(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための、セレン酸またはその薬学的に許容される塩を含む薬剤であって、有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩が一日当たり5μg／kg〜1.0 mg／kgのセレンを送達し、かつ非タウオパチー神経障害がα−シヌクレオパチーでなく、てんかん、発作、脳卒中、脳虚血、低酸素、酸素・グルコース欠乏、および急性頭部外傷からなる群より選択される、薬剤。
【請求項２】
セレン酸がセレン酸ナトリウムの形態である、請求項1記載の薬剤。
【請求項３】
前記処置または予防が、てんかん、発作、脳卒中、脳虚血、低酸素、酸素・グルコース欠乏、および急性頭部外傷からなる群より選択される、神経障害の処置または予防のための別の治療法との併用において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩を投与する段階をさらに含む、請求項1または2記載の薬剤。
【請求項４】
非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための医用薬物の製造における、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用であって、有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩が一日当たり5μg／kg〜1.0 mg／kgのセレンを送達し、かつ非タウオパチー神経障害がα−シヌクレオパチーでなく、てんかん、発作、脳卒中、脳虚血、低酸素、酸素・グルコース欠乏、および急性頭部外傷からなる群より選択される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、非タウオパチー（non−tauopathy）神経障害を処置するか、または予防する方法および組成物における、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用に関連する。いくつかの態様において、本発明は、非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防する方法および組成物中での使用のための他の治療との併用における、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
神経障害は、中枢神経系、末梢神経系または自律神経系に影響を及ぼす障害である。
【０００３】
最近では、いくつかの証拠によって、タウタンパク質がアルツハイマー病等の神経変性障害のみならず、他の神経変性障害にも関係していることが文献中で提示されている［Satch et al., 2006；Wen et al., 2004；Roberson et al., 2007；Deutsch et al., 2006；Bartosik−Psujek, 2006、Ost et al., 2006］。
【０００４】
異常なタウタンパク質の一種として、高リン酸化されたタウタンパク質がある。タウタンパク質は、アルツハイマー病に特異的なSer396残基［Li and Paudel, 2006］を含むいくつかのリン酸化部位で、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β（GSK3β）により、インビボでリン酸化されることが公知である。さらには、GSK3βは、プロテインキナーゼAktによってリン酸化されることが公知であり、Aktの活性は、プロテインフォスファターゼPP2Aによって低減されることが公知である。
【０００５】
最近では、PP2Aが、ヒトの脳の総タウフォスファターゼ活性のおよそ71%を占めることが示されている［Liu et al., 2005］。アルツハイマー病の患者の脳において、総フォスファターゼ活性およびタウに対するPP2A活性が顕著に減少し、一方、PP2B等の他のフォスファターゼの活性は、アルツハイマー病の患者の脳において実際には増加している［Liu et al., 2005］。PP2A活性は、ヒトの脳における大部分のリン酸化部位でのタウのリン酸化のレベルに負に相関する。これは、PP2Aが、ヒトの脳における複数の部位でのリン酸化を制御する主要なタウフォスファターゼであることを示す。これは、アルツハイマー病の脳におけるタウの異常な高リン酸化が、部分的にPP2A活性の下方制御によるものであること、およびPP2Aの活性を増強するよう作用し得る物質は、一部の神経障害の進行を処置し、かつ／または予防する際の臨床的有用性を有すると考えられることを意味する。
【０００６】
タウタンパク質の量を減少させるか、またはタウタンパク質のリン酸化に影響を及ぼし、かつ神経障害の処置または予防において臨床的に有用な物質に関する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、いくつかの非タウオパチー神経性疾患への高リン酸化タウタンパク質等のタウタンパク質の関連、およびプロテインフォスファターゼPP2Aの活性が、セレン酸またはその薬学的に許容される塩への曝露によって増強され得ることに、少なくとも部分的に基づく。以下の2つの分岐的なアプローチを用いて、PP2A活性の増強によって、タウタンパク質のリン酸化、とりわけ高リン酸化を減少させるかまたは阻害してもよい：i）Aktの脱リン酸化および不活性化、それによるGSK3βのリン酸化の減少、および結果的な、タウタンパク質のリン酸化の減少、ならびに、ii）タウタンパク質の直接的な脱リン酸化。タウタンパク質の高リン酸化を含むリン酸化の減少は、神経細胞およびグリア細胞における異常なタウタンパク質の蓄積もしくは沈着を減少させるか、または防止し、したがって神経障害の処置または予防において有用である。
【０００８】
したがって、一つの局面において、本発明は、有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩を被験体に投与する段階を含む、被験体における非タウオパチー神経障害の処置または予防のための方法を提供し、ここで、非タウオパチー神経障害はα−シヌクレオパチーでない。いくつかの態様において、非タウオパチー神経障害は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、脳卒中、脳虚血、脳卒中または脳虚血に関連する認知症、HIVに関連する認知症、興奮毒性に関連する障害、てんかん、発作、統合失調症、多発性硬化症、急性頭部外傷（重度外傷性脳損傷）、および酸素・グルコース欠乏からなる群より選択される。
【０００９】
本発明の別の局面において、非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための医用薬物の製造における、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用が提供され、ここで、非タウオパチー神経障害はα−シヌクレオパチーでない。
