(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯを含むガス状の基質の微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造法であって、
ａ．ＣＯを含む当該基質をバイオリアクターに供給し；そして
ｂ．クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)の培養物を含有する当該バイオリアクター内でＣＯを含む前記基質を嫌気的に発酵させて２，３−ブタンジオールを製造することを含み；
ＣＯを含む当該ガス状の基質が、当該培養物による少なくとも０．４ｍｍｏｌＣＯ／ｇ乾燥細菌細胞重量／分のＣＯ取込み比速度が維持されるように供給される、製造方法。
【請求項２】
ＣＯを含む前記基質が、前記培養物による少なくとも０．６ｍｍｏｌＣＯ／ｇ乾燥細菌細胞重量／分のＣＯ取込み比速度が維持されるように供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記基質が、少なくとも０．８ｍｍｏｌＣＯ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記基質が、少なくとも１．０ｍｍｏｌＣＯ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＯを含む基質の微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造法であって、
ａ．ＣＯを含むガス状の基質をバイオリアクターに供給し；
ｂ．一つ又は複数の２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)細菌の培養物を含有する当該バイオリアクター内でＣＯを含むガス状の前記基質を嫌気的に発酵させることを含み、
２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子が、前記細菌によるＣＯ取込み比が少なくとも０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分であるようにガス状のＣＯ基質を供給することによってアップレギュレートされる、前記方法。
【請求項６】
ＣＯを含む前記基質が、前記培養物による少なくとも０．４ｍｍｏｌＣＯ／ｇ乾燥細菌細胞重量／分のＣＯ取込み比速度が維持されるように供給される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ガス状の前記基質が少なくとも１５体積％から１００体積％のＣＯを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＣＯを含むガス状の前記基質が、産業プロセスからの副産物として得られるガスを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＣＯを含むガス状の前記基質が製鋼所から得られるガスを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質が一つ又は複数の炭水化物をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
一つ又は複数の炭水化物を含む基質を供給するステップの前、及び／又は同時、及び／又は後にＣＯを含む基質を供給する追加のステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｓｉｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）に寄託番号ＤＳＭ１９６３０で寄託されたクロストリジウム・オートエタノゲナム株である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記２，３−ブタンジオールが、０．２ｇ／Ｌ／日より大きい生産性で生産される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
エタノールが発酵の副産物として生成される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物発酵によるブタンジオールの製造、特に、ＣＯを含む基質の微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
輸送用のバイオ燃料はガソリンの魅力的な代替品であり、低濃度ブレンドとして燃料市場に急速に浸透してきている。天然植物源由来のバイオ燃料は化石資源由来の燃料（例えばガソリン）よりも環境的に持続可能で、それらの使用は、燃料燃焼の結果大気中に放出されるいわゆる化石二酸化炭素（ＣＯ２）ガスのレベルの低減を可能にする。その上、バイオ燃料は多くの地域で地元生産できるので、輸入化石エネルギー資源への依存を削減するのにも役立つ。バイオ燃料として使用するのに適切なアルコールは、エタノール、ブタノール及び２，３−ブタンジオールなどである。
【０００３】
エタノールは急速に世界中で主要な水素豊富液体輸送用燃料になりつつある。２００２年におけるエタノールの世界的消費は推定１０８億ガロンであった。燃料エタノール産業に関する世界市場も、ヨーロッパ、日本、米国、及びいくつかの発展途上国でエタノールへの関心が高まっているため、将来的に急成長すると予測されている。
【０００４】
１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール及び２，３−ブタンジオールを含むブタンジオールは、エタノールに優る様々な利点を有していると考えられる。エタノールと同様、ブタンジオールは、自動車燃料の添加剤としてそのまま使用できる。それらはまた、いくつかの潜在的高価値及び／又は高エネルギー製品に比較的容易に変換することもできる。例えば、２，３−ブタンジオールは、二段階プロセスで、航空燃料として使用できる８炭素ダイマーに容易に変換できる。
【０００５】
２，３−ブタンジオールの多用途性は、その二官能性骨格から誘導される。すなわち２個のヒドロキシル基が隣接Ｃ原子上に位置しているので、該分子は、ブタジエン、ブタジオン、アセトイン、メチルエチルケトンなどの物質に極めて容易に変換させることが可能となる。これらの化合物は、広範囲の化学工業製品を製造するためのベース分子として使用される。
【０００６】
さらに、２，３−ブタンジオールは、内燃機関の燃料として使用することもできる。それは、いくつかの点でエタノールよりもガソリンに類似している。環境的に持続可能な燃料の製造及び応用への関心が高まるにつれ、２，３−ブタンジオール（しばしばバイオブタノールと呼ばれる）を製造するための生物学的プロセスへの関心も高まっている。
【０００７】
２，３−ブタンジオールは、炭水化物含有原料の微生物発酵によって製造できる（Ｓｙｕ  ＭＪ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５５：１０−１８（２００１），Ｑｉｎら，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  １４（１）：１３２−１３６（２００６））。２，３−ブタンジオールは、砂糖大根、トウモロコシ、小麦及びサトウキビのような作物由来のバイオマスの微生物発酵によって製造することもできる。しかしながら、これらの炭水化物原料のコストは、人間の食料又は動物飼料としてのそれらの価値によって影響され、また、２，３−ブタンジオール製造用のデンプン又はショ糖生産作物の耕作は、すべての地域で経済的に持続可能とは限らない。そこで、より低コスト及び／又はより豊富な炭素資源を２，３−ブタンジオールに変換するための技術開発に関心が寄せられている。
【０００８】
一酸化炭素（ＣＯ）は、石炭又は石油及び石油製品のような有機材料の不完全燃焼の主要副産物である。炭素含有前駆物質を完全燃焼すれば、最終生成物としてＣＯ２と水だけが得られるが、一部の産業プロセスはＣＯ２よりも一酸化炭素の蓄積を促しやすい高温を必要とする。一つの例が製鋼業で、所望のスチール品質を得るのに高温を必要とする。例えば、オーストラリアの製鋼業は、年間５００，０００トンを超えるＣＯを生成し、大気中に放出していると報告されている。
【０００９】
さらに、ＣＯは合成ガスの主成分でもある。様々な量のＣＯ及びＨ２が炭素含有燃料のガス化によって生成されている。例えば、合成ガスは、廃木材の有機バイオマスを分解することによって製造でき、燃料及びより複雑な化学製品を製造するための前駆物質となっている。
【００１０】
大気中へのＣＯ放出は重大な環境影響をもたらしうる。さらに、排出税の支払いも求められ、工業プラントにかかるコストを押し上げる。ＣＯは反応エネルギー豊富な分子なので、様々な化学製品製造のための前駆化合物として使用できる。しかしながら、この価値ある原料は２，３−ブタンジオールの製造には利用されてこなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｙｕ  ＭＪ，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５５：１０−１８（２００１）
【非特許文献２】Ｑｉｎら，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  １４（１）：１３２−１３６（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、上記欠点を克服するのに少なくともいくらかでも助けになるプロセスを提供すること、又は少なくとも公衆に有用な選択肢を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一側面において、本発明は、一酸化炭素を含む基質の微生物発酵によるブタンジオールの製造法を提供する。特定の態様において、本発明は、微生物発酵によるブタンジオールの製造法を提供し、該方法は、
ａ．ＣＯを含む基質を供給し；
ｂ．一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させてブタンジオールを製造する
ことを含む。
【００１４】
一定の態様において、ブタンジオールは２，３−ブタンジオールである。
別の側面において、本発明は、発酵による２，３−ブタンジオール製造の効率を増大させる方法を提供し、該方法は、
ａ．ＣＯを含む基質を供給し；
