(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
白血病細胞の細胞表面に発現している配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するＣＤ１７９ｂタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体を有効成分として含むことを特徴とする、白血病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、ＣＤ１７９ｂタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体を有効成分として含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の白血病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項５】
配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、ＣＤ１７９ｂタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体を有効成分として含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の白血病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体がヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、請求項４又は５に記載の白血病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ１７９ｂに対する抗体又はそのフラグメントの、癌の治療及び／又は予防剤等としての新規な医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩によって、癌に特異的に反応する抗体類、細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原類、癌抗原をコードする遺伝子類などが同定されており、癌抗原類をターゲットにした特異的癌治療法への期待が高まっている（非特許文献１）。【０００３】
癌治療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが望ましい。１９９１年、ベルギー国Ｌｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは、自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献２）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（非特許文献３；特許文献１）、この方法により、正常細胞にはほとんど発現がなく、癌に特異的に発現するいくつかの癌抗原が単離されている（非特許文献４〜９）。さらに、その一部をターゲットにして、癌抗原に特異的に反応する免疫細胞を用いた細胞療法や、癌抗原を含むワクチンなどの癌特異的免疫療法の臨床試験が実施されている。【０００４】
一方、近年、癌細胞上の抗原タンパク質を標的にした、癌を治療するための各種抗体医薬が世の中に台頭してきた。癌特異的治療薬として一定の薬効が得られ注目されているが、標的となる抗原タンパク質の大部分は正常細胞にも発現するものであり、抗体投与の結果、癌細胞だけでなく、抗原が発現する正常細胞も障害されてしまい、その結果生じる副作用が問題になっている。従って、癌細胞表面に特異的に発現する癌抗原を同定し、それを標的とした抗体を医薬品として使用することができれば、より副作用の少ない抗体医薬による治療が可能になると期待される。【０００５】
ＣＤ１７９ｂは免疫グロブリンの代替軽鎖の一部であり、B細胞の前駆細胞（プレB細胞およびプロB細胞）の膜表面に発現していることが知られている。B細胞の分化に伴い消滅し、成熟B細胞では発現しない。しかしながら、ＣＤ１７９ｂは、プレB細胞が癌化した白血病（プレB細胞性白血病）細胞において発現していることが知られている（非特許文献１０，１１）。またＣＤ１７９ｂは、プレB細胞が癌化したリンパ腫（プレB細胞性リンパ腫）細胞においても発現しており、プレB細胞性リンパ腫の診断マーカーとして利用されうることが知られている（非特許文献１２）。しかしながら、プレB細胞性白血病細胞以外の白血病細胞、プレB細胞性リンパ腫以外のリンパ腫および乳癌細胞等において特異的に発現しているという報告はない。また、ＣＤ１７９ｂに対する抗体が癌の治療及び／又は予防に有用であることを示唆する報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第5698396号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】秋吉毅，「癌と化学療法」、1997年、第２４巻、ｐ551-519
【非特許文献２】Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647(1991)
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813(1995)
【非特許文献４】Int.J.Cancer,72:965-971(1997)
【非特許文献５】Cancer Res., 58:1034-1041(1998)
【非特許文献６】Int.J.Cancer,29:652-658(1998)
【非特許文献７】Int.J.Oncol.,14:703-708(1999)
【非特許文献８】Cancer Res., 56:4766-4772(1996)
【非特許文献９】Hum. Mol. Genet６：33-39 (1997)
【非特許文献１０】Adv. Immunol., 63:1-41(1996)
【非特許文献１１】Blood, 92:4317-4324(1998)
【非特許文献１２】Modern Pathology,17:423-429(2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、癌細胞の表面に特異的に発現する癌抗原タンパク質を同定し、それを標的とした抗体の、癌の治療及び／又は予防剤としての用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌの乳癌組織由来ｃＤＮＡライブラリーと同一患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、取得した遺伝子のヒト相同性遺伝子を基にして、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するヒトＣＤ１７９ｂを作製した。そしてＣＤ１７９ｂが正常組織にはほとんど発現がなく、一方乳癌、白血病及びリンパ腫細胞に特異的に発現していることを見出した。そして、それらＣＤ１７９ｂに対する抗体が、ＣＤ１７９ｂを発現する癌細胞を障害することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。【００１１】
本発明は、配列番号３で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を有するＣＤ１７９ｂタンパク質、又は連続する７以上のアミノ酸を含むその断片、と免疫学的反応性を有する抗体又はそのフラグメントを有効成分として含むことを特徴とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。【００１２】
その実施形態において、上記癌は、ＣＤ１７９ｂ遺伝子を発現している癌である。【００１３】
別の実施形態において、上記癌は、乳癌、白血病又はリンパ腫である。【００１４】
別の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。【００１５】
別の実施形態において、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、又は二重特異性抗体である。【００１６】
別の実施形態において、上記抗体は、配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、ＣＤ１７９ｂタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体である。【００１７】
別の実施形態において、上記抗体は、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、ＣＤ１７９ｂタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体である。【００１８】
本発明はさらに、以下の抗体を提供する。【００１９】
（ｉ）配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、ＣＤ１７９ｂタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。【００２０】
（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、かつ、ＣＤ１７９ｂタンパク質と免疫学的反応性を有する抗体。【００２１】
（ｉｉｉ）細胞障害活性を有する、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の抗体。【００２２】
（ｉｖ）ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体である、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の抗体。【００２３】
本発明はさらに、以下のポリペプチド又はＤＮＡを提供する。【００２４】
（ｖ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００２５】
（ｖｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００２６】
（ｖｉｉ）配列番号１１０の塩基配列を含むＤＮＡ。【００２７】
（ｖｉｉｉ）配列番号１１１の塩基配列を含むＤＮＡ。【００２８】
（ｉｘ）配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列からなる群から選択される、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００２９】
（ｘ）配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列からなる群から選択される、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【発明の効果】
【００３０】
本発明で用いられるＣＤ１７９ｂに対する抗体は、癌細胞を障害する。従って、ＣＤ１７９ｂに対する抗体は癌の治療や予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ＣＤ１７９ｂタンパクをコードする遺伝子の、正常組織及び腫瘍細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；ＣＤ１７９ｂタンパクをコードする遺伝子の発現パターン、参照番号２；ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。
【図２】ＣＤ１７９ｂに対する抗体（抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８）の、ＣＤ１７９ｂを発現するヒト癌細胞株Namalwaが移植されたヌードマウスに対する抗腫瘍効果を示す図である。参照番号３；抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８を投与されたマウスの腫瘍の大きさを、参照番号４；ＰＢＳ（−）を投与されたマウスの腫瘍の大きさを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明が開示する配列表の配列番号３で示されるアミノ酸配列は、イヌ乳腺癌由来ｃＤＮＡライブラリーと同一患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチドのヒト相同因子（ホモログ）として単離された、ＣＤ１７９ｂのアミノ酸配列である（実施例１参照）。本発明で用いられるＣＤ１７９ｂに対する抗体は、抗腫瘍活性を発揮しうる限りいかなる種類の抗体であってもよく、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗体フラグメント、例えばＦａｂやＦ（ａｂ’）２、などを含む。これらの抗体及びそのフラグメントは、当業者に公知の方法により調製することが可能である。本発明においては、ＣＤ１７９ｂタンパク質と特異的に結合することが可能な抗体が望ましいし、また、被験者がヒトである場合には、拒絶反応を回避もしくは抑制するためにヒト抗体又はヒト化抗体であることが望ましい。
