(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象におけるヘルペスウイルス疾患の予防および／または処置のための医薬の製造のための、チモシンα１の使用であって、チモシンα１がＰＴＸ３と組合せられ、ヘルペスウイルスがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）である、使用。
【請求項２】
サイトメガロウイルス誘発症候群を処置するための医薬の製造のための請求項１に記載の使用であって、
該症候群がＣＭＶ単核症であるか、または
該症候群が免疫不全宿主と関連があり、該免疫不全宿主がＡＩＤＳに罹患しているか、もしくは該免疫不全宿主が臓器移植レシピエントである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載した発明は、ウイルス疾患の予防または処置および／またはウイルス活性化の阻害のための医薬調製のための、チモシンα1の、単独または長いペントラキシンPTX3(PTX3)またはその機能的誘導体の一つまたはガンシクロビルとの組合せにおける使用に関し、ここで該ウイルスが、ヘルペスウイルス、例えばサイトメガロウイルス(CMV)、インフルエンザウイルス、例えばH1N1、H3N2、H5N1またはH5N7ウイルス、パラミクソウイルス、例えば麻疹、呼吸器合胞体ウイルス、コロナウイルス、例えばSARS、HIVウイルス、肝炎ウイルスまたはロタウイルスからなる群から選択される。
【背景技術】
【０００２】
ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)は、約50%の一般的集団に広く見出されるヘルペスウイルスである。HIVに罹患している約90%の人はHCMVを担持する。一般集団において、該ウイルスは、通常、初期感染後体内組織中に潜伏したままである。しかしながら、他人からの感染源として働く口腔、尿および生殖管にうつる。該免疫系がなんらの理由で障害となる場合に、HCMVによる感染は、二次的なより重大な感染をもたらし得る。
【０００３】
垂直感染によりHCMVとなる幼児のおよそ5%は深刻な先天性欠損症を有する。これらは、脳損傷、成長阻害、盲目および他の欠損を包含し得る。この問題は、通常、母親が妊娠中に初めてHCMVを有する場合に生じる。
【０００４】
一般的な成人集団において、HCMVは不活性状態にあるが、冠状動脈疾患の進行と関連する可能性がある。HCMV感染は、動脈プラークおよびアテロ−ム性動脈硬化症の進行に関連がある。
【０００５】
HCMVは、弱くなった免疫系を持つ人々に重大な問題を引き起こし得る。
【０００６】
これは、AIDSに罹患している患者または免疫抑制療法中の患者において、最も一般的な問題である。HCMVは、HIV陽性患者の75〜100%に感染している。HCMVに関連のある最も一般的な合併症は、脈絡網膜炎；肝炎、食道炎、大腸炎、胃炎および膵炎を包含する胃腸管感染症；脳炎および多発性神経根炎を包含する神経発達；肺障害；および精巣上体炎を包含する。
【０００７】
広く知られた癌に罹患する人々または臓器または骨髄移植を受ける人々が、一般的に影響を受ける。感染は、HCMVへの第一回目の暴露を理由とするか、または再活性HCMVの結果であり得る。移植および癌患者において、HCMVは、通常肺炎または下痢を引き起こす胃腸感染をもたらし、死をもたらし得る。さらに、HCMVは、臓器移植レシピエントにおける慢性の同種移植機能不全の進行に関与する。肺移植レシピエントにおけるHCMV疾患と閉塞性細気管支炎の進行との関係は、十分確立されている。さらに、HCMVは、同種移植損傷をもたらし得る多くのリスクファクターの一つである。異種の直接的なウイルス浸潤は、肝臓または腎臓移植患者においてHCMV肝炎をもたらし得る。HCMVにより発症した直接的な症状に加え、このウイルスによる感染による真菌および他の日和見感染、例えばニューモシスティス・カリニ（Pneumocystis carinii）肺炎およびエプスタイン・バー（Epstein-Barr）ウイルスに関連する臓器移植後のリンパ球増殖疾患に対するリスクも増加し得る。
【０００８】
大部分の人々は、成人になる時期までにHCMVに感染している。輸血または臓器移植を受けるあらゆる人は、HCMV感染のリスクがある。
【０００９】
さらに、弱くなった免疫系を有する人々および胎児は、重症疾患に対するリスクがある。
【００１０】
弱くなった免疫系を有する人々における能動的なHCMVの処置は、現在、抗ウイルス剤、例えば、ガンシクロビル、ホヅカネットおよびシドフォビルを用いて為されている。
【００１１】
インフルエンザウイルスにより、風邪、ヒトの気道(鼻、喉および肺)に感染する接触伝染性疾患がもたらされる。通常、インフルエンザは突然生じて、次の症状を含み得る：熱、頭痛、倦怠感(病気に罹ったように感じ、極度な疲労感を感じる)、咳、咽喉炎、鼻詰まりおよび身体の痛み。
【００１２】
パラミクソウイルス科のウイルスは、ヒトにおける広範な独特な臨床的疾患を誘導し、これらは、麻疹ウイルス；耳下腺炎、精巣炎および脳炎の症状を有する流行性耳下腺炎ウイルス；および呼吸器病原体であるパラインフルエンザウイルスを包含する。
【００１３】
