(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、細胞毎に表現型および遺伝型情報の関連付けを行う方法：
多数の細胞および標的核酸配列の増幅のための少なくとも１つの試薬を含む第１の溶液、並びに前記第１の溶液と不混和性の第２の溶液を提供すること；
多数のナノウェルを含むナノウェルアレイを形成すること、ここにおいて、前記ナノウェルの各々は、サンプルソースに由来する１つの細胞と、核酸増幅および前記細胞の定量分析を支持するのに十分な量の反応混合物とを含む大きさに作られたナノ流体マイクロウェルを含み、前記ナノウェルの内容物に対する光学的スキャンを提供するように構成されている；
前記第１の溶液におけるそれぞれの細胞の前記表現型を連続的に分析すること；
前記第１の溶液と、前記ナノウェルからの前記反応混合物の蒸発を減少させるように役立つ前記第２の溶液とを組み合わせ、前記ナノウェルを充填すること、ここにおいて、前記ナノウェルは、単一細胞をカプセル化する；
前記アレイにおける前記細胞の位置に基づいて、前記ナノウェルをコード化すること；
前記ナノウェルを前記標的核酸の増幅に適した温度条件に供すること；
それぞれのナノウェルにおいて増幅した核酸配列を測定すること；および
前記アレイにおける前記細胞の位置に基づいて、それぞれのナノウェルからの前記増幅した核酸配列の測定と前記ナノウェル中の前記細胞の前記表現型とを関連付けること。
【請求項２】
前記標的核酸の増幅が等温増幅の実行を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸の増幅がｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたはエンドポイントＰＣＲの実行を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノウェルがインデックスを作るためにコード化された後に、前記ナノウェルを撮像することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記表現型の分析が蛍光シグナルの測定を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記表現型の分析が、複数の表現型測定を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記表現型測定に基づいて、前記細胞を標的細胞および非標的細胞にソートすることを更に含み、前記非標的細胞は廃棄物リザーバーに向けられる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノウェルにて前記細胞を溶解することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅した核酸配列がリアルタイムまたは定量的ＰＣＲによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅した核酸配列の測定が、遺伝物質の吸収を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅した核酸配列の測定が、ＤＮＡ産物に結合するまたはＤＮＡ増幅の副産物に結合するプローブまたは色素による吸収を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
増幅した核酸配列の測定に基づいて前記ナノウェルをソーティングすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム材料をソートおよび回収することを任意に含む、ハイスループットサンプル由来のタンパク質および核酸についての、自動的で関連付けられる細胞毎の定量的測定を行うための方法および装置に関する。
【０００２】
［関連出願］
本国際出願は、仮出願第６０／９５４，９４６号（２００７年８月９日出願、名称「関連付け多パラメーター単一細胞測定および残留する生物学的材料の回収のための方法」）の利益を主張し、当該仮出願は、その全体が本願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）は、研究および臨床の用途において広く使用される。これらの機器は非常に速いマルチパラメーターの分析およびソーティングが可能であるが、大量のサンプル、操作および保守のための熟練した操作者を一般的に必要とし、殺菌することも困難である。ＦＡＣＳ機器は、１０，０００と同程度に少ない細胞および何千万と同程度に多い細胞を分析することができる。しかしながら、ソーティングの用途において、１００，０００未満の細胞のサンプルサイズでは、ソーティングする能力が減弱する。全ての場合において、細胞を予めラベルしなければならない。しばしば抗原または同様の膜結合タンパク質は、蛍光分子（例：フルオレッセインイソチオシアネート、別名ＦＩＴＣ）を結合した抗体を使用してラベルされるが、核染色、細胞内色素または細胞による蛍光タンパク質の合成（例：緑色蛍光タンパク質、別名ＧＦＰ）をフローサイトメトリーによって検出することもできる。分子アッセイもフローサイトメトリーに適用することもできる。例えば、複数の色および／または強度を有する蛍光ビーズを、タンパク質またはペプチド分析物の抗体捕獲アッセイのための固体支持体として使用してもよい。同様に、核酸を、フローサイトメトリーを使用する迅速な読み出しのためのビーズおよび蛍光ラベルにハイブリダイズしてよい。双方の場合において、フローサイトメトリー測定に先立って生化学的処理が行なわれ、迅速なビーズリーダーとして機器が使用される。ある場合には、スキャニングサイトメトリーのアプローチが、読み出しにとって同様に有効となる。ＦＡＣＳ機器は、機器が対応する独立した蛍光チャネルの数までの情報の多重化に対応するが、多重化された情報は単一のタイプ（すなわち、表現型のみ）である。
【０００４】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法（別名ｑＰＣＲ）は、対象となる細胞から抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡを定量的に測定するために使用される技術である。ほとんどのｑＰＣＲ反応は１０，０００〜１００，０００個の細胞のプールされたゲノムの相当物を使用して、バルクで行われる。研究者は、個々の細胞の遺伝的内容の測定にますます興味を持っていが、この努力は、高いコストの試薬および昨今利用できる労働集約的マニュアル的アプローチによって阻害される。その結果、ほとんどの単一細胞ＰＣＲ研究は１００個未満の細胞にて行なわれてきた。最先端技術のロボット工学および１５３６マイクロウェルプレートでさえ、１ウェルあたり１−１０Ｌの範囲の体積を使用し、数百ウェルを越えると高価になる。対象とする細胞集団の１％未満で生じるかもしれない希な事象の場合、５０，０００細胞まで個々に検査することが望ましい可能性がある。現在の技術は、時間および資金の面で著しいコストをかけずに、このレベルのスループットを達成することができない。
【０００５】
情報伝達に関する研究またはシステム生物学における研究において、異なる情報を関連付けることがしばしば望まれる。細胞表面レセプターまたはリポーターと細胞内シグナル伝達とを繋ぐデータは、これらの活動にとってますます価値がある。現在まで、この情報は、バルクの細胞集団に基づいて関連付けられてきた。典型的に、何千から何百万もの細胞が、表面タンパク質またはＲＮＡ発現の何れかについてアッセイされ、その情報が統計的に関連付けられてきた。サンプルにおける任意の異成分も測定において平均される。本質的にサンプルへ異成分を導入するｓｉＲＮＡ遺伝子抑制のような強力な技術は、この情報の平均のために制限されている。
【０００６】
細胞ごとにおける、タンパク質（または表現型のその他のサイン）と遺伝型の核酸との間の定量的関連付けの価値は、多くの研究者によって認識されている。マイクロ流体は、そのような測定に有効な機器を実現する１つの技術であることが明らかにされたが、方法および装置の例は作られていない。
【０００７】
微細加工サイトメーターは、わずか１，０００個の細胞を分析しソートする可能性を有し、付随的に、試薬の消費が少量であり、使用が容易なクローズドシステムである。前者は、複製酵素といった高コストの試薬を用いる場合に重要である。後者は、従来のＦＡＣＳ機器と異なり、エアロゾルが作られず、ソートされた細胞の汚染のリスクおよび生物学上危険な材料を使用することのリスクを低減できるために重要である。いくつかの微細加工細胞アナライザーおよびソーターが記述されてきたが、ほとんどが「概念実証」であった。
【０００８】
微細加工サイトメーター、単一細胞カプセル化の技術および適切なシグナルプロセッシングの要素を組み合わせることにより、タンパク質発現および遺伝子発現の細胞ごとの関連付けが可能となる機器が達成されるかもしれない。
【発明の概要】
【０００９】
以下に記載するように、これらの要素は、マイクロ流体ネットワークにおける関連付けアッセイを実現するために組み合わせられる。ラベルは、表現型の測定のために細胞に前もって付けられる。一実施態様において、連続的フローマイクロ流体ネットワークは、全ての機能性を統合する。マイクロ流体ネットワークの第１の部分において、細胞は表現型ラベルによって作られる蛍光シグナルについて測定される。マイクロ流体ネットワークの第２の部分は、遺伝子発現の測定に適した試薬の予め決定したミックスと共に細胞を個々にマイクロリアクターにカプセル化する。マイクロ流体ネットワークの次の部分において、カプセル化された細胞の流れは参照シグナルでコード化され、このシグナルは、マイクロリアクターの内容物に含まれていてよく、またはそれと分離していてよい。マイクロ流体ネットワークの第４の部分において、細胞は溶解され、遺伝子発現が適切な技術（例：ポリメラーゼ連鎖反応法、別名リアルタイムＰＣＲまたはｑＰＣＲ）によって測定される。その後、マイクロリアクターの流れは次の段階で解読され、シグナルプロセッシングアルゴリズムが表現型の測定と遺伝型の測定とを関連付ける。最後の任意の工程として、マイクロリアクターは、特定のゲノムを濃縮するためにソートされる。関連する実施態様において、最初に細胞をカプセル化し、フェノタイピングおよびコード化を同時に行ってもよい。この後に細胞の溶解が続き、その後、遺伝子発現の測定および解読が同時に行われる。これは、マイクロ流体ネットワークの質問（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）の数を減らす。
【００１０】
第２の実施態様において、マイクロ流体ネットワークは、マイクロウェルのアレイと組み合わせられ、個々の細胞を単離し、遺伝子情報と使用者によってあらかじめ選択された表現型クラスタとを関連付けする。第１の部分において、マイクロ流体ネットワークは、表現型ラベルによって作られる蛍光シグナルついての細胞の測定のために使用される。第２の部分において、マルチパススイッチング・ネットワークが、個々のナノ流体マイクロウェルへ細胞をソートするために使用される。各々の細胞が固有に同定された座標に位置するようにウェルを配置してよく、または、２以上のアレイに細胞をクラスタ分けするようにウェルを配置してよい。後者の場合、使用者は、得られた表現型の情報に基づいて１以上のゲートを選択することで細胞の望ましい行き先を選択する。ウェルは密閉され、細胞は遺伝子発現測定に適した試薬の予め決定したミックスと共に個々にカプセル化される。細胞は溶解され、適切な技術によって、アレイからの読み出しにより遺伝子発現が測定される。マイクロウェルにおける反応からの情報は、遺伝シグナルの統計的分布の検討のために分析してよく、情報と選択された表現型とを個別に関連付けてよい。最後の任意の工程として、個々のマイクロウェルの内容物を、更なる遺伝的分析のために回収してもよい。
【００１１】
第３の実施態様において、ナノ流体マイクロウェルのアレイを使用するスキャニングサイトメトリーアプローチが、個々の細胞を単離し、関連付けられた表現型および遺伝型の情報を捕捉するために使用される。さらに、表現型の測定のために細胞は前もってラベルされる。細胞をマイクロウェルに置き、ウェルを密封し、個々に遺伝子発現測定に適した試薬の予め決定したミックスと共に細胞をカプセル化する。細胞のスキャニングサイトメトリー分析では、ウェルの座標に対してインデックスが付された表現型情報を収集し、細胞を溶解し、その後、アレイからの読み出しのための適切な技術によって遺伝子発現を測定する。シグナルは単一の関連データセットへ連結される。最後の任意の工程として、個々マイクロウェルの内容物を、更なる遺伝的分析のために収集してよい。
【００１２】
全ての実施態様において、１以上の表現型の測定を行ってもよい。典型的に、４または５までの独立した蛍光シグナルを同時に測定できる。遺伝子発現の測定は、単一の遺伝子の測定を行ってもよく、好ましくは、選択された遺伝子の発現レベルについての標準化された定量的情報を得るために、各々の反応において多様な２以上の遺伝子の測定を行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、表現型（例えば、蛍光融合抗体でラベルされた細胞表面タンパク質）および遺伝型（例えば、単一細胞マルチプレックス定量的ＰＣＲ）情報が、どのように連続して得られ、分析のために関連付けられるかを示す、本発明の概念図である。
【図２】図２は、連続的フロー形式における本発明の要素の機能的ブロック図である。
【図３】図３は、改変された連続的フロー形式またはスキャニングサイトメトリー形式における本発明の要素の機能的ブロック図である。
