(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示されるヌクレオチド配列を含み、成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２】
配列番号１１または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含み、成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１１または１２を含む２つのポリペプチドを含むホモ二量体。
【請求項４】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞。
【請求項６】
真核細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
原核細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
賦形剤または担体を含み、請求項２に記載のポリペプチドを含む医薬品組成物。
【請求項９】
成長ホルモン欠損症の治療用である、請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
前記組成物が２日の間隔で投与される、請求項８または９に記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
前記組成物が１週間間隔で投与される、請求項８または９に記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
前記組成物が２週間間隔で投与される、請求項８または９に記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
前記組成物が１カ月間隔で投与される、請求項８または９に記載の医薬品組成物。
【請求項１４】
前記成長ホルモン欠損症が小児期成長ホルモン欠損症または成人成長ホルモン欠損症である、請求項９から１３のいずれか一項に記載の医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモン融合タンパク質、前記タンパク質をコードする核酸分子および前記タンパク質を使用する治療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
受容体と相互作用して生化学的応答を引き起こすリガンドは、アゴニストとして知られており、生化学的応答を妨げるまたは邪魔をするリガンドはアンタゴニストとして知られている。例えば、細胞特異的成長因子は、アゴニストとして働き細胞表面に位置する受容体に結合するリガンドである。リガンド特異的結合により受容体が活性化されると、とりわけ、細胞周期特異的遺伝子の発現および静止細胞の活性化による増殖をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードの活性化を介して細胞増殖が促進される。
サイトカインと呼ばれる一群の成長因子は、いくつかの多様な細胞機能に関与している。これらの機能には、免疫系の調節、エネルギー代謝の調節ならびに成長および発生の制御が挙げられる。サイトカインは、標的細胞上の細胞表面で発現される受容体を介してその効果を媒介する。サイトカイン受容体は、３つの別々の下位グループに分類することができる。１型（成長ホルモンファミリー）受容体は、その細胞外ドメインのアミノ末端部分にある４つの保存されたシステイン残基およびＣ末端部分における保存されたＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフの存在によって特徴づけられる。繰り返しＣｙｓモチーフは、２型（インターフェロンファミリー）およびＩＩＩ型（腫瘍壊死因子ファミリー）にも存在している。
【０００３】
成長ホルモン（ＧＨ）は、小児期の直線的な成長および成人の正常な身体組成にとり重要なタンパク同化サイトカインホルモンである１。ＧＨ交換のための最新の治療計画では、不便で高価な１日１回の皮下注射が必要である。ペグ化２および徐放製剤３〜５を含む長時間作用性調製物を作製するためいくつかのアプローチが取られてきた。ペグ化には、受容体に対するホルモンの親和性を減少させる２という不利な点があり、それに続く精製での化学修飾は高価である。徐放製剤は有効性を証明してはいる４〜７が、そのようなＧＨ調製物は優勢な早期放出プロファイルに特徴づけられており、超生理学的ＧＨレベルを引き起こし３、製造は高価であり、注射は有痛性であることがある４。製造コストを最小限に抑え、優れた薬物動態学的プロファイルを有し、投与が簡単で、患者にとり許容可能であるサイトカイン製剤に対する必要性が存在する。
【０００４】
ＧＨは、細胞表面１型サイトカイン受容体（ＧＨＲ）を通じて働く。他のサイトカイン受容体と共通して、ＧＨＲの細胞外ドメインはタンパク質分解的に切断されて、結合タンパク質（ＧＨＢＰ）として循環する８。生理的条件下では、ＧＨには一部、循環中に１対１のモル比でＧＨＢＰが結合しており、この複合体は生物学的に不活性であり、クリアランスおよび分解から保護されている９、１０。ＧＨとＧＨＢＰとの架橋複合体は、クリアランスを遅らせるが生物活性はない１１。別々に精製されたＧＨＢＰとＧＨとの１対１比での同時投与は、ＧＨのタンパク同化作用を増強することができる１２。したがって、多くのホルモン系のように、循環中の結合は、活性な遊離ホルモンと平衡状態にある不活性循環貯蔵場所を提供する１３。
