(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 外因性アクチビンＡの存在下で多能性ヒト細胞を培養するステップ、並びに
(b) ステップ（a）により得られた胚体内胚葉細胞を、外因性ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸（ＲＡ）の存在下で培養し、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生するステップ、
を含む、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生する方法。
【請求項２】
ＲＡが２μMで供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト細胞を含むin vitroの細胞培養物であって、
前記ヒト細胞が、アクチビンＡ、次いでレチノイン酸及びアクチビンＡで処理された多能性ヒト細胞由来であり、
前記ヒト細胞の少なくとも１０％がＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である、細胞培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に本発明は、哺乳動物の前腸内胚葉細胞を含む組成物、並びに背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物、並びにこのような細胞の産生、単離及び使用方法に関する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許仮出願第６０／７３０，９１７号（表題「ＰＤＸ１発現背側及び腹側前腸内胚葉（PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERM）」、２００５年１０月２７日提出）（この記載内容は参照により本明細書中で完全に援用される）の本出願であり、そしてそれに対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト多能性幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞及び胚性生殖（ＥＧ）細胞は、１９９４年に線維芽細胞フィーダーを含有しない培養物中で初めて単離され（Bongso他、1994）、そして線維芽細胞フィーダーを含有する培養物中でも単離された（Hogan, 1997）。後に、Thomson、Reubinoff及びShamblottは、有糸分裂不活性化マウスフィーダー層を用いたヒトＥＳ及びＥＧ細胞の連続培養を確立した（Reubinoff他、2000；Shamblott他、1998；Thomson他、1998）。
【０００４】
ヒトＥＳ及びＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発達の早期段階を研究するための、並びにいくつかの疾患状態、例えば真性糖尿病及びパーキンソン病における療法的介入のための独特の機会を提供する。例えばｈＥＳＣ由来のインスリン生産β細胞の使用は、糖尿病の治療のためにドナー膵臓からの細胞を利用する一般的細胞療法手順を上回る大幅な改善を提供する。しかしながら現在、ｈＥＳＣからインスリン生産β細胞を生成する方法は分かっていない。したがって、ドナー膵臓からの島細胞を利用する真性糖尿病のための一般的細胞療法処置は、移植に必要とされる高品質の島細胞の不足により制限される。単一Ｉ型糖尿病患者のための細胞療法は、約８×１０8個の膵臓島細胞の移植を要する（Shapiro他、2000；Shapiro他、2001a；Shapiro他、2001b）。したがって、少なくとも２つの健常ドナー器官が、上首尾の移植のために十分な島細胞を得るために必要とされる。ヒト胚性幹細胞は、ヒト細胞療法のための相当量の高品質分化細胞を発達させるための出発物質の供給源を提供する。
【０００５】
ｈＥＳＣを細胞療法用途に独特に適合させる２つの特性は、多能性、並びに長期間培養中にこれらの細胞を保持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）すべての誘導体に分化し、次に胚体外組織（例えば胎盤）及び生殖細胞のほかに、成熟生物体のすべての体細胞型を形成するｈＥＳＣの能力により確定される。多能性はｈＥＳＣに並外れた有用性を付与するが、この特性は、これらの細胞及びそれらの誘導体の研究及び操作のための独特の好機も有する。ｈＥＳＣ培養物を分化する際に生じ得る非常に種々の細胞型のために、膨大な数の細胞型が極めて低い効率で産生される。さらに、任意の所定の細胞型の産生を評価する場合の成功は、適切なマーカーの確定に応じて決まる。効率的な指示分化の達成は、ｈＥＳＣの療法的用途のために大きな重要性を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
細胞療法用途で有用である細胞を生成するための出発材料としてｈＥＳＣを使用するためには、上述の問題を克服することは有益であろう。例えば島細胞移植療法のために必要とされる細胞材料のレベルを達成するために、分化の極めての初期の段階でｈＥＳＣを効
率的に膵島／β−細胞株に向けることが有益である。
【０００７】
分化プロセスの効率的指示のほかに、膵島／β−細胞株への分化経路に沿って中間体細胞型を単離し、特性化すること、そして分化におけるさらなる工程のための適切な系統前駆体としてこのような細胞を用いることも有益である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施の形態は、ＰＤＸ１陰性胚体前腸内胚葉細胞（内胚葉細胞）の細胞培養物に関する。いくつかの実施の形態では、前腸内胚葉は、ＨＮＦ１ｂ及びＦＯＸＡ１マーカーを発現するが、ＰＤＸ１を実質的に発現しない。本発明の他の実施の形態は、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞（背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）の細胞培養物に関する。いくつかの実施の形態では、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は、表３から選択される1つ又は複数のマーカー、及び／又は表４から選択される1つ又は複数のマーカーを発現する。付加的な実施の形態は、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞（腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞）の細胞培養物に関する。いくつかの実施の形態では、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞における同一マーカーの発現と比較して、表３から選択される1つ又は複数のマーカーを発現するが、表４から選択されるマーカーを実質的に発現しない。
【０００９】
本発明の付加的な実施の形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む富化、単離及び／又は精製した細胞集団に関する。他の実施の形態は、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞に関する。さらに他の実施の形態は、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む富化、単離及び／又は精製した細胞集団に関する。
【００１０】
本発明の態様は、胚体内胚葉細胞からのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の細胞培養物を産生する方法又はプロセスにも関する。このようなプロセスとしては、胚体内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団中のＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達を低減又は排除することを包含する。いくつかの実施の形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達を低減又は排除することは、外因的に添加されるＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子、例えばアクチビンＡを胚体内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団から希釈又は除去することにより媒介される。いくつかの実施の形態では、前腸内胚葉細胞への胚体内胚葉細胞の分化は、ＦＧＦファミリー増殖因子及び／又はヘッジホッグ経路阻害剤を胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団に供給することにより増強される。いくつかの実施の形態では、胚体内胚葉細胞は、幹細胞に由来する。好ましくは幹細胞は、胚性幹細胞である。さらに好ましくは、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。いくつかの実施の形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、レチノイド、例えばレチノイン酸の添加により、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞（膵臓内胚葉細胞）に分化される。他の態様は、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の細胞培養物を産生する方法又はプロセスに関する。このようなプロセスは、胚体内胚葉細胞にレチノイン酸を供給することを包含する。いくつかの実施の形態では、胚体内胚葉細胞は、幹細胞に由来する。好ましくは幹細胞は、胚性幹細胞である。さらに好ましくは、幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。本発明のさらなる態様は、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の細胞培養物を産生する方法又はプロセスに関する。このようなプロセスは、胚体内胚葉細胞にＦＧＦファミリー増殖因子を供給することを包含する。いくつかの実施の形態では、胚体内胚葉細胞は、幹細胞に由来する。好ましくは幹細胞は胚性幹細胞である。さらに好ましくは、幹細胞はｈＥＳＣである。
【００１１】
本発明の付加的な実施の形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び／又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、
細胞表面分子のようなＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の細胞表面に発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明の他の実施の形態は、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び／又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は、表３から選択される細胞表面分子、或いは表４から選択される細胞表面分子のようなＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面上で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明のさらに他の実施の形態は、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び／又は精製する方法に関する。このような実施の形態では、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は、表３から選択される細胞表面分子のようなＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の細胞表面で発現される分子と結合する抗体、リガンド又は他の分子を用いることにより、細胞集団中の他の細胞から分離される。
【００１２】
本発明の実施の形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び／又は精製する付加的方法に関する。このような実施の形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の前駆体である多能性細胞又は複能性細胞は、ＨＮＦ１ｂ又はＦＯＸＡ１のようなマーカー遺伝子の発現を内因的に制御するプロモーターの制御下で蛍光レポーター遺伝子を含有するように工学処理される。蛍光的タグ化ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は次に、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）により細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明のさらに他の実施の形態は、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び／又は精製する付加的方法に関する。このような実施の形態では、ＰＤＸ１陽性細胞の前駆体である多能性又は複能性のＰＤＸ１陰性細胞は、表３又は表４から選択されるマーカー遺伝子の発現を内因的に制御するプロモーターの制御下で蛍光レポーター遺伝子を含有するように工学処理される。蛍光的タグ化ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は次に、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）により細胞集団中の他の細胞から分離される。本発明のさらに他の実施の形態は、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を富化、単離、及び／又は精製する付加的方法に関する。このような実施の形態では、ＰＤＸ１陽性細胞の前駆体である多能性又は複能性のＰＤＸ１陰性細胞は、表３から選択されるマーカー遺伝子の発現を内因的に制御するプロモーターの制御下で蛍光レポーター遺伝子を含有するように工学処理される。蛍光的タグ化ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は次に、ＦＡＣＳにより細胞集団中の他の細胞から分離される。
【００１３】
本発明のさらなる実施の形態は、ヒト細胞を含む細胞集団中のヒトＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の分化を促し得る分化因子を同定する方法に関する。この方法は、ヒトＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第１の時点での細胞集団中のマーカー、例えばＨＮＦ１ｂ、ＦＯＸＡ１又はＰＤＸ１の発現を確定する工程、そして第２の時点での細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程を包含する。このような実施の形態では、第２の時点は第１の時点の後であり、そして第２の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。第２の時点での細胞集団中のマーカーの発現が第１の時点での細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減される場合には、候補分化因子はヒトＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。本発明のさらなる実施の形態は、ヒト細胞を含む細胞集団中のヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を同定する方法に関する。この方法は、ヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第１の時点での細胞集団中の表３から選択されるマーカー、又は表４から選択されるマーカーのようなマーカーの発現を確定する工程、そして第２の時点での細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程を包含する。このような実施の形態では、第２の時点は第１の時点の後であり、そして第２の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。第２の時点での細胞集団中のマーカーの発現が第１の時点での細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減される場合には、候補分化因子はヒトＰＤＸ
１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。本発明のさらなる実施の形態は、ヒト細胞を含む細胞集団中のヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を同定する方法に関する。この方法は、ヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第１の時点での細胞集団中の表３から選択されるマーカーのようなマーカーの発現を確定する工程、そして第２の時点での細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程を包含する。このような実施の形態では、第２の時点は第１の時点の後であり、そして第２の時点は候補分化因子を細胞集団に供給した後である。第２の時点での細胞集団中のマーカーの発現が第１の時点での細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減される場合には、候補分化因子はヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。
【００１４】
或る特定の権限において、「〜を含む（comprising）」という用語の任意の一般的に許容可能な定義はあり得ない。本明細書中で用いる場合、「〜を含む」という用語は、任意の付加的な要素の含入を可能にする「オープン」言語を表すよう意図される。これに留意して、本発明の付加的な実施の形態を、以下の番号を付した段落を参照しながら説明する。
【００１５】
１．  ヒト細胞を含む細胞培養物であって、当該ヒト細胞の少なくとも約２６％が表３から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ１）陽性背側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化することができる複能性細胞である細胞培養物。
【００１６】
２．  表３から選択される上記マーカーが細胞表面で発現される、段落１の細胞培養物。
【００１７】
３．  細胞表面で発現される上記マーカーがＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される段落２の細胞培養物。
【００１８】
４．  上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が表４から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、段落１の細胞培養物。
【００１９】
５．  表４から選択される上記マーカーが細胞表面で発現されるマーカーである、段落４の細胞培養物。
【００２０】
６．  細胞表面で発現される上記マーカーがＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択される、段落５の細胞培養物。
【００２１】
７．  上記ヒト細胞の少なくとも３０％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１の細胞培養物。
【００２２】
８.  上記ヒト細胞の少なくとも４０％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１の細胞培養物。
【００２３】
９．  上記ヒト細胞の少なくとも５０％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１の細胞培養物。
【００２４】
１０.  上記ヒト細胞の少なくとも６０％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞であ
る、段落１の細胞培養物。
【００２５】
１１．  上記ヒト細胞の少なくとも７５％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１の細胞培養物。
【００２６】
１２．  ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約２％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１の細胞培養物。
【００２７】
１３．  ＰＤＸ１の発現が上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落１の細胞培養物。
【００２８】
１４．  上記細胞培養物が臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞及び神経細胞から成る群から選択される細胞を実質的に含有しない、段落１の細胞培養物。
【００２９】
１５．  レチノイドをさらに含む、段落１の細胞培養物。
【００３０】
１６．  上記レチノイドがレチノイン酸（ＲＡ）である、段落１５の細胞培養物。
【００３１】
１７．  Ｂ２７をさらに含む、段落１６の細胞培養物。
【００３２】
１８．  ヒト細胞を含む、細胞培養物であって、当該ヒト細胞の少なくとも約２％が表３から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する膵臓−十二指腸ホメオボックス因子−１（ＰＤＸ１）陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化することができる複能性細胞である細胞培養物。
【００３３】
１９．  表３から選択される上記マーカーが細胞表面で発現されるマーカーである、段落１８の細胞培養物。
【００３４】
２０．  細胞表面で発現される上記マーカーがＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される、段落１９の細胞培養物。
【００３５】
２１．  上記ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が表４から選択される１つ又は複数のマーカーを実質的には発現しない、段落１８の細胞培養物。
【００３６】
２２．  上記ヒト細胞の少なくとも約５％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１８の細胞培養物。
【００３７】
２３.  上記ヒト細胞の少なくとも約１０％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１８の細胞培養物。
【００３８】
２４．  上記ヒト細胞の少なくとも約２５％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１８の細胞培養物。
【００３９】
２５.  上記ヒト細胞の少なくとも約５０％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１８の細胞培養物。
【００４０】
２６．  上記ヒト細胞の少なくとも約７５％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞で
ある、段落１８の細胞培養物。
【００４１】
２７．  ヒトフィーダー細胞が上記培養物中に存在し、そして当該ヒトフィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約２％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１８の細胞培養物。
【００４２】
２８．  ＰＤＸ１の発現が上記ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落１８の細胞培養物。
【００４３】
２９．  上記細胞培養物が臓側内胚葉細胞、壁側内胚葉細胞及び神経細胞から成る群から選択される細胞を実質的に含有しない、段落１８の細胞培養物。
【００４４】
３０．  レチノイドをさらに含む、段落１８の細胞培養物。
【００４５】
３１．  上記レチノイドがレチノイン酸（ＲＡ）である、段落３０の細胞培養物。
【００４６】
３２．  Ｂ２７をさらに含む、段落３１の細胞培養物。
【００４７】
３３．  細胞を含む細胞集団であって、当該細胞のうちの少なくとも約９０％が表３から選択される少なくとも１つのマーカーを発現するヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化することができる複能性細胞である細胞集団。
【００４８】
３４．  表３から選択される上記マーカーが細胞表面で発現されるマーカーである、段落３３の細胞集団。
【００４９】
３５．  細胞表面で発現される上記マーカーがＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される、段落３４の細胞集団。
【００５０】
３６．  上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が表４から選択される少なくとも１つのマーカーを発現する、段落３３の細胞集団。
【００５１】
３７．  表４から選択される上記マーカーが細胞表面で発現されるマーカーである、段落３６の細胞集団。
【００５２】
３８．  細胞表面で発現される上記マーカーがＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択される、段落３７の細胞集団。
【００５３】
３９．上記細胞の少なくとも約９５％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落３３の細胞集団。
【００５４】
４０．  上記細胞の少なくとも約９８％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落３３の細胞集団。
【００５５】
４１．  ＰＤＸ１の発現が上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞中のＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択されるマーカーの発現より大き
い、段落３３の細胞集団。
【００５６】
４２．  細胞を含む細胞集団であって、当該細胞のうちの少なくとも約９０％が表３から選択される少なくとも１つのマーカーを発現するヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞であり、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である細胞集団。
【００５７】
４３．  表３から選択される上記マーカーが細胞表面で発現されるマーカーである、段落４２の細胞集団。
【００５８】
４４．  細胞表面で発現される上記マーカーがＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される、段落４３の細胞集団。
【００５９】
４５．  上記ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が表４から選択される１つ又は複数のマーカーを実質的に発現しない、段落４２の細胞集団。
【００６０】
４６．  上記細胞の少なくとも約９５％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落４２の細胞集団。
【００６１】
４７．  上記細胞の少なくとも約９８％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落４２の細胞集団。
【００６２】
４８．  ＰＤＸ１の発現が上記ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞中のＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落４２の細胞集団。
【００６３】
４９．  ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を産生する方法であって、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、及び表３から選択される少なくとも１つのマーカーを発現するＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞への当該ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞集団の少なくとも約２６％の分化を促進するのに十分な量でレチノイドを当該細胞集団に供給する工程であって、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程を包含する方法。
【００６４】
５０．  上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が表４から選択される少なくとも１つのマーカーも発現する、段落４９の方法。
【００６５】
５１．  ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与える工程をさらに包含し、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が上記細胞集団中の背側偏向前腸内胚葉細胞中の表４から選択されるマーカーの存在を検出することにより確定される、段落５０の方法。
【００６６】
５２．  表３又は表４から選択される上記マーカーの発現が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される、段落５０の方法。
【００６７】
５３．  表３又は表４から選択される上記マーカーが免疫細胞化学により確定される、段落５０の方法。
【００６８】
５４．  ＰＤＸ１の発現が上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択され
るマーカーの発現より大きい、段落４９の方法。
【００６９】
５５．  上記レチノイドがＲＡである、段落４９の方法。
【００７０】
５６．  ＲＡが約０．５μＭ〜約５０μＭの範囲の濃度で供給される、段落５５の方法。
【００７１】
５７．  ＲＡが約１μＭ〜約２０μＭの範囲の濃度で供給される、段落５６の方法。
【００７２】
５８．  ＲＡが約２μＭの濃度で供給される、段落５７の方法。
【００７３】
５９．  上記培養物が約５日齢である場合にＲＡが供給される、段落５５の方法。
【００７４】
６０．  上記培養物にＢ２７を供給することをさらに包含する、段落４９の方法。
【００７５】
６１．  上記Ｂ２７が総培地の約０．１％〜約２０％の範囲の濃度で供給される、段落６０の方法。
【００７６】
６２．  Ｂ２７が総培地の約０．５％〜約２％の範囲の濃度で供給される、段落６１の方法。
【００７７】
６３．  Ｂ２７が総培地の約０．５％の濃度で供給される、段落６２の方法。
【００７８】
６４．  Ｂ２７が上記レチノイドとほぼ同時に供給される、段落６０の方法。
【００７９】
６５．  上記培養物にアクチビンＡを供給することをさらに包含する、段落４９の方法。
【００８０】
６６．  アクチビンＡが約１０ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される、段落６５の方法。
【００８１】
６７．  アクチビンＡが約２０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される、段落６６の方法。
【００８２】
６８．  アクチビンＡが約２５ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落６７の方法。
【００８３】
６９.  上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞がＣＭＲＬ培地中で増殖される、段落４９の方法。
【００８４】
７０．  上記ＣＭＲＬ培地が約２μＭのＲＡ、約２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び総培地の約０．５％のＢ２７を含む、段落６９の方法。
【００８５】
７１．  上記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程が多能性ヒト細胞を含む細胞集団を得ること、胚体内胚葉細胞への当該多能性細胞の分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を当該細胞集団に供給すること、そして胚体内胚葉が形成されるのに十分な時間を与えることを包含し、当該胚体内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中の胚体内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落４９の方法。
【００８６】
７２．  段落４９の方法により産生されるＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞。
【００８７】
７３.  ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を産生する方法であって、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、及び表３から選択される少なくとも１つのマーカーを発現するＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞への当該ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な量でＦＧＦファミリー増殖因子を当該細胞集団に供給する工程であって、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程を包含する方法。
【００８８】
７４．  上記細胞集団がＲＡの非存在下で分化される、段落７３の方法。
【００８９】
７５．  上記ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が表４から選択される１つ又は複数のマーカーを発現しない、段落７３の方法。
【００９０】
７６．  ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与える工程をさらに包含し、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに上記十分な時間が上記細胞集団中の腹側偏向前腸内胚葉細胞中の表３から選択されるマーカーの存在を検出することにより確定される、段落７５の方法。
【００９１】
７７．  表３から選択される上記マーカーの発現が定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される、段落７６の方法。
【００９２】
７８．  表３から選択される上記マーカーの発現が免疫細胞化学により確定される、段落７６の方法。
【００９３】
７９．  ＰＤＸ１の発現が上記ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞中のα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及びＮＦＭから成る群から選択されるマーカーの発現より大きい、段落７３の方法。
【００９４】
８０．  上記ＦＧＦファミリー増殖因子がＦＧＦ−１０であり、当該ＦＧＦ−１０が約５ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される、段落７３の方法。
【００９５】
８１．  ＦＧＦ−１０が約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で供給される、段落８０の方法。
【００９６】
８２．  ＦＧＦ−１０が約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される、段落８１の方法。
【００９７】
８３．  上記培養物が約３日齢である場合に上記ＦＧＦファミリー増殖因子が供給される、段落７３の方法。
【００９８】
８４．  上記培養物にＢ２７を供給することをさらに包含する、段落７３の方法。
【００９９】
８５．  上記Ｂ２７が総培地の約０．１％〜約２０％の範囲の濃度で供給される、段落８４の方法。
【０１００】
８６．  Ｂ２７が総培地の約０．５％〜約２％の範囲の濃度で供給される、段落８５の方法。
【０１０１】
８７．  Ｂ２７が総培地の約０．５％の濃度で供給される、段落８６の方法。
【０１０２】
８８．  Ｂ２７が上記ＦＧＦファミリー増殖因子とほぼ同時に供給される、段落８４の
方法。
【０１０３】
８９．  上記培養物にヘッジホッグ阻害剤を供給することをさらに包含する、段落７３の方法。
【０１０４】
９０．  上記ヘッジホッグ阻害剤がＫＡＡＤ−シクロパミンであり、当該ＫＡＡＤ−シクロパミンが約０．１μＭ〜約５０μＭの濃度で供給される、段落８９の方法。
【０１０５】
９１．  ＫＡＡＤ−シクロパミンが約０．５μＭ〜約１０μＭの範囲の濃度で供給される、段落９０の方法。
【０１０６】
９２．  ＫＡＡＤ−シクロパミンが約０．５μＭの濃度で供給される、段落９１の方法。
【０１０７】
９３．  上記ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞がＣＭＲＬ培地中で増殖される、段落７３の方法。
【０１０８】
９４．  上記ＣＭＲＬ培地が約５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１０、約０．５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミン及び総培地の約０．５％のＢ２７を含む、段落９３の方法。
【０１０９】
９５．  上記ＣＭＲＬ培地がＲＡを欠く、段落９４の方法。
【０１１０】
９６．  上記ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程が多能性ヒト細胞を含む細胞集団を得ること、胚体内胚葉細胞への当該多能性細胞の分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を当該細胞集団に供給すること、そして胚体内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与えることを包含し、当該胚体内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中の胚体内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落７３の方法。
【０１１１】
９７．  段落７３の方法により産生されるＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞。
【０１１２】
９８．  ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する方法であって、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を産生するようにＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の集団中の細胞を分化させる工程であって、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、当該細胞集団中に存在する他の細胞型中では実質的に発現されない試薬を当該細胞集団に供給する工程、及び当該細胞集団中に存在する当該他の細胞型から、当該試薬と結合された当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を分離し、それによりＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する、分離する工程を包含する方法。
【０１１３】
９９．  上記マーカーがＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択される、段落９８の方法。
【０１１４】
１００．  上記マーカーがＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される、段落９８の方法。
【０１１５】
１０１．  分化させる工程がＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得ること、
ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でレチノイドを当該細胞集団に供給すること（当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である）、そしてＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与えることをさらに包含し、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中のＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落９８の方法。
【０１１６】
１０２．  供給する工程がＢ２７を供給することをさらに包含する、段落１０１の方法。
【０１１７】
１０３．  検出することが表４から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを包含する、段落１０１の方法。
【０１１８】
１０４．  上記細胞の少なくとも約９５％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落９８の方法。
【０１１９】
１０５．  上記細胞の少なくとも約９８％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落９８の方法。
【０１２０】
１０６．  上記試薬が抗体である、段落９８の方法。
【０１２１】
１０７．  上記抗体がＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４、ＸＰＲ１、ＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される細胞表面ポリペプチドに対する親和性を有する、段落１０６の方法。
【０１２２】
１０８．  段落９８の方法により産生されるＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の富化集団。
【０１２３】
１０９．  ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する方法であって、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を産生するようにＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の集団中の細胞を分化させる工程であって、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、当該細胞集団中に存在する他の細胞型中では実質的に発現されない試薬を当該細胞集団に供給する工程、及び当該細胞集団中に存在する当該他の細胞型から当該試薬と結合された当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を分離し、それによりＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する、分離する工程を包含する方法。
【０１２４】
１１０．  上記マーカーがＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される、段落１０９の方法。
【０１２５】
１１１．  分化させる工程がＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞集団を得ること、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞への当該ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でＦＧＦファミリー増殖因子を当該細胞集団に供給すること（当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である）、そ
してＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間を与えることをさらに包含し、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が形成されるのに十分な時間が当該細胞集団中のＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の存在を検出することにより確定される、段落１０９の方法。
【０１２６】
１１２．  供給する工程がＢ２７を供給することをさらに包含する、段落１１１の方法。
【０１２７】
１１３．  検出することが表３から選択される少なくとも１つのマーカーの発現を検出することを包含する、段落１１１の方法。
【０１２８】
１１４．  上記細胞の少なくとも約９５％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１０９の細胞集団。
【０１２９】
１１５．  上記細胞の少なくとも約９８％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１０９の細胞集団。
【０１３０】
１１６．  上記試薬が抗体である、段落１０９の方法。
【０１３１】
１１７．  上記抗体がＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択される細胞表面ポリペプチドに対する親和性を有する、段落１１６の方法。
【０１３２】
１１８．  段落１０９の方法により産生されるＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の富化集団。
【０１３３】
１１９．  ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する方法であって、多能性細胞の集団を得る工程であって、当該多能性細胞集団の少なくとも１つの細胞が表４から選択されるマーカー遺伝子のいずれか１つのプロモーターの制御下で核酸の少なくとも１つのコピーを含み、当該核酸は蛍光タンパク質をコードする配列又はその生物学的活性断片を含む工程、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を産生するように当該多能性細胞を分化させる工程であって、当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞は背側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、そして細胞集団中に存在する他の細胞型から当該ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を分離する工程を包含する方法。
