(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する化合物と併せて、医薬品として許容される担体を含むことを特徴とする、痛みの治療用組成物であって、前記化合物は、
【化１】
0005404045.tif 000005
【化２】
0005404045.tif 000006
および
【化３】
0005404045.tif 000007
からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項２】
下記式の化合物を医薬品として許容される担体と併せて含む組成物を含有する包装材料を含む製品であって、前記化合物は、
【化４】
0005404045.tif 000008
【化５】
0005404045.tif 000009
からなる群から選択されることを特徴とする製品。
【請求項３】
神経および非神経痛のうち少なくとも一つの治療用であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
神経および非神経痛の併用治療用であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記包装材料には、前記組成物が神経および非神経痛のうち少なくとも一つの治療に有用であることを示す標識が付されることを特徴とする請求項２に記載の製品。
【請求項６】
前記包装材料には、前記組成物が神経および非神経痛の併用治療に有用であることを示す標識が付されることを特徴とする請求項５に記載の製品。
【請求項７】
前記化合物が下記式を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【化６】
0005404045.tif 000010
【請求項８】
前記化合物が下記式を有することを特徴とする請求項２に記載の製品。
【化７】
0005404045.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疼痛の治療に関する。詳細には、本発明は、アデニルシクラーゼ１（ＡＣ１）活性を調節することによる、神経および非神経痛の両方の併用治療に関する新規な方法と、それに有用な組成物とに関する。
【背景技術】
【０００２】
神経因性疼痛と炎症性疼痛では、それらの病因、病態生理、および種々の薬物治療薬による治療への応答が異なっている。外傷は、通常、神経繊維および付随する炎症の両方の関与に起因した、両方のタイプの疼痛の組合せをもたらす。そのときのほとんどは、一方の要素が他方より勝り、確定診断を困難にする。さらに、これら２つのタイプの疼痛に関する現在の治療法は、完全に異なっており、疼痛を１つの治療によって完全に緩和することを困難にしている。重症の急性疼痛は、μオピオイド受容体作動薬（モルヒネ）およびＮＭＤＡ受容体拮抗薬（ケタミン）に応答し；慢性炎症性疼痛は、シクロキシゲナーゼ阻害薬（Ｂｅｘｔｒａ（商標）、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（商標））およびプロスタグランジン阻害薬（アセトアミノフェン）に応答し；神経因性疼痛は、抗てんかん投薬（カルバマゼピン）およびまだ完全に動作が知られていない薬物（ガバペンチン）に応答する。
【０００３】
疼痛は、痛覚伝達で活性化される神経集団、後根神経節ニューロン、脊髄後角、および前帯状皮質（ＡＣＣ）のアデニリルシクラーゼの下流に、高レベルの分子を誘導する。これらの分子には、転写因子ｐＣＲＥＢ（例えば、非特許文献１、２、および３参照）および前初期遺伝子Ｅｇｒ−１（例えば、非特許文献４および５参照）（およびＡｒｃ(非特許文献６参照)）が含まれる。アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）は、ニューロン膜でのＧタンパク質、ＮＭＤＡ受容体、電圧依存性カルシウムチャネル、およびμオピオイド受容体に対するその特異的な相互作用により、ニューロンにおける同時検出器として知られている。アデニリルシクラーゼの役割は、慢性炎症に関連した行動感作において重要であることが示された（例えば、非特許文献７参照）。アデニリルシクラーゼの活性化によって誘発された、一般的なシグナル伝達経路は、記憶および炎症性疼痛におけるその重要な開始剤分子としての能力（例えば、非特許文献８参照）；（例えば、非特許文献９、１０、および１１参照）、および数時間続くＮＭＤＡ受容体依存性シナプス増強へのそれらの寄与（例えば、非特許文献１２参照）を実証した。
【０００４】
特定されたＡＣの１０種の異なるアイソフォーム（例えば、非特許文献１３参照）の中で、ＡＣ１は、ニューロン特異性が非常に高い、脳および脊髄に存在するカルシウムカルモジュリン（ＣａＭ）刺激性ＡＣである。ＡＣ１および８が不足しているマウスは、受動回避に関する長期記憶、文脈および空間記憶が不十分であることを示した（例えば、非特許文献１２、１４参照）。ＡＣ１および８が不足しているマウスは、マウスにおいて慢性炎症性疼痛が低減されたことも示した（例えば、非特許文献７参照）。このように、ニューロン膜結合ＡＣは、神経伝導またはシナプス可塑性変化で発現したタンパク質を通して、最終的には遺伝子転写を制御しかつその効果を媒介する分子の下流カスケードを調節することができる、重要な膜結合酵素である。標的に対してより有効なアイソフォームを特定するために、ＡＣ１およびＡＣ８の作用に関する比較研究が実施された。ＡＣ１が不足しているマウスは、皮下炎症性疼痛（例えば、非特許文献１５参照）、急性筋肉痛、慢性筋肉痛、および神経因性疼痛に優れた効果を発揮することがわかった。
【０００５】
【非特許文献１】Anderson LE and Seybold VS (2000) Phosphorylated cAMP response element binding protein increases in neurokinin-1 receptor-immunoreactive neurons in rat spinal cord in response to formalin-induced nociception. Neurosci Lett 283:29-32
【非特許文献２】Kawasaki Y, Kohno T, Zhuang Zy, Brenner GJ, Wang H, Van Der Meer C, Befort K, Woolf CJ, Ji RR (2004) Ionotropic and metabotropic receptors, protein kinase A, Protein kinase C, and Src contribute to C-fiber-induced ERK activation and cAMP response element-binding protein phosphorylation in drsal horn neurons, leading to central sensitization. J Neurosci 24:8310-8321.
【非特許文献３】Ma and Quirion, 2001
【非特許文献４】Wei F, Xu XC, Qu Z, Milbrandt J, Zhuo M (2000) Role of EGR1 in hippocampal synaptic enhancement induced by titanic stimulation and amputation. J Cell Biol 149:1325-1334.
【非特許文献５】Ko SW, Vadakkan KI, Ao H, Gallitano-Mendel A, Wei F, Milbrandt J, Zhuo M (2005) Selective contribution of Egr1 (zif/268) to persistent inflammatory pain. J Pain 6:12-20.
【非特許文献６】Li X, Lighthall G, Liang DY, Clark JD (2004) Alterations in spinal cord gene expression after hindpaw formalin injection. J Neurosci Res 78:533-541.
【非特許文献７】Wei F, Qiu CS, Kim SJ, Muglia L, Mass JW, Pineda VV, Xu HM, Chen ZF, Storm DR, Muglia LJ, Zhuo M (2002b) Genetic elimination of behavioral sensitization in mice lacking calmodulin-stimulated adenylyl cyclases. Neuron 36:713-726.
