(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）ｂ）ｃ）からなるステップを含む大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法。
ａ）非ヒト動物を提供するステップ
ｂ）前記動物の動脈血圧を上昇させるステップ
ｃ）前記動物の形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）活性を阻害するステップ
【請求項２】
前記ステップｃ）においてＴＧＦ−βのアンタゴニストを使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンタゴニストが抗ＴＧＦ−β中和抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップｃ）においてＴＧＦ−β遺伝子発現の活性化が阻害される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下のａ）ｂ）ｃ）からなるステップを含む大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法。
ａ）非ヒト動物を提供するステップ
ｂ）前記動物の動脈血圧を上昇させるステップ
ｃ）前記動物のＴｒｅｇ細胞の数または活性を低下させるステップ
【請求項６】
前記動物がＣＤ２８、ＣＣＲ７、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、Ｂ７、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＩＣＯＳおよびＣＣＬ１からなる群より選択される遺伝子を欠損している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップｃ）においてＴｒｅｇ細胞が除去されている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記非ヒト動物がマウスである、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記動物が、アンジオテンシンＩＩ、カテコールアミン、エンドセリン１、アルドステロンおよび酢酸デソキソコルチコステロンからなる群より選択される化合物の連続的な量を投与される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の方法により得ることができる非ヒト動物モデル。
【請求項１１】
動脈瘤の治療または予防のためのＴｒｅｇ細胞を含む細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大動脈瘤の診断と治療についての知見を提供することができる大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法に関する。さらに本発明は、動脈瘤の治療または予防が必要な対象における動脈瘤の治療または予防のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
大動脈瘤は、血管壁の部分的脆弱化と拡張によって特徴付けられる慢性変性疾患である
。
【０００３】
大動脈瘤は一般に、その解剖学的部位に従って分類される。胸部大動脈瘤（ＴＡＡ）は上行大動脈、弓部または下行大動脈が関与する。上行胸部大動脈の動脈瘤は、嚢胞性中膜変性に起因することが最も多く、組織学的には平滑筋細胞の脱落や弾性線維の変性として現れる。中膜変性は動脈壁の脆弱化を引き起こし、これが次に大動脈拡張と動脈瘤形成をもたらす。嚢胞性中膜変性は通常、加齢とともにある程度発生するが、その過程は高血圧によって加速される（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ  ＥＭ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００５；１１１：８１６〜８２８に総説がある）。人に大動脈壁内層の異常を生じやすくする条件は数多く存在しており、高血圧、マルファン病、エーラス・ダンロス症候群、結合組織病、ターナー症候群、二尖大動脈弁、家族性胸部大動脈瘤症候群、および胎児発生期に開始する心臓発生の異常などが含まれる。カテーテル挿入、外傷または手術の後に誤って解離も発生しうる。腹部大動脈瘤（ＡＡＡ）は腹腔内の大動脈部分に影響を及ぼす。ＡＡＡは胸部大動脈瘤よりもはるかに一般的である。加齢は重要な危険因子であり、腹部大動脈瘤の発生率は男性で５５歳、女性で７０歳を超えると急激に上昇する。最近の推定では、６５歳を超えた成人におけるＡＡＡ罹患率は４％から９％と示されている。ＡＡＡは局所大動脈壁および全身性アテローム性動脈硬化症と強く関連しているが、明確な因果関係は立証されていない（Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５およびＦａｘｏｎ  ＤＰ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４  Ｊｕｎ  １；１０９（２１）：２６１７〜２５にて概説）。疫学的因子には遺伝的感受性が含まれ、患者の１５％から２０％は家族歴を持つ。ＡＡＡは女性よりも男性においてはるかに一般的（２から５倍）であり、また黒人よりも白人において一般的である。喫煙はＡＡＡの主要な危険因子である。自然経過としては、動脈瘤は破裂の危険性が指数関数的に上昇する５．５ｃｍを超えるまでは徐々に拡大する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＷ、Ｇｅｒａｇｈｔｙ  ＰＪ、Ｌｅｅ  ＪＫ．Ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ａｏｒｔｉｃ  ａｎｅｕｒｙｓｍｓ：ｂａｓｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｂｌ  Ｓｕｒｇ．２００２；３９：１１０〜２３０）。最初の病態生理学的過程は、弾性線維およびＳＭＣの欠損を含めた、中膜の破壊を伴う慢性の貫壁性炎症である。インターロイキン−６などの炎症マーカーの上昇およびＭＭＰ９やエラスチンなどのプロテイナーゼの上昇は、ＡＡＡおよび拡張率と相関する。ドキシサイクリンはＭＭＰ活性を阻害し、実験動物におけるＡＡＡを減少させることができる。臨床試験によりドキシサイクリンによるＭＭＰ９レベルの低下が明らかにされたが、予備試験では拡張率の減少は認められなかった。ロキシスロマイシンなどの他の薬剤も同様に軽度な効果を示すことが明らかになっている。
【０００４】
現在、大動脈瘤に適用できる唯一の治療は、外科的な切除および置換、またはより近年では血管内ステントの挿入である。その後、患者は通常、高血圧を低下させるための長期間の薬剤治療を施される。
【０００５】
したがって、医師による大動脈瘤の予防または治療に寄与する新たな薬剤の提供が必要とされている。
【０００６】
さらに、大動脈瘤への対処における主要な問題は、多くの場合、動脈瘤がかなりの大きさになるまで、大動脈瘤の兆候が表面化しないことである。それゆえ、適時診断が、早期介入を想定し、生存の可能性を劇的に向上させるのに適している可能性がある。
【０００７】
しかし、いずれの場合においても、当該技術分野では、疾患の発生と治療における潜在的機序についての知見を提供するための大動脈瘤動物モデルの探索が恒久的に必要とされている。
【０００８】
遺伝的操作や化学的誘導など、疾患を生じさせるための様々な方法を使用した、いくつかの大動脈瘤マウスモデルが開発された（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｅ  Ｂｉｏｌ．２００４  Ｍａｒ；２４（３）：４２９〜３４）。それらのモデルは、中膜変性、炎症、血栓形成および破裂を含めて、ヒトの疾患が有するいくつかの面を再現している。遺伝的モデルには、細胞外マトリックス成熟異常、エラスチンおよびコラーゲン変性の増加、異常コレステロール恒常性、アンジオテンシンペプチド産生の増強が含まれる。化学的な手法としては、エラスターゼの管腔内注入、塩化カルシウムの大動脈周囲におけるインキュベーション、およびＡｎｇＩＩの皮下注入などがある。例えば、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  Ａ．ら（２０００）は、成熟ａｐｏＥ欠損マウスにアンジオテンシンＩＩを継続的に注入してマウスモデルを開発した。
【０００９】
しかし、当該技術分野においては、再現可能であり（例えば、ＡＩＩ／ＡｐｏＥ欠損マウスモデルにおけるＡＡＡ発生率は、Ｂａｂａｍｕｓｔａ  Ｆら  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．２００６  Ｊｕｎ；１８６（２）：２８２〜９０によると、１４％から６０％を超える範囲で変動した）、（エラスターゼや塩化カルシウムモデルとは異なり）動脈瘤を発達または発生させるのにいかなる外科的処置をも伴わない、信頼性のある大動脈瘤動物モデルの提供が未だ必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下のａ）ｂ）ｃ）からなるステップを含む大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法に関する。
