(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＪＮＫ阻害剤の、大腸炎を治療するための薬剤組成物を調製するための使用であって、
上記ＪＮＫ阻害剤は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列から構成されているか、またはその改変体であり、
上記改変体は、配列番号１１のアミノ酸の１個または２個の置換、付加、および／または、削除を含み、かつＪＮＫを発現する細胞内に存在するときに、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋｌから構成される群から選択されるＪＮＫ標的転写因子の少なくとも１つの活性化を阻害するものである、使用。
【請求項２】
請求項１において規定されたＪＮＫ阻害剤をコードする、単離された核酸の、大腸炎を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【請求項３】
請求項２において規定された核酸を含むベクターの、大腸炎を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【請求項４】
請求項３において規定されたベクターを含む細胞の、大腸炎を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用であって、上記薬剤組成物は、非経口経路（静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、経皮経路を含む）、経腸経路（経口経路、直腸経路を含む）、局所経路（経鼻経路、鼻内経路を含む）、および、他の経路（表皮送達またはパッチ送達）から構成される群から選択された１つの投与経路によって投与される、使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用であって、上記大腸炎は、潰瘍性大腸炎、クローン病、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、激症大腸炎、化学的大腸炎、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン形成大腸炎、潰瘍性大腸炎、および非定型大腸炎から選択される、使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤の投与量（ｋｇ体重当たり）は、１０ｍｍｏｌ／ｋｇまでの範囲内である、使用。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤の投与量は、１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜１ｍｍｏｌ／ｋｇである、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼ阻害剤の使用に関し、より詳細には、プロテインキナーゼｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼの阻害剤、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または、これをコードする核酸、およびこれを含有する薬剤組成物の、大腸炎などの非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療のための使用に関する。大腸炎には、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン大腸炎（Crohn's colitis）、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、激症大腸炎、化学的大腸炎、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、および、非定型大腸炎などが含まれる。
【０００２】
消化器疾患、具体的には非慢性および慢性の消化器疾患の数は、過去１０年間で、西洋文化圏において著しく増加し、これらの国々の国民医療保障制度にとって大きな課題となっている。消化器疾患は、胃腸管に関連する疾患である。消化器疾患には、食道、胃、十二指腸の第１の部分、第２の部分、第３の部分、および第４の部分、空腸、回腸、回盲部の複合体、大腸、（上行結腸、横行結腸、および下行結腸）Ｓ状結腸、および直腸の疾患が含まれる。
【０００３】
慢性炎症性消化器疾患は、頻繁に生じ、大腸炎などの結腸の炎症を特徴とする。大腸炎には、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病（Crohn's disease）、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、激症大腸炎、化学的大腸炎、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン形成大腸炎、潰瘍性大腸炎、および、非定型大腸炎などが含まれる。
【０００４】
ここで、潰瘍性大腸炎およびクローン病は、２つの主要な慢性炎症性消化器疾患、および、２つの主要な種類の炎症性腸疾患を示す。クローン病および潰瘍性大腸炎はどちらも、発症が過去１０年の間に急激に増加した疾患である。例えば、ドイツでは、人口の約０．０１％〜約０．１％、すなわち約１００，０００人に約１０〜１００人が、クローン病または潰瘍性大腸炎を患っていると推定される。
【０００５】
さらに、クローン病または潰瘍性大腸炎の発生率は、毎年、約１〜約８にて増加している。クローン病に冒される割合は、女性の方がわずかに高く、潰瘍性大腸炎の男性女性の比率は、約１：１である。潰瘍性大腸炎およびクローン病を発病する年齢のピークは、１５歳と３０歳との間である。次のピークは、６０歳と８０歳との間に生じる。
【０００６】
潰瘍性大腸炎は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の１つの形であり、大腸炎の１つのサブタイプである、腸、特に大腸または結腸の疾患である。潰瘍性大腸炎の症候は、典型的には、結腸における特徴的な潰瘍または宿弊を含む。潰瘍性大腸炎は、通常、直腸において始まり、大腸または結腸の近接部位に広がり続ける。この場合、通常、上部胃腸管は冒されない。
【０００７】
進行中の疾患の主な症候は、血が混じった下痢が徐々に始まる場合が多い。この場合、患者は、典型的には、痙攣性の腹痛に苦しむ。潰瘍性大腸炎は、腸外の様々な発症（リウマチ性皮膚病（dermatologic rheumatology）、眼球など）に関連している。
【０００８】
潰瘍性大腸炎は、症候が悪化した周期と比較的症候が無い周期とを有する、間欠性の疾患である。潰瘍性大腸炎の原因は、知られていないが、影響を受けやすい遺伝子成分が存在すると推測される。さらに、この疾患は、環境因子に影響されやすい人間において誘発されると推測される。しかし、潰瘍性大腸炎の症候が自然に軽減されることは稀であり、むしろ、特に疾患が慢性病状に変化した時には、沈静させるための治療が必要である。
【０００９】
潰瘍性大腸炎の治療は、典型的には、疾患の程度および分布に応じて決定され、通常、抗炎症薬による治療、免疫抑制、および、免疫応答の特異成分に標的を当てた生物療法が含まれる。
【００１０】
典型的には疾患が直腸に限られている場合の、軽度または中度の炎症活動（軽度または中度の遠位大腸炎）を伴う病状では、一般的な治療には、通常、Pentasa（登録商標）またはSalofalk（登録商標）などの５−アミノサルチル酸ナトリウムの投与が含まれる。あるいは、坐薬または浣腸剤を用いた局所的な投薬法を用いてもよい。また、特に救急治療において、例えばヒドロコルチゾン、ブデノシド、ベクロメタゾン（Betnesol（登録商標））またはプレドニゾン（Rectodelt（登録商標））を含むステロイド含有薬剤の投与を用いてもよい。
【００１１】
典型的には潰瘍性大腸炎が大腸または結腸の近接部位の中に広がった場合の、重度の炎症活動を伴う病状では、ベクロメタゾン（Betnesol（登録商標））またはプレドニゾン（Rectodelt（登録商標））またはその誘導体などといったグルココルチコイドの、静脈注射若しくは静脈内投与（直腸投与または経口投与の形）による投与、または、例えば、アザチオプリン、メトトレキサート（ＭＴＸ）またはサイクロスポリンＡといった免疫抑制薬の投与を用いてよい。抗体、例えば、抗−ＴＮＦ−アルファ（INFLIXIMAB）または抗−ＣＤ４を用いた抗体療法を適用してよい場合もある。
【００１２】
薬物療法に応答しない重篤な慢性病状の場合、結腸切除、すなわち、大腸を手術により部分的または全体的に除去しなければならない場合もあり、この場合の疾患にとっての１つの治癒であると考えられている。これらの治療法は、典型的には、潰瘍性大腸炎による急性の発作の症候を減少させる。しかし、これらの治療法には、この疾患の効果的な且つ持続的な治癒を可能にすると思われるものはない。
【００１３】
（限局性腸炎としても知られる）クローン病は、さらなる重要な慢性炎症性消化器疾患である。クローン病は、腸管および腸の壁全体を冒す、慢性の一過性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の１つのサブタイプである。潰瘍性大腸炎とは異なり、クローン病は、全胃腸管のあらゆる部位を冒し得る。結果的に、クローン病の症候は、個々の患者によって異なる。疾患は、飛び越し病変として知られる、１つの症候において、間に通常の上皮の領域を有する炎症の領域によって特徴付けられる。主な胃腸症状は、腹痛、下痢、便秘、嘔吐、および、体重減少または体重増加である。クローン病は、また、胃腸管の外部において、吹き出物発疹、関節炎、および目の炎症などの合併症を引き起こす。
【００１４】
北アメリカでは、４００，０００〜６００，０００人が、クローン病を患っている（Loftus, E. V.; P. Schoenfeld, W. J. Sandborn (2002年1月)。"The epidemiology and natural history of Crohn’s disease in population-based patient cohorts from North America a systematic review". Alimentary Pharmacology & Therapeutics 16 (1) 51-60.）。
【００１５】
北ヨーロッパの推定患者数は、１００，０００人に２７〜４８人である（Bernstein, Charles N. (2006年7月)。"The Epidemiology of Inflammatory Bowel Disease in Canada A Population-Based Study". The American Journal of Gastroenterology 101 (7) 1559−1568）。さらに、クローン病は、１０代および２０代に最初に発現する傾向にあり、別のピーク罹患率は、５０代から７０代であるが、この疾患は、あらゆる年齢において生じ得る（Hanauer, Stephen B. (1996年3月)."Inflammatory bowel disease". New England Journal of Medicine 334 (13) 841-848; Gopal, Latha; Senthil Nachimuthu (2006-05-23）. Chrohns Disease, eMedicine）。
【００１６】
クローン病の原因は分かっていないが、遺伝的に連鎖している自己免疫疾患であると考えられている。最も高い相対リスクは、兄弟姉妹において発生し、女性においてわずかに高い。この場合、喫煙者がクローン病を発症する割合は３倍以上高い。
【００１７】
多数の薬物療法が、疾患を沈静化し、沈静状態を維持するために用いられている。このような薬物療法には、特に、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）の処方（Pentasa（登録商標）カプセル、アサコール（Asacol）錠剤、リアルダ（Lialda）錠剤、Rowasa保持浣腸剤）、ステロイド系の薬、免疫調整剤（例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン（６−ＭＰ）、およびメトトレキサート）の投与、および、抗−ＴＮＡアルファ抗体（例えば、INFLIXIMAB（登録商標）およびADALIMUMAB（登録商標））などの新規の生物学的薬剤が含まれる。
【００１８】
潰瘍性大腸炎について説明したように、これら治療法は、典型的には、クローン病による急性の発作の症候を減少させるものである。しかし、これらの治療法には、クローン病の効果的な且つ持続的な治癒を可能にすると思われるものはない（例外は、抗−ＴＮＦ−アルファ。しかし、抗−ＴＮＦ−アルファは、副作用の危険が高い）。
【００１９】
大腸炎の他の形には、例えば、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、激症大腸炎、化学的大腸炎、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン形成大腸炎、潰瘍性大腸炎、および非定型大腸炎などが含まれる。しかし、これらのいずれの疾患にも、副作用の危険がない、効果的且つ持続的な治癒法はない。従って、当該技術では、上述の疾患の、新規且つ好ましくは改善された治療法を可能にする、別の薬剤、または改善された薬剤を提供することが、現在も急務である。
【００２０】
従って、本発明の目的は、大腸炎などの非慢性または慢性の（炎症性）消化器疾患の新規且つ好ましくは改善された治療を可能にする、別の治療法、または改善された治療法を提供することにある。大腸炎には、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン大腸炎、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、激症大腸炎、化学的疾患、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、および非定型大腸炎などが含まれる。
【００２１】
この目的は、１５０個よりも短い長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列を、被験体における非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療用の薬剤組成物を調製するために使用することによって解決される。
【００２２】
本明細書において使用される、「非慢性または慢性の炎症性消化器疾患」という用語は、典型的には、胃腸管に関連する非慢性または慢性の炎症性疾患を指す。この疾患には、食道、胃、十二指腸の第１の部分、第２の部分、第３の部分、および第４の部分、空腸、回腸、回盲部の複合体、大腸、（上行結腸、横行結腸、および下行結腸）Ｓ状結腸、および直腸の疾患が含まれる。これに関して、好ましくは、結腸の炎症、例えば大腸炎を特徴とする慢性炎症性消化器疾患が含まれる。大腸炎には、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、激症大腸炎、化学的大腸炎、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン形成大腸炎、潰瘍性大腸炎、および非定型大腸炎などが含まれる。
【００２３】
本願発明者は、驚くべきことに、このようなＪＮＫ阻害剤配列が、被験体におけるこのような慢性または非慢性の炎症性消化器疾患の治療に適していることを発見した。ＪＮＫ阻害剤配列は一般に当該技術において公知であったが、ＪＮＫ阻害剤配列が慢性または非慢性の炎症性消化器疾患の治療に適していることは、明白でもなかったし、従来技術によって示唆されるものでもなかった。
【００２４】
ＪＮＫは、「ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ」の略語である。「ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ」は、マイトジェン活性化蛋白質（ＭＡＰ）キナーゼのストレス活性化されたグループの１つの成分である。このキナーゼは、細胞増殖および細胞分化の制御、より一般的にいうと細胞の環境刺激に対する応答に、関連している。ＪＮＫシグナル伝達経路は、環境ストレスに反応して、且つ、幾つかのクラスの、細胞の表面にあるレセプターの関与によって、活性化される。細胞の表面にあるこれらのレセプターには、サイトカインレセプター、セルペンチンレセプター、およびレセプターチロシンキナーゼが含まれ得る。
【００２５】
哺乳類細胞では、ＪＮＫは、発癌性形質転換、および環境ストレスへの適応反応を媒介するといった生物過程に関連している。ＪＮＫは、また、免疫細胞の成熟および分化を含む免疫応答の調節に関連していると共に、免疫システムによる排除のために識別された細胞におけるプログラムされた細胞死を引き起こすことに関連している。この一意の特性は、薬理学的介入を発展させるための有力な標的をシグナル伝達するＪＮＫを形成した。
【００２６】
しかし、現在まで、ＪＮＫ阻害剤配列の薬理効果は、虚血性脳卒中およびパーキンソン病などの幾つかの神経障害を含む、限られた数の疾患のみに現れていた。ここで、このようなＪＮＫ阻害剤配列は、上流側のキナーゼ阻害剤（例えば、ＣＥＰ−１３４７）、例えばプロテインキナーゼのＡＴＰ−結合部位と競合することによって、キナーゼ活性を直接引き起こすＪＮＫの小さな化学的阻害剤（ＳＰ６００１２５およびＡＳ６０１２４５）、および、ＪＮＫとその基質（Ｄ−ＪＮＫＩおよびＩ−ＪＩＰ）との間の相互作用のペプチド性阻害剤を含み得る（例えば、Kuan et al., Current Drug Target s − CNS & Neurological Disorders, 2005年2月, vol. 4, no. 1, pp. 63-67(5)を参照）。ここで、上流側のキナーゼ阻害剤ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）とは、混合系統キナーゼファミリーの半合成の阻害剤である。
【００２７】
ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）は、栄養の供与を停止した後の主要な胚培養および分化されたＰＣ１２細胞において、並びに、１−メチル−４−フェニルテトラヒドロピリジンで処理されたマウスにおいて、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化を阻害する量のニューロンの生存を促進する。さらに、ＣＥＰ−１３４７（ＫＴ７５１５）が、培養されたニワトリ胚後根神経節、交感神経、繊毛、および運動ニューロンの長期生存を促進することが観察されている（例えば、Borasio et al., Neuroreport. 9(7) 1435-1439（1998年5月11日）を参照）。
【００２８】
この小さな化学的ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５は、ｃ−Ｊｕｎリン酸化の量を低減し、ドーパミン作動性ニューロンをアポトーシスから保護し、Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスにおけるＭＰＴＰ−誘発されたＰＤのドーパミンの量を部分的に回復させることが分かっている（Wang et al., Neurosci Res. 2004年2月; 48(2); 195-202）。
【００２９】
これらの結果は、ＪＮＫ経路が、インビボのＭＰＴＰの神経毒性作用の主な媒介体であることを示しており、ＪＮＫ活性を阻害することは、ＰＤを治療するための新規且つ効果的な方法を示し得る。
【００３０】
小さな化学的ＪＮＫ阻害剤のさらなる実施例は、上述のＪＮＫ−阻害剤ＡＳ６０１２４５である。ＡＳ６０１２４５は、ＪＮＫシグナル伝達経路を阻害し、脳虚血後の細胞生存を促進する。インビボでは、ＡＳ６０１２４５は、広範囲の一過性虚血のアレチネズミモデルにおいて、海馬ＣＡ１神経の遅延された損失に対する著しい保護を提供した。この作用は、ＪＮＫ阻害によって、従ってｃ−Ｊｕｎ発現およびリン酸化によって、媒介される（例えば、Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310(1)25-32. Epub 2004年2月26日を参照）。
【００３１】
しかし、これらを統合すると、これらのＪＮＫ阻害剤配列が示す薬理効果は、特に、幾つかの神経障害（例えば、虚血性脳卒中、およびパーキンソン病）といった限られた数の疾患にのみ有効であることが実証されただけである。
【００３２】
従って、ＪＮＫ阻害剤配列が、非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療にも使用可能であることは、驚くべき結果であった。
【００３３】
本発明の意味において、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列は、典型的に、ヒトまたはラットＩＢ１配列に由来し、好ましくは、配列番号１０２（ラットからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列およびその予測されるアミノ酸配列を示す）、配列番号１０３（ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエキソン−イントロン境界によってコードされたラットからのＩＢ１蛋白質配列を示す）、配列番号１０４（ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列を示す）、または、配列番号１０５（ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を示す）に記載の配列のうちのいずれかによって規定された、またはコードされたアミノ酸配列に由来し、より好ましくは、配列番号１０４（ホモサピエンスのＩＢ１蛋白質配列を示す）、または、配列番号１０５（ホモサピエンスのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列を示す）に記載の配列のうちのいずれかによって規定された、またはコードされたアミノ酸配列、または、これらの任意の断片または改変体に由来していてよい。
【００３４】
換言すると、ＪＮＫ阻害剤配列は、ヒト若しくはラットＩＢ１配列の断片、改変体、または、このような断片の改変体を含む。ヒトまたはラットＩＢ配列は、それぞれ、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５に記載の配列によって規定またはコードされる。
好ましくは、本明細書において用いられるＪＮＫ阻害剤配列は、全部で、１５０個よりも短い長さのアミノ酸残基、好ましくは、５〜１５０個の範囲の長さのアミノ酸残基、より好ましくは１０〜１００個の範囲のアミノ酸残基、さらにより好ましくは１０〜７５個の範囲の長さのアミノ酸残基、および最も好ましくは１０〜５０個の範囲の長さのアミノ酸残基、例えば、１０〜３０、１０〜２０、または、１０〜１５個の長さのアミノ酸残基を含む。
【００３５】
より好ましくは、このようなＪＮＫ阻害剤配列および上述の範囲は、上述の配列のうちのいずれかから、さらにより好ましくは、配列番号１０４に従って規定された、または配列番号１０５によってコードされたアミノ酸配列から選択され、さらにより好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド４２０と９８０の間の範囲において、または、配列番号１０４のアミノ酸１０５と２９１との間の範囲において、および最も好ましくは、配列番号１０５のヌクレオチド５６１と６４７との間の範囲において、または配列番号１０４のアミノ酸１５２と１８０との間の範囲において、選択され得る。
【００３６】
具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、典型的には、ＪＮＫを結合し、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化された転写因子、例えば、ｃ−ＪｕｎまたはＡＴＦ２（例えば、各配列番号１５および１６を参照）、またはＥｌｋ１の活性化を阻害する。
【００３７】
同様に、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のいずれか１つに記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、または、その断片、誘導体、若しくは改変体を含むか、または、これから構成される。より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸配列、またはそのその改変体、断片、または誘導体の、１、２、３、４、またはそれ以上のコピーを含んでいてよい。
【００３８】
１つ以上のコピーが存在するならば、本明細書において使用される、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のこれらのアミノ酸配列、またはその改変体、断片、若しくは誘導体は、何らかのリンカー配列無しに、または１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介さずに、直接互いに連鎖されている。リンカー配列を形成するアミノ酸は、好ましくは、アミノ酸残基としてのグリシンまたはプロリンから選択されている。より好ましくは、本明細書において使用される、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のこれらのアミノ酸配列、または、その断片、改変体、若しくは誘導体は、２つ、３つ、またはそれ以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離され得る。
【００３９】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または、これらの組み合わせから構成されていてよい。好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは、少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含み、ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはアミノ酸Ｌ−アミノ酸は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列において、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で配置されていてよい。
【００４０】
