(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マラリアを引き起こす病原体に対するヒトの免疫感作方法に用いるためのワクチンであって、
ａ）応答を確立するのに十分な初回刺激量中に、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の全部又は実質的に全部をコードしている少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、ヒトの免疫応答を初回刺激するための初回刺激成分と、
ｂ）その初回刺激による免疫応答を追加刺激するのに十分な追加刺激量中に、前記スポロゾイト周囲タンパク質の全部又は実質的に全部をコードしているポリヌクレオチドと共通する少なくとも１つのエピトープを有し、前記スポロゾイト周囲タンパク質又はその断片を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む、前記ヒトの前記の初回刺激による免疫応答を追加刺激するための追加免疫成分と
を含み、前記初回刺激成分の投与がＣＤ８＋Ｔ細胞を初回刺激し、前記追加免疫成分の投与が、初回刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞を復活させ、前記初回刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を広げ、さらに抗マラリアＣＤ８＋Ｔ細胞、抗マラリアＣＤ４＋Ｔ細胞、及び抗マラリア抗体の産生をもたらす、上記ワクチン。
【請求項２】
前記追加免疫成分が、前記初回刺激成分のスポロゾイト周囲タンパク質の全部又は実質的に全部をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの全部又は一部を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記初回刺激量が、０．０１μｇ〜５０ｍｇである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記初回刺激量が２５００μｇである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記初回刺激量を、前記追加免疫成分の投与前に１回〜５回投与する、請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
前記追加刺激量が１μｇ〜１００μｇである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記追加刺激量が５０μｇである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記追加刺激量が２５μｇである、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
前記初回刺激成分を、ＩＭ、ＩＶ、ＩＤ、皮下、経粘膜、組換え細菌、組換えウイルス、若しくは遺伝子銃、又はこれらの組合せから選択される方法によって投与する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記追加免疫成分を、ＩＭ、ＩＶ、ＩＤ、皮下、経粘膜、若しくは急速注射装置、又はこれらの組合せから選択される方法によって投与する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、細胞障害性Ｔリンパ球を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１２】
前記初回刺激成分がＰｆＣＳＰを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記追加免疫成分がＲＴＳ，Ｓを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記初回刺激成分が、スポロゾイト周囲タンパク質の実質的に全部を含み、前記追加免疫成分がＲＴＳ，Ｓを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記のマラリアを引き起こす病原体が熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１６】
マラリアを引き起こす病原体に対するヒトの免疫感作用のキットであって、
ａ）応答を確立するのに十分な初回刺激量中に、スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の全部又は実質的に全部をコードしている少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む、ヒトの免疫応答を初回刺激するための初回刺激ワクチンと、
ｂ）その初回刺激による免疫応答を追加刺激するのに十分な追加刺激量中に、前記スポロゾイト周囲タンパク質の全部又は実質的に全部をコードしているポリヌクレオチドと共通する少なくとも１つのエピトープを有し、前記スポロゾイト周囲タンパク質又はその断片を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む、前記ヒトの前記の初回刺激による免疫応答を追加刺激するための追加免疫ワクチンと
を含み、前記初回刺激ワクチンの投与がＣＤ８＋Ｔ細胞を初回刺激し、前記追加免疫ワクチンの投与が、初回刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞を復活させ、前記初回刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を広げ、さらに抗マラリアＣＤ８＋Ｔ細胞、抗マラリアＣＤ４＋Ｔ細胞、及び抗マラリア抗体の産生をもたらすキット。
【請求項１７】
前記初回刺激ワクチンがＰｆＣＳＰを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記追加免疫ワクチンがＲＴＳ，Ｓワクチンを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記初回刺激ワクチンがＣＳタンパク質の実質的に全部又はその断片をコードしている少なくとも１種のポリヌクレオチドを含み、前記追加免疫ワクチンがＣＳタンパク質の実質的に全部又はその断片を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む、請求項１６記載のキット。
【請求項２０】
前記初回刺激ワクチンがＰｆＣＳＰを含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記追加免疫ワクチンが、ＣＳタンパク質のＣ末端部分の実質的に全部、免疫優性領域の４箇所以上の縦列型反復部分、及びＢ型肝炎ウイルス由来表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を含むハイブリッドタンパク質を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記追加免疫ワクチンが、ＲＴＳ，Ｓ、及びＴｈ１を誘導するアジュバントを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の実質的に全部又はその断片をコードしている少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む初回刺激組成物と、前記スポロゾイト周囲タンパク質の実質的に全部又はその断片を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む追加免疫組成物とを、別々の構成部分として含むワクチンであって、前記追加免疫組成物は、前記スポロゾイト周囲タンパク質の全部又は実質的に全部をコードしているポリヌクレオチドと共通する少なくとも１つのエピトープを有し、前記初回刺激組成物の投与がＣＤ８＋Ｔ細胞を初回刺激し、ひき続く前記追加免疫組成物の投与が前記初回刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞を復活させ、前記初回刺激によるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を広げ、抗マラリアＣＤ８＋Ｔ細胞、抗マラリアＣＤ４＋Ｔ細胞、及び抗マラリア抗体の産生をもたらす、上記ワクチン。
【請求項２４】
前記初回刺激組成物がＰｆＣＳＰを含む、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記追加刺激組成物が、前記ＣＳタンパク質のＣ末端部分の実質的に全部、免疫優性領域の４箇所以上の縦列型反復部分、及びＢ型肝炎ウイルス由来表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を含むハイブリッドタンパク質を含む、請求項２３に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記追加免疫組成物が、ＲＴＳ，Ｓ、及びＴｈ１を誘導するアジュバントを含む、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
前記追加免疫ワクチンが、前記ＣＳタンパク質のＣ末端部分の実質的に全部、免疫優性領域の４箇所以上の縦列型反復部分、及びＢ型肝炎ウイルス由来表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を含むハイブリッドタンパク質を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項２８】
前記追加免疫ワクチンが、ＲＴＳ，Ｓ、及びＴｈ１を誘導するアジュバントを含む、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項２９】
前記ワクチンがさらにアジュバントを含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項３０】
前記追加免疫ワクチンがさらにアジュバントを含む請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年１０月２３日出願の米国特許仮出願第６０／４２０，２６５号（整理番号４０１２．６００１）及び２００３年２月１３日出願の米国特許仮出願第６０／４４７，０２６号（整理番号４０１２．６００２）に基づくものであり、その利権を主張する。これら仮出願の開示は、その全体を本明細書の依拠するところとし、参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、熱帯地方及び亜熱帯地方では公衆衛生の最も大きな問題の一つである。毎年、３〜５億人の人々が新しいマラリア原虫に感染し、開発途上の国々では最高で２７０万人がマラリアで死亡している（１１０）。熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、マラリアによる死の大多数の原因となっているプスモディウム種である。
【０００３】
熱帯熱マラリア原虫の生活環は、４期に分かれており、そのうち３期は人体中で営まれる。一般に１１５を参照されたい。第１期では、感染性のスポロゾイトをその唾液腺に入れて運ぶ蚊が、ヒトから血液というエサを得、そうしている際に、そのヒトの血流にそれらスポロゾイトを伝染させる。肝臓の実質細胞中に入ると、スポロゾイトは、複製してメロゾイトになる。第２期では、メロゾイトが赤血球（ＲＢＣ）に感染しながら血流中を移動する。ＲＢＣは、メロゾイトで満たされると破裂し、子孫を放出し、これが新たなＲＢＣに感染する。貧血は、この感染段階としてよくある症状である。最終的に、これらＲＢＣのいくらかが、雄性及び雌性の生殖母細胞も産生することになる（第３期）。最終段階では、感染させた蚊が、感染したヒトを食し、生殖母細胞を消化する。蚊の中で、雌性の生殖母細胞が受精して、感染性のスポロゾイトの産生をもたらし、こうして生活環が完了する。
【０００４】
熱帯熱マラリア原虫などの病原体が人体に侵入するとき、人体は、免疫系を活性化して応答する。最初に、全身性の応答が起こった後、病原体特異的な応答が生じる。病原体特異的な応答は、侵入病原体に特有の抗原を標的とする。病原体特異的応答の主な２つの部門は、細胞性と液性である。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞は、細胞性免疫応答に関与する。詳細には、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、マクロファージなど、免疫系の他の構成要素に様々な刺激作用を及ぼすインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｙ）などのサイトカインを産生する。ＣＤ８＋Ｔ細胞の特別なクラスである細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、病原体抗原をその表面に発現させている感染細胞細胞を特異的に死滅させる。対照的に、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はヘルパーＴ細胞は、ＣＴＬの発育を促進し、Ｂ細胞を分裂させ、最終的に抗体を産生する。ヘルパーＴ細胞は、ＴＨ１ＣＤ４＋Ｔ細胞とＴＨ２ＣＤ４＋Ｔ細胞の２種のサブセットに分けることができ、これらは、それぞれが産生するサイトカインのプロフィールに従って同定される。病原体特異的免疫応答の第２の部門は、液性応答であり、その際、Ｂ細胞が複製し、分化し、やがて病原体を直接に結合する抗体を産生する。抗体は、宿主細胞と結合していない病原体を覆うのに特に有用である。次いで、マクロファージなどの食細胞が、抗体によって覆われた病原体を飲み込む。
【０００５】
マラリア感染に関しては、病原体特異的免疫応答の別の部門が、熱帯熱マラリア原虫生活環の特定の段階で最も効果的である。感染性のスポロゾイトは、肝臓へと移動し、肝細胞に侵入するとき、細胞内病原体となり、感染細胞の外で過ごす時間はほとんどない。この段階では、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞とＩＦＮ−γなどのそのサイトカイン産物が、感染した宿主細胞の殺し屋役を主に担うことから、これらの細胞は特に重要である。米海軍医学研究センター（ＮＭＲＣ）のマラリア事業及び他の研究所の重要なデータは、ネズミのマラリアにおける細胞内の肝臓寄生体が消滅するかどうかが、肝臓期の寄生体によって発現されるペプチドに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の応答次第であることを示唆している（４５）。ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇すると、スポロゾイトによる攻撃に対する防御が絶たれ（２７、３１、９０、９３、１０８）、未処置動物にＣＤ８＋Ｔ細胞を養子移入すると、防御が付与される（５６、８５、８７、１０９）。
【０００６】
ＤＮＡワクチンは、抗原特異的なＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＴｈ１に偏ったＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含む、細胞内病原体及び腫瘍に対する主要機序である細胞媒介性の免疫応答を誘発する（６、１１、４５、６３、１０４、１０６）。しかし、これまでＤＮＡワクチンは、ヒトにおける防御免疫応答の誘発について最適状態に及ばないことがわかっている。
【０００７】
対照的に、マラリア感染が第２期に及び、ＲＢＣに感染するとき、感染性のメロゾイトは、ＲＢＣ内で複製するだけでなく、血流中を自由に循環する。この感染段階を扱う上では、２点の理由から抗体が最も有効である。第１に、ＣＴＬでは、感染宿主細胞が、ＭＨＣ−Ｉと呼ばれる特別なタンパク質上に抗原を提示する必要がある。ＲＢＣは、ＭＨＣ−Ｉを発現させず、そのためにＣＴＬの有効性が弱まる。第２に、上で論じたように、抗体は、宿主細胞と結合していない病原体に対する食作用を媒介する。したがって、感染の第２期では、Ｂ細胞、及びＢ細胞を刺激するＣＤ４＋Ｔ細胞の両方が、感染と闘うために重要である。
【０００８】
熱帯熱マラリア原虫に対するヒトの免疫応答が複雑であること、並びに多段階の寄生生活環にタンパク質の段階特異的な発現が伴うことは、熱帯熱マラリア原虫に対するワクチンの開発が困難となる一因である。それでもなお、マラリアワクチンは求められて止まない。
【０００９】
スポロゾイト期の熱帯熱マラリア原虫は、マラリアワクチンの潜在的なターゲットとして同定されている。スポロゾイトの主な表面タンパク質は、スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳタンパク質）として知られている。７Ｇ８系統由来のタンパク質は、クローン化、発現、及び配列決定がなされている（２１）。このタンパク質は、４回の副繰返し単位Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｐｒｏを差し挟んで３７回繰り返されるテトラペプチドＡｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏを含む中央の免疫優性反復領域を有することを特徴とする。他の株では、主副の各繰返し単位の数、並びにその相対的な位置が異なる。この中心部分は、ＣＳタンパク質の反復なし部分と呼ばれる繰り返されないアミノ酸配列からなるＮ末端及びＣ末端部分に隣接している。
【００１０】
熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲（ＰｆＣＳＰ）遺伝子を発現させるプラスミドを含有するＤＮＡ系ワクチンが、米カリフォルニア州サンディエゴのＶｉｃａｌ，Ｉｎｃ．及び米海軍医学研究センターによって開発されている（４７）。このワクチンは、１ｍｌあたり２５００μｇの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に含まれる裸のＤＮＡからなるものである。プラスミドは、全ＰｆＣＳＰ遺伝子をコードする全長遺伝子を含み、発現が、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子のプロモーター／エンハンサー、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子の５’側非翻訳領域、及びウシ成長ホルモン遺伝子の転写ターミネーターによって制御されるものである（６４）。哺乳動物細胞中での抗原の発現及び分泌を増強するため、コード配列の５’末端に、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質（ｈＴＰＡ）のリーダーペプチドをコードする配列を付加してあった。したがって、このＰｆＣＳＰプラスミドに含まれる２本のオープンリーディングフレーム配列は、カナマイシン耐性タンパク質とｈＴＰＡリーダー／ＰｆＣＳＰ融合タンパク質とをコードする（４０）。このＰｆＣＳＰプラスミドは、ウイルス性若しくは発癌性のタンパク質をコードする既知の配列を含んでいない。このプラスミドは、６２６１個のヌクレオチド塩基対を含み、その分子量は、平均のＤＮＡ塩基対が６５０ｇｍｕであるとすれば、４．０７×１０６ｇｍｕである。
【００１１】
このＰｆＣＳＰ  ＤＮＡプラスミドは、精製プラスミドから得たクローン化されたＤＮＡ区域を使用し、標準の分子遺伝学技術を利用して構築した。このプラスミドは、細菌（大腸菌）細胞をカナマイシン選択培地で培養して産生させた。細菌細胞によって醗酵させた後、プラスミドＤＮＡを精製した。
【００１２】
臨床治験の開始前に、ＮＭＲＣでＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンの前臨床免疫原性試験を実施した。詳細には、ＰｆＣＳＰプラスミドを培養哺乳動物細胞に一過性に形質移入し、その後、免疫ブロット分析によって抗体発現を評価した。このプラスミドが、マウス及び非ヒト霊長類で抗原特異的な抗体応答及びＣＴＬ応答を誘発する能力も試験した（４０、１０５）。マウスモデルでの試験では、プラスミドＤＮＡによる免疫感作の後に抗原特異的なＣＴＬ応答及び抗体応答が誘発されたことが実証された（３０）。試験ではさらに、免疫感作の筋肉内（ＩＭ）経路が、他の系で報告されたものと比べて、ＣＤ８＋Ｔｈ１免疫応答の誘発に最適であったことを確認した（３０）。さらに、後続の試験では、ＰｆＣＳＰプラスミドによる免疫感作を、単独で、又は赤血球期前肝臓期の他の熱帯熱マラリア原虫タンパク質をコードする最高で４種の他のプラスミドと組合せて、ＩＭ経路によって施した６匹のすべてのアカゲザルの抗原特異的なＣＴＬ応答及び／又は抗体応答が検出可能であったことが示された（１０６）。
【００１３】
臨床治験で使用する前に、大規模な臨床前安全性試験を実施した。この試験は、１）静脈内（ＩＶ）経路又はＩＭ経路で投与したプラスミドＤＮＡのマウス組織分布試験、２）マウス及びウサギでの反復投与安全性試験、及び３）マウスでのプラスミドＤＮＡ組込み試験を含むものであった（６７、７５）。これら試験の概略を以下に示す。
【００１４】
プラスミド分布試験：Ｐａｒｋｅｒらは、マウスの異なる組織におけるプラスミド分布を評価している（７５）。マウスに、ヒトに推奨される最高ｍｇ／ｋｇ用量の２５倍とした１回分のＰｆＣＳＰプラスミドをＩＶ又はＩＭで投与した。組織を収集し、ＰＣＲを使用して、ＩＶ投与後には投与後１時間、２日、及び４週間、ＩＭ投与後には２日、４週間、及び８週間の時点でのプラスミドＤＮＡの存在を評価した。プラスミドＤＮＡは、ＩＭ投与してから１時間後には全組織にくまなく分布したことがわかった。ＩＭ投与してから２日後までに、プラスミドは、骨髄、血液、及び注射部位でしか見られなくなり、注射部位で最も高レベルであった。プラスミドＤＮＡは、ＩＭ投与してから１週間後までに、注射部位でしか検出されなくなった。ＩＶ投与後、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡプラスミドは、生殖腺及び脳を除く全組織に低レベルで分布したことがわかった。ＩＶ投与してから４週間後には、ＤＮＡプラスミドは、１匹の動物の肺でしか検出されなかった。
【００１５】
反復投与安全性試験：Ｐａｒｋｅｒらは、マウス及びウサギにおけるワクチンの繰返し投与の安全性にも対処している（７５）。マウスの反復投与安全性試験では、動物に、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡプラスミドのＩＭ注射を１．０μｇ、１０μｇ、及び１００μｇの用量で２８日間にわたり８回繰り返して施した（ｍｇ／ｋｇでのヒト推奨用量の５〜５００倍に等しい累積用量）。異常な血液学若しくは血清化学、異常な組織病理学、又は抗核抗体若しくはｄｓＤＮＡに対する抗体の誘導の形跡はなかった。ウサギの反復用量安全性試験では、動物に、プラスミドのＩＭ注射を毎週１５０μｇ及び４５０μｇの用量で６回施した。ここでもマウスの試験のように、異常な血液学若しくは血清化学、異常な組織病理学、又は抗核抗体若しくはｄｓＤＮＡに対する抗体の誘導の形跡はなかった。したがって、Ｐａｒｋｅｒの試験では、ＰｆＣＳＰプラスミドが宿主の組織全体に十分に分布すること、このプラスミドが長期間にわたりそれらの組織の一部に残ること、並びにボランティアに投与して有害な反応がないことが示すように、このプラスミドをヒトに使用しても安全であることが示された。
【００１６】
組込み試験：Ｍａｒｔｉｎらは、ＰｆＣＳＰプラスミドが宿主染色体ＤＮＡに組み込まれるかどうかを評価している（６７）。各マウスに１回分のプラスミドＤＮＡを注射し、投与してから３０日後及び６０日後に、ＰＣＲ分析によってＤＮＡ１マイクログラムあたり１〜１０コピーの感度まで組織の分析を行った。全体として、これらの試験では、プラスミドの組込みの証拠は得られず、プラスミドＤＮＡがゲノムＤＮＡに組み込まれることがあるとしても、極めて低レベル、すなわち、自然突然変異に求められるものの数千分の一であることが示唆された。
【００１７】
研究者がＰｆＣＳＰワクチンの安全性を確認すると、ＮＭＲＣは、第２相Ｉ臨床治験を実施した。最初の治験では、健康なマラリア未経験の成人ボランティアに、１９９７年〜１９９８年の間ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンを受けさせた（３３、６２、１０５、１０６）。合計２０人のボランティアが参加し、２０μｇ、１００μｇ、５００μｇ、及び２５００μｇの４通りの各投与群に５人のボランティアを割り振り、１カ月間隔で３回分を受けさせた。Ｌｅらが述べているように、すべての用量が、重症若しくは重篤な有害事象が出現することなく十分な耐容性を示した（６２）。中程度の有害事象が４件あり、すべてワクチン投与との関連はなさそうであるとみなした。最もよくあった苦情は、注射部位の痛みと敏感さであった。これは軽く、４８時間以上は続かず、薬剤投与の必要がなかった。ボランティアはいずれも、血清生化学の重大な異常を伴わなかった。
【００１８】
２０人の対象者はいずれも、抗ｄｓＤＮＡ抗体が誘導されず、又はＡＮＡ（抗核抗体）力価が基線から増大していなかった。Ｗａｎｇらは、ボランティアがいずれも、風乾スポロゾイトに対する間接蛍光抗体試験（ＩＦＡＴ）と組換えペプチド及び合成ペプチドに対する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）とによって評価したところでは、ＰｆＣＳＰに対する抗体を生じなかったことを示した。しかし、２０人のうち１１人のボランティアは、ＣＴＬ活性が、抗原特異的であり、遺伝的な拘束を受けていた。詳細には、対照ペプチドと共にインキュベートした自己由来ターゲット、又はその特定のペプチドと共にインキュベートしたＨＬＡクラスＩ不適合ターゲットがほとんど又は全く認識されなかったので、ＣＴＬ応答は、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存的、ペプチド特異的、かつ遺伝的にＨＬＡ拘束性であった。さらに、ＤＮＡから誘導されたＣＴＬは、多彩なＨＬＡアレルによる拘束を受けていた（１０５、１０７）。ＣＴＬの増加傾向は、用量と関連していた。残りの９人のボランティアでは、それぞれの投与後に実施したどのアッセイでもＣＴＬが検出されなかった。
【００１９】
１９９９年４月に開始した第２の臨床治験では、従来の針ＩＭ（筋肉内）、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）ＩＭ、及びＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）ＩＭ（用量の７０％）プラスＩＤ（皮内）（用量の３０％）の異なる３通りの経路で、１４人の健康な成人ボランティアをＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンによって０、４、及び８週目に免疫感作した。Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）は、針を用いない急速注射装置である。この試験が小規模であることを考えて、ボランティアのＨＬＡ多様性を、この集団中で最も一般的であったＨＬＡクラスＩサブタイプであるＨＬＡ  Ａ２に限定して、遺伝的な拘束を受けているＣＴＬ応答をグループ間で比較できるようにした。この試験に参加したボランティアのうち１０人は、その後、本発明の方法を使用する追加の治験に参加した。この治験及びその結果は、以下の「実施例」の項でさらに述べる。
【００２０】
全体として、このワクチンは、安全であり、十分な耐容性を示した。ボランティアは、ワクチンと関連のある重症又は重篤な有害事象（ＡＥ）を経験しなかった。ボランティアはいずれも、試験した３通りのどの経路でも、ＰｆＣＳＰワクチン投与に関連した重大な検査の異常がなかった（３３）。
【００２１】
ワクチンに対する免疫応答に関しては、ボランティアはいずれも、風乾スポロゾイトに対するＩＦＡＴと組換えペプチド及び合成ペプチドに対するＥＬＩＳＡとによって評価したところでは、ＰｆＣＳＰに対する抗体を生じなかった（１０７）。ＰｆＣＳＰ特異的抗体が存在しなかったことは、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ急速注射装置及び免疫感作のＩＤ経路が、動物モデルでは抗体産生の向上と関連付けられていたので、幾分意外であった（１、３７、６２）。Ｔ細胞応答は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでＩＦＮ−γによって測定した。これらのアッセイを実施するに際には、ＰｆＣＳＰプラスミドによってコードされたＣＳＰタンパク質のＴ細胞エピトープを含むペプチドを使用した。
【００２２】
針ＩＭ群の４人全員のボランティアは、アッセイの１７．６％（２６／１４８）で７／９種のペプチドに応答した。ＢｉｏｊｅｃｔｏｒＩＭ群の５人全員のボランティアは、アッセイの２６．５％（４９／１８５）で９／９種のペプチドに応答した。Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ  ＩＭ／ＩＤ群の５人のうち４人のボランティアが、アッセイの１７．３％（３２／１８５）で７／９のペプチドに応答した。１４人のうち８人のボランティアは、ＣＴＬ応答が検出可能であった。その８人のうち、２人は、針ＩＭ群（合計５／１２６のアッセイで４／７種のペプチドに応答）であり、３人は、ＢｉｏｊｅｃｔｏｒＩＭ群（合計１１／１６８のアッセイで６／８種のペプチドに応答）であり、３人は、Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ  ＩＭ／ＩＤ群（合計１４／１６２のアッセイで６／６種のペプチドに応答）であった（１０７）。全体として、この治験では、抗原特異的ＩＦＮ−γ応答を誘発するのにはＢｉｏｊｅｃｔｏｒ  ＩＭ接種経路が最も有効であること、並びに抗原特異的ＣＴＬ応答を誘発するのにはＢｉｏｊｅｃｔｏｒ  ＩＭ又はＩＭ／ＩＤ経路が最も有効であることが確認された。
【００２３】
要するに、これら２種の臨床治験では、ペプチド特異的で、遺伝的に拘束され、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存的なＣＴＬ活性による測定、及びＩＦＮ−γ産生による測定を行ったところ、ＰｆＣＳＰポリヌクレオチドワクチンが、抗原特異的で遺伝的拘束を受けるＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発し得ることが実証された（１０５、１０７）。第２の臨床治験のボランティアは、ＰｆＣＳＰポリヌクレオチドワクチンを最後に投与されてから１年後に試験したとき、上記で測定されたようなＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞応答を示さなかった。
【００２４】
上で論じたように、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に加えて、ＰｆＣＳＰタンパク質の任意のペプチドに対する抗体も、マラリア感染の制御において重要な役割を果たす（１、７８、９９）。ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンの大抵の受容者は、ＣＤ８＋抗原特異的なＴ細胞応答を発するが、抗ＣＳＰ特異的抗体を生じる受容者はいない。対照的に、研究者らは、ＲＴＳ，Ｓが、ＣＳＰに対する強い抗体応答を誘発し得ることを示している（５３、９９、１００）。ＲＴＳ，Ｓは、ＴＨ−１型細胞性及び液性免疫の強力な誘発物質でもあり、ＲＴＳ，Ｓ特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、主にＴｈ２Ｒ免疫優性多形性領域に集中する（６１）。
【００２５】
ＲＴＳ，Ｓを２回又は３回分投与すると、最後の免疫感作から２〜３週間後に熱帯熱マラリア原虫を負荷させた６０人を超えるボランティアの平均４４％が防御され（８、５４、９９）、最後の免疫感作から２カ月間、半免疫性のガンビア人の７０％が防御された（８）。しかし、この防御は短期間のものである（８、１００）。ＲＴＳ，Ｓによって免疫感作を施すと、抗ＰｆＣＳＰ抗体が誘導され、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＩＦＮ−γ応答も誘発されるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存的なＣＴＬ若しくはＩＦＮ−γ応答は検出されなかった（６１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明は、少なくとも１種の第１のマラリア抗原をコードするポリヌクレオチドを含む初回刺激ワクチンによって免疫応答を初回刺激し、次いで初回刺激ワクチンの少なくとも１種の第１のマラリア抗原と共通する少なくとも１種のエピトープを有する少なくとも１種の第２のマラリア抗原を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む追加免疫ワクチンによって初回抗原刺激による応答を追加刺激する、新規なワクチン接種方法を提供する。この組合せは、現在の抗マラリアワクチン接種戦略に３通りの重大な改善点をもたらす。
