(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするヒト導入遺伝子ポリヌクレオチド配列を含んでいるゲノムを有している、トランスジェニックマウスであって、該マウスがまたそのゲノム中に、該トランスジェニックマウスに対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の代わりにヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子を含み、そして、該マウスは、該導入遺伝子によってコードされる外因性ヒト血液凝固因子の投与に対して寛容である、トランスジェニックマウス。
【請求項２】
前記マウスが、前記ヒト導入遺伝子に相当する内因性血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドの全ても、その一部も発現しない、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターポリヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されている、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよび内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、請求項３に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド配列が、ポリＡポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトｖＷＦタンパク質をコードする、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＩＸタンパク質をコードする、請求項１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０】
第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含んでいるトランスジェニックマウスであって、該ヒト血液凝固因子はヒト血液凝固因子の生理学的活性を有しており、該トランスジェニックマウスは：
（ａ）転写調節性ポリヌクレオチド配列、
（ｂ）該ヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡ、および
（ｃ）ポリアデニル化シグナル、
を含んでいる外因性導入遺伝子構築物をそのゲノム中に有しており、
ここで（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、該トランスジェニックマウス中の該ヒト血液凝固因子またはそのフラグメントの産生を得るために該外因性遺伝子構築物中で作動可能に連結されており、該マウスがまたそのゲノム中に、該トランスジェニックマウスに対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の代わりにヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子を含み、そして、該マウスは、該導入遺伝子によってコードされる外因性ヒト血液凝固因子の投与に対して寛容である、トランスジェニックマウス。
【請求項１１】
前記転写調節性ポリヌクレオチド配列が、５’転写調節性ポリヌクレオチド配列、３’転写調節性ポリヌクレオチド配列、内部転写調節性ポリヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１２】
前記５’調節性配列がプロモーターである、請求項１１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１３】
前記５’調節性配列がエンハンサー領域を含んでいる、請求項１２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１４】
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、請求項１２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１５】
前記マウスが、前記ヒト導入遺伝子に対応する内因性血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドの全ても、その一部も発現しない、請求項１０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１６】
前記ＤＮＡがヒトｖＷＦタンパク質をコードする、請求項１０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１７】
前記ＤＮＡがヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、請求項１０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１８】
前記ＤＮＡがヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする、請求項１０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１９】
前記ＤＮＡがヒトＦＩＸタンパク質をコードする、請求項１０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド導入遺伝子を含んでいるトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該方法は：
該ヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列を、マウスのゲノムＤＮＡに導入して、ヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、該トランスジェニックマウスに対して内因性の対応する血液凝固因子を含んでいない該トランスジェニックマウスを提供する工程、および
該マウスのゲノムＤＮＡ中に、ヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を導入して、該マウスに対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の全てまたは一部を置き換える工程
を包含する、方法。
【請求項２１】
前記導入する工程が、マイクロインジェクションによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記導入する工程が、ウイルスベクターを用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトｖＷＦタンパク質をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＩＸタンパク質をコードする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターポリヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチド配列が、ポリＡ配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスが、前記導入遺伝子についてホモ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックマウスまたは請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記マウスが、前記導入遺伝子についてヘテロ接合性である、請求項１に記載のトランスジェニックマウスまたは請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
ヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含んでいるトランスジェニックマウスを作製するための方法であって、該方法は：
ａ）第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子ならびにポジティブ選択マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程であって、該マーカー遺伝子がｌｏｘＰ部位に隣接している、工程；
ｂ）該マウスと同じマウス種由来の胚性幹細胞中に該ポリヌクレオチド配列を導入する工程であって、該導入が、該ポリヌクレオチド配列が該胚性幹細胞のゲノム遺伝子座に対して相同組み換えされて、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子ならびに該選択マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる胚性幹細胞を作製するような条件下で行われる、工程；
ｃ）該マウスの胚盤胞に該相同組み換えされた胚性幹細胞を注入する工程；
ｄ）該注入された胚盤胞を偽妊娠雌性マウス中に導入する工程；および
ｅ）該偽妊娠雌性マウスが該相同組み換えされたＤＮＡ配列を有する１匹以上のトランスジェニックマウスを出産させる工程であって、該１匹以上のトランスジェニックマウスが第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される該ヒト血液凝固因子を発現する、工程、
を包含し、該方法はさらに、
該マウスのゲノムＤＮＡ中にヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を導入する工程
を包含し、該ポリヌクレオチド配列は、該トランスジェニックマウスが、その内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子を発現しないように、該トランスジェニックマウスに対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の全てまたは一部を置き換えるヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードする、方法。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチドが、前記ヒト血液凝固因子遺伝子に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチド配列が、ポリＡ配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択マーカーが、ネオマイシン耐性遺伝子ｎｅｏである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｅ）由来の一匹以上のトランスジェニックマウスが、Ｃｒｅ欠失系統マウスと交配される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記トランスジェニックマウスが、ヒトｖＷＦ遺伝子を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記トランスジェニックマウスが、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記トランスジェニックマウスが、ヒトＦＶＩＩタンパク質を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記トランスジェニックマウスが、ヒトＦＩＸタンパク質を発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
請求項１または１０に記載のトランスジェニックマウス中で、ヒト血液凝固因子に対する抗体についてスクリーニングするための方法であって、該方法は：
該マウス中で発現されるヒト血液凝固因子に対応する、ヒト血液凝固因子ポリペプチド、そのフラグメント、アナログまたは改変体を含んでいる組成物を該マウスに投与する工程、ならびに
該トランスジェニックマウス由来のサンプル中で該ヒト血液凝固因子に特異的な抗体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記検出工程が、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、前記マウス中での前記導入遺伝子によって発現されるヒト血液凝固因子ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは改変体を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物で投与される前記ヒト血液凝固因子が、水溶性ポリマーを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール部分である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記組成物で投与される前記ヒト血液凝固因子が、ポリシアリル部分を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
投与される前記組成物中の前記ヒト血液凝固因子が、融合タンパク質である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記融合タンパク質が、ヒト血液凝固因子および第二の治療用ポリペプチドを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物がさらに、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される第二のヒト血液凝固因子を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物がさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物が必要に応じてアジュバントを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記投与する工程が、静脈内、皮下、筋肉内、経口または非経口的に行われる、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記サンプルが血清である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
前記サンプルが、前記トランスジェニックマウスから単離された免疫細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
請求項１または１０に記載のトランスジェニックマウス中で、ヒト血液凝固因子の免疫原性についてスクリーニングするための方法であって、該方法は：
該マウス中の前記導入遺伝子によって発現されるヒト血液凝固因子に相当するヒト血液凝固因子を含んでいる組成物を該マウスに投与する工程、ならびに
該ヒト血液凝固因子ポリペプチドの投与に続いて該マウスでの免疫原性事象を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記免疫原性事象が抗体産生である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、前記マウスにおいて前記導入遺伝子によって発現されるヒト血液凝固因子ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは改変体を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、さらに薬学的に受容可能なキャリアを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記組成物が、必要に応じてアジュバントを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
ヒト血液凝固因子に対する化合物の効果を決定するための方法であって：請求項１または１０に記載のトランスジェニックマウスに対して試験化合物を投与する工程、ならびに該化合物の非存在下でのサンプル中の該ヒト血液凝固因子の活性と比較して、該化合物の存在下で該トランスジェニックマウスから採取したサンプル中のヒト血液凝固因子活性における変化を検出する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
前記ヒト血液凝固活性が、血液凝固因子の発現レベル、血液凝固活性の変化、およびタンパク質結合活性からなる群より選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記血液凝固因子がｖＷＦであり、かつ前記凝固因子活性がＦＶＩＩＩ結合である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つのヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニックマウスである実験的マウスモデルであって、該マウスは天然の血液凝固因子が溶液で投与される場合、該ヒト血液凝固因子に対して顕著な抗体力価を生じることがなく、該トランスジェニックマウスのゲノムがまた、該トランスジェニックマウスに対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の代わりにヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、実験的マウスモデル。
【請求項６５】
後天性血友病Ａの実験的マウスモデルである、請求項６４に記載のマウスモデル。
【請求項６６】
血友病Ｂの実験的マウスモデルである、請求項６４に記載のマウスモデル。
【請求項６７】
前記血液凝固因子が第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される、請求項６４に記載の実験的マウスモデル。
【請求項６８】
血液凝固因子に対する寛容の破壊を誘導する薬剤を同定するための方法であって：
ヒト血液凝固因子を発現する請求項６４に記載のトランスジェニックマウスに対して候補剤を投与する工程、
トランスジェニックである該マウスにヒト血液凝固因子を投与する工程、および
該マウス中で抗血液凝固因子応答を検出する工程を包含し、
ここで、該候補剤の投与が抗血液凝固因子応答の発生させる場合、該候補剤は寛容破壊剤である、方法。
【請求項６９】
前記応答が、抗血液凝固因子インヒビターの産生である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記応答が免疫応答である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫応答が、前記ヒト血液凝固因子に対する抗体である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記候補剤が、ペニシリン、フルダラビン、インターフェロンα、化学療法剤、抗生物質、抗精神病剤、炎症促進性サイトカイン、トール様レセプターのリガンドおよびインビボで炎症促進性サイトカインの放出を誘導する任意の他の化合物からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記血液凝固因子が、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される、請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００７年１２月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／０１７，９２０号（これは、参考として本明細書に援用される）の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明の分野
本発明は概して、ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック非ヒト動物、その作製および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
血液凝固とは、一連の成分の、詳細にはフィブリノーゲン、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子およびフォン・ビルブラント因子の連続的な相互作用を含む複雑な過程である。これらの成分のうちの１つの喪失またはその機能の阻害によって、血液凝固の傾向の増大、または凝血不能のいずれかが生じ得、これは患者によっては生命を脅かす場合がある。
【０００４】
第ＶＩＩＩ因子は、血漿中で見出されるタンパク質であって、血液凝固をもたらす反応のカスケードにおいて補因子として作用する。血液中の第ＶＩＩＩ因子の活性の量の欠損によって、主に男性に罹患する遺伝的な状態である、凝固障害の血友病Ａが生じる。血友病Ａは現在、ヒト血漿由来または組み換えＤＮＡ技術を用いて製造された第ＶＩＩＩ因子の治療的調製物で処置されている。このような調製物は、出血のエピソードに対して、または頻繁に一定の間隔で投与されて、制御されていない出血を防ぐ（予防）。
【０００５】
フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）は、第ＶＩＩＩ因子と複合して血漿中で循環する。第ＶＩＩＩ因子と複合されたｖＷＦは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を安定化して、タンパク質溶解性の分解から保護する。血小板凝集におけるその機能に起因して、ｖＷＦはまた血液凝固を直接妨げる。フォン・ビルブラント欠損（ｖＷＤ）（フォン・ビルブラント症候群としても公知）は、ｖＷＦの欠損または過剰発現のいずれかを生じる。ｖＷＦの欠損は、ｖＷＦ補因子を欠いている第ＶＩＩＩ因子の急速な分解に起因して血友病と同様の疾患を生じる。
【０００６】
血友病Ａおよびフォン・ビルブラント症候群の治療のための従来の方法には、血漿から回収するか、または組み換え供給源によって産生した第ＶＩＩＩ因子またはｖＷＦを用い、精製された第ＶＩＩ、ｖＷＦまたは第ＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体を用いて患者を処置する多くの試みがある。投与された外因性のタンパク質に対する抗体の発達によって、処置の有効性が低減し得、これらの患者の処置に対する課題が提示される。例えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体は重度および中程度に重篤な血友病の患者では特に広まっており、これによって抗ＦＶＩＩＩ抗体は５０％という頻度で発達する（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００７】
トランスジェニック動物技術によって、非ヒト動物においてヒトタンパク質の特徴を研究するための固有の機会が提示される。組み換えＤＮＡおよび遺伝子操作技術によって、レシピエントの動物で所望の配列または遺伝子を導入および発現することが可能になってきて、これによってインビボで特定の分子の効果を研究すること、および分子に結合する作用因子を研究することが可能になっている。トランスジェニックマウスを作製するための１つの手順には、新しく交配させた雌性マウスから受精卵を回収すること、および目的の遺伝子のＤＮＡをこの卵の雄性前核にマイクロインジェクションすることが必要である。次に、このマイクロインジェクションされた卵を１日偽妊娠養母の卵管に移植して、出産まで進行させる。例えば、非特許文献３、特許文献１および特許文献２を参照のこと。別の手順は、目的の遺伝子でトランスフェクトされる胚性幹細胞を用いる。次いで。トランスフェクトされた胚性幹細胞をマウスの胚盤胞に注射し、ここで胚性幹細胞は生殖系列を含めて全ての組織の形成に参加し、これによってトランスジェニック子孫が作製される。このアプローチによって、相同組み換え技術と組み合わせて、制御された方式で胚性幹細胞を変更する能力が得られ、従って事前に決定したゲノムを有するトランスジェニックマウスを作製する能力が得られる。例えば：非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６を参照のこと。
【０００８】
トランスジェニックマウスは、目的のタンパク質を発現するかまたは過剰発現するように作製されてもよいし（ノックインマウス）、または目的の遺伝子を欠失するように作製されてもよい（ノックアウトマウス）。ヒトタンパク質分子を発現するトランスジェニックマウスによって、インビボでのヒト分子の研究が可能になる。例えば、非特許文献７は、組み換えＦＶＩＩＩの活性を阻害するＦＶＩＩＩ阻害性抗体の問題を回避するように設計された改変されたヒトＦＶＩＩＩタンパク質（Ｂドメインを欠く）を発現するトランスジェニックマウスを記載している。
【０００９】
トランスジェニック技術の出現によって、またトランスジェニック動物なしでは不可能であろうスクリーニング方法の開発が可能になる。例えば、外因性タンパク質に対する抗体の開発を研究するためには、被験体が目的の分子に対して自然には寛容であるモデルを有することが有用である。特許文献３は、目的のタンパク質を発現し、このタンパク質に対して寛容であるトランスジェニックマウスを用いてポリペプチドの免疫原性についてスクリーニングし、この動物に対して外因性のタンパク質を投与し、このポリペプチドに特異的な抗体についてスクリーニングするための方法を記載している。特許文献４は、哺乳動物抗原を天然に提示するであろう同族のＭＨＣクラスＩＩ分子についてトランスジェニックな動物での哺乳動物抗原の免疫原性を試験するための方法を記載する。
【００１０】
タンパク質治療剤に対する抗体の発達は生物製剤を障害の処置に用いる場合の永遠の問題である。これらの抗体はタンパク質治療剤の活性を阻害する場合が多く、それによって処置の有効性が低下するか、または治療レベルを維持するための薬物の用量の増大が必要になる。血友病などの血液障害は一生にわたる病態である場合が多いので、治療用の血液凝固因子に特異的な抗体の出現は、処置を受けている患者で特に厄介であり、かつこれらの患者を処置する医師にとって課題である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，８７３，１９１号明細書
【特許文献２】米国特許第７，２９４，７５５号明細書
【特許文献３】米国特許第５，４７０，５６０号明細書
【特許文献４】国際公開第２００６／０５６７６９号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｇｉｌｌｅｓら、Ｂｌｏｏｄ，１９９３  ８２：２４５６〜６１
【非特許文献２】Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００６  １７７：１３５５〜６３
【非特許文献３】Ｗａｇｎｅｒら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８１）７８：６３７６〜６３８０
【非特許文献４】ＢａｒｉｂａｕｌｔおよびＫｅｍｌｅｒ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．，１９８９  ６：４８１〜９２
【非特許文献５】Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ  Ｂ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０００  ８５：６０３〜１３
【非特許文献６】ＭｏｒｅａｄｉｔｈおよびＲａｄｆｏｒｄ．Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．，１９９７  ７５：２０８〜１６
【非特許文献７】Ｓｈｉら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．，２００６  １１６：１９７４〜８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、ヒト患者に対する研究なしでインビボにおいてヒト血液凝固因子の活性を研究する方法を開発することが当該分野では必要である。さらに、患者に対する外因性の治療用タンパク質の投与がインビボでタンパク質活性を阻害する抗原特異的抗体の産生を生じるか否かを決定する必要性も当該分野では依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、外因性に投与されたヒト血液凝固ポリペプチド、そのフラグメント改変体またはアナログに対する抗体を検出するための方法を提供することによる血液凝固障害の処置に関する当該分野における１つ以上の要件に取り組む。本発明は、内因性の血液凝固因子の代わりにヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック動物、およびヒトタンパク質に対する抗体を検出するための方法を提供する。
