(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物細胞における遺伝子発現を促進するための発現ベクターであって、
二つの逆位反復（ＩＲ）エレメントで分離された二本の長い配列を有する環状の核酸分子を含み、
前記二本の長い配列のそれぞれが互いに対して相補的であって、それぞれが、
少なくとも一つの遺伝子、および
核のアンカーリングエレメントを含み、
前記二つのＩＲエレメントのいずれも、互いに対して相補的な二本の外側核酸配列と、前記二本の外側核酸配列の間に挿入され、かつ前記二本の外側核酸配列のそれぞれとは異なる中央部配列と、を含み、
前記発現ベクターが哺乳動物細胞における前記遺伝子発現を促進するためにインバーテッドダイマー（ＩＤ）として組織され、
前記発現ベクターが哺乳動物細胞をトランスフェクトする能力を有し、かつ
前記発現ベクターが前記哺乳動物細胞内のエピソームベクターである、発現ベクター。
【請求項２】
前記遺伝子が、シグナルペプチド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ニューロペプチド、抗原、抗体、酵素、凝固因子、抗血管新生因子、前血管新生因子、輸送タンパク質、レセプター、リガンド、調節タンパク質、構造タンパク質、レポータータンパク質、転写調節因子、リボザイム、融合タンパク質および薬物抵抗性タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記タンパク質が天然由来のものか、または人為的に修飾されたものである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記レポータータンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）である、請求項３に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記遺伝子が、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡからなる群より選択される一つのＲＮＡ内に転写される、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記ヒト細胞がミスマッチ修復欠損（ＭＭＲ-）細胞である、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記ＭＭＲ-細胞がＨＣＴ１１６（ｈＭＬＨ１-）細胞かまたはＤＬＤ−１（ｈＭＳＨ６-）細胞である、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記ヒト細胞がミスマッチ修復熟練（ＭＭＲ+）細胞である、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
核のアンカーリングエレメントが、ＥＢＶ核タンパク質ＥＢＮＡ−１およびＥＢＶレプリコンｏｒｉＰをコードするＥＢＶ（エプスタイン・バー・ウイルス）遺伝子を含む、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターが、前記哺乳動物細胞における前記遺伝子の発現を促進することができる、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１に記載の発現ベクターを含むヒト細胞。
【請求項１３】
前記ヒト細胞がミスマッチ修復欠損（ＭＭＲ-細胞）である、請求項１２に記載のヒト細胞。
【請求項１４】
前記ヒト細胞がミスマッチ修復熟練（ＭＭＲ+細胞）である、請求項１２に記載のヒト細胞。
【請求項１５】
哺乳動物細胞における遺伝子を発現させるための方法であって、
請求項１に記載の発現ベクターを前記哺乳動物細胞にトランスフェクトしてトランスフェクト細胞を生産する工程、
前記トランスフェクト細胞を培養して、前記遺伝子がコードするタンパク質を前記トランスフェクト細胞に生産させる工程、および
前記哺乳動物細胞から前記タンパク質を回収する工程、を含む方法。
【請求項１６】
前記遺伝子が、シグナルペプチド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ニューロペプチド、抗原、抗体、酵素、凝固因子、抗血管新生因子、前血管新生因子、輸送タンパク質、レセプター、リガンド、調節タンパク質、構造タンパク質、レポータータンパク質、転写調節因子、リボザイム、融合タンパク質および薬物抵抗性タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記遺伝子が、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡからなる群より選択される一つのＲＮＡ内に転写される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒト細胞がミスマッチ修復欠損（ＭＭＲ-）細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＭＲ-細胞がＨＣＴ１１６（ｈＭＬＨ１-）細胞またはＤＬＤ−１（ｈＭＳＨ６-）細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒト細胞がミスマッチ修復熟練（ＭＭＲ+）細胞である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞における遺伝子発現を促進することができる新規発現ベクターに関する。この発現ベクターは、発現される遺伝子に加えて、核のアンカーリングエレメントおよび少なくとも一つの逆位反復エレメント、好ましくは二つの逆位反復エレメントを含む。さらに本発明は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞へ発現ベクターをトランスフェクトすることによる、遺伝子発現を促進するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の遺伝子発現の方法では、原核生物の発現系を用いてヒトの組み換えタンパク質を発現させている。大部分のヒトの組み換えタンパク質では、グリコシル化、ｇ−カルボキシル化またはｇ−ヒドロキシル化などの翻訳後修飾および／または翻訳時前後修飾を必要とする。従って、原核生物の発現系に関する周知の問題は、哺乳動物の発現系が行うような翻訳後修飾および／または翻訳時前後修飾を原核生物の発現系が行わないことである。正常な機能のために翻訳後修飾および／または翻訳時前後修飾を必要とするタンパク質は、原核生物の発現系で正確に発現されるはずがない。
