(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−プロパンジオールを製造するための方法であって、
−大腸菌由来のｙｑｈＤ遺伝子を過剰発現させることによるメチルグリオキサールレダクターゼ活性の増強、および
−Entner-Doudoroff経路に関与するｅｄｄ遺伝子およびｅｄａ遺伝子の少なくとも１つの欠失
によって特徴づけられる、炭素源からの１，２−プロパンジオールの製造に有用な改変大腸菌が、炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成した１，２−プロパンジオールが回収される、方法。
【請求項２】
前記改変大腸菌において、前記過剰発現が、メチルグリオキサール還元に関与するｙｑｈＤ遺伝子の天然プロモーターを該遺伝子の強レベルの発現を誘導するプロモーターに置換することによって、またはメチルグリオキサール還元に関与するｙｑｈＤ遺伝子の複数のコピーを大腸菌に導入することによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変大腸菌において、ｍｇｓＡ遺伝子の発現の増強によって、またはｍｇｓＡ遺伝子に導入された特異的な突然変異によって、メチルグリオキサールシンターゼ活性が増強されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記改変大腸菌において、メチルグリオキサールから乳酸への変換に関与する次の遺伝子：ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記改変大腸菌において、乳酸、ギ酸またはエタノールの合成に関与する次の遺伝子：ｌｄｈＡ、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ、ａｄｈＥの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記改変大腸菌において、酢酸の合成に関与する次の遺伝子：ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢの少なくとも１つの発現が減弱されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記改変大腸菌において、ｇａｐＡ遺伝子の発現の減弱によって、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ活性が減弱されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記改変大腸菌において、ホスホエノールピルビン酸とは独立の糖移入系に関与し、かつ、ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の増強によって、糖移入の効率が高められている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記改変大腸菌において、糖ホスホトランスフェラーゼ系の効率が、代謝産物ホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーを高めることによって増強されており、ここで、
−ピルビン酸キナーゼをコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されており、および／または
−ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードするｐｐｓＡ遺伝子の発現が増強されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記改変大腸菌において、
−ｇｌｄＡ遺伝子の発現の増強によってグリセロールデヒドロゲナーゼ活性が増強されており、および／または
−ｆｕｃＯ遺伝子の発現の増強によって１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性が増強されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記改変大腸菌において、遺伝子ｌｐｄが、アラニン５５がバリンで置換される置換をもたらす点突然変異を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変大腸菌において、
−ｔｐｉＡ遺伝子の発現の減弱によってトリオースリン酸イソメラーゼ活性が減弱されており、および／または
−ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
回収された１，２−プロパンジオールがさらに精製される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
炭素源からの１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの製造に有用な改変大腸菌であって、
−大腸菌由来のｙｑｈＤ遺伝子を過剰発現させることによるメチルグリオキサールレダクターゼ活性の増強、
−ｍｇｓＡ遺伝子の発現の増強によるメチルグリオキサールシンターゼ活性の増強、および
−Entner-Doudoroff経路に関与するｅｄｄ遺伝子およびｅｄａ遺伝子の少なくとも１つの欠失
によって特徴づけられる、改変大腸菌。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
緒論
本発明は、改変された微生物ならびに１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの製造のためのその使用に関する。
【０００２】
Ｃ３ジアルコールである１，２−プロパンジオールすなわちプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。これは、不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の徐氷液の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より有毒であると認識されているエチレン誘導体の代わりとして１９９３〜１９９４年以来、使用が増えてきた。
【０００３】
１，２−プロパンジオールは現在、大量の水を消費するプロピレンオキシド水和法を用いた化学的手段により製造されている。プロピレンオキシドは、一方はエピクロロヒドリンを用い、他方はヒドロペルオキシドを用いる２つの方法のいずれかよって製造することができる。両経路とも、毒性が強い物質を用いる。さらに、ヒドロペルオキシド経路は、ｔｅｒｔ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールなどの副生成物を生じる。プロピレンの産生を有利にするためには、これらの副生成物の用途を見出さなければならない。この化学的経路は一般的にラセミ１，２−プロパンジオールを生成するが、２つの立体異性体（Ｒ）１，２−プロパンジオールおよび（Ｓ）１，２−プロパンジオールはそれぞれ、ある特定の適用（例えば、特殊化学物質および医薬品のためのキラル出発材料）に関して注目されるものである。
【０００４】
アセトールすなわちヒドロキシアセトン（１−ヒドロキシ−２−プロパノン）はＣ３ケトアルコールである。この生成物は繊維工業のバット染色法において還元剤として使用されている。これは有利にも、環境に有害な排水中の硫黄含量を低減するため、従来の硫黄含有還元剤に取って代わり得る。アセトールはまた、例えばポリオールまたは複素環式分子を製造するために用いられる化学薬品工業の出発材料でもある。これはまた、興味深いキレート特性および溶媒特性を持っている。
【０００５】
アセトールは現在、主として１，２−プロパンジオールの触媒的酸化または脱水によって製造されている。今般、グリセロールのような再生可能な供給原料から出発する新たな方法が提案されている（ＤＥ４１２８６９２およびＷＯ２００５／０９５５３６参照）。現在、化学法によるアセトールの製造コストがその産業上の利用および市場を小さくしている。
【０００６】
これら１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの製造のための化学法の欠点は、生合成を魅力的な選択肢とする。微生物による糖からのこれらの生成物の天然生産に関して２つの経路が同定されている。
【０００７】
１つ目の経路では、６−デオキシ糖（例えば、Ｌ−ラムノースまたはＬ−フコース）がジヒドロキシアセトンリン酸および（Ｓ）−ラクトアルデヒドに開裂され、さらに（Ｓ）−１，２−プロパンジオールへと還元することができる(Badia et al, 1985)。この経路は大腸菌(E. coli)で機能するものの、デオキシヘキソースのコストが高いために経済上実現可能な方法をもたらすことはできない。
【０００８】
２つ目の経路は、解糖経路、次いでメチルグリオキサール経路を介した汎用糖（例えば、グルコースまたはキシロース）の代謝である。ジヒドロキシアセトンリン酸はメチルグリオキサールへ変換され、これがラクトアルデヒドまたはアセトールのいずれかへ還元することができる。その後、これら２つの化合物は２回目の還元を受け、１，２−プロパンジオールを生じ得る。この経路は、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)およびサーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)などの天然（Ｒ）−１，２−プロパンジオール生産株によって用いられている。クロストリジウム・スフェノイデスは、リン酸制限条件下、１．５８ｇ／ｌの力価で１，２−プロパンジオールを産生するために用いられている(Tran Din and Gottschalk, 1985)。また、サーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカムも、１，２−プロパンジオールの製造に関して検討されてきた(Cameron and Cooney, 1986, Sanchez-Rivera et al, 1987)。得られた最高性能は力価９ｇ／ｌであり、０．２ｇ／ｇのグルコースからの収率であった。しかしながら、これらの生物で得られる性能の改良は、利用可能な遺伝的手段が不足しているために限られていると思われる。