【００１０】
上に広範に記載される本方法および用途のいくつかの態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、非タウオパチー神経障害の処置または予防のために適する他の治療法、または非タウオパチー神経障害の症状を緩和するために適する治療法との併用において投与される。本発明の別の局面において、有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩に細胞を曝露する段階を含む、細胞中のタウタンパク質の量を減少させる方法が提供される。
[請求項101]有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩を投与する段階を含む、被験体において非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための方法であって、非タウオパチー神経障害がα−シヌクレオパチーでない、方法。
[請求項102]神経障害が、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、脳卒中、脳虚血、脳卒中または脳虚血に関連する認知症、HIVに関連する認知症、興奮毒性に関連する障害、てんかん、発作、統合失調症、多発性硬化症、急性頭部外傷（重度外傷性脳損傷）、および酸素・グルコース欠乏からなる群より選択される、請求項101記載の方法。
[請求項103]興奮毒性に関連する障害が、脳卒中の間の虚血、外傷、低酸素、低血糖、低血糖および肝性脳症、中枢神経系における長期可塑性変化に関連する障害、不安、鬱病、急性疼痛および耳鳴からなる群より選択される、請求項102記載の方法。
[請求項104]神経障害が、てんかん、発作、統合失調症、脳卒中、脳虚血および酸素・グルコース欠乏である、請求項102記載の方法。
[請求項105]有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩が、過栄養量（supranutritional amount）のセレンを送達する、請求項101記載の方法。
[請求項106]過栄養量のセレンが、一日当たり5μg／kg〜1.0 mg／kgである、請求項105記載の方法。
[請求項107]セレン酸がセレン酸ナトリウムの形態である、請求項101記載の方法。
[請求項108]神経障害の処置または予防のための別の治療法との併用において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩を投与する段階をさらに含む、請求項101記載の方法。
[請求項109]非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための医用薬物の製造における、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用であって、非タウオパチー神経障害がα−シヌクレオパチーでない、使用。
[請求項110]有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩に細胞を曝露する段階を含む、細胞中のタウタンパク質の量を減少させる方法。
[請求項111]タウタンパク質が異常にリン酸化されている、請求項110記載の方法。
[請求項112]異常にリン酸化されたタウタンパク質が高リン酸化されている、請求項111記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】24時間の曝露後の、無血清培養物における5μM、25μMおよび100μMのセレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ならびにセレノメチオニンの組織培養毒性を示すグラフ表示である。
【図２】48時間の曝露後の、無血清培養物における5μM、25μMおよび100μMのセレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ならびにセレノメチオニンの組織培養毒性を示すグラフ表示である。
【図３】神経保護薬MnTBAPと比較した、低酸素誘導性の神経変性に対するセレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウムおよびセレノメチオニンの効果を示す棒チャートのグラフ表示である。
【図４】組織培養物中の100μM、250μMおよび500μMのセレン酸ナトリウムの毒性を示す棒チャートのグラフ表示である。
【図５】虚血誘導性神経変性に対するセレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウムおよびセレノメチオニンの効果を示す棒チャート表示である。
【図６】120μgおよび1.2 mgのセレン酸ナトリウムに曝露されたラットにおける、PTZ誘導性発作の数を示すグラフ表示である（平均±SEM）。
【図７】120μgおよび1.2 mgのセレン酸ナトリウムに曝露されたラットにおける、PTZ誘導性の重度発作の数を示すグラフ表示である（平均±SEM）。
【図８】120μgおよび1.2 mgのセレン酸ナトリウムに曝露され、PTZを注射されたラットにおける、発作活性の持続期間を示すグラフ表示である（平均±SEM）。
【図９】120μgおよび1.2 mgのセレン酸ナトリウムに曝露され、PTZを注射されたラットにおける、発作発症までの潜伏期間を示すグラフ表示である（平均±SEM）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の説明
1.定義
他にそうでないと定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明の実践または試験においては、記載されるものと類似かまたは等価な任意の方法および材料が使用され得るが、好ましい方法および材料が記載される。本発明の目的に関して、以下の用語が下記に定義される。
【００１３】
冠詞「一つの（a）」および「一つの（an）」は、本明細書において、一つまたは一つより多い（すなわち、少なくとも一つの）文法的対象物に言及するために使用される。例として「一つの要素」は、一つの要素または一つより多い要素を意味する。
【００１４】
本明細書において使用される「約」という用語は、参照数量、参照レベル、参照値、参照寸法、参照サイズまたは参照量に対して30%、20%または10%の程度変動する数量、レベル、値、寸法、サイズまたは量に言及する。
【００１５】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて、文脈がそうでないことを要しない限り、「含む（comprise）」という語、ならびに「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」等の変形は、明記された完全体もしくは段階、または完全体の群もしくは段階の群を包含することを意味するが、いかなる他の完全体もしくは段階、または完全体の群もしくは段階の群の排除も意味しないことが理解されると考えられる。
