(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養のための無タンパク質かつ無血清の培地であって、該培地の総乾燥重量ベースで１０重量％を超える量の限外濾過されたダイズ加水分解産物を含み、該ダイズ加水分解産物のうちの少なくとも４０％が５００ダルトン以下の分子量を有し、かつ、該細胞がＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞からなる群より選択される哺乳動物細胞である、培地。
【請求項２】
請求項１に記載の培地であって、該培地は、精製されたダイズ加水分解産物を含む、培地。
【請求項３】
請求項１に記載の培地であって、前記ダイズ加水分解産物は、５００Ｕ／ｇ未満の内毒素含量を有する、培地。
【請求項４】
請求項１に記載の培地であって、前記ダイズ加水分解産物のうちの少なくとも５０％が、５００ダルトン以下の分子量を有する、培地。
【請求項５】
請求項４に記載の培地であって、前記ダイズ加水分解産物のうちの少なくとも５５％が、５００ダルトン以下の分子量を有する、培地。
【請求項６】
請求項１に記載の培地であって、該培地はアミノ酸もまた含む、培地。
【請求項７】
請求項６に記載の培地であって、前記アミノ酸が、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミンまたはこれらの混合物からなる群より選択される、培地。
【請求項８】
請求項１に記載の培地であって、該培地は、緩衝剤物質、酸化安定剤、機械的応力を打ち消す安定剤、およびプロテアーゼインヒビターからなる群より選択される、補助的物質もまた含む、培地。
【請求項９】
哺乳動物細胞の培養のための請求項１に記載の培地の使用。
【請求項１０】
哺乳動物細胞の培養のための請求項１に記載の培地の使用であって、該哺乳動物細胞が、ＣＨＯ細胞およびＢＨＫ細胞からなる群より選択される、使用。
【請求項１１】
細胞の培養のためのプロセスであって、該細胞を、請求項１に記載の培地中に導入する工程、および該細胞を、該培地中で増殖させる工程、を包含する、プロセス。
【請求項１２】
細胞培養からのタンパク質の産生のためのプロセスであって、 細胞を、請求項１に記載の培地中に導入する工程であって、該細胞が所望のタンパク質を発現する、工程；
該細胞を該培地中で増殖させ、そして該タンパク質を発現させ、それにより、該培地中で該細胞と該タンパク質との混合物を産生する、工程；
該混合物から該タンパク質を精製する工程、を包含する、プロセス。
【請求項１３】
細胞培養組成物であって、哺乳動物細胞、および請求項１に記載の培地を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の細胞培養培地を作製するためのプロセスであって、ダイズ加水分解産物を得る工程、限外濾過プロセスを使用して、該ダイズ加水分解産物を限外濾過する工程、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、該ダイズ加水分解産物画分を精製する工程、５００ダルトン以下の分子量を有するダイズ加水分解産物からなるダイズ加水分解産物画分を選択する工程、を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地に関する。
【０００２】  細胞の培養、特に、真核生物細胞もしくは哺乳動物細胞の培養は、効率のよい増殖および所望されるタンパク質の産生に必要とされる、栄養物質および増殖物質をその細胞に利用可能にする、特別の培地の使用を絶えず必要とする。一般に、血清または血清（例えば、ウシ血清）由来の化合物が、この点について培地の成分として使用される。
【０００３】  しかし、細胞培地におけるヒト供給源もしくは動物供給源由来の血清またはタンパク質添加物の使用に関して、特に、ヒトに投与される医学的薬剤の調製のための開始材料がその細胞培養を介して利用可能にされる場合に、多数の問題が存在する。
【０００４】  従って、このような血清調製物に関して、その組成およ容質は、バッチ間ですでに変化する。これは、まさに、このような調製物のドナー生物の相違が原因である。このことは、特に、細胞集団の標準化およびこのような細胞の標準的増殖条件の確立について、かなりの問題を示す。しかし、使用される血清材料の集中的かつ一定の品質管理が、すべての場合において必要とされる。しかし、これは、特に血清のような複合組成物に関して、非常に時間がかかりかつコスト集約的である。
【０００５】  さらに、このような複合調製物は、特に細胞培養から回収されるべき組換えタンパク質についての精製プロセスの状況において、破壊的様式で作用し得る複数のタンパク質を含む。これは特に、回収されるべきタンパク質と相同または類似のタンパク質に当てはまる。当然、これらの問題は、特に深刻である。なぜなら、使用される培地中の生体付属物（ｐｅｎｄａｎｔ）（例えば、ウシタンパク質）は、（例えば、組換えタンパク質のみ特異的に指向するがそのウシタンパク質は指向しない抗体を用いる）非常に特異的な示差的精製を介してのみ、精製の状況において容易に除去され得るからである（Ｂｊｏｅｒｃｋ，Ｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、第１４０巻、１１９４〜１１９７頁；Ｎｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．、１９９３、１６４、３３〜４０頁）。
【０００６】  しかし、培養培地における、血清もしくは血清由来の化合物の使用における明白な問題はまた、マイコプラスマ、ウイルスまたはＢＳＥ因子による汚染の危険である。ヒト血液由来の調製物に関連して、ウイルス（例えば、肝炎ウイルスもしくはＨＩＶ）による汚染の危険は、この関連において特に強調されなければならない。ウシ材料に由来する血清もしくは血清成分に関して、特に、ＢＳＥ汚染の危険が存在する。これに加え、さらに、すべての血清由来材料は、未だ未知の疾患誘導因子により汚染され得る。