【図４】図４は、図２の連続的フロー実施態様にて使用されるマイクロ流体要素の模式図である。
【図５】図５は、図２の連続的フロー実施態様における周期的または非周期的な事象のコード化および解読を通して、表現型および遺伝型の測定の関連付けがどのように得られるかを示す例の模式図である。
【図６】図６は、自給式で使い捨て式のカートリッジおよび機器を含む、表現型および遺伝型の関連付けを行なうための統合システムの実施態様の機能的ブロック図である。
【図７】図７は、図６に示されたマイクロ流体ネットワークで使用するためのサンプルローディングカートリッジの実施態様を示す。
【図８】図８は、細胞毎の表現型および遺伝型の分析および関連付けを行なうための、サンプルローディングカートリッジ、マイクロ流体ローディングチップおよびキャピラリーチューブの実施態様を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、図８のキャピラリーチューブとの使用のための温度調節モジュールの実施態様を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの温度調節モジュールにおけるキャピラリーチューブホルダーの実施態様を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、図９Ａの温度調節モジュールにおけるキャピラリーチューブホルダーの代替となる実施態様を示す。
【図１０】図１０は、細胞毎の表現型および遺伝型の分析および関連付けを行なうための、図７に示されたサンプルローディングカートリッジとの使用のためのマイクロ流体チップの実施態様を示す。
【図１１】図１１は、細胞毎の表現型および遺伝型の分析および関連付けを行なうための、図７に示されたサンプルローディングカートリッジとの使用のためのマイクロ流体チップの代替となる実施態様である。
【図１２】図１２は、単一細胞の表現型および遺伝型の分析および関連付けの離散相関実施態様の機能的ブロック図である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、図１２の離散相関実施態様を行なうためのマイクロ流体要素およびナノウェルアレイの模式図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａに示された実施態様における単一細胞のソーティングおよびインデックス付けのための工程を示す模式図である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、多分岐マイクロ流体回路におけるナノウェルを有する離散相関のための代替となる実施態様の方法を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａに示された実施態様を使用する、９つの表現型クラスタにソーティングされたサンプル用の表現型−遺伝型の関連付けを示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ナノウェルにおけるスキャニングサイトメトリーを使用する単一細胞の表現型および遺伝型の分析および関連付けのための代替となる実施態様の模式図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、図１５Ａに示された実施態様における個々の細胞のスキャニングおよびインデックス付けのための工程を示す。
【図１６】図１６は、単一細胞ゲノムアナライザーおよびソーターの連続的フロー実施態様にて使用されるマイクロ流体要素の模式図である。
【図１７】図１７は、遺伝子型のソーティングを含む個々の実施態様にて使用されるマイクロ流体要素およびナノウェルアレイの模式図である。
【図１８】図１８のＡからＤは、フロー形式を示す実際の装置の実際の微小写真を示す。
【図１９】図１９は、時間の関数としての細胞前方散乱および液滴前方散乱の振幅を示すオシロスコープ形跡である。
【図２０】図２０は、変化する長さを有するコード化された液滴を含む６本の並列キャピラリーの微小写真である。
【図２１】図２１は、可変する長さおよび配列のコード化された液滴を有する３本のキャピラリーの微小写真である。
【図２２】図２２のＡおよびＢは、それぞれＰＣＲの前および後における、微小容器におけるテスト結果を示す。
【図２３】図２３のＡおよびＢは、ＰＣＲ増幅の前および後における、３つのフェーズの系における微小容器を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１４】
本発明は、何百の細胞まで達する、何千の細胞まで達する、何万の細胞まで達するまたは何十万の細胞まで達するサンプルのための拡張可能な（ｓｃａｌａｂｌｅ）基礎における、表現型（例えば、蛍光結合抗体または恒常的に発現される緑色蛍光タンパク質といった蛍光レポーター分子でラベルした細胞表面タンパク質または細胞内タンパク質）および遺伝型（例えば、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、ＤＮＡコピー数またはＲＮＡ遺伝子発現の検出のための単一細胞、マルチプレックス定量的ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ）の情報を、細胞毎に分析するための方法および装置を提供する。より大きなサンプルサイズは、有利に、多次元散乱プロットによって生物学的パターンおよび遺伝子とタンパク質との関係を明らかにすることを可能とする。図１に示されるように、本発明の主目的は、選択された表現型の特徴および選択された遺伝子発現について単一の細胞を連続して調べ、その後、細胞毎の基礎においてこの情報を関連付けすることである。ハイスループットサンプルのための表現型−遺伝型情報を関連付ける方法は、マイクロ流体ネットワーク内の連続的フローサンプルにおいて、あるいはナノウェルアレイチップに予め充填された静的なサンプルおいて行うことができる。例えば、表現型測定は、連続的フロー実施態様におけるフローサイトメトリーまたはナノウェルチップに予め充填された静的なサンプルのためのスキャニングサイトメトリーを使用し、細胞形態学、細胞サイズまたは蛍光ラベルの局在性といったサンプルにおける細胞の物理的特性を示す蛍光シグナル（核対細胞表面または細胞質）を検出することで行うことができる。ある実施態様において、マルチプル表現型測定は、例えば２、３または４色蛍光検出を使用して行うことができる。表現型分析のその他の方法は、細胞の光散乱、すなわち前方および側方散乱を測定することを含む。その後、細胞は、その後の関連付けのための表現型測定のインデックスを作るためにコード化される。ナノウェルチップにおいて、アレイ上の細胞の位置はコード化シグナルを提供する。連続的フロー実施態様において、細胞はナノリッター微小容器にカプセル化され、色素、コード化ビーズまたは任意のその他の光学的検出可能な物理的パラメーターが、擬似乱数的な原理で微小容器と結合し、インデックスを作ることができる。その後、細胞は溶解され、標的ＤＮＡ配列は、例えば、等温増幅またはエンドポイントＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）もしくは定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含むポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、または任意のその他の核酸増幅方法によって増幅され、細胞における関心ある遺伝子発現、遺伝型またはその他の核酸特徴が測定される。各々の微小容器における増幅産物、すなわち増幅されたＤＮＡ塩基配列は、光学イメージングセンサーを使用して検出および測定され、このデータは、各々の微小容器についてそれまで測定された表現型情報との関連付けのためにプロセッサーへ送られる。各々の微小容器の表現型データは、参照シグナルまたはナノウェルアレイ位置によって作られたインデックスを使用して解読され、この情報は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅、例えば、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、ＤＮＡコピー数またはＲＮＡ遺伝子発現の検出からの遺伝型情報と関連付けされる。
【００１５】
図２は、連続的フロー実施態様において、個々の細胞を分析し、表現型および遺伝型データを関連付けるための工程を示す。工程１００において、水溶液に多数の細胞を含むサンプルインプット１０の全集団が、選択された表現型の特徴、例えばタンパク質発現、細胞形態学、細胞サイズまたは蛍光ラベルの位置（核対細胞表面または細胞質）について分析される。細胞は、まず、例えば、蛍光分子（蛍光色素）、緑色蛍光タンパク質または色素でラベルされた抗体によってラベルされる。その後、サンプルはマイクロ流体フロー細胞へ導入され、細胞は単一細胞の流れに集約される。細胞の流れは、その後、表現型ラベルによって作られる蛍光シグナルについて連続して測定される。ある実施態様において、複数の表現型の特徴は、４色フローサイトメトリーを使用して測定することができる。次に、工程１０２において、細胞は、細胞における標的ＤＮＡ配列の増幅に適した試薬の予め決定したミックスとともに、個々にナノリッター微小容器または液滴にカプセル化される。例えば、細胞およびＰＣＲ試薬ミックスは、下に議論されるように、油中水の液滴の流れにおいて個々の細胞を単離およびカプセル化するように設計されたマイクロ流体ネットワークにおけるフローチャネルに導入することができる。液滴または微小容器は、好ましくは、サンプル細胞より大きく、フローチャネルの断面直径より小さな断面直径を有する。例えば、微小容器は、好ましくは、フローチャネルサイズに依存して３０〜５００ミクロンの間である。大多数の微小容器は、好ましくは、細胞濃度および液滴体積に基づいたポアソン分布に従って、１個の細胞または０個の細胞のいずれかを含む。あるいは、カプセル化の能動的な制御を使用して（例えば、抑制された方式で細胞を測定するためのくびれ、バルブまたはゲートを使用して）、非ポアソン分布の０個または１個の細胞を充填してよい。例えば、ある実施態様において、少なくとも９０％の微小容器が１個または０の細胞を含んでおり、あるいは、少なくとも８０％の微小容器が１個または０の細胞を含んでおり、あるいは少なくとも７０％の微小容器が１個または０の細胞を含んでおり、あるいは少なくとも６０％の微小容器が１個または０の細胞を含んでいる。各々のマイクロリアクターにおける細胞の数は、得られるデータを標準化するために測定される。例えば、１つの方法において、フローチャネルが照射され、光学検出器によって、液滴における細胞の存在または非存在を示すシグナル、例えば前方散乱が測定される。より洗練された検出では、前方散乱検出のアレイが使用され、液滴内の細胞／粒子をカウントしおよび配置するためのよりよい空間分解能が提供される。また別のアプローチでは、暗視野照明およびイメージングを単一検出器散乱測定に付加することができる。前方散乱シグナルが液滴の先端を検出したとき、ＣＣＤカメラを液滴の暗視野像を得るために同期させることができる。細胞／粒子は、画像において明るいスポットとなると考えられ、それはカウンティングのために処理および同定することができる。
【００１６】
ある実施態様において、細胞は、使用者によって選択されたパラメーターに基づいて、例えば測定された表現型の特徴に基づいてソートしてもよい。例えば、所望の特徴を有する標的細胞の存在は、蛍光、前方散乱または任意の適したイメージングもしくは検出様式によって、液体の流れにて検出することができる。その後、同時係属中の特許出願番号第１１／７８１，８４８号（名称「細胞ソーティングシステムおよび方法」、当該出願は本願全体に援用される）に記載される、誘電泳動、気圧スイッチまたは双方向液体または光学スイッチを使用して、カプセル化および／またはコード化のために標的細胞を標的フローチャネルに導くことができる。非標的細胞は、廃棄物リザーバーに付けられた廃棄物フローチャネルに導くことができる。ある実施態様において、細胞は、表現型測定の前にソートすることができる。あるいは、細胞は、測定された表現型の特徴に基づいてソートすることができる。代替となる実施態様において、２つのオイルを三相の系を形成するために使用してもよく、当該系では、１つのオイルが担体液体として機能し、第２のオイルは液滴間の空間として機能する。これは、隣接した水性液滴の併合を阻害する。ＰＣＲ増幅の前後の三相の系における微小容器の例は、図２３ＡおよびＢに示される。
【００１７】
工程１０４において、微小容器は、参照シグナルでコード化され、微小容器における細胞の遺伝子発現との後の関連付けのために、微小容器における細胞の表現型情報にインデックスが付けられる。参照シグナルは微小容器に含めることができ、または微小容器と分離させることができる。参照シグナルは、固有のサインを有する任意の物理的パラメーターの擬似乱数的パターンを使用して作ることができ、光学的に測定することができる。その後、コード化された微小容器の１以上の画像が、その後の微小容器の画像との比較および関連付け、続くマイクロリアクターに含まれるものまたはマイクロリアクターと分離されたものとの遺伝型の測定のために記録および保存される。例えば、ある実施態様において、蛍光微小ビーズまたは色素は、擬似乱数的パターンにて微小容器に導入し、その後撮像してもよい。あるいは、微小容器のサイズ、微小容器の長さおよび／または微小容器間の間隔を変化させて、解読可能な擬似乱数的パターンを作ることができる。コード化パターンにおける参照シグナルの間隔は、要求される追跡の精度に依存して変えることができる。例えば、ある実施態様において、参照シグナルはすべての微小容器に関連付けることができ、あるいは、参照シグナルは、１０の微小容器毎に、あるいは１００の微小容器毎に、あるいは２００の微小容器毎に、あるいは５００の微小容器毎に、あるいは１０００の微小容器毎に関連づけることができる。
