(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＮＫ阻害剤の、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺腺維症を治療するための薬剤組成物を調製するための使用であって、
上記ＪＮＫ阻害剤は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列から構成されているか、またはその改変体であり、
上記改変体は、配列番号１１のアミノ酸の１〜２個の置換、付加、および／または、削除を含み、かつＪＮＫを発現する細胞内に存在するときに、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋｌから構成される群から選択されるＪＮＫ標的転写因子の少なくとも１つの活性化を阻害するものである、使用。
【請求項２】
請求項１において規定されたＪＮＫ阻害剤をコードする、単離された核酸の、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺腺維症を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【請求項３】
請求項２において規定された核酸を含むベクターの、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺腺維症を治療するための薬剤組成物を調製するための使用。
【請求項４】
請求項３において規定されたベクターを含む細胞の、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または肺腺維症を治療するための薬剤組成物を調製するための使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に係る使用であって、上記薬剤組成物は、非経口経路（静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、経皮経路を含む）、経腸経路（経口経路、直腸経路を含む）、局所経路（経鼻経路、鼻内経路を含む）、および、他の経路（表皮送達またはパッチ送達）から構成される群から選択された１つの投与経路によって投与される、使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に係る使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤の投与量（ｋｇ体重当たり）は、１０ｍｍｏｌ／ｋｇまでの範囲内である、使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に係る使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤の投与量は、１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜１ｍｍｏｌ／ｋｇである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼ阻害剤の使用に関し、より詳細には、プロテインキナーゼｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または、これをコードする核酸、およびこれを含有する薬剤組成物の、ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する種々な疾患または障害を治療するための使用に関する。これらの疾患または障害は、自己免疫疾患、心疾患、癌疾患、糖尿病（１型または２型の糖尿病を含む）、炎症性疾患、脱毛症（円形脱毛症を含む）、肺の疾患、神経疾患または神経変性疾患、肝臓の疾患、脊椎の疾患、子宮の疾患、ウイルス感染症、およびうつ病から選択される。
【背景技術】
【０００２】
ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）は、マイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化されたグループの１つの成分である。このキナーゼは、細胞増殖および細胞分化の制御、より一般的にいうと細胞の環境刺激に対する応答に、関連している。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに反応して、且つ、幾つかのクラスの、細胞の表面にあるレセプターの関与によって、活性化される。細胞の表面にあるこれらのレセプターには、サイトカインレセプター、セルペンチンレセプター、およびレセプターチロシンキナーゼが含まれ得る。哺乳類細胞では、ＪＮＫは、発癌性形質転換、および環境ストレスへの適応反応を媒介するといった生物過程に関連している。ＪＮＫはまた、免疫細胞の成熟および分化を含む免疫応答の調節に関連していると共に、免疫システムによって破壊のために識別された細胞におけるプログラムされた細胞死を引き起こすことに関連している。この一意の特性は、薬理学的介入を発展させるための有力な標的をシグナル伝達するＪＮＫを形成する。
【０００３】
幾つかの神経障害のうち、ＪＮＫシグナル伝達は、特に、虚血性脳卒中およびパーキンソン病だけでなく、以下に説明するさらなる疾患に関連している。さらに、マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８ａｌｐｈａは、ＪＮＫ−ｃＪｕｎ−経路を中和することによって細胞増殖に負の制御をすることが示された。従って、マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）ｐ３８ａｌｐｈａは、正常および癌細胞の増殖の抑制においてアクティブであると考えられ、さらに、ＪＮＫを癌疾患に関連付けることを示している（例えば、Hui et al., Nature Genetics, Vol 39, No. 6, (2007年6月)を参照）。
【０００４】
ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮＫ）が、脊髄神経ライゲーション（ＳＮＬ）によって発生する神経障害性の痛みに関係があることも示されている。ここで、ＳＮＬは、ＪＮＫ、特にＪＮＫ１のゆっくり且つ持続する活性化を誘発するが、ｐ３８マイトジェン−活性化プロテインキナーゼの活性化は、ＳＮＬの後の脊髄小膠細胞において見出され、２１日間でほとんど基礎レベルまで低下した（Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, 2006年3月29日, 26(13):3551-3560)）。
【０００５】
従って、ＪＮＫシグナル伝達経路を阻害または妨害すること、特に、ＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤を設けることは、ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する障害を治す有効な手段であると考えられる。しかし、現在のところ、幾つかのＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤だけが知られている。
【０００６】
従来技術において既に知られているＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤は、特に、例えば、上流側のキナーゼ阻害剤（例えば、ＣＥＰ−１３４７）は、例えばプロテインキナーゼのＡＴＰ−結合部位と競合することによって、キナーゼ活性を直接引き起こすＪＮＫの小さな化学的阻害剤（ＳＰ６００１２５およびＡＳ６０１２４５）、および、ＪＮＫとその基質（Ｄ−ＪＮＫＩおよびＩ−ＪＩＰ）との間の相互作用のペプチド性阻害剤を含む（例えば、Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, 2005年2月, vol. 4, no. 1, pp. 63-67(5)を参照）。
【０００７】
上流側のキナーゼ阻害剤ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）とは、混合系統キナーゼファミリーの半合成の阻害剤である。ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、栄養の供与を停止した後の主要な胚培養および分化されたＰＣ１２細胞において、並びに、１−メチル−４−フェニルテトラヒドロピリジンで処理されたマウスにおいて、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を阻害する量のニューロンの生存を促進する。さらに、ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）が、培養されたニワトリ胚後根神経節、交感神経、繊毛、および運動ニューロンの長期生存を促進することが可能である（例えば、Borasio et al., Neuroreport. 9(7) 1435-1439（1998年5月11日）を参照）。
【０００８】
この小さな化学的ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５は、ｃ−Ｊｕｎリン酸化の量を低減し、ドーパミン作動性ニューロンをアポトーシスから保護し、Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスにおけるＭＰＴＰ−誘発されたＰＤのドーパミンの量を部分的に回復させることが分かっている（Wang et al., Neurosci Res. 2004年2月; 48(2); 195-202）。これらの結果は、ＪＮＫ経路が、インビボのＭＰＴＰの神経毒性作用の主な媒介体であることをさらに示しており、ＪＮＫ活性を阻害することは、ＰＤを治療するための新規且つ効果的な方法を示し得る。
【０００９】
小さな化学的ＪＮＫ阻害剤のさらなる実施例は、上述のＪＮＫ−阻害剤ＡＳ６０１２４５である。ＡＳ６０１２４５は、ＪＮＫシグナル伝達経路を阻害し、脳虚血後の細胞生存を促進する。インビボでは、ＡＳ６０１２４５は、広範囲の一過性虚血のアレチネズミモデルにおいて、海馬ＣＡ１神経の遅延された損失に対する著しい保護を提供した。この作用は、ＪＮＫ阻害によって、従ってｃ−Ｊｕｎ発現およびリン酸化によって、媒介される（例えば、Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310(1)25-32. Epub 2004年2月26日を参照）。
【００１０】
ＪＮＫシグナル伝達経路の阻害剤の第３のクラスは、上述のように、ＪＮＫとその基質との間の相互作用のペプチド性阻害剤を示している。このようなＪＮＫ阻害剤ペプチドの構造の開始点として、自然発生したＪＮＫ蛋白質の配列アラインメントを用いてもよい。典型的には、これらの蛋白質は、ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含み、ＩＢ１またはＩＢ２といった種々なインスリン結合（ＩＢ）蛋白質において生じる。このような典型的な配列アラインメントの結果は、例えば、ＩＢ１［配列番号１３］、ＩＢ２［配列番号１４］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号１５］、およびＡＴＦ２［配列番号１６］（例えば、図１Ａ〜１Ｃを参照）のＪＮＫ結合ドメイン間の配列アラインメントである。このようなアラインメントによって、部分的に保存された８つのアミノ酸配列（例えば、図１Ａ）が明らかにされる。ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとの間の比較により、これら２つの配列間で高度に保存された、２つのブロックの、７つおよび３つのアミノ酸が明らかになる。
【００１１】
このようなアラインメントに基づいて構成された配列は、例えば、ＷＯ０１／２７２６８号公報またはＷＯ２００７／０３１２８０号公報に開示されている。ＷＯ２００７／０３１２８０号公報およびＷＯ０１／２７２６８号公報は、小さな細胞透過性融合ペプチドを開示している。このペプチドは、ＨＩＶ−ＴＡＴ蛋白質の基本的なトラフィッキング配列に由来するいわゆるＴＡＴ細胞浸透配列と、ＩＢ１の最小２０個のアミノ酸の阻害配列とを含む。どちらの成分も、互いに共有結合されている。
【００１２】
ＷＯ２００７／０３１２８０号公報およびＷＯ０１／２７２６８号公報の両方に開示された、ＭＡＰＫ−ＪＮＫシグナル伝達経路の典型的な（且つ現在のところ唯一の）阻害剤は、例えば、Ｌ−ＪＮＫＩ１（Ｌアミノ酸から構成されるＪＮＫ−阻害剤ペプチド）、またはプロテアーゼ耐性Ｄ−ＪＮＫＩ１ペプチド（非ネイティブＤアミノ酸から構成されるＪＮＫ−阻害剤ペプチド）である。これらのＪＮＫ−阻害剤（ＪＮＫＩ）ペプチドは、ＪＮＫ（ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３）に特異的である。
【００１３】
上述のこれらの小さな化合物阻害剤に反して、ＷＯ２００７／０３１２８０号公報またはＷＯ０１／２７２６８号公報の阻害剤配列、例えば、ＪＮＫＩ１は、むしろ、ＪＮＫとその基質との間の相互作用を阻害する。融合ペプチドは、その、ＴＡＴに由来するトラフィッキング配列によって、細胞の中に効率よく輸送される。トラフィッキング成分によって得られるこの新規の特性によって、融合ペプチドは、細胞の中に能動的に輸送され、該細胞において、これら融合ペプチドは、蛋白質が分解されるまで、有効に維持される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかし、ＷＯ２００７／０３１２８０号公報またはＷＯ０１／２７２６８号公報に係るペプチドは、限られた数の疾患、特に非−悪性の疾患または免疫学的に関連する細胞増殖性疾患といった疾患において有効であることが示されただけである。
【００１５】
従って、本発明の一目的は、ＪＮＫ阻害剤ペプチドによって治癒することが可能なさらなる疾患を特定することにある。本発明の他の一目的は、新規のＪＮＫ阻害剤ペプチドおよびその誘導体（の使用）を、上述の各疾患、およびＪＮＫシグナル伝達に強く関連することがまだ知られていない、または既に知られている疾患の治療のために、提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この目的は、好ましくは本明細書において規定される、典型的には１５０個よりも短い長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列を、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する種々な疾患を治療するための薬剤組成物を調製するために使用することによって、解決される。ここで、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害は、自己免疫疾患、心疾患、癌疾患、糖尿病（１型または２型の糖尿病を含む）、炎症性疾患、脱毛症（円形脱毛症を含む）、肺の疾患、神経疾患または神経変性疾患、肝臓の疾患、脊椎の疾患、子宮の疾患、ウイルス感染症、およびうつ病から選択されることが好ましいが、これらに限定されない。
【００１７】
好ましい一実施形態によれば、自己免疫疾患は、狼瘡、紅斑性狼瘡、およびシェーグレン症候群を含む（しかし、これらに限定されない）自己免疫疾患から選択される。
【００１８】
好ましいさらなる一実施形態によれば、心疾患は、心臓病および冠状動脈性心臓病、動脈硬化症、脳溢血、（腎動脈瘤高血圧といった）腹大動脈の拡張、並びに心筋梗塞症から選択される。
【００１９】
他の好ましい一実施形態によれば、癌疾患は、カポジ肉腫、急性骨髄性白血病（赤白血病を含む）、黒色腫、悪性黒色腫、結腸癌、リンパ腫、肉腫、芽球腫、腎臓癌、胃腸腫瘍、神経膠腫、前立腺腫瘍、膀胱癌、直腸腫瘍、胃癌、咽頭癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌（＝乳腺癌）、子宮癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘパトーム、逆ウイルス誘発性腫瘍（例えば、パピローマウイルス誘発性悪性腫瘍（子宮頸癌）、腺癌、ヘルペスウイルス誘発性腫瘍（例えば、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ−誘発性Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎−誘発性腫瘍（肝細胞癌）、ＨＴＬＶ−１誘発性リンパ腫およびＨＴＬＶ−２誘発性リンパ腫、聴神経神経鞘腫、肺悪性腫瘍（＝肺癌＝気管支悪性腫瘍）、小細胞肺癌、咽喉癌、肛門癌、膠芽腫、直腸癌、星状細胞腫、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽腫、膣癌、睾丸癌、甲状腺癌、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病、下垂体部腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、棘細胞癌、バーキットリンパ腫、喉頭癌、腎臓癌、胸腺腫、子宮体癌、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭頸部腫瘍、乏枝神経膠、外陰癌、腸癌、結腸癌、食道癌（＝咽頭癌）、いぼ状態（wart conditions）、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣悪性腫瘍、軟部組織腫瘍、卵巣癌（＝卵巣悪性腫瘍）、膵臓悪性腫瘍（＝膵臓癌）、子宮内膜癌、肝転移、陰茎癌、舌癌、胆のうがん、白血病、形質細胞腫、眼瞼腫瘍、前立腺癌（＝前立腺腫瘍）などから、または（インフルエンザ、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱病、ＡＩＤＳ、ライム病、リーシュマニア症、炭疽病、および髄膜炎から選択される）感染症から選択される。
【００２０】
好ましいさらなる一実施形態によれば、炎症性疾患は、肺の炎症若しくは肺疾患（急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む）、または、（繊維組織の形成が含まれるが、これに限定されない）組織の炎症である肺腺維症（嚢胞性腺維症を含む）、髄膜炎、および、移植拒絶反応から選択される。
【００２１】
他の好ましい一実施形態によれば、肺の疾患は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、呼吸器系に関連する慢性病（喘息を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎、および肺腺維症を含むが、これらに限定されない、肺の炎症または肺疾患から選択される。
【００２２】
好ましい一実施形態によれば、神経疾患または神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋失調症、癲癇、視神経疾患（緑内障を含む）、目の感染、多発性硬化症、髄膜炎、神経系によって引き起こされる神経細胞疾患または神経系の疾患または障害（軸索切断といった軸索の「切断」または中断を含む）、苦痛（特に神経障害性の痛み）、脳梗塞（虚血性脳卒中を含む）、および、ウイルス性脳障害から選択されるが、これらに限定されない。
【００２３】
好ましいさらなる一実施形態によれば、肝臓の疾患は、肝炎および肝臓中毒症から選択されるが、これらに限定されない。
【００２４】
他の好ましい一実施形態によれば、脊椎の疾患は、椎間板ヘルニアから選択されるが、これらに限定されない。
【００２５】
好ましい一実施形態によれば、子宮の疾患は、子宮内膜症から選択されるが、これらに限定されない。
【００２６】
好ましいさらなる一実施形態によれば、ウイルス（感染）症は、ＨＳＶ、カポジ肉腫、尖圭コンジローム、伝染性軟属腫、デング熱、三日熱、エボラウイルス、風邪、初夏髄膜脳炎（ＥＳＭＥ）、帯状疱疹、肝炎、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスＩＩ型、ヘルペスゾスター、インフルエンザウイルス、日本脳炎、ラッサ熱、マーブルグウイルス、麻疹、口蹄疫、単球増加症、おたふくかぜ、ノーウォークウイルス感染症、パイファー腺熱、天然痘、小児麻痺（脊髄性小児麻痺）、仮性クループ、伝染性紅斑、狂犬病、いぼ、西ナイル熱、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、オルソポックス天然痘ウイルス、オルソポックスアラストリム・ウイルス、パラポックスオヴィス・ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヘルペスＢウイルス、水疱瘡ゾスターウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヒト巨大細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス８、Ｂ型肝炎ウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ルビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルスＣ、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、跳躍病ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、Ｂ型日本脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、ＦＳＭＥウイルス、ＳＡＲＳ−関連性コロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯｃ４３、トロウイルス、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩ型、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス１型若しくはヒト免疫不全ウイルス２型）、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、タカリベウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、ボルナ病ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、サンチョウバエ熱ウイルス、トスカーナウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハザラウイルス、ハサンウイルス、ハンタンウイルス、ソウルウイルス、プロスペクトヒルウイルス、プーマラウイルス、ドブラバ-ベルグラードウイルス、ツラウイルス、シンノンブレウイルス、ヴィクトリア湖マーブルグウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、ドウベンハーゲウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１＋２、オーストラリアコウモリリッサウイルス、アデノウイルスＡ−Ｆ、ヒトパピローマウイルス、疣贅ウイルス６、疣贅ウイルス１１、ポリオーマウイルス、アデノ随伴ウイルス２、ロタウイルス、またはオルビウイルス、水疱瘡（水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、および、マラリアウイルスから選択されるがこれらに限定されないウイルスから選択されるか、または、該ウイルスによって引き起こされる。
【００２７】
他の好ましい一実施形態によれば、鬱病は、大うつ病としても知られる大鬱病性障害、単極性鬱病、臨床的鬱病、または単純鬱病、双極性障害、躁鬱病から選択されるが、これらに限定されない。
【００２８】
当該技術分野において公知のＪＮＫ阻害剤配列は、限られた数の疾患にしか有用性を提供しないので、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列が、上述のＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するために使用可能であると共に該治療に適していることは、驚くべき結果であった。ＪＮＫ阻害剤配列は、概して、当該技術分野において公知であったが、このことは、明白でもなかったし、従来技術によって示唆されるものでもなかった。
【００２９】
典型的に、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列は、ヒトまたはラットＩＢ１配列に由来し、好ましくは、配列番号１０２（ラットからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列およびその予測されるアミノ酸配列を示す）、配列番号１０３（ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエキソン−イントロン境界によってコードされたラットからのＩＢ１蛋白質配列を示す）、配列番号１０４（ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列を示す）、または、配列番号１０５（ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を示す）に記載の配列のうちのいずれかによって規定された、またはコードされたアミノ酸配列に由来し、より好ましくは、配列番号１０４（ホモサピエンスのＩＢ１蛋白質配列を示す）、または、配列番号１０５（ホモサピエンスのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を示す）に記載の配列のうちのいずれかによって規定された、またはコードされたアミノ酸配列、または、これらの任意の断片または改変体に由来していてよい。換言すると、ＪＮＫ阻害剤配列は、ヒト若しくはラットＩＢ１配列の断片、改変体、または、このような断片の改変体を含む。ヒトまたはラットＩＢ配列は、それぞれ、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５に記載の配列によって規定またはコードされる。
【００３０】
好ましくは、本明細書において用いられるＪＮＫ阻害剤配列は、全部で、１５０個よりも短い長さのアミノ酸残基、好ましくは、５〜１５０個の範囲の長さのアミノ酸残基、より好ましくは１０〜１００個の範囲のアミノ酸残基、さらにより好ましくは１０〜７５個の範囲の長さのアミノ酸残基、および最も好ましくは１０〜５０個の範囲の長さのアミノ酸残基、例えば、１０〜３０個、１０〜２０個、または、１０〜１５個の長さのアミノ酸残基を含む。
【００３１】
より好ましくは、このようなＪＮＫ阻害剤配列および上述の範囲は、上述の配列のうちのいずれかから、さらにより好ましくは、配列番号１０４に従って規定された、または配列番号１０５によってコードされたアミノ酸配列から選択され、さらにより好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド４２０と９８０の間の範囲において、または、配列番号１０４のアミノ酸１０５と２９１との間の範囲において、および最も好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド５６１と６４７との間の範囲において、または配列番号１０４のアミノ酸１５２と１８０との間の範囲において、選択され得る。
【００３２】
具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、典型的には、ＪＮＫを結合し、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化された転写因子、例えば、ｃ−ＪｕｎまたはＡＴＦ２（例えば、各配列番号１５および１６を参照）、またはＥｌｋ１の活性化を阻害する。
【００３３】
同様に、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、または、その断片、誘導体、若しくは改変体を含むか、または、これから構成される。
【００３４】
より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸配列、またはそのその改変体、断片、または誘導体の、１、２、３、４、またはそれ以上のコピーを含んでいてよい。１つ以上のコピーが存在するならば、本明細書において使用される、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のこれらのアミノ酸配列、またはその改変体、断片、若しくは誘導体は、何らかのリンカー配列無しに、または１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介さずに、直接互いに連鎖されている。
【００３５】
リンカー配列を形成するアミノ酸は、好ましくは、アミノ酸残基としてのグリシンまたはプロリンから選択されている。より好ましくは、本明細書において使用される、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のこれらのアミノ酸配列、または、その断片、改変体、若しくは誘導体は、２つ、３つ、またはそれ以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離され得る。
【００３６】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または、これらの組み合わせから構成されていてよい。好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは、少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含み、ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはアミノ酸Ｌ−アミノ酸は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列において、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で、配置されていてよい。
【００３７】
好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸だけから構成されていてよい。本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、その後、配列番号１または３に記載の、少なくとも１つの「ネイティブＪＮＫ阻害剤配列」を含むか、またはこれから構成されていてよい。これに関して、「ネイティブ」または「ネイティブＪＮＫ阻害剤配列」という用語は、本明細書において使用されるように全体がＬ−アミノ酸から構成された、配列番号１または３のいずれかに記載の変換されていないＪＮＫ阻害剤配列を指す。
【００３８】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列ＮＨ2−Ｘnb−Ｘna−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢジェネリック（ｓ））［配列番号３］、および／または、ＩＢ１ＸＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／ＴＸ（Ｌ−ＩＢ（ジェネリック））［配列番号１９］のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００３９】
これに関して、各Ｘは、典型的には、好ましくは任意の（ネイティブ）アミノ酸残基から選択されたアミノ酸残基を示す。Ｘnaは、典型的には、好ましくは、セリンまたはトレオニンを除く任意のアミノ酸残基から選択された１つのアミノ酸残基を示す。ここで、ｎ（Ｘの繰り返しの数）は、０または１である。
【００４０】
さらに、各Ｘnbは、任意のアミノ酸残基から選択されていてよく、ここでｎ（Ｘの繰り返しの数）は、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、またはそれ以上であってよく、Ｘnaのｎ（Ｘの繰り返しの数）が０であると仮定すると、Ｘnbは、好ましくは、そのＣ末端においてセリンまたはトレオニンを含まず、この位置においてセリンまたはトレオニンを回避する。好ましくは、Ｘnbは、配列番号１または３に由来するペプチド残基の連続したストレッチを示す。
【００４１】