【０００７】  細胞がその表面に十分接着することを確保しそして細胞から所望の物質の十分な産生を確保するための血清成分の添加は、少数の例外を除き、固体表面上での細胞の培養にとって正に不可欠であると以前は見なされていた。従って、例えば、ＷＯ９１／０９９３５に記載される方法を用いて、表面依存性永続（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）細胞（好ましくは、ベロ細胞）の無血清かつ無タンパク質の培養によって、ＦＳＭＥウイルス／ウイルス抗原の無血清かつ無タンパク質の培養のためのプロセスを達成することが、可能であった（ＷＯ  ９６／１５２３１を参照のこと）。しかし、これらは、組換え細胞ではなく、むしろ、溶菌プロセスにおけるウイルス抗原の産生のために使用される宿主細胞である。
【０００８】  これとは対照的に、組換え調製のために顕著に使用される細胞、例えば、ＣＨＯ細胞は、限定される程度にしか接着できない。従って、従来の方法により増殖されたＣＨＯ細胞は、血清含有条件下でのみ平滑および多孔性の両方のマイクロキャリアに結合する（米国特許第４，９７３，６１６号；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９（１９９２）、２４７〜２５３を参照のこと）。しかし、このような細胞は、無血清条件下で増殖された場合、それらは、この特性を失いそして平滑なキャリアに接着しないか、または、他の接着促進添加物（例えば、フィブロネクチン、インシュリンまたはトランスフェリン）が培地中に提供されなかった場合は、それらは平滑なキャリアから容易に剥離する。しかし、これらもまた、血清に由来するタンパク質である。
【０００９】  これに代わって、これらの細胞は、懸濁培養技術を使用して、ならびに、例えば、バッチプロセスを使用して、または連続培養技術を使用して、増殖され得る。培養は、好ましくは、ケモスタットプロセスを使用して行われる（Ｏｚｔｕｒｋ  Ｓ．Ｓ．ら、１９９６、Ａｂｓｔｒ．Ｐａｐ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、ＢＩＯＴ  １６４、Ｐａｙｎｅ  Ｇ．Ｆ．ら、「Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１９８７、Ｌｙｄｅｒｓｅｎ  Ｂ．Ｋ．編、Ｈａｕｓｅｒ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；２０６〜２１２頁）。Ｋａｔｔｉｎｇｅｒ  Ｈ．ら（Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９６、１５Ａ、１９３〜２０７）は、無タンパク質培地における細胞の長期培養を記載するが、これらの細胞は、キャリア上で培養されなければならず、連続培養技術としての代替法を残さない。これらの細胞は、キャリアの表面に接着した場合、増殖の減少、そして結果として増殖因子の需要の減少が原因で、長期の安定性のみを示すと記載される。
【００１０】  さらに、先行技術において、血清含有条件から開始する無タンパク質培地に細胞を適応させる試みが、いくつかの場合においてなされている。しかし、このような適応に関して、血清含有条件と比較して、発現されるタンパク質の収量および組換え細胞の生産性が、適応後に無タンパク質培地において顕著に減少することが、繰り返し見出された（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０（１９９４）、６９１〜６５８）。
【００１１】  高い細胞密度に関して、組換えタンパク質の産生は、時に、かなり限定されることもまた、見出されている。細胞を無タンパク質培地または無血清培地に適応させる試みの間に、使用される細胞の増殖が減少した不安定性もまた、繰り返し見出され、その結果、発現が減少した細胞が産生されるかまたは非産生細胞が産生され、それによりこれらは、無タンパク質かつ無血清培地において、産生細胞と比較して、増殖の利点を有し、そしてこのことは、これらが、産生細胞を過剰増殖し、そして最終的に、培養全体が非常に低い生成物収量を生じるという事実をもたらす。
【００１２】  （発明の要旨）
従って、本発明は、組換え細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための可能性を改善し、そして組換え細胞が、無血清もしくは無タンパク質様式で効率的に培養され得る、因子およびプロセスを利用可能にする、目的を有する。さらに、表面依存性細胞を培養するのみでなく、懸濁培養技術を使用することもまた可能であるはずであり、それにより細胞の生産性の不安定性が可能な程度抑制されることが必要である。
【００１３】  本発明のさらなる目的は、さらに、組換え細胞の産生を効率的に増加することである。
【００１４】  最後に、本発明に従って、組換え細胞を無血清かつ無タンパク質の培地に適応させることが、改良されそしてより効率的に構成される必要がある。
【００１５】  本発明に従って、これらの課題は、細胞（特に、哺乳動物細胞）の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地によって達成され、この培地は、この培地が一定比率のダイズ加水分解産物を含む特徴により特徴付けられる。
【００１６】  驚くべきことに、上記に定義された目的が、ダイズ加水分解産物を含む培地において細胞を培養することによって、先行技術において記載される無血清培養の不利益を許容する必要がなく達成され得ることを示すことが可能であった。先行技術において公知の他の加水分解産物（例えば、コムギ加水分解産物、イネ加水分解産物または酵母加水分解産物）と対照的に、ダイズ加水分解産物のみが、本発明に従う特性を媒介し、そして例えば、組換え標的タンパク質の有意に増加した収量をもたらすことが、見出された。これらの用語を扱う場合、用語ダイズ加水分解産物または用語ダイズペプトンのいずれもが、異なる意味を有することなく使用され得る。
