(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物起源の材料に直接的にまたは間接的に曝露されたことがない異種非含有ｈＢＳ細胞株を増殖し維持する方法であって、該方法は、
ｉ）異種非含有培地中で、前記異種非含有ｈＢＳ細胞株を、異種非含有条件の下で得られたヒト包皮線維芽細胞支持細胞とともに共存培養することによって増殖し、２日間〜２０日間にわたる適切な間隔にて細胞を継代する工程、および
ｉｉ）ヒト包皮線維芽細胞支持細胞とともに共存培養された前記異種非含有ｈＢＳ細胞株を、適切な異種非含有支持マトリクスおよび異種非含有培地、ここで該異種非含有支持マトリクスは、組換えヒトゼラチン、組換えヒトフィブロネクチン、ヒト胎盤細胞外マトリクスからなる群より選択される、からなる異種非含有および支持細胞非含有培養系に移す工程を包含する方法。
【請求項２】
前記工程ｉ）の細胞の継代が機械的手順を使用することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程ｉ）の細胞の継代が１つ以上の組換え酵素を使用することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の組換え酵素が、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ、組換えトリプシン、および組換えコラゲナーゼからなる群より選択される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｉ）が５．０００Ｕ〜１０．０００Ｕの組換えトリプシンを０．５分間〜３０分間使用することにより行われる請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｉ）が未希釈の直ぐに使用できる濃度のＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを０．５〜１５分間使用することにより行われる請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
前記工程ｉ）が２００Ｕ／ｍｌの組換えコラゲナーゼを１分間〜４０分間使用することにより行われる請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｉｉ）において使用される異種非含有培地が前記工程ｉ）において用いられる異種非含有培地と同じであり得るかまたはそれとは異なり得る請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記工程ｉｉ）において使用される異種非含有培地が、ヒト支持細胞により馴化され得るか、または未分化の増殖を維持するために適切な因子が補充され得る請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記適切な因子が組換えｂＦＧＦおよびＷＮＴ経路の活性化因子からなる群より選択され得る請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ｉ）において使用される異種非含有培地がヒト内細胞塊の細胞の増殖に適した基本培地を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記基本培地がＤＭＥＭである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種非含有培地が２ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌの組換えｂＦＧＦをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種非含有培地が１％ｖ／ｖ〜３０％ｖ／ｖヒト血清をさらに含む請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安定な異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法、当該方法に従って得られる異種非含有ｈＢＳ細胞株、およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、それ自身を新しくする、および特異化されたまたは分化された細胞を生じる独特の能力を有する。心臓細胞または皮膚細胞のような、身体のほとんどの細胞が特異的な機能を行うよう拘束されるが、幹細胞は、それが特異的な細胞型に発達するためのシグナルを受けるまで未拘束のままである。幹細胞を独特にしているものは、特殊化されるようになるそれらの能力と合わせて、それらの増殖能力である。何年もの間、研究者たちは、喪失された、障害された、または罹患された細胞または組織を置き換えるために、幹細胞を使用するための方法を発見することに専念してきた。今までのところ、ほとんどの研究は、２つのタイプの幹細胞、胚性幹細胞および体性幹細胞に専念されている。胚性幹細胞は、着床前の受精卵母細胞、すなわち、胚盤胞に由来するのに対し、体性幹細胞は、成体器官、例えば、骨髄、表皮、腸に存在する。多分化能試験は、胚性または胚盤胞由来の幹細胞（以後、胚盤胞由来の幹細胞またはＢＳ細胞という）は、生殖細胞を含む、生物体の全ての細胞を生じ得たのに対し、体性幹細胞は、異なる細胞型においてより制限されたレパートリーを有することが示された。
【０００３】
おそらく、ｈＢＳ細胞の最も広範囲な適用の可能性は、いわゆる細胞治療のために使用され得る細胞および組織の生成である。多くの疾患および異常は、細胞機能の破壊、または身体の組織の破壊から生じる。今日、提供された器官および組織はしばしば、罹患したまたは破壊された組織を置き換えるために使用される。残念なことに、これらの方法による処置に適切な異常を被る人の数は、移植可能な器官の数をはるかに上回る。ｈＢＳ細胞の利用可能性およびこれらの細胞を異なる細胞運命、例えば、インスリン産生β細胞、心筋細胞、およびドーパミン産生ニューロン、に導くために効果的な方法を開発することに対する熱烈な研究は、糖尿病、心筋梗塞、およびパーキンソン病のような変性疾患の細胞ベースの処置における未来の適用についての益々の見込みを保持する。
【０００４】
しかし、現在利用可能な全てのヒト胚胞盤由来の幹細胞（ｈＢＳ）株は、それらの誘導および／または維持の間、いくつかの点で、動物材料に直接的にまたは間接的に曝露されている。患者において異種混入ｈＢＳ細胞を使用する１つの潜在的重要性は、移植片拒絶の可能性の増大である（Ｍａｒｔｉｎ  ＪＭら、２００５）。さらに、異種曝露は、任意の臨床的適用における非ヒト病原体の移入の危険性を増加する。従って、患者において異種に曝露されたｈＢＳ細胞を使用することに関連される予測される危険性は、臨床的適用についてこれらの細胞を不適切にする。これらの問題を克服するための試みにおいて、いくつかのグループは、支持非含有マトリクス（Ｘｕ  Ｃら、２００１）、または派生のためにヒト起源の支持細胞（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｍら、２００２、Ｉｎｚｕｎｚａ  Ｊら）、およびｈＢＳ細胞株の培養（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｍら、２００３）を使用してきた。しかし、完全な異種非含有系にｈＢＳ細胞株を導き、そして継続的に培養することは、これまでのところ可能でない。ｈＢＳ細胞を得、そして培養するために、完全に、異種非含有の、３つ主な問題が克服されなくてはならない。まず、異種非含有条件下での新規なｈＢＳ細胞株の派生についてのプロトコルが開発されなくてはならない。内細胞塊（ＩＣＭ）の単離は、免疫手術、モルモット血清の使用を包含する手順、により伝統的に行われてきた。本発明者らは、免疫手術手順が除外され得、それゆえＩＣＭ細胞の単離は動物成分への曝露を伴わずに行われ得ることを以前に報告している（Ｈｅｉｎｓら、２００４）。第２および第３は、異種非含有培地の使用と組合せた異種非含有培養系が必要である。これは、異種混入を引き起こす基本培地ではないが、一般的に使用される胎児ウシ血清（ＦＢＳ）または種々の動物タンパク質を含む血清置換物であるので、本発明者らはｈＢＳ細胞が長期間、ヒト血清中で培養され得るかどうか試験することにした。ｈＢＳ細胞培養のためのヒト血清の使用に対する以前の報告はほとんどなく、そして短期間、すなわち、１０継代未満についての培養安定性を示すのみである（Ｒｉｃｈａｒｄｓら、２００２および２００４）。他の研究者らにより報告される、ヒト血清補充培地を使用して未分化の状態にｈＢＳ細胞を維持するための困難性は、ヒトおよび合成成分を使用するｈＢＳ細胞培養系を開発する代わりに、異種非含有培養物、ならびに完全に規定された培養条件、すなわち、完全に公知の組成および濃度を有する培養培地（規定された培養培地）の開発を探求することを促した。しかし、本発明者らは、本明細書中に記載されるように、ヒト線維芽細胞および血清を含有する培養培地に基づいたｈＢＳ細胞の増殖のための系を開発し得た。ｈＢＳ細胞株ＳＡ１２１（ＷＯ２００３０５５９９２の手順に従って確立される）は現在、この血清ベースの培地中で５０継代を超えて首尾よく培養されている。
【０００５】
さらに、本発明者らは、完全に異種非含有のヒト支持細胞の派生および培養のための系を開発した。ヒト包皮線維芽細胞の支持細胞のような、異種非含有ヒト支持細胞の存在が以前に報告されているが、多くの場合において、ＦＢＳのような支持細胞は、支持細胞の実質的な確立および培養の間に動物材料と接触される。
【０００６】
本発明は、ヒトにまたは合成的に由来する成分のような、調節要件を満たす成分をのみ使用する、ｈＢＳ細胞の派生および培養の維持のための完全な異種非含有系の首尾よい開発を報告する。本明細書中に記載される方法は、動物成分への任意の直接的なまたは間接的な曝露を回避し、それにより完全な異種非含有ｈＢＳ細胞を得ることができ、細胞治療の開発のための制限されない供給源として、また、例えば、薬物発見および開発における、毒性試験における、他の適用のために、抗体およびワクチンのような医薬品の製造のために、さらに使用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法に関し、方法は以下：
ｉ）異種非含有手順により、胚盤胞から透明帯を除去し、栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊を得る工程、
ｉｉ）異種非含有手順により、栄養外胚葉を少なくとも部分的に除去して単離された内細胞塊の細胞を得る工程、
ｉｉｉ）内細胞塊の細胞を異種非含有培地中のヒト支持細胞の層上に置く工程、
ｉｖ）異種非含有培地中で約５日間から約５０日間、内細胞塊の細胞と、ヒト支持細胞とを共存培養する工程、
