(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を有し、かつＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強された細胞であって、２９３細胞および２９３Ｔ細胞より選択される細胞に由来する細胞。
【請求項２】
レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子が染色体上に組み込まれていることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項３】
レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されていることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項４】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の増強がＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子の人為的導入によることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項５】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の増強がＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子の染色体上への組み込みによることを特徴とする請求項４記載の細胞。
【請求項６】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性の増強がＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子を含有するプラスミドでの形質転換によることを特徴とする請求項４記載の細胞。
【請求項７】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子が異種のプロモーターの制御下にあることを特徴とする請求項１記載の細胞。
【請求項８】
レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を有し、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換された複製能欠損組換えレトロウイルスベクター産生細胞。
【請求項９】
レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を有し、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換された複製能欠損組換えレトロウイルスベクター産生細胞を培養する工程、および
培養液上清を回収する工程
を包含する、複製能欠損組換えレトロウイルスベクターの製造方法。
【請求項１０】
下記工程を包含するレトロウイルスベクターの製造方法により製造された複製能欠損組換えレトロウイルスベクター：
レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を有し、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換された複製能欠損組換えレトロウイルスベクター産生細胞を培養する工程、および
培養液上清を回収する工程。
【請求項１１】
レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を有し、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強され、組換えレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換されたレトロウイルス産生細胞を培養する工程、
培養液上清を回収してレトロウイルスベクターを得る工程、および
該レトロウイルスベクターをレトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下に標的細胞に感染させる工程
を包含する、標的細胞への遺伝子導入方法。
【請求項１２】
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質がフィブロネクチンもしくはそのフラグメントである、請求項１１記載の標的細胞への遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学、薬学、農林水産学、食品学の分野において、細胞に遺伝子導入して形質転換するために用いるレトロウイルスベクター、前記ベクターを産生するための細胞、ならびに前記ベクターを使用する細胞への遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物への遺伝子導入法としては、ウイルスベクターを用いる方法、裸のＤＮＡをエンドサイトーシスや電気穿孔法、遺伝子銃によって導入する技術などが知られている。ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野で基礎から臨床まで幅広く利用されている技術であり、例えばアデノウイルスベクターは標的細胞で目的遺伝子を一過性に大量発現させるのに適しており、レトロウイルスベクターは、宿主染色体への安定な組み込み機能により長期安定発現が可能であり、遺伝病の遺伝子治療の分野で期待されているベクターであり、また、トランスジェニック動物作成の分野でも期待されている技術である。しかし、ウイルスベクターは、ウイルス感染を介して遺伝子導入されることからウイルスの指向性が問題となり、レセプターを細胞表面に発現していない細胞には遺伝子導入されない。このような問題を克服するため、レトロウイルスベクターのエンベロープを改変し、シュードタイプ化することによって宿主域を改変する、あるいは力価を上げる努力がなされている。レトロウイルスベクターのシュードタイプ化は、主に従来のレトロウイルスベクター、例えばマウス白血病ウイルス由来のベクターのエンベロープタンパク質を他のウイルス種のエンベロープタンパク質に置き換えることによってなされている。例えば、水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus）の外皮糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇを利用した広範な宿主域に感染可能なレトロウイルスベクター［特許文献１、非特許文献１］や、テナガザル白血病ウイルス（Gibbon ape leukemia virus；ＧａＬＶ）のエンベロープを利用してヒト造血幹細胞への導入効率を向上させたベクター［特許文献２、非特許文献２］が開発されている。【０００３】
一方、エンベロープタンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、糖タンパク質であるエンベロープの糖鎖修飾のみを改変する試みとして、体液成分によるレトロウイルスベクターの不活化を防止するためにレトロウイルス表面のα（１，３）ガラクトシルエピトープ（galactosyl epitope）を減少させる技術が検討されている［特許文献３］。ここでは、レトロウイルス産生細胞のガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子の破壊、糖鎖合成阻害剤の利用、糖鎖分解酵素の利用等が提案されている。しかしながら、遺伝子破壊は煩雑な作業であり、糖鎖合成阻害剤、糖鎖分解酵素の使用については適切な使用条件の設定が必要である。【０００４】
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（N-acetylglucosaminyltransferase III；ＧｎＴ−III）は、糖タンパク質のＮ−結合型糖鎖にバイセクティング−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基を転移する酵素である。ＧｎＴ−IIIをコードするラットおよびヒトの遺伝子はすでにクローニングされている［非特許文献３、非特許文献４］。【０００５】
Ｂ型肝炎ウイルスに感染した細胞にＧｎＴ−III遺伝子を導入すると前記ウイルスの遺伝子の発現の抑制により、ウイルスの産生が阻害されることが報告されている［非特許文献５］。レトロウイルスに関して、ＧｎＴ−IIIのウイルス産生への影響、産生されたウイルスの感染効率についての知見はない。【０００６】