【非特許文献８】Woolf CJ and Salter MW (2000) Neuronal plasticity: increasing the gain in pain. Science 288:1765-1769.
【非特許文献９】Kandel ER (2001) The molecular biology of memory strage: a dialogue between genes and synapses. Science 294:1030-1038.
【非特許文献１０】Nestler EJ (2001) Molecular basis of ling-term plasticity underlying addiction. Nat Rev Neurosci 2:119-128.
【非特許文献１１】Zhuo M (2004) Central plasticity in pathological pain. Novartis Found Symp 261:132-145; discussion 145-154.
【非特許文献１２】Wong DT, Athos J, Figueroa XA, Pineda VV, Schaefer ML, Chavkin CC, Muglia LJ, Storm DR (1999) Calcium-stimulated adenylyl cyclase activity is critical for hippocampus-dependent long-term memory and late phase LTP. Neuron 23:787-798.
【非特許文献１３】Xia Z, Storm DR (1997) Calmodulin-regulated adenylyl cyclases and neromodulation. Curr Opin Neurobiol 7:391-396.
【非特許文献１４】Wu ZL, Thomas SA, Villacres EC, Xia Z, Simmons ML, Chavkin C, Palmiter RD, Storm DR (1995) Altered behavior and long-term potentiation in type I adenylyl cyclase mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A 92:220-224.
【非特許文献１５】Wei et al. 2002
【非特許文献１６】Berge,S.M. et al. (1997) J. Pharm. Sci. 66: 1-19
【非特許文献１７】Storm et al. 1998
【非特許文献１８】Williams C. Nat Rev Drug Discov. 2004 Feb; 3(2): 125-35. Review
【非特許文献１９】Wei et al. 2002; Neuron
【非特許文献２０】Sluka KA, Kaltra A, Moore SA (2001) Unilateral intramuscular injections of AC1 dic saline produce a bilateral, long-lasting hyperalgesia. Muscle Nerve 24:37-46.
【非特許文献２１】Haley J, Ketchum S, Dickenson A (1990) Peripheral kappa-opioid modulation of the formalin response: an electrophysiological study in the rat. Eur J Pharmacol 191:437-446.
【非特許文献２２】Wei F, Wnag GD, Kerchner GA, Kim SJ, Xu HM, Chen ZF, Zuo M (2001) Genetic enhancement of inflammatory pain by forebrain NR2B overexpression. Nat Neurosci 4:164-169.
【非特許文献２３】Wei F, Qiu CS, Liauw J, Robinson DA, Ho N, Chatila T, Zhuo M (2002a) Calcium calmodulin-dependent  protein kinase IV is required for fear memory. Nat Neurosci 5:573-579.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の内容を考えると、神経および非神経由来の両方の疼痛を対象とした治療をもたらすために、ＡＣ１を下方制御するプロトコルを開発することが望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
環状化合物のファミリーに属するアデニリルシクラーゼ阻害薬は、神経および非神経痛の両方の併用同時治療で有用であることを、ついに見出した。
【０００８】
したがって、本発明の一態様では、哺乳類における神経および非神経痛の併用治療のための方法が提供される。この方法は、治療上有効な量の、下記の一般式（１）を有する化合物であって、
【０００９】
【化１】
0005404045.tif 000002
【００１０】
式中、
Ａは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルハロゲン化物、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群から選択され、
Ｂは、ヒドロキシ、チオ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ２、−ＳＲ１、あるいは、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、ＯＲ１、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ２、ＳＲ１から選択された１個または複数の置換基で任意選択で置換された−Ｃ１〜Ｃ６飽和または不飽和アルキル基、ＯＨ、ハロゲン、チオ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシで任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ１０芳香族もしくは非芳香族環構造またはＣ３〜Ｃ９芳香族もしくは非芳香族複素環構造からなる群から選択され、式中Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ６カルボキシアルキルからなる群から選択され、あるいはＮＲ１Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン、チオ、ＮＨ２、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ６カルボキシアルキルで任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ６芳香族もしくは非芳香族複素環を形成し、
Ｄは、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシ、ＮＨ２、チオ、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ３、ＳＲ１、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシからなる群から選択され、式中Ｒ１は、上記にて定義された通りであり、Ｒ３は、Ｒ１に関して定義された通りであり、
Ｅは、ＨまたはＯＨ、あるいは、
Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ２、チオ、ＳＲ１、非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、もしくはＣ４〜Ｃ６複素環、またはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル、ハロゲン、もしくはＯＨからなる群から選択された１個または複数の置換基を有する置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、もしくはＣ４〜Ｃ６複素環で、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜１０−アリール−Ｃ１〜６−アルキル、またはＣ３〜１０−アリールオキシ−Ｃ１〜６−アルキルであり、あるいは、