【００１１】
ａ）非ヒト動物を提供するステップ
ｂ）前記動物の動脈血圧を上昇させるステップ
ｃ）前記動物の形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）活性を阻害するステップ
【００１２】
また本発明は、以下のａ）ｂ）ｃ）からなるステップを含む大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法に関する。
【００１３】
ａ）非ヒト動物を提供するステップ
ｂ）前記動物の動脈血圧を上昇させるステップ
ｃ）前記動物のＴｒｅｇ細胞の数または活性を低下させるステップ
【００１４】
また本発明は、動脈瘤の治療または予防のためのＴＧＦ−βまたはその変異体に関する。
【００１５】
また本発明は、動脈瘤の治療または予防のための、Ｔｒｅｇ細胞を含む細胞組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】アンジオテンシンＩＩを長期間注入したマウスにおける収縮期血圧の進展を示す図である。
【図２】生存率を示すグラフである。抗ＴＧＦ−β抗体で処置した通常マウスまたはＣＤ２８もしくはＢ７欠損マウスは、高血圧の通常Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスと比較して、有意に低い生存率（ｐ＜０．０１）を示したことに留意されたい。
【図３】アンジオテンシンＩＩ注入から１４日後に行った腹部大動脈の超音波測定により、アンジオテンシンＩＩ注入ＣＤ２８−／−マウスでは、ＣＤ２８＋／＋マウスと比較して、最大拡張動脈瘤径（ｍｍ）の増加が認められたことを示すグラフである。溶媒のみを注入した通常血圧のＣＤ２８＋／＋マウスおよびＣＤ２８−／−マウスの間では、動脈瘤径に差はなかった。
【図４】高血圧Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊマウスの腹部大動脈瘤の割合を示すグラフである。いずれの飼料中の塩化ナトリウム含有量でも、またいずれの用量で抗ＴＧＦ−β処置した動物においても、有意に高い腹部大動脈瘤の発生率を示したことに留意されたい（ＡｎｇＩＩ単独注入群に対してＰ＜０．０１）。
【図５】Ａ．ＡｎｇＩＩ灌流後のＣＤ２８ＫＯまたはＷＴマウスの代表的な大動脈の写真である。Ｂ．Ｔｒｅｇ欠損ＣＤ２８−／−およびＢ７−／−高血圧動物の腹部大動脈瘤の割合の増加を表す。ＣＤ２８ＫＯおよびＢ７ＫＯ（ＣＤ８０／ＣＤ８６欠損）マウスはいずれも、遺伝的背景が同一であるＣ５７Ｂｌ６／Ｊコントロールと比較して、ＡｎｇＩＩ注入時にＡＡＡ発生率上昇を示した（ｐ＜０．０１）。これらの２系統はＴｒｅｇを欠損しており、ＡＡＡ発生の予防におけるＴｒｅｇの重大な役割が示唆している。各ＰＢＳ群はｎ＝５。ＡｎｇＩＩ群はｎ＝１０〜１７。＊：ＷＴ＋ＡｎｇＩＩ処置マウスと比較してｐ＝０．０００４。
【図６】通常の高血圧Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊ（ａ：ＡｎｇＩＩで処置したＷＴマウスの通常の大動脈の例）およびＣＤ２８−／−高血圧マウス（ｂ：ＡｎｇＩＩで処置したＣＤ２８−／−マウスの拡張した大動脈の例）における、１４日目の腹部大動脈最大径を超音波評価した後の代表的なスクリーンキャプチャーである。後者の動物では、大動脈の内径および外径がより大きいことに留意されたい。（ｃ）抗ＴＧＦ−β抗体で処置した高血圧Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊにおける動脈壁破裂を伴う合併ＡＡＡの画像（ＡｎｇＩＩおよび抗ＴＧＦ−βで処置したマウスの破裂大動脈の例）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義：
用語「発現」は、遺伝子または核酸の発現という文脈で用いられる場合、遺伝子に含まれる情報の遺伝子産物への変換をいう。遺伝子産物は、遺伝子が直接転写された産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたはあらゆるタイプのＲＮＡ）であってもよく、ｍＲＮＡの翻訳により産生されるタンパク質であってもよい。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、編集などの処理により修飾されたメッセンジャーＲＮＡ、および例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、グリコシル化などの修飾を受けたタンパク質（例えば、ＴＧＦ−β）を包含する。
【００１８】
「発現阻害剤」は、遺伝子発現を阻害し、または顕著に低減させる生物学的効果を有する天然または合成の化合物をいう。
【００１９】
本明細書において「ＴＧＦ−β」は、他に特に指示がない限り、任意の１つまたは複数のＴＧＦ−βアイソフォームをいう。同様に用語「ＴＧＦ−β受容体」は、他に指示がない限り、少なくとも１つのＴＧＦ−βアイソフォームに結合し、またはそれに応答したシグナル伝達を行う任意の受容体をいう。現在、ＴＧＦ−βのアイソフォームは５種類知られており（１、２、３、４および５）、これらは全て相互に相同であり（６０〜８０％の同一性）、約２５ｋＤａのホモダイマーを形成し、共通のＴＧＦ−β受容体（Ｔ〔β〕Ｒ−Ｉ、Ｔ〔β〕Ｒ−ＩＩ、Ｔ〔β〕Ｒ−ＩＩＢおよびＴ〔β〕Ｒ−ＩＩＩ）に作用する。哺乳類では、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３が見出されている。ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−β受容体の構造的および機能的な特徴は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、２００１を参照）。ＴＧＦ−βは種間で顕著に保存されている。
【００２０】
用語「変異体」は、全体の構造および当該ポリペプチドの機能を変えることなく所定のアミノ酸残基が変化しているポリペプチドをいい、これに限定されるものではないが、１つのアミノ酸を類似の性質（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有する他のアミノ酸に置換したものが含まれる。類似の機能を有する任意の２つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似率は変化し、例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づくクラスター法などのアラインメント方式による決定では７０％から９９％の範囲になりうることから、保存アミノ酸として上に示された以外のアミノ酸に関してはタンパク質によって異なることもある。「機能保存変異体」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定されるアミノ酸同一性が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、なおより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％であり、かつ天然または親タンパク質と比較して同一である、または実質的に類似する性質または機能を有するポリペプチドを含む。アミノ酸が８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上同一である場合、またはおよそ９０％以上、好ましくは９５％以上類似する（機能的に同一である）場合、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」、または「実質的に類似」である。好ましくは、類似または相同配列は、例えばＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）の集積プログラムや、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡなどの任意の配列比較アルゴリズムを用いたアライメントで同定される。
【００２１】
用語「ＴＧＦ−β活性」は、ＴＧＦ−βが有する全ての生物学的効果を包含し、ＳＭＡＤ２／ＳＭＡＤ３の活性化や、ＳＭＡＤ４またはその他のＳＭＡＤ非依存的な効果（ＭＡＰＫの活性化など）を含む。
【００２２】
用語「阻害剤」「阻害する」「中和する」「拮抗する」およびこれらの同属語は、特定の反応や生物学的活性のアンタゴニストとして機能する化合物の能力をいう。量または生物学的活性の減少は、少なくともおよそ１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上であることが好ましい。この用語はまた、対象とする生物学的活性の原因となっている少なくとも１つのタンパク質（例えばＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β受容体）の相対的な量の減少をも意味する。
