(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
孔径が５〜３２００μｍ、平均孔径５０〜１５００μｍの連通小孔構造を有し厚さが２ｍｍ以上のシート状又はブロック状の支持体の連通小孔構造内全体に誘導水溶液を満たした後、該支持体の上面に細胞を懸濁した培養液を供給すると共に、該支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより該支持体の下面から該誘導水溶液を吸引することによって、該細胞を懸濁した培養液を該支持体の小孔構造内全体に導入することを特徴とする多孔質細胞支持体の製造方法。
【請求項２】
誘導水溶液の使用時の動粘度が培養液の使用時の動粘度の５０〜４５０％である請求項１に記載の多孔質細胞支持体の製造方法。
【請求項３】
誘導水溶液が水、生理食塩水、緩衝液、体液又は培養液である請求項１又は２に記載の多孔質細胞支持体の製造方法。
【請求項４】
水分吸収体が、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせである請求項１から３までのいずれか１項に記載の多孔質細胞支持体の製造方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の多孔質細胞支持体の製造方法によって製造された細胞を懸濁した培養液が支持体中に導入された多孔質細胞支持体に、所定期間経過毎に更に上方から新しい培養液を供給すると共に該支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより該支持体の下面から該培養液を排出させ、培養液の交換を繰り返すことによって細胞が培養された多孔質細胞支持体を製造することを特徴とする多孔質細胞支持体の製造方法。
【請求項６】
支持体の下面に当接させる水分吸収体が、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせである請求項５に記載の多孔質細胞支持体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内部の小孔構造内全体に細胞が播種された厚さ２ｍｍ以上の多孔質細胞支持体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が播種された基質として作用する多孔質構造を持つ支持体は、細胞工学分野で一般的に使用されている。必要とされる形状に整形された支持体に播種された細胞は支持体毎に生体内に移植され使用される。この支持体中には略均一に細胞が播種されていることが望まれている。支持体は小孔構造を有する多孔質の三次元構造であるためその中心部まで細胞を懸濁した培養液（以後、単に細胞懸濁液と呼ぶことがある）で満たすことが容易ではなく、例えば厚さ２ｍｍ以上の支持体全体に亘って細胞を播種することは非常に困難であった。
【０００３】
そこで、細胞懸濁液中に微小成形体を混合し、この微小成形体に細胞凝集塊が形成するまで培養して微小成形体・細胞複合体とし、この微小成形体・細胞複合体を２次元的もしくは３次元的細胞集合体とする方法がある（例えば、特許文献１参照。）。しかし、この方法は、別途微小成形体を準備しておいてこの微小成形体に細胞凝集塊が形成するまで培養して微小成形体・細胞複合体とし、この微小成形体・細胞複合体を２次元的もしくは３次元的細胞集合体とするという多くの工程を必要とするばかりでなく、所望の外形状の支持体を得るのが容易ではないという欠点があった。
【０００４】
そこで、細胞懸濁液中に支持体を沈めてから大気圧より低い圧力あるいは真空の下におくことにより支持体中に細胞懸濁液を浸透させる方法が提案されている（例えば、特許文献２の請求項８参照。）。しかし、このように負圧を利用しただけでは支持体全体に細胞懸濁液を浸透させることは難しいため、特許文献２の方法では細胞懸濁液を浸透させる経路をレーザー光等で形成している。また負圧を利用して圧力を大きく変化させることは細胞にとって好ましい状態ではなく、更に細胞の量は懸濁液中の濃度で規定されるので実際に支持体中に含まれた細胞の量を把握することが難しいという問題もあった。
【０００５】
また、支持体上から細胞懸濁液を遠心力を用いて細胞を支持体中に導入する方法もある（例えば、特許文献３参照。）。しかしながらこの方法も、支持体全体に細胞を播種することは難しく、また細胞に大きな力が加わるため好ましくない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−１６０５９６号公報
【特許文献２】特開２００６−５０８７１７号公報
【特許文献３】特開２００７−１８１４５９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は前記の問題に鑑み、細胞を支持体の小孔構造内全体に容易に播種することができ、細胞に大きな力が加わることがなく、支持体内の細胞の量も略正確に把握することが可能な厚さ２ｍｍ以上の多孔質細胞支持体の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、孔径が５〜３２００μｍ、平均孔径５０〜１５００μｍの連通小孔構造を有し厚さが２ｍｍ以上のシート状又はブロック状の支持体の連通小孔構造内全体に誘導水溶液を満たした後、支持体の上面に細胞を懸濁した培養液（細胞懸濁液）を供給すると共に、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより支持体の下面から誘導水溶液を吸引すれば、支持体の下面から吸引される誘導水溶液と支持体の上面に供給された細胞懸濁液との間に負圧が生じ、供給された細胞懸濁液は吸引される誘導水溶液の流れに追従し誘導水溶液と入れ替わるようにして支持体の小孔構造内全体に行き亘るから、細胞を支持体の小孔構造内全体に確実に播種できることを究明して本発明を完成したのである。