成長ホルモンのようなサイトカインホルモンは、血漿半減期が短く、頻繁な投与が必要である。例えば、成長ホルモン（ＧＨ）交換は連日注射を含む。他のサイトカインと共通して、細胞外ドメインＧＨ受容体は、結合タンパク質として循環し、ＧＨの生物学的半減期を自然に延長する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、ＧＨとその細胞外ドメイン受容体のリガンド−受容体融合体（ＬＲ融合体）の生物学的作用に関する。そのような遺伝子操作されたＬＲ融合タンパク質は、哺乳動物細胞培養から精製された。ラットでは、ＬＲ融合体は天然ＧＨと比べてクリアランスが３００分の１に減少し、単回投与では天然ＧＨで見られる成長よりもはるかに優れていて１０日間成長を促進した。クリアランスが減少したことは、霊長類モデルで再現性がある。ＬＲ融合体は、ＧＨおよびその結合タンパク質とともに天然に存在する不活性ホルモンの貯蔵場所を提供する相互ヘッドトゥーテール二量体を形成する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一態様によれば、
ｉ）配列番号１に示される核酸配列、
ｉｉ）配列番号２に示される核酸配列、
ｉｉｉ）配列番号３に示される核酸配列、
ｉｖ）配列番号４に示される核酸配列、または
ｖ）厳密なハイブリダイゼーション条件下で配列番号１、配列番号２、配列番号３もしくは配列番号４にハイブリダイズする核酸配列を含む核酸分子から選択され、成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。
【０００７】
核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的核酸分子が互いへの一定量の水素結合を受けるときに起こる。ハイブリダイゼーションの厳密性は、核酸を取り囲む環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、および使用される核酸分子の組成と長さにより変化することがある。特定度の厳密性を達成するために必要なハイブリダイゼーション条件の関する計算は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、２００１）およびＴｉｊｓｓｅｎ、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ」、Ｐａｒｔ１、Ｃｈａｐｔｅｒ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク、１９９３）で論じられている。Ｔｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％がその相補鎖にハイブリダイズする温度である。下記はハイブリダイゼーション条件の例となるセットであり限定的なものではない：
超高厳密性（少なくとも９０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６５℃で１６時間、５×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ室温（ＲＴ）で１５分間、２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ６５℃で２０分間、０．５×ＳＳＣ
高厳密性（少なくとも８０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：６５℃〜７０℃で１６〜２０時間、５×〜６×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれＲＴで５〜２０分間、２×ＳＳＣ
２度洗浄：それぞれ５５℃〜７０℃で３０分間、１×ＳＳＣ
低厳密性（少なくとも５０％の同一性を共有する配列がハイブリダイズすることを可能にする）
ハイブリダイゼーション：ＲＴ〜５５℃で１６〜２０時間、６×ＳＳＣ
少なくとも２度洗浄：それぞれＲＴ〜５５℃で２０〜３０分間、２×〜３×ＳＳＣ
【０００８】
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸分子は配列番号１に示される核酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸分子は配列番号２に示される核酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸分子は配列番号３に示される核酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記核酸分子は配列番号４に示される核酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の態様によれば、本発明に従った核酸によってコードされるポリペプチドが提供される。
本発明の追加の態様によれば、
ｉ）配列番号５に示されるアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列、
ｉｖ）配列番号８に示されるアミノ酸配列、
ｖ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、
ｖｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列、
ｖｉｉ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列、
ｖｉｉｉ）配列番号１２に示されるアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが成長ホルモン受容体アゴニスト活性を有するポリペプチドが提供される。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の好ましい実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本発明の追加の態様によれば、配列番号５を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号６を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号７を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号８を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