ＸnaおよびＸnbは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸を示す。さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  ＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＩＢ１）［配列番号１７］のＪＮＫ結合ドメインを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列はさらに、少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号１］を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００４２】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１Ｌ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号３３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号３４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号３５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号３６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号３７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号３８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号３９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ2−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号４０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号４２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号４３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号４４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号４５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号４７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ2−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号４８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ2−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号５０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号５１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号５２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号５３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号５４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号５５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ，配列番号５６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ2−ＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号５７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ2−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号５８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ2−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号５９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号６０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号６２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号６３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ，配列番号６５）；およびＬ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ−ＣＯＯＨ��配列番号６６）のＪＮＫ結合ドメインを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００４３】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  ＰＧＴＧＣＧＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＩＢ１−ロング）［配列番号１３］の（ロング）ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）と、ＩＢ２  ＩＰＳＰＳＶＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡＱＤＳ（ＩＢ２−ロング）［配列番号１４］の（ロング）ＪＮＫ結合ドメインと、ｃ−ＪｕｎＧＡＹＧＹＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＮＬＫＰＨ（ｃ−Ｊｕｎ）［配列番号１５］のＪＮＫ結合ドメインと、ＡＴＦ２  ＴＮＥＤＨＬＡＶＨＫＨＫＨＥＭＴＬＫＦＧＰＡＲＮＤＳＶＩＶ（ＡＴＦ２）［配列番号１６］のＪＮＫ結合ドメインとを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい（例えば、図１Ａ〜１Ｃを参照）。
【００４４】
これに関して、部分的に保存された８つのアミノ酸配列（例えば図１Ａを参照）が、アラインメントによって明らかにされ、ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとをさらに比較することによって、これら２つの配列間で高度に保存された、２つのブロックの、７つおよび３つのアミノ酸が明らかにされる。
【００４５】
他の好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、部分的に、上記で規定されたＤ−アミノ酸から構成される、または全くこれのみから構成されていてよい。より好ましくは、Ｄ−アミノ酸から構成されるこれらのＪＮＫ阻害剤配列は、上述の（ネイティブ）ＪＮＫ阻害剤配列の非ネイティブＤレトロ−インベルソ配列である。「レトロ−インベルソ配列」という用語は、配列の方向が逆であり各アミノ酸残基の対掌性が反転された、直線状のペプチド配列の異性体（例えば、Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)を参照）を指す。
【００４６】
Ｄ−鏡像異性体と逆合成とを組み合わせることの利点は、各アミド結合内のカルボニル基の位置とアミノ基の位置とが交換され、各アルファ炭素内の側鎖基の位置が維持される点である。他に特別な記載がない限り、本発明に従って使用される所定の任意のＬ−アミノ酸配列またはペプチドは、対応するネイティブＬ−アミノ酸配列またはペプチドに、逆の配列またはペプチドを合成することによって、Ｄレトロ−インベルソ配列またはペプチドに変換可能であると推測される。
【００４７】
本明細書において使用されると共に上記で規定されたＤレトロ−インベルソ配列は、種々な有用な特性を有している。例えば、本明細書において使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、本明細書において使用されるＬ−アミノ酸配列と同じ程度、効率良く細胞の中に侵入する。その一方で、本明細書において使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、当該Ｌ−アミノ酸配列よりも安定している。
【００４８】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ2−Ｘnb−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘna−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１  ジェネリック（ｓ））［配列番号４］および／またはＸＳ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸ（Ｄ−ＩＢ（ジェネリック））［配列番号２０］に記載の、少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００４９】
これに関して用いられるように、Ｘ、Ｘna、およびＸnbは、上記で規定された通りであり（好ましくは、Ｄアミノ酸を示す）、Ｘnbは、好ましくは配列番号２または４に由来する残基の連続したストレッチを示す。さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ（Ｄ−ＩＢ１）［配列番号１８］のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むアミノ酸配列に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５０】
より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号２］に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５１】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  Ｄ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号６７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号６９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ2−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号７６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号８１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ2−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号８２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ2−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号８３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号８４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号８５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号８６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号８９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ，配列番号９０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬ−ＣＯＯＨ，配列番号９１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ，配列番号９２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号９３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号９４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号９５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号９６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号９７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ2−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号９８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ2−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号９９）；および、Ｄ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ2−ＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号１００）のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むアミノ酸配列に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５２】
本明細書において使用される、上記で開示されたＪＮＫ阻害剤配列は、表１（配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００）に示されている。この表は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の名前およびその配列識別番号、その長さ、並びにアミノ酸配列を示している。さらに、表１は、例えば、配列番号１、２、５、６、９、および１１、並びに、配列番号３、４、７、８、１０、および１２の、配列とその各一般式とを示す図である。表１はさらに、キメラ配列である配列番号９〜１２および２３〜３２（以下を参照）、Ｌ−ＩＢ１配列である配列番号３３〜６６、並びに、Ｄ−ＩＢ１配列である配列番号６７〜１００を開示している。
【００５３】
【表１】
0005485265.tif 000002
0005485265.tif 000003
0005485265.tif 000004
0005485265.tif 000005
0005485265.tif 000006
0005485265.tif 000007
【００５４】
他の好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で規定された、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のネイティブまたは非ネイティブアミノ酸配列の、少なくとも１つの改変体、断片、および／または、誘導体を含むか、またはこれから構成される。好ましくは、これらの改変体、断片、および／または、誘導体は、本明細書において使用される、上記で開示されたネイティブまたは非ネイティブのＪＮＫ阻害剤配列、特に、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のネイティブまたは非ネイティブアミノ酸配列の生物活性、すなわち、ＪＮＫを結合する、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化された転写因子（例えばｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＥｌｋ１）の活性化を阻害する生物活性を保持する。
【００５５】
機能性は、種々な試験によって、例えば、ペプチドをその標的分子に結合させる試験、または、生物理学的方法（例えば、分光法、コンピュータモデリング法、構造解析法など）によって、試験され得る。特に、上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列、またはその改変体、断片、および／または、誘導体は、親水性分析（例えば、Hopp and Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78 3824-3828を参照）によって分析され得る。
【００５６】
この親水性分析を利用して、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を特定し、これによって、例えば結合実験または抗体合成といった実験的操作のための、基板の構成を支援することが可能である。
【００５７】
第２の構造解析法を行って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列、または、その改変体、断片、および／または、誘導体の、特定の構造モチーフを示す領域を特定してもよい（例えば、Chou and Fasman, 1974, Biochem 13 222-223を参照）。操作、翻訳、二次構造予測、親水性プロファイルおよび疎水性プロファイル、オープンリーディングフレーム予測およびプロッティング、並びに、配列相同性の決定は、当該技術分野において入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを用いて行うことが可能である。
【００５８】
他の、例えば、Ｘ線結晶学（例えば、Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11 7-13を参照）、質量分析法、およびガスクロマトグラフィー法（例えば、METHODS IN PROTEIN  SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY参照）、およびコンピュータモデリング法（例えば、Fletterick and Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, In CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照）を含む構造解析法を用いてもよい。
【００５９】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の少なくとも１つの改変体を含むか、またはこれから構成されていてよい。本発明の意味するところによれば、「配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の改変体」とは、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかに由来する配列である。
【００６０】
ここで、改変体は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸配列のアミノ酸変換を含む。このような変換は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは、１〜５個の置換、付加、および／または、削除を含む。この場合、この改変体は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を示す。
【００６１】
上記に規定されていると共に本明細書において使用されるような、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の改変体が、特定のアミノ酸を置換することによって得られるならば、このような置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換を含む。
【００６２】
保存的アミノ酸の置換には、基内の類似アミノ酸残基が含まれ得る。この類似アミノ酸残基は、十分に相似した物理化学的特性を有しているため、基内の成分間を置換しても分子の生物活性は保存される（例えば、Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864参照）。
【００６３】
上記で規定された配列において、アミノ酸を挿入および／または除去することが可能であり、この際に、特に、挿入および／または除去が、わずかな数の、例えば２０個よりも少ない、および好ましくは１０個よりも少ないアミノ酸だけを含むならば、その機能を変更せずに、挿入および／または除去することが可能であり、機能的活性に重要なアミノ酸は、除去または置換しないことは、当業者には明らかである。
【００６４】
さらに、本明細書において使用される改変体においては、ホスホリラーゼ、好ましくはキナーゼの機能を発現可能なアミノ酸の位置において、さらなるトレオニンを導く置換を回避して、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列、または本明細書において使用されるキメラペプチドの、不活性をインビボまたはインビトロにおいて回避する必要がある。
【００６５】
好ましくは、同じグループに分類され、典型的には、保存的アミノ酸の置換によって交換可能である類似アミノ酸残基を、表２に規定する。
【００６６】
【表２】
0005485265.tif 000008
【００６７】
本明細書において使用される配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００の改変体の特別な形態は、本明細書において使用される配列番号１１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の断片である。この断片は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００と比べて、少なくとも１つの削除によって変換されている。好ましくは、１つの断片は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの少なくとも４つの連続したアミノ酸を含み、その長さは、典型的には、これらの配列のいずれかからのエピトープを特異的に認識するために十分な長さである。
【００６８】
さらにより好ましくは、この断片は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のうちのいずれかのアミノ酸であって、４〜１８個、４〜１５個、または最も好ましくは４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。ここで、下限範囲は、４、または、５、６、７、８、９、または、１０個である。アミノ酸の削除は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００の任意の位置において、好ましくはＮ−末端またはＣ−末端において、生じ得る。
【００６９】
さらに、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の断片は、上述のように、本明細書において使用される配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列として規定され得る。
【００７０】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で規定された、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の少なくとも１つの誘導体をさらに含む、またはこれから構成され得る。
【００７１】
これに関して、「配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の誘導体」とは、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかに由来するアミノ酸配列であり、ここで、誘導体は、（非自然アミノ酸を形成する）少なくとも１つの修飾されたＬ−またはＤ−アミノ酸、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、およびさらにより好ましくは１〜５個の修飾されたＬ−またはＤ−アミノ酸を含む。改変体または断片の誘導体も、本発明の範囲である。
【００７２】
これに関して、「修飾されたアミノ酸」とは、例えば、種々な生物において異なるグリコシル化によって、リン酸化によって、または特異的アミノ酸を標識化することによって変換された、任意のアミノ酸であってよい。このようなラベルは、典型的には、次の（ｉ）〜（vi）から構成されるラベルの群から選択される。
（ｉ）放射性ラベル、すなわち、放射性リン酸化、または硫黄、水素、炭素、窒素などによる放射性ラベル、
（ii）着色された色素（例えば、ジゴキシゲニン（digoxygenin）など）、
（iii）蛍光基（例えば、フルオレセインなど）、
（iv）化学発光基、
（ｖ）固相における固定化のための基（例えば、Hisタグ、ビオチン、strepタグ、flagタグ、抗体、抗原など）、および、
（vi）上記（ｉ）〜（ｖ）に記載したラベルのうちの２つ以上のラベルの組み合わせ。
【００７３】
これに関して、本発明の照会アミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％の「配列同一性を共有する」配列を有するアミノ酸配列とは、対象となるアミノ酸配列が、照会アミノ酸配列の１００アミノ酸当たり５つ未満のアミノ酸の変換を含むことを除いて、照会配列と等しいことを意味することを意図するものである。換言すると、照会アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸配列を得るためには、対象となる配列のアミノ酸残基の５％（１００個のうちの５個）未満に、別のアミノ酸が挿入若しくは置換されているか、または対象となる配列のアミノ酸残基の５％（１００個のうちの５個）未満が削除されていてもよい。
【００７４】
正確に対応してない配列では、第１の配列の「％同一性」は、第２の配列に対して決定され得る。概して、比較されるこれら２つの配列は、配列間の最大相関性を提供するために、位置合わせされている。これは、１つまたは両方の配列に、「間隔」を挿入して、アラインメントの程度を強化することを含む。その後、％同一性は、特に同一または類似の長さの配列に適した、比較される各配列の全長にわたって（いわゆるグローバルアラインメント）決定されるか、または、一意の長さにより適した、かなり短い、一定の長さにわたって（いわゆるローカルアラインメント）決定される。
【００７５】
特に本明細書において使用される、２つ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術において公知である。すなわち、例えば、ウィスコンシン配列分析パッケージ，バージョン９．１において入手可能なプログラム（Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395）である、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および、２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定することが可能である。
【００７６】
ＢＥＳＴＦＩＴは、（Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197）の「局所的相同性」アルゴリズムを用い、２つの配列間の単一の最も類似した領域を発見するものである。配列間の同一性および／または類似性を算出するための他のプログラムも、当該技術では公知である。例えば、ＮＣＢＩのホームページであるワールドワイド・ウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov）を介してアクセス可能なプログラム（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410）のＢＬＡＳＴファミリー、および、ＦＡＳＴＡ（Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448）である。
【００７７】
本発明に従って用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ−阻害剤配列は、当該技術分野において公知の方法、例えば、化学合成法によって、または以下に説明する遺伝子工学法によって、得られる、または生成され得る。例えば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の一部に相当する、該ＪＮＫ阻害剤配列の所望の領域を含むペプチド、または、所望の活性をインビトロまたはインビボで媒介するペプチドは、ペプチドシンセサイザを使用することによって合成可能である。
【００７８】
本発明に従って用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列はまた、本発明に従って用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列が、細胞の中に効率良く輸送されることを可能にするトラフィッキング配列によって修飾され得る。このような修飾されたＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、キメラ配列として提供および使用される。
【００７９】
従って、第２の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドを、被験体における、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するために使用することを提供する。ここで、キメラペプチドの第１のドメインは、トラフィッキング配列を含むが、キメラペプチドの第２のドメインは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、好ましくは配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、またはその誘導体若しくは断片を含む。
【００８０】
典型的には、本発明に従って用いられるキメラペプチドは、少なくとも２５個の長さのアミノ酸残基、例えば、２５〜２５０個の長さのアミノ酸残基、より好ましくは、２５〜２００個の長さのアミノ酸残基、さらにより好ましくは２５〜１５０個の長さのアミノ酸残基、２５〜１００個の長さのアミノ酸残基、および最も好ましくは２５〜５０個の長さのアミノ酸残基を有している。
【００８１】
本明細書において使用されるキメラペプチドは、第１のドメインとして、好ましくは、トラフィッキング配列を含む。トラフィッキング配列は、典型的には、（該トラフィッキング配列が存在する）ペプチドを所望の細胞目的地に方向付けるアミノ酸の任意の配列から選択されている。
【００８２】
従って、本明細書において使用されるようなトラフィッキング配列は、典型的には、ペプチドを、形質膜を横切って、例えば、細胞の外側から形質膜を通って、細胞質の中まで方向付ける。選択的または追加的に、トラフィッキング配列は、ペプチドを、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、またはペルオキシソームに方向付けることも可能である。これは、例えば、２つの成分（例えば、細胞透過性のための成分と、核の位置のための成分と）を混合することによって、または、例えば、細胞膜を輸送する特性、および標的とされた、例えば核内輸送を行う特性を有する、単一の成分によって行うことが可能である。
【００８３】
トラフィッキング配列は、さらに、細胞質成分または細胞の他の任意の成分若しくは区画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置（gloom apparatus）、リゾソーマル小胞）を結合することが可能な他の成分を有していてよい。従って、例えば、第１のドメインのトラフィッキング配列および第２のドメインのＪＮＫ阻害剤配列は、細胞質、または、細胞の他の任意の区画に局在化され得る。これによって、取り込み時に、細胞におけるキメラペプチドの局在性を決定することが可能である。
【００８４】
好ましくは、トラフィッキング配列（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）は、５〜１５０個の長さのアミノ酸配列、より好ましくは、５〜１００個、および最も好ましくは５〜５０個、５〜３０個、またはさらに５〜１５個の長さのアミノ酸を有している。
【００８５】
より好ましくは、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、第１のドメイン内に、連続したアミノ酸配列ストレッチとして生じることも可能である。あるいは、第１のドメイン内のトラフィッキング配列は、２つ以上の断片に分裂されていてもよい。この場合、これらの断片の全ては、トラフィッキング配列全体と類似しており、トラフィッキング配列自体が上記で開示されたような担体特性を保持しているならば、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸によって互いに分離されていてよい。
【００８６】
トラフィッキング配列の断片を分離させるこれらのアミノ酸は、例えば、トラフィッキング配列とは異なるアミノ酸配列から選択されていてよい。あるいは、第１のドメインは、１つ以上の成分から構成されるトラフィッキング配列を含んでいてよく、各成分は、それぞれ、第２のドメインのカーゴＪＮＫ阻害剤配列を、例えば、特定の細胞の区画に輸送する機能を有している。
【００８７】
上記で規定されたトラフィッキング配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれらの組み合わせから構成されていてよい。好ましくは、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含んでいてよい。ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、ＪＮＫトラフィッキング配列内に、ブロック状、非ブロック状、または、これらが交互になった状態で配置されていてよい。
【００８８】
他の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、Ｌ−アミノ酸のみから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、上述の、少なくとも１つの「ネイティブ」トラフィッキング配列を含むか、またはこれから構成されている。これに関して、「ネイティブ」という用語は、全体的にＬ−アミノ酸から構成された変換されていないトラフィッキング配列を指す。
【００８９】
他の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、Ｄ−アミノ酸のみから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、上記で示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含んでいてよい。
【００９０】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインのトラフィッキング配列は、自然発生的な源から得られるか、または、遺伝子工学技術または化学合成法（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）を用いて生成可能である。
【００９１】
第１のドメインのトラフィッキング配列には、例えば、天然蛋白質、例えばＴＡＴ蛋白質（例えば米国特許第５，８０４，６０４号および第５，６７４，９８０号に記載されている。これらの文献を、引用することによって本願に援用する）、ＶＰ２２（ＷＯ第９７／０５２６５号；Elliott and O'Hare, Cell 88  223-233 (1997) に記載されている）、非−ウイルス蛋白質（Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89  10691-10695 (1992)）を含むソースを用いてもよい。
【００９２】
トラフィッキング配列は、アンテナぺディア（例えば、アンテナぺディア担体配列）に由来するか、または基本ペプチド（例えば、５〜１５個の長さのアミノ酸、好ましくは１０〜１２個の長さのアミノ酸を有すると共に、少なくとも８０％、より好ましくは、８５％、またはさらに９０％の基本アミノ酸に由来する。
【００９３】
上記基本アミノ酸は、例えばアルギニン、リジン、および／または、ヒスチジンを含むペプチドである）。さらに、トラフィッキング配列として用いられる１つの天然蛋白質の改変体、改変体、断片、および誘導体を以下に開示する。改変体、断片、および誘導体に関しては、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列について記載した規定を参照されたい。これに応じて、改変体、断片、および誘導体は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上記したように規定される。特に、トラフィッキング配列では、改変体または断片または誘導体は、上記で規定されたトラフィッキング配列として用いられる１つの天然蛋白質と、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列として規定され得る。
【００９４】
本明細書において使用されるキメラペプチドの好ましい一実施形態では、第１のドメインのトラフィッキング配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴ蛋白質に由来する配列、特に、ＴＡＴ蛋白質を構成する８６アミノ酸のうちの幾つかまたは全てを含むか、またはこれから構成されている。
【００９５】