【０００９】
即ち本発明は、孔径が５〜３２００μｍ、平均孔径５０〜１５００μｍの連通小孔構造を有し厚さが２ｍｍ以上のシート状又はブロック状の支持体の連通小孔構造内全体に誘導水溶液を満たした後、該支持体の上面に細胞を懸濁した培養液を供給すると共に、該支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより該支持体の下面から該誘導水溶液を吸引することによって、該細胞を懸濁した培養液を該支持体の小孔構造内全体に導入することを特徴とする多孔質細胞支持体の製造方法である。
【００１０】
また本発明に係る多孔質細胞支持体の製造方法において、誘導水溶液としては使用時の動粘度が培養液の使用時の動粘度の５０〜４５０％であれば、支持体に予め含有された誘導水溶液とこの誘導水溶液と入れ替えられる培養液とに大きな動粘度の差がないので、誘導水溶液と培養液との入れ替えがスムーズ且つ確実にできて好ましく、このような動粘度の誘導水溶液としては、水、生理食塩水、緩衝液、体液又は培養液であれば容易に吸引できて好ましく、また支持体の下面から誘導水溶液を吸引する手段が、支持体の下面に当接させた水分吸収体であるので、複雑な吸引装置を使用することなく簡便に吸引ができるのであり、その水分吸収体が、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせであれば、入手が容易で簡便に使用できて好ましいのである。
【００１１】
また前記多孔質細胞支持体の製造方法によって細胞を懸濁した培養液が支持体中に導入された多孔質細胞支持体に、所定期間経過毎に更に上方から新しい培養液を供給すると共に支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより支持体の下面から培養液を排出させ、培養液の交換を繰り返すことによって細胞を培養させれば、細胞の密度が高いより治療に適した多孔質細胞支持体を簡便に製造することができて好ましく、また支持体の下面から培養液を排出させる手段が、支持体の下面に当接させた水分吸収体であるので、培養液を簡便に排出させることができて好ましく、更に支持体の下面に当接させる水分吸収体が、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせであれば、入手が容易で簡便に使用できて好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る多孔質細胞支持体の製造方法では、孔径が５〜３２００μｍ、平均孔径５０〜１５００μｍの連通小孔構造を有し厚さが２ｍｍ以上のシート状又はブロック状の支持体の連通小孔構造内全体に誘導水溶液を満たした後、支持体の上面に細胞を懸濁した培養液（細胞懸濁液）を供給すると共に、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより支持体の下面から誘導水溶液を吸引するから、支持体の下面から吸引される誘導水溶液と支持体の上面に供給された細胞懸濁液との間に負圧が生じ、供給された細胞懸濁液は吸引される誘導水溶液の流れに追従し誘導水溶液と入れ替わるようにして支持体の小孔構造内全体に行き亘るから、細胞を懸濁した培養液を確実に支持体の小孔構造内全体に導入することができ、これによりこれまで製造が困難であった小孔構造内全体に細胞が播種された厚さ２ｍｍ以上の多孔質細胞支持体を容易に製造することができ、また製造の際に大きな力も加わらないので細胞に負担をかけることがなく、更に支持体の小孔構造内全体に播種された細胞の量も供給された細胞懸濁液の量から容易に把握することができるのである。
またこのようにして製造された小孔構造内全体に細胞が播種された厚さ２ｍｍ以上の多孔質細胞支持体は十分な厚みがあるから、非常に広い用途に使用することが可能となり、従来使用が困難であった分野においても広く利用されることが期待できるのである。
【００１３】
またこのような本発明に係る多孔質細胞支持体の製造方法において、誘導水溶液の使用時の動粘度が培養液の使用時の動粘度の５０〜４５０％であれば支持体に予め含有された誘導水溶液とこの誘導水溶液と入れ替えられる培養液とに大きな動粘度の差がないので、誘導水溶液と培養液との入れ替えがスムーズ且つ確実にでき、このような動粘度の誘導水溶液としては水、生理食塩水、緩衝液、体液又は培養液であれば容易に吸引でき、また支持体の下面から誘導水溶液を吸引する手段が、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみであるので、複雑な吸引装置を使用することなく簡便に吸引ができまた過度な吸引とならないので細胞に大きな負担をかけることがなく、更にその水分吸収体が、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせである場合には、入手が容易で簡便に使用できる。
【００１４】
