(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＶＩ）で表されるカンナビゲロール−キノン（ＣＢＧ−Ｑ）化合物
【化１】
0005575324.tif 000018
【請求項２】
薬剤として用いられる請求項１の化合物。
【請求項３】
ＰＰＡＲγ関連疾患の治療においてＰＰＡＲγアゴニストとして用いられる、請求項１の化合物。
【請求項４】
炎症性疾患、代謝性疾患および2型糖尿病の治療において、ＰＰＡＲγアゴニストとして用いられる、請求項３の化合物。
【請求項５】
高血圧、高中性脂肪血症、高コレステロール血症（ＨＤＬ−Ｃ）、肥満からなる群から選択される代謝性疾患の治療においてＰＰＡＲγアゴニストとして用いられる、請求項３又は４の化合物。
【請求項６】
アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肝線維症、腎症、乾癬、皮膚創傷治癒、皮膚再生、膵臓炎、胃炎、神経変性障害または癌からなる群から選択される炎症性疾患の治療においてＰＰＡＲγアゴニストとして用いられる、請求項３又は４の化合物。
【請求項７】
ＰＰＡＲγ関連疾患治療用の組成物を製造するための、式（ＶＩ）で表される化合物【化１】
0005575324.tif 000019
又はその誘導体を使用した製造方法。
【請求項８】
炎症性疾患、代謝性疾患および2型糖尿病の治療用の組成物を製造するための、請求項７の製造方法。
【請求項９】
高血圧、高中性脂肪血症、高コレステロール血症（ＨＤＬ−Ｃ）、肥満からなる群から選択される代謝性疾患の治療用の組成物の製造するための、請求項７又は８の製造方法。
【請求項１０】
アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肝線維症、腎症、乾癬、皮膚創傷治癒、皮膚再生、膵臓炎、胃炎、神経変性障害または癌からなる群から選択される代炎症性疾患の治療用の組成物の製造するための、請求項７又は８の製造方法。
【請求項１１】
少なくとも請求項１の化合物、および、賦形剤または担体を含む医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤として用いられるカンナビノイド・キノン誘導体（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｑｕｉｎｏｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）に関し、特に、病因が転写因子としてのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ又はＰＰＡＲγ）の機能障害に基づく疾患、すなわちＰＰＡＲγ関連疾患を治療するためのＰＰＡＲγアゴニストとして用いられるカンナビノイド・キノン誘導体に関する。
【０００２】
ＰＰＡＲγは異なる組織のほとんど至るところで発現するので、本発明は、医学分野一般に、そしてより詳しくは、ＰＰＡＲγに対するアゴニスト効果を及ぼすことによって、病気の治療を行い、上述の病因を共有している医学分野に属する。
【背景技術】
【０００３】
（従来技術）
ＰＰＡＲγは、リガンド誘導性転写因子である核内ホルモン受容体のＰＰＡＲ亜科のメンバーである。ＰＰＡＲは、偏性（obligate）パートナーであるレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）とヘテロ二量体を形成する。すべてのＰＰＡＲイソ型は、類似のドメイン構成を有する。すなわち、Ｎ末端Ａ／Ｂドメインは、推定上のリガント非依存性の転写活性化機能１（ＡＦ−１）を有する。二つのＺｎフィンガーからなるＤＮＡ結合Ｃドメインは、ＰＰＡＲ標的遺伝子の制御領域において、ペルオキシゾーム増殖因子反応元素（ＰＰＲＥ）と結合する。Ｄドメインは、Ｃドメインとリガント依存性の転写活性化機能２（ＡＦ−２）を含むＥドメイン（リガント結合ドメイン：ＬＢＤ）との間に柔軟性を与えるヒンジ領域である。ＰＰＡＲの転写活性は、それらのリガントによって制御されるだけでなく、例えばリン酸化のような翻訳後修飾によっても制御される。
【０００４】
ＰＰＡＲγは、骨格筋細胞、溶骨細胞、造骨細胞、いくつかの免疫タイプ細胞を含む組織の範囲で、および脳および末梢神経系で、発現する。脂肪組織は、人体でＰＰＡＲγを最も高いレベルで発現する。
【０００５】
ＰＰＡＲγは、脂肪細胞形成、インスリン感受性および炎症の調節に関与しているので、特に興味深い（非特許文献６，１９，２３参照）。ＰＰＡＲγが、脂肪細胞分化に必要かつ十分であるという事実から、ＰＰＡＲγが脂肪生成の優性制御因子（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）若しくは主要制御因子（ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）であることは明白である。脂質生合成およびインスリン感受性において重要な役割を果たす多数の遺伝子の制御領域は、アダプタータンパク質２（ａＰ２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、アディポネクチンおよびグルコーストランスポーター４（Ｇｌｕｔ４）を含む、ＰＰＡＲγのための結合部位を有する（非特許文献１８参照）。
【０００６】
他方で、ＰＰＡＲの活性化は、炎症誘発性遺伝子の発現を抑制することにより、いくつかの細胞型の抗炎症作用を働かせ、これによりサイトカイン、金属プロテアーゼおよび急性期蛋白の産生を減少させる。また、抗炎症性サイトカインを増加させて、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現を抑制する働きをする（非特許文献２１参照）。ＰＰＡＲは、アクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）、核内因子κＢ（ＮＦ−ＫＢ）、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）、および活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）の伝達経路に拮抗することにより、炎症反応遺伝子の転写を負に制御する（非特許文献２４参照）。重要なことに、ＰＰＡＲはまた炎症誘発性エイコサノイドの異化を促進する（非特許文献５参照）。
【０００７】
ＰＰＡＲγは、炎症性サイトカインの発現を抑制し、しかも免疫細胞の分化を抗炎症性表現型へ向ける能力によって、免疫反応において基本的に重要な役割を果たすことが認識されていた（非特許文献２３参照）。
【０００８】
ＰＰＡＲγの抗炎症効果は、その抗糖尿病性効果と密接な関連がある。脂肪細胞のＰＰＡＲγのリガンド活性化は、インスリン抵抗性を引き起こすと主張されているアディポカイン（ＴＮＦα、インターロイキン６（ＩＬ−６）、レジスチンなど）と称されるタンパク質の産生減少と関連する。従って、脂肪組織におけるＰＰＡＲγの活性化は、アディポカインの産生を変更することにより、全身インスリン感受性に影響を与える。これが、チアゾリジンジオン（ＴＺＤｓ／例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾンなど）のようなＰＰＡＲγの活性化因子が、２型糖尿病の治療において臨床的に使われる理由である（非特許文献１０参照）。
【０００９】
さらに、ＰＰＡＲγアゴニストには、一酸化窒素の可用性の増加、血圧降下、およびアテローム性動脈硬化症の弱化を含む、心血管系へのプラスの効果があることが明らかにされてきた（非特許文献２，９参照）。
【００１０】
したがって、ＰＰＡＲγアゴニストは、高血圧、トリグリセリドの増加、高密度リポ蛋白質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の低下、腹部肥満、炎症、インスリン抵抗性および高血糖を含む、メタボリックシンドロームと総称される代謝異常のクラスタのための適切な治療薬である（非特許文献１２，１４参照）。メタボリックシンドロームは、過剰な腹腔又は内臓脂肪組織により生じるインスリン抵抗性が主要な原因である。
【００１１】
興味深いことに、ＰＰＡＲγアゴニストは、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症および脳卒中のいくつかの実験モデルにおいて、また少数の臨床研究においても、消炎性および神経保護効果を示した（非特許文献１参照）。
【００１２】
さらに、ＰＰＡＲγは、遺伝学的意味において、正式に癌抑制遺伝子と考えられなければならない。それは様々な腫瘍細胞において発現されており、リガンドによるＰＰＡＲγの活性化は、細胞増殖の抑制またはアポトーシスにつながる（非特許文献２２，２３参照）。
【００１３】
表１に示すように、ＰＰＡＲγ活性化の有益な効果を、いくつかの疾患治療に用いることができる。この表は、炎症性疾患におけるＰＰＡＲの作用を要約したものである。この表に用いた略語の意味は、以下の通りである：↓抑制、↑刺激、肝星細胞（ＨＳＣ）、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）、インターフェロンγ（ＩＮＦγ）、誘導性一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）。出典はＫｏｓｔａｄｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５である。
【００１４】
【表１】
0005575324.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｅｒｎａｒｄｏ，Ａ．，Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ，Ｌ．著（２００８年）、「ＰＰＡＲγ自然型および合成アゴニストによる神経膠細胞機能の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ）」、ＰＰＡＲ  Ｒｅｓ．２００８，８６４１４０
【非特許文献２】Ｂｉｓｈｏｐ−Ｂａｉｌｅｙ，Ｄ．著（２０００年）、「心血管系のペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ）」、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２９，８２３−８３４
