(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する測定手順と、
各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う算出手順と、を含み、
前記算出手順では、各光検出器の検出値を収集して得られる測定スペクトルを、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子で得られる単染色スペクトル及び蛍光色素を標識していない微小粒子で得られる自家蛍光スペクトルの線形和として近似することによって各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出し、
前記自家蛍光スペクトルの近似を、蛍光色素を標識していない前記微小粒子に基づいて前記測定手順の前に測定されたスペクトルを利用すること、または蛍光色素を標識していない前記微小粒子に関する予め記憶された標準スペクトルを利用することにより行う蛍光強度補正方法。
【請求項２】
前記制約条件として、算出される各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最小値以上であるという条件を設定する請求項１記載の蛍光強度補正方法。
【請求項３】
前記制約条件として、さらに、算出される各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最大値以下であるという条件を設定する請求項２記載の蛍光強度補正方法。
【請求項４】
前記算出手順において、単染色スペクトル及び自家蛍光スペクトルの線形和による測定スペクトルの近似を、最小二乗法を用いて行う請求項３記載の蛍光強度補正方法。
【請求項５】
前記算出手順において、下記式で示される評価関数が最小値となるパラメータａｋ（ｋ＝１〜Ｍ）を求めることにより、各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出する請求項４記載の蛍光強度補正方法。
0005601098.tif 000016
（式中、Ｘｋ（ｘｉ）は、ｋ番目の蛍光色素の単染色スペクトルあるいは自家蛍光スペクトルにおけるｉ番目の光検出器の検出値を表す。また、ｙｉは、測定スペクトルにおけるｉ番目の光検出器の検出値を表す。σｉは、ｉ番目の光検出器の検出値に対する重みの逆数を表す。）
【請求項６】
蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する測定手段と、
各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う算出手段と、を含み、
前記算出手段では、各光検出器の検出値を収集して得られる測定スペクトルを、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子で得られる単染色スペクトル及び蛍光色素を標識していない微小粒子で得られる自家蛍光スペクトルの線形和により近似することによって各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出し、
前記自家蛍光スペクトルの近似を、蛍光色素を標識していない前記微小粒子に基づいて前記測定手順の前に測定されたスペクトルを利用すること、または蛍光色素を標識していない前記微小粒子に関する予め記憶された標準スペクトルを利用することにより行う蛍光強度算出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光強度補正方法と蛍光強度算出装置に関する。より詳しくは、微小粒子に多重標識された複数の蛍光色素のそれぞれから発生する蛍光の強度を正確に算出するための蛍光強度補正方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞等の微小粒子を蛍光色素を用いて標識し、これにレーザ光を照射して励起された蛍光色素から発生する蛍光の強度やパターンを計測することによって、微小粒子の特性を測定する装置（例えば、フローサイトメータ）が用いられている。近年では、細胞等の特性をより詳細に分析するため、微小粒子を複数の蛍光色素を用いて標識し、各蛍光色素から発生する光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器（ＰＤやＰＭＴなど）により計測するマルチカラー測定が行われるようになっている。マルチカラー測定では、用いる蛍光色素の蛍光波長に応じて光検出器側の光学フィルタを選択して蛍光の検出を行っている。