【００３３】
ここで、「ＣＤ１７９ｂタンパク質と特異的に結合する」とは、ＣＤ１７９ｂタンパク質に特異的に結合し、それ以外のタンパク質と実質的に結合しないことを意味する。
【００３４】
本発明において、ＣＤ１７９ｂに対する抗体は、市販のものを使用してもよい。ヒトＣＤ１７９ｂに対する抗体として、例えばＧＡ１７０、Ｈ−６０、ＨＰ６０５４、Ａ−１９、Ｃ−１６、ＳＬＣ１、ＳＬＣ２、ＳＬＣ３、ＳＬＣ４及びＨＳＬ１１などのクローンが知られており、入手可能である。
【００３５】
本発明で用いることができる抗体の抗腫瘍活性は、後述するように、生体外で該ポリペプチドを発現する腫瘍細胞に対して、免疫細胞又は補体を介した細胞障害活性を示すか否かを調べることによって評価することができる。
【００３６】
さらにまた、本発明における癌の治療及び／又は予防の対象である被験者は、ヒト、ペット動物、家畜類、競技用動物などの哺乳動物であり、好ましい被験者は、ヒトである。
【００３７】
なお、本明細書で使用される「癌」及び「腫瘍」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
【００３８】
以下に、本発明に関する抗原の作製、抗体の作製、ならびに医薬組成物について説明する。
【００３９】
＜抗体作製用抗原の作製＞
本発明で用いられるＣＤ１７９ｂに対する抗体を取得するための感作抗原として使用されるタンパク質又はその断片は、ヒト、イヌ、ウシ、マウス、ラットなど、その由来となる動物種に制限されない。しかし細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、一般的には、哺乳動物由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。例えば、ＣＤ１７９ｂがヒトＣＤ１７９ｂの場合、ヒトＣＤ１７９ｂタンパク質やその部分ペプチド、ヒトＣＤ１７９ｂを発現する細胞などを用いることができる。
【００４０】
ヒトＣＤ１７９ｂ及びそのホモログの塩基配列及びアミノ酸配列は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）にアクセスし、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズム（Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997）を利用することによって入手することができる。なお、ＣＤ１７９ｂは、λ５、ＩＧＬＬ１、Ｖｐｒｅｂ２、ＬＯＣ６０８２４８などとも別称されるが、本明細書では、「ＣＤ１７９ｂ」を代表して使用する。例えば、ヒトＣＤ１７９ｂは、例えばＮＭ＿１５２８５５、ＮＭ＿０２００７０など、マウスＶｐｒｅｂ２は、例えばＮＭ＿０１６９８３など、イヌＬＯＣ６０８２４８は、例えばＸＭ＿８４５２１５などの番号で登録されている。
【００４１】
本発明では、ヒトＣＤ１７９ｂの塩基配列又はアミノ酸配列を基準とした場合、配列番号１又は３で表される配列と５０％〜１００％、好ましくは６０％〜１００％、より好ましくは８０％〜１００％、さらに好ましくは９０％〜１００％、もっとも好ましくは９５％〜１００％、例えば９７％〜１００％、９８％〜１００％、９９％〜１００％又は９９．５％〜１００％の配列同一性を有する配列からなる核酸又はタンパク質がターゲットになる。ここで、「％配列同一性」は、２つの配列を、ギャップを導入するか又はギャップを導入しないで、最大の類似度となるようにアラインメント（整列）したとき、アミノ酸（又は塩基）の総数に対する同一アミノ酸（又は塩基）のパーセンテージ（％）を意味する。
【００４２】
ＣＤ１７９ｂタンパク質の断片は、抗体が認識する最小単位であるエピトープ（抗原決定基）のアミノ酸長から、該タンパク質の全長未満の長さを有する。エピトープの長さは、通常、連続する７〜１２アミノ酸の範囲である。
【００４３】
上記した、ヒトＣＤ１７９ｂタンパク質やその部分ペプチドを含むポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ―ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【００４４】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡは、ヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応行程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号１及び３にそれぞれ示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。
【００４５】
ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号３のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。そのような細胞や組織の例は、骨髄、白血病細胞、乳癌細胞、リンパ腫細胞などである。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, 第２版, Current Protocols in Molecular Biology (1989)等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、ヒトＣＤ１７９ｂタンパク質やその部分ペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。
【００４６】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ  １、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ、ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ  ２９３、マウス胎仔皮膚細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母等の酵母細胞、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製オリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、マルチクローニングサイト、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子、栄養相補遺伝子、等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）など）との融合タンパク質として発現させることもできる。
【００４８】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ（例えば（Ｈｉｓ）６〜（Ｈｉｓ）１０）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【００４９】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション、等の周知の方法を用いることができる。
【００５０】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
＜抗体の構造＞
抗体は通常少なくとも２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭは別として、２本の同一の軽（Ｌ）鎖及び２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０ｋＤａのヘテロ四量体糖タンパク質である。典型的には、それぞれの軽鎖は１つのジスルフィド共有結合により重鎖に連結されているが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は変動する。それぞれの重鎖及び軽鎖はまた鎖内ジスルフィド結合も有する。それぞれの重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ領域）を有し、それにいくつかの定常領域が続く。それぞれ軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ領域）を有し、その反対の端に１つの定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の最初の定常領域と整列しており、かつ軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。抗体の可変ドメインは特定の領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の可変性を示して抗体に結合特異性を付与する。可変領域の相対的に保存されている部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれている。完全な重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲを含む。３つのＣＤＲは重鎖ではそのＮ末から順にＣＤＲＨ１，ＣＤＲＨ２，ＣＤＲＨ３、同様に軽鎖ではＣＤＲＬ１，ＣＤＲＬ２，ＣＤＲＬ３と呼ばれている。抗体の抗原への結合特異性には、ＣＤＲＨ３が最も重要である。また、各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって近接した状態で一緒に保持され、他方の鎖からのＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗体が抗原に結合することに直接寄与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）への関与、Ｆｃγ受容体への結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度、補体カスケードのＣ１ｑ構成要素を介した補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を示す。
【００５２】
＜抗体の作製＞
本発明における抗ＣＤ１７９ｂ抗体とは、ＣＤ１７９ｂタンパク質の全長又は断片と免疫学的反応性を有する抗体を意味する。ここで、「免疫学的反応性」とは、生体内で抗体とＣＤ１７９ｂ抗原とが結合する特性を意味し、このような結合を介して腫瘍を障害（例えば、死滅、抑制又は退縮）する機能、が発揮される。すなわち、本発明で使用される抗体は、ＣＤ１７９ｂタンパク質と結合して腫瘍、例えば白血病、リンパ腫及び乳癌、を障害することができるならば、その種類を問わない。
【００５３】
抗体の例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂや（Ａａｂ’）２）などを含む。また、抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＹ、又は任意のサブクラス、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などである。
【００５４】
抗体はさらに、グリコシル化、アセチル化、ホルミル化、アミド化、リン酸化、ペグ（ＰＥＧ）化などによって修飾されていてもよい。
【００５５】
以下に、種々の抗体の作製例を示す。
【００５６】
抗体がモノクローナル抗体であるときには、例えば、ＣＤ１７９ｂを発現する白血病細胞株Ｎａｍａｌｗａをマウスに投与して免疫し、同マウスより脾臓を抽出し、細胞を分離の上、該細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、癌細胞増殖抑制作用を持つ抗体を産生するクローンを選択する。癌細胞増殖抑制作用を持つモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを単離し、当該ハイブリドーマを培養し、培養上清から一般的なアフィニティー精製法により抗体を精製することで、調製することが可能である。
