(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
低アシルジェランガムの製造法であって、
ａ．スフィンゴモナス・エロデアのＰＨＢ欠損株を発酵ブロス中で発酵させるステップと；
ｂ．発酵ブロスを化学的／酵素的方法によって清澄化するステップ、
該ステップは、
ｉ．発酵ブロスを３０℃〜７０℃の範囲の温度に加熱するステップと；
ｉｉ．一つ又は複数のキレート剤及び一つのリゾチーム酵素と組み合わせた一つ又は複数の抗酸化剤で処理するステップと；
ｉｉｉ．ステップｉｉの発酵ブロスを一つ又は複数の界面活性剤で処理するステップと；そして
ｉｖ．ステップｉｉの発酵ブロスをプロテアーゼ酵素で処理して、２．０％以下の総アシル含有量を有するジェランガムを得るステップと
を含む、
ここで、前記抗酸化剤は、アスコルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、二酸化硫黄、ブチル化ヒドロキシアニソール、システイン、及び亜硫酸ナトリウムからなる群から選ばれる、
と；
ｃ．清澄化発酵ブロスを苛性剤で脱アシル化して、２．０％以下の総アシル含有量を有するジェランガムを得るステップと；そして
ｄ．発酵ブロスからジェランガムを沈殿させるステップと
を含み、
前記沈殿させたジェランガムが、０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも３００ｇ／ｃｍ２を有する、
方法。
【請求項２】
前記沈殿させたジェランガムが、０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも１１７ｇ／ｃｍ２を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記沈殿させたジェランガムが、０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度、１１７ｇ／ｃｍ２〜４００ｇ／ｃｍ２を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗酸化剤が亜硫酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四カリウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸カリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、陽イオン交換樹脂、エチレンジアミン二塩酸塩、エチレンジアミン二酢酸塩、エチレンジアミンリチウム塩、及びエチレンジアミン二ヨウ化水素酸塩からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キレート剤がエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記キレート剤がクエン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、レシチン、モノグリセリド類、モノグリセリド類の酒石酸エステル類、リン酸化モノグリセリド類、ラクチル化モノグリセリド類、アセチル化モノグリセリド類、スクシニル化モノグリセリド類、エトキシル化モノグリセリド類、ソルビタンエステル類、ポリソルベート類、ポリグリセロールエステル類、スクロースエステル類、ステアロイル乳酸ナトリウム、及びプロピレングリコールエステル類からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記苛性剤が、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、及びリン酸三ナトリウムからなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記苛性剤が水酸化カリウムである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、増大された分子量及び増大されたゲル強度を有する高性能低アシル及び部分脱アシル化ジェランガム組成物に関する。本発明はまた、従来のろ過法を使用せずに高清澄性を有する高性能低アシル及び部分脱アシル化ジェランガムを製造するための方法にも関する。本発明はさらに、高性能低アシル及び部分脱アシル化ジェランガムを含む食品及び非食品用の工業製品にも関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の記載
多糖類はガムとも言われ、主に水溶液を増粘又はゲル化するのに使用される。スフィンゴモナス属の微生物によって製造される多糖類はスフィンガンとも呼ばれる。ガムは二つのグループに分類されることが多い。すなわち増粘剤とゲル化剤である。典型的な増粘剤は、デンプン、グアガム、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、メチルセルロース、キサンタンガム、カラヤガム、及びトラガカントガムなどである。一般的なゲル化剤は、ジェランガム、ゼラチン、デンプン、アルギネート、ペクチン、カラギーナン、寒天、及びメチルセルロースなどである。
【０００３】
ゲル化剤は食品工業で様々な用途に使用されている。例えば、ゼリー菓子、ジャム、デザートゲル、アイシング、乳製品、飲料などである。さらに、ゲル化剤は微生物培地の成分としても使用できる。ゲル化剤は、それらが使用されうる条件及びそれらが形成するゲルのテクスチャーに違いがある。ゲルのこうした特徴的性質のために特定のゲル化剤が特定の製品に広く使用されている（例えば、ゼリー菓子におけるデンプン；デザートゲルにおけるゼラチン；アイシングにおける寒天：及びピメント細片(pimento strips)におけるアルギネート）。
【０００４】
一つの特別有用なゲル化剤はジェランガムで、これは細菌のスフィンゴモナス・エロデア(Sphingomonas elodea)（ＡＴＣＣ３１４６１）、及びこの種から派生した菌株によって産生される莢膜多糖である。ジェランガムの構成糖は、モル比２：１：１のグルコース、グルクロン酸及びラムノースである。これらは一緒に連結し、線形の四糖類反復単位を含む一次構造を呈している（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  Ｍ．Ａ．ら，シュードモナス・エロデアによって産生される酸性細胞外ゲル化多糖類の構造(Structure of the acidic extracellular gelling polysaccharide produced by Pseudomonas elodea)，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，１２４（１）：１２３−１３３（１９８３）；Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．ら，シュードモナス・エロデアによって合成された細胞外多糖類、ジェランガムの構造研究(Structural studies of gellan gum, an extracellular polysaccharide elaborated by Pseudomonas elodea) ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，１２４（１）：１３５−１３９（１９８３））。ネイティブ型又は高アシル（“ＨＡ”）型には２個のアシル置換基、アセテート及びグリセレートが存在する。両置換基とも同じグルコース残基上に位置し、平均して１反復単位あたり１個のグリセレート及び二反復単位ごとに１個のアセテートが存在する。低アシル（“ＬＡ”）型はほとんどのアシル基が除去され、そのような基を実質的に持たない線形反復単位となっている。Ｘ線回折分析で、ジェランガムは三重の左巻き平行二重らせんとして存在することが示されている（Ｃｈａｎｄｒａｓｋａｒａｎ，Ｒ．ら，ジェランの結晶構造(The crystal structure of gellan)，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，１７５（１１）：１−１５（１９８８）；Ｃｈａｎｄｒａｓｋａｒａｎ，Ｒ．ら，ジェランにおけるカチオン相互作用：カリウム塩のｘ線研究(Cation interactions in gellan: An x-ray study of the potassium salt)，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．，１８１：２３−４０（１９８８））。