（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列では、ＴＡＴ蛋白質の機能的に有効な断片を形成する、すなわち、細胞内への侵入および取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドを形成する、全長ＴＡＴ蛋白質の部分配列が用いられ得る。このような配列がＴＡＴ蛋白質の機能的に効果的な断片であるかどうかについては、公知の技術（例えば、Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86  7397-7401 (1989)を参照）を用いて決定可能である。
【００９６】
従って、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインにおけるトラフィッキング配列は、ＴＡＴ蛋白質配列の機能的に有効な断片または一部に由来していてよい。この機能的に有効な断片または一部は、８６個よりも少ないアミノ酸を含み、細胞内への取り込み、および任意により、細胞核内への取り込みを示す。より好ましくは、担体として用いられ、キメラペプチドを、細胞膜を横切って浸透させることを媒介する、ＴＡＴの部分配列（断片）は、全長ＴＡＴの基本領域（アミノ酸４８〜５７個、または４９〜５７個）を含むように意図されている。
【００９７】
より好ましい一実施形態によれば、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、ＴＡＴ残基４８〜５７または４９〜５７、および最も好ましくはジェネリックＴＡＴ配列ＮＨ2−Ｘnb−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｌ−ジェネリック−ＴＡＴ（ｓ））［配列番号７］、および／または、ＸＸＸＸＲＫＫＲＲＱ  ＲＲＲＸＸＸＸ（Ｌ−ジェネリック−ＴＡＴ）［配列番号２１］を含むアミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００９８】
ここで、ＸまたはＸnbは、上記で規定された通りである。さらに、配列番号８の残基「Ｘnb」の数は、示されている数に制限されず、上述のように変動し得る。あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれるトラフィッキング配列は、アミノ酸配列ＮＨ2−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ）［配列番号５］を含むペプチドを含むか、またはこれから構成され得る。
【００９９】
他のより好ましい一実施形態によれば、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、上記に示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含むことが可能であり、すなわち、配列ＮＨ2−Ｘnb−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｄ−ジェネリック−ＴＡＴ（ｓ））［配列番号８］、および／または、ＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸ（Ｄ−ジェネリック−ＴＡＴ）［配列番号２２］を有するジェネリックＴＡＴ配列のＤレトロ−インベルソ配列を含むことが可能である。ここでも、Ｘnbは上記で規定された通りである（好ましくはＤアミノ酸を示す）。さらに、配列番号８内の残基「Ｘnb」の数は、示されている数に制限されず、上述のように変動し得る。最も好ましくは、本明細書において使用されるトラフィッキング配列は、Ｄレトロ−インベルソ配列ＮＨ2−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ）［配列番号６］を含んでいてよい。
【０１００】
他の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれるトラフィッキング配列は、上記で規定されたトラフィッキング配列の改変体を含むか、またはこれから構成されていてよい。「トラフィッキング配列の改変体」は、好ましくは、上記で規定されたトラフィッキング配列に由来する配列であり、ここで改変体は、上記で規定されたトラフィッキング配列内に存在する少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含む。修飾の例には、付加、（断片を導く）（内部）削除、および／または、置換が含まれる。このような修飾は、アミノ酸の、典型的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは１〜５個の、置換、付加、および／または、削除を含む。さらに、改変体は、好ましくは、上記で規定されたトラフィッキング配列、より好ましくは配列番号５〜８、または２１〜２２のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列相同性を示す。
【０１０１】
好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる、このようなトラフィッキング配列の修飾は、安定性が増大された、または、低減されたトラフィッキング配列を導く。あるいは、トラフィッキング配列の改変体は、本明細書において使用されるキメラペプチドの細胞内の局在化を調節するように設計されていてよい。
【０１０２】
外因的に付加される場合、上記で規定されたこのような改変体は、典型的には、トラフィッキング配列の細胞の中に侵入すむという性能が保持されるように（すなわち、トラフィッキング配列の改変体の細胞内への取り込みは、トラフィッキング配列として用いられるネイティブ蛋白質の取り込みとほぼ類似するように）設計されている。
【０１０３】
例えば、核局在化にとって重要であると考えられていた基本領域の変換（例えば、Dang and Lee, J. Biol. Chem. 264  18019-18023 (1989); Hauber et al., J. Virol. 63  1181-1187 (1989) ; et al., J. Virol. 63  1-8 (1989)を参照）は、結果的に、トラフィッキング配列の、従って本明細書において使用されるキメラペプチドの成分としてのＪＮＫ阻害剤配列の、細胞質位置または部分的な細胞質位置を生じさせ得る。これに加えて、例えばコレステロールまたは他の脂質成分をトラフィッキング配列に連結させて、膜可溶性が高いトラフィッキング配列を生成することによって、さらなる修飾を改変体内に導入することも可能である。
【０１０４】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれるトラフィッキング配列の、上記に開示した改変体のいずれかは、典型的には当業者に公知の技術を用いて生成可能である（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。
【０１０５】
第２のドメインとして、本明細書において使用されるキメラペプチドは、典型的には、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列のいずれかから選択されたＪＮＫ阻害剤配列（これらのＪＮＫ阻害剤配列の改変体、断片、および／または、誘導体を含む）を含む。
【０１０６】
両方のドメイン、すなわち、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインおよび第２のドメインは、機能ユニットを形成するように連結され得る。第１のドメインと第２のドメインとを連結する、当該技術分野において公知の任意の方法を用いてもよい。
【０１０７】
一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインおよび第２のドメインは、共有結合によって連結されていることが好ましい。本明細書において規定される共有結合は、例えば、上記で規定されたキメラペプチドを、融合蛋白質として発現することによって得られるペプチド結合であってよい。ここに記載される融合蛋白質は、以下に説明する標準的な組み換えＤＮＡ技術と同様の方法、または該技術から容易に適合可能な方法で、形成および使用可能である。しかしながら、両方のドメインは、側鎖を介して連結されていてもよいし、または、化学的リンカー成分によって連結されていてもよい。
【０１０８】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインおよび／または第２のドメインは、該キメラペプチド内の１つ以上のコピーにおいて生じ得る。両方のドメインが単一のコピーで存在するならば、第１のドメインは、第２のドメインのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに連結されていてよい。多数のコピーで存在するならば、第１のドメインおよび第２のドメインは、可能な任意の順番に配置されていてよい。
【０１０９】
例えば、第１のドメインは、本明細書において使用されるキメラペプチド内に、多数のコピーの数で、例えば、２、３、またはそれ以上のコピーで、存在していてよい、これらのコピーは、連続する数で配置されていることが好ましい。その後、第２のドメインは、第１のドメインを含む配列のＮ−末端またはＣ末端において生じる単一のコピーで存在していてよい。
【０１１０】
あるいは、第２のドメインが、多数のコピーの数で、例えば、２、３、またはそれ以上のコピーで存在しており、第１のドメインが、単一のコピーで存在していてもよい。これらの両方の選択肢によれば、第１のドメインおよび第２のドメインは、連続した配置における任意の位置をとることが可能である。
【０１１１】
典型的な構成を以下に示す。例えば、第１のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン‐第２のドメイン、第１のドメイン‐第１のドメイン‐第２のドメイン‐第１のドメイン、第１のドメイン‐第２のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン、または、例えば、第２のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン。これらの例は説明のためであって、本発明の範囲がこれらの例に限定されるものではないことを、当業者は明確に理解できよう。従って、コピーおよび構成の数は、当初に規定したものとは変化し得る。
【０１１２】
好ましくは、第１のドメインおよび第２のドメインは、何らかのリンカー無しに互いに直接連結されていてもよい。あるいは、これらは、１〜１０、好ましくは１〜５のアミノ酸を含むリンカー配列を介して互いに連結されていてもよい。リンカー配列を形成するアミノ酸は、アミノ酸残基としてのグリシンまたはプロリンから選択されていることが好ましい。より好ましくは、第１のドメインおよび第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとの間の２つ、３つ、またはそれ以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離されていてよい。
【０１１３】
本明細書において使用される、上記で規定された少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれら両方の組み合わせから構成されていてよい。ここでは、各ドメイン（および用いられるリンカー）は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれら両方の組み合わせ（例えば、Ｄ−ＴＡＴとＬ−ＩＢ１との組み合わせ、または、Ｌ−ＴＡＴとＤ−ＩＢ１との組み合わせなど）から構成されていてよい。
【０１１４】
好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４、または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含んでいてよい。ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、本明細書において使用されるキメラペプチド内に、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で配置されていてよい。
【０１１５】
具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドは、ジェネリックＬ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ2−Ｘnb−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘnb−Ｘna−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ（ジェネリック）（ｓ））［配列番号１０］に記載のＬ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成されており、ここで、Ｘ、Ｘna、およびＸnbは、好ましくは、上記で規定された通りである。
【０１１６】
より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチドＮＨ2−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号９］を含むか、またはこれから構成される。選択的または追加的に、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＰＰＤＴＹＲＰＫＲＰ  ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ  ＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１）［配列番号２３］、または、ＸＸＸＸＸＸＸＲＫＫ  ＲＲＱＲＲＲＸＸＸＸ  ＸＸＸＸＲＰＴＴＬＸ  ＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ  Ｓ／ＴＸ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢジェネリック）［配列番号２４］を含むか、またはこれから構成されており、ここでも、Ｘは、好ましくは上記で規定された通りである。
【０１１７】
あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））［配列番号２７］、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸncＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））［配列番号２８］、または、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸncＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））［配列番号２９］を含むか、またはこれから構成される。
【０１１８】
これに関して、各Ｘは、典型的には、上記で規定されたアミノ酸残基を示し、より好ましくは、Ｘncは、ペプチド残基の連続したストレッチを示し（各Ｘは、互いに無関係に、グリシンまたはプロリンから選択されている）、例えば、単調なグリシンストレッチ、または単調なプロリンストレッチを示す。ここで、ｎ（Ｘncの繰り返しの数）は、典型的には、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、またはそれ以上、好ましくは０〜５または５〜１０である。Ｘncは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸を示す。
【０１１９】
他の具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドは、上記で開示されたＬ−アミノ酸キメラペプチドのＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成される。本発明に記載の典型的なＤレトロ−インベルソキメラペプチドは、例えば、ジェネリックＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ2−Ｘnb−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘna−Ｘnb−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（ジェネリック）（ｓ））［配列番号１２］である。ここで、Ｘ、Ｘna、およびＸnbは、好ましくは、上記で規定された通りである（好ましくは、Ｄアミノ酸を示す）。
【０１２０】
より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号１１］に記載のＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成される。選択的または追加的に、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１）［配列番号２５］、または、ＸＴ／ＳＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸＸＸＸＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸＸＸＸ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢジェネリック）［配列番号２６］を含むか、またはこれから構成されるか（ここでも、Ｘは、好ましくは、上記で規定された通りである）、または、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））［配列番号３０］、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸncＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））［配列番号３１］、または、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸncＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））［配列番号３２］を含むか、またはこれから構成される。Ｘncは、上記で規定された通りであってよい。
【０１２１】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインおよび第２のドメインは、当該技術において公知の好適な方法で行われる化学的または生化学的結合によって、互いに連結され得る。この化学的または生化学的結合の例には、第１のドメインと第２のドメインとの間にペプチド結合を形成すること、例えば第１のドメインおよび第２のドメインを、融合蛋白質として発現すること、または、例えば上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させることが挙げられる。
【０１２２】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを化学的に架橋させるために適した公知の多くの方法は、非特異的であり、すなわち、これらの方法は、結合点を、輸送ポリペプチドまたはカーゴ高分子上の任意の特定の部位に方向付けない。結果として、非特異的な架橋剤は、機能的部位に作用する、または、活性部位を立体的に遮断して、複合蛋白質を生物学的に不活性にする。したがって、第１のドメインと第２のドメインとをさらに特異的に結合することが可能な、このような架橋法を用いることが好ましい。
【０１２３】
これに関して、結合特異性を増大させる１つの方法は、架橋される第１のドメインおよび第２のドメインのいずれかまたは両方に、１回または数回だけ存在する官能基に、直接化学的に結合させることである。例えば、チオール基を含有する唯一の蛋白質アミノ酸であるシステインは、多くの蛋白質において数回だけ生じる。
【０１２４】
また、例えば、ポリペプチドが、リジン残基を含まない場合、第一級アミンに特異的な架橋剤は、このポリペプチドのアミノ末端にとって選択的であろう。結合特異性を増大させるためにこの方法の使用を成功させるには、ポリペプチドが、分子の生物活性を損なうことなく変更させることが可能な分子の領域において、好適な程度の稀な且つ反応性残基を有していることが求められる。
【０１２５】
システイン残基は、システイン残基が架橋反応に関与すると生物活性を妨げる傾向があるポリペプチド配列の一部に生じた場合には、置き換えてもよい。システイン残基を置き換える場合、典型的には、ポリペプチドの折り畳みに結果として生じる変化を最小化することが望ましい。
【０１２６】
ポリペプチドの折り畳みにおける変化は、この置き換えがシステインに化学的且つ立体的に類似している場合に、最小化される。こういった理由のため、システインの代替としては、セリンが好ましい。以下の実施例において示すように、システイン残基を、架橋のために、ポリペプチドのアミノ酸配列の中に導入する。システイン残基の導入には、アミノ末端若しくはカルボキシ末端における導入、または、アミノ末端若しくはカルボキシ末端の近傍への導入が好ましい。従来の方法は、このようなアミノ酸配列修飾の場合に利用可能であり、ここで、対象となるポリペプチドは、組換えＤＮＡの化学合成または発現によって、生成される。
【０１２７】
本明細書において使用される、上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの結合は、カップリング剤または接合剤によって行うことも可能である。利用可能な分子間架橋剤が幾つか存在する（例えば、Means and Feeney, CHAMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43を参照）。これらの分子間架橋剤には、例えば、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（これらは両方とも、スルフヒドリル基に特異的であり、不可逆リンケージを形成する）や、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または他の、６〜１１の（スルフヒドリル基に比較的特異的である）炭素メチレンブリッジを有する架橋剤、および、（アミノ基およびチロシン基を有する不可逆リンケージを形成する）１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンが挙げられる。
【０１２８】
このために利用可能な他の架橋剤には、アミノ基およびフェノール基を有する不可逆性のクロスリンケージを形成するｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン）、（アミノ基に特異的な）アジプイミド酸ジメチル、（主にアミノ基と反応する）フェノール−１，４ジスルホニル塩素、ヘキサメチレンジイソシアン酸塩、若しくはジイソチオシアン酸塩、または、（主にアミノ基と反応する）アゾフェニル−ｐ−ジイソシアン酸塩、（幾つかの種々な側鎖と反応する）グルタルアルデヒド、および（チロシンおよびヒスチジンと主に反応する）ジスジアゾベンジジン（disdiazobenzidine）が含まれる。
【０１２９】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させるために用いられる架橋剤は、ホモ二機能性であってよく、すなわち、同じ反応をする２つの官能基を有している。好ましいホモ二機能性架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、マイルドな条件（ｐＨ６．５〜７．７）下でスルフヒドリル−含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含有する。これらの２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続されている。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチドを不可逆架橋させるために有効である。
【０１３０】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させるために用いられる架橋剤はまた、ヘテロ二機能性であってもよい。ヘテロ二機能性架橋剤は、２つの異なる官能基、例えば、アミン−反応基およびチオール−反応基を有している。これらの官能基は、遊離アミンを有する蛋白質と、チオールを有する蛋白質とを架橋させる。
【０１３１】
ヘテロ二機能性架橋剤の例には、サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（「ＭＢＳ」）、および、ＭＢＳに類似した拡大された鎖であるスクシニミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（「ＳＭＰＢ」）が挙げられる。これらのクロスリンカーのサクシニミジル基は、第一級アミンと反応し、チオール−反応マレイミドは、システイン残基のチオールとの共有結合を形成する。
【０１３２】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させるために好適な架橋剤は、水溶性が低い場合が多い。従って、その水溶性を改善するために、スルフォン酸塩基といった親水性の成分が架橋剤に添加される。これに関して、水溶性を改善するために改変された架橋剤の例は、スルフォン基−ＭＢＳおよびスルフォン基−ＳＭＣＣであり、これらを、本発明に従って用いてもよい。
【０１３３】
同様に、多くの架橋剤は、基本的には、細胞条件下では開裂不可能な接合を実現する。しかし、上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させることに特に適した幾つかの架橋剤は、細胞状態下で開裂させることが可能な、ジスルフィ供与体どの共有結合を含む。例えば、トラウト試薬（Traut's reagent）、ジチオビス（サクシニミジルプロピオン酸塩）（「ＤＳＰ」）、および、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（「ＳＰＤＰ」）が、公知の開裂可能なクロスリンカーである。開裂可能な架橋剤の使用は、カーゴ成分を標的細胞内に運搬した後に、輸送ポリペプチドから分離させることを可能にする。直接的なジスルフィドリンケージも利用可能である。
【０１３４】
上記で説明した架橋剤を含む多くの架橋剤が、市販されている。これらの使用のための詳細な取扱説明書は、これらの業者から容易に入手可能である。蛋白質架橋および接合調製に関して一般的に参照されるのは、「Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991)」である。
【０１３５】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを化学的に架橋させることは、スペーサーアームの使用を含む。スペーサーアームは、分子内たわみ性を提供するか、または、接合された成分間の分子内距離を調節し、これによって、生物活性を保持することを促進し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド成分の形をしていて良い。あるいは、スペーサーアームが、例えば「長鎖ＳＰＤＰ」内の、架橋剤の一部であってよい（Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H）。
【０１３６】
さらに、上記で開示された１つのキメラペプチドの改変体、断片、または誘導体をここで、用いてもよい。断片および改変体に関しては、一般に、ＪＮＫ阻害剤配列に関して記載した規定が参照される。
【０１３７】
特に、本発明の意味するところでは、「キメラペプチドの改変体」とは、好ましくは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、キメラ改変体は、本明細書において使用される、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載のキメラペプチドのアミノ酸変換を含む。このような変換は、典型的には、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載のアミノ酸の、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは１〜５個の置換、付加、および／または、（断片を導く）削除を含む。
【０１３８】
ここで、本明細書において使用される、変換されたキメラペプチドは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列と、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を示す。好ましくは、これらの改変体は、本明細書において使用されるキメラペプチドに含まれる第１のドメインおよび第２のドメインの生物活性を保持する。
【０１３９】
すなわち、上記で開示された第１のドメインのトラフィッキング活性と、第２のドメインの、ＪＮＫを結合するため、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化された転写因子の活性化を阻害するための活性とを保持する。
【０１４０】
従って、本明細書において使用されるキメラペプチドはまた、上記で開示されたキメラペプチドの断片、特に、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載のキメラペプチド配列の断片を含む。従って、本発明の意味するところにおいて、「キメラペプチドの断片」とは、好ましくは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、断片は、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む。この断片は、好ましくは、これらの配列のいずれかからのエピトープを特異的に認識することを十分に可能にすると共に、当該配列を細胞、核、またはさらなる所望の位置の中まで十分に輸送する程度の長さを含む。
【０１４１】
さらにより好ましくは、断片は、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの、４〜１８個、４〜１５個、または最も好ましくは４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。本明細書において使用されるキメラペプチドの断片はさらに、配列番号９９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載の任意の配列と、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列と規定され得る。
【０１４２】
最終的に、本明細書において使用されるキメラペプチドはまた、上記で開示されたキメラペプチドの誘導体、特に、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載のキメラペプチド配列の誘導体を含む。
【０１４３】
本発明はさらに、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で規定されたキメラペプチド、またはそれらの断片、改変体、若しくは誘導体をコードする核酸配列の、被験体における、上記に規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するための使用に関する。
【０１４４】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする好ましい好適な核酸は、典型的には、ヒトＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（ＡＦ０７４０９１）、ラットＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１０８９５９）、若しくはヒトＩＢ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２１８７７８）から、または、上記で規定された配列のうちのいずれかをコードする任意の核酸配列、すなわち、配列番号１〜２６に記載の任意の配列から、選択される。
【０１４５】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする核酸、または本明細書において使用されるキメラペプチドをコードする核酸は、当該技術分野において公知の任意の方法によって（例えば、配列の３’−末端および５’−末端にハイブリダイゼーション可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、および／または、所定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローン作成することによって）、得られる。
【０１４６】
さらに、本明細書には、ストリンジェントな条件において、上記で規定された（ネイティブ）ＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドのための適切な鎖コーディングとハイブリダイズする核酸配列も開示される。好ましくは、このような核酸配列は、特異的なハイブリダイゼーションを十分に可能にする長さを有する、少なくとも６つの（連続した）核酸を含む。より好ましくは、このような核酸配列は、６〜３８、さらにより好ましくは６〜３０、および最も好ましくは６〜２０または６〜１０の（連続した）核酸を含む。
【０１４７】
「ストリンジェントな条件」とは、配列に依存しており、異なる環境では異なることになる。該して、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける、特異的配列の熱融点（ＴＭ）よりも約５℃低く選択されていてよい。ＴＭは、標的配列の５０％が、完全に適合する試料にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩の濃度がｐＨ７において少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃である条件である。他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（特に、塩基組成、および相補鎖のサイズを含む）、有機溶媒の存在、および塩基の不適合の範囲に影響を与え得るので、任意のパラメータの絶対測定値よりも、パラメータの組み合わせがより重要である。
【０１４８】
「高ストリンジェンシー条件」とは、次のステップを含んでいてよい。例えば、ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡから構成される緩衝剤中で、６５℃で８時間から一晩にわたって前処理する。ステップ２では、上述の事前のハイブリダイゼーション混合物に、１００ｍｇ／ｍｌの変性されたサケの精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０6ｃｐｍの32Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを６５℃で４８時間ハイブリダイズする。
【０１４９】
