(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質溶液からフューリンポリペプチド又はフューリンポリペプチド誘導体を精製する方法であって、以下：
（ａ）該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を、ｐＨ６．０でフューリンポリペプチド又はフューリンポリペプチド誘導体を結合可能である混合陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合させるステップ、
（ｂ）溶出によって該樹脂から該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチドフューリン誘導体を回収するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記混合陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂がＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フューリンポリペプチド誘導体が切断型フューリンポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記切断型フューリンポリペプチドが、配列番号１にしたがうフューリンポリペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶出が段階溶出である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記フューリンポリペプチド、又は前記フューリンポリペプチド誘導体が、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０中で前記混合陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合し、３０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０で洗浄され、２３０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０で溶出される、請求項１〜３および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記フューリンポリペプチド、又は前記フューリンポリペプチド誘導体が、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０中で前記混合陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合し、３０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２
ｐＨ６．０で洗浄され、２３０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０で溶出される、請求項１〜３および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶出が勾配溶出である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記勾配溶出における勾配が１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０中の０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
フューリンポリペプチド又はフューリンポリペプチド誘導体を回収する方法であって、以下：
（ａ）該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を、混合陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂に結合させるステップ、
（ｂ）該混合陽イオン交換／疎水性相互作用樹脂から該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を溶出させるステップ、
（ｃ）溶出された該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体をＡｒｇｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂に結合させるステップ、および
（ｄ）該Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂から該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を溶出させるステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記フューリンポリペプチド誘導体が切断型フューリンポリペプチドであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記切断型フューリンポリペプチドが、配列番号１にしたがうフューリンポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、不活性前駆体タンパク質から成熟タンパク質へのプロセシングに使用される、組換えヒトフューリン、切断型ヒトフューリン又はフューリン誘導体の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質分解性哺乳動物サブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ（ＳＰＣ又はＰＣ）ファミリーは、細菌サブチリシン及び酵母Ｋｅｘ２ｐに類似している。現在まで、フューリン、（ＰＣ３としても知られる）ＰＣ１、ＰＣ２、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、（ＰＣ６としても知られる）ＰＣ５、ＰＣ７（ＬＰＣ、ＰＣ８又はＳＰＣ７）を含めて、ＳＰＣファミリーの７種類のメンバーが同定され、その各々が独特の組織分布を示す。
【０００３】
すべてのＳＰＣは、アミノ末端プロペプチドと、サブチリシン様触媒ドメインと、中間ドメインと、１個以上のドメインで構成された独特のカルボキシ末端とで構成された、マルチドメイン酵素である。プロ、触媒及び中間ドメインは、触媒活性に必須であり、十分である。カルボキシ末端ドメインは、酵素が機能する分泌経路の区画を正確に標的にし、そこに集中するための情報を含むと考えられる。
【０００４】
これらのタンパク質は、単一、対又は複数の基本コンセンサス部位において、ホルモン、成長因子、受容体、ウイルス及び細菌タンパク質を含めた不活性前駆体タンパク質、並びにアルブミン、フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子などの血漿タンパク質のエンド型タンパク質分解性（ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）成熟プロセシングに関係している（非特許文献１）。
【０００５】
