(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）乃至（４）の工程を含んでなる、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法：
（１）ヒトの臍帯血から採取される単核球細胞をＣＤ１４陽性細胞とＣＤ１４陰性細胞とに分画し、次いで、ＣＤ１４陰性細胞をＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ２陰性ＣＤ１４陰性細胞とに分画する工程；
（２）上記（１）で得たＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞をストローマ細胞と共培養してブラスト細胞を出現させる工程；
（３）上記（２）で得たブラスト細胞を上記（１）で得たＣＤ１４陽性細胞とストローマ細胞とを共培養したものに添加しブラスト細胞を増殖させる工程；
（４）上記（３）で得たブラスト細胞をインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下でストローマ細胞と共培養してさらに増殖させ、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団とする工程。
【請求項２】
ストローマ細胞と共培養するに際し、播き込むＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の密度をウェルの底面積当たり６．２×１０５個／ｃｍ２以上とすることを特徴とする請求の範囲第１項記載の細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法。
【請求項３】
請求の範囲第１項記載の工程（１）において、得られたＣＤ１４陽性細胞及びＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を凍結保存する工程を含む請求の範囲第１項又は第２項記載の細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法。
【請求項４】
ストローマ細胞がマウスストローマ細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法に関するものであり、詳細には、下記（１）乃至（４）の工程を含んでなる、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の効率的な製造方法に関するものである。
（１）ヒトの臍帯血から採取される単核球細胞をＣＤ１４陽性細胞とＣＤ１４陰性細胞とに分画し、次いで、ＣＤ１４陰性細胞をＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ２陰性ＣＤ１４陰性細胞とに分画する工程；
（２）上記（１）で得たＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞をストローマ細胞と共培養してブラスト細胞を出現させる工程；
（３）上記（２）で得たブラスト細胞を、上記（１）で得たＣＤ１４陽性細胞とストローマ細胞とを共培養したものに添加しブラスト細胞を増殖させる工程；
（４）上記（３）で得たブラスト細胞をインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下でストローマ細胞と共培養してさらに増殖させ、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団とする工程。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、種々の病原体に対する生体防御システムとしての免疫系の中心的役割を担う細胞集団の一つである。Ｔ細胞は大別してＣＤ４陽性のヘルパーＴ細胞とＣＤ８陽性の細胞障害性Ｔ細胞に分類され、前者は免疫応答の促進、後者はウイルス感染細胞や腫瘍細胞の排除に関与している。ヘルパーＴ細胞はさらに細胞性免疫を促進する１型ヘルパー細胞と体液性免疫を促進する２型ヘルパーＴ細胞に分類される。このような性質の異なるＴ細胞は、巧妙にバランスのとれた免疫応答の下、病原体の排除や感染抵抗性の獲得のために作用している。【０００３】
通常、正常な免疫応答においては、生体を形成する自己抗原に対しては免疫学的寛容が成立しており排除機構が働かない。すなわち、自己反応性Ｔ細胞は、細胞死の誘導又は自己抗原に対する不応答性の誘導がなされる。とりわけ、制御性Ｔ細胞がそのような抑制に能動的に関与しているといわれている。制御性Ｔ細胞は、他のＴ細胞に対して抑制的な作用を有するということによって定義付けられており、近年、特定の免疫応答を抑制する機能を有する細胞集団として研究され、細胞表面マーカーや産生するサイトカインの種類、免疫抑制の機構などが異なる種々の制御性Ｔ細胞が報告されている。【０００４】
制御性Ｔ細胞の中でも最もよく研究されているものは、例えば、サカグチ（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ）、アニュアル・レビュー・オブ・イムノロジー（Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第２２巻、５３１乃至５６２頁（２００４）に記載される、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞である。現在に至るまでの多くの研究成果において、この細胞はＣＤ４陽性及びＣＤ２５陽性を示すことから、ＣＤ４及びＣＤ２５が制御性Ｔ細胞のマーカーとなり得ると考えられている。また、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞については、フォンテノット（Ｆｏｎｔｅｎｏｔ）ら、ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、第４号、３３０乃至３３６頁（２００３）では、転写因子のフォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）を、タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第１９２巻、第２号、３０３乃至３０９頁（２０００）では、Ｔ細胞を不応答に導く細胞障害性Ｔ細胞関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）を発現していることを開示している。一方、コスミ（Ｃｏｓｍｉ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０２巻、第１２号、４１０７乃至４１１４頁（２００３）では、ＣＤ８陽性ＣＤ２５陽性のマーカーを有する免疫抑制活性を有するＴ細胞を開示している。【０００５】
一方、細胞障害活性を有するＴ細胞としては、上記のとおりＣＤ８陽性障害性Ｔ細胞が良く知られており、当該細胞は標的細胞に対して特異性の高い細胞障害活性を発揮する。特開２００５−２４５４３０号公報では、ＣＤ８陽性障害性Ｔ細胞が腫瘍細胞又は腫瘍細胞に特徴的な蛋白質と共に培養することにより、その腫瘍細胞に対して特異的な細胞障害活性を発揮することが開示されている。【０００６】
本願と同じ出願人による国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットには、ヒト血液から採取した単核球細胞をストローマ細胞と共培養すると、細胞障害活性を発揮し、且つ、活性化ヒトＴ細胞に対して免疫抑制活性をも発揮する新規なヒトＴ細胞集団が得られることが開示されている。このヒトＴ細胞集団は、ほぼすべての細胞において細胞膜表面抗原ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／βが陽性であり、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の３つのグループが共存するという特徴を有しており、細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つことから研究用途及び医薬用途への応用が期待されている。【０００７】
一方、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに開示された細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法（以下、本明細書では「従来法」と記載する）は、新鮮な臍帯血又は末梢血から採取した単核球細胞をＩＬ−２非存在下でストローマ細胞との共培養を続け、出現したブラスト細胞をＩＬ−２存在下でストローマ細胞と共培養してさらに増殖させて細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を製造するという簡便な方法ではあるが、新鮮なヒト臍帯血又は末梢血由来の単核球細胞を必要とし、通常、ブラスト細胞の誘導と増殖に３乃至４週間の長期間を要するものである。従来法には、新鮮なヒト臍帯血又は末梢血を必要とすること、培養に長期間（約４週間）を要すること、目的とするヒトＴ細胞集団を誘導できる確率が、通常、１０％（１０例中１例）程度と低いことなどの課題が残っており、産業的に利用可能な製造方法が確立されていないのが現状である。このような状況下、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに開示された細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の、従来法とは異なる効率的な製造方法の確立が求められている。
【発明の開示】
【０００８】
斯かる状況に鑑み、本発明は、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の効率的な製造方法を提供することを課題とする。