ｂ．一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させて２，３−ブタンジオールを製造する
ことを含む。
【００１５】
本発明の別の側面において、微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造法を提供し、該方法は、
ａ．基質を供給し；
ｂ．一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させ、ここで、一つ又は複数の微生物は一つ又は複数の２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含み；
ｃ．２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、微生物によって２，３−ブタンジオールが製造されるようにアップレギュレートする
ことを含む。
【００１６】
特定の態様において、基質はＣＯを含む。
様々な側面の特定の態様において、一酸化炭素を含む基質は、一酸化炭素を含むガス状基質である。一酸化炭素を含むガス状基質は、産業プロセスの副産物として得ることができる。一定の態様において、産業プロセスは、鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、バイオマスのガス化、石炭のガス化、発電、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造及びコークス製造からなる群から選ばれる。一態様において、ガス状基質は、製鋼所から得られるガスを含む。別の態様において、ガス状基質は自動車の排ガスを含む。
【００１７】
特定の態様において、ＣＯ含有基質は典型的には主要割合のＣＯを含有する。例えば、少なくとも約２０％〜約１００体積％のＣＯ、４０％〜９５体積％のＣＯ、４０％〜６０体積％のＣＯ、及び４５％〜５５体積％のＣＯである。特定の態様において、基質は、約２５％、又は約３０％、又は約３５％、又は約４０％、又は約４５％、又は約５０％のＣＯ、又は約５５％のＣＯ、又は約６０体積％のＣＯを含む。６％といった低いＣＯ濃度を有する基質も、特にＨ２及びＣＯ２も併存している場合、適切なこともある。
【００１８】
様々な側面の特定の態様において、ＣＯを含む基質は、２，３−ブタンジオールが製造されるように十分なレベルで供給される。特定の態様において、ＣＯは、少なくとも０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．５ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．７ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．９ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．２ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．５ｍｍｏｌ／ｇ／分の取込み比速度（specific uptake rate）が維持されるように供給される。
【００１９】
様々な側面の一定の態様において、方法は、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)を用いる微生物発酵を含む。
別の側面において、本発明は、微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造法を提供し、該方法は、
ａ．基質を供給し；
ｂ．クロストリジウム・オートエタノゲナムの培養物を含むバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させて２，３−ブタンジオールを製造する
ことを含む。
【００２０】
特定の態様において、基質は、一つ又は複数の炭水化物、例えばフルクトースである。あるいは、基質は、前述のように、一酸化炭素を含む基質、典型的には一酸化炭素を含むガス状基質である。
【００２１】
更なる側面において、本発明は、第一の基質及びＣＯを含む第二の基質の微生物発酵によるブタンジオールの製造法を提供する。好ましくは、ブタンジオールは２，３−ブタンジオールである。
【００２２】
特定の態様において、第一の基質は炭水化物である。一定の態様において、第一の基質はフルクトースである。一定の態様において、第二の基質は、前述のように、一酸化炭素を含むガス状基質である。
【００２３】
特定の態様において、該方法は、
（ａ）第一の基質の微生物発酵によって２，３−ブタンジオールを製造し、
（ｂ）ＣＯを含む第二の基質の微生物発酵によって２，３−ブタンジオールを製造する
ステップを含む。
【００２４】
一定の態様において、ステップ（ａ）と（ｂ）は同時に実施できる。あるいは、ステップ（ａ）は、実質的にステップ（ｂ）の前でも後でもよい。特定の態様において、該方法は、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）を交互に行ってもよい。
【００２５】
本発明の更なる側面において、発酵がバイオリアクター内で行われる、前述の側面のいずれかによる方法を提供する。
本発明の更なる側面において、方法がブタンジオールを捕捉又は回収するステップをさらに含む、前述の側面のいずれかによる方法を提供する。
【００２６】
更なる側面において、前述の側面のいずれかの方法によって製造されるブタンジオール、好ましくは２，３−ブタンジオールを提供する。
本発明は、本願の明細書において言及又は指示された部品、構成要素及び特徴を、個別にも又は集団的にも、前記部品、構成要素又は特徴の二つ以上のいずれか又はすべての組合せでも含むと広く言うこともできる。また、本明細書中で特定の整数が言及され、それが本発明の関連する技術分野で公知の等価物を有している場合、そのような公知の等価物もあたかも個別に示されたかのごとく本明細書に組み込まれると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、三つの発酵槽（Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ２）における２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ＢＤＨ）の相対遺伝子発現を示す。アセテート生成Ｒ２がキャリブレーターとして選ばれ、遺伝子発現はｒｐｏβを参照遺伝子として用いてノーマライズされた。誤差バー＝平均の標準誤差。Ｎ＝３。明らかに、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、２，３−ブタンジオールを製造する微生物培養物でアップレギュレートされている。Ｒ２の微生物培養物は約０．３ｍｍｏｌ／ｇ／分のＣＯ取込み比（specific CO uptake）を有しているが、Ｒ１２の培養物は約０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分の取込み比を有している。培養物に供給されるＣＯの量が増大するとＣＯの取込みも増大し、続いて２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現も増大する。２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現の増大は、総２，３−ブタンジオール生産性の増大をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下に、本発明を、その好適な態様を含め、一般的な言葉で記載する。本発明はさらに、本発明を支持する実験データ、本発明の側面の具体的実施例、及び本発明を実施するための手段を提供する以下の“実施例”の項目の下に示された開示の中でも例示される。
【００２９】
本明細書において、“ブタンジオール”とは、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール及び２，３−ブタンジオールを含むジオールのすべての構造異性体及びそれらの立体異性体のことを言う。“２，３−ブタンジオール”という用語は、該化合物のすべてのエナンチオ及びジアステレオ形、例えば（Ｒ，Ｒ）、（Ｓ，Ｓ）及びメソ形を、ラセミ形、部分的に立体異性体的に純粋な形及び／又は実質的に立体異性体的に純粋な形で含むと解釈されるべきである。
【００３０】
“バイオリアクター”という用語は、一つ又は複数の容器及び／又は塔又は配管からなる発酵装置を含み、連続撹拌槽リアクター（Continuous Stirred Tank Reactor, ＣＳＴＲ）、固定化細胞リアクター（Immobilized Cell Reactor, ＩＣＲ）、細流床リアクター（Trickle Bed Reactor, ＴＢＲ）、バブルカラム(Bubble Column)、ガスリフト発酵槽(Gas Lift Fermenter)、静的ミキサー(Static Mixer)、又は気液接触に適切なその他の容器又はその他の装置を含む。以下に記載するように、一部の態様において、バイオリアクターは第一の増殖リアクターと第二の発酵リアクターを含みうる。従って、基質、例えば一酸化炭素を含む基質をバイオリアクター又は発酵反応に添加すると言う場合、必要に応じてこれらのリアクターのいずれか又は両方に添加することを含むと理解されるべきである。
【００３１】
“一酸化炭素を含む基質”という用語及び類似の用語は、一酸化炭素が、一つ又は複数の細菌株に例えば増殖及び／又は発酵のために利用されうるあらゆる基質を含むと理解されるべきである。
【００３２】
“一酸化炭素を含むガス状基質”は、あるレベルの一酸化炭素を含有するあらゆるガスを含む。ガス状基質は、典型的には、主要割合のＣＯ、好ましくは、少なくとも約１５％〜約９５体積％のＣＯを含有する。
【００３３】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“発酵する”、“発酵プロセス”又は“発酵反応”などの語句は、本明細書中では、プロセスの増殖相及び生成物生合成相の両方を包含するものとする。
【００３４】
