(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）フィラステリデス・ディセントラーチ（Philasterides dicentrarchi）Iyo I株、JF05To株、RF05To株、及びSK05Kyo株からなる群から選んだ株の不活化物、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株の不活化物、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株の不活化物を有効成分とする、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチン。
【請求項２】
請求項１に記載の混合ワクチンを、スクーチカ症の予防又は治療の必要な対象に、有効量で投与することを含む、魚類のスクーチカ症の予防又は治療方法。
【請求項３】
（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株、JF05To株、RF05To株、及びSK05Kyo株からなる群から選んだ株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株の、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチンの製造における使用。
【請求項４】
（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株、JF05To株、RF05To株、及びSK05Kyo株からなる群から選んだ株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株を、それぞれ単独で、あるいは、２つ以上を組合せて、不活化する工程、並びに、
得られた不活化物を混合する工程
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の混合ワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクーチカ症の予防又は治療に有効なワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
魚類寄生虫病の１つであるスクーチカ症は、日本では1990年に初めてヒラメで発症が認められている。我が国の2004年の養殖ヒラメ生産額は約93億円である。このうち約20%を占める愛媛県の魚病指導センターにおけるヒラメ魚病診断件数に占めるスクーチカ症の診断率は年間15〜20%程度と高く、本症による死亡率は30〜70%と推定されている。本症に対する治療・予防法は確立されておらず、本症の発生が原因でヒラメ養殖の廃業を余儀なくされる業者もあるなど、ヒラメ養殖業にとって重要な魚病となっているのが現状である。その後、日本国内だけではなく、韓国においてもヒラメの養殖場において発症例が確認されている。そのため、ヒラメの養殖現場において最も開発が望まれている感染症である。これまで本症の原因となるスクーチカ虫は、Uronema marinumであると報告されていたが、その後、スクーチカ症のヒラメから様々な種類のスクーチカ虫が分離されている。【０００３】
近年、本発明者のグループが形態学的・遺伝子的同定を行った結果、Philasterides dicentrarchi（本学名はMiamiensis avidusとシノニムである）が本症の主原因であることを明らかにした（非特許文献１）。さらには、本発明者のグループは、P. dicentrarchiを用いた実験感染により、ヒラメに対する本虫の高い病原性を確認している（非特許文献２）。【０００４】
このP. dicentrarchiを含むスクーチカ虫を駆除するために、種々の治療方法が試験されている。例えば、ホルマリンなどによる浸漬による殺虫効果（非特許文献３）を確認したり、過酸化水素を含む薬浴による治療方法による効果（特許文献１）を確認したりしているが、P. dicentrarchiの場合は内部寄生性で宿主魚類の脳内にまで侵入するために、十分な効果が得られているとは言えない。
そのような状況の中で本虫のホルマリン不活化ワクチンがスクーチカ症に有効であること（特許文献２、非特許文献４および５）や特定の金属を欠如させた淡水浴による予防・治療方法が報告されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８８２９３９号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００８／０８４１２５号公報
【特許文献３】特開２００６−３０６８３４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】平成１６年度日本魚病学会大会講演要旨集、６５頁、２００４年
【非特許文献２】Diseases of Aquatic Organisms、７３巻、２２７〜２３４頁、２００７年
【非特許文献３】愛媛県水産試験場研究報告、第６号、６５〜７０頁、１９９７年
【非特許文献４】平成１７年度日本魚病学会大会講演要旨集、Ａ−２９、３７頁、２００５年
