(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドのＮ末端側に、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加した、タンパク質。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドを複数連結したポリペプチドのＮ末端側に、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加した、タンパク質。
【請求項３】
配列番号６または８に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞。
【請求項７】
請求項６に記載のＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞を用いた、タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト抗体に対する結合親和性の高いタンパク質、および遺伝子工学的手法を用いた前記タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｆｃレセプターとは免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群のタンパク質分子である。個々の分子種は免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＦｃ認識ドメインによって、単一の、あるいは同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の結合ドメインによって認識する。これによって一定の免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動員されるかが決まってくる（非特許文献１）。Ｆｃレセプターは、さらにサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩの存在が報告されている（非特許文献１）。なかでも、ＦｃγＲＩとＩｇＧの結合親和性は高く、その平衡解離定数（ＫＤ）は１０−８Ｍ以下である（非特許文献２）。ＦｃγＲＩはＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであり、単球とマクロファージ上に構成的に発現され、好中球および好酸球上においては誘導的に発現される。ＦｃγＲＩは、細胞外領域、細胞膜貫通領域、細胞質内領域に区分され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こり、その後細胞質へとシグナルが伝達される。ＦｃγＲＩはＩｇＧとの結合に直接関わるα鎖と、γ鎖の２種類のサブユニットによって構成されており、γ鎖は細胞膜と細胞外領域の境界にあるアミノ酸システインを介した共有結合によりホモダイマーを形成している（非特許文献１）。
【０００３】
近年になり、Ｆｃレセプターの予想外の免疫抑制的な生物学的特性は、特に、自己免疫疾患または自己免疫症候群、移植物の拒絶および悪性リンパ増殖の領域において医薬として注目を浴びつつある（非特許文献２）。
【０００４】
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩα鎖のアミノ酸配列および遺伝子塩基配列は非特許文献３により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、大腸菌（特許文献１）あるいは動物細胞を利用した発現が報告されている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５３１０８６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１
【非特許文献２】Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  Ｔａｋａｉ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８，２００５
【非特許文献３】Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９
【非特許文献４】Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１，２００５
【非特許文献５】Ｙａｓｕｋａｗａ  Ｋ．等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８，６７３，１９９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述した通り、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのＩｇＧ分子Ｆｃ領域に対する結合親和性は平衡解離定数（ＫＤ）として１０−８Ｍ以下と極めて高いものの、血液中に含まれるＩｇＧ分子を捕捉・定量するためには、分子あたりの抗体結合性をさらに向上させる必要があった。そこで本発明は、ヒトＩｇＧ抗体に対する結合親和性が向上したタンパク質、および前記タンパク質の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する： 
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドのＮ末端側に、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加した、タンパク質。
【０００９】
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドを複数連結したポリペプチドのＮ末端側に、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加した、タンパク質。
【００１０】
（３）配列番号６または８に記載のアミノ酸配列からなる、タンパク質。
【００１１】
（４）（１）から（３）のいずれかに記載のタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【００１２】
（５）（４）に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【００１３】
（６）（５）に記載のベクターで宿主を形質転換して得られる、形質転換体。
【００１４】
（７）（６）に記載の形質転換体を用いた、タンパク質の製造方法。
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１６】
１．本発明のタンパク質