【００１８】
工程１０６では、細胞の遺伝型が測定される。細胞が溶解され、例えば等温増幅、エンドポイントＰＣＲ、逆転写ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲによる標的ＤＮＡ配列の増幅のために必要な温度条件に供される。ＰＣＲによって増幅を行なう実施態様において、温度が循環されて、所望のＰＣＲサイクル数に適した温度が作られる。これは、ヒートブロックまたはペルチェ装置を使用する標準的サーマルサイクラーによって達成してもよく、または、代替技術、例えばオーブン、加熱したおよび冷却した空気、優れた熱伝導率を有する熱した液体の流れ、異なる温度に保持された機器構成要素間の装置の移動または当該分野で既知の任意のその他の適した加熱要素によって達成してもよい（この同一のリストが、本願に記述されるその他の実施態様にも適用可能であることが理解されるだろう）。ある実施態様において、微小容器を、固定された温度のゾーンを繰り返し通る蛇行フローチャネルを通して連続的に流し、ポリメラーゼ連鎖反応法を達成することができる。あるいは、微小容器をフローチャネルに充填し、ある程度静的に維持し、一方で、フローチャネルの温度を、ポリメラーゼ連鎖反応法を達成するために必要とされる温度プロファイルに沿って繰り返し循環させることができる。微小容器は標的ＤＮＡの増幅のための所望の数のＰＣＲサイクルに供され、増幅産物が測定される。マイクロリアクターにおいて細胞と共にカプセル化される試薬ミックスは、非特異的蛍光検出分子、例えばインターカレーティング色素もしくは配列特異的蛍光プローブ、例えば分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（商標登録）プローブ、または励起されると増幅産物の量に比例したレベルで蛍光を発する当該分野で既知の任意のその他の適したプローブまたはマーカーを含む。これらのプローブは、二本鎖ＤＮＡ生成物に対して、一本鎖ＤＮＡ生成物に対して、またはＤＮＡ生成物に比例する量で存在し、ＤＮＡ増幅プロセスによって作られた非生成物オリゴヌクレオチドに対して結合してもよい。イメージングシステムは、所望の波長の光を使用して蛍光プローブを励起し、増幅産物を直接または間接的に測定する。
【００１９】
工程１０８において、遺伝型測定が解読される。光学検出器、例えば光電子増倍管、ＣＣＤカメラ、フォトダイオードもしくはフォトダイオードアレイまたはその他の光学検出器によって、各々の微小容器におけるプローブまたはマーカーからの蛍光シグナルの強度を測定し、各々のＰＣＲサイクルの間に少なくとも１回増幅産物の量を決定する。光学検出器からの画像は、イメージプロセシングおよび微小容器の記録されたコード化パターンとの比較のためにコンピューターへ送られる。工程１１０において、インデックス画像を遺伝型測定からの画像と比較するために、当該分野で既知のイメージプロセシングアルゴリズムを使用することができ、その後、遺伝型測定を、細胞ごとに表現型測定に関連づけることができる。
【００２０】
ある実施態様において、工程１１２において、微小容器を、測定された遺伝子発現に基づいてソートし、さらなる分析のために標的核酸を捕らえることができる。上に議論されたような光学的スイッチを、遺伝型測定に基づいた標的フローチャネルまたは廃棄物フローチャネルに微小容器を導くために使用することができる。
【００２１】
代替となる実施態様において、図３に示されるように、いくつかの工程は、マイクロ流体ネットワークにおける質問点の数を最小化するために同時に行なうことができる。ここにおいて、表現型分析のために既にラベルされたサンプルインプット１２における細胞が、機器へ導入され、工程１０２において、細胞における標的ＤＮＡの増幅に適した試薬の予め決定したミックスとともに個々に微小容器または液滴内にカプセル化される。コード化のための参照シグナルは透明な微小容器に同時にカプセル化でき、あるいは、フロー条件を制御して擬似乱数的に微小容器の物理的特性を変更し、参照シグナルを作ることができる。工程１０３において、表現型および参照シグナルを単一の工程で測定および記録し、表現型情報をコード化し、遺伝型測定との関連付けのためのインデックスを作ってもよい。次に、工程１０５において、遺伝型および解読シグナルも単一の工程で測定してもよい。例えば、上記第１の実施態様において、遺伝子型決定光源および検知器は解読のための光源および検知器とは異なる。ここにおいて、光源および／または検知器は共有されてもよい。
【００２２】
個々の細胞を溶解し、その後、微小容器を、例えばリアルタイムまたは定量的ＰＣＲによる標的ＤＮＡ配列の増幅に必要な温度条件に供する。微小容器は、標的ＤＮＡの増幅のための所望の数のＰＣＲサイクルに供される。ＰＣＲ試薬ミックスに含まれる蛍光プローブを励起し、光学検出器により蛍光の強度を検出することにより、ＰＣＲサイクルの間に増幅産物が測定される。光学検出器は、連続的フローシステムによる使用のための走査検知器、あるいは静的な検知器とすることができる。画像は、イメージプロセシングおよび微小容器の記録されたコード化パターンとの比較のためにコンピューターへ送られる。その後、遺伝型測定を、細胞ごとのベースで表現型測定に関連づけることができる。
【００２３】
図４−５は、上記の記述された工程をさらに詳細に示し、および工程を行なうために使用されるマイクロ流体構成成分を示す。工程１００において、表現型分析は、マイクロ流体インレット２０２を介してフローチャネル２０９へ細胞２００を導入することにより行なわれる。細胞２００は、２つの側面の外装バッファーチャネル２０３および２０４によって作られる外装バッファーフロー２０１によってはさまれる。外装フローに使用されるバッファーは、分析される細胞と生物学的に適合し且つ蛍光検出に使用される光学的照明および光学的スイッチ波長の双方に適合する任意のバッファーを使用することができる（すなわち、バッファーは、蛍光励起／検出波長にて十分に低い吸光度を有する）。外装バッファーの好ましい実施態様としては、ＰＢＳ／ＢＳＡ（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクション５を含むｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））が使用される。
【００２４】
外装バッファー２０１は、細胞２００を、細胞２００の単一の列のラインに集約し、その後、分析領域２０５で質問して、細胞の１以上の所望の表現型の特徴を測定する。照明の源、例えば固定レーザーもしくは走査レーザー、ＵＶランプ、発光ダイオードまたはその他の平行にされた光源が、細胞２００に付されたラベル、例えば蛍光色素、抗体、ＧＦＰまたはその他の蛍光色素による蛍光の放出および細胞および容器からの分散を生じさせ、各々の細胞および容器の物理的性質についての情報（例えばサイズ、形態または境界）が提供される。ＣＣＤイメージング、ＰＭＴまたはフォトダイオードアレイといった１以上の光学検出器が、生じるシグナルを測定する。光散乱といったその他の種の光学測定もまた、細胞２００の表現型の特徴の測定のためにこの分析領域２０５にて行うことができる。ある実施態様において、マルチプル表現型測定を、例えば四色フローサイトメトリーを使用して、または蛍光および／または散乱の測定により行うことができる。例えば、複数の蛍光団で細胞をラベルし、異なる波長の蛍光放射に感受性のある付加的な蛍光検出チャネルを使用して、典型的に４８８ｎｍ（但しこれに限定されない）といった単一の励起波長を使用して、マルチプル表現型測定を行うことができる。ここにおいて、各々の検出チャネルは、ＰＭＴに、付加的な蛍光団の蛍光放射波長のための適切なダイクロイックミラーおよび放射フィルターを組み込んでいるだろう。２から４の蛍光の検出チャネルが、この方式で容易に適応される。
【００２５】
示される実施態様において、遺伝子発現の測定に必要な試薬を含むＰＣＲミックスおよび蛍光性ＤＮＡ検出分子またはプローブが、外装フローチャネル２０３、２０４とカプセル化フローチャネル２０７ａ、ｂの間に配置される側方試薬フローチャネル２０６ａ、ｂを介してフローストリームに注入される。代替となる実施態様において、ＰＣＲミックスは、外装バッファーフローチャネル２０３および２０４によって細胞の流れへ導入することができる。
【００２６】
次の工程１０２において、側方カプセル化フローチャネル２０７ａ、ｂを介してフローチャネル２０９に疎水性カプセル化媒質を導入することによって、カプセル化を行うことができる。シリコン油、鉱油、フルオロカーボン油またはその他の疎水性液体を、離散的な水性液滴の生成を促進するために使用してもよい。カプセル化媒質は、ＰＣＲミックスおよび細胞の流れを締めつけて、個々の水ベースのナノリッター微小容器２０８またはマイクロリアクターに分ける。ナノリッター微小容器２０８は、好ましくは、細胞２００より大きいが、マイクロ流体チャネル２０９よりも著しく大きくはない直径を有する。カプセル化フローチャネル２０７ａ、ｂにおけるフロー条件は、微小容器当たり０個または１個の細胞を好ましくはカプセル化することを保証するように選択される。例えば、フローサイトメトリーと適合するマイクロ流体チャネルは、典型的に５０−１００μｍ×１５０−３００μｍの断面積を有し、テフロン（登録商標）キャピラリーチュービングは、４００μｍ程度に小さい直径のものを利用可能であり、微小容器２０８の直径は３０−４００μｍの範囲にあるだろう。
【００２７】
次の工程１０４において、マイクロリアクター２０８の配列のコード化および解読は、表現型データと遺伝型データとの関連付けを促進するために行われる。図５に示されるように、１以上の符号化ビーズ２２０を擬似乱数的配列で細胞の流れにおける細胞２００のうちのいくつかに付すことにより、表現型分析とオイルカプセル化との間でコードかが行なわれる。図示される実施態様において、コード化ビーズ２２０は蛍光シグナルを有しており、これは、読み取りおよび記録され、微小容器２０８の流れにおける個々の微小容器２０８の位置のインデックスを作ることができる。あるいは、色素の光学上検知できるパルスを、擬似乱数的パターンで個々の細胞に関連づけることができる。コード化ビーズ２２０が一旦細胞２００へ付着すると、細胞２００は個々の微小容器２０８にカプセル化され、その後微小容器２０８は解読レーザー２２５を通過し、そこでコード化ビーズ２２０から蛍光が生じ、１以上の検知器２２５が生じたシグナルを測定して微小容器２０８をコード化し、微小容器２０８のインデックスを作る。コード化ビーズ（または色素）および細胞の記録されたパターンは、細胞が溶解され、各々のリアクターからのシグナルが測定された細胞の表現型と関連付けられた後に使用してもよい固有のサインとなる。増幅が行なわれた後、第２の解読レーザー２２６は、微小容器を撮像するために、蛇行フローチャネル２１０の近くに配置される。第２の解読レーザー２２６は、固定もしくは走査レーザー、ＵＶランプまたは発光ダイオードといった光源を使用して、コード化ビーズ２０６からの蛍光の放射または分散を生じさせ、ＣＣＤイメージング、光電子増倍管、フォトダイオードまたはフォトダイオードアレイといった光学検出器はシグナルを測定して、保存されたコード化画像と比較できる微小容器２０８の画像を作り、個々の微小容器２０８を同定する。磁力データストレージにおける欠落したデータビットを同定するために日常的に使用されるエラー訂正アルゴリズムを、一連の事象を決定するために使用してもよい。
【００２８】
図示される実施態様において、微小容器２０８の間の間隔を変えるためにフローチャネル２０９におけるフロー条件を変えることによって、第２の余分のコード化シグナルが提供される。図５に示されるように、これは、別の光学的に検知可能な参照シグナル、すなわち液滴境界シグナルを作る。それは個々の微小容器２０８を追跡するために撮像し、保存しおよび復元することができる。代替となる実施態様において、固有の参照シグナルの復元可能なパターンを作るための何れかの方法を、微小容器をコード化するために別々に使用できる。さらに、両実施態様にて、コード化情報が個々の微小容器に付される頻度を増加または減少させることにより、細胞追跡における許容可能なエラーレベルに依存して、コード化シグナルをある程度強固に作ることができる。例えば、ある実施態様において、コード化ビーズはすべての微小容器に付けることができる。あるいは、コード化ビーズのランダムパターンは、１０の容器毎、あるいは５０の容器毎、あるいは１００の容器毎、あるいは５００の容器毎、あるいは１，０００の容器毎にいくつかの微小容器に適用することができる。同様に、コード化シグナルを微小容器間の距離を変えることにより作る場合、距離を、１０の容器のブロックあるいは５０の容器のブロック、あるいは１００の容器のブロック、あるいは５００の容器のブロック、あるいは１０００の容器のブロックにおいてコード化するように調節することができる。
【００２９】
