(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における組織損傷後の治癒を促進するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項２】
該医薬組成物が創縫合を促進する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
該医薬組成物が瘢痕形成を低減する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
該医薬組成物が組織再生を促進する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
該医薬組成物が、該組織の破壊に必要な圧力（stress）または張力（strain）を増大する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
該医薬組成物が、該組織における幹細胞分化を促進する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象における組織の炎症を軽減するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項８】
対象における線維性組織形成を低減するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項９】
該対象が美容整形を受けている、請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該組織損傷が、切屑（scrape）、切断、切開、火傷、褥創、身体の刺し傷、咬創、刺創、銃創、外科創傷、伸展損傷、挫滅、圧迫損傷、骨折、捻挫、損傷（strain）、発作、梗塞、動脈瘤、ヘルニア形成、虚血、瘻孔化、脱臼、放射線、細胞、組織または臓器移植、または癌の結果生じる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
該組織損傷が、皮膚損傷、筋肉損傷、脳損傷、眼損傷、または脊髄損傷である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該組織損傷が、関節損傷、背部損傷、心臓損傷、血管系損傷、軟組織損傷、軟骨損傷、リンパ節損傷、腱損傷、靱帯損傷、または腹部損傷である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
該コードされたポリペプチドが、アルファコネキシンのカルボキシ末端の５から１９個の隣接アミノ酸を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
該コードされたポリペプチド変異体が、カルボキシ末端アミノ酸配列からの１個のアミノ酸の欠失を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
該アルファコネキシンが、コネキシン３０．２、コネキシン３１．９、コネキシン３３、コネキシン３５、コネキシン３６、コネキシン３７、コネキシン３８、コネキシン３９、コネキシン３９．９、コネキシン４０、コネキシン４０．１、コネキシン４３、コネキシン４３．４、コネキシン４４、コネキシン４４．２、コネキシン４４．１、コネキシン４５、コネキシン４６、コネキシン４６．６、コネキシン４７、コネキシン４９、コネキシン５０、コネキシン５６またはコネキシン５９からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
該アルファコネキシンが、コネキシン３７、コネキシン４０、コネキシン４３、またはコネキシン４５である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
該コードされたポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該コードされたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
該コードされたポリペプチドが、配列番号１のＣ末端の９アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
該コードされたポリペプチドが、細胞内在化配列をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
該細胞内在化配列が、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポルタン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−Ｉ、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジン−スペルミジン−コレステロール）、およびＢＧＴＣ（ビス−グアニジン−トレン−コレステロール）からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
該細胞内在化配列がアンテナペディアであり、該配列が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
該コードされたポリペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
損傷前に細胞または組織を予め処理するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項２５】
アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組成物であって、局所投与のための製剤である、組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、組成物。
【請求項２６】
該組成物がコラーゲンビヒクル溶液である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
該製剤が、軟膏、ローション、クリームまたはジェルである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
該ジェルがpluronic（登録商標）ジェルである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
該製剤がポロキサマーを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
該コードされたポリペプチドが、アルファコネキシンのカルボキシ末端の５から１９個の隣接アミノ酸を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３１】
該アルファコネキシンが、コネキシン３０．２、コネキシン３１．９、コネキシン３３、コネキシン３５、コネキシン３６、コネキシン３７、コネキシン３８、コネキシン３９、コネキシン３９．９、コネキシン４０、コネキシン４０．１、コネキシン４３、コネキシン４３．４、コネキシン４４、コネキシン４４．２、コネキシン４４．１、コネキシン４５、コネキシン４６、コネキシン４６．６、コネキシン４７、コネキシン４９、コネキシン５０、コネキシン５６またはコネキシン５９からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３２】
該アルファコネキシンが、コネキシン３７、コネキシン４０、コネキシン４３、またはコネキシン４５である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３３】
該コードされたポリペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
該コードされたポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
該コードされたポリペプチドが、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３６】
該コードされたポリペプチドが、細胞内在化配列をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３７】
該細胞内在化配列が、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチン、Ａｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポルタン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−Ｉ、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジン−スペルミジン−コレステロール）、およびＢＧＴＣ（ビス−グアニジン−トレン−コレステロール）からなる群から選択されるタンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
該細胞内在化配列がアンテナペディアであり、該配列が、配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
該コードされたポリペプチドが、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項４０】
抗生物質、ステロイド、鎮痛剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、化学療法剤、または他の治療ペプチド、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項４１】
対象における組織損傷後の治癒を促進するためのキットであって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸；および、薬学的に許容される担体を含み、ジェル、包帯、スプレー、ドロップ、シロップ、液体、使い捨てチューブまたはポーチをさらに含む、キットであって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、キット。
【請求項４２】
アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸の、組織治癒を促進するための薬剤の製造における使用であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、使用。
【請求項４３】
組織治癒を促進するための薬剤の製造における配列番号２のアミノ酸配列をコードする単離された核酸の使用。
【請求項４４】
コネキシン３７のカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸であって、該コードされたポリペプチドは、全長コネキシン３７タンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させ、該コードされたポリペプチドは、さらに細胞内在化配列を含む、単離された核酸。
【請求項４５】
該コードされたポリペプチドが、コネキシン３７のカルボキシ末端の５から１９個の隣接アミノ酸を含む、請求項４４に記載の単離された核酸。
【請求項４６】
該コードされたポリペプチドが、配列番号４３と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の単離された核酸。
【請求項４７】
配列番号３、４、５、１０、１１および１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項４８】
対象における組織損傷後の治癒を促進するための物質であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸でコートされた物質であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、物質。
【請求項４９】
該物質が人工物質（bio-engineered material）である、請求項４８に記載の物質。
【請求項５０】
該物質が培養骨格（tissue engineered scaffold）である、請求項４８に記載の物質。
【請求項５１】
該物質が、義四肢、乳房インプラント、陰茎インプラント、精巣インプラント、義眼、顔面インプラント、人工関節、人工心臓弁、人工血管、義歯、顔面補綴、傾斜円板弁（tilted disc valve）、ケージドボール弁（caged ball valve）、義耳、義鼻、人工内耳、および皮膚代替物からなる群から選択される医用移植片である、請求項４８に記載の物質。
【請求項５２】
該物質が、包帯、絆創膏（steri−strip）、縫合糸、ステープル、または移植片からなる群から選択される、請求項４８に記載の物質。
【請求項５３】
創傷部位における線維芽細胞移動を阻止するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項５４】
炎症反応を生じる事象後の炎症細胞移動を低減するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項５５】
該炎症細胞が好中球である、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
炎症反応を生じる事象後の炎症細胞の密度を低下するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項５７】
創傷部位の再上皮形成のための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項５８】
損傷後の毛嚢の再生のための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項５９】
星状細胞の密度を低下するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【請求項６０】
脳損傷後のニューロンの密度を増加するための医薬組成物であって、アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列の４から３０個の隣接アミノ酸、または前記隣接アミノ酸と少なくとも９０％の同一性を有するその変異体を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を含む、医薬組成物であって、該コードされたポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まず、該コードされたポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加させる、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、２００４年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／６３８，３６６号、および２００５年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／６７１，７９６号に優先権の利益を主張し、それらは参照によりその全体が本明細書中に包含される。
【０００２】
承認
本発明は、国立衛生研究所により許可された補助金ＲＯ−Ｉ ＨＬ５６７２８の下に、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
トカゲが尻尾を切り離すとき、それが最終的に増殖するだろうことは、平均的な子供に知られている。さらに、多くの下等動物が、損傷後の全四肢および臓器を含む、非常に複雑な構造を再生し得ることは、そのような事柄を勉強している子供達および大人によく理解される。例えば、魚類は、古い心臓のかなりの部分が削り取られた後、心臓を再び増殖することができる(Poss et al., 2002)。このことは、心臓が、ほとんどの動物の瞬間瞬間の生存に如何に不可欠であるかを考えるとき、驚くべき結果である。
【０００４】
しかしながら、ヒトにおける損傷後の組織、四肢および臓器の再生は、魚と全く同じようにはいかない。機械的損傷、疾患過程および他の原因により損傷を受けたヒト組織が、治癒可能であるとはいえ、複雑な組織構造および機能が完全に修復することは滅多にない。むしろ、ヒトおよび他の高等脊椎動物における損傷からのほぼ全ての組織の回復は、瘢痕組織の形成が大部分を占める。この最も身近な例は、皮膚切断または擦り傷の治癒後に残存する変色および線維化した傷跡である。脳または脊髄への損傷後のグリア性瘢痕組織の形成が、中枢神経系への損傷後の神経機能の回復の主な妨げとなることは、あまり有り難くない(Silver and Miller JH, 2004)。そのような瘢痕化を処置または予防し、損傷後の複雑な組織構造および機能の再生を促進する方法は、現在存在しない。
【発明の開示】
【０００５】
発明の概要
アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド(本明細書中、アルファコネキシン カルボキシ末端(ＡＣＴ)ポリペプチドとも称される)、またはその保存的変異体を提供する。本明細書中、対象における組織損傷後の創傷治癒を促進する方法であって、１個以上の本発明に記載の組成物(例えば、ポリペプチド、核酸、またはベクター)および薬学的に許容される担体を該対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００６】
開示した方法および組成物のさらなる利点は、下記の説明に一部記載され、該説明から一部理解され得るか、または開示した方法および組成物の実施により知得され得る。該開示された方法および組成物の利点は、特許請求の範囲において特に指摘された構成要素および組み合わせにより実現および達成されるだろう。上記の一般的記載および下記の詳細な記載の両方が、単に例示的および説明的であって、請求する本発明の範囲を制限するものではないことは、理解されるべきである。
【０００７】
図面の簡単な説明
本明細書中に包含され、本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示した方法および組成物のいくつかの態様、ならびに開示した方法および組成物の原則を説明するのに用いる説明を記載する。
【０００８】
図１は、アルファコネキシン カルボキシ末端(ＡＣＴ)ポリペプチドが、培養した新生仔筋細胞におけるＣｘ４３ギャップ結合形成の程度を増加することを示す。新生仔ラット心臓由来の筋細胞を、標準プロトコールに従い組織培養ディッシュ上でコンフルエントに近い単層を形成するまで増殖させた。その後、培養物を、（ａ）３０μＭ ＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)、（ｂ）３０μＭ非活性対照ペプチド(配列番号５５)、または（ｃ）ＡＣＴペプチドを含まないまたは対照を含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)、を含む培養培地中、さらに５日間培養した。ペプチドまたはビヒクル対照を添加した培養培地を、実験中、２４時間毎に変えた。（ａ）は、対照条件（ｂ）および（ｃ）と比較して、ＡＣＴペプチドが、筋細胞間のＣｘ４３ギャップ結合形成（矢印により示された点および線）の程度を大幅に増加することを示す。ＡＣＴペプチドに応答してのＣｘ４３ギャップ結合形成のこの増加は、Ｃｘ４３を発現する多くの細胞型に共通である。
【０００９】
図２は、ＡＣＴペプチドが、スクラッチにより損傷した形質転換した線維芽細胞(ＮＩＨ−３Ｔ３細胞)の増殖および移動を阻止することを示す。ＮＩＨ−３Ｔ３単層は、２４時間、ＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)で予め処理され、ｐ２００ピペットチップを用いて“スクラッチ傷を付けた”。その後、“スクラッチ傷”を、（ａ、ｂ）３０μＭ ＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)、（ｃ、ｄ）３０μＭ 非活性対照ペプチド(配列番号５５)、または（ｅ、ｆ）ＡＣＴペプチドを含まないかまたは対照ペプチドを含むビヒクル対照溶液、の存在下で２４時間、“治癒”させる。ＡＣＴペプチド処理した細胞の“スクラッチ傷”は、２４時間後に比較的未治癒のままであり（ａ）、わずかな細胞(大きな矢印)が、最初の“スクラッチ傷”端内の領域(すなわち、小さな黒い矢印で示される領域内)に再増殖する。対照的に、（ｃ）および（ｅ）の対照条件において、多数の細胞(大きな矢印)が、最初の“スクラッチ傷”内の領域に再増殖した。“スクラッチ傷”の再増殖は、“スクラッチ傷”領域中に進入する形質転換細胞の移動により一部起こる。図（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）は、“スクラッチ傷”中または損傷端での細胞の増殖性細胞核抗原(ＰＣＮＡ)での免疫標識を示す。ＡＣＴペプチド処理細胞（ｂ）は、バックグラウンドおよび非増殖と一致した低明度のみを示す。（ｄ）および（ｆ）で示される２つの対照条件のみが、明るく標識された増殖細胞(白色矢印)を示す。これは、ＡＣＴペプチドが、形質転換細胞の増殖を低減させることも示す。
【００１０】
図３は、実験細胞モデルにおいて、損傷後のＡＣＴペプチドによる移動の阻止の定量化を示す。ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞に“スクラッチ傷”をつけ、図２に記載の通り、３０μＭ ＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)の存在下、または対照条件に連続的に２４時間付す。図（ａ）は、２４時間後のＡＣＴペプチドおよび非活性ペプチド処理対照細胞の損傷端を示す。細胞を、可視化を目的として蛍光ファロイジンで標識した。ＡＣＴペプチド処理細胞は、スクラッチ傷領域（白色双頭矢印)の低レベルの再増殖を示す。図（ｂ）は、２４時間後に、スクラッチ傷を再増殖する細胞領域％の棒グラフを示す。ＡＣＴペプチド存在下での損傷領域における細胞の減少は、劇的である（p＜0.000001）。
【００１１】
図４は、上皮細胞ＷＢ−Ｆ３４４における、プロモーターと作動可能に連結されたＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現が、実験細胞モデルにおいてスクラッチ傷後の移動を阻止することを示す。ＷＢ−Ｆ３４４細胞は、単離したラット肝臓細胞を発癌物質で処理することにより得られる形質転換したラット上皮細胞株である(Tsao et al., 1984; Hayashi et al, 1997; Hayashi et al., 1998; Hayashi et al., 2001)。ＷＢ−Ｆ３４４細胞を、ｃＤＮＡ発現プラスミド構築物を用いてトランスフェクトし、プロモーター配列と作動可能に連結されたＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチド(配列番号６)、または対照として、プロモーター配列と作動可能に連結された緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)ポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株を作製するための標準プロトコールを用いて、抗生物質の存在下に選択した。ＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＧＦＰもコードする。そのようなものとして、ＡＣＴペプチドの発現を、光学顕微鏡にて標準的ＧＦＰ蛍光により分析することができる。（ａ）および（ｂ）は、ＧＦＰ＋カルボキシ末端ＡＣＴペプチド配列（ａ）またはＧＦＰのみ（ｂ）を発現するＷＢ−Ｆ３４４細胞株におけるＧＦＰ蛍光の高倍率画像を示す。ＷＢ−Ｆ３４４細胞株のコンフルエントに近い単層を、“スクラッチ傷”を付け、２４時間“治癒”させた。ビヒクルまたは非活性対照ペプチドで処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞の対照の場合と同様に、ＧＦＰを発現する対照上皮細胞株が、スクラッチ傷を再増殖した（ｄ）。しかしながら、プロモーター配列と作動可能に連結されたＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を安定に発現する上皮細胞株において、スクラッチ傷の再増殖は阻止された（ｃ）。
【００１２】
図５は、ＡＣＴペプチドが、新生仔マウスにおいて、切開皮膚損傷後の炎症を軽減し、治癒を改善し、そして瘢痕化を低減することを示す。複数の新生仔マウスを、低体温で鈍化させた。４ｍｍ長の切開皮膚損傷を、外科用メス（scalpel）を用いて、肩甲骨間の背側正中線における皮膚の全層(下層の筋肉レベルに至るまで)を通して作製した。その後、含まない(対照)または６０μＭの濃度で溶解したＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)を含む２０％ pluronic(Ｆ−１２７)ゲルの溶液３０μｌを、切開損傷に適用した。対照またはＡＣＴペプチドを含むゲルを、最初の適用後、連続して２４時間用いた。対照およびＡＣＴペプチドを含むゲルを、第二の適用後、それ以上には用いなかった。４８時間までに、ＡＣＴペプチド処理した損傷（ａ）が、ＡＣＴペプチドを受容しない対照損傷（ｂ）で見られるよりも、顕著により、炎症がより少なく、あまり腫れておらず(創傷端の隆起を意味する)、そして一般的により治癒している。炎症におけるこれらの相違、対照で処理した損傷とＡＣＴペプチドで処理した損傷の腫れおよび治癒は、７２時間点（ｃ、ｄ）および９６時間点（ｅ、ｆ）で継続した。７日で、ＡＣＴペプチド創傷（ｇ）は、対照ペプチド処理損傷（ｈ）で見られるよりも平滑であり、瘢痕化が低下した。同じ動物での同じ損傷の画像が、治癒経時変化における異なる時間点で示されることに注意すること。
