(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカラシンＤ（Cytochalasin D）、3-ATA（3-amino-9-thio(10H)-acridone）、アフィディコリン（Aphidicolin）、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸（2’3’-dideoxythymidine 5’-triphosphate）、チミジン二量体（dipyrimidine dithymidylic acid）、ピリドキサール・リン酸（Pyridoxal 5′-phosphate hydrate）、及びリトコール酸（Lithocholic acid）からなる群より選択される化合物、又は以下の(a)〜(f)、即ち、
(a) DNAポリメラーゼδ1遺伝子、DNAポリメラーゼδ2遺伝子、DNAポリメラーゼδ3遺伝子又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子を標的とするsiRNA；
(b) DNAポリメラーゼδ1遺伝子、DNAポリメラーゼδ2遺伝子、DNAポリメラーゼδ3遺伝子又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト；
(c) DNAポリメラーゼδ1遺伝子、DNAポリメラーゼδ2遺伝子、DNAポリメラーゼδ3遺伝子又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸；
(d) DNAポリメラーゼδ1遺伝子、DNAポリメラーゼδ2遺伝子、DNAポリメラーゼδ3遺伝子又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム；
(e) DNAポリメラーゼδ1遺伝子、DNAポリメラーゼδ2遺伝子、DNAポリメラーゼδ3遺伝子又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子がコードするタンパク質のドミナントネガティブ変異体を細胞内で生成する核酸コンストラクト；
(f) DNAポリメラーゼδ1遺伝子、DNAポリメラーゼδ2遺伝子、DNAポリメラーゼδ3遺伝子又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子がコードするタンパク質のドミナントネガティブ変異体、
からなる群より選択される化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤を有効成分として含有し、免疫療法に使用される悪性黒色腫治療用医薬。
【請求項２】
外科的切除、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される一以上の療法と併用される免疫療法に使用される医薬である、請求項１に記載の悪性黒色腫治療用医薬。
【請求項３】
免疫療法が癌ワクチン療法、サイトカイン療法、活性化自己リンパ球療法（ＣＡＴ療法）、細胞障害性Ｔリンパ球移入療法（ＣＴＬ療法）、及び腫瘍組織浸潤Ｔリンパ球療法（ＴＩＬ療法）からなる群から選択されるいずれかの治療法である、請求項１又は２に記載の悪性黒色腫治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は悪性黒色腫抗原の発現上昇剤及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、メラノーマを含めた悪性腫瘍を対象とした免疫療法が補助療法として頻繁に行われている。しかし、免疫療法の臨床効果はさほど高くないのが現状であり、奏功率を高めるための研究が盛んに行われている。このような研究のほとんどは免疫力、特にリンパ球や樹状細胞などの攻撃能力を高めることを目標としたものである。
ところで、臨床での効果がそれほど上がらないことには、「癌の免疫エスケープ現象」と呼ばれる、癌抗原の発現低下若しくは消失が関連していると考えられる。癌抗原は樹状細胞がリンパ球を癌に対して活性化するために必要であるとともに、リンパ球が癌細胞を攻撃する際の目印となる。癌抗原が消失すればリンパ球が癌を攻撃できなくなり、免疫療法の効果は上がらない。そこで、癌抗原の発現を上昇させれば免疫療法の効果を高めることができると考えられる。この考え方についての手法やいくつかの薬剤が特許文献１、２及び非特許文献１、２に示されている。
【特許文献１】国際公開第２００４／０８７９４１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０１９８８６号パンフレット
【非特許文献１】Kono M et al. Mol Cancer Res. 2006 Oct;4(10):779-92.
【非特許文献２】Dunn IS et al. J Immunol. 2007 Aug:179(4):2134-42.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１と非特許文献１に示された物質は医薬品としての使用実績のないMAPキナーゼ阻害剤であり、その臨床応用には大規模な臨床試験が必要となる。特許文献２と非特許文献２に開示された方法ではインターフェロンβを使用する。現在、インターフェロンβは実際にメラノーマの治療に使用されている。
以上の背景に鑑み本発明は、メラノーマの治療に有効な手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、メラノーマ細胞における抗原（メラノーマ抗原）の発現上昇を促す新規物質を見出すことを目的として検討を重ねた。具体的にはメラノーマ細胞を用いた評価系を構築し、それを利用して様々な薬剤／化合物をスクリーニングした。その結果、１１種類の薬剤／化合物がメラノーマ抗原の発現上昇を促すことを見出すに至った。有効性が認められた薬剤／化合物の中には既に抗癌剤などとして使用されている物質が含まれており、それらについては早期の臨床応用が期待される。対象を広げてスクリーニングを実施した結果、更に９種の薬剤／化合物がメラノーマ抗原の発現上昇を促すことを見出すに至った。更に検討を進めた結果、メラノーマ抗原の発現上昇を引き起こすメカニズムに関し、重要且つ興味深い知見が得られた。
本発明は以上の成果に基づくものであり、以下の構成からなる。
[１]メトトレキセート（Methotrexate）、パクリタキセル（Paclitaxel）、塩酸ダウノルビシン（Daunorubicin, HCl）、塩酸ドキソルビシン（Doxorubicin, HCl）、アクチノマイシンＤ（Actinomycin D）、カンプトテシン（Camptothecin）、エトポシド（Etoposide）、サイトカラシンＤ（Cytochalasin D）、3-ATA（3-amino-9-thio(10H)-acridone）、アフィディコリン（Aphidicolin）、ビスインドールマレイミドI(Bisindolylmaleimide I）、アラビノヌクレオシド（Cytosine Arabinoside）、クルクミン（Curcumin）、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸（2’3’-dideoxythymidine 5’-triphosphate）、チミジン二量体（dipyrimidine dithymidylic acid）、ピリドキサール・リン酸（Pyridoxal 5′-phosphate hydrate）、エピガロカテキンガレート（(-)-Epigallocatechin gallate）、ビダラビン（vidarabine）、レスヴェラトロル（resveratrol）及びリトコール酸（Lithocholic acid）からなる群より選択される化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤。
[２]パクリタキセル（Paclitaxel）、塩酸ダウノルビシン（Daunorubicin, HCl）、塩酸ドキソルビシン（Doxorubicin, HCl）、カンプトテシン（Camptothecin）及びアフィディコリン（Aphidicolin）からなる群より選択される化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤。
[３]アラビノヌクレオシド（Cytosine Arabinoside）、エピガロカテキンガレート（(-)-Epigallocatechin gallate）、ビダラビン（vidarabine）、レスヴェラトロル（resveratrol）及びリトコール酸（Lithocholic acid）からなる群より選択される化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤。
[４]トポイソメラーゼ阻害作用を有する化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤。
[５]DNAポリメラーゼ阻害作用及びRNAポリメラーゼ阻害作用を有する化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤。
[６]DNAポリメラーゼ遺伝子の発現を抑制するか、DNAポリメラーゼの働きを抑制する化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤。
