(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
化１で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類のR1と、
【化１】
0005388004.tif 000011
（式中のR2乃至R4は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環である。）
化２で示されるリンカーの末端のメチル基とが共有結合し、
【化２】
0005388004.tif 000012
（式中のｋ、ｍは、１以上９以下の整数、ｌは、１以上１０以下の整数である。）
さらに、化３で示されるインドシアニン類のR5と、
【化３】
0005388004.tif 000013
（式中のR1乃至R4及びR6乃至R21は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環であり、それらの置換基、例えばカルボン酸、スルホン酸などの置換基において水素イオンが解離できる場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換していてもよい。）
化２で示されるリンカーのもう一つの末端のメチル基とが共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物。
【請求項２】
次式で示されるスルホインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物。
【化４】
0005388004.tif 000014
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｋ、ｌ、ｍ、ｎは、１以上１０以下の整数である。）
【請求項３】
次式で示されるスルホインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物。
【化５】
0005388004.tif 000015
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
【請求項４】
化６で示されるカルボン酸誘導体を溶媒中でイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物と反応させることによって請求項３に記載の化合物を製造する方法。
【化６】
0005388004.tif 000016
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１つに記載のインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を有効成分とすることを特徴とするスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬。
【請求項６】
請求項５に記載のスーパーオキシドアニオン発光分析用試薬を検体溶液と接触させた後、発光強度を測定することを特徴とするスーパーオキシドアニオンの分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物、その製造法およびその化学発光法に関する。さらに詳しくは、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物は、インドシアニン化合物とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物が共有結合してなる化合物であり、その製造法に関する。インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物は、これまでには無い近赤外光の化学発光を誘導することができる化合物である。例えば、スーパーオキシドアニオンの化学発光分析用試薬として利用することができる。さらに、本発明はスーパーオキシドアニオンの分析方法に関する。本発明の化学発光分析用試薬は、スーパーオキシドアニオンとの反応により近赤外光の化学発光を誘導し、例えば、生体内外のスーパーオキシドアニオンを近赤外光シグナルとして検出することによる疾病の診断あるいは疾患の研究に寄与するものとして使用できる。
【背景技術】
【０００２】
これまでイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類は、種々合成されており、それらは、化学発光試薬として有用であることが知られている。これらのイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類の中でCLA、MCLA、FCLA、Red-CLA、Green Chemiluminescent CD、EMPEC等は、スーパーオキシドアニオンの化学発光分析試薬としても用いられ、市販されている。しかし、これらの化学発光試薬から誘導される発光は、水溶液中、CLA、MCLAおよびEMPECは青色であり、FCLAおよびGreen Chemiluminescent CDは緑色であり、Red-CLAは紅色の光である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記発光試薬には、被検体中の夾雑物による消光や被検体からの光透過性が低いという欠点があった。さらに、上記発光試薬には、発光波長が重なる欠点があり、分析の多様化のためには、（１）長波長領域での発光が可能で、（２）他の発光試薬の発光波長との重なりが無い化学発光試薬が望まれている。
【０００４】
このような観点から、特に近赤外光は生体からの透過性が優れており、また、これまでの化学発光試薬の発光波長との重なりが無いか、あるいは少ないという利点があるので、近赤外光を放つ化学発光試薬が望まれている。しかしながら、近赤外光を発する化学発光化合物は知られていなかった。
【０００５】
本発明は、近赤外光の発光が可能な化学発光化合物およびその製造法を提供し、さらには、被検体からの透過性を高め、高い発光強度を示し、かつ高い検出感度を有するスーパーオキシドアニオンの化学発光分析用試薬および化学発光法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係わる化合物は、
＜１＞化７で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類のR1と、
【化７】
0005388004.tif 000002
（式中のR2乃至R4は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環である。）
