(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エシェリキア属(Escherichia sp.)菌株が、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、並びにアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする、それぞれの遺伝子を過発現することを特徴とする、Ｏ−アセチルホモセリンを高収率で生産することが可能なエシェリキア属菌株。
【請求項２】
前記遺伝子が、当該酵素の遺伝子を有するプラスミドの導入、又は当該遺伝子のコピー数の増加によって過発現することを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼの過発現は、当該酵素をコードする遺伝子としてのｍｅｔＸおよびｔｈｒＡを含むプラスミドを導入することにより行われることを特徴とする、請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする３種の遺伝子が全て大腸菌の染色体上に２コピー以上存在することを特徴とする、請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
前記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、およびホモセリンデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素はそれぞれ大腸菌由来のｍｅｔＸ、ｔｈｒＡ、ｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄ遺伝子がコードすることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項６】
前記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ酵素は、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコックス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはミコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)から選択された菌株に由来することを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項７】
前記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ酵素は、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、レプトスピラメエリ(Leptospira meyeri)、デイノコックスラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナスエアルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)またはミコバクテリウムスメグマティス(Mycobacterium smegmatis)に由来することを特徴とする、請求項６に記載の菌株。
【請求項８】
前記ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載の菌株。
【請求項９】
前記菌株はＬ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−リシンを生産することが可能な菌株に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項１０】
前記菌株は大腸菌(Escherichia coli.)であることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項１１】
前記菌株は大腸菌ＦＴＲ２５３３（寄託番号ＫＣＣＭ１０５４１）に由来することを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【請求項１２】
前記菌株は寄託番号ＫＣＣＭ１１０２５Ｐであることを特徴とする、請求項１に記載の菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｏ−アセチル−ホモセリンを高収率で生産することが可能なエシェリキア属菌株に関する。また、本発明は、前記菌株を用いてＯ−アセチル−ホモセリンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニン(methionine)は、動物飼料、食品および医薬品に適用するために、化学的または生物学的に合成できる。
化学合成において、メチオニンは、主に、５−（β−メチルメルカプトエチル）ヒダントインを加水分解させる反応によって生産される。ところが、このような化学合成によって生産されたメチオニンは、Ｌ型とＤ型の混合形態で生産され、それぞれを分離する難しい追加的工程があるという欠点がある。そこで、本発明者は、かかる問題点を解決するために、生物学的方法を用いてＬ−メチオニンを選択的に生産することが可能な技術を開発して特許を出願したことがある（国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号）。この方法は、簡便に「２段階工法」と命名し、発酵によるＬ−メチオニン前駆体生産工程、および酵素による前記Ｌ−メチオニン前駆体のＬ−メチオニンへの転換工程を含む。前記Ｌ−メチオニン前駆体は、好ましくはＯ−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine)およびＯ−スクシニルホモセリン(O-succinylhomoserine)を含む。このような２段階工法を開発することにより、既存の問題となった、硫化物特有の基質毒性問題、メチオニンとＳＡＭｅによるメチオニン合成におけるフィードバック調節問題、およびシスタチオニンガンマシンターゼ(cystathionine gamma synthase)、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)特有の中間産物分解活性問題を全て解決することができた。また、Ｌ−メチオニンのみを選択的に生産することができるため、ＤＬ−メチオニンを同時に生産する既存の化学合成工程に比べて優れた工程であり、さらに同一の反応によって副産物として有機酸、例えば、コハク酸および酢酸を同時に生産することが可能な非常に優れた工程である。
【０００３】
Ｏ−アセチルホモセリンは、メチオニン生産の前駆体として使用される物質であって、メチオニン生合成経路上にある中間体である（国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号）。Ｏ−アセチルホモセリンは、下記反応式のように、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ(O-acetyl transferase)によってＬ−ホモセリンおよびアセチル−ＣｏＡを基質として合成される。
Ｌ−ホモセリン＋アセチル−ＣｏＡ → Ｏ−アセチル−ホモセリン
本発明者の米国特許出願第１２／０６２８３５号では、アスパラギン酸キナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するｔｈｒＡ遺伝子と、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードするデイノコックス由来のｍｅｔＸ遺伝子の発現強化によってＬ−ホモセリンとＯ−アセチルホモセリンの生合成経路を増幅して高収率のＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株、および前記菌株を用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供したことがある。
