(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させ、
ｂ）溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、ここで、溶出バッファーはアセタートであり、
ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、
ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、
ｉｉ）３．５〜４．５のｐＨを有し、
それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含み、
ここで、該方法を１５℃〜２７℃の温度で行う方法。
【請求項２】
該溶出バッファーにおけるアセタートの濃度が０．０５０Ｍ〜０．２００Ｍである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該単量体モノクローナル抗体がＩｇＧ抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該単量体モノクローナル抗体がＩｇＧ１である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該ＩｇＧ抗体が抗ＤＫＫ１抗体である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと１５℃〜２７℃の温度で接触させ、ｂ）０．０５０Ｍ〜０．２００Ｍの濃度のアセタートである溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、ｉｉ）３．５〜４．５のｐＨを有し、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。
【請求項７】
単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと１５℃〜２７℃の温度で接触させ、ｂ）０．０５０Ｍ〜０．２００Ｍの濃度のアセタートである溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、ｉｉ）３．２〜４．５のｐＨを有し、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願の全体にわたり、括弧内のアラビア数字により種々の参考文献が参照されている。本発明が関連する最新技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示の全体を参照により本出願に組み入れることとする。これらの参考文献の完全な書誌的引用は特許請求の範囲の直前に見出されうる。
【背景技術】
【０００２】
過去十年間に、治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の用途が相当に増加している。これらのタンパク質の精製および製剤化におけるｍＡｂの安定性が現在の課題である。ｍＡｂの不安定性はタンパク質製剤中の高レベルの凝集ｍＡｂを与え、これは、タンパク質活性の変化および潜在的に患者における望ましくない免疫応答を招くことを含む幾つかの欠点を有しうる。
【０００３】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、抗体を精製するための有力で広範に用いられている手段である。プロテインＡ樹脂からタンパク質または抗体を溶出するためには、モノクローナル抗体の、該樹脂に対する高いアフィニティーのため、酸性条件が要求される。これらの酸性条件に対する曝露はタンパク質凝集体の形成を引き起こしうる。プロテインＡクロマトグラフィー中の凝集に対処するための幾つかの方法が既に文献に記載されている（１，２，３，４，５，６）。更に、溶出後の低ｐＨ維持段階がウイルスの不活性化のために要求され、これもタンパク質凝集体の形成を引き起こしうる（７，８，９）。
【０００４】
従来、ｍＡｂ製剤中のタンパク質凝集を軽減するための１つのアプローチは、追加的なクロマトグラフィー段階を行うことであった。この解決手段は材料および加工時間の点で高い経費を要し、また、それは各段階で産物の喪失を引き起こし、これはｍＡｂ産物の総収量を減少させうる。
【０００５】
ｍＡｂ製剤中のタンパク質凝集を軽減するためのもう１つの従来のアプローチは、アフィニティークロマトグラフィー段階後のタンパク質凝集の量を減少させるためにピーク・カッティング（ｐｅａｋ  ｃｕｔｔｉｎｇ）のような進んだクロマトグラフィー方法を用いることであった。これらのアプローチは長時間を要し、それらは失敗に終わることが多く、ヒトに使用するのに適したｍＡｂ製剤を得るためには追加的なクロマトグラフィー段階を要する。
【０００６】
ｍＡｂ製剤中のタンパク質凝集を軽減するための更にもう１つの従来のアプローチは、安定剤を使用することであった。これは、タンパク質安定性の変化、更なる精製段階における問題および患者における潜在的に望ましくない免疫応答を含む幾つかの欠点を有しうる。
【０００７】
本発明の主題である方法は、ヒトに使用するのに適した単量体モノクローナル抗体を精製するために、モノクローナル抗体製剤中のタンパク質凝集を軽減するための、より簡便かつより経済的な方法に対する需要に対処するものである。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概括
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第１の方法であって、（ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させ、（ｂ）溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、（ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ［ここで、該産物プールは、（ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、（ｉｉ）約３．５〜約４．５のｐＨを有する］、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
【０００９】
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第２の方法であって、（ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと約１５℃〜約２７℃の温度で接触させ、（ｂ）約０．０３０Ｍ〜約０．０８５Ｍの濃度のシトラートを含む溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、（ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ［ここで、該産物プールは、（ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、（ｉｉ）約３．５〜約４．０のｐＨを有する］、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
【００１０】
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第３の方法であって、（ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと約１５℃〜約２７℃の温度で接触させ、（ｂ）約０．０５０Ｍ〜約０．２００Ｍの濃度のアセタートを含む溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、（ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ［ここで、該産物プールは、（ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、（ｉｉ）約３．５〜約４．５のｐＨを有する］、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中で用いる「タンパク質」または「ポリペプチド」なる語は、ペプチド結合により互いに共有結合したアミノ酸残基から構成されるポリペプチドを意味するものとする。
【００１２】
本明細書中で用いる「抗体」、「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン分子」なる語は互換的に用いられるものとする。各抗体は、その特異的抗原にそれが結合するのを可能にする特有の構造を有するが、すべての抗体は、本明細書に記載されているのと同じ全体的構造を有する。基本的な抗体構造単位はサブユニットの四量体を含むことが公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを有し、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識をもたらす約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能をもたらす定常領域を定める（１０）。
【００１３】
「Ｆｃ」フラグメントなる語は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する、抗体のＣ末端領域「結晶性フラグメント」を意味するものとする。「Ｆａｂ」フラグメントなる語は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含有する、抗体の「フラグメント抗原結合」領域を意味するものとする。
【００１４】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）なる語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味するものとする。すなわち、該集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる可能な天然で生じる突然変異の場合を除き同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対して高特異的である。更に、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各ｍＡｂは該抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンの混入を伴わないハイブリドーマ培養により合成されうる点で好都合である。「モノクローナル」なる語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解釈されるべきではない。例えば、本明細書におけるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に最初に記載されたハイブリドーマ法により製造されることが可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法により製造されうる（１１）。
【００１５】
本明細書中で用いる「単量体モノクローナル抗体」なる語は、２つの重鎖と２つの軽鎖とを含有する（すなわち、単量体）抗体分子を意味するものとする。
【００１６】
本明細書中で用いる「抗ＤＫＫ−１」抗体は、配列番号１および配列番号２に記載されている軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を意味するものとする。図２２を参照されたい。
【００１７】
本明細書中で用いる「抗ＡＤＤＬ」抗体は、本明細書中の配列番号３および配列番号４または配列番号４または配列番号５および配列番号６に記載されている軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を意味するものとする。それぞれ図２３および図２４を参照されたい。