前記したような本発明に係る多孔質細胞支持体の製造方法によって細胞を懸濁した培養液が支持体中に導入された多孔質細胞支持体に、所定期間経過毎に更に上方から新しい培養液を供給すると共に、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより支持体の下面から培養液を排出させ、培養液の交換を繰り返すことによって細胞を培養させると、細胞の密度が高いより治療に適した多孔質細胞支持体を簡便に製造することができ、また支持体の下面から培養液を排出させる手段が、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみであるので、培養液を簡便に排出させることができ、更に、支持体の下面に当接させる水分吸収体が、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせである場合には、入手が容易で簡便に使用できるのである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で使用する支持体は、孔径が５〜３２００μｍ、平均孔径５０〜１５００μｍの連通小孔構造を有し厚さが２ｍｍ以上のシート状又はブロック状の支持体であり、従来から使用されている材料が使用可能である。例えば、ポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル，ポリリンゴ酸及びそれらの共重合体中から選択された少なくとも一種や、コラーゲン，キトサン，ヒアルロン酸，アルジネート及びその複合体の中から選択された少なくとも一種や、リン酸カルシウム，β-TCP，α-TCP，ハイドロキシアパタイト，炭酸基含有ハイドロキシアパタイト及びそれらの複合体の中から選択された少なくとも一種を挙げることができる。これらを組み合わせて用いることもできる。
【００１６】
支持体の連通小孔構造内全体を満たすに誘導水溶液としては、その使用時の動粘度が培養液の使用時の動粘度の５０〜４５０％であれば支持体に予め含有された誘導水溶液とこの誘導水溶液と入れ替えられる培養液とに大きな動粘度の差がないので、誘導水溶液と培養液との入れ替えがスムーズ且つ確実にでき、水、生理食塩水、緩衝液、体液又は培養液が好ましく利用できる。
【００１７】
また培養液に懸濁される細胞には特に限定はないが、例えば、表皮細胞，ケラチン生成細胞，脂肪細胞，肝細胞，神経細胞，神経膠細胞，星状膠細胞，上皮細胞，乳房表皮細胞，鳥細胞，内皮細胞，間葉細胞，真皮線維芽細胞，間皮細胞，造骨細胞，平滑筋細胞，横紋筋細胞，靭帯線維芽細胞，腱線維芽細胞及び軟骨細胞，骨髄細胞，骨芽細胞，歯胚細胞，歯根膜細胞，歯髄細胞，体性幹細胞，又はＥＳ細胞等を用いることができる。
【００１８】
支持体の下面から誘導水溶液を吸引する手段が、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみであるので、複雑な吸引装置を使用することなく簡便に誘導水溶液を吸引ができ、また過度な吸引とならないので細胞に大きな負担をかけることがなくて好ましい。その際使用される水分吸収体は、支持体から適宜誘導水溶液を吸収可能な素材であれば特に限定されずに使用でき、例えば、セルロース系，紙系の濾紙，水分吸収性高分子材，無機質あるいは有機質材料から成る多孔質ブロック材等が利用できるが、特に、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせであれば、入手が容易で簡便に使用できて好ましい。
【００１９】
本発明に係る製造方法により、実際に多孔質細胞支持体を製造するには、先ず孔径が５〜３２００μｍ、平均孔径５０〜１５００μｍの連通小孔構造を有し厚さが２ｍｍ以上のシート状又はブロック状の支持体を準備する。この支持体は前述のように従来から使用されている生体吸収性高分子材料やリン酸カルシウム材料が使用可能であるが、連通した小孔構造を有していない支持体は誘導水溶液の吸引や細胞を懸濁した培養液を支持体の小孔構造内全体に導入することができないので、本発明に係る製造方法では利用することはできない。
支持体を連通した小孔構造を有するように製造する方法としては、生体吸収性高分子材料であれば溶媒に溶解させた後、所定粒径の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型する方法や、リン酸カルシウム材料であれば、特開平５−２３７１７８号公報，特開２００２−５８６８８号公報，特開２００２−１７８４６号公報や特開２００４−５９３４４号公報に記載されている方法を示すことができる。
【００２０】
次にこの支持体の連通小孔構造内全体に誘導水溶液を満たす必要があるが、この誘導水溶液は、細胞を懸濁した培養液と入れ替えるために使用される水溶液であり、当然に細胞を含んでいないので、力を加えて強制的に支持体内に導入してもよく、例えば、支持体を誘導水溶液中に浸漬して減圧状態とし、誘導水溶液を内部まで浸潤させればよい。
【００２１】
このようにして連通小孔構造内全体に誘導水溶液を満たした後、支持体の上面に細胞を懸濁した培養液を供給すると共に、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより支持体の下面から誘導水溶液を吸引することによって、細胞を懸濁した培養液を支持体の小孔構造内全体に導入するが、この支持体の上面への細胞を懸濁した培養液の供給と下面からの誘導水溶液の吸引とは略同時に行えばよい。また先に支持体の下面に当接させた水分吸収体により、支持体の下面から吸引を始めて、多くの誘導水溶液が吸収される前に速やかに、細胞を懸濁した培養液を支持体の上面に供給してもよい。また支持体の側面に枠を嵌めておけば、細胞を懸濁した培養液が支持体の外側を伝わって水分吸収体に流れることを防ぐことができる。
【００２２】
次に、多孔質細胞支持体に導入された細胞を培養するには、支持体の下面に当接させた水分吸収体のみにより支持体の下面から誘導水溶液を吸引することによって前記した細胞を懸濁した培養液を誘導水溶液と入れ替えて細胞を懸濁した培養液が支持体中に導入された多孔質細胞支持体に、所定期間経過毎に更に上方から新しい培養液を供給すると共に支持体の下面に当接させた水分吸収体により支持体の下面から培養液を排出させ、培養液の交換を繰り返せばよい。
【００２３】