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩタンパク質は図１に示すように、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち−１５番目から−１番目までの領域）、２７７アミノ酸の細胞外領域（ＥＣ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２７７番目までの領域）、２１アミノ酸の細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２７８番目から２９８番目までの領域）、６１アミノ酸の細胞内領域（Ｃ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち２９９番目から３５９番目までの領域）からなる。このうち、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域と結合性を有する領域は細胞外領域、特にその中の抗体結合ドメイン（ＢＲ、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８０番目から１７９番目）であり、当該領域でＩｇＧ抗体を直接捕捉している。
【００１７】
本発明のタンパク質における、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列からなるポリペプチドとは配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８０番目から１７９番目のアミノ酸（配列番号４に記載のアミノ酸配列）からなるポリペプチドのことをいい、細胞外領域の抗体結合ドメインの概ね全体配列からなるポリペプチドとは配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち８０番目から１７９番目のアミノ酸からなるポリペプチドのうちＮ末端側および／またはＣ末端側の１から１０アミノ酸を付加および／または削除したポリペプチドのことをいう。
【００１８】
本発明のタンパク質における、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドの連結数は、抗体結合活性を損なわない限り連結することができるが、タンパク質の分子量が概ね１０万を超えると取り扱いが困難となることから、２から１０が好ましい。また、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドを連結する際には、直接前記ポリペプチド同士を直接連結させてもよいし、ＩｇＧ分子Ｆｃ領域に対する抗体親和性、および菌体外に分泌可能なだけの可溶性を有する範囲で適宜リンカーペプチドを挿入してもよい。
【００１９】
本発明のタンパク質の一態様として、Ｎ末端側から１５アミノ酸のシグナルペプチド領域（配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち−１５番目から−１番目までの領域）、連結領域（６アミノ酸）、細胞外領域の抗体結合ドメイン（配列番号４に記載のアミノ酸）からなる、配列番号６に記載のタンパク質をあげることができる。
【００２０】
本発明のタンパク質の別の態様として、Ｎ末端側から１５アミノ酸のシグナルペプチド領域（配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち−１５番目から−１番目までの領域）、連結領域（６アミノ酸）、１つ目の細胞外領域の抗体結合ドメイン（配列番号４に記載のアミノ酸）、連結領域（２アミノ酸）、２つ目の細胞外領域の抗体結合ドメイン（配列番号４に記載のアミノ酸）からなる、配列番号８に記載のタンパク質をあげることができる。
【００２１】
２．本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドのＮ末端側にヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加したタンパク質、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドを複数連結したポリペプチドのＮ末端側にヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加したタンパク質をコードするポリヌクレオチドのことをいう。なお、遺伝子組み換え技術を用いて本発明のタンパク質を製造する場合は、前記タンパク質のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際に、組み換え対象宿主細胞におけるコドンの使用頻度を考慮のうえ変換するのが好ましい。一例としてＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓを宿主とする場合は、セリン（Ｓｅｒ）ではＴＣＡ、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡ、アルギニン（Ａｒｇ）ではＣＧＧ／ＡＧＡ／ＡＧＧ、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡへの変換をそれぞれ避けて変換するのが好ましい（特願２００８−０４６４３８号参照）。
【００２２】
本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一態様として、配列番号６に記載のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換した配列番号５に記載のポリヌクレオチド、配列番号８に記載のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換した配列番号７に記載のポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２３】
３．本発明のタンパク質製造方法
本発明のタンパク質の製造方法としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩから適当な試薬を用いて細胞外領域の抗体結合ドメインを含んだポリペプチドを調製し、前記ペプチド同士を直接またはリンカーを介したペプチド結合により製造する方法、および本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを設計し、前記ポリヌクレオチドから遺伝子工学的手法を用いて製造する方法があげられるが、後者の製造方法が、本発明のタンパク質を簡便かつ大量に生産できる点で好ましい。以下、後者の製造方法について詳細に説明する。
【００２４】
本発明のタンパク質を遺伝子工学的手法により製造するために必要な、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの取得方法としては、
（１）目的とする本発明のタンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、前記ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成して取得する方法、
（２）ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメイン（配列番号３に記載のヌクレオチド配列）の全体配列または概ね全体配列からなるポリヌクレオチドを、直接人工的に、またはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡなどからＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した前記ポリヌクレオチドを適当な方法で連結し取得する方法、
