(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)発酵培地中で宿主細胞を培養する段階であって、
宿主細胞が、発泡剤を細胞外に分泌し、
発酵培地が、曇点を有する消泡剤を含む段階、
ii)発酵培地の温度が曇点より少なくとも20℃高い間に、消泡剤を除去する段階
を含む、発泡剤を生産する方法。
【請求項２】
段階i)において、その中に空気または酸素富化空気を散布することによって、発酵培地を通気する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
段階i)において、発酵培地の温度が、消泡剤の曇点より高い、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
段階ii)において、濾過、遠心分離、または吸着によって、消泡剤を除去する、請求項1から3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
膜濾過によって、消泡剤を除去する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
段階ii)において、少なくとも75%の消泡剤を除去する、請求項1から5のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
段階ii)において、宿主細胞を発酵培地から除去する、請求項1から6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
段階ii)の後で、発泡剤を発酵培地から精製および/または濃縮する、請求項1から7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
消泡剤が食品等級である、請求項1から8のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
消泡剤が、非イオン界面活性剤/ポリマーを少なくとも1種含む、請求項1から9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
消泡剤が、ポリエーテル、ポリ(アルキレングリコール)、エチレン/プロピレンオキシドブロックコポリマー、EO/POブロックコポリマーをベースとするポリアルコール、ポリプロピレングリコールベースのポリエーテル分散体、またはアルコキシ化脂肪酸エステルである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
発泡剤が食品等級である、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
発泡剤がハイドロフォビンである、請求項1から12のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞が、遺伝子組換えされた真菌である、請求項1から13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
段階ii)の後で、発泡剤に対する消泡剤の重量比が、0.2未満である、請求項1から14のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産業用発酵方法に関する。特に、本発明は、発酵による発泡剤の細胞外生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
発泡は、好気性水中発酵における一般的な問題である。発泡は、培養されている好気性生物(例えば、細菌、酵母、真菌、藻、細胞培養物)の成長のために酸素を供給する目的で、発酵培地中に気体を散布することによって引き起こされる。発酵培地がタンパク質、多糖、または脂肪酸などの表面活性成分を含む場合、散布された気体の気泡が液体から離脱するので、培地の表面上に泡が形成されうる。発泡は、泡の中への生産物、栄養素、および細胞の望ましくない喪失を含むいくつかの問題を生じ、封じ込め過程を困難にしうる。発泡を制御する既知の方法は、消泡剤を使用することであり、次の数種類の消泡剤が一般に使用される：シリコーンベース(例えば、ポリジメチルシロキサン)、ポリアルキレングリコール(例えば、ポリプロピレングリコール)、脂肪酸、ポリエステル、および天然油(例えば、亜麻仁油、大豆油)。消泡剤は、気泡の表面上で、泡を形成する成分と置き換わり、気泡の合体による泡の破壊をもたらす。消泡剤は発酵の開始時および/または発酵の間に添加される。
【０００３】
発酵生産物は、食品、個人用品、または医薬品での使用を意図される場合、その生産生物によって発酵培地中に排出されること(すなわち、細胞内ではなく、細胞外生産)が、非常に望ましい。これによって、回収のため生産物を放出させる目的で、物理的または化学的手段によって細胞を破壊する必要性が回避される。細胞を無処置で維持することによって、細胞によって産される物質は容易に生産物から分離でき、その結果、望ましくない混入物質と通常考えられている細胞内物質および遺伝物質が存在しなくなる。これは、生産生物が遺伝子組換えされているとき、特に重要でありうる。しかし、生産物が泡の形成を促進するか、または泡の安定性を強化する場合、例えば、バイオサーファクタントまたはハイドロフォビンの場合は特に、細胞外生産は、発酵槽中で発泡する度合いを高めうる。2つの理由で、消泡剤の使用は、かかる発泡剤の細胞外生産に、特定の問題を起こす。第1に、発泡剤それ自体が、発酵槽中での発泡に寄与するので、消泡剤の必要量が増加する。第2に、消泡剤は生産物の機能性に影響しない低濃度で存在するので、ほとんどの発酵生産物から消泡剤を除去する必要がない。しかし、発酵生産物が発泡剤であるとき、生産物中の消泡剤の存在は発泡剤の機能性を損なうことから、消泡剤は実質的に除去されねばならない。
【０００４】
Baileyら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 58 (2002)、721〜727頁は、トリコデルマリーセイ(Trichoderma reesei)の形質転換体の発酵による、ハイドロフォビンHFB IおよびHFB IIの生産を開示している。消泡剤(Struktol J633)を使用して発泡を防ぎ、水性二相抽出法を使用して、ハイドロフォビンを精製した。しかし、水性二相抽出法またはクロマトグラフィー法などの分離方法は高価であり、食品不適合の化学製品を必要とする可能性がある。
【０００５】
Davisら、Enzyme and Microbial Technology 28 (2001)、346〜354頁は、消泡剤の必要性を回避する代替方法を開示している。この方法において、発酵の間に生成された泡を収集し、その泡から生産物を回収する。この方法は、リポペプチドバイオサーファクタントのサーファクチンの回収および濃縮に成功裏に適用された。しかし、この方法には、いくつかの欠点がある。第1に、泡の連続除去が、発酵の無菌性を損なう可能性がある。第2に、気泡の除去は、発酵槽中の生存細胞数(いくつかの細胞は、泡とともに持ち越されうるので)、液体体積、および栄養素レベルに影響を与える可能性があり、発酵の制御をより困難にする。そして第3に、生産物が非常に安定した泡を形成するとき特に、泡からの生産物の抽出は困難でありうる。したがって、発泡剤の細胞外生産のための改善された発酵方法の必要性が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】EP 1 623 631
【特許文献２】WO01/74864
【特許文献３】WO96/41882
【特許文献４】WO01/014521
【特許文献５】WO01/57076
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Baileyら、Appl. Microbiol. Biotechnol. 58 (2002)、721〜727頁
【非特許文献２】Davisら、Enzyme and Microbial Technology 28 (2001)、346〜354頁
【非特許文献３】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.
