(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における関節炎または関節損傷を改善または予防するための組成物であって、（ａ）配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
ここで、前記ポリペプチドは、軟骨形成活性を有する、
から選択されるアミノ酸配列を有する有効量のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項２】
該ポリペプチドがＰＥＧ化されている、請求項１の組成物。
【請求項３】
該ポリペプチドが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、ポリヒスチジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合している、請求項１の組成物。
【請求項４】
該ポリペプチドが、１、２、３、４、またはそれを超える非天然アミノ酸を含む、請求項１の組成物。
【請求項５】
個体が、関節炎または関節損傷を有している、請求項１の組成物。
【請求項６】
個体が、関節炎または関節損傷を有していないが、関節炎または関節損傷のリスクを有する、請求項１の組成物。
【請求項７】
該アミノ酸配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１の組成物。
【請求項８】
該アミノ酸配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３のいずれか１つである、請求項１の組成物。
【請求項９】
該アミノ酸配列が、配列番号５、９、１３、１７、または２１を含む、請求項１の組成物。
【請求項１０】
該関節炎が、骨関節炎、外傷関節炎、および自己免疫関節炎からなる群から選択される、請求項１の組成物。
【請求項１１】
該哺乳動物が、ヒト、イヌ、またはネコである、請求項１の組成物。
【請求項１２】
該組成物が、さらにヒアルロン酸を含む、請求項１の組成物。
【請求項１３】
間葉幹細胞の軟骨細胞への分化を誘導するための、十分量のポリペプチドを含む組成物であって、ここで、該ポリペプチドが、
（ａ）配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
から選択され、そして、ここで、前記ポリペプチドが、軟骨形成活性を有する、組成物。
【請求項１４】
該ポリペプチドがＰＥＧ化されている、請求項１３の組成物。
【請求項１５】
該ポリペプチドが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、ポリヒスチジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合している、請求項１３の組成物。
【請求項１６】
該ポリペプチドが、１、２、３、４、またはそれを超える非天然アミノ酸を含む、請求項１３の組成物。
【請求項１７】
インビトロで間葉幹細胞の軟骨細胞への分化を誘導するための、請求項１３の組成物。
【請求項１８】
インビボで、哺乳動物に存在する間葉幹細胞の軟骨細胞への分化を誘導するための、請求項１３の組成物。
【請求項１９】
該哺乳動物が、ヒト、イヌ、またはネコである、請求項１３の組成物。
【請求項２０】
該アミノ酸配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１３の組成物。
【請求項２１】
該アミノ酸配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３のいずれか１つである、請求項１３の組成物。
【請求項２２】
該アミノ酸配列が、配列番号５、９、１３、１７、または２１を含む、請求項１３の組成物。
【請求項２３】
関節内輸送のための医薬組成物であって、
（ａ）配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３のアミノ酸配列からなるポリペプチド；
から選択されるアミノ酸配列を含む医学的に有効量のポリペプチドを含み、
ここで、前記ポリペプチドは、軟骨形成活性を有する、組成物。
【請求項２４】
該ポリペプチドがＰＥＧ化されている、請求項２３の組成物。
【請求項２５】
該ポリペプチドが、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、ポリヒスチジン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合している、請求項２３の組成物。
【請求項２６】
該ポリペプチドが、１、２、３、４、またはそれを超える非天然アミノ酸を含む、請求項２３の組成物。
【請求項２７】
さらにヒアルロン酸を含む、請求項２３の組成物。
【請求項２８】
該アミノ酸配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３に対して少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２３の組成物。
【請求項２９】
該アミノ酸配列が、配列番号５、６、７、９、１０、１１、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２１、２２、または２３を含む、請求項２３の組成物。
【請求項３０】
該アミノ酸配列が、配列番号５、９、１３、１７、または２１を含む、請求項２３の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２００９年７月１４日に出願された米国仮出願第６１／２２５，２９３の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１．１１９（ｅ）の下での利益を請求し、その全体の内容が、参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
骨関節炎（ＯＡ）は、もっとも一般的な筋骨格障害を示す。約４０００万人のアメリカ人が、近年罹患しており、この数は、高齢化や平均寿命の上昇の結果として、次の２０年のうちに６０００万に上昇し、身体障害の原因の第４位になることが予測されている。ＯＡは、関節軟骨（関節の潤滑および緩衝を生む細胞およびマトリックスを含む）および関節軟骨の下部の軟骨下骨の両方を含む関節の緩やかな変性衰弱を特徴とする。近年のＯＡ治療は、経口ＮＳＡＩＤｓまたは選択的シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤での鎮痛、コルチコステロイドおよびヒアルロナンなどの剤の関節内（ＩＡ）注射、ならびに外科的アプローチを含む。
【０００３】
間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）は、成人関節軟骨に存在し、単離してインビトロで軟骨細胞および他の間葉細胞系列へ分化させるようにプログラムすることができる。それは、部分的に、成長因子（ＴＧＦβ、ＢＭＰｓ）、血清条件および細胞間接触によって制御される。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、哺乳動物における関節炎または関節損傷を改善または予防する方法を提供する。ある実施態様において、該方法は、配列番号１または２５に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む有効量のポリペプチドを含む組成物を、哺乳動物の関節に投与し、それによって、哺乳動物における関節炎または関節損傷を改善または予防することを含む。
【０００５】
ある実施態様において、該個体は、関節炎または関節損傷を有している。ある実施態様において、該個体は、関節炎または関節損傷を有していないが、関節炎または関節損傷のリスクを有する。
【０００６】
ある実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号１または２５を含む。
【０００７】
ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号２、３、４、２６、２７、または２８に対して少なくとも９５％の同一性を有する。ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号２、３、４、２６、２７、または２８を含む。
【０００８】
ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号５〜２４のいずれかに対して少なくとも８０％同一である。ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号５〜２４のいずれかを含む。
【０００９】
ある実施態様において、該関節炎は、骨関節炎、外傷的関節炎、および自己免疫関節炎からなる群から選択される。
【００１０】
ある実施態様において、該哺乳動物はヒトである。
【００１１】
ある実施態様において、該組成物は、さらにヒアルロン酸を含む。
【００１２】
本発明は、軟骨基質を形成する軟骨細胞への間葉幹細胞の分化を誘導する方法も提供する。ある実施態様において、該方法は、配列番号１または２５に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む十分量のポリペプチドを間葉幹細胞に接触させ、軟骨細胞への幹細胞の分化を誘導することを含む。
【００１３】
ある実施態様において、該方法は、インビトロで実行される。ある実施態様において、該方法は、インビボで実行され、該幹細胞は、哺乳動物に存在する。ある実施態様において、該哺乳動物はヒトである。
【００１４】
ある実施態様において、該ポリペプチドは配列番号１または２５を含む。
【００１５】
ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号２、３、４、２６、２７、または２８に対して少なくとも９５％の同一性を有する。ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号２、３、４、２６、２７、または２８を含む。
【００１６】
ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号５〜２４のいずれかに対して少なくとも８０％同一である。ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号５〜２４のいずれかを含む。
【００１７】
本発明は、関節内輸送および全身性輸送のための医薬組成物も提供する。ある実施態様において、該組成物は、配列番号１または２５に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む医薬的に有効量のポリペプチドを含む。
【００１８】
ある実施態様において、該組成物は、さらにヒアルロン酸を含む。
【００１９】
ある実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号１または２５を含む。
【００２０】
ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号２、３、４、２６、２７、または２８に対して少なくとも９５％の同一性を有する。ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号２、３、４、２６、２７、または２８を含む。
【００２１】
ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号５〜２４のいずれかに対して少なくとも８０％同一である。ある実施態様において、該アミノ酸配列は、配列番号５〜２４のいずれかを含む。
【００２２】
本発明のさらなる特徴、長所、実施態様は、次の詳細な説明および請求項の考察から説明される、または明らかであろう。さらに、先述の発明の要旨および、次の詳細な説明の両方が、例示であり、限定なしに請求項に規定された発明の範囲のさらなる説明を提供するためのものであることが、理解されるべきである。
【００２３】
定義
用語「ペプチド模倣物」および「模倣物」は、天然または非天然に生じるポリペプチド（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３）と実質的に同一の構造的および機能的な特徴を有する合成化学化合物に言及する。ペプチド類似物は、テンプレートペプチドのものと類似の特性を有する非ペプチド薬として製薬産業において広く用いられている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」または「ペプチド模倣物」と呼ばれる（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）。これらは、参照によって本明細書に包含される）。ペプチド模倣物は、治療的に有用なペプチドに構造的に類似するものであり、等価のまたは強化した治療的または予防的効果を産出するために使用してもよい。一般的には、ペプチド模倣物は、目的のポリペプチドにおいて見出されるなどの模範ポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似するが、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって任意的に交換された１または複数のペプチド結合を有する。該模倣物は、完全に合成、非天然のアミノ酸類似物からなるか、または、部分的な天然ペプチドアミノ酸および部分的な非天然アミノ酸類似物のキメラ分子であることができる。該模倣物は、模倣物の構造および／または活性を実質的に改変しない置換でもある限り、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を包含することもできる。例えば、模倣物組成物は、目的のポリペプチドの少なくとも１つの活性を実現することができる場合には、本発明の範囲内である。
【００２４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマーに言及するために区別せずに用いられる。該用語は、１または複数のアミノ酸残基が天然に生じる対応のアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマーに対して用いられ、また、天然に生じるアミノ酸ポリマーおよび非天然に生じるアミノ酸ポリマーに対して用いられる。
【００２５】
用語「アミノ酸」は、天然に生じる合成アミノ酸に言及し、また、天然に生じるアミノ酸に類似する様式で機能するアミノ酸類似物、およびアミノ酸模倣物に言及する。天然に生じるアミノ酸は、遺伝的コードによってコードされるものであり、また、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンなどの後で修飾されたアミノ酸である。アミノ酸類似物は、天然に生じるアミノ酸としての基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、および、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどのＲ基に結合した