【０００５】
ＬＡジェランガムは、ゲル促進カチオン、好ましくはカルシウム及びマグネシウムのような二価カチオンの存在下で冷却するとゲルを形成する。形成されたゲルは堅くて脆い。ＨＡジェランガムはゲルの形成にカチオンの存在を必要とせず、形成されたゲルは、アシル置換基によって著しく影響される構造的及びレオロジー的特徴を有している。従って、ＨＡジェランガムの性質はＬＡジェランガムの性質とは著しく異なる。ＨＡジェランガムゲルは典型的には軟質で柔軟性があり、熱ヒステリシスを欠く。
【０００６】
商業的には、ジェランガムは好気条件下で発酵培地にスフィンゴモナス・エロデア菌を接種することによって形成される。発酵培地は、炭素源、ホスフェート、有機及び無機窒素源、そして適切な微量元素を含有する。発酵は無菌条件下で、エアレーション、撹拌、温度、及びｐＨを厳密に制御しながら実施される。発酵が完了したら、粘稠なブロスを殺菌（パスチャライズ）して生存細胞を殺した後、ガムを回収する。
【０００７】
ジェランガムは、発酵ブロスからの回収法によって異なる特徴を示す。発酵ブロスから直接回収するとネイティブ又は高アシル型のジェランが得られる。これは、Ｓ．エロデアによる修飾で一つのグルコース残基上にアセチル及びグリセリル置換基を持つ。このネイティブ又は高アシル型のジェランを単離すると、軟質で柔軟性、弾性のあるゲルが得られる。ジェランを脱アシル化するとその低アシル型ジェランが得られる。この低アシル型ジェランを単離すると、硬質で堅く脆いゲルが得られる。ネイティブ及び低アシルジェランをブレンドすると、中間的なテクスチャーのゲルが得られる。
【０００８】
現在、ジェランガムは、ジェランガムを含有する発酵ブロスを高温で強アルカリで処理することによって脱アシル化されている。この方法で、ジェランからアシル置換基を除去し、Ｓ．エロデア細胞を溶解する。次に固体及び細胞残屑を酸処理（発酵ブロスの中和／酸性化）とろ過によって除去し、高清澄性の低アシルジェランガムを得る。しかしながら、この方法は、脱アシル化のほか解重合のためにガムの分子量を天然微生物が産生したものより著しく低下させてしまう。ジェランガム回収のための現在の商業的方法は、最大０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度約２９０ｇ／ｃｍ２（０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度約１１３ｇ／ｃｍ２に相当）を有するゲルを製造する。
【発明の概要】
【０００９】
発明の要旨
本発明はジェランガムの製造法に関する。該方法は、スフィンゴモナス・エロデアを発酵ブロス中で発酵させ；所望により発酵ブロスを化学的／酵素的方法によって清澄化し；清澄化発酵ブロスを苛性剤で穏やかに脱アシル化し；そして発酵ブロスからジェランガムを沈殿させるステップを含む。該ジェランガムは０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも約３００ｇ／ｃｍ２又は０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも約１１７ｇ／ｃｍ２を有する。
【００１０】
本発明の一態様において、Ｓ．エロデアはＰＨＢ欠損株である。本発明の別の態様において、清澄化ステップは、約３０℃〜約７０℃の範囲の温度に加熱し；一つ又は複数のキレート剤及び一つのリゾチーム酵素と組み合わせた一つ又は複数の抗酸化剤で処理し；一つ又は複数の界面活性剤で処理し；そしてプロテアーゼ酵素で処理するステップを含む。
【００１１】
本発明は、上記方法によって製造されたジェランガムにも関する。さらに本発明は、０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも約３００ｇ／ｃｍ２又は０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも約１１７ｇ／ｃｍ２を有するジェランガムに関する。本発明の一態様において、脱イオン水中で１％の濃度に再水和されたジェランガムは約６０％より大きい光透過率を有する。本発明の別の態様において、ジェランガムはテクスチャープロファイル分析（“ＴＰＡ”）硬度、少なくとも約９ポンド（ｌｂ）を有する。本発明のさらに別の態様において、ジェランガムは１％ジェランガムの９０℃熱粘度、少なくとも約２５センチポアズ（ｃＰ）を有する。
【００１２】
本発明はさらに、本明細書中に記載の新規ジェランガムを含む食品及び非食品の工業製品にも関する。さらに、本発明は、本明細書中に記載の方法によって製造されたジェランガムを含む食品又は非食品の工業製品にも関する。本発明の工業製品に使用される高性能ジェランガムの濃度は、使用されている現在入手可能な市販品（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標））の濃度より約２０％〜約８５％低い。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度試験と０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度試験との間の直線的相関を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、先行技術の低アシルジェランガムよりも大きいゲル強度を有する低アシルジェランガムの製造法及び部分脱アシル化ジェランガムの製造法に関する。本発明はまた、水溶液中に再水和した際、従来のフィルタープレスを使用しなくても高清澄性を有する低アシル及び部分脱アシル化ジェランガムにも関する。本発明はさらに、これらの高性能ジェランガムを含むデザートゲル、菓子、飲料、微生物及び組織用培地、液体クリーナーなどのような食品及び非食品の工業製品にも関する。
【００１５】
米国特許第５，１９０，９２７号に記載されている高アシル（ＨＡ）ジェランガムは、グリセレート含有量１１〜１３％及びアセテート含有量４〜５％で、総アシル含有量１５〜１８％（ｗ／ｗ）を有する。本明細書中に記載の低アシルジェランガムは、ポリマー鎖上に＜１．０％のグリセレート及び＜１．０％のアセテート、又は総アシル含有量＜２．０％を有すると考えられている。本明細書中に記載の部分脱アシル化ジェランガムは、中間レベルの１〜１１％のグリセレート及び１〜４％のアセテート、総アシル含有量２〜１５％を有する。
【００１６】
スフィンゴモナス・エロデア、ＡＴＣＣ３１４６１、この菌株由来の突然変異体、又はその他の適切な菌株を、当業者に公知の方法によって発酵ブロスとして知られている水溶液中で好気的に成長又は発酵させる。培地は、炭素、窒素、及び無機塩の供給源を含有する。一般に、炭水化物（例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース、キシロース、マンニトールなど）が、栄養培地中の同化炭素源として単独又は組み合わせて使用できる。一般に、炭水化物の量は培地の約２〜４重量％の間で通常変動する。一般に、発酵プロセスでは多くのタンパク性物質が有機窒素源として使用されうる。適切な窒素源は、例えば、酵母加水分解物、大豆ミール、綿実粉、カゼインの加水分解物、トウモロコシ浸出液、アルコール蒸留廃液(distiller's solubles)などである。窒素源は、単独又は組み合わせて、水性培地の約０．０５〜０．２重量％の範囲の量で使用される。培地に配合できる無機塩の中では、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩、硫酸塩、塩化物、硝酸塩、炭酸塩、及び類似のイオンを供給できる常用塩が挙げられる。第一鉄、亜鉛、銅、マンガン、コバルト、及びモリブデンの塩などの微量元素も含まれる。
【００１７】
スフィンガンは莢膜多糖として発酵ブロス中に分泌される。望ましい性質を有するＳ．エロデアの変異株が使用できる。本発明の一態様においては、米国特許出願第１１／２９２，３６６号（２００５年１２月２日出願、引用によってその全文を本明細書に援用する）に記載されているような、ポリヒドロキシブチレート（“ＰＨＢ”）の産生が欠乏したＳ．エロデアの変異株が使用される。ＰＨＢ欠損株と本明細書中に記載の清澄化法を一緒に使用することで、高清澄性の再構成(reconstituted)ジェランガムを低アシルジェランガム又は部分脱アシル化ジェランガムのいずれかで達成することが可能となる。
