(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ａ）：
0005542666.tif 000007
［式中、
・Ｒ１は、１つの検出可能な標識、または少なくとも１つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
・Ｒ２及びＲ３は、互いに独立であって、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ４-(Ｌ)ｎ-、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲを表わし、ここでＲがアルキル又はアリールであり、Ｒ４が１つの検出可能な標識、または少なくとも１つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖、又は１から２０回反復した-(Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２)-を含むリンカーアームであり、
・ｎは１の整数であり
・Ａは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも一つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、
・ｕは０と２との間の整数である］
の標識化試薬。
【請求項２】
式（Ｃ）：
0005542666.tif 000008
［式中、
・Ｒ１は、１つの検出可能な標識、または少なくとも１つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
・Ｒ２及びＲ３は、互いに独立であって、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ４-(Ｌ)ｎ-、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲを表わし、ここでＲがアルキル又はアリールであり、Ｒ４が１つの検出可能な標識、または少なくとも１つの多量体構造によって互いに結合される少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、
・ｎは１に等しい整数である］
の請求項１に記載の標識化試薬。
【請求項３】
式（Ｅ）：
0005542666.tif 000009
の請求項１及び２の何れかに記載の標識化試薬。
【請求項４】
ニトロ基がメタまたはパラ位にあることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載の試薬。
【請求項５】
Ｒ１が式（Ｆ）：
0005542666.tif 000010
のD-ビオチン残基から成ることを特徴とする請求項１から４の何れか一項に記載の試薬。
【請求項６】
ａ）カルボン酸誘導体をラクトンのエノラートと反応させ（クライゼン反応）、環状前駆体を形成する工程、
ｂ）前記環状前駆体をハロゲン酸によって開き、続いてハロゲン化芳香族ケトンを形成する工程、
ｃ）ハロゲン化芳香族ケトンのカルボニル官能基を保護基によって保護し、被保護前駆体を形成する工程、
ｄ）前記被保護前駆体にアミノ化反応（ガブリエル反応）を受けさせ、アミノ化前駆体を形成する工程、
ｅ）前記アミノ化前駆体をアミン官能基を解放するために脱保護し、前記アミン官能基を検出可能な標識と反応させ、そのカルボキシル官能基を活性化し、検出可能な標識を含む前駆体を形成する工程、
ｆ）標識された前駆体は、カルボニル官能基の脱保護のための反応を受けさせ、標識されたカルボニル化前駆体を形成する工程、及び最後に
ｇ）標識されたカルボニル化前駆体を、カルボニル官能基のジアゾ官能基（バンフォード・スティーヴンズ反応）への変換によって請求項１から５の何れか一項に記載の標識化試薬に変換する工程を含む、
請求項１から５の何れか一項に記載の標識化試薬を合成する方法。
【請求項７】
実質的水性緩衝液の均一溶液において、請求項１から５の何れか一項に記載の試薬と生体分子を接触させることを含む、生体分子、特に核酸を標識する方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって得られる標識された生体分子。
【請求項９】
・核酸を断片化する工程；
・請求項１から５の何れか一項に記載の試薬から選択される標識化試薬を介して、標識を断片のうちの少なくとも1つに取り付け、前記試薬は前記断片の少なくとも一つのリン酸に共有結合により優勢的に結合させる工程
を含む、一本鎖又は二本鎖核酸を断片化し且つ標識する方法。
【請求項１０】
断片化と標識化が２工程で実施されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
断片化と標識化が１工程で実施されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
標識化が実質的水性均一溶液において行われること特徴とする、請求項９から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
断片化が、酵素的に、物理的に、又は化学的に実施されることを特徴とする、請求項９から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項９から１３の何れか一項に記載の方法によって得られる標識された核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の標識された核酸を含む、標的核酸を検出するためのキット。
【請求項１６】
請求項１から５の何れか一項に記載の試薬をその上に結合している、固体支持体。
【請求項１７】
核酸を捕獲する方法であって、
・直接または間接的に、請求項８に記載の少なくとも一つの生体分子又は請求項１４に記載の核酸、ジアゾメチル官能基を有する核酸又は生体分子を結合させた固体支持体を提供する工程、
・前記支持体に遊離した核酸を含みうる生物試料を接触させる工程、及び
・分子が共有結合で少なくとも核酸に結合されている前記固体支持体を洗浄する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を標識するための新規の試薬、当該標識を合成する方法、及び特に核酸解析を用いる診断分野において生体分子を標識するための適用に関する。
【０００２】
従来技術は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは核酸を標識するための多数の技術があることを示す。
第１の技術は標識を塩基に取り付けることを含み、塩基は天然であるか修飾されている。第２の技術は標識を糖に結合することを有し、再度それは天然であっても又は修飾されていてもよい。第３の方法は、標識をリン酸に結合することを伴う。
直接的に標識されたヌクレオチドの取込みによって標識された核酸を含む方法では、塩基における標識が、特に使われている。
糖における標識は、化学合成によって調製される核酸プローブの場合に、しばしば使われる。
また、リン酸における標識は、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に、官能基化されたアームと標識を導入するために用いられている。
【０００３】
実際には、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体または核酸の標識化を行うことを必要とする当業者は、塩基又は糖にこの結合を行う傾向があるが、それは彼または彼女にとって非常に便利であり、多数の選択肢があるためである。さらに、これは、塩基の場合はEP-A-0329198、EP-A-0302175、EP-A-0097373、EP-A-0063879、US-A-5449767、US-A-5328824、WO-A-93/16094、DE-A-3910151、EP-A-0567841、糖の場合はEP-A-0286898のような、多数の文献の研究に現れている。
【０００４】