【００１６】
本明細書において使用される「脱リン酸化」とは、タンパク質等の生化学的実体からのリン酸基（PO42-）の化学的除去に言及する。細胞条件下において、脱リン酸化は、フォスファターゼ等の酵素によって酵素学的に達成される。
【００１７】
「高リン酸化」という用語は、タンパク質等の生化学的実体のリン酸化部位が、正常より高いレベルでリン酸化されている状況に言及する。「高リン酸化を阻害するか、または減少させる」という句は、生化学的実体の全ての部位または一部の部位のリン酸化を防止すること、およびリン酸化された全てまたは一部のそれらのリン酸化部位を有する生化学的実体の数を減少させることを包含する。
【００１８】
本明細書において使用される、「併用において」という用語は、神経障害に対するそれらの効果が、少なくとも部分的に同一期間にわたって生じるような、少なくとも二つの物質を用いた被験体の処置に言及する。少なくとも二つの物質の投与は、単一組成物中で同時になされ得るか、または各々の物質が別個の組成物中で同時に、または順次投与され得る。
【００１９】
本明細書において使用される「非タウオパチー神経障害」という用語は、古典的なタウオパチーの症状を提示しない神経障害に言及する。一般的にタウオパチーは、異常なタウタンパク質フィラメントの細胞内凝集体の存在を共通の病理学的性質として有する、多様な認知症および運動障害の群と見なされている。凝集体中のタウタンパク質は、高リン酸化されたタウである可能性がある。タウオパチーにおける、これらのタウタンパク質フィラメントの凝集体は、染色法および光学顕微鏡等の標準的な診断技術によって同定され得る。対照的に、非タウオパチー神経障害は、その一部は高リン酸化されたタウタンパク質等の異常型タウタンパク質に関連するか、またはタウタンパク質の異常量に関連するが、異常なタウの細胞内凝集体を提示しない。非タウオパチー神経障害の例は、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、脳卒中、脳虚血、脳卒中または脳虚血に関連する認知症、HIVに関連する認知症、興奮毒性に関連する障害、てんかん、発作、統合失調症、多発性硬化症、急性頭部外傷（重度外傷性脳損傷）、および酸素・グルコース欠乏を包含する。
【００２０】
本明細書において使用される「α−シヌクレオパチー」という用語は、神経変性障害、または脳の神経細胞中におけるα−シヌクレインの凝集体もしくは異常なα−シヌクレインに関連する障害に言及する。本発明の非タウオパチー神経障害は、α−シヌクレオパチーではない。
【００２１】
本明細書において使用される、「興奮毒性に関連する障害」という用語は、脳におけるグルタミン酸受容体の過剰な活性化に関連する障害である。興奮毒性に関連する障害は、脳卒中の間の虚血、外傷、低酸素、低血糖および肝性脳症；慢性疼痛、薬物耐性、薬物依存、薬物中毒および遅発性ジスキネジア等の中枢神経系における長期可塑性変化に関連する障害、てんかん、統合失調症、不安、鬱病、急性疼痛ならびに耳鳴を包含する。
【００２２】
本明細書において使用される、「栄養量」という用語は、FDAに制限された栄養補助食品の最大用量を超えないセレンの量を包含する。米国において、栄養補助食品に関するこの最大日用量は、一日当たり400μgである。
【００２３】
セレン酸に関連して本明細書において使用される「薬学的な塩」とは、ヒトおよび動物への投与に関して毒理学的に安全な塩を意味する。例えば、薬学的に許容される適切な塩は、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、炭酸、ホウ酸、スルファミン酸、および臭化水素酸等の薬学的に許容される無機酸の塩、または酢酸、プロピオン酸、酪酸、酒石酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、乳酸、ムチン酸、グルコン酸、安息香酸、コハク酸、シュウ酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、サリチル酸、スルファニル酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、エデト酸、ステアリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、ラウリル酸、パントテン酸、タンニン酸、アスコルビン酸およびペンタン酸等の薬学的に許容される有機酸の塩を包含するが、これらに限定されない。
【００２４】
塩基性塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、ニッケル、亜鉛、アンモニウムおよびアルキルアンモニウム等の薬学的に許容される陽イオンとともに形成されるものを包含するが、これらに限定されない。
【００２５】
塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピルおよびブチル塩化物、臭化物ならびにヨウ化物等の低級ハロゲン化アルキル；ジメチル硫酸およびジエチル硫酸などのジアルキル硫酸等の物質で4級化される可能性がある。
【００２６】
セレン酸の適切な金属イオン塩は、ナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウム、カルシウム、鉄、ニッケル、亜鉛、アンモニウムおよびアルキルアンモニウム塩を包含するが、これらに限定されない。好ましいセレン酸の塩は、ナトリウム塩Na2SeO4である。
【００２７】
本明細書において使用される「リン酸化」という用語は、タンパク質等の生化学的実体へのリン酸基（PO42-）の化学的な付加に言及する。細胞条件下において、リン酸化は、キナーゼ等の酵素によって酵素学的に達成される。「リン酸化を阻害するか、または減少させる」という句は、高リン酸化の場合のような、全てのリン酸化部位のリン酸化を防止することを含む、生化学的実体の一つまたは複数のリン酸化部位のリン酸化を防止することを包含する。この句はまた、生化学的実体の一つまたは複数のリン酸化部位で生じるリン酸化を防止することによるか、または生化学的実体の一つまたは複数のリン酸化部位で生じる脱リン酸化の結果として、生化学的実体のリン酸化の程度を減少させることを包含する。
【００２８】
本明細書において互換的に使用される「被験体」または「個体」または「患者」という用語は、予防または処置が望まれる任意の被験体、とりわけ脊椎動物被験体、さらにとりわけ哺乳動物被験体に言及する。本発明の範囲内に入る適切な脊椎動物は、霊長類、鳥類、家畜動物（例えば、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ等）、実験試験動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等）、伴侶動物（例えば、ネコおよびイヌ）ならびに捕獲性野生動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ等）を包含するが、これらに限定されない。好ましい被験体は、神経障害の処置または予防を必要とするヒトである。しかしながら、前記の用語は症状の存在を含意しないことが理解されると考えられる。