非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、またはＣ４〜Ｃ６複素環であり、あるいは
Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル、ハロゲン、またはＯＨからなる群から選択された１個または複数の置換基を有する置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、またはＣ４〜Ｃ６複素環であり、
式中Ｒ１およびＲ２は、上記にて定義された通りであり、
Ｇ、Ｈ、Ｊ、およびＭは、それぞれＮであり、あるいは
ＨおよびＪはそれぞれＣであり、ＧおよびＭはそれぞれＮ、Ｓ、またはＯであり、あるいは
Ｈ、Ｊ、およびＭはそれぞれＣであり、ＧはＮ、Ｓ、またはＯである
化合物を、投与するステップを含む。
【００１１】
本発明の別の態様では、神経および非神経痛の併用治療のための組成物が提供される。この組成物は、医薬品として許容される担体と組み合わせた、上記にて示された式（１）の化合物を含む。
【００１２】
別の態様では、製品が提供される。この製品は、組成物を含有する包装材料を含む。この組成物は、式（１）の化合物および医薬品として許容される担体を含む。包装材料には、哺乳類の神経および非神経痛の両方の併用治療にこの組成物が有用であることを示す、標識が付される。
【００１３】
本発明の別の態様では、式（１）によって定義された化合物の、治療のための使用が提供される。
【００１４】
別の態様では、神経および非神経痛の併用治療用の薬剤を製造するための、式（１）によって定義された化合物の使用が提供される。
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の態様を、下記の図を参照することにより記述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、哺乳類の神経および非神経痛の併用治療で、ＡＣ１の阻害薬を使用する方法を提供する。この方法は、急性疼痛、および運動機能や心拍数、不安などの一般的行動に対して、影響がほとんどないかまたはまったくないことが有利である。
【００１７】
「併用治療」という用語は、単一療法、例えば式（１）によって定義されたＡＣ１阻害薬の投与によって、同時になされる、２つの異なるタイプの疼痛、即ち神経由来の疼痛（神経因性疼痛）と非神経由来の疼痛（侵害受容性疼痛）との同時治療を指す。明確にするために、「治療」は、少なくとも一部には、その部分的阻害も含めたある程度のＡＣ１の阻害による神経および非神経痛のいくらかの低減を指す。
【００１８】
本明細書で使用される「哺乳類」という用語は、ヒト、ならびにペット（例えばイヌ、ネコ、およびウマ）や家畜（例えばウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ）、野生動物などのヒト以外の哺乳類を包含することを意味する。
【００１９】
神経または神経因性疼痛は、末梢または中枢神経系の外傷または機能障害から生ずる疼痛を指す。神経痛は、外傷によって引き起こされる可能性があるが、神経系に対する実際の損傷を必ずしも伴うものではない。神経は、腫瘍によって浸潤または圧迫され、瘢痕組織によって絞扼され、あるいは感染によって炎症を引き起こす可能性がある。神経因性疼痛は、しばしば慢性であり、オピオイドによる治療に十分応答しない。神経因性疼痛の例には、下背部痛、片頭痛および頭痛、任意のタイプの癌などの疾患状態または免疫系に関連した疾患から生ずる疼痛が含まれるが、これらに限定するものではない。
【００２０】
非神経または侵害受容性疼痛は、例えば捻挫、骨折、火傷、衝突、打撲、炎症、閉塞、および筋膜痛も含めた組織損傷からの疼痛を指す。このタイプの疼痛は、通常、期間が限られており（慢性とは対照的に）、オピオイド治療に十分応答する。
【００２１】
本発明の一態様では、哺乳類における神経および非神経痛の両方の同時治療を含む方法が、提供される。この方法では、神経および非神経痛は、下記の一般式（１）を有する阻害薬であって、
【００２２】
【化２】
0005404045.tif 000003
【００２３】
式中、
Ａは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルハロゲン化物、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、およびＣ１〜Ｃ６アルコキシからなる群から選択され、
Ｂは、ヒドロキシ、チオ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ２、−ＳＲ１、あるいは、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、ＯＲ１、ＮＨ２、ＮＯ２、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ２、ＳＲ１、Ｃ３〜Ｃ１０芳香族もしくは非芳香族環構造、またはＣ３〜Ｃ９芳香族もしくは非芳香族複素環構造であってＯＨ、ハロゲン、チオ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシで任意選択で置換された構造から選択された１個または複数の置換基で任意選択で置換された、−Ｃ１〜Ｃ６飽和または不飽和アルキル基からなる群から選択され、式中Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ６カルボキシアルキルからなる群から選択され、あるいはＮＲ１Ｒ２は、ＯＨ、ハロゲン、チオ、ＮＨ２、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ６カルボキシアルキルで任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ６芳香族もしくは非芳香族複素環を形成し、
Ｄは、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシ、ＮＨ２、チオ、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ３、ＳＲ１、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシからなる群から選択され、式中Ｒ１は、上記にて定義された通りであり、Ｒ３は、Ｒ１に関して定義された通りであり、
Ｅは、ＨまたはＯＨ、あるいは、
Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ２、チオ、ＳＲ１、非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、もしくはＣ４〜Ｃ６複素環、またはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル、ハロゲン、もしくはＯＨからなる群から選択された１個または複数の置換基を有する置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、もしくはＣ４〜Ｃ６複素環で、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜１０−アリール−Ｃ１〜６−アルキル、またはＣ３〜１０−アリールオキシ−Ｃ１〜６−アルキルであり、あるいは、
非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、またはＣ４〜Ｃ６複素環であり、あるいは
Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル、ハロゲン、またはＯＨからなる群から選択された１個または複数の置換基を有する置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、またはＣ４〜Ｃ６複素環であり、
式中Ｒ１およびＲ２は、上記にて定義された通りであり、
Ｇ、Ｈ、Ｊ、およびＭは、それぞれＮであり、あるいは
ＨおよびＪはそれぞれＣであり、ＧおよびＭはそれぞれＮ、Ｓ、またはＯであり、あるいは
Ｈ、Ｊ、およびＭはそれぞれＣであり、ＧはＮ、Ｓ、またはＯである
阻害薬を使用した、ＡＣ１の阻害によって治療される。
【００２４】
式（１）の化合物における基本の複素環系は、変数Ｇ、Ｈ、Ｊ、およびＭのそれぞれが窒素（Ｎ）であるような、即ちプリン環系であるようなものでよい。あるいは、ＨおよびＪはそれぞれ炭素でよく、ＧおよびＭは、Ｎ、Ｓ、またはＯから選択してもよく、例えばベンゾチアゾールであってもよい。別の代替例では、例えばインドール、ベンゾチオフェン、またはベンゾフラン環系がそれぞれ得られるように、Ｈ、Ｊ、およびＭはそれぞれ炭素（Ｃ）でよく、Ｇは、Ｎ、Ｓ、またはＯでもよい。