化８で示されるリンカーの末端のメチル基とが共有結合し、
【化８】
0005388004.tif 000003
（式中のｋ、ｍは、１以上９以下の整数、ｌは、１以上１０以下の整数である。）
さらに、化９で示されるインドシアニン類のR5と、
【化９】
0005388004.tif 000004
（式中のR1乃至R4及びR6乃至R21は、水素原子、アルキル基、アリール基、ハロゲン原子、アルコキシル基、カルボキシル基、ホルミル基、スルホニル基、スルホン酸基、アルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基または複素環であり、それらの置換基、例えばカルボン酸、スルホン酸などの置換基において水素イオンが解離できる場合は、その水素イオンの代わりにナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオンが置換していてもよい。）
化８で示されるリンカーのもう一つの末端のメチル基とが共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。
【０００７】
＜２＞次に、次式で示されるスルホインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。
【化１０】
0005388004.tif 000005
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属であり、ｋ、ｌ、ｍ、ｎは、１以上１０以下の整数である。）
【０００８】
＜３＞次に、次式で示されるスルホインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるスルホインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物である。
【化１１】
0005388004.tif 000006
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
【０００９】
＜４＞本発明に係わるインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなる化合物の合成法は、下記の化学式（化１２）で表わされるカルボン酸誘導体とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物とを反応させることを特徴とする。
【化１２】
0005388004.tif 000007
（式中のＭは、ＨあるいはＮａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａなどのアルカリ金属、アルカリ土類金属である。）
【００１０】
＜５＞次に、上述の＜１＞から＜３＞のいずれか１つのインドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を有効成分として含有することを特徴とする化学発光試薬である。
【００１１】
＜６＞さらに、本発明は、上述の＜５＞のスーパーオキシドアニオン分析試薬を検体溶液と接触させた後、発光強度を測定することを特徴とするスーパーオキシドアニオンの分析方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、近赤外光を発するインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物、その製造法が提供されることにより、近赤外光を発するスーパーオキシドアニオン分析用試薬として使用することができ、さらにはスーパーオキシドアニオンの化学発光分析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の近赤外光の発光を誘導する発光化合物は、少なくとも、インドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を含有することを特徴とするものである。この時、インドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類は、直接共有結合しているもののみならず、適当なスペーサー分子鎖を介して共有結合しているものであってもよい。
【００１４】
具体的には、本発明のスーパーオキシドアニオン分析用試薬に用いられるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物としては、前記の化学式（化１１）のものが好ましく例示される。
【００１５】
本発明におけるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物は、以上のとおりのものであり、その合成法は、前記の化学式（化１２）とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を溶液中において反応させることにより成し遂げられる。
【００１６】
すなわち前記の化学式（化１１）に示される化合物の合成法には、以下の例を挙げることができる。工程１では、例えば非特許文献１に記載の方法により合成する次式（化１３）で示される2-[6-acethlphenylamino]1,3,5-hexatrienyl]-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)3-H-indoliumと
【化１３】
0005388004.tif 000008
例えば特許文献１に記載の方法により合成する1-(2-carboxyethyk)-2,3,3-trimethyl-5-sulfo3H-indoliumとを縮合させ、前記の化学式（化１２）で示される新規なインドシアニン化合物1-(2-carboxyethyl)-2-[7-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-ylidene]-1,3,5-heptatrienyl]-3,3-dimethyl-3H-Indoliumを得る。
【００１７】
【特許文献１】特開Ｈ０８−２５９８２６号広報
【非特許文献１】”Novelnear-infrared cyanine fluorochromes: synthesis, properties, and bioconjugation”,Y. Lin, R. Weissleder, C-H. Tung, Bioconjugate. Chem. 13, 605-609 (2002).