【０００３】
一方、現在利用されている蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ（フィコエリスリン）は、蛍光スペクトルに互いに重複する波長帯域が存在する。従って、これらの蛍光色素を組み合わせてマルチカラー測定を行う場合、各蛍光色素から発生する蛍光を光学フィルタにより波長帯域別に分離しても、各光検出器には目的以外の蛍光色素からの蛍光が漏れ込むことがある。蛍光の漏れ込みが生じると、各光検出器で計測される蛍光強度と目的とする蛍光色素からの真の蛍光強度にずれが生じ、測定誤差の原因となる
【０００４】
この測定誤差を補正するため、光検出器で計測された蛍光強度から漏れ込み分の蛍光強度を差し引く蛍光補正（コンペンセーション）が行われている。蛍光補正は、光検出器で計測された蛍光強度が、目的とする蛍光色素からの真の蛍光強度となるように、パルスに電気的あるいは数学的な補正を加えるものである。
【０００５】
数学的に蛍光補正を行う方法として、各光検出器で計測された蛍光強度（検出値）をベクトルとして表し、このベクトルに予め設定した漏れ込み行列の逆行列を作用させることで、目的とする蛍光色素からの真の蛍光強度を算出する方法が用いられている（図３・４、特許文献１参照）。この漏れ込み行列は、各蛍光色素を個別に単標識した微小粒子の蛍光波長分布を解析することによって作成されるものであり、各蛍光色素の蛍光波長分布が列ベクトルとして配列されたものである。漏れ込み行列の逆行列は「補正行列」とも称される。図３・４には、５種類（ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５，ＰＣ７）の蛍光色素と５つの光検出器を用いて５カラー測定を行う場合を例に示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−８３８９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
補正行列を用いた蛍光補正方法では、行列要素に負値を許容しているため、補正後の蛍光強度が負値になる場合がある。これは、各光検出器の検出値に含まれるノイズが行列要素の値に影響を与えていることが原因である。しかし、現実には各蛍光色素からの蛍光強度は負値にはなり得ない。さらに、ある蛍光色素からの蛍光強度が負値として算出されるということは、同時に他の蛍光色素の蛍光強度の算出値に正方向への誤差が生じていることを意味する。
【０００８】
解析する微小粒子集団（ポピュレーション）に、ある蛍光色素についての蛍光強度が負値となる小集団（サブポピュレーション）が存在すると、当該蛍光色素の蛍光強度を対数軸（ログスケール）でプロットした二次元相関図（サイトグラム）上に当該サブポピュレーションがプロットされない。このため、二次元相関図上にプロットされたポピュレーションが実際よりも少なくなったような誤解をユーザに与えるおそれがある。
【０００９】
また、従来の蛍光補正方法では、微小粒子から発生する自家蛍光の検出値をバックグランドとして各光検出器の検出値から減算する際に、ポピュレーション全体の自家蛍光強度の平均値を演算に用いていた。しかし、自家蛍光の強度やパターンはサブポピュレーション毎に異なっている。このため、全てのサブポピュレーションについて一律に上記平均値を減算するという演算そのものが、蛍光強度の算出値の誤差要因となっていた。特に解析対象とするサブポピュレーション間の自家蛍光強度のばらつきが大きい場合には、誤差が顕著となる。
【００１０】
本発明は、複数の蛍光色素により標識された微小粒子を複数の光検出器によってマルチカラー測定する場合に、各蛍光色素からの蛍光強度を正確に算出してユーザに提示する技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題解決のため、本発明は、蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する測定手順と、各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う算出手順と、を含む蛍光強度補正方法を提供する。