【００２３】
本明細書において「ＴＧＦ−βアンタゴニスト」は一般に、ＴＧＦ−βの生物学的活性を直接的に下方制御する任意の化合物をいう。ある分子がＴＧＦ−β遺伝子、ＴＧＦ−β転写産物、ＴＧＦ−βリガンドまたはＴＧＦ−β受容体と相互作用することでＴＧＦ−βの生物学的活性を下方制御する場合、その分子はＴＧＦ−βの生物学的活性を「直接的に下方制御」する。ＴＧＦ−βのアンタゴニストは、例えば、ＴＧＦ−βに結合してその活性を中和し、安定性または前駆体分子の活性を有する成熟型への変換に影響し、ＴＧＦ−βが１つまたは複数の受容体に結合するのに干渉し、またはＴＧＦ−β受容体の細胞内シグナリングに干渉しうる。ＴＧＦ−βアンタゴニストの生物学的活性の中和を評価する方法は当該技術分野で公知である。
【００２４】
用語「抗ＴＧＦ−β抗体」は、ＴＧＦ−βを認識する抗体またはその断片をいう。
【００２５】
本明細書において用語「Ｔ細胞」は、表現型マーカーと、ＴＣＲαの再構成を伴うまたは伴わないＴＣＲβ遺伝子座の再構成とを発現するリンパ球を含む。表現型マーカーはＣＤ４および／またはＣＤ８の発現を含む。
【００２６】
本明細書において用語「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」細胞は、細胞表面マーカーＣＤ４＋およびＣＤ２５＋を発現し、ウェスタンブロットで測定されるＦｏｘＰ３タンパク質および／またはＦｏｘＰ３  ｍＲＮＡ転写産物を発現する自然発生のＴ細胞や、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−β依存性の制御機能を有し、ｆｏｘｐ３を発現するまたは発現しない、Ｔｒ１またはＴＨ３様の表現型を有するＴ細胞をいう。
【００２７】
用語「Ｔｒｅｇ細胞除去剤」は、本明細書において、生物内のＴｒｅｇ細胞循環レベルを低減させる、または生物内のＴｒｅｇ細胞の活性を低減する、またはそれに干渉する任意の作用物質をいう。
【００２８】
動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法：
本発明の目的は、以下のａ）ｂ）ｃ）からなるステップを含む大動脈瘤非ヒトモデル動物の作出方法に関する。
【００２９】
ａ）非ヒト動物を提供するステップ
ｂ）前記動物の動脈血圧を上昇させるステップ
ｃ）前記動物の形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）活性を阻害するステップ
【００３０】
特定な実施形態において、ＴＧＦ−βの阻害は、ＴＧＦ−βアンタゴニストにより行われる。
【００３１】
さらに詳細には、ＴＧＦ−βのアンタゴニストは、低分子量の阻害剤、例えば有機小分子であってもよい。
【００３２】
あるいは、ＴＧＦ−βのアンタゴニストは、抗ＴＧＦ−β抗体または抗ＴＧＦ−β受容体抗体であってもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、ＴＧＦ−βとその受容体との結合を遮断する抗体である。この抗体は、少なくとも１つのＴＧＦ−βアイソフォームまたは少なくとも１つのＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメインに特異的に結合するようなものである。
【００３４】
ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体に対する抗体は、中でも例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスから選択される宿主動物に適した抗原またはエピトープを投与することで、公知の方法に従って産生することができる。抗体産生を増強するため、当該技術分野で知られている種々のアジュバントを用いることができる。本発明の実施に使用できる抗体はポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。
【００３５】
ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体に対するモノクローナル抗体は、継代培養細胞株による抗体分子産生を提供する任意の技法を用いて、調製および単離することができる。産生および単離方法は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）に当初記載されたハイブリドーマを用いる技法、ヒトＴｒｅｇ細胞と細胞ハイブリドーマを用いる技法（Ｃｏｔｅら、１９８３）、およびＥＢＶハイブリドーマを用いる技法（Ｃｏｌｅら、１９８５）を含むが、これらに限定されるものではない。あるいは、一本鎖抗体の産生について報告された方法（例えば米国特許第４，９４６，７７８号を参照）を、抗ＴＧＦ−βまたは抗ＴＧＦ−β受容体一本鎖抗体の産生に適用することができる。本発明の実施に有用であるＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の抗体はまた、抗ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の断片を含み、これには、完全な抗体分子をペプシン消化することで作り出すことができるＦ（ａｂ’）２断片や、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することで作り出すことができるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。あるいは、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体に対する所望の特異性を有する断片を迅速に同定できるように、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖの発現ライブラリーが構築されうる。
【００３６】
１つまたは複数のＴＧＦ−βアイソフォームに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の例としては、米国特許第５，５７１，７１４号や国際特許出願公開ＷＯ９７／１３８４４号、ＷＯ００／６６６３１号に記載されたものなどがある。
【００３７】
非限定的な例示的実施形態において、抗ＴＧＦ−β抗体は、ハイブリドーマ１Ｄ１１．１６（ＡＴＣＣ寄託指定番号９８４９、米国特許番号第５，５７１，７１４号、第５，７７２，９９８号および第５，７８３，１８５号にも記載）により産生されるマウスモノクローナル抗体１Ｄ１１であってよい。１Ｄ１１の重鎖可変領域配列は、アクセッション番号ＡＡＢ４６７８７に基づいて入手可能である。
【００３８】
抗ＴＧＦ−β抗体の別の例は、Ｌｕｃａｓ  Ｃ．ら（１９９０）に記載されたマウスモノクローナル抗体２Ｇ７であってよい。
【００３９】
１つまたは複数のＴＧＦ−β受容体アイソフォームに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の例としては、Ｇｏｒｅｌｉｋ  Ｌら（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２（１）：４６〜５３、米国特許第５，６９３，６０７号、米国特許第６，００１，９６９号、米国特許第６，００８，０１１号、米国特許第６，０１０，８７２号、ＷＯ９２／００３３０、ＷＯ９３／０９２２８、ＷＯ９５／１０６１０およびＷＯ９８／４８０２４に記載されたものなどを含む。
【００４０】
あるいは、ＴＧＦ−βアンタゴニストはＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体と親和性を有するアプタマーであってよい。
【００４１】
アプタマーは、分子認識の観点から抗体の代替物となる分子の一クラスである。アプタマーは、高い親和性および特異性を有し、実質的にあらゆる分類の対象分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．およびＧｏｌｄ  Ｌ．、１９９０に記載されている、ランダム配列ライブラリーの試験管内分子進化（ＳＥＬＥＸ）法によって単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、コンビナトリアルケミストリによるＤＮＡ合成により取得することができる。このライブラリーでは、個々の構成要素は、最終的には化学的に修飾され、独特の配列を有する直線状のオリゴマーである。この分類の分子についての可能な修飾、用途ならびに利点については、Ｊａｙａｓｅｎａ  Ｓ．Ｄ．、１９９９に総説がある。ペプチドアプタマーは、コンビナトリアルライブラリーからツーハイブリッド法（Ｃｏｌａｓら、１９９６）により選択されたＥ．ｃｏｌｉのチオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質により提示される、構造的に拘束された抗体可変領域からなる。
【００４２】
