(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定のジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）パラメータをＩＩ型糖尿病の存在、不在、または重度と相関させる方法であって、
患者試料から得られた一つ以上のＤＰＰ−ＩＶアイソフォームの部分的若しくは完全に分離または単離された部分の少なくとも１つのパラメータを測定するステップと、
前記測定された一つ以上のＤＰＰ−ＩＶアイソフォームのパラメータをＩＩ型糖尿病の存在、不在、または重度と相関させるステップと
を含み
前記ＤＰＰ−ＩＶアイソフォームは等電点に基づいて部分的若しくは完全に分離または単離され、
前記測定されるパラメータはＤＰＰ−ＩＶ活性であり、
連続した範囲の部分の活性が測定され、
前記連続した範囲の部分にわたって活性プロフィールを得るステップをさらに含み、
以下の群から選択された活性プロフィール特徴と糖尿病の存在を相関させることを特徴とする方法：
ａ．ｐＨ４．４以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離または単離されるアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが９０％を超えないこと、
ｂ．ｐＨ４．１５以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離または単離されるアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが６０％を超えないこと、
ｃ．連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも１０％が、ｐＨ４．４以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離または単離されるアイソフォームに存在すること、
ｄ．連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも４０％が、ｐＨ４．１５以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離または単離されるアイソフォームに存在すること、
ｅ．連続した範囲における総測定活性の少なくとも１０％と関連付けられる、ｐＨ４．４における、ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールのピーク、
ｆ．連続した範囲における総測定活性の少なくとも１０％と関連付けられる、ｐＨ４．８における、ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールのピーク、
ｇ．ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールにおける、内部陰性対照と比較して、より高いｐＨへのシフト、
ｈ．ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールにおける、陰性標準と比較して、より高いｐＨへのシフト、および
ｉ．これらの組合せ。
【請求項２】
ａ．連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも９０％が、ｐＨ４．２以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離または単離されるアイソフォームに存在すること、
ｂ．連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも６０％が、ｐＨ３．９以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離または単離されるアイソフォームに存在すること、
ｃ．ｐＨ４．２以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離または単離されるアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが、１０％を超えないこと、
ｄ．ｐＨ３．９以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で部分的若しくは完全に分離若または単離されるアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが４０％を超えないこと、
ｅ．ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールにおける、内部陽性対照と比較して、より低いｐＨへのシフト、
ｆ．ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールにおける、陽性標準と比較して、より低いｐＨへのシフト、および
ｇ．これらの組合せ
からなる群から選択された活性プロフィール特徴と糖尿病の不在を相関させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照によりその全内容が本明細書に組み込まれている、２００６年３月１３日出願の米国仮出願第６０／７８１９２４号、名称「Method of Diagnosing Disease by Isoform Profiling」、２００６年６月９日出願の米国仮出願第６０／８０４３９７号、名称「Separation and Characterization of Dipeptidyl Peptidase IV Isoforms Using Free Flow Electrophoresis (FFE)」、および２００７年３月２日出願の米国仮出願出願番号不明（整理番号Ｐ−７１４８）、名称「Separation and Characterization of Dipeptidyl Peptidase IV Isoforms and/or Isozymes Using Matrix (Free Flow) Electrophoresis」の出願日の権利を主張する。
【０００２】
本発明は、概ね、疾患または病状の診断および予後に関する。
【背景技術】
【０００３】
疾患のリスク評価または診断の現法は、しばしば、除去の過程である摩耗による診断、または侵襲的手術もしくは生検による診断に依存している。確定診断を得た後でさえ、予後は、通常、主観的要因に基づいている。
【０００４】
代謝病などのある種の疾患では、客観的な診断を行うことができる方法がしばしば厄介であり、時間がかかり、そして費用もかかる。例えば、２型糖尿病を診断する第１の方法は、血漿中の血糖レベルを評価する空腹時血漿中ブドウ糖試験である。この試験では、患者が８〜１４時間絶食する必要があり、しばしば、何時間かの間から何日間かの間に複数回の採血を必要とする。加えて、空腹時血漿中ブドウ糖試験は２型糖尿病の存在を診断するのには有用であるが、この試験は疾患予後を予測する能力が極めて制限されている。
【０００５】
医学では、疾患または病状を診断および治療するための、より非侵襲的であり、肉体的負担が少なく、かつより正確な方法を常に探求している。生物学的過程の理解が拡大し、これらの過程に関連している生化学が明らかになるにつれて、特定の疾患または病状のマーカーまたは指示体として、どの組成物が同定され得るかに関するある種の理論が発展した。プロテアーゼおよびペプチダーゼを、クラスとして、それらの、診断における有用性および患者を治療するための標的としての有用性に関して調査した。
【０００６】
一般的背景として、プロテアーゼ／ペプチダーゼは、通常、作用部位、基質選択性、および作用機序など、多くの判定規準によって分類されている。例えば、アミノペプチダーゼは、選択的に、ポリペプチドのＮ末端残基で作用し、カルボキシペプチダーゼは、選択的に、Ｃ末端で作用し、そして、エンドペプチダーゼは、これらの２つの末端の間の部位で作用する。
【０００７】
ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）は、それらの特異的基質から、ジペプチドユニット、すなわち２アミノ酸ユニットを特異的に切り出すペプチダーゼである。多くの異なったＤＰＰが存在し、基質選択性はしばしば、切断部位のすぐＮ末端側のアミノ酸残基で表現される。例えば、ＤＰＰ−Ｉ（ＩＵＢＭＢ酵素命名法ＥＣ．３．４．１４．１）は、ＸａａがＡｒｇもしくはＬｙｓであるか、またはＹａａもしくはＺａａがＰｒｏである場合を除いて、Ｎ末端ジペプチドＸａａ−Ｙａａ−｜−Ｚａａを放出するリソソームシステイン型ペプチダーゼである。ＤＰＰ−ＩＩ（ＩＵＢＭＢ酵素命名法ＥＣ．３．４．１４．２）は、ＹａａがＡｌａまたはｐｒｏである場合に優先的に、Ｎ末端ジペプチドＸａａ−Ｙａａ−｜−を放出するリソソームセリン型ペプチダーゼである。ＤＰＰ−ＩＩＩ（ＩＵＢＭＢ酵素命名法ＥＣ．３．４．１４．４）は、ペプチドに広範な活性を有するサイトゾルペプチダーゼであるが、Ｚが任意のアミノ酸である場合、ｐＨ９．２で、Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｚへの強い選択性を示す。ＤＰＰ−ＩＶ（ＩＵＢＭＢ酵素用語体系ＥＣ．３．４．１４．４）は、Ｚａａがｐｒｏでもヒドロキシプロリンでもないという条件で、Ｙａａがｐｒｏである場合に優先的に、Ｘａａ−Ｙａａ−｜−ＺａａからＮ末端ジペプチドを放出する膜結合セリン型ペプチダーゼである。
【０００８】
ＤＰＰは、生理的に重要な広範な活性に関与しており、神経系、内分泌系、免疫系、および消化系の調節と関連付けられている。ＤＰＰ活性は、タンパク質分解および酵素活性化など、多数の細胞内機能および細胞外機能で実証されている。
【０００９】
前述した特定のＤＰＰに関しては、ＤＰＰ−ＩＶならびにそれに関連したアイソフォームおよびアイソザイムまたは構造類似体、ならびにＤＰＰ−ＩＶ様の活性を示すタンパク質が広範に研究されている。ＤＰＰ−ＩＶ様の活性を示すタンパク質は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性および／または構造類似体、または「ＤＡＳＨ」と呼ばれている。ＤＰＰ−ＩＶは、限定されるものではないが、ＤＰＰ４、ＤＰ４、ＤＡＰ−ＩＶ、ＦＡＰβアデノシンデアミナーゼ複合タンパク質２、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ；Ｘａａ−Ｐｒｏ−ジペプチジル−アミノペプチダーゼ；Ｇｌｙ−Ｐｒｏナフチルアミダーゼ；ポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ；リンパ球抗原ＣＤ２６；糖タンパク質ＧＰ１１０；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ；グリシルプロリンアミノペプチダーゼ；グリシルプロリンアミノペプチダーゼ；Ｘ−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ；ｐｅｐＸ；白血球抗原ＣＤ２６；グリシルプロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ；ジペプチジル−ペプチドヒドロラーゼ；グリシルプロリルアミノペプチダーゼ；ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ；ＤＰＰ  ＩＶ／ＣＤ２６；アミノアシル−プロリルジペプチジルアミノペプチダーゼ；Ｔ細胞誘発分子Ｔｐ１０３；Ｘ−ＰＤＡＰ（Ｂｕｒｇｅｓｓら、特許文献１参照）を含めた多くの名前で呼ばれているＩＩ型膜タンパク質である。
【００１０】
セプラーゼ、線維芽細胞活性化タンパク質α、ＤＰＰ６、ＤＰＰ８、ＤＰＰ９、アトラクチン、Ｎ−アセチル化−α−結合酸性ジペプチダーゼＩ、ＩＩ、およびＬ、静止細胞プロリンジペプチダーゼ、胸腺特異的セリンプロテアーゼ、ならびにＤＰＰ  ＩＶ−βなど、多数のＤＡＳＨタンパク質が報告されている（非特許文献１参照）。