【００１８】
本明細書中で用いる「抗ｈＩＬ−１３ｒα１」抗体は、配列番号７および配列番号８に記載されている軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体を意味するものとする。図２５を参照されたい。
【００１９】
本明細書中で用いる「修飾ＩｇＧ２抗体」は、図２６に示されるアミノ酸配列により表されるモノクローナル抗体の「ＩｇＧ２ｍ４」Ｆｃ領域を有する抗体を意味するものとする。
【００２０】
本明細書中で用いる「二量体」なる語は、単量体と称される２つのサブユニットよりなる生物学的分子を意味するものとする。本発明の「二量体」は、２つの単量体モノクローナル抗体を含有する分子を意味するものとする。
【００２１】
本明細書中で用いる「高次凝集体」または「ＨＯＡ」なる語は、典型的には３００ｋＤａ（すなわち、二量体分子量）を超える、単量体モノクローナル抗体の大きなオリゴマーを意味するものとする。
【００２２】
本明細書中で用いる「凝集体」または「凝集」なる語は、２以上の個々の分子の塊またはオリゴマー化（すなわち、タンパク質凝集体またはタンパク質凝集）を意味するものとする。タンパク質凝集体は可溶性または不溶性でありうる。
【００２３】
本明細書中で用いる「不純物」は、所望のタンパク質産物とは異なる物質（例えば、タンパク質凝集体）を意味するものとする。不純物は所望のタンパク質または別のタンパク質の変異体でありうる。本明細書における不純物の具体例には、所望のタンパク質を産生する宿主細胞からのタンパク質、例えば宿主タンパク質、浸出プロテインＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００３８２３１号を参照されたい）。
【００２４】
本明細書中で用いる「タンパク質分解」なる語は、ある条件下で分解して二量体またはそれ以上の高次凝集体を形成する単量体モノクローナル抗体またはタンパク質を意味するものとする。
【００２５】
一次回収はプロテインＡクロマトグラフィーに対する供給流（ｆｅｅｄ  ｓｔｒｅａｍ）を与える。この供給流を示すために用いられる１つの用語は「デプス・フィルタード・セントレート（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｃｅｎｔｒａｔｅ）」と称され、本明細書中で用いられる場合には、遠心分離（細胞および残渣除去）およびデプス・フィルトレーション（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（＜１０μｍの微細残渣の除去）により処理されたモノクローナル抗体またはタンパク質溶液を意味するものとする。本発明においては、デプス・フィルタード産物がプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの研究用実験のための及び種々の臨床ロットの製造のための供給溶液として使用される。
【００２６】
「プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー」なる語は、プロテインＡを使用する物質および／または粒子の分離または精製を意味するものとし、ここで、該プロテインＡは一般には固相に固定化されている。プロテインＡは、元々はスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）において見出された４０〜６０ｋＤの細胞壁タンパク質である。プロテインＡ樹脂への抗体の結合は高特異的である。プロテインＡは免疫グロブリンのＦｃ領域に高いアフィニティーで結合する。それはヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２ならびにマウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂに高いアフィニティーで結合する。プロテインＡはヒトＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥならびにマウスＩｇＧ３およびＩｇＧ１に中等度のアフィニティーで結合する。ＣＨ２／ＣＨ３領域を含むタンパク質はプロテインＡに可逆的に結合または吸着しうる。本発明におけるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用されるプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムは、アガロース固相、例えばＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）またはＭＡＢＳＵＲＥ（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）上に固定化されたプロテインＡ；ポリスチレン固相、例えばＰＯＲＯＳ  ５０Ａ（商標）カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）上に固定化されたプロテインＡを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本方法に関連して用いられる「サンプル」には、任意の身体組織、血液、血清、血漿、脳脊髄液、リンパ球、浸出物または細胞培養からの上清が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
「負荷（ｌｏａｄ）」または「ローディング」なる語は単位体積当たりのタンパク質の量を意味するものとする。
【００２９】
本明細書中で用いる「接触」なる語は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにおけるプロテインＡ樹脂にモノクローナル抗体を接触させることを意味するものとする。
【００３０】
本明細書中で用いる「溶出バッファー」なる語は、該プロテインＡアフィニティーカラムから該抗体を溶出するために使用される例えばクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムのような主要種を含むバッファーを意味するものとする。
【００３１】
本明細書中で用いる「シトラート」なる語は、対応する酸または塩に由来する、該溶出バッファー中に存在するアニオン種を意味するものとする。
【００３２】
本明細書中で用いる「アセタート」なる語は、対応する酸または塩に由来する、該溶出バッファー中に存在するアニオン種を意味するものとする。
【００３３】
「１以上の画分（画分の１以上）を集める」において本明細書中で用いる「画分」なる語は、ある量の混合物（固体、液体、溶質または懸濁液）がより少量の幾つかの量（「画分」）に分割される分離プロセス（この場合、勾配に従って組成が変化する）の結果物を意味するものとする。ここでは、該単量体モノクローナル抗体が該プロテインＡアフィニティーカラムから溶出するにつれて画分が集められる。
【００３４】
本明細書中で用いる「再生バッファー」なる語は、結合不純物を除去するために該カラムを浄化するために使用されるバッファーを意味するものとする。例えば、高塩バッファー、ＮａＯＨ含有またはリン酸含有バッファー（１３）が挙げられる（１３）。
【００３５】
本明細書中で用いる「カラム容積」または「ＣＶ」なる語は、いずれかのゲル粒子内部容積を含むカラム内部の充填樹脂の容積を意味するものとする。例えば、１０ｍＬカラムに２ｍＬの樹脂が充填されている場合、１ＣＶは２ｍＬである。
【００３６】
本明細書中で用いる「滞留時間」なる語は、該産物の一部分が該樹脂と相互作用する時間の長さを意味するものとする。
【００３７】
本明細書中で用いる「流量」なる語は、カラム容積を滞留時間で割り算したものを意味するものとする。例えば、５分間の特定滞留時間における１０ｍＬの樹脂のカラムに関する流量は以下のようになるであろう。
【００３８】
【数１】
0005529869.tif 000002
【００３９】
本明細書中で用いる「プロテインＡ産物」または「ＰＡＰ」なる語は、例えばクエン酸ナトリウムまたは酢酸ナトリウムのような酸を使用してプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出された産物を意味するものとする。
【００４０】
本明細書中で用いる「クエンチ化（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）プロテインＡ産物」または「ＱＰＡＰ」なる語は、ＰＡＰのｐＨをｐＨ約３．０〜４．０から約６．０〜７．５へと上昇させるために例えばトリス（ｔｒｉｓ）塩基またはホスファート溶液のような塩基がＰＡＰに付加されたものを意味するものとする。
【００４１】
本明細書中で用いる「収率」なる語は、回収された産物の量を、該カラムにローディングされた量で割り算し１００を掛けたものを意味するものとする。例えば、１００グラムの産物を含有する溶液でローディングされたが、そのうちの８０グラムの産物が溶出流から回収されたカラムは、８０％の収率を有するであろう。
【００４２】
本明細書中で用いる「示差走査熱量測定法」または「ＤＳＣ」なる語は、温度の関数としてサンプルおよび対照の温度を増加させるのに要した熱量における差を測定する熱分析技術を意味するものとする。タンパク質の場合、ＤＳＣは、タンパク質およびその個々のドメインの熱安定性に関する並びに該タンパク質のアンフォールディング形態の溶解度に関する情報を提供する。
【００４３】
本明細書中で用いる「高圧または高速液体クロマトグラフィー」または「ＨＰＬＣ」なる語は、化合物を分離、同定および定量するために高圧を利用するカラムクロマトグラフィーの形態を意味するものとする。ＨＰＬＣは、特定された温度の固定相、移動相溶液のためのポンプ、およびカラム上に注入された各化合物を定量するための検出器を含有するカラムを使用する。
【００４４】
「高圧サイズ排除クロマトグラフィー」または「ＨＰＳＥＣ」なる語は、分子量または流体力学的体積に基づいて粒子を分離するために高圧（２０〜１５０ｂａｒ）を使用するクロマトグラフィー法を意味するものとする。本発明においては、この技術は、モノクローナル抗体、二量体およびそれ以上の高次凝集体の分離および定量のために適用される。
【００４５】
本明細書中で用いる「小規模」なる語は、３００ｍＬ未満の樹脂のプロテインＡアフィニティーカラムサイズを意味するものとする。
【００４６】
本明細書中で用いる「安定剤」なる語は、タンパク質凝集体形成の速度（比率）を低下させる例えばアルギニン、プロリンまたはヒスチジンのような物質を意味するものとする。
【００４７】
本明細書中で用いる「時間ゼロサンプル」なる語は、産物が樹脂から溶出した直後に相当する実験開始時間を意味するものとする。
【００４８】
発明の実施形態
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第１の方法であって、（ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させ、（ｂ）溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、（ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ［ここで、該産物プールは、（ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、（ｉｉ）約３．５〜約４．５のｐＨを有する］、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
【００４９】
前記方法の１つの実施形態においては、該溶出バッファーはアセタートまたはシトラートである。
【００５０】
もう１つの実施形態においては、該溶出バッファーにおけるシトラートの濃度は約０．０３０Ｍ〜約０．０８５Ｍである。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００５１】