ＴＧＦ−βアンタゴニストの他の例としては、ドミナントネガティブおよび可溶性ＴＧＦ−β受容体、ＬＡＰ（ＷＯ９１／０８２９１）、ＬＡＰ関連ＴＧＦ−β（ＷＯ９４／０９８１２）、フェツイン（米国特許第５，８２１，２２７号）などのＴＧＦ−β結合性糖タンパク質／プロテオグリカン、デコリン、ビグリカン、フィブロモデュリン、ルミカンおよびエンドグリン（米国特許第５，５８３，１０３号、米国特許第５，６５４，２７０号、米国特許第５，７０５，６０９号、米国特許第５，７２６，１４９号、米国特許第５，８２４，６５５号、米国特許第５，８３０，８４７号、米国特許第６，０１５，６９３号、ＷＯ９１／０４７４８、ＷＯ９１／１０７２７、ＷＯ９３／０９８００、ＷＯ９４／１１０１８７）、マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５，５２０，９２６号）、プロラクチン（ＷＯ９７／４０８４８）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＷＯ９８／１７３０４）、植物、真菌および細菌の抽出物（ＥＰ８１３８７５、ＪＰ８１１９９８４、米国特許第５，６９３，６１０号）、ＳＭＡＤおよびＭＡＤ（ＥＰ８７４０４６、ＷＯ９７／３１０２０、ＷＯ９７／３８７２９、ＷＯ９８／０３６６３、ＷＯ９８／０７７３５、ＷＯ９８／０７８４９、ＷＯ９８／４５４６７、ＷＯ９８／５３０６８、ＷＯ９８／５５５１２、ＷＯ９８／５６９１３、ＷＯ９８／５３８３０、ＷＯ９９／５０２９６、ＷＯ９９／０１７６５、米国特許第５，８３４，２４８号、米国特許第５，８０７，７０８号、米国特許第５，９４８，６３９号、米国特許第６，８２４，９７１Ｂ１号、米国特許出願公開第２００５／１６４２９５（Ａ１）号）やＳｋｉおよびＳｎｏ（Ｓｔｒｏｓｃｈｅｉｎら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８６：７７１〜７７４）などのＴＧＦ−βシグナリングに関係するタンパク質、およびＴＧＦ−βの生物学的活性を直接的に阻害する能力を保持した上記で示した分子の任意の変異体、断片または誘導体などがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
特定の実施形態において、ＴＧＦ−βの阻害は、ＴＧＦ−β遺伝子発現の阻害剤またはＴＧＦ−β受容体遺伝子発現の阻害剤により行うことができる。
【００４４】
本発明で使用されるＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体遺伝子の発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づくものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子やアンチセンスＤＮＡ分子を含み、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体ｍＲＮＡに結合してタンパク質の翻訳を阻止し、またはｍＲＮＡの分解を促進することで、これらの翻訳を直接的に遮断するように働き、それにより細胞内のＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体のレベル、ひいては活性を低下させる。例えば、少なくともおよそ１５塩基の、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体をコードするｍＲＮＡ転写物配列の固有領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば従来のホスホジエステル技法により合成することができ、例えば静脈注射または注入により投与することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するアンチセンス技法を用いる方法は、当該技術分野において周知である（例えば米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号、第６，０４６，３２１号、および第５，９８１，７３２号を参照）。
【００４５】
小分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明に使用されるＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現阻害剤として機能することができる。ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現を特異的に阻害するように（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）、小分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）または小分子二本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物を対象または細胞と接触させることにより、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現を低減させることができる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、配列が公知の遺伝子に関する技術分野において周知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら（１９９９）、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１）、Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．（２００２）、ＭｃＭａｎｕｓ，ＭＴ．ら（２００２）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ．ら（２００２）、米国特許第６，５７３，０９９号および第６，５０６，５５９号、国際特許出願公開ＷＯ０１／３６６４６、ＷＯ９９／３２６１９およびＷＯ０１／６８８３６を参照）。
【００４６】
ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）も、本発明に使用されるＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現阻害剤として機能することができる。
【００４７】
リボザイムも、本発明に使用されるＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の発現阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断に触媒作用を及ぼすことができる酵素的なＲＮＡ分子である。リボザイムの作用メカニズムは、リボザイム分子の相補的な標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーションと、それに続くエンドヌクレアーゼによる切断を含む。したがって、ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体のｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼによる切断に特異的かつ効率的に触媒作用を及ぼすヘアピンまたはハンマーヘッドモチーフの改変リボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。任意の可能性のあるＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、標的分子をスキャンして、典型的には次の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位を探すことで、最初に同定することができる。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子領域に対応するおよそ１５から２０の間のリボヌクレオチドからなる短いＲＮＡ配列について、例えば２次構造などのオリゴヌクレオチド配列を不適にすると予測される構造的特徴を評価することができる。
【００４８】
ＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体の遺伝子発現阻害剤として有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムのいずれも、公知の方法で調製することができる。これらには、例えば固相ホスホアミダイト化学合成などの化学合成法が含まれる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、当該ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ転写により作り出すことができる。上記ＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んだ広範な種類のベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの様々な修飾は、細胞内での安定性および半減期を増大させる手段として、導入することができる。可能な修飾としては、分子の５’および／または３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加することや、オリゴヌクレオチド骨格内でのホスホジエステラーゼによる結合ではなくホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルを用いることなどがあるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイムはｉｎ  ｖｉｖｏで、単独で投与してもよく、ベクターと共に投与してもよい。最も広義の「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびリボザイム核酸の細胞、好ましくはＴＧＦ−βまたはＴＧＦ−β受容体を発現している細胞への移入を促進する能力を持つ任意の運搬手段である。好ましくは、前記ベクターは、ベクター不存在下で生じるであろう分解の程度と比べて、低い分解の程度で細胞に前記核酸を輸送する。一般的には、本発明に有用なベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組込みで操作されたウイルスまたは細菌由来の他の運搬手段を含むが、これらに限定されるものではない。ウイルスベクターは、好ましいタイプのベクターであり、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ−４０タイプウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタインバーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；レトロウイルスなどのＲＮＡウイルスなどのウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定されるものではない。名称が挙げられていないが当該技術分野で公知の他のベクターを容易に用いることができる。
【００５０】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が対象とする遺伝子で置換された非細胞変性真核細胞ウイルスに基づくものである。非細胞変性真核細胞ウイルスとしては、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）などがあり、これらの生活環にはウイルスゲノムＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、およびその後のプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組込みが含まれる。レトロウイルスはヒトの遺伝子治療試験用途で承認されている。最も有用なのは、複製欠損の（すなわち、所望のタンパク質を直接合成することができるが、感染性粒子は製造できない）レトロウイルスである。このような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高効率な遺伝子導入に一般的に利用される。複製欠損レトロウイルスを作製する標準的なプロトコール（プラスミド中に外来遺伝物質を組み込むステップ、パッケージング細胞株にプラスミドをトランスフェクトするステップ、パッケージング細胞株によって組換えレトロウイルスを作製するステップ、組織培養培地からウイルス粒子を回収するステップ、および標的細胞にウイルス粒子を感染させるステップを含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０およびＭｕｒｒｙ、１９９１にて提供されている。
【００５１】
特定の適用のための好ましいウイルスはアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、これらは遺伝子治療用途で既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。実際、１２の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られており、それぞれ異なる組織指向性を有する（Ｗｕ，Ｚ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１４：３１６〜２７）。組換えＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２から得られる（Ｃｈｏｉ，ＶＷ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５；７９：６８０１〜０７）。アデノ随伴ウイルスのタイプ１〜１２は複製欠損となるように設計することができ、幅広い範囲のタイプおよび種の細胞に感染する能力を有する（Ｗｕ，Ｚ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１４：３１６〜２７）。さらにアデノ随伴ウイルスは、熱や脂質溶媒への安定性、多様な系統の細胞への高い形質導入頻度、複数回の連続の形質導入を可能にする重複感染阻害の欠如などの利点を有する。報告されているように、アデノ随伴ウイルスは部位特異的に細胞内ＤＮＡに組み入れることができ、その結果、挿入変異の可能性とレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現のばらつきが最小限になる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルスの感染は、選択圧が存在しない場合、組織培養で１００を超える継代を行っても受け継がれており、これはアデノ随伴ウイルスのゲノム組込みは比較的安定な事象であることを意味している。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の方式でも機能することができる。
【００５２】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは当該技術分野で広範囲に報告されており、当業者に周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。ここ数年、プラスミドベクターは抗原をコードする遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。多くのウイルスベクターが持つのと同じような安全性に対する懸念がないため、プラスミドベクターはこの点において特に利点を有する。しかし、これらプラスミドは、宿主細胞適合性のあるプロモーターを有しており、プラスミド内に動作可能にコードされた遺伝子由来のペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣＩ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔなどがある。その他のプラスミドも当業者に周知である。さらに、制限酵素とライゲーション反応を用いて、特定のＤＮＡ断片を除去および付加するようにプラスミドを特注設計してもよい。プラスミドは、非経口、粘膜、局所の様々な経路から送達されうる。例えばＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下その他の経路により注入することができる。プラスミドはまた、鼻腔内への噴霧または滴下、直腸坐剤および経口により投与することもできる。プラスミドはまた、遺伝子銃を用いて、上皮または粘膜表面に投与することもできる。プラスミドは、水溶液状態、金粒子上の乾燥形態、または限定されるものではないがリポソーム、デンドリマー、コクリートおよび微小カプセル化を含めた別のＤＮＡ送達システムと組み合わせた形態で投与することができる。
【００５３】
好ましい実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはリボザイム核酸配列は、異種の制御領域、例えば異種プロモーターの調節下にある。
【００５４】
あるいは、当該動物は、ＴＧＦ−βを産生または活性化できないように１つまたは複数の遺伝子を欠損していてもよい。例えば、前記動物はＴＧＦ−βそのもの、ＴＧＦ−β受容体、ＴＧＦ−βシグナル分子（ＳＭＡＤ）、または例えばインテグリンα（ｖ）−β６もしくはα（ｖ）−β８もしくはＢＭＰ−７などの、ＴＧＦ−β活性の調節に関与することが知られている遺伝子からなる群より選択される遺伝子を欠損していてもよい。
【００５５】