【００２７】
第１に、２種の異種ワクチンを組み合わせると、免疫系の両方の部門、すなわちＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞と抗体とが活性化される。詳細には、ＰｆＣＳＰワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンを使用しての臨床治験の結果によれば、どちらのワクチンでも、単独ではＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＳＰに対する抗体を呼び起こす持続可能な免疫応答が確認されなかった。本発明は、２種のワクチンを組み合わせ、それによって３種すべての応答を誘発して、この結果を改善するものである。詳細には、ＰｆＣＳＰワクチンがＣＤ８＋Ｔ細胞応答を初回刺激し、ＲＴＳ，ＳワクチンがそのＴ細胞応答を追加刺激する。ＲＴＳ，Ｓワクチンは、抗ＣＳＰ抗体及びＣＤ４＋Ｔ細胞も誘導するので、ＣＳＰに対して生じる免疫応答は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋のＴ細胞応答と抗体応答の両方を含む。ワクチン接種のこの総合的な戦略、すなわち、１種のワクチンで初回刺激し、次いでその初回刺激ワクチンと共通する少なくとも１個の共通エピトープをもつ異なるワクチンで追加免疫するものを、「初回刺激／追加免疫」戦略と呼ぶ。
【００２８】
現在のワクチン接種戦略に対する本発明の第２の重要な改善点は、本発明が、ヒトのＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激にタンパク質ワクチンを使用することにある。本発明の方法は、これまでＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激には効果がないとみなされていたタンパク質系ワクチンを使用してＴ細胞応答を追加刺激する（６１）。
【００２９】
最後に、現在の抗マラリアワクチン接種戦略に対して本発明が提供する第三の重要な改善点は、本発明が、２通りの手段で免疫応答を広げることである。第１に、ＲＴＳ，Ｓ単独では、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＴｈ１  ＩＦＮγ応答しか誘発されなかったが、ＤＮＡによる初回刺激では、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存的な、ＣＤ８＋１型（Ｔｃ１）及びＣＤ４＋１型（Ｔｈ１）の両方のＩＦＮ−γ応答が開始されたので、ＤＮＡ初回刺激／ＲＴＳ，Ｓ追加免疫によって、より広いレパートリーのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞（Ｔｃ１及びＴｈ１）が誘導された。第２に、ＰｆＣＳＰワクチンは、単独で投与されると、ＣＤ８＋Ｔ細胞のある集団を初回刺激する。同様に、ＲＴＳ，Ｓワクチンは、単独で、ある仲間の抗体を作るある集団のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＢ細胞を初回刺激する。しかし、組み合わせると、その結果として生じるＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＰｆＣＳＰワクチンによって最初に初回刺激されたエピトープに及ぶだけでなく、初回刺激ＰｆＣＳＰワクチン接種の後に最初に同定されなかった追加のエピトープにも及ぶ。タンパク質ワクチンが、確立されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を追加刺激するだけでなく、それを広げるはずであるという概念は、当業界でタンパク質ワクチンについて知られていたことを考えると、思いがけないものである。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明は、ヒトにマラリアに対する免疫感作を施す方法であって、ａ）少なくとも１種のマラリア抗原をコードしているポリヌクレオチドを含む初回刺激ワクチンを投与してヒトの免疫応答を初回刺激するステップと、ｂ）続いて、前記初回刺激ワクチンの１種又は複数のマラリア抗原と共通する少なくとも１種のエピトープを有する少なくとも１種のマラリア抗原を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む追加免疫ワクチンを投与して、初回刺激による免疫応答を追加刺激して、マラリアに対する細胞性免疫応答及び液性免疫応答の両方を惹起するステップとを含む方法に関する。
【００３１】
本発明の一実施形態では、初回刺激ワクチンは、追加免疫ワクチン中に存在する同じポリペプチドをコードしている。他の実施形態では、初回刺激ワクチンが、追加免疫ワクチン中に存在するマラリア抗原の一部をコードしているか、又は追加免疫ワクチン中に存在するポリペプチドが、初回免疫ワクチンによってコードされているマラリア抗原の部分であるかのどちらかである。別の実施形態では、各ワクチンは、少なくとも１種のマラリアＴ細胞エピトープを共通にもつ。さらに別の実施形態では、各ワクチンは、少なくとも１種のマラリアＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを共通にもつ。代替実施形態では、２種のワクチンは、数種のマラリアエピトープを共通にもつ。
【００３２】
本発明の方法でマラリアを引き起こすどんな病原体を使用してもよい。一実施形態では、病原体は、熱帯熱マラリア原虫である。他の実施形態では、たとえば、病原体は、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、又は四日熱マラリア原虫でよい。同様に、本発明の方法は、病原体の生活環の任意の段階で発現されるどんなマラリア抗原を用いて使用してもよい。一実施形態では、初回刺激ワクチンは、肝臓期を含む、病原体の前ＲＢＣ期の間に発現される１種又は複数の抗原をコードし、追加免疫ワクチンはそれを含む。さらに別の実施形態では、初回刺激ワクチンのポリヌクレオチドは、感染の肝臓期の間に発現されるスポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも一部分をコードし、追加免疫ワクチンは、そのスポロゾイト周囲タンパク質の少なくとも一部分を含む。さらにまた別の実施形態では、初回刺激ワクチンのポリヌクレオチドは、スポロゾイト周囲タンパク質のほぼ全体をコードし、追加免疫ワクチンは、スポロゾイト周囲タンパク質の部分を含む。ＣＳタンパク質の最小部分は、少なくとも１個のエピトープ又は数個のエピトープを含む免疫原性部分である。特定の一実施形態では、初回刺激ワクチンはＰｆＣＳＰを含み、追加免疫ワクチンはＲＴＳ，Ｓを含む。別の実施形態では、初回刺激ワクチンはＰｆＣＳＰワクチンであり、追加免疫ワクチンはＲＴＳ，Ｓワクチンである。
【００３３】
本発明はさらに、本明細書に記載したような初回刺激ワクチンと追加免疫ワクチンとを含む薬剤キットを提供する。
【００３４】
本発明はさらに、マラリアを予防し、その重症度を軽減するためのワクチンを調製する際に、本明細書で記載したような初回刺激ワクチン及び追加免疫ワクチンを使用するものである。
【００３５】
したがって、本発明は、マラリア用の初回刺激−追加免疫ワクチンを製造する際に、少なくとも１種のマラリア抗原、特にＣＳタンパク質、又はその断片をコードしているポリヌクレオチドを初回刺激ワクチンとして使用し、少なくとも１種のマラリア抗原、特にＣＳタンパク質、又はその断片を含むポリペプチドを追加免疫ワクチンとして使用するものである。特定の一実施形態では、ポリヌクレオチドの一つは、ＤＮＡプラスミドの形であり、全長ＣＳタンパク質又はその断片を発現させることが好ましい。ＣＳタンパク質又はその断片をコードしているポリヌクレオチドは、当業界で知られているような異種プロモーターの制御下に置くことができる。一実施形態では、プロモーターは、任意選択でエキソン１を含むＨＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。特定の一実施形態では、追加免疫ワクチンのポリペプチドは、ＣＳタンパク質のカルボキシ末端部分、たとえば、任意選択でカルボキシ末端の１２アミノ酸を除く、カルボキシ末端部分からの少なくとも１６０個のアミノ酸を含むハイブリッドタンパク質である。初回刺激組成物及び追加免疫組成物は、どちらか又は両方が、追加のマラリア抗原又は他の抗原を含んでもよい。
【００３６】
本発明のこの態様による実施形態では、初回刺激ワクチンは、異種プロモーターの制御下に置かれてＤＮＡプラスミド中に存在する、全長ＣＳタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含み、追加免疫ワクチンは、Ｔｈ１誘導型アジュバント、詳細にはＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ、及び水中油乳濁液を含むアジュバントと組み合わせたＲＴＳ，Ｓを含む。初回刺激ワクチン及び追加免疫ワクチンは、薬剤キットの形で提供してもよい。
【００３７】
本発明は、これまでにマラリアを引き起こす病原体との接触がない、又は接触はあるが完全に防御されていないヒトを部分的に、増強して、又は完全に防御しようとするものである。本発明を使用すると、マラリア感染に罹患する可能性を減らし、感染時には悪化する可能性を減らし、感染しているときには発熱などの病気状態の重症度を軽減し、感染者中の寄生体濃度を低減し、又はマラリア寄生体に曝されているときにはマラリアによって死すべき運命を緩めることができる。マラリアが蔓延している地域では、部分的な防御でさえも有益である。たとえば、人口の約３０％を防御するワクチン処置戦略が、地域社会に重大な影響を与え得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本明細書で示すとおり、マラリア感染に対する多部門からなる免疫応答は、少なくとも１種のマラリア抗原をコードしているポリヌクレオチドを含む初回刺激ワクチンでヒト対象が免疫感作されることによる初回刺激を受け、次いで、初回刺激ワクチンの１種又は複数のマラリア抗原と共通する少なくとも１個のエピトープを有する少なくとも１種のマラリア抗原を含む少なくとも１種のポリペプチドを含む追加免疫ワクチンで免疫感作されることによる追加刺激を受けたものである。驚くべきことに、この免疫感作法では、ポリペプチドワクチンを使用して初回刺激による応答を追加刺激し、またそれを広げる。
【００３９】
「ワクチン」とは、対象に投与されると免疫応答を誘発する分子を含む物体の組成物である。ワクチンは、ポリヌクレオチド分子、ポリペプチド分子、及び炭水化物分子、並びに糖タンパク質、リポタンパク質、炭水化物−タンパク質結合体、２種以上のポリペプチド若しくはポリヌクレオチド同士の融合体といったそれぞれの誘導体及び複合体などを含んでよい。ワクチンはさらに、当業者には容易に理解されるはずであるが、希釈剤、アジュバント、担体、又はこれらの混合物を含んでよい（８３）。
【００４０】
ヒト対象へのポリヌクレオチドワクチン又はタンパク質ワクチンの送達には、任意の接種方法又は接種経路を単独又は組合せで使用してよい。投与経路には、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、又は経粘膜が含まれる。送達手段は様々でよく、たとえば、ヒトにＩＶ、ＩＭ、皮下、又はＩＤ経路で注射を行うことができる。ヒト対象に経粘膜経路で接種してもよい。或いは、送達は、針を用いない「遺伝子銃」、たとえばＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）や他の急速注射装置を使用するなどの針を用いない手段によるものでもよいし、又は微粒子銃送達でもよい。ポリヌクレオチドは、ＰｆＣＳＰワクチンのＤＮＡを含む細菌、又はＰｆＣＳＰワクチンのＤＮＡを含むウイルスとして送達してもよい。
【００４１】
適切なウイルスベクターの例には、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルス若しくはアルファウイルスのベクター、レンチウイルスを含むレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスが含まれる。一実施形態では、これらのベクターが、複製に欠陥のあるウイルスベクターである。これらのウイルスを使用する遺伝子導入技術は、当業者に知られている。たとえば、レトロウイルスベクターを使用すると、本発明のポリヌクレオチドを宿主ゲノムに安定に組み込むことができるが、このような組換えが得策でない場合もある。複製に欠陥のあるアデノウイルスベクターは、これと比べると、エピソームのままであり、したがって、一過性の発現を可能にする。
【００４２】
特定の実施形態では、生きているベクターとして使用するアデノウイルスは、複製に欠陥のある、ヒト若しくはサルのアデノウイルスである。通常、これらのウイルスはＥ１欠失を含み、Ｅ１遺伝子で形質転換されている細胞系で増殖することができる。適切なサルアデノウイルスは、たとえば、チンパンジーから単離されたウイルスである。本発明での使用に適するウイルスの例には、Ｃ６８（Ｐａｎ９としても知られている）（米国特許第６０８３７１６号、参照により本明細書に援用）、Ｐａｎ５、６、及びＰａｎ７（ＷＯ０３／０４６１２４、参照により本明細書に援用）が含まれる。したがって、遺伝子産物が発現されるよう、これらのベクターを操作して、本発明の異種遺伝子を挿入することができる。このような組換えアデノウイルスベクターの使用、定式化、及び製造については、ＷＯ０３／０４６１４２に詳細に述べられており、これを参照により援用する。
【００４３】
ワクチンが、別々の構成部分からなっていてもよい。本明細書では、「別々の構成部分」とは、用語ワクチンが、対象に別々に投与される２種の別個のワクチンを実際に含む状況を指す。この意味で、別々の構成部分からなるワクチンは、別々になっているワクチン構成部分を含むキット又はパッケージであるとみてよい。たとえば、本発明においては、パッケージが、ポリヌクレオチドワクチン構成部分とポリペプチドワクチン構成部分とを含んでよい。
【００４４】
ワクチン中に存在する１種又は複数の抗原が、ワクチン接種を受けた対象にその抗原に対する免疫応答を起こさせるとき、そのワクチンは、免疫応答を「誘発」している。ワクチン接種を受けた対象は、ワクチン抗原特異的Ｔ細胞、ワクチン抗原特異的Ｂ細胞、ワクチン抗原特異的抗体、及びサイトカインの産生を含む免疫系の活性化を証拠とする、免疫応答を起こす。生じる免疫応答は、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、クロム放出アッセイ、細胞内サイトカイン染色、ＦＡＣＳ分析、及び（ペプチド特異的な細胞を同定するための）ＭＨＣ四量体染色を含むいくつかの方法によって測定することができる。当業者でも、これらの方法を使用して、一次免疫応答又は二次免疫応答の測定を行うことができる。
【００４５】
「抗原」とは、抗原に接触した対象において免疫応答を起こし得る物質である。抗原は、通常はポリペプチドであり、宿主の免疫応答の中心である。「エピトープ」又は「抗原決定基」とは、Ｔ細胞及び抗体が特異的に結合する抗原の部分である。抗原は、多数のエピトープを含む。
【００４６】
本発明の方法で使用する初回刺激ワクチンは、以下で論じるマラリア抗原をコードしているポリヌクレオチドを含む。初回刺激ワクチンは、ＤＮＡのみでも、又は細菌若しくはウイルス内で外来のプロモーターの制御下に置かれているＤＮＡでもよい。初回刺激ワクチンのポリヌクレオチドは、プラスミドや、細菌ベクター若しくはウイルスベクターなどの他のベクターなど、適切な送達ベクターの中に存在する。ポリヌクレオチドは、ＨＣＭＶ  ＩＥ遺伝子に由来するプロモーターなどの適切なプロモーターの制御下に置かれていていてよい。初回刺激ワクチンは、マラリア抗原に対する免疫応答を初回刺激するのに有効な量で投与する。本明細書では、免疫応答の「初回刺激」は、Ｔ細胞又はＢ細胞に抗原が提示されるときに起こる。その結果として、初回刺激を受けた細胞は、２回目の後続の免疫応答でも記憶細胞として再び同じ抗原に応答することができる。したがって、初回刺激は、一次免疫応答を起こし、免疫記憶を確立する。当業者には、一次免疫応答が、病原体やワクチンなどの特定の状況で抗原に最初に接触した後の適応免疫応答であることが了解される。しかし、本発明が、免疫に関して未処置の個体における初回刺激ワクチンの使用に限定されないことも理解されよう。むしろ、初回刺激は、初回刺激ワクチンを受けていないが、抗原に接触したことのある抗体でも起こり得る。
【００４７】
「有効な」初回刺激投与量は、０．０１μｇ〜５０ｍｇの範囲のＤＮＡでよい。或いは、投与量は、１μｇ〜１０ｍｇのＤＮＡでも、２．５ｍｇ〜５ｍｇのＤＮＡでもよい。ポリヌクレオチドワクチンは、追加免疫ポリペプチドワクチンの投与前に１回投与することができる。別の実施形態では、初回刺激ワクチンを数回投与してもよい。「有効な」接種回数は、１回〜５回の範囲でよい。或いは、投与回数は、追加免疫ワクチンの投与前に１回〜３回、又は１回〜２回でよい。
【００４８】
「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意のポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）又はポリデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）を指し、ＲＮＡ又はＤＮＡは、変更されていても、されていなくてもよい。ポリヌクレオチドには、限定するものではないが、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域が混在するＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＲＮＡ、及び一本鎖領域と二本鎖領域が混在しているＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドには、一本鎖でも、又はより一般的に二本鎖や一本鎖領域と二本鎖領域の混合でもよいＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子も含まれる。また、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。ポリヌクレオチドには、１種又は複数の修飾塩基を含むＤＮＡ若しくはＲＮＡ、及び安定性又は他の理由を考えて主鎖が修飾されているＤＮＡ若しくはＲＮＡが含まれる。「修飾」塩基には、たとえば、トリチル化された塩基、及びイノシンなどの例外的な塩基が含まれる。様々な変更をＤＮＡ及びＲＮＡに添えることができ、したがって、「ポリヌクレオチド」は、自然界で通常見られるポリヌクレオチドが化学的、酵素的、又は代謝的に改変された形態、並びにウイルスや細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学物質形態を含む。オリゴヌクレオチドは、比較的短いポリヌクレオチドである。
【００４９】
ポリヌクレオチド配列の「断片」とは、基準配列よりも短いが、基準ポリヌクレオチドと同じであると認められる生物学的な機能又は活性を保持しているポリヌクレオチド配列を指す。断片は、基準ポリヌクレオチド配列によってコードされる基準ポリペプチドの少なくとも１個のエピトープをコードしている。本明細書では、「実質的に全部」とは、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの形容に使用するとき、ヌクレオチド塩基又はアミノ酸残基の少数の欠失を別にして、完全な全長のポリヌクレオチド又はポリペプチドをコードし、又はそれに相当する分子を指す。
【００５０】
本発明の方法で使用する追加免疫ワクチンは、以下で論じる、少なくとも１種のマラリア抗原ポリペプチドを含む融合タンパク質を含んでいてよい。このワクチンに使用するポリペプチドは、自然の供給源から単離してもよいし、細菌などの外来生物体に入れた組換えタンパク質として提供してもよいし、又は化学的手段によって合成してもよい。追加免疫ワクチンは、マラリアポリペプチドの免疫原性を増強するために、追加のマラリア性でないポリペプチドをさらに含んでよい。たとえば、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の一部又は全部を使用することができる。初回刺激ワクチン及び追加免疫ワクチンは、少なくとも１個の共通マラリアエピトープを共通にもつ。
【００５１】
本発明による追加免疫ワクチンでの使用に適する融合タンパク質は、ＣＳタンパク質の実質的に全部のＣ末端部分、免疫優性領域の４箇所以上の縦列型反復部分、及びＢ型肝炎ウイルス由来表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を含むハイブリッドタンパク質を含んでいてよい。ハイブリッドタンパク質は、ＣＳタンパク質のＣ末端部分とほぼ相同である、少なくとも１６０個のアミノ酸を含む配列を含む。一実施形態では、ＣＳタンパク質は、Ｃ末端から数えて１２アミノ酸までを欠いていてよい。適切なハイブリッドタンパク質は、たとえば、ＨｂｓＡｇのＮ末端に線状のリンカーを介してフレーム単位で融合した、熱帯熱マラリア原虫７Ｇ８のアミノ酸２１０〜３９８にほぼ対応するような、熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク質の部分を含む。リンカーは、ＨｂｓＡｇのｐｒｅＳ２の部分を含んでよい。
【００５２】
別の実施形態は、参照により本明細書に援用する米国特許第５，９２８，９０２号及び国際特許出願第ＷＯ  ９３／１０１５２号に記載されているＲＴＳ，Ｓと呼ばれるハイブリッド粒子である。このハイブリッドは、１．）ヌクレオチド１０５９〜１０６１によってコードされる、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＤＨ３遺伝子配列由来のメチオニン残基（７１）、２．）ハイブリッド遺伝子の構築に使用されるクローン化手順によって作られたヌクレオチド配列（１０６２〜１０７０）に由来する３個のアミノ酸Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｐｒｏ、３．）熱帯熱マラリア原虫系統７Ｇ８のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）のアミノ酸２１０〜３９８に相当する、ヌクレオチド１０７１〜１６３７によってコードされるアミノ酸１８９個の配列（２１）、４．）ハイブリッド遺伝子の構築に使用されるクローン化手順によって作られたヌクレオチド１６３８〜１６４０によってコードされるアミノ酸（Ａｒｇ）、５．）ヌクレオチド１６４１〜１６５２によってコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（血清型ａｄｗ）ｐｒｅＳ２タンパク質の４個のカルボキシ末端側残基に相当する４個のアミノ酸Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ（１０３）、及び６．）ヌクレオチド１６５３〜２３３０によってコードされ、Ｂ型肝炎ウイルス（血清型ａｄｗ）のＳタンパク質を規定するアミノ酸２２６個の配列からなる。
【００５３】
追加免疫ワクチンは、マラリア抗原に対する、初回刺激による免疫応答を「追加刺激」するのに有効な量で投与する。本明細書では、免疫応答を「追加刺激」するとは、抗原への最初の接触によって初回刺激された（すなわち、すでに接触のあった）対象において二次免疫応答を誘発することを意味する。二次免疫応答は、特定の記憶Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化及び増殖を特徴とする。したがって、特定の免疫応答の追加刺激は、その抗原にその後接触した後に免疫細胞を増殖させ、分化させることによって、初回刺激による免疫応答を増強する。以下で論じるように、ＰｆＣＳＰワクチンの全長ＣＳタンパク質は、９個のＴ細胞エピトープを含み、ＲＴＳ，Ｓは、５個のＴ細胞エピトープを含む（６１）。ＲＴＳ，Ｓエピトープのうちの４個が、ＰｆＣＳＰワクチン中に存在する。たとえば、初回刺激ワクチンが投与されて、抗マラリアＣＤ８＋Ｔ細胞を初回刺激する。追加免疫ワクチンは、次の効果、すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導、抗マラリア抗体の誘導、初回刺激ワクチンによる初回刺激を受けたＣＤ８＋Ｔ細胞の活性の追加刺激、及び最初の初回刺激による免疫応答で初めは確認されていない更なるＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導のうち１又は複数の効果を実現することができる。追加免疫ワクチンは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及び抗マラリア抗体も誘導することができる。免疫応答の追加刺激は、当業界では免疫応答の「復活」としても知られている。
【００５４】
「有効な」追加免疫投与量は、１μｇ〜１００μｇ、又は１０μｇ〜７５μｇ、又は４０μｇ〜６０μｇの範囲でよい。別の実施形態では、追加免疫投与量は５０μｇでよい。さらに別の実施形態では、追加免疫投与量は２５μｇでよい。追加免疫ワクチンの投与は、１回でも複数回でもよい。「有効な」追加免疫投与の回数は、追加免疫ワクチンの１回〜５回分の範囲でよい。或いは、投与回数は、ヒト対象に対して１〜３回又は１〜２回でよい。別の実施形態では、一次免疫応答を追加刺激するのに、ＤＮＡワクチンとタンパク質ワクチンの両方を使用してよい。
【００５５】
「ポリペプチド」とは、ペプチド結合又は変更型ペプチド結合によって互いに結合している２種以上のアミノ酸、すなわちペプチド同配体を含む任意のポリペプチドを指す。「ポリペプチド」とは、一般にペプチド、オリゴペプチド、又はオリゴマーと呼ばれる短鎖のものと、一般にタンパク質と呼ばれる長鎖のものの両方を指す。ポリペプチドは、コドンによって通常コードされるもの以外のアミノ酸を含んでいてもよい。
【００５６】
ポリペプチドには、翻訳後プロセッシングなどの自然の過程、又は当業界でよく知られている化学修飾法によって改変されたアミノ酸配列が含まれる。そのような改変は、基礎の教本、より詳細な小研究論文、並びに膨大な研究文献に十分に記載されている。改変は、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、及びアミノ末端若しくはカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのどの場所で行ってもよい。そのような改変は、所与のポリペプチド中のいくつかの部位で同程度又は様々な程度に存在してよい。また、所与のポリペプチドが、多くの種類の改変を含んでいてもよい。ポリペプチドは、ユビキチン結合の結果として枝分かれしていてもよいし、枝分かれあり又は枝分かれなしで環状でもよい。環状、分枝状、及び分枝環状のポリペプチドは、翻訳後の自然の過程によって生じたものでもよいし、又は合成の方法によって作製してもよい。改変には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ビオチニル化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの生成、ピログルタミン酸の生成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの生成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解によるプロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノ化、硫酸化；アルギニル化など、転移ＲＮＡを媒介とするタンパク質へのアミノ酸付加、及びユビキチン結合が含まれる（７９、８２、９４、１１３）。
【００５７】
ポリペプチド配列の「断片」とは、基準配列よりも短いが、基準ポリヌクレオチドと同じであると認められる生物学的な機能又は活性を保持しているポリペプチド配列を指す。そのような活性には、たとえば、免疫応答を刺激する能力が含まれよう。断片は、基準ポリペプチドの少なくとも１個のエピトープを保持する。ポリペプチドの「部分」とは、基準ポリペプチドのアミノ酸配列の亜集団を指す。部分は、ポリペプチド中のその相対的な位置、たとえばＣ末端側部分又はＮ末端側部分によって記載することができる。
【００５８】
本発明は、表Ａ及び表Ｂに示すものなど、任意のマラリア抗原を用いて使用することができる。
【００５９】
【表１】
0005404990.tif 000002
【００６０】
【表２】
0005404990.tif 000003
【００６１】
「種中周囲タンパク質」又は「ＣＳＰ」とは、マラリア種中表面上の主要な表面ポリペプチドである。熱帯熱マラリア原虫由来のＣＳＰ（ＰｆＣＳＰ）系統７Ｇ８は、クローン化、配列決定、及び発現がなされている（２１）。他のマラリア寄生体由来の別のＣＳＰも特徴付けられており、表Ａに含めてある。
【００６２】
「ＲＴＳ，Ｓ」とは、本明細書では、特定のマラリア抗原を指し、本発明の一実施形態である。ＲＴＳ，Ｓ及びその製造については、米国特許第５，９２８，９０２号及び国際特許出願第ＷＯ９３／１０１５２号により十分な記載があり、両文献を参照により本明細書に援用する。
【００６３】
「広げる」とは、Ｔ細胞応答のレパートリーを増やすことを指す。この場合では、ＲＴＳ，Ｓは、単独ではＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＴｈ１のＩＦＮ−７応答しか誘発しなかったが、ＤＮＡによる免疫感作／初回刺激は、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＣＤ８＋１型（Ｔｃ１）及びＣＤ４＋１型１（Ｔｈ１）の両方のＩＦＮ−γ応答を起こしたので、ＤＮＡによる初回刺激／ＲＴＳ，Ｓによる追加免疫によって、より広いレパートリーのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞（Ｔｃ１及びＴｈ１）が誘導された。当業者ならば、抗原特異的な検出アッセイを使用して、広げられた免疫応答を検出することができる。たとえば、当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＭＨＣ四量体染色、又はクロム放出ＣＴＬアッセイを使用して、Ｔ細胞のレパートリーを決定することができる。
【００６４】
「広げる」とは、免疫応答の対象となるエピトープの範囲を増やすことも指す。最初に初回刺激された免疫細胞に加えて、初回刺激を受けていない、又は検出できないほど数の少ない免疫細胞も、増殖及び活性化が誘発される。したがって、広げられた免疫応答は、もとから初回刺激を受けている応答を拡大するだけでなく、一次応答の一部でなかった新しいエピトープに対する応答も含んでいる。当業者ならば、抗原特異的検出アッセイを使用して、広げられた免疫応答を検出することができる。たとえば、当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ又はＭＨＣ四量体染色を使用して、一次免疫応答の対象であるエピトープのレパートリーを決定し、その範囲を、二次免疫応答の対象であるエピトープのレパートリーと比較することができる。二次免疫応答が一次免疫応答よりも多数のエピトープを対象として起こる場合、二次免疫応答は広げられている。
【００６５】
「ＣＤ８＋Ｔ細胞」とは、ＣＤ８細胞表面マーカーを有することを特徴とする１クラスのＴリンパ球である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩによる拘束を受ける「ＣＴＬ」又は「サプレッサーＴ細胞」である。
【００６６】
「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、ＣＤ４細胞表面マーカーを有することを特徴とする１クラスのＴリンパ球である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩによる拘束を受けるＴリンパ球である。１型又は２型の「ヘルパーＴ細胞」と呼ばれる２種類のＣＤ４＋Ｔ細胞がある。