[７]前記化合物が以下の(a)〜(f)からなる群より選択される化合物である、[６]に記載の悪性黒色腫抗原の発現上昇剤：
(a)DNAポリメラーゼ遺伝子を標的とするsiRNA；
(b)DNAポリメラーゼ遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト；
(c)DNAポリメラーゼ遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸；
(d)DNAポリメラーゼ遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム；
(e)DNAポリメラーゼ遺伝子がコードするタンパク質のドミナントネガティブ変異体を細胞内で生成する核酸コンストラクト；
(f)DNAポリメラーゼ遺伝子がコードするタンパク質のドミナントネガティブ変異体。
[８]前記DNAポリメラーゼ遺伝子が、DNAポリメラーゼδ1遺伝子、DNAポリメラーゼδ2遺伝子、DNAポリメラーゼδ3遺伝子又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子である、[６]又は[７]に記載の悪性黒色腫抗原の発現上昇剤。
[９][１]〜[８]のいずれか一項に記載の発現上昇剤を有効成分として含有する、悪性黒色腫治療用医薬。
[１０]免疫療法に使用される医薬である、[９]に記載の悪性黒色腫治療用医薬。
[１１]外科的切除、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される一以上の療法と併用される免疫療法に使用される医薬である、[９]に記載の悪性黒色腫治療用医薬。
[１２]免疫療法が癌ワクチン療法、サイトカイン療法、活性化自己リンパ球療法（ＣＡＴ療法）、細胞障害性Ｔリンパ球移入療法（ＣＴＬ療法）、及び腫瘍組織浸潤Ｔリンパ球療法（ＴＩＬ療法）からなる群から選択されるいずれかの治療法である、[１０]又は[１１]に記載の悪性黒色腫治療用医薬。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原MART1発現上昇活性の比較。SK-MEL28細胞を用いた試験系で評価した。
【図２】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原gp100発現上昇活性の比較。SK-MEL28細胞を用いた試験系で評価した。
【図３】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原TYR発現上昇活性の比較。SK-MEL28細胞を用いた試験系で評価した。
【図４】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原TRP1発現上昇活性の比較。SK-MEL28細胞を用いた試験系で評価した。
【図５】SK-MEL28細胞を用いた試験系の試験結果。
【図６】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原MART1発現上昇活性の比較。A375細胞を用いた試験系で評価した。
【図７】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原gp100発現上昇活性の比較。A375細胞を用いた試験系で評価した。
【図８】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原TYR発現上昇活性の比較。A375細胞を用いた試験系で評価した。
【図９】１１種類の薬剤／化合物のメラノーマ抗原TRP1発現上昇活性の比較。A375細胞を用いた試験系で評価した。
【図１０】A375細胞を用いた試験系の試験結果。
【図１１】９種の薬剤／化合物の各種メラノーマ抗原発現上昇活性の比較（SK-MEL28細胞を用いた試験系）。
【図１２】９種の薬剤／化合物の各種メラノーマ抗原発現上昇活性の比較（A375細胞を用いた試験系）。
【図１３】担癌マウスを用いた実験の結果。アフィディコリン、メトトレキセート及びドキソルビシンの３剤の効果を比較した。
【図１４】担癌マウスを用いた実験の結果。メトトレキセートを３日間投与した場合のメラノーマ抗原の発現量を示した。
【図１５】腫瘍組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスIの発現増強。メラノーマ抗原の発現上昇を促す各種薬剤について、A375細胞を用いてMHCクラスIの発現増強効果（タンパク質レベル）を比較した。
【図１６】DNAポリメラーゼδ1（POLD1）遺伝子を標的としたRNAiの結果（定量PCR）。POLD1遺伝子の発現阻害によってメラノーマ抗原MART1及びgp100のmRNA発現が上昇することがわかる。
【図１７】DNAポリメラーゼδ2（POLD2）遺伝子を標的としたRNAiの結果（定量PCR）。POLD2遺伝子の発現阻害によってメラノーマ抗原MART1、TYR、TRP1のmRNA発現が上昇することがわかる。
【図１８】DNAポリメラーゼδ3（POLD3）遺伝子を標的としたRNAiの結果（定量PCR）。POLD3遺伝子の発現阻害によってメラノーマ抗原MART1、gp100、TYR、TRP1のmRNA発現が上昇することがわかる。
【図１９】DNAポリメラーゼδ4（POLD4）遺伝子を標的としたRNAiの結果（定量PCR）。POLD4遺伝子の発現阻害によってメラノーマ抗原TYRのmRNA発現が上昇することがわかる。
【図２０】DNAポリメラーゼδ1（POLD1）遺伝子を標的としたRNAiの結果（FCM）。POLD1遺伝子の発現阻害による、メラノーマ抗原MART1の発現上昇がタンパク質レベルで確認された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
（悪性黒色腫抗原の発現上昇剤）
本発明の第１の局面は悪性黒色腫（以下、「メラノーマ」ともいう）抗原の発現上昇剤に関する。「悪性黒色腫抗原（即ち、メラノーマ抗原）」とは、Tリンパ球によって認識される、メラノーマに発現する蛋白又はペプチドを指し、メラノサイト特異的蛋白、各種癌細胞と正常精巣細胞に発現する癌−精巣抗原、癌細胞の突然変異に由来するアミノ酸変異をもつペプチドなどに分けられる。これまでに、メラノーマ抗原としてＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ＴＹＲ（チロシナーゼ）、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ２、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ６、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＵＭ１等が知られている。そして、「悪性黒色腫抗原の発現上昇剤」とは、悪性黒色腫抗原の細胞内での発現量を上昇させる薬剤をいう。本発明の発現上昇剤が標的とするメラノーマ抗原は特に限定されないが、好ましくはＭＡＲＴ１、ｇｐ１００、ＴＹＲ（チロシナーゼ）又はＴＲＰ１である。尚、本発明の発現上昇剤は、二つ以上のメラノーマ抗原を標的とするものであってもよい。【０００７】
本発明の発現上昇剤は、メトトレキセート（Methotrexate）、パクリタキセル（Paclitaxel）、塩酸ダウノルビシン（Daunorubicin, HCl）、塩酸ドキソルビシン（Doxorubicin, HCl）、アクチノマイシンＤ（Actinomycin D）、カンプトテシン（Camptothecin）、エトポシド（Etoposide）、サイトカラシンＤ（Cytochalasin D）、3-ATA（3-amino-9-thio(10H)-acridone）、アフィディコリン（Aphidicolin）、ビスインドールマレイミドI（Bisindolylmaleimide I）、アラビノヌクレオシド（Cytosine Arabinoside, Ara-C）、クルクミン（Curcumin）、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸（2’3’-dideoxythymidine 5’-triphosphate, ddTTP）、チミジン二量体（dipyrimidine dithymidylic acid, pTpT）、ピリドキサール・リン酸（Pyridoxal 5′-phosphate hydrate）、エピガロカテキンガレート（(-)-Epigallocatechin gallate, EGCG）、ビダラビン（vidarabine）、レスヴェラトロル（resveratrol）及びリトコール酸（Lithocholic acid）からなる群より選択される化合物からなる。後述の実施例に示す通り、これらの化合物はいずれも単独でメラノーマ抗原の発現上昇を促した。この中でも、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン（Doxorubicin, HCl）、カンプトテシン及びアフィディコリンはSKMEL28細胞を用いた試験系においても、A375細胞を用いた試験系においても強い活性を示し（後述の実施例を参照）、特に好ましい化合物といえる。また、アラビノヌクレオシド、エピガロカテキンガレート、ビダラビン、レスヴェラトロル及びリトコール酸も高い活性を示し、特に好ましい化合物である。