支持体の下面から培養液を排出させる方法が、水分吸収体のみを支持体の下面に当接させて、水分吸収体を取り替えるだけで培養液の交換が容易にできて好ましい。またその際使用される水分吸収体は、支持体から培養液を排出させることが可能な素材であれば特に限定されずに使用できるが、特に、水分吸収体が、濾紙，紙タオル，吸取紙，加工紙から選ばれる各種の紙類、綿，石英ウール，絹，ウール，ガラスウール，レーヨン，麻，酢酸セルロース，ニトロセルロースから選ばれる各種繊維類、シリカゲル，珪藻土，セルロースパウダーから選ばれる各種多孔質性吸着材、水分吸収性高分子材料の１種又は２種以上の組み合わせであれば、入手が容易で簡便に使用できて好ましい。
【００２４】
【００２５】
このようにして製造された本発明に係る多孔質細胞支持体は、厚さ２ｍｍ以上で小孔構造内全体に細胞が播種されたり、更に培養されたりしているから、非常に広い用途に使用することが可能で、特に医療分野における貢献が極めて大きいのである。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例により具体的に示すが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２７】
＜移植細胞の準備＞
移植細胞１  ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を10％FBS，DMEM培地で懸濁した後、有核細胞数 1.8×104細胞個／cm2の密度で培養皿へ播種した。37℃にて5％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培養液を交換して非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回培養液を交換した。bFGFは５日目から3ng/mlの割合で培養液に添加した。10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（0.05％）＋EDTA（0.2mM）で５分間インキュベートして細胞を回収した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5×103細胞個／cm2の密度で細胞を二代目の継代培養皿へ播種した。
前記の37℃にて5％炭酸ガス存在下で培養するところから、５分間インキュベートして細胞を回収するところまでの操作を再度繰り返して、この二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００２８】
移植細胞２  ウサギの大腿骨・脛骨から採取した間葉系幹細胞
６週齢のウサギの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断し、DMEM培養液（10％FBS，32単位/mlペニシリン，50μg/mlストレプトマイシン）で骨髄内を洗浄した。その洗浄液を回収し、よく懸濁した後、300gで５分間遠心分離して、細胞を分離した。前記骨髄から約7×107個の有核細胞を得た。骨髄から採取した細胞を有核細胞数5×105細胞個／cm2培養フラスコへ播種し、37℃にて5％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培養液を交換し、以後３日に１回培養液を交換した。bFGFは５日目から3ng/mlの割合で培養液に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（0.05％）＋EDTA（0.2mM）で５分間インキュベートして細胞を回収した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5×103細胞個／cm2の密度で細胞を二代目の継代培養皿へ播種した。
前記の37℃にて5％炭酸ガス存在下で培養するところから、５分間インキュベートして細胞を回収するところまでの操作を再度繰り返して、この二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００２９】
移植細胞３  ラットの大腿骨・脛骨から採取した間葉系幹細胞
４週齢のラットの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯などを除いてこれを切除し、その両端を切断し、DMEM培養液（10％FBS，32単位/mlペニシリン，50μg/mlストレプトマイシン）で骨髄内を洗浄した。その洗浄液を回収し、よく懸濁した後、300gで５分間遠心分離して、細胞を分離した。前記骨髄から約7×107個の有核細胞を得た。骨髄から採取した細胞を有核細胞数5×105細胞個／cm2培養フラスコへ播種し、37℃にて5％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培養液を交換し、以後３日に１回培養液を交換した。bFGFは５日目から3ng/mlの割合で培養液に添加した。１０日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（0.05％）＋EDTA（0.2mM）で５分間インキュベートして細胞を回収した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5×103細胞個／cm2の密度で細胞を二代目の継代培養皿へ播種した。
前記の37℃にて5％炭酸ガス存在下で培養するところから、５分間インキュベートして細胞を回収するところまでの操作を再度繰り返して、この二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００３０】
＜支持体の準備＞
支持体１  ポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）ブロック