【０００４】
本発明者は、さらに高い収率でＯ−アセチルホモセリンを生産するために努力した結果、Ｏ−アセチルホモセリンの基質の一つであるホモセリンが合成される生合成経路のうち、ホスホエノールピルビン酸塩からホモセリンまでの生合成経路上に位置する３種の酵素、すなわちホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）の発現を同時に強化し、本発明者の従来の米国特許出願第１２／０６２８３５号に開示した方法よりさらに高い収率でＯ−アセチルホモセリンを生産する方法と菌株を確認した。
本発明から提供するホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンに至る一連の酵素の同時発現強化と類似に、アスパラギン酸塩由来のアミノ酸であるＬ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニン生合成経路上の重要合成酵素の同時発現強化によってＬ−アミノ酸の生産能を強化しようとする試みは、従前にもあった。
【０００５】
ヨーロッパ特許ＥＰ００９００８７２は、大腸菌において、ジヒドロピコリン酸シンターゼ（dihydropicolinate synthase、ｄａｐＡ）、アスパルトキナーゼ（aspartokinase、ｌｙｓＣ）、ジヒドロピコリン酸レダクターゼ（dihydropicolinate reductase、ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーセ（diaminopimelate dehydrogenase、ｄｄｈ）、テトラヒドロピコリン酸スクシニルラーゼ（tetrahydropicolinate succinylase、ｄａｐＤ）、スクシニルジアミノピメリン酸ジアシラーゼ（succinyl diaminopimelate diacylase、ｌｙｓＥ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semi-aldehyde dehydrogenase、ａｓｄ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（phosphoenolpyruvate carboxylase、ｐｐｃ）の活性を増大してリシンの生産を増大することが可能な方法を特徴とする、Ｌ−リシンの効率的な生産を提供した。日本特許ＪＰ２００６−５２０４６０とＪＰ２０００−２４４９２１は、大腸菌における、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパルトキナーゼ（ｔｈｒＡ）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）、ホモセリンキナーゼ（ｔｈｒＢ）、およびトレオニンシンターゼ（ｔｈｒＣ）の活性増大によってＬ−トレオニンの効率的な生産を開示している。また、国際特許公開公報第０７０１２０７８号に開示されたＬ−メチオニン生産特許の場合、コリネバクテリアを用いてアスパルトキナーゼ（ｌｙｓＣ）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（homoserine dehydrogenase、ｈｏｍ）、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（homoserine acetyl transferase、ｍｅｔＸ）、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（O-acetylhomoserine sulfhydrylase、ｍｅｔＹ）、シスタチオニンガンマシンターゼ（cystathionine gamma synthase、ｍｅｔＢ）、コバラミン要求性トランスメチラーゼ（cobalamin-dependent transmethylase、ｍｅｔＨ）、コバラミン非要求性メチオニンシンターゼ（cobalamin-independent methionine synthase、ｍｅｔＥ）、メチルテトラヒドロホレートレダクターゼ（methyltetrahydrofolate reductase、ｍｅｔＦ）、グルコース６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（glucose 6-phosphate dehydrogenase、ｚｗｆ）などの遺伝子の発現増加、およびメチオニン抑制タンパク質（methionine repressor protein、ｍｃｂＲ）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase、ｈｓｋ）、Ｓ−アデノシルメチオニンシンテターゼ（S-adenosylmethionine synthetase、ｍｅｔＫ）、トレオニンデヒドラターゼ（threonine dehydratase、ｌｉｖＡ）などの遺伝子の発現減少によってＬ−メチオニンの生合成を増大した。
【０００６】
ところが、前述したアスパラギン酸塩由来のＬ−アミノ酸の生産に関連した特許らの場合、いずれもアスパラギン酸塩に由来してそれぞれＬ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−メチオニンを生産する特許であり、これら特許の場合、最終産物の種類に応じて、それぞれ異なる遺伝子の組み合わせによってその生産性を増大したことを開示しているだけである。しかし、本発明のホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンに至る一連の酵素の同時発現強化によってＯ−アセチルホモセリンをより効率よく生産する内容は、現在まで他の文献によって開示されたことがない。また、本発明者の酵素組み合わせは、前記Ｌ−アスパラギン酸塩由来のＬ−リシン、Ｌ−トレオニンおよびＬ−メチオニン生産方法では提供していない組み合わせであり、最終産物がＬ−リシン、Ｌ−トレオニンまたはＬ−メチオニンではないという差異点がある。
【０００７】
このような背景の下に、本発明者は、Ｏ−アセチルホモセリンを最大収率で生産するために鋭意努力した結果、Ｏ−アセチルホモセリンを最終産物としており、最大の生産が可能となるように、アスパラギン酸キナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）およびホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＸ）に加えてホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）の少なくとも１種の酵素を大腸菌染色体ＤＮＡおよび／またはプラスミド形態で同時強化することにより、Ｏ−アセチルホモセリンの生産性を増大させる方法、およびＯ−アセチルホモセリンの収率および生産性が増加した菌株を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号
【特許文献２】米国特許出願第１２／０６２８３５号
【特許文献３】ヨーロッパ特許ＥＰ００９００８７２
【特許文献４】特開２００６−５２０４６０
【特許文献５】特開２０００−２４４９２１
【特許文献６】国際特許公開公報第０７０１２０７８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ホモセリン生合成経路に関連したホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンを生合成する一連の酵素をコードする遺伝子を強化し、高い収率でＯ−アセチルホモセリンを生産する菌株を提供する。
