(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（Ｓｍ）菌に結合するアプタマーの選別方法であって、
（ａ）アプタマーの候補となる複数の塩基配列からなる親配列ライブラリを準備し、親配列ライブラリを構成する塩基配列をアラインメント後にペアリングし、又はペアリング後にアラインメントし、各ペアの塩基配列を任意の点で交叉させて組換えた塩基配列を生成し、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させ、結合性の高い核酸の塩基配列を選択して第１進化処理ライブラリを得る、第１進化処理ライブラリ取得ステップと、
（ｂ）第１進化処理ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、塩基配列間で類似性のある１つ以上の配列領域を特定し、
第１進化処理ライブラリを構成する各塩基配列の類似性のある配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成し、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させ、結合性の高い核酸の塩基配列を選択して第２進化処理ライブラリを得る、第２進化処理ライブラリ取得ステップと、
（ｃ）第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、各塩基配列間で相同性の高い２つ以上の配列領域を特定し、
前記２つ以上の配列領域のうち、より高度に保存された配列領域をコア配列領域として特定し、第２進化処理ライブラリを構成する各塩基配列の、コア配列領域以外の配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成し、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させ、結合性の高い核酸をアプタマーとして選別する、アプタマー選別ステップと
を含む、アプタマーの選別方法。
【請求項２】
第１進化処理ライブラリ取得ステップ、第２進化処理ライブラリ取得ステップ及びアプタマー選別ステップにおける各アラインメントは、塩基配列にギャップを挿入し、ギャップを含んだ塩基配列の長さを揃えて行われる、請求項１に記載のアプタマーの選別方法。
【請求項３】
アプタマー選別ステップにおいて、第２進化処理ライブラリを構成する各塩基配列の相同性の高い配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成した後、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させる前に、各塩基配列のコア配列領域以外の部分に変異を導入する、請求項１又は２に記載のアプタマーの選別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（Ｓｍ）菌に結合するアプタマーの選別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、標的分子と特異的に結合する核酸分子であり、分子認識が可能な生体物質として様々な応用が検討されている。アプタマーは、化学的に短時間で合成可能であり、抗体などのタンパク質と比べて熱や乾燥に強く、部位特異的な修飾や固定化が容易であるなどの利点を有している。
【０００３】
標的分子に特異的に結合するアプタマーを取得する方法として、例えばＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法が知られている（非特許文献１参照）。ＳＥＬＥＸ法は次のような工程で行われる。まず、ランダムな塩基配列からなる核酸の集合体を標的分子と反応させ、結合する核酸のみを回収する。続いて、回収した核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。増幅した核酸を再び標的分子と反応させ、結合するものを回収して再びＰＣＲ増幅する工程を繰り返し、結合性の良好なアプタマーを取得する。
【０００４】
アプタマーを取得する別の方法として、コンピューター内で塩基配列を進化させる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ１９９９／０１１８１８号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ  Ｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、ＳＥＬＥＸ法などのＰＣＲ反応を使用する方法においては、ＰＣＲ増幅されにくい塩基配列が取りこぼされる場合があった。すなわち、良好な反応性を有する塩基配列であっても、ＰＣＲ増幅されにくいことによりアプタマーとして選別できない場合があった。また、標的分子との結合性を実験可能な核酸は、多くてもｍｇのレベルであり、この中には１０１３程度の分子しか含まれていない。これに対し、ランダムな塩基配列からなる核酸の集合体は、理論的にはその数万倍以上の配列多様性を持つ。したがって、ＳＥＬＥＸ法などの方法では、ほんの一部の配列だけしか探索できていないと考えられる。