【非特許文献３】Ｂｏｕａｂｏｕｌａ  Ｍ，  Ｈｉｌａｉｒｅｔ  Ｓ，Ｍａｒｃｈａｎｄ  Ｊ，Ｆａｊａｓ  Ｌ，Ｌｅ  Ｆｕｒ  Ｇ，Ｃａｓｅｌｌａｓ  Ｐ著（２００５年）、「アナンダミド誘導ＰＰＡＲγ転写活性と３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞分化（Ａｎａｎｄａｍｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ３Ｔ３−Ｌ１  ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５１７：１７４−１８１
【非特許文献４】Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  Ｓ．著、「ＰＰＡＲγ：カンナビノイドのための親和性を有する核内受容体（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ：ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ）」、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．２００５  Ａｕｇ  １９；７７（１４）：１６７４−８４
【非特許文献５】Ｄｅｌｅｒｉｖｅ  Ｐ，Ｆｒｕｃｈａｒｔ  ＪＣ，  Ｓｔａｅｌｓ  Ｂ著（２００１年）、「炎症制御におけるペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６９，４５３−４５９
【非特許文献６】Ｆｉｅｖｅｔ  Ｃ，  Ｆｒｕｃｈａｒｔ  ＪＣ，Ｓｔａｅｌｓ  Ｂ著（２００６年）、「２型糖尿病およびメタボリックシンドローム治療のためのＰＰＡＲαとＰＰＡＲγの二重アゴニスト（ＰＰＡＲ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ｄｕａｌ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６，６０６−６１４
【非特許文献７】Ｆｕ  Ｊ，  Ｇａｅｔａｎｉ  Ｓ，Ｏｖｅｉｓｉ  Ｆ，Ｌｏ  Ｖｅｒｍｅ  Ｊ，Ｓｅｒｒａｎｏ  Ａ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｄｅ  Ｆｏｎｓｅｃａ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．著（２００３年）、「オレイルエタノールアミドは、核内受容体ＰＰＡＲαの活性化で、摂食と体重を調整する（Ｏｌｅｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｄｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ４２５：９０−９３
【非特許文献８】Ｇｅｌｍａｎ，Ｌ．，Ｆｅｉｇｅ，Ｊ．Ｎ．，Ｄｅｓｖｅｒｇｎｅ，Ｂ．著（２００７年）、「２型糖尿病の治療のための、選択的ＰＰＡＲγ転調変調の分子的基礎（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７７１，１０９４−１１０７
【非特許文献９】Ｈｓｕｅｈ，Ｗ．Ａ．，Ｂｒｕｅｍｍｅｒ，Ｄ．著（２００４年）、「ペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタγ：心血管疾患への影響（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ４３，  ２９７−３０５
【非特許文献１０】Ｌｅｈｍａｎｎ  ＪＭ，ＭｏｏｒｅＬＢ，Ｓｍｉｔｈ−Ｏｌｉｖｅｒ  ＴＡ，Ｗｉｌｋｉｓｏｎ  ＷＯ，Ｗｉｌｌｓｏｎ  ＴＭ，Ｋｌｉｅｗｅｒ  ＳＡ．著、「抗糖尿病性のチアゾリジンジオンは、ペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタγ（ＰＰＡＲγ）のための高親和性配位子である（Ａｎ  ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ  ｉｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ（ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ））」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９５  Ｊｕｎ  ２；２７０（２２）：１２９５３−６
【非特許文献１１】Ｌｉｕ  Ｊ，Ｌｉ  Ｈ，Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ＳＨ，Ｚｕｒｉｅｒ  ＲＢ，Ｃｈｅｎ  ＪＤ著（２００３年）、「合成カンナビノイドであるアジュレミン酸によるペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタγの活性化と結合性（Activation and ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ａｊｕｌｅｍｉｃ  ａｃｉｄ）」、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３，９８３−９９２
【非特許文献１２】Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，Ｇｌｅｚｅｒ  Ａ，Ｔｕｒａｔｔｉ  ＬＡ著、メタボリックシンドローム：危険因子の識別（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ）」、Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ（Ｒｉｏ  Ｊ）２００７；８３（５  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ２０４−８
【非特許文献１３】ＬｏＶｅｒｍｅ  Ｊ，Ｒｕｓｓｏ  Ｒ，Ｌａ  Ｒａｎａ  Ｇ，Ｆｕ  Ｊ，Ｆａｒｔｈｉｎｇ  Ｊ，Ｍａｔｔａｃｅ−Ｒａｓｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．著（２００６年）、「ペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタ−αの活性化による急速な広域痛覚欠如（Ｒａｐｉｄ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ａｎａｌｇｅｓｉａ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ）」、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３１９：１０５１−１０６１
【非特許文献１４】Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＪ，Ｈｏｌｄｅｒ  ＪＣ著、「ＰＰＡＲγアゴニスト：糖尿病、炎症および癌での治療的な役割（ＰＰＡＲ−ｇａｍｍａ  ａｇｏｎｉｓｔｓ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ）」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２０００；２１（１２）：４６９−７４
【非特許文献１５】Ｏ´Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＳＥ，Ｋｅｎｄａｌｌ  ＤＡ．著、「ペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタのカンナビノイド活性化：炎症性疾患の変調への可能性（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ））」、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００９  Ｏｃｔ  １３
【非特許文献１６】Ｏ´Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＳＥ，  Ｓｕｎ  Ｙ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＡＪ，Ｒａｎｄａｌｌ  ＭＤ，Ｋｅｎｄａｌｌ  ＤＡ．著、「ラットの大動脈のおけるカンナビジオールの時間依存的脈管動作（Ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ａｏｒｔａ）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９  Ｊｕｎ  １０；６１２（１−３）：６１−８
【非特許文献１７】Ｏ´Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＳＥ．著、「カンナビノイドは核武装する：ペルオキシゾーム増殖因子活性レセプタの活性化の証拠（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ  ｇｏ  ｎｕｃｌｅａｒ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７  Ｎｏｖ；１５２（５）：５７６−８２
【非特許文献１８】Ｒｏｓｅｎ  ＥＤ，ＭａｃＤｏｕｇａｌｄ  ＯＡ著、「完全な脂肪細胞分化（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｓｉｄｅ  ｏｕｔ）」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００６  Ｄｅｃ；７（１２）：  ８８５−９６
【非特許文献１９】Ｓｔｉｅｎｓｔｒａ  Ｒ，Ｄｕｖａｌ  Ｃ，Ｍｕｌｌｅｒ  Ｍ，Ｋｅｒｓｔｅｎ  Ｓ著（２００７年）、「ＰＰＡＲｓ、肥満および炎症（ＰＰＡＲｓ，ｏｂｅｓｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）」、ＰＰＡＲ  Ｒｅｓ．２００７，９５９７４
【非特許文献２０】Ｓｕｎ  Ｙ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ａ著、「カンナビノイド：ＰＰＡＲｓのアゴニストの新しい群（Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ＰＰＡＲｓ）」、ＰＰＡＲ  Ｒｅｓ．２００７；２００７：２３５１３
【非特許文献２１】Ｓｚｅｌｅｓ，Ｌ．，Ｔｏｒｏｃｓｉｋ，Ｄ．，Ｎａｇｙ，Ｌ．著（２００７年）、「免疫および炎症におけるＰＰＡＲγ：細胞型および疾患（ＰＰＡＲｇａｍｍａ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １７７１，１０１４−１０３０