分子量250,000のDL−乳酸−グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径500μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、孔径が18〜310μｍ、平均孔径180μｍの連通小孔構造を有し、有孔率約80％、直径9ｍｍで厚さ2.2ｍｍの生体吸収性合成高分子から成るブロック状の多孔質体を作製した。
【００３１】
支持体２  ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（PLGA）＋コラーゲンブロック
支持体１を0.01％コラーゲン水溶液に浸漬して減圧状態とし、コラーゲン水溶液を内部まで浸潤させた後、室温で乾燥することによって、表面を一層コラーゲンでコートした孔径が15〜300μｍ、平均孔径170μｍの連通小孔構造を有し、有孔率約75％のブロック状の多孔質体を作製した。
【００３２】
支持体３  βリン酸カルシウム（β-TCP）多孔体
リン酸カルシウム系の直径9ｍｍで厚さ2.2ｍｍの多孔体で、例えば特開平５−２３７１７８号公報（又は特開２００２−５８６８８号公報）に記載されている方法で孔径が70〜420μｍ、平均孔径200μｍの連通小孔構造を有し、有孔率約75％の多孔質体を作製した。
【００３３】
支持体４  βリン酸カルシウム（β-TCP）多孔体＋コラーゲン
支持体３を0.01％コラーゲン水溶液に浸漬して減圧状態とし、コラーゲン水溶液を内部まで浸潤させた後、室温で乾燥することによって、表面を一層コラーゲンでコートした孔径が55〜400μｍ、平均孔径190μｍの連通小孔構造を有し、有孔率約72％の多孔質体を作製した。
【００３４】
支持体５  ハイドロキシアパタイト（HAP）多孔体
リン酸カルシウム系焼結体の直径9ｍｍで厚さ2.2ｍｍの多孔体で、例えば特開２００２−１７８４６号公報（又は特開２００４−５９３４４号公報）に記載されている方法で孔径が23〜300μｍ、平均孔径150μｍの連通小孔構造を有し、有孔率約75％の多孔質体を作製した。
【００３５】
支持体６  ハイドロキシアパタイト（HAP）多孔体＋コラーゲン
支持体５を0.01％コラーゲン水溶液に浸漬して減圧状態とし、コラーゲン水溶液を内部まで浸潤させた後、室温で乾燥することによって、表面を一層コラーゲンでコートした孔径が18〜290μｍ、平均孔径135μｍの連通小孔構造を有し、有孔率約72％の多孔質体を作製した。
【００３６】
支持体７  ポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）ブロック
分子量250,000のDL−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径500μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し，粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、孔径が546〜1446μｍ、平均孔径910μｍの通連小孔構造を有し、有孔率92％、直径9ｍｍで厚さ2ｍｍの生体吸収性合成高分子からなるブロック状の多孔質体を作製した。
【００３７】
支持体８  ハイドロキシアパタイト（HAP）分散ポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）ブロック
分子量250,000のDL−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径20μｍ前後のHAPと粒径500μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるHAP分散PLGAパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、孔径が18〜310μｍ、平均孔径180μｍの通連小孔構造を有し、有孔率80％、直径9ｍｍで厚さ2ｍｍのブロック状の多孔質体を作製した。
【００３８】
支持体９  ポリ乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）ブロック
分子量250,000のDL−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、粒径500μｍ前後の塩化ナトリウムと混合して凍結乾燥し、粉砕して脱塩することで得られるパウダー状材料を圧縮加熱成型することによって、孔径が714〜3118μｍ、平均孔径1340μｍの通連小孔構造を有し、有孔率90％、直径9ｍｍで厚さ4ｍｍの生体吸収性合成高分子からなるブロック状の多孔質体を作製した。
【００３９】
上記の通り準備した支持体を誘導水溶液であるDMEM培養液に浸漬させて減菌したデシケータに入れてから真空ポンプでデシケータ内を減圧して減圧状態とし、誘導水溶液を内部まで浸潤させた後、厚さ約0.7mmの紙系の減菌した濾紙（商品名 ２６−ＷＡ：ADVANTEC社製）の水分吸水体の上に移動して、上記の通り準備した移植細胞を下記の培養液に懸濁させて供給することにより播種し、各々の条件下で培養し、細胞移植治療材料を作製した。なお各支持体は略白色をなしており、支持体中の各移植細胞をコハク酸脱水素酵素で染色することで、各移植細胞の播種状態を確認した。
【００４０】
＜実施例１＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体１上に0.5ml供給して播種し、２時間静置した後で50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に移して回転培養器にて37℃にて２日間回転培養した。その支持体１を切断して内部を観察した結果、移植細胞１が厚さ2.2mmの支持体１の小孔構造内の略全体に播種されていた。
【００４１】