【０００９】
先行技術
大腸菌は天然に１，２−プロパンジオールとアセトールを産生する遺伝的能力を有する。１，２−プロパンジオールへの生合成経路は、解糖中間体ジヒドロキシアセトンリン酸から出発する。この代謝中間体は、ｍｇｓＡ遺伝子によりコードされているメチルグリオキサールシンターゼによってメチルグリオキサールへと変換され得る(Cooper, 1984, Totemeyer et al, 1998)。メチルグリオキサールは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質などの高分子の求核中心と反応し得る極めて有毒な求電子物質である。これは細菌の増殖を阻害し、極めて低濃度で細胞死をもたらし得る（０．３〜０．７ｍＭ）。このため、メチルグリオキサールの解毒のための既存の経路が検討されてきた(Ferguson et al, 1998)。３つの経路が細菌、特に大腸菌で同定されている。
・１つ目は、メチルグリオキサールをＤ−乳酸へ変換するグルタチオン依存性グリオキサラーゼＩ−ＩＩ系（ｇｌｏＡおよびｇｌｏＢ遺伝子によりコードされている）
・２つ目は、メチルグリオキサールの、Ｄ−乳酸への変換を触媒するグルタチオン非依存性グリオキサラーゼＩＩＩ酵素系
・３つ目は、メチルグリオキサールレダクターゼによるメチルグリオキサールの分解を含む。
【００１０】
この最後の系は、１，２−プロパンジオールの製造に適切である。メチルグリオキサールは、Ｃ１にアルデヒド、そしてＣ２のケトンを有するＣ３ケトアルデヒドである。これらの２つの位置はアルコールへ還元可能で、それぞれ非キラル分子であるアセトール（またはヒドロキシアセトン）と、Ｌ型またはＤ型（図１参照）で存在し得るキラル分子であるラクトアルデヒドを生じる。これらの３つの分子、アセトール、Ｌ−ラクトアルデヒドおよびＤ−ラクトアルデヒドはその後他の位置で還元されて、キラル１，２−プロパンジオールを生じ得る。
【００１１】
大腸菌で優先的に用いられている経路は、現時点では明らかにされていない。大腸菌では、補因子として優先的にＮＡＤＰＨを用いるメチルグリオキサールレダクターゼが同定され、部分的に同定されている(Saikusa et al, 1987)。この反応の生成物はラクトアルデヒドであることが示された。Misra et al (1996)は、同じ生成物アセトールが得られる２つのメチルグリオキサールレダクターゼ活性の精製を記載している。一方のＮＡＤＨ依存性活性はアルコールデヒドロゲナーゼ活性であり得るが、ＮＡＤＰＨ依存性活性は非特異的アルデヒドレダクターゼであり得る。Altaras and Cameron (1999)は、大腸菌のｇｌｄＡ遺伝子によりコードされているグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧｌｄＡ）は、メチルグリオキサールの、（Ｒ）−ラクトアルデヒドへの還元、また、アセトールの１，２−プロパンジオールへの変換に活性があることを実証した。
【００１２】
遺伝子ｙｇｈＺが大腸菌からクローニングされ、発現され、そのタンパク質が同定されている（Grant, 2003)。これは補因子としてＮＡＤＰＨを伴い、メチルグリオキサールに対して特異性の高い活性を示すが、この反応の生成物は同定されなかった。この遺伝子は、過剰発現されると、メチルグリオキサール毒性に対する耐性を付与した。
【００１３】
Ko et al (2005)は、メチルグリオキサールの、アセトールへの変換の候補として、大腸菌の９アルド−ケトレダクターゼ(9 aldo-keto reducases)を体系的に検討した。彼らは、４つの精製酵素ＹａｆＢ、ＹｑｈＥ、ＹｅａＥおよびＹｇｈＺがＮＡＤＰＨの存在下でメチルグリオキサールをアセトールへ変換できたことを示した。彼らの研究によれば、メチルグリオキサールレダクターゼＹａｆＢ、ＹｅａＥおよびＹｇｈＺは、解毒に関してin vivoにおけるメチルグリオキサールの代謝に最も関連がある。Di Luccio et al (2006)は、大腸菌のｙｄｊＧ遺伝子の産物がＮＡＤＨを伴ってメチルグリオキサールに活性があることを示したが、この反応の生成物の同定は行われなかった。
【００１４】
単純炭素源を用いて１，２−プロパンジオール生産株を得るための大腸菌の遺伝的改変に関するいくつかの検討がCameronのグループ(Cameron et al, 1998, Altaras and Cameron, 1999, Altaras and Cameron, 2000)およびBennettのグループ(Huang et al, 1999, Berrios-Rivera et al, 2003)によって行われた。これらの研究は、ジヒドロキシアセトンリン酸から１，２−プロパンジオールへの経路における酵素活性をコードする１つ、または数個の遺伝子の発現に頼るものである。Cameron et al (1998)は、ラット水晶体アルドースレダクターゼをコードする遺伝子またはｇｌｄＡ遺伝子のいずれかの過剰発現が０．２ｇ／ｌ未満の１，２−プロパンジオールの生産をもたらしたことを示した。この力価の改良は、２つの大腸菌遺伝子ｍｇｓＡおよびｇｌｄＡを同時発現させることによって可能である。この組合せを用いれば、０．７ｇ／ｌ力価の１，２−プロパンジオールが得られる(Altaras and Cameron, 1999)。力価および収量のさらなる改良は、大腸菌において完全な１，２−プロパンジオール経路を発現された際に得られた(Altaras and Cameron, 2000)。３つの遺伝子ｍｇｓＡ、ｇｌｄＡおよびｆｕｃＯは乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）欠損株で発現された。この組合せを用いたところ、Cameronのグループによって得られた最良の結果は、嫌気的フラスコ培養における１．４ｇ／ｌの１，２−プロパンジオールの生産であり、グルコース消費１ｇ当たり０．２ｇの収率であった。嫌気性流加発酵槽に外挿すると、生産量は１，２−プロパンジオール４．５ｇ／ｌであり、グルコース１ｇ当たり０．１９ｇの収率であった。力価および収率は低いが、同じアプローチを用いて得られた結果が米国特許第６，０８７，１４０号、同第６，３０３，３５２号およびＷＯ９８／３７２０４にも記載されている。Bennettのグループも、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のｍｇｓ遺伝子および大腸菌由来のｇｌｄＡ遺伝子の過剰発現のためにｌｄｈＡ欠損大腸菌宿主株を用いた。嫌気条件下でのフラスコ培養では力価１．３ｇ／ｌおよび収率０．１２ｇ／ｇであったが、微好気培養では力価１．４ｇ／ｌであり、収率は０．１３ｇ／ｇであった。
【００１５】
この段階では、これらの結果は全て、Ｔ．サーモサッカロリチカム種で得られたものほど良くはない。
【００１６】
これまでに、メチルグリオキサールをアセトールへ変換する微生物、特に大腸菌からの内因性活性の使用は記載されていない。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、増強されたメチルグリオキサールレダクターゼ活性を有する改変微生物ならびに１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの製造のためのその使用に関する。メチルグリオキサールレダクターゼ酵素は微生物由来の遺伝子の産物である。このメチルグリオキサールレダクターゼ活性の増強は、メチルグリオキサールの、アセトールへの変換に関与する１以上の遺伝子、好ましくはｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧおよびｙｄｂＣから選択される遺伝子を過剰発現させることによって得られる。
【００１８】
本発明の別の態様において、メチルグリオキサールシンターゼ活性はまた、ｍｇｓＡ遺伝子を過剰発現させることによっても増強される。
【００１９】
本発明のさらなる態様において、Entner-Doudoroff経路がｅｄｄ遺伝子またはｅｄａ遺伝子のいずれか、または双方を欠失させることによって削除される。さらに、メチルグリオキサールからの乳酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｇｌｏＡ、ａｌｄＡ、ａｌｄＢなど）、ピルビン酸からの乳酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｌｄｈＡ）、ギ酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ｐｆｌＡ、ｐｆｌＢ）、エタノールの合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ａｄｈＥ）および酢酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子（ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ）の発現を減弱することにより、不要な副生成物の合成が減弱される。
【００２０】
ｔｐｉＡ遺伝子を欠失させることにより、グルコースの半分がジヒドロキシアセトンリン酸へ、やがては１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールへ代謝されることが好ましい。所望により、利用可能なグリセルアルデヒド３リン酸の一部を１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの合成へ向け直すため、活性なｔｐｉＡ遺伝子を用いてグリセルアルデヒド３リン酸活性を低減してもよい。本発明の一態様では、ｇａｌＰによりコードされているもののようなホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とは独立の糖移入を用いるか、または糖ホスホトランスフェラーゼ系により多くのＰＥＰを供給するかのいずれかによって糖移入の高率を高める。これは、ピルビン酸キナーゼのようなＰＥＰ消費経路（ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子によりコードされる）を排除することによるか、かつ／または例えばＰＥＰシンターゼをコードするｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現することによって得られる。