【００２９】
本明細書において使用される「過栄養（supranutritional）」という用語は、栄養所要量と見なされる量より多い量に言及する。米国において、セレン栄養補助に関してFDAに規定される最大日用量は、一日当たり400μgである。セレンの過栄養量によって、栄養補助に関する最大日用量を上回るセレンが被験体に提供される。例えば、一日あたりのセレンの過栄養量は、5μg／kg〜1.0 mg／kg、5μg／kg〜0.5 mg／kg、5μg／kg〜0.3 mg／kg、0.01 mg／kg〜1.0 mg／kg、0.01 mg／kg〜0.5 mg／kg、0.025 mg／kg〜1.0 mg／kg、0.025 mg／kg〜0.5 mg／kg、0.05 mg／kg〜1.0 mg／kg、0.05 mg／kg〜0.5 mg／kg、0.05 mg／kg〜0.3 mg／kg、0.1 mg／kg〜1.0 mg／kg、0.1 mg／kg〜0.5 mg／kgまたは0.1 mg／kg〜0.3 mg／kg、とりわけ一日当たり0.025 mg／kg〜0.3 mg／kgまたは0.01 mg／kg〜0.3 mg／kgである可能性がある。
【００３０】
本明細書において使用される、神経変性疾患を処置するか、もしくは予防する、またはタウタンパク質のリン酸化を阻害するか、もしくは減少させる、またはGSK3βの活性を阻害するという文脈における「有効量」という用語は、単回用量における、または一連の用量の一部としての、PP2Aの活性を増強する場合に効果的であり、とりわけ神経障害に関連する症状の発生を防止するため、そのような症状を抑制するため、かつ／または既存の症状を処置するために効果的な、セレン酸もしくはその薬学的に許容される塩の投与、または添加を意味する。有効量は、処置される個体の健康状態および身体的状態、処置される個体の分類学的群、組成物の製剤、医療事情および他の関連因子の評価に依存して変動すると考えられる。当該量は、比較的広い範囲内に入るであろうことが予測される。特定の態様において、有効量は、栄養量または過栄養量である。
【００３１】
2.非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防する方法
本発明は、結果としてGSK3βによるタウタンパク質のリン酸化の減少および／またはタウタンパク質の脱リン酸化速度の増加をもたらし得るPP2A活性の増強において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩が効果的であるという判定に部分的に基づく。セレン酸またはその薬学的に許容される塩が、細胞中に存在するタウタンパク質のレベル、または量を減少させる場合に効果的であることも観察されている。
【００３２】
本発明は、非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するために効果的に使用され得る。適切には、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の有効量は、セレン酸の栄養量または過栄養量である。いくつかの態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の量は、一日当たり約5μg／kg〜約1.0 mg／kg、通常一日当たり約0.01 mg／kg〜1.0 mg／kgもしくは0.01 mg／kg〜0.5 mg／kg、または一日当たり0.01 mg／kg〜0.3 mg／kgの量で過栄養用量のセレンを送達する。好ましい態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、セレン酸ナトリウム（Na2SeO4）である。
【００３３】
いくつかの態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための別の治療法との併用において被験体に投与される。セレン酸またはその薬学的に許容される塩との併用において使用され得る、非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための治療法の例示は、以下を包含するがこれらに限定されない：アスピリン（例えば、50〜325 mg／日）、クロピドグレル（例えば、75 mg／日）、アスピリンおよびジピリダモール（例えば、毎日2回25／200 mg）ならびにチクロピジン等の抗血小板剤、降圧薬、抗うつ剤、カルバマゼピン（Tegretol（商標））、クロバザム（Frisium（商標））、クロナゼパム（Klonopin（商標））、エトスクシミド（Zarontin（商標））、フェルバメート（Felbatol（商標））、フォスフェニトイン（cerebyx（商標））、フルラゼパム（Dalmane（商標））、ガバペンチン（Neurontin（商標））、ラモトリジン（Lanictal（商標））、レベチラセタム（Keppra（商標））、オキシカルバゼピン（Trileptal（商標））、メフェニトイン（Mesantoin（商標））、フェノバルビタール（Luminal（商標））、フェニトイン（Dilantin（商標））、プレガバリン（Lyrica（商標））、プリミドン（Mysoline（商標））、バルプロ酸ナトリウム（Epilim（商標））、チアガビン（Gabitril（商標））、トピラマート（Topamax（商標））、バルプロ酸セミナトリウム（Depakoke（商標）、Epival（商標））、バルプロ酸（Depakene（商標）、Convulex（商標））、ビガバトリン（Sabril（商標））、ジアゼパム（Valium（商標））、ロラゼパム（Ativan（商標））、パラアルデヒド（Paral（商標））およびペントバルビタール（Nembutal（商標））等の抗けいれん薬；クロルプロマジン（Thorazine（商標））、フルフェナジン（Prolixin（商標））、ペルフェナジン（Trilafon（商標））、プロクロルペラジン（Compazine（商標））、チオリダジン（Mellaril（商標））、トリフロペラジン（Stelazine（商標））、メソリダジン、プロマジン、トリフルプロマジン（Vesprin（商標））およびレボメプロマジン（Nozinan（商標））を含むフェノチアジン等の定型向精神薬を含む向精神薬；クロルプロチキセン、フルペンチキソール（Depixol（商標）およびFluanxol（商標））、チオチキセン（Navane（商標））、ならびにズクロペンチキソール（Clopixol（商標）およびAcuphase（商標））等のチオキサンテン、ならびにハロペリドール（Haldol（商標））、ドロペリドール、ピモジド（Orap（商標））およびメルペロン等のブチロフェノン；クロザピン（Clozaril（商標））、オランザピン（Zyprexa（商標））、リスペリドン（Risperdal（商標））、クエチアピン（Seroquel（商標））、ジプラシドン（Geodon（商標））、アミスルプリド（Solian（商標））、およびパリペリドン（Invega（商標））を含む非定型向精神薬；アリピプラゾール（Abilify（商標））、ビフェプルノックスおよびノルクロザピン（ACP-104）等のドーパミン部分アゴニスト、インターフェロンβ−1a（Aronex（商標）、Rebif（商標）、CinnoVex（商標））およびインターフェロンβ−1b（Betaseron（商標））等のインターフェロン；グラチラマー酢酸塩（Copaxone（商標））；ミトキサントロン（Novantrone（商標））；ナタリズマブ（Tysabri（商標））ならびにリルゾール（Rilutek（商標））。
