(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の皮膚創傷の閉鎖を増加させるための医薬組成物であって、
δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、及び薬学的に許容される水性担体を含み、ここで、前記担体がCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない、
ここで、前記δ−PKC活性化剤が、インスリン及びインスリンアナログからなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記α−PKC阻害剤が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５に示したアミノ酸配列、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有し、そのカルボキシ末端でアミド化されている配列番号２５に示したアミノ酸配列、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される少なくとも１つである、医薬組成物。
【請求項２】
前記インスリンアナログが、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルジン、ビスファチン、及びL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記インスリンが、ヒトインスリン、ウシインスリン、及びブタインスリンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記インスリンが、組換え発現させられている、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記δ−PKC活性化剤がインスリンであり、前記α-PKC阻害剤が、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列からなるペプチドであり、約0.0001ユニット/L〜約0.1ユニット/Lのインスリン及び約1μM〜約100μMのペプチドを含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
0.0001ユニット/Lのインスリン及び1μMのペプチドを含む、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない前記薬学的に許容される担体が、0.2g/LのKCl、0.2g/Lの無水KH2PO4、8g/LのNaCl、及び1.15g/Lの無水Na2HPO4を含む水性担体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
動物の皮膚創傷の部位での炎症を減少させるための医薬組成物であって、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、及び薬学的に許容される水性担体を含み、前記担体がCa2+及びMg2+カチオンを含んでおらず、
ここで、前記δ−PKC活性化剤が、インスリン及びインスリンアナログからなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記α−PKC阻害剤が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５に示したアミノ酸配列、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有し、そのカルボキシ末端でアミド化されている配列番号２５に示したアミノ酸配列、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される少なくとも１つである医薬組成物。
【請求項９】
前記インスリンアナログが、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルジン、ビスファチン、及びL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記インスリンが、ヒトインスリン、ウシインスリン、及びブタインスリンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記インスリンが、組換え発現させられている、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記δ−PKC活性化剤がインスリンであり、前記α−PKC阻害剤が、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列からなるペプチドであり、約0.0001ユニット/L〜約0.1ユニット/Lのインスリン及び約1μM〜約100μMのペプチドを含む請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
0.0001ユニット/Lのインスリン及び1μMのペプチドを含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない前記薬学的に許容される担体が、0.2g/LのKCl、0.2g/Lの無水KH2PO4、8g/LのNaCl、及び1.15g/Lの無水Na2HPO4を含む水性担体である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
動物上の創傷の閉鎖を増加させるための医薬組成物であって、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、及び薬学的に許容される水性担体を含み、前記担体が、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでおらず、
ここで、前記創傷が、糖尿病性潰瘍創傷、肢端舐性創傷、肉芽創傷、外科創傷、慢性日光膿瘍創傷、及び骨髄炎創傷からなる群から選択される少なくとも１つであり、そして、
前記δ−PKC活性化剤が、インスリン及びインスリンアナログからなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記α−PKC阻害剤が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５に示したアミノ酸配列、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有し、そのカルボキシ末端でアミド化されている配列番号２５に示したアミノ酸配列、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される少なくとも１つである医薬組成物。
【請求項１６】
前記インスリンアナログが、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルジン、ビスファチン、及びL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記インスリンが、ヒトインスリン、ウシインスリン、及びブタインスリンからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記インスリンが、組換え発現させられている、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記δ−PKC活性化剤がインスリンであり、前記α-PKC阻害剤が、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列からなるペプチドであり、約0.0001ユニット/L〜約0.1ユニット/Lのインスリン及び約1μM〜約100μMのペプチドを含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
0.0001ユニット/Lのインスリン及び1μMのペプチドを含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない前記薬学的に許容される担体が、0.2g/LのKCl、0.2g/Lの無水KH2PO4、8g/LのNaCl、及び1.15g/Lの無水Na2HPO4を含む水性担体である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権）
本出願は、2007年7月30日に出願された、その全内容が参考として本明細書で援用される「医薬組成物」と題する米国特許仮出願第60/962,706号明細書に対する優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、創傷の治癒を加速する、皮膚創傷の閉鎖を増加させる、及び皮膚創傷の部位での炎症を低下させるための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
皮膚は、別個の層、つまり各々が相違する細胞特性及び生理学的有意性を有する表皮、真皮及び皮下組織として構造化された複雑な組織である（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００４】
表皮は、その中では増殖及び分化を起こす細胞が厳密に区分化されている重層扁平上皮である（非特許文献１）。正常な生理的状態では、増殖は、基底膜に付着する基底細胞に限定される。分化は、基底細胞が基底膜への付着を消失し、DNA合成を停止し、一連の形態学的及び生化学的変化を受ける空間的工程である。最終的成熟化工程は、皮膚の保護障壁を形成する角化層の生成である（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００５】
真皮は、主としてマトリックス線維から構成され、様々な細胞タイプを含む。さらに、全ての皮膚付属器、つまり微小血管系、汗腺及び皮脂腺、感覚神経及び毛嚢は、真皮に局在する。真皮は、皮膚に栄養を与えことを支持する役割、表皮及び身体の他の部分からのシグナルが外層に到達する経路の維持に貢献すると考えられてきた（非特許文献５、非特許文献４）。皮下組織は、皮下脂肪層としても公知である、主として脂肪細胞からなる皮膚の最深層である。近年まで、この層は、外部温度変化から絶縁し、さらに皮膚の上層に対する機械的支持する役割を有すると考えられてきた（非特許文献６、非特許文献７）。
【０００６】
皮膚内では、重層上皮の継続的回復は、非生存性の角化した扁平上皮の産生をもたらす連続的かつ高度に特化された工程によって維持され、それは、分泌された層状体由来の脂質と共に身体の保護水障壁を構成する。増殖性基底細胞は、表皮特異的基底膜に付着する。ケラチノサイトの分化工程は、基底膜との細胞接触の消失と密接に結び付いている。基底細胞がより表在性の有棘層内へ遊走するにつれて、それらは増殖能力を消失する。剛性角化膜の形成が続くその後の顆粒細胞区画への成熟には、細胞内オルガネラの自己分解及びプログラムされた細胞死が結び付いており、それは、成熟扁平上皮を生じさせる（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。
【０００７】
開放皮膚創傷は、通常は６つの主要要素：（ｉ）炎症、（ｉｉ）線維芽細胞増殖、（ｉｉｉ）血管増殖、（ｉｖ）結合組織合成、（ｖ）上皮形成、及び（ｖｉ）創傷収縮を含む工程によって治癒する。創傷治癒は、これらの成分が個別又は全体としてのいずれかで適正に機能しない場合には損なわれる。栄養不良、感染、薬理学的物質（例、アクチノマイシン及びステロイド剤）、高齢及び糖尿病を含む多数の因子が創傷治癒に影響を及ぼす可能性がある（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。
【０００８】
糖尿病の一般的形態である真性糖尿病は、損傷したインスリンのシグナル伝達、上昇した血漿中グルコース及び数種の特徴的組織が関係する慢性合併症を発生する素因によって特徴付けられる。真性糖尿病の全ての慢性合併症の中でも、足部潰瘍化をもたらす創傷治癒の障害については、極めてわずかしか研究されていない（非特許文献１４、非特許文献１５）。それでも糖尿病患者における皮膚潰瘍化は、膨大な人的及び財政的費用を要する。さらに、足部潰瘍及びそれに続く下肢の切断術は、糖尿病患者の入院の中で最も一般的な原因である。糖尿病では、創傷治癒工程が損なわれ、治癒した創傷は低下した創傷強度を特徴とする（非特許文献１６）。組織修復における欠陥は、ニューロパシー、血管疾患及び感染症を含む幾つかの因子に関連付けられてきた（非特許文献１７、非特許文献１８）。しかし、それにより異常なインスリンのシグナル伝達と関連した糖尿病状態が創傷治癒を損なわせ、皮膚の生理学的機能を変化させる追加の機序については解明されていない。さらに、年齢ならびに例えば糖尿病及び肥満症などの慢性疾患の発生によって影響を受ける身体の様々な部分では外科手技後の創傷治癒という一般的問題もある。外科的設定では、患者の３分の１は、それらの生理的状態ならびに創傷部位での併発感染症の発生に帰せられる創傷治癒の遅延に悩まされている（非特許文献１９）。
【０００９】
皮膚創傷は、ウマ、イヌ、ネコ及び家畜を含む動物において一般的に見出される。動物では、創傷は、創傷管理を必要とする多種多様な一般的症状を有する。このため、動物皮膚科学は、獣医学において最も急速に拡大しつつある分野の１つである。
【００１０】
一般に、これらの創傷の多くは、二次癒合によって治癒する。この工程は、四肢が関与する場合は特に長期間を要する。動物、ならびにヒトでは、創傷治癒工程は、例えば汚染、感染もしくは裂開などの因子によって悪化させられることがあり、それは治癒時間の延長もしくは不適切な創傷閉鎖を引き起こすことが多い（非特許文献１５、非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）。
【００１１】
典型的には、創傷治癒は、新規表皮及び肉芽組織形成の誘導（活性化）ならびに炎症の減少を必要とする。これらの工程は、動物においては、例えば術後創傷、肢端舐性潰瘍、糖尿病性潰瘍などの様々な急性及び慢性創傷の治癒のために不可欠でもある。ウマは、線維芽細胞の増殖及び血管形成が病理的に増加する肉芽組織の過剰によって誘発される慢性創傷（例えば、「肉芽（proud flesh）」）を患う。この異常な肉芽組織は、表皮の高さを越えて過剰に増殖し、隣接皮膚の接近を物理的に遮断し、それは、さもなければその領域の上方で増殖するであろう。この制御されない線維芽細胞の増殖のメカニズムは、未知である。利用できる最適な治療は、過剰な組織の外科的除去術、圧迫包帯法及びコルチコステロイド剤がある。治療には長期間（5〜8カ月間）を要し、病変は通常は再発性である（非特許文献２３、非特許文献２４）。
