存在する知覚神経（一次ニューロン）を通じて脊髄後角に伝達され、脊髄後角Ｉ層およびＩＩ層に存在する二次ニューロンにシナプスを介して伝えられ、二次ニューロンはその信号を中枢（脳）に伝達する。末梢からの知覚信号は、その大部分が第４、第５ＤＲＧを経て脊髄後角に伝えられるので、本発明者らはラットの脊髄第５腰神経のＤＲＧ末梢側を結紮した慢性疼痛モデル、および、アレルギー反応を引き起こす結核菌の死菌(Complete Freund's Adjuvant：ＣＦＡ)をラットの足底に注射した急性疼痛モデルを作製し、ＤＲＧでのイベントを詳細に解析した。その結果、ＣＦＡ刺激によって、シナプス伝達を補完および増強する役割を担っている脳由来神経栄養因子（brain-derived neurotrophic factor：ＢＤＮＦ）のｍＲＮＡの発現量が増加していること、特にエクソン１バリアントが顕著に増加していることを見出した（非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Kobayashi et al., Brain Res. 1206, 13-19 (2008)
【非特許文献２】Aid et al., J. Neurosci. Res. 85, 525-535 (2007)
【非特許文献３】Yang et al., Cancer Res. 65, 219-225 (2005)
【発明の概要】
【０００７】
しかしながら、刺激の結果として、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現量の増加が導かれることは示されたものの、疼痛の発生機序および疼痛を抑制するための技術は未だ不明である。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、疼痛を抑制するための技術を提供することにある。
【０００９】
ＢＤＮＦは脊髄での痛みの伝達を増強する働きを有している可能性があることから、この発現を抑制すれば痛みを抑え得るかもしれない。すなわち、一次ニューロンで合成されるＢＤＮＦを抑えることができれば末梢にて加えた痛みが軽減されるかもしれない。しかし、全身性にＢＤＮＦを抑制してしまうと、中枢における記憶、学習能力が低下し、全ての神経活動に支障をきたし、ひいては神経変性疾患を引き起こしてしまうと考えられる。よって、全身性のＢＤＮＦ抑制を引き起こすことなく、一次ニューロンでのＢＤＮＦ合成を抑制する技術が求められる。しかし、末梢でのＢＤＮＦの発現を抑制した技術はこれまでに知られていない。
【００１０】
本発明者らはＢＤＮＦの遺伝子構造に注目した。ＢＤＮＦの詳細な遺伝子構造は２００７年にタリン大学のTimmuskらのグループによって明らかにされており、８つのイントロンを挟んで９つのエクソンから成り立っている（非特許文献２参照）。タンパク質をコードする翻訳領域は主にエクソン９であり、異なる転写制御を受けて異なるバリアントを発現すると考えられている。バリアントは組織、細胞特異的に発現しているので、痛みを伝える神経に特異的なバリアントが存在すれば、そのバリアントだけを抑制することにより、副作用を軽減しつつ痛みを軽減し得ると考えた。
【００１１】
本発明者らはさらに、ラットの脊髄第５腰神経ＤＲＧの末梢側を結紮した慢性痛モデルを用いて、末梢の神経組織であるＤＲＧにおいて結紮刺激に強く反応して発現が増加するのはエクソン１バリアントであることを見出した（非特許文献１参照）。
【００１２】
これまでに得られた自身の成果を基に、本発明者らは鋭利努力を重ねた結果、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明に係るポリヌクレオチドは、以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであることを特徴としている：（ａ）配列番号１８に示される、塩基配列；（ｂ）配列番号１８に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、塩基配列；（ｃ）配列番号１９に示される、塩基配列；（ｄ）配列番号１９に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、塩基配列；（ｅ）配列番号２０に示される、塩基配列；（ｆ）配列番号２０に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、塩基配列；ならびに（ｇ）配列番号１３、１５、１６、２１〜２６のいずれか１つに示される塩基配列。
【００１３】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、以下の（Ｉ）〜（ＶＩ）のいずれかであることを特徴としている：（Ｉ）配列番号１８に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；（ＩＩ）配列番号１８に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；（ＩＩＩ）配列番号１９に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；（ＩＶ）配列番号１９に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；（Ｖ）配列番号２０に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド；ならびに（ＶＩ）配列番号２０に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる、ポリヌクレオチド。