前記算出手順は、各光検出器の検出値を収集して得られる測定スペクトルを、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子で得られる単染色スペクトル及び蛍光色素を標識していない微小粒子で得られる自家蛍光スペクトルの線形和により近似することによって各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出する手順とする。前記自家蛍光スペクトルの近似は、蛍光色素を標識していない前記微小粒子に基づいて前記測定手順の前に測定されたスペクトルを利用するか、蛍光色素を標識していない前記微小粒子に関する予め記憶された標準スペクトルを利用することにより行う。微小粒子の自家蛍光成分を含めて演算を行うことにより、サブポピュレーション毎に異なる自家蛍光成分を厳密に演算して、サブポピュレーション間の自家蛍光強度のばらつきに起因する測定誤差を解消できる。
前記制約条件としては、算出される各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最小値、例えば０、以上であるという条件を設定する。この制約条件を設けて補正演算を行うことにより、蛍光色素からの蛍光強度が負値として算出されることに起因する測定誤差や二次元相関図（サイトグラム）上のポピュレーション減少の問題を解決できる。前記制約条件としては、さらに必要に応じて、算出される蛍光強度及び自家蛍光強度が所定の最大値以下であるという条件を加えてもよい。
単染色スペクトル及び自家蛍光スペクトルの線形和による測定スペクトルの近似は最小二乗法を用いて行うことができ、具体的には、下記式で示される評価関数が最小値となるパラメータａｋ（ｋ＝１〜Ｍ）を求めることにより、各蛍光色素からの蛍光強度及び自家蛍光強度を算出できる。
【００１２】
【数１】
0005601098.tif 000002
（式中、Ｘｋ（ｘｉ）は、ｋ番目の蛍光色素の単染色スペクトルあるいは自家蛍光スペクトルにおけるｉ番目の光検出器の検出値を表す。また、ｙｉは、測定スペクトルにおけるｉ番目の光検出器の検出値を表す。σｉは、ｉ番目の光検出器の検出値に対する重みの逆数を表す。）
【００１３】
また、本発明は、蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する測定手段と、各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う算出手段と、を含む蛍光強度算出装置をも提供する。
【００１４】
本発明において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、複数の蛍光色素により標識された微小粒子を複数の光検出器によってマルチカラー測定する場合に、各蛍光色素からの蛍光強度を正確に算出してユーザに提示する技術が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】測定スペクトルを単染色スペクトルの線形和により近似して得られる近似曲線を説明するグラフである。
【図２】Ｎ×Ｍ行例Ａの要素を説明する図である。
【図３】従来の補正行列を用いた蛍光補正方法を説明する図である。
【図４】従来の補正行列の行列要素を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．蛍光強度補正方法
（１）測定手順
（２）算出手順
（２−１）フィッティング演算
（２−１−１）近似曲線
（２−１−２）制約条件
（２−１−３）自家蛍光
（２−２）ａｋの算出方法
（２−２−１）線形最小二乗法
（２−２−２）正規方程式
（２−２−３）特異値分解
２．蛍光強度算出装置
【００１８】
１．蛍光強度補正方法
本発明に係る蛍光強度補正方法は、以下の２つの手順を含む。
測定手順：蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光する手順。
算出手順：各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する際に、算出される蛍光強度値に所定の制約条件を設けて補正演算を行う手順。
【００１９】
（１）測定手順
まず、測定対象とする微小粒子を複数の蛍光色素を用いて多重標識する。微小粒子の蛍光色素標識は従来公知の手法によって行うことができる。例えば測定対象を細胞とする場合には、細胞表面分子に対する蛍光標識抗体と細胞とを混合し、細胞表面分子に抗体を結合させる。蛍光標識抗体は、抗体に直接蛍光色素を結合させたものであってよく、ビオチン標識した抗体にアビジンを結合した蛍光色素をアビジン・ビオチン反応によって結合させたものであってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