【００２５】
変数Ａは、Ｈ；ＯＨ；Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩなどのハロゲン；メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、３−メチルペンチル、ヘキシル、およびイソヘキシルなどの分枝状アルキル基を含むＣ１〜Ｃ６アルキル；クロロメチル、フルオロメチル、ブロモエチル、ブロモエチレニル、プロピルフルオロ、イソプロピルヨード、クロロブチル、１，１−ジクロロ−２，３−ブチル、２−ブロモペンチル、３−クロロヘキシル、１−フルオロ−３−メチルヘキシル、および１，１−ジフルオロヘキシルなどのＣ１〜Ｃ６アルキルハロゲン化物；例えばエチレニル、プロピレニル、ブテニル、イソブテニル、２−ブテニル、ペンテニル、イソペンテニル、２−ペンテニル、およびヘキセニルなどの分枝状アルケニル基を含むＣ２〜Ｃ６アルケニル；エチニル、プロピニル、およびブチニルなどの分枝状アルキニル基を含むＣ２〜Ｃ６アルキニル；メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、メトキシメチル、エトキシメチル、エトキシエチル、メトキシエチル、メトキシプロピル、エトキシプロピル、プロピルオキシメチル、プロピルオキシエチル、プロピルオキシプロピル、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、およびイソヘキシルオキシなどの分枝状アルコキシ基を含むＣ１〜Ｃ６アルコキシでもよい。
【００２６】
変数Ｂは、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ２、ＳＲ１、あるいは、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ２、または−ＳＲ１から選択された１個または複数の置換基で任意選択で置換された−Ｃ１〜Ｃ６飽和もしくは不飽和アルキル基、例えば上記にて例示されたアルキル、アルケニル、またはアルキニル基、あるいはＯＨ、ハロゲン、チオ、ＮＨ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、またはＣ１〜Ｃ６アルコキシで任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ１０芳香族もしくは非芳香族環構造またはＣ３〜Ｃ９芳香族もしくは非芳香族複素環構造でよい。「環構造」という用語は、本明細書では、単環ならびに２環式構造などの多環式構造からなる構造を指すのに使用する。「複素環」または「複素環構造」という用語は、コア環構造内にＯ、Ｓ、およびＮから選択された少なくとも１個のヘテロ原子を含む、３〜９員環構造を含むことを意味する。適切な環構造の例には、ベンゼン、ナフタレン、テトラリン、デカリン、ピペリジン、ピロリジン、フラン、ピペラジン、テトラヒドロチフェン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｔｈｉｐｈｅｎｅ）、モルホリン、イミダゾール、ベンゾチオフェン、キノリン、イソキノリン、インドール、ベンゾフラン、およびプリンが含まれる。
【００２７】
変数Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキルハロゲン化物、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ６カルボキシアルキルからなる群から選択される。したがってＯＲ１は、例えば、オキシメチル、オキシジメチル、オキシエチル、オキシ−３−クロロブチル、オキシプロピレニル、またはオキシプロパノールでもよい。ＮＨＲ１は、例えば、メチルアミンなどのアルキルアミン、ならびに２−クロロ−プロピルアミン、ＮＨ−エタノール、ＮＨ−プロパノール、ＮＨ−エチルメチルエーテル、またはＮ−酪酸でよい。同様に、ＮＲ１Ｒ２は、ジエチルアミンなどのジアルキルアミンでよく、または例えば、Ｎ−クロロ−Ｎ−プロピル、Ｎ−メチル−Ｎ−酪酸、Ｎ−メチル−Ｎ−プロパノールでもよい。
【００２８】
ＮＲ１Ｒ２は、上記にて例示したようなＣ３〜Ｃ１０芳香族または非芳香族複素環構造を形成してもよく、任意選択で、ＯＨ、ハロゲン、チオ、ＮＨ２、ＮＯ２、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカノール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ６カルボキシアルキルで置換されていてもよい。
【００２９】
変数Ｄは、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシ、ＮＨ２、チオ、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ３、−ＳＲ１、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または−Ｃ１〜Ｃ６アルコキシでもよい。Ｒ１は、上記にて定義された通りであり、Ｒ３は、Ｒ１に関して定義された通りである。したがってＤは、例えば、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシ、−ＮＨ２、チオ（Ｓ）、−Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または−Ｃ１〜Ｃ６アルコキシなどの、置換されていない基でもよい。Ｄは置換された基でもよく、例えばＤは−ＮＨＲ１であって、このＲ１がメチルやエチル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、２−メチル−ブチルなどのＣ１〜Ｃ６アルキルでよく；Ｄは、メチルエチルアミンやＮ−プロピル−Ｎ−ブロモアミンなどの−ＮＲ１Ｒ３でよく；またはＤは、チオエチルやチオペンチル、チオ−エタン酸などの−ＳＲ１でもよい。Ｃ１〜Ｃ６アルキルおよびＣ１〜Ｃ６アルコキシは、前述のように、ハロゲン、ヒドロキシ、ＮＨ２、チオ、ＮＨＲ１、ＮＲ１Ｒ３、およびＳＲ１で、任意選択で置換されていてもよい。
【００３０】
変数Ｅは、ＨまたはＯＨでもよい。Ｅは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アミノ、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ２、チオ、−ＳＲ１、非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、もしくはＣ４〜Ｃ６複素環、またはＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル、ハロゲン、およびＯＨからなる群から選択された１個または複数の置換基を有する置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、フェニル、もしくはＣ４〜Ｃ６複素環で、任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ３〜１０−アリール−Ｃ１〜６−アルキル、またはＣ３〜１０−アリールオキシ−Ｃ１〜６−アルキルであってもよい。Ｅは、非置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ベンジル、またはＣ４〜Ｃ６複素環でもよく、あるいは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ６カルボキシアルキル、ハロゲン、およびＯＨからなる群から選択された１個または複数の置換基を有する置換Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、ベンジル、またはＣ４〜Ｃ６複素環でもよい。Ｒ１およびＲ２は、すでに定義した通りである。
【００３１】
Ｅに関する基の特定の例には、−メチルフェニル、−エチルフェニル、−プロピルフェニル、−メチルアミン−フェニル、−メチルアミン−プロパノール、−エチルアミン−ペンタノール、−１−メチル−２，６−ジクロロフェニル、−１−２，３−ジヒドロキシ−４−メタン−オール−テトラヒドロフラン、および−ｐ−エトキシ−トリルを含んでもよい。
【００３２】