【００５７】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、例えば以下のようにしても作製することができる。
【００５８】
まず、公知の方法にしたがって、感作抗原を動物に免疫する。一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
【００５９】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付すが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００６０】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3U1（P3-X63Ag8U1）、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11（Margulies. D.H. et al., Cell（1976）8, 405-415）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978）276, 269-270）、FO（deSt. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）等が好適に使用される。
【００６１】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができる。
【００６２】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００６３】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００６４】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０−６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とするハイブリドーマを形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００６５】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
【００６６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６（登録番号ＴＩＢ１９６）と融合させ、所望の活性（例えば、細胞増殖抑制活性）を有するヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００６７】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
【００６８】
すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製できる。
【００６９】
本発明で使用可能な抗体の別の例がポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、例えば、次のようにして得ることができる。
【００７０】
天然のＣＤ１７９ｂタンパク質、あるいはＧＳＴとの融合タンパク質として大腸菌等の微生物において発現させた組換えＣＤ１７９ｂタンパク質、又はその部分ペプチドをマウス、ヒト抗体産生マウス、ウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ＣＤ１７９ｂタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。
【００７１】
ここで、ヒト抗体産生マウスとしては、例えばＫＭマウス（キリンファーマ／Ｍｅｄａｒｅｘ）及びＸｅｎｏマウス（Ａｍｇｅｎ）が知られている。このようなマウスをＣＤ１７９ｂタンパク質又はその断片で免疫するときには、完全ヒトポリクローナル抗体を血液から得ることができる。また、免疫後のマウスから脾臓細胞を取出し、ミエローマ細胞との融合法によりヒト型モノクローナル抗体を作製することができる。
【００７２】
抗原の調製は、例えば、動物細胞を用いた方法（特表２００７−５３００６８）やバキュロウイルスを用いた方法（例えば、ＷＯ９８／４６７７７など）などに準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。
【００７３】
さらにまた、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United   Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
【００７４】
具体的には、ハイブリドーマのｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（Ｖ領域）のｃＤＮＡを合成する。目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００７５】
本発明の抗ＣＤ１７９ｂ抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。しかし、ポリクローナル抗体、遺伝子改変抗体（キメラ抗体、ヒト化抗体など）などであってもよい。
【００７６】
モノクローナル抗体には、ヒトモノクローナル抗体、非ヒト動物モノクローナル抗体（例えばマウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）などが含まれる。モノクローナル抗体は、ＣＤ１７９ｂタンパク質を免疫した非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ヒト抗体産生マウスなど）からの脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得られたハイブリドーマを培養することによって作製されうる。後述の実施例では、マウスモノクローナル抗体＃８が作製され、抗腫瘍効果が確認された。この抗体＃８は、配列番号１０５のアミノ酸配列を有する重鎖可変（ＶＨ）領域と、配列番号１０９のアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ＶＬ）領域とを含み、ここで、該ＶＨ領域に配列番号１０３（ＣＤＲ１）、配列番号１０４（ＣＤＲ２）及び配列番号１０２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が含まれ、該ＶＬ領域に配列番号１０６（ＣＤＲ１）、配列番号１０７（ＣＤＲ２）及び配列番号１０８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が含まれる。
【００７７】
キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡとヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
【００７８】
ポリクローナル抗体には、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にＣＤ１７９ｂタンパク質を免疫して得られる抗体が含まれる。
【００７９】
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。
【００８０】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９９／５１７４３参照）。
【００８１】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Res.（1993）53, 851-856）。
【００８２】
キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域（例えば、ＦＲ）や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。
【００８３】
アミノ酸の置換は、例えば１５未満、１０未満、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下のアミノ酸、好ましくは１〜５アミノ酸、より好ましくは１又は２アミノ酸、の置換であり、置換抗体は、未置換抗体と機能的に同等であるべきである。置換は、保存的アミノ酸置換が望ましく、これは、電荷、側鎖、極性、芳香族性などの性質の類似するアミノ酸間の置換である。性質の類似したアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（トレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）などに分類しうる。
【００８４】
抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
【００８５】
ここで「機能的に同等」とは、対象となる抗体が本発明の抗体と同様の生物学的あるいは生化学的活性、具体的には腫瘍を障害する機能、を有すること、ヒトへの適用時に拒絶反応を本質的に起こさないことなどを指す。このような活性としては、例えば、細胞増殖抑制活性、あるいは結合活性を例示することができる。
【００８６】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。
【００８７】
上記抗ＣＤ１７９ｂ抗体が認識するＣＤ１７９ｂタンパク質のエピトープを認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、抗ＣＤ１７９ｂ抗体が認識するＣＤ１７９ｂタンパク質のエピトープを通常の方法（例えば、エピトープマッピングなど）により決定し、該エピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のエピトープを決定し、抗ＣＤ１７９ｂ抗体とエピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。ここで、「エピトープ」は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、抗原性又は免疫原性を有するポリペプチド断片を指し、その最小単位は、約７〜１２アミノ酸からなる。
【００８８】
本発明の抗体の親和定数Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１であることが望ましい。
【００８９】
本発明の抗体は、抗腫瘍剤とコンジュゲートすることができる。抗体と抗腫瘍剤との結合は、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシ基、チオール基などと反応性の基（例えば、コハクサンイミジル基、ホルミル基、２−ピリジルジチオ基、マレイイミジル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシ基など）をもつスペーサーを介して行うことができる。
【００９０】