【０００９】
本発明者らが細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法、とりわけ、培養方法について鋭意研究したところ、
（Ａ）臍帯血から採取した単核球細胞から、ＣＤ１４陽性細胞とＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とを採取し、まず、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞をストローマ細胞と共培養してブラスト化した細胞（ブラスト細胞）を出現させ、このブラスト細胞を、先に採取したＣＤ１４陽性細胞とストローマ細胞とを共培養したものに添加して増殖させ、さらにインターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下でストローマ細胞と共培養して増殖させると、高確率で目的とする細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団が製造できること；
（Ｂ）ＣＤ１４陽性細胞とＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とは凍結保存が可能であり、目的とするヒトＴ細胞集団を製造するに際し、凍結保存した細胞を適宜解凍して用いることができるので、従来法のようにヒトＴ細胞集団の製造の都度、新鮮なヒト臍帯血又は末梢血を入手し単核球細胞を調製する必要がないこと；及び
（Ｃ）今回考案した製造方法によれば、従来よりも短期間で目的とする細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を製造できること；
を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記（１）乃至（４）の工程を含んでなる、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
（１）ヒトの臍帯血から採取される単核球細胞をＣＤ１４陽性細胞とＣＤ１４陰性細胞とに分画し、次いで、ＣＤ１４陰性細胞をＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ２陰性ＣＤ１４陰性細胞とに分画する工程；
（２）上記（１）で得たＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞をストローマ細胞と共培養してブラスト細胞を出現させる工程；
（３）上記（２）で得たブラスト細胞を上記（１）で得たＣＤ１４陽性細胞とストローマ細胞とを共培養したものに添加しブラスト細胞を増殖させる工程；
（４）上記（３）で得たブラスト細胞をＩＬ−２存在下でストローマ細胞と共培養してさらに増殖させ、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団とする工程。
【００１１】
本発明によれば、研究用途をはじめとして、各種癌疾患、自己免疫疾患及びアレルギー性疾患の治療、移植時における拒絶反応や移植片対宿主反応の緩和など医薬用途に有用な、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の製造方法における第１工程を模式的に表す図である。
【図２】臍帯血Ｎｏ．６由来のＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞をストローマ細胞と共培養して得たブラスト細胞を含むヒト細胞集団のフローサイトメトリーにおける前方散乱光（ＦＳ）と側方散乱光（ＳＳ）の２次元パターンを示す図である。
【図３】臍帯血Ｎｏ．６由来のＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞をストローマ細胞と共培養して得た、ブラスト細胞を含むヒト細胞集団の二重染色フローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図４】臍帯血Ｎｏ．６由来のブラスト細胞をＩＬ−２存在下でストローマ細胞と共培養して得たヒトＴ細胞集団の二重染色フローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図５】本発明の製造方法における第２乃至第４工程を模式的に表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、本発明と同じ出願人による国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに開示された、細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を効率的に製造する方法に関するものである。本発明でいう「細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団」とは、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに記載されているように、ヒト血液から採取される単核球細胞をストローマ細胞と共培養することにより取得することのできるヒトＴ細胞集団であって、下記（１）乃至（５）の特徴を有するものを意味する。
（１）細胞膜表面抗原ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／βが陽性である。
（２）本質的に、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の３つのグループからなる。
（３）共培養に用いたストローマ細胞に対して細胞障害活性を発揮する。
（４）活性化Ｔ細胞に対して免疫抑制活性を発揮する。
（５）インターロイキン−２（ＩＬ−２）存在下においてインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）を産生する。【００１４】
本発明の製造方法においては、まず、第１工程として、ヒト臍帯血から単核球細胞を採取し、これを細胞膜表面抗原ＣＤ１４陽性細胞とＣＤ１４陰性細胞とに分画し、次いで、ＣＤ１４陰性細胞をＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ２陰性ＣＤ１４陰性細胞とに分画する。ヒト臍帯血は、近年の臍帯血移植技術の普及につれて、インフォームドコンセントの下で容易に収集できるようになっている。ヒト臍帯血から単核球細胞を採取する方法としては、リンパ球比重分離液（商品名『フィコールパック−プラス』、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社販売）を使用した常法の比重遠心法などを適用することができる。採取された単核球細胞は、血液細胞用の培地、例えば、Ｄ−ＭＥＭ培地、α−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地などにより、常法により培養することができる。また、必要に応じて、適宜の濃度のウシ胎児血清を補足した培地を用いることもできる。【００１５】
臍帯血由来の単核球細胞をＣＤ１４陽性細胞とＣＤ１４陰性細胞に分画する方法としては、公知のＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）法が有利に利用できる。ＭＡＣＳ法について概略を説明するならば、まず、単核球細胞を含む液に抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体を結合させた磁性化したマイクロビーズを添加して、ＣＤ１４陽性細胞のみを磁性標識する。次いで、磁石を装着したカラムを用いて磁性標識したＣＤ１４陽性細胞を特異的にカラムに吸着させ、磁性標識されていないＣＤ１４陰性細胞をカラムから溶出させる。次いで、磁石をカラムから取り外し、ＣＤ１４陽性細胞を溶出させる。さらに、このＭＡＣＳ法を、抗ヒトＣＤ２モノクローナル抗体を結合したマイクロビーズを用いて、上記で得たＣＤ１４陰性細胞に適用すれば、ＣＤ１４陰性細胞をＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ２陰性ＣＤ１４陰性細胞とに分画することができる。【００１６】
本発明の製造方法における第２工程は、上記第１工程で得たＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞をストローマ細胞と共培養することによりブラスト細胞を出現させる工程である。本発明の製造方法においては、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とストローマ細胞との共培養が必須であり、ストローマ細胞としては、市販のマウスストローマ細胞株、例えば、ＳＴ２細胞、ＯＰ９細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｇ２／ＰＡ６細胞などが入手しやすく有利に利用できる。また、必要に応じて、マウスからストローマ細胞を採取して用いてもよい。さらに、ヒトストローマ細胞などの、マウス以外の哺乳動物由来のストローマ細胞も用いることができる。ストローマ細胞は、その使用に先だち、適宜の培養培地とともに予めマイクロプレートなどに播種した後、１日乃至数日間培養することにより、マイクロプレートのウェル底部にコンフルエントな状態になるまで培養しておく。これにＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を播種し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で培養すると、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の一部がブラスト化し、細胞障害活性を有するブラスト細胞を含む細胞集団となり、ストローマ細胞の生細胞数を次第に減少させる。なお、この第２工程においては、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞のブラスト細胞への分化は誘導できるものの、細胞を多量に増殖させることはできない。【００１７】