【０００８】
また、特許文献１に記載の方法では、標的との結合に寄与する配列領域が不明な場合及び塩基配列の長さが揃っていない場合などには、適用が困難であった。
【０００９】
そこで本発明は、多様な塩基配列を取りこぼすことなくＳｍ菌に対する結合性の高いアプタマーを選別することが可能な、アプタマーの選別方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、Ｓｍ菌に結合するアプタマーの選別方法であって、（ａ）アプタマーの候補となる複数の塩基配列からなる親配列ライブラリを準備し、親配列ライブラリを構成する塩基配列をアラインメント後にペアリングし、又はペアリング後にアラインメントし、各ペアの塩基配列を任意の点で交叉させて組換えた塩基配列を生成し、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させ、結合性の高い核酸の塩基配列を選択して第１進化処理ライブラリを得る、第１進化処理ライブラリ取得ステップと、（ｂ）第１進化処理ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、塩基配列間で類似性のある１つ以上の配列領域を特定し、第１進化処理ライブラリを構成する各塩基配列の類似性のある配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成し、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させ、結合性の高い核酸の塩基配列を選択して第２進化処理ライブラリを得る、第２進化処理ライブラリ取得ステップと、（ｃ）第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、各塩基配列間で相同性の高い２つ以上の配列領域を特定し、前記２つ以上の配列領域のうち、より高度に保存された配列領域をコア配列領域として特定し、第２進化処理ライブラリを構成する各塩基配列の、コア配列領域以外の配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成し、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させ、結合性の高い核酸をアプタマーとして選別する、アプタマー選別ステップとを含む、アプタマーの選別方法を提供する。
【００１１】
上記本発明のアプタマーの選別方法によれば、多様な塩基配列を取りこぼすことなく探索し、Ｓｍ菌に対する結合性の高いアプタマーを選別することができる。例えば、ＰＣＲ増幅されにくい塩基配列も、アプタマーの候補として検討することができる。
【００１２】
本発明のアプタマーの選別方法において、第１進化処理ライブラリ取得ステップ、第２進化処理ライブラリ取得ステップ及びアプタマー選別ステップにおける各アラインメントは、塩基配列にギャップを挿入し、ギャップを含んだ塩基配列の長さを揃えて行われることが好ましい。
【００１３】
上記の親配列ライブラリ、第１進化処理ライブラリ及び第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列の長さが揃っていない場合であっても、ギャップを挿入してギャップを含んだ長さを揃えることによって、本発明のアプタマーの選別方法を適用することができる。
【００１４】
本発明のアプタマーの選別方法のアプタマー選別ステップにおいて、第２進化処理ライブラリを構成する各塩基配列の相同性の高い配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成した後、生成された塩基配列からなる核酸を標的分子と結合させる前に、各塩基配列のコア配列領域以外の部分に変異を導入することが好ましい。
【００１５】
変異を導入することによって、標的分子との結合性を検討するアプタマーの候補の塩基配列にさらなる多様性をもたらすことができる。これによって、より結合性の高いアプタマーを選別できる確率を高めることができる。また、標的分子との結合性に寄与するコア配列領域には変異を導入しないことによって、より効率的に結合性の高いアプタマーを選別することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、多様な塩基配列を取りこぼすことなく、標的分子との結合性の高いアプタマーを選別することが可能な、アプタマーの選別方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１の結果を示すグラフである。
【図２】第１進化処理ライブラリ取得ステップを説明する説明図である。
【図３】第２進化処理ライブラリ取得ステップを説明する説明図である。
【図４】アプタマー選別ステップを説明する説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