【００１１】
本発明の追加の態様によれば、配列番号９を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号１０を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号１１を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
本発明の追加の態様によれば、配列番号１２を含むまたはそれからなる２つのポリペプチドを含むホモ二量体が提供される。
【００１２】
本発明の追加の態様によれば、本発明に従った核酸分子を含むベクターが提供される。
本発明の好ましい実施形態では、前記ベクターは、本発明に従った核酸分子を発現するように適合させた発現ベクターである。
本発明に従った核酸（複数可）を含むベクターは、特に前記ベクターを使用して、核酸を細胞に導入してゲノム中に組み換え、安定なトランスフェクションを行う場合には、プロモーターまたは他の調節配列を含む必要はない。好ましくは、ベクター中の核酸は、宿主細胞における転写のために適切なプロモーターまたは他の調節エレメントに作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主で機能する二機能性発現ベクターでもよい。「プロモーター」とは、転写開始部位の上流にあって転写に必要な調節領域すべてを含有するヌクレオチド配列を意味する。適切なプロモーターには、真核または原核細胞における発現のための構成的、組織特異的、誘導性、発生的または他のプロモーターが挙げられる。「作動可能に連結された」とは、転写がプロモーターから開始されるように適切に位置づけられ方向づけられた同一核酸分子の一部として結合されていることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。
好ましい実施形態では、プロモーターは構成的、誘導性のまたは調節可能なプロモーターである。
【００１３】
本発明の追加の態様に従えば、本発明に従った核酸分子またはベクターでトランスフェクトまたは形質転換された細胞が提供される。
好ましくは、前記細胞は真核細胞である。あるいは、前記細胞は原核細胞である。
本発明の好ましい実施形態では、前記細胞は、真菌細胞（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）菌種、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌種、パンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）菌種）、昆虫細胞（例えば、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）菌種）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞）、植物細胞からなるグループから選択される。
【００１４】
本発明の追加の態様に従って、賦形剤または担体を含む、本発明に従ったポリペプチドを含む医薬品組成物が提供される。
本発明の好ましい実施形態では、前記医薬品組成物は、追加の治療薬と組み合わされる。
本発明の医薬品組成物は、投与される際には、薬学的に許容可能な調製物で投与される。そのような調製物は、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、および任意選択で他の治療薬を常に含有していてもよい。
【００１５】
本発明の医薬品組成物は、注射を含む従来のどんな経路によっても投与することができる。投与および適用は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、関節内、皮下、局所的（眼）、皮膚（例えば、皮膚もしくは粘膜内へのクリーム脂質可溶性インサート）、経皮的、または鼻腔内でもよい。
本発明の医薬品組成物は、有効量で投与される。「有効量」とは、単独で、または追加の用量もしくは相乗薬と一緒に、目的の応答を生み出す量の医薬品／組成物である。これには、疾病の進行を一時的に遅くすることだけを含んでいてもよいが、さらに好ましくは、これは疾病の進行を永久に停止することを含む。これは、常法によりモニターすることができる、または診断法に従ってモニターすることができる。
【００１６】
対象に投与される医薬品組成物の用量は、異なったパラメータに従って、特に使用される投与方法および対象の状態（例えば、年齢、性別）に従って選択することができる。本発明の医薬品組成物は、投与される際に、薬学的に許容可能な量で、および薬学的に許容可能な組成物で適用される。塩は、薬物中に使用される場合、薬学的に許容可能であるほうがよいが、非薬学的に許容可能な塩を都合よく使用して、その薬学的に許容可能な塩を調製してもよく、本発明の範囲から除外されることはない。そのような薬理学および薬学的に許容可能な塩には、以下の酸、すなわち、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、等から調製された塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その上、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属として調製することができる。
【００１７】
医薬品組成物は、必要であれば、薬学的に許容可能な担体と組み合わせてもよい。本明細書で使用する用語「薬学的に許容可能な担体」とは、ヒトへの投与に適した１つまたは複数の適合性固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質を意味する。用語「担体」は、天然であれ合成であれ、適用を促進するために活性成分が組み合わされる有機または無機成分を示す。医薬品組成物の成分は、目的の薬剤効果を実質的に損なうと考えられる相互作用がないような形で、本発明の分子とおよび互いに混合することもできる。