【非特許文献４】Ausubelら、Short Protocols in Molecular Biology (1999)、第4版、John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献５】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology完全版、John Wiley & Sons, Inc.
【非特許文献６】MacCabeおよびVan Alfen、1999年、App. Environ. Microbiol 65巻、5431〜5435頁
【非特許文献７】DesaiおよびBanat、Microbiology and Molecular Biology Reviews、1997年3月、47〜64頁
【非特許文献８】Wessels、1997年、Adv. Microb. Physio. 38巻、1〜45頁
【非特許文献９】Wosten、2001年、Annu Rev. Microbiol. 55巻、625〜646頁
【非特許文献１０】De Vochtら、1998年、Biophys. J. 74巻、2059〜68頁
【非特許文献１１】Wostenら、1994年、Embo. J. 13巻、5848〜54頁
【非特許文献１２】Talbot、2003年、Curr. Biol、13巻、R696〜R698
【非特許文献１３】Colloid Science内のSurfactant Aggregation and Adsorption at Interfaces、J. Eastoe、63頁
【非特許文献１４】Principles, Methods and Applications、T. Cosgrove編、Blackwell Publishing、2005年
【非特許文献１５】「Separation Processes in the Food and Biotechnology Industries」、Grandison, A.S.およびLewis, M.J.編、7頁
【非特許文献１６】Yamagiwaら、J. Chem. Eng. Japan、26(1993)、13〜18頁
【非特許文献１７】Collenら、2002年、Biochim Biophys Acta. 1569巻、139〜50頁
【非特許文献１８】Calonjeら、2002年、「Can. J. Microbiol.」、48巻、1030〜4頁
【非特許文献１９】Askolinら、2001年、Appl Microbiol Biotechnol. 57巻、124〜30頁
【非特許文献２０】De Vriesら、1999年、Eur J Biochem. 262巻、377〜85頁
【非特許文献２１】van de Laar Tら、Biotechnol Bioeng. 96巻(3)、483〜94頁、(1997年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、発泡剤の発酵による細胞外生産において、発泡を抑制する特定の一群の消泡剤を使用することによって、生産物から消泡剤を容易に除去できることを、ここに発見した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、第1の態様において、本発明は、
i) 発酵培地中で宿主細胞を培養する段階であって、
宿主細胞が、発泡剤を細胞外に分泌し、
発酵培地が、曇点を有する消泡剤を含む段階、
ii)発酵培地の温度が曇点より高い間に、消泡剤を除去する段階
を含む発泡剤を生産する方法を提供する。
【００１０】
消泡剤の使用は、発酵の間の発泡を最小化する。曇点を有する消泡剤を選択し、発酵培地の温度がこの曇点より高いことを確実にすることによって、消泡剤は、微粒子形で「曇る」(沈殿する)ことになる。これは、発酵が完了した後で、例えば濾過、遠心分離、または吸着によって、消泡剤を除去できる単純な経路を提供する。対照的に、曇点を有していない消泡剤は、水性二相抽出法またはクロマトグラフィーなどの、より複雑および/またはより高価な分離方法を必要とする。
【００１１】
好ましくは、段階i)において、その中に空気または酸素富化空気を散布することによって、発酵培地を通気する。
【００１２】
好ましくは、段階i)において、発酵培地の温度は消泡剤の曇点より高い。
【００１３】
好ましくは、段階ii)において、濾過、遠心分離、または吸着によって、消泡剤を除去する。より好ましくは、膜(クロスフロー)濾過によって、消泡剤を除去する。
【００１４】
好ましくは、段階ii)において、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、最も好ましくは少なくとも90%の消泡剤を除去する。
【００１５】
好ましくは、段階ii)において、発酵培地の温度は、曇点より少なくとも10℃高く、より好ましくは曇点より少なくとも20℃高く、最も好ましくは曇点よりも少なくとも30℃高い。
【００１６】
好ましくは、宿主細胞もまた、段階ii)において発酵培地から除去する。
【００１７】
好ましくは、段階ii)の後で、発泡剤を、例えば限外濾過によって、発酵培地から精製および/または濃縮する。
【００１８】
好ましくは、消泡剤は食品等級(food-grade)である。
【００１９】
好ましくは、消泡剤は、ポリエーテル、ポリ(アルキレングリコール)、エチレン/プロピレンオキシドブロックコポリマー、エチレン/プロピレンオキシドブロックコポリマーをベースとするポリアルコール、ポリプロピレングリコールベースのポリエーテル分散体、またはアルコキシ化脂肪酸エステルなど、非イオン界面活性剤/ポリマーを少なくとも1種含む。