【００１８】
発酵の後、スフィンガンは典型的にはろ過法によって清澄化され、浮遊物（発酵ブロス環境の一部である微生物細胞及び細胞残屑を含む）から単離されて清澄化スフィンガンとなる。本明細書中に記載のように、清澄化法は代わりに化学的／酵素的方法であってもよい。単離されたスフィンガンを水性媒体に加えることによって得られた溶液及び部分精製スフィンガン溶液も本発明の方法を用いて清澄化できる。本発明の方法に有用な望ましくない発酵固体を含有するスフィンガンの水溶液は、溶液の総重量の約０．０１〜約１０重量％のスフィンガンを含有しうる。いずれかの公知スフィンガンを含有するいずれかの水溶液も本発明の実施に使用できる。
【００１９】
本発明の高性能低アシルジェランガムは、先行技術の低アシルジェランガムより大きいゲル強度を有する。例えば、Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）（ＣＰ  Ｋｅｌｃｏ，ジョージア州アトランタ）製品は、Ｎｅｏ  Ｃｕｒｄｍｅｔｅｒ（登録商標）（ＩＩＯ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏ．，日本）による測定で、最大０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度約２９０ｇ／ｃｍ２（０．１％カードメーターゲル強度約１１３ｇ／ｃｍ２に相当）を有する。低アシルジェランガムのゲル強度は従来０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度試験を用いて記載されてきた。この試験法の上限は４００ｇ／ｃｍ２であるが、本発明の新規ジェランガムはこれを超過する。従って、ゲル強度試験法は、０．１％ジェランガムを使用するように変更されている。
【００２０】
本発明の高性能ジェランガムは、０．２％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも約３００ｇ／ｃｍ２、例えば少なくとも約３２０ｇ／ｃｍ２を有する。等価的には、本発明の高性能ジェランガムは、０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度、少なくとも約１１７ｇ／ｃｍ２、例えば少なくとも約１２５ｇ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｇ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｇ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｇ／ｃｍ２、少なくとも約２２５ｇ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｇ／ｃｍ２、少なくとも約２７５ｇ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｇ／ｃｍ２、及び少なくとも約３２５ｇ／ｃｍ２を有する。本発明の更なる態様は、０．１％ジェランガムのカードメーターゲル強度約１１７ｇ／ｃｍ２〜約４００ｇ／ｃｍ２、例えば約１１７ｇ／ｃｍ２〜約１５６ｇ／ｃｍ２及び約１２５ｇ／ｃｍ２〜約２５０ｇ／ｃｍ２を有しうる。
【００２１】
本発明の高性能低アシルジェランガムは、市販されている低アシルジェランガムと比べて増大した分子量を有する。特定の理論には縛られないが、本発明の高性能低アシルジェランガムは、分子量が増加したために新規の高いゲル強度特性を有すると考えられる。
【００２２】
さらに、本発明の高性能低アシル及び部分脱アシル化ジェランガムは、細胞及び細胞残屑を除去するためのろ過法を使用しなくても高清澄性を有しうる。本明細書中に記載の方法によって清澄化されたスフィンガンを水中に再水和及び溶解すると、実質的に透明なスフィンガン溶液が得られる。本発明による実質的に透明なスフィンガン溶液（１％ｗ／ｗ）は、約６０％より大きい、好ましくは約７０％より大きい、最も好ましくは約８０％より大きい光透過率を有する。光透過率は、従来の技術及び装置（例えば市販の分光光度計）を用いて可視スペクトルの任意の波長で測定してよい。光透過率は、典型的には約４８０ｎｍ〜約６８０ｎｍの波長で測定される。
【００２３】
本発明の低アシルジェランガムは、ＴＰＡ硬度、少なくとも約９ポンド（ｌｂ）、例えば少なくとも約１５ｌｂ、少なくとも約２０ｌｂ、及び少なくとも約２５ｌｂを有する。本発明の低アシルジェランガムは、１％ジェランガムの９０℃熱粘度、少なくとも約２５ｃＰ、例えば少なくとも約７５ｃＰ、少なくとも約１７５ｃＰ、及び少なくとも約３００ｃＰも有する。
酵素清澄化
本発明の一態様において、スフィンガンの水溶液は、段階的にスフィンガン溶液を処理することを含む化学的／酵素的方法によって清澄化される。発酵ブロスを、１）加熱し、２）一つ又は複数のキレート剤及び一つのリゾチーム酵素と組み合わせた一つ又は複数の抗酸化剤で処理し、３）一つ又は複数の界面活性剤で処理し、４）プロテアーゼ酵素で処理し、そして５）所望によりセルラーゼ酵素で処理する。
【００２４】
第一のステップは、水性スフィンガン溶液を、ジャケット付きタンク中での温度制御、直接水蒸気注入などのような従来技術によって高めた温度に加熱することを含む。直接水蒸気注入が加熱時間を最小化するために好適である。清澄化温度範囲は約３０℃〜約７０℃、好ましくは約５０℃〜約６０℃の範囲である。スフィンガン溶液を所望温度に加熱するのに要する時間の長さは、処理されるスフィンガン溶液のサイズ及び体積に応じて著しく変動しうる。例えば、少量（例えば５０ｍｌ）のスフィンガン溶液の温度を室温から約６０℃に上げるのにはほんの数分しかかからないが、４０，０００リットルの溶液（例えば商業的加工で存在しうるような）の温度を同様に上げるには数時間かかるであろう。
【００２５】
次のステップは、水性スフィンガン溶液を所望により少なくとも一つの抗酸化剤、所望により少なくとも一つのキレート剤、及び少なくとも一つのリゾチーム酵素で処理することを含む。好ましくは、水性スフィンガン溶液は、少なくとも一つの抗酸化剤、少なくとも一つのキレート剤、及び少なくとも一つのリゾチーム酵素で処理される。抗酸化剤は、典型的には約７５ｐｐｍ（百万分の一）〜約３００ｐｐｍ、例えば約１５０ｐｐｍ〜約２５０ｐｐｍの範囲の濃度で添加される。典型的には、キレート剤は、スフィンガン溶液に約１５０ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍ、例えば約２００ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの範囲の濃度で添加される。典型的なリゾチーム濃度は、約２５ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍ、例えば約５０ｐｐｍ〜約１５０ｐｐｍの範囲である。溶液は約１時間〜約５時間、例えば約１．５時間〜約２．５時間、及び約１．５時間〜約２時間混合される。
【００２６】
抗酸化剤は、アスコルビン酸、エリソルビン酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸カリウム、亜硫酸水素カリウム、二酸化硫黄、ブチル化ヒドロキシアニソール、システイン、又は亜硫酸ナトリウムであろう。
【００２７】