標識をリン酸に結合することは、塩基または糖を官能基化することを含む技術よりも、複雑な技術であり、特にリン酸の低い反応性のために、より狭い範囲の中で使用されている(参照, 例えば, Jencks W.P. et al., J. Amer. Chem. Soc., 82, 1778-1785, 1960)。同様に、O'DonnelとMcLaughlin (Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure, pp. 216-243、「Bioorganic Chemistry: Nucleic Acids」, Hecht S.M.編集, Oxford University Press, 1996)の総説では、プローブをオリゴヌクレオチド断片に導入する方法に関して、インターヌクレオチド・リン酸ジエステルの効果的なアルキル化は、不可能であると考えられている。 
【０００５】
特許出願WO-A-99/65926は、合成又は天然リボ核酸（ＲＮＡ）を標識する方法であって、ＲＮＡを断片化し、末端のリン酸での標識化を実施することを含む方法を記載する。この文献は、官能基の水酸基、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、ハロゲン化アルキル、及びベンジル型ハロゲン化アルキル、特に5-（ブロモメチル）フルオレセイン誘導体のような、断片化に関連して標識に用いられることができる官能基の一定数を述べる。これらの官能基により核酸は標識されることができるが、この標識が断片化の間に解放されたリン酸に生じるので、効果的標識を得るためには断片化工程と組合せなければならない。さらにまた、それは効果的標識を得るためにＲＮＡに比較して非常に過剰の標識化試薬を加える必要があり、これは過剰な標識によって生じるバックグラウンド・ノイズの問題を引き起こす。最後に、この方法は効果的に二本鎖ＤＮＡに作用しない。
【０００６】
そのため、標識収率に関して効果的であり、標識される位置に関して特異的であり、更には、ＤＮＡとＲＮＡのために使用され得る水素結合を介して、ダブルへリックスの形成に含まれる塩基のハイブリダイゼーションの特性に悪影響を与えず、最後に、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸を、それらが天然であろうと、転写、逆転写、酵素性増幅により調製されたものであろうと等しく標識することができる、新規な試薬に対する要求がある。
【０００７】
出願人は、上に述べた条件に合い、且つ標識化のための反応性官能基としてジアゾメチル官能基を利用するこの種類の新規な標識をすでに提供している。これは、例えば、特許出願WO-A-02/090319、WO-A-02/090584及びWO-A-2005/092910で事実である。 
従って、（式-Ｃ(Ｎ２)-の）ジアゾメチル官能基が、リン酸基のアルキル化のためにすでに用いられているが、特定数の問題が生じる。第一に、少なくとも一つのジアゾ官能基を組み込まれた試薬は単独で通常不安定であり、標識化キット中のこれらの試薬の使用に問題を起こす;標識された生成物の官能基が任意のサンプルの生物学的標的分子の存在を示す場合、これは全く許容できない。
【０００８】
最後に、ジアゾメチル官能基を担持する試薬は、特定の標識、例えばビオチンと結合して、低い水溶解度を有し、それにより、水あるいは水性バッファーだけに溶解する生体分子と結合するためには、水溶性有機溶媒の使用が導かれる。しかしながら、これらの溶媒は標識化反応にあまりに高い濃度で使われる場合、生体分子の沈殿を誘発するリスクがある。従って、水性媒体に十分に溶解する標識化試薬に対する要求がある。
【０００９】
また、上記したように文献WO-A-02/090319、WO-A-02/090584（第一世代の分子）、及びWO-A-2005/092910（第二世代の分子）によって推奨される標識化試薬は、これらの技術的問題を解決する。不注意な省略によって本発明を開示する文章に含まれていないような、これらの文献についての如何なる更なる説明については、これらの文献を参照されたい。
【００１０】
本発明は、従来の分子に対する合理的な改良である。これは、第一及び第二世代の分子には、前に存在したものに関して既に改良がされていたにもかかわらず、化学的に不安定である欠点があるためである。得られた結果は１年以上わたってさえ非常に良好であるので、それゆえに標識化は非常に効果的なままである。加えて、それらの合成は、比較的複雑なままである。第三世代の分子はずっと安定しており、容易に合成することができ、これらの分子を含むキットの使用期限及び合成の工業化に関して、非常に有利である。 
【００１１】
第一及び第二世代の分子は、それらが無水有機溶媒に低温で保たれる場合、１年以上は機能的に安定している。第三世代の分子は、液体または乾燥媒体の何れでも、機能的に及び化学的に、より安定している。従って、それらは、乾燥化または凍結乾燥によって、乾燥状態で、例えば非常に長い期間（１０から１００倍の間）保存された後に、水性媒体中で扱われることができるが、凍結乾燥に耐えない第一世代や第二世代の分子ではそうではない。
第三世代の分子のこの工業的利用は、特に統合化された装置またはマイクロシステムで重要であり、問題が生じた場合に、特定の試薬の安定性に疑いをかけられないように、含まれる化学は非常に有効で頑強でなければならない。 
【００１２】
しかしながら、これらの分子及び標識する方法が特に効果的であるにもかかわらず、出願人は更に標識化の効率を改善する新規な分子と新規な方法を見いだすことに成功した。本発明は、第一及び第二世代の分子の安定性の問題に答える解決策を提供する。従って、２つの新規な分子官能性は、新規な試薬をつくるために結合された。それらは、以下のように定義される： 
・ジアゾメチル官能基は、メタ、パラまたはオルト位のニトロ基（ＮＯ２）によって１回以上置換されるα位の芳香族基を有する。
・そのα’位において、ジアゾ官能基は検出を可能する基を有する。この基は、ビオチンあるいは検出可能な他の任意の基であってもよい。
以前は検出可能な基が芳香族部分に依然として結合されており、α’位は少なくとも一つの非官能性置換基によってのみ、ほとんど占められていたので、この第２ポイントは第一及び第二世代の分子と比較して完全にオリジナルの特徴である。
【００１３】
ニトロ基に対するジアゾ官能基（両方とも環に担持される）のオルト位が本発明による分子の安定性能の特性を促進するが、メタとパラ位がより安定しているジアゾ化合物に結果としてなり、優先して使われる置換位置であることは、重要である。しかしながら、ジアゾ官能基がニトロ基に対しオルトに配置された分子の安定性を改善することは、更に十分にあり得るが、安定化手段を加えることによって、それにより合成がより複雑であるという問題がある。
【００１４】
「多量体構造」、「検出可能な標識」、「間接的システム」、「フルオロフォア」の定義、及び興味のある他の標識、「共役」、「生体分子」、「核酸」、「酵素増幅技術」、「実質的水性溶液」、「均一溶液」、「固体支持体」及び「精製工程」は、特許出願WO-A-2005/092910に記載されているので、必要な場合は参照されたい。
同様に、
・グラフト化の化学、及び
・核酸の３’又は５’末端におけるリン酸の導入についての技術も、またこの上記の特許出願に記載されており、当該文献において本発明の完全な理解のために必要とされる任意の情報を得ることができる。
【００１５】
さらにまた、これらの第三世代の分子に担持されるジアゾメチル官能基は、第一及び第二世代の分子の例に続いて、支持体における核酸の共有結合性グラフト化を可能にする。特に吸着に比較して、グラフト化は単純で、結合は安定であり、固体支持体上の核酸の結合を可能にし、それにより更なる立体障害を少なくすることによって次のハイブリダイゼーション工程を容易にする。
【００１６】
この新しいクラスの分子は、ジアゾ・ケトン・ビオチン（ＤＫＢ）と呼ばれており、下の式（Ａ）：
0005542666.tif 000002
の比較的温度安定性の標識化試薬に代表される。
【００１７】
この第三世代のＤＫＢ分子はスペーサアームＬ（リンカーと呼ばれている）とビオチン、ハプテン、フルオロフォア、蛍光性の基、発光性の基等のような検出可能な基から成っていてもよい標識Ｒ１を含む。
Ｌは少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、ｎは１に等しい整数である。有利には、反応体について前に開示された実施態様または変異体に関係なく、Ｌは単位 -(Ｏ-ＣＨ２-ＣＨ２)-を、１から２０回、好ましくは１から１０回、より好ましくは２から５回反復して含む。