ＰＡＣＥ（対の塩基性アミノ酸開裂酵素）とも称されるＳＰＣメンバーのフューリンは、すべての哺乳動物の組織及び細胞系において一様に発現され、やはりホルモン、成長因子、受容体、ウイルス及び細菌タンパク質、並びに血漿タンパク質を含めて、分泌経路における広範囲の生理活性前駆体タンパク質をプロセシングする能力がある。フューリンは、幾つかのドメイン、すなわち、シグナルペプチド、プロペプチド、触媒ドメイン、中間ドメイン、（ホモＢ又はＰドメインとも称される）、Ｃ末端に位置するシステインリッチドメイン、膜貫通領域、及び細胞質側末端に構造的に配置されるカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリンプロテアーゼ切断部位は、アミノ酸配列Ａｒｇ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇを特徴とする認識配列を含む（非特許文献２）。
【０００６】
完全なフューリンは、ゴルジ装置の膜系中に取り込まれ、そこで機能的に活性である（非特許文献３）。新規合成されたフューリン前駆体が小胞体からゴルジ体領域に移行すると、プロペプチドは、２段階のプロセシング現象で自己触媒的に除去される（非特許文献４）。
【０００７】
フューリンは、トランスゴルジ網と細胞表面の間でもエンドソーム小胞を介して循環し、それによって構成的分泌経路を介した輸送中の前駆体タンパク質とエンドサイトーシス経路に入った分子の両方をプロセシングする。プロセシング区画へのフューリンの細胞分布は、その細胞質側末端内の明確な構造的特徴によって誘導される（非特許文献５）。
【０００８】
プロテアーゼの過剰発現は、連続的に増殖する細胞培養物の増殖に負の影響を及ぼすので、細胞に対するフューリンの毒性作用を低下させる解決策が求められてきた。Ｃ末端ドメインは、フューリンの機能活性に不必要であることが判明し、過剰発現された未変性フューリンの７５〜８０ｋＤの切断型を細胞上清中に分泌タンパク質として検出することができた（非特許文献６）この天然に分泌される切断型フューリンは、「脱落（ｓｈｅｄ）フューリン」としても知られ（非特許文献７；非特許文献８）、膜貫通部分のＮ末端が切断されている（非特許文献９）。
【０００９】
膜貫通及び細胞質ドメインのコード部分が除去された、遺伝子操作によって切り詰められたフューリンタンパク質としては、例えば、アミノ酸Δ７１４〜７９４（非特許文献１０；非特許文献１１）、アミノ酸Δ７１６〜７９４（”Ｓｏｌ−ＰＡＣＥ”，非特許文献１２；非特許文献１３）及びアミノ酸Δ７０５〜７９４（非特許文献１４）が記述されている。さらにシステインリッチ領域の欠損を含むフューリン変異体も記述されている（非特許文献１５；非特許文献１６）。
【００１０】
生物工学的用途に対しては、治療処置の枠組み内の適用例を含めて、ＳＰＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの適用例が想定される。かかる適用例では、ヒトフューリン又は切断型フューリンは、非ヒト起源のエンドペプチダーゼよりも適切であり得る。
【００１１】
フューリン又は切断型フューリンは、プロセシングが商業生産の一生産段階である場合には、あらゆる種類の生物活性物質（例えば、他の酵素）の商業生産において適用できる可能性がある。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｕｖｅｎは、生物医学関連製品の工業生産におけるフューリンの適用の特許を有する（特許文献１、特許文献２及び特許文献３）。
【００１２】
別の例は、プロＶＷＦのプロセシングである。実際、フューリンのエンド型タンパク質分解活性、及び塩基性アミノ酸に対するその選択性は、プロＶＷＦを用いた実験において最初に測定された。プロＶＷＦは、７４１個のアミノ酸を有するプロポリペプチドと２０５０個のアミノ酸を有する成熟ＶＷＦとからなり（非特許文献１７）、内因性フューリンによってその成熟型にプロセシングされる（非特許文献６；非特許文献１８；非特許文献１３）。下流プロセスにおいては、組換えＶＷＦ（ｒＶＷＦ）は最高５０〜７０％のプロｒＶＷＦからなるので、完全に成熟していないプロｒＶＷＦは、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで更にプロセシングされる。プロｒＶＷＦは、未精製フューリンを含むＣＨＯ細胞上清を未精製プロｒＶＷＦの上清に添加することによって、成熟させることができる。しかし、プロｒＶＷＦ及びフューリン濃度が低いため、この成熟過程は、最長数日間持続することがあり、余り再現性がない。したがって、精製フューリン又はフューリン誘導体が成熟過程には好ましいと考えられる。
【００１３】
タンパク質成熟においてフューリン又は切断型フューリンが広範に使用される可能性があるにもかかわらず、驚くべきことに、フューリンの精製方法の開示はごく少数である。
【００１４】
組換え切断型マウスフューリンは、陰イオン交換膜、続いてＭｏｎｏ  Ｑ及びＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラムを用いた精製によって、収率２７％でわずか７倍でしか精製されていない（非特許文献１９）
非特許文献１４は、硫酸アンモニウム分画、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＡＦ−Ｂｌｕｅバッチ式分画及びＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）クロマトグラフィーを使用することによって、ＣＨＯ細胞における切断型マウスフューリンの１００倍精製を約１０％の比較的低収率で達成した。同方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９４；２４４：１６７〜７５に発表されたように、Ｎａｋａｙａｍａ等によっても使用された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，９８９，８５６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，９３５，８１５号明細書
【特許文献３】米国特許第６，２７４，３６５号明細書
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｎａｋａｙａｍａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９９７；３２７：６２５〜３５
【非特許文献２】Ｈｏｓａｋａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９１；２６６：１２１２７〜３０
【非特許文献３】Ｂｒｅｓｎａｈａｎら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９０；１１１：２８５１〜９
【非特許文献４】Ａｎｄｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９７；１６：１５０８〜１８
【非特許文献５】Ｔｅｕｃｈｅｒｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９９；２７４：８１９９〜０７
【非特許文献６】Ｗｉｓｅら、ＰＮＡＳ．１９９０；８７：９３７８〜８２
【非特許文献７】Ｖｉｄｒｉｃａｉｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ．１９９３；１９５：１０１１〜８
【非特許文献８】Ｐｌａｉｍａｕｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００１；３５４：６８９〜９５