【０１３４】
１２０．  上記富化細胞集団が少なくとも約９５％のＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を含む、段落１１９の方法。
【０１３５】
１２１．  上記富化細胞集団が少なくとも約９８％のＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を含む、段落１１９の方法。
【０１３６】
１２２．  分化させる工程がＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞への上記多能性細胞の分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を当該多能性細胞集団に供給すること、そしてＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞への当該ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でレチノイドを当該ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給することをさらに包含する、段落１１９の方法。
【０１３７】
１２３．  上記レチノイドがＲＡである、段落１２２の方法。
【０１３８】
１２４．  供給する工程がＢ２７を供給することをさらに包含する、段落１２３の方法
。
【０１３９】
１２５．  上記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、段落１１９の方法。
【０１４０】
１２６．  上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）により細胞集団中に存在する他の細胞型から分離される、段落１１９の方法。
【０１４１】
１２７．  段落１１９の方法により産生されるＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の富化集団。
【０１４２】
１２８．  ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する方法であって、多能性細胞の集団を得る工程であって、当該多能性細胞集団の少なくとも１つの細胞は表３から選択されるマーカー遺伝子のいずれか１つのプロモーターの制御下で核酸の少なくとも１つのコピーを含み、当該核酸は蛍光タンパク質をコードする配列又はその生物学的活性断片を含む工程、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を産生するように当該多能性細胞を分化させる工程であって、当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞は腹側膵芽の細胞に分化し得る複能性細胞である工程、そして非腹側偏向内胚葉細胞から当該ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を分離する工程を包含する方法。
【０１４３】
１２９．  上記富化細胞集団が少なくとも約９５％のＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む、段落１２８の方法。
【０１４４】
１３０．  上記富化細胞集団が少なくとも約９８％のＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む、段落１２８の方法。
【０１４５】
１３１．  分化させる工程がＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞への上記多能性細胞の分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの増殖因子を当該多能性細胞集団に供給すること、そしてＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進するのに十分な量でＦＧＦファミリー増殖因子を当該ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給することをさらに包含する、段落１２８の方法。
【０１４６】
１３２．  供給する工程がＢ２７を供給することをさらに包含する、段落１２８の方法。
【０１４７】
１３３．  上記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、段落１２８の方法。
【０１４８】
１３４．  上記ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）により細胞集団中に存在する他の細胞型から分離される、段落１２８の方法。
【０１４９】
１３５．  段落１２８の方法により産生されるＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の富化集団。
【０１５０】
１３６．  ヒト細胞を含む細胞集団中のヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る分化因子を同定する方法であって、ヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、当該細胞集団に候補分化因子を供給する工程、第１の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現を確定する工程、第２の時点での当該細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程であって、当該第２の時点は当該第１の時点の次に起こり、そして当該第２の時点は当該候補分化因子を当該細胞集団に供給することに続い
て起こる工程、そして当該第２の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現が当該第１の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現と比較した場合に増大又は低減されるかを判定する工程であって、当該細胞集団中の当該マーカーの発現の増大又は低減は当該候補分化因子がヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進し得ることを示す工程を包含する方法。
【０１５１】
１３７．  上記マーカーが表４から成る群から選択される、段落１３６の方法。
【０１５２】
１３８．  上記ヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約１０％を含む、段落１３６の方法。
【０１５３】
１３９．  ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして当該フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１３６の方法。
【０１５４】
１４０．  上記ヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約９０％を含む、段落１３６の方法。
【０１５５】
１４１．  上記ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして当該フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約９０％がＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１３６の方法。
【０１５６】
１４２.  上記ヒトＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉細胞が背側膵芽の細胞に分化し得る、段落１３６の方法。
【０１５７】
１４３．  上記ヒト胚体内胚葉細胞が上記候補分化因子に応答して膵臓前駆体細胞に分化する、段落１３６の方法。
【０１５８】
１４４．  上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団に供給することより前である、段落１３６の方法。
【０１５９】
１４５．  上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団に供給するのとほぼ同時である、段落１３６の方法。
【０１６０】
１４６．  上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団に供給することの後である、段落１３６の方法。
【０１６１】
１４７．  上記マーカーの発現が増大される、段落１３６の方法。
【０１６２】
１４８．  上記マーカーの発現が低減される、段落１３６の方法。
【０１６３】
１４９．  上記マーカーの発現が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される、段落１３６の方法。
【０１６４】
１５０．  上記マーカーの発現が、免疫細胞化学により確定される、段落１３６の方法。
【０１６５】
１５１．  上記分化因子が小分子を含む、段落１３６の方法。
【０１６６】
１５２．  上記分化因子がポリペプチドを含む、段落１３６の方法。
【０１６７】
１５３．  上記分化因子が増殖因子を含む、段落１３６の方法。
【０１６８】
１５４．  ヒト細胞を含む細胞集団中のヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進することができる分化因子を同定する方法であって、ヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞を含む細胞集団を得る工程、候補分化因子を当該細胞集団に供給する工程、第１の時点で当該細胞集団中のマーカーの発現を確定する工程、第２の時点で当該細胞集団中の同一マーカーの発現を確定する工程であって、当該第２の時点が当該第１の時点の後であり、当該第２の時点が当該細胞集団に当該候補分化因子を供給することの後である工程、そして当該第２の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現が、当該第１の時点での当該細胞集団中のマーカーの発現と比較して増大又は低減されているかを判定する工程であって、当該細胞集団中のマーカーの発現の増大又は低減は、当該候補分化因子が、当該ヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞の分化を促進することができることを示す工程を含む方法。
【０１６９】
１５５．  上記マーカーが表３から成る群から選択される、段落１５４の方法。
【０１７０】
１５６．  上記ヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約１０％を含む、段落１５４の方法。
【０１７１】
１５７．  ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして当該フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１５４の方法。
【０１７２】
１５８．  上記ヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が上記細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約９０％を含む、段落１５４の方法。
【０１７３】
１５９．  上記ヒトフィーダー細胞が上記細胞集団中に存在し、そして当該フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約９０％がＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞である、段落１５４の方法。
【０１７４】
１６０．  上記ヒトＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉細胞が腹側膵芽の細胞に分化し得る、段落１５４の方法。
【０１７５】
１６１．  上記ヒト胚体内胚葉細胞が、上記候補分化因子に応答して、膵臓前駆体細胞に分化する、段落１５４の方法。
【０１７６】
１６２．  上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団に供給することより前である、段落１５４の方法。
【０１７７】
１６３．  上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団に供給するのとほぼ同時である、段落１５４の方法。
【０１７８】
１６４．  上記第１の時点が、上記候補分化因子を上記細胞集団に供給することの後である、段落１５４の方法。
【０１７９】
１６５．  上記マーカーの発現が増大される、段落１５４の方法。
【０１８０】
１６６．  上記マーカーの発現が低減される、段落１５４の方法。
【０１８１】
１６７．  上記マーカーの発現が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される、段落１５４の方法。
【０１８２】
１６８．  上記マーカーの発現が、免疫細胞化学により確定される、段落１５４の方法。
【０１８３】
１６９．  上記分化因子が小分子を含む、段落１５４の方法。
【０１８４】
１７０．  上記分化因子がポリペプチドを含む、段落１５４の方法。
【０１８５】
１７１．  上記分化因子が増殖因子を含む、段落１５４の方法。
【０１８６】
上記の方法及び組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される細胞に関することが理解されよう。しかしながら上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途のために用いられ得る。
【０１８７】
本発明の付加的な実施の形態は、米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００３年１２月２３日出願）、米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）」、２００４年４月２７日出願）、米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年７月９日出願）、米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体（CHEMOKINE CELL SURFACE RECEPTOR FOR THE ISOLATION OF DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年７月１４日出願）、米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年１２月２３日出願）、及び米国特許出願第１１／１１５，８６８号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉（PDX1 EXPRESSING ENDODERM）」、２００５年４月２６日出願）、米国特許出願第１１／１６５，３０５号（表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法（METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERM）」、２００５年６月２３日出願）（これらの開示は参照により本明細書に完全に援用される）にも見出され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８８】
［詳細な説明］
原腸形成と呼ばれる初期ヒト発達におけるきわめて重大な段階は、受精後２〜３週間で起こる。原腸形成は、３つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に有意である（Lu他、2001；Schoenwolf and Smith, 2000）。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成に関与するが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及び他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成に関与する胚葉として定義される（Grapin-Botton and Melton, 2000；Kimelman and Griffin, 2000；Tremblay他、2000；Wells and Melton, 1999；Wells and Melton, 2000）。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側内胚葉部分及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質の形成に関与する。
【０１８９】
原腸形成中、胚体内胚葉形成のプロセスは、中内胚葉細胞（中胚葉又は内胚葉を形成するための細胞構成成分）が原始線条と呼ばれる構造を介して移動する細胞移動事象で開始する。胚体内胚葉は、線条の前部分を通して、そして結節（線条の最前領域での特殊化構
造）を通して移動する細胞に由来する。移動が起こると、胚体内胚葉はまず最前腸管に存在し、そして腸管の後端の形成に伴って終わる。
【０１９０】
発生中のＰＤＸ１遺伝子発現
ＰＤＸ１（ＳＴＦ−１、ＩＤＸ−１、ＩＰＦ−１、ＩＵＦ−１及びＧＳＦとも呼ばれる）は、膵臓及び吻側十二指腸の発生のために必要とされる転写因子である。ＰＤＸ１は、後前腸内胚葉から生じる膵臓性内胚葉中で最初に発現され、そしてマウスではＥ８．５から出発して、外分泌細胞及び内分泌細胞の両方を生じる。その後、ＰＤＸ１はベータ細胞及びいくつかのデルタ細胞に制限されるようになる。この発現パターンは、成人で保持される。ＰＤＸ１は、発生の早期に十二指腸製内胚葉で（形成中の膵臓に隣接する）、次に十二指腸性腸細胞並びに腸内分泌細胞、洞性胃で、並びに総胆管、胆嚢管及び胆管でも発現される。発現のこの領域も、膵臓発現が主に吻側十二指腸に制限されるようになる時点で、限定されるようになる。
【０１９１】
マウス及びヒトにおけるＰＤＸ１の標的化崩壊は、膵臓無形成を引き起こす（Jonsson,
J.他, Nature, 606-609, 1994；Offield, MF,他, Devel. 983-995, 1996；Stoffers, D.A.他 Nature Genetics, 106-110, 1997）。ＰＤＸ１は、インスリン及びソマトスタチン膵臓内分泌細胞の最終的分化中にも必要とされ、そしてヒトにおける単一対立遺伝子の機能的崩壊はＭＯＤＹ４型（青年の成人発症型糖尿病）及び後期開始ＩＩ型糖尿病の重症膵臓機能不全に関連する（Stoffers D.A.他, Nature Genetics 138-139, 1997）。
【０１９２】
膵臓の胚形成中、予定膵臓組織の出芽は原腸内胚葉の背側及び腹側で生じる。これらの突出は、前腸内胚葉の最後端で領域限定的に起こる。マウスでは、これは受精後約８．５〜９．５日目（ｄｐｃ）に、そしてヒトでは３０ｄｐｃに起こる。ヒトにおいては３５ｄｐｃまでに、背側芽及び腹側芽が成長し、分枝管系を発達させ、融合して、限定器官を形成する。ＰＤＸ１タンパク質は、早期膵芽が拡大し、そして管、腺房及び内分泌細胞を含む膵臓を構成する主細胞に分化するために必要とされる。
【０１９３】
腸管の反対側面上の位置、並びに脊索及び心臓性中胚葉とのそれぞれの関連のため、背側膵臓構造及び腹側膵臓構造に関する発生プログラムは明瞭に異なる。背側膵臓原基及び腹側膵臓原基の特殊化を制御する独自の発生プログラムに関して、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）から生成される胚体内胚葉（ＤＥ）培養から背側偏向及び腹側偏向ＰＤＸ１発現前腸内胚葉を産生するために、２つの別個の方法をわれわれは開発した。これらのＰＤＸ１発現（ＰＤＸ１陽性）前腸内胚葉細胞は、膵臓及び十二指腸上皮、並びに前胃粘膜の内分泌細胞に発生することに対して応答能を有する。
【０１９４】
本発明の態様は、胚体内胚葉細胞が、ＰＤＸ１発現（ＰＤＸ１陽性）前腸内胚葉細胞の少なくとも２つの区別可能な型に分化し得るという発見に関する。ＰＤＸ１の発現の前に、胚体内胚葉細胞はＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に分化し得るということもわれわれは発見した。これらのＰＤＸ１陰性細胞にレチノイド化合物、例えばレチノイン酸を供給することは、ＰＤＸ１の発現を誘導する。本発明の別の態様では、胚体内胚葉細胞は分化して、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成する。本明細書中で用いる場合、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に関しては、「背側」又は「背側偏向」とは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、背側膵芽のような前腸の後部分の背側由来の組織を生じ得るものであるということを意味する。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が一旦「背側偏向」になると、それは典型的には前腸の後部分の腹側由来の組織まで発生しない。別の態様では、胚体内胚葉細胞は、分化して、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成する。本明細書中で用いる場合、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に関して、「腹側」又は「腹側偏向」とは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が、肝臓及び腹側膵芽のような前腸の後部分の腹側由来の組織を生じ得るものであるということを意味する。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が一旦「腹側偏向」になると、それは典型
的には前腸の後部分の背側由来の組織まで発生しない。
【０１９５】
上記の発見にかんがみて、本発明の実施形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、背側偏向ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、腹側偏向ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の組成物、及び／又は背側偏向及び腹側偏向ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の混合物を含む組成物、並びにこのような組成物の産生方法に関する。本発明の他の実施形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の、このような細胞の分化を促進する因子に関するスクリーニングに関する。さらなる他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の背側、腹側又は混合集団を、このような細胞の分化を促進する因子に関してスクリーニングすることに関する。「混合集団」とは、有意量の背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及び腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の両方を含む細胞集団を意味する。
【０１９６】
本明細書中で用いる場合、ＦＧＦファミリー増殖因子としては、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２及び／又はＦＧＦ２３からなる群からから選択されるＦＧＦファミリー増殖因子であるが、これらに限定されない。
【０１９７】
本明細書中で用いる場合、ヘッジホッグ阻害剤としては、ＫＫＡＤ−シクロパミン、ＫＫＡＤ−シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路遮断抗体、並びに当業者に既知のヘッジホッグ経路機能のその他の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞及びそれに関連したプロセス
本発明の実施形態は、ＰＤＸ１陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、ＰＤＸ１陰性内胚葉細胞が腸管の前腸／中腸領域（ＰＤＸ１陰性前腸／中腸内胚葉）由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、３つの一次胚細胞株（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸／中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞（前腸／中腸接合部の細胞を含む）を指す。
【０１９９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の産生のためのプロセスに関する。いくつかの実施形態では、これらのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、腸管の前部分（ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉）由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞である。
【０２００】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の背側、腹側及び混合集団並びにそれに関連したプロセス
本発明の実施形態は、ＰＤＸ１陰性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞が腸管の前腸／中腸領域（ＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉）由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本発明の他の実施形態は、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の産生のための新規の確立したプロセスであって、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞が腸管の前腸／中腸領域（ＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉）由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞であるプロセスに関する。本明細書中で用いる場合、「複能性」又は「複能性細胞」とは、限定数の他の特定細胞型を生じ得るが、３つの一次胚細胞株（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）すべてを生じ得るわけではない細胞型を指す。本明細書中で用いる場合、「前腸／中腸」は、腸管の前部分の細胞並びに腸管の中央部分の細胞（前腸／中腸接合部の細胞を含む）を指す。いくつかの実施形態は、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は背側前腸内胚葉細胞である。他の実施形態では、ＰＤＸ１
陽性内胚葉細胞は腹側前腸内胚葉細胞である。
【０２０１】
本発明野いくつかの好ましい実施形態は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のためのプロセスに関する。いくつかの実施形態では、これらのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、腸管の前部分（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞である。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、背側前腸内胚葉細胞である。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は腹側前腸内胚葉細胞である。
【０２０２】
付加的な好ましい実施形態は、前腸の後部分のＰＤＸ１陽性内胚葉細胞の産生のためのプロセスに関する。いくつかの実施形態では、これらのＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、腸管の前腸領域の後部分由来の細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞である。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、背側膵芽の細胞のような前腸の後部分に由来する細胞、組織又は器官に分化し得る背側内胚葉細胞である。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞は、腹側膵芽の細胞のような前腸の後部分由来の細胞、組織又は器官に分化し得る腹側前腸内胚葉細胞である。
【０２０３】
背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、例えば本明細書中に記載される方法により産生されるものを用いて、完全分化インスリン産生β−細胞を産生し得る。本発明のいくつかの実施形態では、陽性背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を形成するよう、ＰＤＸ１を実質的に発現しない胚体内胚葉細胞（ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞、本明細書中では胚体内胚葉とも呼ばれる）を分化することにより、陽性背側及び／又は腹側ＰＤＸ１前腸内胚葉細胞は産生される。ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、本明細書中に記載されるような多能性細胞、例えば胚性幹細胞を分化することにより、或いは任意の他の既知の方法により、調製され得る。多能性細胞からＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を産生するための便利で且つ高効率的な方法は、米国特許第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年１２月２３日提出）（この記載内容は参照により本明細書中で完全に援用される）に記載されている。
【０２０４】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を産生するプロセスは、多能性細胞からの膵臓組織、例えば腺房細胞、管細胞及び島細胞の効率的産生のための基礎を提供する。或る特定の好ましい実施形態では、ヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ヒトＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に由来し、これは同様にｈＥＳＣに由来する。これらのヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は次に、機能性インスリン産生β細胞を産生するために用いられ得る。有用量のインスリン産生β細胞を得るために、膵島／β細胞運命に到達する前に起こる分化工程の各々に関して、分化の高効率性が望ましい。背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化は機能性膵島／β細胞の産生に向かう早期工程に相当するため（図１に示すように）、この工程での分化の高効率性が特に望ましい。
【０２０５】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の効率的分化の望ましさにかんがみて、本発明のいくつかの態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約２〜２５％の転換を生じるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明のいくつかの態様は、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約２６％から少なくとも約７５％の転換を生じるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。本発明の他の態様は、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の約２６％から少なくとも約７５％の転換を生じるｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。典型的には、上記の方法は、限定化及び一時的特定化方式での培養及び増殖因子の適用を包含する。ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞と特異的に結合する試薬を用いることによる集団中の他の細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の単離及び／
又は精製により達成され得る。代替的方法として、ＰＤＸ１発現の検出を可能にするために、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、レポーター遺伝子、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識され得る。このような蛍光標識細胞は次に、蛍光励起細胞選別器（ＦＡＣＳ）により精製され得る。本発明のさらなる態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団に、並びにＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのそしてそれからの分化に有用な因子を同定するための方法に関する。本発明の付加的態様は、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団に、並びに背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのそしてそれからの分化に有用な因子を同定するための方法に関する。本発明のさらなる他の態様は、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び富化細胞集団に、並びに腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのそしてそれからの分化に有用な因子を同定するための方法に関する。
【０２０６】
細胞培養物又は細胞集団中のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の量を確定するために、培養物中又は集団中の他の細胞からこの細胞型を区別する方法が望ましい。したがって本発明の或る特定の実施形態は、その存在、非存在及び／又は相対発現レベルがＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を示す細胞マーカーに、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、確定するための方法に関する。  本明細書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、及び材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の確定は、発現されるマーカーの相対量若しくは絶対量の検出、又は単にマーカーの存在若しくは非存在の検出のいずれかを指す。本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写体、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は小分子（例えば１０，０００ａｍｕ未満の分子量を有する分子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
本発明のいくつかの実施形態では、マーカーの存在、非存在及び／又は発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される。例えば或る特定の遺伝子マーカー、例えばＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１、ＮＦＭ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ホメオボックスＡ１３（ＨＯＸＡ１３）、ホメオボックスＣ６（ＨＯＸＣ６）、及び／又は本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写体の量が、定量的Ｑ−ＰＣＲにより確定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的割合を同定すると共に確定するために用いられる。いくつかの実施形態では、背側及び腹側の両方のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に共通であるマーカー、例えばＰＤＸ１、及び／又は表３から選択される1つ又は複数のマーカーは、Ｑ−ＰＣＲ及び／又は免疫組織化学により検出される。他の実施形態では、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるマーカー、例えば表４から選択される1つ又は複数のマーカーは、Ｑ−ＰＣＲ及び／又は免疫組織化学により検出される。
【０２０８】
本明細書中に記載される分化の方法及び検出の方法を使用することにより、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含むＰＤＸ１陽性前腸細胞を同定すること、並びに細胞培養物又は細胞集団中の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の比率を確定することが可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、産生される背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性細胞又は細胞集団よりも少なくとも約２桁大きいレベルでＰＤＸ１遺伝子を発現する。他の実施形態では、産生される背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性細胞又は細胞集団よりも２桁を超えるレベルでＰＤＸ１遺伝子を発現する。さらに他の実施形態では、産生される背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞
集団は、ＰＤＸ１胚体内胚葉細胞又は細胞集団よりも約２桁以上大きいレベルでＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択されるマーカーの１つ又は複数を発現する。さらに他の実施形態では、産生される背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞又は細胞集団よりおよそ２桁又は３桁以上大きいレベルで、表３から選択される１つ又は複数のマーカーを発現する。さらなる実施形態では、産生される背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞又は細胞集団よりおよそ２桁又は３桁以上大きいレベルで、表４から選択される１つ又は複数のマーカーを発現する。
【０２０９】
本明細書中に記載される組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性内胚葉を含むＰＤＸ１陽性内胚葉を含む細胞培養物及び細胞集団、並びにこのような細胞培養物及び細胞集団を産生する方法は、ヒト発達の初期の段階をモデリングするのに有用である。さらに、本明細書中に記載される組成物及び方法は、疾患状態、例えば真性糖尿病における治療的介入にも役立ち得る。例えばＰＤＸ１陽性前腸内胚葉は限られた数の組織の供給源として役立つため、純粋な組織又は細胞型の発達に用いられ得る。
【０２１０】
多能性細胞からのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（胚体内胚葉）の産生
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（「胚体内胚葉」とも呼ばれる）を先ず産生することにより、多能性細胞から産生される。胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に簡潔に、また米国特許第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉（DEFINITIVE ENDODERM）」、２００４年１２月２３日出願）（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）に詳細に記載されている。これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合体で始まり、発生した配偶子細胞以外には多能性又は全能性細胞を含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移入により得られる胚を指す。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。このような多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化無しで多能性状態で培養物中で維持されることができる。このような方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号及び同第６，２５１，６７１号に（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）記載されている。
【０２１１】
胚体内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に保持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に保持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられるフィーダー層のうちの１つは、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（米国特許出願第２００２／００７２１１７号（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）参照）。胚体内胚葉を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの保持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの保持方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）に記載されている。
【０２１２】
本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しないかのいず
れかの培養物中に保持され得る。いくつかの胚性幹細胞保持手法では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）に記載される技法が用いられる。
【０２１３】
幹細胞は、それらが胚体内胚葉へ分化されることを要するまで、日常的処理により多能性状態で培養物中で維持される。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子を幹細胞培養物へ供給することにより達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子は、ノーダル／アクチビン又はＢＭＰサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、増殖因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４から成る群から選択される。さらに、増殖因子Ｗｎｔ３ａ及び他のＷｎｔファミリー成員は、胚体内胚葉細胞の産生に有用である。或る特定の分化プロセスでは、上述の増殖因子のいずれかの組合せが使用され得る。
【０２１４】
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、胚体内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で増殖因子が培養物中に存在するように、上記増殖因子が細胞に供給される。いくつかのプロセスでは、上記増殖因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
【０２１５】
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の増殖因子は、それらの添加後、細胞培養物から除去される。例えば増殖因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、又は約１０日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、増殖因子は、それらの添加後約４日で除去される。
【０２１６】
胚体内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清の培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、又は約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いて増殖される。さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。
【０２１７】
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（胚体内胚葉）への多能性細胞の分化のモニタリング
胚体内胚葉へのｈＥＳＣ培養の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には或る特定
のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野で既知である。マーカー遺伝子発現を定量するために、当該技術分野で既知である他の方法も用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意な発現の欠如が確定される。
【０２１８】