次に、工程１０６において、カプセル化された細胞２００は溶解され、リアルタイムまたは定量的ＰＣＲによって遺伝子発現について分析される。細胞の溶解のために、レーザーによる光分解、超音波に基づく溶解または化学的溶解を含む幾つかの当該分野で既知の手段を使用することができる。その後、微小容器２０８は、増幅および増幅した遺伝子生成物のリアルタイム検出に必要な１以上の温度ゾーンを通って微小容器２０８を通る、蛇行マイクロ流体チャネル２１０を通って流れる。図示される実施態様において、蛇行チャネル２１０は、３つの温度ゾーン２１１、２１２および２１３を繰り返し流れる。温度ゾーンは、ＰＣＲサイクルの実行に適した温度に維持される。例えば、ここに示されるように、第１の温度ゾーン２１１はほぼ６０度であり、第２の温度ゾーン２１２はほぼ７２度であり、および第３の温度ゾーン２１３はほぼ９６度である。温度調節システムは、微小容器が、ＰＣＲサイクルに適した時間のあいだ各々の温度ゾーンに保持されることを保証するように、フロー条件を調節する。微小容器２０８は、温度ゾーン２１１、２１２、２１３を複数回通過し、各々の通過の後に測定されて増幅産物の量が決定される。上に議論されるように、ＰＣＲミックスは、増幅産物の量に比例したレベルで蛍光を発するプローブを含む。蛍光団は、固定または走査レーザー、ＵＶランプ、発光ダイオードといった光源２１４によって、各々のＰＣＲサイクルの際に特異的な時または温度で励起し、光電子増倍管、ＣＣＤカメラ、フォトダイオードもしくはフォトダイオードアレイまたはその他の光学検出器といった検出器２１５によって検出してよい。検出器２１５は、マイクロリアクター２０８における増幅産物の量を決定するために蛍光の強度を測定する。
【００３０】
次に、工程１０８において、それまで記録された表現型測定が解読される。図５に示されるように、第２の解読レーザー２２５は、蛇行チャネル２１０にて増幅するのに従って、個々の微小容器２０８からコード化シグナルを読む。コード化シグナルおよび遺伝子発現測定は、その後、コード化シグナルの解読およびコード化シグナルおよび最近測定された遺伝子発現に関する細胞のための表現型情報の関連付けのためのプロセッサーに送られる。
【００３１】
ある実施態様において、測定された細胞の選択された一部から遺伝物質を回収すること、あるいは表現型に関連付けることなく遺伝的サインに基づいて細胞をソートすることが望ましい可能性がある。例えば、図１２に示されるように、ある実施態様において、遺伝子発現測定の終わりに、微小容器２０８を２または廃棄物リザーバー２３１および標的リザーバー２３０といったリザーバーにソートしてもよい。微小容器は側方動力スイッチ２２５の使用によりソートされ、関連付けられた表現型−遺伝型測定に基づいて、標的フローチャネル２２０に流れ込む層状フローストリームと、廃棄物フローチャネル２１との間で、微小容器２０８が切り替えられる。側方動力スイッチは、光学的作用、誘電泳動、流体のパルスまたは同様の方法を使用して生成してよい。ある実施態様において、表現型測定は行なわれず、ＰＣＲ増幅後のソートは遺伝型測定のみに基づく。
【００３２】
図６は、マイクロ流体ネットワークにおいて、細胞毎の表現型および遺伝型の関連付けを行うための統合システムの実施態様を示す。機器３００は、温度モジュール３０２、励起光源３０３、３０８、およびカートリッジ３２０に含まれるサンプルを質問および分析するために必要な検知器３１２、３０４および３０６を収容するための再利用可能なプラットフォームを含む。マイクロ流体ネットワークチップを含む使い捨てサンプルローディングカートリッジ３２０は、サンプルの分析を行なうために機器３００と接続される。カートリッジ３２０は、細胞サンプルおよび全試薬、バッファー、コード化色素またはビーズ、および試料細胞をコード化し、単離しおよび増幅するために要求されるカプセル化媒質を含むように構成される、複数のリザーバー３２１−３２４を有する。図示される実施態様において、細胞サンプルはリザーバー３２３に含まれ、オイルカプセル化媒質はリザーバー３２４に含まれ、コード化ビーズはリザーバー３２２に含まれ、単一細胞のフローストリームを作るための外装バッファーはリザーバー３２１に含まれる。ここにおいて、増幅に必要な試薬および蛍光性のマーカーを含むＰＣＲミックスは、同様に外装リザーバー３２１に含まれている。
【００３３】
チップは、ＵＶ接着剤によってカートリッジ３２０の光学窓領域に接合され、チップからのインレットポートは、使い捨てカートリッジ３２０上のそれぞれのリザーバー体積と接続される。チップ上のサンプルフローチャネル３０９におけるインレットポートは、使い捨てカートリッジ上の細胞サンプルリザーバー３２３に流体的に接続され、サンプルフローチャネル３０９に細胞が導入される。細胞サンプルリザーバー３２３の形は、典型的に円錐形であり、インレットポートに向けて先細る。好ましい実施態様において、インレットリザーバーはポリプロピレン挿入物を含み、細胞接着を最小化し結果的に細胞収量を最大化する。チップ上のマイクロ流体チャネル３０５および３０７は、リザーバー３２１および３２４におけるアウトレットをサンプルフローチャネル３０９に接続する。側方フローチャネル３０５ａおよびｂはＰＣＲミックスをサンプルフローチャネル３０９に加えるように形成され、その後、側方フローチャネル３０７はサンプルフローチャネル３０９へオイルを導入し、オイル内のサンプル細胞をカプセル化する。カートリッジ３２０は、４８８ｎｍレーザー３０３および蛍光検出器３１２といった光源は、サンプルフローチャネル３０９に隣接して位置するように、機器３００内に位置する。カートリッジは、光学的に透明なアクリル酸プラスチックから好ましくは製造される。光学窓は、さらに、マイクロ流体ネットワークにおける選択された点の可視的な質問を可能にし、カートリッジを通ったおよびマイクロ流体チップへの励起光源および光学検出器の照射を可能にする。適切な場合、その他の光学的に透明なプラスチックまたは適切な材料をアクリル樹脂の代わりに用いてよい。マイクロ流体チャネルは、光学的に透明な基板で同様に作られ、サンプルフローチャネル３０９への細胞検出光学の照射が可能になる。この基板は、典型的に、ガラス、石英、プラスチック、例えばポリメタクリル酸メチル等（ＰＭＭＡ）、およびその他のキャスタブルなまたは細工可能なポリマー（例えばポリジメチルシロキサン、ＰＤＭＳまたはＳＵ８）であるが、これらに限定されない。
【００３４】
４８８ｎｍレーザー３０３からの光は、カートリッジ３２０を通って、カプセル化領域のすぐ上流のサンプルフローチャネル３０９に照射されて、細胞を質問する。４８８ｎｍレーザー３０３は、サンプル細胞の選択された表現型の特徴に関する。蛍光検出器３１２は、細胞についての表現型情報を測定するために蛍光を測定する。その後、オイルのようなカプセル化媒質は、個々のナノリッター微小容器内に単一細胞をカプセル化するために適切な条件の下のサンプルフロー細胞３０９へ導入される。その後、微小容器は、それらのカプセル化された細胞の１以上の測定された表現型の特徴に基づいて、さらなる遺伝子型決定のためのサンプルフローチャネル３０９を通って、または廃棄物リザーバー３３４への輸送のための廃棄物フローチャネル３３０へソートされる。微小容器がサンプルフローチャネル３０９を通って流されるとともに、インデックス解読レーザー３０８は、擬似乱数的配列において、それまでに細胞と相互作用したインデックスビーズを励起する。解読センサー３０６は、サンプルフローチャネル３０９を通って流れる順に、細胞へ付されたインデックスビーズの配列を検出、撮像および保存し、遺伝型測定の画像との後の関連付けのための微小容器のインデックスを作る。一旦微小容器がコード化されると、それらはＰＣＲ増幅のためにマイクロ流体チップ上で蛇行マイクロ流体チャネルに充填される。機器上の温度モジュール３０２は、予め充填されたマイクロ流体チャネルに隣接して位置し、ＰＣＲ増幅の達成に必要な温度ゾーンを通してマイクロ流体チップにて微小容器を循環させる。温度モジュール３０２は、ヒートブロックまたはペルチェ装置を使用する温度調節要素および標準的サーマルサイクラーを含み、または、それは、代替技術、例えば、統合されたヒーティングワイヤー、オーブン、加熱したおよび冷却した空気、優れた熱伝導率を有した熱した液体の流れ、異なる温度に保持された機器構成要素間の装置の移動または当該分野で既知の任意のその他の適した加熱要素によって達成してもよい。ある実施態様において、複数の発熱体を使用して、空間的温度ゾーンを作ることができ、チップは電動要素を使用して物理的に通過する。あるいは、冷風／熱風加熱器のような単一の発熱体を使用して、マイクロ流体チャネルを加熱および冷却し、ＰＣＲ増幅のための温度プロファイルを通して循環させることができる。温度調節要素は温度を制御し、所望の数のＰＣＲサイクルのために複数回、ＰＣＲ温度プロファイルを通して蛇行チャネルを循環させる。
【００３５】
微小容器は増幅産物の量を決定するために各々のＰＣＲサイクルの後に分析される。上で議論するように、ＰＣＲミックスは、増幅産物の量に比例したレベルで蛍光を発するプローブを含んでいる。プローブは、各々のＰＣＲサイクルの間の特異的な時または温度に、光源、例えば固定または走査レーザー、ＵＶランプ、発光ダイオードによって励起してよい。蛍光シグナルは、マイクロ流体チップに隣接して位置するＰＣＲイメージセンサー３０４、例えば光電子増倍管、ＣＣＤカメラ、フォトダイオードもしくはフォトダイオードアレイまたはその他の光学検出器によって測定される。イメージセンサー３０４は、蛍光の強度を測定し、マイクロリアクター２０８における増幅産物の量を測定し、各々の微小容器における細胞の遺伝型を測定する。インデックス解読レーザー３０８は、さらに各々の微小容器に関連したインデックスビーズを励起し、コード化シグナルは、解読センサー３０６により撮像される。その後、各々の微小容器のためのコード化シグナルおよび遺伝型データは、インデックス付けおよび表現型測定と個々の微小容器２０８からの遺伝型データとの関連付けのためのプロセッサーへ送られる。ある実施態様において、微小容器は、例えば液滴サイズおよび各々の画像における位置を使用して、サイクル毎に撮像および追跡される。代替となる実施態様において、微小容器は撮像され、所望の数のＰＣＲサイクルが完了した後に、コード化シグナルが読まれる。
【００３６】
図７は、表現型および遺伝型情報の単一細胞分析および関連付けを行うための、マイクロ流体キャピラリーチューブまたはマイクロ流体チップとの使用のための使い捨てサンプルローディングカートリッジの実施態様を示す。カートリッジは６つのリザーバー３２１−３２６を内蔵しており、それぞれ、別々に形成されたアウトレットは、付属のチップ上のマイクロ流体チャネルへのインターフェース接続を提供する。リザーバー体積３２１−３２６はスナップ式フタ３４０で密閉され、このフタは、気圧コントローラーと個々のリザーバー３２１−３２６との間の接続のためのポートが空けられている。ポートは、空気の圧力がリザーバーに加えられることを可能にし、リザーバー３２１−３２６が別々に加圧されることで取り付けられたマイクロ流体チップのマイクロ流体ネットワークを通して液体および細胞が移動する。代替となる実施態様において、液体は、シリンジポンプ、蠕動ポンプまたはその他の移動の方法によって移動させることができる。図示される実施態様において、リザーバー３２３は、約５から５０μＬの間の体積を有するサンプルを保持するよう構成される；リザーバー３２４は、約５０−１５００μＬの間の体積を有するオイルといったカプセル化媒質を保持するよう構成される；リザーバー３２１はＰＣＲミックスを保持するよう構成される。ある実施態様において、付加的なリザーバー３２２は蛍光ビーズまたは色素といったコード化媒質を保持するよう構成してよい。リザーバー３２１、３２２、３２３および３２４は、サンプル、ＰＣＲミックスおよび任意にコード化媒質を充填し、カプセル化媒質に細胞をカプセル化するために、取り付けられたチップのマイクロ流体ネットワークにおけるインレットに流体的に接続するように構成されたポートをそれぞれ含む。リザーバー３２５および３２６は廃棄物リザーバーの形態の実施態様として使用することができ、ここにおいて、細胞はカプセル化に先立ってソートされる。あるいは、１以上のリザーバー３２５および３２６は、取り付けられたＰＣＲチップ上の多数のガス抜き管に流体的に接続し、外部環境からのサンプル流れの汚染を予防しながら、チップ上のマイクロ流体チャネル内のサンプルの流れの熱膨張および収縮を可能にすることができる。フタ３４０は、カートリッジ体３４１に対して密閉状態であることを助けるためのシリコンガスケットを含む。さらに、それは、カートリッジ体積と外的環境との間の気体浸透性で、液体を通さない接点を作るために、０．１μｍのポリプロピレンフィルターを組み込む。使い捨てカートリッジのその他の実施態様は、同時係属中の特許出願番号第１１／７８１，８４８号（名称「細胞ソーティングシステムおよび方法」、当該出願は本願全体に援用される）に更に詳細が記載されている。
【００３７】
上で議論するように、表現型−遺伝型関連付けを行なうための装置および方法は、何百の細胞まで達する、何千の細胞まで達する、何万の細胞まで達するまたは何十万の細胞まで達するサンプルに拡張性を有する（ｓｃａｌａｂｌｅ）。機器プラットフォーム３００および使い捨てサンプルローディングカートリッジ３２０は、１００個までの細胞、あるいは１０００個までの細胞、あるいは１万個までの細胞、あるいは１０万個までの細胞のサンプルを処理するよう構成されるいくつかの異なるキャピラリーチューブまたはマイクロ流体ネットワークチップとともに使用することができる。
【００３８】