抗腫瘍剤の例は、文献等で公知の下記の抗腫瘍剤、すなわち、パクリタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、チオテパ、ブスルファン、インプロスルファン、ピポスルファン、ベンゾドーパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、ウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ）、アルトレートアミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｉｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）、トリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、ブラタシン、ブラタシノン、カンプトセシン、ブリオスタチン、カリスタチン（ｃａｌｌｙｓｔａｔｉｎ）、クリプトフィシン１、クリプトフィシン８、ドラスタチン、ズオカルマイシン、エレウテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、クロランブシル、クロロナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、トロフォスファミド（ｔｒｏｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ウラシルマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン（ｃｈｌｏｒｏｚｏｔｏｃｉｎ）、フォテムスチン（ｆｏｔｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ダイネマイシン、クロドロネート、エスペラマイシン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（ｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン（ｃａｒｚｉｎｏｐｈｉｌｉｎ）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アドリアマイシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｍｙｃｉｎ）、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎｓ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメクス、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキセート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン、アンシ���ビン、アザシチジン（ａｚａｃｉｔｉｄｉｎｅ）、６−アザウリジン（ａｚａｕｒｉｄｉｎｅ）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；アンドロゲン類、例えばカルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン（ｔｅｓｔｏｌａｃｔｏｎｅ）、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン（ａｍｓａｃｒｉｎｅ）、ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）、ビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）、エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）、ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、エルフォルニチン  （ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）、レンチナン、ロニダミン（ｌｏｎｉｄａｍｉｎｅ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ）、アンサミトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎｅ）、ミトグアゾン（ｍｉｔｏｇｕａｚｏｎｅ）、ミトキサントロン、モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）、ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）、ペントスタチン、フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）、ピラルビシン、ロソキサントロン（ｌｏｓｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ラゾキサン（ｒａｚｏｘａｎｅ）、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲルマニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｒｍａｎｉｕｍ）、テニュアゾン酸（ｔｅｎｕａｚｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）、ロリジン（ｒｏｒｉｄｉｎｅ）Ａ、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））、ウレタン、ビンデシン、ダカーバジン、マンノムスチン（ｍａｎｎｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ミトブロニトール、ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）、ピポブロマン（ｐｉｐｏｂｒｏｍａｎ）、ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ドキセタキセル、クロランブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−チオグアニン、メルカプトプリン、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ノバントロン（ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、テニポシド、エダトレキセート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ（ｘｅｌｏｄａ）、イバンドロナート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）、イリノテカン、トポイソメラーゼインヒビター、ジフルオロメチロールニチン（ＤＭＦＯ）、レチノイン酸、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、並びにそれらの薬学的に許容可能な塩又は誘導体を包含する。
【００９１】
あるいは、本発明の抗体には、文献等で公知の、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｌｕなどの放射性同位体を結合することも可能である。放射性同位体は、腫瘍の治療や診断のために有効なものが望ましい。
【００９２】
本発明の抗体は、ＣＤ１７９ｂと免疫学的反応性を有する抗体、あるいは、ＣＤ１７９ｂを特異的に認識する抗体である。該抗体は、それを投与する対象動物において拒絶反応がほとんど又はまったく回避されるような構造をもつ抗体であるべきである。そのよう抗体としては、例えば対象動物がヒトである場合、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体（例えばヒト−マウスキメラ抗体）、単鎖抗体、二重特異性抗体などが挙げられる。これらの抗体は、重鎖及び軽鎖の可変領域がヒト抗体由来のものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）とヒト抗体由来のフレームワーク領域からなるものであるか、あるいは、重鎖及び軽鎖の可変領域が非ヒト動物抗体由来のものであり、かつ、重鎖及び軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のものである組換え型抗体である。好ましい抗体は、前２つの抗体である。
【００９３】
これらの組換え型抗体は、次のようにして作製することができる。ハイブリドーマなどの抗体産生細胞からヒトＣＤ１７９ｂに対するモノクローナル抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ラットモノクローナル抗体、ニワトリモノクローナル抗体など）をコードするＤＮＡをクローニングし、これを鋳型にして該抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードするＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法等により作製し、Ｋａｂａｔ  ＥＵ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5Th Ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, Md.(1991)）に基づいて軽鎖及び重鎖の各可変領域の配列又は各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列を決定する。さらに、これらの各可変領域をコードするＤＮＡ又は各ＣＤＲをコードするＤＮＡを、遺伝子組換え技術（Sambrook et al., Molecular Cloning, 第２版, Current Protocols in Molecular Biology (1989)）又はＤＮＡ合成機を用いて作製する。ここで、上記ヒトモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生動物（例えば、マウス）にヒトＣＤ１７９ｂを免疫したのち、該免疫動物から切除した脾細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって作製することができる。これとは別に、必要に応じて、遺伝子組換え技術又はＤＮＡ合成機を用いてヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域及び定常領域をコードするＤＮＡを作製する。
【００９４】
ヒト化抗体の場合には、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡ中のＣＤＲ配列を、それらに対応する、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲ配列と置換したＤＮＡを作製し、それによって得られたＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、ヒト化抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
【００９５】
キメラ抗体の場合には、ヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体の軽鎖又は重鎖の可変領域をコードするＤＮＡをそれぞれ、ヒト抗体由来の軽鎖又は重鎖の定常領域をコードするＤＮＡと連結することによって、キメラ抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。
【００９６】
単鎖抗体の場合には、この抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをリンカーを介して直線状に連結された抗体であり、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、リンカーをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを結合することによって単鎖抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。また、リンカーは、１２〜１９アミノ酸からなり、例えば１５アミノ酸の（Ｇ４Ｓ）３（Kim, GB. et al.,  Protein Engineering Design and Selection 2007, 20(9):425-432）が挙げられる。
【００９７】
二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）の場合には、この抗体は２つの異なるエピトープと特異的に結合可能な抗体であり、例えば重鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡ、及び軽鎖可変領域ＡをコードするＤＮＡをこの順序で結合する（ただし、軽鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡと重鎖可変領域ＢをコードするＤＮＡとは上記のようなリンカーをコードするＤＮＡを介して結合される。）ことによって二重特異性抗体をコードするＤＮＡを作製することができる。ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はいずれも、ヒト抗体由来のものであるか、あるいは、ＣＤＲのみヒト以外の動物（例えばマウス、ラット、ニワトリなど）由来の抗体のＣＤＲによって置換されたヒト抗体由来のものである。
