(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴センサ用チップと、
前記表面プラズモン共鳴センサ用チップの表面に、当該チップの表面と垂直に光を照射する光源と、
前記表面プラズモン共鳴センサ用チップで反射した光を受光する光検出器とからなる表面プラズモン共鳴センサにおいて、
前記表面プラズモン共鳴センサ用チップは、基板と、前記基板の表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層とを有し、
前記金属層の表面には溝状をした複数の凹部が形成され、前記凹部の両側壁面は前記基板の主平面に対して７５度以上９０度未満の傾斜面となっていて、前記凹部の開口部の幅は前記凹部の底面の幅よりも広くなっており、
前記凹部の両側壁面と底面に前記金属層の表面を有しており、
前記センサ用チップは、前記凹部の両側壁面の金属層表面に、生体分子を固定化するための有機分子層を形成され、
前記凹部は、前記凹部内に垂直に入射した光を前記両側壁面の金属層表面で受けることによって前記両側壁面の金属層表面間に局在的な共鳴電界を発生し、
前記光検出器は、前記光源から出て前記凹部の前記両側壁面の金属層表面の延びる方向に直交する偏光面を持って前記センサ用チップの表面に垂直に入射し、前記金属層の表面の前記凹部を含む領域で反射した直線偏光又は直線偏光成分の光を選択的に受光することにより、前記センサ用チップにおける反射率又は前記光検出器で受光した光強度を測定することを特徴とする、表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項２】
前記光源と前記センサ用チップとの間に偏光板を備え、
前記センサ用チップの表面に垂直に入射する光が前記偏光板を通過した直線偏光の光であり、前記センサ用チップの表面において前記直線偏光の光の偏光面が、前記凹部の前記対向する金属層表面の延びる方向に直交していることを特徴とする、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項３】
前記センサ用チップと前記光検出器との間に偏光板を備え、
前記センサ用チップの表面に垂直に入射する光が非直線偏光の光であり、前記金属層の表面で反射した光のうち、前記凹部の前記対向する金属層表面の延びる方向に直交する偏光面を持って前記金属層に入射した直線偏光成分が選択的に前記偏光板を通過することを特徴とする、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項４】
前記凹部が前記基板の主平面に垂直な方向から見て一方向で長い形状を有していることを特徴とする、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項５】
前記凹部は、前記金属層の表面に一定のピッチで配列していることを特徴とする、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項６】
前記凹部の深さが２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、前記金属層の表面に入射する光の偏光面に平行な方向における前記凹部の幅が２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることを特徴とする、請求項２に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項７】
互いに隣接する前記凹部どうしの間隔が、前記金属層の表面に入射する光の波長の２分の１以下であることを特徴とする、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項８】
互いに隣接する前記凹部どうしの間隔が、４００ｎｍ以下であることを特徴とする、請求項７に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項９】
前記センサ用チップに対して２波長以上の光を垂直に入射させ、前記センサ用チップで反射した各波長の光の反射率又は各波長の光の光強度を前記光検出器で測定することを特徴とする、請求項１に記載の表面プラズモン共鳴センサ。
【請求項１０】
基板と、
前記基板の表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層とからなり、
前記金属層の表面で、当該金属層の表面に垂直に入射した光を受ける表面プラズモン共鳴センサ用チップにおいて、
前記金属層の表面には溝状をした複数の凹部が形成され、前記凹部の両側壁面は前記基板の主平面に対して７５度以上９０度未満の傾斜面となっていて、前記凹部の開口部の幅は前記凹部の底面の幅よりも広くなっており、
前記凹部の両側壁面と底面に前記金属層の表面を有しており、
前記凹部の両側壁面の金属層表面に、生体分子を固定化するための有機分子層が形成され、
前記凹部は、前記凹部内に垂直に入射した光を前記両側壁面の金属層表面で受けることによって前記両側壁面の金属層表面間に局在的な共鳴電界を発生し、
前記凹部の前記両側壁面の金属層表面の延びる方向に直交する偏光面を持って前記金属層の表面に垂直に入射し、前記金属層の表面の前記凹部を含む領域で反射した直線偏光又は直線偏光成分の光を選択的に検知されることを特徴とする、表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１１】
前記基板はその表面に複数の窪みを有し、前記金属層は、前記基板表面に設けられた窪みの形状を反映して凹部を形成するよう、前記基板の表面に形成されていることを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１２】
前記金属層は、前記基板の窪み内に膜厚が４０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の金属薄膜によって形成されていることを特徴とする、請求項１１に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１３】
前記凹部の底面の中央部が前記凹部の開口側に向けて盛り上がっていることを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１４】
前記盛り上がりの高さが、前記凹部の深さに対して５％以上２０％以下であることを特徴とする、請求項１３に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１５】
前記凹部は、互いに平行な溝を形成していることを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１６】
前記凹部を２方向に沿って配列し、かつ、前記凹部を千鳥状に配置したことを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１７】
前記凹部は、一方の配列方向におけるピッチが当該方向における前記凹部の幅の２倍よりも大きいことを特徴とする、請求項１６に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１８】
前記凹部を形成された複数の測定領域を有し、各測定領域毎に前記凹部の深さ、幅または配列ピッチが異なることを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項１９】
前記有機分子層は、基板表面からの長さが５０ｎｍ以上の分子と基板表面からの長さが５０ｎｍよりも短い分子とからなることを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項２０】
前記金属層の材質が、Ａｕ又はＡｇであることを特徴とする、請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップ。
【請求項２１】
請求項１０に記載の表面プラズモン共鳴センサ用チップを製造するための方法であって、
凸パターンを有するスタンパを製作する工程と、
未硬化の樹脂に前記スタンパを押圧することによって前記スタンパの凸パターンを当該樹脂に転写し、当該樹脂を硬化させることにより前記基板を成形すると共に前記凸パターンの反転形状によって前記基板の表面に窪みを形成する工程と、
前記基板の表面に金属を堆積させて前記金属層を形成し、前記窪みの形状を反映して形成された金属層によって前記凹部を形成する工程と、
からなる表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン共鳴センサ及び当該センサ用チップに関する。特に、局在型表面プラズモン共鳴を利用した表面プラズモン共鳴センサと表面プラズモン共鳴センサ用チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の６０％は水分で構成され、残り４０％のうち半分はタンパク質で構成されており、人体の細胞、筋肉、皮膚の大部分はタンパク質からなる。そのため、病気とタンパク質の変異に相関が認められる場合が多く、癌、インフルエンザその他の病気では、病気の進行に伴って体内（血液中など）において特定のタンパク質が増加する。
【０００３】
従って、特定のタンパク質の状態（特定のタンパク質の有無、量など）をモニターすることで病気の罹患、進行状況を知ることができ、現在では、数十種類のタンパク質について病気との相関が確認されている。例えば、腫瘍（癌）の進行とともに増加する生体分子は腫瘍マーカーと呼ばれ、腫瘍の発生部位に応じてそれぞれ異なる腫瘍マーカーが特定されている。
【０００４】
また、生体内のタンパク質、ＤＮＡ、糖鎖といった生体分子は、疾患の発生と直接的に関係していることが多いので、それら生体分子間の相互作用を解析することにより、病気のメカニズムを解明し、特効薬の開発を行うことが可能になりつつある。
【０００５】
上記腫瘍マーカーを含め、特定のタンパク質の有無や量を簡便かつ高精度に測定するツールとしてバイオセンサがあり、将来的には誤診防止、早期診断、予防医療等への応用が期待されている。
【０００６】
タンパク質など生体分子の相互作用を検出する方法としては、表面プラズモン共鳴が利用されている。表面プラズモン共鳴（SPR; Surface Plasmon Resonance）とは、金属表面の自由電子と電磁波（光）との相互作用によって生じる共鳴現象であって、蛍光検出方式に比べると、試料を蛍光物質で標識する必要が無いため簡便な手法として注目されている。表面プラズモン共鳴を利用したセンサには、伝搬型表面プラズモン共鳴センサと局在型表面プラズモン共鳴センサとがある。
【０００７】
伝搬型表面プラズモン共鳴センサの原理を図１（ａ）−（ｄ）により簡単に説明する。伝搬型表面プラズモン共鳴センサ１１は、図１（ａ）（ｃ）に示すように、ガラス基板１２の表面に厚み５０ｎｍ程度のＡｕ、Ａｇ等の金属膜１３を形成したものである。この伝搬型表面プラズモン共鳴センサ１１は、ガラス基板１２側から光を照射し、ガラス基板１２と金属膜１３との界面において光を全反射させる。全反射した光を受光し、光の反射率を測定することによって生体分子等がセンシングされる。
【０００８】
すなわち、この反射率測定を光の入射角θを変化させることによって行うと、図１（ｂ）に示すように、ある入射角（共鳴入射角）θ１で反射角が大きく減衰する。ガラス基板１２と金属膜１３の界面に入射した光が当該界面で全反射するとき、当該界面で発生するエバネッセント光（近接場光）と金属の表面プラズモン波が相互作用する。そして、ある特定の波長や特定の入射角においては、光のエネルギーが金属膜１３中に吸収され、金属膜１３中の自由電子の振動エネルギーに変化し、光の反射率が著しく低下するのである。
【０００９】
この共鳴条件は、金属膜１３の周辺物質の誘電率（屈折率）に依存するため、周辺物質の物性変化を高感度に検出する手法として用いられる。特に、バイオセンサとして用いる場合には、図１（ａ）に示すように、あらかじめ金属膜１３の表面に特定のタンパク質（抗原）と特異的に結合する抗体１４（プローブ）を固定化しておく。そこに導入された検査試料１５にターゲットとなる抗原１６が存在すると、図１（ｃ）に示すように抗原１６が抗体１４と特異的に結合する。そして、抗原１６が結合することで金属膜１３の周辺の屈折率が変化し、共鳴波長や共鳴入射角が変化する。従って、検査試料１５を導入する前後における共鳴波長の変化、共鳴入射角の変化、あるいは共鳴波長や共鳴入射角の時間的変化を測定することにより、検査試料１５中に抗原１６が含まれているかどうか検査できる。また、どの程度の濃度で抗原１６が含まれているかも検査することができる。
【００１０】
図１（ｄ）は、入射角θに対する反射率の依存性を測定した結果の一例を表している。図１（ｄ）において、破線は検査試料１５を導入する前の反射率スペクトル１７ａを示し、実線は検査試料１５が導入されて抗体１４に抗原１６が結合した後の反射率スペクトル１７ｂを示す。こうして検査試料１５を導入する前後における共鳴入射角の変化Δθを測定すると、検査試料１５が抗原１６を含んでいるかどうかを検査できる。また、抗原１６の濃度も検査することができ、特定の病原体の有無や疾患の有無などを検査することができる。
【００１１】
なお、一般的な伝搬型表面プラズモン共鳴センサでは、ガラス基板に光を導入するためにプリズムを用いている。そのため、センサの光学系が複雑かつ大型化し、またセンサ用チップ（ガラス基板）とプリズムをマッチングオイルで密着させる必要がある。このような取り扱いにくさをを解消するため、例えば特許文献１は、回折格子を利用した伝搬型表面プラズモン共鳴センサを提案している。