更にもう１つの実施形態においては、アセタートの濃度は約０．０５０Ｍ〜約０．２００Ｍである。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００５２】
前記方法のもう１つの実施形態においては、該方法は、約４℃〜約３０℃の温度で行う。ここで用いる「約」は±４℃を意味するものとする。
【００５３】
もう１つの実施形態においては、該方法は、約１５℃〜約２７℃の温度で行う。ここで用いる「約」は±４℃を意味するものとする。
【００５４】
１つの実施形態においては、該単量体モノクローナル抗体はＩｇＧ抗体である。
【００５５】
もう１つの実施形態においては、該単量体モノクローナル抗体はＩｇＧ１または修飾ＩｇＧ２抗体である。
【００５６】
もう１つの実施形態においては、該ＩｇＧ１抗体は抗ＡＤＤＬ抗体である。一例は、図２３の配列番号３および配列番号４として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＡＤＤＬ抗体である（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３８１２５号を参照されたい）。
【００５７】
更にもう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２抗体はＩｇＧ２ｍ４抗体である（図２６）（例えば、米国出願第１１／５８１，９３１号を参照されたい）。
【００５８】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ＤＫＫ−１抗体である。一例は、図２２の配列番号１および配列番号２として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＤＫＫ−１抗体である（例えば、米国出願第１２／０１２，８８５号を参照されたい）。
【００５９】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ＡＤＤＬ抗体である。一例は、図２４の配列番号５および配列番号６として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＡＤＤＬ抗体である（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４０５０８号を参照されたい）。
【００６０】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ｈＩＬ−１３ｒα−１抗体である。一例は、図２５の配列番号７および配列番号８として表される重鎖および軽鎖を有する抗ｈＩＬ−１３ｒα−１抗体である（例えば、米国出願第１１／８７５，０１７号を参照されたい）。
【００６１】
１つの実施形態においては、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度のアミノ酸を該溶出バッファーに加える。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００６２】
もう１つの実施形態においては、該アミノ酸はヒスチジン、プロリンまたはアルギニンである。
【００６３】
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第２の方法であって、（ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと約１５℃〜約２７℃の温度で接触させ、（ｂ）約０．０３０Ｍ〜約０．０８５Ｍの濃度のシトラートを含む溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、（ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ［ここで、該産物プールは、（ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、（ｉｉ）約３．５〜約４．５のｐＨを有する］、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
【００６４】
前記方法の１つの実施形態においては、該溶出バッファーはアセタートまたはシトラートである。
【００６５】
もう１つの実施形態においては、該溶出バッファーにおけるシトラートの濃度は約０．０３０Ｍ〜約０．０８５Ｍである。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００６６】
更にもう１つの実施形態においては、アセタートの濃度は約０．０５０Ｍ〜約０．２００Ｍである。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００６７】
前記方法のもう１つの実施形態においては、該方法は、約４℃〜約３０℃の温度で行う。ここで用いる「約」は±４℃を意味するものとする。
【００６８】
もう１つの実施形態においては、該方法は、約１５℃〜約２７℃の温度で行う。ここで用いる「約」は±４℃を意味するものとする。
【００６９】
１つの実施形態においては、該単量体モノクローナル抗体はＩｇＧ抗体である。
【００７０】
もう１つの実施形態においては、該単量体モノクローナル抗体はＩｇＧ１または修飾ＩｇＧ２抗体である。
【００７１】
もう１つの実施形態においては、該ＩｇＧ１抗体は抗ＡＤＤＬ抗体である。一例は、図２３の配列番号３および配列番号４として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＡＤＤＬ抗体である（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３８１２５号を参照されたい）。
【００７２】
更にもう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２抗体はＩｇＧ２ｍ４抗体である（図２６）（例えば、米国出願第１１／５８１，９３１号を参照されたい）。
【００７３】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ＤＫＫ−１抗体である。一例は、図２２の配列番号１および配列番号２として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＤＫＫ−１抗体である（例えば、米国出願第１２／０１２，８８５号を参照されたい）。
【００７４】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ＡＤＤＬ抗体である。一例は、図２４の配列番号５および配列番号６として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＡＤＤＬ抗体である（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４０５０８号を参照されたい）。
【００７５】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ｈＩＬ−１３ｒα−１抗体である。一例は、図２５の配列番号７および配列番号８として表される重鎖および軽鎖を有する抗ｈＩＬ−１３ｒα−１抗体である（例えば、米国出願第１１／８７５，０１７号を参照されたい）。
【００７６】
１つの実施形態においては、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度のアミノ酸を該溶出バッファーに加える。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００７７】
もう１つの実施形態においては、該アミノ酸はヒスチジン、プロリンまたはアルギニンである。
【００７８】
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第３の方法であって、（ａ）該サンプルをプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムと約１５℃〜約２７℃の温度で接触させ、（ｂ）約０．０５０Ｍ〜約０．２００Ｍの濃度のアセタートを含む溶出バッファーで該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、（ｃ）段階（ｂ）からの該単量体モノクローナル抗体の画分の１以上を集めてプロテインＡ産物プールを形成させ［ここで、該産物プールは、（ｉ）５％未満の高次凝集体を含み、（ｉｉ）約３．５〜約４．５のｐＨを有する］、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
【００７９】
前記方法の１つの実施形態においては、該溶出バッファーはアセタートまたはシトラートである。
【００８０】
もう１つの実施形態においては、該溶出バッファーにおけるシトラートの濃度は約０．０３０Ｍ〜約０．０８５Ｍである。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００８１】
更にもう１つの実施形態においては、アセタートの濃度は約０．０５０Ｍ〜約０．２００Ｍである。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００８２】
前記方法のもう１つの実施形態においては、該方法は、約４℃〜約３０℃の温度で行う。ここで用いる「約」は±４℃を意味するものとする。
【００８３】
もう１つの実施形態においては、該方法は、約１５℃〜約２７℃の温度で行う。ここで用いる「約」は±４℃を意味するものとする。
【００８４】
１つの実施形態においては、該単量体モノクローナル抗体はＩｇＧ抗体である。
【００８５】
もう１つの実施形態においては、該単量体モノクローナル抗体はＩｇＧ１または修飾ＩｇＧ２抗体である。
【００８６】
もう１つの実施形態においては、該ＩｇＧ１抗体は抗ＡＤＤＬ抗体である。一例は、図２３の配列番号３および配列番号４として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＡＤＤＬ抗体である（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３８１２５号を参照されたい）。
【００８７】
更にもう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２抗体はＩｇＧ２ｍ４抗体である（図２６）（例えば、米国出願第１１／５８１，９３１号を参照されたい）。
【００８８】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ＤＫＫ−１抗体である。一例は、図２２の配列番号１および配列番号２として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＤＫＫ−１抗体である（例えば、米国出願第１２／０１２，８８５号を参照されたい）。
【００８９】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ＡＤＤＬ抗体である。一例は、図２４の配列番号５および配列番号６として表される重鎖および軽鎖を有する抗ＡＤＤＬ抗体である（例えば、ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４０５０８号を参照されたい）。
【００９０】
もう１つの実施形態においては、該修飾ＩｇＧ２ｍ４抗体は抗ｈＩＬ−１３ｒα−１抗体である。一例は、図２５の配列番号７および配列番号８として表される重鎖および軽鎖を有する抗ｈＩＬ−１３ｒα−１抗体である（例えば、米国出願第１１／８７５，０１７号を参照されたい）。
【００９１】