【非特許文献５】Journal of Fish Pathology,（韓国）,１９巻、２号、１７３〜１８１頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、スクーチカ症に有効であるといわれる従来のワクチンであっても、その効果は十分なものであるとは言えず、更なる有効性の高いワクチンの開発が望まれている。特に、本発明者のグループは、本発明において、P. dicentrarchiに３つの血清型が存在し、単一のワクチンでは、その他の血清型の本虫の感染を予防できないことを明らかにした。そこで、本発明は、スクーチカ症、特には、斃死率の高いP. dicentrarchiの感染に対して、有効的に予防・治療可能なワクチンを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究を進めた結果、３種類の異なる血清型の本虫によって得られるワクチンを組合せてなる本発明の混合ワクチンが、P. dicentrarchiに対する有効性を飛躍的に向上させるものであり、単一のワクチンでは予防できない本虫の感染に対しても、有効な予防・治療を発揮することを見出し、本発明の混合ワクチンを完成させたものである。【０００９】
本発明は、
［１］（１）フィラステリデス・ディセントラーチ（Philasterides dicentrarchi）Iyo I株と同じ血清型を示す株の不活化物、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株の不活化物、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株の不活化物を有効成分とする、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチン；
［２］フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株が、Iyo I株、JF05To株、RF05To株、及びSK05Kyo株からなる群から選んだ株である、［１］に記載の混合ワクチン；
［３］［１］又は［２］に記載の混合ワクチンを、スクーチカ症の予防又は治療の必要な対象に、有効量で投与することを含む、スクーチカ症の予防又は治療方法；
［４］（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株の、スクーチカ症の予防又は治療用の混合ワクチンの製造における使用；
［５］（１）フィラステリデス・ディセントラーチ Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）フィラステリデス・ディセントラーチ Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）フィラステリデス・ディセントラーチ Mie0301株と同じ血清型を示す株を、それぞれ単独で、あるいは、２つ以上を組合せて、不活化する工程、並びに、
得られた不活化物を混合する工程
を含むことを特徴とする、［１］又は［２］に記載の混合ワクチンの製造方法
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、斃死率の高いP. dicentrarchiの感染を含むスクーチカ症の予防・治療に対する有効性の高いワクチンである。より詳細には、本発明によれば、食品を前提に飼育されている養殖魚類に投与しても問題のない安全な魚類用ワクチンを提供できる。本発明の不活化ワクチンは、その抗原を得る過程においてP. dicentrarchiが容易に量産できること、及び不活化方法も単純であることから簡便かつ低コストの工程で製造することができる。さらに、製造されたワクチンは、P. dicentrarchiに起因するスクーチカ症に対する感染防御能力を誘導することができる。したがって、養殖産業とその関連産業における生産性と品質向上、および養殖における環境衛生の改善に多大に寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Iyo I株（レーン１）、JF05To株（レーン２）、RF05To株（レーン３）、SK05Kyo株（レーン４）、Nakajima株（レーン５）、Mie0301株（レーン６）および抗Iyo I株、SK05Kyo株、Nakajima株、Mie0301株血清を用いたウエスタンブロッティングの結果を示した図である。図のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄはそれぞれ抗Iyo I株、SK05Kyo株、Nakajima株、Mie0301株血清の反応プロファイルである。なお、図１の最左側のレーンは分子量マーカーを表す。
【図２】３種混合ワクチンを接種したヒラメへのIyo I株（4.03×104cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。■は3種混合ワクチン接種区を示し、◆はＭＥＭ対照区を示している。
【図３】３種混合ワクチンを接種したヒラメへのNakajima株（4.03×104cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。■は3種混合ワクチン接種区を示し、◆はＭＥＭ対照区を示している。
【図４】３種混合ワクチンを接種したヒラメへのMie0301株（4.03×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。■は3種混合ワクチン接種区を示し、◆はＭＥＭ対照区を示している。
【図５】Iyo I、Nakajima及びMie0301の各単一ワクチンを接種したヒラメへのIyo I株（6.12×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●、■、▲、○は、Iyo I株、Nakajima株、Mie株、ＭＥＭ対照区を示している。