【００１２】
特許文献１に開示された伝搬型表面プラズモン共鳴センサは、図２に示すように、基板１８の表面に金属膜１９を形成し、金属膜１９の上に離散的に薄膜を積層して回折格子２０（グレーティング）を形成したものである。
【００１３】
この伝搬型表面プラズモン共鳴センサでは、回折格子２０に光を照射すると、照射光は回折格子２０によって反射し、回折現象によりエバネッセント光が生じる。また、回折格子２０に光が照射することにより回折格子２０の表面に表面プラズモン波が生じる。そして、ある波長の光が特定の入射角で照射されたときにエバネッセント光と表面プラズモン波とが共鳴し、表面プラズモン共鳴が起きる。よって、この伝搬型表面プラズモン共鳴センサでも、例えば回折格子２０の上に抗体を固定しておくことにより、特定の抗原を検出することができる。
【００１４】
このような回折格子型伝搬ＳＰＲセンサには断面が矩形波状のものも見られるが、一般的には正弦波形状のものが多い。また、回折格子型伝搬ＳＰＲセンサにおける凹凸は回折格子として働くものであるから、そのデューティー比は１：１であることが望ましい。
【００１５】
図３は凹凸形状の回折格子を表している。この回折格子２０のピッチをＰ、すなわち凸部（光反射面）の幅をＰ／２、凹部の幅もＰ／２とし、入射光の入射角をθ、回折光の出射角をφとする。隣り合った凸部どうしで反射した光の光路差は、図３から、
Ｐcosθ−Ｐcosφ
となる。よって、入射光の波長をλとすれば、反射光の位相が揃って強め合う条件は、
cosθ−cosφ＝ｍ・λ／Ｐ
となる。ここで、ｍ＝０、±１、…は回折次数である。この式の左辺の最大値は２であるから、回折を発生させるためには、（λ／Ｐ）＜２である必要がある。
【００１６】
よって、このような回折格子型伝搬ＳＰＲセンサでは、センサとして可視光域（λ＝４００−８００ｎｍ）の光を使用する場合には、可視光域全体で回折を起こす条件として、Ｐ＞４００ｎｍが必要条件となる。
【００１７】
また、回折格子型伝搬ＳＰＲセンサでは、光を斜め方向から入射させるのが一般的である。
【００１８】
この結果、回折格子型伝搬ＳＰＲセンサでは、数百ｎｍと広いセンシングエリアを有する。
【００１９】
つぎに、局在型表面プラズモン共鳴センサについて説明する。局在型表面プラズモン共鳴センサは、表面プラズモン共鳴によって発生する自由電子振動が金属ナノ構造の局所領域で定在するものであり、そのセンシング領域は数十ｎｍというように、伝搬型表面プラズモン共鳴センサに比べて非常に小さいことが知られている。
【００２０】
局在型表面プラズモン共鳴センサとしては、例えば特許文献２に開示されたものがある。この局在型表面プラズモン共鳴センサ２１は、平均粒径が数十ｎｍの金属微粒子（金属ナノ微粒子）を用いて金属ナノ構造を実現したものである。このセンサ２１にあっては、金属微粒子のコロイド溶液にガラス基板２２を浸漬し、ガラス基板２２の表面に金属微粒子２３を分布させる。そして、図４（ａ）に示すように、ガラス基板２２の裏面側から光を垂直に入射させ、ガラス基板２２を透過した光の強度を計測する。受光した透過光を分光手段によって分光し、各波長における吸光度を求めると、図４（ｂ）に示すように、ある波長（共鳴波長）で吸光度のピークが生じる。
【００２１】
この共鳴現象は、光（電磁波）の交流電界によって金属微粒子２３中の自由電子が振動し、ある振動数で光と自由電子が共鳴して自由電子が光エネルギーを吸収し、共鳴波長で吸光度がピークとなるものである。
【００２２】
この現象も金属微粒子２３の周囲の誘電率（屈折率）の影響を受けるので、金属微粒子に何らかの誘電体物質（例えば、抗原）が付着すると、吸光度が変化する。例えば、金属微粒子に誘電体物質が付着する前には図４（ｂ）の破線で示す吸光度特性２４ａであったものが、付着後には図４（ｂ）の実線で示す吸光度特性２４ｂに変化する。よって、吸光度のピーク値の変化を読み取ることにより誘電体物質の付着の有無や付着量を検知できる。
【００２３】
【特許文献１】特開２００２−３５７５４３号公報
【特許文献２】特開２０００−３５６５８７号公報
【非特許文献１】岡本  隆之、”金属ナノ粒子相互作用およびバイオセンサに関する調査研究”（図２）、プラズモニック研究会、平成１４年度科学研究費補助金（基礎研究Ｃ）、研究成果報告書、http://www.plasmon.jp/index.html
【非特許文献２】N. Felidj et al. "Controlling the optical response of regular arrays of gold particles for surface-enhanced Raman scattering", Phys. Rev. B 65, 075419(2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
表面プラズモン共鳴センサには、上記のように伝搬型表面プラズモン共鳴センサと局在型表面プラズモン共鳴センサとがある。しかし、伝搬型表面プラズモン共鳴センサでは、センシングエリアがガラス基板表面から数百ｎｍとタンパク質のサイズ（十ｎｍ前後）に比べて大きい。そのため、このセンサは検査試料の温度変化や検査試料中の夾雑物（例えば、検査対象以外のタンパク質）の影響を受け易く、バイオセンサでは、抗体に結合されず検査試料中に浮遊している抗原にも感度を持つ。これらはノイズの原因となるため、Ｓ／Ｎ比が小さくて高感度のセンサを作製することが難しい。また、高感度のセンサを作製するためには、ノイズの原因となる夾雑物を取り除く工程や、検査試料の温度を一定に保つための厳密な温度制御手段を必要とし、装置が大型になったり、装置コストが高価になったりする。
【００２５】
これに対し、局在型表面プラズモン共鳴センサでは、金属微粒子（金属ナノ微粒子）の表面に発生する近接場がセンシング領域となるため、回折限界以下の数十ｎｍの感度領域を実現できる。その結果、局在型表面プラズモン共鳴センサでは、金属微粒子から離れた領域に浮遊する検査対象物には感度を持たず、金属微粒子表面の非常に狭い領域に付着した検査対象物にのみ感度を持たせることができ、より高感度のセンサを実現できる可能性がある。また、このセンサによれば、検査試料の温度を一定温度に制御するための厳密な温度制御手段が必要なくなる。
【００２６】
金属微粒子を用いた局在表面プラズモン共鳴センサでは、金属微粒子から離れて浮遊している検査対象物に感度を持たないので、ノイズ成分が少なくなり、その意味では伝搬型表面プラズモン共鳴センサに比べて高感度である。しかし、Ａｕ、Ａｇ等の金属微粒子において発生する表面プラズモン共鳴を利用したセンサでは、金属微粒子の表面に付着している検査対象物から得られる信号の強度が小さく、その意味では感度がまだ低く、あるいは感度が十分でなかった。
【００２７】
非特許文献１は、特許文献２の発明者による論文である。図５は非特許文献１（図２）から引用したものであり、「平均径２０ｎｍの金ナノ粒子を堆積したガラス基板を種々の屈折率を持つ液体に浸けたときの吸収スペクトル」を表している。図５を用いて当該センサの感度、すなわちセンサに接する媒質の屈折率が１変化したときの共鳴波長の変化を求めると、その感度は１００ｎｍ／ＲＩＵ程度であり、十分な感度を得ることができない。
【００２８】
なお、この感度値は、媒質の屈折率が１.３３３（水）から１.７３７（Diiodemethane）に変化したときの共鳴波長の変化を図５から３０ｎｍと読み取って計算した。
感度＝３０／（１.７３７−１.３３３）＝７４ [ｎｍ／ＲＩＵ]
そして、この値よりも若干大きく見積もって、当該センサの感度を１００ｎｍ／ＲＩＵ程度とした。
【００２９】
また、特許文献２の局在型表面プラズモン共鳴センサでは、ガラス基板をコロイド溶液に浸漬して金属微粒子をガラス基板の上に固定するという方法を用いているので、同じプロセスで作製しても金属微粒子の分布密度が一定にならず、分布密度のばらつきが大きい。さらに、金属微粒子の分布密度が小さい場合には、図６（ａ）に示すように、比較的容易に金属微粒子どうしを分離させることができるが、金属微粒子の分布密度が大きくなると、図６（ｂ）の円内に見られるように、金属微粒子の凝縮が発生し、品質を安定させることが難しい。よって、商品化するには量産性が問題となり、特に感度を高くするために金属微粒子の分布密度を大きくすると、ますます量産性が悪くなる問題がある。
【００３０】
非特許文献２には、電子ビームを利用して金属微粒子が均一に配列した金属ナノ構造を作製する方法が示されている。この方法を、図７（ａ）−（ｆ）に従って説明する。まず図７（ａ）に示すように基板２５の全面にフォトレジスト２６をコーティングする。ついで、図７（ｂ）に示すように、この基板２５上の金属微粒子形成位置において、フォトレジスト２６に順次電子ビーム２７を打ち込んで電子ビーム２７の打ち込み位置でフォトレジスト２６を可溶化させる。そして、このフォトレジスト２６を現像処理すると、図７（ｃ）に示すように、フォトレジスト２６の可溶化された部分が除去され、フォトレジスト２６には金属微粒子形成位置にホール２８が開口される。図７（ｄ）に示すように、このフォトレジスト２６の上からＣｒ２９を堆積させると、ホール２８内に露出した基板２５の表面にもＣｒ２９が堆積する。ついで、図７（ｅ）に示すように、フォトレジスト２６の上からＡｕ３０を堆積させると、ホール２８内ではＣｒ２９の上にＡｕ３０が堆積する。この後、基板２５をエッチング液に浸けてフォトレジスト２６を剥離させると、図７（ｆ）に示すように、基板２５の表面には所望のパターンで金属微粒子（Ａｕ３０）が形成される。図８はこのようにして得られた金属微粒子のパターンを示す図（非特許文献２から引用）であって、白く見える部分が金属微粒子を表わしている。
【００３１】
図７のような方法によれば、任意の配置パターンで金属微粒子を形成することができるが、電子ビームを打ち込む工程では、絞った電子ビームで一箇所ずつ描画していくため、数時間掛かる。そのため、１枚のセンサ用チップを作製するのに半日程度必要となり、作製スループットが非常に低い。よって、このような方法でも量産化が困難で、安価なセンサ用チップの実現は不可能であった。
【００３２】
本発明は、このような技術的課題に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、従来の局在型表面プラズモン共鳴センサよりも高感度の局在型表面プラズモン共鳴センサ及び表面プラズモン共鳴センサ用チップを提供することにある。また、本発明の別な目的は、製造プロセスの安定性を実現すると共にローコスト化を図ることができる当該局在型表面プラズモン共鳴センサ用チップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３３】
本発明の表面プラズモン共鳴センサは、表面プラズモン共鳴センサ用チップと、前記表面プラズモン共鳴センサ用チップの表面に、当該チップの表面と垂直に光を照射する光源と、前記表面プラズモン共鳴センサ用チップで反射した光を受光する光検出器とからなる表面プラズモン共鳴センサにおいて、前記表面プラズモン共鳴センサ用チップは、基板と、前記基板の表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層とを有し、前記金属層の表面には溝状をした複数の凹部が形成され、前記凹部の両側壁面は前記基板の主平面に対して７５度以上９０度未満の傾斜面となっていて、前記凹部の開口部の幅は前記凹部の底面の幅よりも広くなっており、前記凹部の両側壁面と底面に前記金属層の表面を有しており、前記センサ用チップは、前記凹部の両側壁面の金属層表面に、生体分子を固定化するための有機分子層を形成され、前記凹部は、前記凹部内に垂直に入射した光を前記両側壁面の金属層表面で受けることによって前記両側壁面の金属層表面間に局在的な共鳴電界を発生し、前記光検出器は、前記光源から出て前記凹部の前記両側壁面の金属層表面の延びる方向に直交する偏光面を持って前記センサ用チップの表面に垂直に入射し、前記金属層の表面の前記凹部を含む領域で反射した直線偏光又は直線偏光成分の光を選択的に受光することにより、前記センサ用チップにおける反射率又は前記光検出器で受光した光強度を測定することを特徴としている。ここで、局在的な共鳴電界とは、共鳴電界が金属表面に沿って伝搬せず、共鳴によって増強された電界の領域が入射光の回折限界よりも小さいもののことをいう。
【００３４】
本発明の表面プラズモン共鳴センサにあっては、金属層に形成されたナノサイズの凹部を含む領域に垂直に光を入射させると、凹部内の対向する両側壁面における自由電子と入射光との間で結合が起こり、凹部内部に強い電界が集中して強い局在型表面プラズモン共鳴が発生することが分かった。表面プラズモン共鳴が起きると、光のエネルギーが金属層の表面プラズモン波に吸収されるので、ある波長（共鳴波長）において光の反射率又は光検出器で受光する光強度が低下する。この共鳴波長は、凹部内にある媒質の屈折率により変化するので、かかる表面プラズモンセンサによれば、凹部内の両側壁面に誘電体物質が付着したことや付着量の変化などを検知することができる。特に、バイオセンサとして使用して特定のタンパク質の検出に使用することができる。