【００２０】
好ましくは、発泡剤は食品等級である。
【００２１】
好ましくは、発泡剤はハイドロフォビン、より好ましくはクラスIIのハイドロフォビン、最も好ましくは、トリコデルマリーセイからのHFBIまたはHFBIIである。
【００２２】
好ましくは、宿主細胞は遺伝子組換えされた真菌、より好ましくは酵母、最も好ましくはサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。
【００２３】
好ましくは、段階ii)の後で、発泡剤に対する消泡剤の重量比は0.2未満、より好ましくは0.15未満、最も好ましくは0.1未満である。
【００２４】
発明の詳細な説明
別途、定義されないかぎり、本明細書に使用される全ての専門および科学用語は、(例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリッド形成技術、および生化学における)当業者によって一般的に理解されるのと同様の意味を有する。分子および生化学の方法のために使用される標準的な技術は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、(2001)、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, N.Y.、およびAusubelら、Short Protocols in Molecular Biology (1999)、第4版、John Wiley & Sons, Inc.-、およびCurrent Protocols in Molecular Biologyというタイトルの完全版に見出されうる。
【００２５】
発泡剤
本発明の文脈において、用語「発泡剤」は、気泡の合体を妨げることにより、泡の形成を促進および/または泡の安定性を強化する、生物由来の界面活性剤を意味する。
【００２６】
好ましくは、発泡剤は、水溶液中で、発泡剤が少なくとも20%の気体相量を有する泡を生成するようなものであり、以下の試験に従って、5℃で1時間の保存後に、より好ましくは2時間後に、最も好ましくは4時間後に、その泡のうちの少なくとも50%が残っている。
【００２７】
発泡剤(0.5重量%)の水溶液80mLを調製する。冷却した(2℃)円柱状の垂直に据え付けた、内部の大きさが高さ105mmおよび直径72mmの被覆ステンレススチール容器中で、溶液をせん断することによって、溶液に通気する。容器のふたは、試料のための46%(180ml)を残して、内部容積の54%を占める。試料をせん断するために使用されるローターは、それが回転するときに容器の内側表面をこする、正確な大きさ(72mm×41.5mm)の長方形の羽根車から成る。また、長方形の取り付け具に対して45°の角度で据えた2枚の半円形(直径60mm)の高せん断翼を、ローターに取り付ける。容器中に80mLの溶液を注ぎ、ふたを固定する。次に、溶液を1250rpmで10分間、せん断する。直ちに、通気された溶液をメスシリンダー中に注ぐ。メスシリンダーから泡体積を直ちに読み取り、5℃で保存後、再び読み取る。気体相体積は、以下の通り、測定された泡体積と既知の水相体積(すなわち、80mL)とから判定される：
気体相体積=[(泡体積-80mL)/(泡体積)]×100。
【００２８】
泡中の液体は経時的に流出し、その結果、上部の泡と下部の水溶液という2つの分離した異なる層になる。しかし、ここで肝心な点は、泡相の安定性である。気体相体積の算定のために、泡体積を、2つの異なる層に分離したかどうかにかかわりなく、系、すなわち気体相と液体相の両相の全体体積と考える。したがって、気体相体積の値は、気体の減少に対する泡の安定性の定量的指標となる。したがって、泡の最初の気体相体積が50%である場合、保存後、気体相体積は少なくとも25%であるべきであり、最初の気体相体積が20%である場合、保存後、少なくとも10%でなければならない。
【００２９】
発泡剤としては、ハイドロフォビンならびに、糖脂質(例えば、ラムノリピド、トレハロリピド  セロビオリピド、ソホロリピド);リポペチドおよびリポタンパク質(例えば、ペプチド-脂質、セッラウエッチン、ビスコシン、サーファクチン、スブチリシン、グラミシジン、ポリミキシン);脂肪酸、中性脂肪、およびリン脂質;ポリマーバイオサーファクタント(例えば、エマルサン、バイオディスパーサン、マンナン-脂質-タンパク質、リポサン、炭水化物-タンパク質-脂質、タンパク質PA)、微粒子性バイオサーファクタント(小胞および線毛、全細胞)、配糖体(例えば、サポニン)、および繊維性タンパク質(例えば、フィブロイン)などの、バイオサーファクタントが挙げられる。乳および大豆のタンパク質/タンパク質加水分解物もまた、発泡剤であるが、これらは通常、発酵法によって生産されない。好ましくは発泡剤は、乳もしくは大豆のタンパク質またはタンパク質加水分解物ではない。特に好ましい実施形態において、発泡剤はハイドロフォビンである。
【００３０】