α炭素、と同一の構造を有する化合物に言及する。このような類似物は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に生じるアミノ酸と同一の基本的化学構造を保持する。天然にコードされるアミノ酸は、２０の共通のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン）およびピロールリジンならびにセレノシステインである。
【００２６】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸および核酸の両方の配列に対して用いられる。特定の核酸配列に関して、保存的に修飾された変異体は、同一である、または本質的に同一であるアミノ酸配列をコードする、またはアミノ酸配列をコードしない核酸に言及し、本質的に同一である配列に言及する。遺伝的コードの縮重のため、多数の機能的に同一である核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。たとえば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定される各々の位置において、該コドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく、説明された対応コドンのいずれかに改変することができる。
このような核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的に修飾された変異の一種である。本明細書において、ポリペプチドをコードする各核酸配列は、核酸の各々のありうるサイレント変異も説明する。当業者は、核酸における各々のコドン（但し、通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常メチオニンのための唯一のコドンであるトリプトファンＴＧＧを除く）は、機能的に同一である分子を産出するために変更することができることを認識するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各々のサイレント変異は、各々記述された配列において、黙示されている。
【００２７】
アミノ酸配列に関して、コードされる配列における単一のアミノ酸または少数のパーセンテージのアミノ酸を改変、付加または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、改変によって化学的に類似するアミノ酸でアミノ酸を置換させる「保存的に修飾された変異体」であることを、当業者は認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の一覧は、本技術分野においてよく知られている。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、およびアレルに対して付加されるものであり、これらを排斥するものではない。
【００２８】
次の８つの群は、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。
【００２９】
「配列同一性のパーセンテージ」は、最適にアラインされた２つの配列を、該２つの配列の最適アラインメントのために、比較窓で比較することによって測定され、ここで、比較窓におけるポリヌクレオチド配列の部分は、付加または欠失を含まない参照配列（例えば、本発明のポリペプチド）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。該パーセンテージは、同一である核酸塩基またはアミノ酸残基が、両方の配列に生じる位置の数を測定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を、比較の窓における位置の総数で割り、その結果に１００をかけて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【００３０】
２またはそれを超える核酸またはポリペプチド配列の文脈において、用語「同一である」またはパーセント「同一性」は、同一の配列である２またはそれを超える配列または部分列に言及する。２つの配列が、比較窓にわたる最大一致にわたって、または、次の配列比較アルゴリズムの１つを用いてまたは手動アラインメントおよび目視検査によって測定される指定領域にわたって、比較してアラインした場合に、特定のパーセンテージ同一である（すなわち、特定の領域にわたって、または、特定されない場合には、完全な配列にわたって、６０％同一である、任意的に６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である）アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合には、２つの配列は、「実質的に同一である」。本発明は、本明細書において例示されるポリペプチド（例えば、配列番号１〜２８のいずれか）にそれぞれ実質的に同一であるポリペプチド、およびその使用を提供し、その使用は、関節炎または関節損傷を処置または予防するための使用を含むが、それらに限定されない。任意的に、該同一性は、少なくとも約５０ヌクレオチドの長さの領域にわたって、より好ましくは、１００から５００または１０００またはそれを超えるヌクレオチドの長さの領域にわたって、または、参照配列の完全長にわたって、存在する。
【００３１】
配列比較のためには、典型的には、１つの配列が、参照配列として作用し、試験配列は、これと比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列が、コンピューターに入力され、必要に応じて部分列座標が指定され、そして、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターを使用することができ、また、別のパラメーター指定することができる。配列比較アルゴリズムは、続いて、プログラムパラメーターに基づき、参照配列と比較した試験配列におけるパーセント配列同一性を計算する。
【００３２】
本明細書において、「比較窓」は、２０〜６００、普通には、約５０〜約２００、より普通には約１００〜約１５０からなる群から選択される、隣接位置の数の任意の１つの断片への参照を含み、ここで、配列は、２つの配列が最適にアラインされた後、同一数の隣接位置の参照配列と比較されてもよい。比較のための配列のアラインメントの方法は、本技術分野においてよく知られている。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃのローカルホモロジーアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性検索の方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターでの遂行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ、  ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または、手動アラインメントおよび目視検査によって（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照）によって行うことができる。
【００３３】
パーセント配列同一性および配列類似性の測定に適したアルゴリズムの２つの例が、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同一長のワードとアラインした場合にいくつかの正値閾値スコアＴと一致するか、それを満たすかのいずれかである、クレリー配列におけるＷ長のショートワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰｓ）をまず同定することを含む。Ｔは、近隣ワードスコア閾値とも呼ばれる（上記Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを探すためのデフォルト検索の種としての役割を果たす。該ワードヒットは、累積アラインメントスコアが上昇することができる限り、各配列にそって両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列のためにはパラメーターＭ（一致残基のペアのためのリワードスコア；常に＞０）およびＮ（非一致残基のためのペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列のためには、スコアリングマトリックスが、累積スコアを計算するために用いられる。それぞれの方向におけるワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値からの数Ｘによって低下する場合、１または複数の負スコア残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが、ゼロまたはそれ未満になる場合、または、いずれかの配列の末端に到達した場合に中止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度およびスピードを決定する。（ヌクレオチド配列のための）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）Ｍ＝５、Ｎ＝−４および、両ストランドの比較を使用する。アミノ酸配列のためのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両ストランドの比較を用いる。
【００３４】
ＢＬＡＳＴ  アルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計的分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こりうる確率の指標を提供する。例えば、もし、参照核酸との試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合には、核酸は、参照配列と類似していると考えられる。
【００３５】
本明細書において、用語「ヒアルロン酸」は、ヒアルロン酸のエステルおよびヒアルロン酸の塩を含むヒアルロン酸の誘導体を含むものとして使用され、用語ヒアルロナンも含む。該呼称は、低および高分子量型のヒアルロナンの両方、および、架橋ヒアルロナンまたはハイランも含む。このようなヒアルロナンの例は、Ｓｙｎｖｉｓｃ（商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．），ＯＲＴＨＯ  ＶＩＳＣ（商標）（Ａｎｉｋａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍａｓｓ．）、およびＨＹＡＬＧＡＮ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ  Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．）である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】インビトロ軟骨形成の間のＭＳＣ−誘導ＩＩ型コラーゲン産生の定量的評価。  ｈＭＳＣｓ（１０，０００／３８４ウェル）をｈＭＳＣ増殖培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において２４時間プレートした。該細胞を、上記タンパク質でさらに７２時間処理した。培地を無血清ＤＭＥＭに交換し、追加の刺激なしにさらに１４日間培養した。終わりに際して、細胞をホルマリンで固定し、洗浄し、ＩＩ型コラーゲンに対する抗体で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。ＩＩ型コラーゲン染色の量は、ハイコンテントイメージング（Ｏｐｅｒａ、  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）によって定量化した。データは、３つの実験からそれぞれの投与量について２つプールした（ｎ＝６）。
【００３７】
【図２】ＡＮＧＴＰＬ３−誘導軟骨形成の特性評価。  （Ａ）ペレット培養（１ｘ１０６細胞／ペレット）において、２１日間、無血清ＤＭＥＭ、１×ＩＴＳおよびＡＮＧＴＰＬ３（指定の場合）中でｈＭＳＣｓを培養した。培地を３日ごとに交換した。製造者の指示によるヒトＴａｑｍａｎ特異的プローブを用いてアグレカンｍＲＮＡ発現を定量化した（３つの実験から２つずつプールされたデータ（ｎ＝６））。  （Ｂ）ウシ軟骨を単離し、叩いて対称円にし、器官培養に入れた。該スライスを４８時間２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦａおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ（炎症性メディエーター）で処理して、ＡＮＧＰＴＬ３の存在下または非存在下で、軟骨マトリックスの分解を誘導し、マトリックス損傷の指標であるグルコサミノグルカン放出のパーセント阻害を同定した（４つのドナーからプールしたデータ、ｎ＝１２）。  （Ｃ）初期正常ヒト軟骨細胞および滑膜細胞（増殖培地中、２５００／３８４ウェル）を、プレートし、２４時間３７℃で培養した。２４時間の期間をとおしてＡＮＧＴＰＬ３に応じた穏やかな軟骨細胞特異的細胞増殖の上昇が実証された（２つの実験からプールされたデータ、２反復／投与量（ｎ＝４））。
【００３８】
【図３】ｍＡＮＧＴＰＴＬ３。  （Ａ）主要タンパク質構造および確認されたグリコシル化部位。  （Ｂ）ｍＡＮＧＴＰＬ３Ｃ末端ＦＬＤ（２２５−４５５）の原子構造（１．８オングストローム）。
【００３９】
【図４】ＡＮＧＰＴＬ３配列の配列アラインメント。  （Ａ）ヒト、マウス、ウシ、およびイヌネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の配列アラインメント；  （Ｂ）ヒト、マウス、ウシ、イヌおよびウマネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の配列アラインメント。
【００４０】
【図５】外科骨関節炎モデルにおけるのインビボ効能。  Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝１２／群）からの右膝の前十字靱帯（ＡＣＬ）、内側半月板脛骨靱帯（ＭＭＴＬ）、および内側側副靱帯（ＭＣＬ）の外科的切断を行い、膝関節における不安定化を誘導し、それによってＯＡ表現型を引き起こした。外科手術の１週間後、マウスに３〜４週間に１回ごと、関節内投与を行った。  （Ａ）末梢血を、外科手術の２８日後に収集した。循環ＩＩ型コラーゲン断片（ＣＴＸ−ＩＩ）をＥＬＩＳＡ（Ｎｏｒｄｉｃ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって定量化した。ｍＡＮＧＰＴＬ３投与量＝２００ｎｇ／膝、３週間ごとの注射。  （Ｂ）脛骨プラトーの定量的評価を０〜４スケールで行った。０は正常であり、５は重度のＯＡである（軟骨の全層破壊）。各マウスからの２つの片が、２の観察者によって無分別に等級分けされた。ｍＡＮＧＰＴＬ３投与量＝２００ｎｇ／膝、３週間ごと注射。  （Ｃ）インキャパシタンステストによって、または、モニター装置を通して外科手術の脚と別の脚とで立ったマウスの時間のパーセンテージを測定することによって、ＯＡ痛を測定した。読み出し値は、外科手術３６日後の痛応答を示す（示された濃度でＡＮＧＰＴＬ３の１週間ごと投与量の３投与量）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な説明