以下の実施例でさらに記載するように、胚体内胚葉の信頼性の大きいマーカーは、ＳＯＸ１７遺伝子である。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現し、それによりＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１である。胚体内胚葉細胞は、原始内胚葉及び臓側内胚葉の特徴であるＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する（表１を参照）ため、いくつかのプロセスでは、ＳＯＸ１７及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされる。他のプロセスでは、ｈＥＳＣに特有のＳＯＸ１７マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。
【０２１９】
胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、細胞表面ケモカイン受容体をコードし、そのリガンドは、化学誘引物質ＳＤＦ−１である。成体におけるＣＸＣＲ４受容体保有細胞の主要な役割は、骨髄への造血細胞の遊走、リンパ球輸送並びに様々なＢ細胞及びマクロファージ血液細胞系統の分化であると考えられる［Kim, C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］。ＣＸＣＲ４受容体はまた、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の進入のための共受容体として機能する［Feng, Y.他, Science, 272, 872-877 (1996)］。［McGrath, K.E.他, Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］により実施される広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びその特有のリガンドであるＳＤＦ−１［Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］の発現は、マウスにおいて初期発達及び成体期中に示された。発達におけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで崩壊される［Nagasawa他, Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q.他, Immunmity, 10, 463-471 (1999)］場合、それが後期胚致死性をもたらしたことが実証された際に明らかとなってきた。McGrath他は、ＣＸＣＲ４は、ＲＮアーゼ保護及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸形成胚（Ｅ７．５）中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡであることを実証した。原腸形成胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞を遊走することに主に関与されるようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。Ｅ７．２−７．８マウス胚では、ＣＸＣＲ４及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している［McGrath, K.E.他, Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］。
【０２２０】
多能性細胞を分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、胚体内胚葉細胞の産生を追跡するために、ＣＸＣＲ４の発現をモニタリングすることができる。さらに、本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１を包含する胚体内胚葉
の他のマーカーを発現するが、これらに限定されない。胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされ得る。他のプロセスでは、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。
【０２２１】
内胚葉細胞におけるＣＸＣＲ４の発現は、ＳＯＸ１７の発現を妨げないことが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４を大いに発現するが、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ又はＰＤＸ１を大いには発現しない。
【０２２２】
胚体内胚葉の富化、単離及び／又は精製
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び／又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上に実質的に存在するマーカー分子（例えば、ポリペプチド）に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインＳＤＦ−１又はＳＤＦ−１に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。このような分子としては、ＳＤＦ−１フラグメント、ＳＤＦ−１融合体又はＳＤＦ−１擬似体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
抗体を作製し、また細胞単離のためにそれらを使用する方法は当該技術分野で既知であり、このような方法は、本明細書中に記載する抗体及び胚体内胚葉細胞を用いた使用に実施することができる。一プロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体を磁気ビーズへ結合させた後、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物において胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズと結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界へ細胞／抗体／ビーズ複合体を暴露させる。いったん胚体内胚葉細胞が培養物において他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は崩壊されて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度平板培養される。
【０２２４】
富化、単離又は精製された胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団を得るためのさらなる方法もまた使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ４抗体を、細胞間接着及び基材接着を低減させるように処理した胚体内胚葉含有細胞培養物とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を、一次抗体に結合することが可能な二次抗体（例えば、ＦＩＴＣ結合抗体）とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、緩衝液中に再懸濁させる。次に、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞懸濁液を分析及び選別する。ＣＸＣＲ４陽性細胞を、ＣＸＣＲ４陰性細胞と分離して回収して、それによりこのような細胞型の単離をもたらす。望ましい場合、単離細胞組成物は、代替的な親和性ベースの方法を使用することにより、或いは胚体内胚葉に特異的な同じか、又は異なるマーカーを使用したさらなる一連の選別によりさらに精製することができる。
【０２２５】
さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンド又は他の分子を使用して、富化、単離及び／又は精製される。いくつかのプロセスでは、分子はＳＤＦ−１又はそれらのフラグメント、融合体又は擬似体である。
【０２２６】
好ましいプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が胚体内胚葉系統へと分化するように誘導された後、他の非胚体内胚葉細胞から富化、単離及び／又は精製される。上述の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階でこのような培養物を用いて使用することができることが理解されよう。
【０２２７】
直ぐ上で記載された手法に加えて、胚体内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の選択的生存又は選択的拡大を促す増殖条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。
【０２２８】
本明細書中に記載する方法を使用して、胚体内胚葉細胞及び／又は組織の富化、単離及び／又は精製された集団は、少なくともいくつかの分化を受けた多能性細胞培養物又は細胞集団（例えば、幹細胞培養物又は細胞集団）からｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。いくつかの方法では、細胞は、無作為な分化を受ける。しかしながら、好ましい方法では、細胞は、主として胚体内胚葉へ分化するように誘導される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生に関する。本明細書中に記載する方法を使用して、細胞集団又は細胞培養物は、未処理の細胞集団又は細胞培養物と比較した場合、少なくとも約２〜約１０００倍、胚体内胚葉含有量が富化され得る。
【０２２９】
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉（胚体内胚葉）を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉に富んだ細胞集団が挙げられる。例えば、培養物中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞増殖条件、増殖因子濃度及び培養工程の時機（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手法は、胚体内胚葉への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばＣＸＣＲ４受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。
【０２３０】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の産生
胚体内胚葉細胞は、これらの細胞のさらなる分化により膵臓分化に向けて特殊化されて、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を産生し得る。本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかでは、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物並びに富化又は精製された細胞集団は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団へのさらなる分化のために用いられ得る。
【０２３１】
典型的には、胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団中でのＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達を低減するか又は排除することにより、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞に分化される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達を低減すること又は排除することは、外因的に添加されるＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子、例えばアクチビンＡを胚体内胚葉の細胞培養物又は細胞集団から希釈するか又は除去することにより媒介される。他の実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達は、フォリスタチン及び／又はノギンのようなＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達を遮断する化合物を胚体内胚葉細胞に供給することにより、低減されるか又は排除される。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達は、胚体内胚葉細胞へのヒ
ト多能性細胞の分化後、約１日間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日又は１０日超の間、低減されるか又は排除され得る。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、前腸内胚葉細胞への胚体内胚葉細胞の分化は、ＦＧＦファミリー増殖因子及び／又はヘッジホッグ経路阻害剤を胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団に供給することにより増強される。このような実施形態では、ＦＧＦファミリー増殖因子及び／又はヘッジホッグ経路阻害剤が、胚体内胚葉細胞培養物中でのＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達を低減し又は排除した後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日又は１０日超で供給される。好ましい実施形態では、ＦＧＦファミリー増殖因子及び／又はヘッジホッグ経路阻害剤は、胚体内胚葉細胞培養物中でのＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達を低減し又は排除することとほぼ同時に供給される。
【０２３３】
好ましい実施形態において、胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団に対して供給されるＦＧＦファミリーの増殖因子は、ＦＧＦ１０及び／又はＦＧＦ７である。しかし、他のＦＧＦファミリーの増殖因子又はＦＧＦファミリーの増殖因子類似体若しくは模倣体が、ＦＧＦ１０及び／又はＦＧＦ７の代わりに、又はそれらに加えて供給され得ることが理解されよう。例えば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２及び／又はＦＧＦ２３から成る群から選択されるＦＧＦファミリーの増殖因子が供給され得る。このような実施形態では、ＦＧＦファミリーの増殖因子及び／又はＦＧＦファミリーの増殖因子類似体若しくは模倣体が、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞に供給される。
【０２３４】
他の好ましい実施形態において、ヘッジホッグ阻害因子はＫＡＡＤ−シクロパミンである。しかし、他のヘッジホッグ阻害因子を用いることができることが理解されよう。このような阻害因子としては、ＫＫＡＤ−シクロパミン類似体、ジェルビン、ジェルビン類似体、ヘッジホッグ経路阻害抗体及び当業者に既知のヘッジホッグ経路機能の任意の他の阻害因子が挙げられるが、これらに限定されない。単独で、又はＦＧＦファミリーの増殖因子と共に用いられる場合、ヘッジホッグ阻害因子は、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４ μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２ μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ又は少なくとも約５０μＭの濃度で供給され得る。
【０２３５】
胚体内胚葉細胞からのＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の集団の産生のための好ましい一プ
ロセスでは、ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達は、胚体内胚葉へのヒト多能性細胞の大部分の分化後（例えば、以下の実施例に記載されるように３日、４又は５日間の分化プロトコール後）、約２日間低減されるか又は排除される。ほぼ同時に、胚体内胚葉細胞の細胞培養物又は細胞集団に、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１０及び０．２μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンを供給する。
【０２３６】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清の培地中で分化及びさらに成長させることができる。血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、血清代替物を用いて増殖させる。例えば、或る特定の実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。本明細書中に記載された或る特定のプロセスでは、分化の培地は、血清、又は血清代替物又はインスリン若しくはインスリン様増殖因子を含む任意のサプリメントを含まない。
【０２３７】
或る特定のプロセスでは、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、Ｂ２７の存在下で成長させる。このような分化プロセスでは、Ｂ２７は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、或いは約２０％（ｖ／ｖ）を上回る濃度で、培養培地へ供給され得る。或る特定のプロセスでは、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）である。或いは、添加するＢ２７サプリメントの濃度は、市販のＢ２７ストック溶液の濃度の倍数単位で調整され得る。例えば、Ｂ２７は、５０倍ストック溶液としてInvitrogen(Carlsbad,
CA)から入手可能である。十分な容量の成長培地へこのストック溶液を十分量添加することにより、所望の量のＢ２７を補充した培地が生じる。例えば、成長培地９０ｍｌへ５０倍Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを添加することにより、５倍Ｂ２７を補充した成長培地が生じる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１倍、約０．２倍、約０．３倍、約０．４倍、約０．５倍、約０．６倍、約０．７倍、約０．８倍、約０．９倍、約１倍、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍及び約２０倍以上であり得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、レチノイド酸（ＲＡ）等のレチノイドを含む培地に細胞を接触させることによるか、又はさもなければ細胞に供給することにより、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞をＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へとさらに分化させ得る。いくつかの実施形態では、レチノイドは、レチノイドが少なくとも約１nＭ、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくと
も約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ又は少なくとも約５０μＭの濃度で存在するように、細胞培養物の細胞へ供給される。このような実施形態では、レチノイドは、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日又は約１０日超で細胞に供給され、その後胚体内胚葉細胞培養物でのＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達が低滅又は除かれる。好ましい実施形態では、約０．０５μＭ  ＲＡ〜約２μＭ  ＲＡが、約２〜３日、ＰＤＸ−１陰性前腸内胚葉細胞培養物に供給され、その後ＴＧＦβスーパーファミリー増殖因子シグナル伝達が低滅又は除去される。
【０２３９】
本明細書中に記載される分化プロセスでは、上記の分化因子が細胞培養物から除去され、その後それを添加することができる。例えば、上記の分化因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去され得る。
【０２４０】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化のモニタリング
ＨＮＦ１ｂ及び／又はＦＯＸＡ１の発現、並びにＰＤＸ１の発現の欠如は、Ｑ−ＰＣＲ及び／又は免疫細胞化学のような上記の方法を用いて検出され及び／又は定量されて、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングする。上記のマーカーのほかに、本発明のいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７の発現も確定される。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載する方法により産生されるＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１又はＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含まない。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載するプロセスにより産生されるＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞培養物は、臓側内胚葉、壁側内胚葉及び／又は神経細胞を実質的に含まない。
【０２４２】
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を含む組成物
本発明のいくつかの実施形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような細胞組成物に関し、ここでＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞は、腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官へ分化することができる多分化能細胞である。或る特定の実施形態によれば、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉は哺乳類細胞であり、好ましい実施形態では、そのような細胞はヒト細胞である。
【０２４３】
本明細書中に記載する他の実施形態は、ｈＥＳＣ、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞及び中胚葉細胞から成る群から選択される１つ又は複数の細胞型の細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関する。いくつかの実施形態では、ｈＥＳＣは、培養物において総細胞の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満を構成する。他の実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、培養物において総細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満を構成する。さらなる他の実施形態では、中胚葉細
胞は、培養物において総細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満を構成する。
【０２４４】
本発明のさらなる実施形態は、主要細胞型としてＰＤＸ１陰性前腸内胚葉を含む本明細書中に記載するプロセスにより産生される細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載するプロセスは、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％又は少なくとも約５０％のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞から成る。他の実施形態では、本明細書中に記載するプロセスは、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも６％、少なくとも５％、少なくとも４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％又は少なくとも約１％のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞から成る。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞のパーセントは、培養物中に存在するフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０２４５】
本発明のさらに他の実施形態は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞及びＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の混合物を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関する。例えば、約９５のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態では、約５のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約９５のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。さらに、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して他の比率のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団も意図される。例えば、約１，０００，０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１００，０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１０，０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約５００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性
前腸内胚葉細胞、約１０個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約５個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約４個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約２個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約２個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約４個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約２０個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５０個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１００個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０００個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０，０００個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞、１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１００，０００個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞及び約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１，０００，０００個のＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む組成物が意図される。
【０２４６】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞が産生されるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ヒト多能性幹細胞のようなヒト多能性細胞に由来する。或る特定の実施形態では、ヒト多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する。或る特定の他の実施形態では、ヒト多能性細胞は、胚期を過ぎて発達した多細胞構造の生殖腺組織又は胚組織に由来する。
【０２４７】
本発明のさらなる実施形態は、ヒトＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を包含するヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７、ＨＮＦ１ｂ及び／又はＦＯＸＡ１マーカーの発現は、少なくとも約２％のヒト細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１ｂ及び／又はＦＯＸＡ１マーカーの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞において、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９８％のヒト細胞において、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセント（ここで、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１ｂ及び／又はＦＯＸＡ１マーカーの発現は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも多い）は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０２４８】
本発明のいくつかの実施形態は、ヒトＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７、ＨＮＦ１ｂ及び／又はＦＯＸＡ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約２％〜少なくとも約９８％を上回るヒト細胞において、ＰＤＸ１マーカーの発現よりも多いことが理解
されよう。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１ｂ及び／又はＦＯＸＡ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞において、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９８％のヒト細胞において、ＰＤＸ１マーカーの発現よりも多い。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセント（ここで、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１ｂ及び／又はＦＯＸＡ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、ＰＤＸ１マーカーの発現よりも多い）は、フィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０２４９】
本明細書中に記載されるプロセスを用いて、他の細胞型を実質的に含有しないＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。細胞培養物中又は細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という用語は、その細胞培養物又は細胞集団が含有しない特定の細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在するということを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生されるＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。
【０２５０】
本発明の一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づくＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞の記述は、ＳＯＸ１７高、ＨＮＦ１ｂ高、ＦＯＸＡ１高、ＰＤＸ１低、ＡＦＰ低、ＳＯＸ７低、ＳＯＸ１低、ＺＩＣ１低且つＮＦＭ低である。
【０２５１】
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からの直接的なＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生
本明細書中に記載されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含むＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞から産生される。好ましい方法は、出発物質としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、ｈＥＳＣは先ずＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生のための出発物質は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解されたい。むしろ、任意のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞が、それらの起源と関係なく、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
【０２５２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団へのさらなる分化のために用いられ得る。例えばヒトＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、前の分化工程（即ち、多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化する工程）から残存している分化因子、例えばアクチビン、ノダル及び／又はＢＭＰも含む。他の実施形態では、前の分化工程で利用された因子を細胞培養物又は細胞集団から除去した後、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞の分化のために用いられる因子を添加する。他の実施形態では、ＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のための供給源として用いられる。
【０２５３】
培養中のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への細胞の分化を促進する分化因子（前腸分化因子）をＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給することにより、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞に分化される。本発明のいくつかの実施形態では、前腸分化因子は、レチノイド、例えばレチノイン酸（ＲＡ）である。いくつかの実施形態では、レチノイドは線維芽細胞増殖因子、例えばＦＧＦ−４又はＦＧＦ−１０と一緒に用いられる。他の実施形態では、レチノイドは、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの成員及び／又は馴化培地と一緒に用いられる。
【０２５４】
「馴化培地」とは、基本培地と比較して変更される培地を意味する。例えば培地の状態調節は、栄養素及び／又は増殖因子のような分子を、基本培地中の元のレベルから増やすか又は減じる。いくつかの実施形態では、一定期間、或る特定の条件下で或る型の細胞を増殖させるか又は保持させることにより、培地は状態調節される。例えば培地は、限定数の時間、限定温度で、限定組成物の培地中にｈＥＳＣを拡張させ、分化させ又は保持させることにより状態調節され得る。当業者に理解されるように、細胞、培地型、持続時間及び環境条件の多数の組合せを用いて、ほぼ無限大数の馴化培地を生成し得る。本発明のいくつかの実施形態では、約１％〜約２０％の血清濃度を含む培地中で分化多能性細胞を増殖させるか又は保持させることにより、培地は状態調節される。他の実施形態では、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む培地中で分化多能性細胞を増殖させるか又は保持させることにより、培地は状態調節される。さらに他の実施形態では、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４を含む培地中で分化多能性細胞を増殖させるか又は保持させることにより、培地は状態調節される。好ましい実施形態では、約２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び約２μＭのＲＡを含むＲＰＭＩのような培地中で２４時間、分化ｈＥＳＣを増殖させるか又は保持させることにより、馴化培地は調製される。
【０２５５】
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化を増強するために用いられる培地を状態調節するために用いられる細胞は、約０％〜約２０％の血清及び／又はＴＧＦβスーパーファミリーの１つ又は複数の増殖／分化因子を含むＲＰＭＩのような培地中で約５日間に亘って、ｈＥＳＣのような多能性細胞から分化される細胞である。分化因子、例えばアクチビンＡ及びＢＭＰ４は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で供給される。本発明の或る特定の実施形態では、培地を状態調節するために用いられる細胞は、低血清ＲＰＭＩ中で約５日間に亘って、ｈＥＳＣから分化される。いくつかの実施形態によれば、低血清ＲＰＭＩとは、低血清含有培地を指し、この場合、血清濃度は限定期間に亘って漸次増大される。例えば一実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、細胞増殖の第１日目に約０．２％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、細胞増殖の第２日目に約０．５％ＦＢＳ、そして細胞増殖の第５日目に約２％ＦＢＳを含む。別の実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、１日目に約０％、２日目に約０．２％、３〜６日目に約２％の濃度を含む。或る特定の好ましい実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、１つ又は複数の分化因子、例えばアクチビンＡ及びＢＭＰ４を供給される。培地を状態調節するために用いられる細胞を調製するに際しての使用のほかに、低血清ＲＰＭＩは、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化のための培地として用いられ得る。
【０２５６】
馴化培地はＲＰＭＩ以外の培地から調製され得るが、但し、このような培地はＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の増殖又は保持を妨げないと当業者に理解される。培地を状態調節するために用いられる細胞は種々の型のものであり得るということも理解される。新たに分化された細胞が培地を状態調節するために用いられる実施形態では、このような細胞はＲＰＭＩ以外の培地中で分化され得るが、但し、培地はこのような細胞の増殖又は保持を阻害しない。さらに、本明細書中に報告される作用を達成するためには他の時間で十分であるので、状態調節期間も状態調節のために用いられる細胞の調製期間も、それぞれ２４時
間又は５日である必要はないと当業者は理解する。
【０２５７】
概して、線維芽細胞増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの成員、馴化培地、又は任意のこれらの前腸分化因子の組合せと組合せたレチノイドの使用は、レチノイド単独より大きな、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を引き起こす。好ましい実施形態では、ＲＡ及びＦＧＦ−１０はともに、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物に供給される。別の好ましい実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、馴化培地、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＲＡを含む培養中で分化される。
【０２５８】
本明細書中に記載される分化プロセスの実施形態のうちのいくつかに関して、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度で上記の前腸分化因子が細胞培養物又は細胞集団中に存在するよう、これらの因子は細胞に供給される。細胞培養物及び／又は細胞集団に関して用いられる場合、「一部」という用語は、単一細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲で、任意のゼロ以外の量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。
【０２５９】
本発明のいくつかの実施形態において、レチノイドは、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９ μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ又は少なくとも約５０μＭの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。本明細書で用いられるように、「レチノイド」は、レチノール、レチナール又はレチノイン酸、及び任意のこれらの化合物の誘導体を表す。好ましい実施形態では、レチノイドはレチノイン酸である。
【０２６０】
本発明の他の実施形態では、線維芽細胞増殖因子ファミリーの１つ又は複数の分化因子は、細胞培養物中に存在する。例えばいくつかの実施形態では、ＦＧＦ−４は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物中に存在し得る。本発明のさらなる実施形態では、ＦＧＦ−１０は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物中に存在し得る。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ−１０のいずれか（しかし両方ではない）は、ＲＡと一緒に細胞培養物に供給される。好ましい実施形態では、ＲＡは１μＭの濃度で細胞培養物中に存在し、そしてＦＧＦ−１０は５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【０２６１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの増殖因子及び／又は
馴化培地が細胞培養物中に存在する。これらの分化因子は、ＲＡ及び／又はその他に中−前腸分化因子、例えばＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０（これらに限定されない）と組合せて用いられ得る。例えばいくつかの実施形態では、アクチビンＡ及び／又はアクチビンＢは、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物中に存在し得る。本発明のさらなる実施形態では、馴化培地は、全培地の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％の濃度で細胞培養物中に存在する。いくつかの実施形態では、アクチビンＡ、アクチビンＢ及び馴化培地がＲＡとともに細胞培地に供給される。好ましい実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、約１μＭのＲＡ、約２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ並びに分化ｈＥＳＣにより約２４時間状態調節された低血清ＲＰＭＩ培地を含む培養中でＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化されるが、この場合、分化ｈＥＳＣは約１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含む低血清ＲＰＭＩ中で約５日間分化されている。別の好ましい実施形態では、アクチビンＢ及び／又はＦＧＦ−１０はさらにまた、それぞれ２５ｎｇ／ｍｌ及び５０ｎｇ／ｍｌで培養中に存在する。
【０２６２】
本発明の或る特定の実施形態では、上記の前腸分化因子は、それらの添加後、細胞培養物から除去される。例えば前腸分化因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去され得る。
【０２６３】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の培養は、低減された血清を含有する培地中で増殖され得る。血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替品で増殖される。例えば、或る特定の実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は血清を用いずに増殖される。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は血清代替品で増殖される。
【０２６４】
さらなる他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このような実施形態では、Ｂ２７は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、又は約２０％（ｖ／ｖ）より大きい濃度で、培地に供給され得る。或る特定の実施形態では、培地中のB２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）である。代替的には、添加するＢ２７サプリメントの濃度を、市販のＢ２７ストック溶液の濃度の位数単位で調整することができる。例えば、Ｂ２７は５０倍ストック溶液としてInvitrogen（Carlsbad, CA）で市販されている。このストック溶液を十分量、十分量の成長培地に添加するこ