【００１５】
一局面では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、およびフォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有している、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。一実施形態では、このトランスジェニック動物は、ヒト導入遺伝子に対応する内因性の血液凝固因子をコードしているポリヌクレオチドの全ても、その一部も発現しない。関連の実施形態では、このトランスジェニック動物は、ヒト導入遺伝子に対応する内因性の血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを発現する。一実施形態では、このトランスジェニック動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、スナネズミ（アレチネズミ）、モルモット、ブタ、ウシおよび非ヒト霊長類からなる群より選択される非ヒト動物である。一実施形態では、この非トランスジェニック動物はマウスである。
【００１６】
一実施形態では、このトランスジェニック動物は、ヒト導入遺伝子にホモ接合性である。さらなる実施形態では、このトランスジェニック動物は、ヒト導入遺伝子にヘテロ接合性である。
【００１７】
別の実施形態では、この血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列は、プロモーター領域に対して作動可能に連結される。本発明のトランスジェニック動物では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター、筋肉特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーター、神経特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、平滑筋細胞特異的プロモーター、チロシナーゼ特異的プロモーター、血液凝固因子プロモーター、または脂肪組織プロモーターまたは誘導性プロモーターである。関連の実施形態では、このプロモーターは、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよび内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される。
【００１８】
さらなる実施形態では、この血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列はさらにポリＡ配列を含む。
【００１９】
種々の局面では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる非ヒトトランスジェニック動物を提供し、ここでこのヒト血液凝固因子はヒト血液凝固因子の生理学的活性を保持しており、このトランスジェニック動物は：（ａ）転写調節性ポリヌクレオチド配列と、（ｂ）このヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡと、（ｃ）この血液凝固因子をコードするＤＮＡの発現を生じるポリアデニル化シグナルと、を含んでいる外因性遺伝子構築物をそのゲノム内に安定に組み込んでおり、ここで（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、このトランスジェニック動物中のこのヒト血液凝固因子の産生を得るためにこの外因性遺伝子構築物中で作動可能に連結されている。一実施形態では、このトランスジェニック動物は、ヒト導入遺伝子に対応する内因性の血液凝固因子の全ても、その一部も発現しない。さらなる実施形態では、この転写調節性ポリヌクレオチド配列は、５’転写調節性ポリヌクレオチド配列、３’転写調節性ポリヌクレオチド配列、内部転写調節性ポリヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２０】
一実施形態では、外因性遺伝子構築物の５’調節性配列はプロモーターであり、必要に応じてエンハンサー領域を含んでいる。関連の局面では、このプロモーターは、本明細書に記載されるようなプロモーター領域である。
【００２１】
さらなる局面では、本明細書に記載される任意の非ヒトトランスジェニック動物は必要に応じてまた、このトランスジェニック非ヒト動物に対して内因性のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の代わりにヒト主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むと考えられる。一実施形態では、このヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子は、限定するものではないが、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＯ、ＬＭＰ、ＴＡＰおよびＴＡＰＢＰを含んでいる非ヒトトランスジェニック動物中での発現に適切な任意のＨＬＡ遺伝子である。関連の実施形態では、ヒト血液凝固因子を発現する本発明のトランスジェニック動物は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスと、ヒト血液凝固因子を発現する本発明のトランスジェニック動物とを交配することによってヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するように作製される。あるいは、ヒト血液凝固因子を発現する本発明のトランスジェニック動物は、本発明の非ヒトトランスジェニック動物のゲノムＤＮＡ中にＭＨＣクラスＩＩ遺伝子をコードしているポリヌクレオチド配列を導入することによって、ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するように作製される。導入遺伝子を導入することは、当該分野で公知の任意の方法によって行われると考えられる。一実施形態では、この導入は、マイクロインジェクションによって、またはウイルスベクターによって行われる。
【００２２】
さらなる実施形態では、この導入は、上記非ヒト動物のゲノムＤＮＡ中に、ヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を導入して、この動物に対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の全てまたは一部を置き換える工程を包含する。
【００２３】
一実施形態では、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトｖＷＦ遺伝子およびヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現し、内因性のｖＷＦおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現しない。関連の実施形態では、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子およびヒトクラスＩＩ遺伝子を発現し、かつ内因性のＦＶＩＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現しない。さらなる実施形態では、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトＦＶＩＩ遺伝子およびヒトクラスＩＩ遺伝子を発現し、かつ内因性のＦＶＩＩおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現しない。なおさらなる実施形態では、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、ヒトＦＩＸ遺伝子およびヒトクラスＩＩ遺伝子を発現し、かつ内因性ＦＩＸおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現しない。
【００２４】
本発明はさらに、内因性の血液凝固因子の代わりに、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択されるヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法を考慮する。この方法は、非ヒト動物のゲノムＤＮＡ中にヒト血液凝固因子をコードしているポリヌクレオチド配列を導入する工程を包含し、ここでこのトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含み、かつこのトランスジェニック動物に対して内因性である対応する血液凝固因子は含まない。一実施形態では、この導入は、当該分野で公知の任意の方法で行われる。種々の局面では、この導入は、マイクロインジェクションによって、またはウイルスベクターによって行われる。
【００２５】
関連の実施形態では、トランスジェニック動物を作製する方法では、このヌクレオチド配列は、本明細書に記載のようなプロモーター領域に作動可能に連結される。さらに、このプロモーターは、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよび内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択されると考えられる。別の実施形態では、このヌクレオチド配列は、ポリＡ配列を含む。
【００２６】
さらなる局面では、本発明は、ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法を提供し、この方法は：ａ）ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択されるヒト血液凝固因子、ならびにポジティブ選択マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程であって、このマーカー遺伝子がｌｏｘＰ部位に隣接している工程と；
ｂ）この非ヒト動物と同じ動物種由来の胚性幹細胞中にこのポリヌクレオチド配列を導入する工程であって、このポリヌクレオチド配列がこの胚性幹細胞のゲノム遺伝子座に対して相同組み換えされて、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択されるヒト血液凝固因子ならびに上記ポジティブ選択マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる胚性幹細胞を作製するような条件下で行われる、工程と；ｃ）この非ヒト動物の胚盤胞にこの相同組み換えされた胚性幹細胞を注入する工程と；ｄ）この注入された胚盤胞を偽妊娠雌性非ヒト動物中に導入する工程および；ｅ）この偽妊娠雌性動物がこの相同組み換えされたＤＮＡ配列を有する１匹以上のトランスジェニック動物を出産させる工程とを包含し、ここでこのトランスジェニックマウスがＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択されるヒト血液凝固因子を発現する。一実施形態では、工程（ｂ）において、ヒト導入遺伝子ポリヌクレオチド配列は、胚性幹細胞のゲノムにおいて少なくとも１つの天然に存在する血液凝固因子遺伝子の全部または一部をコードしているゲノム遺伝子座中に相同組み換えされる。
【００２７】
一実施形態では、上記の方法の血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列はさらに、ヒト血液凝固遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。関連の実施形態では、このプロモーターは、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される。別の実施形態では、この血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列は、ポリＡ配列を含む。
【００２８】
種々の局面では、上記選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質、ネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）耐性遺伝子、ジフテリア毒素耐性遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｉｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）からなる群より選択される。一実施形態では、この選択マーカーはネオマイシン耐性遺伝子ｎｅｏである。別の実施形態では、この選択マーカーはジフテリア毒素である。
【００２９】
関連の実施形態では、本発明のトランスジェニック動物は、Ｃｒｅ欠失系統マウスと交配される。
【００３０】
関連の局面では、トランスジェニック動物を作製する方法は、上記非ヒト動物の上記ゲノムＤＮＡ中にヒト主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を導入する工程をさらに包含し、このポリヌクレオチド配列は、ヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードしており、この遺伝子は、このトランスジェニック動物が、その内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子を発現しないように、このトランスジェニック動物に対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の全てまたは一部を置き換えている。一実施形態では、この導入は、当該分野で公知の任意の方法によって行われる。特定の実施形態では、この導入はマイクロインジェクションによって、またはウイルスベクターによって行われる。
【００３１】
なおさらなる局面では、本発明は、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択されるヒト血液凝固因子を発現するポリヌクレオチド導入遺伝子を含んでいる非ヒトトランスジェニック中で、ヒト血液凝固因子に対する抗体についてスクリーニングするための方法を考慮し、この方法は、この動物中で発現されるヒト血液凝固因子をコードしているヒト導入遺伝子に対応するヒト血液凝固因子ポリペプチド、そのフラグメント、アナログまたは改変体を含んでいる組成物をこの動物に投与する工程と、このトランスジェニック動物由来の試験サンプル中でこのヒト血液凝固因子に特異的な抗体を検出する工程とを包含する。
【００３２】
一実施形態では、この検出工程は、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、または磁気ビーズを用いて行われる。特定の実施形態では、この検出はＥＬＩＳＡによって行われる。
【００３３】
別の実施形態では、本発明のスクリーニング方法で投与される組成物中のヒト血液凝固因子は、水溶性ポリマーに対する化学的結合によって改変される。一実施形態では、この水溶性ポリマーは当該分野で公知の任意の水溶性ポリマーである。関連の実施形態では、この水溶性ポリマーはポリエチレングリコール部分である。さらに化学的結合としては、限定するものではないが、グリコシル化、ＰＥＧ化、ポリシアル化、または融合タンパク質を形成するための第二のポリペプチド配列の付加が挙げられる。別の実施形態では、ヒト血液凝固因子は、ポリシアル化部分を含む。さらに別の特定の実施形態では、組成物中のヒト血液凝固因子は、融合タンパク質であり、かつ種々の局面では、この融合タンパク質は、ヒト血液凝固因子および第二の治療剤を含む。他の局面では、この第二の薬剤は、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択される第二のヒト血液凝固因子である。
【００３４】
本発明によれば、考慮されるスクリーニング方法の試験サンプルは、免疫細胞および血清からなる群より選択される。一実施形態では、このサンプルは血清である。別の実施形態では、このサンプルは、トランスジェニック動物から単離された免疫細胞である。
【００３５】
別の局面では、本発明は、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択されるヒト血液凝固因子を発現する導入遺伝子を含んでいる非ヒトトランスジェニック動物中で、ヒト血液凝固因子の免疫原性をスクリーニングするための方法を考慮し、この方法は、この動物中で発現される導入遺伝子によって発現されるヒト血液凝固因子に対して対応するヒト血液凝固因子を含んでいる組成物をこの動物に投与する工程と、このヒト血液凝固因子ポリペプチドの投与に続いて動物中の免疫原性事象を検出する工程とを包含する。
【００３６】
種々の局面では、この免疫原性事象は、ヒト血液凝固因子に対する抗体の産生に関連している。一実施形態では、この免疫原性事象は、同種抗体産生およびアレルギー反応からなる群より選択される。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法で投与される組成物中のヒト血液凝固因子は、動物によって発現されるヒト血液凝固因子導入遺伝子のフラグメント、アナログまたは改変体を含むことがさらに考慮される。別の実施形態では、この組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む。さらに別の実施形態では、この組成物は必要に応じてアジュバントを含む。
【００３８】
投与工程は静脈内で、皮下で、筋肉内で、経口的に、非経口的にまたは吸入によって行われると考えられる。
【００３９】
さらなる局面では、本発明はヒト血液凝固因子での試験化合物の効果を決定するための方法を考慮し、この方法は：ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ｖＷＦ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩおよびＦＸＩＩＩからなる群より選択されるヒト血液凝固因子を発現する導入遺伝子を含んでいる非ヒトトランスジェニック動物に対してこの試験化合物を投与する工程と、この化合物の非存在下でのヒト血液凝固因子活性に比較してこの化合物の存在下でのヒト血液凝固因子活性における変化を検出する工程とを包含する。種々の実施形態では、このヒト血液凝固活性は、血液凝固因子の発現、血液凝固活性、およびタンパク質結合活性からなる群より選択される。関連の実施形態では、この血液凝固因子はｖＷＦであり、かつこの凝固因子活性はＦＶＩＩＩ結合である。
【００４０】
別の局面では、本発明は、少なくとも１つのヒト血液凝固因子を発現する非ヒトトランスジェニック動物である実験的動物モデルであって、この動物は（天然の）血液凝固因子が投与される場合ヒト血液凝固因子に対して顕著な抗体力価を生じることのない、実験的動物モデルを提供する。しかし、この動物モデルは、血液凝固因子が新抗原を担持する場合、または血液凝固因子が先天性免疫系を活性化する不純物と一緒に注射される場合、この血液凝固因子に対する抗体を産生する。一実施形態では、この動物は、後天性の血液凝固因子障害の誘導の影響を受けやすい。
【００４１】
一実施形態では、この動物モデルは、後天性血友病Ａの実験的動物モデルである。後天性血友病Ａは、新抗原を担持するヒトＦＶＩＩＩを注射することによって、またはトール様レセプターについてのリガンドとともにヒトＦＶＩＩＩを注射することによって誘導される。関連の実施形態では、この動物モデルは、後天性血友病Ｂの実験動物モデルである。
【００４２】
さらなる実施形態では、実験的動物モデルは第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される、ヒト血液凝固因子を含む。
【００４３】
さらなる局面では、本発明は、血液凝固因子に対する寛容の破壊を誘導する薬剤（寛容破壊剤（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ−ｂｒｅａｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ））を特定するための方法を考慮し、この方法は以下：ヒト血液凝固因子を発現し、かつヒト血液凝固因子に対する有意な抗血液凝固因子応答を欠いている本明細書に記載のトランスジェニック非ヒト動物に対して候補剤を投与する工程と、トランスジェニックである動物にこのヒト血液凝固因子を投与する工程と；この動物中で抗血液凝固因子応答を検出する工程とを包含し、ここで、この候補剤は、この候補剤の投与が抗血液凝固因子応答の発生させる場合、寛容破壊剤である。
【００４４】
一実施形態では、抗血液凝固因子応答は、抗血液凝固因子インヒビターの産生である。関連の実施形態では、この応答は、免疫応答である。さらなる実施形態では、この免疫応答は、ヒト血液凝固因子に対する抗体の産生である。
【００４５】
特定の実施形態では、この候補剤は、ペニシリン、フルダラビン、インターフェロンα、化学療法剤、抗生物質、抗精神病剤、トール様レセプターのリガンド、炎症促進性サイトカイン、およびインビボで炎症促進性サイトカインの放出を誘導する任意の他の化合物からなる群より選択される。
【００４６】
一実施形態では、この血液凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするヒト導入遺伝子ポリヌクレオチドを含んでいるゲノムを有している、トランスジェニック非ヒト動物。
（項目２）
前記動物が、前記ヒト導入遺伝子に相当する内因性血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドの全ても、その一部も発現しない、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目３）
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターポリヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されている、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目４）
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよび内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、項目３に記載のトランスジェニック動物。
（項目５）
前記ポリヌクレオチド配列が、ポリＡポリヌクレオチド配列を含む、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目６）
前記動物がマウスである、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目７）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトｖＷＦタンパク質をコードする、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目８）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目９）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目１０）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＩＸタンパク質をコードする、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目１１）
前記動物がまた、該トランスジェニック動物に対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の代わりにヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子を発現する、項目１に記載のトランスジェニック動物。
（項目１２）
第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる非ヒトトランスジェニック動物であって、該ヒト血液凝固因子はヒト血液凝固因子の生理学的活性を有しており、該トランスジェニック動物は：
（ａ）転写調節性ポリヌクレオチド配列、
（ｂ）該ヒト血液凝固因子をコードするＤＮＡ、および
（ｃ）ポリアデニル化シグナル、
を含んでいる外因性導入遺伝子構築物をそのゲノム中に有しており、
ここで（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、該トランスジェニック動物中の該ヒト血液凝固因子またはそのフラグメントの産生を得るために該外因性遺伝子構築物中で作動可能に連結されている、非ヒトトランスジェニック動物。
（項目１３）
前記転写調節性ポリヌクレオチド配列が、５’転写調節性ポリヌクレオチド配列、３’転写調節性ポリヌクレオチド配列、内部転写調節性ポリヌクレオチド配列、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１２に記載のトランスジェニック動物。
（項目１４）
前記５’調節性配列がプロモーターであり、必要に応じてエンハンサー領域を含んでいる、項目１３に記載のトランスジェニック動物。
（項目１５）
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、項目１４に記載のトランスジェニック動物。
（項目１６）
前記動物が、前記ヒト導入遺伝子に対応する内因性血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドの全ても、その一部も発現しない、項目１２に記載のトランスジェニック動物。
（項目１７）
前記ＤＮＡがヒトｖＷＦタンパク質をコードする、項目１２に記載のトランスジェニック動物。
（項目１８）
前記ＤＮＡがヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、項目１２に記載のトランスジェニック動物。
（項目１９）
前記ＤＮＡがヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする、項目１２に記載のトランスジェニック動物。
（項目２０）
前記ＤＮＡがヒトＦＩＸタンパク質をコードする、項目１２に記載のトランスジェニック動物。
（項目２１）
前記トランスジェニック動物がまた、該トランスジェニック動物に対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の代わりにヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、項目１２に記載のトランスジェニック動物。
（項目２２）
第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド導入遺伝子を含んでいるトランスジェニック非ヒト動物を作製する方法であって、該方法は：
該ヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチド配列を、非ヒト動物のゲノムＤＮＡに導入して、ヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含むが、該トランスジェニック動物に対して内因性の対応する血液凝固因子を含んでいない該トランスジェニック非ヒト動物を提供する工程を包含する、方法。
（項目２３）
前記導入する工程が、マイクロインジェクションによって行われる、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記導入する工程が、ウイルスベクターを用いて行われる、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトｖＷＦタンパク質をコードする、項目２２に記載の方法。
（項目２６）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質をコードする、項目２２に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＶＩＩタンパク質をコードする、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
前記ポリヌクレオチド配列が、ヒトＦＩＸタンパク質をコードする、項目２２に記載の方法。
（項目２９）
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターポリヌクレオチド配列に対して作動可能に連結されている、項目２２に記載の方法。
（項目３０）
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ポリヌクレオチド配列が、ポリＡ配列を含む、項目２２に記載の方法。