【００６７】
上述のように、免疫応答は、抗原に対して、その抗原と免疫系の細胞との相互作用によって起こる。生じる免疫応答は、液性免疫応答又は細胞媒介型免疫応答（伝統的に、それぞれ抗体及び細胞によるエフェクター防御機構で特徴付けられている）の極端な２部門に広く分類することができる。これらの応答部門は、Ｔｈ１型応答（細胞媒介型応答）及びＴｈ２型免疫応答（液性応答）と呼ばれている。極度のＴｈ１型免疫応答は、抗原特異的ハプロタイプ拘束性のＣＴＬの産生及びナチュラルキラー細胞の応答を特徴とするであろう。マウスでは、Ｔｈ１型応答はしばしば、ＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の産生を特徴とするが、ヒトではそれがＩｇＧ１型の抗体の産生である。Ｔｈ２型の免疫応答は、マウスではＩｇＧ１、ＩｇＡ、及びＩｇＭを含む広範な免疫グロブリンアイソタイプの産生を特徴とする。
【００６８】
これら２種類の免疫応答が起こる背後にある駆動力は、サイトカインという、免疫系の細胞を助け、来たるべき免疫応答をＴｈ１又はＴｈ２のどちらかの応答に向ける勤めを果たす、同定されているいくつかのタンパク質メッセンジャーである。したがって、Ｔｈ１型のサイトカインが高レベルであると、所与の抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘発に有利になる傾向があり、Ｔｈ２型のサイトカインが高レベルであると、その抗原に対する液性免疫応答の誘発に有利になる傾向がある。Ｔｈ１型とＴｈ２型の免疫応答の区別は絶対的でないことを留意されたい。現に、個体は、Ｔｈ１優性又はＴｈ２優性であると形容される免疫応答を支持することになる。しかし、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにおいてＭｏｓｍａｎｎ及びＣｏｆｆｍａが述べていることに関して、サイトカインのファミリーを考えることがしばしば好都合である（７０）。昔から、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γ及びＩＬ−２サイトカインの産生と関連付けられている。Ｔｈ１型免疫応答の誘発としばしば直接に関連付けられる、ＩＬ−１２などの他のサイトカインは、Ｔ細胞によって産生されない。対照的に、Ｔｈ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦ−β）の分泌と関連付けられている。
【００６９】
本発明での使用に適するアジュバントには、水酸化アルミニウムゲル（アラム）やリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が含まれるが、カルシウム、鉄、又は亜鉛の塩でもよいし、或いはアシル化されたチロシン若しくはアシル化された糖の不溶性懸濁液、陽イオン若しくは陰イオンに誘導体化された多糖、ポリホスファゼン、又はモンタナイドリポソームでもよい。
【００７０】
本発明で使用するワクチンの製剤に際して、ＰｆＣＳＰプラスミドにおいては、アジュバントを投与してもしなくてもよい。ＲＴＳ，Ｓの場合、アジュバント組成物は、Ｔｈ１応答を優先的に誘発することができる。さらに、他の液性応答を含む別の応答も誘発することができる。
【００７１】
ある種のワクチンアジュバントは、Ｔｈ１型又はＴｈ２型の各サイトカイン応答を刺激するのに特に適している。伝統的に、ワクチン接種後又は感染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２バランスの最適な指標としては、抗原による再刺激の後、Ｔリンパ球によるＴｈ１若しくはＴｈ２サイトカインの産生をｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接に測定した値、及び／又は抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比の測定値が挙げられる。たとえば、Ｔｈ１型のアジュバントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原による再刺激がなされるとき、単離されたＴ細胞集団を刺激して、高レベルのＴｈ１型サイトカインを産生させ、Ｔｈ１型アイソタイプと関連する抗原特異的な免疫グロブリン応答を誘発するものである。本発明での使用に適するアジュバントを製造するために配合してよいＴｈ１型の免疫増強薬には、たとえば、モノホスホリル脂質Ａ、詳細には３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）が含まれよう。３Ｄ−ＭＰＬは、米モンタナ州Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍによって製造されている周知のアジュバントである。化学的には、この物質はしばしば、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと、４、５、若しくは６本のアシル化鎖との混合物として供給される。これは、ＧＢ  ２１２２２０４Ｂで教示されている方法によって精製、調製することができ、この参照文献は、ジホスホリル脂質Ａ及びその３−Ｏ−脱アシル化変形形態も開示している。他の精製リポ多糖及び合成リポ多糖の記載もある（米国特許第６，００５，０９９号、４２、４３、ＥＰ０  ７２９  ４７３  Ｂ１、ＥＰ０  ５４９  ０７４  Ｂ１）。一実施形態では、３Ｄ−ＭＰＬは、直径０．２μｍ未満の小さい粒径の微粒子製剤の形であり、その製造方法は、ＥＰ０  ６８９  ４５４で開示されている。
【００７２】
サポニンは、本発明と共に使用してよいＴｈ１免疫増強薬のもう一つの例である。サポニンは、よく知られているアジュバントである（６０）。たとえば、ＱｕｉｌＡ（南米産の樹木キラヤ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮由来）及びその画分が、米国特許第５，０５７，５４０号、ＥＰ０  ３６２  ２７９  Ｂ１、及びＫｅｎｓｉｌの（５２）に記載されている。血液分解性（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ）サポニンのＱＳ２１及びＱＳ１７（ＨＰＬＣによって精製されたＱｕｉｌＡ画分）は、強力な全身アジュバントとして記載されており、その製造方法は、米国特許第５，０５７，５４０号及びＥＰ０  ３６２  ２７９  Ｂ１で開示されている。これらの参照文献には、全身ワクチン用の強力なアジュバントとして働くＱＳ７（血液分解性でないＱｕｉｌ−Ａ画分）の使用も記載されている。ＱＳ２１の使用は、Ｋｅｎｓｉｌらの（５１）にさらに記載されている。ＱＳ２１とポリソルベート若しくはシクロデキルトリンとの組合せも知られている（ＷＯ  ９９／１０００８）。ＱＳ２１やＱＳ７などのＱｕｉｌＡ画分を含む微粒子アジュバントは、ＷＯ９６／３３７３９及びＷＯ９６／１１７１１に記載されている。
【００７３】
免疫増強薬のさらに別の例は、メチル化されていないＣｐＧジヌクレオチドを含む免疫促進性オリゴヌクレオチド（「ＣｐＧ」）である。ＣｐＧは、ＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。ＣｐＧは、全身経路及び経粘膜経路の両方によって投与するとアジュバントになることが当業界で知られている（ＷＯ９６／０２５５５、ＥＰ  ４６８５２０、２３、６８）。歴史的に、カルメット−ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）のＤＮＡ画分が、抗腫瘍効果を発揮し得たことが観察されている。更なる研究では、ＢＣＧ遺伝子配列由来の合成オリゴヌクレオチドが、免疫促進性の作用を誘発し得ることが示された（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で）。これらの研究の著者らは、中央のＣＧモチーフを含むある種の回文配列がこの活性を受け持ったという結論を下している。ＣＧモチーフの免疫促進における主要な役割は、後にＫｒｉｅｇによって解明されている（５７）。詳細な分析では、ＣＧモチーフがある種の配列状況になければならないこと、並びにそのような配列が細菌ＤＮＡ中にはよくあるが、脊椎動物ＤＮＡ中ではまれであることが示されている。免疫促進性の配列はしばしば、プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジンであり、ＣＧモチーフはメチル化されていない。しかし、他のメチル化されていないＣｐＧ配列も免疫促進性であることがわかっており、本発明で使用してよい。
【００７４】
６個のヌクレオチドのある種の組合せでは、回文配列が存在することがある。数個のこれらモチーフが、１種のモチーフの繰返し又は異なるモチーフの組合せとして、同じオリゴヌクレオチド中に存在してよい。これら免疫促進性配列を含むオリゴヌクレオチドが存在すると、ナチュラルキラー細胞（インターフェロンγを産生し、細胞障害活性を有する）及びマクロファージ（Ｗｏｏｌｄｒｉｇｅら、１９７７年）を含む様々な免疫サブセットが活性化され得る。メチル化されていないＣｐＧを含み、このコンセンサス配列をもたない他の配列も、現在では免疫促進性であることがわかっている。ワクチンに製剤する際、ＣｐＧは一般に、随意の溶液にして遊離の抗原と共に投与し（ＷＯ９６／０２５５５、６８）、又は抗原に共有結合させ（ＷＯ  ９８／１６２４７）、又は水酸化アルミニウムなどの担体を配合する（肝炎表面抗原）（９、２３）。
【００７５】
上述のような免疫増強薬には、たとえば、リポソーム、水中油乳濁液、及び又は（水酸化アルミニウムなどの）アルミニウム塩を含む金属塩などの担体を配合してよい。たとえば、３Ｄ−ＭＰＬには、水酸化アルミニウム（ＥＰ０  ６８９  ４５４）又は水中油乳濁液（ＷＯ  ９５／１７２１０）を配合することができ、ＱＳ２１には、コレステロール含有リポソーム（ＷＯ９６／３３７３９）、水中油乳濁液（ＷＯ９５／１７２１０）、又はアラム（ＷＯ９８／１５２８７）を配合すると有利であり、ＣｐＧには、アラム（９、２３）又は他の陽イオン担体を配合することができる。
【００７６】
モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組合せ（ＷＯ９４／００１５３、ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９６／３３７３９、ＷＯ９８／５６４１４、ＷＯ９８／０５３５５、ＷＯ９９／１２５６５、ＷＯ９９／１１２４１）や、ＷＯ９４／００１５３で開示されているようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せなど、免疫増強薬の組合せを使用してもよい。或いは、ＣｐＧにＱＳ２１などのサポニンを加えた組合せも、本発明で使用することができる。したがって、適切なアジュバント系には、たとえば、３Ｄ−ＭＰＬなどのモノホスホリル脂質Ａとアルミニウム塩の組合せが含まれる。別の実施形態は、ＷＯ９４／００１５３で開示されているようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せや、ＷＯ９６／３３７３９で開示されているような、ＱＳ２１をコレステロール含有リポソーム中に入れて失活させてある反応性のより低い組成物（ＤＱ）など、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体を組み合わせている。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ、及びトコフェロールを水中油乳濁液中に入れて使用するさらに別のアジュバント製剤が、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。別の実施形態では、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを単独で、又はアルミニウム塩と共に使用する。追加のアジュバント及び／又は担体の組合せの例には、３Ｄ−ＭＰＬ＋ＤＱ中ＱＳ２１、アラム＋３Ｄ−ＭＰＬ、アラム＋ＤＱ中ＱＳ２１＋３Ｄ−ＭＰＬ、アラム＋ＣｐＧ、３Ｄ−ＭＰＬ＋ＤＱ中ＱＳ２１＋水中油乳濁液、及びＣｐＧが含まれる。
【００７７】
別の実施形態では、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１とを、ＣｐＧを加え、又はＣｐＧなしで組み合わせる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比は、大体１：１０〜１０：１、１：５〜５：１、又は１：１でよい。一実施形態では、この比は、２．５：１〜１：１のＤ−ＭＰＬ：ＱＳ２１である。通常、ヒトへの投与向けには、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬは、１回分あたり、１〜１００４ｇや１０〜Ｌｇ〜５０ｇなど、１ｐｉｇ〜２００４ｇの範囲でワクチン中に存在する。通常、水中油は、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のαトコフェロール、及び０．３３〜３％のｔｗｅｅｎ８０を含む。スクアレン：αトコフェロールの比は、より安定な乳濁液をもたらすので、１以下とする。Ｓｐａｎ８５も、１％のレベルで存在していてよい。場合によっては、本発明のワクチンが安定剤を含有すると有利になることもある。
【００７８】
ＣＳタンパク質又はその免疫原性部分を、任意選択でハイブリッドタンパク質の形で含む、ＲＴＳ，Ｓなどの本発明によるポリペプチド追加免疫ワクチンと共に使用するアジュバントは、３Ｄ−ＭＰＬとＱＳ２１の組合せを、ＣｐＧと共に、又はＣｐＧなしで含んでよい。
【００７９】
これまでの包括的な記述、及び以下の詳細な記述はどちらも、単に例を示し、説明するものであり、特許を請求する本発明を限定するものではない。また、本発明は、記載した特定の実施形態に限定されるものでなく、それなりに当然様々でよい。さらに、本発明の範囲は、その特許請求の範囲によってのみ限定されるので、特定の実施形態の記述に使用した用語は、限定的なものでない。
【００８０】
値の範囲については、本発明は、文脈に明らかに別段の指摘がない限り、その範囲の上限と下限の間にある各値を、下限の単位の少なくとも１０分の一まで含む。さらに、本発明は、記載した、他の任意の間にある値を含む。また本発明は、記載範囲から特に除外されない限り、その範囲の上限と下限のどちらか又は両方を除く範囲も含む。
【００８１】
別段の規定がない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語の意味は、本発明が属する分野の技術者によって一般に理解されているものである。当業者ならば、本発明を実施し、又は試すのに、本明細書に記載のものと同様又は同等な方法及び材料を使用してよいことも承知されるであろう。さらに、本明細書で言及したすべての出版物を参照により援用する。
【００８２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形の「ａ」、「ｏｒ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがってたとえば、「ａ  ｓｕｂｊｅｃｔ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」への言及は、複数のそのようなｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅを含み、「ｔｈｅ  ａｇｅｎｔ」への言及は、１種又は複数のａｇｅｎｔ及び当業者に知られているその同等物への言及を含むというようになる。
【００８３】
さらに、成分の量、反応条件、純度の％、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの長さなどを示す、本明細書及び特許請求の範囲で使用するすべての数は、別段の指示がない限り、用語「約」によって緩和される。したがって、本明細書及び特許請求の範囲で述べる数に関するパラメーターは、本明細書の所望の性質に応じて様々でよい近似値である。少なくとも、また特許請求の範囲に同等物の原則を適用することを制限しないものとして、数に関する各パラメーターはせめて、有効数字で報告された数字を考えて、通常の切り捨て法を適用して解釈すべきである。それにもかかわらず、詳細な実施例で述べる数値は、できる限り正確に報告する。しかし、任意の数値は、その実験測定値の標準偏差からの一定の誤差を本質的に含む。
【００８４】
以下の実施例で、本発明をさらに説明する。実施例は、本発明を単に例示するものにすぎず、本発明のある実施形態の様々な有益な性質を開示するものである。以下の実施例は、本発明を限定するものと解釈すべきでない。
【実施例１】
【００８５】
初回刺激による抗−ＰｆＣＳＰ応答のＲＴＳ，Ｓワクチンによる追加刺激
２４人のＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性ボランティアをこの試験に起用した。ボランティアのＨＬＡ多様性は、遺伝的拘束を受けるＴ細胞応答を集団間で比較できるようにするため、この集団で最も一般的なＨＬＡクラスＩサブタイプに限定した。このボランティアらはいずれも、以前にマラリアに接触していなかった。２４人の個体のうち、１０人が次の上述のＰｆＣＳＰワクチン臨床治験に参加した。この治験の間、このボランティアらには、１回あたり２５００μｇとして、４週間の間隔を挟んで合計３回分のＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン（ＶＣＬ−２５１０、前述のとおりＶｉｃａｌ，Ｉｎｃ（米カリフォルニア州サンディエゴ）製（６２））を与えた（６２）。したがって、この治験で、この１０人のボランティアらは、追加免疫ＲＴＳ，Ｓワクチンを与える１２〜１４カ月前にＤＮＡワクチンの最後の投与を受けた。残りの１４人のボランティアは、以前にＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンを与えられておらず、したがって非初回刺激対照として使用した。２４人のボランティアは全員、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンとＲＴＳ，Ｓワクチンのどちらによる免疫感作の前にも、ＰｆＣＳＰ、ＨＩＶ、ＨＢＶコア抗原、ＨＣＶ、ワクシニアウイルス、及びｄｓＤＮＡに対する抗体について陰性であった。ＤＮＡによって初回刺激した１０人のボランティアのうち６人、及び１４人の非初回刺激対照のうち８人が、ＨＢｓＡｇに対する抗体について陽性であった。
【００８６】
２４人全員のボランティアの左三角筋に、０週間目と８週間目の２回のＲＴＳ，Ｓワクチン注射を施した。ＲＴＳ，Ｓワクチンは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と融合させた熱帯熱マラリア原虫（ＮＦ５４／３Ｄ７）ＣＳＰタンパク質のアミノ酸２０７〜３９５を含むものであった（８）。簡潔に述べると、ＲＴＳ，Ｓタンパク質は、ＣＳタンパク質の実質的に全部のＣ末端側部分、免疫優性領域の４箇所以上の縦列型反復部分、及びＨＢｓＡｇを含むハイブリッドタンパク質である。ＲＴＳ，Ｓの調製の包括的な記述については、参照により本明細書に援用するＷＯ９３／１０１５２及び米国特許第５，９２８，９０２号を参照されたい。
【００８７】
得られる組換え型ＲＴＳ，Ｓタンパク質を酵母中に発現させ（９９）、油中水乳濁液にした免疫促進薬のモノホスホリル脂質Ａ及びＱＳ２１（Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｉｎｃ、ベルギーＲｉｘｅｎｓａｒｔ）と組み合わせて、ＲＴＳ，Ｓワクチンを作製した。具体的には、凍結乾燥した製剤は、ＲＴＳ，Ｓペレット及びアジュバント希釈剤を含んでいた。ＲＴＳ，Ｓペレットは、ＲＴＳ，Ｓ（５０μｇ）及びラクトース（３．１５％）を凍結保護物質として含んでいた。アジュバント希釈剤は、ＭＰＬ（５０μｇ）、ＱＳ−２１（５０μｇ）、及び油／水乳濁液を含んでいた。得られるワクチン製剤は、１ｍｌ体積の乳濁液中に５０μｇのＲＴＳ，Ｓを含み、注射の３０分前に調製した。３人のＨＬＡ不適合ボランティアには、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンを与えなかった。この３人のボランティアからのサンプルを、アッセイで負の対照として使用した。非初回刺激群の１人のボランティアが、最初の免疫感作の後に試験を辞退した。
【００８８】
ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン中に含まれる全長ＰｆＣＳＰ配列の上流領域には、ＲＴＳ，Ｓワクチン中には存在しなかった、いくつかのＴ細胞エピトープが含まれていた。しかし、２種のワクチン間には、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンによって予め免疫感作を施されたボランティアに、ＲＴＳ，Ｓワクチンを潜在的な「追加免疫」ワクチンとして投与することを妥当にするだけの部分的重複があった。詳細には、ＲＴＳ，Ｓは、１９個のＮＡＮＰ繰返し部分からなる高度に保存された領域を含むＰｆＣＳＰ部分と、酵母中で非融合型ＨＢｓＡｇと共発現されるＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）と融合したＣＳＰカルボキシ末端とを含む（３６）。ＰｆＣＳＰワクチンの全長ＣＳタンパク質は、９個のＴ細胞エピトープを含み、ＲＴＳ，Ｓは、５個のＴ細胞エピトープを含んでいる（６１）。ＲＴＳ，Ｓエピトープのうちの４個は、ＰｆＣＳＰワクチン中に存在する。
【００８９】
実施例２〜７では、ボランティアそれぞれから採取した血液サンプルでその後行った分析を詳述する。簡潔に述べると、Ｔ細胞応答は、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンによる初回刺激を受けたボランティアについて、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンを最後に投与してから１２〜１４カ月後に、全員のボランティアについて、ＲＴＳ，Ｓワクチンを最初及び２回目に投与してから１、２、及び６週間後に試験した。抗体は、免疫感作前、並びにＲＴＳ，Ｓワクチンをそれぞれ投与してから２、４、６、及び８週間後に試験した。
【実施例２】
【００９０】
ＣＴＬ応答
上述のように、ＲＴＳ，Ｓワクチン単独で免疫感作を施すと、ヒトでは、抗体が誘導され、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＩＦＮ−γ応答が誘発されるが、抗原特異的なＣＴＬのヒトでの誘発は報告されていない（６１）。ＤＮＡによって誘導された記憶ＣＴＬが、ＲＴＳ，Ｓワクチンによる追加免疫によって復活し得るかどうか、並びに追加免疫による応答が、ＤＮＡ初回刺激によるもとの応答よりも広げられたかどうかを判定するために、異なるボランティアで抗原特異的ＣＴＬの細胞障害活性の評価を行った。ＲＴＳ，Ｓによる免疫感作の１〜２週間前、並びにＲＴＳ，Ｓを最初及び／又は２回目に投与してから１又は２週間後に、ＤＮＡによって初回刺激したボランティア又は初回刺激していないボランティアの血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を収集した。次いで、これらのＰＢＭＣを、抗原提示ターゲット細胞の溶解を検出するクロム放出アッセイで使用した（１０５）。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏクロム放出アッセイは、以前に記載されているとおりに実施した（１０５）。詳細には、エフェクター細胞を産生させるのに、全ＰＢＭＣの２０％に、ＰｆＣＳＰを発現させるＡＬＶＡＣ（ｖＣＰ１８２）を、５ｐｆｕ／細胞の密度で、３７℃で９０分間かけて感染させた。２回洗浄した後、これらのＰＢＭＣを残りのＰＢＭＣと合わせ、７〜１０日間培養した。４８時間後に組換え型ヒトＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ、米カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）を加えた（２０Ｕ／ｍｌ）。ターゲット細胞は、１０μｇ／ｍｌのＰｆＣＳＰ特異的なＣＴＬエピトープ又は対照ペプチドで一晩かけて感作した、自己由来又はＭＨＣ不適合のＰＨＡ芽細胞とした。ＣＴＬ活性は、従来型の６時間のクロム放出アッセイによって評価した。溶解率（％）は、（実験放出−培地対照放出）／（最大放出−培地対照放出）×１００と定めた。特異的溶解率（％）は、実験ペプチドと共にインキュベートしたターゲットの溶解率から、負の対照であるＨＩＶｇａｇＡ２拘束性ペプチドと共に培養したターゲットの溶解率を減じて決定した。ＣＴＬ応答は、同じアッセイの少なくとも２種類のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で免疫感作後の特異的溶解率が≧１０％であり、かつ免疫感作前の特異的溶解率が＜１０％であった場合に限り、陽性であるとみなした。
【００９２】
純度８０〜９５％の合成ペプチドを、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（豪Ｃｌａｙｔｏｎ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）から入手し、ＣＴＬターゲットの感作に使用した。ＰｆＣＳＰ由来であり、ＲＴＳ，Ｓ配列中に含まれる８種のペプチドも使用した。これら８種のペプチドには、９〜１０アミノ酸長の、４種の画定されたＣＴＬ  ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープが含まれた。４種のＣＴＬエピトープは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ペプチドＡ２．３１９；アミノ酸残基３１９〜３２７、ＹＬＮＫＩＱＮＳＬ；配列番号１）、−Ａ＊０１０１（ペプチドＡ１．３１０；アミノ酸残基３１０〜３１９、ＥＰＳＤＫＨＩＫＥＹ；配列番号２）、−Ａ＊０３０１（ペプチドＡ３／１１．３３６；アミノ酸残基３３６〜３４５、ＶＴＣＧＮＧＩＱＶＲ；配列番号３）、及び−Ｂ＊３５０１（ペプチドＢ３５．３５３；アミノ酸残基３５３〜３６０、ＫＰＫＤＥＬＤＹ；配列番号４）による拘束を受けていた。他の４種のペプチドは、ＤＲ結合ペプチドのＤＲ．３１６（アミノ酸残基３１６〜３３５、ＩＫＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳＰＣＳ；配列番号５）、ＤＲ．３１８（アミノ酸残基３１８〜３３２、ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷ；配列番号６）、ＤＲ．３６３（アミノ酸残基３６３〜３８３、ＤＩＥＫＫＩＣＫＭＥＫＣＳＳＶＦＮＶＶＮＳ；配列番号７）、及びＤＲ．３４６（アミノ酸残基３４６〜３６５、ＩＫＰＧＳＡＮＫＰＫＤＥＬＤＹＡＮＤＩＥ；配列番号８）であり、上述のように１５〜２０アミノ酸長であった。（１０７）。１５アミノ酸長の１３種のＰｆＣＳＰ由来ペプチド、及び２０種のＨＢｓＡｇ由来ペプチドの各プールは、Ｇｌａｘｏ  ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｉｎｃ（ベルギーＲｉｘｅｎｓａｒｔ）から提供を受けた。１３種のＰｆＣＳＰペプチドのアミノ酸配列は、次のとおりである。
0005404990.tif 000004
インフルエンザマトリックスタンパク質由来のペプチド（残基５８〜６６、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ、ＨＬＡ−Ａ２．１；配列番号２２）、又は破傷風毒素ＴヘルパーユニバーサルエピトープＰ３０（残基９４７〜９６９、ＦＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥＴ、ＤＲ及びＤＰ拘束性；配列番号２３）を正の対照として使用した（７４）。ＨＩＶｇａｇタンパク質由来のペプチド（残基７７〜８５、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ、ＨＬＡ−Ａ２．１拘束性；配列番号２４）、又は熱帯熱マラリア原虫タンパク質由来のペプチドＥｘｐ−１（残基８２〜９６、配列ＡＧＬＬＧＮＶＳＴＶＬＬＧＧＶ、ＤＲ拘束性；配列番号２５）を負の対照として使用した。
【００９３】
ＲＴＳ，Ｓ追加免疫による、ＤＮＡによって誘発された記憶ＣＴＬの復活
ＤＮＡによって初回刺激され、又は初回刺激を受けていない、ＲＴＳ，Ｓワクチン投与直前の各ボランティアでは、ＣＴＬが検出されなかった。ＲＴＳ，Ｓワクチンのみを与えらた１４人の非初回刺激ボランティアではいずれも、ＣＴＬ応答が検出されなかった。抗原特異的かつ遺伝的拘束を受けるＣＴＬ応答が、５／１０人のＤＮＡ初回刺激ボランティアで検出された（図１ｃ）。５人の応答者のうち１人は、最初に投与してから１週間後にＣＴＬ（Ｖ６）を得、その他の者は、ＲＴＳ，Ｓの２回目の投与後にＣＴＬを得た。ＤＮＡ初回刺激ボランティアでのＣＴＬ応答の出現度（７／１１３アッセイ、６．２％）は、非初回刺激ボランティア（０／１２５アッセイ、０％）と比べて有意に大きかった（Ｐ＝０．００４７）。ＣＴＬ応答の出現度は、１２〜１４カ月前にＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンを３回与えた１５人のボランティアにおいて、単独のＤＮＡ免疫感作の後に認められたものとほぼ同等であった（３０／４５８アッセイ、６．６％）（１０７）。
【００９４】
ＤＮＡによる初回刺激及びＲＴＳ，Ｓによる追加刺激を受けているボランティアのＣＴＬの規模（特異的溶解率の範囲［幾何平均］：１１．４〜２８．１［１５．４］）も、ＤＮＡ免疫感作のみによって誘発されたもの（１０．５〜９０．０［１５．６］）と同じ範囲にあった。このＲＴＳ，Ｓワクチンは、以前の２件の研究で最も勢力の強い応答を伴ったＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含んでいなかった（１０５、１０７）。
【００９５】
ＲＴＳ，Ｓ配列中に存在する、画定された全４種のＰｆＣＳＰ特異的ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープに対するＣＴＬ応答が検出された。５人のＣＴＬ応答者のうち、４人がＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープＡ２．３１９に対するＣＴＬを得、１人がＨＬＡ−Ａ１拘束性エピトープＡ１．３１０に応答し（Ｖ２）、２／４人のＡ２．３１９応答者は、ＨＬＡ−Ａ３拘束性及びＨＬＡ−Ｂ７拘束性のエピトープ、すなわちそれぞれＡ３．３３６（Ｖ８）及びＢ７．２８５（Ｖ９）にも応答した。ＣＤ８＋ＣＴＬエピトープＡ２．３１９（下線部）を含む、報告するＣＤ４＋ＣＴＬエピトープＤＲ．３１８（配列ＥＹＬＮＫＩＱＮＳＬＳＴＥＷＳ；配列番号２６）に対する検出可能なＣＴＬはなかった（６９）。ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡを受けていないが、ＲＴＳ，Ｓワクチンを２回受けている１４人のボランティアでも、検出可能なＣＴＬ活性はなかった。こうしたボランティアらにＣＴＬ活性がなかったことは、このワクチンが、単独ではＣＤ８＋Ｔ細胞活性（たとえば、ＣＴＬ活性）を誘発し得なかったことを示している以前の研究と一致する。
【００９６】
ＲＴＳ，Ｓワクチンによる追加免疫後に陽性のＣＴＬ応答を得た５人のＤＮＡ初回刺激ボランティアの中で、３人は、２回目及び３回目にＰｆＣＳＰ  ＤＮＡ免疫感作を施してから２週間後及び６週間後、ＲＴＳ，Ｓ追加免疫のほぼ１年前に試験したとき、同じエピトープに対する検出可能なＣＴＬ活性を以前には示さなかった（１０７）。対照的に、５人のボランティアのうち２人は、単独のＤＮＡ免疫感作後、ＲＴＳ，Ｓ内に含まれるペプチドに対する検出可能なＣＴＬ活性を以前にも示した。この２人のボランティアは、ＲＴＳ，Ｓ追加刺激に応答しなかった。
【００９７】
ＲＴＳ，Ｓ追加免疫によるＣＴＬ応答は、ＤＮＡ初回刺激によるＣＴＬ応答よりも広い
ＲＴＳ，Ｓワクチンによって追加免疫した後、ＣＴＬ応答が陽性であった５人のＤＮＡ初回刺激ボランティアのうち、３人（Ｖ３、Ｖ６、及びＶ８）は、ＲＴＳ，Ｓ追加免疫後に、ＤＮＡ初回刺激後には応答がなされなかったエピトープに応答した。詳細には、ＣＴＬ応答は、両方の負の対照（ＭＨＣ＋対照及び非ＭＨＣ＋ペプチド）のバックグラウンドに対する免疫感作後の特異的溶解率が≧１０％である場合に限り陽性とみなした。Ｖ３及びＶ６では、ＰｆＣＳＰワクチンによるＤＮＡ初回刺激後、エピトープＡ２．３１９に対するＣＴＬ応答はなかった（図１ａ及び図１ｂ）。しかし、ＲＴＳ，Ｓによる追加免疫の後、どちらのボランティアも、このエピトープに対するＣＴＬ応答を示した（図１ｃ）。Ｖ８は、ＤＮＡ初回刺激の後、エピトープＡ２．３１９及びＡ３．３３６に対するＣＴＬ応答を得なかったが、しかしこの初回刺激を施したボランティアにＲＴＳ，Ｓワクチンで追加免疫を施した後に、これらのエピトープに対するＣＴＬ応答が現れた（図１ａ、１ｂ、及び１ｃ）。