【００２１】
具体的には、１，２−プロパンジオールの製造に関して、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｇｌｄＡによりコードされる）および１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｆｕｃＯによりコードされる）のような、ジヒドロキシアセトンリン酸を１，２−プロパンジオールへ変換する他の酵素を増強するために所望により微生物を改変してもよい。さらに、ピルビン酸をアセチル−ｃｏＡへ変換する酵素は、嫌気条件下で見られる高濃度ＮＡＤＨに耐性であることも有用である。これはｌｐｄ遺伝子の特異的突然変異により得ることができる。最後に、アセトールの１，２−プロパンジオールへの還元のためのＮＡＤＨを節約するために、ａｒｃＡ遺伝子およびｎｄｈ遺伝子を欠失させることができる。１，２−プロパンジオールの製造に用いる微生物は細菌、酵母および真菌から選択されるが、大腸菌またはクロストリジウム・アセトブチリカムのいずれかが好ましい。本発明は、単純炭素源または複合炭素源を含有する適切な増殖培地で改変微生物を培養すること、および生成した１，２−プロパンジオールを回収および精製することによる１，２−プロパンジオールの製造方法を提供する。
【００２２】
具体的には、アセトールの製造に関して、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を減弱または欠失させて１，２−プロパンジオールの形成を妨げる。アセトールの製造に用いる微生物は細菌、酵母および真菌から選択されるが、大腸菌または肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)のいずれかが好ましい。本発明のもう１つの目的は、単純炭素源を含有する適切な増殖培地で該改変微生物を培養すること、および生成したアセトールを回収および精製することによるアセトールの製造方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす添付図面は本発明を例示し、その説明とともに本発明の原理を説明にするのに役立つ。
【００２４】
【図１】炭水化物からの１，２−プロパンジオール生産系の開発における中枢代謝の遺伝子工学を示す。
【図２】陰イオン交換クロマトグラフィーカラムｐＨ７における３つのタンパク質ＹＱＨＤ、ＹＤＨＦおよびＧＬＤＡの溶出プロフィールを示す。
【発明の具体的説明】
【００２５】
本発明は、炭素源からの１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの製造に有用な改変微生物に関し、該微生物は微生物由来の１以上の遺伝子によりコードされているメチルグリオキサールレダクターゼ活性の増強によって特徴づけられる。
【００２６】
本明細書において、特許請求の範囲および明細書の解釈に以下の用語を用いることができる。
【００２７】
本発明によれば、「培養」、「増殖」および「発酵」とは、単純炭素源を含有する適切な増殖培地での細菌の増殖を表すために互換的に用いられる。
【００２８】
「改変微生物」とは、メチルグリオキサールレダクターゼ活性を増強させるように改変された、細菌、酵母または真菌などの微生物を表す。このような改変は、遺伝子置換またはメチルグリオキサール還元に関与する遺伝子の発現のためのベクターの導入をはじめとする、微生物を遺伝要素で形質転換するための通常の手段を含む。それはまた、突然変異誘発を誘導するための通常の条件下での微生物の無作為な、または指定された突然変異誘発も含む。それはまた、ＷＯ２００４／０７６６５９に開示されている進化方法など、微生物を進化させるための方法も含む。
【００２９】
「製造に有用」とは、その微生物が発酵により目的の生成物を製造することを表す。発酵は、好気、微好気または嫌気条件下で実施可能な従来の方法である。
【００３０】
本発明において「炭素源」とは、微生物の正常な増殖を支えるために当業者が使用可能ないずれの炭素源も表し、ヘキソース、ペントース、単糖類、二糖類、オリゴ糖、デンプンまたはその誘導体、ヘミセルロース、グリセロールおよびそれらの組合せであり得る。
【００３１】
「増強された酵素活性」とは、その活性が、改変前の同じ微生物で測定された野生型酵素の活性より優れていることを意味する。対応する非改変微生物は、メチルグリオキサールレダクターゼ活性の改変以外は改変微生物と同じ特徴を有する微生物である。メチルグリオキサールレダクターゼ活性は、Misra et al (Molecular and Cellular Biochemistry 156: 117-124 (1996))またはKo et al (J. Bacteriol. 187: 5782-5789 (2005))に開示されている方法などの通常の手段によって測定することができる。
【００３２】
有利には、メチルグリオキサールレダクターゼ活性は、対応する非改変微生物のメチルグリオキサールレダクターゼ活性に比べて少なくとも５０％、好ましくは少なくとも１００％増強される。
【００３３】
好ましくは、メチルグリオキサールレダクターゼ活性の増強は、メチルグリオキサール還元に関与する少なくとも１つの遺伝子を過剰発現させることによって得られる。
【００３４】
「発現」とは、その遺伝子の産物である、対応するタンパク質の生成をもたらす遺伝子配列からの転写および翻訳を指す。
【００３５】
目的遺伝子の過剰発現を得るために、当業者ならば例えば下記のような種々の方法を知っている。
【００３６】
１−遺伝子の天然プロモーターの、該目的遺伝子のより強レベルの発現を誘導するプロモーターでの置換
より強レベルの発現は、遺伝子の天然プロモーターを、選択された微生物で強い遺伝子発現を誘導することが知られているプロモーターで置換することによって得ることができる。このようなプロモーターとしては、大腸菌では、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、λプロモーターｃＩまたは当業者に知られているその他のプロモーターがある。他の微生物については、当業者がならば、使用可能なプロモーターを決定することができる。
【００３７】
２−以下：
・目的遺伝子を担持および発現する発現ベクターを導入すること
・遺伝子の付加的コピーをその微生物の染色体へ導入すること
による、メチルグリオキサール還元に関与する目的遺伝子の複数のコピーの、微生物への導入。
【００３８】
本発明の特定の実施態様では、次の遺伝子：ｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｄｈＦ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧおよびｙｄｂＣのうちの少なくとも１つが過剰発現される。該遺伝子はメチルグリオキサールをアセトールへ変換可能な酵素をコードする。好ましくは、ｙｑｈＤ遺伝子が単独でまたは遺伝子と組み合わせて過剰発現される。
【００３９】
本発明の別の実施態様では、増強されたメチルグリオキサール活性を有する微生物がさらに改変される。
【００４０】
好ましくは、本発明の微生物は増強されたメチルグリオキサールシンターゼ活性を提供する。有利には、これはＤＨＡＰのメチルグリオキサールへの変換に関与するメチルグリオキサールシンターゼをコードするｍｇｓＡ遺伝子の発現の増強によって得られる。
【００４１】
この増強された酵素活性を得るための別法は、天然タンパク質よりも高い活性を呈する遺伝子産物の翻訳を可能とする特異的な突然変異をｍｇｓＡ遺伝子に導入することである。
【００４２】
好ましくは、本発明の微生物において、Entner-Doudoroff経路に関与する少なくとも１つの遺伝子が減弱される。Entner-Doudoroff経路は、解糖の他に、グルコースをグリセルアルデヒド３リン酸とピルビン酸に分解する別の方法を提供する。Entner-Doudoroff経路の減弱は、ほとんどの、または良ければ全てのグルコースが解糖により分解され、１，２−プロパンジオールの製造に利用されることを保証する。
【００４３】
好ましくは、次の遺伝子：ｅｄｄ、ｅｄａの少なくとも１つの発現が減弱される。
【００４４】
「酵素の活性の減弱」とは、改変前の同じ微生物で観察された活性に比べた、目的酵素の活性の低下を指す。当業者ならばこの結果を得るための多数の手段を知っており、例えば、下記のものがある：
・その遺伝子への、この遺伝子の発現レベルまたはコードされているタンパク質の活性のレベルを低下させる突然変異の導入、
・その遺伝子の天然プロモーターの、より低い発現をもたらす強度の低いプロモーターでの置換、
・対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を脱安定化するエレメントの使用、
・発現が全く必要でないならば、その遺伝子の欠失。
【００４５】
本発明において「遺伝子の発現の減弱」とは、遺伝子の発現の部分的なまたは完全な抑制を表し、その後、それは「減弱された」と言われる。この発現の抑制は、その遺伝子の発現の阻害、その遺伝子発現に必要なプロモーター領域の全てもしくは一部の欠失、またはその遺伝子のコード領域の欠失のいずれかであり得る。好ましくは、遺伝子の減弱は本質的にその遺伝子の完全な欠失であり、その遺伝子は、本発明の株の同定、単離および精製を助ける選択マーカー遺伝子で置換することができる。遺伝子は好ましくは、相同組換えの技術によって不活性化される(Datsenko, K.A. & Wanner, B. L. (2000) "One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K- 12 using PCR products". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)。
【００４６】
本発明の別の実施態様では、メチルグリオキサールから乳酸への変換に関与する少なくとも１つの酵素の活性が減弱される。この減弱の目的は、利用可能なメチルグリオキサールが本質的に１，２−プロパンジオールの合成のために細胞機構によって用いられるというものである（図１参照）。