Ａは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも一つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、ｕは０と２との間、好ましくは０と１との間の整数である。
ある特定の実施態様では、Ａは芳香環にジアゾメチル官能基を共役させることを可能にする、少なくとも一つのエチレン二重結合を含むリンカーアームである。ジアゾメチル官能基の安定性を保持する一方で立体障害を少なくするために、リンカーアームＡの機能はジアゾメチル官能基を環から遠ざけることである。「共役」によって、リンカーアームＡの炭素鎖に沿った芳香環の電子非局在を意味する。例えば、アームＡは、以下の構造：
0005542666.tif 000003
［式中、
・ｖは１と１０との間の整数であり、好ましくは、ｖは１又は２である、及び 
・Ｒ１０はＨまたはアルキル基であり、好ましくはＲ１０はＨ、メチルまたはエチルである］
を有する。
ラジカルＲ３及びＲ４は、互いに独立であり、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２-(Ｌ)ｎ-Ｙ-Ｘ-、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲを表わし、ここでＲはアルキル又はアリールである。
【００１８】
第二の実施態様によれば、標識化試薬は、下記の式(Ｃ)：
0005542666.tif 000004
［式中：
・Ｒ１は、１つの検出可能な標識、または少なくとも１つの多量体構造によって互いに連結される少なくとも２つの検出可能な標識を表し、
・Ｒ３及びＲ４は、互いに独立であり、Ｈ、ＮＯ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、Ｉ、Ｒ２-(Ｌ)ｎ-Ｙ-Ｘ-、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲ２、Ｒ、ＮＨＣＯＲ、ＣＯＮＨＲ又はＣＯＯＲを表わし、ここでＲがアルキル又はアリールであり、
・Ｌは、少なくとも２つの共有結合の直鎖を含むリンカーアームであり、
・ｎは１に等しい整数である］
である。
【００１９】
第三の実施態様によれば、標識化試薬は、式（Ｅ）：
0005542666.tif 000005
である。
【００２０】
いかなる実施態様においても、ニトロ基がメタまたはパラ位にあるという点で、試薬は特に特徴づけられる。
有利なある実施態様において、基Ｒ１は、式（Ｆ）：
0005542666.tif 000006
のD-ビオチン残基から成る。
【００２１】
本発明は、同様に、上記の標識化試薬を合成する方法に関し、前記方法は次の工程を含む：
ａ）カルボン酸誘導体をラクトンのエノラートと反応させ（クライゼン縮合）、環状前駆体を形成すること、
ｂ）前記環状前駆体をハロゲン酸によって開き、続いてハロゲン化芳香族ケトンを形成すること、
ｃ）ハロゲン化芳香族ケトンのカルボニル官能基を保護基によって保護し、被保護前駆体を形成すること、
ｄ）前記被保護前駆体にアミノ化反応（ガブリエル反応）を受けさせ、アミノ化前駆体を形成すること、
ｅ）前記アミノ化前駆体をアミン官能基を解放するために脱保護し、前記アミン官能基を検出可能な標識と反応させ、そのカルボキシル官能基を活性化し、検出可能な標識を含む前駆体を形成すること、
ｆ）標識された前駆体は、カルボニル官能基の脱保護のための反応を受けさせ、標識されたカルボニル化前駆体を形成すること、及び最後に
ｇ）標識されたカルボニル化前駆体を、カルボニル官能基のジアゾ官能基（バンフォード・スティーヴンズ反応）への変換によって上記の通りに標識化試薬に変換する工程。
【００２２】
ある実施形態において、生体分子、特に核酸を標識する方法は、上記の通りに、実質的水性緩衝液の均一溶液において、試薬に生体分子を接触させることを含む。
本発明は、同様に、上記の方法によって得られる標識された生体分子に関する。
また、本発明は、一本鎖又は二本鎖を標識化し、断片化する核酸の方法に関し、
・核酸を断片化すること；
・上記の試薬から選択される標識化試薬を介して断片の少なくとも一つに標識を取り付け、前記試薬を前記断片の少なくとも一つのリン酸に共有結合で、優勢的に結合させる工程を含む。
【００２３】
ある実施態様において、方法は、断片化及び標識化が２工程で実施されることを特徴とする。
他の実施態様では、方法は、断片化及び標識化が１工程で実施されることを特徴とする。
いかなる実施態様においても、方法は、標識化が実質的水性均一溶液において行われるという点を特徴とする。
いかなる実施態様においても、方法は、断片化が酵素的に、物理的に又は化学的に実施されることを特徴とする。
本発明は、同様に、上記の任意の実施態様に従った方法により得られる標識された核酸に関する。
更に、本発明は、例えば上に開示した標識された核酸を含む標的核酸を検出するためのキットに関する。
また、本発明は、その上に上記の試薬が結合される固体支持体にも関する。
【００２４】
また、本発明は核酸を捕獲する方法であって、
・直接または間接的に、少なくとも一つの生体分子又は核酸、ジアゾメチル官能基を有する核酸又は生体分子を結合させた固体支持体を提供すること、
・前記支持体に遊離した核酸を含みうる生物試料を接触させること、及び
・分子が共有結合で少なくとも核酸に結合されている前記固体支持体を洗浄する工程を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
添付の実施例と図は、特定の実施態様を表わすものであり、本発明の範囲を限定するものとは見なされない。
【図１】図１は、本発明による分子によって、ＲＮＡ又はＤＮＡ形態の一本鎖核酸の標識化を例示する反応スキームを示す。
【図２】図２は、メタ・ニトロＤＫＢ分子を合成する方法の反応スキームを示す。
【図３】図３は、パラ・ニトロＤＫＢ分子を合成する方法の反応スキームを示す。
【図４】図４は、特許出願WO-A-02090319に記載されている第二世代の［Ｂｉｏ−ＥＧ３］２−ＰＤＡＭ分子（以下にＢＢＰと称される）と比較した、液体培地中のＤＫＢの比較安定性を示す。
【図５】図５は、ＢＢＰと比較した、乾燥形態のＤＫＢの比較安定性を示す。
【図６】図６は、標識ＢＢＰ、メタ・ニトロＤＫＢ、及びパラ・ニトロＤＫＢにより、各標識の濃度４５ｍＭで標識された、精製後のＲＮＡアンプリコンの結果を示す。
【図７】図７は、標識ＢＢＰ、メタ・ニトロＤＫＢ、及びパラ・ニトロＤＫＢにより、各標識の濃度は２ｍＭで、３ｍＭのＨＣｌの存在下で標識された、未精製のＲＮＡアンプリコンの結果を示す。
【図８】図８は、標識メタ・ニトロＤＫＢ及びパラ・ニトロＤＫＢによって、各標識の濃度は３ｍＭで、３ｍＭのＨＣｌの存在下で標識された、ＲＮＡアンプリコンの時間に応じた結果を示す。
【図９】図９は、使用した技術（本発明に従って、あるいはKreatechのＵＬＳ（汎用標識システム）のどちらか）に応じたＲＮＡアンプリコンの標識化の有効性の比較を示す。
【図１０】図１０は、本願明細書で使用される分子の概要である。
【００２６】
後述する実施例において、以下の略語を使用する：
・Ａｒ：芳香族、
・ｓ：一重項、
・ｄ：二重項、
・ｔ：三重項、
・ｑｕ：五重項、
・ｍ：分離不可能な複合体、
・Ｍ：多重項、
・ＨＰＬＣ：高圧液体クロマトグラフィー、
・ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー、
・ＮＭＲ：核磁気共鳴、
・ＲｆまたはＴＲ：保持時間、
・ＤＭＳＯ-ｄ６：重水素化ジメチルスルホキシド、
・ＤＭＣＦ：ジメチルシクロヘキシルアンモニウム・ホルマート、 
・ＣＤＣｌ３：重水素化クロロホルム、及び 
・ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド、
・ＤＣＭ：ジクロロメタン
・ＭｅＯＨ：メタノール
・ＡＣＮ：アセトニトリル
・ミリＱ水：ミリポア超純水
・ＤＭＡＣ：ジメチルアミノ桂皮アルデヒド。
【００２７】
ＤＫＢ化合物の合成と分析の一般的条件：
これらの条件は、下記の実施例１、２、３及び４に適用できる。
ＨＰＬＣ条件(Waters Alliance 2795 HPLC system, diode array detector PDA 996, Empowerソフトウェア, version 2, 及び Waters XTerra MS C18 4.6x30 2.5 μm)：
１）基本的方法：
溶出剤Ａ：ミリＱ水
溶出剤Ｂ：ＡＣＮ
溶出剤Ｃ：５００ｍＭのアンモニア水、ｐＨ１２
