(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(IA)又は(IB)：
【化１】
0005441882.tif 000005
（式中、R1はベンゼン環上に存在する1個又は2個以上のシアノ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、及びスルホ基からなる群から選ばれる置換基を示し、R2及びR3はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R4及びR5はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し、R6は水素原子又はアルキル基を示す〕で表される化合物又はその塩。
【請求項２】
R1がベンゼン環上の1個のシアノ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、又はスルホ基であり、R2及びR3が水素原子であり、R4及びR5が水素原子であり、R6が水素原子である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項３】
キサンテン環に結合するベンゼン環において、R1が置換するフェニル基が結合するジカルボニル基の結合位置がキサンテン環に対してパラ位である請求項１に記載の化合物又はその塩。
【請求項４】
請求項１に記載の一般式(IA)又は(IB)で表される化合物又はその塩を含む過酸化水素測定用試薬。
【請求項５】
ヒトの生体外において過酸化水素を測定する方法であって、下記の工程：(A)請求項４に記載の試薬と過酸化水素とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した上記試薬由来の分解物の蛍光を測定する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は過酸化水素に特異的に反応する蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
過酸化水素は古くから生体の障害因子として知られている。もっとも、近年ではスーパーオキサイドや過酸化水素といった比較的酸化力の弱い活性酸素種は生体のシグナル伝達因子として利用されていると考えられている。過酸化水素の生体内挙動を可視化するために過酸化水素を特異的に可視化する手段が求められているが、従来、過酸化水素を含む活性酸素種に反応する蛍光プローブは知られているものの（特許文献１）、過酸化水素に対して特異的に反応し、その他の活性酸素種には実質的に反応しない蛍光プローブは開発されていない。
【特許文献１】特開2004-200921号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の課題は過酸化水素に特異的に反応する蛍光プローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記の一般式(I)で表される化合物が過酸化水素と反応して大幅な蛍光強度の増大を示す一方、その他の活性酸素種（ヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、スーパーオキサイド、一酸化窒素、一重項酸素）に対しては実質的に反応性を有しておらず、蛍光強度の増大を示さないことを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成された。
すなわち、本発明により、下記の一般式(IA)又は(IB)：
【化１】
0005441882.tif 000002
（式中、R1はベンゼン環上に存在する1個又は2個以上の電子吸引性置換基を示し、R2及びR3はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し；R4及びR5はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示し、R6は水素原子又はアルキル基を示す〕で表される化合物又はその塩が提供される。【０００５】
上記発明の好ましい態様によれば、R1がベンゼン環上の1個のシアノ基、ハロゲン原子、カルボキシ基、又はスルホ基であり、R2及びR3が水素原子であり、R4及びR5が水素原子であり、R6が水素原子である化合物又はその塩；キサンテン環に結合するベンゼン環において、R1が置換するフェニル基が結合するジカルボニル基の結合位置がキサンテン環に対してパラ位である上記の化合物又はその塩が提供される。【０００６】
別の観点からは、本発明により、上記の一般式(IA)又は(IB)で表される化合物又はその塩を含む過酸化水素測定用試薬が提供される。この試薬は過酸化水素特異的蛍光プローブとして有用である。【０００７】