ｖ）もしあれば、栄養外胚葉過増殖から、内細胞塊の細胞またはそれらの由来する細胞を、異種非含有手順により解放する工程、
ｖｉ）内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を、異種非含有培地中のヒト支持細胞の新鮮な層に選択的に移して異種非含有ｈＢＳ細胞を得る工程、
ｖｉｉ）異種非含有培地中で、ヒト支持細胞と共存培養することにより、異種非含有ｈＢＳ細胞を増殖して異種非含有ｈＢＳ細胞株を得る工程を包含する。
【０００８】
特定の実施態様において、本発明は、上記のような異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法を提供するが、方法における開始点は、上記の任意の工程であり得、すなわち、本発明の方法は、工程ｉｉ）〜工程ｖｉｉ）、工程ｉｉｉ）〜工程ｖｉｉ）、工程ｉｖ）〜工程ｖｉｉ）、工程ｖ）〜工程ｖｉｉ）、工程ｖｉ）〜工程ｖｉｉ）、または工程ｖｉｉ）（または以下に記載されるように工程ｖｉｉｉ））を包含し得る。
【０００９】
本明細書中で使用されるように、用語「異種非含有」は、非ヒト動物起源の材料、例えば、細胞、組織、および／または体液、ならびにそれらの派生体に、直接的にまたは間接的に決して曝露されないことを意味するために意図される。
【００１０】
本発明に従って得られた異種非含有ｈＢＳ細胞株を維持するために、方法はさらに以下の工程
ｖｉｉｉ）異種非含有ｈＢＳ培地中で、異種非含有ｈＢＳ細胞株を、ヒト支持細胞とともに共存培養することによって増殖し、そして約２日間〜約２０日間、例えば、約４日間〜約１２日間にわたる適切な間隔にて細胞を継代する工程を包含し得る。
【００１１】
工程ｖｉｉｉ）において選択される間隔は、細胞増殖に依存する。
【００１２】
上記の工程ｖｉｉｉ）はまた、本発明の特定の局面である。
【００１３】
得られた異種非含有ｈＢＳ細胞株を、支持細胞非含有培養系において維持することが所望され得、従って本発明に従う方法は、さらに以下の工程
ｉｘ）異種非含有ｈＢＳ細胞株を、異種非含有および支持細胞非含有培養系に移す工程を包含する。
【００１４】
工程ｉｘ）は、ＷＯ２００４０９９３９４に従って行われ得、これは本明細書中に参考として援用される。
【００１５】
工程ｉ）
透明帯は、厚い細胞外マトリクスであり、糖タンパク質に富み、哺乳動物の卵子（卵）を取り囲む。工程ｉ）における栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊を得るための受精卵からの透明帯の除去は、ａ）酸性溶液、ｂ）例えばヒアルロニダーゼまたはプロナーゼのような組換え酵素、またはｃ）機械的手順を使用することにより行われ得る。透明帯の分解の過程後、顕微鏡において外観検査が行われ得る。
【００１６】
本明細書中で使用されるように、用語「栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊」は、工程ｉ）に受精卵を供した後に得られる材料を意味するために意図され、ここでは透明帯は、酸性加水分解、酵素的消化、または機械的手順により除去される。
【００１７】
本明細書中で使用される組換え酵素は、これらの酵素についてのヒトアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有することが意図され、すなわち、本明細書中で使用される組換え酵素は、ヒトアミノ酸配列を有するが、組換え的に産生される。
【００１８】
透明帯が、酸性溶液を使用することにより取り除かれる場合、胚盤胞は、約５秒間〜約１８０秒間、例えば、約１０秒間〜約１２０秒間、約１５秒間〜約９０秒間、約２０秒間〜約６０秒間、約３０秒間〜約５０秒間のように、酸性溶液に供される。
【００１９】
重要なことに、酸性溶液のｐＨは、透明帯の炭化水素構造を加水分解するに関して十分低く、すなわち、酸性溶液のｐＨは、約２〜約３、例えば約２．５〜約２．８、例えば２．５である。任意の適切な酸が使用され得る。本発明の好ましい実施態様において、酸性溶液は、ｐＨ２．５＋／−０．３を伴う酸タイロード溶液（Ｓｉｇｍａ）である。
【００２０】
透明体が、１つ以上の組換え酵素を使用することにより除去される場合、胚盤胞は、１つ以上の組換え酵素の溶液に供される。１つ以上の組換え酵素は、これらの酵素についてのヒトアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有することが意図される。
【００２１】
適切な酵素の例は、例えば、組換えプロナーゼ、組換えヒアルロニダーゼ、および組換えトリプシンである。工程ｉ）における適切な細胞酵素溶液のさらなる例は、組換えまたは異種非含有の、および潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ならびに組換えまたは異種非含有の、潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、およびＤＮアーゼ活性物、例えば、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の酵素溶液である。
【００２２】
適切な濃度および処理時間は、以下に与えられる：
プロテアーゼ：１０Ｕ／ｍｌ、約２〜約２０分間、例えば、約２〜約１０分間、約２分間〜約５分間、または約３〜４分間（最適）。
【００２３】
ヒアルロニダーゼ：７０．０００Ｕ／ｍｌ、約２〜２４０分間。
【００２４】
ヒト組換えトリプシン：５〜１０．０００Ｕ、約０．５〜約３０分間。
【００２５】
透明帯はまた、機械的手順により除去され得、ここでは例えばガラスキャピラリーが顕微鏡における外観検査のもとに使用される。
【００２６】
工程ｉｉ）
透明帯の除去後、胚盤胞の残されたもの、すなわち、栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊は、栄養外胚葉を少なくとも部分的に除去するために、工程ｉｉ）に供される。あるいは、自発的に孵化される胚盤胞は、直接的に工程ｉｉ）に供され得、それにより工程ｉ）を省略する。
【００２７】
工程ｉｉ）は、ａ）酸性溶液、ｂ）１つ以上の組換え酵素、またはｃ）機械的手順を使用することにより行われ得る。
【００２８】
工程ｉｉ）が酸性溶液を使用することにより行われる場合、工程ｉ）において得られた栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊は、約５秒間〜約１８０秒間、例えば、約１０秒間〜約１２０秒間、約１５秒間〜約９０秒間、約２０秒間〜約６０秒間、約３０秒間〜約５０秒間のように、酸性溶液に供される。
【００２９】
重要なことに、酸性溶液のｐＨは、栄養外胚葉のタンパク質構造を加水分解するに関して十分低く、すなわち、酸性溶液のｐＨは、約２〜約３、例えば約２．５〜約２．８、例えば２．５である。任意の適切な酸が使用され得る。本発明の好ましい実施態様において、酸性溶液は、ｐＨ２．５＋／−０．３を伴う酸タイロード溶液（Ｓｉｇｍａ）である。
【００３０】
栄養外胚葉が、１つ以上の組換え酵素を使用することにより少なくとも部分的に除去される場合、栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊は、１つ以上の組換え酵素の溶液に供される。１つ以上の組換え酵素は、これらの酵素についてのヒトアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する組換え酵素であることが意図される。
【００３１】
適切な酵素は、組換えタンパク質分解酵素、例えば、組換えトリプシンおよびＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを含むセリンプロテアーゼである。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを使用する場合、工程ｉｉ）は、典型的に、工程ｉ）において得られた栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊を、未希釈の直ぐに使用できる濃度のＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔに、約０．５〜約１０分間、例えば、約０．５〜約８分間、約０．５〜約５分間、約１〜約３分間、例えば１．５分間、供することにより行われる。組換えトリプシンを使用する場合、工程ｉｉ）は典型的に、工程ｉ）において得られた栄養外胚葉で囲まれた内細胞塊を、約５．０００Ｕ〜約１０．０００Ｕの組換えトリプシンに、約０．５分間〜約３０分間供することにより行われる。
【００３２】
工程（ｉｉ）における適切な細胞酵素溶液のさらなる例は、組換えまたは異種非含有の、潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ならびに組換えまたは異種非含有の、潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、およびＤＮアーゼ活性物、例えば、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の酵素溶液である。
【００３３】
栄養外胚葉はまた、機械的手順により少なくとも部分的に除去され得、これはガラスキャピラリーを切断道具として使用することにより行われ得る。内細胞塊の細胞の検出は、顕微鏡により、可視的に容易に行われ得る。
【００３４】
工程ｉｉｉ）
工程ｉｉｉ）において、工程ｉｉ）後に得られる材料は、典型的に、顕微鏡の下でガラスキャピラリーを使用することにより、ヒト支持層上に置かれる。さらに、必要であれば、ヒト支持層は、例えば、ＰＲＩＭＡＲＩＡ（登録商標）プラスチック皿のような適切な培養皿中に含まれ得る。必要であれば、皿の培養表面は、適切なマトリクス材料で、この材料が異種非含有であれば、コートされ得る。この情況における使用に適切な材料としては、組換えヒトゼラチンが挙げられる。
【００３５】
工程ｉｖ）
本発明に従う方法の工程ｉｖ）において、内細胞塊の細胞は、細胞集団を増殖するために、約５日間〜約５０日間、例えば、約５日間〜約３０日間、例えば、約５日間〜約２０日間、または約５日間〜約１５日間、共存培養される。本発明の１つの実施態様において、内細胞塊の細胞は、工程ｉｖ）において１０日間、共存培養される。
【００３６】
１回以上の培地交換が、工程ｉｖ）における内細胞塊の細胞の共存培養の間に、約２０％〜約１００％、例えば、約３０％〜約８０％、約４０％〜約６０％の培地を交換することにより行われ得る。本発明の１つの実施態様において、１回以上の培地の交換が、工程ｉｖ）における内細胞塊の細胞の共存培養の間に、約５０％の培地を交換することにより行われる。１回以上の培地の交換は、約２日間〜約１４日間、例えば、約４日間〜約７日間の間隔で行われ得る。