（項目３２）
前記動物がマウスである、項目２２に記載の方法。
（項目３３）
前記動物が、前記導入遺伝子についてホモ接合性である、項目１に記載のトランスジェニック動物または項目２２に記載の方法。
（項目３４）
前記動物が、前記導入遺伝子についてヘテロ接合性である、項目１に記載のトランスジェニック動物または項目２２に記載の方法。
（項目３５）
前記非ヒト動物のゲノムＤＮＡ中に、ヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を導入して、該動物に対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の全てまたは一部を置き換える工程をさらに包含する、項目２２に記載の方法。
（項目３６）
ヒト血液凝固因子をコードするポリヌクレオチドを含んでいるトランスジェニック非ヒト動物を作製するための方法であって、該方法は：
ａ）第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子ならびにポジティブ選択マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する工程であって、該マーカー遺伝子がｌｏｘＰ部位に隣接している、工程；
ｂ）該非ヒト動物と同じ動物種由来の胚性幹細胞中に該ポリヌクレオチド配列を導入する工程であって、該導入が、該ポリヌクレオチド配列が該胚性幹細胞のゲノム遺伝子座に対して相同組み換えされて、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子ならびに該選択マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでいる胚性幹細胞を作製するような条件下で行われる、工程；
ｃ）該非ヒト動物の胚盤胞に該相同組み換えされた胚性幹細胞を注入する工程；
ｄ）該注入された胚盤胞を偽妊娠雌性非ヒト動物中に導入する工程；および
ｅ）該偽妊娠雌性動物が該相同組み換えされたＤＮＡ配列を有する１匹以上のトランスジェニック動物を出産させる工程であって、１匹以上のトランスジェニックマウスが第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される該ヒト血液凝固因子を発現する、工程、
を包含する、方法。
（項目３７）
前記ポリヌクレオチドが、前記ヒト血液凝固因子遺伝子に対して作動可能に連結されたプロモーターを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記プロモーターが、αフェトプロテインプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶプロモーター、および内因性血液凝固因子プロモーターからなる群より選択される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ポリヌクレオチド配列が、ポリＡ配列を含む、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
前記選択マーカーが、ネオマイシン耐性遺伝子ｎｅｏである、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
工程（ｅ）由来の一匹以上のトランスジェニック動物が、Ｃｒｅ欠失系統マウスと交配される、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
前記トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトｖＷＦ遺伝子を発現する、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
前記トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質を発現する、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
前記トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトＦＶＩＩタンパク質を発現する、項目３６に記載の方法。
（項目４５）
前記トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトＦＩＸタンパク質を発現する、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
前記非ヒト動物のゲノムＤＮＡ中にヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列を導入する工程をさらに包含し、該ポリヌクレオチド配列は、前記トランスジェニック動物が、その内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子を発現しないように、該トランスジェニック動物に対して内因性の主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子の全てまたは一部を置き換えているヒト主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子をコードする、項目３６に記載の方法。
（項目４７）
非ヒトトランスジェニック動物中で、ヒト血液凝固因子に対する抗体についてスクリーニングするための方法であって、該トランスジェニック動物は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子を発現するポリヌクレオチド導入遺伝子を含んでおり、該方法は：
該動物中で発現されるヒト血液凝固因子に対応する、ヒト血液凝固因子ポリペプチド、そのフラグメント、アナログまたは改変体を含んでいる組成物を該動物に投与する工程、ならびに
該トランスジェニック動物由来のサンプル中で該ヒト血液凝固因子に特異的な抗体を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目４８）
前記検出工程が、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって行われる、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記組成物が、前記動物中での前記導入遺伝子によって発現されるヒト血液凝固因子ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは改変体を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
前記組成物で投与される前記ヒト血液凝固因子が、水溶性ポリマーを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール部分である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記組成物で投与される前記ヒト血液凝固因子が、ポリシアリル部分を含む、項目４９に記載の方法。
（項目５３）
投与される前記組成物中の前記ヒト血液凝固因子が、融合タンパク質である、項目４７に記載の方法。
（項目５４）
前記融合タンパク質が、ヒト血液凝固因子および第二の治療用ポリペプチドを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記組成物がさらに、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される第二のヒト血液凝固因子を含む、項目４７に記載の方法。
（項目５６）
前記組成物がさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む、項目４７に記載の方法。
（項目５７）
前記組成物が必要に応じてアジュバントを含む、項目４７に記載の方法。
（項目５８）
前記投与する工程が、静脈内、皮下、筋肉内、経口または非経口的に行われる、項目４７に記載の方法。
（項目５９）
前記サンプルが血清である、項目４７に記載の方法。
（項目６０）
前記サンプルが、前記トランスジェニック動物から単離された免疫細胞である、項目４７に記載の方法。
（項目６１）
非ヒトトランスジェニック動物中で、ヒト血液凝固因子の免疫原性についてスクリーニングするための方法であって、該非ヒトトランスジェニック動物は、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択されるヒト血液凝固因子ポリペプチドを発現する導入遺伝子を含んでおり、該方法は：
該動物中の該導入遺伝子によって発現されるヒト血液凝固因子に相当するヒト血液凝固因子を含んでいる組成物を該動物に投与する工程、ならびに
該ヒト血液凝固因子ポリペプチドの投与に続いて該動物での免疫原性事象を検出する工程、
を包含する、方法。
（項目６２）
前記免疫原性事象が抗体産生である、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記組成物が、前記動物での前記導入遺伝子によって発現されるヒト血液凝固因子ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは改変体を含む、項目６１に記載の方法。
（項目６４）
前記組成物が、さらに薬学的に受容可能なキャリアを含む、項目６１に記載の方法。
（項目６５）
前記組成物が、必要に応じてアジュバントを含む、項目６１に記載の方法。
（項目６６）
ヒト血液凝固因子に対する化合物の効果を決定するための方法であって：第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）からなる群より選択されるヒト血液凝固因子を発現する導入遺伝子を含んでいる非ヒトトランスジェニック動物に対して試験化合物を投与する工程、ならびに化合物の非存在下でのサンプル中の該ヒト血液凝固因子の活性と比較して、該化合物の存在下で該トランスジェニック動物から採取したサンプル中のヒト血液凝固因子活性における変化を検出する工程を包含する、方法。
（項目６７）
前記ヒト血液凝固活性が、血液凝固因子の発現レベル、血液凝固活性の変化、およびタンパク質結合活性からなる群より選択される、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記血液凝固因子がｖＷＦであり、かつ前記凝固因子活性がＦＶＩＩＩ結合である、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
少なくとも１つのヒト血液凝固因子を発現する非ヒトトランスジェニック動物である実験的動物モデルであって、該動物は天然の血液凝固因子が溶液で投与される場合、該ヒト血液凝固因子に対して顕著な抗体力価を生じることがない、実験的動物モデル。
（項目７０）
後天性血友病Ａの実験的動物モデルである、項目６９に記載の動物モデル。
（項目７１）
血友病Ｂの実験的動物モデルである、項目６９に記載の動物モデル。
（項目７２）
前記血液凝固因子が第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される、項目６９に記載の実験的動物モデル。
（項目７３）
血液凝固因子に対する寛容の破壊を誘導する薬剤を同定するための方法であって：
ヒト血液凝固因子を発現する項目６９に記載のトランスジェニック非ヒト動物に対して候補剤を投与する工程、
トランスジェニックである該動物にヒト血液凝固因子を投与する工程、および
該動物中で抗血液凝固因子応答を検出する工程を包含し、
ここで、該候補剤の投与が抗血液凝固因子応答の発生させる場合、該候補剤は寛容破壊剤である、方法。
（項目７４）
前記応答が、抗血液凝固因子インヒビターの産生である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記応答が免疫応答である、項目７３に記載の方法。
（項目７６）
前記免疫応答が、前記ヒト血液凝固因子に対する抗体である、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記候補剤が、ペニシリン、フルダラビン、インターフェロンα、化学療法剤、抗生物質、抗精神病剤、炎症促進性サイトカイン、トール様レセプターのリガンドおよびインビボで炎症促進性サイトカインの放出を誘導する任意の他の化合物からなる群より選択される、項目７３に記載の方法。
（項目７８）
前記血液凝固因子が、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子および第ＸＩＩＩ因子からなる群より選択される、項目７３〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１Ａは、非ヒト動物ゲノムへの挿入のためのヒト第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含んでいるプラスミドを図示している。図１Ｂは、非ヒト動物ゲノムへの挿入のためのヒト第ＶＩＩＩ因子ポリヌクレオチドを含んでいるプラスミドを図示している。
【図２】図２Ａは、非ヒト動物ゲノムへの挿入のためのヒトｖＷＦポリヌクレオチドを含んでいるプラスミドを図示している。図２Ｂは、非ヒト動物ゲノムへの挿入のためのヒトｖＷＦポリヌクレオチドを含んでいるプラスミドを図示している。
【図３−１】図３は、ｖＷＦインサートの配列を示しており、これはリーダー配列ならびに開始コドンおよび終止コドンを含んでいる（太字）（配列番号１６）。
【図３−２】図３は、ｖＷＦインサートの配列を示しており、これはリーダー配列ならびに開始コドンおよび終止コドンを含んでいる（太字）（配列番号１６）。
【図４】図４は、ヒト第ＶＩＩ遺伝子を含んでいるベクターを図示する。
【図５】図５Ａは、ヒトＦＶＩＩＩのマウストランスジェニックの異なる亜系統における抗ＦＶＩＩＩ抗体産生を示す。亜系統Ｇのマウスは、４回（図５Ａ）または８回（図５Ｂ）のいずれかの毎週用量を与えた場合、抗ＦＶＩＩＩ抗体を生成した。亜系統ＥおよびＩのマウスはいずれの用法でも抗ＦＶＩＩＩ抗体を生成しなかった。図５Ｂは、ヒトＦＶＩＩＩのマウストランスジェニックの異なる亜系統における抗ＦＶＩＩＩ抗体産生を示す。亜系統Ｇのマウスは、４（図５Ａ）または８（図５Ｂ）の毎週用量のいずれかを与えた場合、抗ＦＶＩＩＩ抗体を生成した。亜系統ＥおよびＩのマウスはいずれの用法でも抗ＦＶＩＩＩ抗体を生成しなかった。
【図６】図６は、ヒトＦＶＩＩＩについてトランスジェニックなマウスの異なる亜系統における、異なるＩｇＧサブクラスおよびＩｇＡの抗ＦＶＩＩＩ抗体産生を示す。亜系統Ｇにおけるマウスは、８回の毎週用量を与えた場合、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃの抗ＦＶＩＩＩ抗体を作製した（図６Ａ）。亜系統Ｅのマウスは、どのＩｇＧサブクラスの抗ＦＶＩＩＩ抗体も生成しなかった（図６Ｂ）。亜系統Ｉの４匹のマウスのうち１匹が、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの抗ＦＶＩＩＩ抗体を作製した（図６Ｃ）。
【図７】図７は、天然のＦＶＩＩＩまたは新抗原を担持しているＦＶＩＩＩのいずれかの４回の毎週用量の適用後ヒトＦＶＩＩＩ導入遺伝子（亜系統Ｅ）を発現するマウスでの抗ＦＶＩＩＩ抗体産生を図示する。
【図８】図８は、外因性のヒトＦＶＩＩを投与された後のヒトＦＶＩＩを発現するトランスジェニックマウスでの、およびコントロールマウスでの抗体産生を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
本発明は、血液凝固障害を処置するために有用な改良された組成物に関する当該分野での必要性、ならびに外因性に投与された血液凝固因子組成物に対する応答で作製され得る抗体についてスクリーニングする方法に取り組む。本発明はまた、ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック動物を、ある場合には、その動物に対して内因性の血液凝固因子および必要に応じて１つ以上のヒト主要組織適合性複合体遺伝子の代わりに、提供して、ヒト血液凝固因子治療剤に対する抗体の発達を分析する。
【００４９】
定義
他に規定しない限り、本明細書に用いられる全ての技術的および科学用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。以下の引用文献によって、本発明で用いられる多くの用語の一般的定義が当業者に示される：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ，第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。
【００５０】
各々の刊行物、特許出願、特許、および本明細書に引用される他の参考文献は本開示と矛盾しない程度までその全体が出典明記によって援用される。
【００５１】
本明細書および添付の特許請求の範囲に用いる場合、単数形「１つの、ある（不定冠詞：ａ、ａｎ）」および「この、その（定冠詞：ｔｈｅ）」は、状況が明らかに別段示すのでない限り、複数の言及を包含する。
【００５２】
本明細書において用いる場合、以下の用語は、別段の明記が無い限りそれらに帰せられる意味を有する。
【００５３】
本明細書において用いる場合、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素などの発現産物を「コードする配列」または「コードする」配列とは、発現された場合、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生を生じるヌクレオチド配列であり、すなわち、このヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする。タンパク質のコード配列は、開始コドン（通常はＡＴＧ）および終止コドンを含む場合がある。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「遺伝子」とは、１つ以上のポリペプチド、タンパク質または酵素の全てまたは一部を含むアミノ酸をコードするＤＮＡ配列またはそのアミノ酸の特定の配列を指し、かつイントロン、および調節性ＤＮＡ配列、例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、５’非翻訳領域、または３’−非翻訳領域（これは、例えば、遺伝子が発現される条件に影響する）を含んでも含まなくてもよい。構造的遺伝子ではないいくつかの遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写される場合があるが、アミノ酸配列には翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、またはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。
【００５５】
本明細書において用いる場合、「プロモーター」または「プロモーター配列」とは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合し得、かつコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。一局面では、このプロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で結合され、上流（５’方向）に伸びてバックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。関連の局面では、プロモーター配列内に転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることによって例えば都合よく規定される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。プロモーターは、エンハンサーおよびリプレッサー配列を含んでいる他の発現制御配列と作動可能に会合されてもよい。
【００５６】
一局面では、遺伝子発現を制御するために用いられるプロモーターとしては限定するものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０早期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７〜７９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１〜１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節性配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９〜４２，１９８２）；酵母および他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えば、Ｇａｌ  ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール脱水素酵素）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター；および神経または脳特異的な発現を呈する転写制御領域、例えば、視床下部で活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２〜１３７８，１９８６）、Ｔｈｙ１．２「汎ニューロン（ｐａｎ−ｎｅｕｒｏｎａｌ）」プロモーター、およびスナプシンＩプロモーター（Ｈｏｗｌａｎｄら、Ｂｒａｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ａｇｉｎｇ  １６：６８５〜６９９，１９９５）（ニューロンで活性）が挙げられる。プロモーターは内因性の血液凝固因子プロモーターであるということも考えられる。当該分野の作業者は、当該分野で公知の任意のプロモーターが有用であること、および発現が所望される細胞タイプが特定のプロモーターの使用を決定づけることができることを理解するであろう。
【００５７】
本明細書において用いる場合、コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡに転写して、これが次にトランスＲＮＡスプライシングされて（イントロンを含む場合）翻訳され、ｍＲＮＡの場合には、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、細胞中の転写および翻訳の制御配列「の制御下である」、「に作動可能に連結されている」または「と作動可能に会合されている」。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「発現する」および「発現」という用語は、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによって、遺伝子またはＤＮＡ配列中の情報を顕在化することを可能にするか顕在化すること、例えば、タンパク質を産生することを指す。ＤＮＡ配列は、タンパク質などの「発現産物」を形成するために細胞中でまたは細胞によって発現される。この発現産物自体、例えば、得られたタンパク質はまた「発現される」と言うこともできる。発現産物は、種々の局面では、細胞内、細胞外または分泌型として特徴付けられる。「細胞内」という用語は、細胞の内側を意味する。「細胞外」という用語は、細胞の外側、例えば、膜貫通タンパク質を意味する。ある物質は、細胞の外側に、細胞のいずれかから、または細胞の内側に有意な値で出現する場合、その細胞によって「分泌される」。
【００５９】
本明細書において用いる場合、「トランスフェクション」とは、細胞への外来核酸の導入を指す。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性、異種、非本質的または細胞外）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の胚性幹（ＥＳ）細胞または前核への導入であって、その結果その細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、トランスジェニック動物中の所望の物質を生じるような導入を指す。
【００６０】
本明細書において用いる場合、「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入され、それによって宿主を形質転換し、かつその導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するビヒクルを指す。「ベクター」という用語は、本明細書において「プラスミド」という用語と交換可能に用いられる。
【００６１】
本明細書において用いる場合、「選択マーカー」とは、酵素または他のタンパク質をコードする遺伝子であって、この酵素または他のタンパク質が発現される細胞または生物体に対して、薬物、抗生物質または他の薬剤に対する耐性などの同定可能な表現型変化を付与し、その結果、このマーカーの発現または活性が（例えば、限定するものではないが、陽性マーカー、例えば、ｎｅｏ遺伝子）について、または（例えば、限定するものではないが、陰性マーカー、例えば、ジフテリア遺伝子）に対して選択される遺伝子を指す。異種の選択マーカーとは、正常には見出されないであろう動物のゲノムに挿入されている選択マーカー遺伝子を指す。
【００６２】
選択マーカーの例としては限定するものではないが、抗生物質耐性遺伝子、例えば、ネオマイシン（ｎｅｏ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）、ジフテリア毒素、ホスホトランスフェラーゼ（ｐｈｃｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。当該分野の当業者は当該分野で公知の任意の選択マーカーがこの方法で有用であることを理解するであろう。
【００６３】
本明細書において用いる場合、「異種」とは、天然には存在しないエレメントの組み合わせを指す。例えば、異種ＤＮＡとは、通常は細胞内にも細胞の染色体部位にも位置していないＤＮＡを指す。異種ＤＮＡは細胞に異種の遺伝子を含むと考えられる。異種の発現制御エレメントとは、自然に作動可能に連結されているものとは異なる遺伝子と作動可能に連結されているこのようなエレメントである。
【００６４】
本明細書において用いる場合、「異種」という用語は、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）由来のタンパク質および種々の種由来の相同なタンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含む、「共通の進化起源」を保有するタンパク質の間の関係を指す（Ｒｅｅｃｋら、Ｃｅｌｌ  ５０：６６７，１９８７）。このようなタンパク質（およびそれらのコードする遺伝子）は、保存された位置での特定の残基またはモチーフの類似性パーセントの観点であろうとまたは存在の観点であろうと、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。
【００６５】
比較のための配列の最適アラインメントを、例えば、限定するものではないが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似性検索方法によって；これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または視覚検査によって（一般には、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）行われる。配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適切であるアルゴリズムの別の例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであって、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０，１９９０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７，１９９３を参照のこと）。
【００６６】
本明細書において用いる場合、「内因性」とは、宿主生物体で天然に発現されるか、または細胞、組織または生物体の中に由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドまたは他の化合物を指す。「外因性」とは、細胞、組織または生物体の外側に由来するポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは他の化合物を指す。
【００６７】
本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸残基からなるポリマーを指す。合成ポリペプチドは一局面では、自動化ポリペプチドシンセサイザーを用いて合成される。「タンパク質」という用語は代表的には、大型のポリペプチドを指す。「ペプチド」という用語は代表的には短いポリペプチドを指す。
