(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の片側に、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種し、播種後の多孔質体を培養液に入れ１００〜１０００Ｇの加速度を所定時間加えて軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を凝集させた後、凝集させた細胞に加速度を加えずに血清を含まずアスコルビン酸，アスコルビン酸誘導体，デキサメタゾンから選ばれた１種又は２種以上が含まれている培養液で培養して厚さが２００μｍ以上の軟骨細胞層を形成することを特徴とする軟骨組織再生シートの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨腫瘍摘出や骨折などの疾患や事故などにより受けた骨の創傷部位を修復するために用いる軟骨組織再生シートの作製方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、機能障害や機能不全に陥った生体組織・臓器の再生を計る再生医療の実現が求められている。再生医療は、本来生体が持っている治癒能力では回復できなくなった生体組織を、細胞，細胞担体及び細胞成長因子の三因子を使って元の組織と同じような形態や機能を再び作り出す新たな医療技術である。
【０００３】
骨の再生誘導にも骨補填材が使用されており、その材料としてはハイドロキシアパタイトやリン酸三カルシウムが用いられていた。しかし、体内に異物を残さないことが好ましいことから基材として生体親和性や生体吸収性などの条件が要求され、ポリ乳酸やポリグリコール酸や乳酸とグリコール酸との共重合体のような生体吸収性合成高分子（例えば、特許文献１参照。）、又はゼラチン等の天然高分子で調製した多孔質性担体材料（例えば、特許文献２参照。）が骨補填材の基材として用いられている。基材の骨組織再生誘導用シートとしての応用例としては、リン酸三カルシウムをそれよりも軟質なシートに挟み積層にしたシートがある（例えば、特許文献３参照。）。しかしこの方法では、リン酸三カルシウムを用いるので靭性の面から骨としては不十分であるという欠点があった。
【０００４】
その後、基材に培養細胞を付与した骨再生シートが開発され、間葉系幹細胞をシート状に培養した培養細胞シートと生分解性物質をシート状に形成した生分解シートとを積層してなる骨再生シート（例えば、特許文献４参照。）が提案されている。また、多孔質シート上に間葉系細胞から分化させた間葉系組織前駆体細胞と細胞外基質とが付着している間葉系組織再生誘導用シートもある（例えば、前記特許文献１参照。）。これらの発明は培養骨芽細胞の付着したシートを体内に入れ、体内での膜性骨化によって骨芽細胞から骨を形成させる方法である。しかしながら、骨芽細胞様細胞は積層して培養することができないという問題があるため骨芽細胞層を用いたシートでは細胞層の厚さが１００μｍを超える再生シートを提供できなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−１１６２１２号公報
【特許文献２】特開２００４−１０５０４６号公報
【特許文献３】特開２００４−２４７０６号公報
【特許文献４】特開２００３−２７５２９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、従来の培養した骨芽細胞を用いる骨組織再生シートでは不可能であった厚い軟骨細胞層を有している軟骨組織再生シートの作製方法とを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、従来の培養した骨芽細胞を用いる骨組織再生シートではなく、厚い細胞層が形成可能な軟骨組織を高分子シート上に一旦形成し、それを培養して細胞層部分の厚さが２００μｍ以上である軟骨組織再生シートを作製できることを見出して本発明を完成したのである。
【０００８】
即ち本発明は、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の片側に、軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種し、播種後の多孔質体を培養液に入れ１００〜１０００Ｇの加速度を所定時間加えて軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を凝集させた後、凝集させた細胞に加速度を加えずに血清を含まずアスコルビン酸，アスコルビン酸誘導体，デキサメタゾンから選ばれた１種又は２種以上が含まれている培養液で培養して厚さが２００μｍ以上の軟骨細胞層を形成することを特徴とする軟骨組織再生シートの作製方法であある。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る軟骨組織再生シートの作製方法で作製した軟骨組織再生シートは、従来の骨芽細胞を用いて作製した軟骨組織再生シートと比較して軟骨細胞層の厚さが２００μｍ以上であり、治癒時間の短縮や軟骨組織再生シートの強度を向上させることが可能な優れた軟骨組織再生シートであり、このように厚い軟骨細胞層は生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の片側に形成した厚さが２００μｍ以上の軟骨細胞層を内軟骨性骨化と同様の作用によって形成可能となったのである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明で用いるシート状の多孔質体を構成する生体吸収性合成高分子としては、例えば従来から用いられているポリグリコール酸，ポリ乳酸，乳酸−グリコール酸共重合体，ポリ−ε−カプロラクトン，乳酸−ε−カプロラクトン共重合体，ポリアミノ酸，ポリオルソエステル，ポリリンゴ酸及びそれらの共重合体中から選択された少なくとも一種のホモポリマー又はコポリマーから選ばれる生体吸収性合成高分子を用いることが強度と生体への安全性の面から好ましい。