また、本発明の表面プラズモン共鳴センサにあっては、前記光検出器が、前記光源から出て前記凹部の前記対向する両側壁面に位置する金属層表面の延びる方向に直交する偏光面を持って前記センサ用チップの表面に垂直に入射し、前記金属層の表面の前記凹部を含む領域で反射した直線偏光又は直線偏光成分の光を選択的に受光することにより、前記センサ用チップにおける反射率又は前記光検出器で受光した光強度を測定する。このため、光の電界成分の方向が金属層表面に垂直になるので、金属表面において表面プラズモン波が大きく励起されることになる。よって、表面プラズモン共鳴センサの感度を非常に高くすることができる。なお、本発明においては、偏光面とは、光（電磁波）の電界の振動面を指す。
【００３５】
しかも、本発明の表面プラズモン共鳴センサでは、凹部内に大きな電界増強が見られるので、強い表面プラズモン共鳴を引き起こすことができ、従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサや局在型表面プラズモン共鳴センサと比較して非常に感度の高いセンシングを行うことができる。さらに、本発明の表面プラズモン共鳴センサは、金属層の表面から数十ｎｍ程度の狭い領域で感度を持つので、金属層から離れた領域の物質によるノイズが小さく、Ｓ／Ｎ比の良好な表面プラズモン共鳴センサを製作することができる。
【００３６】
さらに、これまでの局在型表面プラズモン共鳴センサでは、金属ナノ構造（金属微粒子）が断続的（島状）に存在しているため、効率的に製造することが難しかった。これに対し、本発明の表面プラズモン共鳴センサでは、金属層を連続的に形成しておくことができるので、スタンパを用いたナノインプリンティング技術等で窪みを設けた基板の上に蒸着、スパッタ等のプロセスで金属膜を形成することで凹部を形成することができる。よって、量産性に優れているため、高精度のセンサをローコストで生産することができる。
【００３７】
本発明の表面プラズモン共鳴センサのある実施態様は、前記光源と前記センサ用チップとの間に偏光板を備え、前記センサ用チップの表面に垂直に入射する光が前記偏光板を通過した直線偏光の光であり、前記センサ用チップの表面において前記直線偏光の光の偏光面が、前記凹部の前記対向する金属層表面の延びる方向に直交していればよい。このような実施態様によれば、光の電界成分の方向が金属層表面に垂直になるので、金属表面において表面プラズモン波が大きく励起されることになる。よって、表面プラズモン共鳴センサの感度が非常に高くなる。
あるいは、別な実施態様においては、前記センサ用チップと前記光検出器との間に偏光板を備え、前記センサ用チップの表面に垂直に入射する光が非直線偏光の光であり、前記金属層の表面で反射した光のうち、前記凹部の前記対向する金属層表面の延びる方向に直交する偏光面を持って前記金属層に入射した直線偏光成分が選択的に前記偏光板を通過するようになっていてもよい。このような実施態様によれば、凹部内で最も大きな表面プラズモン共鳴を起こした成分のみを抽出して光検出器で検知することができるので、表面プラズモン共鳴センサの感度が非常に高くなる。
【００３８】
本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様は、前記凹部の底面に金属層表面を有していることを特徴としている。凹部の底面に金属層表面を有していることにより、凹部内で表面プラズモン共鳴を起こさせやすくなる。
本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様は、前記センサ用チップが、前記凹部の内壁面に、生体分子を固定化するための有機分子層を形成されていることを特徴としている。かかる実施態様にあっては、凹部内に生体分子を固定化することができるので、特定の生体分子を検出することができバイオセンサとして用いることが可能になる。
また、本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様においては、前記凹部が前記基板の主平面に垂直な方向から見て一方向で長い形状を有していてもよい。
【００３９】
本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様においては、前記凹部が前記金属層の表面に一定のピッチで配列し、特に好ましくは周期的な形状に形成している。かかる実施態様では、反射率スペクトルにおけるピーク半値幅を狭くすることができ、測定精度を向上させることができる。
【００４０】
本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様は、前記凹部の深さが２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下であり、前記金属層の表面に入射する光の偏光面に平行な方向における前記凹部の幅が２０ｎｍ以上１００ｎｍ以下となっている。凹部の深さが１００ｎｍよりも大きくなると、１０００ｎｍ以上の波長で共鳴吸収が発生して水による強い共鳴吸収と重なる恐れがあり、またピーク半値幅も広くなるためである。凹部の深さが２０ｎｍよりも小さくなると、センサ感度が小さくなるためである。また、一般的なタンパク質のサイズが１０ｎｍ前後であるので、バイオセンサとしての用途も考慮すると、凹部の幅は少なくとも２０ｎｍ程度は必要であり、また凹部の幅が１００ｎｍ以上に広くなると、凹部内における電界増強の効果が悪くなるからである。
【００４１】
本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様は、互いに隣接する前記凹部どうしの間隔（凹部の中心間の距離）が前記金属層の表面に入射する光の波長の２分の１以下となっている。かかる実施態様によれば、測定領域に入射した光が凹部によって回折現象を起こすことがなくなり、回折の影響を排除することができる。特に、入射光が可視光域の光である場合には、互いに隣接する前記凹部どうしの間隔は４００ｎｍ以下とすることが望ましい。
【００４２】
本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様は、前記センサ用チップに対して２波長以上の光を垂直に入射させ、前記センサ用チップで反射した各波長の光の反射率又は各波長の光の光強度を前記光検出器で測定するものである。かかる実施態様によれば、特定の２波長以上の波長における反射率又は光強度を比較することにより共鳴波長の変化を評価することができる。よって、既知の特定物質の有無などを検査する用途に望ましい。
【００４３】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップは、基板と、前記基板の表面の少なくとも一部を覆うように形成された金属層とからなり、前記金属層の表面で、当該金属層の表面に垂直に入射した光を受ける表面プラズモン共鳴センサ用チップにおいて、前記金属層の表面には溝状をした複数の凹部が形成され、前記凹部の両側壁面は前記基板の主平面に対して７５度以上９０度未満の傾斜面となっていて、前記凹部の開口部の幅は前記凹部の底面の幅よりも広くなっており、前記凹部の両側壁面と底面に前記金属層の表面を有しており、前記凹部の両側壁面の金属層表面に、生体分子を固定化するための有機分子層が形成され、前記凹部は、前記凹部内に垂直に入射した光を前記両側壁面の金属層表面で受けることによって前記両側壁面の金属層表面間に局在的な共鳴電界を発生し、前記凹部の前記両側壁面の金属層表面の延びる方向に直交する偏光面を持って前記金属層の表面に垂直に入射し、前記金属層の表面の前記凹部を含む領域で反射した直線偏光又は直線偏光成分の光を選択的に検知されるものである。
【００４４】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップにあっては、金属層に形成されたナノサイズの凹部を含む領域に垂直に光を入射させると、凹部内の対向する金属側面における自由電子と入射光との間で結合が起こり、凹部内部に強い電界が集中して強い局在型表面プラズモン共鳴が発生する。表面プラズモン共鳴が起きると、光のエネルギーが金属層の表面プラズモン波に吸収されるので、ある波長（共鳴波長）において光の反射率又は光検出器で受光する光強度が低下する。この共鳴波長は、凹部内にある媒質の屈折率により変化するので、かかる表面プラズモンセンサ用チップによれば、凹部内に誘電体物質が付着したことや付着量の変化などを検知することができる。特に、バイオセンサとして使用して特定のタンパク質の検出に使用することができる。
【００４５】
しかも、本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップでは、凹部内に大きな電界増強が見られるので、強い表面プラズモン共鳴を引き起こすことができ、従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサや局在型表面プラズモン共鳴センサと比較して非常に感度の高いセンシングを行うことができる。さらに、本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップは、金属層の表面から数十ｎｍ程度の狭い領域で感度を持つので、金属層から離れた領域の物質によるノイズが小さく、Ｓ／Ｎ比の良好な表面プラズモン共鳴センサ用チップを製作することができる。
【００４６】
さらに、これまでの局在型表面プラズモン共鳴センサでは、金属ナノ構造（金属微粒子）が断続的（島状）に存在しているため、効率的に製造することが難しかった。これに対し、本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップでは、金属層を連続的に形成しておくことができるので、スタンパを用いたナノインプリンティング技術等で窪みを設けた基板の上に蒸着、スパッタ等のプロセスで金属膜を形成することで凹部を形成することができる。よって、量産性に優れているため、高精度のセンサ用チップをローコストで生産することができる。
【００４７】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップのある実施態様は、前記基板がその表面に複数の窪みを有し、前記金属層は、前記基板表面に設けられた窪みの形状を反映して凹部を形成するよう、前記基板の表面に形成されている。かかる実施態様によれば、凹部を形成された基板の表面に金属層を形成すれば、金属層により窪みに倣って凹部が形成される。よって、金属層に簡単な工程で微細な凹部を形成することができる。
【００４８】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップの別な実施態様における前記金属層は、前記基板の窪み内に膜厚が４０ｎｍ以上１００ｎｍ以下の金属薄膜によって形成されている。金属層の膜厚が４０ｎｍよりも薄いと反射光の光量が不十分になり、また、金属層があまり厚くなって膜厚１００ｎｍ以上になると、成膜時間が長くなり、製造コストや作製スループットが悪くなるからである。
【００５０】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップのさらに別な実施態様は、前記凹部の底面の中央部が前記凹部の開口側に向けて盛り上がっている。かかる実施態様によれば、凹部の底面に付着した物質を電界強度の高い領域へ持ち上げることができるので、センサ感度を向上させることができる。
【００５１】
特に、この凹部底面の盛り上がりの高さは、凹部の深さに対して５％以上２０％以下であることが好ましい。５％よりも小さくても、２０％よりも大きくても、センサ感度を向上させる度合いが低下するからである。
【００５２】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップのさらに別な実施態様は、前記凹部が互いに平行な溝を有している。かかる実施態様によれば、表面プラズモン共鳴の発生する領域を長く、広くすることができ、センサ感度を向上させることができる。
【００５３】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップのさらに別な実施態様は、前記凹部を２方向に沿って配列し、かつ、前記凹部を千鳥状に配置したものである。かかる実施態様では、凹部の側壁面に特定の分子を固定するための有機分子層などを形成しておく用途の場合には、有機分子層を形成するための面積を大きくすることができ、センサ感度を向上させることができる。
【００５４】
さらに、上記実施態様においては、前記凹部の一方の配列方向におけるピッチが当該方向における前記凹部の幅の２倍よりも大きいことが望ましい。かかる実施態様によれば、各凹部で反射した光どうしが干渉しにくくなる。
【００５５】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップのさらに別な実施態様は、前記凹部を形成された複数の測定領域を有し、各測定領域毎に前記凹部の深さ、幅または配列ピッチが異なっている。かかる実施態様では、複数の測定領域を有しているので、複数種類の検査を一度に行うことができ、効率よく検査を行える。また、各測定領域毎に異なる共振波長を持たせることができるので、複数の測定領域の全体に一度に光を照射しても各測定領域で生じた信号を個別に検出することができる。よって、各測定領域に対して順次光をスキャンする必要がなく、表面プラズモン共鳴センサの構成を簡略にすることができる。
【００５６】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップのさらに別な実施態様は、前記金属層の表面に、生体分子を固定化するための有機分子層が形成されたものである。かかる実施態様にあっては、有機分子層に生体分子を固定することができるので、特定の生体分子を検出することができバイオセンサとして用いることが可能になる。