好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸だけから構成されていてよい。本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、その後、配列番号１または３に記載の、少なくとも１つの「ネイティブＪＮＫ阻害剤配列」を含むか、またはこれから構成されていてよい。これに関して、「ネイティブ」または「ネイティブＪＮＫ阻害剤配列」という用語は、本明細書において使用されるように全体がＬ−アミノ酸から構成された、配列番号１または３のいずれかに記載の変換されていないＪＮＫ阻害剤配列を指す。
【００４１】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列ＮＨ2−Ｘnb−Ｘna−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢジェネリック（ｓ））［配列番号３］、および／または、ＩＢ１ＸＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤＳ／ＴＸ（Ｌ−ＩＢ（ジェネリック））［配列番号１９］のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００４２】
これに関して、各Ｘは、典型的には、好ましくは任意の（ネイティブ）アミノ酸残基から選択されたアミノ酸残基を示す。Ｘnaは、典型的には、好ましくは、セリンまたはトレオニンを除く任意のアミノ酸残基から選択された１つのアミノ酸残基を示す。ここで、ｎ（Ｘの繰り返しの数）は、０または１である。
【００４３】
さらに、各Ｘnbは、任意のアミノ酸残基から選択されていてよく、ここでｎ（Ｘの繰り返しの数）は、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、またはそれ以上であってよく、Ｘnaのｎ（Ｘの繰り返しの数）が０であると仮定すると、Ｘnbは、好ましくは、そのＣ末端においてセリンまたはトレオニンを含まず、この位置においてセリンまたはトレオニンを回避する。好ましくは、Ｘnbは、配列番号１または３に由来するペプチド残基の連続したストレッチを示す。ＸnaおよびＸnbは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸を示す。
【００４４】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  ＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＩＢ１）［配列番号１７］のＪＮＫ結合ドメインを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列はさらに、少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号１］を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００４５】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１Ｌ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号３３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号３４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号３５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号３６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号３７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号３８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号３９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ2−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号４０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号４２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号４３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号４４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号４５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号４７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ2−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号４８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ2−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号４９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号５０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号５１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号５２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号５３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号５４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号５５）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ，配列番号５６）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ2−ＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ，配列番号５７）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ2−ＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱ−ＣＯＯＨ，配列番号５８）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ2−ＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳ−ＣＯＯＨ，配列番号５９）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ2−ＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号６０）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ2−ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６１）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ2−ＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶ−ＣＯＯＨ，配列番号６２）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ2−ＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱ−ＣＯＯＨ，配列番号６３）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ2−ＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６４）；Ｌ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ2−ＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦ−ＣＯＯＨ，配列番号６５）；およびＬ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ2−ＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬ−ＣＯＯＨ��配列番号６６）のＪＮＫ結合ドメインを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００４６】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  ＰＧＴＧＣＧＤＴＹＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤＴ（ＩＢ１−ロング）［配列番号１３］の（ロング）ＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）と、ＩＢ２  ＩＰＳＰＳＶＥＥＰＨＫＨＲＰＴＴＬＲＬＴＴＬＧＡＱＤＳ（ＩＢ２−ロング）［配列番号１４］の（ロング）ＪＮＫ結合ドメインと、ｃ−ＪｕｎＧＡＹＧＹＳＮＰＫＩＬＫＱＳＭＴＬＮＬＡＤＰＶＧＮＬＫＰＨ（ｃ−Ｊｕｎ）［配列番号１５］のＪＮＫ結合ドメインと、ＡＴＦ２  ＴＮＥＤＨＬＡＶＨＫＨＫＨＥＭＴＬＫＦＧＰＡＲＮＤＳＶＩＶ（ＡＴＦ２）［配列番号１６］のＪＮＫ結合ドメインとを含む群から選択される少なくとも１つの（ネイティブ）アミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい（例えば、図１Ａ〜１Ｃを参照）。
【００４７】
これに関して、部分的に保存された８つのアミノ酸配列（例えば図１Ａを参照）が、アラインメントによって明らかにされ、ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとをさらに比較することによって、これら２つの配列間で高度に保存された、２つのブロックの、７つおよび３つのアミノ酸が明らかにされる。
【００４８】
他の好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、部分的に、上記で規定されたＤ−アミノ酸から構成される、または全くこれのみから構成されていてよい。より好ましくは、Ｄ−アミノ酸から構成されるこれらのＪＮＫ阻害剤配列は、上述の（ネイティブ）ＪＮＫ阻害剤配列の非ネイティブＤレトロ−インベルソ配列である。「レトロ−インベルソ配列」という用語は、配列の方向が逆であり各アミノ酸残基の対掌性が反転された、直線状のペプチド配列の異性体（例えば、Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994)を参照）を指す。
【００４９】
Ｄ−鏡像異性体と逆合成とを組み合わせることの利点は、各アミド結合内のカルボニル基の位置とアミノ基の位置とが交換され、各アルファ炭素内の側鎖基の位置が維持される点である。他に特別な記載がない限り、本発明に従って使用される所定の任意のＬ−アミノ酸配列またはペプチドは、対応するネイティブＬ−アミノ酸配列またはペプチドに、逆の配列またはペプチドを合成することによって、Ｄレトロ−インベルソ配列またはペプチドに変換可能であると推測される。
【００５０】
本明細書において使用されると共に上記で規定されたＤレトロ−インベルソ配列は、様々な有用な特性を有している。例えば、本明細書において使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、本明細書において使用されるＬ−アミノ酸配列と同じ程度、効率良く細胞の中に侵入する。その一方で、本明細書において使用されるＤレトロ−インベルソ配列は、当該Ｌ−アミノ酸配列よりも安定している。
【００５１】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ2−Ｘnb−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘna−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１  ジェネリック（ｓ））［配列番号４］および／またはＸＳ／ＴＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸ（Ｄ−ＩＢ（ジェネリック））［配列番号２０］に記載の、少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５２】
これに関して用いられるように、Ｘ、Ｘna、およびＸnbは、上記で規定された通りであり（好ましくは、Ｄアミノ酸を示す）、Ｘnbは、好ましくは配列番号２または４に由来する残基の連続したストレッチを示す。
【００５３】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤ（Ｄ−ＩＢ１）［配列番号１８］のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むアミノ酸配列に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５４】
より好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、アミノ酸配列ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号２］に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５５】
さらに、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１  Ｄ−ＩＢ１（ｓ１）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号６７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号６８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号６９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ４）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ５）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ６）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ７）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ８）（ＮＨ2−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ９）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１０）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号７６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１１）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号７７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１２）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号７８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１３）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号７９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１４）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１５）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号８１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１６）（ＮＨ2−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号８２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１７）（ＮＨ2−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号８３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１８）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号８４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ１９）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号８５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２０）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号８６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２１）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２２）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号８８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２３）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号８９）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２４）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ，配列番号９０）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２５）（ＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬ−ＣＯＯＨ，配列番号９１）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２６）（ＮＨ2−ＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮ−ＣＯＯＨ，配列番号９２）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２７）（ＮＨ2−ＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬ−ＣＯＯＨ，配列番号９３）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２８）（ＮＨ2−ＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴ−ＣＯＯＨ，配列番号９４）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ２９）（ＮＨ2−ＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴ−ＣＯＯＨ，配列番号９５）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３０）（ＮＨ2−ＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰ−ＣＯＯＨ，配列番号９６）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３１）（ＮＨ2−ＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号９７）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３２）（ＮＨ2−ＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫ−ＣＯＯＨ，配列番号９８）；Ｄ−ＩＢ１（ｓ３３）（ＮＨ2−ＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰ−ＣＯＯＨ，配列番号９９）；および、Ｄ−ＩＢ１（ｓ３４）（ＮＨ2−ＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲ−ＣＯＯＨ，配列番号１００）のＪＮＫ結合ドメイン（ＪＢＤ）を含むアミノ酸配列に記載の少なくとも１つのＤレトロ−インベルソ配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【００５６】
本明細書において使用される、上記で開示されたＪＮＫ阻害剤配列は、表１（配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００）に示されている。この表は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の名前およびその配列識別番号、その長さ、並びにアミノ酸配列を示している。さらに、表１は、例えば、配列番号１、２、５、６、９、および１１、並びに、配列番号３、４、７、８、１０、および１２の、配列とその各一般式とを示す図である。表１はさらに、キメラ配列である配列番号９〜１２および２３〜３２（以下を参照）、Ｌ−ＩＢ１配列である配列番号３３〜６６、並びに、Ｄ−ＩＢ１配列である配列番号６７〜１００を開示している。
【００５７】
【表１】
0005547719.tif 000002
【００５８】
0005547719.tif 000003
【００５９】
0005547719.tif 000004
【００６０】
0005547719.tif 000005
【００６１】
0005547719.tif 000006
【００６２】
他の好ましい一実施形態によれば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で規定された、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のネイティブまたは非ネイティブアミノ酸配列の、少なくとも１つの改変体、断片、および／または、誘導体を含むか、またはこれから構成される。
【００６３】
好ましくは、これらの改変体、断片、および／または、誘導体は、本明細書において使用される、上記で開示されたネイティブまたは非ネイティブのＪＮＫ阻害剤配列、特に、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のネイティブまたは非ネイティブアミノ酸配列の生物活性、すなわち、ＪＮＫに結合する、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化された転写因子（例えばｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＥｌｋ１）の活性化を阻害する生物活性を保持する。
【００６４】
機能性は、様々な試験によって、例えば、ペプチドをその標的分子に結合させる試験、または、生物理学的方法（例えば、分光法、コンピュータモデリング法、構造解析法など）によって、試験され得る。特に、上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列、またはその改変体、断片、および／または、誘導体は、親水性分析（例えば、Hopp and Woods, 1981. Proc Natl Acad Sci USA 78 3824-3828を参照）によって分析され得る。
【００６５】
この親水性分析を利用して、ペプチドの疎水性領域および親水性領域を特定し、これによって、例えば結合実験または抗体合成といった実験的操作のための、基板の構成をデザインすることが可能である。第２の構造解析法を行って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列、または、その改変体、断片、および／または、誘導体の、特定の構造モチーフを示す領域を特定してもよい（例えば、Chou and Fasman, 1974, Biochem 13 222-223を参照）。
【００６６】
操作、翻訳、二次構造予測、親水性プロファイルおよび疎水性プロファイル、オープンリーディングフレーム予測およびプロッティング、並びに、配列相同性の決定は、当該技術分野において入手可能なコンピュータソフトウェアプログラムを用いて行うことが可能である。
【００６７】
他の、例えば、Ｘ線結晶学（例えば、Engstrom, 1974. Biochem Exp Biol 11 7-13を参照）、質量分析法、およびガスクロマトグラフィー法（例えば、METHODS IN PROTEIN  SCIENCE, 1997, J. Wiley and Sons, New York, NY参照）、およびコンピュータモデリング法（例えば、Fletterick and Zoller, eds., 1986. Computer Graphics and Molecular Modeling, In CURRENT COMMUNICATIONS IN MOLECULAR BIOLOGY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照）を含む構造解析法を用いてもよい。
【００６８】
従って、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の少なくとも１つの改変体を含むか、またはこれから構成されていてよい。本発明の意味するところによれば、「配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の改変体」とは、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、改変体は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸配列のアミノ酸変換を含む。
【００６９】