【非特許文献９】Ｖｅｙら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９４；１２７：１８２９〜４２
【非特許文献１０】Ｌｅｄｕｃら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１４３０４〜８
【非特許文献１１】Ｍｏｌｌｏｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１６３９６〜４０２
【非特許文献１２】Ｗａｓｌｅｙら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：８４５８〜６５
【非特許文献１３】ＲｅｈｅｍｔｕｌｌａおよびＫａｕｆｍａｎ，Ｂｌｏｏｄ．１９９２；７９：２３４９〜５５
【非特許文献１４】Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１６０９４〜９
【非特許文献１５】Ｈａｔｓｕｚａｗａら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２；１０１：２９６〜３０１
【非特許文献１６】Ｃｒｅｅｍｅｒｓら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２１８２６〜３４
【非特許文献１７】Ｖｅｒｗｅｉｊら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８６；５：１８３９〜４７
【非特許文献１８】Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎら、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．１９９０；１４：２６５〜７５
【非特許文献１９】Ｃａｍｅｒｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０００；２７５：３６７４１〜９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかし、これらの方法はすべて、幾つかの連続段階を使用するため、比較的時間がかかり、フューリンの精製度又は収率が低い。かかるフューリン精製方法は、フューリンが、調製すべきタンパク質に加えて必要とされるにすぎない大規模工業プロセスでは役に立たない。したがって、高精製度及び高収率と合わせて迅速なフューリン精製プロセスが当分野では大いに必要とされる。本発明の発明上の課題は、例えばプロｒＶＷＦなどのプロタンパク質を成熟させることができる、ヒト組換えフューリン又は切断型フューリンの高収率及び十分な精製度の簡単な単一カラム精製段階を開発することである。さらに、本質的に純粋なフューリン又は切断型フューリンを得るために、それに続く追加の精製段階を開発すべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
サブチリシン様プロタンパク質コンバターゼの一メンバーであるＰＡＣＥ（対の塩基性アミノ酸開裂酵素）とも称されるフューリンは、すべての哺乳動物の組織及び細胞系において一様に発現され、分泌経路における広範囲の生理活性前駆体タンパク質をプロセシングする能力がある。フューリン又は切断型フューリンは、プロタンパク質のプロセシングが商業生産の一生産段階である場合には、あらゆる種類の生物活性物質の商業生産において適用できる可能性がある。タンパク質成熟においてフューリン又は切断型フューリンが広範に使用される可能性があるにもかかわらず、利用可能なフューリンの精製方法はごく少数であり、その方法は最適ではない。改善されたフューリン精製方法を開発するために、組換え切断型ヒトフューリンをＣＨＯ細胞中で発現させ、限外ろ過及び透析ろ過によって約５０倍に濃縮した。濃縮物を、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣを用いたカラムクロマトグラフィーによって精製することができ、３０〜５０倍の精製倍率（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）、及び少なくとも６０％の収率を得た。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー後に得られた少なくとも２０％純粋な切断型フューリン調製物は、既にプロフォンウィルブランド因子のオンカラム成熟が可能な精製度であった。追加のＡｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー精製も実施した。切断型ヒトフューリンの精製のための２つのカラムプロセスによって、比活性約２９０，０００Ｕフューリン／ｍｇタンパク質及び収率約５０％でほぼ純粋な調製物が得られた。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
タンパク質溶液からフューリン又はフューリン誘導体を精製する方法であって、以下：（ａ）タンパク質溶液からの該フューリン又はフューリン誘導体を、ｐＨ６．０でフューリンを結合可能である陰イオン交換樹脂に結合させるステップ、（ｂ）溶出によって該フューリン又はフューリン誘導体を回収するステップを含む、方法。
（項目２）
上記陰イオン交換樹脂が、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０Ｍ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からなる群より選択されることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記陰イオン交換樹脂がＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）であることを特徴とする、項目１〜２に記載の方法。
（項目４）
上記フューリン誘導体が切断型フューリンであることを特徴とする、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記切断型フューリンが、アミノ酸５７８から７９４をＣ末端側で欠く配列番号１のフューリンであることを特徴とする、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体がＣａｐｔｏ  ＭＭＣ（商標）カラムに結合し、段階溶出によって回収されることを特徴とする、項目４に記載の方法。
（項目７）
上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０中で上記Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに結合し、３０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０で洗浄され、２３０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０で溶出される、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０中で上記Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに結合し、３０ｍＭ塩化ナトリウム５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０で洗浄され、２３０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０で溶出される、項目７に記載の方法。