【図６】Iyo I、Nakajima及びMie0301の各単一ワクチンを接種したヒラメへのNakajima株（6.12×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●、■、▲、○は、Iyo I株、Nakajima株、Mie株、ＭＥＭ対照区を示している。
【図７】Iyo I、Nakajima及びMie0301の各単一ワクチンを接種したヒラメへのMie株（6.12×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●、■、▲、○は、Iyo I株、Nakajima株、Mie株、ＭＥＭ対照区を示している。
【図８】３種混合ワクチンを接種したヒラメへのIyo I株（3.06×105cells/fish）による攻撃試験の経日的累積死亡率変化を示したグラフである。●は3種混合ワクチン接種区を示し、■はＭＥＭ対照区を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に使用される各株の不活化物、すなわち、不活化ワクチンは、常法に従って調製することができ、例えば、次のように調製することができる。P. dicentrarchi（以下、本虫という。）に魚類株化細胞ＣＨＳＥ−２１４（ATCC No. CRL-1681；北海道大学大学院水産科学研究院海洋応用生命科学部門  吉水永守教授より分与）を摂食させ、２０℃で５日間静置培養する。魚類株化細胞ＣＨＳＥ−２１４は、ＣＨＳＥ−２１４細胞用培地［１０％牛胎児血清を処方したイーグルＭＥＭ（Minimum Essential Medium）培地（日水製薬製：製品コード05900）を炭酸水素ナトリウムでｐＨ７．３に調整したもの］を用いて２０℃で単層になるまで培養する。このように培養した本虫を遠心分離により集め、不活化剤、例えば、ホルマリン、グルタルアルデヒド、β−プロピオラクトンなどを加えて不活化する。たとえば、ホルマリンの例では、３５％ホルマリン液を終濃度が０．３％となるように加え、４℃の温度下で一晩不活化する。ただし、不活化により、抗原性が損なわれる場合は不活化条件を緩和する。たとえば、不活化剤の減量、pH緩衝剤の添加、不活化温度を低下する等が挙げられる。
【００１３】
ここで使用する原虫としては、（１）Philasterides dicentrarchi Iyo I株と同じ血清型を示す株、（２）Nakajima株と同じ血清型を示す株、及び（３）Mie0301株と同じ血清型を示す株、すなわち、互いに異なる血清型を示す３種類の株を使用する。Iyo I株と同じ血清型を示す株としては、例えば、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株を使用することができる。
これらの株は、本発明者のグループが単離・同定したものであり、その詳細を表１に示す。
【００１４】
【表１】
0005598820.tif 000002
【００１５】
Iyo I型（セロタイプＩ型）では、抗Iyo I株ウサギ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った時（図１Ａ及び図１Ｂ）、30kDaに強く反応するタンパク質が検出される（レーン１〜４）。一方、抗Nakajima株ウサギ抗体（図１Ｃ）および抗Mie0301株ウサギ抗体（図１Ｄ）では、このようなタンパク質が検出されない。
Nakajima型（セロタイプII型）では、抗Nakajima株ウサギ抗体および抗Mie0301株ウサギ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った時（図１Ｃ及び図１Ｄ）、38kDaに強く反応するタンパク質が検出される（レーン５）。
Mie0301型（セロタイプIII型）では、抗Nakajima株ウサギ抗体および抗Mie0301株ウサギ抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った時（図１Ｃ及び図１Ｄ）、34kDaに強く反応するタンパク質が検出される（レーン６）。
【００１６】
本発明で用いる本虫の形態学的特徴は、約３０×４００μｍの楕円形で、繊毛を有する。他の繊毛虫と異なり、組織食性であり、細菌類だけではなく、動物細胞（例：魚類株化細胞）を摂食する。また、本虫は分類学上、アンキスツルム目（Scuticociliatida）、フィラスタ亜目（Philasterina）、フィラスター科（Philasteridae）に分類される。
本発明で用いる本虫の継代培養は、２０℃の保存下で一ヶ月に一度、フレッシュな細胞に継代する。少なくとも数日に一度、顕微鏡下で本虫を観察し、虫体が小さくなってきた場合には、一ヶ月以内でも継代を行う。前記継代による病原性変化は５年間安定であることを確認している。また、継代による抗原性の変化も認められていない。
【００１７】
本発明の３種混合ワクチンとは、上記血清型の異なる３種類の不活化ワクチン（好ましくはホルマリン不活化ワクチン）を組み合わせたものである。その組合せの比率は特に限定されるものではないが、例えば、最も少量の単一ワクチンに対して、細胞数に関して１〜５倍、好ましくは１〜３倍の量で、各単一ワクチンを使用することができ、特に好ましくは、各々単一ワクチンが１：１：１の比率で混合されたものがよい。
本発明の混合ワクチンの濃度としては、特に限定する必要はない。使用場面に応じて適宜濃度を調整して使用することができる。特に、各ワクチンの合計量として、１０５cells／fish以上であれば、十分な有効性が得られる。