ステップ３では、２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のフィコール、および０．０１％のＢＳＡを含む溶液において、フィルターを３７℃で１時間洗浄する。この後、０．１×ＳＳＣにおける洗浄を、５０℃で４５分間行う。ステップ４では、フィルターを、オートラジオグラフィーに曝す。高ストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において公知である（例えば、Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NYを参照）。
【０１５０】
「中程度のストリンジェンシー条件」とは、次のステップを含んでいてよい。ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、および１００ｍｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、５５℃で６時間前処理する。ステップ２では、同じ溶液に、５〜２０×１０6ｃｐｍ32Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを５５℃で１８〜２０時間ハイブリダイズする。
【０１５１】
ステップ３では、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む溶液において、フィルターを３７℃で１時間洗浄し、その後、１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液において６０℃で３０分間洗浄することを、２回行う。ステップ４では、フィルターをドライブロッティングして、オートラジオグラフィーに曝す。中程度のストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において公知である（例えば、「Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY」を参照）。
【０１５２】
最後に、「低ストリンジェンシー条件」には、次のステップを含むことが可能である。ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液において、４０℃で６時間前処理する。ステップ２では、同じ溶液に、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（wt/vol）の硫酸デキストラン、および５〜２０×１０６ｃｐｍ32Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイズする。
【０１５３】
ステップ３では、フィルターを、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＳＤＳを含む溶液において、５５℃で１．５時間洗浄する。この洗浄溶液を、新鮮な溶液と置き換え、６０℃においてさらに１．５時間培養する。ステップ４では、フィルターをドライブロッティングして、オートラジオグラフィーに曝す。必要に応じて、フィルターを６５〜６８℃で３回洗浄して、フィルムに再び曝す。低ストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において公知である（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられるような条件）。例えば「Ausubel et al., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY」を参照されたい。
【０１５４】
上記で規定された本発明に係る核酸配列を用いて、ペプチドを発現させることが可能である。すなわち、上記で規定された本発明に係る核酸配列を用いて、分析、特徴づけ、または治療上の使用のために本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列または本明細書において使用されるキメラペプチドを、（本明細書において使用される）対応するペプチドが（組織分化若しくは発生の構成的または特別な段階、または疾患状態において）好ましくは発現される組織用のマーカーとして発現させることが可能である。これらの核酸の他の使用には、例えば、核酸のゲル電気泳動−ベースの分析における分子量マーカーとしての使用が含まれる。
【０１５５】
本発明のさらなる一実施形態によれば、上記で規定された、１つ以上のＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの組み換え型に発現させるという上述の目的のために、発現ベクターを用いてもよい。「発現ベクター」という用語は、本明細書では、二本鎖または一本鎖である、環状または線形のＤＮＡまたはＲＮＡを示すために用いられる。発現ベクターはさらに、宿主細胞または単細胞または多細胞宿主生物内に移転される、上記で規定された少なくとも１つの核酸を含む。本明細書において使用される発現ベクターは、好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列またはその断片若しくは改変体、あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチド、または、その断片若しくは改変体をコードする、上記で規定された核酸を含む。
【０１５６】
さらに、本発明に係る発現ベクターは、好ましくは、種々な調整要素を含む、発現を支援するための適切な要素を有している。これらの種々な調整要素の例には、ウイルス源、細菌源、植物源、哺乳類の源、および、宿主細胞内に挿入されたポリヌクレオチドの発現を始動する他の真核細胞の源からのエンハンサー／プロモーターが挙げられる。これらの要素の例には、インスレータ、境界素子（boundary elements）、ＬＣＲ（例えば、Blackwood and Kadonaga (1998), Science 281, 61-63によって記載されている）、または、マトリクス／スカフォード結合領域（例えば、Li, Harju and Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408によって記載されている）などが挙げられる。
【０１５７】
幾つかの実施形態では、調整要素は、異種要素である（すなわち、ネイティブ遺伝子プロモーターではない）。あるいは、遺伝子および／または該遺伝子に挟まれた領域のネイティブプロモーターによって、必要な転写信号および翻訳信号が、供給されてもよい。
【０１５８】
「プロモーター」という用語は、本明細書における使用では、ＤＮＡの領域であって、上記で規定された１つ以上の核酸配列の転写を制御するように機能すると共に、ＤＮＡ−依存性のＲＮＡ−ポリメラーゼの結合部位の存在、および、プロモーターの機能を調整するために相互作用する他のＤＮＡ配列の存在によって、構造的に特定される領域を指す。機能的な発現を促進するプロモーターの断片は、プロモーターとしての活性を保持する、短縮された、または、省略されたプロモーター配列である。プロモーター活性は、当該技術分野において公知の任意のアッセイ（例えば、Wood, de Wet, Dewji, and DeLuca, (1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596;  Seliger and McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141）、または市販のPromega（登録商標）によって測定可能である）。
【０１５９】
ここに規定された発現ベクターにおいて使用される「エンハンサー領域」とは、典型的には、１つ以上の遺伝子の転写を増加させるように機能する、ＤＮＡの領域を指す。より詳細に言うと、「エンハンサー」という用語は、本明細書における使用では、遺伝子の発現を、その位置および方向に無関係に、発現される遺伝子に対して、促進、増大、改善、または、向上させるＤＮＡ調整要素であり、１つ以上のプロモーターの発現を促進、増大、改善、または、向上させることであり得る。
【０１６０】
ここに規定される発現ベクターにおいて使用されるプロモーター／エンハンサー配列は、植物、動物、昆虫、または、菌類の調整配列を利用していてよい。例えば、酵母および他の菌類（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）からの、プロモーター／エンハンサー要素を用いてもよい。選択的または追加的に、これらは、動物の転写調節領域を含んでいてよい。
【０１６１】
動物の転写調節領域の例には、（ｉ）膵臓ベータ細胞の内部において活性のインスリン遺伝子制御領域（例えば、Hanahan, et al., 1985. Nature 315 115-122を参照）、（ii）リンパ球様細胞の内部において活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Grosschedl, et al., 1984, 細胞 38  647-658を参照）、（iii）肝臓の内部において活性のアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1 268-276を参照）、（iv）脳希突起膠細胞の内部において活性のミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域（例えば、Readhead, et al., 1987, Cell 48 703-712を参照）、および、（ｖ）視床下部の内部において活性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Mason, et al., 1986, Science 234 1372-1378を参照）が挙げられる。
【０１６２】
さらに、本明細書において規定される発現ベクターは、増幅マーカーを含んでいてよい。この増幅マーカーは、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、およびＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸塩耐性（ＣＡＤ）から成る群から選択され得る。
【０１６３】
本発明に適した典型的な発現ベクターまたはその誘導体には、特に、例えば、ヒトまたは動物のウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）、昆虫ウイルス（例えばバキュロウイルス）、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダファージ）、プラスミドベクター、およびコスミドベクターが含まれる。
【０１６４】
本発明はさらに、上記で規定された核酸の配列をコーディングするペプチドを発現することが可能な、種々な宿主ベクター系を利用してよい。これらの宿主ベクター系には、（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳類細胞系、（ii）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系、（iii）酵母ベクターを含有する酵母、または（iv）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリアが含まれるが、これらに限定されない。利用される宿主ベクター系に応じて、多数の好適な転写要素および翻訳要素のうちの任意の１つを用いてよい。
【０１６５】
このような宿主ベクター系に適した宿主細胞株であって、対象となる挿入された配列の発現を調節する宿主細胞株、または、該配列が特定の所望の方法でコードした、発現されたペプチドを変更若しくは処理する宿主細胞株が、選択されることが好ましい。さらに、特定のプロモーターからの発現は、選択された宿主株において、特定の誘発因子の存在下で強化され、従って、遺伝子工学により生産されたペプチドの発現の制御を促進することが可能である。
【０１６６】
さらに、種々な宿主細胞は、発現されたペプチドの翻訳処理およびポスト翻訳処理、並びに修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化など）の特性および特別のメカニズムを有している。従って、外来ペプチドの所望の修飾および処理を確実に行うために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。例えば、バクテリア系内のペプチド発現を用いて、グリコシル化されていないコアペプチドを生成することが可能である。その一方で、哺乳類細胞の内部における発現は、異種のペプチドの「ネイティブ」グリコシル化を確実に行う。
【０１６７】
本発明は、さらに、上述のＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに対する抗体を、本明細書において規定されるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するために使用することを提供する。さらに、本発明に係るＪＮＫ阻害剤配列に特異的、またはこのような阻害剤配列を含むキメラペプチドに特異的な抗体を生成するために有効な手段が記載され、この目的のために用いられる。
【０１６８】
本発明によれば、本明細書において規定された、ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、並びに、その断片、改変体、または誘導体を、これらのペプチド成分を免疫特異的に結合させる抗体を生成するイムノゲンとして利用してもよい。このような抗体には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。具体的な一実施形態では、本発明は、上記で規定された、キメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列に対する抗体を提供する。これらの抗体の製造には、当該技術分野で公知の種々な方法を用いてよい。
【０１６９】
一例として、上記で規定されたキメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列を注射することによって、種々な宿主動物に、ポリクローナル抗体を生成するための免疫性を与えることが可能である。この際に、免疫応答を向上させるために、種々な補佐剤を用いることが可能である。
【０１７０】
補佐剤には、フロインドアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ＣｐＧ、ポリマー、プルロニック、および、ヒト補佐剤（例えばカルメットゲラン杆菌およびコリネバクテリウムパルヴム）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
上記で規定されたメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列に対するモノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養によって抗体分子の生成を提供する、任意の技術を利用してよい。このような技術には、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, 1975. Nature 256 495-497を参照）、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983, Immunol Today 4 72を参照）、および、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985. In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７２】
ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用可能であり、ヒトハイブリドーマの使用によって（Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80 2026-2030を参照)、または、ヒトＢ−細胞をエプスタイン-バーウイルスによってインビトロで形質転換することによって（Cole, et al.,1985. In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照））生成可能である。
【０１７３】
本発明によれば、本明細書において規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに特異的な一本鎖抗体を生成するための技術を採用してもよい（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーを構成するための方法（例えば、Huse et al., 1989. Science 246 1275-1281を参照）を採用して、これらのＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドにとって所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ効率のよい識別を可能にすることもできる。
【０１７４】
非−ヒト抗体を当該技術分野において公知の技術によって、「ヒト化」してもよい（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照）。本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに対してイディオタイプを含有する抗体断片を、当該技術分野において公知の技術によって生成してもよい。
【０１７５】
この抗体断片の例には、（ｉ）抗体分子をペプシン消化することによって生成されるＦ（ａｂ’）2断片、（ii）Ｆ（ａｂ’）2断片のジスルフィドブリッジを減少させることによって生成されるＦａｂ断片、（iii）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片、および、（iv）Ｆｖ断片が挙げられる。
【０１７６】
本発明の一実施形態では、抗体をスクリーニングするために用いられる方法であって、所望の特異性を有する方法には、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、および他の、当該技術分野において公知の免疫媒介性技術が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７７】
具体的な一実施形態では、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド（例えば、典型的には５〜２０個、好ましくは８〜１８個、および最も好ましくは８〜１１個のアミノ酸の長さを含むその断片）の特定のエピトープに対して特異的な抗体の選択は、このようなエピトープを有する、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの断片に結合させるハイブリドーマの生成によって促進される。上記で規定されたエピトープに特異的なこれらの抗体も、本明細書において提供される。
【０１７８】
ここで規定される抗体を、ＪＮＫ阻害剤配列（および／または、これに対応して、上記で規定されたキメラペプチド）の局在化および／または数量化に関する当該技術分野で公知の方法において、用いてもよい。これは、例えば、適切な生理学的試料内のペプチドの量を測定するため、診断方法における使用のため、または、ペプチドを造影するための使用のためである。
【０１７９】
本発明に従って規定される、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、および／または、抗体は、本明細書において規定される疾患のうちのいずれかの予防または治療のため、特に、本明細書において規定されるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の予防または治療のために適用され得る薬剤組成物に製剤可能である。
【０１８０】
典型的には、このような本発明に従って用いられる薬剤組成物は、次の有効成分を１つ含む。すなわち、（ｉ）任意の１つ以上の、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体、断片、若しくは誘導体、特に、配列番号１〜４および１３〜２０および３３〜１００の配列のうちのいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上記の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、および／または、（ii）上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体若しくは断片をコードする核酸、および／または、（iii）上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体、断片、若しくは誘導体を任意で１つ以上含む細胞、および／または、（iv）上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体若しくは断片をコードする、ベクター、および／または、核酸でトランスフェクトされた細胞、を含む。
【０１８１】
好ましい一実施形態によれば、このような、本発明に従って使用される薬剤組成物は、典型的には、安全且つ有効な量の、上記で規定された成分を含む。この成分は、好ましくは、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上記の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、または、これをコードする少なくとも１つの核酸、または、上記で規定された、少なくとも１つのベクター、宿主細胞、若しくは抗体の成分である。
【０１８２】
本発明の発明者は、本明細書においてそれぞれ規定されるＪＮＫ−阻害剤配列およびキメラペプチドが、本発明の疾患に関連する細胞内への特に良好な取り込み率を示すことを、さらに発見した。従って、被験体に投与される薬剤組成物内の、各ＪＮＫ−阻害剤配列およびキメラペプチドの量は、非常に低い投与量である（これに限定されない）。このため、投与量は、当該技術分野において公知のペプチド薬剤、例えばＤＴＳ−１０８（Florence Meyer-Losic et al., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53）よりも大幅に低い。これは、例えば、潜在的な副作用の低減、および、費用の低減といった、幾つかの有利な面を有している。
【０１８３】
好ましくは、この投与量（ｋｇ体重当たり）は、１０ｍｍｏｌ／ｋｇ未満、好ましくは１ｍｍｏｌ／ｋｇ未満、より好ましくは１００μｍｏｌ／ｋｇ未満、さらにより好ましくは１０μｍｏｌ／ｋｇ未満、さらにより好ましくは１μｍｏｌ／ｋｇ未満、さらにより好ましくは１００ｎｍｏｌ／ｋｇ未満、最も好ましくは５０ｎｍｏｌ／ｋｇ未満の範囲内である。
【０１８４】
従って、この投与量の範囲は、好ましくは、約１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、またはこれらの値のうちの任意の２つの値の組み合わせであってよい。
【０１８５】
これに関して、上述の薬剤組成物を用いる場合の、治療の処方、例えば投薬量の決定などは、典型的には、一般開業医や他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療される疾患、個々の患者の状態、送達の部位、投与方法、および、開業医に公知の他の要因が考慮される。上述の技術および説明は、例えば、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980」に見出すことが可能である。
【０１８６】
従って、本発明に従って使用される、上記で規定された薬剤組成物の成分の「安全且つ有効な量」とは、これらの各または全ての成分の、本明細書において規定されるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の良好な緩和を誘発するのに十分な量を意味する。しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、深刻な副作用を回避するために十分に少ない量であり、すなわち、利点と危険との間の実用的な関係を許可する量である。
【０１８７】
これらの限度の決定は、典型的には、実用的な医学的判断の範囲内にある。このような成分の「安全且つ有効な量」は、治療される特定の病状、治療される患者の年齢および健康状態、病状の重篤度、治療の期間、用いられる特定の薬学的に許容され得る担体に伴う治療法の性質、および、担当する医師の知識および経験の範囲内である類似の要因に関連して変動する。本発明に係る薬剤組成物は、本発明に従って、ヒト医学目的およびまた獣医目的に用いることが可能である。
【０１８８】
本発明に従って用いられる薬剤組成物は、さらに、これらの成分のうちの１つに加えて、（適合性の）薬学的に許容され得る担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、または、当業者に公知の他の材料を含む。
【０１８９】
これに関して、「（適合性の）薬学的に許容され得る担体」という表現は、好ましくは、液体または非液体ベースの組成物を含む。「適合性の」という用語は、本明細書において使用される薬剤組成物の構成物質が、上記で規定された薬学的に有効な成分、および他の成分と混合されることが可能であり、この際に、通常の使用条件下で薬学的有効性を実質的に低減する相互作用が生じないことを意味している。薬学的に許容され得る担体は、治療されるヒトへの投与に適したようにするには、当然ながら、純度が十分に高く、且つ、毒性が十分に低くなければならない。
【０１９０】
本明細書において使用される薬剤組成物が、液体の形で提供されるならば、薬学的に許容され得る担体は典型的には、１つ以上の（適合性の）薬学的に許容され得る液体担体を含む。この組成物は、（適合性の）薬学的に許容され得る液体担体として、例えば、パイロジェンフリー水、等張食塩水または緩衝化（水）溶液（例えばリン酸塩、クエン酸塩など、緩衝化溶液、植物油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびシオブローマからの油））、ポリオール（例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）、アルギン酸などを含んでいてよい。特に、本明細書において使用される薬剤組成物を注射する場合、緩衝剤、好ましくは水性緩衝液を用いてもよい。
【０１９１】
本明細書において使用される薬剤組成物が固形に提供されるならば、薬学的に許容され得る担体は、典型的には、１つ以上の（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体を含む。この組成物は、（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体として、例えば、１つ以上の適合性の固形を含んでもよいし、または、液体の充填剤若しくは希釈剤若しくはカプセルに包まれた化合物を用いてもよい。このカプセルに包まれた化合物は、ヒトへの投与に適している。
【０１９２】
このような（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体の幾つかの例は、例えば、糖質（例えば、ラクトース、グルコース、およびサッカロース）、でんぷん（例えば、コーンスターチまたはジャガイモでんぷん）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース）、粉状のトラガカント、モルト、ゼラチン、獣脂、固体の滑沢剤（glidant）（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム）、硫酸カルシウムなどが挙げられる。
【０１９３】
（適合性の）薬学的に許容され得る担体または他の材料の正確な特性は、投与経路に依存している。従って、（適合性の）薬学的に許容され得る担体の選択は、原則的に、本発明に従って用いられる薬剤組成物が投与される方法によって決定される。本発明に従って用いられる薬剤組成物は、例えば、全身的に投与され得る。投与経路には、例えば、（例えば注射を介した）非経口経路（例えば静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、または、経皮経路など）、経腸経路（例えば、経口または直腸経路など）、局所用経路（例えば経鼻、または鼻腔内経路など）、または他の経路（例えば表皮経路、またはパッチ送達）が含まれる。
【０１９４】
用いられる薬剤組成物の好適な量を、動物モデルを用いた一般的な実験によって決定することが可能である。このようなモデルには、うさぎ、ひつじ、マウス、ラット、イヌ、および非ヒトの霊長類モデルが含まれるが、これらに限定されることを意図するものではない。
【０１９５】
注射のための好ましい単位投与量の形態は、殺菌水溶液、生理食塩水、またはこれらの混合物が含まれる。このような溶液のｐＨは、約７．４に調節されている必要がある。注射のための好適な担体には、ヒドロゲル、制御された放出または遅延された放出のための装置、ポリ乳酸、およびコラーゲンマトリクスが含まれる。
【０１９６】
局所的に適用するために好適な薬学的に許容され得る担体には、ローション、クリーム、ゲルなどにおける使用に適した担体が含まれる。化合物が、経口的に投与されるならば、錠剤、カプセルなどが、好ましい単位剤形である。経口投与に使用可能な、単位投剤形の調製のための薬学的に許容され得る担体は、従来技術において公知である。この担体の選択は、味、費用、および貯蔵性などの二次的な検討条件によって決定される。この選択は、本発明の目的には重要ではなく、当業者が容易に選択することが可能である。
【０１９７】
経口投与用の薬剤組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液体状であってよい。錠剤は、上記で規定された固形の担体、例えばゼラチン、および、任意により補佐剤を含んでいてよい。経口投与用の液状薬剤組成物は、一般的には、上記で規定された液体担体、例えば水、石油、および、動物油若しくは植物油、鉱物油、または、合成油を含んでいてよい。生理食塩水溶液、デキストロース若しくは他の糖類溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）が含まれていてもよい。
【０１９８】
静脈内、皮膚若しくは皮下注射、または、苦痛を有する部位への注射の場合、有効成分は、非経口的に受容可能な水溶液の形をしており、この水溶液は、パイロジェンフリーであると共に、好適なｐＨ、等張性、および安定度を有している。当業者は、好適な溶液を、例えば、等張性ビヒクル（例えば生食注射、リンガー液、乳酸加リンガー液）を用いて、調製可能である。
【０１９９】
必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、および／または、他の添加物が含まれていてもよい。個体に供給されるものが、ポリペプチド、ペプチドであろうと、本発明に係る薬学的に有効な他の化合物である核酸分子であろうと、投与は、好ましくは「予防的に有効な量」、または、「治療的に有効な量」（場合によっては）である。この量は、個体に対する有効性を示すために十分な量である。投与される実際の量、および、投与の速度および時間的経過は、治療されるものの性質および重篤度によって決定される。
【０２００】
本明細書において規定される疾患の予防および／または治療には、典型的には、上記で規定された薬剤組成物の投与が含まれる。「調節」という用語は、上述の疾患のいずれかが過剰に発現した時に、ＪＮＫの発現を抑制することを含む。「調節」という用語はまた、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上記の規定に範囲内におけるその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列を、自然なｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＮＦＡＴ４結合部位の競合阻害剤として細胞内で用いることによって、上述の疾患のいずれかにおいて、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４のリン酸化を抑制することを含む。
【０２０１】
「調節」という用語は、また、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４、およびそれらの関連するパートナーから構成される（これらに限定されない）転写因子のヘテロ−複合体およびホモ−複合体の抑制を含む。関連するパートナーの例には、ｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２、およびｃ−ｆｏｓから構成されるＡＰ−１複合体が挙げられる。
【０２０２】
上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害が、ＪＮＫ過剰発現と関連付けられる場合、このような抑制力のあるＪＮＫ阻害剤配列を、細胞内に導入することが可能である。この場合、「調節」は、例えば、ＩＢペプチド特異的抗体の使用により、ＩＢ−ペプチドがＪＮＫに結合することを阻止して、これによって、ＩＢ−関連ペプチドによるＪＮＫ阻害を回避することによって、ＪＮＫ発現を増加させることを含む。
【０２０３】
被験体を、上記で開示された薬剤組成物で予防および／または治療することは、典型的には、一定の（「治療的に有効な」）量の上記薬剤組成物を被験体に投与する（インビボ）ことによって実現され得る。ここで、被験体とは、例えば任意の、哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、または豚であってよい。「治療的に有効な」という用語は、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を十分に改善する、薬剤組成物の有効成分の量を指す。
【０２０４】
従って、上記で規定されたような任意のペプチド、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２に記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列を、本発明の具体的な一実施形態において用いて、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を、例えば、活性化されたＪＮＫシグナル経路を調節することにより、治療することが可能である。
【０２０５】
しかしながら、上記で規定されたペプチドは、また、核酸によってコードされていてよく、その後、例えば遺伝子療法における使用のために、本発明に係る薬剤組成物の一部を形成することが可能である。ここで、遺伝子療法とは、上記で規定された特異的な核酸を、例えば上記で規定された薬剤組成物を用いて、被験体に投与することによって行われる療法を指す。ここで、核酸は、Ｌ−アミノ酸だけを含む。本発明の本実施形態では、核酸は、コードされたペプチドを生成し、該コードされたペプチドは、その後、疾患または障害を調節する機能によって、治療効果を発揮するように機能する。本発明の実施においては、当該技術分野において利用可能な遺伝子療法に関する任意の方法（例えば、Goldspiel, et al., 1993. Clin Pharm 12 488-505を参照）を用いてよい。
【０２０６】