【００１２】
動物におけるその他の特定病理には、イヌにおける肢端舐性皮膚炎及び蚕食性潰瘍が含まれる。肢端舐性皮膚炎は、同一領域の反復リッキング（舐めること）の結果として生じる、イヌ病変に関連する隆起して赤くなった、強靱でゴム状の組織を意味する、イヌにおける一般的問題である。肢端舐性皮膚炎の治療における数多くのストラテジーにもかかわらず、治癒率及び有効性は不十分であり、多くの症例において潰瘍の再発が発生する（非特許文献２５、非特許文献２１）。
【００１３】
プロテインキナーゼC（PKC）は、ATPからタンパク質上のセリン及びトレオニン残基へのリン酸塩の共有結合移動を触媒する、及び皮膚生理機能の調節に重要な役割を果たすリン脂質依存性酵素のファミリーの1つである。基質タンパク質のリン酸化は、それらの機能的特性の修飾を生じさせる立体構造変化を誘導する。これまで、11のアイソフォームが、増殖、分化、細胞生存、及び死を調節する様々な細胞機能及びシグナル伝達経路に関係することが見いだされた（非特許文献２６）。特異的な補因子要件、組織局在及び細胞区分化は、各アイソフォームについての特異的なシグナル伝達カスケードの分化機能及び微調整を示唆している。そこで、特異的刺激は、特定の生物学的状況においてそれらの発現、局在及びリン酸化状態によって調節されるアイソフォーム特異的PKCシグナリングを介して分化応答をもたらすことができる。PKCアイソフォームは、様々な細胞外シグナルによって活性化され、順に受容体、酵素、細胞骨格タンパク質及び転写因子を含む細胞タンパク質の活性を修飾する。したがって、PKCファミリーは、細胞シグナル処理において中心的役割を果たす。
【００１４】
セリン／トレオニンキナーゼのプロテインキナーゼC（PKC）ファミリーのプロトタイプについては、ホスファチジルイノシトールの分解産物であるジアシルグリセロール（DAG）によって活性化されるPKCを最初に発見したNishizuka及び共同研究者（非特許文献２７）によって最初に報告された（非特許文献２８）。その他の研究は、PKCが発癌促進性ホルボールエステルの細胞内受容体であることを解明した。
【００１５】
全てのPKCファミリーメンバーは、２つの主要ドメイン、N末端での調節ドメイン及びC末端での触媒ドメインに分割できる構造骨格を共有している。これらの領域は、保存領域（C1〜C4）及びアイソフォーム間で異なる領域（V1〜V5）と分類される（非特許文献２９）、上記参照。さらに、PKCは、認識部位を遮断して活性化を防止する基質認識モチーフに緊密に似ている、調節領域内で偽基質ドメインを示す（非特許文献３０、非特許文献３１）。アイソフォームのPKCファミリーは、それらの構造特性及び補因子要件に基づいて３つの主要グループに分割することができる。これらには、古典的cPKC（α、βI、βII、及びγ）、新規nPKC（δ、ε、η、θ）、ならびに非定型ａPKC（ζ及びτ／λ）アイソフォームを含んでいる（非特許文献３２、非特許文献２７、非特許文献３３）。
【００１６】
すべてのPKCアイソフォームは、それらを活性化するためには、リン脂質二重層の成分を必要とする。古典的cPKCは、カルシウム（Ca2+）依存性であり、さらに活性化のためにはホルボールエステルなどのDAG又はDAGアナログを必要とする。新規ｎPKCは、Ca2+には依存しないが、それでも最大活性化のためにはDAG又はホルボールエステルを必要とする（非特許文献３４）。非定型ａPKCは、Ca2+には依存せず、活性化のためにDAG又はホルボールエステルを必要としないが、ホスファチジルセリンを必要とする（非特許文献３５）。さらに、基質認識の主要成分は、細胞シグナル伝達におけるPKCアイソフォームの特異的活性に関係している調節メカニズムを制御し、明確な標的基質のリン酸化と関連している調節ドメイン内の偽基質領域である（非特許文献３６、非特許文献３７）。
【００１７】
5つのPKCアイソフォームであるα、δ、ε、η及びζは、in vivo（生体内）の皮膚表皮中及び培養ケラチノサイト中で識別した。しかし、例えばβ及びγなどの他のPKCアイソフォームは皮膚の真皮層中で検出された。さらに、PKCアイソフォームのタイプ及びPKC分布のパターンは相違する組織間で相違し、さらに表現型の関数として変化する場合がある。重要なことに、PKCアイソフォームは、in vivo及びin vitroで基底及び分化両方の皮膚ケラチノサイト内に分布しており、創傷治癒において重要な役割を果たす可能性がある。
【００１８】
そこで、皮膚創傷及びその他の慢性創傷を治療するのに役立つようにPKC活性を調節する改良された組成物及び方法に対する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１９】
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【非特許文献３７】Hofmann J (1997) The potential for isoenzyme-selective modulation of protein kinase C. FASEB J 11: 649-669
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本明細書開示は一般に、カルシウム及びマグネシウムイオンを含んでいない生物活性皮膚創傷治癒剤及び／又は抗炎症薬を含む医薬組成物、ならびに前記医薬組成物を用いて皮膚創傷及び／又は炎症を治療する方法に関する。好ましくは、前記医薬組成物は、局所的もしくは局部的投与に、特には皮下投与の好適である。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本明細書開示の一態様は、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００２２】
本明細書開示のまた別の態様は、インスリン、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列からなるペプチド、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない0.2g/LのKCl、0.2g/Lの無水KH2PO4、8g/LのNaCl、及び1.15g/Lの無水Na2HPO4を含む薬学的に許容される水性担体を含む組成物である。
【００２３】
好ましくは、薬学的に許容される担体は、本組成物を緩衝するのに好適なリン酸塩もしくはリン酸塩含有化合物を含んでいる。特に好ましい実施形態は、0.2LのKCl、0.2g/Lの無水KH2PO4、8g/LのNaCl及び1.15g/Lの無水Na2HPO4が含まれる。そのような薬学的に許容される担体は、さらにまた本発明の一態様であり、カルシウムもしくはマグネシウムイオンを含んでいない薬学的に許容される担体を提供するために必要な成分と混合する工程によって調製できる。
【００２４】
本明細書開示のまた別の態様は、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体、ならびに薬物溶出スカフォールドを含む組成物である。
【００２５】
本明細書開示のまた別の態様は、それによって本医薬組成物が製造される、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を提供する工程と、ならびにδ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を組み合わせる工程とを含む工程によって製造される医薬組成物である。
【００２６】
本明細書開示のまた別の態様は、動物上の皮膚創傷の閉鎖を増加させるための方法であって、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、ならびに動物上の皮膚創傷へ有効量の本医薬組成物を投与する工程とを含み、それによって皮膚創傷の閉鎖が増加させられる。
【００２７】
本明細書開示のまた別の態様は、動物上の皮膚創傷の部位での炎症を減少させるための方法であって、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、ならびに動物上の皮膚創傷の部位へ有効量の本医薬組成物を投与する工程とを含み、それによって皮膚創傷の部位での炎症が減少させられる。
【００２８】
本明細書開示のまた別の態様は、インスリンもしくはインスリンアナログ、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００２９】
本明細書開示のまた別の態様は、約0.0001ユニット/L〜約0.1ユニット/LのインスリンならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００３０】
本明細書開示のまた別の態様は、動物上の創傷の閉鎖を増加させるための方法であって、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、ならびに動物上の創傷へ有効量の本医薬組成物を投与する工程とを含み、このとき前記創傷は、糖尿病性潰瘍創傷、肢端舐性創傷、肉芽創傷、外科創傷、慢性日光膿瘍創傷、及び骨髄炎創傷からなる群から選択される少なくとも１つであり、それによって創傷の閉鎖が増加させられる。
【００３１】
本明細書開示のまた別の態様は、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにK＋カチオンを含んでいてCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００３２】
本明細書開示のまた別の態様は、δ−PKC活性化剤、ならびにK＋カチオンを含んでいてCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００３３】
本明細書開示のまた別の態様は、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００３４】
本明細書開示のまた別の態様は、動物の皮膚創傷の部位での炎症を減少させるための方法であって、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、ならびに動物上の皮膚創傷へ有効量の本医薬組成物を投与する工程とを含み、それによって皮膚創傷の部位での炎症が減少させられる。
【００３５】
本発明の他の態様は、本明細書に記載したような本発明の組成物を使用して、肉芽組織形成、上皮増殖、及び皮膚増殖を促進する工程を含んでいる。
【００３６】
最後に、本明細書に開示した組成物は、完全にCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない、又はこれらのカチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含んでいる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】様々な製剤に製剤された指示した医薬化合物を利用してin vitroでの創傷治癒の有効性を示している細胞培養皿の写真である（Axiovert 25 Zeiss顕微鏡下での50倍の倍率）。
【図１Ｂ】処置24時間後の閉鎖の百分率としての創傷閉鎖を示す図である。
【図２Ａ】医薬組成物が製剤Aにおいて有意な創傷閉鎖を促進することを示すグラフである。
【図２Ｂ】様々な製剤を用いた処置後の代表的な創傷の写真である。
【図３】様々な製剤での処置後の創傷部位での炎症負荷を示すグラフである。
【図４】様々な製剤での処置後の肉芽組織形成を示すグラフである。
【図５】Myr−偽基質PKCαペプチドが様々な製剤でPKCα活性を阻害する能力を示すグラフである。
【図６Ａ】創傷閉鎖及び細胞増殖での様々な製剤におけるインスリンの作用を示している、細胞培養皿の（Axiovert 25 Zeiss製顕微鏡下での倍率200倍）の拡大写真である。
【図６Ｂ】インスリンの存在下及び非存在下で、様々な製剤を用いた処置24時間後のコントロールの百分率としてのin vitroの創傷閉鎖を示すグラフである。
【図６Ｃ】チミジン取込みによって測定される細胞増殖を示すグラフである。
【図７】細胞培地の交換前及び交換後の、7カ月齢から2年齢のマウス由来のケラチノサイトでの細胞増殖にインスリン及びインスリン+PKCα阻害剤が及ぼす作用を示すグラフである。
【図８Ａ】様々な製剤における本医薬組成物を用いた慢性足部潰瘍の処置及び閉鎖の増加を示す写真及びグラフである。
【図８Ｂ】様々な製剤における第0日及び第60日における患者の慢性糖尿病性創傷の処置及び増加した閉鎖を示す写真である。
【図９】本医薬組成物を用いたウマにおける慢性肉芽（Ploud Flesh）創傷の処置を示している第0日、第3カ月及び第6カ月の写真である。
【図１０】本医薬組成物を用いた骨髄炎を伴う慢性日光膿瘍の処置を示している第0日、第30日及び第60日の写真である。
【図１１】本医薬組成物を用いた自己外傷によって誘発された非治癒性肢端舐性創傷の処置の進行を示している第0日、第2カ月及び第3.5カ月の写真である。
【図１２】商標HUMALOG（登録商標）によって公知であるヒトインスリンアナログであるヒトインスリンリスプロ（rDNA起源）の一次構造の略図である。
【図１３】商標NOVOLOG（登録商標）によって公知であるヒトインスリンアナログであるインスリンアスパルト（rDNA起源）の一次構造の略図である。
【図１４】商標LANTUS（登録商標）によって公知であるヒトインスリンアナログであるインスリングラルジン（rDNA起源）の一次構造の略図である。
【図１５】商標NOVOLIN（登録商標）Rによっても公知であるヒトインスリンアナログであるHUMULIN（登録商標）Rの一次構造の略図である。
【図１６】製剤Aで提供されたインスリンアナログ単独を用いた処置後及び未処置コントロール創傷と比較した表皮及び肉芽組織形成によって測定された創傷治癒率（%）を示すグラフである。試験したインスリンアナログは、インスリンリスプロ（HumL）、インスリンアスパルト（Novo）、インスリングラルジン（LANTUS（登録商標））、及びHUMULIN（登録商標）（HumR）であった。
【図１７】HUMULIN（登録商標）R（HumR）、USPインスリン（Ins USP）、及びPKCα偽基質阻害性ペプチド（pep）単独又はインスリンアナログ及び阻害性ペプチドを併用した処置を用いた場合の肉芽組織形成によって測定された創傷治癒の促進を示しているグラフである。