【００１７】  本発明に従う培地は、好ましくは、その培地の総乾燥重量ベースで、１０重量％を超える量のダイズ加水分解産物を含む。一般に、その培地中のダイズ加水分解産物は、４〜４０％の量で提供される。
【００１８】  特定のダイズ加水分解産物の選択は、本発明に従って重要ではない。市場にて見出される、複数のダイズ調製物（例えば、（例えば、パパインにより）酵素的に消化された、ダイズ粉末由来のペプトン）が、６．５と７．５との間のｐＨ値で、そして９％と９．７％との間の総窒素含量で、そして８％と１５％との間の灰分で、本発明に従って使用され得る。これらは、当業者により細胞培養のために一般的に使用される形態の、ダイズ由来のペプトンである。
【００１９】  好ましい形態の実施形態に従って、本発明に従う培地におけるダイズ加水分解産物の精製調製物またはその粗画分の使用が、なされる。効率的な培養を妨げ得る不純物が、好ましくはこの精製の間に除去されるか、またはこの加水分解産物の精度が、例えば、分子量に関して、改善される。
【００２０】  本発明に従って、限外濾過工程の提供は、実際に、この精製の間で特に価値があることが示されている。このことが原因で、限外濾過されたダイズ加水分解産物の使用が、本発明に従う培地において特に好ましい。
【００２１】  限外濾過は、先行技術において包括的に記載されるプロセスに従って、行われ得、例えば、規定のカットオフ値の膜フィルターが使用される。
【００２２】  限外濾過されたダイズペプトンの精製は、ゲルクロマトグラフィーによって、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５もしくはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０または等価な材料を用いる）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または「逆相」クロマトグラフィーによって、行われ得る。これらは、当業者が精通している先行技術からのプロセスである。この方法を使用して、規定の分子量（すなわち、１０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン以下、より好ましくは３５０ダルトン以下）のダイズ加水分解産物を含む、画分が選択され得る。従って、本発明はまた、無血清かつ無タンパク質の細胞培養培地を作製するためのプロセスを包含し、このプロセスは、ダイズ加水分解産物を得る工程、限外濾過プロセスを使用して、そのダイズ加水分解産物を限外濾過する工程、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、そのダイズ加水分解産物画分を精製する工程、および１０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン以下、より好ましくは３５０ダルトン以下の分子量を有するダイズ加水分解産物からなるダイズ加水分解産物画分を選択する工程、を包含する。
【００２３】  特に有利なダイズ加水分解産物は、以下の特徴によって、特徴付けられる：それが１０．３％と１５．６％との間の遊離アミノ酸含量を有するか、または好ましくは１２％と１３．５％との間の遊離アミノ酸含量を有し、７．６％と１１．４％との間の総窒素含量を有するか、または好ましくは８．７％と９．５％との間の総窒素含量を有し、そして５００Ｕ／ｇ未満の内毒素含量を有し、そしてそれにより、その少なくとも４０％、もしくは好ましくはその少なくとも５０％、もしくは特に好ましくはその少なくとも５５％が、２００〜５００ダルトンの分子量を有し、そしてその少なくとも１０％、もしくは好ましくはその１５％が、５００〜１０００ダルトンの分子量を有する。最も好ましくは、そのダイズ加水分解産物のうちの少なくとも９０％は、５００ダルトン以下の分子量である。そのようなダイズ加水分解産物は、組換えタンパク質の工業的産生に特によく適する。なぜなら、その特定の特徴が原因で、それは特に容易に標準化され得、そして慣用的プロセスにおいて使用可能であるからである。
【００２４】  ダイズ加水分解産物に加えて、本発明に従う培地はまた、それ自体公知である様式で合成培地（例えば、文献から十分に公知である、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９またはＲＰＭＩ）を含み得る。
【００２５】  さらに、本発明に従う培地はまた、好ましくは、アミノ酸を含み、このアミノ酸は、好ましくは、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−グルタミンまたはこれらの混合物からなる群より選択される。
【００２６】  以下のアミノ酸もまた、好ましくは、本発明に従う培地に添加される：Ｌ−アスパラギン（０．００１〜１ｇ／Ｌ（培地）の量で、好ましくは０．１〜０．０５ｇ／Ｌの量で、特に好ましくは０．０１５〜０．０３ｇ／Ｌの量で）、Ｌ−システイン（０．００１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．００５〜０．０５ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０３ｇ／Ｌ）、Ｌ−シスチン（０．００１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０１５〜０．０３ｇ／Ｌ）、Ｌ−プロリン（０．００１〜１．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０７ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０２〜０．０５ｇ／Ｌ）、Ｌ−トリプトファン（０．００１〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．０１５〜０．０３ｇ／Ｌ）、およびＬ−グルタミン（０．０５〜１ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１ｇ／Ｌ）。