【００１８】
なお、出願人は、Philasterides dicentrarchiのIyo I株、Nakajima株、Mie0301株の各株を平成２０年７月２４日付で、Philasterides dicentrarchiのJF05To株、RF05To株、SK05Kyo株の各株を平成２０年１０月７日付で、特許庁長官の指定する寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターへ寄託申請を行ったところ、平成２０年８月１日付並びに平成２０年１０月１６日付で受託できないとして寄託受託証不交付通知を受けた。よって、本発明で用いられる原虫は自己寄託として取扱い、特許法施行規則第２７条の３の分譲については出願人が保証するものとする。
【００１９】
本発明の混合ワクチンを適応することができる魚種としては、スクーチカ症が発症する可能性のある魚種である限り特に限定されるものではないが、ヒラメ、ターボット、マダイ、イシダイ、イシガキダイ、メイタガレイなどが挙げられる。また、いずれの魚種についても、感染の可能性がある任意の年齢または任意のサイズの魚類に使用できる。使用法は、たとえば、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、浸漬処理などの方法が挙げられる。その中でも、腹腔内投与は少ない抗原量で十分な免疫を誘導することができる。
本発明の混合ワクチンによって有効な予防・治療ができる原虫としては、Philasterides dicentrarchi Iyo I株、Nakajima株、Mie0301株、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株などが挙げられる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例に基づいて、更に本発明を具体的に説明するが、本発明を限定するものではない。【００２１】
参考例１
異なる魚種、異なる地域で分離されたPhilasterides dicentrarchiの抗原性を比較するために、非動化アッセイおよびウエスタンブロッティングを行った。
（１）非動化アッセイ
Philasterides dicentrarchiのIyo I、Nakajima、Mie0301、SK05Kyoの各分離株を選択し、家兎血清を作製した。供試株には、Iyo I株、Nakajima株、Mie0301株、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株を用いた。非動化アッセイには、上記の抗血清を２０、４０、８０、１６０、３２０、６４０、１２８０および２５６０倍に希釈したものを、Philasterides dicentrarchiのそれぞれの株（約１００虫体）と感作し、顕微鏡下で凝集および非動化を観察し、非動化力価を求めた。【００２２】
その結果を表２に示した。抗Iyo I株血清（抗体）は、Iyo I株、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株に対して、それぞれ８０倍以上の凝集抗体価を示した。しかし、Nakajima株およびMie0301株においては２０倍以下であった。一方、抗Nakajima株血清（抗体）は、Nakajima株に対しては1280倍の凝集抗体価を示したものの、残りの５株に対しては、２０倍以下であった。抗Mie0301株血清（抗体）においても抗Nakajima株血清（抗体）の結果と同様に、ホモの系であるMie0301株のみで高い非動化が認められた。【００２３】
【表２】
0005598820.tif 000003
【００２４】
（２）ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングは定法により以下の方法で行った。抗血清および株は上記の非動化アッセイと同様のものを用いた。
本虫を、イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）に１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を配合し、７．５％の炭酸水素ナトリウム水でｐＨ７．３に調整した培地で単層に培養した魚類株化細胞ＣＨＳＥ−２１４細胞上で、５日間培養した。
本虫を培養後、遠心分離（５００×ｇ、２０℃、５分）にて本虫を回収し、ＦＢＳを含まないイーグルＭＥＭ培地で洗浄後、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液に懸濁させた。懸濁液に同量の１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）サンプルバッファーを混合し、ヒートブロック上で１００℃、３分加熱した。その懸濁液からＳＤＳ−ＰＡＧＥによりゲル上でタンパク質を分離した。このゲルを２５％メタノール−１０％酢酸含有のクマシーブリリアントブルー（和光純薬製）で染色した。【００２５】
その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離したタンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、その膜を１０％のスキムミルク含有ＴＢＳ−Ｔで２時間ブロッキングし、ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。