図８は、使い捨てカートリッジ３２０との使用のための、マイクロ流体ローディングチップ４００およびキャピラリーチューブ４２０の実施態様を示す。マイクロ流体チップ４１０は、例えばＵＶ接着剤による接合によって、カートリッジ３２０の光学窓領域に取り付けられるように構成される。インレットポート４１１、４１２および４１３は、チップがカートリッジ３２０に取り付けられたときに、ＰＣＲミックスリザーバー３２１、カプセル化媒質リザーバー３２４およびサンプルインプットリザーバー３２３に接続するようにマイクロ流体チップに配置される。サンプルインレットポート４１３はサンプルフローチャネル４０９に流体的に接続されており、使用の際、サンプルリザーバー３２３に含まれるサンプル細胞は、サンプルフローチャネル４０９へ輸送されると考えられる。ＰＣＲミックスリザーバー４１１は、Ｔ分岐でサンプルフローチャネル４０９と交差するＰＣＲフローチャネル４０５ａ、ｂに流体的に接続されており、サンプルフローチャネル４０９を通って流れるサンプル細胞の流れにＰＣＲミックスが導入される。ある実施態様において、ＰＣＲミックスのフロー条件は制御され、ＰＣＲミックスの導入は、さらにサンプルフローを細胞の単一列の流れに組織化する。あるいは、サンプルフロー細胞４０９の直径は、サンプルがサンプル細胞インプット４１３で導入されるときに、サンプルを細胞の単一列の流れに組織化するように構成できる。カプセル化媒質インレット４１２は、ＰＣＲミックスとの交差の下流のＬ−分岐でサンプルフローチャネル４０９と交差するカプセル化フローチャネル４０７に流体的に接続させることができる。オイルといったカプセル化媒質は、細胞およびＰＣＲミックスの液滴をつまんで、好ましくはオイルカプセル化媒質に囲まれた単一細胞を含むナノリッター微小容器の流れに分離するのに適した条件の下、サンプルフローチャネル４０９とカプセル化フローチャネル４０７との間の「Ｌ」分岐で細胞およびＰＣＲミックスの流れに流れ込む。カプセル化フローチャネル４０７におけるフロー条件は、微小容器当たり０個または１個の細胞が好ましくはカプセル化されることを保証するように制御される。例えば、フローサイトメトリーと適合するマイクロ流体チャネルは、典型的に５０−１００μｍ×１５０−３００μｍの断面積を有し、テフロンキャピラリーチュービングは４００μｍもの小さな直径で利用可能であり、従ってナノリッター微小容器４０８は、３０−４００μｍの範囲の直径を有するだろう。マイクロ流体チャネルネットワークにおけるフロー条件の設定および制御は、ダイレクトドライブポンプ気圧ポンプ、電気動力学、キャピラリー作用、重力または流体のフローを生じさせるその他の方法によって達成することができる。
【００３９】
その後、微小容器４０８の流れは、微小容器および遺伝子発現の測定における遺伝物質の増幅のために、マイクロ流体キャピラリーチューブ４２０に充填される。上で議論するように、サンプルフローチャネル４０９およびカプセル化フローチャネル３０７におけるフロー条件は、上に議論されるようにナノリッター微小容器のサイズおよび／またはナノリッター微小容器間の間隔を変化させるように制御して、微小容器の相対的位置をコード化し符号付けするため微小容器の固有の配列を提供することができる。図示される実施態様において、キャピラリーチューブにおける微小容器間の距離（ｄ）は約５００から１０００μｍの間であり、マイクロ流体キャピラリーチューブ４２０の全長（Ｌ）は約５００から１０００ｍｍの間であり、約１０００微小容器の容量を提供する。代替となる実施態様において、液滴の間隔またはマイクロ流体キャピラリーチューブの全長はより大きいまたはより小さいサンプルを収容するように調節することができる。使用において、キャピラリーチューブは、各々の端が連結されて接続している多数の隣接した平行セグメントを含む蛇行配列の形にすることができる。例えば、ある実施態様において、キャピラリーチューブは１０−２０の間の平行セグメントに分割される。連結は、各々約４０−５０ｍｍの長さの多数の隣接した平行セグメントを残して切り離される。キャピラリーチューブは、キャピラリーチューブ内の微小容器の位置におけるＰＣＲ増幅サイクル中の熱膨張の波及効果を最小化するために、増幅処理に先立って多数のセグメントへ分割され、これによって、個々の微小容器の位置を追跡する能力が改善され、増幅産物の測定は、個々の微小容器についての表現型測定に先立って関連づけることができる。
【００４０】
図９Ａ−Ｃに、キャピラリーベースのＰＣＲシステムにて使用するための温度調節モジュールを示す。一旦キャピラリーチューブ４２０に微小容器が充填され、多数のセグメント４２１に分割されると、セグメント４２１は多数の矩形溝４２３を有するアルミニウムブロック４２２、またはキャピラリーチューブホルダーに入れられる。矩形溝は、約１ｍｍの深さ、あるいは２ｍｍの深さ、あるいは３ｍｍの深さ、あるいは４ｍｍの深さ、あるいは５ｍｍの深さを有する。一実施態様において、図９Ｂに示されるように、矩形溝４２３はキャピラリーチューブの断面直径よりわずかに狭い幅を有しており、溝の底および側壁とキャピラリーチューブとの間に熱的な接触が存在する。しかしながら、ある実施態様において、キャピラリーチューブがアルミニウムブロックの底および側壁に隣接している限り、矩形溝は、キャピラリーチューブの直径よりわずかに大きな幅を有してよい。代替となる実施態様において、図９Ｃに示されるように、キャピラリーチューブホルダー４２４の底側面はキャピラリーチューブセグメントの直径に対応するように形作られ、アルミニウムブロック４２２とキャピラリーセグメント４２１との間により熱的な接触が存在する。上記の両実施態様において、矩形溝の側壁は、キャピラリーチューブの直径以上の幅を有している。ある実施態様において、厚さが約１ｍｍであるガラスカバー４２５をアルミニウムブロックの上面に置き、外気への伝導およびブロックの熱放射を予防することができる。あるいは、ガラスカバーを使用せずに、より深い溝を使用することができる。代替となる実施態様において、矩形溝の側壁をキャピラリーチューブの直径より薄くし、矩形溝間の間隔を有利に減少させ、これにより加熱ブロックにおけるキャピラリーチューブの密度を増大させることができる。そのような実施態様において、ガラスカバーをキャピラリー直径と等しい高さを有する矩形溝上に使用して、より薄い側壁を有して優れた熱伝導の維持することができ、あるいは、矩形溝の高さはキャピラリーチューブの直径の少なくとも１．５倍とすることができる。例えば、一実施態様において、溝の深さがキャピラリーチューブの直径の少なくとも１．５倍である限り、側壁は約０．１〜０．２ｍｍの厚さを有することができる。一旦アルミニウムブロック４２２に多数のキャピラリーチューブセグメント４２１が充填されると、アルミニウムブロックの温度は、１℃／Ｓで６０℃から９５℃まで上昇して、ＰＣＲ増幅のための温度プロファイルを通ってキャピラリーチューブセグメント４２１を循環させることができる。上に議論された任意の適切な発熱体も、所望の数のＰＣＲサイクルを通って温度を循環させるために使用することができる。
【００４１】
図１０は、より大きなサンプルにおいて単一細胞の表現型および遺伝型の分析および関連付けを行なうためのマイクロ流体チップ５００の実施態様を示す。示されるマイクロ流体チップ５００は、約７５ｍｍ×７５ｍｍであり、１０，０００の微小容器までの容量を有している。マイクロ流体チップは、好ましくは、マイクロチャンネルへの細胞検出光学の照射を可能にする光学的に透明な基板である。この基板は、典型的に、ガラス、石英、プラスチック、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等、およびその他のキャスタブルなまたは細工可能なポリマー（例えばポリジメチルシロキサン、ＰＤＭＳまたはＳＵ８）であるが、これらに限定されない。
【００４２】
上で議論するように、使用において、マイクロ流体チップ５００は、サンプル、ＰＣＲミックスおよびカプセル化媒質を含む使い捨てサンプルローディングカートリッジに付けられている。チップ５００は、チップが使い捨てカートリッジの光学窓に配置されたときに使い捨てカートリッジの細胞リザーバー、ＰＣＲミックスリザーバーおよびオイルリザーバーに接続するように構成された、細胞インレット５１３、ＰＣＲミックスインレット５１２およびオイルインレット５１１を有する。細胞インレットポート５１５はサンプルフローチャネル５０９に流体的に接続され、使用において、使い捨てカートリッジのサンプルリザーバーに含まれる細胞は、サンプルフローチャネル５０９へ輸送されるだろう。ＰＣＲミックスインレット４１１はＰＣＲフローチャネル５０５ａ、ｂに流体的に接続され、当該チャネルはサンプルフローチャネル５０９と交差して、サンプルフローチャネル４０９を通って流れる細胞の流れへＰＣＲミックスを導入する。ある実施態様において、ＰＣＲミックスのフロー条件は制御され、ＰＣＲミックスの導入によって、さらにサンプルフローが細胞の単一列の流れに集約される。あるいは、サンプルフロー細胞５０９の直径は、細胞が細胞インプット５１３で導入されるときに、サンプルが細胞の単一列の流れへ集約するように構成することができる。オイルインレット５１２はカプセル化フローチャネル５０７に流体的に接続され、当該チャネルは、ＰＣＲミックスの交差の下流のＬ−分岐において、サンプルフローチャネル４０９と交差する。オイル流入は、細胞およびＰＣＲミックスの液滴をつまんで、好ましくはオイルカプセル化媒質に囲まれた単一細胞を含むナノリッター微小容器の流れに分離するのに適したフロー条件の下で、サンプルフローチャネル４０９とカプセル化フローチャネル４０７との間の「Ｌ」分岐において細胞およびＰＣＲミックスの流れに注入される。ある実施態様において、表現型測定にさらに関連付けることが可能なあらかじめ選択された亜集団に、カプセル化された細胞の数を制限するために、ソーティング領域を提供して、カプセル化に先立ってサンプルをソートしてもよい。例えば、ソーティングは、核形成された細胞にのみ注目して、赤血球を排除するように行うことができる。ナノリッター微小容器は、好ましくはサンプル細胞より大きくフローチャネルの断面直径未満の断面直径を有する。例えば、微小容器は、好ましくは、フローチャネルサイズに依存して３０μｍ−４００μｍの間の断面直径を有する。
【００４３】
上で議論するように、カプセル化フローチャネル５０７におけるフロー条件は、大多数の微小容器が好ましくは１個の細胞または０個の細胞のいずれかを含むことを保証するように制御される。例えば、ある実施態様において、少なくとも９０％の微小容器は１個または０の細胞を含み、あるいは、少なくとも８０％の微小容器は１個または０の細胞を含み、あるいは、少なくとも７０％の微小容器は１個または０の細胞を含み、あるいは、少なくとも６０％の微小容器は１個または０の細胞を含む。さらに、ある実施態様において、カプセル化フローチャネル５０７および／またはサンプルフローチャネル５０９のフロー条件を、微小容器サイズおよび／または微小容器間の間隔を周期的に変化させるように制御し、個々の微小容器の符号付けおよび追跡のためのコード化シグナルを作ることができる。マイクロ流体チャネルネットワークにおけるフロー条件の設定および制御は、ダイレクトドライブポンプ、気圧ポンプ、電気動力学、キャピラリー作用、重力または流体のフローを生じさせるその他の方法によって達成することができる。
【００４４】
微小容器の流れは、その後、サンプル細胞における標的配列の増幅のためにサンプルフローチャネル５０９に流体的に接続された蛇行チャネル５２０に充填される。蛇行分析チャネル５０９は、多数のターンセグメント５３１ａ−ｉによって接続される隣接したセグメント５２１ａ−ｊを有する多数の平行セグメント５２１ａ−ｊへ分割される。蛇行チャネルは、好ましくは、サンプルサイズおよび微小容器の間の所望の間隔に依存して、それぞれ５０−１００ｍｍの長さの５０−１００の間の平行セグメントに分割される。ガス抜き管５４０ａ−ｊは、蛇行チャネル５２０の各々の平行セグメント５２１ａ−ｊの各々の端に流体的に接続される。ガス抜き管５４０ａ−ｊは、増幅プロセスにおける温度サイクル間の各々のセグメント５２１ａ−ｊにおける微小容器の流れの熱膨張および収縮に適応するように構成される。ガス抜き管に接続された多数の平行セグメントへの蛇行チャネル５２０の分割は、個々の小さなセグメント５２１ａ−ｊへの熱膨張による微小容器の移動を分離し、これによって、蛇行チャネル５２０全体にわたる熱膨張の波及効果を除去する。したがって、温度サイクリングの際の蛇行チャネル５２０内の微小容器の移動を大幅に減少することができ、蛇行チャネル５２０内に含まれるような大きな体積を有するサンプルにおける個々の微小容器を追跡する能力が改善される。温度サイクリングの際の微小容器の移動の最小化は、隣接した微小容器によって占められる空間にわたって前後に移動する微小容器からの汚染のリスクを最小化し、隣接した微小容器の結合の可能性を減少させる。
【００４５】
使用において、ガス抜き管５４１ａ−ｊは、蛇行チャネル５２０のローディングの際に、高圧シールによって密封され、蛇行チャネル５２０において正圧を保持し、蛇行チャネル５２０における微小容器のローディングを保証する。ある実施態様において、第１に、高圧シールは、サンプルローディングの際に各々のガス抜き管５４０ａ−ｊを密封するために、機械的な膜および１以上のゴムガスケットを含むことができる。あるいは、ガス抜き管は、ローディング後にエッチング可能なフォトレジスト材料または熱膨張圧力によって圧倒することができる疎水性バルブで覆うことができる。蛇行チャネル５２０が一旦充填されると、第１の高圧シールを解くまたは除去することができる。その後、外部環境からガス抜き管５４０ａ−ｊを分離して、微小容器の汚染を予防するために、第２のシールが使用される。第２のシールは、好ましくは、熱サイクリングの際の、各々のセグメント５２１ａ−ｊにおける微小容器の流れの熱膨張および収縮の適応にとって機械的に適合している。例えば、ある実施態様において、第２のシールは、ガス抜き管５４０ａ−ｊに付された薄膜またはフレキシブルな膜を含むことができる。あるいは、ガス抜き管５４０ａ−ｊを、使い捨てカートリッジにおいて、１以上の一般的なガス抜きリザーバーに流体的に接続し、フレキシブルな膜またはフィルターを有したフタによって外部環境から分離することができる。
【００４６】