このような変換は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載のアミノ酸の１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは、１〜５個の置換、付加、および／または、削除を含む。この場合、この改変体は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を示す。
【００７０】
上記に規定されていると共に本明細書において使用されるような、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の改変体が、特定のアミノ酸を置換することによって得られるならば、このような置換は、好ましくは、保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換には、基内の類似アミノ酸残基が含まれ得る。この類似アミノ酸残基は、十分に相似した物理化学的特性を有しているため、基内の成分間を置換しても分子の生物活性は保存される（例えば、Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864参照）。
【００７１】
上記で規定された配列において、アミノ酸を挿入および／または除去することが可能であり、この際に、特に、挿入および／または除去が、わずかな数の、例えば２０個よりも少ない、および好ましくは１０個よりも少ないアミノ酸だけを含むならば、その機能を変更せずに、挿入および／または除去することが可能であり、機能的活性に重要なアミノ酸は、除去または置換しないことは、当業者には明らかである。
【００７２】
さらに、本明細書にて使用される改変体においては、ホスホリラーゼ、好ましくはキナーゼのための機能発現可能なアミノ酸の位置において、さらなるトレオニンの導入を回避して、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の不活性化、または本明細書において使用されるキメラペプチドの不活性化を、インビボまたはインビトロにおいて回避する必要がある。
好ましくは、同じグループに分類され、典型的には、保存的アミノ酸置換によって交換可能である類似アミノ酸残基を、表２に規定する。
【００７３】
【表２】
0005547719.tif 000007
【００７４】
本明細書において使用される配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００の改変体の特別な形態は、本明細書において使用される配列番号１１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の断片である。この断片は、典型的には、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００と比べて、少なくとも１つの削除によって変換されている。
【００７５】
好ましくは、１つの断片は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの少なくとも４つの連続したアミノ酸を含み、その長さは、典型的には、これらの配列のいずれかからのエピトープを特異的に認識するために十分な長さである。さらにより好ましくは、この断片は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００のうちのいずれかのアミノ酸であって、４〜１８個、４〜１５個、または最も好ましくは４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。
【００７６】
ここで、下限範囲は、４、または、５、６、７、８、９、または、１０個である。アミノ酸の削除は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００の任意の位置において、好ましくはＮ−末端またはＣ−末端において、生じ得る。
【００７７】
さらに、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の断片は、上述のように、本明細書において使用される配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列として規定され得る。
【００７８】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列は、上記で規定された、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の少なくとも１つの誘導体をさらに含む、またはこれから構成され得る。
【００７９】
これに関して、「配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の（ネイティブまたは非ネイティブ）アミノ酸配列の誘導体」とは、好ましくは、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかに由来するアミノ酸配列であり、ここで、誘導体は、（非自然アミノ酸を形成する）少なくとも１つの修飾されたＬ−またはＤ−アミノ酸、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、およびさらにより好ましくは１〜５個の修飾されたＬ−またはＤ−アミノ酸を含む。改変体または断片の誘導体も、本発明の範囲である。
【００８０】
これに関して、「修飾されたアミノ酸」とは、例えば、様々な生物において異なるグリコシル化によって、リン酸化によって、または特異的アミノ酸を標識化することによって変換された、任意のアミノ酸であってよい。このようなラベルは、典型的には、次の（ｉ）〜（ｖｉ）から構成されるラベルの群から選択される。
（ｉ）放射性ラベル、すなわち、放射性リン酸化、または硫黄、水素、炭素、窒素などによる放射性ラベル、
（ｉｉ）着色された色素（例えば、ジゴキシゲニン（digoxygenin）など）、
（ｉｉｉ）蛍光基（例えば、フルオレセインなど）、
（ｉｖ）化学発光基、
（ｖ）固相上の固定化のための基（例えば、Hisタグ、ビオチン、strepタグ、flagタグ、抗体、抗原など）、および、
（ｖｉ）上記（ｉ）〜（ｖ）に記載したラベルのうちの２つ以上のラベルの組み合わせ。
【００８１】
これに関して、本発明の照会アミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％の「配列同一性を共有する」配列を有するアミノ酸配列とは、対象となるアミノ酸配列が、照会アミノ酸配列の１００アミノ酸当たり５つ未満のアミノ酸の変換を含むことを除いて、照会配列と等しいことを意味することを意図するものである。換言すると、照会アミノ酸配列と少なくとも９５％同一である配列を有するアミノ酸配列を得るためには、対象となる配列のアミノ酸残基の５％（１００のうちの５）未満に、別のアミノ酸が挿入若しくは置換されているか、または対象となる配列のアミノ酸残基の５％（１００のうちの５）未満が削除されていてもよい。
【００８２】
正確に対応してない配列では、第１の配列の「％同一性」は、第２の配列に対して決定され得る。概して、比較されるこれら２つの配列は、配列間の最大相関性を提供するために、位置合わせされている。これは、１つまたは両方の配列に、「間隔」を挿入して、アラインメントの程度を強化することを含む。その後、％同一性は、特に同一または類似の長さの配列に適した、比較される各配列の全長にわたって（いわゆるグローバルアラインメント）決定されるか、または、一意の長さにより適した、かなり短い、一定の長さにわたって（いわゆるローカルアラインメント）決定される。
【００８３】
特に本明細書において使用される、２つ以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当該技術において公知である。すなわち、例えば、ウィスコンシン配列分析パッケージ，バージョン９．１において入手可能なプログラム（Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395）である、例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および、２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定することが可能である。ＢＥＳＴＦＩＴは、（Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197）の「局所的相同性」アルゴリズムを用い、２つの配列間の単一の最も類似した領域を発見するものである。
【００８４】
配列間の同一性および／または類似性を算出するための他のプログラムも、当該技術では公知である。例えば、ＮＣＢＩのホームページであるワールドワイド・ウェブサイト（ncbi.nlm.nih.gov）を介してアクセス可能なプログラム（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410）のＢＬＡＳＴファミリー、および、ＦＡＳＴＡ（Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448）である。
【００８５】
本発明に従って用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ−阻害剤配列は、当該技術分野において公知の方法、例えば、化学合成法によって、または以下に説明する遺伝子工学法によって、得られる、または生成され得る。例えば、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列の一部に相当する、該ＪＮＫ阻害剤配列の所望の領域を含むペプチド、または、所望の活性をインビトロまたはインビボで媒介するペプチドは、ペプチドシンセサイザを使用することによって合成可能である。
【００８６】
本発明に従って用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列は、また、本発明に従って用いられると共に上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列が、細胞の中に効率良く輸送されることを可能にするトラフィッキング配列によって修飾され得る。このような修飾されたＪＮＫ阻害剤配列は、好ましくは、キメラ配列として提供および使用される。
【００８７】
従って、第２の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドを、被験体における、非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療用の薬剤組成物を調製するために使用することを提供する。ここで、キメラペプチドの第１のドメインは、トラフィッキング配列を含むが、キメラペプチドの第２のドメインは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、好ましくは配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の配列のいずれかのＪＮＫ阻害剤配列、またはその誘導体若しくは断片を含む。
【００８８】
典型的には、本発明に従って用いられるキメラペプチドは、少なくとも２５個の長さのアミノ酸残基、例えば、２５〜２５０個の長さのアミノ酸残基、より好ましくは、２５〜２００個の長さのアミノ酸残基、さらにより好ましくは２５〜１５０個の長さのアミノ酸残基、２５〜１００個の長さのアミノ酸残基、および最も好ましくは２５〜５０アミノ酸残基を有している。
【００８９】
本明細書において使用されるキメラペプチドは、第１のドメインとして、好ましくは、トラフィッキング配列を含む。トラフィッキング配列は、典型的には、（該トラフィッキング配列が存在する）ペプチドを所望の細胞目的地に方向付けるアミノ酸の任意の配列から選択されている。従って、本明細書において使用されるようなトラフィッキング配列は、典型的には、ペプチドを、形質膜を横切って、例えば、細胞の外側から形質膜を通って、細胞質の中まで方向付ける。
【００９０】
選択的または追加的に、トラフィッキング配列は、ペプチドを、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体（ＥＲ）、リソソーム、またはペルオキシソームに方向付けることも可能である。これは、例えば、２つの成分（例えば細胞透過性のための成分と、核の位置のための成分と）を混合することによって、または、例えば、細胞膜を輸送する特性、および標的とされた、例えば核内輸送を行う特性を有する、単一の成分によって行うことが可能である。
【００９１】
トラフィッキング配列は、さらに、細胞質成分または細胞の他の任意の成分若しくは区画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ装置（gloom apparatus）、リゾソーマル小胞）を結合することが可能な他の成分を有していてよい。従って、例えば、第１のドメインのトラフィッキング配列および第２のドメインのＪＮＫ阻害剤配列は、細胞質、または、細胞の他の任意の区画に局在化され得る。これによって、取り込み時に、細胞におけるメラペプチドの局在性を決定することが可能である。
【００９２】
好ましくは、トラフィッキング配列（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）は、５〜１５０個の長さのアミノ酸の配列、より好ましくは、５〜１００個、および最も好ましくは５〜５０個、５〜３０個、またはさらに５〜１５個の長さのアミノ酸を有している。
【００９３】
より好ましくは、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、第１のドメイン内に、連続したアミノ酸配列ストレッチとして生じることも可能である。あるいは、第１のドメイン内のトラフィッキング配列は、２つ以上の断片に分裂されていてもよい。この場合、これらの断片の全ては、トラフィッキング配列全体と類似しており、トラフィッキング配列自体が上記で開示されたような担体特性を保持しているならば、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸によって互いに分離されていてよい。
【００９４】
トラフィッキング配列の断片を分離させるこれらのアミノ酸は、例えば、トラフィッキング配列とは異なるアミノ酸配列から選択されていてよい。あるいは、第１のドメインは、１つ以上の成分から構成されるトラフィッキング配列を含んでいてよく、各成分は、それぞれ、第２のドメインのカーゴＪＮＫ阻害剤配列を、例えば、特定の細胞の区画に輸送する機能を有している。
【００９５】
上記で規定されたトラフィッキング配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれらの組み合わせから構成されていてよい。好ましくは、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含んでいてよい。ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、ＪＮＫトラフィッキング配列内に、ブロック状、非ブロック状、または、これらが交互になった状態で配置されていてよい。
【００９６】
他の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、Ｌ−アミノ酸のみから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、上述の、少なくとも１つの「ネイティブ」トラフィッキング配列を含むか、またはこれから構成されている。これに関して、「ネイティブ」という用語は、全体的にＬ−アミノ酸から構成された変換されていないトラフィッキング配列を指す。
【００９７】
他の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、Ｄ−アミノ酸のみから構成されていてよい。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドのトラフィッキング配列は、上記で示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含んでいてよい。
【００９８】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインのトラフィッキング配列は、自然発生的なソースから得られるか、または、遺伝子工学技術または化学合成法（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）を用いて生成可能である。
【００９９】
第１のドメインのトラフィッキング配列には、例えば、天然蛋白質、例えばＴＡＴ蛋白質（例えば米国特許第５，８０４，６０４号および第５，６７４，９８０号に記載されている。これらの文献を、引用することによって本願に援用する）、ＶＰ２２（ＷＯ第９７／０５２６５号；Elliott and O'Hare, Cell 88  223-233 (1997) に記載されている）、非−ウイルス蛋白質（Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89  10691-10695 (1992)）を含むソースを用いてもよい。
【０１００】
トラフィッキング配列は、アンテナぺディア（例えば、アンテナぺディア担体配列）に由来するか、または基本ペプチド（例えば、５〜１５個の長さのアミノ酸、好ましくは１０〜１２個の長さのアミノ酸を有すると共に、少なくとも８０％、より好ましくは、８５％、またはさらに９０％の基本アミノ酸に由来する。上記基本アミノ酸は、例えばアルギニン、リジン、および／または、ヒスチジンを含むペプチドである。）。
【０１０１】
さらに、トラフィッキング配列として用いられる１つの天然蛋白質の改変体、改変体、断片、および誘導体を以下に開示する。改変体、断片、および誘導体に関しては、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列について記載した規定を参照されたい。これに応じて、改変体、断片、および誘導体は、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列について上記したように規定される。特に、トラフィッキング配列では、改変体または断片または誘導体は、上記で規定されたトラフィッキング配列として用いられる１つの天然蛋白質と、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列として規定され得る。
【０１０２】
本明細書において使用されるキメラペプチドの好ましい一実施形態では、第１のドメインのトラフィッキング配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１  ＴＡＴ蛋白質に由来する配列、特に、ＴＡＴ蛋白質を構成する８６アミノ酸のうちの幾つかまたは全てを含むか、または、これから構成されている。
【０１０３】
（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列では、ＴＡＴ蛋白質の機能的に有効な断片を形成する、すなわち、細胞内への侵入および取り込みを媒介する領域を含むＴＡＴペプチドを形成する、ＴＡＴ蛋白質の全長の部分配列が用いられ得る。このような配列がＴＡＴ蛋白質の機能的に効果的な断片であるかどうかについては、公知の技術（例えば、Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86  7397-7401 (1989)を参照）を用いて決定可能である。
【０１０４】
従って、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインにおけるトラフィッキング配列は、ＴＡＴ蛋白質配列の機能的に有効な断片または一部に由来していてよい。この機能的に有効な断片または一部は、８６よりも少ないアミノ酸を含み、細胞内への取り込み、および任意により、細胞核内への取り込みを示す。より好ましくは、担体として用いられ、キメラペプチドを、細胞膜を横切って浸透させることを媒介する、ＴＡＴの部分配列（断片）は、ＴＡＴの全長の基本領域（アミノ酸４８〜５７、または４９〜５７）を含むように意図されている。
【０１０５】
より好ましい一実施形態によれば、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、ＴＡＴ残基４８〜５７または４９〜５７、および最も好ましくはジェネリックＴＡＴ配列ＮＨ2−Ｘnb−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｌ−ジェネリック−ＴＡＴ（ｓ））［配列番号７］、および／または、ＸＸＸＸＲＫＫＲＲＱ  ＲＲＲＸＸＸＸ（Ｌ−ジェネリック−ＴＡＴ）［配列番号２１］を含むアミノ酸配列を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【０１０６】
ここで、ＸまたはＸnbは、上記で規定された通りである。さらに、配列番号８の残基「Ｘnb」の数は、示されている数に制限されず、上述のように変動し得る。あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれるトラフィッキング配列は、アミノ酸配列ＮＨ2−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ）［配列番号５］を含むペプチドを含むか、またはこれから構成され得る。
【０１０７】
他のより好ましい一実施形態によれば、（本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる）トラフィッキング配列は、上記に示された配列のＤレトロ−インベルソペプチドを含むことが可能であり、すなわち、配列ＮＨ2−Ｘnb−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｄ−ジェネリック−ＴＡＴ（ｓ））［配列番号８］、および／または、ＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸ（Ｄ−ジェネリック−ＴＡＴ）［配列番号２２］を有するジェネリックＴＡＴ配列のＤレトロ−インベルソ配列を含むことが可能である。
【０１０８】
ここでも、Ｘnbは上記で規定された通りである（好ましくはＤアミノ酸を示す）。さらに、配列番号８内の残基「Ｘnb」の数は、示されている数に制限されず、上述のように変動し得る。最も好ましくは、本明細書において使用されるトラフィッキング配列は、Ｄレトロ−インベルソ配列ＮＨ2−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ）［配列番号６］を含んでいてよい。
【０１０９】
他の一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれるトラフィッキング配列は、上記で規定されたトラフィッキング配列の改変体を含むか、またはこれから構成されていてよい。
【０１１０】
「トラフィッキング配列の改変体」は、好ましくは、上記で規定されたトラフィッキング配列に由来する配列であり、ここで改変体は、上記で規定されたトラフィッキング配列内に存在する少なくとも１つのアミノ酸の修飾を含む。
【０１１１】
修飾の例には、付加、（断片を導く）（内部）削除、および／または、置換が含まれる。このような修飾は、アミノ酸の、典型的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは、１〜５個の、置換、付加、および／または、削除を含む。さらに、改変体は、好ましくは、上記で規定されたトラフィッキング配列、より好ましくは配列番号５〜８、または２１〜２２のいずれかと、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、またはさらに９９％の配列相同性を示す。
好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれる、このようなトラフィッキング配列の修飾は、安定性が増大された、または低減されたトラフィッキング配列を導く。
【０１１２】
あるいは、トラフィッキング配列の改変体は、本明細書において使用されるキメラペプチドの細胞内の局在化を調節するように設計されていてよい。外因的に付加される場合、上記で規定されたこのような改変体は、典型的には、トラフィッキング配列の細胞の中に侵入するという性能が保持されるように（すなわち、トラフィッキング配列の改変体の細胞内への取り込みは、トラフィッキング配列として用いられるネイティブ蛋白質の取り込みとほぼ類似するように）設計されている。
【０１１３】
例えば、核局在化にとって重要であると考えられていた基本領域の変換（例えば、Dang and Lee, J. Biol. Chem. 264  18019-18023 (1989); Hauber et al., J. Virol. 63  1181-1187 (1989) ; et al., J. Virol. 63  1-8 (1989)を参照）は、結果的に、トラフィッキング配列の、従って本明細書において使用されるキメラペプチドの成分としてのＪＮＫ阻害剤配列の、細胞質位置または部分的な細胞質位置を生じさせ得る。
【０１１４】
これに加えて、例えばコレステロールまたは他の脂質成分をトラフィッキング配列に連結させて、膜可溶性が高いトラフィッキング配列を生成することによって、さらなる修飾を改変体内に導入することも可能である。
【０１１５】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメイン内に含まれるトラフィッキング配列の、上記に開示した改変体のいずれかは、典型的には当業者に公知の技術を用いて生成可能である（例えば、Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning A laboratory manual. 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照）。
【０１１６】
第２のドメインとして、本明細書において使用されるキメラペプチドは、典型的には、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列のいずれかから選択されたＪＮＫ阻害剤配列（これらのＪＮＫ阻害剤配列の改変体、断片、および／または、誘導体を含む）を含む。
【０１１７】
両方のドメイン、すなわち、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインおよび第２のドメインは、機能ユニットを形成するように連結され得る。第１のドメインと第２のドメインとを連結する、当該技術分野において公知の任意の方法を用いてもよい。
【０１１８】