【０００３】
当該ヒトの組み換えタンパク質を発現させるために従来より広く用いられている別の遺伝子発現方法は、哺乳動物の発現系である。翻訳後修飾および翻訳時前後修飾を経験するそれらの能力が原因で、哺乳動物の発現系では哺乳動物細胞を用いる。
【０００４】
とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いる哺乳動物の発現系は、治療および診断に用いるための生物薬剤学的タンパク質を発現させることに関してはルーチンで使いやすい発現系となった。
【０００５】
哺乳動物細胞における遺伝子発現を促進するための従来の方法は、濃度を徐々に高めた選択薬剤に対する段階的な選択によって遺伝子を増幅する工程を含む。哺乳動物細胞における遺伝子発現を促進するための従来の方法の一つの態様では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて、メトトレキサート（ＭＴＸ）に対しての段階的な選択を利用して、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を増幅させる（Ｏｍａｓａ，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９４、６００−６０５を参照。）。
【０００６】
しかしながら、段階的な選択は単調であって時間を要する。このプロセスでは、遺伝子を高レベルで発現する細胞を完成させるのに数ヶ月を要し、非ヒト哺乳動物細胞での翻訳後修飾はヒト細胞でのそれと同一ではない。さらに、このような遺伝子増幅を伴う従来の遺伝子発現の促進方法は、治療および診断のために用いる生物薬剤学的タンパク質の生産の際に、ヒト細胞で広く採用されてはいない。一般的に、ヒト細胞で作製されたヒトのタンパク質は、非ヒト系で生産されたその対応物と比較して有利な特性を持っているはずである。
【０００７】
ヒト細胞におけるミスマッチ修復（ＭＭＲ）系が遺伝子の増幅を強く抑制することが観測された。Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９，３３０４−３３１０、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１３８０２−１３８０７を参照すること。したがって、遺伝子の増幅によって促進された遺伝子発現は、ＭＭＲ+（ＭＭＲ−正常／ＭＭＲ熟練）細胞で強く抑制される。ＨＣＴ１１６細胞はｈＭＬＨ１遺伝子の変異体であるため、ＭＭＲ-（ＭＭＲ−欠損）である。ＨＣＴ１１６細胞が遺伝子の増幅によって遺伝子発現を促進することが示される。対照的に、ＨＣＴ１１６＋Ｃｈ３（野生型ｈＭＬＨ１遺伝子を保持する染色体３の導入の故にＭＭＲ+である）またはＨＣＴ１１６＋ｈＭＬＨ１（野生型ｈＭＬＨ１遺伝子を保持するｃＤＮＡの導入の故にＭＭＲ＋である）は、遺伝子の増幅による薬物抵抗性遺伝子発現の促進を抑制する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の遺伝子発現方法の欠点、および哺乳動物細胞（特にヒト細胞）における遺伝子発現を促進するための従来の方法の欠点を克服するために、本発明は、上記の問題を緩和するかまたは防止するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの態様は、少なくとも一つの遺伝子、核のアンカーリングエレメント、およびそれぞれが互いに対して相補的な二本の外側核酸配列を含む少なくとも一つの逆位反復（ＩＲ）エレメントを含む発現ベクターを提供することである。発現ベクターはエピソームベクターであり、哺乳動物細胞をトランスフェクトする能力にさらに特徴を有する。好ましくは、ＩＲエレメントは二本の外側核酸配列の間に挿入された中央部配列を含み、それは二本の外側核酸配列のそれぞれとは異なるものである。また好ましくは、発現ベクターがｐＧＴ０２−ＧＦＰなどの一つのＩＲエレメントを含み、最も有利には、ｐＧＴ０３−ＧＦＰおよびｐＧＴ０４−ＩＤなどの二つのＩＲエレメントを含む。発現ベクターが二つのＩＲエレメントを含む場合、これらの二つのＩＲエレメントは同一であってもよく、または異なっていてもよい。
【００１０】
発現ベクター内の遺伝子は、タンパク質をコードするものか、または非コードＲＮＡ内に転写されてもよい。遺伝子によってコードされるタンパク質としては、シグナルペプチド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ニューロペプチド、抗原、抗体、酵素、凝固因子、抗血管新生因子、前血管新生因子、輸送タンパク質、レセプター、リガンド、調節タンパク質、構造タンパク質、レポータータンパク質、転写調節因子、リボザイム、融合タンパク質、および薬物抵抗性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。タンパク質は天然由来のものまたは人為的に修飾されたものであり、たとえばＥＧＦＰ（すなわち、緑色蛍光タンパク質）があり、これはレポータータンパク質である。
【００１１】
非コードＲＮＡとしては、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１２】
哺乳動物細胞としては、ミスマッチ修復欠損（ＭＭＲ-）細胞またはミスマッチ修復熟練（ＭＭＲ+）細胞などのヒト細胞が好ましい。ＭＭＲ-細胞の具体例としては、ＨＣＴ１１６（ｈＭＬＨ１-）細胞またはＤＬＤ−１（ｈＭＳＨ６-）細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。ＭＭＲ+細胞の具体例としては、ＨＣＴ１１６＋ｃｈ３細胞またはＨＣＴ１１６＋ｈＭＬＨ１細胞が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００１３】
核のアンカーリングエレメントとしては、ＥＢＶ核タンパク質ＥＢＮＡ−１およびＥＢＶレプリコンｏｒｉＰをコードするＥＢＶ（エプスタイン・バー・ウイルス）遺伝子が好ましい。