【特許文献１】国際公開第９４／２９４４０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９４／２３０４８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９６／０３５２０号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｃ．Ｂｕｒｎｓ、外４名、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第９０巻、第８０３３〜８０３７頁（１９９３）
【非特許文献２】Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ、外５名、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、第６５巻、第２２２０〜２２２４頁（１９９１）
【非特許文献３】Ａ．Ｎｉｓｈｉｋａｗａ、外４名、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２６７巻、第１８１９９〜１８２０４頁（１９９２）
【非特許文献４】Ｙ．Ｉｈａｒａ、外５名、Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１３巻、第６９２〜６９８頁（１９９３）
【非特許文献５】Ｅ．Ｍｉｙｏｓｈｉ、外５名、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、第２７０巻、第２８３１１〜２８３１５頁（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
レトロウイルスのエンベロープの改変によるシュードタイピングは宿主域の改変や、感染効率の向上、ウイルス粒子の安定性の向上などの効果が期待できるものの、感染効率を向上させうるエンベロープの取得は容易ではない。そこで、我々は、レトロウイルスのエンベロ−プを改変するのではなく、産生細胞の細胞膜の糖鎖構造を修飾することによるウイルスの感染効率の向上を目指した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究の結果、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強された細胞を用いてレトロウイルスベクターを調製した場合に、この細胞から産生されるレトロウイルスベクターはフィブロネクチンのフラグメントのようなレトロウイルス結合活性を有する機能性物質の共存下での遺伝子導入効率が有意に向上することを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
本発明の第１の発明はレトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を有し、かつＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性が増強された細胞に関する。【００１０】
第１の発明の細胞としては、レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子が染色体上に組み込まれている細胞、またはレトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されている細胞が例示される。【００１１】
第１の発明において、前記細胞にはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子が人為的に導入されていてもよく、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子が染色体上に組み込まれている細胞、前記遺伝子を含有するプラスミドで形質転換されている細胞が例示される。ここで、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子は異種のプロモーターの制御下にあってもよい。【００１２】
さらに、第１の発明の細胞は、例えば２９３細胞および２９３Ｔ細胞より選択される細胞に由来するものであってもよい。【００１３】
本発明の第２の発明は、第１の発明の細胞が組換えレトロウイルスベクターで形質転換されてなる、レトロウイルス産生細胞に関する。【００１４】
本発明の第３の発明は、第２の発明のレトロウイルス産生細胞を培養し、その培養液上清を回収することを特徴とするレトロウイルスベクターの製造方法に関する。【００１５】
本発明の第４の発明は、第３の発明のレトロウイルスベクターの製造方法により製造されたレトロウイルスベクターに関する。【００１６】
本発明の第５の発明は、第４の発明のレトロウイルスベクターをレトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下に標的細胞に感染させる工程を包含する、標的細胞への遺伝子導入方法に関する。【００１７】
第５の発明において、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質としてはフィブロネクチンもしくはそのフラグメントが例示される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下で高い遺伝子導入効率を示す組換えレトロウイルスベクターが提供される。前記ベクターを使用することにより、標的細胞に高い効率で目的の遺伝子を安定に導入することができる。レトロウイルスベクターは、遺伝病に限らない種々の疾患の治療に使用することができることから、本願発明は広く医療分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図２】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図３】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図４】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図５】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図６】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図７】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図８】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図９】各種クローン由来ウイルスによる遺伝子導入効率を示す図である。
【図１０】２９３Ｔおよび２９３Ｔ／ｈＧ３−１株由来アンフォトロピックレトロウイルスによる各種感染方法における遺伝子導入効率を示す図である。
【図１１】２９３Ｔおよび２９３Ｔ／ｈＧ３−１株由来アンフォトロピックレトロウイルスによる各種感染方法における遺伝子導入効率を示す図である。
【図１２】２９３Ｔおよび２９３Ｔ／ｈＧ３−１株由来アンフォトロピックレトロウイルスによる各種感染方法における遺伝子導入効率を示す図である。
【図１３】２９３Ｔおよび２９３Ｔ／ｈＧ３−１株由来エコトロピックレトロウイルスによる各種感染方法における遺伝子導入効率を示す図である。
【図１４】２９３Ｔおよび２９３Ｔ／ｈＧ３−１株由来エコトロピックレトロウイルスによる各種感染方法における遺伝子導入効率を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明には、通常、組換えレトロウイルスベクターが使用され、特に、複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中に、ベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。【００２１】