【００１３】
図６は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける大きな切除皮膚損傷後の炎症を軽減し、治癒を改善し、そして瘢痕化を低減することを示す。麻酔した成体マウスに、肩甲骨間の背側正中線における下層の筋肉に至るまでの８ｍｍ幅の円形切除皮膚損傷を、鋭利な外科用はさみを用いて作製した（すなわち、（ａ）および（ｂ）に示す通り）。損傷の境界を、プラスチックシート中、８ｍｍ幅の円形テンプレート切断により定めた。その後、含まない(対照)または１００μＭの濃度で溶解したＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)を含む３０％ pluronicゲルの溶液１００μｌを、切除損傷に適用した。対照またはＡＣＴペプチドを含むゲルを、最初の適用後、連続して２４時間用いた。対照およびＡＣＴペプチドを含むゲルを、第二の適用後、それ以上には用いなかった。より早く閉じたＡＣＴペプチド処理した大きな切除損傷（ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ）は、１４日間の経時変化において、ＡＣＴペプチドを受容しない対照損傷（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ）よりも、外見上炎症が低減し、より早く治癒し、そして瘢痕化が低減した。実際、１４日目の対照損傷は、損傷の早急な治癒が不十分であることを示す未だ部分的な疥癬を示す（ｊ）。同じ動物での同じ損傷の画像が、治癒経時変化における異なる時間点で示されることに注意すること。
【００１４】
図７は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける切除皮膚損傷後の炎症性細胞の密度を低下することを示す。創傷部位全体の皮膚生検を、図６に記載の実験において、切除損傷の２４時間後に何匹かのマウスから採取した。図（ａ）および（ｂ）は、対照およびＡＣＴペプチド処理した損傷それぞれの創傷のほぼ中央からの横断面の低倍率概観図を示す。正常な組織学的所見の皮膚により囲まれた創傷端(小さい矢印で示した)を、両方の場合に観察することができる。黒色の長方形は、（ａ）および（ｂ）の左側の創傷端上に位置する。これらの２個の長方形内の組織学的構造を、対照およびＡＣＴペプチド処理した組織のそれぞれに関して、（ｃ）および（ｄ）に高倍率で示す。最も興味があるのは、損傷基底部から創傷端および損傷外表面までまたはその近くまでの整列した線維性物質の“襟様（collar−like）”組織(矢印)である。整列した線維性物質は、ＡＣＴペプチド処理した損傷（ｃ）よりも、対照損傷（ｄ）においてより組織化されている外観を有する。また、ＡＣＴペプチド処理した組織において、線維性物質が点在するかなり低密度の炎症性細胞が存在する。これは、（ｃ）および（ｄ）で見られる黒い長方形内の組織切片領域が高倍率でそれぞれ見られる、（ｅ）および（ｆ）で確認される。整列した線維性物質が点在する炎症性細胞には、マスト細胞、好中球およびマクロファージが含まれる。これらの炎症性細胞は、ＡＣＴペプチド処理した損傷におけるよりも、対照損傷においてより高密度で生じる。
【００１５】
図８は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける切除皮膚損傷後の治癒を促進し、瘢痕化を低減し、そして複雑な組織構造の再生を促進することを示す。図６に記載の実験において１４日間の最後に、切除損傷部位全体の皮膚生検を採取し、これらの皮膚試料からの組織切片を、Ｈ＆Ｅ組織化学的に染色した。図（ａ）および（ｂ）は、ＡＣＴペプチドおよび対照それぞれの損傷のほぼ中央からの横断面の低倍率概観図を示す。正常な組織学的所見の皮膚により囲まれた創傷端(小さい矢印で示した)を、両方の場合に観察することができる。黒色の長方形は、（ａ）および（ｂ）の画像の各損傷のほぼ中央に位置する。これらの２個の長方形内の組織学的構造を、ＡＣＴペプチドおよび対照組織のそれぞれに関して、（ｃ）および（ｄ）に高倍率で示す。ＡＣＴペプチド処理した損傷領域内の組織は、より複雑性を有することが明らかである。ＡＣＴ処理した創傷の外表面には、損傷表面の再上皮形成が完了したことを示す上皮細胞の連続した層が存在するが、該上皮は、創傷のほぼ中央がまだ比較的薄い（ｃ）。毛嚢の再生は、既に、治癒した損傷を覆う新しい上皮中の幹細胞とはデノボで相違して見える(ｃ、小さい矢印)。比較すると、損傷表面の再上皮形成は不完全であり、対照損傷の上皮中の毛嚢を再生する徴候はない（ｄ）。ＡＣＴペプチド処理した損傷皮膚の再形成上皮下に、腺状構造、線維および結合組織、血管組織、筋肉および脂肪細胞を含む、正常な構造的複雑性のかなりの修復が見られる（すべて（ａ、ｃ）に見られる。）。毛嚢と同様に、この組織複雑性は、幹細胞の分化により再生された。対照的に、対照損傷において創傷組織は、この瘢痕組織内に特に見られない組織構造の他の複雑性を有する線維性瘢痕組織の均一の大きなプラグが完全に多数を占めている（ｂ、ｄ）。
【００１６】
図９は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける切除皮膚損傷後の炎症を軽減し、治癒を改善し、そして瘢痕化を低減することを示す。麻酔した成体マウスに、頸部および(上部)背部上に鋭利な外科用はさみを用いて２個の小さな（５ｍｍ直径）切除皮膚創傷を作製した。損傷の境界を、プラスチックシート中、５ｍｍ幅の円形テンプレート切断により定めた。その後、含まない(対照)または１００μＭの濃度で溶解したＡＣＴペプチド(ＡＣＴ ２−配列番号１、ＡＣＴ １−配列番号２、ＡＣＴ ３−配列番号３、ＡＣＴ ４−配列番号４、ＡＣＴ ５−配列番号５)の１種を含む２０％ pluronicゲルの溶液５０−６０μｌを、切除損傷に適用した。対照またはＡＣＴペプチドを含むゲルを、最初の適用後、連続して２４時間用いた。対照およびＡＣＴペプチドを含むゲルを、第二の適用後、それ以上には用いなかった。ＡＣＴ １ (ｅ−ｈ)、ＡＣＴ ２ (ｉ−ｌ)、ＡＣＴ ３ (ｍ−ｐ)、およびＡＣＴ５ (ｕ−ｘ)ペプチドの場合に、より早く閉じた切除損傷は、２４０時間（１０日間）の経時変化において、ＡＣＴペプチド（ａ−ｄ）を受容しない対照損傷よりも、外見上炎症が低減し、より早く治癒し、そして瘢痕化が低減したことを特記し得る。ＡＣＴ ４ ペプチド(ｑ−ｔ)はまた、経時変化において対照よりも治癒の中程度の改善を示したが、他のペプチドよりも程度が低い。同じ動物での同じ損傷が、治癒経時変化における異なる時間点で示されることに注意すること。
【００１７】
図１０は、ＡＣＴペプチドが、成体ラットにおける脳の穿痛損傷後のグリア性瘢痕を形成する星状細胞の数および密度を減少することを示す。（ｂ）および（ｃ）は、ＡＣＴペプチド(１００μＭ)＋ビヒクルゲル（ｂ）または対照としてコラーゲンビヒクルゲルのみ（ｃ）で満たした、脳組織(皮質)を覆う中空線維膜(ＨＦＭ)移植片の切片の低倍率概観図を示す。対照組織（ｃ）において、高密度の免疫標識したＧＦＡＰ陽性星状細胞が、ＨＦＭにより生じる損傷部位近くで観察される。これらの細胞の密度は、損傷からわずかに遠位で減少するように見える。対照的に、より低密度のＧＦＡＰ陽性星状細胞が、ＡＣＴペプチドで満たしたＨＦＭ付近で観察される（ｂ）。実際、ＧＦＡＰ陽性細胞のレベルは、正常な損傷を受けていない脳組織に見られるのと異ならない。図（ｂ）および（ｃ）中の白色長方形内の組織領域は、（ｄ）および（ｅ）それぞれにて高倍率で示される。ＡＣＴペプチドで処理した脳損傷（ｄ）において、ＧＦＡＰ陽性星状細胞が、数が少ないだけでなく、対照損傷（ｅ）で見られるよりも小さいことが判明し得る。
【００１８】
図１１は、ＡＣＴペプチドが、成体ラットにおける脳の穿痛損傷後の神経維持および神経再生を促進することを示す。（ａ）および（ｂ）は、脳の穿痛損傷後１週間に、対照としてコラーゲンビヒクルゲルまたはＡＣＴペプチド＋ビヒクルゲルで満たした脳組織(皮質)を覆う中空線維膜(ＨＦＭ)移植片(移植または損傷境界を矢印で示す)の切片の低倍率概観図を示す。対照組織（ｂ）において、高密度の免疫標識したＧＦＡＰ陽性星状細胞および低密度のＮｅｕＮ免疫標識したニューロンが、ＨＦＭにより生じる損傷部位近くで観察される。これらの細胞の密度は、ＨＦＭから遠位で、それぞれ減少および増加するように見える。対照的に、より低密度のＧＦＡＰ陽性星状細胞およびより数の多いＮｅｕＮ免疫標識したニューロンが、ＡＣＴペプチドで満たしたＨＦＭ付近（ならびに遠位）で観察される（ａ）。（ａ）および（ｂ）におけるＨＦＭ付近の領域を、高倍率図の（ｃ）および（ｂ）それぞれに示す。また、対照組織（ｄ）において、ＡＣＴペプチド処理した組織（ｃ）と比較して、著しく増加した密度のＧＦＡＰ陽性星状細胞および低減した密度のＮｅｕＮ陽性ニューロンが観察される。相補的パターンが、星状細胞より多く見られるＮｅｕＮ陽性ニューロンを含む、ＡＣＴペプチドを含むＨＦＭ付近で観察される（ｃ）。興味深いことに、高倍率図の（ｃ）は、対照（ｄ）と比較して、分裂過程のニューロンが高頻度で示される。
【００１９】
発明の詳細な説明
開示した方法および組成物は、下記の特定の態様の詳細な説明および本明細書中に包含される実施例、ならびに図面およびその上記および下記の説明を参照することにより、より容易に理解することができる。
【００２０】
アルファコネキシンのカルボキシ末端アミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド(本明細書中、アルファコネキシン カルボキシ末端(ＡＣＴ)ポリペプチドとも称される)、またはその保存的変異体を提供する。１つの局面において、提供したＡＣＴポリペプチドは、組織損傷後に、炎症を軽減し、治癒を促進し、瘢痕化を低減し、引張強度を増強し、そして複合組織再生を促進する。他の局面において、提供したポリペプチドは、コネキシンにより形成されるギャップ結合チャネル重合の範囲を増加する。
【００２１】
開示した組成物および方法は、他に特に記載がなければ、特定の合成方法、特定の分析技術、または特定の試薬に限定されず、それ自体変わってよいが理解されるべきである。本発明に用いた技術は、特定の態様を記載する目的であって、限定することを意図しないことも理解されるべきである。
【００２２】
使用され得る、併用され得る、製造に使用され得る物質、組成物および成分、または開示した方法および組成物の製品を開示する。これらおよび他の物質は本明細書で開示され、これらの物質の組み合わせ、集合物、結合物、群などは、これらの化合物のそれぞれ様々な個々および集合的組み合わせおよび順列への特定の言及が、明確に開示され得ないが、それぞれが、本明細書中で具体的に意図され説明されることを開示されていると、理解される。例えば、ベクターが開示され、検討され、プロモーターを含む多数のベクター成分が検討されるとき、プロモーターおよび他のベクター成分のあらゆる組み合わせおよび置換、および可能性のある修飾が、それを否定する記載がない限り、特に意図される。故に、分子Ａ、Ｂ、およびＣのクラスが開示され、ならびに分子Ｄ、Ｅ、およびＦのクラス、および分子の組み合わせ例であるＡ−Ｄが開示されるとき、そして、それぞれが個々に記載されないときでも、それぞれが個々にかつ集合的に意図される。故に、この例として、それぞれの組み合わせであるＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆが特に意図され、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；ならびに、組み合わせ例であるＡ−Ｄの記載から開示されたと見なされるべきである。同様に、これらの何らかの集合または組み合わせも、特に意図され、開示される。故に、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの部分集合が、特に意図され、Ａ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ;および、組み合わせ例であるＡ−Ｄの記載から明らかになると見なされるべきである。この概念を、開示した組成物を作製および使用する方法における工程を含むが、これに限定されない本発明の全ての局面に適用する。故に、実行され得る様々なさらなる工程があるとき、これらのさらなる工程はそれぞれ、開示の方法の何れかの特定の態様または態様の組み合わせを用いて実行可能であり、かかる組み合わせはそれぞれ、特に意図され、開示されたと見なされるべきであることは、理解される。
【００２３】
様々な配列が本明細書中で提供され、これらおよびその他を、Genbankのwww.pubmed.govに見出すことができる。当業者は、配列不一致および相違をいかに解決するか、および特定の配列の組成物および方法を如何にして他の関連する配列に適合させるかを理解する。プライマーおよび／またはプローブを、本明細書に記載のおよび当技術分野で公知の情報を与える何らかの配列のために設計することができる。
【００２４】
本明細書で提供したポリペプチドは、アルファコネキシンのカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸を含む何らかのポリペプチド（ここで、該ポリペプチドは、全長アルファコネキシンタンパク質を含まない。）であり得る。故に、１つの局面において、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンの細胞質Ｎ末端ドメインを含まない。他の局面において、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンの２つの細胞外ドメインを含まない。他の局面において、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンの４つの膜貫通ドメインを含まない。他の局面において、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンの細胞質ループドメインを含まない。他の局面において、提供したポリペプチドは、４番目の膜貫通ドメイン近位にあるアルファコネキシンの細胞質カルボキシ末端ドメインの配列の一部を含まない。カルボキシ末端のほとんどのアミノ酸のから、１７から３０アミノ酸に常に位置する、アルファコネキシンにおいて保存されたプロリンまたはグリシン残基が存在する(表２)。例えば、ヒトＣｘ４３に関して、アミノ酸３６３のプロリン残基は、カルボキシ末端（ほとんどがイソロイシン）から１９アミノ酸前に位置する。他の例において、ニワトリＣｘ４３に関して、アミノ酸３６２のプロリン残基は、カルボキシ末端（ほとんどがイソロイシン）から１８アミノ酸前に位置する。他の例に置いて、ヒトＣｘ４５に関して、アミノ酸３７７のグリシン残基は、カルボキシ末端（ほとんどがイソロイシン）から１９アミノ酸前に位置する。他の例において、ラットＣｘ３３に関して、アミノ酸２５８のプロリン残基は、カルボキシル末端（ほとんどがメチオニン）から２８アミノ酸前に位置する。故に、他の局面において、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンの該保存されたプロリンまたはグリシン残基の近位のアミノ酸を含まない。故に、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンのＣ末端のほとんどの４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸を含む、アルファコネキシンのＣ末端のほとんどの４から３０個のアミノ酸を含み得る。
【００２５】
提供したペプチドにおけるアルファコネキシンのカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸は、非アルファコネキシンまたは非ＡＣＴペプチドコネキシン アミノ酸に隣接し得る。隣接非アルファコネキシンおよび非ＡＣＴコネキシン アミノ酸の例を、本明細書で提供する。非ＡＣＴコネキシン アミノ酸の例は、ヒトＣｘ４３のカルボキシ末端の２０から１２０アミノ酸である(配列番号７２)。他の例は、ニワトリＣｘ４３のカルボキシ末端の２０から１２０アミノ酸であり得る(配列番号７３)。他の例は、ヒトＣｘ４５のカルボキシ末端の２０から１２０アミノ酸であり得る(配列番号７４)。他の例は、ニワトリＣｘ４５のカルボキシ末端の２０から１２０アミノ酸であり得る(配列番号７５)。他の例は、ヒトＣｘ３７のカルボキシ末端の２０から１２０アミノ酸であり得る(配列番号７６)。他の例は、ラットＣｘ３３のカルボキシ末端の２０から１２０アミノ酸であり得る(配列番号７７)。
【００２６】
非アルファコネキシンの例は、増強した緑色蛍光タンパク質の２３９アミノ酸配列である(ＡＣＴ１は、図４にて、ＧＦＰと機能的に融合して示される；配列番号７８)。他の局面において、ＡＣＴ１は、ＧＦＰの２３９アミノ酸配列のカルボキシ末端と融合するとき、機能的であることが示されていることを考慮すると(例えば、図４)、ＡＣＴペプチドは、少なくとも２３９アミノ酸までの非コネキシン ポリペプチドと隣接するとき機能性を保持すると予想される。実際、ＡＣＴ配列が、特定のポリペプチドの遊離カルボキシ末端として維持される限り、ＡＣＴペプチドは、その標的に接近し得る。故に、ＡＣＴペプチドに加えて過剰な２３９アミノ酸を含むポリペプチドは、損傷後の炎症を軽減し、治癒を促進し、引張強度を増加し、瘢痕化を低減し、そして組織再生を促進するように機能し得る。
【００２７】
コネキシンは、細胞間コミュニケーションに関与するギャップ結合チャネルのサブユニットタンパク質である(Goodenough and Paul, 2003)。ヌクレオチド配列の保存パターンに基づき、コネキシンタンパク質をコードする遺伝子は、アルファおよびベータコネキシン遺伝子の２つのファミリーに分けられる。アルファコネキシンのカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸配列は、多数の特徴および保存された特性により特徴付けられる(表２を参照のこと)。組織化のこの保存は、特徴的３Ｄ構造の形成、複数のパートナーとなるタンパク質との相互作用、脂質および膜との相互作用の仲介、ＤＮＡを含む核酸、輸送および／または阻止膜チャネルとの相互作用のためのＡＣＴペプチドの能力と一致し、タンパク質分解的切断、タンパク質架橋、ＡＤＰリボシル化、グリコシル化およびリン酸化のためのコンセンサス配列を提供する。故に、通常、提供したポリペプチドは、該タンパク質のアルファコネキシンのカルボキシ末端との結合を仲介するタンパク質のドメインと相互作用する。例えば、腎芽細胞腫過剰発現タンパク質(ＮＯＶ)は、Ｃｘ４３ Ｃ末端ドメインと相互作用する(Fu et al, J Biol Chem. 2004 279(35):36943−50)。このおよび他のタンパク質が、アルファコネキシンのカルボキシ末端と相互作用し、さらに、高分子複合体を形成する他のタンパク質と相互作用すると考えられる。故に、提供したポリペプチドは、例えば、Ｃｘ４３ギャップ結合チャネルの集合の調節に関与するような分子機構の働きを阻止し得る。
【００２８】
本明細書で用いる“阻止する”、“阻止の”および“阻止”は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターを低下させることを意味する。これには、活性、応答、状態、または疾患の完全な喪失が含まれ得るが、それらに限定されない。これにはまた、例えば、天然または対照レベルと比べて、活性、応答、状態または疾患の１０％の低下が含まれ得る。故に、低下は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の何れかの低下量であり得る。
【００２９】
提供したポリペプチドのＡＣＴ配列は、何れかのアルファコネキシン由来であり得る。故に、提供したポリペプチドのアルファコネキシン成分は、ヒト、マウス、ウシ、モグラ（monotrene）、有袋動物、霊長動物、げっ歯動物、鯨類、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、魚類、脊椎動物、原索動物または他のアルファコネキシン由来であり得る。
【００３０】
故に、提供したポリペプチドには、マウスコネキシン４７、ヒトコネキシン４７、ヒトコネキシン４６．６、ウシコネキシン４６．６、マウスコネキシン３０．２、ラットコネキシン３０．２、ヒトコネキシン３１．９、イヌコネキシン３１．９、ヒツジコネキシン４４、ウシコネキシン４４、ラットコネキシン３３、マウスコネキシン３３、ヒトコネキシン３６、マウスコネキシン３６、ラットコネキシン３６、イヌコネキシン３６、ニワトリコネキシン３６、ゼブラフィッシュコネキシン３６、モローネコネキシン３５、モローネコネキシン３５、イモリコネキシン３５、フグコネキシン３６、ヒトコネキシン３７、チンパンジーコネキシン３７、イヌコネキシン３７、ハムスター（Cricetulus）コネキシン３７、マウスコネキシン３７、ハムスター（Mesocricetus）コネキシン３７、ラットコネキシン３７、マウスコネキシン３９、ラットコネキシン３９、ヒトコネキシン４０．１、アフリカツメガエルコネキシン３８、セブラフィッシュコネキシン３９．９、ヒトコネキシン４０、チンパンジーコネキシン４０、イヌコネキシン４０、ウシコネキシン４０、マウスコネキシン４０、ラットコネキシン４０、ハムスター（Cricetulus）コネキシン４０、ニワトリコネキシン４０、ヒトコネキシン４３、サル（Cercopithecus）コネキシン４３、ウサギ（Oryctolagus）コネキシン４３、リス（Spermophilus）コネキシン４３、ハムスター（Cricetulus）コネキシン４３、ハムスター（Phodopus）コネキシン４３、ラットコネキシン４３、イノシシ（Sus）コネキシン４３、ハムスター（Mesocricetus）コネキシン４３、マウスコネキシン４３、キャビアコネキシン４３、ウシコネキシン４３、ハリネズミ（Erinaceus）コネキシン４３、ニワトリコネキシン４３、アフリカツメガエルコネキシン４３、ウサギ（Oryctolagus）コネキシン４３、コイ（Cyprinus）コネキシン４３、ゼブラフィッシュコネキシン４３、ジャイアントダニオ（Danio aequipinnatus）コネキシン４３、ゼブラフィッシュコネキシン４３．４、ゼブラフィッシュコネキシン４４．２、ゼブラフィッシュコネキシン４４．１、ヒトコネキシン４５、チンパンジーコネキシン４５、イヌコネキシン４５、マウスコネキシン４５、ウシコネキシン４５、ラットコネキシン４５、ニワトリコネキシン４５、フグコネキシン４５、ニワトリコネキシン４５、ヒトコネキシン４６、チンパンジーコネキシン４６、マウスコネキシン４６、イヌコネキシン４６、ラットコネキシン４６、ハムスター（Mesocricetus）コネキシン４６、ハムスター（Cricetulus）コネキシン４６、ニワトリコネキシン５６、ゼブラフィッシュコネキシン３９．９、ウシコネキシン４９、ヒトコネキシン５０、チンパンジーコネキシン５０、ラットコネキシン５０、マウスコネキシン５０、イヌコネキシン５０、ヒツジコネキシン４９、ハムスター（Mesocricetus）コネキシン５０、ハムスター（Cricetulus）コネキシン５０、ニワトリコネキシン５０、ヒトコネキシン５９、または他のアルファコネキシンからなる群から選択されるコネキシンのＡＣＴが含まれ得る。アルファコネキシンのアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、受託番号で表１に同定されるものが含まれる。
【００３１】
【表１】
0005602891.tif 000002
【表２】
0005602891.tif 000003
【００３２】
故に、提供するポリペプチドは、配列番号１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号９０、または配列番号９１のアミノ酸配列、またはその保存的変異体もしくは断片を含み得る。
【００３３】