が例示できる。
【００２５】
（１）の方法で取得する場合において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際は、前述したように、組み換え対象宿主細胞におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。（２）の方法で取得する場合において、配列番号１に記載のヒトＦｃγＲＩのヌクレオチド配列から直接人工的にヒトＦｃγＲＩ細胞外領域ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリヌクレオチドを調製する際は、組み換え対象宿主細胞におけるコドンの使用頻度を考慮のうえ、使用頻度が低いコドン、いわゆるレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）に該当する場合は、使用頻度の高いコドンにあらかじめ変換後、調製するのが好ましい（特願２００８−０４６４３８号参照）。
【００２６】
また、（１）、（２）いずれの方法で本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する場合においても、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド同士を、または前記ポリヌクレオチドに発現ベクターを連結させるための制限酵素認識配列、もしくは発現したヒトＦｃγＲＩの抗体結合ドメインの簡便な精製・定量を可能にするためのタグ配列を付加してもよい。前記付加する制限酵素認識配列としては、ベクターおよび連結するＤＮＡ断片のポリヌクレオチド配列を考慮のうえ適切な配列を選択すればよい。前記付加するタグ配列としては、遺伝子工学で多用される、ポリヒスチジンタグやｃ−ｍｙｃタグといったオリゴペプチドをコードするヌクレオチド配列が例示できる。また、タグ配列を付加する箇所は前記ポリヌクレオチドの５’末端側に付加してもよいし、３’末端側に付加してもよい。
【００２７】
本発明のタンパク質を、遺伝子工学的手法を用いて製造するために使用する発現ベクターとしては、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドおよび宿主中で発現ベクターを複製するための複製起点を有し、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであれば、適宜選択し使用できるが、通常は取り扱いの容易な発現プラスミドを用いる。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させるためのポリヌクレオチドとしては、乳糖プロモータ系、トリプトファンプロモータ系、ＧＡＬ４プロモータ系、ＳＶ４０プロモータ系、アデノウイルスプロモータ系に由来するポリヌクレオチドが例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよいが、宿主がＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞といった細胞の場合は、プロモーター系としてＳＶ４０プロモータ系に由来するポリヌクレオチドが好ましい。また、前記発現ベクターを用いて形質転換する操作にあたり、発現ベクターが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするために、発現ベクター中にアンピシリンといった薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのポリヌクレオチド（薬剤耐性遺伝子）を含んでいるのが好ましい。
【００２８】
本発明のタンパク質を、遺伝子工学的手法を用いて製造するために使用する宿主としては、安定的にタンパク質を発現可能なＣＯＳ細胞やＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞）を例示することができる。また、前記細胞に、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んだ発現プラスミドを導入し、さらに特定の薬剤に対する耐性も付与した細胞について、薬剤に対する耐性の強さから前記細胞のスクリーニングを行なうことで、本発明のタンパク質を高発現する細胞を得ることができる。前記スクリーニングにおいて、薬剤としてはメソトレキセート（ＭＴＸ）、耐性濃度としては数μＭ以上がそれぞれ好ましい。ＭＴＸに対する耐性の付与方法は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）が含まれていればよい。
【００２９】
本発明のタンパク質は細胞外領域の抗体結合ドメインから構成されるため、生産に用いた培養液、または培養上清から、通常の生理活性タンパク質回収法によって分離精製することができる。分離精製方法としては、市販のＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィーを例示することできる。また、培無血清培地を用いて培養液中の他のタンパク質を減少させることにより、前述したタンパク質の分離回収効率を高めることもできる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドのＮ末端側に、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加していることを特徴としており、配列番号２に記載のヒトＦｃγＲＩと同様に抗体結合性を有している。このことは、個体発生および免疫機能の研究、およびこれらの研究成果に基づく治療診断薬等の開発に大きな意義を持つ。また、抗ＦｃγＲＩ抗体を作製するための免疫源、およびＦｃγＲＩの免疫化学測定方法の標準物質として用いることもできる。
【００３１】
また、本発明のタンパク質を適当なクロマトグラフィー担体（例えば、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎゲル（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ＨｉｓＴｒａｐ  ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ（ＧＥヘルスケアバイオサイエン社製）、トレシル基活性型ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ社製））に固定することで、ヒトモノクローナル抗体といった抗体を精製する吸着剤として用いることもできる。
【００３２】