呼吸器合胞体ウイルス(RSV)は、幼児や1歳までの子供のなかで細気管支炎および肺炎に関する最も一般的な病因である。病気は、発熱、鼻水、咳および時には喘鳴による始まることが最も多い。RSVは、通常、軽症−重症の風邪の様な症候に関連して一生を通して繰り返される感染をもたらす；しかしながら、重症な下気道疾患は、あらゆる年齢で、特に老人の間で、または障害のある心臓、肺または免疫系を有する人々の間で起こり得る。
【００１４】
コロナウイルスは、多様な哺乳動物および鳥類に感染し、ヒトにおいては、経腸感染による重症急性呼吸器症候群(SARS)および神経学的症候群を包含する呼吸器感染を引き起こす。成人感染は一般的ではなく、また再感染は一生にわたり発症すると思われる。
【００１５】
ヒトの免疫不全ウイルス(HIV)はレトロウイルスである。レトロウイルス粒子中の遺伝子情報は、RNAにコードされている。宿主細胞中に入る際に、このRNAは、ウイルス逆転写酵素によりDNAに複製される。ウイルス遺伝子の情報であるこのcDNAコピーは、核中の宿主細胞の染色体に組み入れられ得る。このプロウイルスは、再活性化されて、より感染性のより高いレトロウイルス粒子を産生する前に、多くの細胞区分に対して不活性にすることが出来る。
【００１６】
ウイルス性肝炎は、ウイルス感染によりもたらされるあらゆるタイプの肝臓炎症である。肝臓疾患をもたらすと認識される３つの最も一般的なウイルスは、肝炎A、肝炎Bおよび肝炎非A、非B(肝炎Cとも呼ばれる)である。いくつかの他の型が認識されている：肝炎D、肝炎Eおよび最近同定された肝炎G。7番目のタイプ(肝炎F)の嫌疑はあるが確認されていない。
【００１７】
ロタウイルスは、子供の間で米国において毎年およそ55,000人の子供を入院させ、全世界で年間600,000人以上の子供を死亡させる重症な下痢の最も一般的な病因である。
【００１８】
チモシンα1は、医療分野で十分知られている化合物である。
【００１９】
この化合物は、胸腺抽出物中に存在する酸性ペプチドであって、いくつかのインビトロおよびインビボアッセイにおいて免疫調節特性を示す(1972; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 1800-1803)。
【００２０】
チモシンα1の従来の使用も、既に知られている。
【００２１】
ヒト非小細胞肺癌("NSCLC")細胞を用いて予め接種されたヌードマウスへのチモシンα1の皮下投与は、腫瘍体積が有意に低下した。
【００２２】
メチルコラントレン誘導性線維肉腫を有するマウスでの肺の転移もまたチモシンα1により低下し、そして局所線維肉腫増殖ならびにリンパ肉腫細胞の肝臓および肺転移は、チモシンα1を用いて処置したBALB/cマウスにおいて有意に低下した。
【００２３】
PTX3は、様々な細胞型において(Bottazzi, et al., J. Biol. Chem, 1997; 272; 32817-32823)、特に炎症性サイトカインのインターロイキンβ(IL-lβ)および腫瘍壊死因子α(TNF−α)に暴露後の単核食細胞および内皮細胞において発現されるタンパク質である。
【００２４】
このタンパク質は、2つの構造ドメイン、即ち任意の既知分子と関連しないＮ末端および短いペントラキシン、例えばＣ反応性タンパク質(CRP)と類似したＣ末端からなる。実質的な類似性は、ヒトPTX3(hPTX3)および動物PTX3との間に見出される。
【００２５】
PTX3遺伝子は、ヒト3q領域(q24-28)と類似した領域において、3q 25領域内のhPTX3に関する確認された位置と一致して、マウス染色体3上に位置している。さらに、マウスPTX3 (mPTX3)(Introna, M., et al.: Blood, 87 (1996) ; 1862-1872)は、構成、位置および配列に基づいて、hPTX3と非常に類似している(Breviario,F., et al. : J. Biol. Chem., 267. 22190, 1992)。
【００２６】
特に、配列間の同一性の程度は、ヒト遺伝子およびマウス遺伝子との間で82%であり、保存性置換を考慮すると92%に達する。
【００２７】
hPTX3の配列とmPTX3の配列間の高度な類似性は、進化の過程におけるペントラキシンの高度な保存性に関する表れである(Adv. Immunol. 34: 141, 1983)。
【００２８】
ペントラキシンの概説として、H. Gewurz, etal., Current Opinion in Immunology,1995, 7. 54-64を参照されたい。
【００２９】
PTX3の従来の使用は既に知られている。
【００３０】
国際特許出願W099/32516は、感染性(真菌、細菌、原虫またはウイルス)、炎症性または腫瘍性疾患の治療のための長いPTX3の使用を説明するものである。W099/32516において、PTX3はHCMVまたはインフルエンザウイルスを処理するために有用であるということは全く記載されていない。
【００３１】
W002/38169は、増殖ファクターFGF-2の異常な活性化に関連する疾患の処置に有用な医薬品の調製のための長いペントラキシン PTX3の使用を説明するものである。
【００３２】
W002/36151は、自己免疫疾患の処置のための長いペントラキシン PTX3の使用を説明するものである。
【００３３】
W003/011326は、メス不妊症の処置のための長いペントラキシン PTX3の使用を説明するものである。
【００３４】
WO2005060997は、自己免疫疾患および骨および軟骨の退行性疾患の予防および処置のための医薬品の調製のための長いPTX3の阻害剤の使用を説明するものである。