【００５７】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップのさらに別な実施態様は、上記実施態様における前記有機分子層が、基板表面からの長さが５０ｎｍ以上の分子と基板表面からの長さが５０ｎｍよりも短い分子とからなるものである。このように長い分子と短い分子によって有機分子層が形成されていると、短い分子は金属層の近傍で生体分子を結合し、長い分子は金属層から離れたところで生体分子を結合し、生体分子を結合した長い分子が折れ曲がることによってその生体分子も金属層の近傍へ引き寄せられるので、金属層の近傍の領域に多くの生体分子を集めることができ、センサ感度をより一層高めることができる。このような長い分子としては、例えばリンカー部と呼ばれるものを用いることができ、リンカー部は数十ｎｍの長さを有しているが、その長さが５０ｎｍ以上あれば曲がり易くなる。
【００５８】
本発明の表面プラズモン共鳴センサのさらに別な実施態様は、前記金属層の材質としてＡｕ又はＡｇを用いている。かかる金属層材質は化学的に安定であり、また強い表面プラズモン共鳴を発生させることができる。
【００５９】
本発明にかかる表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法は、本発明にかかる表面プラズモン共鳴センサ用チップを製造するための方法であって、凸パターンを有するスタンパを製作する工程と、未硬化の樹脂に前記スタンパを押圧することによって前記スタンパの凸パターンを当該樹脂に転写し、当該樹脂を硬化させることにより前記基板を成形すると共に前記凸パターンの反転形状によって前記基板の表面に窪みを形成する工程と、前記基板の表面に金属を堆積させて前記金属層を形成し、前記窪みの形状を反映して形成された金属層によって前記凹部を形成する工程とからなる。
【００６０】
本発明の表面プラズモン共鳴センサ用チップの製造方法によれば、スタンパを用いて基板に窪みを形成し、この窪みの形状を反映するように金属層を形成して凹部を形成しているので、同じ形状の凹部を有する表面プラズモン共鳴センサ用チップをばらつきなく安定に製作することができる。また、容易に量産することができるので、表面プラズモン共鳴センサ用チップをローコストで製作することができる。
【００６１】
なお、本発明における前記課題を解決するための手段は、以上説明した構成要素を適宜組み合せた特徴を有するものであり、本発明はかかる構成要素の組合せによる多くのバリエーションを可能とするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００６３】
（実施形態１）
図９は、本発明の実施形態１による局在型表面プラズモン共鳴センサ（以下、局在ＳＰＲセンサという。）３１の基本的構成を示す概略図である。局在ＳＰＲセンサ３１は、ハロゲンランプのような光源３２、光ファイバ３３、コリメータレンズ３４、ピンホールを有するコリメータ板３５、偏光板３６、ビームスプリッタ３７（ハーフミラーでもよい。）、対物レンズ３８、フローセル４８、分光器４０、光検出器４１、データ処理装置４２、シリンジポンプ４３よりなる。
【００６４】
光源３２は、ハロゲンランプのように白色光を照射するものが望ましいが、測定に用いる波長域の光を含むものであればよい。光源３２から出射された光Ｌは、光ファイバ３３によってコリメータレンズ３４へ導かれる。コリメータレンズ３４は、光ファイバ３３の先端から出射された光Ｌをコリメート化し、平行ビームとして通過させる。コリメータレンズ３４でコリメート化された光Ｌは、コリメータ板３５のピンホールを通過することにより細く絞られた平行ビームとなる。ピンホールを通過した平行ビームは、ある偏光面（例えば、図９の紙面に平行な偏光面）を有する直線偏光だけが偏光板３６を通過する。なお、本発明においては、光（電磁波）の電界の振動面を偏光面と定義し、その電界の方向を偏光方向と定義する。
【００６５】
偏光板３６を通過した直線偏光の光Ｌはビームスプリッタ３７に入射し、入射光量の約１／２の光だけがビームスプリッタ３７を真っ直ぐに透過する。ビームスプリッタ３７を透過した平行ビームは対物レンズ３８を通過し、対物レンズ３８によりフローセル４８内の測定領域４４（凹構造を形成された領域）に集光される。
【００６６】
フローセル４８内には、検査試料溶液を通過させるための流路４５が設けられており、測定領域４４は流路４５に面している。流路４５には、送液管４６を通じてシリンジポンプ４３により検査試料溶液が供給され、流路４５を通過した検査試料溶液は回収管４７を通じて回収される。
【００６７】
フローセル４８の測定領域４４に照射された光Ｌは、測定領域４４で反射して元の方向に戻る。元の方向に戻った測定光は対物レンズ３８を通過して再び平行ビームとなり、ビームスプリッタ３７に入射する。ビームスプリッタ３７に入射した測定光は、その光量の約１／２だけがビームスプリッタ３７内の貼合せ面で９０度の方向へ反射される。なお、対物レンズ３８は、測定領域４４で各方向へ反射した光を集めることができるように、十分な開口径を有するものを用いている。
【００６８】
ビームスプリッタ３７で反射した光Ｌは、分光器４０を通過して各波長の光に分光され、光検出器４１で受光される。光検出器４１は、複数の受光面を有するフォトダイオードアレイ、ＣＣＤ等によって構成されており、光の分光方向と平行に受光面が並んでいる。よって、分光器４０で分光された光を光検出器４１で受光することにより、各波長毎の光強度を検出することができる。
【００６９】
データ処理装置４２は、フローセル４８を照射する光の各波長毎の光強度をデータとして予め与えられている。よって、データ処理装置４２により、予め与えられているデータと光検出器４１で検出した各波長毎の光強度を比較することで、フローセル４８における各波長毎の反射率の分光特性（反射率スペクトル）などを求めることができる。
【００７０】
つぎに、フローセル４８の構造を詳細に説明する。図１０（ａ）はフローセル４８の構造を示す分解斜視図、図１０（ｂ）は組み立てた状態の断面図である。フローセル４８は、表面プラズモン共鳴センサ用チップ（以下、センサ用チップという。）３９の上にスペーサ５３及びカバー５４を重ねた三層構造となっている。センサ用チップ３９は、基板５１の表面全体にＡｕ、Ａｇ等の金属薄膜からなる金属層５２を成膜したものであり、金属層５２の一部に測定領域４４が形成されている。なお、基板５１は、スライドガラスやガラス板などが好ましいが、不透明なものであってもよい。また、金属層５２は、基板５１の表面全面に設ける必要はなく、測定領域４４を含む小さな領域のみに形成してもよく、測定領域４４のみに形成してもよい。
【００７１】
スペーサ５３には、検査試料溶液を通過させるための流路４５が形成されており、流路４５は測定領域４４の上面を通過するように配置されている。カバー５４には、流路４５の両端に対向する位置において、供給口５５と排出口５６が開口されている。供給口５５には前記送液管４６が接続され、ここから流路４５内に検査試料溶液を供給する。また、排出口５６には前記回収管４７が接続され、流路４５を通過した検査試料溶液はここから排出され、回収管４７へと回収される。なお、未使用と使用済みのフローセル４８を区別できるよう、カバー５４やスペーサ５３は透明または半透明であることが望ましい。
【００７２】
図１１（ａ）は測定領域４４を拡大して示す平面図、図１１（ｂ）は図１１（ａ）の一部をさらに拡大した図、図１１（ｃ）は図１１（ｂ）の断面図である。測定領域４４においては、金属層５２の表面に複数本の微細な凹部５７（金属薄膜による凹構造）が形成されている。凹部５７は角溝状に形成されており、測定領域４４の端から端まで直線状に延びている。また、複数本の凹部５７は、互いに平行に配置されている。特に、凹部５７は一定のピッチで周期的に形成されていることが望ましい。凹部５７の内部は、開口部を除き金属層５２によって囲まれており、特に両側の内壁面では金属層５２が対向している。また、凹部５７の底面の金属層５２は平坦に形成されている。
【００７３】
フローセル４８内における測定領域４４の向きは、光学的な理由からは特に限定されない。例えば図１０に示すように凹部５７の長手方向が流路４５の送液方向と直交するように形成されていてもよく、また凹部５７の長手方向が流路４５の送液方向と平行となるように形成されていてもよい。
【００７４】
局在ＳＰＲセンサ３１においては、図１２に示すように、偏光板３６を透過した直線偏光の光Ｌが測定領域４４に対して垂直に入射し、かつ、直線偏光の光Ｌの偏光面が凹部５７の長手方向と直交するように、フローセル４８が配置される。
【００７５】
このような配置のもとで測定領域４４に直線偏光の光Ｌが垂直入射すると、凹部５７内に入射した光により、図１２に矢印で示すように凹部５７の両側壁面間に電界Ｅが生じる。図１２に記入した「＋」、「−」は金属層５２の表面における電界の正負を表わしており、これは光の電界成分の向きに応じて時間とともに変化する。図１３は金属層５２の金属微粒子に入射した光Ｌの電界Ｅを表わした概略図である。金属微粒子内に光Ｌが入射すると、金属微粒子ｐの電子雲ｅが電界の影響を受けて変位して振動し、金属微粒子の両側壁面に表面プラズモン波が生じる。一方、凹部５７を有する金属層５２に入射した光は、凹部５７の両端において電界Ｅを生じ、その電界の振動と金属層５２内部の自由電子の固有振動が結合することで、局在型ＳＰＲが発生する。よって、金属層５２に入射した光のエネルギーがＳＰＲによって凹部５７へ集中し、金属層５２へ入射した光の一部が吸収される。
【００７６】
この結果、光検出器４１で受光した光から求めた反射率はある特定の波長（共鳴波長）で小さくなる。この特定の波長は、検査試料溶液の屈折率によって変化するので、反射率の極小点の波長又はその変化を調べることで検査試料溶液に含まれる誘電体物質の屈折率や種類などを検査することができる。また、後述のように、特定のタンパク質を特異的に結合させる抗体などを用いることにより、検査試料溶液に含まれる特定のタンパク質の有無や含有量などを検査することができる。
【００７７】
このような局在ＳＰＲセンサ３１で、入射した電界の全てを同一の共鳴モードに寄与させるためには、各凹部５７をその長手方向が互いに平行となるように形成し、偏光面が各凹部５７の長手方向と直交するように直線偏光の光を入射させ、入射光全体を共鳴に寄与させるような構成が効率的であると考えられる。
【００７８】
なお、このようなセンサ用チップ３９においては、凹部５７の幅や深さが不均一であると、反射率の極小点（下ピーク）の幅が広くなるので、各凹部５７の幅や深さは同じであることが望ましい。また、凹部５７の配列されているピッチも一定であることが望ましい。従って、凹部５７は同じ断面形状のものが周期的に形成されていることが望ましい。
【００７９】
（凹部の形状やサイズとチップ用センサの特性との関係）
従来、金属微粒子どうしを近づけた場合に、金属微粒子間のギャップ部分で非常に強い電界の増強が起きるという報告がなされている。そのため、本発明のセンサ用チップ３９にあっても、金属層５２の表面に形成された凹部５７（以下、凹構造と呼ぶこともある。）において両側の側壁面間を適当な間隔にすれば、両側壁面間に強い分極が生じて凹部５７内に強い共鳴電界が発生し、金属微粒子を分散させた従来の局在型表面プラズモン共鳴センサよりも高感度なセンシングを実現できると考えられる。
【００８０】
そこで、まずセンサ用チップ３９の試作品を作製して反射率スペクトルを測定することにしたが、それに先だって試作品と同じシミュレーション用モデルを作製し、コンピュータ・シミュレーションにより反射率スペクトルを求めた。
【００８１】
図１４は試作品における１単位の凹部５７の断面を表している。この試作品では、樹脂製の基板５１に形成された窪み５８を、底面の幅Ｂｓ＝８５ｎｍ、開口部の幅Ｗｓ＝１５６ｎｍ、深さＤｓ＝７９ｎｍ、側壁面の傾斜角α＝７９度とした。また、基板５１の表面には膜厚がＴ＝３９ｎｍの金属層５２（Ａｕ薄膜）が堆積し、金属層５２によって窪み５８内に形成された凹部５７を、底面の幅Ｂｍ＝４２ｎｍ、開口部の幅Ｗｍ＝１１３ｎｍ、深さＤｍ＝８９ｎｍ、側壁面の傾斜角β＝７４.５度とした。窪み５８及び凹部５７は、一定のピッチＰ＝３００ｎｍで平行に配列されている。さらに、基板５１の屈折率を１.４９とし、金属層５２に接する検査試料溶液は、屈折率がｎ＝１.００、ｎ＝１.３３、ｎ＝１.３６の３通りとした。
【００８２】
このような試作品と同一のシミュレーション用モデルに基づいて、偏光面が凹部５７の長手方向に対して直交するようにして直線偏光の光を垂直入射させたときの、反射率スペクトルをＲＣＷＡ（Rigorous Coupled Wave Analysis）法によって解析した。図１５はこのシミュレーション結果を示す。屈折率がｎ＝１.００の検査試料溶液では、波長が６４８.８ｎｍで反射率が極小となり、屈折率がｎ＝１.３３の検査試料溶液では、波長が８５９.４ｎｍで反射率が極小となり、屈折率がｎ＝１.３６の検査試料溶液では、波長が８７５.１ｎｍで反射率が極小となる。なお、図１５に示した反射率スペクトルにおける紫外線波長から５５０ｎｍ付近までにおける反射率の低下は、Ａｕのバンド間遷移によるものである（図１６も同様）。
【００８３】
検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.３３の場合とｎ＝１.３６の場合とでは共鳴波長が１５.７ｎｍだけシフトしているので、これから感度を計算すると、このセンサ感度は、