好ましい一実施形態では、遺伝子療法に用いられる、上記で規定された核酸は、好適な宿主内の、上記で規定された任意の１つ以上のＩＢ−関連ペプチドをコードすると共に発現する発現ベクターの一部である。上記で規定された任意の１つ以上のＩＢ−関連ペプチドとは、すなわち、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列である。具体的な一実施形態では、このような発現ベクターは、ＪＮＫ阻害剤配列のコーディング領域に動作可能に連結されたプロモーターを有している。このプロモーターは、上述のように、例えば、誘導的または構成的、および、任意により組織特異的であると規定され得る。
【０２０７】
具体的な一実施形態では、上記で規定されたような核酸分子が、遺伝子療法に用いられる。ここでは、上記で規定された核酸分子のコーディング配列（およびその、任意の他の所望の配列）が、ゲノム内の所望の部位において相同的組み換えを促進し、これらの核酸の染色体内発現を提供する領域によって挟まれている（例えば、Koller and Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86 8932-8935を参照）。
【０２０８】
本発明によれば、上記で規定された核酸を、遺伝子療法のために、特にここでは、上述の、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の遺伝子療法のために、患者の中に送達することは、直接的（すなわち、患者が核酸、または核酸−含有ベクターに直接曝される）であってもよいし、または、間接的（すなわち、最初に、核酸によって細胞をインビトロで形質転換させ、その後、患者に移植する）であってもよい。これら２つの方法は、それぞれ、インビボ遺伝子療法、または生体外遺伝子療法として公知である。本発明の具体的な一実施形態では、核酸を、直接インビボで投与する。ここで、核酸は、コードされた産生物を生成するために、発現する。これは、当該技術分野において公知の多数の方法のうちのいずれかによって実現され得る。
【０２０９】
これらの公知の方法には、例えば、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構成する方法、および、細胞内に来るように核酸を投与する方法（例えば、欠損若しくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いて感染させることによって；米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、微粒子衝撃（bombardment）を用いてむき出しのＤＮＡを直接注射する方法（例えば、「GeneGun」、Biolistic、DuPont）、核酸を脂質で被覆する方法、関連する細胞の表面にあるレセプター／トランスフェクション剤を用いた方法、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル内にカプセルで包む方法、これを、核の中に侵入することが分かっているペプチドへのリンケージに投与する方法、または、これを、レセプター媒介性のエンドサイトーシスに感染し易いリガンドへのリンケージに投与する方法（例えば、Wu and Wu, 1987.J Biol Chem 262 4429-4432を参照）が挙げられる。このレセプター媒介性のエンドサイトーシスに感染し易いリガンドに対するリンケージ内に投与する方法は、対象となるレセプターを特異的に発現する種類の細胞を「標的」とするために用いられ得る。
【０２１０】
本発明の実施における遺伝子療法のさらなる方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、カルシウムリン酸塩−媒介性トランスフェクション、ウイルス感染などのような方法によって、（上記で規定されたような核酸を含む）遺伝子をインビトロ組織培養液内の細胞の中に移転させる方法を含む。概して、この転移の方法は、同時に、選択可能なマーカーを細胞に転移することを含む。細胞はその後、淘汰圧（例えば、抗生物質に対する抵抗）下に置かれ、このため、移転された遺伝子を取り上げて発現する細胞の分離を促進させる。これらの細胞は、その後、患者に送達される。
【０２１１】
具体的な一実施形態では、結果として生じる組み換え細胞をインビボで投与する前に、核酸を細胞内に導入する。当該技術分野において公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、対象となる核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターに感染させること、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロセル−媒介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合、および、受容細胞の必要な発生および生理学的機能を確保する類似の方法）は、この転移によっては妨げられない。例えば、Loeffler and Behr, 1993. Meth Enzymol 217  599-618を参照。選択された技術は、核酸を細胞に安定して転移させ、細胞によって核酸を発現可能なことを提供する必要がある。好ましくは転移された核酸は、遺伝性であり、細胞後代によって発現可能である。
【０２１２】
本発明の好ましい実施形態では、結果として生じる組み換え細胞は、当該技術分野において公知の種々な方法によって、患者に送達され得る。当該技術分野において公知の方法には、例えば、上皮細胞への注射（例えば皮下注射）、植皮としての組み換え皮膚細胞を患者に付着させること、および、組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）の静脈内注射が含まれる。
【０２１３】
使用が想定される細胞の合計数は、所望の作用、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。遺伝子療法のために核酸が導入され得る細胞は、任意の、所望の利用可能な細胞の種類を包含し、異種、異種遺伝子的、同質遺伝子的、または自己繁殖的であってよい。
【０２１４】
細胞の種類には、分化された細胞、例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞、および血液細胞、または、種々な幹細胞若しくは前駆細胞、特に、胎児心筋細胞、肝臓幹細胞（国際特許公開ＷＯ９４／０８５９８号）、神経幹細胞（Stemple and Anderson, 1992, Cell 71 973-985）、例えば、骨髄から得られる造血幹細胞若しくは前駆細胞、臍帯血液、末梢血、胎児の肝臓などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、遺伝子療法に利用されるこれらの細胞は、患者の自己細胞である。
【０２１５】
選択的および／または追加的に、本明細書に記載される疾患の治療のために、上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および／または、核酸を送達するための標的療法、より詳細にいうと、（標的）抗体または細胞特異的リガンドのような標的システムを用いることによって、所定の種類の細胞に送達するための標的療法を用いてよい。
【０２１６】
標的とするために用いられる抗体は、典型的には、以下に規定する任意の疾患に関連する細胞の細胞表面蛋白質に特異的である。一例として、これらの抗体は、例えば、Ｂ−細胞に関連付けられた表面蛋白質といった細胞表面抗体に関連していてよい。Ｂ−細胞に関連付けられた表面蛋白質の例には、ＭＨＣクラスＩＩＤＲ蛋白質、ＣＤ１８（ＬＦＡ−１ベータ鎖）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４０若しくはＢｇｐ９５、または、例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ１３８などから選択された細胞表面蛋白質が挙げられる。
【０２１７】
標的構成は、典型的には、本明細書において規定された、本発明に係るＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および核酸を、細胞表面蛋白質に抗体特異的に共有結合させることによって、または、細胞特異的リガンドに結合させることによって、調製され得る。蛋白質は、例えば、ペプチド結合または化学的結合、化学的架橋などによって、このような抗体に結合され得る、または、このような抗体に付着され得る。その後、標的療法は、標的構成を、薬学的に有効な量で、以下に規定する投与経路のいずれかによって、患者に投与することによって行われ得る。例えば、投与経路は、腹膜内経路、経鼻経路、静脈内経路、経口経路、およびパッチ送達経路である。
【０２１８】
好ましくは、上記で規定された標的抗体または細胞特異的リガンドに結合される、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸は、例えば、共有結合の加水分解によって、ペプチダーゼによって、または、任意の他の好適な方法によって、インビトロまたはインビボにおいて放出され得る。
【０２１９】
あるいは、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸が、小細胞特異的リガンドに結合されるならば、リガンドの放出は、行われない。細胞表面に存在する場合、キメラペプチドは、そのトラフィッキング配列が活性化されると、細胞の中に侵入する。標的化は、種々な利用のため、例えば、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および核酸が、許容できないような毒性である場合、または、極めて多い投薬量を必要とするような場合に望ましい。
【０２２０】
本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、および／または、キメラペプチドを直接的に投与する代わりに、これらを、細胞内に導入されたエンコーディング遺伝子から、例えば、投与されるウイルスベクターから発現させることによって、標的細胞内に生成することも可能である。ウイルスベクターは、典型的には、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドをコードする。このベクターは、治療される特異的細胞に標的化され得る。さらに、このベクターは、調整要素を含むことが可能である。この調整要素は、多かれ少なかれ、選択的に、所定の調節によって、標的細胞によって切替えられる。この技術は、成熟蛋白質をその前駆物質の代わりに利用するＶＤＥＰＴ技術の改変体（ウイルス−指向性酵素プロドラッグ療法）を示す。
【０２２１】
あるいは、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドを、抗体またはウイルスを用いることによって、前駆物質に投与してもよい。これらのＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドは、その後、治療される細胞内に生成された活性化剤、または治療される細胞に標的化された活性化剤によって、活性形に変換される。この種の方法は、ＡＤＥＰＴ（抗体−指向性酵素プロドラッグ療法）またはＶＤＥＰＴ（ウイルス−指向性酵素プロドラッグ療法）としても知られている。ＡＤＥＰＴは、細胞−特異性抗体に接合することによって、活性化剤を細胞に標的化することを含み、ＶＤＥＰＴは、活性化剤、例えば、ＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドを、ウイルスベクター内のエンコーディングＤＮＡから発現させることによって、ベクター内に生成することを含む（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１号公報およびＷＯ９０／０７９３６号公報を参照）。
【０２２２】
さらなる一実施形態によれば、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、または、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチド、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２に記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、に対する抗体を、（インビトロ）アッセイ（例えば、免疫学的検定）において用いて、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害から選択された様々な状態および病状を検出、予測、診断、または監視するか、または、その治療を監視することが可能である。
【０２２３】
この免疫学的検定は、患者に由来する試料を、免疫特異性−結合が生じる条件下で、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸配列に対する抗体に接触させ、その後、該抗体によって、免疫特異性−結合の量を検出または測定することを含む方法によって、行うことが可能である。具体的な一実施形態では、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸配列に特異的な抗体を用いて、患者からの組織または血清試料の、ＪＮＫまたはＪＮＫ阻害剤配列の存在を分析することが可能である。ここでは、異常な量のＪＮＫが、疾患状態を示している。
【０２２４】
用いられ得る免疫学的検定には、ウエスタンブロット、放射免疫学的検定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドウィッチ」免疫学的検定、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光免疫学的検定、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、および、蛋白質−Ａ免疫学的検定などといった技術を用いた、競合アッセイおよび非競合アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
あるいは、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、または上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドに対する抗体を、典型的には、例えば、培養された動物細胞、ヒト細胞、または微生物から選択された標的細胞に送達して、細胞応答を、典型的には当業者に知られた生物理学的方法によって監視することによって、（インビトロ）アッセイを行ってもよい。
【０２２６】
典型的には、本明細書において用いられる標的細胞は、培養された細胞（インビトロ）、またはインビボ細胞、すなわち、生きた動物若しくはヒトの臓器または組織、または生きた動物若しくはヒト内に存在する微生物を含む細胞であってよい。
【０２２７】
本発明はさらに、診断目的または治療目的のキットの使用、特に、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の治療、予防、または監視のためのキットの使用を提供する。ここで、このキットは、１つ以上の容器を備えており、該容器は、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、および／または、上記で規定されたこれらのＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列に対する、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載のキメラペプチドに対する、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２に記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体または断片を含むＪＮＫ阻害剤配列に対する、抗−ＪＮＫ阻害剤配列抗体、または、このような抗−ＪＮＫ阻害剤配列抗体、および任意により、該抗体への、標識化された結合パートナーを含む。
【０２２８】
ここで抗体の中に組み込まれるラベルには、化学発光、酵素、蛍光、比色分析、または放射性成分が含まれるが、これらに限定されない。他の具体的な一実施形態では、上記で規定されたＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害の治療、予防、または監視における診断のための使用のためのキットが、提供される。このキットは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドをコードする核酸、あるいは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドを補完する核酸を含む１つ以上の容器を備えており、任意により、これらの核酸に対して標識化された結合パートナーも提供されている。
【０２２９】
具体的な他の一実施形態では、このキットを、上述の目的のために、１つ以上の容器、および、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、６〜３０ヌクレオチド長）を含むキットとして用いてもよい。一対のオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Innis, et al., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CAを参照）、リガーゼ連鎖反応、循環プローブ反応（cyclic probe reaction）などの方法、または、当該技術分野において公知の、ここでは上記で規定された核酸と共に用いられる方法のための、増幅プライマーとして機能することが可能である。
【０２３０】
このキットは、上述の目的のためのアッセイにおいて、診断、基準、またはコントロール（対照）としての使用のために、任意により、所定の量の、上記で規定された精製されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で規定されたキメラペプチド、またはこれらをコードする核酸をさらに含むことが可能である。
【０２３１】
本発明の範囲は、これらの具体的な実施形態によって限定されるものではない。むしろ、本明細書に記載されるこれらの実施形態に加えて、本発明の様々な変形が、当業者には、上述の明細書および添付の図面から明らかとなろう。このような変形例は、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０２３２】
本明細書には、種々な文献を引用している。これらの文献の開示内容を、引用することによって、その全体を援用する。
【０２３３】
他に記載がない限り、本明細書において使用される全ての技術的且つ科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の知識を有する当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載された方法および材料に類似または等しい方法および材料を、本発明の実施または試験において用いてもよいが、好適な方法および材料については、後に記載する。
【０２３４】
本明細書に記載される、全ての文献、特許出願、特許、および他の引用文献は、引用によって、その全体を援用する。係争時には、規定を含む本明細書が、検査されることになる。さらに、材料、方法、および実施例は、単に、例示的なものであり、限定するものであることを意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】Ａ〜Ｃは、示される転写因子における、保存されたＪＢＤドメイン領域のアラインメントを示す図である。ここで用いられるＪＮＫ阻害剤配列は、配列アラインメントを実施することによって特徴付けられる。このアラインメントの結果が、図１のＡ〜Ｃに例示的に示されている。図１のＡは、ＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−Ｊｕｎ、およびＡＴＦ２のＪＢＤの間で、最も相同性が高い領域を示す図である。パネルＢは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）のＪＢＤおよびＬ−ＩＢ１のＪＢＤのアミノ酸配列を、比較のために示す図である。完全に保存された残基は、星印で示されており、ＧＦＰ−ＪＢＤ23Mutベクター内のＡｌａに変換された残基は、白丸で示されている。図１のＣは、ＪＮＫ阻害剤配列およびトラフィッキング配列を含むキメラ蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。図示された実施例では、トラフィッキング配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴポリペプチドに由来し、ＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１（ｓ）ポリペプチドに由来する。パネルＢおよびＣでは、ヒト、マウス、およびラットの配列は同一である。
【図２】ヒト、マウス、およびラットからのジェネリックＴＡＴ−ＩＢ融合ペプチドの配列を示す図である。
【図３】ワンウェルアプローチにおいて、配列番号９および１１に記載の融合ペプチドを用いた、ＨｅｐＧ２細胞における内因性のＪＮＫ−活性の阻害の結果を示す図である。図３から、特に図３のパネルｄから明らかなように、配列番号１１に記載のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここでは、Ｄ−ＪＮＫＩと省略されている）は、ＪＮＫ−活性を、配列番号９に記載のＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここでは、Ｌ−ＪＮＫＩと略記）よりもさらに良好に効果的に阻害する。
【図４】ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１に記載のキメラＪＮＫ阻害剤配列の、細胞毒性アッセイの結果を示す図である（実施例１２を参照）。図示されるように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ＨＦＦに対して細胞毒性ではない。ＨＦＦを、９６−ウェル組織培養プレート内に播種した。ＤＭＳＯ（５μＭの薬剤と同じレベル）、または１、２、および５μＭのＸＧ−１０２を含有する培地を添加し、２４時間保持した。ニュートラルレッドを手短に添加し、細胞を固着させ、その後、色素を抽出した。５４０ｎｍにおいて、吸光度を測定した。ＤＭＳＯと、１μＭのＸＧ−１０２との間には、差異は観察されなかった。
【図５】ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１に記載のキメラＪＮＫ阻害剤配列の、水痘帯状疱疹ウイルスウイルス（ＶＺＶ）に対する活性を試験するために行ったプラーク減少アッセイの結果を示す図である（実施例１２を参照）。図示されるように、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、特に０．５μＭおよび１μＭの濃度において、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の強力な阻害剤である。
【図６】ＸＧ−１０２とも呼ばれる、配列番号１１に記載のキメラＪＮＫ阻害剤配列を用いた、培養されたヒト繊維芽細胞における水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）の阻害の結果を示す図である（実施例１２を参照）。図示されるように、ＶＺＶは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）に対して著しい感受性を示している。ＶＺＶ複製は、陰性コントロール（ＸＧ−１００、Ｔａｔペプチドのみ）の存在下において、通常であった。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験された最も低い濃度である０．２５μＭにおいても、ＶＺＶ複製を阻止した。
【図７】ブレオマイシン誘発性急性肺炎の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療において、肺のホモジナイゼーションにおけるＭＰＯを用いて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、肺における細胞動員に対する活性を示す図である。図示されているように、ＭＰＯは、ブレオマイシンの投与後には、顕著には誘発されなかった。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、肺のＭＰＯのレベルにわずかな影響しか有していなかった。
【図８】ブレオマイシン誘発性急性肺腺維症の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、ＴＮＦのレベルに対する活性を示す図である。ＴＮＦのレベルを測定すると、ＢＬＭモデルでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与後に、ＢＡＬＦにおいて、ＴＮＦのレベルが減少する傾向が観察された。ＢＬＭの後には、ＴＮＦのレベルは極めて低い。
【図９】ブレオマイシン誘発性急性肺腺維症の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、気管支肺胞洗浄空間内の細胞動員に対する活性を示す図である。０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、自己リンパ球を著しく低減させ、この点で、自己リンパ球によって特徴付けられる炎症段階の間に動員される全ての細胞の数を低減させる。０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、自己リンパ球を増大させるか、または気管支肺胞の空間に動員される全ての細胞の数を増大させる（ｎ＝各グループに付き５匹のマウス；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１）。
【図１０】ブレオマイシン誘発性急性肺腺維症の動物モデルを用いた、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療における、組織構造の結果を示す図である。肺の３μｍの切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＢＬＭ投与の１０日後に、炎症細胞の堆積、繊維性の区域、肺構造の欠損が、観察された。図示されているように、これらのパラメータの低減は、高投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ）ではなく、低投与量（０．００１ｍｇ／ｋｇ）のＸＧ−１０２を投与した後に、観察された。
【図１１】ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療が、ＥＬＩＳＡによって算出された脳のＡβ1-40およびＡβ1-42のレベルに与える効果を示す図である。これらのグラフは、トリトン４０およびトリトン４２による異なる脳のホモジネート分画における、ＥＬＩＳＡによって判定されたＡβ1-40（左）およびＡβ1-42（右）のレベルを示すものである。データは、分散した点プロットとして、個々の値（黒）およびグループ平均±ＳＥＭと共に、示されている。顕著な相違点に星印を付けた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。グループ間の顕著な相違点は、Ａβ1-42のトリトンＸ−１００分画においてのみ観察された。
【図１２】ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療が、ＥＬＩＳＡによって判定されたＣＳＦＡβ1-40およびＡβ1-42のレベルに与える効果を示す図である。これらのグラフは、ＣＳＦにおける、ＥＬＩＳＡによって算出されたＡβ1-40（左）およびＡβ1-42（右）のレベルを示している。データは、分散した点プロットとして、個々の値（黒）およびグループ平均±ＳＥＭと共に、示されている。顕著な相違点に星印を付けた（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１）。両方の投与量のＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療は、ＣＳＦにおけるＡβ1-40およびＡβ1-42の著しい減少を導いた。
【図１３】ｈＡＰＰＴｇマウスにおける、チオフラビンＳ染色剤で視覚化された数のプラークへの、治療効果を示す図である。これらのグラフは、皮質および海馬における、チオフラビンＳで染色されたプラークのｍｍ2当りの数を示している。ＸＧ−１０２（配列番号１１）治療は、海馬において、プラークの数を、負の用量依存的に低減させた。データは、平均値＋ＳＥＭとして示されている。グループ当たりＮ＝８。＊…ｐ＜０．０５；＊＊…ｐ＜０．０１。
【図１４】ｈＡＰＰＴｇマウスにおける、チオフラビンＳで視覚化されたプラーク面積［％］に与える、治療効果を示す図である。これらのグラフは、皮質および海馬における、チオフラビンＳにポジティブなプラークのプラーク面積［％］を示している。ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、海馬において、プラークによって得られる面積を著しく低減させた。データは、平均値＋ＳＥＭとして示されている。グループ当たりＮ＝８。
【図１５】ＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与が、２型糖尿病の動物モデルにおける空腹時血糖値（絶対値および相対値）に与える結果を示す図である。グループＡおよびＣにおいて、空腹時血糖を、６８日目まで３日ごとに測定し、１１１日目の終了日まで、定期的に測定した。我々は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療された糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値が、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ著しく減少すること（ｐ＜０．００１）を観察した。ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスの空腹時血糖値は、およそ５ｍｍｏｌ／Ｌの低い横ばい状態に達した。この効果は、投与の１４日後に現れ、調査中はずっと、従って２１日目から１１１日目までのウォッシュアウト（休薬）期間の間もずっと、持続した。これとは異なり、我々は、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号１１）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与を続けた２８日間において、効果がないことを観察した。
【図１６】１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与が、２型糖尿病の動物モデルの体重に与える結果を示す図である。我々は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスにおいて、体重増加が、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ著しく抑制されたこと（ｐ＜０．００１）を観察した。この効果は、投与の２８日目から現れ、終了日１１１まで持続した。これとは異なり、我々は、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号１１）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与を続けた２８日間において、体重について変化がなかったことを観察した。
【図１７】２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、調査６８日目に代謝飼育カゴにおいて測定される、２４時間での飼料および水摂取、および、尿および糞の生成に与える影響を、図１７において（ｇ）にて示す図である。我々は、飼料摂取および尿生成が減少する傾向を観察したものの、測定したこれらのパラメータのいずれにおいても、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて顕著な影響を有していなかったことを観察した。
【図１８】２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、調査６８日目に代謝飼育カゴにおいて測定される、２４時間での飼料および水摂取、および、尿および糞の生成に与える影響を、図１８において（体重のｇに標準化された）示す図である。我々は、食料摂取および尿生成が減少する傾向を観察したものの、測定したこれらのパラメータのいずれにおいても、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて顕著な影響を有していなかったことを観察した。
【図１９】２型糖尿病の動物モデルにおいて、５７日目、７７日目、および１０８日目に測定された、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す図である。図１９は、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、インスリン、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−６の血漿レベルに与える効果を示す。我々は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、測定されたパラメータのいずれにも顕著な効果を有していなかったことを観察した。
【図２０】２型糖尿病の動物モデルにおいて、５７日目、７７日目、および１０８日目に測定された、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す図である。図２０は、ｔＰＡＩ−１、ＴＮＦ、およびレジスチンの血漿レベルに与える効果を示す。我々は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、血漿レジスチンのレベルを除く、測定されたパラメータのいずれにも顕著な効果を有していなかったことを観察した。レジスチンの血漿レベルは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）で治療した動物において、７７日目および１０８日目に、極めて高かった。
【図２１】２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、副睾丸脂肪パッド、鼠径部皮下脂肪パッド、および、後腹膜脂肪パッドの組織重量に与える影響を示す図である。我々は、ＸＧ−１０２で治療したマウスにおいて、ビヒクルコントロールと比べて、副睾丸（ｐ＜０．０５）および後腹膜（ｐ＜０．０１）の脂肪質量が著しく減少したことを観察した。
【図２２】２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、脳、脾臓、および心臓の組織重量に与える影響を示す図である。我々は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、これらのパラメータに全く作用しなかったことを観察した。