これは、２０分間の１%から６４％のアセトニトリル（一定の５ｍＭのアンモニア水、ｐＨ＝９）の、直線濃度勾配に対応する。
２）ＤＭＣＦ（ジメチルシクロヘキシルアンモニウム・ホルマート）方法：
溶出剤Ａ：ミリＱ水
溶出剤Ｂ：ＡＣＮ
溶出剤Ｃ：５００ｍＭのＤＭＣＦ、ｐＨ７
これは、２０分間の１%から６４％の５ｍＭのＤＣＭＦ含有アセトニトリル（ｐＨ＝７）の直線濃度勾配に対応する。
ＤＭＣＦの５００ｍｍｏｌ／ｌ溶液を、３７ｍｌのジメチルシクロヘキシルアミン、９．４ｍｌの純粋なギ酸及び２００ｍｌの水から調製する。ｐＨを７に合わせ、溶液は水により５００ｍｌにした。
３）一般的な合成条件：
薄層クロマトグラフ分析は、Alugram（登録商標）Macherey-Nagel SIL G/UV254 4x8 cm シリカプレートで、２５４ｎｍのＵＶ検出により、又はビオチン化された生成物の場合はＤＭＡＣにより実施した。
生成物は、Flukaシリカゲル６０（４０-６３μｍ）でシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。フラッシュクロマトグラフィー（アルゴン下での運転）による分離の条件は、Clark Still et al. (Clark Still, W.; Kahn, M.; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978, 43, 2923-2925)に記載されている条件、すなわちシリカの高さが１５ｃｍに固定されること、速度５ｃｍ／分で運転すること、量に応じたカラムの直径及び精製される生成物のＲｆを厳密に守ることである。
ＮＭＲスペクトルは、Bruker ２００ＭＨｚ分光器に記録された。ケミカルシフト（δ）は、内標準として使用される溶媒のピークに比較して、ｐｐｍで示す（２５℃において、ＣＤＣｌ３：７．２４ｐｐｍ；ＤＭＳＯ−ｄ６：２．４９ｐｐｍ；Ｄ２Ｏ：４．８０ｐｐｍ）。スペクトルは、以下の省略形を使用して記載されている：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｑｕ＝五重項、ｍ＝分離不可能な複合体、Ｍ＝多重項。 
質量スペクトル（ＭＳ）は、２〜１０μｌ／分でシリカチューブによる注入、ポジティブモードのエレクトロスプレー・イオン化法によってＬＣＱ-イオントラップ計測器（Thermofinnigan、サンノゼ、CA、米国）で得られた。使用する主要な溶媒は、ＤＣＭ及びＭｅＯＨである。
【００２８】
実施例１：メタ・ニトロＤＫＢの合成：
目的：
ＤＫＢ分子：メタ・ニトロＤＫＢの合成の実施可能性を示す。
手順： 
合成の詳細を図２に示す。それは、市販されている、塩化メタ・ニトロベンジル（塩化3-ニトロベンゾイル）の分子から始まる(Aldrich, Saint Quentin Fallavier, フランス)。
【００２９】
分子１
マグネシウム・エトキシド（5.41g; 0.0473モル）をクロロベンゼン（33ml）に、続いてα-アセチル-γ-ブチロラクトン（5.29ml; 0.0492モル）に懸濁し、懸濁液は、アルゴン下に置いて、撹拌し、７５℃で３時間加熱する。反応混合物は周囲温度まで冷却された後、塩化3-ニトロベンゾイル（10g; 0.0539モル）のクロロベンゼン（16.4ml）の溶液を加えて、系を４０℃で２時間加熱した。
混合物は、２５ｍｌの１Ｍ硫酸によって加水分解される前に１０℃まで冷却し；系をデカントし、有機相（上相）を回収し、５％の炭酸水素ナトリウム溶液によって洗浄される。次に、最終的に直径７ｃｍ及び高さ１０．５ｃｍのシリカゲルカラムで、溶出速度５ｃｍ／分により精製する前に、有機相を減圧下で乾燥するまで蒸発させる。第１相において、カラムに通される溶出剤はシクロヘキサン／酢酸エチルの７０／３０混合物、続いて５０／５０混合物である。期待される生成物を含む分画を合わせて、乾燥まで蒸発し、生成物１を得て（8.17g; 収率＝73.5%）、続く反応において直接使用する。
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール：９５／５
ＨＰＬＣ：ＤＭＣＦ法；ＴＲ＝７．７分
【００３０】
分子２
分子１（5.50g; 0.0234モル）を４８％強度の臭化水素酸水溶液（33ml;6v)に懸濁し、２時間環流する。溶液を周囲温度に冷却した後、水相を３０ｍｌのジクロロメタンによって３回抽出する。有機相は、５％の炭酸水素ナトリウムによって逆抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発した。これにより生成物２が得られる（6.06g；収率＝95.8%）。
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール：９５／５ 
ＨＰＬＣ：ＤＭＣＦまたはベーシック法；ＴＲ＝１３．６分
1H NMR (200 MHz, DMSO): 2.416 ppm (qu, 2H, CH2-CH2Br), 3.426 ppm (t, 2H, CH2Br), 3.279 ppm (t, 2H, CH2-CO), 7.738 ppm (t, 1H, Ar), 8.328 (d, 1H, Ar), 8.457 (d, 1H, Ar), 8.837 (s, 1H, Ar).
【００３１】
分子３
ディーン・スターク装置を載せた丸底フラスコの中で、化合物２（4.00g; 14.7mmol）、エチレングリコール（2.87ml; 51.4mmol）、パラ‐トルエンスルホン酸（139.6mg; 7.35mmol）及びトルエン（50ml; 12.5v）を混合し、次に混合物は合計７時間（１３０℃の設定温度で５．５時間、次に１５０℃で１．５時間）還流する。反応を完了し、トルエンを減圧下で蒸発させ、残留物を７０ｍｌの酢酸エチルに溶解し、５０ｍｌの２５０ｍｍｏｌ／ｌの炭酸水素ナトリウム溶液によって２回洗い、次に５０ｍｌの水で２回洗い、有機相を硫酸ナトリウムを通じて乾燥し、濾過し、乾燥まで蒸発して、シリカゲルのクロマトグラフィー(Φ = 7 cm, h = 7 cm, f = 5 cm/分)で、シクロヘキサン／酢酸エチル：８５／１５の溶出剤により精製した。このカラムの後、化合物３を得る（3.70g；収率＝79.6%）。
ＴＬＣ溶出剤：シクロヘキサン／酢酸エチル：８５／１５
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１５．３分
1H NMR (200 MHz, DMSO): 1.90-2.10 ppm (m, 4H, CH2-CH2-CH2Br), 3.425 ppm (t, 2H, CH2Br), 3.798 ppm (t, 2H, CH2-O), 4.081 ppm (t, 2H, CH2-O), 7.561 ppm (t, 1H, Ar), 7.75-7.85 ppm (m, 1H, Ar), 8.10-8.25 (m, 1H, Ar), 8.30-8.35 (m, 1H, Ar) 
【００３２】
分子４
生成物３（3.70g; 11.7mmol）をＤＭＦ（40ml、0.3M）に溶解し、次にフタルイミドカリウムの全量を一度に加え、混合物を１５５℃で１５分間加熱する。ＤＭＦを減圧下で蒸発させ、次に蒸発残留物を６０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、６０ｍｌの０．１モル／ｌの水酸化ナトリウム溶液によって洗浄する；水相を３０ｍｌのジクロロメタンによって逆抽出し、２つの有機相を合わせて、硫酸ナトリウムの層を通じて乾燥し、つづいて溶媒の蒸留によって乾燥まで溶液の濾過と蒸発を行う。残留物をエタノールに溶解し（55ml; 12 v)、１０℃に冷却する前に２０分間環流で加熱し（溶解が完了しない）、生成物を沈殿させて、ガラスフリットで吸引によりろ過し；生成物４は、９．２ｍｌのエタノールで２回洗浄し、次に減圧下で乾燥させた（3.99g；収率＝89.1%）。
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１４．９分
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : 1.604-2.005 ppm (m, 4H, CH2-CH2-CH2-N), 3.677-3.783 ppm (m, 4H, O-CH2-CH2-O), 4.019 ppm (t, 2H, CH2-N), 7.500 (t, 1H, Ar), 7.600-8.000 (m, 4H, phthalimide), 8.150 (d, 1H, Ar), 8.300 (s, 1H, Ar)