【００３７】
残余の栄養外胚葉細胞は、工程ｉｉｉ）において内細胞塊の細胞を置く場合、ヒト支持細胞層上に置かれ得たので、顕微鏡による外観検査が、栄養外胚葉が内細胞塊の細胞または内細胞塊由来の細胞の増殖を妨げるか否かを見るために、一定の間隔で行われ得る。細胞を工程ｖ）に持ち込むのに適切な時点は、顕微鏡における検査により、かなりの細胞増殖が数日にわたって注目される時である。
【００３８】
工程ｉｖ）において行われる内細胞塊の細胞の増殖の間、これらの細胞のいくつかは、胚盤胞由来の幹（ＢＳ）細胞へのそれらの形質転換を開始するかもしれない。従って、工程ｉｖ）において得られた細胞集団は、内細胞塊の細胞およびそれらの由来する細胞、すなわち、ＢＳ細胞を含み得る。
【００３９】
工程ｖ）およびｖｉ）
上記のように、内細胞塊の細胞およびそれらの由来する細胞は、残余の栄養外胚葉が混入され得る。この場合であれば、栄養外胚葉は、内細胞塊の細胞またはそれらの由来する細胞を取り囲む傾向がある。内細胞塊の細胞またはその由来する細胞は、ａ）機械的手順またはｂ）１つ以上の組換え酵素を使用することにより、このような栄養外胚葉過増殖から解放され得る。
【００４０】
適切な機械的手順は、ガラスキャピラリーを切断道具として使用することである。内細胞塊の細胞またはその由来する細胞は、顕微鏡における外観検査において選択的に切り出され、そして異種非含有培地中のヒト支持細胞の新鮮な層に移されて、異種非含有ｈＢＳ細胞を得る（工程ｖｉ）。
【００４１】
あるいは、もしあれば、栄養外胚葉過増殖から、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞は、工程ｖ）において、組換えトリプシンおよびＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを含む１つ以上の組換えタンパク質分解酵素を使用することにより解放される。工程ｖ）において組換えトリプシンが、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を解放するために使用される場合、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞は典型的に、約５．０００Ｕ〜約１０．０００Ｕの組換えトリプシンとともに、約０．５分間〜約３０分間インキュベートされる。工程ｖ）においてＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔが、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を解放するために使用される場合、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞は典型的に、未希釈の直ぐに使用できる濃度のＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔとともに、約０．５〜約１５分間インキュベートされる。
【００４２】
工程ｖ）およびｖｉ）における適切な細胞酵素溶液のさらなる例は、組換えまたは異種非含有の、および潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ならびに組換えまたは異種非含有の、潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、およびＤＮアーゼ活性物、例えば、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の酵素溶液である。
【００４３】
内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を栄養外胚葉から、もしあれば、解放した後、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞は、顕微鏡における外観検査において選択され、そして異種非含有培地中のヒト支持細胞の新鮮な層に移されて、異種非含有ｈＢＳ細胞を得る（工程ｖｉ）。
【００４４】
工程ｖｉｉ）
工程ｖｉｉ）において、異種非含有ｈＢＳ細胞は、ヒト支持細胞と共存培養することにより増殖されて、異種非含有ｈＢＳ細胞株を得る。１回以上の継代が、工程ｖｉｉ）における異種非含有ｈＢＳ細胞の増殖の間に行われ得、ここではｈＢＳ細胞は、顕微鏡における外観検査において選択的に継代される。これらの継代は、ガラスキャピラリーを切断道具として使用することにより行われ得る。あるいは、工程ｖｉｉ）における１回以上の継代は、１つ以上の組換え酵素、例えば、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ、組換えトリプシン、および／または組換えコラゲナーゼを使用することにより行われ得る。
【００４５】
ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを使用する場合、工程ｖｉｉ）は典型的に、未希釈の直ぐに使用できる濃度のＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを、約０．５〜約１５分間使用することにより行われる。
【００４６】
組換えトリプシンを使用する場合、工程ｖｉｉ）は典型的に、約５．０００Ｕ〜約１０．０００Ｕの組換えトリプシンを、約０．５分間〜約３０分間使用することにより行われる。
【００４７】
組換えコラゲナーゼを使用する場合、工程ｖｉｉ）は典型的に、約２００Ｕ／ｍｌの組換えコラゲナーゼを、約１分間〜約４０分間使用することにより行われる。工程（ｖｉｉ）における適切な細胞酵素溶液のさらなる例は、組換えまたは異種非含有の潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ならびに組換えまたは異種非含有の潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、およびＤＮアーゼ活性物、例えば、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【００４８】
個々の継代において使用される培地は、同じであるかまたは異なり得る。
【００４９】
工程ｖｉｉｉ）
異種非含有ｈＢＳ細胞株の増殖は、工程ｖｉｉ）において記載される増殖に従う。
【００５０】
本発明の１つの実施態様において、工程ｖｉｉｉ）における細胞の継代は、機械的解体により、例えば、ガラスキャピラリーを切断道具として使用することにより、行われ得る。あるいは、工程ｖｉｉｉ）における細胞の継代は、１つ以上の組換え酵素、例えば、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ、組換えトリプシン、および／または組換えコラゲナーゼを使用することにより行われ得る。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ、組換えトリプシン、および組換えコラゲナーゼを使用するための濃度およびインキュベーション時間は、工程ｖｉｉ）について記載されたようである。
【００５１】
工程（ｖｉｉｉ）における適切な細胞酵素溶液のさらなる例は、組換えまたは異種非含有の、および潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素、例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ならびに組換えまたは異種非含有の、潜在的に組み合わされるタンパク質分解酵素、コラーゲン分解酵素、およびＤＮアーゼ活性物、例えば、Ａｃｃｕｍａｘ（商標）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の酵素溶液である。
【００５２】
工程ｉｘ）
本発明の特定の実施態様において、得られたｈＢＳ細胞株は、工程ｉｘ）において異種非含有の、支持非含有細胞系に移され、当該培養系は、例えば、組換えヒトゼラチン、組換えヒトフィブロネクチン、ヒト胎盤細胞外マトリクスのような適切な異種非含有支持マトリクスと、ｈＢＳ細胞株の確立の際（工程ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖｉ）、ｖｉｉ））、またはヒト支持細胞上の維持の際（ｖｉｉｉ））に用いられた異種非含有培地と同じであり得るか、またはそれとは異なり得る、適切な異種非含有培地とを含み得る。ｈＢＳ細胞株の未分化の増殖を維持するために、異種非含有培地は、ヒト支持細胞により馴化され得るか、またはこれは、例えば、高濃度における組換えｂＦＧＦおよび／またはＷＮＴ経路の活性化因子のような、適切な因子が補充され得る。
【００５３】
ヒト支持細胞の調製
工程ｉｉｉ）、ｖｉ）、ｖｉｉ）、およびｖｉｉｉ）のいずれにおいても使用されるヒト支持細胞は、異種非含有条件下で得られる。ヒト支持細胞は、健常なヒト組織に由来し、そしてバイオプシーにより獲得され得る。
【００５４】
ヒト支持細胞が由来し得るヒト組織は、肺性、胎児、新生児、幼若、または成体の細胞を包含し、そしてこれはさらに、包皮を含む皮膚、臍帯、筋肉、肺、上皮、胎盤、卵管、腺、間質、または胸部に由来する組織を包含する。ヒト支持細胞は、ヒト線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、および上皮細胞からなる群に関する細胞タイプに由来し得る。ヒト支持細胞を派生するために使用され得る特定の細胞タイプの例は、胎性線維芽細胞、胚外内胚葉細胞、胚外中胚葉細胞、胎児線維芽細胞および／または線維細胞、胎児筋細胞、胎児皮膚細胞、胎児肺細胞、胎児内皮細胞、胎児上皮細胞、臍帯間葉細胞、胎盤線維芽細胞および／または線維細胞、胎盤内皮細胞、出生後ヒト包皮線維芽細胞および／または線維細胞、出生後筋細胞、出生後皮膚細胞、出生後内皮細胞、成体皮膚線維芽細胞および／または線維細胞、成体筋細胞、成体卵管内皮細胞、成体腺内皮細胞、成体子宮内膜間質細胞、成体乳ガン実質細胞、成体内皮細胞、成体上皮細胞、または成体ケラチン生成細胞を包含する。
【００５５】
本発明において使用される支持細胞はさらに、不死化され得るか、または遺伝的に改変され得る。支持細胞の不死化は、培養において理論的に無期限の数の分裂を介して増殖する能力の獲得を意味する。不死化を行うためのいくつかの方法があり、および１つのアプローチは、例えば、ウイルス、レトロウイルスで細胞を形質転換することであるか、および／またはテロメラーゼ逆転写酵素タンパク質（ＴＥＲＴ）の発現による。ＴＥＲＴは、ほとんどの細胞において不活性であるが、ｈＴＥＲＴが外因的に発現される場合、細胞は複製老化を回避するのに十分なテロメア長を維持し得る。