以下で説明するように、上記化合物の多くはトポイソメラーゼ阻害剤に該当する。この事実に基づき本発明の一態様は、トポイソメラーゼ阻害作用を有する化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤を提供する。
一方、アラビノヌクレオシド、クルクミン、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸、チミジン二量体、ピリドキサール・リン酸、エピガロカテキンガレート、ビダラビン、レスヴェラトロル及びリトコール酸はいずれもDNA・RNAポリメラーゼ阻害剤として知られている薬剤である。そこで本発明の一態様は、DNAポリメラーゼ阻害作用及びRNAポリメラーゼ阻害作用を有する化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤を提供する。【０００８】
メトトレキセートは、葉酸のアナログで、核酸合成に必要な活性葉酸を産生させるジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）を阻害し、DNA合成を阻害する。また、DHFR、チミジル酸合成酵素などの葉酸依存性の酵素を抑制し、DNA合成を阻害する。メトトレキセートは、細胞増殖抑制およびアポトーシスを引き起こし、抗腫瘍活性を示す。【０００９】
パクリタキセルは、イチイの皮から分離された抗腫瘍剤であり、βチューブリンに結合して会合を促進（脱重合を阻害）する。これにより、腫瘍細胞は細胞周期のG2/M期に停止し、分裂が阻害され、アポトーシスが引き起こされる。【００１０】
塩酸ダウノルビシンは抗腫瘍剤であり、トポイソメラーゼIおよびII阻害剤である。DNA合成及びDNA依存性RNA合成を阻害することで腫瘍細胞の増殖を抑制する。【００１１】
塩酸ドキソルビシンは抗腫瘍性抗生物質である。トポイソメラーゼII阻害剤で、トポイソメラーゼIIによるDNA鎖切断状態で、トポイソメラーゼIIとDNAの共有結合複合体を安定化してDNA合成とRNA合成を阻害する。また、特異的インターカレーションによって腫瘍細胞内のDNAと結合し、細胞分裂の際にDNAの開裂を妨げる。【００１２】
アクチノマイシンＤは抗腫瘍性抗生物質であり、デオキシグアノシン残基を介してDNAと複合体を形成することによって、DNA依存性RNAポリメラーゼを阻害する。高濃度においてはDNAポリメラーゼの阻害作用を示す。また、セリンプロテアーゼの競合的阻害剤としても作用する。【００１３】
カンプトテシンは、クロタキカズラ科クサミズキ(Nothapodytes foetida)、ヌマミズキ科カンレンボク(Camptotheca acuminata)に含まれるアルカロイドであり、高い抗腫瘍活性と広い抗腫瘍スペクトルを示す。DNAトポイソメラーゼI阻害剤である。【００１４】
エトポシドはトポイソメラーゼII阻害剤で、トポイソメラーゼIIによるDNA鎖切断状態で、トポイソメラーゼIIとDNAの共有結合複合体を安定化してDNA合成を阻害する。【００１５】
サイトカラシンＤは、アクチンフィラメントの重合阻害剤であり、細胞質分裂を抑制する。【００１６】
3-ATAは、ポリアニオン性の多芳香族化合物であり、タンパク質・核酸複合体の形成に依存する細胞プロセスの強力な阻害剤として使用されている。また、3-ATAはDNAトポイソメラーゼIIを強力に阻害する活性を有し、血管新生の強力な阻害剤としても作用する。【００１７】
アフィディコリンは、DNAポリメラーゼ阻害剤である。ポリメラーゼα、δ及びεの特異的阻害剤で、細胞周期のG1期で細胞が停止する。【００１８】
ビスインドールマレイミドIはプロテインキナーゼC（PKC）を阻害する。【００１９】
アラビノヌクレオシドは抗悪性腫瘍剤（抗がん剤）の一種で、急性骨髄性白血病の第一次選択薬である。また、ピリミジンアナログであり、dCTPと拮抗的にポリメラーゼを阻害する。【００２０】
クルクミンはカレーのスパイスであるウコン（ターメリック、学名Curcuma longa）の黄色色素で、ポリフェノールの一種である。クルクミンは、ポリメラーゼの鋳型DNAおよび基質dNTPとの結合を非拮抗的に阻害する。【００２１】
2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸は、dTTPの代わりにDNA鎖に取り込まれて、ポリメラーゼの伸長反応を停止させる。【００２２】
チミジン二量体は、DNAに紫外線などが照射されるとチミン塩基間に化学結合が形成され、生成する二量体である。突然変異の原因となるが、生体にはチミジン二量体に特異的な除去修復機構がある。【００２３】
ピリドキサール・リン酸は、鋳型DNAとは非拮抗的に、基質dNTPとは拮抗的に結合し、ポリメラーゼを阻害する。すべての動物由来のポリメラーゼを阻害するが、特にαとεを強く阻害する。【００２４】
エピガロカテキンガレートは緑茶に多く含まれる成分である。鋳型DNAとは拮抗的に、基質dNTPとは非拮抗的に結合し、阻害する。すべての動物由来ポリメラーゼを阻害するが、特にαとλを強く阻害する。エピガロカテキンガレートはCOX、NO、酸化ストレス阻害剤、テロメラーゼ阻害剤でもある。【００２５】
ビダラビンは細胞内でリン酸化されて対応するヌクレオチドとなり、ウイルスのDNAポリメラーゼ活性を阻害してDNAの伸長を抑制することにより、抗ウイルス作用を示す。【００２６】
レスヴェラトロルはブドウの皮や赤ワインに含まれる成分でポリフェノールの一種である。ポリメラーゼαに結合し、基質のdNTPと非拮抗的に阻害する。ポリメラーゼα、δ、λを阻害するが、βは阻害しない。【００２７】
リトコール酸は胆汁酸の一種で、ヒト体内にも微量に存在する。ポリメラーゼβのN末8 kDaドメインに結合する。31 kDaの触媒ドメインには結合しない。すべての動物由来ポリメラーゼを阻害するが、βを強く阻害する。
尚、以上の化合物はいずれも市販されており、容易に入手可能である。【００２８】
後述の実施例に示す通り、メラノーマ抗原の発現上昇を促す手段としてDNAポリメラーゼ遺伝子の発現を抑制することが有効であるとの知見が得られた。当該知見に基づき本発明の一態様では、DNAポリメラーゼ遺伝子の発現を抑制する化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤が提供される。一方、上記知見に従えば、DNAポリメラーゼの働きの抑制もまた、メラノーマ抗原の発現上昇を促す手段として有効であるといえる。そこで本発明の他の一態様では、DNAポリメラーゼの働きを抑制する化合物からなる、悪性黒色腫抗原の発現上昇剤が提供される。本発明を構成する化合物の例は次の通りである。尚、DNAポリメラーゼ遺伝子の発現を抑制するとは、DNAポリメラーゼ遺伝子の発現過程（転写、転写後調節、翻訳、翻訳後調節を含む）を抑制することを意味する。また、本発明における「発現の抑制」は一過的抑制及び恒常的抑制のいずれでもよい。
(a)DNAポリメラーゼ遺伝子を標的とするsiRNA
(b)DNAポリメラーゼ遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト
(c)DNAポリメラーゼ遺伝子の転写産物を標的とするアンチセンス核酸
(d)DNAポリメラーゼ遺伝子の転写産物を標的とするリボザイム
(e)DNAポリメラーゼ遺伝子がコードするタンパク質のドミナントネガティブ変異体を細胞内で生成する核酸コンストラクト
(f)DNAポリメラーゼ遺伝子がコードするタンパク質のドミナントネガティブ変異体【００２９】
上記(a)〜(f)の内、(a)〜(d)が「DNAポリメラーゼ遺伝子の発現を抑制する化合物」に該当し、上記(e)及び(f)が「DNAポリメラーゼの働きを抑制する化合物」に該当する。【００３０】
DNAポリメラーゼは１５種以上存在し、各DNAポリメラーゼはいくつかのサブユニットの複合体である。本発明の化合物は、標的とするDNAポリメラーゼのいずれかのサブユニットをコードする遺伝子の発現を抑制するか、或いは当該サブユニットの働きを抑制することによって所期の効果、即ち悪性黒色腫抗原の発現を上昇させるという効果を発揮する。【００３１】
上記(a)及び(b)は、いわゆるRNAi（RNA interference；RNA干渉）による発現抑制に利用される化合物である。換言すれば、上記(a)又は(b)の化合物を有効成分とする本発明の発現上昇剤によればRNAiによりDNAポリメラーゼの発現を抑制することができる。RNAiは真核細胞内で引き起こすことが可能な、配列特異的な転写後遺伝子抑制のプロセスである。哺乳動物細胞に対するRNAiでは、標的mRNAの配列に対応する配列の短い二本鎖RNA（siRNA）が使用される。通常、siRNAは21〜23塩基対である。哺乳動物細胞は二本鎖RNA（dsRNA）の影響を受ける２つの経路（配列特異的経路及び配列非特異的経路）を有することが知られている。配列特異的経路においては、比較的長いdsRNAが短い干渉性のRNA（即ちsiRNA）に分割される。他方、配列非特異的経路は、所定の長さ以上であれば配列に関係なく、任意のdsRNAによって惹起されると考えられている。この経路ではdsRNAが二つの酵素、即ち活性型となり翻訳開始因子eIF2をリン酸化することでタンパク質合成のすべてを停止させるPKRと、RNAase L活性化分子の合成に関与する2',5'オリゴアデニル酸シンターゼが活性化される。この非特異的経路の進行を最小限に留めるためには約30塩基対より短い二本鎖RNA（siRNA）を使用することが好ましい(Hunter et al. (1975) J Biol Chem 250: 409-17; Manche et al. (1992) Mol Cell Biol 12: 5239-48; Minks et al. (1979) J Biol Chem 254: 10180-3; 及び Elbashir et al. (2001) Nature 411: 494-8を参照されたい）。【００３２】