【図１８】HUMULIN（登録商標）R（HumR）、インスリンリスプロ（HumL）、及びPKCα偽基質阻害性ペプチド（pep）単独又はインスリンアナログ及び阻害性ペプチドを相乗的に併用した処置を用いた場合の重症炎症率（%）を示しているグラフである。
【図１９】培地A及び培地B中で培養した一次皮膚ケラチノサイトにおけるビスファチンもしくはL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩による処置後の、7カ月齢から2年齢のマウス発現由来のケラチノサイト細胞におけるケラチン1を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本明細書開示の医薬組成物は、種々の溶媒中に様々な無機及び有機塩を含む薬学的に許容される担体ならびにPKCα阻害剤、及び／又はインスリンを含んでいる。
【００３９】
薬学的に許容される担体の代表的な製剤組成物は、水、塩化及びリン酸カリウム及びナトリウムを含んでいてよく、これらは生理的に許容されものであり、そして、これを以下のように調製できる：
Ａ）塩化カリウム0.2g/L（KCl）
Ｂ）リン酸二水素カリウム（無水）0.2g/L（KH2PO4）
Ｃ）塩化ナトリウム8.0（g/L）（NaCl）
Ｄ）リン酸水素ナトリウム（無水）1.15g/L（Na2HPO4）
本製剤は、カルシウム又はマグネシウムイオンを含んでいてはならない。
【００４０】
任意のPKCα阻害剤を使用できるが、好ましくは、PKCα阻害剤は、PKCαの偽基質領域に対応するミリストイル化ペプチド（Myr*-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln-OH（配列番号１、CAS［147217-25-2］）である。PKCα偽基質領域は、この特定アイソフォームの基質領域に特に高いアフィニティーを有している。使用できる追加のPKC阻害剤の例には、以下の表１に示したペプチドが含まれる。
【００４１】
【表１−１】
0005411857.tif 000002
【表１−２】
0005411857.tif 000003
【表１−３】
0005411857.tif 000004
【００４２】
さらに、下記のPKC阻害剤もまた、本明細書開示による医薬組成物において使用できる。
Ａ）NPC15437-二塩酸塩水和物（Sigma社）、（S）−2，6−ジアミノ−N−［（1−（1−オキソトリデシル）−2−ピペリジニル）メチル］ヘキサンアミド二塩酸塩水和物としても公知である。
分子式−C25H50N4O2・2HCl・xH2O
分子量−511.61（無水ベース）
CAS番号−141774-20-1（無水）
MDL番号−MFCD00210207
PubChem Substance ID−24897504
Ｂ）CGP41251−［4’−N−ベンゾイルスタウロスポリン］［ミドスタウリン］．スタウロスポリン誘導体であるPKC412（CGP41251）は、プロテインキナーゼC（PKC）の従来型アイソフォームのより選択的な阻害剤である。
分子式−O35H30N4O4
分子量−570.65
【００４３】
【化１】
0005411857.tif 000005
【００４４】
Ｃ）Ro31-8220−ビスインドリルマレイミドIX、メタンスルホン酸塩（Upstate Biootechnology社）
分子式−C25H23N5O2S・CH4O3S
分子量−553.66
製品番号♯19-163；式は下記に示す：
【００４５】
【化２】
0005411857.tif 000006
【００４６】
Ｄ）Go6976 α及びPKCβ１阻害剤である、12−（2−シアノエチル）−6，7，12，13−テトラハイドロ−13−メチル−5−オキソ−5H−インドロ［2，3−a］ピロロ［3，4−c］カルバゾール
Ｅ）GF-109203X 強力かつ選択的なプロテインキナーゼＣ阻害剤である、2−［1−（3−ジメチルアミノプロピル）−1H−インドール−3−イル］−3−（1H−インドール−3−イル）マレイミド
Ｆ）ISIS  3521/LY900003 Isis Pharmaceuticals社（カリフォルニア州カールズバッド）から市販で入手できる、以下の配列（配列番号５６）を備える、アプリノカルセンとしても公知である20-ヌクレオチド ホスホロチオエート デ−オキシリボ−オリゴヌクレオチド：
５’−ＧＴＴＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡ−３’（配列番号５６）
【００４７】
好ましい実施形態では、本明細書開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体、レギュラーインスリンもしくはPKCδを活性化するその機能的アナログ、及びPKCαを阻害する９アミノ酸から構成される市販で入手できる合成ペプチドを含んでいる。
【００４８】
好ましい医薬組成物は： 
ａ）塩化カリウム0.2g/L（KCl）
ｂ）リン酸二水素カリウム（無水）0.2g/L（KH2PO4）
ｃ）塩化ナトリウム8.0g/L（NaCl）
ｄ）リン酸水素ナトリウム（無水）1.15g/L（Na2HPO4）
ｅ）ミリストイル化ペプチド（1〜100μM）、例えばMyr*-Phe-Ala-Arg-Lys-Gly-Ala-Leu-Arg-Gln-OH（配列番号１）
ｆ）レギュラーインスリンもしくはその機能的アナログ（治療用量：0.1〜10ユニット/mL）を含んでいる。
上記に列挙した濃度は、組成物中の好ましい最終濃度である。
【００４９】
本医薬組成物は、インスリンもしくはその機能的アナログをPKCα阻害剤と、カルシウム又はマグネシウムイオンを含んでいない薬学的に許容される担体中で混合する工程によって調製される。本明細書開示による医薬組成物は、液剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、又はエマルジョン剤の形態で、当業者であれば容易に利用できる方法によって調製できることが企図されている。
【００５０】
２つの生物活性成分であるインスリン及びPKCα阻害剤ペプチドは、液剤中に製剤化されると共に作用して創傷治癒を誘導する。インスリンもしくはその機能的インスリンアナログの濃度は、0.1〜10ユニット/mLであってよい。PKCαのペプチド阻害剤の濃度は、1〜100μMであってよい。好ましい濃度は、1mLの溶液中の0.1ユニットのインスリン（10-6M）及び1μgのペプチド（10-6M）である。
【００５１】
本明細書開示による医薬組成物中で使用するためのインスリンは、組換え型、又は例えばヒトインスリンもしくはヒトに使用するために好適な非ヒト哺乳動物インスリンなどの天然起源由来であってよい。さらにまた、本医薬組成物は、例えばインスリンの機能的アナログなどのインスリンアナログを用いて調製できることもまた企図されている。インスリンアナログの非限定的例は、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルジン、及び組換え型ヒトインスリン、ビスファチン、及びL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩（本明細書ではL−αとも識別した）である。
【００５２】
これらのインスリンアナログの特定のものは、ヒトレギュラーインスリンの構造に類似する基本的一次構造を共有している。インスリンリスプロは、B−28位でプロリン及びB−29位でリシンがアナログでは逆になっているので、ヒトインスリンから識別される。インスリンアスパルトは、B−28位でプロリンがアスパラギン酸と置換されているので、ヒトインスリンから識別される。インスリングラルジンは、位置A−21位でアミノ酸アスパラギンがグリシンで置換され、2つのアルギニン残基はβ−鎖のC末端へ加えられているので、ヒトインスリンから識別される。組換え型ヒトインスリンはヒトインスリンと構造的に同一であり、例えばサッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）を用いるなどによるペプチドを生成するためのrDNA技術によって生成される。
【００５３】
ビスファチンは、インスリンアナログとして機能するアディポサイトカインであり、インスリン受容体に結合して活性化することのできるインスリン模倣体である。L−αは、Ca2+-非感受性PKCアイソザイムであるδ、ε、及びηを活性化する有機化合物である。L−αは、プレクストリンホモロジー（PH）ドメインを通してホスホイノシチド−1（GRPl）タンパク質に対する一般的受容体へ結合し、さらに、NIH/3T3細胞の遊走性を増加させ、アクチン再組織化及び膜ラフリング現象を生成すると報告されている。
【００５４】
好ましい実施形態では、治療有効量の医薬組成物は、それを必要とする被験者に投与される。本医薬組成物は、所与の治療を提供するために有効な任意の公知の投与経路によって、好ましくは液剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤での局所投与、又は任意の他の局部投与（例えば、皮下注射）によって投与することができる。本医薬組成物は、さらにまた例えばガーゼ、パッチ、パッド、又はスポンジなどの薬物溶出デバイスによって投与することもできる。
【００５５】
本明細書開示による本医薬組成物のまた別の態様は、本医薬組成物を使用して損傷した皮膚もしくは皮膚創傷を処置することである。本組成物は、必要に応じて頻回に、及び創傷を適切に処置して所与の終点に到達するために、例えば創傷が完全に寛解するまで必要な期間にわたり投与されなければならない。当業者であれば、本明細書開示による組成物及び方法を利用して、適切な処置経過を容易に決定することができる。
【００５６】
本明細書開示による医薬組成物のまた別の態様は、肉芽組織形成、表皮増殖、及び皮膚増殖を促進することである。本明細書開示による本医薬組成物のまた別の態様は、例えば炎症性皮膚疾患によって誘発された炎症などの炎症を処置する方法である。
【００５７】
本明細書で使用する用語「α−PKC阻害剤」は、任意の機序によってPKCαアイソフォームの活性を阻害できる分子を意味する。PKCαアイソフォームの例には、目録番号NM_002737（ヒト（Homo sapiens）PKCα）、XM_548026（イヌ（Canis lupus familiaris）PKCα）、XM_001494589（ウマ（Equus caballus）PKCα）、及びNM_011101（マウス（Mus musculus）PKCα）に記載された核酸によってコードされたPKCαアイソフォーム、又はCLUSTALWアルゴリズムのデフォルト設定を用いて決定されるこれらのPKCαアイソフォームの成熟型と少なくとも95%同一であるペプチド鎖が含まれる。α−PKC阻害剤分子は、結合、共有結合修飾又はそのような分子とPKCαアイソフォームとの物理的相互作用を含む他の機序によってPKCαアイソフォームを直接的に阻害することができる。α−PKC阻害剤分子はさらにまた、PKCαアイソフォームの活性化に関係する第2分子の活性を変調させることによってPKCαアイソフォームを間接的に阻害することもできる（例えば、PKCαアイソフォームの活性を阻害するためPKCαアイソフォーム関連性シグナリングカスケードの成分の活性を変調させる、又はPKCαアイソフォームの発現を防止するRNAをサイレインシングすることにより）。
【００５８】
本明細書で使用する用語「δ−PKC活性化剤」は、任意の機序によってPKCδアイソフォームを活性化できる、又は細胞もしくは組織中のPKCδアイソフォーム活性を増加できる分子を意味する。PKCδアイソフォームの例には、目録番号NM_006254（ヒト（Homo sapiens）PKCδ）、NM_001008716（イヌ（Canis lupus familiaris）PKCδ）、XM_001915127（ウマ（Equus caballus）PKCδ）、及びNM_011103（マウス（Mus musculus）PKCδ）に記載された核酸によってコードされたPKCδアイソフォーム、又はCLUSTALWアルゴリズムのデフォルト設定を用いて決定されるこれらのPKCδ阻害剤アイソフォームの成熟型と少なくとも85%同一であるペプチド鎖が含まれる。δ−PKC活性化剤分子は、結合、共有結合修飾又はそのような分子とPKCδアイソフォームとの物理的相互作用を含む他の機序によってPKCδアイソフォームを直接的に活性化することができ、PKCδアイソフォーム基質及び補因子を含むことができる。δ−PKC活性化剤分子はさらにまた、PKCδアイソフォームの活性化に関係する第2分子の活性を変調させることによってPKCδアイソフォームを間接的に活性化することもできる（例えば、PKCδアイソフォームを活性化するためのインスリン受容体などのPKCδアイソフォーム関連性シグナリングカスケードの成分の活性を変調させることによって）。δ−PKC活性化剤分子は、さらに細胞もしくは組織中のPKCδアイソフォームの増加した発現を生成することによって、細胞もしくは組織中のPKCδアイソフォーム活性を増加させることもできる。
【００５９】
本明細書で使用する用語「薬物溶出スカフォールド」は、生理学的に活性な分子を放出できる固定材料を意味する。薬物溶出スカフォールドは、不溶性、可溶性、非生体吸収性、又は生体吸収性であってよい固定相材料を含むことができる。
【００６０】
本明細書で使用する用語「インスリン」は、インスリン受容体を活性化でき、糖尿病の治療において有用であることが公知である、天然型ペプチドホルモン及びそれらのプレプロインスリンならびにそれらの成熟型ではジスルフィド結合で連結されたA及びB鎖を含むプロインスリン前駆体型を意味する。例えばヒト、ウシ、及びブタなどの多数の相違する動物種由来のインスリンは、周知であり、当業者であれば容易に認識されるであろう。重要なことに、インスリンは、組換え技術によって生成することができる。
【００６１】
本明細書で使用する用語「インスリンアナログ」は、任意の機序によってインスリン受容体を活性化できる、天然型インスリン中では見いだされない構造を含む分子を意味する。そのような分子は、天然型インスリンの1つ以上の構造的態様が修飾されているインスリンの構造的アナログであってよい。そのような分子は、天然型インスリン中では見いだされる構造を含まない模倣体分子であってもよい。インスリンアナログは、さらにまたインスリン様成長因子（例、インスリン様成長因子1）を含むことができる。インスリンアナログは、結合、共有結合修飾又はそのような受容体との物理的相互作用を含む他の機序によってインスリン受容体を直接的に活性化することができる。インスリンアナログは、さらにまたそのような受容体の活性化に関係している第2分子の活性を変調させることによって間接的にインスリン受容体を活性化することができる。理論によって拘束することを望まなくても、インスリン受容体の活性化はPKCδアイソフォームの間接的活性化を生じさせると考えられている。多数の相違するインスリンアナログは周知であり、当業者であれば容易に認識されるであろう。