１５.７／（１.３６−１.３３）＝５２２.３ｎｍ／ＲＩＵ
となった。これは、Ａｕ微粒子を用いた従来の局在型表面プラズモン共鳴センサの感度（１００ｎｍ／ＲＩＵ程度）の約５倍の値である。よって、この結果は非常に高感度なセンシングの可能性を示しており、凹部５７内において対向する金属側壁面間で強い共鳴が起きたためであると考えられる。
【００８４】
ついで、実際に製作したセンサ用チップ３９の試作品を用いて反射率スペクトルを測定した。試作品は、後述のような製造方法（図２９）により作製した。測定は、図９に示したような局在ＳＰＲセンサ３１を用いて行い、測定試料溶液として屈折率がｎ＝１.００（空気）、ｎ＝１.３３（水）、ｎ＝１.３６（エタノール）の３種類のものを用いた。
【００８５】
図１６はこの試作品を用いた反射率スペクトルの測定結果を示す。この測定では、屈折率がｎ＝１.００の検査試料溶液では、波長が６６６.８ｎｍで反射率が極小となり、屈折率がｎ＝１.３３の検査試料溶液では、波長が８２８.０ｎｍで反射率が極小となり、屈折率がｎ＝１.３６の検査試料溶液では、波長が８４４.２ｎｍで反射率が極小となった。
【００８６】
検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.３３の場合とｎ＝１.３６の場合とでは共鳴波長が１６.２ｎｍだけシフトしているので、これから感度を計算すると、このセンサ感度は、
１６.２／（１.３６−１.３３）＝５４０ｎｍ／ＲＩＵ
となった。試作品の場合の図１６の反射率スペクトルやセンサ感度は、シミュレーションの場合の図１５の反射率スペクトルやセンサ感度とよく一致しており、センサ感度（５４０ｎｍ／ＲＩＵ）は従来の局在型表面プラズモン共鳴センサに比べて非常に高い感度となることが確認された。また、この測定結果からは、シミュレーションの妥当性も支持される。
【００８７】
図１７は、凹部５７における電界分布をシミュレーションした結果を表している。この電界分布は、検査試料溶液の屈折率を１.３３とし、入射光波長を８５９.４ｎｍとしてＦＤＴＤ（Finite Difference Time Domain）法により詳細に計算したものである。このモデルは計算機メモリの都合上簡易化したものを使用し、入射電界強度は０.０５とした。図１７によれば、凹部５７内部の側壁面間において電界強度が１.０を超えているから、電界強度が２０倍以上に増強されており、電界強度の非常に大きな領域が数十ｎｍ以下の空間に集中した局在型ＳＰＲが発生していることを確認できた。なお、ここに記載した電界強度と図１７に示した電界強度は任意単位のものであり、入射電界強度を基準値０.０５としたものである。
【００８８】
しかし、金属層５２の凹部５７で局在型ＳＰＲを起こさせるには、どのような形状、サイズの凹部５７であってもよいというわけではない。さらに、実際にバイオセンサとして使用することを想定した場合には、光源の特性、測定対象物の吸光特性、検出系などの点から種々の制約が加わる。そのため、単に金属層の表面に凹構造を設ければ、そのまま局在型表面プラズモン共鳴センサとして使えるという訳ではない。前述のように、これまで金属凹構造内部において発生する局在型ＳＰＲについて解析を行った例は非常に少ない。また、これをセンサへと利用した例が無いため、具体的にどのような凹構造にすれば当該センサとして利用でき、高感度なセンサを実現できるかといった点についてはまったく分かっていなかった。
【００８９】
これまでの報告では、局在型ＳＰＲの特性（共鳴波長、ピークのシャープさ、感度など）は、金属微粒子の形状、サイズ、材質などによって変化することが知られている。本発明における凹構造でも、実際のセンサへの応用を考えようとすれば、その形状、サイズ等と共鳴特性の相関を把握する必要がある。
【００９０】
このような観点から、凹部５７の幅Ｗｍ、深さＤｍ、側壁面の傾斜角βと共鳴波長との関係について調べた。ここで用いた金属層５２の種類は、可視光域で局在型ＳＰＲが発生し、化学的に安定であり、かつ局在型表面プラズモン共鳴センサの材料として最も一般的なＡｕを用いて解析を行った。
【００９１】
まず、凹部５７の幅と深さを変化させた場合の共鳴波長の変化を調べた。図１８は凹部５７の幅Ｗｍと深さＤｍをそれぞれ２０ｎｍから１００ｎｍまで変化させたときの共鳴波長の変化を表している。共鳴波長は、５０ｎｍ毎に区分された領域で表している。これは、凹部５７の側壁面の傾斜角β＝９０度、ピッチＰ＝２８０ｎｍ、検査試料溶液の屈折率ｎ＝１.３３として、ＲＣＷＡによるシミュレーションで解析したものである。
【００９２】
また、図１９は凹部５７の幅Ｗｍを６０ｎｍに固定して、深さＤｍを２０ｎｍ、４０ｎｍ、６０ｎｍ、８０ｎｍ、１００ｎｍに変化させたときの反射率スペクトルを表したものである。
【００９３】
図１８及び図１９から分かることは、共鳴波長は特に凹部５７の深さＤｍと相関があり、深さＤｍが深くなると、共鳴波長は大きな変化率で長波長側へとシフトするということである。これは凹部５７の深さが大きくなると多極性のモードの影響が発生し、長波長側へのシフトが起きるためであると考えられる。また、共鳴波長は深さＤｍほどではないが、凹部５７の幅Ｗｍとも相関があり、幅Ｗｍが狭くなると長波長側へシフトする。
【００９４】
バイオセンサとして利用する場合には、水の吸収スペクトルの影響を排除するため、可視光から近赤外までの領域において共鳴吸収を発生させる必要がある。凹部５７の深さＤｍがおおよそ１００ｎｍ以上になると、水による吸収の強い１０００ｎｍ以上の波長で共鳴吸収が発生するため、可視光から近赤外までの領域で共鳴を発生させるには、凹部５７の深さＤｍは１００ｎｍ以下にする必要がある。
【００９５】
ついで、実際に凹部５７の深さＤｍを変えたものを試作して深さＤｍとの相関を確認した。図２０は深さを変えた試作品の凹部５７の断面形状を表している。この試作品では、樹脂製の基板５１に形成された窪み５８を、底面の幅Ｂｓ＝７０ｎｍ、開口部の幅Ｗｓ＝１２１ｎｍ、深さＤｓ＝４７ｎｍ、側壁面の傾斜角α＝７３度とした。また、基板５１の表面には膜厚がＴ＝６０ｎｍの金属層５２（Ａｕ薄膜）が堆積し、金属層５２によって窪み５８内に形成された凹部５７を、底面の幅Ｂｍ＝４７ｎｍ、開口部の幅Ｗｍ＝１３８ｎｍ、深さＤｍ＝５４ｎｍ、側壁面の傾斜角β＝７０度とした。窪み５８及び凹部５７は、ピッチＰ＝３００ｎｍで平行に配列されている。さらに、基板５１の屈折率を１.４９とし、金属層５２に接する検査試料溶液は、屈折率がｎ＝１.００、ｎ＝１.３３、ｎ＝１.３６の３通りとした。この図２０の試作品では、図１４の試作品の凹部５７の深さＤｍが８９ｎｍであるのに対し、凹部５７の深さをＤｍ＝５４ｎｍと浅くしている。
【００９６】
図２１は、図２０の試作品と同一のモデルを用いて反射率スペクトルをシミュレーション（ＲＣＷＡ法）により求めた結果を表している。また、図２２は、図２０の試作品を用いて反射率スペクトルを実測した結果を表している。この試作品は、後述のような製造方法（図２９）により作製した。また、測定は、図９に示したような局在ＳＰＲセンサ３１を用いて行い、測定試料溶液として屈折率がｎ＝１.００（空気）、ｎ＝１.３３（水）、ｎ＝１.３６（エタノール）の３種類のものを用いた。
【００９７】
図２１のシミュレーション結果によれば、検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.００のときには共鳴波長は５６１.５ｎｍ、検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.３３のときには共鳴波長は６５３.２ｎｍ、検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.３６のときには共鳴波長は６６５.１ｎｍである。また、図２２の実測結果によれば、検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.００のときには共鳴波長は５５７.５ｎｍ、検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.３３のときには共鳴波長は６４７.６ｎｍ、検査試料溶液の屈折率がｎ＝１.３６のときには共鳴波長は６５６.２ｎｍである。ここでもシミュレーションと実測結果とは良好な一致が確認された。
【００９８】
よって、図１４の試作品のモデルを用いたシミュレーション結果である図１５と、図２０の試作品のモデルを用いたシミュレーション結果である図２１とを比較すれば、凹部５７の深さＤｍが浅くなると、共鳴波長が短波長側へ変化することが分かる。同様に、図１４の試作品を用いた実測結果である図１６と、図２０の試作品を用いた実測結果である図２２とを比較しても、凹部５７の深さＤｍが浅くなると、共鳴波長が短波長側へ変化することが分かる。例えば、図１６と図２２の実測結果で検査試料溶液の屈折率が１.３３の場合を比較すれば、凹部５７の深さが８９ｎｍから５４ｎｍへと浅くなると、共鳴波長が８２８.０ｎｍから６４７.６ｎｍへと大きく短波長側へ変化する。
【００９９】
つぎに、凹部５７の幅Ｗｍや深さＤｍとピークの半値幅との関係について調べた。図２３にこの結果を示す。図２３は凹部５７の幅Ｗｍと深さＤｍを変化させたときのピーク半値幅の大きさをシミュレーションで解析した結果を表わしている。極小値でのピーク半値幅は、つぎのように定義される。図２４に示すように、極小点での反射率をＲｄ、当該極小点よりも短波長側に位置する極大点の反射率をＲｕとし、極小点の両側でその平均値Ｒｃ＝（Ｒｕ＋Ｒｄ）／２に等しい反射率となる点の波長をλ１、λ２（但し、λ１＜λ２）とする。このとき、
λ２−λ１／｛（Ｒｕ−Ｒｄ）／２｝
で定義される量をピーク半値幅と呼ぶ。よって、ピーク半値幅が小さいほど極小値でのピークがシャープになるので、共鳴点の検出を高精度に行うことができる。
【０１００】
図２３によれば、凹部５７の深さＤｍが深いほど、ピーク半値幅は顕著に広くなることが分かる。これは、凹部５７の深さが深くなると、準静電モデルからの乖離が大きくなり、凹部５７内での入射光の位相のズレの影響が無視できなくなってピーク半値幅が広がるからであると推定される。また、凹部５７の幅Ｗｍに関しても、幅Ｗｍが狭いほどピーク半値幅が狭くなることが分かる。
【０１０１】
つぎに、凹部の幅Ｗｍや深さＤｍとセンサ感度との関係について調べた。図２５は凹部５７の幅Ｗｍと深さＤｍを変化させたときのセンサ感度の大きさをシミュレーションで解析した結果を表わしている。
【０１０２】
図２５によれば、凹部５７の深さＤｍが浅いほど、センサ感度は顕著に低下する。これは、凹部５７の深さＤｍが浅いと表面プラズモンによって発生する共鳴電界の領域が小さくなるため、入射光のエネルギーを有効に利用することができず、感度が低下すると考えられる。なお、凹部５７の幅Ｗｍが狭くなると共鳴電界の領域が狭くなるが、その分対向する金属層５２の側壁面どうしが近接することにより電界の増強が大きくなる。そのため、凹部５７の幅Ｗｍは、深さＤｍほど感度への影響が顕著でないと考えられる。
【０１０３】
これまでに述べた結果を総合すると、凹部５７の深さＤｍは１００ｎｍ以下であることが必要である。しかし、感度の観点から見ると、図２５に示すように深さＤｍが浅いほど感度が顕著に低下する。よって、凹部５７の深さＤｍは、現実的には２０−１００ｎｍ程度がセンサとして有効であることが分かる。
【０１０４】
また、凹部５７の幅Ｗｍについても、共鳴点のピークのシャープさから考えると、深さＤｍの中間点において１００ｎｍ以下であることが望ましい。ただし、バイオセンサとして用いる場合には、表面にタンパク質のプローブ層や抗体などを形成することを考えると、一般的なタンパク質のサイズが１０ｎｍ前後であることから、側壁面間には少なくとも２０ｎｍ程度は隙間が空いている必要がある。そのため、凹部５７の幅Ｗｍは２０−１００ｎｍ程度がバイオセンサとしては理想的であることが分かる。
【０１０５】
つぎに、凹部５７の側壁面の傾斜角βとセンサ感度との相関について調べた。このために、幅Ｗｍ＝６０ｎｍ、深さＤｍ＝４０ｎｍ、ピッチＰ＝２８０ｎｍの凹部５７を作製し、その側壁面の傾斜角βを６０度から９０度まで変化させて感度を測定した。この結果を図２６に示す。この図から明らかなように、凹部５７の側壁面は垂直に近いほど感度が高くなることが分かる。この理由は、側壁面の傾斜角βが小さくなると、ＳＰＲが凹部５７の開口側へ広がった状態になり、電界の閉じ込め効果が低減し、その結果、電界増強度が減少して感度が低下するものと予想される。よって、本発明の局在ＳＰＲセンサ３１で高感度化を実現するには、側壁面の傾斜角βをできるだけ９０度に近づけることが望ましい。
【０１０６】
凹部５７を配列するピッチＰに関しては、４００ｎｍ以上の間隔をあけると入射光の角度によっては回折が生じ、局在型ＳＰＲの共鳴ピークと混在してしまう弊害がある。よって、回折を発生させないようにする場合には、４００ｎｍ以下とすればよい。なお、本発明のセンサ用チップ３９では、凹部５７の内部で発生する局在型プラモン共鳴であるため、ピッチＰが２００−４００ｎｍの場合には、凹部５７のパターン構造と共鳴特性との間に、深さＤｍや幅Ｗｍを変化させる場合ほどの大きな相関は見られない。
【０１０７】
つぎに、凹部５７内における金属膜の必要領域について調べた。まず、図２７（ａ）に示すように、屈折率が１.４９の基板５１の上に膜厚４０ｎｍの金属層５２を形成し、ここに深さＤｍ＝４０ｎｍ、幅Ｗｍ＝６０ｎｍの凹部５７を形成した。この凹部５７は両側壁面だけが金属層５２によって覆われており、凹部５７の底面には金属層５２はなく、基板５１が露出している。この試作品の上面を水（ｎ＝１.３３）又はエタノール（ｎ＝１.３６）で満たして反射率スペクトルを測定したところ図２７（ｂ）のような結果を得た。