【００６８】
本明細書において用いる場合、ポリペプチドの「フラグメント」とは、全長ポリペプチドまたはタンパク質発現産物よりも小さいポリペプチドの任意の一部を指す。フラグメントとは代表的には、全長ポリペプチドの欠失アナログであり、ここでは１つ以上のアミノ酸残基は、全長ポリペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去されている。従って、「フラグメント」は、下に記載される欠失アナログのサブセットである。
【００６９】
本明細書において用いる場合、「アナログ」とは、天然に存在する分子に対して、特定の状況にかかわらず種々の程度まで、構造が実質的に類似であって、かつ同じ生物学的活性を有しているポリペプチドを指す。アナログは、１つ以上の変異に基づいて、そのアナログが由来する天然に存在するポリペプチドに比較してそれらのアミノ酸配列の組成が異なり、この変異は、（ｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端での１つ以上のアミノ酸残基の欠失および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端での１つ以上のアミノ酸の挿入または付加（代表的には「付加」アナログ）および／または天然に存在するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域（代表的には「挿入」アナログ）の挿入または付加、あるいは（ｉｉｉ）天然に存在するポリペプチド配列における他のアミノ酸についての１つ以上のアミノ酸の置換を含む。置換は、置換されているアミノ酸の物理−化学的または機能的な関連性および置換しているアミノ酸に基づいて保存的または非保存的である。
【００７０】
本明細書において用いる場合、「対立遺伝子改変体」とは、同じ遺伝子座を占有している遺伝子の任意の２つ以上の多形相をいう。対立遺伝子改変体は、天然には、変異を通じて生じ、かつ集団内の表現型多型を生じ得る。特定の局面では、遺伝子変異は、サイレントである（コードされるポリペプチドに変化はない）か、または変更されたアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードしてもよい。「対立遺伝子改変体」はまた、遺伝子対立遺伝子改変体のｍＲＮＡ転写物由来のｃＤＮＡ、およびそれらによってコードされるタンパク質を指す。
【００７１】
本明細書において用いる場合、「改変体」とは、正常には分子の一部ではない追加の化学部分を含むように改変されているポリペプチド、タンパク質またはそのアナログを指す。このような部分は、種々の局面において、分子の可溶性、吸収および／または生物学的半減期を調節する。この部分は種々の他の局面では、代替的には、分子の毒性を低下して、その分子の任意の望ましくない副作用を排除または減弱するなどである。このような効果を媒介できる部分は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）に開示される。この分子に対してこのような部分をカップリングするための手順は当該分野で周知である。例えば、この改変体は、タンパク質に対してインビボにおいてより長い半減期を付与する化学的修飾を有している血液凝固因子であってもよい。一実施形態では、このポリペプチドは、当該分野で公知の水溶性ポリマーの添加によって改変される。関連の実施形態では、ポリペプチドは、グリコシル化、ＰＥＧ化および／またはポリシアル化によって修飾される。
【００７２】
本明細書において用いる場合、「寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）」とは、例えば、レシピエントへの非自己ＭＨＣ抗原の導入に対する応答においてそうでなければ生じるであろう抗原−レシピエントの免疫応答の欠如を指す。寛容とは、種々の局面では、体液性、細胞性または体液性および細胞性の応答の両方に関与する。寛容とは、本明細書において用いる場合、抗原または化合物に対する完全な免疫学的寛容、すなわち免疫応答なしを指すだけでなく、部分的な免疫学的寛容、すなわち、限定された免疫応答（これは化合物に対する応答を完全に排除も阻害もそうでなければ抑制もしない）も指す。例えば、いくつかの局面では、寛容性の被験体は、化合物に対して検出可能な免疫応答を呈するが、これは、同じ化合物に対して曝露された時の非寛容の被験体の免疫応答に比較して、有意に少ないか、または低下されている。
【００７３】
本明細書において用いる場合、「寛容破壊」または「寛容を破壊する」とは、レシピエントが自然に寛容であるか、または生物学的手段を通じた誘導を介して寛容である抗原に対しての寛容が後天的になくなることを指す。寛容性が破壊された被験体は、レシピエントが以前に寛容であった抗原または化合物の存在に応答し、この抗原または化合物に対する応答は、寛容性が破壊されている被験体では検出可能である。一局面では、このレシピエントの応答は免疫学的応答である。
【００７４】
「寛容（性）破壊剤」または「寛容（性）を破壊するための薬剤」とは、レシピエントに投与された場合、レシピエントが自然に寛容であるか、または生物学的手段を通じた誘導を介して寛容である抗原に対する応答の生成を可能にするか許容する薬剤である。特定の抗原についての寛容破壊剤としては、レシピエントの応答、例えば、ネガティブなまたは有害な応答、例としては、限定するものではないが、抗原が、寛容が破壊された後の被験体に投与された場合、その抗原に対するインヒビターの産生および／または抗−抗原免疫応答、例としては、抗体の産生を可能にするものであって、その被験体が以前に寛容であり、寛容破壊の前には有意な応答を呈さなかったものが挙げられる。
【００７５】
候補の寛容破壊剤とは、抗−抗原応答、例えばインヒビターおよび／または抗−抗原抗体の産生の誘導を可能にする能力について試験された任意の薬剤である。この候補の薬剤は、天然に見出されるかまたは合成される。種々の局面では、候補剤は、化学ライブラリー、天然の生成物のライブラリー、またはコンビナトリアルライブラリーから選択される。化学ライブラリーは、公知の化合物の構造的アナログからなる。天然の産物のライブラリーとは、微生物、動物、植物もしくは海洋生物、またはそれらから単離されたタンパク質もしくは低分子のコレクションであり、これらは候補剤のスクリーニングのための混合物を作製するために用いられる。コンビナトリアルライブラリーは、多数のペプチド、オリゴヌクレオチドまたは有機化合物からなる。化学的ライブラリー、天然の産物のライブラリー、またはコンビナトリアルライブラリーを作製または合成する方法は、当該分野で公知である。さらに、化学ライブラリーおよびコンビナトリアルライブラリーは市販されている。特定の実施形態では、この候補剤は、化学療法剤、抗生物質、抗精神病剤、ペニシリン、フルダラビン、インターフェロンα、トール様レセプターのリガンド、炎症促進性サイトカインおよびインビボで炎症促進性サイトカインの放出を誘導する任意の他の化合物からなる群より選択される。しかし、この動物モデルは、血液凝固因子が新抗原を担持する場合この血液凝固因子に対する抗体を産生する。
【００７６】
本明細書において用いる場合、「検出可能部分」または「標識」とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的または他の方法によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで通常用いられる）、ビオチン−ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテンおよびタンパク質（抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能）、または標的に対して相補的な配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能部分はしばしば、測定可能なシグナル、例えば、放射性シグナル、色素生産性シグナル、または蛍光シグナルを生じ、これがサンプル中の結合した検出可能な部分の量を定量するために用いられる。
【００７７】
血液凝固因子
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）とは哺乳動物の肝臓で作製される約２６０ｋＤａの分子量の血漿の糖タンパク質である。これは、血液凝固をもたらす凝固反応のカスケードの重要な成分である。このカスケード内の工程では、第ＩＸａ因子がＦＶＩＩＩと組み合されて、第Ｘ因子を活性型第Ｘａ因子に変換する。第ＦＶＩＩＩはこの工程での補因子として作用し、第ＩＸａ因子の活性についてカルシウムイオンおよびリン脂質とともに必要である。２つの最も一般的な血友病障害は、機能的なＦＶＩＩＩの欠損（血友病Ａ、全ての症例のうち約８０％）または機能的な第ＩＸａ因子の欠損（血友病Ｂまたはクリスマス因子疾患）によって生じる。
【００７８】
近年までに、血友病Ａの標準的な治療は、ヒトドナーの血漿由来のＦＶＩＩＩ濃縮物の調製の頻繁な注入を包含する。この補充療法はかなり有効であるが、このような治療は、肝炎およびＡＩＤＳなどのウイルス媒介性疾患の危険に患者をさらす。このリスクは、モノクローナル抗体を用いる免疫精製による血漿からのＦＶＩＩＩのさらなる精製によって、および有機溶媒または熱のいずれかでの処置によるウイルスの不活性化によって軽減されているが、このような調製物は、処置の費用を大きく増大し、リスクがなくなるわけではない。これらの理由のため、患者は予防的にではなく対症的に処置されている。さらなる合併症は患者のうち約１５％が血漿由来のＦＶＩＩＩに対する阻害性抗体を発症するということである。
【００７９】
血友病Ａの処置における重要な進歩は、ヒトＦＶＩＩＩの完全な２，３５１個のアミノ酸配列をコードしているｃＤＮＡクローンの単離（Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：３３０（１９８４）および米国特許第４，７５７，００６号，１９８８年７月１２日を参照のこと）、ならびにヒトＦＶＩＩＩ遺伝子ＤＮＡ配列およびその作製のための組み換え方法の提供である。しかし、組み換えＦＶＩＩＩを投与されている患者は、やはり疾患の処置を妨害するＦＶＩＩＩ特異的抗体を発達させる場合がある。血友病の処置のための第ＶＩＩＩ因子製品としては、限定するものではないが以下が挙げられる：ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）（Ａｎｔｉｈｅｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  （Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ），Ｐｌａｓｍａ／Ａｌｂｕｍｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｔｈｏｄ，ｒＡＨＦ−ＰＦＭ）、組み換え抗血友病因子（ＢＩＯＣＬＡＴＥ（商標）、ＧＥＮＡＲＣ（登録商標）、ＨＥＬＩＸＡＴＥ  ＦＳ（登録商標）、ＫＯＡＴＥ（登録商標）、ＫＯＧＥＮＡＴＥ  ＦＳ（登録商標）、ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＥ（登録商標））：ＭＯＮＯＣＬＡＴＥ−Ｐ（登録商標）、第ＶＩＩＩ因子の精製調製物：Ｃ，抗血友病因子／フォン・ビルブラント因子複合体（Ｈｕｍａｎ）ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ（登録商標）およびＡＬＰＨＡＮＡＴＥ（商標）、抗血友病因子／フォン・ビルブラント因子複合体（Ｈｕｍａｎ）；およびＨＹＡＴＥ  Ｃ（登録商標）、精製されたブタ第ＶＩＩＩ因子。
【００８０】
フォン・ビルブラント因子は、血漿中に、１×１０６〜２０×１０６ダルトンという分子量の一連のマルチマー型で存在する。ｖＷＦは、哺乳動物の内皮細胞で主に形成される糖タンパク質であって、引き続き循環中に分泌される。この関係では、約２２０ｋＤの分子量を有しているポリペプチド鎖から出発して、５５０ｋＤの分子量を有しているｖＷＦ二量体は、いくつかのイオウ結合の形成によって細胞中で作製される。最大２千万ダルトンまで分子量が増大するｖＷＦのさらなるポリマーを、連結によってｖＷＦ二量体から形成する。特に高分子量のｖＷＦ多量体は血液凝固において本質的な重要性を有すると推定される。
【００８１】
ｖＷＦ症候群は、ｖＷＦの産生不足または過剰産生がある場合、臨床的に顕在化する。ｖＷＦの過剰産生は、血栓の増大を生じる（血管の内側の凝血または血栓の形成、血流の閉塞）が、高分子量型のｖＷＦのレベル低下または欠失によって、血小板凝集および創傷閉鎖の阻害に起因する出血の増大および出血時間の延長が生じる。
【００８２】
ｖＷＦ欠損はまた、表現型の血友病Ａを生じ得る。なぜならｖＷＦは機能的な第ＶＩＩＩ因子の本質的な成分であるからである。これらの場合には、第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血液凝固カスケード中の機能が障害されるような程度まで短くなる。フォン・ビルブラント病（ｖＷＤ）またはｖＷＦ症候群に罹患している患者は、高頻度に第ＶＩＩＩ因子欠損を呈する。これらの患者では、第ＶＩＩＩ因子活性の低下は、第Ｘ染色体遺伝子の欠損の結果ではないが、血漿中のｖＷＦの定量的および定性的な変化の間接的な結果である。血友病ＡとｖＷＤとの間の相違は通常、ｖＷＦ抗原を測定することによって、またはリストセチン−補因子活性を決定することによって影響され得る。ｖＷＦ抗原含量とリストセチン補因子活性の両方がほとんどのｖＷＤ患者で低下されるが、それらは血友病Ａでは正常である。ｖＷＦ症候群の処置のためのｖＷＦ産物としては、限定するものではないが以下が挙げられる：ＨＵＭＡＴＥ−Ｐ；および、ＩＭＭＵＮＡＴＥ（登録商標）、ＩＮＮＯＢＲＡＮＤ（登録商標）、および８Ｙ（登録商標）（これらの治療は、血漿由来のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ濃縮物を含んでいる）。
【００８３】
第ＶＩＩ因子（プロコンバーチン）、セリンプロテアーゼ酵素は、血液凝固カスケード中の中央のタンパク質の１つである。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の主な役割は、組織因子（ＴＦ）と組み合わせて凝固のプロセスを開始することである。血管損傷の際、ＴＦは血液および循環中の第ＶＩＩ因子に曝される。一旦ＴＦに結合すれば、ＦＶＩＩは、種々のプロテアーゼによってＦＶＩＩａに対して活性化され、この中ではトロンビン（第ＩＩａ）、活性化第Ｘ因子およびＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体自体である。組み換えヒト第ＶＩＩａ因子（ＮＯＶＯＳＥＶＥＮ（登録商標））は、補充凝固因子に対するインヒビターを発達させた血友病患者での制御されない出血での使用のために導入されている。ヒト第ＶＩＩ因子を発現するトランスジェニック生物体は、Ｈｗａｎｇら、（Ｍａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４８５〜９２，２００４）によって開発されており、これには、ヒトＦＶＩＩを発現するトランスジェニック魚を記載している。
【００８４】
第ＩＸ因子（ＦＩＸ，クリスマス因子）はセリンプロテアーゼであって、第ＸＩａ因子または第ＶＩＩａ因子（組織因子経路の）によって活性化されない限り不活性である。第ＩＸａ因子中に活性化された場合、これは、第Ｘ因子におけるアルギニン−イソロイシン結合を加水分解することによって作用して、第Ｘａ因子を形成する。第ＶＩＩＩ因子は、ＦＩＸプロテアーゼ活性について必要な補因子である（Ｌｏｗｅ  Ｇ  Ｄ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１１５：５０７−１３，２００２）。第ＩＸ因子の欠損は、血友病Ｂまたはクリスマス疾患を生じる。ヒト第ＩＸ因子を発現するトランスジェニック動物が開示されている。例えば、ヒツジの乳汁中にヒト第ＩＸ因子を発現するトランスジェニックヒツジを開示している、Ｓｃｈｎｉｅｋｅら、（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：２１３０〜３３，１９９７）、およびトランスジェニックマウスにおけるヒトＦＩＸの発現を開示するＡｌｅｘａｎｄｅｒら、（Ｈｕｍ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．４：９９３〜９，１９９５）を参照のこと。また、Ｂｉｇｇｅｒら、（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００６  １３（２）：１１７〜２６，２００６）は、いくつかの動物で最大１年までタンパク質に対する寛容を誘導する血友病Ｂのマウスモデルにおけるヒト第ＩＸ因子を発現する造血幹細胞の投与を開示する。Ｗａｄｄｉｎｇｔｏｎら、（Ｂｌｏｏｄ．２００３  １０１：１３５９〜６６）は、レシピエントの動物においてヒトタンパク質に対する寛容を誘導するためのマウスに対するヒトＦＩＸを発現するアデノウイルスベクターの子宮内投与を開示する。
【００８５】
本発明の方法における使用に対して受け入れられる追加の血液因子としては、限定するものではないが、第ＩＩ因子（当該分野ではトロンビンとして公知）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００４９７）（その欠損は、血栓およびプロトロンビン異常症を生じる）；第Ｖ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００１２１）（その欠損は、出血性素因またはある形態の血栓形成傾向を生じ、活性化プロテインＣ耐性としても公知）、第ＸＩ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００１１９）（その欠損はローゼンタール症候群（Ｃ型血友病）を生じる）、および第ＸＩＩＩ因子サブユニットＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００１２０）およびサブユニットＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿００１９８５）（その欠損はＩ型欠損（ＡおよびＢサブユニットの両方の欠損）およびＩＩ型欠損（Ａサブユニットのみの欠損）として特徴付けられ、そのいずれかが生涯にわたる出血傾向、創傷治癒欠陥を生じ得る）、ならびに習慣性流産第ＸＩＩ因子（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００４９６）；プロテインＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００３０３）；抗トロンビンＩＩＩ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００４７９）、およびその活性型が挙げられる。
【００８６】
ヒト血液凝固因子のフラグメント、改変体およびアナログ
血液凝固障害の処置においてヒト血液凝固因子タンパク質の治療上の有効性を評価するために、そのヒト血液凝固因子ポリペプチドまたはそのフラグメント、改変体もしくはアナログを本明細書に記載のトランスジェニックマウスに投与する。
【００８７】
ポリペプチドフラグメント、改変体またはアナログを調製するための方法は当該分野で周知である。ポリペプチドのフラグメントは、限定するものではないが、酵素的切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン）を用いて調製し、また組み換え手段を用いて特異的なアミノ酸配列を有しているポリペプチドフラグメントを生成する。所望のフラグメントをコードしているポリヌクレオチドを用いて、リガンド結合ドメイン、レセプター結合ドメイン、二量体化もしくは多量体化ドメイン、または任意の他の当該分野で公知の特定可能なドメインなどの、特定の活性を有しているタンパク質の領域を含んでいるポリペプチドフラグメントを生成してもよい。
【００８８】
ポリペプチドアナログを作製する方法も周知である。ポリペプチドのアミノ酸配列アナログは、実質的、挿入性または欠失の改変体である。ポリペプチドのフラグメントを含んでいる欠失アナログは、機能または免疫原性の活性に必須ではない天然のタンパク質の１つ以上の残基を欠く。挿入性のアナログは、ポリペプチド中の非末端ポイントでの物質の付加を包含する。これは、免疫反応性エピトープまたは単なる単一の残基の挿入を包含し得る。
【００８９】
アナログは、それらが由来し、かつ本明細書に記載されている血液凝固因子に対して実質的に相同であっても、または実質的に同一であってもよい。意図されるアナログは、野性型ポリペプチドの生物学的活性、例えば、血液凝固活性の少なくともある程度を保持するものである。
【００９０】
実質的なアナログは代表的には、タンパク質内の１つ以上の部位で野性型の１つのアミノ酸を別のものに交換し、他の機能または特性の喪失なしに、本明細書に記載されるようなポリペプチドの１つ以上の特性を調節するように設計されてもよい。一局面では、置換は保存的置換である。「保存的アミノ酸置換」とは、類似の化学的特徴の側鎖を有しているアミノ酸でのアミノ酸の置換を意味する。保存的置換を作製するための類似のアミノ酸としては、酸性の側鎖を有しているアミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸）；塩基性の側鎖を有しているアミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）；極性のアミド側鎖（グルタミン、アスパラギン）；疎水性、脂肪族側鎖（ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン）；芳香族側鎖（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）；小型の側鎖（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）；または脂肪族ヒドロキシル側鎖（セリン、トレオニン）が挙げられる。
【００９１】
フラグメントおよびアナログをコードするポリヌクレオチドは、天然に存在する分子に対して同じまたは類似の生物学的活性を保有する天然に存在する分子の生物学的に活性なフラグメント改変体またはアナログをコードするように、当業者によって容易に作製できる。これは、ＰＣＲ技術、ＤＮＡコード分子の消化などによって行うことができる。従って、当業者は、ＤＮＡ鎖における単一塩基の変化を作製して、変化されたコドンおよびミスセンス変異を生じることができるであろう。
【００９２】
例示的な血液凝固因子アナログは、例えば、出典明記によって本明細書に援用されている、米国特許第６，３４６，５１３号、米国特許第６，３１６，２２６号、米国特許第６，１５６，８８８号、米国特許第６，１３０，２０３号、および米国特許第６，９５８，３２２号に記載されている。
【００９３】
考慮されるヒト血液凝固因子改変体としては、ユビキチン結合、グリコシル化、治療剤または診断剤へのコンジュゲーション、標識（例えば、放射性各種または種々の酵素を用いる）、ポリマー共有結合、例えばＰＥＧ化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）、非加水分解性結合の誘導、およびヒトのタンパク質に正常には存在しないオルニチンなどのアミノ酸の化学合成による挿入または置換などの技術によって化学的に改変されたポリペプチドが挙げられる。改変体は、本発明の非改変分子の結合特性を保持する。
【００９４】
ＰＥＧ化された血液凝固因子アナログを調製することは一般には、（ａ）結合構築物ポリペプチドが１つ以上のＰＥＧ基に結合するような条件下でポリペプチドとポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とを反応させる工程、および（ｂ）この反応産物（単数または複数）を得る工程を包含する。一般には、アシル化反応の最適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きいほど、ポリ−ＰＥＧ化産物の割合が大きい。いくつかの実施形態では、結合構築物は、Ｎ末端で単一のＰＥＧ部分を有する。
【００９５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、血液凝固因子に結合して、インビボでのより長い半減期を得ることができる。ＰＥＧ基は、任意の都合のよい分子量であってもよく、直線であっても分枝であってもよい。ＰＥＧの平均分子量は、約２キロダルトン（「ｋＤ」）〜約１００ｋＤａ、約５ｋＤ〜約５０ｋＤａ、または約５ｋＤａ〜約１０ｋＤａにおよぶ。ＰＥＧ基は、血液凝固因子上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基）に対するＰＥＧ部分上の天然または操作された反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基）を通じたアシル化または還元性のアルキル化を介して、あるいは当該分野で公知の任意の他の技術によって、血液凝固因子に結合される。
【００９６】
本発明の方法で有用なポリペプチド改変体としては、ポリシアリレート（ＰＳＡ）部分を含むポリペプチドが挙げられる。ポリシアリレート化ポリペプチドを調製するための方法は、米国特許出願公開２００６０１６０９４８およびＳａｅｎｋｏら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １２：４２〜５１，２００６に記載されている。
【００９７】
本発明の方法における使用のためのヒト血液凝固因子は、ポリペプチドである第二の薬剤との融合タンパク質であってもよいとさらに考えられる。一実施形態では、ポリペプチドである第二の薬剤は限定するものではないが、酵素、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面レセプター、細胞表面レセプターの細胞外ドメイン、細胞接着分子または上記のタンパク質のフラグメントもしくは活性ドメインである。関連の実施形態では、この第二の薬剤は、血液凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子およびフォン・ビルブラント因子である。この考慮される融合タンパク質は、当該分野で周知の化学的技術または組み換え技術によって作製される。
【００９８】
投与のための血液凝固因子組成物
本明細書に記載される血液凝固因子ポリペプチド（フラグメント、アナログまたは改変体を含む）を試験被験体に投与するために、血液凝固因子ポリペプチドは、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアを含んでいる組成物中に処方される。「薬学的にまたは薬理学的に受容可能な」という句は、下記のように、当該分野で周知の経路を用いて投与した場合、アレルギーも他の有害反応も生じない分子的実態および組成物を指す。「薬学的に受容可能なキャリア」とは任意のかつ全ての臨床的に有用な溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。
【００９９】
さらに、化合物は、水または共有の有機溶媒との溶媒和物を形成し得る。このような溶媒和物も同様に考慮される。
【０１００】
血液凝固因子組成物は、経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、吸入スプレーによって、経膣的に、直腸的に、または頭蓋内注射によって投与され得る。非経口という用語は本明細書において用いる場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、嚢内注射または注入の技術を包含する。静脈内、経皮、筋肉内、乳房内、腹腔内、くも膜下腔内、眼球後方、肺内の注射およびまたは特定部位での外科的移植も同様に考慮される。一般には、組成物は、発熱物質を本質的に含まず、レシピエントに有害であり得る他の不純物も含まない。
【０１０１】
薬学的組成物の処方物は、選択される投与経路（例えば、溶液、エマルジョン）に従って変化し得る。投与されるべき組成物を含む適切な組成物は、生理学的に受容可能なビヒクルまたはキャリア中で調製される。溶液またはエマルジョンについては、適切なキャリアとしては、例えば、水溶液またはアルコールの溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられ、これには生理食塩水および緩衝化媒体が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油を挙げることができる。静脈内ビヒクルは、種々の添加物、防腐剤または液体、栄養物または電解質補充物を含み得る。
【０１０２】