【００１１】
ＤＰＰ−ＩＶは、腸、肝臓、肺、腎臓、および胎盤を含めた様々な異なった組織の上皮細胞および内皮細胞上で構成的に発現される（非特許文献２、３参照）。ＤＰＰ−ＩＶは、循環Ｔリンパ球上で発現されており、細胞表面抗原であるＣＤ−２６と同義であることが示されている（非特許文献４参照）。膜結合型に加えて、ＤＰＰ−ＩＶは可溶型でも存在し、ＤＰＰ−ＩＶ活性は血液血漿および滑液などの体液中で見出すことができる（非特許文献４、５参照）。
【００１２】
ＤＰＰ−ＩＶは、神経ペプチド代謝、Ｔ細胞活性化、細胞接着、腎臓および腸でのプロリン含有ペプチドの消化、ＨＩＶ感染およびアポトーシス、ならびにある種のメラノーマ細胞の腫瘍形成能の調節で重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献６、７参照）。
【００１３】
ＤＰＰ−ＩＶの天然基質には、数種のケモカイン、サイトカイン、神経ペプチド、循環ホルモン、および生理活性ペプチドが含まれる（非特許文献８参照）。ＤＰＰ−ＩＶは、ペプチドホルモンの代謝およびアミノ酸輸送の調節における主要な役割が示唆されている（非特許文献９参照）。
【００１４】
ＤＰＰ−ＩＶ発現は、分裂促進性または抗原性の刺激で、Ｔ細胞で増大するが、これは免疫系での役割を示唆している（非特許文献６参照）。サイトカイン産生、ＩＬ−２媒介細胞増殖、およびＢ細胞ヘルパー活性などのＴリンパ球の他の様々な機能も、ＤＰＰ−ＩＶ活性に依存していることが示されている（非特許文献１０参照）。加えて、ＤＰＰ−ＩＶは、Ｔ細胞活性化中および増殖中に同時刺激機能を有するようである（非特許文献１１参照）。
【００１５】
ＤＰＰ−ＩＶは、細胞外酵素であるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）を局在化させるための膜固定化機能（非特許文献１２参照）、ならびにコラーゲンおよびフィブロネクチンへの結合による細胞マトリックス結合への参加（非特許文献１３参照）を含めた他の生物学的過程に関与している。
【００１６】
ＤＰＰ−ＩＶは、内分泌調節および代謝生理における役割も演じていると考えられている。例えば、ＤＰＰ−ＩＶは、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）のアミノ末端Ｈｉｓ−Ａｌａジペプチドを切断して、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを生成し、それによって、ＧＬＰ−１に対する生理反応を短縮する。ＤＰＰ−ＩＶは、その基質にインシュリン分泌性ホルモンＧＬＰ−１および胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）が含まれ、これらは、それらのＮ末端アミノ酸２残基が除去されることによって不活性化されるので、グルコース代謝の制御に関係付けられている（非特許文献１４参照）。
【００１７】
正常な生理機能に加えて、ＤＰＰは、癌、自己免疫疾患、心臓血管疾患、代謝病、および感染性疾患を含めた疾患状態におけるそれらの役割が研究されている。
【００１８】
例えば、ＤＰＰ−ＩＶは肺転移性乳癌細胞および前立腺癌細胞の接着分子であることが示唆されている（非特許文献１５参照）。良性前立腺肥大症を有する患者からの組織ホモジネート中、およびプロスタトソーム（ｐｒｏｓｔａｔｏｓｏｍｅ）中で高ＤＰＰ−ＩＶ活性が見出されている（非特許文献１６参照）。
【００１９】
自己免疫疾患である乾癬、関節リウマチ（ＲＡ）、および扁平苔癬の患者からのヒト皮膚線維芽細胞で高レベルのＤＰＰ−ＩＶ発現が見出されている（非特許文献１７参照）。
【００２０】
ＤＰＰ−ＩＶは、肥満および食欲調節など、多くの代謝病に関連している。例えば、より広範に研究されているＤＰＰ−ＩＶ関連代謝病の１つが２型糖尿病である。Ｍａｎｎｕｃｃｉらは、糖尿病における慢性高血糖とＤＤＰ−ＩＶとの間の相関関係を定義し、記述している。この研究は、循環ＤＰＰ−ＩＶ活性がＩＩ型糖尿病における高血糖の度合いと直接的に相関していると結論付けている。
【００２１】
他の研究は、ＤＰＰ−ＩＶと、血糖レベルを調節するホルモンカスケードに関与する様々なホルモンとの間の相関を論じている。これらの研究は、インシュリン分泌に重要なホルモンをＤＰＰ−ＩＶが分解すると結論付けている。詳細には、ＤＰＰ−ＩＶがグルカゴン様１ペプチド（ＧＬＰ−１）を分解し、その結果、インシュリン分泌の低減がもたらされ、それゆえに血糖の増大がもたらされると示唆されている。この現象に基づいて、ＩＩ型糖尿病の治療用にＤＰＰ−ＩＶの阻害剤が開発されている（非特許文献１８参照）。
【００２２】
ＤＰＰ−ＩＶは、ＣＤ４+Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスの侵入および感染性に明らかに必須である（非特許文献１９参照）。したがって、ＤＰＰ−ＩＶの抑制が、この機構も抑制するかもしれないという示唆がいくらかある。
【００２３】
【特許文献１】米国特許第７１６９９２６号明細書
【非特許文献１】Busek et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36:408-421 (2004)
【非特許文献２】Hartel et al., Histochemistry 89(2):151-161 (1988)
【非特許文献３】Yaron and Naider, Critical Rev. Biochem. Mol. Biol. 28(1):31-81 (1993)
【非特許文献４】Sedo et al., Arthritis Res. Ther. 7:253-269 (2005)
【非特許文献５】Gorrell, Clinical Sci. 108:277-292 (2005)
【非特許文献６】Mattem et al., Scand. J. Immunol. 33:737 (1991)
【非特許文献７】Pethiyagoda et al., Clin. Exp. Metastasis 18(5):391-400 (2000)
【非特許文献８】Lambeir et al., J. Biol. Chem. 276(32):29839-29845 (2001)
【非特許文献９】Hildebrandt et al., Clin. Sci. (Lond.) 99(2):93-104 (2000)
【非特許文献１０】Schon et al., Scand. J. Immunol. 29:127 (1989)
【非特許文献１１】von Bonin et al., Immunol. Rev. 161:43-53 (1998)
【非特許文献１２】Franco et al., Immunol. Rev. 161: 27-42 (1998)
【非特許文献１３】Loster et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 217(1):341-348 (1995)
【非特許文献１４】Mannucci et al., Diabetologia 48:1168-1172 (2005)
【非特許文献１５】Johnson et al., J. Cell. Biol. 121:1423 (1993)
【非特許文献１６】Vanhoof et al., Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 30:333 (1992)
【非特許文献１７】Raynaud et al., J. Cell. Physiol. 151:378 (1992)
【非特許文献１８】Green et al., Diab. Vasc. Dis. Res. 3(3):159-165 (2006)
【非特許文献１９】Wakselman et al., J. Dermatol. Sci. 22:152-160 (2000)
【非特許文献２０】DiCarlantonio et al., Gamete Res. 15(2):161 175 (2005)
【非特許文献２１】Mazzocco et al., FEBS Journal 273(5):1056 1064 (2006)
【非特許文献２２】Schmauser et al., Glycobiol. 9(12):1295 1305 (1999)
【非特許文献２３】Harrison's Principles of Internal Medicine
【非特許文献２４】Zuo et al., Analytical Biochem. 284:266-278 (2000)
【非特許文献２５】Becker et al., J. Micromech. Microeng. 8:24 28 (1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
最近、ＤＰＰ研究のいくつかの道筋が、ＤＰＰ関連の疾患状態および病状の処置および治療を開発する手段として、ＤＰＰレベルの操作に焦点を合わせた。しかし、これまでのところ、この研究からはわずかな処置および治療しか得られていない。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
ＤＰＰに基づいた治療および診断手段の開発、ならびに生物学的過程におけるその役割が依然として求められている。ここに記載する本発明の実施形態は、ＤＰＰ関連の疾患状態または病状の予後または診断の方法を対象としている。詳細には、特定のＤＰＰの識別された部分の１つまたは複数のパラメータを測定し、上記測定を、上記疾患状態または病状の存在、不在、または重度と相関させる。
【００２６】
ここに記載する本発明の別の実施形態は、ＤＰＰ関連の疾患状態または病状の予後または診断の方法を対象としている。詳細には、ＤＰＰアイソフォームの識別された部分の１つまたは複数のパラメータを測定し、上記測定を、上記疾患状態または病状の存在、不在、または重度と相関させる。
【００２７】
記載する発明の別の実施形態は、ＩＩ型糖尿病の診断または予後の方法を対象としている。詳細には、患者試料から得られたＤＰＰ−ＩＶアイソフォームの１つまたは複数の識別された部分の少なくとも１つのパラメータを測定し、上記測定をＩＩ型糖尿病の存在、不在、または重度と相関させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本明細書に記載の方法は、ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）関連の疾患状態または病状のリスク評価、診断、または予後を提供する。詳細には、記載の方法は、特定のＤＰＰパラメータに関連した疾患状態または病状のリスク評価、診断、または予後の方法に関する。記載の方法の実施形態によれば、識別されたＤＰＰ部分のパラメータが測定される。上記測定は、その後、前記疾患状態または病状の存在、不在、または重度と相関される。
【００２９】
この出願の目的では、「プロテアーゼ」および「ペプチダーゼ」という用語は同義的に使用され、ペプチドアミド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）は、ポリペプチドからジペプチドユニットを切り出すプロテアーゼである。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「特定のＤＰＰの識別された部分」という用語は、何らかの方法でお互いから識別、分離、または単離された、患者試料から得られた特定のＤＰＰ（例えば、特定のＤＰＰファミリー、例えば、ＤＰＰ−Ｉ、ＤＰＰ−ＩＩ、ＤＰＰ−ＩＩＩ、ＤＰＰ−ＩＶなどからの１つまたは複数のアイソフォーム）を指す。
【００３１】