本発明の方法に使用するのに適切なキレート剤は、スフィンガン溶液中の多価金属イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｕ２＋など）を、金属イオンと多座複合体を形成することによって及び金属イオンと沈殿物を形成することによって又は金属イオンを吸着することによって封鎖することができる化合物又は組成物である。有用なキレート剤の例は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二カリウム、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸四カリウム、クエン酸、クエン酸三ナトリウム、クエン酸三カリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸カリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、陽イオン交換樹脂、エチレンジアミン二塩酸塩、エチレンジアミン二酢酸塩、エチレンジアミンリチウム塩、及びエチレンジアミン二ヨウ化水素酸塩などであるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の方法に使用されるキレート剤は、クエン酸、並びにエチレンジアミン四酢酸、クエン酸、リン酸、ピロリン酸、ポリリン酸、炭酸、メタリン酸、及びエチレンジアミンの塩などである。さらに好ましくは、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム又はクエン酸がキレート剤として使用される。
【００２８】
方法に使用するのに適切なリゾチームは、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）リゾチーム（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州パロアルト）又は植物、動物、又は微生物由来源から得られる任意のリゾチームなどである。
【００２９】
スフィンガン溶液を抗酸化剤（一つ又は複数）、キレート剤（一つ又は複数）、及びリゾチームで処理した後、次のステップは該溶液を少なくとも一つの界面活性剤で処理することである。界面活性剤（一つ又は複数）は、約５０ｐｐｍ〜約４００ｐｐｍ、例えば約１５０ｐｐｍ〜約３００ｐｐｍの濃度範囲で添加される。次に溶液を約０．５時間〜約２時間、例えば約１時間〜約１．５時間撹拌する。
【００３０】
本発明の方法に使用するのに適切な界面活性剤は、親水性及び疎水性物質（固体又は液体）の存在下で水性エマルジョンを形成できる化合物又は組成物である。好ましくは、界面活性剤は水又は水−アルコール可溶性の化合物又は組成物である。有用な界面活性剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム（“ＳＤＳ”）、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ＴＷＥＥＮ  ８０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ブリッジウォーター）、レシチン、モノグリセリド類、モノグリセリド類の酒石酸エステル類、リン酸化モノグリセリド類（例えば一ナトリウム塩として）、ラクチル化モノグリセリド類、アセチル化モノグリセリド類、スクシニル化モノグリセリド類、エトキシル化モノグリセリド類、ソルビタンエステル類、ポリソルベート類、ポリグリセロールエステル類、スクロースエステル類、ステアロイル乳酸ナトリウム、プロピレングリコールエステル類などであるが、これらに限定されない。さらに好ましくは、ＳＤＳが界面活性剤として使用される。
【００３１】
次に、溶液は少なくとも一つのプロテアーゼ酵素で処理される。プロテアーゼ酵素は、約１００ｐｐｍ〜約３０００ｐｐｍ、例えば約５００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの濃度で添加され、溶液と約０．５時間〜約５時間、例えば約１時間〜約４時間混合される。
【００３２】
本方法に使用するのに適切なプロテアーゼ酵素は、細菌、真菌、又は植物源由来の酸性、中性又はアルカリ性プロテアーゼである。本発明の方法に有用な酸性プロテアーゼ酵素の例は、アルペルギルス(Aspergillus)属の微生物、例えばＡ．ニガー(A.niger)によって産生されるプロテアーゼなどであるが、これに限定されない。本発明の方法に有用な中性プロテアーゼ酵素は、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)のような微生物によって産生されるプロテアーゼなどであるが、これに限定されない。本発明の方法に有用なアルカリ性プロテアーゼ酵素は、バシラス属の微生物、例えば、枯草菌(B.subtilis)、Ｂ．リケニホルミス(B.licheniformis)、及びＢ．プミルス(B.pumilus)によって産生されるアルカリプロテアーゼ；ストレプトミセス(Streptomyces)種、例えば、Ｓ．フラジアエ(S.fradiae)、Ｓ．グリセウス(S.griseus)及びＳ．レクタス(S.rectus)によって合成されるプロテアーゼ；及びズブチリシン、例えばズブチリシン・ノボ(Novo)及びズブチリシン・カールスベルグ(Carlsberg)から得られるプロテアーゼ（ズブチロペプチダーゼＡ及びズブチロペプチダーゼＢのようなプロテアーゼも含む）などであるが、これらに限定されない。
【００３３】
最後に、発酵培地がセルロース質の残渣を含有する場合、セルラーゼ酵素を加えてもよい。本発明の方法に使用するためのセルラーゼ酵素の例は、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）ＢＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，デンマーク・Ｂａｇｓｖａｅｒｄ）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ＣＬ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州パロアルト）、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）ＧＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，カリフォルニア州パロアルト）などであるが、これらに限定されない。
【００３４】
酵素処理ステップで使用される酵素は、固体の細胞残屑を回収プロセスでより除去しやすい化合物に分解するので、スフィンガン生成物の純度が改良され、清澄化プロセスに役立つ。それにより、溶液にもどした場合のスフィンガン生成物の透過率が改良される。
【００３５】
スフィンガン溶液をキレート剤（一つ又は複数）、抗酸化剤（一つ又は複数）、及び界面活性剤（一つ又は複数）で処理することによる影響を受ける清澄度は、その後の酵素処理を完了するための酵素濃度又は所要時間に影響を及ぼしうることに注意すべきである。例えば、本方法で使用されるキレート剤（一つ又は複数）、抗酸化剤（一つ又は複数）、及び界面活性剤（一つ又は複数）の量が増大すると、スフィンガン溶液の清澄性に影響を及ぼすために使用される酵素の量及び／又は所要時間は減少しうる。
脱アシル化
清澄化の前か後のいずれかで、ジェランガムは一つ又は複数の強又は弱苛性剤、例えば水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、リン酸三ナトリウムなどで脱アシル化できる。水酸化カリウムが好適な苛性剤である。一態様において、脱アシル化は化学的／酵素的方法による清澄化の後に行われる。別の態様において、脱アシル化はろ過法による清澄化の前に行われる。
【００３６】
発酵槽のｐＨを約９．５〜約１２．５、例えば約９．７〜約１１．７の範囲に上げるのに足る苛性剤を加える。次にブロスを約１９０°Ｆ（約８８℃）〜約２１０°Ｆ（約９９℃）の温度で熱処理する。加熱後、ｐＨを、硫酸、塩酸、又はリン酸、好ましくは硫酸のような酸溶液で約３．５〜約９．０、例えば約４．０〜約７．０のｐＨに下げる。得られたジェラン生成物の脱アシル化度及び性質はアルカリ処理のレベルによって影響されることに注意すべきである。例えば、強アルカリ処理を使用した場合、ジェランガムはさらに脱アシル化されてより堅くて脆いゲルが生成し、分子量は現在市販されている製品のように低下する。他方、穏やかなアルカリ処理を使用した場合、分子量の低下は少なく、さらに穏やかなアルカリ処理レベルでは、ジェランガムのアシル含有量は高くなり（すなわち部分脱アシル化）、より柔軟なゲルが形成される。
【００３７】
脱アシル化後、ジェランガムは当該技術分野で周知の方法、例えばイソプロピル又はエチルアルコールの使用によって沈殿させることができる。
食品及び非食品用工業製品