活性成分として血液凝固因子を含んでいる本発明の方法で有用な薬学的組成物は、投与経路次第で薬学的に受容可能なキャリアまたは添加物を含んでもよい。このようなキャリアまたは添加物の例としては、水、薬学的に受容可能な有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチル・デンプン・ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、薬学的に受容可能なサーファクタントなどが挙げられる。用いられる添加物は、本発明の剤形に依存して、必要に応じて、限定するものではないが、上記またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１０３】
種々の水性キャリア、例えば、水、緩衝化水、０．４％の生理食塩水、０．３％のグリセリン、または水性懸濁液は、水性懸濁物の製造に適切な賦形剤と組み合わせて活性な化合物を含み得る。このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアカシアゴムであり；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチル−エネオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分的エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分的エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアートであってもよい。水性懸濁液はまた、１つ以上の防腐剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾアートを含んでもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、血液凝固因子組成物は、貯蔵のために凍結乾燥されて、使用前に適切なキャリア中で再構成される。この技術は、従来の免疫グロブリンによって有効であることが示されている。当該分野で公知の任意の適切な凍結乾燥および再構成技術を使用する。凍結乾燥および再構成は、種々の程度の抗体活性喪失をもたらすこと、およびその使用レベルを調節して補償しなければならないことが当業者によって理解される。
【０１０５】
水の添加による水性懸濁液の調製に適切な分散性の粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つ以上の防腐剤と混合された活性化合物をもたらす。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、上記で既に言及されるものによって例示される。
【０１０６】
特定の実施形態では、これらの処方物における血液凝固因子の濃度は、例えば、約０．５％、通常は少なくとも約１重量％〜１５または２０重量％程度まで広範に変化し、かつ選択された特定の投与方式に従って主に、液体容積、粘度などに基づいて選択される。従って、例えば、限定するものではないが、非経口注射のための代表的な薬学的組成物は、最大１ｍｌまでの滅菌緩衝化水および５０ｍｇの血液凝固因子を含むように作製される。静脈内注入物の代表的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液および１５０ｍｇの血液凝固因子を含むように作製されてもよい。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかであり、かつ例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１５版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）にさらに詳細に記載されている。二重特異性抗体の有効投与量は、１投与あたり体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇの範囲内である。
【０１０７】
種々の局面では、薬学的組成物は、無菌の注射可能な溶液または分散液の即時的な調製のための滅菌の注射用水溶液、油性懸濁液、分散または滅菌の粉末の形態である。この懸濁物は、上述されている適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を用いて公知の技術に従って処方され得る。無菌の注射可能な調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌の注射溶液または懸濁液であってもよい。いくつかの実施形態では、このキャリアは、溶媒または分散媒体であり、これは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）、その適切な混合物、植物油、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定油は溶媒または懸濁培地として都合よく使用される。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含んでいる任意の無刺激性の固定油を使用してもよい。さらに脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射可能な調製物において用途を見出す。
【０１０８】
全ての場合、この形態は、無菌でなければならず、かつ容易な注射能力がある程度まで液体でなければならない。この適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、およびサーファクタントの使用によって維持される。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保護されなければならない。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされる。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが所望されるであろう。特定の局面では、注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によってもたらされる。
【０１０９】
投与に有用な組成物は、その有効性を増大するために取り込みまたは吸収のエンハンサーとともに処方され得る。このようなエンハンサーとしては、例えば、サリチル酸塩、グリココール酸／リノール酸、グリコレート、アプロチニン、バシトラシン、ＳＤＳ、カプラートなどが挙げられる。例えば、Ｆｉｘ（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８５：１２８２〜１２８５，１９９６）ならびにＯｌｉｙａｉおよびＳｔｅｌｌａ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３２：５２１〜５４４，１９９３）を参照のこと。
【０１１０】
さらに、この方法または本発明における使用について意図される組成物の親水性および疎水性の特性は、十分バランスがとれており、それによってインビトロおよび特にインビボの使用の両方についてその有用性が向上するが、このようなバランスを欠く他の組成物は、実質的に有用性が低い。詳細には、本発明における使用について意図される組成物は、水性媒体中で適切な程度の溶解度を有し、これによって身体中での吸収および生体利用性か可能になるがまた、脂質中である程度の溶解度を有しており、これによって、この化合物は細胞膜を横切って作用の推定部位に対して移動することが可能になる。
【０１１１】
トランスジェニック動物の準備
一般には、本発明のトランスジェニック動物は、ヒト以外の任意の形質転換可能な種を包含する。特に目的なのは哺乳動物であり、これには、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、スナネズミ（アレチネズミ）、モルモット、およびブタなどの公知の形質転換可能な種が挙げられる。なぜなら形質転換方法が開発されているからであり、これにはウシおよび非ヒト霊長類を含む。
【０１１２】
本発明のトランスジェニック動物は、少なくとも１つの外来遺伝子がゲノムに挿入されている遺伝子操作された動物である。これらの動物によって、他の試験系では達成できない、全身的および特異的な方式で、細胞レベルに対する調節性のプロセスを検査して支配することが可能になる。記載されたタイプのトランスジェニック動物は、治療的な血液凝固因子の投与のインビボ効果を分析するために有用であり、この血液凝固因子としては、限定するものではないが、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）、第ＩＩ因子（ＦＩＩ）、第Ｖ因子（ＦＶ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、第ＸＩ因子、（ＦＸＩ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）および第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）が挙げられる。トランスジェニック動物は、推定上の寛容宿主免疫系の状況での抗自己抗体の発達を生じることに対する、化合物、すなわち精製された凝固タンパク質またはその改変体の効果を評価するために優れたモデルとして役立つ。このような理解は、限定するものではないが、血友病、フォン・ビルブラント症候群などを含む血液凝固障害の処置のための因子の設計および試験に必須である。
【０１１３】
さらに特定の局面では、ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック動物はまた、ヒト組織適合性複合体（ＭＨＣ）遺伝子も発現すると考えられる。ＭＨＣ遺伝子は、細胞表面上の外来抗原を発現すること、およびＣＤ８＋（ＭＨＣクラスＩ）またはＣＤ４＋（ＭＨＣクラスＩＩ）Ｔ細胞のいずれかに対して抗原を提示することに関与する。ヒトＭＨＣクラスＩトランスジェニックマウス（Ｅｓｃｏｂａｒら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：２１４〜９，１９９９）およびヒトＭＨＣクラスＩＩトランスジェニックマウス（ＷＯ  ２００６／０５６７６９およびＦｕｇｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，６１５１〜６１５５，１９９４）の両方とも、当該分野で記載されており、その開示は出典明記によって本明細書に援用される。
【０１１４】
ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子としては、非ヒトトランスジェニック動物での発現に適切な任意のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子が挙げられ、これには限定するものではないが、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ−、ＨＬＡ−ＤＯ、ＬＭＰ、ＴＡＰおよびＴＡＰＢＰ（ＭＨＣ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：９２１〜９２３，１９９９，出典明記によって本明細書に援用される）が挙げられる。
【０１１５】
本明細書の導入遺伝子は、天然の調節（発現制御）配列に隣接するか、または異種配列に会合している、ヒト血液凝固因子またはヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子タンパク質のコード配列（例えば、ｃＤＮＡ、合成コード配列、またはゲノムＤＮＡ）を含み、この配列は、プロモーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’非コード領域および３’非コード領域などを含む。このコード配列はまた、当該分野で公知の多くの手段によって修飾され得る。このような修飾の非限定的な例としてはメチル化、「キャップ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、およびヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電された結合を有するもの（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、特定の局面では、１つ以上の追加の共有結合部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレーター（例えば、金属、放射性金属、鉄、酸化金属など）およびアルキレーターを含む。ポリヌクレオチドはメチルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキスホスホラミダート結合の形成によって誘導体化され得る。さらにいくつかの実施形態では、本明細書のポリヌクレオチドは、検出可能シグナルを提供できる標識を用いて直接または間接的に修飾される。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。
【０１１６】
遺伝子発現の制御は、当該分野で周知の種々の方法によって達成される。導入遺伝子の発現は、代表的には、所定の設定の条件、例えば、所定の化合物もしくは特定の物質の存在、または環境的な状態、例えば、組織型もしくは温度における変化に対して応答性であるプロモーターを選択することによって、構成的であるか、または公知の手段によって誘導性または抑制可能であるように調節される。「誘導性発現」という用語は、規定の条件下で遺伝子発現が生じるための任意の手段におよび、この手段および条件の選択は、宿主生物の利便性および妥当性に基づいて選択されている。
【０１１７】
形質転換は、その生物体の細胞のおよびその生物学の特徴に対して依存する種々の公知の技術によって行われる。安定な形質転換とは、細胞へのおよび細胞核へのＤＮＡ進入を包含する。単一の細胞から再生される生物（これはいくつかの哺乳動物を含む）については、形質転換が、インビトロの培養で行われ、続いて形質転換体の選択および形質転換体の再生が行われる。細胞へＤＮＡまたはＲＮＡを移入するために高頻度に用いられる方法としては、マイクロインジェクション、微粒子銃ボンバードメント（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｇｕｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、陽イオン性脂質、リポソームまたは他のキャリア物質とのＤＮＡまたはＲＮＡ複合体の形成、エレクトロポレーション、ならびに形質転換ＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスベクターへの組み込みが挙げられる。他の技術が当該分野で公知である。細胞核へのＤＮＡ移入は、細胞プロセスによって生じ、しばしば適切なベクターの選択によって、細胞内トランスポザーセもしくはリコンビナーゼによって作用される際に、組み込み部位配列を含むことによって、補助され得る（例えば、［Ｃｒａｉｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８，２２：７７；Ｃｏｘ．Ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（Ｒ．Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ，編集）１９８８，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，４２９〜４９３頁；Ｈｏｅｓｓ．Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ編集）Ｖｏｌ．４，１９９０，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，第９９〜１０９頁を参照のこと。
【０１１８】
種々のＥＳ細胞が由来するマウス株の遺伝的バックグラウンドは当該分野で公知であり、これにはマウス株１２９に由来するＥＳ細胞：亜株１２９／Ｓｖと１２９／Ｓｖ−ＣＰとの間の交雑由来のマウス胚盤胞に由来するＲ１細胞（Ｎａｇｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９０：８４２４〜８，１９９３）；１２９／Ｓｖ／Ｅｖ由来のＧＳ１細胞が挙げられる。Ｄ３細胞（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：５７６〜８，１９８７）およびＪ１細胞は、１２９／Ｓｖまたは１２９／ｔｅｒＳｖに由来する。これもＥＳマウスを生じたＴＴ２細胞は、Ｆ１ハイブリッド株（Ｃ５７ＢＬ／６×ＣＢＡ）（Ｙａｇｉら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：７０〜６，１９９３）に由来した。
【０１１９】
いくつかの局面での血液凝固因子を発現するために用いられる発現ベクターおよび核酸はまた、組織特異的なプロモーターを含む。このようなプロモーターは当該分野で公知であり、限定するものではないが、肝臓特異的プロモーター類（例えば、アルブミン；Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１：５１２４〜３２，１９９７；α−フェトプロテイン）、筋特異的プロモーター類（例えば、ミオシン軽鎖１（Ｓｈｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：４０３〜１０，１９９７，α−アクチン）、膵臓特異的プロモーター（例えば、インスリンまたはグルカゴンプロモーター類）、神経特異的プロモーター類（例えば、チロシンヒドロキシラーゼプロモーターまたはニューロン特異的エノラーゼプロモーター）、内皮細胞特異的プロモーター類（例えば、フォン・ビルブラント因子；Ｏｚａｋｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１４８３〜９０，１９９６）、ならびに平滑筋細胞特異的プロモーター類（例えば、２２ａ；Ｋｉｍら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１００６〜１４，１９９７）が挙げられる。他の組織特異的プロモーター類としては、ガン治療を開発するのにも用いられるプロモーター類が挙げられ、これにはチロシン特異的プロモーター類（Ｄｉａｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７８９〜９５，１９９８）、ヒトアロマターゼチトクロームｐ４５０由来の脂肪組織プロモーター（ｐ４５０ａｒｏｍ）（米国特許第５，４４６，１４３号；Ｍａｈｅｎｄｒｏｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９４６３  １９４７０，１９９３；およびＳｉｍｐｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：３１７  ３２４，１９９３を参照のこと）が挙げられる。このプロモーターは、内因性の血液凝固因子プロモーターであるとさらに考えられる。本発明の方法で有用なベクターおよび他の核酸分子としては、導入遺伝子の一時的発現を制限する配列も挙げることができる。例えば、導入遺伝子は、薬物誘導性プロモーターによって、例えば、プロモーターにｃＡＭＰ応答エレメントエンハンサーを含むことおよびトランスフェクトまたは感染された細胞をｃＡＭＰ調節薬で処理することによって制御される（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１８８３〜９３，１９９６）。あるいは、リプレッサーエレメントは、薬物の存在下で転写を予防し得る（Ｈｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７：３３３９〜４３，１９９７）。発現の空間的制御はまた、ｅｒｇ１遺伝子プロモーターと組み合わせて電離放射線（放射線治療）を用いることによっても達成されている（Ｓｅｕｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５：５５６１〜５，１９９５）。
【０１２０】
ヒト血液凝固因子類またはヒトＭＨＣクラス遺伝子類をコードする組み換え核酸構築物は、増幅のために任意の適切なプラスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクター中に挿入されてもよく、それによって当該分野で公知の方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：  １９８９）を用いて増殖されてもよい。一実施形態では、真核細胞、例えば、脊椎動物細胞と適合性の発現ベクターを用いる。真核生物細胞発現ベクターは、当該分野で周知であり、市販の供給源から入手可能である。意図される発現ベクターは、真核生物配列（細菌中のベクターの増殖を容易にするため）および１つ以上の真核生物転写単位（ブタの細胞中で機能的な）の両方を含む。代表的にはこのようなベクターは、所望の組み換えＤＮＡ分子の挿入のために都合のよい制限部位を提供する。ｐｃＤＮＡＩ、ｐＳＶ２、ｐＳＶＫ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＰＶＶ−１／ＰＭＬ２ｄおよびｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．３１２５５）由来のベクターは、非ヒト細胞のトランスフェクションのために適切な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターのいくつかを、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で改変して、原生動物細胞および真核生物細胞の両方で複製および薬物耐性選択を容易にする。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）、またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ，ｐＲＥＰ−由来およびｐ２０５）などのウイルスの誘導体を、ブタ細胞でのタンパク質の発現に用いる。宿主細胞のプラスミドおよび形質転換の調製に使用される種々の方法が当該分野で周知である。本発明で有用な他の適切な発現系について、および一般的な組み換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）を参照のこと。
【０１２１】
トランスジェニック動物、特にマウスまたはラットを作製するための技術は周知である（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ  １１５：１７１〜２２９，１９８９）。導入遺伝子を導入するための種々のアプローチが利用可能であり、これには、細胞への核酸のマイクロインジェクション、レトロウイルスベクター方法、および胚性幹（ＥＳ）細胞への遺伝子移入が挙げられる。受精した卵母細胞を、トランスジェニック動物を作製するために用いる場合、所望の外来ＤＮＡまたは導入遺伝子を卵母細胞に組み込む。卵母細胞への導入遺伝子の組み込みは、適切なレトロウイルスベクターを介して、またはマイクロインジェクションによってなどのいくつかの方法で行う。トランスジェニックマウスは、Ｌｅｄｅｒらに発行された米国特許第４，７３６，８６６号に記載のとおり、そして、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，と題されたＢ．Ｈｏｇａｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）によって示されるとおり、妊娠中のマウスから単離した胚盤胞へのＤＮＡのマイクロインジェクションによって当該分野で慣用的に作製される。また、例えば、Ｈａｒｅｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：２４５〜２８１，１９９９；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６６（３）：７２９〜７３４，１９９９；Ｉｖｉｃｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｄ．，６０：９９〜１３１，１９９９；Ｈａｌｌら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２１：１５７〜１７８  １９９７も参照のこと。米国特許第６，４９２，５７５号は、ＥＳ細胞を形質転換し、この形質転換された細胞を四倍体胚盤胞に注入することによってトランスジェニックマウスを作製する方法を記載する。ヘテロ接合性の同胞を異種交配することによって、所望の遺伝子を担持しているホモ接合性の動物を得る。
【０１２２】
さらに、Ｃａｐｅｃｃｈｉらは、導入遺伝子が胚性、胎児性または成体の多能性幹細胞中に組み込まれる方法を記載している（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８〜１２９２，１９９１）。この方法では、胚性幹細胞はインビトロで培養された胚盤胞から単離される。これらの胚性幹細胞は、多くの細胞世代にわたって分化せずに培養中で安定に維持される。次いで導入遺伝子を、エレクトロポレーションまたは他の形質転換方法によって胚性幹細胞に組み込む。導入遺伝子を担持する幹細胞を選択して胚盤胞の内部細胞塊に注射する。次いで、胚盤胞を偽妊娠雌に移植する。胚盤胞の内部細胞塊の全ての細胞が導入遺伝子を担持するのではないので、その動物は導入遺伝子に関してキメラである。キメラ動物の異種交配によって、導入遺伝子を担持している動物の作製が可能になる。このプロセスの概説は、Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９８９，５：７０〜７６によって提供される。
【０１２３】
導入遺伝子の送達は、レトロウイルス送達系によって達成され得る。例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：１９，１９８８を参照のこと。一局面では、レトロウイルス構築物はウイルスの構造遺伝子が単一の遺伝子で置換されているものであり、この遺伝子が次にウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に含まれる調節性エレメントの制御下で転写される。種々の単一遺伝子ベクター骨格が用いられており、これにはモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＭｏＭｕＬＶ）が含まれる。一実施形態では、内部プロモーターの制御下、選択マーカーの遺伝子および目的の第二の遺伝子などの異なる遺伝子の複数の挿入を可能にするレトロウイルスベクターは、このタイプの骨格由来である。例えば、Ｇｉｌｂｏａ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：２９，１９８８を参照のこと。
【０１２４】
タンパク質産物の発現のためのベクターの構築のエレメントは当業者に公知である。レトロウイルスベクターからの効率的な発現は、Ｃｈａｎｇら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ７：２６４，１９８９に概説される、ＳＶ  ４０プロモーターまたはＬＴＲプロモーターなどの「強力な」プロモーターを用いて転写を制御する場合に観察される。これらのプロモーターは、構成的であって、かつ組織特異的発現を一般には可能にしない。他の適切なプロモーターは本明細書に考察されている。
【０１２５】
パッケージング細胞株の使用によって、産生された組み換えビリオンの有効性および感染性を増大できる。Ｍｉｌｌｅｒ，１９９０，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５を参照のこと。マウスのレトロウイルスベクターは、遺伝子を効率的にマウス胚に（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、１９８５，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：６６３；Ｇｒｉｅｄｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．３：１６２，１９８７），および造血幹細胞に（例えば、Ｌｅｍｉｓｃｈｋａら、Ｃｅｌｌ  ４５：９１７〜９２７，１９８６；Ｄｉｃｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１６５〜１７０，１９８６を参照のこと）移入するために有用である。
【０１２６】