まず、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップについて説明する。まず、Ｓｍ菌に結合するアプタマーの候補となる複数の塩基配列からなる、親配列ライブラリを準備する。塩基配列の長さは２０〜２００塩基であることが好ましいが、これに限定されない。準備する塩基配列は可能な限り多い方がよい。また、後述のペアリングが行いやすいように、親配列ライブラリの構成要素は偶数であることが好ましい。これらの塩基配列は、コンピューター上でランダムに発生させた塩基配列でもよく、標的分子との結合性を有することがあらかじめ明らかである塩基配列でもよい。
【００１９】
ここで、親配列ライブラリを構成する塩基配列のうち、標的分子に対する結合性が高いことがあらかじめ明らかな塩基配列や、２次構造予測や３次構造予測の結果から安定な構造を有する可能性が高いことがあらかじめ明らかな塩基配列は、１個ではなく複数個を親配列ライブラリに含めることが好ましい。親配列ライブラリに含める本数は適宜判断すればよいが、例えば２〜５０個である。本明細書において、ライブラリに含まれる特定の塩基配列の数を増加させることを「倍加」という。倍加によって、より結合性の高いアプタマーを選別できる可能性を高めることができる。
【００２０】
続いて、親配列ライブラリを構成する塩基配列をアラインメント（並列）し、ペアリングする。言い換えると、親配列ライブラリを構成する全ての塩基配列をアラインメントし、無作為に選んだ２個の塩基配列からなるペアの集団に分ける。アラインメントとペアリングの順序は逆でもよく、親配列ライブラリを構成する塩基配列をペアリングし、各ペアの塩基配列を、アラインメントしてもよい。すなわち、親配列ライブラリを構成する塩基配列を２個の塩基配列からなるペアの集団に分け、各ペアの塩基配列をアラインメントしてもよい。
【００２１】
アラインメントとは、塩基配列の相同性のある領域が分かるように塩基配列を並べることを意味し、同一の塩基配列を有する部分塩基配列又は相同性のある部分塩基配列が同じ位置に並ぶようにギャップを挿入して並べる。アラインメントにおいて、親配列ライブラリを構成する塩基配列の長さが同一でない場合には、アラインメントする塩基配列に最大の相同性を与える位置にギャップを挿入することを優先し、短いほうの塩基配列にギャップを挿入することが好ましい。本明細書において、ギャップとは空白（空白の塩基）を意味する。本明細書において、用語「相同性」及び「類似性」は同義に用いられる場合がある。
【００２２】
続いて、各ペアの塩基配列を任意の点で交叉させて組換える。すなわち、任意の点から互いの塩基配列を交換した新たな塩基配列を生成する。任意の点は、全てのペアにおいて、同一の位置、例えば５’末端からｎ塩基目であってもよく、各ペアで異なる位置であってもよい。以上の交叉及び組換えの操作を、全てのペアリングした塩基配列について行い、新たな塩基配列の集団を生成する。
【００２３】
新たな塩基配列には、変異を導入してもよい。変異はランダムなものが好ましく、置換変異、１〜数塩基の欠失、１〜数塩基の付加であってよい。変異を導入する割合を高めることにより、アプタマーの候補配列を大きく変化させることができる。また、変異を導入する割合を低くすることにより、より限られたアプタマーの候補配列を検討することができる。例えば、標的分子との結合性が低い塩基配列からなる親配列ライブラリを使用する場合には、変異の導入割合を高く設定してもよい。これにより、より多様性の高いアプタマーの候補を検討することができる。また、標的分子と比較的高い結合性を有する塩基配列からなる親配列ライブラリを使用する場合には、変異の導入割合を低く設定してもよい。これにより、より結合性の高いアプタマーを取得できる可能性が高まる。ここで、変異の導入割合を高く設定する場合には、変異導入前の塩基配列の塩基数を基準として、１０〜３０％の塩基を変異させるとよい。また、変異の導入割合を低く設定する場合には、同じ基準で０．５〜１０％の塩基を変異させるとよい。
【００２４】
続いて、新たな塩基配列からなる核酸を実際に合成し、標的分子との結合性を評価する。核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡやＬＮＡなどの核酸類似体及びこれらの混合物のいずれであってもよいが、取り扱いが簡単なことからＤＮＡが好ましい。修飾標的分子と核酸の結合性の評価方法には特に制限はなく、例えば、次のような方法が使用できる。まず、標的分子を９６ウェルプレートに固定する。続いて蛍光標識（例えばＦＩＴＣ標識）した核酸を各ウェルに添加して反応させる。続いて未反応の核酸を洗浄して除去し、ウェルに結合した蛍光標識の蛍光強度を測定する。あるいは、未反応の核酸を洗浄して除去したのち、酵素標識（例えばアルカリフォスファターゼ標識）された抗蛍光標識抗体を反応させ、未反応の抗体を洗浄して除去した後、酵素の基質を添加し、ウェルに結合した蛍光標識の量に応じた発光、発色又は蛍光を測定する。上記の方法において、９６ウェルプレートの代わりに、ＰＶＤＦ膜などのメンブレンを用いてもよい。また、標的分子が例えば微生物の表面に存在する場合には、後述の実施例と同様にして微生物と核酸との結合性を検討してもよい。
【００２５】