発明者らは、驚くべきことに、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)を用いる微生物発酵によって２，３−ブタンジオールを製造できることを示した。彼らは、発酵生成物は様々なアルコールを含み、エタノール及び２，３−ブタンジオールが重要な置換物（substituents）となることを見出した。２，３−ブタンジオールはこれまでクロストリジウム・オートエタノゲナムを用いた発酵生成物としては確認されていなかった。特に、発明者らは、炭水化物を含む基質からクロストリジウム・オートエタノゲナムを用いて２，３−ブタンジオール及びその他の生成物を製造できることを見出した。特に、フルクトースは、アセテート、エタノール及び２，３−ブタンジオールを含む生成物に変換できる。驚くべきことに、２，３−ブタンジオールは、クロストリジウム・オートエタノゲナムによってＣＯを含む基質、特にＣＯを含むガス状基質から製造できることも示された。発酵プロセスにガス状炭素源、特にＣＯを含む供給源を使用した場合、これまで２，３−ブタンジオールの製造はもたらされなかった。
【００３５】
本発明の特定の態様において、２，３−ブタンジオール製造の効率は、基質を２，３−ブタンジオールが製造されるほどの十分なレベルで供給することによって増大できる。微生物培養物に供給される基質の量が増加すると、培養物によって製造される２，３−ブタンジオールの量が増加することが分かった。
【００３６】
本発明の特定の態様において、ＣＯを含む基質は、２，３−ブタンジオールが製造されるほど十分なレベルで供給される。Ｃ．オートエタノゲナムを含む微生物培養物は、ＣＯを約１．５〜２ｍｍｏｌ／ｇ乾燥重量微生物細胞／分までの速度で取り込めることが示されている（ＣＯ取込み比）。本発明の特定の態様において、ＣＯを含む基質は、Ｃ．オートエタノゲナムを含む微生物培養物に、取込み比が実質的に又は少なくとも０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．５ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．７ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．９ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．２ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．５ｍｍｏｌ／ｇ／分に維持されるように供給される。そのような態様において、２，３−ブタンジオールは、少なくとも０．５ｇ／Ｌ；又は少なくとも１ｇ／Ｌ；又は少なくとも２ｇ／Ｌ；又は少なくとも５ｇ／Ｌという、かなりの発酵生成物となる。特定の態様において、２，３−ブタンジオールは、少なくとも０．５ｇ／Ｌ／日；又は少なくとも１ｇ／Ｌ／日の速度で製造される。
【００３７】
本発明の特定の態様において、本発明の方法を実施するために使用される装置は、ＣＯ供給、ＣＯ取込み、バイオマスレベル、２，３−ブタンジオール製造などのパラメータの測定及び／又は制御が可能である。例えば、サンプルをバイオリアクターから取り出して上記パラメータの一つ又は複数を測定し、バイオリアクターの条件を２，３−ブタンジオールの製造が改良されるように最適に調整することができる。例えば、微生物培養物が２，３−ブタンジオールを全く又はわずかな量しか製造していないバイオリアクターでは、ＣＯ供給を２，３−ブタンジオールが製造されるように増加させることができる。
【００３８】
アセテート及びエタノールのような生成物は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ｒら，１９９４，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４５／４６：１４５に記載されているように、ＣＯからアセチル−ＣｏＡサイクル及びＴＨＦサイクルの組合せを経由して製造されることは認められている。しかしながら、本発明の方法によれば、驚くべきことに、特に、ＣＯ取込み比速度が少なくとも０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．５ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．７ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．９ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．２ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．５ｍｍｏｌ／ｇ／分に維持されるようにＣＯを供給すると、２，３−ブタンジオールを製造できることが示された。理論に縛られたくはないが、十分な又は高いレベルのＣＯを供給することによって、２，３−ブタンジオールのような高エネルギー生成物が発酵中に製造できると考えられる。２，３−ブタンジオールのような生成物の前駆物質は、電子受容体として働いて微生物細胞から過剰の還元力をＮＡＤ（Ｐ）Ｈの形態で取り除くので、好適なＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ平衡が回復すると考えられる。さらに、培養物によって発酵された炭水化物も同様の様式で２，３−ブタンジオールに変換できると考えられる。
【００３９】
下記遺伝子がＣ．オートエタノゲナム中に推定的に確認されている。すなわち、α−アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）、α−アセトラクテートデカルボキシラーゼ（ＡＬＤＣ）及び２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（２，３ＢＤＨ）である。Ｃ．オートエタノゲナム（ＤＳＭＺに受入番号１９６３０で寄託された株）の推定２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＯＲＦ  １２８３）は、クロストリジウム・ノビイ(Clostridium novyi)（ＮＴ０１ＣＸ＿０３４４）の２，３ＢＤＨと、アミノ酸の同一性７３％（２６２／３５７）及び類似性(positives)８４％（３００／３５７）という強い相同性を示す。ＯＲＦ  １２８３は、枯草菌(Bacillus subtilis)の遺伝子ＹｄｊＬ（ｂｄｈＡ）とも顕著な相同性を示す（４７％のアミノ酸同一性、６３％の類似性及び３ｅ−８９の期待値(E-value)）。ＬＺ１５６０のＯＲＦ  １２８３は２，３ＢＤＨであるという更なる証拠は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の２，３ＢＤＨ（ＹＡＬ０６０Ｗ）との相同性に依拠している（Ｅ＝２ｅ−５３）。
【００４０】
理論に縛られたくはないが、２，３−ブタンジオールは以下のようにピルベート（アセチルＣｏＡから生じた同化における中間体）から製造されると考えられる。
【００４１】
【化１】
0005618995.tif 000002
【００４２】
Ｃ．オートエタノゲナム中の２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼのリアルタイムＰＣＲ研究から、相当量の２，３−ブタンジオールが製造されている培養物中ではそれは実質的にアップレギュレートされていることが示されている。そこで、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼを本発明の方法に従ってアップレギュレートさせればよい。例えば、ＣＯが十分なレベルで供給されている場合、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼはアップレギュレートされる。特に、微生物培養物によるＣＯ取込み比が、少なくとも０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．５ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．７ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．９ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．２ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．５ｍｍｏｌ／ｇ／分となるようにＣＯが供給された場合、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼはアップレギュレートされる。従って、本発明は、基質の微生物発酵による２，３−ブタンジオールの、２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼのアップレギュレーションによる製造法を提供する。
【００４３】
発明者らはさらに、炭水化物基質及びＣＯを含むガス状基質のような異なる基質を、微生物の２，３−ブタンジオール製造中に悪影響なしに切り替えられることも示した。さらに、発明者らは、例えば一つの基質が入手できない場合、基質を交替させれば２，３−ブタンジオールの製造を続けられるであろうことも想定している。
【００４４】
得られた結果によれば、本発明の一態様において、２，３−ブタンジオールは、炭水化物を含む基質の微生物発酵によって製造される。本発明の別の態様において、一酸化炭素を含む基質、好ましくはＣＯを含むガス状基質は、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)によって２，３−ブタンジオールを含む様々な生成物に変換される。
【００４５】
本発明の更なる態様において、炭水化物（好ましくはフルクトース）を含む第一の基質を発酵反応の初期段階で使用し、該基質の完全消費後、基質をＣＯを含む第二の基質に切り替えることができる。ここでも発明者らは、驚くべきことに、２，３−ブタンジオールは、炭水化物を含む第一の基質が唯一の炭素源である初期段階で製造されるだけでなく、ＣＯを含む基質が唯一の炭素源である後期段階でも製造されることを見出した。
【００４６】
発明者らは、２，３−ブタンジオールが、酢酸緩衝液及びクエン酸緩衝液のような代替緩衝溶液を含有する培地などの様々な条件下で製造されることを示した。発明者らはまた、ｐＨが制御されず変動しうる態様においても２，３−ブタンジオールはなお製造されることも示す。所望の発酵を実施するのに適切な培地の例は以下の実施例の項に記載する。
【００４７】