本発明の他の目的は、前記菌株を用いてＯ−アセチルホモセリンを高収率で生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明のある観点によれば、（ａ）ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、およびホモセリンデヒドロゲナーゼ、並びに（ｂ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれた少なくとも１種の酵素の活性が導入および増進された、Ｏ−アセチルホモセリンを高収率で生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)菌株を提供する。
本発明の他の観点によれば、前記菌株を培養培地で発酵する段階を含む、当該培地内にＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供する。
本発明の別の観点によれば、（ａ）前記Ｏ−アセチルホモセリン生産能が向上したエシェリキア属由来の菌株を培養し、発酵によってＯ−アセチルホモセリンを生産する段階と、（ｂ）生産されたＯ−アセチルホモセリンを分離する段階と、（ｃ）前記分離されたＯ−アセチルホモセリンをメチルメルカプタンと共に、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、およびＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼよりなる群から選ばれた酵素の存在下に、Ｌ−メチオニンおよびアセテートに転換させることを含むＬ−メチオニンおよびアセテートを生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
したがって、本発明によれば、アスパラギン酸キナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＸ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）の６種の酵素を大腸菌染色体ＤＮＡとプラスミド形態で同時強化する方法、および菌株によってさらに高い収率でＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを生産することができ、このように生産されたＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンは、本発明者が２００７年に出願した「Ｌ−メチオニ前駆体生産菌株および前記菌株を用いたＬ−メチオニンの生産方法」（国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号）に開示したように、Ｏ−アセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼによってメチオニンと酢酸の合成の前駆体として用いてＬ−メチオニンを高収率で生物転換することができる。
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照する次の説明からさらに明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は本発明に係るＯ−アセチルホモセリン生産菌株の生合成経路の模式図である。
【図２】図２は染色体挿入用ｐＳＧ−２ｐｐｃベクターの遺伝子地図及び製作を示す概略図である。
【図３】図３は染色体挿入用ｐＳＧ−２ａｓｐＣベクターの遺伝子地図及び製作を示す概略図である。
【図４】図４は染色体挿入用ベクターｐＳＧ−２ａｓｄベクターの遺伝子地図及び製作を示す概略図である。
【図５】図５は発現用ベクターｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬの遺伝子地図及び製作を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一つの様態によれば、本発明は、（ａ）ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、およびホモセリンデヒドロゲナーゼの活性、並びに（ｂ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼよりなる群から選ばれた少なくとも１種の酵素の活性が導入および増進された、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能が向上したエシェリキア属(Escherichia sp.)菌株に関する。
本発明で使用される用語「Ｌ−メチオニン前駆体」とは、メチオニン特化生合成経路の一部分である代謝物質、またはこの誘導体、特に、Ｏ−アセチルホモセリンを意味する。
本発明で使用される用語「Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株」とは、Ｏ−アセチルホモセリンを生物体内で生産することが可能な原核または真核微生物菌株であって、本発明に係る操作によってＯ−アセチルホモセリンを蓄積することが可能な菌株をいう。例えば、本発明で有用な菌株は、エシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、サルモネラ属(Salmonellar sp.)、ブレビバクテリア属(Brevibacteria sp.)、ヒポモナス属(Hypomononas sp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacterium sp.)、ノカルジア属(Norcardia sp.)、カビ類(fungi)または酵母類(yeast)に属する微生物菌株が含まれ得る。好ましくは、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属の微生物菌株と酵母である。さらに好ましくはエシェリキア属の微生物菌株であり、一層さらに好ましくは大腸菌であり、より好ましくはＬ−リシン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−イソロイシンまたはＬ−メチオニンを生産する菌株由来である。最も好ましくは、本発明によって提供された既存の特許（米国特許出願第１２／０６２８３５号）に開示されている寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐまたは寄託番号ＫＣＣＭ１０９２５Ｐ由来の菌株である。または、ＦＴＲ２５３３（寄託番号ＫＣＣＭ１０５４１）由来の菌株を用いることができる。
【００１４】
本発明で使用される用語「活性の導入および増進」とは酵素の細胞内活性の増加を意味し、これは前記酵素をコードする遺伝子の過発現によって行われ得る。例えば、目的遺伝子の過発現は、前記遺伝子のプロモーター部位および/または５’−ＵＴＲ地域の塩基配列を変形させることにより、タンパク質発現を増進させることができ、目的遺伝子を染色体上に追加導入することにより発現を強化させることができ、目的遺伝子をベクター上に自己プロモーターまたは強化された別個のプロモーターと共に導入して菌株に形質転換させることにより、タンパク質の発現量を強化させることができる。また、目的遺伝子のＯＲＦ(open reading frame)地域に突然変異を導入することにより、目的遺伝子を過発現させることができる。過発現の測定によれば、相応するタンパク質の活性または濃度が野生型タンパク質または初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として一般に最小１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加することが分かる。好ましくは、酵素活性の導入および増進は当該酵素の遺伝子を有するプラスミドを導入し、或いは染色体上で当該酵素をコードしている遺伝子のコピー数を増加させ、或いは当該酵素の遺伝子のプロモーター配列を置換または変形させることにより、酵素の活性を導入および増進させることができる。
【００１５】