【００２７】  上記に示されるアミノ酸は、個別にかまたは組み合わせてかのいずれかで、本発明に従う培地に添加され得る。上述のアミノ酸のすべてを含む、アミノ酸混合物の組み合わせ添加が、特に好ましい。
【００２８】  無血清かつ無タンパク質の培地が、特定の形態の実施形態において使用され、それによりこの培地は、上述のアミノ酸混合物と精製された限外濾過されたダイズペプトンとの組み合わせをさらに含む。
【００２９】  驚くべきことに、例えば、ウイルスもしくは他の病原体を不活化するために、この培地が、負の効果を伴うことなく、約５〜２０分間、または好ましくは１５分間、７０〜９５℃にて、または好ましくは８５〜９５℃にて、加熱され得ることが見出された。
【００３０】  本発明に従って、既知のどの合成培地も、このダイズ加水分解産物と組み合わせて使用され得る。従来の合成培地は、無機塩、アミノ酸、ビタミン、糖質供給源および水を含み得る。例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２培地の使用が、なされ得る。この培地におけるダイズ抽出物の濃度は、好ましくは、０．１ｇ／Ｌと１００ｇ／Ｌとの間であり得、特に好ましくは１ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間であり得る。特に好ましい形態の実施形態に従って、その分子量に関して標準化されたダイズペプトンが、使用され得る。そのダイズペプトンの分子量は、好ましくは５０ｋＤ未満であり、特に好ましくは１０ｋＤ未満であり、最も好ましくは１ｋＤ未満である。
【００３１】  限外濾過されたダイズペプトンの添加は、組換え細胞株の生産性に特に有利であることが示されており、それにより、ダイズペプトンの平均分子量は３５０ダルトンである（Ｑｕｅｓｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。これは、総窒素含量が約９．５％でありかつ遊離アミノ酸含量が約１３％である、ダイズ単離物である。
【００３２】  １，０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン以下、特に好ましくは３５０ダルトン以下の分子量である、精製された限外濾過されたダイズペプトンの使用が、特に好ましい。
【００３３】  本発明に従う培地はまた、好ましくは、補助的物質（例えば、緩衝剤物質、酸化安定剤、機械的応力（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｓｔｒｅｓｓ）を打ち消す安定剤、またはプロテアーゼインヒビター）もまた含む。
【００３４】  以下の組成を有する培地の使用が、特になされる：合成最少培地（１〜２５ｇ／Ｌ）、ダイズペプトン（０．５〜５０ｇ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（０．０５〜１ｇ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（０．１〜１０ｇ／Ｌ）、アスコルビン酸（０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）、エタノールアミン（０．０００５〜０．０５ｇ／Ｌ）および亜セレン酸ナトリウム（１〜１５μｇ／Ｌ）。
【００３５】  必要な場合、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−７１またはＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１０８）が、本発明に従って、消泡剤としてこの培地に添加され得る。
【００３６】  この薬剤は、通気の負の効果から細胞を保護するために、一般的に使用される。なぜなら、界面活性剤を添加しなければ、上昇しそして破裂する気泡が、これらの気泡の表面上に位置する細胞の損傷をもたらし得るからである（「スパージング（ｓｐａｒｇｉｎｇ）」（ＭｕｒｈａｍｍｅｒおよびＧｏｏｃｈｅｅ、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．６：１４２〜１４８）。
【００３７】  非イオン性界面活性剤の量は、これにより０．０５ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌとの間であるが、特に好ましくは、可能な最小量は、０．１ｇ／Ｌと５ｇ／Ｌとの間である。
【００３８】  さらに、本発明に従う培地はまた、シクロデキストリンまたはその誘導体を含み得る。
【００３９】  この無血清かつ無タンパク質の培地は、好ましくは、プロテアーゼインヒビター（例えば、組織培養に適切でありそして合成起源もしくは植物起源である、セリンプロテアーゼインヒビター）を含む。
【００４０】  すでに適応されている細胞（すなわち、この無タンパク質かつ無血清の培地における増殖にすでに適応されている細胞）が、好ましくは、本発明に従う培地における培養のための細胞として使用される。このような予め適応された細胞を用いて増加した収量が達成され得るだけでなく、無血清かつ無タンパク質の培養についてのそれら細胞の安定性もまた、本発明に従う培地の使用によって明らかに改善されることが、見出されている。
【００４１】  しかし、組換え細胞クローンは、本発明に従って特に価値があることがわかっており、本発明によって、これらのクローンは、無血清かつ無タンパク質の培地中で、開始から少なくとも４０世代の間そして好ましくは５０世代の間安定であり、組換え産物を発現する。
【００４２】  このような細胞クローンは、血清含有培地上での元の組換え細胞クローンの培養、および無血清かつ無タンパク質の培地へのこれらの細胞の再適応の後に得られる、細胞培養物から入手され得る。
