(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］
X-A1-Gly-Arg-Gly-E-D        ［１］
（式中、Xはアミノ酸のN−末端保護基を表し、A１は、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜３個から構成されるペプチド残基を表し、Glyはグリシン残基を、Argはアルギニン残基を表し、A２は、グリシン残基、リジン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基又はアラニン残基を表し、Eはスペーサー又は結合手を、Dは励起波長が500〜800nmである蛍光色素由来の置換基をそれぞれ表す。）で示される、β−グルカン及び／又はエンドトキシン測定用のペプチド誘導体。
【請求項２】
A１がアミノ酸残基であって、該アミノ酸残基が、ロイシン残基、イソロイシン残基、セリン残基、トレオニン残基から選ばれるものである請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項３】
A１がトレオニン残基である請求項１に記載のペプチド誘導体。
【請求項４】
Xで示されるN末端保護基がアセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、トシル基、グルタリル基及びt-ブトキシカルボニル基から選ばれるものである請求項１〜３の何れかに記載のペプチド誘導体。
【請求項５】
Dで示される蛍光色素由来の置換基が、シアニン色素由来のものである、請求項１〜４の何れかに記載のペプチド誘導体。
【請求項６】
Dで示される蛍光色素由来の置換基における色素が、Cy系色素、Dy系色素、HiLyte系色素、又はAlexa系色素である、請求項１〜４の何れかに記載のペプチド誘導体。
【請求項７】
Eで示されるスペーサーが下記一般式［３］
R1-A-R2            ［３］
［式中、R1はカルボキシル基と反応性を有する基を、Aは炭素数１〜６の直鎖アルキレン基を、R2はDで示される蛍光色素由来の置換基中の官能基と反応性を有する基をそれぞれ示す］で示される化合物由来のものである、請求項１〜６の何れかに記載のペプチド誘導体。
【請求項８】
一般式［１］が、
Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH-(CH2)4-NH-D    
（式中、Bocはt-ブトキシカルボニル基を表し、Thrはトレオニン残基を、Gly、Arg、Dは、前記と同じ）である、請求項１記載のペプチド誘導体。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかに記載のペプチド誘導体を含有する、β−グルカン及び／又はエンドトキシン測定用試薬。
【請求項１０】
β−グルカン及び／又はエンドトキシンを含む試料と、カブトガニ血球成分と、請求項１〜８の何れかに記載のペプチド誘導体とを反応させ、その結果遊離する下記一般式［２］
H-A２-E -D        ［２］
（式中、A２、E及びDは前記と同じ。）
を未反応物質と分離定量し、その値に基づいて行うことを特徴とするβ−グルカン及び／又はエンドトキシンの測定方法。
【請求項１１】
分離定量方法がキャピラリー電気泳動又は液体クロマトグラフィーを用いる方法である請求項９記載の測定方法。
【請求項１２】
カブトガニ血球成分と、請求項１〜８の何れかに記載のペプチド誘導体とを、構成成分として含んで成るβ−グルカン及び／又はエントドキシンの測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(1→3)-β-D-グルカン（以下β-グルカン）及び／又はエンドトキシンとカブトガニ血球成分との反応により活性化される凝固酵素の活性測定用基質として有用な新規ペプチド誘導体及び該誘導体を用いたβ−グルカン及び／又はエンドトキシンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖（Lipopolysaccharide,LPS）であり、強い発熱性物質として知られている。このため、注射用医薬品等においてエンドトキシンの検出は重要と考えられており、米国や日本の薬局方にもエンドトキシン試験法が収載されている。また、エンドトキシンはグラム陰性菌感染症におけるショックの主な原因と考えられており、臨床診断上では、血漿中エンドトキシンの測定がグラム陰性菌感染症の診断、グラム陰性菌感染症の治療効果及び予後の判定、エンドトキシンショックの早期診断等に用いられている。一方、β-グルカンは多くの病原性真菌の主要細胞壁構成成分の一つとして知られており、臨床診断上では血漿あるいは血清中β-グルカンの測定が、真菌感染症の早期診断、治療効果および予後の判定に用いられている。【０００３】
エンドトキシン及び／又はβ-グルカンの測定方法としては、カブトガニ血球成分とエンドトキシン及び／又はβ-グルカンとの反応により活性化される複数のプロテアーゼ前駆体（ファクターC、ファクターG、ファクターB、プロクロッティング酵素、コアギュローゲン）の作用を利用する方法、その中でも、発色基あるいは蛍光基に隣接するアミド結合が切断されることにより発色または蛍光が大きく変化する発色基や蛍光基を利用した方法、即ち、ニトロフェノール、ニトロアニリン、クマリン誘導体、インドキシル誘導体等の発色性化合物又は蛍光性化合物をアミド結合を介して導入した合成ペプチド誘導体をエンドトキシン測定用の基質として使用する測定方法は種々報告されている（特公昭59-19532号公報、特公昭61-54400号公報、特開昭57-502266号公報、特開平8-34796号公報）。しかしながら、何れの基質を用いた測定も、発色基あるいは蛍光基に隣接するアミド結合が切断されることにより発色または蛍光が大きく変化する発色基や蛍光基を導入していた。その結果、測定感度が低い、遊離された物質の励起波長が、血清中の夾雑物質が有する励起波長の範囲内にあるため、これらによる影響を回避できない等の理由により高感度測定に適用できないという問題を有していた。【０００４】
【特許文献１】特公昭59-19532号公報
【特許文献２】特公昭61-54400号公報
【特許文献３】特開昭57-502266号公報