好適な一実施態様として、本発明は、アスパラギン酸キナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）、ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＸ）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）の６種の酵素活性の導入および増進によってＯ−アセチルホモセリンをより高い収率で生産する微生物菌株、および前記菌株を用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供する。好ましくは、アスパラギン酸キナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）またはホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＸ）を発現するベクターを菌株に形質転換することができ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）よりなる群から少なくとも１種の酵素をコードする遺伝子が大腸菌染色体内で２コピー数以上に存在することができ、最も好ましくは、前記３種の遺伝子がいずれも大腸菌染色体内で２コピー数以上に存在して前記酵素の活性を導入および増進することができる。
具体的に、本発明では、Ｌ−メチオニン前駆体としてのＯ−アセチルホモセリンの合成を増加させるために、メチオニン生合成経路のうち、第１段階を媒介する酵素としてのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｍｅｔＸ遺伝子の発現を増進させる。ｍｅｔＸは、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を持つタンパク質をコードする遺伝子の通称であり、新しい外部ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、多様な微生物種から得られる。、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を得られる菌株の例としては、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、デイノコックス属(Deinococcus sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、またはミコバクテリウム属(Mycobacterium sp.)が含まれるが、これに限定されない。好ましくは、前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、コリネバクテリウムグルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、レプトスピラメエリ(Leptospira meyeri)、デイノコックスラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)、シュードモナスエアルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)またはミコバクテリウムスメグマティス(Mycobacterium smegmatis)からなる群から選ばれた菌株に由来の遺伝子によってコードされる。さらに好ましくは、前記ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース登録番号Ｑ９ＲＶＺ８（配列番号１８）、ＮＰ＿２４９０８１（配列番号１９）、またはＹＰ＿８８６０２８（配列番号２０）のアミノ酸配列を有する。レプトスピラメエリ(Leptospira meyeri)に由来のｍｅｔＸ遺伝子は、フィードバック阻害抵抗性(J Bacteriol. 1998 Jan;180(2):250-5. Belfaiza J et al.)があるものと知られている。他の様々なホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼは以前の本発明者の研究からフィードバック阻害が解除されたことを確認した。
【００１６】
例えば、ｍｅｔＸ遺伝子の導入および増進は、遺伝子の導入により、または目的遺伝子の５’−ＵＴＲおよび／またはプロモーター部位の変形により実現できる。好ましくは、ｍｅｔＸ遺伝子の導入および増進はｍｅｔＸ遺伝子を含む発現ベクター上に自己プロモーターまたは強化された別個のプロモーターと共に導入して菌株に形質転換させ、プラスミド形態で導入される。ｍｅｔＸ遺伝子発現の増進によってメチオニン前駆体の合成が増加する。
また、前記菌株は、Ｏ−アセチルホモセリンの前駆体であるホモセリンの合成を増加させるために、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を増進させるように製作される。本願において、ｔｈｒＡは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼの活性を有するペプチドをコードする遺伝子の通称である。好ましくは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース登録番号ＡＰ＿０００６６６の遺伝子によってコードされる。好ましくは前記ｔｈｒＡ遺伝子を含む発現ベクターを菌株に形質転換させてプラスミド形態で導入し、最も好ましくは前記ｍｅｔＸおよびｔｈｒＡ遺伝子を同時に含む発現ベクターを菌株に形質転換させ、プラスミド形態で導入して発現を導入および増進させることができる。
【００１７】
本発明の具体的実施態様として、前記Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン生産菌株を製造する方法は次のとおりである。
まず、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを蓄積することを可能とするために、菌株から、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする遺伝子をそれぞれ染色体挿入ベクターｐＳＧにクローニングした後、菌株に形質転換させることにより、前記母菌株の染色体内の該当遺伝子のコピー数を２コピー数以上に増大させて当該遺伝子の発現増加を誘導する。その結果、遺伝子の発現が増進される。次に、アスパラギン酸キナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）及びホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＸ）をコードする遺伝子は菌株内にプラスミドDNAとして導入される。これに関して、アスパラギン酸キナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼ（ｔｈｒＡ）のプロモーターをＣＪ１プロモーターで置換し、デイノコックス由来のホモセリンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＸ）をｔｈｒＡ−ｍｅｔＸオペロン形態で製作し、低いコピープラスミドベクターとしてのｐＣＬ２０プラスミドにクローニングしたプラスミドｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−Ｃを、前記で製作したホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、およびアスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）がそれぞれ２コピー数である菌株に形質転換することにより、ホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンに至る一連の生合成経路を全て強化した菌株を製造する。
【００１８】
前記一連の酵素は、下記反応式に示すように、ホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンに合成する活性を持っている。よって、このような一連の合成を有する遺伝子の発現を強化する場合、細胞内にＯ−アセチルホモセリンの蓄積を誘導することができる。