一実施形態では、上記特定のＤＰＰの少なくとも１つのアイソフォームを、上記ＤＰＰの他の少なくとも１つのアイソフォームから識別するであろう何らかの病状に上記特定のＤＰＰを曝露する。識別された部分のそれぞれが特定のＤＰＰの１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームを含有してもよく、また、一部の部分がＤＰＰアイソフォームを含有しなくてもよい。別の実施形態では、ＤＰＰ（１ファミリーまたは複数のファミリーのＤＰＰが含まれてもよい）を、上記ＤＰＰの他の少なくとも１つのアイソフォームから上記ＤＰＰの少なくとも１つのアイソフォームを識別するであろう何らかの病状に曝露する。
【００３２】
詳細には、完全に、または部分的のみに部分に、そして互いから個々のＤＰＰアイソフォームを識別できる。したがって、１つの識別された部分が１つまたは複数のアイソフォームを含有してもよく、あるいは識別された部分のそれぞれが１つのアイソフォームのみを含有してもよい。同様に、１つの識別された部分が１つのアイソフォームを含有してもよく、一方で、他の識別された部分が複数のアイソフォームを含有している。加えて、一部の識別された部分は、１つまたは複数の他の部分が１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームを含有している限り、ＤＰＰアイソフォームを含有しないでもよい。
【００３３】
上記特定のＤＰＰは、ＤＰＰ−Ｉ、ＤＰＰ−ＩＩ、ＤＰＰ−ＩＩＩ、またはＤＰＰ−ＩＶを含めたいかなる特定のＤＰＰファミリーまたはＤＡＳＨファミリーの一員でもよい。例示的実施形態では、ＤＰＰがＤＰＰ−ＩＶである。特定のＤＰＰと指定されていないＤＰＰには、特定のものではないＤＰＰと特定のＤＰＰとの両方が含まれる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、ＤＰＰの「アイソフォーム」という用語は、何らかの物理的な方法で相違しているが、すべてが共通の特徴的触媒活性、相同な一次構造／アミノ酸配列を有するか、または同一の遺伝子座に由来する１つまたは複数のＤＰＰ酵素の複数の形態のうちの任意のものを指す。ＤＰＰアイソフォームの触媒活性は、触媒の程度または速度が同一である必要はなく、共通の基質プロフィールのみでよい。同様に、アイソフォームの一次構造が同一である必要はなく、その酵素のアミノ酸配列における小さな付加、欠失、または変異の結果生じたものでもよい。
【００３５】
アイソフォームは、類似または同一の一次構造を有してもよく、同じ触媒活性を有しても、異なった１つまたは複数の触媒活性を有してもよい。アイソフォームの一次構造は、同じ触媒活性を保持しながら、有意に異なっていることもある。アイソフォームは、同じか、または異なった二次構造、三次構造、および／または四次構造を有してもよいが、それらが同一または類似の一次構造および／または酵素活性を保持し、かつ／または同一の遺伝子座に由来する限り、それらは依然としてお互いのアイソフォームである。
【００３６】
アイソフォームは、同一の遺伝子座に由来しても、異なった遺伝子座に由来してもよい。それらは異なった対立遺伝子、複数の遺伝子座、または同一の遺伝子から産生されたメッセンジャーＲＮＡの選択的スプライシングの結果でも、または、多糖、リン酸、スルフヒドリル、シアル酸、または他の基の添加などの翻訳後修飾の結果でもよい。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「アイソフォーム」にはアイソザイムも含まれる。本明細書で使用される場合、「アイソザイム」（あるいはイソ酵素）という用語は、アイソフォームの１タイプであり、それは一次構造／アミノ酸配列における遺伝学的に決定されている相違から生じる複数の酵素形態のうちの任意のものを指す。
【００３８】
同一の触媒活性、遺伝子座、または一次構造を共有する任意の群の酵素は、お互いのアイソフォームである。複数のＤＰＰアイソフォームが知られている。例えば、ＤＰＰ−Ｉは、同一の遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ遺伝子ＩＤ：１０７５）からコードしている転写産物変種に由来する少なくとも２つのアイソフォームで存在している。同様に、ＤＰＰ−ＩＩ（非特許文献２０参照）、ＤＰＰ−ＩＩＩ（非特許文献２１参照）、およびＤＰＰ−ＩＶ（非特許文献２２参照）の複数のアイソフォームが報告されている。
【００３９】
例えば、プロリンの後のジペプチド結合を切断するいかなる酵素もＤＰＰ−ＩＶアイソフォームである。当業者ならば、ＤＰＰの多数のアイソフォームに容易に気づく。本明細書では、すべてのアイソフォームが同定されているわけではない。限定ではなく、例として、ＤＰＰ−ＩＶアイソフォームには、ＤＰＰ−ＩＶ、ＤＰＰ−ＩＶの様々なシアル化形態、膜結合ＤＰＰ−ＩＶ、可溶性ＤＰＰ−ＩＶ、ならびに、セプラーゼ、線維芽細胞活性化タンパク質α、ＤＰＰ６、ＤＰＰ８、ＤＰＰ９、アトラクチン、Ｎ−アセチル化−α−結合酸性ジペプチダーゼＩ、ＩＩ、およびＬ、静止細胞プロリンジペプチダーゼ、胸腺特異的セリンプロテアーゼ、およびＤＰＰ  ＩＶ−βなど、任意のジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性および／または構造ホモログ（ＤＡＳＨ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
測定できるＤＰＰパラメータには、量、濃度、活性、発現、または翻訳後修飾の量もしくはタイプが含まれる。
【００４１】
ＤＰＰの「量」には、ＤＰＰの存在、不在、または量が含まれる。ＤＰＰの「活性」には、比活性を含めた、酵素活性の存在、不在、量、程度、または速度が含まれる。ＤＰＰの「発現」には、ＤＰＰ発現の存在、不在、速度、または量が含まれる。ＤＰＰの「濃度」は、部分に存在する単位容積あたりのＤＰＰアイソフォームの量である。
【００４２】
ＤＰＰパラメータは、直接的に測定しても、間接的に測定してもよく、また定性的であっても、定量的であってもよい。
【００４３】
ＤＰＰ活性は、ＤＰＰ活性を定量的または定性的に測定できるいかなるアッセイを用いて測定してもよい。ＤＰＰの活性を測定するのに適したアッセイには、検出可能に標識された基質におけるＤＰＰ活性の加水分解産物の存在または量を検出するアッセイが含まれる。上記標識は、直接的に検出可能でも、間接的に検出可能でもよく、蛍光発生的でも、化学発光でも、熱量測定でも、放射性でもよい。蛍光発生標識には、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）および７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）が含まれる。
【００４４】
当業者ならば理解するであろうが、シグナルの検出方法は、そのアッセイで使用される正確な検出系に依存するであろう。上記検出系は、質量変化、アミノ酸配列もしくはペプチド長の変化、発色変化、または蛍光発生変化を検出するものでよい。上記検出方法は、当技術分野で記述されている多様な検出スキームの中でもとりわけ、検出可能な変化をもたらす二次酵素反応を含めた二次検出スキームを利用するものでもよい。
【００４５】
例えば、放射標識された検出試薬が利用される場合には、シンチレーション計測およびオートラジオグラフィー（通常、走査デンシトメトリーと併用される）など、生物試料からのシグナルを定量できる技術、または生物試料からのシグナルを参照試料からのシグナルと比較できる技術を用いてシグナルが測定されるであろう。化学発光検出系が使用される場合には、シグナルは通常、ルミノメーターを用いて検出されるであろう。蛍光検出系が使用される場合には、分光蛍光光度計を用いて蛍光を測定することができる。検出系からシグナルを検出する方法は当技術分野で周知である。
【００４６】
一部の実施形態では、検出可能に標識された基質におけるＤＰＰ活性の加水分解産物の存在または量を検出するアッセイを介して、ＤＰＰ活性を測定する。ＤＰＰ−ＩＶ活性は、ＤＰＰ−ＩＶによって触媒されるであろう検出可能に標識された任意の基質、すなわちＸ−Ｙ−Ｒの加水分解を検出するアッセイを用いて測定できる。式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、ＹはＰｒｏ（プロリン）、Ａｌａ（アラニン）、またはＡｒｇ（アルギニン）であり、Ｒは直接的または間接的に検出可能な任意の標識である。
【００４７】
ＤＰＰ量は、定量的または定性的に１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームの量を測定できるいかなるアッセイを用いて測定してもよい。ＤＰＰ量を測定するのに適したアッセイには、ウェスタンブロット分析、タンパク質分光光度法、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれるが、これらに限定されない。この点では、１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームに特異的な抗体が特に有用である。
【００４８】
ＤＰＰ濃度は、１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームの濃度を定量的または定性的に測定できるいかなるアッセイを用いて測定してもよい。ＤＰＰ濃度を測定するのに適したアッセイには、ウェスタンブロット分析、タンパク質分光光度法、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。この点では、１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームに特異的な抗体が特に有用である。
【００４９】
ＤＰＰ発現は、１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームの発現を定量的または定性的に測定できるいかなるアッセイを用いて測定してもよい。ＤＰＰ発現を測定するのに適したアッセイは、通常、ＤＰＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出し、それらには、ノーザンブロット分析およびウェスタンブロット分析またはこれらの変法（例えば、ファーウェスタン分析、マイクロアレイチップ）が含まれる。
【００５０】
翻訳後修飾のタイプまたは程度は、１つまたは複数のＤＰＰアイソフォームの修飾を定量的または定性的に測定できるいかなるアッセイを用いても測定できる。翻訳後修飾のタイプまたは程度を測定するのに適したアッセイには、レクチン結合、ウェスタンブロット分析、タンパク質分光光度法、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【００５１】
１つまたは複数のパラメータを測定できる。例えば、単一パラメータ（例えば、量、濃度、活性、発現、翻訳後修飾の量またはタイプ）を測定できる。別法では、２つ以上のパラメータを測定できる。例えば、量および濃度、量および活性、量および発現、濃度および活性、濃度および発現、または活性および発現のそれぞれ両者を測定できる。同様に、量、活性、および発現；量、濃度、および発現；または濃度、活性、および発現を測定できる。
【００５２】
２種以上の測定を行う場合、それらを同時に行っても、連続して行ってもよい。例えば、活性と同時に量を測定してもよい。別法では、活性の前または後に量を測定してもよい。３種以上の測定を行う場合、それらを同時に行っても、連続して行ってもよい。例えば、翻訳後修飾のタイプおよび活性を同時に測定して、量を翻訳後修飾のタイプおよび活性の前に測定してもよく、または、量、翻訳後修飾のタイプ、および活性をそれぞれ、互いに同時に又は連続して測定する。同様に、さらに多くの測定を行う場合、それらを、互いに同時に又は連続して行ってもよく、各グループが、他のあらゆるグループと同時に又は連続して測られるように、可能な各方法でグループ分けしてもよい。換言すれば、各測定を要因的方法または分配的方法でグループ分けしてもよく、各グループは、他のすべてのグループと連続的に又は同時に測定することができる。