また、本発明の製造方法における第２工程において、ストローマ細胞と共培養する際のＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の密度はマイクロプレートの１ウェル（３ｍｌ、底面積９．６２ｃｍ２）当たり６×１０６個以上、すなわち、ウェルの底面積当たり６．２×１０５個／ｃｍ２以上の比較的高密度に調整するのが望ましい。当該細胞密度が１ウェル（３ｍｌ）当たり２×１０６個、すなわち、ウェルの底面積当たり２．１×１０５個／ｃｍ２程度と比較的低密度の場合には、ストローマ細胞との共培養によりブラスト化する細胞が少なく、得られるヒト細胞集団の全細胞中のブラスト細胞の占める割合が低下し、効率が悪くなる。【００１８】
本発明の製造方法における第３工程は、第１工程で得たＣＤ１４陽性細胞を予め上記第２工程におけると同様にストローマ細胞と共培養しておいたものに、第２工程で得たブラスト細胞を含む細胞又はこれから比重遠心法などにより精製したブラスト細胞を添加し、さらに共培養することによりブラスト細胞を増殖させる工程である。なお、ＣＤ１４陽性細胞はストローマ細胞との共培養によりブラスト細胞の増殖を促進する細胞に分化するものの、自らがブラスト化することはない。ブラスト細胞のストローマ細胞との共培養においては、ストローマ細胞が全て破壊されると増殖が抑制されることから、ストローマ細胞が全て破壊されるまでの間に、ブラスト細胞を新鮮なストローマ細胞を付着させたマイクロプレートに移し替える必要がある。移し替えにあたっては、浮遊するブラスト細胞が増殖し始めたら、２乃至３日間隔で、順次、浮遊細胞をピペットなどで回収して、次のストローマ細胞を付着させた新鮮なマイクロプレートに移し替えて共培養を続行する。本工程においては、播種したブラスト細胞に前工程においてブラスト化しなかった休止細胞が混在していたとしても、共培養を続ける過程で消失（死滅）し、最終的にはブラスト細胞のみとなる。このようにして、６乃至９日間培養を続けることにより、播種した細胞数に対して細胞数が約３乃至１５倍まで増加したブラスト細胞を取得することができる。【００１９】
本発明の製造方法における第４工程は、前記第３工程で増殖させたブラスト細胞を、ＩＬ−２存在下でストローマ細胞と共培養してさらに増殖させ、目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団とする工程である。ＩＬ−２は血液由来細胞中に存在するＩＬ−２依存性の活性化Ｔ細胞を増殖させるので、前記第２及び第３工程では活性化Ｔ細胞を増殖させないように、ＩＬ−２非存在下での培養を行うが、本工程の段階では細胞は既にブラスト細胞だけになっており、ＩＬ−２存在下で培養することにより、さらに目的とするヒトＴ細胞集団を播種した細胞数に対して細胞数として約７乃至４００倍まで増殖させることができる。また、ＩＬ−２存在下でストローマ細胞と共培養する本工程により、ブラスト細胞を目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団に分化させることができる。【００２０】
以上の４工程を含んでなる本発明の製造方法によれば、細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を効率良く製造することができる。本発明の製造方法においては、一旦、取得したＣＤ１４陽性細胞とＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とを凍結保存しておくことができるので、必要に応じて、適宜解凍して使用でき、細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を製造する上で新鮮なヒト臍帯血又は末梢血由来の単核球細胞を必要としない。【００２１】
本発明の製造方法により製造したヒトＴ細胞集団が、目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団であるか否かは、以下の判定基準に基づき判定することができる。
（１）ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞数が全細胞数の２０％以上を占める。
（２）共培養に用いたストローマ細胞に対して細胞障害活性を示す。
（３）ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対して細胞障害活性を示す。
（４）活性化Ｔ細胞に対する免疫抑制活性を有する。
（５）細胞膜表面抗原ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／βがいずれも陽性である。
（６）ＩＬ−２存在下においてＩＬ−１０を産生する。
なお、上記の内、（２）及び（４）乃至（６）は国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに記載された、細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の特徴であり、（１）及び（３）は本発明において新たに設定した判定基準である。【００２２】
本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、本質的に、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ａグループ）、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞（Ｂグループ）、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ｃグループ）の３つのグループからなり、これら３グループの合計の細胞数が全体の細胞数の９０％以上、好ましくは、９５％以上を占める。本発明でいう細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（Ａグループ）を比較的多く含むヒトＴ細胞集団であることに特徴があり、全細胞数に占めるＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の数が２０％以上であるのが望ましい。ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の数が低くＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞（Ｂグループ）やＣＤ４陽性ＣＤ８陰性Ｔ細胞が主となれば、Ｔ細胞集団は目的とする細胞集団とは異なる一般的なヘルパー型Ｔ細胞の形態となる。ブラスト細胞やヒトＴ細胞集団におけるＡ乃至Ｃの各グループが占める割合は、二重染色した抗ヒトＣＤ４抗体及び抗ヒトＣＤ８抗体を併用したフローサイトメトリー法により測定することができる。この方法は、本発明の製造方法における第２工程から第４工程までのいずれの工程後においても簡便に測定することができるので、全細胞中の前記したＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞が占める割合を調べることにより、目的とするヒトＴ細胞集団が製造できつつあるか否かの指標とすることができる。【００２３】
本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、その取得のために共培養に用いたストローマ細胞に対して細胞障害活性を発揮する。本発明における製造工程においては、共培養に用いたストローマ細胞が完全に消滅することが肉眼観察できるので、ストローマ細胞に対する細胞障害活性を確認することができる。製造工程におけるとは別に、本発明の製造方法で得られるヒトＴ細胞集団のストローマ細胞への細胞障害活性を試験した場合、効果細胞（Ｅ）としての本発明の製造方法により得られるヒトＴ細胞集団と標的細胞（Ｔ）としてのストローマ細胞との細胞数の比率（Ｅ／Ｔ比）が１／１以上で、取得に用いたストローマ細胞のほとんどは消滅（死滅）する。【００２４】
さらに、細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットにも開示されているように、ストローマ細胞以外の細胞の種々の細胞に対しても細胞障害活性を発揮する。本発明においては、ストローマ細胞以外の細胞に対する細胞障害活性を、ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞を用いて測定した。ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対する細胞障害活性の強さは、後述する実施例で示すように、本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を効果細胞（Ｅ）として、標的細胞（Ｔ）としてのＷｉＤｒ細胞に対して添加して共培養した後、生存細胞数を、メチレンブルー色素を用いたダイ・アップテイク法などで測定することにより評価することができる。なお、斯界ではこのような測定において、通常のヘルパーＴ細胞の形態を有するヒトＴ細胞集団（ヒト血液から分離したＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体で刺激しＩＬ−２存在下で培養・増殖させたＣＤ４陽性Ｔ細胞集団。以下、本明細書では「コンベンショナルＴ細胞」と呼称する）が対照として用いられるものの、本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、コンベンショナルＴ細胞に比べ有意に高い細胞障害活性を示す。【００２５】