【００１４】
発現ベクターは、哺乳動物細胞内で遺伝子の発現を促進する能力を持つものである。
【００１５】
本発明の別の態様は、インバーテッドダイマー（ＩＤ）として組織される発現ベクターを提供することである。発現ベクターは、二つの逆位反復（ＩＲ）エレメントで分離された二本の長い核酸配列を有する環状の核酸分子である。二本の長い核酸配列のそれぞれは互いに対して相補的であって、それぞれが少なくとも一つの遺伝子および核のアンカーリングを含み、二つのＩＲエレメントのそれぞれが二本の外側核酸配列を含み、それぞれが互いに対して相補的である。二つのＩＲエレメントは、互いに同一であるかまたは異なっている。ＩＤはエピソームベクターである。
【００１６】
最後に、本発明は、発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトしてトランスフェクト細胞を生産する工程、トランスフェクト細胞を培養して、遺伝子がコードするタンパク質をトランスフェクト細胞に生産させる工程、および哺乳動物細胞からタンパク質を回収する工程によって、哺乳動物細胞における遺伝子を発現させるための方法を提供する。
【００１７】
発現ベクターは、エレクトロポレーションによって哺乳動物細胞内にトランスフェクトされる。
【００１８】
本発明のその他の目的、利点および新規な特性は、次の詳細な説明と、添付の図面とを併せて用いることによってより明白になるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義
本明細書で用いられる「発現ベクター」という用語は、ベクター、とりわけエピソームベクターを意味する。一般的に、ベクターは、標的細胞内に特定の遺伝子を導入して発現させるために用いられるプラスミドである。発現ベクターによって、安定したｍＲＮＡの大量生産が可能になる。一旦発現ベクターが細胞内に入ると、細胞性転写および翻訳機構によって、その遺伝子がコードするタンパク質が生産される。プラスミドは、ｍＲＮＡの大量生産を誘導する非常に活性の強いプロモーターが含まれるように改変される。エピソームベクターは、宿主細胞内で自発的に自己複製する能力を有する。
【００２０】
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は、機能的ＲＮＡ産物を生産するのに必要な情報を含む核酸セグメントのセットであって、転写プロセスを介してコントロールされるものを意味する。次いで、このＲＮＡを直接的に（例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびその他の非コードＲＮＡ（ＳＲＰ・ＲＮＡなど）、アンチセンスＲＮＡ、もしくはマイクロＲＮＡ）用いてもよく、またはタンパク質の合成に方向付けることができる。「タンパク質をコードする遺伝子」または「タンパク質が遺伝子によってコードされる」というフレーズが用いられる場合、遺伝子がｍＲＮＡに転写され、次いでタンパク質に翻訳されることを意味し、哺乳動物細胞で生じる翻訳後および翻訳時前後が包含される。
【００２１】
発現ベクターの促進された複製系を介して哺乳動物細胞内で発現され得るタンパク質の具体例としては、シグナルペプチド、成長因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ニューロペプチド、抗原、抗体、酵素、凝固因子、抗血管新生因子、前血管新生因子、輸送タンパク質、レセプター、リガンド、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーター遺伝子、転写調節因子、リボザイム、融合タンパク質および薬物抵抗性タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。このタンパク質は、天然由来のものか、または人為的に修飾されたものである。
【００２２】
本明細書で用いられる「レポーター遺伝子」という用語は、細胞培養中、動物内または植物内において、対象の別の遺伝子に接触する「遺伝子」を意味する。特定の遺伝子をレポーターとして選択する。というのは、それらが容易に特定されたり測定されるか、またはそれらが選択マーカーだからである。レポーター遺伝子は一般的に、対象の遺伝子が細胞集団または生物体の集団によって利用されたか、またはそれらによって発現したかどうかを決定するのに用いられている。通常用いられるレポーター遺伝子としては、クラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子（これはそれを発現する細胞がＵＶ光下で緑に輝くように導く）、酵素ルシフェラーゼ（これはルシフェリンとの反応を触媒して発光させる）、ｌａｃＺ遺伝子（これはβ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードする遺伝子を発現する宿主細胞を青く見せる）、およびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（これは抗生物質のクロラムフェニコールに対する抵抗性を付与する）、が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。レポーター遺伝子がコードするタンパク質を、本明細書では「レポータータンパク質」と呼ぶ。
【００２３】
本明細書で用いられる「逆位反復エレメント」という用語（以下「ＩＲ」）は、二本の外側核酸配列と、必要に応じて中央部配列とを有する核酸分子を意味する。外側核酸配列のそれぞれは、互いに対して相補的である。この二本の外側核酸配列はパリンドロームを形成してもよい。中央部配列は、二本の外側核酸配列のそれぞれとは異なり短い核酸配列であり、二本の外側核酸配列の間に挿入され、二本の外側核酸配列によって形成されたパリンドロームを混乱させる。たとえば、「５’−ｔａａｔｃｃｇｇａ  ｔｔ  ｔｃｃｇｇａｔｔａ−３’」の配列を有する核酸であって、二本の外側核酸配列が「５’−ｔａａｔｃｃｇｇａ−３’」および「５’−ｔｃｃｇｇａｔｔａ−３’」であり、それに対して中央部配列が「５’−ｔｔ−３’」というものである。
【００２４】