【非特許文献２２】Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｋ，Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｄ，Ｉｓｈｉｍｏｔｏ  Ｋ，Ｄｏｉ  Ｔ著、「癌におけるＰＰＡＲｓの役割（Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＰＰＡＲｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ）」、ＰＰＡＲ  Ｒｅｓ．２００８；２００８：１０２７３７
【非特許文献２３】Ｔｏｎｔｏｎｏｚ  Ｐ，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ著、「脂肪を越えて：ＰＰＡＲγの多様な生物学（  Ｆａｔ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ：ｔｈｅ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＰＰＡＲｇａｍｍａ）」、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００８；７７：２８９−３１２．Ｒｅｖｉｅｗ
【非特許文献２４】Ｖａｎｄｅｎ  Ｂｅｒｇｈｅ  Ｗ，Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ  Ｌ，Ｄｅｌｅｒｉｖｅ  Ｐ，ＤｅＢｏｓｓｃｈｅｒ  Ｋ  Ｓｔａｅｌｓ  Ｂ，Ｈａｅｇｅｍａｎ  Ｇ著（２００３年）、「遺伝子制御のパラダイム：炎症、ＮＦ−ｋＢおよびＰＰＡＲ（Ａ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ：ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，  ＮＦ−ｋＢ  ａｎｄ  ＰＰＡＲ）」、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５４４，１８１−１９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＰＰＡＲγリガンドには、それに関連したいくつかの副作用があることが一般に認識されている。それには、体重増加、浮腫、および血漿リポ蛋白の増加が含まれる（非特許文献８参照）。現在、これらの副作用を生じない新規なＰＰＡＲγアゴニストが研究されており、部分的なまたは低親和性アゴニストが有益であることが示唆されている（非特許文献８参照）。
【００１７】
ＰＰＡＲにカンナビノイドを直接結合することが、レポーター遺伝子アッセイまたは３Ｔ３−Ｌ１脂肪生成アッセイを通したいくつかの研究で示されている。これらには、オレイルエタノールアミド（非特許文献７参照）、アジュレム酸（非特許文献１１，４参照）、２−アラキドノイルグリセロール（非特許文献４参照）、アナンダミド（非特許文献３参照）、ＷＩＮ５５２１２−２、ノラジンエーテルおよびビローダミン（非許文献２０参照）、Δ9-テトラヒドロカンナビノール（非特許文献１６参照）、およびＣＢＤ（非特許文献１６参照）が含まれる。それらの一部は、ＰＰＡＲγＬＢＤ領域と相互作用すると述べられている（非特許文献１１，１６参照）。
【００１８】
にもかかわらず、ＰＰＡＲ活性化が、すべてのカンナビノイドに共通であるというわけではない（非特許文献１３，３，７参照）。カンナビノイドによるＰＰＡＲ活性化は、いくつかの再調査の対象となった（非特許文献１５，４，１７，２０参照）。しかしながら、カンナビノイドのキノン誘導体のＰＰＡＲγ活性に関しては、これまで報告されていない。
【００１９】
本発明で実施された比較例で分かるように、残念ながら、公知のＰＰＡＲγアゴニストのほとんど、特にいくつかのカンナビノイド誘導体は、ＰＰＡＲγとの結合の低効率、したがって低いＰＰＡＲγアゴニスト効果を示している。しかもさらに悪いことに、これらの一部はいくつかの細胞型において高い細胞毒性を示す。
【００２０】
従って、組織におけるＰＰＡＲγの遍在的生体内分布と、その結果として多数のＰＰＡＲγ関連疾患の存在に留意しつつ、公知のアゴニストと比較してＰＰＡＲγとの結合に高い効率性を有し、従って、生体の内外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ）より高いＰＰＡＲγアゴニスト効果を及ぼすことが可能な合成ＰＰＡＲγアゴニストの開発が最も重要であり、ＰＰＡＲγ関連疾患患者の状態改善に役立つ。
【００２１】
さらに、それらのＰＰＡＲγアゴニストが低い細胞毒性を示すことが望ましい。
【００２２】
本発明は、上記課題の解決へ向けて前進する新たなステップ提供するものであり、高いＰＰＡＲγアゴニスト効果と低い細胞毒性の故にＰＰＡＲγ関連疾患の治療に適した新規な化合物を開発するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、カンナビノイド誘導体（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）、特にカンナビジオール（ＣＢＤ）やカンナビゲロール（ＣＢＧ）のような自然型カンナビノイドから逸脱して、いくつかの特定の遊離基（ｒａｄｉｃａｌ）の置換により合成されるカンナビノイド・キノン誘導体（ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ  ｑｕｉｎｏｎｅ（Ｑ）ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）の製剤に焦点を合わせる。
【００２４】
本発明の化合物は、式（Ｉ）で表されるカンナビ・キノン誘導体である。
【００２５】
【化１】
0005575324.tif 000003
【００２６】
ここで、Ｒ１は水素、ヒドロキシル、メチルまたはアルデヒド基を意味し、Ｒ２はシクロヘキセン誘導体または脂肪族化合物、好ましくはアルケンを意味し、Ｒ３はヒドロキシル基またはメチルオキシ基を意味する。ただし、式（ＩＩ）の化合物を除く。
【００２７】
【化２】
0005575324.tif 000004
【００２８】
本発明の化合物の好適な実施例は、式（ＩＩＩ）で表されるヒドロキシ−カンナビジオール−キノン（Ｈ−ＣＢＤ−Ｑ）である。
【００２９】
【化３】
0005575324.tif 000005
【００３０】
他の好適な実施例は、式（ＩＶ）で表されるメチル−カンナビジオール−キノン（Ｍ−ＣＢＤ−Ｑ）である。
【００３１】
【化４】
0005575324.tif 000006
【００３２】
他の好適な実施例は、式（Ｖ）で表されるホルミル−メトキシ−カンナビジオール−キノン（ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑ）である。
【００３３】
【化５】
0005575324.tif 000007
【００３４】
他の好適な実施例は、式（ＶＩ）で表されるカンナビゲロール−キノン（ＣＢＧ−Ｑ）である。
【００３５】
【化６】
0005575324.tif 000008
【００３６】
実施例および図から下記のように推測されるように、一般式（Ｉ）に含まれるキノン基（Ｑ）は、本発明の化合物に、ＰＰＡＲγと直接結合するキャパシティを与えるものであり、これらの化合物は十分ＰＰＡＲγアゴニスト候補である。さらに、本発明はまた、化合物が前記遊離基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３と共に前記キノン基を含む式を有するときに、前記したＰＰＡＲγと直接結合するキャパシティがより効率的であることを示す。この化合物は、従来技術に含まれる化合物と比較して、いくつかの細胞株において有用な低い細胞毒性レベルを示す。
【００３７】
図１，２に示すように、本発明の化合物、特にＣＢＧ−Ｑは、ＰＰＡＲγと直接結合し、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は２，２で、周知の化合物ＣＢＤ−ＱとＣＢＮのＩＣ５０値より非常に低い。図１，２で示される結論は、図３によっても承認される。すなわち、ＣＢＧ−Ｑが、ＣＢＧより（図３Ｂ）、ＣＢＤとＣＢＤ−Ｑより（図３Ａ）高い効率で、ＰＰＡＲγ活性化を誘発することを示す。繊維芽細胞の脂肪細胞への分化の刺激は、ＰＰＡＲγリガンドの周知の特性であるところ、図４に示すように、ＣＢＧ−Ｑは、この繊維芽細胞の脂肪細胞への分化を刺激する機能を、ＣＢＧに比してより強く働かせたことが明らかである。
【００３８】
さらに、図８Ａに示すように、本発明のＣＢＤ−Ｑ誘導体（Ｍ−ＣＢＤ−Ｑ、Ｈ−ＣＢＤ−ＱおよびＦＭ−ＣＢＤ−Ｑ）は、ＣＢＤ−Ｑより高い効率でＰＰＡＲγ活性化を誘発し、中でもＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが最高のＰＰＡＲγ活性化値を示す。加えて、図８Ｂでは、ＣＢＤ−Ｑ（Ｍ−ＣＢＤ−Ｑ、Ｈ−ＣＢＤ−ＱおよびＦＭ−ＣＢＤ−Ｑ）において導かれた化学修飾が、ＰＰＡＲγ親和性を維持し、ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑの場合は親和性を増加さえさせたことが確認される。これらの結果は細胞培養において確認された。すなわち３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞の脂肪細胞分化を刺激する能力を検討したところ、ＣＢＤ−Ｑ誘導体（Ｍ−ＣＢＤ−Ｑ、Ｈ−ＣＢＤ−ＱおよびＦＭ−ＣＢＤ−Ｑ）、特にＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが、ＣＢＤとＣＢＤ−Ｑに比してより強く、しかも１μＭより高い濃度ではＣＢＤ−Ｑで観察された細胞毒性効果なしに（実施例７を参照）、繊維芽細胞の分化を刺激したことを示した（図８C）。
【００３９】
図１〜４および図８から推論されるすべてのデータは、Ｍ−ＣＢＤ−Ｑ、Ｈ−ＣＢＤ−Ｑ、ＦＭ−ＣＢＤ−ＱおよびＣＢＧ−Ｑが、ＰＰＡＲγと結合し、公知の化合物（ＣＢＤ−ＱとＣＢＮ）に比してより効率的にその転写活性を増加させるＰＰＡＲγリガンドであることを示す。
【００４０】
従って、本発明の化合物は、ＰＰＡＲγアゴニストとして、病因が転写因子としてのＰＰＡＲγ機能の障害に基づく疾患（ＰＰＡＲγ関連疾患）、例えば、代謝性疾患（高血圧、高中性脂肪血症、高コレステロール血症（ＨＤＬ−Ｃ）、肥満、炎症性疾患（表１参照）（アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肝線維症、腎症、乾癬、皮膚創傷治癒、皮膚再生、膵臓炎、胃炎、神経変性障害、および癌）、２型糖尿病（インスリン抵抗性）または高血糖に用いることができる。