【００１４】
本発明に係る二本鎖ポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドと対合するポリヌクレオチドとを含むことを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る治療剤は、疼痛を治療するために、上記ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを含有していることを特徴としている。本発明において、疼痛の治療は、発症前に予防的に行われるものであっても発症後に治療的に行われるものであってもよい。
【００１６】
本発明に係る治療用キットは、疼痛を治療するために、上記ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。本発明において、疼痛の治療は、発症前に予防的に行われるものであっても発症後に治療的に行われるものであってもよい。
【００１７】
本発明に係る治療方法は、疼痛を治療するために、上記ポリヌクレオチドまたは二本鎖ポリヌクレオチドを被験体に投与する工程を包含することを特徴としている。本発明において、疼痛の治療は、発症前に予防的に行われるものであっても発症後に治療的に行われるものであってもよい。
【００１８】
本発明を用いれば、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を抑制し得る。さらに、本発明を用いれば、疼痛を抑制し得る。
【００１９】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＢＤＮＦ遺伝子の構造および構築したレポータープラスミドの概略を示す図である。
【図２】構築したレポータープラスミドを用いて調べたプロモーター活性を示す図である。
【図３】合成した二本鎖ポリヌクレオチドの配列を示す図である。
【図４】合成した二本鎖ポリヌクレオチドを用いて調べたプロモーター活性を示す図である。
【図５】本発明に係るポリヌクレオチドを用いる治療レジメンの概略を示す図である。
【図６】本発明に係るポリヌクレオチドによるＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現抑制効果を示す図である。
【図７】本発明に係るポリヌクレオチドを用いる治療レジメンの概略を示す図である。
【図８】本発明に係るポリヌクレオチドによる疼痛抑制効果を示す図である。
【図９】本発明に係るポリヌクレオチドによる慢性疼痛抑制効果を示す図である。
【図１０】本発明に係るポリヌクレオチドによる慢性疼痛抑制効果を示す図である。
【図１１】本発明に係るポリヌクレオチドによる慢性疼痛抑制効果を示す図である。
【図１２】本発明に係るＢＤＮＦプロモーター領域の二本鎖ポリヌクレオチドの配列を示す図である。
【図１３】本発明に係る二本鎖ポリヌクレオチドを用いて調べたプロモーター活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔１〕機能性ポリヌクレオチド
本発明者らは、実施例にて後述するように、ＢＤＮＦのエクソン１のプロモーター領域３種を取得した後、Ｓ３−ＡＳ２と称した領域（配列番号１および４）がその全体にわたってプロモーター活性を有していること、特にＳ３−Ｓ４領域（配列番号１８、２０）が強いプロモーター活性を有していることを見出した。さらに、Ｓ３−Ｓ４領域の中でも、Ｃ領域、Ｅ領域およびＦ領域（配列番号１３、１５、１６、２４〜２６）は、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を抑制し得、かつ疼痛を抑制し得るＤＮＡを提供し得た。
【００２２】
本発明は、疼痛を治療するための機能性ポリヌクレオチドを提供する。本発明に係る機能性ポリヌクレオチドは、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を抑制し得る。また、本発明に係る機能性ポリヌクレオチドを用いて作製したＤＮＡによって、疼痛抑制効果が実証された。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、「機能性ポリヌクレオチド」は「ＢＤＮＦのエクソン１バリアントに特異的なポリヌクレオチド」が意図される。本発明に係る機能性ポリヌクレオチドは、後述するポリヌクレオチド（第１のポリヌクレオチド）と、該ポリヌクレオチドと対合する第２のポリヌクレオチドとからなる二本鎖ポリヌクレオチドであることが好ましいが、第１のポリヌクレオチドまたは第２のポリヌクレオチドだけであってもよい。また、生体内で分解されにくい態様にて第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含んでいてもよい。このような態様は、当該分野において公知である。さらに、第１のポリヌクレオチドおよび／または第２のポリヌクレオチドが挿入されたベクターとして提供されてもよい。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される。）またはリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＵと省略される。）の配列として示される。