とで、所望量のＢ２７を添加した培地が作られる。例えば、５０倍Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに加えることで、５倍Ｂ２７を添加した成長培地が作られる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１倍、約０．２倍、約０．３倍、約０．４倍、約０．５倍、約０．６倍、約０．７倍、約０．８倍、約０．９倍、約１倍、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍及び約２０倍超であり得る。
【０２６５】
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からの背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生
本明細書中に記載される背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、ｈＥＳＣは先ずＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
【０２６６】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の混合集団の産生に関連して記載される場合、本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団は、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団へのさらなる分化のために用いられ得る。例えばヒトＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、前の分化工程（即ち、多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化する工程）から残存している分化因子、例えばアクチビン、ノダル及び／又はＢＭＰも含み得る。他の実施形態では、前の分化工程で利用された因子を細胞培養物又は細胞集団から除去した後、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞の分化のために用いられる因子を添加する。他の実施形態では、ＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のための供給源として用いられる。
【０２６７】
培養物中のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物にレチノイド、例えばレチノイン酸（ＲＡ）を供給することにより、背側ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞に分化される。いくつかの実施形態では、レチノイドは、増殖因子のＴＧＦβスーパーファミリーの一成員及び／又はConnaught Medical Research Labs培地（ＣＭＲＬ培地）（Invitrogen, Carlsbad, CA）と一緒に用いられる。
【０２６８】
本明細書中に記載される分化プロセスの実施形態のいくつかに関して、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度でこれらの因子が細胞培養物又は細胞集団中に存在するよう、ＲＡ又は上記の分化因子の組合せが細胞に供給される。細胞培養物及び／又は細胞集団に関して用いられる場合、「一部」という用語は、単一細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲で、任意のゼロ以外の量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。好ましい実施形態において、「一部」という用語は、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０
％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％又は少なくとも７５％の細胞培養物又は細胞集団を意味する。
【０２６９】
本発明のいくつかの実施形態において、レチノイドは、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ又は少なくとも約５０μＭの濃度で存在するように細胞培養物の細胞に供給される。
【０２７０】
本発明の好ましい実施形態では、背側偏向ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の一集団は、外因性ＦＧＦ−１０又は他のＦＧＦファミリー増殖因子の非存在下でレチノイン酸を供給することにより産生される。このような実施形態では、ＲＡは約２μＭの濃度で供給される。好ましい実施形態では、ＲＡはＣＭＲＬ培地中に約２μＭの濃度で供給される。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、アクチビンＡ及び／又はアクチビンＢは、ＲＡとともに細胞培養物に供給される。例えばいくつかの実施形態では、ＲＡは約２μＭの濃度で細胞培養物に供給され、そしてアクチビンＡ及び／又はアクチビンＢは、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に供給される。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、分化因子及び／又はＣＲＭＬ培地は、ｈＥＳＣからの分化の開始後、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、或いは約１０日超で、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給される。好ましい実施形態では、分化因子及び／又はＣＲＭＬ培地は、ｈＥＳＣからの分化の開始後約５日目にＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給される。
【０２７３】
本発明の或る特定の実施形態では、上記の分化因子は、それらの添加後に細胞培養物か
ら除去される。例えば上記の分化因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去され得る。
【０２７４】
背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の培養物は、低減された血清を含有する培地中で増殖され得る。血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替品で増殖される。例えば、或る特定の実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかの実施形態では、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は血清を用いずに増殖される。他の実施形態では、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は血清代替品で増殖される。
【０２７５】
さらなる他の実施形態では、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このような実施形態では、Ｂ２７は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、又は約２０％（ｖ／ｖ）より大きい濃度で、培地に供給され得る。或る特定の実施形態において、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）である。代替的には、添加するＢ２７サプリメントの濃度を、市販のＢ２７ストック溶液の濃度の倍数単位で調整することができる。例えば、Ｂ２７は５０×ストック溶液としてInvitrogen（Carlsbad, CA）で市販されている。このストック溶液を十分量、十分量の成長培地に添加することで、所望量のＢ２７を添加した培地が作られる。例えば、５０×Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに加えることで、５倍Ｂ２７を補充した成長培地が作られる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１倍、約０．２倍、約０．３倍、約０．４倍、約０．５倍、約０．６倍、約０．７倍、約０．８倍、約０．９倍、約１倍、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍及び約２０倍超であり得る。
【０２７６】
ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉からの腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生
本明細書中に記載される腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物及び細胞集団は、上記のような多能性細胞から生じるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉から産生される。さらに、上記のように、好ましい方法は出発材料としてヒト胚性幹細胞を利用する。一実施形態では、ｈＥＳＣは先ずＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に転換され、これは次に、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に転換される。しかしながら、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のための出発材料は、多能性細胞分化方法を用いて産生される胚体内胚葉細胞に限定されないと理解される。むしろ、任意のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、それらの起源にかかわらず、本明細書中に記載される方法に用いられ得る。
【０２７７】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の混合集団の産生に関連して記載される場合、本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団は、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は富化細胞集団へのさらなる分化のために用いられ得る。例えばヒトＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が用いられ得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、前の分化工程（即ち、多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化する工程）から残存している分化因子、例えばアクチビン、ノダル及び／又はＢＭＰも含み得る。他の実施形態では、前の分化工程で利用された因子を細胞培養物又は細胞集団から除去した後、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞の分化のために用いられる因子を添加する。他の実施形態では、ＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の産生のための供給源として用いられる。
【０２７８】
培養物中のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７−陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物にＦＧＦファミリー増殖因子或いはＦＧＦファミリー増殖因子類似体又は模倣物を供給することにより、腹側ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞に分化される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦファミリー増殖因子或いはＦＧＦファミリー増殖因子類似体又は模倣物は、ヘッジホッグ阻害剤及び／又はConnaught Medical Research Labs培地（ＣＲＭＬ培地）（Invitrogen, Carlsbad, CA）と一緒に用いられる。特に好ましい実施形態では、ＦＧＦ−１０及び／又はＫＡＡＤ−シクロパミンは、ＲＡ又は他のレチノイドの非存在下でＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に供給される。或る特定の実施形態では、ＢＭＰ４は、ＲＡ又は他のレチノイドの非存在下でＦＧＦ−１０及び／又はＫＡＡＤ−シクロパミン中に含まれ得る。ＦＧＦファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び／又はヘッジホッグ阻害剤の添加後約１日〜約１０日後、レチノイド、例えばＲＡ、又はレチノイド含有サプリメント、例えばＢ２７が供給されて、ＰＤＸ１の発現を誘導する。好ましい実施形態では、ＲＡは、ＦＧＦファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び／又はヘッジホッグ阻害剤の添加後約２日、約３日、約４日又は約５日目に供給される。他の実施形態では、Ｂ２７は、ＦＧＦファミリー増殖因子類似体又は模倣物及び／又はヘッジホッグ阻害剤を供給するのとほぼ同時に供給される。
【０２７９】
本明細書中に記載される分化プロセスの実施形態のいくつかに関して、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団の少なくとも一部の分化を促進するのに十分な濃度でこれらの因子が細胞培養物又は細胞集団中に存在するよう、レチノイド並びに上記の分化因子の組合せが細胞に供給される。細胞培養物及び／又は細胞集団に関して用いられる場合、「一部」という用語は、単一細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲で、任意のゼロ以外の量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。好ましい実施形態において、「一部」という用語は、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４
％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％又は少なくとも７５％の細胞培養物又は細胞集団を意味する。
【０２８０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＦＧＦファミリー増殖因子或いはＦＧＦファミリー増殖因子類似体又は模倣物は、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、又は少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在するよう、細胞培養物の細胞に供給される。他の実施形態では、単独で、又はＦＧＦ−１０と共に用いられる場合、ＫＡＡＤ−シクロパミンは、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．０２μＭ、少なくとも約０．０４ μＭ、少なくとも約０．０８μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約０．２μＭ、少なくとも約０．３μＭ、少なくとも約０．４μＭ、少なくとも約０．５μＭ、少なくとも約０．６μＭ、少なくとも約０．７μＭ、少なくとも約０．８μＭ、少なくとも約０．９μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約１．１μＭ、少なくとも約１．２ μＭ、少なくとも約１．３μＭ、少なくとも約１．４μＭ、少なくとも約１．５μＭ、少なくとも約１．６μＭ、少なくとも約１．７μＭ、少なくとも約１．８μＭ、少なくとも約１．９μＭ、少なくとも約２μＭ、少なくとも約２．１μＭ、少なくとも約２．２μＭ、少なくとも約２．３μＭ、少なくとも約２．４μＭ、少なくとも約２．５μＭ、少なくとも約２．６μＭ、少なくとも約２．７μＭ、少なくとも約２．８μＭ、少なくとも約２．９μＭ、少なくとも約３μＭ、少なくとも約３．５μＭ、少なくとも約４μＭ、少なくとも約４．５μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約２０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約４０μＭ又は少なくとも約５０μＭの濃度で供給され得る。
【０２８１】
本発明の好ましい実施形態では、腹側偏向ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の一集団は、ＲＡの非存在下でＣＭＲＬ培地中の５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１０及び０．５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンをＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の一集団に供給することにより産生される。ＦＧＦ−１０及びＫＡＡＤ−シクロパミンの添加後約２日目に、２μＭのＲＡが添加されて、ＰＤＸ１陽性細胞への細胞の分化を完了する。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、分化因子及び／又はＣＲＭＬ培地は、ｈＥＳＣからの分化の開始後、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、或いは約１０日超で、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給される。好ましい実施形態では、分化因子及び／又はＣＲＭＬ培地は、ｈＥＳＣからの分化の開始後約３日目にＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に供給される。
【０２８３】
本発明の或る特定の実施形態では、上記の分化因子は、それらの添加後に細胞培養物から除去される。例えば上記の分化因子は、それらの添加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日又は約１０日以内に除去され得る。
【０２８４】
腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の培養物は、低減された血清を含有する培地中で増殖され得る。血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、血清代替品で増殖される。例えば、或る特定の実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ
／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかの実施形態では、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は血清を用いずに増殖される。他の実施形態では、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は血清代替品で増殖される。
【０２８５】
さらなる他の実施形態では、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このような実施形態では、Ｂ２７は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で、又は約２０％（ｖ／ｖ）より大きい濃度で、培地に供給され得る。或る特定の実施形態において、培地中のＢ２７の濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）である。代替的には、添加するＢ２７サプリメントの濃度を、市販のＢ２７ストック溶液の濃度の倍数単位で調整することができる。例えば、Ｂ２７は５０倍ストック溶液としてInvitrogen（Carlsbad, CA）で市販されている。このストック溶液を十分量、十分量の成長培地に添加することで、所望量のＢ２７を添加した培地が作られる。例えば、５０倍Ｂ２７ストック溶液１０ｍｌを成長培地９０ｍｌに加えることで、５倍Ｂ２７を添加した成長培地が作られる。培地中のＢ２７サプリメントの濃度は、約０．１倍、約０．２倍、約０．３倍、約０．４倍、約０．５倍、約０．６倍、約０．７倍、約０．８倍、約０．９倍、約１倍、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約１６倍、約１７倍、約１８倍、約１９倍、約２０倍及び約２０倍超であり得る。Ｂ２７が供給されるいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陰性細胞の腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉への分化を達成するために、レチノイドが供給されない。
【０２８６】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化のモニタリング
多能性細胞からの胚体内胚葉細胞の分化に関するのと同様に、ＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉からＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞への分化の進行は、これらの細胞型に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。このようなモニタリングは、種々の条件下での、例えば１つ又は複数の分化因子濃度及び環境条件下での所望量のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量を確定させ得る。好ましい実施形態では、所望量のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生のために十分である時間の量は、ＰＤＸ１の発現を検出することにより確定される。本発明のいくつかの実施形態では、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。代替的には、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このような実施形態では、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。上記のように、マーカー遺伝子により産生される発現マーカーを定量する好ましい方法は、Ｑ−ＰＣＲの使用による。特定の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲは、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現を、並びに他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の発現の欠如を定量することにより、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉培養の細胞の進行をモニタリングするために用いられる。当該技術分野で既知である他の方法も、マーカー遺伝子発現を定量するために用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、対象となる当該マーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにＰＤＸ１陰性胚体内胚葉、ｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が確定される。
【０２８７】
以下の実施例でさらに記載されるように、ＰＤＸ１は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉と関連するマーカー遺伝子である。このようなものとして、本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１の発現が確定される。他の実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉中で発現される他のマーカー、例えばＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６（これらに限定されない）の発現も確定される。ＰＤＸ１は或る特定の他の細胞型（即ち内蔵内胚葉及び或る特定の神経外胚葉）によっても発現され得るため、本発明のいくつかの実施形態は、内蔵内胚葉及び／又は神経外胚葉に関連したマーカー遺伝子発現の非存在又は実質的非存在を実証することに関する。例えばいくつかの実施形態では、内蔵内胚葉及び／又は神経細胞中で発現されるマーカー、例えばＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭ（これらに限定されない）の発現が確定される。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１又はＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含有しない。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載されるプロセスにより産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、内蔵内胚葉、壁側内胚葉及び／又は神経細胞を実質的に含有しない。
【０２８９】
背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化のモニタリング
以下の実施例中の表３及び／又は表４に記載される１つ又は複数のマーカーの発現は、背側ＰＤＸ１陽性内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングするために、上記の方法、例えばＱ−ＰＣＲ及び／又は免疫細胞化学を用いて検出及び／又は定量され得る。背側偏向及び腹側偏向ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の両方に関連したマーカーは、表３に記載されている。これらのマーカーのうち、ＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表３に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＤＵＳＰ９、ＣＤＨ６及びＳＯＸ９から成る群から選択される。背側偏向前腸内胚葉に関連したマーカーは、表４に記載されている。表４マーカーの各々は、他のＰＤＸ１陽性細胞と比較して、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞中で選択的に、特異的に又は独自的に発現される。これらのマーカーのうち、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表４に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、ＨＯＸＡ１、ＰＤＥ１１Ａ、ＦＡＭ４９Ａ及びＷＮＴ５Ａから成る群から選択される。
【０２９０】
上記のマーカーのほかに、本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉中で発現される他のマーカー、例えばＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６（これらに限定されない）の発現も確定される。ＰＤＸ１は或る特定の他の細胞型（即ち内蔵内胚葉及び或る特定の神経外胚葉）によっても発現され得るため、本発明のいくつかの実施形態は、内蔵内胚葉及び／又は神経外胚葉に関連したマーカー遺伝子発現の非存在又は実質的非存在を実証することに関する。例えばいくつかの実施形態では、内蔵内胚葉及び／又は神経細胞中で発現されるマーカー、例えばＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭ（これらに限定されない）の発現が確定される。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１又はＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含有しない。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載されるプロセスにより産生される背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、内蔵内
胚葉、壁側内胚葉及び／又は神経細胞を実質的に含有しない。
【０２９２】
腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化のモニタリング
前節に記載されたように、背側偏向及び腹側偏向ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に関連したマーカーは、表３に記載されている。このようなものとして、表３に記載されるマーカーのうちの１つ又は複数の発現は、上記の方法、例えばＱ−ＰＣＲ及び／又は免疫細胞化学を用いて検出及び／又は定量されて、腹側ＰＤＸ１陽性内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングし得る。表３に記載されるマーカーのうち、ＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２及びＳＬＣ２７Ａ２から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表３に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＤＵＳＰ９、ＣＤＨ６及びＳＯＸ９から成る群から選択される。さらに、表４に記載されるマーカーは、背側偏向前腸内胚葉中で選択的に、特異的に又は独自的に発現されるため、これらのマーカーのうちの１つ又は複数の、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉中での発現と比較した場合の、発現の欠如又は発現低減を検出することは、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の分化をモニタリングするために有用でもある。表４マーカーのうち、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択されるマーカーは、細胞表面マーカーである。背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の産生をモニタリングするための表４に列挙されるいくつかの好ましいマーカーは、ＨＯＸＡ１、ＰＤＥ１１Ａ、ＦＡＭ４９Ａ及びＷＮＴ５Ａから成る群から選択される。このようなものとして、表３から選択される１つ又は複数のマーカーを発現するＰＤＸ１陽性細胞中のこれらのマーカーの非存在又は微量の発現は、腹側ＰＤＸ１陽性ということを示す。
【０２９３】
上記のマーカーのほかに、本発明のいくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉中で発現される他のマーカー、例えばＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６（これらに限定されない）の発現も確定される。ＰＤＸ１は或る特定の他の細胞型（即ち内蔵内胚葉及び或る特定の神経外胚葉）によっても発現され得るため、本発明のいくつかの実施形態は、内蔵内胚葉及び／又は神経外胚葉に関連したマーカー遺伝子発現の非存在又は実質的非存在を実証することに関する。例えばいくつかの実施形態では、内蔵内胚葉及び／又は神経細胞中で発現されるマーカー、例えばＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭ（これらに限定されない）の発現が確定される。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１又はＮＦＭマーカー遺伝子を発現する細胞を実質的に含有しない。或る特定の実施形態では、本明細書中に記載されるプロセスにより産生される腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物は、内蔵内胚葉、壁側内胚葉及び／又は神経細胞を実質的に含有しない。
【０２９５】
背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の富化、単離及び／又は精製
上記のプロセスのいずれかにより産生されるＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、例えば背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、このような細胞に特異的である親和性タグを用いることにより、富化され、単離され、及び／又は精製され得る。背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の細胞表面に存在するが、本明細書中に記載される方法により産生される細胞培養物中に見出される他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子（例えばポリペプチド）に特異的な抗体、リガンド又は他の結合作因である。いくつかのプロセスでは、ＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＳＬＣ２７Ａ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ、
ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択される細胞表面マーカーと結合する抗体が、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の富化、単離又は精製のための親和性タグとして用いられる。
【０２９６】
抗体を製造するための、且つ細胞単離のためにそれらを用いるための方法は当該技術分野で既知であり、このような方法は、本明細書中に記載される抗体並びに背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を伴う私用のために実行され得る。一プロセスでは、ＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＳＬＣ２７Ａ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から選択されるマーカーと結合する抗体は、磁気ビーズに付着されて、次に細胞間及び基質接着を低減するよう酵素的に処理された細胞培養物中の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞と結合させられる。細胞／抗体／ビーズ複合体は次に、非結合細胞からビーズ結合胚体内胚葉細胞を分離するために用いられる可動性磁場に曝露される。背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が培養中の他の細胞から一旦物理的に分離されると、抗体結合は崩壊され、そして細胞は適切な組織培養培地中に再び平板培養される。
【０２９７】
富化、単離又は精製された背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞培養物又は集団を得るための付加的方法も用いられ得る。例えばいくつかの実施形態では、ＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＳＬＣ２７Ａ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択されるマーカーと結合する抗体は、細胞間及び基質接着を低減するよう処理された背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉含有細胞培養物とともにインキュベートされる。次に細胞は洗浄され、遠心分離され、そして再懸濁される。細胞懸濁液は次に、一次抗体と結合し得る二次抗体、例えばＦＩＴＣ接合抗体とともにインキュベートされる。次に細胞は、洗浄され、遠心分離され、そして緩衝液中に再懸濁される。次に細胞懸濁液は分析され、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を用いて選別される。マーカー陽性細胞はマーカー陰性細胞から分離回収され、それによりこのような細胞型の単離を生じる。所望により、単離細胞組成物は、代替的親和性ベースの方法を用いることにより、或いは背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いる付加的回数の選別により、さらに精製され得る。
【０２９８】
さらなる他のプロセスでは、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＣＤＨ６、ＧＡＢＲＡ２、ＧＲＩＡ３、ＩＬ６Ｒ、ＫＣＮＪ２、ＬＧＡＬＳ３、ＬＧＡＬＳ３／ＧＡＬＩＧ、ＳＥＲＰＩＮＦ２、ＳＬＣ２７Ａ２、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＣＤ４７、ＥＰＢ４１Ｌ１、ＭＡＧ、ＳＦＲＰ５、ＳＬＣ１６Ａ１０、ＳＬＣ１６Ａ２、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ３０Ａ４、ＳＬＩＣＫ、ＳＬＩＴＲＫ４及びＸＰＲ１から成る群から選択されるマーカーと結合するリガンド又は他の分子を用いて、富化され、単離され、及び／又は精製される。
【０２９９】
好ましいプロセスでは、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物が背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉系統に向けて分化するよう誘導された後、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は他の細胞から富化され、単離され、及び／又は精製される。上記の富化、単離及び精製手法は分化の任意の段階でこのような培養とともに用いられ得ると理解される。
【０３００】
直ぐ上に記載された手法のほかに、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。付加的には、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の選択的生存又は選択的拡張を促進する増殖条件での連続継代培養の方法によっても、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は富化されるか又は単離され得る。
【０３０１】
本明細書中に記載される方法を用いて、少なくともいくつかの分化を経ているＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団から、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は組織の富化、単離及び／又は精製集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの方法では、細胞は無作為分化を受ける。しかしながら好ましい方法では、細胞は主に、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒトＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞からの背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生に関する。本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約２〜約１０００倍、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉含量を富化され得る。いくつかの実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約５〜約５００倍富化され得る。他の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約１０〜約２００倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約２０〜約１００倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約４０〜約８０倍富化され得る。或る特定の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約２〜約２０倍富化され得る。
【０３０２】
背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の富化、単離及び／又は精製
本発明の付加的態様に関して、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、富化され、単離され、及び／又は精製され得る。本発明のいくつかの実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に関して富化される細胞集団は、細胞培養物からこのような細胞を単離することにより産生される。
【０３０３】
本発明のいくつかの実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は蛍光標識され、次に蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を用いることにより非標識細胞から単離される。このような実施形態では、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸、又は発現可能な蛍光マーカー遺伝子、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子をコードする別の核酸は、ＰＤＸ１陽性細胞を標識するために用いられる。例えばいくつかの実施形態では、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的活性断片の発現がこのようなプロモーターの制御下にあるよう、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片の少なくとも１つのコピーが、表３又は表４から選択される遺伝子のプロモーターの下流で、多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、表３又は表４から選択されるマーカーをコードする核酸の全コード領域が、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片により置換される。他の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片は、表３又は表４から選択されるマーカーをコードする核酸の少なくとも一部とフレーム内で融合され、それにより融合タンパク質を生成する。このような実施形態では、融合タンパク質はＧＦＰと類似の蛍光活性を保有する。
【０３０４】
蛍光的にしるしを付けられた細胞、例えば上記の多能性細胞は、上記のように、胚体内胚葉に、そして次に背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化される。背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は蛍光マーカー遺伝子を発現するが、一方、
ＰＤＸ１陰性細胞はそうではないため、これら２つの細胞型は分離され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及び非標識ＰＤＸ１陰性細胞の混合物を含む細胞懸濁液は、ＦＡＣＳを用いて選別される。背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性細胞から別々に回収され、それによりこのような細胞型の単離を生じる。所望により、単離細胞組成物は、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いる付加的回数の選別により、さらに精製され得る。
【０３０５】
上記の富化、単離及び精製手法は分化の任意の段階でこのような培養とともに用いられ得ると理解される。
【０３０６】
本明細書中に記載される方法を用いて、少なくともいくつかの分化を経ているＰＤＸ１陰性、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞培養物又は細胞集団から、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞又は組織の富化、単離及び／又は精製集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの実施形態では、細胞は無作為分化を受ける。しかしながら好ましい実施形態では、細胞は主に、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生に関する。
【０３０７】
本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約２〜約１０００倍、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞含量を富化され得る。いくつかの実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約５〜約５００倍富化され得る。他の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約１０〜約２００倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約２０〜約１００倍富化され得る。さらに他の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約４０〜約８０倍富化され得る。或る特定の実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して少なくとも約２〜約２０倍富化され得る。
【０３０８】
背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉を含む組成物
本発明のいくつかの実施形態は、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が背側膵芽及び／又は腹側膵芽のような腸管の前部分に由来する細胞、組織又は器官に分化し得る複能性細胞である細胞組成物に関する。或る特定の実施形態によれば、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞は哺乳類の細胞であり、好ましい実施形態では、このような細胞はヒト細胞である。
【０３０９】