【００４３】  用語「元の細胞クローン」とは、組換えヌクレオチド配列での宿主細胞のトランスフェクション後に、実験条件下で安定な様式で組換え産物を発現する、組換え細胞クローントランスフェクタントを意味することが理解され得る。この元のクローンを、その増殖を最適化するために、血清含有培地中で増殖させる。その生産性を増加するために、元のクローンを、必要に応じて、選択薬剤の存在下で選択マーカーおよび／または増殖マーカーでの選択を用いて増殖させる。ラージスケールの工業生産については、元の細胞クローンを、血清含有培養条件下で高い細胞密度にまで増殖し、次いで、産生段階の直前に無血清または無タンパク質培地に再適応させる。この場合、培養は、好ましくは、選択圧を用いずに行う。
【００４４】  この元の組換え細胞クローンの培養は、無血清かつ無タンパク質の培地での開始から行われ得；結果として、再適応は必要ではない。この場合において、必要な場合には、選択薬剤をもまた使用し得、そして選択マーカーおよび／または増殖マーカーでの選択を行い得る。このためのプロセスは、例えば、ＥＰ  ０  ７１１  ８３５に記載される。
【００４５】  無血清かつ無タンパク質の培地への再適応後に得られた細胞培養物を、無血清かつ無タンパク質の条件下で（必要に応じて、選択圧の非存在下で）安定した様式で産物を産生する、これらの細胞集団の細胞クローンについて試験する。これは、例えば、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質に対する標識された特異的抗体を用いる免疫蛍光によって行い得る。産物のプロデューサーとして同定された細胞を、この細胞培養物から単離し、そしてこの細胞を、好ましくは産生条件に等しい無血清かつ無タンパク質の条件下で再増殖させる。従って、細胞の単離は、細胞を単離し、そして細胞を産物プロデューサーについて試験することによって行い得る。
【００４６】  安定な細胞を含む細胞培養物を、安定な組換えクローンについて再度試験し得、そしてこれらのクローンを、細胞培養物から単離しそしてサブクローニングする。次いで、無血清かつ無タンパク質の条件下で得られる安定な組換え細胞クローンを、無血清かつ無タンパク質の条件下でさらに増殖させ得る。
【００４７】  本発明に従う培地中でこのように調製される組換え細胞クローンまたは細胞集団は、これらが、少なくとも４０世代の間、好ましくは少なくとも５０世代の間、そして特に６０世代よりも長い間、安定であり、そして組換え産物を発現するという特徴によって、特に優れている。
【００４８】  このような安定な組換え細胞クローンまたは細胞集団の例は、ブダペスト条約に準じて、ＥＣＡＣＣ（ＵＫ）に番号９８０１２２０６の下で寄託されている。
【００４９】  本発明に従って培養される細胞培養物は、好ましくは、組換え哺乳動物細胞から誘導される。本明細書によると、組換え哺乳動物細胞とは、組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質をコードする配列を含む全ての哺乳動物細胞であり得る。接着的または非接着的のいずれかで増殖する、全ての連続的に増殖する細胞が、この点において包含される。組換えＣＨＯ細胞または組換えＢＨＫ細胞が、特に好ましい。組換えポリペプチドまたは組換えタンパク質は、血液因子、増殖因子または他の生物医学的に関連する産物であり得る。
【００５０】  本発明に従って、組換え血液因子（例えば、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、プロテインＳ、プロテインＣ、これらの因子のうちの１つの活性化形態、またはｖＷＦ）のコード配列を含みそして数世代にわたって安定な様式でこれらの因子を発現し得る、細胞クローンが好ましい。ｖＷＦまたはｖＷＦ活性を有するポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子またはＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド、ｖＷＦおよび第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第ＩＩ因子を発現する組換えＣＨＯ細胞が、この点において特に好ましい。
【００５１】  マスターセルバンクを開始するために、３０世代が必要とされる。１０００Ｌスケールの平均的なバッチ培養を行うためには、少なくとも約４０世代が必要とされる。個々の細胞クローンから開始することによって、本発明に従う培地を用いて、約８〜１０世代で「マスターセルバンク（ｍａｓａｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）」（ＭＣＢ）および「ワーキングセルバンク（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ）」（ＷＣＢ）を調製することが可能であり、そしてそれゆえ、生産スケール（生産バイオマス）での無タンパク質かつ無血清条件下で、２０〜２５世代までで細胞培養物を調製することが可能であるが、対照的に、いくつかの世代は、先の細胞クローンおよび培地を用いた無血清または無タンパク質培地上での増殖後に不安定になり、結果として、ａ）産物プロデューサーを含む均一な細胞培養が不可能であり、そして、ｂ）長期間にわたる安定な産物の生産性が不可能である。
【００５２】  しかし、対照的に、本発明に従って、血清含有培地中で培養した元の細胞クローンと比較してでさえ、増加した産物生産性を見い出すことがなお可能であった。
【００５３】  さらなる局面に従って、本発明はまた、細胞（特に、哺乳動物細胞）の培養プロセスに関し、このプロセスは、これらの細胞を本発明に従う培地中に導入し、次いで、この培地中で培養するという特徴によって特徴付けられる。