【００３５】
Blood, 1 January 2006, Volume 107, Number 1では、PTX3が炎症症状および自己反応性細胞の活性化の下にある組織損傷を制限するのに役立つことを説明するものである。
【００３６】
ガンシクロビルは、医療分野でよく知られた抗ウイルス剤である。それは、免疫系が完全に機能していない人々において、サイトメガロウイルス感染により生じた感染を処置するために使用される。これは後天性免疫欠損症(AIDS)罹患患者を含む。また、ガンシクロビルは、臓器または骨髄移植を受ける患者、さらに進行性ヒト免疫欠損ウイルス(HIV)感染罹患患者において、CMV感染を予防するために使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
驚くべきことに、かつ予測不可能なことに、チモシンα1の、単独または長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルとの組合せは、ウイルス活性化の阻害および／またはウイルス疾患の予防または処置のための医薬品調製のために有用であることを本発明にて見出した。
【００３８】
すなわち、本発明の目的は、哺乳動物対象において、ヘルペスウイルス、例えばサイトメガロウイルス(CMV)；インフルエンザウイルス、例えば、H1N1、H3N2、H5N1またはH5N7ウイルス；パラミクソウイルス、例えば麻疹；呼吸器合胞体ウイルス；コロナウイルス、例えばSARS：HIVウイルス；肝炎ウイルス;またはロタウイルス疾患を含む群から選択されるウイルス性疾患の活性化の阻害に関する医薬品調製のための、有効量のチモシンα1の単独または長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルとの組合せにおける使用である。
【００３９】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物対象において、ヘルペスウイルス、例えばサイトメガロウイルス(CMV)；インフルエンザウイルス、例えばH1N1、H3N2、H5N1またはH5N7ウイルス；パラミクソウイルス、例えば麻疹、呼吸器合胞体ウイルス；コロナウイルス、例えばSARS、HIVウイルス；肝炎ウイルス、またはロタウイルスを含む群から選択される、ウイルス性疾患の予防および／または処置に関する医薬品調製のための、有効量のチモシンα1の単独または長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルとの組合せにおける使用である。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、サイトメガロウイルス誘発症候群を処置するための、医薬品調製のための、有効量のチモシンα1の単独または長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルとの組合せにおける使用であって、ここで、
−該症候群がCMV単核症であり；
−該症候群が免疫不全宿主と関連がある;
−該免疫不全宿主がAIDSに罹患しており;
−該免疫不全宿主が臓器移植レシピエント、である。
【００４１】
本発明のさらなる目的は、インフルエンザ誘発症候群を処置するための医薬品調製のための、有効量のチモシンα1の、単独または長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルとの組合せにおける使用であって、該症候群は、H1N1、H3N2、H5N1またはH5N7ウイルスからなる群から選択されるウイルスに依るものである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図1. Tα1はインビボでのMCMV感染を保護する。  BALB/c(図1a)およびC57BL6(図1b)マウスを各々、1 x 105または5×105PFUのMCMVを用いて感染させた。ウイルス力価を、種々の時点(図1a)または感染一週間後(図1b)で採取した組織上での標準プラークアッセイによりMEF細胞で定量し、log10(平均±標準誤差, SE)として表した。チモシンα1 (200μg/kgを、7または14日間与えた)およびGCV(40mg/kgを一週間に３回与えた)を投与して、感染日を開始する。コントロールにはスクランブルペプチドを与えた。結果は、4つの独立した実験の代表的なものである。棒線は標準誤差を示す。*Ｐ＜0.05, 処置および非処置マウス間のウイルス負荷。
【図２】図2．Tα1はMCMV感染においてNK細胞再活性を促進させる。  一週間200μg/kgチモシンα1を用いて非処理(-)または処置済み(+) MCMV-感染BALB/cマウスの脾臓由来の全細胞(図2a, 図2b)またはNK(図2c)細胞の表現型分析；"なし（None）"とは非感染マウスを示す。数字は、感染一週間後のFACS分析での陽性細胞％を示す。ヒストグラムは、4つの独立した実験のうちの１つの代表的なものである(図2d)。上記の通り処置したマウスからのELISPOTアッセイによるIFN-・-産生NK細胞の細胞毒性活性(YAC-1標的に対する標準的な51Cr-放出アッセイによる)および頻度。棒線は、標準誤差を示す。*Ｐ＜0.05, 感染vs非感染マウス。**Ｐ＜0.05, チモシンα1-処置vs非処理感染マウス。示した結果は5つの独立した実験からのものである。