前記の外来遺伝子には特に限定はなく、目的の細胞で発現させることが望まれる任意の遺伝子を挿入することができ、ポリペプチド（酵素、成長因子、サイトカイン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、デコイ、ＲＮＡ干渉を起こすＲＮＡ等をコードする遺伝子が例示される。本発明では、前記の外来遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターにより発現が制御されるよう、組換えレトロウイルスベクター内に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の転写を達成するためにはプロモーターおよび転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列がベクター内に存在していてもよい。さらに、好ましくは、導入された遺伝子はその下流にターミネーター配列を含有することができる。さらに、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子（例えば薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、β−ガラクトシダーゼやルシフェラーゼのようなレポーターとして機能しうる酵素をコードする遺伝子等）を有していてもよい。【００２２】
本発明に使用される組換えレトロウイルスベクター（組換えレトロウイルスベクター、本明細書では組換えレトロウイルスと記載することがある）にも限定はなく、公知のレトロウイルスベクター、例えばＭＦＧベクターやα−ＳＧＣベクター（国際公開第９２／０７９４３号パンフレット）、ｐＢａｂｅ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、第３５８７〜３５９６頁（１９９０）］、ｐＬＸＩＮ（クロンテック社製）、ｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）等のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター［ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ベクター、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来ベクター等］あるいはこれらを改変したベクターを使用することができる。【００２３】
本発明のレトロウイルスベクターはＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（以下、ＧｎＴ−IIIと記載する）の作用によって糖鎖修飾を受けたレトロウイルスベクターである。レトロウイルス粒子表面の糖鎖修飾はレトロウイルス産生細胞において行われる。当該レトロウイルス産生細胞は、レトロウイルス由来のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子を有し、かつＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII遺伝子活性が増強された細胞をレトロウイルスベクター、または前記ベクターに対応するレトロウイルスベクタープラスミドで形質転換することにより作製される。【００２４】
一般的なレトロウイルスベクターの産生方法としては、あらかじめレトロウイルスの構造タンパク質をコードするｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子を導入されたレトロウイルスパッケージング細胞に、外来遺伝子を搭載しパッケージングシグナルを有する組換えレトロウイルスベクタープラスミドを導入することによって産生させる方法と、レトロウイルスの構造タンパク質を有さない通常の細胞にｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子の発現ベクタープラスミドと同時に、外来遺伝子を搭載しパッケージングシグナルを有する組換えレトロウイルスベクタープラスミドをトランスフェクションして産生させる方法とが挙げられる。本発明には前記のいずれの方法も使用することができる。【００２５】
前者の場合、効率の良い方法を選択して組換えレトロウイルスベクタープラスミドのトランスフェクションを行えば一過性にウイルスベクターを産生させることが可能であり、また長期安定発現株を樹立してレトロウイルス産生細胞株を取得することも可能である。この方法には、公知のパッケージング細胞株、例えばＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、ＧＰ＋Ｅ−８６やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（米国特許第５,２７８,０５６号）、Ｐｓｉ−Ｃｒｉｐ［Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、第８５巻、第６４６０〜６４６４頁（１９８８）］等の細胞株を使用することができる。【００２６】
後者の場合、ほとんどの場合が一過性のウイルス産生を目的としており、力価の高いウイルスを得るには、より高いトランスフェクション効率が要求される。例えば、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞を宿主に用いることが多い。【００２７】
自己複製可能レトロウイルス粒子の出現を防止する観点からは、本発明に使用される細胞ではｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子は近接して存在しないことが好ましい。例えば、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子とｅｎｖ遺伝子が染色体上の異なる位置に組み込まれた細胞や、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を含有するプラスミドとｅｎｖ遺伝子を含有する異なるプラスミドの両者が導入された細胞が本発明には好適である。【００２８】
また、ｅｎｖ遺伝子は産生しようとするレトロウイルスベクターと同じウイルス由来のエンベロープタンパク質をコードするものに限定されるものではなく、異種ウイルス由来のｅｎｖ遺伝子を有する、シュードタイプ（pseudotyped）パッケージングのための細胞も本発明に包含される。前記のｅｎｖ遺伝子としては、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ネコ内在性ウイルス（feline endogenous virus）由来のｅｎｖ遺伝子やｅｎｖとして機能しうるタンパク質をコードする遺伝子を使用することができる。【００２９】
なお、本発明はレトロウイルスベクターを産生する細胞に限定されるものではない。組換えレトロウイルスベクターのゲノムとなる、パッケージングシグナルを有するＤＮＡ（トランスファーベクター）を有していない細胞であっても、前記ＤＮＡを導入することによりレトロウイルスベクターを産生することができるものであれば本発明の細胞に包含される。【００３０】
本願発明においては、レトロウイルスを産生する細胞においてＧｎＴ−III活性を増強させることにより、ウイルス表面タンパク質の糖鎖が修飾されたレトロウイルスベクターが作製される。【００３１】
ここで、ＧｎＴ−III活性の増強とは、細胞におけるＧｎＴ−IIIの酵素活性がその通常の量に比較して増加していることを意味する。特に本発明を限定するものではないが、本発明にレトロウイルス産生細胞として使用される細胞のＧｎＴ−III活性は、当該細胞の本来のＧｎＴ−III活性に比較して５倍以上、好ましくは１０倍以上高いＧｎＴ−III活性を有している。ＧｎＴ−IIIの酵素活性の増加は、例えばＧｎＴ−III活性を測定するか、あるいはＧｎＴ−IIIをコードする遺伝子より転写されるｍＲＮＡ量を公知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ法やノーザンハイブリダイゼーション等によって測定することにより確認することができる。【００３２】
ＧｎＴ−III活性の増強は、染色体上のＧｎＴ−IIIをコードする遺伝子の発現誘導の他、染色体上のＧｎＴ−III遺伝子の改変（コピー数の増加やプロモーター、エンハンサー等の挿入）、ＧｎＴ−III遺伝子の細胞への導入、細胞の変異処理によるＧｎＴ−III遺伝子高発現株の取得等、公知の手法により達成されうる。【００３３】
ヒトＧｎＴ−IIIをコードする遺伝子の構造は公知であり［Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１３巻、第６９２〜６９８頁（１９９３）］、この情報をもとに染色体上のＧｎＴ−III遺伝子の改変を行うことができる。例えば、レトロウイルス産生細胞として使用される細胞における、ＧｎＴ−IIIをコードする遺伝子の位置を決定し、該遺伝子の上流に天然において該遺伝子の上流に存在して該遺伝子の発現を制御しているものとは異なる異種のプロモーター、例えば強力なプロモーターや誘導可能なプロモーターを挿入し、当該遺伝子の発現量を増加させることができる。また、本願実施例に記載された、人為的にＧｎＴ−IIIをコードする遺伝子を細胞に導入する方法によれば、より簡便にＧｎＴ−III活性の増強された細胞を取得することができる。【００３４】