種々のＩＲを、ヒトのゲノムの多数の異なる領域から見出すことができる。ヒトのゲノムのＩＲ情報は、一般に開放されている。たとえば、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙは逆位反復データベース（ＩＲＤＢ）の公共の集積所を有し、ここではゲノムＤＮＡにおけるＩＲに関する情報が提供されており、分析のための様々なツールを保持している。http、//tandem.bu.edu/cgi-bin/irdb/irdb.exeを参照すること。現在のところ、これらには、逆転反復発見アルゴリズム、対象の特定の反復を発見するためのクエリーとフィルタリング能力、配列の類似性に基づく反復クラスタリングアルゴリズム、ＰＣＲプライマー選択、および様々なフォーマットデータのダウンロードが含まれる。さらに、ＩＲＤＢは研究のための集積化された作業場として機能する。分析結果の貯蔵スペースが提供され、共同研究者がそれらのデータおよび分析を非公開で共有することも可能である。その他のＩＲとしては、Ｌｙｕ、ＬｉｎおよびＬｉｕ（Ｌｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８５、１４８５−１５０１）が記載したものが挙げられる。ＩＲは人工的に設計することもできる。
【００２５】
本明細書で用いられる「インバーテッドダイマー」という用語（以下「ＩＤ」）は、二つのＩＲエレメントによって分離された二本の長い核酸配列を含む、環状の核酸分子を意味する。二本の長い核酸配列のそれぞれは、互いに対して相補的であり、それぞれは少なくとも一つの遺伝子および核のアンカーリングエレメントを含む。ＩＤは、二つの末端ＩＲを含む線状ＤＮＡ基質から生産される。理論上、二つの末端ＩＲを含む線状ＤＮＡ基質は、細胞内のエキソヌクレアーゼまたはヘリカーゼ／ヌクレアーゼによる処理を経てダンベル様ＤＮＡ中間体に変換される。エキソヌクレアーゼ／ヘリカーゼの特異性に応じて、二つのタイプの環状のＩＤを作製することができる。第一のタイプでは、二本鎖５’→３’または３’→５’エキソヌクレアーゼが、ＤＮＡ鎖の両側に一本鎖ＤＮＡが突き出るように二つの末端ＩＲを露出させることができる。次いで、逆位反復における末端ヘアピンループの形成により、ＤＮＡが末端ループを伴うダンベル様中間体に変換する。その後のＤＮＡの複製により、ダンベル様ＤＮＡが環状のインバーテッドダイマーに変換される。第二のタイプでは、同一のまたは異なるエキソヌクレアーゼ／ヘリカーゼが線状ＤＮＡ基質を一本鎖ＤＮＡに変換させることができる。このことは、一方の末端から前進して作動する単一のエキソヌクレアーゼかまたはヘリカーゼのいずれかによって達成することができる。一本鎖ＤＮＡ上でＩＲをアニーリングすることによって、末端ループを伴うダンベル様ＤＮＡが形成される。その後のＤＮＡの複製により、ダンベル様ＤＮＡが環状のインバーテッドダイマーに変換される。引用により本明細書に取り込まれるＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９、３５２９−３５３８を参照すること。
【００２６】
「核のアンカーリングエレメント」という用語は、細胞の核内、特にヒト細胞の核内に保持される核酸分子の核酸配列を意味する。ベクターであって核のアンカーリングエレメントを有するこの核酸分子は、核の核マトリックスに固定されている。核のアンカーリングエレメントの具体例としては、ＥＢＶ核タンパク質をコードするＥＢＶ遺伝子（たとえば核抗原−１［ＥＢＮＡ−１］）およびＥＢＶの複製起点（すなわちＥＢＶレプリコン、ｏｒｉＰ）、パポバウイルスの複製起点およびパポバウイルスのｌａｒｇｅ  Ｔ抗原、またはポリオーマウイルス（Ｐｙ）の複製起点（ＰｙＯｒｉ）およびｌａｒｇｅ  Ｔ（ＬＴ）抗原遺伝子（ＰｙＬＴ）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ  ａｎｄ  Ｄｅｎｎｉｓ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９、８５−９２を参照すること。
【００２７】
好ましい核のアンカーリングエレメントとしては、ＥＢＶ遺伝子およびＥＢＶの複製起点である。ＥＢＶ遺伝子およびＥＢＶの複製起点のアンカーリングの効力は、ｏｒｉＰ配列の高親和性のマトリックス付着（Ｊａｎｋｅｌｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，１１６５−１１７６、Ｍａｔｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６２，９−１７）、およびｏｒｉＰの複製開始領域結合タンパク質のＥＢＮＡ−１（Ｌｕｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５，２５３３−２５４２、Ｐｏｌｖｉｎｏ−Ｂｏｄｎａｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，１９９２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８７，５９１−６０３、Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，３８０６−３８１０）との相互反応に起因することが示されている。
【００２８】
本発明に従えば、少なくとも一つの逆位反復エレメントを含むか、またはインバーテッドダイマーとして組織された発現ベクターが構築される。これらのベクターは、遺伝子発現が劇的に向上するように選択されたことが実証される。選択薬剤に対する抵抗性遺伝子が発現した場合、高濃度の選択薬剤を利用して一工程で細胞を選択してもよい。さらにＭＭＲ+ヒト細胞では、発現ベクターによって発現されるタンパク質を迅速かつ効率的に得ることができる。
【００２９】
本発明による方法は、細胞内で少なくとも一つのタンパク質を生産するためのものであり、次の工程を含む、
【００３０】
（ａ）少なくとも一つの核のアンカーリングエレメント、少なくとも一つの遺伝子、および少なくとも一つの逆位反復エレメントを含む発現ベクターを調製する工程、
【００３１】
（ｂ）発現ベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトしてトランスフェクト細胞を作製する工程、
【００３２】
（ｃ）トランスフェクト細胞を培養して、遺伝子がコードするタンパク質をトランスフェクト細胞に生産させる工程、ならびに
【００３３】
（ｄ）タンパク質を回収する工程。