標的特異的なRNAiを生じさせるためには標的遺伝子のmRNA配列の一部と相同なセンスRNA及びこれに相補的なアンチセンスRNAからなるsiRNAを細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させればよい。上記(a)は前者の方法に対応する化合物であり、同様に上記(b)は後者の方法に対応する化合物である。【００３３】
標的遺伝子（本発明の場合はDNAポリメラーゼ遺伝子）を標的とするsiRNAは、通常、当該遺伝子のmRNAの配列における連続する領域と相同な配列からなるセンスRNAとその相補配列からなるアンチセンスRNAがハイブリダイズした二本鎖RNAである。ここでの「連続する領域」の長さは通常15〜30塩基、好ましくは18〜23塩基、より好ましくは19〜21塩基である。【００３４】
末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖RNAが高いRNAi効果を発揮することが知られている。そこで本発明においても、そのような構造のsiRNAを採用することが好ましい。オーバーハングを形成する塩基の長さは特に限定されないが、好ましくは2塩基（例えばTT、UU）である。【００３５】
修飾したRNAからなるsiRNAを用いることにしてもよい。ここでの修飾の例としてホスホロチオエート化、修飾塩基（例えば蛍光標識塩基）の使用が挙げられる。【００３６】
siRNAの設計及び調製は常法で行うことができる。siRNAの設計には通常、標的配列に固有の配列（連続配列）が利用される。尚、適当な標的配列を選択するためのプログラム及びアルゴリズムが開発されている。【００３７】
上記(b)の「siRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト」とは、それを細胞に導入すると細胞内でのプロセスによって所望のsiRNA（標的遺伝子に対するRNAiを引き起こすsiRNA）が生ずる核酸性分子をいう。当該核酸コンストラクトの一つの例はshRNA（short hairpin RNA）である。shRNAは、センスRNAとアンチセンスRNAがループ構造部を介して連結された構造（ヘアピン構造）を有し、細胞内でループ構造部が切断されて二本鎖siRNAとなり、RNAi効果をもたらす。ループ構造部の長さは特に限定されないが、通常は3〜23塩基である。【００３８】
核酸コンストラクトの別の例は、所望のsiRNAを発現し得るベクターである。このようなベクターとしては、後のプロセスによってsiRNAに変換されるshRNAを発現する（shRNAをコードする配列がインサートされた）ベクター（ステムループタイプ又はショートヘアピンタイプと呼ばれる）、センスRNAとアンチセンスRNAを別々に発現するベクター（タンデムタイプと呼ばれる）が挙げられる。これらのベクターは当業者であれば常法に従い作製することができる（Brummelkamp TR et al.(2002) Science 296:550-553; Lee NS et al.(2001) Nature Biotechnology 19:500-505; Miyagishi M & Taira K (2002) Nature Biotechnology 19:497-500; Paddison PJ et al.(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1443-1448; Paul CP et al.(2002) Nature Biotechnology 19 :505-508; Sui G et al.(2002) Proc Natl Acad Sci USA 99(8):5515-5520; Paddison PJ et al.(2002) Genes Dev. 16:948-958等が参考になる）。現在、種々のRNAi用ベクターが利用可能である。このような公知のベクターを利用して本発明のベクターを構築することにしてもよい。この場合、所望のRNA（例えばshRNA）をコードするインサートDNAを用意した後、ベクターのクローニングサイトに挿入し、RNAi発現ベクターとする。【００３９】
尚、標的遺伝子に対するRNAi作用を発揮するsiRNAを細胞内で生じさせるという機能を有する限り、ベクターの由来や構造は限定されるものではない。従って、各種ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等）、非ウイルスベクター（リポソーム、正電荷型リポソーム等）等を用いることができる。ベクターに利用可能なプロモーターの例を示すと、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーターである。これらのプロモーターはRNAポリメラーゼIII系のプロモーターであり、高い発現効率を期待できる。【００４０】
上記(c)はアンチセンス法による発現抑制に利用される化合物である。換言すれば、上記(c)の化合物を有効成分とする本発明の薬剤によれば、アンチセンス法によりDNAポリメラーゼ遺伝子の発現を抑制することができる。アンチセンス法による発現阻害を行う場合には例えば、標的細胞内で転写されたときに、DNAポリメラーゼ遺伝子のmRNAの固有の部分に相補的なRNAを生成するアンチセンス・コンストラクトが使用される。このようなアンチセンス・コンストラクトは例えば、発現プラスミドの形態で標的細胞に導入される。一方、アンチセンス・コンストラクトとして、標的細胞内に導入されたときに、DNAポリメラーゼ遺伝子のmRNA／又はゲノムDNA配列とハイブリダイズしてその発現を阻害するオリゴヌクレオチド・プローブを採用することもできる。このようなオリゴヌクレオチド・プローブとしては、好ましくは、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼなどの内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるものが用いられる。アンチセンス核酸としてDNA分子を使用する場合、DNAポリメラーゼ遺伝子のmRNAの翻訳開始部位（例えば-10〜+10の領域）を含む領域に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。【００４１】
アンチセンス核酸と、標的核酸との間の相補性は厳密であることが好ましいが、多少のミスマッチが存在していてもよい。標的核酸に対するアンチセンス核酸のハイブリダイズ能は一般に両核酸の相補性の程度及び長さの両方に依存する。通常、使用するアンチセンス核酸が長いほど、ミスマッチの数が多くても、標的核酸との間に安定な二重鎖（又は三重鎖）を形成することができる。当業者であれば、標準的な手法を用いて、許容可能なミスマッチの程度を確認することができる。【００４２】
アンチセンス核酸はDNA、RNA、若しくはこれらのキメラ混合物、又はこれらの誘導体や改変型であってもよい。また、一本鎖でも二本鎖でもよい。塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格部分を修飾することで、アンチセンス核酸の安定性、ハイブリダイゼーション能等を向上させることなどができる。また、アンチセンス核酸に、細胞膜輸送を促す物質（例えば Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652; PCT Publication No. W088/09810, published December 15, 1988を参照されたい)や、特定の細胞に対する親和性を高める物質などを付加してもよい。【００４３】
アンチセンス核酸は例えば市販の自動DNA合成装置（例えばアプライド・バイオシステムズ社等）を使用するなど、常法で合成することができる。核酸修飾体や誘導体の作製には例えば、Stein et al.(1988), Nucl. Acids Res. 16:3209やSarin et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451等を参照することができる。【００４４】
標的細胞内におけるアンチセンス核酸の作用を高めるために、pol IIやpol IIIといった強力なプロモーターを利用することができる。即ち、このようなプロモーターの制御下に配置されたアンチセンス核酸を含むコンストラクトを標的細胞に導入すれば、当該プロモーターの作用によって十分な量のアンチセンス核酸の転写を確保できる。【００４５】
アンチセンス核酸の発現は、哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）で機能することが知られている任意のプロモーター（誘導性プロモーター又は構成的プロモーター）によって行うことができる。例えば、SV40初期プロモーター領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウィルスの3'末端領域由来のプロモーター(Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797)、疱疹チミジン・キナーゼ・プロモーター(Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)等のプロモーターを使用することができる。【００４６】