主題のジェランガムは、例えば、飲料、菓子、ジャム及びゼリー、加工食品、水性ゲル、パイの詰め物、デザートゲル、アイシング、乳製品、例えばヨーグルト、プディング、ホイップ、クリーマー、ゲル化ミルク、及びアイスクリームなどのような食品工業における増粘剤として有用である。さらに、主題のゲル化剤は、ゲル化ペットフード、微生物及び組織用培地、液体クリーナー、練り歯磨き、石鹸及びボディソープ、脱臭用ゲル、空気清浄用ゲル、軟質カプセル及び微生物ゲルのその他の公知の工業用途に使用することもできる。
【００３８】
本明細書中に記載されたジェランガムの高性能な特性のために、該ジェランガムは標準的な市販の低アシルジェランガムより低い濃度でゲル化機能を提供することが可能になる。使用されるジェランガムの濃度は、使用されている現在市販の製品（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標））の濃度より約１５％〜約９０％低い、例えば約２０％〜約８５％低い、約２５％〜約７５％低い、約３０％〜約６５％低い、及び約３５％〜約５５％低い。ジェランガムの量の削減は費用節減を提供し、また、これまで寒天のような低コストのゲル化剤しか使用できなかったその他の用途においても経済的にジェランガムを使用することを可能にする。
【００３９】
本発明の高性能ジェランガムは熱安定性を付与するために使用することもできる。一態様において、高性能ジェランガムは多層デザートゲルに使用される。熱的に安定なジェランガムのネットワークが、独特のデザイン及びパターンを有するデザートゲルの形状を８５℃での殺菌の間維持するのに役立つ。熱安定性の提供におけるジェランガムの有効性は目視観察又はレオロジー測定によって評価できる。
【００４０】
別の態様において、本発明のジェランガムはグミ菓子のために熱安定性を提供する。グミ菓子における熱安定性は、グミ菓子は（熱で）変形し融解するので、グミ菓子の直径の増加を測定することによって評価できる。
【００４１】
さらに別の態様において、高性能低アシルジェランガムは、飲用ゼリーの主要構造成分として特徴的な脆いゲルネットワークを提供するために使用される。
本発明の別の態様は、高性能ジェランガムを、望ましいゲルテクスチャーを提供するためにウォーターデザートゲル系に使用するなど、その他のゲル化ハイドロコロイドと共に使用することを提供する。ジェランガムと共に通常使用されるゲル化ハイドロコロイドは、カラギーナン、カラギーナン／ローカストビーンガム系、カラギーナン／コンニャク系、及びキサンタンガム／ローカストビーンガム系などであるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００４２】
実施例
以下の実施例は本発明の説明のために提供するものであり、本発明の範囲を何らかの形で制限するものと誤解すべきでない。
【００４３】
実施例１
酵素的清澄化、生成物回収、及び０．１％カードメーターゲル強度分析
Ｓ．エロデアのＰＨＢ欠損株の発酵による発酵槽ブロス（バッチ番号  ＧＢ０５６６２）４５００Ｌを５０℃の温度に加熱し、機械的撹拌によって混合した。混合を続けながら、２００ｐｐｍの亜硫酸ナトリウム、１００ｐｐｍのリゾチーム、及び２５０ｐｐｍのＥＤＴＡ二ナトリウムを発酵槽に加えた。試薬の混合を２時間続け、この間発酵槽の温度を高めた温度に維持されるよう制御した。次に２５０ｐｐｍのドデシル硫酸ナトリウムを発酵槽ブロスに加え、１時間撹拌した。その後、１０００ｐｐｍのプロテアーゼ酵素を発酵ブロスに加え、発酵ブロスと３時間混合した。多糖類を脱アシル化するために水酸化カリウムを該ブロスに加え、１１．３４のｐＨを達成した。
【００４４】
ブロスを、１００℃に加熱し、ｐＨを硫酸で調整して５．５９に下げ、そして処理発酵ブロス１容量に対して３容量のイソプロパノール／水共沸混合物を用いて沈殿させて回収した。沈殿した繊維をトレイ乾燥機で乾燥させ、摩砕して微粉末にした。１グラムの乾燥粉末サンプルを周囲温度で９５０ｍｌの純水でもどした。粉末を６００ｒｐｍで約２分間混合することによって分散させた。サンプルを含有するビーカーを約１００℃に維持された水浴に入れた。サンプルの混合をサンプルが９０℃に達するまで続けた。次に撹拌をさらに１０分間続けた。次に、６１．６ｇ／ｌの乳酸カルシウム１０ｍｌを熱サンプルに加え、さらに１分間撹拌した。次に、サンプルを総溶液重量が１０００ｇになるまで熱純水を加えることによって調整した。サンプルをさらに１分間混合した後、ゼリーカップに注いで栓をした。次いでサンプルを８℃の水浴に約２時間入れて置いた。
【００４５】
ゲル強度は、Ｎｅｏ  Ｃｕｒｄｍｅｔｅｒ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ  ＭＥ−３０３で測定した。この測定では、Ｎｅｏ  Ｃｕｒｄｍｅｔｅｒ（登録商標）の操作マニュアルに記載されているように、１００グラムのバネ、延長ロッド、５．６ｍｍのプランジャー、及び１００グラム荷重のセルウェイトを使用した。このサンプルの場合、０．１％のグラムカードメーターゲル強度は３１７ｇ／ｃｍ２であった。
【００４６】
実施例２
酵素的清澄化、生成物回収、及びテクスチャープロファイル分析
Ｓ．エロデアのＰＨＢ欠損株の発酵による発酵槽ブロス（バッチ番号  ＧＢ０５４４３）４５００Ｌを５０℃の温度に加熱し、機械的撹拌によって混合した。混合を続けながら、２００ｐｐｍの亜硫酸ナトリウム、１００ｐｐｍのリゾチーム、及び２５０ｐｐｍのＥＤＴＡ二ナトリウムを発酵槽に加えた。試薬の混合を２時間続け、この間発酵槽の温度を高めた温度に維持されるよう制御した。次に２５０ｐｐｍのドデシル硫酸ナトリウムを発酵槽ブロスに加え、１時間撹拌した。その後、１０００ｐｐｍのプロテアーゼ酵素を発酵ブロスに加え、発酵ブロスと３時間混合した。多糖類を脱アシル化するために水酸化カリウムを該ブロスに加え、１１．１３のｐＨを達成した。
【００４７】
ブロスを、１００℃に加熱し、ｐＨを硫酸で調整して５．５１に下げ、そして処理発酵ブロス１容量に対して３容量のイソプロパノール／水共沸混合物を用いて沈殿させることによって回収した。沈殿した繊維をトレイ乾燥機で乾燥させ、摩砕して微粉末にした。１．５グラムの乾燥粉末サンプルを３０５ｇの脱イオン水でもどし、周囲温度で８００ｒｐｍで１分間撹拌しながら混合した。混合物を９０℃に加熱後、熱源を止め、混合物を１分間撹拌した。次に、３ｍＬの０．６Ｍ塩化カルシウムストック溶液を加え、さらに１分間撹拌した。混合物の重量を予熱した脱イオン水で３０１ｇに増やし、再度３０秒間撹拌した。表面の気泡をスプーンで除去し、溶液をテクスチャープロファイル分析（“ＴＰＡ”）リング（グリース塗布）に注ぎ入れた。これを一晩保持してゲル化した。
【００４８】
次に該ゲルをＴＰＡによって試験した（Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．ら，ジェランガムゲルのテクスチャー(The Texture of Gellan Gum Gels)，Ｇｕｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，４：２１９−２２７（１９８８））。これは自立ゲルの圧縮試験である。サンプルを元の高さの２０％に２インチ／分の速度で２回圧縮した。モジュラス、硬度、脆性及び弾性を測定した。硬度の測定は、最初の圧縮サイクル時の最大力で、サンプルのゲル化性能（ゲル強度）を表す。ＴＰＡ硬度２５．７ポンド（ｌｂ）が測定された。
【００４９】
実施例３
酵素的清澄化、生成物回収、及び熱粘度測定
Ｓ．エロデアのＰＨＢ欠損株の発酵による発酵槽ブロス（バッチ番号  ＧＢ０５３４１）４５００Ｌを５０℃の温度に加熱し、機械的撹拌によって混合した。混合を続けながら、２００ｐｐｍの亜硫酸ナトリウム、１００ｐｐｍのリゾチーム、及び２５０ｐｐｍのＥＤＴＡ二ナトリウムを発酵槽に加えた。試薬の混合を２時間続け、この間発酵槽の温度を高めた温度に維持されるよう制御した。次に２５０ｐｐｍのドデシル硫酸ナトリウムを発酵槽ブロスに加え、１時間撹拌した。その後、１０００ｐｐｍのプロテアーゼ酵素を発酵ブロスに加え、発酵ブロスと３時間混合した。多糖類を脱アシル化するために水酸化カリウムを該ブロスに加え、１１．４８のｐＨを達成した。
【００５０】