【００９８】
上述のように、当業者は、タンパク質系ワクチンを、ＣＴＬ応答の刺激に有効であるとみなしていなかった。同じく、タンパク質系ワクチンであるＲＴＳ，Ｓは、これまでＣＤ８＋Ｔ細胞応答の刺激に無効であるとみなされていた（６１）。知られていたこととは対照的に、上記データは、ＤＮＡ初回刺激の後、ＲＴＳ，Ｓが、新たなＣＴＬエピトープに対するＣＴＬ応答を刺激し得ることをはっきりと示している。
【００９９】
ペプチド特異的なＩＦＮ−γ（以下）及びＣＴＬの応答の出現度及び規模の分析は、χ２乗検定、フィッシャーの正確確率検定（２標本）、又はスチューデントのｔ検定（２標本）を使用して行った。各Ｔ細胞亜集団のＩＦＮ−γｍＲＮＡ発現レベルの割合の比較には、対応のあるサンプル用のｔ検定を使用した。有意性レベルは、ｐ値＜０．０５であった。
【実施例３】
【０１００】
ＰｆＣＳＰに対するＴ細胞のＩＦＮ−γ応答
ＩＦＮ−γ応答の評価は、次のような標準のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって行った。ＰｆＣＳＰ特異的なＩＦＮ−γ産生細胞の数を、以前に記載されているとおりに、１０μｇ／ｍｌのペプチドの存在下で３６時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激した後、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定した（１０７）。ウェル中のサイトカイン産生細胞に相当するスポットの数（細胞生成スポット；ＳＦＣ）を、自動化されたスポットカウントシステム（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ、米バージニア州Ｆａｉｒｆａｘ）で数えた。応答は、ＳＦＣ／１０６ＰＢＭＣの平均数として示し、１）実験ペプチドを加えてあるウェル中の平均細胞数が対照ペプチドを加えたウェルよりも有意に大きかった場合（ｐ＜０．０５、スチューデントのＴ検定）、２）正味のＳＦＣ／ウェル（実験ペプチドウェル中の平均ＳＦＣ−対照ペプチドウェル中の平均）が≧５ＳＦＣ／ウェルであった場合、及び３）刺激指数（実験ペプチドウェル中の対照ペプチド中の平均ＳＦＣ対平均ＳＦＣの比）が２．０より大きい場合に有意であるとみなした。さらに、免疫感作の前に得た細胞の、ＰｆＣＳＰ特異的ペプチドに対する応答が上で定めたように陽性であった場合、免疫感作後の同じペプチドに対する応答は、陽性であるとみなさなかった。
【０１０１】
本明細書では、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴにおける「陽性応答者の出現度」とは、特定のペプチドについて陽性であると判定されるボランティアの数を、試験群のボランティアの総数で割ったものである。「陽性ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイの出現度」とは、ペプチドに対する陽性反応の数を、そのペプチドで実施した試験の総数で割ったものである。たとえば、１０人のボランティアそれぞれにつき６種のペプチドを試験する場合、試験の総数は６０である。これら試験のうち３６試験が陽性である場合、陽性アッセイの出現度は６０のうち３６である。「ＩＦＮ−γ応答の規模」は、ＰＢＭＣ１００万個あたりのＳＦＣの数で示す。
【０１０２】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイでは、ＲＴＳ，Ｓワクチンの最初及び２回目の投与の１〜２週間前、並びにそれから６週間後に単離したＰＢＭＣを使用した。これらのアッセイでは、実施例２で論じた８種の画定されたＰｆＣＳＰペプチド（ＨＬＡクラスＩ拘束性エピトープを含む４種の９アミノ酸ペプチド、及びそれぞれがクラスＩＩ拘束性エピトープを含み、うち３種がクラスＩ拘束性エピトープも含んでいた４種の１５〜２０アミノ酸ペプチド）、及びＲＴＳ，Ｓ配列中に含まれる１３種のＰｆＣＳＰペプチドのプールと共にＰＢＭＣをインキュベートした。これらのペプチドについても、上記実施例２でより詳細に論じている。
【０１０３】
ＤＮＡ初回刺激又は非初回刺激の各ボランティアは、ＲＴＳ，Ｓ免疫感作前には検出可能なＰｆＣＳＰ特異的ＩＦＮ−γ応答を示さなかった。ＭＨＣクラスＩ拘束性エピトープしか含んでいない９アミノ酸ペプチドだけを使用するアッセイでは、免疫感作後のどの時点でもＩＦＮ−γ応答が検出されなかった。これらは、実施例２で論じたペプチドと同じである。最初の投与の後、１０人中６人のＤＮＡ初回刺激ボランティアで、４種すべての１５〜２０アミノ酸ＰｆＣＳＰペプチドについて陽性のＩＦＮ−γ応答が検出されたのに対し、非初回刺激ボランティアでは１４人中２人がそのペプチド１種についてそうであったにすぎない（ｐ＝０．０１９）（表１）。陽性応答者とは、４種のペプチドの少なくとも１種に応答した者である。その上で、初回刺激群の応答者は、試験した４種すべてのペプチドに応答し、非初回刺激群の応答者は、試験した４種のうち１種のペプチドにしか応答しなかった。応答の出現度は、個々のＨＢｓＡｇＡｂ状況にかかわらず、ＤＮＡ初回刺激ボランティアで非初回刺激ボランティアによりも有意に高かった（陽性アッセイ／全アッセイ：２０／１１６［１８．１％］対４／１６４［２．４％］、ｐ＝０．００００１）（表１）。
【０１０４】
【表３】
0005404990.tif 000005
【０１０５】
ＲＴＳ，Ｓワクチンの２回目の投与後、１０人中８人のＤＮＡ初回刺激ボランティア及び１４人中１１人の非初回刺激ボランティアでＩＦＮ−γ応答が検出された（表１）。ＲＴＳ，Ｓワクチンの２回目の投与後の応答者数について、２群間に差はないが（陽性アッセイ数／全アッセイ（％）を参照のこと）、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの全体としての陽性アッセイ数は、非初回刺激ボランティアと比べて統計学的に有意に多かった（陽性アッセイ／全アッセイ、６１／２３８［２５．６％］対４４／３２０［１３．８％］、ｐ＝０．０００４）（表１）。全体としての陽性アッセイ数のこの差は、陽性アッセイの出現度によって明示されるように、ボランティアのＨｂＳＡｇ抗体状態と直接に関連していた。２回目のＲＴＳ，Ｓ免疫感作後の陽性アッセイ数は、ＨＢｓＡｇ抗体陽性の個体の中では、ＤＮＡ初回刺激ボランティアで非初回刺激ボランティアよりも有意に多かったが（２３／７２［３１．９％］対１１／８４［１３．１％］、ｐ＝０．００７８）、ＨｂｓＡｇ抗原陰性の個体ではそうでなかった（３７．５％対４０．３％の陽性アッセイ）。
【０１０６】
エピトープレベルでは、ペプチドＤＲ．３１６、ＤＲ．３１８、及びＤＲ．３６３に対するＩＦＮ−γ応答を、ＤＮＡ初回刺激群と非初回刺激群とで比較した。ＤＲ．３１６及びＤＲ．３１８は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の重なり合うエピトープを含み、ＤＲ．３６３は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのみを含んでいる（１０７）。
【０１０７】
表２に示すように、ペプチドＤＲ．３１６に対するＩＦＮ−γ応答は、最初のＲＴＳ，Ｓワクチン投与後では、非初回刺激ボランティアの１４人中０人に対し、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの１０人中４人で検出され（ｐ＝０．００９５）、ＲＴＳ，Ｓワクチンの最初及び２回目の投与後では、非初回刺激ボランティアの１３人中５人に対し、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの１０人中６人で検出された（ｐ＝０．３５）。すべてのアッセイを総合的にみなしたとき（ＲＴＳ，Ｓワクチンの最初及び２回目の投与後）、ＤＮＡ初回刺激群は、陽性アッセイの出現度がより高かったが（陽性アッセイ／全アッセイ、１７／６０対８／８１、ｐ＝０．００４６）、ＩＦＮ−γ応答の規模には差がなかった（ＳＦＣの範囲：１１．９〜１０６．３［３３．０］対１７．５〜５８．１［２８．４］、ｐ＝０．２１）。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
また、表２に示したように、ペプチドＤＲ．３１６の最初の２アミノ酸を含んでいないペプチドＤＲ．３１８に対するＩＦＮ−γ応答は、ＲＴＳ，Ｓワクチンの最初の投与後では、非初回刺激ボランティアでの１４人中０人に対し、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの１０人中３人で検出され（ｐ＝０．０２８）、ＲＴＳ，Ｓワクチンの最初及び２回目の投与後では、非初回刺激ボランティアの１３人中１人に対し、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの１０人中６人で検出された（ｐ＝０．００６９）。最初及び２回目のＲＴＳ，Ｓワクチン投与後に実施したＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、全体として、ＤＮＡ初回刺激群の陽性アッセイ出現度がより高かったことを示した（陽性アッセイ／全アッセイ、１４／６０対１／８１、ｐ＜０．００００３）。ＲＴＳ，Ｓワクチンしか受けなかった群で、このペプチドに対して１件の応答しかなかったことを考えると、応答の規模を比較するのは不可能であった。
【０１１０】
既知のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含んでいないペプチドＤＲ．３６３に対するＩＦＮ−γ応答は、最初のＲＴＳ，Ｓワクチン投与後では、非初回刺激ボランティアの１４人中２人に対し、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの１０人中３人で検出され（ｐ＝０．３５）、全体としての最初及び２回目のＲＴＳ，Ｓワクチン投与後では、非初回刺激ボランティアの１４人中９人に対し、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの１０人中４人で検出された（ｐ＝０．２４）（表２）。最初及び２回目のＲＴＳ，Ｓワクチン投与後に行ったアッセイは、ＤＮＡ初回刺激群とＲＴＳ，Ｓ単独群の陽性アッセイ出現度に有意差がなかったことを示した（陽性アッセイ／全アッセイ、８／６０対１８／８１、ｐ＝０．１７８）。しかし、２回目のＲＴＳ，Ｓ投与後の、非初回刺激ボランティアのＩＦＮ−γ応答の規模は、ＤＮＡ初回刺激ボランティアよりも有意に高かった（ＳＦＣ範囲：１０６細胞あたり１３．１〜５８．８［２６．４幾何平均］対１０６細胞あたり１４．０〜１４０．６［４７．９幾何平均］、ｐ＝０．００４）。
【０１１１】
同様に、ＲＴＳ，Ｓワクチンを２回投与した後の陽性応答個体の出現度にも、ＤＮＡ初回刺激群とＲＴＳ，Ｓ単独群とに差がなかった（８／１０対１１／１３）。表１を参照されたい。ＤＮＡ初回刺激群の個体は、ＲＴＳ，Ｓワクチンしか受けなかったボランティアよりも、応答した試験ペプチドが有意に多かった。１０人のＤＮＡ初回刺激ボランティア中の８人の応答者のうち、１人は、試験した１５〜２０アミノ酸ペプチドの４種類全部に対して応答し、１人が３種のペプチドに、５人が２種のペプチドに応答し、１人だけが１種のペプチドにしか応答しなかった。１３人の非初回刺激ボランティア中の１１人の応答者のうち、１人が３種のペプチドに応答し、２人が２種のペプチドに応答し、８人が１種のペプチドにしか応答しなかった（２／８人がＤＲ．３１６に応答し、６／８人がＤＲ．３６３に応答した）。全体として、非初回刺激ボランティアの１１人中３人に対し、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの８人中７人が、少なくとも２種の試験ペプチドに応答した（ｐ＝０．００９４）。
【実施例４】
【０１１２】
ＨＢｓＡｇに対するＴ細胞のＩＦＮ−γ応答
ＲＴＳ，Ｓは、ＰｆＣＳＰの部分及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）からなる融合タンパク質である。ＨＢｓＡｇに対する抗体を有する個体では、アジュバント中に含めたＲＴＳ，Ｓによる免疫感作の、Ｔ細胞応答の誘発における効率は有意に劣っていた。この結果は、ＤＮＡ初回刺激ボランティアでは、はるかに目立たなくなった。４種の１５〜２０アミノ酸ペプチドに対する応答にＨＢｓＡｇ抗体状況が及ぼした影響が顕著であったので、調査を拡大した。最初及び２回目のＲＴＳ，Ｓ免疫感作後、すべての試験時点で１３種のＰｆＣＳＰペプチド（ｐＰｆＣＳＰ）プールと１９種のＨＢｓＡｇペプチドプールをＰＢＭＣ中に同時に用いて上述のようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行って、ＰｆＣＳＰとＨＢｓＡｇに対する各ＩＦＮ−γ応答を比較した。未処置の非ＤＮＡ初回刺激個体では、ＨＢｓＡｇ成分がＴ細胞応答に免疫優性であったが（ＨＢｓＡｇ陰性の非初回刺激ボランティアでは、ＰｆＣＳＰの０／６人の応答者に対してＨＢｓＡｇは６／６人の応答者、並びにＨＢｓＡｇ陽性の非初回刺激ボランティアでは、ＰｆＣＳＰの１／８人の応答者に対してＨＢｓＡｇは７／８人の応答者）、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡで初回刺激すると、Ｔ細胞応答がＰｆＣＳＰに向けられて、この免疫優性が釣合いをもったと思われた（表３；ＨＢｓＡｇ陰性の初回刺激ボランティアでは、ＰｆＣＳＰの２／４人の応答者に対してＨＢｓＡｇが２／４人の応答者、並びにＨＢｓＡｇ陽性の初回刺激ボランティアでは、ＰｆＣＳＰの４／６人の応答者に対してＨＢｓＡｇが６／６人の応答者）。
【０１１３】
【表５】
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【０１１４】
非初回刺激ボランティアでは、ＨＢｓＡｇに対するＩＦＮ−γ応答が、ＨＢｓＡｇに対する抗体を有するか否かにかかわらず、すべてのボランティアで高かった（表３及び表４、非初回刺激ボランティアを参照のこと）。表３に示したように、ＲＴＳ，Ｓワクチンの最初の投与後、ＨｂｓＡｇペプチドプールに対する応答の規模は、ＨＢｓＡｇに対する抗体が予め存在している個体で、そのような抗体をもたない個体よりも有意に大きかった（ＳＦＣ範囲／１０６個ＰＢＭＣ［幾何平均］：１３．１〜２２２．９［６０．１］対１３．１〜１３２．５［３３．９］、ｐ＝０．０１３）。しかし、ＲＴＳ，Ｓワクチンによる２回目の免疫感作後では、２群間にＩＮＦγの規模の差はなかった（規模のデータを参照のこと）。ＨＢｓＡｇ抗体陰性個体のＨＢｓＡｇに対する応答は、ＲＴＳ，Ｓワクチンの２回目の投与後に、最初の投与後と比べて有意に増大した（表３）。詳細には、２回のＲＴＳ，Ｓワクチン投与後の陽性アッセイの出現度は、最初の投与後で９／１５であったのに対し、１７／１８であった（ｐ＝０．０３５）（表３の脚注を参照のこと）。ＩＦＮ−γ応答の規模は、１回だけの投与で１３．１〜１３２．５［幾何平均＝５３３．９］であったのに対し、１２．５〜３１７．５［幾何平均＝９７．３］であった（ｐ＝０．０２４）（表３の脚注を参照のこと）。２回目の投与後、ＳＦＣ数は、ＨｂｓＡｇ抗体陰性個体で、ＨＢｓＡｇ抗体陽性個体よりも有意に多かった（１２．５〜３１７．５［９７．３］に対して２０．０〜２７８．８［６２．３］、ｐ＝０．０１３）（表３）。
【０１１５】
表３が示すように、ＰｆＣＳＰに対するＩＦＮ−γ応答は、ＨＢｓＡｇに対する応答とは異なるパターンを示した。ＲＴＳ，Ｓワクチンの１回目の投与後に、８人中７人のＨＢｓＡｇ陽性ボランティア及び６人全員のＨＢｓＡｇ陰性ボランティアとして示される、１４人中１３人の非初回刺激ボランティアが、ＨＢｓＡｇに応答した。対照的に、ＰｆＣＳＰに対しては、８人中１人のＨＢｓＡｇ陽性ボランティア及び６人中０人のＨＢｓＡｇ陰性ボランティアとして示される、この１４人中１人の個体しか応答しなかった（ｐ＝０．００４９）。全体として、ＲＴＳ，Ｓの最初及び２回目の投与後の陽性応答者出現度及び陽性アッセイ出現度によって評価したところ、ＲＴＳ，Ｓによって誘発されたＩＦＮ−γ応答は、ＤＮＡによる初回刺激を受けなかったすべてのボランティアで、ＰｆＣＳＰに対してはＨＢｓＡｇに対してよりも有意に低く、抗ＨＢｓＡｇ抗体が予め存在している個体においてさえ低かった（表３）。非初回刺激ボランティアのｐ値を参照されたい。同様に、ＩＦＮ−γ応答の規模も、各免疫感作後、ＨＢｓＡｇ抗体陽性個体（ｐ＜０．０５〜０．００３２）及びＨＢｓＡｇ抗体陰性個体（ｐ＝０．０００１）の両方でより低かった（表３）。表３の規模の欄の、強調表示したｐ値を参照されたい。これらのデータは、非初回刺激個体では、ＲＴＳ，Ｓが、ＰｆＣＳＰとＨＢｓＡｇとに対するＴ細胞応答を惹起し、ＨＢｓＡｇに対する応答の方がＰｆＣＳＰに対する応答よりも有意に強かったことを示した（表４）。
【０１１６】
ＨｂｓＡｇ抗体陽性でもあるＤＮＡ初回刺激ボランティアでは、最初のＲＴＳ，Ｓ投与後の陽性アッセイ数は、ＰｆＣＳＰに対してよりもＨＢｓＡｇに対しての方が多かった（１２／１５対４／１５、ｐ＝０．００３４）（表３）。しかし、２回目のＲＴＳ，Ｓワクチンを投与すると、ＰｆＣＳＰに対する陽性アッセイの出現度は、ＨＢｓＡｇ抗体陽性ボランティアのＨＢｓＡｇについての出現度と異なっていなかった。ＤＮＡ初回刺激ボランティアについての出現度のデータを参照されたい。ＤＮＡ初回刺激を受けたＨｂｓＡｇ抗体陰性ボランティアでは、ＲＴＳ，Ｓワクチンの最初又は２回目の投与後、これらの出現度は異なっていなかった。ＰｆＣＳＰ及びＨｂｓＡｇに対する各応答の規模は、ＨｂｓＡｇ抗体状態にかかわらず、最初の投与後では類似していた（表３）。しかし、２回目の投与後では、ＤＮＡ初回刺激を受けたＨＢｓＡｇ抗体陽性個体の、ＨＢｓＡｇに対する応答の規模が、ＰｆＣＳＰに対する応答の規模に比べて有意に増大した（ＳＦＣ範囲／１０６個ＰＢＭＣ［幾何平均］：１８．１〜６８．８［３３．８］対１８．８〜１３１．３［５２．８］、ｐ＝０．０２４）。これらの結果は、ＲＴＳ，Ｓワクチンが複数回投与された場合、ＨＢｓＡｇに対する応答が、ＰｆＣＳＰに対する応答よりも結局優勢になり得ることを示唆した。
【実施例５】
【０１１７】
ヒトにおいて、ＲＴＳ，ＳはＴｈ１応答しか誘発しないが、ＤＮＡワクチンは、Ｔｃ１（ＣＤ８＋）型及びＴｈ１（ＣＤ４＋）型の両方の応答を誘発する
ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンは、単独でＩＦＮ−γ応答を誘発することができるので、ＲＴＳ，Ｓワクチンの２回目の投与後、陽性応答者については、両方の群のＩＦＮ−γ応答が同等であった（８／１０に対して１１／１４）（表１）。それでもやはり、これまでに報告したように、単独のＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンによって誘発されたＩＦＮ−γ応答は、異なるＴ細胞サブタイプに応じて異なっていた。ＤＮＡによる免疫感作は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に依存的なＩＦＮ−γ応答を誘発し（１０７）、ＲＴＳ，Ｓは、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存的な応答だけを誘発する（６１）。
【０１１８】
両方の誘発のＩＦＮ−γ応答のＴ細胞プロフィール、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのエフェクター相の特徴付けを、それぞれＥＬＩＳＰＯＴ及びリアルタイムＰＣＲによって、ＤＮＡ単独、ＲＴＳ，Ｓ単独で免疫感作したボランティア、又はＤＮＡ初回刺激／ＲＴＳ，Ｓ追加免疫ボランティアからのＰＢＭＣを用いて行った。
【０１１９】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、抗ＣＤ４＋又は抗ＣＤ８＋でコートしたＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．、米ニューヨーク州Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ）を使用して、ペプチドと共に培養する前にＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたＰＢＭＣを用いて実施した。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルは、選択的に濃縮処理したＴ細胞集団、すなわちＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ−の各Ｔ細胞でのリアルタイムＰＣＲによって測定した。これらのアッセイでは、凍結したＰＢＭＣを、１０％のヒトＡＢ血清を加えた、２４穴プレート中の完全ＲＰＭＩ培地２ｍｌ中で３×１０６細胞／ウェルの密度で一晩培養して元に戻し、次いで短いペプチド（９〜１０アミノ酸Ａ２ペプチド配列ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ；配列番号２７）で２時間、又は長いペプチド（１５〜２０アミノ酸）で４時間、１０μｇ／ｍ１の密度で刺激した。次に、ＰＢＭＣを収集し、ＭＡＣＳ  ＭｕｌｔｉＳｏｒｔキットを使用してＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮を行い、次いで、濃縮処理したＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４５ＲＡ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、米カリフォルニア州Ａｕｂｕｒｎ）に通して、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞及びＣＤ４５ＲＡ−細胞を分離した。
【０１２０】
リアルタイムＰＣＲによってＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡを定量化するために、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を使用して、濃縮処理したＴ細胞サブセットから全ＲＮＡを単離した。ランダム六量体及びＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して、全ＲＮＡからＣＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲによるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの相対定量は、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲキットを製造者の指示に従って使用しながら、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によって行った。ＩＦＮ−γ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマー、プローブ、及び標準物質は、社内で設計及び標準化した。リアルタイムＰＣＲによるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの相対定量は、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲキットを製造者の指示に従って使用しながら、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）によって行った。ＩＦＮ−ｇ及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを増幅するためのプライマー（ｈＩＦＮ−ｇ−Ｆ、ＴＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＡ、配列番号２８；ｈＩＦＮ−ｇ−Ｒ、ＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＡＧＡＡＡＡ、配列番号２９；ｈＧＡＰＤＨ−Ｆ、５’ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ、配列番号３０；ｈＧＡＰＤＨ−Ｒ、ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ、配列番号３１）、プローブ（ｈＩＦＮ−ｇプローブ：ＴＧＴＣＡＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＡ、配列番号３２；ｈＧＡＰＤＨプローブ：ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ、配列番号３３）は、製造者のプロトコルに従って社内で設計及び標準化した。各実験サンプルでＧＡＰＤＨの増幅を内在対照として行って、各反応に加える全ＲＮＡの量及び質の差を計上した。熱循環条件は、５０℃で２分間及び９５℃で１０分間の後、９５℃で１５秒及び６０℃で１分間からなる２ステップのＰＣＲを５０回とした。全サンプルを３通りに増幅した。ターゲットｍＲＮＡレベルと逆の相関がある閾値サイクル（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）（Ｃｔ）を、レポーター蛍光発光が閾値レベルを上回って増大したサイクル数として測定した。ターゲット遺伝子の発現は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現の値をもとに異なるサンプル間で標準化した。
【０１２１】
Ｔ細胞のどのサブセットがＩＦＮ−γ応答の誘発相に関与したかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの前に、枯渇処理したＴ細胞集団を、画定されたＰｆＣＳＰペプチドと共にインキュベートした。平行して、ＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用したものと同じペプチドと共にインキュベートした後、縮処理したＴ細胞集団サブセットでのリアルタイムＰＣＲによってＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルを評価して、実際にＩＦＮ−γを分泌したエフェクターＴ細胞の輪郭を描いた。ペプチドＤＲ．３６３（クラスＩＩ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのみを含む）及びＤＲ．３１６（クラスＩ及びクラスＩＩ拘束性の重なり合うＣＤ４＋エピトープ及びＣＤ８＋エピトープを含む）に対する応答を評価して、ＰｆＣＳＰに対する、異なるワクチン送達系によるＩＦＮ−γ応答の根底にある機序を比較した。ＨＬＡ−Ａ２拘束性、免疫優性、かつ保存されている、インフルエンザマトリックスタンパク質（ＦｌｕＭ  Ａ２）由来ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ、及びＨＬＡ−ＤＲ拘束性の、破傷風毒素（ＴＴ−ＤＲ）由来ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープに対する応答も同時に評価して、異なるエピトープ、アッセイ、及びボランティア間の内部標準化を果たした。
【０１２２】
ＦｌｕＭ  Ａ２ペプチドに対するＩＦＮ−γ応答のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの誘発は、受けた抗マラリアワクチンの種類が何であるかにかかわらず、試験した１７人すべての個体で、ＰＢＭＣの培養直前にＣＤ４＋Ｔ細胞でなくＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させると、ＩＦＮ応答が完全になくなるか、又は有意に減少したことから、ＣＤ４＋Ｔ細胞でなくＣＤ８＋Ｔ細胞に依存的であった（図２ａ）。対照的に、ペプチドＴＴ−ＤＲに対する応答は、試験した３人全員の陽性応答者で、完全にＣＤ８＋Ｔ細胞でなくＣＤ４＋Ｔ細胞に依存的であった（図２ｂ）。
【０１２３】
濃縮処理した４種のＴ細胞集団（ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ−）でのリアルタイムＰＣＲによって測定したＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイから得た知見と一致していた。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡは、ＦｌｕＭ  Ａ２ペプチドで刺激した後、主にＣＤ８＋Ｔ細胞中でアップレギュレーションされた（図２ｅ：規準物質）。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞では６．８倍（範囲、３．４〜１２．９倍）に増加したのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞では２．２倍（範囲、０．９８〜７．５８倍）の増加であった（ｐ＝０．０３）。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションの百分率は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を上回って平均で７８％であった（範囲、６２〜９９％）。対照的に、ＴＴ−ＤＲによる刺激後では、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡが、主にＣＤ４＋Ｔ細胞でアップレギュレーションされた（図２ｅ：規準物質）。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡレベルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞では７．６倍（範囲、２．４〜１８．３）に増加したのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では２．２倍（範囲、１．１〜４．６）の増加であった（ｐ＝０．０２）。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を上回って７９％（範囲、７４〜１００％）であった。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＦｌｕＭ  Ａ２ペプチドに対するＩＦＮ−γ応答の機能エフェクターであり、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴＴ−ＤＲペプチドに対する機能エフェクターであることを示唆した。
【０１２４】