医薬品組成物は、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸を含む適切な緩衝剤を含有していてもよい。
医薬品組成物は、任意選択で、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールなどの適切な保存剤を含有していてもよい。
【００１８】
医薬品組成物は、都合よく単位用量形で提示してもよく、薬学の技術分野で公知の方法のうちいずれによって調製してもよい。すべての方法が、活性薬剤を１つまたは複数の付属成分を構成する担体と会合させる段階を含む。一般に、組成物は、均一に密接に活性化合物を液体担体、微粉化固体担体、または両方と会合させ、次に必要であれば、製品を成形することにより、調製される。
経口投与に適した組成物は、それぞれが所定量の活性化合物を含有する、カプセル、錠剤、トローチ剤などの個別の単位として提示してもよい。他の組成物には、シロップ、エリキシル剤または乳剤などの水性液体または非水性液体中の懸濁剤が挙げられる。
【００１９】
非経口投与に適した組成物は、好ましくはレシピエントの血液と等張性の無菌水性または非水性調製物を都合よく含む。この調製物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用した公知の方法に従って製剤してもよい。無菌注射用調製物は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒性非経口的に許容可能な希釈液または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液でもよい。用いてもよい許容可能な溶媒には、水、リンゲル液、および等張食塩水がある。さらに、無菌固定油は、溶媒または懸濁化剤として都合よく用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含むどんな無菌固定油を用いてもよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製に使用してもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内等の投与に適した担体の製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに見ることができる。
【００２０】
本発明の追加の態様に従って、本発明に従った有効量の少なくとも１つのポリペプチドを投与することを含む、成長ホルモン欠損症を患ったヒト対象を治療する方法が提供される。
本発明の好ましい方法では、前記ポリペプチドは静脈内に投与される。
本発明の別の好ましい方法では、前記ポリペプチドは皮下に投与される。
本発明の追加の好ましい方法では、前記ポリペプチドは２日間隔を置いて投与され、好ましくは、前記ポリペプチドは１週間間隔で、２週間間隔でまたは１月間隔で投与される。
【００２１】
本発明の好ましい方法では、前記成長ホルモン欠損症は小児期成長ホルモン欠損症である。
本発明の好ましい方法では、前記成長ホルモン欠損症は成人成長ホルモン欠損症である。
成長ホルモン欠損症の治療には、例えば、ターナー症候群、プラダーウィリー症候群、子宮内発育遅延、突発性低身長、腎不全、例えば、化学療法治療中およびエイズの治療における異化状態の治療が挙げられる。
【００２２】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および前記単語の変形、例えば、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むが、限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、成分、整数または段階を除外することを意図してはいない（および除外しない）。
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通して、単数形は、文脈が他の方法で要求しなければ、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されているところでは、本明細書は、文脈が他の方法で要求しなければ、単一性だけではなく複数存在することも企図していると理解されるべきである。
【００２３】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と併せて記載されている特色、整数、特徴、化合物、化学的部分もしくは基は、それと不適合でなければ、本明細書に記載する他のどんな態様、実施形態または実施例にも適用できると理解されるべきである。
本発明の実施形態は、これから、実施例のみにより、以下の図を参照して本発明の実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】公表されている構造２７（ｐｄｂ３ＨＨＲ）に基づいて、ＧＨ、ＧＨ結合タンパク質（ＧＨＢＰ）、ＬＲ融合およびＧＨＲ間の関係の概略図である。（ａ）１対１複合体においてＧＨがＧＨＢＰに結合している天然の立体構造。（ｂ）ＧＨは、ＧＨＢＰ複合体から放出されて、細胞表面ＧＨ受容体に結合する。（ｃ）ＧＨがｅｘＧＨＲに連結されて、単量体の形のＬＲ融合分子が形成される。（ｄ）１分子中のＧＨがもう１つの分子中のｅｘＧＨＲに結合している相互ヘッドトゥーテール二量体を形成するＬＲ融合体のモデル。最後に、（ｅ）では、単量体の形のＬＲ融合体は、ＧＨ受容体に結合し活性化することができる。