【００３４】
併用療法は、セレン酸の非存在下において通常使用される量の非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するために使用される物質と共に、有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩を包含し得る。あるいは、非タウオパチー神経障害を処置する場合に使用される物質の量は、セレン酸またはその薬学的に許容される塩との共投与の場合に低減される可能性がある。いくつかの態様において、併用によって相乗効果が提示される可能性がある。
【００３５】
本発明の特定の態様は、有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩を被験体に投与する段階を一般的に含む、被験体において非タウオパチー神経障害を処置するか、または予防するための方法に向けられる。これらの方法を実践するために、被験体を管理する個人は、被験体の特定の状態および状況に関して、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の有効な投与形態を決定することが可能である。セレン酸の有効量は、症状の発生を予防すること、症状を抑制すること、および症状を処置することを含む、非タウオパチー神経障害の処置または予防のために効果的な量である。いくつかの態様において、有効量は栄養量である。他の態様において、有効量は過栄養量である。特定の態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、セレン酸ナトリウムである。
【００３６】
本発明の方法における使用のための、投与の様式、投与されるセレン酸の量、およびセレン酸製剤が以下に議論される。処置される非タウオパチー神経障害は、適切な対照と比較して、疾患過程の指標である一つまたは複数の診断パラメーターを測定することによって決定される可能性がある。ヒトの被験体の場合、「適切な対照」は処置前の個体の場合か、またはプラセボで処置されたヒト（例えば、年齢が一致するかもしくは類似の対照）の場合もある。本発明によれば、非タウオパチー神経障害の処置は、非限定に以下の段階を包含し、かつ包括する：（i）該疾患に罹患しやすい可能性があるが、未だ該疾患と診断されていない被験体において非タウオパチー神経障害を予防する段階であって、したがって、処置が非タウオパチー神経障害に関する予防的処置から構成される段階;（ii）非タウオパチー神経障害を阻害する段階、すなわち非タウオパチー神経障害の進行を阻止する段階；または（iii）非タウオパチー神経障害に起因する症状を緩和させる段階。
【００３７】
本発明の方法は、非タウオパチー神経障害と診断された個体、非タウオパチー神経障害を有することが疑われる個体、または非タウオパチー神経障害を罹患しやすいことが既知であり、かつ非タウオパチー神経障害を発症する可能性があると見なされる個体を処置するために適切である。
【００３８】
特定の態様において、セレン酸は、セレン酸ナトリウムである。
【００３９】
本発明の方法を用いた処置に関する例示的な被験体は、脊椎動物、とりわけ哺乳動物である。特定の態様において、被験体は、ヒト、ヒツジ、畜牛、ウマ、ウシ、ブタ、イヌおよびネコからなる群より選択される。好ましい被験体はヒトである。
【００４０】
セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、薬剤送達の分野において公知である以下の任意の数の技術によって製剤され得る。全ての製剤が各々の投与経路に関して適切とは限らないことに留意して、セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、いくつかの手段によってもちろん投与されてもよい。セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、固体形態または液体形態において投与され得る。適用は経口、直腸、経鼻、局所（口腔かつ舌下を含む）または吸入によるものであってもよい。セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、従来型の薬学的に許容される補助剤、担体および／または希釈剤と共に投与されてもよい。
【００４１】
固体形態の適用は、錠剤、カプセル、粉剤、ピル、トローチ剤、座薬および顆粒状形態の投与を含む。それらはまた、香料、色素、希釈剤、柔軟剤、結合剤、保存剤、耐久剤（lasting agent）、および／もしくは封入材料等の、担体または添加剤も包含してもよい。液体形態の投与は、溶液、懸濁液および乳液を包含する。これらはまた、上述の添加剤と共に提供されてもよい。
【００４２】
使い易さのために適切な粘性であると仮定して、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の溶液および懸濁液は、注射されてもよい。注射のために粘性が強過ぎる懸濁液は、必要な場合、そのような目的のために設計された装置を使用して移植されてもよい。徐放性形態は、非経口手段または腸内手段を介して一般に投与される。非経口投与は、本発明を実施するために使用されるセレン酸またはその薬学的に許容される塩の別の投与経路である。「非経口」とは、注射のために適切な、および経鼻投与、経膣投与、腸管投与および舌下投与のために適切な製剤を包含する。
【００４３】
セレン酸またはその薬学的に許容される塩の投与は、経口投与製剤を包含してもよい。経口投与製剤は、カプセルもしくは錠剤の形態において、または水溶性ベースの溶液として、好ましくは毎日1回〜3回投与される。セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、毎日、継続的に、一週間に1回、または一週間に3回のいずれかで静脈内投与されてもよい。
【００４４】
セレン酸またはその薬学的に許容される塩の投与は、毎日の投与を包含してもよく、好ましくは徐放性カプセルまたは錠剤の形態において毎日1回、または水溶性溶液として毎日1回を包含してもよい。