標的分子との結合性が高い核酸を選択し、これらの塩基配列からなる集団を第１進化処理ライブラリとする。この第１進化処理ライブラリを親配列ライブラリに用いて、上記の（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップを複数回繰り返すことが好ましい。繰り返すことにより、得られる核酸の標的分子との結合性が更に向上する場合がある。（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップを繰り返しても標的分子との結合性があまり向上しなくなったら次のステップに進むことが好ましい。
【００２６】
図２は、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップの過程の一例を説明する説明図である。図２において、親配列ライブラリは配列Ａ〜Ｄの塩基配列からなる。まず、これらの塩基配列をアラインメントしてからペアリングする。図２では、親配列ライブラリは、配列Ａ及びＢからなるペア１及び配列Ｃ及びＤからなるペア２のペアの集団に分けられている。次に、ペア１を構成する配列Ａ及びＢを任意の点で組換え、さらに変異を導入して新たな塩基配列Ａ’及びＢ’が得られる。同様にペア２においても配列Ｃ及びＤをもとに新たな塩基配列Ｃ’及びＤ’が得られる。このようにして得られた新しい世代の配列を有する核酸を合成し、標的分子との結合性が高い核酸を選択し、選択した塩基配列からなる集団を第１進化処理ライブラリとする。（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップを複数回繰り返すことが好ましい。繰り返すことにより、得られる核酸の標的分子との結合性が向上する。（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップを繰り返しても標的分子との結合性があまり向上しなくなったら次のステップに進むことが好ましい。
【００２７】
続いて、（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップについて説明する。上記の第１進化処理ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、塩基配列間で類似性のある１つ以上の配列領域を特定する。ここで、類似性のある配列領域とは、上記の第１進化処理ライブラリを構成する塩基配列からなる核酸のうち、標的分子との結合性が最も高い核酸の塩基配列を基準とした場合に、３０％以上の相同性を有する１〜３０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは３〜１５塩基の塩基配列からなる部分配列領域を意味する。ここで特定する、類似性のある配列領域は、高い相同性を有している必要はなく、相同性を有する可能性があればよい。第１進化処理ライブラリを構成する塩基配列の長さが同一でない場合には、短い塩基配列に１又は複数のギャップを挿入して長さを揃えてアラインメントすることが好ましい。ギャップは塩基配列のいずれの位置に挿入してもよいが、上記の相同性の高い配列領域に最大の相同性を与える位置に挿入することが好ましい。
【００２８】
本明細書において、「３０％以上の相同性を有する塩基配列」とは、２つの塩基配列をアラインメントして比較した場合に、３０％以上の塩基が同一である塩基配列を意味する。上述したように、塩基配列をアラインメントする際には、最大の相同性を与えるようにギャップを挿入してもよい。
【００２９】
続いて、第１進化処理ライブラリを構成する各塩基配列について、上記の類似性のある配列領域を無作為に交換した新たな塩基配列を生成する。類似性のある配列領域が複数特定された場合には、それぞれの対応する配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成する。新たな塩基配列には、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップと同様に変異を導入することが好ましい。
【００３０】
続いて、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップと同様にして、新たな塩基配列からなる核酸を実際に合成し、標的分子との結合性を評価する。
【００３１】
標的分子との結合性が高い核酸を選択し、これらの塩基配列からなる集団を第２進化処理ライブラリとする。この第２進化処理ライブラリを（第１進化処理ライブラリとして）用いて、上記の（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップを複数回繰り返すことが好ましい。繰り返すことにより、得られる核酸の標的分子との結合性が更に向上する場合がある。（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップを繰り返しても標的分子との結合性があまり向上しなくなったら次のステップに進むことが好ましい。
【００３２】