【図３】図3．チモシンα1は、pDCにおいてウイルス複製、IRF7活性化およびサイトカイン産生を促進する。  CD11b+DCまたはpDCを、BALB/cマウスの骨髄から生成して、MCMVを用いて感染させ、光学顕微鏡による形態学について、およびMCMVgB転写物発現(両方48h)に関するリアルタイムPCRによるウイルス複製について、または抗IRF7(2h後)を用いる免疫ブロッティングによるIRF7の核発現について評価した(図3a)。細胞は、感染の前に2時間37℃にて50μg/mlチモシンα1に暴露された(+)かまたは暴露されていない(-)。−は非感染細胞を示す。示した結果は、３つの内の1つの代表的な実験を示す。  核画分を、抗アルドラーゼ(陰性コントロールとして)抗体を用いてブロッティングにより確認した。  矢印は誘導性バンドを示す。レーン1, 非感染細胞；レーン2, MCMV感染；レーン3, チモシンα1 処置；レーン4, MCMV＋チモシンα1 処置(図3b)。上記のとおりに処理したDCサブセットによるサイトカイン産生(pg/ml)。棒線は標準誤差を示す。*Ｐ＜0.05, MCMV感染DC vs MCMV非感染DCにおけるサイトカイン産生。**Ｐ＜0.05, チモシンα1 処置 vs チモシンα1 非処理DC(図3c)。MCMV感染期間のマウスにおけるサイトカイン産生。MCMV感染マウス由来の脾臓細胞の培養上清におけるサイトカインレベル(pg/ml)、およびチモシンα1またはGCVを用いて一週間処置したMCMV感染マウス由来の脾臓細胞の培養上清におけるサイトカインレベル(pg/ml)。*Ｐ＜0.05, 処置vs非処置マウス. ND, 実施せず
【図４】図4．Tα1はTLR9/MyD88-依存経路を活性化する。  5×105PFUのMCMVを用いて感染させ、一週間200μg/kgのTα1で処理したC 57BL6、TLR4-/-、TLR9-/-およびMyD88-/-マウスにおけるウイルス負荷(図4a)およびサイトカイン産生(図4b)。ウイルス力価を、log10と表し、感染および処置後一週間に採取した感染組織に対する標準的プラークアッセイによりMEF細胞で定量した。脾臓細胞の培養上清におけるサイトカイン(pg/ml)レベルを、ELISAアッセイによって決定した。棒線は標準誤差を示す。*P＜0.05, Tα1処置 vs 非処置マウス。結果は、3つの独立した実験の内の1つの代表的なものである。
【図５】図5．チモシンα1は、GCVとの組み合わせにおいて効果的である。  BALB/cまたはC57BL6 マウスを、105または5×105PFU各々のMCMVを用いて感染させた。log10として表示したウイルス力価を、感染7日後から採取した肺組織に対する標準的プラークアッセイによりMEF細胞で定量した。Tα1(200μg/kg/毎日、一週間)および／またはGCV(40mg/kg、一週間に3回)を投与して感染日を開始する。脾臓細胞(7日)の培養上清におけるサイトカイン(pg/ml) レベルをELISAアッセイにより決定した。棒線は、標準誤差を示す。*Ｐ＜0.05, 処置 vs 非処置マウス。結果は、3つの独立した実験の代表的なものである。
【図６】図6．Tα1は、ネズミサイトメガロウイルス感染において、PTX3との組合せにおいて効果的である。  同系交配のC57BL6およびBALB/c マウスを、1x105(BALB/c)または5 x 105(C57BL6)のプラーク形成ユニット(PFU)のMCMVを用いて腹腔内(i.p.)注射した。ウイルス力価を、処置後一日目に採取した組織上の標準的プラークアッセイによりMEF細胞で定量した。処置は次の通りであった：Tα1(200mg/kg/ip)およびPTX3 (1mg/k/ip) (SIGMA-Tau, Pomezia, Rome, Italy)を感染日から開始して7日連続して投与した。コントロールには、スクランブルペプチドを与えた。非感染動物からの全ての臓器はウイルス陰性であった。ウイルス力価をlog10と表した(平均±標準誤差, SE)。
【実施例】
【００４３】
実施例1
材料および方法
マウス
メスの8〜12週齢野生型(WT)の同系交配のC57BL6およびBALB/cマウスを、Charles River Breeding Laboratories (Calco, Italy)から購入した。同型接合体TLR9-(TLR9-/-)、TLR4-(TLR4-/-)およびMyD88-(MyD88-/-)欠損マウス(C57BL6バックグラウンドで)の生育対を、the University of Perugia（Perugia, Italy.）の生育施設で、特別な無菌条件下で生育させた。実験を、研究機関動物委員会(the institutional animal committee) により承認されたプロトコールおよびEU動物実験指針（European Economic Community Council Directive）ならびに研究機関動物飼育および使用のガイドライン(institutional animal care and use guidelines)に沿って行った。
【００４４】
病原体、感染および処置