本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、活性化ヒトＴ細胞に対して免疫抑制活性を発揮する。免疫抑制活性は、例えば、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞における免疫抑制活性の測定に利用される同種混合リンパ球反応法により測定することができる。免疫抑制活性の強さは、ゴッドフレー（Ｇｏｄｆｒｅｙ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０４巻、第２号、４５３乃至４６１頁（２００４）に記載された、臍帯血から誘導したＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性の判定基準（免疫抑制活性６５％以上：明らかな抑制活性、免疫抑制活性２０乃至６５％：弱い抑制活性）に基づき判定することができる。本発明の製造方法で得られるヒトＴ細胞集団の免疫抑制活性は、免疫寛容を誘導することによって治療可能な疾患、例えば、リウマチ、Ｉ型糖尿病、クローン病などの自己免疫疾患、食物アレルギー、花粉症、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患や、移植時における拒絶反応や移植片対宿主反応の緩和などの目的に利用することができる。【００２６】
本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットにも開示されているようにＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／βの、Ｔ細胞に特徴的な細胞膜抗原がほぼすべての細胞において陽性を示す。本発明の製造方法で得られるヒトＴ細胞集団の細胞膜表面抗原は、表面抗原に対する抗体を用いるフローサイトメトリー法（間接蛍光抗体法）にて解析することができる。具体的には、市販のマウス抗ヒトＣＤ３抗体、マウス抗ヒトＣＤ２５抗体、マウス抗ヒトＣＤ２８抗体又はマウス抗ヒトＴ細胞抗原受容体α／β抗体を、ヒトＴ細胞集団に加えて３０分間処理し、常法に従い、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）或いはフィコエリスリン（ＰＥ）を結合させた２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）で同様に処理した後、フローサイトメトリー法で解析すればよい。【００２７】
また、本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットや後述する実施例に記載するとおり、ＩＬ−２存在下で培養液上清中にＩＬ−１０を産生する。ＩＬ−１０は主として免疫抑制を担うサイトカインであり、Ｔ細胞においては２型ヘルパーＴ細胞によって産生され、１型ヘルパーＴ細胞によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等のサイトカインの産生を抑制し、また、マクロファージによるＩＬ−１等の炎症性サイトカインの産生を抑制することが知られている。よって、本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、ＩＬ−１０の産生を介して免疫抑制活性を発揮する可能性が考えられる。【００２８】
また、本発明の製造方法で得られる細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団は、核内で転写因子ＦＯＸＰ３を発現し細胞質内の細胞障害性Ｔ細胞関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）が陽性である細胞を含んでいる。自己免疫病、アレルギーなどの過剰な免疫応答を抑制する細胞群であるＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞は、特異的に転写因子ＦＯＸＰ３を発現しており、常にＣＴＬＡ−４を高発現していることが知られている。また、ＦＯＸＰ３はＣＴＬＡ−４の発現を制御していることが知られている。【００２９】
なお、本発明の製造方法における第１工程で得られるＣＤ１４陽性細胞及びＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞は、実施例で後述するように、いずれも凍結保存することが可能であり、必要に応じて解凍し、次の培養工程に用いることができる。ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を、凍結することなく第２工程の培養に用いた場合と、一旦、凍結保存した後、解凍して第２工程の培養に用いた場合とでは、得られる全細胞中のブラスト細胞の割合にはほとんど差が認められない。しかしながら、凍結と解凍により細胞は若干障害されるので、凍結した細胞を次の第２工程の培養に供する場合には、播き込む細胞数を高めに設定するのが望ましい。【００３０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、実施例１により本発明の細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法を、実施例２により本発明の製造方法で得られたヒトＴ細胞集団が目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団であるか否かを判定した試験結果を説明する。また、参考例により、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに開示された従来法と従来法によって得られたヒトＴ細胞集団の判定結果を説明する。
【実施例１】
【００３１】
＜第１工程：ヒト臍帯血由来単核球細胞からのＣＤ１４陽性細胞及びＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の調製＞
インフォームドコンセントを交わした妊婦１０名の、分娩時に切除した臍帯から血液（Ｎｏ．１乃至１０）を採取し、それぞれＲＰＭＩ１６４０培地で約２倍容に希釈し、常法に従い、『フィコールパック−プラス』（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社販売）上に重層して遠心分離した。単核球を含む層をそれぞれ採取し、生理食塩水で洗浄して臍帯血Ｎｏ．１乃至１０に由来する単核球細胞を取得した。得られた単核球細胞に、それぞれＭＡＣＳ法を適用し、以下のようにして、ＣＤ１４陽性細胞及びＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を調製した。すなわち、単核球細胞１０７個当たり８０μｌの０．２５％ウシ血清アルブミンと２ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）を用いて単核球細胞を分散させ、抗ヒトＣＤ１４モノクローナル抗体を結合させ磁性化したマイクロビーズ（商品名『ＣＤ１４マイクロビーズ』、ミルテニー・バイオテック社販売）２０μｌを添加混合し、４乃至８℃で１５分間静置することによって磁気標識処理した。次いで、磁気標識処理した細胞に同リン酸緩衝生理食塩水を加えて遠心・洗浄後、細胞１０８個当たり５００μｌの同緩衝液に分散し、予め同緩衝液で前処理し磁石を装着したＭＡＣＳ法用カラム（商品名『ＬＳカラム』、ミルテニー・バイオテック社販売）に注ぎ、同緩衝液にて溶出した。この操作で溶出した磁気標識されていない細胞をＣＤ１４陰性細胞として回収した。次いで、磁石をカラムから取り外した後、同緩衝液で磁気標識された細胞を溶出し、ＣＤ１４陽性細胞として回収した。さらに、上記で取得したＣＤ１４陰性細胞を細胞１０７個当たり６０μｌの同緩衝液に分散し、ＦｃＲブロッキング試薬（ミルテニー・バイオテック社販売）を加えた後、抗ヒトＣＤ２モノクローナル抗体を結合させ磁性化したマイクロビーズ（商品名『ＣＤ２マイクロビーズ』、ミルテニー・バイオテック社販売）２０μｌを添加した以外は上記と同様に操作し、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ２陰性ＣＤ１４陰性細胞とに分画した。臍帯血Ｎｏ．１乃至１０由来の単核球細胞から以上のようにして調製したＣＤ１４陽性細胞Ｎｏ．１乃至１０とＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞Ｎｏ．１乃至１０はそれぞれ以下の第２工程の培養に供した。本実施例に記載した本発明の製造方法における第１工程を模式図として図１に示す。【００３２】
＜第２工程：ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とストローマ細胞との共培養によるブラスト細胞の取得＞
第１工程で調製したＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞Ｎｏ．１乃至１０を、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、予めマウスストローマ細胞株「ＳＴ２」（ＲＣＢ０２２４、理研バイオリソースセンター）をコンフルエントになるまで培養してウェル底部（底面積９．６２ｃｍ２）に付着させておいた市販の６ウェルマイクロプレート（１ウェルにつきマウスストローマ細胞４×１０５個）に、１ウェルにつき６×１０６個、すなわち、ウェルの底面積当たり６．２×１０５個／ｃｍ２の密度で播種した。約１週間共培養した後、浮遊細胞を培地とともに回収し、それぞれブラスト細胞を含むヒト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０とした。【００３３】
＜ヒト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０におけるブラスト細胞の割合の算出＞