【００１１】
また、生体吸収性合成高分子の分子量が１０,０００〜５００,０００であることが好ましく、１０,０００未満ではシートの固さが低下する傾向があり、５００,０００を超えるとシートが硬くなり過ぎて使用し難くなる。また、生体吸収性合成高分子のシートは多孔質体であることが必要であり、その孔の直径は１〜５００μｍが好ましい。１μｍ未満ではシートの柔軟性が乏しくなり、５００μｍを超えるとシート面が著しく粗造化して細胞の播種率が低下する傾向がある。
【００１２】
本発明で使用する軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞としては、軟骨細胞を直接又は間葉系幹細胞，間葉系細胞及び滑膜細胞などの軟骨細胞に分化し得る又はそれらの修復を促進し得る能力を有する幹細胞、例えば、骨盤（腸骨）や手足の長管骨（大腿骨，脛骨）の骨髄及び／又は骨膜，滑膜，歯槽骨等の骨髄，口蓋又は歯槽骨等の骨膜等から採取される細胞が挙げられる。採取する方法としては通常医科で行われている方法が特に限定されずに使用でき、中でも採取の際、皮膚，筋肉の剥離切開が最小ですむ簡易な手術で行うことが可能な腸骨等の骨髄，口蓋又は歯槽骨等の骨膜等を採取源とすることが好ましい。
【００１３】
採取した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞は、通法に従い組織培養用の培養容器で１〜２週間の間増幅培養される。培養に用いられる培地としては、適宜の培地が使用できるが、例えば自己血清，ウシ胎児血清を含有した細胞培養用のαMEM培地が好適に使用できる。このとき、特定の成長因子（例えばbFGF）を作用させると、間葉系幹細胞は高い多分化能力を保ったまま増殖され軟骨の再生を促進でき、顕著な再生能力を有する。
【００１４】
特定の成長因子の存在下で多分化能力を保ったまま増幅培養された間葉系幹細胞をトリプシン等の処理により培養容器から剥離し、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の片側に播種する。
【００１５】
軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の片側に播種し，培養液に入れ遠心分離機等により１００〜１０００Ｇ、好ましくは２００〜６００Ｇの加速度を所定時間加える。一旦加速度を加えると以後は加圧下で培養しなくとも幹細胞を確実に軟骨細胞へ分化させることが可能であり、更に加速度による高圧でシート状の多孔質体の内部に軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を侵入させることができる。その結果、厚い軟骨細胞の層を得ることができる。
【００１６】
このとき、播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて加速度を加えてもよいし、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体方向から播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞へ向けて加速度を加えてもよいが、播種した軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて加速度を加えた方がシート状の多孔質体の内部に細胞が侵入し易いので高い細胞の播種率を得ることができて好ましい。
【００１７】
加速度を加える時間は、加速度の強さ，細胞の密度や使用する生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の条件によって異なるが、３０秒から３０分間であることが好ましい。また、加速度を加える際の温度は一般の細胞培養温度に等しく特に制限はない。
【００１８】
軟骨細胞又は軟骨細胞に分化する幹細胞を播種した生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を入れた培養液ごと１００〜１０００Ｇの加速度を加えて凝集させた後に、生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を血清を含まない培養液（例えば、文献：Science 284, 143-147, 1999記載の培地）を用いて加速度を加えずに常圧で３〜４週間培養してシートの片側に十分な量の軟骨細胞を培養又は分化させる。このときの軟骨細胞の厚さによって最終的な軟骨組織部分の厚さを調整することが可能である。軟骨細胞は骨芽細胞と比較して厚い細胞層を形成させることが可能であり、具体的には厚さ２００μｍ以上の細胞層を形成させることができる。培養液にはアスコルビン酸，アスコルビン酸誘導体，デキサメタゾンから選ばれた１種又は２種以上が含まれている必要があり、これらが無い場合は必要な厚さの軟骨細胞層を得ることができない。
【００１９】
本発明での血清とは凝固させた血液から血球成分を除いた上清画分であり、例えばヒト血清，ウシ胎児血清やウマ胎児血清などがある。
【００２０】