１つの実施形態においては、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度のアミノ酸を該溶出バッファーに加える。ここで用いる「約」は±０．０１５Ｍを意味するものとする。
【００９２】
もう１つの実施形態においては、該アミノ酸はヒスチジン、プロリンまたはアルギニンである。
【００９３】
前記方法のそれぞれのもう１つの実施形態においては、該プロテインＡ産物プールは３．２以上のｐＨを有する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体（図２２に示す配列番号１および配列番号２）に関する、４℃、１７℃および３７℃における時間の関数としての、６．１のＰＡＰプールｐＨにおける高次凝集体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ６．１（４℃）、○＝ｐＨ６．１（１７℃）および△＝ｐＨ６．１（３７℃）。
【図２】図２は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体（図２２に示す配列番号１および配列番号２）に関する、４℃、１７℃および３７℃における時間の関数としての、３．５のＰＡＰプールｐＨにおける高次凝集体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ３．５（４℃）、○＝ｐＨ３．５（１７℃）および△＝ｐＨ３．５（３７℃）。
【図３】図３は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、４℃、１７℃および３７℃における時間の関数としての、６．１のＰＡＰプールｐＨにおける二量体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ６．１（４℃）、○＝ｐＨ６．１（１７℃）および△＝ｐＨ６．１（３７℃）。
【図４】図４は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、４℃、１７℃および３７℃における時間の関数としての、３．５のＰＡＰプールｐＨにおける二量体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ３．５（４℃）および○＝ｐＨ３．５（１７℃）。
【図５】図５は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、２５℃および３０℃における時間の関数としての、３．５のＰＡＰプールｐＨにおける高次凝集体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ３．５（２５℃）および○＝ｐＨ３．５（３０℃）。
【図６】図６は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、２５℃および３０℃における時間の関数としての、３．５のＰＡＰプールｐＨにおける二量体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ３．５（２５℃）および○＝ｐＨ３．５（３０℃）。
【図７】図７は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、２１℃における時間の関数としての、４．０、４．５および５．０のｐＨにおける高次凝集体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ４．０（２１℃）、○＝ｐＨ４．５（２１℃）および△＝ｐＨ５．０（２１℃）。
【図８】図８は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、３０℃における時間の関数としての、４．０、４．５および５．０のｐＨにおける高次凝集体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ４．０（３０℃）、○＝ｐＨ４．５（３０℃）および△＝ｐＨ５．０（３０℃）。
【図９】図９は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、２１℃における時間の関数としての、４．０、４．５および５．０のｐＨにおける二量体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ４．０（２１℃）、○＝ｐＨ４．５（２１℃）および△＝ｐＨ５．０（２１℃）。
【図１０】図１０は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、３０℃における時間の関数としての、４．０、４．５および５．０のｐＨにおける二量体形成の比率を示す。該図において、□＝ｐＨ４．０（３０℃）、○＝ｐＨ４．５（３０℃）および△＝ｐＨ５．０（３０℃）。
【図１１】図１１は、ｐＨ３．５にける抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体ＰＡＰに関する、４℃、１７℃、２５℃および３０℃における時間に対する高次凝集体のレベルを示す。該図において、■＝３０℃、◆＝２５℃、▲＝１７℃および×＝４℃。
【図１２】図１２は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、ｐＨ３．９１および５０ｍＭのシトラート濃度における時間および温度の関数としての高次凝集体形成を示す。該図において、◇＝ｐＨ３．９１（４℃）、□＝ｐＨ３．９１（１５℃）、△＝ｐＨ３．９１（２０℃）および×＝ｐＨ３．９１（２４℃）。
【図１３】図１３は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、室温での５０ｍＭおよび１００ｍＭのシトラート濃度における時間の関数としての高次凝集体形成を示す。該図において、■＝ｐＨ３．５（２５℃）および◆＝ｐＨ３．９１（２４℃）。
【図１４】図１４は、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する、２５℃におけるシトラート濃度および時間の関数としての高次凝集体形成を示す。該図において、
【化１】
0005529869.tif 000003
【図１５Ａ】図１５Ａは、ｐＨ３．０での３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートにおける抗ＤＫＫ１抗体に関するＤＳＣプロファイルを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ｐＨ３．５での３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートにおける抗ＤＫＫ１抗体に関するＤＳＣプロファイルを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ｐＨ４．０での３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートにおける抗ＤＫＫ１抗体に関するＤＳＣプロファイルを示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ｐＨ４．５での３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートにおける抗ＤＫＫ１抗体に関するＤＳＣプロファイルを示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ｐＨ５．０での３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートにおける抗ＤＫＫ１抗体に関するＤＳＣプロファイルを示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ｐＨ５．５での３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートにおける抗ＤＫＫ１抗体に関するＤＳＣプロファイルを示す。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、ｐＨ６．０での３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートにおける抗ＤＫＫ１抗体に関するＤＳＣプロファイルを示す。
【図１７】図１７は、２５℃での５０ｍＭ  アルギニンの存在下および非存在下の６０ｍＭ  クエン酸溶出の場合の抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体形成に関する高次凝集体形成の比率を示す。該図において、◇＝６０ｍＭシトラート＋５０ｍＭアルギニン（ｐＨ３．５および２５℃）および□＝６０ｍＭシトラートのみ（ｐＨ３．５および２５℃）。
【図１８】図１８は、２５℃での２５０ｍＭ  アルギニンの存在下および非存在下の１００ｍＭ  クエン酸溶出の場合の抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する高次凝集体形成の比率を示す。該図において、◇＝１００ｍＭシトラート＋２５０ｍＭアルギニン（ｐＨ３．５および２５℃）および□＝１００ｍＭシトラートのみ（ｐＨ３．５および２５℃）。
【図１９】図１９は、２５℃における時間の関数としてのリン酸塩バッファーと比較した種々のシトラート濃度での抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する高次凝集体形成の比率を示す。該図において、
【化２】
0005529869.tif 000004
【図２０】図２０は、経時的な１５ｍＭクエン酸における２５℃での高次凝集体の比率に対する抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体のモノクローナル抗体濃度の効果を示す。該図において、◆＝８ｍｇ／ｍＬ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂ、■＝１４ｍｇ／ｍＬ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂおよび▲＝３４ｍｇ／ｍＬ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂ。
【図２１】図２１は、２１℃での１５ｍＭシトラートおよび２５℃での８５ｍＭアセタートにおけるｐＨ４．０での経時的な高次凝集体の比率に対する抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体のモノクローナル抗体濃度の効果を示す。該図において、●＝５ｍｇ／ｍｌ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂ（アセタート中）、＋＝１１ｍｇ／ｍＬ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂ（アセタート中）、△＝３７ｍｇ／ｍｌ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂ（アセタート中）および◆＝７ｍｇ／ｍｌ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂ（シトラート中）。
【図２２】図２２は重鎖および軽鎖の抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体アミノ酸配列（配列番号１および配列番号２）を示す。
【図２３】図２３は重鎖および軽鎖の抗ＡＤＤＬ＃１モノクローナル抗体アミノ酸配列（配列番号３および配列番号４）を示す。
【図２４】図２４は重鎖および軽鎖の抗ＡＤＤＬ＃２モノクローナル抗体アミノ酸配列（配列番号５および配列番号６）を示す。
【図２５】図２５は重鎖および軽鎖の抗ｈＩＬ−１３ｒα−１モノクローナル抗体アミノ酸配列（配列番号７および配列番号８）を示す。