ＧｎＴ−IIIをコードする遺伝子の細胞への導入は、前記遺伝子をベクターに挿入して宿主に導入し、実施することができる。ベクターは公知のものから適切なものを選択すればよく、例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターを使用する場合、例えば通常のトランスフェクション法（リン酸カルシウム法やカチオニックリポソーム法など）で細胞への導入を実施することができる。さらに、導入されたＧｎＴ−IIIをコードする遺伝子が細胞の染色体ＤＮＡ上に組み込まれるような手法を用いてもよい。なお、本発明において、レトロウイルス産生細胞におけるＧｎＴ−IIIの発現は一過性発現でも、安定発現でもよい。【００３５】
レトロウイルスエンベロープタンパク質のＮ末には膜移行シグナルがあり、エンベロープタンパク質は細胞内で糖鎖が付加された後、タンパク質分解酵素によってＴＭタンパク質とＳＵタンパク質に切断され、多量体を形成して細胞膜表面に発現されると考えられている。細胞膜直下ではｇａｇ−ｐｏｌ融合タンパク質やｇａｇタンパク質がカプシドを形成し、ゲノムＲＮＡを取り込んでアッセンブリーを完了し、細胞から出芽する。このときレトロウイルスは宿主細胞の脂質二重膜を纏った形で出芽する。糖転移酵素を高発現する細胞から産生されるレトロウイルスは、ウイルス粒子の表面タンパク質が糖鎖修飾を受けていることが期待できる。従って、特に本発明の限定を意味するものではないが、ウイルス産生細胞のＧｎＴ−III活性が増強されている場合には細胞由来の膜タンパク質、ウイルスのエンベロープタンパク質にはＧｎＴ−IIIの作用によって生成する、下記式（化１）に示すバイセクティング−ＧｌｃＮＡｃ構造を有する糖鎖が付加されると考えられる。あるいは、オリゴマンノース型やハイブリッド型の糖鎖修飾の割合が増加することも考えられる。【００３６】
【化１】
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【００３７】
ＧｎＴ−IIIで糖鎖を修飾されたレトロウイルスは、例えばレトロウイルス産生細胞にＧｎＴ−III発現ベクタープラスミドを導入してＧｎＴ−III安定発現株を得、その培養上清から得ることが可能である。また、２９３細胞、２９３Ｔ細胞などにＧｎＴ−III発現ベクタープラスミドを導入してＧｎＴ−III安定発現株を得、このＧｎＴ−III導入２９３細胞、２９３Ｔ細胞などにｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子の発現ベクタープラスミドと外来遺伝子を搭載しパッケージングシグナルを有する組換えレトロウイルスベクタープラスミドを同時にトランスフェクションし、ＧｎＴ−III修飾レトロウイルスを得ることが可能である。あるいは、２９３細胞、２９３Ｔ細胞などにＧｎＴ−III発現ベクタープラスミドとｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子の発現ベクタープラスミドと外来遺伝子を搭載しパッケージングシグナルを有する組換えレトロウイルスベクタープラスミドを同時にトランスフェクションし、ＧｎＴ−III修飾レトロウイルスを得ることが可能である。このようにして得られたレトロウイルスベクターは０．４５μｍフィルターでろ過して、使用するまで超低温フリーザーで保存が可能である。【００３８】
本発明の方法により、ＧｎＴ−III活性が増強された細胞から調製された組換えレトロウイルスは、特にレトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下に実施される遺伝子導入において優れた感染効率を示す。【００３９】
レトロウイルス結合活性を有する機能性物質を使用する遺伝子導入方法は、例えば国際公開第９５／２６２００号パンフレット、国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、第８７６〜８８２頁（１９９６）等に記載されている。当該方法には、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位の両方を同一分子上に有する機能性物質を使用する方法、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と標的細胞結合部位とを有する機能性物質との混合物を使用する方法とがあるが、本発明の方法により調製されたレトロウイルスはいずれの方法にも使用することができる。【００４０】
上記の機能性物質は、レトロウイルス結合活性および／または標的細胞結合活性を有するものであれば特に限定はない。例えば、フィブロネクチン由来のヘパリン結合ドメイン（ヘパリン−IIドメイン）、線維芽細胞増殖因子、Ｖ型コラーゲンのフラグメント、前記のポリペプチドの誘導体や改変体、ポリリジン、ＤＥＡＥデキストランなどがレトロウイルス結合活性を有する機能性物質として例示される。また、標的細胞結合活性を有する機能性物質には、所望の標的細胞に結合する能力を有する任意の物質を使用することができる。特に本発明を限定するものではないが、例えば、細胞結合活性を有するポリペプチド（細胞骨格タンパク質等）、細胞もしくは細胞表面の生体分子を認識する抗体、成長因子、サイトカイン、糖鎖等が標的細胞結合活性を有する機能性物質として例示される。【００４１】
本発明の態様の１つとして、フィブロネクチン由来のヘパリン結合ドメインを含有する機能性物質の存在下に、前記のＧｎＴ−III活性が増強された細胞から調製された組換えレトロウイルスを標的細胞に感染させる、標的細胞への遺伝子導入方法が挙げられる。前記機能性物質は、好適には、細胞接着ドメインとヘパリン結合ドメインの両者を有するフィブロネクチンフラグメントが例示される。前記細胞接着ドメインとしては、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４に結合する細胞接着ドメインが特に好適である。前記のフィブロネクチンフラグメントは、生体より精製されたフィブロネクチンからプロテアーゼ消化などの手段で調製することができ、また、組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、レトロネクチンとしてタカラバイオ社から発売されている組換えフィブロネクチンフラグメントは、ヘパリン結合ドメイン、ＶＬＡ−５結合ドメイン、ＶＬＡ−４結合ドメインを有しており、本発明に好適である。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲内に限定されるものではない。【００４３】
実施例１
ヒトＧｎＴ−III発現プラスミドベクターの構築
ヒトＧｎＴ−IIIをコードするＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｅ１３１９４、配列番号１）を含むＤＮＡ断片を調製し、遺伝子発現用プラスミドベクターｐＴｒｉＥｘ−３  Ｈｙｇｒｏ（ノヴァジェン社製）のＮｃｏＩサイト−Ｓｓｅ８３８７Ｉサイト間に挿入した組換えプラスミドを作製した。この組換えプラスミドをｐｈＧ３−Ｈｙｇｒｏと命名した。【００４４】
このプラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、形質転換体１コロニーを５ｍｌのＬＢ培地中で３７℃にて８時間振とう培養した。その後、８０ｍｌのＬＢ培地で拡大培養し、ＱＩＡ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。【００４５】
実施例２
１．  ２９３Ｔ細胞導入クローンの単離
ヒト２９３Ｔ細胞［Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第７巻、第３７９〜３８７頁（１９８７）］の培養は、１０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ社製）を増殖培地とし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。組織培養用６ｃｍ径プレート（岩城硝子社製）に、１プレートあたり３×１０６個のヒト２９３Ｔ細胞を播種して一晩培養した。翌日、ヒト２９３Ｔ細胞がセミコンフルエントであることを確認し、培地を吸引除去し、あらたに１プレートあたり３ｍｌの増殖培地を添加した。【００４６】