アスコルビン酸誘導体としては、例えば、アスコルビン酸リン酸エステル，アスコルビン酸パルミチン酸エステル，アスコルビン酸ステアリン酸エステル，アスコルビン酸グルコシド，アスコルビン酸ナトリウム，ジパルミチン酸アスコルビル，アスコルビン酸硫酸エステル，Ｌ-３‐Ｏ-エチルアスコルビン酸がある。これらのアスコルビン酸誘導体は１種又は２種以上を任意に組み合わせて用いることができ、アスコルビン酸，デキサメタゾンと同時に使用することもできる。
【００２１】
本発明に係る軟骨組織再生シートの作製方法では、前述の方法によって高分子シートの片側に軟骨細胞層を一旦形成させる。
【００２２】
以下，本発明を実施例により具体的に示すが，本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
１）大腿骨・脛骨からの骨髄液の採取
４週齢のウサギの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯等を除いてこれを切除し、その両端を切断し、10％ウシ胎児血清，αMEM培地で骨髄内を洗浄し、その洗浄液中でよく懸濁して骨髄液をほぐした後、300Gで５分間遠心分離し、細胞を分離して約7×107個の有核細胞を得た。
【００２４】
２）骨髄由来間葉系幹細胞の培養
骨髄から採取した7×107の有核細胞を前記と同様の10％ウシ胎児血清，αMEM培地の入った75cm2培養フラスコへ播種し、37℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。６日目で培地を交換することによって非接着細胞を除去した。以後３日に１回の割合で培地を交換した。また、５日目からはbFGFを３ng/mlの割合で培地に添加した。その結果、10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。この培養フラスコを（0.05%トリプシン＋0.2mM MEDTA）で５分間インキュベートして細胞を剥離，回収した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5×103細胞個／cm2の密度で細胞を二代目の継代培養皿へ播種した。前記の37℃にて５％炭酸ガス存在下で培養するところから、５分間インキュベートして細胞を回収するところまでの操作を繰り返して、この二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００２５】
３）生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の作製
分子量230,000のポリ−Ｌ−乳酸と分子量250,000のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体とを所定の割合で混合した高分子ブレンドをジオキサンに溶解させた後、凍結乾燥によって、孔のサイズが平均20μｍ，有孔率52％，厚さ250μｍの生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を作製した。
【００２６】
４）軟骨組織のシートの作製
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を直径９mmに切断し、その片面側に前記の間葉系細胞を集密状態のまま播種した。遠心分離器（商品名：小型卓上遠心機，コクサン社製）により播種した間葉系細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて略垂直に約352Gの加速度を３分間加えた（半径15cm，1500rpm）。その後、軟骨分化誘導培地（50μg/ml アスコルビン酸二リン酸，100μg/ml ピルビン酸，4.5g/l D-(+)-グルコース，2mM L-グルタミン，10ng/ml TGF-β3，10-7M デキサメタゾン，1% ITS+を含有したαMEM）にて37℃，常圧下で４週間培養して軟骨組織のシートを作製した。
【００２７】
５）軟骨組織再生シートの作製
前記の軟骨組織のシートを骨分化誘導培地（10% ウシ胎児血清，50μg/ml アスコルビン酸二リン酸，2mM Ｌ−グルタミン，10-7M Ｄデキサメタゾン，10mM βグリセロリン酸を含有したαMEM）にて37℃，常圧下で４週間培養して軟骨組織再生シートを作製した。
【実施例２】
【００２８】
１）ヒト腸骨骨髄液から採取した間葉系幹細胞
ヒト腸骨骨髄液から採取した細胞を10％ウシ胎児血清，αMEM培地で懸濁した後、有核細胞数 1×107細胞個／10cm直径培養皿へ播種した。37℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。３日目で培地を交換し、非接着細胞（造血系細胞）を除いた。以後３日に１回培地を交換した。bFGFは５日目から３ng/mlで培地に添加した。10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。これらの培養皿をトリプシン（0.05 %）＋EDTA（0.2 mM）で５分間インキュベートして、細胞を単離した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5×103細胞個／cm2の密度で細胞を播種した。前記の37℃にて５％炭酸ガス存在下で培養するところから，５分間インキュベーとして細胞を回収するところまでの操作を再度繰り返して，この二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００２９】
２）生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の作製