ホスホエノールピルビン酸塩＋Ｈ２Ｏ＋ＣＯ２ <−> オキサロ酢酸＋リン酸塩
オキサロ酢酸＋グルタミン酸塩  <−>  アスパラギン酸塩＋α−ケトグルタル酸塩
アスパラギン酸塩＋ＡＴＰ  <−>  アスパルチル−４−リン酸塩＋ＡＤＰ
アスパルチル−４−リン酸塩＋ＮＡＤＰＨ<−> アスパラギン酸塩−セミアルデヒド＋リン酸塩＋ＮＡＤＰ＋
アスパラギン酸塩−セミアルデヒド＋ＮＡＤＰＨ<−> ホモセリン
ホモセリン＋アセチル−ＣｏＡ  <−>  Ｏ−アセチル−ホモセリン＋ＣｏＡ
【００１９】
前記ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸キナーゼとホモセリンデヒドロゲナーゼ、およびホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子それぞれを通称ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ、ｔｈｒＡおよびｍｅｔＸと表記する。前記遺伝子は、文献『Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21., Science. 1999 Nov 19; 286(5444):1571-7』によって公開された大腸菌およびデイノコックスラディオデュランスＲ１のゲノム配列から得ることができる。また、前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースからも得ることができる。例えば、遺伝子銀行ＩＤ（ＧｅｎＢａｎｋＩＤ）は、ｐｐｃ（８９１１００７４）、ａｓｐＣ（８５６７４２７４）、ａｓｄ（８９１１０５７８）、ｔｈｒＡ（８９１０６８８６）、およびｍｅｔＸ（１７９９７１８）である。前記方法によって製作されたＯ−アセチルホモセリン生産菌株は、アスパラギン酸塩からＯ−アセチルホモセリンに至る一連の生合成経路の強化によってＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを高収率で生産することが可能な菌株を製作することができる。前記方法によって製作したＯ−アセチルホモセリン生産菌株ＣＪＭ−ＸＰＡ２（ｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬ）菌株を「大腸菌ＣＡ０５−０５６７」と命名し、ＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に２００９年８月１１日付で寄託番号ＫＣＣＭ１１０２５Ｐで寄託した。
【００２０】
Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株は、Ｌ−リシン、Ｌ−トレオニンまたはＬ−イソロイシンを生産する菌株を用いて製造することができる。好ましくは、Ｌ−トレオニンを生産する菌株を使用することにより製造することができる。この場合には、既にホモセリンまでの合成が円滑に行われた菌株であって、さらに多い量のメチオニン前駆体を合成することができる。また、ｍｅｔＸ遺伝子の発現を増進させてより多い量のメチオニン前駆体を合成することができる。
本願において使用される用語「Ｌ−トレオニン生産菌株」とは、生体内でＬ−トレオニンを生産することが可能な原核または真核微生物菌株をいう。例えば、エシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、またはブレビバクテリア属(Brevibacteria sp.)に属するＬ−トレオニン生産微生物菌株が含まれ得る。好ましくはエシェリキア属(Escherichia sp.)であり、最も好ましくは大腸菌(Escherichia coli)である。
【００２１】
本発明の好適な実施態様として、国際特許公開公報第２００５／０７５６２５号に開示されたＬ−トレオニン生産菌株としてのＦＴＲ２５３３を使用することができる。ＦＴＲ２５３３は、大腸菌寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６から派生された大腸菌ＴＦＲ７６２４に由来する。大腸菌寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６は大腸菌ＴＦ４０７６に由来する。大腸菌寄託番号ＫＣＣＭ１０２３６は、ＰＥＰからの酢酸オキサロの形成を促進するｐｐｃ遺伝子、およびアスパラギン酸塩からトレオニンを生合成するために必要な酵素、例えばｔｈｒＡ（アスパルトキナーゼ）および１−ホモセリンデヒドロゲナーゼ）、ｔｈｒＢ（ホモセリンキナーゼ）、およびｔｈｒＣ（トレオニンシンターゼ）を高い水準に発現するので、Ｌ−トレオニン生産を増加させることができる。また、大腸菌ＴＦＲ７６２４（ＫＣＣＭ１０５３８）は、Ｌ−トレオニン生合成のために必要なｔｙｒＢ遺伝子の発現を抑制する不活性化ｔｙｒＲ遺伝子を持っている。また、大腸菌ＦＴＲ２５３３（ＫＣＣＭ１０５４１）は、不活性化されたｇａｌＲ遺伝子を持つＬ−トレオニン生産菌株、またはＬ−トレオニン生産大腸菌である。
本発明の好適な実施態様として、米国特許出願第１２／０６２８３５号に開示された菌株ＣＪＭ２−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２５Ｐ）を使用することができる。前記菌株は、大腸菌ＦＴＲ２５３３菌株のｍｅｔＢ、ｔｈｒＢ、ｍｅｔＪ、およびｍｅｔＡ遺伝子を欠損させた後、ｍｅｔＡの位置にデイノコックスラディオデュランス由来のｍｅｔＸ遺伝子を導入し、しかる後に、ｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させた菌株であって、大腸菌寄託番号ＫＣＣＭ１０９２５Ｐの菌株である。
【００２２】
また、本発明の好適な実施態様として、米国特許出願第１２／０６２８３５号に開示された菌株ＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）を使用することができる。前記菌株は、大腸菌ＣＪＭ００２（ＫＣＣＭ１０５６８）菌株に由来するもので、ｍｅｔＢ、ｔｈｒＢ、ｍｅｔＪ、およびｍｅｔＡ遺伝子を欠損させ、ｍｅｔＡの位置にデイノコックスラディオデュランス由来のｍｅｔＸ遺伝子を導入した後、ｔｈｒＡ発現ベクターで形質転換させた菌株であって、大腸菌寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐの菌株である。
【００２３】
本発明の具体的な実施例では、ｐｐｃ遺伝子の２コピーを大腸菌の染色体上に挿入するための挿入用ベクターｐＳＧ−２ｐｐｃを製作し（図２）、ａｓｐＣ遺伝子の２コピーを大腸菌の染色体上に挿入するための挿入用ベクターｐＳＧ−２ａｓｐＣを製作し（図３）、ａｓｄ遺伝子の２コピーを大腸菌の染色体上に挿入するための挿入用ベクターｐＳＧ−２ａｓｄを製作した（図４）。また、ｔｈｒＡ遺伝子と同時にｍｅｔＸ遺伝子の発現のためのｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬベクターを製作した（図５）。前記ｐＳＧ−２ｐｐｃ、ｐＳＧ−２ａｓｐＣおよびｐＳＧ−２ａｓｄベクターを、順次、米国特許出願第１２／０６２８３５号に開示されたｔｈｒＡおよびｍｅｔＸの強化菌株ＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）に形質転換させ、前記菌株内にｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄが２コピーに増幅されて存在する菌株を製造することにより、ＣＪＭ−ＸＰＡ２と命名した。前記菌株にｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬベクターを形質転換することにより、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能をフラスコ培養によって確認した。