発泡剤は、自然に発泡剤を発酵培地に分泌する宿主生物を培養することによって得ることができる。例えば、ハイドロフォビンは、ハイフォミセテス(hyphomycetes)(例えば、トリコデルマ)、バシジオミセテス(basidiomycetes)、およびアスコミセテス(ascomycetes)などの糸状菌を培養することによって得ることができる。特に好ましい宿主は、クリパリン(cryparin)と命名されたハイドロフォビンを分泌するクリフォネクトリアパラシチカ(Cryphonectria parasitica)などの食品等級生物である(MacCabeおよびVan Alfen、1999年、App. Environ. Microbiol 65巻、5431〜5435頁)。同様に、サーファクチンは、バシラスサブチリス(Bacillus subtilis)から、糖脂質は、例えばシュードモナスアエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、ロードコッカスエリトロポリス(Rhodococcus erythropolis)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)種、およびトルロプシスボンビコラ(Torulopsis bombicola)から得ることができる(DesaiおよびBanat、Microbiology and Molecular Biology Reviews、1997年3月、47〜64頁)。
【００３１】
代替方法として、発泡剤は、組換え技術によって生産しうる。例えば、典型的には、微生物である宿主細胞を組み換えて、発泡剤を発現しうる。発泡剤(ここでは、発泡剤はポリペプチドである)をコードしている核酸構築物、または発泡剤(ここでは、発泡剤は非ペプチド、例えばバイオサーファクタントである)を生産するのに必要な酵素を、宿主細胞中へ導入する技術は、当技術分野においてよく知られている。組換え技術はまた、発泡剤配列を組み換えるか、または所望の/改善された特性を有する新規の発泡剤を合成するために、使用されうる。
【００３２】
典型的には、適切な宿主細胞または生物は、所望のポリペプチド発泡剤をコードする核酸構築物によって、形質転換される。ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、転写および翻訳のため、そしてそれらが適切な条件下で発現されるように(例えば、適切な配向および正確な読み枠で、ならびに適切な標的指向および発現配列を有して)、必要な要素をコードしている適切な発現ベクター中に挿入しうる。これらの発現ベクターを構築するのに必要とされる方法は、当業者にとってよく知られている。
【００３３】
ポリペプチドコード配列を発現するために、いくつかの発現系を使用しうる。これらとしては、適切な発現ベクターで形質転換した、細菌、真菌(酵母を含む)、昆虫細胞系、および植物細胞培養系が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい宿主は、食品等級と考えられている、すなわち「一般に安全とみなされている」(GRAS)宿主である。
【００３４】
適切な真菌の種としては、(限定されないが)サッカロミセス(Saccharomyces)属、クリベロミセス(Kluyveromyces)属、ピチア(Pichia)属、ハンセヌラ(Hansenula)属、カンジダ(Candida)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属等などの酵母、および(限定されないが)アスペルギルス(Aspergillus)属、トリコデルマ属、ムコール(Mucor)属、ネウロスポラ(Neurospora)属、フサリウム(Fusarium)属等などの糸状種が挙げられる。
【００３５】
ポリペプチド発泡剤をコードする配列は、自然界に確認される発泡剤とアミノ酸レベルで、好ましくは少なくとも80%同一であり、より好ましくは少なくとも95%または100%同一である。しかし、当業者は、発泡剤の生物学的活性を低下させない、同類置換またはその他のアミノ酸変化を行うことができる。
【００３６】
ハイドロフォビンは、特に好ましいクラスの発泡剤である。EP 1 623 631において、本発明者らは、ハイドロフォビンが、不均一化および合体に対して、優秀な安定性を有する水性の泡を生成させることを、以前に発見した。ハイドロフォビンは、非常に有効な発泡剤なので、発酵培地中のハイドロフォビンの存在は、泡の制御に関する特定の問題を提起する。
【００３７】
ハイドロフォビンは、明確に定義されたクラスのタンパク質(Wessels、1997年、Adv. Microb. Physio. 38巻、1〜45頁、Wosten、2001年、Annu Rev. Microbiol. 55巻、625〜646頁)であり、疎水性/親水性界面で自己集合が可能で、保存配列：
Xn-C-X5〜9-C-C-X11〜39-C-X8〜23-C-X5〜9-C-C-X6〜18-C-Xm(配列番号1)
を有する
(式中、Xは、任意のアミノ酸を表し、nおよびmは、独立して整数を表す)。典型的には、ハイドロフォビンは、長さ125までのアミノ酸を有する。保存配列中のシステイン残基(C)は、ジスルフィド架橋の一部である。本発明の文脈において、用語ハイドロフォビンは、より広い意味を有し、以下の配列：
Xn-C-X1〜50-C-X0〜5-C-X1〜100-C-X1〜100-C-X1〜50-C-X0〜5-C-X1〜50-C-Xm(配列番号2)
を含むタンパク質など、疎水性-親水性界面で自己集合してタンパク質膜になる特徴をなお示す、機能的に同等のタンパク質、または疎水性-親水性界面で自己集合して結果的にタンパク質膜になる、特徴をなお示す、前記タンパク質の一部分を含む。本発明の定義に従うと、自己集合は、Teflonへタンパク質を吸着し、円偏光二色性を使用して、二次構造(一般にα-らせん)の存在を確証することによって検出できる(De Vochtら、1998年、Biophys. J. 74巻、2059〜68頁)。
【００３８】