次に、ブロッキングした膜を一次抗体として抗血清ともに１時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔ（Tris-Buffered Saline-Tween）で洗浄した。さらに、二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて１時間反応させた。その膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）Conjugate substrateキット（バイオ・ラッド・ラボラトリーズ社製）でバンドを可視化した。【００２６】
その結果は、非動化アッセイを支持する結果となった（図１）。すなわち、Iyo I株（図１のレーン１）、JF05To株（レーン２）、RF05To株（レーン３）、SK05Kyo株（レーン４）の３０ｋＤａのタンパク質が、抗Iyo I株血清（図１Ａ）および抗SK05Kyo株血清（図１Ｂ）の各抗体において、強い反応性を示した。しかし、Nakajima株（レーン５）およびMie0301株（レーン６）ではこのバンドは認められなかった。また、抗SK05Kyo抗体（Ｂ）では、Mie0301株において３４ｋＤａに強い反応が認められた。
一方、抗Nakajima株血清（図１Ｃ）および抗Mie0301株血清（図１Ｄ）を用いた場合には、Nakajima株、Mie0301株でそれぞれ３８ｋＤａ、３４ｋＤａで強いバンドを示した。【００２７】
これらの非動化アッセイおよびウエスタンブロッティングの結果から、Philasterides dicentrarchiは少なくとも３つのセロタイプが存在することが明らかになった（serotype I; Iyo I、JF05To株、RF05To株、SK05Kyo株、serotype II; Nakajima株、serotype III; Mie0301株）。【００２８】
実施例１：３種混合ワクチンの有効性試験
（１）ワクチンの作製
（ａ）供試魚
ヒラメの稚魚２００匹を、おとひめヒラメ用海産種苗用飼料（日清丸紅飼料社製）を用いて２週間給餌して、平均体重１０．３ｇになるまで予備飼育したものを使用した。【００２９】
（ｂ）本虫の培養
本虫は、イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）に１０％牛胎児血清を配合し、７．５％の炭酸水素ナトリウム水でｐＨ７．３に調整した培地で単層に培養した魚類株化細胞ＣＨＳＥ−２１４細胞上で、５日間培養した。【００３０】
（ｃ）ホルマリン不活化ワクチンの調製
上記培養した本虫（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）１．６５×１０６〜９．８５×１０６cellsを、終濃度が０．３％となるように３５％ホルマリン（ナカライテスク製）を加え、４℃で一昼夜不活化させて、３種類のホルマリン不活化ワクチンを調製した。そして、上記の３種類のワクチンを同一比率で加えて混合ワクチンを調製した。【００３１】
（２）ワクチン接種
上記（１）で作製したホルマリン不活化ワクチンをヒラメ（平均体重１０．３ｇ）に６．７６×１０５cells／fishの濃度となるように、１００μＬを腹腔内接種した。そして、２週間後、追加免疫として９．８５×１０５cells／fishの濃度で免疫を行った。
また、対照として細胞培養で用いたＭＥＭ培地そのものを１００μＬ腹腔内に接種した。【００３２】
（３）安全性試験
ワクチン接種後、供試魚を１０Ｌの水槽に収容し、流水を行いながら、２ヶ月間飼育観察を行い、安全性を確認した。飼育期間中は前記と同様に給餌した。【００３３】
（４）攻撃試験（有効性の判定）
最終免疫して４日目に、混合ワクチンで免疫したヒラメ（ワクチン接種区）および免疫を行わなかったヒラメ（対照区）を、それぞれ４つの区に分け、各区１５匹で試験を行った。Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株の各株により感染させた。また、比較するため、ワクチン接種区および対照区に本虫を感染させない区を入れた。Iyo I株およびNakajima株では、４．０３×１０４cells／fishで１００μＬとなるように腹腔内接種した。また、Mie0301株では、予備試験の結果から他の2株よりも病原性が低いことが明らかにされたことから４．０３×１０５cells／fishで同様に腹腔内接種した。
ワクチンの有効性は（１−ワクチン接種区の死亡率／対照区の死亡率）×１００％の式により、有効率として求めた。【００３４】
（５）試験結果
結果（経日的累積死亡率の変化）を図２（Iyo I株による攻撃）、図３（Nakajima株による攻撃）、図４（Mie0301株による攻撃）に示す。
３種混合ワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１４日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ７５％、７３．３％及び９２．９％とともに良好な免疫効果を示した。Iyo I株及びNakajima株では５％以下の危険率で有意差が認められた。Mie0301株では１％以下の危険率で有意差が認められた。【００３５】
比較例１：単一ワクチンの有効性試験
（１）ワクチンの作製
供試魚および本虫の培養は実施例と同様の方法で行った。ホルマリン不活化ワクチンの調製は上記培養した本虫（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）１．６５×１０６〜９．８５×１０６cellsを、終濃度が０．３％となるように３５％ホルマリン（ナカライテスク製）を加え、４℃で一昼夜不活化させて、３種類のホルマリン不活化ワクチンを調製した。【００３６】