ブロスを、１００℃に加熱し、ｐＨを硫酸で調整して５．４に下げ、そして処理発酵ブロス１容量に対して３容量のイソプロパノール／水共沸混合物を用いて沈殿させることによって回収した。沈殿した繊維をトレイ乾燥機で乾燥させ、摩砕して微粉末にした。３．０グラムの乾燥粉末サンプルを、９０℃の水浴中で、３００ｍＬの脱イオン水を含有するビーカーに撹拌しながら徐々にもどした。熱ビーカーを天秤で秤量し、溶液の内容量を脱イオン水で３００グラムに増やし、２０秒間撹拌した。１０ｍＬシリンジを用い、８ｍＬの溶液を、熱水浴に接続されたウォータージャケット付きＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  ＬＶ  粘度計の小サンプルアダプタカップに注入した。水浴中で予熱されたスピンドル＃１８を用い、１％ジェランガムの９０℃熱粘度を１２ｒｐｍの粘度計速度で測定した（ｒｐｍは粘度の測定値が範囲内になるように調整された）。２３９ｃＰという熱粘度が測定された。熱粘度は多糖類サンプルの分子量、ひいてはゲル化性能に関係すると考えられる。
【００５１】
実施例４
Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）と高性能ジェランガムの０．１％カードメーターゲル強度の比較
いくつかの４５００リットルのＳ．エロデアの発酵バッチを実施例１の化学的／酵素的処理法を用いて清澄化した。ただし、水酸化カリウム添加後に達成された脱アシル化ｐＨはバッチごとに異なっていた。処理された発酵ブロスを実施例１の手順に従って回収し乾燥粉末にした。０．１％カードメーターゲル強度を実施例１に記載のように測定した。発酵バッチ番号、脱アシル化ｐＨ、及び０．１％カードメーターゲル強度を、比較のために３種類の市販低アシルジェランガムバッチ（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標））と共に表１に示す。データは、０．１％カードメーターゲル強度は実験バッチの方が著しく高いことを示している。
【００５２】
【表１】
0005546249.tif 000002
【００５３】
実施例５
Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）と高性能ジェランガムのテクスチャープロファイル分析
いくつかの４５００リットルのＳ．エロデアの発酵バッチを実施例１の化学的／酵素的処理法を用いて清澄化した。ただし、水酸化カリウム添加後に達成された脱アシル化ｐＨはバッチごとに異なっていた。処理された発酵ブロスを実施例１の手順に従って回収し乾燥粉末にした。テクスチャープロファイル分析（“ＴＰＡ”）を実施例２に記載のように測定した。発酵バッチ番号、脱アシル化ｐＨ、及びＴＰＡ硬度（ｌｂ）を、比較のために３種類の市販低アシルジェランガムバッチ（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標））と共に表２に示す。データは、ＴＰＡ硬度値は実験バッチの方が著しく高いことを示している。
【００５４】
【表２】
0005546249.tif 000003
【００５５】
実施例６
Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）と高性能ジェランガムの熱粘度測定値の比較
いくつかの４５００リットルのＳ．エロデアの発酵バッチを実施例１の化学的／酵素的処理法を用いて清澄化した。ただし、水酸化カリウム添加後に達成された脱アシル化ｐＨはバッチごとに異なっていた。処理された発酵ブロスを実施例１の手順に従って回収し乾燥粉末にした。熱粘度を実施例３に記載のように測定した。発酵バッチ番号、脱アシル化ｐＨ、及び熱粘度（センチポアズ）を、比較のために３種類の市販低アシルジェランガムバッチ（Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標））と共に表３に示す。データは、１％ジェランガムの９０℃熱粘度値は実験バッチの方が著しく高いことを示している。
【００５６】
【表３】
0005546249.tif 000004
【００５７】
実施例７
０．１％カードメーターゲル強度に及ぼす脱アシル化ｐＨの影響
いくつかの４５００リットルのＳ．エロデアの発酵バッチを実施例１の化学的／酵素的処理法を用いて清澄化した。ただし、脱アシル化ｐＨは水酸化カリウムの添加量を変更することによってバッチの回収中様々に変更された。脱アシル化後、処理され脱アシル化された発酵ブロスを実施例１の手順に従って回収し乾燥粉末にした。０．１％カードメーターゲル強度を実施例１に記載のように測定した。発酵バッチ番号、脱アシル化ｐＨ、及び０．１％カードメーターゲル強度を表４に示す。データは、典型的には脱アシル化ｐＨが低いほど高いカードメーターゲル強度が達成されていることを示している。
【００５８】
【表４】
0005546249.tif 000005
【００５９】
実施例８
ＴＰＡ硬度及び熱粘度に及ぼす脱アシル化ｐＨの影響
いくつかの４５００リットルのＳ．エロデアの発酵バッチを実施例１の化学的／酵素的処理法を用いて清澄化した。ただし脱アシル化ｐＨは水酸化カリウムの添加量を変更することによってバッチの回収中様々に変更された。脱アシル化後、処理され脱アシル化された発酵ブロスを実施例１の手順に従って回収し乾燥粉末にした。ＴＰＡ硬度及び熱粘度をそれぞれ実施例２及び３に記載のように測定した。発酵バッチ番号、脱アシル化ｐＨ、ＴＰＡ硬度及び熱粘度を表５に示す。データは、典型的には脱アシル化ｐＨが低いほど高いＴＰＡ硬度値及び１％ジェランガムの９０℃熱粘度が達成されていることを示している。
【００６０】
【表５】
0005546249.tif 000006
【００６１】
実施例９
ゲル透過クロマトグラフィー／多角度光散乱（“ＧＰＣ／ＭＡＬＬＳ”）による相対分子量測定
市販のＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）と本発明の高性能ジェランガムの希ストック水溶液を、２００ｍｌの脱イオン水に０．０１グラムのエチレンジアミン四酢酸（“ＥＤＴＡ”）と共に０．２０グラムのジェランサンプルを溶解することによって調製した。該溶液を５０℃に加熱し、冷却した後、予め０．２ミクロンのフィルタを通してろ過した２５ｍＭのテトラメチルアンモニウムクロリド中で選択濃度（０．０３３〜０．０５０％ジェラン）にまで希釈した。
【００６２】
ＧＰＣ／ＭＡＬＬＳシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  ６００コントローラー、Ｗａｔｅｒｓ  ６１０  ＨＰＬＣポンプ、Ｗａｔｅｒｓ  ７１７＋自動サンプラー、一連の２個のＧＰＣカラム（３０ｃｍのＷａｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  ２０００カラムと３０ｃｍのＷａｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｌｉｎｅａｒカラム）、ＤＡＷＮ  ＤＳＰレーザー光度計（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．，カリフォルニア州サンタバーバラ）及びＷａｔｅｒｓ  ４１０示差屈折計（すべてのＷａｔｅｒｓ製品はＷａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，マサチューセッツ州ミルフォードより）で構成されていた。次に、０．１０ｍＬのサンプルを溶離液流に注入し（２５ｍＭテトラメチルアンモニウムクロリド、０．５０ｍｌ／分）、サイズ排除クロマトグラフィーカラムによって分子サイズに基づいて分離した。カラムからのサンプルの溶離に従い、相対分子量と濃度のプロファイルが光散乱及び屈折率検出器によって決定された。屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）の指数０．１４５を用いてサンプルの濃度（及び相対分子量）を溶離体積の関数として決定した。文献報告値（Ｐａｏｌｅｔｔｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，１５：１７１（１９９１））及び何が水性塩溶液中の多糖類に典型的であるかということを基に、この値を選択した。
【００６３】