なお、本発明のタンパク質はＩｇＧ抗体に対する親和性を有したまま、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩと比較し、分子量を低減させることができる。そのため、本発明のタンパク質の別の態様である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのうち、細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列または概ね全体配列からなるポリペプチドを複数連結したポリペプチドのＮ末端側に、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩのシグナルペプチドを付加したタンパク質において、細胞外領域の抗体結合ドメインの全体配列もしくは概ね全体配列からなるポリペプチドの連結数を多くすることができ、ＩｇＧ抗体に対する結合親和性をより向上させることが可能である。
【００３３】
さらに、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに連結し、このベクターを宿主細胞に形質転換して得られる形質転換体を用いて、本発明のタンパク質を製造することで、ＩｇＧ抗体に対する結合親和性の高いタンパク質を簡便かつ大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの細胞外領域である可溶性ＦｃγＲＩおよび抗体結合ドメインの構造を示す図である。ＳＳはシグナルペプチド、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞質内領域をそれぞれコードする領域、ＢＲは抗体結合ドメインを示す。図の上部の数字はそれぞれの領域のヌクレオチドをコードするアミノ酸数を示す。
【図２】プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒの遺伝子地図を示す図である。
【図３】プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒの遺伝子地図を示す図である。
【図４】プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ７細胞の培養上清より調製したヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを１つ含むタンパク質溶液のＥＬＩＳＡ測定結果を示す図である。
【図５】プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ７細胞の培養上清より調製したヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを１つ含むタンパク質溶液のＥＬＩＳＡ測定結果を示す図である。
【図６】プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ７細胞の培養上清より調製したヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを２つ連結したタンパク質溶液の抗体結合活性の測定結果を示す図である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
実施例１  発現プラスミドの作製（その１）
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域のうち抗体結合ドメインを含むタンパク質を発現可能なプラスミドの作製を、以下の方法で行なった。
（１）ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域のうち抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを以下の方法で調製した。
（１−１）Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号９（５’−ＣＣＣＡＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣ−３’、配列番号１の２８３から３０９番目の塩基に相当）と配列番号１０（５’−ＧＣ［ＴＣＴＡＧＡ］ＴＣＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ［ＡＣＴＡＧＴ］ＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧ−３’：角かっこ部分はそれぞれ制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩの認識配列、３６から６０番目の塩基は配列番号１の５２８から５５２番目の塩基の相補鎖に相当）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した。なお、ヒトＦｃγＲＩの調製および定量を行なうために、発現させるタンパク質のＣ末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにＰＣＲプライマーを設計した。
（１−２）ＰＣＲ反応を、９４℃・５分の熱処理後、９４℃・３０秒間の第一ステップ、６５℃・３０秒間の第二ステップ、７２℃・１分間の第三ステップを２５サイクル行ない、最後に、７２℃・７分の条件で行なった。反応液組成を表１に示す。
【００３７】
【表１】
0005575463.tif 000002
【００３８】
（１−３）ＰＣＲ反応終了後、２％のアガロース電気泳動にて、設計通りのサイズに相当するバンドを確認した。
（１−４）目的産物に相当するバンドをアガロースゲルから抽出（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名）：キアゲン社製）し、ヒトＦｃγＲＩの抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（２）（１）で調製したポリヌクレオチドにヒトＦｃγＲＩのシグナルペプチド領域をコードするポリヌクレオチドを、以下の方法で連結した。
（２−１）（１）で調製したポリヌクレオチドと、配列番号１１（５’−ＧＡ［ＡＧＡＴＣＴ］ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＧＣＣＣＡＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列、９から７１番目の塩基は配列番号１の１から６３番目の塩基に相当）のオリゴヌクレオチドとを等モル量で混合し、ＰＣＲを（１−２）に記載の条件のうちサイクル数を５回に変更した条件で行ない、両ヌクレオチドを連結した。なお、配列番号１１のオリゴヌクレオチドは５’末端側にヒトＦｃγＲＩのシグナルペプチド領域をコードするポリヌクレオチドが付加され、３’末端側は抗体結合ドメインのＮ末端側をコードするポリヌクレオチドとなるよう設計した。
（２−２）（２−１）のＰＣＲ反応液をテンプレートとし、配列番号１０と配列番号１２（５’−ＧＡ［ＡＧＡＴＣＴ］ＡＴＧＴＧＧＴＴＣＴＴＧＡＣＡＡＣＴＣＴＧＣＴＣＣ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＢｇｌＩＩの認識配列、９から３３番目の塩基は配列番号１の１から２５番目の塩基に相当）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、（１−２）と同様に行なった。