アルファコネキシンの２０−３０のカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸配列は、独特かつ保存された組織化により特徴付けられる。この独特かつ保存された組織化は、ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフ(Φ−x−Φ；式中、x＝任意のアミノ酸であり、Φ＝疎水性アミノ酸である；例えば、表２、太字）、ならびにこのモチーフの近位にあるプロリン（Ｐ）および／またはグリシン（Ｇ）ヒンジ残基；高頻度のリン酸化セリン（Ｓ）および／またはリン酸化スレオニン（Ｔ）残基；および、高頻度の正荷電のアルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）および負荷電のアスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸を含み得る。多くのアルファコネキシンに関して、ＰおよびＧ残基は、ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフのカルボキシ末端の近位にあるクラスターモチーフ(例えば、表２、イタリック体)に生じる。ほとんどのアルファコネキシンのＳおよびＴのリン酸化アミノ酸はまた、一般的に、クラスター化したリピート様モチーフ中に組織化される(例えば、表２、下線）。この組織化は、特にＣｘ４３の場合、２０カルボキシ末端のほとんどのアミノ酸の９０％が、後者の７個のアミノ酸からなる。配列の高い保存性のさらなる例において、Ｃｘ４３のＡＣＴペプチド組織化は、ヒトから魚類まで高度に保存されている(例えば、表２のヒトおよびゼブラフィッシュについてのＣｘ４３ ＡＣＴ配列を比較)。他の例において、Ｃｘ４５のＡＣＴペプチド組織化は、ヒトから鳥類まで高度に保存されている(例えば、表２のヒトおよびニワトリについてのＣｘ４５ ＡＣＴ配列を比較)。他の例において、Ｃｘ３６のＡＣＴペプチド組織化は、霊長動物から魚類まで高度に保存されている(例えば、表２のチンパンジーおよびゼブラフィッシュについてのＣｘ３６ ＡＣＴ配列を比較)。
【００３４】
【表３】
0005602891.tif 000004
【００３５】
故に、１つの局面において、提供したポリペプチドは、１）ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフ、２）プロリン（Ｐ）および／またはグリシン（Ｇ）ヒンジ残基；３）リン酸化セリン（Ｓ）および／またはリン酸化スレオニン（Ｔ）残基のクラスター；ならびに、４）高頻度の正荷電アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）および負荷電のアスパラギン酸（Ｄ）および／またはグルタミン酸（Ｅ）アミノ酸からなる群から選択される１個、２個、３個または全てのアミノ酸モチーフを含む。他の局面において、提供したポリペプチドは、カルボキシ末端のＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフ、ＰＤＺ結合モチーフの近位にあるプロリン（Ｐ）および／またはグリシン（Ｇ）ヒンジ残基、ならびにヒンジ残基の近位にある正荷電の残基（Ｋ、Ｒ、Ｄ，Ｅ）を含む。
【００３６】
ＰＤＺドメインは、最初、シナプス後肥厚タンパク質であるＰＳＤ９５／ＳＡＰ９０、ショウジョウバエ腫瘍抑制因子であるｄｌｇ−Ａ、およびタイトジャンクションタンパク質であるＺＯ−１中に保存された配列要素として、同定された。当初は、ＧＬＧＦまたはＤＨＲモチーフと称されていたが、それらは現在、これらの頭文字の３文字からＰＤＺ含有タンパク質(ＰＳＤ９５／ＤＬＧ／ＺＯ−１)として公知である。これらの８０−９０アミノ酸配列は、現在、７５タンパク質よりも多く同定されており、特徴として、単一タンパク質中に複数コピーで発現される。故に、１つの局面において、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンのＰＤＺドメインを含むタンパク質との結合を阻害し得る。ＰＤＺドメインは、本明細書中“ＰＤＺモチーフ”と称される、ＰＤＺ結合モチーフにより埋められ得る、構造的によく定義された相互作用‘ポケット’を有するタンパク質相互作用モジュールの特定のタイプである。ＰＤＺモチーフは、いつもではないが、通常、細胞内カルボキシ末端に位置するコンセンサス配列である。ＰＤＺモチーフの４つのタイプは、Ｉ型(Ｓ／Ｔ−ｘ−Φ)、ＩＩ型(Φ−ｘ−Φ)、ＩＩＩ型(Ψ−ｘ−Φ)およびＩＶ型(Ｄ−ｘ−Ｖ)（ここで、ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、疎水性残基(Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｇ、Ｗ、Ｃ、Ｍ、Ｆ)であり、Ψは、塩基性親水性残基(Ｈ、Ｒ、Ｋ)である。）に分類されている(Songyang, Z., et al. 1997. Science 275, 73−77)。故に、１つの局面において、ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフを含むポリペプチドを提供する。
【００３７】
アルファＣｘ３７の１８個のカルボキシ末端のほとんどのアミノ酸配列が、ＡＣＴペプチド課題の例外的変形を示すことを特記する。Ｃｘ３７ ＡＣＴ様配列は、ＧＱＫＰＰＳＲＰＳＳＳＡＳＫＫＱ＊ＹＶ(配列番号４３)である。故に、Ｃｘ３７のカルボキシ末端の４アミノ酸は、ＩＩ型ＰＤＺ結合ドメインと一部のみ一致する。古典的ＩＩ型ＰＤＺ結合ドメインの代わりに、Ｃｘ３７は、疎水性アミノ酸が予期され得る２位に中性のＱ＊を有する。そのようなＣｘ３７は、ＩＩ型ＰＤＺ結合ドメイン様配列と称されるかもしれない部分を含む。それにもかかわらず、Ｃｘ３７は、クラスター化したセリン残基、高頻度のＲおよびＫ残基ならびにＰＤＺ結合ドメイン様配列の近位にあるＰに富む配列を含むＡＣＴペプチド組織化の全ての他の局面を完全に維持する。上記の７０以上の他のアルファコネキシンと共通したＡＣＴ様組成の全体的保存レベルを考慮して、Ｃｘ３７ ＡＣＴ様カルボキシ末端が、提供された能力で機能することが理解される。
【００３８】
比較のため、ベータコネキシンＣｘ２６を表２に示す。Ｃｘ２６は、カルボキシ末端のＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフを有さない；カルボキシ末端のほとんどのアミノ酸の３０％未満は、Ｓ、Ｔ、Ｒ、ＤまたはＥ残基を含む；ＰおよびＧヒンジ残基のクラスターを含む、ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフまたはＰＤＺ結合様モチーフの近位にあるモチーフが見られない；そして、セリンおよびスレオニンのリン酸化アミノ酸の、クラスター化した、リピート様モチーフが見られない。Ｃｘ２６は、配列のカルボキシ末端付近の次に順にクラスター化した３個のリシン(Ｋ)残基を有している。しかしながら、上記に列記される７０以上のアルファコネキシンで調査されたアルファコネキシンは、カルボキシ末端に３個の繰り返しＫ残基のドメインのこの特徴を示すとは確認されなかった(Ｃｘ２６は、ベータコネキシンであり、故に、ＡＣＴドメインを有さないと定義される)。
【００３９】
本明細書で記載の通り、アミノ酸のこの比較的短いストレッチの独特の機能的特徴は、皮膚および脳と同程度多様な組織における損傷後の炎症を軽減し、治癒を促進し、瘢痕化を低減し、引張強度を増加し、そして複雑な組織構造および機能の再生を促進する、予期せぬ役割を包含する。故に、１つの局面において、提供したポリペプチドは、ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフ(Φ−ｘ−Φ；ここで、ｘ＝任意のアミノ酸、Φ＝疎水性アミノ酸)を含む。他の局面において、提供したＡＣＴポリペプチドの５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上のアミノ酸が、プロリン(Ｐ)、グリシン(Ｇ)、リン酸化セリン(Ｓ)、リン酸化スレオニン(Ｔ)、アルギニン(Ｒ)、リシン(Ｋ)、アスパラギン酸(Ｄ)、またはグルタミン酸(Ｅ)アミノ酸残基の１つ以上を含む。
【００４０】
プロリン(Ｐ)、グリシン(Ｇ)、アルギニン(Ｒ)、リシン(Ｋ)、アスパラギン酸(Ｄ)、およびグルタミン酸(Ｅ)なるアミノ酸は、タンパク質の構造および機能の決定に必須である。プロリンおよびグリシン残基は、機能に必要とされるポリペプチドの折りたたみ構造の形成を可能にする、タンパク質の３Ｄ構造の折りたたみを提供する。荷電アミノ酸配列はしばしば、折りたたみタンパク質の表面に位置し、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−脂質相互作用、酵素−基質相互作用およびタンパク質−核酸相互作用を含む、ポリペプチドにより仲介される化学的相互作用に必要である。故に、他の局面において、ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフの近位にあるプロリン(Ｐ)、グリシン(Ｇ)、リシン(Ｋ)、アスパラギン酸(Ｄ)、およびグルタミン酸(Ｅ)に富む領域は、ＡＣＴペプチドの記載の作用に必要な特徴を提供する。他の局面において、提供したポリペプチドは、ＩＩ型ＰＤＺ結合モチーフの近位にあるプロリン(Ｐ)、グリシン(Ｇ)、リシン(Ｋ)、アスパラギン酸(Ｄ)、および／またはグルタミン酸(Ｅ)に富む領域を含む。
【００４１】
リン酸化は、タンパク質の最も一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質の構造および機能の調節または修飾に重要である。リン酸化により修飾されるタンパク質の構造および機能の局面には、タンパク質構造、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−脂質相互作用、タンパク質−核酸相互作用、チャネル開閉、タンパク質輸送およびタンパク質代謝が含まれる。故に、１つの局面において、リン酸化セリン(Ｓ)および／またはリン酸化スレオニン(Ｔ)に富む配列は、それらの記載の作用において、ポリペプチドの効果を増加または減少する、ＡＣＴペプチドの機能を修飾するのに必要である。他の局面において、提供したポリペプチドは、セリン(Ｓ)および／またはリン酸化スレオニン(Ｔ)に富む配列またはモチーフを含む。
【００４２】
他の例において、ＡＣＴペプチドの定義に関して、魚類のような下等動物における高度の組織／臓器再生の可能性を考慮すると、メチオニンが、ゼブラフィッシュＣｘ４３のＡＣＴ配列のアミノ末端付近に生じることは、非常に都合よい(表２)。メチオニンをコードすることに加えて、メチオニン塩基対のトリプレットは、別の翻訳開始部位でもある。このメチオニンから翻訳が始まるとき、配列ＳＳＲＡＲＰＤＤＬＤＶ(配列番号９０)が作製され得る。この翻訳産物は、標準的なＡＣＴペプチドの保存された顕著な特徴を全て維持する。特に、このペプチドは、カルボキシ末端のＩＩ型ＰＤＺ結合ドメインを含み、ＰＤＺ結合ドメインの近位にあるＰ、ＲおよびＤ残基に富むドメインを有する。さらに、該配列は、そのアミノ末端でＡＣＴペプチド機能を調節する可能性を有する、クラスター化したＳモチーフを含む。このことは、魚類のような高い組織／臓器再生可能性を有する動物が、ＡＣＴペプチド配列を直接翻訳し得るという興味深い可能性をもたらす。
【００４３】
故に、提供したポリペプチドは、ヒト Ｃｘ４３のＣ末端配列を含み得る。故に、提供したポリペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含み得る。ポリペプチドは、ヒトＣｘ４０のカルボキシ末端の９アミノ酸を含み得る。故に、ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含み得る。
【００４４】
特定のタンパク質が本明細書中に記載されるとき、変異体、誘導体および断片が意図される。タンパク質変異体および誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列修飾を伴い得る。例えば、アミノ酸配列修飾は典型的に、３つのクラス：置換変異体、挿入変異体または欠失変異体、の１つ以上に分類される。挿入には、アミノおよび／またはカルボキシ末端融合ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。挿入は、通常、アミノまたはカルボキシ末端融合の挿入よりも少ない挿入、例えば、約１から４個までの残基の挿入である。欠失は、タンパク質配列からの１個以上のアミノ酸残基の除去により特徴付けられる。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異導入、それによる変異体をコードするＤＮＡの作製、およびその後の、組み換え細胞培養でのＤＮＡの発現により作製される。公知の配列を有するＤＮＡの決められた部位での置換変異体を作製するための技術は、よく知られており、例えば、Ｍ１３プライマー変異導入およびＰＣＲ変異導入が含まれる。アミノ酸置換は、一般的に、単一残基で起こるが、一度に多数の異なる位置で起こり得る；挿入は、通常、約１から１０個のアミノ酸残基であり得る。欠失または挿入は、好ましくは、隣接対に行われ、すなわち、２個の残基の欠失、または２個の残基の挿入である。置換、欠失、挿入またはその何れかの組み合わせは、最終構築物に至るまでの組み合わせであり得る。変異は、リーディングフレームの外の配列に位置せず、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造のそのような変化が望まれる場合を除き、ｍＲＮＡの二次構造を作製し得る相補的領域を作製し得ない。置換変異体は、少なくとも１個の残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されているものである。そのような置換は、一般的に、下記の表３に従って作製され、保存的置換と称される。
【００４５】
【表４】
0005602891.tif 000005
【００４６】
例えば、１個のアミノ酸残基と生物学的および／または化学的に類似の別の残基との置換は、保存的置換として当業者に公知である。例えば、保存的置換は、ある疎水性残基を別の残基に、またはある極性残基を別の残基に置換し得る。置換には、表３に示す組み合わせが含まれる。それぞれ明確に開示された配列の保存的置換変異体は、本明細書中に記載のポリペプチドの範囲内に包含される。
【００４７】
一般的に、保存的置換は、得られるポリペプチドの生物学的活性にほとんど影響しない。特定の例において、保存的置換は、ペプチドの生物学的機能に実質的に影響を与えないペプチドにおけるアミノ酸置換である。ペプチドは、１個以上のアミノ酸置換、例えば、２−１０個の保存的置換、２−５個の保存的置換、４−９個の保存的置換、例えば２、５または１０個の保存的置換を含み得る。
【００４８】
ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異またはＰＣＲのような標準的方法を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することにより１個以上の保存的置換を包含して作製され得る。あるいは、ポリペプチドは、標準的ペプチド合成方法を用いて１個以上の保存的置換を包含して作製され得る。アラニンスキャンを、タンパク質のアミノ酸残基が、アミノ酸置換を許容し得るかどうかを同定するために用い得る。一例において、タンパク質の生物学的活性は、アラニン、または他の保存的アミノ酸(例えば、下記に列挙のもの)を、１種以上の天然アミノ酸に置換するとき、２５％よりも減少せず、例えば２０％以下、例えば１０％以下の減少である。
【００４９】
保存的置換についてのさらなる情報は、数ある文献の中で、Ben−Bassat et al.,(J. Bacteriol. 169:751−7, 1987)、O’Regan et al., (Gene 77:237−51, 1989)、Sahin−Toth et al.,(Protein Sci. 3:240−7, 1994)、Hochuli et al.,(Bio/Technology 6:1321−5, 1988)、ならびに遺伝学および分子生物学の標準テキストに見出すことができる。
【００５０】
置換または欠失変異導入は、Ｎ−グリコシル化(Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ)またはＯ−グリコシル化(ＳｅｒまたはＴｈｒ)のための部位を挿入するために用い得る。システインまたは他の不安定な残基の欠失も、望ましいかもしれない。可能性のあるタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば、塩基性残基の欠失またはグルタミン残基またはヒスチジン残基の置換により達成される。
【００５１】
任意の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドへの組み換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミン残基およびアスパラギン残基はしばしば、対応するグルタミン残基およびアスパラリル残基に翻訳後脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman ＆ Co., San Francisco pp 79−86 [1983])、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびにいくつかの例において、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
【００５２】
開示された組成物中に挿入され得る多数のアミノ酸およびペプチド類似体が存在することが理解される。例えば、表３に示すアミノ酸よりも多数の、異なる機能的置換基を有するＤアミノ酸またはアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドと逆の立体異性体、ならびにペプチド類似体の立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、選択したアミノ酸を有するｔＲＮＡ分子を帯電させ、部位特異的方法でペプチド鎖中に類似アミノ酸を挿入するために、例えば、アンバーコドンを利用して遺伝的構築物を作製することにより、ポリペプチド鎖中に容易に挿入され得る(Thorson et al., Methods in Molec. Biol. 77:43−13 (1991), Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348−354 (1992); Ibba, Biotechnology ＆ Genetic Enginerring Reviews 13:197−216 (1995), Cahill et al, TIBS, 14(10):400−403 (1989); Benner, TIB Tech, 12:158−163 (1994); Ibba and Hennecke, Bio/technology, 12:678−682 (1994)、それらは全て、少なくともアミノ酸類似体に関係する物質について、参照により本明細書中に包含される)。
【００５３】
分子は、ポリペプチドに似ているが、天然ペプチド結合により結合し得ないように作製され得る。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体のための結合には、CH2NH−、−CH2S−、−CH2−CH2−、−CH＝CH−(シスおよびトランス)、−COCH2−、−CH(OH)CH2−、および−CHH2SO−(これらおよび他が、Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983); Spatola, A. F., Vega Data (March 1983), Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications (general review); Morley, Trends Pharm Sci (1980) pp. 463−468; Hudson, D. et al, Int J Pept Prot Res 14:177−185 (1979) (−CH2NH−, CH2CH2−); Spatola et al. Life Sci 38:1243−1249 (1986) (−CH H2− S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. 1307−314 (1982) (−CH−CH−、シスおよびトランス); Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392−1398 (1980) (−COCH2−); Jennings−White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 (1982) (−COCH2−); Szelke et al. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (−CH(OH)CH2−); Holladay et al Tetrahedron. Lett 24:4401−4404 (1983) (−C(OH)CH2−);および、Hruby Life Sci 31:189−199 (1982) (−CH2−S−)中に見出され得る；それらはそれぞれ、参照により本明細書中に包含される。）が含まれ得る。ペプチド類似体は、ｂ−アラニン、ｇ−アミノ酪酸などのような結合原子間の２つ以上の原子を有し得ることが理解される。
【００５４】
アミノ酸類似体およびペプチド類似体はしばしば、より経済的な生産、より優れた化学的安定性、増強された薬理学的特性(半減期、吸収、可能性、有効性など)、変化した特異性(例えば、広域の生物学的活性)、減少した抗原性、生物学的障壁(例えば、腸、血管、血液−脳−関門)を越える増加した能力などのような、増強したまたは所望の特性を有する。
【００５５】
Ｄ−アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸がペプチダーゼなどにより認識されないため、より安定なペプチドを作製するのに使用され得る。コンセンサス配列の１個以上のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸での系統的置換(例えば、Ｌ−リシンをＤ−リシンに置換)を、より安定なペプチドを作製するために用い得る。システイン残基を、２個以上のペプチドと共に環化または結合するために用い得る。これは、ペプチドを特定の構造にするのに役立ち得る(Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 :387 (1992)、参照により本明細書中に包含される)。
【００５６】
故に、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンのＣ末端(ＡＣＴ)の保存的変異体を含み得る。表４に示す通り、配列番号２の配列内の単一の保存的置換の例を、配列番号３の配列に示す。配列番号２の配列内の３個の保存的置換の例を、配列番号４の配列に示す。故に、提供したポリペプチドは、配列番号３または配列番号４のアミノ酸を含み得る。
【００５７】
【表５】
0005602891.tif 000006
【００５８】
本明細書中に開示の遺伝子およびタンパク質の何れかの変異体、修飾体、または誘導体を定義するための１つの方法は、特定の公知の配列との配列同一性(本明細書中、相同性とも称される)の点から、変異体、修飾体および誘導体を定義することが理解される。記載のまたは公知の配列と、少なくとも６５、６６、６１、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有する本明細書中に開示の核酸およびポリペプチドの変異体が特に開示される。当業者は、２個のタンパク質または核酸の配列同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、配列同一性は、配列同一性がその最高レベルであるように、２個の配列を整列した後に計算され得る。
【００５９】
配列同一性の別の計算方法は、公開されたアルゴリズムにより実行され得る。比較のための配列の最適アライメントを、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的配列同一性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48:443 (1970)の配列同一性アライメントアルゴリズムにより、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)の類似法の探索により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ)により、または調査により行うことができる。これらの参考文献は、配列同一性を計算する方法について、それらの全体を参照により本明細書中に包含される。
【００６０】
同様の配列同一性は、例えば、Zuker, M. Science 244:48−52, 1989、Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sd. USA 86:7706−7710, 1989、Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281−306, 1989（少なくとも核酸アライメントに関係する物質について、参照により本明細書中に包含される。）に開示されるアルゴリズムにより、核酸について得られる。
【００６１】
故に、提供したポリペプチドは、アルファコネキシンのＣ末端（ＡＣＴ）と、少なくとも６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。故に、１つの局面において、提供したポリペプチドは、配列番号１、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号９０または配列番号９１と、少なくとも６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。例として、ヒトＣｘ４３(配列番号２)のカルボキシ末端上に生じる９アミノ酸の同じストレッチと、６６％の配列同一性を有するポリペプチド(配列番号４)を提供する。