【００５６】
さらに、支持層はゲノムに取り込まれる特異的な遺伝子を有するように遺伝的に改変され得る。これらの遺伝子は、目的のマーカー、またはｈＢＳ細胞に有利であることが知られる生体分子、例えばｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）のような増殖因子の合成をコードし得る。
【００５７】
ヒト支持細胞がｈＢＳ細胞に由来する場合、ｈＢＳ細胞に由来する細胞は線維芽細胞であり得る。
【００５８】
本発明の１つの実施態様において、ヒト支持細胞は、新生児ヒト包皮に由来する。
【００５９】
本発明の特定の実施態様において、ヒト支持細胞は、線維芽細胞であり、好ましくはヒト新生児包皮線維芽細胞に由来する。
【００６０】
ヒト包皮サンプルは、割礼された男児から得ることができる。サンプルは、２×Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する滅菌ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のような、適切な滅菌培地中で無菌的に選択され得る。皮膚外殖片は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン−ストレプトミオシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、および１０％のヒト血清（Ｔａｌｌｈｅｄｅｎら、２００５）を含有する、２５ｃｍ２ｐｒｉｍａｒｉａ組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のような、組織培養フラスコ中に置かれる。約１０日後、コンフルエントな単層が確立される。細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して連続的に継代された。本発明者らは、各継代間の適切な期間は、約２〜約２０日間であり、通常、最大が２０継代のように、少なくとも１５継代が適切であることを見出した。増殖後、それらはマイコプラズマ、１型および２型ＨＩＶ、Ｂ型およびＣ型肝炎、サイトメガロウイルス、１型および２型単純ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、およびヒトパピローマウイルスを含むヒト病原体の標準パネルについて試験された。
【００６１】
異種非含有培地
培地は、ヒト内細胞塊の細胞の増殖に適切な任意の基本培地であり得る。１つの適切な培地は、１〜３０％ｖ／ｖヒト血清および２〜１００ｎｇ／ｍｌ組換えｂＦＧＦが補充されたＤｕｌｃｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地である（ＤＭＥＭ）。１つの実施態様において、基本培地は、２０％ｖ／ｖヒト血清を含む。別の実施態様において、基本培地は１０ｎｇ／ｍｌ組換えｂＦＧＦを含む。他の基本培地が、それらが液体の形態において栄養成分、すなわち、微量元素のような無機成分およびアミノ酸のような有機成分、塩、ビタミン、エネルギー提供剤、糖を含む炭水化物などを伴う基剤を、内細胞塊の細胞に提供する限り、使用され得る。重要なことは、培地は異種非含有である。
【００６２】
工程ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖｉ）、ｖｉｉ）、および／またはｖｉｉｉ）のいずれにおいても使用される異種非含有培地は、ヒト内細胞塊の細胞の増殖に適切な基本培地を含む。１つの適切な基本培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地である（ＤＭＥＭ）である。しかし、他の基本培地が同様に作用し得る。異種非含有基本培地に加えて、異種非含有培地はさらに、ヒト血清、組換えｂＦＧＦ、Ｌ−グルタミン、またはｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ペニシリン、および／またはストレプトマイシンを含み得る。
【００６３】
異種非含有培地におけるヒト血清の濃度は、好ましくは、約１％〜３０％ｖ／ｖのヒト血清、例えば、約１０％ｖ／ｖ〜約３０％ｖ／ｖヒト血清、約１５％ｖ／ｖ〜約２５％ｖ／ｖヒト血清、およびより好ましくは２０％ｖ／ｖヒト血清である。
【００６４】
異種非含有培地における組換えｂＦＧＦの濃度は、好ましくは、約２ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ組換えｂＦＧＦ、例えば、約５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ組換えｂＦＧＦ、約５ｎｇ／ｍｌ〜約２５ｎｇ／ｍｌ組換えｂＦＧＦ、約５ｎｇ／ｍｌ〜約１５ｎｇ／ｍｌ組換えｂＦＧＦ、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ組換えｂＦＧＦである。
【００６５】
異種非含有培地におけるＬ−グルタミンまたはＧｌｕｔａｍａｘ（登録商標）の濃度は、好ましくは、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば、約０．７５ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、例えば、２ｍＭである。
【００６６】
異種非含有培地における非必須アミノ酸の濃度は、好ましくは、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ、例えば、約０．０３ｍＭ〜約０．８ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．６ｍＭ、約０．０７ｍＭ〜約０．４ｍＭ、約０．０９ｍＭ〜約０．２ｍＭ、例えば、０．１ｍＭのようである。
【００６７】
異種非含有培地におけるβ−メルカプトエタノールの濃度は、好ましくは、約１０μＭ〜約２００μＭ、例えば、約２５μＭ〜約１７５μＭ、約５０μＭ〜約１５０μＭ、約７５μＭ〜約１２５μＭ、例えば、１００μＭである。
【００６８】
異種非含有培地におけるペニシリンの濃度は、好ましくは、約５単位／ｍｌ〜約２００単位／ｍｌ、例えば、約１０単位／ｍｌ〜約１５０単位／ｍｌ、約２５単位／ｍｌ〜約１００単位／ｍｌ、約２５単位／ｍｌ〜約７５単位／ｍｌ、例えば、約５０単位／ｍｌである。
【００６９】
異種非含有培地におけるストレプトアビジンの濃度は、好ましくは、約５μｇ／ｍｌ〜約２００μｇ／ｍｌ、例えば、約１０μｇ／ｍｌ〜約１５０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ〜約７５μｇ／ｍｌ、例えば、約５０μｇ／ｍｌである。
【００７０】
また、他の異種非含有培地が、増殖工程（ｖｉｉ）および（ｖｉｉｉ）におけるような、本発明の１つ以上の個々の工程において使用され得る。このような培地は、塩、ビタミン、エネルギー供給源（例えば、グルコース）、鉱物、およびアミノ酸を含み得る。培地に添加される適切な増殖因子は、例えば、ＧＡＢＡ，ピペコール酸、塩化リチウム、およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）、およびｂＦＧＦであり得る。さらに、その培地は化学的に規定され得る。従って、本発明において派生される異種非含有ｈＢＳ細胞株は、血清を含有する培地以外の培地において、継代培養または増殖され得る。
【００７１】
ヒト血清の調製
高質のヒト血清（Ｔａｌｌｈｅｄｅｎら、２００５）が、本発明者らの実験室において繰り返し産生された。血液は、病院の血液センターにて多数の標準病原体について試験された（ＢおよびＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、および梅毒）。
【００７２】
従って、工程ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖｉ）、ｖｉｉ）、およびｖｉｉｉ）のいずれにおいても使用されるヒト血清は、以下の工程により調製される
ａ）ヘパリンでコートされていないバッグ中に健常なヒト血液を回収する工程
ｂ）約０．５時間〜約５時間、例えば、約０．５時間〜約２時間、ヘパリンでコートされていないバッグを攪拌する工程、
ｃ）少なくとも１０時間、ほぼ５℃の温度にて、ヘパリンでコートされていないバッグをインキュベートする工程、
ｄ）必要に応じて、例えば、非凝固フィブリンの不在のような凝固の質、液相の不透明度に基づいて選択する工程
ｅ）凝固材料から血清を分離する工程
ｆ）工程ｄ）において得られた血清を滅菌濾過する工程
ｇ）少なくとも１５ドナーから血清をプールする工程
ｈ）使用の前に血清を凍結する工程。
【００７３】
本発明の特定の実施態様において、異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法は、以下の工程：
１）約１０秒間〜約１０分間、好ましくは約３０秒間〜約６０秒間、室温での、胚盤胞と酸タイロード溶液とのインキュベーションにより、透明帯および栄養外胚葉の少なくとも一部分を除去して、単離された内細胞塊の細胞を得る工程、
２）ＤＭＥＭ、ヒト血清、組換えｂＦＧＦ、Ｌ−グルタミン、またはｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含む異種非含有培地中のヒト包皮線維芽細胞の支持細胞の層上に内細胞塊の細胞を置く工程、
３）約５日間〜約１５日間、少なくとも５０％の異種非含有培地を３〜５日毎に交換して、内細胞塊の細胞と、ヒト包皮線維芽細胞の支持細胞とを共存培養する工程、
４）内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を、もしあれば、栄養外胚葉過増殖から、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を酵素処理として使用することにより、解放する工程、
５）内細胞塊またはその由来する細胞を、異種非含有培地中のヒト包皮線維芽細胞の支持細胞の新鮮な層に選択的に移して、異種非含有ｈＢＳ細胞を得る工程、
６）異種非含有ｈＢＳ細胞を、異種非含有培地中でヒト包皮線維芽細胞の支持細胞と共存培養することにより増殖して、異種非含有ｈＢＳ細胞株を得る工程、を包含する。
【００７４】
特定の実施態様において、本発明は、上記のように異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法を提供するが、方法における開始点は、上記の任意の工程であり得、すなわち、本発明の方法は、工程２）〜工程６）、工程３）〜工程６）、工程４）〜工程６）、工程５）〜工程６）、または工程６）（または以下に記載されるように工程７））を包含し得る。