【図２６】図２６は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４からのＦｃ領域のものと比較された、モノクローナル抗体のＩｇＧ２ｍ４  Ｆｃ領域からのアミノ酸配列のアライメントを示す。
【００９５】
本発明は以下の実施例から更に深く理解されるであろう。しかし、記載されている特定の方法および結果は、添付の特許請求の範囲に完全に記載されている本発明の単なる例示に過ぎない、と当業者は容易に認識するであろう。
【実施例１】
【００９６】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー溶出およびそれに続く低ｐＨ維持中のタンパク質凝集のレベルを減少させるための温度低下
タンパク質凝集の温度およびｐＨ依存性を特徴づけるために、シトラート（１００ｍＭ、ｐＨ３．５）を含有するＰＡＰ溶出プールに対する温度およびｐＨの効果を抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関して評価した。抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体のような他のｍＡｂにも同じ方法が利用可能である。
【００９７】
材料および方法
小規模：ＡＫＴＡ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ  １００（商標）を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。ＰＡＰのｐＨ調節のためのトリス塩基はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験用のＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。デプス・フィルタード・セントレート（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｃｅｎｔｒａｔｅ）を得、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）および２つの温度制御室を使用して、ＰＡＰおよびＱＰＡＰサンプルの温度を制御した。
【００９８】
実験１Ａ：
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂（３３．３５ｍＬ）が充填されたカラム（１．７ｃｍ×１４．５ｃｍ）を５ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）で６．８ｍＬ／分（５分の滞留時間）で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを１７℃で６．８ｍＬ／分の流量で樹脂１リットル当たり２７ｇ  ｍＡｂでローディングした。ローディング後、該カラムを３ＣＶのＰＢＳで洗浄し、ついで４ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄した。該産物を８．３ｍＬ／分（４分の滞留時間）で０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で０．５〜３．０ＣＶにわたって溶出させた。溶出後、ＰＡＰ（９ｇ／Ｌ）プールをｐＨ３．５で１７℃で３０分間維持した。該低ｐＨ維持の後、ｐＨ３．５における該プロテインＡ産物（ＰＡＰ）の一部を４、１７および３７℃で配置した。該ＰＡＰ流の残りをｐＨ６．１にクエンチし、４、１７および３７℃で配置した。ｐＨ条件３．５および６．１からのサンプル（２８０μＬ）を種々の時間間隔で採取し、トリス塩基（１Ｍ、２０μＬ）を使用してｐＨ６にクエンチし、ＨＰＳＥＣを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。該カラムを５ＣＶの５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、１Ｍ  塩化ナトリウムで８．３ｍＬ／分で再生させ、ＰＢＳ中の２０％  エタノール中で保存した。
【００９９】
実験１Ｂ：
この実験は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを行うために、この段階を２５℃で行ったこと以外は実験１Ａに記載されているのと同じカラム、供給ストックおよび方法を用いた。溶出後、該ＰＡＰ（８ｇ／Ｌ、ｐＨ３．５）を細分し、２５℃および３０℃で配置した。両方の温度におけるサンプル（２８０μＬ）を種々の時間間隔で採取し、トリス塩基（１Ｍ、２０μＬ）を使用してｐＨ６にクエンチし、ＨＰＳＥＣを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。該カラムを５ＣＶの５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、１Ｍ  塩化ナトリウムで８．３ｍＬ／分で再生させ、ＰＢＳ中の２０％  エタノール中で保存した。
【０１００】
分析：
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上でＰＯＲＯＳ（商標）プロテインＡ  ＩＤ免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのＰＡＰまたはＱＰＡＰサンプルをｍＡｂ単量体濃度に関して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系上でＴｏｓｏｈサイズ排除カラム（０．７８ｃｍ  ＩＤ×３０ｃｍ長）を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体（二量体およびそれ以上の高次凝集体）を定量した。溶液ｐＨを測定するために、ｐＨプローブ（±０．１ｐＨ単位の精度）およびメーター（温度補償を伴うもの）（共にＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）を使用した。
【０１０１】
結果および考察
抗ＤＫＫ−１抗体を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、種々のｐＨ（３．５、６．１）および温度（４℃〜３７℃）値で維持して、タンパク質凝集に対するｐＨおよび温度の効果を判定した。ＨＰＳＥＣ分析による判定によると、３７℃で３．５日間までの維持期間にわたり、プロテインＡアフィニティーカラムからの産物溶出の後で該ＰＡＰ流をｐＨ６．１にクエンチした場合、タンパク質凝集は生じなかった（図１）。３．５日の時点で、ｐＨ６．１および３７℃で、高次凝集体レベルは０．８％から１．３％に増加した一方、抗体レベルは９８％から９７％に減少した。該二量体はｐＨ６．１において全ての温度で一定レベルのままであった（図３）。該単量体は４℃および１７℃、ｐＨ６．１で安定なままであった（図１および３を参照されたい）。
【０１０２】
ｐＨ３．５において、高次凝集体（ＨＯＡ）のレベルは温度上昇と共に有意に増加した（図２）。また、二量体のレベルは１７℃への温度上昇と共にｐＨ３．６で０．８％増加した（図４）。３７℃およびｐＨ３．６で、該単量体の安定性は急速に減少し（図２および４を参照されたい）、これはタンパク質凝集体の有意な沈殿を促進させる。この沈殿はＨＰＳＥＣによるタンパク質凝集レベルの定量の精度に影響を及ぼす可能性があり、この方法の制限となる。温度を４℃に低下させると、ＨＯＡレベルは３０分後に僅か０．７％および８時間後に１．５％であった（図２）。したがって、ＰＡＰの温度を１７℃から４℃に低下させることにより、ＨＯＡレベルは有意に４％〜７％減少した。
【０１０３】
タンパク質凝集体形成に対する、より高い温度（＞１７℃）の効果を定量するために、２５℃および３０℃で追加的な実験を行った。ＰＡＰ（ｐＨ３．５、９ｍｇ／ｍＬ  抗ＤＫＫ−１抗体）における高次凝集体（ＨＯＡ）のレベルは２５℃では２０分ごとに１．５％〜３．０％増加し、３０℃では２０分ごとに４％〜６％増加した（図５）。二量体のレベルは２５℃では４時間で７％まで増加し、３０℃では１．５時間で１０％に増加した（図６）。また、２５℃での実験の時間ゼロサンプル（産物溶出および採集後）は０．６％のＨＯＡを含有していた。したがって、この実験で該産物が結合している又は該カラムから溶出している間に、ＨＯＡは形成しなかった。
【実施例２】
【０１０４】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー溶出およびそれに続く低ｐＨ維持中のタンパク質凝集のレベルを減少させるためのＰＡＰプールのｐＨの上昇
タンパク質凝集に対するｐＨの影響を特徴づけるために、ＱＰＡＰ溶出プールに対するｐＨ（３．５〜５．０）の効果を抗ＤＫＫ１モノクローナル抗体に関して評価した。抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体のような他のｍＡｂにも同じ方法が利用可能である。
【０１０５】
材料および方法
小規模：ＡＫＴＡ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ  １００（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。ＰＡＰのｐＨ調節のためのトリス塩基はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験用のＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。デプス・フィルタード・セントレート（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｃｅｎｔｒａｔｅ）をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）および２つの温度制御室を使用して、ＰＡＰおよびＱＰＡＰサンプルの温度を制御した。
【０１０６】
実験２Ａ：
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂（３３．３５ｍＬ）が充填されたカラム（１．７ｃｍ×１４．５ｃｍ）を５ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）で６．８ｍＬ／分（５分の滞留時間）で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを、室温（２１℃）で６．８ｍＬ／分の流量を用いて、樹脂１リットル当たり２５ｇ  ｍＡｂでローディングした。ローディング後、該カラムを３ＣＶのＰＢＳで洗浄し、ついで４ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で洗浄した。該産物を８．３ｍＬ／分（４分の滞留時間）で０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で０．５〜３．０ＣＶにわたって溶出させた。溶出後、ＰＡＰ（６．９ｇ／Ｌ）プールを、１Ｍ  トリス塩基（１６ｖ％）を使用してｐＨ６にクエンチした。
【０１０７】
実験２Ｂ：
このＱＰＡＰ流を該ｐＨ実験のための供給体として使用した。シトラート溶液（４Ｍ、５０〜１００μＬ）を、該溶液ｐＨが５．０に到達するまで、該ＱＰＡＰ（２０ｍＬ）に加えた。この溶液のサンプル（２ｍＬ）をｐＨ５．０で採取し、２１℃および３０℃で配置した。ｐＨ４．５および４．０における溶解状態を得るために、この手順を繰返した。サンプル（１００μＬ）を種々の時点で採取し、トリス塩基（０．５〜１Ｍ、１０〜３０μＬ）を使用してｐＨ６にクエンチし、ＨＰＳＥＣを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。
【０１０８】
分析：