相対的な重量平均（“Ｍｗ”）及び数平均（“Ｍｎ”）分子量を光散乱検出器＃８〜１６の直線外挿を用いて計算した。３個の市販Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ジェランガムサンプルの重量平均及び数平均分子量を平均して対照の相対分子量とし、これに１．０の値を与えた。これによって実験バッチを市販品と比較するための標準値が提供された。相対分子量の結果を表６に示す。結果は、この方法論によれば、市販のＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）サンプルは本発明の高性能低アシルジェランガムのサンプルより分子量が著しく低いことを示している。データは、高性能低アシルジェランガムサンプルの平均Ｍｗは、対照の市販低アシルジェランガムサンプルの平均の１．８３倍であったことを示している。
【００６４】
【表６】
0005546249.tif 000007
【００６５】
実施例１０
原子間力顕微鏡法（“ＡＦＭ”）による相対分子量測定
０．１％ジェランガム溶液を、０．１ｇのジェランを１００ｍＬの脱イオン水中に水和し、５０℃に加熱することによって調製した。これらのストック溶液をＡＦＭ測定のために脱イオン水でさらに希釈した。０．１％ジェラン溶液の一部を１０μＬピペットを用いて採取し、１０ｍＬ又は２０ｍＬの脱イオン水で希釈した。これらの希釈ジェラン溶液２５μＬ（０．５ｐｐｍ及び１．０ｐｐｍ）を劈開したばかりの雲母表面にスプレーし、約５０℃の真空オーブン中で３０分間乾燥させた。
【００６６】
乾燥サンプルをＮａｎｏｓｃｏｐｅ（登録商標）IIIa（Ｖｅｅｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，ニューヨーク州ウッドベリー）を用いて画像化した。タッピングモード用にエッチングされたシリカ（“ＴＥＳＰ”）のチップによるタッピングモード（断続接触モード）において、２００μＬの「Ｊ」段階を使用した。一連の少なくとも１０個の５μＬ×５μＬのスキャン結果を各サンプルについて雲母表面全体の様々な位置で収集した。ジェラン鎖の径路長(contour length)を各サンプルについて少なくとも２個の代表的な５μＬ×５μＬのスキャンイメージを用いて測定した。およそ２００の分子の径路長を各サンプルについて測定し、相対分子量の平均と分布を得た。
【００６７】
２個の市販Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）サンプル（ロット番号５Ｇ３９０８Ａ及び５Ｇ３９２８Ａ）と１個の本発明の高性能ジェランガムのサンプル（バッチ番号ＧＢ０５８１０−３）の分子量をＡＦＭで分析した。２個の市販Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ジェランガムサンプルの径路長を平均して対照の相対分子量とし、これに１．０の値を与えた。これによって実験バッチを市販品と比較するための標準値が提供された。相対分子量の結果を表７に示す。カラム“ｎ”は径路長を測定するのに使用した分子の数を表す。ＡＦＭの結果は、ＧＰＣ／ＭＡＬＬＳの結果を裏付ける第二の独立した分子量技術としての役割を果たしており、本発明の新規な高性能低アシルジェランガムが市販の低アシルジェランガムより著しく高い分子量を有していることを立証している。
【００６８】
【表７】
0005546249.tif 000008
【００６９】
実施例１１
高性能低アシルジェランガムの清澄度及びアシル含有量
Ｓ．エロデアのＰＨＢ欠損株のいくつかの４５００リットル発酵バッチを実施例１の化学的／酵素的処理法を用いて清澄化した。実施例１の手順に従って発酵ブロスを水酸化カリウムで脱アシル化した後、回収して乾燥粉末にした。清澄度を測定するため、実施例３の手順に従って３ｇの乾燥粉末を脱イオン水で１％の濃度にもどした。もどした熱ゲルをチューブに注入し、パーセント透過率を波長４９０ｎｍで分光光度計で測定した。パーセント透過率を表８に示す。
【００７０】
アシル含有量を測定するために、１．５ｇの乾燥粉末を１５ｇの６０％イソプロピルアルコール（“ＩＰＡ”）と１５秒間渦撹拌した。渦撹拌後、液体を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、デカントすることによって除去した。これを６０％ＩＰＡで５回繰り返して未結合有機酸塩を除去し、最後はサンプルの乾燥を容易にするために１５ｇの９９％ＩＰＡを用いた。最後のデカント後、サンプルを遠心分離管から回収し、５０℃の真空オーブン中で一晩乾燥させた。次に、２５ｍｇの乾燥粉末を８０℃の脱イオン水５ｍＬ中にもどした。次に該サンプルを０．５Ｍのトリフルオロ酢酸（“ＴＦＡ”）中で一晩１００℃で加水分解した。加水分解サンプルを希釈して２５ｍＬにし、０．４５μＬのナイロンディスク型シリンジフィルタを通してろ過した。ろ液中の有機酸をＤｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州サニーベール）の、ＩｏｎＰａｃ（登録商標）ＩＣＥ−ＡＳ１イオン排除カラムと導電率検出器を備えたＨＰＬＣシステムを用いて定量した。アシル含有率を表８に示す。
【００７１】
【表８】
0005546249.tif 000009
【００７２】
実施例１２
高性能部分脱アシル化ジェランガムの清澄度及びアシル含有量
Ｓ．エロデア（低ＰＨＢ産生変異株を使用）の二つの４５００リットル発酵バッチを実施例１の化学的／酵素的処理法を用いて清澄化した。発酵ブロス実施例１の手順に従って水酸化カリウムで穏やかに脱アシル化し、回収して乾燥粉末にした（バッチ番号ＧＢ０５３４１を二つの異なるｐＨ条件で脱アシル化した）。乾燥粉末を実施例３の手順に従って脱イオン水で１％の濃度にもどした。もどした熱ジェランガム溶液をチューブに注入し、パーセント透過率を波長４９０ｎｍで分光光度計で測定した。また、乾燥粉末のサンプルを脱イオン水でもどし、０．５ＭのＴＦＡ中１００℃の温度で１８時間加水分解し、加水分解ガムのグリセレート及びアセテート成分をＨＰＬＣで測定した。脱アシル化ｐＨ、パーセント透過率、及びアシル含有率を表９に示す。
【００７３】
【表９】
0005546249.tif 000010
【００７４】
実施例１３
殺菌時のデザートゲルの熱安定性を改良するための高性能低アシルジェランガムの使用
３個の高性能低アシルジェランガムサンプル（バッチ番号ＧＢ０６６１２−８、ＧＢ０６４０５−５、及びＧＢ０６６２２−６）と１個の市販Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）サンプル（ロット番号５Ｇ３９２８Ａ）の、デザートゲル系（表１０の配合参照）に熱安定性を提供することにおける相対的有効性をＢｏｈｌｉｎ  ＣＶＯレオメーター（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，英国ウースターシャー）を用いて比較した。熱デザートゲル溶液の弾性率（“Ｇ’”）を、４ｃｍ  ４°のコーン／プレートのジオメトリーのレオメーターを用いて０．１５の歪み及び１Ｈｚで、８０℃から２０℃に５℃／分で冷却しながら測定した。次にゲルのＧ’を２０℃から９０℃に５℃／分で再加熱しながら測定した。デザートゲル系が商業的殺菌プロセス（８５℃、３０分）の間その完全性を維持するためには、再加熱相中最低５ＰａのＧ’が必要であることがこれまでに分かっている。各ジェランガムサンプルを０．０１２５％〜０．０２５％の間の３つの異なる濃度で試験し、各サンプルの再加熱中の最小Ｇ’をジェラン濃度の関数としてプロットした。次にこのプロットを用いて、５ＰａのＧ’を達成するのに必要なジェラン濃度を内挿を用いて決定した。熱安定性の提供における相対的有効性は、５ＰａのＧ’を達成するのに必要な濃度として表され、試験した各サンプルの結果を表１１に示す。結果は、３個の高性能ジェランガムは、デザートゲル系に同様の熱安定性を提供するのにＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）の量より平均して約２４％少なくてすむことを示している。
【００７５】
【表１０】
0005546249.tif 000011
【００７６】
【表１１】
0005546249.tif 000012
【００７７】
実施例１４
飲用ゼリーにおける高性能低アシルジェランガムの使用