ポリスチレン製丸底チューブ（ファルコン社製）にｐｈＧ３−Ｈｙｇｒｏ  １０μｇと２Ｍ  ＣａＣｌ２  ６２μｌを入れて滅菌蒸留水を加えて５００μｌとし、さらにトランスフェクションバッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１２ｍＭ  Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ  ７．１０）５００μｌを添加後ただちに電動ピペッターの排出を利用して２０秒間バブリングした。こうして調製した溶液を上記の２９３Ｔ細胞のプレートに均一に滴下した。対照としてｐＴｒｉＥｘ−３  Ｈｙｇｒｏ（Ｍｏｃｋ）を同様の操作で導入した２９３Ｔ細胞を調製した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２で９時間培養した後、培養上清を吸引除去し、あらたに１プレートあたり４ｍｌの増殖培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。遺伝子導入操作より２日後、各ヒト２９３Ｔ細胞をトリプシン（ギブコ社製）処理でプレートから剥がし、１０ｍｌの増殖培地に懸濁後、細胞数を計数して組織培養用１０ｃｍ径プレート（岩城硝子社製）に１プレートあたり６×１０６個、４×１０６個、２×１０６個で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日からハイグロマイシン（インビトロジェン社製）を０．３ｍｇ／ｍｌ含有する増殖培地で培養した。【００４７】
ハイグロマイシン選択培地で３〜４日毎に培地交換しながら１６日間培養後、出現したハイグロマイシン耐性コロニーをクローニングリング（岩城硝子社製）でクローニングし、４８ウェルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）の１ウェルに播種した。クローン化した各ヒト２９３Ｔ細胞は、増殖速度に合わせて２４ウェルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）、６ｃｍ径プレート、１０ｃｍ径プレートへと継代しながら培養を続け、最終的にＭｏｃｋ導入（すなわち対照としてのｐＴｒｉＥｘ−３  Ｈｙｇｒｏを導入した）ヒト２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／Ｍ）を１０クローン、ｐｈＧ３−Ｈｙｇｒｏを導入したヒト２９３Ｔ細胞（２９３Ｔ／ｈＧ３）を２０クローン得た。【００４８】
２．  発現確認
上記１にて得られた２９３Ｔ／ｈＧ３の各クローン１×１０７個よりＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。これを鋳型として下記の操作によりｃＤＮＡ合成反応を行った。５Ｕ／μｌ  ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＸＬ（ライフサイエンス社製）１μｌ、１０×ＲＮＡ  ＰＣＲバッファー（タカラバイオ社製）２μｌ、  ４０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ０．５μｌ、５０ｐｍｏｌ／μｌ  Ｒａｎｄｏｍ  ９ｍｅｒｓ  １μｌ、各１０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合液  ２μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ４μｌ、１μｇ相当の鋳型  １μｌを混合し、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ蒸留水で２０μｌにメスアップして調製した反応液を３０℃で１０分、４２℃で３０分、９９℃で５分、４℃で５分反応させた。反応後、この反応液１μｌを鋳型としてヒトＧｎＴ−III遺伝子特異的プライマー対（ｈＧ３−Ｆ１、ｈＧ３−Ｒ４；配列番号２、３にそれぞれｈＧ３−Ｆ１、ｈＧ３−Ｒ４の塩基配列を示す）を使用したＰＣＲ反応により、ヒトＧｎＴ−III遺伝子の検出を行った。反応は、９４℃で５分間反応後、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃で７分間反応した。陽性コントロールとしてｐｈＧ３−Ｈｙｇｒｏを用い、陰性コントロールには２９３Ｔ／Ｍクローンから上記と同様に調製したＲＴ−ＰＣＲ産物１μｌを用いた。ＰＣＲ反応後、反応液８μｌを２％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅断片を確認した。その結果、陰性コントロールでもヒトＧｎＴ−III遺伝子由来の断片の増幅が確認されたが、２９３Ｔ／ｈＧ３クローンから調製した鋳型を用いた場合、陰性コントロールよりも増幅産物量が増加しており、上記１で単離した２９３Ｔ／ｈＧ３クローンではｐｈＧ３−Ｈｙｇｒｏ由来のヒトＧｎＴ−IIIが発現されていることが示された。【００４９】
３．  ＧｎＴ−III酵素活性の定量
上記１にて得られた２９３Ｔ／ｈＧ３の２クローン（２９３Ｔ／ｈＧ３−１株および２９３Ｔ／ｈＧ３−６７株）、２９３Ｔ／Ｍの２クローン（２９３Ｔ／Ｍ２株および２９３Ｔ／Ｍ３株）、２９３Ｔ細胞をそれぞれ１０６〜１０７個回収し、ＰＢＳにて洗浄後、遠心分離にて得た沈殿に１００μｌのＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭＭ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（シグマ社製）を加え、室温で１５分間攪拌した。２０４００×ｇ、１５分間の遠心分離後上清を回収してＧｎＴ−III粗酵素液とし、活性測定を行った。粗酵素液の一部は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（ピアス社製）を用いてタンパク質定量を行った。【００５０】
３μｌのＧｎＴ−III粗酵素液、５μｌの２×緩衝液〔２５０ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ  （ｐＨ  ６．２５）、２００ｍＭ  ＭｎＣｌ２、４００ｍＭ  Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、１．０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〕、１μｌの０．２Ｍ  ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、１μｌの３８５ｐｍｏｌ／μｌ  Ｇｎ，Ｇｎ−ｂｉ−ＰＡ［タカラバイオ社製、PA-Sugar Chain O12、下記式（化２）にその構造を示す］を混合し、３７℃で２時間反応させた。反応後、１０μｌの反応停止液〔２％  ｓｏｄｉｕｍ  ｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅ、２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ〕を加え、９８℃で５分間加熱して酵素を失活させ、２０４００×ｇ、３分間遠心分離して上清を得た。その上清１０μｌをＨＰＬＣにより分析した。カラムはＰＡＬＰＡＫ  ＴｙｐｅＲ（ＣＡ８０００：４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、タカラバイオ社製）、溶離液は０．５％  １−ブタノールを含有する１００ｍＭ酢酸トリエチルアミン緩衝液（ｐＨ  ４．０）を使用し、カラム温度は４０℃、流速は１．０ｍｌ／分に設定した。検出には蛍光検出器を使用し、励起波長を３２０ｎｍ、検出波長を４００ｎｍに設定した。この条件でＧｎ，Ｇｎ−ｂｉ−ＰＡ糖鎖は９．６分に、Ｇｎ（Ｇｎ）Ｇｎ−ｂｉ−ＰＡ糖鎖は１８．１分に溶出された。ＧｎＴ−IIIの活性はＧｎ（Ｇｎ）Ｇｎ−ｂｉ−ＰＡ［下記式（化３）にその構造を示す］の生成量と先に定量した粗酵素液のタンパク量に基づいて算出したＧｎＴ−ＩＩＩの比活性から判定した。その結果、２９３Ｔ細胞の活性を１．０としたＧｎＴ−IIIの活性は、２９３Ｔ／Ｍ２株で２．４、２９３Ｔ／Ｍ３株で１．０、２９３Ｔ／ｈＧ３−１株で３２．２、２９３Ｔ／ｈＧ３−６７株で５９．３であった。このことから、２９３Ｔ／ｈＧ３クローンではｐｈＧ３−Ｈｙｇｒｏ由来のヒトＧｎＴ−III遺伝子のため、ＧｎＴ−III酵素活性が増強されていることが示された。【００５１】