【００２５】
ポリヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。本発明に係るポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００２６】
本発明に係る機能性ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００２７】
本発明に係る機能性ポリヌクレオチドは、当該分野において公知の任意の手法に従って容易に作製され得、例えば、化学合成されても、組換え発現されてもよい。また、このような機能性ポリヌクレオチドは生体内での分解抑制のため、または、生体内での安定性を促進するために化学修飾されてもよい。
【００２８】
本発明に係る機能性ポリヌクレオチドは、２０〜３００塩基長であることが好ましく、２５〜２００塩基長であることがより好ましく、３０〜１００塩基長であることがさらに好ましい。本発明に係る機能性ポリヌクレオチドが二本鎖である場合、二本鎖を形成する一対のポリヌクレオチドは完全に対合している必要はなく、ミスマッチなどの不対部分が存在してもよい。また、二本鎖ポリヌクレオチドは、その末端部分が突出していてもいなくてもよく、突出している場合は、機能性ポリヌクレオチドとしての機能を阻害しない程度の塩基数であれば特に限定されない。また、本発明に係る機能性ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであり得、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を特異的に阻害し得るポリヌクレオチドであれば、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖による二本鎖、またはＤＮＡとＲＮＡの混在型ポリヌクレオチドでもよい。
【００２９】
１つの局面において、第１のポリヌクレオチドは、(i) 配列番号１８に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることを特徴としている。他の局面において、第１のポリヌクレオチドは、(ii) 配列番号１３、１５および１６の少なくともいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることを特徴としている。
【００３０】
また、Ｓ３−Ｓ４領域からなるポリヌクレオチドの効果を、Ｃ領域、Ｅ領域およびＦ領域からなるポリヌクレオチドが維持していることから、Ｓ３−Ｓ４領域からなるポリヌクレオチドのフラグメント（部分断片）であってもＣ領域、Ｅ領域およびＦ領域の少なくともいずれか１つの塩基配列を含むものもまた、本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、第１のポリヌクレオチドは、(iii) 配列番号１８に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる塩基配列からなるポリヌクレオチド、でもあり得る。
【００３１】
さらに、Ｓ３−Ｓ４領域からなるポリヌクレオチドにおいて、Ｃ領域、Ｅ領域およびＦ領域の少なくともいずれか１つの塩基配列が保持されていれば、それ以外の領域の塩基配列が多少異なっていてもよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、第１のポリヌクレオチドは、(iv) 配列番号１８に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいるポリヌクレオチド、あるいは、(v) 配列番号１８に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号１３、１５および１６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいるポリヌクレオチドであり得る。
【００３２】
ＢＤＮＦのエクソン１のプロモーター領域は、ラット、ヒトおよびマウスの間で高度に保存されている。上述したＳ３−ＡＳ２と称した領域、Ｓ３−Ｓ４領域、ならびにＣ領域、Ｅ領域およびＦ領域について、ヒトにおいてもラットと同様の効果が示されている。すなわち、１つの局面において、第１のポリヌクレオチドは、(i)' 配列番号２０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることを特徴としている。他の局面において、第１のポリヌクレオチドは、(ii)' 配列番号２４〜２６の少なくともいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることを特徴としている。なおさらに、第１のポリヌクレオチドは、(iii)' 配列番号２０に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる塩基配列からなるポリヌクレオチド、でもあり得、(iv)' 配列番号２０に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいるポリヌクレオチド、あるいは、(v)' 配列番号２０に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号２４〜２６に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいるポリヌクレオチドであり得る。
【００３３】
また、マウスにおいても同様の効果が期待できる。１つの局面において、第１のポリヌクレオチドは、(i)'' 配列番号１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることを特徴としている。他の局面において、第１のポリヌクレオチドは、(ii)'' 配列番号２１〜２３の少なくともいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、であることを特徴としている。なおさらに、第１のポリヌクレオチドは、(iii)'' 配列番号１９に示される塩基配列の部分配列でありかつ配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいる塩基配列からなるポリヌクレオチド、でもあり得、(iv)'' 配列番号１９に示される塩基配列に対して１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加されている塩基配列またはその部分配列からなり、配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいるポリヌクレオチド、あるいは、(v)'' 配列番号１９に示される塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、配列番号２１〜２３に示される塩基配列の少なくとも１つを含んでいるポリヌクレオチド、であり得る。
【００３４】
実施例にて後述するように、Ｃ領域、Ｅ領域およびＦ領域（配列番号１３、１５、１６）は、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を抑制し得、かつ疼痛を抑制し得るＤＮＡを提供し得た。疼痛を抑制し得るＣ領域、Ｅ領域およびＦ領域からなるポリヌクレオチドがエクソン１バリアントの発現を抑制し得る効果を維持していることと同様に、Ｓ３−ＡＳ４、Ｓ４−ＡＳ５、Ｓ５−ＡＳ２領域からなるポリヌクレオチドのフラグメント（部分断片）であってもエクソン１バリアントの発現を抑制し得る効果を維持していること（実施例にて後述）より、Ｓ３−ＡＳ４、Ｓ４−ＡＳ５、Ｓ５−ＡＳ２領域からなるポリヌクレオチドのフラグメントも本発明の範囲内に含まれ得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００３５】
本発明に係る機能性ポリヌクレオチドは、上記構成を有することにより、ＢＤＮＦのエクソン１バリアント以外のバリアントの発現を阻害することなく、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を特異的に阻害し得るＤＮＡまたはＲＮＡを提供することができる。
【００３６】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法に従って行われ得る。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルタを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、検出用プローブとしても有用である。
【００３８】
〔ＩＩ〕疼痛の治療
本発明は、疼痛を治療する技術を提供する。より詳細には、本発明は、上述した機能性ポリヌクレオチドを含有している、疼痛の治療剤を提供する。また、本発明は、上述した機能性ポリヌクレオチドを備えている、疼痛の治療用キットを提供する。さらに、本発明は、上述した機能性ポリヌクレオチドを被験体に投与する工程を包含する、疼痛の治療方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「治療」は、症状の軽減または排除が意図され、予防的（発症前）または治療的（発症後）に行われ得るもののいずれもが包含される。
【００３９】
本発明を用いて治療する対象は、疼痛を発症する疾患であれば特に限定されないが、好ましくは、神経因性疼痛あるいはＣＲＰＳ（complex regional pain syndrome：複合性局所痛症候群）などに分類される、ＰＨＮ（Post-Herpetic Neuralgia：帯状疱疹後神経痛）、三叉神経痛、カウザルギー視床痛、糖尿病性ニューロパチーや、さらに慢性疼痛の側面を有する癌性疼痛、整形外科的慢性痛（脊柱管狭窄症、変形性脊椎症、頸肩腕痛など）や手術後痛など難治性の疼痛疾患であり得る。投与部位もまた特に限定されないが、好ましくは、脊髄クモ膜下投与あるいは後根神経節直接注入であり得る。
【００４０】