【図２】ＬＲ融合体の特徴づけおよび生物活性を示す図である。（ａ）は、ＬＲ融合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離に続くクーマシー染色（ＣＳ）およびＧＨ特異的抗体を使用したウェスタンブロッティング（ＷＢ）を示している。ＬＲ融合体はほぼ７５ｋＤａで、分離して別々にほぼ５ｋＤａの２つのバンドとなる。（ｂ）は、ＬＲ融合体が未変性ＰＡＧＥにより分離されて、２つのタンパク質型、すなわちファースト（Ｆ）とスロー（Ｓ）があることを示している。（Ｃ）未変性ＰＡＧＥから個々のバンド（ＦおよびＳ）を切り出し、還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによりさらに分離し、続いてＧＨ特異的抗体を使用したウェスタンブロッティングにかけた。両方のバンド（ＦおよびＳ）はほぼ７５ｋＤａに移動し、以前示されたダブレットとして分離する。これにより、未変性ＰＡＧＥにより観察された２つの別々のバンドは両方とも７５ｋＤａ  ＬＲ融合体で構成されており、自然条件下では単量体と二量体として平衡状態で存在している可能性があることが示唆される。（ｄ）は、ゲルろ過に続くＬＲ融合体の溶出プロファイルを示している。２つの別々のピークに分かれているのは、ＬＲ融合体が溶液中では単量体と二量体として存在していることを再び示している。（ｅ）ＧＨとＬＲ融合体に対する細胞に基づいたＧＨＲシグナル伝達バイオアッセイ。ｙ軸は、Ｓｔａｔ５ルシフェラーゼレポーターアッセイから補正されたルシフェラーゼの誘導倍率を示している。ＧＨの標準曲線は、０、０．２５、０．５、１．０、２．０および５ｎＭの範囲であり、ＬＲ融合体標準曲線は、０．１、２、５、１０、２５、５０、１００および２５０ｎＭの範囲である。ＧＨの最大応答は５ｎＭで達成され、ＬＲ融合体の最大応答は５０〜２５０ｎＭを必要とする。
【図３】皮下（ｓｃ）および静脈内（ｉｖ）投与後に測定されたＧＨおよびＬＲ融合体のプロファイルを示す図である。（ａ）はｓｃ投与後の初期段階（５時間）を示しており、（ｂ）はｉｖ後の後期段階（８日間）を示しており、（ｃ）はｓｃ投与後の後期段階を示している。
【図４】ＧＨおよびＬＲ融合体を使用した皮下治療後の体重変化を示す図である。（ａ）は連日ＧＨ対プラセボ（媒体のみ）後、（ｂ）は隔日注射、（ｃ）は１日目と５日目の２回注射、（ｄ）は１日目の単回注射、（ｅ）は異なった治療計画後の体重変化の概要を示している。＊＊＊＝ｐ＜０．０００１ＧＨ対ＬＲ融合体
【図５】１Ｂ７ｖ０、１Ｂ７ｖ１、１Ｂ７ｖ２、および１Ｂ７ｖ３のインビボ活性を示す図である。
【図６】ラット投与１Ｂ７ｖ０、１Ｂ７ｖ１、１Ｂ７ｖ２、および１Ｂ７ｖ３における体重増加を示す経時変化を示す図である。
【図７】皮下投与後の１Ｂ７ｖ０、１Ｂ７ｖ１、１Ｂ７ｖ２、および１Ｂ７ｖ３の薬物動態を示す図である。
【図８】静脈内投与後の１Ｂ７ｖ０、１Ｂ７ｖ１、１Ｂ７ｖ２、および１Ｂ７ｖ３の薬物動態を示す図である。
【図９】アカゲザルにおける１ｍｇ／ｋｇの連続ｓ／ｃ投薬に続く１Ｂ７ｖ２および１Ｂ７ｖ３に対する薬物動態プロファイルを示す図である。赤色点線は、ヒト成長ホルモンの最小有効濃度を示している。
【図１０】表１は、下垂体摘出ラットにおけるＧＨまたはＬＲ融合体を使用した１０日間治療後の結果（平均±標準誤差）を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
材料および方法
動物およびヒト試料の使用。ヒト試料の使用は、地元の倫理委員会により承認され、患者がインフォームドコンセントを与えた。実験はすべて、実験または他の科学的目的のために使用される動物保護に関するフランスの法律（１９８６年１１月２４日の議会指令Ｎ°８６／６０９／ＥＥＣ）に従って行われた。
材料。材料は、他の方法で述べられていなければ、すべてＳｉｇｍａ（Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）から購入した。組換えＧＨはＰｆｉｚｅｒから購入し、結合アッセイにおいて使用される組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来ヒトＧＨ結合タンパク質はＤＳＬ（ＤＳＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）より贈与され、ヨウ素化ＧＨはＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ  Ｐａｒｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）より贈与された。精製および特徴づけに使用されたＧＨおよびＧＨＲ  ｍＡｂは、Ｓｋｒｉｖｅｒ博士（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ  Ｐａｒｋ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から贈与されたｍＡｂｓ  Ｂ０７ｂおよびＢ２４ａならびにｍＡｂ２６３（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）以外は自家材料（ＣＳ）であった。
【００２６】
ＧＨ−ｅｘＧＨＲ  ＬＲ融合体の精製。ヒトＧＨおよびＧＨ受容体は、それぞれヒト下垂体および肝臓からＲＴ−ＰＣＲにより増幅され、ヒトＧＨ分泌シグナル配列下のベクター、ｐＳｅｃ  Ｔａｇ−Ｖ５／ＦＲＴ／Ｈｉｓｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）にクローン化された。Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーの４つのリピートを使用して、ヒトＧＨの天然のＣ末端をヒトＧＨＲの天然のＮ末端に連結した。ＣＨＯ  Ｆｌｐ−Ｉｎ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）中に安定なクローンが作製され、タンパク質無添加培地に適応され、懸濁培養で増殖された。ＬＲ融合体発現は、自家ＥＬＩＳＡにより確認された。親和性精製はＧＨ  ｍＡｂカラムを使用して実施された。