【００２０】
蛍光色素には、従来公知の物質を２以上組み合わせて用いることができる。例えば、フィコエリスリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−テキサスレッド(PE-Texas red)、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ７、エチジウムブロマイド（Ethidium bromide）、プロピジウムアイオダイド（Propidium iodide）、ヘキスト（Hoechst）33258/33342、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ（Acridine orange）、クロモマイシン（Chromomycin）、ミトラマイシン（Mithramycin）、オリボマイシン（Olivomycin）、パイロニン（Pyronin）Ｙ、チアゾールオレンジ（Thiazole orange）、ローダミン（Rhodamine）１０１イソチオシアネート（isothiocyanate）、ＢＣＥＣＦ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１−ＡＭＡ、エクオリン（Aequorin）、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｄｏ−１−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ、オキソノール（Oxonol）、テキサスレッド(Texas red)、ローダミン（Rhodamine）１２３、１０−Ｎ−ノニ−アクリジンオレンジ（Acridine orange）、フルオレセイン（Fluorecein）、フルオレセインジアセテート（Fluorescein diacetate）、カルボキシフルオレセイン（Carboxyfluorescein）、カルビキシフルオレセインジアセテート（Caboxyfluorescein diacetate）、カルボキシジクロロフルオレセイン（Carboxydichlorofluorescein）、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテート（Carboxydichlorofluorescein diacetate）が挙げられる。
【００２１】
次に、複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に対して光を照射し、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光する。測定手順は、従来公知のマルチカラー測定フローサイトメータを用いた方法と同様にして行うことができる。
【００２２】
（２）算出手順
算出手順においては、測定手順で取得された各光検出器の検出値を補正演算して各蛍光色素からの蛍光強度を算出する。この際、本発明に係る蛍光強度補正方法では、算出される蛍光強度が所定の最小値以上であるという制約条件下で補正演算を行う。
【００２３】
補正演算は、補正行列を用いた従来方法により行うことができる。また、補正演算として、各光検出器の検出値を収集して得られる測定スペクトルを、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子で得られる単染色スペクトル等の線形和により近似するフィッティング演算を採用することもできる。以下、フィッティング演算による例について詳しく説明する。
【００２４】
（２−１）フィッティング演算
（２−１−１）近似曲線
フィッティング演算では、測定スペクトルを単染色スペクトルの線形和により近似することにより、各蛍光色素からの真の蛍光強度を算出する。この際、単染色スペクトルに自家蛍光スペクトルも加えて、これらの線形和による近似を行ってもよい。「測定スペクトル」とは、蛍光波長帯域の重複する複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して得られるものである。また、「単染色スペクトル」とは、各蛍光色素の蛍光波長分布であり、各蛍光色素を個別に標識した微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を光検出器で受光し、検出値を収集して得られるものである。さらに、「自家蛍光スペクトル」とは、微小粒子そのものが発する蛍光の波長分布であり、蛍光色素を標識していない微小粒子に光を照射することによって微小粒子から発生する蛍光を光検出器で受光し、検出値を収集して得られるものである。上記の測定スペクトルのスペクトル成分には、自家蛍光スペクトルが含まれ得る。