【００６２】
本明細書で使用する用語「標準状態」は、25℃±2℃の温度及び１気圧の圧力を意味する。本明細書に記載し、1ユニット量ベース（例、mol/L、M、ユニット／mL、μg/mLなど）で表示した液剤、懸濁剤、及びその他の製剤の濃度は、「標準状態」で決定した。用語「標準状態」は、当該技術分野では当該技術分野で認識された単一組の温度もしくは圧力を意味するためには使用されないが、その代りに参照「標準状態」条件下で、特定の組成物を備える液剤、懸濁剤、又は他の製剤を記載するために使用される温度及び圧力を規定する参照状態である。これは、液剤の容量が、一部には、温度及び圧力の関数であるためである。当業者であれば、本明細書に開示した組成物と同等の組成物が他の温度及び圧力で生成できることを認識するであろう。
【００６３】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される担体」は、ヒト又は他の動物へ投与するために適合する1つ以上の適合する固体もしくは液体充填剤希釈剤又はカプセル化物質を意味する。
【００６４】
本明細書開示の一態様は、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。理想的には、薬学的に許容される担体は、それらを治療されるヒト又は動物に投与するために適合させるために高純度及び低毒性でなければならない。そのような薬学的に許容される担体は、δ−PKC活性化剤及びα−PKC阻害剤の生物活性をさらに維持しなければならない。
【００６５】
そのような薬学的に許容される担体は、さらにまた、酢酸塩をベースとする緩衝液、2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）をベースとする緩衝液、フタル酸水素カリウムをベースとする緩衝液、KH2PO4をベースとする緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをベースとする緩衝液、及びホウ砂（Na2B4O710H2O）をベースとする緩衝液を含むことができる。100mLの0.1Mフタル酸水素カリウム＋指示した量（ユニット、mL）の0.1M NaOHである。そのような緩衝液は、下記の製剤により作製できる、又は下記の製剤を含むことができる：
0.1M NaOHを用いて所与のpHへ調整した、100mLの0.1M   KH2PO4；
0.1M HClを用いて所与のpHへ調整した、100mLの0.1Mトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；及び
0.1M HClを用いて所与のpHへ調整した、100mLの0.025M Na2B4O710H2O（ホウ砂）。
【００６６】
適切な薬学的に許容される担体の例には、水、ワセリン、石油系ゼリー（petroleum jelly）、ミネラルオイル、植物油、動物油、例えば微結晶、パラフィン及び臭蝋（ozocerite）ワックスなどの有機及び無機ワックス、例えばキサンタン類、麦芽、タルク、ゼラチン、糖、セルロース、コラーゲン、デンプン、もしくはアラビアゴムなどの天然ポリマー、合成ポリマー、アルコール、ポリオール、リン酸緩衝液、カカオ脂、乳化剤、例えばTWEEN（商標）などの界面活性化剤が含まれる。担体は、例えばアルコールなどの、水中に実質的に混和性である水混和性担体組成物であってよい。水混和性の局所用の薬学的に許容される担体は、上述した１つ以上の成分を用いて作製される担体を含むことができ、さらにまた例えばリポソーム、マイクロスポンジ、マイクロスフェアもしくはマイクロカプセル、水性軟膏、油中水型もしくは水中油型エマルジョン、ゲル剤などの水分含有、水分散性もしくは水溶性組成物を含む、持続放出性もしくは遅延放出性担体を含むことができる。当業者であれば、他の薬学的に許容される担体を認識するであろう。
【００６７】
本発明の組成物において使用するための薬学的に許容される担体には、その他の適合する医薬活性化剤及び添加物を含めることができる。例えば、NOVOCAINE（商標）、リドカインなどの局所麻酔薬を薬学的に許容される担体中に含めることができる。ベンジルアルコール及びその他の保存料などの添加物もまた、薬学的に許容される担体中に含めることができる。当業者であれば、他の薬学的に許容される活性化剤及び添加物を容易に認識するであろう。
【００６８】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、δ−PKC活性化剤は、インスリン及びインスリンアナログからなる群から選択される少なくとも１つである。
【００６９】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、インスリンアナログは、インスリンリスプロ、インスリンアスパルト、インスリングラルジン、ビスファチン、及びL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩からなる群から選択される少なくとも１つである。他のインスリンアナログの例には、インスリングルリシン、インスリンデテミル、及びアルブリンが含まれる。これらのうちの特定のインスリンアナログは、商標名APIDRA（登録商標）、HUMALOG（登録商標）、LANTUS（登録商標）、LEVEMIR（登録商標）、NOVOLIN（登録商標）、HUMULIN（登録商標）、NOVOLOG（登録商標）によっても公知である。さらに、HUMULIN（登録商標）Rは、0.16mg/mLのグリセリン及び0.7μg/mLの塩化亜鉛を含めて調製できる。これらのHUMULIN（登録商標）R組成物のpHは、1N塩酸又は1N水酸化ナトリウムを用いてpH7.4へ調整することができる。本明細書に開示した組成物は、上述したZn2+イオンを含む、HUMULIN（登録商標）Rインスリンアナログ製剤の成分をさらに含むことができる。
【００７０】
ビスファチンは、配列番号６３に示したヒト（Homo sapiens）ビスファチンのアミノ酸配列を含むことができる。ビスファチンは、配列番号６４に示したマウス（Mus musculus）ビスファチンのアミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、例えば配列番号６３もしくは配列番号６４と、90%超の同一性、又は95%超の同一性を有する分子、又はこれらの生物活性フラグメントもしくは変異体などの他のビスファチン分子を認識するであろう。さらに、当業者であれば、アミノ末端メチオニン残基は、典型的にはin vivoで発現するビスファチン及びその他のポリペプチド鎖の成熟型から切り出される。
【００７１】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、インスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン、及びブタインスリンからなる群から選択される少なくとも１つである。
【００７２】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、インスリンは組換え技術によって発現させられる。組換えDNAを用いた宿主細胞の形質転換による組換え発現は、当業者に周知である従来型技術によって実施することができる。宿主細胞は、原核細胞、古細菌細胞又は真核細胞であってよい。組換えインスリンペプチド鎖などの組換え技術により発現したポリペプチドの単離及び精製は、例えば、調製用のクロマトグラフィ及び所定のポリペプチドへ特異的に結合する抗体又は他の分子を用いるアフィニティー精製を含む当該技術分野において周知の技術によって実施することができる。
【００７３】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、α−PKC阻害剤は、（S）−2，6−ジアミノ−N−［（１−（1−オキソトリデシル）−2−ピペリジニル）メチル］ヘキサンアミド二塩酸塩水和物；4’−N−ベンゾイルスタウロスポリン；ビスインドリルマレイミドIX、メタンスルホン酸塩；12−（2−シアノエチル）−6，7，12，13−テトラハイドロ−13−メチル−5−オキソ−5H−インドロ［2，3−a］ピロロ［3，4−c］カルバゾール；2−［1−（3−ジメチルアミノプロピル）−1H−インドール−3−イル］−3−（1H−インドール−3−イル）マレイミド；及びアプリノカルセンからなる群から選択される少なくとも１つである。当業者であれば、本明細書に開示した組成物中では、PKC阻害剤は塩、水和物、及び複合体の形態にあってよいことを認識するであろう。さらに、当業者であれば、PKC阻害剤は本明細書に開示した組成物中で組み合わせられることを認識するであろう。
【００７４】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、α−PKC阻害剤は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５に示したアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される少なくとも１つである。
【００７５】
そのようなペプチドは、α-アミノ基のt-BOC又はFMOC保護として一般的に使用される方法によって合成できる。どちらの方法も、それにより単一アミノ酸がペプチドのカルボキシ末端から出発する各工程で加えられる工程的合成を含んでいる（Coligan他、Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1991, Unit 9）。本発明のペプチドは、さらにまたMerrifield（85 J. Am. Chem. Soc. 2149（1962））、及びStewart and Young， Solid Phase Peptides Synthesis, （Freeman, San Francisco, 1969, pp.27−62）に記載された周知の固相ペプチド合成法によって、0.1〜1.0mmolのアミン類／gポリマーを含むコポリ（スチレン-ジビニルベンゼン）を用いて合成することができる。化学合成の完了後には、0℃での約1/4〜1時間にわたる液体HF-10%アニソールを用いた処理によってポリマーから脱保護して開裂させることができる。試薬の蒸発後、ペプチドは、1%酢酸溶液を用いてポリマーから抽出され、次に粗材料を生成するために凍結乾燥される。これは通常は、溶媒として5%酢酸を用いるSephadex G-15上でのゲル濾過などの技術によって精製することができる。カラムの適切な画分を凍結乾燥すると、均質なペプチドもしくはペプチド誘導体が産生するので、これを次にアミノ酸分析法、薄層クロマトグラフィ、高性能液体クロマトグラフィ、紫外線吸収分光法、モル回転法、及び溶解度に基づく方法などの標準技術によって特性解析することができる。
【００７６】
ペプチドは、さらにまた例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母及び細菌ならびに例えばin vitro転写系及び翻訳系などの無細胞系において、タンパク質の組換え発現系によるなどの、任意の生物学的方法によって合成できる。タンパク質発現は、明確に確立された方法によって各系に対して最適化できる。タンパク質は、標準方法（Frederich M. Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, 1989）によって精製できる。例えば、タンパク質は、（Erangionic and Neel, Analytical Biochemistry, 210:179, 1993）に記載されたように、細菌中でGST-融合タンパク質として発現させ、グルタチオンアガロースビーズ（Sigma社）によって精製することができる。又は、タンパク質は哺乳動物細胞中の分泌性生成物として発現させ、馴化培地から精製することができる（Cadena and Gill, Protein Expression and Purification 4:177, 1993）。Merrifieldの方法によって調製されたペプチドは、例えばApplied Biosystems 431A-01ペプチド合成装置（カリフォルニア州マウンテンビュー）などの全自動ペプチド合成装置を用いて、又はHoughten, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:5131（1985）によって記載された手動ペプチド合成技術を用いて合成することができる。ペプチドは、共有結合修飾、液相ペプチド合成、又は当業者には公知である任意の他の方法によって合成することもできる。
【００７７】
ペプチドは、それらの活性基が必要に応じて例えばt-ブチルジカルボン酸（t-BOC）基又はフルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）基を使用して保護されるアミノ酸もしくはアミノ酸アナログを用いて合成することができる。アミノ酸及びアミノ酸アナログは、市販で購入できる（Sigma  Chemical社；Advanced Chemtec社）又は当該技術分野において公知の方法を用いて合成できる。
【００７８】
本明細書に開示したペプチド内のアミノ酸は、例示したペプチドにおいて示した特定のアミノ酸の1つ以上のアミノ酸置換によって修飾することができる。アミノ酸置換変化には、1つの塩基性アミノ酸とまた別の塩基性アミノ酸との置換、1つの疎水性アミノ酸とまた別の疎水性アミノ酸との置換又は他の保存的置換を含むことができる。アミノ酸置換は、さらにまた例えばArgに対するオルニチン（Orn）もしくはホモアルギニン（homoArg）などの非天然型アミノ酸の使用を含むことができる。
【００７９】
ペプチドは、他の分子の共有結合又はペプチド内に存在する官能基の反応によって修飾することもできる。そのような修飾の例には、ポリエチレングリコール分子、脂質、炭水化物、又は他の分子の結合が含まれる。そのような修飾の特定の例には、さらにまたミリストイル化及びアミド化が含まれる。ペプチドを共有結合修飾するための技術は当該技術分野において周知であり、当業者であれば多数のそのような技術を知っているであろう。