以前に可能であったよりもかなり高いウイルス力価の獲得を可能にする追加のレトロウイルス技術は、エコトロピックなパッケージング細胞株とアンホトロピックなパッケージング細胞株との間の連続的な移動による増幅、いわゆる「ピンポン」法を包含する。例えば、Ｋｏｚａｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３５００〜３５０８，１９９０；Ｂｏｄｉｎｅら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３１９：５８９〜６００，１９８９を参照のこと。さらに、ウイルス力価を増大するための技術によって、ウイルス産生細胞株との直接のインキュベーションよりもウイルス含有上清を使用して、効率的な形質導入を得ることが可能になる。例えば、Ｂｏｄｉｎｅら、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３１９：５８９〜６００，１９８９を参照のこと。細胞ＤＮＡの複製が、宿主ゲノムへのレトロウイルスベクターの組み込みに必要であるので、例えば標的細胞を誘導して、増殖因子でのインビトロの処置によって割ること（例えば、Ｌｅｍｉｓｃｈｋａら、Ｃｅｌｌ  ４５：９１７〜９２７，１９８６；Ｂｏｄｉｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：８８９７〜８９０１，１９８９を参照のこと）、または５−フルオロウラシルに対してレシピエントを曝すこと（例えば、Ｍｏｒｉら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４  Ｓｕｐｐｌ．１：４５７〜４６３，１９８４）によって、活発に周期している幹細胞を標的する頻度を増大することが望ましい場合がある。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、動物への導入遺伝子の導入の間、導入遺伝子を内因性の遺伝子に挿入し、それによって内因性の遺伝子機能をノックアウトすることが考慮される。他の実施形態では、この外因性の遺伝子は、内因性の遺伝子の発現が保存されるような位置で動物ゲノムに挿入される。従って、このトランスジェニック動物は、動物に挿入されたヒト導入遺伝子ポリヌクレオチドに対応する内因性のポリヌクレオチドの全てを発現するか、または一部を発現してもよい。
【０１２８】
免疫原生事象を検出する方法
米国特許第５，４７０，５６０号および同第５，６７０，１３４号は、トランスジェニック哺乳動物に対して異種であり、内因性遺伝子として認識されているためにその動物に寛容である、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有しているトランスジェニック哺乳動物を用いてタンパク質の免疫原性を検出するための方法を記載する。発現される導入遺伝子に対して類似または同一のポリペプチドを含む調製物は、寛容動物に対して投与され、ポリペプチドに特異的な抗体の発達はラジオイムノアッセイまたはＥＬＩＳＡシステムを用いて決定される。米国特許第５，４７０，５６０号および同第５，６７０，１３４号に記載のシステムと異なり、本明細書に記載のトランスジェニック動物は、いくつかの実施形態では、内因性遺伝子の代わりにヒトタンパク質を発現する。
【０１２９】
ヒト血液凝固因子導入遺伝子に特異的な抗体を特定するために有用なトランスジェニック動物は、コントロール動物における内因性タンパク質の正常な発現と同様のレベルでヒト血液凝固因子を発現し、ヒト導入遺伝子によってコードされるタンパク質に寛容であり、すなわちタンパク質が外因性に投与される場合にそのタンパク質に対する強力な免疫応答を生成できる。
【０１３０】
異種ポリペプチドに対して寛容であるトランスジェニック動物は、非寛容の動物における免疫応答を誘導するように計算された任意の方式で分析されるヒト血液凝固因子を含む調製物と接触される。一実施形態では、宿主動物は、ヒト患者のためのインビボの治療または診断の設定において、その調製物について意図する同じ投与経路、キャリアおよび投与頻度を用いて異種ポリペプチドと接触される。注射および緩衝液の投与量、経路およびスケジュールが患者で達成されないならば、これらのパラメーターは、前臨床の動物研究に、またはインビトロの実験に由来する。治療用タンパク質またはポリペプチドの場合、これは、薬理学的に受容可能な等張性のキャリア、例えば、生理食塩水、５％デキストロース、またはリン酸塩緩衝液中で非経口でも、筋肉内または皮下の投与であってもよい。免疫賦活薬またはアジュバントまたは新抗原を必要に応じて調製物に含んでもよい。治療または診断の投与量の複数の投与も評価される。一実施形態では、その調製物は、導入遺伝子によってコードされる異種ポリペプチドを含む。別の実施形態では、この調製物は、ヒト導入遺伝子によってコードされる異種血液因子ポリペプチドのフラグメント、改変体またはアナログを含む。
【０１３１】
ある場合には、より大きい溶解度または安定性、酵素消化に対する耐性、改善された生物学的半減期、および当業者に公知の他の特徴などの所望の特徴を有しているポリペプチドフラグメント、改変体またはアナログの免疫原性を決定することが所望され得る。この場合、トランスジェニック動物を作製するためのトランスフェクションのために用いられるＤＮＡは、異種ポリペプチドの天然の一次アミノ酸配列をコードするが、試験調製物は、天然の異種ポリペプチドのフラグメント、アナログまたは改変体である構造を有している異種ポリペプチドを含む。
【０１３２】
さらなる実施形態では、本調製物は、ヒト導入遺伝子によってコードされる異種ポリペプチドとインビボで相互作用して動物で免疫原性または毒性の応答を生じると予想される治療剤または診断剤を含む。例えば、投与のための調製物は、別の治療剤に融合された異種タンパク質を含んでもよく、この因子は、当該分野で公知のポリペプチド、化学的部分、または他の治療剤であってもよい。
【０１３３】
試験調製物の免疫原性は必要に応じて、調製物中に存在する任意の天然型および／または変性型の免疫原性に比較される。これらの形態のタンパク質は、それぞれ陰性および陽性のコントロールである。このタンパク質は、１００℃で１〜２分間の加熱、またはドデシル硫酸ナトリウム、７Ｍの塩化グアニジンもしくは８Ｍの尿素などの変性剤での処理など、当業者に公知の種々の手順によって正のコントロールのために変性される。正のコントロールによって、そのトランスジェニック動物は、構成的に天然ではないことを確実にするために処理されたタンパク質に対して応答する免疫レパートリーを有しているか否かが確認される。さらなる免疫原性の正のコントロールを、天然の試験タンパク質とアジュバントとを組み合わせることによって行い、トランスジェニック宿主における免疫応答を増強する。別の正のコントロールは、第三の供給源由来のポリペプチド、例えば、ウシ成長ホルモン、チャイニーズ・ハムスターｔＰＡまたはブタ第ＶＩＩＩ因子の使用である。特定の実施形態では、このアジュバントは、特に試験タンパク質の免疫原性を増強することが公知であるか、またはタンパク質の免疫原性を増強するために一般に用いられる任意のアジュバントである。２つの通常用いられる技術は、等容積のフロイント完全（ＦＡ）アジュバント（初回注射のため）もしくは不完全アジュバント（後の注射のため）を用いて水性緩衝液中でタンパク質を乳化すること、またはミョウバンを用いて溶液からタンパク質を同時沈殿することである。次いで、アジュバントおよびタンパク質の混合物をトランスジェニック動物に皮下または筋肉内注射する。注射スケジュールは、変更されてもよいが、タンパク質の免疫原性を試験するためには２週間隔での２つの注射が通常用いられる。試験される用量は、１注射あたり１〜１０００μｇにおよんでもよく、これには１注射あたり１、２、５、１０、１５、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００μｇが挙げられる。
【０１３４】
イムノアッセイ中の検出因子は、検出可能部分または標識に連結されてもよい。検出可能部分または標識とは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な組成物を指す。検出可能部分はしばしは、測定可能なシグナル、例えば、放射活性シグナル、色素生産性シグナルまたは蛍光シグナルを生じ、これを用いてサンプル中の結合した検出可能部分の量を定量する。いくつかの実施形態では、この検出可能部分は、共有結合的に、またはイオン結合、ファン・デル・ワールス結合または水素結合のいずれかによってプライマーまたはプローブに組み込まれるか、またはそこに結合される（例えば、放射性ヌクレオチド、またはストレプトアビジンによって認識されるビオチニル化ヌクレオチドの組み込み）。この検出可能部分は直接または間接的に検出可能である。間接的な検出は、検出可能部分に対する第二の直接または間接的な検出可能部分の結合を包含し得る。例えば、限定するものではないが、この検出可能部分は、結合パートナーのリガンド、例えば、ストレプトアビジンの結合パートナーであるビオチンなど、または特異的にハイブリダイズできる相補的配列のための結合パートナーである、ヌクレオチド配列である。その結合パートナーは、それ自体が直接検出可能であってもよい、例えば、抗体は、それ自体蛍光分子で標識されてもよい。関連の実施形態では、この結合パートナーはまた、間接的に検出可能であり、例えば、相補的なヌクレオチド配列を有している核酸は、他の標識された核酸分子とのハイブリダイゼーションを通じて次に検出可能になる分岐したＤＮＡ分子の一部である（例えば、ＰＤ．ＦａｈｒｌａｎｄｅｒおよびＡ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１６５，１９８８を参照のこと）。シグナルの定量は、例えば、シンチレーションカウント、濃度測定またはフローサイトメトリーによって達成される。
【０１３５】
本発明の免疫原性アッセイ方法での使用に適切な標識の例としては、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ）フルオロフォア（例えば、フルオレセイン）、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで通常用いられるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンもしくはハプテン、ならびに、例えば、ハプテンもしくはペプチド中に放射性標識を組み込むことによって検出可能に作製されるか、またはハプテンもしくはペプチドと特異的に反応性の抗体を検出するために用いられるタンパク質が挙げられる。また、抗血清もしくはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質、または標的に対して相補的な配列を有する核酸分子、ナノタグ、分子量ビーズ、磁性剤、ナノビーズもしくはマイクロビーズ含有蛍光色素、量子ドット、量子ビーズ、蛍光タンパク質、蛍光標識を有するデンドリマー、マイクロ・トランスポンダー、電子供与体分子もしくは分子構造、または光反射性粒子も考慮される。
【０１３６】
本発明での使用について考慮される追加の標識としては、限定するものではないが、蛍光色素（例えば、フルオレセイン・イソチオシアナート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡで通常用いられる他の酵素）、および比色定量標識、例えば、コロイド金、色ガラスまたはプラスチックビーズ（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）および発光または化学発光標識（例えば、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ（Ｅｕ），ＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ）が挙げられる。
【０１３７】
この標識は、当該分野で周知の方法に従ってアッセイの所望の成分に直接または間接的にカップリングされ得る。一実施形態では、この標識は本発明において有用な活性剤のコンジュゲーションのためにイソシアネートまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル試薬を用いて成分に共有結合される。本発明の一局面では、二官能性イソシアナート試薬を用いて、生体高分子に対して標識をコンジュゲートして、活性因子が結合することなく標識生体高分子コンジュゲートを形成する。この標識生体高分子コンジュゲートを、本発明による標識されたコンジュゲートの合成のための中間体として用いてもよいし、またはこの生体高分子コンジュゲートを検出するために用いてもよい。上記で示されるとおり、広範な種々の標識を用い、標識の選択は必要な感度、アッセイの所望の成分とのコンジュゲージョンの容易さ、安定性の要件、利用可能な装置、および処分の条件に依存する。非放射性標識はしばしば、間接的な方法によって結合される。一般には、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合される。次いでリガンドは別の分子（例えば、ストレプトアビジン）分子に結合し、これが固有に検出可能であるか、またはシグナル系、例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物に共有結合される。
【０１３８】
本発明の方法で有用な化合物は、特定の局面では、例えば、酵素または発蛍光団とのコンジュゲーションによってシグナル発生化合物に直接コンジュゲートされる。標識としての使用に適切な酵素としては限定するものではないが、加水分解酵素、特にホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼが挙げられる。標識としての使用に適切な蛍光化合物としては限定するものではないが、上記で列挙された化合物、ならびに、蛍光誘導体類、ローダミンおよびその誘導体類、ダンシル、ウンベリフェロン、エオシン、ＴＲＩＴＣアミン、キニン、フルオレセインＷ、アクリジンイエロー、リサミンローダミン、Ｂスルホニルクロリドエリスロセイン、ルテニウム（トリス、ビピリジニウム）、ユーロピウム、テキサスレッド、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド、フラビン・アデニン・ジヌクレオチドなどが挙げられる。標識としての使用に適切な化学発光化合物としては限定するものではないが、ＭＳＤスルファ−ＴＡＧ、ユーロピウム（Ｅｕ）、サマリウム（Ｓｍ）、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。本発明の方法で有用な種々の標識またはシグナル発生系の概説については、米国特許第４，３９１，９０４号を参照のこと。
【０１３９】
標識を検出するための手段は、当業者に周知である。従って、例えば、標識が放射性である場合、検出のための手段としては、シンチレーションカウンター（例えば、ラジオイムノアッセイ、シンチレーション近接解析）（Ｐｉｔａｓら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ．３４：９０６〜１２，２００６）または写真用フィルム（オートラジオグラフィーなどの）が挙げられる。標識が蛍光標識である場合、適切な波長の光で蛍光色素を励起すること、および得られた蛍光を検出することによってこの標識は検出され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または当該分野で公知の他の方法）。蛍光は、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などのような電子感知器の使用によって視覚的に検出できる。同様に、酵素標識は、酵素のための適切な基質を提供すること、および得られた反応産物を検出することによって検出され得る。比色標識または化学発光標識は、標識と会合された色を観察することによって単に検出され得る。本発明の方法での使用のために適切な他の標識および検出システムは、当業者に容易に明らかになるであろう。このような標識されたモジュレーターおよびリガンドは、疾患または健康状態の診断に用いられる。
【０１４０】
一実施形態では、本発明の方法で有用な標識された組成物は、限定するものではないが、フィルター、プレートまたは膜を含む固体支持体に結合される。標識された化合物は溶液中で標識されて相互作用し得ることがさらに考えられる。例えば、捕獲抗体は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）供与体分子で標識されてもよく、この標的分子はＦＲＥＴ受容体分子で標識され、その結果その分子は、結合が生じるとき近位である。あるいは、この標的分子は、ＦＲＥＴ供与体および抗体分子ＦＲＥＴ受容体で標識されてもよい。別の可能性は、標的および抗体がハイブリダイズするとき、その抗体または標的上に両方とも存在するクエンチング分子および蛍光分子を分離することである。この標的分子は、試薬と相互作用している場合、その標識が発光するのに十分ちょうど近い。これによって、それが試薬と相互作用する場合（直接モニタリング）その分子がちょうど発光するだけのシステムが生じる。狭い帯域通過フィルターを用いて、分子の標識のもの以外の全ての波長をブロックする。ＦＲＥＴ分子対は当該分野で市販されており（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから）、製造業者のプロトコールに従って用いられ得る。ＦＲＥＴ発光はＣＣＤカメラのような光学画像化技術を用いて検出される。
【０１４１】
抗体−抗原相互作用を検出する別の方法は、電子供与体を用いてそれを標識することである。このドナー標識は、電気的接触に対して電子を与えて、ここに試薬を結合することである。例えば、エレクトロ・イムノアッセイ（ｅｌｅｃｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）の方法で有用な酵素を記載するＧｈｉｎｄｉｌｉｓ，Ａ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．２８：８４〜９，２０００）およびＤａｉら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｒｅｖ．２９：２３３〜４０，２００５）を参照のこと。次いで、この電子の接触をＡＤ（アナログ→デジタル）変換器によって読み取って定量する。電子のカウントが高いほど、生じた相互作用が多かった。
【０１４２】
単一分子の検出が可能な標識の一実施形態は、出典明記によって本明細書に援用されるＳｃｈｕｌｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｃｄ．Ｓｃｉ．，９７：９９６〜１００１（２０００）に記載のような、光学レポーターとしてのプラズモン共鳴粒子（ｐｌａｓｍｏｎ−ｒｅｓｏｎａｎｔ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）（ＰＲＰ）の使用である。ＰＲＰは、金属内の伝導電子の集団共鳴（すなわち、表面プラズモン共鳴）という理由で著しい効率で光を弾性的に散乱する、代表的には４０〜１００ｎｍの直径の金属ナノ粒子である。ナノ粒子に関連するプラズモン共鳴の大きさ、ピーク波長およびスペクトルバンド幅は粒子のサイズ、形状および物質組成、ならびに局所の環境に依存する。調製の間にこれらのパラメーターに影響することによって、スペクトルの可視範囲のいずれかで散乱ピークを有するＰＲＰが形成される。球状のＰＲＰについては、ピーク散乱波長および散乱効率の両方とも大きい半径で増大し、示差的に着色された標識を生じるための手段が得られる。例えば、銀の球の集団は、再現性に調製され、それについてピーク散乱波長は、調製の間にその球の最終の半径を調節することによって、標的された波長の２〜３ナノメートル内である。ＰＲＰは明るく、にもかかわらずナノサイズであるので、それらは単一分子の検出のための指標として用いられる；すなわち視野内の結合されたＰＲＰの存在によって、単一の結合事象が示され得る。
【０１４３】
別の例示的な実施形態では、このデバイスは、イムノアッセイ方法を用いる血液凝固因子の迅速な検出における使用のための試験ストリップであり、ここでは液体サンプル中の血液凝固因子は、限られた標識された抗体結合部位について免疫された血液凝固因子と競合する。このアッセイ手順では、体液サンプルは、標識された抗体−色素コンジュゲートと混合し、多孔性膜にそって移動する。血液凝固因子の濃度が試験の検出限界以下である場合、未結合の抗体−色素コンジュゲートは、その膜上に固定された血液凝固因子レセプターコンジュゲートに結合し、「負の」試験ゾーンでカラーのバンドが作製される。逆に、血液凝固因子レベルが検出限界かまたはそれより高い場合、遊離の血液凝固因子は、抗体−色素コンジュゲートに対する結合によって膜上の固定された血液凝固因子コンジュゲートと競合し、抗原−抗体複合体を形成し、これによってカラーのバンドの発色を妨げる。サンプル中の血液凝固因子レベルにかかわらず、カラーのバンドが各々のコントロールのゾーンで作製され、これがその試薬が化学的に活性であることを確認する品質管理の指標として役立つ。
【０１４４】
抗原−抗体複合体はまた、ナノ粒子由来の技術を用いて検出される。例えば、金ナノ粒子クエンチングを記載しているＡｏら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．７８：１１０４〜６，２００６）、抗体検出におけるＳｉＯ（２）／Ａｕナノ粒子表面を記載しているＣｈｅｎら、（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７：２３１３〜２１，２００６）、ならびに固体基質−室温リン光イムノアッセイ（ＳＳ−ＲＴＰ−ＩＡ）での使用のためのジブロモフルオレセインを含有する二酸化ケイ素ナノ粒子を記載しているＬｉｅｕら、（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．３０７：３４〜４０，２００５）を参照のこと。
【０１４５】
本発明の方法については、抗体または血液凝固因子は、限定するものではないが、例えば、ポリスチレン、ナノ粒子、例えば、２種の金属からなる銀−金ナノ粒子（Ｙａｎ  Ｃｕｉら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，１１０：４００２−０６，２００６）およびポリアミド膜（ＰＡＭ）シート（Ｓｕｎら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４：１６２７〜３７，２００１）から作製される、タンパク質、マイクロキャリア、マクロ固相ビーズ、磁気ビーズに結合する、フィルター、ＰＶＣ膜、ＰＤＶＦ膜、ＰＶＣプレートおよび他のプレートを含む種々の固体支持体に結合され得る。
【０１４６】
例えば、多重蛍光分子充填、種々の物質、表面組織、表面パターンなどを有するマイクロスフェアを識別タグとして利用する。捕獲抗体またはリソソーム酵素のいずれかをビーズに共有結合して、血清中のリソソーム酵素−特異的な抗体の量をアッセイするための反対の結合パートナーに対して反応することを考慮する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ６．１１）を参照のこと。蛍光的に充填されたマイクロスフェアは現在、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．および他の会社から入手可能である。マイクロスフェアおよび２０ｎｍの直径のポリスチレンビーズが現在利用可能である。
【０１４７】
血液凝固因子または抗体は、例えば、支持体の製造業者によって記載されるとおり、または当該分野で公知の標準的な化学架橋技術を用いて、当該分野の標準的なプロトコールを用いて固体支持体に結合される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）架橋キットを参照のこと。
【０１４８】
候補剤
寛容破壊剤を特定するための本発明の方法で有用な候補剤は当該分野で利用可能である。本発明で有用な候補剤は、任意の有機または無機の分子、複合体または物質であると考えられる。例示的な候補剤は、化学ライブラリー、自然物質のライブラリー、またはコンビナトリアルライブラリーから得られる。
【０１４９】
一実施形態では、以下を含む当該分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法での任意の多数のアプローチを用いて薬剤が得られる；生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行な固相または溶液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法。この生物学的ライブラリーのアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，１２：１４５，１９９７）。このようなライブラリーは、当業者によって調製可能である（例えば、米国特許第４，５２８，２６６号および同第４，３５９，５３５号、および特許協力条約（Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｔｒｅａｔｙ）公開番号ＷＯ  ９２／１５６７９、ＷＯ  ９２／１５６７７、ＷＯ  ９０／０７８６２、ＷＯ  ９０／０２８０９によって調製されてもよいし、または市販の供給源から購入されてもよい（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｐｈ．Ｄ．．ＴＭ．Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ）。
【０１５０】
本発明の一実施形態では、有機分子は、化合物が個々にアッセイされる化学ライブラリーから、または複数の化合物が一度にアッセイされるコンビナトリアル化学ライブラリーから選択され、次いでデコンボリューションされて最も活性な化合物が決定および単離される。
【０１５１】
多数の化学ライブラリーが、当該分野で、例えば製薬会社の所有権のあるライブラリーとして存在しており、このようなライブラリーにおける化合物は、適切な候補剤である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーの代表的な例としては、Ａｇｒａｆｉｏｔｉｓら、「Ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｓｉｒｅｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」、米国特許第５，４６３，５６４号；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｗ．，「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｒｒａｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ」、ＷＯ  ９５／０２５６６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ」、ＷＯ  ９５／２４１８６；Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｄｉｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ  ｌｉｂｒａｒｙ」、ＷＯ  ９５１３０６４２；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，「Ｎｅｗ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ  ９５／１６９１８；Ｃｈｅｎｅｒａ，Ｂ．ら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｃａｒｂｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、ＷＯ  ９５／１６７１２；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，「Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｏｎ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ」、米国特許第５，２８８，５１４号；Ｆｅｌｄｅｒ，Ｅ．ら、「Ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ  ９５／１６２０９；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｒ．ら、「Ｅｎｃｏｄｅｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、ＷＯ  ９３／２０２４２；Ｐａｖｉａ，Ｍ．Ｒら、「Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｕｓｅｆｕｌ  ｎｏｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ」、ＷＯ  ９５／０４２７７；Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｄ．Ｗｅｌｌｅｒ，「Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ」、米国特許第５，５０６，３３７号；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｃ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓ，Ｍｅｔａｔｈｉａｚａ  ｏｎｅｓ，ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｔｈｅｒｅｏｆ」、ＷＯ  ９６／００１４８；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｇ．Ｂ．およびＧ．Ｐ．Ｗｅｉ，「Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｅｓ」、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７：４８８７  ９０，１９９６；Ｒｕ��ｌａｎｄ，Ｂ．ら、「Ｓｏｌｉｄ−ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｅ  ．ｂｅｔａ．−Ｌａｃｔａｍｓ」、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２５３  ４，１９９６；Ｌｏｏｋ，Ｇ．Ｃ．ら、「Ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ４−Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ  ａｎｄ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６：７０７  １２，１９９６に記載されるライブラリーが挙げられる。