（２）ワクチン接種
上記（１）で作製した３種のホルマリン不活化ワクチンをヒラメ（平均体重１０．０５ｇ）に１．６５×１０５cells／fishの濃度となるように、１００μＬを腹腔内接種した。そして、２週間後、追加免疫として３×１０５cells／fishの濃度で免疫を行った。
また、対照として細胞培養で用いたＭＥＭ培地そのものを１００μＬ腹腔内に接種した。【００３７】
（３）安全性試験
ワクチン接種後、供試魚を１０Ｌの水槽に収容し、流水を行いながら、２ヶ月間飼育観察を行い、安全性を確認した。飼育期間中は前記と同様に給餌した。【００３８】
（４）攻撃試験（有効性の判定）
最終免疫して４日目に、３種のホルマリン不活化ワクチンで各々免疫したヒラメ（ワクチン接種区）および免疫を行わなかったヒラメ（対照区）を、それぞれ４つに分け、１６区とし、各区１５匹で試験を行った。Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株の各株により感染させた。感染力価は、６．１２×１０５cells／fishで１００μＬとなるように腹腔内接種した。
ワクチンの有効性は（１−ワクチン接種区の死亡率／対照区の死亡率）×１００％の式により、有効率として求めた。【００３９】
（５）試験結果
結果（経日的累積死亡率の変化）を図５（Iyo I株による攻撃）、図６（Nakajima株による攻撃）、図７（Mie0301株による攻撃）に示す。
Iyo I株によるワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１３日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ４１．７％、０％及び０％であり、同じ血清型のものでも効果が低くかった。Iyo I株だけが対照区に対して、１％以下の危険率で有意差が認められた。
また、Nakajima株によるワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１３日間の攻撃日数での有効率は０％、２１．４％、及び０％であり、同様に同じ血清型のものでも効果が低くかった。全ての株とも対照区に対して、有意差はなかった。
さらに、Mie0301株によるワクチンを接種したヒラメは各原虫の攻撃（Iyo I株、Nakajima株及びMie0301株）に対し、１３日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ３３．３％、２５．０％及び３３．３％であり、同じ血清型のものでも効果が低くかった。Mie0301株及びIyo I株だけが対照区に対して、５％以下の危険率で有意差が認められた。【００４０】
実施例２：高濃度一回免疫による３種混合ワクチンの有効性試験
（１）ワクチンの作製
（ａ）供試魚
ヒラメの稚魚１６０匹を、おとひめヒラメ用海産種苗用飼料（日清丸紅飼料社製）を用いて２週間給餌して、平均体重１２．５ｇになるまで予備飼育したものを使用した。【００４１】
（ｂ）本虫の培養
本虫は、イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（日水製薬株式会社製）に１０％牛胎児血清を配合し、７．５％の炭酸水素ナトリウム水でｐＨ７．３に調整した培地で単層に培養した魚類株化細胞ＣＨＳＥ−２１４細胞上で、５日間培養した。【００４２】
（ｃ）ホルマリン不活化ワクチンの調製
上記培養した本虫（Iyo I株、Nakajim株及びMie030株）４．３０×１０６〜８．８５×１０６cellsを、終濃度が０．３％となるように３５％ホルマリン（ナカライテスク製）を加え、４℃で一昼夜不活化させて、３種類のホルマリン不活化ワクチンを調製した。そして、上記の３種類のワクチンを同一比率で加えて混合ワクチンを調製した。【００４３】
（２）ワクチン接種
上記（１）で作製した各種のホルマリン不活化ワクチンをヒラメに２．１５×１０６cells／fishの濃度となるように、１００μＬを腹腔内接種した。
また、対照として細胞培養で用いたＭＥＭ培地そのものを１００μＬ腹腔内に接種した。【００４４】
（３）安全性試験
ワクチン接種後、供試魚を１０Ｌの水槽に収容し、流水で、２ヶ月間飼育観察を行い、安全性を確認した。飼育期間中は前記と同様に給餌した。【００４５】
（４）攻撃試験（有効性の判定）
免疫して１１日目に、混合ワクチンで免疫したヒラメ（ワクチン接種区）および免疫を行わなかったヒラメ（対照区）を、それぞれ２つの区に分け、各区３０匹で試験を行った。３．６×１０５cells／fishでIyo I株を腹腔内接種で感染させた。また、ワクチン接種区および対照区に本虫を感染させない区を入れた。
ワクチンの有効性は（１−ワクチン接種区の死亡率／対照区の死亡率）×１００％の式により、有効率として求めた。【００４６】
（５）試験結果
結果（経日的累積死亡率の変化）を図８に示す。
３種混合ワクチンを接種したヒラメはIyo I株の攻撃に対し、１４日間の攻撃日数での有効率はそれぞれ６８．５％と良好な免疫効果を示し、５％以下の危険率で有意差が認められた。３種混合ワクチンおよび対照区の非感染区は、斃死が認められなかったため、図８から省略した。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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