【００８０】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、α−PKC阻害剤は、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有し、そのカルボキシ末端でアミド化されている配列番号２５に示したアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００８１】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、α−PKC阻害剤は、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列からなるペプチドである。
【００８２】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体は、0.2g/LのKCl、0.2g/Lの無水KH2PO4、8g/LのNaCl、及び1.15g/Lの無水Na2HPO4を含む水性担体である。
【００８３】
本明細書開示のまた別の態様は、インスリン、そのアミノ末端でミリストイル化アミノ酸残基を有する配列番号１に示したアミノ酸配列からなるペプチド、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない0.2g/LのKCl、0.2g/Lの無水KH2PO4、8g/LのNaCl、及び1.15g/Lの無水Na2HPO4を含む薬学的に許容される水性担体を含む組成物である。
【００８４】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、本組成物は、0.0001ユニット/L〜約0.1ユニット/Lのインスリン及び約1μM〜約100μMのペプチドを含んでいる。
【００８５】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、本組成物は、0.0001ユニット/Lのインスリン及び1μMのペプチドを含んでいる。
【００８６】
本明細書開示のまた別の態様は、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体、ならびに薬物溶出スカフォールドを含む組成物である。本薬物溶出スカフォールドは、医薬組成物を送達できる任意の固相構造であってよい。薬物溶出スカフォールドは医薬組成物を保持することができ、経時的に拡散、毛細管作用、重力、又は分子をトランスファーさせるための他の物理的工程などの手段によって送達することができる。薬物溶出スカフォールドは、例えば、層状もしくは織り繊維、繊維マット、発泡体、ゲル、様々な固体もしくは任意の他の固相構造のマトリックスを含んでいてよく，ステントなどの任意の形態で提供することができる。当業者であれば、他の適当な薬物溶出スカフォールドを認識するであろう。
【００８７】
本組成物の１の実施形態では、薬物溶出スカフォールドは、多孔性固体を含んでいる。そのような多孔性固体の例には、スポンジ、発泡体、ガーゼ、ゲル、又は他のマトリックスが含まれる。当業者であれば、薬物溶出スカフォールドの他の例を認識するであろう。
【００８８】
本組成物の１つの実施形態では、薬物溶出スカフォールドは、スポンジである。
【００８９】
本明細書開示のまた別の態様は、ａ）δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を提供する工程と、及びｂ）δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を組み合わせる工程とを含み、それにより医薬組成物が製造される工程によって製造される医薬組成物である。
【００９０】
本明細書に開示する他の組成物は、本組成物の成分を提供する工程と、次にそのような成分を製造するためにこれらの成分を組み合わせる工程を同様に含む工程によって製造することもできる。
【００９１】
本明細書開示のまた別の態様は、動物上の皮膚創傷の閉鎖を増加させるための方法であって：ａ）δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、及びｂ）動物の皮膚創傷へ有効量の医薬組成物を投与する工程とを含み、それにより前記皮膚創傷の閉鎖が増加させられる方法である。
【００９２】
皮膚創傷の閉鎖は、正常組織を含む創傷の非罹患周縁部を識別する工程と、治癒していない創傷の周縁部内の領域を決定する工程とによって評価できる。創傷の閉鎖は、創傷の周縁部内の未治癒領域が測定前に比較して減少する場合に発生する。最終的に、皮膚創傷の閉鎖の増加は、未治癒領域が存在しないように創傷の完全閉鎖を生じさせる。当業者であれば、創傷閉鎖のための他の技術を認識し、そしてそれが増加しているかどうかを認識するであろう。
【００９３】
当業者は、当業者であれば容易に実施できるルーチン的な実験による組織学検査、H&E染色法、ケラチン14染色法、もしくは免役化学によって、又は膿瘍形成、過剰な白血球増加症、及び血管中の高いRBC/WBC比を観察することによって、医薬組成物の有効量を決定することができる。当業者であれば、治療前の創傷の面積及び処置後の合理的時間の変化を単純に観察又は測定することによって、有効量の医薬組成物が皮膚創傷を有する被験者に投与されてきたことを識別することもできる。
【００９４】
本明細書開示の方法において投与するために適当な医薬組成物は、液剤、軟膏剤、エマルジョン剤、クリーム剤、ゲル剤、顆粒剤、フィルム剤及びプラスター剤の形態で提供することができる。当業者であれば、投与のために適当な本明細書に開示した医薬組成物の他の形態を認識するであろう。
【００９５】
本明細書開示のまた別の態様は、動物上の皮膚創傷の部位での炎症を減少させるための方法であって：ａ）δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、及びｂ）動物の皮膚創傷へ有効量の医薬組成物を提供する工程とを含み、それにより前記皮膚創傷の部位での炎症が減少させる方法である。
【００９６】
炎症は、以下のパラメータ：創傷領域での皮膚創傷での皮膚創傷膿瘍形成、過剰な白血球増加症（固定視野（×200）内で＞100cell）、及び20%を超える血管内のWBC含量が固定視野（×200）内で示される血管内の高いWBC/RBC（白血球／赤血球）比のうちの少なくとも2つが存在する場合に発生する。炎症は、上記のパラメータが皮膚創傷の部位に1つしか、又は全く存在しない場合には減少させられると見なすことができる。又は、皮膚創傷部位での炎症は、例えば腫脹、発赤、膿（puss）などの他の周知の臨床徴候によって評価することができる。炎症は、これらの臨床徴候の重症度が減少した、又は完全に取り除かれた場合に減少したと見なすことができる。当業者であれば、炎症を評価するための他の技術を認識し、及びそれが減少しているかどうかについても認識するであろう。
【００９７】
本明細書開示のまた別の態様は、インスリンもしくはインスリンアナログ、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【００９８】
本明細書開示の組成物及び方法の任意の実施形態では、本組成物は、0.0001ユニット/L〜約0.1ユニット/Lのインスリン又はインスリンアナログを含んでいる。
【００９９】
本明細書開示の組成物及び方法の任意の実施形態では、本組成物は、0.0001ユニット/Lのインスリン又はインスリンアナログを含んでいる。
【０１００】
本明細書開示の組成物及び方法の任意の実施形態では、本組成物は、約0.0001ユニット/L〜約0.1ユニット/LのインスリンならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含んでいる。
【０１０１】
本明細書開示のまた別の態様は、動物上の創傷の閉鎖を増加させるための方法であって、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、Ca2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、ならびに動物上の創傷へ有効量の本医薬組成物を投与する工程とを含み、前記創傷は、糖尿病性潰瘍創傷、肢端舐性創傷、肉芽創傷、外科創傷、慢性日光膿瘍創傷、及び骨髄炎創傷からなる群から選択される少なくとも１つであり、それにより前記創傷の閉鎖が増加させられる方法である。
【０１０２】
本明細書開示のまた別の態様は、δ−PKC活性化剤、α−PKC阻害剤、ならびにK+カチオンを含んでいてCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。K+カチオンの起源の例には、塩化カリウム（KCl）、炭酸水素カリウム（KHCO3）、及びリン酸カリウム（KH2PO4）が含まれる。当業者であれば、K+カチオンの他の起源を容易に認識するであろう。
【０１０３】
本明細書開示のまた別の態様は、δ−PKC活性化剤、ならびにK+カチオンを含んでいてCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【０１０４】
本明細書開示のまた別の態様は、δ−PKC活性化剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【０１０５】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、本医薬組成物は、約1μM〜約100μMのα−PKC阻害剤ペプチドを含んでいる。
【０１０６】
本明細書開示の組成物及び方法の一の実施形態では、本医薬組成物は、1μMのα−PKC阻害剤ペプチドを含んでいる。
【０１０７】
本明細書開示のまた別の態様は、動物上の皮膚創傷の部位での炎症を減少させるための方法であって、δ−PKC活性化剤、ならびにCa2+及びMg2+カチオンを含んでいない薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する工程と、ならびに動物上の皮膚創傷へ有効量の本医薬組成物を投与する工程とを含み、それによって皮膚創傷の部位での炎症が減少させられる方法である。
【実施例】
【０１０８】
（材料及び実験方法）
材料
組織培養培地及び血清は、Biological Industries社（イスラエル国ベイトハーメック）から購入した。増強化学ルミネセンス（ECL）は、BioRad社（イスラエル国）から購入したキットを用いて実施した。抗p−tyrモノクローナル抗体は、Upstate Biotechnology社（米国ニューヨーク州レイクプラシッド）から購入した。PKCアイソフォームに対するポリクローナル及びモノクローナル抗体は、Santa Cruz社（米国カリフォルニア州）及びTransduction Laboratories社（ニューヨーク州レキシントン）から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ−抗ウサギ及び抗マウスIgGは、Bio-Rad社（イスラエル国）から入手した。ロイペプチン、アプロチニン、PMSF、DTT、オルトバナジン酸ナトリウム、及びペプスタチンは、Sigma Chemicals社（ミズーリ州セントルイス）から購入した。インスリン（humulinr-組換え型ヒトインスリン）は、Eli Lilly France SA社（フランス国フェーガースハイム）から購入した。IGF1は、Cytolab社（イスラエル国レフォボト）から購入した。ケラチン14抗体は、Babco-Convance社（カリフォルニア州リッチモンド）から購入した。BDGF-BBはR&D systems社（ミネアポリス）から購入し、ミリストイル化PKCα偽基質はCalbiochem社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。高速細胞増殖キット（Rapid Cell Proliferation Kit）は、Calbiochem社（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。
【０１０９】
使用したインスリンアナログは、インスリンリスプロ（HUMALOG（登録商標）、Eli Lilly社）、インスリンアスパルト（NOVOLOG（登録商標）、Novo Nordisk社）、インスリングラルジン（LANTUS（登録商標）、Sanofi Aventis社）、及び組換え型ヒトレギュラーインスリン（HUMULIN（登録商標）Ｒ、Eli Lilly社）であった。使用した追加のインスリンアナログは、マウスビスファチン（ALEXIS Corporation社、スイス国ラウゼン、製品番号ALX-201-318-C050）及びL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩（Calbiochem社；製品番号524615）（L−α）であった。
【０１１０】
ケラチン1特異的抗体及びウエスタンブロッティング二次抗体は、市販で入手できる。
【０１１１】
マウスケラチノサイトの単離及び培養
一次ケラチノサイトは、以前に記載されたように新生児皮膚から単離した。ケラチノサイトは、8% キレックス（キレックス-100、BioRad社）処理ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（EMEM）中で培養した。増殖性基底細胞表現型を維持するために、最終Ca2+濃度を0.05mMに調整した。実験は、プレーティングの5〜7日後に実施した。
【０１１２】
培地A及びＢは、どちらも8% キレックス（商標）処理ウシ胎児血清を含むBiological Industries社（イスラエル国）からのEMEM（イーグル最小必須培地）であった。キレックス（商標）は、遊離Ca2+及びMg2+イオンに結合する強力なキレート化剤であり、培養細胞がこれらのイオンを生体内利用可能にすることを防止する。培地AはKClを含んでいないが、培地BはKCl  0.4mg/mLを含んでいる。
【０１１３】
免疫沈降のための細胞溶解液の調製
ケラチノサイトを含む培養皿は、Ca2+／Mg2+非含有PBSで洗浄した。細胞は機械的に剥離させ、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤の混合物（20μg/mLのロイペプチン、10μg/mLのアプロチニン、0.1mM  PMSF；1mM  DTT；200μM オルトバナジン酸塩；2μg/mLのペプスタチン）を含むRIPA緩衝液（50mMのトリス-HCl（pH7.4）；150mM  NaCl；1mM EDTA；10mM NaF；1% Triton x 100；0.1％  SDS；1% デオキシコール酸ナトリウム）中に溶解させた。この製剤を4℃で20分間にわたり最高速度の微量高速遠心機内で遠心分離にかけた。免疫沈降には上清を使用した。
【０１１４】
免疫沈降