【００９８】
上記のようにして作製された組換えＤＮＡを、１つ又は複数の適当なベクターに組み込み、これを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し、（共）発現させることによって組換え型抗体を作製することができる（P.J. Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P. Shepherd and C. Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS、J.W. Goding., Monoclonal Antibodies: principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。
【００９９】
上記の方法によって作製される本発明の抗体は、例えば、重鎖可変領域に配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域に配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列を含む抗体である。ここで、配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列はそれぞれ、マウス抗体重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、また、配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列はそれぞれ、マウス抗体軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。したがって、本発明のヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体又は二重特異性抗体は、例えば以下の抗体である。
【０１００】
（ｉ）重鎖の可変領域が配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の可変領域が配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む抗体。
【０１０１】
（ｉｉ）重鎖の可変領域が配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含み、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列及びヒト抗体由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。
【０１０２】
（ｉｉｉ）重鎖可変領域に配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖可変領域に配列番号１０９のアミノ酸配列を含む抗体。
【０１０３】
（ｉｖ）重鎖の可変領域が配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、かつ、重鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含む、並びに、軽鎖の可変領域が配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、かつ、軽鎖の定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列を含んでなる抗体。
【０１０４】
なお、ヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域及び可変領域の配列は、例えばＮＣＢＩ（米国：ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＧｅｎｅなど）から入手可能であり、例えばヒトＩｇＧ１重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２２８、ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域については登録番号Ｊ００２３０、ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域については登録番号Ｘ０３６０４、ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域については登録番号Ｋ０１３１６、ヒト軽鎖κ定常領域については登録番号Ｖ００５５７、Ｘ６４１３５、Ｘ６４１３３など、ヒト軽鎖λ定常領域については登録番号Ｘ６４１３２、Ｘ６４１３４などの配列を参照することができる。
【０１０５】
上記抗体は、好ましくは、細胞障害活性を有しており、これによって抗腫瘍効果を発揮することができる。
【０１０６】
また、上記抗体における重鎖及び軽鎖の可変領域やＣＤＲの特定の配列は、単に例示を目的としたものであり、特定の配列に限定されないことは明らかである。ヒトＣＤ１７９ｂに対する別のヒト抗体又は非ヒト動物抗体（例えばマウス抗体）を産生しうるハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を回収し、ヒトＣＤ１７９ｂとの免疫学的結合性及び細胞障害活性を指標として目的の抗体であるか否かを判定する。それによって目的のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを識別したのち、上記のとおり、該ハイブリドーマから目的の抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを作製し配列決定し、該ＤＮＡを別の抗体の作製のために利用する。
【０１０７】
さらに本発明の上記抗体は、ＣＤ１７９ｂを特異的に認識するという特異性を有する限り、上記（ｉ）から（ｉｖ）の各抗体の特にフレームワーク領域の配列及び／又は定常領域の配列において、１若しくは数個（好ましくは、１若しくは２個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加があってもよい。ここで数個とは、２〜５個、好ましくは２個又は３個を意味する。
【０１０８】
本発明はさらに、本発明の上記抗体をコードするＤＮＡ  、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡ、あるいは、上記抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡも提供する。そのようなＤＮＡは、例えば、配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列をコードする塩基配列含む軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、などを含む。
【０１０９】
これらの配列のＤＮＡによってコードされる相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗体の特異性を決定する領域であるため、抗体のそれ以外の領域（すなわち、定常領域及びフレームワーク領域）をコードする配列は他の抗体由来の配列であってもよい。ここで他の抗体とはヒト以外の生物由来の抗体も含むが、副作用低減の観点からはヒト由来のものが好ましい。すなわち、上記のＤＮＡでは、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域及び各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
【０１１０】
さらに、本発明の抗体をコードするＤＮＡの別の例は、配列番号１０５のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードする領域が配列番号１０９のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡなどである。ここで、配列番号１０５のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号１１０の塩基配列である。また、配列番号１０９のアミノ酸配列をコードする塩基配列の例は、配列番号１１１の塩基配列である。これらのＤＮＡでも、重鎖及び軽鎖の各定常領域をコードする領域がヒト抗体由来の対応アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むことが好ましい。
【０１１１】
本発明のＤＮＡは、例えば上記の方法又は以下の方法で得ることができる。まず、本発明の抗体に関わるハイブリドーマから、市販のＲＮＡ抽出キットを用いて全ＲＮＡを調製し、ランダムプライマー等を用いて逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する。次いで既知のマウス抗体重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子の各可変領域において、それぞれ保存されている配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲ法によって、抗体をコードするｃＤＮＡを増幅させる。定常領域をコードする配列については、既知の配列をＰＣＲ法で増幅することによって得ることができる。ＤＮＡの塩基配列は、配列決定用プラスミド又はファージに組み込むなどして、常法により決定することができる。
【０１１２】
本発明で用いられる抗ＣＤ１７９ｂ抗体によるＣＤ１７９ｂ発現癌細胞に対する抗腫瘍効果は、以下の機序により起こると考えられる。
【０１１３】
ＣＤ１７９ｂ発現細胞のエフェクター細胞抗体依存的細胞障害性（ＡＤＣＣ）；
ＣＤ１７９ｂ発現細胞の補体依存的細胞障害性（ＣＤＣ）。
【０１１４】
従って、本発明で用いられる抗ＣＤ１７９ｂ抗体の活性評価は、以下実施例に具体的に示されるように、生体外でＣＤ１７９ｂを発現する癌細胞に対して上記ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を測定することで評価することができる。
【０１１５】
本発明で用いられる抗ＣＤ１７９ｂ抗体は、癌細胞上のＣＤ１７９ｂタンパク質と結合し、上記活性によって、抗腫瘍作用を示すことから、癌の治療あるいは予防に有用であると考えられる。すなわち本発明は、抗ＣＤ１７９ｂ抗体を有効成分とする、癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物を提供する。抗ＣＤ１７９ｂ抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト化抗体にすることが好ましい。
【０１１６】
なお、抗ＣＤ１７９ｂ抗体と癌細胞表面上のＣＤ１７９ｂタンパク質との結合親和性が高い程、抗ＣＤ１７９ｂ抗体による、より強い抗腫瘍活性が得られる。従って、ＣＤ１７９ｂタンパク質と高い結合親和性を有する抗ＣＤ１７９ｂ抗体を獲得できれば、より強い抗腫瘍効果が期待でき、癌の治療及び／又は予防を目的とした医薬組成物として適応することが可能になる。高い結合親和性として、前述したように、結合定数Ｋａ（ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）が、好ましくは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも５×１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも５×１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも５×１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１であることが望ましい。
【０１１７】
＜医薬組成物＞
本発明の癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物の標的は、ＣＤ１７９ｂ遺伝子を発現している癌（細胞）であれば特に限定されないが、好ましくは白血病、リンパ腫、乳癌からなる群より選択される癌（細胞）であり、これらの癌には、例えば、乳腺癌、複合型乳腺癌、乳腺悪性混合腫瘍、乳管内乳頭状腺癌、肥満細胞腫、慢性型リンパ球性白血病、消化管型リンパ腫、消化器型リンパ腫、小〜中細胞型リンパ腫、等も包含される。