【００３４】
発現ベクターによって保持されている遺伝子を発現させるために用いる哺乳動物細胞の中で好ましいものとしては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒトの胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞、ｈＭＬＨ１-/-細胞を伴うヒトの結腸ガン細胞（ＨＣＴ１１６、ＨＣＴ１１６＋ｃｈ３およびＨＣＴ１１６＋ｈＭＬＨ１）、ヒトの結腸ガン細胞（ＤＬＤ−１（ｈＭＳＨ６-））が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３５】
次の実験計画は例証であり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱することなく、思慮分別のある熟練者が想定するものなどの妥当な変形物を、ここで生産することができる。
【実施例１】
【００３６】
［発現ベクターの構築およびトランスフェクション］
図１Ａに関連して、市販のｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）、市販のｐＤＲ２プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）に由来するＥＢＶベースのｐ２２０．２プラスミド、および市販のｐＭＡＭｎｅｏプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を用いて、ｐＧＴ０１−ＧＦＰプラスミドを構築した。
【００３７】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドは、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩならびにＸｈｏＩの制限部位を含むマルチクローニング部位を有する。
【００３８】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩで消化して、マルチクローニング部位に由来するＸｈｏＩ制限部位を消去し、線状ｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＤＮＡを得た。この線状ｐＥＧＦＰ−Ｎ１・ＤＮＡは、アガロースゲル精製の後にセルフライゲーションを受けた。ＥｃｏＲＩによる消化を利用して、ＸｈｏＩ部位の欠失を確認した。ＸｈｏＩ欠失ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを得た。ＸｈｏＩ欠失ｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミドを制限酵素ＡｆｌＩＩおよびＡｐａＬＩで消化することによって、ＥＧＦＰタンパク質およびＥＧＦＰ・ＣＤＳを駆動させるＣＭＶプロモーターをコードするＥＧＦＰコード配列（ＣＤＳ）を有するＥＧＦＰ遺伝子を得た。
【００３９】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに関連して、プラスミドｐＧＴ０１−ＧＦＰは、核のアンカーリングエレメント、ハイグロマイシンＢ抵抗性遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、ＡｆｌＩＩ制限部位、ＰｖｕＩＩ制限部位、ＸｈｏＩ制限部位およびＢａｍＨＩ制限部位を有する。ＥＧＦＰ遺伝子を一つの遺伝子としてＢａｍＨＩ制限部位内に挿入した。核のアンカーリングエレメントは、ＥＢＶ核タンパク質ＥＢＮＡ−１およびＥＢＶレプリコンｏｒｉＰをコードするＥＢＶ遺伝子を含む。
【００４０】
まず最初に、ｐＭＡＭｎｅｏプラスミドのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を伴うｐ２２０．２プラスミドから、プラスミドｐＧＴ０１−ＧＦＰを得た。
【００４１】
逆位反復エレメントであって、外側核酸配列としての二つのＨセグメントおよび逆位反復エレメントの中央部配列としてのＰセグメントを含むＨＰＨ断片を、ｐＨＰＨプラスミドから得た。ｐＢＲ３２２（Ｂｉ  ａｎｄ  Ｌｉｕ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，８１９−８２３）からｐＨＰＨプラスミドを作製した。ＨＰＨ断片はｐＨＰＨプラスミドにおけるＨＰＨ／ｔｅｔカセットとして形成され、そしてそれは、Ｐセグメントの方向性に依存して機能的テトラサイクリン遺伝子の転写をコントロールする遺伝子スイッチであった。
【００４２】
ｐＨＰＨプラスミド（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３００９−３０１６）をＮｒｕＩ消化することによって、短縮ＨＰＨ断片を得た。
【００４３】
ＨＰＨ断片を第一の逆位反復エレメントとしての平滑末端化ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、そしてＥＧＦＰ遺伝子をＡｆｌＩＩ制限部位にクローニングすることによって、プラスミドｐＧＴ０２−ＧＦＰを作製した。
【００４４】
第二の逆位反復エレメントとしてのＨＰＨ断片を、ｐＧＴ０２−ＧＦＰのＰｖｕＩＩ制限部位に第一の逆位反復エレメントに対してＰの逆向きでさらにクローニングすることによって、プラスミドｐＧＴ０３−ＧＦＰを作製した。制限酵素消化によって、第一の逆位反復エレメントおよび第二の逆位反復エレメントの相対的な方向性を決定した。
【００４５】
図２に関連して、ｐＧＴ０３−ＧＦＰをＸｈｏＩ酵素で消化し、ゲル精製に付して線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡを得た。
【００４６】
線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡは二つの末端を有し、第一の逆位反復エレメントおよび第二の反復はそれぞれ末端に近い位置にあった。
【００４７】
線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡを変性させて、一本鎖の線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡを含んだ中和されたＤＮＡ溶液を得た。ある量の０．１Ｎ・ＮａＯＨを用いるアルカリ変性によって、線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡの変性を達成した。