【化２】
0005546716.tif 000003
【００５２】
【化３】
0005546716.tif 000004
【００５３】
実施例３
２９３Ｔ／ｈＧ３クローンからのウイルス調製
１．  ウイルス液の調製
上記実施例２で単離した２９３Ｔ／ｈＧ３クローンのうち、ＧｎＴ−III遺伝子の発現が確認された７クローンを選択し、アンフォトロピックレトロウイルス液を調製した。対照実験として２９３Ｔ細胞と２９３Ｔ／Ｍの２クローンについても同様の操作を行った。６ウェルの組織培養用プレート（岩城硝子社製）の１ウェルあたり上記の各細胞クローンのそれぞれを１．５×１０６個ずつ播種し、２ｍｌの１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した。翌日、各細胞クローンがセミコンフルエントであることを確認し、各ウェルの培地を吸引除去し、あらたに１ウェルあたり１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを１．５ｍｌ添加した。更にクロロキン（和光純薬社製）を終濃度２５μＭとなるように各ウェルに加えた。ポリスチレン製丸底チューブ内にてレトロウイルスの構成タンパク質ｇａｇ−ｐｏｌを発現させるベクター、ｐＧＰ  プラスミドベクター（タカラバイオ社製）を２７．５μｇと、同じくアンフォトロピックｅｎｖを発現させるためのｐＥ−ａｍｐｈｏプラスミドベクター（タカラバイオ社製）を２７．５μｇ、レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）にプラスミドｐＱＢＩ２５（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社製）に挿入されているクラゲ由来の蛍光タンパク質（Red-shift Green Fluorescent Protein：ｒｓＧＦＰ）遺伝子を挿入したレトロウイルス産生用プラスミドベクターを５５μｇ、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ３４１μｌをあわせて滅菌蒸留水で２７５０μｌに調製し、これを１３００μｌずつ  ２本に分けた。１本のチューブにつきトランスフェクションバッファー１３００μｌを添加後ただちに電動ピペッターの排出を利用して２０秒間バブリングし、各ウェルに５００μｌずつ均一に滴下した。このプレートを３７℃、５％ＣＯ２にて９時間培養した後、培養上清１．５ｍｌを除去し、あらたに１ウェルあたり２ｍｌの１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを添加して培養を続けた。遺伝子導入操作より２４時間後、各ウェルの培地を新鮮な１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ  ２ｍｌと交換し、更に２４時間培養した後、培養上清を採取し、０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過してウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃で保存した。【００５４】
２．  ウイルス上清液の力価の測定
ウイルス上清液の力価の測定はＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）を使用して標準的な方法［Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁（１９８８年）］に従って測定した。すなわち、６ウェルの組織培養用プレートに１ウェルあたり５×１０４個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１０％ウシ血清（ギブコ社製）を含有するＤＭＥＭ  ２ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した後、培地を吸引除去し、各ウェルに系列希釈したウイルス上清液１ｍｌを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）を終濃度８μｇ／ｍｌとなるように加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２で４〜６時間培養し、更に１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭを１ｍｌ添加して７２時間培養した。このプレートより回収した細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）による解析に供し、ｒｓＧＦＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の割合を測定した。ウェルあたりの仕込み細胞数にｒｓＧＦＰ発現細胞の割合とウイルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清１ｍｌあたりの感染性粒子数（I.V.P.／ｍｌ）を算出し、ウイルス力価とした。ウイルス調製を数回行い、ウイルス力価を測定したところ、２９３Ｔ／ｈＧ３クローン由来のウイルス液の力価は１．９×１０５I.V.P.／ｍｌから２．８×１０６I.V.P.／ｍｌの範囲であり、対照実験として用いた２９３Ｔ細胞由来のウイルス液の力価は９．４×１０５I.V.P.／ｍｌから１．６×１０６I.V.P.／ｍｌ、２９３Ｔ／Ｍクローン由来のウイルス液力価は１．８×１０６I.V.P.／ｍｌから２．６×１０６I.V.P.／ｍｌの範囲であった。【００５５】
実施例４
１．  ＣＨ−２９６コートプレートの作製
表面未処理２４ウェルプレート（ファルコン社製）に１ウェルあたり５００μｌの３２μｇ／ｍｌのフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（レトロネクチン；タカラバイオ社製）を添加して４℃で一晩放置した後、２％ＢＳＡ／ＰＢＳで室温にて３０分間ブロッキングし、さらにＰＢＳで洗浄した。このプレートをＣＨ−２９６コートプレートとし、必要に応じて作製した。【００５６】
２．  ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への遺伝子導入
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への遺伝子導入に使用したウイルスは、実施例３で調製したウイルス液のうち、ヒトＧｎＴ−III修飾ウイルスとして２９３Ｔ／ｈＧ３−１株および２９３Ｔ／ｈＧ３−６７株より調製したウイルスを選択した。対照として２９３Ｔ細胞より調製したウイルス、及びＭｏｃｋウイルスとして２９３Ｔ／Ｍ２株より調製したウイルス１種を選択した。これらウイルスを用いて、上記のＣＨ−２９６コートプレートを用いてＮＩＨ／３Ｔ３細胞へ感染させ、ヒトＧｎＴ−III遺伝子が導入された細胞から調製されたレトロウイルスの感染性の変化を以下に示す操作によって調べた。【００５７】
１０ｃｍ径プレートでセミコンフルエントに生育したＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、トリプシン処理でプレートから剥がし、１０ｍｌの１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭに懸濁後、１９０×ｇ、３分遠心して細胞を集め、生細胞数を計数して１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭにて２×１０５個／ｍｌに調製した。また、実施例３で得られた各ウイルス液を１０％ウシ胎仔血清（ＪＲＨ社製）含有のＤＭＥＭで希釈し、２×１０４I.V.P.／ｍｌに調製した。ＣＨ−２９６コートプレートの１ウェルに上記のＮＩＨ／３Ｔ３細胞液  １００μｌ、希釈ウイルス液  ２００μｌ、１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ  ２００μｌを添加し、３日間３７℃、５％ＣＯ２で培養した。３日後のＮＩＨ／３Ｔ３細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅによる解析に供し、ｒｓＧＦＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の割合を測定し遺伝子導入効率とした。ＣＨ−２９６コートプレートを用いた感染の対照実験として組織培養用２４ウェルプレートに１ウェルあたり２×１０４個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ  ５００μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した後、培地を吸引除去し、各ウェルに上記で調製した２×１０４I.V.P.／ｍｌのウイルス液２００μｌと１０％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ  ３００μｌを加え、更にポリブレンを終濃度８μｇ／ｍｌとなるように加えた。これを３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養し、３日後のＮＩＨ／３Ｔ３細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅに供し、ｒｓＧＦＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の割合を測定した。【００５８】