図１１は、より大きなサイズのサンプル例えば１００，０００までの微小容器を含むサンプルにおいて単一細胞の表現型および遺伝型の分析および関連付けを行なうためのマイクロ流体チップ６００の代替となる実施態様を示す。チップ６００は、４つの独立したローディングおよび分析ゾーン６１０ａ、ｂ、ｃ、ｄに分割され、これらはそれぞれ、約１００から２００μｍの間の微小容器間の間隔を有して２５，０００までの微小容器を保持するように形成された蛇行チャネル６２０ａ−ｄを有する。さらに、チップは、チップの所望の容量に依存して、多かれ少なかれローディングゾーンに分類することができると想像できる。各々のローディングゾーン６１０ａ−ｄは、使い捨てカートリッジの細胞リザーバー、ＰＣＲミックスリザーバーおよびオイルリザーバーに接続するよう形成された、細胞インレット６１３ａ−ｄ、ＰＣＲミックスインレット６１２ａ−ｄおよびオイルインレット６１１ａ−ｄを有する。チップ６００における各々のローディングゾーン６１０ａ−ｄは、好ましくは、以前に記述される１０，０００ＰＣＲ容量チップと同一の寸法を有しており、細胞インプット、ＰＣＲインプットおよびオイルインプットの相対的位置は類似している。使用において、ＰＣＲチップ６００は、チップ６００におけるサンプルおよびＰＣＲミックスの充填ために、各々のローディングゾーン６１０ａ−ｄを使い捨てカートリッジに一時的に接続するモーター駆動ステージに接続することができ、ナノリッター微小容器におけるサンプルおよびＰＣＲミックスのカプセル化のためにオイルを導入し、単一のローディングおよび分析ゾーンを有する１０，０００ＰＣＲマイクロ流体チップ５００のために上に記述したのと同様に微小容器を蛇行分析ゾーンに充填する。あるいは、カートリッジおよびチップは単一の一体構造装置へ統合することができる。
【００４７】
例えば、ある実施態様において、使い捨てカートリッジは、カプセル化媒質およびＰＣＲミックスのための共有されるリザーバーを有することができ、これは、例えば上記のようなモーター駆動ステージを使用してそれぞれのチップに交互に接続され、または、各々のチップまたはローディングゾーンに多重化される。あるいは、使い捨てカートリッジは、多数の独立したオイルおよびＰＣＲミックスリザーバーを有することができ、それぞれ単一のローディングゾーンに取り付けられる。同様に、ある実施態様において、カートリッジは、１以上のバルブおよび液体チャネルを使用して各々の細胞インプットに多重化される単一のサンプルリザーバーを有することができる。あるいは、ある実施態様において、カートリッジは複数のサンプルリザーバーを有してよく、それぞれ独立に単一細胞インプットおよび分析ゾーンに接続される。カートリッジはさらに、表現型分析を行なうために各々のローディングゾーンへの光学的な到達を可能にするよう形成される。
【００４８】
マイクロ流体チップ５００に関して以前に記述したように、１００，０００ＰＣＲチップ６００における各々のローディングおよび分析ゾーン６１０ａ−ｄは、各々の微小容器におけるサンプル細胞の標的配列の増幅のために、サンプルフローチャネル６０９ａ−ｄに流体的に接続された蛇行チャネル６２０ａ−ｄを含む。蛇行分析チャネル６２０は、多数のターンセグメントによって接続される多数の平行セグメントへ分割される。各々の蛇行チャネル６２０ａ−ｄは、好ましくは、サンプルサイズおよび微小容器の間の所望の間隔に依存して、約５０−１００ｍｍの長さの５０−１００の間の平行セグメントに分割される。ガス抜き管６４０は、蛇行チャネル６２０ａ−ｄの各々の平行セグメントの各々の端に流体的に接続され、ローディングプロセスの際に蛇行チャネル６２０ａ−ｄを密封し、増幅プロセスの際に蛇行チャネルを外部環境から分離しながら、熱膨張および収縮を可能にする。
【００４９】
代替となる実施態様において、表現型−遺伝型分析および関連付けは、ナノウェルアレイチップに予め充填されたサンプルで行うことができる。図１２は、ナノウェルアレイに予め充填されたサンプルに由来する遺伝型データのための、表現型−遺伝型データの分析および関連付けの工程を示す。工程７００において、サンプルインプット７０における細胞は、選択された表現型の特徴について個々に分析される。ある実施態様において、表現型分析は、ナノウェルへの細胞の単離に先立って、マイクロ流体環境中で、または例えば上で議論するようなフローサイトメトリーによって、行なうことができる。あるいは、表現型の測定は、スキャニングサイトメトリーを使用して細胞が個々のナノウェルに分離された後に行なうことができる。上で議論するように、ある実施態様において、マルチプル表現型測定は、例えば、マルチプル蛍光検出器、または光散乱測定および蛍光の組み合わせを使用して行うことができる。
【００５０】
工程７０２において、細胞は、測定された表現型の特徴といった、使用者によって選択されたパラメーターに基づいてソートしてよい。その後、標的細胞は、ナノウェルアレイへの送達のために標的フローチャネルに導くことができる。非標的細胞は廃棄物リザーバーに付けられた廃棄物フローチャネルに導くことができる。
【００５１】
工程７０４において、標的細胞は、１以上のアレイのナノウェルに連続して置かれる。ナノウェルは好ましくは各々１個の細胞を含むように大きさが設定される。ナノウェルは、遺伝子発現測定に必要な試薬および励起されたときに増幅産物の量に比例したレベルで蛍光を発する蛍光性検出分子またはプローブが予め充填されている。ある実施態様において、利用可能なウェルの数は、好ましくは、限界希釈を保証するために、測定される細胞の数を超える。個々のウェルは疎水性の流体のフタ（例えばオイル）を使用して互いに分離される。各々のナノウェルにおける細胞のための表現型情報は、アレイにおける各々の細胞の正確な位置に基づいて、インデックスを付けて記録することができる。
【００５２】
工程７０６において、個々の細胞の遺伝型が測定される。細胞は、熱、レーザー、超音波または化学薬品による溶解によって、または当該分野で既知のその他の適切な技術によって溶解される。アレイは熱的にブロックヒーターに連結され、ナノウェルは、等温増幅またはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって遺伝子産物を増幅するために必要な１以上の温度を循環する。アレイは所望の数の増幅サイクルに供され、増幅された遺伝子生成物が測定される。
【００５３】
工程７０８において、遺伝型測定が解読される。蛍光性検分子出またはプローブは、光源、例えば固定または走査レーザー、ＵＶランプ、発光ダイオードを用いて励起され、光学検出器、例えばＣＣＤイメージング、光電子増倍管、フォトダイオードまたはフォトダイオードアレイがアレイを撮像して、各々のナノウェルからの蛍光シグナルの強度を測定し、増幅産物の量を検出する。ある実施態様において、ＣＣＤカメラといった光学検出器はアレイ全体を撮像する。あるいは、励起光源をスキャニングすることにより、または光電子増倍管に組み合わせられた光ファイバーといったスキャニング検出器により、各々のナノウェルを連続的に質問することができる。画像は、各々のナノウェルについてそれまでに記録された表現型測定へのイメージプロセシングおよび関連付けのためにプロセッサーへ送られ、各々の細胞について関連付けされた表現型および遺伝型データ７４が供給される。
【００５４】
図１３Ａ−Ｂに示されるように、ある実施態様において、細胞の表現型分析は、マイクロ流体環境にて連続して行なうことができ、その後、細胞は、増幅および遺伝型分析のためのナノウェルアレイに充填することができる。ここにおいて、工程７００では、マイクロ流体フローチャネル７０９へ細胞８０８を導入することにより、表現型分析が行なわれる。上で議論するように、フローチャネルは、例えばフローチャネル７０９の断面直径を減少させることにより、表現型分析のために、単一細胞の流れへ細胞を集約するよう構成できる。細胞８０８は、分析領域７０５で連続して質問され、細胞の１以上表現型の特徴が測定される。ある実施態様において、細胞は、測定された表現型の特徴または使用者により選択されたその他のパラメーターに基づいて、標的細胞および非標的細胞へソートされる。所望の特徴を有する標的細胞の存在は、蛍光、前方散乱または任意の適したイメージングもしくは検出様式によって、液体の流れにて検出することができる。その後、標的細胞は、ナノウェルアレイチップ８００の個々のナノウェル８０１ａ−ｆへの送達のために、同時係属中の特許出願番号第１１／７８１，８４８号（名称「細胞ソーティングシステムおよび方法」、当該出願は本願全体に援用される）に記述される誘電泳動、含気性スイッチまたは双方向液体または光学スイッチを使用して、標的フローチャネル７１１に導くことができる。非標的細胞は廃棄物リザーバーに付けられた廃棄物フローチャネル７１０に導かれる。
【００５５】
工程７０４において、標的フローチャネル７１１は、個々のナノウェル８０１ａ−ｆに向けて標的細胞の流れを送るために、ナノウェルアレイチップ８００のマイクロ流体チャネル８０３に流体的に接続される。標的細胞８０８は、個々のナノウェル８０１ａ−ｆに連続して置かれる。各々のナノウェル位置８０１ａ−ｆは、必要なＰＣＲ試薬、および増幅産物の量に比例したレベルで蛍光を発する蛍光検出器またはマーカーが予め充填されている。ナノウェルアレイにおける各々の細胞の位置は、アレイにおける位置に基づいて、各々の細胞の表現型測定を遺伝型測定と関連付けるために後に使用できるインデックスを作る。各々のナノウェル８０１ａ−ｆは、好ましくは、単一細胞および標的ＤＮＡ配列の増幅に必要な試薬を保持する数ナノリッターの体積を有する。例えば、一実施態様において、ウェルは、７０μｍの深さを有する１００μｍｘ１００μｍの正方形である。ナノウェル８０１ａ−ｆは、ガラス、石英、プラスチック、例えばポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等、およびその他のキャスタブルで細工可能なポリマー（例えばポリジメチルシロキサン、ＰＤＭＳまたはＳＵ８）を含む（但しこれらに限定されない）様々な材料を使用して、微細加工により作成することができる。ナノウェル８０１ａ−ｆを接続するマイクロ流体チャネル８０３の深さは、典型的に、１０μｍから１００μｍの範囲であるが、これに限定されない。マイクロ流体チャネルの幅は、典型的に、深さの１から５倍であるが、これに限定されない。一旦細胞が個々のナノウェル８０１ａ−ｆに充填されると、オイルまたはその他の適切なカプセル化媒質がマイクロ流体チャネル８０３を通って流され、各々のウェルにおいて、ＰＣＲ試薬と共に個々の細胞が分離される。
【００５６】
次に、工程７０６において、分離された細胞は溶解され、ポリメラーゼ連鎖反応法を達成するために必要とされる温度プロファイルで循環される。例えば、ここに示されるように、アレイ８００は、９６℃周辺の第１の温度、６０℃周辺の第２の温度および７２℃周辺の第３の温度で循環される。ある実施態様において、ナノウェルアレイの温度は、加熱ブロック、統合ヒーティングワイヤー、ペルチェヒーターといった当該分野で既知の１以上の加熱要素を使用して、または加熱／冷却した液体または加熱／冷却した空気を循環させることにより、ＰＣＲに適した温度を作るために調節することができる。所望の数のＰＣＲサイクルが行われ、増幅産物が測定される。各々のナノウェルにおける蛍光プローブまたはマーカーは、光源、例えば固定または走査レーザー、ＵＶランプ、発光ダイオードを用いて励起され、光学検出器８１５、例えばＣＣＤイメージング、光電子増倍管、フォトダイオードまたはフォトダイオードアレイが ナノウェルを撮像して、蛍光シグナルの強度を測定する。代替となる実施態様において、ＵＶ光は核酸生成物の吸収を測定するために使用されてもよい。その後、遺伝型の測定は、アレイ上のそれらの位置によってインデックスを付けることができる。その後、したがって、個々の細胞のための表現型および遺伝型の測定はナノウェルアレイにおける位置に基づいて関連付けることができる。
【００５７】
図１４に示される代替となる実施態様において、フローチャネル７０９における細胞８０８の流れはマルチプル標的アレイ９０１ａ−ｉへソートされる。マルチプル標的アレイの場合、ソーティングスイッチのネットワークは、いくつかの測定される表現型の特徴に従って、複数回細胞の流れをソートするために使用してもよい。例えば、ここに示されるように、４つのソーティングスイッチ７２５ａ−ｄが、各々のソートのための分岐にて、細胞を三方向にソートするために使用される。示されるソーティングネットワークは、ソートに先立って測定された表現型に基づいて、９つの異なるアレイ９０１ａ−ｉへの細胞の分離を可能にする。個々の細胞をそれらの表現型に関連付けることなく、各々のアレイの遺伝子発現の細胞ごとの統計的分布を決定してもよく、図１４Ｂに示されるように、統計値を、使用者によって選択された９個までの表現型クラスタに関連付けてもよい。
【００５８】