式（１）の化合物がＡＣ１を阻害するか否かを決定するには、ｃＡＭＰアッセイなどの十分に確立されたアッセイを使用してもよい。ＡＣ１は、ＡＴＰからｃＡＭＰへの変換を触媒するので、試験化合物の存在下でのＡＣ１発現細胞によるｃＡＭＰの産生をモニタすることにより、試験化合物のＡＣ１阻害活性を測定することができる。簡単に言うと、ＡＣ１をコードするＤＮＡがトランスフェクトされた非ＡＣ１発現細胞を、様々な濃度の潜在的ＡＣ１阻害化合物と共にインキュベートする。適切な反応時間の後、反応混合物中のｃＡＭＰの量を決定することによって、ＡＣ１活性を測定する。ｃＡＭＰがごくわずかしかなく、またはまったく存在しない状態は、阻害活性があることを示している。
【００３３】
デュアルルシフェラーゼレポーターシステムは、下記の特定の実施例においてより詳細に記述されるように、ＡＣ１阻害活性を測定するのに使用してもよい。このアッセイでは、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を、ホタルルシフェラーゼの発現レベルの変化として検出し、その転写を、上流のｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に結合している転写因子ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）によって調節する。ＨＥＫ２９３細胞などの細胞に、ルシフェラーゼをコードする構成体をトランスフェクトし、試験化合物と共にインキュベートする。適切なインキュベーション期間の後に、ルシフェラーゼ活性を測定する。ルシフェラーゼ活性の阻害は、ＡＣ１阻害薬の存在を示している。
【００３４】
式（１）による化合物の例には、図６に例示される化合物が含まれる。これらの化合物は、当業者に理解されるように、標準的な化学合成プロトコルを使用して容易に合成することができるが、Ａｓｉｎｅｘ  Ｌｔｄ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｓ、およびＭａｙｂｒｉｄｇｅなどの供給元から購入してもよい。具体的には、本明細書で「ＢＡＳ」と示される化合物は、Ａｓｉｎｅｘ  Ｌｔｄ．から購入することができ、「ＨＴＳ」、「ＪＦＤ」、「ＲＪＣ」、「ＳＢ」、および「ＢＴＢ」で示される化合物は、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅから購入することができ、「Ｃ」と示される化合物は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｌａｂｓから購入することができる。
【００３５】
本発明の別の態様では、下記の一般式（２）を有するプリン阻害薬であって、
式中、変数Ａ、Ｂ、Ｄ、およびＥが上記にて定義された通りである阻害薬を使用して、神経および非神経痛の両方の同時治療を含む方法が、提供される。
【００３６】
【化３】
0005404045.tif 000004
【００３７】
本発明による治療方法は、一般に医薬品組成物の形をとる上記にて定義されたＡＣ１阻害薬の投与および／または使用を含む。本発明による医薬品組成物は、典型的には、ＡＣ１阻害薬および医薬品として許容される担体を含む。医薬品として許容される担体は、所望の投与経路に適するように選択することができる。本明細書で使用される、「医薬品として許容される担体」には、任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延薬、および生理学的に適合性のあるものが含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、非経口、脊髄、または表皮投与（例えば、注射または輸液による）に適することが好ましい。投与経路に応じて、活性化合物、即ちＡＣ１阻害薬を、酸の作用および化合物を不活性にする可能性のあるその他の自然状態からこの化合物を保護する材料で被覆してもよい。
【００３８】
本発明の医薬品組成物は、１種または複数の医薬品として許容される塩を含んでもよい。「医薬品として許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保有し、かつ望ましくないあらゆる毒性効果を発揮しない塩を指す（例えば、非特許文献１６参照）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩が含まれる。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、およびリンなどの無毒性無機酸から、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性有機酸から得られるものが含まれる。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、およびカルシウムなどのアルカリ土類金属から、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカインなどの無毒性有機アミンから得られるものが含まれる。
【００３９】
本発明の医薬品組成物は、医薬品として許容される抗酸化薬を含んでもよい。医薬品として許容される抗酸化薬の例には、（１）アスコルビン酸や塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化薬、（２）パルミチン酸アスコルビルやブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化薬、および（３）クエン酸やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート薬が含まれる。
【００４０】
本発明の医薬品組成物に用いてもよい、適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適正な流動性は、例えば、レチシンなどのコーティング材料の使用によって、また分散液の場合には必要とされる粒度の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【００４１】
これらの組成物は、例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤、香料、および／または分散剤を含有してもよい。微生物の存在の防止は、滅菌手順と、様々な抗菌および抗真菌薬、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含めることの両方によって、確実にすることができる。糖や塩化ナトリウムなどの等張薬を、組成物中に含めることも望ましい。さらに、注射可能な医薬品形態の長期にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらすことができる。
【００４２】
治療組成物は、典型的には、滅菌されかつ製造および保存条件下で安定でなければならない。滅菌注射液は、必要とされる量の活性化合物を、必要に応じて上記列挙された１種の成分または成分の組合せと共に、適切な溶媒に組み込み、その後、滅菌精密濾過を行うことによって、調製することができる。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高い薬物濃度に適したその他の秩序構造として、配合することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒でもよい。適正な流動性は、例えば、レチシンなどのコーティング材料の使用によって、また分散液の場合には必要とされる粒度の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖や、マンニトール、ソルビトール、などのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。
【００４３】
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療がなされる哺乳類、および特定の投与形態に応じて変わることになる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を発揮する組成物の量になる。一般に、全体で１００パーセントのうち、この量は、医薬品として許容される担体と組み合わせた状態で、活性成分が約０．０１パーセントから約９９パーセントに及ぶことになり、好ましくは活性成分が約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセントから約３０パーセントになる。