上記の実験の結果を図１に示す。図中、横軸にはウイルス液が調製された細胞が記載されており、（Ｐｂ）はポリブレン存在下に感染が実施された群を、（ＲＮ）はＣＨ−２９６コートプレートで感染が実施された群をそれぞれ示す。縦軸は遺伝子導入効率（％）を示す。【００５９】
ポリブレンを用いて感染させた対照実験の場合、ｒｓＧＦＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の割合は各ウイルス間でほぼ同等であったが、ＣＨ−２９６コートプレートを用いた場合、ヒトＧｎＴ−III修飾ウイルスを感染させたＮＩＨ／３Ｔ３細胞ではｒｓＧＦＰ発現細胞の割合が非修飾ウイルス感染ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対して１．７〜２．２倍に上昇した（図１）。これは、ＣＨ−２９６コートプレートを用いた場合、ヒトＧｎＴ−IIIによって膜表面が修飾されたレトロウイルスではその感染性が向上することを示すものである。【００６０】
３．  血球系細胞への遺伝子導入
ヒトＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）は１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社製）を増殖培地とし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。また、ヒトＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２００３）は１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０を増殖培地とし、終濃度２ｎｇ／ｍｌの顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ：シェリング・プラウ社製）存在下のもと、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。実施例３で調製したウイルス液を上記２に記載の方法でＣＨ−２９６コートプレートを用いてM.O.I.（multiplicity of infection）＝０．２の条件で感染させた。細胞の調製、ウイルスの希釈には各細胞の増殖培地を用いた。感染から３日後の各細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅに供し、ｒｓＧＦＰ発現各細胞の割合を測定した。この結果を図２、３に示す。図２はＫ５６２細胞、図３はＴＦ−１細胞についての結果を示しており、図中、横軸にはウイルス液が調製されたクローン名が記載されている。縦軸は遺伝子導入効率（％）を示す。【００６１】
ヒトＧｎＴ−III修飾ウイルスを感染させたＫ５６２、及びＴＦ−１細胞ではｒｓＧＦＰ発現細胞の割合が非修飾ウイルス感染Ｋ５６２、及びＴＦ−１細胞に対して１．５〜１．７倍に上昇した。【００６２】
４．  各種細胞への遺伝子導入
ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１２１）、２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、Ａ３７５Ｍ細胞［Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．、第３８巻、第１３７〜１４７頁（１９８７）］、ＫＢ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７）、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２９）は１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを増殖培地とし、ＭＫＮ１細胞（ＢＲＣ  ＲＣＢ１００３）は１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０を増殖培地として３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。実施例３で調製したウイルス液のうち、ヒトＧｎＴ−III修飾ウイルスとして２９３Ｔ／ｈＧ３−１より調製したウイルス、対照として２９３Ｔ及び２９３Ｔ／Ｍ２より調製したウイルスを用い、上記２と同様にM.O.I.＝０．２の条件で、ポリブレンあるいはＣＨ−２９６コートプレートを用いて各種細胞へ感染させた。感染から３日後の各細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅに供し、ｒｓＧＦＰ発現各細胞の割合を測定した。この結果を図４〜９に示す。図４〜９にはそれぞれＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、Ａ３７５Ｍ細胞、ＫＢ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞、ＭＫＮ１細胞での結果が示されている。図中、横軸にはウイルス液が調製されたクローン名が記載されており、（Ｐｂ）はポリブレン存在下に感染が実施された群を、（ＲＮ）はＣＨ−２９６コートプレートで感染が実施された群をそれぞれ示す。縦軸は遺伝子導入効率（％）を示す。【００６３】
ヒトＧｎＴ−III修飾ウイルスを感染させた各細胞ではｒｓＧＦＰ発現細胞の割合が非修飾ウイルス感染各細胞に対して上昇した。【００６４】
実施例５
２９３Ｔ／ｈＧ３クローンからのウイルス調製と標的細胞への遺伝子導入
１．ウイルス液の調製
実施例２で単離した２９３Ｔ／ｈＧ３クローンのうち、発現の確認されたものから２９３Ｔ／ｈＧ３−１株を選択し、アンフォトロピックレトロウイルス液、およびエコトロピックレトロウイルス液を調製した。対照実験として２９３Ｔ細胞についても同様の操作を行った。組織培養用６センチ径プレート（岩城硝子社製）に３×１０６個の２９３Ｔあるいは２９３Ｔ／ｈＧ３クローンを播種し、４ｍｌの１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩培養した。翌日、２９３Ｔおよび２９３Ｔ／ｈＧ３クローンがセミコンフルエントであることを確認し、各プレートの１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを吸引除去し、あらたに１プレートあたり１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを３ｍｌ添加した。更にクロロキン（和光純薬社製）を終濃度２５μＭとなるように各プレートに加えた。アンフォトロピックレトロウイルス調製用にポリスチレン製丸底チューブを２本用意し、各チューブ内にてｐＧＰプラスミドベクター（タカラバイオ社製）を５μｇと、アンフォトロピックｅｎｖを発現させるためのｐＥ−ａｍｐｈｏプラスミドベクター（タカラバイオ社製）を５μｇ、レトロウイルスベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）にｒｓｇｆｐ遺伝子を搭載したレトロウイルス産生用プラスミドベクターを１０μｇ、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ６２μｌをあわせて滅菌蒸留水で５００μｌに調製した。