一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインおよび第２のドメインは、共有結合によって連結されていることが好ましい。本明細書において規定される共有結合は、例えば、上記で規定されたキメラペプチドを、融合蛋白質として発現することによって得られるペプチド結合であってよい。ここに記載される融合蛋白質は、以下に説明する標準的な組み換えＤＮＡ技術と同様の方法、または該技術から容易に適合可能な方法で、形成および使用可能である。しかしながら、両方のドメインは、側鎖を介して連結されていてもよいし、または、化学的リンカー成分によって連結されていてもよい。
【０１１９】
本明細書において使用されるキメラペプチドの第１のドメインおよび／または第２のドメインは、該キメラペプチド内の１つ以上のコピーにおいて生じ得る。両方のドメインが単一のコピーで存在するならば、第１のドメインは、第２のドメインのＮ−末端またはＣ−末端のいずれかに連結されていてよい。
【０１２０】
多数のコピーで存在するならば、第１のドメインおよび第２のドメインは、可能な任意の順番に配置されていてよい。例えば、第１のドメインは、本明細書において使用されるキメラペプチド内に、多数のコピーの数で、例えば、２、３、またはそれ以上のコピーで、存在していてよい。これらのコピーは、連続する数で配置されていることが好ましい。
【０１２１】
その後、第２のドメインは、第１のドメインを含む配列のＮ−末端またはＣ末端において生じる単一のコピーで存在していてよい。あるいは、第２のドメインが、多数のコピーの数で、例えば、２、３、またはそれ以上のコピーで存在しており、第１のドメインが、単一のコピーで存在していてもよい。
【０１２２】
これらの両方の選択肢によれば、第１のドメインおよび第２のドメインは、連続した配置における任意の位置をとることが可能である。典型的な構成を以下に示す。例えば、第１のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン‐第２のドメイン、第１のドメイン‐第１のドメイン‐第２のドメイン‐第１のドメイン、第１のドメイン‐第２のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン、または、例えば、第２のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン‐第１のドメイン。
【０１２３】
これらの例は説明のためであって、本発明の範囲がこれらの例に限定されるものではないことを、当業者は明確に理解できよう。従って、コピーおよび構成の数は、当初に規定したものとは変化し得る。
【０１２４】
好ましくは、第１のドメインおよび第２のドメインは、何らかのリンカー無しに互いに直接連結されていてもよい。あるいは、これらは、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を含むリンカー配列を介して互いに連結されていてもよい。リンカー配列を形成するアミノ酸は、アミノ酸残基としてのグリシンまたはプロリンから選択されていることが好ましい。より好ましくは、第１のドメインおよび第２のドメインは、第１のドメインと第２のドメインとの間の２つ、３つ、またはそれ以上のプロリン残基のヒンジによって互いに分離されていてよい。
【０１２５】
本明細書において使用される、上記で規定された少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれら両方の組み合わせから構成されていてよい。ここでは、各ドメイン（および用いられるリンカー）は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれら両方の組み合わせ（例えば、Ｄ−ＴＡＴとＬ−ＩＢ１との組み合わせ、または、Ｌ−ＴＡＴとＤ−ＩＢ１との組み合わせなど）から構成されていてよい。
【０１２６】
好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、少なくとも１または２個、好ましくは少なくとも３、４、または５個、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９個、およびさらにより好ましくは少なくとも１０個またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含んでいてよい。ここで、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、本明細書において使用されるキメラペプチド内に、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で配置されていてよい。
具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドは、ジェネリックＬ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ2−Ｘnb−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−Ｘnb−Ｘna−ＲＰＴＴＬＸＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ（ジェネリック）（ｓ））［配列番号１０］に記載のＬ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成されている。
【０１２７】
ここで、Ｘ、Ｘna、およびＸnbは、好ましくは、上記で規定された通りである。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチドＮＨ2−ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ−ＣＯＯＨ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号９］を含むか、またはこれからから構成される。
【０１２８】
選択的または追加的に、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ  ＰＰＤＴＹＲＰＫＲＰ  ＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰ  ＲＳＱＤＴ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１）［配列番号２３］、または、ＸＸＸＸＸＸＸＲＫＫ  ＲＲＱＲＲＲＸＸＸＸ  ＸＸＸＸＲＰＴＴＬＸ  ＬＸＸＸＸＸＸＸＱＤ  Ｓ／ＴＸ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢジェネリック）［配列番号２４］を含むか、またはこれからから構成されており、ここでも、Ｘは、好ましくは上記で規定された通りである。
【０１２９】
あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸キメラペプチド配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））［配列番号２７］、ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸncＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））［配列番号２８］、または、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＸncＲＰＫＲＰＴＴＬＮＬＦＰＱＶＰＲＳＱＤ（Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））［配列番号２９］を含むか、またはこれから構成される。
【０１３０】
これに関して、各Ｘは、典型的には、上記で規定されたアミノ酸残基を示し、より好ましくは、Ｘncは、ペプチド残基の連続したストレッチを示し（各Ｘは、互いに無関係に、グリシンまたはプロリンから選択されている）、例えば、単調なグリシンストレッチ、または単調なプロリンストレッチを示す。ここで、ｎ（Ｘncの繰り返しの数）は、典型的には、０〜５、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、またはそれ以上、好ましくは０〜５または５〜１０である。Ｘncは、Ｄアミノ酸またはＬアミノ酸を示す。
【０１３１】
他の具体的な一実施形態によれば、本明細書において使用されるキメラペプチドは、上記で開示されたＬ−アミノ酸キメラペプチドのＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成される。
【０１３２】
本発明に係る典型的なＤレトロ−インベルソキメラペプチドは、例えば、ジェネリックＤ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドＮＨ2−Ｘnb−ＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲ−Ｘna−Ｘnb−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−Ｘnb−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（ジェネリック）（ｓ））［配列番号１２］である。
【０１３３】
ここで、Ｘ、Ｘna、およびＸnbは、好ましくは、上記で規定された通りである（好ましくは、Ｄアミノ酸を示す）。より好ましくは、本明細書において使用されるキメラペプチドは、ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドＮＨ2−ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ））［配列番号１１］に記載のＤ−アミノ酸キメラペプチドを含むか、またはこれから構成される。
【０１３４】
選択的または追加的に、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＴＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＹＴＤＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１）［配列番号２５］、または、ＸＴ／ＳＤＱＸＸＸＸＸＸＸＬＸＬＴＴＰＲＸＸＸＸＸＸＸＸＲＲＲＱＲＲＫＫＲＸＸＸＸＸＸＸ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢジェネリック）［配列番号２６］を含むか、またはこれから構成されるか（ここでも、Ｘは、好ましくは、上記で規定された通りである）、または、本明細書において使用されるキメラペプチドは、Ｄ−アミノ酸キメラペプチド配列ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＰＰＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ１））［配列番号３０］、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸncＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ２））［配列番号３１］、または、ＤＱＳＲＰＶＱＰＦＬＮＬＴＴＰＲＫＰＲＸncＲＲＲＱＲＲＫＫＲ（Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ３））［配列番号３２］を含むか、またはこれから構成される。Ｘncは、上記で規定された通りであってよい。
【０１３５】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインおよび第２のドメインは、当該技術において公知の好適な方法で行われる化学的または生化学的結合によって、互いに連結され得る。この化学的または生化学的結合の例には、第１のドメインと第２のドメインとの間にペプチド結合を形成すること、例えば第１のドメインおよび第２のドメインを、融合蛋白質として発現すること、または、例えば上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させることが挙げられる。
【０１３６】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを化学的に架橋させるために適した公知の多くの方法は、非特異的であり、すなわち、これらの方法は、結合点を、輸送ポリペプチドまたはカーゴ高分子上の任意の特定の部位に方向付けない。結果として、非特異的な架橋剤は、機能的部位を攻撃する、または、活性部位を立体的に遮断して、複合蛋白質を生物学的に不活性にする。したがって、第１のドメインと第２のドメインとをさらに特異的に結合することが可能な架橋法を用いることが好ましい。
【０１３７】
これに関して、結合特異性を増大させる１つの方法は、架橋される第１のドメインおよび第２のドメインのいずれかまたは両方に、１回または数回だけ存在する官能基に、直接化学的に結合させることである。例えば、チオール基を含有する唯一の蛋白質アミノ酸であるシステインは、多くの蛋白質において数回だけ生じる。また、例えば、ポリペプチドが、リジン残基を含まない場合、第一級アミンに特異的な架橋剤は、このポリペプチドのアミノ末端にとって選択的であろう。
【０１３８】
結合特異性を増大させるために、この方法の使用を成功させるには、ポリペプチドが、分子の生物活性を損なうことなく変更させることが可能な分子の領域において、好適な程度の稀な且つ反応性残基を有していることが求められる。
【０１３９】
システイン残基は、システイン残基が架橋反応に関与すると生物活性を妨げる傾向があるポリペプチド配列の一部に生じた場合には、置き換えてもよい。システイン残基を置き換える場合、典型的には、ポリペプチドの折り畳みに結果として生じる変化を最小化することが望ましい。
【０１４０】
ポリペプチドの折り畳みにおける変化は、この置き換えがシステインに化学的且つ立体的に類似している場合に、最小化される。こういった理由のため、システインの代替としては、セリンが好ましい。
【０１４１】
以下の実施例において示すように、システイン残基を、架橋のために、ポリペプチドのアミノ酸配列の中に導入する。システイン残基の導入には、アミノ末端若しくはカルボキシ末端における導入、または、アミノ末端若しくはカルボキシ末端の近傍への導入が好ましい。従来の方法は、このようなアミノ酸配列修飾の場合に利用可能であり、ここで、対象となるポリペプチドは、組換えＤＮＡの化学合成または発現によって、生成される。
【０１４２】
本明細書において使用される、上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとの結合は、カップリング剤または接合剤によって行うことも可能である。利用可能な分子間架橋剤が幾つか存在する（例えば、Means and Feeney, CHAMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43を参照）。
【０１４３】
これらの分子間架橋剤には、例えば、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド（これらは両方とも、スルフヒドリル基に特異的であり、不可逆リンケージを形成する）や、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または他の、６〜１１の（スルフヒドリル基に比較的特異的である）炭素メチレンブリッジを有する架橋剤、および、（アミノ基およびチロシン基を有する不可逆リンケージを形成する）１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンが挙げられる。
【０１４４】
このために利用可能な他の架橋剤には、アミノ基およびフェノール基を有する不可逆性のクロスリンケージを形成するｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン、（アミノ基に特異的な）アジプイミド酸ジメチル、（主にアミノ基と反応する）フェノール−１，４ジスルホニル塩素、ヘキサメチレンジイソシアン酸塩若しくはジイソチオシアン酸塩、または、（主にアミノ基と反応する）アゾフェニル−ｐ−ジイソシアン酸塩、（幾つかの様々な側鎖と反応する）グルタルアルデヒド、および（チロシンおよびヒスチジンと主に反応する）ジスジアゾベンジジン（disdiazobenzidine）が含まれる。
【０１４５】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させるために用いられる架橋剤は、ホモ二機能性であってよく、すなわち、同じ反応をする２つの官能基を有している。
【０１４６】
好ましいホモ二機能性架橋剤は、ビスマレイミドヘキサン（「ＢＭＨ」）である。ＢＭＨは、マイルドな条件（ｐＨ６．５〜７．７）下でスルフヒドリル−含有化合物と特異的に反応する２つのマレイミド官能基を含有する。これらの２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続されている。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含むポリペプチドを不可逆架橋させるために有効である。
【０１４７】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させるために用いられる架橋剤はまた、ヘテロ二機能性であってもよい。ヘテロ二機能性架橋剤は、２つの異なる官能基、例えば、アミン−反応基およびチオール−反応基を有している。これらの官能基は、遊離アミンを有する蛋白質と、チオールを有する蛋白質とを架橋させる。
【０１４８】
ヘテロ二機能性架橋剤の例には、サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（「ＭＢＳ」）、および、ＭＢＳに類似した拡大された鎖であるスクシニミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）酪酸塩（「ＳＭＰＢ」）が挙げられる。これらのクロスリンカーのサクシニミジル基は、第一級アミンと反応し、チオール−反応マレイミドは、システイン残基のチオールとの共有結合を形成する。
【０１４９】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させるために好適な架橋剤は、水溶性が低い場合が多い。従って、その水溶性を改善するために、スルフォン酸塩基といった親水性の成分が架橋剤に添加される。これに関して、水溶性を改善するために改変された架橋剤の例は、スルフォン基−ＭＢＳおよびスルフォン基−ＳＭＣＣであり、これらを、本発明に従って用いてもよい。
【０１５０】
同様に、多くの架橋剤は、基本的には、細胞条件下では開裂不可能な接合を実現する。しかし、上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを架橋させることに特に適した幾つかの架橋剤は、細胞状態下で開裂させることが可能な、ジスルフィ供与体との共有結合を含む。
【０１５１】
例えば、トラウト試薬（Traut's reagent）、ジチオビス（サクシニミジルプロピオン酸塩）（「ＤＳＰ」）、および、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸塩（「ＳＰＤＰ」）が、公知の開裂可能なクロスリンカーである。開裂裂可能な架橋剤の使用は、カーゴ成分を標的細胞内に運搬した後に、輸送ポリペプチドから分離させることを可能にする。直接的なジスルフィドリンケージも利用可能である。
【０１５２】
上記で説明した架橋剤を含む多くの架橋剤が、市販されている。これらの使用のための詳細な取扱説明書は、これらの業者から容易に入手可能である。蛋白質架橋および接合調製に関して一般的に参照されるのは、「Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press (1991)」である。
【０１５３】
上記で規定されたキメラペプチドの第１のドメインと第２のドメインとを化学的に架橋させることは、スペーサーアームの使用を含む。スペーサーアームは、分子内たわみ性を提供するか、または、接合された成分間の分子内距離を調節し、これによって、生物活性を保持することを促進し得る。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むポリペプチド成分の形をしていて良い。あるいは、スペーサーアームが、例えば「長鎖ＳＰＤＰ」内の、架橋剤の一部であってよい（Pierce Chem. Co., Rockford, IL., cat. No. 21651 H）。
【０１５４】
さらに、上記で開示された１つのキメラペプチドの改変体、断片、または誘導体をここで、用いてもよい。断片および改変体に関しては、一般に、ＪＮＫ阻害剤配列に関して記載した規定が参照される。
【０１５５】
特に、本発明の意味するところでは、「キメラペプチドの改変体」とは、好ましくは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、キメラ改変体は、本明細書において使用される、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載のキメラペプチドのアミノ酸変換を含む。このような変換は、典型的には、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載のアミノ酸の、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、およびより好ましくは１〜５個の置換、付加、および／または、（断片を導く）削除を含む。
【０１５６】
ここで、本明細書において使用される、変換されたキメラペプチドは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列と、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を示す。好ましくは、これらの改変体は、本明細書において使用されるキメラペプチドに含まれる第１のドメインおよび第２のドメインの生物活性を保持する。すなわち、上記で開示された第１のドメインのトラフィッキング活性と、第２のドメインの、ＪＮＫに結合するため、および／または、少なくとも１つのＪＮＫ活性化された転写因子の活性化を阻害するための活性とを保持する。
【０１５７】
従って、本明細書において使用されるキメラペプチドは、また、上記で開示されたキメラペプチドの断片、特に、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載のキメラペプチド配列の断片を含む。
【０１５８】
従って、本発明の意味するところにおいて、「キメラペプチドの断片」とは、好ましくは、配列番号９〜１２および２３〜３２に記載の配列のいずれかに由来する配列である。ここで、断片は、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの少なくとも４つの連続したアミノ酸を含む。
【０１５９】
この断片は、好ましくは、これらの配列のいずれかからのエピトープを特異的に認識することを十分に可能にすると共に、当該配列を細胞、核、またはさらなる所望の位置の中まで十分に輸送する程度の長さを含む。
【０１６０】
さらにより好ましくは、断片は、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの、４〜１８個、４〜１５個、または最も好ましくは４〜１０個の連続したアミノ酸を含む。本明細書において使用されるキメラペプチドの断片はさらに、配列番号９９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載の任意の配列と、少なくとも約３０％、５０％、７０％、８０％、または９５％、９８％、またはさらに９９％の配列同一性を共有する配列と規定され得る。
【０１６１】
最終的に、本明細書において使用されるキメラペプチドはまた、上記で開示されたキメラペプチドの誘導体、特に、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに記載のキメラペプチド配列の誘導体を含む。
【０１６２】
本発明は、さらに、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で規定されたキメラペプチド、またはそれらの断片、改変体、若しくは誘導体をコードする核酸配列の、本明細書において規定される被験体における、非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療用の薬剤組成物を調製するための使用に関する。
【０１６３】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする好ましい好適な核酸は、典型的には、ヒトＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（ＡＦ０７４０９１）、ラットＩＢ１核酸（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１０８９５９）、若しくはヒトＩＢ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２１８７７８）から、または、上記で規定された配列のうちのいずれかをコードする任意の核酸配列、すなわち、配列番号１〜２６に記載の任意の配列から、選択される。
【０１６４】
本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列をコードする核酸、または本明細書において使用されるキメラペプチドをコードする核酸は、当該技術分野において公知の任意の方法によって（例えば、配列の３’−末端および５’−末端にハイブリダイゼーション可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、および／または、所定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチド配列を用いて、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからクローン作成することによって）、得られる。
【０１６５】
さらに、本明細書には、ストリンジェントな条件において、上記で規定された（ネイティブ）ＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドのための適切なストランドコーディングとハイブリダイズする核酸配列も開示される。好ましくは、このような核酸配列は、特異的なハイブリダイゼーションを十分に可能にする長さを有する、少なくとも６つの（連続した）核酸を含む。より好ましくは、このような核酸配列は、６〜３８、さらにより好ましくは６〜３０、および最も好ましくは６〜２０または６〜１０の（連続した）核酸を含む。
【０１６６】