発明者らは、上述のように、アッセイを２種の標準物質と平行して行い、ＤＮＡ  ＰｆＣＳＰワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンによって誘発された、２種の異なるＰｆＣＳＰペプチド（ＤＲ．３６３及びＤＲ．３１６）に対するＩＦＮ−γ応答のＴ細胞プロフィールを明らかにした。ペプチドＤＲ．３６３がＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含んでいるがＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含んでいないことと一致して、枯渇処理したＴ細胞集団を用いたＥＬＩＳＰＯＴの結果は、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンのみ（被験者２／２人、Ｖ１及びＶ５）又はＲＴＳ，Ｓのみ（被験者６／６人）を受けたボランティアで、ペプチドＤＲ．３６３に対するＩＦＮ−γ応答が、完全にＣＤ４＋Ｔ細胞依存的であったことを示した（図２ｃ）。濃縮処理したＴ細胞集団におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＥＬＩＳＰＯＴによるＴ細胞依存性と整合性があった。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡは、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン及びＲＴＳ，Ｓワクチンで免疫感作されたどちらのボランティアでも、主にＣＤ４＋Ｔ細胞でアップレギュレーションされた（図２ｅ：ＤＲ．３６３）。ＤＮＡで免疫感作した５人の被験ボランティアでは、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡレベルが、ＣＤ４＋Ｔ細胞では５．３倍（範囲、２．６〜１１．５）に増加したのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では１．７倍（範囲、０．９９〜３．２）の増加であった（ｐ＝０．０１４）。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を上回って７４％であった（範囲、６４〜９１％）。ＲＴＳ，Ｓで免疫感作した４人のボランティア被験ボランティアでも同じパターンが見られ（図２ｅ）、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡレベルが、ＣＤ４＋Ｔ細胞では９．２倍（範囲、２．９〜５３．５）に増加したのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では０．９倍（範囲、０．６〜１．１）の増加であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を上回って８６％（範囲、７３〜９８％）であった。これらの結果は、ＤＮＡ  ＰｆＣＳＰワクチンが、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存的なＩＦＮ−γ応答に加え、ＰｆＣＳＰ特異的かつＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＩＦＮ−γ応答を誘発したことの第１の証拠となった。
【０１２５】
ＤＲ．３１６（ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の重なり合うエピトープ）に対するＩＦＮ−γ応答は、単独のＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンを受けているボランティアでは、種々のＴ細胞サブセットに応じて様々であった。これまでに報告されているように（１０７）、この応答は、ＤＮＡのみを受けたボランティア（Ｖ１）ではＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に依存的であったのに対し（図２ｄ）、ＲＴＳ，Ｓワクチンのみを受けたボランティア（３／３人の被験ボランティア）では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみに依存的で、ＣＤ８＋Ｔ細胞には依存的でなかった（図２ｄ）。さらに、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡは、ＤＮＡで免疫感作したボランティアにおいて主にＣＤ８＋Ｔ細胞でアップレギュレーションされたが（図２ｅ：ＤＲ．３１６）、ＥＬＩＳＰＯＴによると、この応答はＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に依存的であった。
【０１２６】
ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞で６４．７倍に増加したのに対し、ＣＤ４＋Ｔ細胞では０．３６倍の増加であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮγ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を上回って９９．６％であった。対照的に、ＲＴＳ，Ｓワクチンで免疫感作したボランティアでは、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの転写が、主にＣＤ４＋Ｔ細胞でアップレギュレーションされた（図２ｅ：ＤＲ．３１６）。ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞では２４．７倍（範囲、５．３〜１７６．７倍）に増加したのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では２．５倍（範囲、１．１〜５．６倍）の増加であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を上回って８６％（範囲、６９〜９８％）であった。これらの知見は、ＤＮＡによる免疫感作では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ応答のｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘発相にしか関与しておらず、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＤＲ．３１６に対して実際にＩＦＮ−γを分泌する細胞であることを示唆した。ＲＴＳ，Ｓワクチンで免疫感作した個体では対照的に、これらの結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、同じペプチド（ＤＲ．３１６）に対してＩＦＮ−γを産生するエフェクターＴ細胞であることを示唆した。
【実施例６】
【０１２７】
ＤＮＡ初回刺激／ＲＴＳ，Ｓ追加免疫は、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のレパートリーを広げる
ＤＮＡ初回刺激ボランティアにおけるＲＴＳ，Ｓワクチンでの追加免疫によって、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のレパートリーの輪郭が浮かび上がった。ペプチドＤＲ．３６３（ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを含んでいない）に対するＩＦＮ−γ応答は、単独のＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンで免疫感作したボランティアで、ＣＤ４＋Ｔ細胞にのみ依存的であった。ＲＴＳ，Ｓによる追加刺免疫後のＤＮＡ初回刺激群の２／３人の応答者（Ｖ１及びＶ５）でも、ＤＲ．３６３に対する同じ型の応答が検出された。驚くべきことに、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルによって測定した応答規模は、ＤＮＡのみの３回の免疫感作後では、Ｖ１で７．６倍、Ｖ５で１２．５倍の増加であったのに対し、ＲＴＳ，Ｓによる追加免疫の後、ボランティアＶ１で９４．９倍、Ｖ５で４６．７倍に増大した。図３の「ＤＮＡ単独」バーを参照されたい。ＲＴＳ，Ｓ追加免疫後の応答の規模は、Ｖ１ではＤＮＡ免疫感作後の１２．５倍、Ｖ５では３．７倍であった（図３；「ＤＮＡ単独」バーと「ＤＮＡ／ＲＴＳ，Ｓ」バーを比較されたい）。
【０１２８】
ペプチドＤＲ．３１６に対するＩＦＮ−γ応答は、単独のＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチン又はＲＴＳ，Ｓワクチンを受けたボランティアでは、種々のＴ細胞サブセットに応じて様々であった。ＤＮＡによって誘発された応答は、誘発相ではＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に依存的であったが、エフェクター相ではＣＤ８＋Ｔ細胞のみに依存的であった。エフェクター相の測定を行うときには、ペプチドで刺激した後にＴ細胞集団を枯渇させた。対照的に、ＲＴＳ，Ｓによって誘発された応答は、誘発相及びエフェクター相の両方で、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみに依存的であった。したがって、ＲＴＳ，Ｓによる追加刺激後、ＤＮＡ初回刺激ボランティアのＤＲ．３１６に対する応答が、単独のＤＮＡ又はＲＴＳ，Ｓで免疫感作したボランティアで見られる２通りのパターンが混ざったものであったことは意外でない（図２ｄ）。
【０１２９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの誘発相では、最初のＲＴＳ，Ｓ投与の後、３／５人の応答者（４／６アッセイ）で、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に依存的な、ＤＲ．３１６に対するＩＦＮ−γ応答が検出された。２回目のＲＴＳ，Ｓ投与の後、４／６人の応答者（７／１２アッセイ）で、完全にＣＤ４＋Ｔ細胞依存的であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞には部分的にしか依存的でないＩＦＮ−γ応答が検出された。ＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させても、ＩＦＮ−γの産生はなくならず（図４ａ）、ＲＴＳ，Ｓによる初回刺激後には、ＣＤ８＋ＴだけでなくＣＤ４＋Ｔ細胞もＩＦＮ−γを産生したことが示唆された。同時に、エフェクター相では、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルが、ＤＮＡ単独で免疫感作したボランティアではＣＤ８＋Ｔ細胞でのみ、又はＲＴＳ，Ｓ単独で免疫感作したボランティアではＣＤ４＋Ｔ細胞でのみアップレギュレーションされたのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞（８／８人の応答者）だけでなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＲＴＳ，Ｓの最初の投与後４／８人の応答者、２回目の投与後６／８人の応答者）でもアップレギュレーションされた（図２ｅ：ＤＲ．３１６、ＶＩ（ＤＮＡ）とＶ２２（ＲＴＳ，Ｓ）を比較されたい）。
【０１３０】
全体として、ＲＴＳ，Ｓによる追加免疫の後、８人中６人の応答者で、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションが検出され、ＣＤ４＋Ｔ細胞でのＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションが３．０〜２８．３倍（幾何平均、６．６倍）であったのに対し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では、４．０〜２８１．０３（幾何平均、１９．７倍）であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡのアップレギュレーションの百分率は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を上回って２３．５％（範囲、６．５〜４５．１％であった）。ここまでの結果は、ＲＴＳ，Ｓによる追加刺激後のＤＮＡ初回刺激ボランティアで、ＤＲ．３１６に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞にＩＦＮ−γを産生させるためのヘルパーＴ細胞として（ＤＮＡによって誘発されるＩＦＮ−γ応答の特徴）だけでなく、ＩＦＮ−γを産生するエフェクターとして（ＲＴＳ，Ｓによって誘発されるＩＦＮ−γ応答の特徴）も機能したことを実証したものであった（表５）。
【０１３１】
上記データによって、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存的なＩＦＮ−γ応答が、非初回刺激ボランティアでは実証されなかったが、ＤＮＡ初回刺激−ＲＴＳ，Ｓ追加免疫ボランティアでは実証された。これらのデータからは、同じエピトープに対する、ＣＤ４及びＣＤ８の両方に依存的なＩＦＮ−γ応答も実証された。ペプチドＤＲ．３１６は、ＩＦＮ−γ応答が異なるＴ細胞サブセットに依存的であることから、ＣＤ４及びＣＤ８の重なり合うエピトープであると特定された。
【０１３２】
【表６】
0005404990.tif 000008
【実施例７】
【０１３３】
ＤＮＡ初回刺激／ＲＴＳ，Ｓ追加免疫ボランティアの抗体応答
風乾熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトに対する抗体応答の評価を、ＲＴＳ，Ｓによる免疫感作前、ＲＴＳ，Ｓを最初に投与してから２、４、６及び８週間後、２回目に投与してから１、２、４、及び６週間後に行った。抗体の力価は、これまでに記載されているような間接蛍光抗体試験（ＩＦＡＴ）によって決定した（３３）。予想どおり、各群で抗体応答に若干の変動性があったものの、抗体力価は上等であった（図５）。力価は、２回目のＲＴＳ，Ｓ投与の４週間後に最高点に達し、幾何平均力価は、５１２０〜２０４８０の範囲であった。しかし、１件を除き、どの時点でも全スポロゾイトに対する抗体力価に統計学的な有意差はなかった。最初に投与してから２週間後において、ＰｆＣＳＰを受けたことがなく、ＨＢｓＡｇに対する抗体を有するボランティア群（ＤＮＡ−／ＨＢ＋）の、ＩＦＡＴによる抗体の幾何平均力価３２２５が、ＰｆＣＳＰを受けたことがあり、ＨＢｓＡｇに対する抗体を有するボランティア（ＤＮＡ＋／ＨＢ＋）の幾何平均力価７１８．４よりも大きかった（Ｐ＝０．０２）。これは主に、予定されていたＲＴＳ，Ｓによる２回目の免疫感作のちょうど前の６週間の時点の後に試験を辞退した、ＤＮＡ−／ＨＢ＋群の１人のボランティアの高い力価１０２４０によるものであった。２回目のＲＴＳ，Ｓ投与後、各群間に統計学的有意差は存在しなかった。
【０１３４】
結論
熱帯熱マラリア原虫、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及びＨＩＶのような感染に対する有効で持続性のあるワクチン開発の経過は、予想以上に手間取り、困難であり、かつ複雑であることがわかった。上記の本発明の分析は、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡによる初回刺激とＲＴＳ，Ｓによる追加免疫とによって、免疫系の細胞性及び液性の両部門による応答が誘発されることを示すものである。さらに、ＨＢｓＡｇに対する抗体を有する個体の中で、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡワクチンによる初回刺激を受けた個体は、ＲＴＳ，Ｓアジュバント添加ワクチンの投与後、ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡを受けたことのないボランティアよりも良好なＴ細胞応答を生じた。マラリアワクチン又は他のワクチンの大抵の受容者は、免疫感作又は感染によるＨＢｓＡｇに対する抗体をもつことになるので、このことは、この初回刺激追加免疫による免疫感作戦略の重要な強みとなり得る。
【０１３５】
この分析は、ＲＴＳ，Ｓ  ＤＮＡによるワクチンを最後に接種してから１２〜１４カ月後に追加刺激することによって、ボランティアの５０％で、ＤＮＡ初回刺激によるＰｆＣＳＰ特異的なＣＴＬ応答が復活したことを示し、ＤＮＡワクチンが、記憶Ｔ細胞の応答を長持ちさせるのに非常に有効であったことを示唆している。ＲＴＳ，Ｓ注射後にＣＴＬが復活した５人中２人のボランティアは、ＤＮＡのみで免疫感作した後にはＣＴＬが検出可能でなかったので、ＤＮＡワクチンによる免疫感作が、これらの個体において記憶ＣＴＬを誘導するのには優れていたが、エフェクターＴ細胞応答の誘発には最適でなかったかもしれないことが示唆される（３８、９２）。ＲＴＳ，Ｓのみを受けた非初回刺激ボランティアではＣＴＬが検出されなかったので、ＲＴＳ，Ｓは、ＰｆＣＳＰ特異的なＣＴＬを初回刺激することができなかったが、ＤＮＡワクチンによって引き起こされたＣＴＬ応答を追加刺激する能力を備えていた。ＤＮＡ初回刺激によるＰｆＣＳＰ特異的なＩＦＮ−γ応答も、ＲＴＳ，Ｓによって、特に最初の投与後に強く追加刺激された。４種のうち１種のペプチドに対してしか応答を示さなかった１４人中２人の非初回刺激ボランティアに対し、１０人中６人のＤＮＡ初回刺激ボランティアは、試験した４種すべてのペプチドに対するＩＦＮ−γ応答を示した。ＲＴＳ，Ｓの２回の投与後、応答の出現度及び規模については有意差がなかったものの、ＩＦＮ−γ応答のエピトープレベルでの幅は、ＤＮＡ初回刺激ボランティアで非初回刺激ボランティアよりも有意に広かった。１１人中３人の非初回刺激ボランティアに対して８人中７人のＤＮＡ初回刺激ボランティアが、少なくとも２種の試験ペプチドに応答した（ｐ＝０．００９４）。
【０１３６】
結果は、ＤＮＡ初回刺激／ＲＴＳ，Ｓ追加免疫が、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞のレパートリーを広げることも示唆している。ＤＮＡ初回刺激によって、ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の２通りのプロフィール、すなわち（１）重なり合うＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＤＲ．３１６及びＤＲ．３１８）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＣＤ８＋１型応答、及び（２）ＤＲ拘束性ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（ＤＲ．３６３）に対するＣＤ４＋１型ＩＦＮ−γ応答が開始された。一方、単独のＲＴＳ，Ｓは、ＣＤ４＋１型ＩＦＮ−γ応答のみを誘発した（図２）。ＤＲ．３１６、すなわち重なり合うＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに関しては、単独のＤＮＡがＣＤ４＋依存的なＣＤ８＋１型応答を誘発し、単独のＲＴＳ，Ｓがこのペプチドに対するＣＤ４＋１型応答を誘発した。しかし、ＤＮＡで初回刺激し、ＲＴＳ，Ｓで追加免疫すると、ＤＲ．３１６に対する両方のパターンのＩＦＮ−γ応答が同時に誘発された（図４、表４）。加えて、ＲＴＳ，Ｓは、ＤＮＡ初回刺激後には検出されなかった、新たなＣＴＬエピトープに対するＣＴＬ応答を刺激した。
【０１３７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生の傍観者的な助力者の役目を果たすのではないか。上記の結果は、それぞれ、ＰＢＭＣをペプチドによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激する前後に枯渇又は濃縮処理したＴ細胞集団で、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びリアルタイムＰＣＲを平行して実施して、この仮説を検証するものである。ＩＦＮ−γ産生細胞の数及びＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルをペプチドによる刺激の前後で比較すると、単独のＤＮＡワクチン及び単独のＲＴＳ，Ｓワクチンによって誘発されるＩＦＮ−γ応答に関与するＴ細胞の機能プロフィールの輪郭が浮かび上がった。
【０１３８】
ここでの結果は、ＤＮＡによる初回刺激が、追加免疫後の応答を、初回刺激された抗原の方に向け得ることを示唆している。ＲＴＳ，Ｓによる免疫感作に関しては、このことが特に重要であると思われる。ＲＴＳ，Ｓは、マラリア抗原ＰｆＣＳＰに対するＴ細胞応答を増強し得るはずの担体としてＨＢｓＡｇを備えた設計がなされた。基点においてＨＢｓＡｇ抗原に対する抗体をもっていた個体は、以前にＢ型肝炎ワクチンよって免疫感作されている。サハラ以南のアフリカで送達された抗マラリアワクチンのターゲット集団は、ＨＢｓＡｇに自然に接触し、又は以前にそれに対するワクチン接種を受けていることが予想されるはずである。
【０１３９】
ＰｆＣＳＰに対するＩＦＮ−γ応答をＤＮＡ初回刺激ボランティアと非初回刺激ボランティアとで比較すると、抗ＨＢｓＡｇ抗体が存在していた個体間で有意差が示された（表１、３、及び５）。ＨＢｓＡｇ及びＰｆＣＳＰに対する個々のＩＦＮ−γ応答を同時に比較すると、ＲＴＳ，Ｓによって誘発されたＩＦＮ−γ応答は、ＤＮＡによる初回刺激を受けていないすべてのボランティアで、ＰｆＣＳＰに対する応答がＨｂｓＡｇよりも有意に低く、抗ＨＢｓＡｇが予め存在している個体においてでさえも低かったことが明らかになった。ＲＴＳ，Ｓを１回投与した後、ＨＢｓＡｇには１３／１４人の対象ボランティアが応答したが、ＰｆＣＳＰに対するＩＦＮ−γ応答は、１４人中１人の個体でしか検出されなかった。一方、ＲＴＳ，Ｓによる追加免疫の後、ＰｆＣＳＰに対するＩＦＮ−γ応答の出現度及び規模が、ＨＢｓＡｇ血清陽性個体とＨＢｓＡｇ血清陰性個体とで同等であったので（表５）、ＤＮＡ初回刺激ボランティアの主鎖抗原に対する応答は、ＰｆＣＳＰに対するＩＦＮ−γ応答の誘発に、ほとんど又は全く影響を及ぼさなかった。これらの結果は、ＤＮＡが、Ｔ細胞応答を開始し、それを特異的抗原に向け、所望の免疫とバックグラウンド応答との釣合いを取ることを実証した。ＤＮＡ初回刺激ボランティアは、抗ＨＢｓＡｇ血清が陽性であるかにかかわらず、ＰｆＣＳＰ及びＨＢｓＡｇに対するＩＦＮ−γ応答が同等であり、非初回刺激ボランティアは、ＨＢｓＡｇに対するＩＦＮ−γ応答がＰｆＣＳＰと比べて有意に強い（表４）。
【０１４０】
現在、組換え融合タンパク質、並びにターゲットタンパク質を発現させる組換え型のウイルス及び細菌を生み出すことにかなりの労力が払われている。多くの場合、ＨＢｓＡｇ、ワクシニア、ポリオウイルス、及び腸チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）のための免疫感作を受けた個体には、そのワクチンのこれらの主鎖成分に対する抗体が予め存在することになる。ワクチンの主鎖成分（たとえば、ＨＢｓＡｇ）に対する抗体を有する個体において、ターゲットタンパク質をコードしているＤＮＡによって初回刺激を施すと、ターゲットタンパク質に対するＴ細胞免疫応答が、組換えタンパク質のみで初回刺激するのよりも増強されたことは、この初回刺激追加免疫免による疫感作戦略の強みとなり得る。
【０１４１】
【表７】
0005404990.tif 000009
【０１４２】
ＤＮＡをワクチン媒体として使用して免疫応答を初回刺激すると、最初のＴ細胞応答を組換え免疫原に集中させることが可能になる。単にその免疫原がＤＮＡワクチン中に発現される唯一の外来タンパク質だからである。組換えＲＴＳ，Ｓ又はポックスウイルスは、ＤＮＡベクターよりもワクチン媒体として本質的により免疫原性であるかもしれないが、ウイルスを感染させた細胞は、Ｔ細胞の免疫優性を得ようと組換え免疫原と競合する多種類のウイルス由来エピトープを産生する。ワクチンを受けている多くの個体は、必然的に担体抗原に接触し、又は組換えウイルス若しくはタンパク質中に抗原を含む他のワクチン接種を受けている可能性が最も見込まれるので、担体抗原に対するエフェクター応答によって、特異的抗原に対するＴ細胞応答の誘発が妨害されることになる。
【０１４３】
この研究では、ＤＮＡ初回刺激／組換えタンパク質追加免疫による免疫感作戦略によって、抗原特異的ＣＤ４＋ヘルパー、ＣＤ８＋Ｔ細胞依存的ＣＴＬ、及びＩＦＮ−γの各応答、並びにＴｈ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞依存的なＩＦＮ−γ応答が、ヒトのボランティアにおいてすべて同時に実現した。免疫応答の両部門を誘発することのできるこの戦略は、予防及び治療用のワクチンに無類の強みを提供するものである。
【０１４４】
以下の刊行物、並びにこの出願の任意の箇所で他に言及した刊行物を、参照により特に本明細書に援用する。
１．  Ａｇｕｉａｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．Ｏ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｓａｃｃｉ，Ｊ．Ｂ．，Ｊｒ，Ｌａｎａｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｍａｊａｍ，Ｖ．Ｆ．，Ｓｔｏｕｔ，Ｒ．Ｒ．，及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「無針ジェット装置を用いた免疫化によるマラリアＤＮＡワクチンに対するウサギの免疫応答の増強（Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｒａｂｂｉｔｓ  ｔｏ  ａ  ｍａｌａｒｉａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ  ｊｅｔ  ｄｅｖｉｃｅ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：２７５〜８０（２００１）。
２．  Ａｉｄｏｏ，Ｍ．，Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．，Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｃ．Ｅ．，Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ，Ｍ．，Ｍｅｉｓｎｅｒ，Ｓ．Ｊ．，Ｋｒａｕｓａ，Ｐ．，Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．，Ｇｏｔｃｈ，Ｆ．，Ｆｉｄｏｃｋ，Ｄ．Ａ．ら、「マラリアに対する細胞毒性Ｔリンパ球誘導ワクチン用の保存抗原成分の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｌａｎｃｅｔ  ３４５：１００３（１９９５）。
３．  ａｌ  Ｙａｍａｎ，Ｆ．，Ｇｅｎｔｏｎ，Ｂ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．，Ｆａｌｋ，Ｍ．，Ｔｒｉｇｌｉａ，Ｔ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｄ．ら、「パプアニューギニアの風土病流行地域における熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイト表面抗原−２に対する体液性応答とマラリア罹患率との関係（Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−２  ａｎｄ  ｍａｌａｒｉａ  ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ｉｎ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｎｄｅｍｉｃ  ａｒｅａ  ｏｆ  Ｐａｐｕａ  Ｎｅｗ  Ｇｕｉｎｅａ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５１：５９３（１９９４）。
４．  ａｌ  Ｙａｍａｎ，Ｆ．，Ｇｅｎｔｏｎ，Ｂ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．，Ｔａｒａｉｋａ，Ｊ．，Ｇｉｎｎｙ，Ｍ．，Ｍｅｌｌｏｒ，Ｓ．ら、「臨床的マラリアからのパプアニューギニアの子どもの保護におけるＲＥＳＡ及びＳＰｆ６６と比較した熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＭＳＰ２に対する体液性応答の役割の評価（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＭＳＰ２  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ＲＥＳＡ  ａｎｄ  ＳＰｆ６６  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｐａｐｕａ  Ｎｅｗ  Ｇｕｉｎｅａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｆｒｏｍ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｐａｒｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：４９３（１９９５）。
５．  Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ｆ．，Ｃｒｅｗｔｈｅｒ，Ｐ．Ｅ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．，Ｍａｒｇｅｔｔｓ，Ｍ．，Ｍａｔｔｈｅｗ，Ｍ．Ｌ．，Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｂ．，Ｐｙｅ，Ｄ．、「組み換えＡＭＡ−１を用いる免疫化がプラスモジウムチャバウジ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｃｈａｂａｕｄｉ）への感染からネズミを守る（Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＭＡ−１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｃｈａｂａｕｄｉ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６（２〜３）：２４０〜７（１９９８）。
６．  Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．ら、「サイトカイン増強ＤＮＡワクチン接種によるアカゲザルにおけるウイルス血症制御及び臨床的ＡＩＤＳ予防（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｖｉｒｅｍｉａ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＡＩＤＳ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｂｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０，４８６〜９２（２０００）。
７．  Ｂｌａｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｅｉｄｒｉｃｈ，Ｈ．Ｇ．，Ｄｏｎａｃｈｉｅ，Ｓ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｊ．Ｓ．及びＨｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．，「マラリアメロゾイト表面タンパク質の単一断片が赤血球侵入中に寄生虫上に残存し侵入阻害抗体の標的となる（Ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｍａｌａｒｉａ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｍａｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｉｎｖａｓｉｏｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：３７９（１９９０）。
８．  Ｂｏｊａｎｇ，Ｋ．Ａ．，Ｍｉｌｌｉｇａｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｐｉｎｄｅｒ，Ｍ．，Ｖｉｇｎｅｒｏｎ，Ｌ．，Ａｌｌｏｕｅｃｈｅ，Ａ．，Ｋｅｓｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｂａｌｌｏｕ，Ｗ．Ｒ．，Ｃｏｎｗａｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｒｅｅｃｅ，Ｗ．Ｈ．，Ｇｏｔｈａｒｄ，Ｐ．，Ｙａｍｕａｈ，Ｌ．，Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅ，Ｍ．，Ｖｏｓｓ，Ｇ，Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｂ．Ｍ．，Ｈｉｌｌ，Ａ．，ＭｃＡｄａｍ，Ｋ．Ｐ．，Ｔｏｒｎｉｅｐｏｒｔｈ，Ｎ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｄ，Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｔ；ＲＴＳ，Ｓマラリアワクチン試験チーム、「ガンビアの半免疫成年男性における熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）感染に対するＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２マラリアワクチンの有効性−−ランダム試験（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ＲＴＳ，Ｓ／ＡＳ０２  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｍｉ−ｉｍｍｕｎｅ  ａｄｕｌｔ  ｍｅｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｇａｍｂｉａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｔｒｉａｌ）」、Ｌａｎｃｅｔ  ３５８：１９２７〜３４（２００１）。