さらに別の観点からは、本発明により、過酸化水素の測定方法であって、下記の工程：(A)上記の試薬と過酸化水素とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した上記試薬由来の分解物の蛍光を測定する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により提供される過酸化水素測定用試薬は、種々の活性酸素のなかで過酸化水素に対して特異的に反応して強い蛍光を発する性質を有しており、過酸化水素を高い感度で特異的に測定することができるという優れた特徴を有している。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の過酸化水素測定用試薬の特性を示した図である。(A) 化合物5（1μM）に過酸化水素 （H2O2）(100μM)を添加した場合の蛍光スペクトル（励起波長490 nm）の時間変化；(B) 化合物5（1μM）に過酸化水素（100μM、30分間）、ヒドロキシルラジカル（hydroxylradical）（10μM）、パーオキシナイトライト（peroxynitrite）（10μM）、次亜塩素酸イオン(hypochlorite) (10μM)、一酸化窒素発生剤のNOC13 (100μM)、 一重項酸素発生剤の3-(1，4-ジヒドロ-1,4-エピジオキシ-1-ナフチル)プロピオン酸（EP-1） (100μM)を添加した場合の520 nm（励起波長490 nm）における相対蛍光強度；(C) 化合物5（10μM）に対してヒポキサンチン/キサンチンオキシダーゼ（HPX/xanthine oxidase（X.O.））系を用いてスーパーオキサイド (10μM)を反応させた場合の520 nm（励起波長490 nm）における相対蛍光強度を示す。
【図２】RAW264.7細胞のイメージング像を示した図である。A)刺激なし；B) リポポリサッカライド（LPS）およびインターフェロン-γ（IFN-γ)で刺激あり、について励起波長470-495 nm、蛍光波長510-550 nmでの蛍光イメージング結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
R1はベンゼン環上に存在する1個又は2個以上、好ましくは1個の電子吸引性置換基を示す。電子吸引性置換基の種類は特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子）、シアノ基、カルボキシ基、スルホ基などが例示されるがこれらに限定されることはない。R1としては例えばシアノ基が好ましい。R1はベンゼン環上に1個又は2個以上存在することができ、2個以上存在する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。R1の結合位置は特に限定されないが、1個の場合にはジカルボニル基に対してパラ位であることが好ましい。また、R1の電子吸引性を損なわない限り、R1が置換するベンゼン環上にはR1以外の置換基（例えばメチル基などの電子供与性置換基）が1個又は2個以上存在していてもよい。R1が1個のシアノ基であり、ジカルボニル基に対してパラ位に結合することが好ましい。この場合において該ベンゼン環上にはR1以外の置換基が存在しないことが好ましい。【００１１】
R2及びR3はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示すが、R2及びR3は水素原子であることが好ましい。R4及びR5はそれぞれ独立に水素原子、アルキルカルボニル基、又はアルキルカルボニルオキシメチル基を示す。アルキルカルボニル基又はアルキルカルボニルオキシメチル基のアルキル部分としては直鎖状又は分枝鎖状のC1-6アルキル基が好ましい。R4及びR5は水素原子であることが好ましい。R6は水素原子又はアルキル基を示す。アルキル部分としては直鎖状又は分枝鎖状のC1-6アルキル基が好ましい。R6としては水素原子が好ましい。【００１２】
キサンテン環に結合するベンゼン環において、R1が置換するフェニル基が結合するジカルボニル基の結合位置は特に限定されないが、キサンテン環に対してパラ位であることが好ましい。【００１３】
上記一般式(IA)又は(IB)で表される本発明の化合物は酸付加塩又は塩基付加塩として存在することができる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、又はメタンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩などを挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩などの有機アミン塩などを挙げることができる。これらのほか、グリシンなどのアミノ酸との塩を形成する場合もある。本発明の化合物又はその塩は水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。【００１４】
上記一般式(IA)又は（IB）で表される本発明の化合物は、置換基の種類により、1個又は2個以上の不斉炭素を有する場合があるが、1個又は2個以上の不斉炭素に基づく光学活性体や2個以上の不斉炭素に基づくジアステレオ異性体などの立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。また、R6が水素原子の場合にはカルボキシ基がラクトンを形成する場合もあるが、本発明の範囲にはこのような構造異性体も包含される。なお、一般式(IA)においてR4が水素原子である化合物と一般式(IB)においてR6が水素原子である化合物は互変異性体に相当しているが、このような互変異性体の存在は当業者に容易に理解されることであり、いずれの互変異性体も本発明の範囲に包含される。【００１５】