【図２３】２型糖尿病の動物モデルにおいて、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号１１）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、腎臓および肝臓の組織重量に与える影響を示す図である。我々は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）で治療したマウスにおいて、腎臓（ｐ＜０．０５）および肝臓（ｐ＜０．０１）の質量が、ビヒクルコントロールと比べて、著しく減少したことを観察した。
【図２４】初代培養されたマクロファージを、ＸＧ−１０２（配列番号１１）で培養し、その後、広範囲にわたって洗浄したものを示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）の存在は、ＸＧ−１０２に対する特異的抗体を用いて顕示させた。ＸＧ−１０２は、初代マクロファージにしっかりと組み込まれている。
【図２５】放射性同位体で標識化されたＣ14（１ｍｇ／ｋｇ）のペプチドを、３つの異なる経路（ｓ．ｃ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．）を介して投与することによって、マウスを治療したものを示す図である。動物を、注射の７２時間後に犠牲にし、免疫ラジオグラフィーを施した。矢状断面を露出させ、主に肝臓、脾臓、および骨髄内の蓄積ＸＧ−１０２ペプチドを顕示させた（ＸＧ−１０２：配列番号１１）。
【図２６】１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２をｉ．ｖ．で注射したラットの肝臓内のＸＧ−１０２（配列番号１１）に対する免疫染色を示す図である。動物を、注射の２４時間後に犠牲にした。ＤＡＢ基質を用いて顕示させた。この図も、肝臓、および特にクッパー細胞（マクロファージ）内にＸＧ−１０２が著しく蓄積していることを示している。
【図２７】２つの細胞株における、サイトカインおよびケモカインの放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）が、骨髄性細胞株およびリンパ球様細胞株におけるサイトカインの放出を阻害して、ＴＨＰ−１細胞（パネルＡ〜Ｃ）における、ＬＰＳ−誘発されたＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびＭＣＰ−１の放出を低減し、ジャーカット細胞（パネルＤ−Ｆ）におけるＰＭＡおよびイオノマイシン−誘発性ＩＦＮｇ、ＩＬ−６、およびＩＬ−２の産生を低減する。コントロール（ＸＧ−１０１）は、安定度が悪いため、それほど効果的でない。
【図２８】は、一次細胞におけるサイトカインの放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）はまた、一次リンパ球様細胞および骨髄性細胞におけるサイトカインの放出を阻害して、マウスのマクロファージ（パネルＡ〜Ｃ）におけるＬＰＳ−誘発性ＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびランテス放出を低減すると共に、マウスのＴ細胞（パネルＤ〜Ｅ）におけるＰＭＡおよびイオノマイシン−誘発性ＴＮＦａ、およびＩＦＮｇの産生を低減する。細胞に傷害を与えない濃度のＸＧ−１０２において、効果が生じる（パネルＦ）。
【図２９】ラットからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列、およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す図である。
【図３０】ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエクソン−イントロン境界によってコードされた、ラットからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０３）を示す図である。
【図３１】ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図３２】は、ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１０５）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０２３６】
［実施例］
実施例１：ＪＮＫ阻害剤配列の同定
ＪＮＫとの効果的な相互作用のために重要なアミノ酸配列を、公知のＪＮＫ結合ドメインＪＢＤ間の配列アラインメントによって同定した。ＩＢ１［配列番号１３］、ＩＢ２［配列番号１４］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号１５］、およびＡＴＦ２［配列番号１６］のＪＢＤ間の配列を比較することにより、低度に保存された８つのアミノ酸配列（図１Ａ）を規定した。
【０２３７】
ＪＮＫを結合させることにおいて、ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤが、ｃ−ＪｕｎまたはＡＴＦ２のＪＢＤよりも約１００倍効果的であるため（Dickens et al. Science 277: 693 (1997)）、最大の結合を与えるためには、当然、ＩＢ１とＩＢ２との間に保存された残基が重要であることは間違いない。ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとの間の比較により、これら２つの配列間で高度に保存された、２つのブロックの、７つおよび３つのアミノ酸を規定した。
【０２３８】
これら２つのブロックは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号１］内の１９のアミノ酸のペプチド配列内に含まれており、比較のために、ＩＢ１［配列番号１７］に由来する２３ａａペプチド配列内に示されている。これらの配列は、図１Ｂに示されており、Ｌ−ＩＢ１配列内の破線は、保存された残基をＬ−ＩＢ１（ｓ）と揃えるために、配列内の隙間を示すものである。
【０２３９】
実施例２：ＪＮＫ阻害剤融合蛋白質の調製
配列番号１のＣ−末端を、２つのプロリン残基から成るリンカーを介して、ＨＩＶ−ＴＡＴ４ｇ５７に由来する配列番号５に記載の１０個のアミノ酸の長さの担体ペプチドのＮ−末端（Vives et al., J Biol. Chem.  272: 16010 (1997)）に共有結合させることによって、配列番号９に記載のＪＮＫ阻害剤融合蛋白質を合成した。このリンカーは、最大のたわみ性を可能にして、望ましくない２次的構造変化を回避するために用いたものである。この基本構造を調製して、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）（配列番号１）およびＬ−ＴＡＴ［配列番号５］をそれぞれ指定した。
【０２４０】
配列番号１１に記載の全てのＤレトロ−インベルソペプチドを、これに応じて合成した。この基本構造を調製して、Ｄ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号２］およびＤ−ＴＡＴ［配列番号６］をそれぞれ指定した。
【０２４１】
配列番号９、１０、１１、および１２に記載の全てのＤおよびＬ融合ペプチドを、従来のＦｍｏｃ合成法によって産生し、さらに、質量分析法によって分析した。最終的に、これらの融合ペプチドを、ＨＰＬＣによって精製した。プロリンリンカーの効果を算定するために、２種類のＴＡＴペプチドを産生した。これら２種類のＴＡＴペプチドのうち、一方は２つのプロリンを有しており、他方は全く有していない。２つのプロリンを加えることは、ＴＡＴペプチドを細胞の内部に侵入させること、またはＴＡＴペプチドを細胞の内部において局在化させることを変更することはないと思われる。保存されたアミノ酸残基を示すジェネリックペプチドは、図２に示されている。
【０２４２】
実施例３：ＪＢＤ１９による細胞死の阻害
ＩＢ１（ｓ）の１９ａａの長さのＪＢＤ配列が、ＪＮＫ生物活性に与える影響を調査した。この１９ａａ配列を、Ｎ−末端で、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ  ＪＢＤ１９構成）に結合させ、この構成がＩＬ１によって誘発された膵臓ベータ−細胞アポトーシスに与える効果を評価した。この形態のアポトーシスは、ＪＢＤ1-280でトランスフェクションすることによって阻止されることが既に示されているが、当該技術分野において公知のＥＲＫ１／２またはｐ３８の特異的阻害剤は、これを、保護しなかった。
【０２４３】
１９アミノ酸の保存された配列、および、完全に保存された領域において突然変異した配列を有する、ＪＢＤ１９に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、（Clontech社からの）緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の中に、方向を定めて挿入した。１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍＬペニシリン、および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０媒質において、インスリンを生成するＴＣ−３細胞を培養した。インスリンを生成するＴＣ−３細胞を、上記に示されたベクターでトランスフェクトし、この細胞培養基に、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。ＩＬ−１を添加して４８時間後に、アポトーシス細胞の数を、インバータ蛍光顕微鏡を用いて計数した。アポトーシス細胞を、細胞質の「水疱形成」特性によって通常の細胞から選別し、２日後に計数した。
【０２４４】
ＧＦＰは、コントロールとして用いられる緑色蛍光蛋白質発現ベクターである。ＪＢＤ１９は、ＩＢ１のＪＢＤに由来する１９ａａ配列に結合されたキメラＧＦＰを発現するベクターであり、ＪＢＤ１９Ｍｕｔは、ＧＦＰ−ＪＢＤ１９と同じベクターであるが、１つのＪＢＤは、図１Ｂとして示される４つの保存された残基において、突然変異しており、ＪＢＤ1-280は、全ＪＢＤ（ａａ１−２８０）に結合されたＧＦＰベクターである。ＧＦＰ−ＪＢＤ１９を発現する構造は、全ＪＢＤ1-280と同じ低度に効果的に、ＩＬ−１誘発性膵臓細胞のアポトーシスを妨げた。
【０２４５】
さらなるコントロールである、完全に保存されたＩＢ１（ｓ）残基において突然変異した配列は、アポトーシスを妨げる能力を著しく低下させた。
【０２４６】
実施例４：ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの細胞インポート
ＴＡＴおよびＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（「ＴＡＴ−ＩＢペプチド」）のＬ−およびＤ−鏡像異性体の、細胞の中に侵入する能力を評価した。フルオレセインに接合されたグリシン残基のＮ−末端を付加することによって、Ｌ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）、およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド［それぞれ、配列番号５、６、９、および１２］を標識化した。標識化されたペプチド（１μＭ）をＴＣ−３細胞培養に添加し、これを、実施例３に記載したように維持した。所定の時間に何回か、細胞をＰＢＳで洗浄し、冷却されたメタノール−アセトン（１：１）において、５分間固着させた後に、蛍光顕微鏡下で検査した。
【０２４７】
フルオレセイン−標識化したＢＳＡ（１μＭ，１２モル／モル  ＢＳＡ）をコントロールとして用いた。フルオレセインで標識化した全ペプチドは、一旦、培養基に添加されると、細胞に、効果的且つ迅速（５分以内）に侵入するという結果が示された。逆に、フルオレセインで標識化したウシ血清アルブミン（１μＭ  ＢＳＡ，１２モルのフルオレセイン／モル  ＢＳＡ）は、細胞には侵入しなかった。
【０２４８】
時間経過検査では、Ｌ−鏡像異性体ペプチド用の蛍光信号の強度は、２４時間周期の後に、７０％減少したことが示された。４８時間では、信号はほとんど存在しなかった。逆に、Ｄ−ＴＡＴおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、細胞の内部において極めて安定していた。
【０２４９】
これら全てのＤレトロ−インベルソペプチドからの蛍光信号は、１週間後でも、極めて強力であり、信号は、処理後２週間経って漸く、わずかに減少した。
【０２５０】
実施例５：ｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１リン酸化のインビトロ阻害
ペプチドが、これらの標的転写因子のＪＮＫ−媒介性リン酸化に与える影響を、インビトロで調査した。活性化されていない、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３を、転写および翻訳ウサギ網赤血球溶解物キット(TRANSCRIPTION AND TRANSLATION rabbit reticulocyte lysate kit)（Promega）を用いて産生し、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１の固相キナーゼアッセイにおいて、単独、または、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）に融合させて、基質として用いた。
【０２５１】
反応緩衝剤（２０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩（ｐＮＰＰ）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのｐ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのジチオスレイトール）中で、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、またはＪＮＫ３キナーゼに、Ｌ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５μＭ）を２０分間混ぜ合わせて、用量反応検査を行った。
【０２５２】
その後、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および５ｐＣｉ33Ｐ−−ｄＡＴＰ、並びに１μｇの、ＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ  １〜８９）、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（ａａ  １〜９６）、またはＧＳＴ−ＥＬＫ１（ａａ  ３０７〜４２８）を添加することによって、キナーゼ反応を開始させた。ＧＳＴ−融合蛋白質は、Stratagene社（LaJolla, CA）から購入したものである。
【０２５３】
この混合物に、１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズも添加した。その後、反応生成物を、１０％のポリアクリルアミド変性ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを乾燥させて、次にＸ線フィルム（Kodak）に曝した。
【０２５４】
２．５μＭ程の少ない投与量のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドにおいて、ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１リン酸化のほぼ完全な阻害が、観察された。しかし、顕著な例外は、Ｅｌｋ１のＪＮＫ３リン酸化のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）が阻害されなかったことであった。全体的に、ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、これらの標的転写因子のＪＮＫファミリーのリン酸化を阻害することにおいて、著しい効果を示した。
【０２５５】
Ｄ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５０μＭ用量検査）の、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３によって、ＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ  １〜７３）リン酸化を阻害する能力を上記のように分析した。全体的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ−媒介性リン酸化を減少させるが、そのレベルは、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）よりも約１０−２０倍、効率が悪かった。
【０２５６】
実施例６：活性化されたＪＮＫによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害
本明細書において規定されたＬ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドが、ストレス刺激によって活性化されたＪＮＫに与える影響を、ＵＶ−光が照射されたＨｅＬａ細胞またはＩＬ−１処理されたＰＴＣ細胞からＪＮＫをプルダウンするＧＳＴ−Ｊｕｎを用いて、評価した。ＰＴＣ細胞を上述のように培養した。１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリン、および２ｍＭのグルタミンが補充されたＤＭＥＭ媒質中で、ＨｅＬａ細胞を培養した。
【０２５７】
細胞抽出物の調製に用いる１時間前に、ＰＴＣ細胞を上述のＩＬ−１で活性化し、その一方で、ＨｅＬａ細胞をＵＶ光（２０Ｊ／ｍ2）によって活性化した。細胞培養物を、溶解緩衝剤（２０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＰ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのジチオスレイトール）において掻爬することによって、コントロールである、ＵＶ光を照射させたＨｅＬａ細胞、およびＩＬ−１処理されたＴＣ−３細胞から、細胞抽出物を調製した。
【０２５８】
ＳＳ−３４ベックマンローターにおいて１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことによって、破片を除去した。１００μｇの抽出物を、１μｇのＧＳＴ−ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）および１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズ（Sigma）により、室温で１時間培養した。次に、掻爬緩衝剤（scraping buffer）で４回洗浄し、Ｌ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（２５μＭ）を補充した同じ緩衝剤中で、ビーズを２０分間再懸濁させた。その後、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および５ｐＣｉ33Ｐ−ガンマ−ｄＡＴＰを添加することによってキナーゼ反応を開始させ、３０℃で３０分間培養した。
【０２５９】
反応生成物を、その後、１０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。ゲルを乾燥させて、次に、Ｘ線フィルム（Kodak）に曝した。これらの実施例では、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、活性化されたＪＮＫによって、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を効果的に妨げた。
【０２６０】
実施例７：本明細書において規定されたＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドによる、ｃ−ＪＵＮリン酸化のインビボ阻害
本明細書において規定された細胞透過性のペプチドが、ＪＮＫシグナル伝達をインビボで阻止するかどうかを判定するために、我々は、異種のＧＡＬ４システムを用いた。上述の通りに培養されたＨｅＬａ細胞を、５ｘＧＡＬ−ＬＵＣレポーターベクターと、ＧＡＬ−Ｊｕｎ発現構造（Stratagene）とで同時にトランスフェクトした。ＧＡＬ−Ｊｕｎ発現構造は、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインに結合されたｃ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）の活性化ドメインを含む。
【０２６１】
ＪＮＫの活性化を、すぐ上流のキナーゼＭＫＫ４およびＭＫＫ７を発現するベクターを同時トランスフェクション（Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999)を参照）することによって、実現した。つまり、３ｘ１０5細胞に、３．５−ｃｍの皿内のプラスミドを、ＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim）を製造者の取扱説明に従って用いて、トランスフェクトした。ＧＡＬ−Ｊｕｎを含む実験のために、２０ｎｇのプラスミドに、１μｇのレポータープラスミドｐＦＲ−Ｌｕｃ（Stratagene）と、プラスミドを発現する０．５μｇのＭＫＫ４またはＭＫＫ７とをトランスフェクトした。
【０２６２】
トランスフェクションの３時間後、細胞培地を変化させて、ＴＡＴおよびＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（１μＭ）を添加した。１６時間後に、蛋白質含有量に標準化した後のPromegaの「Dual Reporter System」を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０２６３】
ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの添加により、ｃ−Ｊｕｎの活性化が阻止され、それに続く、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７−媒介性のＪＮＫの活性化が阻止された。ＨｅＬａ細胞は、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２アイソフォームを発現するが、ＪＮＫ３を発現しないため、我々は、細胞にＪＮＫ３をトランスフェクトした。ここでも、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ２−媒介性活性化を阻害した。
【０２６４】
実施例８：全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の合成
本発明のペプチドは、逆合成され、自然な蛋白質分解を妨げる全てのＤアミノ酸ペプチド（すなわち全てのＤレトロ−インベルソペプチド）であってよい。本発明の全てのＤレトロ−インベルソペプチドは、ネイティブペプチドに似た機能的特性を有するペプチドを提供することになる。ここで、アミノ酸成分の側鎖は、ネイティブペプチドアラインメントに対応しているが、プロテアーゼ耐性の基幹を保持している。
【０２６５】
本発明のレトロ−インベルソペプチドは、Ｄ−アミノ酸を用いて合成された類縁物質である。この合成は、アミノ酸をペプチド鎖の中に付着させて、レトロ−インベルソペプチド類縁物質におけるアミノ酸の配列が、モデルとして機能する選択されたペプチドにおける配列と正確に逆となるようにすることによって行われる。
【０２６６】
例えば、（Ｌ−アミノ酸から構成された）自然発生的ＴＡＴ蛋白質が、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号５］を有しているならば、この（Ｄ−アミノ酸から構成された）ペプチドのレトロ−インベルソペプチド類縁物質は、配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ［配列番号６］を有していることになる。
【０２６７】
Ｄ−アミノ酸の鎖を合成して、レトロ−インベルソペプチドを形成するための手順は、当該技術分野において知られている（例えば、Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996)を参照）。特に、配列番号２、４、６、８、１１〜１２、１８、２０、２２、および、２５〜２６に記載のレトロ−ペプチドを、従来のＦｍｏｃ合成法によって生成し、さらに質量分析法によって分析した。最終的に、これらをＨＰＬＣによって精製した。
【０２６８】
自然なプロテアーゼおよび固有の免疫原性による劣化が、ネイティブペプチド特有の問題であるため、本発明のヘテロ二価またはヘテロ多価化合物は、所望のペプチドの「レトロ−インベルソ異性体」を含むように調製される。従って、ペプチドを自然な蛋白質分解から保護することは、半減期を延長し、免疫応答の範囲を減少させ、ペプチドをアクティブに破壊するため、特異的ヘテロ二価またはヘテロ多価化合物の効果を増大させるはずである。
【０２６９】
実施例９：全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の長期生物活性
ペプチドへテロ結合体（上述のキメラ配列を参照）を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）レトロ−インベルソの、ネイティブＬ−アミノ酸類縁物質よりも長期の生物活性が示されている。これは、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドが、実施例５に示されるように、ネイティブプロテアーゼによる劣化から保護されているからである。
【０２７０】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによる、ＩＬ−１誘発性膵臓ベータ細胞死の阻害を分析した。ＴＣ−３細胞を、上述の通りに示されたペプチド（１μＭ）を単回添加して３０分間培養した後、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
【０２７１】
その後、ＩＬ−１による培養の２日後に、アポトーシス細胞を、プロピジウムヨウ化物およびHoechst社の３３３４２核染色剤を用いて計数した。各実験につき、最小１，０００細胞を計数した。平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が示されている。ｎ＝５。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ＩＬ−１誘発性アポトーシスを、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同様の範囲まで減少させた。
【０２７２】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１Ｐ誘発性細胞死の長期阻害も分析した。ＴＣ−３細胞を、上述の通りに、示されるペプチド（１μＭ）を単回添加して３０分間培養した後、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、その後、２日毎にサイトカインを添加した。ＩＬ−１による培養の１５日後に、アポトーシス細胞を、プロピジウムヨウ化物およびHoechst社の３３３４２核染色剤を用いて計数した。ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの単回添加が、長期の保護を与えるものではないことに留意されたい。各実験につき、最小１，０００細胞を計数した。結果的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、長期（１５日間）の保護を提供することが可能であったが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は不可能であった。
【０２７３】
実施例１０：本発明に従って用いられるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによるＪＮＫ転写因子の抑制
ＡＰ−１ダブル標識プローブ（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号１０１）を用いて、ゲルリターデイションアッセイを行った。５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−アルファで１時間処理された、または処理されていないＨｅＬａ細胞の核を抽出した。本発明に従って用いられるＴＡＴおよびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドを、ＴＮＦ−アルファの処理の３０分前に添加した。特異的ＡＰ−１  ＤＮＡ複合体を有するゲルの一部だけが示されている（標識化されていない特異的および非特異的競合物質との競合実験によって示されるように）。
【０２７４】
本発明に従って用いられるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ＴＮＦ−アルファの存在下において、ＡＰ−１  ＤＮＡ結合複合体の形成を減少させる。
【０２７５】
実施例１１：オールインワンウェルアプローチを用いたＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害（図３を参照）
実験の前日に、ＨｅｐＧ２細胞を、３，０００細胞／ウェルで播種した。その後、濃度が増大されたインターロイキン−１［ＩＬ−１ベータｖ）］または腫瘍壊死因子［ＴＮＦアルファ（●）］（ａ）を添加して、ＪＮＫを３０分間活性化させた。細胞を、２０ｍＭのヘペス（Hepes）、０．５％のトゥイーン（Tween）（ｐＨ７．４）において溶解させ、アルファスクリーン（AlphaScreen）ＪＮＫを処理した。（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１によって誘発されたＪＮＫ活性のＺ’が、３８４ウェル／プレート（ｎ＝９６）において測定された。（ｃ）化学的ＪＮＫ阻害剤［staurosporin（○）およびSP600125（●）］による内因性ＩＬ−１ベータ−誘発性ＪＮＫ活性の阻害。（ｄ）配列番号９に記載のペプチド性阻害剤Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）［ここでは、Ｌ−ＪＮＫｉ（ｖ）と略記されている）および配列番号１１に記載のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＤ−ＪＮＫｉ（◆）と略記されている）およびＪＢＤ（●）（Ｌ−ＪＮＫＩに対応しているが、ＴＡＴ配列を有さない）］の、ＩＬ−１に依存する、ＪＮＫ活性に与える影響。全てのパネルは、３つの独立した実験（ｎ＝３）を示すものである。
【０２７６】
方法：アルファスクリーンキナーゼアッセイ
原理：アルファスクリーンとは、マイクロプレートフォーマットの生体分子相互作用を検査するために用いられる非放射性ビーズベースの技術である。頭文字ＡＬＰＨＡは、Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay（化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ）を表す。これは、「供与体」ビーズおよび「受容体」ビーズを近接させ、その後、化学的反応のカスケードが、増幅された信号を生成するように機能する生物学的相互作用を含む。
【０２７７】
６８０ｎｍにおけるレーザ励起によって、「供与体」ビーズ内の光応答性物質（フタロシアニン）が、周囲酸素を、励起一重項状態に変換する。その４μ秒半減期内に、一重項酸素分子が、約２００ｎｍまでで溶液中に拡散することが可能であり、受容体ビーズがその近傍にある場合、一重項酸素は、「受容体」ビーズ内のチオキセン誘導体と反応して、３７０ｎｍで化学発光を生成する。この化学発光は、さらに、同一の「受容体」ビーズ内に含まれる蛍光団を活性化する。励起した蛍光団は、次に、５２０〜６２０ｎｍで発光する。受容体ビーズが存在しない場合、一重項酸素は、基底状態まで降下し、信号は生成されない。
【０２７８】
最初に、キナーゼ試薬（Ｂ−ＧＳＴ−ｃＪｕｎ、抗Ｐ−ｃＪｕｎ抗体およびアクティブＪＮＫ３）を、キナーゼ緩衝剤（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ3ＶＯ4、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）において希釈して、ウェル（１５μｌ）に添加した。その後、反応物を、１０μＭのＡＴＰの存在下で２３℃において１時間培養した。
【０２７９】
検出緩衝剤（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％のＢＳＡ）中で希釈された１０μｌのビーズ混合物（蛋白質Ａ受容体２０μｇ／ｍｌおよびストレプトアビジン供与体２０μｇ／ｍｌ）を添加することによって、検出を行い、その後、暗がりにおいて、２３℃でさらに１時間培養した。
【０２８０】
ＪＮＫ内因性活性を測定するために、キナーゼアッセイを行った。このキナーゼアッセイは、上述のとおりに行ったが、アクティブなＪＮＫ３を、細胞溶解物と置き換え、細胞溶解後に、反応キナーゼ成分を添加した点が異なる。Ｂ−ＧＳＴ−ｃｊｕｎおよびＰ−ｃＪｕｎ抗体は同じ濃度で用いたが、ＡＴＰは、１０μＭではなく、５０μＭ用いた。アルファスクリーン信号を、Fusion装置またはEnVision装置上で、直接分析した。
【０２８１】
実施例１２：水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）によるウイルス感染の治療における、全ての、Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の判定
培養された宿主細胞（ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ））において、ＪＮＫ阻害剤ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）を試験化合物として用いて、本発明に従って使用されるＩＢ（ｓ）ペプチドおよび全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドの活性の判定を、試験した。ウイルスは、偏性細胞内寄生体であり、それらの生活サイクルを完結するためには機能している細胞環境を必要とする。すなわち、瀕死の細胞は、ウイルス複製を支援しない。
【０２８２】
さらに、細胞機能の阻害剤は、細胞に対して毒性を有している可能性があり、ウイルスの成長を非特異的に阻止することが可能である。従って、病気または瀕死の宿主細胞は、非特異的に減少されたウイルス力価を示すことが可能である。このことが結果を変造し得るため、最初に、細胞毒性アッセイを行い、培養細胞の、試験化合物に対する耐性を測定した。次に、プラーク減少アッセイを行い、その後、ＪＮＫ阻害剤ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の、感染した細胞における、ウイルス性帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に対する活性を試験した。
【０２８３】
Ａ）全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドの細胞毒性の判定