本発明の他の実施形態は、ｈＥＳＣ、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及び中胚葉細胞から成る群から選択される１つ又は複数の細胞型の細胞から成る組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、ｈＥＳＣは、培養物中で全細胞の約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満含まれる。他の実施形態では、ＰＤＸ１陰性確定的内胚葉細胞は、培養物中で全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、
約３％未満、約２％未満、又は約１％未満含まれる。さらに別の実施形態では、中胚葉細胞は、培養物中で全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満含まれる。
【０３１０】
本発明の付加的実施形態は、多数派細胞型として背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む本明細書中に記載されるプロセスにより産生される組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるプロセスは、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％、又は少なくとも約５０％の背側及び／又は腹側のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。他の実施形態では、本明細書で記載されるプロセスは、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％、又は少なくとも約１％の背側及び／又は腹側のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物及び／又は細胞集団を産生する。好ましい実施形態では、この細胞培養物又は細胞集団の細胞は、ヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団中の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞のパーセンテージは、培養物中に残存するフィーダー細胞と関係なく算定される。
【０３１１】
本発明のさらに他の実施形態は、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞及びＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の混合物を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団に関する。例えば約９５個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。他の実施形態では、約５個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約９５個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が産生され得る。さらに、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して他の比率の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が意図される。例えば約１，０００，０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１００，０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１０，０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹
側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１０００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約５００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１００個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１０個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約５個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約４個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約２個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約２個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個の多能性細胞に対して少なくとも約４個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個の多能性細胞に対して少なくとも約５個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約２０個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約５０個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１００個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０００個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１０，０００個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１００，０００個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、約１個のＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞に対して少なくとも約１，０００，０００個の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物が意図される。
【０３１２】
本発明のいくつかの実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞が産生されるＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞は、ヒト多能性細胞、例えばヒト多能性幹細胞に由来する。或る特定の実施形態では、ヒト多能性細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する。或る特定の他の実施形態では、ヒト多能性細胞は、胚段階後に発生した多細胞構造の生殖腺組織又は胚組織に由来する。
【０３１３】
本発明のさらなる実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、ＰＤＸ１マーカーの発現がヒト細胞の少なくとも約２％においてＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、ＰＤＸ１マーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１の発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい細胞培養物又は集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
【０３１４】
本発明のいくつかの実施形態は、ヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がヒト細胞の少なくとも約２％〜少なくとも約９８％より多くでＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現より大きい組成物に関すると理解される。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞では、少なくとも約１０％のヒト細胞では、少なくとも約１５％のヒト細胞では、少なくとも約２０％のヒト細胞では、少なくとも約２５％のヒト細胞では、少なくとも約３０％のヒト細胞では、少なくとも約３５％のヒト細胞では、少なくとも約４０％のヒト細胞では、少なくとも約４５％のヒト細胞では、少なくとも約５０％のヒト細胞では、少なくとも約５５％のヒト細胞では、少なくとも約６０％のヒト細胞では、少なくとも約６５％のヒト細胞では、少なくとも約７０％のヒト細胞では、少なくとも約７５％のヒト細胞では、少なくとも約８０％のヒト細胞では、少なくとも約８５％のヒト細胞では、少なくとも約９０％のヒト細胞では、少なくとも約９５％のヒト細胞では、又は少なくとも約９８％のヒト細胞では、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現より大きい。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現より大きい細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
【０３１５】
本発明の他の実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、表３から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がヒト細胞の少なくとも約２％においてＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、表３から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。いくつかの実施形態では、表３から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい細胞培養物又は細胞集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
【０３１６】
本発明の他の実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がヒト細胞の少なくとも約２％においてＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい組成物に関する。他の実施形態では、表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少な
くとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。いくつかの実施形態では、表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい細胞培養物又は集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
【０３１７】
本発明の他の実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、表３から選択されるマーカーの発現がヒト細胞の少なくとも約２％においてＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きく、そして表４から選択されるマーカーが背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞中の同一マーカーの発現と比較して、実質的に発現されない組成物に関する。他の実施形態では、表３から選択されるマーカーの発現は、ヒト細胞の少なくとも約５％で、ヒト細胞の少なくとも約１０％で、ヒト細胞の少なくとも約１５％で、ヒト細胞の少なくとも約２０％で、ヒト細胞の少なくとも約２５％で、ヒト細胞の少なくとも約３０％で、ヒト細胞の少なくとも約３５％で、ヒト細胞の少なくとも約４０％で、ヒト細胞の少なくとも約４５％で、ヒト細胞の少なくとも約５０％で、ヒト細胞の少なくとも約５５％で、ヒト細胞の少なくとも約６０％で、ヒト細胞の少なくとも約６５％で、ヒト細胞の少なくとも約７０％で、ヒト細胞の少なくとも約７５％で、ヒト細胞の少なくとも約８０％で、ヒト細胞の少なくとも約８５％で、ヒト細胞の少なくとも約９０％で、ヒト細胞の少なくとも約９５％で、又はヒト細胞の少なくとも約９８％で、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きい。このような実施形態では、表４から選択されるマーカーは、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞中の同一マーカーの発現と比較して、実質的に発現されない。いくつかの実施形態では、表３から選択されるマーカーの発現がＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現よりも大きく、そして表４から選択されるマーカーが背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞中の同一マーカーの発現と比較して、実質的に発現されない細胞培養物又は集団中のヒト細胞のパーセンテージは、フィーダー細胞を考慮せずに算定される。
【０３１８】
本発明の付加的実施形態は、哺乳類内胚葉細胞、例えばヒト内胚葉細胞を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、ＰＤＸ１マーカーの発現並びに表３又は表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現が内胚葉細胞の少なくとも約２％においてＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現より大きい組成物に関する。他の実施形態では、ＰＤＸ１マーカーの発現、及び表３又は表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、内胚葉細胞の少なくとも約５％、内胚葉細胞の少なくとも約１０％、内胚葉細胞の少なくとも約１５％、内胚葉細胞の少なくとも約２０％、内胚葉細胞の少なくとも約２５％、内胚葉細胞の少なくとも約３０％、内胚葉細胞の少なくとも約３５％、内胚葉細胞の少なくとも約４０％、内胚葉細胞の少なくとも約４５％、内胚葉細胞の少なくとも約５０％、内胚葉細胞の少なくとも約５５％、内胚葉細胞の少なくとも約６０％、内胚葉細胞の少なくとも約６５％、内胚葉細胞の少なくとも約７０％、内胚葉細胞の少なくとも約７５％、内胚葉細胞の少なくとも約８０％、内胚葉細胞の少なくとも約８５％、内胚葉細胞の少なくとも約９０％、内胚葉細胞の少なくとも約９５％、又は内胚葉細胞の少なくとも約９８％でＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現より大きい。
【０３１９】
本発明のさらに他の実施形態は、哺乳類内胚葉細胞、例えばヒト内胚葉細胞を含む組成物、例えば細胞培養物又は細胞集団であって、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現並びに表３又は表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現が内胚葉細胞の少なくとも約２％においてＡＦＰ、Ｓ
ＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現より大きい組成物に関する。他の実施形態では、ＳＯＸ１７、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現、及び表３又は表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、内胚葉細胞の少なくとも約５％、内胚葉細胞の少なくとも約１０％、内胚葉細胞の少なくとも約１５％、内胚葉細胞の少なくとも約２０％、内胚葉細胞の少なくとも約２５％、内胚葉細胞の少なくとも約３０％、内胚葉細胞の少なくとも約３５％、内胚葉細胞の少なくとも約４０％、内胚葉細胞の少なくとも約４５％、内胚葉細胞の少なくとも約５０％、内胚葉細胞の少なくとも約５５％、内胚葉細胞の少なくとも約６０％、内胚葉細胞の少なくとも約６５％、内胚葉細胞の少なくとも約７０％、内胚葉細胞の少なくとも約７５％、内胚葉細胞の少なくとも約８０％、内胚葉細胞の少なくとも約８５％、内胚葉細胞の少なくとも約９０％、内胚葉細胞の少なくとも約９５％、又は内胚葉細胞の少なくとも約９８％でＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカーの発現より大きい。
【０３２０】
本明細書中に記載されるプロセスを用いて、他の細胞型を実質的に含有しない背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。細胞培養物中又は細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という用語は、その細胞培養物又は細胞集団が含有しない特殊化細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在するということを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１、ＺＩＣ１及び／又はＮＦＭマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。
【０３２１】
本発明の一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の記述は、ＰＤＸ１  高、表３から選択されるマーカー  高、表４から選択されるマーカー  高、ＡＦＰ  低、ＳＯＸ７  低、ＳＯＸ１  低、ＺＩＣ１  低及びＮＦＭ  低である。
【０３２２】
本発明の一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の記述は、ＰＤＸ１  高、表３から選択されるマーカー  高、表４から選択されるマーカー  低（背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉での同じマーカーの発現と比較して）、ＡＦＰ  低、ＳＯＸ７  低、ＳＯＸ１  低、ＺＩＣ１  低及びＮＦＭ  低である。
【０３２３】
ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞中のＰＤＸ１の発現増大
本発明のいくつかの態様は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団中でのＰＤＸ１遺伝子産物の発現を増大する方法に関する。このような実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１遺伝子産物の発現を増大するために十分である量で分化因子と接触される。分化因子と接触されるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１陰性又はＰＤＸ１陽性のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、分化因子はレチノイドである。或る特定の実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、約０．０１μＭ〜約５０μＭの範囲の濃度でレチノイドと接触される。好ましい実施形態では、レチノイドはＲＡである。
【０３２４】
本発明の他の実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団中でのＰＤＸ１遺伝子産物の発現は、ＳＯＸ１７陽性細胞を線維芽細胞増殖因子ファミリーの分化因子と接触させることにより増大される。このような分化因子は、単独で又はＲＡと一緒に用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で線維芽細胞増殖因子と接触される。好ましい実施形態では、ＦＧＦ増殖因子は、ＦＧＦ−１０である。
【０３２５】
本発明のいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団中でのＰＤＸ１遺伝子産物の発現は、ＳＯＸ１７陽性細胞をＢ２７と接触させることにより増大される。この分化因子は、単独で、又はレチノイド及びＦＧＦファミリー分化因子の一方若しくは両方と一緒に用いられ得る。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度でＢ２７と接触される。好ましい実施形態では、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞は、ＲＡ、ＦＧＦ−１０及びＢ２７と接触される。
【０３２６】
ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団中でのＰＤＸ１遺伝子産物の発現を増大するための方法は、低減された血清を含有するか又は全く含有しない増殖培地中で実行され得る。いくつかの実施形態では、血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲である。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７陽性細胞は、血清代替品を用いて増殖される。
【０３２７】
上記の方法は、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞中での表３及び／又は表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現を増大するためにも用いられ得ると理解される。同様に、このような方法は、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞中での表３から選択される１つ又は複数のマーカーの発現を増大するために用いられ得る。
【０３２８】
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る因子の同定
本発明の付加的態様は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る１つ又は複数の分化因子を同定する方法に関する。このような方法では、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団が得られ、そして細胞培養物又は細胞集団中でのＰＤＸ１の発現が確定される。ＰＤＸ１の発現を確定した後、細胞培養物又は細胞集団の細胞は、候補分化因子と接触される。いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１の発現は、細胞と候補分化因子との接触時、又は接触直後に、確定される。ＰＤＸ１発現は次に、細胞と候補分化因子との接触後の１つ又は複数の時点で確定される。候補分化因子との接触前のＰＤＸ１発現と比較して、ＰＤＸ１の発現が候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る因子を同定する上記の方法は、細胞培養物又は細胞集団中でのＨＯＸＡ１３遺伝子及び／又はＨＯＸＣ６遺伝子の発現を確定することも包含する。このような実施形態では、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６の発現は、細胞が候補分化因子と接触される前及び後の両方で確定される。候補分化因子との接触前のＰＤＸ１及びＨＯＸＡ１３発現と比較して、ＰＤＸ１及びＨＯＸＡ１３の発現は、候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得るとして同定される。同様に、候補分化因子との接触前のＰＤＸ１及びＨＯＸＣ６発現と比較して、ＰＤＸ１及びＨＯＸＣ６の発現が候補分化因子との接触後に増大された場合、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。好ましい実施形態では、候補分化因子は、細胞培養物又は細胞集団の細胞と候補分化因子との接触の前及び後の両方で、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６の発現を確定することにより、候補分化因子は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得ると同定される。好ましい実施形態では、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及び／又はＨＯＸＣ６の発現は、Ｑ−ＰＣＲにより確定される。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、ＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６のうちの１つ又は複
数の発現は、細胞と候補分化因子との接触の前というよりむしろ、細胞培養物又は細胞集団の細胞と候補分化因子との接触時又は接触直後に確定され得ると理解される。このような実施形態では、細胞と候補分化因子との接触時又は接触直後の１つ又は複数のＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６の発現は、細胞と候補分化因子との接触後の１つ又は複数の時点での１つ又は複数のＰＤＸ１、ＨＯＸＡ１３及びＨＯＸＣ６の発現と比較される。
【０３３１】
上記の方法のいくつかの実施形態では、細胞と候補分化因子との接触後にＰＤＸ１発現が確定される１つ又は複数の時点は、約１時間〜約１０日の範囲であり得る。例えばＰＤＸ１発現は、細胞と候補分化因子との接触後約１時間、細胞と候補分化因子との接触後約２時間、細胞と候補分化因子との接触後約４時間、細胞と候補分化因子との接触後約６時間、細胞と候補分化因子との接触後約８時間、細胞と候補分化因子との接触後約１０時間、細胞と候補分化因子との接触後約１２時間、細胞と候補分化因子との接触後約１６時間、細胞と候補分化因子との接触後約２４時間、細胞と候補分化因子との接触後約２日、細胞と候補分化因子との接触後約３日、細胞と候補分化因子との接触後約４日、細胞と候補分化因子との接触後約５日、細胞と候補分化因子との接触後約６日、細胞と候補分化因子との接触後約７日、細胞と候補分化因子との接触後約８日、細胞と候補分化因子との接触後約９日、細胞と候補分化因子との接触後約１０日、又は細胞と候補分化因子との接触後約１０日以後に確定され得る。
【０３３２】
本明細書中に記載される方法で用いるための候補分化因子は、ポリペプチド及び小分子のような化合物から選択され得る。例えば候補ポリペプチドとしては、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、細胞外基質タンパク質及び合成ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、増殖因子は、ＦＧＦファミリーからであり、例えばＦＧＦ−１０である。候補小分子としては、組合せ化学合成及び天然産物から生成される化合物、例えばステロイド、イソプレノイド、テルペノイド、フェニルプロパノイド、アルカロイド及びフラビノイドが挙げられるが、これらに限定されない。数千のクラスの天然及び合成小分子が利用可能であり、且つ本明細書中に記載される方法に用いるよう意図される小分子は上記で例示されたクラスに限定されないと当業者に理解される。典型的には、小分子は、１０，０００ａｍｕ未満の分子量を有する。好ましい実施形態では、小分子はレチノイド、例えばＲＡである。
【０３３３】
上記の方法を用いて、表４からの１つ又は複数のマーカーの発現をモニタリングすることにより、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る因子を同定し得ると理解される。いくつかの実施形態では、表３から選択される１つ又は複数のマーカー及び表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がモニタリングされる。
【０３３４】
同様に、上記の方法を用いて、表３からの１つ又は複数のマーカーの発現をモニタリングすることにより、腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化を促進し得る因子を同定し得ると理解される。いくつかの実施形態では、表３から選択される１つ又は複数のマーカー及び表４から選択される１つ又は複数のマーカーの発現がモニタリングされる。
【０３３５】
背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る因子の同定
本明細書中に記載される或る特定のスクリーニング方法は、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る少なくとも１つの分化因子を同定するための方法に関する。これらの方法のいくつかの実施形態では、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞、例えばヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞集団が得られる。次に細胞集団は、候補分化因子を供給される。候補分化因子を供給される前又はそれとほぼ同時である第１の時点で、マーカーの発現が確定される。代替的には
、マーカーの発現は、候補分化因子の供給後に確定され得る。第１の時点の後、そして細胞集団に候補分化因子を供給する工程の後である第２の時点で、同一マーカーの発現が再び確定される。候補分化因子が背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得るか否かは、第１の時点でのマーカーの発現を第２の時点でのマーカーの発現と比較することにより確定される。第２の時点でのマーカーの発現が、第１の時点でのマーカーの発現と比較して増大されるか又は低減された場合には、候補分化因子は、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得る。好ましい実施形態では、マーカーの発現は、Ｑ−ＰＣＲにより確定される。
【０３３６】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態は、ヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を含む細胞集団又は細胞培養物を利用する。例えば細胞集団は、ヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を実質的に精製した細胞集団であり得る。或いは細胞集団は、ヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の富化集団であって、この場合、細胞集団中のヒト細胞の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％又は少なくとも約９７％より以上が、ヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である。本明細書中に記載される他の実施形態では、細胞集団は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも８５％以上がヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞であるヒト細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、非ヒト細胞、例えば非ヒトフィーダー細胞を含む。他の実施形態では、細胞集団は、ヒトフィーダー細胞を含む。このような実施形態では、上記フィーダー細胞以外のヒト細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は少なくとも約９５％以上がヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞である。
【０３３７】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法の実施形態では、細胞集団は、候補（試験）分化因子と接触されるか、そうでなければそれを供給される。候補分化因子は、ヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進する能力を有し得る任意の分子を含み得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、候補分化因子は、1つ又は複数の型の細胞に関する分化因子であることが既知である分子を含む。代替的実施形態では、候補分化因子は、細胞分化を促進することが既知でない分子を含む。好ましい実施形態では、候補分化因子は、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進することが既知でない分子を含む。
【０３３８】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、小分子を含む。好ましい実施形態では、小分子は、約１０，０００ａｍｕ又はそれ未満の分子量を有する分子である。いくつかの実施形態では、小分子はレチノイドを含む。いくつかの実施形態では、小分子はレチノイン酸を含む。
【０３３９】
本明細書中に記載される他の実施形態では、候補分化因子はポリペプチドを含む。ポリペプチドは、任意のポリペプチド、例えば糖タンパク質、リポタンパク質、細胞外基質タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモン、インターロイキン又は増殖因子（これらに限定されない）であり得る。好ましいポリペプチドとしては、増殖因子が挙
げられる。
【０３４０】
本明細書に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態において、候補分化因子は、アンフィレグリン、Ｂ−リンパ球刺激因子、ＩＬ−１６、チモポイエチン、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２、プレＢ細胞コロニー増強因子、内皮分化関連因子１（ＥＤＦ１）、内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ナチュラルキラー細胞増強因子（ＮＫＥＦＡ）、骨形成タンパク質（Bone mophogenetic protein）２、骨形成タンパク質８（造骨タンパク質（osteogeneic protein）２）、骨形成タンパク質６、骨形成タンパク質７、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、ＣＧＩ−１４９タンパク質（神経内分泌分化因子）、サイトカインＡ３（マクロファージ炎症性タンパク質１−α）、膠芽腫（Gliablastoma）細胞分化関連タンパク質（ＧＢＤＲ１）、肝細胞癌由来増殖因子、ニューロメジンＵ−２５前駆体、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、Ｔ細胞特異的ＲＡＮＴＥＳ前駆体、胸腺樹状細胞誘導因子１、トランスフェリン、インターロイキン１（ＩＬ１）、インターロイキン２（ＩＬ２）、インターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン５（ＩＬ５）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン７（ＩＬ７）、 インターロイキン８（ＩＬ８）、インターロイキン９（ＩＬ９）、インターロイキン１０（ＩＬ１０）、インターロイキン１１（ＩＬ１１）、インターロイキン１２（ＩＬ１２）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、エリスロポイエチン、トロンボポイエチン、ビタミンＤ３、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、脳由来神経栄養因子、白血病抑制因子、甲状腺ホルモン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ａＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ、β神経増殖因子、アクチビンＡ、形質転換増殖因子β１（ＴＧＦ−β１）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、バースト促進活性（Burst promoting activity）（ＢＰＡ）、赤血球促進活性（ＥＰＡ）、ＰＧＥ２、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、ニュートロフィン増殖因子（ＮＧＦ）、ニュートロフィン３、ニュートロフィン４／５、毛様体神経栄養因子、神経膠由来ネキシン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩（Ascrorbate）、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン、ＴＷＳ１１９、オキシトシン、バソプレシン、メラニン細胞刺激ホルモン、コルチコトロピン（corticortropin）、リポトロピン、チロトロピン、成長ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、コルチコトロピン放出因子、ゴナドトロピン放出因子、プロラクチン放出因子、プロラクチン阻害因子、成長ホルモン放出��子、ソマトスタチン、チロトロピン放出因子、カルシトシン遺伝子関連ペプチド、副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド１、グルコース依存性インスリン分泌促進ポリペプチド、ガストリン、セクレチン、コレシストキシン、モチリン、血管活性腸管ペプチド、物質Ｐ、膵臓ポリペプチド、ペプチドチロシンチロシン、神経ペプチドチロシン、インスリン、グルカゴン、胎盤性ラクトゲン、リラキシン、アンジオテンシンＩＩ、カルシトリオール（calctriol）、心房性ナトリウム利尿ペプチド、及びメラトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、カルシトニン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾール、コルチコステロン、アルドステロン、エピネフィン、ノルエピネフリン（norepinepherine）、アンドロスチエン（androstiene）、カルシトリオール、コラーゲン、デキサメタゾン、β−メルカプトエタノール、レチノイン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、５−アザシチジン、アンホテリシンＢ、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩（Ascrorbate）、イソブチルキサンチン、インドメタシン、β−グリセロールホスフェート、ニコチンアミド、ＤＭＳＯ、チアゾリジンジオン、及びＴＷＳ１１９から成る群から選択される１
つ又は複数の増殖因子を含む。
【０３４１】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子は、1つ又は複数の濃度で、細胞集団に供給される。いくつかの実施形態では、候補分化因子は、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度が約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌの範囲であるよう、細胞集団に供給される。いくつかの実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌの範囲である。他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌの範囲である。さらに他の実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲である。好ましい実施形態では、細胞周囲の培地中の候補分化因子の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ、約２５ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、約７５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ、約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１７５ｎｇ／ｍｌ、約２００ｎｇ／ｍｌ、約２２５ｎｇ／ｍｌ、約２５０ｎｇ／ｍｌ、約２７５ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ、約３２５ｎｇ／ｍｌ、約３５０ｎｇ／ｍｌ、約３７５ｎｇ／ｍｌ、約４００ｎｇ／ｍｌ、約４２５ｎｇ／ｍｌ、約４５０ｎｇ／ｍｌ、約４７５ｎｇ／ｍｌ、約５００ｎｇ／ｍｌ、約５２５ｎｇ／ｍｌ、約５５０ｎｇ／ｍｌ、約５７５ｎｇ／ｍｌ、約６００ｎｇ／ｍｌ、約６２５ｎｇ／ｍｌ、約６５０ｎｇ／ｍｌ、約６７５ｎｇ／ｍｌ、約７００ｎｇ／ｍｌ、約７２５ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌ、約７７５ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌ、約８２５ｎｇ／ｍｌ、約８５０ｎｇ／ｍｌ、約８７５ｎｇ／ｍｌ、約９００ｎｇ／ｍｌ、約９２５ｎｇ／ｍｌ、約９５０ｎｇ／ｍｌ、約９７５ｎｇ／ｍｌ、約１μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、約１６μｇ／ｍｌ、約１７μｇ／ｍｌ、約１８μｇ／ｍｌ、約１９μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ、約２５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約７５μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ、約２５０μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ、約３５０μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ、約４５０μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ、約５５０μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ、約６５０μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ、約７５０μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ、約８５０μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ、約９５０μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ又は約１０００μ／ｍｌ超である。
【０３４２】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法の或る特定の実施形態では、細胞集団は、レチノイド、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ−４、ＢＭＰ−４、アクチビンＡ、アクチビンＢ又は任意の他の前腸分化因子以外の任意の分子を含む候補分化因子を供給される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、レチノイン酸以外の任意の分子を含む候補分化因子を供給される。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるスクリーニング方法の工程は、第１の時点及び第２の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を確定することを包含する。これらの実施形態のいくつかでは、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に供給する前、又はそれとほぼ同時であり得る。或いはいくつかの実施形態では、第１の時点は、候補分化因子を細胞集団に供給した後である。いくつかの実施形態では、複数のマーカーの発現は、第１の時点で確定される。
【０３４４】
第１の時点での少なくとも１つのマーカーの発現を確定することのほかに、本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態は、第１の時点の後であり、そして候補分化因子を細胞集団に供給した後である第２の時点で少なくとも１つのマーカーの発現を確定することを意図する。このような実施形態では、同一マーカーの発現が、第一及び第２の時点の両方で確定される。いくつかの実施形態では、複数のマーカーの発現が
、第一及び第２の時点の両方で確定される。このような実施形態では、複数の同一マーカーの発現が、第１の時点及び第２の時点の両方で確定される。いくつかの実施形態では、その各々が第１の時点の後であり、そしてその各々が候補分化因子を細胞集団に供給した後である複数の時点で、マーカー発現が確定される。或る特定の実施形態では、マーカー発現はＱ−ＰＣＲにより確定される。他の実施形態では、マーカー発現は免疫細胞化学により確定される。
【０３４５】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法の或る特定の実施形態では、その発現が第一及び第２の時点で確定されるマーカーは、前腸の後部由来である組織及び／又は器官を作り上げる細胞の前駆体である細胞へのヒト背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化に関連するマーカーである。いくつかの実施形態では、前腸の後部に由来する組織及び／又は器官は、最終分化細胞を含む。いくつかの実施形態では、マーカーは、膵臓細胞又は膵臓前駆体細胞を示す。いくつかの実施形態では、マーカーは表３又は表４から選択されるマーカーである。
【０３４６】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法のいくつかの実施形態では、候補分化因子を細胞集団に供給することと、第２の時点でのマーカー発現を確定することとの間に十分な時間を経過させる。候補分化因子を細胞集団に供給することと第２の時点でのマーカーの発現を確定することとの間の十分な時間は、約１時間という短い時間から、約１０日間という長い時間までであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマーカーの発現が、細胞集団に候補分化因子を供給した後で複数回確定される。いくつかの実施形態では、十分な時間は、少なくとも約１時間、少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約７８時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９０時間、少なくとも約９６時間、少なくとも約１０２時間、少なくとも約１０８時間、少なくとも約１１４時間、少なくとも約１２０時間、少なくとも約１２６時間、少なくとも約１３２時間、少なくとも約１３８時間、少なくとも約１４４時間、少なくとも約１５０時間、少なくとも約１５６時間、少なくとも約１６２時間、少なくとも約１６８時間、少なくとも約１７４時間、少なくとも約１８０時間、少なくとも約１８６時間、少なくとも約１９２時間、少なくとも約１９８時間、少なくとも約２０４時間、少なくとも約２１０時間、少なくとも約２１６時間、少なくとも約２２２時間、少なくとも約２２８時間、少なくとも約２３４時間、又は少なくとも約２４０時間である。