上記で回収したブラスト細胞を含むヒト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０について、以下の方法によりブラスト細胞と休止細胞との細胞数をそれぞれ求めた。すなわち、回収したヒト細胞集団をフローサイトメトリーに供し、前方散乱光（ＦＳ）と側方散乱光（ＳＳ）の２次元パターンを解析して得られるブラスト細胞と休止細胞との細胞数に基づき、次式によってブラスト細胞の割合を算出した。また、フローサイトメトリーの一例として、ヒト細胞集団Ｎｏ．６のＦＳとＳＳの２次元パターンを図２に示す（図２中、符号Ｂはブラスト細胞を、符号Ｒは休止細胞を表し、他の点の大半は細胞の破片である）。
【式１】
【００３４】
0005602133.tif 000002
【００３５】
＜ヒト細胞集団における細胞膜表面抗原ＣＤ４及びＣＤ８の解析＞
取得したヒト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０について、常法にしたがって、フィコエリスリン（ＰＥ）標識マウス抗ヒトＣＤ４抗体及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識マウス抗ヒトＣＤ８抗体（日本ベクトンディッキンソン社製造）を用いて二重染色し、フローサイトメトリー分析を行なうことにより、ブラスト細胞をＣＤ４陽性ＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の３グループに分類し、細胞数に基づきブラスト細胞における各グループの細胞の割合（％）を求めた。本工程により得られたヒト細胞集団のフローサイトメトリーの一例として、ヒト細胞集団Ｎｏ．６の結果を図３に示す（図３中、符号Ａ、Ｂ及びＣは、それぞれＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性細胞及びＣＤ４陰性ＣＤ８陽性細胞を意味する）。ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とストローマ細胞との共培養によるブラスト細胞の調製結果を表１にまとめた。
【００３６】
【表１】
0005602133.tif 000003
【００３７】
表１に示すように、臍帯血Ｎｏ．１乃至１０にそれぞれ由来するＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とストローマ細胞とを共培養したところ、本発明の製造方法における第２工程において、試験した１０例全てでブラスト細胞の出現が認められた。培養終了時の全細胞中に占めるブラスト細胞の割合は２１乃至６４％程度であり、ブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の割合は３０乃至７３％程度であった。また、本工程終了時における全細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の割合は６．７乃至４４％程度であった。
【００３８】
＜第３工程：ブラスト細胞を含むヒト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０のＣＤ１４陽性細胞／マウスストローマ細胞ＳＴ２との共培養によるブラスト細胞の増殖＞
前記第１工程で調製した臍帯血Ｎｏ．１乃至１０由来のＣＤ１４陽性細胞を、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、予めマウスストローマ細胞株ＳＴ２をコンフルエントになるまで培養してウェル底部に付着させておいた市販の６ウェルマイクロプレート（１ウェルにつきマウスストローマ細胞４×１０５個）に、１ウェルにつき２×１０６個／３ｍｌずつ播種して１週間共培養した。次いで、得られた共培養物に、前記第２工程で取得したブラスト細胞を含むヒト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０を、それぞれ１ウェルにつき２×１０６個／３ｍｌずつ播種し、２乃至３日間培養した後に増殖細胞を新たなマウスストローマ細胞ＳＴ２上に植え替え培養する操作を２回繰り返した。
【００３９】
培養後、ヒト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０を播種して培養した培養物のそれぞれから浮遊するブラスト細胞を培地とともに回収してブラスト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０とした。各ブラスト細胞集団における細胞数を常法により測定し、培養に用いた細胞数に基づいてブラスト細胞の増殖率を求めるとともに、実施例２と同様の方法により、ブラスト細胞をＣＤ４陽性ＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の３グループに分類し、細胞数に基づきブラスト細胞における各グループの細胞の割合（％）を求めた。結果を表２にまとめた。
【００４０】
【表２】
0005602133.tif 000004
【００４１】
表２に示すように、本工程におけるブラスト細胞の増殖倍率は３．５乃至１３．１倍で、平均すると８．６倍であった。前工程において全細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合が９．６％と最も低値を示した臍帯血Ｎｏ．９由来のヒト細胞集団は、本工程後においてもＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞数が全細胞数の１１．９％と低く、目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の判定基準の一つとして定めた、「ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞数が全細胞数の２０％以上」を満たしていなかった。この段階で、前記基準を満たすものは１０例中９例であった。
【００４２】
＜第４工程：ヒトブラスト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０のＩＬ−２存在下でのストローマ細胞との共培養による増殖＞
前記第３工程で得たヒトブラスト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０を、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清とＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、予めマウスストローマ細胞株ＳＴ２をコンフルエントになるまで培養してウェル底部に付着させておいた市販の６ウェルマイクロプレート（１ウェルにつきマウスストローマ細胞４×１０５個）に、１ウェルにつき５×１０６個／３ｍｌずつ播種して２乃至３日間培養した後に増殖細胞を新たなマウスストローマ細胞ＳＴ２上に植え替え培養する操作を２回繰り返した。
【００４３】
培養後、ブラスト細胞集団Ｎｏ．１乃至１０を播種して培養した培養物のそれぞれから前記第３工程の場合と同様に細胞を回収しヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０とした。各ヒトＴ細胞集団における細胞数を測定し、培養に用いた細胞数に基づいて増殖率を求めるとともに、前記第２工程と同様の方法により、ヒトＴ細胞集団をＣＤ４陽性ＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の３グループに分類し、細胞数に基づきヒトＴ細胞集団における各グループの細胞の割合（％）を求めた。本工程により得られたヒトＴ細胞集団のフローサイトメトリーの例として、ヒトＴ細胞集団Ｎｏ．６の結果を図４に示す（図４中の符号Ａ、Ｂ及びＣについては、図３と同様）。結果を表３にまとめた。
【００４４】
【表３】
0005602133.tif 000005
【００４５】
図４に示すように、本工程により得たヒトＴ細胞集団は、実質的にＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（図４における符号Ａ）、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞（図４における符号Ｂ）、及び、ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞（図４における符号Ｃ）の３つのグループからなるものであり、第１工程後（図３）で示したヒト細胞集団の場合よりもＣＤ４陰性ＣＤ８陽性細胞の割合が増加していた。また、表３に示すように、本工程における細胞の増殖倍率は７．６乃３８２倍であった。前記第２工程及び第３工程において全細胞数に占めるＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の細胞数が低値を示した臍帯血Ｎｏ．９由来のヒトＴ細胞集団は、本工程後においてもＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の細胞数が全細胞（ヒトＴ細胞集団）数の９．４％と低く、前記した基準を満たしていなかった。
【００４６】
本発明の製造方法における第２、第３及び第４工程の流れを模式的に図５にまとめた。図５を用いて上記３つの工程を再度説明するならば、第２工程（図５における上段）では、第１工程で得たＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞（図５における符号１）を予めコンフルエントな状態まで増殖させておいたストローマ細胞（図５における符号２）に添加して共培養を行い、ブラスト細胞（図５における符号３）を出現させる。第３工程では、第１工程で得たＣＤ１４陽性細胞（図５における符号４）をストローマ細胞と共培養しておいたものに前記ブラスト細胞またはブラスト細胞を含む細胞を添加し、植え継ぎながらブラスト細胞を増殖させる。第４工程では、ブラスト細胞をＩＬ−２存在下でストローマ細胞と共培養（図５における符号５）して植え継ぎながら増殖させ、細胞障害活性と免疫抑制活性とを併せ持つヒトＴ細胞集団を得る。
