(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に細胞間物質溶解酵素を作用させる第１の工程と、
前記第１の工程により得られた単細胞化された植物を含む懸濁液にα−トコフェロールγシクロデキストリン包接体と多価アルコールを添加する第２の工程と、
前記第２の工程により分散された細胞を含む懸濁液を減圧蒸留濃縮もしくは遠心分離にて濃縮する第３の工程と、
前記第３の工程により濃縮された懸濁液を凍結乾燥又は噴霧乾燥にて粉末化する第４の工程と、
を備えたことを特徴とする、単細胞化処理された植物の粉末化方法。
【請求項２】
前記多価アルコールがグリセリンであることを特徴とする請求項１に記載の単細胞化処理された植物の粉末化方法。
【請求項３】
請求項１記載の粉末化方法により得られる植物の単細胞化粉末であって、細胞膜の安定化剤としてα−トコフェロールγシクロデキストリン包接体と多価アルコールを添加したことを特徴とする植物の単細胞化粉末。
【請求項４】
前記多価アルコールがグリセリンであることを特徴とする請求項３に記載の植物の単細胞化粉末。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単細胞化処理された植物の粉末化方法に関し、単細胞懸濁液の濃縮化時に生じる細胞の凝集及び密着を防止することが可能で、しかも、濃縮後の凍結乾燥時や得られた単細胞化粉末を再懸濁する際にも、細胞壁と細胞膜の破損を防ぐことができる好適な粉末化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、いわゆる健康食品や化粧品等の分野において、野菜、果物、薬草などの植物を単細胞化することにより、植物の細胞内に存在する栄養成分、色素成分などの機能性成分を細胞内に閉じ込めたまま粉末化して製品化する技術が利用されている。
【０００３】
単細胞化の利点としては、機能性成分を細胞内に閉じ込めた状態を保持することによる機能性成分の保存性の向上と、加工時に発生する機能性成分の酸化等の変質及びロスの低減が挙げられる。特に、加工時に容易に変質してしまう機能性成分は、ミキサー等を用いて機械的に粉砕・抽出する方法では有効利用できず、細胞壁や細胞膜を破損せずに単細胞化することができて初めてその機能性を十分に利用することができる。
【０００４】
植物を単細胞化し粉末化する製法は、大まかには以下の２つの工程からなる。最初の工程は、植物を単細胞化する工程である。植物は多数の細胞が細胞間物質で接着されて構成されているが、この細胞間物質は主にペクチン及びペクチンを不溶化したプロトペクチンを主とする多糖類であり、この多糖類を分解する酵素を作用させることによって植物を単細胞化することができる。
【０００５】
細胞間物質が主としてプロトペクチンからなる場合は、細胞間物質溶解酵素としてペクチナーゼを使用する。ペクチナーゼは、ペクチンを分解する酵素の総称であり、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼなど、数種類の酵素が混合されたものである。また、Bacillus属、Rhizopus属、Aspergillus 属等、起源となる菌により各酵素の活性及び配分が異なり、それによって特性が変化するので、種々のペクチナーゼが市販されている。
【０００６】
次に、単細胞化された植物の懸濁液を乾燥させて粉末化する工程を実施する。例えば、ペクチナーゼを用いて単細胞化した植物は、単細胞化された細胞を含む懸濁液となる。植物の細胞壁は、セルロースからなる基本骨格が多糖類（マトリックス多糖：ヘミセルロース、ペクチン等）からなる基質に埋め込まれて構成されている。ペクチンは、酸性多糖であり、ホモガラクツロナン、ラムノガラクツロナンＩ、ラムノガラクツロナンII、アピオガラクツロナン、アラビナン、ガラクタンなどが知られている。
【０００７】
よって、単細胞化した植物を健康食品や化粧品として製品化するためには、ペクチナーゼによる単細胞化処理を行った後に、単細胞化植物を含んだ懸濁液を乾燥させて粉末化する工程が不可欠である。単細胞化植物の粉末化は噴霧乾燥や凍結乾燥によって実現されている。
【０００８】
そこで、上記工程を含む先行技術が幾つか提案されている。
【特許文献１】特開平９−７５０２６号公報
【０００９】
例えば、上記特許文献１には、植物に、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属糸状菌から分離される酵素で、強固なプロトペクチンを解離するプロトペクチナーゼを主体とする細胞間物質分解酵素を作用させて、植物柔組織の細胞間物質を分解して植物を単細胞化する方法が開示されている。
【００１０】