本発明に係る治療剤は、上述した機能性ポリヌクレオチドを活性成分として含有している組成物であり、その目的、成分などに応じて、緩衝液および／または補助剤などの当業者に公知の任意の成分を含有している。また、本発明に係る治療用キットは、上述した機能性ポリヌクレオチドを、主要コンポーネントとして備えているキットであり、その目的、成分などに応じて、緩衝液および／または補助剤などの当業者に公知の任意の成分をさらなるコンポーネントとして備えている。本明細書中で使用される場合、「組成物」は一物質中に複数の成分が含有されている態様が意図され、このような複数の成分が個々の物質として分離して提供される場合は、「キット」として認定され得る。用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えている」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、一組成物中の成分を別々に備えているキットであっても、複数の組成物を備えているキットであってもよい。
【００４１】
一般的な治療剤の投与方法としては、局所投与および全身投与の二通りが考えられる。しかし、疼痛治療のためにＢＤＮＦを抑制しようと試みても、全身のＢＤＮＦを全て抑制することによる副作用が生じる可能性は高いと思われる。したがって、通常容易に想定されえるＢＤＮＦ抑制技術を疼痛治療に適用する場合、抑制されるＢＤＮＦの範囲を限定する必要がある。本発明に係る治療剤を用いれば、以下の（１）〜（２）に示すとおり、いずれの投与方法も可能である：
（１）ヒトのＤＲＧは直径１ｃｍ程度であるので、ＤＲＧへの局所投与により機能性ポリヌクレオチドの直接導入を容易に行い得る。また、病的な痛みを伝えている神経の近傍にカテーテルを挿入し、本発明に係る治療剤を長期にわたって持続的に投与することも可能である。
（２）ＢＤＮＦバリアントの発現は、組織特異的または細胞特異的な発現機構によって制御されている。また、ＢＤＮＦは神経細胞特異的であるので、神経細胞以外の細胞に対して本発明に係る治療剤は無害であると考えられ、痛みの刺激がない場合の神経細胞内ではＢＤＮＦの発現は非常に低いので本発明に係る治療剤が他のバリアントの発現に影響を与える可能性は低いと考えられる。よって、本発明に係る機能性ポリヌクレオチドを全身投与しても、疼痛を発症している標的組織のみでのノックダウンが可能となると考えられる。
【００４２】
本発明に係る治療剤の導入方法としては、ポリヌクレオチド溶液として導入する方法、transfection試薬を用いて導入する方法、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、アデノウイルスなど）を用いて導入する方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４４】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００４５】
〔実施例１：転写調節領域の同定〕
ヒト、ラット、マウスのＢＤＮＦエクソン１上流の塩基配列をアライメントして、相同性が保存されている場所を見出した。ヒト、ラット、マウスの間で共通する領域にプライマーＳ３、Ｓ４、Ｓ５、ＡＳ２（配列番号７〜１０）を設定し、ヒトおよびラットのＢＤＮＦエクソン１のプロモーター領域をＰＣＲで増幅した後、長さの異なる３種のプロモーター領域を取得した（配列番号１；ヒトＳ３−ＡＳ２、配列番号２；ヒトＳ４−ＡＳ２、配列番号３；ヒトＳ５−ＡＳ２、配列番号４；ラットＳ３−ＡＳ２、配列番号５；ラットＳ４−ＡＳ２、配列番号６；ラットＳ５−ＡＳ２）。シークエンス解析により得られたプロモーター領域の塩基配列に変異がないことを確認した。各プロモーターをホタルルシフェラーゼレポータープラスミドpGL4.14（Promega社）に挿入した（図１）。各プロモーターを有しているホタルルシフェラーゼレポータープラスミド（０．１８μｇ）と、導入効率補正用のウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドpTK-hRG（０．０２μｇ）を、トランスフェクション試薬Effectene（QIAGEN社）を用いてラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞に導入した。コントロールとして、プロモーターを有していないpGL4.14ベクターを用いた。導入７２時間後にDual-Luciferaseアッセイ（Promega社）を行った。各プロモーターのホタルルシフェラーゼ活性値を、インターナルコントーロールであるウミシイタケルシフェラーゼ活性値で除することにより、トランスフェクション時の細胞導入効率を補正した。少なくともＳ３とＳ４の間に強いプロモーター活性を有していることが示された（図２）。【００４６】
〔実施例２：二本鎖ポリヌクレオチドによる、転写調節領域の転写能の抑制効果〕
ラットＢＤＮＦエクソン１のプロモーター領域Ｓ３とＳ４との間（ラットＳ３−Ｓ４領域：配列番号１８）を、オーバラップする７つのフラグメント（断片Ａ〜Ｇ：それぞれ配列番号１１〜１７）に分けて、それぞれのセンス鎖ＤＮＡおよびアンチセンス鎖ＤＮＡを合成した(図３)。各断片のセンス鎖とアンチセンス鎖とを混合し１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中にて７０℃から自然冷却することにより二本鎖ＤＮＡを作製した。各二本鎖ＤＮＡ断片（Ａ〜Ｇ）５０ｎＭ存在下にて、ヒトＳ３−ＡＳ２およびラットＳ３−ＡＳ２を有しているホタルルシフェラーゼレポータープラスミドpGL4.14（０．１８μｇ）、およびウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドpTK-hRG（０．