【実施例２】
【００４７】
実施例１の第４工程で得られたヒトＴ細胞集団が、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに開示した目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性とを併せ持つヒトＴ細胞集団であるか否かを判定するため、以下に示す基準を設定し、全ての基準を満たすものを目的のヒトＴ細胞集団と判定した。
（１）ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の細胞数が全細胞数の２０％以上を占める。
（２）共培養に用いたストローマ細胞に対して細胞障害活性を示す。
（３）ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対して細胞障害活性を示す。
（４）活性化Ｔ細胞に対する免疫抑制活性を有する。
（５）細胞膜表面抗原ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／βがいずれも陽性である。
（６）ＩＬ−２存在下においてＩＬ−１０を産生する。【００４８】
上記の内、（１）については実施例１において既に確認されており、（２）については実施例１の第４工程におけるストローマ細胞との共培養において、ストローマ細胞の消滅（死滅）が肉眼観察され、細胞障害活性が確認されたため、以下の試験では、実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０について、上記（３）乃至（６）の基準を満たすか否かについて検討した。【００４９】
＜ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対する細胞障害活性＞
ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞（ＪＲＣＢ０２２４、ヒューマンサイエンス研究資源バンク)に対する細胞障害活性は、生存細胞数を、メチレンブルー色素を用いたダイ・アップテイク法で測定することにより評価した。ＷｉＤｒ細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、これを４×１０４個／ウェルの細胞濃度でゼラチン処理した４８ウェルプレートに播き込み、一晩培養した。これに、効果細胞（Ｅ）として、実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団１乃至１０を、標的細胞（Ｔ）としてのＷｉＤｒ細胞に対して、それぞれ細胞数としてＥ：Ｔ＝８：１の割合で添加し、共培養を開始した（培地：ＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＣＳ、ＩＬ−２  １０ｎｇ／ｍｌ）。２０時間後に効果細胞と死細胞を除去し、培地（ＲＰＭＩ１６４０  １０％ＦＣＳ）を４００μｌ添加した。次に２５％グルタルアルデヒド溶液(和光社製)を１滴、パスツールピペットで添加し、１５分間固定した後、水洗、乾燥した。次に０．１％メチレンブルー(和光社製)を２００μｌ添加し、１５分間染色した後、水洗、乾燥した。最後に０．３３Ｎ塩酸２００μｌを添加してメチレンブルーを溶出、抽出液を２００μｌ回収し、９６ウェルプレートに移して吸光度計（商品名「Ｖｍａｘ  プレートリーダー」、和光純薬製）で６５０ｎｍの吸光度を測定し、下記式２により細胞障害活性（％）を算定した。式２中、共培養値とはＷｉＤｒ細胞とヒトＴ細胞集団を共培養したものの吸光度を、ＷｉＤｒ細胞単独培養値とは効果細胞（Ｅ）としてのヒトＴ細胞集団を加えずに培養したものの吸光度を、ブランク値とは細胞を播くことなく同様に処理したものの吸光度をそれぞれ意味する。なお、本測定においては、コンベンショナルＴ細胞（ヒト血液から分離したＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性細胞を、抗ヒトＣＤ３抗体と抗ヒトＣＤ２８抗体で刺激しＩＬ−２存在下で培養・増殖させたＣＤ４陽性Ｔ細胞集団）を対照として用い、同様に細胞障害活性を測定した。結果を表４に示す。
【式２】
【００５０】
0005602133.tif 000006
【００５１】
【表４】
0005602133.tif 000007
【００５２】
表４に示すように、対照のコンベンショナルＴ細胞のヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対する細胞障害活性（％）は１２．４％であり、この値よりも細胞障害活性（％）が有意に高い５０％以上のものを細胞障害活性を有すると判定した。ヒトＴ細胞集団Ｎｏ．２乃至１０はいずれもヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対する細胞障害活性（％）が７３％以上を示し、ＷｉＤｒ細胞に対する細胞障害活性を有すると判定した。ヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１が示す細胞障害活性は３９．３％と対照のコンベンショナルＴ細胞よりも高値を示したものの、基準値を下回っていた。
【００５３】
＜免疫抑制活性＞
常法の同種混合リンパ球反応法により、実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０の免疫抑制活性を測定した。
【００５４】
応答細胞としてのＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞は以下の方法で調製した。リンパ球比重分離液（商品名『フィコールパック−プラス』）を用いた常法の比重遠心法によりヒト末梢血から単核球細胞を採取し、これに抗ヒトＣＤ２５モノクローナル抗体を結合させたマイクロビーズ（ミルテニー・バイオテック社販売）を用いＭＡＣＳ法を適用してＣＤ２５陽性細胞を除去することによってＣＤ２５陰性細胞を採取し、さらにこのＣＤ２５陰性細胞から、抗ヒトＣＤ４モノクローナル抗体を結合させたマイクロビーズ（ミルテニー・バイオテック社販売）を用いたＭＡＣＳ法を適用してＣＤ４陽性細胞を採取した。
【００５５】
刺激細胞としての樹状細胞を以下の方法で調製した。ヒト臍帯血から、「ヒトＣＤ１４マイクロビーズ」（ミルテニー・バイオテック社販売）を用い、ＭＡＣＳ法を適用してＣＤ１４陽性の単球を採取し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下で１乃至２週間培養した後、樹状細胞を採取し、それをリポ多糖で２日間培養し、同種混合リンパ球反応法に使用する直前に常法にしたがってマイトマイシンＣ処理した。
【００５６】
上記の応答細胞を１×１０５個及び刺激細胞を５×１０３個ずつ、マイクロプレートのウェル中に播種し、これに実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０をそれぞれ１×１０５個ずつ播種し、７日間培養した。培養が終了する１６時間前に培養培地中に３Ｈ−チミジンを適当量添加し、被験ウェルとした。また、対照ウェルとして、ヒトＴ細胞集団を添加しない以外は同様に処理したウェルを用意した。常法にしたがい、被験ウェル及び対照ウェルにおける３Ｈ−チミジンの取り込み量を測定し、下記式３により免疫抑制活性（％）を算定した。なお、免疫抑制活性については、ゴッドフレー（Ｇｏｄｆｒｅｙ）ら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第１０４巻、第２号、４５３乃至４６１頁（２００４）に記載された、臍帯血から誘導したＣＤ４陽性ＣＤ２５陽性制御性Ｔ細胞の免疫抑制活性の判定基準（免疫抑制活性６５％以上：明らかな抑制活性、免疫抑制活性２０乃至６５％：弱い抑制活性）に基づき判定した。結果を表５に示す。
【式３】
【００５７】
0005602133.tif 000008
【００５８】
【表５】
0005602133.tif 000009
【００５９】
表５に示すように、実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０は、１０例全てが免疫抑制活性６５％以上を示し、全１０例が、明らかな免疫抑制活性を有すると判定された。
【００６０】
＜細胞膜表面抗原ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／βの解析＞
抗ヒトＣＤ３抗体（アールアンドディー社製造）、抗ヒトＣＤ２５抗体(ベックマンコールター社製造)、抗ヒトＣＤ２８抗体（アールアンドディー社製造）及び抗ヒトＴ細胞抗原受容体α／β抗体（日本ベクトンディッキンソン社製造）をそれぞれ用いてフローサイトメトリー法にて実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０を解析した。陰性対照としてＭＯＰＣ−２１マウスミエローマＩｇＧ（アイシーエヌ社製造）を用いた。上記抗体で被験細胞を３０分間処理し、常法にしたがい、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を結合させた２次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ）で３０分間処理した。被験細胞はフローサイトメーター(商品名「ＥＰＩＣＳ  ＸＬ」、ベックマンコールター社製造)で分析し、表６に示した。なお、陽性率（％）は被験細胞のうち、陰性対照を基準に設定した閾値以上の蛍光強度を示す細胞の割合を示し、Ｔ細胞であることを示すＣＤ３及びＴ細胞抗原受容体α／βについては、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに開示された細胞障害活性と免疫抑制活性とを併せ持つヒトＴ細胞集団におけると同様に、陽性率（％）が９０％以上を示すものを陽性と判定し、ＣＤ２５及びＣＤ２８については、同様に陽性率（％）が７０％以上を示すものを陽性と判定した。