【００５４】  従って、本発明はまた、組換え細胞（好ましくは、真核生物細胞、そして特に、哺乳動物細胞）の培養のための、本発明に従う培地の使用に関する。
【００５５】  従って、本発明の主題はまた、本発明に従う培地および細胞（好ましくは、真核生物細胞、そして特に、哺乳動物細胞）を含む、細胞培養物である。
【００５６】  本発明は、以下の実施例および図面によってより詳細に明らかにされるが、これらに限定されない。
【００５７】  （実施例）
（実施例１：血清含有培地から無血清かつ無タンパク質の培地に切り換えた後のｒｖＷＦ−ＣＨＯ細胞の安定性）
ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞を、プラスミドｐｈＡｃｔ−ｒｖＷＦおよびｐＳＶ−ｄｈｆｒで同時トランスフェクトし、そしてｖＷＦ発現クローンを、Ｆｉｓｃｈｅｒら（１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３５１：３４５−３４８）によって記載されるようにサブクローニングした。ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を、血清含有条件下であるがＭＴＸ非存在下で安定様式でｒｖＷＦを発現したサブクローンから開始し、そしてこれらの細胞を、血清含有条件下で多孔性のマイクロキャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標））上に固定した。無血清かつ無タンパク質の培地への細胞の切り換えを、２×１０7細胞／１ｍＬマトリクスの細胞密度に到達した後に行った。細胞を、無血清かつ無タンパク質の条件下で数世代の間さらに培養した。細胞を、標識した抗ｖＷＦ抗体での免疫蛍光によって、種々の時点で無血清かつ無タンパク質の培地中で試験した。細胞の安定性の評価を、培地を切り換える前、無血清かつ無タンパク質の培地において１０世代後および６０世代後で、ワーキングセルバンクを使用して行った。ワーキングセルバンクは、依然として１００％ｒｖＷＦプロデューサーを示したが、ｒｖＷＦプロデューサーの割合は、無血清かつ無タンパク質の培地中で１０世代後に約５０％に減少した。６０世代後では、９５％を超える細胞が、非プロデューサーであることが同定された。
【００５８】  （実施例２：安定な組換えＣＨＯクローンのクローニング）
希釈系列を、実施例１に従うｒｖＷＦ−ＣＨＯ細胞（ｒ−ｖＷＦ−ＣＨＯ  Ｆ７と命名されたこの安定な細胞クローンは、ブダペスト条約に準じて、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ  ＳＰ４  ＯＪＧ、ＵＫに、１９９８年１月２２日に寄託し、受託番号９８０１２２０６が付与された）を含む細胞培養物から調製し、この細胞を、無血清かつ無タンパク質の培地中で６０世代の間培養し、そして０．１細胞を、マイクロタイタープレートの各ウェルに播種した。細胞を、血清の添加物もタンパク質添加物も含まずかつ選択圧なしのＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓＦ１２において約３週間培養し、そして細胞を、標識した抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光を介して試験した。陽性として同定された細胞クローンを、シードセルバンクの調製のための開始クローンとして使用した。マスターセルバンク（ＭＣＢ）を、無血清かつ無タンパク質の培地中のシードセルバンクから開始し、そして個々のアンプルを取り出し、そしてワーキングセルバンクのさらなる調製のために冷凍した。ワーキングセルバンクを、個々のアンプルから無血清かつ無タンパク質の培地中に調製した。細胞を、多孔性マイクロキャリア上に固定し、そして無血清かつ無タンパク質の条件下で数世代の間さらに培養した。細胞を、標識抗ｖＷＦ抗体を用いる免疫蛍光によって、無血清かつ無タンパク質の培地中で種々の時点で生産性について試験した。細胞の安定性の評価を、ワーキングセルバンク段階、および無血清かつ無タンパク質の培地中での１０世代後および６０世代後に行った。約１００％の細胞が、陽性の安定なクローンとして同定され、これらは、ワーキングセルバンク段階、１０世代後および６０世代後に、ｒｖＷＦを発現する。
【００５９】  （実施例３：組換え細胞クローンの細胞特異的生産性）
規定された数の細胞を、組換え細胞の培養中の規定された段階で取り出し、そしてこれらを、新鮮な培地と共に２４時間インキュベートした。ｒｖＷＦ：Ｒｉsｔｏ−ＣｏＦ−活性を、細胞培養物の上清液中で決定した。表１は、本発明に従う安定な組換え細胞クローンの場合において、細胞特異的生産性が、無血清かつ無タンパク質の培地中で６０世代後でさえ安定であり、そしてそれが、血清含有培地中で培養した元のクローンと比較して増加されたことを示す。
【００６０】
【表１】
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（実施例４：合成の無血清かつ無タンパク質の培地の組成）
【００６１】
【表２】
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（実施例５：無タンパク質かつ無血清の最少培地中でのｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の培養）
ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含有する細胞培養物を、灌流を伴う１０Ｌ攪拌タンク中で培養した。実施例４に従う培地を、この場合において使用した。これによって、細胞を多孔性マイクロキャリア（Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に固定し、次いで、少なくとも６週間培養した。灌流速度は、４容量交換／日であり；ｐＨは、６．９〜７．２であり；Ｏ2濃度は、約２０〜５０％であり、そして温度は、３７℃であった。