＜実施例２＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体１上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を下記する方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。培養液の交換は３日毎に培養液から支持体１を取り出し、厚さ約0.7mmの紙系の濾紙（商品名 ２６−ＷＡ：ADVANTEC社製）の水分吸水体の上に載置すると共に、支持体１上から前記骨分化用培養液を供給して支持体１内の培養液を交換した。その支持体１を切断して内部を観察した結果、実施例１と同様に移植細胞１が支持体１の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４２】
＜実施例３＞
軟骨分化用培養液（αMEM，グルコース4.5mg/ml，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10ng/mlTGF-β3，6.25μg/mlインスリン，6.25μg/mlトランスフェリン，6.25μg/mlセレン酸，5.33μg/mlリノレイン酸，1.25mg/mlウシ血清アルブミン）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体１上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例３に係る支持体１も切断して内部を観察した結果、移植細胞１が支持体１の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４３】
＜実施例４＞
脂肪分化誘導用培養液（DMEM，グルコース4.5mg/ml，10％FBS，10μg/mlインスリン，0.2 mMインドメタシン，10-6Mデキサメサゾン，0.5mM３-イソブチル-１-メチル キサンチン）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体１上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例４に係る支持体１も切断して内部を観察した結果、移植細胞１が支持体１の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４４】
＜実施例５＞
軟骨分化用培養液（αMEM，グルコース4.5mg/ml，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10ng/mlTGF-β3，6.25 μg/mlインスリン，6.25 μg/mlトランスフェリン，6.25μg/mlセレン酸，5.33μg/mlリノレイン酸，1.25mg/mlウシ血清アルブミン）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞２を支持体２上に0.5 ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例５に係る支持体２も切断して内部を観察した結果、移植細胞２が支持体２の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４５】
＜実施例６＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞３を支持体１上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例６に係る支持体１も切断して内部を観察した結果、移植細胞３が支持体１の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４６】
＜実施例７＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞３を支持体２上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例７に係る支持体２も切断して内部を観察した結果、移植細胞３が支持体２の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４７】
＜実施例８＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体３上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例８に係る支持体３も切断して内部を観察した結果、移植細胞１が支持体３の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４８】
＜実施例９＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞２を支持体４上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例９に係る支持体４も切断して内部を観察した結果、移植細胞２が支持体４の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００４９】
＜実施例１０＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞３を支持体５上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例１０に係る支持体５も切断して内部を観察した結果、移植細胞３が支持体５の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００５０】