【００６２】
本明細書中で提供したポリペプチドは、対象における組織損傷へ直接添加され得る。しかしながら、提供したポリペプチドの細胞質内局在の効率は、ポリペプチドとシスまたはトランスに化学的に結合する細胞内在化トランスポーターにより増大される。細胞内在化トランスポーターの効率は、Ｔａｔ−ＨＡペプチドを有する細胞の光または同時形質導入により、さらに増大される。
【００６３】
故に、提供したポリペプチドは、細胞内在化トランスポーターまたは配列を含み得る。細胞内在化配列は、当技術分野で公知のまたは新しく開示された何らかの内在化配列、またはその保存的変異体であり得る。細胞内在化トランスポーターおよび配列の非限定例には、アンテナペディア配列、ＴＡＴ、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ペネトラチンＡｎｔｐ−３Ａ（Ａｎｔｐ変異体）、ブフォリンＩＩ、トランスポルタン、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）、Ｋ−ＦＧＦ、Ｋｕ７０、プリオン、ｐＶＥＣ、Ｐｅｐ−１、ＳｙｎＢｌ、Ｐｅｐ−７、ＨＮ−Ｉ、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジン−スペルミジン−コレステロール）およびＢＧＴＣ（ビス−グアニジン−トレン−コレステロール）が含まれる（表５を参照のこと）。
【００６４】
【表６】
0005602891.tif 000007
【００６５】
故に、供されるポリペプチドは、配列番号７、配列番号１４(Bucci, M. et al 2000. Nat. Med. 6, 1362−1367)、配列番号１５(Derossi, D., et al. 1994. Biol.Chem. 269, 10444−10450)、配列番号１６(Fischer, P.M. et al. 2000. J. Pept. Res. 55, 163−172)、配列番号１７(Frankel, A. D. ＆ Pabo, C. O. 1988. Cell 55,1189−1193; Green, M. ＆ Loewenstein, P. M. 1988. Cell 55, 1179−1188)、配列番号１８(Park, C. B., et al. 2000. Proc. Natl Acad. Sd. USA 97, 8245−8250)、配列番号１９ (Pooga, M., et al. 1998. FASEB J. Yl, 61−11)、配列番号２０(Oehlke, J. et al. 1998. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127−139)、配列番号２１(Lin, Y. Z., et al. 1995. J. Biol. Chem. 270, 14255−14258)、配列番号２２(Sawada, M., et al. 2003. Nature Cell Biol. 5, 352−357)、配列番号２３(Lundberg, P. et al. 2002. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85−90)、配列番号２４(Elmquist, A., et al. 2001. Exp. Cell Res. 269, 237−244)、配列番号２５(Morris, M. C, et al. 2001. Nature Biotechnol. 19, 1173−1176)、配列番号２６(Rousselle, C. et al. 2000. MoL Pharmacol. 57,679−686)、配列番号２７(Gao, C. et al. 2002. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057−4065)、または配列番号２８(Hong, F. D. ＆ dayman, G. L. 2000. Cancer Res. 60, 6551−6556)のアミノ酸配列をさらに含み得る。提供したポリペプチドは、ＢＧＳＣ(ビス−グアニジン−スペルミジン−コレステロール)またはＢＧＴＣ(ビス−グアニジン−トレン−コレステロール)をさらに含み得る(Vigneron, J.P. et al. 1998. Proc. Natl. Acad. Sd. USA. 93, 9682−9686)。上記の参考文献は、ベクターおよび配列の細胞内在化の教示について、その全体を参照により本明細書中に包含される。現在公知のまたは後に同定される何らかの他の内在化配列を、本発明のペプチドと組み合わせ得る。
【００６６】
提供したポリペプチドは、何らかのＡＣＴ配列(例えば、本明細書中に開示の何れかのＡＣＴペプチド)を、本明細書中に供される何らかの細胞内在化配列と組み合わせて含み得る。該組み合わせの例を、表６に示す。故に、供されるポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含むアンテナペディア配列を含み得る。故に、提供したポリペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のアミノ酸配列を含み得る。
【００６７】
【表７】
0005602891.tif 000008
【００６８】
また、本明細書にて提供されるポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。開示した核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド置換からなる。これらのおよび他の分子の非限定的例は、本明細書中に開示される。例えば、ベクターが細胞中で発現されるとき、発現されたｍＲＮＡは、一般的に、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵからなり得ることが理解される。
【００６９】
“単離された核酸”または“精製された核酸”とは、本発明のＤＮＡがそれに由来する生物の天然に存在するゲノム中の遊離の遺伝子、隣接遺伝子であるＤＮＡを意味する。故に、本用語には、例えば、自己複製プラスミドまたはウイルスのような、ベクター中に挿入される組み換えＤＮＡ；または、原核もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に挿入される組み換えＤＮＡ(例えば、トランスジーン)；または、別個の分子として存在する組み換えＤＮＡ(例えば、ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化、または化学的もしくはインビトロ合成により作製される、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片)が包含される。さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組み換えＤＮＡも包含される。用語“単離された核酸”は、ＲＮＡとも称され、例えば、単離されたＤＮＡ分子によりコードされるｍＲＮＡ分子、または化学的に合成されるｍＲＮＡ分子、または少なくともいくつかの細胞成分、例えば、他のタイプのＲＮＡ分子またはポリペプチド分子から分離または実質的に遊離されるｍＲＮＡ分子である。
故に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００７０】
故に、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８または配列番号８９の核酸配列を含み得る核酸を提供する。
【００７１】
本明細書中に提供した核酸は、発現制御配列と作動可能に連結され得る。また、発現制御配列と作動可能に連結される、本明細書中で提供した核酸の１個以上を含むベクターを提供する。インビトロまたはインビボのどちらかでの、細胞への核酸の送達に用い得る多数の組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は、主に、ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系の２つのクラスに分類され得る。例えば、核酸を、エレクトロポレーション、リポフェクション、カルシウムリン酸沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドのような多数の直接送達系、またはカチオン性リポソームのような細胞または担体中の遺伝物質の輸送により送達し得る。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント、またはエレクトロポレーションおよびＤＮＡの直接拡散のような物理的機械的方法を含むトランスフェクションのための適する方法が、例えば、Wolff, J. A., et al., Science, 247, 1465−1468, (1990)；および、Wolff, J. A. Nature, 352, 815−818, (1991)に記載される。かかる方法は、当技術分野でよく知られており、本明細書に記載の組成物および方法を用いて使用するために容易に適用可能である。任意の場合において、方法は、大きなＤＮＡの分子を用いて特に機能を修飾し得る。さらに、これらの方法は、担体の特徴を標的とするのに用いることにより任意の疾患および細胞集団を標的とするために用い得る。
【００７２】
輸送ベクターは、細胞中に遺伝子を送達するために用いる何らかのヌクレオチド構築物(例えば、プラスミド)、または遺伝子を送達するための一般的ストラテジーの一部、例えば組み換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部であり得る(Ram et al. Cancer Res. 53:83−88, (1993))。
【００７３】
本明細書で用いる通り、プラスミドまたはウイルスベクターは、配列番号６のような開示された核酸を、分解することなく、それが送達される細胞において遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを含む細胞中に、輸送する物質である。いくつかの態様において、プロモーターは、ウイルスまたはレトロウイルスに由来する。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経栄養性ウイルス、ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスを含むシンドビズおよび他のＲＮＡウイルス類である。また、ウイルスをベクターとしての使用に適するようにする、これらのウイルス類の特性を共有する何らかのウイルスファミリーを開示する。レトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしてのＭＭＬＶの所望の特性を発現するレトロウイルス類が含まれる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも、大きな遺伝的荷重、すなわち、トランスジーンまたはマーカー遺伝子を運搬することができ、そのため、通常用いられるベクターである。しかしながら、それらは、非増殖性細胞において有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、使用しやすく、高力価を有し、エアロゾル剤形で送達可能であり、非分裂細胞をトランスフェクトし得る。ポックスウイルスベクターは、大きく、挿入遺伝子のためのいくつかの部位を有し、熱安定性であり、室温で貯蔵可能である。また、ウイルス抗原によって誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように作製されたウイルスベクターが開示される。このタイプのベクターは、インターロイキン８または１０のためのコーディング領域を運搬し得る。
【００７４】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞内に導入するための化学的または物理的方法よりも高いトランスフェクション能力（遺伝子を導入する能力）を有し得る。典型的に、ウイルスベクターは、非構造性初期遺伝子、構造性後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写因子、複製およびカプシド化（encapsidation）に必要な逆方向末端反復、およびウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターを含む。ベクターとして作製されるとき、ウイルス類は、一般的に、１個以上の初期遺伝子が除かれ、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが、除かれたウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム中に挿入される。このタイプの構築物は、約８ｋｂまでの外来遺伝物質を運搬し得る。除去された初期遺伝子の必要な機能は、一般的に、初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように作製された細胞株により供給される。
【００７５】
レトロウイルスは、何らかのタイプ、サブファミリー、属、または指向性（tropism）を含む、レトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的に、Verma, I.M., Retroviral vectors for gene transfer. In Microbiology− 1985, American Society for Microbiology, pp. 229−232, Washington, (1985)（参照により本明細書中に包含される。）に記載される。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの使用方法の例は、米国特許番号第4,868,116号および同第4,980,286号；ＰＣＴ出願番号WO 90/02806およびWO 89/07136；ならびに、Mulligan, (Science 260:926−932 (1993))（それらの教示は、参照により本明細書中に包含される。）に記載される。
【００７６】
レトロウイルスは、本質的に、核酸荷重（cargo）をその中に包含しているパッケージである。核酸荷重は、複製された娘分子が、パッケージコート内に効率よくパッケージされ得るようにする、パッケージシグナルをそれと共に運搬する。パッケージシグナルに加えて、複製、および複製されたウイルスのパーケージングのためにシスで必要な多数の分子が存在する。典型的に、レトロウイルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含む。それは、一般的に、標的細胞に運搬されるべき外来ＤＮＡにより置き換えられるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、一般的に、パッケージコート中に取り込むためのパッケージシグナル、ｇａｇ転写単位の開始を伝達する配列、逆転写のtＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位を含む逆転写に必要な要素、ＤＮＡ合成中にＲＮＡ鎖の転換（switch）を導く末端反復配列、ＤＮＡ合成の第二鎖の合成のためのプライミング部位として働くプリンに富む配列である５’から３’ＬＴＲ、および宿主ゲノム中へのレトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にするＬＴＲの末端付近の特定配列を含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子の除去は、約８ｋｂの外来配列をウイルスゲノム中に挿入し、逆転写され、そして複製により新しいレトロウイルス粒子中にパッケージされるのを可能にする。この核酸の量は、各転写産物のサイズに依存する多くの遺伝子の送達のために十分である。
【００７７】
ほとんどのレトロウイルスベクターにおける複製機構およびパッケージングタンパク質(ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ)を除去した後、該ベクターを、一般的に、パッケージング細胞株中にそれらを置換して作製する。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージング機構を含むが、何らかのパッケージシグナルを欠くレトロウイルスを用いてトランスフェクトまたは形質転換された細胞株である。選択されるＤＮＡを運搬するベクターが、これらの細胞株中にトランスフェクトされるとき、興味のある遺伝子を含むベクターが、ヘルパー細胞によりシスに提供される機構により、複製され、新しいレトロウイルス粒子中にパーケージされる。該機構のためのゲノムは、それらが必要なシグナルを欠くためパーケージされない。
【００７８】
複製不全アデノウイルスの構築は、(Berkner et al., J. Virology 61:1213−1220 (1987)；Massie et al., MoI. Cell. Biol. 6:2872−2883 (1986)；Haj−Ahmad et al., J. Virology 51:261−21 A (1986)；Davidson et al., J. Virology 61:1226−1239 (1987)；Zhang “Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome−mediated transfection and PCR analysis” BioTechniques 15:868−872 (1993))に記載されている。これらのウイルスのベクターとして使用の利点は、それらが、最初の感染細胞内で複製可能であるが、新子ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞型に広がる程度が限定されることである。組換えアデノウイルスは、直接の、インビボ送達後に、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ柔組織、および多数の他の組織部位への高効率の遺伝子導入の達成が示されている(Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580−1586 (1993); Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381−387 (1993); Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085−1092 (1993); Moullier, Nature Genetics 4:154−159 (1993); La Salle, Science 259:988−990 (1993); Gomez−Foix, J. Biol. Chem. 267:25129−25134 (1992); Rich, Human Gene Therapy 4:461−476 (1993); Zabner, Nature Genetics 6:75−83 (1994); Guzman, Circulation Research 73:1201−1207 (1993); Bout, Human Gene Therapy 5:3−10 (1994); Zabner, Cell 75:207−216 (1993); Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287−1291 (1993); andRagot, J. Gen. Virology 74:501−507 (1993))。組換えアデノウイルスは、野生型または複製不全アデノウイルスと同様の方法で、特定の細胞表面受容体に結合し、ウイルスが、受容体を介するエンドサイトーシスにより内在化された後、遺伝子導入を達成する(Chardonnet and Dales, Virology 40:462−477 (1970); Brown and Burlingham, J. Virology 12:386−396 (1973); Svensson and Persson, J. Virology 55:442−449 (1985); Seth, et al., J. Virol. 51:650−655 (1984); Seth, et al., MoI. Cell. Biol. 4:1528−1533 (1984); Varga et al., J. Virology 65:6061−6070 (1991); Wickham et al., Cell 73:309−319 (1993))。
【００７９】
ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子を除かれたアデノウイルスに基づくものであり得、これらのバイロン（viron）は、ヒト２９３細胞株のような細胞株中に作製される。１つの局面において、Ｅ１およびＥ３遺伝子は両方とも、アデノウイルスゲノムから除去される。ウイルスベクターの他のタイプは、アデノ関連ウイルス(ＡＡＶ)に基づく。この不完全パルボウイルスは、多くの細胞型に感染可能であり、ヒトに対して非病原性である。ＡＡＶ型ベクターは、約４から５ｋｂを運搬することができ、野生型ＡＡＶは、１９番染色体中に安定に挿入することが知られている。例として、このベクターは、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ｔｋおよび／または緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子のようなマーカー遺伝子を含み得る、Avigen, San Francisco, CAにより作製されたＰ４．１Ｃベクターであり得る。
【００８０】
他のタイプのＡＡＶウイルスにおいて、ＡＡＶは、異種遺伝子と作動可能に連結した細胞特異的発現をもたらすプロモーターを含む少なくとも１個のカセットに隣接する逆方向末端反復(ＩＴＲ)の対を含む。本明細書中、異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに由来しない何らかのヌクレオチド配列または遺伝子を意味する。
【００８１】
典型的に、領域をコードするＡＡＶおよびＢ１９は、欠失されており、結果として、安全な非細胞毒性ベクターである。ＡＡＶ ＩＴＲ、またはその修飾体は、感染性および部位特異的結合を与えるが、細胞毒性ではなく、プロモーターは、細胞特異的発現をもたらす。米国特許番号第6,261,834号は、ＡＡＶベクターと関係する物質について、参照により本明細書中に包含される。
【００８２】
故に、開示されたベクターは、実質的に毒性なく、哺乳動物染色体中に挿入され得るＤＮＡ分子を提供する。
【００８３】
ウイルスおよびレトロウイルス中に挿入された遺伝子には、通常、所望の遺伝子産物の発現制御を補助するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して比較的一定の位置にあるとき機能するＤＮＡの配列または複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要な中核要素を含み、上流要素および応答要素を含んでいてよい。
【００８４】
大きなヒトヘルペスウイルスを用いる分子遺伝学的実験は、大きな異種ＤＮＡ断片が、ヘルペスウイルスを用いる感染に許容性の細胞中に、クローニング、増殖および確立され得る手段を提供する(Sun et al., Nature genetics 8:33−41, 1994; Cotter and Robertson,. Curr Opin MoI Ther 5: 633−644, 1999)。これらの大きなＤＮＡウイルス(ヘルペス単純ウイルス(ＨＳＶ)およびエプスタインバールウイルス(ＥＢＶ)）は、１５０ｋｂ以上のヒト異種ＤＮＡの断片を特定の細胞に送達する能力を有する。ＥＢＶ組換え体は、大きなＤＮＡ断片をエピソームＤＮＡとして感染したＢ細胞中で維持し得る。個々のクローンは、遺伝的に安定に見える３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を運搬する。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶでの感染中に恒常的に発現される特定のＥＢＶ核タンパク質であるＥＢＮＡｌを必要とする。さらに、これらのベクターは、トランスフェクションに使用でき、そこで、多量のタンパク質が一時的にインビトロで作製され得る。ヘルペスウイルス単位複製配列（amplicon）系はまた、２２０ｋｂ以上のＤＮＡパッケージ断片に、およびエピソームとしてＤＮＡを安定に維持し得る感染細胞に用いられる。
【００８５】
他の有用な系には、例えば、複製および宿主限定的非複製ワクシニアウイルスベクターが含まれる。
【００８６】
開示した組成物は、標的細胞に様々な方法で送達され得る。例えば、該組成物は、エレクトロポレーションにより、リポフェクションにより、またはリン酸カルシウム沈殿により送達され得る。選択される送達機構は、標的とされる細胞型の一部、および送達が、例えばインビボまたはインビトロで起こるかどうかに依存し得る。
【００８７】