【０１０８】
一方、図２８（ａ）に示すように、屈折率が１.４９の基板５１の表面に窪み５８を形成し、この基板５１の上に膜厚４０ｎｍの金属層５２を形成し、ここに深さＤｍ＝４５ｎｍ、幅Ｗｍ＝６０ｎｍの凹部５７を形成した。この凹部５７は両側壁面及び底面が金属層５２によって覆われている。この試作品の上面を水（ｎ＝１.３３）又はエタノール（ｎ＝１.３６）で満たして反射率スペクトルを測定したところ図２８（ｂ）のような結果を得た。
【０１０９】
図２７（ｂ）と図２８（ｂ）とを比較すると、図２８（ｂ）には波長が６６０ｎｍあたりにＳＰＲによる極小点が見られるが、図２７（ｂ）ではこのようなＳＰＲによる極小点は見られない。従って、図２７（ａ）のように凹部５７の底面に金属層５２がない場合には、ＳＰＲが起きないので、センサとしては凹部５７の底面も金属層５２によって覆っておく必要がある。
【０１１０】
なお、本実施形態では金属層にＡｕを用いて実験やシミュレーションを行なったが、ＡｕとＡｇはどちらも可視光域でＳＰＲを発生し、共鳴波長も１００ｎｍ程度の違いであるので、上記の如き凹部５７の形状やサイズはＡｇについても適用可能である。
【０１１１】
（製造方法）
本実施形態によるセンサ用チップ３９の製造工程を図２９により説明する。まず、Ｓｉ基板５９の上にスピンコータ等によってフォトレジスト６０を塗布する。ついで、半導体製造プロセスを利用してフォトレジスト６０に基板の窪みと同じ形状の凹パターン６１を形成し、多数の凹パターンを有する図２９（ａ）のような原盤を作製する。ここで、半導体製造プロセスとしては、Ｘ線リソグラフィー、電子線リソグラフィー、ＤＲＩＥ（Deep Reactive Ion Etching）などを利用する。電鋳技術を応用して原盤の上に金型６２（スタンパ）を作製した。すなわち、図２９（ｂ）に示すように、原盤の上にＮｉを堆積させて金型６２を作製した。原盤から剥離された金型６２の下面には、図２９（ｃ）に示すように、上記原盤の反転形状６３が形成される。
【０１１２】
ついで、ナノインプリンティング技術を利用して樹脂上に窪みを形成した。すなわち、図２９（ｄ）に示すように、ガラス板６４の上に熱可塑性樹脂であるＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を塗布し、これを約１２０℃以上に加熱した状態で先ほどの金型６２でＰＭＭＡを押圧し、そのままの状態で常温に戻すことでＰＭＭＡを硬化させる。なお、使用する樹脂は紫外線硬化型のものであってもよい。その結果、図２９（ｅ）に示すようにＰＭＭＡにより成形された基板５１の表面に原盤と同じ凹パターンが転写され、基板５１の表面に窪み５８が成形される。基板５１に窪み５８を成形する方法としてナノインプリンティングを用いる利点としては、金型６２を一枚作製することで、大量の複製品を得ることができ、量産性が非常に高い点と、原盤と同じパターンを高精度に再現性良く得られるという点が挙げられる。また、原盤に耐性の高いものを用いれば、金型６２が摩耗した場合には、原盤から新たに金型６２を作製することができる。
【０１１３】
このようにして得られた複製品の基板５１の表面に、スパッタリングによってＡｕ、Ａｇ等の金属を堆積させて窪み５８の形状を反映するように金属層５２を成膜し、図２９（ｆ）のようなセンサ用チップ３９の基板部分を得た。ここで、基板５１の表面と金属層５２の密着性が不十分である場合には、基板５１と金属層５２の間にＴｉ、Ｃｒなどの密着層を設けてもよい。また、反射光の光量を十分得るためには、金属層５２の厚さは４０ｎｍ以上であることが望ましい。ただし、金属層５２があまり厚いと、コストや作製スループットが良くないため、現実的には４０−１００ｎｍ程度の膜厚が望ましい。このようにして作製したセンサ用チップ３９の基板部分の断面写真（断面構造をＡＦＭ、ＳＥＭにより求めたもの）を図３０に示す。
【０１１４】
図２６に示したように、凹部５７の側壁面の傾斜角βは９０度が好ましい。このような凹部５７を得るためには、原盤に形成される凹パターン６１の側壁面を傾斜角が９０度となるように加工する必要がある。垂直性の高い凹パターン６１を原盤に加工するには、Ｓｉ基板５９としてウェハ表面が１１０面の基板を用い、Ｓｉ基板５９の表面をＳｉＯ２等の保護膜によって覆った後、ドライエッチング等によって凹パターン形成位置で保護膜に開口をあける。そして、当該開口を通してＫＯＨ、ＴＭＡＨなどのエッチャントを用いてＳｉ基板５９を異方性ウェットエッチングすれば、側壁面の傾斜角がほぼ９０度の凹パターン６１をＳｉ基板５９に作製することができる。また、Ｃｒなどをマスクとして利用し、ＤＲＩＥなどによってＳｉ基板をドライエッチングしても比較的垂直な凹パターンを作製することが可能である
【０１１５】
本発明のセンサ用チップ３９では、金属層５２の表面に凹部５７を設けた構造であるので、例えば上記のようなナノインプリンティング技術を利用して簡便に作製することができ、安価で高精度なセンサ用チップ３９を量産することが可能になる。すなわち、従来の局在型表面プラズモン共鳴センサでは、金属微粒子などの金属部が離散的に分布した島構造であったために製造効率が悪かったが、本発明のセンサ用チップ３９では、金属が途切れることなく形成された連続構造であるため、基板上に形成した凹部５７に金属層５２を成膜するだけで効率よくセンサ用チップ３９を作製できる。
【０１１６】
よって、本発明によれば、前記のように安価かつ高精度にセンサ用チップ３９を量産することができ、また、非常に感度の高いセンサ用チップ３９を作製することができるので、本発明によれば、金属微粒子による従来の局在型表面プラズモン共鳴センサで課題となっていた感度や量産性等の問題を解決することができる。
【０１１７】
（回折格子型の伝搬型表面プラズモン共鳴センサとの比較）
これまで、伝搬型ＳＰＲを発生させるための回折格子として金属表面に凹凸を設けた例は数多く報告されている。この一例を図２において説明した。一方、金属層の表面に設けた凹構造の内部で発生する局在型表面プラズモン共鳴センサについての報告例は無く、センサとして具体的に検討するのは、本発明が初めてである。しかし、凹構造を有する点では、回折格子型の伝搬型表面プラズモン共鳴センサと本発明のセンサ用チップは共通しているので、回折格子を有する伝搬型表面プラズモン共鳴センサ（以下、回折格子型伝搬ＳＰＲセンサという。）と凹構造を有する局在型表面プラズモン共鳴センサ（以下、凹構造局在ＳＰＲセンサという。）の違いを以下に説明する。
【０１１８】
まず、パターン形状からいうと、凹構造局在ＳＰＲセンサでは側壁面が垂直な凹部が好ましい。凹構造局在ＳＰＲセンサでは、凹構造は回折格子として機能させるためのものではなく、その内部で局在型ＳＰＲを発生させるものであるため、凹部の幅（Ｗｍ）は凹部の配列ピッチ（Ｐ）に対して２分の１よりも小さく、隣接する凹部間の平坦面が凹部の幅よりも広くなっていることが望ましい。
【０１１９】
凹構造局在ＳＰＲセンサの凹構造は回折格子として機能するものではないので、ピッチＰは光の波長の１／２以下にすることが望ましい。可視光域の光を使用する場合では、回折光と分離するために、凹部の周期は４００ｎｍ以下とするのが好ましい。特に、２００ｎｍ以下にすれば、可視光域のどの波長の光についても回折が起こらなくなる。
【０１２０】
凹構造局在ＳＰＲセンサでは、感度を上げるためには光を垂直に入射させるのが好ましい。
【０１２１】
本発明の凹構造局在ＳＰＲセンサでは、センシングエリアが数十ｎｍと狭く、金属層の極く近傍の特定物質だけを高精度に検知可能である。また、凹構造局在ＳＰＲセンサでは、凹部内にＳＰＲを閉じ込めることができるので、非常に高い感度を得ることができる。
【０１２２】
（変形例）
図３１は実施形態１の局在ＳＰＲセンサ３１の変形例を示す概略図である。図９の実施形態では、センサ用チップ３９に直線偏光の光を照射したが、図３１の変形例では、センサ用チップ３９で反射した光のうちから特定の偏光面の光を取り出すようにしている。すなわち、この変形例では、コリメータレンズ３４とコリメータ板３５によって細く絞った白色光をビームスプリッタ３７に入射させ、ビームスプリッタ３７で９０度の方向へ反射した光を対物レンズ３８によってセンサ用チップ３９の測定領域４４に集光させている。そして、測定領域４４で反射した非偏光の白色光を対物レンズ３８に再び透過させて平行光化した後、ビームスプリッタ３７を入射させる。ビームスプリッタ３７と分光器４０の間には偏光板３６が配置されており、ビームスプリッタ３７を真っ直ぐに透過した光は、偏光板３６を通過することによって直線偏光の光となり、分光器４０で分光された後に光検出器４１で受光される。
【０１２３】
ここで、偏光板３６は、その偏光方向がセンサ用チップ３９に設けられた凹部５７の長手方向と直交する向きに配置されている。すなわち、測定領域４４で反射した光のうち、凹部５７の長手方向と直交する偏光面を有する直線偏光成分だけを透過させるように偏光板３６が配置されている。例えば、凹部５７の長手方向が図３１の紙面に垂直な方向を向いている場合には、偏光板３６はその偏光方向が光軸に垂直で紙面と平行になるように配置される。従って、この変形例でも、凹部５７の長手方向に垂直な偏光面の光だけを光検出器４１で検知することができ、高い検出感度を実現することができる。
【０１２４】
なお、この変形例では、投光側と受光側の位置が図９の場合と逆になっているが、その理由はつぎのとおりである。図９のような配置又は図３１のような配置から、受光系と投光系との位置を入れ替えれば、ビームスプリッタ３７の角度が傾いていた場合には、光検出器４１には凹部５７の長手方向に垂直な方向から傾いた偏光面の光が入射することになり、センサ感度が低下する。
【０１２５】
これに対し、図９の局在ＳＰＲセンサ３１の場合には、投光系と偏光板がセンサ用チップ３９の垂直方向位置にあるので、偏光板３６を通過した直線偏光の光がビームスプリッタ３７を真っ直ぐに通過する。よって、偏光板３６の偏光方向と凹部５７の長手方向とが直交するように配置されていれば、ビームスプリッタ３７の配置角度に誤差が生じても凹部５７に入射する直線偏光の光の偏光面が傾く恐れがない。
【０１２６】
同様に、図３１の変形例の場合には、受光系と偏光板がセンサ用チップ３９の垂直方向位置にあるので、ビームスプリッタ３７を真っ直ぐに通過した光偏光板を通過して直線偏光の光となる。よって、偏光板３６の偏光方向と凹部５７の長手方向とが直交するように配置されていれば、ビームスプリッタ３７の配置角度に誤差が生じても凹部５７に入射する直線偏光の光の偏光面が傾く恐れがない。
【０１２７】
また、実施形態１の局在ＳＰＲセンサ３１でも上記変形例でも、偏光板を用いることにより凹部５７内の金属層５２と最も強く共鳴した光を光検出器で検知するようにしたが、場合によっては偏光板を用いないことも可能である。本発明の局在ＳＰＲセンサ３１では、光検出器４１で検知する直線偏光の光の偏光面が凹部５７の長手方向に垂直な場合に最もセンサ感度が高くなり、偏光面が凹部５７の長手方向に平行となった場合には感度を持たない。よって、偏光板を用いない場合には、局在ＳＰＲセンサ３１の感度は低下することになる。しかし、測定対象によっては、例えば低感度でも測定できるような反応量の大きな測定対象の場合には使用することが可能である。また、凹部５７が円柱状や円筒状のように等方的で長手方向を定めることができない形状を有している場合も、偏光板を用いなくてもよい。
【０１２８】
（実施形態２）
本発明の実施形態２によるセンサ用チップ３９を説明する。実施形態２のセンサ用チップ３９は、凹部５７の底面中央部が開口側に向けて盛り上がっていることを特徴としている。
【０１２９】
図１７に示した凹部５７の内部で発生する電界分布を詳細に見ると、凹部５７の底部近傍では、あまり電界強度が大きくないことが分かる。これは、凹部５７内における電気力線が開口側に膨らんでいるからである。そのため、実施形態１のように凹部５７の底面が平坦面になっていると、図３２（ａ）に示すように凹部５７の底面にタンパク質等の特定物質が結合したとしても、その特定物質は電界強度の小さな領域に位置することになり、特定物質による屈折率変化はあまり信号変化に寄与しないと考えられる。
【０１３０】
そこで、実施形態２のセンサ用チップでは、図３２（ｂ）に示すように、凹部５７の長手方向に垂直な断面において凹部５７の底面の中央部を両端よりも少し浅くし、底面の中央部が開口側へ向けて盛り上がるようにしている。このようにすれば、凹部５７の底面にタンパク質等の特定物質が結合した場合には、当該特定物質は凹部５７の底面により持ち上げられて電界強度の比較的大きな領域に位置することになり、屈折率変化による信号変化を大きくすることができて感度が向上する。
【０１３１】
つぎに、凹部５７の底面を底上げする効果をシミュレーションによって確認した。この確認に用いた凹構造モデルの一方は、図３３（ａ）に示すように、平均のパターン幅（Ｗｍ＋Ｂｍ）／２＝６０ｎｍ、深さＤｍ＝４０ｎｍ、側壁面の傾斜角β＝７５度、ピッチＰ＝３００ｎｍの凹部５７を有するものであって、その底面は平坦面となっている。もう一方の凹構造モデルは、図３３（ｂ）に示すように、同じく平均のパターン幅（Ｗｍ＋Ｂｍ）／２＝６０ｎｍ、深さＤｍ＝４０ｎｍ、側壁面の傾斜角β＝７５度、ピッチＰ＝３００ｎｍの凹部５７を有するものであって、その底面は中央が両端よりもＫ＝２ｎｍだけ盛り上がった形状となっている。