【０１５２】
本発明の候補剤としては、融合タンパク質類、ポリペプチド類、ペプチド模倣物類、プロドラッグ類、レセプター類、結合剤類、リボザイム類、低分子類、ペプチド類、抗体類、または血液凝固因子タンパク質に対する寛容を調節する能力についてスクリーニングされる他の薬物が挙げられる。例示的な候補剤としては限定するものではないが、ペニシリン、フルダラビン、インターフェロン−α、化学療法剤、抗生物質、抗精神病剤、トール様レセプターのリガンド、炎症促進性サイトカインおよびインビボで炎症促進性サイトカインの放出を誘導する任意の他の化合物が挙げられる。
【０１５３】
トール様レセプターのリガンドは、例えば、Ｊｉｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２９：１８２〜９１，２００８およびＷａｌｅｓら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．６：９７１〜８０，２００７に記載される。
【０１５４】
候補剤は、トランスジェニック動物へのヒト血液凝固因子の投与の際、上記のような任意の免疫学的アッセイまたは他のインヒビターアッセイ、例えばＢｅｔｈｅｓｄａ  Ｕｎｉｔスケールアッセイを用いて抗血液凝固因子インヒビターの存在が検出される場合、寛容破壊剤と考えられる。
【０１５５】
キット
キットも本発明の範囲内であると考えられる。代表的なキットは、検出可能な標識に対して必要に応じて結合される、ヒト血液凝固因子に特異的に結合する第一の抗体、および既知量の血液凝固因子を含有している血液凝固因子標準を備えてもよい。他の成分は、血液凝固因子に対して、または第一の抗体に対して結合する検出可能な標識に連結された第二の抗体などのイムノアッセイを行うための試薬を必要に応じて備えてもよい；その標識が酵素である場合、キットはまた酵素が検出可能なシグナルを放つ基質を備えてもよい。
【０１５６】
本発明の追加の局面および詳細は、以下の実施例から明らかになり、これは限定ではなく例示を意図するものである。
【実施例】
【０１５７】
実施例１
トランスジェニックマウスでのヒト第ＶＩＩＩ因子のノックイン
第ＦＶＩＩＩ因子活性に対する第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のインヒビターのインビボ効果を研究するために、ヒトＦＶＩＩＩ［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿０００１３２（アイソフォームａ前駆体）、ＮＭ＿０１９８６３（アイソフォームｂ前駆体）］をマウス遺伝子の代わりに発現するマウスを開発した。
【０１５８】
ＦＶＩＩＩノックインマウスについては、ヒトＦＶＩＩＩの全長ｃＤＮＡを含んでいるプラスミドを、ｐＢｌｕｅ−ＦＶＩＩＩベクター（＃３０７，図１Ａ）を用いて作製した。ＦＶＩＩＩ  ｃＤＮＡ（７．２ｋＢ）は、ｐＢｌｕｅ−ＦＶＩＩＩ  ＃３０７プラスミドから、Ｘｈｏ１／Ｎｏｔ１制限酵素変性によって切りだして変性し、ＦＶＩＩＩインサートは、製造業者のプロトコールを用いて遺伝子抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。次いで、ＦＶＩＩＩインサートをｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６ベクター（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）（図１）または肝臓特異的発現ベクターｐＢＳ−Ａｌｂ／ａＦｅｔｏ（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋら、Ｇｅｎｅｓｉｓ  １２６：１５１−５３，２０００）のいずれかに挿入した。
【０１５９】
ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６ベクターへのクローニングのために、そのベクターを制限酵素Ｓａｌ１／Ｎｏｔ１で切断し、ＡＰＥＸ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩの熱不安定性アルカリホスファターゼ）を用いて脱リン酸化して、変性の後にアガロースゲル電気泳動した。４．４ｋｂおよび２１ｂｐのフラグメントを得た。ベクターフラグメントをゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で清浄にした。調製されたＦＶＩＩＩインサートを、ＬＩＧＡＴＥ−ＩＴ（商標）ライゲーションキット（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いてｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６ベクターに連結し、そのプラスミドをＯＭＮＩＭＡＸ２（商標）−Ｔ１ｒ細菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。クローンをＬＢ培地中で増殖して、そのプラスミドをｍｉｎｉｐｒｅｐ（Ｑｉａｇｅｎ）によって単離した。次いで、１０個のクローンを、Ｘｈｏ１またはＫｐｎ１制限酵素を用いる酵素消化によって分析し、続いてアガロースゲル電気泳動した。次いで正確なクローンを、ｍｉｄｉｐｒｅｐｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。作製されたｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６−ＦＶＩＩＩセンス（１１．６ｋｂ）から、インサートをＳａｌ１／Ｘｈｏ１／ｐｖｕ１酵素を用いて切断した。７．２ｋｂおよび４．４ｋｂのフラグメントを得た。７．２ｋｂのフラグメント（ＦＶＩＩＩインサート）をアガロースゲルから抽出して、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で清浄にした。
【０１６０】
ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６−ＦＶＩＩＩベクターからの浄化したＦＶＩＩＩインサートをＴ４リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、この調製された標的ベクターｐＢＳ−Ａｌｂ／ａＦｅｔｏ中に連結した（図１Ｂ）。この物質をＯＭＮＩＭＡＸ２（商標）−Ｔ１Ｒ細菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に形質転換した。クローンをＬＢ培地中で増殖して、ミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）を行ってプラスミドを単離した。そのクローンをＸｈｏ１およびＳａｃＩＩ／Ｘｂａ１、Ｎｏｔ１、Ｐｖｕ１およびＳｅｘＡ１酵素を用いる制限によって、続いてアガロースゲル電気泳動によって検査した。センスおよびアンチセンスのクローン（２０．１ｋｂ）を得た。次に、ｐＢＳ−Ａｌｂ／ａＦｅｔｏ−ＦＶＩＩＩセンスプラスミドの１つのクローンを、ＬＢ培地中で増殖し、次いでＧｉｇａｐｒｅｐプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。このプラスミドをＸｂａ１、ＳａｃＩＩ／Ｘｂａ１、Ｎｏｔ１およびＢｇｌＩＩ酵素で消化し、続いてアガロースゲル電気泳動によって試験した。配列分析は、ＶＢＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＧｍｂＨ（Ａｕｓｔｒｉａ）によって行った。
【０１６１】
トランスジェニックマウスの作製のためには、上記のプラスミドはＸｈｏ１制限酵素で直線化して、Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ）中に入れた。そのプラスミドを、Ｅ１７血友病マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンド上のＥ１７ｋｏ欠失）から、またはＲｕｅｌｉｃｋｅら、（Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ８５：５８９〜６０１，２０００）による野性型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから得た受精した卵母細胞の雄性前核にマイクロインジェクションした。
【０１６２】
陽性のクローンを、胚盤胞への注入およびキメラ細胞の作製のために選択する。胚盤胞は、妊娠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌性から単離する。陽性のヒトＦＶＩＩＩ−含有ＥＳクローンを胚盤胞に注入して、この注入された胚盤胞をＯＦ１偽妊娠メス中に移植する。ＥＳ細胞の存在は、被膜のカラーマーカーを最初に用いて評価する。次いで、そのキメラをＣ５７Ｂｌ／６株と交配してＦ１世代を生育させる。
【０１６３】
実施例２
ヒトｖＷＦノックインのトランスジェニック動物
フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００５５２］は、一次止血のための内皮下層に対する血小板の正常な接着に必要であり、第ＶＩＩＩ因子を安定化するのに関与している。ｖＷＦは、プレ−プロ−ｖＷＦとして内皮細胞中で合成されて、細胞内でプロペプチドおよび成熟ｖＷＦに処置される。ｖＷＦ疾患は、共通の特徴を共有する多数のサブタイプを有している一般的な遺伝性の出血障害であり、全てがプロ−ｖＷＦの欠損に関与する。ｖＷＦ疾患のマウスモデルは、重篤なヒトのｖＷＦ疾患（ＩＩＩ型）を模倣する、ノックアウトストラテジーを用いて作製されている（Ｄｅｎｉｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：９５２４〜２９，１９９８）。ノックアウトマウスにおけるｖｗｆにおける組み換えヒトｖＷＦの注射は、ＦＶＩＩＩを安定化し、このことは、ヒトタンパク質がマウス宿主で正常に機能し得ることを示唆している。ヒト患者への投与のためのｖＷＦ化合物の評価を可能にするヒトｖＷＦタンパク質に対して寛容の動物モデルを作製するために、ｖＷＦのヒト化マウスモデルが開発され、ここではマウスｖＷＦはヒトｖＷＦによって置換される。
【０１６４】
マウスｖＷＦ遺伝子は第６染色体に位置し、かつ１５４．１ｋＢに及ぶ。この遺伝子は、５６個のイントロンによって隔てられた５７個のエキソンを含む。ヒト遺伝子を挿入するためには、ヒト遺伝子は、マウス遺伝子の第一のコード領域にエキソン６および７で挿入されることが決定された。このプロトコールを開始するために、ヒト遺伝子の挿入ポイントとすべきであったマウスの相同配列を最初にクローニングする必要があった（図３）。３つの独立したクローンを作製した：（１）標的ベクターであるＬＡｄｉの５’長相同性アームの遠位部分を作製するために用いたエキソン４と５との間の５’配列を含んでいる約３．６ｋｂのフラグメント；（２）５’長相同性アームＬＡｐｒの近位部分を作製するために用いた、エキソン５および隣接イントロン配列を含む約４．７ｋｂのフラグメント；（３）エキソン６の下流に位置しかつ標的ベクターＳＡｍａｘ、および正のコントロールベクターについて３’短相同性アームを作製するために用いられる約３．８ｋｂのフラグメント。図２Ａおよび図２Ｂは、トランスジェニック動物へヒトｖＷＦ遺伝子をクローニングするための代表的なベクターを示す。
【０１６５】
ｖｗｆクローンを作製するために、以下の条件で表１でプライマーを用いてゲノム１２９／ＳｖＰａｓＥＳ細胞ＤＮＡでＤＮＡ増幅を行った：９４℃２分の１サイクル、ならびに１５〜２０サイクルの９４℃３０秒間、６５℃３０秒間、および６８℃７分。ＰＣＲ産物は、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にＴＡ−クローニングを介してサブクローニングした。ＴＡ−クローニングは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ）のターミナル・トランスフェラーゼ活性を利用し、かつＰＣＲ産物の各々の末端に単一の３’−Ａオーバーハングを付加する。これによって、単一の３’−Ｔオーバーハングを有する直線化クローニングベクター中にこのＰＣＲ産物を直接クローニングすることが可能になる。この得られたプラスミドを、ＴＯＰＯ−ＬＡｄｉ、ＴＯＰＯ−ＬＡｐｒ（またはＴＯＰＯＰ−ＬＡｐｒ−ｍｏｄ）およびＴＯＰＯ−ＳＡ−Ｔ１と命名した。
【０１６６】
【表１】
0005624891.tif 000002
ヒトｖｗｆ遺伝子を含んでいる標的ベクター（１−ＨＲ）は以下を含んで作製した：１２９  ＳＶ／ＰＡＳ  ＥＳ細胞株ゲノムと同質遺伝的な相同性領域；ヒトｖｗｆ遺伝子でのマウスｖｗｆのコード領域の置換；ＬｏｘＰ組み換え部位に隣接するポジティブ選択ネオマイシン遺伝子；およびジフテリア毒素（ＤＴＡ）ネガティブ選択マーカー。ヒト化ｖｗｆベクターについては、選択カセットを、Ｃｒｅ発現細菌への標的ベクターのトランスフェクションによって切り出した。
【０１６７】
標的ベクターを作製するために、ＫｐｎＩ−ＭｌｕＩ−ＨｐａＩ−Ｍｆｅｌ制限由来のヒトｖＷＦ配列を含んでいる第一の合成のフラグメントであるスクリプト−Ｔｇリンカーと一緒に２４２ｂｐのＴｇ３’部分合成（ＥｃｏＲ’Ｖ〜ＥｃｏＲＩを除外）、およびＢｓｔＢＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｓａｃ１制限部位を作製した［スクリプト−Ｔｇリンカー，
【０１６８】
【化１】
0005624891.tif 000003
（配列番号：７）］。
【０１６９】
これらの部位によって、その後のクローニング工程を粘着性のライゲーションを排他的に用いて行うことが可能になり、これによって構築工程の効率および速度が確実になる。導入された部位によってまた、サザンブロット分析を用いる相同組み換えおよびリコンビナーゼ切り出し事象の確認が容易になり、ベクターを標的するための固有の直線化部位が得られる。
【０１７０】
次に大きいリンカーフラグメントＧＡ１リンカーが開発されており、これは、Ｐａｃ１−ＰｍｅＩ−ＨｐａＩ制限部位と一緒にＥｃｏＲＩ〜ＮｈｅＩに由来するＬＡｄｉ３’合成）、ＮｓｉＩ〜イントロン５のＬＡ  ３’部分合成３’末端、およびＭｌｕｌ−Ｍｆｅｌ−ＢｓｉＷｌ−ＳｎａＢ１−Ａｖｒｌｌ−Ｎｒｕｌ−Ａｓｃｌ制限部位を含んでおり、これが９０６ｂｐのＧＡ１リンカーフラグメントを生じる［ＧＡ１リンカー、
【０１７１】
【化２】
0005624891.tif 000004
【０１７２】
【化３】
0005624891.tif 000005
（配列番号：８）］。
マウスｖｗｆのＳｗａＩ、Ｅｃｏ４７１１およびＢｓｕ３６１制限部位を含んでいる次の配列を、新選択カセットを含んでいるＧ２ベクター（ＧｅｎＯｗａｙ，Ｌｙｏｎ，ＦＲ）中に挿入した。このベクターをＧ２−ｍｏｄベクターと呼ぶ。
【０１７３】
陽性コントロールベクターを作製するために、ＴＯＰＯＬａｄｉ−Ｔ４プラスミドから単離した２３０６ｂｐのＨｐａＩ／ＥｃｏＲＩ  ＬＡｄｉフラグメントをＧＡ１ベクターに連結して、ＬＡｄｉベクター（６０６１ｂｐ）を得た。導入遺伝子を挿入するために、１−ｃＤＮＡプラスミドから単離した８２６８ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントを、ＭｆｅＩ／ＥｃｏＲＶを用いてスクリプト−Ｔｇベクターに連結した（このプラスミドは１−Ｔｇベクターと呼ぶ）。ｐｏｌｙＡ配列（Ｇ１３６から単離した６３２ｂｐのＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ）を１−Ｔｇベクターに、ＢｓｔＩ／ＥｃｏＲＩ部位で挿入した（１−ＴＧ−ｐＡベクター）。
【０１７４】
次に、ＴＯＰＯ−ＬＡｐｒプラスミドからの４２５５ｂｐのＮｈｅＩ／ＮｓｉＩフラグメントを、ＬＡｄｉベクター（１−ＬＡベクター）に連結した。新規な短いアームのフラグメントを挿入するために、ＳＡ−Ｃ＋プラスミド由来の３６７２ｂｐのＳｍａＩ／ＮｈｅＩフラグメントを、１−ＬＡベクターに連結した（１−ＳＡベクター）。導入遺伝子を挿入するために、１−Ｔｇ−ｐＡプラスミド由来の９１５５ｂｐのＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、１−ＬＡベクターに挿入して、１−ＬＡ−Ｃ＋ベクターを作製した。標的ベクターへ長相同性アームを挿入するために、ＬＡ−Ｃ＋ベクターから単離された１５３１４ｂｐのＰｍｅＩ／ＢｓｉＷＩフラグメントを１−ＳＡベクターに挿入した。これは、１−ＬＳＡベクターと呼ばれる最終の標的ベクターの１バージョンである。ジフテリア毒素ネガティブ選択マーカーを挿入するために、１−ＬＳＡベクターから単離した１９０１３のＡｓｃＩ／ＰｍｅＩフラグメントをＧ１４１プラスミド（ＧｅｎＯｗａｙ）に挿入して、最終の標的ベクター１−ＨＲを得る。
【０１７５】
上記のＳＡ−Ｃ＋ベクターは、ＴＯＰＯ−ＳＡ−Ｔ１プラスミドから単離された３２５８ｂｐのＢｓｕ３６１／ＤｒａＩフラグメントを、Ｂｓｕ３６１／Ｅｃｏ４７ＩＩＩを用いて切断したＧ２−ｍｏｄベクター中に連結することによって短相同性アームの陽性コントロールとして作製した。
【０１７６】
ＰＣＲスクリーニングおよびサザンブロット分析によって、切断事象およびＥＳ細胞でのポジティブクローニングの同一性が確認された。サザンブロットは、以下の条件を用いて行った：ハイブリダイゼーションは４×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ、０．５％のスキムミルク、２０ｍＭのＥＤＴＡ、６５℃、１８時間であり；洗浄２回は、３×ＳＳＣ、１％のＳＤＳで６５℃で１５分、次いで２×０．５×ＳＳＣ、１％のＳＤＳで６５℃で１分間である。
【０１７７】
ＥＳ細胞への挿入のために、１−ＨＲベクターをＮｒｕ１によって直線化し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。１２９  Ｓｖ／ＰＡＳ  ＥＳ細胞は、エレクトロポレーション（５×１０６個のＥＳ細胞、４０μｇの直線化されたプラスミド，２６０Ｖ，５００μＦ）によって、直線化した１−ＨＲベクターでトランスフェクトして、Ｇ４１８選択培地（２００μｇ／ｍｌのＧ４１８）で増殖した。Ｇ４１８耐性クローンを単離して、９６ウェルプレート中で増幅した。ポジティブクローンを、プライマーＧＸ１４０６  ５’−ＣＴＡＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＧ−３’（配列番号９）およびＧＸ６３１０  ５’−ＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣ−３’（配列番号１０）を用いて、ＰＣＲ（９４℃．２分、１サイクル；９４℃３０秒、６５℃３０秒、６８℃５分、３５サイクル；６８℃８分、１サイクル）によって組み換え事象についてスクリーニングして、２８７２ｂｐのフラグメントをもたらした。
【０１７８】
５’相同性組み換えストラテジーを用いる追加のサザンブロット分析で、陽性クローン中で正確な野性型（６８６５ｂｐ）および組み換え事象（１４８９７ｂｐ）の存在を検出した。３’相同組み換えストラテジーを用いるサザンブロット分析によって、９４７０ｂｐの野性型フラグメントおよび１１０８０ｂｐの組み換え事象フラグメントを生じる。このハイブリダイゼーションによってまた、ＥＳ細胞によって担持されたＤＮＡの追加の無作為に組み込まれたコピーはないことが確認された。
【０１７９】
４つの陽性クローンを胚盤胞への注入およびキメラ細胞の作製のために選択した。胚盤胞は、妊娠Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌から単離した。陽性のヒトｖｗｆ−含有ＥＳクローンを、胚盤胞に注入して、その注入された胚盤胞をＯＦ１偽妊娠雌に再移植した。ＥＳ細胞の存在は、被膜のカラーマーカーを最初に用いて評価した。キメラは、５０％〜８０％の範囲で作製した。このキメラを次にＣ５７Ｂｌ／６およびＣｒｅ欠失系統と交配して、Ｆ１世代を生育させる。
【０１８０】
インビボの組み換え事象は、サザンブロット分析によって上記のようにモニターしてもよい。インビボでの組み換え事象の誘導およびヒト化ｖｗｆ対立遺伝子の産生のために、導入遺伝子を担持している標的動物を、「欠失（ｄｅｌｅｔｅｒ）」マウスを発現するＣｒｅ−リコンビナーゼと交配する（例えば、Ｔａｎｇら、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３２：１９９〜２０２，２００２；Ｊｏｒｇｅｚら、Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４４：１８３〜８，２００６を参照のこと）。
【０１８１】
実施例３
ヒト第ＶＩＩ因子ノックイントランスジェニック動物
第ＶＩＩ因子［Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＮＭ＿０００１３１（アイソフォームａ前駆体）、ＮＭ＿０１９６１６（アイソフォームｂ前駆体）］は、凝固カスケード中の重要な分子であり、かつ第ＶＩＩ因子の欠損は、出血障害および凝固経路を刺激する能力の低下を生じる（Ｏｓｔｅｒｕｄ  Ｂ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  １：１７５〜８１，１９９０）。ＦＶＩＩにおける先天性欠損は、血漿由来および組み換えのＦＶＩＩで処置されている（Ｂａｕｅｒ  Ｋ．，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ２６  Ｓｕｐｐｌ  １：１５５〜８，１９９６）。
【０１８２】
ヒト第ＶＩＩ因子遺伝子を発現するヒト化トランスジェニックマウスを作製するため、第ＶＩＩ因子ｃＤＮＡを含んでいるｐＢ４−ＦＶＩＩベクターをＥｃｏＲＩで消化してｃＤＮＡを抽出した。ＦＶＩＩのｃＤＮＡを、アルブミン特異的プロモーターを含んでいるｐＢＳ−Ａｌｂ／αフェトベクター中に連結した。ｐＢＳ−Ａｌｂ／αフェトベクターを最初に、ＸｈｏＩ制限消化によって調製し、次いで子ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）処理を用いて脱リン酸化した。Ｋｌｅｎｏｗ処理後、ＦＶＩＩのｃＤＮＡを、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｏｚｙｍｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてｐＢＳ−Ａｌｂ／αフェトベクター中に連結した。組み換えクローンは、制限消化およびアガロースゲル分析によって確認した。
【０１８３】
ｐＢＳ−Ａｌｂ／αフェトベクターを、ＮｏｔＩによって消化して、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ｐＥＮＴＲＹベクターへの挿入のためのＦＶＩＩ導入遺伝子を抽出した。アルブミンプロモーター、ポリＡ配列およびαフェトプロテインエンハンサーを含有しているｐＥＮＴＲＹベクターを最初に、ＤｒａＩおよびＥｃｏＲＶで消化して、上記のようにＣＩＰ処理で脱リン酸化した。Ｋｌｅｎｏｗ処理後、ＦＶＩＩのｃＤＮＡを、Ｑｕｉｃｋリガーゼを用いてｐＥＮＴＲＹベクターに連結し、クローン挿入を、ＰＣＲおよびゲル分析を用いて確認した。
【０１８４】
次いで、ＦＶＩＩのｃＤＮＡをｐＥＮＴＲＹベクターから取り出して、ヒトＨＰＲＴ遺伝子の一部を含むＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ｐＤＥＳＴ（商標）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に挿入した。その導入遺伝子をｐＥＮＴＲＹおよびｐＤＥＳＴプラスミド上のａｔｔＲ１とａｔｔＲ２の組み換え部位の間の相同組み換えによって挿入した（図４）。組み換え事象およびクローン挿入は、制限分析によって分析した。得られたベクターをＰｖｕＩによって直線化し、フェノール／クロロホルム抽出し、ＥＳ細胞中にエレクトロポレーションした。
【０１８５】
用いたＥＳ細胞は、マウスＣ５７Ｂｌ／６および１２９のゲノムに基づいたハイブリッドバックグラウンドを示すＢＰＥＳ細胞である。ＦＶＩＩ導入遺伝子は、ＥＳ細胞のｈｐｒｔドッキング部位で挿入する。機能的／ｈｐｒｔ遺伝子を依然として発現する陽性のクローンを次にＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）媒体中で選択する。ＨＰＲＴ発現の損失によって、ＨＡＴ培養培地での増殖のための細胞の感受性がもたらされる。次いで陽性のクローンを上記のように胚盤胞にマイクロインジェクションする。
【０１８６】
実施例４
ヒト血液凝固因子およびヒトＭＨＣ遺伝子を発現する二重トランスジェニックマウス
ヒトタンパク質を発現するトランスジェニックマウスは、寛容動物に対する治療剤として投与される場合ヒトタンパク質の潜在的な免疫原性を決定するために有用であるが、外因性に投与されたタンパク質の免疫原性を測定する別の方法は、ヒト免疫系の状況でのタンパク質の免疫原性を評価することである。自己抗体の産生を刺激するため、外因性ペプチドは、天然のＭＨＣタンパク質の状況でＴ細胞に対して提示されなければならない。代表的な免疫応答の間、外因性抗原は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子を発現する抗原提示細胞によって採取され、この抗原はその抗原性エピトープフラグメントへの細胞質にプロセシングされ、そのペプチドエピトープはＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子のポケット中で抗原提示細胞の表面上に提示される。ＭＨＣＩＩ抗原複合体に対するＴ細胞の表面上の同族のＴ細胞レセプターの結合は、抗体産生をもたらし得る事象のカスケードを活性化する。
【０１８７】
どのヒト血液凝固因子のペプチドがヒト環境の状況で抗原性であるかを決定するために、ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ヒトＭＨＣ遺伝子を発現するように改変されてもよい。代表的には、微生物学的タンパク質ではない、投与される外因性のタンパク質の場合、そのタンパク質は採取されて、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質によって提示される。従って、ヒト免疫系の状況でのヒト血液凝固因子の免疫原性を決定するために、上記のＴｇ動物はさらに、天然のクラスＩＩ遺伝子の代わりにヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するように改変される。
【０１８８】