故に、組成物には、開示したポリペプチド、核酸またはベクターに加えて、例えばカチオン性リポソームのような、リポソームのような脂質(例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール)またはアニオン性リポソームが含まれる。リポソームにはさらに、要すれば、特定の細胞を標的とするのを容易にするタンパク質が含まれ得る。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与を、標的器官へ輸血によるか、または呼吸管の標的細胞へ呼吸管中への吸入により投与することができる。リポソームに関しては、例えば、Brigham et al. Am. J. Resp. Cell. MoI. Biol. 1:95−100 (1989); Feigner et al. Proc. Natl. Acad. Sd USA 84:7413−7417 (1987);米国特許番号第4,897,355号を参照のこと。さらに、化合物を、マクロファージのような特定の細胞型を標的とし得るマイクロカプセルの成分として投与可能であり、ここで、マイクロカプセルからの化合物の拡散または化合物の送達を、特定の速度または投与量について設計する。
【００８８】
外来ＤＮＡの対象細胞への投与および取り込みを含む上記の方法(すなわち、遺伝子導入またはトランスフェクション)において、組成物の細胞への送達は、様々な機構により可能である。一例として、送達は、LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE(GIBCO−BRL, Inc., Gaithersburg, MD)、SUPERFECT(Qiagen, Inc. Hilden, Germany)およびTRANSFECTAM(Promega Biotec, Inc., Madison, WI)のような市販のリポソーム製品、ならびに当技術分野の標準方法に従い製造された他のリポソームを用いて、リポソームにより可能である。さらに、開示した核酸またはベクターを、Genetronics, Inc.(San Diego, CA)により利用可能な技術であるエレクトロポレーションにより、ならびにSONOPORATION機(ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, AZ)を用いて、インビボで送達可能である。
【００８９】
細胞に送達される核酸は、典型的に組み込み（integration）配列を含む、宿主細胞ゲノム中に組み込まれるべきである。これらの配列はしばしば、特に、ウイルスに基づく系を用いるとき、ウイルス関連配列である。これらのウイルス組み込み系はまた、送達系に含まれる核酸が、宿主ゲノム中に組み込まれ得るように、リポソームのような核酸に基づかない系を用いて送達されるべき核酸中に組み込まれ得る。
【００９０】
宿主ゲノムへの組み込みのための他の一般的な技術には、例えば、宿主ゲノムを用いる相同的組み換えを促進するように設計された系が含まれる。これらの系は、一般的に、宿主ゲノム中に組み込まれるべき送達核酸をもたらす、ベクター核酸と標的核酸の間で起こる組み換えである、宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する発現されるべき核酸と隣接した配列を利用する相同的組み換えを促進するために必要なこれらの系および方法は、当技術分野で公知である。
【００９１】
組成物は、当技術分野でよく知られている様々な方法(例えば、そのままのＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉注射、エンドサイトーシスなど)により、対象の細胞にインビボおよび／またはエクスビボで送達され得る。
【００９２】
エクスビボ方法を用いるとき、細胞または組織を、当技術分野でよく知られている標準プロトコールに従い、取り出し、体外で維持することができる。組成物を、例えば、リン酸カルシウムにより仲介される遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームのような何らかの遺伝子輸送機序により細胞中に導入し得る。その後、遺伝子導入細胞は、融合される(例えば、薬学的に許容される担体と共に)か、または細胞または組織タイプについての標準方法により対象に戻され同位的に移植され得る。標準方法は、対象への様々な細胞の移植または注入について公知である。
【００９３】
細胞に送達される核酸には、一般的に、発現制御系が含まれる。例えば、ウイルスおよびレトロウイルス系における挿入遺伝子には、通常、所望の遺伝子産物の発現制御を補助するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して比較的一定の位置にあるとき機能するＤＮＡの配列または複数の配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要な中核要素を含み、上流要素および応答要素を含み得る。
【００９４】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからのプロモーターにより制御された転写産物は、様々な起源、例えばポリオーマ、シミアンウイルス４０(ＳＶ４０)、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスのようなウイルス類のゲノムから、または異種哺乳動物プロモーター、例えばベータアクチンプロモーターから得られる。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、都合よくは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として得られる(Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978))。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、都合よくは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として得られる(Greenway, PJ. et al., Gene 18: 355−360 (1982))。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモーターも、本発明において有用である。
【００９５】
エンハンサーは、一般的に、転写開始部位から一定でない位置で機能するＤＮＡの配列を意味し、転写単位に対して５’(Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981))または３’(Lusky, M.L., et al., MoI. Cell Bio. 3: 1108 (1983))のどちらかであり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン(Banerji, JX. et al., Cell３３: 729 (1983))内、ならびにそのコーディング配列(Osborne, T.F., et al., MoI. Cell Bio. 4: 1293 (1984))内に存在し得る。それらは通常、１０から３００ｂｐ長であり、シスで機能する。エンハンサーは、隣接プロモーターからの転写を増加させる。エンハンサーにはまた、しばしば、転写の調節を仲介する応答要素を含む。プロモーターはまた、転写の調節を仲介する応答要素を含み得る。エンハンサーはしばしば、遺伝子の発現制御を決定する。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン)から公知であるが、一般的に、一般的発現のために真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用し得る。例は、複製起点(１００−２７０ｂｐ)の後側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーター エンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルス エンハンサーである。
【００９６】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を誘導する簡単なまたは特定の化学的事象により活性化され得る。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンのような試薬により調節され得る。また、ガンマ線照射のような放射線照射への暴露、または化学療法薬のアルキル化によるウイルスベクター遺伝子発現の増強方法がある。
【００９７】
任意の態様において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写されるべき転写単位の領域の最大発現のための構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用し得る。任意の構築物において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定の時間に特定の細胞タイプでのみ発現されるとしても、全ての真核細胞タイプで働く。このタイプのプロモーターは、ＣＭＶプロモーター(６５０塩基)である。他のこのようなプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス(全長プロモーター)、およびトロウイルスベクターＬＴＲである。
【００９８】
全ての特定の調節要素を、黒色腫細胞のような特定の細胞タイプで選択的に発現される発現ベクターをクローニングし、構築するために用いることができることが示されている。グリア線維性酸性タンパク質(ＧＦＡＰ)プロモーターを、グリア起源の細胞において遺伝子を選択的に発現するために用いた。
【００９９】
真核宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞)において使用される発現ベクターにはまた、ｍＲＮＡ発現に影響し得る転写の終了に必要な配列が含まれ得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写される。３’非翻訳領域にはまた、転写終了部位が含まれる。転写単位にはまた、ポリアデニル化領域が含まれる。この領域の１つの利点は、転写単位が、ｍＲＮＡのように処理および輸送され得るという可能性を増大することである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は、よく確立されている。相同ポリアデニル化シグナルを、遺伝子導入構築物に用いることができる。任意の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、約４００塩基からなる。他の標準配列のみを、または上記の配列を共に含む転写単位は、構築物の発現を改善し、安定性を改善する。
【０１００】
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物を、遺伝子が細胞に送達され、発現されるかどうかを決定するために用いる。マーカー遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質である。
【０１０１】
いくつかの態様において、マーカーは、選択可能マーカーであり得る。哺乳動物細胞に適する選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素(ＤＨＦＲ)、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体Ｇ４１８、ヒドロマイシン（hydromycin）、およびピューロマイシンである。そのような選択可能マーカーが、哺乳動物宿主細胞中に成功裏に運搬されるとき、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれたときに生存可能である。選択型の２つの広く利用されている異なるカテゴリーが存在する。第一のカテゴリーは、細胞の代謝、および添加培地には依存しない増殖のための能力を欠く変異細胞株の使用に基づく。２つの例は、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の添加なしに増殖する能力を欠く。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な任意の遺伝子を欠くため、欠失ヌクレオチドが培地の添加により供給されない限り生存不可能である。培地を添加する代わりに、無傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、その結果、それらの増殖必要条件を変える。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、培地の供給なしに生存不可能であろう。
【０１０２】
第二のカテゴリーは、何らかの細胞タイプに用いられ、変異細胞株の使用に必要ではない選択スキームを意味する優位な選択である。これらのスキームは、一般的に、宿主細胞の増殖を停止するために薬剤を使用する。新規の遺伝子を有するそれらの細胞は、薬剤耐性与えるタンパク質を発現し、選択的に生存し得る。そのような優位な選択の例は、ネオマイシン(Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982))、ミコフェノール酸(Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980))またはハイグロマイシン(Sugden, B. et al., MoI. Cell. Biol. 5: 410−413 (1985))なる薬剤を使用する。３つの例が、それぞれＧ４１８またはネオマイシン(ジェネティシン)、ｘｇｐｔ(ミコフェノール酸)またはハイグロマイシンなる適当な薬剤に対して耐性を与えるために、真核細胞制御下に細菌遺伝子を用いる。他に、ネオマイシン類似体Ｇ４１８およびピューロマイシンが含まれる。
【０１０３】
また、本明細書で提供したベクターの１個以上を含む細胞を提供する。本明細書で用いる“細胞”、“細胞株”、および“細胞培養物”は、互換可能に用いられ得、そのような全ての記載が、後代を含む。開示した細胞は、本明細書で供されるベクターをクローニングまたは増殖するために使用する何らかの細胞であり得る。故に、細胞は、何らかの初代細胞培養または確立された細胞株由来であり得る。方法を、細菌、植物、動物などのような原核または真核細胞を含む何らかの細胞に用いることができる。細胞タイプは、ベクターの選択および所望の使用に基づき、当業者により選択可能である。
【０１０４】
本明細書中に開示される核酸分子またはベクターのいずれかを用いて動物の細胞をトランスフェクトする方法により作製された動物を開示する。本明細書中に開示される核酸分子またはベクターのいずれかを用いて動物の細胞をトランスフェクトする方法により作製された動物であって、哺乳動物である動物を開示する。また、本明細書中に開示される核酸分子またはベクターのいずれかを用いて動物の細胞をトランスフェクトする方法により作製される動物であって、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長動物である動物を開示する。
【０１０５】
本明細書で供するポリペプチド、核酸、またはベクターの１個以上、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。故に、本明細書で供するＡＣＴポリペプチドの何れかの２個以上の組み合わせ、および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。例えば、配列番号１および配列番号５ならびに薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【０１０６】
“薬学的に許容される”は、生物学的でないか、または他の望ましくなくない物質を意味し、すなわち、該物質は、何らかの望ましくない生物学的効果を引き起こすか、またはそれが含まれる医薬組成物の他の成分の何れか有害な方法で相互作用することなく、核酸またはベクターと同様に、対象に投与され得る。担体は、もちろん、当業者によく知られている通り、活性成分の何らかの分解を最小にし、対象における何らかの悪い副作用を最小にするために選択され得る。
【０１０７】
本明細書で提供した組成物は、創傷、組織損傷、炎症部位または癌に投与され得る何らかの公知のまたは新しく発見された物質をさらに含み得る。例えば、供される組成物は、抗生物質(例えば、アミノグリコシド、セファロスポリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、エリスロマイシン、フルオロキノロン、マクロライド、アゾリド、メトロニダソール、ペニシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム−スルファメトキキサゾール、バンコマイシン)、ステロイド類(例えば、アンドラン（Andrane）(例えば、テストステロン)、コレスタン(例えば、コレステロール)、コール酸(例えば、コール酸)、コルチコステロイド(例えば、デキサメタゾン)、エストラエン（Estraene）(例えば、エストラジオール)、プレグナン(例えば、プロゲステロン)、麻薬性および非麻薬性鎮痛薬(例えば、モーフィン、コデイン、ヘロイン、ヒドロモルホン、レボルファノール、メペリジン、メタドン、オキシドン、プロポキシフェン、フェンタニル、メタドン、ナロキソン、ブプレノルフィン、ブトルファノール、ナルブフィン、ペンタゾシン)、化学療法薬(例えば、アルトレタミン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、ロイプロライド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペンタスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチンのような抗癌剤であるが、これらに限定されない)、
【０１０８】
抗炎症剤(例えば、アルクロフェナク；プロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセトニド（Algestone Acetonide）；アルファアミラーゼ；アムシナフェル（Amcinafal）；アムシナファイド（Amcinafide）；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリロース；アナキンラ；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジドジナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン（Cintazone）；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタゾール；酪酸クロベタゾン；クロピラク；プロピオン酸クロチカゾン；酢酸コルメタゾン（Cormethasone Acetate）；コルトドキソン；デカン酸塩；デフラザコート；デラテストリール（Delatestryl）；デポテストステロン；デソニド；デソキシメタゾン；ジプロピオン酸デキサメサゾン；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド（Drocinonide）；エンドリゾン（Endrysone）；エンリモマブ（Enlimomab）；エノリカム ナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナメート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナク；フェンクロラク；フェンドサル；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコルト；フルフェナム酸；フラミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；酢酸フルオロメトロン；フルクァゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタゾル；ハロpredone Acetate；Ibufenac；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダプ；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；酢酸イソフルプレドン；イソキセパク；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロモキシカム（Lomoxicam）；エタボン酸ロテプレドノール；メクロフェナメイトナトリウム；メクロフェナム酸；メクロリソン（Meclorisone）二酪酸；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メステロロン；メタンドロステノロン；メテノロン；酢酸メテノロン；スレプタン酸メチルプレドニゾロン；モミフルメート（Momiflumate）；ナブメトン；ナンドロロン；ナプロキセン；ナプロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサンドロラン（Oxandrolane）；オキサプロジン；オキシオキシフェンブタゾン；オキシメトロン；塩酸パラニリン；多硫酸ペントサンナトリウム；グリセリン酸フェンブタゾンナトリウム；パーフェニドン；ピロキシカム；ケイ皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオラミン；ピルプロフェン；プレドナゼート（Prednazate）；プリフェロン；プロドン酸（Prodolic Acid）；プロクアゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット；サルコレクス；サルナセジン；サルサラート（Salsalate）；塩化サングイナリウム；セクラゾン；セルメタシン；スタノゾロール；スドキシカム���スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルメート；タロサラート；テブフェロン；テニダプ；テニダプナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テストテスロン；テストテスロン混合物；テトリダミン（Tetrydamine）；チオピナク；ピルビン酸チクソコルトール（Tixocortol Pivalate）；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド（Triclonide）；トリフルミダート；ジドメタシン；ゾメピラックナトリウム)、または抗ヒスタミン剤(例えば、エタノールアミン(ジフェンヒドラミンカルビノキサミンのような)、エチレンジアミン(トリペレナミンピリラミンのような)、アルキルアミン(クロルフェニラミン、デクスクロフェニラミン、ブロモフェニラミン、トリプロリジンのような)、他の抗ヒスタミン剤（アステミゾール、ロラタジン、フェキソフェナジン、ブロフェニラミン（Bropheniramine）、クレマスチン、アセトアミノフェン、プソイドエフェドリン、トリプロリジンのような)のクラスの１種以上をさらに含み得る。
【０１０９】
組成物は、局所的、経口または非経腸的に投与され得る。例えば、組成物は、体外、頭蓋内、膣内、皮下、皮内、心臓内、胃内、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮投与、鼻内、または吸入により投与され得る。本明細書で用いる“頭蓋内投与”は、例えば、カテーテルまたはニードルによる髄腔内、脳室内または経ちょう形骨送達を含む、脳への物質の直接送達を意味する。
【０１１０】
組成物の非経腸的投与は、用いるとき、一般的に注射によることを特徴とする。注射剤は、液体溶液または懸濁液として常套形態、注射の前に液体の懸濁溶液に適する固形、またはエマルジョンとして製造され得る。非経腸投与に適当なごく最近修正された方法は、一定の投与量が維持されるように、遅延放出または持続放出系の使用を含む。例えば、米国特許番号第3,610,795号（参照により本明細書中に包含される。）を参照のこと。
【０１１１】
本明細書で用いる“局所的経鼻投与”は、一方または両方の鼻孔を介して鼻および鼻腔への組成物の送達を意味し、スプレー機構または液滴機構による送達、または核酸またはベクターのエアロゾル化による送達を含み得る。吸入による組成物の投与は、スプレーまたは液滴機構による送達により鼻または口を介して可能である。送達はまた、挿管により呼吸器系のある領域(例えば、肺)に直接可能である。
【０１１２】
必要とされる組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重および全身状態、処置されるアレルギー性疾患の重症度、用いる特定の核酸またはベクター、その投与方法などに依存して、対象によって変化し得る。故に、全ての組成物について正確な量を特定するのは不可能である。しかしながら、適当な量を、本明細書中の教示を与える常套の実験のみを用いて当業者により決定することができる。
【０１１３】