【００４５】
セレン酸またはその薬学的に許容される塩、および神経障害を処置するために適切な少なくとも一つの物質の併用は、単一製剤もしくは単一組成物で、または別個の製剤もしくは別個の組成物で、固体形態または液体形態において投与されることが可能である。いくつかの態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩、および神経障害を処置するための物質は、単一錠剤もしくは単一カプセル、または別個の錠剤もしくは別個のカプセルとして経口的に投与される。他の態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩、および神経障害を処置するための物質は、単一組成物または別個の組成物において静脈内投与される。
【００４６】
本発明はまた、栄養量または過栄養量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩を含む、神経障害を処置するか、または予防するための薬学的組成物も提供する。いくつかの態様において、組成物は、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の一部としての、例えば400μg〜80 mg等の約40μg〜約80 mgのセレン量でセレンを送達するセレン酸の量、および薬学的に許容される担体を含む。いくつかの態様において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、約40μg〜約80 mg、または400μg〜80 mgの量でセレンを送達する。例示において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、単一の、または分割された一日用量に関して、約400μg〜80 mg、401μg〜80 mg、500μg〜40 mg、とりわけ800μg〜40 mgの量でセレンを送達する。
【００４７】
セレン酸またはその薬学的に許容される塩を含む薬学的組成物は、神経障害を処置するか、または予防するための別の物質をさらに含む場合がある。例えば、該組成物は、セレン酸またはその薬学的に許容される塩、および少なくとも一つの以下の物質を含む可能性がある：アスピリン（例えば、50〜325 mg／日）、クロピドグレル（例えば、75 mg／日）、アスピリンおよびジピリダモール（例えば、毎日2回25／200 mg）ならびにチクロピジン等の抗血小板剤、降圧薬、抗うつ剤、カルバマゼピン（Tegretol（商標））、クロバザム（Frisium（商標））、クロナゼパム（Klonopin（商標））、エトスクシミド（Zarontin（商標））、フェルバメート（Felbatol（商標））、フォスフェニトイン（cerebyx（商標））、フルラゼパム（Dalmane（商標））、ガバペンチン（Neurontin（商標））、ラモトリジン（Lanictal（商標））、レベチラセタム（Keppra（商標））、オキシカルバゼピン（Trileptal（商標））、メフェニトイン（Mesantoin（商標））、フェノバルビタール（Luminal（商標））、フェニトイン（Dilantin（商標））、プレガバリン（Lyrica（商標））、プリミドン（Mysoline（商標））、バルプロ酸ナトリウム（Epilim（商標））、チアガビン（Gabitril（商標））、トピラマート（Topamax（商標））、バルプロ酸セミナトリウム（Depakoke（商標）、Epival（商標））、バルプロ酸（Depakene（商標）、Convulex（商標））、ビガバトリン（Sabril（商標））、ジアゼパム（Valium（商標））、ロラゼパム（Ativan（商標））、パラアルデヒド（Paral（商標））およびペントバルビタール（Nembutal（商標））等の抗けいれん薬；クロルプロマジン（Thorazine（商標））、フルフェナジン（Prolixin（商標））、ペルフェナジン（Trilafon（商標））、プロクロルペラジン（Compazine（商標））、チオリダジン（Mellaril（商標））、トリフロペラジン（Stelazine（商標））、メソリダジン、プロマジン、トリフルプロマジン（Vesprin（商標））およびレボメプロマジン（Nozinan（商標））を含むフェノチアジン等の定型向精神薬を含む向精神薬；クロルプロチキセン、フルペンチキソール（Depixol（商標）およびFluanxol（商標））、チオチキセン（Navane（商標））、およびズクロペンチキソール（Clopixol（商標）ならびにAcuphase（商標））等のチオキサンテン、ならびにハロペリドール（Haldol（商標））、ドロペリドール、ピモジド（Orap（商標））およびメルペロン等のブチロフェノン；クロザピン（Clozaril（商標））、オランザピン（Zyprexa（商標））、リスペリドン（Risperdal（商標））、クエチアピン（Seroquel（商標））、ジプラシドン（Geodon（商標））、アミスルプリド（Solian（商標））、およびパリペリドン（Invega（商標））を含む非定型向精神薬；アリピプラゾール（Abilify（商標））、ビフェプルノックスおよびノルクロザピン（ACP-104）等のドーパミン部分アゴニスト、インターフェロンβ−1a（Aronex（商標）、Rebif（商標）、CinnoVex（商標））およびインターフェロンβ−1b（Betaseron（商標））等のインターフェロン；グラチラマー酢酸塩（Copaxone（商標））；ミトキサントロン（Novantrone（商標））；ナタリズマブ（Tysabri（商標））ならびにリルゾール（Rilutek（商標））。
【００４８】
本発明の薬学的組成物は、非免疫原性でかつセレン酸に生体適合性であり、かつ無傷の分子としての生体内吸収、生体内分解、除去が可能である任意のさらなる構成成分を包含する可能性がある。製剤は、即座に使用可能な形態において供給される場合があるか、または投与に先立ちビヒクル添加を要する無菌粉剤、もしくは無菌液体として供給される場合がある。無菌性が望まれる場合、製剤が無菌条件下で作製され得るか、混合物の個々の構成成分が無菌であり得るか、または製剤が使用前に無菌濾過され得る。そのような溶液はまた、バッファー、塩、賦形剤、保存剤等の薬学的に許容される適切な担体も含み得る。
【００４９】
いくつかの態様において、本発明の方法において、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の投与のための経口製剤が使用される。これらの製剤は、血流中への吸収を遅延させるために、溶解度を減少させたセレン酸またはその薬学的に許容される塩を一般に含む。さらに、これらの製剤は、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の吸収を遅延させる役割を果たし得る他の構成成分、物質、担体等を包含してもよい。カプセルまたはマトリックスから、セレン酸もしくはその薬学的に許容される塩を遅延拡散または制御拡散させるために、生体内分解性であるか、またはそうでなくてもよいマイクロカプセル化、重合体エントラップメントシステム、および浸透圧ポンプも使用されてもよい。