＜実施例１１＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞３を支持体６上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例１１に係る支持体６も切断して内部を観察した結果、移植細胞３が支持体６の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００５１】
＜実施例１２＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体５上に0.5ml供給して播種し、50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例１２に係る支持体５も切断して内部を観察した結果、移植細胞１が支持体５の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００５２】
＜実施例１３＞
軟骨分化用培養液（αMEM，グルコース4.5mg/ml，10-7Mデキサメサゾン，50μg/ml アスコルビン酸２リン酸，10 ng/ml TGF-β3，6.25μg/ml インスリン，6.25μg/ml トランスフェリン，6.25μg/ml セレン酸，5.33μg/ml リノレイン酸，1.25 mg/ml ウシ血清アルブミン）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞２を支持体７上に0.5 ml供給して播種し、50 mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。続いて50 mlの骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10 % FBS，10-7Mデキサメサゾン，50 μg/ml アスコルビン酸２リン酸，10 mM βグリセロリン酸）が入った遠沈管に移して３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例１３に係る支持体７も切断して内部を観察した結果，移植細胞２が支持体７の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００５３】
＜実施例１４＞
骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10 % FBS，10-7Mデキサメサゾン，50 μg/ml アスコルビン酸２リン酸，10 mM βグリセロリン酸）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体８上に0.5 ml供給して播種し、50 mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら１週間37℃で回転培養した。実施例１４に係る支持体８も切断して内部を観察した結果，移植細胞１が支持体７の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００５４】
＜実施例１５＞
軟骨分化用培養液（αMEM，グルコース4.5mg/ml，10-7Mデキサメサゾン，50μg/ml アスコルビン酸２リン酸，10 ng/ml TGF-β1，6.25μg/ml インスリン，6.25μg/ml トランスフェリン，6.25μg/ml セレン酸，5.33μg/ml リノレイン酸，1.25 mg/ml ウシ血清アルブミン）に2×106細胞個／mlの密度で懸濁させた移植細胞１を支持体９上に0.5 ml供給して播種し、50 mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に入れて３日毎に培養液を実施例２と同様の方法で交換しながら４週間37℃で回転培養した。実施例１５に係る支持体９も切断して内部を観察した結果，移植細胞１が支持体９の小孔構造内の略全体に培養されていた。
【００５５】
＜比較例１＞
予め支持体１を培養液（αMEM）に浸漬させて減菌したデシケータに入れてから真空ポンプでデシケータ内を減圧して減圧状態とし、培養液（αMEM）を内部まで浸潤させた後に、支持体１を設置した細胞培養プレートに骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）を満たし、上から2×106細胞個／mlの密度で骨分化用培養液に懸濁させた移植細胞１を0.5ml供給して播種し、２時間静置した後で50mlの培養液が入った遠沈管に培養液と共に移して37℃にて２日間培養した。その支持体１を切断して内部を観察した結果、コハク酸脱水素酵素で染色された移植細胞１が白色の支持体１の上部に非常に濃い色の薄い層となって現れた。これは移植細胞１が支持体１の内部まで浸透せず、支持体１の上部に密集したためである。
【００５６】
＜比較例２＞
予め支持体１を培養液（DMEM）に浸漬させて減菌したデシケータに入れてから真空ポンプでデシケータ内を減圧して減圧状態とし、培養液（DMEM）を内部まで浸潤させた後に、支持体１を設置した細胞培養プレートに骨分化用培養液（αMEM，グルコース1.0mg/ml，10％FBS，10-7Mデキサメサゾン，50μg/mlアスコルビン酸２リン酸，10mMβグリセロリン酸）を満たし、上から2×106細胞個／mlの密度で骨分化用培養液に懸濁させた移植細胞１を0.5ml供給して播種し、細胞培養プレート毎５００ｇ×５分の遠心分離を行い強制的に導入を試み、２時間静置した後に50mlの培養液が入った遠沈管に培養液とともに移して37℃にて２日間培養した。この比較例２に係る支持体１も比較例１に係る支持体１と同様に、移植細胞１が支持体１の内部まで浸透せず、移植細胞１が支持体１の上部に密集していた。