（項目９）
Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに結合した上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が勾配溶出によって回収されることを特徴とする、項目４に記載の方法。
（項目１０）
Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに結合した上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が勾配溶出によって回収され、該勾配が１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０中の０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌであることを特徴とする、項目９に記載の方法。
（項目１１）
項目１に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
（項目１２）
少なくとも１００，０００Ｕ／ｍｇタンパク質の比活性を有する、項目１に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
（項目１３）
エンド型タンパク質分解に活性な量の項目１１に記載のフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
（項目１４）
フューリン又はフューリン誘導体を回収する方法であって、以下：（ａ）タンパク質溶液からの該フューリン又はフューリン誘導体を、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに結合させるステップ、（ｂ）該フューリン又はフューリン誘導体を溶出させるステップ、（ｃ）該フューリン又はフューリン誘導体をＡｒｇｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムに結合させるステップ、および（ｄ）該フューリン又はフューリン誘導体を溶出させるステップを含む、方法。
（項目１５）
上記フューリン誘導体が切断型フューリンであることを特徴とする、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
上記切断型フューリンが、アミノ酸５７８から７９４をＣ末端側で欠く配列番号１で示される配列を有することを特徴とする、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
項目１４に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
（項目１８）
少なくとも２９０，０００Ｕ／ｍｇタンパク質の比活性を有する、項目１７に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
（項目１９）
エンド型タンパク質分解に活性な量の項目１８に記載のフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】段階溶出を用いたＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムクロマトグラフィーによる切断型フューリンの精製（実施例５）を示すグラフである。
【図２】勾配溶出を用いたＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムクロマトグラフィーによる切断型フューリンの精製（実施例５）を示すグラフである。
【図３】追加のＡｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーと一緒にＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムクロマトグラフィーから得られた切断型フューリンの精製（実施例６）を示すグラフである。
【図４】Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ、及びＡｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムと組み合わせたＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣによって精製された、切断型フューリンのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離（実施例２及び実施例６）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「フューリン」という用語は、当分野では明確に定義されており、例は、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬデータベースに見つけることができ（受託番号Ｐ０９９５８、本発明の一実施形態においては、フューリンは、米国特許第５，９８６，０７９号に開示され、米国特許第５，９８６，０７９号に開示されたＤＮＡ配列によってコードされる、ペプチドを意味する。
【００２１】
「フューリン誘導体」という用語は、（「脱落フューリン」とも称される）フューリンアミノ酸の切断型断片、その天然変種、又は計画的に改変されたその配列を含む。したがって、アミノ酸の挿入、欠失又は交換によってフューリン又は切断型フューリン類似体から生成され、フューリン様生物学的活性を有するすべてのタンパク質も、本発明の方法によって精製することができる。
【００２２】
本発明の一実施形態においては、フューリン及びフューリン誘導体は、組換え技術によって、すなわち、かかるＤＮＡで形質転換された適切な宿主細胞においてかかるフューリン又はフューリン誘導体をコードするＤＮＡを発現させることによって、製造することができる。
【００２３】
本願の切断型フューリンは、フューリンエンドペプチダーゼ活性をコードする配列を保持しつつ、フューリンをコードするＤＮＡをその３’末端及び／又はその５’末端で切り詰めることによって、生成させることができる。膜貫通（ＴＭ）領域及び／又はシステインリッチ領域（ＣＲＲ）のコード配列を欠失させることが望ましい場合もある。シグナル配列をコードする領域を除去すること、及び／又はそれを異種配列で置換することが望ましい場合もある本発明による切断型フューリンは、ゴルジ装置の膜中に切断型フューリンを固定するのに役立ち得る推定上の膜貫通領域を含むこともできる。
【００２４】
フューリンＤＮＡ配列の一部（特に、触媒ドメインのコード領域を含む部分）を異種コード配列に連結して、フューリンの酵素特異性を有する融合ペプチドを作製することが望ましい場合もある。
【００２５】
本発明の好ましい一実施形態においては、切断型フューリンは、ヒト起源であり、例えば米国特許第５，９８６，０７９号に開示された野生型ヒトフューリンのアミノ酸配列からアミノ酸５７８から７９４を欠くＣ末端切断型である。本発明による切断型フューリンは、細胞に実質的に有毒ではなく、細胞中で多量に発現させることができるように切り詰められる。かかる切断型フューリンは当分野で公知である。
【００２６】