I．導入
【００４２】
本発明は、アンジオポイエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）が間葉幹細胞における軟骨細胞分化を刺激するという発見に、部分的に基づいている。したがって、本発明は、軟骨細胞への間葉幹細胞分化を誘導する方法を提供する。また、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を関節、椎骨、椎間板、または全身に投与することによって関節炎または関節損傷を予防または改善するためのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の投与を提供する。
ＩＩ．アンジオポイエチン様３
【００４３】
アンジオポイエチン様３は、分泌因子のアンジオポイエチン様ファミリーのメンバーである。これは、主に肝臓に発現し、シグナルペプチド、Ｎ−末端コイルドコイルドメイン（ＣＣＤ）およびＣ末端フィブリノゲン（ＦＢＮ）様ドメインからなるアンジオポイエチンの特徴構造を有する。アンジオポイエチン様３におけるＦＢＮ様ドメインは、αＶ／β３インテグリンに結合し、この結合が、内皮細胞接着および遊走を誘導することが示された。
【００４４】
様々なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が、本発明において使用することができる。本明細書において説明されるように、ネイティブＡＮＧＰＴＬ３は、一般的には、インビボで開裂され、アミノ−末端およびカルボキシル末端断片になる。本発明は、軟骨形成活性を有する様々なＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の使用を想定する。ある実施態様において、本発明は、完全長ネイティブ（またはその変異体）ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質アミノ酸配列の使用を提供する。ある実施態様において、本発明は、ＡＮＧＰＴＬ３配列、またはその変異体の（完全長ネイティブ配列ではない）部分を含むＡＮＧＰＴＬ３タンパク質であって、軟骨形成活性を保持するもの、すなわち、ネイティブタンパク質のアミノ酸末端側終端ではないものを提供する。ある実施態様において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、ＣＣＤドメインを持たない、および／または、有意なＣＣＤ活性を持たない。したがって、ある実施態様において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、ネイティブマウス（例えば、配列番号１２）、ヒト（例えば、配列番号８）、ウシ（例えば、配列番号１６）、イヌ（例えば、配列番号２０）、またはウマ（例えば、配列番号２４）ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質配列、または実質的に同一である配列の少なくとも断片（例えば、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０の隣接するアミノ酸）を含むが、ネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の少なくとも２００の隣接するアミノ−末端アミノ酸を含まない。
【００４５】
ある実施態様において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、フィブリノゲン−様ドメインを含む。ある実施態様において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、ネイティブマウス（例えば、配列番号１２）、ヒト（例えば、配列番号８）、ウシ（例えば、配列番号１６）、イヌ（例えば、配列番号２０）、またはウマ（例えば、配列番号２４）ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質配列のアミノ酸２０７−４５５、２０７−４００、２０７−３５０、２２５−４５５、２２５−４００、２２５−３５０、２４１−４５５、２４１−４００、２４１−３５０に対応する隣接するアミノ酸を含む、または、これらの配列と実質的同一であるが、フランキングネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質アミノ酸配列を含まない。ある実施態様において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質（配列番号１〜２８のいずれかを含むがこれらに限定されない）は、Ｃ末端配列の少なくとも部分を欠き、例えば、Ｃ−末端からの１０、２０、３０、４０、５０アミノ酸を欠く。
【００４６】
上記の本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、上記の領域の側面に位置するネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質配列を含まなくてよいが、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、非ネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質フランキング配列を含むことができる。例えば、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の軟骨形成活性部分は、１または複数の異種アミノ酸に融合させて、融合タンパク質を形成させることができる。融合パートナー配列は、アミノ酸タグ非−Ｌ（例えば、Ｄ−）アミノ酸、またはインビボ半減期を伸ばすための、および／もしくはプロテアーゼ耐性を高めるための他のアミノ酸模倣物、標的化配列または他の配列を含むことができるが、それらに限定されない。
【００４７】
本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、ネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の変異体およびトランケーション、ならびに上記活性断片の変異体およびトランケーションを包含する。活性変異体は、本技術分野における当業者に知られているあらゆる方法によって同定することができる。ある実施態様において、活性タンパク質のアミノ酸アラインメントは、不変である位置、または保存されたアミノ酸変化を含む位置を同定するために確立されうる。配列番号１、２、３、または４は、ヒト、マウス、ウシ、およびイヌネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のある領域（それぞれ、位置２４１−４５５、２２５−４５５および２０７−４５５、ならびにネイティブ完全長）の間に不変アミノ酸を含むコンセンサス配列を表す。配列番号２５、２６、２７、または２８は、ヒト、マウス、ウシ、イヌ、およびウマネイティブＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のある領域（それぞれ、位置２４１−４５５、２２５−４５５および２０７−４５５、ならびにネイティブ完全長）の間において不変アミノ酸を含むコンセンサス配列を表す。したがって、ある実施態様において、本発明の軟骨形成ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、配列番号１、２、３、４、２５、２６、２７、または２８を含む。ある実施態様において、本発明の軟骨形成ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれかと（配列番号の長に渡って測定して）実質的に同一であるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、軟骨形成活性を有する。本明細書において定義されるように、軟骨形成または軟骨形成活性は、ＭＳＣｓからの軟骨細胞の成長に言及する。軟骨形成活性の指標は、軟骨マトリックス産生を含むがこれらに限定されない。軟骨マトリックス産生は、様々なマーカー、例えば、Ｓｏｘ９、ＩＩ型コラーゲン、またはグルコサミノグルカン（ＧＡＧ）産生によって測定してもよい。ある実施態様において、ＧＡＧ産生は、軟骨マトリックス産生のためのマーカーとして測定される。ある実施態様において、軟骨特異的タンパク質発現でのＧＡＧ産生の３倍増加は、陽性の軟骨マトリックス産生を示す。
【００４９】
ある実施態様において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然にコードされるアミノ酸を含むであろう。非天然に生じるアミノ酸を作製しタンパク質に導入する方法は、知られている。例えば、米国特許第７，０８３，９７０、および７，５２４，６４７を参照のこと。１または複数の所望の非天然アミノ酸を含むタンパク質の作製に適した直交翻訳システムの作成のための一般的な原理は、直交翻訳システムを作成するための一般的な方法として、本技術分野において知られている。例えば、“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ；”と題された国際公開公報ＷＯ２００２／０８６０７５、“ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ；”と題されたＷＯ２００２／０８５９２３、“ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ；”と題されたＷＯ２００４／０９４５９３、“ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ”と題され、２００４年７月７日出願のＷＯ２００５／０１９４１５、２００４年７月７日出願のＷＯ２００５／００７８７０、２００４年７月７日出願のＷＯ２００５／００７６２４、２００５年１０月２７日出願のＷＯ２００６／１１０１８２、および“ＳＹＳＴＥＭＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＩＮ  ＥＵＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＨＯＳＴ  ＣＥＬＬＳ”と題され２００７年３月７日出願のＷＯ２００７／１０３４９０を参照のこと。これらのそれぞれの内容は、参照によって全体が組み込まれる。非天然アミノ酸を組み込む直交翻訳システム、およびその産生および使用の方法の議論のためには、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ．”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  ４４：３４−６６；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２２７−２３８；Ｘｉｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００５）“Ａｄｄｉｎｇ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．”Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：５４８−５５４；およびＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ，（２００６）“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ３５：２２５−２４９；Ｄｅｉｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ，（２００５）“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｋｙｎｅ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５：１５２１−１５２４；Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２）“Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ−Ａｚｉｄｏ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．”Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２４：９０２６−９０２７；および２００５年９月２０日出願の国際公開公報ＷＯ２００６／０３４３３２も参照のこと。これらのそれぞれの内容は、参照によって全体が組み込まれる。さらなる詳細は、米国特許第７，０４５，３３７；第７，０８３，９７０；第７，２３８，５１０；第７，１２９，３３３；第７，２６２，０４０；第７，１８３，０８２；第７，１９９，２２２；および第７，２１７，８０９に見出される。
【００５０】
「非天然にコードされるアミノ酸」は、共通アミノ酸の１つではないアミノ酸またはピロールリジンもしくはセレノシステインに言及する。用語「非天然にコードされるアミノ酸」と同意語として用いられる他の用語は、「非天然アミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「非天然に生じるアミノ酸」、および様々にハイフンで結んだ、およびハイフンで結んでいないそれらのバージョンである。用語「非天然にコードされるアミノ酸」は、天然にコードされるアミノ酸（２０の共通アミノ酸、またはピロールリジンおよびセレノシステインを含むがこれらに限定されない）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体増殖しているポリペプチド鎖には翻訳複合体によって天然に組み込まれないアミノ酸も含むがそれらに限定されない。このような非天然に生じるアミノ酸の例は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン、およびＯ−フォスフォチロシンを含むがこれらに限定されない。
【００５１】