【００４４】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば治療応答）が得られるように調節する。例えば、単一のボーラスを投与してもよく、何回かに分けた用量を時間をかけて投与してもよく、またはこの用量を、治療状況の必要性により示されるように、比例的に減少または増加させてもよい。投与を容易にし、投薬を均一にするために、単位剤形として非経口組成物を配合することが、特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、治療がなされる哺乳類用の単一の投薬として適切な、物理的に切り離された単位を指し、各単位は、必要とされる医薬品担体と一緒になって、所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形に関する仕様は、（ａ）活性化合物の独自の特徴および実現される特定の治療効果、および（ｂ）個々の感受性を治療する活性化合物などの調剤の分野に固有の制約、によって決定され、かつこれらに直接左右される。
【００４５】
本発明の医薬品組成物中の、活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対して毒性を持つことなく、特定の患者、組成物、および投与形態に対して所望の治療応答を実現するのに有効な活性成分の量が得られるように、変えてもよい。選択された投薬レベルは、用いられる本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排泄率、治療の所要期間、用いられる特定の組成物との組合せで使用されるその他の薬物、化合物、および／または材料、年齢、性別、体重、状態、全身の健康、および治療がなされる患者の以前の病歴、および医療の分野で周知の因子などを含めた様々な薬物動態因子に左右されることになる。本発明のＡＣ１阻害薬の「治療上有効な投薬」は、神経および非神経（例えば炎症）痛の低減をもたらすことが好ましい。当業者なら、そのような量は、哺乳類患者のサイズ、症状の重症度、および選択された特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、決定することができる。
【００４６】
哺乳類にＡＣ１阻害薬を投与する場合、その投薬量は、典型的には約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重に及び、より一般には０．０１から５ｍｇ／ｋｇ体重に及ぶ。例えば投薬量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にすることができる。
【００４７】
本発明の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法の１つまたは複数を使用して、１つまたは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者によって理解されるように、投与経路および／または形態は、所望の結果に応じて様々に変わることになる。本発明のＡＣ１阻害薬に関する好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、動脈内、くも膜下、嚢内、眼窩内、心臓内、経気管、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下腔、髄腔内、硬膜外、および胸骨内注射および輸液を含めた非経口経路が含まれる。あるいは、その他の好ましい投与経路には、局所、表皮、または粘膜投与経路、例えば鼻内、経口、膣、直腸、舌下、または局所を含めた非経口でない経路（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｒｏｕｔｅｓ）が含まれる。
【００４８】
ある実施形態では、本発明のＡＣ１阻害薬を、１種または複数の追加の治療薬と組み合わせて投与することができる。例えば、本明細書に開示されるＡＣ１阻害薬は、神経および非神経（例えば炎症）痛の併用治療に有用であるが、ある特定の状況では、哺乳類におけるさらなる疼痛を阻害するために、１種または複数の追加の鎮痛薬と組み合わせてＡＣ１阻害薬を投与することが望まれてもよい。本発明のＡＣ１阻害薬を一緒に組み合わせることができる、その他の鎮痛薬の非限定的な例には、μオピオイド受容体作動薬（例えばモルヒネ）、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬（例えばケタミン）；シクロキシゲナーゼ阻害薬（例えばＢｅｘｔｒａ（商標）、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（商標））、プロスタグランジン阻害薬（例えばアセトアミノフェン）；抗てんかん投薬（例えばカルバマゼピン）、およびガバペンチンが含まれる。
【００４９】
本発明の別の態様では、製品が提供される。製品は、組成物を含有する包装材料を含む。組成物は、上記にて示される一般化学式（１）を有するＡＣ１阻害薬、および上述の医薬品として許容される担体を含む。包装材料には、この組成物が神経および非神経痛の両方の併用同時治療に有用であることを示す、標識が付される。
【００５０】
製品に含まれる組成物は、任意の適切な投与可能な形を構成してもよく、上記にて詳述された、任意の適切な投薬量を含んでもよい。
【００５１】
包装材料は、ボトル、カートン、およびチューブなどを含めた、治療で使用される組成物を包装するのに一般に使用される任意の適切な材料でよい。
【００５２】
本発明の実施形態を、限定するものと解釈すべきではない下記の特定の実施例において記述する。
【実施例】
【００５３】
（細胞培養）
ＡＣ１が欠けていることが知られているヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３；ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５７３）細胞を、加湿した９５％空気および５％ＣＯ２インキュベータ内で、１０％ウシ胎児血清が補われたＤＭＥＭ中、３７℃で成長させた。
【００５４】
（ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＣ１の発現）
ＡＣ１発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３−ＡＣ１）は、寛大にもＤｒ．Ｒｏｎ  Ｔａｕｓｓｉｇ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）により提供された。ＤＮＡトランスフェクションでは、ＨＥＫ２９３細胞を、直径６０ｍｍのシャーレ（１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭを含有する）にシャーレ当たり１×１０６の密度で蒔き、一晩成長させ、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりｐｃＤＮＡ３−ＡＣ１（シャーレ当たり０．８μｇＤＮＡ）をトランスフェクトした。安定なトランスフェクト済みクローンを、０．８ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地中で選択し、この培地内で維持した。
【００５５】
（逆転写酵素−ＰＣＲ）
トータルＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ、カナダ）を使用して、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞から単離した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＱＩＡＧＥＮワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ、カナダ）により、５０μｌの反応体積中で、下記の増幅条件下で、即ち初期変性を９４℃で５分間、その後に、９４℃で４５秒、５８℃で３０秒、および７２℃で４５秒を３５サイクル、最後に伸長を７２℃で７分間という条件下で行った。ＡＣ１に関するＰＣＲプライマーは、下記の通りであった：順方向：５’−ＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＣＴＴ  ＧＴＣＴＡＣＣ−３’、逆方向：５’−ＧＡＣＡＣＣＣＧＧＡＡＡＡＡ  ＴＡＴＧＧＣＴＡＧ−３’。ＰＣＲ産物の電気泳動を、１．５％アガロースゲル上で行い、臭化エチジウムにより染色した。
【００５６】
（ＡＣ１トランスフェクト細胞におけるｃＡＭＰアッセイ）