本発明に開示する方法によって精製されるフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体を使用して、タンパク質分解性切断によってプロタンパク質からタンパク質を調製することができる。プロタンパク質は、適切なタンパク質分解処理によって機能タンパク質に変換することができるタンパク質の全前駆体を含むものとする。特に、プロタンパク質は、プロ酵素、プレプロ酵素、又は生化学的、生理学的若しくは生物工学的に使用可能なタンパク質若しくは酵素の他の（不活性）前駆体とすることができる。
【００２７】
前駆体ポリペプチドの例としては、ＶＷＦ、第ＩＸ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロトロンビン、第Ｘ因子、第ＶＩＩ因子、骨ガンマカルボキシグルタマートタンパク質などの凝固因子、インスリン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）などの成長因子が挙げられるが、それだけに限定されない。
【００２８】
本願によるフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体の製造は、かかるタンパク質をコードする組換えＤＮＡの遺伝子操作の当分野で公知の任意の方法、例えば、ＲＮＡの逆転写、及び／又はＤＮＡの増幅、続いてベクターの移入、及びタンパク質の組換え発現の種々の方法を含むことができる。種々のベクター、永久細胞系、ウイルス発現系などの通常の真核生物発現系のすべてを使用することができる。フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体をコードする組換えＤＮＡ、例えば、プラスミドは、プラスミドが首尾よく移入された細胞を選択する選択マーカーをコードするＤＮＡ配列も含むことができる。
【００２９】
本発明によるフューリン、フューリン誘導体又は切断型フューリンを組換え製造するための細胞系は、外来ＤＮＡを宿主細胞の染色体に安定に組み込むことによって製造することができる。宿主細胞型は、任意の真核細胞とすることができる。一実施形態においては、細胞は、フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体の翻訳後修飾を実行する能力を有する哺乳動物細胞である。例えば、前記哺乳動物細胞は、例えば、ＳｋＨｅｐ−、ＣＨＯ−、ＨＥＫ２９３−及びＢＨＫ細胞からなる群より選択される細胞系のような哺乳動物細胞系に由来する。真核生物発現系として、酵母、及び内因性フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体を発現する他の細胞型も使用することができる。トランスジェニック動物もフューリン又はその誘導体の発現に使用することができる。組換えタンパク質の発現の場合、ＣＨＯ−ＤＵＸＳ  Ｂ１１細胞が特に適切であることが証明された（Ｕｒｌａｕｂら、ＰＮＡＳ  １９８０；７７：４２１６〜２０）。この細胞は、任意の規模で培養することができる。一具体例においては、ＣＨＯ細胞は、８０〜２００Ｌ規模のケモスタット発酵によって培養された。
【００３０】
本発明において細胞培養に使用する培地、試薬及び条件に特別な制限はない。細胞は、血清を用いて、さらに、無血清条件下、又は無血清及び無タンパク質条件下で、連続式又はバッチ式で培養することができる。
【００３１】
本発明によるフューリンは、場合によってはプロテアーゼ阻害剤の存在下で、溶解によって細胞から単離し、従来法によって更に精製することができる。フューリンは、分泌顆粒中で生じるようなｐＨ５．５の比較的酸性の培地において活性であるが、このタンパク質はｐＨ７．５でもその活性を維持する。フューリンの活性は、Ｃａ２＋イオンの存在に依存する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性の場合、２〜５ｍＭのカルシウム濃度が最適であることが判明した。ＥＤＴＡなどの金属キレート剤の存在は、フューリンの活性を大きく阻害する。
【００３２】
フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体のタンパク質分解活性の評価は、任意の適切な試験によって、例えば、フューリンが特異的である二塩基性切断部位を含む蛍光発生基質を用いることによって、実施することができる（Ｓｃｈｌｏｋａｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９６；２４：２５７〜６７）。前記アッセイでは、１単位は、蛍光発生基質Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣから３０℃１分で７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）１ｐｍｏｌを放出するフューリンの量として定義される。或いは、タンパク質分解活性は、フューリンをプロタンパク質、例えばプロｒｖＷＦと一緒に十分な時間インキュベートすることによって測定することもできる。プロｒｖＷＦプロセシングの程度は、例えばウエスタンブロット法によって、分析することができる。
【００３３】
本発明は、組換え製造されたフューリンを細胞培養培地から精製する方法を規定する。フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体は、圧力に対して安定なクロマトグラフィーゲルＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０Ｍ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）など、ｐＨ６．０でフューリンを結合可能である陰イオン交換樹脂によって、驚くべきことに有利に精製することができる。
【００３４】
本発明の一実施形態においては、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑは、フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体の高発現及び高体積供給の捕捉及び中間精製における使用に驚くほど効率的であることが判明した。極めて硬いマトリックスは、より広い作業範囲の流速、層高及び試料粘度が可能であり、そのすべてがプロセシングコストに正の影響を及ぼす。高流速は、処理体積を増加させ、工程所要時間を短縮する。層高が長いと、大きい装置が不要になり、設置面積が小さく維持される。粘ちゅう性試料の高流量処理とは、希釈が少なく、サイクル時間が短いことを意味する。
【００３５】
本願の別の一実施形態においては、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）樹脂を使用した。前記樹脂を使用することによって、３０〜５０の驚くほど高い精製倍率、少なくとも６０％の高収率、及び少なくとも１００，０００Ｕ／ｍｇタンパク質の比活性を単一精製段階で得ることができた。
【００３６】
本発明の更に別の一実施形態においては、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂を用いて精製された切断型フューリンを、Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４Ｂカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などのＡｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を用いて更に精製した。前記２種類の樹脂を使用することによって、１４０の驚くほど高い精製倍率、５０％の高収率、約１４０の精製倍率、少なくとも９０〜９５％の純度、及び２９０，０００Ｕ／ｍｇタンパク質の比活性を得ることができる。