非天然にコードされるアミノ酸は、典型的には２０の天然アミノ酸において用いられるものとは別の任意の置換側鎖を有する任意の構造である。本発明の非天然にコードされるアミノ酸は、典型的には、天然アミノ酸とは側鎖の構造の点でのみ異なるので、非天然にコードされるアミノ酸は、天然にまたは非天然にコードされるものを非限定的に含む他のアミノ酸と、天然に生じるポリペプチドにおいて形成されるのと同一の様式でアミド結合を形成する。しかしながら、非天然にコードされるアミノ酸は、天然アミノ酸からそれらを区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、任意的にアルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ホウ酸塩、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基、もしくは同様のもの、またはその任意の組み合わせを含む。本発明における使用に適しうる他の非天然に生じる目的のアミノ酸は、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属−含有アミノ酸、放射性活性アミノ酸、新規の官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージされたおよび／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似物を含むアミノ酸、糖置換セリンなどのグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト−含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に開裂可能なおよび／または光開裂可能なアミノ酸、約５を超えるまたは約１０を超える炭素を非限定的に含むポリエーテルまたは長鎖炭化水素を非限定的に含む天然アミノ酸と比較して伸張した側鎖を持つアミノ酸、炭素接続糖類含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、および１または複数の毒性部分を含むアミノ酸を含むがそれらに限定されない。
【００５２】
本発明における使用に適し得て、水溶性ポリマーとの反応に有用な非天然にコードされるアミノ酸は、例えば、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジドおよびアルキン反応基を有するものを含むがこれらに限定されない。ある実施態様において、非天然にコードされるアミノ酸は、サッカリド部分を含む。このようなアミノ酸の例は、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギンおよびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンを含む。このようなアミノ酸の例は、天然に生じるアミノ酸とサッカリドとの間のＮ−またはＯ−結合が、天然には一般には見出されない共有結合（アルケン、オキシム、チオエーテル、アミド、および同等物を含むがこれらに限定されない）に交換されている例も含む。このようなアミノ酸の例は、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトース、および同等物などの天然に生じるタンパク質において一般的には見出されないサッカリドも含む。
【００５３】
例えば、インビボ半減期を伸張するために、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に（例えば、ポリペプチド鎖内において、または、Ｎ−もしくはＣ末端のいずれかにおいて）導入できる別の型の修飾は、ＰＥＧ化または長鎖ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）の組み込みである。ＰＥＧまたはＰＥＧの長鎖ポリマーの導入は、例えば、尿への急速ろ過を予防するために、本発明のポリペプチドの有効分子量を増大させる。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ３配列におけるリジン残基は、ＰＥＧに直接的にまたはリンカーを通して、接合される。このようなリンカーは、例えば、適切に修飾されたＰＥＧ鎖への結合のためのチオール官能基を含有するＧｌｕ残基またはアシル残基であることができる。ＰＥＧ鎖を導入するための別の方法は、まずＣ−末端に、または溶媒露出残基に、ＡｒｇまたはＬｙｓ残基の代用などのＣｙｓ残基を導入する。このＣｙｓ残基は、次に、例えば、マレイミド機能を含有するＰＥＧ鎖に部位特異的に付着させられる。ＰＥＧまたはＰＥＧの長鎖ポリマーを組み込むための方法は、本技術分野においてよく知られており（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ  １０：１４５１−８（２００５）；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，Ｒ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：２１７−５０（２００３）；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５４：４５９−７６（２００２）などに説明されている）、その内容は参照によって本明細書に包含される。本技術分野において知られているポリマー接合の別の方法も、本発明において使用することができる。ある実施態様において、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）が、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質へのポリマー接合として導入される（例えば、ＷＯ２００８／０９８９３０；Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．，１９：２１４４−５５（２００８）を参照のこと）。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質と接合したホスホリルコリン−含有ポリマーが、本発明において使用することができる。当業者は、別の生体適合性ポリマー接合を利用することができることを容易に認識するであろう。
【００５４】
（上記などの）非天然アミノ酸の組み込みを通してＰＥＧまたはＰＥＧポリマーを組み込むためのより最近に報告された改変ネイティブアプローチは、本発明のポリペプチドで実行することができる。このアプローチは、進化したｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンテターゼペアを利用し、アンバーサプレッサーコドンによる発現プラスミドにおいてコードされる（Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｂｉｏ−ｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４，５７４３−５）。例えば、ｐ−アジドフェニルアラニンは、本発明のポリペプチドに組み込まれ、そして、還元剤および銅イオンの存在下で、アセチレン部分を有するＰＥＧポリマーとの反応に供され、「ヒュスゲン［３＋２］付加環化」として知られる有機反応を促進させることができる。
【００５５】
ある実施態様において、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を改変するためのＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の特異的な変異を想定する。このような変異は、Ｏ−連結またはＮ−連結グリコシル化部位を含むがそれらに限定されない１または複数のグリコシル化部位を導入または除去するように選択されることができる。ある実施態様において、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、天然に生じるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質と比較して非改変であるグリコシル化部位およびパターンを有する。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の変異体は、グリコシル化部位の数および／またはタイプが、天然に生じるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質と比較して改変されたグリコシル化変異体を含む。ある実施態様において、ポリペプチドの変異体は、ネイティブのポリペプチドと比較して数が多いまたは少ないＮ−連結グリコシル化部位を含む。Ｎ−連結グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと指定されたアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であってよい。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−連結炭水化物鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。また、この配列を除去する置換は、存在するＮ−連結炭水化物鎖を除去するであろう。ある実施態様において、Ｎ−連結炭水化物鎖の再配列が、提供され、ここで、１または複数のＮ−連結グリコシル化部位（典型的には天然に生じるもの）が除去され、そして、１または複数の新しいＮ−連結部位が作製される。
【００５６】
ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質変異体の例は、天然に生じるＡＮＧＰＴＬ３タンパク質のアミノ酸配列と比較して１または複数のシステイン残基が欠失して別のアミノ酸（例えば、、セリン）に置換されたシステイン変異体を含む。ある実施態様において、不溶性封入体の単離後など、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が、生物学的に活性なコンフォーメーションにリフォールドされなければならない場合には、システイン変異体は、有用でありうる。ある実施態様において、システイン変異体は、ネイティブのポリペプチドと比較して少ない数のシステイン残基を有する。ある実施態様において、システイン変異体は、非ペアシステインにからもたらされる相互作用を最小化するために、偶数のシステイン残基を有する。
【００５７】
ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の機能的変異体または修飾されたフォームは、本発明のＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の融合タンパク質および１または複数の融合ドメインを含む。融合ドメインのよく知られた例は、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンを含むがこれらに限定されない。融合ドメインは、所望の特性を授与するために選択することができる。例えば、ある融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィによって融合タンパク質を単離するために特に有用である。親和性精製の目的のために、グルタチオン−、アミラーゼ−、およびニッケル−またはコバルト−接合樹脂などのアフィニティクロマトグラフィのための関連するマトリックスが使用される。このようなマトリックスの多くは、（ＨＩＳ６）融合パートナーに有用なＰｈａｒｍａｃｉａ  ＧＳＴ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、およびＱＬＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）などの「キット」の形で入手することができる。別の例として、融合ドメインは、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の検出を促進するように選択されうる。このような検出ドメインの例は、様々な蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）、ならびに通常は短いペプチド配列でありそれに対する特異的な抗体を入手することができる「エピトープタグ」を含む。特異的なモノクローナル抗体を容易に入手することができ、よく知られているエピトープタグは、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス血球凝集（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグを含む。ある場合において、融合ドメインは、関連するプロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それによってそれからの組換えタンパク質を遊離させるのを可能にする、Ｘａ因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ開裂部位を有する。そして、遊離されたタンパク質は、続いて行われるクロマトグラフィ分離によって融合ドメインから単離することができる。ある実施態様において、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、インビボでＡＮＧＰＴＬ３タンパク質を安定化するドメイン（「安定用」ドメイン）と融合している。「安定化」は、血清半減期を上昇させるあらゆることを意味し、これが破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態効果によるかどうかは関係ない。免疫グロブリンのＦｃ部分との融合は、幅広いタンパク質に所望の薬物動態特性を授与することが知られている。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合は、所望の特性を授与することができる。選択されうる別のタイプの融合ドメインは、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメイン、および（所望の付加的な生物学的機能を授与する）機能的ドメインを含む。
ＩＩＩ．アンジオポイエチン様３タンパク質疾患指標
【００５８】