アデニリルシクラーゼ活性を、ＨｉｔＨｕｎｔｅｒ  ｃＡＭＰ  ＸＳアッセイキット（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を使用して、前述のように（非特許文献１７参照）測定した。安定なＡＣ１発現を伴うＨＥＫ２９３細胞を、集密するまで成長させた。細胞を、ＰＢＳ中０．０２％ＥＤＴＡを使用して、分離した。１×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液を、低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、および１ｍＭの３−イソブチル−１メチルキサンチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含むフェノールレッドなしのＤＭＥＭ培地中で調製した。約２００００個の細胞（２０μｌ中）を、９６ウェル培養プレートの各ウェルに添加した。これらの細胞には、３７℃で４５分間、５％ＣＯ２のインキュベータ内でインキュベートすることにより、連続濃度のアデニリルシクラーゼの潜在的な非競合阻害薬が存在しない状態でまたは存在下で、１０μＭのフォルスコリン（非特異的アデニリルシクラーゼ活性剤）、１０μＭのＡ２３１８７（カルシウムイオノフォア）、および２ｍＭのＣａＣｌ２の組合せで刺激を与えた。ｃＡＭＰ  ＸＳ抗体／Ｌｙｓｉｓミックス（２０μｌ）を添加し、ＲＴで６０分間インキュベートし、その後、ｃＡＭＰ  ＸＳ  ＥＤ試薬をさらに２０μｌ添加し、ＲＴで６０分間インキュベートした。ＥＡ／ＣＬ基質ミックス（４０μｌ）を添加し、ＲＴで一晩インキュベートした後に、化学ルミネセンスをＣＬＩＰＲリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。このアッセイを、４回実施した。
【００５７】
（デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイによる、ＡＣ１発現ＨＥＫ２９３細胞における化学スクリーニング）
ＡＣ１阻害薬について、そのＣＲＥＢ発現に対する下流効果を評価するために、デュアルルシフェラーゼレポーターシステムを使用した（非特許文献１８参照）。このレポーターアッセイでは、細胞内ｃＡＭＰ濃度の変化を、ホタルルシフェラーゼの発現レベルの変化として検出し、その転写は、上流ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に結合している転写因子ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）によって調節した。ＨＥＫ２９３細胞を、抗生物質が存在しない状態で９６ウェルプレートに継代培養し、一晩成長させ、リポフェクタミン２０００試薬を使用して、ｐＧＬ３−ＣＲＥ−ホタルルシフェラーゼおよびｐＧＬ３−ＣＭＶ−ウミシイタケルシフェラーゼ構成体（ウェル当たり、０．２５μｇ  ＤＮＡ）でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を一晩インキュベートし、培地を、ＤＭＥＭ含有１０％ウシ胎児血清に変えた。４８時間後、１００μＭの濃度で試験がなされた各ＡＣ１阻害薬が存在しない状態かまたはその存在下で、細胞を、１０μＭフォルスコリン、１０μＭカルシウムイオノフォアＡ２３１８７、および２ｍＭ  ＣａＣｌ２で独立に処理し、または１０μＭフォルスコリン、１０μＭ  Ａ２３１８７、および２ｍＭ  ＣａＣｌ２の組合せで独立に処理した。６時間のインキュベーション期間の終わりに、細胞を収集し、ルシフェラーゼ活性について、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりアッセイを行った。相対発光量を、ＳＩＲＩＵＳ照度計によって測定した。
【００５８】
（動物）
この研究で使用したマウスは、Ｃ５７Ｂｌ／６株成体（８週齢）およびＣ５７Ｂｌ／６バックグラウンドのＡＣ１ノックアウトマウス（非特許文献１９参照）であった。これらの動物を収容して、食物および水を適宜得ることができる状態で、１２時間：１２時間の明：暗サイクルにかけた。プロトコルのすべては、トロント大学のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅに従った。野生型およびノックアウトの両方を、十分にグルーミングした。実験者には、遺伝子型が伏せられた。
【００５９】
（急性炎症性筋肉痛に関するホルマリンリックテスト）
短時間のハロタン麻酔下で、１０μＬの５％ホルマリンを左ひ腹筋に注射した。針を側面から逸らして、骨に刺さらないようにし、その先端を、筋腹の中央で停止させた。大腿部および足も含めて注射がなされた脚を舐め、または噛むのに費やした全時間を記録し、２時間にわたって５分ごとに合計した。試験化合物が行動に及ぼす効果を研究するために、試験がなされる各化合物を、ホルマリンの筋肉内注射の３０分前に、腹腔内注射した。
【００６０】
（慢性炎症性筋肉痛の誘発）
当初は慢性疼痛を研究するための機械的異痛の筋肉モデル（特許文献２０参照）を、これらの実験に適合させた。マウスを、ハロタン下で短時間麻酔した。２０μｌのカラゲナン（３％、生理食塩水ｐＨ７．２中）を、左ひ腹筋に深く筋肉内注射した。対照として、生理食塩水を使用した。注射は、第１および５日目に実施した。行動侵害受容応答を、第１、２、５（注射の前後）、１４、および２８日目に測定した。
【００６１】
（無害性機械的刺激に対する応答）
マウスをプレキシガラス拘束器上に置き、試験前に３０分間、環境に順応させた。機械的異痛について、屈曲点へのフォンフレイフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、イリノイ）の適用に対する、後足の応答性に基づいて評価した。正の応答には、舐めること、噛むこと、および後足を突然引っ込めることが含まれる。実験は、閾値刺激を特徴付けるために実施した。１．６５フィラメントからの機械的圧力（０．００８ｇｍの力）は、無害であることがわかった。次いでこのフィラメントを使用して、機械的異痛の試験をした。１０回の試験を、５分間隔で毎回実施し、その結果を、正の応答のパーセンテージとして表した。正の応答には、持続する後足の引込みと、その後の舐める動作または引っ掻く動作が含まれた。
【００６２】
（神経因性疼痛に対するＡＣ１阻害の評価）
神経因性疼痛を、当技術分野で以前から知られているように、総腓骨神経を結紮することによって誘発させた。この方法は、神経因性疼痛における行動侵害受容応答を評価するための有効なマウスモデルであることがわかった。ＡＣ１阻害の効果を、第７日目に、結紮と同側の足背上で、最大の機械的異痛に関して評価した。実験は、ＡＣ１阻害薬の腹腔内注射ならびにＡＣ１阻害薬の経口投与の３０分後に、ＡＣ１ノックアウトマウスならびに正常マウスの両方で実施した。
【００６３】
（データ分析）
結果を、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。統計比較を、２元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【００６４】
（化学物質）
上述の試験を使用して試験された化学物質（阻害薬）には、図６に例示したものが含まれる。
【００６５】
（結果）
（ｃＡＭＰアッセイによるＡＣ１安定発現ＨＥＫ２９３での化学物質の濃度依存性効果）
ＡＣ１発現ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞に安定にトランスフェクトし、ＡＣ１発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した（図１ａ−レーン１：１００ｂｐ  ＤＮＡラダー分子量マーカー。レーン２：対照としての、ＡＣ１発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＡＣ１からのＰＣＲ産物。レーン３：ＡＣ１なしでベクターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３。レーン４：ＡＣ１発現ベクターがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３。）。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色した。
【００６６】