発明者らは、そのようなプロセスで製造された２，３−ブタンジオールは、当該技術分野で公知の分離技術を用いて容易に回収できると考えている。さらに、２，３−ブタンジオールは、ブタジエン、ブタジオン、アセトイン、メチルエチルケトンなどのような物質に容易に変換できる。そのような化合物は、あらゆる化学工業製品の相当割合を製造するのに使用される有益なベース分子である。従って、発明者らは、本明細書中に開示されたプロセスで製造された２，３−ブタンジオールは、様々な周知の工業製品の製造に使用できると考えている。
【００４８】
本発明は、本明細書においては、クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)を利用し、及び／又は２，３−ブタンジオールを製造する本発明の好適な態様に関連して一般的に記載される。しかしながら、代替の微生物がＣ．オートエタノゲナムの代わりになりうることは理解されるべきである。同様に、本方法は２，３−ブタンジオール以外のブタンジオールの製造及び回収にも使用できる。従って、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“２，３−ブタンジオール”への言及は、一般用語“ブタンジオール”によって置き換えることができる。
【００４９】
方法
一態様において、本発明は、微生物発酵によるブタンジオールの製造法を提供する。好適な態様において、該方法は、少なくとも、ＣＯを含む基質、好ましくはＣＯを含むガス状基質を嫌気的に発酵して２，３−ブタンジオールを得るステップを含む。
【００５０】
本発明の好適な態様において、該方法は、
（ａ）ＣＯを含む基質、好ましくはＣＯを含むガス状基質を供給し；
（ｂ）一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させて２，３−ブタンジオールを製造する
ステップを含む。
【００５１】
別の態様において、本発明は、発酵による２，３−ブタンジオール製造の効率を増大させる方法を提供し、該方法は、
（ａ）ＣＯを含む基質を供給し；
（ｂ）一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させて２，３−ブタンジオールを製造する
ことを含む。
【００５２】
特定の態様において、ＣＯを含む基質は、相当量の２，３−ブタンジオール、例えば少なくとも０．５ｇ／Ｌ発酵培地、又は少なくとも１ｇ／Ｌ、又は少なくとも２ｇ／Ｌ、又は少なくとも５ｇ／Ｌが製造されるのに足るレベルで供給される。一定の態様において、ＣＯは、少なくとも０．５ｇ／Ｌ／日；又は少なくとも１ｇ／Ｌ／日の速度で２，３−ブタンジオールが製造されるのに足るレベルで供給される。特定の態様において、ＣＯは、少なくとも０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．５ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．７ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．９ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．２ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．５ｍｍｏｌ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される。当業者であれば、所要の取込み速度が達成されるようなＣＯ、特にガス状ＣＯの供給法はわかるであろう。しかしながら、例を挙げると、発酵培地中でのガスホールドアップを増大させるような因子は、微生物培養物による生成物への変換に利用できるＣＯの量を増大させることになろう。ガスホールドアップは、典型的には機械的手段、例えばＣＳＴＲ内での撹拌の増加によって増大させることができる。さらに、ＣＯをより速い速度又は高い分圧で供給することも発酵ブロス中でのＣＯアベイラビリティを増大することになろう。
【００５３】
別の態様において、本方法は、ブタンジオール、好ましくは２，３−ブタンジオールを製造するための、クロストリジウム・オートエタノゲナムによる炭水化物を含む基質の発酵に関する。
【００５４】
別の態様において、本方法は、
（ａ）第一の基質の微生物発酵によって２，３−ブタンジオールを製造し、
（ｂ）ＣＯを含む第二の基質の微生物発酵によって２，３−ブタンジオールを製造する
ステップを含む。
【００５５】
一定の態様において、第一の基質は炭水化物であり、一部の態様において、該基質はフルクトースである。好ましくは、第二の基質はＣＯを含むガス状基質である。特定の態様において、ステップ（ａ）と（ｂ）は同時に実施することができる。あるいは、ステップ（ａ）は、実質的にステップ（ｂ）の前でも後でもよい。好ましくは、該方法は、ステップ（ａ）とステップ（ｂ）を交互に行ってもよい。
【００５６】
本発明の一定の態様において、該方法はさらに、製造された２，３−ブタンジオールを捕捉又は回収するステップを含む。
微生物
本発明の態様において、発酵に使用される一つ又は複数の微生物はクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)である。好適な態様において、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）に識別寄託番号１９６３０で寄託された株の識別特徴を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。別の態様において、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、ＤＳＭＺ寄託番号ＤＳＭＺ１００６１の識別特徴を有するクロストリジウム・オートエタノゲナムである。
【００５７】
本発明の方法に使用される細菌の培養は、嫌気性細菌を用いる基質の培養及び発酵のための当該技術分野で公知の様々なプロセスを用いて実施できる。技術例は本文書の“実施例”の項に提供されている。更なる例を挙げると、発酵にガス状基質を用いる下記文献に一般的に記載されたプロセスも利用できる。Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．Ａｃｋｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｃ．Ｃｌａｕｓｅｎ及びＪ．Ｌ．Ｇａｄｄｙ（１９９１）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，５；１４５−１６５；Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．Ａｃｋｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｃ．Ｃｌａｕｓｅｎ及びＪ．Ｌ．Ｇａｄｄｙ（１９９１）．Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｆｕｅｌ．７０．６０５−６１４；Ｋ．Ｔ．Ｋｌａｓｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．Ａｃｋｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｃ．Ｃｌａｕｓｅｎ及びＪ．Ｌ．Ｇａｄｄｙ（１９９２）．Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｉｎｔｏ  ｌｉｑｕｉｄ  ｏｒ  ｇａｓｅｏｕｓ  ｆｕｅｌｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１４；６０２−６０８；Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，Ｇ．Ｍ．Ａｎｔｏｒｒｅｎａ，Ｅ．Ｃ．Ｃｌａｕｓｅｎ及びＪ．Ｌ．Ｇａｄｄｙ（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｇａｓｅｏｕｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ：Ｃａｒｂｏｎ  Ｍｏｎｏｘｉｄｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  Ａｃｅｔａｔｅ．２．Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３４．６．７８５−７９３；Ｊ．Ｌ．Ｖｅｇａ，Ｅ．Ｃ．Ｃｌａｕｓｅｎ及びＪ．Ｌ．Ｇａｄｄｙ（１９８９）．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｇａｓｅｏｕｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ：Ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  ａｃｅｔａｔｅ．１．Ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．３４．６．７７４−７８４；並びにＪ．Ｌ．Ｖｅｇａ，Ｅ．Ｃ．Ｃｌａｕｓｅｎ及びＪ．Ｌ．Ｇａｄｄｙ（１９９０）．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｃｏａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇａｓ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ．Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．３．１４９−１６０。炭水化物を含む基質上での細菌培養法も当該技術分野では周知である。
【００５８】
基質
本発明の一態様において、２，３−ブタンジオールは、クロストリジウム・オートエタノゲナムを用いた炭水化物を含む基質の微生物発酵によって製造される。当該技術分野で公知の発酵に適切な多数の炭水化物の例があり、炭水化物基質の発酵に使用される多数のプロセスタイプの例があることはわかるであろう。例を挙げると、適切な基質は、グルコース及びフルクトースのような単糖類、スクロース又はラクトースのようなオリゴ糖類、セルロース又はデンプンのような多糖類などを含みうるが、これらに限定されない。これらの炭水化物基質（及びそれらの混合物）のいずれも本発明に適切であると考えられるが、好適な炭水化物基質はフルクトース及びスクロース（及びそれらの混合物）である。