また、下記特許文献２には、香辛料原料に細胞間物質溶解酵素を作用させて植物組織を崩壊することにより単細胞化または微細組織化するとともに、細胞間物質を溶解除去した香辛料が開示されている。
【特許文献２】特開平７−２３７３２号公報
【００１１】
また、従来より、単細胞化処理された植物の懸濁液を粉末化する方法も種々提案されている。例えば、上記特許文献１には、単細胞懸濁液１ｍｌ中の細胞数が１０5 〜１０6 程度と少なくなる場合、この液をｐＨ７．０に補正後、スプレードライヤーにかけて噴霧乾燥（スプレードライ）することで単細胞粉末を得る方法が開示されている。
【００１２】
また、上記特許文献２には、香辛料原料にプロトペクチナーゼなどの酵素を作用させて単細胞化し、篩別した後、得られた懸濁液を遠心分離にかけて上澄みを除去し、得られたペースト状の沈殿物を水洗した後、凍結乾燥（フリーズドライ）して乾燥する方法が開示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献１のように、単細胞化した植物を含んだ懸濁液を噴霧乾燥して粉末化する場合は、例えば１２０℃以上の熱を加えることになり、細胞膜や細胞内成分に悪影響を与えることは避けられないという問題があった。
【００１４】
また、特許文献２のように、懸濁液を遠心分離にかけて上澄みを除去して濃縮後、凍結乾燥によって粉末化させる方法を用いる場合は、濃縮してペースト状の沈殿物とした時点で細胞間の距離が短くなるため単細胞同士が凝集および密着してしまうという問題があった。
【００１５】
このように、単細胞同士が凝集および密着したままの状態で凍結乾燥を行うと、乾燥後に粉砕して粉末化したときに細胞が破壊されてしまうため、単細胞化の最大の目的である細胞内の機能成分の保護が不可能となる。そこで、懸濁液を濃縮しないか、濃縮の割合を減らすことも考えられたが、１回の凍結乾燥で得られる単細胞化処理された植物の量が少なくなり、コストアップが避けられず採算が取れなくなるので、製品化は困難となる。
【００１６】
加えて、従来の製法は、濃縮化時には再接着せず細胞壁が保持されている場合でも、凍結時の氷晶化によって細胞膜が破損するという問題もあった。
【００１７】
植物細胞はセルロース、へミセルロースなどから構成される細胞壁と、脂質二重膜で構成される細胞膜で細胞内部を保護している。細胞壁は物理的な外力から細胞内を守り、細胞膜は細胞内外の物質の出入りを制御している。したがって、細胞膜が破損した単細胞化粉末は、たとえ細胞壁が破損していない状態であっても、細胞壁の間隙を酸素が自由に通過するため、細胞内の機能性成分は徐々に変質してしまう。同様に、揮発性成分は細胞壁の間隙から細胞外へと放出される。また、細胞膜の破損による最大の問題は、単細胞化粉末を水に懸濁させた時に発生する水溶性成分及び揮発性成分の細胞外への漏洩である。これら成分は懸濁時に速やかに細胞外へ拡散してしまい、単細胞粉末のメリットをすべて損ねてしまう。
【００１８】
以上をまとめると、従来の技術には、濃縮化時に生じる細胞の凝集及び密着の問題（以下、第１の課題という。）と、凍結乾燥時や得られた単細胞化粉末を再懸濁する際に生じる細胞膜等の破損の問題（以下、第２の課題という。）があった。
【００１９】
本発明は、上記した従来の第１及び第２の課題を解決するためになされたものであり、単細胞化された植物を濃縮する際に生じる細胞同士の凝集及び密着を防止することが可能で、しかも、細胞膜の破損を防止することもできる最適な単細胞化粉末を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記の目的を達成するため、本発明の単細胞化処理された植物の粉末化方法は、
植物に細胞間物質溶解酵素を作用させる第１の工程と、
前記第１の工程により得られた単細胞化された植物を含む懸濁液にα−トコフェロールγシクロデキストリン包接体と多価アルコールを添加する第２の工程と、
前記第２の工程により分散された細胞を含む懸濁液を減圧蒸留濃縮もしくは遠心分離にて濃縮する第３の工程と、
前記第３の工程により濃縮された懸濁液を凍結乾燥又は噴霧乾燥にて粉末化する第４の工程と、
を備えたことを最も主要な特徴点としている。
【００２１】
また、本発明の植物の単細胞化粉末は、上記粉末化方法により得られる植物の単細胞化粉末であって、細胞膜の安定化剤としてα−トコフェロールγシクロデキストリン包接体と多価アルコールを添加したことを最も主要な特徴点としている。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、シクロデキストリンが単細胞化された植物の細胞の周囲に集まってミセルを形成して表面が親水基となり互いに電気的に反発するので、減圧蒸留濃縮もしくは遠心分離にて濃縮するときでも、単細胞同士の凝集、密着、再結着が防止され、単細胞の状態を保ち細胞壁を破壊することなく粉末化することが可能となり、第１の課題を解決することができる。