【０１３２】
上記２つの凹構造モデルに対して、凹部５７の底面の中央に直径３.８ｎｍ、屈折率１.５７の物質６５（ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を想定）が付着した前後における共鳴波長の変化を調べた。図３３（ａ）のように底面が平坦面であるモデルでは、物質６５が付着する前の共鳴波長が６３０.０８５２ｎｍであったのに対し、付着後は共鳴波長が６３０.０８７３ｎｍとなり、Δλ＝０.００２１ｎｍだけ信号がシフトした。これに対し、図３３（ｂ）のように底面の中央部がＫ＝２ｎｍ盛り上がったモデルでは、ＢＳＡを想定した物質６５が付着する前の共鳴波長が６２８.４５４０ｎｍであったのに対し、付着後は共鳴波長が６２８.４６１５ｎｍとなり、Δλ＝０.００７５ｎｍだけ信号がシフトした。従って、凹部５７の底面中央を両端よりも２ｎｍだけ盛上げることによって信号変化量が約３.６倍に向上することを確認できた。
【０１３３】
つぎに、底面を盛上げる高さ（以下、底上げ高さＫと呼ぶ。）を変化させた場合の共鳴波長のシフト量を調べた。この結果を図３４に示す。図３４から明らかなように、底上げ高さＫが６ｎｍまでは、凹部５７の底面中央を高くすることによって共鳴波長のシフト量が増加しているが、底上げ高さＫが８ｎｍになると、逆に共鳴波長がマイナス側へ変化してしまっている。これは、底面の盛上げ量を大きくし過ぎた結果、凹部５７の内部で発生する電界分布を乱してしまい、共鳴現象自体が変化してしまったためであると考えられる。この結果から、底面の中央を盛上げる量は凹部５７の深さ全体に対して５％以上２０％以下にしておくことが良いことが分かった。
【０１３４】
（製造方法）
実施形態２によるセンサ用チップの製造方法を図３５により説明する。この製造方法は、図２９において説明した実施形態１の製造方法とほぼ同じであるので、主として異なる点を説明する。まず原盤を作製する際に、図３５（ａ）に示すように、Ｓｉ基板５９の上に塗布されたフォトレジスト６０に半導体製造プロセスを利用して凹パターン６１を形成するとともに、各凹パターン６１の底面に円弧状に盛り上がった凸部６６を形成する。
【０１３５】
ついで、図３５（ｂ）のように原盤の上にＮｉを堆積させて金型６２を作製すると、図３５（ｃ）に示すように、金型６２下面の反転形状６３の下面には凹部６７ができる。ついで、図３５（ｄ）に示すように、この金型６２を用いてガラス板６４上に塗布されたＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）にナノインプリンティングを行う。そうすると、図３５（ｅ）に示すように、ＰＭＭＡが硬化した基板５１の表面には、原盤の凹パターンが転写され、基板５１の表面に窪み５８が成形され、窪み５８の底面には凸部６８が成形される。
【０１３６】
このようにして得られた複製品の基板５１の表面に、スパッタリングによってＡｕ、Ａｇ等の金属を堆積させて窪み５８の形状を反映するように金属層５２を成膜すると、図３５（ｆ）に示すように、窪み５８とその底面の凸部６８により、金属層５２には凹部５７とその底面に円弧状の底上げ部６９が形成される。
【０１３７】
実施形態２によるセンサ用チップの異なる製造方法を図３６及び図３７に示す。図３６（ａ）は実施形態１の図２９（ａ）−（ｃ）と同様にして製作された金型６２を表し、図３６（ｂ）、（ｃ）は、図２９（ｄ）、（ｅ）と同じ工程を表している。こうして図３６（ｃ）に示すような基板５１がナノインプリンティング法により成形されると、基板５１の表面にはスパッタリングによってＡｕ、Ａｇ等のスパッタ粒子を堆積させて金属層５２を成膜する。スパッタ工程においては、チャンバ内部の真空度や基板の回転数を調整することで、スパッタ粒子の角度分布の広がりを調整することができる。このスパッタ工程において、図３７に示すように、スパッタ粒子の飛来方向の角度分布にある程度広がりを持たせると、両側に遮蔽物の無い底面の中央では両側から金属粒子が入射するので金属層５２の膜厚が厚くなり、片側が遮蔽されている底面の端では片側のみから金属粒子が入射するので金属層５２の膜厚が薄くなる。その結果、スパッタリングを行うことで自然に凹部５７の底面の中央が盛り上がり、図３６（ｄ）に示すように、凹部５７の底面に底上げ部６９が生じる。
【０１３８】
図３６及び図３７により説明したような製造方法で実製作されたセンサ用チップ３９のＡＦＭ像を図３８に示す。図３８において黒く見える部分が凹部５７である。また、図３９はセンサ用チップ３９の断面における金属層表面のプロファイルを表した図である。図３９において三角形のマークを施された位置は、図３８において三角形のマークを施された位置に対応している。図３８及び図３９により、図３９のようにスパッタリングを行うことで凹部５７の底面の中央が両端よりも数ｎｍ程度高くなることを確認できた。
【０１３９】
（実施形態３）
つぎに、本発明の実施形態２によるセンサ用チップの凹構造を説明する。実施形態３のセンサ用チップにおいては、実施形態１のように凹部５７が測定領域４４の端から端まで溝状に延びているのでなく、図４０に示すように、凹部５７を長手方向において複数に分割している。この結果、凹部５７は略矩形状の凹構造となっていて、互いに直交する２方向に沿って並んでいる。
【０１４０】
凹部５７の配列の仕方は、矩形配列（格子状の配列の仕方）でもよく、デルタ配列（図４０（ｂ）のような千鳥状の配列の仕方）でもよいが、ここではデルタ配列の場合について説明する。凹部５７は、入射光の偏光面と平行な方向においては、実施形態１の場合と同様に一定のピッチＰで並んでいるが、偏光面に垂直な方向では凹部５７の幅Ｓ１と凹部５７間の平坦部分の幅Ｓ２とは等しくなっている。また、この幅Ｓ１＝Ｓ２は、６０ｎｍ以上としている。
【０１４１】
実施形態３の特徴を実施形態１の場合と比較して説明する。実施形態１の場合には、凹部５７が凹溝状に延びているので、特定の誘電体物質を固定化するための有機分子層（例えば、後述のバイオセンサにおける固定化層など）を固定しておいて特定物質の検出を行う場合には、図４１（ａ）（ｂ）においてメッシュ状のハッチングを施した側壁面には当該有機分子層を固定して特定物質の検査に寄与させることができる。しかし、図４１（ｂ）で楕円で囲んだような中央部の領域には当該有機分子層を固定することができず、しかもその領域は凹部５７の長手方向に沿って延びている。
【０１４２】
これに対し、実施形態３では、実施形態１の凹部５７を複数個に分割しているので、図４２（ａ）（ｂ）にメッシュ状のハッチングを施した側壁面のみならず、梨地状のハッチングを施した側壁面にも有機分子層を固定することができ、特定物質の検知に寄与する側壁面の面積を増大させることができ、共鳴波長の変化量を大きくすることができる。よって、光の利用効率を維持したままで、局在ＳＰＲセンサ３１の高感度化が可能になる。
【０１４３】
また、入射光の偏光面と垂直な方向において凹部５７の幅Ｓ１とその間の平坦面の幅Ｓ２を等しくしているので、凹部５７どうしを十分に離して隣接する凹部５７どうしの相互作用によるモードの発生を防ぐことができる。
【０１４４】
なお、図４３に示すように、凹部５７は送液方向と平行となるように配置し、検査試料溶液が流れ込んでくる側（上流側）の傾斜角を流れ出す側（下流側）の傾斜角よりも小さくし、凹部５７への検査試料溶液の流れ込みを促進させてもよい。
【０１４５】
（実施形態４）
本発明にかかる局在ＳＰＲセンサは、タンパク質を検出するためのバイオセンサとしても使用することができる。実際にバイオセンサとしての機能を確認するため、図２０で説明したような構造の試作品を用いてタンパク質の検出を行った。検出対象の抗原としては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いた。
【０１４６】
まず、ＢＳＡ抗原を特異的に検出するためにはＢＳＡ抗体を測定領域４４に固定化する必要がある。ここで、局在ＳＰＲセンサ３１においては、感度領域が数十ｎｍと狭いため、できるだけ薄い固定化層（生体分子を固定するための有機分子層）が要求される。そこで、Orla Protein Technologies社（英国）から販売されている固定化層を用いた。この固定化層７３は、図４４（ｂ）に示すように抗体と結合する"プロテインＡ"７１とＡｕ表面に自己組織化膜を形成する部位（自己組織化部７２）が融合したタンパク質であり、薄い膜で抗体を固定化する表面を形成することができる。
【０１４７】
まずこの固定化層７３を測定領域４４に形成し、その後に２０μｌ／minの速度で送液を行なってＢＳＡ抗体（０.０３ｍｇ／ｍｌ）とＢＳＡ抗原（０.１ｍｇ／ｍｌ）を流した。この結果、図４４（ａ）に示すように金属層５２の表面に固定された固定化層７３に抗体７４（ＢＳＡ抗体）が結合し、抗体７４に抗原７５（ＢＳＡ抗原）が特異的に結合され、金属層５２の近傍の屈折率が変化するので、図９に示したような局在ＳＰＲセンサ３１を用いて共鳴波長の変化を測定した。
【０１４８】
このときの共鳴波長のシフト量を図４５に示す。図４５の横軸は経過時間、縦軸は共鳴波長である。図４４（ａ）に示すように、まずＢＳＡ抗体が固定化層７３に結合し、ついでＢＳＡ抗体にＢＳＡ抗原が結合すると考えられるので、図４５の最初の約１.４ｎｍの共鳴波長シフトはＢＳＡ抗体によるものであり、その後の約０.５ｎｍの共鳴波長シフトはＢＳＡ抗原によるものである。このように本発明の局在ＳＰＲセンサ３１によりタンパク質を検出できることが示された。
【０１４９】
また、図４６（ｂ）に示すように、自己組織化膜形成部位７６と抗体７４のSingle chain部が融合したタンパク質を用いると、図４６（ａ）のように固定化層をより一層薄く、且つ表面形成プロセスを簡便に行うことができる。反対に、抗原を測定領域に固定化しておけば特定の抗体を検出することが可能である。
【０１５０】
さらに、本発明の局在ＳＰＲセンサを用いれば、固定化する生体分子を変えることによって、プロテインチップやＤＮＡチップ等のバイオセンサだけでなく、アレルゲンの測定を行う食品センサ、環境センサ、味覚センサ、匂いセンサ、爆薬センサなどへの応用が可能である。
【０１５１】
（実施形態５）
バイオセンサの検出感度を大幅に上昇させる方法として、図４７に示すようなサンドイッチ法がある。この方法は、抗体７４に結合した抗原７５に対して、さらに抗体７４を反応させることで、より大きな屈折率変化を起こし、感度を数倍に上昇させるものである。
【０１５２】
このような方法は公知であるが、公知の方法では、血液などの検体を流した後に、再度、抗体溶液を流す操作は複雑であり、一般家庭用のバイオセンサとしては現実的ではない。また、この方式では、実際の反応量よりも過剰量の抗体を一定時間流す必要があり、コスト、測定時間などに関しても問題がある。
【０１５３】
これに対し、本発明のセンサ用チップ３９の場合には、図１７のような電界分布をとることから、金属層５２の表面の数十ｎｍ以上の領域においては、入射光の電界以上にはほとんど電界が増強されない。つまり、この領域に存在するタンパク質の屈折率変化はほとんど信号変化に寄与しない。この性質を利用して、センサ用チップ３９ではサンドイッチ法による自動的な感度上昇が可能である。すなわち、実施形態４の固定化層７３に、図４８（ａ）のように"プロテインＡ"７１と自己組織化部７２の間にリンカー部７７（数十ｎｍ以上の長さを持つ。）を含む長い固定化層７８を一定の割合で設けておくことで、図４９に示すように増感用の抗体７４を信号変化に寄与しない領域に“隠す”ことができる。
【０１５４】
ここで、リンカー部７７の素材としては、数十ｎｍ以上の長さに調製可能であり、図４８（ｂ）のように自由な方向に湾曲し、抗体分子の溶液内での移動を妨げないものが適している。具体的には、ポリグリシンや（Gly−Gly−Gly−Ser）ｎなどのフレキシブルなペプチドリンカーが考えられる。これらは、プロテインＡや自己組織化部を構成するタンパク質（Orla proteinなど）との融合タンパク質として大腸菌内で発現することが可能であるので、作製プロセスやコストが削減できる。また、非特異吸着の少ないポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ）やデキストランなどの糖鎖、ＤＮＡなどをタンパク質の官能基と化学結合させ、リンカーとして用いることも可能である。
【０１５５】
このバイオセンサを用いる場合には、図４９のように抗体７４を直接固定する固定化層７３と共にリンカー部７７を介して増感用の抗体７４を固定する固定化層７８を金属層５２の表面に固定しておく。この表面に抗原７５を含んだ検査試料溶液を流した場合には、まず抗原７５が固定化層７３の抗体７４に結合する。ついで、その抗原７５が接着剤の役割を果たし、図５０に示すように、リンカー部７７が湾曲することでリンカー部７７の先に捕捉されていた増感用の抗体７４が抗原７５に結合して自動的なサンドイッチ反応が起こる。このとき、図１４に示した電界の増強が強く発生している領域に増感用の抗体７４が移動することで、高い信号変化が起こる。
【０１５６】
また、抗原送液後に、送液速度や送液方向をパルス的に変化させることで、長いリンカー部７７が湾曲してリンカー部７７の先に捕捉されている増感用の抗体７４がサンドイッチ反応を起こすきっかけを作っても良い。
【０１５７】
このようにリンカー部７７を利用することで、従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサでは困難であった自動的なサンドイッチ反応が可能になり、大幅な感度上昇が実現できる。