タンパク質溶液中でTeflonのシートをインキュベートし、次に水または緩衝液で少なくとも3回洗浄することによって、膜の形成を確立できる(Wostenら、1994年、Embo. J. 13巻、5848〜54頁)。タンパク質膜は、当技術分野で十分確証されているように、蛍光マーカーでの標識または蛍光抗体の使用など、いずれかの適切な方法で可視化できる。mおよびnは典型的に、0から2000までの範囲の値を有するが、より一般的に、mおよびnは全体で、100または200未満である。本発明の文脈におけるハイドロフォビンの定義は、ハイドロフォビンと別のポリペプチドとの融合タンパク質や、ハイドロフォビンと多糖などの他の分子との複合物を含む。
【００３９】
現在までに確認されているハイドロフォビンは一般に、クラスIまたはクラスIIのどちらかに分類される。いずれの型も、疎水性界面で、自己集合して両親媒性膜になる分泌されたタンパク質として、真菌中に確認された。クラスIのハイドロフォビンの集合体は一般に、比較的難溶性であるが、その一方で、クラスIIのハイドロフォビンの集合体は、様々な溶媒に容易に溶解する。好ましくは、ハイドロフォビンは水溶性であり、これは、ハイドロフォビンが水に少なくとも0.1%、好ましくは少なくとも0.5%溶解することを意味する。少なくとも0.1%溶解するということは、水99.9mL中0.1gのハイドロフォビンを、20℃で、30分間、30,000g遠心分離するとき、ハイドロフォビンが全く沈殿しないことを意味する。
【００４０】
ハイドロフォビンのようなタンパク質(例えば、「チャプリン」)もまた、アクチノミセテ(Actinomycete)種およびストレプトミセス(Streptomyces)種などの糸状細菌中で確認された(WO01/74864;Talbot、2003年、Curr. Biol、13巻、R696〜R698)。真菌ハイドロフォビンと対照的に、これらの細菌タンパク質は、2つのシステイン残基しか有していない可能性があるので、1つまでのジスルフィド架橋しか形成しえない。かかるタンパク質は、配列番号1および2で示された共通配列を有するハイドロフォビンと機能的同等物の例であり、本発明の範囲内にある。
【００４１】
ハイドロフォビンをコードする34を超える遺伝子が、16を超える真菌種からクローニングされた(例えば、アガリクスビスポルス(Agaricus bisporus)中に確認されたハイドロフォビンの配列を示しているWO96/41882、およびWosten、2001年、Annu Rev. Microbiol. 55巻、625〜646頁を参照されたい)。本発明の目的のためには、天然のハイドロフォビンに対して、アミノ酸レベルで、少なくとも80%の同一性を有するハイドロフォビンもまた、用語「ハイドロフォビン」の中に含まれる。
【００４２】
消泡剤
用語「消泡剤」は、発泡が起こる前に通常添加される消泡剤と、泡が形成された時点で通常添加される消泡剤(時として、デフォーマーとして知られる)との両方を含む。本発明における使用に適する消泡剤の具体的な群は、曇点を示すものである。Colloid Science中のSurfactant Aggregation and Adsorption at Interfaces、J. Eastoe、63頁、Principles, Methods and Applications、T. Cosgrove編、Blackwell Publishing、2005年に記載されている通り、曇点は、消泡剤の水溶液が相分離する(すなわち、消泡剤の分子が光を散乱させる凝集体を形成する)とき、濁って見えてくる温度である。
【００４３】
曇点を示す消泡剤の例としては、エチレンオキシド/プロピレンオキシドブロックコポリマー、エチレンオキシド/プロピレンオキシドブロックコポリマーをベースとするポリアルコール、およびエチレンおよびプロピレンオキシドのポリエーテルなどのポリ(アルキレングリコール)(PAG)ベースの化合物、ならびに脂肪酸エステルベースの化合物が挙げられる。
【００４４】
曇点は界面活性剤組成および化学構造に応じる。例えば、ポリオキシエチレン(PEO)非イオン界面活性剤の曇点は、所与の疎水性基のEO含有量が増加するにつれて上昇する。好ましくは、消泡剤の曇点は、0℃から90℃の間、より好ましくは5℃から60℃の間である。
【００４５】
好ましくは、消泡剤は、ポリエーテル、ポリ(アルキレングリコール)、エチレン/プロピレンオキシドブロックコポリマー、エチレン/プロピレンオキシドブロックコポリマーをベースとするポリアルコール、プロピレングリコールベースのポリエーテル分散体、またはアルコキシ化脂肪酸エステルなどの非イオン界面活性剤/ポリマーを少なくとも1種含む。PAGベースの消泡剤(Schill and Seilacherから入手可能なStruktol J647など)、EO/POブロックコポリマーをベースとするポリアルコール(Schill and Seilacherから入手可能なStruktol J647など)、およびその他の非イオン界面活性剤系消泡剤は、ハイドロフォビンなどの強力な発泡剤の存在下においてさえも、泡を破壊するのに特に有効である。
【００４６】
消泡剤の混合物を使用でき、その場合、かかる混合物の曇点は、各成分の最高の曇点で定義される。
【００４７】
曇点を示すいくつかの一般的な市販されている消泡剤を、Table 1(表1)に示す。
【００４８】
【表１】
0005547080.tif 000002
【００４９】
発酵方法および消泡剤の除去
発泡剤を生産する発酵は、バイオリアクター(例えば、産業用発酵槽)中で、液体発酵培地中で宿主細胞を培養することによって実行される。培地の組成(例えば、栄養素、炭素源など)、温度、およびpHは、培養物の成長および/または発泡剤の生産にとって適切な条件を提供するために選択される。培養物の呼吸のための酸素を供給するために、通常、空気または酸素富化空気が培地中に散布される。