物質は、溶液または懸濁液(例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれた)であり得る。これらは、抗体、受容体または受容体リガンドを介して特定の細胞タイプを標的とすることができる。下記の参考文献は、腫瘍組織に対して特定のタンパク質を標的とするためのこの技術の使用例である(Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447−451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275−281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700−703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3−9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421−425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57−80, (1992);および、Roffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062−2065, (1991))。“ステルス”のようなビヒクルおよび他の抗体結合リポソーム(結腸癌を標的とする脂質仲介薬剤を含む)、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体仲介標的化、リンパ球指向性腫瘍標的化、ならびにインビボでのマウス神経膠腫細胞の高特異的治療的レトロウイルス標的化が含まれる。下記の参考文献は、腫瘍組織に対して特定のタンパク質を標的とするためのこの技術の使用例である(Hughes et al., Cancer Research, 49:6214−6220, (1989);および、Litzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179−187, (1992))。概して、受容体は、構成的またはリガンド誘導的のどちらかの、エンドサイトーシス経路に関与する。クラスリン被覆ピット中のこれらの受容体クラスターは、受容体がその中に貯蔵されている酸性化エンドソームを経てクラスリン被覆小胞により細胞内に入り、その後、細胞表面に再生されて、細胞内に貯蔵されるか、またはリソソーム中で分解される。内在化経路は、栄養取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の排除、ウイルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体のレベル調節のような様々な機能を果たす。多くの受容体が、細胞タイプ、受容体濃度、リガンドタイプ、リガンド価、ならびにリガンド濃度に依存して、２種以上の細胞内経路に従う。受容体仲介エンドサイトーシスの分子および細胞機構は、概説されている(Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399−409 (1991))。
【０１１４】
適する担体およびそれらの製剤が、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995に記載される。典型的に、薬学的に許容される塩の適当な量を、該製剤を等張にするために製剤に用いる。薬学的に許容される担体の例には、食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、約５から約８、約７から約７．５であり得る。担体は、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性マトリクス（ここで、マトリクスは、成形品の形態、例えば、フィルム、リポソームまたは微粒子である。）のような持続放出製剤をさらに含む。任意の担体は、より好ましくは、例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に依存し得ることは、当業者に理解されるだろう。
【０１１５】
医薬的担体は、当業者に公知である。これらは、最も一般的には、滅菌水、食塩水、および生理的ｐＨで緩衝化した溶液のような溶液を含む、ヒトへの薬剤投与のための標準的担体であり得る。組成物を、筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物を、当業者により用いられる標準的方法に従って投与することができる。
【０１１６】
医薬組成物には、選択した分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤などが含まれ得る。医薬組成物にはまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などのような１種以上の活性成分が含まれ得る。医薬組成物を、局所または全身処置が望ましいかどうか、ならびに処置すべき領域に依存して多数の方法で投与することができる。投与を、局所的(眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口、吸入により、または非経腸的に、例えば、by 点滴、皮下、腹腔内または筋肉注射により行い得る。
【０１１７】
非経腸投与のための製剤には、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルである。水性担体には、食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経腸的ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、水分および栄養素補充剤、電解質補充剤(リンゲルデキストロースに基づくもののような)などが含まれる。保存剤および他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような存在であり得る。
【０１１８】
局所投与のための製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ジェル(例えば、ポロキサマージェル)、液滴、坐剤、スプレー、液体および粉末が含まれ得る。従来の医薬的担体、水性、粉末または油性塩基、増粘剤などが、必要または所望であり得る。開示した組成物は、例えば、マイクロファイバー、ポリマー(例えば、コラーゲン)、ナノ粒子、エアロゾル、ローション、クリーム、繊維製、プラスチック製、培養骨格（tissue engineered scaffold）、マトリックス材、錠剤、埋め込み容器、粉末、油、樹脂、創傷用包帯、ビーズ、マイクロビーズ、遅延放出ビーズ、カプセル、注射剤、点滴、ポンプ装置、シリコンインプラント、または何らか人工物質（bio−engineered material）で投与され得る。
【０１１９】
１つの局面において、提供した薬学的に許容される担体は、ポロキサマーである。商標名Pluronics（登録商標）で示されるポロキサマーは、透明な熱可逆性ジェル水溶液由来の非イオン性界面活性剤である。ポロキサマーは、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド−ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ)のトリブロックコポリマーである。２個のポリエチレンオキシド鎖は、親水性であるが、ポリプロピレン鎖は、疎水性である。これらの疎水性および親水性特性は、水溶液中に入れられるとき、帯電する。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ鎖は、疎水性中心が、共にミセルを形成し得るとき、小さな鎖を形成する。逐次的に、ミセルは、水が、親水性末端付近にほんのわずかに存在しているとき、グループで共に固体(ゲル)を形成するため、ゲル化特性を有する傾向がある。それを冷蔵するとき、液体になるが、温められると硬化する。この特性は、冷却時にそれを正確な用量測定のためにシリンジ中に入れることができるため、調剤に有用である。体温まで温めるとき(皮膚に適用するとき)、それは、適当な塗布および付着を容易にするために、完全に合うように厚くなる(とりわけ、大豆レシチン／パルミチン酸イソプロピルと併用するとき)。Pluronic（登録商標）Ｆ１２７(Ｆ１２７)は、容易に入手可能なため広く使用され、故に、そのような医薬適用に用いられる。Ｆ１２７は、２：１のＰＥＯ：ＰＰＯ重量比を有する、１００：６５：１００のＥＯ：ＰＯ：ＥＯ比を有する。Pluronicゲルは、水溶液であり、一般的に、２０−３０％のＦ１２７を含む。故に、供される組成物を、Ｆ１２７中にて投与することができる。
【０１２０】
経口投与のための組成物には、粉末または顆粒、水または非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、薬包、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が、望ましい。
【０１２１】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸のような無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸のような有機酸と反応させることによるか、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基、ならびにモノ、ジ、トリアルキルおよびアリールアミンおよび置換エタノールアミンのような有機塩基と反応させることにより形成される、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として投与され得る可能性がある。
【０１２２】
組成物の効果的な投与量および投与スケジュールは、経験的に決定可能であり、そのような決定は、当業者の技術内である。組成物の投与のための投与量範囲は、疾患症状が影響を受ける、所望の効果をもたらすのに十分多い量である。投与量は、望まない交差反応、アナフラキシー反応などのような悪い副作用をもたらすほど多量であってはならない。一般的に、投与量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与方法、または他の薬剤がレジメンに含まれるかどうかにより変化し、当業者により決定され得る。投与量は、何らかの逆適応症（counterindication）の際には、個々の医者により調整され得る。投与量は変化し、１日または数日間、毎日１個以上の用量投与で投与され得る。手引きを、医薬製品の特定のクラスの適当な投与量についての文献に見出し得る。投与量範囲は、本明細書に記載の組成物の適応症、状態の重症度、およびその投与経路に大きく依存する。
【０１２３】
例えば、調査のための実験室ツールとしての適用において、ＡＣＴペプチド組成物を、０．０１％ｗ／ｖ程度まで低い用量で用い得る。投与量を、０．０２％ｗ／ｖ程度まで低くし得、局所的皮膚創傷処置において２％ｗ／ｖまで高くし得る可能性がある。かなり高濃度の、組成物のみまたは他の化合物との組み合わせの組成物を、癌／腫瘍治療のような適用に、または急性組織損傷後すぐの初期高濃度ボーラスとして用いることができる。故に、提供したポリペプチドの上限は、例えば、腫瘍塊に直接送達される初期ボーラスとして供されるとき、２−５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖまでであり得る。例えば、筋肉内、脳内、心臓内および髄腔内投与の非経腸的経路のための推奨される上限投与量は、損傷の重症度に依存して、１％ｗ／ｖまたはｖ／ｖまでであり得る。この上限投与量は、例えば、ポリペプチドが、その作用を促進するかまたは該ポリペプチドと共に作用する他の薬剤と併用されるかによって、製剤により変化し得る。
【０１２４】
提供したポリペプチドの連続送達のために、例えば、点滴との併用において、状態の改善を基に医師により決定される経時変化により体重１ｋｇ当たり０．０１ｇの上限を用い得る。他の例において、例えば、皮膚創傷に、局所的に送達される供した核酸の上限濃度は、例えば、核酸が、その作用を促進するかまたは該核酸と共に作用する他の薬剤と併用されるかによって、創傷１ｃｍ２当たり５−１０μｇであり得る。これは、改善に基づき医師により決定される頻度で繰り返され得る。他の例において、内服的、例えば、筋肉内、脳内、心臓内および髄腔内に送達される供した核酸の上限濃度は、５０−１００μｇ／ｍｌの溶液であり得る。この場合も、頻度は、改善に基づき医師により決定され得る。
【０１２５】
外科手術前の、提供したポリペプチドを用いて領域の前処理も開示する。ポリペプチドの濃度は、１０−３０％のpluronicゲル、または外科手術の少なくとも３−６時間前に興味のある部位内へのペプチドの透過を可能にする何らかのそのような担体と共に混合して、１０−２００μＭであり得る。この前手順処理は、炎症性応答の減少を含む、外科手術に対するその後の治癒応答を改善し得る。
【０１２６】
ウイルスベクターは、臨床適用における潜在的な可能性を示すかどうかに関わらず、高度な実験ツールである。そのようなものとして、注意点は、ウイルスベクターの予期される投与量体制の計算を根拠とし、用いるベクターのタイプにかなり依存して変化し得る。例えば、レトロウイルスベクターは、癌細胞のような分裂細胞に効率よく感染し、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、コードしたタンパク質を無制限に発現し続ける。動物モデル設定において、レトロウイルスの一般的投与量は、１ｍｌ当たり１０７から１０９感染単位の範囲である。対照的に、アデノウイルスは、最も効率よくは、分裂後細胞を標的とするが、細胞は、宿主免疫系により迅速に除去されるか、またはウイルスは、感染細胞が再び増殖し、次いでウイルスエピソームＤＮＡが薄められるとき、最終的に失われる。実際に、この一時的な感染の経時変化が、任意の臨床状態において、例えば小さな損傷の改善において、本明細書に記載の組成物の短期間送達に有用であり得る。動物モデルにおいて、アデノウイルス１ｍｌ当たりの１０８から１０１１感染単位の濃度が、一般的に、研究に用いられる。動物モデルからのデータに基づくベクターの用量範囲は、臨床設定に最終的に用いられ、薬学的に許容される製剤の開発に至るまでを想定され得る。
【０１２７】
０．０２％ｗ／ｖでのＡＣＴ組成物の２回の局所適用；１回目の早急な適用、２回目の２４時間後の適用は、炎症を軽減し、治癒を促進し、瘢痕化を低減し、引張強度を増加し、そして組織再生を促進するのに十分である。しかしながら、臨床設定において、１日最大３回までの、５％までの濃度での局所適用が、医師によって決定されるようにかなりの改善が達成されるまで、推奨される。内服投与、例えば、静脈内、筋肉内、脳内、心臓内および髄腔内に関して、１日１％ｗ／ｖまたはｖ／ｖの投与量の、３回までの最大頻度が、かなりの改善が医師により決定されるまで、推奨される。
【０１２８】
創傷治癒を促進するためのポリペプチドのような、開示した組成物の投与後、治療組成物の効果を、熟練の当業者によく知られている様々な方法で評価することができる。例えば、当業者は、本明細書に記載のポリペプチドのような組成物が、該組成物が対象における組織損傷後の瘢痕組織形成を減少するか、線維性組織形成を減少するか、組織再生を改善するか、または炎症を軽減し得るという観察により、対象における創傷治癒の促進に有効であることを理解し得る。これらの基準の測定方法は、当技術分野で公知であり、本明細書中に開示される。また、本明細書で供する組成物(例えば、ポリペプチド、核酸、またはベクター)を含む物質を提供する。例えば、ＡＣＴポリペプチドで被覆される、創傷を処置するために用いられる物質を提供する。創傷の処置に用いられる物質の非限定的例には、包帯、絆創膏（steri−strip）、縫合糸、ステープル、または移植片(例えば、皮膚移植片)が含まれる。
【０１２９】
例えば、物質(例えば、包帯、絆創膏、縫合糸、ステープル、移植片)を、１０−２００μＭの範囲の濃度で供したポリペプチドに浸漬できる。次いで、該物質を乾燥させ、滅菌容器中に密封し得る。該物質を、１０−２００μＭ濃度のポリペプチドを含む１０−３０％pluronicゲルの液体中に、４℃で浸漬できる。次いで、該物質を、ゲル重合するようにほぼ室温にし、物質を覆うポリペプチド含浸ゲルの被覆を除き、それを滅菌容器中に密封し得る。ポリペプチドを、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)またはポリウレタンのような架橋可能ヒドロゲル系に組み込むこともでき、その後それを、創傷を処置するための物質(例えば、包帯、絆創膏、縫合糸、ステープル、移植片)に構築し得る。故に、ヒドロゲル−ペプチド物質からなる合成物を提供する。
【０１３０】
対象に移植する前に、提供したポリペプチドで覆った医用移植片も開示する。例えば、そのような移植手術における通常の問題は、目的の組織の過度の硬化、収縮および最終的に変形をもたらす、瘢痕組織形成からの移植片周囲の収縮嚢（contraction capsule）の形成である。移植片中または移植片上での本発明のポリペプチドの使用が、この変形を減少するかまたは予防し得る。医用移植片の非限定的例には、義四肢、乳房インプラント、陰茎インプラント、精巣インプラント、義眼、顔面インプラント、人工関節、人工心臓弁、人工血管、義歯、顔面補綴、傾斜円板弁（tilted disc valve）、ケージドボール弁（caged ball valve）、義耳、義鼻、人工内耳、および皮膚代替物(例えば、豚異種移植片／豚皮膚、BIOBRANE、培養角化細胞)が含まれる。
【０１３１】
Ａ．方法
対象における組織損傷後の創傷治癒を促進する方法であって、１個以上の本明細書で供される組成物(例えば、ポリペプチド、核酸、またはベクター)および薬学的に許容される担体を、該対象に投与することを含む方法を本明細書にて提供する。組織損傷を有する対象を処置する方法であって、１個以上の本明細書で供される組成物(例えば、ポリペプチド、核酸、またはベクター)および薬学的に許容される担体を、該対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
【０１３２】
“促進する”、“促進”および“促進すること”は、活性、応答、状態、疾患、または他の生物学的パラメーターにおける増加を意味する。これには、活性、応答、状態または疾患の開始が含まれ得るが、これに限定されない。これには、例えば、天然または対象レベルと比較して、活性、応答、状態または疾患の１０％増加も含まれ得る。故に、増加は、天然または対象レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または何れかの間の増加量であり得る。
【０１３３】
“処置する”または“処置”は、疾患または状態を軽減する方法を意味する。処置はまた、単なる症状というよりむしろ、疾患または状態自体の根本原因を減少する方法を意味し得る。処置は、天然レベルからの低下であり、疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状の完全な除去に限られない。例えば、創傷治癒を促進するための開示された方法は、同じ対象または対照対象における天然レベルと比較したとき、疾患を有する対象における疾患の１個以上の症状の１０％の軽減があるとき、処置されると見なされる。故に、軽減は、天然または対象レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または何れかの間の軽減である得る。
【０１３４】
本明細書で用いる“対象”には、動物、植物、細菌、ウイルス、寄生虫および何らかの他の生物または核酸を有する物質（entity）が含まれるが、これらに限定されない。対象は、脊椎動物、より具体的には哺乳動物(例えば、ヒト、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、非ヒト霊長動物、ウシ、ネコ、モルモットまたはげっ歯動物)、魚類、鳥類またはは虫類または両生類であり得る。対象は、無脊椎動物、より具体的には節足動物(例えば、昆虫および甲殻類)であり得る。本用語は、特定の年齢および性別を示さない。故に、成人／成体および新生の対象、ならびに胎児／胎仔（男性／オスまたは女性／メスに関わらず）が、包含されることが意図される。患者は、疾患または障害を有する対象を意味する。用語“患者”には、ヒトおよび動物対象が含まれる。
【０１３５】
提供した方法は、対象における組織損傷後の瘢痕組織形成を減少し得る。“瘢痕組織”は、組織の破壊を継ぐように働く、無秩序なコラーゲンおよび他の結合組織タンパク質の過剰産生によりもたらされる、体内の何れかの組織における損傷または疾患部位に形成する線維(線維性)結合組織を意味する。瘢痕組織は、損傷した皮膚および下層筋肉、損傷した心筋、または肝臓のような内臓の疾患領域を元に戻すことができる。それは、緻密で分厚く、通常、血液の供給が不十分なため周辺組織よりも血色が悪く、破壊された組織を構造的に元に戻すが、欠失組織の機能を果たし得ない。それは、冒された組織における正常な弾性をしばしば制限し得る膠原線維からなる。故に、瘢痕組織は、リンパ系または循環系に影響を与えるとき、筋肉運動の範囲を制限するか、または体液の適当な循環を阻止し得る。脳または脊髄の損傷後のグリア性瘢痕組織は、中枢神経系の損傷後の神経機能の修復に対する主な障害の１つである。瘢痕組織の減少を、損傷部位内の細胞タイプの集団により評価し得る。例えば、グリア性瘢痕組織の減少を、星状細胞に対するニューロン比の増加により評価し得る。瘢痕組織形成の減少を、瘢痕組織の瘢痕幅または面積の簡単な測定により測定し得る(Wilgus et al., 2003)。さらに、組織学的評価を、正常組織と比較して、治癒組織内での構造的複雑性の回復について行い得る。
【０１３６】
対象における組織損傷後の線維性組織形成の減少に加えて、提供した組成物および方法を、例えば、乾癬、皮膚および全身性肥満細胞症、喘息、湿疹、副鼻腔炎、アテローム性動脈硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、多発性硬化症、肺線維症および嚢胞性線維症のような、対象における線維性組織形成の病的増加と関係する疾患を処置するために用いることもできる。対象における線維性組織形成の減少は、対象における特定の組織および／または臓器の正常な構造および機能の回復が、処置後にもたらされるかどうかを評価する医師の臨床判断により測定され得る。例として、乾癬について、医師は、ところどころの、白色薄片状積層（flaky white buildup）で覆われた赤色になった皮膚の減少があるかどうかを決定するために対象の皮膚を評価し得る。ある種の乾癬が、にきび様(膿疱性乾癬)または火傷(紅皮症)の出現により特徴付けられる。かかる場合において、医師は、処置が、これらの症状の減少に至るかどうかを決定し得る。医師が判断するのが対象における組織または臓器の場合、生検が、臨床的に利用可能かつ／または必要であるか、またはヒト疾患の動物モデルにおいて、生検の組織断片が調製され、組織学的構造は、線維症が減少し、正常組織構造および機能の回復が達成されるかどうかを決定するために、臨床病理学者および／または熟練した組織病理学者により評価され得る。正常組織に対する線維症の面積を、かかる組織プレパラートで定量的に評価することも可能であった。
【０１３７】
対象における組織損傷後の、引張強度のような正常な組織機構特性を回復し得る方法を提供する。“引張強度”は、組織または創傷を破壊するために必要な圧力または張力を意味する。
【０１３８】
処置した創傷の引張強度は、処置後３ヶ月以内に、非損傷組織の６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％であり得る。故に、対象における正常な非損傷組織の引張強度に近づくかまたは達するための治癒損傷の引張強度の増加を含む、組織の機械的特性を回復する方法であって、１個以上の本明細書で供される組成物(例えば、ポリペプチド、核酸、またはベクター)および薬学的に許容される担体を、該対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１３９】
引張強度／伸張性に対して重要であり得る創傷のタイプは、筋骨格構造／組織、およびこれらの構造で覆われている皮膚のけがを含み得る。例えば、関節、骨、軟骨、腱、または靱帯を連結する引張強度を改善し得る方法を提供する。肘、膝または足（foot）を覆う皮膚のような、圧力（stress）／張力（strain）の程度が高い皮膚の引張強度を改善し得る方法も提供する。関節損傷の治癒と関係する最も一般的な問題は、治癒した接着面の収縮、および非伸展性をもたらすような過度の瘢痕化である。これは、化粧品および精神的影響が大きい。ペプチドの特性は、関節のより優れた運動性につながるかかる瘢痕組織の形成を調節し、低減するのを補助し得る。
【０１４０】
対象における組織損傷後の組織再生を改善し得る方法を提供する。“再生”は、損傷後の身体または身体の一部、組織、または個体、または正常な身体過程としての再生（renewal）、再増殖、または修復を意味する。瘢痕化と対照的に、組織再生は、その元の構造的、機能的、および生理的状態への該組織の回復を含む。これはまた、本明細書中、組織の“複雑性”を意味する。回復は、天然または対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、または何れかの間の回復を意味する、部分的または完全な回復であり得る。一例として、皮膚損傷の場合、組織再生は、毛嚢、腺状構造、血管、筋肉または脂肪の修復を含み得る。脳損傷の場合、組織再生は、ニューロンの維持または修復を含み得る。一例として、皮膚の場合、組織再生における改善は、正常な再生した皮膚に対する線維性瘢痕組織の量を比として測定することにより評価することができる。他の例として、創傷領域の体積に標準化された、再生皮膚腺のような別個の再生構造からカウントし得る。