本発明の化合物の代表的化合物の製造方法を本明細書の実施例に詳細かつ具体的に示した。当業者は、本実施例の説明を基にして反応原料、反応条件、及び反応試薬などを適宜選択し、必要に応じてこれらの方法に修飾や改変を加えることによって、上記一般式で表される本発明の化合物をいずれも製造することができる。なお、原料化合物として用いることができる4-アミノフルオレセインなどのフルオレセイン誘導体は、例えば、亀谷哲治著、有機合成化学IX、南江堂、215頁(1977年)等に記載の方法に準じて製造できる。【００１６】
本明細書において用いられる「測定」という用語は、定量、定性、又は診断などの目的で行われる測定、検査、検出などを含めて、最も広義に解釈しなければならない。本発明による過酸化水素の測定方法は、一般的には、(A)上記の試薬と過酸化水素とを反応させる工程、及び(B)上記工程(A)で生成した上記試薬由来の分解物の蛍光を測定する工程を含んでいる。上記一般式(IA)又は(IB)で表される化合物はそれ自体が無蛍光性又は弱蛍光性であるが、過酸化水素と接触すると過酸化水素の作用により分解して強蛍光性の5-カルボキシフルオレセインを生成する。【００１７】
本発明の過酸化水素測定用試薬は、種々の活性酸素種、すなわちヒドロキシルラジカル、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、一酸化窒素、過酸化水素、スーパーオキサイドアニオン、及び一重項酸素などのうち、過酸化水素に特異的に反応する性質を有しており、過酸化水素を特異的に測定可能な試薬である。【００１８】
本発明の試薬を用いた蛍光測定手段は特に限定されないが、イン・ビトロで蛍光スペクトルを測定する方法や、バイオイメージングの手法を用いてイン・ビボで蛍光スペクトルを測定する方法などを採用することができる。例えば、定量を行う場合には、常法に従って予め検量線を作成しておくことが望ましい。本発明の試薬はマイクロインジェクション法等により細胞内に取り込ませれば、個々の細胞内に局在する過酸化水素をバイオイメージング手法により高感度にリアルタイムで測定することができるほか、細胞培養液又は組織切片等の培養液又は灌流液中に用いることで細胞や生体組織が放出する過酸化水素を測定できる。すなわち、本発明の試薬を用いることにより、細胞又は生体組織での過酸化水素の挙動をリアルタイムに測定することが可能であり、疾患病態の原因究明、治療薬の開発などに好適に利用できる。【００１９】
本発明の試薬は、必要に応じて試薬の調製に通常用いられる添加剤を配合して組成物として用いてもよい。例えば、生理的環境で試薬を用いるための添加剤として、溶解補助剤、pH調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供される。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
【化２】
0005441882.tif 000003
【００２１】
(1) 5-(4-Cyanophenylethynyl)fluorescein diacetate (4)の合成
化合物3をJ. Org. Chem., 2003, 68, 8264-8267を参照して合成した。280 mg (0.516mmol)の化合物3、80 mg (0.629 mmol)の4-エチニルベンゾニトリル、22.8 mg (0.0325 mmol)のジクロロビス(トリフェニルホスフィン)パラジウムおよび28.4 mg (0.149 mmol)のヨウ化銅を20 mlのテトラヒドロフラン (THF)に懸濁し、これに0.27 ml (1.95 mmol)のトリエチルアミンを加え、反応液をアルゴン雰囲気下室温で12時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的化合物216 mg (0.399 mmol;収率 74%)を得た。【００２２】
(2) 5-(4-Cyanobenzoyl)carbonylfluorescein (5)の合成
72.4 mg (0.137 mmol)の化合物4を1 mlのジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解させ、そこに4.37 mg (0.0246 mmol)の塩化パラジウムを加え、反応液をアルゴン雰囲気下100℃で10時間攪拌した。反応液を室温まで冷却した後、10 mlのメタノールと100 mgの炭酸カリウムを加え、室温で30分間攪拌した。反応液中のメタノールを減圧留去し、2N 塩酸を加えて中和してから分取HPLCにより精製し、目的物32.0 mg (0.0654 mmol;収率 48%)を得た。
1H NMR (300MHz, DMSO-d6) δ 10.1 (s, 1H), 8.50 (m, 1H), 8.37 (d, 1H, J = 8.07 Hz), 8.20 (d, 2H, J = 8.25 Hz), 8.10 (d, 2H, J = 8.07 Hz), 7.51 (d, 1H, J = 8.04 Hz), 6.69 (d, 2H, J = 1.65 Hz), 6.63 (d, 2H, J = 8.61 Hz), 6.54 (dd, 2H, J = 8.79, 1.65 Hz)