【００３３】
分子５
物質４（3.987g; 10.4mmol）をメタノール（210ml; 53 v)に懸濁し、次にヒドラジンと周囲温度で混合する（15.2ml; 313mmol）。反応は２０分後に終了する。反応混合物は乾燥するまで蒸発させ、残留物を１００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、１００ｍｌの水で洗う;得られた水相を、１００ｍｌのジクロロメタンで２回抽出し、続いて１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出する。全ての有機相を合わせて、減圧下で蒸発させ、シリカゲルカラム（Φ=5cm、h =15cm 、f = 5cm/分）に置き、溶出剤として、ジクロロメタン/メタノール/アンモニア水：90/10/1を使用する。
最後に化合物５を得た（2.11g；収率＝80.1%）。
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール/アンモニア水：90/10/3
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝４．８分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.464-1.666 ppm (m, 4H, CH2-CH2-NH2), 1.904-1.985 ppm (M, 2H, -CH2-CH2-CH2-NH2); 2.689 ppm (t, 2H, CH2-NH2), 3.753-4.115 ppm (m, 4H, O-CH2-CH2-O), 7.540 ppm (t, 1H, Ar), 7.837 ppm (d, 1H, Ar), 8.147 ppm (d, 1H, Ar), 8.331 ppm (s, 1H, Ar)
【００３４】
分子６
ビオチン（6.00g; 24.5mmol）を無水ＤＭＦ(60ml; 10 v)に溶解し、アルゴン下で溶液をピリジン（2.44ml; 30.0mmol）と、続いてペンタフルオロフェニル・トリフルオロアセタート（5.258ml; 30.5mmol）と混合し、この混合物は３０分間４０℃に加熱されて、次にオーバーナイトで周囲温度まで戻される。チェック後−反応は終了している−ＤＭＦを蒸発させ、残留物を２００ｍｌのジクロロメタンに溶解する;生成物は懸濁したままであり、吸引によりろ過し、濾過ケーキを５ｍｌのジクロロメタンで３回洗い、次に固体生成物は２５℃のオーブン中で減圧下で乾燥される。
これにより、非常にきれいな生成物がＴＬＣ（6.18g; 61.3%）中に得られる。
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール：90/10 
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１０．０分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.2-1.8 ppm (m,6H), 2.3-3.4 ppm (m, 5H), 4.0-4.4 ppm (m, 2H), 6.1-6.6 ppm (m, 2H)
【００３５】
分子７
試薬５（500mg; 1.98mmol）を６０℃で、ＤＭＦ（5ml; 10v）とトリエチルアミン（2.22ml; 15.8mmol）の混合物に溶解し;平行して、化合物６も６０℃で４．９ｍｌのＤＭＦに溶解する。６の溶液を５の溶液に混合し、混合物はオーバーナイトで周囲温度で撹拌する。それを更なる処理をせず、乾燥まで蒸発させる。
【００３６】
分子８
物質７（948mg; 1.98mmol）を８０％酢酸（５ｍｌ；５．３ｖ）と、環流で１６時間反応させる（ＮＢ：６Ｍの塩酸を使用することも可能であり、それは非常に良く反応する）。反応はＨＰＬＣによりモニターされ、完了させなければならない。酢酸を、減圧下、蒸留により蒸発させ、次に残留物を５００ｍｌのジクロロメタン/メタノール  90/10混合物に溶解し、２５０ｍｌの０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液により洗浄する。このように精製された有機相を硫酸ナトリウムを通じて乾燥させ、濾過し、乾燥まで蒸発させる。これにより化合物８が得られる（244.8mg; 28.4%).生成物は更なる処理をすることなしに粗形態で使用される。
ＴＬＣ溶出剤：使用しない；開始生成物を、最終的な生成物から区別することが不可能である
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝９．９分
【００３７】
分子９
化合物８を、ＤＭＦ（2.49ml; 12.3 v)とメタノール（12.5ml; 51 v)の混合物に溶解し、酢酸（640μl; 11.1mmol）と混合する；開始生成物は可溶性でない。最後に、ヒドラジン（271μl; 5.57mmol）を加え、試薬が溶解すると、溶液は黄色になる。周囲温度で撹拌し５時間後に、全ての溶媒を蒸発させ、１０ｍｌの水により３回、同時蒸発させる。粗反応生成物を５℃で１５ｍｌチューブ中の８ｍｌのミリＱ水に溶解し、生成物を沈澱させ、系を３０秒撹拌し、次にチューブを３分間、８５００ｒｐｍで遠心分離する;上澄みを抜き、操作を２回繰り返す。最後の洗浄の間に、水のｐＨを確認すると、実際に７である；もはや酸は残っていない。
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝８．４分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.1-1.9 ppm (m, 8H, -CH2-), 2.085 ppm (t, 2H, CO-CH2), 2.50-2.90 ppm (m, 4H, biotin), 3.00-3.20 ppm (m, 3H), 3.30-3.40 ppm (m, 2H), 4.0-4.4 ppm (m, 2H, biotin), 6.30 and 6.50 ppm (2s, 2H, NH biotin), 7.23 ppm (s, 2H, NH), 7.866 ppm (d, 2H, Ar), 8.155 (s, 2H, Ar)
【００３８】
分子１０
粉末９（250mg; 0.56mmol）をＤＭＦ（4.65ml; 18.6 v)に溶解し、−５℃に冷却し、テトラメチルグアニジン（571μl; 4.53mmol）に、続いて３Åモレキュラーシーブ（957mg）及び酸化マンガン（3.03g; 45.3mmol）に混合する。反応混合物は、４０分間、アルゴン下、−５℃で撹拌し、次に１ｃｍのセリットのプラグでろ過し；次にろ液が無色になるまで、プラグをメタノールでリンスする。このろ液を回収し、減圧下で蒸発させる（浴温;最高３５℃）。蒸発残留物を、１５ｍｌチューブ中の４ｍｌのジクロロメタン/メタノール  ９０／１０混合物に溶解し：次に４ｍｌの０．１Ｍの炭酸水素ナトリウム溶液で洗う。上澄みは、遠心の後で取り除かれる。ジクロロメタン相を３５０μｌのメタノール及び４ｍｌの炭酸水素ナトリウムと混合し、この系を混合してデカントし、水相を取り除き、最後の有機相を無水炭酸ナトリウムを使用して乾燥し、この系をろ過し、ろ液は減圧下で乾燥まで蒸発させる。これによりオレンジ粉末を得る（最後の２つの工程で、196.8mg；収率＝79.3%）。
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１１．０５分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.1-1.9 ppm (m, 8H, -CH2-), 2.058 ppm (t, 2H, CO-CH2), 2.4-3.4 ppm (m, 7H), 3.0-3.2 ppm (m, 5H), 4.0-4.3 ppm (m, 2H, biotin), 6.33 and 6.40 ppm (2s, 2H, NH biotin), 7.36 ppm (d, 1H, Ar), 7.50-7.70 ppm (m, 2H, Ar+NH), 7.80-7.90 ppm (m, 3H, Ar).