【００５３】
複数種の測定の場合に加えて、いかなる所与の測定も、それが１つのパラメータの測定でも、複数のパラメータの測定でも、任意の所与の患者試料に関して複数回行うこと、すなわち反復することができる。
【００５４】
加えて、上記部分に関して、いかなる組合せの測定を行ってもよい。例えば、上記部分のうちの１つ、一部、またはすべてに関して、単一のパラメータを測定してもよい。同様に、上記部分の１つ、一部、またはすべてに関して、複数のパラメータを測定してもよい。単一のパラメータを１つまたは一部の部分に関して測定し、その一方で、別のパラメータを他の部分またはすべての部分に関して測定してもよい。例えば、量を１つの部分のみに関して測定してもよく、その一方で、すべての部分の活性を測定してもよい。同様に、１つの部分のみの活性を測定してもよく、その一方で、すべての部分の量を測定してもよい。
【００５５】
１つまたは複数のＤＰＰパラメータを測定する場合、患者試料を多数のアリコートに分割して、別々のアリコートを異なったＤＰＰパラメータを測定するのに用いても、反復測定を行うのに用いてもよい。加えて、または別法として、異なったＤＰＰパラメータの測定用、または反復測定用に、識別されたＤＰＰ部分のそれぞれを多数のアリコートに分割してもよい。反復測定は本発明の方法に必要ではないが、本発明の実施形態の多くは、反復試験、とりわけデュプリケート試験、およびトリプリケート試験を利用するであろう。
【００５６】
別法として、アレイタイプのアッセイ、または多重検出技術を利用したアッセイ（例えば、異なった蛍光色素マーカーで標識された検出試薬を利用したアッセイ）など、異なったＤＰＰパラメータの個々のレベルを単一のアッセイで測定できるアッセイを用いて、複数のＤＰＰパラメータのレベルを単一反応で測定するために、患者試料、またはそれから得られた１アリコートを試験してもよい。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ＤＰＰ関連の疾患または病状」という用語は、１つまたは複数の特定の測定可能ＤＰＰパラメータの相違によって特徴付けられる疾患または病状を指す。ＤＰＰ関連の疾患または病状は、必ずしも、ＤＰＰの変化によって引き起こされたものではなく、１つまたは複数のＤＰＰパラメータを測定することによって診断またはモニターできるものである。
【００５８】
ＤＰＰ関連の疾患状態および病状には、代謝病、自己免疫疾患、癌、およびウイルス感染が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
代謝病は、代謝の障害であり、これには後天性疾患および遺伝病の両方が含まれるが、本明細書でもそのように使用される。それらのうちの多くが非特許文献２３に記載されている。一般に、代謝病は、以下の３つの主要クラス、すなわち、糖原病（すなわち、ＩＩ型糖尿病など、糖質代謝に影響を与える疾患）、脂肪酸酸化障害（すなわち、ファブリ病など、脂肪成分の代謝に影響を与える障害）、およびミトコンドリア疾患（すなわち、リー症候群など、ミトコンドリアに影響を与える障害）に分けられる。
【００６０】
本発明で検出できる代謝病状態には、ＩＩ型糖尿病、低血糖、高血糖、グレーブス病、クッシング症候群、アルカプトン尿症、白子症、ヒスチジン血症、高オルニチン血症、ウィルソン病、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病、クラッベ病、パジェット病、メープルシロップ尿症、またはフェニルケトン尿症が含まれるが、これらに限定されない。例示的実施形態では、上記ＤＰＰはＤＰＰ−ＩＶであり、上記疾患はＩＩ型糖尿病である。
【００６１】
本発明で検出できる自己免疫疾患には、関節リウマチ、扁平苔癬、乾癬、ぶどう膜炎、溶血性貧血、リウマチ熱、クローン病、ギラン−バレー症候群、乾癬、甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、または全身性紅斑性狼瘡が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、上記自己免疫疾患は乾癬、関節リウマチまたは扁平苔癬であり、上記ＤＰＰはＤＰＰ−ＩＶである。
【００６２】
本発明で検出できる癌には、乳房；大腸；直腸；肺；中咽頭；下咽頭；食道；胃；膵臓；肝臓；胆のう；輸胆管；小腸；腎臓、膀胱、および尿路上皮を含めた尿路；頚管、子宮、卵巣、絨毛膜癌、および妊娠絨毛性疾患を含めた女性生殖管；前立腺、精のう、精巣、および胚細胞腫を含めた男性生殖管；甲状腺、副腎、および脳下垂体を含めた内分泌腺の原発性および転移性の固形腫瘍および癌腫；血管腫、黒色腫、骨または軟部組織から生じる肉腫、およびカポジ肉腫を含めた皮膚；星状細胞腫、神経膠腫、グリア芽腫、網膜胚種細胞腫、神経腫、神経芽腫、神経鞘腫、および髄腹腫を含めた、脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍；緑色腫、プラズマ細胞腫、紅斑期および腫瘍期の菌状息肉症、ならびに皮膚Ｔ細胞性リンパ腫／白血病を含めた白血病などの造血器悪性腫瘍から生じた固形腫瘍；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方を含めたリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明で検出できるウイルス感染には、アデノウイルス科、ビルナウイルス科、ブンヤウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルソミクソウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ）、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科など、ヒトおよび他の動物にとって病原性であるウイルス科によって引き起こされた感染が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、上記ＤＰＰはＤＰＰ−ＩＶであり、上記ウイルス病はＨＩＶである。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、ＤＰＰ関連に疾患状態または病状の診断、予後、疾病進行モニタリング、またはリスク評価を必要とする任意の生物を指し、上記患者は、ＤＰＰ発現に関連した生理学を有する。そのような患者には、ヒト、高等霊長類、他の哺乳動物（例えば、ネコ、イヌ、およびウマなどの家畜哺乳動物、ラットおよびマウスなどの齧歯動物、ならびにライオン、トラ、およびクマなどの野生動物）、鳥類（例えば、ニワトリ、インコ）、および他の動物が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「患者試料」または「生物試料」という用語は、標的酵素を含有すると予測され得るであろう患者から採取されたか、または由来する任意の試料を指し、それには細胞性試料および無細胞試料の両方が含まれる。患者試料には、筋、肝臓、肺、脾臓、脂肪、乳房、および腫瘍組織などの組織；全血、血漿、血清、および血球などの血液および血液産物；ならびに尿、唾液、涙、粘液、羊水、脳脊髄液、滑膜関節液、および精液などの他の生物体液が含まれるが、これらに限定されない。患者試料は、複数の体液および／または組織の組合せも含有できる。
【００６６】
試料は、静脈穿刺、腰椎穿刺、羊水穿刺、および組織生検など、臨床的に許容できるいかなる方法で患者から入手してもよい。
【００６７】
試料は、患者から得られたまま直接使用してもよいが、本発明の一態様では、ＤＰＰを部分に識別する（例えば、ＤＰＰアイソフォームを部分に識別する）前、またはＤＰＰパラメータを測定する前に、試料処理が企図されている。処理には、均質化、希釈、濃縮、超音波処理、凍結、保存剤もしくは他の薬剤との混合、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
加えて、ＤＰＰが膜に結合していると予測される細胞または他の組織を含有する試料も、ＤＰＰが細胞膜から遊離して、それによって、試料からタンパク質／酵素を分離または単離するための、当技術分野で認められている方法のいずれかで、それが利用可能となるように処理してもよい。膜結合タンパク質を遊離させる方法は当技術分野で周知であり、それらには、凍結／融解、均質化処理、超音波処理、および活性酵素の化学的または酵素的な膜からの遊離が含まれる。
【００６９】
一部の例では、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤、または生物試料の輸送、保存、および取り扱いに適した何らかの他の成分を含む容器内に患者試料を収集する。
【００７０】
患者試料が液体で構成される場合、処理には、血液試料中の赤血球、白血球、および血小板など（例えば血漿を得るために）、有核細胞および／または非有核細胞の除去の形態が含まれていてもよく、また、血液から特定の凝固カスケードタンパク質を除くなど（例えば血清を得るために）、特定のタンパク質の除去が含まれていてもよい。例えば、血液は、ヘパリン、クエン酸、またはプロテアーゼ阻害剤を有する容器内に収集してもよく、収集の際にヘパリン、クエン酸、またはプロテアーゼ阻害剤と接触させてもよい。
【００７１】
例えば、識別または測定前に総タンパク質含量を正規化するための、試料の濃縮または希釈を、追加の処理に含めてもよい。これらの活動を行うためのプロトコールは当技術分野で周知である。
【００７２】
ＤＰＰパラメータの測定と、疾患状態または病状とを相関させた後、結果がオペレータに伝達されてもよい。結果には、疾患状態または病状の存在、不在、または重度が含まれている。
【００７３】
「オペレータ」は、医師、看護師、医師助手、医療技術者、検査技師、または本発明の１つもしくは複数のステップを実施する機械もしくは装置を操作する任意の者、または患者を含めた、上記診断もしくは予後情報を受信できる任意の者でよい。例えば、上記診断または予後情報は、ファクシミリ、電話、テキストメッセージング、またはＥメールを介して患者または患者の代理に自動的に伝達されてもよい。
【００７４】
結果を伝えるためのいかなる手段を用いてもよく、それらには、電子スクリーン、デジタルスクリーン、または印刷可能物などの媒体に疾患状態を表示すること、電話、テキストメッセージング、Ｅメール、またはファクシミリを介して、ブザー、ベル、電子生成音声、または録音音声などの可聴信号を発生させることが含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
ＤＰＰアイソフォームをＤＰＰ部分に部分的または完全に識別するのは、任意のＤＰＰパラメータの測定の前でも、それと同時でもよい。例えば、３つ以上のタイプのＤＰＰアイソフォームが試料中に存在すると仮定した場合、上記アイソフォームを、２つの部分のみに識別して、各部分が複数のタイプのアイソフォームを含有する（すなわち、部分的に識別される）ようにしても、各部分が１つのタイプのアイソフォームのみを含有するように、上記アイソフォームを部分に識別（すなわち、完全に識別）してもよい。同様に、１つの部分が１つのタイプのみのアイソフォームを含有し、他の部分が複数のタイプのアイソフォームを含有するように、上記アイソフォームを２つ以上の部分に部分的に識別してもよい。
【００７６】
ＤＰＰ部分は、物理的な分離もしくは単離、またはアイソフォームを相互に同定もしくは識別する他の方法を含めたいかなる手段で識別してもよい。
【００７７】