【００２３】
また、本発明の粉末化方法の第２の工程で添加するシクロデキストリンは、濃縮化後も残存し、細胞膜の安定化剤としても機能するので、懸濁液の凍結乾燥時や得られた単細胞化粉末の再懸濁する際にも、細胞膜の良好な状態が保持され、破損を防止できるので、第２の課題も解決することができる。そのため、本発明の植物の単細胞化粉末は、細胞内部の機能性成分、特に水溶性成分や揮発性成分の変質や漏洩を大幅に低減することができ、さらには、例えば腸に到達するまで機能性成分を細胞内に保持することで、リポソーム製剤と同様のドラッグデリバリーシステムの機能が得られる。
【００２４】
例えば植物に含まれる有益な機能性たんぱく質である各種の酵素や、トランスジェニック植物中に発現させたワクチンタンパク質等は、経口摂取した場合、胃に含まれるたんぱく質分解酵素によって容易に分解される。これらが腸で有効に働く場合、腸に達した時には既に失活しており、酵素やワクチンタンパク質としての機能性を十分に発揮できない。しかし、本発明では、シクロデキストリン又はその誘導体と、必要に応じて多価アルコールや、α−トコフェロール、コレステロール、カロテノイド、食用油脂、脂肪酸、脂肪酸エステル、コレステロールエステルから選択される一又は複数の油性物質を添加することによって細胞膜を安定化しているため、細胞内にある酵素やワクチンは胃での分解を免れ、腸で放出される。そのため、腸内でその酵素やワクチンタンパク質の機能性を十分に発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、第１及び第２の課題を解決するという目的を、植物に細胞間物質溶解酵素を作用させる第１の工程と、前記第１の工程により得られた単細胞化された植物を含む懸濁液にシクロデキストリンを添加する第２の工程と、前記第２の工程により分散された細胞を含む懸濁液を減圧蒸留濃縮もしくは遠心分離にて濃縮する第３の工程と、前記第３の工程により濃縮された懸濁液を凍結乾燥又は噴霧乾燥にて粉末化する第４の工程とを備えた粉末化方法を採用することによって達成した。以下、本発明の第１〜第４の工程の一例を具体的に説明する。
【００２６】
（第１の工程）
第１の工程は、植物に細胞間物質溶解酵素を作用させる工程である。細胞間物質溶解酵素としては、例えばペクチナーゼを使用することができる。例えば、植物を所要のサイズに切断した後、水に浸し、ペクチナーゼが所定の重量％となるように調整した酵素液を添加し、酵素反応させると、単細胞を含む懸濁液の状態となる。なお、細胞壁分解酵素を併用して同時に細胞壁を分解し、プロトプラストとしてもよい。細胞壁分解酵素としては、例えばセルラーゼを使用することができる。第１の工程により、植物は単細胞化された懸濁液の状態となる。
【００２７】
この懸濁液には残渣が含まれているため、２０メッシュ（ＪＩＳ）の篩で濾過し、残渣を取り除く。こうして得られた懸濁液は、時間が経過すると単細胞粒子が沈殿し、２層に分離する。
【００２８】
（第２の工程）
第２の工程は、第１の工程により得られた単細胞化された植物を含む懸濁液にシクロデキストリンを添加する工程である。具体的には、例えば第１の工程で得られた懸濁液１００重量部に対し、シクロデキストリン０．１〜５重量部を微量添加してよく攪拌する。シクロデキストリンはグルコースが５個以上結合した環状オリゴ糖の一種である。
【００２９】
また、第２工程で、シクロデキストリンと共に多価アルコールを添加しても良い。多価アルコールも、シクロデキストリンと共に、単細胞化粉末の細胞膜の安定化剤として機能するからである。具体的には、植物１００重量部に対し、シクロデキストリン０．０５〜１０重量部と多価アルコール０．００５〜５重量部を添加して充分に時間をかけて緩やかに攪拌する。なお、懸濁液には残渣が含まれるため、必要に応じてフィルターでろ過を行う。
【００３０】
添加する多価アルコールとしては、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジエチレングリコールなどから選択できる。より好ましくはグリセリンを使用する。
【００３１】
なお、第２工程は第１工程と同時に実施することも可能である。すなわち、同じ反応槽に細胞間物質溶解酵素とシクロデキストリンを同時に添加して作用させてもよく、また反応槽に添加する順序はシクロデキストリンの方が先になっても構わない。
【００３２】