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上でＰＯＲＯＳ（商標）プロテインＡ  ＩＤ免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのＰＡＰまたはＱＰＡＰサンプルをｍＡｂ濃度に関して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系上でＴｏｓｏｈサイズ排除カラム（０．７８ｃｍ  ＩＤ×３０ｃｍ長）を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体（すなわち、二量体およびそれ以上の高次凝集体）を定量した。溶液ｐＨを測定するために、ｐＨプローブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（＋／−  ０．１ｐＨ単位の精度を有するもの）およびメーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（温度補償を伴うもの）を使用した。
【０１０９】
結果および考察
タンパク質凝集に対するｐＨの効果を判定するために、該ＱＰＡＰのｐＨをｐＨ４．０〜ｐＨ５．０に低下させた。該単量体は２１℃および３０℃でｐＨ４．５またはそれ以上で少なくとも２．５時間にわたり安定であった（図７および９、ならびに８および１０を参照されたい）。ｐＨ４．０におけるＨＯＡレベルは２１℃では０．９％〜２．０％の範囲であり、３０℃では２．５時間にわたり３％〜１３％の範囲であった（図７および図８）。ｐＨ４．０におけるＨＯＡレベルは温度上昇と共に増加し、これは、実施例１においてｐＨ３．５で見られたのと同じ傾向である。該二量体レベルは２１℃、ｐＨ４．０〜５．０で一定のままであったが、ｐＨ４．０で温度が３０℃に上昇すると増加した（図９および図１０）。
【０１１０】
温度に加えて、ｐＨもＰＡＰプールにおけるタンパク質凝集体の形成の動力学的速度に影響を及ぼした。該ＰＡＰプールのｐＨが上昇するにつれて、高次凝集体および二量体の比率は有意に減少した。この実験におけるイオン強度変化の影響を、高濃縮酸を使用することにより調節した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー溶出およびそれに続く低ｐＨ維持段階中のタンパク質凝集を防ぐために、より高いｐＨで該溶出を行うことが可能である。
【実施例３】
【０１１１】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー溶出およびそれに続く低ｐＨ維持中のプロテインＡ凝集体のレベルを減少させるための溶出バッファー濃度およびｐＨの効果の分離
溶出バッファーのｐＨおよび濃度の影響を分離して、ＰＡＰプールにおけるタンパク質凝集に対する両方のパラメーターの影響を特徴づけした。また、該プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーから該単量体を溶出させるのに必要な溶出バッファーの最小濃度を決定した。これを抗ＤＫＫ１モノクローナル抗体に関して評価した。
【０１１２】
材料および方法
小規模：ＡＫＴＡ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ  １００（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。ＰＡＰのｐＨ調節のためのトリス塩基はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験用のＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。デプス・フィルタード・セントレート（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｃｅｎｔｒａｔｅ）をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、ＰＡＰおよびＱＰＡＰサンプルの温度を制御した。
【０１１３】
実験Ａ：
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂（１．０６ｍＬ）が充填されたカラム（０．５ｃｍ×５．４ｃｍ）を５ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）で０．２ｍＬ／分（５分の滞留時間）で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを、室温（１７℃〜２１℃）で０．２ｍＬ／分の流量を用いて、樹脂１リットル当たり２５ｇ  ｍＡｂでローディングした。ローディング後、該カラムを３ＣＶのＰＢＳ、ついで４ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で０．２ｍＬ／分で洗浄した。０．５〜１．０ｍＬ／分（１〜２分の滞留時間）で少なくとも２．５ＣＶにわたる１０％の０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）（１０ｍＭ  シトラート）での段階勾配を用いて、該産物を溶出させた。２０％、３０％および１００％の０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）バッファー（それぞれ２０ｍＭ、３０ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラート）を使用して、この溶出段階を更に３回繰返した。溶出後、該ＰＡＰ流の全てを、１Ｍ  トリス塩基を使用してｐＨ６にクエンチした。該カラムを５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、１Ｍ  塩化ナトリウムで０．５〜１．０ｍＬ／分で再生させ、ＰＢＳ中の２０ｖ％エタノール中で保存した。
【０１１４】
実験Ｂ：
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂（１０．４ｍＬ）が充填されたカラム（１．１ｃｍ×１０．９ｃｍ）を５ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）（ＰＢＳ）で２．２ｍＬ／分（５分の滞留時間）で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを、室温（１７℃〜２０℃）で２．１ｍＬ／分の流量を用いて、樹脂１リットル当たり２７ｇ  ｍＡｂでローディングした。ローディング後、該カラムを３ＣＶのＰＢＳ、ついで４ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で２．１ｍＬ／分で洗浄した。２．６ｍＬ／分（４分の滞留時間）で０．５〜３ＣＶにわたる６０％の０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）（６０ｍＭ  シトラート）または４０％の０．１Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）（４０ｍＭ  シトラート）での段階勾配を用いて、該産物を溶出させた。溶出直後、該ＰＡＰ（１１ｇ／Ｌ）プールのサンプルを２５℃のサーモミキサー（ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）内に配置した。時間ゼロサンプルを溶出直後に採取し、トリス塩基でクエンチし、タンパク質凝集体含量分析のためにＨＰＳＥＣに付した。サンプル（２００μＬ）を種々の時間間隔で採取し、トリス塩基（０．５〜１Ｍ、５〜１０μＬ）を使用して直ちにｐＨ６にクエンチし、ＨＰＳＥＣを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。該プロテインＡアフィニティーカラムを５ＣＶの５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、１Ｍ  塩化ナトリウムで２．４ｍＬ／分で再生させ、ＰＢＳ中の２０％  エタノール中で保存した。該６０％  シトラート溶出（６０ｍＭ  シトラート）のために、該ＰＡＰプールを別々の２ｍＬ  アリコートに細分した。シトラート（４Ｍ、５〜１０μＬ）を、ｐＨ３．４または３．６に達するようアリコートに加えた。リン酸（８ｖ％、１０μＬ）を、ｐＨ３．６に達するようアリコートに加えた。
【０１１５】
実験Ｃ：
酸濃度が抗ＤＫＫ−１の安定性に影響を及ぼすかどうかを判定するために、該プロテインＡ溶出バッファーにおいて該シトラート濃度を５０ｍＭに減少させた。この減少した酸濃度は溶出中のｐＨ傾きの勾配に影響を及ぼし、これは、３．６に対して３．９の、より高いＰＡＰプールｐＨを与えた。
【０１１６】
２３〜２５℃で５分の滞留時間を用いてデプス・フィルタード・セントレート（１．７ｇ／Ｌ  抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂ）をプロテインＡカラム（Ｖ＝３３．３５ｍＬ、プレート：２０２６Ｎ／ｍ２、非対称：１．３３）上にローディングした。ローディング後、該カラムを３ＣＶのＰＢＳ、ついで４ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で０．２ｍＬ／分で洗浄した。該溶出のために、１００ｍＭ  シトラート（ｐＨ３．５）の５０％勾配を用いて、該樹脂から該抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体を溶出させた。溶出中、０．５から３．０ＣＶまで０．５ＣＶごとに画分を集めた。これらの画分を単量体濃度、ｐＨおよび伝導率に関して分析し、ついで７．２ｇ／Ｌの最終濃度となるようプールした。該ＰＡＰ流のサンプルを種々の温度（４、１５、２０および２３〜２５℃）およびｐＨ値（３．９、４．２、４．５、５．０）で配置し、ＨＰＳＥＣを用いて種々の時点で凝集に関して分析した（図１１）。
【０１１７】
該酸濃度を５０ｍＭに減少させると、該ｐＨ勾配が若干変化し、これは１００ｍＭ  シトラートの場合の３．６に対して３．９のＰＡＰ  ｐＨを与えた。しかし、該溶出プロファイルは重なっており、該産物採集ウィンドウは同じままであろう。該５０％溶出に関するプロテインＡ収率は９４％であった。前記の種々の温度で５０ｍＭ  シトラート溶出を用いたＨＯＡプロファイルを図１２に示す。２３〜２５℃における５０ｍＭ  シトラート溶出と１００ｍＭ  シトラート溶出との比較を図１３に示す。
【０１１８】
分析：
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上でＰＯＲＯＳ（商標）プロテインＡ  ＩＤ免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのＰＡＰサンプルをｍＡｂ濃度に関して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系上でＴｏｓｏｈサイズ排除カラム（０．７８ｃｍ  ＩＤ×３０ｃｍ長）を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体（すなわち、二量体およびそれ以上の高次凝集体）を定量した。溶液ｐＨを測定するために、ｐＨプローブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（±  ０．１ｐＨ単位の精度を有するもの）およびメーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（温度補償を伴うもの）を使用した。
【０１１９】
結果および考察
該樹脂からの該単量体の溶出のための可能なシトラートの最低濃度を決定するために、該プロテインＡアフィニティーカラムを種々のシトラート濃度で溶出させた。該１０ｖ％および２０ｖ％  シトラート濃度は、該カラムに結合した該単量体の８０％を溶出させた（非表示）。該シトラート濃度を３０ｖ％に増加させると、僅か２％の追加的単量体が該カラムから溶出した。したがって、該カラムから８０％以上の単量体を溶出させるための最小濃度は２０ｍＭ  シトラートであった。