本発明の一態様では、リボザイムによる発現抑制を利用する（上記(d)の化合物の場合）。部位特異的認識配列でmRNAを開裂させるリボザイムを用いて標的mRNAを破壊することもできるが、好ましくはハンマーヘッド・リボザイムを使用する。ハンマーヘッド・リボザイムの構築方法については例えばHaseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591を参考にすることができる。【００４７】
アンチセンス法を利用する場合と同様に、例えば安定性やターゲット能を向上させることを目的として、修飾されたオリゴヌクレオチドを用いてリボザイムを構築してもよい。効果的な量のリボザイムを標的細胞内で生成させるために、例えば、強力なプロモーター（例えばpol IIやpol III）の制御下に、当該リボザイムをコードするDNAを配置した核酸コンストラクトを使用することが好ましい。【００４８】
上記(e)及び(f)の化合物は、ドミナントネガティブ変異を利用して標的（本発明の場合はDNAポリメラーゼ）の働きを抑制する。ドミナントネガティブ変異体とは、変異の導入によって、正常なタンパク質（本発明の場合はDNAポリメラーゼを構成するサブユニット）に比べて機能（活性）が低下したものをいう。従って、その機能を完全に喪失したものに限らず、その機能が部分的に障害されているものドミナントネガティブ変異体に含まれる。ドミナントネガティブ変異体は、対応する正常タンパク質と競合することによって間接的に正常タンパク質の機能を抑制することができる。ドミナントネガティブ変異体を得るためには、一つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加などによってタンパク質の機能が障害されるように、正常タンパク質をコードする核酸に変異を導入すればよい。変異の導入は、PCR法を利用した方法など、常法で行うことができる。また、変異導入用の市販のキットを利用してもよい。【００４９】
本発明の好ましい一態様では、DNAポリメラーゼδを標的とする。この態様の場合、DNAポリメラーゼδの構成遺伝子群、即ちDNAポリメラーゼδ1遺伝子（以下、「POLD1遺伝子」とも呼ぶ）、DNAポリメラーゼδ2遺伝子（以下、「POLD2遺伝子」とも呼ぶ）、DNAポリメラーゼδ3遺伝子（以下、「POLD3遺伝子」とも呼ぶ）又はDNAポリメラーゼδ4遺伝子（以下、「POLD4遺伝子」とも呼ぶ）の発現を抑制する化合物、或いはDNAポリメラーゼδ1、DNAポリメラーゼδ2、DNAポリメラーゼδ3又はDNAポリメラーゼδ4の働きを抑制する化合物が用いられる。尚、POLD1遺伝子の配列（配列番号１）、POLD2遺伝子の配列（配列番号２）、POLD3遺伝子の配列（配列番号３）及びPOLD4遺伝子の配列（配列番号４）を配列表に示す。【００５０】
POLD1遺伝子等を標的としたsiRNAの配列の一例を以下に示す（詳細は後述の実施例を参照）。
POLD1遺伝子を標的としたsiRNA：配列番号５、６
POLD2遺伝子を標的としたsiRNA：配列番号７、８
POLD3遺伝子を標的としたsiRNA：配列番号９、１０
POLD4遺伝子を標的としたsiRNA：配列番号１１、１２【００５１】
（悪性黒色腫治療用医薬）
本発明の第２の局面は上記発現上昇剤の用途に関する。この局面では、上記発現上昇剤を有効成分として含有する悪性黒色腫（メラノーマ）治療用医薬（以下、「本発明の医薬」という）が提供される。本発明の医薬は、典型的には、メラノーマを罹患した対象に対して腫瘍の消失ないし縮小、症状の改善などを目的として適用される。但し、再発防止などの予防的処置に本発明の医薬を適用してもよい。【００５２】
本発明の医薬は免疫療法に使用される。より詳しくは、メラノーマに対する免疫療法の効果を高めるために使用される。「免疫療法」とは、生体の免疫応答を利用した治療法のことをいう。代表的な免疫療法として、癌ワクチン療法（樹状細胞療法（ＤＣ療法）を含む）、サイトカイン療法、活性化自己リンパ球療法（ＣＡＴ療法）、細胞障害性Ｔリンパ球移入療法（ＣＴＬ療法）、及び腫瘍組織浸潤Ｔリンパ球療法（ＴＩＬ療法）が知られている。これらの中のいずれの免疫療法にも本発明の医薬を適用可能である。尚、メラノーマ細胞に特異的な抗体（典型的にはメラノーマ抗原特異的抗体）を用いた治療法も免疫療法の一つであり、当該治療法にも本発明の医薬を適用可能である。【００５３】
ここで、「癌ワクチン療法」とは、癌抗原（ペプチドやタンパク質など）を直接又は免疫担当細胞に取り込ませた後に患者に接種（投与）し、免疫系を活性化する能動免疫療法である。免疫担当細胞として樹状細胞を利用するものは樹状細胞（ＤＣ）療法と呼ばれる。樹状細胞療法では、癌細胞を異物と認識するように教育された樹状細胞を生体に戻し、免疫誘導を図る。癌ワクチン療法では、免疫誘導ないし活性化のための物質として、腫瘍抗原（天然型又は組換え型）又はその部分ペプチド（天然型又は組換え型）や腫瘍細胞溶解液、腫瘍抗原のHLA結合ペプチド（天然型又は組換え型）などが利用される。【００５４】
「サイトカイン療法」とは、免疫反応を活性化する物質であるサイトカインを生体に投与する治療法である。インターフェロン（ＩＦＮ）やインターロイキン２（ＩＬ−２）などが頻用される。【００５５】
「活性化自己リンパ球療法（ＣＡＴ療法）」とは、免疫反応の中心的役割を担うＴリンパ球を生体外で増殖・活性化させた後に生体へ戻す治療法である。Ｔリンパ球の活性化には抗ＣＤ３抗体やインターロイキン２（ＩＬ−２）などが用いられる。【００５６】
「細胞障害性Ｔリンパ球移入療法（ＣＴＬ療法）」とは、標的に対する特異的攻撃能を獲得した細胞障害性Ｔリンパ球を生体に移入する治療法である。【００５７】
浸潤性の癌では、癌組織を異物として認識する能力を有するリンパ球（腫瘍組織浸潤Ｔリンパ球）が胸腹水や癌組織に存在する。当該リンパ球を生体外で増殖・活性化させた後に生体へ戻す治療法が「腫瘍組織浸潤Ｔリンパ球療法（ＴＩＬ療法）」と呼ばれる。【００５８】
本発明の医薬を使用した免疫療法において、本発明の医薬の投与タイミングは特に限定されない。即ち、免疫療法の主たる処置の前又は後、或いは処置と同時に本発明の医薬が投与される。「免疫療法の主たる処置」とは、免疫応答を惹起ないし活性化するために生体に対して施す中核的な操作をいう。例えば、癌ワクチン療法の一つであるワクチン接種であれば、生体に対してワクチンを接種する操作が「免疫療法の主たる処置」に該当する。同様に、活性化自己リンパ球療法であれば、生体に対して活性化リンパ球を移入する操作が「免疫療法の主たる処置」に該当し、細胞障害性Ｔリンパ球移入療法であれば、生体に対して細胞障害性Ｔリンパ球を移入する操作が「免疫療法の主たる処置」に該当する。
本発明の医薬を複数回投与することにしてもよい。複数回の投与を実施する場合の各投与のタイミングも特に限定されない。【００５９】
単独で実施される免疫療法に限らず、外科的切除、化学療法、及び放射線療法からなる群より選択される一以上の療法と併用される免疫療法に本発明の医薬を適用することもできる。好ましい一態様では、化学療法及び／又は放射線療法と併用される免疫療法に本発明の医薬が適用される。尚、ここでの「化学療法」に使用される薬剤は特に限定されない。メラノーマの化学療法に使用される薬剤として、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、チオテパ、シスプラチン、パクリタキセル、タモキシフェン、ビンクリスチン、サイマルファシン、アドリマイシン、ビンテジン、ビンブラスチン、塩酸ニムスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ソラフェニブ、セレコキシブ、テロゾロミドなどが知られている。また、ＤＡＶ療法（ダカルバジン、塩酸ニムスチン、ビンクリスチン）、ＤＡＶ−ｆｅｒｏｎ療法（ダカルバジン、塩酸ニムスチン、ビンクリスチン、インターフェロンβ）、ＣＤＶ療法（シスプラチン、ダカルバジン、ビンクリスチン）など、複数の薬剤を併用することも試みられている。【００６０】
本発明の医薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。【００６１】
製剤化する場合の剤型も特に限定されない。剤型の例は錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤である。
本発明の医薬には、期待される治療効果（又は予防効果）を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の医薬中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約０．１重量％〜約９５重量％の範囲内で設定する。【００６２】
本発明の医薬はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では本発明の医薬はヒトに対して適用される。例えば経口、静脈内、皮内、皮下、リンパ節内、筋肉内、腹腔内、経皮、経粘膜などを挙げることができる。