添加するシクロデキストリンとしては、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、それらの誘導体のどれを用いても良い。本発明において「シクロデキストリン」は、その誘導体を含むものである。また、非分岐シクロデキストリン、分岐シクロデキストリン（グルコシルシクロデキストリン、マルトシルシクロデキストリンなど）、シクロデキストリン誘導体（ジメチルシクロデキストリン、ヒドロキシエチルシクロデキストリンなど）のどれを用いても良い。
【００３３】
もっとも、本発明者等が種々検討したところによると、γ体のシクロデキストリンは、水への溶解性が高いので、より好ましいことが判明している。また、細胞同士の再結着を防ぐ第１の課題に対しては、マルトシルβシクロデキストリンがより好ましいことが判明している。
【００３４】
非分岐シクロデキストリン、分岐シクロデキストリン、シクロデキストリン誘導体の内部は、疎水性（親油性）、外部は親水性となっている。シクロデキストリンによって各細胞粒子は表面が親水基のミセルを形成するので、このミセル化した各細胞粒子は電気的な反発により分散し、各単細胞が分散した好適な懸濁液を得ることができる。
【００３５】
また、第２工程で、α−トコフェロール、コレステロール、カロテノイド、食用油脂、脂肪酸、脂肪酸エステル、コレステロールエステルから選択される一又は複数の油性物質を、シクロデキストリン、多価アルコールと共に併用してもよい。前記油性成分も、シクロデキストリン、多価アルコールと共に、単細胞化粉末の細胞膜の安定化剤として機能するからである。ここで、前記油性物質はシクロデキストリン包接体であってもよいし、シクロデキストリンとの物理的混合物でも、前記包接体及び物理的混合物の混在した状態でもよい。具体的には、シクロデキストリン１００重量部に対して前記油性物質１０〜５０重量部を添加して充分に時間をかけて緩やかに攪拌する。前記包接体として使用する場合は、シクロデキストリンと前記油性物質とを強攪拌等の一般的な方法で先に包接体としたものを、単細胞化された植物の懸濁液に添加して充分に時間をかけて緩やかに攪拌する。なお、モル比でα−トコフェロール：γ−シクロデキストリン＝１：２となるように調整したα−トコフェロールγ−シクロデキストリン包接体を使用することで細胞膜の安定性が最も高くなることが判明している。これは、前記油性物質単体やシクロデキストリン単体よりも、前記油性物質のシクロデキストリン包接体のほうが、細胞膜との結合性が高い為だと考えられる。
【００３６】
（第３の工程）
第３の工程は、第２の工程で得られた単細胞が分散された懸濁液を、遠心分離または減圧蒸留濃縮により濃縮する工程である。遠心分離を用いる場合は、例えば、懸濁液を１５００Ｇで１０分間遠心分離機にかけてミセル化した単細胞粒子を分離した後、水を加えて濃縮率を整えた懸濁液を得る。また、減圧蒸留濃縮を用いる場合は、例えば、減圧蒸留濃縮装置を用いて懸濁液を減圧下で３０℃に保ち蒸留濃縮し、濃縮された懸濁液を得る。本発明では、第２工程において、シクロデキストリンを添加していることにより、細胞同士の接着が防止されるため、従来の技術では再接着を起こして後の粉末化の工程で細胞壁破壊の原因となっていた高濃縮化が可能となる。
【００３７】
（第４の工程）
第４の工程は、第３の工程により濃縮された懸濁液を凍結乾燥（フリーズドライ）又は噴霧乾燥（スプレードライ）にて粉末化する工程である。凍結乾燥を用いる場合、粉末化は、例えば、濃縮された懸濁液を−３０℃で予備冷凍後、真空凍結乾燥器にて最終品温が６０℃以下となるよう５０時間程度乾燥させ、その後、適度な圧力を加えて打撃することで粉砕することにより実施される。以上の第１〜第４の工程により、単細胞化された状態をそのまま保って健康食品や化粧品用の粉末を得ることができる。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明の効果を確認するために実施した試験１〜５を示し、本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
〔試験１：単細胞懸濁液を高濃縮した際の再結着防止効果の確認〕
人参にペクチナーゼ（マセロチームＡ（登録商標）：ヤクルト薬品工業社製）を作用させて単細胞化し、減圧蒸留濃縮にて濃縮する際の条件を変化させて、凍結乾燥によって得られた粉末の性質を比較した。なお、得られた粉末中の細胞からの内容成分の流出量を確認するため、細胞内に色素（βカロテン）が多く含まれる人参を使用した。
【００４０】
（酵素処理）
人参１００ｇを５ｍｍ角に切断した後、３００ｇの蒸留水に浸し、上記ペクチナーゼの割合が水と人参を併せた総重量に対して０．５重量％となるように調整した酵素液を添加して４５℃、１２０分間攪拌下（３００ｒｐｍ）で反応させて懸濁液を得た。残渣を２０メッシュ（ＪＩＳ）の篩で濾過して単細胞を含む懸濁液を得た。
【００４１】
（濃縮）