【００７５】
工程６）において得られた異種非含有ｈＢＳ細胞株の維持は、さらなる工程
７）異種非含有培地中でヒト包皮線維芽細胞の支持細胞と共存培養することにより、異種非含有ｈＢＳ細胞株を増殖し、少なくとも５０％の異種非含有培地を３〜５日毎に交換し、そして適切な間隔にて、例えば３〜８日毎に細胞を継代する工程により行われ得る。
【００７６】
工程１）における透明帯の除去後に顕微鏡における外観検査が行われ得る。
【００７７】
上記の異種非含有培地における個々の成分の好ましい濃度に関する詳細および事項は、変更すべきところは変更して、工程２）、３）、５）、６）、および７）において使用される異種非含有培地に適用される。
【００７８】
工程３）において、外観検査は、栄養外胚葉が、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞の増殖を干渉するか否かをみるために、一定の間隔にて行われ得る。
【００７９】
本発明の１つの実施態様において、内細胞塊の細胞またはその由来する細胞は、顕微鏡における外観検査の際にガラスキャピラリーを切断道具として使用することにより、工程５）において選択的に移される。
【００８０】
工程７）における異種非含有ｈＢＳ細胞株の増殖に適切な継代間隔は、細胞増殖に依存し、そしてガラスキャピラリーを使用する手作業の移動により行われ得る。
【００８１】
さらなる局面
以下に記載される本発明のさらなる局面において、上記の主要な局面の下に記載される詳細および事項が、変更すべきところは変更してしかるべく適用される。
【００８２】
本発明の別の局面は、異種非含有ｈＢＳ細胞を得るための方法に関し、以下の工程：
ｉ）異種非含有手順により、透明帯を有しない胚盤胞から、栄養外胚葉を少なくとも部分的に除去して内細胞塊の細胞を得る工程、
ｉｉ）内細胞塊の細胞を異種非含有培地中のヒト支持細胞の層上に置く工程、
ｉｉｉ）異種非含有培地中で約５日間〜約５０日間、内細胞塊の細胞と、ヒト支持細胞とを共存培養する工程、
ｉｖ）もしあれば、栄養外胚葉過増殖から、内細胞塊の細胞またはそれらの由来する細胞を、異種非含有手順により解放する工程、
ｖ）内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を、異種非含有培地中のヒト支持細胞の新鮮な層に選択的に移して異種非含有ｈＢＳ細胞を得る工程、
ｖｉ）異種非含有培地中で、ヒト支持細胞と共存培養することにより、異種非含有ｈＢＳ細胞を増殖して異種非含有ｈＢＳ細胞株を得る工程を包含する。
【００８３】
本発明のなお別の局面は、異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法に関し、以下の工程：
ｉ）少なくとも部分的に栄養外胚葉非含有の内細胞塊の細胞を異種非含有培地中のヒト支持細胞の層上に置く工程、
ｉｉ）異種非含有培地中で約５日間〜約５０日間、内細胞塊の細胞と、ヒト支持細胞とを共存培養する工程、
ｉｉｉ）もしあれば、栄養外胚葉過増殖から、内細胞塊の細胞またはそれらの由来する細胞を、異種非含有手順により解放する工程、
ｉｖ）内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を、異種非含有培地中のヒト支持細胞の新鮮な層に選択的に移して異種非含有ｈＢＳ細胞を得る工程、
ｖ）異種非含有培地中で、ヒト支持細胞と共存培養することにより、異種非含有ｈＢＳ細胞を増殖して異種非含有ｈＢＳ細胞株を得る工程を包含する。
【００８４】
本発明のなお別の局面は、異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法に関し、以下の工程：
ｉ）異種非含有培地中で約５日間〜約５０日間、少なくとも部分的に栄養外胚葉非含有の内細胞塊の細胞と、ヒト支持細胞とを共存培養する工程、
ｉｉ）もしあれば、栄養外胚葉過増殖から、内細胞塊の細胞またはそれらの由来する細胞を、異種非含有手順により解放する工程、
ｉｉｉ）内細胞塊の細胞またはその由来する細胞を、異種非含有培地中のヒト支持細胞の新鮮な層に選択的に移して異種非含有ｈＢＳ細胞を得る工程、
ｉｖ）異種非含有培地中で、ヒト支持細胞と共存培養することにより、異種非含有ｈＢＳ細胞を増殖して異種非含有ｈＢＳ細胞株を得る工程を包含する。
【００８５】
本発明はまた、当該異種非含有ｈＢＳ細胞株を得るための方法とは別に、異種非含有ｈＢＳ細胞株の増殖および培養の維持に関する。本明細書中に記載されるヒト血清ベースの培地、およびヒト支持細胞は、変更すべきところは変更して、増殖の方法に適用され得る。さらなる詳細は、以下の工程ｖｉｉ）および工程ｖｉｉｉ）の下での記載から明らかである。
【００８６】
異種非含有ｈＢＳ細胞株の特徴づけ
本発明はさらに、本発明に従う方法により得られる異種非含有ｈＢＳ細胞株に関する。このような異種非含有ｈＢＳ細胞株は、任意の非ヒト動物材料に直接的にまたは間接的に決して曝露されておらず、方法の全ての工程における全ての成分がまた、任意の非ヒト動物材料、例えば、非ヒト哺乳動物に由来する任意の材料に曝露されていないことを意味する。従って、本発明に従って使用されたヒト支持細胞は、任意の非ヒト動物材料への任意の曝露を伴わずに派生され得る。ヒト起源の異種非含有ｈＢＳ細胞株の確立および維持の間に使用される任意の有機材料は、ヒト起源であるか、または合成、半合成、または組換えの材料であり得る。
【００８７】
本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞株は、自己再生および多分化能を適切な期間維持し、したがって、これは適切な期間安定である。この情況において、用語「安定な」は、本発明に従うヒト支持細胞の層上で増殖される場合、５０週間よりも多く、例えば、４０週間よりも多く、３０週間よりも多く、２０週間よりも多く、１５週間よりも多く、未分化の状態における増殖能力を示すことが意図される。従って、本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞株は、理論的に不死である。
【００８８】
本発明の方法に従う方法により得られる異種非含有ｈＢＳ細胞株は、分化された細胞の調製のために使用され得る。それゆえ、本発明はまた、このような分化された細胞に関する。
【００８９】
さらに、本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞または細胞株は、凍結および解凍を受け得る。特定の実施態様において、本発明において得られる異種非含有ｈＢＳ細胞株は、本明細書中で参考として援用されるＣｅｌｌａｒｔｉｓ、ＷＯ２００４０９８２８５により以前に示されるガラス化法に従って、凍結および解凍され得る。
【００９０】
ｈＢＳ細胞培養物の均質性を増すために、本発明において得られた細胞は、本明細書中に参考として援用されるＷＯ２００５０５９１１６において記載されるクローンの派生に供され得る。
【００９１】
本発明により得られる異種非含有ｈＢＳ細胞株は、一般的な要件を満たす。細胞株は、１つ以上の以下の、特に少なくとも以下の特徴の４、５、６、７、または８の特徴を有する
ｉ）分裂が不活性化された支持細胞上で増殖される場合、１５週間よりも多く、未分化の状態における増殖能力を示す、および／または
ｉｉ）正常な正倍数性の染色体核型を示す、および／または
ｉｉｉ）培養の間、安定な染色体核型を示す、および／または
ｉｖ）インビトロおよびインビボの両方で全てのタイプの胚葉の派生体に分化する可能性を維持する、および／または
ｖ）少なくとも２つの以下の分子マーカー、ＯＣＴ−４、アルカリホスファターゼ、カルボヒドレートエピトープＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ  １−６０、ＴＲＡ  １−８１、およびモノクローナル抗体ＧＣＴＭ−２により認識されるケラチン硫酸／コンドロイチン硫酸の細胞周囲マトリクスのプロテイングリカンのタンパク質核を示す、ならびに／または
ｖｉ）分子マーカーＳＳＥＡ−１または他の分化マーカーを示さない、ならびに／または
ｖｉｉ）その多分化能性を維持し、そして免疫不全マウスに注入される場合、インビボで奇形腫を形成する、ならびに／または
ｖｉｉｉ）分化し得る。
【００９２】
本発明の異種非含有ｈＢＳ細胞株は、少なくとも１つの、例えば、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、または少なくとも６つの以下の基準：Ｏｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４についてのポジティブな反応、ならびにＳＳＥＡ−１についてのネガティブな反応を示す。
【００９３】
以下の、分化段階に関して異種非含有ｈＢＳ細胞を特徴づけするための方法において、多分化能および核型が記載される。これらの方法は、本発明の方法に従って得られたｈＢＳ細胞が上記の基準を満たすか否かを調査するために使用され得る。
【００９４】
免疫組織化学
本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞は、それらの分化の状態を監視するために、未分化の細胞についての免疫組織化学的のマーカー、Ｏｃｔ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４に対して分析され得る。
【００９５】
アルカリホスファターゼ
アルカリホスファターゼおよびテロメラーゼ活性はしばしば、未分化のｈＢＳ細胞についてのマーカーとして考慮される。活性は、任意の利用可能な市販のキットにより測定され得る。
【００９６】
インビトロでの多分化能
異種非含有ｈＢＳ細胞株の多分化能は、２〜７日毎の培地の交換を伴う約３〜４週間の培養の間、組織皿においてコロニーを自発的に分化させることにより試験される。コロニーは、３つの異なる胚葉からの細胞を同定するために、免疫組織化学により分析される。適切な抗体は、外胚葉についてβチューブリン、中胚葉についてＡＳＭＡ（α平滑筋アクチン）、および内胚葉についてＨＮＦ３β（肝臓核因子３β）である。
【００９７】
インビボでの多分化能−奇形腫
ヒトｈＢＳ細胞株が多分化能を有したままであったか否かを分析するための１つの方法は、腫瘍、奇形腫を得るために免疫不全マウスに細胞を外殖することである。腫瘍において見出される種々のタイプの組織は、全ての３つの胚葉を示すべきである。重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を欠損する系統は、奇形腫形成の分析のために使用され得る。ヒトＢＳ細胞は、精巣中または腎臓被膜下のいずれかに外科的に置かれ得る。精巣または腎臓において、ＢＳ細胞は、１０  ０００〜１００  ０００細胞の範囲において移植され得る。腫瘍は通常、約１ヶ月後に触診可能である。次いで、マウスは１〜４ヶ月後に屠殺され、そして腫瘍が切り出され、そしてパラフィン−または凍結−切片法のために固定化される。続いて、腫瘍組織は免疫組織化学法により分析される。全ての３つの胚葉について特異的なマーカーが使用され得る。