【０１２０】
種々のｐＨ点における単量体安定性に対するシトラート濃度の影響を判定するために、種々のシトラート濃度を試験した。シトラート濃度を６０ｍＭに低下させ、ｐＨを３．８に増加させると、該ＨＯＡレベルは、２５℃において、１００ｍＭ  シトラート（ｐＨ３．５）の場合の４％〜５％に対して０．３％であった（図１４）。該シトラート濃度がｐＨ３．６で４０ｍＭ  シトラートに低下した場合、該ＨＯＡレベルは少なくとも３時間にわたり０．３％のままであった。したがって、該単量体安定性はシトラート濃度およびｐＨの関数であった。該溶出プールのｐＨを調節するためにシトラートの代わりにリン酸を加えると、該ＨＯＡレベルは各時点のサンプルに関して２時間まで約０．３％増加した。したがって、リン酸の添加は、同じ溶液ｐＨ（３．６）のシトラートより速くＨＯＡ形成の比率を増加させた。
【０１２１】
ＰＡＰプールｐＨ３．６においては、以下の４つの異なる酸濃度を試験した：４０ｍＭ、７５ｍＭおよび１００ｍＭ  シトラートならびに０．１ｖ％  リン酸を含有する６０ｍＭ  シトラート。ＨＯＡのレベルはシトラート濃度の増加と共に増加した。また、ＨＯＡのレベルは、７５ｍＭを超えるシトラート濃度において経時的に有意に増加した。例えば、１時間の時間枠内で、ＨＯＡの比率は１００ｍＭ  シトラートにおいては２０分当たり２％であったが、３．６の同じｐＨの７５ｍＭ  シトラートにおいては２０分当たり０．２％〜０．３％であった。該ＰＡＰプールへのリン酸の添加は、３．６の同じ溶液ｐＨのシトラートの場合よりＨＯＡ形成の比率を増加させた。ｐＨが一定に維持された場合、該ＰＡＰプールにおけるシトラートの濃度はＨＯＡ形成に影響を及ぼした。
【０１２２】
前記図１２から、ｐＨ３．９の５０ｍＭ  シトラート溶出条件では少なくとも１２時間にわたって１５℃以下で該ＰＡＰは極めて安定であり、０．４％以下のＨＯＡを含有していた。該抗ＤＫＫ−１  ｍＡｂも、該ＰＡＰにおいて、より高い温度で安定性の向上を示した。例えば、２０〜２５℃で１２時間の維持の後、該ＰＡＰは１．０％〜１．４％のＨＯＡを含有していた。３０〜６０分間の低ｐＨ維持時間にわたる該ＰＡＰにおけるＨＯＡレベルは２０〜２５℃で０．２％〜０．４％であり、これは、図１３で比較により示されるロットにおける３％〜６％のＨＯＡレベルより低い。５０ｍＭ  シトラートＰＡＰにおけるタンパク質分解の総量（ＨＯＡ＋二量体）は１．５％であったが、これは５％以下の目標を達成した。したがって、シトラート濃度の低下およびｐＨの上昇はＰＡＰにおけるＨＯＡレベルを６０分以下の維持時間にわたって３％〜６％から０．５％に有意に減少させることが判明した。
【実施例４】
【０１２３】
示差走査熱量測定法により測定されたモノクローナル抗体の熱誘発アンフォールディングに対するｐＨおよびシトラート濃度の影響
示差走査熱量測定法は、タンパク質安定性を測定するために用いられる手段である。タンパク質安定性は環境に大きく左右され、そのような環境は、タンパク質のフォールディング（折り畳み）構造を安定化する及び不安定化する両方の能力を有する。ＤＳＣは、溶媒対照の熱容量と比較して温度上昇中のタンパク質溶液の熱容量を測定することにより実施される。タンパク質溶液と溶媒対照との間の熱容量の差は、該タンパク質の変性を表すプロファイルを提供する。このプロファイルから、見掛け上の融点Ｉが決定されうる。アンフォールディング状態へのタンパク質の変性は、しばしば、凝集または化学分解のような望ましくない事象を引き起こす（１９，２０、２１，２２，２３）。
【０１２４】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）は、タンパク質の温度誘発性アンフォールディングを測定することにより、フォールディングのメカニズムに関する何らかの洞察を提供する。ＤＳＣにより提供された情報は、タンパク質安定性が関わる種々の用途、例えばクローン選択、製剤開発およびタンパク質の特徴づけにおいて有用である（２４，２５）。最も安定な薬物化合物を開発過程の初期において特定するための比較的簡便な方法を有することは、商業化までの時間が短縮されうるため非常に大きな利点となる。ＤＳＣは製剤開発においても決定的に重要である。ｐＨ、イオン強度および他の賦形剤のようなタンパク質環境における変化はタンパク質の折り畳み構造に影響を及ぼして、融点の変化を引き起こしうる。製剤バッファーにおける種々の添加物をスクリーニングすることにより、ＤＳＣは、バッファー組成を最適化するための迅速な方法を提供する。
【０１２５】
治療用タンパク質の凝集は精製過程における問題からインビボでの免疫応答までの多岐にわたる非常に重大な影響を及ぼす。タンパク質の変性およびそれに続く凝集は、ｐＨおよび温度を含む多数の要因に感受性である。したがって、これらの要因の両方を調節することが治療用タンパク質の安定性に非常に重要である。
【０１２６】
モノクローナル抗体は複数のドメインを有し、それらのそれぞれは別々の様態でｐＨおよびイオン強度により影響される。タンパク質の熱安定性に対するイオン強度（３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭのシトラート濃度）およびｐＨ（３．０〜６．０）の効果を評価するために、ＤＳＣを用いた。
【０１２７】
材料および方法
３０ｍＭ、６０ｍＭおよび１００ｍＭの濃度のクエン酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の溶液を調製した。水酸化ナトリウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して、該シトラート溶液を３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５および６．０  ｐＨ単位の目標値にｐＨ調節した。Ａｃｃｕｍｅｔ  ｐＨメーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して該ｐＨ測定値を得た。
【０１２８】
製剤化バッファー中の５４．２ｍｇ／ｍＬの抗ＤＫＫ−１抗体を各ｐＨの該シトラートバッファーで１ｍｇ／ｍＬに希釈した。最終的な１ｍｇ／ｍＬ溶液の濃度およびｐＨを測定した。該製剤化バッファーを、対照バッファーとして使用するために、同じ比率で希釈した。
【０１２９】
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）をＭｉｃｒｏＣａｌ（商標）ＶＰ−ＤＳＣ上で行った。温度を１℃／分の速度で２５℃から９５℃まで上昇させた。該対照バッファーを差し引き、該濃度を正規化し、ベースライン補正を行うことにより（Ｏｒｉｇｉｎソフトウェアを使用した）、生ＤＳＣプロファイルを分析した。サンプルは二重に重複して実験に使用された。
【０１３０】
結果および考察
抗ＤＫＫ１抗体の熱安定性に対するｐＨおよびシトラート濃度の影響を、ＤＳＣを用いて調べた。結果は、ｐＨの減少と共に融点が低下すること示している。結果はまた、シトラートが、低ｐＨ値におけるこのモノクローナル抗体の熱安定性に、より大きな影響を及ぼすことを示唆している。
【０１３１】
４．５未満のｐＨ値においては、シトラートバッファーで希釈された抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体は、低いシトラート濃度において、より熱的に安定である（図１５Ａ、Ｂ、Ｃ）。ｐＨ３．０において、１００ｍＭ  シトラートは該タンパク質を完全にアンフォールディングさせたようであり、該プロファイルにおいて転移点（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）は存在しない。３０ｍＭおよび６０ｍＭ  シトラートに関しては、単一の転移点が明らかであり、このことは、該抗体のドメインの２つがアンフォールディングしていることを示唆している。該データは、この単一の転移点が該抗体のＦａｂ領域のアンフォールディングに相当することを裏付けている。ｐＨが４．０へと上昇するにつれて、該ドメインのアンフォールディング温度が上昇し、３つの転移点が見出された。最も不安定な転移点は、十中八九、ＣＨ２ドメインのアンフォールディングであり、ＦａｂフラグメントのアンフォールディングおよびＣＨ３ドメインのアンフォールディングがそれに続く。
【０１３２】
４．５以上のｐＨ値においては、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体に関する見掛け上の転移温度はシトラート濃度に無関係である（図１６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。ｐＨの上昇と共に該抗体の融点は上昇する。より高いｐＨ値においては、２つのドメインが同時にアンフォールディングして、１つの転移に関する大きなエンタルピーおよびより低いエンタルピーを有する第２の転移を示すプロファイルを与える。本発明者らは、他のモノクローナル抗体での結果から、ＣＨ２ドメインおよびＦａｂが、最初の大きな転移に対応する高ｐＨ値での類似した融点を有すると結論づけている。ＣＨ３ドメインのアンフォールディングは、より高い融点を有し、第２の転移に対応する。
【０１３３】
シトラート濃度およびｐＨはモノクローナル抗体の熱誘発性アンフォールディングに影響を及ぼす。ｐＨが低下するにつれて、抗ＤＫＫ−１モノクローナル抗体の熱安定性は低下する。シトラート濃度は、低ｐＨ値において、見掛け上の転移温度に影響を及ぼすに過ぎない。シトラート濃度が低いほど、融点は高くなる。
【実施例５】
【０１３４】
タンパク質凝集に対するアミノ酸安定剤の効果
該プロテインＡアフィニティー樹脂からタンパク質または抗体を溶出させるためには、酸条件が要求される。低ｐＨ（３〜４）でのこれらの酸条件に対する曝露はタンパク質凝集体の形成を引き起こしうる。プロテインＡ溶出バッファーへの安定剤の添加は低ｐＨにおいてタンパク質の安定性を増加させることが示された。該溶出バッファー中のアルギニンの存在が高次凝集体のレベルを減少させ、それによりｍＡｂ安定性を増加させるかどうかを判定するために、この実験のための安定剤としてアルギニンを選択した。全ての実験は２５℃で行った。
【０１３５】
アルギニン（５０ｍＭ）の存在下および非存在下で６０ｍＭ  シトラートを使用する溶出の場合には、対照と比較して１時間当たりのＨＯＡの比率における０．０１％の減少が認められたに過ぎなかった（図１７）。しかし、アルギニン（２５０ｍＭ）の存在下および非存在下で１００ｍＭ  シトラートを使用する溶出の場合には、対照と比較して１時間当たりの高次凝集体の比率における２．９％の減少が認められた（図１８）。したがって、アルギニンは、１００ｍＭ  シトラート溶液における高次凝集体のレベルを減少させるのに有効であり、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびそれに続く低ｐＨ維持段階中の凝集体のレベルを減少させるためのもう１つの選択肢として使用可能である。
【実施例６】
【０１３６】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用されるシトラートおよびアセタート溶出バッファーにおける単量体安定性に対するタンパク質濃度の効果の検討
シトラートおよびアセタートバッファーにおけるタンパク質濃度の影響を調べて、各バッファー系における凝集率に対する濃度の効果を判定した。また、ｐＨ４．０におけるシトラートおよびアセタートバッファーを比較して、凝集に対する該酸タイプの効果を判定した。
【０１３７】
材料および方法