その結果、生産菌株の染色体内にホスホエノールピルビン酸塩からアスパラギン酸塩に至る遺伝子ｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄを２コピーに増幅すると、Ｏ−アセチルホモセリンの生成収率は、ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ遺伝子が２コピーに増幅されていない菌株ＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）に比べて２９．１％から３２．７％に３．６％増加することを確認した。さらに、ホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンの生合成に至る全ての遺伝子ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ、ｔｈｒＡおよびｍｅｔＸを染色体またはプラスミドＤＮＡ形態で増幅するとき、Ｏ−アセチルホモセリンの生成収率がｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄ遺伝子が２コピーに増幅されていないＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）菌株に比べて２９．１％から４６％に非常に高く１６．９％向上することを確認した。また、ホスホエノールピルビン酸塩からアスパラギン酸塩に至るｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄのみを増幅した場合にはＯ−アセチルホモセリンの収率が３２．７％であり、ｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄの増幅なしでｔｈｒＡおよびｍｅｔＸのみを増幅した場合にはＯ−アセチルホモセリンの収率が３７．５％である結果からみて、ホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンの生合成経路上に位置する全体遺伝子ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ、ｔｈｒＡおよびｍｅｔＸを染色体とプラスミド形態として遺伝子コピー数を増大して発現量を同時に増加させる場合、いずれか一つの遺伝子の発現量を増加させたことに比べてＯ−アセチルホモセリンの生産収率が４６％と大きく増加させることができることを確認し（実施例２、表２）、本発明の方法で製造された菌株のＯ−アセチル生産能が大幅向上したことを確認した。
【００２４】
別の様態として、本発明は、前記方法によって製造されたＯ−アセチル−ホモセリン生産能が向上した大腸菌を培養培地で発酵する段階を含み、培地にＯ−アセチル−ホモセリンを蓄積させることにより、Ｏ−アセチル−ホモセリンを生産する方法に関する。
別の様態として、本発明は、（ａ）前記方法によって製造されたＯ−アセチルホモセリン生産能が向上したエシェリキア属由来の菌株を培養し、発酵によってＯ−アセチルホモセリンを生産する段階、（ｂ）生産されたＯ−アセチルホモセリンを分離する段階、および（ｃ）前記分離されたＯ−アセチルホモセリンおよびメチルメルカプタンを基質として、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼおよびＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性を有する酵素よりなる群から選ばれた転換酵素を用いて酵素反応を起し、Ｌ−メチオニンおよびアセテートを生産する方法に関する。
【００２５】
前記方法は、本発明者が２００７年に出願した国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号に基づいた方法によるもので、メチオニン転換酵素としてのシスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、またはＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性を用いてＬ−メチオニンを生産する方法であって、本発明で提供する菌株を用いる場合、さらに高い収率でＬ−メチオニンを生産することができる。
前記で製造されたＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリン生産菌株の培養過程は、当業界に知られている適切な培地と培養条件に応じて行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には回分式、連続式および流加式培養が含まれるが、これに限定されない。このような各種培養方法は、例えば文献『“Biochemical Engineering” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176』に開示されている。
【００２６】
培養に使用される培地は、特定の菌株の要求条件を適切に満足させなければならない。多様な微生物の培地は、例えば文献『“Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington D. C., USA, 1981』に開示されている。前記培地は多様な炭素源、窒素源、および微量元素成分を含む。炭素源は、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、澱粉およびセルロースなどの炭水化物；大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などの脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸などの脂肪酸；グリセロールおよびエタノールなどのアルコールと酢酸などの有機酸を含む。これらの炭素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、コーンスティープリカー（(corn steep liquor)ＣＳＬ）およびベスン粉(bean flour)などの有機窒素源、および尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を含む。これらの窒素源は、単独でまたは組み合わせて使用できる。前記培地にはリン酸源としてさらにリン酸二水素カリウム(potassium dihydrogen phosphate)、リン酸水素カリウム(dipotassium hydrogen phosphate)および相応するナトリウム含有塩(sodium-containing salts)を含むことができる。また、培地は硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属を含むことができる。また、アミノ酸、ビタミン、および適した前駆体などが添加できる。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加できる。
【００２７】
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することにより、培養中の気泡生成を抑制することができる。また、培養液の好気性条件を保つために、培養液内に酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）が注入できる。培養物の温度は一般に２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養はＬ−メチオニン前駆体の生産が所望の水準に到達するまで続けることが可能であり、好ましい培養時間は１０〜１６０時間である。
以下、実施例によって本発明をより詳しく説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものとして解析してはいけない。
【００２８】