【００３９】
結果と結論：
我々は第三世代の分子を合成することが可能であることを示した。この合成は、前世代の分子に関連するものよりも非常に単純である。 
例えば、第二世代の分子は１１工程の合成を必要とし、それは比較的複雑で面倒である。
さらに、第二世代の分子のための合成経路は、あまり用途が広くない。本発明の対象である新合成経路は、ずっと用途が広い。すなわち、同じ合成経路に続いて、最終生成物分子の多様性を増やすために、他の芳香族基質を使用することができる。
【００４０】
実施例２：パラ・ニトロＤＫＢの合成：
目的：
ＤＫＢ分子、パラ・ニトロＤＫＢの合成の実現可能性を示すこと。
手順：
本来の合成を図３に示す。開始生成物は、塩化パラ・ニトロベンジル(Aldrich, St Quentin Fallavier, フランス)である。以下で合成したさまざまな分子は、実施例１に記載された同じ手順に正確に基づく。
【００４１】
分子１１
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール：95/5 
ＨＰＬＣ：ベーシック法；Ｔｒ＝１．８分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 2.40-2.90 ppm (m, 2H, CH2-CH2O), 4.432 ppm (M, 2H, CH2O), 5.153 ppm (t, 1H, C=O-CH-C=O), 8.303 ppm (d, 2H, Ar), 8.382 ppm (d, 2H, Ar)
MS: [M-H+]- at m/z = 234.3.
【００４２】
分子１２
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール：95/5 
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１３．９分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 2.189 ppm (qu, 2H, CH2-CH2Br), 3.177 ppm (t, 2H, CH2Br), 3.624 ppm (t, 2H, CH2-CO), 8.217 ppm (d, 2H, Ar), 8.334 (d, 2H, Ar)
【００４３】
分子１３
ＴＬＣ溶出剤：シクロヘキサン/酢酸エチル：85/15 
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１５．５分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.80-2.10 ppm (m, 4H, CH2-CH2-CH2Br), 3.415 ppm (t, 2H, CH2Br), 3.767 ppm (t, 2H, CH2-O), 4.077 ppm (t, 2H, CH2-O), 7.669 ppm (d, 2H, Ar), 8.186 (d, 2H, Ar)
【００４４】
分子１４
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１５．１分
1H NMR (200 MHz, CDCl3) : 1.50-1.65 ppm (m, 4H, CH2-CH2-CH2-N), 3.65-3.70 ppm (m, 4H, CH2-O and CH2-N), 4.00-4.10 ppm (M, 2H, CH2-O), 7.55-7.65 (M, 2H, Ar), 7.65-7.75 (M, 2H, phthalimide), 7.80-7.90 ppm (M, 2H, phthalimide) 8.192 ppm (M, 21H, Ar)
【００４５】
分子１５
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール/アンモニア水：90/10/3
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝５．０分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.30-1.60 ppm (m, 4H, CH2-CH2-NH2), 1.80-2.00 ppm (M, 2H, -CH2-CH2-CH2-NH2); 2.678 ppm (t, 2H, CH2-NH2), 3.769 ppm (M, 2H, O-CH2), 4.060 ppm (M, 2H, O-CH2), 7.66 ppm (M, 2H, Ar), 8.177 ppm (M, 2H, Ar)
【００４６】
分子１７
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝９．１分
ＴＬＣ溶出剤：ジクロロメタン/メタノール：90/10
【００４７】
分子１８
ＴＬＣ溶出剤：使用しない；最終的な生成物から開始生成物を区別することが不可能である。
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝９．０分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.2-1.7 ppm (m, 8H, -CH2-), 2.093 ppm (t, 2H, CO-CH2), 2.4-3.0 ppm (m, 2H, biotin), 3.0-3.2 ppm (m, 5H), 4.0-4.4 ppm (m, 2H, biotin), 6.34 and 6.40 ppm (2s, 2H, NH biotin),7.70-7.90 ppm (m, 2H, Ar+NH), 8.20-8.50 ppm (m, 2H, Ar), 8.63 ppm (s, 1H, Ar)
【００４８】
分子１９
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝８．２分
【００４９】
分子２０
ＨＰＬＣ：ベーシック法；ＴＲ＝１０．７分
1H NMR (200 MHz, DMSO) : 1.2-1.9 ppm (m, 8H, -CH2-), 2.066 ppm (t, 2H, CO-CH2), 2.5-3.0 ppm (m, 4H), 3.0-3.2 ppm (m, 2H), 4.00-4.40 ppm (m, 2H, biotin), 6.36 and 6.42 ppm (2s, 2H, NH biotin), 7.19 ppm (d, 2H, Ar), 7.875 ppm (t, 1H, NH), 8.133 ppm (d, 2H, Ar).
【００５０】
結果と結論：
パラ・ニトロＤＫＢ分子の合成における工程は、メタ・ニトロＤＫＢ分子の合成で上記したものと同一である；塩化メタ・ニトロベンジルまたは塩化3-ニトロベンゾイルの分子の代わりに、塩化パラ・ニトロベンジルまたは塩化4-ニトロベンゾイルの分子から開始することが、必要とされる全てである。
【００５１】
実施例３：ＢＢＰ（ｂｉｓ-ｂｉｏ-ＰＤＡＭ）分子に比較した、メタ又はパラ・ニトロＤＫＢの周囲温度における液状媒質中での安定性の例証：
目的：
第二世代の分子と比較して、ＤＫＢ分子の液状媒質における安定性を示すこと。この目的のために、加速安定性研究を極限条件下で行った。すなわち化合物を周囲温度（２２℃±１℃）で、９６／４  ＤＭＳＯ／メタノール混合物中に１２５ｍＭで保存した。これらが極端な貯蔵条件である点に注目されたい。
手順： 
図１０に明示した３つの化合物、メタ・ニトロＤＫＢ、パラ・ニトロＤＫＢ及びＢＢＰを、９６／４  ＤＭＳＯ／メタノール混合物に１２５ｍＭで溶解し、周囲温度（２２℃±１℃）で貯蔵する。クロマトグラムのピークの全ての積分により、主要生成物の分解を測定するために（the Empower 2ソフトウェアのPDA Max Plot）、連続した一定の間隔で、これらの溶液の２μｌをＨＰＬＣ（ベーシック法、Waters HPLCシステム）に注入した。次に、図４に明示するように、時間の関数としての初期化合物の純度の変化を報告する。
結果と結論：
ＢＢＰは数日以内に分解されるが（１０日目で純度＜１０％）、一方でＤＫＢはずっと安定したままである（パラ・ニトロＤＫＢでは貯蔵の２ヶ月後純度＞４０％）。電子非局在化によって及び立体効果によって、ニトロ・アリール単位アルファとジアゾ官能基の標識アルファ’の組合せはジアゾ官能基を安定させて、それによりジアゾ官能基を加水分解から影響を受けにくくする。
【００５２】
実施例４：ＢＢＰ分子と比較した、メタ又はパラ・ニトロＤＫＢの４℃における乾燥形態での安定性の例証：
目的：
第二世代のＢＢＰ分子と比較して、ＤＫＢ分子の乾燥安定性を示すこと。
手順：
３つの化合物、メタ・ニトロＤＫＢ、パラ・ニトロＤＫＢ及びＢＢＰを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１０％トレハロースとの溶液に２５０ｍＭで溶解する。溶液は、５０ｎモルのアリコートにおいて、オーバーナイトで凍結乾燥する。次に乾燥生成物を４℃で保存する。