単細胞を含む懸濁液へのシクロデキストリンの添加については、以下のように条件を変えて、比較例１、実施例１〜３とした。
比較例１：  シクロデキストリンを添加しないもの
実施例１：  懸濁液に対しβ−シクロデキストリン（CAVAMAX （登録商標）W7、Wacker-Chemie GmbH社）１重量％を添加するもの
実施例２：  懸濁液に対しγ−シクロデキストリン（CAVAMAX （登録商標）W8、Wacker-Chemie GmbH社）１重量％を添加するもの
実施例３：  懸濁液に対しマルトシルβシクロデキストリン（G2−β−CDTM、横浜国際バイオ研究所製）１重量％を添加するもの
【００４２】
各懸濁液は、スターラーを用いてよく攪拌し、１時間静置した。これら４つの条件で、懸濁液の重量のそれぞれ２．５〜５倍まで減圧蒸留濃縮にて濃縮した。
【００４３】
（凍結乾燥）
濃縮した懸濁液を冷蔵庫にて２４時間静置した後、冷凍庫にて凍結した。この凍結した懸濁液を凍結乾燥により乾燥させて粉末を得た。得られた乾燥粉末を０．０１ｇ取り、１０ｃｃの水に再度添加し、ＭＩＣＲＯＴＵＢＥ  ＭＩＸＥＲ  ＭＴ３６０（ＴＯＭＹ社製) を用いて１５分攪拌させたのち、顕微鏡を用いて細胞の状態を確認した。なお、比較例１、実施例１〜３について、それぞれ２回ずつ試験を行った。結果は、表１に示すとおりとなった。
【００４４】
【表１】
0005575386.tif 000002
【００４５】
単細胞化した植物の懸濁液を濃縮する場合、比較例１のようにシクロデキストリンを添加せずにそのまま濃縮すると、図５（ａ）に示すように、細胞同士が密着した状態（いくつもの細胞が重なりあった状態）が見られた。また、細胞同士が密着した状態のため、凍結乾燥時もしくは乾燥後粉砕時に細胞壁の破損の原因となり、図５（ｂ）に示すように、内容成分が流出して塊状になったものが多く見られた。この結果は、内容成分が揮発性であれば粉砕時に失われてしまうことを示している。なお、図１は、比較例１の顕微鏡写真全体を表したものである。
【００４６】
一方、実施例１〜３のように、シクロデキストリンを微量添加した懸濁液を濃縮した本発明の場合は、細胞同士の密着がほとんどないという結果が得られた。具体的には、図２は、β−シクロデキストリンを添加した実施例１の顕微鏡写真を、図３は、マルトシルβシクロデキストリンを添加した実施例２の顕微鏡写真を、図４は、γ−シクロデキストリンを添加した実施例３の顕微鏡写真を示している。何れも細胞同士の密着がなく、細胞の内容成分の流出が低減されている。
【００４７】
特に、マルトシルβシクロデキストリンでは、濃縮した懸濁液の重量（ｇ）に対する得られた乾燥粉末の重量（ｇ）の割合が１０％以上の高濃縮時でも、図３に示すように、細胞同士の密着がないだけでなく、細胞が均一に分散しており、好適な結果が得られた。
【００４８】
懸濁液にシクロデキストリンを添加すると、懸濁液中の細胞の細胞壁に存在するペクチンのカルボキシル基、メチルエステル化したカルボキシル基などをシクロデキストリンが包接すると考えられる。シクロデキストリンの外部はヒドロキシ基が多数存在し、親水性を示すため、液中で細胞同士が反発し、高濃度に濃縮した場合でも細胞間の距離が保たれる。
【００４９】
シクロデキストリンの水への溶解度は、２５℃で、α体が１４．５ｇ／１００ｍＬ、β体が１．８ｇ／１００ｍＬ、γ体が２３．２ｇ／１００ｍＬ、マルトシルβシクロデキストリンが１６２ｇ／１００ｍＬであり、β体はその溶解性が一番低い。上記実験では、β体よりもγ体、γ体よりもマルトシルβシクロデキストリンの方が良い結果が得られており、本発明で得られる作用には、シクロデキストリンの水への溶解性が関連していると考えられる。特に、マルトシルβシクロデキストリンを用いた場合、最も良い結果が得られることがわかった。
【００５０】
もっとも、γ−シクロデキストリンは、マルトシルβシクロデキストリンよりも低コストで実施できるため、コストをなるべく抑えつつ一定レベル以上の良い効果を得たい場合は、γ−シクロデキストリンを用いるのが望ましい。
【００５１】
〔試験２−１：単細胞化粉末の細胞膜保持率の測定）
（単細胞化粉末の作成）
ペクチナーゼ（マセロチームＡ（登録商標）：ヤクルト薬品工業社製）：５％を添加した酵素反応液２０ｍｌに、一辺５ｍｍに刻んだオーストラリア産ブルーベリーの果皮１０ｇを加え、３７℃で５時間インキュベートして単細胞懸濁液を作成し、２０メッシュのフィルターを用いて残渣を取り除いた。この懸濁液１ｍｌ（アントシアニン含有赤色細胞の数：３．５×１０3 ／ｍｌ）に対し、γ−シクロデキストリン（CAVAMAX （登録商標）W8、Wacker-Chemie GmbH社）、グリセリン（和光純薬工業社製  特級）、α−トコフェロール（dl−α−トコフェロール、和光純薬工業社製）の量を下記実施例Ａ〜Ｄのように変化させて添加し、充分に時間をかけて均一になるように緩やかに攪拌した後に遠心分離（１５００Ｇ×１０分）によって上清を取り除き、残った沈殿を凍結乾燥して単細胞化粉末を得た。また、シクロデキストリン、グリセリン、α−トコフェロールを全く添加せず、その他は全く同じ方法で単細胞化粉末を作成し比較例ａとした。さらに、シクロデキストリン、グリセリン、α―トコフェロールを全く添加せず、デキストリン（アミコールＲ：日澱化学社製）を添加し、その他は全く同じ方法で単細胞化粉末を作成し比較例ｂとした。