【０１１８】
また本発明で用いられる抗体又はそのフラグメントは、上記に記載した癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。
【０１１９】
本発明で用いられる抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
【０１２０】
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
【０１２１】
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−６０と併用してもよい。
【０１２２】
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
【０１２３】
投与は、経口又は非経口、好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
【０１２４】
また、患者の年齢、症状、性別などにより適宜投与方法を選択することができる。抗体又はそのフラグメントを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり０．００１〜１０００００ｍｇ／ｂｏｄｙの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【０１２５】
＜ポリペプチド及びＤＮＡ＞
本発明は更に、上記抗体に関わる以下のポリペプチド及びＤＮＡも提供する。
【０１２６】
（ｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１２７】
（ｉｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１２８】
（ｉｉｉ）配列番号１１０の塩基配列を含むＤＮＡ。
【０１２９】
（ｉｖ）配列番号１１１の塩基配列を含むＤＮＡ。
【０１３０】
（ｖ）配列番号１０３、１０４及び１０２のアミノ酸配列からなる群から選択される、重鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１３１】
（ｖｉ）配列番号１０６、１０７及び１０８のアミノ酸配列からなる群から選択される、軽鎖ＣＤＲポリペプチド、及び該ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【０１３２】
これらのポリペプチド及びＤＮＡは、上記のとおり、遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。
【実施例】
【０１３３】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの具体例によって制限されないものとする。【０１３４】
実施例１：ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの同定
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
手術により摘出したイヌの乳腺癌組織から酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  ｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ  ＲＮＡを精製した。【０１３５】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてイヌ乳腺癌由来ｃＤＮＡファージライブラリを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリの作製にはｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリのサイズは２．９９×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。【０１３６】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したイヌ乳腺癌由来ｃＤＮＡファージライブラリを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３〜４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｃ  Ｅｘｔｒａ：  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２〜３時間反応させた。【０１３７】
上記患犬血清としては、上記乳腺癌を摘出された同一の患犬及び他の乳腺癌患犬より採取した血清計３検体をそれぞれ用いた。これらの血清は−８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ファージを宿主大腸菌（ＸＬ１−ＢＬｕｅ  ＭＲＦ'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次いで０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ−カラム  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。【０１３８】
かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ  Ｄｏｇ  ＩｇＧ−ｈ＋Ｉ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％  ゼラチン  ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する９２８２０個のファージクローンをスクリーニングして、４５個の陽性クローンを単離した。【０１３９】
（３）単離抗原遺伝子の相同性検索
上記方法により単離した４５個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液２５０μｌ、さらにＥｘＡｓｓｉｓｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５〜３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。【０１４０】
精製したプラスミドは、配列番号９４に記載のＴ３プライマーと配列番号９５に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号４〜９２の偶数番号に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列（配列番号５〜９３の奇数番号）を用いて、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との相同性検索を行った結果、得られた４５個全ての遺伝子がＣＤ１７９ｂをコードする遺伝子であることが判明した。４５個の遺伝子間の相同性は、塩基配列９４〜９９％、アミノ酸配列９６〜９９％であった。この遺伝子のヒト相同因子をコードする遺伝子との相同性は、タンパク質に翻訳される領域において、塩基配列６２〜８２％、アミノ酸配列６９〜８０％であった。ヒト相同因子の塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２及び３に示す。【０１４１】
（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ及びヒトの正常組織及び各種細胞株における発現をＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０〜１００ｍｇ及び各細胞株５〜１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ−Ｉｎｓｅｒｔ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得したイヌ遺伝子に特異的なプライマー（配列番号９６及び９７に記載）及びそのヒト相同遺伝子に特異的なプライマー（配列番号９８及び９９に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃−３０秒、６０℃−３０秒、７２℃−３０秒のサイクルを３０回繰り返して行った。なお、上記した配列番号９６及び９７に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは、配列番号４の塩基配列中の３２番〜３４１番を増幅するものであり、配列番号４〜９２の偶数番号に示されるイヌＣＤ１７９ｂ遺伝子全てに共通の領域を増幅するものであった。また、配列番号９８及び９９に示す塩基配列を有する遺伝子特異的プライマーは配列番号１の塩基配列中の２１６番〜７３８番塩基の領域を増幅するものであった。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（配列番号１００及び１０１に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、取得したイヌ遺伝子は、健常なイヌ組織では全く発現が見られず、一方イヌ乳癌組織で強い発現が見られた。ヒト相同遺伝子の発現では、ヒト正常組織で発現が確認できたのは骨髄のみで、ヒト癌細胞では白血病細胞株及び乳癌細胞株で発現が検出され、ＣＤ１７９ｂが白血病細胞株と乳癌細胞株に特異的に発現していることが確認された。【０１４２】
なお、図１中、縦軸の参照番号１は、上記で同定した遺伝子の発現パターンを、参照番号２は、比較対照であるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現パターンを示す。【０１４３】
（５）癌細胞上での抗原タンパクの発現解析
次にＣＤ１７９ｂ遺伝子の発現が確認された各癌細胞株について、その細胞表面上にＣＤ１７９ｂタンパクが発現しているかどうかを調べた。上記で遺伝子発現が認められた各ヒト癌細胞株それぞれ１０６細胞を１．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブにて遠心した。これに５μｌのマウス抗ヒトＣＤ１７９ｂ抗体（クローン名：ＧＡ１７０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、さらに９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁後、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄した後、５μｌのＦＩＴＣ標識ラビット抗マウスＩｇＧ２ａモノクロ−ナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）及び９５μｌの０．１％牛胎児血清を含むＰＢＳで懸濁し、氷上で１時間静置した。ＰＢＳで洗浄後、ベクトンディッキンソン株式会社のＦＡＣＳキャリバーにて蛍光強度を測定した。一方、上記と同様の操作を、マウス抗ヒトＣＤ１７９ｂ抗体の代わりにマウスＩｇＧ２ａ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ（ＭＢＬ社製）を用いて調製し、コントロールとした。その結果、抗ヒトＣＤ１７９ｂ抗体を添加された細胞は、コントロールに比べて、いずれも蛍光強度が１０％以上強く、このことから、上記ヒト癌細胞株の細胞膜表面上にＣＤ１７９ｂタンパクが発現していることが確認された。【０１４４】
実施例２：ＣＤ１７９ｂに対する抗体の癌細胞に対する抗腫瘍効果
（１）ＡＤＣＣ活性
次にＣＤ１７９ｂに対する抗体が、ＣＤ１７９ｂを発現する腫瘍細胞を障害することができるかどうかを検討した。市販のヒトＣＤ１７９ｂに対するマウス抗体（クローン名：ＧＡ１７０）を用いて評価を行った。実施例１（５）でＣＤ１７９ｂの発現が確認された３種類のヒト白血病細胞、Ｎａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ及びＲＰＭＩ１７８８（いずれもATCCから購入）をそれぞれ１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これにＧＡ１７０をそれぞれ１μｇずつ添加し、さらにマウスの脾臓から分離したリンパ球をそれぞれ２ｘ１０５個ずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、ＧＡ１７０による各癌細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、Ｎａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ及びＲＰＭＩ１７８８それぞれに対して、それぞれ３２．６％、３２．３％及び２８．３％のＡＤＣＣ活性が確認された。一方、ＧＡ１７０のアイソタイプコントロール（クローン名：６Ｈ３）を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、ＣＤ１７９ｂに対する抗体を用いたＡＤＣＣ活性により、ＣＤ１７９ｂを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。【０１４５】