本発明の医薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量や投与スケジュールの設定においては一般に患者の症状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮し、必要に応じて予備実験を行い、適当な投与量を設定することが可能である。【００６３】
（メラノーマの治療法）
本発明は更に、メラノーマの治療法を提供する。ここでの「メラノーマの治療法」には、メラノーマの再発防止などの予防的処置も含む。本発明の治療法では、免疫療法の治療効果を高めるために本発明の医薬が患者に投与されることになる。【００６４】
尚、本明細書で特に言及しない事項（条件、操作方法など）については常法に従えばよく、例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）、Current protocols in Immunology, John Wiley& Sons Inc等を参考にすることができる。
【実施例】
【００６５】
＜メラノーマ抗原の発現上昇を促す物質の探索＞
メラノーマ抗原の発現上昇を促す新規物質を見出すことを目的として、メラノーマ細胞を用いた評価系を構築し、それを利用して様々な薬剤／化合物をスクリーニングした。その結果選択された１１種類の化合物について活性を評価した。【００６６】
１．材料および実験方法
（１）薬剤／化合物と試薬
ビスインドールマレイミドI（Bisindolylmaleimide I）、エトポシド（Etoposide，VP-16）はCalbiochem社、パクリタキセル（Paclitaxel）、塩酸ダウノルビシン（Daunorubicin,HCl）、塩酸ドキソルビシン（Doxorubicin,HCl）、アクチノマイシンＤ（Actinomycin D）、カンプトテシン（Camptothecin）、メトトレキセート（Methotrexate）、サイトカラシンＤ（Cytochalasin D）、アフィディコリン（Aphidicolin）は和光純薬、Aurintricarboxylic Acid（3-ATA）はALEXIS社、U0126はcell signaling Technologies社より入手した。Melan-A/MART1を認識するMelan-A抗体はNova Castra社、gp100を認識するHMB45抗体はDako Cytomation社、チロシナーゼ(TYR)抗体およびTRP1抗体はSanta Cruz Biotechnology社より入手した。【００６７】
（２）細胞および培養法
各薬剤／化合物の効果を確認するため、ヒトメラノーマ細胞SK-MEL28（理研バイオリソースセンター）及びA375（DSファーマバイオメディカル（株））を使用した。SK-MEL28はMelan-A/MART1およびgp100の発現が陽性の細胞で、A375はMelan-A/MART1およびgp100の発現が陰性の細胞である。各細胞の培養には、A375は10％ウシ胎児血清（FBS、Equintec-Bio Inc.社製）を含んだDMEM（Sigma-Aldrich社製）を、SK-MEL28は10％ウシ胎児血清（FBS、Equintec-Bio Inc.社製）を含んだMEM（Sigma-Aldrich社製）を増殖培養液として用い、空気中に５％の割合で炭酸ガスを含む培養器内で３７℃にて行った。【００６８】
（３）細胞を用いた薬剤アッセイ
６ウェル細胞培養プレート（商標：Falcon、BD Biosciences社製）に、５×１０５個のヒトメラノーマ細胞（SK-MEL28、A375）を植え込み、２４時間培養後、薬剤／化合物を添加し、７２時間培養を行った。
薬剤／化合物の添加最終濃度は次の通りである。陽性コントロールとして使用したU0126は10μM、メトトレキセート（1μM）、パクリタキセル（100nM）、塩酸ダウノルビシン（100nM）、塩酸ドキソルビシン（100nM）、アクチノマイシンＤ（10nM）、カンプトテシン（100nM）、エトポシド(VP-16)（1μM）、サイトカラシンＤ（100nM）、3-ATA（10μM）、アフィディコリン（1μM）、ビスインドールマレイミドI（10μM）。【００６９】
（４）フローサイトメーター（FCM）解析
メラノーマ細胞の細胞質内のメラノーマ抗原を測定するために、薬剤／化合物を添加して培養した細胞をトリプシン−EDTA溶液（Sigma-Aldrich社製）を使用して回収し、遠心してペレットにした細胞を１ｍLの３７℃、２％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、２分間氷冷する。そこに、氷冷した１００％エタノールを９ｍL加えて、３０分間氷冷する。４％FBS入りPBSで２回洗浄した後、再度４％FBS入りPBSを入れて１０分間室温で静置する。再度ペレットにした細胞に、それぞれのメラノーマ抗原に対する抗体（一次抗体）を加えて４５分間室温に置く。４％FBS入りPBSで洗浄後、二次抗体としてそれぞれの一次抗体に対応するFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体をもしくはFITC標識ウサギ抗ヤギIgG抗体（ZYMED LABORATORIES INC.社）を加えて３０分間室温に置く。最後に、４％FBS入りPBSで２回洗浄する。
この細胞サンプルのFITC蛍光強度をフローサイトメーターFACS  Calibur（BD Biosciences社）で測定し、CellQuestソフトウエア（BD Biosciences社）でそれぞれ薬剤／化合物添加細胞サンプルのMean channel fluorescenceを計算し、薬剤／化合物の添加無しで培養した細胞のそれと比較して相対増加率を計算した。【００７０】
２．結果
フローサイトメーター解析の結果を図１〜１０に示す。SK-MEL28細胞を用いた試験系では、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、カンプトテシン、サイトカラシンＤ、アフィディコリン及びビスインドールマレイミドIにMART1発現上昇活性を認めた（図１）。アフィディコリンの活性は極めて高く、陽性コントロールのU0126を凌駕する。また、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン及びサイトカラシンＤの活性も非常に高い。【００７１】
一方、メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、カンプトテシン、エトポシド、サイトカラシンＤ、3-ATA、アフィディコリン、ビスインドールマレイミドIにgp100発現上昇活性を認めた（図２）。中でもパクリタキセル、エトポシド及びサイトカラシンＤの活性は非常に高い。また、アフィディコリン及びビスインドールマレイミドIの活性もこれに次いで高い。【００７２】
メラノーマ抗原TYRについては、メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン及びアフィディコリンに発現上昇活性を認めた（図３）。中でも、パクリタキセル、塩酸ドキソルビシン、カンプトテシン及びアフィディコリンの活性は極めて高い。【００７３】
メラノーマ抗原TRP1については、メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、エトポシド、サイトカラシンＤ及びアフィディコリンに発現上昇活性を認めた（図４）。中でも、パクリタキセルとカンプトテシンの活性は極めて高い。また、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ及びアフィディコリンの活性はこれに次いで高い。【００７４】
一方、A375細胞を用いた試験系では、メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、エトポシド、アフィディコリンにMART1発現上昇活性を認めた（図６）。中でも塩酸ダウノルビシン、カンプトテシン及びアフィディコリンの活性は極めて高い。【００７５】
メラノーマ抗原gp100については、メトトレキセート、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、エトポシド、サイトカラシンＤ、3-ATA及びアフィディコリンに発現上昇活性を認めた（図７）。中でも、メトトレキセート、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、カンプトテシン、エトポシド及びアフィディコリンの活性は極めて高い。【００７６】
メラノーマ抗原TYRについては、メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、エトポシド、サイトカラシンＤ、アフィディコリン及びビスインドールマレイミドIに発現上昇活性を認めた（図８）。中でもカンプトテシンとアフィディコリンの活性は飛び抜けて高い。また、メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ及びエトポシドの活性も非常に高い。【００７７】