【００６２】  図１は、１０Ｌ灌流バイオリアクター中のｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞クローンの培養の結果を示す：
ａ）４２日の期間にわたる第ＶＩＩＩ因子活性（ミリユニット（ｍＵ）／ｍＬ）および灌流速度（１〜５／日）；
ｂ）この灌流バイオリアクターにおける容量生産性（第ＶＩＩＩ因子のユニット（Ｕ）／Ｌ／日）。
【００６３】
【表３】
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表３は、ｒＦＶＩＩＩ発現細胞の安定性および特異的生産性を示す。これらの結果を得るために、サンプルを、１５日後、２１日後、２８日後、３５日後および４２日後に採取し、次いで、３００ｇで遠心分離し、そして新鮮な無血清かつ無タンパク質の培地中に再懸濁した。細胞培養物の上清液中の第ＶＩＩＩ因子濃度および細胞数を、さらに２４時間後に測定した。特異的なＦＶＩＩＩ生産性を、これらのデータから計算した。
【００６４】  ８８８ミリユニット／１０6細胞／日の安定な平均生産性が達成された。この安定な生産性をまた、無血清かつ無タンパク質の培地中で１５日後、２１日後、２８日後、３５日後および４２日後に、標識抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いる免疫蛍光によって確かめた。
【００６５】  （実施例６：さらなる培地成分を含有する無タンパク質かつ無血清の培地中の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の生産性の比較）
ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、バッチ様式で培養した。この場合において、以下のアミノ酸を添加した実施例４に従う培地を使用した：
【００６６】
【表４】
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細胞を、３７℃でかつｐＨ６．９〜７．２で増殖させた。細胞を、２４〜７２時間にわたってバッチプロセスを使用して増殖させた。
【００６７】  組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の生産性を、以下の培地組成において測定した：
Ｍｉｘ１：ダイズペプトンを含有せずそして上記の表に従うアミノ酸混合物をさらに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む；
Ｍｉｘ２：ダイズペプトンを含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む；
Ｍｉｘ３：ダイズペプトンを含有しそして上記の表に従うアミノ酸混合物をさらに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む；
Ｍｉｘ４：上記の表に従うアミノ酸混合物および２．５ｇ／ｌの精製し、限外濾過したダイズペプトンをさらに含有する、無血清かつ無タンパク質の培地を含む。限外濾過したダイズペプトンの精製は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラム上でのクロマトグラフィーによって行った。
【００６８】  （実施例７：ケモスタット培養法を用いる無タンパク質かつ無血清の培地中での組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の培養）
ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を含む細胞培養物を、１０Ｌの攪拌バイオリアクタータンクにおいて培養した。この場合において、ダイズペプトンを含有せず、実施例６に従うアミノ酸混合物を含有する、実施例４に従って作製した培地を使用した。細胞を、３７℃でかつｐＨ６．９〜７．２で増殖させ；酸素濃度は、２０〜５０％の空気飽和度であった。サンプルを２４時間毎に採取し、第ＶＩＩＩ因子力価および培養物の上清液中の細胞濃度を測定した。全細胞濃度は、２日目から１４日目までで一定であった。限外濾過したダイズペプトンを、６日目から開始して、培地に添加した。第ＶＩＩＩ因子の生産性を、３に例示する；測定は、ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ  ＣｏＡ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ／４システムによって行った。免疫蛍光を、標識した抗ＦＶＩＩＩ抗体を用いて行った。第ＶＩＩＩ因子の生産性における明確な増加、それゆえ、このバイオリアクター系の容量生産性の増加が、ダイズペプトンの添加の結果として生じ、これによって、ダイズペプトンの添加が、細胞増殖の明確な増加を導かなかったことが、データから理解され得る。連続培養におけるダイズペプトンの非存在は、数日後の第ＶＩＩＩ因子の生産性の明確な減少を導き、これに対して、ダイズペプトンの添加は、結果として、ほぼ１０倍の生産性の増加を導く。しかし、この添加は、細胞数を増加しないので、これによって、限外濾過したダイズペプトンが、結果として、生産性における明確な増加を導き、この生産性が細胞増殖に非依存性であることが明確に示される。
【００６９】  （実施例８：異なる加水分解産物を含有する無タンパク質かつ無血清の培地中の組換えＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞の増殖速度および生産性の比較）
ｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞培養物を、バッチ様式で培養した。この場合、異なる加水分解産物（ダイズ、酵母、イネおよびコムギ由来）を添加した、実施例４に記載のように無血清かつ無タンパク質の培地を使用した。加水分解産物を添加しない無血清かつ無タンパク質の培地を、コントロールとして使用した。