13C NMR (100MHz, DMSO-d6) δ 191.2, 190.7, 167.5, 159.8, 157.8, 151.8, 136.7, 135.5, 133.8, 133.0, 130.8, 129.3, 127.0, 125.1, 118.0, 116.8, 112.8, 108.5, 102.3
HRMS (ESI-) Calcd for [M-H], 488.07703, Found, 488.07359 (-3.43mmu)【００２３】
例２
化合物5はキサンテン環からベンジル構造へのPhoto-induced electron Transfer (PeT)機構により消光し、それ自体は弱蛍光性である。一方、過酸化水素との反応により強蛍光性の5-カルボキシフルオレセインを生成する。
【化３】
0005441882.tif 000004
【００２４】
図１(A)には化合物5（1μM）に過酸化水素 (100μM)を添加した場合の蛍光スペクトル（励起波長490 nm）の時間変化（5、15、30、60分後）を示した。(B)には、化合物5（1μM）に過酸化水素（100μM、30分間）、ヒドロキシルラジカル（10μM）、パーオキシナイトライト（10μM）、次亜塩素酸イオン (10μM)、一酸化窒素発生剤のNOC13 (100μM)、一重項酸素発生剤のEP-1 （3−(1，4−ジヒドロ-1,4-エピジオキシ-1-ナフチル)プロピオン酸）(100μM)を添加した場合の520 nm（励起波長490 nm）における相対蛍光強度を示した。なお、ヒドロキシルラジカル（10μM）の試験系への添加は、化合物5溶液に過酸化水素（10μM）の添加後、直ちに過塩素酸鉄（II）の精製水溶液（10μM）を添加し、フェントン反応によりヒドロキシルラジカルを発生させる方法で行った。(C)には化合物5（10μM）に対して キサンチンオキシダーゼ（xanthine oxidase（x.o.））（2.38 mUnit/L）及びヒポキサンチン（HPX）10μMを加えたヒポキサンチン/キサンチンオキシダーゼ(HPX/x.o.)系を用いてスーパーオキサイド (10μM)を反応させた場合、該HPX/x.o.系にさらにスーパーオキサイドディスムターゼ（SOD）(60 Unit/L)を共存させた場合、また該HPX/x.o.系においてSODの代わりにカタラーゼ（100 Unit/L）を共存させた場合、のそれぞれについて520 nm（励起波長490 nm）における相対蛍光強度を示した。【００２５】
(A) 化合物5に過酸化水素を添加した場合、経時的に蛍光強度の増大が観察された。
(B) 化合物5に過酸化水素、ヒドロキシルラジカル（hydroxylradical）、パーオキシナイトライト（peroxynitrite）、次亜塩素酸イオン(hypochlorite) 、NOC13 、EP-1をそれぞれ添加した場合を比較すると、過酸化水素を添加した場合にのみ蛍光強度の増大が観察され、その他の活性酸素種では蛍光強度の増大を示さないことが確認された。
(C) 化合物5に対してHPX/x.o.系を用いてスーパーオキサイド を反応させた場合、コントロール(Hnon)に対して蛍光強度は増大した。HPX/x.o.系にSODを添加しても蛍光強度の増大の程度に大きな変動はなかった。一方、カタラーゼ添加により蛍光強度の増大が抑制されコントロール(Hnon)付近まで低下した。これより、HPX/x.o.系で観察される蛍光強度の増大はスーパーオキサイドの不均化反応産物である過酸化水素によるものであると考えられた。以上の成績より、本発明の化合物5は、過酸化水素特異的蛍光プローブとしての性質を有しており、過酸化水素測定用試薬として使用できると結論された。また、HPX/x.o.系にカタラーゼを共存させた場合の成績より、本発明の化合物は、カタラーゼの活性測定用としても使用できることが確認された。【００２６】
例３
化合物5は生細胞における過酸化水素の検出にも適用できることを確認した。リポポリサッカライド(LPS)(50μg/ml)およびインターフェロン-γ（IFN-γ）(100 unit/ml)でRAW264.7細胞を12時間刺激した後、化合物5のジアセチル体を細胞にロードし、それから2時間後にオリンパス社製のU-MNIBA2フィルターセット（励起波長470-495 nm、蛍光波長510-550nm）を用い蛍光顕微鏡観察した(図2)。刺激していない細胞に化合物5をロードした場合（A）に比べて、刺激を加えた細胞では蛍光強度の増大が観察された（B）。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明により提供される過酸化水素測定用試薬は、種々の活性酸素のなかで過酸化水素に対して特異的に反応して強い蛍光を発する性質を有しており、過酸化水素を高い感度で特異的に測定することができるので、過酸化水素の生体内挙動を可視化するために有用である。
【図１】
0005441882.tif 000006
【図２】
0005441882.tif 000007