図３は、（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップの過程の一例を説明する説明図である。図３において、第１進化処理ライブラリは配列Ａ〜Ｄの塩基配列からなる。まず、これらの塩基配列をアラインメントし、塩基配列間で類似性のある配列領域を特定する。図３では、配列領域１及び配列領域２が特定されている。
【００３３】
続いて、第１進化処理ライブラリを構成する各塩基配列について、上記の対応する類似性のある配列領域同士を無作為に交換した新たな塩基配列を生成する。すなわち、類似性のある配列領域１は配列領域１同士で交換し、配列領域２は配列領域２同士で交換する。さらに、これらの塩基配列に変異を導入して、新しい世代の配列Ａ’、Ｂ’、Ｃ’及びＤ’を得る。このようにして得られた新しい世代の配列を有する核酸を合成し、標的分子との結合性が高い核酸を選択し、選択した塩基配列からなる集団を第２進化処理ライブラリとする。
【００３４】
続いて、（ｃ）アプタマー選別ステップについて説明する。上記の第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列を必要であればアラインメントし、各塩基配列間で相同性が高い２つ以上の配列領域を特定する。ここで、相同性が高い配列領域とは、上記の第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列からなる核酸のうち、標的分子との結合性が最も高い核酸の塩基配列を基準とした場合に、８０％以上の相同性を有する１〜３０塩基、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは３〜１５塩基の塩基配列からなる部分配列領域を意味する。第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列の長さが同一でない場合には、短い塩基配列にギャップを挿入して長さを揃えてアラインメントすることが好ましい。ギャップは塩基配列のいずれの位置に挿入してもよいが、上記の相同性の高い配列領域に最大の相同性を与える位置に挿入することが好ましい。
【００３５】
上記の２つ以上の配列領域のうち、より高度に保存された配列領域をコア配列領域とする。より高度に保存された配列領域とは、第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列のうち、全て又はほとんど全ての塩基配列が共有する、より相同性の高い配列領域を意味する。
【００３６】
続いて、第２進化処理ライブラリを構成する各塩基配列について、上記のコア配列領域以外の配列領域同士を無作為に交換した新たな塩基配列を生成する。コア配列領域以外の配列領域が複数特定された場合には、それぞれの対応する配列領域同士を無作為に交換した塩基配列を生成する。新たな塩基配列には、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップと同様に変異を導入してもよいが、コア配列領域には変異を入れないことが好ましい。コア配列領域に変異を入れると、アプタマーの結合性が低下する可能性が高い。
【００３７】
続いて、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップと同様にして、新たな塩基配列からなる核酸を実際に合成し、標的分子との結合性を評価する。標的分子との結合性が高い核酸をアプタマーとして選別する。
【００３８】
ここで、標的分子との結合性が高い核酸を選択し、これらの塩基配列からなる集団を（第２進化処理ライブラリとして）用いて、上記の（ｃ）アプタマー選別ステップを複数回繰り返すことが好ましい。繰り返すことにより、得られる核酸の標的分子との結合性が更に向上する場合がある。（ｃ）アプタマー選別ステップを繰り返しても標的分子との結合性があまり向上しなくなった時点で、結合性が最も高い核酸をアプタマーとして選別することが好ましい。
【００３９】
図４は、（ｃ）アプタマー選別ステップの過程の一例を説明する説明図である。図４において、第２進化処理ライブラリは配列Ａ〜Ｄの塩基配列からなる。まず、これらの塩基配列をアラインメントし、塩基配列間で相同性の高い配列領域を特定する。図４では、配列領域１〜３が特定されている。さらに、配列領域のうち最も相同性の高い配列領域をコア配列領域とする。図４では、配列領域２がコア配列領域として特定されている。
【００４０】
続いて、第２進化処理ライブラリを構成する各塩基配列について、コア配列領域を除いた配列領域同士を無作為に交換した新たな塩基配列を生成する。すなわち、配列領域１を配列領域１同士で交換し、配列領域３を配列領域３同士で交換する。さらに、これらの塩基配列に変異を導入して、新しい世代の配列Ａ’、Ｂ’、Ｃ’及びＤ’を得る。このときにコア配列領域には変異を導入しない。このようにして得られた新しい世代の配列を有する核酸を合成し、標的分子との結合性が高い核酸を選択し、上記のステップを複数回繰り返すことで得られる標的分子との結合性が最も高い核酸をアプタマーとして決定する。
【００４１】
以上のようにして、多様な塩基配列を取りこぼすことなく探索し、Ｓｍ菌に対する結合性の良好なアプタマーを選別することができる。
【００４２】