【００４７】
メチルグリオキサールの、乳酸への変換に関与する遺伝子としては特に下記のものがある：
・メチルグリオキサールからのラクトイルグルタチオンの合成を触媒するグリオキサラーゼＩをコードするｇｌｏＡ遺伝子、
・ラクトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（（Ｓ）ラクトアルデヒドからの（Ｓ）乳酸の合成を触媒する）をコードするａｌｄＡおよびａｌｄＢ遺伝子。
【００４８】
これらの遺伝子の１以上を微生物において減弱するのが有利である。好ましくは、遺伝子ｇｌｏＡを減弱するか、または完全に欠失させる。
【００４９】
本発明の微生物において、乳酸、エタノールおよびギ酸などの副生成物の合成に関与する少なくとも１つの酵素が減弱されることが好ましい。
【００５０】
特に、ピルビン酸からの乳酸の合成を触媒する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｌｄｈＡ、およびアセチル−ＣｏＡからのエタノールの合成を触媒するアルコール−アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ａｄｈＥを減弱することが有利である。
【００５１】
同様に、アセチル−ＣｏＡとギ酸の代わりに、ピルビン酸から、アセチル−ＣｏＡ  ＣＯ２とＮＡＤＨを生産するために微生物にピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体を使用させることもできる。これは、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子ｐｆｌＡおよびｐｆｌＢを減弱することによって達成することができる。
【００５２】
本発明の別の特定の実施態様では、副生成物である酢酸の合成が、その合成に関与する少なくとも１つの酵素を減弱することにより妨げられる。１，２−プロパンジオールの製造を至適化するためにはこのような酢酸合成を回避することが好ましい。
【００５３】
酢酸の生産を妨げるためには、ａｃｋＡ、ｐｔａおよびｐｏｘＢから選択される少なくとも１つの遺伝子を減弱するのが有利である。これらの遺伝子は全て、異なる酢酸生合成経路（図１参照）に関与する酵素をコードしている。
【００５４】
本発明の特定の実施態様では、トリオースリン酸イソメラーゼ活性が減弱される。好ましくは、この結果はｔｐｉＡ遺伝子の発現を減弱することにより達成される。このｔｐｉＡ遺伝子は、ＤＨＡＰの、グリセルアルデヒド３リン酸への変換を触媒する酵素「トリオースリン酸イソメラーゼ」をコードしている（図１参照）。この遺伝子の発現の減弱により、代謝されたグルコースの半分が１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールへ変換されることが確実となる。
【００５５】
本発明の特定の実施態様では、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ活性が減弱される。グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼは、ＧＡＰＤＨとも呼ばれ、グルコースの、ピルビン酸への解凍変換に関与する重要な酵素の１つである。この酵素の減弱の結果、ＧＡ３Ｐの一部が１，２−プロパンジオールおよび／またはアセトールの合成に向け直される。そして、１，２−プロパンジオール／グルコースの収量は１モル／モルより大きくなり得る。このグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、野生型ＧＡＤＰＨの通常活性の約３０％未満、より好ましくは１０％未満であるのが有利である。
【００５６】
好ましくは、ＧＡＰＤＨをコードするｇａｐＡ遺伝子の発現が減弱される。
【００５７】
好ましくは、本発明の微生物において、糖移入の効率が高められる。ｇａｐＡ遺伝子発現の強い減弱はＧＡＰＤＨ反応において５０％を超える炭素フラックスの低下をもたらし、この結果、移入グルコース１モル当たり１モル未満のＰＥＰが合成される。移入はグルコース６リン酸を生じるＰＥＰからグルコースへのホスホ転移と結びついていることから、ＰＥＰは、細胞への単純糖の移入に通常用いられる糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）により必要とされる。よって、ＰＥＰ量を減らすと、糖移入に負の影響が及ぶ。
【００５８】
本発明の特定の実施態様では、糖はホスホエノールピルビン酸とは独立の糖移入系によって微生物に移入され得る。リン酸化を含まない遺伝子ｇａｌＰによりコードされているガラクターゼ−プロトン共輸送体が利用可能である。この場合、移入したグルコースは、ｇｌｋ遺伝子によりコードされているグルコースキナーゼ活性によってリン酸化されなければならない。この経路を促進するために、ｇａｌＰおよびｇｌｋから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が増強される。結果として、ＰＴＳは分配可能となり、それはｐｔｓＨ、ｐｔｓＩまたはｃｒｒから選択される少なくとも１つの遺伝子を減弱することによって排除することができる。
【００５９】
本発明の別の特定の実施態様では、糖ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の効率が、代謝産物ホスホエノールピルビン酸のアベラビリティーを高めることによって増強される。ｇａｐＡ活性の減弱およびピルビン酸へ向かう炭素フラックスのために、本発明の改変株におけるＰＥＰの量は限定され、細胞へ輸送されるグルコースの量が少なくなり得る。
【００６０】
微生物株においてＰＥＰのアベラビリティーを高めるために使用可能な様々な手段がある。特に、ＰＥＰ→ピルビン酸の反応を減弱する手段がある。好ましくは、この結果を得るために前記の株においてピルビン酸キナーゼ酵素をコードするｐｙｋＡおよびｐｙｋＦから選択される少なくとも１つの遺伝子が減弱される。ＰＥＰのアベラビリティーを高める別法は、この酵素の活性を高めることによってホスホエノールピルビン酸シンターゼにより触媒されるピルビン酸→ＰＥＰの反応に有利になるようにすることである。この酵素はｐｐｓＡ遺伝子によりコードされている。よって、好ましくは、この微生物において、ｐｐｓＡ遺伝子の発現が好ましくは増強される。両改変が微生物に同時に存在してもよい。
【００６１】
本発明の特定の実施態様では、改変微生物は、主として１，２−プロパンジオールを生産するように設計される。この結果はアセトールおよび他の前駆体（例えば、ラクトアルデヒド）の、１，２−プロパンジオールへの変換に有利となるようにすることによって達成される。これには、下記が含まれる。
・グリセロールデヒドロゲナーゼ活性を増強すること。好ましくは、ｇｌｄＡ遺伝子の発現が増強される。
・好ましくはｆｕｃＯ遺伝子の発現を増強することにより、１，２−プロパンジオールオキシドレダクターゼ活性を増強すること。
【００６２】
特に嫌気性または微好気性条件下で、ピルビン酸の、アセチルＣｏＡへの代謝に有利な酵素（特に、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体）がＮＡＤＨによる阻害に対して低い感受性を有することが有利である。より低い感受性とは、野生型酵素の感受性に対して定義される。このような特徴は、酵素のタンパク質配列においてアラニン５５のバリン残基による置換をもたらす、ｌｐｄ遺伝子（ＰＤＣのサブユニットのリポアミドデヒドロゲナーゼをコードする）における特異的突然変異によって得ることができる。
【００６３】
嫌気性または微好気性条件下で、前駆体の、１，２−プロパンジオールへの還元に関するＮＡＤＨのアベラビリティーが高められることが有利である。これは、グローバルレギュレーターＡｒｃＡ（ａｒｃＡ遺伝子によりコードされている）により媒介されるトリカルボン酸サイクルに対する抑制を軽減することにより得られる。細胞のＮＡＤＨ濃度はまた、遺伝子ｎｄｈによりコードされているＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを不活性化することにより増強され得る。よって、好ましくは、ａｒｃＡおよびｎｄｈから選択される少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱される。
【００６４】
好ましくは、主として１，２−プロパンジオールを生産するように設計される微生物は細菌、酵母または真菌から選択される。より好ましくは、微生物は腸内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科から選択される。いっそうより好ましくは、微生物は大腸菌種またはクロストリジウム・アセトブチリカム種のいずれかに由来するものである。
【００６５】
本発明の別の特定の実施態様では、改変微生物は主としてアセトールを生産するように設計される。好ましくは、この結果は、アセトールの１，２−プロパンジオールへの変換に関与する少なくとも１つの酵素の活性を減弱することにより達成される。好ましくは、ｇｌｄＡ遺伝子の発現が減弱される。
【００６６】
有利には、主としてアセトールを生産するように設計される微生物は細菌、酵母または真菌である。より好ましくは、微生物は腸内細菌科、バチルス科、ストレプトミセス科およびコリネバクテリア科の種から選択される。いっそうより好ましくは、微生物は大腸菌種または肺炎桿菌種のいずれかに由来するものである。
【００６７】
本発明はまた、本発明の微生物が炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成された１，２−プロパンジオールが回収される、１，２−プロパンジオールを製造するための方法に関する。１，２−プロパンジオールの製造は好気性、微好気性または嫌気性条件下で行われる。
【００６８】
一つの実施態様において、大腸菌種の微生物が、単純炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖される。
【００６９】
別の実施態様では、クロストリジウム・アセトブチリカム種の微生物が単純炭素源または複合炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖される。