【００６１】
【表６】
0005602133.tif 000010
【００６２】
表６に示すように、実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０は、１０例全てが細胞膜表面抗原ＣＤ３陽性率９８．２％以上、Ｔ細胞抗原受容体α／β陽性率９８．２％以上、ＣＤ２５陽性率８０．８％以上、及び、ＣＤ２８陽性率７１．５％以上、を示し、細胞膜表面抗原ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／βがいずれも陽性と判定された。
【００６３】
＜ＩＬ−２存在下におけるＩＬ−１０産生能＞
実施例１の第４工程においてヒトＴ細胞集団を取得した際の培養液上清を用いて、上清中のＩＬ−１０濃度を、抗ヒトＩＬ−１０抗体を用いたアッセイキット（イーバイオサイエンス社製造）により測定することによりヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０のＩＬ−２存在下におけるＩＬ−１０産生能を調べた。なお、本測定においては、前記細胞障害活性の項で述べた、斯界において対照としてよく用いられるコンベンショナルＴ細胞が３０ｐｇ／ｍｌ程度のＩＬ−１０を産生することから、それよりも有意に高い１００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１０を培養液中に産生したヒトＴ細胞集団を、ＩＬ−１０産生能を有すると判定した。結果を表７に示す。
【００６４】
【表７】
0005602133.tif 000011
【００６５】
表７から明らかなように、ヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１を除くＮｏ．２乃至１０の全てが培養上清中に７００ｐｇ／ｍｌ以上のＩＬ−１０を産生しており、ＩＬ−１０産生能の基準を満たすものは１０例中９例であった。
【００６６】
＜総合判定＞
上記試験で得られた結果に基づき、実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１乃至１０が、目的とする細胞障害活性及び免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団であるか否かを総合的に判定した。結果を表８にまとめた。なお、表８中、符号○及び×は、それぞれ、判定基準を満たす、及び、判定基準を満さない、を意味する。
【００６７】
【表８】
0005602133.tif 000012
【００６８】
表８から明らかなように、実施例１の第４工程で得たヒトＴ細胞集団Ｎｏ．２乃至８及びＮｏ．１０は、６項目の判定基準全てにおいて基準値を満たし、目的とする、細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団であると判定された。一方、ヒトＴ細胞集団Ｎｏ．１は、ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対する細胞障害活性とＩＬ−１０産生能において基準を満たしておらず、また、ヒトＴ細胞集団Ｎｏ．９はブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合において基準を満たしていなかった。使用した臍帯血１０例から細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団が８例得られたこととなり、本発明の製造方法により細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団が製造できる確率は８０％と高確率であることが判明した。なお、ヒトＴ細胞集団Ｎｏ．２乃至８及びＮｏ．１０における核内ＦＯＸＰ３及び細胞質内ＣＴＬＡ−４の発現についても国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットと同様に調べたところ、いずれも陽性と判定され、国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレットに開示された細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団と同等のヒトＴ細胞集団であることが確認された。
【参考例】
【００６９】
＜従来法によるヒト臍帯血由来単核球細胞からの細胞障害活性と免疫抑制活性とを併せ持つヒトＴ細胞集団の製造＞
インフォームドコンセントを交わした妊婦１０名の、分娩時に切除した臍帯から血液（Ｎｏ．１´乃至１０´）を採取し、それぞれＲＰＭＩ１６４０培地で約２倍容に希釈し、常法に従い、リンパ球比重分離液（商品名『フィコールパック−プラス』、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社販売）を用いた比重遠心法により単核球を含む層をそれぞれ採取し、生理食塩水で洗浄して単核球細胞を取得した。得られた単核球細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させ、予めマウスストローマ細胞株ＳＴ２細胞（ＲＣＢ０２２４、理研バイオリソースセンター）をコンフルエントな状態まで培養してウェル底部に付着させておいた市販の６ウェルマイクロプレート（１ウェルにつきマウスストローマ細胞数４×１０５個）に、３×１０６個ずつ播種した。１週間培養後、浮遊細胞を培地とともに回収し、新鮮なストローマ細胞を付着させた６ウェルマイクロプレートに移し、引き続き共培養した。この操作を繰り返し合計３週間以上培養し、均一なＴ細胞形態を示す増殖性のブラスト細胞を出現させ、培養が４週間を過ぎた時点でＩＬ−２を添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）することにより細胞を増殖させた。得られた細胞について、さらに上記と同様の方法でブラスト細胞の出現の有無、及び、得られたブラスト細胞中に占めるＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合を実施例１と同様にフローサイトメトリーにより調べた。結果を表９に示す。
【００７０】
【表９】
0005602133.tif 000013
【００７１】
表９に示すように、用いた臍帯血１０例中の２例、すなわち、臍帯血Ｎｏ．１´及び８´由来の単核球細胞からはブラスト細胞の出現自体が認められなかった。また、臍帯血Ｎｏ．３´乃至７´、及び、Ｎｏ．９´及び１０´由来の単核球細胞からはブラスト細胞の出現は認められたものの、細胞中に占めるＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合が２０％未満であり、目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の基準に満たないものであった。この段階で、基準を満たすヒトＴ細胞集団は臍帯血Ｎｏ．２´由来の１例のみとなった。臍帯血Ｎｏ．２´由来ヒトＴ細胞集団について、前記した判定基準（３）ヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞に対する細胞障害活性；（４）免疫抑制活性；（５）細胞表面抗原ＣＤ３、ＣＤ２５、ＣＤ２８及びＴ細胞抗原受容体α／β；（６）ＩＬ−１０産生能；を実施例２と同じ方法により調べたところ、全ての基準を満たしていた。国際公開番号  ＷＯ  ２００７／１０５７９７  Ａ１パンフレット記載の従来法によっては、細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団が１０例中１例しか得られないことを示す本参考例の結果は、従来の製造方法が、目的とするヒトＴ細胞集団は得られるものの、その確率が１０％程度の効率の悪いものであることを明瞭に物語っている。
【００７２】
下記の実施例３では本発明の第２工程に与えるＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の細胞数の影響について、また、実施例４及び５では本発明の製造方法における第１工程において得たＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ１４陽性細胞の凍結保存の影響について説明する。
【実施例３】
【００７３】
＜本発明の製造方法における第２工程に与えるＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の細胞数の影響＞
本発明の製造方法における第２工程、すなわち、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞のストローマ細胞との共培養によるブラスト細胞の誘導工程に与えるＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の細胞数の影響を検討した。【００７４】
インフォームドコンセントを交わした妊婦１名から採取した臍帯血（Ｎｏ．Ｔ１）から、実施例１と同じ方法で単核球細胞の調製及びＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の調製を行った。次いで、予めマウスストローマ細胞ＳＴ２をコンフルエントな状態まで増殖させておいたマイクロプレートのウェル（３ｍｌ、底面積９．６２ｃｍ２）に２．０×１０６個又は６．０×１０６個、すなわち、ウェルの底面積当たり２．１×１０５個又は６．２×１０５個／ｃｍ２の密度でＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を播き込み、８日間培養した後、浮遊細胞を培地とともに回収し、実施例２の方法で全細胞中のブラスト細胞の割合、及び、ブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性及びＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の各細胞グループの割合を測定した。結果を表１０に示す。【００７５】