【００２５】
図１に基づいて、測定スペクトルを単染色スペクトルの線形和により近似して得られる近似曲線について説明する。
【００２６】
図中、Ｘ軸は観測点を、Ｙ軸は検出値を示す。図では、光検出器ｘ１で受光された蛍光の検出値をｙ１、光検出器ｘ２で受光された蛍光の検出値をｙ２、光検出器ｘｎで受光された蛍光の検出値をｙｎで示している。各検出値ｙ１〜ｙｎを結ぶ線が測定スペクトルである。
【００２７】
また、図では、１番目の蛍光色素（蛍光色素１）の単染色スペクトルを表す曲線（基底関数）をＸ１（ｘ），２番目の蛍光色素（蛍光色素２）の単染色スペクトルを表す曲線をＸ２（ｘ），Ｍ番目の蛍光色素（蛍光色素Ｍ）の単染色スペクトルを表す曲線をＸＭ（ｘ）で示している。単染色スペクトルは、測定の都度に各蛍光色素を個別に標識したサンプルを調製して取得してもよく、あるいは予め記憶された標準スペクトルを利用してもよい。
【００２８】
各光検出器では、蛍光色素１から蛍光色素Ｍまでの全ての蛍光色素からの蛍光がそれぞれ所定比率で漏れ込んだ状態で受光される。そのため、各光検出器の検出値は、蛍光色素１から蛍光色素Ｍまでの基底関数にそれぞれ所定比率を乗じた値の和として下記式（１）によって近似することができる。ここで、各光検出器への各蛍光色素からの蛍光の漏れ込み比率ａｋは、各蛍光色素の発光強度（真の蛍光強度）により規定される。
【００２９】
【数２】
0005601098.tif 000003
【００３０】
具体的には、例えば、光検出器ｘ１の検出値ｙ１は、蛍光色素１の蛍光強度Ｘ１（ｘ１）に比率ａ１を乗じた値から蛍光色素Ｍの基底関数ＸＭ（ｘ１）に比率ａＭを乗じた値までの和ｙ（ｘ１）として近似される。そして、光検出器ｘ１への蛍光色素１〜Ｍからの蛍光の漏れ込み比率ａｋ（ｋ＝１〜Ｍ）は、蛍光色素１〜Ｍの発光強度に相応する。
【００３１】
（２−１−２）自家蛍光
測定スペクトルのスペクトル成分には、自家蛍光スペクトルが含まれ得る。従って、測定スペクトルの線形和による近似は、単染色スペクトルに加えて自家蛍光スペクトルも加えて行ってもよい。自家蛍光スペクトルは、測定の都度に蛍光色素を標識していないサンプルを調製して取得してもよく、あるいは予め記憶された標準スペクトルを利用してもよい。微小粒子の自家蛍光に起因した検出値を含めて演算を行う場合、上記式（１）において、基底関数ＸＭ（ｘ１）の定義に、蛍光色素の単染色スペクトルを表す曲線に加えて、自家蛍光スペクトルを表す曲線を含める。自家蛍光スペクトルは、微小粒子のサブポピュレーション毎に異なる可能性があるため、サンプルに複数のサブポピュレーションが含まれる場合には、サブポピュレーション毎に設定した複数の基底関数ＸＭ（ｘ）を用いる。
【００３２】
各光検出器では、蛍光色素からの蛍光に加えて、自家蛍光成分も所定比率で漏れ込んだ状態で受光される。そのため、各光検出器の検出値は、各蛍光色素の基底関数と自家蛍光の基底関数にそれぞれ所定比率を乗じた値の和によって近似することができる。ここで、各光検出器への自家蛍光の漏れ込み比率ａｋも、自家蛍光の発光強度（真の蛍光強度）により規定される。
【００３３】
具体的には、例えば、光検出器ｘ１の検出値ｙ１は、蛍光色素１の蛍光強度Ｘ１（ｘ１）に比率ａ１を乗じた値から蛍光色素Ｌの基底関数ＸＬ（ｘ１）に比率ａＬを乗じた値までの和に、さらに自家蛍光（Ｌ＋１）の蛍光強度ＸＬ＋１（ｘ１）に比率ａＬ＋１を乗じた値から自家蛍光Ｍの蛍光強度ＸＭ（ｘ１）に比率ａＭを乗じた値までの和を加えた和ｙ（ｘ１）として近似される。そして、光検出器ｘ１への自家蛍光の漏れ込み比率ａｋ（ｋ＝（Ｌ＋１）〜Ｍ）は、自家蛍光の発光強度に相応する。なお、ここで、Ｌは、用いる蛍光色素数とサンプル中の微小粒子のサブポピュレーション数に応じて１〜Ｍまでの間で設定される整数である。
【００３４】
従来の蛍光補正方法では、各光検出器の検出値から、ポピュレーション全体の自家蛍光強度の平均値をバックグランドとして一律に減算していた。このため、サブポピュレーション毎の自家蛍光の強度やパターンの違いを演算要素から排除してしまうこととなり、蛍光強度の算出値の誤差要因となっていた。本発明に係る蛍光強度補正方法では、微小粒子の自家蛍光成分を含めて演算を行うことにより、サブポピュレーション毎に異なる自家蛍光成分を厳密に演算して、サブポピュレーション間の自家蛍光強度のばらつきに起因する測定誤差を解消できる。
【００３５】