欠損動物、特に欠損マウスは一般に市販されている。しかし、欠損動物やノックアウト動物を作出する方法は当該技術分野において周知である。例えば、標的変異を含むノックアウト動物は、例えばＪｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．（Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．１９９９、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＨｏｇａｎ，Ｂ．ら（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ．１９９４、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）の方法で記されたように、当該技術分野における定法に従って得ることができる。例えば上述の方法によるヘテロ接合性および／またはホモ接合性のノックアウト動物は、対象とする遺伝子の変異対立遺伝子を有する胚性幹（ＥＳ）細胞クローンを選択し、組換え胚性幹細胞クローンにおける標的変異を確認し、確認された組換え胚性幹細胞を野生型動物の胚盤胞に注入し、これら注入された胚盤胞を偽妊娠の仮母に移植し、胚盤胞から生じたキメラを野生型動物と交配し、これら交配により生じた仔について標的変異の存在を試験し、ホモ接合性ノックアウト動物を得るために任意にヘテロ動物を交配して、得ることができる。また、本発明の方法で使用することができる当該技術分野で用いられる胚性幹細胞には、例えばＣ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＤＢＡ／２、ＣＢＡ／およびＳＶ１２９などのマウス系統由来の胚性幹細胞が含まれる。好ましくはＣ５７ＢＬ／６マウス由来の胚性幹細胞が用いられる（Ｓｅｏｎｇ，Ｅら（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０、５９〜６２；Ｗｏｌｆｅｒ，Ｄ．Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５（２００２）：３３６〜３４０）。また欠損動物を作出する方法は、ＷＯ０３０３７０７４およびＵＳ２００７０５６０５２にも記載されている。
【００５６】
あるいは、標的遺伝子のノックアウトはＷＯ２００６０４８４６６またはＷＯ２００６０４８４６５に記載のとおり条件付きで行ってもよく、これによって所望の時に、かつ／または特定の組織もしくは細胞で発現を撹乱することができる。
【００５７】
ＴＧＦ−β阻害の効果の１つとして、制御性Ｔ細胞またはＴｒｅｇ細胞の機能損傷が確立されている（総説として、Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００６を参照）。事実、ＴＧＦ−βはＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞の発生と増殖を促進することができ（Ｙａｍａｇｉｗａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００１；Ｐｅｎｇら、ＰＮＡＳ、２００４）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞において制御性表現型を誘導することができる（Ｃｈｅｎら、Ｊ  Ｅｘｐｅｒ  Ｍｅｄ  ２００３；Ｆａｎｔｉｎｉら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００４）ことが示されている。
【００５８】
したがって、本発明のさらなる目的は、以下のａ）ｂ）ｃ）からなるステップを含む大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法に関する。
【００５９】
ａ）非ヒト動物を提供するステップ
ｂ）前記動物の動脈血圧を上昇させるステップ
ｃ）前記動物のＴｒｅｇ細胞の数または活性を低下させるステップ
【００６０】
特定の実施形態において、本発明は以下のａ）ｂ）ｃ）からなるステップを含む大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法に関する。
【００６１】
ａ）非ヒト動物を提供するステップ
ｂ）前記動物の動脈血圧を上昇させるステップ
ｃ）前記動物のＴｒｅｇ細胞の数または活性を低下させるステップであって、Ｔｒｅｇ細胞の数または活性の低下は前記動物において形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）の活性を阻害することで行われるステップ
【００６２】
典型的には、ＴＧＦ−βの活性阻害は上述された方法の任意の１つにより行うことができる。
【００６３】
特定の実施形態において、ステップｃ）においてＴｒｅｇ細胞除去剤が使用される。内因性Ｔｒｅｇ細胞の除去は、当該技術分野で知られた任意の方法によりもたらされる。Ｔｒｅｇ細胞除去剤は、ホルモン、成長因子、抗体、抗体断片、抗体模倣物および遺伝的または酵素的に操作されたそれらの対応物などが含まれる。
【００６４】
好ましくは、Ｔｒｅｇ細胞除去剤は、Ｔｒｅｇ細胞に関連した抗原または受容体を認識し結合する能力を有する。本発明において使用される好ましいＴｒｅｇ細胞除去剤は、Ｔｒｅｇ細胞を認識して不活化することができる抗体および抗体模倣物である。好ましくは、当該抗体はＴｒｅｇ細胞上に発現した細胞表面抗原に対するものである。Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面抗原に対する特異的抗体の例として、ＣＤ２５、ＣＣＲ７、Ｂ７、Ｆｏｘｐ３、ＣＣＲ４およびＣＣＲ８に対する抗体があるが、これらに限定されるものではない。このような抗体は上述の方法に従って産生することができる。
【００６５】
代替的なＴｒｅｇ細胞除去剤としては、Ｔｒｅｇ細胞を特異的に死滅させる細胞毒性を有する薬剤などがある。
【００６６】
別の実施形態において、ステップｃ）において遺伝子発現阻害剤を使用することができ、前記遺伝子はＣＤ２８、ＣＣＲ７、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、Ｂ７、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＩＣＯＳおよびＣＣＬ１からなる群より選択することができる。前記発現阻害剤は、上述のものと同じタイプのものであってもよい。
【００６７】
あるいは、動物はＴｒｅｇ細胞を産生または動員できなくするような１つまたは複数の遺伝子を欠損している。例えば、前記動物はＣＤ２８、ＣＣＲ７、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、Ｂ７、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＩＣＯＳおよびＣＣＬ１からなる群より選択される遺伝子を欠損していてもよい。前記動物は上述の方法に従って作出することができる。
【００６８】
本発明の方法によるステップａ）の動物は、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコおよびイヌからなる群より選択することができる。さらに好ましくは、前記動物はマウスである。前記マウスはＣ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＤＢＡ／２、ＣＢＡ／およびＳＶ１２９系統からなる群より選択することができる。
【００６９】
本発明の方法によるステップｂ）において、動物の動脈血圧は、前記動物に血液量、動脈抵抗（例えば血管収縮剤）、心拍数または血液の粘性を増加させることができる化合物を連続的に投与することによって上昇させることができる。このような化合物の例としては、アンジオテンシンＩＩ、カテコールアミン（アドレナリンまたはノルアドレナリン）、エンドセリン１、アルドステロンおよび酢酸デソキシコルチコステロンなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
動物の血圧は、１１０ｍｇＨｇより高く、好ましくは１１５ｍｇＨｇより高く、さらに好ましくは１２０ｍｇＨｇより高いものであってよいが、１８０ｍｇＨｇを超える値に達してもよい。
【００７１】
連続投与は、当該技術分野で周知の任意の方法、例えば針つきのポンプで行うことができる。例えば、マウスではミニ浸透圧ポンプ（ＡＬＺＥＴ１００２、ＤＵＲＥＣＴ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）を用いることができる。
【００７２】
本発明の別の目的は、本発明の方法により得ることができる動脈瘤非ヒト動物モデルを提供することである。
【００７３】
このような動物モデルは、動脈瘤治療薬のスクリーニング、動脈瘤の生理病理学研究、動脈瘤治療のための外科的方法の試験、動脈瘤の診断または予測マーカーへの試みにおいて有用でありうる。
【００７４】
治療方法：
本発明の別の態様として、動脈瘤の予防または治療のための方法および組成物が提供される。
【００７５】
この組成物は、ＴＧＦ−βと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいてもよい。
【００７６】