クロマトグラムのピークの全ての積分により、主要生成物の分解を測定するために（the Empower 2ソフトウェアのPDA Max Plot）、連続した一定の間隔で、これらの溶液の１５μｌをＨＰＬＣ（Waters）に注入した。次に、図５に明示するように、時間の関数としての初期化合物の純度の変化を報告する。
【００５３】
結果と結論：
実施例３と同様だが、ＢＢＰが凍結乾燥に耐えないが（この工程の間に＞６０％分解）、一方でＤＫＢが完全に安定したままであり、特にメタ・ニトロＤＫＢが特にそうであったことが、より顕著に証明される。ジアゾ官能基に対するニトロ・アリール単位アルファとジアゾ官能基の標識アルファ’の組合せは当該官能基を非常に安定化し、加水分解から影響を受けにくくする。
【００５４】
実施例５：ＢＢＰ分子と比較した、メタ又はパラ・ニトロＤＫＢによる核酸の中間体精製を伴う標識化：
目的：
第二世代の分子（ＢＢＰ）と比較して、ＤＫＢ分子による核酸の標識化の有効性を示すこと。
この目的のために、増幅反応により得られたＲＮＡアンプリコン（マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１７４塩基配列の断片）をＤＫＢによる反応によって、ビオチンで標識する。標識化反応の生成物は、Affymetrix DNAチップ上のハイブリダイゼーションによって検出される（J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, A. Troesch et al., 1999に記載のCustom DNA Chip Combo Myco )。
手順：
以下の成分をチューブに加える：
・１８μｌの２５０ｍＭの標識溶液（ＤＭＳＯ／メタノール  ９６／４）、ＤＫＢ又はＢＢＰのどちらか、
・１２μｌのＤＭＳＯ、
・１５μｌのＮＡＳＢＡ０．５Ｘバッファー（「NucliSensベーシックキット  EasyQ」ビオメリュー）、
・３５μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
・５μｌのＮＡＳＢＡ０．１Ｘ（ＮＡＳＢＡ増幅反応、１０倍希釈、１７４塩基のアンプリコン）、
・１５μｌの２０ｍＭのＨＣｌ又は１５μｌの水、及び
・１５μｌの水（非ＨＣｌコントロールとして）。
溶液をボルテックスし、次に６５℃で１０分間インキュベートする。
核酸の精製：
標識された核酸は、製造業者によって推奨される精製プロトコルを使用して、QiaQuickカラム（PCR精製キットQiaQuick、Qiagen、ヒルデン、ドイツ）で精製した。溶出量は１００μｌである。
【００５５】
ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション：
精製後、標識された核酸は、４００μｌのハイブリダイゼーション・バッファーに移される。サンプルは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６ＳＲＮＡの「GenBank」M20940配列の解析用に設計されたＤＮＡチップにハイブリザイズさせる。このＤＮＡチップはA. Troesch et al（J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, 1999）によって記載されている。
ハイブリダイゼーション工程は、A. Troesch et alの上記刊行物に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルとバッファーを利用して、FS 450 fluidics stations (Affymetrix, Santa Clara, Californie, USA)で実施する。
ハイブリダイゼーションは、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）の結合が、以下の条件下で使用された標識のビオチンと相互作用することで明らかにされる：３００μｌの純水；３００μｌの１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７）／１ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／０．００５％の消泡剤；６μｌのＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）；６μｌのＳＡ−ＰＥ（３００μｇ／ｍｌ）。
【００５６】
ＤＮＡチップの読取り：
標識化とハイブリダイゼーションの後で、ＤＮＡチップの表面に放出される蛍光の読取及びシグナル強度と相同性パーセンテージ用データの作成を、Affymetrix(Scanner Gene Chip Array 及びGCOSソフトウェア)から提供される読取りシステムとソフトウェアによって実施する。読取りシステムは、rfu（相対的蛍光単位）で表示されるシグナル強度とバックグラウンド・ノイズ強度を提供する。相同性パーセンテージをリファレンス配列（この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列）と比較して示す（図６、続いて図７及び図９でも、%BCは%Rightと等しい）。
シグナルの正中の強度（Med）及びバックグラウンド・ノイズの正中の強度（Med Bckgd）、相同性パーセンテージ（%Right)を、標識ＢＢＰ、メタ・ニトロＤＫＢ及びパラ・ニトロＤＫＢの図６のグラフに示す。
【００５７】
結果と結論：
一般的に言って、求められる主要なパラメーターは、９０％より高い相同性パーセンテージである。第２に、高い特異的なシグナルと低いバックグラウンド・ノイズが求められる。
この実施例は、添加塩酸の非存在下で、標識メタ・ニトロＤＫＢが最高の結果を呈することを示す。添加の３ｍＭ塩酸の存在下では、標識メタ・ニトロＤＫＢとパラ・ニトロＤＫＢがＢＢＰ基準標識より良好な結果を呈する。
全ての場合において、ＤＫＢの非常に高い安定性にかかる評価については、それらの標識能力は第二世代のＢＢＰ基準分子の標識能力に勝っていない場合であっても少なくとも同じである点において、後の標識が前の世代の分子に比べ優れていることを示す。
【００５８】
実施例６：ＢＢＰ分子と比較した、メタ又はパラ・ニトロＤＫＢによる核酸の中間体精製を伴わない標識：
目的：
目的は、過剰の標識を精製しない不利な条件下で実施例５と同じことを証明することである。
手順：
１ｍｌチューブ中に、以下の成分を混合する：
・５μｌの８ｍＭの標識溶液（DMSO/メタノール  96/4）。標識はＤＫＢかＢＢＰのどちらかを含む。
・５μｌのＮＡＳＢＡ  ０．１Ｘ  （ビオメリューのNucliSensベーシックキット）、
・５μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び
・５μｌの２０ｍＭのＨＣｌ。
溶液をボルテックスし、次に６５℃で１０分間インキュベートする。
この方法で標識された核酸は精製しないで、直接ハイブリダイズする。
【００５９】
ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション：
標識された核酸は、精製せずに、４８０μｌのハイブリダイゼーション・バッファーに移される。サンプルは、前の実施例と同じ方法でＤＮＡチップにハイブリダイズさせる。
ＤＮＡチップの読取り：
標識ＢＢＰ、メタ・ニトロＤＫＢ及びパラ・ニトロＤＫＢについての強度、バックグラウンド・ノイズ、及び相同性パーセンテージに関する結果を図７のグラフに示す。
【００６０】
結果と結論：
この実施例は、標識メタ・ニトロＤＫＢ及びパラ・ニトロＤＫＢが、それらがＢＢＰ基準分子に比較して減少したバックグラウンド・ノイズを呈することを意味する構造を有することを示す。特異的なシグナルも向上し（特にパラ・ニトロＤＫＢの場合）と、相同性パーセンテージは、ＢＢＰでは比較的低いが、メタ・ニトロＤＫＢでは極めて高くなっている。前の世代に比較して、第三世代の分子の優位性が、前の世代に比較して、再度示される。
【００６１】
実施例７：メタ又はパラ・ニトロＤＫＢにより標識したアンプリコンの２４時間にわたる安定性の評価：
目的：
目的は、標識したＲＮＡアンプリコンがその蛍光強度を失うことなしに、ＤＮＡチップ上に２４時間までハイブリダイズできることを証明することである。これは、ＲＮＡ−標識の結合の安定性を示す。
手順：
以下の成分をチューブに加える：
・５μｌの１０ｍＭの標識（メタ・ニトロＤＫＢ又はパラ・ニトロＤＫＢ）ＤＭＳＯ／ＭｅＯＨ（９６／４）溶液、
・５μｌのＮＡＳＢＡ  ０．１Ｘ  増幅生産物（ビオメリューのNucliSensベーシックキット）、
・５μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、及び
・５μｌの水。
溶液をボルテックスし、次に６５℃で１０分間インキュベートする。
【００６２】