【００５２】
（懸濁液１ｍｌに対する添加量）
実施例Ａ  γ−シクロデキストリン                      １．０％
実施例Ｂ  γ−シクロデキストリン                      １．０％
グリセリン                                  ０．１％
実施例Ｃ  γ−シクロデキストリン                      １．０％
グリセリン                                  ０．１％
α−トコフェロール                          ０．２％
実施例Ｄ  α−トコフェロールγ−シクロデキストリン
包接体（α−トコフェロール：シクロデキス
トリンの重量比＝１：５）                    １．０％
グリセリン                                  ０．１％
比較例ａ  添加せず
比較例ｂ  デキストリン                                １．０％
【００５３】
（細胞膜の保持率）
上記のようにして得られた各粉末をそれぞれ蒸留水１ｍｌに懸濁し、アントシアニン含有赤色細胞のうち、細胞膜が破損していない細胞の数を顕微鏡下でカウントした。なお、細胞膜が破損していないアントシアニン含有赤色細胞の例として、実施例Ｄの粉末を水に再懸濁時の細胞を図７に示す。結果は以下の表２のようになった。
【００５４】
【表２】
0005575386.tif 000003
【００５５】
表２により明らかなように、何も添加せずに粉末化した比較例ａやデキストリンを添加して粉末化した比較例ｂの場合、粉末の再懸濁時に細胞膜を保持した細胞が全体の１０％未満と微量であるのに対して、実施例Ａでは、γ−シクロデキストリンを微量添加することにより、細胞膜を保持した赤色細胞が全体の５０％以上と有意に増加し、細胞膜が安定化したことが確認された。さらに、実施例Ｂ、Ｃ、Ｄでは、グリセリン、α−トコフェロールをシクロデキストリンと併せて微量加えることによって、細胞膜を保持した赤色細胞が全体の７０％〜９０％となり、細胞膜の安定性がさらに増加することが確認された。さらに実施例Ｃ、Ｄの比較により、α−トコフェロールとγシクロデキストリンの物理的混合物よりも、α−トコフェロールγシクロデキストリン包接体の方が細胞膜の安定性を高めることが確認された。
【００５６】
〔試験２−２：細胞膜保持率の測定〕
（単細胞化粉末の作成）
北欧産青果ブルーベリー１０ｇを、細胞間物質溶解酵素（ペクトリアーゼＹ−２３、盛進工業社製）：０．５％）、γ−シクロデキストリン（CAVAMAX （登録商標）W8、Wacker-Chemie GmbH社）：０．５％、グリセリン（和光純薬工業社製  特級）：０．１％を含む３０ｍｌの溶液に浸漬し、４０℃で１時間インキュベートして単細胞化した。上記反応液から２０メッシュ（ＪＩＳ）のフィルターにて残渣を取り除いた後、遠心分離（１５００Ｇ×１０分）によって濃縮した後、凍結乾燥して本発明にかかるブルーベリー単細胞化粉末０．２ｇを得た（以下、実施例４とする）。比較対照には、γ−シクロデキストリン及びグリセリンを添加しない以外は上記と全く同じ方法で得られる単細胞化粉末を使用した（以下、比較例２とする。）。
【００５７】
（細胞内アントシアニン保持率の調査）
細胞膜が破損していると、単細胞化粉末を蒸留水に懸濁させた時に容易にアントシアニン等の水溶性成分が流出する。そこで、実施例４と比較例２で、細胞内アントシアニン保持率＝（（総アントシアニン量）−（漏洩したアントシアニン量））／（単細胞化粉末の総アントシアニン量）を夫々調査した。
【００５８】
なお、漏洩したアントシアニン量は、単細胞化粉末０．０５ｇを蒸留水１ｍｌに懸濁させて４℃にて１晩静置したのち、遠心分離（１５００Ｇ）によって分離した上清のアントシアニン量から算出した。また、アントシアニン量は１％塩酸酸性メタノールにて１００℃×１時間加熱して抽出されるデルフィニジンの極大吸収波長の吸光度から算出した。試験結果は、表３に示すとおりとなった。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