【００４１】
図５に示すように、ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑは、抗炎症性化合物として脂肪組織に正の効果をもたらし、従って、インスリン抵抗性を低下させることによる２型糖尿病の治療に用いるＰＰＡＲγアゴニストとして適切である。さらに、図６で明らかなように、ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの両化合物は、インスリン存在下および不存在下の何れにおいても、グルコース取り込みを増加させる。もっとも、インスリンの不存在下では、ＣＢＧ−ＱがＣＢＧに比してより高い効果を示す。このように、ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑは、インスリン抵抗性を低下させることによる２型糖尿病の治療に用いるＰＰＡＲγアゴニストとして適切であるが、ＣＢＧ−Ｑは特に好ましい。その理由は、ＴＺＤロシグリタゾンのような公知の化合物が使用された場合に観察される骨粗鬆症の進行への付加的効果を生ずることなく、炎症誘発性脂肪組織条件（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）の減少を通じて、またインスリン不存在下においてもグルコース取り込みの増加を通じて、インスリン抵抗性を減少させることにより、２型糖尿病治療に用いることができるからである（図７）。
さらに、ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが、インスリン存在下でグルコース取り込みを増加できることも確認された（図９）。
【００４２】
従って、本発明の化合物は、ＰＰＡＲγアゴニストとして、特に炎症性疾患（従来技術の表１を参照）、代謝性疾患および２型糖尿病を治療するために適切である。
【００４３】
本発明のすべての化合物はＰＰＡＲγアゴニストとして良好な特性を示しており、したがっていずれも無視できないが、ＣＢＧ−ＱとＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが特に好適である。その理由は、これらの生体内外でのＰＰＡＲγ活性の増加、インスリン感受性効果の向上および低い細胞毒性による。
【００４４】
本発明の化合物は、これらの誘導体、類似体、互変異性型、立体異性体、多形体、代謝類似体、薬理学的に許容される塩類、薬理学的に許容される溶媒和化合物、および同じ化合物を含む組成物をも含む。
【００４５】
したがって、本発明の化合物は、単独で用いることもできるし、他の活性素（ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、例えば他のカンナビノイド誘導体）や賦形剤（共溶媒、界面活性剤、油、湿潤薬、緩和剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤など）とともに、組成物、特に医薬品組成物に調製することもできる。緩衝剤（ＴＲＩＳ）または燐酸緩衝液のような、薬理的に許容される緩衝剤は何れも用いることができる。
【００４６】
典型的な組成物は、本発明の化合物、またはその誘導体を含み、担体または希釈剤となる薬理学的に許容される賦形剤と組み合わせる。このような組成物は、カプセル、サッシェ、紙、その他の容器の形をとる。組成物の製造は、従来からある医薬品組成物の製法技術を用いる。例えば、対象となる化合物は、通常、担体と混合され、または担体で希釈され、またはアンプル剤、カプセル、サッシェ、紙、その他の容器の形状の担体に封入される。担体が希釈剤として作用する場合、それは固体上、半固体上又は液体上の素材であり、活性化合物のための伝播体、賦形剤または媒体として作用する。
【００４７】
対象化合物は、例えばサッシェの中のように、粒状で丈夫な容器に吸着させることができる。好適な担体としては、水、塩類液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸または低分子量アルキルエーテルセルロース、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンがある。
【００４８】
同様に、担体または希釈剤は、例えばモノステアリン酸グリセリンやグリセリルジステアリン酸のような、本技術分野で公知の持続性遊離材（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）を、単独で又はワックスと混合した形で含んでもよい。
【００４９】
製剤はまた、湿潤剤、乳化および沈殿防止剤、保存剤、甘味料または香料を含んでもよい。本発明の製剤は、患者への投与後に、その有効成分が速効的に、持続的にまたは遅発的に放出されるよう、本技術分野で周知の製法で調製してもよい。医薬品組成物は殺菌され、必要に応じて、活性体と有害的な反応をしない補助作用剤、乳化剤、浸透圧に作用する塩、緩衝剤および／または着色物質などが混合される。
【００５０】
投与経路は、経口、鼻、肺、経皮、あるいは直腸、皮下、静脈内、内部尿道、筋肉内、鼻腔内、眼など非経口に用いる溶液または軟膏など、対象化合物を適切で所望の作用点へ効果的に運ぶ経路であれば何れでもよい。
【００５１】
鼻噴投与のために、対象化合物を液体担体、特に水溶性担体に溶解又は懸濁させて製剤に含ましめ、噴霧用としてもよい。担体には、添加剤として、プロピレングリコールのような可溶化剤、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）またはシクロデキストリンのような吸収促進剤、パラベンのような防腐剤を含めてもよい。
【００５２】
局所製剤の調製のために、対象化合物は、本技術分野に公知の皮膚科学的伝播体（dermatological vehicle）に入れられる。対象化合物の投与量および局所製剤における対象化合物の濃度は、伝播体、選択された投与手段または装置、患者の臨床症状、副作用、製剤中での化合物の安定性によって異なる。したがって、医師は、当該患者又は類似の患者による臨床経験から、適切な濃度の対象化合物を含んだ適切な製剤を用い、製剤の投与量を選択する。
【００５３】
点眼のために、対象化合物は、目への使用に適した溶液、懸濁液および軟膏に調製される。濃度は、通常、局所製剤のために上記で述べたことと同様である。
【００５４】
経口投与のために、固体又は液体の単位投与形（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）が調製される。錠剤のような固体組成物を調製するために、対象化合物は、従来成分である例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、硫酸カルシウム、澱粉、ラクトース、アカシア、メチルセルロース、及び薬品希釈剤または担体として機能的に同等の物質、と混合して製剤にする。
【００５５】
錠剤は、対象化合物を不活性製薬希釈剤と混合し、その混合物を適切なサイズの硬ゼラチンカプセルに充填することにより調製される。軟ゼラチンカプセル剤は、許容される植物油、軽流動ワセリンまたは他の不活性油とともに、対象化合物のスラリーを機械被包して調製される。経口投与のためには、シロップ、エリキシル、懸濁液（suspensions）のような液体単位投与形が調製される。水溶性型は、糖、芳香族香料および防腐剤とともに水溶性伝播体の中で分解されて、シロップを形成する。エリキシルは、エタノールのような水アルコール伝播体に、糖およびサッカリンのような適切な甘味料を加え、さらに芳香族香料を加えて、調製する。懸濁液は、水溶性伝播体に、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの沈殿防止剤を用いて調製する。
【００５６】
適切に注射可能な溶液または懸濁液の使用など非経口的使用に適した製剤は、通常の技能を備えた専門家には明らかである。無菌の製剤は、内皮、筋肉内、血管内、および皮下を含むさまざまな局所または非経口経路に適している。
【００５７】
対象化合物に加えて、組成物は、所望の製剤と放出方式に応じて、薬学的に受け入れられる無毒性の担体または希釈剤を含んでもよく、これには、動物または人間へ投与する医薬品組成物を作るために一般的に用いられる伝播体を含む。希釈剤には、化合物の生物学的活性に過度に影響を及ぼさないようなものを選択する。特に注射可能な製剤に有用な希釈剤の例としては、水、さまざまな塩類の有機又は無機の塩溶液、リンゲル液、ブドウ糖溶液およびハンクス溶液がある。
【００５８】
加えて、医薬品組成物または製剤には、他の担体、免疫賦活剤または無毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤などの添加剤を含めてもよい。さらにまた、製剤には賦形剤を含めることができる。この賦形剤には、共溶媒、界面活性剤、油、湿潤薬、緩和剤、防腐剤、安定化剤および抗酸化剤が含まれる。トリス緩衝液またはリン酸緩衝液のような薬理的に受け入れられる緩衝液を用いてもよい。
【００５９】
希釈剤、添加剤および賦形剤の有効量は、溶解度や生物活性などの観点から薬理学的に許容される製剤を得るのに効果的な量である。
【００６０】
対象化合物をマイクロスフェアに組み込んでもよい。対象化合物をアルブミンのマイクロスフェアに充填し、そこからこのようなマイクロスフェアを鼻噴投与用の乾燥粉末に戻すことが可能である。マイクロスフェアの調製に適した他の材料には、寒天、アルギン酸塩、キトサン、澱粉、ヒドロキシエチルデンプン、アルブミン、アガロース、デキストラン、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲンおよびカゼインが含まれる。マイクロスフェアは、噴霧乾燥法または乳化製法のような当業者に公知の方法によって製造できる。
【００６１】
例えば、アルブミンのマイクロスフェアは、ウサギ血清アルブミンをリン酸緩衝液の中でオリーブ油に加え、撹拌して油中水型エマルジョンを生じさせて調製できる。そして、エマルジョンにグルタルアルデヒド溶液を添加し、撹拌してアルブミンを架橋させる。それから、マイクロスフェアを遠心分離し、油を除去し、球体を石油エーテル、続いてエタノールで洗浄する。最後に篩にかけ、集め、濾過して乾燥する。
【００６２】
澱粉マイロスフェアは、ジャガイモ澱粉のような暖かい水性デンプン溶液を、水の中でポリエチレングリコールの加熱溶液に添加し、撹拌してエマルジョンを形成し、調製できる。二相システム（澱粉溶液が内相となる）が生じてから、混合液を撹拌し続けて室温に冷却すると、内相がゲル粒子に転化する。