図１５Ａ−Ｂに示されるように、ある実施態様において、細胞が、個々のナノウェル８０１ａ−ｆに置かれ分離された後、各々の細胞の表現型がスキャニングサイトメトリーによって測定される。ここにおいて、細胞は、例えば、蛍光分子（例：フルオレッセインイソチオシアネート、別名ＦＩＴＣ）に結合した抗体、核染色、細胞内色素または細胞による蛍光タンパク質（例：緑色蛍光タンパク質、別名ＧＦＰ）の合成を使用して、表現型分析のためにラベルされる。その後、細胞は、標的配列の増幅に必要とされるＰＣＲ試薬および増幅された標的配列の量を検出するための蛍光プローブまたはマーカーとともにナノウェル８０１ａ−ｆに蓄積され、分離される。ナノウェル８０１ａ−ｆは正方形で水平な底であってよく、または、好ましくは、先細で小さな水平な底を有してよく、細胞は、ウェルの底に自動的に集約する。これは、細胞の表現型を測定するのに必要な光学的スキャンの数を減らす。単一の細胞は各々のナノウェル８０１ａ−ｆに置かれる。固定および走査レーザー、ＵＶランプ、発光ダイオードのような光源８４０が、ナノウェルアレイ８００における細胞の蛍光ラベルを励起するために使用され、アレイ８００における各々のナノウェルは、蛍光検出器８１２で連続して質問され、細胞の１以上表現型の特徴が測定される。アレイにおける各々の細胞の位置および表現型測定が記録され、続く単一細胞遺伝型測定は、表現型測定に容易に関連付けてもよい。以前に記述したように、分離された細胞は溶解され、遺伝物質を増幅するために複数回ＰＣＲ温度プロファイルを通って循環する。レーザー８４０が、各々のナノウェルにおける蛍光マーカーまたはプローブの励起のために使用され、蛍光検出器８１２が蛍光シグナルの強度を測定し、各々のＰＣＲサイクルの後に増幅された遺伝物質の量が決定される。この遺伝型測定はアレイにおける各々の位置のために記録され、各々のナノウェル位置のためのそれまで記録された表現型の測定との関連付けのためにプロセッサーへ送られ、個々の細胞のための表現型および遺伝型の測定が関連付けられる。実際、コード化および解読は、ウェルのアレイによって課された座標システムによって可能になる。
【００５９】
ある実施態様において、図１５Ａおよび１８に示されるように、それは、細胞の表現型および遺伝型の測定に基づいて、ナノウェルアレイにて増幅され測定された細胞の選択された一部から遺伝物質を回収することが望まれてよい。細胞は、図１３および１５に示されるように、ナノウェルのアレイに蓄積される前にまたは後に、１以上の表現型測定について質問することができ、または細胞が単に遺伝型情報に基づいて回収される場合、それらは、ナノウェルアレイ８００に直接蓄積されてよい。上で議論するように、細胞は分離され、溶解され、アレイ８００は、遺伝子発現サインの増幅のために１以上の温度を通して熱的に循環される。増幅された遺伝物質は、光学検出器８１５によって測定され、各々のナノウェル位置のための表現型情報に関連づけられる。遺伝物質は、その後、ロボット工学的なマイクロピペット８２０の使用により、関連付けられた表現型−遺伝型情報に基づいて対象とされるナノウェルから回収され、個々にアドレス可能な対象とするウェルから物質が抽出される。
【００６０】
図１３および１５に示されるナノウェル実施態様に使用される付加的な方法は、遺伝型分析のみのためである。細胞は、図１３および１５にて以前記載されたように、分離され、溶解され、熱的に循環され、遺伝型情報が測定され、何万から何十万の細胞において、平行した単一細胞の遺伝データが得られる。典型的にナノリッターの小さな体積のために、反応１回および細胞１個当たりのコストは、バルクにおける同数の細胞の反応当たりのコストに匹敵するだろう。
【００６１】
図１８Ａ−１８Ｂは、多様なフロー形式における細胞単離の微小写真を示す。特に、微小写真図１８Ａおよび図１８Ｂは、プラスチックに形成された装置を示し、図１８Ｃおよび１８Ｄは、ＰＤＭＳに形成された装置を示す。図１８Ａにおいて、サンプルミックス溶液インプット１００２、スペーサー材料インプット１００４（例えば、フルオロカーボンオイルのようなスペーサーオイルを含む）および溶液インプット１００６の交差１０００は、スペーサー材料によって分離された溶液内に含まれるサンプルミックスのアウトプット１００８をもたらす。図１８Ｂでは、４００μｍと記されるバーによって、微小写真の寸法を示す。図１８Ｃは、図１８と同一の一般的な構成要素を有する同様の構造を示し、対応する方式で番号が付されている。
【００６２】
図１９は、表示されるように、細胞前方散乱および液滴前方散乱のオシロスコープの形跡を示す。ｙ軸は強度を示し、ｘ軸は時間を示す。液滴前方散乱（ＦＳＣ）に見られるように、液滴は、かなり規則的な周期性があり、１つの液滴と次の液滴との間の境界が示される。対照的に、細胞前方散乱（ＦＳＣ）におけるピークの数は、各々の液滴における細胞の数を示す。
【００６３】
図２０は、写真の上から下に向かって１０１１から１０１６と表示される６つのキャピラリーの微小写真を示す。物質のコード化は、液滴長における変化を通して達成される。例えば、キャピラリー１０１３における液滴長と隣接したキャピラリー１０１２における液滴長との比較は、液滴長における有意な変化を示す。
【００６４】
図２１は、液滴長を変えることによりもたらされる、さらなるコード化のパターンを示す微小写真である。微小写真の上から下に向かって、キャピラリー１０２１、１０２２および１０２３と番号付けされる。長さおよび位置の両方が、変化する配列を形成することができ、いくぶん「モールス符号」パターンのように見える。
【００６５】
図２２Ａおよび２２Ｂは、遺伝子発現の実際のテスト結果を示す。図２２Ａは平行した２０のキャピラリーが示され、各々、多数の個々の反応体積で占められる。図２２Ａは、表現型ＣＤ３４の結果を示す。図２２ＢはｑＰＣＲ後の結果を示す。明るい反応液滴は肯定的な遺伝子発現を表わす。それらの液滴のいくつかは、微小写真に追加された矢でラベルされる。一般に、液滴あたり１〜２個の細胞が存在する。約５％の細胞がＫＧ１Ａであり、これはＣＤ３４陽性である。約９５％の細胞がジャーカット細胞であり、これはＣＤ３４陰性である。ｑＰＣＲ強度と表示されたグラフは、サイクルの数の関数としての定量的ＰＣＲ強度を示す。ｘ軸は左において０サイクルであり、右において約４６サイクルで終わる。ＣＴ組織写真は、細胞毎の基礎におけるＣＤ３４の発現の量を反映する。
【００６６】
前述の発明は、フローサイトメトリー表現型データを核酸増幅と関連付けるための方法および装置について記述するものの、各々の細胞の表現型測定との関連付けのために、微小容器においてその他の分子アッセイ、例えばＤＮＡメチル化、タンパク質存在量、サイトカイン検出またはその他の酵素的もしくはタンパク質アッセイを行えることが容易に想像できる。そのうえ、微小容器内の単一細胞測定および関連付けに重点が置かれているものの、上記の装置および方法は、複数の細胞における測定のための表現型−遺伝型データを関連付けるために使用することができると認識されるべきである。
【００６７】
前述の発明は、明瞭さおよび理解の目的のために例証および例としてかなり詳細に記述されたものの、当業者にとって、この発明の教えに照らせば、本発明の精神または範囲から外れることなく、一定の改変および修飾を本発明に行ってもよいことが明らかであるだろう。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
以下を含む、マイクロ流体単一細胞の分析および関連付けのための統合された構造：
以下を含むカートリッジ、
光学窓、
少なくとも以下を含む多数のリザーバー：
サンプルリザーバー、
液体リザーバー、
試薬リザーバー；
少なくとも以下を含むチップ：
サンプルリザーバーに流体的に結合した、細胞インレットチャネル、
前記液体リザーバーおよび前記細胞インレットチャネルに流体的に結合した、第１の液体インレットチャネル、
前記試薬リザーバーおよび前記細胞インレットチャネルに流体的に結合した、第２の液体インレットチャネル、
第１および第２の液体インレットチャネルの下流の前記細胞インプットチャネルに流体的に結合した第１の末端および第１および第２の末端を有し互いに流体的に接続された多数の平行区画を含む、蛇行チャネル、
前記多数の区画の前記第１および第２の末端に位置する多数のガス抜き管
ここにおいて、前記チップは、前記光学窓に隣接して位置する。
［２］
少なくとも以下を含むフタを更に含む、［１］に記載の統合された構造：
インレットを有し、且つ、少なくとも１つの前記サンプルリザーバーおよび前記液体リザーバーに結合した、気圧ポート、ならびに
前記気圧ポートの前記インレットと少なくとも１つの前記サンプルリザーバーおよび前記液体リザーバーとの間に位置するフィルター。
［３］
更に以下を含む、［２］に記載の統合された構造：
配管が介在することなく、源からの気圧を前記気圧ポートにつなぐ多岐管。
［４］
前記カートリッジが更に第２の液体リザーバーを含み、前記チップが更にコード化領域を含む、［１］に記載の統合された構造：
ここにおいて、前記第２の液体リザーバーは、第１の液体インレットチャネルおよび前記第２の液体インレットチャネルの下流の細胞インプットチャネルに流体的に結合している。
［５］
前記カートリッジが更に廃棄物リザーバーを含み、前記チップが更にソーティング領域を含む、［１］に記載の統合された構造：
ここにおいて、前記細胞インプットチャネルは前記廃棄物リザーバーに流体的に結合している。
［６］
前記ソーティング領域が側方動力スイッチを含む、［３］に記載の統合された構造。
［７］
前記側方動力スイッチが、光学的作用、誘電泳動または流体のパルスを使用することで作られる、［６］に記載の統合された構造。
［８］
前記蛇行チャネルが２．５−５メーターの間の長さである、［１］に記載の統合された構造。
［９］
前記蛇行チャネルが５０−１００の平行区画を含む、［１］に記載の統合された構造。
［１０］
前記多数のガス抜き管が、充填の間に前記蛇行チャネルを封鎖するよう構成された第１のシールおよび外部環境から前記ガス抜き管を分離するよう構成された第２のシールを有する、［１］に記載の統合された構造。
［１１］
前記第２のシールが熱膨張および収縮に機械的に適合している、［１０］に記載の統合された構造。
［１２］
前記第１のシールが、それぞれ機械的機構を含む、［１０］に記載の統合された構造。
［１３］
前記第１のシールが、それぞれ光反応性材料を含む、［１０］に記載の統合された構造。
［１４］
前記第１のシールが、それぞれ疎水性材料を含む、［１０］に記載の統合された構造。
［１５］
前記第２のシールが、外部環境から前記蛇行チャネルを分離するよう構成された薄膜をそれぞれ含む、［１０］に記載の統合された構造。
［１６］
カートリッジが、フィルターを有するガス抜きリザーバーを更に有し、前記多数のガス抜き管が前記ガス抜きリザーバーに流体的に結合した、［１］に記載の統合された構造。
［１７］
前記蛇行チャネルにおける液体の温度を調節するために、前記蛇行チャネルに実施可能的に繋がった温度モジュールを更に含む、［１］に記載の統合された構造。
［１８］
前記温度モジュールが、前記蛇行路における液体の温度を繰り返し循環させるための加熱要素および温度調節要素を含む、［１］に記載の統合された構造。
［１９］
前記加熱要素がヒートブロックを含む、［１８］に記載の統合された構造。
［２０］
前記加熱要素が加熱された空気を含む、［１９］に記載の統合された構造。
［２１］
更に多数のチップを含む、［１］に記載の統合された構造：
ここにおいて、前記カートリッジは、前記多数のリザーバーを前記多数のチップに繋ぐように構成されている。
［２２］
前記カートリッジが、前記多数のリザーバーを前記多数のチップに流体的に繋ぐための１以上のバルブを更に含む、［２１］に記載の統合された構造。
［２３］
更に多数のチップを含む、［１］に記載の統合された構造：
ここにおいて、前記カートリッジが更に多数のサンプルリザーバーを含み、前記サンプルリザーバーは、それぞれ１つの前記多数のチップ上で細胞インプットに流体的に繋がるように構成されている。
［２４］
前記カートリッジが、１つの多数のチップ上で第１の液体インレットチャネルに流体的に繋がるようにそれぞれ構成された多数の液体リザーバー、および１つの多数のチップ上で第２の液体インレットチャネルに流体的に繋がるようにそれぞれ構成された多数の試薬リザーバーを更に含む、［２３］に記載の統合された構造。
［２５］
以下を含む、マイクロ流体単一細胞の分析および関連付けのための統合された構造：
以下を含む、カートリッジ
光学窓
少なくとも以下を含む、多数のリザーバー：
サンプルリザーバー、
液体リザーバー、および
試薬リザーバー；
少なくとも以下を含む、フタ：
インレットを有し、且つ、少なくとも１つのサンプルリザーバーおよび前記液体リザーバーに結合した、気圧ポート、
前記気圧ポートの前記インレットと少なくとも１つの前記サンプルリザーバーおよび前記液体リザーバーとの間に位置する、フィルター、および
配管が介在することなく、源からの気圧を前記気圧ポートにつなぐ多岐管、
少なくとも以下を含む、チップ：
液体媒質における１以上の細胞の受け入れに適し、サンプルリザーバーに流体的に結合した、細胞インレットチャネル、
前記液体リザーバーおよび前記細胞インレットチャネルに流体的に結合した、第１の液体インレットチャネル、
前記試薬リザーバーおよび前記細胞インレットチャネルに流体的に結合した、第２の液体インレットチャネル、
前記第１の液体インレットチャネルおよび前記第２の液体インレットチャネルの下流の前記細胞インレットチャネル流体的に結合した、アウトレットチャネル、
ここにおいて、前記チップは、少なくとも部分的に、前記光学窓に隣接して位置する；および
前記アウトレットチャネルに流体的に結合したキャピラリーチューブ。
［２６］
前記キャピラリーチューブは５００−１０００ｍｍの間の長さである、［２５］に記載の統合された構造。
［２７］
前記第１の液体インレットチャネルは、前記第２の液体インレットチャネルの下流の前記細胞インレットチャネルに流体的に結合した、［２５］に記載の統合された構造。
［２８］
前記カートリッジが更に廃棄物リザーバーを含み、前記チップが更にソーティング領域を含む、［２５］に記載の統合された構造：
ここにおいて、前記細胞インプットチャネルは前記廃棄物リザーバーに流体的に結合している。
［２９］
以下を含む、単一細胞分析および関連付けのためのマイクロ流体チップ：
以下を含む、ローディングゾーン：
サンプル源に流体的に結合するよう構成された、細胞インレットチャネル、
第１および第２の末端を有する第１の液体インレットチャネルであって、前記第１の末端は試薬源に流体的に結合するよう構成され、前記第２の末端は前記細胞インレットチャネルに流体的に結合するよう構成される、第１の液体インレットチャネル；および