【００５０】
セレン酸またはその薬学的に許容される塩は、単独でまたは別の薬剤の一部として使用され得る。したがって、本発明はまた、神経障害の処置のためのセレン酸またはその薬学的に許容される塩を含む薬剤も考慮する。
【００５１】
本発明の別の局面において、有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩に細胞を曝露する段階を含む、細胞中のタウタンパク質の量を減少させる方法が提供される。
【００５２】
この局面のいくつかの態様において、タウタンパク質は、高リン酸化等の異常なリン酸化を受けている。
【００５３】
他の態様において、タウタンパク質は、正常量のリン酸化を受けている。
【００５４】
理論に拘束されることを望むわけではないが、タウタンパク質は、神経性疾患に関連するように見受けられ、かつ神経毒性傷害の媒介物質であるように見受けられる。正常レベルのリン酸化または高リン酸化を伴うタウタンパク質の量の減少は、神経保護的である可能性がある。
【００５５】
本発明の性質がより明確に理解され、かつ実質的な効果を得るために、その特定の好ましい態様が、以下の非限定的実施例に関連して以下に記載される。
【００５６】
実施例
実施例1
培養されたラット海馬切片における、セレン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウムおよびセレノメチオニンの興奮毒性、低酸素ならびに虚血に対する神経保護効果の調査
方法：
以下の様に改変されたPringle et al 1997の基本的方法を使用して、器官型海馬切片培養物を調製した：
ウィスター仔ラット（8〜11日齢）を断頭し、4.5 mg／mLグルコースを添加した氷冷のゲイ（Gey）のバランス塩類溶液中で、海馬を迅速に解剖した。マッキルベイン組織チョッパー（McIlwain tissue chopper）上で横断切片（400μm）を切断し、氷冷のゲイのバランス塩類溶液中に戻した。切片を分離し、ミリセル（Millicell）CM培養挿入物上にプレートし（ウェル当たり4）、37℃／5% CO2で14日間維持した。維持培地は、25%の熱不活化されたウマ血清、25%のハンクス平衝塩溶液（HBSS）、ならびに1 mMグルタミンおよび4.5 mg／mLグルコースを添加したアール平衡塩が添加された50%最小必須培地（MEM）からなる。3〜4日毎に、培地を交換した。
【００５７】
低酸素：
実験的低酸素が、以前に遂行された（Pringle et al., 1996；1997）。簡単には、5μg／mLの排除性蛍光色素ヨウ化プロピジウム（PI）を含む無血清培地（1 mMグルタミンおよび4.5 mg／mLグルコースを添加したSFM−75% MEM、25% HBSS）に、14日目の培養物を移した。画像取得に先立ち、培養物をSFM中で60分間平衡化させた。ローダミンフィルターセットに適合させたライカDMIL倒立顕微鏡を使用して、PI蛍光を検出した。この段階でPI蛍光が検出された任意の培養物を、さらなる研究から排除した。95%N2／5%CO2で飽和された無血清培地（SFM）（＋PI）に培養物を移すことによって、低酸素を誘導した。密封される前に10分間、10 L／分で気体を継続的に送風することによって、環気が95%N2／5%CO2で飽和された気密チャンバー中で培養プレート（蓋なし）を密封し、インキュベーター中に170分間配置した（したがって、低酸素の合計時間は180分であった）。低酸素期間の終了時に、酸素正常状態のPIを含むSFMに培養物を戻し、インキュベーター中に24時間配置した。神経保護の陽性対照として、100μMでMn(III)テトラキス（4−安息香酸）ポルフィリンクロライド（MnTBAP）を使用した。低酸素の前、間および後のパラダイム（低酸素状態の24時間前、3時間の低酸素状態の間、および低酸素状態の24時間後に培地中に存在する化合物）を使用して、調査対象の化合物の効力を評価した。
【００５８】
虚血：
95%N2／5%CO2で飽和されたグルコース欠乏培地（1 mMグルタミンを添加したGFM−75%MEM、25%HBSS）＋PIに培養物を移すことによって、実験的虚血を誘導した。続いて、密封される前に10分間、10 L／分で気体を継続的に送風することによって、環気が95%N2／5%CO2で飽和された気密チャンバー中で培養プレート（蓋なし）を密封し、インキュベーター中に50分間配置した（したがって、虚血の合計時間は60分であった）。虚血期間の終了時に、酸素正常状態のPIを含むSFMに培養物を戻し、インキュベーター中に24時間配置した。100μMのMnTBAPを神経保護の陽性対照として使用した。虚血の前、間および後のパラダイム（虚血の24時間前、1時間の虚血の間、および虚血の24時間後に培地中に存在する化合物）を使用して、調査対象の化合物の効力を評価した。
【００５９】
神経細胞損傷の決定
PC上で駆動するImageJソフトウェアを使用して、神経細胞損傷を評価した。単色CCDカメラを使用して画像を捕捉し、オフライン解析のために保存した。薬剤の添加前に光透過画像を捕捉し、24時間の回復期間の終了時にPI蛍光画像を記録した。続いて、透過画像からCA1領域の面積を決定した。ImageJの閾値機能を使用してCA1中のPI蛍光の面積を測定し、PI蛍光がバックグラウンドを上回って検出されるCA1のパーセンテージとして、神経細胞損傷を表現する（Pringle et al., 1997）。
【００６０】
化合物
試験された実験化合物は、全てSigma Aldrichから得た。
セレン酸ナトリウム（cat.＃S8295）
亜セレン酸ナトリウム（cat.＃00163）
セレノメチオニン（cat.＃S3132）
【００６１】
毒性を引き起こすと考えられる組織培養曝露レベルを決定するために、該化合物に対して予備的な毒性スクリーニングを遂行した。各々の化合物をSFM中で5 mMに作製し、続いて、5μM、25μMおよび100μMの最終濃度を得るために、1μL／mL、5μL／mLおよび20μL／mLで使用した。24時間後および48時間後に損傷を測定した（図1および2中に示される結果）。亜セレン酸ナトリウムは、5μMを上回ると毒性が見出され、かつセレノメチオニンは、25μMを上回ると毒性であった。セレン酸ナトリウムは、試験された100μMまでのいかなる濃度でも毒性は見出されなかった。以下に続く実験において使用される濃度を決定するために、これらの結果を使用した。
【００６２】
SFM中で化合物を10 mMに作製した。SFMを用いて、セレン酸ナトリウムを1 mM、100μMおよび5μMに系列希釈し、50 nm、1μM、10μMおよび100μMの最終濃度を得るために、これらの各々を10μL／mLで使用した。亜セレン酸ナトリウムを100μMに希釈し、セレノメチオニンを500μMに希釈した。続いて、1μMおよび5μMの最終濃度を得るために、これらを10μL／mLで使用した。