０２μｇ）を、ラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞に同条件にて導入し、導入２４時間後にDual-Luciferaseアッセイを行った（図４）。その結果、Ａ〜ＧのすべてのＤＮＡ断片に転写抑制能があることが判明した。特にＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆには、プロモーターＳ３−ＡＳ２領域の転写活性を強く抑制する能力があることを確認した。マウスおよびヒトのＢＤＮＦエクソン１のプロモーター領域Ｓ３とＳ４との間の塩基配列を、それぞれ配列番号１９および２０に示す。また、上記Ｃ、Ｅ、Ｆに対応するマウスの塩基配列を配列番号２１〜２３に、ヒトの塩基配列を配列番号２４〜２６に示す。【００４７】
〔実施例３：機能性ポリヌクレオチドの大量調製〕
上記３種類のＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆを使用した。いずれも３５塩基対の二本鎖ＤＮＡである。【００４８】
まずpCRII-TOPOプラスミドをＥｃｏＲＶ制限酵素部位で平滑末端に切り開き、５’リン酸化した各ＤＮＡ断片の二本鎖ＤＮＡをＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅを用いて挿入した。このＤＮＡ断片はpCRII-TOPOプラスミド内のＭ１３プライマー（ＦＷおよびＲＶ）の結合部位間に存在するので、このプラスミドを鋳型として、Ｍ１３プライマー（ＦＷおよびＲＶ）を使用し、上記ＤＮＡ断片の配列を含む計２６１塩基対の部分をＰＣＲで増幅した。【００４９】
増幅したＰＣＲ産物を、精製、濃縮し、ＤＮＡ濃度を１７．４ｐＭ（３μｇ／μＬ）に調整した。さらに、調製したＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆを等量ずつ混合し、それぞれを５．８ｐＭ（１μｇ／μＬ）の濃度で含む溶液を作製した。この混合溶液は、全ＤＮＡ濃度が１７．４ｐＭ（３μｇ／μＬ）である。対照ＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆの配列を含まないpCRII-TOPOプラスミドを鋳型として、Ｍ１３プライマーを使用し、プライマー間の計２２５塩基対の部分をＰＣＲで増幅した。得られたＰＣＲ産物を、精製、濃縮し、ＤＮＡ濃度を１７．４ｐＭ（２．６μｇ／μＬ）に調整し、対照ＤＮＡとして使用した。【００５０】
〔実施例４：機能性ポリヌクレオチド投与実験１〕
クモ膜下に投与したＤＮＡ断片がＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を抑制しているか否かを確認するために、無処置のラット（６週齢の雄性ＳＤラット）に対して、カテーテルの先端が第４腰神経ＤＲＧ付近に届くように挿入した。カテーテルの他端を、皮下を通して後頭部から体外に出した。挿入手術に伴う疼痛、炎症を避けるため、次の処置までには約１週間間隔を開けた（カテーテル挿入から７日後を０日目とした（図５））。【００５１】
ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆの溶液またはＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆの配列を含まない対照ＤＮＡ溶液（各１７．４ｐＭ）を、各３匹のラットのクモ膜下に、１２時間前および０時間の時点で、２０μＬずつ注入した。【００５２】
２回目の投与（すなわち０時間）の３６時間後にラット第４腰神経ＤＲＧを摘出し、ＢＤＮＦ遺伝子のエクソン１バリアントの発現量をＲＴ−ＰＣＲにて解析した。ＢＤＮＦ遺伝子の転写産物量はGAPDH遺伝子の発現を内部標準として補正した。具体的には、組織からのＲＮＡ抽出を、RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。１個のＤＲＧから得られる全ＲＮＡ（３〜５μｇ）をReady-To-Go T-Primed First-Strand Kit（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡを１／１０に希釈してＢＤＮＦの各エクソンの定量に用いた。また、内部標準用のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡまたはアクチン  ｍＲＮＡの定量にはさらに１／１０希釈して用いた。ＰＣＲ断片をpCRII-TOPOベクターに組み込んだものを用いて、予め塩基配列を確認し、定量用の検量線を作成した。定量ＰＣＲ装置にはLightCycler（Ｒｏｃｈｅ社）を使用し、プライマー、反応液およびＰＣＲのプログラムを表１〜３のように設定した。定量ＰＣＲ用のSYBR GreenＩ溶液にはタカラ製を用いた。反応液中にテンプレートを含まないものをネガティブコントロールに用いた。【００５３】
【表１】
0005545211.tif 000002
【００５４】
【表２】
0005545211.tif 000003
【００５５】
【表３】
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【００５６】