【００５０】
消泡剤は、最初の培地組成物中に含まれてよく、および/または、発酵の間を通して必要とされるときに添加されてよい。一般的な実行では、消泡剤の添加を自動的に始動させる導電率プローブなどの泡検出法を使用する。本発明において、消泡剤は、好ましくは0.1から20g/L、より好ましくは1から10g/Lの濃度で存在する。
【００５１】
段階i)の間、すなわち発酵の間、発酵槽の温度は、消泡剤の曇点より上または下であってよい。消泡剤は、この曇点より上で気泡合体および泡崩壊を引き起こすのに最も有効であるから、好ましくは、発酵槽の温度は、消泡剤の曇点より高い。発酵槽の温度は一般に、宿主細胞の成長および/または生産のための最適条件を達成するために、選択される。
【００５２】
発酵の終わりに、消泡剤を実質的に除去し、確実に発泡剤の機能性が損なわれないようにしなければならない。好ましくは消泡剤の少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、最も好ましくは少なくとも90%を、除去する。例えば、段階ii)の後で、発泡剤に対する消泡剤の重量比は、好ましくは0.2未満、より好ましくは0.15未満、最も好ましくは0.1未満である。
【００５３】
発酵培地の温度が消泡剤の曇点より確実に高く、その結果、消泡剤が相分離することによって、消泡剤の除去は達成される。相分離した消泡剤は、
-濾過、例えば、デッドエンド濾過またはフィルタープレス
-膜(クロスフロー)濾過、例えば、精密濾過または限外濾過
-遠心分離
-吸収剤として、例えば活性炭、シリカ、または珪藻土を使用する、吸着
などのいずれかの適切な方法によって、発酵培地から除去しうる。
【００５４】
消泡剤の除去は、単一段階で、例えばこれらの方法の1つによって起こりうる。代替として、前記方法を反復または組み合わせてよい。例えば、最初の濾過段階の後で、濾液を(必要であれば)再加熱し、再度、濾過してよい。
【００５５】
本発明者らは、発酵培地の温度が、曇点よりも少なくとも10℃、好ましくは曇点よりも少なくとも20℃、最も好ましくは曇点よりも少なくとも30℃高い場合、より多くの消泡剤が除去されることを発見した。
【００５６】
発酵培地の温度は、発泡剤が変性されるほど高くてはならない。この理由のために、発泡剤は熱安定性があること、例えばハイドロフォビンが好ましい。好ましくは、発酵培地の温度は90℃未満、より好ましくは75℃未満である。好ましい実施形態において、消泡剤は20〜30℃の範囲の曇点を有し、段階ii)の発酵培地の温度は、40〜60℃の範囲である。対照的に、従来の方法において、かかる高い温度に発酵培地を保持することは、(色および風味の変化を引き起こしうる)分解反応、酵素不活性化、タンパク質の変性、および機能性の損失の可能性を最小化するために、意図的に回避される(例えば、「Separation Processes in the Food and Biotechnology Industries」、Grandison, A.S.およびLewis, M.J.編、の7頁を参照されたい)。
【００５７】
消泡剤を分離するための好ましい方法は、膜濾過である。その曇点より高い温度で、消泡剤を含む発酵培養液の膜濾過を実行すると、沈殿した消泡剤による膜の汚染が起き、透過流量が低下し、結果としての処理が困難になると、一般に考えられてきた。例えば、Yamagiwaら、J. Chem. Eng. Japan、26(1993)、13〜18頁、およびWO01/014521)を参照されたい。したがって、膜濾過は曇点より低い温度で行われるべきであると、以前は考えられてきた。しかし、本発明者らは、ここに、消泡剤の曇点より約25℃高い温度で、限外濾過および精密濾過の作業を実行するとき、許容できる流量が得られることを発見した。
【００５８】
確実に、発泡剤生産物に(望ましくない汚染物質と通常みなされる)細胞内遺伝子物質がないようにするため、細胞を発酵培地から除去しなければならい。好ましい実施形態において、例えば曇点より高い温度で行われる精密濾過の段階において、沈殿した消泡剤を除去すると同時に、細胞を培地から分離する。
【００５９】
代替の実施形態において、細胞は、曇点より低い温度で、例えば、濾過(例えば、デッドエンド濾過またはフィルタープレス)、膜/クロスフロー濾過(例えば、精密濾過または限外濾過)、または遠心分離によって、消泡剤の除去に先立つ別個の段階で、培地から除去してもよい。この実施形態において、(例えば、限外濾過による)精製および/または濃縮段階は、細胞除去後であるが消泡剤分離前に、(曇点より低い温度で再度)実行してよい。次に、消泡剤を既に記載されている通り除去しうるように、培地を曇点より高い温度まで加熱する。
【００６０】
消泡剤および細胞が発酵培地から除去された時点で、発泡剤生産物は、例えば限外濾過によって、必要に応じて、さらに精製し、濃縮してもよい。発泡剤がハイドロフォビンである場合、例えば、ハイドロフォビンを表面に吸着し、次に表面をTween 20などの界面活性剤と接触させ、表面からハイドロフォビンを溶出することに関する、WO01/57076に記載の手順によって、発泡剤を発酵培地から精製しうる。また、Collenら、2002年、Biochim Biophys Acta. 1569巻、139〜50頁、Calonjeら、2002年、Can. J. Microbiol. 48巻、1030〜4頁、Askolinら、2001年、Appl Microbiol Biotechnol. 57巻、124〜30頁、およびDe Vriesら、1999年、Eur J Biochem. 262巻、377〜85頁も参照されたい。