「ストリンジェントな条件」とは、配列に依存しており、異なる各環境下では互いに異なるものであろう。該して、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度およびｐＨにおける、特異的配列の熱融点（ＴＭ）よりも約５℃低く選択されていてよい。ＴＭは、標的配列の５０％が、完全に適合する試料にハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩の濃度がｐＨ７において少なくとも約０．０２モルであり、温度が少なくとも約６０℃である条件である。他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（特に、塩基組成、および相補鎖のサイズを含む）、有機溶媒の存在、および塩基の不適合の範囲に影響を与え得るので、任意のパラメータの絶対測定値よりも、パラメータの組み合わせがより重要である。
【０１６７】
「高ストリンジェンシー条件」とは、次のステップを含んでいてよい。例えば、ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．０２％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡから構成されるバッファー中で、６５℃で８時間から一晩にわたって前処理する。
【０１６８】
ステップ２では、上述の事前のハイブリダイゼーション混合物に、１００ｍｇ／ｍｌの変性されたサケの精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０6ｃｐｍの32Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを６５℃で４８時間ハイブリダイズする。
【０１６９】
ステップ３では、２×ＳＳＣ、０．０１％のＰＶＰ、０．０１％のフィコール、および０．０１％のＢＳＡを含む溶液において、フィルターを３７℃で１時間洗浄する。
【０１７０】
この後、０．１×ＳＳＣにおける洗浄を、５０℃で４５分間行う。ステップ４では、フィルターを、オートラジオグラフィーに曝す。
【０１７１】
高ストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において公知である（例えば、Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NYを参照）。
【０１７２】
「中程度のストリンジェンシー条件」とは、次のステップを含んでいてよい。ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、および１００ｍｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、５５℃で６時間前処理する。
【０１７３】
ステップ２では、同じ溶液に、５〜２０×１０6ｃｐｍ32Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを５５℃で１８〜２０時間ハイブリダイズする。
【０１７４】
ステップ３では、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む溶液において、フィルターを３７℃で１時間洗浄し、その後、１×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液において６０℃で３０分間洗浄することを、２回行う。ステップ４では、フィルターをドライブロッティングして、オートラジオグラフィーに曝す。
【０１７５】
中程度のストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において公知である（例えば、「Ausubel et al., (eds.), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, a Laboratory Manual, Stockton Press, NY」を参照）。
【０１７６】
最後に、「低ストリンジェンシー条件」には、次のステップを含むことが可能である。ステップ１では、ＤＮＡを含むフィルターを、３５％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＶＰ、０．１％のフィコール、１％のＢＳＡ、および５００μｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液において、４０℃で６時間前処理する。
【０１７７】
ステップ２では、同じ溶液に、０．０２％のＰＶＰ、０．０２％のフィコール、０．２％のＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、１０％（wt/vol）の硫酸デキストラン、および５〜２０×１０６ｃｐｍ32Ｐ−標識プローブを加えたものにおいて、フィルターを４０℃で１８〜２０時間ハイブリダイズする。
【０１７８】
ステップ３では、フィルターを、２×ＳＳＣ、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＳＤＳを含む溶液において、５５℃で１．５時間洗浄する。この洗浄溶液を、新鮮な溶液と置き換え、６０℃においてさらに１．５時間培養する。
【０１７９】
ステップ４では、フィルターをドライブロッティングして、オートラジオグラフィーに曝す。必要に応じて、フィルターを６５〜６８℃で３回洗浄して、フィルムに再び曝す。
【０１８０】
低ストリンジェンシーの、使用可能な他の条件は、当該技術分野において公知である（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられるような条件）。例えば「Ausubel et al., (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons, NY; and Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY」を参照されたい。
【０１８１】
上記で規定された本発明に係る核酸配列を用いて、ペプチドを発現させることが可能である。すなわち、上記で規定された本発明に係る核酸配列を用いて、分析、特徴づけ、または治療上の使用のために本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列または本明細書において使用されるキメラペプチドを、（本明細書において使用される）対応するペプチドが（組織分化若しくは発生の構成的または特別な段階、または疾患状態において）好ましくは発現される組織用のマーカーとして発現させることが可能である。これらの核酸の他の使用には、例えば、核酸のゲル電気泳動−ベースの分析における分子量マーカーとしての使用が含まれる。
【０１８２】
本発明のさらなる一実施形態によれば、上記で規定された、１つ以上のＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの組み換え型に発現させるという上述の目的のために、発現ベクターを用いてもよい。
【０１８３】
「発現ベクター」という用語は、本明細書では、二本鎖または一本鎖である、環状または線形のＤＮＡまたはＲＮＡを示すために用いられる。発現ベクターはさらに、宿主細胞または単細胞または多細胞宿主生物内に移転される、上記で規定された少なくとも１つの核酸を含む。
【０１８４】
本明細書において使用される発現ベクターは、好ましくは、本明細書において使用されるＪＮＫ阻害剤配列またはその断片若しくは改変体、あるいは、本明細書において使用されるキメラペプチド、または、その断片若しくは改変体をコードする、上記で規定された核酸を含む。
【０１８５】
さらに、本発明に係る発現ベクターは、好ましくは、様々な調整要素を含む、発現を支援するための適切な要素を有している。これらの様々な調整要素の例には、ウイルス源、細菌源、植物源、哺乳類の源、および、他の真核細胞の源からのエンハンサー／プロモーターが挙げられる。上記エンハンサー／プロモーターは、ホスト細胞内に挿入されたポリヌクレオチドの発現を始動し、例としては、インスレータ、境界素子（boundary elements）、ＬＣＲ（例えば、Blackwood and Kadonaga （1998）, Science 281, 61−63によって記載されている）、または、マトリクス／スカッフフォールド結合領域（例えば、Li, Harju and Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408によって記載されている）などが挙げられる。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、調整要素は、異種要素である（すなわち、ネイティブ遺伝子プロモーターではない）。あるいは、遺伝子および／または該遺伝子に挟まれた領域のネイティブプロモーターによって、必要な転写信号および翻訳信号が、供給されてもよい。
【０１８７】
「プロモーター」という用語は、本明細書における使用では、ＤＮＡの領域であって、上記で規定された１つ以上の核酸配列の転写を制御するように機能すると共に、ＤＮＡ−依存性のＲＮＡ−ポリメラーゼの結合部位の存在、および、プロモーターの機能を調整するために相互作用する他のＤＮＡ配列の存在によって、構造的に特定される領域を指す。
【０１８８】
機能的な発現を促進するプロモーターの断片は、プロモーターとしての活性を保持する、短縮された、または、省略されたプロモーター配列である。プロモーター活性は、当該技術分野において公知の任意の試験法（例えば、Wood, de Wet, Dewji, and DeLuca, (1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596;  Seliger and McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141）、または市販のPromega（登録商標））によって測定可能である。
【０１８９】
ここに規定された発現ベクターにおいて使用される「エンハンサー領域」とは、典型的には、１つ以上の遺伝子の転写を増加させるように機能する、ＤＮＡの領域を指す。より詳細に言うと、「エンハンサー」という用語は、本明細書における使用では、遺伝子の発現を、その位置および方向に無関係に、発現される遺伝子に対して、促進、増大、改善、または、向上させるＤＮＡ調整要素であり、１つ以上のプロモーターの発現を促進、増大、改善、または、向上させることであり得る。
【０１９０】
ここに規定される発現ベクターにおいて使用されるプロモーター／エンハンサー配列は、植物、動物、昆虫、または、菌類の調整配列を利用していてよい。例えば、酵母および他の菌類（例えば、ＧＡＬ４プロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）からの、プロモーター／エンハンサー要素を用いてもよい。選択的または追加的に、これらは、動物の転写調節領域を含んでいてよい。
【０１９１】
動物の転写調節領域の例には、（ｉ）膵臓ベータ細胞の内部において活性のインスリン遺伝子制御領域（例えば、Hanahan, et al., 1985. Nature 315 115-122を参照）、（ii）リンパ球様細胞の内部において活性の免疫グロブリン遺伝子制御領域（例えば、Grosschedl, et al., 1984, 細胞 38  647-658を参照）、（iii）肝臓の内部において活性のアルブミン遺伝子制御領域（例えば、Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1 268-276を参照）、（iv）脳希突起膠細胞の内部において活性のミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域（例えば、Readhead, et al., 1987, Cell 48 703-712を参照）、および、（ｖ）視床下部の内部において活性の性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（例えば、Mason, et al., 1986, Science 234 1372-1378を参照）が挙げられる。
さらに、本明細書において規定される発現ベクターは、増幅マーカーを含んでいてよい。この増幅マーカーは、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、およびＮ−（ホスホンアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸塩耐性（ＣＡＤ）から成る群から選択され得る。
【０１９２】
本発明に適した典型的な発現ベクターまたはその誘導体には、特に、例えば、ヒトまたは動物のウイルス（例えば、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルス）、昆虫ウイルス（例えばバキュロウイルス）、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダファージ）、プラスミドベクター、およびコスミドベクターが含まれる。
【０１９３】
本発明はさらに、上記で規定された核酸の配列をコーディングするペプチドを発現することが可能な、様々な宿主（ホスト）ベクター系を利用してよい。これらの宿主ベクター系には、（ｉ）ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどに感染した哺乳類細胞系、（ii）バキュロウイルスなどに感染した昆虫細胞系、（iii）酵母ベクターを含有する酵母、または（iv）バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換されたバクテリアが含まれるが、これらに限定されない。利用される宿主ベクター系に応じて、多数の好適な転写要素および翻訳要素のうちの任意の１つを用いてよい。
【０１９４】
このような宿主ベクター系に適した宿主細胞株であって、対象となる挿入された配列の発現を調節する宿主細胞株、または、該配列が特定の所望の方法でコードした、発現されたペプチドを変更若しくは処理する宿主細胞株が、選択されることが好ましい。
【０１９５】
さらに、特定のプロモーターからの発現は、選択された宿主株において、特定の誘発因子の存在下で強化され、従って、遺伝子工学により生産されたペプチドの発現の制御を促進することが可能である。さらに、様々な宿主細胞は、発現されたペプチドの翻訳処理およびポスト翻訳処理、並びに修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化など）の特性および特別のメカニズムを有している。
【０１９６】
従って、外来ペプチドの所望の修飾および処理を確実に行うために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。例えば、バクテリア系内のペプチド発現を用いて、グリコシル化されていないコアペプチドを生成することが可能である。その一方で、哺乳類細胞の内部における発現は、異種のペプチドの「ネイティブ」グリコシル化を確実に行う。
【０１９７】
本発明は、さらに、上述のＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに対する抗体を、本明細書において規定される非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療用の薬剤組成物を調製するために使用することを提供する。さらに、本発明に係るＪＮＫ阻害剤配列に特異的、またはこのような阻害剤配列を含むキメラペプチドに特異的な抗体を生成するために有効な手段が記載され、この目的のために用いられる。
【０１９８】
本発明によれば、本明細書において規定された、ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、並びに、その断片、改変体、または誘導体を、これらのペプチド成分を免疫特異的に結合させる抗体を生成するイムノゲンとして利用してもよい。このような抗体には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーが含まれる。具体的な一実施形態では、本発明は、上記で規定された、キメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列に対する抗体を提供する。これらの抗体の製造には、当該技術分野で公知の様々な方法を用いてよい。
【０１９９】
一例として、上記で規定されたキメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列を注射することによって、様々な宿主動物に、ポリクローナル抗体を生成するための免疫性を与えることが可能である。この際に、免疫応答を向上させるために、様々な補佐剤を用いることが可能である。補佐剤には、フロインドアジュバント（完全および不完全）、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、ジニトロフェノールなど）、ＣｐＧ、ポリマー、プルロニック、および、ヒト補佐剤（例えばカルメットゲラン杆菌およびコリネバクテリウムパルヴム）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
上記で規定されたメラペプチドまたはＪＮＫ阻害剤配列に対するモノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養によって抗体分子の生成を提供する、任意の技術を利用してよい。
【０２０１】
このような技術には、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, 1975. Nature 256 495-497を参照）、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983, Immunol Today 4 72を参照）、および、ヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985. In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用可能であり、ヒトハイブリドーマの使用によって（Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80 2026-2030を参照)、または、ヒトＢ−細胞をエプスタイン−バーウイルスによってインビトロで形質転換することによって（Cole, et al.,1985. In Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照））生成可能である。
【０２０３】
本発明によれば、本明細書において規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに特異的な一本鎖抗体を生成するための技術を採用してもよい（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照）。
【０２０４】
さらに、Ｆａｂ発現ライブラリーを構成するための方法（例えば、Huse et al., 1989. Science 246 1275-1281を参照）を採用して、これらのＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドにとって所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ効率のよい識別を可能にすることもできる。非−ヒト抗体を当該技術分野において公知の技術によって、「ヒト化」してもよい（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照）。
【０２０５】
本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドに対してイディオタイプを含有する抗体断片を、当該技術分野において公知の技術によって生成してもよい。この抗体断片の例には、（ｉ）抗体分子をペプシン消化することによって生成されるＦ（ａｂ’）2断片、（ii）Ｆ（ａｂ’）2断片のジスルフィドブリッジを減少させることによって生成されるＦａｂ断片、（iii）抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成されるＦａｂ断片、および、（ｉｖ）Ｆｖ断片が挙げられる。
【０２０６】
本発明の一実施形態では、抗体をスクリーニングするために用いられる方法であって、所望の特異性を有する方法には、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、および他の、当該技術分野において公知の免疫媒介性技術が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０７】
具体的な一実施形態では、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド（例えば、典型的には５〜２０、好ましくは８〜１８、および最も好ましくは８〜１１の個の長さのアミノ酸を含むその断片）の特定のエピトープに対して特異的な抗体の選択は、このようなエピトープを有する、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドの断片に結合させるハイブリドーマの生成によって促進される。上記で規定されたエピトープに特異的なこれらの抗体も、本明細書において提供される。
【０２０８】
ここで規定される抗体を、ＪＮＫ阻害剤配列（および／または、これに対応して、上記で規定されたキメラペプチド）の局在化および／または数量化に関する当該技術分野で公知の方法において、用いてもよい。これは、例えば、適切な生理学的試料内のペプチドの量を測定するため、診断方法における使用のため、または、ペプチドを造影するための使用のためである。
【０２０９】
本発明に従って規定される、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、および／または、抗体は、本明細書において規定される疾患のうちのいずれかの予防または治療のため、特に、本明細書において規定される非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の予防または治療のために適用され得る薬剤組成物に製剤可能である。
【０２１０】
典型的には、このような本発明に従って用いられる薬剤組成物は、次の有効成分を１つ含む。すなわち、（ｉ）任意の１つ以上の、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体、断片、若しくは誘導体、特に、配列番号１〜４および１３〜２０および３３〜１００の配列のうちのいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上記の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、および／または、（ii）上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体若しくは断片をコードする核酸、および／または、（iii）上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体、断片、若しくは誘導体を任意で１つ以上含む細胞、および／または、（iv）上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチド、および／または、その改変体若しくは断片をコードする、ベクター、および／または、核酸でトランスフェクトされた細胞、を含む。
【０２１１】
好ましい一実施形態によれば、このような、本発明に従って使用される薬剤組成物は、典型的には、安全且つ有効な量の、上記で規定された成分を含む。この成分は、好ましくは、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上記の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、または、これをコードする少なくとも１つの核酸、または、上記で規定された、少なくとも１つのベクター、宿主細胞、若しくは抗体の成分である。
【０２１２】
本発明の発明者は、本明細書においてそれぞれ規定されるＪＮＫ−阻害剤配列およびキメラペプチドが、本発明の疾患に関連する細胞内への特に良好な取り込み率を示すことを、さらに発見した。従って、被験体に投与される薬剤組成物内の、各ＪＮＫ−阻害剤配列およびキメラペプチドの量は、非常に低い投与量である（これに限定されない）。このため、投与量は、当該技術分野において公知のペプチド薬剤、例えばＤＴＳ−１０８（Florence Meyer-Losic et al., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53）よりも大幅に低い。これは、例えば、潜在的な副作用の低減、および、費用の低減といった、幾つかの有利な面を有している。
【０２１３】
好ましくは、この投与量（ｋｇ体重当たり）は、１０ｍｍｏｌ／ｋｇ未満、好ましくは１ｍｍｏｌ／ｋｇ未満、より好ましくは１００μｍｏｌ／ｋｇ未満、さらにより好ましくは１０μｍｏｌ／ｋｇ未満、さらにより好ましくは１μｍｏｌ／ｋｇ未満、さらにより好ましくは１００ｎｍｏｌ／ｋｇ未満、最も好ましくは５０ｎｍｏｌ／ｋｇ未満の範囲内である。
従って、この投与量の範囲は、好ましくは、約１ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約１０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ、約５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１μｍｏｌ／ｋｇ、約１００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約３００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、約５００ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約７５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、約２５０ｐｍｏｌ／ｋｇ〜約５ｎｍｏｌ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、またはこれらの値のうちの任意の２つの値の組み合わせであってよい。
【０２１４】
これに関して、上述の薬剤組成物を用いる場合の、治療の処方、例えば投薬量の決定などは、典型的には、一般開業医や他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、治療される疾患、個々の患者の状態、送達の部位、投与方法、および、開業医に公知の他の要因が考慮される。上述の技術および説明は、例えば、「REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980」に見出すことが可能である。