【００１８】
工程２は、工程１で得られるインドシアニン化合物（化１２）と次式（化１４）で示されるイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を化学結合し、目的の新規インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物（化１１）を得るものである。
【化１４】
0005388004.tif 000009
【００１９】
以上の工程１および工程２を次式（化１５）に示す。
【化１５】
0005388004.tif 000010
【００２０】
さらに本発明のスーパーオキシドアニオンの発光分析用試薬は、インドシアニン類とイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン類が共有結合してなるインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を有効成分として含有することを特徴とする発光試薬である。
【００２１】
さらに、本発明のスーパーオキシドアニオン分析用試薬は、以上のとおりのインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物を有効成分とするものであれば、その他の物質、例えば、溶剤、緩衝剤、安定剤、界面活性剤等を含有してもよい。
【００２２】
そして本発明は、スーパーオキシドアニオンを検出する方法をも提供する。すなわち、本発明のスーパーオキシドアニオンの分析方法では、前記のスーパーオキシドアニオン分析用試薬を検体溶液に添加、混合するなどして接触させ、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物によって発せられる光の強度を測定することによりスーパーオキシドアニオンを簡便に分析することが可能となるのである。
【００２３】
この時、添加するスーパーオキシドアニオン分析試薬の量等の分析条件は特に限定されない。具体的には、スーパーオキシドアニオン分析試薬の濃度は、分析系に影響を与えない程度であればよい。また、スーパーオキシドアニオンの分析は、被検体に影響を与えない温度範囲で行なえばよい。例えば、一般に生体を被検体とし、水溶液中で分析を行なう場合には、約１０℃〜４０℃の温度範囲が好ましい。
【００２４】
さらに本発明のインドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物によって発せられる光の発光波長は、最大波長約７８５ｎｍ〜８００ｎｍであるため他成分による消光は少なく被検体からの透過性がよい。
【００２５】
本発明において、「アルキル基」とは、置換基を有していてもよい炭素数１個〜２０個の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基をいい、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコサニルなどの直鎖の基または、分岐状に結合した基をいう。
【００２６】
本発明において、「アルコキシル基」とは、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、メチキシエトキシ、メトキシプロポキシ、エトキシエトキシ、エトキシプロポキシ、メトキシエトキシエトキシ基などの炭素数１個〜２０個のアルコキシル基が直鎖上にまたは分岐状に結合したものなどを挙げることができる。
【００２７】
本発明において、「アリール基」とは、フェニル、ナフチルなどの炭素数６〜２０個の芳香族炭化水素を挙げることができる。
【００２８】
本発明において、「複素環」とは、例えば、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、イソオキサゾール、トリアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ピラゾール、フラザン、ピラン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジンなどを挙げることができる。
【００２９】
本発明において、「ハロゲン原子」とは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などを挙げることができる。
【００３０】
本発明において、「インドシアニン類」とは、近赤外蛍光を発するインドシアニン化合物をいう。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明の好適な一実施の形態を実施例によって具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、本発明の範囲で様々に改変して実施することができる。
【００３２】
＜実施例１：前記の化学式（化１２）で示される化合物1-(2-carboxyethyl)-2-[7-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-ylidene]-1,3,5-heptatrienyl]-3,3-dimethyl-3H-Indoliumの合成＞2-[6-acethlphenylamino]1,3,5-hexatrienyl]-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)3-H-indolium（０．３ｇ）と1-(2-carboxyethyk)-2,3,3-trimethyl-5-sulfo3H-indolium（０．１６ｇ）とをPyridine（３ｍＬ）およびN,N-dimethylformamide（３ｍＬ）の混合液中、室温で３０分間攪拌した。反応液にアセトン（８０ｍＬ）を加え、1-(2-carboxyethyl)-2-[7-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-ylidene]-1,3,5-heptatrienyl]-3,3-dimethyl-3H-Indolium  を析出させ、ろ過し目的物（０．４４ｇ）の固体を得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H
NMR (500 MHz, DMSO-d6, 26℃) ・ 1.62 (6H, s), 1.65 (6H, s), 1.77 (4H, br.s), 2.53 (2H, t, J =
7.3 Hz), 2.67 (2H, t, J = 7.3 Hz), 4.12 (2H, t, J = 7.3 Hz), 4.24
(2H, t, J = 7.3 Hz), 6.30 (1H, d, J = 12.8 Hz), 6.5-6.62 (3H, m),
7.22 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.41 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.60 (1H, dd,
J = 1.3, 8.6 Hz), 7.65 (1H, dd, J = 1.3, 8.6 Hz), 7.69 (1H, d, J
= 1.3 Hz), 7.75 (1H, d, J = 1.3 Hz), 7.75 (1H, t, J = 12.8 Hz),
7.82 (1H, t, J = 12.8 Hz), 7.95 (1H, t, J = 12.8 Hz). 13C
NMR (125.65 MHz, DMSO-d6, 26℃) ・ 22.33, 26.06, 27.00, 27.26, 31.42, 39.50, 43.88, 48.19, 49.01,
50.61, 103.31, 105.34, 109.58, 110.75, 119.62, 119.75, 125.77, 126.00, 126.10,
126.20, 139.89, 140.69, 141.94, 142,11, 144.36, 145.43, 150.02, 152.29, 156.25,
169.88, 171.98, 173.07.  LC/MS (ESI, positive mode): m/z:
calcd for C34H40N2O11S3
748.18, found: 748.97 [M+1]+.