例えば、識別は、電気泳動移動度または等電点（ｐＩ）；熱安定性；分子量；アイソフォームの一次構造が相違している場合には、アミノ酸配列；抗体親和性または結合活性；翻訳後修飾の程度またはタイプ；およびＫmまたは速度定数などの動態特性などの生化学的性質の相違に基づいたものであり得る。
【００７８】
ＤＰＰ部分を物理的に分離するか、または物理的分離を行わずに部分を識別するのに、異なったＤＰＰアイソフォームに特異的な抗体またはレクチンを用いてもよい。例えば、異なったＤＰＰアイソフォームのそれぞれに特異的な抗体が異なった検出可能標識を有していてもよく、その場合、部分を識別するのに、物理的分離を必要としない。別法では、異なったＤＰＰアイソフォームを部分に物理的に分離するのに、上記抗体を支持体またはカラムで用いてもよい。
【００７９】
分離の方法には、ｐＩに基づいて分離を行う等電点焦点法；電荷および／または分子量に基づいて識別を行える、ゲルもしくはフィルターなどのマトリックス中またはゲルフリーの電気泳動法；上記アイソフォームへのレクチン結合の程度またはそれに親和性を有するレクチンの多様性；抗体結合；およびアフィニティークロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー法が含まれる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「等電点」（ｐＩ）という用語は、分子の正味の荷電がなくなるｐＨである。ｐＩは等電ｐＨとも呼ばれる。したがって、本出願の目的では、「ｐＩ」および「等電ｐＨ」という用語は同義的に使用される。例示的実施形態では、ＤＰＰ部分がｐＩに基づいて識別され、上記特定のＤＰＰがＤＰＰ−ＩＶである。
【００８１】
等電点焦点法の方法には、フリーフロー電気泳動、等電点電気泳動、またはクロマトフォーカシング、もしくは経時的にｐＨが変化する緩衝系の、固相を通過する流動によって促進される他の固相媒介の分離法が含まれる。
【００８２】
等電点電気泳動では、対象とする試料をゲルスラブ、フィルター、または固定されたｐＨ勾配を含有する他の媒体に直接的に注入または投与する。
【００８３】
ｐＨ勾配は電場の方向に平行して走行し、試料中のタンパク質は、そのｐＩに等しいｐＨ環境に達する以前の異なったｐＨ環境を通って一方向に移動することによって相互に分離される。
【００８４】
タンパク質がいったんそのｐＩに達すれば、それはマトリックス物質中で不動となるであろう。この点で、試料をマトリックス物質から取り出して、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（非特許文献２４参照）、平面チップ上での２次元目分離（非特許文献２５参照）、蛍光分析などの酵素活性を検出するためのアッセイ、または任意のＤＰＰパラメータを測定するのに適したアッセイなどのさらなる分析に利用にする。
【００８５】
フリーフロー電気泳動は、伝統的な電気泳動におけるアクリルアミドゲル、またはクロマトグラフィーで使用される分離相など、いかなる固体マトリックスも使用しない電気泳動法である。代わりに、分析物は、流れ方向に垂直に印加された電場内で、連続的な層流または緩衝溶液中における、それらの電荷量および／または電気泳動移動度に従って分離される。
【００８６】
フリーフロー電気泳動を行う機械の一例が、ＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社、型式＃４４１１１７）である。このシステムを用いて、分離チャンバーの端にある９６本の毛細血管に、識別された試料を収集する。これらの毛細血管は、連続的分画が収集区分（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｄｉｖｉｄｅ）中に流入するのを可能にし、その流出液は、複数の画分中に物理的に分離された状態のままとなる。この方法は、少なくとも３つの分離原理、すなわち等電点焦点法（ＩＥＦ）、ゾーン電気泳動（ＺＥ）、および等速電気泳動（ＩＴＰ）を介した試料分離に適している。いったん収集されれば、等電点焦点法の後で使用する目的で記載されているアッセイ、すなわち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、平面チップ上での２次元目分離、および酵素活性分析のうちのいずれかを介しても、その画分を分析できる。
【００８７】
識別および測定は、いかなる特定の順序にも限定されない。識別は、パラメータ測定の前に行われても、後で行われても、測定と同時に行われてもよい。例えば、特定のＤＰＰは、電気泳動などの方法を用いて物理的に部分に分離してもよく、そしてその後、それらの部分のすべてまたは一部の１つまたは複数のパラメータを測定してもよい。
【００８８】
別法では、測定および識別が同時に行われる場合、例えば、その検出可能標識からのシグナルを測定する間に、それぞれが異なった検出可能標識に連結されている、異なったＤＰＰアイソフォームに特異的な抗体と患者試料を接触させることによって、特定のＤＰＰを部分に識別してもよい。
【００８９】
別の実施形態では、二重検出系を用いて、部分またはアイソフォームを識別できる。例えば、すべてまたはほとんどのＤＰＰアイソフォーム、およびＤＰＰアイソフォームの、さらに小さい部分に特異的な１つまたは複数の抗体またはレクチンに結合する固相結合抗体とＤＰＰアイソフォームを接触させることができる。より特異的な抗体またはレクチンのそれぞれが、特有の検出可能標識を含有している。上記アイソフォームを１つまたは複数の抗体およびレクチンの両方と同時に接触させることも、順次に、例えば、結合抗体と接触させ、その後、より特異的な抗体／レクチンと接触させるか、またはより特異的な抗体／レクチンと接触させ、その後結合抗体と接触させることもできる。
【００９０】
ＤＰＰを、２つ以上の部分に識別してもよい。部分の数は、所望の識別の程度、および識別を行う方法に依存する。ＤＰＰが識別される部分の数に制限はないが、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、４８、９６、１００、２００、３００、３８４、４００、５００または１５３６の部分など、２つ以上の部分にＤＰＰを識別してもよい。例えば、一部の実施形態では、標準的な９６ウェルプレートでの操作およびパラメータ測定を可能にするために、例えば９６の部分に、ＤＰＰアイソフォームを識別するのが好都合である。
【００９１】
アイソフォームの完全な識別には、各ＤＰＰ部分が複数のＤＰＰアイソフォームを含有するべきではなく、一部の部分はＤＰＰアイソフォームを含有しなくてもよい。アイソフォームの部分的な識別には、少なくとも１つのＤＰＰ部分が複数のＤＰＰアイソフォームを含有するべきであるが、他の部分はＤＰＰアイソフォームを含有しなくても、１つのＤＰＰアイソフォームを含有しても、複数のＤＰＰアイソフォームを含有してもよい。
【００９２】
本発明の特定の実施形態では、複数の時点で個体から患者試料を得る。そのような「連続的」試料採取は、典型的な医学的異常の発症前における、疾患の早期発症の判定に好適であり、それゆえ、より有効な疾病管理または疾患回避にさえ導き得るであろう、より早期の治療戦略を容易にする。そのような連続的試料採取は、患者における疾患、例えばＩＩ型糖尿病の進行のモニタリングに関する本発明の態様に好適である。これは、上記疾患に関連して患者が行っている任意の治療の有効性を評価するのに特に有用である。連続的試料採取または反復試料採取は、疾患または病状が発症する個々のリスクを測定するのにも有用であり得る。
【００９３】
連続的試料採取は、毎時間、半日に１回、毎日、毎週、毎月、年４回（すなわち３カ月ごと）、半年ごと、毎年、２年ごと、またはさらに少ない頻度など、任意の所望の時間表で実施できる。測定レベルと参照レベルとの比較は、新しい試料が測定される度に行ってもよく、レベルに関するデータは、より低頻度で行われる分析のために保持してもよい。
【００９４】
測定または識別は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことが好ましい。一実施形態では、測定および識別の両方がｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。
【００９５】
当業者ならば理解するであろうが、本明細書に開示する方法には、患者試料の完全性および／または特徴を決定する様々なＤＰＰパラメータまたは非ＤＰＰパラメータ（疾患関連パラメータであってもそうでなくてもよい）のうちのいずれの測定が含まれていてもよい。例えば、性別のマーカーとして、概して雌性で高い、エストロゲンレベルを測定してもよく、またはコレステロールレベルなどの他の化学血液測定を行ってもよい。
【００９６】
他の疾患関連の非ＤＰＰパラメータを、診断または予後を確認するために測定してもよい。一部の実施形態では、上記非ＤＰＰパラメータがヘモグロビンＡ１Ｃレベルであり、上記疾患が糖尿病である。総ヘモグロビンの７％未満のヘモグロビンＡ１Ｃレベルは、糖尿病の不在を示し、総ヘモグロビンレベルの７％を超えるレベルは糖尿病の存在を示す。非ＤＰＰパラメータは、ＤＰＰパラメータの前に測定しても、その後に測定してもよく、または同時に測定してもよい。
【００９７】
測定されたＤＰＰパラメータを疾患状態または病状に相関させるために、測定されたＤＰＰパラメータを、参照、すなわち標準または内部対照と比較してもよい。陽性または陰性の参照と比較した、個別的または相加的なＤＰＰパラメータの増大、減少、またはシフトを疾患状態と相関させてもよい。
【００９８】
別法として、識別された酵素の部分のＤＰＰパラメータを、識別された酵素の別の部分のパラメータと比較してもよく、またはそれを、２つ以上の識別された部分の全測定値と比較してもよい。
【００９９】
当然ながら、測定パラメータは、対応するパラメータと比較するべきである。例えば、ＤＰＰ量を測定する場合には、ＤＰＰ量の値は、参照または他の部分のＤＰＰ量の値と比較するべきである。ＤＰＰ発現を測定する場合には、それを、参照または他の部分のＤＰＰ発現と比較するべきである。
【０１００】
特定の実施形態では、連続した範囲の部分のパラメータを測定する。例えば、等電点に基づいて分離されたアイソフォームに関して、隣接したｐＨまたは等電点に分離された２つ以上の部分の１つまたは複数のパラメータを測定してもよい。
【０１０１】
連続した範囲の部分にわたって、測定パラメータのプロフィールを入手してもよい。別法として、非連続的な範囲の部分の測定に基づいて測定パラメータのプロフィールを入手してもよい。上記プロフィールはすべての部分に基づくものであっても、部分の部分集合に基づくものであってもよい。
【０１０２】
疾患状態との相関関係を決定するために様々な部分相互または部分間で行うことのできる様々な比較が多数ある。測定されたパラメータのデータを解析する技法、または上記データを他のデータと比較する技法は、当業者にはよく知られている。それゆえ、そのような技法はすべて、本明細書では詳細に論じられていない。所望の結論（すなわち疾患状態の存在または不在）に達するために、データを解析する例示的技法の１つを、図１４のグラフを参照して例示する。図１４において、ｙ軸はＤＰＰパラメータ（例えば、活性、発現、量、濃度、翻訳後修飾のタイプまたは量）のレベルを示す。ｘ軸は識別の次元（例えば、ｐＩ、ｐＨ、またはアイソフォームタイプ）を示す。
【０１０３】
グラフを参照して、３つの領域、すなわち「ａ」領域、「ｂ」領域、および「ｃ」領域が強調されている。各領域に関して、範囲内の総測定値（例えば、所与の範囲の曲線下面積）を測定することができ、値「ａ」および「ｂ」、合計値「ｃ」が得られる。測定できる他の値には、範囲内のピーク値、範囲内でピーク値が到達されている点、範囲内の任意点（例えば特定のｐＩまたはｐＨ）における特定の活性、測定パラメータが増大または低減する点（例えば屈曲点）、他の測定値との比較におけるｘ軸に沿った測定パラメータのシフト、ならびにこれらの組合せが含まれる。上記の値は、連続した範囲の部分を測定することによって入手されたプロフィールに基づいて計算しても、単一または複数の部分の測定に基づいて計算してもよい。