【００５９】
当業者であれば、発酵可能な糖は、例えばＵＳ２００７００３１９１８号に記載されているように、セルロース及びリグノセルロース系バイオマスから前処理及び糖化のプロセスを通じて得られることは分かるであろう。バイオマスは、あらゆるセルロース又はリグノセルロース系材料のことを言い、セルロースを含む材料、及び所望によりさらにヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖及び／又は単糖を含む材料を含む。バイオマスは、バイオエネルギー作物、農業廃棄物、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙由来のスラッジ、庭ゴミ、木くず及び林業廃棄物などであるが、これらに限定されない。しかしながら、本発明の例示的態様においては、市販のフルクトースが発酵のための炭素及びエネルギー源として使用される。
【００６０】
特定の態様において、一酸化炭素を含む基質、好ましくは一酸化炭素を含むガス状基質が本発明の方法に使用される。ガス状基質は、産業プロセスの副産物として得られる廃ガスでも、燃焼機関（例えば自動車）の排ガスのような他の何らかの供給源から得られる廃ガスでもよい。一定の態様において、産業プロセスは、製鋼所のような鉄金属製品製造、非鉄製品製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、発電、カーボンブラック製造、アンモニア製造、メタノール製造及びコークス製造からなる群から選ばれる。これらの態様において、ＣＯ含有ガスは、それが大気中に放出される前に何らかの好都合な方法を用いて産業プロセスから捕捉されうる。一酸化炭素を含むガス状基質の組成によっては、それを発酵に導入する前に処理して何らかの望まざる不純物、例えばダスト粒子を除去するのも望ましいであろう。例えば、ガス状基質は公知の方法を用いてろ過又はスクラブすることができる。
【００６１】
本発明の他の態様において、一酸化炭素を含むガス状基質は、バイオマスのガス化から供給することもできる。ガス化のプロセスは、限られた空気又は酸素の供給下でバイオマスを部分燃焼することを含む。得られるガスは典型的には、主にＣＯ及びＨ２と、少量のＣＯ２、メタン、エチレン及びエタンを含む。例えば、サトウキビから砂糖、又はトウモロコシや穀物からデンプンといった食料の抽出及び加工中に得られるバイオマス副産物、又は林業によって生じる非食料バイオマス廃棄物をガス化すると、本発明で使用するのに適切なＣＯ含有ガスを製造することができる。
【００６２】
ＣＯ含有基質は典型的には主要割合のＣＯ、例えば、少なくとも約２０％〜約１００体積％のＣＯ、４０％〜９５体積％のＣＯ、４０％〜６０体積％のＣＯ、及び４５％〜５５体積％のＣＯを含有する。特定の態様において、該基質は、約２５％、又は約３０％、又は約３５％、又は約４０％、又は約４５％、又は約５０％のＣＯ、又は約５５％のＣＯ、又は約６０体積％のＣＯを含む。６％といった低いＣＯ濃度を有する基質も、特にＨ２及びＣＯ２も併存している場合、適切なこともある。
【００６３】
特定の態様において、ＣＯは、２，３−ブタンジオールの生成が起こるのに十分なレベルで供給される。特定の態様において、ＣＯは、少なくとも０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．５ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．７ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも０．９ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．２ｍｍｏｌ／ｇ／分；又は少なくとも１．５ｍｍｏｌ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される。当業者であれば、所要の取込み速度が達成されるようなＣＯ、特にガス状ＣＯの供給法はわかるであろう。しかしながら、例を挙げると、発酵培地中でのガスホールドアップを増大させるような因子は、微生物培養物による生成物への変換に利用できるＣＯの量を増大させることになろう。当業者であれば、ガスホールドアップの増大法はわかるであろう。しかしながら、非制限的例を挙げると、ガスホールドアップは、典型的には機械的手段、例えばＣＳＴＲ内での撹拌の増加によって増大される。さらに、ＣＯをより速い速度又は高い分圧で供給することも発酵ブロス中でのＣＯアベイラビリティを増大することになるだろう。
【００６４】
ガス状基質が何らかの水素を含有することは必要ではないが、これは２，３−ブタンジオールの製造に有害であるとは考えられていない。ガス状基質はいくらかのＣＯ２、例えば約１％〜約８０体積％、又は１％〜約３０体積％のＣＯ２も含有しうる。一態様において、それは約５％〜約１０体積％を含有する。別の態様において、ガス状基質は約２０体積％のＣＯ２を含有する。
【００６５】
典型的には、一酸化炭素は発酵反応にガス状態で添加される。しかしながら、本発明は、この状態での基質の添加に限定されるとみなされるべきでない。例えば、一酸化炭素は液体で供給することもできる。例えば、液体を一酸化炭素含有ガスで飽和した後、その液体をバイオリアクターに添加すればよい。これは標準的な方法論を用いて達成できる。一例を挙げると、マイクロバブル分散物発生装置（Ｈｅｎｓｉｒｉｓａｋら、Ｓｃａｌｅ−ｕｐ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｅｒｏｂｉｃ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ  １０１，Ｎｕｍｂｅｒ  ３／Ｏｃｔｏｂｅｒ，２００２）が使用できる。
【００６６】
本発明の一態様において、発明者らは、２，３−ブタンジオールは、第一の基質及び第二の基質の発酵によって製造できることを確認した。本発明の一つの特定の態様において、２，３−ブタンジオールは、第一の基質、例えばフルクトースのような炭水化物、及び第二の基質、好ましくはＣＯを含む基質が供給されると製造される。
【００６７】
更なる態様において、発明者らは、２，３−ブタンジオールは第一の基質によって製造され、それが完全消費されたら第一の基質は第二の基質と交換でき、２，３−ブタンジオールは製造され続けることを確認した。特定の態様において、第一の基質はフルクトースであり、フルクトースが完全消費されたらＣＯを含む基質を供給することができる。発明者らは、驚くべきことに、２，３−ブタンジオールは製造され続けることを見出した。発明者らはさらに、第一の基質と第二の基質は、必要であれば交代させることもできると考えている。例えば、第一の基質が入手できない場合、第一の基質のアベイラビリティが改良されるまで代替の基質を使用することができる。
【００６８】
培地
細菌の増殖及び基質からブタンジオールへの発酵を起こすためには、基質の他に適切な栄養培地もバイオリアクターに供給する必要があることは分かるであろう。栄養培地は、使用される微生物の増殖を可能にするのに十分なビタミン及びミネラルなどの成分を含有している。クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)の増殖に適切な嫌気性培地は当該技術分野で知られている。例えば、Ａｂｒｉｎｉら（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ，ｓｐ．Ｎｏｖ．，Ａｎ  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｆｒｏｍ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｍｏｎｏｘｉｄｅ；Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６１：３４５−３５１（１９９４））に記載されている。以下の“実施例”の項に適切な培地の更なる例を提供する。
【００６９】
発酵条件
発酵は、望ましくは、基質からブタンジオールへの発酵が起こるのに適切な条件下で実施されるべきである。考慮されるべき反応条件は、温度、培地流速、ｐＨ、培地の酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽リアクターを使用する場合）、植菌量、基質レベルが制限的にならないような最大の基質濃度及び基質のバイオリアクターへの導入速度、並びに生成物抑制を回避するための最大の生成物濃度などである。ＣＯを含む基質の嫌気的発酵に適切な発酵条件の例は、ＷＯ２００７／１１７１５７、ＷＯ２００８／１１５０８０、ＷＯ２００９／０２２９２５及びＷＯ２００９／０６４２００に詳述されている。前記特許の開示内容は引用によって本明細書に援用する。前記特許中に報告されている発酵条件は、本発明の方法に合わせて容易に変更できる。
【００７０】
発明者らは、ｐＨが制御されていない一態様において、２，３−ブタンジオール製造に悪影響はないようであることを確認した。
バイオリアクター
発酵反応は、本明細書中で先に述べたように、任意の適切なバイオリアクター内で実施できる。本発明の一部の態様において、バイオリアクターは、微生物が培養される第一の増殖リアクターと、増殖リアクターからのブロスが供給され、ほとんどの発酵生成物（例えば２，３−ブタンジオール）が製造される第二の発酵リアクターとを含みうる。
【００７１】
生成物回収
発酵によって、栄養培地中に、所望生成物（例えばブタンジオール）及び／又は一つ又は複数の副産物（例えばエタノール、アセテート及びブチレート）、並びに細菌細胞を含む発酵ブロスが得られる。好適な態様において、発酵生成物は２，３−ブタンジオールを含む。
【００７２】
２，３−ブタンジオール、又は２，３−ブタンジオール及び一つ又は複数のその他のアルコールを含有する混合アルコールストリームは、発酵ブロスから当該技術分野で公知の方法、例えば分別蒸留又は蒸発、パーベーパレーション、及び抽出発酵によって回収できる。アセテート及びブチレートを含む酸などの副産物も、当該技術分野で公知の方法を用いて発酵ブロスから回収できる。例えば、活性炭フィルターを使用する吸着システム又は電気透析が使用できる。
【００７３】