【０３４７】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態では、第２の時点でのマーカーの発現が、第１の時点でのこのマーカーの発現と比較して、増大したか又は低減したかがさらに確定される。少なくとも１つのマーカーの発現の増大又は低減は、候補分化因子が背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の分化を促進し得るということを示す。同様に、複数のマーカーの発現が確定される場合、第２の時点での複数のマーカーの発現が、第１の時点でのこの複数のマーカーの発現と比較して、増大したか又は低減したかをさらに確定する。マーカー発現の増大又は低減は、第一及び第２の時点での細胞集団中のマーカーの量、レベル又は活性を測定するか又はそうでなければ評価することにより確定され得る。このような確定は、他のマーカー、例えばハウスキーピング遺伝子発現と相対的であるか、或いは絶対的であり得る。マーカー発現が第１の時点に比べて、第２の時点で増大する或る特定の実施形態では、増大量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍超である。いくつかの実施形態では、増大量は２倍未満である。マーカー発現が第１の時点に比べて、第２の
時点で低減する実施形態では、低減量は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、又は少なくとも約１００倍超である。いくつかの実施形態では、低減量は２倍未満である。
【０３４８】
本明細書中に開示する方法それぞれを、背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞に関して記載してきたが、或る特定の実施形態では、これらの方法は、本明細書中に記載される背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性前腸／中腸内胚葉細胞及び／又は本明細書中に記載される前腸の後方部分の背側及び／又は腹側ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞を含む組成物を産生するのに使用することができることが理解されよう。さらに、本明細書中に開示するＰＤＸ１陽性内胚葉細胞型のいずれかを本明細書中に記載するスクリーニング方法に利用することができる。
【０３４９】
本発明を一般的に記載してきたが、例証の目的のためにのみ本明細書中に提供され、限定的であるよう意図されない或る特定の実施例を参照することによりさらなる理解が得られる。
【実施例】
【０３５０】
以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用を記載する。多能性ヒト細胞を産生する方法は、当該技術分野で既知であり、多数の科学出版物、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第６，０９０，６２２号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）に記載されている。
【０３５１】
〔実施例１〕
ヒトＥＳ細胞
内胚葉発達についての研究のために、本発明者等は、多能性であり、そして正常核型を保持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、５日齢胚内部細胞塊からＥＳ細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を、患者によるインフォームドコンセント後に、体外受精周期からの過剰凍結胚から得た。解凍の直後に、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、ＩＴＳサプリメント）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に孵化胚盤胞を平板培養した。胚が培養皿に接着し、そして約２週間後、未分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再度平板培養することにより移動を成し遂げた。誘導以来、ｈＥＳＣｙｔ−２５を、１００回にわたって逐次継代した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、ｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。
【０３５２】
幹細胞又は他の多能性細胞は本明細書中に記載される分化手法のための出発物質としても用いられ得ると当業者により理解される。例えば当該技術分野で既知の方法により単離され得る胚性生殖腺隆起から得られる細胞は、多能性細胞出発物質として用いられ得る。
【０３５３】
〔実施例２〕
ｈＥＳＣｙｔ−２５特性化
ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養中に１８ヶ月にわたって、正常な形態特性、核型特性、増殖特性及び自己再生特性を保持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０抗原（これらはすべて、未分化ｈＥＳＣに特有である）に対
する強免疫反応性を示し、そしてアルカリ性ホスファターゼ活性、並びに他の確立されたｈＥＳＣ株と同一の形態を示す。さらにヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、懸濁液中で培養される場合、胚様体（ＥＢ）も容易に形成する。その多能性の実証として、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要胚葉を表わす種々の細胞型に分化する。ＺＩＣ１に関するＱ−ＰＣＲ、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）により、外胚葉産生を実証した。β−ＩＩＩチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のＥＢを処理して、臓側内胚葉（ＶＥ）、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理された細胞は、高レベルのα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）及びＳＯＸ７（ＶＥの２つのマーカー）を５４時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でＡＦＰを発現した。以下で記載するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰ発現の非存在下でのＳＯＸ１７に関する実時間定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学により立証されるように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のＥＢを、いくつかの時点でのブラキュリ遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表わす細胞を形成する能力により示されるように、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は多能性である。
【０３５４】
〔実施例３〕
ＳＯＸ１７抗体の産生
ｈＥＳＣ培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対する抗体の産生に着手した。
【０３５５】
マーカーＳＯＸ１７は、それが原腸形成中に形成する際に胚体内胚葉全体にわたって発現され、その発現は、器官形成の開始頃まで腸管で維持される（しかし、発現のレベルは、Ａ−Ｐ軸に沿って様々である）。ＳＯＸ１７はまた、胚体外内胚葉細胞のサブセットでも発現される。このタンパク質の発現はまた、中胚葉又は外胚葉では観察されていない。ＳＯＸ１７は、胚体外系統を排除するためのマーカーと併用される場合、胚体内胚葉系統に適切なマーカーであることが現在発見されている。
【０３５６】
本明細書中で詳述するように、ＳＯＸ１７抗体は、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の産生を目的とした様々な処理手順及び分化手順の影響を具体的に検査するのに利用された。ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びトロンボモジュリンに対して反応性がある他の抗体もまた、臓側内胚葉及び壁側内胚葉（胚体外内胚葉）の産生を除外するのに使用された。
【０３５７】
ＳＯＸ１７に対する抗体を産生するために、ＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端におけるアミノ酸１７２〜４１４（配列番号２）に相当するヒトＳＯＸ１７  ｃＤＮＡ（配列番号１）の一部（図２）は、抗体産生会社GENOVAC(Freiberg, Germany)にて、そこで開発された手順に従って、ラットにおける遺伝子免疫化に使用した。遺伝子免疫化に関する手段は、米国特許第５，８３０，８７６号、同第５，８１７，６３７号、同第６，１６５，９９３号及び同第６，２６１，２８１号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ００／２９４４２号及び同第ＷＯ９９／１３９１５号（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）に見出すことができる。
【０３５８】
遺伝子免疫化に関する他の適切な方法はまた、非特許文献にも記載されている。例えば、Barry他は、Biotechniques 16: 616-620, 1994（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）において遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の産生について記載している。特異的タンパク質に対する抗体を産生するための遺伝子免疫化方法の具体例は、例えば、Costaglia他(1998) ヒト甲状腺刺激ホルモン受容体に対する遺伝子免疫化は、甲状
腺炎を引き起こし、且つ自然受容体を認識するモノクローナル抗体の産生を可能にする(Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies recognizing the native receptor), J. Immunol. 160: 1458-1465、Kilpatrick他(1998) 遺伝子銃送達されるＤＮＡベースの免疫化は、Ｆｌｔ−３受容体に対するマウスモノクローナル抗体の迅速な産生を媒介する(Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor), Hybridoma 17: 569-576、Schmolke他(1998) ＤＮＡ免疫化により産生されるＥ２特異的モノクローナル抗体によるヒト血清におけるＧ型肝炎ウイルス粒子の同定(Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization), J. Virol. 72: 4541-4545、Krasemann他(1999) 異例の核酸ベースの免疫化戦略を用いたタンパク質に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy), J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri他(1996) ＤＮＡ免疫化によるヘリコバクター・ピロリ細胞空胞化毒素の規定部分に対するモノクローナル抗体の生成(Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization), J. Biotechnol. 51: 191-194（その開示は参照により本明細書に完全に援用される）に見出すことができる。
【０３５９】
ＳＯＸ７及びＳＯＸ１８は、図３に示される相関系統樹に表されるようにＳＯＸ１７に対する最も密接なＳｏｘファミリー類縁体である。本発明者等は、遺伝子免疫化により産生されるＳＯＸ１７抗体がＳＯＸ１７に特異的であり、またその最も密接なファミリー成員と反応しないことを実証するために、陰性対照としてヒトＳＯＸ７ポリペプチドを用いた。特に、ＳＯＸ７及び他のタンパク質は、ヒト線維芽細胞において発現させ、続いてウェスタンブロット及びＩＣＣによりＳＯＸ１７抗体との交差反応性に関して分析した。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰ発現ベクターの産生、ヒト線維芽細胞へのそれらのトランスフェクション、並びにウェスタンブロットによる分析に関して以下の方法を利用した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰの産生に用いられる発現ベクターは、それぞれｐＣＭＶ６(OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD)、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６(Invitrogen, Carlsbad, CA)及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clonetech, Palo Alto, CA)であった。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化ＭＤＸヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン２０００(Invitrogen, Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの３６時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有する５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸中で回収した。ＮｕＰＡＧＥ（４〜１２％グラジエントポリアクリルアミド、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、且つＰＤＶＦ膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移入された細胞タンパク質１００μｇのウェスタンブロット分析は、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０(Sigma, St. Louis, MO)中のラットＳＯＸ１７抗血清の１０００倍希釈で、続いてアルカリホスファターゼ結合抗ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)でプロービングして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用されるタンパク質サイズ標準物質は、広範囲の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。
【０３６０】
図４では、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７又はＥＧＦＰ  ｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたヒト線維芽細胞から作製されるタンパク質抽出物を、ＳＯＸ１７抗体によりウェスタンブロットでプロービングした。ｈＳＯＸ１７トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物のみが、ヒトＳＯＸ１７タンパク質の予測４６Ｋｄａ分子量に近い〜５１Ｋｄａの
バンドを生じた。ヒトＳＯＸ７又はＥＧＦＰトランスフェクト細胞のいずれかから作製される抽出物に対してもＳＯＸ１７抗体の反応性は見られなかった。さらに、ＳＯＸ１７抗体は、ｈＳＯＸ１７発現構築物でトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の核を明らかに標識したが、ＥＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞は標識しなかった。したがって、ＳＯＸ１７抗体は、ＩＣＣによる特異性を示す。
【０３６１】
〔実施例４〕
胚体内胚葉のマーカーとしてのＳＯＸ１７抗体の確証
部分的に分化させたｈＥＳＣをＳＯＸ１７及びＡＦＰ抗体で同時標識して、ＳＯＸ１７抗体がヒトＳＯＸ１７タンパク質に特異的であり、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７（これは、ＳＯＸ遺伝子ファミリーサブグループＦの密接に関連する成員である（図３））及びＡＦＰはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、ＡＦＰ及びＳＯＸ７は、ＩＣＣにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正（bonifide）の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。ＳＯＸ１７抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはＡＦＰ陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図５Ａは、少数のＳＯＸ１７細胞がＡＦＰで同時標識されることを示すが、ＳＯＸ１７+細胞の区域においてＡＦＰ+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた（図５Ｂ）。同様に、壁側内胚葉は、ＳＯＸ１７を発現することが報告されているため、壁側マーカーＳＰＡＲＣ及び／又はトロンボモジュリン（ＴＭ）と共にＳＯＸ１７による抗体の同時標識を使用して、壁側内胚葉であるＳＯＸ１７+細胞を同定することができる。図６Ａ〜図６Ｃに示されるように、トロンボモジュリン及びＳＯＸ１７同時標識された壁側内胚葉細胞は、ｈＥＳ細胞の無作為分化により産生された。
【０３６２】
上記細胞標識実験を考慮して、胚体内胚葉細胞の独自性は、マーカープロファイルＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／［ＴＭlo又はＳＰＡＲＣlo］により樹立され得る。換言すると、ＳＯＸ１７マーカーの発現は、臓側内胚葉の特徴であるＡＦＰマーカー、及び壁側内胚葉の特徴であるＴＭ又はＳＰＡＲＣマーカーの発現よりも大きい。したがって、ＳＯＸ１７に関して陽性であるが、ＡＦＰに対して陰性であり、且つＴＭ又はＳＰＡＲＣに対して陰性である細胞は、胚体内胚葉である。
【０３６３】
胚体内胚葉の予測となるようなＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＴＭlo／ＳＰＡＲＣloマーカープロファイルの特異性のさらなる徴候として、ＳＯＸ１７及びＡＦＰ遺伝子発現が、抗体標識細胞の相対数と定量的に比較された。図７Ａに示されるように、レチノイン酸（臓側内胚葉誘導物質）又はアクチビンＡ（胚体内胚葉誘導物質）で処理したｈＥＳＣは、ＳＯＸ１７  ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて１０倍の差をもたらした。この結果は、ＳＯＸ１７抗体標識細胞数における１０倍の差に反映している（図７Ｂ）。さらに、図８Ａに示されるように、ｈＥＳＣのアクチビンＡ処理は、処理無しと比較して６．８倍ＡＦＰ遺伝子発現を抑制した。これは、図８Ｂ及び図８Ｃに示されるように、これらの培養物におけるＡＦＰ標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、ＡＦＰ遺伝子発現におけるこのおよそ７倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のＡＦＰ抗体標識細胞数における同様の７倍の減少の結果であることが実証された（図９Ａ及び図９Ｂ）。この結果は、Ｑ−ＰＣＲにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて有意である。
【０３６４】
ノーダルファミリー成員（ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ−ＮＡＡ）の存在下でのｈＥＳＣのインキュベーションは、経時的にＳＯＸ１７抗体標識細胞の有意な増加をもたらした。連続的なアクチビン処理の５日目までには、５０％を超える細胞がＳＯＸ
１７で標識された（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。アクチビン処理の５日後にはＡＦＰで標識された細胞はほとんど存在しなかったか、或いは全く存在しなかった。
【０３６５】
要約すると、ヒトＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端の２４２個のアミノ酸に対して産生される抗体は、ウェスタンブロットでヒトＳＯＸ１７タンパク質を同定したが、その最も密接なＳｏｘファミリー類縁体であるＳＯＸ７を認識しなかった。ＳＯＸ１７抗体は、主としてＳＯＸ１７+／ＡＦＰlo/-である分化ｈＥＳＣ培養物における細胞のサブセット（９５％を超える標識細胞）並びにＳＯＸ１７及びＡＦＰ（臓側内胚葉）に関して同時標識する少量パーセント（５％未満）の細胞を認識した。アクチビンによるｈＥＳＣ培養物の処理は、ＳＯＸ１７遺伝子発現並びにＳＯＸ１７標識細胞の顕著な増大をもたらし、ＡＦＰ  ｍＲＮＡの発現及びＡＦＰ抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。
【０３６６】
〔実施例５〕
Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）が、ｈＥＳＣ分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定は、Ｑ−ＰＣＲにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析した。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Ｑ−ＰＣＲ分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感度及び必要なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感度により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の顕在的な分化に先立つ特定の分化経路に対する偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することはできない。このため、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成功をスクリーニングするための少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Ｑ−ＰＣＲは、半ハイスループットスケール(semi-high throughput scale)の分析にて定量的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。
【０３６７】
本実施例で採用するアプローチは、Ｒｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  ３０００機器(Corbett Research)でのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ化学及び２段階ＲＴ−ＰＣＲ方式を使用して相対定量を実施することであった。このようなアプローチにより、今後のさらなるマーカー遺伝子の分析用のｃＤＮＡサンプルの積上げが可能となり、したがって、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。
【０３６８】
プライマーは、これが混入ゲノムＤＮＡからの増幅を排除すると実験的に確定されているため、エクソン間境界にわたって存在するか、又は可能であれば少なくとも８００ｂｐのイントロンにまたがるように設計された。イントロンを含有しないマーカー遺伝子を使用したか、又はマーカー遺伝子が偽遺伝子を保有した場合、ＲＮＡサンプルのＤＮアーゼＩ処理が実施された。
【０３６９】
本発明者等は、細胞サンプルにおける遺伝子発現の広範囲のプロファイル描写を提供するために、日常的にＱ−ＰＣＲを使用して、標的細胞型及び非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現を測定した。初期のｈＥＳＣ分化（具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉）に関連し、且つ確証されたプライマー組が利用可能であるマーカーを以下の表１に提供する。これらのプライマー組のヒト特異性もまた実証されている。ｈＥＳＣが多くの場合マウスフィーダー層上で増殖するため、このことは重要な事実である。最も典型的には、三重反復サンプルが各条件に関して採取され、各定量的確定に関連した生物学的可変性を評価するために二重反復で個別に分析された。
【０３７０】
ＰＣＲ鋳型を生成するために、総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ(Qiagen)を使用して単離されて、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(Molecular Probes)を用いて定量化された。総ＲＮＡ  ３５０〜５００ｎｇからの逆転写は、オリゴｄＴプライマー及び無作為なプライマーのミックスを含有するｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット(BioRad)を使用して実施した。続いて、反応物それぞれ２０μＬを総容量１００μＬにまで希釈して、３μＬをそれぞれ４００ｎＭ順方向プライマー及び逆方向プライマーを含有するＱ−ＰＣＲ反応物１０μＬ並びに２×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎマスターミックス(Qiagen)５μＬにおいて使用した。２段階サイクリングパラメータは、８５〜９４℃（具体的には各プライマー組に関するアンプリコンの融点に従って選択される）で５秒の変性、続く６０℃での４５秒のアニール／伸長を用いて使用された。各伸長段階の最後の１５秒の間に、蛍光データを回収した。３点の１０倍希釈シリーズを使用して、各実施に関する標準曲線を作成して、サイクル閾値（Ｃｔ）をこの標準曲線に基づいて定量値へ変換した。各サンプルに関する定量値は、ハウスキーピング遺伝子性能に対して正規化され、続いて平均値及び標準偏差は、三重反復サンプルに関して算出された。ＰＣＲサイクリングの終わりには、融解曲線分析を実施して、反応物の特異性を確かめた。単一の特異的産物は、そのＰＣＲアンプリコンに適したＴmでの単一ピークにより示された。さらに、逆転写酵素無しで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増幅しない。
【０３７１】
Ｑ−ＰＣＲ方法論を確立する際の第１の工程は、実験系における適切なハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）の検証であった。ＨＧは、ＲＮＡインプット、ＲＮＡ完全性及びＲＴ効率に関してサンプルにわたって正規化するのに使用されるため、正規化が意味のあるものであるためには、ＨＧがすべてのサンプル型において経時的に一定レベルの発現を示すことに価値があった。本発明者等は、分化ｈＥＳＣにおけるサイクロフィリンＧ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、β−２−ミクログロブリン、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢＳ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）及びグルクロニダーゼβ（ＧＵＳ）の発現レベルを測定した。本発明者等の結果により、β−２−ミクログロブリン発現レベルが、分化の間に増大されることが示され、したがって本発明者等は、正規化に関してこの遺伝子の使用を排除した。他の遺伝子は、経時的に、並びに複数の処理にわたって一貫した発現レベルを示した。本発明者等は規定通りに、サイクロフィリンＧ及びＧＵＳの両方を使用して、すべてのサンプルに関して正規化因子を算出した。多数のＨＧの使用は、同時に正規化プロセスに固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増大させる。
【０３７２】
正規化において使用するための遺伝子を獲得した後、続いてＱ−ＰＣＲを利用して、種々の実験処理を施したサンプルにわたる多くのマーカー遺伝子の相対遺伝子発現レベルを確定した。用いたマーカー遺伝子は、それらが初期胚葉の代表的な特異的集団において富化を示すことから選択されており、特に胚体内胚葉及び胚体外内胚葉で差次的に発現される遺伝子の組に焦点を当てている。これらの遺伝子並びにそれらの関連富化プロファイルを表１に示している。
【０３７３】
【表１】
0005404047.tif 000002
【０３７４】
多くの遺伝子が、２つ以上の胚葉で発現されるため、同じ実験内で多くの遺伝子の発現レベルを定量的に比較することが有用である。ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉で、またより程度は低いが、臓側内胚葉及び壁側内胚葉で発現される。ＳＯＸ７及びＡＦＰは、この初期発達時点で、臓側内胚葉で発現される。ＳＰＡＲＣ及びＴＭは、壁側内胚葉で発現され、ブラキュリは、初期中胚葉で発現される。
【０３７５】
胚体内胚葉細胞は、高レベルのＳＯＸ１７  ｍＲＮＡ並びに低レベルのＡＦＰ及びＳＯＸ７（臓側内胚葉）、ＳＰＡＲＣ（壁側内胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）を発現すると予測された。さらに、ＺＩＣ１は、初期外胚葉の誘導をさらに除外するのに本明細書で使用された。最後に、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂは、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉の両方で発現され、したがって、胚体内胚葉におけるＳＯＸ１７発現と相関する（表１）。表１に記載するマーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを示す代表的な実験を図１１〜図１４に示している。
【０３７６】
上記データを考慮すると、増大用量のアクチビンが、ＳＯＸ１７遺伝子発現の増大をもたらしたことが明らかである。さらに、このＳＯＸ１７発現は、胚体外内胚葉とは対照的に主として胚体内胚葉を表した。この結論は、ＳＯＸ１７遺伝子発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現と逆相関したという観察から生じる。
【０３７７】
〔実施例６〕
胚体内胚葉へのヒトＥＳ細胞の定方向分化
ヒトＥＳ細胞培養物は、それらの未分化状態を能動的に維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側内胚葉及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞（ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びＳＯＸ７発現）並びにＺＩＣ１及びネスチン（外胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ＥＳ細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して検査又は特定されていない。それ自体で、また初期状態で、ＥＳ細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特性化の大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたＥＳ細胞培養
物においてＳＯＸ１７hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意により多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。
【０３７８】
未分化ｈＥＳＣコロニーは線維芽細胞フィーダーの床上に広がるため、コロニーの縁にある細胞は、コロニーの内部に存在する細胞とは異なった別の形態を呈する。これらの外側の縁細胞の多くが、それらのあまり一様ではない、より大きな細胞体の形態により、またより高いレベルのＯＣＴ４の発現により識別され得る。ＥＳ細胞が分化し始めると、ＥＳ細胞は、未分化ＥＳ細胞に対して、ＯＣＴ４発現のレベルを上方又は下方へ変更させることが記載されている。未分化閾値を上回るか、又は下回るＯＣＴ４レベルの変更は、多能性状態から離れた分化の初期状態の表れであり得る。
【０３７９】
未分化コロニーがＳＯＸ１７免疫細胞化学により検査される場合、時折ＳＯＸ１７陽性細胞の小さな１０〜１５個の細胞クラスターが、外縁上の無作為な位置で、また未分化ｈＥＳＣコロニー間の接合部で検出された。上述したように、外側コロニー縁のこれらの散在ポケットは、コロニーのサイズが拡大し、且つより混雑してくるため、古典的なＥＳ細胞形態から離れて分化する第１の細胞のいくつかであるようであった。より若くてより小さな完全未分化コロニー（１ｍｍ未満、４〜５日齢）は、コロニー内で又はコロニーの縁でＳＯＸ１７陽性細胞を示さなかったのに対して、より老齢のより大きなコロニー（直径１〜２ｍｍ、５日齢超）は、いくつかのコロニーの外縁で、或いは上述の古典的なｈＥＳＣ形態を示さない縁の内部の領域で、ＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の散発的な単離パッチを有していた。これが有効なＳＯＸ１７抗体の第１の発達であった場合、このような初期「未分化」ＥＳ細胞培養物で発達する胚体内胚葉細胞は、これまでに実証されていない。
【０３８０】
Ｑ−ＰＣＲによるＳＯＸ１７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現レベルの逆相関に基づくと、これらのＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の大部分が、抗体同時標識による壁側内胚葉マーカーに関して陰性であろう。これは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、ＴＭ発現壁側内胚葉細胞に関して具体的に実証された。ノーダル因子であるアクチビンＡ及びアクチビンＢへの暴露は、ＴＭ発現の強度及びＴＭ陽性細胞の数の劇的な減少をもたらした。アクチビン処理培養物に関するＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体を使用した三重標識により、ＡＦＰ及びＴＭに関しても陰性であるＳＯＸ１７陽性細胞のクラスターが観察された（図１６Ａ〜図１６Ｄ）。これらは、分化ｈＥＳＣ培養物におけるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の第１の細胞標示である（図１６Ａ〜図１６Ｄ及び図１７）。
【０３８１】
上述のＳＯＸ１７抗体及びＱ−ＰＣＲツールを用いて、本発明者等は、ＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＳＰＡＲＣ／ＴＭlo胚体内胚葉細胞となるようにｈＥＳＣを効率的にプログラミングすることが可能な多数の手順を探究してきた。本発明者等は、ＳＯＸ１７遺伝子発現に関してＱ−ＰＣＲにより集団レベルで、及びＳＯＸ１７タンパク質の抗体標識により個々の細胞のレベルで測定される場合、これらの細胞の数及び増殖能力を増大させることを目的とした様々な分化プロトコルを適用した。
【０３８２】
本発明者等はまず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を創出するのに使用するためのノーダル／アクチビン／ＢＭＰのようなＴＧＦβファミリー増殖因子の影響を分析及び記載した。通常の実験では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ又はこれらの増殖因子の組合せを未分化ヒト幹細胞系ｈＥＳ  Ｃｙｔ−２５の培養物へ添加して、分化プロセスを開始させた。
【０３８３】
図１９に示されるように、１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡの添加は、分化の４日目までに、未分化ｈＥＳＣに対して、ＳＯＸ１７遺伝子発現の１９倍の誘導をもたらした。アクチビンＡと共に、アクチビンファミリーの第２の成員であるアクチビンＢを添加する
ことにより、併用アクチビン処理の４日目までに、未分化ｈＥＳＣを上回る３７倍の誘導がもたらされた。最後に、アクチビンＡ及びアクチビンＢと共に、ノーダル／アクチビン由来のＴＧＦβファミリーの第３の成員、並びにＢＭＰサブグループであるＢＭＰ４を添加することにより、未分化ｈＥＳＣの誘導の５７倍に誘導を増大させた（図１９）。アクチビン及びＢＭＰによるＳＯＸ１７誘導を、因子無しの培地対照と比較した場合、５倍、１０倍及び１５倍の誘導が４日目の時点で生じた。アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰによる三重処理の５日目までに、ＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣの７０倍より高く誘導された。これらのデータは、ノーダル／アクチビン  ＴＧＦβファミリー成員のより高い用量及びより長い処理時間がＳＯＸ１７の増大された発現をもたらすことを示している。
【０３８４】
ノーダル並びに関連分子アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＯＸ１７の発現及び胚体内胚葉形成を促進する。さらに、ＢＭＰの添加は、おそらくノーダル補助受容体であるＣｒｉｐｔｏのさらなる誘導により、改善されたＳＯＸ１７の誘導をもたらす。
【０３８５】
本発明者等は、ＢＭＰ４と一緒のアクチビンＡ及びアクチビンＢの組合せが、ＳＯＸ１７誘導、したがって胚体内胚葉形成の相加的増大をもたらすことを実証している。アクチビンＡ及びアクチビンＢと組み合わせた長期間（４日を超える）のＢＭＰ４添加は、壁側内胚葉及び臓側内胚葉並びに胚体内胚葉においてＳＯＸ１７を誘導し得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、添加の４日以内に処理からＢＭＰ４を除去することは有益である。
【０３８６】
個々の細胞レベルでのＴＧＦβ因子処理の影響を確定するために、経時的なＴＧＦβ因子添加を、ＳＯＸ１７抗体標識を使用して検査した。すでに図１０Ａ〜図１０Ｆで示したように、経時的にＳＯＸ１７標識細胞の相対数が劇的に増大した。相対定量化（図２０）は、ＳＯＸ１７標識細胞の２０倍を超える増大を示す。この結果は、細胞の数並びにＳＯＸ１７遺伝子発現レベルの両方が、ＴＧＦβ因子暴露の時間とともに増大していることを示す。図２１に示されるように、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４への暴露の４日後に、ＳＯＸ１７誘導のレベルは、未分化ｈＥＳＣに対して１６８倍に到達した。図２２は、ＳＯＸ１７陽性細胞の相対数もまた、用量応答性であったことを示す。１００ｎｇ／ｍｌ以上のアクチビンＡ用量は、ＳＯＸ１７遺伝子発現及び細胞数を強く誘導することが可能であった。
【０３８７】
ＴＧＦβファミリー成員のほかに、Ｗｎｔファミリーの分子が、胚体内胚葉の特定化及び／又は維持において役割を果たし得る。Ｗｎｔ分子の使用もまた、アクチビン単独を上回るアクチビン＋Ｗｎｔ３ａで処理したサンプルにおける増大したＳＯＸ１７遺伝子発現により示されるように、胚体内胚葉へのｈＥＳＣの分化に有益であった（図２３）。
【０３８８】
上述の実験はすべて、添加因子を伴って１０％血清を含有する組織培養培地を使用して実施した。驚くべきことに、図２４Ａ〜図２４Ｃに示されるように、血清の濃度が、添加アクチビンの存在下でＳＯＸ１７発現のレベルに対して影響することを本発明者等は発見した。血清レベルが１０％から２％へ低減すると、ＳＯＸ１７発現は、アクチビンＡ及びアクチビンＢの存在下で３倍になった。
【０３８９】
最後に、本発明者等は、アクチビン誘導ＳＯＸ１７+細胞が、図２５Ａ〜図２５Ｄに表されるように培養物中で分裂することを実証した。矢印は、ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩ標識有糸分裂プレートパターン及び位相差有糸分裂プロファイルにより明らかなように有糸分裂中であるＳＯＸ１７／ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された細胞を示す。
【０３９０】
〔実施例７〕
ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、ｈＥＳＣは、ＴＧＦβファミリー、より具体的にはアクチビン／ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の比率が、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンＡの所定濃度で、より高いレベルのＦＢＳが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンＡの非存在下では、胚体内胚葉系統へのｈＥＳＣの分化は、非常に非効率であり、ＦＢＳ濃度は、ｈＥＳＣの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。
【０３９１】
これらの実験では、０．５％、２．０％又は１０％ＦＢＳを補充し、且つ１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを伴うか、又は伴わないＲＰＭＩ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA、カタログ番号６１８７０−０３６）中で６日間増殖させることにより、ｈＥＳＣを分化させた。さらに、分化の最初の３日間にわたる０．５％〜２．０％に及ぶＦＢＳのグラジエントもまた、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと併用した。６日後に、反復サンプルを各培養条件から回収して、リアルタイム定量的ＰＣＲにより相対遺伝子発現に関して分析した。残存細胞は、ＳＯＸ１７タンパク質の免疫蛍光検出用に固定した。
【０３９２】
ＣＸＣＲ４の発現レベルは、使用した７つの培養条件にわたって劇的に変化した（図２６）。概して、ＣＸＣＲ４発現は、アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）では高く、外因性アクチビンＡを施さない培養物（ＮＦ）では低かった。さらに、Ａ１００処理培養物の中でも、ＣＸＣＲ４発現は、ＦＢＳ濃度が最も低かった場合に最も高かった。相対発現が、アクチビンＡを施さない条件（ＮＦ）により一致するように、１０％ＦＢＳ条件におけるＣＸＣＲ４レベルが顕著に低減した。
【０３９３】
上述したように、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＨＮＦ３β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特性化と一致する。７つの分化条件に関するこれらの４つの遺伝子の相対発現は、ＣＸＣＲ４の相対発現を反映する（図２７Ａ〜図２７Ｄ）。このことは、ＣＸＣＲ４もまた胚体内胚葉のマーカーであることを実証する。
【０３９４】
外胚葉系統及び中胚葉系統は、各種マーカーのそれらの発現により胚体内胚葉と識別することができる。初期中胚葉は、遺伝子ブラキュリ及びＭＯＸ１を発現する一方で、新生神経外胚葉は、ＳＯＸ１及びＺＩＣ１を発現する。図２８Ａ〜図２８Ｄは、外因性アクチビンＡを施さない培養物が、中胚葉及び外胚葉の遺伝子発現に関して優先的に富化されたこと、及びアクチビンＡ処理培養物の中でも、１０％ＦＢＳ条件がまた、中胚葉及び外胚葉のマーカー発現の増大レベルを有したことを実証している。発現のこれらのパターンはＣＸＣＲ４のパターンと反比例し、ＣＸＣＲ４が、この発達期間でｈＥＳＣに由来する中胚葉又は外胚葉中ではそれほど高度に発現されないことを示した。
【０３９５】
哺乳類発達中の初期に、胚体外系統への分化もまた起こる。ここでは、ＳＯＸ１７を包含する胚体内胚葉と共通して多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化が特に関連している。胚体内胚葉を胚体外臓側内胚葉と識別するためには、これらの２つの間を識別できるマーカーを検査するべきである。ＳＯＸ７は、臓側内胚葉では発現されるが、胚体内胚葉系統では発現されないマーカーを表す。したがって、ＳＯＸ７発現の非存在下での強固なＳＯＸ１７遺伝子発現を示す培養条件は、胚体内胚葉を含有し、臓側内胚葉を含有しない可能性が高い。ＳＯＸ７が、アクチビンＡを施さない培養物において高度に発現され、ＳＯＸ７はまた、ＦＢＳが１０％で包含される場合に、アクチビンＡの存在下でさえ増大された発現を示したことが図２８Ｅに示されている。このパターンは、ＣＸＣＲ４発現パターンの逆であり、ＣＸＣＲ４が、臓側内胚葉ではあまり高度に発現されないことを
示唆する。
【０３９６】
上述の分化条件それぞれに存在するＳＯＸ１７免疫反応性（ＳＯＸ１７+）細胞の相対数もまた確定した。ｈＥＳＣは、高用量アクチビンＡ及び低ＦＢＳ濃度（０．５％〜２．０％）の存在下で分化させた場合、ＳＯＸ１７+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に分布した。高用量アクチビンＡを使用したが、ＦＢＳは１０％（ｖ／ｖ）で包含された場合、ＳＯＸ１７+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布されるのではなく、常に単離クラスターに出現した（図２９Ａ及び図２９Ｃ、並びに図２９Ｂ及び図２９Ｅ）。外因性アクチビンＡが使用されなかった場合に、ＳＯＸ１７+細胞のさらなる減少が観察された。これらの条件下では、ＳＯＸ１７+細胞はまたクラスターに出現し、これらのクラスターは、高アクチビンＡ低ＦＢＳ処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった（図２９Ｃ及び図２９Ｆ）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。
【０３９７】
〔実施例８〕
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンＡの用量はまた、胚体内胚葉をｈＥＳＣから得ることができる効率に影響を及ぼす。本実施例は、アクチビンＡの用量を増大させることにより培養物におけるＣＸＣＲ４+細胞の比率が増大することを実証する。