【００７０】
有利には、回収された１，２−プロパンジオールがさらに精製される。
【００７１】
本発明はまた、本発明の微生物が単純炭素源を含有する適切な増殖培地で増殖され、生成したアセトールが回収される、アセトールを製造するための方法に関する。アセトールの製造は、好気性または微好気性条件下、好ましくは好気性条件下で行われる。
【００７２】
有利には、回収されたアセトールがさらに精製される。
【００７３】
発酵工程のための培養条件は、当業者ならば容易に定義することができる。特に、細菌は２０℃〜５５℃の間、好ましくは２５℃〜４０℃の間の温度、好ましくは、Ｃ．アセトブチリカムでは約３５℃、大腸菌および肺炎桿菌(K. pneumoniae)では約３７℃で発酵される。
【００７４】
この工程は回分法、流加法または連続法のいずれかで行うことができる。
【００７５】
「好気性条件下」とは、酸素が、液体相に気体を溶解させることにより培養物に供給されることを意味する。これは、（１）酸素を含有する気体（例えば、空気）を液体相に散布すること、または（２）培養培地を含有する容器を振盪して、上部空間に含まれている酸素を液体相に送ることにより得ることができる。嫌気性条件下ではなく好気性条件下での発酵の利点は、電子受容体としての酸素の存在が、その株の、細胞プロセスのためにより多くのエネルギーをＡＴＰ形態で生産する能力を改良するということである。従って、その株はその全般的代謝が改良されている。
【００７６】
微好気性条件は、低パーセンテージの酸素（例えば、０．１〜１０％の間の酸素を含み、窒素で１００％とした混合物を用いる）が液体相に溶解される培養条件として定義される。
【００７７】
嫌気性条件は、培養培地に酸素が供給されない培養条件として定義される。厳密な嫌気性条件は、他の気体の痕跡を除去するために培養培地に窒素のような不活性ガスを散布することにより得られる。硝酸を電子受容体として用い、株によるＡＴＰ生産を改良し、その代謝を改良することができる。
【００７８】
本発明において「適切な増殖培地」とは、微生物の増殖に適合した既知のモル構成の培地を表す。例えば、少なくとも１つの炭素源を含有し、使用する細菌に適合した既知の設定構成の無機培養培地である。従って、大腸菌および肺炎桿菌用の無機増殖培地は、特に、Ｍ９培地(Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128)、Ｍ６３培地(Miller, 1992; A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) と同一もしくは類似の組成のもの、またはSchaefer et al. (1999, Anal. Biochem. 270: 88-96)により定義されているものなどの培地、および下記のＭＰＧと呼ばれる最小培養培地であり得る。
【００７９】
【表１】
0005546870.tif 000002
【００８０】
大腸菌または肺炎桿菌の培養に用いる炭素源は好ましくは単純炭素源であり、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。
【００８１】
従って、Ｃ．アセトブチリカム用の増殖培地は、クロストリジウム増殖培地(CGM, Wiesenborn et al., Appl. Environm. Microbiol., 54: 2717-2722)またはMonot et al. (Appl. Environm. Microbiol., 44: 1318-1324)もしくはVasconcelos et al. (J. Bacterid., 176: 1443-1450)により示されているような無機増殖培地と同一もしくは類似の組成のものであり得る。
【００８２】
Ｃ．アセトブチリカムの培養に用いられる炭素源は単純炭素または複合炭素のいずれかである。単純炭素源はアラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロースまたはキシロースであり得る。特に好ましい単純炭素源はグルコースである。複合炭素源はデンプンまたはヘミセルロースであり得る。特に好ましい複合炭素源はデンプンである。
【００８３】
本発明は上記、下記および大腸菌に関して実施例に記載されている。よって、本発明の始原株および進化株に関して減弱、欠失または過剰発現可能な遺伝子は、主として大腸菌由来の遺伝子の名称を用いて定義される。しかしながら、この名称は本発明によればより一般的な意味を持ち、他の微生物において対応する遺伝子も包含する。当業者ならば、大腸菌由来の遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ参照番号を用いて、大腸菌以外の生物における等価な遺伝子を同定することができる。
【００８４】
相同配列の同定の手段およびそれらの相同性％は当業者によく知られており、特に、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/で、このウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに使用することができるＢＬＡＳＴプログラムを含む。得られた配列は、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷプログラム(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)を、これらのウェブサイトに示されているデフォルトパラメーターとともに用いて利用（アライン）することができる。
【００８５】
ＰＦＡＭデータベース（protein families database of alignments and Hidden Markov Models http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アライメントの大きなコレクションである。各ＰＦＡＭは、複数のアライメントの可視化、タンパク質ドメインの観測、生物間での分布の評価、他のデータベースへのアクセスの確保および既知のタンパク質構造の可視化を可能とする。
【００８６】
ＣＯＧ（Clusters of Orthologous Groups of protein http://www.ncbi.nlm.nih. gov/COG/）は、４４の主要な系統発生論的系統を表す６６の完全に配列決定された単細胞ゲノムに由来するタンパク質配列を比較することにより得られる。各ＣＯＧは少なくとも３つの系統から定義され、古くから保存されていたドメインの同定が可能となる。
【００８７】
参照文献（本明細書に引用されている順）
【表２】
0005546870.tif 000003
【実施例】
【００８８】
実施例１：ケモスタットで培養された大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおけるメチルグリオキサールの還元に関与する酵素の抽出、精製および同定
ａ）メチルグリオキサールの還元に関与するＮＡＤＨ依存性またはＮＡＤＰＨ依存性酵素の精製方法：
メチルの還元に関与するＮＡＤＨ依存性またはＮＡＤＰＨ依存性酵素を精製するために設計された全精製工程は５つの段階からなる。各段階で、標的酵素を酵素活性アッセイにより検出した。２つの酵素活性を測定した：１）ＮＡＤＰＨ依存性メチルグリオキサール還元、２）ＮＡＤＨ依存性メチルグリオキサール還元。
１）厳密な嫌気性条件下または微好気性条件下のいずれかで行った大腸菌ＭＧ  １６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ（株の構築については、ＷＯ２００５／０７３３６４を参照）のケモスタット培養から微生物バイオマスを回収した。
２）これらの細胞を遠心分離により採取し、５ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．５で２回洗浄し、同じバッファーに再懸濁させた後、−２０℃で保存した。
３）これらの細胞を音波処理により破砕した（０℃、嫌気性条件下、各サイクルの間にプロテアーゼ阻害剤の存在下での２分を挟んで、３０秒４サイクル）。細胞残渣を遠心分離により除去し、細胞ホモジネート中に存在する核酸を硫酸ストレプトマイシン処理により沈殿させるか、酵素処理（ベンゾナーゼ）により加水分解した（表Ｉ）。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
表１によれば、硫酸ストレプトマイシン処理の方が有効であり、高い比活性をもたらす。これにより、目的酵素の生物活性を維持しながら夾雑物（核酸および望まないタンパク質）を除去することが可能となる。
【００９１】
４）硫酸ストレプトマイシンで処理された細胞ホモジネートを遠心分離し、ＡＫＴＡ精製系に接続し、５ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラム(Ressource Q, Amersham Bioscience)に適用した。タンパク質の分離をｐＨ７または７．５または８で行った。タンパク質を連続ＫＣｌ勾配（２％）により溶出し、個々の画分として回収した。
【００９２】
５）酵素活性を含む溶出画分をプールし、５ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファーで平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム(Hitrap phenyl sepharose, Amersham Biosciences)に適用した。
【００９３】
必要であれば、ゲル浸透クロマトグラフィーの最終工程を加えてもよい。
【００９４】
各工程の後に、収率および精製倍率を求めた。最終の精製工程の後、活性画分中に残留するタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより分離した。目的タンパク質は、画分の活性とスポットの大きさを相関させることによって同定した。タンパク質スポットを切り出し、洗浄し、特異的プロテアーゼで消化し（トリプシン消化）、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ）を行って同定した。