【００９８】
遺伝子特徴づけ：染色体分析、および蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、およびテロメラーゼ活性
試験される異種非含有ｈＢＳ細胞株の染色体は、トリプシン−ＧｉｅｍｓａまたはＤＡＰＩ染色を使用して可視化され得る。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析について、第１２、１３、１７、１８、２０、２１染色体、および性染色体（ＸおよびＹ）についてのプローブを含む市販のキットが、製造業者の指示に従って、僅かな改変を伴って使用され得る。スライドは、適切なフィルターおよびソフトウェアを備える倒立顕微鏡においてさらに分析され得る。幹細胞、および胚盤胞由来の幹細胞はさらに、酵素テロメラーゼのそれらの活性について特徴付けられ得、これは例えば、テロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて試験され得る。キットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による産物の増殖によるテロメラーゼの内部活性、および酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いるその検出を使用する。テロメアーゼ活性は、ＱＰＣＲにより測定されても良い。
【００９９】
遺伝的特徴づけ：ＱＰＣＲ
本発明の細胞の分化の状態は、特異的遺伝子についてのＱＰＣＲによりさらに試験され得る。以下においてこれがどのように行われ得るのかを簡潔に記載する。未分化のまたは分化されたｈＢＳ細胞コロニーは、全コロニーとして培養プレートから機械的に分離され得、そしてＰＢＳ中で洗浄され得、そして−８０℃において保存され得る。ＲＮＡは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを、製造業者の指示に従い使用してさらに抽出され得る。それゆえ、逆転写が、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）においてＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（製造業者の指示に従う）のような、適切なキットを使用して行われ、そしてＱＰＣＲが適切な条件下で行われる。全ての遺伝子は同じ泳動において定量され得、そして−可能であれば−いくつかのサンプルの分化の状態が、遺伝子マーカーに基づく個々のサンプルについての数学的指数を算定することにより比較され得る。（より詳細なプロトコルは、ＷＯ２００６０９４７９８において記載される）。
【０１００】
ヒト病原体のパネルについての試験
本発明において使用される、支持細胞、血清、および胚盤胞のような個々の成分は、使用の前に、ならびに異種非含有ｈＢＳ細胞株は、一旦確立されると、ヒト病原体、例えば、マイコプラズマ、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎、サイトメガロウイルス、１型および２型単純ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、およびヒトパピローマウイルスについて試験され得る。ヒト病原体の不在は、もちろん、異種非含有ｈＢＳ細胞株および細胞、または細胞株に由来する他の生物学的材料の任意の臨床的使用に非常に重要である。
【０１０１】
シアル酸  Ｎｅｕ５Ｇｃ試験
本発明に従って派生される異種非含有ｈＢＳ細胞は、膜結合糖分子であるシアル酸Ｎｅｕ５Ｇｃについてさらに試験され得る。この試験のネガティブな結果は、非ヒト動物材料への直接的なまたは間接的な曝露が何ら生じなかったことの指標として見られ得る。
【０１０２】
本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞または細胞株の使用
本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞株は、その分化された派生体の調製、例えば、全ての３つの胚葉の前駆体細胞、および異なって分化された細胞タイプについて特有の特徴、例えば、肝細胞様特徴、心筋細胞様特徴、ニューロン様特徴を示すより分化された細胞を使用し得る。
【０１０３】
ＧＭＰ（良好な製造手順）産生
本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞株は、ＧＭＰ産生、例えば、ｈＢＳ細胞および／またはその分化された細胞の臨床的なＧＭＰ産生にさらに使用され得る。さらに、本明細書中に記載される異種非含有派生のための方法は、臨床的に適用可能な細胞株および派生体を提供するためのＧＭＰおよび／またはｃＧＭＰ条件下で行われ得る（Ｍａｒｔｉｎら、  Ｎａｔ．Ｍｅｄ  ２００５）。
【０１０４】
医学的使用
本発明に従う異種非含有ｈＢＳ細胞株、またはその分化された派生体は、医療において使用され得る。例えば、異種非含有ｈＢＳ細胞株またはその分化された派生体は、組織変性により引き起こされる病変および／または疾患の予防および／または処置のための医薬品を製造するために使用され得る。さらに、異種非含有ｈＢＳ細胞株、またはその分化された派生体は、代謝的な病変および／または疾患の処置および／または予防のための医薬品を製造するために使用され得る。
【０１０５】
本発明の方法に従う方法により得られるｈＢＳ細胞は、疾患の予防および／または処置について、哺乳動物への異種非含有ｈＢＳ細胞の移植のための医薬を製造するために使用され得る。特定の局面は、自家移植における異種非含有ｈＢＳ細胞の使用であり、すなわち、問題の特定の患者からのヒト材料のみが、異種非含有ｈＢＳ細胞および／または細胞株の調製において使用されている。
【０１０６】
多くの異なる種類の疾患が想定され得、ここでは本発明に従う異種非含有細胞または細胞株は使用に適切であり、肝臓疾患、心筋梗塞を含む心臓血管疾患；例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含む神経変性疾患のような変性疾患；糖尿病が挙げられる。
【０１０７】
このような医薬は、水性媒体のような薬学的に受容される媒体中に分散された未分化の異種非含有ｈＢＳ細胞または分化された異種非含有ｈＢＳ細胞を含み得る。媒体は、ｐＨ調節剤、安定化剤、保存剤、浸透圧調節剤、および生理学的に受容される塩からなる群より選択される１つ以上の添加剤；ならびに／または治療的に活性な物質、予防的に活性な物質、移植改良剤、生存能力改良剤、分化改良剤、および免疫抑制剤からなる群より選択される１つ以上の薬剤を含み得る。
【０１０８】
再生医療および細胞治療
それらの多分化能および十分に分化された組織細胞型および／または前駆体細胞型に分化する（特定の組織タイプに拘束される細胞型を増殖する）能力により、本明細書中で示される異種非含有法により派生されるような細胞は、再生医療に極めて有用であることが証明され得た。例えば多能性心臓前駆体細胞に対して、ある生物学的経路に沿って細胞を分化した後に、心臓関連疾患の処置が想定され得るか、または例えば、肝臓前駆体に対して細胞を分化した後に（例えば、ＷＯ２００６０３４８７３において示されるように）、肝臓関連疾患の処置が想定され得るか、または神経前駆体に対して細胞を分化した後に、神経疾患、例えば、多発性硬化症、低酸素傷害、虚血性傷害、外傷性傷害、パーキンソン病、および脱髄異常の処置が想定される。
【０１０９】
本明細書中に記載されるように得られる異種非含有ｈＢＳ細胞株に由来するさらなる前駆体細胞型は、心臓細胞型以外の例えば、骨および軟骨をまた生じる能力を備える中胚葉である得るか、またはβ細胞のような膵細胞型をまた生じる能力を備える内胚葉であり得る。
【０１１０】
心筋梗塞を被っている心臓において機能を回復するために、心筋細胞および新しい血管を置き換える必要がある。本明細書中で示される方法に従って派生されるｈＢＳ細胞のような、臨床的に適合されるｈＢＳ細胞株が利用可能であり、これらの細胞を前駆体細胞の派生のために使用することが可能であり、前駆体細胞は後にヒトにおいて移植され得、そして使用の可能性について評価され得る。このような前駆体細胞は、心筋梗塞の部位のような、変性された組織の細胞型にさらにインサイチュで分化する可能性を有し得る。
【０１１１】
さらに、異種非含有ｈＢＳ細胞株から分化された細胞は、例えば、壊死性の、アポトーシス性の、障害性の、機能不全性の、または形態学的に異常な心筋と関連される異常を処置するために使用され得る。このような異常としては、虚血性心疾患、心筋梗塞、リウマチ性心疾患、心内膜炎、自己免疫心疾患、心臓弁膜症、先天性心臓異常、心律動異常、および心不全が挙げられるが、これらに制限されない。これらの分化された細胞は、増殖し得、そして心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞を含む）に分化する可能性を有し、それゆえ、心筋梗塞から生じる虚血により引き起こされる心臓傷害を、逆転、阻害、または予防することにより、多数の心臓異常および疾患を処置するのに適切であり得る。
【０１１２】
なおさらなる局面において、本明細書中で示される異種非含有細胞から分化された細胞は、異常な心律動、例えば、心不整脈により特徴付けられる心臓異常を処置するために使用され得る。
【０１１３】
処置は、好ましくは、治療的に有効な用量の細胞を被験体の心臓に投与することにより、好ましくは心臓に注射することにより、行われ得る。治療的に有効な用量は、有利なまたは所望される臨床結果を生じるのに十分な量であり、この用量は１回以上の投与において投与され得た。注射は、心臓の種々の領域に投与され得、修復が必要とされる心臓組織のタイプに依存する。投与は、胸腔を切開した後にカテーテルベースのアプローチを使用して行われ得るか、または任意の適切な血管を介して投入され得る。細胞の有効な用量は、体重、年齢、生理学的状態、病歴、梗塞面積、および虚血の発生後の経過時間のような因子に基づき得る。細胞の投与は、好ましくは、被験体を免疫抑制レジメで、好ましくはこのような拒絶を阻害するように、このような投与の前に処置することを包含する。
【０１１４】
他の使用
本発明に従う方法により得られる異種非含有ｈＢＳ細胞株、またはその分化された派生体はまた、例えば、ヒト変性疾患のような、ヒト疾患を研究するためのインビトロモデルにおける使用にこれらが非常に適切であるので、医学研究のために使用され得る。
【０１１５】