転写バイオアッセイ。これらは、ヒトＧＨＲを安定的に発現しているヒト２９３細胞において前述の通りに実施された１６。
【００２７】
ＥＬＩＳＡ。自家ＧＨおよびＬＲ融合体ＥＬＩＳＡは、サンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットに基づいて確立されている。アッセイでは、標準物質（ＧＨまたはＬＲ融合体）、対照および未知物質が、ヒトＧＨ抗体（ｍＡｂ  １０Ａ７）に対するマウス抗体でプレコートされたウェル中でヒトＧＨ（ｍＡｂ  ７Ｆ８）に対するビオチン標識マウス抗体と一緒にインキュベートされる。アッセイの検出限界は２．５ｐｇであり、イントラおよびインターアッセイＣＶは＜１０％である。ＩＧＦ−Ｉ  ＥＬＩＳＡはＤＳＬ（ＤＳＬ−１０−２９００  ＡＣＴＩＶＥマウス／ラット  ＩＧＦ−Ｉキット、ＤＳＬ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｅ、ＵＫ）から購入した。
【００２８】
薬物動態研究。Ｊａｎｖｉｅｒ（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ  Ｓａｉｎｔ  Ｉｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）製の生後７週間の正常スプラーグドーリーラットを薬物動態研究のために使用した。Ｓｃまたはｉｖ投与（陰茎静脈）および血液回収（眼窩洞）を、イソフルラン麻酔下で行った。ラット（ｎ＝４〜６／グループ）には、０．１ｍｇ／ｋｇのｒｈＧＨまたはＬＲ融合体をｉｖまたはｓｃに注射した。血液試料は後眼窩神経叢から採取した。血清を回収し、アッセイまで−７０℃で貯蔵した。薬物動態パラメータは、非線形最小二乗回帰分析を使用して、ホルモン濃度対時間の値をコンパートメントモデルにフィットさせることにより評価した。クリアランス値は、動物体重に規準化した。動物体重あたりのクリアランス速度および終末期半減期（ｔ１／２）は、ｉｖボーラスモデルフィットから得られる係数および指数を使用して計算した。
【００２９】
霊長類薬物動態研究
被検物質１Ｂ７ｖ２および１Ｂ７ｖ３は、１１．９ｍＭリン酸ナトリウムとカリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム、０．０１％ポリソルベート８０を含有する溶液中で製剤し、溶液のｐＨは７．４に調整した。
研究デザイン
動物は４つの治療グループ（１媒体、１つの１Ｂ７ｖ２試験グループ、１つの１Ｂ７ｖ３試験グループ）に割り当て、媒体グループには３匹のオス、２つの治療グループにはグループあたり４匹のオスを含む。服用レベルおよび投与される容量は、下の表に概要を述べた通りであった。
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【００３０】
血液試料は、血清中の適切な検査物質の濃度を決定するために、研究中ずっとすべての動物から入手した。これらの試料は研究中のいくつかの時点で採取した。
臨床評価項目および測定
１Ｂ７ｖ２および１Ｂ７ｖ３の血清濃度は有効なＥＬＩＳＡ法を使用して決定された。それぞれのタンパク質の薬物動態プロファイルは、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ（ｖ４．０．１）ソフトウェアを使用して、血清中のそれぞれのタンパク質濃度対時間をプロットすることにより決定した。
【００３１】
成長研究。成長研究は下垂体摘出ラットを使用し、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）製のスプラーグドーリーラットで実施された。ラットは生後４週間目にイソフルラン麻酔下で育種者により下垂体摘出され、手術が成功したことを判断する体重基準に基づく選別の１週間後に配送された。動物は個別に檻に入れられ、実験段階に入る前にもう１週間休息を与えられた。賦形剤、ｒｈＧＨおよびＬＲ融合体の注射液は２ｍｌ／ｋｇを超えることは決してなかった。ラットは毎日体重を量り、投与プロトコルにより、１０日間検査物質の注射を受けた。
【００３２】
ＬＲ融合体の特徴づけ。ＬＲ融合体の立体構造は、１６の立体構造的感受性ｈＧＨ受容体ｍＡｂのパネルを使用して調べた。変性、未変性ゲルおよびウェスタンブロッティングを使用して、ＬＲ融合体を分析し、ウェスタンブロッティングはＧＨに非立体構造的感受性を利用して実施した。溶液中のＬＲ融合タンパク質の形は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  Ｇ２００分析カラムと分析超遠心分離を使用して、ゲルろ過により規定した。分析超遠心分離（ＡＵＣ）は、沈降速度により実施した（解析サービス、Ｄｒ  Ａｎｄｙ  Ｂａｒｒｙ、Ａｓｔｂｕｒｙ、Ｌｅｅｄｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ）。
統計。２つのグループは、その分散が正常に分布している場合は、スチューデント検定と比較し、正常に分布していない場合は、スチューデントサタースウェイト検定により比較した。分布はＦ検定で試験した。一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して、３つ以上のグループの平均値を比較し、有意性のレベルがｐ＜０．０５の場合には、個々の比較はダネット検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）で実施した。統計検定はすべて、５％レベルの有意性で両側性であり、欠測値のためのインピュテーションは行わなかった。
【実施例】
【００３３】
ＬＲ融合体の設計および特徴づけ