【００４８】
等容量の０．１Ｎ・ＨＣｌ＋１０分の１の容量の１Ｍ・Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）を加えて中性とし、それによって、ＤＮＡ溶液をクエンチした。中和されたＤＮＡ溶液を３７℃で１０分間という短時間インキュベートし、次いで氷上で維持した。
【００４９】
第一の逆位反復エレメントの外側核酸配列（Ｈセグメント）のそれぞれを他のものとアニーリングし、第二の反復の外側核酸配列のそれぞれもそのようにした。
【００５０】
一本鎖の線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡの二つの末端のそれぞれの近傍ではヘアピン様構造が形成され、自己アニーリングした一本鎖の線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡが得られた。図２に関連して、自己アニーリングした一本鎖の線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ・ＤＮＡの末端間でギャップが形成された。ＤＮＡポリメラーゼおよびリガーゼを用いて、自己アニーリングした一本鎖の線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ  ＤＮＡを処理してギャップをふさぎ、そしてダンベル様ＤＮＡを得てもよい（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５，３００９−３０１６、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９、３５２９−３５３８）。
【００５１】
自己アニーリングした一本鎖の線状ｐＧＴ０３−ＧＦＰ  ＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α（ＲｅｃＡ-）内に導入してＤＮＡの複製を可能にし、図２で示されるようなダンベル様ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを作製した。二本鎖ＤＮＡプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ消化で選択し、インバーテッドダイマーｐＧＴ０４／ＩＤを得た。
【００５２】
発現ベクターとして用いられる構築されたｐＧＴ０１−ＧＦＰ、ｐＧＴ０２−ＧＦＰ、ｐＧＴ０３−ＧＦＰおよびｐＧＴ０４／ＩＤを用いて、市販のＮｕｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ａｍａｘａ、ドイツ）を利用したエレクトロポレーションによって、製造メーカーの説明書に従って細胞内へのトランスフェクションを行った。トランスフェクト細胞を２４〜４８時間培養した後、安定したクローンを選択するための５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを添加した。
【００５３】
本発明による主な目的は、トランスフェクト細胞において遺伝子発現を促進することであった。この目的のために、ヒト細胞を複製する能力を有する発現ベクターを消化して、核のアンカーリングエレメントを含むことによって長期の培養期間にわたって持続性を分子に与えた。実施例において、核のアンカーリングエレメントはＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰを含む。ＥＢＮＡ−１およびｏｒｉＰを含むベクターまたは発現ベクターも、ＥＢＶベクターとして知られている。ｏｒｉＰ配列を含む高親和性マトリックス付着領域を介してＥＢＶベクターが核マトリックスにしっかりと固定されることが示された（Ｊａｎｋｅｌｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１，１１６５−１１７６、Ｍａｔｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６２，９−１７）。さらに、ｏｒｉＰの複製開始領域結合タンパク質ＥＢＮＡ−１との相互作用が、ＥＢＶベクターの霊長類細胞における複製、分離および保存にとって必要である（Ｌｕｐｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５，２５３３−２５４２、Ｐｏｌｖｉｎｏ−Ｂｏｄｎａｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，１９９２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８７，５９１−６０３、Ｙａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，３８０６−３８１０）。図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに関連して、少なくとも一つの逆位反復エレメントが介在するＤＮＡの再配列が、濃度を徐々に高めた薬物による選択および遺伝子コピーの増加を介しての遺伝子発現をさらに促進できるかどうかを実証するために、ＥＢＶエレメントおよび少なくとも一つの逆位反復（ＩＲ）エレメントを含む発現ベクターを、上記のように構築した。ＣＭＶプロモーターによって駆動される、ＥＧＦＰタンパク質をコードするＥＧＦＰ遺伝子を、それぞれの発現ベクター内に遺伝子としてクローニングした。さらに図２に関連して、インバーテッドダイマーｐＧＴ０４／ＩＤは、ＩＲが介在する再配置を介したｐＧＴ０３−ＧＦＰから作製されたＤＮＡ産物であった。
【実施例２】
【００５４】
［細胞の調製］
ＨＣＴ１１６（ｈＭＬＨ１-/-を伴うヒトの結腸ガン）細胞を、Ｄｒ．Ｃ．Ｒ．Ｂｏｌａｎｄ（ＵＣＳＤ，ＣＡ）（Ｋｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４，４３０８−４３１２、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２４７）から入手した。