異種非含有ｈＢＳ細胞自体、ならびにそれらに由来する細胞株および細胞集団の適用の可能性は、例えば、医薬品産業における薬物発見および薬物開発プロセスにおいて、ならびに全種類の化学薬品の毒性を試験するにおいて、見出され得る。今日、薬物候補の大規模なおよび高性能なスクリーニングは通常、化学結合親和性および特異性に対する情報を提供する生化学アッセイに依存するが、機能に対する情報はほとんどまたは全くない。機能的なスクリーニングは、細胞ベースのスクリーニングに依存し、そして通常、安価および迅速に、高容量にて産生され得る細菌または酵母のような、臨床的な関連性が不十分な生物体を使用する。各回のスクリーニングは、臨床的により優れた関連性のモデル種を使用するが、これらはより費用がかかり、そしてスクリーニングプロセスは時間を要する。ヒト原発細胞または不死化細胞型に基づくスクリーニング技術が存在するが、これらの細胞は、インビトロ培養および形質転換の結果としての生存機能の喪失に起因して供給または有用性が制限される。異種非含有ｈＢＳ細胞および操作された条件下で分化されたｈＢＳ細胞への接近手段は、ヒト細胞ベースのアッセイを、大容量であるが、臨床的な関連性を妥協することなく行う、新規なおよび独特な能力を提供する。
【０１１６】
異種非含有ｈＢＳ細胞は、高容量と改良された臨床的有意性とを組み合わせることにより、高処理能のスクリーニングにおいて使用され得る。ｈＢＳ細胞において、遺伝的に改変された細胞の種々の細胞型への分化を伴ってまたは伴わないで、遺伝子ターゲティングを使用してゲノムを正確に改変する能力は、一次および二次スクリーニングを介する新規な治療的に活性な物質の同定への、この技術の適用を許容する。
【０１１７】
従って、別の局面において、本発明は、本発明に従う方法により得られるｈＢＳ細胞の、以下に規定される使用に関する
ｉ）モノクローナル抗体の産生
ｉｉ）インビトロ毒性スクリーニング
ｉｉｉ）潜在的な薬物原料のインビトロスクリーニング、または
ｉｖ）潜在的な薬物原料の同定。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
異種非含有ｈＢＳ細胞の獲得および培養
臨床的な体外受精（ＩＶＦ）処置からの余剰なヒト胚は、インフォームドコンセント、およびエーテボリ大学での地方倫理委員会からの承認後に提供された。提供された胚は、５日齢まで、ＩＶＦ処置において伝統的に使用される培地中で、胚盤胞に培養された。胚盤胞は、Ｇａｒｄｎｅｒに従って４ＡＡとして、およびＷＯ２００３０５５９９２に従ってＡ品質の胚盤胞として等級付けされた（多くの異なる密集されたＩＣＭ細胞を伴う増殖された胚盤胞、および多くの細胞を伴う密集された栄養外胚葉）。胚盤胞は、約２７０のオスモル濃度で、２０％（ｖ／ｖ）ヒト血清、４ｎｇ／ｍＬヒト組換えｂＦＧＦ、１％ペニシリン−ストレプトミオシン、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌβ−メルカプトエタノール、および１％非必須アミノ酸が補充された、異種非含有血清を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中、マイトマイシン−Ｃ不活化の異種非含有ヒト包皮線維芽細胞の支持層上に内細胞塊の細胞を置く前に、透明帯および栄養外胚葉の部分を除去するために、酸タイロード溶液（Ｍｅｄｉｃｕｌｔ）溶液（すぐに使用できる濃度）で、１５〜３０秒間、室温において処理された（図１および２を参照のこと）。次いで、胚盤胞は、３７℃にて空気中の５％ＣＯ２濃度中で、インキュベートされた。培地の５０％が、２〜３日毎に交換され、そして１０日後、細胞は新鮮なｈＦＦ支持層に機械的に継代された。第２継代から、ｈＢＳ細胞（細胞株ＳＡ６１１）は、ガラスキャピラリーを切断および移動の道具として使用して、機械的に継代された。それらは、１週間に約１回継代され、そして優先出願時（２００５年１０月）に第１１継代よりも多く培養された。（図３を参照のこと）。総じて、異種非含有ＳＡ６１１  ｈＢＳ細胞株は、ＰＣＴ出願時（２００６年１０月）には第３０継代を超えて培養された。
【０１１９】
（実施例２）
ヒト包皮線維芽細胞の支持細胞株（例えば、細胞株ｈＦＦ００３）の確立
ヒト包皮サンプルは、割礼された８週例の男児から、２×ゲンタマイシンを含有する滅菌ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に無菌で回収された。皮膚外殖片は、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン−ストレプトミオシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、および１０％のヒト血清を含有する２５ｃｍ２のｐｒｉｍａｒｉａ組織培養フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の内部に置かれた。約１０日後、コンフルエントな単層が確立された。細胞は、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して連続的に継代された。増殖後、それらはヒト病原体（マイコプラズマ、１型および２型ＨＩＶ，Ｂ型およびＣ型肝炎、サイトメガロウイルス、１型および２型単純ヘルペスウイルス、エプスタインバールウイルス、ヒトパピローマウイルス）の標準パネルについて試験された。
【０１２０】
（実施例３）
支持層の調製
異種非含有ヒト線維芽細胞支持層をプレートする前に、組織培養ウェルは、０．１％組換えヒトゼラチン（Ｆｉｂｒｏｇｅｎ）で、最低１時間、室温にてコートされる。ＩＭＤＭ、１０％ヒト血清、および１％ペニシリン−ストレプトミオシン中で増殖された異種非含有ｈＦＦ００３（第５継代〜第８継代）細胞のコンフルエントな単層は、次いで、マイトマイシン−Ｃ（Ｓｉｇｍａ）で２．５時間処理された。マイトマイシン−Ｃで処理された支持層は、ＩＶＦウェル中（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に、１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清、１％ペニシリン−ストレプトミオシン、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌβメルカプトエタノール、および１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が補充されたＤＭＥＭ（上記）に基づく培地中で、２．８９ｃｍ２当たり２００  ０００細胞でプレートされた。胚盤胞を、それらの内細胞塊およびそれらに由来する細胞またはｈＢＳ細胞とともに置く前に、培地はＤＭＥＭ（上記）に交換され、ここでは代わりに２０％（ｖ／ｖ）ヒト血清、１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えｂＦＧＦ、１％ペニシリン−ストレプトミオシン、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌβメルカプトエタノール、および１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が補充された。（実施例１において記載される培地と同じ）。
【０１２１】
（実施例４）
血清ベースの培地の調製
ヒト血清は、約８℃にて一晩ヘパリンでコートされていないプラスチックバッグを回収することにより、少なくとも１５人の健常な個体からの血液サンプルから得られ（Ｂｌｏｄｃｅｎｔｒａｌｅｎ、Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、それにより血清は凝固材料から分離され得た。血清はさらに、滅菌濾過され、プールされ、そして適切な分量において凍結された。（使用の前に血液は、Ｂｌｏｄｃｅｎｔｒａｌｅｎ、Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにて、ＢおよびＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、および梅毒を含む病原体の標準バッテリーについて試験された）。培地は、２０％（ｖ／ｖ）の解凍血清を、実施例１において記載されるような他の成分とともに、ＤＭＥＭ（上記）に添加することによりさらに調製された。
【０１２２】
（実施例５）
異種非含有ｈＢＳ細胞のガラス化による凍結および解凍
ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１は、ＷＯ２００４０９８２８５において記載される方法に従っていくつかの継代、例えば、第２５継代において凍結および解凍されている。２つの溶液ＡおよびＢが調製される（溶液Ａ：Ｃｒｙｏ−ＰＢＳ中の滅菌濾過された１０％エチレングリコール、１０％ＤＭＳＯ；溶液Ｂ：Ｃｒｙｏ−ＰＢＳ中の滅菌濾過された０．３Ｍトレハロース、２０％エチレングリコール、１０％ＤＭＳＯ）。ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１の選択されたコロニーは、幹細胞切断道具（Ｓｗｅｍｅｄ  Ｌａｂｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｉｌｌｄａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、細胞が定期的な継代について切断されるのと同じ方法において切断された。細胞片は先ず、５００ｍｌの予め加熱された（３７℃）溶液Ａ中で１分間、インキュベートされ、次いで２５ｍｌの溶液Ｂに移され、そして３０秒間インキュベートされ、次いで、溶液Ｂの新鮮な液滴に再度移され、そして２０〜３０秒の間でインキュベートされる。容量は約４０〜５０μｌであった。細胞片は、ガラス化のために調製されたわら中に吸引され、次いでわらはボンドで密閉された。わらは、液体窒素中にさらに浸された。
【０１２３】
数日後、凍結されたＳＡ６１１を含むわらは、記載されるように解凍された：２つの溶液ＣおよびＤが調製された（溶液Ｃ：Ｃｒｙｏ−ＰＢＳ中の滅菌濾過された０．２Ｍトレハロース；溶液Ｄ：Ｃｒｙｏ−ＰＢＳ中の滅菌濾過された０．１Ｍトレハロース）。溶液ＣおよびＤ、ならびにｈＢＳ細胞培地は、３７℃に予め加熱された。ガラス化されたＳＡ６１１を含む密閉されたわらは、液体窒素タンクから取り出された。わらは、室温に１０秒間静置され、次いで４０℃の水浴中で迅速に解凍された（数秒内）。わらは、オートクレーブされたはさみを使用して、閉じられた端で切り開かれ、そして内容物は、シリンジを使用して、わらから溶液Ｃ中に押し出された。ｈＢＳ細胞は、１分間、５００μｌの溶液Ｃ中でインキュベートされ、そして５００μｌの溶液Ｄに移され、そして５分間インキュベートされた。立体顕微鏡の下、異種非含有血清ベースの培地中にｈＢＳ細胞片は迅速にリンスされ、次いで培養皿において、血清ベースの培地中の異種非含有ヒト線維芽の支持細胞の表面に播種された。次いで細胞は培養され（３７℃にてインキュベートされた）、そして確立された新規なコロニーの数が計数され、そしてガラス化後のｈＢＳ細胞の生存能を検証するために継代された。