ＴＧＦ−βおよびその変異体は様々な方法で取得することができる。これらは、ウシの骨やヒトの血小板などの天然に存在する資源から得ることができる。これらの調製方法は下記を含む。前記ペプチドは、様々な市販の自動合成機を用いて固体支持の上に合成されてもよい。さらに、これらは組換えＤＮＡ技術を用いて調製することもできる。このようにこれらは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子の増幅により高レベルに発現しているサルＴＧＦ−β遺伝子を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）で調整された増殖培地から取得することができる。形質転換ＣＨＯ細胞からＴＧＦ−β前駆体ポリペプチドおよびホモダイマーを取得する方法は、Ｇｅｎｔｒｙら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）７：３４１７〜３４２７、および１９８８年１月２５日に出願された米国特許出願第１４７，８４２号に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。ＴＧＦ−βまたはその変異体はまた、１９８８年１月２５日に出願された同時継続の米国特許出願第１４８，２６７号に記載された組換え技術を使用することによって調製することができ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
ＴＧＦ−βおよびその変異体は、種々の精製技術を用いて、実質的に細胞成分を含まないように精製することができる。これらの技術は、溶媒抽出、ゲル浸透クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、電気泳動、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィーなどを含むことができる。
【００７８】
したがって、本発明のさらなる目的は、対象における動脈瘤の治療または予防のためのＴＧＦ−βまたはその変異体の使用に関する。
【００７９】
本発明の別の目的は、対象における動脈瘤の治療または予防のためのＴＧＦ−βまたはその変異体をコードする核酸の使用に関する。
【００８０】
典型的には、前記核酸はＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクターに含まれていてよい。
【００８１】
また、本発明のさらなる目的は、対象における動脈瘤の治療または予防のための上述の核酸を含むベクターに関する。
【００８２】
これらのベクターは、対象に投与した際に前記ポリペプチドの発現を引き起こし、または誘導するため、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御要素を含んでもよい。さらにベクターは、複製起点および／または選択マーカーを１つまたはいくつか含んでもよい。プロモーター領域は、コード配列に対して異種であっても同種であってもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用を含めた任意の適切な宿主細胞において、普遍的な、構成的な、制御された、および／または組織特異的な発現を提供することができる。プロモーターの例としては、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳類遺伝子プロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）などが含まれる。
【００８３】
特定の適用のための好ましいウイルスはアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり、これらは遺伝子治療でヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。実際、１２の異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜１２）が知られており、それぞれ異なる組織指向性を有する（Ｗｕ，Ｚ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１４：３１６〜２７）。組換えＡＡＶは、依存性パルボウイルスＡＡＶ２から得られる（Ｃｈｏｉ，ＶＷ  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５；７９：６８０１〜０７）。アデノ随伴ウイルスのタイプ１〜１２は複製欠損となるように設計することができ、幅広い範囲のタイプおよび種の細胞に感染する能力を有する（Ｗｕ，Ｚ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００６；１４：３１６〜２７）。さらにアデノ随伴ウイルスは、熱や脂質溶媒への安定性、多様な系統の細胞への高い形質導入頻度、複数回の連続の形質導入を可能にする重複感染阻害の欠如などの利点を有する。報告されているように、アデノ随伴ウイルスは部位特異的にヒト細胞内ＤＮＡに組み入れることができ、その結果、挿入変異の可能性とレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現のばらつきが最小限になる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルスの感染は、選択圧が存在しない場合、組織培養で１００を超える継代を行っても受け継がれており、これはアデノ随伴ウイルスのゲノム組込みは比較的安定な事象であることを意味している。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の方式でも機能することができる。
【００８４】
プラスミドの例としては、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどの複製起点を含む複製プラスミドや組込み型プラスミドが含まれる。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶのベクターが含まれる。これらの組換えウイルスは、例えばパッケージング細胞の核酸導入やヘルパープラスミドまたはウイルスによる一過性核酸導入など、当該技術分野で公知の技術により作製することができる。典型的なウイルスパッケージング細胞の例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが含まれる。このような複製欠損組換えウイルスを作製する詳細なプロトコールは、例えばＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８に見出されうる。
【００８５】
本発明のさらなる目的は、対象における動脈瘤の治療または予防のための前記発明に記載の核酸および／またはベクターによってトランスフェクト、感染、形質転換された細胞の使用に関する。用語「形質転換」は、宿主細胞が導入遺伝子または配列を発現して所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列がコードするタンパク質または酵素を産生することができるように、「外来」（すなわち外因性または細胞外の）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受け入れ発現する宿主細胞は「形質転換」されている。全てのタイプの哺乳類宿主細胞が一般的な発現システムに用いられる。哺乳類細胞の例としては、哺乳類細胞株（例えばベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）の他に、初代または確立された哺乳類細胞培養物（例えばリンパ芽球細胞、繊維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生される）が含まれる。より詳細には、本発明は、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、内皮前駆細胞もしくは平滑筋細胞、または骨髄由来（単核もしくは間葉系）細胞などの、血管細胞もしくは内皮細胞またはその派生物を企図する。
【００８６】
本発明のさらなる目的は、対象における動脈瘤の治療または予防のためのＴＧＦ−β受容体アゴニストの使用に関する。
【００８７】
特定の実施形態において、ＴＧＦ−β受容体アゴニストは低分子量化合物、例えば有機小分子であってよい。
【００８８】
あるいは、ＴＧＦ−β受容体アゴニストは抗ＴＧＦ−β受容体抗体であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＧＦ−β受容体アゴニストは、少なくとも１つのＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメインに結合し、前記受容体をＴＧＦ−βと同じように活性化する抗体である。このような抗体は上述と同じ方法により産生される。
【００８９】
本発明のさらなる目的は、対象における動脈瘤の治療または予防のためのＴＧＦ−β遺伝子発現賦活剤の使用に関する。
【００９０】
本発明のさらなる目的は、動脈瘤の治療または予防のためのＴｒｅｇ細胞を含む細胞組成物に関する。
【００９１】