【００９５】
ｂ）嫌気性条件下で増殖させた大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおける、メチルグリオキサール還元に関与する酵素の同定
陰イオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ７）と、その後の疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた精製工程の結果、メチルグリオキサールを還元する２つのＮＡＤＰＨ依存性酵素：ｙｑｈＤ遺伝子によりコードされているＹＱＨＤ（４２ＫＤａ）およびｙｄｈＦ遺伝子によりコードされているＹＤＨＦ（３３ＫＤａ）が同定された（図２）。第三の酵素も、ＮＡＤＨ依存性およびＮＡＤＰＨ依存性のメチルグリオキサール還元において活性があることが判明した（ｇｌｄＡ遺伝子によりコードされているグリセロールデヒドロゲナーゼ）。
【００９６】
陰イオン交換クロマトグラフィーをｐＨ８で行った後に、疎水性相互作用クロマトグラフィーを行い、ゲル浸透クロマトグラフィーの最終工程を行うと、メチルグリオキサールを還元する別のＮＡＤＰＨ依存性酵素：ｄｋｇＢ（ｙａｆＢ）遺伝子によりコードされている２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼＢ（２９ＫＤａ）が同定された。
【００９７】
ｃ）微好気性条件下で増殖された大腸菌ＭＧ  １６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ＡｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおける、メチルグリオキサール還元に関与する酵素の同定
陰イオン交換クロマトグラフィー（ｐＨ７．５）を用いて設計された精製工程の結果、ＮＡＤＰＨ依存性のメチルグリオキサール還元を触媒するｙｃｄＷ遺伝子によりコードされているＹＣＤＷと呼ばれる３６ＫＤａタンパク質が同定された。
【００９８】
陰イオン交換クロマトグラフィーをｐＨ７．５で行った後に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うと、メチルグリオキサールの還元を触媒する他の２つのＮＡＤＰＨ依存性酵素：ｙｑｈＤ遺伝子によりコードされているＹＱＨＤ（４２ＫＤａ）（すでに嫌気性条件下で増殖させた細胞から精製）およびｄｋｇＡ（ｙｑｈＥ）遺伝子によりコードされている２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸レダクターゼＡ（３１ＫＤａ）が同定された。
【００９９】
実施例２：メチルグリオキサール還元における遺伝子の関与を評価するための、大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ＡｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおける欠失ΔｙｑｈＤ，ΔｙａｆＢ，ΔｙｄｈＦおよびΔｙｃｄＷの導入
ａ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの構築
プロトコール１に従い、大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ：：ｃｍにおいてクロラムフェニコール耐性カセットを除去した。
プロトコール１：耐性カセットの除去
クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットを以下の技術に従って除去した。クロラムフェニコールおよび／またはカナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位にＦＬＰレコンビナーゼ作用を有するプラスミドｐＣＰ２０をエレクトロポレーションによりこの株へ導入した。４２℃で連続培養した後、これらの抗生物質耐性カセットの欠損を、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１００】
この株において予め確立されている改変の存在を、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１０１】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ｌｄｈＡ：：ｋｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄと命名した。
【０１０２】
【表４】
0005546870.tif 000005
【０１０３】
ｂ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの構築
カナマイシン耐性カセットを除去するため、およびｌｄｈＡ遺伝子を不活性化するために、プロトコール２に従い、関連遺伝子の大部分を欠失したｌｄｈＡ遺伝子にクロラムフェニコール耐性カセットを挿入した。
プロトコール２：組換えのためのＰＣＲ産物の導入および組換え体の選択
遺伝子または遺伝子間領域の置換のために選択され、表３に示されたオリゴヌクレオチドを用い、プラスミドｐＫＤ３由来のクロラムフェニコール耐性カセットまたはプラスミドｐＫＤ４由来のカナマイシン耐性カセットを増幅した(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000))。次に、得られたＰＣＲ産物を、そこで発現したλ  Ｒｅｄ（γβ，ｅｘｏ）系が相同組換えに極めて有利である、プラスミドｐＫＤ４６を担持するレシピエント株にエレクトロポレーションにより導入した。その後、抗生物質耐性形質転換体を選択し、その耐性カセットの挿入を、表２に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いた分析により確認した。
【０１０４】
この株の他の改変も、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１０５】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄと命名した。
【０１０６】
【表５】
0005546870.tif 000006
【０１０７】
ｃ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｑｈＤの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおいて、プロトコール２に記載の技術を表３に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｙｑｈＤ遺伝子を不活性化した。
【０１０８】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｑｈＤ：：ｋｍと命名した。
【０１０９】
この株の他の改変も、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１１０】
次に、クロラムフェニコール耐性カセットおよびカナマイシン耐性カセットをプロトコール１に従って除去した。
【０１１１】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｑｈＤと命名した。
【０１１２】
ｄ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙａｆＢの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、プロトコール２に記載の技術を表３に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることによりｙａｆＢ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｙａｆＢ：：ｋｍと命名した。
【０１１３】
大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおける、その遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによるｙａｆＢ遺伝子の欠失は、ファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。
プロトコール３：遺伝子欠失のためのファージＰ１を用いた形質導入
レシピエント大腸菌における、その遺伝子を耐性カセット（カナマイシンまたはクロラムフェニコール）で置換することによる選択された遺伝子の欠失は、ファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。プロトコールは、（ｉ）単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株でのファージ溶解液の作製、および（ｉｉ）このファージ溶解液によるレシピエント株の形質導入の二段階であった。
【０１１４】
ファージ溶解液の作製
・１０ｍｌのＬＢ＋Ｃｍ  ３０μｇ／ｍｌ＋グルコース０．２％＋ＣａＣｌ２  ５ｍＭでの、単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株の一晩培養物１００μｌを播種する。
・振盪しながら３７℃で３０分インキュベーション。
・野生株ＭＧ１６５５で作製したファージＰ１溶解液１００μｌ（およそ１×１０９ファージ／ｍｌ）を加える。
・３７℃で３時間、全ての細胞が溶解するまで振盪する。
・２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスにかける・
・４５００ｇで１０分の遠心分離を行い、細胞残渣を除去する。
・上清を無菌試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを加える。
・この溶解液を４℃で保存する。
【０１１５】
形質導入
・ＬＢ培地中、大腸菌レシピエント株の一晩培養物５ｍｌを１５００ｇで１０分遠心分離する。
・この細胞ペレットを２．５ｍｌのＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ５ｍＭ中に懸濁させる。