【０１０４】
上記測定値の１つと疾患状態を相関させるために、範囲「ａ」の値を範囲「ｂ」の値と、範囲「ａ」の値を範囲「ｃ」の値と、範囲「ｂ」の値を範囲「ｃ」の値と、範囲「ａ」の値を内部対照または標準と、範囲「ｂ」の値を内部対照もしくは標準と、および／または範囲「ｃ」の値を内部対照もしくは標準と比較することができよう。
【０１０５】
別法として、１つもしくは複数の所与の識別の次元に関連した任意の範囲における個別な定量測定、またはそのような定量測定の任意の比率を得て、既知の参照値またはそのような測定の値の参照範囲と比較でき、上記参照範囲は、疾患の存在、不在または重度がそれによって判定される尺度を提供するように、臨床試験を通して確立されている。識別（例えばアイソフォーム識別）の次元で、同時に、または連続的に測定され、定量的読み取り値を事前に確立された参照範囲に正規化するのに使用できる内部または外部標準の包含によって定量測定を補足してもよい。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「標準」という用語は、集団のセグメントから得られる値、通常は平均、中央値または平均値を指す。標準は、陽性標準でも、陰性標準でもよく、同齢集団から得ることができる。同齢集団（そこから標準値を得ることができる）は、試験個体と同じの年齢であることが理想的であるが、ほぼ同齢の集団も許容できる。ほぼ同齢の集団は、試験個体の年齢の約１歳以内、約５歳以内、約１０歳以内、約１５歳以内、または約２０歳以内を含めた１〜２０歳以内のものでよく、試験される個体の年齢を包含する様々な年齢の群でもよい。ほぼ同齢の集団は、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、または１０年増分のものでよい（例えば６２歳の個体の標準値の供給源として働く「５年増分」の群には、５８〜６２歳個体、５９〜６３歳個体、６０〜６４歳個体、６１〜６５歳個体、または６２〜６６歳個体が含まれ得る）。
【０１０７】
陽性標準は、特定の疾患状態を有する集団のセグメントから得られる値、例えば平均値を指す。陰性標準は、特定の疾患状態を有していない集団のセグメントから得られる値、例えば平均値を指す。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「内部対照」という用語は、疾患状態が既知である単一の患者または患者の群からの１つまたは複数の試料から得られた値を指す。内部対照は、陽性対照でも、陰性対照でも、同一患者対照でもよい。例えば、内部対照は、特定の疾患状態を有する１体または複数の患者からの陽性対照でも、特定の疾患状態を有さない１体または複数の患者からの陰性対照でもよい。最後に、内部対照は、診断される患者から、疾患進行を測定するために、異なった時間に別の身体部位（すなわち血液対肝臓）から得られた試料、または測定前に異なった処理を施された２つ以上試料から得られた試料、または同一タイプもしくは異なったタイプであり得る別々の容器（例えば、２本のＥＤＴＡ血漿管、または１本のＥＤＴＡ血漿管および１本の血清管）内に収集された試料から得られた値でよい。
【０１０９】
内部対照値は、診断される患者の測定と同時に得ても、また別のときに得てもよい。
【０１１０】
測定値相互、または測定値と参照値との間の比較の結果は、疾患を診断するか、疾患の診断または予後を補助するため、患者の疾患の重度に従って患者を階層化するため、または特定の患者における疾患の進行をモニターするために使用する。したがって、測定値と参照値との比較が、疾患を指示／示唆する相違（すなわち増大または低減）を示す場合、適切な診断が補助または実施される。逆に、参照レベルとの測定レベルの比較が、疾患の診断を指示または示唆する相違を示さない場合、適切な診断は補助または実施されない。
【０１１１】
複数の疾患関連ＤＰＰパラメータが測定されたが、様々な測定が疾患の診断を一致して示唆または指示しなかった場合、「多数者」の示唆または指示（例えば、上記方法が４種の疾患関連ＤＰＰパラメータを用い、そのうち３種が疾患を示唆／指示する場合）が用いられる。そのような結果は、個体の疾患の診断を示唆または指示するものと理解されよう。
【０１１２】
測定値と参照値とを比較する過程は、問題となっている糖尿病関連のＤＰＰパラメータの測定値および参照値のタイプに適切な任意の好都合な方法で実行することができる。「測定」は、定量的または定性的な測定技法を用いて実施でき、測定値と参照値との比較のモードは、利用した測定技術に応じて変化し得る。例えば、ＤＰＰ活性レベルを測定するのに定性分析を用いる場合、上記レベルは、蛍光反応産物の強度を、目視での比較によって比較しても、分光光度計からのデータの比較（例えば、測定装置から得られた数値データ、または棒グラフなどのグラフィックデータを比較する）によって比較してもよい。しかし、本発明の方法で使用される測定値は、定量的な値であることが最も一般的であろうと予測される。（例えば、試料１ｍｌあたりのＤＰＰアイソフォームのナノグラムなどの濃度または絶対量の定量測定）。他の例では、測定値は定性的である。定量測定を用いた場合、数値データを精査することによって、そしてデータ表示を精査する（例えば棒グラフまたは線グラフなどのグラフ表示を精査する）ことによって比較を行うことができる。
【０１１３】
比較の方法は、手作業によるもの（本発明の方法の開業医による目視検査など）でも、自動化されているものでもよい。例えば、アッセイ装置（化学発光シグナル測定用のルミノメーターなど）は、それがＤＰＰパラメータの測定値と参照値とを比較するのを可能にする回路およびソフトウェアを含有するものでよい。別法として、測定値と参照値とを比較するのに、分離した装置（例えばデジタルコンピュータ）を用いてもよい。比較用の自動装置は、測定された疾患関連のＤＰＰパラメータの、保存された参照値を含有してもよく、同時に測定された参照試料から得られた参照値と測定値を比較してもよい。
【０１１４】
一部の実施形態では、本発明の方法は、測定レベルと参照レベルとの「単純」比較または「２成分」比較を用い、例えば、測定レベルと参照レベルとの比較によって、測定レベルが参照レベルより高いか、または低いかが判定される。一部の実施形態では、値の、いかなる相違も疾患を示す。
【０１１５】
本明細書に記載の通り、パラメータは、定量的（絶対値）に測定しても、定性的（相対値）に測定してもよい。所与の評価のための、疾患関連ＤＰＰパラメータレベルは、それぞれが重複しても、しなくてもよい。本明細書に記載の通り、一部の実施形態では、定性的データが疾患状態の所与のレベル（軽度、中度、または重度）を示し、他の実施形態では、定量的データが疾患状態の所与のレベルを示す。
【０１１６】
本発明の特定の態様では、測定値と参照値との間の相違の規模を判定するのに比較を行い、例えば、測定値と参照値との間の相違の「倍率」またはパーセントを比較する。何らかの最小倍率差より約２倍低いか、または高い倍率差は、例えば疾患の存在を示唆または指示する。ＤＰＰの絶対量、濃度、活性または発現を測定し、それを参照の絶対値と比較することによって、倍率差を測定することも、いずれの値も絶対量、濃度、活性、または発現の尺度ではなく、かつ／または両方の値が同時に測定される参照値と標本値との間の相対差によって倍率差を測定することもできる。別法では、例えば「ｃ」に対する「ｂ」と比較された「ｃ」に対する「ａ」の倍率差、またはアッセイ系の中の測定可能パラメータの任意の他のそのような比率を比較することによって、試験データ自体の中で倍率差を測定してもよい。したがって、特定の診断を示唆または指示する、測定値と参照値との相違の規模は、測定値を生むために測定された特定のパラメータと、使用された参照値とに依存するであろう。
【０１１７】
本明細書に記載の通り、ｐＩによって分離された、連続した範囲のＤＰＰ−ＩＶアイソフォームから得られたＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールと、ＩＩ型糖尿病の存在、不在、または重度との間には相関関係がある。この相関関係は、患者試料からの、識別されたＤＰＰ−ＩＶ部分の１つまたは複数のＤＰＰ−ＩＶパラメータを測定するステップと、前記測定されたＤＰＰ−ＩＶパラメータを、患者におけるＩＩ型糖尿病の存在、不在、または重度と相関させるステップとを含む、ＩＩ型糖尿病の診断または予後の方法で使用される。特定の実施形態では、ＤＰＰ−ＩＶパラメータがＤＰＰ−ＩＶ活性である。特定の実施形態では、ＤＰＰ−ＩＶ部分がｐＩに基づいて識別される。
【０１１８】
ＤＰＰ−ＩＶパラメータを集団標準または内部対照と比較してもよい。陰性集団標準または陰性内部対照からのいかなる相違も、糖尿病の存在または重度と相関させることができる。測定されたＤＰＰ−ＩＶパラメータと、陰性参照との相違の程度が大きいほど、予後が重度となる。同様に、陽性集団標準または陽性内部対照とのいかなる相違も、糖尿病の不在と相関させることができる。上記に論じた通り、パラメータには、活性、量、発現または濃度が含まれる。
【０１１９】
ＤＰＰ−ＩＶ部分は、本明細書に開示したいかなる特徴または方法によって識別してもよい。例示的実施形態では、ｐＩに基づいてＤＰＰ−ＩＶ部分を識別する。特定の実施形態では、フリーフロー電気泳動によってＤＰＰ−ＩＶ部分を分離する。
【０１２０】
図１０は、１体の健康患者と１体の糖尿病患者との間における、血漿中の、ｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶ部分のＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールの比較を示す。本発明者らは、糖尿病患者におけるＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールが、より高いｐＨへとシフトすることを示した。任意の１つまたは複数の点におけるＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールの、ここに示す任意の健康患者から得られた値からのいかなる相違も、任意の１つまたは複数の点におけるＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールの、内部陰性対照または集団標準から得られた値からのいかなる相違も、糖尿病と相関させることができる。
【０１２１】
したがって、ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールにおける、本明細書で示した任意の陰性標準または集団陰性標準からの、より高いｐＨへのシフトも、糖尿病を示す。同様に、ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールにおける、内部陰性対照からの、より高いｐＨへのシフトは、ＩＩ型糖尿病の存在を示す。活性プロフィールにおけるシフトが顕著であるほど、疾患は、より重度である。
【０１２２】
陽性標準は、健康な試料または集団の「正反対」である極端な測定値に関連したものであるが、問題のｐＩ範囲内における最も極端なアイソフォームの測定値で代表させることができる。そのような陽性標準は、例えば、すべてのグリカンの完全な不在が、典型的な健康試料に含有されているアイソフォームから最も遠い測定可能なアイソフォーム状態に相当する場合には、すべてのグリコシル化を完全に除去する化学的または酵素的方法で患者試料を処理することによって確立できるであろう。この処理から生じる極端なアイソフォームは、実際の試料中では、実際には決してありえないが、依然として、アッセイのための測定可能な対照を提供する目的で、最も遠い可能なｐＨ範囲を定めるのには使用できることに留意するべきである。別法として、この「極端な」陽性アイソフォームは、別々に測定してもよいであろう外部対照、または分析されるべき試料へ投入された後で測定される外部対照であり得るであろう。特定の実施形態では、そのような陽性対照は、結果として得られる試料測定の正規化を補助するのにも使用できるであろう。