表３により明らかなように、本発明にかかる実施例４の単細胞化粉末は、γ−シクロデキストリン及びグリセリンの添加により細胞膜が安定化しているため、比較例２の単細胞化粉末と比較すると、水溶性成分の細胞外への漏洩がはるかに低減されており、かつ、粉末としてのアントシアニン含有量も１０％向上していることが確認された。
【００６１】
〔試験３：単細胞化粉末中のビタミンＣの安定性調査〕
（単細胞化粉末の作成）
青果パプリカ１０ｇに、ペクチナーゼ（マセロチームＡ（登録商標）：ヤクルト薬品工業社製）を作用させ、その他の条件は試験２−２と全く同一にしてパプリカ単細胞化粉末０．１３ｇを得た（以下、実施例５とする）。比較対照には、パプリカを粉砕して凍結乾燥したパプリカ粉末（以下、比較例３とする）を使用した。また、比較対照として、Ｌ−アスコルビン酸（ナカライテスク製：純度９９．５％、以下、比較例４とする）のデータも測定した。
【００６２】
（加速試験及びビタミンＣ定量）
パプリカにはビタミンＣ（アスコルビン酸）が多く含まれている。細胞膜が破損されずに良い状態を保持している程、ビタミンＣは細胞膜によって保護され、安定化する。そこで、実施例５、比較例３、比較例４の各粉末に対し、湿度５％、温度４５℃の条件下で３日間の加速試験を行い、前後のビタミンＣ量を、ビタミンＣ定量キット（コスモ・バイオ社製）を用いて定量し、各粉末０．０１ｇあたりのビタミンＣ残存率（％：加速試験後の残存ビタミンＣ量／加速試験前のビタミンＣ量）を求めた。結果は、以下の表４に示すとおりとなった。
【００６３】
【表４】
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【００６４】
表４により明らかなように、本発明にかかる単細胞化粉末は、細胞膜が破損されずに良い状態を保持しているため、細胞内のビタミンＣは、比較例３の凍結乾燥粉末や比較例４のＬ−アスコルビン酸と比較して格段に安定していることが確認された。
【００６５】
〔試験４：βカロテンの溶出試験〕
試験３で作成した実施例５のパプリカ単細胞化粉末０．０５ｇを用いて胃液処理又は腸液処理を行い、βカロテンの溶出試験を実施した。比較対照としては、極刻みにしたパプリカ青果０．５ｇ（水分含量９０％）を検体とした（以下、比較例５とする。）。
【００６６】
胃液にはペプシン４％を含む日本薬局方崩壊試験の第１液５０ｍｌ、腸液にはトリプシン２％及びパンクレアチン２％を含む第２液５０ｍｌを使用した。胃液処理は３７℃にて２時間、腸液処理は３７℃にて３時間それぞれをインキュベートした。
【００６７】
その後、βカロテンの極大吸収波長（４５３ｎｍ）の吸光度を測定し、溶出したβカロテンの吸光度の値を比較した。結果は、以下の表５に示すとおりとなった。
【００６８】
【表５】
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【００６９】
比較例５のパプリカでは総溶出量０．１７３６に対し、胃液処理０．１２２５となっており、総量の７０％が胃液処理で溶出している。これに対して、本発明にかかるパプリカ単細胞化粉末では、総溶出量０．７５７０に対し、腸液処理０．５８０７となっており、７６％が腸液処理で溶出している。この結果から、本発明のパプリカ単細胞化粉末を経口摂取した場合、その細胞内のβカロテンが主に腸で溶出するというドラッグデリバリーシステムの機能を持つことが明らかとなった。さらに、本発明のパプリカ単細胞化粉末は青果の４倍のβカロテンが溶出したことから、青果に比べ消化性も格段に高まることが確認された。
【００７０】
〔試験５：タンパク質の消化試験〕
試験２−２と全く同一の製法で得られた人参単細胞化粉末（以下、実施例６とする。）を使用して、胃及び腸でのタンパク質の消化試験を実施した。
【００７１】
胃液及び腸液は試験４と同じ方法で調整した。実施例６の人参単細胞化粉末を胃液又は腸液に懸濁し、３７℃にて１時間インキュベートし、胃液中及び腸液中の細胞内のタンパク質残量、及び処理液中に遊離するアミノ酸としてロイシンを定量し、それぞれ消化前のタンパク質に対する分解率、及びロイシン量の経時変化を調査した。結果は、図６のグラフに示すとおりとなった。
【００７２】
図６のグラフに示すように、実施例６の人参単細胞化粉末は、胃液処理ではタンパク質の分解は進まず、タンパク質の分解により遊離するアミノ酸（ロイシン）量は１５〜６０分の間でほとんど変化しない。一方、腸液処理ではタンパク質の分解が進み、その分解に対応して遊離アミノ酸（ロイシン）量が増加している。１時間の胃液処理でのタンパク質分解率は総量の１０％未満、腸液処理でのタンパク質分解率は総量の３３％となった。この結果から、本発明の単細胞化粉末は、経口摂取した場合、胃内では細胞内タンパク質の安定性が保たれ、腸内では細胞膜が乱れて、たんぱく質が放出及び分解されるドラッグデリバリーシステムの機能を有することが確認された。