【０１４１】
１つの局面において、組織再生は、損傷細胞を交換するために幹細胞の動員および分化を伴う。本明細書で用いる“幹細胞”は、組織または臓器の分化細胞中に見出されるか、または例えば、組織または臓器の主要な特殊化した細胞タイプを産するためにそれ自体再生され分化し得る胚性幹細胞、成人骨髄系幹細胞などの、外部起源からもたらされる未分化細胞である。生物における幹細胞の主な役割は、それらが発見される組織を維持および修復することである。幹細胞による分化とは、未分化細胞(例えば、幹細胞)が、皮膚、神経、心臓、肝臓、または筋肉細胞のような特殊化した細胞の特徴を獲得する過程を意味する。一例として、皮膚損傷の場合、組織再生は、毛嚢の上皮に存在する幹細胞の分化を含み得る(Alonso and Fuchs, 2003)。脳損傷の場合、組織再生は、ニューロンの幹細胞の分化を含み得る。対象における組織損傷後の幹細胞分化を促進し得る方法を提供する。増強した幹細胞分化は、臨床的に許容される遺伝的手段、または内生もしくは移植した幹細胞を得る他の手段を提供し、標識した幹細胞の分化頻度および正常な組織構造への取り込みを決定することにより測定可能である。他の例として、毛嚢のような任意の構造は、組織損傷後の内生幹細胞から再生されることが知られている。そのようなものとして、組織損傷領域に標準化された毛嚢のカウントを、増強した幹細胞分化の定量的評価として用い得る。
【０１４２】
対象における炎症を軽減する方法を提供する。“炎症”、“炎症応答”または“免疫応答”は、結果として血流量の増加ならびに免疫細胞および分泌物の流入をもたらす、紅化、帯熱、腫れ、痛みおよび機能の喪失により特徴付けられる損傷、感染または炎症に対する生体組織の反応を意味する。炎症は、感染性微生物の侵入に対する身体の反応であり、結果として、残骸を除去するために、感染領域への血流量の増加、白血球細胞を引きつける化学物質の放出、血漿の流量増加、ならびに単球(または、脳の場合は星状細胞)の出現をもたらす。炎症応答を刺激するものは何でも炎症性であると言われている。故に、対象における組織損傷に応答する炎症を軽減することに加えて、例えば、喘息、湿疹、副鼻腔炎、アテローム性動脈硬化症、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、皮膚および全身性肥満細胞症、乾癬、ならびに多発性硬化症を含む、炎症性細胞レベルの病的増加と関係する疾患を処置するためにも用い得る組成物および方法を提供する。例えば創傷の治癒による痒みを低減し得るポリペプチドでの処置を提供する。概して、痒みは、マスト細胞により放出されるヒスタミンによって生じる。マスト細胞脱顆粒およびヒスタミン放出を低減し得るポリペプチドを提供する。故に、痒み、擦り傷、洞性炎症（sinus irritation）、アレルギー性咳、赤目、喘息および湿疹が含まれるが、それに限定されない、ヒスタミン放出を伴う状態の処置に使用し得るポリペプチドを提供する。
【０１４３】
炎症の軽減は、例えば、単球または星状細胞のような炎症性細胞タイプの密度の減少により測定可能である。炎症の軽減は、例えば、好中球、マスト細胞、好塩基球および単球のような炎症性細胞タイプの密度の減少により測定可能である。炎症の軽減は、好中球活性のインビボ測定により計算可能である(Jones et al., 1994)。マスト細胞脱顆粒の頻度またはヒスタミンレベルの測定のような因子に加えて、活性酸素種のレベルの測定を、炎症の軽減の測定として用いることができる。炎症のレベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲによる任意の遺伝子、例えば、インターフェロン−アルファ、−ベータおよび−ガンマ、腫瘍壊死因子−アルファ、インターロイキン １ベータ、−２、−４、−５、−６、−８、−１２、−１８、−２３、−２７、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩＩおよびｉＮＯＳのような遺伝子、の転写レベルの検査により間接的に測定可能である。対象の組織および／または血漿を含む体液における前炎症性サイトカインレベルの測定は、炎症の軽減を測定できる。ＡＣＴペプチドの作用機序は、炎症細胞移動の阻止および／または前炎症性化学物質(ヒスタミン、活性酸素種)、ならびにインターロイキン（ＩＬ）−Ｉ、ＩＬ−６、ＩＬ−８および腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)のような前炎症性サイトカインの阻害により可能であるということに注目すべきである。
【０１４４】
対象における形質転換細胞の増殖を阻止し得る方法を提供する(図２を参照のこと)。形質転換細胞とは、無制御増殖の異常な分裂および増殖をする新生物、癌または腫瘍細胞を意味する。故に、該形質転換細胞の増殖(すなわち、過形成)の阻止は、増殖の減少をもたらし、故に、癌の悪性度を軽減する。開示の組成物および方法を、癌の代表的な非限定的リストである下記：神経膠腫、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌のような肺癌、神経芽腫、膠芽腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、喉、咽頭および肺の扁平上皮癌、結腸癌、子宮癌、子宮頸癌、乳癌、および上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血系癌、睾丸癌、結腸直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌を処置するために用いることができる。故に、対象において癌を処置するために用い得る方法を提供する。例えば、対象において神経膠腫を処置するために用い得る方法を提供する。
【０１４５】
形質転換細胞増殖の阻害は、例えば、Ｋｉ６７／ＭＩＢ−１ 免疫染色、トリチウム化チミジンまたはブロモデオキシウリジン標識指標、ＤＮＡ Ｓ期分画、増殖性細胞核抗原発現、可能性のある倍加時間および核小体形成領域関連タンパク質(ＡｇＮＯＲ)の分析のような、様々な細胞増殖マーカーおよびキットにより測定可能である。腫瘍の増殖活性が、周期 (増殖分画)に入った細胞の割合および細胞周期の速度の両方に依存するため、腫瘍の実際の増殖活性を、等式[ＰＡ＝Ｋｉ６７またはＭＩＢ−１スコア×ＡｇＮＯＲ]で測定すること可能だろう(Pich et al., 2004)。他の例において、組織病理学者は、形質転換細胞集団において増殖を決定するために、有糸分裂の簡単な定性的かつ定量的指標を用いて生検組織切片を評価するのに熟練している。
【０１４６】
様々なマウスモデルが、癌研究のために開発されている。特定のタイプの癌についての特定のマウスモデルが存在する。例えば、膀胱癌、子宮癌、子宮内膜癌、消化管癌、泌尿生殖器癌、頭頸部癌、造血系癌、腎臓癌、肺癌、乳腺癌、黒色腫、骨髄腫、神経系癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、肉腫、皮膚癌である。これらのモデルは、よく記載され用いられる。本明細書で供するポリペプチド、核酸またはベクターの好ましい効果が、これらのモデルの何れかにおいて実験可能である。例えば、皮膚癌マウスモデルを、実証のたに簡単に用いることができる。特定の病原体を有さない、同系交配マウス(ヌードマウス)を用いる、増殖性ヒト癌性組織の異種移植モデルを用いて癌を培養することが出来る(Yoo, 2004)。本明細書で供するポリペプチド、核酸またはベクターを、腫瘍に局所的に挿入するか、または例えば、静脈内注射、筋肉注射、腹腔内投与によりその標的に達するように全身的に投与し得る、例えば、中空線維膜(Orlandini and Margaria. 1983; Ming Chu et al., 1998)およびマイクロファイバーのような人工物質、遅延放出ビーズ、皮下注射針、留置カテーテルで局所投与できる。この処置剤を、単独で、または他の治療化合物、例えば化学療法剤と併用投与し得る。
【０１４７】
提供した方法は、対象における形質転換細胞の転移を阻止し得る。“転移”とは、通常、血管またはリンパ管を介する、元の部位から体内の１個以上の他の部位への癌細胞の移動を意味する。転移は、一連の事象に分けることができる。第一に、癌細胞移動は、腫瘍細胞が、増殖の原発部位を離れ、しばしば基底膜に侵入し、局所の血管系に移動する過程である。脈管内への侵入は、癌細胞が血管内に侵入し、遠位部位に分配される過程を記載する。浸潤は、脈管系からの癌細胞放出過程を意味する。最後に、遠位部位での癌細胞の増殖は、局在化した増殖因子利用能、間質細胞の影響、および周囲の細胞外マトリックス環境(いわゆる“生育地（soil）”)、ならびに腫瘍の増殖による血管新生により供された栄養素および因子の利用能にかなり影響を受ける。故に、供した組成物および方法は、該細胞の転移(すなわち、転移性移動)を阻止することにより対象における形質転換細胞の転移を阻止し得る。腫瘍形成は、無制御の細胞増殖をもたらす細胞周期の秩序の破壊の結果である。間期を経る細胞周期の進行およびチェックポイント通過を制御する特定の細胞過程−機序が、脱制御される。通常、これらの事象は、保存的機序ならびに細胞周期遺伝子およびそれらの産物のような分子の存在により高度に保存されている。転移性移動の阻止を、そのような細胞周期遺伝子および産物、例えば、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ(Ｃｄｋ)、Ｃｄｋインヒビター(ＣＫＩ)および細胞外因子(すなわち、増殖因子)のレベルにより測定可能である。レーザーサイトメトリーおよび市販のソフトウェアを用いる画期的な技術が、細胞周期過程および細胞増殖の定量化および評価に利用可能である。ヒストグラムを用いる、倍数値を含む、Ｓ期分画測定、および有士分裂指数および腫瘍倍加時間指数のような指数の概算は、腫瘍の悪性度を評価するために担当医に適切な情報を提供する。
【０１４８】
本明細書で用いる組織損傷は、例えば、切屑（scrape）、切断、裂傷創、挫滅、圧迫損傷、伸展損傷、咬創、擦り傷、銃創、爆創、身体の刺し傷、刺創、火傷、風焼け、日焼け、化学火傷、外科創傷、外科的介入、医学的介入、胞、組織または臓器移植後の宿主拒絶、医薬の効果、医薬の副作用、褥創、放射線障害、化粧品による皮膚創傷、内臓損傷、疾患過程(例えば、喘息、癌)、感染、病原体、発生過程、成熟過程(例えば、にきび)、遺伝的異常、発達異常、環境有害物質、アレルギー誘発物質、頭皮損傷、顔面損傷、顎損傷、足損傷（foot injury）、つま先損傷、指損傷、骨損傷、生殖器損傷、関節損傷、排泄器官損傷、眼損傷、角膜損傷、筋肉損傷、脂肪組織損傷、肺損傷、気道損傷、ヘルニア、肛門損傷、痔疾、耳損傷、網膜損傷、皮膚損傷、腹部損傷、腕損傷、脚損傷、スポーツ外傷、背部損傷、分娩損傷（birth injury）、早産損傷（premature birth injury）、毒性咬傷（toxic bite）、毒針咬傷（sting）、腱損傷、靱帯損傷、心臓損傷、心臓弁損傷、脈管系損傷、軟骨損傷、リンパ系損傷、頭蓋大脳外傷、脱臼、食道穿孔、瘻孔（fistula）、爪損傷、異物（foreign body）、骨折、凍傷、手損傷、熱ストレス障害（heat stress disorder）、裂傷、頸部損傷、自傷、ショック状態、外傷性軟組織損傷、脊髄損傷（spinal cord injury）、脊髄損傷（spinal injury）、捻挫、筋損傷（strain）、腱損傷、靱帯損傷、軟骨損傷、胸部損傷、歯損傷、外傷、神経系損傷、老化、動脈瘤、卒中、消化管損傷、梗塞、または虚血性損傷の結果生じ得る。
【０１４９】
Ｂ．組成物の作製方法
本明細書で開示の組成物および開示の方法に必要な組成物を、特に他に記載がなければ、特定の試薬または化合物に関して当業者に公知の何らかの方法を用いて作製することができる。
【０１５０】
例えば、供した核酸を、標準化学合成法を用いるか、または酵素法または何らかの他の公知の方法を用いて作製することができる。そのような方法は、標準的酵素消化法、その後のヌクレオチド断片単離(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chapters 5, 6を参照のこと)から、例えば、BiosearchまたはBeckmanシステム１プラスＤＮＡ合成機(例えば、Milligen−Biosearch, Burlington, MAのモデル８７００自動合成機またはABIモデル380B)を用いてシアノエチルホスホロアミデート（cyanoethyl phosphoramidite）法による純粋な合成法までの範囲であり得る。オリゴヌクレオチドの作製に有用な合成方法は、Ikuta et ah, Ann. Rev. Biochem. 53:323−356 (1984) (ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法)、およびNarang et al., Methods EnzyrnoL, 65:610−620 (1980) (ホスホトリエステル法)にも記載される。タンパク質核酸分子は、Nielsen et ah, Bioconjug. Chem. 5:3−7 (1994)に記載のもののような公知の方法を用いて作製され得る。
【０１５１】
配列番号２のような開示したポリペプチドの１つの作製方法は、タンパク質化学技術により、２個以上のペプチドまたはポリペプチドを共に結合させることである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドを、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル)またはＢｏｃ(Ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル)化学(Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)のどちらかを用いて、現在利用可能な実験室装置を用いて化学的に合成することができる。当業者は、開示したタンパク質に相当するペプチドまたはポリペプチドを、例えば、標準的化学反応により合成することができることを容易に理解し得る。例えば、ペプチドまたはタンパク質の他の断片を合成し、その後レジンから切断することができるが、ペプチドまたはポリペプチドを、その合成レジンから切断することなく合成することができ、それ故に、他の断片を機能的に阻害する末端基を露出させる。ペプチド縮合反応により、これらの２個の断片は、それらのカルボキシおよびアミノ末端それぞれでのペプチド結合により共有結合してタンパク質またはその断片を形成することができる(Grant GA (1992) Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. Y. (1992); Bodansky M and Trost B., Ed. (1993) Principles of Peptide Synthesis. Springer− Verlag Inc., NY (それらは、少なくともペプチド合成に関係する物質について参照により本明細書中に包含される)。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを、本明細書に記載の通り、インビボで独立して合成する。単離すると、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを、同様のペプチド縮合反応により結合させ、そのペプチドまたは断片を形成させ得る。
【０１５２】
例えば、クローン化または合成ペプチド断片の酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチド断片を、大きなペプチド断片、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインを作製するために結合させることが可能である(Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 (1991))。あるいは、合成ペプチドの天然化学ライゲーションを、より短いペプチド断片から大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的に作製するために利用可能である。この方法は、２段階の化学反応からなる(Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science, 266:776−779 (1994))。最初の段階は、非保護合成ペプチド−チオエステルを、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の非保護ペプチド断片と化学選択的に反応させ、チオエステル結合中間体を最初の共有結合生成物として得る。反応条件を変えることなく、この中間体は、自発的な、迅速な分子内反応を受け、ライゲーション部位に天然ペプチド結合を形成する(Baggiolini M et al. (1992) FEBS Lett. 307:97−101; Clark−Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 (1994); Clark−Lewis I et al., Biochemistry, 30:3128 (1991); Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623−30 (1994))。
【０１５３】
あるいは、非保護ペプチド断片を、化学的に結合させ、化学的ライゲーションの結果、ペプチド断片間に形成される結合は、非天然(非ペプチド)結合である(Schnolzer, M et al. Science, 256:221 (1992))。この技術を、完全な生物学的活性を有するタンパク質ドメインの類似体ならびに多量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いた(deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257−267 (1992))。
【０１５４】
組成物ならびに組成物に至る中間体を作製するための方法を開示する。合成化学方法および標準的分子生物学的方法のような、これらの組成物を作製するために用い得る様々な方法が存在する。これらおよび他の開示した組成物を作製する方法が特に開示されることが理解される。本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸および該核酸の発現を制御する配列を作動可能に連結させることを含む方法により作製された核酸分子を開示する。細胞を本明細書に記載の核酸の何れかを用いて形質転換する方法により作製された細胞を開示する。本明細書に記載の核酸のいずれかを発現する方法により作製された開示したペプチドの何れかを開示する。動物の細胞を、本明細書に記載の核酸分子の何れかを用いて形質転換する方法により作製された動物を開示する。動物の細胞を、本明細書に記載の核酸分子の何れかを用いてトランスフェクトする方法により作製された動物であって、哺乳動物である動物を開示する。また、動物の細胞を、本明細書に記載の核酸分子の何れかを用いてトランスフェクトする方法により作製された動物であって、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長動物である動物を開示する。また、動物に本明細書に記載の細胞の何れかを添加する方法により作製された動物を開示する。
【０１５５】
Ｃ．キット
上記の物質ならびに他の物質は、開示の方法を実行するのに有用なキット、または開示の方法の実行を補助するためのキットとして、何らかの適する組み合わせで共にパッケージされ得る。それは、特定のキット中のキット構成要素が、開示の方法において共に使用するために設計され適合されるとき有用である。例えば、創傷治癒を促進するためのキットであって、本明細書に記載の１個以上のポリペプチド、核酸またはベクターおよび薬学的に許容される担体を含むキットを開示する。かかるキットにはまた、ジェル、包帯、ミリポアテープ、薬用Ｑチップ、スプレー、ドロップ、シロップ、液体、使い捨てチューブまたはポーチが含まれ得る。キットはまた、生成物または製剤の適する使用および安全性の情報のための指示書を含み得る。キットは、医師により決定されるような、適用に基づく投与量情報および投与方法を含み得る。
【０１５６】
Ｄ．使用
開示の方法および組成物を、実験室研究ツールを含むが、これに限定されない多数の領域に適用可能である。これらの製剤は、例えば、細胞増殖、細胞移動のようないくつかの細胞過程において調節的役割を果たす。これらの製剤は、様々な細胞過程、細胞周期制御、細胞行動、細胞、臓器または組織の試験化合物などに対する応答を研究するための、インビトロおよびインビボモデル系の両方で実験室レベルで使用可能である。該製剤を、それらのみ、または他の化合物との組み合わせまたは細胞増殖分析のためのキットのようなキットの一部として提供することができる。該キットは、それらのみまたは他の化合物との組み合わせで本明細書に記載の製剤を含み得る。かかるキットは、実験を容易にするために設計された指示書を含み得る。他の使用が開示され、開示から明らかであり、および／または当業者に理解され得る。
【実施例】
【０１５７】
実施例１：インビボスクラッチ傷
新生仔ラット心臓由来の筋細胞を、標準プロトコールに従い組織培養ディッシュ上でコンフルエントに近い単層を形成するまで増殖させた。その後、その培養物を、３０μＭ ＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)、３０μＭ 非活性対照ペプチド(配列番号５５)を含む培養培地、またはＡＣＴペプチドを含まないかまたは対照ペプチドを含むリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中、さらに５日間培養した。非活性対照ペプチドは、カルボキシ末端を有するポリペプチドを含み、ここで、ＡＣＴペプチド配列は逆であった。ＡＣＴおよび対照ペプチドのアミノ末端を両方ともビオチン化し、標準的顕微鏡法またはビオチンとの結合に高親和性のストレプトアビジンに基づく生化学的方法を用いて、細胞質中のペプチドの検出(すなわち、分析)が可能である。
【０１５８】
ペプチドまたはビヒクル対照を添加した培養培地を、実験中２４時間毎に交換した。図１ａは、ＡＣＴペプチドが、対照条件(図１ｂおよび図１ｃ)と比較して筋細胞で、Ｃｘ４３ギャップ結合形成の程度をかなり増加させることを示す。図４に示す通り、ＡＣＴペプチドに応答して、このＣｘ４３ギャップ結合形成の増加は、Ｃｘ４３を発現する多数の細胞タイプに共通である。
【０１５９】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、標準プロトコールに従い組織培養ディッシュ上でコンフルエントに近い単層を形成するまで２−３日間増殖させ、その後、該単層をＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)で２４時間前処理し、ｐ２００ピペットチップで“スクラッチ傷”を付けた。その後、“スクラッチ傷”を、培養培地中に溶解した３０μＭ ＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)の存在下(図２ａ、ｂ)または２種の対照条件下(図２ｃ−ｆ)で、２４時間、再び増殖させた。第一の対照条件において、“スクラッチ傷”を付けた細胞を、３０μＭの濃度で培養培地中に溶解した非活性対照ペプチド(図１を参照のこと)の存在下で２４時間再増殖させた(図２ｃ、ｄ)。第二の対照条件において、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)を培養培地に添加し、“スクラッチ傷を付けた”細胞を、ＡＣＴペプチドを含まないかまたは対照ペプチドを含むビヒクル対照溶液の存在下で再増殖させた(図２ｅ、ｆ)。ＡＣＴペプチド処置細胞の“スクラッチ傷”は、２４時間後に、最初の“スクラッチ傷”端の領域内(すなわち、小さな黒色矢印で印した領域内)に増殖するほんの少しの細胞（大きな矢印）を含み、比較的再増殖しないままであった(図２ａ)。対照的に、対照条件(図２ｃ、ｅ)において、多数の細胞(大きな矢印)が、最初の“スクラッチ傷”領域内で再増殖した。“スクラッチ傷”の再増殖は、“スクラッチ傷”領域中に多数存在する形質転換細胞の移動により一部生じる。図２ｂ、ｄおよびｆは、“スクラッチ傷”または損傷端の細胞の増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）免疫標識を示す。ＡＣＴペプチド処理細胞(図２ｂ)は、バックグラウンドおよび非増殖と一致する低光度のみを示す。図(図２ｄ、ｆ)に示す２種の対照条件でのみ、明るく標識した増殖細胞(白色矢印)が見られる。このことは、ＡＣＴペプチドが、実験用細胞モデルにおいて形質転換細胞の増殖も低下させることを示す。
【０１６０】