【０１２３】
活性における「シフト」とは、１つまたは複数のＤＰＰ−ＩＶ部分のＤＰＰ−ＩＶ活性におけるいかなる相違も意味する。例えば、ＤＰＰ−ＩＶ活性の測定値は、１つの識別された部分のみで参照と相違していても、一部またはすべての部分で相違していてもよい。ＤＰＰ−ＩＶ活性レベルの傾向、例えば、より高いｐＨで、より高い活性レベルであることは、ＩＩ型糖尿病を検出するのに特に有用である。
【０１２４】
糖尿病患者および健康患者は、ＤＰＰ−ＩＶがｐＩに基づいて識別された場合、ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールに、２つの主要ピークも示す。糖尿病患者は、約ｐＨ４．４および約ｐＨ４．８のピークを示す傾向にある。これらのピークには、それぞれ、ｐＩ識別されたアイソフォームの総測定活性の約１０％が存在している。健康な患者は、約ｐＨ３．９および約ｐＨ４．１のピークを示す傾向にある。
【０１２５】
「ピーク」とは、測定されたすべての値に対する少数の局所的な極値の１つを意味する。各値は、識別された部分と関連している。ピーク値は、１つの識別された部分、または識別された部分の１群と関連するものでよい。この値は、したがって、単一の識別された部分に関する離散値、または１範囲の識別された部分に関する複数の離散値の集積であってもよい。例えば、識別された部分の関数である値のプロフィールは、ピークを１つだけ含有するものでも、複数のピークを含有するものでもよい。通常、先端の１、２、３、４、または５つの値のみがピークであると考えられるであろう。任意選択で、例えば、ピークは、好ましくは、その大きさが上昇から低下へと変化する複数の隣接した値からのプロフィール、またはその近傍に関連した値であってもよい。
【０１２６】
したがって、ｐＨ３．９もしくは約ｐＨ３．９および／またはｐＨ４．１もしくは約ｐＨ４．１にある、ｐＩ識別ＤＤＰ−ＩＶアイソフォームのＤＰＰ−ＩＶ活性における最大ピークは、糖尿病の不在と相関させることができる。
【０１２７】
同様に、ｐＨ４．４もしくは約ｐＨ４．４および／またはｐＨ４．８もしくは約ｐＨ４．８にある、ｐＩ識別ＤＰＰ−ＩＶアイソフォームのＤＰＰ−ＩＶ活性におけるピークは、糖尿病の存在と相関させることができる。連続した範囲における、ＤＰＰ−ＩＶの総測定活性の少なくとも約１０％であるピークは、糖尿病の存在に関して、特に有用である。ｐＨ４．４もしくは約ｐＨ４．４および／またはｐＨ４．８もしくは約ｐＨ４．８のピークが高いほど、より重度の診断となる。
【０１２８】
図１１は、健康患者および糖尿病患者から得られたｐＩ識別されたアイソフォームの累積ＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールを示すプロットである。プロットの各点は、連続した範囲の識別されたアイソフォームのｐＨ増大の関数である総活性の累積パーセントを表す。上記に説明されている通り、ＤＰＰアイソフォームは、ｐＨの特定の狭帯域とそれぞれが関連している個別の識別された部分に分離することによって識別される。
【０１２９】
図１２は、測定されたｐＨ範囲の酸性の端から開始して、識別されたアイソフォーム部分の活性を合計した、個々の患者から得られたｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶ部分に由来する累積活性が、測定された範囲の総活性の９０％に達したｐＨを示す。健康患者は、約ｐＨ４．２以下で識別されたアイソフォームに関して、９０％のＤＰＰ−ＩＶ活性に達した。対照的に、糖尿病患者は、約ｐＨ４．４以下で識別されたアイソフォームに関して、９０％のＤＰＰ−ＩＶ活性に達しなかった。より病気の重い患者から得られた累積ＤＰＰ−ＩＶ活性は、さらに高いｐＨで識別されたアイソフォームを考慮に入れるまで、総累積ＤＰＰ−ＩＶ活性の９０％に達しなかった。
【０１３０】
したがって、試料から得られたｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶ部分に由来する累積活性が試料の総活性の９０％に達するｐＨは、ＤＰＰ−ＩＶ活性測定を疾患と相関させるのに使用できる。したがって、約ｐＨ４．４以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されるアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが約９０％を超えない場合、糖尿病の存在が検出される。連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも約１０％が、約ｐＨ４．４以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されるアイソフォームに存在している場合、糖尿病の存在が検出される。９０％の活性に達する、ｐＨ４．４を超えるｐＨが高いほど、より重度の予後を示す。
【０１３１】
連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも約９０％が、約ｐＨ４．２以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されるアイソフォームに存在する場合、糖尿病の不在が検出される。約ｐＨ４．４以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されるアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが、約１０％を超えない場合、糖尿病の不在が検出される。
【０１３２】
図１３は、測定されたｐＨ範囲の酸性の端から開始して、アイソフォームの活性を合計した、個々の患者から得られたｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶ部分に由来する累積活性が総活性の６０％に達したｐＨを示す。健康患者は、ｐＨ３．９で、６０％のＤＰＰ−ＩＶ活性に達した。対照的に、糖尿病患者は、約ｐＨ４．１５以上まで、６０％のＤＰＰ−ＩＶ活性に達しなかった。より病気の重い患者からの累積ＤＰＰ−ＩＶ活性は、さらに高いｐＨで識別されたアイソフォームを考慮に入れるまで、総累積ＤＰＰ−ＩＶ活性の６０％に達しなかった。
【０１３３】
したがって、試料から得られたｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶ部分に由来する累積活性が試料の総活性の６０％に達するｐＨは、ＤＰＰ−ＩＶ活性測定を疾患と相関させるのに使用できる。したがって、約ｐＨ４．１５以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されるアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが約６０％を超えない場合、糖尿病の存在が検出される。連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも約４０％が、約ｐＨ４．１５以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されるアイソフォームに存在する場合、糖尿病の存在が検出される。６０％の活性に達する、ｐＨ４．１５を超えるｐＨが高いほど、より重度の予後を示す。
【０１３４】
連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性の少なくとも約６０％が、約ｐＨ３．９以下のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されるアイソフォームに存在する場合、糖尿病の不在が検出される。約ｐＨ３．９以上のｐＨ範囲と関連付けられる等電点で識別されたアイソフォーム中に存在する連続した範囲における、すべての測定された部分の総ＤＰＰ−ＩＶ活性のパーセントが、約４０％を超えない場合、糖尿病の不在が検出される。
【実施例１】
【０１３５】
タンパク質を電荷量に基づいて分離するフリーフォーム電気泳動（ＦＦＥ）（ＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システム）を用いて、ＤＰＰ−ＩＶアイソフォームを部分に分離し、特徴分析した。タンパク質アイソフォームの単離は、活性に対する特定の修飾の役割を検査するために行うことが好まれている。活性分析は、特定の活性の増大が、アイソフォームｐＩの増大と相関していることを示す。これは、翻訳後修飾が、ＤＰＰ−ＩＶ活性の調節に役割を演じているかもしれないことを示唆する。ＦＦＥは、酵素修飾を疾患状態と相関させることができるさらなる研究を容易にするかもしれない。
【０１３６】
ＦＦＥは、ＢＤ（商標）フリーフロー電気泳動システムを用いて以下の通りに行った。Ｓｉｇｍａ（商標）社（１〜１００ｍｇ）から入手したブタＤＰＰ−ＩＶを、ｐＨ適合分離培地中に希釈した（概ね１：５）。希釈されたタンパク質を、Ｂｅｃｔｏｎ（商標）ＦＦＥチャンバーの最も陰極側の試料注入口で添加し、約６０ｍＬ／ｈの分離媒体流速、３〜１０のｐＨ勾配を用いて、１２００〜１５００Ｖおよび２０〜２５ｍＡの印加によって分離した。
【０１３７】
等電点焦点法（ＩＥＦ）−ＦＦＥ緩衝液および培地は、未変性条件および３〜１０のｐＨ勾配を用い、製造会社のプロトコール（Ｂｅｃｔｏｎ（商標）ＦＦＥ適用マニュアル）に従って調製した。等電点焦点法ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（ＩＥＦ）は、Ｔ：４％を含むカスタムメイドゲルを用いて、または適切なｐＨ範囲で平衡化されたブランクＰｒｅｃｏａｔｓ（商標）（Ｓｅｒｖａ社）を用いて行った。タンパク質バンドを検出するために銀染色法が行った。その結果を図３に示す。
【０１３８】
活性分析は以下の通りに行った。４５μｌのアッセイ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ８．０１］０．０５％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ）を５μｌのタンパク質試料に添加し、Ｔｉｎｉｔｉａｌから蛍光の増大を測定した。活性は、３０℃における基質Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＡＭＣ（２５０μＭ）の加水分解から生じた相対蛍光単位（ＲＦＵ）／分の増大で表した。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
【０１３９】
タンパク質のトリプシン消化は、ＰＡＧＥ（ＩＥＦ）またはＳＤＳ−ＰＡＧＥの後で可視化されたＳｙｐｒｏ  Ｒｕｂｙ染色されたバンドを切り出し、その後、キットの指示（Ｐｉｅｒｃｅ社／Ｓｉｇｍａ社）に従って消化することによって行った。
【０１４０】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法（ＭＡＬＤＩ）ＭＳは以下の通りに行った。ペプチドを「ゲル内」消化し、抽出し（指示の通り）、ＺｉｐＴｉｐ（登録商標）Ｐｉｐｅｔｔｅ  Ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて精製した。消化されたペプチドを１：１でマトリックス（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を飽和した６０％アセトニトリル溶液）と混合し、ステンレススチールターゲット（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社）上に置いた。