【０３９８】
ｈＥＳＣは、０．５％〜２％ＦＢＳ（分化の最初の３日にわたって０．５％から１．０％、そして２．０％へ増大される）及び０、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充したＲＰＭＩ培地中で分化させた。分化の７日後に、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ（ＥＤＴＡ）を含有するＣａ2+／Ｍｇ2+を伴わないＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を解離させた。細胞は、３５μｍナイロンフィルタに通して濾過して、計数して、ペレット化した。ペレットは、少量の５０％ヒト血清／５０％正常ロバ血清中に再懸濁させて、氷上で２分間インキュベートして、非特異的抗体結合部位をブロックした。これに、５０μｌ（およそ１０5個の細胞を含有する）当たり１μｌのマウス抗ＣＸＣＲ４抗体（Abcam、カタログ番号ａｂ１０４０３−１００）を添加して、標識を氷上で４５分間進めた。細胞は、２％ヒト血清を含有するＰＢＳ（緩衝液）５ｍｌを添加することにより洗浄して、ペレット化した。緩衝液５ｍｌによる２回目の洗浄を完了させた後、細胞は、１０5個の細胞当たり緩衝液５０μｌ中に再懸濁させた。二次抗体（ＦＩＴＣ結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、カタログ番号７１５−０９６−１５１）を最終濃度５μｇ／ｍｌで添加して、３０分間標識させた後、上述のように緩衝液中で２回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に５×１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps Research Institute)にてスタッフによりＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ(Beckton Dickenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的ＰＣＲによる遺伝子発現分析用の総ＲＮＡの単離のために、ＲＬＴ溶解緩衝液(Qiagen)に直接回収した。
【０３９９】
フローサイトメトリーにより確定される場合のＣＸＣＲ４+細胞の数は、アクチビンＡの用量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増加することが観察された（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。ＣＸＣＲ４+細胞は、Ｒ４ゲート内に納まるものであり、このゲートは、事象の０．２％がＲ４ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。ＣＸＣＲ４+細胞数の劇的な増大は、アクチビンＡ用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝子発現における強固な増大と相関する（図３１Ａ〜図３１Ｄ）。
【０４００】
〔実施例９〕
ＣＸＣＲ４陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚
葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を激減させる
上記実施例８で同定されるＣＸＣＲ４+細胞及びＣＸＣＲ４-細胞を回収して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に確定した。
【０４０１】
ＣＸＣＲ４遺伝子発現の相対レベルは、アクチビンＡの用量の増大に伴って劇的に増大した（図３２）。これは、ＣＸＣＲ４+細胞のアクチビンＡ用量依存的増大と極めて強く相関した（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。また、各集団からのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、この集団中のほぼすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を回収するためのＦＡＣＳ方法の効率を実証している。
【０４０２】
遺伝子発現分析により、ＣＸＣＲ４+細胞は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の大部分を含有するだけでなく、ＣＸＣＲ４+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現も含有することが明らかとなった。図３１Ａ〜図３１Ｄに示されるように、ＣＸＣＲ４+細胞はさらに、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＨＮＦ３Ｂ及びＭＩＸＬ１に関してＡ１００母集団を上回って富化した。さらに、ＣＸＣＲ４-分画は、これらの胚体内胚葉マーカーに関して非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、ＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図３３Ａ〜図３３Ｄは、ＣＸＣＲ４+細胞が、Ａ１００母集団に対してブラキュリ、ＭＯＸ１、ＺＩＣ１及びＳＯＸ７の遺伝子発現に関して激減したことを示す。このＡ１００母集団は、低用量条件又はアクチビンＡ無しの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンＡの存在下で分化されるｈＥＳＣからのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内胚葉である集団を生じることを示す。
【０４０３】
〔実施例１０〕
ＣＸＣＲ４を使用した細胞集団中の胚体内胚葉細胞の定量
本明細書中ですでに確定されるような、及び２００３年１２月２３日に出願された「胚体内胚葉(DEFINITIVE ENDODERM)」と題する米国仮特許出願第６０／５３２，００４号で確定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量を確認するために、ＣＸＣＲ４及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をＦＡＣＳにより分析した。
【０４０４】
上記実施例に記載されるような方法を使用して、ｈＥＳＣを分化させて、胚体内胚葉を産生した。特に、分化細胞培養物における収率及び純度を増大させるために、培地の血清濃度を以下の通りに制御した：１日目には０．２％ＦＢＳ、２日目には１．０％ＦＢＳ及び３〜６日目には２．０％ＦＢＳ。分化培養物は、３つの細胞表面エピトープであるＥ−カドヘリン、ＣＸＣＲ４及びトロンボモジュリンを使用して、ＦＡＣＳにより選別した。続いて、選別した細胞集団をＱ−ＰＣＲにより分析して、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対発現レベルを確定した。最適に分化させた培地から採取されるＣＸＣＲ４選別細胞は、９８％を超える純度の胚体内胚葉細胞の単離をもたらした。
【０４０５】
表２は、本明細書中に記載する方法を使用してｈＥＳＣから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果を示す。
【０４０６】
【表２】
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【０４０７】
特に、表２は、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７陽性細胞（内胚葉）が細胞培養物における細胞の７０％〜８０％を構成したことを示す。これらのＳＯＸ１７発現細胞のうち、少なくとも２％がＴＭ（壁側内胚葉）を発現し、１％未満がＡＦＰ（臓側内胚葉）を発現した。ＴＭ陽性細胞とＡＦＰ陽性細胞との比率（組み合わせた壁側内胚葉及び臓側内胚葉、総計３％）をＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率から差し引きした後、細胞培養物の約６７％〜約７７％が胚体内胚葉であったことが観察され得る。およそ１０％の細胞が、ｈＥＳＣに関するマーカーであるＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）に関して陽性であり、細胞の約１０〜２０％が他の細胞型であった。
【０４０８】
ＦＡＣＳ分離前に得られる分化細胞培養物における胚体内胚葉の純度は、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下にＦＢＳ濃度を維持することにより、上述の低血清手順と比較して改善させることができることを本発明者等は発見している。しかしながら、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下に細胞培養物を維持することはまた、産生される胚体内胚葉細胞の総数の低減をもたらす。
【０４０９】
本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも長い間、アクチビンの存在下で培養において維持及び拡大されている。このような場合では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β発現は、培養期間にわたって維持される。さらに、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＺＩＣ１及びＢＲＡＣＨは、これらの培養物では検出されなかった。このような細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも実質的に長い間、培養において維持及び拡大させることができる可能性が高い。
【０４１０】
〔実施例１１〕
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からＲＮＡを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製集団由来のＲＮＡの遺伝子チップ分析により分析した。Ｑ−ＰＣＲも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の潜在性をさらに研究した。
【０４１１】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、２０％ノックアウト血清代替物、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持された。ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトアクチビンＡ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中で５日間培養することにより胚体内胚葉へ分化させた。ＦＢＳの濃度は、各日以下の通りに変化させた：０．１％（１日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。
【０４１２】
遺伝子発現分析用のｈＥＳＣ及び胚体内胚葉の精製集団を得るために、細胞を蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）により単離した。免疫精製は、ｈＥＳＣに関してはＳＳＥＡ４抗原（R&D Systems、カタログ番号ＦＡＢ１４３５Ｐ）を使用して、また胚体内胚葉に関してはＣＸＣＲ４（R&D Systems、カタログ番号ＦＡＢ１７０Ｐ）を使用して達成された。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen、カタログ番号２５３００−０５４）を使用して解離させて、２％ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、氷上で１０分間１００％ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清８００μｌ中で５×１０6個の細胞にフィコエリトリン結合抗体２００μｌを添加することにより氷上で３０分間実施した。細胞をＰＢＳ緩衝液８ｍｌで２度洗浄して、同１ｍｌ中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ単離は、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ(BD Biosciences)を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された。細胞は、ＲＬＴ溶解緩衝液に直接回収して、ＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ(Qiagen)により単離した。
【０４１３】
精製ＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム及びＵ１３３プラス２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して、発現プロファイルデータの作成のためにExpression Analysis(Durham, NC)に複製して提出した。提示されたデータは、２つの集団、すなわちｈＥＳＣと胚体内胚葉との間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。ｈＥＳＣに見出される発現レベルを上回る強固な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉の高度に特性化される新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにＱ−ＰＣＲによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、また経時的なｈＥＳＣ分化のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。
【０４１４】
図３４Ａ〜図３４Ｍは、或る特定のマーカーに関する遺伝子発現の結果を示す。結果は、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの添加の１日後、３日後及び５日後に分析した細胞培養物、５日目の分化手順の終わりに精製されたＣＸＣＲ４発現性胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）に関して、及び精製ｈＥＳＣにおいて表示される。図３４Ｃ及び図３４Ｇ〜図３４Ｍの比較により、６つのマーカー遺伝子、すなわちＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、互いにほぼ同一であり、且つまたＣＸＣＲ４の発現のパターン及びＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比と同一である発現パターンを示す。上述したように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉並びにＳＯＸ７発現胚体外内胚葉の両方において発現される。ＳＯＸ７は胚体内胚葉で発現されないため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比は、全体として集団において証明されるＳＯＸ１７発現への胚体内胚葉の寄与の信頼性高い推定を提供する。パネルＣに対するパネルＧ〜Ｌ及びＭの類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、胚体内胚葉のマーカーである可能性が高いこと、及びそれらが胚体外内胚葉細胞で有意に発現されないことを示す。
【０４１５】
本明細書中に記載されるＱ−ＰＣＲの結果は、ＩＣＣによりさらに確認することができることが理解されよう。
【０４１６】
〔実施例１２〕
レチノイン酸及びＦＧＦ−１０は、胚体内胚葉培養物において特異的にＰＤＸ１を誘導する
以下の実験は、ＲＡ及びＦＧＦ−１０が胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１の発現を誘導することを実証する。
【０４１７】
ヒト胚性幹細胞をアクチビン有り又は無しで４日間培養した。４日目に、１μＭ  ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０を細胞培養物へ添加した。ＲＡ／ＦＧＦ−１０添加の４８時間後に、ＰＤＸ１マーカー遺伝子及び前腸内胚葉に特異的でない他のマーカー遺伝
子の発現をＱ−ＰＣＲにより定量した。
【０４１８】
胚体内胚葉細胞へのＲＡの適用は、臓側内胚葉（ＳＯＸ７、ＡＦＰ）、神経（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）又はニューロン（ＮＦＭ）遺伝子発現マーカーの発現を増大させずに（図３６Ａ〜図３６Ｆを参照）、ＰＤＸ１遺伝子発現の強固な増大を引き起こした（図３５を参照）。ＰＤＸ１遺伝子発現は、１μＭ  ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０への暴露の４８時間後に、胚体内胚葉において観察されるものよりもおよそ５００倍高いレベルまで誘導された。さらに、これらの結果は、実質的なＰＤＸ１誘導が、ＲＡ適用に先立ってアクチビンを施さない培養物に比べてアクチビン処理細胞培養物に見出される１６０倍高いＰＤＸ１発現により示されるように、胚体内胚葉（ＳＯＸ１７）に予め分化させた細胞培養物においてのみ起こったことを示す。
【０４１９】
〔実施例１３〕
ＦＧＦ−１０は、ＲＡ単独を上回るＰＤＸ１発現のさらなる増大を提供する
本実施例は、ＲＡ及びＦＧＦ−１０の組合せが、ＲＡ単独よりも大いにＰＤＸ１発現を誘導することを示す。
【０４２０】
これまでの実施例と同様に、ｈＥＳＣは、アクチビン有り又は無しで４日間培養した。４日目に、細胞を以下のうちの１つで処理した：１μＭ  ＲＡ単独、ＦＧＦ−４又はＦＧＦ−１０のいずれかと併用した１μＭ  ＲＡ、或いはＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０の両方と併用した１μＭ  ＲＡ。ＰＤＸ１、ＳＯＸ７及びＮＦＭの発現は、ＲＡ又はＲＡ／ＦＧＦの９６時間後に、Ｑ−ＰＣＲにより定量された。
【０４２１】
アクチビン、これに続くレチノイン酸によるｈＥＳＣ培養物の処理は、ＰＤＸ１遺伝子発現の６０倍の増大を誘導した。ＲＡ処理物へのＦＧＦ−４の添加は、わずかに多いＰＤＸ１を誘導した（ＲＡ単独に対しておよそ３倍）。しかしながら、ＦＧＦ−１０及びレチノイン酸を共に添加することにより、ＰＤＸ１の誘導はさらに、ＲＡ単独に対して６０倍増強された（図３７Ａを参照）。この非常に強固なＰＤＸ１誘導は、アクチビン無し又はＲＡ／ＦＧＦ処理を用いた場合よりも１４００倍超高かった。興味深いことに、ＦＧＦ−４及びＦＧＦ−１０の添加は、ＦＧＦ−１０の有益な効果を同時に根絶させて、ＦＧＦ−４添加に起因してわずかなＰＤＸ１の増大のみをもたらした。
【０４２２】
ＲＡ／ＦＧＦ−４又はＲＡ／ＦＧＦ−１０の組合せの添加は、ＲＡ／ＦＧＦの組合せに暴露させない細胞と比較した場合、前腸内胚葉に関連しないマーカー遺伝子の発現を増大させなかった（図３７Ｂ及び図３７Ｃを参照）。
【０４２３】
〔実施例１４〕
レチノイン酸用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで前方−後方（Ａ−Ｐ）位置に影響を及ぼす
ＲＡの用量がｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物のＡ−Ｐ位置に影響を及ぼすかどうかを判定するために、以下の実験を実施した。
【０４２４】
ヒト胚性幹細胞は、アクチビン有り又は無しで４日間培養した。４日目に、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−１０は、０．０４μＭ、０．２μＭ又は１．０μＭで、ＲＡを併用して培養物に添加された。ＰＤＸ１マーカー遺伝子の発現並びに前腸内胚葉に特異的でない他のマーカーの発現をＱ−ＰＣＲにより定量化した。
【０４２５】
５０ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ−１０と併用した様々な用量でのレチノイン酸の添加は、特異的な前方−後方位置パターンと相関する差次的遺伝子発現パターンを誘導した。ＲＡの最大用量（１μＭ）は、前方の内胚葉マーカー（ＨＯＸＡ３）の発現を優先的に誘導し、またＰＤＸ１の最も強固な増大をもたらした（図３８Ａ及び図３８Ｂ）。ＲＡの中間用量
（０．２μＭ）は、中腸内胚葉マーカー（ＣＤＸ１、ＨＯＸＣ６）を誘導した（図３８Ｃ及び図４１Ｅを参照）のに対して、ＲＡの最小用量（０．０４μＭ）は、後腸内胚葉マーカー（ＨＯＸＡ１３）を優先的に誘導した（図３８Ｄを参照）。ＲＡ用量は、神経（ＳＯＸ１）又はニューロン（ＮＦＭ）マーカーのいずれかの相対発現に対して実質的に影響しなかった（図３８Ｆ及び図３８Ｇを参照）。本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでモルフォゲンとしての、特に分化ｈＥＳＣの内胚葉誘導体のモルフォゲンとしてのＲＡの使用を示す。
【０４２６】
〔実施例１５〕
Ｂ２７サプリメントの使用は、ＰＤＸ１の発現を増強する
胚体内胚葉におけるＰＤＸ１発現は、多数の因子の使用及び細胞増殖／分化状態により影響を与え得る。以下の実験では、本発明者等はＢ２７サプリメントの使用が胚体内胚葉細胞においてＰＤＸ１の発現を増強することを示す。
【０４２７】
ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で増殖させた未分化ｈＥＳ細胞を高用量のアクチビンＡ（０．５〜２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２中１００〜２００ｎｇ／ｍｌ）で４日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。アクチビンＡ無しの対照に、アクチビンＡを添加せずに０．５〜２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２を施した。４日目に、培養物に、２％ＦＢＳ中のアクチビンＡ無し（無し）及び２％血清代替物中のアクチビンＡ無し（ＳＲ）、又は２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２中の２μＭ  ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０と共に５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（無し、＋ＦＢＳ、＋Ｂ２７）、並びに同様に２％血清代替物（ＳＲ）の２μＭ  ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０と共に５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡのいずれかを施した。Ｂ２７サプリメント(Gibco/BRL)は、２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ１２へ直接５０倍希釈として添加した（＋Ｂ２７）。二重反復細胞サンプルを各点に関して採取して、総ＲＮＡを単離して、上述のようにＱ−ＰＣＲへ付した。
【０４２８】
図３９Ａ〜図３９Ｅは、無血清サプリメントＢ２７が、血清無しで増殖させた細胞におけるこのようなマーカー遺伝子発現と比較した場合、前腸内胚葉に特異的でないマーカー遺伝子の発現の増大を誘導することなく、ＰＤＸ１遺伝子発現の誘導にさらなる有益性を提供することを示す。
【０４２９】
〔実施例１６〕
ＰＤＸ１の誘導を増強するためのアクチビンＢの使用
本実施例は、アクチビンＢの使用が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物においてＰＤＸ１陽性細胞へのＰＤＸ１陰性細胞の分化を増強することを示す。
【０４３０】
ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で増殖させた未分化ｈＥＳＣ細胞を低血清／ＲＰＭＩ中の高用量のアクチビンＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）で６日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。ＦＢＳ用量は、１日目に０％、２日目に０．２％、及び３〜６日目に２％であった。胚体内胚葉産生に関する陰性対照（ＮＦ）には、アクチビンＡを添加せずに２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩを施した。ＰＤＸ１発現を誘導するために、培養物それぞれに、６日目に２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中で２μＭにてレチノイン酸を施した。１日目〜５日目にアクチビンＡで処置した培養物に、種々の用量で組み合せたアクチビンＡ及びアクチビンＢを供給したか、或いは５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ単独状態を維持した。アクチビンＡ無しの対照培養物（ＮＦ）にはアクチビンＡもアクチビンＢも供給しなかった。このＲＡ／アクチビン処理は３日間実施して、３日目にＰＤＸ１遺伝子発現を二重反復細胞サンプルからのＱ−ＰＣＲにより測定した。
【０４３１】
図４０Ａは、２５ｎｇ／ｍｌ（Ａ２５）又は５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）のアクチビンＡ
の存在下での１０〜５０ｎｇ／ｍｌ（ａ１０、ａ２５及びａ５０）の範囲の用量でのアクチビンＢの添加が、５０ｎｇ／ｍｌでアクチビンＡのみを施した培養物を少なくとも２倍ＰＤＸ１発現を増大させたことを示す。アクチビンＢの添加の結果としてのＰＤＸ１の増大は、発達におけるこの時点で肝臓並びに膵臓に関するマーカーであるＨＮＦ６発現の増大を伴わなかった（図４０Ｂを参照）。この結果は、膵臓へ分化している細胞の比率が肝臓に比べて増大していることを示唆する。
【０４３２】
〔実施例１７〕
ＰＤＸ１の誘導を増強するための血清用量の使用
胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１の発現は、分化プロセス全体にわたって細胞培養物中に存在する血清の量により影響を受ける。以下の実験は、ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉へのｈＥＳＣの分化中の培養物における血清のレベルが、ＰＤＸ１陽性内胚葉へのこれらの細胞のさらなる分化中のＰＤＸ１の発現に影響することを示す。
【０４３３】
ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で増殖させた未分化ｈＥＳＣを、低血清／ＲＰＭＩ中の高用量のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で５日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。ＦＢＳ用量は、１日目に０．１％、２日目に０．５％、及び３〜５日目に０．５％、２％又は１０％のいずれかであった。アクチビンＡ無しの対照（ＮＦ）には、毎日同じＦＢＳ／ＲＰＭＩ投与を施したが、アクチビンＡは添加しなかった。ＰＤＸ１発現は、ＲＡの添加により６日目に誘導を開始した。６〜７日目中に、培養物に、０．５％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中で２μＭにて、８日目に１μＭにて、及び９〜１１日目に０．２μＭにてレチノイン酸を施した。アクチビンＡは、レチノイン酸処理中５０ｎｇ／ｍｌへ低減させて、アクチビンＡ無しの対照（ＮＦ）から取り去った。
【０４３４】
図４１Ａは、３日間の胚体内胚葉誘導（３日目、４日目及び５日目）中のＦＢＳ投与は、レチノイン酸処理中にＰＤＸ１遺伝子発現の誘導を変化させる持続的な能力を有したことを示す。これは、ＺＩＣ１（図４１Ｂ）又はＳＯＸ７（図４１Ｃ）遺伝子発現の発現パターンの有意な変更を伴わなかった。
【０４３５】
〔実施例１８〕
ＰＤＸ１の誘導を増強するための条件培地の使用
また、胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１の発現に影響を与える他の因子及び成長条件を研究した。以下の実験は、ＰＤＸ１陽性内胚葉細胞へのＰＤＸ１陰性胚体内胚葉細胞の分化に対する条件培地の影響を示す。
【０４３６】
ヒト胚性幹細胞は、マウス胚線維芽細胞フィーダー上で増殖させた未分化ｈＥＳＣ細胞を、低血清／ＲＰＭＩ中の高用量のアクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）で５日間処理することにより胚体内胚葉へ分化するように誘導された。ＦＢＳ用量は、１日目に０．２％、２日目に０．５％、及び３〜５日目に２％であった。
【０４３７】
続いて、５日間のアクチビンＡ処理により生成された胚体内胚葉培養物は、２５ｎｇ／ｍｌでアクチビンＡを含有する２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ中でのＲＡの添加により、ＰＤＸ１発現内胚葉へ分化するように４日間誘導させた。ＲＡは、添加の最初の２日間に関しては２μＭ、３日目には１μＭ、及び４日目には０．５μＭであった。ＰＤＸ１誘導に関するこの基本培地は、新鮮な状態で（２Ａ２５Ｒ）或いは４つの異なる細胞集団のうちの１つにより２４時間条件付けした後に供給された。条件培地（ＣＭ）は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦＣＭ）から、或いは３つの条件、ｉ）３％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ（ＣＭ２）又はｉｉ）アクチビンＡ（ＣＭ３）又はｉｉｉ）骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）（ＣＭ４）のうちの１つによりまず５日間分化させたｈＥＳＣから生成した。アクチビンＡ又はＢＭ
Ｐ４因子は、上述したものと同じＦＢＳ投与レジメン（０．２％、０．５％、２％）下で１００ｎｇ／ｍｌで供給された。これらの３つの異なる分化パラダイムは、ＰＤＸ１誘導培地が条件付けられ得るヒト細胞の３つの非常に異なる集団を生じる。増殖因子を添加しない３％ＦＢＳ（ＮＦ）は、大部分が胚体外内胚葉細胞、外胚葉細胞及び中胚葉細胞で構成される不均一集団を生じる。アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）は、大部分の胚体内胚葉をもたらし、ＢＭＰ４処理培養物（Ｂ１００）は、主として栄養外胚葉及び幾らかの胚体外内胚葉をもたらす。
【０４３８】
図４２Ａは、ＰＤＸ１がＲＡ処理の最初の２日間にわたって新鮮な培地及び条件培地において同等に誘導されたことを示す。しかしながら、３日目までには、ＰＤＸ１発現は、新鮮な培地及びＭＥＦ条件培地処理において減少し始めた。分化されたｈＥＳＣは、維持、或いは新鮮な培地よりも３〜４倍高いレベルでＰＤＸ１遺伝子発現のさらなる増大をもたらす条件培地を生じた。ｈＥＳＣ条件培地において高ＰＤＸ１発現を維持する効果はさらに、ＲＡ処理の４日目に増幅されて、新鮮な培地よりも６〜７倍高いレベルを達成した。図４２Ｂは、条件培地処理が、ＣＤＸ１遺伝子発現の相当低いレベルをもたらし、遺伝子は、ＰＤＸ１発現内胚葉の領域では発現されなかったことを示す。これは、ＰＤＸ１発現内胚葉の全体的な純度が、分化されたｈＥＳＣ培養物から生成される条件培地で胚体内胚葉を処理することによりかなり増強されたことを示している。
【０４３９】
図４３は、ＰＤＸ１遺伝子発現が、胚体内胚葉細胞へ適用させる条件培地の量に対する陽性の用量応答を示したことを示す。各プレートへ添加される培地の総容量は５ｍｌであり、条件培地の指示容量（図４３を参照）は、新鮮な培地（Ａ２５Ｒ）へ希釈した。新鮮な培地４ｍｌへ添加される条件培地ちょうど１ｍｌは、依然として新鮮な培地単独５ｍｌよりも高いＰＤＸ１発現レベルを誘導及び維持することが可能であったことに留意されたい。これは、ＰＤＸ１発現内胚葉の誘導に関する条件培地の有益な効果が、細胞から条件培地への幾らかの物質（単数又は複数）の放出に依存的であること、及びこの物質（単数又は複数）が、ＰＤＸ１発現内胚葉の産生を用量依存的に増強することを示唆する。
【０４４０】
〔実施例１９〕
ＰＤＸ１へ結合する抗体の確証
ＰＤＸ１へ結合する抗体は、細胞集団中のＰＤＸ１発現の誘導をモニタリングするための有用なツールである。本実施例は、ＰＤＸ１に対するウサギポリクローナル抗体及びＩｇＹ抗体を使用して、このタンパク質の存在を検出することができることを示す。
【０４４１】
第１の実験では、細胞溶解産物におけるＰＤＸ１と結合するＩｇＹ抗ＰＤＸ１（ＩｇＹ
α−ＰＤＸ１）抗体をウェスタンブロット分析により確証した。この分析で、ＭＤＸ１２ヒト線維芽細胞又はＰＤＸ１発現ベクターで予め２４時間トランスフェクトしたＭＤＸ１２細胞由来の総細胞溶解産物５０μｇへのＩｇＹ  α−ＰＤＸ１抗体の結合を比較した。細胞溶解産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離して、エレクトロブロッティングにより膜へ転写して、その後ＩｇＹ  α−ＰＤＸ１一次抗血清で、それに続いてアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ＩｇＹ（Ｒｂ  α−ＩｇＹ）二次抗体でプロービングした。一次抗体及び二次抗体の種々の希釈は、細長い膜（strips of the membrane）を分離するために以下の組合せで適用した：Ａ（５００倍一次希釈、１０，０００倍二次希釈）、Ｂ（２，０００倍、１０，０００倍）、Ｃ（５００倍、４０，０００倍）、Ｄ（２，０００倍、４０，０００倍）、Ｅ（８，０００倍、４０，０００倍）。
【０４４２】
結合は、試験した抗体の組合せすべてにてＰＤＸ１発現ベクター（ＰＤＸ１陽性）でトランスフェクトした細胞中で検出された。最大濃度の一次抗体及び二次抗体の両方を共に使用する場合（組合せＡ）で、結合は、トランスフェクトしていない（ＰＤＸ１陰性）線維芽細胞において観察されるのみであった。このような非特異的結合は、トランスフェク
トした線維芽細胞及びトランスフェクトしていない線維芽細胞の両方においてＰＤＸ１よりもわずかに高い分子量でのさらなるバンドの検出を特徴とした。
【０４４３】
第２の実験では、ＰＤＸ１へのポリクローナルウサギ抗ＰＤＸ１（Ｒｂ  α−ＰＤＸ１）抗体の結合を免疫組織化学により試験した。このような実験用のＰＤＸ１発現細胞を産生するために、ＭＳ１−Ｖ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２４６０）をＰＤＸ１ＥＧＦＰの発現ベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clontech)を用いて構築した）で一過的にトランスフェクトした。続いて、トランスフェクト細胞をＲｂ  α−ＰＤＸ１及びα−ＥＧＦＰ抗血清で標識した。トランスフェクト細胞は、Ｃｙ５結合二次抗体の使用によるＥＧＦＰ蛍光並びにα−ＥＧＦＰ免疫組織化学の両方により可視化した。ＰＤＸ１免疫蛍光は、α−Ｒｂ  Ｃｙ３結合二次抗体の使用により可視化した。
【０４４４】
Ｒｂ  α−ＰＤＸ１及びα−ＥＧＰＦ抗体の結合は、ＧＰＦ発現と共局在化した。
【０４４５】
〔実施例２０〕
ヒト膵臓組織の免疫組織化学
本実施例は、ＰＤＸ１に対する特異性を有する抗体を使用して、免疫組織化学によりヒトＰＤＸ１陽性細胞を同定することができることを示す。
【０４４６】
第１の実験では、ヒト膵臓のパラフィン包埋切片を、２００倍希釈でのモルモット抗インスリン（Ｇｐ  α−Ｉｎｓ）一次抗体で、これに続いて１００倍希釈でのＣｙ２へ結合されたイヌ抗モルモット（Ｄ  α−ＧＰ）二次抗体でインスリンに関して染色した。第２の実験では、ヒト膵臓の同じパラフィン包埋切片を、４０００倍希釈でのＩｇＹ  α−ＰＤＸ１一次抗体で、これに続いて３００倍希釈でのＡＦ５５５へ結合されたＲｂ  α−ＩｇＹ二次抗体でＰＤＸ１に関して染色した。第１の実験及び第２の実験から回収した画像を併せた。第３の実験では、ＩｇＹ  α−ＰＤＸ１抗体で染色した細胞をＤＡＰＩでも染色した。
【０４４７】
ヒト膵臓切片の分析により、ランゲルハンス島の強力な染色の存在が明らかとなった。最強のＰＤＸ１シグナルは島（インスリン陽性）に出現したが、弱い染色は腺房組織（インスリン陰性）でも観察された。ＤＡＰＩ及びＰＤＸ１同時染色は、ＰＤＸ１が、大部分（しかし、排他的ではない）核へ局在化したことを示す。
【０４４８】
〔実施例２１〕
レチノイン酸処理細胞からのＰＤＸ１の免疫沈降
ＲＡの存在下で分化させた胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１発現、及びＲＡを用いて分化させなかった胚体内胚葉細胞におけるＰＤＸ１の欠如をさらに確認するために、ウサギ抗ＰＤＸ１（Ｒｂ  α−ＰＤＸ１）抗体を使用して、ＲＡ分化させた胚体内胚葉細胞及び未分化の胚体内胚葉細胞の両方からＰＤＸ１を免疫沈降させた。免疫沈降させたＲＡは、ＩｇＹ  α−ＰＤＸ１抗体を使用してウェスタンブロット分析により検出した。
【０４４９】
免疫沈降用の未分化の胚体内胚葉細胞溶解産物及び分化した胚体内胚葉細胞溶解産物を得るために、ｈＥＳＣを低血清中で１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡで５日間処理した（胚体内胚葉）後、５０ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡ及び２μＭのオールトランスＲＡで２日間（１μＭで１日間、及び０．２μＭで１日間）処理した（ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉）。陽性対照として、細胞溶解産物はまた、ＰＤＸ１発現ベクターでトランスフェクトしたＭＳ１−Ｖ細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−２４６０）からも調製した。ＰＤＸ１は、Ｒｂ  α−ＰＤＸ１及びウサギ特異的二次抗体を各溶解産物へ添加することにより免疫沈降させた。沈降物を遠心分離により回収した。免疫沈降物をＳＤＳ含有緩衝液中に溶解させた後、ポリアクリルアミドゲル上へ充填した。分離後、タンパク質をエレクトロブロッティン
グにより膜へ転写し、その後ＩｇＹ  α−ＰＤＸ１一次抗体、これに続いて標識Ｒｂ  α−ＩｇＹ二次抗体でプロービングした。
【０４５０】
ＭＳ１−Ｖ陽性対照細胞から回収した免疫沈降物並びに８日目（レーンｄ８、ＲＡ処理の開始の３日後）及び９日目（レーンｄ９、ＲＡの開始の４日後）の細胞からの免疫沈降物は、ＰＤＸ１タンパク質に関して陽性であった（図４４）。未分化の胚体内胚葉細胞（すなわち、アクチビンＡで処理した５日目の細胞−図４４において（Ａ）で示す）及び未分化のｈＥＳＣ（すなわち、未処理の５日目の細胞−図４４において（ＮＦ）で示す）から得られた沈降物はＰＤＸ１に関して陰性であった。
【０４５１】
〔実施例２２〕
ＰＤＸ１プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系の生成
細胞単離に関してＰＤＸ１マーカーを使用するために、本発明者等は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞を発現可能なレポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けした。本実施例は、ＰＤＸ１調節領域の制御下でレポーター遺伝子を含有するレポーターカセットを含むベクターの構築について記載する。本実施例はまた、このベクターでトランスフェクトした細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）、並びにそのゲノムに組み込まれたこのレポーターカセットを有する細胞の調製について記載する。
【０４５２】
レポーター遺伝子で遺伝的にタグ付けしたＰＤＸ１発現胚体内胚葉細胞系は、ＰＤＸ１遺伝子の調節領域（プロモーター）の制御下にＧＦＰレポーター遺伝子を配置させることにより構築された。まず、ＥＧＦＰ発現がヒトＰＤＸ１遺伝子プロモーターにより誘導されるプラスミド構築物は、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clontech)のＣＭＶプロモーターをＰＤＸ１転写開始部位の上流約４．４キロ塩基対（ｋｂ）から下流約８５塩基対（ｂｐ）に及ぶヌクレオチド配列を含むヒトＰＤＸ１制御領域（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ１９２４９６）で置き換えることにより生成された。この領域は、ＰＤＸ１遺伝子の特徴とされる調節要素を含有し、トランスジェニックマウスにおいて正常なＰＤＸ１発現パターンを付与するのに十分である。得られたベクターにおいて、ＥＦＧＰの発現は、ＰＤＸ１プロモーターにより誘導される。いくつかの実験では、このベクターは、ｈＥＳＣへトランスフェクトすることができる。
【０４５３】
ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰカセットを上記ベクターから切除して、続いてホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する選択ベクターへサブクローニングした。選択カセットは、カセットの除去を可能にするためにｆｌｐリコンビナーゼ認識部位に隣接された。この選択ベクターを線状化した後、標準的なリポフェクション方法を使用してｈＥＳＣへ導入した。Ｇ４１８における選択の１０〜１４日後に、未分化のトランスジェニックｈＥＳＣクローンを単離及び拡大させた。
【０４５４】
〔実施例２３〕
ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の単離
以下の実施例は、ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣがＰＤＸ１陽性内胚葉細胞へ分化され、これに続いて蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）により単離され得ることを実証する。
【０４５５】
ＰＤＸ１プロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣは、アクチビンＡ含有培地中で５日間、これに続いてアクチビンＡ及びＲＡを含む培地中で２日間分化させた。続いて、分化細胞は、トリプシン消化により回収して、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ
ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ上でＲＮＡ溶解緩衝液又はＰＢＳへ直接選別した。単一の生細胞のサンプルが、ＥＧＦＰに関してゲーティングすることなく採取され（Ｌｉｖｅ）、単一の
生細胞は、ＥＧＦＰ陽性（ＧＦＰ）及びＧＦＰ陰性（Ｎｅｇ）集団へゲーティングされた。一実験では、ＥＧＦＰ陽性分画は、蛍光強度に従って２つの同様のサイズの集団に分離された（Ｈｉ及びＬｏ）。
【０４５６】
選別後、細胞集団は、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学の両方により分析した。Ｑ−ＰＣＲに関して、ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムを使用して調製されて、その後ｃＤＮＡへ変換された。Ｑ−ＰＣＲは、上述したように実施した。免疫組織化学分析に関して、細胞をＰＢＳ中に選別して、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定して、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離機を使用してスライドガラス上へ接着させた。サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９）に対する一次抗体はChemicon製であり、肝細胞核因子３β（ＨＮＦ３β）に対する一次抗体はSanta Cruz製であり、グルコーストランスポーター２（ＧＬＵＴ２）に対する一次抗体はR&D systems製であった。ＦＩＴＣ(緑色）又はローダミン（赤色）に結合させた適切な二次抗体を使用して、一次抗体の結合を検出した。
【０４５７】
分化細胞の典型的なＦＡＣＳ選別を図４５に示す。本実施例における単離ＰＤＸ１陽性細胞のパーセントはおよそ７％であり、約１％〜約２０％まで分化効率に応じて変化した。
【０４５８】
選別した細胞はさらに、Ｑ−ＰＣＲ分析に付した。分化細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ＰＤＸ１遺伝子発現との相関を示した。非蛍光性細胞と比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＰＤＸ１発現レベルの２０倍を超える増大を示した（図４６）。高及び低ＥＧＦＰ強度の細胞の分離は、ＥＧＦＰ発現レベルがＰＤＸ１発現レベルと相関することを示した（図４７）。ＰＤＸ１マーカー分析に加えて、選別した細胞は、膵臓内胚葉において発現されるいくつかの遺伝子のＱ−ＰＣＲ分析に付した。これらのマーカー遺伝子（ＮＫＸ２．２、ＧＬＵＴ２、ＫＲＴ１９、ＨＮＦ４α及びＨＮＦ３β）のそれぞれの産物はすべて、ＥＧＦＰ陽性分画で富化された（図４８Ａ〜図４８Ｅ）。対照的に、神経マーカーＺＩＣ１及びＧＦＡＰは、選別されたＥＧＦＰ発現細胞において富化されなかった（図４９Ａ及び図４９Ｂ）。
【０４５９】
免疫組織化学により、事実上すべての単離ＰＤＸ１陽性細胞が、ＫＲＴ１９及びＧＬＵＴ２を発現するとみなされた。この結果は、膵臓内胚葉系統の細胞に関して予測される。これらの細胞の多くはまた、抗体染色によりＨＮＦ３β陽性であった。
【０４６０】
〔実施例２４〕
ＰＤＸ１陽性背側前腸内胚葉及びＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉の産生
本実施例は、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉の産生、並びにＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。
【０４６１】
各日、１００ｎｇ／ｍｌの濃度でアクチビンＡを培地に供給する３日又は５日プロトコールを用いて、未分化ｈＥＳＣから、胚体内胚葉を産生した。背側分化及び腹側分化の両方に関して、最初の５日間の培地組成は以下の通りであった：１日目  −  ＲＰＭＩ＋０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２日目  −  ＲＰＭＩ＋０．２％ＦＢＳ、３日目  −  ＲＰＭＩ＋２．０％ＦＢＳ、４日目  −  ＲＰＭＩ＋２．０％ＦＢＳ、及び５日目  −  ＲＰＭＩ＋２．０％ＦＢＳ。腹側分化に関して、１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡ中で３日間、胚体内胚葉を産生し、次に３ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４及び５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０に曝露した。最初の２日間はＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ中で、次いでその後、Ｂ２７サプリメント（１部のＢ２７対２００部の培地（容積で）  −  （１：２００））（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含有するＣｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（ＣＭＲＬ）培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）（Parker R.C.他, 1957. N.Y. Academy of Sciences 5: 303参照（この記載内容は参照により本明細書中で完全に援用され