９．  Ｂｒａｚｏｌｏｔ  Ｍｉｌｉａｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．，Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｓｉｅｇｒｉｓｔ，Ｃ．Ａ．，Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．、「ＣｐＧ  ＤＮＡが若いネズミにおけるＢ型肝炎表面抗原に対する強力なＴｈ１体液性及び細胞媒介免疫応答を誘導する（ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｃａｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｔｒｏｎｇ  Ｔｈｌ  ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｍｉｃｅ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１５５５３〜８（１９９８）。
１０．  Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｄａｌｙ，Ｔ．Ｍ．，Ｖａｉｄｙａ，Ａ．Ｂ．及びＬｏｎｇ，Ｃ．Ａ．、「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）メロゾイト表面抗原の３’部分が保護モノクローナル抗体により認識されるエピトープをコードする（Ｔｈｅ  ３’ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ａ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｎｃｏｄｅｓ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５：６０２（１９８８）。
１１．  Ｃａｌａｒｏｔａ，Ｓ．ら、「ＨＩＶ−１感染患者におけるＤＮＡワクチン注射により誘導される細胞毒性応答（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨＩＶ−１−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ）」、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：１３２０〜２５（１９９８）。
１２．  Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｐ．，Ｃａｓｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｇｏｓｎｅｌｌ，Ｗ．Ｌ．，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ａ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｔａｍ，Ｌ．Ｑ．，Ｈａｓｈｉｒｏ，Ｃ．Ｑ．，Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．，Ｌｅｅ  Ｎｇ，Ｃ．Ｔ．，Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｂ．Ｔ．及びＨｕｔ，Ｇ．Ｓ．、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイト表面タンパク質１の組み換えバキュロウイルス４２キロダルトンＣ−末端断片がマラリアからヨザルを守る（Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ４２−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｏｔｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２５３（１９９６）。
１３．  Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｌｅｅｆ，Ｍ．Ｌ．，Ｙｕａｎ，Ｌ．Ｆ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．及びＢｅａｕｄｏｉｎ，Ｒ．Ｌ．、「段階特異的スポロゾイト抗原に対して作られるネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）モノクローナル抗体の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：６０４（１９８７）。
１４．  Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｗ．Ｅ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｔ，Ｐ．，Ｙｕａｎ，Ｌ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．，Ｂｅａｕｄｏｉｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｂｒｏｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「マラリアワクチンがその配列内の保護エピトープに抗体を誘導することの不可能性（Ｉｎａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｉｔｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：６６８（１９９１）。
１５．  Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｍｅｌｌｏｕｋ，Ｓ．，Ｃｏｌｅ，Ｃ．，Ｂｅｃｈａｒａ，Ｒ．ら、「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）−−１７−ｋＤ肝臓及び赤血球段階タンパク質は阻害性モノクローナル抗体の標的（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ：１７−ｋＤ  ｈｅｐａｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｓｔａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．８０：４１９〜４２９（１９９５）。
１６．  Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｆａｌｌａｒｍｅ  Ｍａｊａｍ，Ｖ．，Ｃｏｒｒａｄｉｎ，Ｇ．Ｐ．ら、「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）１７キロダルトン肝細胞赤血球タンパク質からの線状合成ペプチドを用いた免疫化によるネズミマラリアからのＣＤ４＋  Ｔ−細胞及びγ−インターフェロン依存性の保護（ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌ−  ａｎｄ  ｇａｍｍａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  １７−ｋｉｌｏｄａｌｄｏｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５６０４〜５６１４（１９９９）。
１７．  Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｔ．，Ｄｏｎａｃｈｉ，Ｓ．，Ａｎａｎｄ，Ｒ．ら、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイト表面からの４６〜５３ｋＤ糖タンパク質（４６−５３  ｋＤ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ）」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｉｎ．３２：１５〜２４（１９８８）。
１８．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｗ．Ｅ．，Ｇａｌｌａｎｄ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｓ．及びＭｏｒｒｉｓ，Ｃ．Ｌ．、「フクロウザルにおける血液段階ワクチンの試験用の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の異なる菌株の選定（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｆｏｒ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ａｏｔｕｓ  ｎａｎｃｙｍａｉ  ｍｏｎｋｅｙｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５１：２２４〜２３２（１９９４）。
１９．  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｗ．Ｅ．，Ｐｙｅ，Ｄ．，Ｃｒｅｗｔｈｅｒ，Ｐ．Ｅ．，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ，Ｋ．Ｌ．，Ｇａｌｌａｎｄ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｕｌｚｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｏｐｐｅｌ，Ｒ．Ｌ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｃ．Ｌ．及びＡｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ｆ．、「プラスモジウムフラジャイル（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆｒａｇｉｌｅ）の組み換え頂端膜抗原−１を用いてリスザルに誘導された保護免疫（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｓｑｕｉｒｒｅｌ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｐｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−１  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆｒａｇｉｌｅ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５１：７１１〜７１９（１９９４）。
２０．  Ｄａｌｙ，Ｔ．Ｍ．及びＬｏｎｇ，Ｃ．Ａ．、「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＬメロゾイト表面タンパク質１の組み換え１５キロダルトンカルボキシル末端断片がネズミにおける保護免疫応答を誘導する（Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  １５−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｙｏｅｌｌｉ  １７ＸＬ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２４６２〜２４６７（１９９３）。
２１．  Ｄａｍｅ，Ｊ．Ｂ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．Ｌ．，ＭｃＣｕｔｃｈａｎ，Ｔ．Ｆ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｗｉｒｔｚ，Ｒ．Ａ．，Ｈｏｃｋｍｅｙｅｒ，Ｗ．Ｔ．，Ｍａｌｏｙ，Ｗ．Ｌ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．ら、「ヒトマラリア寄生虫、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト上の免疫優性表面抗原をコードする遺伝子の構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５（４６６２）：５９３〜９（１９８４）。
２２．  Ｄａｕｂｅｒｓｉｅｓ，Ｐ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｔ，Ｐ．，Ｂｒａｈｉｍｉ，Ｋ．，Ｌａｎｇｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ａ．，Ｏｌｌｏｍｏ，Ｂ．，ＢｅｎＭｏｈａｍｅｄ，Ｌ．，Ｓｌｉｅｒｅｎｄｒｅｇｔ，Ｂ．，Ｅｌｉｎｇ，Ｗ．，Ｖａｎ  Ｂｅｌｋｕｍ，Ａ．，Ｄｕｂｒｅｕｉｌ，Ｇ．，Ｍｅｉｓ，Ｊ．Ｆ．，Ｇｕｅｒｉｎ−Ｍａｒｃｈａｎｄ，Ｃ．，Ｃａｙｐｈａｓ，Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｇｒａｓ−Ｍａｓｓｅ，Ｈ．，Ｄｒｕｉｌｈｅ，Ｐ．，及びＭｏｈａｍｅｄ，Ｌ．Ｂ．、「保存された前赤血球肝臓段階抗原３を用いた免疫化によるチンパンジーにおける熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアに対する保護（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｒｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ−ｓｔａｇｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ３）」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：１２５８〜６３（２０００）。
２３．  Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．，Ｗｅｅｒａｔｎａ，Ｒ．，Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｊ．，Ｔｙｇｒｅｔｔ，Ｌ，Ｓｃｈｏｒｒ，Ｊ．，Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｗｅｅｒａｎｔａ，Ｒ．、「ＣｐＧ  ＤＮＡは組み換えＢ型肝炎表面抗原で免疫化したネズミにおける特異的免疫の強力なエンハンサー（ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：８７０〜６（１９９８）。
２４．  Ｄｅａｎｓ，Ｊ．Ａ．、「血液段階二日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）寄生虫の保護抗原（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄｓｔａｇｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ）」、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂｉｏｌ．３０７：１５９〜１６９（１９８４）。
２５．  Ｄｅａｎｓ，Ｊ．Ａ．，Ｋｎｉｇｈｔ，Ａ．Ｍ．，Ｊｅａｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｗａｔｅｒｓ，Ａ．Ｐ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．及びＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．、「微量で不変の二日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）６６ｋＤメロゾイト抗原を用いたアカゲザルにおけるワクチン接種試験（Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｎｏｒ，ｉｎｖａｒｉａｎｔ，Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ  ６６  ｋＤ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）」、Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５３５〜５５２（１９８８）。
２６．  Ｄｅｌｐｌａｃｅ，Ｐ．，Ｂｈａｔｉａ，Ａ．，Ｃａｇｎａｒｄ，Ｍ．ら、「タンパク質ｐ１２６−−熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイトの放出に関連する寄生虫恐怖性空胞抗原（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐ１２６：ａ  ｐａｒａｓｉｔｏｐｈｏｒｏｕｓ  ｖａｃｕｏｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ）」、Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．６４：２１５（１９８７）。
２７．  Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｈｏｂａｒｔ，Ｐ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．「マラリアに対する保護の遺伝的制限の多遺伝子ＤＮＡ免疫化を用いた無効化−−ＣＤ８＋細胞、γ−インターフェロン、及び酸化窒素依存性免疫（Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ，ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１７３９〜１７４６（１９９６）。
２８．  Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．Ｏ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｍ．，Ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ，Ｐ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から搬出されたタンパク質１の相同体、ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）の保護肝細胞赤血球タンパク質１７ｋＤａ遺伝子の同定及び特徴付け（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １７  ｋＤａ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ，ｈｏｍｏｌｏｇ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｅｘｐｏｒｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７８６１〜１７８６８（１９９６）。
２９．  Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，Ｓ．，Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．，Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．，Ｃｈｅｓｔｎｕｔ，Ｒ．Ｗ．，Ｋｅｏｇｈ，Ｅ．，Ａｐｅｌｌａ，Ｅ．，Ｎｕｔｍａｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｌａｌ，Ａ．Ａ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｏｌｏｏ，Ａ．及びＳｅｔｔｅ，Ａ．「ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ上位型アレルにより制限される熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの変性細胞毒性Ｔ細胞エピトープ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｂｙ  ＨＬＡ−Ａ  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ｂ  ｓｕｐｅｒｔｙｐｅｓ  ａｌｌｅｌｅｓ）」、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７：９７〜１１２（１９９７）。
３０．  Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｒｇａｌｉｔｈ，Ｍ．，Ｈｏｂａｒｔ，Ｐ．，及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「マラリア制御へのアプローチとしてのＤＮＡワクチン接種−−現状と戦略（ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍａｌａｒｉａ  ｃｏｎｔｒｏｌ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）」、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２６：３７〜５６（１９９８）。
３１．  Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）モデルにおいてＣＤ８＋  Ｔ細胞により開始するマラリアに対する抗原特異的な適応免疫にはＩＬ−１２及びＮＫ細胞が必要（ＩＬ−１２  ａｎｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｍｏｄｅｌ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３（２）：８８４〜９２（１９９９）。
３２．  Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｂａｌｌｏｕ，Ｗ．Ｒ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ，Ｍ．Ｒ．，Ｍａｊａｒｉａｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｍａｌｏｙ，Ｗ．Ｌ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｉｒｔｚ，Ｒ．Ａ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，Ｗｏｏｌｌｅｔｔ，Ｇ．Ｒ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｆ．及びＨｏｃｋｉｎｅｙｅｒ，Ｗ．Ｔ．、「ネズミマラリアスポロゾイトワクチンの有効性−−ヒトワクチン開発への影響（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：４５３〜４５６（１９８７）。
３３．  Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｇｏｒａｋ，Ｅ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｆｒｅｙｄｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｏｓｉｎｏｗｏ，Ｏ．，Ｒｉｃｈｉｅ，Ｔ．Ｌ．，Ｓｔｏｌｔｚ，Ｅ．，Ｔｒｅｓｐａｌａｃｉｏｓ，Ｆ．，Ｎｅｒｇｅｓ，Ｊ．，Ｎｇ，Ｊ．，Ｆａｌｌａｎｎｅ−Ｍａｊａｍ，Ｖ．，Ａｂｏｔ，Ｅ．，Ｇｏｈ，Ｌ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｊ．，Ｓｔｏｕｔ，Ｒ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「有針又は無針ジェット注射を経由したＰｆＣＳＰ  ＤＮＡマラリアワクチン投与後の安全性、耐容性、及び抗体応答の不在、並びに筋肉内経路と筋肉内／皮内経路の組合せとの比較（Ｓａｆｅｔｙ，Ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｌａｃｋ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｉａ  Ｎｅｅｄｌｅ  ｏｒ  Ｎｅｅｄｌｅ−ｆｒｅｅ  Ｊｅｔ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ／Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  Ｒｏｕｔｅｓ）」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１５５１〜６０（２００２）。
３４．  Ｅｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｃａｓｐｅｒｓ，Ｐ．，Ｍａｔｉｌｅ，Ｈ．，Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｔｕｅｂｅｒ，Ｄ．及びＴａｋａｃｓ，Ｂ．、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ）の非相同的挑戦からサルを守る組み換え又は天然タンパク質の能力（Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｏｒ  ｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｉｕｍ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：３４９８〜３５０３（１９９１）。
３５．  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．及びＨｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．、「精製ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）分裂体抗原で免疫化したＢＡＬＢ／ｃネズミの保護応答特性（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｓｃｈｉｚｏｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）」、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５４：６０９〜６１６（１９８３）。
３６．  Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ＭｃＧｏｖｅｒｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｋｒｚｙｃｈ，Ｕ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，ＬａＣｈａｎｃｅ，Ｒ．，Ｈｅｐｐｎｅｒ，Ｄ．Ｇ．，Ｙｕａｎ，Ｇ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ，Ｍ．，Ｓｌａｏｕｉ，Ｍ．ら、「組み換え生成した熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質−Ｂ型肝炎抗原サブユニットワクチンの安全性、免疫原性、及び有効性（Ｓａｆｅｔｙ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１：１５７６〜８５（１９９５）。
３７．  Ｇｒａｍｚｉｎｓｋｉ，Ｒ．Ａ．，Ｍａｒｉｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｄｏｏｌａｎ．Ｄ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｏｂａｌｄｉａ，Ｎ．，Ｒｏｓｓａｎ，Ｒ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｈｏｂａｒｔ，Ｐ．，Ｍａｒｇａｌｉｔｈ，Ｍ．，及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．、「ヨザルにおけるマラリアＤＮＡワクチン（Ｍａｌａｒｉａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ａｏｔｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：９１３〜９１５（１９９７）。
３８．  Ｇｕｒｕｎａｔｈａｎ，Ｓ．，Ｗｕ，Ｃ．Ｙ．，Ｆｒｅｉｄａｇ，Ｂ．Ｌ．及びＳｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．、「ＤＮＡワクチン−−長期細胞免疫誘発へのカギ（ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａ  ｋｅｙ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２，４４２〜７（２０００）。
３９．  Ｈａｒｎｙｕｔｔａｎａｋｏｒｎ，Ｐ．，ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｄｏｎａｃｈｉｅ，Ｓ．，Ｈｅｉｄｒｉｃｈ，Ｈ．Ｇ．，Ｒｉｄｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．、「阻害性モノクローナル抗体は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＲＡＰ−１タンパク質のタンパク分解性開裂部位に隣接するエピトープを認識する（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｓｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＲＡＰ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．５５：１７７〜８６（１９９２）。
４０．  Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．，Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｒ．ら、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）前赤血球段階ＤＮＡワクチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現及びｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｐｒｅ−ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｓｔａｇｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．２：２９〜３８（１９９８）。
４１．  Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．，Ｄａｖｉｓ，Ｊ．，Ｎａｒｄｉｎ，Ｅ．，Ｂｅｉｅｒ，Ｍ．，Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｊ．，Ｅｄｄｙ，Ｈ．，Ｌｏｓｏｎｓｋｙ，Ｇ．，Ｈｏｌｌｉｎｇｄａｌｅ，Ｍ．，Ｓｚｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｍ．，Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．，Ｃｌｙｄｅ，Ｄ．及びＥｄｅｌｍａｎ，Ｒ．、「照射を受けたスポロゾイトを有するヒトの免疫化の成功−−保護された個人の体液性及び細胞応答（Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ：ｈｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．４５：５３９〜５４７（１９９１）。
４２．  Ｈｉｌｇｅｒｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｎｉｐｐｅ，Ｈ．，Ｊａｎｓｚｅ，Ｍ．，Ｗｉｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ｍ．、「体液性免疫応答に対する合成免疫賦活剤の相乗効果（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３９２〜６（１９８６）。
４３．  Ｈｉｌｇｅｒｓ，Ｌ．Ａ．，Ｓｎｉｐｐｅ，Ｈ．，Ｊａｎｓｚｅ，Ｍ．，Ｗｉｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ｍ．、「合成スルホリポ多糖類−−体液性免疫応答用の新規免疫賦活剤（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｕｌｐｈｏｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｎｏｖｅｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．６０：１４１〜６（１９８７）。
４４．  Ｈｉｌｌ，Ａ．Ｖ．Ｓ．，Ｅｌｖｉｎ，Ｊ．，Ｗｉｌｌｉｓ，Ａ．Ｃ．ら、「ＨＬＡ−Ｂ５３と重篤マラリアへの抵抗性との関連の分子解析（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｂ５３  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｅ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：４３４（１９９２）。
４５．  Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．及びＤｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．「マラリアワクチンが標的とする感染肝細胞（Ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．６：１２１８−１９（２０００）。
４６．  Ｈｏｌｄｅｒ，Ａ．Ａ．及びＦｒｅｅｍａｎ，Ｒ．Ｒ．、「精製寄生虫抗体を用いた血液段階ローデントマラリアに対する免疫化（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｐａｒａｓｉｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：３６１〜３６４（１９８１）。
４７．  Ｈｏｒｎ，Ｎ．Ａ．，Ｍｅｅｋ，Ｊ．Ａ．，Ｂｕｄａｈａｚｉｅ，Ｇ．，Ｍａｒｑｕｅｔ，Ｍ．、「プラスミドＤＮＡを用いた癌遺伝子治療−−ヒト臨床試験用のＤＮＡ精製（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ）」、
Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６（５）：５６５〜７３（１９９５）。
４８．  Ｉｎｓｅｌｂｕｒｇ，Ｊ．，Ｂｚｉｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｌｉ，Ｗ．Ｂ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｋａｎｓｏｐｏｎ，Ｊ．，Ｈａｈｍ，Ｂ．Ｋ．，Ｂａｔｈｕｒｓｔ，Ｉ．Ｃ．，Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．及びＲｏｓｓａｎ，Ｒ．Ｎ．、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の組み換えＳＥＲＡタンパク質によりヨザルに誘導された保護免疫（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ａｏｔｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＳＥＲＡ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：１２４７〜１２５０（１９９１）。
４９．  Ｉｎｓｅｌｂｕｒｇ，Ｊ．，Ｂａｔｈｕｒｓｔ，Ｉ．Ｃ．，Ｋａｎｓｏｐｏｎ，Ｊ．，Ｂａｒｃｈｆｅｌｄ，Ｇ．Ｌ．，Ｂａｒｒ，Ｐ．Ｊ．及びＲｏｓｓａｎ，Ｒ．Ｎ．、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の組み換えＳＥＲＡタンパク質によりヨザルに誘導された保護免疫−−保護免疫の誘導に対する免疫賦活剤の効果（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  Ａｏｔｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｂｙ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＳＥＲＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ：ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：２０４１〜２０４７（１９９３）。
５０．  Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋｉ，Ｌ．，Ｂｌａｃｋ，Ｃ．Ｇ．，及びＣｏｐｐｅｌ，Ｒ．Ｌ．、「組み換えネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）メロゾイト表面タンパク質を用いた免疫化により致死性の挑戦から５分の４のネズミが守られる（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４／５  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）」、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６８：６０３４〜７（２０００）。
５１．  Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．，Ｐａｔｅｌ，Ｕ．，Ｌｅｎｎｉｃｋ，Ｍ．，Ｍａｒｃｉａｎｉ，Ｄ．、「キラジャサポナリアモリナコルテックス（Ｑｕｉｌｌａｊａｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  ｃｏｒｔｅｘ）からの免疫賦活活性を有するサポニンの分離及びその特徴付け（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｐｏｎｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  Ｑｕｉｌｌａｊａｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  ｃｏｒｔｅｘ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：４３１〜７（１９９１）。
５２．  Ｋｅｎｓｉｌ，Ｃ．Ｒ．「ワクチン免疫賦活剤としてのサポニン（Ｓａｐｏｎｉｎｓ  ａｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）」、Ｇｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，１２：１〜５５（１９９６）。
５３．  Ｋｅｓｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．，ＭｃＫｉｎｎｅｙ，Ｄ．Ａ．，Ｔｏｉｎｉｅｐｏｒｔｈ，Ｎ．，Ｏｃｋｅｎｈｏｕｓｅ，Ｃ．Ｆ．，Ｈｅｐｐｎｅｒ，Ｄ．Ｇ．，Ｈａｌｌ，Ｔ．，Ｋｒｚｙｃｈ，Ｕ．，Ｄｅｌｃｈａｍｂｒｅ，Ｍ．，Ｖｏｓｓ，Ｇ．，Ｄｏｗｌｅｒ，Ｍ．Ｇ．，Ｐａｌｅｎｓｋｙ，Ｊ．，Ｗｉｔｔｅｓ，Ｊ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｂａｌｌｏｕ，Ｗ．Ｒ．；ＲＴＳ，Ｓマラリアワクチン評価グループ、「実験熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアに対する組み換えスポロゾイト周囲タンパク質ワクチン療法の有効性（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｇｉｍｅｎｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｍａｌａｒｉａ）」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８３（４）：６４０〜７（２００１）。
５４．  Ｋｅｓｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．ら、「実験熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアに対する組み換えスポロゾイト周囲タンパク質ワクチン療法の有効性（Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８３：６４０〜４７（２００１）。
５５．  Ｋｈｕｓｍｉｔｈ，Ｓ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｂｅａｕｄｏｉｎ，Ｒ．Ｌ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「スポロゾイト表面タンパク質２及びＣＳタンパク質を用いたワクチン接種によるマラリアに対する保護（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｂｙ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｐｌｕｓ  ＣＳ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：７１５〜７１８（１９９１）。
５６．  Ｋｈｕｓｍｉｔｈ，Ｓ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「スポロゾイト表面タンパク質２を認識するＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞クローンの養子移入によるネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）に対する完全保護（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｂｙ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａ  ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２９７９〜２９８３（１９９４）。
５７．  Ｋｒｉｅｇ，Ａ．Ｍ．，Ｙｉ，Ａ．Ｋ．，Ｍａｔｓｏｎ，Ｓ．，Ｗａｌｄｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｉｓｈｏｐ，Ｇ．Ａ．，Ｔｅａｓｄａｌｅ，Ｒ．，Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，Ｇ．Ａ．，Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．、「微生物ＤＮＡ中のＣｐＧモチーフが直接的なＢ細胞活性化を開始させる（ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｄｉｒｅｃｔ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６〜９（１９９５）。
５８．  Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｙａｄａｖａ，Ａ．，Ｋｅｉｓｔｅｒ，Ｄ．Ｂ．，Ｔｉａｎ，Ｊ．Ｈ．，Ｏｈｌ，Ｍ．，Ｐｅｒｄｕｅ  Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ａ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｈ．及びＫａｓｌｏｗ，Ｄ．Ｃ．、「ヨザルにおける組み換え熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイト表面タンパク質−１の免疫原性及びｉｎ  ｖｉｖｏ有効性（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｉｎ  Ａｏｔｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）」、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１：３２５〜３３２（１９９５）。
５９．  Ｋｕｍａｒ，Ｓ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｗ．，Ｅｇａｎ，Ａ．，Ｙａｄａｖａ，Ａ．，Ｇａｒｒａｕｄ，Ｏ．，Ｂｌａｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｐａｔｉｎｏ，Ｊ．Ａ．，Ｄｉｇｇｓ，Ｃ．，Ｋａｓｌｏｗ，Ｄ．Ｃ．、「メロゾイト表面タンパク質１の１９キロダルトンＣ末端に基づく複数の免疫賦活剤処方のうち４種の組み換え熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ワクチンのヨザルにおける免疫原性及び有効性（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  Ａｏｔｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  １９−Ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  Ｃ  Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １）」、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６８：２２１５〜２２２３（２０００）。
６０．  Ｌａｃａｉｌｌｅ−Ｄｕｂｏｉｓ，Ｍ．及びＷａｇｎｅｒ，Ｈ．、「サポニンの生物及び薬理活性に関する検討（Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓａｐｏｎｉｎｓ）」、Ｐｈｙｔｏｉｎｅｄｉｃｉｎｅ．２：３６３〜３８６（１９９６）。
６１．  Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．，Ｍｏｒｉｓ，Ｐ．，Ｖｏｓｓ，Ｇ．，Ｐａｔｈａｎ，Ａ．ら、「組み換え熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアワクチン、ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢＡＳ２による集中的Ｔｈ１型細胞及び体液性免疫応答の強力な誘導（Ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｃｕｓｅｄ  Ｔｈ１−Ｔｙｐｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢＡＳ２，  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８０：１６５６〜６４（１９９９）。
６２．  Ｌｅ，Ｔ．，Ｃｏｏｎａｎ，Ｋ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．ら、「健康な成人ボランティアに対するマラリアＤＮＡワクチンの筋肉内投与後の安全性、耐容性、及び体液免疫応答（Ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｌａｒｉａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１８９３〜１９０１（２０００）。
６３．  Ｌｅｅ，Ａ．Ｙ．ら、「ＤＮＡ免疫化によりプライミングされた免疫優性のＨＣＶ特異的ＣＴＬエピトープに特異的な細胞毒性Ｔ細胞の数の定量化（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ＨＣＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１９６２〜６８（２０００）。
６４．  Ｌｕｋｅ，Ｃ．Ｊ．，Ｃａｒｎｅｒ，Ｋ．，Ｌｉａｎｇ，Ｘ．，Ｂａｒｂｏｕｒ，Ａ．Ｇ．、「ｏｓｐＡに基づくＤＮＡワクチンがライム病ボレリア感染からネズミを守る（Ａｎ  ｏｓｐＡ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）」、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７５：１９１〜７（１９９７）。
６５．  Ｍａｊａｒｉａｎ，Ｗ．Ｒ．，Ｄａｌｙ，Ｔ．Ｍ．ら、「ＩｇＧ３モノクローナル抗体を用いたネズミマラリアに対する受動的免疫化（Ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍａｌａｒｉａ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ＩｇＧ３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：３１３１  （１９８４）。
６６．  Ｍａｌｉｋ，Ａ．，Ｅｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質に対抗するヒト細胞毒性Ｔリンパ球（Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：３３００〜３３０４（１９９１）。
６７．  Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．ら、「プラスミドＤＮＡマラリアワクチン−−筋肉内注射後のゲノム組込みの可能性（Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）」、Ｈｕｍａｎ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１０：７５９〜６８（１９９９）。
６８．  ＭｃＣｌｕｓｋｉｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｄａｖｉｓ，Ｈ．Ｌ．、「ＣｐＧ  ＤＮＡはネズミに対する鼻腔内投与によりＢ型肝炎表面抗原に対して全身及び粘膜免疫反応の強力なエンハンサーとなる（ＣｐＧ  ＤＮＡ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｎｄ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｍｉｃｅ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４４６３〜６（１９９８）。
６９．  Ｍｏｒｅｎｏ，Ａ．，Ｃｌａｖｉｊｏ，Ｐ．，Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｒ．，Ｄａｖｉｓ，Ｊ．，Ｓｚｔｅｉｎ，Ｍ．，Ｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．及びＮａｒｄｉｎ，Ｅ．、「スポロゾイトで免疫化したボランティアからの細胞毒性ＣＤ４＋  Ｔ細胞は熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＣＳタンパク質を認識する（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＣＳ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：９９７−１００３（１９９１）。
７０．  Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．及びＣｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ．、「ＴＨ１及びＴＨ２細胞−−異なるパターンのリンホカイン分泌により異なる機能的特性が得られる（ＴＨ１  ａｎｄ  ＴＨ２  ｃｅｌｌｓ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｌｅａｄ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３（１９８９）。
７１．  Ｍｕｓｔｉ，Ａ．Ｍ．，Ｚｅｈｎｅｒ，Ｚ．，Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ａ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，及びＫｒａｍｅｒ，Ｒ．Ａ．、「ニワトリ遺伝子と相同な配列により単離されるグリセリンアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼをコードする２種の酵母遺伝子の転写マッピング（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｇｅｎｅ）」、Ｇｅｎｅ  ２５：１３３〜１４３（１９８３）。
７２．  Ｏｅｕｖｒａｙ，Ｃ．，Ｂｏｕｈａｒｏｕｎ  Ｔａｙｏｕｎ，Ｈ．，Ｇｒａｓ  Ｍａｓｓｅ，Ｈ．ら、「メロゾイト表面タンパク質−３−−血液単球と協同して熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の死滅を促進させる抗体を誘導するマラリアタンパク質（Ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−３：ａ  ｍａｌａｒｉａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）」、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１５９４（１９９４）。
７３．  Ｏｅｕｖｒａｙ，Ｃ．，Ｂｏｕｈａｒｏｕｎ  Ｔａｙｏｕｎ，Ｈ．，Ｇｒａｓ  Ｍａｓｓｅ，Ｈ．ら、「細胞−抗体協同メカニズムの抗原性及び抗体の生物活性により同定される、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の新規メロゾイト表面抗原（ＭＳＰ−３）（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｉｎ（ＭＳＰ−３），ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌｕｌａｒ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ．Ｃｒｕｚ．Ｓｕｐｐ  ２：７７（１９９４）。
７４．  Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｔａｎ，Ａ．，Ｔｅｒｍｉｊｔｅｌｅｎ，Ａ．，Ｄｅｍｏｔｚ，Ｓ．，Ｃｏｒｒａｄｉｎ，Ｇ．，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．、「一般に免疫原性のＴ細胞エピトープ：Ｔ細胞によるヒトＭＨＣクラスＩＩへの乱交雑な結合及び乱交雑な認識（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ：ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：２２３７〜４２（１９８９）。
７５．  Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｂｏｒｅｌｌｉｎｉ，Ｆ．，Ｗｅｎｋ，Ｍ．Ｌ．ら、「プラスミドＤＮＡマラリアワクチン−−ネズミ及びウサギにおける組織分布及び安全性研究（Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｒａｂｂｉｔｓ）」、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１０（５）：７４１〜５８（１９９９）、
７６．  Ｐｅｒｒｉｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｄａｙａｌ，Ｒ．及びＲｉｅｄｅｒ，Ｈ．、「ヒト免疫血清と反応する熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の赤血球段階からの抗原の特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｆｒｏｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｓｔａｇｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｒｅａｃｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｅｒａ）」、Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．７５：１６３〜１６５（１９８１）。
７７．  Ｐｅｒｒｉｎ，Ｌ．Ｈ．，Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｅ．，Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｐ．Ｈ．及びＭｉｅｓｃｈｅｒ，Ｐ．Ａ．「モノクローナル抗体によるヒト赤血球における熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の成長阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ２８９：３０１〜３０３（１９８１）。
７８．  Ｐｏｔｏｃｎｊａｋ，Ｐ．，Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｎ．，Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．及びＮｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｖ．、「スポロゾイト表面抗原（Ｐｂ４４）に対するモノクローナル抗体の一価の断片（Ｆａｂ）がマラリア感染からネズミを守る（Ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｆａｂ）ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（Ｐｂ４４）ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５１：１５０４〜１５１３（１９８０）。
７９．  『タンパク質−−構造と分子特性（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）』第２版、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ著、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９９３。
８０．  Ｒａｍａｓａｍｙ，Ｒ．、「ヒトマラリア寄生虫、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）における糖タンパク質−レクチン結合特性、及び可能な糖質−タンパク質結合に関する研究（Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｍａｌａｒｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ−ｌｅｃｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｎｋａｇｅ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６５：１４７（１９８７）。
８１．  Ｒａｍａｓａｍｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．，Ｌｏｒｄ，Ｒ．、「マラリアワクチン候補抗原上の阻害性モノクローナル抗体により定義されたエピトープの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎｃａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ａ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３：３０５（１９９０）。
８２．  Ｒａｔｔａｎら、「タンパク質合成−−翻訳後の修飾及びエージング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ）」、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２（１９９２）。
８３．  『レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）』第１８版（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．、イーストン、ペンシルバニア州、１９９０）。
８４．  Ｒｉｄｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，Ｔａｋａｃｓ，Ｂ．，Ｅｔｌｉｎｇｅｒ，Ｈ．，Ｓｃａｉｆｅ，Ｊ．Ｇ．、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のロプトリー抗原はリスザルにおいて保護作用を示す（Ａ  ｒｈｏｐｔｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｉｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  Ｓａｉｍｉｒｉ  ｍｏｎｋｅｙｓ）」、Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １０１：１８７〜９２（１９９０）。
８５．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｃｏｒｄｅｙ，Ａ．−Ｓ．，Ａｒｒｅａｚａ，Ｇ．，Ｃｏｒｒａｄｉｎ，Ｇ．，Ｒｏｍｅｒｏ，Ｐ．，Ｍａｒｙａｎｓｋｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．及びＺａｖａｌａ，Ｆ．「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイト周囲タンパク質由来のＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞クローンはマラリアから保護する（ＣＤ８＋  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：５７９〜５８５（１９９１）。
８６．  Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．Ｏ．ら、「二日熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ）マラリア用の多段階多抗原非相同性プライムブーストワクチンはアカゲザルにおいて部分的保護を提供する（Ｍｕｌｔｉｓｔａｇｅ  ｍｕｌｔｉａｎｔｉｇｅｎ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｉｍｅ  ｂｏｏｓｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉ  ｍａｌａｒｉａ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｐａｒｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５５６５〜７２（２００１）。