分子量250,000のＤＬ−乳酸／グリコール酸共重合体をジオキサンに溶解させた後、凍結乾燥によって、孔のサイズが平均20μｍ，有孔率52％，厚さ250μｍの生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を作製した。
【００３０】
３）軟骨組織のシートの作製
生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を直径９mmに切断し、その片面側に前記の間葉系細胞を集密状態のまま播種した。遠心分離器（商品名：小型卓上遠心機，コクサン社製）により播種した間葉系細胞方向から生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体へ向けて略垂直に約352Gの加速度を３分間加えた（半径15cm，1500rpm）。その後、軟骨分化誘導培地（50μg/ml アスコルビン酸二リン酸，100μg/ml ピルビン酸，4.5g/l D-(+)-グルコース，2mM L-グルタミン，10ng/ml TGF-β3，10-7M デキサメタゾン，1% ITS+を含有したαMEM）にて37℃，常圧下で４週間培養して軟骨組織のシートを作製した。
【００３１】
５）軟骨組織再生シートの作製
前記の軟骨組織のシートを骨分化誘導培地（10% ウシ胎児血清，50μg/ml アスコルビン酸二リン酸，2mM Ｌ−グルタミン，10-7M デキサメタゾン，10mM βグリセロリン酸を含有したαMEM）にて37℃，常圧下で４週間培養して軟骨組織再生シートを作製した。培養終了後にシートを凍結包埋し。厚さ７μmの薄切片を作製し、ヘマトオキシリンエオシンで染色して顕微鏡で観察した結果、シートに片面から約40μm侵入した部分に続いて約170μmの計約210μmの軟骨組織層が形成されていることが確認できた。
【００３２】
本発明方法で作製したヒト間葉系幹細胞を原料として作製した軟骨組織再生シートをスキッドマウスに移植した。移植後8週の時点で検体を採収し、ヘマトオキシリンエオシン染色、アリザリンレッド染色，ヒトビメンチン抗体染色を行った。また、検体よりm-RNAを回収しRT-PCRにより軟骨組織に特有にみられるタイプＩコラーゲン、オステオカルシンの発現解析を行った。その結果、スキッドマウスの背中の皮下に移植した検体は表面光沢があり色が乳白色であることが観察された。また、ヒトビメンチン陽性組織のヘマトオキシリンエオシン染色とアリザリンレッド染色の結果ではコラーゲンが豊富に含まれた石灰化組織が認められた。更に検体から抽出したm-RNA試料中にヒトタイプＩコラーゲンやヒトオステオカルシンを発現するm-RNAが検出同定された。これらのことから移植したヒト軟骨組織再生シートがマウス体内で機能していることが確認できた。また、得られた軟骨組織再生シートでは軟骨細胞が高密集状態で表面及び表面から十分な深さに至るまで培養されていることも確認した。
【００３３】
＜比較例1＞
１）大腿骨・脛骨からの骨髄液の採取
４週齢のラットの大腿骨，脛骨から筋肉及び靭帯等を除いてこれを切除し、その両端を切断し、10%ウシ胎児血清，αMEM培地で骨髄内を洗浄し、その洗浄液中で良く懸濁して骨髄液をほぐした後、300Gで５分間遠心分離し、細胞を分離して約7×107個の有核細胞を得た。
【００３４】
２）骨髄由来間葉系幹細胞の培養
ラット骨髄から採取した7×107個の有核細胞を前記と同様の10%ウシ胎児血清，αMEM培地の入った75cm2培養フラスコへ播種し、37℃にて５％炭酸ガス存在下で培養した。５日目で培地を交換することによって非接着細胞を除去した。以後３日に１回の割合で培地を交換した。また、５日目からはbFGFを３ng/mlの割合で培地に添加した。その結果、10日前後でほぼ集密的にまで増殖した。この培養フラスコを（0.05%トリプシン＋0.2mM MEDTA）で５分間インキュベートして細胞を剥離，回収した。細胞数をCoulterカウンター（Z1シングル，コールター社製）で計測し、そして5×103細胞個／cm2の密度で細胞を二代目の継代培養皿へ播種した。前記の37℃にて５％炭酸ガス存在下で培養するところから、５分間インキュベートして細胞を回収するところまでの操作を繰り返して、この二代目の継代培養皿から得た三代目の細胞を用いた。
【００３５】
３）生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体の作製
分子量230,000のポリ−Ｌ−乳酸と分子量250,000のDL−乳酸／グリコール酸共重合体とを所定の割合で混合した高分子ブレンドをジオキサンに溶解させた後、凍結乾燥によって、孔のサイズが平均20μｍ，有孔率52％，厚さ250μｍの生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を作製した。
【００３６】
４）骨芽細胞組織再生用シートの作製
前記の間葉系細胞を生体吸収性合成高分子から成るシート状の多孔質体を直径９mmに切断し、その上に2x104cell/cm2の濃度となるように播種した。その後、骨分化誘導培地（10% ウシ胎児血清，50μg/ml アスコルビン酸二リン酸，2mM L-グルタミン，10-7M デキサメタゾン，10mM βグリセロリン酸を含有したαMEM）にて37℃，常圧下で4週間培養して骨芽細胞組織のシートを作製した。培養終了後にシートを凍結包埋し。厚さ７μmの薄切片を作製し、ヘマトオキシリンエオシンで染色して顕微鏡で観察した結果、シートに片面から約40μm侵入した部分に続いて約10μmの計約50μmの薄い骨芽細胞組織しか形成できなかったことが確認できた。