【００６１】
一例にすぎず、限定されない以下の実施例および図に参照して、本発明を、さらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】Struktol J647およびJ633の0.2重量%水溶液に対する温度の関数としての透過%を示す図である。
【図２】実施例2において決定された較正グラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
(実施例)
(実施例1：消泡剤のための曇点の決定)
消泡剤の曇点は、ここで実証される以下の方法によって2種の市販の消泡剤について測定し、消泡剤の1つは曇点を有し(Struktol J647)、もう1つは曇点を有していない(Struktol J633)。
【００６４】
各消泡剤の0.2重量%溶液を、室温で水溶液に調製した。20mLの試料を、円筒状ガラス製バイアル(Turbiscan)中に注入した。水浴で1時間、測定温度に試料を平衡化した。Turbiscan Lab Expert(Formulaction、フランス)を使用して、試料の濁度を決定した。この装置は、波長λ880nmの光源、および試料溶液の入っているバイアルの底から25mm点で、試料を透過する入射光のパーセンテージを測定する、入射光から180°の光学センサーを有する。溶液が濁るにつれて、透過光が減少する。試料バイアルを、これもまた所望の測定温度に設定されたTurbiscan Lab Expertに移動した。透過%を、5℃から開始して、5℃間隔での温度の関数として測定し、その結果を図1に示す。J647の透過は、20から25℃の間で、75%から0%までに劇的に減少し、この温度範囲内で曇点に到達したことを示す。これは、製造者の見積もり値24℃に一致する。(曇点のより正確な値が必要とされる場合、より小さい温度間隔、例えば1または2℃で、測定できる。)対照的に、J633は曇点を有していないので、濁度の変化をほとんど示さない。したがって、J647は本発明における使用のために適した消泡剤であり、その一方で、J633は適していない。
【００６５】
(実施例2：モデル溶液からの消泡剤の除去)
溶液の温度を曇点より高くに上昇させ、濾過により沈殿物を除去することによって、モデル溶液から消泡剤を除去できることを実証する実験を実施した。Struktol J647を一定分量3.00gとり、MilliQ水で1Lに希釈することにより、Struktol J647の0.3%(w/v)溶液を調製した。この溶液の試料を、必要温度に設定された水浴に、1時間入れることにより、曇点より高く加熱した。次に、回旋により試料を穏やかに混合し、直ちに濾過した。
【００６６】
2種の異なる実験を実施した。第1に、固定溶液温度(50℃)で、2mlシリンジで、孔径0.45μm(Pall Life Sciences Acrodisc)、0.2μm、1.20μm、および5.00μm(以上全てSartorius Minisart)のフィルターを使用して、フィルターの孔径の効果を調査した。第2に、固定孔径(0.2μm)を使用し、溶液温度を30から70℃まで(すなわち、曇点より6から46℃高く)変化させた。
【００６７】
非イオン界面活性剤のためのLange LCK 433 Water Testing Kitを使用して、濾液中の消泡剤の濃度を決定した。これは、非イオン界面活性剤(J647など)が、指示薬TBPE(テトラブロモフェノールフタレインエチルエステル)との複合体を形成し、それをジクロロメタン中に抽出し、測光法で測定して濃度を決定できるという原理を使用する。第1に、較正曲線を作成した。Struktol J647を一定分量3.00gとり、15℃でMilliQ水で1Lに希釈することにより、Struktol J647の0.3%(w/v)溶液を調製した。これから一定分量をとり、MilliQ水で希釈し、濃度6、15、30、60、150、および300mg/Lとした。MilliQ水をブランク試料として使用した。各濃度の試料0.2mlを、TBPEおよびジクロロメタンの入っている試験管キットに添加した。試験管を2分間穏やかに混合し、30分間静置させた。次に、このTesting Kitの指示に従って、Lange DR2800分光光度計で、605nmで、試験管を測定した。図2は、この結果の較正グラフを示す。
【００６８】
次に、濾液をMilliQ水で1/10に希釈した。0.2mlの試料を、前記の通り分光光度計で測定し、各濾液中の消泡剤の濃度を、較正グラフから読み取った。濾液に残っている消泡剤の量(%)を、
(濾液中で測定された濃度)/(既知の出発濃度)×100%
で、算定した。
【００６９】
Lange LCK 333 Water Testing Kitを使用して、適切な濃度範囲で較正曲線を作成し、同様の技術により0.2mg/L(2×10-5% w/v)まで下がった消泡剤濃度を測定できる。この場合、一定分量0.2mlよりむしろ2mlの測定試料を試験キットに添加する。
【００７０】
結果をTable 2(表2)に示す。50℃で0.2μmフィルターを使用する2つの測定の間に残る消泡剤の量の差(すなわち6%)は、この方法に伴うエラーバーを示す。
【００７１】
【表２】
0005547080.tif 000003
【００７２】
データは、フィルター孔径が小さいほど、除去される消泡剤の量が多くなること、すなわち、予想通り溶液中に残る量が減少することを示す。J647について、孔径5.0μmは、消泡剤の大部分を除去するほど小さくなく、その一方で、孔径0.2μmは、約90%の消泡剤を除去する結果となる。データはまた、所与の孔径について、溶液温度を上昇させることによって、より有効な消泡剤の除去がもたらされることも示す。