【００５５】
野生型ｈＭＬＨ１  ｃＤＮＡ（ＣＭＶプロモーターのコントロール下）を内部に持つプラスミドｐＣ９ＭＬＨＷＴを、Ｄｒ．Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎから入手した。
【００５６】
プラスミドｐＣ９ＭＬＨＷＴを用いて、エレクトロポレーションによりＨＣＴ１１６細胞をトランスフェクトし、ミスマッチ修復機能を復活させた（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９，３３０４−３３１０）。得られたｈＭＬＨ１タンパク質を発現するＧ４１８抵抗性クローンをＨＣＴ１１６＋ｈＭＬＨ１と名付けた。ＨＣＴ１１６＋ｈＭＬＨ１細胞を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で培養した。
【００５７】
別の結腸ガンのセルラインＤＬＤ−１（ｈＭＳＨ６-）（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−２２１）を、Ｄｒ．Ｔｈｏｍａｓ  Ａ．Ｋｕｎｋｅｌ（ＮＩＥＨＳ，ＮＣ）から入手した。１０％のウシ胎仔血清を添加した完全ＲＰＭＩ培地でＤＬＤ−１細胞を培養した。
【実施例３】
【００５８】
［エンリッチメント・アッセイ］
薬剤による選択の２４時間前に、約１×１０4のサブコンフルエントな細胞を、１０％の市販のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地またはＤＭＥＭ培地を満たした１００×２０ｍｍの培養皿に播種した。培地の栄養が消費され、細胞の老廃物が蓄積したので、古くなった培地を期間内に新鮮な培地で新しいものにした。培地を新しいものにした後、支持された濃度でハイグロマイシンＢをそれぞれのプレートに添加した。５％のＣＯ2を供給したインキュベーター内で、培養皿を３７℃でインキュベートした。処理から２〜４日後に、ハイグロマイシンＢによって誘導される細胞毒性によって、新鮮な培地と一緒に細胞を再補充した。生き残ったコロニーの生育を１０〜１４日後に観察した。５００細胞を１００×２０ｍｍの培養皿に播種し、生育から１０日後のコロニー数を数えることによって、セルラインの平板効率を測定した。
【実施例４】
【００５９】
（１）緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）生産の測定
細胞をＰＢＳで一回洗浄し、トリプシン処理を行って、ＰＢＳに再懸濁させた。ＦＡＣＳ・Ｖａｎｔａｇｅセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、４８０ｎｍの励起波長および５２５ｎｍの蛍光波長で、ＥＧＦＰの緑色蛍光を測定した。
【００６０】
（２）組み換え遺伝子発現の促進
ヒトの結腸ガン細胞であるＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６、およびＨＣＴ１１６＋ｈＭＬＨ１を、それぞれの発現ベクターでトランスフェクトし、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを用いて、安定したクローンについて選択した。それぞれの安定したクローンの複数の安定したクローン細胞を培養した。それぞれのヒトの結腸ガン細胞の１×１０4の安定したクローン細胞を播種し、４００μｇ／ｍｌまたは１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢのいずれかを含む培地でさらに培養した。
【００６１】
図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄに関連して、ｐＧＴ０４／ＩＤをトランスフェクトされた結腸ガンのセルラインＤＬＤ−１（ＭＭＲ-）細胞およびＨＣＴ１１６（ＭＭＲ-）細胞では、１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢで選択された少なくとも一つの逆位反復を伴う細胞に比べて、５０倍を超えるコロニーが生じた。図４Ａに関連して、４００μｇ／ｍｌまたは１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢでの培養時において、細胞中のＥＧＦＰの収率が上昇したことが、フローサイトメトリーによって観察された。
【実施例５】
【００６２】
［ウェスタンブロット］
プロテアーゼインヒビターのカクテルは、セリン、システイン、アスパラギン酸のプロテアーゼおよびアミノペプチダーゼなどのプロテアーゼの阻害について幅広い特異性を伴ったプロテアーゼインヒビターの混合物である。プロテアーゼインヒビターのカクテルは、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）、ペプスタチンＡ、Ｅ−６４、ベスタチン、ロイペプチンおよびアプロチニンを含んでもよい。プロテアーゼインヒビターのカクテルは、金属キレート剤を含んでいなくてもよい。プロテアーゼインヒビターのカクテルは市販品でもよい。
【００６３】
プロテアーゼインヒビターのカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含む溶解用緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ・ｐＨ７．６、０．５％のＳＤＳ、１％のデオキシコール酸ナトリウムおよび５ｍＭのＥＤＴＡ）で細胞抽出物を調製した。同じ量のタンパク質サンプルを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にエレクトロブロッティングした。ＧＦＰ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に対する抗体およびアクチン（ｌ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。検出のために、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）と複合化させた二次抗体およびエンハンスド・ケミルミネセンス（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いた。
【００６４】