本発明の一定の態様において、２，３−ブタンジオール及び副産物は、発酵ブロスから、ブロスの一部をバイオリアクターから連続的に取り出し、微生物細胞をブロスから分離し（都合よくは、例えばろ過によって）、そして２，３−ブタンジオール並びに所望によりその他のアルコール及び酸をブロスから回収することによって回収される。アルコールは例えば蒸留によって都合よく回収でき、酸は例えば活性炭上への吸着によって回収できる。分離された微生物細胞は発酵バイオリアクターに戻すのが好ましい。アルコール及び酸の除去後に残った無細胞透過物も発酵バイオリアクターに戻すのが好ましい。バイオリアクターに戻す前に追加の栄養素（例えばビタミンＢ類）を無細胞透過物に加えて栄養培地を補充してもよい。
【００７４】
また、２，３−ブタンジオール及び／又は副産物の回収中にブロスのｐＨを調整した場合、そのｐＨは、バイオリアクターに戻す前に発酵バイオリアクター中のブロスのｐＨと類似したｐＨに再調整されるべきである。
【００７５】
次に、本発明を以下の非制限的実施例に関してさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００７６】
材料及び方法
【００７７】
【化２−１】
0005618995.tif 000003
【００７８】
【化２−２】
0005618995.tif 000004
【００７９】
【化２−３】
0005618995.tif 000005
【００８０】
Ｎａ２Ｓｘの製造
５００ｍｌのフラスコにＮａ２Ｓ（９３．７ｇ、０．３９ｍｏｌ）及び２００ｍｌのＨ２Ｏを入れた。該溶液を塩が溶解するまで撹拌し、硫黄（２５ｇ、０．１ｍｏｌ）を一定Ｎ２流下で加えた。室温で２時間撹拌後、透明な赤みがかった褐色液体となった“Ｎａ２Ｓｘ”溶液（［Ｎａ］に関しては約４Ｍ及び硫黄に関しては約５Ｍ）をＮ２でパージした血清ボトルに移し、アルミホイルで包んだ。
【００８１】
Ｃｒ（II）溶液の製造
１Ｌの三つ口フラスコに気密性の入口と出口を取り付け、不活性ガス下での作業とその後の適切な貯蔵フラスコへの所望生成物の移し替えができるようにした。該フラスコに、ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（４０ｇ、０．１５ｍｏｌ）、亜鉛顆粒［２０メッシュ］（１８．３ｇ、０．２８ｍｏｌ）、水銀（１３．５５ｇ、１ｍＬ、０．０６７６ｍｏｌ）及び５００ｍＬの蒸留水を入れた。Ｎ２で１時間洗浄(flushing)後、混合物を約８０℃に温めて反応を開始させた。一定Ｎ２流下で２時間撹拌後、混合物を室温に冷却し、さらに４８時間連続撹拌した。その時間までに反応混合物は濃青色溶液に変化した。該溶液をＮ２でパージした血清ボトルに移し、後で使うために冷蔵庫に保管した。
【００８２】
細菌
使用されたクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)は、Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ（ＤＳＭＺ）に寄託され、受入番号１９６３０を割り当てられたものである。
【００８３】
サンプリング及び分析手順
培地サンプルは、発酵リアクター（例えばＣＳＴＲ又は血清ボトル）から発酵の過程中周期的に採取した。培地採取のたびごとに、リアクターにガスが出入りしないように注意した。
【００８４】
ＨＰＬＣ：
ＨＰＬＣシステム  Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ。移動相：０．００２５Ｎ  硫酸。流速及び圧力：０．８００ｍＬ／分。カラム：Ａｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ；カタログ番号９６４８、１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ。カラム温度：６０℃。検出器：屈折率。検出器の温度：４５℃。
【００８５】
サンプル調製法：
４００μＬのサンプル及び５０μＬの０．１５Ｍ  ＺｎＳＯ４及び５０μＬの０．１５Ｍ  Ｂａ（ＯＨ）２をエッペンドルフ管に入れる。該管を１２，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離する。２００μＬの上清をＨＰＬＣバイアルに移し、５μＬをＨＰＬＣ機器に注入する。
【００８６】
ヘッドスペース分析：
測定は、二つのチャンネルが設備されたＶａｒｉａｎ  ＣＰ−４９００  マイクロＧＣで実施した。チャンネル１は、１０ｍのＭｏｌ−ｓｉｅｖｅカラムで、７０℃、２００ｋＰａのアルゴン及びバックフラッシュ時間４．２秒で運転された。一方、チャンネル２は、１０ｍのＰＰＱカラムで、９０℃、１５０ｋＰａのヘリウム及びバックフラッシュなしで運転された。両チャンネルのインジェクター温度は７０℃であった。ランタイムは１２０秒にセットされたが、興味あるすべてのピークは通常１００秒以内に溶出された。ＣＯ取込み比は、細胞１グラム（乾燥重量−下記参照）あたりのＣＯ消費を計算することによって決定された。
【００８７】
細胞密度：
細胞密度は、規定分量の発酵ブロス中の細菌細胞を数えることによって決定した。あるいは、サンプルの吸光度を６００ｎｍで測定し（分光光度計）、乾燥重量を公表手順に従って計算することによって決定した。
【００８８】
硫化金属溶液１：
約９５０ｍＬの溶液Ａを１Ｌの発酵槽に移し、窒素を散布した。Ｈ３ＰＯ４（８５％溶液、１．５ｍＬ）を加え、濃ＮＨ４ＯＨ（水溶液）を用いてｐＨを５．３に調整した。レサズリン（２ｇ／Ｌ溶液１ｍＬ）を加え、溶液にＮ２を散布した。塩化クロム（II）を、溶液のＯＲＰが約−１５０ｍＶに下がるまで加えた。１０倍溶液Ｃを加えた後、多硫化ナトリウム（４．３Ｍ溶液１．４４ｍＬ又は６Ｍ溶液１ｍＬ）を加え、溶液にＮ２を散布した。
【００８９】
実施例１Ａ：発酵による２，３−ブタンジオールの製造
クロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)を用いた基質の発酵的変換をＣＳＴＲ反応器内で２週間にわたって実施し、周期的にモニターした。ＣＳＴＲ実験に使用した培地は、表Ｅに掲載されている成分に従って調製した。リン酸塩混合物は、０．６５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４と１５．３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４からなるものであった。リン酸、アンモニウム塩及び塩酸システインなどのその他すべての成分を８００ｍｌの水に混合してから緩衝塩を溶液に加えた。このような手順で進めることにより、確実にｐＨが約６．５を上回り、培地成分の沈殿が防止された。溶液を希釈して１Ｌにし、沸騰するまで加熱し、一定流のＮ２ガス下で室温にまで放冷することによって嫌気性にした。冷却したら、溶液を最終ｐＨ５．３に調整し、ビタミンＢを加えた。嫌気性は実験の間ずっと維持された。炭水化物（５ｇ／Ｌフルクトース）を基本培地調製物に加えた。培地溶液を発酵槽に導入し、所望により各ＣＯ含有ガスを実験開始時から、又は所定間隔の後に散布した。これらの実験中、ｐＨは５．５に維持されるようＮａＯＨ水溶液を加えることによって調節した。活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を反応器に５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。反応器の温度は３７℃に維持され、撹拌速度は４００ｒｐｍであった。
【００９０】
結果：
当初、発酵はフルクトースを基質として含有していたため、酢酸、エタノール及び２，３−ブタンジオールが生成した。時間経過とともにフルクトースが消費されたので、ＣＯ（９５％ＣＯ、５％ＣＯ２）を含むガスストリームを培地に散布した。培地はｐＨ５．５に維持された（表１）。炭水化物が消費されても上記生成物の濃度は増大しており、ＣＯが２，３−ブタンジオールを含む生成物の製造に使用されたことを明らかに示していることに注意すべきである。
【００９１】
【表１】
0005618995.tif 000006
【００９２】
実施例１Ｂ：発酵による２，３−ブタンジオールの製造
更なる実験で、クロストリジウム・オートエタノゲナムによる基質の変換をＣＳＴＲ反応器内で１０日間にわたって実施し、周期的にモニターした。この場合、発酵槽と培地は実施例１Ａに従って用意したが、基質は連続散布された模擬製鋼所ガス（７０％ＣＯ、１％Ｈ２、１４％Ｎ２、１５％ＣＯ２）のみで、培地のｐＨは５．５で一定に保たれた（表２）。基質の変換はここでも酢酸、エタノール及び２，３−ブタンジオールをもたらし、発酵開始時に炭水化物基質がなくても酢酸、エタノール及びブタンジオールが製造されることを示していた。
【００９３】
【表２】
0005618995.tif 000007
【００９４】
実施例２：発酵による２，３−ブタンジオールの製造
更なる実験で、クロストリジウム・オートエタノゲナムによる基質の変換をＣＳＴＲ反応器内で３日間にわたって実施し、周期的にモニターした。この場合、発酵槽と培地は実施例１Ａに記載されたものに従って用意したが、基質は連続散布された模擬製鋼所ガス（７０％ＣＯ、１％Ｈ２、１４％Ｎ２、１５％ＣＯ２）とフルクトース（１０ｇ／Ｌ）で、培地のｐＨは５．５で一定に保たれた（表３）。基質の変換はここでも酢酸、エタノール及び２，３−ブタンジオールをもたらした。
【００９５】
【表３】
0005618995.tif 000008
【００９６】
実施例１Ａ、１Ｂ及び２で概説した発酵槽実験間の各実験終了時におけるアセテート、エタノール及び２，３−ブタンジオールの最終濃度も比較した（注、これらの結果は表１〜３で測定された最終濃度の記述であり、比較のために表４にまとめた）。
【００９７】
【表４】
0005618995.tif 000009
【００９８】
実施例３：発酵による２，３−ブタンジオールの製造
培地条件が２，３−ブタンジオールの製造にどのように影響しうるかを確かめるために、選択可能な（選択肢のある）緩衝液を含む培地入りの血清ボトルを用意し、発酵生成物を実験終了時に分析した（表５）。培養は２３４ｍｌの密封血清ボトル中で実施した。各ボトルは５０ｍｌの上記培地（表Ｅ）を含有し、所望により酢酸緩衝液（０．０２Ｍ）又はクエン酸緩衝液（０．０２Ｍ）のいずれかで緩衝され、ｐＨ５．３に調整された。各血清ボトルの１８４ｍｌのヘッドスペースを最初にＮ２で、次いで９５％ＣＯ、５％ＣＯ２又は７０％ＣＯ、１５％ＣＯ２、１４％Ｎ２、１％Ｈ２のいずれかで３０ｐｓｉの過剰圧にまで満たした。各ボトルに２ｍｌのクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を植菌した。振盪培養器を使用し、反応温度は３７℃に維持した。