可動性（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４リンカーを介してＧＨＲ細胞外ドメイン（ｅｘＧＨＲ１〜２３８）のＡ＆Ｂドメインに連結されたヒトＧＨをコードする組換え遺伝子を作製した（図１ｃ）。このＬＲ融合体はＣＨＯ細胞で発現され、ＧＨアフィニティーメディアに対するｍＡｂを使用して、＞９５％純度まで精製された（図２ａ）。ＬＲ融合体は１６の立体構造的感受性ｍＡｂを使用してＥＬＩＳＡによりスクリーニングされた。これらのｍＡｂはすべて、ヒト血清由来ＧＨＢＰに対する親和性に匹敵する親和性でＬＲ融合体に結合した。クーマシー染色およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロッティングにより、ＬＲ融合タンパク質が、２つのバンド間でほぼ５ｋＤａ差のあるほぼ７５ｋＤａのダブレットとして分離することが明らかになった。未変性ＰＡＧＥゲル分析（図２ｂ）は、凝集の証拠を何も示さなかった。ＬＲ融合体は、２つの別々の形として現れた。これらの別々のタンパク質形、すなわちファースト（Ｆ）とスロー（Ｓ）を未変性ＰＡＧＥゲルから切り出し、次に還元状態下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより再分析した。未変性ＰＡＧＥからのＦ形とＳ形の両方が７５ｋＤａダブレットからなっていた（図２ｃ）。溶液中に２種類の形のＬＲ融合体が存在する証拠は、分析ゲルろ過により裏付けられた（図２ｄ）。これらの結果は、溶液中に二量体として存在するＬＲ融合体と一致している。これは、単量体の大きさが７５ｋＤａで確認された分析超遠心分離により確認された。
【００３４】
インビトロバイオアッセイおよび薬物動態
ＬＲ融合体のインビトロ生物活性は、ＧＨ特異的ルシフェラーゼレポーターアッセイ１６を使用して試験した。ＬＲ融合体は、この静的アッセイ法ではＧＨと比べた生物活性のほぼ１０％を有していたが、ＬＲ融合体は、ＧＨよりも高濃度ではあるが最大応答を刺激することができた（図２ｅ）。ＬＲ融合体の薬物動態プロファイルは、単回皮下（ｓｃ）または静脈内（ｉｖ）注射後、正常ラットで調べた（図３）。実証されたＬＲ融合体は、投与経路に関係なくクリアランスを遅らせ、ｓｃ投与後の吸収を遅らせた。ｉｖボーラス後、ＬＲ融合体の終末期半減期は２１±２時間であり、クリアランスは３．３±０．９ｍｌ・時間−１・ｋｇ−１であった。ＬＲ融合体のクリアランスはＧＨの３００分の１の速さであった２、１２。単回ｓｃ投与後、ＬＲ融合体は、ＧＨと比べてピークが遅れていた（３０対１時間）。ＬＲ融合体は、それでも８日目に検出可能であり、ＧＨは６時間目に検出不可能であった。ＬＲ融合体の並はずれた薬物動態が大きさと関係しているのかどうかを調べた。同一リンカーを有する２つの変異ＬＲ融合分子、すなわち、１つはＢドメインｅｘＧＨＲのみへのＧＨのＬＲ融合体（５５ｋＤａ）およびもう１つはｅｘＧＨＲに連結した直列（ＧＨに連結したＧＨ）（１００ｋＤａ）を試験した。５５ｋＤａと１００ｋＤａタンパク質の両方が、最初の７５ｋＤａＬＲ融合体と比べると、バイオアッセイにおいて増加したアゴニスト活性を示したが、両方で循環半減期はｉｖ投与後は＜４時間であった（使用された試料採取プロトコルがもっと長い半減期を予想していたために、正確な半減期決定は可能ではなかった）。結果によれば、最初の７５ｋＤａＬＲ融合体の並はずれた薬物動態は分子量と関係しているだけではなかったことが確認されている。
【００３５】
ｔ−０およびｔ−３３６時間（１４日）目における１ｍｇ／ｋｇの２回順次ｓ／ｃ用量に続く１Ｂ７ｖ２および１Ｂ７ｖ３に対する霊長類研究の薬物動態プロファイルは図９に示されている。＜１時間の半減期を有する天然ヒト成長ホルモンと比べて、前記レベルは急速に最大値に到達し、かなり長時間かけて減少することに注目することができる。順次投薬の持続期間にわたり点線により明示されるように、前記レベルは最小有効濃度を優に上回って維持されてもいる。
【００３６】
ＧＨに対するＬＲ融合体成長促進の優位性
生物活性を試験するために、ＬＲ融合体とＧＨを下垂体摘出（ＧＨ欠損）ラットに投与した。ＧＨの連日投与により、１０日にわたる連続成長が誘導された。次に、ＬＲ融合体を、隔日ｓｃ注射、または１０日にわたる２回注射、または単回注射のいずれかでＧＨと比較した。すべての実験で、等モル用量のＧＨとＬＲ融合体を使用し、同一総量を１０日の期間にわたり与え、２２０μｇ／ｋｇ／日で、最大成長応答を得るために以前使用された用量に類似する１０日にわたりほぼ１０ｎモルであった１２。ＬＲ融合体は、同一注射プロトコル下でＧＨよりも大きく、連日ＧＨ注射後に見られる増加に類似する体重増加を促進した（図４および表）。ＧＨは、注射後２４時間で体重増加を促進するだけと思われた。これとは対照的に、ＬＲ融合体は、単回注射として与えられるときでも、１０日にわたり連続体重増加をもたらした。類似の成長パターンは、大腿骨、脛骨、胸腺、肝臓および腎臓で見られた（表）。すべての動物からの１０日終末期出血は、ＧＨ依存バイオマーカー、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ならびにＧＨおよびＬＲ融合体レベルについて分析された（表）。ＩＧＦ−１レベルは、単回注射後でもＬＲ融合体投与後有意に上昇し、ＧＨの連日注射後に見られるレベルよりも有意に大きかった。ＧＨのレベルは全注射計画後に終末期出血では検出不可能であり、ＬＲ融合体レベルは単回注射の１０日後検出可能であった。
【００３７】
ＧＨのＬＲ融合体はタンパク質アゴニストを産生することを実証した。前記分子がヘッドトゥーテール相互二量体（図１ｄ）を形成する能力は、その増強されたインビボ生物活性の原因であることを提唱する。
ＬＲ融合体の設計は、ＧＨＲの既知の結晶構造に基づいていた１７。４繰り返しを有する可動性Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー（８０Åの予想される長さ）を使用した。この長いリンカーは、ＧＨ部分がそれでも細胞表面ＧＨＲと相互作用することができるように、ＧＨとＧＨＲ間の比較的可動性のテザーとして選んだ（図１ｅ）。類似のＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーは、安定性と免疫原性の欠如のせいで、組換え単鎖Ｆｖ抗体産生において使用されたことがあった１８。