メラノーマ抗原TRP1については全ての薬剤（メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、エトポシド、サイトカラシンＤ、3-ATA、アフィディコリン及びビスインドールマレイミドIに発現上昇活性を認めた（図９）。アフィディコリンの活性は抜きんでて高い。また、メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン及びエトポシドの活性も非常に高い。【００７８】
SK-MEL28細胞を用いた試験系の試験結果をまとめて示す図５と、A375細胞を用いた試験系の試験結果をまとめて示す図１０より、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、カンプトテシン及びアフィディコリンは特に有効な薬剤であるといえる。【００７９】
以上のように、１１種類の薬剤／化合物がメラノーマ抗原の発現上昇を促すことが明らかとなった。メトトレキセート、パクリタキセル、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、アクチノマイシンＤ、カンプトテシン、エトポシドは既に薬剤としてヒトへの使用実績があり、早期に臨床応用できると期待される。【００８０】
＜メラノーマ抗原の発現上昇を促す物質の追加探索＞
メラノーマ抗原の発現上昇を促す新規物質を更に見出すことを目的として、薬剤／化合物をスクリーニングした。スクリーニングの結果として選択された９種類の化合物について活性を評価した。【００８１】
１．材料および実験方法
（１）薬剤／化合物と試薬
アラビノヌクレオシド（Cytosine Arabinoside, Ara-C）、クルクミン（Curcumin）、ピリドキサール・リン酸（Pyridoxal 5′-phosphate hydrate）、エピガロカテキンガレート（(-)-Epigallocatechin gallate, EGCG）、ビダラビン（vidarabine）、レスヴェラトロル（resveratrol）、リトコール酸（Lithocholic acid）の7種はSigma-Aldrich社、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸（2’3’-dideoxythymidine 5’-triphosphate, ddTTP）はJENA BIOSCIENCE社、チミジン二量体（dipyrimidine dithymidylic acid, pTpT）はMIDLAND CERTIFIED REAGENT社より入手した。Melan-A/MART1を認識するMelan-A抗体はNova Castra社、gp100を認識するHMB45抗体はDako Cytomation社、チロシナーゼ(TYR)抗体およびTRP1抗体はSanta Cruz Biotechnology社よりそれぞれ入手した。【００８２】
（２）細胞および培養法
各薬剤／化合物の効果を確認するため、ヒトメラノーマ細胞SK-MEL28（理研バイオリソースセンター）及びA375（DSファーマバイオメディカル（株））を使用した。SK-MEL28はMelan-A/MART1およびgp100の発現が陽性の細胞で、A375はMelan-A/MART1およびgp100の発現が陰性の細胞である。各細胞の培養には、A375は10％ウシ胎児血清（FBS、Equintec-Bio Inc.社製）を含んだDMEM（Sigma-Aldrich社製）を、SK-MEL28は10％ウシ胎児血清（FBS、Equintec-Bio Inc.社製）を含んだMEM（Sigma-Aldrich社製）を増殖培養液として用い、空気中に５％の割合で炭酸ガスを含む培養器内で３７℃にて行った。【００８３】
（３）細胞を用いた薬剤アッセイ
１２ウェル細胞培養プレート（商標：Falcon、BD Biosciences社製）に、１×１０５個のヒトメラノーマ細胞（SK-MEL28、A375）を植え込み、２４時間培養後、薬剤／化合物を添加し、７２時間培養を行った。
薬剤／化合物の添加最終濃度は次の通りである。アラビノヌクレオシド（A375では100μM、SK-MEL28ではチロジナーゼを測定するときのみ50μMで、そのほかは20μM）、クルクミン（いずれも0.2μM）、ピリドキサール・リン酸（いずれも500μM）、エピガロカテキンガレート（いずれも100μM）、ビダラビン（A375では300μM、SK-MEL28では60μM）、レスヴェラトロル（A375では20μM、SKMEL28では50μM）、リトコール酸（A375では100μM、SK-MEL28では20μM）、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸（A375細胞のTRP-1を測定するときのみ2μMで、それ以外は10μM）、ジピリミジンチミジン二リン酸（いずれも100μM）。【００８４】
（４）フローサイトメーター（FCM）解析
メラノーマ細胞の細胞質内のメラノーマ抗原を測定するために、薬剤／化合物を添加して培養した細胞をトリプシン−EDTA溶液（Sigma-Aldrich社製）を使用して回収し、遠心してペレットにした細胞を１ｍLの３７℃、２％ホルムアルデヒドで１０分間固定し、２分間氷冷する。そこに、氷冷した１００％エタノールを９ｍL加えて、３０分間氷冷する。４％FBS入りPBSで２回洗浄した後、再度４％FBS入りPBSを入れて１０分間室温で静置する。再度ペレットにした細胞に、それぞれのメラノーマ抗原に対する抗体（一次抗体）を加えて４５分間室温に置く。４％FBS入りPBSで洗浄後、二次抗体としてそれぞれの一次抗体に対応するFITC標識ヤギ抗マウスIgG抗体をもしくはFITC標識ウサギ抗ヤギIgG抗体（ZYMED LABORATORIES INC.社）を加えて３０分間室温に置く。最後に、４％FBS入りPBSで２回洗浄する。
この細胞サンプルのFITC蛍光強度をフローサイトメーターFACS  Calibur（BD Biosciences社）で測定し、CellQuestソフトウエア（BD Biosciences社）でそれぞれ薬剤／化合物添加細胞サンプルのMean channel fluorescenceを計算し、薬剤／化合物の添加無しで培養した細胞のそれと比較して相対増加率を計算した。【００８５】
２．結果
フローサイトメーター解析の結果を図１１及び１２に示す。SK-MEL28細胞を用いた試験系では、アラビノヌクレオシド、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸、チミジン二量体、エピガロカテキンガレート、ビダラビン及びレスヴェラトロルにMART1発現上昇活性を認めた（図１１）。アラビノヌクレオシドの活性は特に高い。【００８６】
一方、アラビノヌクレオシド、エピガロカテキンガレート及びビダラビンにgp100発現上昇活性を認めた（図１１）。アラビノヌクレオシドの活性は特に高い。【００８７】
メラノーマ抗原TRP1については、アラビノヌクレオシド、ビダラビン、レスヴェラトロル及びリトコール酸に、非常に高い発現上昇活性を認めた（図１１）。【００８８】
メラノーマ抗原TYRについては、アラビノヌクレオシド、ビダラビン及びレスヴェラトロルに発現上昇活性を認めた（図１１）。中でもビダラビンの活性はずば抜けて高い。【００８９】
一方、A375細胞を用いた試験系では、アラビノヌクレオシド、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸、チミジン二量体、ピリドキサール・リン酸、エピガロカテキンガレート、ビダラビン、レスヴェラトロル及びリトコール酸にMART1発現上昇活性を認めた（図１２）。アラビノヌクレオシドとエピガロカテキンガレートの活性は高く、ビダラビンとレスヴェラトロルの活性は極めて高い。【００９０】
メラノーマ抗原gp100については、アラビノヌクレオシド、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸、チミジン二量体、ピリドキサール・リン酸、エピガロカテキンガレート、ビダラビン、レスヴェラトロル及びリトコール酸に発現上昇活性を認めた（図１２）。中でも、アラビノヌクレオシド、ビダラビン及びレスヴェラトロルの活性は非常に高い。【００９１】
メラノーマ抗原TRP1については、アラビノヌクレオシド、クルクミン、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸、エピガロカテキンガレート及びビダラビンに発現上昇活性を認めた（図１２）。中でもアラビノヌクレオシドとエピガロカテキンガレートの活性は非常に高い。【００９２】
メラノーマ抗原TYRについては、アラビノヌクレオシド、クルクミン、2’3’-ジデオキシチミジン三リン酸、チミジン二量体、エピガロカテキンガレート、ビダラビン及びリトコール酸に発現上昇活性を認めた（図１２）。アラビノヌクレオシドの活性はずば抜けて高い。【００９３】
以上の結果をまとめると、アラビノヌクレオシド、エピガロカテキンガレート、ビダラビン、レスヴェラトロル及びリトコール酸は特に有効な薬剤であるといえる。【００９４】
以上のように、９種類の薬剤／化合物がメラノーマ抗原の発現上昇を促すことが明らかとなった。ここで、アラビノヌクレオシド、ピリドキサール・リン酸及びビダラビンは既に薬剤としてヒトへの使用実績がある。一方、クルクミン、エピガロカテキンガレート及びレスヴェラトロルは食品成分である。従って、これらの薬剤／化合物は早期に臨床応用できると期待される。【００９５】
＜担癌マウスを用いた生体での効果確認実験＞