Ｔｒｅｇ細胞集団の作出方法は当該技術分野で周知である（例えばＷＯ２００７１１０７８５）。特定の実施形態において、本発明は、以下のａ）ｂ）ｃ）ｄ）からなるステップを含む、その対象における動脈瘤の治療または予防のための方法に関する。
【００９２】
ａ）前記対象からの血液サンプルを提供するステップ
ｂ）前記サンプルにおけるＴｒｅｇ細胞集団を単離するステップ
ｃ）前記ステップｂ）のＴｒｅｇ細胞集団を増加させるステップ
ｄ）前記ステップｃ）のＴｒｅｇ細胞集団を投与するステップ
【００９３】
本発明のさらなる目的は、動脈瘤の治療または予防が必要な対象における動脈瘤の治療または予防のためのＴｒｅｇ細胞賦活剤に関する。
【００９４】
特定の実施形態において、前記Ｔｒｅｇ細胞の賦活剤は低分子量化合物、例えばＴａｏ  Ｒら  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００７に記載されているヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤などの有機小分子であってよい。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は当該技術分野で周知であり、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＲＷ（２００２）、および国際特許出願公開ＷＯ２００４１１３３６６号およびＷＯ２００７０７４１７６号に記載されている。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の例としては、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、アピシジン、酪酸ナトリウム、（−）−デプデシン、スクリプタイド、シルチノールが含まれるが、これらに限定されるものではない。これらの化合物はＳｉｇｍａから市販されているものであってよい。
【００９５】
あるいは、前記Ｔｒｅｇ細胞の賦活剤は、ＣＤ２８、ＣＤ３またはＣＴＬＡ−４からなる群より選択される受容体に対する抗体であってよい。Ｔｒｅｇ細胞の増殖を引き起こすことができるＣＤ２８特異的抗体の例は、当該技術分野で周知であり、Ｔａｃｋｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７：２３９〜２４７およびＵＳ２００７１３４２４０に記載されている。
【００９６】
あるいは、前記Ｔｒｅｇ細胞賦活剤は、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−βなどのサイトカインまたは成長因子であってよい。
【００９７】
本発明はさらに、以下の図および実施例を考慮して説明される。
【実施例１】
【００９８】
本実施例では、本発明の大動脈瘤マウスモデル（アンジオテンシンＩＩによる動脈血圧上昇および抗ＴＧＦ−β抗体によるＴＧＦ−β活性阻害、またはアンジオテンシンＩＩによる動脈血圧上昇およびＣＤ２８もしくはＢ７遺伝子のノックアウトによるＴｒｅｇ細胞の数もしくは活性の低減のいずれかにより得られる）を試験した。
【００９９】
方法：
動物モデル：基準血圧は、連続した５日間の測定により決定した。基準値を記録した後、アンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を１，０００ｎｇ／ｋｇ／ｍｉｎの速度で注入する浸透圧ミニポンプ（Ａｌｚｅｔ  Ｍｏｄｅｌ  ２００４；ＤＵＲＥＣＴ）を皮下に移植し、連続的な高血圧を検証するために、血圧を２８日間継続して測定した。動物に、０．４％塩化ナトリウムを含む通常食か、高血圧と腎臓損傷を増強するための５％塩化ナトリウムを含む高塩食（ＳＤＳ）のいずれかを摂取させた。全ての試験動物は８から１４週齢の間であった。プロトコールは、フランス農務省および国立衛生研究所の動物の管理および保護に関するガイドラインに従った。両系統とも、全ての実験において、週齢および性別をマッチさせた野生型および遺伝的背景（Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ背景）が類似している遺伝子改変動物を用いた。正常のＣ５７ＢＩ／６ＪおよびＣＤ２８欠損動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．から入手した。Ｂ７．１／Ｂ７．２（ＣＤ８０／ＣＤ８６）欠損動物はＢｅｎｏｉｔ  Ｓａｌｏｍｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  Ｍａｒｉｅ  Ｃｕｒｉｅ−ＣＮＲＳ  Ｕ７０８７  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐａｒｉｓ）から入手した。抗汎ＴＧＦ−β抗体（クローン２Ｇ７）は週３回、マウス１匹当たり５００μｇの濃度で２週間、その後マウス１匹当たり１５０μｇの濃度でさらに２週間投与した。一部の実験では、Ｃ５７ＢＩ６／Ｊマウスはより低い濃度の抗ＴＧＦ−β抗体（マウス当たり１５０μｇを週３回、４週間）で処置した。安楽死の後、２８日目またはその前に死亡したまたは１４日目の超音波試験により合併ＡＡＡと診断されたマウス（血栓、頭頂出血および／または解離による破裂）の、胸腹部大動脈を外科的に解剖した。
【０１００】
ＡＡＡ診断は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、超音波およびカラードップラーイメージングで評価された腹部大動脈の拡張期外径の増加に基づいて行った（例として図５を参照）。ｅｘ  ｖｉｖｏでは、ＡＡＡは肉眼的な血管壁の部分的脆弱化および拡張により確認された。いくつかの例において、死亡した動物で後腹膜出血が観察された。ＡＡＡの最終確認は、エラスチン断片化および血管平滑筋細胞の消失という組織病理学的証拠により得られた。まれに、管腔または壁在血栓が観察された。
【０１０１】
結果：
図１のデータは、ＴＧＦ−β活性の中和がＡｎｇＩＩのプレス活性に影響しないことを示す。ＣＤ２８  ＫＯおよびＢ７  ＫＯマウスでのＴｒｅｇ欠損は、ＡｎｇＩＩ誘導性の高収縮期血圧を有意には変化させなかった。これらの群における２８日目の低値傾向は、ＡＡＡを有する動物の腹部大動脈下流の灌流が重度に変化したことに関係するものと考えられた。
【０１０２】
同様の収縮期血圧にもかかわらず、ＴＧＦ−β活性を損傷している（２Ｇ７抗体で処置したＣ５７Ｂｌ６／Ｊ）、またはＣＤ２８もしくはＢ７共刺激分子を欠損しているいずれかの高血圧動物は、２８日の間に有意に高い死亡率を示した（ＡｎｇＩＩ単独処置のＣ５７Ｂｌ６／Ｊと各々比較してｐ＜０．０１）（図２）。
【０１０３】
全てのケースにおいて、ＡＡＡの組織病理学的解析によりＴ細胞（ＣＤ３＋）の顕著な浸潤が明らかになり、抑制のないＴ細胞浸潤が示唆された。正常のマウスではＴＧＦ−β活性中和によりＴｒｅｇの作用が阻害されることが期待され、より具体的にはＣＤ２８およびＢ７欠損動物は制御性Ｔ細胞を欠く。合わせて、これら３つの条件で観察された類似の表現型（死亡および全てのＡＡＡ関連死を伴うＡＡＡ）は、高血圧性ＡＡＡの発生予防にＴＧＦ−β経路およびＴｒｅｇの重大な役割を支持する。本実験の経過においては、これらの条件でのＡＡＡ誘導には高血圧が必要であった。
【０１０４】
他のＡＡＡモデルとの比較：
最初に記述されたモデルであるアンジオテンシンＩＩ／ＡｐｏＥモデル（Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら；２０００）では、ＡＡＡ発生率は約３３％と報告された。その後、同じモデルを用いて、ＡＡＡ発生率は１４％（Ｂａｂａｍｕｓｔａら、２００６を参照）から９０％（Ｔｈｏｍａｓら、２００６を参照）まで変化しうることが同著者により見出された。加えて、これらの研究における動脈瘤の重症度（拡張度、血栓または破裂の存在）は極度にばらついている。
【０１０５】
対照的に、アンジオテンシンＩＩで動脈血圧を上昇させ、抗ＴＧＦ−β抗体でＴＧＦ−β活性を阻害することで得られる我々のモデルでは、ＡＡＡ発生率は常に９０％から１００％の間であり、動脈瘤破裂による死亡率は常に７０％以上である。
【実施例２】
【０１０６】
ＣＤ２８−マウス６匹を（上述のように）アンジオテンシンＩＩと、１ｍｇ／ｋｇ／日のトリコスタチンで１４日間処置した。トリコスタチンはヒストンデアセチラーゼの阻害剤であり、Ｔｒｅｇの数を上昇させることが知られている（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００７  Ｎｏｖ；１３（１１）：１２９９〜３０７）。
【０１０７】
実施例１で示したように、アンジオテンシンＩＩ単独で処置したＣＤ２８−マウスは、動脈瘤罹患性が高く、野生型マウスと比べて高い死亡率を示した。対照的に、トリコスタチン処置はこれらの動物の動脈瘤を予防したことから、Ｔｒｅｇの機能が回復すると動脈瘤罹患性は低減することが明らかになった。
【０１０８】
参考文献
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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