毒性の判定のために、培養細胞（ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ））を、９６−ウェル組織培養プレート内に播種した。ＤＭＳＯ（５μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）と同じレベル）、または、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を含有する培地を、幾つかの濃度（１、２、および５μＭ）で添加し、２４時間保持した。
【０２８４】
次に、ニュートラルレッドアッセイを行った。次の（Taylor et al, 2004, J. Virology, 78:2853-2862において行われているような）有効性アッセイのための最高投与量を設定するために、細胞毒性アッセイのためのニュートラルレッド比色アッセイ（１セット６つの複製において）を用いた。
【０２８５】
生きた細胞は、ニュートラルレッドを吸収するため、吸光度のレベルは、細胞の生存可能性および数の定量的測定値となる。ニュートラルレッドの取り込みは、細胞の数に正比例しており、通常のエンドサイトーシスを反映する。従って、ニュートラルレッドを短いパルスで、０時間、または２４時間において、上記培地に添加した。固着および抽出後、染料を添加し、各試料における染料の量を、５４０ｎｍにおいて、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで測定した（図４を参照）。
【０２８６】
いずれの量のＸＧ−１０２（配列番号１１）でも、細胞毒性は観察されず、細胞の成長は、ＤＭＳＯ希釈剤だけの場合（コントロール）と比べて、抑制されなかった。従って、標準的な濃度である１μＭは、ＨＦＦ細胞に明確には作用しておらず、より高い投与量でも、許容されるであろう。
【０２８７】
Ｂ）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）の、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に対する抗ウイルス作用を評価するためのプラーク減少アッセイ
ＸＧ−１０２（配列番号１１）が、投与量に依存した抗ウイルス作用を有していたかどうかを判定するために、標準的な１μＭの投与量およびその大小近くの濃度範囲を試験した。
【０２８８】
このプラーク減少アッセイでは、２４−ウェルプレート内のコンフルエントなヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）を、ＶＺＶに感染したＨＦＦと共に、１：１００（感染多重度ＭＯＩ（Multiplicity of Infection）＝０．０１）の比率で培養し、細胞に２時間吸収させた。過剰のウイルスを洗浄により排除し、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を０μＭ（ＤＭＳＯだけ）、０．５μＭ、１μＭ、または２μＭ含有する培地を添加した。この時点にて、１つの試料を取り出し、感染の初期レベルを測定した。ここで、各ウェルは、〜１５０ｐｆｕを含有していた。
【０２８９】
２４時間後、２つのウェルを、トリプシンで処理し、その後、上記細胞サスペンジョンを、３つのＭｅＷｏ細胞単層上に滴下して、各試料のＶＺＶに感染した細胞の数を判定した。成長が抑制されていない間、ＶＺＶは、通常、１日で１０倍に増加する。これは、ＶＺＶが、細胞分裂によって増殖するからである。上記１０倍に増加する増殖は、ＤＭＳＯだけで処理された培養にて観察されたものであり、１２００±４３０ｐｆｕの収量であった（図５）。上記判定の結果は、次の表３の通りである。
【０２９０】
【表３】
0005485265.tif 000009
【０２９１】
従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験した全ての濃度において、強い抗ウイルス作用を有していた。ここで、ＶＺＶは、ほぼ２００〜３００ｐｆｕになった。これらのＥＣ50を補間する結果のグラフを用いることによって、およそ０．３μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）が、ＶＺＶの収量を５０％減少させることが計算された。
【０２９２】
細胞毒性および有効性のデータから、５．０μＭ／０．３μＭの、予備的な選択指数（preliminary Selective Index）（Ｔｏｘ／ＥＣ50）を計算した。上記選択指数は、１７未満の値を提供する。ここで、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の濃度は、細胞の５０％を殺傷する程度には達していないので、実際のＳＩは、より高いと考えられる。
【０２９３】
Ｃ）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）による、ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）内の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）複製の測定
ヒト包皮繊維芽細胞（ＨＦＦ）内の水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）複製をＸＧ−１０２（配列番号１１）によって阻止する、ＸＧ−１０２の最小有効量を判定するために、ＨＦＦのコンフルエントな単分子層をＶＺＶ−ＢＡＣ−Ｌｕｃ菌株で２時間培養し、その後、０．２５μＭ、０．５μＭ、若しくは１．０μＭの濃度のＸＧ−１０２（配列番号１１）、または陰性コントロール（ＸＧ−１００，１．０μＭ）で、２４時間処理した。ウイルス収量を、ルシフェラーゼアッセイによって測定した。試料を３部作成し、平均ルミネセンスを表示させた。エラーバーは、平均値からの標準偏差を示すものである。
【０２９４】
結果として、ＶＺＶ複製は、陰性コントロール（Ｔａｔペプチドのみ）の存在下では、通常であった。ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、試験した最も低い濃度である０．２５μＭにおいて、ＶＺＶ複製を阻止した。本実験では、最小有効量は測定され得なかった。
【０２９５】
なぜＶＺＶが感染中のＪＮＫ−活性に依存しているかは、まだ分かっていないが、この酵素には、クリティカルな要件が存在するものと思われる。従って、培養液におけるＶＺＶの拡散（spread）を完全に阻止するためには、低濃度（０．２５μＭ）のＸＧ−１０２（配列番号１１）で十分である。この量のＸＧ−１０２（配列番号１１）が、感染された細胞内の全てのＪＮＫ分子に結合する点が、この作用の１つの説明となり得る。あるいは、０．２５μＭのＸＧ−１０２（配列番号１１）は、ＪＮＫ−活性を、ＶＺＶ複製に最適な閾値レベルよりも下に低下させ得る。この実験の結果は、図６にまとめられている。
【０２９６】
実施例１３：慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療における、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の判定
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の治療における、典型的な全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を判定するために、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、ブレオマイシン誘発性急性肺炎および腺維症の動物モデルにおいて用いる。ブレオマイシン誘発性炎症および腺維症の説明については、既に、文献に記載されている。本実験の目的は、皮下（ｓ．ｃ．）経路によるＸＧ−１０２（配列番号１１）が、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、並びにブレオマイシン誘発性炎症および腺維症の肺における、好中球の動員（recruitment）に与える影響を、
−ブレオマイシンの単回投与（１０ｍｇ／ｋｇ）の１日後、
−および、腺維症を発症した場合には、１０日後に、調査することであった。
【０２９７】
１）方法および実験的アプローチ
ブレオマイシンの鼻腔内単回投与によって、２つの投与量の試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）、およびビヒクルコントロールを、ｓ．ｃ．で与え、マウスを、１日後および１０日後に分析した。モデルに用いた動物は、グループ当たり１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）であった。
【０２９８】
実験グループは、ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）、および０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）を含み、治療は、ブレオマイシンの投与の前に、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、３日ごとに連続皮下投与することから構成された。
【０２９９】
急性肺炎を、ＢＡＬ洗浄、細胞現象、細胞計数、および肺ミエロペルオキシダーゼ活性によって、２４時間監視した。化合物の影響を、ビヒクルコントロールと比較した。肺腺維症を、ブレオマイシンの単回投与の１０日後に、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を用いて、組織学的に評価した。
【０３００】
１．１）  ブレオマイシンの投与
ケタミン−キシラジンの軽い麻酔の状態で、Bellon Laboratories社（Montrouge、フランス)からの生理食塩水中の硫酸ブレオマイシン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）、または生理食塩水を、容積４０μＬの鼻注入法によって、気道を介して与えた。ブレオマイシン誘発性炎症および腺維症のためにブレオマイシンを投与したグループには、ビヒクル、０．００１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）、および０．１ｍｇ／ｋｇＸＧ−１０２（配列番号１１）が含まれる。ブレオマイシン誘発性炎症の経路は、皮下（ｓ．ｃ．）経路であり、投与は、単回投与として行った。ブレオマイシン誘発性腺維症のための経路は、皮下（ｓ．ｃ．）経路であり、投与は、１０日間で３回行った。
【０３０１】
１．２）  気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）
気管を切開した後に、プラスチックのカニューレを挿入し、３７°Ｃに加熱した０．３ｍｌのＰＢＳ溶液を用いて、気腔を洗浄した。採取した試料を、直ちに２部に分けた。一方の第１の部分（上記２部の第１の洗浄に相当する１ｍｌ）は、媒介物質の測定のために用い、他方の第２の部分は、細胞判定に用いた（４ｍｌ）。最初の部分を、遠心分離させ（６００ｇで１０分間）、上清を分別し、媒介物質の判定まで、−８０°Ｃで保存した。その後、細胞ペレットを、０．４ｍｌの滅菌ＮａＣｌ（０．９％）中に再懸濁させ、第２の部分と共にプールし、細胞計数に用いた。
【０３０２】
１．３）  肺のホモジナイゼーション
ＢＡＬの後、肺全体を取り出し、１ｍｌのＰＢＳを有するマイクロチューブ（Lysing matrix D, Q Bio Gene, Illkrich、フランス）の中に置いた。Fastprep（登録商標）システム（FP120, Q Bio Gene, Illkrich、フランス）を用いて、全ての肺組織抽出物を調製した。その後、この抽出物を遠心分離させ、上清を、媒介物質の測定、およびSircolコラーゲンアッセイ（France Biochem Division、フランス）を用いたコラーゲンアッセイを行うまで、−８０°Ｃで保存した。
【０３０３】
１．４）  細胞計数および細胞判定
細胞の総数を、ＢＡＬ液において、マラッセ（Malassez）血球計を用いて測定した。MGG Diff-quick（Dade Behring AG）で染色した後に、差別化した細胞の計数をサイトスピン調製（サイトスピン３、hermo Shandon）上で行った。標準的な形態基準を用いて、２００の細胞について、差別化した細胞の計数を行った。
【０３０４】
１．５）  ＴＮＦ測定
ＢＡＬＦ中のＴＮＦのレベルを、ＥＬＩＳＡアッセイキット（Mouse DuoSet, R&D system、ミネアポリス、米国）を製造社の取扱説明に基づいて用いて、判定した。結果をｐｇ／ｍｌで報告する。
【０３０５】
１．６）  ＭＰＯ−測定
ＸＧ−１０２を投与した時のＭＰＯ−レベルを測定した。本実験において、ブレオマイシンの後には、ＭＰＯは、あまり誘発されなかった。さらに、ＸＧ−１０２は、肺のＭＰＯレベルに影響しなかった。
【０３０６】
１．７）  組織構造
ＢＡＬおよび肺血流の後、標準的な顕微鏡分析のために、大きなローブ(葉)を、４％の緩衝ホルムアルデヒド中で固着させた。３−ｍの切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０３０７】
２．）  結果
Ａ）第１の調査：ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発性急性肺炎
グループ：ビヒクル、ＸＧ−１０２（配列番号１１）０．００１ｍｇ／ｋｇ、およびＸＧ−１０２（配列番号１１）０．１ｍｇ／ｋｇ
経路：ｓ．ｃ．経路、単回投与
ａ）  気管支肺胞洗浄空間における細胞動員
０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、好中球動員、および炎症段階中に動員された細胞の総数を著しく低減させる。０．００１ｍｇ／ｋｇでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、好中球の動員、または、他の種類の細胞が気管支肺胞腔の中に動員することに全く作用しなかった（代表的な一実験では、グループ当たりｎ＝５匹のマウス；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１）。
【０３０８】
ｂ）  肺のホモジナイゼーションにおける、ＭＰＯを用いた肺への細胞動員
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、宿主防御システムにおいて、重要な役割を果たしている。５３ｋＤａの２つの重鎖と１５ｋＤａの２つの軽鎖とから構成される、この１４０ｋＤａの蛋白質は、１９６０年代に最初に発見された。ＭＰＯが、白血球の活性化に応答して、好中球および単球の顆粒から放出されることは、過酸化水素および塩化物イオンを、強力な酸化剤である次亜鉛素酸（ＨＯＣｌ）に変換させることを可能にする。ＭＰＯは、防御システムにおける重要な目的を果たすが、ＭＰＯは、また幾つかの炎症状態の原因にもなることを、様々な研究が示している。ここで、例えば、ＭＰＯレベルの増大は、冠動脈疾患に関連していることが示されている。さらに、組織ＭＰＯのレベルは、好中球の活性の状態を反映しており、好中球の組織への浸透の徴候を示す。
【０３０９】
本実験では、ブレオマイシンの投与後、ＭＰＯは、あまり誘発されなかった。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、肺内のＭＰＯレベルに全く作用しなかった。（図７参照）。
【０３１０】
ｃ）  ＴＮＦ測定
ＴＮＦのレベルを測定すると、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を投与した後は、ＢＡＬＦ中のＴＮＦのレベルは、減少する傾向が観察され、ＢＬＭの投与後は、ＴＮＦのレベルは非常に低かった（図８参照）。
ｄ）  結論
０．１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、好中球および全細胞の気管支肺胞腔内への動員を減少させ、ＴＮＦのレベルの減少傾向を増大させることが観察できた。さらに、組織スライドの本調査は、気管支の周辺空間において、炎症細胞の堆積が減少していることを示した。従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）が、ブレオマイシン誘発性炎症を減少させたという結論付けが可能である。
【０３１１】
得られた結論に基づき、本実験を、さらに、腺維症モデルにおいても行った。
【０３１２】
Ｂ）  第２の調査：ブレオマイシン（ＢＬＭ）誘発性肺腺維症
グループ：ビヒクル、ＸＧ−１０２（配列番号１１）０．００１ｍｇ／ｋｇ、およびＸＧ−１０２（配列番号１１）０．１ｍｇ／ｋｇ
経路：ｓ．ｃ．経路、１０日間で３回
ａ）  気管支肺胞洗浄空間への細胞動員
０．００１ｍｇ／ｋｇにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、リンパ球動員を著しく低減させ、この時点ではリンパ球動員によって特徴付けられる炎症段階中に動員された細胞の総数を著しく低減させた。０．１ｍｇ／ｋｇでは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、全く作用しなかった（グループ当たりｎ＝５匹のマウス；＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．００１）（図９参照）。
【０３１３】
ａ）  組織構造
３μｍの肺の切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＢＬＭ投与の１０日後に、炎症細胞の堆積、繊維性の区域、肺構造の欠損を観察した。ＸＧ−１０２を低投与量（０．００１ｍｇ／ｋｇ）で投与した後には、炎症細胞の堆積等のパラメータの減少が、観察されたが、高投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で投与した後には観察されなかった（図１０参照）。
【０３１４】
ｂ）  結論
０．００１ｍｇ／ｋｇの低投与量で３回にわたって投与されたＸＧ−１０２（配列番号１１）が、ブレオマイシン誘発性後炎症、特に、この時点で観察されるリンパ球動員を低減するという結論付けが可能である。さらに、当該投与量で３回にわたって投与された試験物質が、ブレオマイシン誘発性腺維症を弱毒化する。肺構造がより良好に保存された、ほとんど広がっていない繊維性の区域が、観察できた。
【０３１５】
実施例１４：アルツハイマー病の治療における、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の判定
アルツハイマー病における、典型的な全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドＸＧ−１０２（配列番号１１）の活性を判定するために、ロンドン型変異およびスウェーデン型変異のＡＰＰ７５１を過剰発現するｈＡＰＰ−遺伝子導入マウスモデルにおいて、ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、モリス水迷路の行動試験と、プラーク負荷を測定する免疫組織学的試験と、マウスの脳内のβ−アミロイド1-40およびβ−アミロイド1-42レベルを測定するＥＬＩＳＡ試験とを用いて評価した。
【０３１６】
ａ）  方法
ｉ）  イントロダクション
本調査は、５ヶ月齢（±２週齢）の雌のｈＡＰＰＴｇマウスを用いて、試験物質（ＸＧ−１０２，配列番号１１）の、行動マーカー、生化学的マーカー、および組織学的マーカーについての有効性を評価するためのものであった。このために、マウスを、４ヶ月間、２週間または３週間ごとに治療し、治療期間の終わりに、行動を、モリス水迷路において評価した。犠牲にしたマウスの、脳、ＣＳＦ、および血液を採取した。Ｔｇマウスの異なる４つの脳のホモジネート分画およびＣＳＦにおいて、Ａβ４０およびＡβ４２のレベルを判定した。治療グループ当たり８匹のＴｇ動物の皮質および海馬におけるプラーク負荷を、定量した。
【０３１７】
ii）  動物
Ｃ５７ＢＬ／６ｘＤＢＡのバックグランドを有する、５ヶ月齢（±２週齢）の雌のＴｇマウスを、治療グループ１〜３（ｎ＝１２）にランダムに割当てた。動物に、ビヒクルまたは２つの異なる濃度のＸＧ−１０２（配列番号１１）を、生後５ヶ月から始まって４ヶ月間継続して、２週または３週ごとに皮下（ｓ．ｃ．）塗布して投与した。本調査に用いた全ての動物は、黒い目をしており、ＭＷＭプールの外の目印を知覚したと思われる。しかし、一匹の動物だけは視力が弱かった。これは、いわゆる予備試験である目に見えるプラットフォームのトレーニングにおいて確認されたことであった。治療開始前、予備を含む全ての動物を、調査のために隔離した。特定の動物の視覚障害が確認された場合、当該マウスは、本調査から除去される。
【０３１８】
iii）  動物の識別および収容
各マウスは、耳標によって識別される。これらのマウスは、個々の通気飼育カゴ（ＩＶＣ）内の、Rettenmaier（登録商標）によって提供された標準的な齧歯類の寝具の上に収容された。各飼育カゴには、最大５匹のマウスが収容されている。マウスは、国際基準に基づいて記載されたＪＳＷ標準操作手順（ＳＯＰ  ＧＥＮ０１１）に従って飼育した。各飼育カゴは、調査番号、性別、マウスの個体登録番号（ＩＲＮ）、出生日、および、スクリーニング日、並びに、治療グループの割当てを示す色付きのカードで識別した。調査中の気温は、約２４°Ｃに維持し、相対湿度は、約４０〜７０％に維持した。動物を、一定の明暗サイクル（１２時間ごとの明／暗）下で収容した。動物は、自由に、通常の水道水を利用可能であった。
【０３１９】
iv）治療
４０匹の雌のｈＡＰＰ遺伝子導入マウスを、異なる２つの投与量の試験物質ＸＧ−１０２（配列番号１１）で、すなわち、２週間ごとに０．１ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ．）で、または、３週間ごとに１０ｍｇ／ｋｇ（ｂ．ｗ．）で、治療するか（グループ当たりｎ＝１２）、または、４ヶ月にわたり３週間に１度、ビヒクル（ｎ＝１２）（ｓ．ｃ．）で治療した。
【０３２０】
ｖ）  モリス水迷路（ＭＷＭ）
モリス水迷路（ＭＷＭ）試験を、直径１００ｃｍの黒い円形プールにおいて行った。温度が２２±１°Ｃの水道水を充填し、プールを、視覚的に４つの区域に分割した。水の表面の真下約０．５ｃｍに、透明のプラットフォーム（直径８ｃｍ）を置いた。予備試験を除く、全試験セッションの間、プラットフォームを、プールの南西の四分区間内に置いた。４日間続くトレーニングセッションの前日に、動物は、いわゆる「予備試験」（６０秒続く試験を２回）を行って、各マウスの視覚能力が正常であるかを確認する必要があった。この条件を満たした動物だけを、ＭＷＭ試験に用いた。
【０３２１】
ＭＷＭ試験では、各マウスは、４日連続して、３つのテストを行わなければならなかった。１つのテストは、最大１分間かかった。この時間の間、マウスは、隠された透明の目標を探さなければならない。動物が、水から「道」を探すことができなければ、試験担当者が、マウスを導くか、またはプラットフォーム上に載せた。各試験後、マウスは、１０〜１５秒間、プラットフォームの上で休息を許された。この時間の間に、マウスは、環境における位置確認を行うことが可能であった。追跡システムが悪影響することを回避するために、薄暗い照明条件下で調査を行った（Kaminski; PCS, Biomedical Research Systems）。
【０３２２】
プールを取り囲む壁の上には、黒、太字の記号（例えば、円および四角形）が記載されたポスターを貼った。このポスターは、マウスが、位置確認のためにこれらの記号を目印として使用することができるものである。各テストの、泳いでいるグループは、５〜６匹のマウスから構成されている。そのため、試験と試験との間の時間として、約５〜１０分を確保した。
【０３２３】
逃避潜時（マウスが、隠されたプラットフォームを見つけるため、従って、水から逃避するために必要とした時間［秒］）、経路（標的に達するための軌道［メーター］の長さ）、および、ゴールの四分区間における居住の定量化のために、コンピュータによる追跡システムを用いた。コンピュータは、プール中央の上方に設置されたカメラに接続されている。カメラは、マウスの尻尾の上に、小さなヘアピンで固定させた発光ダイオード（ＬＥＤ）の信号を検出する。
【０３２４】
４日目の最後のテストの１時間後に、マウスは、いわゆるプローブテストを実行しなければならなかった。この時点で、プラットフォームをプールから除去して、この１分間のプローブテストの間に、実験担当者は、元の標的位置を越えたマウスの数を計数した。さらに、この四分区間内にいるマウスと、他の３つの四分区間内にいるマウスの数を計数した。この試験の間はずっと、マウスは、プラットフォームについての、どんな性質のいかなる手がかりも、得ることはできなかった。
【０３２５】
vi）  組織サンプリング
治療周期の終わり、且つ、全ての行動試験の後に、残った全てのマウス（ｎ＝２８）を犠牲にした。このために、全てのマウスを、ＳＯＰ  ＭＥＴ０３０に記載される標準的な吸入麻酔（Isofluran, Baxter）によって沈静した。
【０３２６】
大後頭孔の鈍的切開および露出により、脳脊髄液（ＣＳＦ）を得た。露出させた大後頭孔の中に、パスツールピペットを、約０．３〜１ｍｍの深さまで挿入した。ＣＳＦを、流れが完全に停止するまで、吸引および毛管作用によって採取した。各試料の２つの部分標本を、直ちに冷凍し、ＥＬＩＳＡ技術によるさらなる分析に用いるまで、−８０°Ｃで保持した。
【０３２７】
ＣＳＦのサンプリングの後、各マウスを仰向けに置いて、胸部を切開し、１ｃｃの注射器に取り付けられた２６−標準規格注射針を、右心室の中に挿入した。この針を軽く吸引して、ＥＤＴＡの中に血を採血し、続いて、血漿を得るために用いた。血漿を得るために、各マウスからの血液サンプルを、遠心分離機（GS - 6R Beckman)において、スイングバケツ（swing buckets）(GH - 3.8 BECKMAN）を有するローターを用いて、１，７５０ｒｐｍ（７００ｇ）で１０分間回転させた。血漿を冷凍して、さらなる分析まで、−２０°Ｃで保存した。
【０３２８】
血液サンプリングの後、遺伝子導入マウスの心臓内を、０．９％の塩化ナトリウムで灌注した。脳を、素早く取り出し、小脳を切除した。全てのマウスの右脳半球を、生成したばかりの新鮮な４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）中において、室温で１時間、液浸固着させた。その後、脳を、１５％のスクロースＰＢＳ溶液に２４時間移して、凍結防止を確保した。次の日に、脳を、イソペンタン内で冷凍し、組織調査（ＳＯＰ  ＭＥＴ０４２）に用いるまで、−８０°Ｃで保存した。左脳半球の重量を計測し、液体窒素中で冷凍し、−８０°Ｃで、生化学分析用に保存した。
【０３２９】
vii）Ａβ1-40およびＡβ1-42の判定
各Ｔｇマウスの４つの異なる脳ホモジネート分画、およびＣＳＦ試料における、Ａβ1-40およびＡβ1-42のレベルを、ＥＬＩＳＡ技術によって評価した。高感度のＡβ1-40およびＡβ1-42ＥＬＩＳＡ試験キットを、The Genetics Company（商標），スイス（ＳＯＰ  ＭＥＴ０５８）から購入した。
【０３３０】
ＣＳＦを、上記のとおりに用意した。脳ホモジネートのために、冷凍した脳半球を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＴＲＩＳ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）−緩衝液（５ｍｌ）中で、ホモジナイゼーションを行った。１．２５ｍｌのこの初期の脳ＴＢＳホモジネートを、−８０°Ｃで保存した。１．２５ｍｌをさらに調査した。残りの脳ホモジネート（２．５ｍｌ）を遠心分離にかけ、結果として生じた上清（＝ＴＢＳ分画）を等分し、ＥＬＩＳＡ判定まで−２０°Ｃで保存した。
【０３３１】
ペレットを、トリトンＸ−１００（２．５ｍｌ）中に懸濁させ、遠心分離機にかけ、上清（＝トリトンＸ−１００分画）を等分し、−２０°Ｃで保持した。これらのステップを、ＳＤＳ（２．５ｍｌ）で繰り返した。ＳＤＳ分画からのペレットを、次の遠心分離にかける前に、７０％の蟻酸（０．５ｍｌ）中で懸濁させた。得られた上清を、等分されると共に−２０°Ｃで保持された１ＭのＴＲＩＳ（９．５ｍｌ）で中和した（＝ＦＡ分画）。
【０３３２】
４つの脳ホモジネート分画（ＴＢＳ、トリトンＸ−１００、ＳＤＳ、およびＦＡ）の試料を、ＥＬＩＳＡ技術によるＡβ1-40およびＡβ1-42判定に用いた。ＥＬＩＳＡ試験キットは、The Genetics Company（商標），スイス（ＳＯＰ  ＭＥＴ０６２）から購入したものである。ＴＢＳおよびトリトンＸ−１００が、単量構造からオリゴマー構造までを溶解したと推測可能である。前原腺維および水不溶性の原腺維のようなポリマーは、ＳＤＳおよびＦＡに溶解可能であった。これに関して、４つの全分画の調査は、Ａβ重合状態への洞察も提供する。
【０３３３】
viii）  脳形態の評価
調査した全Ｔｇ動物の脳組織は、本手順のばらつきによる偏りを回避するために、正確に同じ方法で処理した。２４Ｔｇマウス（グループ当たり８匹）の脳の半分から、各層（全部で５層）当り、２０ｃｒｙｏ−切片を、１０μｍの厚さ（Leica CM 3050S）で矢状に切断し、５つ（各層から１つずつ）を処理し、プラーク負荷の定量化を評価した。矢状の５つの層は、Paxinos and Franklinの形態アトラス「The Mouse Brain」（第２版）に記載の、図１０４〜１０５、１０７〜１０８、１１１〜１１２、１１５〜１１６、および１１８〜１１９に対応している。
【０３３４】
第１の層は、領域ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＧＤｌｂ、およびＧＤｍｂの全海馬を含む要件によって特定されている。海馬および皮質における免疫反応性を、モノクローナルヒトＡβ−特異性抗体６Ｅ１０（Signet）およびチオフラビンＳ染色剤を用いて、定量化して評価した。残りの脳半球または用いられなかった脳組織は、本プロジェクトが終了するまで、ＪＳＷ  ＣＮＳにおいて、保存および貯蔵した。
【０３３５】
ｂ）  評価
ｉ）  行動
モリス水迷路試験では、スイミングプールの長さ、スイミング経路、逃避潜在時間、スイミング速度を、および、以前のプラットフォームを越えるプローブテストでは、各Ｔｇ動物について、位置、およびプールの各四分区間で過ごす時間を、特別なコンピュータソフトウェアで測定した。
【０３３６】
ii）  生化学的評価
全てのＴｇマウスの、ＣＳＦ試料、および脳標本からの試料を、市販のＡβ1-40およびＡβ1-42ＥＬＩＳＡで分析した。適切な基準の測定を同時に行った。脳標本からの試料２部を分析した。試料の数が少ないため、ＣＳＦ試料は、１回の測定のみで分析した。
【０３３７】
iii）  組織構造
i1）  アミロイド沈着およびプラーク負荷の測定
６Ｅ１０免疫組織化学のために、次の評価手順を用いた。
【０３３８】
aa）  スライス境界の視覚化のための画像を、画像にコントラストを付加せずに、対比する。
【０３３９】
bb）  皮質の輪郭のインタラクティブ画像および、その後の皮質面積（＝領域面積）を測定する。
【０３４０】
cc）  染色された対象が、所定の強度に基づいた閾値（各画像で同一）よりも上、且つ、８μｍ2のサイズよりも上で検出される、対象となる区域（ＡＯＩ）をインタラクティブ描写する。
【０３４１】
dd）  信号／ノイズ比（各画像で同一）を向上させるための滑らかなコントラスティングの後、各対象の区域の測定、すなわち、ＡＯＩ内の染色された区域の合計、および、対象の総数を測定する。
【０３４２】
ee）  海馬についても、aa）−dd）を繰り返し行う。
【０３４３】
ff）  平均プラーク寸法（＝「プラークの総面積／プラークの総数」）、相対プラーク数および面積（＝「プラークの数／領域面積」および「プラークの総面積／領域面積＊１００」）を計算する。
【０３４４】
gg）  Ｅｘｃｅｌのスプレッドシートに、「画像の名称、領域面積、プラークの数、プラークの総面積、プラークの相対数、相対プラーク面積、および平均プラーク寸法」といったパラメータを含むデータを自動転送する。画質および除外基準をそれぞれ記録するために、備考欄のフィールドを用いた。除外基準は、スライスの欠損部分、多くの皺、顕著な傷、または、（例えば、阻止試薬の完全な反応を阻害し得る膨張による）染色の不整合である。
【０３４５】
hh）  （未加工データを未加工のまま維持するために）画像を保存せずに閉じる。
【０３４６】
ｃ）  結果
ｉ）  一般的観察
全部で４０匹の雌のｈＡＰＰ  Ｔｇマウスを、調査の対象とした。これらのマウスのうち、１２匹の動物が、治療期間が終了する前に、原因不明により死亡した。
【０３４７】
ii）  行動的結果
ＭＷＭにおける空間的学習は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療によっては、全く影響されない状態で維持された。０．１ｍｇ／ｋｇで治療したマウスは、１日目と４日目との間において、学習実績が悪いという傾向を示した。１日目および４日目の平均実績の二方向ＡＮＯＶＡにより、全てのグループ（ｐ＜０．００１）にとって、有意の高い学習を示しただけでなく、因子処理の有意の影響（ｐ＝０．０４５）も示した。しかし、ボンフェローニのポストテストは、有意点まで達しなかった。
【０３４８】
iii）  生化学的結果
aa）  脳ホモジネート分画のＡβレベル
試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療は、脳ホモジネートＡβ1-40レベルに影響を与えなかった（図１１参照）。Ａβ1-42レベルのグループ間の差異は、トリトンＸ−１００分画において現れただけであった。トリトンＸ−１００分画では、低投与量の試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）（０．１ｍｇ／ｋｇ）で治療された動物は、ビヒクルグループ（ｐ＜０．０５）および高投与量のグループ（ｐ＜０．０１）と比べて、著しい低下を示した。
【０３４９】
bb）  ＣＳＦのＡβレベル
試験物質ＸＧ−１０２（配列番号２）による治療の後、ＣＳＦのＡβ1-40およびＡβ1-42レベルは、ビヒクルグループと比べて、著しく低下した。どちらグループも、Ａβ1-40およびＡβ1-42のｐ値は、高投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）ではｐ＜０．０１であり、ＸＧ−１０２（配列番号２）の低投与量では＜０．０５であった（図１２参照）。
【０３５０】
iv）  脳組織構造および免疫組織化学の結果
aa）  アミロイド沈着およびプラーク負荷
プラーク負荷を、異なる２つの方法によって定量化した。一方の方法である、主にヒトアミロイドペプチドのＡＡ１−１に対する６Ｅ１０を用いたＩＨＣ染色法を行った。他方の、成熟した神経炎プラークのベータ−シート構造およびコアを標識化するチオフラビンＳ染色法を行った。
【０３５１】
まず、切開およびＩＨＣ手順における問題、および治療によってある程度誘発される萎縮症を排除することが可能であることを示すために、測定する領域区域である、皮質および海馬を、全てのグループを通して極めて一定にする（＞５％の変化がこの方法によって検出可能である）。
【０３５２】
６Ｅ１０およびチオフラビンＳの定量化は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療の後の、プラークの中心における、ベータ−シート構造が選択的に低減され、その一方で、残留したヒトアミロイドは、この治療からは影響を受けないか、または、わずかに増大したことを示している。
【０３５３】