【００６３】
これらの粒子を室温でろ過して取り出し、エタノールのような溶媒中でスラリー化する。その後、再び粒子をろ過して取り出し、空気で乾燥させる。
【００６４】
そして、マイクロスフェアを、熱処理のような周知の架橋手順により、あるいは化学架橋溶剤を用いて硬化させる。適切な溶剤には、ジアルデヒド（グリオキサール、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、脂肪アルデヒド、グルタルアルデヒドおよびフタルアルデヒドを含む）、ジケトン（例えばブタンジオン）、エピクロロヒドリン、ポリリン酸塩およびホウ酸塩が含まれる。ジアルデヒドは、アミノ基との相互作用によってアルブミンのようなタンパク質を架橋させるために用いられ、ジケトンはシッフ塩基をアミノ基により形成する。エピクロロヒドリンは、アミノ基またはヒドロキシル基のようなエポキシ誘導体に対する求核試薬を有する化合物を活性化する。
【００６５】
「単位投与形」（ｕｎｉｔ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）という用語は、人間、イヌ、ネコおよび齧歯類のような哺乳動物を対象とする単位投薬量として適切な、物理的に分離した単位を指し、各単位が、必要な製薬希釈剤、担体または伝播体と共同して所望の製薬効果を発揮すべく算出された所定量の活性物質を含む。本発明の単位投与形の仕様は、（ａ）活性物質の固有の特徴と達成される特定の効果、及び（ｂ）人間および動物に用いる例えば活性物質の調剤技術に内在する限界により決められ、左右される。単位投与形の例は、錠剤、カプセル、ピル、粉パケット、ウェーハ、坐薬、顆粒、カシェ剤、茶さじ一杯、大さじ一杯、点滴一滴、アンプル、バイアル、定量吐出エアゾール、前述の何れのものの分離倍数（ｓｅｇｒａｇａｔｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）、および本願明細書において記載されている他の方式である。組成物をキットに含めることができ、そのキットには、一つ以上の組成物の単位投与形と、本願明細書に記載されている単一又は複数の疾患の治療用の使用説明書が含まれる。
【００６６】
遅行的または持続的放出投与方式が、本願明細書に記載されている組成物で用いられ、治療用化合物の連続的または長期的な供給源を提供する。これには、多くの生体高分子（生物学的製剤基礎システム）、リポソーム、コロイド、樹脂を使用するシステム、その他の高分子投与方式または区分化された容器も含まれる。このような遅行的投与方式は、局所、眼内、経口および非経口ルートを介して投与される製剤に適用される。
【００６７】
治療では、有効量の対象化合物が用いられる。本発明に従って用いられる化合物の投与量は、その化合物と、その投与を受ける患者の年齢、体重、および臨床症状などの治療条件に応じて異なる。他の要素には、投与経路、患者、患者の病歴、疾患経過の重症度および特定の化合物の効能が含まれる。投与量は、患者に対する容認できない毒性を産生することなく、疾患の症状または徴候を改善するのに十分であることが求められる。一般に、化合物の有効量は、症状の主観的軽減、あるいは臨床医その他の有資格観察者であれば気づくような客観的に識別できる症状改善をもたらす量である。
【００６８】
本発明の化合物は、ビタミンＤレセプタと結合し又はその活性を修飾する天然又は合成化合物とともに、あるいはレチノイドＸレセプタと結合し又はその活性を修飾する化合物とともに経口投与することもでき、これにより疾患治療またはその予防の相乗効果をもたらす。この発明に含まれる薬剤ともに投与されると相乗効果を生む化合物には、例えば、ビタミンＤ類似体、種々のレチノイン酸誘導体、およびレチノイドＸレセプタまたはレチノイン酸レセプタのための他の活性剤（例えば、ＬＧ１００２６８、タザロテン、ＴＴＮＰＢ、ＡＧＮ１９０１２１、アダプレネ、あるいはＬＧＤ１０６９（タルグレチン）を含むがこれに限定されない）がある。
【００６９】
従って、本発明は、式（Ｉ）で表される化合物と、その誘導体に関する。
【００７０】
【化１】
0005575324.tif 000009
【００７１】
ここで、Ｒ１は水素、ヒドロキシル、メチルまたはアルデヒド基を意味し、Ｒ２はシクロヘキセン誘導体または脂肪族化合物、好ましくはアルケンを意味し、Ｒ３はヒドロキシル基またはメチルオキシ基を意味する。ただし、式（ＩＩ）の化合物を除く。
【００７２】
【化２】
0005575324.tif 000010
【００７３】
本発明の化合物の好適な実施例は、式（ＩＩＩ）で表されるヒドロキシ−カンナビジオール−キノン（Ｈ−ＣＢＤ−Ｑ）である。
【００７４】
【化３】
0005575324.tif 000011
【００７５】
他の好適な実施例は、式（ＩＶ）で表されるメチル−カンナビジオール−キノン（Ｍ−ＣＢＤ−Ｑ）である。
【００７６】
【化４】
0005575324.tif 000012
【００７７】
他の好適な実施例は、式（Ｖ）で表されるホルミル−メトキシ−カンナビジオール−キノン（ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑ）である。
【００７８】
【化５】
0005575324.tif 000013
【００７９】
他の好適な実施例は、式（ＶＩ）で表されるカンナビゲロール−キノン（ＣＢＧ−Ｑ）である。
【００８０】
【化６】
0005575324.tif 000014
※式（ＶＩ）挿入
【００８１】
本発明の第２の実施例は、式（Ｉ）の化合物の薬剤としての使用、特に炎症性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肝線維症、腎症、乾癬、皮膚創傷治癒、皮膚再生、膵臓炎、胃炎、神経変性障害または癌）、代謝性疾患（例えば、高血圧、高中性脂肪血症、高コレステロール血症（ＨＤＬ−Ｃ）、肥満）及び２型糖尿病から選択されるＰＰＡＲγ関連疾患の治療におけるＰＰＡＲγアゴニストとしての使用に関する。
【００８２】
本発明の第３の実施例は、上記式（Ｉ）の化合物を、炎症性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肝線維症、腎症、乾癬、皮膚創傷治癒、皮膚再生、膵臓炎、胃炎、神経変性障害または癌）、代謝性疾患（例えば、高血圧、高中性脂肪血症、高コレステロール血症（ＨＤＬ−Ｃ）、肥満）及び２型糖尿病から選択されるＰＰＡＲγ関連疾患の治療のための組成物の製造に使用することに関する。
【００８３】
本発明の第４の実施例は、少なくとも上記化合物の一つと、適切で許容される賦形剤を含む組成物に関する。
【００８４】
本発明の最後の実施例は、炎症性疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、関節リウマチ、肝線維症、腎症、乾癬、皮膚創傷治癒、皮膚再生、膵臓炎、胃炎、神経変性障害または癌）、代謝性疾患（例えば、高血圧、高中性脂肪血症、高コレステロール血症（ＨＤＬ−Ｃ）、肥満）及び２型糖尿病から選択されるＰＰＡＲγ関連疾患の治療方法に関する。これには、上記組成物の有効量を患者へ投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
本発明の図面を、以下で簡単に説明する。各図面のより詳細な説明は、各実施例の記載に含まれる。
【図１】（公知のカンナビノイドについてのＰＰＡＲγ結合アッセイ）テストされた化合物の濃度（μＭ）はｘ軸で示され、ＰＰＡＲγ結合値としての蛍光分極化の減少率はｙ軸で示される。この図は、従来技術に含まれるカンナビノイドがどのように直接ＰＰＡＲγと結合するか示す。ＣＢＤ−ＱおよびＣＢＮでより好適な数値が観察される。
【図２】（ＣＢＧ対ＣＢＧ−ＱのＰＰＡＲγ結合アッセイの比較）テストされた化合物の濃度（μＭ）はｘ軸で示され、ＰＰＡＲγ結合値としての蛍光分極化の減少率はｙ軸で示される。この図は、ＣＢＧ−Ｑが、ＣＢＧに比して、さらに図１で示された最も公知の化合物（ＣＢＤ−ＱおよびＣＢＮ）に比して、より良好なＩＣ５０値で、ＰＰＡＲγと直接結合することを示す。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｂａｒｓ）による平均値を示す。
【図３】（トランス活性化アッセイ）テストされた化合物の濃度（μＭ）はｘ軸で示され、ＰＰＡＲγ活性化倍率（ａｃｔｉｖｉａｔｉｏｎ  ｆｏｌｄ）はｙ軸で示される。この図は、ＰＰＡＲγ活性に対するＣＢＤとＣＢＤ−Ｑ（図３Ａ）の効果（図３Ａ）またはＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの効果（図３Ｂ）を示し、ＣＢＧ−Ｑが、ＣＢＧ、ＣＢＤ、あるいはＣＢＤ−Ｑより高い効率でＰＰＡＲγの活性化を誘導できることを証明する。
【図４】（脂肪細胞分化アッセイ／十分に分化した脂肪細胞の全トリグリセリド定量化（ｍｍｏｌ／Ｌ  ｏｆ  ３Ｔ３−Ｌ１、ｙ軸））データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。テストされたすべての濃度で、ＣＢＧ−Ｑ誘導体が、繊維芽細胞の脂肪細胞への分化を刺激することわかった。この図は３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞の脂肪細胞への分化を促進する能力を、ＣＢＧ−ＱがＰＰＡＲγリガンドであることの付加的確認として示す。ＣＢＧ−Ｑが、ＣＢＧに比してより強く繊維芽細胞の脂肪細胞への分化を促進することがわかった。まとめると、これらのデータは、ＣＢＧ−Ｑが、結合しその転写活性を増加させるＰＰＡＲγリガンドであることを、初めて示す。
【図５】（ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの抗炎症性化合物としての脂肪組織に対する効果の比較）この図は、脂肪細胞分化のマーカーとして用いられる遺伝子（ａＰ２とＰＰＡＲγ）の発現、ならびにアディポカインを分類するいくつかの遺伝子（レジスチン、ＩＬ―６、ＡｄｉｐｏＱ）に対する、ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの効果を示す。炎症誘発性サイトカインＩＬ―６遺伝子発現の減少、ならびに主要な抗炎症アディポカインであるＡｄｉｐｏＱ遺伝子発現の増加が観察される。結果は、ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑが脂肪組織に対する抗炎症化合物として正の効果を有することを示す。