本発明のポリペプチド、組成物、および方法が、任意のタイプの関節炎または関節損傷の処置または予防のために使用されてもよいことが想定される。本発明のポリペプチド、組成物、および方法は、様々な軟骨性障害の処置または予防に使用されてもよいことがさらに想定される。ある実施態様において、本発明のタンパク質は、例えば、関節炎または関節損傷の遺伝的または家族歴がある、または以前に関節手術がある、もしくは関節手術の最中であるなどの、関節炎または関節損傷を予防するために投与される。本発明のポリペプチド、組成物、および方法で処置されるべきまたは予防されるべき病状または障害の例は、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、骨関節炎、変性椎間板疾患、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、免疫介在性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、幼若リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫介在性腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、多発性硬化、特発性脱髄性多発神経障害またはギラン−バール症候群、および慢性炎症性脱髄性多発神経障害などの中枢および末梢神経系の脱髄疾患、伝染性肝炎（肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、および他の非肝炎ウイルス）などの肝胆道疾患、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、および硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎：クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、およびウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫または免疫介在性皮膚疾患、多形紅斑、および接触皮膚炎、乾癬、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、および、じんましん、などのアレルギー疾患、好酸球性肺炎、特発性肺線維症、および過敏性肺炎などの肺の免疫学的疾患、移植片拒絶および移植片対宿主病を含む移植関連疾患を含むがそれらに限定されない。本発明のある実施態様において、本発明のポリペプチド、組成物、および方法は、骨関節炎の処置のために使用されうる。
【００５９】
ある実施態様において、本発明のポリペプチド、組成物、および方法は、外傷的損傷または軟骨疾患に起因して損傷した軟骨性組織における軟骨細胞増殖および軟骨産生を刺激するための方法を提供する。脊椎、肩、肘、手首、指の関節、尻、膝、足首、および足の関節などの関節表面を示す組織は、処置にとって特に重要である。処置の恩恵を受けうる疾患の例は、骨関節炎、リウマチ性関節炎、他の自己免疫疾患、または離断性骨軟骨症を含む。さらに、軟骨奇形が、ヒトにおいて小人症の形態でしばしば見られ、このことは、該ポリペプチド、組成物、および方法が、これらの患者において有用であろうことを示唆する。
【００６０】
本発明のポリペプチド、組成物、および方法が、哺乳動物の処置のために有用であることが想定される。本明細書においては、「哺乳動物」は、ヒト、牛（例えば、雌牛）、馬、イヌ、羊、豚、ウサギ、ヤギ、ネコなどの家畜および家畜動物、ならびに動物園の動物スポーツ動物またはペット動物を含む、哺乳動物として分類される任意の哺乳動物を意味する。本発明のある実施態様において、哺乳動物はヒトである。
【００６１】
ある実施態様において、本発明のポリペプチドは、処置されるべき哺乳動物とは異種であることができる。例えば、ウシＡＮＧＰＴＬ３タンパク質またはその断片、ウシＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に由来するタンパク質またはペプチド（例えば、修飾されたウシＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ウシＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の保存的変異体、ウシＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に由来するペプチド模倣物）が、ヒト患者の処置において使用される。ある実施態様において、異種ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質が、移植のための培養の軟骨細胞集団を拡張するために使用することができる。ある実施態様において、拡張した培養は、次に、処置されるべき哺乳動物にホモロジーがあるポリペプチドおよび組成物と混ぜ合わせられ、関節腔に、または、軟骨欠損に直接に、入れられる。また、本発明のポリペプチドは、同一の種に由来する。すなわち、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質またはその断片、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に由来するタンパク質またはペプチド（例えば、修飾されたヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質の保存的変異体、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質に由来するペプチド模倣物）が、ヒト患者の処置において使用される。処置されつつある哺乳動物の同一種に由来するタンパク質の使用によって、不用意な免疫応答を避けてもよい。
【００６２】
本発明のポリペプチドおよび組成物は、単独で、またはタンパク質の持続放出に適した担体との複合体で、関節の滑液への直接注射、全身性投与（経口または静脈内）、または軟骨欠損への直接投与によって適用することができる。本発明のポリペプチド、組成物、および方法は、自家または同種軟骨細胞移植のための培養における軟骨細胞集団を拡張するために使用することができる。該移植は、本発明のポリペプチドおよび組成物の投与からなる併用療法で任意的に投与することができる。これらの手順において、例えば、軟骨細胞は、損傷した関節の非損傷小耐力領域から関節鏡視下的に収集することができ、本発明のポリペプチドおよび組成物の存在下で、培養し、移植に先立ち、細胞の数を増加させることができる。拡張した培養は、続いて、本発明のポリペプチドおよび組成物と混ぜ合わされ、関節腔に、または欠損に直接に、入れられる。本発明のポリペプチドおよび組成物は、軟骨を形成することができる、および／または移植された軟骨細胞またはその前駆細胞を適所に保つのに役立つ、細胞を含む骨膜または軟骨膜移植片と組み合わせて使用することができる。本発明のポリペプチドおよび組成物は、関節の洗浄、骨髄の刺激、掻爬関節形成、骨軟骨病変ドリリング、または軟骨下骨の微小破壊と併用して、軟骨損傷の修復のために使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドおよび組成物の投与に起因する軟骨の増殖の後、新たに形成された軟骨表面を適切に形成させるには、さらなる外科処置が必要であるかもしれない。
ＩＶ．医薬組成物
【００６３】
上記の疾患または障害を処置するための本発明の化合物の投与量は、投与の様式、対象者の年齢、体重、および処置されるべき対象者の病状に応じて異なり、最終的には、主治医または主治獣医によって決定されるであろう。主治医または主治獣医によってこのように決定される化合物の量は、本明細書において「有効量」と呼ばれる。
【００６４】
投与に適した剤形は、賦形剤を含み、水性および非水性溶液；酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、およびその剤形を等張にする溶質を含むことができる等張滅菌溶液；懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁液を含むがこれらに限定されない。
【００６５】
本発明の文脈において、患者に投与される投与量は、時間とともに対象者における有益な応答をもたらすために十分であるべきである。投与量は、用いられる特定のタンパク質の効能、および対象者の病状、ならびに、体重または処置されるべき領域の表面領域によって決定されるであろう。投与量の多さは、特定の対象者における特定のタンパク質またはベクターの投与に伴う副作用の存在、性質、および程度によっても決定されるであろう。投与は、単一の投与量によって、または分けた投与量によって達成することができる。
Ｖ．投与の方法
【００６６】
本発明のタンパク質を罹患した関節に輸送するためには、任意の方法を用いることができる。本発明の実施において、組成物は、例えば、関節内に（すなわち、関節へ）、経口的に、静脈内に投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルなどのユニット投与量または多投与量密封容器において存在することができる。溶液および懸濁液は、前記の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。本発明のタンパク質は、所望の治療または効果に応じて、１または複数のさらなる活性剤（例えば、、ヒアルロン酸またはその塩）と組み合わせて効率的に使用することもできる。
【実施例】
【００６７】
次の実施例は、請求項の発明を説明するために提供されるものであって、これを限定するためのものではない。
実施例１  軟骨形成の誘導剤のハイスループットスクリーン
【００６８】
ＯＡ関節修復のための新しい非侵襲戦略を同定し明らかにするために、我々は、ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）の軟骨細胞への分化を選択的に指示することができるタンパク質の非偏向ハイスループットスクリーンを開発した。このアッセイシステムは、軟骨における在住ＭＳＣをモデルとし、天然修復能力を刺激し、統合した軟骨再生を増進するメディエーターを同定する。我々は、ハイスループットによって固有の分泌タンパク質ライブラリーを試験するために、ヒトおよびマウスＭＳＣｓの細胞ベースのスクリーンを選んだ。このアプローチは、軟骨形成に影響を与える非同定およびネイティブタンパク質リガンドの迅速な同定を可能にする戦略を提供する。
【００６９】
これらの分泌タンパク質を研究するために、哺乳動物産生細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ）からの調整培地（ＣＭ）の産生、およびフリースタイルＨＥＫ−Ｆ細胞からの精製タンパク質の産出の２つのアプローチがとられた。これらの補完的アプローチは、組み合わさって、様々な適用において新規の標的同定を可能にする。
【００７０】
ＭＳＣアッセイにおけるタンパク質のスクリーニングによって、有力候補であるアンジオポイエチン−様３、略称ＡＮＧＰＴＬ３が同定された。ＡＮＧＰＴＬ３は、ＣＭおよび精製タンパク質の両方の２つの並行直交初期スクリーンで同定された。コンセプトＣＭスクリーンの証拠で、ＣＭの移動の後、Ｃ３Ｈ１０ｔｌ／２細胞を７日間インキュベートした。軟骨マトリックス産生を検出するためにアルシアンブルー染色によってアッセイし、軟骨形成は、ＡＮＧＰＴＬ３−７５含有ウェルにおいて起こることが見出された。ＡＮＧＰＴＬ３−７５は、ヒトＭＳＣｓの軟骨分化のための５３１の精製タンパク質のスクリーニングによって独立に同定された。
【００７１】
初期スクリーニングアッセイの後、続いて、ＡＮＧＰＴＬ３を、６つの第２アッセイにおいて特徴付けた。これらアッセイは、
（１）マウス間葉Ｃ３Ｈ１０ｔｌ／２細胞の単層培養：ＩＩ型コラーゲンおよびＳｏｘ９タンパク質発現（軟骨形成のマーカー）を誘導するが、オステオカルシン（骨発生のマーカー）の誘導はない；
（２）ウシ軟骨細胞におけるＴＮＦα／オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）−誘導酸化窒素（ＮＯ）放出の阻害；
（３）ウシ軟骨器官培養におけるＴＮＦα／ＯＳＭ−誘導グルコサミノグルカン（ＧＡＧ）放出の阻害；
（４）ヒトＭＳＣペレット培養システムにおける軟骨マトリックス遺伝子発現（アグレカン）の誘導；
（５）初期ヒト軟骨細胞、ヒト滑膜線維芽細胞、およびヒトＭＳＣｓにおける毒性の欠如；
（６）ヒト軟骨細胞の増殖の刺激、
を含む。
【００７２】
そのヒトホモログは、他の既知の軟骨形成の誘導剤と比較して、定量的イメージベースのＩＩ型コラーゲンアッセイにおいて軟骨形成のための類似の効能を保持するけれども、マウスＡＮＧＰＴＬ３タンパク質は、マウス、ヒトおよびウシ細胞タイプにおいて機能するので、さらなる特徴づけのために、潜在的に軟骨形成分化を誘導したとして（０．５−５ｎＭ）選択された（図１）。マウスおよびヒトＭＳＣの両方が、（それぞれ）単分子層およびペレット培養で、０．５−５ｎＭ  ＡＮＧＰＴＬ３で処置されて１８〜２１日間分化させられ、３つの軟骨特異的タンパク質：ＩＩ型コラーゲン、Ｓｏｘ９およびアグレカンを発現する。これは、免疫組織化学染色およびＴａｑｍａｎによるｍＲＮＡ定量化（図２Ａ）の両方によってアッセイされた。さらに、データは、マウスＭＳＣｓを１８日間培養後、アルカリフォスファターゼの発現の減少を通し、ＡＮＧＰＴＬ３が、線維性修復応答に向けた自発傾向を阻害することを示唆する。組織損傷を予防する潜在的能力を評価するために、ウシ軟骨器官培養を、ＴＮＦαおよびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）で刺激した。マトリックス変性の指標である刺激されたグルコサミノグルカン放出は、ＡＮＧＰＴＬ３での処置によって有意に阻害された（図２Ｂ）。さらに、初期ヒト軟骨細胞の処置によって、２４時間内において細胞増殖において２倍の増加がもたらされたのに対し、ヒト滑膜細胞ではそうではなかったが（図２Ｃ）、このことは、軟骨に対するその作用の特異性を示唆する。そのタンパク質は、また、初期ヒト軟骨細胞、滑膜線維芽細胞およびＭＳＣｓの生存能力に対して、明白なインビトロ毒性効果を持たなかった（＜１００μＭ）（データは示さず）。
【００７３】
目下の臨床試験での２つの候補間の直接的な比較において、１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１８または１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７の処置が、軟骨形成小節を誘導することができたが、全般的なマトリックス産生は、ＡＮＧＰＴＬ３と比較して、少なかった。ＦＧＦ１８は、アルシアンブルー、Ｓｏｘ９またはＩＩ型コラーゲン染色を増加させる能力に欠けており、このことは、本物の軟骨基質の特異性を欠くことを示す。１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７が、アルシアンブルー、Ｓｏｘ９およびＩＩ型コラーゲン染色を増加させたが、有意性は、類似濃度では、それほど高くなかった。
実施例２：組換え完全長ＡＮＧＰＴＬ３および変異タンパク質の発現、ならびに機能分析
【００７４】