さらに図４Ｂに関連して、５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌまたは１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢでの培養時に、細胞内でのＥＧＦＰの収率の増加が、ウェスタンブロットによって観察された。
【００６５】
結果
上記で示される実施例から、核のアンカーリングエレメントおよび（単数または複数の）ＩＲエレメントの両者を含む発現ベクターが、ＭＭＲ-細胞およびＭＭＲ+細胞の両者において、遺伝子のトランス遺伝子発現を促進することが明確に実証された。
【００６６】
核のアンカーリングエレメント、一つまたは二つのＩＲエレメント、二つの薬物抵抗性遺伝子（すなわちハイグロマイシンＢ抵抗性遺伝子およびアンピシリン遺伝子）ならびにヒト細胞に対するレポーター遺伝子（すなわちＥＧＦＰ遺伝子）を含む発現ベクターをトランスフェクトすることによって、本発明の実験を実施した。図３に示されるような、より多くのクローンが１０００μｇのハイグロマイシンＢでも生存したという知見によって実証されるように、トランスフェクト細胞は、薬物抵抗性（すなわちハイグロマイシンＢ抵抗性）が劇的に改善することが明らかになった。さらに、図４で示されるような、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動でのＥＧＦＰのより高い蛍光強度およびより強い染色で実証されるように、より高濃度のハイグロマイシンＢでも生存したクローンにおけるＥＧＦＰの濃度は、より低濃度のハイグロマイシンＢおよび（発現ベクターによるトランスフェクトを受けていない）コントロールにおいて生存したもののそれよりも有意に高かった。この結果から、遺伝子の増幅および発現がトランスフェクト細胞内で促進されたことが確認された。最も注目すべきことは、（遺伝子の増幅および発現が抑制されていない）ＭＭＲ−欠損細胞だけではなく、（遺伝子の増幅および発現を抑制する影響があるはずの）ＭＭＲ熟練細胞でも改善が見られたことであった。
【００６７】
本発明において構築された様々なベクターの中で、環状のインバーテッドダイマー（「ＩＤ」）として構築されたｐＧＴ０４／ＩＤ発現ベクターが、宿主細胞内での最も強い薬物抵抗性効果と最も高いＥＧＦＰ濃度を提供した。
【００６８】
熟練者であれば、本明細書で用いられる薬物抵抗性遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子を、その他のタンパク質、たとえば成長因子、ホルモン、サイトカイン、ケモカイン、ニューロペプチド、抗原、抗体、酵素、凝固因子、抗血管新生因子、前血管新生因子、輸送タンパク質、レセプター、リガンド、調節タンパク質、構造タンパク質、転写調節因子、およびリボザイムをコードする遺伝子と置換することができることを理解するだろう。従って、本発明によって、治療用タンパク質の大量生産のために、およびタンパク質の生産に最も適した発現系またはセルラインのスクリーニングのために、発現ベクターを用いることができることが実証された。
【００６９】
本発明の多くの特徴および利点は、本発明の構造および特性の詳細と共に上記の説明に記載されているが、その開示はあくまで例示である。細部において、とりわけ本発明の原則の範囲内で各部の形状、大きさおよび配置に関して、添付の請求の範囲が表現する用語の広く一般的な意味が示す最大の範囲まで、変更がなされてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１Ａ】本発明に基づく発現ベクターｐＧＴ０１−ＧＦＰの地図である。
【図１Ｂ】本発明に基づく発現ベクターｐＧＴ０２−ＧＦＰの地図である。
【図１Ｃ】本発明に基づく発現ベクターｐＧＴ０３−ＧＦＰの地図である。
【図２】図１Ｃの発現ベクターｐＧＴ０３−ＧＦＰから発現ベクターｐＧＴ０４／ＩＤを作製するフローチャートである。
【図３Ａ】ｐＧＴ０３−ＧＦＰまたはｐＧＴ０４／ＩＤでトランスフェクトされたＤＬＤ−１（ｈＭＳＨ６-）細胞の写真であり、ここで、このトランスフェクト細胞は４００μｇ／ｍｌまたは１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢで処理されていた。
【図３Ｂ】ｐＧＴ０２−ＧＦＰ、ｐＧＴ０３−ＧＦＰまたはｐＧＴ０４／ＩＤでトランスフェクトされたＨＣＴ１１６（ｈＭＬＨ１-）細胞またはＨＣＴ１１６＋ｈＭＬＨ１細胞の写真であり、ここで、このトランスフェクト細胞は１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢで処理されていた。
【図３Ｃ】図３Ａのトランスフェクト細胞の生き残ったコロニーを示す棒グラフである。
【図３Ｄ】図３ＢのｐＧＴ０３−ＧＦＰまたはｐＧＴ０４／ＩＤでトランスフェクトされた細胞の生き残ったコロニーを示す棒グラフである。
【図４Ａ】ｐＧＴ０４／ＩＤでトランスフェクトされ、そして５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌまたは１０００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢで処理されたＤＬＤ−１細胞の緑色蛍光の強度に対する細胞数のグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａの細胞のＥＧＦＰ発現のウェスタンブロット分析の写真である。トランスフェクトされていないＤＬＤ−１細胞をネガティブコントロールとして用いた。細胞抽出物のゲルにおける抗アクチンモノクローナル抗体を利用して、タンパク質の添加レベルのコントロールを行った（データは示さず）。
【図１Ａ】
0005554907.tif 000002
【図１Ｂ】
0005554907.tif 000003
【図１Ｃ】
0005554907.tif 000004
【図２】
0005554907.tif 000005
【図３Ａ】
0005554907.tif 000006
【図３Ｂ】
0005554907.tif 000007
【図３Ｃ】
0005554907.tif 000008
【図３Ｄ】
0005554907.tif 000009
【図４Ａ】
0005554907.tif 000010
【図４Ｂ】
0005554907.tif 000011