【０１２４】
（実施例６）
異種非含有ｈＢＳ細胞株の特徴づけ
免疫組織化学的および組織化学的分析
ｈＢＳ細胞コロニー培養物は、４％パラホルムアルデヒド中に固定され、続いて細胞膜を浸透化された。連続的な洗浄およびブロッキング工程後、細胞は、一晩４℃にて、一次抗体とともにインキュベートされた。使用された一次抗体は、Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）に特異的であった。ＦＩＴＣ−またはＣｙ３結合二次抗体が検出のために使用された。核は、ＤＡＰＩ（Ｖａｃｔａｓｈｉｅｌｄ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｅｃｔｏｒｌａｂｓ．ｃｏｍ）で対比染色された。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性は、製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）に従って決定された。３つの異なる胚葉からの細胞を同定するために、免疫組織化学的分析が以下の抗体を用いて、上述で概説されるように行われた：内胚葉について、ＨＮＦ３β（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｉｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ）が使用された。中胚葉細胞は、ＡＳＭＡ（会社）により検出され、そして神経外胚葉細胞は、β−チューブリン−ＩＩＩ  ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）により同定された。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）反応は、市販のキットを使用し、そして製造業者のプロトコル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って検出された。未分化のコロニーにおけるポジティブな反応は、ＡＬＰ（図４を参照のこと）、Ｏｃｔ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４について検出されたが、ＳＳＥＡ−１（図５、６、８を参照のこと）はネガティブであった。（図４〜６を参照のこと）。
【０１２５】
染色体分析およびＦＩＳＨ
遺伝子特徴づけのために指定されたｈＢＳ細胞は、２つの継代についてマウス胚線維芽細胞に移されるか、またはＭａｔｒｉｇｅｌプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移され、そしてさらに約１０日間培養された。次いで細胞は、ＣａｌｙｃｕｌｉｎＡの存在下でインキュベートされ、遠心分離により回収され、低張処理により溶解され、そしてエタノールおよび氷酢酸を使用して固定された。染色体は、トリプシン−ＧｉｅｍｓａまたはＤＡＰＩ染色を使用して可視化された。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析のために、第１２、１３、１７、１８、２０、２１染色体、ならびに性染色体（ＸおよびＹ）についてのプローブを含む市販のキットが、製造業者の指示に従い、少しの改変を伴って使用された。スライドは、適切なフィルターおよびソフトウェアを備える逆位顕微鏡（ＣｙｔｏＶｉｓｉｏｎ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｉｍａｇｉｎｇｃｏｒｐ．ｃｏｍ）において分析された。ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１は第９〜１０継代にて遺伝的に特徴づけられた。核型分析により実証されるように、ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１は二倍体の正常な核型を有する。核型は４６ＸＹである。選択された染色体に対するＦＩＳＨ分析は、この知見を確認した。ＳＡ６１１の核型が正常と確認された。（図９を参照のこと）。
【０１２６】
インビトロでの多分化能
ＳＡ６１１の多分化能は最初に、ｈＢＳ細胞コロニーが支持層上で自発的に分化することを許容することによるか、または未分化のｈＢＳ細胞コロニーを、それらが自発的に分化することを許容されたＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）コート化プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移すことによるかのいずれかで、インビトロで試験された。両方の場合において、培地は、分化が誘導された場合にＶｉｔｒｏＨＥＳＴＭ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ、Ｋｕｎｇｓｂａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に切り替えられた。３〜４週間の培養後、コロニーは３つの異なる胚葉からの細胞を同定するために免疫組織化学により解析された。ポジティブな反応が、初期の内胚葉マーカーＨＮ３β（Ｆｏｘａ１ともまた呼ばれる）、外胚葉マーカーβ−チューブリン、およびＡＳＭＡ（α−平滑筋アクチン）について同定された。（ＨＮＦ３βおよびβ−チューブリン反応については図７、および全ての３つのマーカーについては図１０（Ｂ、Ｄ、Ｆ）を参照のこと。
【０１２７】
インビボでの多分化能
異種非含有ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１のインビボでの多分化能の性質を研究するために、未分化のｈＢＳ細胞の塊をＳＣＩＤマウスの腎臓被膜下に移植した。奇形腫内の外胚葉（神経外胚葉、図１０Ａ）、中胚葉（軟骨、図１０Ｃ）、および内胚葉（腸管様の上皮、図１０Ｅ）の組織の出現は、ＳＡ６１１が多能性ｈＢＳ細胞の特徴的なインビボ分化能力を示すことを実証する。
【０１２８】
まとめると、異種非含有ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１は、未分化の多分化能のヒトＢＳ細胞の遺伝型特徴および表現型特徴を安定に発現した。
【０１２９】
参考文献
ＷＯ２００４０９８２８５−密閉されたわらでのガラス化法によるヒト胚盤胞由来の幹細胞の低温保存。
【０１３０】
ＷＯ２００３０５５９９２−多分化能性のヒト胚盤胞由来の幹細胞株の確立のための方法。
【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】透明帯および栄養外胚葉の一部分を除去するための酸タイロード溶液での処置の前の胚盤胞を、４０倍の倍率において示す。
【図２】透明帯および栄養外胚葉の一部分を除去するための酸タイロード溶液での処置の後の胚盤胞を、４０倍の倍率において示す。
【図３】Ａ）第７継代、４日目のｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１を１０倍の倍率において示す。
【図４】未分化のｈＢＳ細胞マーカーＡ）ＡＬＰについてのポジティブな反応を示す。
【図５】未分化のｈＢＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−４についてのポジティブな反応、および分化されたｈＢＳ細胞マーカーＳＳＥＡ−１についてのネガティブな反応を示し、両方ともに第６継代および２０倍の倍率における。
【図６】未分化のｈＢＳ細胞マーカーＴｒａ  １−６０およびＴｒａ  １−８１についてのポジティブな反応を示し、両方ともに第６継代および２０倍の倍率における。
【図７】内胚葉マーカーＨＮＦ−３βについての、および神経外胚葉マーカーβチューブリンについての、２１〜２８日間の自発的な分化を受けた後の第６継代におけるポジティブな反応を、２０倍の倍率において示す。
【図８】異種非含有ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１のさらなる形態学的および免疫組織的な化学特徴を示す。（Ａ）は、胚盤胞を示す（尺度＝２５μｍ）。（Ｂ）は、異種非含有条件下で第１２継代後のＳＡ６１１の構造を示す（尺度＝１００μｍ）。（Ｃ〜Ｈ）は、Ｏｃｔ−４（Ｃ）、ＳＳＥＡ−１（Ｄ）、Ｔｒａ  １−６０（Ｅ）、Ｔｒａ  １−８１（Ｆ）、ＳＳＥＡ−３（Ｇ）、ＳＳＥＡ−４（Ｈ）を使用した、第１２継代後の未分化のＳＡ６１１の免疫蛍光を示す（（Ｃ）および（Ｅ）における画像は、異なる二次抗体を使用する二重染色の画像であることに留意のこと）。尺度＝（Ｃ）、（Ｅ）、および（Ｇ）において５０μｍ、ならびに（Ｆ）および（Ｈ）において１００μｍ。
【図９】第９継代における異種非含有ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１の遺伝子特徴を示す。（Ａ）は、染色体が二倍体および正常であることを示す。（Ｂ）および（Ｃ）は、ＳＡ６１１からの選択された染色体の蛍光インサイチュハイブリダイゼーションを示し、これは細胞はＸＹであり、そして正常な第１２および第１７染色体について二倍体であったことを実証する。（Ｃ）青色においてＸ染色体、金色においてＹ染色体、赤色において第１３染色体、水色において第１８染色体、および緑色において第２１染色体をさらに示す（黒色および白色において可視化することはほとんど不可能である）。
【図１０】（Ａ）、（Ｃ）、および（Ｅ）においてインビボでの、ならびに（Ｂ）、（Ｄ）、および（Ｆ）においてインビトロでの、異種非含有ｈＢＳ細胞株ＳＡ６１１の多分化能性の確認を示す：異種非含有条件下で第１１継代後のＳＡ６１１からの奇形腫の組織学的分析：（Ａ）神経外胚葉（外胚葉）、（Ｃ）軟骨（中胚葉）、（Ｅ）腺上皮（内胚葉）。インビトロで分化されたＳＡ６１１は、継代の２〜４週間後に免疫蛍光により分析された：（Ｂ）β−ＩＩＩ−チューブリンポジティブなニューロン（外胚葉）、（Ｄ）ＡＳＭＡポジティブな平滑筋アクチン（中胚葉）、および（Ｆ）ＨＮＦ３β（Ｆｏｘａ２）−ポジティブな細胞（内胚葉）。尺度５０μｍ（Ａ、Ｂ，Ｄ、Ｅ，Ｆ）、尺度１００μｍ（Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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