【０２１５】
従って、本発明に従って使用される、上記で規定された薬剤組成物の成分の「安全且つ有効な量」とは、これらの各または全ての成分の、本明細書において規定される非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の良好な緩和を誘発するのに十分な量を意味する。
【０２１６】
しかし、同時に、「安全且つ有効な量」は、深刻な副作用を回避するために十分に少ない量であり、すなわち、利点と危険との間の実用的な関係を許可する量である。これらの限度の決定は、典型的には、実用的な医学的判断の範囲内にある。
【０２１７】
このような成分の「安全且つ有効な量」は、治療される特定の病気、治療される患者の年齢および健康状態、病気の重篤度、治療の期間、用いられる特定の薬学的に許容され得る担体に伴う治療法の性質、および、担当する医師の知識および経験の範囲内である類似の要因に関連して変動する。本発明に係る薬剤組成物は、本発明に従って、ヒト医学およびまた獣医学の目的に用いることが可能である。
【０２１８】
本発明に従って用いられる薬剤組成物は、さらに、これらの成分のうちの１つに加えて、（適合性の）薬学的に許容され得る担体、賦形剤、緩衝剤、安定剤、または、当業者に公知の他の材料を含む。
【０２１９】
これに関して、「（適合性の）薬学的に許容され得る担体」という表現は、好ましくは、液体または非液体ベースの組成物を含む。「適合性の」という用語は、本明細書において使用される薬剤組成物の構成物質が、上記で規定された薬学的に有効な成分、および他の成分と混合されることが可能であり、この際に、通常の使用条件下で薬学的有効性を実質的に低減する相互作用が生じないことを意味している。薬学的に許容され得る担体は、治療されるヒトへの投与に適したようにするには、当然ながら、純度が十分に高く、且つ、毒性が十分に低くなければならない。
【０２２０】
本明細書において使用される薬剤組成物が、液体の形で提供されるならば、薬学的に許容され得る担体は典型的には、１つ以上の（適合性の）薬学的に許容され得る液体担体を含む。この組成物は、（適合性の）薬学的に許容され得る液体担体として、例えば、パイロジェンフリー水、等張食塩水またはバッファー（水）溶液（例えばリン酸塩、クエン酸塩など、バッファー溶液、植物油（例えば、ラッカセイ油、綿実油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびシオブローマからの油））、ポリオール（例えば、ポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール）、アルギン酸などを含んでいてよい。特に、本明細書において使用される薬剤組成物を注射する場合、バッファー、好ましくは水性バッファーを用いてもよい。
【０２２１】
本明細書において使用される薬剤組成物が固形に提供されるならば、薬学的に許容され得る担体は、典型的には、１つ以上の（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体を含む。この組成物は、（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体として、例えば、１つ以上の適合性の固形を含んでもよいし、または、液体の充填剤若しくは希釈剤若しくはカプセルに包まれた化合物を用いてもよい。このカプセルに包まれた化合物は、ヒトへの投与に適している。
【０２２２】
このような（適合性の）薬学的に許容され得る固形の担体の幾つかの例は、例えば、糖質（例えば、ラクトース、グルコース、およびサッカロース）、でんぷん（例えば、コーンスターチまたはジャガイモでんぷん）、セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロース）、粉状のトラガカント、モルト、ゼラチン、獣脂、固形の滑沢剤（glidant）（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム）、硫酸カルシウムなどが挙げられる。
【０２２３】
（適合性の）薬学的に許容され得る担体または他の材料の正確な特性は、投与経路に依存している。従って、（適合性の）薬学的に許容され得る担体の選択は、原則的に、本発明に従って用いられる薬剤組成物が投与される方法によって決定される。
【０２２４】
本発明に従って用いられる薬剤組成物は、例えば、全身的に投与され得る。投与経路には、例えば、（例えば注射を介した）非経口経路（例えば静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、または、経皮経路など）、経腸経路（例えば、経口または直腸経路など）、局所用経路（例えば経鼻、または鼻腔内経路など）、または他の経路（例えば表皮送達、またはパッチ送達）が含まれる。
【０２２５】
用いられる薬剤組成物の好適な量を、動物モデルを用いた一般的な実験によって決定することが可能である。このようなモデルには、うさぎ、ひつじ、マウス、ラット、イヌ、および非ヒトの霊長類モデルが含まれるが、これらに限定されることを意図するものではない。
【０２２６】
注射のための好ましい単位投与量の形態は、殺菌水溶液、生理食塩水、またはこれらの混合物が含まれる。このような溶液のｐＨは、約７．４に調節されている必要がある。注射のための好適な担体には、ヒドロゲル、制御された放出または遅延された放出のための装置、ポリ乳酸、およびコラーゲンマトリクスが含まれる。局所的に適用するために好適な薬学的に許容され得る担体には、ローション、クリーム、ゲルなどにおける使用に適した担体が含まれる。
【０２２７】
化合物が、経口的に投与されるならば、錠剤、カプセルなどが、好ましい単位剤形である。経口投与に使用可能な、単位投剤形の調製のための薬学的に許容され得る担体は、従来技術において公知である。この担体の選択は、味、費用、および貯蔵性などの二次的な検討条件によって決定される。この選択は、本発明の目的には重要ではなく、当業者が容易に選択することが可能である。
【０２２８】
経口投与用の薬剤組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液体状であってよい。錠剤は、上記で規定された固形の担体、例えばゼラチン、および、任意により補佐剤を含んでいてよい。経口投与用の液状薬剤組成物は、一般的には、上記で規定された液体担体、例えば水、石油、および、動物若しくは植物油、鉱物油、または、合成油を含んでいてよい。生理食塩水溶液、デキストロース若しくは他の糖類溶液、またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）が含まれていてもよい。
【０２２９】
静脈内、皮膚若しくは皮下注射、または、苦痛を有する部位への注射の場合、有効成分は、非経口的に受容可能な水溶液の形をしており、この水溶液は、パイロジェンフリーであると共に、好適なｐＨ、等張性、および安定度を有している。
【０２３０】
当業者は、好適な溶液を、例えば、等張性ビヒクル（例えば生食注射、リンガー液、乳酸加リンガー液）を用いて、調製可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤、および／または、他の添加物が含まれていてもよい。
【０２３１】
個体に供給されるものが、ポリペプチド、ペプチドであろうと、本発明に係る薬学的に有効な他の化合物である核酸分子であろうと、投与は、好ましくは「予防的に有効な量」、または、「治療的に有効な量」（場合によっては）である。この量は、個体に対する有効性を示すために十分な量である。投与される実際の量、および、投与の速度および時間的経過は、治療されるものの性質および重篤度によって決定される。
【０２３２】
本明細書において規定される疾患の予防および／または治療には、典型的には、上記で規定された薬剤組成物の投与が含まれる。「調節」という用語は、上述の疾患のいずれかが過剰に発現した時に、ＪＮＫの発現を抑制することを含む。
【０２３３】
「調節」という用語はまた、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２の配列のいずれかに記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上記の規定に範囲内におけるその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列を、自然なｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＮＦＡＴ４結合部位の競合阻害剤として細胞内で用いることによって、上述の疾患のいずれかにおいて、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４のリン酸化を抑制することを含むが、これに限定されない。
【０２３４】
「調節」という用語はまた、ｃ−ｊｕｎ、ＡＴＦ２、またはＮＦＡＴ４、およびそれらの関連するパートナーから構成される（これらに限定されない）転写因子のヘテロ−複合体およびホモ−複合体の抑制を含む。関連するパートナーの例には、ｃ−ｊｕｎ、ＡＦＴ２、およびｃ−ｆｏｓから構成されるＡＰ−１複合体が挙げられる。非慢性または慢性の炎症性消化器疾患が、ＪＮＫ過剰発現と関連付けられる場合、このような抑制力のあるＪＮＫ阻害剤配列を、細胞内に導入することが可能である。この場合、「調節」は、例えば、ＩＢペプチド特異的抗体の使用により、ＩＢ−ペプチドがＪＮＫに結合することを阻止して、これによって、ＩＢ−関連ペプチドによるＪＮＫ阻害を回避することによって、ＪＮＫ発現を増加させることを含む。
【０２３５】
被験体を、上記で開示された薬剤組成物で予防および／または治療することは、典型的には、一定の（「治療的に有効な」）量の上記薬剤組成物を被験体に投与する（インビボ）ことによって実現され得る。ここで、被験体とは、例えば任意の、哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、または豚であってよい。「治療的に有効な」という用語は、非慢性または慢性の炎症性消化器疾患を十分に改善する、薬剤組成物の有効成分の量を指す。
【０２３６】
従って、上記で規定されたようなペプチド、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載の少なくとも１つのＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２に記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列を、本発明の具体的な一実施形態において用いて、上記で規定されたような非慢性または慢性の炎症性消化器疾患を、活性化されたＪＮＫシグナル経路を調節することにより、治療することが可能である。
【０２３７】
本発明に係る薬剤組成物内に含有される、上記で規定されたペプチドは、核酸によってコードされていてよい。これは、上記ペプチドが遺伝子療法の目的で投与される場合に、特に有利である。ここで、遺伝子療法とは、上記で規定された特異的な核酸を、例えば上記で規定された薬剤組成物を用いて、被験体に投与することによって行われる療法を指す。ここで、核酸は、Ｌ−アミノ酸だけを含む。
【０２３８】
本発明の本実施形態では、核酸は、コードされたペプチドを生成し、該コードされたペプチドは、その後、疾患または障害を調節する機能によって、治療効果を発揮するように機能する。本発明の実施においては、当該技術分野において利用可能な遺伝子療法に関する任意の方法（例えば、Goldspiel, et al., 1993. Clin Pharm 12 488-505を参照）を用いてよい。
【０２３９】
好ましい一実施形態では、遺伝子療法に用いられる、上記で規定された核酸は、好適な宿主内の、上記で規定された任意の１つ以上のＩＢ−関連ペプチドをコードすると共に発現する発現ベクターの一部である。
【０２４０】
上記で規定された任意の１つ以上のＩＢ−関連ペプチドとは、すなわち、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２のいずれかに記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列である。
【０２４１】
具体的な一実施形態では、このような発現ベクターは、ＪＮＫ阻害剤配列のコーディング領域に動作可能に連結されたプロモーターを有している。このプロモーターは、上述のように、例えば、誘導的または構成的、および、任意により組織特異的であると規定され得る。
【０２４２】
具体的な一実施形態では、上記で規定されたような核酸分子が、遺伝子療法に用いられる。ここでは、上記で規定された核酸分子のコーディング配列（およびその、任意の他の所望の配列）が、ゲノム内の所望の部位において相同的組み換えを促進する領域によって挟まれているため、これらの核酸の染色体内発現を提供する（例えば、Koller and Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86 8932-8935を参照）。
【０２４３】
本発明によれば、上記で規定された核酸を、遺伝子療法のために、特にここでは、上述の、上記で規定された非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の遺伝子療法のために、患者の中に送達することは、直接的（すなわち、患者が核酸、または核酸−含有ベクターに直接曝される）であってもよいし、または、間接的（すなわち、最初に、核酸によって細胞をインビトロで形質転換させ、その後、患者に移植する）であってもよい。これら２つの方法は、それぞれ、インビボ遺伝子療法、または生体外遺伝子療法として公知である。
【０２４４】
本発明の具体的な一実施形態では、核酸を、直接インビボで投与する。ここで、核酸は、コードされた産生物を生成するために、発現する。これは、当該技術分野において公知の多数の方法のうちのいずれかによって実現され得る。
【０２４５】
これらの公知の方法には、例えば、核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構成して、投与し、細胞内にて上記核酸を発現する方法（例えば、欠損若しくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いて感染させることによって；米国特許第４，９８０，２８６号を参照）、非修飾のＤＮＡを直接注射する方法、微粒子の集中投与（bombardment）を用いる方法（例えば、「GeneGun」、Biolistic、DuPont）、核酸を脂質で被覆する方法、関連する細胞の表面にあるレセプター／トランスフェクション剤を用いた方法、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセル内にカプセルで包む方法、上記核酸を、核の中に侵入することが知られているペプチドへリンケージした状態にて投与する方法、または、上記核酸を、レセプター媒介性のエンドサイトーシスに感染し易いリガンドへのリンケージにて投与する方法（例えば、Wu and Wu, 1987.J Biol Chem 262 4429-4432を参照）が挙げられる。
【０２４６】
このレセプター媒介性のエンドサイトーシスに感染し易いリガンドに対するリンケージ内に投与する方法は、対象となるレセプターを特異的に発現する種類の細胞を「標的」とするために用いられ得る。
【０２４７】
本発明の実施における遺伝子療法のさらなる方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、カルシウムリン酸塩−媒介性トランスフェクション、ウイルス感染などのような方法によって、上記で規定されたような核酸をインビトロ組織培養液内の細胞の中に移転させる方法を含む。
【０２４８】
概して、この転移の方法は、同時に、選択可能なマーカーを細胞に転移することを含む。細胞はその後、淘汰圧（例えば、抗生物質に対する抵抗）下に置かれ、このため、移転された遺伝子を取り上げて発現する細胞の分離を促進させる。これらの細胞は、その後、患者に送達される。
【０２４９】
具体的な一実施形態では、結果として生じる組み換え細胞をインビボで投与する前に、核酸を細胞内に導入する。当該技術分野において公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、対象となる核酸配列を含有するウイルスまたはバクテリオファージベクターに感染させること、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロセル−媒介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合、および、受容細胞の必要な発生および生理学的機能を確保する類似の方法）は、この転移によっては妨げられない。
【０２５０】
例えば、Loeffler and Behr, 1993. Meth Enzymol 217  599-618を参照。選択された技術は、核酸を細胞に安定して転移させ、細胞によって核酸を発現可能なことを提供する必要がある。好ましくは転移された核酸は、遺伝性であり、細胞後代によって発現可能である。
【０２５１】
本発明の好ましい実施形態では、結果として生じる組み換え細胞は、当該技術分野において公知の様々な方法によって、患者に送達され得る。当該技術分野において公知の方法には、例えば、上皮細胞への注射（例えば皮下注射）、植皮としての組み換え皮膚細胞を患者に付着させること、および、組み換え血液細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）の静脈内注射が含まれる。
【０２５２】
使用が想定される細胞の合計数は、所望の作用、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。遺伝子療法のために核酸が導入され得る細胞は、任意の、所望の利用可能な細胞の種類を包含し、異種、異種遺伝子的、同質遺伝子的、または自己繁殖的であってよい。
【０２５３】
細胞の種類には、分化された細胞、例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞、および血液細胞、または、様々な幹細胞若しくは前駆細胞、特に、胎児心筋細胞、肝臓幹細胞（国際特許公開ＷＯ９４／０８５９８号）、神経幹細胞（Stemple and Anderson, 1992, Cell 71 973-985）、例えば、骨髄から得られる造血幹細胞若しくは前駆細胞、臍帯血液、末梢血、胎児の肝臓などが含まれるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、遺伝子療法に利用されるこれらの細胞は、患者の自己細胞である。
【０２５４】
選択的および／または追加的に、本明細書に記載される疾患の治療のために、上記で規定された、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および／または、核酸を送達するための標的療法、より詳細にいうと、（標的）抗体または細胞特異的リガンドのような標的システムを用いることによって、所定の種類の細胞に送達するための標的療法を用いてよい。標的とするために用いられる抗体は、典型的には、以下に規定する任意の疾患に関連する細胞の細胞表面蛋白質に特異的である。
【０２５５】
一例として、これらの抗体は、例えば、Ｂ−細胞に関連付けられた表面蛋白質といった細胞表面抗体に関連していてよい。Ｂ−細胞に関連付けられた表面蛋白質の例には、ＭＨＣクラスＩＩＤＲ蛋白質、ＣＤ１８（ＬＦＡ−１ベータ鎖）、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４０若しくはＢｇｐ９５、または、例えばＣＤ２、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６８、ＣＤ７１、ＣＤ１３８などから選択された細胞表面蛋白質が挙げられる。
【０２５６】
標的構成は、典型的には、本明細書において規定された、本発明に係るＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および核酸を、細胞表面蛋白質に抗体特異的に共有結合させることによって、または、細胞特異的リガンドに結合させることによって、調製され得る。
【０２５７】
蛋白質は、例えば、ペプチド結合または化学的結合、化学的架橋などによって、このような抗体に結合され得る、または、このような抗体に付着され得る。その後、標的療法は、標的構成を、薬学的に有効な量で、以下に規定する投与経路のいずれかによって、患者に投与することによって行われ得る。
【０２５８】
例えば、投与経路は、腹膜内経路、経鼻経路、静脈内経路、経口経路、およびパッチ送達経路である。好ましくは、上記で規定された標的抗体または細胞特異的リガンドに付着される、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸は、例えば、共有結合の加水分解によって、ペプチダーゼによって、または、任意の他の好適な方法によって、インビトロまたはインビボにおいて放出され得る。
【０２５９】
あるいは、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸が、小細胞特異的リガンドに付着されるならば、リガンドの放出は、行われない。細胞表面に存在する場合、キメラペプチドは、そのトラフィッキング配列が活性化されると、細胞の中に侵入する。
【０２６０】
標的化は、様々な利用のため、例えば、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、および核酸が、許容できないような毒性である場合、または、極めて多い投薬量を必要とするような場合に望ましい。
【０２６１】
本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列、および／または、キメラペプチドを直接的に投与する代わりに、これらを、細胞内に導入されたエンコーディング遺伝子から、例えば、投与されるウイルスベクターから発現させることによって、標的細胞内に生成することも可能である。ウイルスベクターは、典型的には、本発明に係る、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドをコードする。
【０２６２】
このベクターは、治療される特異的細胞に標的化され得る。さらに、このベクターは、調整要素を含むことが可能である。この調整要素は、多かれ少なかれ、選択的に、所定の調節によって、標的細胞によって切替えられる。この技術は、成熟蛋白質をその前駆物質の代わりに利用するＶＤＥＰＴ技術の改変体（ウイルス−指向性酵素プロドラッグ療法）を示す。
【０２６３】
あるいは、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドを、抗体またはウイルスを用いることによって、前駆物質の形態にて投与してもよい。これらのＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドは、その後、治療される細胞内に生成された活性化剤、または治療される細胞に標的化された活性化剤によって、活性形に変換される。
【０２６４】
この種の方法は、ＡＤＥＰＴ（抗体−指向性酵素プロドラッグ療法）またはＶＤＥＰＴ（ウイルス−指向性酵素プロドラッグ療法）としても知られている。ＡＤＥＰＴは、細胞−特異性抗体に接合することによって、活性化剤を細胞に標的化することを含み、ＶＤＥＰＴは、活性化剤、例えば、ＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドを、ウイルスベクター内のエンコーディングＤＮＡから発現させることによって、ベクター内に生成することを含む（例えば、ＥＰ−Ａ−４１５７３１号およびＷＯ９０／０７９３６号を参照）。
【０２６５】
さらなる一実施形態によれば、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、または、本明細書において規定されるＪＮＫ阻害剤配列若しくはキメラペプチド、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列、および／または、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載のキメラペプチド、および／または、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２に記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体若しくは断片を含むＪＮＫ阻害剤配列、に対する抗体を、（インビトロ）アッセイ（例えば、免疫学的検定）において用いて、上記で規定された非慢性または慢性の炎症性消化器疾患から選択された様々な状態および病状を検出、予測、診断、または監視するか、または、その治療を監視することが可能である。
【０２６６】
この免疫学的検定は、患者に由来する試料を、免疫特異性−結合が生じる条件下で、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸配列に対する抗体に接触させ、その後、該抗体によって、免疫特異性−結合の量を検出または測定することを含む方法によって、行うことが可能である。
【０２６７】
具体的な一実施形態では、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、または核酸配列に特異的な抗体を用いて、患者からの組織または血清試料の、ＪＮＫまたはＪＮＫ阻害剤配列の存在を分析することが可能である。ここでは、異常な量のＪＮＫが、疾患状態を示している。
【０２６８】
用いられ得る免疫学的検定には、ウエスタンブロット、放射線免疫学的検定（ＲＩＡ）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドウィッチ」免疫学的検定、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル内沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光免疫学的検定、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、および、蛋白質−Ａ免疫学的検定などといった技術を用いた、競合アッセイおよび非競合アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
あるいは、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、または上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドに対する抗体を、典型的には、例えば、培養された動物細胞、ヒト細胞、または微生物から選択された標的細胞に送達して、細胞応答を、典型的には当業者に知られた生物理学的方法によって監視することによって、（インビトロ）アッセイを行ってもよい。