【００６３】
低酸素実験から得られた結果（結果は図3）を考慮して、OGD実験において使用されるセレン酸ナトリウムの濃度を増加した。
【００６４】
この場合、SFM中でセレン酸ナトリウムを50 mMに作製し、続いて25 mM、10 mMおよび1 mMに系列希釈し、10μM、100μM、250μMおよび500μMの最終濃度を得るために、これらの各々を10μL／mLで使用した。亜セレン酸ナトリウムおよびセレノメチオニンは、前記と同様に行った。OGDと並行して、これらのより高い濃度でのセレン酸ナトリウムの毒性を評価する実験を実施した（結果は図4）。
【００６５】
結果
低酸素のみに曝露された培養物において、48%±4.4%のCA1領域においてPI蛍光を観察し（n＝48）、かつこれは100μM MnTBAPによって防止された（n＝24、P＜0.01対低酸素状態のみ）。100μMセレン酸ナトリウムでも有意な損傷緩和が見られたが（P＜0.05対低酸素のみ、n＝24）、他の試験化合物では見られなかった（図3）。
【００６６】
酸素グルコース欠乏（OGD）虚血のみに曝露された培養物において、47%±4.5%のCA1領域においてPI蛍光を観察し（n＝48）、かつこれは100μM MnTBAPによって防止された（n＝24、P＜0.01対OGDのみ）。有意な損傷緩和は、100μMセレン酸ナトリウム（P＜0.01対OGDのみ、n＝24）および250μMセレン酸ナトリウム（P＜0.05対OGDのみ、n＝24）で見られたが、他の試験化合物では見られなかった（図5を参照のこと）。低酸素後に500μMセレン酸ナトリウムで観察された有意な毒性の増加が存在したが、これは低酸素の非存在下におけるこの濃度での該化合物の神経毒性によるものであることが引き続いて示された（図4）。
【００６７】
実施例2
ラットにおけるPTZ誘導性の発作活性
試料および方法
動物
全ての動物実験は、実験動物の世話および使用に関するアメリカ国立衛生研究所（NIH）のガイドラインに従って遂行され、かつ国家実験動物センター、クオピオ、フィンランドの倫理委員会によって承認された。200〜240 gの重量の、総計30成体のオスのスプラーグドーリー（Sprague-Dawley）ラット（タコニック、デンマーク）を使用した。食料および水に自由にアクセスでき、標準的温度（22±1℃）および光制御された環境（7 am〜8 pmまで光点灯）で動物を収容した。
【００６８】
以下の通り、動物を分類した。
・ビヒクルで処置された10匹のラット（飲用水として無菌水）
・無水セレン酸ナトリウム（100 mL無菌水中に120マイクログラム）で処置された10匹のラット、PTZ注射に先立ち7日間、飲用水中で経口投与
・無水セレン酸ナトリウム（100 mL無菌水中に1.2ミリグラム）で処置された10匹のラット、PTZ注射に先立ち7日間、飲用水中で経口投与
【００６９】
PTZ誘導性の発作
オスのスプラーグドーリーラットに、ペンチレンテトラゾール（PTZ）（60 mg／kg）を腹腔内投与する（i.p.、生理食塩水中に2 mL／kg）。
【００７０】
薬剤送達
PTZ注射に先立ち7日間、飲用水中でセレン酸ナトリウムを経口投与する。ラットは、水に自由にアクセスできる（通常の一日の水消費量は、30 mL／ラット／日である）。
【００７１】
発作活性のモニタリング
PTZ投与に続いて30分間、行動変化を観察した。発作の発生率（発作および重度の発作）、最初の発作出現の潜伏時間、ならびに発作活性の持続期間を、抗けいれん薬効果の指標として使用した。動物が死亡した場合は、発作数を計数しなかった。典型的に、致死は一回の極めて重度な発作の結果であって、これは単一の重度の発作として記録した。死亡した動物には、30分間の最大発作持続期間を充当した。一つの例において、ある動物（番号1）は、極めて強度でかつ長期間の一回の発作のみを起こし、この場合、一回の単一の重度の発作のみが記録された。重度の発作とは、伸張性痙攣および捻転性痙攣を含む長期間の発作と定義した。
【００７２】
統計学的解析
値はパーセンテージとして提示され、差異はP＜0.05のレベルで統計学的に有意であると見なされる。StatsDirectソフトウェアを使用して、統計学的解析を遂行した。一元配置分散分析（1-way-ANOVA）、続いてダネット検定（Dunnet’s test）によって、群の間の差異を解析した（対照（＝ビヒクル処置されたPTZラット）群との比較）。
【００７３】
結果
致死
ビヒクル群（1匹）および120μgセレン酸ナトリウム群（1匹）において、致死を観察した。
【００７４】
発作数
ビヒクルを受けた動物は、22.8±4.9の発作を起こした。セレン酸ナトリウムは、120μg群において8.5±2.1に、かつ1.2 mg群において9.9±2.2に、発作数を有意に減少させた（図6）。
【００７５】
重度の発作の数
ビヒクルを受けた動物は、1.5±0.3の重度の発作を起こした。セレン酸ナトリウムは、120μg群において0.8±0.1に発作の数を有意に減少させた。1.2 mgのセレン酸ナトリウムで処置された動物は、0.9±0.1の重度の発作を起こした（図7）。
【００７６】
発作活性の持続期間
ビヒクルを受けた動物の発作活性の持続期間は、1443.4±166.3秒であった。セレン酸ナトリウム処置は、120μg（770.9±189.9秒）および1.2 mg（808.6±126.1秒）の双方で、発作活性の持続期間を有意に減少させた（図8）。
【００７７】
発作発症までの潜伏時間
ビヒクルを受けた動物は、76.4±10.7秒で発作を発症した。120μgおよび1.2 mgでセレン酸ナトリウムを受けた動物は、各々、217.6±117.6秒および107.6±26.9秒で発作を発症した。群の間で、発作の発症における有意差は存在しなかった（図9）。
【００７８】
結論
これらのデータは、セレン酸ナトリウムが、120μgおよび1.2 mgの双方で、PTZ投与に応答する発作の数ならびに発作活性の持続期間を減少させることを実証する。120μgのセレン酸ナトリウムはまた、PTZ投与に続いて起こった重度の発作の数を減少させた。このモデルにおいては、発作発症の潜伏時間に対して、いずれの用量の化合物も有意な効果を有しなかった。
【００７９】
参照文献
0005542673.tif 000002
0005542673.tif 000003
【図１】
0005542673.tif 000004
【図２】
0005542673.tif 000005
【図３】
0005542673.tif 000006
【図４】
0005542673.tif 000007
【図５】
0005542673.tif 000008
【図６】
0005542673.tif 000009
【図７】
0005542673.tif 000010
【図８】
0005542673.tif 000011
【図９】
0005542673.tif 000012