Smith 株 MCMV 唾液腺抽出物のストックをBALB/cマウスから調製し、BALB/c マウス胎児線維芽細胞(MEF)に対する標準プラークアッセイにおいて力価を決定した(J. Gen. Virol. 2002; 83:2983-2993)。マウスを、MCMVの1×105(BALB/c)または5×105(C57BL6)プラーク形成ユニット(PFU)を用いて腹腔内(i.p.)注射した。f. ウイルス力価を、種々の時点で採取した組織に対して標準プラークアッセイによりMEF細胞で定量した。処置は後記の通りであった：チモシンα1およびスクランブル(sccrambled)ポリペプチド(SciClone Pharmaceuticals, San Mateo, CAから両方入手)は、精製し(内毒素レベルは標準的リムルス溶菌アッセイから＜0.03 pg/mlであった)、滅菌し、凍結乾燥したアセチル化ポリペプチドとして供給される。配列は後記のとおりであった：Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-O (T・1)およびAc-Ala-Lys-Ser-Asp-Val-Lys-Ala-Glu-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala-Asn-Glu-OH (スクランブルペプチド)。該凍結乾燥粉末を滅菌水に溶解して、200μg/kg/i.p.量を感染日から開始して7または14日間連続的に毎日投与した。ガンシクロビル(GCV)(Cymevene; from Recordati, Milan, Italy)を、40mg/kg/i.p.量で感染6時間後に開始して一週間に3回隔日にて投与した。コントロールにはスクランブルペプチドまたは希釈液単独を与えた。
【００４５】
DCサブセット作成
CD11b+DCを得るために7日間150U/mLマウスrGM-CSF (Sigma)および75U/mL rIL-4)(R&D System)の存在下あるいはpDCを得るために9日間FLT3-L（200ng/mL）(Immunex Corporation, Seattle, WA)の存在下に、10%濾過済ウシ血清、2-メルカプトエタノール(50μM)、ピルビン酸ナトリウム(1mM)、2mM L-グルタミン、HEPES(10mM)およびゲンタマイシン(50μg/ml)を含むIscoveの修飾培地(Blood 2003, 102:3807)中でBALB/c骨髄細胞（106/ml）を培養することにより、DCを得た。さらに24時間、LPS(1μg/ml)またはシトシンホスホロチオエート-グアニンオリゴデオキシヌクレオチド(CpG-B ODN 1668)(2μg/ml）(Coley Pharmaceutical Group, Wellesley, MA)をCD11b+DCまたはpDCに添加することにより、最終成熟を達成させ、各CD11ｂ＋DC（Blood 2003, 102:3807）は、CD11c高発現によって識別され、明らかにCD8a+DCおよびCD11b+DCから構成されていた。pDCを、CD11c低、Ly6G+、CD8a+/-細胞と規定した。写真を、AxioVision Software Rel. 3.1 (Carl Zeiss S.p.A., Milano, Italy)を用いる高解像度顕微鏡カラーカメラAxioCamにより撮影した。
【００４６】
フローサイトメトリー分析
抗CD16/32(2.4G2)抗体とFcRのブロッキングの後に、細胞をCELLQuest（登録商標）を備えたFACScanフローサイトメーター (Becton Dickinson, Mountain View, CA)により抗原発現について分析した。無関係のAbを有する細胞染色のコントロールを使用して、バックグラウンドの蛍光値を得た。
【００４７】
プラークアッセイ
プラークアッセイを、コンフルエンス以下まで増幅させ、連続希釈したウイルスサンプルと共に2時間37℃でインキュベートした細胞にて決定した(Science 2001, 292:934)。
非感染動物由来の全ての臓器はウイルス陰性であった。ウイルス力価をlog10(平均±標準偏差,SE)として表した。
【００４８】
ウイルス複製の阻害
DC(106/ウェル)を、血清不含DMEMで希釈された50μg/mlのチモシンα1と共に2時間37℃でインキュベートし、その後105PFUMCMVを添加した。伝染性を48時間後に測定した。
【００４９】
NK細胞の細胞毒性活性
DX5マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)による脾臓から精製したNK細胞を、NK1.1+CD3- 細胞と規定した。NK細胞溶解活性を、51Cr標識YAC-1 リンパ腫細胞に対して評価した(Blood 2005, 106:4397)。
【００５０】
IRF7のイムノブロット分析
DCを、単独もしくは組合せのいずれかにおいて、2〜50μg/mlのチモシンα1または105PFUのMCMVに暴露した。核抽出物を、NE-PER核および細胞抽出試薬(Pierce, Celbio S.r.l., Milan, Italy)を用いて調製し、核抽出物のタンパク質濃度を、製造者指示書に従ってBCA-200タンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて決定した。IRF7の核含量を、ウサギ抗IRF7(H246)抗体およびウシ抗ウサギ・ホースラディッシュペルオシダーゼ(Santa Cruz Biotechnology)を用いるウェスタン・ブロットにより決定した。可視化を、ECLウェエスタン・ブロット分析システム（Amersham and Kodak Biomax）を用いて行った。
【００５１】
MCMV mRNAの定量化のためのリアルタイムRT-PCR