【０２７０】
典型的には、本明細書において用いられる標的細胞は、培養された細胞（インビトロ）、またはインビボ細胞、すなわち、生きた動物若しくはヒトの臓器または組織、または生きた動物若しくはヒト内に存在する微生物を含む細胞であってよい。
【０２７１】
本発明はさらに、診断目的または治療目的のキットの使用、特に、上記で規定された非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療、予防、または監視のためのキットの使用を提供する。
【０２７２】
ここで、このキットは、１つ以上の容器を備えており、該容器は、ＪＮＫ阻害剤配列、キメラペプチド、核酸配列、および／または、上記で規定されたこれらのＪＮＫ阻害剤配列またはキメラペプチドに対する抗体、例えば、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列に対する、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかの配列に記載のキメラペプチドに対する、配列番号１〜４、および１３〜２０、および３３〜１００のいずれかの配列に記載のＪＮＫ阻害剤配列であって、配列番号５〜８および２１〜２２に記載のトラフィッキング配列、または上述の規定の範囲内のその改変体または断片を含むＪＮＫ阻害剤配列に対する、抗−ＪＮＫ阻害剤配列抗体、または、このような抗−ＪＮＫ阻害剤配列抗体、および任意により、該抗体への、標識化された結合パートナーを含む。
【０２７３】
ここで抗体の中に組み込まれるラベルには、化学発光、酵素、蛍光、比色分析、または放射性成分が含まれるが、これらに限定されない。他の具体的な一実施形態では、上記で規定された非慢性または慢性の炎症性消化器疾患の治療、予防、または監視における診断のための使用のためのキットが、提供される。このキットは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドをコードする核酸、あるいは、上記で規定されたＪＮＫ阻害剤配列および／またはキメラペプチドを補完する核酸を含む１つ以上の容器を備えており、任意により、これらの核酸に対して標識化された結合パートナーも提供されている。
【０２７４】
具体的な他の一実施形態では、このキットを、上述の目的のために、１つ以上の容器、および、一対のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、６〜３０ヌクレオチド長）を含むキットとして用いてもよい。一対のオリゴヌクレオチドプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；例えば、Innis, et al., 1990. PCR PROTOCOLS, Academic Press, Inc., San Diego, CAを参照）、リガーゼ連鎖反応、循環プローブ反応（cyclic probe reaction）などの方法、または、当該技術分野において公知の、ここでは上記で規定された核酸と共に用いられる方法のための、増幅プライマーとして機能することが可能である。
【０２７５】
このキットは、上述の目的のためのアッセイにおいて、診断、基準、または対照としての使用のために、任意により、所定の量の、上記で規定された精製されたＪＮＫ阻害剤配列、上記で規定されたキメラペプチド、またはこれらをコードする核酸をさらに含むことが可能である。
【０２７６】
本発明の範囲は、これらの具体的な実施形態によって限定されるものではない。むしろ、本明細書に記載されるこれらの実施形態に加えて、本発明の様々な変形が、当業者には、上述の明細書および添付の図面から明らかとなろう。このような変形例は、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０２７７】
本明細書には、様々な文献を引用している。これらの文献の開示内容を、引用することによって、その全体を援用する。
【０２７８】
他に記載がない限り、本明細書において使用される全ての技術的且つ科学的用語は、本発明が属する当該技術分野の知識を有する当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載された方法および材料に類似または等しい方法および材料を、本発明の実施または試験において用いてもよいが、好適な方法および材料については、後に記載する。
【０２７９】
本明細書に記載される、全ての文献、特許出願、特許、および他の引用文献は、引用によって、その全体を援用する。係争時には、規定を含む本明細書が、検査されることになる。さらに、材料、方法、および実施例は、単に、例示的なものであり、限定するものであることを意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】示される転写因子における、保存されたＪＢＤドメイン領域のアラインメントを示す図である。ここで用いられるＪＮＫ阻害剤配列は、配列アラインメントを実施することによって特徴付けられる。このアラインメントの結果が、Ａ〜Ｃに例示的に示されている。Ａは、ＩＢ１、ＩＢ２、ｃ−Ｊｕｎ、およびＡＴＦ２のＪＢＤの間で、最も相同性が高い領域を示す図である。Ｂは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）のＪＢＤおよびＬ−ＩＢ１のＪＢＤのアミノ酸配列を、比較のために示す図である。完全に保存された残基は、星印で示されており、ＧＦＰ−ＪＢＤ23Mutベクター内のＡｌａに変換された残基は、白丸で示されている。Ｃは、ＪＮＫ阻害剤配列およびトラフィッキング配列を含むキメラ蛋白質のアミノ酸配列を示す図である。図示された実施例では、トラフィッキング配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＴＡＴポリペプチドに由来し、ＪＮＫ阻害剤配列は、ＩＢ１（ｓ）ポリペプチドに由来する。パネルＢおよびＣでは、ヒト、マウス、およびラットの配列は同一である。
【図２】ヒト、マウス、およびラットからのジェネリックＴＡＴ−ＩＢ融合ペプチドの配列を示す図である。
【図３】ＩＢＤの検査において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療時の臨床的な数値を示す図であり、一日当たり、各濃度１および１００μｇ／ｋｇＳＣのＸＧ−１０２を用いた治療による数値を示す図である。
【図４】ＩＢＤの検査において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療時の用量反応曲線を示す図であり、一日当たり、各濃度０．０１、０．１、１、１０、１００、および１０００μｇ／ｋｇＳＣのＸＧ−１０２を用いた治療による用量反応曲線を示す図である。
【図５】ＩＢＤの検査において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療時の臨床的な数値を示す図であり、各濃度１および１００μｇ／ｋｇＳＣのＸＧ−１０２（単回投与ＳＣ）を、日０において単回投与として用いた治療による数値を示す図である。
【図６】ＩＢＤの検査において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療時の臨床的な数値を示す図であり、濃度１および１００μｇ／ｋｇＰＯのＸＧ−１０２（日用量、ＰＯ）を、反復投与として用いた治療による数値を示す図である。
【図７】ＩＢＤの検査において、ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療時の臨床的な数値を示す図であり、濃度１および１００μｇ／ｋｇＰＯのＸＧ−１０２（単回投与ＰＯ）を、日０において単回投与として用いた治療による数値を示す図である。
【図８】初代培養されたマクロファージを、ＸＧ−１０２（配列番号１１）で培養し、その後、広範囲にわたって洗浄したものを示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）の存在は、ＸＧ−１０２に対する特異的抗体を用いて顕示させた。ＸＧ−１０２は、初代マクロファージにしっかりと組み込まれている。
【図９】放射性同位体で標識化されたＣ14（１ｍｇ／ｋｇ）のペプチドを、３つの異なる経路（ｓ．ｃ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．）を介して投与することによって、マウスを治療したものを示す図である。動物を、注射の７２時間後に犠牲にし、免疫ラジオグラフィーを施した。矢状断面を露出させ、主に肝臓、脾臓、および骨髄内の蓄積ＸＧ−１０２ペプチドを顕示させた（ＸＧ−１０２：配列番号１１）。
【図１０】１ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２をｉ．ｖ．で注射したラットの肝臓内のＸＧ−１０２（配列番号１１）に対する免疫染色を示す図である。動物を、注射の２４時間後に犠牲にした。ＤＡＢ基質を用いて顕示させた。この図も、肝臓、および特にクッパー細胞（マクロファージ）内にＸＧ−１０２が著しく蓄積していることを示している。
【図１１】２つの細胞株における、サイトカインおよびケモカインの放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）が、骨髄性細胞株およびリンパ球様細胞株におけるサイトカインの放出を阻害して、ＴＨＰ−１細胞（パネルＡ〜Ｃ）における、ＬＰＳ−誘発されたＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびＭＣＰ−１の放出を低減し、ジャーカット細胞（パネルＤ−Ｆ）におけるＰＭＡおよびイオノマイシン−誘発性ＩＦＮｇ、ＩＬ−６、およびＩＬ−２の産生を低減する。対照（ＸＧ−１０１）は、安定度が悪いため、それほど効果的でない。
【図１２】一次細胞におけるサイトカインの放出の阻害を示す図である。ＸＧ−１０２（配列番号１１）はまた、一次リンパ球様細胞および骨髄性細胞におけるサイトカインの放出を阻害して、マウスのマクロファージ（パネルＡ〜Ｃ）におけるＬＰＳ−誘発性ＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびランテス放出を低減すると共に、マウスのＴ細胞（パネルＤ〜Ｅ）におけるＰＭＡおよびイオノマイシン−誘発性ＴＮＦａ、およびＩＦＮｇの産生を低減する。細胞に傷害を与えない濃度のＸＧ−１０２において、効果が生じる（パネルＦ）。
【図１３】ＴＮＢＳ−誘発性大腸炎における効果を示す図である。炎症性腸疾患を有する患者のマクロファージおよびリンパ球において、ＪＮＫが活性化される。これは、組織障害において、ＴＮＦａ、ＩＬ−６、およびＩＦＮｇの産生が増大することに関連した応答である。５０および１００ｍｇ／ｋｇのＸＧ−１０２を皮下投与することにより、マウスをＴＮＢＳ−誘発性大腸炎（パネルＡ〜Ｃ）から保護し、ＤＡＩ、体重減少、および直腸出血を減少させる。
【図１４】ラットからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列、およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号１０２）を示す図である。
【図１５】ｒＩＢ１遺伝子−スプライス供与体のエクソン−イントロン境界によってコードされた、ラットからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０３）を示す図である。
【図１６】ホモサピエンスからのＩＢ１蛋白質配列（配列番号１０４）を示す図である。
【図１７】ホモサピエンスからのＩＢ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号１０５）を示す図である。
【０２８１】
［実施例］
実施例１：ＪＮＫ阻害剤配列の同定
ＪＮＫとの効果的な相互作用のために重要なアミノ酸配列を、公知のＪＮＫ結合ドメインＪＢＤ間の配列アラインメントによって同定した。ＩＢ１［配列番号１３］、ＩＢ２［配列番号１４］、ｃ−Ｊｕｎ［配列番号１５］、およびＡＴＦ２［配列番号１６］のＪＢＤ間の配列を比較することにより、低度に保存された８つのアミノ酸配列（図１Ａ）を規定した。ＪＮＫを結合させることにおいて、ＩＢ１およびＩＢ２のＪＢＤが、ｃ−ＪｕｎまたはＡＴＦ２のＪＢＤよりも約１００倍効果的であるため（Dickens et al. Science 277: 693 (1997)）、最大の結合を与えるためには、当然、ＩＢ１とＩＢ２との間に保存された残基が重要であることは間違いない。ＩＢ１のＪＢＤとＩＢ２のＪＢＤとの間の比較により、これら２つの配列間で高度に保存された、２つのブロックの、７つおよび３つのアミノ酸を規定した。
【０２８２】
これら２つのブロックは、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号１］内の１９のアミノ酸のペプチド配列内に含まれており、比較のために、ＩＢ１［配列番号１７］に由来する２３ａａペプチド配列内に示されている。これらの配列は、図１Ｂに示されており、Ｌ−ＩＢ１配列内の破線は、保存された残基をＬ−ＩＢ１（ｓ）と揃えるために、配列内の隙間を示すものである。
【０２８３】
実施例２：ＪＮＫ阻害剤融合蛋白質の調製
配列番号９に記載のＪＮＫ阻害剤融合蛋白質を、配列番号１のＣ−末端に共有結合にて連結することによって、ＨＩＶ−ＴＡＴ４ｇ５７に由来する配列番号５に記載のＮ−末端１０アミノ酸ロング担体ペプチドに対して、２つのプロリン残基から成るリンカーを介して合成した（Vives et al., J Biol. Chem.  272: 16010 (1997)）。このリンカーは、最大のたわみ性を可能にして、望ましくない２次的構造変化を回避するために用いたものである。この基本構造を調製して、Ｌ−ＩＢ１（ｓ）（配列番号１）およびＬ−ＴＡＴ［配列番号５］をそれぞれ指定した。
【０２８４】
配列番号１１に記載のＤレトロ−インベルソペプチドの全てを、上記合成に応じて合成した。この基本構造を調製して、Ｄ−ＩＢ１（ｓ）［配列番号２］およびＤ−ＴＡＴ［配列番号６］をそれぞれ指定した。
【０２８５】
配列番号９、１０、１１、および１２に記載のＤおよびＬの融合ペプチドの全てを、従来のＦｍｏｃ合成法によって産生し、さらに、質量分析法によって分析した。最終的に、これらの融合ペプチドを、ＨＰＬＣによって精製した。プロリンリンカーの効果を算定するために、２種類のＴＡＴペプチドを産生した。これら２種類のＴＡＴペプチドのうち、一方は２つのプロリンを有しており、他方は全く有していない。２つのプロリンを加えることは、ＴＡＴペプチドを細胞の内部に侵入させること、またはＴＡＴペプチドを細胞の内部において局在化させることについて変更することはないと思われる。保存されたアミノ酸残基を示すジェネリックペプチドは、図２に示されている。
【０２８６】
実施例３：ＪＢＤ１９による細胞死の阻害
ＩＢ１（ｓ）の１９ａａロングＪＢＤ配列が、ＪＮＫ生物活性に与える影響を調査した。この１９ａａ配列を、Ｎ−末端で、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ  ＪＢＤ１９構成）に結合させ、この構成がＩＬ１によって誘発された膵臓ベータ−細胞アポトーシスに与える効果を評価した。この形態のアポトーシスは、ＪＢＤ1-280でトランスフェクションすることによって阻止されることが既に示されているが、ＥＲＫ１／２またはｐ３８の特異的阻害剤は、これを、保護しなかった（Ammendrup et al., supraを参照）。
【０２８７】
１９アミノ酸の保存された配列、および、完全に保存された領域において突然変異した配列を有する、ＪＢＤ１９に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、（Clontech社からの）緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をコードするｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターのＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の中に、方向を定めて挿入した。
【０２８８】
１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍＬペニシリン、および２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０媒質において、インスリンを生成するＴＣ−３細胞を培養した。インスリンを生成するＴＣ−３細胞を、示されるベクターでトランスフェクトし、この細胞培養基に、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）を添加した。ＩＬ−１を添加して４８時間後に、アポトーシス細胞の数を、インバータ蛍光顕微鏡を用いて計数した。アポトーシス細胞を、細胞質の「気泡発生」特性によって、通常の細胞から選別し、２日後に計数した。
【０２８９】
ＧＦＰは、対照として用いられる緑色蛍光蛋白質発現ベクターである。ＪＢＤ１９は、ＩＢ１のＪＢＤに由来する１９ａａ配列に結合されたキメラＧＦＰを発現するベクターであり、ＪＢＤ１９Ｍｕｔは、ＧＦＰ−ＪＢＤ１９と同じベクターであるが、１つのＪＢＤは、図１Ｂとして示される４つの保存された残基において、突然変異しており、ＪＢＤ1-280は、全ＪＢＤ（ａａ１−２８０）に結合されたＧＦＰベクターである。ＧＦＰ−ＪＢＤ１９を発現する構造は、全ＪＢＤ1-280と同じ程度に効果的に、ＩＬ−１により誘発性の膵臓−細胞のアポトーシスを妨げた。
【０２９０】
さらなる対照である、完全に保存されたＩＢ１（ｓ）残基において突然変異した配列は、アポトーシスを妨げる能力を著しく低下させた。
【０２９１】
実施例４：ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの細胞インポート
ＴＡＴおよびＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（「ＴＡＴ−ＩＢペプチド」）のＬ−およびＤ−鏡像異性体の、細胞の中に侵入する能力を評価した。フルオレセインに接合されたグリシン残基のＮ−末端を付加することによって、Ｌ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）、およびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド［それぞれ、配列番号５、６、９、および１２］を標識化した。
【０２９２】
標識化されたペプチド（１μＭ）を、ＴＣ−３細胞培養に添加し、これを、実施例３に記載したように維持した。各細胞を、ＰＢＳで所定の回数にて洗浄し、冷却されたメタノール−アセトン（１：１）において、５分間固定した後に、蛍光顕微鏡下で検査した。
【０２９３】
対照として、フルオレセイン−標識化したＢＳＡ（１μＭ，１２ moles／mol ＢＳＡ）を用いた。フルオレセインで標識化した全ペプチドは、一旦、培養基に添加されると、細胞に、効果的且つ迅速（５分以内）に侵入するという結果が示された。逆に、フルオレセインで標識化したウシ血清アルブミン（１μＭ  ＢＳＡ，１２ molesのフルオレセイン／mol ＢＳＡ）は、細胞には侵入しなかった。
【０２９４】
時間経過検査では、Ｌ−鏡像異性体ペプチド用の蛍光信号の強度は、２４時間の後に、７０％減少したことが示された。４８時間では、信号はほとんど存在しなかった。逆に、Ｄ−ＴＡＴおよびＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１は、細胞の内部において、極めて安定していた。
【０２９５】
これら全てのＤレトロ−インベルソペプチドからの蛍光信号は、１週間後でも、極めて強力であり、信号は、処理後２週間経って漸く、わずかに減少した。
【０２９６】
実施例５：ｃ−ＪＵＮ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１リン酸化のインビトロ阻害
ペプチドが、これらの標的転写因子のＪＮＫ−媒介性リン酸化に与える影響を、インビトロで調査した。活性化されていない、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３を、転写および翻訳ウサギ網赤血球溶解物キット(TRANSCRIPTION AND TRANSLATION rabbit reticulocyte lysate kit)（Promega）を用いて産生し、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１の固相キナーゼアッセイにおいて、単独、または、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）に融合させて、基質として用いた。
【０２９７】
反応用のバッファー（２０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩（ｐＮＰＰ）、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのｐ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのジチオスレイトール）中で、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、またはＪＮＫ３キナーゼに、Ｌ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５μＭ）を２０分間混ぜ合わせて、投与量応答性検査を行った。
【０２９８】
その後、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および５ｐＣｉ33Ｐ−ｄＡＴＰ、並びに１μｇの、ＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ  １〜８９）、ＧＳＴ−ＡＦＴ２（ａａ  １〜９６）、またはＧＳＴ−ＥＬＫ１（ａａ  ３０７〜４２８）を添加することによって、キナーゼ反応を開始させた。ＧＳＴ−融合蛋白質は、Stratagene社（LaJolla, CA）から購入したものである。
【０２９９】
この混合物に、１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズも添加した。その後、反応生成物を、１０％のポリアクリルアミド変性ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ゲルを乾燥させて、次にＸ線フィルム（Kodak）に曝した。２．５μＭ程の少ない投与量のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドにおいて、ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋ１リン酸化のほぼ完全な阻害が、観察された。
【０３００】
しかし、顕著な例外は、Ｅｌｋ１のＪＮＫ３リン酸化のＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）が阻害されなかったことであった。全体的に、ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、これらの標的転写因子のＪＮＫファミリーのリン酸化を阻害することにおいて、著しい効果を示した。
【０３０１】
Ｄ−ＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１、およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（０−２５０μＭ用量検査）の、組み換えＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびＪＮＫ３によって、ＧＳＴ−Ｊｕｎ（ａａ  １〜７３）リン酸化を阻害する能力を上記のように分析した。全体的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ−媒介性リン酸化を減少させるが、そのレベルは、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）よりも約１０−２０倍、効率が悪かった。
【０３０２】
実施例６：活性化されたＪＮＫによるｃ−ＪＵＮリン酸化の阻害
本明細書において規定されたＬ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドが、ストレス刺激によって活性化されたＪＮＫに与える影響を、ＵＶ−光が照射されたＨｅＬａ細胞またはＩＬ−１処理されたＰＴＣ細胞からＪＮＫをプルダウンするＧＳＴ−Ｊｕｎを用いて、評価した。
【０３０３】
ＰＴＣ細胞を上述のように培養した。１０％のウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００単位／ｍｌのペニシリン、および２ｍＭのグルタミンが補充されたＤＭＥＭ媒質中で、ＨｅＬａ細胞を培養した。細胞抽出物の調製に用いる１時間前に、ＰＴＣ細胞を上述されたようにＩＬ−１で活性化し、その一方で、ＨｅＬａ細胞をＵＶ−光（２０Ｊ／ｍ2）によって活性化した。
【０３０４】
細胞培養物を、溶解用のバッファー（２０ｍＭのトリス−アセテート、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のトリトンＸ−１００、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−リン酸塩、５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＰ−グリセロリン酸塩、１ｍＭのジチオスレイトール）において掻爬することによって、対照である、ＵＶ−光を照射させたＨｅＬａ細胞、およびＩＬ−１処理されたＴＣ−３細胞から、細胞抽出物を調製した。ＳＳ−３４ベックマンローターにおいて１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行うことによって破片（デブリ）を除去した。
【０３０５】
１００μｇの抽出物を、１μｇのＧＳＴ−ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）および１０μＬのグルタチオン−アガロースビーズ（Sigma）により、室温で１時間培養した。次に、掻爬用のバッファー（scraping buffer）で４回洗浄し、Ｌ−ＴＡＴまたはＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（２５μＭ）を補充した同じバッファー中で、上記ビーズを２０分間再懸濁させた。その後、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および５ｐＣｉ33Ｐ−ガンマ−ｄＡＴＰを添加することによって、キナーゼ反応を開始させ、３０℃で３０分間培養した。