核酸の精製：
標識した核酸を、製造業者によって推奨される精製プロトコルを使用して、QiaQuickカラムで（PCR精製キット、Qiagen）精製した。溶出量は１００μｌである。
ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション：
精製後の、標識化核酸を、４００μｌのハイブリダイゼーション・バッファーに移す。
サンプルは、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６ＳＲＮＡの「GenBank」M20940配列の解析用に設計されたＤＮＡチップにハイブリザイズさせる。このＤＮＡチップはA. Troesch et al（J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, 1999）によって記載されている。
ハイブリダイゼーション工程は、８０μｌのハイブリダイゼーション混合物をチップに注入し、次にハイブリダイゼーション・オーブンにチップを４５℃で０．５時間、２時間、６．５時間又は２４時間置くことによって行った。
ハイブリダイゼーションは、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）の結合が、以下の条件下で使用された標識のビオチンと相互作用することで明らかにされる：３００μｌの純水；３００μｌの１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７）／１ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／０．００５％の消泡剤；６μｌのＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）；６μｌのＳＡ−ＰＥ（３００μｇ／ｍｌ）。
【００６３】
ＤＮＡチップの読取り：
標識化とハイブリダイゼーションの後で、ＤＮＡチップの表面に放出される蛍光の読取り、及びシグナル強度と相同性パーセンテージ用データの作成を、Affymetrix(Scanner Gene Chip Array及びGCOSソフトウェア)から提供される読取りシステムとソフトウェアによって実施する。読取りシステムは、ｒｆｕ（相対的蛍光単位）で表示されるシグナル強度とバックグラウンド・ノイズ強度を提供する。相同性パーセンテージをリファレンス配列（この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列）と比較して示す。
ハイブリダイゼーション時間を関数としたシグナルの正中の強度（Med）を標識メタ・ニトロＤＫＢ（ｍ−ＮＯ２−ＤＫＢ）及びパラ・ニトロＤＫＢ（ｐ−ＮＯ２−ＤＫＢ）について図８のグラフに示す。
それらは、蛍光シグナルが安定したままであり、ハイブリダイゼーション時間に関して上昇する傾向さえあることを示す。
【００６４】
結果と結論：
この実施例は、メタ・ニトロＤＫＢまたはパラ・ニトロＤＫＢにより標識されたアンプリコンがハイブリダイゼーションの過程において、２４時間に延長されても完全に安定したままであることを示す（特に長いハイブリダイゼーションや腫瘍学での遺伝子発現において有利である）；図８を参照。
蛍光シグナルが時間とともに増加さえすることが観察され、それはアンプリコンの良好なハイブリダイゼーションのためである（ハイブリダイゼーションの反応速度は遅い）。
そのため、これは標識-核酸の結合の安定性を証明する。
【００６５】
実施例８：本発明に記載する分子と市販の技術 (ULS RNA標識キット, Kreatech, オランダ)の標識化の効率の比較：
手順：
ＲＮＡアンプリコンは、上述のとおりＮＡＳＢＡ増幅によって調製し、ＢＢＰ、ｐ−ＮＯ２−ＤＫＢまたはｍ−ＮＯ２−ＤＫＢ分子で標識する。
以下の成分をチューブに加える：
・５μｌのＮＡＳＢＡ  １Ｘ（ビオメリューのNucliSensベーシックキット）、
・５μｌの２０ｍＭのＢＢＰ、ｐ−ＮＯ２−ＤＫＢ又はｍ−ＮＯ２−ＤＫＢのＤＭＳＯ／メタノール（９６／４）溶液、
・５μｌの１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、及び
・５μｌの水。
溶液をボルテックスし、次に６５℃で１０分間インキュベートする。
Kreatechの市販キットによる標識化を、製造業者によって推奨されるプロトコルに従って行った。要約すると、次のものを混合する：
・２０μｌのＮＡＳＢＡ  １Ｘ（ビオメリューのNucliSensベーシックキット）、
・１μｌの標識溶液、
・３μｌの１０×バッファー、及び
・６μｌの水。
溶液を８５℃で３０分間インキュベートした。
【００６６】
核酸の精製：
ＢＢＰ、ｐ−ＮＯ２−ＤＫＢ又はｍ−ＮＯ２−ＤＫＢ分子を使用して標識した核酸を、製造業者によって推奨される精製プロトコルを使用して、QiaQuickカラム（PCR精製キット、Qiagen）で精製した。
溶出量は１００μｌである。
市販のキットを使用して核酸を標識する場合、Kreatechにより推奨され提供されている精製を使用した。
最終体積は３０μｌであり、その会社によって推奨される１００μｌのブロッキング溶液を添加する。
【００６７】
ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション：
精製に続いて、標識化核酸を、４００μｌのハイブリダイゼーション・バッファー（ＢＢＰ、ｐ−ＮＯ２−ＤＫＢ又はｍ−ＮＯ２−ＤＫＢ）か、３７０μｌのハイブリダイゼーション・バッファー（Kreatech）に移す。
前記核酸を、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６ＳＲＮＡの「GenBank」M20940配列の解析用に設計されたＤＮＡチップにハイブリダイズさせる。
このＤＮＡチップはA. Troesch et al（J. Clin. Microbiol., 37(1), PP49-55, 1999）によって記載されている。
ハイブリダイゼーション工程は、A. Troesch et alの上記刊行物に記載されているハイブリダイゼーションプロトコルとバッファーを利用して、FS 450 fluidics stations (Affymetrix, Santa Clara, Californie, USA)で実施する。
ハイブリダイゼーションは、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識されたストレプトアビジン（ＳＡ）の結合が、以下の条件下で使用された標識のビオチンと相互作用することで明らかにされる：３００μｌの純水；３００μｌの１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７）／１ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／０．００５％の消泡剤；６μｌのＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）；６μｌのＳＡ−ＰＥ（３００μｇ／ｍｌ）。
【００６８】
ＤＮＡチップの読取り：
標識化とハイブリダイゼーションの後で、ＤＮＡチップの表面に放出される蛍光の読取り、及びシグナル強度と相同性パーセンテージ用データの作成を、Affymetrixから提供される読取りシステムとソフトウェアによって実施する(Gene Chip Array及びGCOSソフトウェア)。
読取りシステムは、ｒｆｕ（相対的蛍光単位）で表示されるシグナル強度とバックグラウンド・ノイズ強度を示す。
相同性パーセンテージをリファレンス配列（この場合はマイコバクテリウム・ツベルクローシスの配列）と比較して示す。
シグナルの正中の強度（Med）、バックグラウンド・ノイズの正中の強度（Med Bckgd)、及び相同性パーセンテージ（％ＢＣ）を、標識ＢＢＰ、ｍ−ＮＯ２−ＤＫＢ及びｐ−ＮＯ２−ＤＫＢについて、及び競合社のキットについて図９のグラフに示す。
【００６９】
結果と結論：
Kreatechの場合は、バックグラウンド・ノイズ（図９）から明確に分けられるシグナルを得るためには４倍以上の濃度のＲＮＡを加える必要であるが、全ての場合でＤＫＢ又はＢＢＰ分子により生成される標識より１０倍以上弱いままであるので、Kreatech（供給者によって記載されている条件を正確に適用する）のcis-platin標識を使用する技術は本発明によって提供される技術的解決法よりも非常に低い標識能力を有することがわかった。 
全ての場合において、同一性パーセンテージ（%BC）は同じままである。
従って、他の標識化技術と比較して、インター・ヌクレオシド結合上の標識化は、分子の生成にかかわりなく、非常により良好な検出感度を得ることを可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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