マウスＡＮＧＰＴＬ３は、５１ｋＤａタンパク質であると予測される。これは、アンジオポイエチンに類似した構造を有するが、Ｔｉｅ２受容体に結合する能力を欠き、区別される機能を有する、７つの同定されたアンジオポイエチン−様（ＡＮＧＰＴＬ）タンパク質のファミリーに属する。それらは、Ｎ−末端コイルドコイルドメイン（ＣＣＤ）およびＣ末端フィブリノゲン−様ドメイン（ＦＬＤ）を含む。ＡＮＧＰＴＬタンパク質は、その微環境、および、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）との相互作用によって密接に制御されるが、その正確な相互作用部位も、パートナーも、詳細には解明されてこなかった。ＡＮＧＰＴＬ３は、肝臓によって分泌され、全身に循環する。ＬＸＲ−誘導高トリグリセリド血が、ＡＮＧＰＴＬ３放出に起因することを証拠として、これは、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）を通して制御される。推定ヘパリン結合モチーフを通したＣＣＤおよびＥＣＭの間の相互作用は、ＡＮＧＰＴＬ４について報告されるのと似たように、前駆タンパク質転換酵素認識配列（Ｒ２２１−Ｒ２２４）における開裂の阻害をもたらすかもしれない。開裂は、リポタンパク質リパーゼ活性（ＬＰＬ）を阻害するＣＣＤの能力の有意な増加をもたらし、それによって、トリグリセリド血（ＴＧ）の増加をもたらす。これは、本発明に先立ち同定されたＡＮＧＰＴＬ３の主要な生物学的機能を表す。Ｃ末端ＦＬＤは、内皮細胞接着を誘導し、インビボでのラット角膜直接移植後、血管形成媒介するのに十分である。組換えＡＮＧＰＴＬ３は、精製αＶβ３インテグリンに結合することができ、内皮細胞におけるＦＡＫ、ＭＡＰＫおよびＡＫＴシグナル伝達の増加を引き起こすことも実証された。これらのデータは、ＦＬＤのインテグリンとの相互作用が、血管形成を媒介することを示唆する。
【００７５】
ＡＮＧＰＴＬ３の発現は、報告されてこなかったし、ヒト軟骨細胞、ｈＭＳＣまたはヒト滑膜線維芽細胞におけるウェスタンブロッティングを用いる我々の研究でも観察されてこなかったし、その発現は、マウス膝関節において見出されなかった。さらに、我々のスクリーンで同定されたこの新規の軟骨形成機能に関する、関節細胞におけるいずれかの断片についての活性も報告されていない。
【００７６】
我々のデータは、完全長ＡＮＧＰＴＬ３が軟骨形成および軟骨保護のための新規メディエーターであることを示す。我々は、ＡＮＧＰＴＬ３のどのドメインが、この新規軟骨形成機能に決定的かを調べた。詳細な生物物理的特性決定のために、ＡＮＧＰＴＬ３のトランケーション系および完全長タンパク質を、限定的で均一なグリコシル化を与える改変ＨＥＫ−Ｓ細胞株において発現させ、精製した。質量分光学アプローチによって、すべての４つの予測されたＮ−連結グリコシル化（Ｎ１１５、Ｎ２３２、Ｎ２９６、およびＮ３５７、図３Ａ）の場所が確認された。ＨＥＫ内因的にプロセスされた断片から、ＣＣＤおよびＦＬＤドメインの間のタンパク質分解開裂部位がＲ２２４であると測定された。完全長ＡＮＧＰＴＬ３は、質量＞４００ｋＤａでのサイズ排除クロマトグラフィによって溶出し、このことは、異種グリコシル化での三量体を示す。サイズ排除および静的光散乱法によって単量体であることが示されるＦＬＤ（２４１−４５５）を結晶化した。ＦＬＤの原子構造を、１．８オングストローム解像度で測定した。ＦＬＤ構造は、Ｃ−末端に向けて３つのループを向けるらせん伸長を持つコアベータシート形態を明らかにし、これは、他のＦＬＤホモログの典型である（図３Ｂ）。ドメインのＣ末端部分における温度要因は、残りの構造よりも高く、このことは、この領域における高度の柔軟性を示唆する。ＡＮＧＰＴＬ２／Ｔｉｅ２構造（ＰＤＢコード：２ＧＹ７）との重ね合わせは、ＦＬＤのＣ末端部分が、タンパク質タンパク質相互作用に関与するかもしれないことを示唆する。
【００７７】
産生された５つのトランケーション生成物を、複数の軟骨形成アッセイで評価した。結果は、ＣＣＤ単独では活性保持がないが、ＦＬＤでは活性が維持することを示唆する。さらに、ＳＭＡＤｌリン酸化は、完全長または変異ＧまたはＨ単独での３日間の刺激に応じて増加し、このことは、軟骨形成シグナル伝達カスケードの活性化を示唆する。
【００７８】
関節内に注射されたタンパク質の全身性暴露は、滑液リンパ排出のために限られているけれども、全身性暴露を最小化することが、時には望ましい。全身性暴露がある場合には、ＡＮＧＰＴＬ３の開裂は、ＣＣＤドメインの放出を引き起こすかもしれない。ＣＣＤによるＬＰＬ活性の阻害の増加は、患者のＴＧレベルの改変をもたらしうる。我々の結果は、ＡＮＧＰＴＬ３の潜在的な臨床的利点を示す。たとえば、ＡＮＧＰＴＬ３における軟骨形成活性が位置する場所の切除によって、我々は、脂質代謝または血管形成特性に対する望まない全身性効果を最小化または排除するであろう。軟骨形成活性は、主としてＣ末端に位置し、そのため、このドメインの特異的使用は、完全長分子またはＮ末端のＴＧ制御の懸念を軽減するであろう。完全長ＡＮＧＰＴＬ３は、通常、血清において存在するので、予想される免疫原性はない。Ｃ末端を使用するさらなる利点は、それは、開裂し、かつ三量体の完全長タンパク質と比較して単量体（〜２９ｋＤａ）であり、そのため、循環において存在するかもしれない任意の小パーセンテージの全身性半減期を減少させ、血管形成からの任意の潜在的な効果を制限するであろうことである。
実施例３：ＡＮＧＰＴＬ３のインビボ分析
【００７９】
我々は、潜在的な有害減少および関節内滞留に対処するために、完全長ＡＮＧＰＴＬ３のいくつかのインビボ評価を行った。８週齢Ｃ５７ＢＬ／１０マウスの左膝関節に３．６μｇの完全長ＡＮＧＰＴＬ３で関節内（ＩＡ）注射した後、我々は、２４時間の暴露の存在下および非存在下での発現を免疫組織化学的に評価した。滑液リンパ管へのトランス滑液流によるタンパク質および水にとっての典型的なターンオーバーが約２時間であるので、２４時間まで、検出できるレベルのＡＮＧＰＴＬ３は、わずかしか滑液に留まらない、または滑液に留まらないはずである。結果は、非処置関節におけるＡＮＧＰＴＬ３の内因性発現がないが、関節軟骨および半月板において、２４時間の時点でさえ細胞周囲マトリックスのタンパク質が有意に検出されることを明らかにした。さらに、細胞毒性の軟骨細胞への広がりや、インビボでの軟骨損傷は、検出されなかった。一連のラットの膝関節への３ＩＡ注射（１週間に１回を３週間）の後、臨床的には、毒性はなかった（関節膨潤も、歩き方の変化もなかった）し、ラットの関節における急性炎症反応の証拠となるものもなかった。組織学的には、滑膜炎の増加や、注射された５つのラットの関節における無制御的な増殖はなかった。マウスでのように、ＡＮＧＰＴＬ３は、軟骨マトリックスおよび周囲の軟骨細胞において検出され得た。これらの結果は、ＡＮＧＰＴＬ３は、軟骨自体に対する望ましくない効果を引き起こさず、そして、ＡＮＧＰＴＬ３は、インビボで軟骨および半月板に入り保持されることを示す。
【００８０】
ＯＡは、単一疾患実体ではなく、様々な病院的因子の帰結でありうる。ヒトにおいて、それは、しばしば、異常な生物力学的ストレスまたは遺伝的に獲得された関節軟骨または骨の異常性によって引き起こされる。したがって、「最善の」小動物ＯＡモデルを選択することは、困難であり、複数のモデルが、任意の治療の保護特性を測定するために、探索されるべきである。我々は、慢性ＯＡモデル（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒａａｎおよび同僚らによって説明された研究に基づきコラーゲナーゼＶＩＩ誘導）およびＧｌａｓｓｏｎらの仕事に基づき関節における３つの主要な靱帯（ＡＣＬ、ＭＣＬおよびＭＭＴＬ）の横断面を使う急性外科モデルの効能研究を完成させた。両方のモデルは、ＯＡに共通に関係する病理的変化誘導した。プロテオグリカン染色の喪失、軟骨および骨の浸食、骨棘形成ならびに滑膜および靱帯の化生性変化が、ＯＡの注射の４〜８週間後にはっきりと分かりうる。図５は、ＯＡのＡＮＧＰＴＬ３外科モデルの再生能力を表す。ＯＡについて潜在的バイオマーカーの検証を始めるため、外科モデルの間で末梢血を回収して、軟骨損傷ゆえに放出されたＩＩ型コラーゲン断片を測定した（図５Ａ）。組織学的分析および、それに続く中間脛骨プラトーの等級付けは、２００ｎｇ  ＡＮＧＴＰＬ３／膝の１週間に１回３週間での処置後の軟骨マトリックスにおける再生を明らかにした（図５Ｂ）。
【００８１】
８週間外科ＯＡマウスのサブセットにおいて、３投与量のＡＮＧＰＴＬ３が、インキャパシタンス測定を通したＯＡ−誘導痛を軽減するかどうかについて調べられた。この方法は、外科手術および非外科手術肢の間の重量配分を測定する。外科手術の後３６日目に、および、ＰＲＯｌでの処置３週間ごとに、１００ｎｇ／膝もの低さの投与が、ビヒクル処置外科手術膝と比較した有意な向上を実証した（図５Ｃ）。これらの組み合わせたデータは、ＡＮＧＴＰＬ３が、２つのＯＡモデル（病理的修正および痛み縮小の両方）においてインビボ効能を有することの具体的な証拠を提供し、新規のＯＡ治療としてのその発達の進歩を裏付ける。
【００８２】
本明細書に記載された実施例および実施態様は、例示のためだけのものであり、それらを考慮した様々な修飾または変化が本技術分野における当業者によって示唆されるであろうし、それらは、本出願、および添付の請求項の範囲の精神および範囲内に含まれると理解される。本明細書において引用された全ての公開、特許、および特許出願は、あらゆる目的でその全体が、参照によって本明細書に包含される。
【００８３】
配列表
Ｘ  ＝  任意のアミノ酸
丸括弧中のアミノ酸は、アミノ酸があってもなくてもよいことをを示す。
【００８４】
配列番号：１
２４１−４５５  コンセンサス  
ＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＴＬＩＱＨＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＥＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＱＳＮＹＸＬＲＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＹＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＰＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ
【００８５】
配列番号：２  
２２５−４５５  コンセンサス  
ＴＴＰＸＸＸＸＮＥＸＸＮＸＸＸＸＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＴＬＩＱＨＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＥＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＱＳＮＹＸＬＲＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＹＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＰＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ
【００８６】
配列番号：３  
２０７−４５５  コンセンサス  
ＸＩＸＥＸＸＥＸＳＬＳＳＫＸＲＡＰＲＴＴＰＸＸＸＸＮＥＸＸＮＸＸＸＸＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＴＬＩＱＨＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＥＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＱＳＮＹＸＬＲＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＹＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＰＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ  
【００８７】
配列番号：４  
完全長コンセンサス  
ＭＸＴＩＫＬＸＬＸＸＸＰＬＶＩＸＳＸＸＤＸＤＸＸＳＸＤＳＸＸＸＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＤＬＳＬＸＴＸＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＸＴＸＸＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＸＥＬＸＳＫＸＥＳＬＬＥＥＫＸＸＬＱＸＫＶＸＸＬＥＸＱＬＴＸＬＩＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＥＶＴＳＬＫＸＸＶＥＸＱＤＮＳＩＸＸＬＬＱＸＶＥＸＱＹＸＱＬＸＱＱＸＸＱＩＫＥＩＥＸＱＬＲ（Ｘ）ＸＸＩＸＥＸＸＥＸＳＬＳＳＫＸＲＡＰＲＴＴＰＸＸＸＸＮＥＸＸＮＸＸＸＸＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＴＬＩＱＨＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＥＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＱＳＮＹＸＬＲＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＹＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＰＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ（ＳＥＸＸＥ）
【００８８】
配列番号：５  
ヒトＡＮＧＰＴＬ３  ２４１−４５５  
ＧＩＰＡＥＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＭＹＡＩＲＰＳＮＳＱＶＦＨＶＹＣＤＶＩＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＶＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＹＩＥＹＳＦＹＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＡＩＴＧＮＶＰＮＡＩＰＥＮＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＧＹＳＧＧＷＷＷＨＤＥＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＡＫＳＫＰＥＲＲＲＧＬＳＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＴＤ
【００８９】
配列番号：６  
ヒトＡＮＧＰＴＬ３  ２２５−４５５  
ＴＴＰＦＬＱＬＮＥＩＲＮＶＫＨＤＧＩＰＡＥＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＭＹＡＩＲＰＳＮＳＱＶＦＨＶＹＣＤＶＩＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＶＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＹＩＥＹＳＦＹＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＡＩＴＧＮＶＰＮＡＩＰＥＮＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＧＹＳＧＧＷＷＷＨＤＥＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＡＫＳＫＰＥＲＲＲＧＬＳＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＴＤ
【００９０】
配列番号：７  
ヒトＡＮＧＰＴＬ３  ２０７−４５５  
ＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＦＬＱＬＮＥＩＲＮＶＫＨＤＧＩＰＡＥＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＭＹＡＩＲＰＳＮＳＱＶＦＨＶＹＣＤＶＩＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＶＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＹＩＥＹＳＦＹＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＡＩＴＧＮＶＰＮＡＩＰＥＮＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＧＹＳＧＧＷＷＷＨＤＥＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＡＫＳＫＰＥＲＲＲＧＬＳＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＴＤ
【００９１】
配列番号：８  
完全長ヒトＡＮＧＰＴＬ３  ｇｉ｜７６５６８８８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０５５３１０．１｜［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］  
ＭＦＴＩＫＬＬＬＦＩＶＰＬＶＩＳＳＲＩＤＱＤＮＳＳＦＤＳＬＳＰＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＤＬＳＬＱＴＳＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＴＴＹＫＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＬＥＬＮＳＫＬＥＳＬＬＥＥＫＩＬＬＱＱＫＶＫＹＬＥＥＱＬＴＮＬＩＱＮＱＰＥＴＰＥＨＰＥＶＴＳＬＫＴＦＶＥＫＱＤＮＳＩＫＤＬＬＱＴＶＥＤＱＹＫＱＬＮＱＱＨＳＱＩＫＥＩＥＮＱＬＲＲＴＳＩＱＥＰＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＦＬＱＬＮＥＩＲＮＶＫＨＤＧＩＰＡＥＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＭＹＡＩＲＰＳＮＳＱＶＦＨＶＹＣＤＶＩＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＶＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＹＩＥＹＳＦＹＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＡＩＴＧＮＶＰＮＡＩＰＥＮＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＧＹＳＧＧＷＷＷＨＤＥＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＡＫＳＫＰＥＲＲＲＧＬＳＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＴＤＳＥＳＦＥ  
【００９２】
配列番号：９  
マウスＡＮＧＰＴＬ３  ２４１−４５５  
ＤＬＰＡＤＣＳＡＶＹＮＲＧＥＨＴＳＧＶＹＴＩＫＰＲＮＳＱＧＦＮＶＹＣＤＴＱＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＫＤＧＳＱＤＦＮＥＴＷＥＮＹＥＫＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＡＩＶＱＱＳＮＹＩＬＲＬＥＬＱＤＷＫＤＳＫＨＹＶＥＹＳＦＨＬＧＳＨＥＴＮＹＴＬＨＶＡＥＩＡＧＮＩＰＧＡＬＰＥＨＴＤＬＭＦＳＴＷＮＨＲＡＫＧＱＬＹＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＮＤＩＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＴＫＳＲＰＥＲＲＲＧＩＹＷＲＰＱＳＲＫＬＹＡＩＫＳＳＫＭＭＬＱＰＴＴ
【００９３】
配列番号：１０  
マウスＡＮＧＰＴＬ３  ２２５−４５５  
ＴＴＰＰＬＱＬＮＥＴＥＮＴＥＱＤＤＬＰＡＤＣＳＡＶＹＮＲＧＥＨＴＳＧＶＹＴＩＫＰＲＮＳＱＧＦＮＶＹＣＤＴＱＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＫＤＧＳＱＤＦＮＥＴＷＥＮＹＥＫＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＡＩＶＱＱＳＮＹＩＬＲＬＥＬＱＤＷＫＤＳＫＨＹＶＥＹＳＦＨＬＧＳＨＥＴＮＹＴＬＨＶＡＥＩＡＧＮＩＰＧＡＬＰＥＨＴＤＬＭＦＳＴＷＮＨＲＡＫＧＱＬＹＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＮＤＩＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＴＫＳＲＰＥＲＲＲＧＩＹＷＲＰＱＳＲＫＬＹＡＩＫＳＳＫＭＭＬＱＰＴＴ
【００９４】
配列番号：１１  
マウスＡＮＧＰＴＬ３  ２０７−４５５  
ＩＱＥＰＳＥＮＳＬＳＳＫＳＲＡＰＲＴＴＰＰＬＱＬＮＥＴＥＮＴＥＱＤＤＬＰＡＤＣＳＡＶＹＮＲＧＥＨＴＳＧＶＹＴＩＫＰＲＮＳＱＧＦＮＶＹＣＤＴＱＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＫＤＧＳＱＤＦＮＥＴＷＥＮＹＥＫＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＡＩＶＱＱＳＮＹＩＬＲＬＥＬＱＤＷＫＤＳＫＨＹＶＥＹＳＦＨＬＧＳＨＥＴＮＹＴＬＨＶＡＥＩＡＧＮＩＰＧＡＬＰＥＨＴＤＬＭＦＳＴＷＮＨＲＡＫＧＱＬＹＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＮＤＩＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＴＫＳＲＰＥＲＲＲＧＩＹＷＲＰＱＳＲＫＬＹＡＩＫＳＳＫＭＭＬＱＰＴＴ
【００９５】
配列番号：１２  
完全長マウスＡＮＧＰＴＬ３  ｇｉ｜３３４６９１１７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０３８９４１．１｜［Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ］  
ＭＨＴＩＫＬＦＬＦＷＰＬＶＩＡＳＲＶＤＰＤＬＳＳＦＤＳＡＰＳＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＤＬＳＬＲＴＮＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＴＴＳＴＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＶＥＬＮＳＫＬＥＳＬＬＥＥＫＴＡＬＱＨＫＶＲＡＬＥＥＱＬＴＮＬＩＬＳＰＡＧＡＱＥＨＰＥＶＴＳＬＫＳＦＶＥＱＱＤＮＳＩＲＥＬＬＱＳＶＥＥＱＹＫＱＬＳＱＱＨＭＱＩＫＥＩＥＫＱＬＲＫＴＧＩＱＥＰＳＥＮＳＬＳＳＫＳＲＡＰＲＴＴＰＰＬＱＬＮＥＴＥＮＴＥＱＤＤＬＰＡＤＣＳＡＶＹＮＲＧＥＨＴＳＧＶＹＴＩＫＰＲＮＳＱＧＦＮＶＹＣＤＴＱＳＧＳＰＷＴＬＩＱＨＲＫＤＧＳＱＤＦＮＥＴＷＥＮＹＥＫＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＡＩＶＱＱＳＮＹＩＬＲＬＥＬＱＤＷＫＤＳＫＨＹＶＥＹＳＦＨＬＧＳＨＥＴＮＹＴＬＨＶＡＥＩＡＧＮＩＰＧＡＬＰＥＨＴＤＬＭＦＳＴＷＮＨＲＡＫＧＱＬＹＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＮＤＩＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＲＴＫＳＲＰＥＲＲＲＧＩＹＷＲＰＱＳＲＫＬＹＡＩＫＳＳＫＭＭＬＱＰＴＴ
【００９６】
配列番号：１３  
ウシＡＮＧＰＴＬ３  ２４１−４５４  
ＤＩＰＡＤＣＴＩＩＹＮＱＧＫＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＭＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＫＹＹＴＥＹＳＦＨＬＧＤＨＥＴＮＹＴＬＨＬＡＥＩＳＧＮＧＰＫＡＦＰＥＨＫＤＬＭＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＳＮＳＧＧＷＷＹＨＤＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＫＡＫＡＫＰＥＲＫＥＧＩＣＷＫＳＱＤＧＲＬＹＳＩＫＡＴＫＭＬＩＨＰＳＤ
【００９７】
配列番号：１４  
ウシＡＮＧＰＴＬ３  ２２５−４５４  
ＴＴＰＳＦＨＳＮＥＴＫＮＶＥＨＤＤＩＰＡＤＣＴＩＩＹＮＱＧＫＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＭＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＫＹＹＴＥＹＳＦＨＬＧＤＨＥＴＮＹＴＬＨＬＡＥＩＳＧＮＧＰＫＡＦＰＥＨＫＤＬＭＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＳＮＳＧＧＷＷＹＨＤＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＫＡＫＡＫＰＥＲＫＥＧＩＣＷＫＳＱＤＧＲＬＹＳＩＫＡＴＫＭＬＩＨＰＳＤ
【００９８】
配列番号：１５  
ウシＡＮＧＰＴＬ３  ２０７−４５４  
ＩＫＥＳＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＳＦＨＳＮＥＴＫＮＶＥＨＤＤＩＰＡＤＣＴＩＩＹＮＱＧＫＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＭＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＫＹＹＴＥＹＳＦＨＬＧＤＨＥＴＮＹＴＬＨＬＡＥＩＳＧＮＧＰＫＡＦＰＥＨＫＤＬＭＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＳＮＳＧＧＷＷＹＨＤＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＫＡＫＡＫＰＥＲＫＥＧＩＣＷＫＳＱＤＧＲＬＹＳＩＫＡＴＫＭＬＩＨＰＳＤ
【００９９】
配列番号：１６  
完全長ウシＡＮＧＰＴＬ３  ｇｉ｜１２２６９２３９１｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１０７３８１４．１｜［Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ］  
ＭＹＴＩＫＬＦＬＩＩＡＰＬＶＩＳＳＲＴＤＱＤＹＴＳＬＤＳＩＳＰＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＤＬＳＬＱＴＮＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＡＴＳＫＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＬＥＬＤＳＫＬＥＳＬＬＥＥＫＩＬＬＱＱＫＶＲＹＬＥＤＱＬＴＤＬＩＫＮＱＰＱＩＱＥＹＬＥＶＴＳＬＫＴＬＶＥＱＱＤＮＳＩＫＤＬＬＱＩＶＥＥＱＹＲＱＬＮＱＱＱＳＱＩＫＥＩＥＮＱＬＲＲＴＧＩＫＥＳＴＥＩＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＳＦＨＳＮＥＴＫＮＶＥＨＤＤＩＰＡＤＣＴＩＩＹＮＱＧＫＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＭＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＫＹＹＴＥＹＳＦＨＬＧＤＨＥＴＮＹＴＬＨＬＡＥＩＳＧＮＧＰＫＡＦＰＥＨＫＤＬＭＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＦＮＣＰＥＳＮＳＧＧＷＷＹＨＤＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＰＫＡＫＡＫＰＥＲＫＥＧＩＣＷＫＳＱＤＧＲＬＹＳＩＫＡＴＫＭＬＩＨＰＳＤＳＥＮＳＥ
【０１００】
配列番号：１７  
イヌＡＮＧＰＴＬ３  ２４０−４５４  
ＤＩＰＡＮＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＲＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＮＤＮＫＨＹＩＥＹＦＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＩＬＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＶＮＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＮＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＱＲＡＫＴＫＰＥＲＲＲＧＬＹＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤ
【０１０１】
配列番号：１８  
イヌＡＮＧＰＴＬ３  ２２４−４５４  
ＴＴＰＦＬＨＬＮＥＴＫＮＶＥＨＮＤＩＰＡＮＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＲＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＮＤＮＫＨＹＩＥＹＦＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＩＬＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＶＮＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＮＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＱＲＡＫＴＫＰＥＲＲＲＧＬＹＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤ
【０１０２】
配列番号：１９  
イヌＡＮＧＰＴＬ３  ２０６−４５４  
ＩＱＥＳＴＥＮＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＦＬＨＬＮＥＴＫＮＶＥＨＮＤＩＰＡＮＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＲＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＮＤＮＫＨＹＩＥＹＦＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＩＬＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＶＮＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＮＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＱＲＡＫＴＫＰＥＲＲＲＧＬＹＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤ
【０１０３】
配列番号：２０  
完全長イヌＡＮＧＰＴＬ３  ｇｉ｜５７０８６５０５｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿５３６６８６．１｜［Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ］  
ＭＹＴＩＫＬＦＬＦＩＩＰＬＶＩＳＳＫＩＤＲＤＹＳＳＹＤＳＶＳＰＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＤＬＳＬＱＴＮＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＴＴＳＫＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＬＥＬＮＳＫＶＥＳＬＬＥＥＫＩＬＬＱＱＫＶＲＹＬＥＫＱＬＴＳＬＩＫＮＱＰＥＩＱＥＨＰＥＶＴＳＬＫＴＦＶＥＱＱＤＮＳＩＫＤＬＬＱＴＶＥＥＱＹＲＱＬＮＱＱＨＳＱＩＫＥＩＥＮＱＬＲＮＶＩＱＥＳＴＥＮＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＦＬＨＬＮＥＴＫＮＶＥＨＮＤＩＰＡＮＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＲＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＫＳＧＳＳＷＴＬＩＱＨＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＥＮＹＲＹＧＦＧＲＬＤＧＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＱＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＮＤＮＫＨＹＩＥＹＦＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＩＬＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＨＶＮＣＰＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＮＶＣＧＥＮＮＬＮＧＫＹＮＫＱＲＡＫＴＫＰＥＲＲＲＧＬＹＷＫＳＱＮＧＲＬＹＳＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤＳＥＳＳＥ
【０１０４】
配列番号：２１  
ウマＡＮＧＰＴＬ３  ２４１−４５５  
ＤＦＰＡＤＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＫＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＩＳＧＳＳＷＩＬＩＱＲＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＱＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＦＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＲＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＴＩＥＹＳＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＶＰＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＱＬＮＣＬＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＤＶＣＧＧＤＮＰＮＧＫＹＮＫＰＲＳＫＴＫＰＥＲＲＲＧＩＣＷＫＳＱＮＧＲＬＹＴＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤ
【０１０５】
配列番号：２２  
ウマＡＮＧＰＴＬ３  ２２５−４５５  
ＴＴＰＳＦＨＬＮＥＴＫＤＶＥＨＤＤＦＰＡＤＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＫＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＩＳＧＳＳＷＩＬＩＱＲＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＱＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＦＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＲＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＴＩＥＹＳＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＶＰＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＱＬＮＣＬＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＤＶＣＧＧＤＮＰＮＧＫＹＮＫＰＲＳＫＴＫＰＥＲＲＲＧＩＣＷＫＳＱＮＧＲＬＹＴＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤ
【０１０６】
配列番号：２３  
ウマＡＮＧＰＴＬ３  ２０７−４５５  
ＩＱＥＳＴＥＮＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＳＦＨＬＮＥＴＫＤＶＥＨＤＤＦＰＡＤＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＫＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＩＳＧＳＳＷＩＬＩＱＲＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＱＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＦＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＲＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＴＩＥＹＳＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＶＰＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＱＬＮＣＬＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＤＶＣＧＧＤＮＰＮＧＫＹＮＫＰＲＳＫＴＫＰＥＲＲＲＧＩＣＷＫＳＱＮＧＲＬＹＴＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤ
【０１０７】
配列番号：２４  
完全長ウマＡＮＧＰＴＬ３［ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ］  
ＭＹＴＩＫＬＦＬＶＩＡＰＬＶＩＳＳＲＩＤＱＤＹＳＳＬＤＳＩＰＰＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＡＬＳＬＱＴＮＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＴＴＳＫＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＬＥＬＮＳＫＬＥＳＬＬＥＥＫＳＬＬＱＱＫＶＫＹＬＥＥＱＬＴＫＬＩＫＮＱＰＥＩＱＥＨＰＥＶＴＳＬＫＴＦＶＥＱＱＤＮＳＩＫＤＬＬＱＴＭＥＥＱＹＲＱＬＮＱＱＨＳＱＩＫＥＩＥＮＱＬＲＲＴＧＩＱＥＳＴＥＮＳＬＳＳＫＰＲＡＰＲＴＴＰＳＦＨＬＮＥＴＫＤＶＥＨＤＤＦＰＡＤＣＴＴＩＹＮＲＧＥＨＴＳＧＩＹＳＩＫＰＳＮＳＱＶＦＮＶＹＣＤＶＩＳＧＳＳＷＩＬＩＱＲＲＩＤＧＳＱＮＦＮＥＴＷＱＮＹＫＹＧＦＧＲＬＤＦＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＳＩＶＫＲＳＮＹＩＬＲＩＥＬＥＤＷＫＤＮＫＨＴＩＥＹＳＦＨＬＧＮＨＥＴＮＹＴＬＨＬＶＥＩＴＧＮＶＰＮＡＬＰＥＨＫＤＬＶＦＳＴＷＤＨＫＡＫＧＱＬＮＣＬＥＳＹＳＧＧＷＷＷＨＤＶＣＧＧＤＮＰＮＧＫＹＮＫＰＲＳＫＴＫＰＥＲＲＲＧＩＣＷＫＳＱＮＧＲＬＹＴＩＫＳＴＫＭＬＩＨＰＩＤＳＥＳＦＥＬＲＱＩＫＫＰＭＮ
【０１０８】
配列番号：２５  
２４１−４５５  コンセンサス  
ＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＸＬＩＱＸＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＸＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＸＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＸＳＮＹＸＬＥＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＸＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＸＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＸＸＮＸＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ
【０１０９】
配列番号：２６  
２２５−４５５  コンセンサス  
ＴＴＰＸＸＸＸＮＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＸＬＩＱＸＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＸＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＸＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＸＳＮＹＸＬＥＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＸＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＸＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＸＸＮＸＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ
【０１１０】
配列番号：２７  
２０７−４５５  コンセンサス  
ＸＩＸＥＸＸＥＸＳＬＳＳＫＸＲＡＰＲＴＴＰＸＸＸＸＮＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＸＬＩＱＸＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＸＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＸＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＸＳＮＹＸＬＥＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＸＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＸＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＸＸＮＸＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ
【０１１１】
配列番号：２８  
完全長コンセンサス  
ＭＸＴＩＫＬＸＬＸＸＸＰＬＶＩＸＳＸＸＤＸＤＸＸＳＸＤＳＸＸＸＥＰＫＳＲＦＡＭＬＤＤＶＫＩＬＡＮＧＬＬＱＬＧＨＧＬＫＤＦＶＨＫＴＫＧＱＩＮＤＩＦＱＫＬＮＩＦＤＱＳＦＹＸＬＳＬＸＴＸＥＩＫＥＥＥＫＥＬＲＲＸＴＸＸＬＱＶＫＮＥＥＶＫＮＭＳＸＥＬＸＳＫＸＥＳＬＬＥＥＫＸＸＬＱＸＫＶＸＸＬＥＸＱＬＴＸＬＩＸＸＸＸＸＸＸＥＸＸＥＶＴＳＬＫＸＸＶＥＸＱＤＮＳＩＸＸＬＬＱＸＸＥＸＱＹＸＱＬＸＱＱＸＸＱＩＫＥＩＥＸＱＬＲ（Ｘ）ＸＸＩＸＥＸＸＥＸＳＬＳＳＫＸＲＡＰＲＴＴＰＸＸＸＸＮＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸＰＡＸＣＸＸＸＹＮＸＧＸＨＴＳＧＸＹＸＩＸＰＸＮＳＱＸＦＸＶＹＣＤＸＸＳＧＳＸＷＸＬＩＱＸＲＸＤＧＳＱＸＦＮＥＴＷＸＮＹＸＸＧＦＧＲＬＤＸＥＦＷＬＧＬＥＫＩＹＸＩＶＸＸＳＮＹＸＬＥＸＥＬＸＤＷＸＤ（Ｘ）ＫＸＸＸＥＹＸＦＸＬＧＸＨＥＴＮＹＴＬＨＸＸＸＩＸＧＮＸＸＸＡＸＰＥＸＸＤＬＸＦＳＴＷＸＨＸＡＫＧＸＸＸＣＸＥＸＸＳＧＧＷＷＸＸＸＸＣＧＸＸＮＸＮＧＫＹＮＫＸＸＸＫＸＸＰＥＲＸＸＧＸＸＷＸＸＱＸＸＸＬＹＸＩＫＸＸＫＭＸＸＸＰＸＸ（ＳＥＸＸＥＸＸＸＸＸＸＸＸＸ）
【図１】
0005602850.tif 000002
【図２】
0005602850.tif 000003
【図３Ａ】
0005602850.tif 000004
【図３Ｂ】
0005602850.tif 000005
【図４Ａ−１】
0005602850.tif 000006
【図４Ａ−２】
0005602850.tif 000007
【図４Ｂ−１】
0005602850.tif 000008
【図４Ｂ−２】
0005602850.tif 000009
【図５】
0005602850.tif 000010
【配列表】
0005602850000001.app