る））中で、ＢＭＰ４／ＦＧＦ１０添加を実行した。背側分化手法に関して、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ中で５日間、胚体内胚葉を産生し、次に、Ｂ２７サプリメントを含有するＣＭＲＬ培地（１：２００）中の２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）及び２５ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡに曝露した。
【０４６２】
ＲＡベースの背側分化手法では、ＰＤＸ１の強力な誘導、並びにＨＨＥＸ又はアルブミン（これらは腹側肝臓マーカーである）の発現誘導を伴わないＨＢ９発現の保持が存在する（図５０Ａ〜図５０Ｄ）。ＲＡを用いないが、代わりにＦＧＦ１０及びＢＭＰを用いる腹側分化プロトコールでは、ＰＤＸ１遺伝子発現も強く誘導された。ＲＡ処理に対比して、ＨＢ９（背側内胚葉マーカー）発現は保持されず、そして腹側肝臓マーカー、例えばアルブミン及びＨＨＥＸはＰＤＸ１とともに強く誘導された（図５０Ａ〜図５０Ｄ）。これらのデータは、ＲＡの存在下で、前腸ＰＤＸ１発現内胚葉は肝臓（腹側器官）マーカーを欠き、そしてＨＢ９のような背側マーカーを発現するということを示した。ＲＡの非存在下では、ＰＤＸ１発現は高ＨＢ９発現レベルを伴わなかった。さらに古典的肝臓マーカー、例えばアルブミン及びＨＨＥＸの発現は、肝臓が専ら腹側内胚葉に由来するため、胚体内胚葉が腹側分化プログラムを選択的に遂行するということを示した。
【０４６３】
〔実施例２５〕
ＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉細胞の産生は胚体内胚葉形成によっている
本実施例は、種々の量の胚体内胚葉細胞を含む培養物からのＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。胚体内胚葉を有しない培養物は、ＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉の極めて少ない産生を示す。胚体内胚葉細胞の初期量が増大するように、腹側偏向前腸内胚葉の産生も増大する。
【０４６４】
４つの別個の条件を用いて、胚体内胚葉への種々の割合の分化を生じるｈＥＳＣを処理した。４つの条件はすべて、１日目に０％ＦＢＳを、２日目に０．２％ＦＢＳを、そして３日目及び４日目に２％ＦＢＳを補充するＲＰＭＩを利用した。４つの条件を以下に示す：（ａ）５μＭのＳＵ５４０２を伴う１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、（ｂ）外因性増殖因子なし、（ｃ）１５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、並びに（ｄ）１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ。最初の４日間の分化の後、産生される胚体内胚葉の相対レベルはサーベラス（ＣＥＲ）及びＳＯＸ１７発現レベルにより示され、それにより胚体内胚葉は条件（ａ）下では本質的に存在せず、条件（ｂ）下では最小限であり、条件（ｃ）下では存在し、そして条件（ｄ）下では高度に存在した。次にすべての培養物を、ＲＰＭＩ中の２％ＦＢＳの基本培地中の３ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０及び０．５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンとともに２日間、その後、Ｂ２７抽出物の２００倍希釈液を伴うＣＭＲＬから成る基本培地中の３ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌでのＦＧＦ１０及び０．５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンとともに６日間、インキュベートした。
【０４６５】
ＳＵ５４０２及びＢＭＰ４の存在下で、その条件下ではＣＥＲ及びＳＯＸ１７遺伝子発現の欠如により実証されるように胚体内胚葉が産生されず（図５１Ａ及び５１Ｂ）、ＢＭＰ４／ＦＧＦ１０による処理（腹側内胚葉条件）後、ＰＤＸ１又はアルブミン遺伝子発現の誘導は認められなかった（図５１Ｃ及び図５１Ｄ）。これは、無増殖因子条件（条件（ｂ））に関しても同様にいえたが、この場合、低レベルのＣＥＲ及びＳＯＸ１７により示されるように、極最小レベルの胚体内胚葉が形成された（図５１Ａ及び図５１Ｂ）。ＰＤＸ１及びアルブミン遺伝子発現は無増殖因子条件下では非常に低かった（図５１Ｃ及び図５１Ｄ）が、遺伝子発現の量は、条件（ａ）から産生されるものより有意に大きかった。中間（１５ｎｇ／ｍｌ）及び高（１００ｎｇ／ｍｌ）用量のアクチビンＡで処理されたｈＥＳＣは、高ＳＯＸ１７遺伝子発現レベルにより示される強固な胚体内胚葉分化を生じた（図５１Ｂ）。高用量アクチビン処理は、非常に高いＣＥＲ発現レベルにより示されるような、主に前内胚葉形質を有する胚体内胚葉を産生した。条件（ｃ）及び条件（ｄ）の処
理はともに、高レベルのＰＤＸ１及びアルブミン遺伝子発現により示されるような強固な腹側内胚葉分化を示した（図５１Ｃ及び図５１Ｄ）。前内胚葉はより後の内胚葉に分化する能力を依然として有するが、一方、後内胚葉細胞はより前方性の運命（anterior fates）を獲得する能力を失っているため、ＰＤＸ１及びアルブミン発現のレベルはほとんどの前内胚葉において最大であった。これらのデータは、腹側ＰＤＸ１発現前腸内胚葉及び肝臓の産生が胚体内胚葉の効率的産生によっているということを強く示した。
【０４６６】
〔実施例２６〕
ＢＭＰ４はＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉に必要でない
本実施例は、ＢＭＰ４の非存在下でのＰＤＸ１陽性腹側偏向前腸内胚葉の産生を記載する。
【０４６７】
それぞれ１日目〜３日目に、０％、０．２％及び２％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ基本培地中の１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンに未分化ｈＥＳＣを曝露することにより、胚体内胚葉を産生した。アクチビンＡ処理の３日後、２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩから成る基本培地に培養物を切り替えて、以下の条件のうちの１つの下で保持した：（ａ）５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０及び０．５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミンを伴う３ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、（ｂ）５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０及び０．５μＭのＫＡＡＤ−シクロパミン、或いは（ｃ〜ｅ）外因性因子なし。２日後、上記の条件（ａ〜ｃ）に従って、基本培地をＣＭＲＬ＋Ｂ２７サプリメント（１：２００）に取り替えて、細胞を保持した。代替的には、Ｂ２７サプリメント（１：２００）を有するＲＰＭＩ（条件（ｄ））又は２％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ（条件（ｅ））中に外因性因子を伴わずに、細胞を保持した。同一の因子処理条件を、８日より長い分化の間、保持した。
【０４６８】
ＢＭＰ４は、ＢＭＰ４の非存在下でのＰＤＸ１及びアルブミンの発現の強固な誘導により示されるように、ＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉細胞又は肝臓内胚葉細胞のいずれかを産生するために必要でなかった（図５２Ａ及び図５２Ｂ）。ＢＭＰ４添加はＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉の産生のためにあまり好ましくないと思われたが、ＦＧＦ１０及びＫＡＡＤ−シクロパミン処理へのＢＭＰ４の添加は腹側前腸肝臓内胚葉遺伝子発現を低減しない（図５２Ａ及び図５２Ｂ）。Ｂ２７サプリメントを伴うＣＭＲＬの使用は、添加因子の非存在下（条件（ｃ））でＰＤＸ１発現を誘導する何らかの能力を有したが、一方、Ｂ２７を伴うＲＰＭＩ（条件（ｄ））及び２％ＦＢＳを伴うＲＰＭＩ（条件（ｅ））はＰＤＸ１発現の如何なる誘導も示さなかった（図５２Ａ）。肝臓遺伝子発現の誘導に及ぼす基本培地の有意の作用が存在するとは思われなかった。要するに、ＦＧＦ１０及びＫＡＡＤ−シクロパミンは、ＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉を産生するのに十分である。
〔実施例２７〕
ＰＤＸ１陽性背側前腸内胚葉及びＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉の同定のためのマーカー
【０４６９】
本実施例は、特に、ＰＤＸ１陽性背側前腸内胚葉及びＰＤＸ１陽性腹側前腸内胚葉の同定、検出、富化、単離、精製、標的化及び／又は検証のために有用なマーカーを記載する。
【０４７０】
実施例２４に記載されたように分化される細胞培養物を遺伝子チップ分析に付して、胚体内胚葉への、そしてさらにより成熟した背側内胚葉表現型及び腹側内胚葉表現型へのｈＥＳＣの分化中に起こる遺伝子発現動態を包括的にモニタリングした。実施例２４で示された時点で、二重反復サンプルを単離した。その内部標準操作手順に従って、Expression
Analysis（Durham, NC）によるAffymetrixのＵ１３３プラス２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを用いて、遺伝子発現プロファイルを確定した。手動検査による、並びに階層的クラスター分析によるこれら７つの条件／時点全体の遺伝子発現のパターンを評価した。腹側分化パラダイム及び背側分化パラダイムの両方で発現される新規の遺伝子を見出
すためにＰＤＸ１発現（背側及び腹側）の一過性パターンを整合させる遺伝子発現のパターンを調べた。
【０４７１】
ＰＤＸ１との発現パターンにおける有意の類似性を有し、したがってＰＤＸ１発現前腸内胚葉細胞中で同時発現され得る遺伝子が提供される。表３に列挙した遺伝子は、背側及び腹側のＰＤＸ１分化の両方で発現される。表４中の遺伝子は、背側偏向され、そして背側ＰＤＸ１パターンで選択的に発現される。
【０４７２】
表３は、背側及び腹側のＰＤＸ１陽性前腸内胚葉の両方で発現される３９のマーカーを列挙する。列１は、各マーカーに関して一般的に既知の遺伝子記号を提示する。列２〜列４は、それぞれＵｎｉｇｅｎｅ、ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ及びＯＭＩＭアクセッション番号を提示する。列５は、列１に記載したマーカーを含む核酸配列に関するＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号を記載した。最後に列６は、列挙遺伝子マーカーによりコードされるポリペプチドマーカーの機能的活性の説明を提示する。
【０４７３】
表３に列挙したアクセッション番号は、これらのマーカーの各々の主要な核酸配列及びポリペプチド配列の両方を含めて表に記載した各配列についての特定情報を検索するために当業者に用いられ得ると理解される。
【０４７４】
【表３Ａ】
0005404047.tif 000004
【表３Ｂ】
0005404047.tif 000005
【０４７５】
図５３Ａ〜図５３Ｅはさらに、ＰＤＸ１と表３から選択されるマーカーとの間の発現プロファイルの共通点を例証する。特に図５３Ａ〜図Ｅは、この実験でモニタリングされる７つの条件／時点全体のＰＤＸ１の発現とほぼ同一の遺伝子発現パターンを表示した遺伝子の例を提示する。類似性のこの程度のパターン認識はほとんど、ＰＤＸ１を発現し、したがってこれらのマーカーを、背側及び／又は腹側の内胚葉起源の両方からのＰＤＸ１陽性前腸内胚葉に関する優れた新規の候補マーカーにする同一細胞中でのこれらの遺伝子の同時発現を反映する。
【０４７６】
表４は、背側ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉中で特異的及び／又は選択的に発現される５０個のマーカーを列挙する。列１は、各マーカーに関して一般的に既知の遺伝子記号を提示する。列２〜列４は、それぞれＵｎｉｇｅｎｅ、ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ及びＯＭＩＭアクセッション番号を提示する。列５は、列１に記載したマーカーを含む核酸配列に関するＧｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号を記載した。最後に列６は、列挙遺伝子マーカーによりコードされるポリペプチドマーカーの機能的活性の説明を提示する。
【０４７７】
表４に列挙したアクセッション番号は、これらのマーカーの各々の主要な核酸配列及びポリペプチド配列の両方を含めて表に記載した各配列についての特定情報を検索するために当業者に用いられ得ると理解される。
【０４７８】
【表４Ａ】
0005404047.tif 000006
【表４Ｂ】
0005404047.tif 000007
【表４Ｃ】
0005404047.tif 000008
【０４７９】
図５４Ａ〜図５４Ｄは、背側内胚葉条件（ＲＡ処理）における特異的（ＨＯＸＡ１及びＰＤＥ１１Ａ）又は選択的（ＦＡＭ４９Ａ及びＷＮＴ５Ａ）発現を示す遺伝子発現のパターンを表示する遺伝子の例を提示する。これらのマーカーは、ＰＤＸ１陽性背側偏向前腸内胚葉の同定のための新規の候補遺伝子である。
【０４８０】
〔実施例２８〕
ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の産生
本実施例は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉の産生を記載する。
【０４８１】
ヒト胚性幹細胞を２段階プロトコールにより７日間分化させて、ＰＤＸ１細胞を得た。第一段階は、ＤＥを強固に産生するためのアクチビンＡ中での５日間の分化から成る（D'Amour, K.他, Nature Biotechnology 23, 1534-1541, (2005)）。段階２は、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＫＡＡＤ-シクロパミン（０．５μＭ）を含有する２％ＦＢＳを伴う新鮮なＲＰＭＩ中での２日分化から成る。
【０４８２】
ＦＧＦ１０（５〜５００ｎｇ／ｍｌ）の添加は、ＫＡＡＤ−シクロパミン（０．１〜２μＭ、ソニックヘッジホッグ阻害剤）の添加とともに有益であり、これらは胚体内胚葉細胞を前腸内胚葉ドメインにさらに特殊化した。
【０４８３】
本明細書中に記載される方法、組成物及び装置は、目下、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。その変更及びその他の使用は当業者に行われ、これらは本発明の精神に包含され、そして開示の範囲により限定される。したがって本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書に開示される発明に種々の置換及び修正がなされ得るということは、当業者には明らかである。
【０４８４】
添付の特許請求の範囲及び本開示全体を通して用いられる場合、「本質的に〜から成る」という語句は、当該語句の後ろに列挙される任意の要素を含むことを意味し、列挙した要素に関する開示において特定される活性又は作用を妨害しないか又は関与しない他の要素に限定される。したがって「本質的に〜から成る」という語句は、列挙した要素が必要とされるか又は必須であるが、他の要素は任意であり、それらが列挙した要素の活性又は作用に影響を及ぼすかにかかわらず存在してもしなくてもよいということを示す。
【０４８５】
本明細書中には多くの文献及び特許文献が引用されている。本特許文書中に引用される個々、及び全ての引用はその全体が引用として組み入れられる。
【０４８６】
いくつかの参考文献については完全な引用を本文中に示した。その他の引用文献については、本文中の引用は著者と発行年によるものであり、完全な引用を以下に示す。
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【図面の簡単な説明】
【０５６２】
【図１】ｈＥＳＣからのβ細胞の産生に関して提唱される分化経路の概略図である。経路における第１の工程は、ＥＳ細胞から胚体内胚葉系列へ送り、また膵臓内胚葉、内分泌内胚葉又は島／β細胞へのさらなる分化事象に先立つ第１の工程を表す。経路における第２の工程は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉へのＳＯＸ１７陽性／ＰＤＸ１陰性胚体内胚葉の変換を示す。これらの移行を媒介するのに有用ないくつかの要因は、イタリック体で表示している。標的細胞を規定するための関連マーカーには下線を付している。
【図２】保存モチーフの位置を表示し、且つＧＥＮＯＶＡＣによる免疫化手順に使用される領域を強調するヒトＳＯＸ１７  ｃＤＮＡの概略図である。
【図３】ＳＯＸ１７が、ＳＯＸ７に、また幾分劣るがＳＯＸ１８に最も密接に関連することを示す相関系統樹を示す図である。ＳＯＸ１７タンパク質は、同種内のＳＯＸ  Ｆ群サブファミリーの他の成員に対するよりも種相同体間でより密接に関連する。
【図４】ラット抗ＳＯＸ１７抗体でプロービングしたウェスタンブロットを示す図である。このブロットは、線維芽細胞において過剰発現されるヒトＳＯＸ１７タンパク質に関するこの抗体の特異性（レーン１）及びＥＧＦＰとの免疫反応性の欠如（レーン２）或いは最も密接に関連するＳＯＸスーパーファミリー成員であるＳＯＸ７（レーン３）を実証する。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、相当数のＡＦＰ+同時標識細胞を表示するＳＯＸ１７+細胞のクラスター（Ａ）を示す顕微鏡写真である。これは、ＡＦＰ+細胞がほとんど又は全く観察されない他のＳＯＸ１７+クラスター（Ｂ）と著しく対照している。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、壁側内胚葉及びＳＯＸ１７を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ｈＥＳ細胞の無作為に分化された培養物における壁内胚葉細胞の細胞表面上に位置するヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質に関する免疫細胞化学を示す。パネルＢは、ＴＭ及びＳＯＸ１７に関して二重標識されたＡで示されるのと同一野である。パネルＣは、ＤＡＰＩ標識された核を伴う同野の位相差画像である。ＤＡＰＩ標識された核とＳＯＸ１７標識化との完全な相関に留意されたい。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＯＸ１７遺伝子発現及びＳＯＸ１７特異的抗体による抗ＳＯＸ１７陽性細胞を示す棒グラフである。パネルＡは、未分化対照培地（ＳＲ２０）に対して、アクチビンＡがＳＯＸ１７遺伝子発現を増大させる一方で、レチノイン酸（ＲＡ）はＳＯＸ１７発現を強く抑制することを示す。パネルＢは、これらの変化の同一パターン並びに類似した規模が、ＳＯＸ１７+細胞数に反映されることを示しており、ＳＯＸ１７遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ測定は、単一細胞レベルでの変化を大きく反映することを示す。
【図８】図８Ａは、アクチビンＡの存在下での分化ｈＥＳＣの培養は、低レベルのＡＦＰ遺伝子発現を維持するのに対して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で無作為に分化することが可能である細胞は、ＡＦＰの強力なアップレギュレーションを示すことを示す棒グラフである。発現レベルの差異は、およそ７倍である。図８Ｂ及び図８Ｃは、１０％ＦＢＳ単独（上部）に対するアクチビンＡ処理状態（下部）で観察されるＡＦＰ+細胞の非常に希少且つ小さなクラスターにより示されるように、アクチビンＡによるＡＦＰ発現の抑制もまた単一細胞レベルで明白であることを示す２つの顕微鏡写真の画像である。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、フローサイトメトリーを使用したＡＦＰ+細胞数の定量化を示す比較画像である。この図は、アクチビンＡの存在（右パネル）及び非存在（左パネル）下でのＡＦＰ遺伝子発現の変化の規模（図８Ａ）がＡＦＰ+細胞の数に正確に対応することを実証し、さらに個々の細胞レベルで起こる変化を示すためのＱ−ＰＣＲ分析の有用性を支持する。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ（ＮＡＡ）へのｈＥＳＣの暴露が、５日間にわたってＳＯＸ１７+細胞の数の著しい増大をもたらすことを示す顕微鏡写真である（Ａ〜Ｃ）。ＤＡＰＩ染色された核により示されるように（Ｄ〜Ｆ）、ＳＯＸ１７+細胞の相対存在量を、各野に存在する細胞の総数と比較することにより、すべての細胞のおよそ３０〜５０％が、ＮＡＡによる５日の処理後にＳＯＸ１７に対して免疫反応性であることを観察することができる。
【図１１】アクチビンＡ（０、１０、３０又は１００ｎｇ／ｍｌ）は、分化ｈＥＳＣにおけるＳＯＸ１７遺伝子発現を用量依存的に増大させることを実証する棒グラフである。増大された発現は、接着培養上での３日間の処理後にすでに強固であり、同様に続く１日、３日及び５日の懸濁培養まで継続する。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＭＩＸＬ１（パネルＡ）、ＧＡＴＡ４（パネルＢ）及びＨＮＦ３ｂ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。アクチビンＡ用量依存的増大はまた、胚体内胚葉の３つの他のマーカーであるＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂに関しても観察される。アクチビン用量に応答した増大された発現の規模は、ＳＯＸ１７に関して観察される規模と際立って類似しており、アクチビンＡが、４つすべての遺伝子を同時発現する細胞の集団（ＳＯＸ１７+、ＭＩＸＬ１+、ＧＡＴＡ４+及びＨＮＦ３ｂ+）を特定していることを強く示している。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＡＦＰ（パネルＡ）、ＳＯＸ７（パネルＢ）及びＳＰＡＲＣ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。臓側内胚葉マーカーＡＦＰの発現においてアクチビンＡ用量依存的減少が見られる。原始内胚葉（ＳＯＸ７）及び壁側内胚葉（ＳＰＡＲＣ）のマーカーは、依然として未変化のままであるか、或いはいくつかの時点で抑制を示し、アクチビンＡが、これらの胚体外内胚葉細胞型を特定するように作用しないことを示している。このことはさらに、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂの増大された発現が、アクチビンＡに応答した胚体内胚葉細胞の数の増大に起因し得るという事実を支持する。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、ＺＩＣ１（パネルＡ）及びブラキュリ発現（パネルＢ）に対するアクチビンＡの影響を示す棒グラフである。神経マーカーＺＩＣ１の一貫した発現は、神経分化に対するアクチビンＡの用量依存的影響が見られないことを実証する。ブラキュリの減少された発現により示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ処理により媒介される中胚葉分化の顕著な抑制が見られる。これは、中内胚葉前駆体からの胚体内胚葉の増大された特定の結果である可能性が高い。より低レベルのアクチビンＡ処理（１０ｎｇ／ｍｌ及び３０ｎｇ／ｍｌ）は、未処理対照培養物に対して分化のより後期の時点でブラキュリの発現を維持する。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、アクチビンによる処理に応答した減少された壁側内胚葉分化を示す顕微鏡写真である。ＴＭhi壁側内胚葉の領域は、血清単独で分化される場合、培養物の至るところで見られる（Ａ）のに対して、アクチビンが包含される場合、ＴＭ+細胞の分化は乏しく（Ｂ）、ＴＭ免疫反応性の全体的な強度はより低い。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｄは、アクチビンＡ及びアクチビンＢによる処理に応答したマーカー発現を示す顕微鏡写真である。ｈＥＳＣは、アクチビンＡ及びアクチビンＢにより連続４日間処理して、ＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体で三重標識した。パネルＡ−ＳＯＸ１７、パネルＢ−ＡＦＰ、パネルＣ−ＴＭ及びパネルＤ−相／ＤＡＰＩ。ＡＦＰ（Ｂ）及びＴＭ（Ｃ）免疫反応性の完全な非存在と関連した数多くのＳＯＸ１７陽性細胞（Ａ）に留意されたい。
【図１７】ｈＥＳＣからのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの胚体内胚葉及び臓側内胚葉の出現を示す顕微鏡写真である。臓側内胚葉の領域はＡＦＰhi／ＳＯＸ１７lo/-により同定される一方で、胚体内胚葉は、完全に反対のプロファイルであるＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-を示す。この野は、これらの２つの領域の互いに対する近接性に起因して選択的に選択された。しかしながら、何度もＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-領域がＡＦＰhi細胞の任意の領域からの絶対的な単離で観察され、これは臓側内胚葉細胞とは別個の胚体内胚葉細胞の発達を示唆する。
【図１８】ＴＧＦβファミリーのリガンド及び受容体を表す概略図である。ＡＲ  Ｓｍａｄ及びＢＲ  Ｓｍａｄを活性化する因子は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の産生に有用である（J Cell Physiol. 187: 265-76を参照）。
【図１９】個々のＴＧＦβ因子及びＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２０】ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７+細胞数の増大を示す棒グラフである。
【図２１】ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２２】アクチビンＡが、ＳＯＸ１７+細胞数の用量依存的増大を誘導することを示す棒グラフである。
【図２３】アクチビンＡ及びアクチビンＢで処理した培養物へのＷｎｔ３ａの添加が、アクチビンＡ及びアクチビンＢ単独により誘導されるレベルを上回ってＳＯＸ１７発現を増大させることを示す棒グラフである。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、胚体内胚葉への分化が低ＦＢＳ状態で増強されることを示す棒グラフである。２％ＦＢＳを含有する培地（２ＡＡ）中でのアクチビンＡ及びＢによるｈＥＳＣの処理は、１０％ＦＢＳ培地（１０ＡＡ）中での同じ処理と比較して、２〜３倍高いレベルのＳＯＸ１７発現をもたらす（パネルＡ）。胚体内胚葉マーカーＭＩＸＬ１の誘導（パネルＢ）はまた、同じ方法で影響を及ぼし、ＡＦＰ（臓側内胚葉）の抑制（パネルＣ）は、１０％ＦＢＳ状態よりも２％ＦＢＳにおいて高い。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｄは、ＳＯＸ１７+細胞が培養中に分裂していることを示す顕微鏡写真である。ＳＯＸ１７免疫反応性細胞は、ｈＥＳＣコロニーの分化中の縁に存在し（Ｃ、Ｄ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）で標識される（パネルＢ）が、ＯＣＴ４では同時標識されていない（パネルＣ）。さらに、明確な有糸分裂の外観が、ＳＯＸ１７+細胞（矢印）並びにＯＣＴ４+の未分化ｈＥＳＣ（矢じり）の両方において核のＤＡＰＩ標識化により観察することができる（Ｄ）。
【図２６】様々な培地条件下での分化ｈＥＳＣにおけるＣＸＣＲ４の相対発現レベルを示す棒グラフである。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｄは、胚体内胚葉マーカーのパネルが、どのようにして図２６で示されるのと同じ分化処理にわたってＣＸＣＲ４と非常に類似した発現のパターンを共有するかを示す棒グラフである。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｅは、中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）に関するマーカーが、どのようにして図２６で示されるのと同じ処理にわたってＣＸＣＲ４発現に対する逆相関を示すかを示す棒グラフである。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｆは、図２６〜図２８で示される３つの培地条件にわたってＳＯＸ１７免疫反応性細胞における相対的な差異を示す顕微鏡写真である。
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｃは、分化培地に添加されるアクチビンＡの増大濃度によるＣＸＣＲ４+細胞数の増大を実証するフローサイトメトリードットプロットである。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｄは、高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞（Ａ１００−ＣＸ＋）が、母集団（Ａ１００）よりも胚体内胚葉マーカーに関してさらに一層富化されることを示す棒グラフである。
【図３２】蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して単離されるＣＸＣＲ４+細胞及びＣＸＣＲ４-細胞からの遺伝子発現、並びに母集団中の遺伝子発現を示す棒グラフである。これは、ＣＸＣＲ４+細胞が各母集団に存在する本質的にすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を含有し、またＣＸＣＲ４-集団がＣＸＣＲ４遺伝子発現をほとんど含有しないか、或いは全く含有しないことを実証する。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｄは、これらの非胚体内胚葉マーカーの発現においてすでに抑制されている高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞における中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）遺伝子発現の欠乏を実証する棒グラフである。
【図３４−１】図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜パネルＬに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜パネルＦに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜パネルＭそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した列は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加無し）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。
【図３４−２】図３４の続き
【図３４−３】図３４の続き
【図３５】４日目に添加されるレチノイン酸（ＲＡ）及び線維芽細胞増殖因子−１０（ＦＧＦ−１０）の存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日後及び６日後のｈＥＳＣの培養物におけるＰＤＸ１遺伝子の相対発現を示すグラフである。
【図３６】図３６Ａ〜図３６Ｆは、４日目に添加されるレチノイン酸（ＲＡ）及び線維芽細胞増殖因子−１０（ＦＧＦ−１０）の存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日後及び６日後のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＳＯＸ１７、（Ｂ）ＳＯＸ７、（Ｃ）ＡＦＰ、（Ｄ）ＳＯＸ１、（Ｅ）ＺＩＣ１及び（Ｆ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。
【図３７】図３７Ａ〜図３７Ｃは、４日目に添加されるレチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞増殖因子−１０（ＦＧＦ−１０）及び線維芽細胞増殖因子−４（ＦＧＦ−４）の存在下又は非存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日後及び８日後のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＳＯＸ７及び（Ｃ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。
【図３８】図３８Ａ〜図３８Ｇは、４日目に添加される１μＭ、０．２μＭ又は０．０４μＭのレチノイン酸（ＲＡ）と組み合わせて５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０と接触させた胚体内胚葉細胞の培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＨＯＸＡ３、（Ｃ）ＨＯＸＣ６、（Ｄ）ＨＯＸＡ１３、（Ｅ）ＣＤＸ１、（Ｆ）ＳＯＸ１及び（Ｇ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。
【図３９】図３９Ａ〜図３９Ｅは、レチノイン酸（ＲＡ）、線維芽細胞増殖因子−１０（ＦＧＦ−１０）及び以下の：血清代替物（ＳＲ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はＢ２７のうちの１つの組合せの存在下での、アクチビン有り及び無しでの４日後及び８日後のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＳＯＸ７、（Ｃ）ＡＦＰ、（Ｄ）ＺＩＣ１及び（Ｅ）ＮＦＭの発現の相対レベルを示す。
【図４０】図４０Ａ〜図４０Ｂは、６日後（ＲＡの添加の直前）及び９日目（ＲＡへの暴露の３日後）のｈＥＳＣの培養物における膵臓（ＰＤＸ１、ＨＮＦ６）及び肝臓（ＨＮＦ６）に関するマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。２５ｎｇ／ｍｌ（Ａ２５）又は５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）のいずれかのアクチビンＡの存在下で、１０ｎｇ／ｍｌ（ａ１０）、２５ｎｇ／ｍｌ（ａ２５）又は５０ｎｇ／ｍｌ（ａ５０）の用量でアクチビンＢの添加を比較するように、様々な条件が包含された。任意のアクチビンＡ又はアクチビンＢ無しの条件（ＮＦ）は、胚体内胚葉及びＰＤＸ１陽性内胚葉の産生に関する陰性対照として作用する。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１及び（Ｂ）ＨＮＦ６の発現の相対レベルを示す。
【図４１】図４１Ａ〜図４１Ｃは、５日目（レチノイン酸の添加の直前）並びにＲＡ暴露の２日後、４日後及び６日後（それぞれ７日目、９日目及び１１日目）の、１００ｎｇ／ｍｌ（Ａ１００）、５０ｎｇ／ｍｌ（Ａ５０）を有する、又はアクチビンＡ無し（ＮＦ）のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。各棒の真下のパーセント表示は、３日〜５日の分化中のＦＢＳ用量を示す。７日目に開始して、ＲＡ（Ｒ）で処理した細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地中で増殖させた。ＲＡ濃度は、７日目に２μＭ、９日目に１μＭ及び１１日目に０．２μＭであった。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＺＩＣ１、（Ｃ）ＳＯＸ７の発現の相対レベルを示す。
【図４２】図４２Ａ〜図４２Ｂは、まず胚体内胚葉を誘導させるために低ＦＢＳ中アクチビンＡで（５日目）、続いてＰＤＸ１発現内胚葉を誘導させるために２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及びＲＡを含む新鮮な（Ａ２５Ｒ）培地、又は様々な条件培地（ＭＥＦＣＭ、ＣＭ＃２、ＣＭ＃３及びＣＭ＃４）及びＲＡで処理したｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。マーカー発現は、５、６、７、８及び９日目に確定された。パネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＣＤＸ１の発現の相対レベルを示す。
【図４３】まず胚体内胚葉を誘導させるために低ＦＢＳ中アクチビンＡで、続いてアクチビンＡ及びレチノイン酸を含む新鮮な培地（Ａ２５Ｒ）、又は新鮮な培地中へ希釈される条件培地中の様々な量のＲＡで処理したｈＥＳＣの培養物におけるＰＤＸ１の相対発現を示すグラフである。培地の総容量は、すべての場合で５ｍｌである。
【図４４】ＲＡ及び５０ｎｇ／ｍｌ  アクチビンＡの添加の３日後（ｄ８）及び４日後（ｄ９）のＲＡ処理した胚体内胚葉細胞から免疫沈降されるＰＤＸ１を示すウェスタンブロットである。
【図４５】ＰＤＸ１プロモーターの制御下にあるＥＧＦＰレポーターで遺伝的にタグ付けしたＰＤＸ１陽性前腸内胚葉細胞の蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣ）の結果を表示する概略グラフである。
【図４６】生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）及びＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の選別された集団に関するハウスキーピング遺伝子に対して正規化した相対ＰＤＸ１発現レベルを示すグラフである。
【図４７】生存細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）、最小のＥＧＦＰシグナル強度（Ｌｏ）を有するＥＧＦＰ陽性細胞集団の半数及び最大のＥＧＦＰシグナル強度（Ｈｉ）を有するＥＧＦＰ陽性細胞集団の半数の選別された集団に関するハウスキーピング遺伝子に対して正規化した相対ＰＤＸ１発現レベルを示すグラフである。
【図４８】図４８Aから図４８Eは生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）及びＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の選別された集団中の５つの膵臓内胚葉マーカーのハウスキーピング遺伝子に対して正規化した相対発現レベルを示すグラフである。パネル：Ａ−ＮＫＸ２．２、Ｂ−ＧＬＵＴ２、Ｃ−ＨＮＦ３β、Ｄ−ＫＲＴ１９及びＥ−ＨＮＦ４α。
【図４９】図４９は、生細胞（Ｌｉｖｅ）、ＥＧＦＰ陰性細胞（Ｎｅｇ）及びＥＧＦＰ陽性細胞（ＧＦＰ＋）の選別された集団中の２つの非膵臓内胚葉マーカーのハウスキーピング遺伝子に対して正規化した相対発現レベルを示すグラフである。パネル：Ａ−ＺＩＣ１及びＢ−ＧＦＡＰ。
【図５０】図５０Ａ〜図５０Ｄは、任意の要素を添加する前の分化の開始時（０ｄ）、及び３日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ａ１００）（３ｄ）、その後４〜１１日目で３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０（Ｂ３Ｆ５０）（７ｄ、９ｄ及び１１ｄ）の存在下、又は５日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ａ１００）（５ｄ）、その後６日目及び７日目で２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び２μＭＲＡ（Ａ２５Ｒ）（７ｄ）の存在下のいずれかでのｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。このパネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＡＬＢ、（Ｂ）ＰＤＸ１、（Ｃ）ＨＢ９及び（Ｄ）ＨＨＥＸの発現の相対レベルを示す。
【図５１−１】図５１Ａ〜図５１Ｄは、任意の要素を添加する前の分化の開始時（０ｄ）、及び４つの以下の条件の１つで分化して４日後のｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである：（ａ）１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４及び５μＭＳＵ５４０２（Ｂ／ＳＵ）、（ｂ）要素なし（ＮＦ）、（ｃ）１５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ａ１５）、又は（ｄ）１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ。この分化の後に、５〜１２日目で３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０及び０．５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｂ３Ｆ５０Ｋ０．５）の存在下でインキュベートする（６ｄ、８ｄ、１０ｄ及び１２ｄ）。このパネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＣＥＲ、（Ｂ）ＳＯＸ１７、（Ｃ）ＰＤＸ１及び（Ｄ）ＡＬＢの発現の相対レベルを示す。
【図５１−２】図５１の続き
【図５２】図５２Ａ〜図５２Ｂは、任意の要素を添加する前の分化の開始時（０ｄ）、３日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビン（Ａ１００）の存在下で（３ｄ）、４日目及び５日目で、要素なし（ＮＦ）、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０及び０．５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（ＦＫ）、又は３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０及び０．５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（ＢＦＫ）の存在下で（５ｄ）、並びに６日目〜１３日目で、ＲＰＭＩ培地において要素なし（２Ｒ）、Ｂ２７を添加したＲＰＭＩ培地において要素なし（０ＲＢ）、Ｂ２７を添加したＣＭＲＬ培地において要素なし（０ＣＢ）、Ｂ２７を添加したＣＭＲＬ培地において５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０及び０．５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（ＦＫ）、又はＢ２７を添加したＣＭＲＬ培地において３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０及び０．５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（ＢＦＫ）の存在下で（７ｄ、９ｄ、１１ｄ及び１３ｄ）、ｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。このパネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１及び（Ｂ）ＡＬＢの発現の相対レベルを示す。
【図５３】図５３Ａ〜図５３Ｅは、任意の要素を添加する前の分化の開始時（０ｄ）、及び３日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ａ１００）（３ｄ）、その後４〜１１日目で３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０（Ｂ３Ｆ５０）（７ｄ、９ｄ及び１１ｄ）の存在下、又は５日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ａ１００）（５ｄ）、その後６日目及び７日目で２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び２μＭ  ＲＡ（Ａ２５Ｒ）（７ｄ）の存在下のいずれかでのｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。このパネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＰＤＸ１、（Ｂ）ＳＥＲＰＩＮＦ２、（Ｃ）ＤＵＳＰ９、（Ｄ）ＣＤＨ６及び（Ｅ）ＳＯＸ９の発現の相対レベルを示す。
【図５４】図５４Ａ〜図５４Ｄは、任意の要素を添加する前の分化の開始時（０ｄ）、及び３日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ａ１００）（３ｄ）、その後４日目〜１１日目で３ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４及び５０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−１０（Ｂ３Ｆ５０）（７ｄ、９ｄ及び１１ｄ）の存在下、又は５日間１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ（Ａ１００）（５ｄ）、その後６及び７日目で２５ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び２μＭ  ＲＡ（Ａ２５Ｒ）（７ｄ）の存在下のいずれかでのｈＥＳＣの培養物におけるマーカー遺伝子の相対発現を示すグラフである。このパネルは、以下のマーカー遺伝子：（Ａ）ＨＯＸＡ１、（Ｂ）ＰＤＥ１１Ａ、（Ｃ）ＦＡＭ４９Ａ及び（Ｄ）ＷＮＴ５Ａの発現の相対レベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【配列表】
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