上記の（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップにおける類似性のある配列領域の特定及び（ｃ）アプタマー選別ステップにおける相同性の高い配列領域の特定においては、核酸の２次構造予測、３次構造予測などのシミュレーションを利用してもよい。シミュレーションの結果から相同性の高い配列領域の候補と考えられる塩基配列について、実際に核酸を合成し、標的分子との結合性を評価してもよい。結合性評価の結果、標的分子との結合性が高い塩基配列を相同性の高い配列領域の候補としてもよい。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。
【００４４】
（実施例１）
Ｓｍ菌（ＡＴＣＣ２５１７５）そのものを標的としてアプタマーを選別した。標的分子は、Ｓｍ菌の表面に特異的に存在する分子である。
【００４５】
（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップ
コンピューターを用いて塩基配列をランダムに発生させ、発生させた塩基配列からなるＤＮＡを化学合成した。ＤＮＡにはＦＩＴＣ標識を行った。塩基配列の長さは１０〜１００塩基であった。
【００４６】
Ｓｍ菌をＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）で１．０×１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した。この溶液に、上記のＦＩＴＣ標識したＤＮＡ（終濃度  １μＭ）及びＴＢＳ−Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）−１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）で５００倍希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ＦＩＴＣ抗体を混合し反応させた。続いて、Ｓｍ菌をＴＢＳ−Ｔで洗浄し、Ｓｍ菌に結合しなかったＤＮＡや抗体を除去した。洗浄後の反応液１μｌをニトロセルロースメンブレンにブロットし、ＥＣＬ  ａｄｖａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を添加して、酵素−基質反応による化学発光を生じさせた。生じた発光量をＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて測定し、測定値と陰性対象の発光量との比を算出し、ＤＮＡのＳｍ菌に対する結合性（結合能）の指標として数値化した。
【００４７】
得られた結果に基づいて結合性の高いＤＮＡの塩基配列を選択し、親配列ライブラリとした。
【００４８】
得られた複数種類の親配列ライブラリに倍加処理を行った。続いて親配列ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、無作為に２個の塩基配列同士をペアリングした。続いて各ペアの塩基配列を交叉させて組換えた。交叉点は各塩基配列の長さを考慮したうえで、一般的に使用されるコンピュータープログラムにより乱数を発生させて位置決めし、交叉点の３’側の塩基配列を組換えた。以上の交叉及び組換えの操作を、全ての塩基配列ペアについて各々行い、新たな塩基配列の集団を生成した。続いて得られた塩基配列の集団に変異を導入した。変異導入前の塩基配列の塩基数を基準として、１０％の塩基を変異させる置換変異を導入した。
【００４９】
続いて、変異を導入した塩基配列からなるＤＮＡを化学合成した。ＤＮＡにはＦＩＴＣ標識を行った。続いて、上記と同様にしてＳｍ菌との結合性を評価し、結合性の高かった塩基配列を選択した。
【００５０】
選択した塩基配列集団を親配列ライブラリとして用いて、以上の操作を繰り返した。すなわち、倍加処理、アラインメント、ペアの作成、交叉及び組換え、変異導入、Ｓｍ菌との結合性の評価の各操作を、上記と同様にして合計６回繰り返し行った（第１〜６世代）。（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップを繰り返すたびにＳｍ菌との結合性が高くなることが確認された。第６世代の塩基配列集団から、結合能の高いＤＮＡの塩基配列８種類を選択し、第１進化処理ライブラリとした。
【００５１】
（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップ
第１進化処理ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、類似性のある配列領域が同じ位置に並ぶことを優先し、塩基配列の長さが同じになるようにギャップを挿入した。この結果、複数の類似性のある配列領域（ブロック）が特定され、この配列領域に基づいて塩基配列を４箇所にブロック分けした。続いて、第１進化処理ライブラリを構成する塩基配列の、それぞれ対応する配列領域（ブロック）同士を互いにランダムに交換し、新たな塩基配列の集団を生成した。続いて、得られた塩基配列の集団に変異を導入した。変異導入前の塩基配列の塩基数を基準として、１０％の塩基を変異させる置換変異を導入した。