溶解液は、300μgの細胞溶解液を25μLのプロテインA/Gセファロース（Santa Cruz社、米国カリフォルニア州）と混合することによって予備浄化し、この懸濁液を4℃で30分間にわたり持続的に回転させた。製剤は次に4℃で10分間にわたり最高速度で遠心分離し、30μLのA/Gセファロースを個々の抗原に対して特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体と共に上清へ加えた（希釈率、1:100）。サンプルは4℃で一晩回転させた。懸濁液を次に4℃で10分間にわたり最高速度で遠心分離させ、ペレットはRIPA緩衝液で洗浄した。この懸濁液を再び15,000×g（4℃で10分間）遠心し、TBST中で4回洗浄した。サンプル緩衝液（0.5M トリス-HCl（pH6.8）、10% SDS；10%グリセロール；4% 2−β−メルカプトエタノール；0.05%  ブロモフェノールブルー）を加え、サンプルを5分間にわたり沸騰させ、次にSDS−PAGEにかけた。
【０１１５】
アデノウイルス構築体
組み換えアデノウイルスベクターは、Saito他著、54 J. Virol. 711（1985）によって以前に記載されたように構築した。
【０１１６】
PKCアイソフォーム遺伝子を用いたケラチノサイトの形質導入
培養培地を吸引し、ケラチノサイト培養物は、例えばPKCαなどの特異的PKCアイソフォームをコードするPKC組換えアデノウイルスで1時間にわたり感染させた。次に培養をMEMで2回洗浄し、再補給した。感染10時間後の細胞を24時間にわたり無血清の低Ca2+含有MEMへ移した。
【０１１７】
PKC活性
特異的PKC活性は、適切な処理後にケラチノサイト培養から新しく調製した免疫沈降物中で決定した。これらの溶解液はNaFを含まないRIPA緩衝液中で調製した。活性は、SignaTECTプロテインキナーゼCアッセイシステム（Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して測定した。PKCα偽基質をこれらの試験における基質として使用した。
【０１１８】
細胞増殖
細胞増殖は、6ウエルプレート内での［3H ］チミジン取込みによって測定した。細胞には1時間にわたり［3H］チミジン（3μCi/mL）をパルスした。インキュベーション後、細胞はPBSで5回洗浄し、各ウエルには1時間にわたり5% TCAを加えた。この溶液を除去し、細胞を1M NaOH中に溶解させた。細胞内に取り込まれた標識化チミジンをTRI-CARB（商標）液体シンチレーションカウンタの3Hウィンドウ内で計数した。
【０１１９】
PKCイムノキナーゼアッセイ
精製及び標準化されたPKCアイソザイムは、Dr. P. Blumberg（NCI（米国立癌研究所）、NIH（米国立衛生研究所））及びDr. Marcello G. Kazanietz（ペンシルバニア大学医学部）のご厚意により提供された。一次ケラチノサイトは500μLの1% Triton Lysis Buffer（1% Triton-X 100、10μg/mLのアプロチニン及びロイペプチン、2μg/mLのペプスタチン、1mM  PMSF、1mM EDTA、200μM  Na2VO4、10mM  NaF 、1×PBS中）中で収集した。溶解液を4℃で30分間にわたりインキュベートし、4℃で30分間にわたり16,000×gでスピンさせた。上清を新しい試験管へトランスファーした。細胞溶解液の免疫沈降は、5μg/サンプルの抗−α6/GoH3（PharMingen社）及び30μL/サンプルのProtein A/G Plus Agaroseスラリー（Santa Cruz社）と共に4℃で一晩実施した。ビーズをRIPA緩衝液で1回、50mM トリス/HCl（pH7.5）で2回洗浄した。35μLの反応緩衝液（1mM CaCl2、20mM  MgCl2、50mM トリス-HCl（pH7.5））を各アッセイに加えた。各アッセイに、DMSOもしくは10mM  TPAのいずれかを含む5.5μL/アッセイのリン脂質小胞（vesicle）の懸濁液をスラリーへ、標準化された量の特異的PKCアイソザイムと共に加えた。この反応は10μL/アッセイの125mM ATP（1.25μCi／アッセイ［γ-32P］ATP、Amersham社）を加えることによって開始させ、30℃で10分間持続させた。次にビーズをRIPA緩衝液で2回洗浄した。30μL/サンプルのタンパク質ローディング色素（3×Laemmli、5% SDS）を加え、サンプルを水浴中で5分間にわたり沸騰させた。タンパク質は8.5%ゲルでのSDS−PAGEによって分離し、Protran膜（Schleicher & Schuell社）上に移し、オートラジオグラフィーによって視認した。ヒストンのリン酸化及びPKC基質ペプチドのリン酸化は、PKC活性のためのコントロールとして使用した。
【０１２０】
in vivo切開の形成及び炎症の誘導
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。
【０１２１】
その他の技術
ウエスタンブロッティングなどのその他の技術は、例えばSambrook et al．，Molecular Cloning：A Laboratory Manual（3d ed. 2001）に記載されたような当該技術分野において周知の標準プロトコールを用いて実施した。
【０１２２】
実施例及び図面では、PKCα阻害剤は、特記しない限り、配列番号１に示したミリストイル化ペプチドであった。同様に、インスリンは組換え型ヒトインスリンであり、他に特記しない限り、「インスリン」、「USP（米国薬局方）インスリン」、又は「Ins USP」と同一視した。
【０１２３】
（実施例１）
下記の実験は、様々な製剤で調製されたインスリン（10-6M；0.1ユニット/mL）及びPKCα阻害剤（Myr−偽基質PKCαペプチド（1μM））を利用してin vitroでの創傷治癒の有効性を決定するために実施した。
【０１２４】
最初に、マウスケラチノサイトを単離及び培養した。手短には、一次ケラチノサイトは、Alt他、2004；Li他、1996にしたがって新生児皮膚から単離した。ケラチノサイトは、8% キレックス（キレックス−100、BioRad社）処理ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地（EMEM）中で培養した。増殖性基底細胞表現型を維持するために、培養培地中の最終Ca2+濃度を0.05mMに調整した。
【０１２５】
5日後、コンフルエントなケラチノサイトをin vitroスクラッチアッセイにかけ、創傷治癒を追跡した。創傷形成後、インスリン＋PKCα阻害剤を様々な製剤で細胞培養に加えた：製剤A ダルベッコのリン酸緩衝食塩液（DPBS--）；製剤B リン酸塩、カリウム、カルシウム及びマグネシウムを含むリン酸緩衝食塩液（PBS）；製剤C トリスヒドロキシメチルアミノエタン（CAS番号［77-86-1］）ならびに製剤D トリスヒドロキシメチルアミノエタン（CAS番号［77-86-1］）及びKCl 0.4mg/mLを含んでいた。製剤は、約7.2のpHで提供され、所与の浸透圧を維持するために必要な塩などの他の成分を含むことができる。
【０１２６】
創傷閉鎖を追跡した。処置24時間後には、未処置コントロールと比較して、製剤A中のインスリン＋PKCα阻害剤で処置された培養だけが創傷の閉鎖を示した。この実験は3回ずつ実施した。代表的細胞培養皿を図１Ａに示した。図１Ｂは、処置24時間後の閉鎖率としての創傷閉鎖を示している（p<0.05）。
【０１２７】
（実施例２）
下記の実験は、様々な製剤中で調製されたインスリン＋PKCα阻害剤によって媒介される創傷閉鎖をさらに評価するために実施した。
【０１２８】
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は創傷上へ直接適用される上述した様々な製剤（製剤A〜C）でのインスリン（10-6M；0.1ユニット/mL）；偽基質PKCαペプチド、1μM（PKCα阻害剤）；又はインスリン＋PKCα阻害剤（Myr−偽基質PKCαペプチド、1μM及びインスリン、0.1ユニット）を用いて毎日処置した。
【０１２９】
7日後、創傷を切除し、創傷の形態及び組織学を検査することによって治癒創傷率（%）を評価した。結果は、1群当たりの創傷の総数に比較した治癒創傷率（%）として表示した。創傷の完全治癒は、製剤B及び製剤Cでの創傷の辺縁閉鎖に比較して製剤Aで適用されたインスリン＋PKCα阻害剤の処置によって劇的に誘導された。全製剤について、インスリン又は偽基質ペプチド単独を用いた処置は、製剤単独でのみ処置されたコントロール群に比較して創傷治癒を促進しなかった。これらの結果は、図２Ａに示した。7日間の処置後の創傷の代表的写真は、図２Ｂに供した。
【０１３０】
（実施例３）
下記の実験は、偽基質PKCαペプチド（PKCα阻害剤）の抗炎症作用を評価するために実施した。
【０１３１】
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は、上述した様々な製剤（製剤A〜C）中で創傷上に直接適用されるMyr−偽基質PKCαペプチド（1μM）を用いて毎日処置した。
【０１３２】
7日後、創傷を切除し、組織学検査及び免疫組織化学検査にかけた。炎症負荷は、創傷間隙に以下のパラメータ3つのうちの少なくとも２つが存在する場合には重度と見なした。（１）創傷領域での膿瘍形成、（２）過剰な白血球増加症（固定視野（×200）内で＞100cells）、（３）血管内での高WBC/RBC比、ここで20%を超える血管内のWBC含量が固定視野（×200）内で示される。結果を要約し、群内の創傷数に比較した重症炎症を備える創傷の百分率（%）として表示した。図３に示したように、偽基質PKCαペプチドが製剤Aで適用された場合にのみ重症炎症の有意な減少が認められた。処置が製剤B又は製剤Cで適用された場合には、炎症負荷の減少は見られなかった。
【０１３３】
（実施例４）
下記の実験は、本医薬組成物が肉芽組織（granular tissue）形成に及ぼす作用を評価するために実施した。
【０１３４】
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は、創傷上に直接適用される上述した様々な製剤（製剤A〜C）中のMyr−偽基質PKCαペプチド、1μM及びインスリン0.1ユニット/mLを用いて毎日処置した。
【０１３５】
7日後、創傷を切除し、固定し、標準方法にしたがってH&E染色後に組織学的に評価した。肉芽組織形成は、H&E染色法を利用して評価し、創床での全創傷領域中の形成された肉芽組織の百分率にしたがってスコア付けした。インスリン＋PKCα阻害剤で処置した場合は、コントロールならびに製剤B及び製剤C処置群に比較して、製剤A中のインスリン＋PKCα阻害剤で毎日処置された創傷だけが肉芽組織形成の有意な増加を示した。結果は、図４に示した。
【０１３６】
（実施例５）
下記の実験は、偽基質PKCαペプチドがPKCα活性を阻害する能力に製剤の含量が影響を及ぼすかどうかを決定するために実施した。
【０１３７】
マウスケラチノサイトは、上述したように単離して培養した。5日後、コンフルエントなケラチノサイトをPKCα組換えアデノウイルスで感染させた。組換えアデノウイルスベクターは、Alt他著、2001年、Alt他著、2004年、Gartsbein他著、2006年に記載されたように構築した。ケラチノサイト培養物は、1時間にわたりPKC組換えアデノウイルスを含む上清で感染させた。次に培養物をMEMで2回洗浄し、再補給した。感染10時間後の細胞は、24時間にわたり無血清の低Ca2+含有のMEMへ移した。
【０１３８】
感染の24時間後、細胞は上述したように様々な製剤（製剤A及びＢ）中で１5分間にわたりPKCα阻害剤（Myr−偽基質PKCαペプチド、1μM）により処置した。
【０１３９】
細胞抽出液は、次にPKC活性アッセイにかけた。最初に、一次ケラチノサイトは500μLの1% Triton Lysis Buffer（1% Triton-X 100、10μg/mLのアプロチニン及びロイペプチン、2μg/mLのペプスタチン、1mM PMSF、1mM EDTA、200μM Na2VO4、10mM NaF、1×PBS中）中で収集した。溶解液を次に4℃で30分間にわたりインキュベートし、4℃で30分間にわたり16,000×gでスピンさせた。上清を新しい試験管へトランスファーした。細胞溶解液の免疫沈降は、5μg/サンプルの抗−α6/GoH3（PharMingen社）抗体及び30μL/サンプルのProtein A/G-Plus Agaroseスラリー（Santa Cruz社）を用いて4℃で一晩実施した。ビーズをRIPA緩衝液で1回、50mM  トリス-HCl（pH7.5）で2回洗浄した。35μLの反応緩衝液（1mM CaCl2、20mM MgCl2、50mM トリス-HCl（pH7.5））を各アッセイに加えた。各アッセイに、DMSOもしくは10mM TPAのいずれかを含む5.5μL/アッセイのリン脂質小胞の懸濁液をスラリーへ、標準化された量の特異的PKCアイソザイムと共に加えた。この反応は10μL/アッセイの125mM ATP（1.25μCi/アッセイ［γ-32P］ATP、Amersham社）を加えることによって開始させ、30℃で10分間持続させた。次にビーズをRIPA緩衝液で2回洗浄した。30μL/サンプルのタンパク質ローディング色素（3×Laemmli、5% SDS）を加え、サンプルを水浴中で5分間にわたり沸騰させた。タンパク質は8.5%ゲルでのSDS−PAGEによって分離し、Protran膜（Schleicher & Schuell社）上にトランスファーし、オートラジオグラフィーによって視認した。PKC活性のための陽性コントロールとして、ヒストンのリン酸化及びPKC基質ペプチドのリン酸化を使用した。
【０１４０】
特異的PKC活性は、SignaTECTプロテインキナーゼCアッセイシステム（Promega社、米国ウィスコンシン州マディソン）を製造業者の取扱説明書にしたがって使用して測定した。PKCα偽基質をこれらの試験における基質として使用した。
【０１４１】
コントロール製剤及び未処置細胞培養皿を比較して、製剤A中のPKCα阻害剤だけが過剰発現細胞におけるPKCα活性を有意に阻害することができた。実験は2回ずつ実施した。結果は、PKCαを過剰発現するコントロール細胞中のPKCα活性に比較してPKCα活性の減少率として図５に表示した。
【０１４２】
（実施例６）
様々な製剤でのインスリンにより媒介されるin vitro創傷閉鎖及び細胞増殖を評価するためにまた別の実験を実施した。
【０１４３】