【００７３】
(実施例3：モデル発酵培地からの消泡剤の除去)
典型的な発酵培地からの消泡剤の除去を実証するために、モデル発酵培地を調製した。最初に、Table 3(表3)に示される組成物を有する2種の溶液を調製した。典型的な流加発酵において、バッチ1は出発培地であり、バッチ2は、供給期間を通じて徐々に供給される。
【００７４】
【表３】
0005547080.tif 000004
【００７５】
各バッチ(量1L)を、121℃で20分間加圧滅菌した。次に、バッチを混合し(50:50)、消泡剤濃度0.6g/Lを有するモデル発酵培地を作った。培地に植菌せず、または培地を発酵させないで、未加工で試験した。試料を加熱し濾過して、消泡剤を除去し、全て実施例2に記載されている通り、消泡剤の残りの量を測定した。各場合に残る消泡剤の比率を、Table 4(表4)に示す。
【００７６】
【表４】
0005547080.tif 000005
【００７７】
実験を繰り返したが、追加の消泡剤をモデル発酵培地に添加し、出発濃度を3g/Lとした。結果をTable 5(表5)に示す。
【００７８】
【表５】
0005547080.tif 000006
【００７９】
これは、曇点を有する消泡剤を選択することにより、簡単で便利に、消泡剤をモデル発酵培地から実質的に除去できることを実証する。
【００８０】
(実施例4：発泡剤を含む発酵液からの消泡剤の除去)
サッカロミセスセレビシエの遺伝子組換えされた株の流加発酵を実施した。ハイドロフォビンの細胞外発現を発酵の間に達成するように、真菌トリコデルマリーセイ(発泡剤)由来のハイドロフォビンHFBIIをコードしている遺伝子を組み込むことで、株を組み換えた。グルコースを炭素源として使用し、方法を300Lの発酵槽で総体積150Lの規模にして、基本的に、van de Laar Tらによって、Biotechnol Bioeng. 96巻(3)、483〜94頁、(1997年)中に記載されている通りに、発酵を実行した。(van de Laar Tらによって使用されたStruktol J673の代わりに)消泡剤Struktol J647を使用して、発酵の間、発泡を制御した。
【００８１】
発酵の終わりに、発酵液を15℃(すなわち、消泡剤J647の曇点より低い)で精密濾過し、酵母細胞を除去した。2体積の脱イオン水での透析濾過を使用して、孔径0.1μmを有するKerasepセラミック膜により、パイロット規模のプラントで精密濾過を実施した。次に、再び15℃で液を限外濾過し、HFBIIを部分的に精製した。限外濾過は、膜貫通圧0.9バールおよび4体積の透過濾過で、1kD Synderらせん状巻きポリマー膜によった。
【００８２】
限外濾過段階後の発酵液中の消泡剤の濃度を(実施例2に記載されている通り)測定したところ、0.196g/Lであった。以下の通りに、HFBIIの濃度を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定したところ、0.320g/Lであった。分析前に、試料を60%の水性エタノールで希釈し、濃度約200μg/mlにした。30℃で、Vydac Protein C4カラム(250×4.6mm)で、HPLC分離を実施した。214nmでの紫外線検出によってハイドロフィンを測定し、VTT Biotechnology(Espoo、フィンランド)から入手した既知のHFBII濃度の試料との比較によって、濃度を算定した。
【００８３】
次に、実施例2に記載されている通り、細胞の存在しない液体を50℃に加熱し、その温度で30分間保持し、次に濾過して(孔径0.2μm)、消泡剤を除去した。濾液中の消泡剤およびHFBIIの残った量を、前記の通り測定し、Table 6(表6)(「第1段階」と書かれた欄)に示す。次に、この第1段階からの濾液を50℃まで再加熱し、この温度でさらに30分間保持し、前記の通り濾過した。結果として生じた濾液中のHFBIIおよび消泡剤の濃度を測定し、Table 6(表6)(「第2段階」)にまた示す。
【００８４】
【表６】
0005547080.tif 000007
【００８５】
これは、曇点を有する消泡剤を選択することによって、簡単で便利に、宿主細胞および発泡剤を含む発酵液から、消泡剤を実質的に除去できることを実証する。
【００８６】
上の各項で言及された本発明の様々な特徴および実施形態は、変更すべきは変更して、その他の項に適切に適用する。したがって、1つの項に明記された特徴は、その他の項で明記された特徴に、適切に組み合わされてよい。
【００８７】
上の明細書に言及された全ての出版物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明の記載された方法の様々な変更例および改変例は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって明白であろう。本発明は、具体的な好ましい実施形態と関連して記載されたが、請求された本発明は、かかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことが、理解されるべきである。実際、当業者にとって明白である、本発明を実行するための記載された形態の様々な変更例は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【図１】
0005547080.tif 000008
【図２】
0005547080.tif 000009
【配列表】
0005547080000001.app