【０１５８】
（実施形態６）
実際の臨床等の使用においては、複数の生体分子の検出を一度に行うことによって診断をハイスループットに行う、精度を向上するといったニーズがある。
【０１５９】
このようなニーズに応えるためには、図５１に示すように、センサ用チップ３９に複数の測定領域４４、すなわち測定領域４４ａ、４４ｂを形成しておき、複数の測定領域４４ａ、４４ｂを含む領域（例えば、図５１で破線の楕円で囲んだ領域）に入射光を照射するようにすればよい。
【０１６０】
各測定領域４４ａ、４４ｂを同じ構造とし、それぞれの測定領域４４ａ、４４ｂに異なるプローブ（抗体など）を固定化することで、一度に複数の生体分子の検出が可能となる。異なるプローブを固定化するためには、スポッター等を用いればよい。
【０１６１】
あるいは、各測定領域４４ａ、４４ｂにおける凹部５７の幅、深さ、ピッチ、溝の向きなどが異なっていても良い。
【０１６２】
複数の測定領域４４ａ、４４ｂを含む領域に入射光を照射したとき、各測定領域４４ａ、４４ｂ毎にプローブが異なっていたり、凹部５７の幅や深さなどが異なっていると、各測定領域４４ａ、４４ｂごとに共鳴波長が異なるので、図５２に示すように複数の反射率のピーク（共鳴波長）が観察される。
【０１６３】
それぞれのピークは各測定領域４４ａ、４４ｂにおけるＳＰＲに起因するものであるため、各ピークのシフトを検出することで、一度に各測定領域４４上での反応を測定することができる。
【０１６４】
このように各測定領域４４ａ、４４ｂ毎に凹部５７の構造又はプローブを異なるものにしておくことにより、入射光で測定領域４４ａ、４４ｂを一つずつスキャンせずに、一度の照射で複数の測定領域４４ａ、４４ｂ上の反応を検出することができる。よって、光をスキャンするための機構等が不要になるため、局在ＳＰＲセンサを小型化、かつ安価にできる。
【０１６５】
従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサでは、発生したＳＰＲが金属表面を数μｍ−数ｍｍの広がりをもって伝搬するため、隣合う測定領域どうしは数百μｍ以上離しておく必要があり、そのため、センサ用チップを高密度化することができないという課題があった。しかし、本発明のような局在型表面プラズモン共鳴センサでは、発生したＳＰＲは局所的に存在するだけであるため、隣の測定領域プローブとの間隔を数μｍ程度に近接させておくことが可能であり、複数の測定領域を高密度に配置できるといったメリットがある。
【０１６６】
（実施形態７）
図５３は、センサ用チップ３９に設けられた２つの測定領域４４ａ、４４ｂで、凹部５７の長手方向の向きを互いに９０度異ならせた場合を表わしている。測定領域４４ａ、４４ｂに入射する直線偏光の光は、凹部５７の長さ方向に垂直な偏光面を有するものは大きな感度を持ち、凹部５７の長さ方向に垂直な偏光面を有するものはほとんど感度を持たないから、測定領域４４ａ、４４ｂに非偏光の光を照射し、測定領域４４ａ、４４ｂで反射した光を偏光ビームスプリッタ７９によって各偏光方向に分離してそれぞれの光検出器で検出することで、各測定領域４４ａ、４４ｂにおける反応をそれぞれ個別に検出することができる。
【０１６７】
（実施形態８）
実際の測定においては、試料溶液中に気泡が混入している場合がある。気泡が測定領域に溜まると、大きな屈折率変化が生じ、測定エラーが発生する。経験上、特に測定領域４４の境界部において気泡がトラップされることが多い。
【０１６８】
気泡によるエラーを回避するためには、測定領域の境界と測定に寄与する領域とを離すために、測定領域を大きくすれば良いが、この方法ではセンサ用チップを製作するための原盤の作製時間が無駄に長くかかってしまう。
【０１６９】
図５４は、このような問題を解消するため、測定領域よりも送液の上流側に気泡８１を捕捉するためのトラップ８０を設けたものである。トラップ８０としては、例えば送液方と直交する方向に長い１本ないし複数本の凹溝や突起でもよく、測定領域と同じパターンであってもよい。気泡のサイズは大きい場合には数ｍｍサイズとなるため、トラップ８０と測定領域４４とは１ｍｍ以上離しておく方がよい。
【０１７０】
（実施形態９）
図５５は本発明の実施形態による局在ＳＰＲセンサを説明する図である。この実施形態では、測定領域４４に白色光を照射するのでなく、特定の２波長λ１、λ２の光を照射するようにしている。この２波長λ１、λ２とは、図５５に示すように、反応前には波長λ１における反射率Ｒ１ａが波長λ２における反射率Ｒ２ａよりも小さく（Ｒ１ａ＜Ｒ２ａ）、反応後には波長λ１における反射率Ｒ１ｂが波長λ２における反射率Ｒ２ｂよりも大きく（Ｒ１ｂ＞Ｒ２ｂ）なるように選ばれたものである。もちろん、光検出器４１の受光量を比較してもよい。
【０１７１】
かかる実施形態によれば、２つの特定の波長における反射率又は受光量を比較するだけでよいので、特定の物質の有無を検知する用途では簡単に検査を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサの原理を説明する図である。
【図２】図２は、回折格子を用いた従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサの構造を示す概略図である。
【図３】図３は、回折格子を用いた従来の伝搬型表面プラズモン共鳴センサにおいて、入射光が回折を起こす様子を表した図である。
【図４】図４（ａ）は、従来の局在型表面プラズモン共鳴センサの構造を示す概略図、図４（ｂ）は図４（ａ）の局在型表面プラズモン共鳴センサにより測定した吸光度特性の例を示す図である。
【図５】図５は、図４の局在型表面プラズモン共鳴センサにより測定された「平均径２０ｎｍの金ナノ粒子を堆積したガラス基板を種々の屈折率を持つ液体に浸けたときの吸収スペクトル」を表した図である。
【図６】図６（ａ）は、ガラス基板をコロイド溶液に浸漬して金属微粒子をガラス基板の上に固定する方法により、比較的小さな分布密度で金属微粒子を固定した様子を示す図、図６（ｂ）は、比較的大きな分布密度で基板上に金属微粒子を固定した様子を示す図である。
【図７】図７（ａ）−（ｆ）は、電子ビームを利用して金属微粒子が均一に配列した金属ナノ構造を作製する方法を説明する図である。
【図８】図８は、図７の方法により得られた金属微粒子のパターンを示す図である。
【図９】図９は、本発明の実施形態１による局在型表面プラズモン共鳴センサの構造を示す図である。
【図１０】図１０（ａ）は、図９の局在ＳＰＲセンサに用いられているフローセルの構造を示す分解斜視図、図１０（ｂ）は組み立てた状態の断面図である。
【図１１】図１１（ａ）は、フローセルの測定領域を示す平面図、図１１（ｂ）は図１１（ａ）の一部を拡大した図、図１１（ｃ）は図１１（ｂ）の断面図である。
【図１２】図１２は、測定領域に入射する光の偏光面と凹部の長手方向との関係を示す断面図である。
【図１３】図１３は、金属微粒子に入射した光の電界を表わした概略図である。
【図１４】図１４は、実施形態１の試作品における、一つの凹部の断面形状を示す図である。
【図１５】図１５は、図１４の試作品をシミュレーションして求めた反射率スペクトルを示す図である。
【図１６】図１６は、図１４の試作品を用いて実測した反射率スペクトルを示す図である。
【図１７】図１７は、凹部内とその近辺における電界分布をシミュレーションした結果を表した図である。
【図１８】図１８は、凹部の幅Ｗｍと深さＤｍを変化させたときの共鳴波長の変化を表した図である。
【図１９】図１９は、凹部の幅を６０ｎｍに固定して、深さＤｍを変化させたときの反射率スペクトルを表した図である。
【図２０】図２０は、深さの異なる実施形態１の試作品における、一つの凹部の断面形状を示す図である。
【図２１】図２１は、図２０の試作品をシミュレーションして求めた反射率スペクトルを示す図である。
【図２２】図２２は、図２０の試作品を用いて実測した反射率スペクトルを示す図である。
【図２３】図２３は、凹部の幅Ｗｍと深さＤｍを変化させたときのピーク半値幅の変化を表した図である。
【図２４】図２４は、ピーク半値幅の定義を説明するための図である。
【図２５】図２５は、凹部の幅Ｗｍと深さＤｍを変化させたときのセンサ感度の変化を表した図である。
【図２６】図２６は、凹部の側壁面の傾斜角とセンサ感度との関係を表した図である。
【図２７】図２７（ａ）は底面に金属層のない凹部を示す断面図、図２７（ｂ）はその反射率スペクトルを示す図である。
【図２８】図２８（ａ）は底面に金属層を有する凹部を示す断面図、図２８（ｂ）はその反射率スペクトルを示す図である。
【図２９】図２９（ａ）−（ｆ）は、実施形態１のセンサ用チップの製造工程を説明する図である。
【図３０】図３０は、図２６（ａ）−（ｆ）の工程により作製したセンサ用チップの断面を表した図である。
【図３１】図３１は、実施形態の局在ＳＰＲセンサの変形例を示す概略図である。
【図３２】図３２（ａ）は、本発明の実施形態１による凹部の断面を示す図である。図３２（ｂ）は、本発明の実施形態２による凹部の断面を示す図である。
【図３３】図３３（ａ）は、本発明の実施形態１の試作品における凹部の断面を示す図である。図３３（ｂ）は、本発明の実施形態２の試作品における凹部の断面を示す図である。
【図３４】図３４は、凹部の底面の底上げ高さＫと共鳴波長のシフト量Δλとの関係を表した図である。
【図３５】図３５（ａ）−（ｆ）は、実施形態２のセンサ用チップの製造工程を説明する図である。
【図３６】図３６（ａ）−（ｄ）は、実施形態２のセンサ用チップの別な製造工程を説明する図である。
【図３７】図３７は、図３６の製造工程のうちのスパッタの工程を説明する図である。
【図３８】図３８は、図３６及び図３７に示した製造方法で実製作されたセンサ用チップのＡＦＭ像を示す図である。
【図３９】図３９は、図３８のセンサ用チップの断面プロファイルを表した図である。
【図４０】図４０（ａ）は、本発明の実施形態３のセンサ用チップにおける測定領域４４の平面図、図４０（ｂ）は図４４（ａ）の一部を拡大した図である。
【図４１】図４１（ａ）、（ｂ）は、実施形態１の場合における、固定化層などの固定領域を示す平面図及び断面図である。
【図４２】図４２（ａ）、（ｂ）は、実施形態３の場合における、固定化層などの固定領域を示す平面図及び断面図である。
【図４３】図４３は、検査試料溶液が流れ込んでくる側の側壁面の傾斜角を小さくした凹部５７を示す断面図である。
【図４４】図４４（ａ）は、固定化層を介して抗体や抗原を固定したセンサ用チップを示す部分断面図である。図４４（ｂ）は固定化層に固定された抗体と、抗体に特異的に結合した抗原を示す図である。
【図４５】図４５は、固定化層を固定されたセンサ用チップに抗体と抗原を含む検査試料溶液を流したときの、共鳴波長の変化を示す図である。
【図４６】図４６（ａ）は、自己組織化膜形成部位と抗体のSingle chain部が融合したタンパク質を用いて抗原を固定したセンサ用チップを示す部分断面図である。図４４（ｂ）は、自己組織化膜形成部位とSingle chain部が融合した抗体に抗原が特異的に結合した状態を示す図である。
【図４７】図４７（ａ）は、サンドイッチ法により抗体や抗原を固定したセンサ用チップを示す部分断面図である。図４７（ｂ）は抗原を挟んで２つの抗体がつながった様子を示す図である。
【図４８】図４８（ａ）は、ほぼ真っ直ぐに伸びたリンカー部を示す図、図４８（ｂ）は、湾曲したリンカー部を示す図である。
【図４９】図４９は、センサ用チップの金属層に固定されたリンカー部が延びている状態を示す図である。
【図５０】図４９は、センサ用チップの金属層に固定されたリンカー部が湾曲して、リンカー部の先の抗体が、別な抗体に特異的に結合している抗原に結合した状態を示す図である。
【図５１】図５１は、本発明の実施形態６による局在ＳＰＲセンサを説明する図である。
【図５２】図５２は、図５１の局在ＳＰＲセンサにより測定した反射率スペクトルを説明する図である。
【図５３】図５１は、本発明の実施形態７による局在ＳＰＲセンサを説明する図である。
【図５４】図５４は、本発明の実施形態８による局在ＳＰＲセンサを説明する図である。
【図５５】図５５は、本発明の実施形態９による局在ＳＰＲセンサを説明する図である。
【符号の説明】
【０１７３】
３１      局在型表面プラズモン共鳴センサ（局在ＳＰＲセンサ）
３２      光源
３６      偏光板
３７      ビームスプリッタ
３９      センサ用チップ
４０      分光器
４１      光検出器
４２      データ処理装置
４３      シリンジポンプ
４４、４４ａ、４４ｂ      測定領域
４５      流路
４８      フローセル
５１      基板
５２      金属層
５３      スペーサ
５４      カバー
５７      凹部
５８      窪み
５９      Ｓｉ基板
６０      フォトレジスト
６２      金型
６４      ガラス板
６９      底上げ部
７１      "プロテインＡ"
７２      自己組織化部
７３      固定化層
７４      抗体
７５      抗原
７６      自己組織化膜形成部位
７７      リンカー部
７８      固定化層
７９      偏光ビームスプリッタ
８０      トラップ
８１      気泡
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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