【００３７】
種々の緩衝系を使用して、フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体を緩衝し、本発明に使用されるカラムを平衡化することができる。一般に、ｐＨ６．０で緩衝能を有するあらゆる緩衝剤を使用することができる。これには、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及びＴｒｉｓ緩衝剤が含まれる。本発明の一実施形態においては、緩衝剤は５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭ  ＣａＣｌ２であり、別の一実施形態においては、１０ｍＭ酢酸ナトリウム／１ｍＭ  ＣａＣｌ２である。ｐＨは５．５から８．０の範囲であり、別の一実施形態においては、ｐＨは６．０である。
【００３８】
本発明は、本発明に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体のエンド型タンパク質分解に活性な量と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物も含む。担体は、好ましくは液剤とすることができ、好ましくは緩衝等張水溶液である。本発明に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体は、単一成分調製物として、又は複数成分系として、例えばＶＷＦのプロタンパク質として、他の成分と組み合わせて、フューリンポリペプチドを含む薬剤として提供することができる。
【００３９】
薬学的に許容される担体としては、希釈剤などの賦形剤、及び安定剤、防腐剤、可溶化剤などの添加剤も挙げられる。本発明のポリペプチドは、任意の薬学的に許容される塩の形とすることもできる。
【００４０】
本明細書では「薬学的に許容される」という用語は、米国若しくは欧州連合政府の規制行政機関によって認可された、又は米国薬局方、若しくは動物用、より具体的にはヒト用の他の一般に認知された薬局方に記載されていることを意味する。
【００４１】
以下の実施例は、本発明を説明するものであるが、本発明の範囲を決して限定するものではない。当業者の知識内の変更は、本発明の範囲内であると考えるべきである。
【実施例】
【００４２】
実施例１  組換え切断型フューリンの発現及び分析
アミノ酸５７８から７９４を欠く切断型ヒトフューリン（配列番号１）を、８０〜２００Ｌ規模のケモスタット発酵によって培養されたＣＨＯ細胞において発現させた。フューリン含有ＣＨＯ細胞上清を約５０倍に濃縮し（０．６ｍ２  Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ  ３０ｋＤａ膜を備えた限外ろ過ユニット、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０に対して透析ろ過し、使用するまで（１週間以内）−２０℃で貯蔵した。
【００４３】
試料のタンパク質含有量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄによって記述された原理によって測定した（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６；７２：２４８〜５４）。微量検定手順を製造者の指示に従って実施し、認証ヒト血清調製物（Ｑｕａｌｉｔｒｏｌ  ＨＳ−Ｎ、ＤｉａＳｙｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｈｏｌｚｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて較正し、２０から１．８μｇタンパク質／ｍＬの較正範囲を得た。濃縮試料を０．９％ＮａＣｌで希釈した。
【００４４】
酵素フューリン活性を蛍光発生アッセイにおいて測定した。このアッセイでは、１単位は、蛍光発生基質Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣから３０℃１分で７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）１ｐｍｏｌを放出するフューリンの量として定義される。組換えフューリン標準（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５で１：１０、１：２０、１：４０、１：８０、１：１６０及び１：３２０希釈した）。希釈試料１５０μＬを基質（Ｂｏｃ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ酢酸塩；Ｂａｃｈｅｍ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ＧｍｂＨ；Ｗｅｉｌ  ａｍ  Ｒｈｅｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５０μＬと一緒に、蛍光を適用するための黒色マイクロタイタープレート中で３０℃で１２０分間振とうした。インキュベーション後１０分以内にＡＭＣの放出を分光蛍光光度計によって３６０ｎｍ／４６０ｎｍで測定した。フューリン濃度をフューリンを用いた基準曲線によって計算した。
【００４５】
過剰の検出抗体を用いた２部位（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ形式、及び単一インキュベーション多層免疫技術（ｓｉｎｇｌｅ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）ＳＩＭＩＴ（Ｎａｓｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９０；１２９：１５１〜７）において汚染ＣＨＯタンパク質を測定した。宿主細胞抗原を非組換え前駆体ＣＨＯ細胞系ＤＵＫＸの細胞培養上清から調製した。宿主細胞抗原に対するポリクローナル抗体をヤギにおいて産生させた。コーティングのために、コーティング緩衝剤（ＨＣｌでｐＨ９．５に調節した１００ｍＭ炭酸ナトリウム、１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム）中のヤギ抗ＣＨＯ抗体（所内調製物）の１：５００溶液を使用した。ＰＢＳＴ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭリン酸二水素カリウム、７ｍＭ無水リン酸水素二ナトリウム、０．５ｍＬ  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭベンズアミジン）を試料希釈及びブロッキングに使用した。所内ビオチン化抗体（ヤギ抗ＣＨＯビオチン）とストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）の組合せを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質として用いた検出に使用した。親和性精製された宿主細胞調製物を、９５ｎｇ／ｍＬから３ｎｇ／ｍＬ  ＣＨＯタンパク質のアッセイ較正範囲を扱うアッセイ標準（ＣＨＯタンパク質アッセイ標準、３８０ｎｇ／ｍＬ、所内調製物）として使用した。標準希釈物のＯＤ及びＣＨＯタンパク質濃度の対数変換、並びに線形回帰曲線の計算の後に、試料を測定した。