第１および第２の末端を有する第２の液体インレットチャネルであって、前記第１の液体インレットチャネルの下流で、前記第１の末端は液体源に流体的に結合するよう構成され、前記第２の末端は前記細胞インレットチャネルに流体的に結合する、第２の液体インレットチャネル；
以下を含む、分析ゾーン
第１および第２の液体インレットチャネルの下流で、前記細胞インプットチャネルに流体的に結合した第１の末端および第１および第２の末端を有し互いに流体的に繋がった多数の平行区画を含む、蛇行チャネル、
前記多数の区画の前記第１および第２の末端に位置する、多数のガス抜き管。
［３０］
前記多数のガス抜き管が、更に、前記蛇行チャネルを封鎖するよう構成された第１のシールおよび外部環境から前記ガス抜き管を分離するよう構成された第２のシールを有する、［２９］に記載のマイクロ流体チップ。
［３１］
前記第１のシールが、それぞれ機械的機構を含む、［３０］に記載のマイクロ流体チップ。
［３２］
前記第１のシールが、それぞれ光反応性材料を含む、［３０］に記載のマイクロ流体チップ。
［３３］
前記第１のシールが、それぞれ疎水性材料を含む、［３０］に記載のマイクロ流体チップ。
［３４］
前記第２のシールが、外部環境から前記蛇行チャネルを分離するよう構成された薄膜をそれぞれ含む、［３０］に記載のマイクロ流体チップ。
［３５］
前記蛇行チャネルが２．５−５メーターの間の長さである、［２９］に記載のマイクロ流体チップ。
［３６］
前記蛇行チャネルが５０−１００の平行区画を含む、［２９］に記載のマイクロ流体チップ。
［３７］
ローディングゾーンおよび分析ゾーンをそれぞれ含む多数の区画を更に含む、［２９］に記載のマイクロ流体チップ。
［３８］
さらに４つの区画を含む、［３７］に記載のマイクロ流体チップ：
ここにおいて、各々の分析ゾーンにおける前記蛇行チャネルは、２．５−５メーターの間の長さであり、５０−１００の平行セグメントに分離されている。
［３９］
以下を含む、細胞毎に表現型および遺伝型情報の関連付けを行う方法：
多数の細胞および標的ＤＮＡ配列の増幅のための少なくとも１つの試薬を含む第１の溶液、並びに前記第１の溶液と不混和性の第２の溶液を提供すること；
前記第１の溶液におけるそれぞれの細胞の前記表現型を連続的に分析すること；
前記第１の溶液と前記第２の溶液とを組み合わせ、多数のナノリッター微小容器を含む流れを形成すること、ここにおいて、多数のナノリッター微小容器は、単一細胞をカプセル化し、または細胞を含まない；
ナノリッター微小容器の前記流れを参照シグナルによってコード化すること；
前記ナノリッター微小容器を前記標的ＤＮＡの増幅に適した温度条件に供すること；
それぞれのマイクロリアクターにおいて遺伝子発現を測定すること；および
前記参照シグナルを解読し、それぞれのマイクロリアクターからの前記遺伝子発現の測定と前記マイクロリアクター中の前記細胞の前記表現型とを関連付けること。
［４０］
前記標的ＤＮＡの増幅が等温増幅の実行を含む、［３９］に記載の方法。
［４１］
前記温度条件が反復性のサーマルサイクリングを含む、［３９］に記載の方法。
［４２］
前記標的ＤＮＡの増幅がｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲまたはエンドポイントＰＣＲの実行を含む、［４１］に記載の方法。
［４３］
前記参照シグナルが前記マイクロリアクターに含まれる、［３９］に記載の方法。
［４４］
前記参照シグナルが、ナノリッター微小容器の前記流れに含まれるマイクロビーズまたは色素の擬似乱数的パターンの作成によって作られる、［４３］に記載の方法。
［４５］
前記参照シグナルが、前記ナノリッター微小容器間の擬似乱数的スペーシングパターンの作成によって作られる、［３９］に記載の方法。
［４６］
前記参照シグナルが、前記ナノリッター微小容器のサイズを擬似乱数的に変えることによって作られる、［３９］に記載の方法。
［４７］
前記流れがインデックスを作るための前記参照シグナルによってコード化された後に、ナノリッター微小容器の前記流れを撮像することを更に含む、［３９］に記載の方法。
［４８］
前記表現型の分析が蛍光シグナルの測定を含む、［３９］に記載の方法。
［４９］
前記表現型の分析が、複数の表現型測定を行うことを含む、［３９］に記載の方法。
［５０］
前記表現型測定に基づいて、前記細胞を標的細胞および非標的細胞にソートすることを更に含む、［３９］に記載の方法
ここにおいて、前記非標的細胞は廃棄物リザーバーに向けられる。
［５１］
前記ナノリッター微小容器にて前記細胞を溶解することを更に含む、［３９］に記載の方法。
［５２］
前記細胞の溶解が、浸透圧ショック、加熱、レーザー溶解または超音波によって行われる、［５１］に記載の方法。
［５３］
前記遺伝子発現がリアルタイムまたは定量的ＰＣＲによって測定される、［３９］に記載の方法。
［５４］
記遺伝子発現の測定が、遺伝物質の吸収を測定することを含む、［３９］に記載の方法。
［５５］
前記遺伝子発現の測定が、ＤＮＡ産物に結合するまたはＤＮＡ増幅の副産物に結合するプローブまたは色素による吸収を測定することを含む、［３９］に記載の方法。
［５６］
遺伝子発現の測定に基づいてナノリッター微小容器の前記流れをソーティングすることを更に含む、［３９］に記載の方法。
［５７］
前記第１の溶液および前記第２の溶液をマイクロ流体ネットワークに導入することを更に含む、［３９］に記載の方法。
［５８］
前記マイクロ流体ネットワークが以下を含む、［５７］に記載の方法：
前記第１および第２の溶液を組み合わせて、多数のナノリッター微小容器を含む流れを形成するための、少なくとも第１および第２のフローチャネルを含むローディングゾーン、
コード化領域、および
以下を含む、分析ゾーン
第１および第２の末端を有する多数の平行区画を有し、互いに流体的に接続した、蛇行フローチャネル、および
前記多数の区画の前記第１および第２の末端に位置する多数のガス抜き管、および
解読領域。
［５９］
ナノリッター微小容器の前記流れがナノ流体マイクロウェルのアレイにソートされ、それぞれのウェルが単一のマイクロリアクターを含み、前記ナノリッター微小容器を反復性温度サイクリングに供する前記工程が、マイクロウェルの前記アレイを反復性温度サイクリングに供することである、［３９］に記載の方法。
［６０］
前記多数のナノリッター微小容器が少なくとも１０００のナノリッター微小容器を含む、［３９］に記載の方法。
［６１］
前記多数のナノリッター微小容器が少なくとも１０，０００のナノリッター微小容器を含む、［６０］に記載の方法。
［６２］
前記多数のナノリッター微小容器が少なくとも１００，０００のナノリッター微小容器を含む、［６１］に記載の方法。
［６３］
以下を含む、マイクロ流体ネットワークにおける個々の細胞における関連付けされた表現型および遺伝型分析を提供するための統合システム：
多数の細胞を含む水性溶液を含むサンプル源；
疎水性液体を含むカプセル化源；
以下を含む、マイクロ流体ネットワーク：
以下を含む、ローディングゾーン：
前記サンプル源に流体的に結合されたサンプルフローチャネル；
前記液体リザーバーおよび前記サンプルフローチャネルに流体的に結合した側方フローチャネル、および
前記サンプル源が多数のナノリッター微小容器に分離されるように、前記側方フローチャネルにおけるフロー条件を誘導するよう構成されたコントローラー、および
以下を含む、分析ゾーン：
前記試薬インレットおよび側方フローチャネルの下流の前記細胞インプットチャネルに流体的に結合した第１の末端並びに第１および第２の末端を有し互いに流体的につながった多数の平行区画を含む、蛇行チャネル、
前記多数の区画の前記第１および第２の末端に位置する多数のガス抜き管
前記サンプルフローチャネルにおける前記ナノリッター微小容器からのシグナルを測定するよう構成される、前記サンプルフローチャネルに実施可能的に結合した第１の光学検出器；
前記分析ゾーンに実施可能的に結合した、加熱要素および温度調節要素を含む、温度モジュール；
特定の波長で前記蛇行チャネルを照射するよう構成された、励起光源；
前記蛇行チャネルにおける前記ナノリッター微小容器からの増幅産物を検出し測定するよう構成された、第２の光学検出器；
前記第１および第２の光学検出器によって検出されるシグナルを記録し関連付けるための前記光学検出器に繋がったプロセッサー。
［６４］
前記マイクロ流体ネットワークが、参照シグナルを前記多数のナノリッター微小容器に適用するよう構成されたコード化領域を更に含む、［６３］に記載の統合システム。
［６５］
前記ナノリッター微小容器上でコードされた前記参照シグナルを解読するように構成された解読センサーを更に含む、［６４］に記載の前記統合システム。
［６６］
前記温度調節モジュールが、ＰＣＲの達成に適した温度を通して、前記分析ゾーンの前記温度を反復して循環させるように構成された、［６３］に記載の統合システム。
［６７］
前記ローディングゾーンが、前記サンプル源における前記多数の細胞の物理的特性を測定し、前記物理的特性に基づいて前記サンプル源をソートするように構成されたソーティング領域を更に含む、［６３］に記載の統合システム。
［６８］
前記ソーティング領域がスイッチを含む、［６７］に記載の統合システム。
［６９］
前記ソーティング領域が廃棄物リザーバーに流体的につながった、［６７］に記載の統合システム。
［７０］
標的ＤＮＡ配列の増幅に必要な１以上の試薬の溶液を含む試薬源を更に含む、［６３］に記載の統合システム
ここにおいて、前記ローディングゾーンは、流体的に前記試薬源に結合した試薬フローチャネルおよび前記試薬源を前記サンプルフローチャネルに導入するための前記サンプルフローチャネルを更に含む。
［７１］
前記分析ゾーンが、前記マイクロリアクターにおける前記増幅産物の前記測定に基づいて、前記ナノリッター微小容器をソートするように構成されたソーティングスイッチを更に含む、［６３］に記載の統合システム。
［７２］
前記プロセッサーがエラー訂正アルゴリズムを含む、［６３］に記載の統合システム。
［７３］
以下を含む、マイクロ流体環境において、細胞毎に表現型および遺伝型情報を関連付ける方法：
水性環境にて多数の細胞を含むサンプル溶液および前記サンプル溶液に不混和性のカプセル化溶液を提供すること；
前記サンプル溶液および前記カプセル化溶液をマイクロ流体ネットワークに導入すること；
前記サンプル溶液にてそれぞれの細胞の前記表現型を連続的に測定すること；
前記マイクロ流体ネットワークにて、前記サンプル溶液および前記カプセル化溶液を組み合わせて、前記サンプル溶液を多数のナノリッター微小容器に分離すること；
ナノリッター微小容器の前記流れを参照シグナルでコード化すること；
第１および第２の末端を有し、互いに流体的につながった多数の平行区画および前記多数の区画の前記第１および第２の末端に位置する多数のガス抜き管を含む蛇行チャネルに、前記多数のナノリッター微小容器を導入すること；
前記多数のナノリッター微小容器にて標的ＤＮＡ配列するために、前記蛇行チャネルを反復性温度サイクリングに供すること；
前記多数のナノリッター微小容器にて前記増幅産物を測定すること；および
前記参照シグナルを解読し、それぞれのマイクロリアクターからの増幅産物の測定と、それぞれのマイクロリアクターにおける細胞の表現型測定とを関連付けすること。
［７４］
前記組み合わせる工程が以下を含む、［７３］に記載の方法
前記サンプル溶液をサンプルフローチャネルに導入すること；
前記カプセル化溶液を、前記サンプルフローチャネルに流体的に結合した側方フローチャネルに導入すること；および
前記側方フローチャネルの下流にて前記サンプルフローチャネル内の前記サンプル溶液が多数のナノリッター微小容器に分割するように、前記側方フローチャネルにおけるフロー条件を誘導すること。
［７５］
前記マイクロ流体ネットワークが更に廃棄物リザーバーを含み、サンプル溶液中の細胞を、表現型測定に基づいて、標的および非標的細胞にソーティングし、前記非標的細胞を廃棄物リザーバーに移す工程を更に含む、［７３］に記載の方法。
［７６］
前記温度サイクリングが前記蛇行チャネルを加熱した空気に供することを含む、［７３］に記載の方法。
［７７］
前記多数のガス抜き管がローディングの際に前記蛇行チャネルを封鎖するように構成される機械的シールを含む、［７３］に記載の方法。
［７８］
前記蛇行チャネルを反復性温度サイクリングに供したときに、前記多数のガス抜き管が、前記蛇行チャネルにおけるナノリッター微小容器の前記流れに沿った熱膨張を最小化するように構成される、［７７］に記載の方法。
［７９］
前記多数のガス抜き管が温度サイクリングの際に外部環境から前記蛇行チャネルを分離するよう構成されたシールを含む、［７８］に記載の方法。
［８０］
標的ＤＮＡ配列の増幅が定量的ＰＣＲを行うことを含む、［７９］に記載の方法。
［８１］
標的ＤＮＡ配列の増幅がマルチプル定量的ＰＣＲサイクルを行うことを含む、［８０］に記載の方法。
［８２］
９０％を超える前記多数のナノリッター微小容器が０または１個の細胞を含む、［７３］に記載の方法。
［８３］
８０％を超える前記多数のナノリッター微小容器が０または１個の細胞を含む、［７３］に記載の方法。
［８４］
７０％を超える前記多数のナノリッター微小容器が０または１個の細胞を含む、［７３］に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
0005547071.tif 000014
【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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