【００５２】
続いて、変異を導入した塩基配列からなるＤＮＡ（１本鎖オリゴＤＮＡ）を化学合成した。ＤＮＡにはＦＩＴＣ標識を行った。続いて、上記と同様にしてＳｍ菌との結合性を評価し、結合性の高かった塩基配列を選択した。選択した塩基配列集団を用いて、（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップを３回繰り返した（第７〜９世代）。（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップにおいては、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップの時よりも、Ｓｍ菌との結合性のより大きな向上が認められた。第９世代の塩基配列集団から、結合能の高いＤＮＡの塩基配列３種類を選択し、第２進化処理ライブラリとした。
【００５３】
（ｃ）アプタマー選別ステップ
第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列をアラインメントし、相同性の高い配列領域が同じ位置に並ぶことを優先し、塩基配列の長さが同じになるようにギャップを挿入した。この結果、３個の配列領域が確認され、相同性の高い配列領域に基づいて塩基配列を３箇所にブロック分けした。配列領域のうち、全ての塩基配列で最も相同性の高い領域をコア配列領域として特定した。
【００５４】
続いて、第２進化処理ライブラリを構成する塩基配列の配列領域（ブロック）のうち、コア配列領域以外のものについて、それぞれ対応するブロック同士を互いにランダムに交換し、新たな塩基配列の集団を生成した。続いて、得られた塩基配列の集団の、コア配列領域以外の部分に変異を導入した。変異導入前の塩基配列の塩基数を基準として、各ブロックにおいて５％ずつの塩基を変異させる置換変異を導入した。
【００５５】
続いて、変異を導入した塩基配列からなるＤＮＡを化学合成した。ＤＮＡにはＦＩＴＣ標識を行った。続いて、上記と同様にしてＳｍ菌との結合性を評価し、結合性の高かった塩基配列を選択した。選択した塩基配列集団を用いて、以上の操作を繰り返した。すなわち、アラインメント、相同性の高い配列領域の確認、コア配列領域の特定、ブロック分け、配列領域の交換、変異導入、Ｓｍ菌との結合性の評価の各操作を、上記と同様にして合計３回繰り返し行った（第１０〜１２世代）。
【００５６】
その結果、Ｓｍ菌との結合性は飛躍的に高くなり、第１１世代で結合性の最大の向上が観察された。第１２世代では結合性の向上は認められなかった。図１に実施例１の結果を示す。図１は、上記の各世代における、Ｓｍ菌との結合性の評価の結果を表したグラフである。ｘ軸（横軸）方向に、各世代のライブラリを構成する塩基配列を、Ｓｍ菌との結合性が高いものから順に並べた。ｙ軸は世代数を示す。ｚ軸（縦軸）は各塩基配列からなるＤＮＡのＳｍ菌との結合性の高さ（相対値）を示す。第９世代（図中「＊」で示す。）、第１０世代（図中「＊＊」で示す。）及び第１１世代（図中「＊＊＊」で示す。）の塩基配列からなるＤＮＡにおいて、Ｓｍ菌との結合性の飛躍的な向上が認められた。
【００５７】
（比較例１）
（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップを続けた場合
実施例１の第６世代の塩基配列集団から、Ｓｍ菌との結合性の高いＤＮＡの塩基配列８種類を選択したものを親配列ライブラリとして用いて、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップをさらに第７〜９世代まで繰り返し、得られた塩基配列からなるＤＮＡとＳｍ菌との結合性を評価した。その結果、実施例１のような結合性の向上は認められなかった。
【００５８】
（比較例２）
（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップを続けた場合
実施例１の第９世代の塩基配列集団から、Ｓｍ菌との結合性の高いＤＮＡの塩基配列３種類を選択したものを第１進化処理ライブラリとして用いて、（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップをさらに第１０〜１２世代まで繰り返し、得られた塩基配列からなるＤＮＡとＳｍ菌との結合性を評価した。その結果、実施例１のような結合性の飛躍的な向上は認められなかった。
【００５９】
以上の結果は、（ａ）第１進化処理ライブラリ取得ステップ、（ｂ）第２進化処理ライブラリ取得ステップ及び（ｃ）アプタマー選別ステップを組み合わせることによって初めて標的分子に対して飛躍的に結合性が向上したアプタマーの選別が可能となることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、多様な塩基配列を取りこぼすことなく、Ｓｍ菌との結合性の高いアプタマーを選別することが可能な、アプタマーの選別方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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