【表１０】
0005602133.tif 000014
【００７６】
表１０から明らかなように、播き込むＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞のウェル底面積当たりの密度を２．１×１０５個／ｃｍ２とした場合には、ストローマ細胞と共培養して得た全細胞中のブラスト細胞及び全細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の割合がそれぞれ、２８．６％及び１６．９％と比較的低い値となった。一方、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞のウェル底面積当たりの密度を６．２×１０５個／ｃｍ２とした場合には、全細胞中のブラスト細胞及び全細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の割合がそれぞれ、６１．８％及び４４．７％と比較的高い値となった。この結果は、本発明の製造方法における第２工程においては、ブラスト細胞及びブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞を効率的に誘導するためには、播き込むＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の密度をウェル底面積当たり６．２×１０５個／ｃｍ２と比較的高めに設定するのが望ましいことを示している。
【実施例４】
【００７７】
＜ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の凍結保存がブラスト細胞誘導に与える影響＞
本発明の製造方法における第１工程において臍帯血由来単核球細胞から調製したＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の凍結保存が、第２工程のブラスト細胞の誘導に与える影響を検討した。【００７８】
インフォームドコンセントを交わした妊婦３名から採取した臍帯血（Ｎｏ．Ｓ１、Ｓ２及びＳ３）から、実施例１と同じ方法で単核球細胞をそれぞれ調製し、さらに単核球細胞からＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を調製した。得られたＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を２つに分け、一方はそのまま第２工程のストローマ細胞との共培養に供し、もう一方は細胞保存液（商品名『セルバンカー』、十慈フィールド社製）に分散して−８０℃で一晩凍結し、２４時間後に−１９６℃（液体窒素）内に保存した。１２、６９又は９４日間凍結保存した後、３７℃の温浴中で急速解凍した後、上記と同様に第２工程の培養に供した。第２工程のストローマ細胞との共培養では約１週間培養した後、浮遊細胞を培地とともに回収し、実施例２の方法で全細胞中のブラスト細胞の割合、及び、ブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性及びＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の各細胞グループの割合を測定した。ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞の凍結保存操作の有無がブラスト細胞の誘導に与える影響を表１１に示す。【００７９】
【表１１】
0005602133.tif 000015
【００８０】
表１１に示すように、凍結保存したＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を第２工程のストローマ細胞との共培養に供した場合、試験した３例とも全細胞中のブラスト細胞の割合は凍結保存しない場合と同等であった。また、凍結保存したＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞を用いた場合、ブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の割合が、凍結保存しない細胞を用いた場合に比べ若干低下する傾向が３例全てにおいて認められ、凍結又は解凍による細胞障害が認められた。しかしながら、その後の第３工程に供する細胞数を高めに設定すれば培養に影響しないことが判明した。
【実施例５】
【００８１】
＜ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞及びＣＤ１４陽性細胞の凍結保存がブラスト細胞誘導に与える影響＞
本発明の製造方法における第１工程において調製したＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞及びＣＤ１４陽性細胞のいずれをも凍結保存し、解凍して用いた場合の第２工程のブラスト細胞の誘導及び第３工程のブラスト細胞の増殖に与える影響を検討した。【００８２】
インフォームドコンセントを交わした妊婦１名から採取した臍帯血（Ｎｏ．Ｎ１）から、実施例１と同じ方法で単核球細胞をそれぞれ調製し、さらに単核球細胞からＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞及びＣＤ１４陽性細胞を調製した。得られたＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ１４陽性細胞をそれぞれ細胞保存液（商品名『セルバンカー』、十慈フィールド社製）に分散して−８０℃で一晩凍結し、２４時間後に−１９６℃（液体窒素）内に保存した。９０日間凍結保存した後、３７℃の温浴中で急速解凍した後、ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞は実施例４と同様に第２工程の培養に供し、ＣＤ１４陽性細胞は実施例１と同様に第３工程の培養に供した。第２工程のストローマ細胞との共培養では約１週間培養した後、ブラスト細胞を含む浮遊細胞を培地とともに回収し、実施例２の方法で全細胞中のブラスト細胞の割合、及び、ブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性及びＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の各細胞グループの割合を測定したところ、それぞれ３４．８％、及び、４２．７％、４８．３％及び６．２％であった。次いで、凍結保存・解凍したＣＤ１４陽性細胞とストローマ細胞ＳＴ２とを約１週間共培養しておいた培地に上記で得たブラスト細胞を含むヒト細胞を添加し、実施例１の第３工程と同じ条件で培養を行い、得られたブラスト細胞の増殖率、ブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性及びＣＤ４陰性ＣＤ８陽性の各細胞グループの割合を測定した。結果を表１２に示す。【００８３】
【表１２】
0005602133.tif 000016
【００８４】
表１２から明らかなように、第１工程において得たＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞とＣＤ１４陽性細胞をいずれも凍結保存し、９０日後に解凍してそれぞれを第２及び第３工程の培養に用いても、得られるブラスト細胞中のＣＤ４陽性ＣＤ８陽性細胞の割合は２９．５％と、凍結保存することなく培養した場合と遜色ない値が得られることが判明した。【００８５】
実施例４及び５の結果は、本発明の製造方法における第１工程において調製したＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞及びＣＤ１４陽性細胞はいずれも凍結保存が可能であり、必要に応じて解凍して本発明の製造方法における第２及び第３工程の培養に使用できることを示している。本発明の製造方法は、目的とする細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を製造する上で、従来法のように、ヒトＴ細胞集団製造の都度、新鮮なヒト臍帯血を入手する必要がないという利点を有している。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
叙述したとおり、本発明の細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団の製造方法によれば、自己免疫疾患、アレルギー性疾患などの治療、移植医療、癌治療などに有用な細胞障害活性と免疫抑制活性を併せ持つヒトＴ細胞集団を効率よく製造することができる。本発明は、かくも顕著な作用効果を奏する発明であり、産業上の貢献度が誠に多大な意義ある発明である。
【符号の説明】
【００８７】
図２において、
Ｂ：ブラスト細胞
Ｒ：休止細胞
図３及び４において、
Ａ：ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞
Ｂ：ＣＤ４陽性ＣＤ８弱陽性Ｔ細胞
Ｃ：ＣＤ４陰性ＣＤ８陽性Ｔ細胞
図５において、
１：ＣＤ２陽性ＣＤ１４陰性細胞
２：ストローマ細胞
３：ブラスト細胞
４：ＣＤ１４陽性細胞
５：ＩＬ−２存在下でのストローマ細胞との共培養
【図１】
0005602133.tif 000017
【図２】
0005602133.tif 000018
【図３】
0005602133.tif 000019
【図４】
0005602133.tif 000020
【図５】
0005602133.tif 000021