（２−３）ＰＣＲ終了後、（１−３）および（１−４）と同様の方法により、ヒトＦｃγＲＩのシグナルペプチド領域を連結した抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（３）（２）で調製したポリヌクレオチドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化後、これらの制限酵素により事前に消化したプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（非特許文献５）とライゲーションし（Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２：タカラバイオ社製）、５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを添加したＬＢ寒天培地を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
（４）（３）の形質転換体を５０μｇ／ｍＬの抗生物質カルベシニリンを含むＬＢ培地により培養（３７℃、１８時間）し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（商品名、キアゲン社製）によりプラスミドを抽出した。
（５）抽出プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、２％のアガロース電気泳動に供した。
【００３９】
結果、インサートサイズから設計通りであることを確認し、これをｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒとした。図２にｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒの構造概略を示す。
【００４０】
実施例２  発現プラスミドの作製（その２）
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域のうち抗体結合ドメインを２つ連結したタンパク質を発現可能なプラスミドの作製を、以下の方法で行なった。
（１）ヒトＦｃγＲＩの抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを以下の方法で調製した。
（１−１）Ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ  ＳＣ１１９８４１プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製）をテンプレートとし、配列番号１３（５’−ＣＧ［ＧＣＴＡＧＣ］ＣＣＣＡＴＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣ：角かっこ部分は制限酵素ＮｈｅＩの認識配列、９から３５番目の塩基は配列番号１の２８３から３０９番目の塩基に相当）と配列番号１４（５’−ＧＧ［ＡＣＴＡＧＴ］ＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧ−３’：角かっこ部分は制限酵素ＳｐｅＩの認識配列、９から３３番目の塩基は配列番号１の５２８から５５２番目の塩基の相補鎖に相当）のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用した他は、実施例１の（１−２）と同様にＰＣＲ反応を行なった。
（１−２）実施例１の（１−３）および（１−４）と同様な方法で、目的産物を精製し、ヒトＦｃγＲＩの抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（２）（１）で調製したポリヌクレオチドを制限酵素ＮｈｅＩとＳｐｅＩにより消化し、制限酵素ＳｐｅＩにより事前に消化した実施例１で作製したプラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒ（図２）と実施例１の（３）から（５）と同様な方法でライゲーションし、形質転換およびプラスミド抽出を行なった。なお、制限酵素ＮｈｅＩとＳｐｅＩで消化した断片はライゲーション可能であるが、再消化することはできない。この性質を利用して、複数のポリペプチドを連結する際は制限酵素ＳｐｅＩおよびＢｇｌＩＩ消化により挿入断片の挿入方向を確認することができる。
（３）抽出プラスミドを制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、２％のアガロース電気泳動に供し、インサートサイズから設計通りであることを確認した。また、制限酵素ＢｇｌＩＩとＳｐｅＩにより消化して同様に電気泳動に供し、消化断片が制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩの消化断片と同じもの、すなわち、挿入した抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドがＮｈｅＩとＳｐｅＩでライゲーションし、プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒ（図２）の抗体結合ドメインのＤＮＡ配列と同方向になっているものを選択した。
【００４１】
結果、インサートサイズおよび制限酵素ＢｇｌＩＩとＳｐｅＩ消化断片長から設計通りであることを確認し、これをｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒとした。図３にｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒの構造概略を示す。
【００４２】
実施例３  発現プラスミドの塩基配列の確認
実施例１および２で作製したプラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒ（図２）、ｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒ（図３）に挿入されている、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩの抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（商品名、ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）において解析した。なお、シークエンスは挿入配列を制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩにより消化し、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ末端を平滑化し、事前にＳｍａＩ処理したプラスミドｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）に挿入して行なった。シークエンス用プライマーとして、配列番号１５（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）と配列番号１６（５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ−３’）に示すオリゴヌクレオチドを使用した。