実施例１：Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株の製造
<１−１>ｐｐｃ挿入用ｐＳＧベクターの製作
大腸菌の染色体上にｐｐｃ ＤＮＡを挿入するために、挿入用ベクターとしてのｐＳＧ−２ｐｐｃを製作した。
米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に基づいてｐｐｃ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ｇｉ：８９１１００７４）を確保し、これに基づいてｐｐｃ遺伝子の−２００部分からｐｐｃ ＯＲＦを含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号１および２）と、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号３および４）とを合成した。
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号１および２と配列番号３および４のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは変性９６℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；および重合反応７２℃、４分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。
【００２９】
その結果、ｐｐｃ遺伝子と制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ、そしてＳａｃＩおよびＫｐｎＩを含有した約３．１ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
前記ＰＣＲによって獲得したｐｐｃ遺伝子の末端に含まれた制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳａｃＩ、そしてＳａｃＩおよびＫｐｎＩを処理し、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＫｐｎＩが処理されたｐＳＧ７６−Ｃ(J Bacteriol. 1997 Jul; 179(13):4426-8)ベクターに接合によってクローニングし、最終的に２コピーのｐｐｃ遺伝子がクローニングされたｐＳＧ−２ｐｐｃ組み換えベクターを製作した。図２はｐｐｃ染色体挿入用ベクターｐＳＧ−２ｐｐｃを示す図である。
【００３０】
<１−２>ａｓｐＣ挿入用ｐＳＧベクターの製作
大腸菌の染色体上にａｓｐＣ ＤＮＡを挿入するために、挿入用ベクターとしてのｐＳＧ−２ａｓｐＣを製作した。
米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に基づいてａｓｐＣ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ｇｉ：８５６７４２７４）を確保し、これに基づいてａｓｐＣ遺伝子の−２００部分からｐｐｃ ＯＲＦを含有し、制限酵素ＢａｍＨ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号５および６）を合成した。
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号５および６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは変性９６℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。
その結果、ａｓｐＣ遺伝子と制限酵素ＢａｍＨＩを含有した約１．５ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
前記ＰＣＲによって獲得したａｓｐＣ遺伝子の末端に含まれた制限酵素ＢａｍＨＩを処理し、制限酵素ＢａｍＨＩが処理されたｐＳＧ７６−Ｃベクターに接合によってクローニングした。最終的に２コピーのａｓｐＣ遺伝子がクローニングされたｐＳＧ−２ａｓｐＣ組み換えベクターを製作した。図３はａｓｐＣ染色体挿入用ベクターｐＳＧ−２ａｓｐＣを示す図である。
【００３１】
<１−３>ａｓｄ挿入用ｐＳＧベクターの製作
大腸菌の染色体上にａｓｄ ＤＮＡを挿入するために、挿入用ベクターとしてのｐＳＧ−２ａｓｄを製作した。
米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に基づいてａｓｄ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ｇｉ：８９１１０５７８）を確保し、これに基づいてａｓｄ遺伝子の−２００部分からｐｐｃ ＯＲＦを含有し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号７および８）と、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号９および１０）とを合成した。
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号７および８と配列番号９および１０のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは変性９６℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。
その結果、ａｓｄ遺伝子と制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ、そしてＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを含有した約１．５ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
前記ＰＣＲによって獲得したａｓｄ遺伝子の末端に含まれた制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを処理し、制限酵素ＥｃｏＲＩが処理されたｐＳＧ７６−Ｃベクターに接合によってクローニングし、最終的に２コピーのｐｐｃ遺伝子がクローニングされたｐＳＧ−２ａｓｄ組み換えベクターを製作した。図４はａｓｄ染色体挿入用ベクターｐＳＧ−２ａｓｄを示す図である。
【００３２】
<１−４>ＴｈｒＡおよびＭｅｔＸ発現用ｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬベクターの製作
Ｏ−アセチルホモセリンの合成のために、ｔｈｒＡおよびｍｅｔＸを発現する組み換えベクターを導入して前記遺伝子の発現を強化した。
ｔｈｒＡ遺伝子と同時にｍｅｔＸ遺伝子の発現のためのベクターを製作するために、米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に基づいてｍｅｔＸ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ｇｉ：１７９９７１８）を確保し、これに基づいてｍｅｔＸ遺伝子のＡＴＧ部分からＴＡＡ部分までｍｅｔＸ ＯＲＦを含有し、両末端に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認知部位を含んでいるプライマー（配列番号１１および１２）を合成した。
デイノコックスラディオデュランスＲ１の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号１１および１２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用した。ＰＣＲは変性９６℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し行った。