【００３８】
ＬＲ融合体は適切に折り畳まれ、２つの別々の種、すなわち、潜在的に単量体と二量体として、未変性ＰＡＧＥゲル上にもゲルろ過中にも現れた。二量体の存在は、分析超遠心分離により確認された。ＬＲ融合体は、それぞれのＬＲ融合分子中のＧＨ部分がもう一方の受容体部分に分子間結合することを通じて相互ヘッドトゥーテール二量体を形成することを提唱する（図１ｄ）。ＬＲ融合体は、おそらくグリコシル化のせいで５ｋＤａの分子量差があって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に２つのバンドとして現れた１９、２０。
ＬＲ融合体はＧＨと比べるとインビボではより強力であったが、インビトロでは生物活性が１０分の１であった。この矛盾は、ＬＲ融合体の二量体化のせいだと考えられる。静的インビトロバイオアッセイでは、ダイマーは、天然ＧＨ／ＧＨＢＰ複合体に見られるように生物学的に不活性だと考えられる２１、２１。しかし、インビボでは、二量体は、生物学的に活性な単量体と平衡状態で不活性ホルモンの貯蔵場所を提供する。
【００３９】
ラットへのｉｖ投与後、本発明者らのＬＲ融合体は、ＧＨと比べるとクリアランスは３００分の１に減少し、ＧＨ／ＧＨＢＰ複合体またはコンジュゲートについて以前報告されたクリアランスと比べると１０〜３０分の１に減少していた１１、１２。他の２つのＬＲ融合変異体、１つは５５ｋＤａ、もう１つは１００ｋＤａを試験した。どちらのタンパク質も同一の遅延クリアランスを示さなかった。したがって、ＬＲ融合体の遅延クリアランスの原因となるのは単量体のサイズだけではないと結論づけられる。ＧＨクリアランスに対する腎臓寄与は、ヒトで２５〜５３％２３、ラットで６７％２４であると推定されている。したがって、腎クリアランスを減らすだけでは、ＧＨクリアランスをほぼ半分にするとしか予想することはできない２。ＧＨクリアランスはＧＨ受容体機序とは比較的無関係なので２５、タンパク質分解が主要な一因であると推定される。本発明者らのＬＲ融合体の大きく減少するクリアランスは、腎クリアランスの減少とタンパク質分解を妨げる立体構造の両方に起因しうることを提唱する。
【００４０】
下垂体摘出ラットでは、１０日間に１度だけ与えられた本発明者らのＬＲ融合体は、ＧＨの連日注射に関して見られた体重増加に類似する体重増加をもたらした。ＧＨとの１対１モルの複合体として同時投与されたＧＨＢＰは成長を増強することはすでに明らかにされている１２。同一プロトコルを使用して、本発明者らのＬＲ融合タンパク質は単回注射後１０日にわたり成長を促進し、ＧＨ／ＧＨＢＰ複合体は連日注射を必要とし、本発明者らのＬＲ融合体は、ＧＨ／ＧＨＢＰ同時投与後に見られるレベルよりも高いＩＧＦ−Ｉレベルを生み出した。ＧＨは、ＧＨＢＰにコンジュゲートされると生物学的に不活性であり、非共有結合された複合体はＬＲ融合体の安定性を欠いている１１、１２。ＬＲ融合体の生物学的作用がより大きいのは、その増加した安定性およびＧＨＲを単量体の形で活性化する能力と関係がある可能性がある。
【００４１】
ヒトでは、ＩＧＦ−Ｉレベルは通常、ＧＨ活性の優れたバイオマーカーである。しかし、下垂体摘出ラットでは、ＩＧＦ−Ｉレベルは必ずしもＧＨに対する成長応答を反映していない２、１２。ＬＲ融合体投与により、ＧＨ注射と比べてＩＧＦ−Ｉレベルは明らかに上昇した。成長のＧＨとＩＧＦ−Ｉの用量反応は下垂体摘出ラットでは異なることを示唆する。したがって、本研究で使用されたＬＲ融合体の用量は、最大成長応答を促進するのに必要な用量を上回っていたが、それでもＩＧＦ−Ｉ産生を刺激することができた。ラットは、ヒトよりも迅速な腎クリアランスを示しており、ヒトにおいて必要とされる投与計画を予想するのが困難になっている。ＬＲ融合体はＧＨよりも低い用量で、はるかに少ない頻度で使用することができると期待してもよいであろう。
【００４２】
これまでは、サイトカインホルモンと血清アルブミンの融合物とペグ化を使用して、循環半減期を延長してきた２、２６。本発明者らのＬＲ融合分子は、これらの２つのアプローチよりも大きな利点を有している。ペグ化は、タンパク質のクリアランスを遅延するのに高度に効果的であるが、化学修飾を必要とし、その受容体に対するリガンドの親和性を減少させる２。したがって、ペグ化ではより大きな用量が必要とされるが、本発明者らのＬＲ融合体では、類似の用量で天然ＧＨよりも大きな効果がある。卵白とのＧＨ融合体、Ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎに関しては、これは臨床研究から引き揚げられたと理解されているので、比較的わずかなことしか知られていない。１つのＰＫ研究では２６、Ａｌｂｕｔｒｏｐｉｎは、ＧＨと比べると、ｓ．ｃ．に与えられた場合、終末期半減期の長さが６倍になっていたが、本発明者らのＬＲ融合タンパク質は、ＧＨについて公表された値と比べて、ｉ．ｖに与えると終末期半減期の長さが１００倍になる１２（天然ヒトＧＨでは、１８．６ｍｌ／分、ｋｇのクリアランス値＝１１１６ｍｌ／時間、ｋｇおよびＶｄ＝３３６ｍｌ／ｋｇであり、したがって、Ｔ１／２＝０．６９３×３３６／１１１６＝０．２１時間）。ＧＨは循環ｅｘＧＨＲに自然に結合し、したがって、本発明者らのＬＲ融合体は、他のタンパク質との融合体と比べると、免疫原性である可能性はなく、広範囲なインシリコＴ細胞エピトープスクリーニングでは、ＬＲ融合分子中に部位は明らかにならなかった（データは示していない）。
【００４３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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