・対照試験管：細胞１００μｌ
単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１  １００μｌ
・試験管試験：細胞１００μｌ＋単一の遺伝子が欠失したＭＧ１６５５株のファージＰ１  １００  μｌ
・振盪せずに３０℃で３０分インキュベーション。
・各試験管に１Ｍクエン酸ナトリウム１００μｌを加え、ボルテックスにかける。
・１ｍｌのＬＢを加える。
・振盪しながら３７℃で１時間インキュベーション。
・試験管を７０００ｒｐｍで３分遠心分離した後、ディッシュ上、ＬＢ＋Ｃｍ３０μｇ／ｍｌでプレーティング。
・３７℃で一晩インキュベーション。
【０１１６】
次に、抗生物質耐性形質転換体を選択し、欠失の挿入を、表１に示された適切なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１１７】
この株の他の改変も、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１１８】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙａｆＢ：：ｋｍと命名した。
【０１１９】
次に、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットおよびカナマイシン耐性カセットを除去した。
【０１２０】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｑｆＢと命名した。
【０１２１】
ｅ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｄｈＦの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおいて、プロトコール２に記載の技術を表３に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｙｄｈＦ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｄｈＦ：：ｋｍと命名した。
【０１２２】
この株の他の改変も、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１２３】
次に、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットおよびカナマイシン耐性カセットを除去した。
【０１２４】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｄｈＦと命名した。
【０１２５】
ｆ）改変大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｃｄＷの構築
大腸菌株ＭＧ１６５５において、プロトコール２に記載の技術を表３に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｙｃｄＷ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ΔｙｃｄＷ：：ｋｍと命名した。
【０１２６】
大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄにおける、その遺伝子をカナマイシン耐性カセットで置換することによるｙｃｄＷ遺伝子の欠失は、プロトコール３に記載のファージＰ１を用いた形質導入技術によって行った。ＭＧ１６５５  ΔｙｃｄＷ：：ｋｍ株においてファージＰ１の溶解液を得、このファージ溶解液を用い、大腸菌株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄの形質導入を行った。
【０１２７】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ：：ｃｍ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｃｄＷ：：ｋｍと命名した。
【０１２８】
この株の他の改変も、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１２９】
次に、プロトコール１に従い、クロラムフェニコール耐性カセットおよびカナマイシン耐性カセットを除去した。
【０１３０】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊，ΔｔｐｉＡ，ΔｐｆｌＡＢ，ΔａｄｈＥ，ΔｌｄｈＡ，ΔｇｌｏＡ，ΔａｌｄＡ，ΔａｌｄＢ，Δｅｄｄ，ΔｙｃｄＷと命名した。
【０１３１】
ｆ）同定されたメチルグリオキサールレダクターゼをコードする遺伝子に欠失を有する株の培養
欠失ΔｙｑｈＤ，ΔｙａｆＢ，ΔｙｄｈＦおよびΔｙｃｄＷを有する４つの株をエルレンマイヤーフラスコ内、微好気性条件下、ｐＨ６．７のＭＰＧ培地中、３７℃で培養した。
【０１３２】
培養７２時間後、アセトールおよび１，２−プロパンジオールの生産を培養上清においてＨＰＬＣにより測定した。結果を表４に示す。
【０１３３】
【表６】
0005546870.tif 000007
【０１３４】
これらの結果は、同定されたメチルグリオキサールレダクターゼの全てが、メチルグリオキサールのアセトールへの、さらに１，２−プロパンジオールへの変換に関与していることを示した。ｙｑｈＤの欠失の結果、おそらくメチルグリオキサールの蓄積のために強い増殖阻害が生じた。また、ｙｑｆＢおよびｙｄｈＦの欠失もアセトールおよび１，２−プロパンジオールの生産に主要な影響を持つ。
【０１３５】
実施例３：大腸菌ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）、大腸菌ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）および大腸菌ＭＧ１６５５（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）の改変株の構築
１，２−プロパンジオールの生産を高めるために、ｔｒｃプロモーターを用い、遺伝子の種々の組合せをプラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１から発現させた。
【０１３６】
ａ）プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１の構築
プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１はプラスミドｐＭＥ１０１に由来し、希少な制限エンドヌクレアーゼＮｈｅＩ、ＳｎａＢＩ、ＰａｃＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳａｃＩＩおよびＡｇｅＩに特異的な認識部位配列とその後にクロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ８２４のａｄｃ転写ターミネーターを含む多重クローニング部位を担持している。
【０１３７】
低コピーベクターからの発現のために、プラスミドｐＭＥ１０１を次のように構築した。プラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631 - GenBank AX085428)を、オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１ＲならびにｌａｃＩ遺伝子を担持するベクターｐＴｒｃ９９Ａ(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)由来のＢｓｔＺ１７Ｉ−ＸｍｎＩ断片を用いてＰＣＲ増幅し、増幅されたベクターにｔｒｃプロモーターを挿入した。
【０１３８】
ＰＭＥ１０１Ｆ（配列番号５５）：
ccgacagtaagacgggtaagcctg
ＰＭＥ１０１Ｒ（配列番号５６）：
agcttagtaaagccctcgctag
【０１３９】
多重クローニング部位とａｄｃ転写ターミネーターを含む合成二本鎖核酸リンカーを用いてｐＭＥ１０１ＶＢ０１を作製した。ＮｃｏＩまたはＨｉｎｄＩＩＩで消化された制限部位によってフランキングされた、相補的な２つの１００塩基のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせた。この１００塩基対の産物をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたプラスミドｐＭＥ１０１にサブクローニングしてｐＭＥ１０１ＶＢ０１を作製した。
【０１４０】
ｐＭＥ１０１ＶＢ０１  １は、１００塩基（配列番号５７）：
catgggctagctacgtattaattaaagatctcctaggagctcaccggtTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTAggcgcgcca
からなり、
ｐＭＥ１０１ＶＢ０１  ２は、１００塩基（配列番号５８）：
agcttggcgcgccTAAAAAAATAAGAGTTACCATTTAAGGTAACTCTTATTTTTAaccggtgagctccctagagatctttaattaatacgtagctagcc
からなり、
・多重クローニング部位に対応する領域（下線の小文字）
・クロストリジウム・アセトブチリカムＡＴＣＣ  ８２４ｐＳＯＬ１（ＮＣ＿００１９８８）のａｄｃ転写ターミネーター（配列１７９８４７〜１７９８１４）に相当する領域（大文字）を含む。
【０１４１】
ｂ）１，２−プロパンジオールの生合成経路の遺伝子の種々の組合せを発現させるためのプラスミドの構築（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡおよびｐＭＥ１０１ＹＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ）
【０１４２】
表１に示されたオリゴヌクレオチドを用い、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから種々の遺伝子をＰＣＲ増幅した。
【０１４３】
【表７】
0005546870.tif 000008
【０１４４】