その結果、ｍｅｔＸ遺伝子と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有した約１ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
前記ＰＣＲによって獲得したｍｅｔＸ遺伝子に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを処理し、本発明者によって出願された米国特許出願第１２／０６２８３５号で製作されたｔｈｒＡ発現ベクターｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬプラスミドに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを処理した切片と接合によってクローニングし、最終的にｔｈｒＡとｍｅｔＸを同時に発現するベクターｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬを製作した（図５）。
【００３３】
<１−５>Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株の製作
実施例<１−１>で製作したｐｐｃ染色体挿入ベクターとしてのｐＳＧ−２ｐｐｃをＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）（米国特許出願第１２／０６２８３５号）菌株に形質転換してＬＢ−Ｃｍ（酵母抽出１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール２５μｇ／Ｌ）培地で培養した後、クロラムフェニコール耐性を有するコロニーを選抜した。選抜された形質転換体はｐＳＧ−２ｐｐｃベクターが染色体内のｐｐｃ部分に１次挿入された菌株である。前記で確保された２コピーのｐｐｃ遺伝子が挿入された菌株に、ｐＳＧベクター内に存在するＩ−ｓｃｅＩ部分を切断する制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩを発現するベクターｐＡＳｃｅｐを形質転換し、ＬＢ−Ａｐ（酵母抽出１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、アンピシリン１００μｇ／Ｌ）で生長する菌株を選別した。このように選別された菌株は、ｐｐｃ遺伝子は２コピーに増幅され、１次挿入によってｐｐｃ遺伝子と同時に挿入されたｐＳＴ７６−Ｃベクターが除去された形態である。このような方法を同様に、実施例<１−２>で製作したｐＳＴ７６Ｃ−２ａｓｐＣおよび実施例<１−３>で製作したｐＳＴ７６Ｃ−２ａｓｄベクターに順次繰り返し行った。その結果、ＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）菌株から、ｐｐｃ、ａｓｄおよびａｓｐＣが２コピーに増幅された菌株を製作した。こうして製作された菌株をＣＪＭ−ＸＰＡ２と命名した。
【００３４】
製作されたＣＪＭ−ＸＰＡ２菌株を、実施例<１−４>で製作したｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬベクターで形質転換してＬＢ−Ｓｐ（酵母抽出１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、スペクチノマイシン１００μｇ／Ｌ）培地で培養した後、スペクチノマイシンに耐性を有するコロニー１０株を選抜し、Ｏ−アセチルホモセリンの生産性を比較した。ＣＪＭ−ＸＰＡ２（ｐＣＪ−ｔｈｒＡ（Ｍ）−ｍｅｔＸ−ＣＬ）菌株を「大腸菌ＣＡ０５−０５６７」と命名し、ＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に２００９年８月１１日付で寄託番号ＫＣＣＭ１１０２５Ｐで寄託した。それぞれのＯ−アセチルホモセリン生産能力を比較した。
【００３５】
実施例２：Ｏ−アセチルホモセリンの生産のための発酵
実施例１で製作した菌株のメチオニン前駆体であるＯ−アセチルホモセリンの生産性を確認するために、三角フラスコ培養を行った。
表１に示したＯ−アセチル−ホモセリン力価培地を用いて三角フラスコでＯ−アセチルホモセリンの生産性を比較した。
【００３６】
【表１】
0005445243.tif 000002
【００３７】
３２℃の培養器でＬＢ固体培地内に一晩培養した単一コロニーを２５ｍＬのＯ−アセチルホモセリン力価培地に１白金耳ずつ接種して３２℃、２５０ｒｐｍで４２〜６４時間培養した。培養物からＯ−アセチルホモセリンをＨＰＬＣによって分析した。分析結果を表２に示した。
下記表２に示した結果のように、Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株の染色体内にホスホエノールピルビン酸塩からアスパラギン酸塩に至る遺伝子ｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄを２コピーに増幅させるときに、Ｏ−アセチルホモセリンの生成収率は、ｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄ遺伝子が２コピーに増幅されていない菌株ＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）に比べて２９．１％から３２．７％に３．６％増加することを確認した。さらに、ホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンの生合成に至る全ての遺伝子ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ、ｔｈｒＢおよびｍｅｔＸを染色体とプラスミド形態で増幅させるときに、Ｏ−アセチルホモセリンの生成収率は、ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ遺伝子が２コピーに増幅されていないＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）菌株に比べて２９．１％から４６％に非常に高い１６．９％程度向上することを確認した。
【００３８】
総合すれば、ホスホエノールピルビン酸塩からアスパラギン酸塩に至るｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄのみを増幅した場合には、Ｏ−アセチルホモセリンの収率が３２．７％、ｐｐｃ、ａｓｐＣおよびａｓｄの増幅なしでｔｈｒＡおよびｍｅｔＸのみを増幅した場合には、Ｏ−アセチルホモセリンの収率が３７．５％である結果からみて、ホスホエノールピルビン酸塩からＯ−アセチルホモセリンの生合成経路上に位置する全体遺伝子ｐｐｃ、ａｓｐＣ、ａｓｄ、ｔｈｒＡおよびｍｅｔＸを染色体とプラスミド形態として遺伝子コピー数を増大して発現量を同時に増加させる場合、いずれか一つの遺伝子の発現量を増加させたことに比べてＯ−アセチルホモセリンの生産収率が４６％に大きく増加させることができることを確認した。
【００３９】
【表２】
0005445243.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００４０】
上述したように、本発明は、培地内で発酵するときに培養培地で高収率にてＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属菌株を提供する。また、Ｏ−アセチルホモセリンとメチルカプタンを基質として、２段階のＬ−メチオニン生産工法を用いて転換反応を起こす場合、高収率でＬ−メチオニンと酢酸を同時に生産することができる。
以上、本発明の好適な実施例について説明の目的で開示したが、当業者であれば、添付した請求の範囲に開示された本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変形、追加または置換を加え得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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