同様に、エコトロピックレトロウイルス調製用にポリスチレン製丸底チューブを２本用意し、各チューブ内にてｐＧＰプラスミドベクターを５μｇと、エコトロピックｅｎｖを発現させるためのｐＥ−ｅｃｏプラスミドベクター（タカラバイオ社製）を５μｇ、レトロウイルスベクタープラスミｐＤＯＮ−ＡＩにｒｓｇｆｐ遺伝子を搭載したレトロウイルス産生用プラスミドベクターを１０μｇ、２Ｍ  ＣａＣｌ２  ６２μｌをあわせて滅菌蒸留水で５００μｌに調製した。１本のチューブにつきトランスフェクションバッファー５００μｌを添加後ただちに電動ピペッターの排出を利用して２０秒間バブリングし、各プレートに１ｍｌずつ均一に滴下した。これを３７℃、５％ＣＯ２にて９時間培養し、９時間後、培養上清３ｍｌを除去し、あらたに１プレートあたり４ｍｌの１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭを添加し、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。遺伝子導入操作より２４時間後、各プレートの培地を新鮮な１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ  ４ｍｌと交換し、３７℃、５％ＣＯ２にて更に２４時間培養した後、培養上清を０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過してウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃で保存した。【００６５】
２．ウイルス上清液の力価の測定
ウイルス上清液の力価の測定はＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用し、実施例３の２．ウイルス上清液の力価の測定に準じて行った。アンフォトロピックレトロウイルスの力価は、２９３Ｔ／ｈＧ３クローン由来のウイルス液が１．９×１０６I.V.P.／ｍｌ、対照実験として用いた２９３Ｔ細胞由来のウイルス液が１．１×１０６I.V.P.／ｍｌ、エコトロピックレトロウイルスの力価は、２９３Ｔ／ｈＧ３クローン由来のウイルス液が３．７×１０６I.V.P.／ｍｌ、対照実験として用いた２９３Ｔ細胞由来のウイルス液が６．０×１０６I.V.P.／ｍｌであった。【００６６】
３．ヒトＧｎＴ−III修飾アンフォトロピックレトロウイルスを利用した遺伝子導入
上記実施例５の１で調製したウイルス液のうち、２９３Ｔ／ｈＧ３−１株で調製されたヒトＧｎＴ−III修飾アンフォトロピックレトロウイルスと、対照として２９３Ｔ細胞より調製されたアンフォトロピックレトロウイルスを用い、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への遺伝子導入をポリブレン（Ｐｂ）法及びＣＨ−２９６コートプレートを用いたＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔ（ＳＮ）法を用いてM.O.I.＝０．２の条件で行った。また、ＨＴ１０８０細胞、Ｋ５６２細胞へは、同じくＰｂ法及びＳＮ法と、ＣＨ−２９６コートプレートを用いたＢｏｕｎｄ  ｖｉｒｕｓ（ＢＶ）法の３種で行った。ＨＴ１０８０細胞については各種方法でM.O.I.＝０．２の条件で感染させ、Ｋ５６２細胞へはM.O.I.＝２．０の条件で感染させた。Ｐｂ法、ＳＮ法は、それぞれ実施例４の２記載の方法に従って行った。ＢＶ法はウイルス液を１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０を用いてＨＴ１０８０細胞への感染用に８×１０３I.V.P.／ｍｌ、Ｋ５６２細胞への感染用に８×１０４I.V.P.／ｍｌに調製し、ＣＨ−２９６コートプレートの１ウェルに５００μｌずつ添加した後、そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターにて４時間静置してＣＨ−２９６へのウイルスの吸着を促し、４時間後、ウイルス上清を除去して１ウェル０．５ｍｌずつの１×ＰＢＳで洗浄後、４×１０４／ｍｌに調製した各細胞を１ウェルに５００μｌずつ添加して感染させた。これを３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養し、３日後の各細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、ＧＦＰ発現各細胞の割合を測定した。この結果を図１０〜１２に示す。図１０〜１２はそれぞれＮＩＨ／３Ｔ３細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｋ５６２細胞での結果が示されている。図中、横軸には感染方法が示されており、Ｐｂはポリブレン存在下に感染が実施された群を、ＳＮはＣＨ−２９６コートプレートでＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔ法を用いて感染が実施された群を示し、ＢＶはＣＨ−２９６コートプレートでＢｏｕｎｄ  ｖｉｒｕｓ法で感染が実施された群をそれぞれ示す。縦軸は遺伝子導入効率（％）を示す。
ヒトＧｎＴ−III修飾ウイルスを感染させた各細胞では、ＣＨ−２９６存在下でｒｓＧＦＰ発現細胞の割合が非修飾ウイルス感染各細胞に対して上昇した。【００６７】
４．ヒトＧｎＴ−III修飾エコトロピックレトロウイルスを利用した遺伝子導入
上記実施例５の１で調製したウイルス液のうち、２９３Ｔ／ｈＧ３−１株で調製されたヒトＧｎＴ−III修飾エコトロピックレトロウイルスと、対照として２９３Ｔ細胞より調製されたエコトロピックレトロウイルスを用い、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞への遺伝子導入をＰｂ法及びＣＨ−２９６コートプレートを用いたＳＮ法を用いてM.O.I.＝０．２の条件で行った。また、マウスＬ１２１０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１９）は１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０を増殖培地とし、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養を行い、Ｐｂ法及びＳＮ法と、ＣＨ−２９６コートプレートを用いたＢＶ法の３種で、M.O.I.＝２．０の条件で感染を行った。Ｐｂ法、ＳＮ法は、それぞれ実施例４の２記載の方法に従って行い、ＢＶ法は上記３記載の方法に従って行った。これを３７℃、５％ＣＯ２で３日間培養し、３日後の各細胞をフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）に供し、ＧＦＰ発現各細胞の割合を測定した。この結果を図１３、１４に示す。図１３、１４はそれぞれＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｌ１２１０細胞での結果が示されている。図中、横軸には感染方法が示されており、Ｐｂはポリブレン存在下に感染が実施された群を、ＳＮはＣＨ−２９６コートプレートでＳｕｐｅｒｎａｔａｎｔ法を用いて感染が実施された群を示し、ＢＶはＣＨ−２９６コートプレートでＢｏｕｎｄ  ｖｉｒｕｓ法で感染が実施された群をそれぞれ示す。縦軸は遺伝子導入効率（％）を示す。
ヒトＧｎＴ−III修飾ウイルスを感染させた各細胞では、ＣＨ−２９６存在下でｒｓＧＦＰ発現細胞の割合が非修飾ウイルス感染各細胞に対して上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によれば、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質の存在下で高い遺伝子導入効率を示す組換えレトロウイルスベクターが提供される。前記ベクターを使用することにより、標的細胞に高い効率で目的の遺伝子を安定に導入することができる。レトロウイルスベクターは、遺伝病に限らない種々の疾患の治療に使用することができることから、本願発明は広く医療分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６９】
SEQ ID NO:2; Synthetic primer hG3-F1 to amplify a gene encoding GnT-III.
SEQ ID NO:3; Synthetic primer hG3-R4 to amplify a gene encoding GnT-III.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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