【００４６】
切断型フューリン調製物の内毒素含有量をＬｉｍｕｌｕｓ血球抽出成分（Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）アッセイにおいて測定した。ＬＡＬは、内毒素の存在下で活性化された酵素系を含む。手短に述べると、活性化された酵素は、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）を発色基質Ｓ−２４２３（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＨＣｌ、ＣｏａＣｈｒｏｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  ＧｍｂＨ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）から分裂させて、黄色を発する。ｐＮＡの遊離は、ＥＬＩＳＡリーダーにおいて４０５ｎｍで動力学的に測定される。内毒素濃度は、内毒素標準（Ｅ．ｃｏｌｉ  ０１１１：Ｂ４）を用いた基準曲線によって計算される。
【００４７】
実施例２  単一カラム精製段階としてのＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ樹脂の確認
上述したように発現させ、分析した切断型フューリンを、フューリン又は切断型フューリン調製物にはこれまで使用されなかった異なるクロマトグラフィー樹脂を用いて、比較しながら精製した。２種類の陰イオン交換樹脂、すなわち、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とＣａｐｔｏ（商標）Ｑ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び混合陽イオン交換／疎水性相互作用ゲル（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、ＣＨＯ細胞上清に由来する切断型フューリンの精製及び濃淡膜電位について試験した。クロマトグラフィーの運転を、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭ  ＣａＣｌ２緩衝剤を用いて、ｐＨ７．５（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０及びＣａｐｔｏ（商標）Ｑ）及び５．５〜８．０（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ）で実施した。切断型フューリンカラムロード及び導電率は、個々のクロマトグラフィー運転ごとに異なった（表１）。結合したフューリンをローディングバッファー中の線形０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ勾配によって１５ＣＶ以内で溶出させた。調製されたすべての切断型フューリン試料は、内毒素を含まないことに留意されたい。
【００４８】
【表１】
0005485873.tif 000002
異なるカラムに対する結果は各グループ内で比較的均一であったので、概観しやすいように平均を計算した。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０を用いた５つの実験、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑを用いた３つの実験、及びＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣを用いた３つの実験の平均をそれぞれ表２に示す。
【００４９】
【表２】
0005485873.tif 000003
Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０及びＣａｐｔｏ（商標）Ｑは、切断型フューリンの純度をそれぞれ３倍及び８倍増加させることができたのに対して、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣでは３２の精製倍率が得られた。カラム溶出物における切断型フューリン収率は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣでは６５％、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｑでは５６％、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  ６５０では４９％であった。
【００５０】
切断型フューリンの高精製倍率に加えて、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣを使用すると、汚染ＣＨＯタンパク質の除去係数（ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｒｅｍｏｖａｌ）も最高になった。８〜１８％勾配ＳＤＳゲル上のＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色バンドで測定して、切断型フューリンは少なくとも２０％純粋であった。典型例を図４に示す。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ溶出物のうち異なる切断型フューリン調製物３μｇをレーン４〜７に充填した（レーン１：フューリン標準、レーン２及び３：Ａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出物、Ｍ＝分子量マーカー。
【００５１】
実施例３  酢酸ナトリウム緩衝剤によるＨｅｐｅｓ緩衝剤の置換
緩衝剤コスト（約５００ユーロ／１Ｌカラム）を削減するために、代替緩衝系を試験した。Ｈｅｐｅｓ濃度の減少は、カラム流液及び洗浄画分中の切断型フューリンがかなり急増したので、不可能であった。Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに５，０００〜３０，０００Ｕフューリン／ｍＬゲルを充填し、ローディングバッファー中の０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌ勾配によって１５ＣＶ以内で溶出させた。
【００５２】
幾つかの緩衝系を試験し、１０ｍＭ酢酸ナトリウムによって５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝剤と少なくとも類似した精製倍率、収率及び能力が得られることが判明した。Ｈｅｐｅｓ又は酢酸ナトリウム緩衝剤を用いた３つの実験の平均を表３に示す。
【００５３】
【表３】
0005485873.tif 000004
実施例４  導電率の変更による、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムを用いた切断型フューリン精製の最適化
Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに７０，０００〜１００，０００Ｕフューリン／ｍｇゲルを充填した。充填液を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０で透析して、導電率約１ｍＳ／ｃｍを得た。導電率を１ｍＳ／ｃｍに調節することによって、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムの流液及び洗浄画分中の切断型フューリンの損失を約１７％から検出不可能なレベルにまでかなり減少させることができた。さらに、カラムロードを約１００，０００Ｕフューリン／ｍＬゲルまで増加させることができた（表４）。１５０，０００Ｕフューリン／ｍＬゲルの適用後に、かなりの切断型フューリンの急増が認められた。しかし、大規模調製のための最適化中にカラムロードを１５０，０００Ｕ／ｍＬゲルに増加することができると期待できる。