マウスケラチノサイトは、上述したように単離して培養した。5日後、創傷治癒を追跡するために、コンフルエントなケラチノサイトをin vitroスクラッチアッセイにかけた。創傷形成後、インスリン（インスリン10-6M；0.1ユニット/mL）を上述した様々な製剤（製剤C及びD）中で細胞培養へ加えた。創傷閉鎖を48時間にわたり追跡した。この実験は3回ずつ実施した。代表的細胞培養皿は、図６Ａに示した。創傷閉鎖は、図６Ｂにおいて処置48時間後の閉鎖率として表示した。
【０１４４】
次に、創傷内での培養細胞の増殖は、チミジン取込みを利用して評価した（図６Ｃ）。細胞増殖は、6ウエルプレート内での［3H］チミジン取込みによって測定した。細胞には1時間にわたり24ウエルプレート内に配置し、［3H］チミジン（3μCi/mL）をパルスした。インキュベーション後、細胞はPBSで5回洗浄し、各ウエルには1時間にわたり5%TCAを加えた。この溶液を次に除去し、細胞を1M NaOH中に溶解させた。細胞内に取り込まれた標識化チミジンを液体シンチレーションカウンタの3Hウインドウ内で計数した。図６Ａ〜Ｃに示したように、KClの添加はインスリン誘導性創傷閉鎖及び細胞増殖を変化させた。
【０１４５】
（実施例７）
培地B中でのケラチノサイトのプレインキュベーションがin vitroでの細胞増殖にインスリン及びインスリン＋PKCα阻害剤が及ぼす作用に与える影響を評価した。成体マウス（7〜10カ月齢から2年齢）の尾由来の5日齢のコンフルエントなケラチノサイトの培養をin vitroで増殖させた。MEM （培地A）中での5日後、増殖培地を培地B（上記）と交換した。培地交換と平行して、又はその24時間後、細胞はインスリン又はインスリン＋PKCα阻害剤で処置した。細胞の増殖率は、市販で入手できるRapid Cell Proliferation Kit（製品番号QIA127；Calbiochem社）を用いて測定した。この実験は6回ずつ実施した。結果は、未処置細胞（コントロール）の百分率として表示した。図７から明らかなように、24時間にわたる培地B中での細胞のプレインキュベーションは、細胞増殖にインスリン及びインスリン＋PKCα阻害剤が及ぼす作用を増強する。
【０１４６】
（実施例８Ａ）
慢性足部潰瘍を有するヒト患者を製剤A（図８の下方パネルに示した結果）又は、製剤C（図８Ａの上方パネルに示した結果）を適用したインスリン＋PKCα阻害剤の局所的適用によって12週間にわたり毎日処置した。製剤Aで適用されたインスリン＋PKCα阻害剤は12週までに完全閉塞を示したが、製剤Cでインスリン＋PKCα阻害剤で処置された患者の潰瘍においては有意な治癒は所見されなかった。患者の創傷を週に1回追跡し、VISITRAK（登録商標）（Smith & Nephew社）を利用して測定した。創傷の幅及び創傷の長さのフォローアップグラフは両方の患者についての12週間の測定を示した（下方パネル）。
【０１４７】
（実施例８Ｂ）
糖尿病性創傷に罹患しているヒト患者を製剤A（図８Ｂの左側パネルに示した結果）又は製剤C（図８Ｂの右側パネルに示した結果）で適用したインスリン＋PKCα阻害剤の局所的適用によって60日間にわたり毎日処置した。製剤Aで適用されたインスリン＋PKCα阻害剤は60日までに完全創傷閉鎖及び治癒を示したが、製剤C中のインスリン＋PKCα阻害剤で処置された患者の創傷においては有意な治癒は所見されなかった。図８Ｂは、第0日及び第60日の創傷のフォローアップ資料を示している。
【０１４８】
（実施例９）
1年齢の雌性クォーターウマは、過増殖した肉芽の過増殖組織（肉芽proud flesh）創傷に罹患しており、1ヶ月間にわたり治癒が得られていなかった。この創傷を3カ月間にわたり製剤Aでのインスリン＋PKCα阻害剤により毎日処置した。この期間後、創傷は完全に閉鎖されて治癒した。6カ月後のフォローアップは、完全な組織再生を示した。これらの結果は、図9に示した。
【０１４９】
（実施例１０）
2年齢のウマは、骨髄炎を伴う慢性日光膿瘍と診断されたひづめ創傷を有していた。この創傷の治癒は、数カ月間にわたって発生しなかった。製剤Aでのインスリン＋PKCα阻害剤による毎日の処置は、30分間にわたる創傷への本組成物の直接適用によって実施した。図１０に示したように、処置の1カ月間以内に、創傷サイズは有意に減少し、2カ月間以内に創傷は完全に閉鎖されて治癒した。
【０１５０】
（実施例１１）
常性に舐めること（すなわち、肢端舐め（acral lick））に起因する足の創傷に罹患しているイヌを数カ月間にわたり従来型治療法を用いて処置したが、治癒は得られなかった。製剤Aでのインスリン＋PKCα阻害剤による毎日の処置を実施すると、創傷は完全に閉鎖され、2カ月以内に治癒した。処置の3.5カ月後、完全な毛皮の再生が観察された。これらの結果は、図１１に示した。
【０１５１】
（実施例１２）
インスリンアナログ単独が創傷治癒を促進できるかどうかを決定するために、製剤Aで調製された4つのインスリンアナログを試験した。全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷を、創傷上に直接配置される製剤A（上記）での0.1ユニット/mLの様々なインスリンアナログで毎日処置した。試験したインスリンアナログは、インスリンリスプロ（HumL）、インスリンアスパルト（Novo）、インスリングラルジン（LANTUS（登録商標））、及びHUMULIN（登録商標）R（HumR）であった。7日後、創傷を切除し、固定し、H&E染色後に組織学的に評価した。
【０１５２】
創傷治癒率は、表皮基底層形成及び肉芽組織形成の測定によって別個に評価した。表皮閉鎖は、表皮基底層形成を検出するためにケラチン14染色法を利用することによって評価した。完全な表皮再構築を示した創傷を、治癒したと見なした。肉芽組織形成は、H&E染色法を利用して評価し、創床での全創傷領域中に形成された肉芽組織の百分率にしたがってスコア付けした。70%を超える肉芽組織形成を示した創傷を治癒したと見なした。
【０１５３】
これらの結果は、コントロールに比較して、製剤A中のインスリンアナログ単独が創傷治癒及び創傷閉鎖を増加させることを証明している。これらの結果は、図１６に示した。図１６では、インスリンアナログは商標名の略称で記載されている：インスリンリスプロは「HumL」、インスリンアスパルトは「Novo」、インスリングラルジンは「LANTUS（登録商標）」、及びHUMULIN（登録商標）Rは「HumR」。
【０１５４】
（実施例１３）
相乗作用を識別するために、図１７に示したように、組換え型ヒトレギュラーインスリン及びUSPインスリン、PKCα偽基質阻害性ペプチドを用いた処置後の肉芽組織形成を評価することによって創傷治癒を測定した。
【０１５５】
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は、図１７に示した、製剤AでのPKCα偽基質阻害性ペプチド（1μg/mL）又は0.1ユニット/mLの組換え型ヒトレギュラーインスリン、USPインスリン、及びPKCα偽基質阻害性ペプチド（1μg/mL）により毎日処置し、及び創傷上に直接配置された。そして、た。7日後、創傷を切除し、固定し、H&E染色後に組織学的に評価した。
【０１５６】
肉芽組織形成は、H&E染色法を利用して評価し、創床での全創傷領域中に形成された肉芽組織の百分率にしたがってスコア付けした。70%を超える肉芽組織形成を示した創傷を治癒したと見なした。
【０１５７】
コントロール創傷もしくは各化合物単独が投与された場合と比較して、結果は、PKCα偽基質阻害性ペプチドと併用したUSPインスリンが、レギュラー組換え型ヒトインスリン＋PKCα偽基質阻害性ペプチドの併用に類似する創傷治癒への相乗作用を生じさせることを証明している。このデータは、インスリンアナログ及びPKCα偽基質阻害性ペプチドの併用が肉芽組織形成を促進して創傷を治療することに有用な可能性があることを示している。
【０１５８】
これらの結果は、図１７に示した。図１７では、レギュラー組換え型ヒトインスリン及びUSPインスリンは、各々略称「HumR」及び「Ins USP」によって表示した。PKCα偽基質阻害性ペプチドは、「pep」と表示した。
【０１５９】
（実施例１４）
インスリンアナログ、組換え型ヒトインスリン及びPKCα偽基質阻害性ペプチドを用いた治療が炎症に及ぼす作用を決定するために、これらの処置後の炎症を測定した。
【０１６０】
重症炎症のレベルは、C57BL/6Jマウス（1群マウス6匹）上の皮膚創傷部位で測定した。創傷は、上述したように切開によって作製した。毎日の処置は、図１８に示したように、製剤AでのPKCα偽基質阻害性ペプチド（1μg/mL）、0.1ユニット/mLの組換え型ヒトインスリン、又は0.1ユニット/mLのインスリンリスプロを用いて実施した。標準方法を用いてエマルジョンを調製し、薬物溶出スカフォールドとして機能するガーゼ包帯を用いて皮膚に送達した。7日後、皮膚組織を切除し、固定し、H&E染色後に組織学的に評価した。
【０１６１】
重症炎症は、以下のパラメータ（上記）を利用して評価した：
（１）膿瘍形成
（２）過剰な白血球増加症（固定視野（×200）内で＞100cell）
（３）20%を超える血管内のWBC含量が固定視野（×200）内で示される血管内での高WBC/RBC比。
【０１６２】
重症炎症の総百分率は、各検体について観察された上記のパラメータ各々によって記録したデータを統合することによって決定した。炎症負荷は、創傷間隙に上記のパラメータ3つのうちの少なくとも2つが存在する場合には重度と見なした。
【０１６３】
これらの結果は、コントロールに比較して、インスリンアナログ及び組換え型ヒトインスリンが、製剤A中でPKCα阻害性ペプチドと併用した場合に重症炎症皮膚における炎症反応の減少を相乗作用的に促進することを証明している。このデータは、図１８に示した処置は、例えば炎症性皮膚疾患によって誘発される炎症などの皮膚の炎症性障害を治療する際に使用できることを示している。このデータはさらに、本明細書に開示した医薬組成物を送達するためにエマルジョン製剤及び例えばガーゼスポンジなどの薬物溶出スカフォールドを使用できることも示している。
【０１６４】
これらの結果は、図１８に示した。図１８では、レギュラー組換え型ヒトインスリン及びインスリンリスプロは、各々略称「HumR」及び「HumL」と識別した。PKCα偽基質阻害性ペプチドは、「pep」と識別した。
【０１６５】
（実施例１５）
培地A及び培地B中でのケラチノサイトのインキュベーションならびにマウスビスファチン及びL−α−ホスファチジルイノシトール−3，4，5−トリホスフェート，ジパルミトイル−，ヘプタアンモニウム塩（L−α）（Calbiochem社、製品番号524615）がケラチン1の発現に及ぼす影響
【０１６６】
成体マウス（7〜10カ月齢から2年齢）の尾から単離した一次皮膚ケラチノサイトを上記の培地A（MEM ）中で維持した。（培地A）中での5日後、培養皿の半分の増殖培地を培地B（上記）と交換した。
【０１６７】
次にビスファチンもしくはL−αを図１９に示すように、各々個別に培地A中で培養した細胞（図１９Ａ）及び培地B中で培養した細胞（図１９Ｂ）に加えた。ビスファチンの培養培地中の最終濃度は、0.0001μg/mL（ビスファチン）であった。L−αの培養培地中の最終濃度は、100ng/mLであった。
【０１６８】
細胞分化は、上述したようにカルシウム含量を0.05mMから0.12mMへ上昇させることによって誘導した。分化の24時間後、細胞を採取し、ウエスタンブロット分析を実施した。ケラチン1に対して特異的な抗体を使用して、標準ウエスタンブロッティング技術を用いてケラチン1タンパク質の発現を評価した。ケラチン1の発現は、次に標準濃度計法を用いて定量した。
【０１６９】
ケラチン1は、有棘細胞分化マーカーである。ケラチノサイト内でのケラチン1の発現は、表皮ケラチノサイト内での有糸分裂活性の消失に関連しており、末端分化の中間工程に限定されている。減少したケラチノサイト分化には、ケラチノサイトの遊走及び増殖に関連し、したがって表皮形成に関連している。
【０１７０】
これらの結果は、コントロールサンプルと比較して、ケラチン1の発現が培地A中でのビスファチン及びL−αの両方を用いた処置後に減少したことを示した（図１９Ａ）。これとは対照的に、培地B中で培養したケラチノサイトのケラチン1発現は、ビスファチン又はL−αいずれの処置によっても有意には変化しなかった。（図１９Ｂ）。これらをまとめると、これらの結果は、例えばビスファチン又はL−αなどのインスリンアナログが、培地Aで提供された場合にはケラチノサイト分化を阻害して表皮形成を促進できることを示している。
【０１７１】
図面の詳細な説明
図１．様々な製剤で調製されたインスリン＋PKCα阻害剤を利用したin vitroでの創傷治癒の有効性。
5日齢の培養、コンフルエントなケラチノサイトin vitroスクラッチアッセイにかけ、創傷治癒を試験した。
創傷形成後、インスリン及びPKCα阻害剤（インスリン10-6M；0.1ユニット/mL）、Myr−偽基質PKCαペプチド（1μM）を上述した様々な製剤（製剤A〜C）中での細胞培養に加え、創傷閉鎖を追跡した。処置24時間後、未処置コントロールに比較して、製剤Aで提供されたインスリン＋PKCα阻害剤で処置された細胞のみが、創傷の閉鎖を示した。この実験は3回ずつ実施した。図１Ａは、代表的な細胞培養プレートの写真を示している。図１Ｂは、処置24時間後の創傷閉鎖率を示している（p<0.05）。
【０１７２】
図２．インスリン＋PKCα阻害剤は、製剤Aでのみ有意な創傷閉鎖を促進する。
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は上述したように様々な製剤（製剤A〜C）において創傷上へ直接適用するインスリン（10-6M；0.1ユニット/mL）、PKCα阻害剤（1μMの偽基質PKCαペプチド）、又はインスリン＋PKCα阻害剤（1μMの偽基質PKCαペプチド及び0.1ユニットのインスリン）を用いて毎日処置した。7日後、創傷を切除し、創傷の形態及び組織学を検査することによって治癒創傷の百分率を評価した。図２Ａでは、結果は、1群当たり全創傷当たりの治癒創傷の百分率として表示した。創傷の完全な治癒及び閉鎖は、製剤Aで適用されたインスリン＋PKCα阻害剤の処置によって誘導された。これとは対照的に、製剤B及び製剤Cを用いた場合は、創傷の辺縁閉鎖しか観察されなかった。全製剤条件について、インスリン又は偽基質ペプチド単独を用いた処置は、様々な製剤だけで処置されたコントロール群に比較して、創傷治癒有効性を促進しなかった。図２Ｂは、代表的な創傷生検からの写真を示している。
【０１７３】
図３．PKCα阻害剤は、製剤Aで投与された場合にのみ創床での重症炎症負荷を減少させる。