【図６】（３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞のグルコースの取り込みに対するＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの効果の比較）この図は、化合物ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの何れもが、インスリンの存在下（＋）でも不存在下（−）でも、グルコースの取り込みを増加させるが、インスリンの不在下では、ＣＢＧに比してＣＢＧ−Ｑの効率が高いことを示す。ｙ軸は、ＤＰＭμｇタンパク質倍率を表す。したがって、ＣＢＧ−Ｑは、炎症誘発性脂肪組織状態を低下させ、さらにグルコースの取り込みを増加させることにより、インスリン抵抗性治療に用いることができる。
【図７】（骨髄由来の間葉系幹細胞におけるＰＰＡＲアゴニストとしてのＣＢＧ−Ｑ。ＣＢＧ−Ｑは、造骨細胞分化を抑制しない。）この図は、ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの、特定の脂肪細胞遺伝子発現（ＰＰＡＲγ２イソ型とＬＰＬ）（図７Ｂ）および特定の造骨細胞遺伝子発現（ＲＵＮＸ２とＡＬＰ）（図７Ａ）に対する効果を示す。遺伝子発現倍率は、ｙ軸で示される。抗糖尿病性のチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）薬ロシグリタゾンでの治療によるＰＰＡＲγ活性の増加が、造骨細胞数の減少および脂肪細胞数の増加をもたらすことが知られている。しかしながら、この図は、ＣＢＧ−Ｑの使用の結果として、脂肪細胞（ＰＰＡＲとＬＰＬ）と造骨細胞（Ｒｕｎｘ２とＬＰＬ）の両方において、マーカー遺伝子の発現の著しい変化は生じなかったことを示す。この結果は、ＣＢＧ−Ｑを、骨粗鬆症の進行への付加的な効果を伴うことなく、ＰＰＡＲγアゴニストとして用いることができることを示す。
【図８】（ＣＢＤ−Ｑ誘導体の、ＰＰＡＲγ活性への効果）図８Ａは、テストされた化合物の濃度（μＭ）をｘ軸で示し、ＰＰＡＲγ活性化倍率をｙ軸で示す。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。ＣＢＤ−Ｑ誘導体には、ＣＢＤ−Ｑに比して、ルシフェラーゼ活性の顕著な増加が見られた。この結果は、ＣＢＤ−Ｑ誘導体が、ＣＢＤ−Ｑに比してより高い効率で、ＰＰＡＲγ活性化を誘発できることを示す。ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが最高のＰＰＡＲγ活性化値を示した。  図８Ｂは、テストされた化合物の濃度（μＭ）をｘ軸で示し、リガンドの存在下でのＰＰＡＲγ活性値としての蛍光分極化の減少率はｙ軸で示される。ＩＣ５０値は、凡例に含まれる。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。この図は、ＣＢＤ−Ｑの化学修飾がＰＰＡＲγ親和性を維持し、またＦＭ−ＣＢＤ−Ｑの場合は増加さえさせたことを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃ（十分に分化された脂肪細胞の総トリグリセリド定量化（ｍｍｏｌ／Ｌ  ｏｆ  ３Ｔ３−Ｌ１、ｙ軸））データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。テストされたすべての濃度において、ＣＢＤ−Ｑ誘導体は、ＣＢＤとＣＢＤ−Ｑに比してより強く、しかもＣＢＤ−Ｑでは観察された１μｍより高い濃度での細胞毒性効果なしに（棒がないことに注目）、繊維芽細胞の脂肪細胞への分化を促進することが分かった。ここでも、ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが最も高い効率を示した。
【図９】（３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞でのグルコースの取り込みに対するＣＢＤ、ＣＢＤ−ＱおよびＦＭ−ＣＢＤ−Ｑの効果の比較）２つの供与量（１μＭと１０μＭ）が、インスリン（１．７４μＭ）の存在下においてテストされた。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。ｙ軸は、ＤＰＭμｇタンパク質倍率を表す。結果は、化合物ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが、インスリンの存在下においても、グルコースの取り込みを増加させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
後述する本発明の実施例は、好適な実施例を示すことを目的とするものであって、その保護範囲を限定するものではない。
【００８７】
実施例１（ＰＰＡＲγ結合アッセイ）
本発明の化合物の、ＰＰＡＲγリガンド結合ドメインと結合する能力を、Ｐｏｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎ  ＰＰＡＲγ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ  Ａｓｓａｙ  Ｇｒｅｅｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて測定した。少しの間、競合者を黒３８４浅底ウェルプレート（ＮＵＮＣ社）内の反応緩衝液において希釈した。そして、精製されたＰＰＡＲγリガンド結合ドメインと蛍光ＰＰＡＲγリガンド（Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ  ＰＰＡＲ  Ｇｒｅｅｎ）を加えた。サンプルを室温で２時間培養し、４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの放出波長によりＧｅｎｉｕｓ  Ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ社）を用いてプレートを読みとることにより蛍光偏光度を得た。
【００８８】
図１に示すように、このＰＰＡＲγ結合アッセイは、従来技術において含まれる以下のカンナビノイドを用いてまず最初に実施した：カンナビゲロール（ＣＢＧ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビジバリン（ＣＢＤＶ）、カンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）、Δ８−テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）、Δ８−テトラヒドロカンナビノール−ビリジン（ＴＨＣＶ）、ＣＢＤ−キノン（ＣＢＤ−Ｑ）およびアブノーマルＣＢＤ（Ａｂｎｏｒｍａｌ−ＣＢＤ）。また、それらのＩＣ５０値を示す。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。
【００８９】
これらのカンナビノイドは、ＰＰＡＲ−ＬＢＤ／Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ  ＰＰＡＲ  Ｇｒｅｅｎ錯体から、蛍光性のＦｌｕｏｒｍｏｎｅ  ＰＰＡＲ  Ｇｒｅｅｎリガンドを置換し、分極化値の減少をもたらした。この結果は、前記カンナビノイドが直接ＰＰＡＲγと結合することを示す。ＣＢＤ−ＱおよびＣＢＮでは、より良好な値が観察される。
【００９０】
さらに、図２は同じＰＰＡＲγ結合アッセイを示すが、従来技術に含まれるカンナビノイドＣＢＧと本発明のカンナビノイドＣＢＧ−Ｑを用いて実施したものであって、それらのＩＣ５０値を示す。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。
【００９１】
ＣＢＧ−Ｑは、ＰＰＡＲ−ＬＢＤ／Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ  ＰＰＡＲ  Ｇｒｅｅｎ錯体から、他の何れのカンナビノイドより良好なＩＣ５０値で、蛍光Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ  ＰＰＡＲ  Ｇｒｅｅｎリガンドを置換した。この結果は、ＣＢＧ−Ｑが、ＣＢＧに比して（図２）、さらにＣＢＤ−ＱおよびＣＢＮに比して（図１）、最も良好なＩＣ５０値で、ＰＰＡＲγと直接結合することを示す。
【００９２】
実施例２（本発明で使用する細胞株）
以下の細胞株が、本発明で用いられた：ＡＧＳ（ヒト胃腺がん）、ＨＣＴ１１６（ヒトコロン癌）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌）、ＭＤＡ（ヒト乳がん）、Ｔ４７Ｄ（ヒト胸部腺癌）、２９３  Ｔ（ヒト腎臓上皮細胞株）、３Ｔ３−Ｌ１（マウス胎生期繊維芽細胞脂肪同類）。
【００９３】
すべての細胞株は、１０％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；スペイン・バルセロナのＣａｍｂｒｅｘ社）、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を含んだ、補充されたダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ；スペイン・バルセロナのＣａｍｂｒｅｘ社）の中で、３７°Ｃ、５％のＣＯ２で育てられた。
【００９４】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、スペイン・コルドバのレイナ・ソフィア大学病院の尽力で、血液科を通してドナーから取得した。間葉系幹細胞は、１５％のＦＢＳを有するα―ＭＥＭ培地の中で維持された。
【００９５】
実施例３（３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞分化分析）
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の細胞株を、ＲＮＡ隔離およびトリグリセライド定量化のために、６ウェルプレート  の中で、２×１０５ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの濃度で、平板培養した。３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞を、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭと抗生物質の中で、コンフルエントになるまで（３日間）育てた。そして、ｄａｙ０で、培地を、２日間の分化誘導のために、デキサメタゾン１μｍ、ＩＢＭＸ０．５ｍＭおよびインスリン１０μｇ／ｍｌで補充した。ｄａｙ２において、培地を、インスリン５μｇ／ｍｌだけで更に２日間、補充した。使用されるすべての培地には、ｄａｙ０から、カンナビノイド又はロシグリタゾン（１μｍ）を制御として補充した。ＲＮＡ抽出の場合、細胞はｄａｙ４に収穫した。トリグリセライド定量化のために、細胞を、ｄａｙ１２まで培地の中で維持し、カンナビノイドを補充し、２日ごとにリフレッシュした。