【００４３】
解析の結果、プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒ、ｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒに挿入されている、ヒトＦｃγＲＩの抗体結合ドメインからなるタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列はいずれも設計通りであることを確認した。ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号５に、前記ドメインを２つ連結したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を配列番号７に、それぞれ示す。
【００４４】
実施例４  ＣＯＳ細胞を用いたタンパク質の発現
ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域における抗体結合ドメインを１つまたは２つ連結したタンパク質を分離精製した。具体的には以下の通りである。
（１）実施例１および２で作製したプラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒ（図２）、ｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒ（図３）を、リポフェクトアミン（インビトロジェン社製）を用いてＣＯＳ７細胞に導入し、１０％  ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で培養することで（３７℃、３日間）、一過的に細胞外へタンパク質を発現させ、培養後、培養液を回収した。
（２）培養上清約１Ｌを、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で透析し脱塩処理を施した。
（３）２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した３００ｍＬのＳｔｒｅａｍｌｉｎｅ  ＳＰゲル（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を備えた吸着流動床システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、同緩衝液で洗浄後、１０％グリセロール、１Ｍ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）により溶出し、ヒトＩｇＧ結合活性を含むタンパク質の濃縮画分を調製した。
（４）（３）で得られた濃縮画分を、２０ｍＭ  イミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に透析し、同緩衝液で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ＨＳカラム（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に添加し、洗浄後、５００ｍＭ  イミダゾール、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出することで、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを含むポリペプチド（約３０μｇ）または前記ペプチドを２つ連結したタンパク質（約５０μｇ）精製標品を得た。なお、タンパク質濃度の定量は、ウシガンマグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法に基づくプロテインアッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行なった。
【００４５】
実施例５  発現したタンパク質の抗体結合活性の評価
実施例４で調製したタンパク質を用いて、抗体結合活性を以下の方法でＥＬＩＳＡ法により評価した。
（１）９６穴のＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製）に１００μｇ／ｍＬから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）または１０μｇ／ｍＬのガンマグロブリン製剤を各ウェルに１００μＬずつ添加し、４℃で１８時間静置することによりガンマグロブリンを固相に固定化した。
（２）ＴＢＳ緩衝液（０．２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で洗浄後、Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）によりブロッキング操作を行なった。
（３）ＴＢＳ緩衝液で洗浄後、調製した培養上清の精製濃縮液を１００μＬ添加し、（１）で固定化したヒトガンマグロブリンと反応させた（３０℃、２時間）。
（４）（３）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、Ｈｉｓ−ｐｒｏｂｅ（Ｈ−１５）ＨＲＰ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加した。
（５）（４）の反応終了後、ＴＢＳ緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４６】
評価結果を図４、５および６に示す。図４および５の通り、プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ７細胞の培養上清の精製濃縮液に抗体結合活性が検出された。すなわち、ｐＥＣＥＦｃＢ１ｄｈｆｒに挿入された、ヒトＦｃレセプターＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを含むポリペプチドからなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを含むポリペプチドからなるタンパク質を得ることができ、かつ、当該タンパク質がヒト抗体に結合活性を保持していることを示している。また、図６の通り、プラスミドｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒにより形質転換されたＣＯＳ７細胞の培養上清の精製濃縮液に抗体結合活性が検出された。すなわち、ｐＥＣＥＦｃＢ２ｄｈｆｒに挿入された、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを含むポリペプチドが２つ連結したタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の抗体結合ドメインを含むポリペプチドが２つ連結したタンパク質を得ることができ、かつ、当該タンパク質がヒト抗体に結合活性を保持していることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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