図６に示すように、ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆの投与群は対照ＤＮＡ投与群に比べ、エクソン１バリアントのｍＲＮＡ量が有意に減少していた。このことは、ＤＲＧへのＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆの導入が、ＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を有効に抑制することを示している。【００５７】
〔実施例５：機能性ポリヌクレオチド投与実験２〕
実施例４において、上記ＤＮＡ断片によってＤＲＧのＢＤＮＦエクソン１バリアントの発現が抑制されることが判明したので、上記ＤＮＡ断片が炎症による痛みを抑制し得るかどうかを確かめた。カテーテル挿入から９日後、炎症性疼痛誘導物質である完全フロイントアジュバント(ＣＦＡ)１００μＬを、左後肢足底に皮下注射し、実施例４と同様に行った（図７）。【００５８】
ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆを混合した溶液（１７．４ｐＭ；ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆをそれぞれ５．８ｐＭ含む。）または対照ＤＮＡ溶液（１７．４ｐＭ）を用いた。ＣＦＡ皮下注射の２日前、１日前、ＣＦＡ注射直前に、３４８ｐｍｏｌ（２０μＬ）の溶液をクモ膜下に注入した。混合溶液導入群、対照ＤＮＡ溶液導入群には各５匹のラットを使用した。【００５９】
ＤＮＡ断片投与直前からＣＦＡ注射５日後まで、ラットの疼痛行動評価を毎日行った。疼痛行動は、機械的刺激に対する疼痛閾値（５０％反応域値）により評価した。具体的には、ラットを１０×２０ｃｍ四方の壁に囲まれた金網の上にのせ、安静になるまで３０分以上放置した。金網の下から、太さの違う５種類のナイロンフィラメント（von Freyフィラメント）を、細いものから順に後肢足底の中心にそっと押し当て、刺激による逃避行動の有無を観察した。逃避行動を示す閾値をChaplanらの方法により求めた。閾値はフィラメントの堅さをグラムで表示しており、数値が低いほど痛みに敏感に反応することを示している。【００６０】
図８に示すように、ＤＮＡ断片投与群は対照ＤＮＡ投与群に比べ、疼痛を有意に抑制していた。特に、刺激３日後および４日後においては、ＤＮＡ断片の効果が顕著に観察された。この実験より、ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆが疼痛抑制効果を有すること、および、事前に投与しておいても疼痛抑制効果を発揮できることが明らかになった。【００６１】
〔実施例６：機能性ポリヌクレオチド投与実験３〕
ラットの脊髄第５腰神経ＤＲＧの末梢側を結紮して慢性疼痛モデルを作成すると同時に、カテーテルの先端を第４腰神経ＤＲＧ付近に留置した。実施例４に準じてカテーテルの他端は皮下を通して後頭部から体外に出した。【００６２】
ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆを混合した溶液（１７．４ｐＭ）（ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆ各々５．８ｐＭを含む）または対照ＤＮＡ溶液（１７．４ｐＭ）を用いた。神経結紮による痛覚過敏の成立を確認した後、５日目、６日目、７日目に混合溶液をクモ膜下に注入した。【００６３】
ラットの疼痛行動観察は、慢性疼痛モデル作成直前から７日目の３回目（最終）投与後もさらに１週間にわたって行った。方法は実施例５と同様である。【００６４】
図９には典型的な実施例を挙げた。Ｄａｙ  ０のデータは手術直前の行動評価を示す。図９の（ａ）に示すように、このラットではＤＮＡ断片投与により患側の反応は、健側（非侵襲側）の反応の約８０％まで回復（７日目から１０日目）しており、ＤＮＡ断片の効果が顕著に現れていることが明らかとなった。図９の（ｂ）では、（ａ）に示すＤＮＡ断片投与ラットと別の対照ＤＮＡ投与ラットの患側同士を比較した結果であるが、対照ＤＮＡ投与ラットでは疼痛抑制は見られなかった。実施例を増やして得た結果を図１０に示す。上記の例を含むＤＮＡ断片投与ラット４匹、コントロール投与ラット３匹である。図１０に示すように、ＤＮＡ断片投与ラットは対照ＤＮＡ投与ラットに比べ、有意に疼痛が抑制されていることが明らかになった。グラフを見やすくするために痛みを感じている患側足のみを図１１に示す。この実験により、ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆは慢性疼痛の抑制効果を有すること、およびＤＮＡ断片投与は健側の行動評価に対してはなんら影響をおよぼさないこと、さらに疼痛発症後に投与しても疼痛抑制効果を発揮できることが明らかになり、人での臨床応用に大きな期待が持てる。【００６５】
〔実施例７：ＢＤＮＦエクソン１プロモーター領域の広範囲の、機能性ポリヌクレオチドによる転写能の抑制効果〕