なお、細胞障害活性は、上記のように、本発明で用いられるＣＤ１７９ｂに対する抗体と、マウスリンパ球及びクロミウム５１を取り込ませた１０３個の各白血病細胞株とを混合して４時間培養し、培養後培地に放出されたクロミウム５１の量を測定して、以下計算式＊により算出した各白血病細胞株に対する細胞障害活性を示した結果である。【０１４６】
＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＤ１７９ｂに対する抗体及びマウスリンパ球を加えた際のＮａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ及びＲＰＭＩ１７８８からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。【０１４７】
（２）ＣＤＣ活性
ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で６０分間、静置した後３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離することで、ＣＤＣ活性測定用の血清を調製した。３種類のヒト白血病細胞、Ｎａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ及びＲＰＭＩ１７８８をそれぞれ１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした後、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を５０％含むＲＰＭＩ培地で懸濁し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これにＧＡ１７０をそれぞれ１μｇずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、ＧＡ１７０による各癌細胞に対するＣＤＣ活性を算出した。その結果、Ｎａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ及びＲＰＭＩ１７８８それぞれに対して、それぞれ３０．５％、２１．２％及び３０．５％のＣＤＣ活性が確認された。一方、ＧＡ１７０のアイソタイプコントロール（クローン名：６Ｈ３）を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、ＣＤ１７９ｂに対する抗体を用いたＣＤＣ活性により、ＣＤ１７９ｂを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。【０１４８】
なお、細胞障害活性は、上記（１）と同様、以下計算式＊により算出した各白血病細胞株に対する細胞障害活性を示した結果である。【０１４９】
＊式：細胞障害活性（％）＝ＣＤ１７９ｂに対する抗体及びウサギ血清を加えた際のＮａｍａｌｗａ、ＢＤＣＭ及びＲＰＭＩ１７８８からのクロミウム５１遊離量÷１Ｎ塩酸を加えた標的細胞からのクロミウム５１遊離量×１００。【０１５０】
実施例３：モノクローナル抗体の作製
（１）抗原タンパクの調製
ヒトＣＤ１７９ｂタンパクは動物細胞へのリポフェクション法により調製した。ヒトＣＤ１７９ｂ遺伝子（配列番号２２）を制限酵素サイトＸｈｏＩ及びＢａｍＨＩを介して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域をコードするベクターであるＳＲａＩｇＧ１Ｆｃベクターに導入した。ＳＲaＩｇＧ１Ｆｃベクターは、ｐｃＤＬ−ＳＲa２９６ベクター（ＤＮＡＸ社製）に、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の遺伝子を導入したベクターである。次に、プラスミド２４μｇをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００  （インビトロジェン社製）６０μｌと混合し、さらにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）を添加し、総量３ｍｌになるように調製し室温で２０分以上静置した。予め２×１０６ｃｅｌｌｓ／１２ｍｌＯＰＴＩ  ＭＥＭに調製したＣＨＯ−Ｋ１細胞に上述のプラスミドの混合液３ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下８時間以上培養し、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）１０ｍｌに置き換え４〜５日培養を行った。得られた培養上清中に生産される抗原タンパクの精製をＰｒｏｔｅｉｎＡ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて行った。ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰを２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（平衡化緩衝液・洗浄緩衝液）で十分に平衡化し、培養上清に平衡化緩衝液を１：１で混合した溶液を導入した。次に、洗浄緩衝液で十分に洗浄した後、０．２Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  緩衝液（ｐＨ２．５）で溶出を行った。溶出液には１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９）を添加して中和し、さらに限外濾過により２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）／０．１５Ｍ  ＮａＣｌを用いてバッファー交換操作を行い、ヒトＣＤ１７９ｂタンパクを調製した。【０１５１】
（２）ハイブリドーマの取得
（１）で調製した抗原タンパク（ヒトＣＤ１７９ｂタンパク）１００μｇを等量のＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント（シグマ社製）と混合し、これをマウス１匹当たりの抗原溶液とした。抗原溶液を６週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社製）の腹腔内に投与後、１週間毎にさらに３回の投与を行い、免疫を完了した。最後の免疫から３日後に摘出した脾臓を、滅菌した２枚のスライドガラスに挟んで擂り潰し、ＰＢＳ（−）（日水社製）を用いて洗浄し１５００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を除去する操作を３回繰り返して脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）とを１０：１の比率にて混和し、そこに３７℃に加温した１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地２００μｌとＰＥＧ１５００（ベーリンガー社製）８００μｌを混和して調製したＰＥＧ溶液を加えて５分間静置して細胞融合を行った。１７００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去後、Ｇｉｂｃｏ社製のＨＡＴ溶液を２％当量加えた１５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ選択培地）１５０ｍｌで細胞を懸濁し、９６穴プレート（ヌンク社製）各ウェル当たり１００μｌずつ、プレート１５枚に播種した。７日間、３７℃、５％ＣＯ２環境にて培養することで、脾臓細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマを得た。【０１５２】
（３）ハイブリドーマの選抜
作製したハイブリドーマが産生する抗体のヒトＣＤ１７９ｂタンパクに対する結合親和性を指標にハイブリドーマを選抜した。上記（１）で調製したヒトＣＤ１７９ｂタンパク溶液１μｇ／ｍｌを９６穴プレート１ウェル当たりに１００μｌ添加し、４℃にて１８時間静置した。各ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、０．５％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液（シグマ社製）を１ウェル当たり４００μｌ添加して室温にて３時間静置した。溶液を除いて、１ウェル当たり４００μｌのＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記（２）で得られたハイブリドーマの各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温にて２時間静置した。ＰＢＳ−Ｔで各ウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（インビトロジェン社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して１５〜３０分間静置して発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍ−５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、吸光度値が最も高かった抗体を産生するハイブリドーマを選抜した。【０１５３】
選抜したハイブリドーマを９６穴プレート１ウェル当たりに０．５個となるようにプレートに添加し培養した。１週間後、ウェル中に単一のコロニーを形成しているハイブリドーマが観察された。それらウェルの細胞をさらに培養して、クローニングされたハイブリドーマ株６０個を得た。【０１５４】
次に上記６０個のハイブリドーマ株が産生する抗体の白血病細胞に対する結合親和性を指標にハイブリドーマ株を選抜した。９６穴プレートに１ｍｇ／ｍｌのポリＬリジン（シグマ社製）−ＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて３０分静置した。ポリＬリジン−ＰＢＳ溶液を除いて、各ウェルに滅菌蒸留水を満たして捨てる操作を３回繰り返して、その後クリーンベンチ内にてプレートを風乾した。ＣＤ１７９ｂの発現が確認されているヒト白血病細胞株ＮａｍａｌｗａをＰＢＳ（−）中に１０６個／ｍｌとなるように懸濁し、上記プレート１ウェル当たり１００μｌを添加して室温にて１５分間静置した。１７００ｒｐｍで５分間遠心した後、上清を除去し、０．０５％グルタルアルデヒド（シグマ社製）−ＰＢＳ溶液を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１０分間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、０．５％ＢＳＡ溶液を１ウェル当たり３００μｌ添加して４℃にて１８時間静置した。ＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄後、上記で得た６０個のハイブリドーマ株の各培養上清を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて２時間静置した。上清を除去しＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄した後、ＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を１ウェル当たり１００μｌ添加して室温にて１時間静置した。ＰＢＳ−Ｔにてウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を１ウェル当たり１００μｌ添加して３０分間静置し発色反応を行った。発色後、１規定硫酸を１ウェル当たり１００μｌ添加して反応を停止させ吸光度計を用いて４５０ｎｍ〜５９５ｎｍの吸光度値を測定した。その結果、最も吸光度値が高い、すなわち最も強く細胞に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ株＃８を選抜した。【０１５５】