アフィディコリン、メトトレキセート及び塩酸ドキソルビシンの３剤の生体での効果（メラノーマ抗原の発現上昇効果）を、動物モデルを用いて検討した。【００９６】
１．方法
B16メラノーマ細胞2x106をB6マウスの背部に皮下注すると1週間ほどして腫瘍結節を形成する。この担癌B6マウスに各薬剤又はDMSO（コントロール）を1日1回、5日間腹腔内投与し、最終投与日の2日後に腫瘍結節を取り出した。結節中の腫瘍細胞からRNAを抽出し、メラノーマ抗原であり、ヒトのMART1、gp100、DCT遺伝子に対応するマウス遺伝子である、Mart1、gp100及びDctの発現量を調べた。試験群当たり３匹のマウスを使用した（n=3）。メトトレキセートについては、1日1回、3日間投与し、最終投与の翌日に結節を回収する短期プロトコールによる実験も行った。【００９７】
定量PCRは、以下の手順で行った。RNAはRneasy mini kit（QIAGEN社製）を用いて抽出した。抽出したRNAより、Taqman Reverse Transcription Reagents（Applied Biosystems社製）を用いてcDNAを作製した。このcDNAをサンプルとし、標的遺伝子（マウスMart1、マウスgp100及びマウスDct遺伝子、マウスβ-actin遺伝子）を特異的に検出するプライマー及びプローブ（いずれも日本EGT社製）、並びにqPCR Mastermix Low ROX（EUROGENTEC社製）を用いて、Taqman法による定量PCRをリアルタイム定量PCRシステムMX3000p（Stratagene社製）により行った。それぞれの薬剤を添加したサンプルのマウスMart1、マウスgp100及びマウスDctのmRNA量を薬剤／化合物の添加無しで培養した細胞のそれと比較し、マウスβ-actinの発現量で補正した相対増加率をMX-proソフトウエア（Stratagene社製）で計算した。【００９８】
２．結果
5日間投与ではアフィディコリン、メトトレキセート、塩酸ドキソルビシンのいずれについてもメラノーマ抗原の上昇が認められた（図１３）。塩酸ドキソルビシンを5日間投与するとマウスに負担がかかることが分かった。メトトレキセートの場合、3日間の投与でも有意にメラノーマ抗原の発現上昇が認められた（図１４）。但し、3日間投与より5日間投与の方がメラノーマ抗原の発現量は多い。【００９９】
＜腫瘍組織適合遺伝子複合体クラスI分子の発現増強効果についての検討＞
腫瘍組織適合遺伝子複合体（MHC）はメラノーマ抗原を提示する際に必要不可欠な分子である。MHCがメラノーマ細胞で減少していると、たとえメラノーマ抗原が細胞内に多く発現していてもメラノーマ細胞の表面へ提示されず、リンパ球による腫瘍細胞認識効率は高まらない。このことから、免疫療法の奏功率を向上させるためには、MHCの発現増強も非常に重要であるとされる。細胞障害性リンパ球は腫瘍細胞表面に提示された抗原とMHCクラスI分子を一緒に認識して、腫瘍細胞を傷害するので、特にMHCクラスIの発現がメラノーマ免疫療法において重要である。そこで、メラノーマ抗原の発現上昇を促す作用を認めた各薬剤について、MHCクラスIの発現に対する作用・効果を検討した。【０１００】
１．方法
A375メラノーマ細胞をこれまで同様に薬剤で処理し、メラノーマ細胞のMHCクラスIの発現上昇を細胞質表面染色のフローサイトメーター（FCM）によりタンパク質レベルで確認した。FCM解析では細胞質表面染色によりMHCクラスIタンパクのうちでも実際に細胞表面に発現して抗原提示に働いている量のみを測定した。細胞質表面染色のFCM解析は以下の手順で行った。細胞を5mM EDTAと1%Bovine Serum Albumin（BSA）を含んだPBS（EDTAおよびBSAはSigma-Aldrich社製、PBSは商標：GIBCO、Invitrogen社製）で回収し、４℃冷却遠心してペレットにした細胞をPBSで洗浄した後、再度PBSを入れて細胞浮遊液として、それにPE標識マウス抗ヒトMHCクラスI抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を加えて暗所の氷上に３０分間静置し、PBSで洗浄後、1％ホルムアルデヒドを加えて１０分暗所室温で静置し、PBSで洗浄後にFCM解析に供した。この細胞サンプルのPE蛍光強度をフローサイトメーターFACS Calibur（BD Biosciences社）で測定し、CellQuestソフトウエア（BD Biosciences社）でそれぞれ薬剤／化合物添加細胞サンプルのMean channel fluorescenceを計算し、薬剤／化合物の添加無しで培養した細胞のそれと比較して相対増加率を計算した。【０１０１】
２．結果
タンパク質レベル（図１５）において、各薬剤にMHCクラスIの発現増強効果を認めた。【０１０２】
３．考察
上記の動物実験の結果と合わせると、メラノーマ抗原の発現増強とMHCの発現増強の２つの観点より、実験に使用した各薬剤が免疫療法の補助薬剤として有用であるといえる。【０１０３】
＜メラノーマ抗原の発現上昇を引き起こすメカニズムの検討＞
DNAポリメラーゼ阻害剤によるメラノーマ抗原の発現上昇について上記の通り検討を行い、有用ないくつかの薬剤を明らかにした。ところで、DNAポリメラーゼは15種類以上知られている。DNAポリメラーゼ阻害剤のいくつかについては、いずれのポリメラーゼに対して阻害作用を発揮するのか明らかになっている。メラノーマ抗原の発現上昇を促すことが明らかとなったDNAポリメラーゼ阻害剤のうち、アフィディコリン、アラビノヌクレオシド（AraC）、レスヴェラトロル、ビダラビン（AraA）等は、DNAポリメラーゼα、β、γ、δ、εに作用することが分かっている。そこで、メラノーマ抗原の発現上昇についてのメカニズムを詳細に検討するため、メラノーマ細胞内でこれらのDNAポリメラーゼの遺伝子発現を抑制することで同様の効果が得られるか検討した。【０１０４】
１．方法
代表として、DNAポリメラーゼδを標的とした場合について説明する。DNAポリメラーゼδを構成するサブユニットDNAポリメラーゼδ1、2、3及び4（POLD1〜4）遺伝子に対する1μgのsiRNA（以下に示す）をエレクトロポレーション法にてそれぞれ1×106個のヒトメラノーマ細胞（SK-MEL28、A375）に導入した。これらを6ウェル細胞培養プレート（商標：Falcon、BD Biosciences社製）に植え込み、48もしくは72時間培養した。定量PCRによって、メラノーマ抗原の発現上昇をメッセンジャーRNAレベル（詳細は上記＜担癌マウスを用いた生体での効果確認実験＞、１．方法の欄を参照）で検討した。また、POLD1 siRNA導入サンプルについては細胞質内染色のフローサイトメーター（FCM）（詳細は上記＜メラノーマ抗原の発現上昇を促す物質の追加探索＞、１．材料および実験方法、（４）の欄を参照）により、MART1及びgp100の発現上昇をタンパク質レベルで検討した。定量PCRでは、MART1、gp100、チロジナーゼ(TYR)、チロジナーゼ関連遺伝子１(TRP1)の遺伝子とヒトβ-アクチン遺伝子を特異的に検出するプライマーおよびプローブ（いずれも日本EGT社製）を使用した。【０１０５】
（NM_002691(POLD1遺伝子、配列番号１)に対するsiRNA）
5'-GCACAUGGGUGACCUGCAAdTdT-3'（配列番号５（オリゴdT部分を除く配列））
3'-dTdTCGUGUACCCACUGGACGUU-5'（配列番号６（オリゴdT部分を除く配列））
（NM_006230.1 (POLD2遺伝子、配列番号２)に対するsiRNA）
5'-UGAGACCCUUCCUGGAGAAdTdT-3'（配列番号７（オリゴdT部分を除く配列））
3'-dTdTACUCUGGGAAGGACCUCUU-5'（配列番号８（オリゴdT部分を除く配列））
（NM_006591.1(POLD3遺伝子、配列番号３)に対するsiRNA）
5'-GCAUCCAUGUGUACAGCAUdTdT-3'（配列番号９（オリゴdT部分を除く配列））
3'-dTdTCGUAGGUACACAUGUCGUA-5'（配列番号１０（オリゴdT部分を除く配列））
（NM_021173.2 (POLD4遺伝子、配列番号４)に対するsiRNA）
5'-GAGGUGUGGCAGGUGCUGAdTdT-3'（配列番号１１（オリゴdT部分を除く配列））
3'-dTdTCUCCACACCGUCCACGACU-5'（配列番号１２（オリゴdT部分を除く配列））【０１０６】
２．結果
DNAポリメラーゼδの構成遺伝子群の発現抑制によってメラノーマ抗原の発現上昇効果が得られることが示唆された（図１６〜２０）。尚、DNAポリメラーゼα、β、εを標的とした場合においてもメラノーマ抗原の発現上昇を認めた（結果を図示せず）。【０１０７】
以上の通り、DNAポリメラーゼ遺伝子の発現抑制によってメラノーマ抗原の発現上昇が促されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明の発現上昇剤によれば、メラノーマ細胞における抗原（メラノーマ抗原）の発現量を上昇させることによって免疫療法の効果を高めることができる。このように本発明はメラノーマの免疫療法において有用である。本発明の発現上昇剤はメラノーマの再発防止にも利用され得る。【０１０９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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