【００９９】
ここでも、実験に使用された緩衝液にかかわりなく、２，３−ブタンジオールが製造されたことは明白である。さらに、血清ボトルはｐＨ制御されなかったので、生成物はｐＨ制御が限定的（又はなし）でも製造されるようであることにも注意すべきである。
【０１００】
【表５】
0005618995.tif 000010
【０１０１】
実施例４：ＣＳＴＲ内でのバッチ発酵
約１．３Ｌの溶液Ａを２Ｌの発酵槽に移し、窒素を散布した。レサズリン（２ｇ／Ｌ溶液１．３５ｍＬ）を加えた。Ｈ３ＰＯ４（８５％溶液、２．０２５ｍＬ）を加え、濃ＮＨ４ＯＨ（水溶液）を用いてｐＨを５．３に調整した。塩化クロム（II）を、溶液のＯＲＰが約−１５０ｍＶに下がるまで加えた。多硫化ナトリウム（４．３Ｍ溶液６．０７ｍｌ）を加え、濃ＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調整した。溶液にＮ２を１時間散布した後、硫化金属溶液１（１５０ｍｌ）及び溶液Ｂ（１５ｍｌ）を加えた。該溶液にＮ２を、次いでＣＯ含有ガス（３％Ｈ２；３０％Ｎ２；４７％ＣＯ；２０％ＣＯ２）を散布し、その後、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を約５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。ガス流速は、高いＣＯ取込み比を維持するために、微生物培養物がＣＯ制限されないように調整した。発酵の結果を表６に示す。
【０１０２】
【表６】
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【０１０３】
７．５日間の総２，３−ブタンジオール蓄積はおよそ７．５ｇ／Ｌであった。２，３−ブタンジオールは、低いＣＯ取込み比速度では低レベルで製造されることが確認されている。しかしながら、ＣＯ取込み速度を０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分より高く維持できるようにガスを供給すると、２，３−ブタンジオールの生産性は著しく増加する。本例では、ＣＯ取込み比は数日間にわたって平均０．８ｍｍｏｌ／ｇ／分に維持され、１，３−ブタンジオールは１ｇ／Ｌを超える速度で製造されている。
【０１０４】
実施例５：ＣＳＴＲ内でのバッチ発酵
約１．３Ｌの溶液Ａを２Ｌの発酵槽に移し、窒素を散布した。Ｈ３ＰＯ４（８５％溶液、２．０２５ｍＬ、３０ｍＭ）を加え、濃ＮＨ４ＯＨ（水溶液）を用いてｐＨを５．３に調整した。溶液Ｂ（１３．５ｍｌ）を加え、溶液にＮ２を散布した。塩化クロム（II）を、溶液のＯＲＰが約−１５０ｍＶに下がるまで加えた。レサズリン（２ｇ／Ｌ溶液１．３５ｍＬ）を加えた。多硫化ナトリウム（６Ｍ溶液２．８５ｍｌ）を加え、溶液にＮ２を１２時間散布した後、ＣＯ含有ガス（１％Ｈ２；１４％Ｎ２；７０％ＣＯ；１５％ＣＯ２）に切り替えた。濃ＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調整した後、硫化金属溶液１（１５０ｍｌ）を加えた。溶液にＣＯ含有ガスをさらに３０分間散布した後、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を約５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。ここでも、ガス流速は、高いＣＯ取込み比を維持するために、微生物培養物がＣＯ制限されないように調整した。発酵の結果を表７に示す。
【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
約６日後の総２，３−ブタンジオールは５ｇ／Ｌであった。ここでも、高いＣＯ取込み比の結果、少なくとも０．５ｇ／Ｌ／日という著しく高い２，３−ブタンジオールの生産性がもたらされている。
【０１０７】
実施例６：ＣＳＴＲ内でのバッチ発酵
約１．３Ｌの溶液Ａを１．５Ｌの発酵槽に移し、窒素を散布した。Ｈ３ＰＯ４（８５％溶液、２．２５ｍＬ）を加え、濃ＮＨ４ＯＨ（水溶液）を用いてｐＨを５．３に調整した。溶液Ｂ（１５ｍｌ）を加え、溶液にＮ２を散布した。塩化クロム（II）を、溶液のＯＲＰが約−１５０ｍＶに下がるまで加えた。レサズリン（２ｇ／Ｌ溶液１．５ｍＬ）を加えた。多硫化ナトリウム（３Ｍ溶液１．５ｍｌ）を加え、溶液にＮ２を１時間散布した。ＦｅＣｌ２（３．７５ｍＬ）、ＣｏＣｌ２（１．８７５ｍＬ）、ＮｉＣｌ２（１．８７５ｍＬ）、Ｈ３ＢＯ３（０．３７５ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４（０．３７５ｍｌ）、ＭｎＣｌ２（０．３７５ｍｌ）、Ｎａ２ＷＯ４（０．３７５ｍｌ）及びＺｎＣｌ２（０．１８７５ｍｌ）の０．１Ｍ溶液を加え、溶液にＣＯ含有ガス（５０％Ｈ２；３２％ＣＯ；４％ＣＯ２；３２％ＣＨ４）を散布した。濃ＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調整した後、溶液Ｃ（１５０ｍｌ）を加えた。溶液にＣＯ含有ガスをさらに３０分間散布した後、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を約５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。ガス流速は、高いＣＯ取込み比を維持するために、微生物培養物がＣＯ制限されないように調整した。発酵の結果を表８に示す。
【０１０８】
【表８】
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【０１０９】
４日後の総２，３−ブタンジオール濃度は約３ｇ／Ｌであった。達成された速度は前の発酵（実施例４及び５）より低いが、基質ストリームは相当部分の水素を含む。結果は、２，３−ブタンジオールは混合ＣＯ／Ｈ２基質を用いても製造されることを示している。
【０１１０】
実施例７：連続撹拌槽リアクター内での連続発酵
培地をｐＨ５．５で次のように調製した。溶液Ｄの、システイン−ＨＣｌ以外の全成分を４００ｍｌの蒸留水中に混合した。この溶液を沸騰するまで加熱し、一定流の９５％ＣＯ、５％ＣＯ２ガス下で室温にまで放冷することによって嫌気性にした。冷却したら、システイン−ＨＣｌを加え、溶液のｐＨを５．５に調整した後、体積を１０００ｍｌにした。嫌気性は実験の間ずっと維持された。
【０１１１】
５リットルのバイオリアクターに、上記のようにして調製されたＬＭ３３培地４．９Ｌを入れた。ガスを大気圧のＣＯ含有ガス（１％Ｈ２；１４％Ｎ２；７０％ＣＯ；１５％ＣＯ２）に切り替えた後、１００ｍｌのクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を植菌した。バイオリアクターを３７℃に維持し、培養開始時は２００ｒｐｍで撹拌した。増殖期の間、撹拌を４００ｒｐｍに増大した。ｐＨを５．５に調整し、５ＭのＮａＯＨの自動添加によって維持した。新鮮な嫌気性培地をバイオリアクターに連続的に添加し、バイオリアクター内の規定のバイオマス及びアセテートレベルを維持した。２，３−ブタンジオールの生産性を表９に示す。
【０１１２】
【表９】
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【０１１３】
連続運転の最初の８９日間、発酵槽はＣＯ制限条件下で運転されたので、最少の２，３−ブタンジオールしか製造されなかった。しかしながら、８８日目頃、ＣＯ取込み比が増大するようにガス流を増加させた。この段階で、２，３−ブタンジオールの生産性は少なくとも１．２ｇ／Ｌ／日に著しく増大した。９２日目頃、ガス流を培養物の取込み比が約０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分に低下するように減少させたところ、２，３−ブタンジオールの生産性も低下した。しかしながら、平均の取込み比が約０．４ｍｍｏｌ／ｇ／分の場合でさえ、２，３−ブタンジオールの生産性は少なくとも０．５ｇ／Ｌ／日を維持していた。
【０１１４】
実施例８：ＣＳＴＲ内でのバッチ発酵
約１．３Ｌの溶液Ａを２Ｌの発酵槽に移し、窒素を散布した。Ｈ３ＰＯ４（８５％溶液、１．５ｍＬ）を加え、濃ＮＨ４ＯＨ（水溶液）を用いてｐＨを５．３に調整した。溶液Ｂ（１５ｍｌ）を加え、溶液にＮ２を散布した。塩化クロム（II）を、溶液のＯＲＰが約−１５０ｍＶに下がるまで加えた。多硫化ナトリウム（３Ｍ溶液１ｍｌ）を加え、溶液にＮ２を１２時間散布した。ＦｅＣｌ２（３．７５ｍＬ）、ＣｏＣｌ２（１．８７５ｍＬ）、ＮｉＣｌ２（１．８７５ｍＬ）、Ｈ３ＢＯ３（０．３７５ｍｌ）、Ｎａ２ＭｏＯ４（０．３７５ｍｌ）、ＭｎＣｌ２（０．３７５ｍｌ）、Ｎａ２ＷＯ４（０．３７５ｍｌ）及びＺｎＣｌ２（０．２ｍｌ）の０．１Ｍ溶液を加え、溶液にＣＯ含有ガス（１％Ｈ２；１４％Ｎ２；７０％ＣＯ；１５％ＣＯ２）を散布した。
【０１１５】
レサズリン（２ｇ／Ｌ溶液１ｍＬ）を加えた。濃ＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調整し、溶液にＣＯ含有ガスをさらに３０分間散布した後、活発に増殖中のクロストリジウム・オートエタノゲナム培養物を約５％（ｖ／ｖ）のレベルで植菌した。表１０に、約２週間の運転後、発酵槽に蓄積された２，３−ブタンジオール生成物を示す。ＣＯ取込み比速度は培養物の生存度に対して補正されている。培養物の生存度はＷＯ２００９／０２２９２５に記載されている方法を用いて決定した。前記特許は引用によって本明細書に援用する。
【０１１６】
【表１０】
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【０１１７】
１３〜１４日の２４時間にわたって、ＣＯ取込み比は約０．５ｍｍｏｌ／ｇ／分に維持され、２，３−ブタンジオールの生産性は０．６ｇ／Ｌ／日であった。
実施例９：ＬＺ１５６０における２，３−ブタンジオール製造の遺伝子調節
サンプルは三つの発酵から採取し、２，３−ブタンジオール製造中の遺伝子発現を調べた。一つのサンプルは、エタノール及び２，３−ブタンジオールを含む生成物を製造中の、実施例８に記載された１３日目のバッチ発酵から採取した。このサンプルを以下の結果ではＲ１２と表す。第二のサンプルは、エタノールと２，３−ブタンジオールの両方を製造しているバッチ発酵から採取した。このサンプルを結果ではＲ１１と表す。第三のサンプル（Ｒ２）は、実施例７の１〜８９日目と類似の条件下で運転中の連続発酵から採取した。微生物培養物はＣＯを制限され、発酵ブロスは、安定なアセテート濃度約１３ｇ／Ｌ、エタノール濃度１ｇ／Ｌ未満及びわずかな量の２，３−ブタンジオールを含んでいた。リアルタイムＰＣＲを用いて、遺伝子がＲ２と比べてアップレギュレートされているか又はダウンレギュレートされているかどうかを決定した。