内因性クラスＩＩタンパク質を欠いているトランスジェニックマウスは、当該分野で公知である。例えば、内因性遺伝子の標的された破壊を用いて全ての内因性のＭＨＣＩＩ遺伝子を欠いているＴｇマウスの作製を記載している、Ｍａｄｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１０３３８〜３４３，１９９９を参照のこと。さらに、ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するマウスは、当該分野で公知である。例えば、ヒトＤＲ４遺伝子およびヒトＣＤ４タンパク質を発現するマウスを記載するＦｕｇｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，６１５１〜６１５５，１９９４；ならびにその両方ともヒトＭＨＣＩＩ  ＤＲおよびＤＱタンパク質を発現するＴｇマウスを記載しているＣｈｅｎｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２１：１９５〜１９９，２００３，およびＭａｄｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２３：３４３〜４７，１９９９を参照のこと。
【０１８９】
第一の方法では、ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック動物を、ヒト主要組織適合性（ＭＨＣ）遺伝子を発現する同じ種のトランスジェニック非ヒト哺乳動物と交配する。この二重のトランスジェニック動物は、ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック動物と、ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現する第二の動物とを交配することによって作製され得、その結果その子孫は両方の導入遺伝子を発現する。例えば、トランスジェニックヒトｖＷＦマウス（Ｔｇ−ｈｕ  ｖＷＦ）、Ｔｇ−ｈｕ  ＦＶＩＩＩ、Ｔｇ−ｈｕ  ＦＶＩＩ、Ｔｇ−ｈｕ  ＦＩＸのマウス、または異なるヒト血液凝固因子を発現するマウスを、限定するものではないが、ヒトＤＲ２、ＤＲ４またはＤＱの遺伝子を含む、目的のヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を発現するＴｇマウスと交配する。例えば、ＷＯ２００６／０５６７６９；Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（前出）；およびＣｈｅｎｇら（前出）を参照のこと。次いで、マウスを、導入遺伝子配列の挿入のＰＣＲ確認などの当該分野で公知の技術を用いて遺伝型決定して、二重のトランスジェニックゲノムを有している被験体を特定する。
【０１９０】
別の方法を用いて、ヒト血液凝固因子を発現するＴｇ動物由来の胚を、ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子をコードする第二の導入遺伝子を発現するようにさらに改変してもよい。例えば、胚は、前の実施例に記載されるような妊娠Ｔｇヘテロ接合性またはホモ接合性のＴｇ−ｈｕ  ｖＷＦ、Ｔｇ−ｈｕ  ＦＶＩＩＩ、Ｔｇ−Ｈｕ  ＦＶＩＩまたはＴｇ−ｈｕ  ＦＩＸマウスから単離され、ＷＯ２００６／０５６７６９，Ｍａｄｓｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（前出）；およびＣｈｅｎｇら（前出）に記載のような、ヒトＭＨＣクラスＩＩ遺伝子をコードする発現カセットで引き続いて形質転換される。次いで、二重のトランスジェニック胚を偽妊娠マウスおよび上記のように交配した二重トランスジェニックマウスに移植する。マウスは、導入遺伝子配列の挿入のＰＣＲ確認などの当該分野で公知の技術を用いて遺伝子型決定によって二重トランスジェニックとして正に特定される。
【０１９１】
ヒト血液凝固因子遺伝子およびヒトＭＨＣＩＩ遺伝子の両方を発現するマウスは、ヒト血液凝固因子に寛容であり、また外因性タンパク質が抗原特異的抗体を生じる事象では、ヒトの免疫系の状況で抗原を提示する。ヒトＭＨＣ遺伝子を用いて、天然の抗原性エピトープの提示が可能になり、従って、ヒト患者で免疫原性である、血液凝固因子などの外因性に投与されるタンパク質の一部が決定される。抗原性エピトープを特定することで、血液凝固および凝血の障害を有している患者の治療の改善を開発することが補助される。
【０１９２】
実施例５
ヒトタンパク質に対して寛容な動物中における外因性に投与されたタンパク質に対する抗体についてのスクリーニング
ヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒトｖＷＦ因子、ヒト第ＩＸ因子またはヒト第ＶＩＩ因子の導入遺伝子を発現する、および必要に応じて、またヒトＭＨＣクラスＩＩも発現するヒト化マウスは、そのタンパク質が外因性に投与される場合、関連のヒトタンパク質に対して寛容でなければならない。ヒト化動物によって、目的のタンパク質に対する抗体の自然な発達についてスクリーニングすること、およびこのヒト化動物に対する外因性タンパク質またはその改変体の投与後、抗自己抗体の発達についてアッセイすることが可能になる。
【０１９３】
任意の内因性抗自己抗体産生について試験するために、ヒト化マウスでの血液因子特異的抗体のレベルを、血液凝固因子に特異的なモノクローナル抗体を用いてＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイによって測定する。例えば、ヒト化ｖＷＦマウスでは、血清サンプルは、ヒトｖＷＦタンパク質を発現する動物から得て、抗ｖＷＦ特異的抗体のベースラインのレベルは、ＥＬＩＳＡによってアッセイする（例えば、Ｓｏｆｆら、Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ．１２１：４２４〜３０，１９９３；およびＭｏｈｒｉら、Ｂｌｏｏｄ  ９１：３６２３〜９，１９９８を参照のこと）。要するに、被験体由来の血清サンプルを、２２℃で１時間、ｖＷＦでコーティングした９６ウェルのポリスチレンプレートのウェルに対して漸増濃度で添加する。ＰＢＳでの洗浄後、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートしたアイソタイプ特異的なＩｇを各々のウェルに添加する。次いで、ペルオキシダーゼ基質（ｏ−フェニレンジアミン；Ｚｙｍｅｄ）を添加して、その反応を２ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４で停止した。次いで、検出された抗体の量を標準曲線に比較して、抗ｖＷＦ抗体のレベルを決定する。
【０１９４】
次いで、動物に、精製したヒトｖＷＦまたはヒトｖＷＦタンパク質のフラグメント、アナログもしくは改変体（治療上用いることができる）を投与し、抗−ｖＷＦ血清のレベルを特定の時点で評価した。血清サンプルは、限定するものではないが、治療用タンパク質の投与後４時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間を含む種々の時点で採取した。治療用タンパク質を複数回の投与にわたってまたはその後の週に投与した場合、血清サンプルは宿主動物に対する治療用タンパク質の再投与の際に反復して採取して、抗原特異的抗体の発達の遅延があるか否かを決定する。血清サンプルは上記で設定したとおりＥＬＩＳＡによってアッセイする。
【０１９５】
上記の抗原特異的抗体アッセイ、または同様のアッセイをまた、ＦＶＩＩまたはＦＶＩＩＩヒト化動物のいずれかを用いて行ってもよい。例えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイを記載している、Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ８：６４４〜８，２００２およびＳａｈｕｄら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １３：３１７〜２２，２００７を参照のこと。要するに、当該分野で公知のプロトコールおよび技術を用いて、精製されたＦＶＩＩＩを、洗浄およびブロッキング工程の後、基質、通常はポリスチレンプレート上にコーティングし、次いで抗ＦＶＩＩＩ抗体を推定上含有する血清サンプルをＦＶＩＩＩコーティングしたプレートでインキュベートする。そのプレートを洗浄して、過剰の抗体および血清を除去し、結合した抗体を周知の検出方法、例えば、同族の検出試薬を用いて検出される検出酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）にコンジュゲートされた抗アイソタイプ抗体を用いて検出する。
【０１９６】
同様のアッセイがＦＶＩＩに対する抗体を検出するのに有用である。ヒトＦＶＩＩを、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて９６ウェルプレートにコーティングする。ヒト化ＦＶＩＩ動物から単離された血清を、ＦＶＩＩコーティングウェルに加える。次にＦＶＩＩ特異的抗体を上記のように検出する。
【０１９７】
実施例６
トランスジェニック動物でのＦＶＩＩおよびＦＶＩＩＩのＲＮＡの発現
ｈｕＦＶＩＩトランスジェニックマウスでのヒト第ＶＩＩ因子（ｈｕＦＶＩＩ）の遺伝子発現パターンを決定するために、定量的なポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を用いた：９つの器官を導入遺伝子発現について分析した：肝臓、リンパ節、肺、脾臓、腎臓、心臓、骨髄、大腿上部の筋肉および脳。
【０１９８】
器官を収集して、貯蔵および輸送のためにＲＮＡ安定化試薬（ＲＮＡｌａｔｅｒ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）中に直ちに入れた。その器官のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，カタログ番号７４１０４）のプロトコールに従って単離した。単離されたＲＮＡの濃度を決定して、それに応じて希釈した。混入しているゲノムＤＮＡの残留量を、ｇＤＮＡ  Ｗｉｐｅｏｕｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）の一部）を用いてＲＮＡ調製物から取り出し、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｃＤＮＡは、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔのプロトコールに従ってＲＮＡサンプルから合成した。
【０１９９】
その器官のパネルでのｈｕＦＶＩＩ遺伝子発現（４匹の雄性ｈｕＦＶＩＩトランスジェニックマウス）の定量は、以下の設定を用いて行った。
【０２００】
プライマー：ｈｕＦＶＩＩ  ＭＳ２は５’  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＣＡ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ３’（配列番号１１）；ｈｕＦＶＩＩ  ＭＳ２  ｒｅｖは５’  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＴＴＣ  ３’（配列番号１２）。
【０２０１】
ＰＣＲは、ＰｅｒｆｅＣＴａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ，Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ならびにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍおよび７０００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、以下のパラメーターを用いて設定した：活性化，９５℃１０分間：４０サイクルのＤＮＡ変性、９５℃１５秒；アニーリング／伸長：５８℃１分。
【０２０２】
表２に示す結果（Ｃｔ値によってランク付け（ｎ．ｄ．＝検出不能））によって、ヒトＦＶＩＩのＲＮＡの最高の発現は、検討した全ての動物の肝臓で見出されることが示される。
【０２０３】
【表２】
0005624891.tif 000006
ヒト第ＶＩＩＩ因子トランスジェニックマウスにおいてヒト第ＶＩＩＩ因子（ｈｕＦＶＩＩＩ）の遺伝子発現パターンを決定するために、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＱＰＣＲ）を用いた。ｈｕＦＶＩＩＩマウスの３つの異なる亜系統を以下の８つの臓器でｈｕＦＶＩＩＩの発現について検討および研究した：肝臓、リンパ節、肺、脾臓、腎臓、心臓、大腿上部の筋肉および新生児胸腺。
【０２０４】
器官を収集して、貯蔵および輸送のためにＲＮＡ安定化試薬中に直ちに入れ、そのＲＮＡを上記のように調製した。
【０２０５】
その器官のパネルでのｈｕＦＶＩＩＩ遺伝子発現の定量は、以下に記載のとおり行った。
【０２０６】
混入しているｇＤＮＡが無いことを確認するため、そしてｃＤＮＡの完全性をチエックするために、内因性のコントロールを用いた［Ｍｏｕｓｅ  ＡＣＴＢ（アクチン，β），ＶＩＣ／ＭＧＢプローブ，（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号４３５２３４１  Ｅ）］。
【０２０７】
ヒトＦＶＩＩＩのＲＮＡは以下のプローブおよびプライマーを用いて増幅した：
プローブ：ｈｕＦＶＩＩＩ−ＦＡＭ：ＣＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧ−ＢＨＱ（配列番号１３）（発蛍光団／クエンチャー対ＦＡＭ／Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ（登録商標））色素を含んでいる）；
プライマー・フォワードｈｕＦＶＩＩＩ：ＧＧＣＡＣＴＧＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＧＴ（配列番号１４）；
プライマー・リバースｈｕＦＶＩＩＩ：ＧＡＴＧＣＴＣＧＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣＡＴ（配列番号１５）
ＰＣＲは、Ｔａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：７０００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムで用いて、以下のパラメーターを用いて行った：活性化，９５℃１０分間，４０サイクル；ＤＮＡ変性、９５℃１５秒；アニーリング／伸長：６０℃１分。
【０２０８】
結果によって、ｈｕＦＶＩＩＩのＲＮＡの最高の発現は、亜系統ＥおよびＩの肝臓で見出されることが示される。各々の３つの亜系統の２匹の雌性マウスおよび２匹の雄性マウス由来のＣｔ値を表３〜８に示す。
【０２０９】
表３は、ｈｕＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス、亜系統Ｅの２匹の雌性マウスおよび２匹の雄性マウスの肝臓、腎臓、心臓、肺、リンパ節、筋肉、脾臓でのｈｕＦＶＩＩＩの発現を示す（ｎ．ｄ．＝検出不能）。
【０２１０】
【表３】
0005624891.tif 000007
表４は、ｈｕＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス、亜系統Ｅの２匹の雌性マウスおよび２匹の雄性マウスの新生児胸腺でのｈｕＦＶＩＩＩの発現を示す。
【０２１１】
【表４】
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表５は、ｈｕＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス、亜系統Ｇの２匹の雌性マウスおよび２匹の雄性マウスの肝臓、腎臓、肺、リンパ節、筋肉、および脾臓でのｈｕＦＶＩＩＩの発現を示す（ｎ．ｄ．＝検出不能）。
【０２１２】
【表５】
0005624891.tif 000009
表６は、ｈｕＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス、亜系統Ｇの２匹の雌性マウスおよび２匹の雄性マウスの新生児胸腺でのｈｕＦＶＩＩＩの発現を示す。
【０２１３】
【表６】
0005624891.tif 000010
表７は、ｈｕＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス、亜系統Ｉの２匹の雌性マウスおよび２匹の雄性マウスの肝臓、腎臓、肺、リンパ節、筋肉、および脾臓でのｈｕＦＶＩＩＩの発現を示す（ｎ．ｄ．＝検出不能）。
【０２１４】
【表７】
0005624891.tif 000011
表８は、ｈｕＦＶＩＩＩトランスジェニックマウス、亜系統Ｉの２匹の雌性マウスおよび２匹の雄性マウスの新生児胸腺でのｈｕＦＶＩＩＩの発現を示す。
【０２１５】
【表８】
0005624891.tif 000012
ＲＮＡ分析によって、作製された３つ全てのトランスジェニックマウス亜系統の肝臓および新生児胸腺で導入遺伝子が発現されることが示される。これらの臓器は動物の免疫系の作製の間、高度に関連しており、新生児胸腺での発現はしばしば免疫系発達の間の胸腺で発現されたタンパク質に対する寛容をもたらし得る。
【０２１６】
実施例７
トランスジェニックマウスは、外因性の天然のヒトＦＶＩＩＩまたはＦＶＩＩａに寛容である
ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニックマウスがヒトの天然のタンパク質の引き続く投与に対して寛容であるか否かを決定するため、血友病マウス（ＦＶＩＩＩノックアウト）を上記のようなヒトＦＶＩＩＩを発現するマウスと交配した（亜系統Ｅ、ＧおよびＩ）。マウスにヒトＦＶＩＩＩを投与し、続いて抗ＦＶＩＩＩ抗体応答を測定した。
【０２１７】
トランスジェニックマウスの３つの亜系統（亜系統Ｅ、ＧおよびＩ）に、ｈｕＦＶＩＩＩのｉ．ｖ．投与を、２００μＬ容積中で１用量あたり２００ｎｇのｈｕＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＳＡ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）として週一回の間隔で与えた。血清サンプルは、４回または８回の週一回の投与後に採取し、抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて測定した。
【０２１８】
結果によって、４回または８回の週一回の投与のいずれかを与えた場合、亜系統Ｇのマウスは抗ＦＶＩＩＩ抗体を生じたことが示された（図５Ａおよび図５Ｂ）。亜系統ＥおよびＩのマウスは、いずれの用法でも抗ＦＶＩＩＩ抗体を生じなかった。これらの研究によって、３つのトランスジェニック亜系統のうちの２つがヒトＦＶＩＩＩに寛容であることが示される。さらに、特異的なＩｇＧサブクラスおよびＩｇＡの抗体力価を分析した。
【０２１９】
結果によって、ＦＶＩＩＩの８回の週一回の投与を与えた場合、亜系統ＧのマウスはＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃの抗ＦＶＩＩＩ抗体を生じたが、ＩｇＡ抗体は生じなかったことが示された（図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃ）。亜系統Ｅのマウスは、ＦＶＩＩＩの８回の週一回の投与を与えた場合なんら抗ＦＶＩＩＩ抗体を生じなかった。亜系統Ｉの４匹のマウスのうち１匹が、ＦＶＩＩＩの８回の毎週の用量で与えた場合、ＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、およびＩｇＧ２ｂの抗ＦＶＩＩＩ抗体を生じた。これらの結果によって、亜系統Ｅのマウスは、ヒトＦＶＩＩＩに対して完全に寛容であり、亜系統Ｉのマウスは部分的に寛容であり、かつ亜系統ＧのマウスはヒトＦＶＩＩＩに寛容でないことが示される。
【０２２０】
ヒトＦＶＩＩａを発現するトランスジェニックマウスが外因性タンパク質に寛容であるか否かを決定するために、ＦＶＩＩａトランスジェニックマウスを外因性ＦＶＩＩａ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＳＡ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）の投与の際に抗ＦＶＩＩａ抗体について評価した。
【０２２１】
１０匹のコントロールの野性型マウスおよび５匹のＦＶＩＩａトランスジェニックマウスに、ｈｕＦＶＩＩａのｉ．ｖ．投与を、２００μＬ容積中で１用量あたり１０μｇのｈｕＦＶＩＩａとして週一回の間隔で与えた。血清サンプルは、４回または８回の週一回の投与後に採取し、抗ＦＶＩＩＩ抗体の力価は、標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて測定した。図８は、ヒトＦＶＩＩを発現するマウスは外因性ヒトＦＶＩＩに対する応答で抗ＦＶＩＩ抗体を生じないが、コントロールのマウスは高い力価の抗ＦＶＩＩ抗体を生じることを示す。
【０２２２】
上記の実験によって、ヒト血液凝固因子ＶＩＩＩを発現するトランスジェニック動物の１つの亜系統（亜系統Ｅ）およびヒト血液凝固因子ＶＩＩを発現するマウスの系統は、それぞれ、天然のヒト血液凝固因子ＶＩＩＩまたはＶＩＩの外因性の投与に寛容であることが示される。これらのトランスジェニック動物は、補充療養を受けているヒト患者で通常生じ、かつ後天性の血友病Ａなどの後天性の血液因子障害で自然に生じ得る治療的な血液凝固因子に対する、ヒト血液因子の投与に対するインビボの応答およびインヒビターの発達を研究するために有用な動物モデルを提供する。
【０２２３】
実施例８
新抗原を担持する血液凝固因子によるトランスジェニック動物での寛容の破壊
ヒト血液凝固因子を発現するトランスジェニック動物でのヒト血液凝固因子に対する免疫寛容が破壊できることを示すために、亜系統Ｅの動物（天然のヒトＦＶＩＩＩに免疫寛容）を、新抗原を担持しているヒトＦＶＩＩＩを含むモデル物質で処理した。新抗原は天然のヒトＦＶＩＩＩの化学修飾によって作製した。動物を天然のヒトＦＶＩＩＩまたは新抗原を担持するヒトＦＶＩＩＩで処理した。
【０２２４】
マウスを、２００μＬ中の２００ｎｇのＦＶＩＩＩ（ＡＤＶＡＴＥ，Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＳＡ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）または新抗原を担持する２００ｎｇのＦＶＩＩＩ（Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＳＡ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａが作製）を用いて４回の週一回の投与で処理した。血清サンプルを最終投与後に採取して、抗−ＦＶＩＩＩ抗体力価を標準的なＥＬＩＳＡプロトコールを用いて測定した。
【０２２５】
図７に示す結果によって、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）で処理したマウスは、抗ＦＶＩＩＩ抗体を発達しないことが示される。しかし、新抗原を含んでいるＦＶＩＩＩで処理された９匹のマウスのうち８匹が抗ＦＶＩＩＩ抗原を発達させた。これらの結果、これらのトランスジェニック動物は、ヒト血液凝固因子における新抗原形成を認識する有用なモデルとなることが示される。
【０２２６】
実施例９
血液凝固因子を発現するトランスジェニック動物における血液因子寛容の研究
治療用血液因子に対するインヒビターの発達、または抗血液因子抗体の自然な発達は、出血障害の有効な処置に対する有意な障害である。例えば、ＦＶＩＩＩ療法を受けている血友病患者は、治療用タンパク質に対する抗体を発達し得、これが処置を無効にする（Ｒｅｄｉｎｇ  Ｍｏｎｔ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １２（補遺６）：３０〜３６，２００６）。さらに、後天性の血友病Ａ（ＡＨＡ）は、ある個体がＦＶＩＩＩに対する抗体を自然に生じるときに発症する。現在まで後天性の血友病の決定的な病因論はないが、ＡＨＡの頻度は、自己免疫疾患を有している個体、特定のタイプのガンを有している個体では高く、ペニシリン、フルダラビンまたはインターフェロンαなどの薬物処置に対するアレルギー反応から生じることが示されている（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら、Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ｍｏｎｉｔ  １３：ＲＡ５５〜６１，２００７）。
【０２２７】
血友病の動物モデルは血友病患者におけるＦＶＩＩＩインヒビターの発達を研究するために用いられているが（Ｒｅｉｐｅｒｔら、Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈｅａｍａｔｏｌ  １３６：１２〜２５，２００６）、後天性の血友病Ａにおける寛容の破壊、または血友病患者における寛容の他のタイプの破壊を研究するのに十分な動物モデルは存在しない。本明細書に記載されるヒト血液因子を発現するトランスジェニック動物は、後天性の血友病Ａおよび他の自然な自己免疫または血液凝固因子に対する自然なインヒビターの発達を研究するための有用なモデルである。
【０２２８】
一実施形態では、ヒトＦＶＩＩＩを発現するトランスジェニック動物は、ペニシリン、フルダラビンまたはインターフェロンαなどのＡＨＡを生じることが公知の薬物で処置され、その動物は、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発達について評価される。別の実施形態では、トランスジェニック動物は、炎症促進性サイトカイン、トール様レセプターのリガンド、またはインビボで炎症促進性サイトカインの放出を誘導してＦＶＩＩＩに対する寛容を破壊する任意の他の化合物を投与される。インヒビター誘導の程度を決定するために、血液凝固因子インヒビターを、当該分野で周知の技術を用いて測定する。例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｕｎｉｔ（ＢＵ）スケールを用いて、ＦＶＩＩＩインヒビターの程度を評価する（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ  Ｍ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １１：１１９〜２５，２００６）。本明細書に記載のＥＬＩＳＡ方法はまた、抗血液因子抗体を測定するために用いられる。サイトカインおよび免疫関連分子のレベルはまた、自己抗体および他のインヒビターの誘導に対する免疫系の反応を検査するために処置の前後で決定される。
【０２２９】
トランスジェニック動物はまた、ＡＨＡの有効な処置、血液凝固因子に対する他の自然な自己免疫、または治療的な血液凝固因子の反復投与後に生じる血液凝固因子の他のインヒビターを研究するために有用である。血液因子インヒビターが発達しているトランスジェニックマウスは、体液性免疫応答および後天性免疫応答を阻害する因子で処置され、例えば、ステロイド、サイクロスポリン、γグロブリンおよびリツキシマブなどの生物製剤（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ  Ｗ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １２（Ｓｕｐｐｌ  ６）：９４〜１０１，２００６；Ａｌｖａｒａｄｏら、Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １３：４４３〜４８，２００７）が投与され、自己抗体および他のインヒビターのレベルが評価される。
【０２３０】
インヒビターはまた、血友病ＢのためのＦＩＸ処置を受けている患者でも発達することが公知である（ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ  Ｄ．，Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  １３８：３０５〜１５，２００７）。ＦＩＸについてトランスジェニックなマウスは、ＦＶＩＩＩおよび血友病Ａについて上記されたのと同様のレジメンを用いて血友病Ｂ患者でのインヒビターの発達の研究に有用である。
【０２３１】
本明細書で記載されるトランスジェニック動物は、治療用ヒトタンパク質に応答して生じる抗原特異的抗体の発見が可能で、治療が患者に有害であり得ることを予測するための価値のあるツールおよび最も有益であり得るツールを提供する。
【０２３２】
上記の例示的な実施例で示されるような本発明における多数の改変およびバリエーションは、当業者にとって思い浮かぶと予想される。結果として、添付の特許請求の範囲で生じるような限定のみが本発明とみなされるべきである。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図４】
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【図８】
0005624891.tif 000022
【配列表】
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