算出された各サブポピュレーションの自家蛍光強度は、蛍光色素からの蛍光強度と同様に、その情報を二次元相関図（サイトグラム）上に表示し、ユーザに提示するようにしてもよい。これにより、ユーザが自家蛍光強度の大小により、所望のサブポピュレーションを選択（ゲーティング）したり、微小粒子の種類や状態を判定したりすることができ、新たな解析手法を提供できる。
【００３６】
（２−１−３）制約条件
この式（１）で示される近似曲線は、後述する線形最小二乗法を用いてａｋを求めることにより得られる。このａｋは、各蛍光色素の真の蛍光強度あるいは微小粒子の自家蛍光強度に同等であり、物理的に負値にはなり得ない値である。そこで、本発明に係る蛍光強度補正方法では、このａｋについて、所定の最小値以上であるという制約条件（下限値条件）を設けて補正演算を行う。制約条件の最小値は、具体的には、各蛍光色素の蛍光強度あるいは微小粒子の自家蛍光強度は負値になり得ないことから、０を用いることができる。さらに、最小値には、０よりも大きい値を用いてもよい。加えて、ａｋについて、所定の最大値よりも小さいという第二の制約条件（上限値条件）をさらに設けて補正演算を行うこともできる。
【００３７】
下限値条件を設けて補正演算を行うことにより、蛍光色素からの蛍光強度が負値として算出されることに起因する測定誤差や二次元相関図（サイトグラム）上のポピュレーション減少の問題を解決できる。
【００３８】
また、自家蛍光は、その強度が蛍光色素の蛍光強度と比べて小さく、信号品質として良くない。そのため、自家蛍光強度の算出値には、各光検出器の検出値に含まれるノイズが大きく影響し、誤差を生じる要因となる。自家蛍光の検出値に、下限値条件及び／又は上限値条件を設けて演算を行うことにより、ノイズに起因する測定誤差の問題を解決できる。
【００３９】
特に、測定対象微小粒子の自家蛍光強度が大きく、蛍光色素からの蛍光強度が相対的に小さい場合には、微小粒子の蛍光の陰性あるいは陽性の判定が困難となる。自家蛍光の検出値に下限値条件として０を加えることで、陰性データの検出値は必ず０となるため、蛍光色素からの蛍光強度が相対的に小さい場合にも、陽性データの判定が容易となる。
【００４０】
（２−２）ａｋの算出方法
（２−２−１）線形最小二乗法
以下に、ａｋを求めるための具体的な手順を説明する。ここでは、測定スペクトルを単染色スペクトルのみの線形和により近似する場合を説明するが、この手順は、自家蛍光スペクトルも加えて近似する場合にも適用が可能である。まず、下記式（２）で示される評価関数（カイ二乗）を定義する。そして、この式（２）が最小値となるようなパラメータａｋ（ｋ＝１〜Ｍ）を求める。
【００４１】
【数３】
0005601098.tif 000004
（式中、σｉは、ｉ番目の光検出器の測定値に対する重みの逆数を表す。例えばｉ番目の光検出器の測定誤差分散などでもよく、もしそのような重みの逆数がなければ全て1としてもよい。）
【００４２】
（２−２−２）正規方程式
次に、下記式（３）の要素から構成されるＮ×Ｍ行例Ａ（図２参照）と、長さＮのベクトルｂ（下記式（４））を定義し、当てはめにより得たＭ個のパラメータａ１〜ａＭを並べたベクトルをａとおく。
【００４３】
【数４】
0005601098.tif 000005
【００４４】
【数５】
0005601098.tif 000006
【００４５】
上記（２）式が最小値をとるのは、χ２をＭ個のパラメータａｋで微分した値がすべて０になるときである。
【００４６】
【数６】
0005601098.tif 000007
【００４７】
上記式（５）は、和をとる順番を換えると次式のような行列方程式（正規方程式）の形にできる。
【００４８】
【数７】
0005601098.tif 000008
【００４９】
ここで、［ａｋj］はＭ×Ｍ行列、［βｋ］は長さＭのベクトルである。
【００５０】
【数８】
0005601098.tif 000009
【００５１】
【数９】
0005601098.tif 000010
【００５２】
従って、上記式（５）は、行列形で書くと次式のようになる。
【００５３】
【数１０】
0005601098.tif 000011
【００５４】
式（９）は、Ｍ元連立一次方程式であり、これを解くことによってａｊが得られる。
【００５５】
（２−２−３）特異値分解
上記の正規方程式を用いた方法に替えて特異値分解により、Ｍ個のパラメータａ１〜ａＭを並べたベクトルａを求めても良い。
【００５６】