高感受性RT-PCRアッセイを、全細胞性RNAからMCMV糖タンパク質B(gB)DNAの356-bp セグメントの増幅のために使用した(51)。cDNAの合成およびPCRを、記載したとおりに行った(Blood 2003, 102:3807)。合成DNAオリゴヌクレオチドプライマーを、MCMVgB遺伝子の公開された配列から選択した(17)。センスプライマーはcDNA No.2416-2443：5’-AAG-CAG-CAC-ATC-CGC-ACC-CTG-AGC-GCC-3’に基づいており、アンチセンスはNo.2745-2772：5’-CCA-GGC-GCT-CCC-GGC-GGC-CCG-CTC-TCG-3’に基づいている。
サイクル条件は、3分間95℃での初期変性、続いて1分間95℃、1分間50℃および20秒72℃のサイクル、そして10分間72℃での最終伸張であった。ハウスキーピングβ-アクチン遺伝子のPCR増幅を、各サンプルについてサンプル負荷を制御して、製造者指示書(Applied Biosystems)のとおりにサンプル間を正規化出来るように行った。
【００５２】
ELISAおよびELISPOTアッセイによるサイトカインの定量
有糸分裂促進物質刺激性脾臓細胞(10μg/mL ConAを用いる48時間刺激)またはMCMVパルス化DC(24時間)の培養上清中のサイトカインのレベルを、ELISA(R&D System およびPBL, Biomedical Lab, Milan, Italy)により決定した。アッセイの検出限界(pg/mL)は、IL-12 p70については＜16、IFN-γについては＜10、IL-10については＜3およびIFN-αについては＜10であった。IFN-γ-産生NK細胞を、精製NKでのELISPOTアッセイにより計測した(Blood 2003, 102:3807)。結果を、細胞の2倍希釈物の複製物を用いて計算した、105細胞あたりのサイトカイン産生細胞(±SE)の平均数として表した。
【００５３】
統計的解析
スチューデント対応のあるt検定を使用して、実験群における値の有意性を決定した(有意性をP＜0.05と定義した)。生存データを、マン・ホイットニー（Mann-Whitney）U検定を用いて試験した。インビボで該群を6匹の動物で構成した。特に記述のない限り、データは平均±SEである。
【００５４】
結果
チモシンα1はMCMV感染から保護する
感受性(BALB/c)または耐性(C57BL6)マウスのいずれかの急性のMCMV一次感染におけるチモシンα1の投与効果を評価した。マウスを致死用量以下のMCMVを用いて感染させ、チモシンα1またはGCVを用いて処理し、脾臓、肺、肝臓および唾液腺における力価担持を、標準的プラークアッセイ力価測定により感染後の様々な週にて決定した。MCMVは、特に感染の初期段階において、耐性マウス(図1b)よりも感受性マウス(図1a)の内臓臓器において、より高い力価に複製された。スクランブルペプチドではなく、7日間200μg/kg量にて与えたチモシンα1は、感受性および耐性マウスの両方において、様々な内臓臓器内でのウイルス担持を有意に低下させた。効果はGCVと類似しており、14日間与えたチモシンα1よりも高かった。耐性マウスにおいて、チモシンα1の効果は、特に唾液腺および肝臓(図1b)において明らかであった。また、チモシンα1は、より高いPFU(データを示していない)を用いて感染したBALB/cマウスにおいてウイルス担持を有意に低下した。これらの結果は、チモシンα1がMCMV感染において治療効果を発揮することを示すものである。
【００５５】
チモシンα1は、MCMV感染において、NK反応性を回復させ、サイトカイン産生を促進する
Ly49HNK細胞は、CD8a+DC(4)の相互制御を含む様々なメカニズムを介するMCMV感染のコントロールに主に関与している。MCMV感染マウスの脾臓におけるNK細胞の拡張および機能活性に対するチモシンα1の効果を評価した。図2は、CD4+またはCD8+T細胞(図2a)の拡張に影響しないが、チモシンα1を用いる一週間の処置により、NK1.1＋NK細胞(図2b)を拡張させたことを示す。NK細胞は、活性化マーカーCD69(図2c)の発現増加により明らかなように完全に活性化された。IFN-.-産生細胞の頻度およびエクス・ビボで精製された脾臓NK細胞の細胞毒性活性は双方、チモシンα1処置(図2d)により顕著にアップ・レギュレーションされた。
【００５６】
チモシンα1は、pDCにおいてウイルス感染、IRF7活性化およびサイトカイン産生を促進する
MCMV感染におけるNK細胞の初期活性化は、NK細胞の細胞毒性および増殖を促進するIFN-α/βおよびIFN-産生を誘導するIl-12(Nat. Immunol. 2001;2: 1144-1150; An. J. Immunol. 1996; 156:1138-1142)により媒介されるので、チモシンα1の存在下にMCMVに暴露したDCサブセットによるサイトカイン産生パターンを評価した。MCMVを用いる急性感染は、感受性BALB/cマウスにおいて完全ではないが一過的に免疫抑制を誘導し、これはCD11b+DCの感染と関連する可能性がある(Nat. Immunol. 2001;2: 1077-1084)。CD11b+DCは、インビトロおよびインビボ両方のMCMVの増殖感染をサポートするが(Nat. Immunol. 2001; 2:1077-1084)、MCMVはpDCでは複製しない(J. Exp. Med. 2003; 197:885-898; J. Exp. Med. 2002; 195:517-528)。