以上の実験によりＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆは慢性疼痛の抑制効果を有することが明らかとなったので、次に、ＤＮＡ断片Ｃ、Ｅ、Ｆを含む広いプロモーター領域二本鎖ＤＮＡによる転写能抑制効果を解析した。ＢＤＮＦエクソン１のプロモーター領域Ｓ３−ＡＳ２を３分割して、オーバラップする３つの断片を作製した。具体的には、アンチセンスプライマーＡＳ４（配列番号２７）およびＡＳ５（配列番号２８）を作製し、ラットＳ３−ＡＳ４（２４０ｂｐ；配列番号２９）、Ｓ４−ＡＳ５（３０８ｂｐ；配列番号３０）、Ｓ５−ＡＳ２（４３２ｂｐ；配列番号６）をＰＣＲで増幅後、精製、濃縮した（図１２）。コントロールとして、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳのＭ１３プライマーの間（Ｍ４とＲＶプライマーとの間の２４６ｂｐ）をＰＣＲで増幅後、精製、濃縮した。ラットプロモーター領域Ｓ３−ＡＳ４、Ｓ４−ＡＳ５、Ｓ５−ＡＳ２に対応するヒトプロモーター領域Ｓ３−ＡＳ４、Ｓ４−ＡＳ５、Ｓ５−ＡＳ２の塩基配列をそれぞれ配列番号３１、３２、３に示す。【００６６】
各二本鎖ＤＮＡ断片（ラットＳ３−ＡＳ４、Ｓ４−ＡＳ５、Ｓ５−ＡＳ２、コントロール）０．６μｇ存在下にて、ヒトＳ３−ＡＳ２およびラットＳ３−ＡＳ２を有しているホタルルシフェラーゼレポータープラスミドｐＧＬ４．１４（０．１８μｇ）、およびウミシイタケルシフェラーゼレポータープラスミドｐＴＫ−ｈＲＧ（０．０２μｇ）を、ラットグリオーマ細胞株Ｃ６細胞に導入し、導入２４時間後にＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイを行った。ポジティブコントロールとしてＤＮＡ断片Ｃ（０．６μｇ）も一緒に行った。その結果、プロモーター領域Ｓ３−ＡＳ４、Ｓ４−ＡＳ５、Ｓ５−ＡＳ２は、プロモーターＳ３−ＡＳ２領域の転写活性を抑制することを確認した（図１３）。Ｓ４−ＡＳ５、Ｓ５−ＡＳ２は単独ではやや抑制効果は弱いが、Ｓ３−ＡＳ４と混在させて投与すれば、より効果的であると考えられる。【００６７】
以上により、ＢＤＮＦ遺伝子の遺伝子発現に重要な発現調節領域に対する二本鎖ポリヌクレオチドはインビトロおよびインビボの両方においてＢＤＮＦのエクソン１バリアントの発現を有意に抑制し、機能性ポリヌクレオチドとして用いることにより疼痛抑制することが可能であることがわかった。特に、実施例１（図２）に示すように、エクソン１上流の調節領域の、Ｓ３−ＡＳ２間のＤＮＡ配列は全体にわたって活性を有しているので、実際に抑制効果を確認したＳ３−ＡＳ２間の中の一部分からなる二本鎖ＤＮＡだけでなく、Ｓ３−ＡＳ２の全長二本鎖ＤＮＡを用いるとより効果的に抑制能を示すことができると考えられる。【００６８】
急性痛に関する様々な製剤が知られているが、慢性疼痛に効果的な製剤はほとんど知られておらず、しかもいずれもＢＤＮＦを標的としたものではない。本発明を用いる疼痛抑制は、交通事故や手術後の後遺症、癌性疼痛、糖尿病などに有効であると考えられる。また、癌細胞は癌化した後にＢＤＮＦを合成していることが報告されている（非特許文献３参照）。ＢＤＮＦは神経を引き寄せる作用があることより、癌の耐え難い痛みの原因の１つはＢＤＮＦに起因している可能性がある。本発明を用いるＢＤＮＦの発現抑制は、末期癌、癌の骨転移などの癌性疼痛の治療に有効であると考えられる。【００６９】
このように、本発明者らはＢＤＮＦの発現を阻害すると疼痛を抑制することが可能であることを示した。よって、ＢＤＮＦの発現を阻害する物質は疼痛治療剤になり得る。本発明者らが作り出した、Ｃ６ラットグリオーマ培養細胞にてＢＤＮＦ発現量の増減を測定するシステムは、新規の疼痛治療剤をスクリーニングする新しい技術である。より詳細には、本システムは、実施例１および２で使用した「ＢＤＮＦのエクソン１上流領域を有しているルシフェラーゼプラスミドが導入されたラットグリオーマＣ６培養細胞」である。本システムは、好ましくは、当該ルシフェラーゼプラスミドをラットグリオーマＣ６培養細胞にトランスフェクション（遺伝子導入）後、ハイグロマイシン存在下で培養し、当該ルシフェラーゼプラスミドが導入されたラットグリオーマＣ６培養細胞のみを株化した当該ルシフェラーゼプラスミド導入ラットグリオーマＣ６培養細胞株であり得る。ルシフェラーゼプラスミドはハイグロマイシン耐性遺伝子を有しているので、ハイグロマイシン存在下で培養することにより、導入細胞のみを純化することができる。用いる細胞としては、Ｃ６細胞に限定されず、ＤＲＧの初代培養細胞であっても他のＢＤＮＦ生産細胞であってもよい。ＢＤＮＦ発現量を検出する方法としては、ルシフェラーゼアッセイに限定されず、ＲＴ−ＰＣＲ法、マイクロアレイを用いる方法、抗体を用いたウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などであってもよい。ｃＤＮＡの増幅も必要に応じて行われればよく、好ましい方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（栄研化学株式会社）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（宝酒造株式会社）などが挙げられる。【００７０】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明を用いれば、難治性慢性疼痛に代表される疼痛の治療が可能になるので、医療分野および医薬品分野において大いに貢献し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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