【００７０】  開始細胞密度は、それぞれ、０．６×１０5および０．４×１０6であった。細胞を、ｐＨ６．９〜７．２でバッチプロセスを使用して３７℃で培養した。
【００７１】  表５：ダイズ加水分解産物（限外濾過した）および酵母加水分解産物を添加した無血清かつ無タンパク質の培地中でｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を用いた培養実験の結果を示す。開始細胞密度は、０．６×１０5細胞であった。加水分解産物を添加しなかった無血清かつ無タンパク質の培地を、コントロールとして使用した。
【００７２】
【表５】
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表６：ダイズ加水分解産物（限外濾過した）、イネ加水分解産物およびコムギ加水分解産物を添加した無血清かつ無タンパク質の培地中でｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞を用いた培養実験の結果を示す。開始細胞密度は、０．６×１０5細胞であった。加水分解産物を添加しなかった無血清かつ無タンパク質の培地を、コントロールとして使用した。
【００７３】
【表６】
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表７：ダイズ加水分解産物（限外濾過した）およびコムギ加水分解産物を添加した無血清かつ無タンパク質の培地中のｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞での培養実験の結果を示す。開始細胞密度は、０．４×１０6細胞であった。
【００７４】
【表７】
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（実施例９：ダイズ加水分解産物を含有する無タンパク質かつ無血清培地中のＢＨＫ細胞の培養）
ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）細胞を、ＣａＰＯ4手順によって以下のプラスミドを用いて３回同時トランスフェクトした：２５μｇのプラスミドｐＳＶ−ＦＩＩ（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｂ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，第２７１巻、２３７３７−２３７４２頁）（これは、ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０初期遺伝子プロモーター）の制御下にヒト第ＩＩ因子（プロトロンビン）ｃＤＮＡを含む）；４μｇのプラスミドｐＳＶ−ＤＨＦＲ（メトトレキサート耐性）；および１μｇのプラスミドｐＵＣＳＶ−ｎｅｏ（Ｓｃｈｌｏｋａｔ、Ｕ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６、第２４巻、２５７−２６７頁）（これは、Ｇ４１８／ネオマイシン耐性を媒介する）。安定な細胞クローンを、メトトレキサート濃度を３μＭの濃度にまで段階様式で増加させることにより、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含んだ培地中での培養によって選択した。
【００７５】  この様式で得られたクローンをサブクローニングし、無タンパク質かつ無血清培地に適応させた。培養を、懸濁培養技術を使用して行った。
【００７６】  結果は、表６に示され得る；ダイズ加水分解産物を含有する無タンパク質かつ無血清培地中で増殖させたＢＨＫ細胞は高速度かつ安定な速度の、組換え第ＩＩ因子の産生を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、１０Ｌ灌流バイオリアクターにおけるｒＦＶＩＩＩ−ＣＨＯ細胞クローンの培養の結果を示す：  ａ）４２日の期間にわたる第ＶＩＩＩ因子活性（ミリユニット／ｍＬ）および灌流速度（１〜５／日）；  ｂ）この灌流バイオリアクターにおける容量生産性（第ＶＩＩＩ因子のユニット／Ｌ／日）。
【図２】  図２は、種々の培地中での組換え第ＶＩＩ因子を発現するＣＨＯ細胞の培養（バッチプロセスを使用する）の場合における、第ＶＩＩＩ因子の生産性（ｍＵ／ｍＬ）の比較を示す。Ｍｉｘ１は、ダイズ加水分解産物を含まないが、表４に列挙したアミノ酸混合物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなり；Ｍｉｘ２は、ダイズ加水分解産物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなり；Ｍｉｘ３は、ダイズ加水分解産物および表４に列挙したアミノ酸混合物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなり；そしてＭｉｘ４は、２．５ｇ／ｌの精製し、限外濾過したダイズ加水分解産物および表４に列挙したアミノ酸混合物を含む、無血清かつ無タンパク質の培地からなる。限外濾過したダイズ加水分解産物の精製のために、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムを使用した。
【図３】  図３は、精製し、限外濾過したダイズペプトンの添加開始（すなわち、培養の６日目）の後の無血清かつ無タンパク質の培地における、組換え第ＶＩＩＩ因子を発現するＣＨＯ細胞の連続増殖の場合における、第ＶＩＩＩ因子生産性（Ｕ／Ｌ）を示す。
【図４】  図４は、ダイズ加水分解産物を含む無タンパク質かつ無血清の培地中で増殖させた、組換え第ＩＩ因子を発現するＢＨＫ細胞を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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