非感染マウスからの骨髄から得たCD11b+DCまたはpDCサブセットを用い、様々なDCサブセットによるサイトカイン産生および様々なDCサブセットにおけるウイルス複製に対するチモシンα1の効果を直接評価した。先の試験結果(Nat. Immunol. 2001;2: 1077-1084; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101:3516-3521)と一致して、MCMVはpDCではなくCD11b+DC中で複製した。驚くべきことに、ウイルス複製は、CD11b+DCにおいて、チモシンα1により影響されなかったが、実際にはpDCにおいて促進された(図3a)。HCMVは、これらファクターの核内蓄積をもたらすIRF3およびIRF7の一時活性化を含むインターフェロン産生に対して、協調的な細胞性抗ウイルス応答を誘起することが知られる。IRF7は、pDCにおける抗ウイルス1型IFN産生の優れた調節因子であるので、ウイルスおよび／またはチモシンα1暴露に対する両方のDCサブセットにおける核のIRF7発現のレベルを抗IRF7抗体を用いる免疫ブロッティングにより測定した。CD11b+DCではなくpDCにおいて、単独または併用にて、ウイルスまたはチモシンα1暴露のいずれかによりIRF7の移動が示された(図3a)。また、IRF3のリン酸化および移動を評価して、ウイルス単独またはチモシンα1と共に暴露する場合にCD11b+DCにおいては活性化を見出したが、pDCにおいては検出されなかった(データは示していない)。サイトカイン産生に関して、pDCはCD11b+DCよりも多いが、両方のDCサブセットは、ウイルスに対する応答の際に既に知られているようにIFN-aおよびIL-12p70を産生した。しかし、チモシンα1を用いるpDCの前処置は、IFN-ａの産生を大きく増加させたが、IL-12p70の産生には影響しなかった。非常に驚くべきことに、チモシンα1は、CD11b+DCによりIFN-aを若干促進させた(図3b)。これらのデータは、チモシンα1が、pDCにおいてIRF7依存性の抗ウイルスプログラムを促進させることを示すものであった。インビトロでのサイトカイン産生のパターンとインビボでのパターンとの相互関係を示すために、MCMV感染BALB/cマウスおよびチモシンα1を用いて処置したBALB/cマウスからの脾臓細胞の培養上清中のIL-12p70、IFN-a、IFN-およびIL-10産生を測定した。チモシンα1を用いる処置により、IFN-aおよびIFN-産生が有意に増加したこと、特に感染の第一週目に増加したことが示された。また、IL-12p70は処置直後に若干増加し、その後低下した。これらの効果は、GCVを用いて得られた結果に相当した。驚くべきことに、チモシンα1は、IL-10産生を劇的に増加させた(図3c）。まとめると、これらのデータから、チモシンα1は、MCMVへの応答においてIFN-a/IFN209依存経路の活性化に有利に働くことが示された。
【００５７】
チモシンα1はTLR9/MyD88-依存経路を活性化する
機能的TLRシグナルを獲得した有効な抗MCMV免疫性監視、特にTLR9/MyD88シグナル伝達経路は、IRF7依存性の抗ウイルスプログラム(27)および迅速なMCMVクリアランスに重要な役割があるが、一方でTLR2、TLR3およびTLR4は、有意な役割を担うとは考えられていなかった(J. Immunol. 2005; 175:6723-6732)。感染におけるチモシンα1の効果におけるTLRの関連を評価するために、TLR欠損マウスを、MCMVを用いて攻撃し、チモシンα1で処置し、ウイルス複製に供した。発表されたデータに一致して(J. Immunol. 2005; 175:6723-6732)、TLR9-/-、特にMyD88-/-マウスは、C57BL6マウスよりもMCMVに対して高い感受性であったが、一方でTLR4欠損マウスはマウスの耐性に顕著に影響しなかった(図4a)。チモシンα1はC57BL6およびTLR4-/-マウスにおいて有効であったが、TLR9-/-およびMyD88-/-マウスにおいては完全に有効ではなく、この知見は、チモシンα1の抗ウイルス活性におけるTLR9/MyD88依存性のシグナル伝達経路の関与を示唆するものである。繰り返すが、チモシンα1の効果は、IL-12p70よりもIFN-αの産生と直接的に相関し、そしてIFN-αのレベルは、TLR9-/-またはMyD88-/-マウスではなく(図4b)、C57BL6およびTLR4-/-マウスからの脾臓細胞の上清において有意に増加した。
【００５８】
実施例2
チモシンα1は、GCVとの組合せにおいて相乗的である
実施例1に記載した方法を用いて、チモシンα1がGCVと組合せて機能し得るかどうかを評価した。この目的のために、MCMVを用いて感染した感受性または耐性マウスを、GCVおよび／またはチモシンα1を用いて一週間併用処置し、ウイルス力価およびサイトカインの産生パターンを評価した。得られた予備結果から、この組合せは、どちらのマウスのタイプの肺においてもウイルス力価を低下させる場合に相乗的であり、IFN-αおよびIFN-T.の産生を促進したことが示された。
【００５９】
実施例3
チモシンα1はPTX3との組合せにおいて相乗的である
実施例1に記載した方法を用いて、チモシンα1がPTX3との組合せにおいて機能し得るかどうかを評価した。