【００５４】
【表４】
0005485873.tif 000005
実施例５  勾配又は段階溶出によるＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムからの切断型フューリンの回収
カラムクロマトグラフィーの堅牢性を高めるために、切断型フューリンの溶出のための塩化ナトリウム勾配の代わりに段階勾配を使用した。（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０に対して透析された）切断型フューリン約８０，０００Ｕ／ｍＬゲル（勾配）及び３０，０００Ｕ／ｍＬゲル（段階勾配）をＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに充填した。クロマトグラフィーの運転を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム／１ｍＭ  ＣａＣｌ２緩衝剤を用いてｐＨ６で実施した。１５カラム体積以内の酢酸ナトリウムローディングバッファー中の０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌの勾配溶出に加えて、３０ｍＭ塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤における追加の洗浄段階、及び同じ緩衝剤中の２３０ｍＭ塩化ナトリウムによる溶出を実施した。カラムを平衡緩衝剤３０体積、次いで３０ｍＭ塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤１０体積で洗浄した。切断型フューリンを２３０ｍＭ塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤１４体積で溶出させた。最初の２３０ｍＭ塩化ナトリウム溶出物３体積を収集した。その結果、精製倍率が低下し、溶出物中の切断型フューリン絶対濃度が減少した。それぞれ２つの実験の平均を表５に示す。これとは対照的に、段階溶出から溶出した切断型フューリンのピーク収集（ｐｅａｋ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（図１）は、勾配溶出から得られたピーク収集（図２）よりも良好であった。
【００５５】
【表５】
0005485873.tif 000006
実施例６  Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムから溶出した切断型フューリンの更なるＡｒｇｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム精製
Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー後に得られた少なくとも２０％純粋な切断型フューリン調製物は、既にプロＶＷＦのオンカラム成熟が可能な精製度であった。精製倍率を高めるために、追加のＡｒｇｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー精製を実施することができる。
【００５６】
Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣクロマトグラフィー段階からの切断型フューリン含有溶出物を５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝剤、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７，０に対して透析し、約３３，０００Ｕフューリン／ｍＬゲルを、同じ緩衝剤で平衡化されたＡｒｇｉｎｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４Ｂカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。切断型フューリンを平衡緩衝剤中の０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌ勾配で２５カラム体積以内で溶出させた。クロマトグラフィー運転結果を図３に示す。約６０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて溶出した切断型フューリンピークを、１０ｋＤａカットオフポリスルホン膜を用いた限外ろ過によって５倍濃縮し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌに調節した。Ｓａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）Ｐ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）上で無菌ろ過後、切断型フューリンを−２０℃で貯蔵した。切断型フューリンの比活性は、約２９０，０００＋／−６０，０００Ｕ／ｍｇタンパク質（ｎ＝３）であった。超濃縮（ｕｌｔｒａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）前（図４、レーン３）及び超濃縮後（図４、レーン２）のＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色によって測定して、出発材料としての発酵上清に比べた全収率は約５０％（ｎ＝３）であり、全精製倍率は約１４０倍であり、純度は少なくとも９０〜９５％であった。
【００５７】
本発明において示す実施例によれば、切断型フューリンの最良の精製方法は、切断型フューリン濃縮物（８０，０００〜１００，０００Ｕ／ｍＬゲル）約１５千万単位をｐＨ６．０＋／−０．１に調節し、それを１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．０に対して平衡化された１．５Ｌ  ＢＰＧ１００／２０  Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣカラムに適用することである。カラムを平衡緩衝剤３０体積、次いで３０ｍＭ塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤１０体積で洗浄する。切断型フューリンを２３０ｍＭ塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤１４体積で溶出させる。最初の２３０ｍＭ塩化ナトリウム溶出物３体積の収集が、最も濃縮されたフューリン溶液になる。より高い精製度が望まれる場合には、追加のＡｒｇｉｎｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー精製を実施することができる。
【００５８】
【化１】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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