次いで、フォルスコリンおよびＡ２３１８７の刺激効果を、ＡＣ１発現ありまたはＡＣ１発現なしのＨＥＫ２９３細胞において比較した。フォルスコリンおよびＡ２３１８７の両方は、ＡＣ１発現なしのＨＥＫ２９３細胞におけるよりもＡＣ１発現細胞において、より高いｃＡＭＰレベルを誘発することがわかった（図１ｂ）。フォルスコリンおよびＡ２３１８７の組合せは、より高いレベルのｃＡＭＰをもたらした（図１ｂ）。次いで阻害薬について、ＡＣ１トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるフォルスコリンおよびカルシウムイオノフォア刺激ｃＡＭＰレベルに対するこの阻害薬の影響を試験した。阻害薬のすべては、ｃＡＭＰレベルの統計上有意な低下があることを示した（Ｐ＜０．００１）（図１ｃ）。
【００６７】
（ＣＲＥＢ発現に対する新規なＡＣ１阻害薬の影響）
ＡＣ１発現ありまたはＡＣ１発現なしのＨＥＫ２９３細胞での、ＣＲＥＢ発現に対するフォルスコリンおよびＡ２３１８７の刺激効果を比較した。フォルスコリンおよびＡ２３１８７は、ＡＣ１発現なしのＨＥＫ２９３細胞よりもＡＣ１発現細胞において、より強力なルシフェラーゼ活性を誘発した。フォルスコリンおよびＡ２３１８７の組合せは、ルシフェラーゼ活性の最も強固な誘発を引き起こすことができた。次いで、フォルスコリンおよびＡ２３１８７によって刺激された、ＡＣ１安定発現ＨＥＫ２９３に対する各ＡＣ１阻害薬の効果を測定した。試験がなされたすべての阻害薬は、１００μＭの濃度でルシフェラーゼ活性を阻害することがわかった（図１ｄ）。
【００６８】
（選択されたＡＣ阻害薬によるＡＣ１発現の蓄積活性化の用量依存性阻害）
ＡＣ１発現ＨＥＫ２９３細胞を、ＡＣ１阻害薬の存在下、１０μＭフォルスコリン、１０μＭ  Ａ２３１８７、および２ｍＭ  ＣａＣｌ２の組合せで処理した。ｃＡＭＰ産生は、０．２から２００μＭの間の濃度依存的手法で、各阻害薬によって阻害され、このときのＩＣ５０は、ＳＱ２２５３６に関して２２μＭであり、ＨＴＳ０９８３６に関して１０μＭであり、ＪＦＤ０２７９３に関して１８μＭであり、ＳＢ０１７８８／ＤＡに関して４５μＭであった（図２）。
【００６９】
（新規なＡＣ１阻害薬による急性炎症性筋肉痛での侵害受容性応答の用量依存性阻害）
ＨＴＳ０９８３６は、０．１から５ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲で、急性筋肉炎症性疼痛のリッキング応答の有意な低減（Ｐ＜０．００１）を示し、このときのピーク応答は、１ｍｇ／ｋｇ体重であった（図３）。
【００７０】
（アデニリルシクラーゼ１は急性の持続炎症性筋肉痛に寄与する）
動物の行動応答に対するＡＣ１の寄与を、左ひ腹筋に対する１０μｌの５％ホルムアルデヒドの筋肉内注射によって誘発された、急性筋肉痛に関して評価した。側方アプローチによって注射するように注意を払い、針の先端を筋肉中央に保持した。ホルマリン試験は、組織損傷媒介型炎症性疼痛により誘発された行動変化の、一般的な試験である（非特許文献２１参照）（非特許文献２２および２３参照）。１２０分間の、注射された脚での動物のリッキングおよび噛付き応答が、観察された（野生型、Ｎ＝８マウス、生理食塩水対照；野生型、Ｎ＝８マウス、ホルムアルデヒド対照；注射ＡＣ１、Ｎ＝８マウス）（図４ａ）。脳または脊髄の種々のレベルでのＮＭＤＡ受容体に応じて、ホルマリン誘発性行動応答は、３つの段階からなる（（非特許文献２１参照）および（非特許文献２２参照））。応答の最初の段階は、野生型に比べてＡＣ１ノックアウトで著しく変化しなかったが、これはＡＣ１が、ホルムアルデヒドに対する急性感覚応答の初期段階に、著しくは寄与しないことを示している。有意な相違は、第２および３段階で、野生型とＡＣ１ノックアウトマウスとの間で観察されたが、これは、急性炎症中の継続応答に、ＡＣ１が不可欠であることを示している。カルモジュリン刺激ＡＣは、ＮＭＤＡ受容体媒介性カルシウム進入によって活性化され、第２および３段階での低減は、通常なら数時間続いているＮＭＤＡ受容体依存性シナプス増強（非特許文献１２参照）が不十分であることに起因する可能性がある。
【００７１】
（アデニリルシクラーゼ１は、神経因性疼痛に寄与する）
神経因性疼痛中に誘発された機械的異痛を、左総腓骨神経の結紮から７日後に試験した。動物の行動応答を、１２０分の第３段階中の時間に対してプロットした。ＡＣ１  ＫＯマウスは、同側において、すべての段階において応答の著しい低減を示した。
【００７２】
（ＡＣ１阻害薬は、慢性炎症性筋肉痛および神経因性疼痛を逆転させる）
ＡＣ１阻害薬を、慢性炎症性筋肉痛に対するその抗侵害受容効果について試験した。フォンフレイフィラメントに対する機械的応答を試験した。０．１および１ｍｇ／ｋｇ体重の両方の投薬量は、機械的異痛の著しい低減を示した。投薬量１ｍｇ／ｋｇ体重は、優れた効果を発揮することがわかった（図５ａ）。神経因性疼痛の場合、異痛は、０．１および１ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で著しく低下した（図５ｂ）。慢性炎症性疼痛および神経因性疼痛の組合せとして誘発された、より重症な形の疼痛における機械的異痛は、０．１および１ｍｇ／ｋｇ体重の両方のＨＴＳ  ０９８３６（図５ｃ）と、０．１ｍｇ／ｋｇおよび１．１ｍｇ／ｋｇ体重のＮＢ００１（図７）とを用いた動物の前処理（ｉ．ｐ．注射）によって、著しく低下した。疼痛モデル（ラット）に対する１ｍｇ／ｋｇ／３ｍｌ  ＮＢ００１の経口投与も、ガバペンチンに対する応答（図８）に比べて機械的異痛の著しい低下（図８）を示した。
【００７３】
（考察）
ＡＣ１ノックアウトマウスは、持続性炎症性痛覚の第２および３段階で著しい低下を示したが、これは、Ｃａ−カルモジュリン刺激ＡＣが、持続性筋肉痛の知覚に重要な分子であることを示している。ＡＣ１が不足しているマウスは、神経因性疼痛が低下したことを示し、皮下組織および筋肉の両方の慢性炎症における長期痛覚過敏を示すことができなかった。ｃＡＭＰは、細胞のほとんどでその正常機能に不可欠であるので、これらの酵素の非競合的阻害薬について、他の代謝経路に対する作用が最小限に抑えられるように特異的にＡＣ１を阻害することになるものを選択するために、試験をした。
【００７４】
これら阻害性分子の、培養物中のＡＣ１トランスフェクト細胞系に対する活性をスクリーニングすることによって、ＡＣ１特異的阻害薬のファミリーを選択することが可能になった。ＡＣ１はニューロン特異的であるので、これらの非競合的阻害薬は、ニューロン上のみで作用すると予測される。ＡＣ１選択的阻害薬による、動物モデルにおける急性の持続的神経因性および慢性の皮下および筋肉炎症性疼痛での、行動侵害受容性応答の有意な低下は、これら異なるタイプの疼痛を媒介するＡＣ１の役割を示している。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】（ａ）はＲＴ−ＰＣＲ増幅によって確認された、ＨＥＫ細胞系へのＡＣ１発現ベクターの安定なトランスフェクションを示す図である。（ｂ）はＡＣ１トランスフェクト細胞系における、アデニリルシクラーゼ１に対するフォルスコリンおよびカルシウムイオノフォア刺激を示すグラフである。データは、ＡＣ１発現ＨＥＫ２９３細胞系の非刺激ｃＡＭＰレベルと比較して表す（ｎ＝４）。（ｃ）はアデニリルシクラーゼのフォルスコリンおよびカルシウムイオノフォア刺激に対する、非競合ＡＣ１阻害薬の効果を示すグラフである。（ｄ）はＣＲＥＢ発現レベルの変化として示される、アデニリルシクラーゼ１に対する非競合ＡＣ１阻害薬の効果を示すグラフである。
【図２】選択されたＡＣ阻害薬による、ＡＣ１発現の蓄積活性化の用量依存性阻害を示す、対数プロットである。
【図３】急性炎症性筋肉痛に対する、アデニリルシクラーゼ阻害薬の用量応答を示す棒グラフである。
【図４】筋肉内ホルマリンによって誘発された急性持続性筋肉痛（ａ）および機械的異痛によって誘発された神経因性疼痛（ｂ）での、アデニリルシクラーゼのカルシウム刺激アイソフォームの遺伝子欠失の作用を、棒グラフによって示す図である。
【図５】慢性炎症性筋肉痛（ａ）、神経因性疼痛（ｂ）、神経因性および炎症性筋肉痛の組合せに対する、ＡＣ１阻害薬、ＨＴＳ０９８３６の作用を、棒グラフによって示す図である。
【図６】本発明による例示的なＡＣ１阻害薬を示す図である。
【図７】本発明による化合物のｉ．ｐ．投与による、ＡＣ１の阻害（および神経因性疼痛の低減）を示すグラフである。
【図８】本発明による化合物の経口投与での、機械的異痛の低減を示す図である。
【図９】マウス疼痛モデルでの引込み応答に対する、ガバペンチンの蓄積作用を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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