８７．  Ｒｏｍｅｒｏ，Ｐ．，Ｍａｒｙａｎｓｋｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｃｏｒｒａｄｉｎ，Ｇ．，Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｒ．Ｓ．，Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｖ．及びＺａｖａｌａ，Ｆ．、「クローニングされた細胞毒性Ｔ細胞はスポロゾイト周囲タンパク質中のエピトープを認識し、マラリアから保護する（Ｃｌｏｎｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：３２３〜３２５（１９８９）。
８８．  Ｓａｕｌ，Ａ．，Ｌｏｒｄ，．，Ｊｏｎｅｓ，Ｇ．Ｌ．ら、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原ＭＳＡ２の不変異ペプチドを用いた保護的免疫化（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＭＳＡ２）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２０８（１９９２）。
８９．  Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｌ．，Ｂｕｓｈｅｌｌ，Ｇ．Ｒ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のロプトリー抗原は阻害性モノクローナル抗体により認識される保存された可変のエピトープを含有する（Ａ  ｒｈｏｐｔｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｎｄ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｓｅｄ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．１８：１８３〜９５（１９８６）。
９０．  Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ，Ｌ．，Ｖｉｌｌａｑｕｉｒａｎ，Ｊ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ａ．ら、「マラリアスポロゾイトに対する免疫に必要なγ−インターフェロン、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及び抗体（Ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｍａｌａｒｉａ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ）」、Ｎａｔｕｒｅ．３３０：６６４〜６６６（１９８７）。
９１．  Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．ら、「ＤＮＡに基づく免疫化により誘導される保護免疫の向上−−抗原及びＧＭ−ＣＳＦをコードするプラスミドＤＮＡを用いたプライミング及び抗原発現組み換えポックスウイルスを用いたブースティング（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ｐｒｉｍｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ＧＭ−ＣＳＦ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：５９０５〜１２（２０００）。
９２．  Ｓｅｄｅｒ，Ｒ．Ａ．及びＨｉｌｌ，Ａ．Ｖ．、「細胞免疫を必要とする細胞感染に対するワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ４０６、７９３〜８。（２０００）。
９３．  Ｓｅｇｕｉｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｋｌｏｔｚ，Ｆ．Ｗ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，Ｗｅｉｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｇｏｏｄｂａｒｙ，Ｍ．，Ｓｌａｙｔｅｒ，Ｍ．ら、「照射されたネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）に感染した蚊にさらされたネズミは酸化窒素シンターゼの誘導によりマラリアから保護される−−γ−インターフェロン及びＣＤ８＋  Ｔ細胞の関与（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３５３−３５８（１９９４）。
９４．  Ｓｅｉｆｔｅｒら、「タンパク質修飾及び非タンパク質補助因子の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ）」、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６（１９９０）。
９５．  Ｓｈｉ，Ｙ．Ｐ．，Ｓａｙｅｄ，Ｕ．，Ｑａｒｉ，Ｓ．Ｈ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｕｄｈａｙａｋｕｍａｒ，Ｖ．，Ｏｌｏｏ，Ａ．Ｊ．，Ｈａｗｌｅｙ，Ｗ．Ａ．，Ｋａｓｌｏｗ，Ｄ．Ｃ．，Ｎａｈｌｅｎ，Ｂ．Ｌ．及びＬａｉ，Ａ．Ａ．「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）メロゾイト表面タンパク質１のＣ−末端１９キロダルトン領域に対する自然免疫応答（Ｎａｔｕｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：２７１６〜２７２３（１９９６）。
９６．  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ｗ．Ａ．，Ｔａｍ，Ｌ．Ｑ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｋ．Ｊ．，Ｈｕｉ，Ｇ．Ｓ．，Ｃａｓｅ，Ｓ．Ｅ．，Ｙａｍａｇａ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｈａｎｇ，Ｓ．Ｐ．，Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｂ．及びＫａｎ，Ｓ．Ｃ．、「メロゾイト表面被覆前駆体タンパク質はヨザルを熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）から完全に保護する（Ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏａｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ａｏｔｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３０１４〜３０１８（１９８７）。
９７．  Ｓｉｍ，Ｂ．Ｋ．Ｌ．，Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｐ．Ａ．，Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ．Ｄ．ら、「１７５Ｋ熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）赤血球結合抗原の一次構造、並びにマラリアメロゾイトの侵入を阻害する抗体を誘導するペプチドの同定（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  １７５Ｋ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｈｉｃｈ  ｅｌｅｉｃｉｔｓ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）」、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ＩＩＩ：１８７７（１９９０）。
９８．  Ｓｉｍ，Ｂ．Ｋ．Ｌ．，Ｃｈｉｔｎｉｓ，Ｃ．Ｅ．，Ｄｅａｌ，Ｃ．Ｄ．ら、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）：メロゾイトリガンドＥＢＡ−１７５の機能的に活性な領域のさらなる特徴付け（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｕｍ：ｆｕｒｔｈｅｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｌｉｇａｎｄ  ＥＢＡ−１７５）」、７８：２５９（１９９４）。
９９．  Ｓｔｏｕｔｅ，Ｊ．Ａ．，Ｓｌａｏｕｉ，Ｍ．，Ｈｅｐｐｎｅｒ，Ｄ．Ｇ．ら、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアに対する組み換えスポロゾイト周囲タンパク質ワクチンの予備的評価（Ａ  ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｍａｌａｒｉａ）」、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：８６〜９１（１９９７）。
１００．  Ｓｔｏｕｔｅ，Ｊ．Ａ．，Ｋｅｓｔｅｒ，Ｋ．Ｅ．，Ｋｒｚｙｃｈ，Ｕ．ら、「ＲＴＳ，Ｓマラリアワクチンを用いた免疫化後の長期有効性及び免疫反応（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＲＴＳ，Ｓ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７８：１１３９〜４４（１９９８）。
１０１．  Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｗ．，Ｔｒａｐｅ，Ｊ．Ｆ．，Ｒｏｇｉｅｒ，Ｃ．，Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ａ．，Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｖ．Ｅ．，Ｎａｒｕｍ，Ｄ．Ｌ．、「全長バキュロウイルス組み換えＰＦ８３／ＡＭＡ−１を用いた捕捉酵素結合免疫吸着アッセイにより検出された熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）８３キロダルトン頂端膜抗原（ＰＦ８３／ＡＭＡ−１）に対する自然抗体の高い保有率（Ｈｉｇｈ  ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ８３−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ａｐｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＦ８３／ＡＭＡ−１）  ａｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｃａｐｔｕｒｅ−ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  ｕｓｉｎｇ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＦ８３／ＡＭＡ−１）」、Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．５１：７３０−４０（１９９４）。
１０２．  Ｔｈｏｍａｓ，Ａ．Ｗ．，Ｎａｒｕｍ，Ｄ．，Ｗａｔｅｒｓ，Ａ．Ｐ．，Ｔｒａｐｅ，Ｊ．Ｆ．，Ｒｏｇｉｅｒ，Ｃ．，Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ａ．，Ｒｏｓａｒｉｏ，Ｖ．，Ｄｒｕｉｌｈｅ，Ｐ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．，Ｄｅｎｎｉｓ，Ｄ．、「ヒト及び非ヒト霊長類マラリアにおけるＡＭＡ−Ｉ族分子に対する免疫の諸相（Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＡＭＡ−Ｉ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｍａｌａｒｉａｓ）」、Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ  ８９  Ｓｕｐｐｌ．２：６７〜７０（１９９４）。
１０３．  Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｐ．，Ｇｒａｙ，Ｐ．，Ｑｕｉｒｏｇａ，Ｍ．ら、「Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の主要タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ）」、Ｎａｔｕｒｅ  ２８０：８１５−８１９（１９７９）。
１０４．  Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｃｏｒｒａｄｉｎ，Ｇ．，Ｄｅ  ｌａ  Ｖｅｇａ，Ｐ．，Ｆｒａｎｋｅ，Ｅ．Ｄ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイト表面タンパク質２線状ペプチドによる、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＥＮ−γに依存した感染肝細胞の除去の誘導による、マラリアに対する保護（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ  ｂｙ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｌｉｎｅａｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ−  ａｎｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：４０６１〜４０６７（１９９６）。
１０５．  Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｌｅ，Ｔ．Ｐ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｃｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．，Ｈｏｂａｒｔ，Ｐ．，Ｍａｒｇａｌｉｔｈ，Ｍ．，Ｎｇ，Ｊ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，ｄｅ  Ｔａｉｓｎｅ，Ｃ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｊ．Ａ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「マラリアＤＮＡワクチンによるヒトにおける抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｂｙ  ａ  ｍａｌａｒｉａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：４７６〜４８０（１９９８）。
１０６．  Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｂａｒｔ，Ｐ．，Ｔｉｎｅ，Ｊ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｆａｌｌａｒｒｎｅ，Ｖ．，Ｓａｃｃｉ，Ｊ．Ｂ．，Ｊｒ．，Ｋａｕｒ，Ｍ．，Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｗ．Ｒ．、「４種の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＤＮＡプラスミドの混合物を用いた免疫化による非ヒト霊長類における複数の抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球の同時誘導（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ＤＮＡ  ｐｌａｓｍｉｄｓ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：４１９３〜２０２（１９９８）。
１０７．  Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｂａｒａｃｅｒｏｓ，Ｆ．Ｍ．，Ｇｏｒａｋ，Ｅ．Ｊ．，Ｃｈａｒｏｅｎｖｉｔ，Ｙ．，Ｃａｒｕｃｃｉ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．Ｃ．，Ｒａｈａｒｄｊｏ，Ｎ．，Ｇａｙ，Ｔ．，Ｈｏｂａｒｔ，Ｐ．，Ｓｔｏｕｔ，Ｒ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｒ．，Ｒｉｃｈｉｅ，Ｔ．Ｌ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｊ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「マラリアＤＮＡワクチンによるヒトにおけるＣＤ４（＋）Ｔ細胞依存性ＣＤ８（＋）タイプ１応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＣＤ８（＋）  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｂｙ  ａ  ｍａｌａｒｉａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ）」、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ  ９８（１９）：１０８１７〜２２（２００１）。
１０８．  Ｗｅｉｓｓ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｂｅａｕｄｏｉｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｇｏｏｄ，Ｍ．Ｆ．、「マラリアスポロゾイトで免疫化させるネズミの保護にはＣＤ８＋  Ｔ細胞（細胞毒性／抑制因子）が必要（ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ／ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ）ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｌａｒｉａ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅｓ）」、ＰＮＡＳ−ＵＳＡ．８５（２）：５７３〜６（１９８８）。
１０９．  Ｗｅｉｓｓ，Ｗ．Ｒ．，Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．，Ｈｏｌｌｉｎｄａｌｅ，Ｍ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「ネズミマラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ）及びネズミマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）の両方からネズミを守るスポロゾイト周囲タンパク質を対象とするＴ細胞クローン（Ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｌｏｎｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｔｈ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５；１４９（６）：２１０３〜９（１９９２）。
１１０．  ＷＨＯ報告書『世界のワクチンと免疫化の現状（Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ’ｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）』、ジュネーブ：世界保健機構（１９９６）。
１１１．  Ｗｉｚｅｌ，Ｂ．，Ｒｏｇｅｒｓ，Ｗ．Ｏ．，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｌａｎａｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｔｉｎｅ，Ｊ．Ａ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト表面タンパク質２に対するネズミ細胞毒性Ｔリンパ球の導入（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：１４８７〜１４９５（１９９４）。
１１２．  Ｗｉｚｅｌ，Ｂ．，Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．，Ｃｈｕｒｃｈ，Ｐ．，Ｔｉｎｅ，Ｊ．Ａ．，Ｌａｎａｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｄ．Ｍ．，Ｂａｌｌｏｕ，Ｗ．Ｒ．，Ｓｅｔｔｅ，Ａ．及びＨｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、「スポロゾイト免疫化ボランティアにおける複数の熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト表面タンパク質２エピトープに対するＨＬＡ−Ａ２制限細胞毒性Ｔリンパ球応答（ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：７６６〜７７５（１９９５）。
１１３．  Ｗｏｌｄ，Ｆ．、「翻訳後のタンパク質修飾−−展望と見通し（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ）」、１〜１２、『タンパク質の翻訳後の共有結合修飾（Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）』、Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８３年。
１１４．  Ｙａｎｇ，Ｃ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｗ．Ｅ．，Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｊ．Ｓ．ら、「ブロックコポリマー免疫賦活剤中のメロゾイト表面タンパク質１の組み換えＣ−末端断片を用いた免疫化によるリスザルにおける三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）血液段階感染に対する部分的保護（Ｐａｒｔｉａｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ  ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｉｍｉｒｉ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｉｎ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ａｄｊｕｖａｎｔ）」、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．６７：３４２（１９９９）。
１１５．  『ジンサー細菌学（Ｚｉｎｓｓｅｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』１１８０〜８３（Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ，Ｈｉｌｄａ  Ｐ．Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｄ．Ｂｅｒｎａｒｄ  Ａｍｏｓ，及びＣａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｍ．Ｗｉｌｆｅｒｔ（編）、第２０版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ  １９９２）。
【０１４５】
当業者ならば、本明細書を考察し、ここで開示する本発明を実施することによって、本発明の他の実施形態が明らかとなろう。本明細書及び実施例は、単に例示的なものとみなし、本発明の正確な範囲及び意図は、添付の特許請求の範囲によって示されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】ＤＮＡ初回刺激直後（図１ａ）、ＲＴＳ，Ｓによる追加免疫直前（図１ｂ）、及びＲＴＳ，Ｓ追加免疫直後（図１ｃ）のＣＴＬ応答を陽性対象及び陽性ペプチドごとに示すグラフである。黒の棒は、試験ペプチドを含み相応なＭＨＣ提示のあるサンプルを表す。点模様の棒は、対照ペプチドを含み相応なＭＨＣ提示のあるサンプルを表す。しま模様の棒は、試験ペプチドを含み相応なＭＨＣ提示のないサンプルを表す。ＤＮＡ初回刺激後（ａ）、追加免疫前（ｂ）、又は１回目（ボランティア番号６＝Ｖ６）若しくは２回目（Ｖ２、３、８、及び９）のＲＴＳ，Ｓ投与から２週間後（ｃ）に採取した新鮮なＰＢＭＣを、ＰｆＣＳＰを発現させるＡＬＶＡＣによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで７日間刺激し、５時間のクロム放出アッセイにおいて、実験用の８〜１０アミノ酸ＰｆＣＳＰ由来ペプチド又は対照ペプチド（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１拘束性ＨＩＶｇａｇ）（ＭＨＣ＋対照）と共にインキュベートした、ＨＬＡクラスＩ適合ターゲット（ＭＨＣ＋ペプチド）又は不適合ターゲット（非ＭＨＣ＋ペプチド）に対して試験した。応答は、実験ペプチドと対照ペプチドを適用した各ターゲット細胞の溶解率（％）の差が、少なくとも２種のエフェクター細胞対ターゲット細胞の比（Ｅ：Ｔ）について≧１０％であった場合に限り陽性であるとみなした。単一のＥ：Ｔ比（２０：１又は４０：１）での溶解率を、ペプチドごとに、同時に評価したその対照を添えて示す。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮ−γ応答に関与したＴ細胞を、それぞれ誘発相及びエフェクター相で特徴付けるグラフである。ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡのみで３回（ＶＩ及びＶ５）又はＲＴＳ，Ｓのみで２回（Ｖ１９、Ｖ２１、及びＶ２２）免疫感作したボランティアの凍結ＰＢＭＣを、ペプチド（ａ）Ｆｌｕ  Ｍ  Ａ２、（ｂ）ＴＴ−ＤＲ、（ｃ）ＰｆＣＳＰ  ＤＲ．３６３、又は（ｄ）ＰｆＣＳＰ  ＤＲ．３１６と共に培養する直前に対照Ｄｙｎａｂｅａｄｓで処理したもの、又はそのＣＤ４＋Ｔ細胞若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させたものを用いて、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。平行して、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベル（ｅ）を、選択的に濃縮処理した、同じボランティア由来のＴ細胞集団（ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ４＋／ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ８＋／ＣＤ４５ＲＡ−）でのリアルタイムＰＣＲによって、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで試験した同じセットのペプチドと共に３６時間培養した直後に同じ試験時点で測定した。
【図３】リアルタイムＰＣＲ  ＩＦＮ−γによって測定した、Ｔ細胞サブセット中のＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。ＰｆＣＳＰ  ＤＮＡ（ＤＮＡ単独）を３回投与した後、及びその個体がＲＴＳ，Ｓワクチン（ＤＮＡ／ＲＴＳ，Ｓ）の２回の投与によって追加免疫を受けた後に得た、２人のボランティア（ＶＩ及びＶ５）の凍結細胞を試験した。細胞をペプチドＰｆＣＳＰ  ＤＲ．３６３と共に３６時間インキュベートし、選択的に濃縮処理し、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現を評価した。ＤＮＡによる免疫感作の後、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の、ボランティアＶ１のＣＤ４５ＲＡ−サブセット及びボランティアＶ５のＣＤ４５ＲＡ＋サブセットでは適度にアップレギュレーションされたが（５〜１０倍）、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではアップレギュレーションされなかった。ＲＴＳ，Ｓによる追加免疫に伴って、両方のボランティアのアップレギュレーションされたＣＤ４＋Ｔサブセットでは、ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現レベルが有意に（８０〜１００倍）増加したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞では増加しなかった。
【図４】ＲＴＳ，Ｓの最初の投与後の、ペプチドＤＲ．３１６（ＣＤ８＋Ｔｃｌのみ）に対するＩＦＮ−γ応答のＤＮＡによって誘発されたパターンから、ＲＴＳ，Ｓワクチンの２回目の投与後の２通りのパターンの混合（ＣＤ８＋Ｔｃ１及びＣＤ４＋Ｔｈ１）への移行を示すグラフである。ボランティアＶ２の細胞で行ったｅｘ  ｖｉｖｏ  ＥＬＩＳＰＯＴでは、（ａ）ＲＴＳ，Ｓの最初の投与後、ＩＦＮ−γ応答が、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の培養前の枯渇処理によって有意に減少した（ＤＮＡによって誘発されたＩＦＮ−γ応答の特徴）。ＲＴＳ，Ｓワクチンの２回目の投与後では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみの枯渇処理が活性を有意に低下させた。平行して、リアルタイムＰＣＲによるエフェクター相では、（ｂ）ＩＦＮ−γ  ｍＲＮＡの発現は、ＲＴＳ，Ｓの最初の投与後、ＣＤ８＋Ｔ細胞でアップレギュレーションされたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではアップレギュレーションされず、ＲＴＳ，Ｓの２回目の投与後、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の両方でアップレギュレーションされた。「２ｗｋｐ１」は最初の投与から２週間後を指し、「２ｗｋｐ２」は２回目の投与から２週間後を指す。
【図５】ＤＮＡ初回刺激／ＲＴＳ，Ｓ追加免疫ボランティアのＩＦＡＴ抗体力価を示すグラフである。抗体の力価は、ＲＴＳ，Ｓの最初の投与前にＨＢｓＡｇに対する抗体をもつ（＋）、またもたない（−）ＤＮＡ初回刺激（＋）ボランティア及び非初回刺激（−）ボランティアの幾何平均±ＳＥ（９５％信頼区間）として示した。抗体アッセイは、ＲＴＳ，Ｓによる最初及び２回目の免疫感作の後に実施した。最初の投与から２週間後に、ＤＮＡ−／ＨＢｓＡｇ＋ボランティアの力価がＤＮＡ＋／ＨＢｓＡｇ＋よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．０２）ことを除き、どの群の間にも有意差がなかった。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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