高性能ジェランガムサンプル（バッチ番号ＧＢ０６６２３−７）を飲用ゼリーに０．０６％〜０．１％の濃度で使用して、０．１％の市販Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）サンプル（ロット番号５Ｇ３９２８Ａ）で製造した対照と比較した。表１２に示した配合物を、ジェランガムとクエン酸ナトリウムを混合し、該混合物を撹拌下でＤＩ（脱イオン）水に加えることによって製造した。次に該混合物を９０℃に加熱した。次いで残りの成分を加え、９０℃で１分間混合した。その後、蒸発による混合物の水分損失を熱ＤＩ水で調整した。アルミニウム張りのプラスチック製飲用ゼリーバッグに熱溶液を充填し、ヒートシールした。最後にゼリーバッグを８５℃の水浴中で３０分間殺菌し、次いで冷水道水を流しながら室温に冷却した。
【００７８】
【表１２】
0005546249.tif 000013
【００７９】
飲用ゼリーを室温で１週間貯蔵後、シネレシス（ゲルから分離した水分％）及びゲルのテクスチャー（３人のメンバーで構成される味見者による）について評価した。表１３に示したシネレシス及び官能評価の結果によれば、高性能ジェランガムの濃度が０．０６％〜０．０７％のサンプルは、０．１％Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）で製造した対照と類似の飲用ゼリーを提供するようである。従って、現在入手可能なジェランガムと比べると、高性能ジェランガムの必要量はかなり少なくて済む。
【００８０】
【表１３】
0005546249.tif 000014
【００８１】
実施例１５
ゼリー菓子における高性能低アシルジェランガムの使用
市販のＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）サンプル（ロット番号５Ｇ３９０１Ａ）と本発明の高性能低アシルジェランガムサンプル（バッチ番号ＧＢ０６４０５−５）を、表１４に示した典型的なゼリー菓子配合物で比較した。配合物は、やかんでコーンシロップ、高果糖コーンシロップ（ブドウ糖果糖液糖）、及び水（Ａ）を沸騰させることによって製造した。砂糖、ジェランガム、及びリン酸塩（Ｂ）を乾燥ブレンドし、次いで混合しながらやかんに分散させた。該混合物を混合しながら沸騰まで持って行き、その後２〜３分間沸騰させてガムの水和を確実にした。砂糖（Ｃ）をバッチが冷めないように徐々に加え、沸騰によって溶解した。次に、混合物を混合しながら屈折計可溶性固形分（糖度）７９％にまで減じた。次に、酸及びクエン酸塩溶液（Ｄ）を混合しながら合わせた（所望であればフレーバー及び着色料を加えることもできる）。最後に、混合物を直ちに、用意されたスターチの型内に置き、屈折計可溶性固形分８２〜８３％が達成されるまで３０℃〜３５℃（８６°Ｆ〜９５°Ｆ）で２〜３日間保持した。
【００８２】
【表１４】
0005546249.tif 000015
【００８３】
４個のトライアルを実施した。０．８％Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）の対照１個と０．８％、０．６％及び０．４％の濃度レベルの高性能ジェランガム３個である。サンプルを直径２５ｍｍ、高さ１０ｍｍのディスク形にスターチモールドした。完成したサンプルを７０％の圧縮でＴＰＡ硬度について試験した。報告値は、１個のトライアルにつき５個のサンプルの平均ＴＰＡ硬度±標準偏差であり、表１５に示す。
【００８４】
【表１５】
0005546249.tif 000016
【００８５】
対照濃度（０．８％）では、高性能ジェランガムはＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ジェランガムより２３３％高い平均ＴＰＡ硬度値を実現した。さらに、０．４％の濃度の高性能ジェランガムは対照濃度（０．８％）のＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ジェランガムと等価のＴＰＡ硬度を達成している。このことは、ゼリー菓子ではＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ジェランガムは約５０％少ない高性能ジェランガムで置き換えられることを示している。
【００８６】
実施例１６
グミ菓子に熱安定性を提供するための高性能低アシルジェランガムの使用
市販のＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）サンプル（ロット番号６Ａ５３０７Ａ）と本発明の高性能ジェランガムサンプル（バッチ番号ＧＢ０６６２２−８）を、表１６に示したグミ菓子配合物で比較した。配合物は、まず水とゼラチン（Ａ）のゼラチン前溶液を製造し、該溶液を６０℃（１４０°Ｆ）に３〜４時間保持して溶解させた。その間、コーンシロップ、水、及びクエン酸ナトリウム溶液（Ｂ）をやかんに沸騰させた。次に、砂糖及びジェランガム（Ｃ）を乾燥ブレンドし、混合しながらやかんに分散させた。該混合物を混合しながら沸騰まで持って行き、２〜３分間沸騰させてガムの水和を確実にした。次に砂糖（Ｄ）をバッチが冷めないように徐々に加え、沸騰によって溶解した。次に、混合物を混合しながら屈折計可溶性固形分８５〜８６％にまで減じた。その後、ゼラチン前溶液（Ａ）を加え、よく混合した。次に酸（Ｅ）をフレーバー及び着色料（所望により）と共に混合しながら加えた。混合物は屈折計可溶性固形分約７７％であった。最後に、該混合物を用意されたスターチモールドに直ちにデポジットし、屈折計可溶性固形分８１〜８２％が達成されるまで２５℃〜３０℃（７７°Ｆ〜８６°Ｆ）で２〜３日間保持した。
【００８７】
【表１６】
0005546249.tif 000017
【００８８】
５個のトライアルを実施した。１個はジェランガムなし（“ゼラチン対照”）、２個はＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）（０．２４％及び０．１２％）、そして２個は高性能ジェランガム（０．１２％及び０．０６％）で実施した。サンプルを直径２５ｍｍ、高さ１０ｍｍのディスク形にスターチモールドした。各完成サンプルを蒸気不透過性の延伸ポリプロピレンヒートシールバッグに包装し、４５℃の実験室オーブンで熱安定性を試験した。サンプルはこの高めた温度で変形し融解するので、サンプルの直径は増加した。８時間後、サンプルの平均直径を測定し、サンプルの平均直径の増加を計算した。測定結果を表１７に示す。
【００８９】
【表１７】
0005546249.tif 000018
【００９０】
ゼラチン対照と比べて、評価したいずれのタイプ及びいずれの濃度のジェランガムも、平均直径の増加量は著しく少なかった。しかしながら、観察を通じて、１０％の平均直径増加率が、サンプルが容認できる熱安定性を有するとみなすための最大許容レベルであると判断された。０．２４％のＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）サンプルは適切な熱安定性を達成した（すなわち平均直径増加率が≦１０％であった）。これに対し、高性能ジェランガムはわずか０．０６％の濃度で適切な熱安定性を達成していた。この熱安定性の測定によれば、Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）はグミ菓子では約７５％低い濃度の高性能ジェランガムで置き換えることができる。
【００９１】
実施例１７
ウォーターデザートゲルにおけるテクスチャー改質剤としての高性能低アシルジェランガムの使用
２個のデザートゲルを製造する。ゲルＡはＫｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）を含み、ゲルＢは高性能低アシルジェランガムを含み、どちらもさらにキサンタンガム及びローカストビーンガムを含む。デザートゲルの配合を表１８に示す。ゲルＡはゲルＢより多量のジェランガムを有するが、ゲルＡ及びゲルＢともに非常に類似したゲルテクスチャーと食感品質を有する。従って、Ｋｅｌｃｏｇｅｌ（登録商標）ジェランガムと同じ効果を提供するのに高性能低アシルジェランガムは少量で済む。
【００９２】
【表１８】
0005546249.tif 000019
【００９３】
以上、本発明を現時点でその好適な態様と考えられることに関して記載してきたが、本発明は上記の態様に限定されないことは理解されるべきである。それどころか、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲に含まれる様々な変形及び等価のアレンジもカバーするものとする。
【図１】
0005546249.tif 000020