【００９６】
この実施例は、３Ｔ３−Ｌ１細胞脂肪生成上のＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの効果を示す図４で説明される。上記で挙げたように、ロシグリタゾン（１μＭ）を脂肪細胞分化の制御として用いた。
【００９７】
ＣＢＧ−ＱがＰＰＡＲγリガンドであることを確認するために３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞における脂肪細胞分化を促進する能力を調べた。ＣＢＧ−Ｑが、ＣＢＧより強く、繊維芽細胞の脂肪細胞への分化を促進することわかった。それは、脂肪細胞におけるトリグリセライド蓄積によって示される。
【００９８】
まとめると、これらのデータは、ＣＢＧ−ＱがＰＰＡＲγと結合しその転写活性を増加させるＰＰＡＲγリガンドであることを、初めて示すものである。
【００９９】
実施例４（ＣＢＧおよびＣＢＧ−Ｑの、特定の脂肪細胞遺伝子発現（ａＰ２とＰＰＡＲγ）およびアディポカイン遺伝子発現（レジスチン、ＩＬ―６、ＡｄｉｐｏＱ）に対する効果）
ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの、脂肪細胞分化のマーカーとして用いられる遺伝子（ａＰ２とＰＰＡＲγ）に対する効果及びアディポカインを分類する遺伝子（レジスチン、ＩＬ―６、ＡｄｉｐｏＱ）に対する効果を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて検討した。グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子として用いた。
【０１００】
ＣＢＧおよびＣＢＧ−Ｑは、脂肪細胞と比較して、いかなる化合物を加えることなしに、付加的遺伝子発現反応を示し、これらの脂肪細胞分化を促進する効果が確認された。炎症誘発性サイトカインＩＬ―６の減少と主要な抗炎症性アディポカインであるＡｄｉｐｏＱの増加が観察された。この結果は、ＣＢＧとＣＢＧ−Ｑが、脂肪組織に対する抗炎症化合物としての正の効果を有することを示す。
【０１０１】
脂肪組織における炎症誘発性サイトカインの生産とＡｄｉｐｏＱの減少は、脂肪組織上でのみならず筋肉と肝臓上でのインスリン抵抗性の増加を導き、短期間で２型糖尿病をもたらす（図５）。
【０１０２】
実施例５（グルコースの取り込み）
２−デオキシ−Ｄ−グルコース輸送のアッセイのために、１２ウェルプレートで培養される３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞から、２時間の培養によって、血清を除いた。それから、細胞を、４５０μｌのＫＲＨ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＨａＯＨ［ｐＨ７．４］、１２０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、および１．３ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）内で、１．７４μＭのインスリンとともに２０分間培養した。
【０１０３】
グルコース輸送は、０．５ｍＭの２−デオキシ−Ｄ−［１，２−３Ｈ］グルコース（０．２５μＣｉ）を含む５０μのＫＲＨ緩衝液を各ウェルに添加することにより開始された。５分後に、氷冷ＫＲＨ緩衝液で３回細胞を洗浄することによって、輸送は終了した。細胞を可溶化し、取り込まれた放射活性を液体シンチレーション計数法で計測した。
【０１０４】
このアッセイは図６で示されるが、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞でのグルコース取り込みに対するＣＢＧとＣＢＧ−Ｑの効果の分析を示す。２つの用量について、インスリン（１．７４μＭ）の存在下および不存在下でテストした。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。その結果は、いずれの化合物も、インスリンの存在下でも不存在下でも、グルコースの取り込みを増加させるが、インスリンの不在下では、ＣＢＧに比してＣＢＧ−Ｑがより高い効果があることを示す。
【０１０５】
このように、ＣＢＧ−Ｑは、還元炎症誘発性脂肪組織条件の減少、およびグルコース取り込みの増加を通じて、インスリン抵抗性の治療に用いることができた。
【０１０６】
また、図９は、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞でのグルコース取り込みに対するＣＢＤ、ＣＢＤ−ＱおよびＦＭ−ＣＢＤ−Ｑの効果を示す。２つの用量について、インスリン（１．７４μＭ）の存在下においてテストした。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞におけるＦＭ−ＣＢＤ−Ｑのグルコース取り込みへの効果を分析するために、２つの用量が、インスリンの存在においてテストされた。結果は、化合物ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑがインスリンの存在下でグルコースの取り込みを増加させることを示す。
【０１０７】
実施例６（骨髄から取り出された間葉系幹細胞におけるＰＰＡＲアゴニストとしてのＣＢＧ−Ｑ。ＣＢＧ−Ｑは、造骨細胞分化を阻害しない。）
細胞を、１０％のＦＢＳを有するα−ＭＥＭ培地を含むＰ６プレート（スイス・トラーザディンゲンのＴＰＰ社）上で、５００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の細胞数で、平板培養した。細胞培養が８０−９０％コンフルエントのときに、造骨細胞への分化を誘導するために、培地を１０−８Ｍのデキサメタゾン、０．２ｍＭのアスコルビン酸、および１０ｍＭのβ−グリセリン酸で補充し、脂肪細胞への分化を誘導するために、培地を５×１０−７Ｍのデキサメタゾン、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、および５０ｍＭのインドメタシンで補充した。すべての誘導因子は、Sigma-Aldrich社のものであった。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、対応する制御と共に（分化誘導剤の不存在下）、造骨性の又は脂肪生成の培地で２１日間育てた。細胞サンプルを、ｄａｙ１３に集めた。
【０１０８】
図７に示すように、ＣＢＧおよびＣＢＧ−Ｑの、特定の脂肪細胞遺伝子発現（ＰＰＡＲγ２とＬＰＬ）（図７Ｂ）および特定の造骨細胞遺伝子発現（Ｒｕｎｘ２とＡＬＰ）（図７Ａ）に対する効果を調べた。核リボソームＤＮＡの発現値は、得られた値を正常化するために用いた。脂肪細胞および造骨細胞は、脂肪生成または骨胚発生に特有の分化培地におけるヒト間葉系幹細胞の分化によって得た。分析は定量的リアルタイムＰＣＲによって実行し、その結果は、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値として示す。骨形成造骨細胞および脂肪形成脂肪細胞は、いずれも間葉系幹細胞から得られる。
【０１０９】
抗糖尿病性のチアゾリジンジオン（ＴＺＤ）薬ロシグリタゾンを用いた治療に因るＰＰＡＲγ活性の増加は、造骨細胞数の減少および脂肪細胞数の増加をもたらす。間葉系幹細胞の造骨細胞または脂肪細胞への分化に対するＣＢＧＣＢＧ−Ｑの効果をテストするため、化合物を２１日の間、分化培地に加え、特定の遺伝子発現を定量的リアルタイムＰＣＲで測定し。
【０１１０】
脂肪細胞（ＰＰＡＲとＬＰＬ）および造骨細胞（Ｒｕｎｘ２とＬＰＬ）の何れにおいても、遺伝子標識に著しい変化は観察されなかった。この結果は、ＣＢＧ−Ｑが、骨粗鬆症の進行に対する付加的な効果のないＰＰＡＲアゴニストとして用いることができることを示す。
【０１１１】
実施例７（ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）による細胞毒性試験）
細胞懸濁液のアリコートを、１００μｌ量で、１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ密度の９６ウェル組織培養プレートへ調合した。さまざまな濃度のカンナビノイドを添加し、２４時間後に、それらの有効性を、ＭＴＴアッセイ（Charmichaelなど；１９８７年）を用いてテストした。各ＭＴＴ分析において、分析された物質のあらゆる濃度を、３回の反復試験によってテストした。さまざまな化合物の抑制作用を、溶媒（０．５％のＤＭＳＯ）で処理される細胞と比較した抑制率として、算出した。
【０１１２】
表２は、いくつかの細胞株について、ＣＢＤ、ＣＢＤ−Ｑ、ＣＢＧおよびＣＢＧ−Ｑによる処理から２４時間後の、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）による細胞毒性分析のＩＣ５０値を示す。
【０１１３】
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール系の一種）による細胞毒性アッセイ（２４時間の処理）において、ＣＢＧ−Ｑは、ＣＢＧと比較して類似の細胞毒性効果を示し、ＣＢＤおよびＣＢＤ−Ｑと比較して低い値を示した。最も強い細胞毒性効果は、ＣＢＤ−Ｑで観察された。
【０１１４】
細胞株は、以下に由来する：ＡＧＳ（ヒト胃腺がん）、ＨＣＴ１１６（ヒトコロン癌）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌）、ＭＤＡ（ヒト乳がん）、Ｔ４７Ｄ（ヒト胸部腺癌）、３Ｔ３−Ｌ１（マウス胎生期繊維芽細胞−脂肪同類）。
【０１１５】
【表２】
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【０１１６】
表３は、ＣＢＤ−Ｑ誘導体による処理から２４時間後の、細胞株におけるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール系の一種））による細胞毒性分析のＩＣ５０値を示す。
細胞株におけるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）による細胞毒性分析（２４時間の処理）において、すべてのＣＢＤ−Ｑ誘導体が、ＣＢＤ−Ｑに比して細胞毒性効果の低下を示した。