【００３３】
＜実施例２：前記の化学式（化１１）で示される化合物4-(2-((1E,3E,5E,7E)-7-(1-(3-(2-(3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamido)ethylamino)-3-oxopropyl)-3,3-dimethyl-5-sulfoindolin-2-ylidene)hepta-1,3,5-trienyl)-3,3-dimethyl-5-sulfo-3H-indolium-1-yl)butane-1-sulfonateの合成＞
1-(2-carboxyethyl)-2-[7-[1,3-dihydro-3,3-dimethyl-5-sulfo-1-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-ylidene]-1,3,5-heptatrienyl]-3,3-dimethyl-3H-Indolium（０．０３６ｍｇ）、N-(2-aminoethyl)-3-(6-(4-methoxyphenyl)-3-oxo-3,7-dihydroimidazo[1,2-a]pyrazin-2-yl)propanamide（０．０２０ｇ）、ＤＭＡＰ（０．００６ｇ）、ＷＳＣ（０．０４３ｇ）、Pyridine（０．７ｍＬ）、N,N-dimethylformamide（０．７ｍＬ）の混合物を、室温で３時間攪拌した。反応液にアセトン（１０ｍＬ）を加え、析出物をろ過し、得られた固体をシリカゲルクロマトグラフィーに供し、目的物をメタノールと塩化メチレンの混液で溶出し、目的物（０．０１８ｇ）を得た。以下に目的物の機器分析データを示す。
1H
NMR (500 MHz, D2O, 27℃, Aceton: 2.11 ppm) ・
1.34 (6H, s), 1.47 (6H, s), 1.67 (4H, m), 2.45 (2H, t, J
= 8.6 Hz), 2.57 (2H, t, J = 6.7 Hz), 2.80 (4H, m), 3.11 (4H, m), 3.55
(3H, s), 3.72 (2H, br.t), 4.09 (2H, t, J = 6.7 Hz), 5.87 (1H, d, J
= 14.0 Hz), 5.92 (1H, d, J = 13.4 Hz), 5.99 (1H, t, J = 13.4 Hz),
6.08 (1H, t, J = 12.8 Hz), 6.65 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.05 (1H, d,
J = 8.5 Hz), 7.08 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.10 (1H, m), 7.21 (2H, d,
J = 8.5 Hz), 7.42 (1H, br.s), 7.47 (1H, t, J = 13.4 Hz), 7.58
(1H, t, J = 12.8 Hz), 7.60 (1H, dd, J = 1.2, 8.5 Hz), 7.65 (1H,
d, J = 1.2 Hz), 7.66 (1H, dd, J = 1.2, 8.5 Hz), 7.67 (1H, d, J
= 1.2 Hz), 7.78 (1H, br.s). LC/MS (ESI, positive mode):
m/z: calcd for C52H59N7O13S3
1085.33, found: 1086.08 [M+1]+.
【００３４】
＜実施例３：発光スペクトルの測定＞
ＫＣｌ（０．２Ｍ）、ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）、3-モルホリノプロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)（２０ｍＭ）を含む緩衝水溶液（ｐＨ７．２、０．５ｍＬ）に２５℃で、ヒポキサンチン水溶液（０．３ｍＭ、０．５ｍＬ）、インドシアニン結合型イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3-オン化合物（前記の化学式（化１１））水溶液（２．５×１０−５Ｍ、４０μＬ）およびキサンチンオキシダーゼ水溶液（０．３７ｕｎｉｔ／ｍＬ、４０μＬ）を加え、ルミフルスペクトロキャプチャー（アトー社製）を用いて発光スペクトルを測定した。発光スペクトルは最大発光波長約７８５ｎｍ〜８００ｎｍを示した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】前記の化学式（化１１）で示される化合物のヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキサイドとの反応による化学発光スペクトル(スパイク状のピークはノイズ。感度補正は行なっていない）。前記の化学式（化１１）の濃度は１μＭ。キサンチンオキシダーゼ濃度は０．０１５ｕｎｉｔ／ｍＬ。
【図２】ヒポキサンチン−キサンチンオキシダーゼ系におけるスーパーオキサイドと前記の化学式（化１１）で示される化合物の反応におけるキサンチンオキシダーゼ濃度と発光強度（７８５ｎｍ）の相関。前記の化学式（化１１）の濃度は１μＭ。
【図１】
0005388004.tif 000017
【図２】
0005388004.tif 000018