詳細に言うと、皮質の６Ｅ１０ＩＲプラーク負荷は、１０ｍｇ／ｋｇＸＧ−１０２（配列番号１１）で治療したマウスのビヒクルと比べて、増大した。しかし、海馬プラークの数では、有意水準に達した。図１３および１４は、６Ｅ１０  ＩＨＣと異なり、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療により、海馬のチオフラビンＳにポジティブなプラークの数、および、面瀬の比率（プラークの数：１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の場合ｐ＜０．０５、０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の場合ｐ＜０．０１）が、負の用量依存して、低減されることを示している。
【０３５４】
０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療は，また、平均プラーク寸法を減少させた。しかし、この作用は、ＡＮＯＶＡ（無対の両側Ｔ検定：ｐ＝０．０７４）では、有意水準に達しなかった。皮質よりも海馬において、おそらく後のプラークの病理症状に起因するであろう環境において、皮質のプラークでは、これらの作用は生じなかった。５ヶ月齢において治療を開始することは、海馬におけるプラーク堆積の時点に正確に適合しているが、その一方で、皮質のプラークは、３ヶ月齢において、定量化のために用いられる拡大において視認可能になり始める。
【０３５５】
質的には、チオフラビンＳで染色されたプラークに対する、６Ｅ１０の比率は増大し、２重に標識化されたスライスに見られるようなベータ−シートプラークのコアの寸法は、小さくなる。
【０３５６】
まとめると、これらのデータは、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療が、プラーク堆積の初期段階におけるベータ−シート形成、および、プラークコアにおけるベータ−シート形成に、それぞれ、作用することを、裏付けている。
【０３５７】
ｄ）  作用のまとめ、および結論
・モリス水迷路において測定された空間的ナビゲーションは、治療から影響を受けない状態で維持された。０．１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療により、学習実績は、結果的に、トレーニングの第１日目と最終日との間で、わずかにより乏しくなった。
【０３５８】
・０．１ｍｇ／ｋｇＸＧ−１０２（配列番号１１）グループのトリトンＸ−１００が減少したことを除いて、Ａβ1-40およびＡβ1-42脳レベルは、安定した状態を維持した。
【０３５９】
・ＣＳＦでは、両方の投与量および両方の分画について、Ａβレベルの減少が検出可能であった。
【０３６０】
・６Ｅ１０の定量化において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療が、高投与量であるグループのヒトアミロイドベータを、増大させる傾向があった。このことは、Ａβ  ＥＬＩＳＡによって得られたデータと一致している。
・これとは異なり、チオフラビンＳ染色法によって検出された海馬のベータ−シート負荷は、ＸＧ−１０２（配列番号１１）の治療後、投与量に依存して低減し、低投与量である０．１  ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）において、大きく低減したが、残留した皮質のプラーク負荷は、不変のまま維持された。処理開始時における、年齢に依存した、海馬内のプラーク堆積の開始に従って、これは、プラーク堆積の初期の段階におけるベータ−シート形成に対する初期のアクションを示唆している。
【０３６１】
実施例１５：２型糖尿病の治療における、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の活性の判定
実施例１５は、２型糖尿病の治療において、ＩＢ（ｓ）ペプチド、並びに、全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチド、およびその改変体の活性を決定すること、特に、２型糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるＸＧ−１０２（配列番号１１）による慢性的治療の効果を、空腹時血糖値を３日ごとに（２８日間）に測定することによって、判定することを、意図するものである。
【０３６２】
材料および方法
ｉ）  動物
全部で二十（２０）匹の雄のｄｂ／ｄｂマウス（８週間齢）を、Charles River（ドイツ）から入手した。他の記載がない限り、到着後、動物は、グループごとに（グループ当たりｎ＝６〜７）収容し、げっ歯類用の標準食（Altromin standard #1324 chow; C. Petersen, Ringsted，デンマーク）および水を、自由に与えた。
【０３６３】
これらのマウスを、温度および湿度が制御された部屋に、（４：００に点灯し、１６：００に消灯する）１２：１２のＬ／Ｄ周期の下で、収容した。
【０３６４】
ii）  グループおよびランダム化
到着後、４日後において（On day-4）、マウスを、血糖値（空腹時；Biosen S line分析器（EKF diagnostic，ドイツ）上で測定した血糖）に基づいてランダム化して、次の薬剤治療グループ（ｎ＝６）のうちの１つに加えた。
【０３６５】
１）  ビヒクルコントロール、Ｓ．Ｃ．（生理食塩水）
２）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）、１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．
３）  ＸＧ−１０２（配列番号１１）、１０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ
上記の全ての投与量は、ベースフリーで測定した。薬剤の純度：９５．２８％，ペプチド含有量：７８．０％。全ての化合物を、３ｍｌ／ｋｇの容積で、皮下（ｓ．ｃ．）投与した。ビヒクルコントロールおよびＸＧ−１０２（配列番号１１）の製剤説明は、次のとおりである。
【０３６６】
まず、ＸＧ−１０２（配列番号１１）をビヒクル中に溶解させる。製剤（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの投与量にそれぞれ対応する、濃度０．３３および３．３ｍｇ／ｍｌ）を、以下の手順に従って調製した。試験成分の純度およびペプチド含有量を考慮して、濃度を計算し、表示した（乗算係数は１．３４６であった）。
【０３６７】
・  原液の調製：冷凍−乾燥させた試験化合物ＸＧ−１０２（配列番号１１）を、最低１時間、解凍し、１ｍＭ（３．８２３ｍｇ／ｍＬに相当）のビヒクル中の、原液として調製した。部分標本を、治療日ごとに用意し、約−８０°Ｃで保存した。この原液を、治療日ごとに、所望の濃度まで希釈した。
【０３６８】
・  原液の保存：約−８０°Ｃ；
・  希釈した製剤の保存：室温で最大２４時間
溶解する前に、粉末を、−２０°Ｃで保存した。原液の安定性は、約−８０°Ｃで３ヶ月である。動物に投与するための希釈した製剤の安定性は、室温で２４時間である。未使用の希釈材料は、４〜８°Ｃで保存されているならば、最大７日間保存可能であった。
【０３６９】
ｃ）  実験の手順
８日間の環境順化の後、マウスを、アウトライングループに従って、２１日間、毎日午前８時に、午後４時の消灯の８時間前にＳＣ投与することによって、治療した。その後、調査２１日目に、最も高濃度のＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を停止し、その一方で、調査２８日目まで、日用量のビヒクルコントロールおよびＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）を継続した。調査２８日目から１１１日目の終了日まで、ビヒクルおよびＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療されたマウスを、ウォッシュアウト期間（投与なし）において観察し、その一方で、ＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスを、２８日間の治療後に、処分した。
【０３７０】
ｉ）  血糖
投与の６時間後に、７時間の空腹状態の動物からの血糖を、尻尾の血管からの１０μｌの血液試料を、ヘマトクリットチューブに採取することによって測定し、次に、Biosen s-line分析器（EKF-diagnostic、ドイツ）で分析した。
【０３７１】
ii）  代謝飼育カゴ
グループ１＋３：マウスを代謝飼育カゴの中に置いて、２４時間の食料および飲料摂取、並びに、２４時間の尿および糞の生成を記録した。マウスを、ｎ＝６〜７の２つのサブチームに分類し、続いて、調査７１〜７２日目に、代謝の特性付けを行った。
【０３７２】
iii）  アジポキンパネル
グループ１＋３：３つのケース（調査５７日目、６６日目、および１０８日目）において、血液を、尻尾の血管から、ＥＤＴＡが被覆されたヘマトクリットチューブ（１００μｌ）を用いて採取した。その後、血液の遠心分離を行い、血漿を採取し、−２０°Ｃで、測定まで保存した。その後、次のアジポキン／サイトカインのパネルを、Luminexに基づいた７つのplex、すなわち、レプチン、レジスチン、ＭＣＰ−１、ＰＡＩ−１、ＴＮＦα、インスリン、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）を用いて決定した。
【０３７３】
iv）  終了
グループ１＋３（１１１日目）：次の臓器、すなわち、鼠径部皮下脂肪、副睾丸脂肪、後腹膜脂肪、脳、肝臓、腎臓、脾臓、および心臓を抽出し、重量を量った。ここに記載の全ての臓器は、場合によっては行われる将来の組織病理学検査のための４％ＰＦＡ中の試料である。また、膵臓（全体）を、場合によっては後に行う立体学的且つ免疫組織化学分析のために採取し、目を、場合によっては後に行う網膜症の分析のために採取した。グループ２（２８日目）：組織も血漿も採集しなかった。
【０３７４】
ｃ）  結果
ｉ）  一般的観察
急性の投与周期の間、動物は、通常のレベルの敏捷さおよび活性を示しており、薬剤で治療した動物において、鎮静作用の徴候はなかった。ビヒクルで処理された動物間では、食料および飲料摂取は、通常の範囲内であった。
【０３７５】
しかし、およそ２週間の投与の後、皮下組織において、結節性腺維症が、高投与量のＸＧ−１０２（配列番号２）化合物に対する反応として、観察された。これらの結節状腺維症は、グループＣの全てのマウスにおいて、開放創に進行した。グループＢでは、軽い結節状腺維症が観察された。結果として、注射部位の変更を行った。動物への投与が完了した後、これらの動物は治癒し、結節状腺維症も、徐々に消滅した。ビヒクルで処置された動物では、何の臨床的作用も観察されなかった。
【０３７６】
ii）  血糖
空腹時血糖値（絶対および相対）が、図１５に示されている。グループＡおよびＣにおいて、空腹時血糖を、６８日目まで３日ごとに測定し、１１１日目の終了日まで、定期的に測定した。
【０３７７】
ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療された糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスの空腹時血糖値において、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ有意の（ｐ＜０．００１）減少が観察された。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスの空腹時血糖値は、約５ｍｍｏｌ／Ｌで低い横ばい状態に達した。この作用は、投与の１４日後に現れ、調査の間ずっと、従って、２１日目〜１１１日目までのウォッシュアウト期間の間、維持された。これとは異なり、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与した２８日間の間、何の作用も観察されなかった。
【０３７８】
iii）  体重
体重の測定（絶対および相対）が、図１６に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療したマウスにおいて、体重増加が、ビヒクルコントロールと比べて、明らか且つ有意（ｐ＜０．００１）に阻害されたことが観察された。この作用は、投与の２８日目から現れ、終了日である１１１日目まで持続した。これとは異なり、低投与量のＸＧ−１０２（配列番号２）（１ｍｇ／ｋｇ）では、投与した２８日間の間、体重に何の作用も観察されなかった。
【０３７９】
代謝飼育カゴ
ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の、調査６８目日の代謝飼育カゴにおいて、測定される、２４時間の食料および飲料摂取、並びに、尿および糞の生成に与える影響が、図１７（ｇ）および図１８（体重のｇに標準化された）に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）は、食料摂取および尿の生成を減少させる傾向があったが、ビヒクルコントロールと比べて、測定されたパラメータのいずれにも有意の作用も与えなかったことが、観察された。
【０３８０】
アジポキン
５７日目、７７日目、および１０８日目に測定されたビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、インスリン、ＭＣＰ−１、およびＩＬ−６の血漿レベルに与える作用が、図１９に示されており、ｔＰＡＩ−１、ＴＮＦ、およびレジスチンの血漿レベルに与える作用が、図２０に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）で治療された動物の７７日目および１０８日目において、血漿レジスチンのレベルが有意に高かったことを除いて、ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）は、ビヒクルコントロールと比べて、測定されたパラメータのいずれにも、有意の作用を与えなかったことが観察された。
【０３８１】
処分時の組織重量
ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）の、副睾丸脂肪パッド、鼠径部皮下脂肪パッド、および後腹膜脂肪パッドの組織重量に与える作用が、図２１に示されている。ＸＧ−１０２で治療されたマウスでは、ビヒクルコントロールと比べて、副睾丸（ｐ＜０．０５）および後腹膜（ｐ＜０．０１）の脂肪質量における著しい減少が、観察された。
【０３８２】
ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、脳、脾臓、および心臓の組織重量に与える作用が、図２２に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、ビヒクルコントロールと比べて、これらのパラメータに何の優位な作用も与えないことが観察された。
【０３８３】
最終的に、ビヒクルまたはＸＧ−１０２（配列番号２）（１０ｍｇ／ｋｇ）が、腎臓および肝臓の組織重量に与える作用が、図２３に示されている。ＸＧ−１０２（配列番号２）で治療したマウスにおいて、ビヒクルコントロールと比べて、腎臓（ｐ＜０．０５）および肝臓（ｐ＜０．０１）の質量が著しく減少したことが観察された。
【０３８４】
これらの結果をまとめると、１０ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与は、血糖値の著しい減少を導くと考えられ、従って、ＸＧ−１０２（配列番号１１）は、糖尿病および上昇した血糖値の治療のための、有望な新規の手段であると考えられる。
【０３８５】
実施例１６：好ましい各実施形態
以下に、本発明に係る幾つかの好ましい各実施形態を列挙する。
【０３８６】
１．  １５０個よりも短い長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列の、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体における上記ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害は、自己免疫疾患、心疾患、癌疾患、糖尿病（１型または２型の糖尿病を含む）、炎症性疾患、脱毛症（円形脱毛症を含む）、肺の疾患、神経疾患または神経変性疾患、肝臓の疾患、脊椎の疾患、子宮の疾患、ウイルス感染症、およびうつ病から選択される、使用。
【０３８７】
２．  実施形態１に係る使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５に記載の配列のいずれかによって規定された、またはコードされた、ヒトまたはラットＩＢ１配列、または、その任意の断片若しくは改変体に由来する、使用。
【０３８８】
３．実施形態１または２に係る使用であって、上記自己免疫疾患は、狼瘡、紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群を含む自己免疫疾患から選択される、使用。
【０３８９】
４．  実施形態１または２に係る使用であって、上記心疾患は、心臓疾患および冠状動脈性心臓病、動脈硬化症、脳溢血、（腎動脈瘤高血圧といった）腹大動脈の拡張、並びに心筋梗塞症から選択される、使用。
【０３９０】
５．  実施形態１または２に係る使用であって、上記癌疾患は、カポジ肉腫、急性骨髄性白血病（赤白血病を含む）、黒色腫、悪性黒色腫、結腸癌、リンパ腫、肉腫、芽球腫、腎臓癌、胃腸腫瘍、神経膠腫、前立腺腫瘍、膀胱癌、直腸腫瘍、胃癌、咽頭癌、膵臓癌、肝臓癌、乳癌（＝乳腺癌）、子宮癌、子宮頸癌、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘパトーム、逆ウイルス誘発性腫瘍（例えば、パピローマウイルス誘発性悪性腫瘍（例えば子宮頸癌）、腺癌、ヘルペスウイルス誘発性腫瘍（例えば、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ−誘発性Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎−誘発性腫瘍（肝細胞癌）、ＨＴＬＶ−１−誘発性リンパ腫およびＨＴＬＶ−２−誘発性リンパ腫、聴神経神経鞘腫、肺悪性腫瘍（＝肺癌＝気管支悪性腫瘍）、小細胞肺癌、咽喉癌、肛門癌、膠芽腫、直腸癌、星状細胞腫、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽腫、膣癌、睾丸癌、甲状腺癌、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー病、下垂体部腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、棘細胞癌、バーキットリンパ腫、喉頭癌、腎臓癌、胸腺腫、子宮体癌、骨肉腫、非ホジキンリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭頸部腫瘍、乏枝神経膠、外陰癌、腸癌、結腸癌、食道癌（＝咽頭癌）、いぼ状態（wart conditions）、小腸腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣悪性腫瘍、軟部組織腫瘍、卵巣癌（＝卵巣悪性腫瘍）、膵臓悪性腫瘍（＝膵臓癌）、子宮内膜癌、肝転移、陰茎癌、舌癌、胆のうがん、白血病、形質細胞腫、眼瞼腫瘍、前立腺癌（＝前立腺腫瘍）などから、または、インフルエンザ、マラリア、ＳＡＲＳ、黄熱病、ＡＩＤＳ、ライム病、リーシュマニア症、炭疽病、髄膜炎から選択される感染症から、選択される、使用。
【０３９１】
６．  実施形態１または２に係る使用であって、上記炎症性疾患は、肺の炎症若しくは急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を含む肺疾患、または、繊維組織の形成が含まれ、嚢胞性腺維症を含む組織の炎症である肺腺維症、髄膜炎、移植拒絶反応から選択される、使用。
【０３９２】
７．  実施形態１または２に係る使用であって、上記肺の疾患は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、呼吸器系に関連する慢性病（喘息を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎、および肺腺維症を含む、肺の炎症または肺疾患から選択される、使用。
【０３９３】
８．  実施形態１または２に係る使用であって、上記神経疾患または神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋失調症、癲癇、視神経疾患（緑内障を含む）、目の感染、多発性硬化症、髄膜炎、神経系によって引き起こされる神経細胞疾患または神経系の疾患または障害（軸索切断といった軸索の「切断」または中断を含む）、苦痛（特に神経障害性の痛み）、ウイルス性脳障害から選択される、使用。
【０３９４】
９．  実施形態１または２に係る使用であって、上記肝臓の疾患は、肝炎、肝臓中毒症から選択される、使用。
【０３９５】
１０．  実施形態１または２に係る使用であって、上記脊椎の疾患は、椎間板ヘルニアから選択される、使用。
【０３９６】
１１．  実施形態１または２に係る使用であって、上記子宮の疾患は、子宮内膜症から選択される、使用。
【０３９７】
１２．  実施形態１または２に係る使用であって、上記ウイルス（感染）症は、ＨＳＶ、カポジ肉腫、尖圭コンジローム、伝染性軟属腫、デング熱、三日熱、エボラウイルス、風邪、初夏髄膜脳炎（ＥＳＭＥ）、帯状疱疹、肝炎、単純ヘルペスＩ型、単純ヘルペスＩＩ型、ヘルペスゾスター、インフルエンザウイルス、日本脳炎、ラッサ熱、マーブルグウイルス、麻疹、口蹄疫、単球増加症、おたふくかぜ、ノーウォークウイルス感染症、パイファー腺熱、天然痘、小児麻痺（脊髄性小児麻痺）、仮性クループ、伝染性紅斑、狂犬病、いぼ、西ナイル熱、水痘、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、オルソポックス天然痘ウイルス、オルソポックスアラストリム・ウイルス、パラポックスオヴィス・ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヘルペスＢウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ヒト巨大細胞ウイルス、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、エプスタイン−バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス８、Ｂ型肝炎ウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ルビウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルスＣ、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、跳躍病ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、Ｂ型日本脳炎ウイルス、ポワッサンウイルス、ＦＳＭＥウイルス、ＳＡＲＳ−関連性コロナウイルス、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＯｃ４３、トロウイルス、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩ型、ヒトＴ細胞リンパ好性ウイルスＩＩ型、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）（すなわちヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型）、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、タカリベウイルス、フニンウイルス、マチュポウイルス、ボルナ病ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、サンチョウバエ熱ウイルス、トスカーナウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハザラウイルス、ハサンウイルス、ハンタンウイルス、ソウルウイルス、プロスペクトヒルウイルス、プーマラウイルス、ドブラバ−ベルグラードウイルス、ツラウイルス、シンノンブレウイルス、ヴィクトリア湖マーブルグウイルス、ザイールエボラウイルス、スーダンエボラウイルス、アイボリーコーストエボラウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、狂犬病ウイルス、モコラウイルス、ドウベンハーゲウイルス、ヨーロッパコウモリリッサウイルス１＋２、オーストラリアコウモリリッサウイルス、アデノウイルスＡ−Ｆ、ヒトパピローマウイルス、疣贅ウイルス６、疣贅ウイルス１１、ポリオーマウイルス、アデノ随伴ウイルス２、ロタウイルス、またはオルビウイルス、水疱瘡（水痘帯状疱疹ウイルスを含む）、またはマラリアウイルスから選択されるか、または、該ウイルスによって引き起こされる、使用。
【０３９８】
１３．  実施形態１または２に係る使用であって、上記鬱病は、大うつ病、大うつ病、単極性鬱病、臨床的鬱病、鬱病、双極性障害、躁鬱病から選択される、使用。
【０３９９】
１４．  実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の、ＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、５〜１５０個、より好ましくは１０〜１００個、さらにより好ましくは１０〜７５個、および最も好ましくは１０〜５０個の範囲のアミノ酸残基を含む、使用。
【０４００】
１５．  実施形態１〜４のいずれかに記載の、ＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）に結合する、使用。
【０４０１】
１６．  実施形態１〜５のいずれかに記載の、ＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、上記ＪＮＫ阻害剤配列が、ＪＮＫを発現する細胞内に存在するときに、少なくとも１つのＪＮＫ標的転写因子の活性化を阻害する、使用。
【０４０２】
１７．  実施形態１〜１６のいずれかに係る、ＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ標的転写因子は、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋｌから構成される群から選択される、使用。
【０４０３】
１８．  実施形態１〜１７のいずれかに係る、ＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、ＪＮＫを発現する細胞内に存在するときに、ＪＮＫ効果を変更する、使用。
【０４０４】
１９．  実施形態１〜１８のいずれかに係る使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれらの組み合わせから構成されており、好ましくは、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４、または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含み、上記Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、上記ＪＮＫ阻害剤配列において、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で配置されている、使用。
【０４０５】
２０．  実施形態１〜１９のいずれかに係る使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、または、その断片、誘導体、若しくは改変体を含むか、またはこれから構成されている、使用。
【０４０６】
２１．  共有結合によって連結された、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドであって、上記第１のドメインは、トラフィッキング配列を含み、上記第２のドメインは、実施形態１〜２０のいずれかにおいて規定されたＪＮＫ阻害剤配列を含む、キメラペプチドの、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体における、上記ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害は、実施形態１〜１３のいずれか１つに規定されている、使用。
【０４０７】
２２．  実施形態２１に係る、キメラペプチドの使用であって、上記キメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれらの組み合わせから構成され、好ましくは、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含み、上記Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、上記キメラペプチドにおいて、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で配置されている、使用。
【０４０８】
２３．  実施形態２１または２２に係る、キメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を含む、使用。
【０４０９】
２４．  実施形態２１〜２３のいずれかに係る、キメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、配列番号５、６、７、８、２１、または２２のアミノ酸配列から構成されているか、またはこれを含む、使用。
【０４１０】
２５．  実施形態２１〜２４のいずれかに係る、キメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、上記ペプチドの細胞取り込みを増大させる、使用。
【０４１１】
２６．  実施形態２１〜２５のいずれかに係る、キメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、上記ペプチドの核局在化を導く、使用。
【０４１２】
２７．  実施形態２１〜２６のいずれかに係る、キメラペプチドの使用であって、上記キメラペプチドは、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載のアミノ酸配列、またはその断片、若しくは改変体から構成されているか、またはこれを含む、使用。
【０４１３】
２８．  実施形態１〜２０のいずれかにおいて規定されたＪＮＫ阻害剤配列または実施形態２１〜２７のいずれかにおいて規定されたキメラペプチドをコードする、単離された核酸の、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体における上記ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害は、実施形態１〜１３のいずれか１つに従って規定されている、使用。
【０４１４】
２９．  実施形態２８において規定された核酸を含むベクターの、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体における上記ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害は、実施形態１〜１３のいずれか１つに従って規定されている、使用。
【０４１５】
３０．  実施形態２９において規定されたベクターを含む細胞の、被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するための使用であって、被験体における上記ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害は、実施形態１〜１３のいずれか１つに従って規定されている、使用。
【０４１６】
３１．  被験体におけるＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害を治療するための薬剤組成物を調製するための、実施形態１〜２０のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列に免疫特異的に結合する抗体の使用、または、実施形態２１〜２７のいずれかに係るキメラペプチドに免疫特異的に結合する抗体の使用であって、被験体における上記ＪＮＫシグナル伝達に強く関連する疾患または障害は、実施形態１〜１３のいずれか１つに従って規定されている、使用。
【０４１７】
３２．  上述の実施形態のいずれかに係る使用であって、上記薬剤組成物は、非経口経路（静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、経皮経路を含む）、経腸経路（経口経路、直腸経路を含む）、局所経路（経鼻経路、鼻内経路を含む）、および、他の経路（表皮送達またはパッチ送達）から構成される群から選択された１つの投与経路によって投与される、使用。
【図１】
0005485265.tif 000010
【図２】
0005485265.tif 000011
【図３】
0005485265.tif 000012
【図４】
0005485265.tif 000013
【図５】
0005485265.tif 000014
【図６】
0005485265.tif 000015
【図７】
0005485265.tif 000016
【図８】
0005485265.tif 000017
【図９】
0005485265.tif 000018
【図１０】
0005485265.tif 000019
【図１１】
0005485265.tif 000020
【図１２】
0005485265.tif 000021
【図１３】
0005485265.tif 000022
【図１４】
0005485265.tif 000023
【図１５】
0005485265.tif 000024
【図１６】
0005485265.tif 000025
【図１７】
0005485265.tif 000026
【図１８】
0005485265.tif 000027
【図１９】
0005485265.tif 000028
【図２０】
0005485265.tif 000029
【図２１】
0005485265.tif 000030
【図２２】
0005485265.tif 000031
【図２３】
0005485265.tif 000032
【図２４】
0005485265.tif 000033
【図２５】
0005485265.tif 000034
【図２６】
0005485265.tif 000035
【図２７】
0005485265.tif 000036
【図２８】
0005485265.tif 000037
【図２９−１】
0005485265.tif 000038
【図２９−２】
0005485265.tif 000039
【図３０−１】
0005485265.tif 000040
【図３０−２】
0005485265.tif 000041
【図３０−３】
0005485265.tif 000042
【図３１−１】
0005485265.tif 000043
【図３１−２】
0005485265.tif 000044
【図３１−３】
0005485265.tif 000045
【図３２−１】
0005485265.tif 000046
【図３２−２】
0005485265.tif 000047
【配列表】
0005485265000001.app