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は、上述した様々な製剤（製剤A〜C）で創傷上に直接適用されたPKCα阻害剤（偽基質PKCαペプチド（1μM））を用いて毎日処置した。7日後、創傷を切除し、組織学検査及び免疫組織化学検査にかけた。炎症負荷は、創傷間隙に以下のパラメータ３つのうちの少なくとも２つが存在する場合には重度と見なした：（１）創傷領域での膿瘍形成、（２）過剰な白血球増加症（固定視野（×200）内で＞100cell）、（３）20%を超える血管内のWBC含量が固定視野（×200）内で示される血管内での高WBC/RBC比。結果を要約し、群内の全創傷数当たりの重症炎症を備える創傷の百分率として表示した。棒グラフから明らかなように、PKCα阻害剤が製剤Aで適用された場合にのみ重症炎症の有意な減少が観察された。処置が製剤B又は製剤Cで適用された場合には、炎症負荷の減少は見られなかった。
【０１７４】
図４．インスリン＋PKCα阻害剤は、製剤Aで処置された場合に肉芽組織形成を誘導する。
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は、上述した様々な製剤（製剤A〜Ｃ）で創傷上に直接適用されたインスリン及びPKCα阻害剤（偽基質PKCαペプチド、1μM及びインスリン（0.1ユニット/mL））を用いて毎日処置した。7日後、創傷を切除し、固定し、H&E染色後に組織学的に評価した。肉芽組織形成は、H&E染色法を利用して評価し、創床での全創傷領域に比較して形成された肉芽組織の百分率にしたがってスコア付けした。製剤A中のインスリン＋PKCα阻害剤で毎日処置した創傷だけが、コントロール、製剤B及び製剤C処置群に比較して肉芽組織形成の有意な増加を示した。
【０１７５】
図５．製剤条件は、偽基質PKCαペプチドがPKCα活性を阻害する能力に影響を及ぼす。
5日齢の培養、コンフルエントなケラチノサイトを、PKCαをコードする組換えアデノウイルスで感染させた。感染の24時間後、細胞は図５に示したように製剤（製剤A及びB）で１5分間にわたりPKCα阻害剤（Myr−偽基質PKCαペプチド、1μM）により処置した。処置後、細胞を溶解させ、上述したようにPKCα活性アッセイにかけた。コントロールに比較して、製剤Aで提供されたPKCα阻害剤だけが過剰発現細胞におけるPKCα活性を有意に阻害することができた。実験は2回ずつ実施した。結果は、PKCαを過剰発現するコントロール細胞に比較してPKCα活性の減少率として表示した。
【０１７６】
図６．インスリンを利用するin vitroでの創傷閉鎖及び細胞増殖の有効性は、製剤含量に依存する。
5日齢の培養、コンフルエントなケラチノサイトをin vitroスクラッチアッセイにかけ、創傷治癒を試験した。創傷形成後、インスリン（10-6M；0.1ユニット/mL）を上述した様々な製剤（製剤C及びD）で細胞培養物へ加えた。創傷閉鎖を４8時間にわたり追跡した。実験は3回ずつ実施した。（Ａ）代表的な細胞培養皿の写真を示した。（Ｂ）創傷閉鎖は、処置４８時間後の閉鎖率として表示した。（Ｃ）増殖アッセイは、上述したチミジン取込み増殖アッセイを用いて創傷内の培養細胞上で実施した。インスリンは、KClを含む製剤Dで提供された場合は、それ自体が部分的創傷閉鎖及び細胞増殖を誘導した。製剤Cは、図６Ａ〜６Ｃから明らかなように、インスリン誘導性創傷閉鎖及び細胞増殖を阻害した。
【０１７７】
図７．培地B中でのプレインキュベーションは、インスリン及びインスリン＋PKCα阻害剤がin vitroでの細胞増殖に及ぼす作用を増強する。
成体マウス（7〜10カ月齢から2年齢）の尾から調製した5日齢のコンフルエントなケラチノサイトの培養を、市販で入手できるRapid Cell Proliferation Kit（製品番号QIA127；Calbiochem社）を利用した増殖アッセイにかけた。MEM 中で5日後、増殖培地は上記の培地Bと交換した。
培地交換に平行して、又はその24時間後、細胞をインスリン又はインスリン＋PKCα阻害剤で処置した。実験は、6回ずつ実施した。結果は、未処置細胞（コントロール）の百分率として表示した。24時間にわたる培地B中での細胞のプレインキュベーションは、図７に示したようにインスリン及びインスリン＋PKCα阻害剤が細胞増殖に及ぼす作用を増強する。
【０１７８】
図８．製剤Aで調製したインスリン＋PKCα阻害剤は慢性的な非治癒性創傷の創傷治癒を誘導するが、製剤Cで調製した場合は誘導しない。
例えば糖尿病随伴性足部及び手部潰瘍などの慢性糖尿病随伴性潰瘍を有する患者を、12週間にわたり製剤A（図Ａ、下方パネル）又は製剤C（図８Ａ、上方パネル）で適用したインスリン＋PKCα阻害剤の局所適用によって毎日処置した。製剤Aで適用したインスリン＋PKCα阻害剤は12週間後までに完全閉鎖を示したが、製剤C中のインスリン＋PKCα阻害剤で処置された患者の潰瘍では有意な治癒は所見されなかった。患者の創傷は、VISITRAK（登録商標）（Smith & Nephew社）を利用して週1回追跡し、測定した。創傷幅及び創傷長のフォローアップグラフは、両方の患者の12週間にわたる測定値について表示した（図８の右側パネル）。
糖尿病性創傷に罹患している患者を、60日間にわたり製剤A（図８Ｂ、右側パネル）又は製剤C（図８Ｂ、左側パネル）で適用したインスリン＋PKCα阻害剤の局所適用によって毎日処置した。製剤Aで適用されたインスリン＋PKCα阻害剤は、60日後までに完全治癒及び創傷閉鎖を生じさせた。製剤C中のインスリン＋PKCα阻害剤で処置された創傷では、有意な治癒は見られなかった。第0日及び第60日での創傷のフォローアップ写真は、図８Ｂに示した。
【０１７９】
図９．製剤A中で調製したインスリン＋PKCα阻害剤は、ウマにおける肉芽慢性創傷の治癒を誘導する。
1年齢の雌クォーターウマは、過増殖した肉芽組織（肉芽）創傷に罹患しており、1カ月間にわたり治癒が得られていなかった。創傷は、3カ月間にわたり製剤A中のインスリン＋PKCα阻害剤により毎日処置した。この期間後、創傷は完全に閉鎖して治癒した。6カ月後のフォローアップ検査では、完全な組織再生が観察された。
【０１８０】
図１０．製剤Aで調製したインスリン＋PKCα阻害剤は慢性日光膿瘍及び骨髄炎を治癒させる。
2年齢のウマは、骨髄炎を伴う慢性日光膿瘍であると診断されたひづめ創傷を有しており、1カ月間にわたり治癒が得られていなかった。製剤A中のインスリン＋PKCα阻害剤による毎日の処置は、30分間にわたる創傷への本組成物の直接適用によって実施した。図１０に示したように、創傷サイズは処置1カ月間以内に有意に減少し、創傷は2カ月間以内に完全に閉鎖して治癒した。
【０１８１】
図１１．製剤Aで調製したインスリン＋PKCα阻害剤は、自己外傷（肢端舐め）によって誘発された慢性創傷を治癒させる。
常に自分で舐め続けていることに起因する足の慢性肢端舐性創傷に罹患しているイヌは、従来方法を用いて治療されたが、数カ月間にわたって治癒が得られていなかった。この創傷を、局所適用される製剤A中のインスリン＋PKCα阻害剤により毎日処置した。2カ月間以内に、創傷は完全に閉鎖して治癒した。３．５カ月間以内に、完全な毛皮の再生が観察された。
【０１８２】
図１２．
商標名HUMALOG（登録商標）によって公知であるインスリンリスプロ（rDNA起源）の略図表示である。インスリンリスプロのα鎖（配列番号５７）及びβ鎖（配列番号５８）のアミノ酸配列を各々示した。
【０１８３】
図１３
商標NOVOLOG（登録商標）によって公知であるヒトインスリンアナログであるインスリンアスパルト（rDNA起源）の一次構造の略図表示である。インスリンアスパルトのα鎖（配列番号５７）及びβ鎖（配列番号５９）のアミノ酸配列を各々示した。
【０１８４】
図１４．
商標LANTUS（登録商標）によって公知であるヒトインスリンアナログであるインスリングラルジン（rDNA起源）の一次構造の略図表示である。LANTUS（登録商標）のα鎖（配列番号６０）及びβ鎖（配列番号６１）のアミノ酸配列を各々示した。
【０１８５】
図１５．
商標HUMULIN（登録商標）R及びNOVOLIN（登録商標）Rによって公知である組換え型ヒトレギュラーインスリンの一次構造の略図表示である。HUMULIN（登録商標）Rのα鎖（配列番号５７）及びβ鎖（配列番号６２）のアミノ酸配列を各々示した。
【０１８６】
図１６．様々なインスリンアナログは、製剤Aで提供されると同様に創傷治癒を生じさせる。
全層（長さ20mm）の皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は、創傷上に直接配置された製剤A（上記）で図６に示した0.1ユニット/mLのインスリンアナログを用いて毎日処置した。試験したインスリンアナログは、インスリンリスプロ（「HumL」）、インスリンアスパルト（「Novo」）、インスリングラルジン（「LANTUS（登録商標）」）、及び組換え型ヒトインスリン（「HumR」）であった。7日後、創傷を切除し、固定し、H&E染色後に組織学的に評価した。
創傷治癒率は、表皮基底層形成及び肉芽組織形成を測定することによって評価した。表皮閉鎖は、表皮基底層形成を検出するためにケラチン14染色法を利用することによって評価した。完全な表皮再構築を示した創傷を治癒したと見なした。肉芽組織形成は、H&E染色法を利用して評価し、創床での全創傷領域に比較して形成された肉芽組織の百分率にしたがってスコア付けした。70%を超える肉芽組織形成を示した創傷を治癒したと見なした。
インスリンアナログは、商標名の略称によって識別した：インスリンリスプロは「HumL」、インスリンアスパルトは「Novo」、インスリングラルジンは「LANTUS（登録商標）」、及びHUMULIN（登録商標）Rは「HumR」。
【０１８７】
図１７．PKCα阻害性ペプチドと組み合わされたUSPインスリンは、HUMULIN（登録商標）R＋PKCα阻害性ペプチドと同様に創傷治癒を促進する。
全層（長さ20mm）皮膚切開は、麻酔をかけたC57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）の上背部上で実施した。切開後、創傷は、製剤A（上記）中のPKCα偽基質阻害性ペプチド（1μg/mL）又は0.1ユニット/mLのHUMULIN（登録商標）RもしくはUSPインスリンを用いて毎日処置し、そして、これらは創傷上に直接配置された。7日後、創傷を切除し、固定し、H&E染色後に組織学的に評価した。
肉芽組織形成は、H&E染色法を利用して評価し、創床での全創傷領域に比較して形成された肉芽組織の百分率にしたがってスコア付けした。70%を超える肉芽組織形成を示した創傷を治癒したと見なした。
レギュラー組換え型ヒトインスリン及びUSPインスリンは、各々略称「HumR」及び「Ins USP」と識別した。PKCα偽基質阻害性ペプチドは、「pep」と識別した。
【０１８８】
図１８．PKCα阻害性ペプチドと組み合わせたインスリンアナログは、重度に炎症を起こした皮膚における炎症応答の減少を相乗的に促進する。
重症炎症のレベルは、C57BL/6Jマウス（1群当たりマウス6匹）上の皮膚創傷部位で測定した。創傷は、上述したように切開によって調製した。毎日の処置は、図１９に示したように製剤A（上記）中のPKCα偽基質阻害性ペプチド（1μg/mL）又は0.1ユニット/mLのHUMULIN（登録商標）Rもしくはインスリンリスプロを用いて実施した。エマルジョンを調製し、薬物溶出スカフォールドとして機能するガーゼ包帯からの送達によって皮膚上に配置した。7日後、皮膚組織を切除し、固定し、H&E染色後に組織学的に評価した。
重度の炎症は、下記のパラメータを利用して評価した。
（１）膿瘍形成
（２）過剰な白血球増加症（固定視野（×200）内で＞100cells）
（３）20%を超える血管内のWBC含量が固定視野（×200）内で示される血管内での高WBC/RBC比。
炎症負荷は、創傷間隙に上記のパラメータ３つのうちの少なくとも２つが存在する場合には重度と見なした。
重症炎症の総百分率は、各検体について観察された上記のパラメータ各々によって記録したデータを統合することによって決定した。
HUMULIN（登録商標）R及びインスリンリスプロは、各々、略称「HumR」及び「HumL」として識別した。PKCα偽基質阻害性ペプチドは、「pep」と識別した。
【０１８９】
図１９．培地A及び培地B中で、ビスファチン及びL−αを用いて処置された経時ケラチノサイトでのケラチン1の発現。
成体マウス（7〜10カ月齢から2年齢）の尾から調製した一次皮膚ケラチノサイトを培地A（MEM ）中で維持した。培地A中で5日後、培養皿の半分の増殖培地を培地B（上記）と交換した。ビスファチン又はL−αを次に培地A及び培地B中で培養した細胞へ提供した。
次に0.05mM〜0.12mMの培養培地中のカルシウムレベルを上昇させることによって細胞分化を誘導した。分化の24時間後、誘導した細胞を収集し、ウエスタンブロット分析を実施した。次に市販で入手できるケラチン1特異的抗体を使用して細胞溶解液中でのケラチン1の発現を評価した。発現は、標準ウエスタンブロッティング及び濃度計法を用いて評価した。
【０１９０】
本明細書で言及したすべての参考文献（例、学術論文、特許文書、及び目録番号）は、その内容全体が参考として援用される。
【０１９１】
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【図１Ａ】
0005411857.tif 000007
【図１Ｂ】
0005411857.tif 000008
【図２Ａ】
0005411857.tif 000009
【図２Ｂ】
0005411857.tif 000010
【図３】
0005411857.tif 000011
【図４】
0005411857.tif 000012
【図５】
0005411857.tif 000013
【図６Ａ】
0005411857.tif 000014
【図６Ｂ】
0005411857.tif 000015
【図６Ｃ】
0005411857.tif 000016
【図７】
0005411857.tif 000017
【図８Ａ】
0005411857.tif 000018
【図８Ｂ】
0005411857.tif 000019
【図９】
0005411857.tif 000020
【図１０】
0005411857.tif 000021
【図１１】
0005411857.tif 000022
【図１２】
0005411857.tif 000023
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
0005411857.tif 000029
【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【配列表】
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