上記で選抜したハイブリドーマ株＃８が産生する抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８のアイソタイプをＥＬＩＳＡ法により決定した。ハイブリドーマ株＃８の培養上清をサブアイソタイピングキット（コスモバイオ社製）により、その添付プロトコールに従い評価したところ、抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８はＩｇＧ３であることが判明した。【０１５６】
実施例４：抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８の抗腫瘍効果
（１）抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８の調製
ハイブリドーマ株＃８をハイブリドーマＳＦＭ（インビトロジェン社製）により培養した。培養液は１５００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ遠心後、フィルターシステム０．２２μｍに通した。抗体の精製には、Ｈｉｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）カラムを使用した。カラムをＰＢＳで洗浄し、平衡化した。次に、培養上清をカラムに導入し、その後ＰＢＳにて洗浄を行った。０．１ＭＧｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で溶出を行い、精製抗体を得た。【０１５７】
（２）生体外（細胞レベル）での抗腫瘍効果
ＡＤＣＣ活性
抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８が、ヒトＣＤ１７９ｂを発現する腫瘍細胞を障害することができるかどうかを検討した。ヒトＣＤ１７９ｂの発現が確認されているヒト白血病細胞、Ｎａｍａｌｗａを１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした。その後１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これに抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８を２μｇ添加し、さらにマウスの脾臓から分離したリンパ球をそれぞれ２ｘ１０５個ずつ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８によるＮａｍａｌｗａ細胞に対するＡＤＣＣ活性を算出した。その結果、Ｎａｍａｌｗａに対して、それぞれ６０．６％のＡＤＣＣ活性が確認された。一方、アイソタイプコントロール（クローン名：ＭＥ０７）を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、抗ＣＤ１７９モノクローナル抗体＃８は、ＡＤＣＣ活性によりＣＤ１７９ｂを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。【０１５８】
ＣＤＣ活性
ウサギから採血した血液をエッペンドルフチューブに入れ、室温で６０分間、静置した後３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離することで、ＣＤＣ活性測定用の血清を調製した。ヒト白血病細胞であるＮａｍａｌｗａを１０６個５０ｍｌ容の遠心チューブに集め、１００μＣｉのクロミウム５１を加え３７℃で２時間インキュベートした後、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ培地で３回洗浄した。その後上記で調製したウサギ血清を５０％含むＲＰＭＩ培地で懸濁し、９６穴Ｖ底プレート１穴あたり１０３個ずつ添加した。これに抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８を２μｇ添加して、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。培養後、障害を受けた腫瘍細胞から放出される培養上清中のクロミウム５１の量を測定し、抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８によるＮａｍａｌｗａ細胞に対するＣＤＣ活性を算出した。その結果、Ｎａｍａｌｗａに対して、３０．５％のＣＤＣ活性が確認された。一方、アイソタイプコントロール（クローン名：ＭＥ０７）を用いて同様の操作を行ったところ、上記活性は検出されなかった。従って、抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８は、ＣＤＣ活性によりＣＤ１７９ｂを発現する腫瘍細胞を障害することができることが明らかになった。【０１５９】
（３）マウス生体内における抗腫瘍効果
抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体#8の担癌マウス生体内における抗腫瘍活性を評価した。使用した抗体は、上記と同様にハイブリドーマ株#8の培養上清をカラム精製したものを用いた。【０１６０】
ＣＤ１７９ｂを発現するヒト由来の癌細胞株を移植した担癌マウスを用いて、抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体#8の抗腫瘍活性を評価した。２０匹のヌードマウス（BALB/c Slc-nu/nu、日本ＳＬＣ社由来）の背部皮下に、１匹あたり106個のNamalwa細胞を移植し、腫瘍が直径7mm程度の大きさになるまで成長させた。その内、１０匹の担癌マウスに対して、１匹あたり、BALB/cマウス（BALB/c Cr Slc、日本ＳＬＣ社由来）の末梢血から分離した107個のリンパ球と、300μｇの抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体#8をそれぞれ尾静脈から投与した。その後、２日間計３回、同量のマウスリンパ球及び抗体を各担癌マウスに尾静脈投与し、毎日腫瘍の大きさを計測することによって、抗腫瘍効果を評価した。一方、残り１０匹の担癌マウスに対して、上記抗体の代わりにＰＢＳ（−）を投与し、これをコントロール群とした。本検討の結果、抗ＣＤ１７９ｂ抗体を投与された群は、抗体投与開始時の腫瘍体積を１００％とした場合に、８日目には６５％にまで退縮し、１１日目，１７日目、２０日目には、それぞれ５２％，４５％、３５％にまで腫瘍が縮小した（図２参照）。一方、コントロール群では、８日目、１１日目、１７日目、２０日目にはそれぞれ、約１８０％，２２０％，３５０％，４２０％にまで腫瘍が増大した（図２参照）。この結果から、取得した抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体#8は、ＣＤ１７９ｂを発現する癌細胞に対して、生体内で強い抗腫瘍効果を発揮することが示された。なお、腫瘍の大きさは、長径×短径×短径×0.5の計算式を用いて、体積を算出した。【０１６１】
実施例５：抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８の可変領域遺伝子のクローニング
ハイブリドーマ株＃８からｍＲＮＡを抽出し、マウス・リーダー配列及びＩｇＧ３の抗体定常領域に特異的なプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ法により、抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８の重鎖可変（ＶＨ）領域及び軽鎖可変（ＶＬ）領域の遺伝子を取得した。配列決定のために、それら遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン社製）にクローニングした。【０１６２】
（１）ＲＴ−ＰＣＲ  
１０６個のハイブリドーマ株＃８から、ｍＲＮＡ  ｍｉｃｒｏ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてｍＲＮＡを調製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて、得られたｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを合成した。これら操作は各キットの添付プロトコールに従って行った。【０１６３】
得られたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ法により抗体遺伝子の増幅を行った。
ＶＨ領域の遺伝子取得のために、マウス・リーダー配列に特異的なプライマー（配列番号１１２）及びマウスＩｇＧ３定常領域に特異的なプライマー（配列番号１１３）を使用した。またＶＬ領域の遺伝子取得のために、マウス・リーダー配列に特異的なプライマー（配列番号１１４）及びマウスκ鎖定常領域に特異的なプライマー（配列番号１１５）を使用した。これらプライマーはＪｏｎｅｓ  ＳＴ  ａｎｄ  Ｂｅｎｄｉｎｇ  ＭＭ  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９，８８−８９（１９９１）を参考に設計した。ＰＣＲは、Ｅｘ−ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いた。１０×ＥＸ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（１．０μＭ）各２μｌ，Ｅｘ  ｔａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）０．２５μｌにｃＤＮＡサンプルを加え、滅菌水により総量５０μｌとした。９４℃で２分処理後、変性９４℃１分、アニーリング５８℃３０秒、伸張反応７２℃１分の組み合わせで３０サイクルの条件で行った。【０１６４】
（２）クローニング
上記で得られた各ＰＣＲ産物を用いてアガロースゲルにて電気泳動を行い、ＶＨ領域及びＶＬ領域それぞれのＤＮＡバンドを切り出した。ＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてその添付プロトコールに従って行った。精製した各ＤＮＡはＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）を用いてｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。連結したベクターをＤＨ５ａコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ社製）に定法に従い形質転換を行った。各形質転換体それぞれ１０クローンを培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン）で３７℃一晩培養後、各プラスミドＤＮＡをＱｉａｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した。【０１６５】
（３）配列決定
ＶＨ領域及びＶＬ領域の遺伝子配列解析は、（２）のプラスミドＤＮＡをＭ１３フォワードプライマー（配列番号１１６）及びＭ１３リバースプライマー（配列番号１１７）を用いて、蛍光シーケンサー（ＡＢＩ社製ＤＮＡシーケンサー３１３０ＸＬ）により、ＡＢＩ社製のビッグダイターミネーターｖｅｒ３．１サイクルシーケンシングキットを用いて、その添付プロトコールに従い行った。その結果、各々の遺伝子配列が決定された（各々１０クローンで一致）。抗ＣＤ１７９ｂモノクローナル抗体＃８のＶＨ領域のアミノ酸配列を配列番号１０５に、ＶＬ領域のアミノ酸配列を配列番号１０９に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１６６】
本発明の抗体は、癌の治療及び／又は予防のため有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１６７】
配列番号９４、９６〜９９：プライマー
配列番号９５：Ｔ７プライマー
配列番号１００及び１０１：ＧＡＰＤＨプライマー
配列番号１１６及び１１７：プライマー
【図１】
0005573156.tif 000002
【図２】
0005573156.tif 000003
【配列表】
0005573156000001.app