図３ａは、２４時間後のＡＣＴペプチドおよび非活性ペプチド処置対照細胞の損傷端を示す。細胞を、可視化を補助するために蛍光ファロイジンで標識した。ＡＣＴペプチド処理細胞は、スクラッチ傷領域の低い再増殖レベルを示す(白色双頭矢印)。図３ｂは、２４時間後のスクラッチ傷の再増殖細胞領域％の棒グラフを示す。ＡＣＴペプチド存在下、損傷領域における細胞の減少は劇的であり、０．０００００１未満のｐ値を有する。
【０１６１】
ＷＢ−Ｆ３４４細胞は、単離したラット肝臓細胞の発癌物質を用いる処理により得られた形質転換されたラット上皮細胞株である(Tsao et al., 1984; Hayashi et al., 1997; Hayashi et al., 1998; Hayashi et al, 2001)。ＷＢ−Ｆ３４４細胞を、ｃＤＮＡ発現プラスミド構築物を用いてトランスフェクトし、標準プロトコールを用いて抗生物質存在下に選択し、プロモーター配列と作動可能に連結したＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチド(配列番号６)または対照としてプロモーター配列と作動可能に連結した緑色蛍光タンパク質(ＧＦＰ)ポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株を作製した。ＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、ＧＦＰをコードする。そのようなものとして、ＡＣＴペプチドの発現を、光学顕微鏡下で標準ＧＦＰ蛍光光学により評価することができた。図４ａ、ｂは、ＧＦＰのみ(図４ａ)またはＧＦＰ＋ＡＣＴペプチド配列のカルボキシ末端(図４ａ)またはＧＦＰのみ(図４ｂ)を発現するＷＢ−Ｆ３４４細胞株のＧＦＰ蛍光の高倍率画像を示す。ＷＢ−Ｆ３４４細胞株のコンフルエント付近の単層を“スクラッチ傷”を付け、２４時間再増殖させる。ビヒクルまたは非活性対照ペプチドで処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞の対照の場合と同様に、ＧＦＰを発現する対照上皮細胞株は、スクラッチ傷を再増殖した(図４ｃ)。しかしながら、プロモーターと作動可能に連結されたＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を安定に発現する上皮細胞株において、スクラッチ傷の再増殖が阻害された(図４ｄ)。ＷＢ−Ｆ３４４細胞株に加えて、プロモーター配列と作動可能に連結されたＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチドを安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞株を作製した。
【０１６２】
実施例２：インビボ創傷治癒
一腹の新生仔マウスを、低体温法を用いて脱感作した。４ｍｍ長の切開皮膚損傷を、肩甲骨間の背側正中線の皮膚(下層にある筋肉のレベルに至る)の全層に外科用メスを用いて作製した。その後、含まない（対照）または６０μＭ濃度でＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)を溶解して含む２０％ pluronic(Ｆ−１２７)ゲル溶液３０μｌを、切開した損傷に用いた。Pluronicゲルは、ミセルでのＡＣＴペプチドの均一分散を補助し得る弱い界面活性特性を有する。より重要なことは、２０％pluronicゲルは、１５℃以下の温度で液体であるが、体温(３７℃)で重合化する。このpluronicゲルの特性は、恐らく、ペプチドを創傷のプロテアーゼに富む環境下で分解から保護し、また、ペプチドの活性濃度がより長時間維持されるのを可能にする、切開損傷部位での組織中へのペプチドの制御放出を補助した。対照またはＡＣＴペプチドを含むゲルを、最初の適用後連続して２４時間用いた。対照およびＡＣＴペプチド含有ゲルを、第二の適用後にはさらに適用しなかった。４８時間後、ＡＣＴペプチド処理損傷(図５ａ)が、ＡＣＴペプチドを受容しない対照損傷(図５ｂ)よりも外見上、かなり閉傷し、炎症が少なく、腫れが少なく(創傷端の突起に注目のこと)、ならびに一般的により治癒したことを特記できる。炎症におけるこれらの相違である対照処理損傷とＡＣＴペプチド処理損傷との間の腫れおよび治癒が、７２(図５ｃ、ｄ)および９６(図５ｅ、ｆ)時間点で持続した。７日目に、ＡＣＴペプチド創傷(図５ｇ)は、対照ペプチド処理損傷(図５ｈ)より平滑になり、瘢痕化の出現は少なかった。同じ動物における同じ損傷の画像が、治癒経時変化中の異なる時間点で示されることを特記する。
【０１６３】
麻酔した成体マウスを、肩甲骨間の背側正中線における下層の筋肉に至るまでの８ｍｍ幅の円形切除皮膚損傷を、鋭利な外科用はさみを用いて作製した(図６ａ、ｂ)。損傷の境界を、プラスチックシート中、８ｍｍ幅の円形テンプレート切断により定めた。その後、含まない(対照)または１００μＭの濃度で溶解したＡＣＴ １ ペプチド(配列番号２)を含む３０％ pluronicゲルの溶液１００μｌを、切除損傷に適用した。対照またはＡＣＴペプチドを含むゲルを、最初の適用後、連続して２４時間用いた。対照およびＡＣＴペプチドを含むゲルを、第二の適用後、それ以上には用いなかった。より早く閉じたＡＣＴペプチド処理した大きな切除損傷(図６ａ、ｃ、ｅ、ｇ、ｉ)は、１４日間の経時変化において、ＡＣＴペプチドを受容しない対照損傷(図６ｂ、ｄ、ｆ、ｈ、ｊ)よりも、外見上炎症が低減し、より早く治癒し、そして瘢痕化が低減した。実際、１４日目の対照損傷は、損傷の早急な治癒が不十分であることを示す未だ部分的な疥癬を示す(図６ｊ)。
【０１６４】
創傷部位全体の皮膚生検を、切除損傷後２４時間のうちに採取し、これらの皮膚試料を、標準プロトコールを用いて２％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、区分し、ヘモトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)組織化学的染色した。図７ａおよび７ｂは、ＡＣＴペプチドおよび対照処理した損傷それぞれの創傷の中心付近からの横断面の低倍率概観図を示す。正常な組織学的所見の皮膚により囲まれた創傷端(小さい矢印で示した)を、両方の場合に観察することができる。黒色の長方形は、図７ａおよび７ｂの画像の左側の創傷端上に位置する。図７ａおよび７ｂの左側の創傷端上に位置する長方形内の組織学的構造を、ＡＣＴペプチドおよび対照処理した組織のそれぞれに関して、図７ｃおよび７ｄに高倍率で示す。興味があるのは、損傷基底部から創傷端および損傷外表面までまたはその近くまでの整列した線維性物質の“襟様（collar−like）”組織(矢印)である。線維性物質は、損傷表面から移動する炎症性細胞の移動のための基質として働く(Elder et al., 1997)。興味深いことに、整列した線維性物質は、ＡＣＴペプチド処理した損傷（図７ｃ）よりも、対照損傷（図７ｄ）においてより組織化される外観を有する。また、ＡＣＴペプチド処理した組織において、線維性物質が点在するかなり低密度の炎症性細胞が存在する。これは、（図７ｄ）および（図７ｃ）で見られる黒い長方形内の組織切片領域が高倍率でそれぞれ見られる、（図７ｅ）および（図７ｆ）で確認される。整列した線維性物質が点在する炎症性細胞には、マスト細胞、好中球およびマクロファージが含まれる。これらの炎症性細胞は、ＡＣＴペプチド処理した損傷におけるよりも、対照損傷においてより高密度で生じる。
【０１６５】
１４日間の最後に、切除損傷部位全体の皮膚生検を採取し、これらの皮膚試料からの組織切片を、Ｈ＆Ｅ組織化学的に染色した。図８ａおよび図８ｂは、ＡＣＴペプチドおよび対照それぞれの損傷のほぼ中央からの横断面の低倍率概観図を示す。正常な組織学的所見の皮膚により囲まれた創傷端(小さい矢印で示した)を、両方の場合に観察することができる。黒色の長方形は、図８ａおよび図８ｂの画像の各損傷のほぼ中央に位置する。これらの２個の長方形内の組織学的構造を、ＡＣＴペプチドおよび対照組織のそれぞれに関して、図８ｃおよび図８ｄに高倍率で示す。ＡＣＴペプチド処理した損傷領域内の組織は、より複雑性を有することが明らかである。ＡＣＴ処理した創傷の外表面には、損傷表面の再上皮形成が完了したことを示す上皮細胞の連続した層が存在するが、該上皮は、創傷のほぼ中央がまだ比較的薄い(図８ｃ)。まれに、毛嚢の再生は、既に、治癒した損傷を覆う新しい上皮中の幹細胞とはデノボで相違して見える(図８ｃ、小さい矢印)。比較すると、損傷表面の再上皮形成は不完全であり、対照損傷の上皮中の毛嚢を再生する徴候はない。ＡＣＴペプチド処理した損傷皮膚の再形成上皮下に、腺状構造、線維および結合組織、血管組織、筋肉および脂肪細胞を含む、正常な構造的複雑性のかなりの修復が全てはっきりと見られる（図８ａ、ｃ）。毛嚢と同様に、この組織複雑性は、幹細胞の分化により再生された。対照的に、対照損傷において創傷組織は、この瘢痕組織内に特に見られない組織構造の他の複雑性を有する、線維性瘢痕組織の均一の大きなプラグが完全に多数を占めている（図８ｂ、ｄ）。
【０１６６】
麻酔した成体マウスに、頸部および(上部)背部上に鋭利な外科用はさみを用いて２個の小さな（５ｍｍ直径）切除皮膚創傷を作製した。損傷の境界を、プラスチックシート中、５ｍｍ幅の円形テンプレート切断により定めた。その後、含まない(対照)または１００μＭの濃度で溶解したＡＣＴペプチド(ＡＣＴ ２−配列番号１，ＡＣＴ １−配列番号２、ＡＣＴ ３−配列番号３、ＡＣＴ ４−配列番号４、ＡＣＴ ５−配列番号５)の１種を含む３０％ pluronicゲルの溶液５０−６０μｌを、切除損傷に適用した。対照またはＡＣＴペプチドを含むゲルを、最初の適用後、連続して２４時間用いた。対照およびＡＣＴペプチドを含むゲルを、第二の適用後、それ以上には用いなかった。ＡＣＴ １ (図９ｅ−ｈ)、ＡＣＴ ２ (図９ｉ−ｌ)、ＡＣＴ ３ (図９ｍ−ｐ)、およびＡＣＴ５ (図９ｕ−ｘ)ペプチドの場合に、より早く閉じた切除損傷は、２４０時間（１０日間）の経時変化において、ＡＣＴペプチド（図９ａ−ｄ）を受容しない対照損傷よりも、外見上炎症が低減し、より早く治癒し、そして瘢痕化が低減したことを特記し得る。ＡＣＴ ４ ペプチド(図９ｑ−ｔ)はまた、経時変化において対照よりも治癒の中程度の改善を示した。同じ動物での同じ損傷が、治癒経時変化における異なる時間点で示されることに注意すること。
【０１６７】
開口創傷の領域を、標準プロトコールに従い、複数(対照または処理条件につき、〜５匹のマウス)の成体マウスのＮＩＨ画像を用いて経時変化を測定した。その後、これらの個々の領域測定を、特定の時間点で対照損傷について測定された平均値（すなわち、除算）に１００を乗じて標準化し、対照と比較して閉じた創傷の％を得、その後、時間に対してプロットした。マンホイットニーのＵ検定を用いて、ＡＣＴペプチドの効果を経時変化で統計的に評価した。ＡＣＴ １、ＡＣＴ ２、ＡＣＴ ３、およびＡＣＴ ５ペプチドは、切除損傷後のた創縫合率を顕著に改善した。これらの処理は、有意なｐ値の結果を与える。ＡＣＴ １およびＡＣＴ ３は、対照よりも顕著な改善を定量的に与えた。一定であるが、より小さい改善が、対照よりもＡＣＴ ４ペプチドでも観察された。
【０１６８】
麻酔した成体ラットを、定位固定装置に置いた。頭皮を正中切開し、頭蓋骨を露出させた。定位ドリルをブレグマの２ｍｍの後部に合わせ、２つの穴を、ブレグマの左右からそれぞれ２．５ｍｍ、かつ硬膜下３．５ｍｍに、１ｍｍの球体ビットで開けた。脳損傷を、１８ゲージの注射針を挿入して作製した。座標を、Paxinos and Watson (1986)による地図（atlas）から決定した。中空線維膜(ＨＦＭ)を、該穴に挿入し、外表皮膚縫合を傷を覆うために行った。ＡＣＴペプチドを、ＨＦＭを含む２％コラーゲンビヒクル溶液中、１００μＭ濃度で溶解した。単離したＨＦＭの実験は、これらの人工構築物が、少なくとも７日間、ＡＣＴペプチド(ビオチン−ストレプトアビジン反応により評価される通り)水溶液の検出可能レベルの遅延放出が可能であったことを示した。炎症およびその後のグリア性瘢痕形成と関係する反応性星状細胞増加症は、げっ歯動物モデルの脳損傷後によく特徴付けられた経時変化の次に起こる(Norenberg, 1994; Fawcett and Asher, 1999)。典型的に、ラット脳における星状細胞応答は、ニューロンの欠失および脳組織の複雑性の他の局面と共に、一週間後が最大である。その後、グリア瘢痕組織の出現と共に、ＧＦＡＰ陽性星状細胞の密度が低下する。図１０ｂおよび図１０ｃは、脳透過性損傷後一週間、ＡＣＴペプチド＋ビヒクルゲルまたは対照コラーゲンビヒクルゲルで満たした、脳組織(皮質)を覆うＨＦＭ移植片の切片の低倍率概観図を示す。対照組織（図１０ｃ）において、高密度の免疫標識したＧＦＡＰ陽性星状細胞が、ＨＦＭにより生じる損傷部位近くで観察される。これらの細胞の密度は、損傷からわずかに遠位で減少するように見える。対照的に、より低密度のＧＦＡＰ陽性星状細胞が、ＡＣＴペプチドで満たしたＨＦＭ付近で観察される(図１０ｂ)。実際、ＧＦＡＰ陽性細胞のレベルは、正常な損傷を受けていない脳組織に見られるのと異ならない。図１０ｂおよび図１０ｃ中の白色長方形内の組織領域は、図１０ｄおよび図１０ｅそれぞれにて高倍率で示される。ＡＣＴペプチドで処理した脳損傷（図１０ｄ）において、ＧＦＡＰ陽性星状細胞が、数が少ないだけでなく、対照損傷（図１０ｅ）で見られるよりも小さいことが判明し得る。
【０１６９】
図１１ａおよび図１１ｂは、脳の穿痛損傷後１週間に、対照コラーゲンビヒクルゲル（図１１ｂ）またはＡＣＴペプチド＋ビヒクルゲル（図１１ａ）で満たした脳組織(皮質)を覆うＨＦＭ移植片(移植または損傷境界を矢印で示す)の切片の低倍率概観図を示す。対照組織（図１１ｂ）において、高密度の免疫標識したＧＦＡＰ陽性星状細胞および低密度のＮｅｕＮ免疫標識したニューロンが、ＨＦＭにより生じる損傷部位近くで観察される。これらの細胞の密度は、ＨＦＭから遠位で、それぞれ減少および増加するように見える。対照的に、より低密度のＧＦＡＰ陽性星状細胞およびより数の多いＮｅｕＮ免疫標識したニューロンが、ＡＣＴペプチドで満たしたＨＦＭ付近（ならびに遠位）で観察される（図１１ａ）。図１１ａおよび図１１ｂにおけるＨＦＭ付近の領域を、高倍率図の図１１ｃおよび図１１ｂそれぞれに示す。また、対照組織（図１１ｄ）において、ＡＣＴペプチド処理した組織（図１１ｃ）と比較して、著しく増加した密度のＧＦＡＰ陽性星状細胞および低減した密度のＮｅｕＮ陽性ニューロンが観察される。相補的パターンが、星状細胞より多く見られるＮｅｕＮ陽性ニューロンを含む、ＡＣＴペプチドを含むＨＦＭ付近で観察される（図１１ｃ）。
【０１７０】
興味深いことに、高倍率図の図１１ｄは、対照（図１１ｄ）と比較して、分裂過程のニューロンが高頻度で示される。このことは、ＡＣＴペプチド処理と関係する高密度のニューロンが、新しいニューロンの産出になり得ることを示唆する。ＡＣＴペプチドはまた、ニューロンが脳損傷後に細胞死しないようにすることにより一部でニューロン密度を増加し得る。
【０１７１】
実施例３：急性脊髄損傷の処置
急性脊髄損傷を有する対象は、機能の小さな神経学的な回復さえ、それらのその後の独立に重要な影響を与え得る、重大な問題のある群を示す。一例において、急性脊髄損傷を有する対象に、急性脊髄損傷部位に直接、８時間以内に１５分かけてＡＣＴペプチド(例えば、配列番号１)の０．０２％から０．１％溶液をボーラス投与し、次いで４５分後、その後２３から４８時間、ＡＣＴペプチドの０．０１％溶液を注入した。別の例において、ＡＣＴペプチドを、急性脊髄損傷部位、または急性脊髄損傷領域を越える神経再接続を促進するように設計された培養生体骨格（tissue engineered bioscaffold）中に直接、８時間以内に負荷した遅延放出ナノ粒子をコートするために用いる。機能の改善を、運動活性、針を刺した皮膚の感受性および感覚の回復を測定するために設計された評価を含む神経学的転帰検査により、処置後一定間隔(例えば、６、１２、２６および５２週)で医師により評価する。
【０１７２】
実施例４：切除皮膚創傷の創縫合、組織再生、および引張強度の定量的評価
ＡＣＴペプチド(ｎ＝１２)および対照(Ｎ＝８)の５ｍｍ直径の切除皮膚創傷を、上記の成体マウスに作製した。その後、創縫合率の定量的評価、再生した毛嚢の計数および引張強度測定を、最初の損傷後９０日までの時間点で、創傷を受けた皮膚に行う。対照創傷と比較して、縫合（closure）は、ペプチド処理の２４時間以内に顕著に増大した。同様に、１０日目にて、ほとんどの創傷の縫合が完了間近なとき、極めて大きな相違が、ＡＣＴペプチド処理創傷が対照創傷よりも平均４３％小さいように維持されていた。１０日目に、ＡＣＴペプチド創傷は、対照創傷よりも、治癒創傷の単位面積当たり再生した毛嚢の数の有意な３．２倍増加を示した。
【０１７３】
損傷後１ヶ月および３ヶ月にて、治癒した５ｍｍ直径の切除創傷の機械的特性を実験した。機械的特性評価に関して、動物を殺した後に皮膚試料を得、５ｋｇのロードセルを備えるＭＴＳ ８５８ Ｍｉｎｉ Ｂｉｏｎｉｘ(MTS Systems Corporation, MN, USA)を用いて評価した。評価の間、皮膚試料を０．５ｍｍ／秒の速度で破壊するために拡張した。圧力および張力を、破壊時に測定した。引張強度(圧力)および破壊するための伸張(張力)を、下記の通りに計算した；圧力(Ｎ／ｍｍ２)＝破壊力(Ｎ)／試料の断面積(ｍｍ２)。張力(％)＝[破壊時の長さの増加(ｍｍ)／元の長さ(ｍｍ)]×１００。各創傷皮膚試料についての圧力および張力計算を、同じ動物から集めた近位の正常な皮膚試料に標準化した。
【０１７４】
１ヶ月において、創傷皮膚の破壊に必要な圧力(すなわち、標準化した力)は、対照創傷皮膚のそれと同じ程度であった。３ヶ月において、処理群中の高いバラツキは、対照からの有意な平均値の分離を不可能にしたが、ペプチド処理した創傷皮膚の破壊のための標準化した圧力は、平均して対照創傷皮膚の２倍であった。この結果は、ペプチド処理創傷の内因性引張強度が、非処理創傷のそれと同程度か、またはそれより良好であったことを証明する。さらに、ペプチド処理創傷の伸張性の顕著な改善が見られた。ペプチド処理創傷の破壊に必要な張力(すなわち、伸張性)は、１か月において対照よりもやや改善された。３ヶ月において、ペプチド処理創傷は、非創傷皮膚の正常に近い９０％まで増加する、より著しい改善を示した。対照的に、３ヶ月において対照創傷は、正常皮膚の６０％程度の伸張性のみとなった。
【０１７５】
開示した方法および組成物が、変わり得ることが記載される特定の方法、プロトコール、および試薬に限定されないことが理解される。また、本明細書で用いられる専門用語は、特定の態様のみを説明する目的であって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定され得る本発明の範囲を制限することを意図しないことが理解される。
【０１７６】
本明細書および特許請求の範囲で用いる通り、単数形“a”、“an”および“the”には、文脈中他にはっきりと記載されない限り複数形が包含されることに留意すべきである。故に、例えば、“ポリペプチド”なる記載には、複数のかかるポリペプチドが包含され、“ポリペプチド”なる記載は、１個以上のポリペプチドおよび当業者に公知のその同等物などに関する。
【０１７７】
“任意の”または“所望により”は、その後に記載される事象、状況、または物質が、起こるかもしくは起こらないか、または存在していてよいかもしくは存在し得ないことを意味し、該記載には、事象、状況、または物質が、起こるかまたは存在する例、および起こらないかまたは存在しない例が含まれる。
【０１７８】
範囲は、本明細書中、“約”１つの特定の値から、および／または“約”他の特定の値までで示され得る。そのような範囲が示されるとき、また、本明細書中他に特に記載がない限り、記載の特定の考慮および検討は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までの範囲である。同様に、値が、その前の“約”の使用により近似値として示されるとき、特定の値が、本明細書中他に特に記載がない限り、開示されたと見なされるべき、別の、特に考慮される態様を形成することが理解されるだろう。それぞれの範囲の終点が、本明細書中他に特に記載がない限り、他方の終点と関連して、および他方の終点と独立して重要であることが、さらに理解されるだろう。最終的に、明確に開示された範囲内に含まれる個々の値の全ておよび値の下位範囲が、本明細書中他に特に記載がない限り、特に考慮され、開示されたと見なされるべきであることが理解されるはずである。特定の場合において、これらの態様のいくつかまたは全てが明確に開示されるかどうかに関わらず、上記のことは適用される。
【０１７９】
他に異なる定義がない限り、本明細書で用いる全ての技術および化学的用語は、当技術分野の開示した方法および組成物について、当業者に一般的に理解されているのと同様の意味を有する。本明細書に記載のものと同様または等価な何らかの方法および物質を、本発明の方法および組成物の実施または試験に用いることができるが、特定の有用な方法、装置、および物質が記載される。本明細書に引用される文献および引用される物質は、特に参照により本明細書中に包含される。本発明が、先の発明によってかかる開示内容に先行する権利を与えられないということを認めると解釈されてはならない。何れの参考文献も先行技術を構成すると認められない。参考文献の議論は、それらの作者が主張することを記載し、本発明者らは、引用した文献の正確性および妥当性を調べる権利を有する。多くの刊行物が本明細書中に参照されるが、そのような参照が、これらの文献の何れかが当技術分野の一般的知識の一部を形成という承認を構成しないことは、明確に理解されるだろう。
【０１８０】
本明細書の記載のおよび特許請求の範囲の記載を通して、用語“含む”およびその用語の変形、例えば“包含”および“含む”は、“限定することなく含むこと”を意味し、例えば、他の付加物、成分、個体（integer）または段階（step）を除くことを意図しない。
【０１８１】
当業者は、本明細書に記載の方法および組成物の特定の態様の多くの同等物を、常套の実験程度を用いて、認識または確認することができる。かかる同等物は、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０１８２】
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【０１８３】
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【０１８５】
【表８】
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【表９】
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【０１８６】
【表１０】
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【表１１】
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【０１８７】
【表１２】
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【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】図１は、アルファコネキシン カルボキシ末端(ＡＣＴ)ポリペプチドが、培養した新生仔筋細胞におけるＣｘ４３ギャップ結合形成の程度を増加することを示す。
【図２】図２は、ＡＣＴペプチドが、スクラッチにより損傷した形質転換した線維芽細胞(ＮＩＨ−３Ｔ３細胞)の増殖および移動を阻止することを示す。
【図３】図３は、実験細胞モデルにおいて、損傷後のＡＣＴペプチドによる移動の阻止の定量化を示す。
【図４】図４は、上皮細胞ＷＢ−Ｆ３４４における、プロモーターと作動可能に連結されたＡＣＴペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現が、実験細胞モデルにおいてスクラッチ傷後の移動を阻止することを示す。
【図５】図５は、ＡＣＴペプチドが、新生仔マウスにおいて、切開皮膚損傷後の炎症を軽減し、治癒を改善し、そして瘢痕化を低減することを示す。
【図６】図６は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける大きな切除皮膚損傷後の炎症を軽減し、治癒を改善し、そして瘢痕化を低減することを示す。
【図７】図７は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける切除皮膚損傷後の炎症性細胞の密度を低下することを示す。
【図８】図８は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける切除皮膚損傷後の治癒を促進し、瘢痕化を低減し、そして複雑な組織構造の再生を促進することを示す。
【図９】図９は、ＡＣＴペプチドが、成体マウスにおける切除皮膚損傷後の炎症を軽減し、治癒を改善し、そして瘢痕化を低減することを示す。
【図１０】図１０は、ＡＣＴペプチドが、成体ラットにおける脳の穿痛損傷後のグリア性瘢痕を形成する星状細胞の数および密度を減少することを示す。
【図１１】図１１は、ＡＣＴペプチドが、成体ラットにおける脳の穿痛損傷後の神経維持および神経再生を促進することを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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