特異値分解（ＳＶＤ）とは、任意のＮ×Ｍ行列Ａが、３個の行列Ｕ，Ｗ，ＶＴの積の形（下記式（１０））に書ける線形代数の定理に基いている。行列ＵはＮ×Ｍの列直交行列、行列ＷはＭ×Ｍの対角行列（対角成分ｗｉは非負で、特異値と称される）、行列ＶＴはＭ×Ｍの直交行列Ｖの転置である。また、行列Ｕ，Ｖは正規直交行列であり、各列が互いに正規直交である（下記式（１１）参照）。
【００５７】
【数１１】
0005601098.tif 000012
【００５８】
【数１２】
0005601098.tif 000013
【００５９】
上記式（２）は、次式のように書きなおすことができる。
【００６０】
【数１３】
0005601098.tif 000014
【００６１】
行列Ａを特異値分解して、上記式（１０）のように行列Ｕ，Ｗ，Ｖが得られたとき、式（１２）を最小にするベクトルａは次式により求められる。この操作は、後退代入と呼ばれる。もし、ｗｉの中で十分に小さい値があれば、１／ｗｉを０と置き換えて処理を進める。
【００６２】
【数１４】
0005601098.tif 000015
【００６３】
２．蛍光強度算出装置
本発明に係る蛍光強度算出装置は、従来のフローサイトメータ等と同様に流体系と光学系、分取系、データ処理系などから構成される。
【００６４】
流体系は、フローセルにおいて測定対象とする微小粒子を含むサンプル液をシース液の層流の中心に流し、フローセル内に微小粒子を一列に配列させる手段である。フローセルに替えて、マイクロチップ上に形成した流路内において、微小粒子を一列に配列させてもよい。
【００６５】
光学系は、蛍光色素により標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を光検出器で受光する測定手段である。光学系では、微小粒子から発生する前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光も検出される。光学系は、具体的には、レーザ光源と、微小粒子に対してレーザ光を集光・照射するための集光レンズやダイクロイックミラー、バンドパスフィルター等からなる照射系と、レーザ光の照射によって微小粒子から発生する蛍光や散乱光を検出する検出系と、によって構成される。検出系は、例えば、PMT（photo multiplier tube）や、CCDやCMOS素子等のエリア撮像素子等によって構成され、受光波長帯域の異なる光検出器が複数配設される。
【００６６】
微小粒子の分取を行う場合には、サンプル液を、微小粒子を含む液滴としてフローセル外の空間に吐出し、液滴の移動方向を制御して所望の特性を備えた微小粒子を分取する。分取系は、サンプル液を液滴化してフローセルから吐出させるピエゾ素子等の振動素子と、吐出される液滴に電荷を付与する荷電手段と、液滴の移動方向に沿って、移動する液滴を挟んで対向して配設された対電極などから構成される。
【００６７】
データ処理系は、光検出器から検出値を電気信号として入力され、電気信号に基づいて微小粒子の光学特性を解析する。データ処理系は、各光検出器から検出値を収集して得られる測定スペクトルを、上述した方法に従って単染色スペクトル及び自家蛍光スペクトルの線形和により近似し、各蛍光色素から発生した真の蛍光強度と微小粒子の自家蛍光強度を算出する。このため、データ処理系は、上述した本発明に係る蛍光強度算出方法の各ステップを実行するためのプログラムを記憶するハードディスク等の記録媒体と、プラグラムを実行するCPU及びメモリ等を有する。
【００６８】
データ処理系には、各光検出器からの信号の品質を向上させるため、各光検出器間のデータの平滑化を行うノイズフィルタを設けることが好ましい。平均化処理は、光検出器の数や受光波長帯域、使用する蛍光色素や、測定対象微小粒子の自家蛍光波長、さらに各機器のノイズ周波数成分等を考慮して行われる。データの平滑化を行うことにより、ノイズの影響を抑えることが可能となり、演算精度が向上し、より正確に蛍光強度を算出できる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明に係る蛍光強度補正方法等によれば、複数の蛍光色素により標識された微小粒子を複数の光検出器によってマルチカラー測定する場合に、各蛍光色素からの蛍光強度を正確に算出してユーザに提示できる。従って、本発明に係る蛍光強度補正方法等は、細胞等の微小粒子の特性をより詳細に解析するため寄与し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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