【０３０６】
その後、反応生成物を、１０％ポリアクリルアミド変性ゲル上で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させた。ゲルを乾燥させて、次に、Ｘ線フィルム（Kodak）に曝した。これらの実施例では、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、活性化されたＪＮＫによって、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化を効果的に妨げた。
【０３０７】
実施例７：本明細書において規定されたＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドによる、ｃ−ＪＵＮリン酸化のインビボ阻害
本明細書において規定された細胞透過性ペプチドが、ＪＮＫシグナル伝達をインビボで阻止するかどうかを判定するために、我々は、異種のＧＡＬ４システムを用いた。上述の通りに培養されたＨｅＬａ細胞を、５ｘＧＡＬ−ＬＵＣレポーターベクターと、ＧＡＬ−Ｊｕｎ発現構造（Stratagene）とで同時にトランスフェクトした。
【０３０８】
ＧＡＬ−Ｊｕｎ発現構造は、ＧＡＬ４ＤＮＡ−結合ドメインに結合されたｃ−Ｊｕｎ（アミノ酸１〜８９）の活性化ドメインを含む。ＪＮＫの活性化を、すぐ上流のキナーゼＭＫＫ４およびＭＫＫ７を発現するベクターを同時トランスフェクション（Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999)を参照）することによって、実現した。
【０３０９】
つまり、３ｘ１０5細胞に、３．５−ｃｍの皿内のプラスミドを、ＤＯＴＡＰ（Boehringer Mannheim）を製造者の取扱説明に従って用いて、トランスフェクトした。ＧＡＬ−Ｊｕｎを含む実験のために、２０ｎｇのプラスミドに、１μｇのレポータープラスミドｐＦＲ−Ｌｕｃ（Stratagene）と、プラスミドを発現する０．５μｇのＭＫＫ４またはＭＫＫ７とをトランスフェクトした。
【０３１０】
トランスフェクションの３時間後、細胞媒体を変化させて、ＴＡＴおよびＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチド（１μＭ）を添加した。１６時間後に、蛋白質含有量に標準化した後のPromegaの「Dual Reporter System」を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０３１１】
ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの添加により、ｃ−Ｊｕｎの活性化が阻止され、それに続く、ＭＫＫ４およびＭＫＫ７−媒介性のＪＮＫの活性化が阻止された。ＨｅＬａ細胞は、ＪＮＫ１およびＪＮＫ２アイソフォームを発現するが、ＪＮＫ３を発現しないため、我々は、細胞にＪＮＫ３をトランスフェクトした。ここでも、ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドは、ｃ−ＪｕｎのＪＮＫ２−媒介性活性化を阻害した。
【０３１２】
実施例８：全ての−Ｄレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の合成
本発明のペプチドは、逆合成され、自然な蛋白質分解を妨げる全てのＤアミノ酸ペプチド（すなわち全てのＤレトロ−インベルソペプチド）であってよい。本発明の全ての−Ｄレトロ−インベルソペプチドは、ネイティブペプチドに似た機能的特性を有するペプチドを提供することになる。ここで、アミノ酸成分の側鎖は、ネイティブペプチドアラインメントに対応しているが、プロテアーゼ耐性の基幹を保持している。
【０３１３】
本発明のレトロ−インベルソペプチドは、Ｄ−アミノ酸を用いて合成された類縁物質である。この合成は、アミノ酸をペプチド鎖の中に付着させて、レトロ−インベルソペプチド類縁物質におけるアミノ酸の配列が、モデルとして機能する選択されたペプチドにおける配列と正確に逆となるようにすることによって行われる。
【０３１４】
例えば、（Ｌ−アミノ酸から構成された）自然発生的ＴＡＴ蛋白質が、配列ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ［配列番号５］を有しているならば、この（Ｄ−アミノ酸から構成された）ペプチドのレトロ−インベルソペプチド類縁物質は、配列ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ［配列番号６］を有していることになる。
【０３１５】
Ｄ−アミノ酸の鎖を合成して、レトロ−インベルソペプチドを形成するための手順は、当該技術分野において知られている（例えば、Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39,2030-2039 (1996)を参照）。特に、配列番号２、４、６、８、１１〜１２、１８、２０、２２、および、２５〜２６に記載のレトロ−ペプチドを、従来のＦｍｏｃ合成法によって生成し、さらに質量分析法によって分析した。最終的に、これらをＨＰＬＣによって精製した。
【０３１６】
自然なプロテアーゼおよび固有の免疫原性による劣化が、ネイティブペプチド特有の問題であるため、本発明のヘテロ二価またはヘテロ多価化合物は、所望のペプチドの「レトロ−インベルソ異性体」を含むように調製される。従って、ペプチドを自然な蛋白質分解から保護することは、半減期を延長し、免疫応答の範囲を減少させ、ペプチドをアクティブに破壊するため、特異的ヘテロ二価またはヘテロ多価化合物の効果を増大させるはずである。
【０３１７】
実施例９：全てのＤレトロ−インベルソＩＢ（ｓ）ペプチドおよびその改変体の長期生物活性
ペプチドへテロ結合体（上述のキメラ配列を参照）を含むＤ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）レトロ−インベルソの、ネイティブＬ−アミノ酸類縁物質よりも長期の生物活性が示されている。これは、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ（ｓ）ペプチドが、実施例５に示されるように、ネイティブプロテアーゼによる劣化から保護されているからである。
【０３１８】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによる、ＩＬ−１−誘発性の膵臓ベータ細胞の死の阻害を分析した。ＴＣ−３細胞を、上述の通りに、示されるペプチド（１μＭ）を単回添加して３０分間培養した後、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加した。
【０３１９】
その後、ＩＬ−１を有する培養の２日後に、アポトーシス細胞を、プロピジウムヨウ化物およびHoechst社の３３３４２核染色剤を用いて計数した。各実験につき、最小１，０００細胞を計数した。Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドは、ＩＬ−１−誘発性のアポトーシスを、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢペプチドと同様の範囲まで減少させた。
【０３２０】
Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドによるＩＬ−１Ｐ−誘発性の細胞死の長期阻害も分析した。ＴＣ−３細胞を、上述の通りに、示されるペプチド（１μＭ）を単回添加して３０分間培養した後、ＩＬ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、その後、２日毎にサイトカインを添加した。ＩＬ−１を有する培養の１５日後に、アポトーシス細胞を、プロピジウムヨウ化物およびHoechst社の３３３４２核染色剤を用いて計数した。
【０３２１】
ＴＡＴ−ＩＢ１ペプチドの単回添加が、長期の保護を与えるものではないことに留意されたい。各実験につき、最小１，０００細胞を計数した。結果的に、Ｄ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は、長期（１５日間）の保護を提供することが可能であったが、Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）は不可能であった。
【０３２２】
実施例１０：本発明に従って用いられるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドによるＪＮＫ転写因子の抑制
ＡＰ−１ダブル標識プローブ（５’−ＣＧＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＡＡ−３’（配列番号１０１）を用いて、ゲルリターデイションアッセイを行った。５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−で１時間処理された、または処理されていないＨｅＬａ細胞の核が、示されているように、抽出された。
【０３２３】
本発明に従って用いられるＴＡＴおよびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドを、ＴＮＦ−アルファの前に、３０分添加した。特異的ＡＰ−１  ＤＮＡ複合体を有するゲルの一部だけが示されている（標識化されていない特異的および非特異的競合物質との競合実験によって示される）。
【０３２４】
本発明に従って用いられるＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドは、ＴＮＦ−アルファの存在において、ＡＰ−１  ＤＮＡ結合複合体の形成を減少させる。
【０３２５】
実施例１１：オールインワンウェルアプローチを用いたＨｅｐＧ２細胞における内因性ＪＮＫ活性の阻害
実験の前に、ＨｅｐＧ２細胞を、１日当たり３’０００細胞／ウェルで播種した。その後、濃度が増大されたインターロイキン−１［ＩＬ−１ベータ）］または腫瘍壊死因子［ＴＮＦアルファ）］（ａ）を添加して、ＪＮＫを３０分間活性化させた。細胞を、２０ｍＭのヘペス（Hepes）、０．５％のトゥイーン（Tween）（ｐＨ７．４）において溶解させ、アルファスクリーン（AlphaScreen）ＪＮＫを処理した。（ｂ）１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１によって誘発され、３８４ウェル／プレート（ｎ＝９６）においてＪＮＫ活性のために測定されたＺ’。（ｃ）化学的ＪＮＫ阻害剤［staurosporinおよびSP600125］による内因性ＩＬ−１ベータ−誘発性ＪＮＫ活性の阻害。（ｄ）配列番号９に記載のペプチド性阻害剤Ｌ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）［ここでは、Ｌ−ＪＮＫｉと略されている）および配列番号１１に記載のＤ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）（ここではＤ−ＪＮＫｉと略されている）およびＪＢＤ（Ｌ−ＪＮＫＩに対応しているが、ＴＡＴ配列を有さない）］の、ＩＬ−１に依存する、ＪＮＫ活性に与える影響。全てのパネルは、３つの独立した実験（ｎ＝３）を示すものである。
【０３２６】
方法：アルファスクリーンキナーゼアッセイ
原理：アルファスクリーンとは、マイクロプレートフォーマットの生体分子相互作用を検査するために用いられる非−放射性ビーズ−ベースの技術である。頭文字ＡＬＰＨＡは、Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay（化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ）を表す。
【０３２７】
これは、「供与体」ビーズおよび「受容体」ビーズを近接させ、その後、化学的反応のカスケードが、増幅された信号を生成するように機能する生物学的相互作用を含む。６８０ｎｍにおけるレーザ励起によって、「供与体」ビーズ内の光線感作物質（フタロシアニン）が、周囲酸素を、励起一重項状態に変換する。
【０３２８】
その４μ秒の半減期内に、一重項酸素分子が、約２００ｎｍ未満で溶液中に拡散することが可能であり、受容体ビーズがその近傍にある場合、一重項酸素は、「受容体」ビーズ内のチオキセン誘導体と反応して、３７０ｎｍで化学発光を生成する。この化学発光は、さらに、同一の「受容体」ビーズ内に含まれる蛍光団を活性化する。励起した蛍光団は、次に、５２０〜６２０ｎｍで発光する。受容体ビーズが存在しない場合、一重項酸素は、基底状態まで降下し、信号は生成されない。
【０３２９】
最初に、キナーゼ試薬（Ｂ−ＧＳＴ−ｃＪｕｎ、抗Ｐ−ｃＪｕｎ抗体およびアクティブＪＮＫ３）を、キナーゼ用のバッファー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、１００μＭのＮａ3ＶＯ4、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）において希釈して、ウェル（１５μｌ）に添加した。その後、反応物を、１０μＭのＡＴＰの存在下で２３℃において１時間培養した。
【０３３０】
検出用のバッファー（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭのＮａＣｌ、８０ｍＭのＥＤＴＡ、０．３％のＢＳＡ）中で希釈された１０μｌのビーズ混合物（蛋白質Ａ受容体２０μｇ／ｍｌおよびストレプトアビジン供与体２０μｇ／ｍｌ）を添加することによって検出を行い、その後、暗がりにおいて、２３℃でさらに１時間培養した。
【０３３１】
ＪＮＫ内因性活性を測定するために、キナーゼアッセイを行った。このキナーゼアッセイは、上述のとおりに行ったが、アクティブなＪＮＫ３を、細胞溶解物と置き換え、細胞溶解後に、反応キナーゼ成分を添加した点が異なる。Ｂ−ＧＳＴ−ｃｊｕｎおよびＰ−ｃＪｕｎ抗体は同じ濃度で用いたが、ＡＴＰは、１０μＭではなく、５０μＭにて用いられた。アルファスクリーン信号を、Fusion装置またはEnVision装置上で、直接分析した。
【０３３２】
実施例１２：本発明に従って用いられるＤ−およびＬ−ＴＡＴ−ＩＢ１（ｓ）ペプチドの治療的活性の評価
ａ）試験システム
ｉ）種／血統：マウス／ＢＡＬＢ／ｃ
ii）源：Harlan Israel社
iii）性：雌
iv）動物の総数：ｎ＝１５０
ｖ）年齢：若い成人、検査開始時の年齢は７週間
vi）体重：治療開始時の動物の重量変動は、平均重量の±２０％を超過しない。
【０３３３】
vii）動物の健康状態：本検査において用いた動物の健康状態は、到着次第検査した。良好な健康状態の動物だけを、実験室の環境に順応させ（少なくとも７日間）、検査で用いた。
【０３３４】
viii）無作為化：動物を、乱数表に従って、実験グループに無作為に割当てた。
【０３３５】
ix）終了：本検査の終了時に、生存している動物を、頸椎脱臼（cercical dislocation）によって、安楽死させた。
【０３３６】
ｂ）試験グループの構成および投与量
以下の表は、検査をした実験のグループを列挙したものである。
【０３３７】
【表３】
0005547719.tif 000008
【０３３８】
ｃ）試験手順
５０％のエタノール中に溶解されたＴＮＢＳを投与することによって、大腸炎を誘発させた。
【０３３９】
その後、全動物に、単回投与または反復投与の日用量として、投与量０．１〜１０００μｇ／ｋｇの範囲のＸＧ−１０２を腹膜内または皮下投与して、これらの動物を処理した（上記を参照）。
【０３４０】
ｄ）観察および検査
ｉ）臨床的徴候
上述の実験の持続時間にわたって、注意深い臨床的実験を行い、記録した。観察には、例えば、皮膚の、毛の、目の、粘膜の外観変化、分泌物および排泄物（例えば下痢）の発生、並びに自律的活性を含む。歩行、姿勢、および処理への反応における変化、並びに、突飛な行動、震え、痙攣、睡眠状態、および昏睡状態の存在も、記録した。
【０３４１】
ii）体重
動物の個体の体重を毎日測定した。
【０３４２】
iii）大腸炎の臨床的評価
体重、便の粘度、および直腸ごとの出血を、全て、毎日記録し、疾患の重篤度数値のパラメータとした。
【０３４３】
【表４】
0005547719.tif 000009
【０３４４】
iv）結腸の肉眼的病理検査
実験の最終日に、動物を安楽死させ、次の数値に従った肉眼的病理検査評価のために、結腸を取り除いた。
【０３４５】
【表５】
0005547719.tif 000010
【０３４６】
ｅ）結果
ｉ）臨床的徴候
ＸＧ−１０２（配列番号１１）による治療後の臨床的検査中には、異常は検出されなかった。
【０３４７】
ii）死亡率
死亡の記録無し。
【０３４８】
iii）体重
ＴＮＢＳが、日１において、著しい体重減少を誘発した。ＸＧ−１０２（配列番号１１）の投与は、体重減少を妨げるか、または症候を改善し、回復を支援した。
【０３４９】
iv）臨床的数値
ＴＮＢＳを注入されたビヒクルで処理された動物は、検査１日目に、最大数値に達し、検査５日目またはその後にのみ完全に回復した。スルファサラジン治療を行った結果、臨床的数値が低減した。任意の投与量、投与経路、または上記で規定されたような投与回数スケジュール（単回投与または日用量）を用いて投与されたＸＧ−１０２（配列番号１１）は、結果的に、一般的に用いられる参照薬剤スルファサラジンの場合に観察されるものと同等またはこれよりも良好な効果を有していた。
【０３５０】
ｖ）肉眼的病理検査数値
検査終了時の肉眼的分析により、ＴＮＢＳを注入されたビヒクルで処理された動物が、結腸に沿って、浮腫および潰瘍を患っていたことが明らかになった。スルファサラジンは、肉眼的病理検査を完全に低減することにおいて有効であった。
【０３５１】
vi）結腸の長さ
結腸の長さに対する、疾患の誘発または治療の影響は、観察されなかった。
【０３５２】
vii）結腸の重量
結腸の重量に対する、疾患の誘発または治療の影響は、観察されなかった。
【０３５３】
ｆ）結論
生存中のデータに限定される、上述の実験の状態下で得られた上述の検出事項に鑑み、ＳＣまたはＰＯで投与された、配列番号１１に記載の典型的な配列ＸＧ−１０２は、疾患の回復を強化することにおいて、アクティブであった。
【０３５４】
実施例１３：好ましい各実施形態
以下に、本発明に係る幾つかの好ましい各実施形態を列挙する。
【０３５５】
１．  １５０個よりも短い長さのアミノ酸を含むＪＮＫ阻害剤配列の、被験体における慢性または非慢性の炎症性消化器疾患を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【０３５６】
２．  実施形態１に係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、または配列番号１０５に記載の配列のいずれかによって規定された、またはコードされた、ヒトまたはラットＩＢ１配列、または、その断片若しくは改変体に由来する、使用。
【０３５７】
３．  実施形態１または２に係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、５〜１５０個、より好ましくは１０〜１００個、さらにより好ましくは１０〜７５個、および最も好ましくは１０〜５０個のアミノ酸残基の範囲を含む、使用。
【０３５８】
４．  実施形態１〜３のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、ｃ−ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）に結合する、使用。
【０３５９】
５．  実施形態１〜４のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、上記ＪＮＫ阻害剤配列が、ＪＮＫを発現する細胞内に存在するときに、ＪＮＫを標的とする、少なくとも１つの転写因子の活性化を阻害する、使用。
【０３６０】
６．  実施形態１〜５のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ標的転写因子は、ｃ−Ｊｕｎ、ＡＴＦ２、およびＥｌｋｌから構成される群から選択される、使用。
【０３６１】
７．  実施形態１〜６のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、ペプチドが、ＪＮＫを発現する細胞内に存在する時に、ＪＮＫ効果を変更する、使用。
【０３６２】
８．  実施形態１〜７のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記ＪＮＫ阻害剤配列は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれらの組み合わせから構成されており、好ましくは、少なくとも１または２、好ましくは少なくとも３、４、または５、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９、およびさらにより好ましくは少なくとも１０またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含み、上記Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、上記ＪＮＫ阻害剤配列において、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で配置されている、使用。
【０３６３】
９．  実施形態１〜８のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列の使用であって、上記阻害剤配列は、配列番号１〜４、１３〜２０、および３３〜１００に記載の少なくとも１つのアミノ酸配列、または、上記アミノ酸配列の断片、誘導体、若しくは改変体を含むか、または、上記アミノ酸配列、または、上記アミノ酸配列の断片、誘導体、若しくは改変体から構成されている、使用。
【０３６４】
１０．  共有結合によって連結された、少なくとも１つの第１のドメインおよび少なくとも１つの第２のドメインを含むキメラペプチドであって、上記第１のドメインは、トラフィッキング配列を含み、上記第２のドメインは、実施形態１〜９のいずれかにおいて規定されたＪＮＫ阻害剤配列を含む、キメラペプチドの、被験体における慢性または非慢性の炎症性消化器疾患を治療するための薬剤組成物を調製するための使用。
【０３６５】
１１．  実施形態１０に係るキメラペプチドの使用であって、上記キメラペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれらの組み合わせから構成され、好ましくは、少なくとも１または２、好ましくは少なくとも３、４または５、より好ましくは少なくとも６、７、８、または９、およびさらにより好ましくは少なくとも１０またはそれ以上の、Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸を含み、上記Ｄ−アミノ酸および／またはＬ−アミノ酸は、上記キメラペプチドにおいて、ブロック状、非ブロック状、またはこれらの形状が交互になった状態で配置されている、使用。
【０３６６】
１２．  実施形態１０または１１に係るキメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴポリペプチドのアミノ酸配列を含む、使用。
【０３６７】
１３．  実施形態１０〜１２のいずれかに係るキメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、配列番号５、６、７、８、２１、または２２のアミノ酸配列から構成されているか、またはこれを含む、使用。
【０３６８】
１４．  実施形態１０〜１３のいずれかに係るキメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、上記ペプチドの細胞への取り込みを増大させる、使用。
【０３６９】
１５．  実施形態１０〜１４のいずれかに係るキメラペプチドの使用であって、上記トラフィッキング配列は、上記ペプチドの核局在化を導く、使用。
【０３７０】
１６．  実施形態１０〜１５のいずれかに係るキメラペプチドの使用であって、上記キメラペプチドは、配列番号９〜１２および２３〜３２のいずれかに係るアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列の断片、若しくは改変体から構成されているか、または、上記アミノ酸配列、または上記アミノ酸配列の断片、若しくは改変体を含む、使用。
【０３７１】
１７．  実施形態１〜９のいずれかにおいて規定されたＪＮＫ阻害剤配列または実施形態１０〜１６のいずれかにおいて規定されたキメラペプチドをコードする、単離された核酸の、被験体における慢性または非慢性の炎症性消化器疾患を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【０３７２】
１８．  実施形態１７において規定された核酸を含むベクターの、被験体における慢性または非慢性の炎症性消化器疾患を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【０３７３】
１９．  実施形態１８において規定されたベクターを含む細胞の、被験体における慢性または非慢性の炎症性消化器疾患を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【０３７４】
２０．  実施形態１〜９のいずれかに係るＪＮＫ阻害剤配列に免疫特異的に結合する抗体、または、実施形態１０〜１６のいずれかに係るキメラペプチドに免疫特異的に結合する抗体の、被験体における慢性または非慢性の炎症性消化器疾患を治療するための薬剤組成物を調製するための、使用。
【０３７５】
２１．  上述の実施形態のいずれかに係る使用であって、上記薬剤組成物は、非経口経路（静脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、経皮経路を含む）、経腸経路（経口経路、直腸経路を含む）、局所経路（経鼻経路、鼻内経路を含む）、および、他の経路（表皮送達またはパッチ送達）から構成される群から選択された１つの投与経路によって投与される、使用。
【０３７６】
２２．  上述の実施形態のいずれかに係る使用であって、上記非慢性または慢性の炎症性疾患は、食道、胃、十二指腸の第１の部分、第２の部分、および第３の部分、空腸、回腸、回盲部の複合体、大腸、の疾患、上行結腸、横行結腸、および下行結腸Ｓ状結腸、および直腸の疾患、慢性炎症性消化器疾患から選択された胃腸管の疾患であって、潰瘍性大腸炎、クローン病、空置大腸炎、虚血性大腸炎、感染性大腸炎、激症大腸炎、化学的大腸炎、顕微鏡的大腸炎、リンパ球性大腸炎、コラーゲン形成大腸炎、潰瘍性大腸炎、および非定型大腸炎から選択される大腸炎を含む、結腸の炎症により特徴付けられる、使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【配列表】
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