【００７３】
以上説明したように、本発明によれば、シクロデキストリンが単細胞化された植物の細胞の周囲に集まってミセルを形成して表面が親水基となり互いに電気的に反発するので、減圧蒸留濃縮もしくは遠心分離にて濃縮するときでも、単細胞同士の凝集及び密着、再結着が防止され、単細胞の状態を保ち細胞壁を破壊することなく粉末化することが可能となり、第１の課題を解決することができる。
【００７４】
また、本発明の単細胞化粉末は、添加したシクロデキストリンが細胞膜の安定化剤として機能するので、懸濁液の凍結乾燥時や得られた単細胞化粉末の再懸濁する際にも、細胞膜の破損を防止でき、第２の課題も解決することができる。加えて、本発明によれば、以下の（１）（２）（３）の効果も得られる。
【００７５】
（１）噴霧乾燥が利用できること
本発明は、凍結乾燥だけでなく、噴霧乾燥も用いた場合でも、細胞内の状態を保って粉末化することができる。これは、噴霧乾燥の場合、例えば１２０℃以上の熱を加えることになるため、従来の粉末化方法では、細胞膜や細胞内成分に悪影響を与えることは避けられないという問題があったが、本発明では、シクロデキストリンが単細胞化された細胞の周囲に集合して膜を形成するため、このシクロデキストリンの膜によって細胞内への熱の伝達が可及的に遮断されるからである。
【００７６】
（２）粉末化された製品になった後に起きる細胞同士の接着も回避できること
単細胞化された植物の細胞壁表面に存在する水溶性多糖は吸湿性があるため、従来の粉末化方法では、粉末化された製品になった後においても、時間の経過とともに細胞壁表面が水分を含み、細胞同士が互いに接着してしまうという問題があった。しかし、本発明では、シクロデキストリン自体に吸湿性があるため、シクロデキストリンが細胞壁表面に存在する水溶性多糖に代わって水分を吸収するので、細胞壁表面が水分を含むことは可及的に抑制される。したがって、本発明では、粉末化された製品になった後に細胞同士が接着する問題点も解消され、製品の取り扱いが容易となる。
【００７７】
（３）ドラッグデリバリーシステムとして利用できること
細胞膜は胃の環境下で分解されない。本発明により得られる単細胞化粉末は、細胞膜が破損することなく安定化しているので、植物が有する天然の機能性成分の変質及びロスを低減すると共に、経口摂取した場合に胃での分解を防止し、その後小腸に達した時はじめて細胞膜が乱れて細胞内成分を放出することができる。したがって、特に胃酸での変質によって著しく効果を失う機能性成分については、腸での吸収率が向上し、その有効利用率は格段に改善される。
【００７８】
本発明は上記実施例に限らず、各請求項に記載された技術的思想の範囲内で、適宜実施の形態を変更しても良い。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の粉末化方法は、例えば、唐辛子、ゴーヤ、アロエ、にんにく、青パパイヤ、大豆、玉ねぎ、ウコン、長寿草など植物の種類は問わず、種々の植物を原材料とする健康食品や化粧品などに広く適用可能なものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】シクロデキストリンを添加しない比較例１の粉末化方法で得られた乾燥粉末を光学顕微鏡（１００倍）で撮影したものである。
【図２】懸濁液に対しβ−シクロデキストリン１重量％を添加する実施例１の粉末化方法で得られた乾燥粉末を光学顕微鏡（１００倍）で撮影したものである。
【図３】懸濁液に対しγ−シクロデキストリン１重量％を添加する実施例２の粉末化方法で得られた乾燥粉末を光学顕微鏡（１００倍）で撮影したものである。
【図４】懸濁液に対しマルトシルβシクロデキストリン１重量％を添加する実施例３の粉末化方法で得られた乾燥粉末を光学顕微鏡（１００倍）で撮影したものである。
【図５】シクロデキストリンを添加しない比較例１の粉末化方法で得られた乾燥粉末を光学顕微鏡（１００倍）で撮影したものであり、（ａ）は細胞同士が密着した状態を、（ｂ）は内容成分が流出して塊状になった状態を示したものである。
【図６】タンパク質の消化試験（試験５）の結果を示したもので、タンパク質残量と遊離ロイシン量の時間毎の変化を表したグラフである。
【図７】細胞膜保持率の測定試験（試験２−１）において実施例Ｄの粉末を水に再懸濁した時の細胞膜が破損していないアントシアニン含有赤色細胞を示したものである。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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