【００６０】
この目的のために、MCMVで感染した感受性(BALB/c)または耐性(C57BL6)マウスを、PTX3および／またはチモシンα1を用いて一週間併用処理し、肺内のウイルス力価について評価した。この結果から(図6)、どちらの薬剤の単独処理も、どちらのマウスのタイプの肺においてもウイルス力価を低下させたことを確認した。さらに、驚くべきことに、感受性または耐性マウスのいずれにおいても、この活性成分の組合せは、ウイルス複製の制ならびにIFN-aおよびIFN-g、IL-12p70およびIFN-gの産生に関しても、予測不可能な相乗効果を示した。
【００６１】
本発明は、ウイルス疾患のために(または、ウイルス活性化の阻害のために)処置されている患者に投薬するための、または投薬における使用のための、１以上の単位用量を含む治療個装、ここで各単位用量が１以上の該単位用量の断続的投与が例えばHCMVなどに有効であるように個装中にチモシンα1および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルの量を含んでいる；ならびに最終的な医薬容器、ここで該容器が標識をさらに含有するかまたは含んでおり、該標識は、チモシンα1、および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルが、例えばHCMV罹患患者の処置に適用されることを示している；を意図している。
【００６２】
さらに、本発明は、梱包材および該梱包材内に含有されたチモシンα1 および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルを含む製品を意図するものであって、ここで該長いペントラキシンPTX3はHCMVを処置するために治療上有効であり、該個包装材は長いペントラキシンPTX3がHCMVを処理するのに使用できることを示す標識を含む。
【００６３】
本発明に従って、チモシンα1および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルが、活性成分、および所望により医薬的に許容し得る希釈剤または賦形剤を含んでいる、別々の形態または単一用量の形態で投与され得る。
【００６４】
本発明に従って、チモシンα1 および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルが別の形態で投与される(即ち、2回の別の投与)場合、該活性成分は、連続投与(即ち同時に)されても、また上記した標識に示唆されたスケジュールに従って連続投与されてもよい。
【００６５】
本発明の使用において、用語「処置」または「処置すること」は、重症なウイルスの疾患に関する進行、活性化または退縮の、予防、禁止、軽減、阻害、改善、停止、法律規制、遅延または抑制を包含する、その通常の意味をもつ。
【００６６】
本発明に従って、用語「有効量」は、目的とする結果を為し得る化合物の量を指す。例えば、ウイルスの疾患を処置する目的で投与される有効量のチモシンα1 および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルは、重症なウイルス疾患の進行を予防、禁止、緩和、改善、中止、遅延または逆転させるのに必要な量であり、かかりつけ医師の判断に従い、投与されるべき一日用量は対象患者の体重、年齢および患者の一般的条件に依拠する。
【００６７】
また、本発明は、医薬担体との関連において、活性成分としてチモシンα1 および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルを含有する医薬製剤を用いる方法を包含する。当業者は、かかる処方およびその製造を知っており、例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,(16th ed.1980)を参照されたい。
【００６８】
製剤は、活性成分の単位用量形態で製剤されるのが好ましい。用語「単位用量形態」は、ヒト対象に対する適切な単位用量を物理的に分配することを指し、各単位は、適切な医薬賦形剤との関連において所望の治療効果を与えるように計算された所定の量の活性材料を含有する。
【００６９】
チモシンα1 および所望により長いペントラキシンPTX3またはガンシクロビルは、医薬上許容し得る担体または賦形剤との組合せにおいて、医薬組成物の形態で投与され得る、この比率および性質は、選択された担体および／または賦形剤、選択された投与経路および標準的医薬実施において、化合物の溶解性および化学特性により決定される。
【００７０】
医薬組成物を、医薬分野ではよく知られている様式で調製した[例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, (16th ed. 1980)を参照されたい]。
【００７１】
担体または賦形剤とは、活性成分のためのビヒクルまたは培地としての役割をもつ固体、半固体または液体材であり得る。好適な担体または賦形剤は当業者にはよく知られている。医薬組成物は、経口、吸入、非経口または局所使用に適合され得る、錠剤、カプセル、エアゾール、吸入剤、座薬、溶液、懸濁液、リポソーム等の形態で患者に投与され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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