小規模：ＡＫＴＡ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ  １００（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して全ての小規模実験を行った。リン酸ナトリウムバッファーはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。アセタートおよびシトラートはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。ＰＡＰのｐＨ調節のためのトリス塩基はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験用のＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。クエンチされたプロテインＡ産物をこれらの実験のための供給ストックとして使用した。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、ＰＡＰおよびＱＰＡＰサンプルの温度を制御した。
【０１３８】
ＱＰＡＰ流をこの実験のための供給体として使用した。４５００ｒｐｍの遠心速度で３０ｋＤａ膜を使用して、該供給体を４〜５体積のリン酸ナトリウムバッファー中にダイアフィルトレーションした。該ダイアフィルトレーション後、各溶液を元の濃度の１倍、２倍および４倍に濃縮した。それらの種々の濃度における該サンプルの半分を少なくとも４体積の酢酸ナトリウム（５０ｍＭ、ｐＨ５．０）溶液中にダイアフィルトレーションした。
【０１３９】
実施例２から得られた３つの異なる濃縮溶液の第１の組では、シトラート（１５ｍＭ）を、ｐＨ４．０となるよう各溶液に加えた。各溶液のサンプル（２ｍＬ）を採取し、２１℃で配置した（図７）。濃縮溶液の第２の組では、ｐＨ４．０となるよう氷酢酸を加えた（合計８５ｍＭ  アセタート）。各溶液のサンプル（２ｍＬ）を採取し、２５℃で配置した（図７）。実験の各組で、サンプル（１４０μＬ）を種々の時点で採取し、トリス塩基（０．２５Ｍ〜１．０Ｍ、１０〜２０μＬ）を使用してｐＨ６へとクエンチし、ＨＰＳＥＣを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。
【０１４０】
分析：
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上でＰＯＲＯＳ（商標）プロテインＡ  ＩＤ免疫アフィニティーカートリッジを使用して、サンプルを単量体ｍＡｂ濃度に関して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系上でＴｏｓｏｈサイズ排除カラム（０．７８ｃｍ  ＩＤ×３０ｃｍ長）を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体（すなわち、二量体およびそれ以上の高次凝集体）を定量した。溶液ｐＨを測定するために、ｐＨプローブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（＋／−  ０．１ｐＨ単位の精度を有するもの）およびメーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（温度補償を伴うもの）を使用した。
【０１４１】
結果および考察
シトラートおよびアセタートバッファーにおけるｍＡｂ濃度の効果を調べて、各バッファー系における凝集率に対する濃度の影響を判定した。シトラート（１５ｍＭ、ｐＨ３．５）溶液では、ｍＡｂ濃度が増加するにつれて、高次凝集体形成の比率も増加した（図２０）。例えば、１時間の維持時間の後、高次凝集体のレベルは８ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ濃度における０．３％から３４ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ濃度における２．６％へと増加した。したがって、溶液中のタンパク質の濃度は低ｐＨのシトラート緩衝系における高次凝集体形成の比率に影響を及ぼす。しかし、アセタート（８５ｍＭ、ｐＨ４．０）溶液では、高次凝集体のレベルは５ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬおよび３７ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ濃度において１％未満と一定のままであった（図２１）。
【０１４２】
高次凝集体形成に対する酸タイプの影響を判定するために、ｐＨ４．０で２５℃でのこのアセタート実験からの結果を、ｐＨ４．０で２１℃での該シトラート実験からの結果と共にグラフ化した（図２１）。ｐＨ４．０においては、該シトラート緩衝系では高次凝集体の比率は３０分ごとに０．２％増加し始めるが、該アセタート緩衝系では高次凝集体のレベルは一定のままである。したがって、ｐＨ４．０においては、ｍＡｂ安定性はシトラートバッファーよりアセタートバッファーにおいて高かった。
【０１４３】
結論
温度およびｐＨに加えて、タンパク質濃度もＰＡＰプールにおけるタンパク質凝集体形成の比率に影響を及ぼした。ｐＨ３．５のシトラート緩衝溶液においては、ｍＡｂ濃度が増加するにつれて、高次凝集体の比率が有意に増加した。しかし、ｐＨ４．０のアセタート緩衝溶液においては、５ｍｇ／ｍＬから３７ｍｇ／ｍＬまでの範囲の種々のタンパク質濃度で高次凝集体のレベルは１％未満のままであった。５ｍｇ／ｍＬ〜１１ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質の存在下のｐＨ４．０の該アセタートおよびシトラートバッファー系を比較したところ、該ｍＡｂは該アセタートバッファーにおいて、より高い安定性を示した。したがって、溶出バッファーのタイプはｍＡｂ安定性において何らかの役割を果たしており、アセタートはｐＨ４．０においてシトラートバッファーより安定である。アセタートはプロテインＡアフィニティーカラムからのｍＡｂ溶出のための代替的バッファーとして使用可能である。
【実施例７】
【０１４４】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー溶出およびそれに続く低ｐＨ維持中のタンパク質凝集体のレベルに対するｐＨ、温度、バッファー組成およびタンパク質ローディングの効果の検討
【０１４５】
材料および方法
小規模：ＡＫＴＡ  ＥＸＰＬＯＲＥＲ  １００（商標）を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。ＰＡＰのｐＨ調節のためのトリス塩基はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）から購入した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験用のＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。デプス・フィルタード・セントレート（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｃｅｎｔｒａｔｅ）を得、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）および２つの温度制御室を使用して、ＰＡＰおよびＱＰＡＰサンプルの温度を制御した。
【０１４６】
実験：
ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）樹脂（１０ｍＬ）が充填されたカラム（１．７ｃｍ×１４．５ｃｍ）を５ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＬ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）バッファーで２．０ｍＬ／分（５分の滞留時間）で平衡化した。表１に挙げられている温度で２．０ｍＬ／分の流量を用いて、デプス・フィルタード・セントレートを、表１に挙げられている濃度（樹脂１リットル当たりのｍＡｂのｇ）でローディングした。ローディング後、該カラムを３ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）バッファーで２ｍｌ／分で洗浄し、ついで４ＣＶの６ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）で２ｍｌ／分で洗浄した。２ｍｌ／分の１００％の段階勾配（０．５から開始し３．５で終了する）（４分の滞留時間）で３ＣＶの溶出バッファー（目標ｐＨ値にするためのクエン酸無水物およびクエン酸三ナトリウム塩の混合物）を使用して、該産物を溶出させた。
【０１４７】
この実験で使用した溶出バッファーは以下のとおりである：
・６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ３．５。
・４０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ３．２。
・４０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ３．８。
・８０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ３．２。
・８０ｍＭ  クエン酸ナトリウム，ｐＨ３．８。
【０１４８】
溶出後、０、１５、３０、６０、１２０分の時点で、ＨＰＳＥＣを用いて、該産物溶出サンプルをタンパク質凝集体含量に関して分析した。サンプルは、該サンプルをクエンチするために加えられた４０マイクロリットルの０．２５Ｍ  トリス塩基を伴う２００マイクロリットルであろう。該カラムを５ＣＶの５０ｍＭ  水酸化ナトリウム、１Ｍ  塩化ナトリウムバッファーで２．０ｍＬ／分で再生させ、ＰＢＳ中の２０ｖ％  エタノール溶液中で保存した。
【０１４９】
分析：
Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上でＰＯＲＯＳ（商標）プロテインＡ  ＩＤ免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのサンプルをｍＡｂ単量体濃度に関して分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００（商標）ＨＰＬＣ系上でＴｏｓｏｈサイズ排除カラム（０．７８ｃｍ  ＩＤ×３０ｃｍ長）を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体（二量体およびそれ以上の高次凝集体）を定量した。溶液ｐＨを測定するために、ｐＨプローブ（±０．１ｐＨ単位の精度）およびメーター（温度補償を伴うもの）（共にＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）を使用した。
【０１５０】
結果
ｐＨ、温度、バッファー濃度およびタンパク質ローディングの効果を調べて、収率およびたんぱく質凝集に対するそれらの影響を判定した。前記実験の結果は以下の表１において見出されうる。
【０１５１】
１０℃でｐＨ３．２においては、ローディングもシトラート濃度も収率にも凝集レベルにも有意な影響を及ぼさない。１０℃でｐＨ３．８においては、ローディングおよび／またはシトラート濃度は収率を減少させるが、凝集は低レベル（＜５％）のままである。３０℃でｐＨ３．２においては、８０ｍＭ  シトラート濃度では、ローディングは凝集には有意な影響を及ぼさないが、温度は収率の減少および凝集レベルの増加に大きな影響を及ぼし、一方、４０ｍＭ  シトラートでは影響はほとんど見られない。４０〜８０ｍＭ  シトラートにおいては、３０℃でｐＨが３．２から３．８へと変化するにつれて、凝集レベルは有意に減少し、収率は増加する。
【０１５２】
【表１】
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【０１５３】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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