【０１１８】
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ合成手順：
全ＲＮＡは、約２．５×１０９個の細菌細胞からＡｕｒｕｍ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｆａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて単離した。カラム上でＤＮアーゼをＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  セット（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて消化した。全ＲＮＡは分光光度計を用いて定量化し、その純度（Ａ２６０／２８０比によって測定）を決定した後、ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  合成キット（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。
【０１１９】
リアルタイムＰＣＲ手順：
リアルタイムＰＣＲ用のプライマーは、ＬａｎｚａＴｅｃｈ社が所有権を有する社内ゲノム配列を基にしたフリーウェアのＰｒｉｍｅｒ３を用いて設計した。リアルタイムＰＣＲ反応混合液として、１２．５μＬの２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏｒａｄ社）、各１．５μＬの１μＭフォワード及びリバースプライマー、５μＬの１０倍希釈ｃＤＮＡテンプレート、及び総体積２５μＬになるまで滅菌水を含有する混合液を構築した。該混合液を９５℃で３分間加熱し、その後、９５℃１５秒、５５℃１５秒及び７２℃３０秒を４０サイクル実施した。プライマーの二量体化又は増幅の他の人為的影響を検出するために、リアルタイムＰＣＲ終了直後、融解曲線分析を実施した（１℃／秒で５８℃〜９５℃を３８サイクル）。全反応とも三重に実施した。遺伝子発現の定量は、ＭｙｉＱ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて実施し、リアルタイムデータはｉＱ５光学系ソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ社）を用いて分析した。
【０１２０】
結果：
リアルタイムＰＣＲアッセイから得られた生のＣｔ値を、相対遺伝子発現及び標準誤差とともに表１１に示す。ＲＮＡポリメラーゼのベータ鎖（ｒｐｏβ）を遺伝子発現のノーマライゼーションのための参照遺伝子として選択した。比較ΔＣＴ法を用いた相対定量を使用して２，３ＢＤＨの相対遺伝子発現を計算した。アセテート産生培養物（Ｒ２）を全分析におけるキャリブレーター（参照標準）として選択した。
【０１２１】
【表１１】
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【０１２２】
本研究で示されたリアルタイムＰＣＲデータから、２，３−ブタンジオールの遺伝子発現は酢酸生成培養物（Ｒ２）と比べて溶媒生成(solventogenic)培養物（Ｒ１１／Ｒ１２）で著しく高いことが分かる。細胞収穫時に約０．６ｇ／Ｌ／日の２，３−ブタンジオールを製造していたＲ１２の微生物培養物は、Ｒ２に比べて最高の遺伝子アップレギュレーション（７．６４±０．８倍）を示している。これに続くのがＲ１１で、細胞収穫時に１．５３ｇ／Ｌの総２，３−ブタンジオールを製造し、４．７５±１．８倍の遺伝子アップレギュレーションを示している。
【０１２３】
本発明をある好適な態様に関して本明細書中で説明してきたが、それは過度の実験をせずとも読者が本発明を実施できるようにするためである。当業者であれば、本発明は、具体的に記載されたもの以外にも、変形及び変更が可能であることは分かるであろう。本発明はすべてのそのような変形及び変更も含むことは理解されるはずである。さらに、表題、見出しなどは、本文献に対する読者の理解を増進するために提供されるものであって、本発明の範囲を制限するものとして読まれるべきでない。
【０１２４】
以上及び以下で引用されたすべての出願、特許及び出版物（もしあるとすれば）の全開示内容は引用によって本明細書に援用する。
本明細書中での何らかの先行技術への言及は、その先行技術が米国又は世界中のあらゆる国において共通の一般的知識の一部を形成していることの承認又は何らかの形態の示唆ではなく、そのように受け取られるべきでもない。
【０１２５】
本明細書及び以下の請求項の全体を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、“含む(comprise, comprising)”などの用語は、排他的意味とは反対に、包括的意味、すなわち“含むが、限定されない”の意味と解釈されるものとする。
以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
微生物発酵によるブタンジオールの製造法であって、
ａ．ＣＯを含む基質を供給し；
ｂ．一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させてブタンジオールを製造する
ことを含む方法。
［請求項２］
ブタンジオールが２，３−ブタンジオールである、請求項１に記載の方法。
［請求項３］
発酵による２，３−ブタンジオール製造の効率を増大させる方法であって、
ａ．ＣＯを含む基質を供給し；
ｂ．一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させて２，３−ブタンジオールを製造する
ことを含む方法。
［請求項４］
ＣＯを含む基質が、２，３−ブタンジオールが製造されるほど十分なレベルで供給される、請求項２又は３に記載の方法。
［請求項５］
ＣＯを含む基質が、培養物による少なくとも０．４ｍｍｏｌＣＯ／ｇ乾燥細菌細胞重量／分のＣＯ取込み比速度が維持されるように供給される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項６］
前記基質が、少なくとも０．６ｍｍｏｌＣＯ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される、請求項５に記載の方法。
［請求項７］
前記基質が、少なくとも０．８ｍｍｏｌＣＯ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される、請求項５又は６に記載の方法。
［請求項８］
前記基質が、少なくとも０．８ｍｍｏｌＣＯ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項９］
前記基質が、少なくとも１．０ｍｍｏｌＣＯ／ｇ／分の取込み比速度が維持されるように供給される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１０］
微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造法であって、該方法は、
ａ．基質を供給し；
ｂ．一つ又は複数の２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む一つ又は複数の微生物の培養物を含有するバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させ；
ｃ．２，３−ブタンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子を、当該微生物によって２，３−ブタンジオールが製造されるようにアップレギュレートする
ことを含む方法。
［請求項１１］
前記基質がＣＯを含む、請求項１１に記載の方法。
［請求項１２］
ＣＯを含む基質が、２，３−ブタンジオールが製造されるほど十分なレベルで供給される、請求項１１に記載の方法。
［請求項１３］
ＣＯを含む基質が、培養物による少なくとも０．４ｍｍｏｌＣＯ／ｇ乾燥細菌細胞重量／分のＣＯ取込み比速度が維持されるように供給される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１４］
一つ又は複数の微生物がクロストリジウム・オートエタノゲナム(Clostridium autoethanogenum)である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
［請求項１５］
ＣＯを含む基質がガス状である、請求項１〜９又は１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１６］
ＣＯを含む基質が、少なくとも約１５％〜約１００体積％のＣＯを含む、請求項１５に記載の方法。
［請求項１７］
ＣＯを含む基質が、産業プロセスからの副産物として得られるガスを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
［請求項１８］
ＣＯを含む基質が製鋼所から得られるガスを含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
［請求項１９］
微生物発酵による２，３−ブタンジオールの製造法であって、
ａ．基質を供給し；
ｂ．クロストリジウム・オートエタノゲナムの培養物を含むバイオリアクター内で前記基質を嫌気的に発酵させて２，３−ブタンジオールを製造する
ことを含む方法。
［請求項２０］
前記基質が一つ又は複数の炭水化物を含む、請求項１９に記載の方法。
［請求項２１］
一つ又は複数の炭水化物を含む基質を供給するステップの前、同時、又は後にＣＯを含む基質を供給する追加のステップを含む、請求項２０に記載の方法。
［請求項２２］
ＣＯを含む基質を供給するステップと、一つ又は複数の炭水化物を含む基質を供給するステップとを交互に行うことを含む、請求項２１に記載の方法。
［請求項２３］
請求項２〜２２のいずれか１項に記載の方法によって製造される２，３−ブタンジオール。
【図１】
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