【０１４１】
消化されたタンパク質を同定するために、最初のＭＡＬＤＩ−飛行時間（ＴＯＦ）ペプチド質量フィンガープリント（ＰＭＦ）を用い、その後、特定のペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦ同定を行った（両方ともＭａｓｃｏｔを用いた）。結果を図４Ａおよび４Ｂに示す。
【実施例２】
【０１４２】
実施例２で記述する実験は、実施例１で示したものと同一のプロトコールに従ったが、タンパク質試料が健康患者から得られたヒト血漿に由来するものであった点が異なる。
【０１４３】
ヒト血漿試料（ＥＤＴＡ抗凝血物質）を２体の個体から取得し、実施例１の記載に従ってＤＰＰ−ＩＶアイソフォームを部分に分離した。活性は、実施例１の記載の通りに測定した。ブタＤＰＰ−ＩＶアイソフォームに類似した活性プロフィールが存在するかどうか確認するために、ＤＰＰ−ＩＶ活性のパターンを検査した。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。
【０１４４】
図６Ａおよび６Ｂで報告された結果から、ＤＰＰ−ＩＶ活性に関して、ブタＤＰＰ−ＩＶで見られものと類似した活性がヒト血漿中に広っていることが観察された。より高いｐＨ値で活性の増大が観測された（約ｐＨ５．２で最大）。比活性の測定には、正確なタンパク質（ＤＰＰ−ＩＶ）の定量化が必要であろう。
【０１４５】
実施例１および２を通して、ＦＦＥ（ＩＥＦ）を用いてタンパク質アイソフォームを分離することができ、別々のアイソフォームの生化学的特徴分析が可能になることが実証された。ブタＤＰＰ−ＩＶモデルは、異なった比活性を示す多重アイソフォーム（質量分析を用いて同定される）を示す。ＦＦＥの後で分析すると、ヒトＤＰＰ−ＩＶ（血漿中で分離された）は類似の傾向を示す。翻訳後修飾（ＰＴＭ）がＤＰＰ−ＩＶ比活性を調節する役割を演じているかもしれない。ＦＦＥは、他のタンパク質と同様に、ＤＰＰ−ＩＶの個々のアイソフォームの潜在的ＰＴＭの同定および関連付けを容易にし得る。
【０１４６】
ＤＰＰ−ＩＶは、上述の通りに測定した。ＤＰＰ−ＩＶのブタ実験からの結果と比較した場合、図６Ａおよび６Ｂに示す結果は、ＦＦＥの後で分析した際に、同様に分析されたブタＤＰＰ−ＩＶと同様な活性傾向をヒトＤＰＰ−ＩＶが示すことを示している。
【０１４７】
併せて、実施例１および２からの結果は、翻訳後修飾（ＰＴＭ）がＤＰＰ−ＩＶ比活性を調節する役割を演じているかもしれないこと、および他のタンパク質と同様に、ＤＰＰ−ＩＶの個々のアイソフォームの潜在的ＰＴＭの同定および関連付けをＦＦＥが容易にし得ることを示唆する。
【実施例３】
【０１４８】
実施例３に記載の実験は、実施例１で示したものと同一のプロトコールに従ったが、タンパク質試料がヒト血漿に由来するものであった点、およびＩＥＦが３〜７のｐＨ勾配で行われた点が異なっていた。詳細には、２型糖尿病（血糖レベル５３８ｍｇ／ｄＬ）を有するヒトから１種、および健康なヒトから１種の２種のヘパリン処理ヒト血漿試料を得た。
【０１４９】
図７および８に示す結果は、糖尿病の試料が、より高い等電位範囲を有するＤＰＰ−ＩＶアイソフォームプロフィールを示すことを示している。
【実施例４】
【０１５０】
４体の健康患者および５体の糖尿病患者からの血漿をｐｌによって識別した。ＦＦＥは、Ｂｅｃｔｏｎ（商標）ＦＦＥチャンバーを用いて、以下の通りに行った。血漿（１：８希釈）２５μｌを、グリセロール２５μｌ、０．０８％ＨＰＭＣ  ２５μｌ、ｐＨ３〜７の分離緩衝液１２５μｌと混合した。その後、希釈されたタンパク質を、Ｂｅｃｔｏｎ（商標）ＦＦＥチャンバーの最も陰極側の試料注入口で添加し、未変性条件および３〜７のｐＨ範囲を用い、１２００〜１５００Ｖおよび２０〜２５ｍＡを印加して、インターバル等電点焦点法（Ｉｎｔｅｒｖａｌ  Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｆｏｃｕｓｉｎｇ）（ＩＩＥＦ）−ＦＦＥで分離した。ＩＩＥＦ−ＦＦＥは、合計６４分間の滞留時間、１０℃で行った。５０ｍＬ／ｈｒの緩衝液流速を５分間隔（５分間前方、その後５分間後方）で合計６０分間用いた。試料添加中の溶媒流速１８０ｍＬ／ｈｒにおいて、６０００μｌ／ｈｒで２分間、試料添加を行った。試料添加の後、電圧を印加し、溶媒流速５０ｍＬ／ｈｒ、５分間隔（５分間前方、その後５分間後方）で、合計６０分間流れるように設定した。前方への緩衝液流を２分間、３００ｍＬ／ｈｒに増大させ、休止させ、その後２分間９６ウェルに収集する間欠分離に従って試料を収集した。実施例１における概説に従って、ＤＰＰ−ＩＶ活性を試験した。結果を図１０および１１に示す。
【０１５１】
図１０で、明色の棒グラフは、各ｐＩで１体の健康患者から得られた値を表し、暗色の棒グラフは、各ｐＩで１体の糖尿病患者から得られた平均値を表す。
【０１５２】
健康患者では、約ｐＨ３．９および約ｐＨ４．１に、２つの主要ピークが観測される。同様に、糖尿病患者では、約ｐＨ４．４および約ｐＨ４．８に２つの主要ピークが観測される。糖尿病血漿プロフィールは、健康患者からの血漿プロフィールより高いｐＨ、すなわち右にシフトしている。
【０１５３】
この実施例では、群１は健康であり（ＳＯ４、Ｓ１１、Ｓ０７、およびＳ０２）、群２は、診断された糖尿病患者、すなわち、Ｌ２０５−血糖値＝約１３９ｍｇ／ｄＬ；Ｓ０９−血糖値未知；Ｓ０８−血糖値＝約９０ｍｇ／ｄＬ、患者の疾患は薬物投与で管理されている；ＳＯ１−ＢＧ＝約１５０ｍｇ／ｄＬ；およびＳ１３９−ＢＧ＝約３５０ｍｇ／ｄＬである。
【０１５４】
健康な対象からの血漿のアリコートを分割し、半分をノイラミニダーゼによって脱シアリル化し、半分を対照として残した。この実施例中で上述した条件下で、各部分を分離し、酵素分析によってアイソフォームプロフィールを測定した。シアル酸の除去は、約ｐＨ４．０から約ｐＨ５．０までのプロフィールのシフトをもたらした。
【０１５５】
結果を、図９の棒グラフで表す。
【０１５６】
脱シアリル化は、表１に示す通り、比活性の２〜３倍の増大をもたらした。
【０１５７】
【表１】
0005410955.tif 000002
【０１５８】
余剰のシアリル化がＤＰＰ−ＩＶの有効性（すなわち比活性）を低減させているように見える。それゆえ、シアリル化などの翻訳後修飾は、異なった疾患状態を有する患者が異なったアイソフォームプロフィールを示し得る理由の１つとなっている。
【０１５９】
複数の試料の実際のｐＨ勾配を説明するために、ｐＨ読み取り値対％局所活性（そのｐＨにおける）を半統合（ｓｅｍｉ−ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）した。その後、ｐＨ範囲に沿ったパーセント活性を付加した。これを図１１に示す。本質的には、これは、いくつのｐＨで、活性における特定の「閾値」に達したかを明視化することを可能にする。
【０１６０】
９０％における健康および糖尿病のデータを図１２、６０％におけるデータを図１３に示す。９０％活性では、健康患者はすべて、極めて厳密にｐＨ４．２の値をとり、一方、糖尿病患者はすべて、おおまかにｐＨ４．４を超える値をとり、より高いｐＨでは、疾患の重度の増大が伴っている。６０％活性では、健康患者はすべて、厳密にほぼｐＨ３．９の値をとり、糖尿病患者はすべて、おおまかにｐＨ４．１５を超える値をとっている。
【０１６１】
ここの記載の本発明を特定の実施形態に関して説明したが、これらの実施形態は本発明の原則および適用を例示するのみであることを理解するべきである。それゆえ、例示した実施形態には多数の改変を加えることができ、添付されている特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、他の設定も導き出せることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】アイソフォームのフリーフロー電気泳動分離のワークフローを示す図である。
【図２Ａ】未変性ＩＥＦ−ＦＦＥ後におけるブタＤＰＰ−ＩＶの活性試験の結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】未変性ＩＥＦ−ＦＦＥ後におけるブタＤＰＰ−ＩＶの活性試験の結果を示すグラフであり、識別されたブタＤＰＰ−ＩＶアイソフォームの比活性（Ｕ／ｎｇ酵素）を示す。
【図３】ブタＤＰＰ−ＩＶの未変性ＦＦＥ（ｐＨ３〜１０）分離から生じた画分２７〜４７の銀染ＩＥＦアクリルアミドゲルを示す図である。
【図４Ａ】ＩＥＦゲルから切り出された最も酸性のアイソフォームのトリプシン消化タンパク質バンドのペプチド質量フィンガープリント解析を示す図である。ＰＭＦの分析は、すべてのアイソフォームがＤＰＰ−ＩＶであると同定している。
【図４Ｂ】ＩＥＦゲルから切り出されたわずかに、より塩基性のアイソフォームのトリプシン消化タンパク質バンドのペプチド質量フィンガープリント解析を示す図である。ＰＭＦの分析は、すべてのアイソフォームがＤＰＰ−ＩＶであると同定している。
【図５Ａ】ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦによる、選択されたＤＰＰ−ＩＶピークの確認を示す図である。
【図５Ｂ】ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦによる、選択されたＤＰＰ−ＩＶピークの確認を示す図である。
【図６Ａ】２体の健康対象のヒト血漿から得たＦＦＥ識別されたＤＰＰ−ＩＶアイソフォームのＤＰＰ−ＩＶ活性を示す図である。
【図６Ｂ】２体の健康対象のヒト血漿から得られたＦＦＥ識別されたＤＰＰ−ＩＶアイソフォームのＤＰＰ−ＩＶ活性を示す図である。
【図７】正常ヒト対象からのＦＦＥ識別されたアイソフォームのＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールを示す図である。
【図８】５３８ｍｇ／ｄＬのブドウ糖レベルを有する糖尿病ヒト対象から得られたＦＦＥ識別されたアイソフォームのＤＰＰ−ＩＶ活性プロフィールを示す図である。
【図９】健康ヒト患者から得られたＦＦＥ識別されたアイソフォームの脱シアリル化の結果起こるＤＰＰ−ＩＶプロフィールシフトの例を示す図である。活性はＲＦＵ／分間で表されている。黒塗りの棒グラフは処置された試料を表し、斜線の棒グラフは未処置の試料を表す。
【図１０】健康患者（明色の棒グラフ）および糖尿病患者（暗色の棒グラフ）から得られた血漿における、ｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶアイソフォーム相互のＤＰＰ−ＩＶ活性の比較、ならびに糖尿病患者から得られた脱シアリル化アイソフォーム（暗色の線）を示す図である。点線は各部分が識別されたｐＨを表す。
【図１１】健康患者および糖尿病患者から得られたｐＩ識別されたＤＰＰ−アイソフォームのｐＨ対ＤＰＰ−ＩＶ活性のブレイクアウトプロットである。Ｓ０４、Ｓ１１、Ｓ０７、およびＳ０２は健康であり、残りは糖尿病である。
【図１２】各対象からのｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶアイソフォームＩが９０％ＤＰＰ−ＩＶ活性に達するｐＨのプロットである。Ｓ０４、Ｓ１１、Ｓ０７、およびＳ０２は健康であり、残りは糖尿病である。
【図１３】各対象からのｐＩ識別されたＤＰＰ−ＩＶアイソフォームＩが６０％ＤＰＰ−ＩＶ活性に達するｐＨのプロットである。Ｓ０４、Ｓ１１、Ｓ０７、およびＳ０２は健康であり、残りは糖尿病である。
【図１４】識別されたＤＰＰアイソフォームの測定パラメータが疾患と相関し得る様々な方法を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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