ＰＣＲ増幅した断片を表５に示される制限酵素で切断し、プラスミドｐＭＥ１０１ＶＢ０１の制限部位へクローニングした。次のプラスミドを構築した：ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｆβ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡおよびｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ。
【０１４５】
次に、これらのプラスミドを大腸菌ＭＧ１６５５株に導入した。
【０１４６】
実施例４：１，２−プロパンジオールを高収量で生産し得る大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ），（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ），（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）および大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ（ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ），（ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ）の改変株の構築
大腸菌ＭＧ１６５５株における天然ｇａｐＡプロモーターの、合成ショートＰｔｒｃ１６プロモーター（配列番号６９：gagctgttgacgattaatcatccggctcgaataatgtgtgg）での置換は、プロトコール２に記載の技術を表３に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、２２５ｐｂの上流ｇａｐＡ配列をＦＲＴ−ＣｍＲ−ＦＲＴおよび操作プロモーターで置換することにより行う。
【０１４７】
耐性カセットの挿入は、表２に示されたオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認した。
【０１４８】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍと命名した。
【０１４９】
大腸菌ＭＧ１６５５株において、プロトコール２に記載の技術を表３に示されたオリゴヌクレオチドとともに用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入し、関連遺伝子の大部分を欠失させることにより、ｅｄｄ−ｅｄａ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ−ｅｄａ：：ｋｍと命名した。
【０１５０】
この欠失を、プロトコール３に従い、大腸菌株ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍに導入した。
【０１５１】
得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ：：ｃｍ，Δｅｄｄ−ｅｄａ：：ｋｍと命名した。
【０１５２】
次に、プロトコール１に従い、抗生物質耐性カセットを除去した。
【０１５３】
プロトコール２に従い、表３に示されたオリゴヌクレオチドを用いてＭＧ１６５５  ΔｇｌｏＡ：：ｃｍ株を構築し、この欠失を、プロトコール３に従って予め構築した株に導入した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ：：ｃｍと命名した。
【０１５４】
先の株において、プロトコール２に従い、表３に示されたオリゴヌクレオチドを用い、カナマイシン抗生物質耐性カセットを挿入することにより、ｐｙｋＡ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ：：ｃｍ，ΔｐｙｋＡ：：ｋｍと命名した。
【０１５５】
次に、プロトコール１に従い、抗生物質耐性カセットを除去した。プロトコール２に従い、表３に示されたオリゴヌクレオチドを用い、クロラムフェニコール抗生物質耐性カセットを挿入することにより、ｐｙｋＦ遺伝子を不活性化した。得られた株を大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ：：ｃｍと命名した。
【０１５６】
次に、プロトコール１に従い、抗生物質耐性カセットを除去した。
【０１５７】
各段階で、それまでに構築された全ての欠失の存在を、表３に示されたオリゴヌクレオチドを用いて確認した。
【０１５８】
ホスホエノールピルビン酸の生産を高めるために、ｐｐｓＡ遺伝子を、ｇａｐＡプロモーターを用いてプラスミドｐＪＢ１３７から発現させた。プラスミドｐＪＢ１３７−Ｐ  ｇａｐＡ−ｐｐｓＡの構築のため、ｐｐｓＡ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０１５９】
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＦは、６５塩基（配列番号７０）：
ccttttattcactaacaaatagctggtggaatatATGTCCAACAATGGCTCGTCACCGCTGGTGC
からなり、
・ウェブサイトhttp://genolist.pasteur.fr/Colibri/)の参照配列であるｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
２．ｐｐｓＡＲは、４３塩基（配列番号７１）：
aatcgcaagcttGAATCCGGTTATTTCTTCAGTTCAGCCAGGC
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子の領域（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８２７５８〜１７８２７８０）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ（下線の文字）
を含む。
同時に、大腸菌ｇａｐＡ遺伝子のｇａｐＡプロモーター領域を、以下のオリゴヌクレオチドを用いて増幅した。
１．ｇａｐＡ−ｐｐｓＡＲは、６５塩基（配列番号７２）：
GCACCAGCGGTGACGAGCCATTGTTGGACATatattccaccagctatttgttagtgaataaaagg
からなり、
・ｐｐｓＡ遺伝子（１７８５１３６〜１７８２７５８）の配列（１７８５１０６〜１７８５１３６）と相同な領域（大文字）および
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０７９４〜１８６０７６１）と相同な領域（小文字）
を含む。
２．ｇａｐＡＦは、３３塩基（配列番号７３）：
ACGTCCCGGGcaagcccaaaggaagagtgaggc
からなり、
・ｇａｐＡプロモーター（１８６０６３９〜１８６０６６１）と相同な領域（小文字）
・制限部位ＳｍａＩ（下線の文字）
を含む。
【０１６０】
次に、両断片を、オリゴヌクレオチドｐｐｓＡＲおよびｇａｐＡＦ(Horton et al. 1989 Gene 77:61-68)を用いて融合した。ＰＣＲ増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｍａＩで切断し、ベクターｐＪＢ１３７（ＥＭＢＬ受託番号：Ｕ７５３２６）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングし、ベクターｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを得た。
【０１６１】
種々のｐＭＥ１０１ＶＢ０１プラスミドおよびｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡを大腸菌株ＭＧ１６５５Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦに導入した。得られた株をそれぞれ大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ（株１）、大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ（株２）および大腸菌ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ，ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ，ｐＪＢ１３７−ＰｇａｐＡ−ｐｐｓＡ（株３）と命名した。
【０１６２】
実施例５：好気性条件下での１，２−プロパンジオール生産に関する種々の株の比較
実施例４で記載したように得られた株（株１、２および３）および対照株（対照１：ＭＧ１６５５  ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙｑｈＤ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、対照２：ＭＧ１６５５  ｐＭＥ１０１ＶＢ０１−ｙａｆＢ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡ、対照３：ＭＧ１６５５  ｐＭＥ１０１ＹＢ０１−ｙｑｈＥ−ｍｇｓＡ−ｇｌｄＡおよび対照４：ＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ１６−ｇａｐＡ，Δｅｄｄ−ｅｄａ，ΔｇｌｏＡ，ΔｐｙｋＡ，ΔｐｙｋＦ）を、エルレンマイヤーフラスコ内、好気性条件下、炭素源としてグルコースを含む最小培地中で培養した。培養は３４℃または３７℃で行い、培養培地をＭＯＰＳで緩衝させることによりｐＨを維持した。培養の終了時に、発酵培養液中の１，２−プロパンジオール、アセトールおよび残留グルコースをＨＰＬＣにより分析し、グルコースに対する１，２−プロパンジオールおよびグルコースに対する１，２−プロパンジオール＋アセトールを算出した。
【０１６３】
【表８】
0005546870.tif 000009
【図１】
0005546870.tif 000010
【図２】
0005546870.tif 000011
【配列表】
0005546870000001.app