細胞株は、以下に由来する：ＡＧＳ（ヒト胃腺がん）、ＨＣＴ１１６（ヒトコロン癌）、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚癌）、ＭＤＡ（ヒト乳がん）、Ｔ４７Ｄ（ヒト胸部腺癌）、３Ｔ３−Ｌ１（マウス胎生期繊維芽細胞−脂肪同類）。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
実施例８（一過的形質移入およびルシフェラーゼアッセイ）
７×１０３２９３Ｔ細胞を、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）透明ボトム白色９６ウェル  Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ（登録商標）  Ｏｐｔｉｌｕｘ（登録商標）  プレートで２４時間播種した。その後、細胞に、Ｒｏｔｔｉｆｅｃｔ反応（ドイツ・カールスルーエのＲｏｔｈ社）を使用し、製造業者の助言にしたがって、指示されたプラスミドを形質移入した。
【０１１９】
形質移入から２４時間後に、細胞を、カンナビノイドの投与量を増加して６時間前処理した。それから、細胞を、２５ｍＭの三リン酸塩ｐＨ  ７．８、８ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１％のトリトンＸ−１００、および７％のグリセロールで溶解した。
【０１２０】
細胞可溶化物のルシフェラーゼ活性を、ＴｒｉＳｔａｒ  ＬＢ  ９４１  マルチモードモード・マイクロプレートリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）を用い、ルシフェラーゼ・アッセイ・キット（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ社）の指示に従って測定した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード・アッセイ（米国カリフォルニア州リッチモンドのＢｉｏ−Ｒａｄ社）により測定した。溶解緩衝液で得られたバックグラウンドを各実験値から減算し、特定のトランス活性化を、未処理の細胞に対する誘導倍率（ｆｏｌｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）として表した。すべての実験を、少なくとも３回繰り返した。
【０１２１】
プラスミドには、Ｇａｌ４−ｈＰＰＡＲγ（プラスミド名：ｐＣＭＶ−ＢＤ−ｈＰＰＡＲγ（ダルハウジー大学薬理学部Ｓｉｎａｌ研究所で作成）とルシフェラーゼ遺伝子と融合する５つのＧＡＬ４ＤＮＡ結合部位を含むＧＡＬ４−ＬＵＣレポータープラスミドを用いた。
【０１２２】
図３は上記アッセイの結果を示し、このうち図３ＡはＣＢＤとＣＢＤ−ＱのＰＰＡＲγ活性に対する効果を、図３ＢはＣＢＧとＣＢＧ−Ｑのそれを表す。このアッセイにはトランス活性化アッセイが用いられ、ＰＰＡＲγを一時的に過剰発現させる２９３Ｔ細胞で、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子（ＰＰＡＲγ−ＧＡＬ４／ＧＡＬ４−ＬＵＣ）と組み合わせて行われ、カンナビノイドで６時間処理した。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。
【０１２３】
キノン誘導体を用いた場合は、未処理細胞に比して、ルシフェラーゼ活性の著しい増加が認められる。この結果から、化合物ＣＢＧ−Ｑが、ＣＢＧに比してより高い効率でＰＰＡＲγ活性化を誘発することが確認される。
【０１２４】
さらに、図８Ａは、ＰＰＡＲγを一時的に過剰発現させる２９３Ｔ細胞で、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子（ＰＰＡＲγ−ＧＡＬ４／ＧＡＬ４−ＬＵＣ）と組み合わせて行われ、カンナビノイドで６時間処理されるトランス活性化アッセイを示す。データは、３回の反復の偏差標準誤差棒による平均値を示す。
【０１２５】
未処理の細胞（参考として値１によって示される）との比較では、ＣＢＤ−Ｑ誘導体を用いた場合に、ＣＢＤ−Ｑに比してルシフェラーゼ活性の著しい増加が認められた。この結果から、ＣＢＤ−Ｑ誘導体が、ＣＢＤ−Ｑに比してより高い効率でＰＰＡＲγ活性化を誘発することが確認される。ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑが、最高のＰＰＡＲγ活性化値を示した。
【０１２６】
また、図８Ｂは、ＰＰＡＲγ結合アッセイを示し、ＣＢＤ−Ｑ誘導体が、ＰＰＡＲ−ＬＢＤ／Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ  ＰＰＡＲ  Ｇｒｅｅｎ錯体から、蛍光Ｆｌｕｏｒｍｏｎｅ  ＰＰＡＲ  Ｇｒｅｅｎリガンドを置換し、分極化値の減少をもたらしたことを示す。この結果は、ＣＢＤ−Ｑの化学修飾がＰＰＡＲγ親和性を維持し、ＦＭ−ＣＢＤ−Ｑの場合は、親和性を増加さえさせたことを示す。
【０１２７】
実施例９（総トリグリセリド定量化（Ｔｏｔａｌ  ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ））
３Ｔ３−Ｌ１が十分に分化された脂肪細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２ＭのＮａＣｌ、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸および５０ｍＭのリン燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）を含む緩衝液内で、５秒間の音波破砕を３回を行い、細胞内容物を放出した。
【０１２８】
放出された総トリグリセリド内容物を、市販のトリグリセリド・アッセイ・キット（スペインのＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ社）を用い、比色反応を基礎に、分光光度計の５００ｎｍの吸光度で測定し定量化した。
【０１２９】
図８Ｃは、ＣＢＤ−Ｑ誘導体が培養細胞のＰＰＡＲγリガンドであることを、３Ｔ３−Ｌ１繊維芽細胞の脂肪細胞分化を促進する能力を検討することによって、確認するものである。テストされたすべての濃度で、ＣＢＤ−Ｑ誘導体が、ＣＢＤとＣＢＤ−Ｑに比してより強く、しかも１μｍより高い濃度ではＣＢＤ−Ｑで観察された細胞毒性ことなく（棒がないことに注目）、繊維芽細胞の脂肪細胞への分化を促進することが分かった。
【０１３０】
実施例１０（本発明（実施例４および６）で使用されたＰＣＲおよびリアルタイム定量的ＰＣＲ）
ＰＣＲ反応は、以下を含む２５μの混合液から構成された：１ｘＰＣＲバッファ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．２μＭの各ＳＳＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒｓ）、１μｌの転写ｃＤＮＡ、および０．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ社）。
定量的リアルタイムＰＣＲには、ｉＣｙｃｌｅｒ・ｉＱ・リアルタイムＰＣＲ計測器（米国カリフォルニア州リッチモンドのＢｉｏ−Ｒａｄ社）とｉＱ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いた。
【０１３１】
増幅は、１μｌのｃＤＮＡ、２５μｌの２ｘＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ（１００ｍＭのＫＣｌ、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、ｄＮＴＰがそれぞれ０．４ｍＭ、５０ｕ／ｍｌのｉＴａｃ ポリメラーゼ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、および２０ｎＭフルオレセイン）、および２μｌのプライマー２μＭを有する５０μｌの最終液量（ｆｉｎａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）において実行された。特定のプライマー配列は、表４に示される。
【０１３２】
熱サイクル条件は、９４°Ｃで  ２分、続いて、９４°Ｃで１５秒、６０°Ｃで３０秒、７２°Ｃで１分のサイクルを３５回、である。７２°Ｃで５分の延長の最終ステップも入れた。
【０１３３】
増幅を正確に評価するために、融解プログラム（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ）も入れた［７０°Ｃで１０  秒（＋０．５°Ｃｘ６０）］。増幅産物を、０．５ｕｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１．８％のアガロースゲルの電気泳動によって、追加的に分析した。ペダーセン（２００１）により、相対的発現値を算出した。
【０１３４】
【表４】
0005575324.tif 000017
【０１３５】
実施例１１（ＣＢＧのＣＢＧヒドロキシキノン（ＣＢＧ―Ｑ）への酸化）
本発明の上記式（IV）で表されるＣＢＧヒドロキシキノン（ＣＢＧ―Ｑ）の製造方法を次に示す。
ヘキサメチルリン酸トリアミド（５ｍＬ）にＣＢＧ（２００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を溶かして冷却（冷却浴）した溶液に、ｎ−ブチルリチウムヘキサン溶液（０．６６ｍＬ、２．５Ｍ、１．６５ｍｍｏｌ、２．５ｍｏｌ同等）を滴状添加した。添加は、通常の好気状態の下で行った。
【０１３６】
そして、冷却浴を取り除き、溶液を５０°Ｃで加熱した（油浴）。反応は、薄層クロマトグラフィー（石油エーテル−ＥｔＯＡｃ９：１、Ｒｆ．ＣＢＧ＝０．３２；ＲｆＣＢＧキノン＝０．４６）によりモニターし、２時間後に、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加およびＥｔＯＡｃによる抽出により調べた。有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、重力カラムクロマトグラフィ（溶離液として、石油エーテル−ＥｔＯＡｃ９５：５）によって蒸発させ浄化し、ＣＢＧ―ヒドロキシキノンの１３０ｍｇ（６２％）を産出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【配列表】
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