【特許文献４】特開平8-34796号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、高感度測定を可能とするβ-グルカン又はエンドトキシン測定用ペプチド誘導体及びそれを用いたβ-グルカン及び／又はエンドトキシン測定方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記状況に鑑み、分子量の違いに基づく分離を短時間で且つコンパクトな装置を用いて行う方法（キャピラリーチップ電気泳動法等）が近年発展してきたことに注目し、該方法を利用すれば、発色基あるいは蛍光基に隣接するアミド結合が切断されることにより発色または蛍光が大きく変化する従来の発色基や蛍光基以外のものも適用できると考えた。そして、血清中の夾雑物質が有する励起波長（300〜450nm）より長波長の励起波長を有する蛍光色素を導入した基質を用いればβ-グルカン及び／又はエンドトキシンを高感度に測定可能となると考えて検討を行った。しかしながら、従来用いられていた基質（例えば、X-F-Gly-Arg-Y：X-F-はN−末端が保護されたアミノ酸残基を表し、Glyはグリシン残基を、Argはアルギニン残基を表し、Yは遊離することにより発色または蛍光が大きく変化する発色基や蛍光基を表す）のYの代わりにこれら色素を導入した場合には、LAL(Limulusamebocyte lysate)等のカブトガニ血球成分カスケードに於いて活性化されたクロッティング酵素との反応性が低い（酵素との反応性が遅くなる）という問題があることが判った。そこで更に研究した結果、X-F-A-Gly-Arg-のＣ末端に更にもう一つのアミノ酸残基を結合したものに上記色素を導入したものが、クロッティング酵素により特異的に切断され、且つその反応速度が従来の基質に対するそれと同等またはそれ以上であることを見出した。即ち、
X-A１-Gly-Arg-A２-E-D        ［１］
（式中、Xはアミノ酸のN−末端保護基を表し、A１は、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜３個から構成されるペプチド残基を表し、Glyはグリシン残基を、Argはアルギニン残基を表し、A２は、グリシン残基、リジン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基又はアラニン残基を表し、Eはスペーサー又は結合手を、Dは蛍光色素由来の置換基をそれぞれ表す。）
で示されるペプチド誘導体が、クロッティング酵素によりArg-A２間の結合が特異的に切断され、更に、ペプチドに対するクロッティング酵素の反応速度が従来の基質に対するそれと同等またはそれ以上であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
本発明は、（１）下記一般式［１］
X-A１-Gly-Arg-A２-E -D        ［１］
（式中、X、A１、Gly、Arg、A２、E、Dは上記と同じ。）で示されるペプチド誘導体、（２）上記ペプチド誘導体を含有する、β−グルカン及び／又はエンドトキシン測定用試薬、（３）β−グルカン及び／又はエンドトキシンを含む試料と、カブトガニ血球成分と、上記ペプチド誘導体とを反応させ、その結果遊離する下記一般式［２］
H-A２-E -D        ［２］
（式中、A２、E及びDは前記と同じ。）
を未反応物質と分離定量し、その値に基づいて行うことを特徴とするβ−グルカン及び／又はエンドトキシンの測定方法、（４）カブトガニ血球成分と、上記ペプチド誘導体とを、構成成分として含んで成るβ−グルカン及び／又はエントドキシンの測定用試薬キットに関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来の方法と比較し、β−グルカン及び／又はエンドトキシンを高感度に、特に血清中のβ−グルカン及び／又はエンドトキシンを高感度に測定することを可能とする。また、従来法よりも短時間での測定を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Boc-Thr-OH、H-Gly-OEt、Boc-Arg(NO2)-OH、Boc-Gly-OH、Boc-NH-(CH2)4-NH2、Hilyte647を原料としてBoc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647を合成した時の模式図を示す。尚、図１中の(1)〜(12)は、下記(i)〜(xii)の合成により得られた化合物(1)〜(12)を表す。
【図２】Boc-Thr-OH、Gly-OEt、Boc-Arg(NO2)-OH、Boc-NH-(CH2)4-NH2、Hilyte647を原料としてBoc-Thr-Gly-Arg-NH(CH2)4NH-Hilyte647を合成した時の模式図を示す。尚、図２中の(2)及び(4)は実施例１の(ii)及び(iv)で得られた化合物(2)及び(4)を、(C1)〜(C6)は下記参考例(i)〜(vi)の合成で得られた化合物(C1)〜(C6)を表す。
【図３】本発明の基質を用いた場合と参考例１で得た基質を用いた場合について、反応時間と分解物質量（総面積に対する分解産物面積）の関係を示した。なお、−◆−は、本発明の基質（Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH-(CH2)4-HiLyte647）を用いた時の結果を--◇--は、既知の基質（Boc-Thr-Gly-Arg-NH-(CH2)4-HiLyte647）を用いた時の結果をそれぞれ表す。
【図４】キャピラリーチップのレイアウトを示す。
【図５】キャプラリー内の泳動用試料と試液の配置関係を表した図である。
【図６】マイクロチップ電気泳動による分離測定を行った時の、本発明のペプチド誘導体の酵素分解産物濃度とβ-グルカン濃度との関係を示したグラフである。
【図７】HPLCによる分離測定を行った時の、本発明のペプチド誘導体の酵素分解産物濃度とβ-グルカン濃度との関係を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のペプチド誘導体は、下記一般式［１］で示されるものであるが、
X-A１-Gly-Arg-A２-E -D        ［１］
（式中、X、A１、Gly、Arg、A２、E、Dは上記と同じ。）
該一般式［１］で示されるペプチド誘導体は、無機酸又は有機酸と酸付加塩を形成していてもよく、そのような酸付加塩の具体例としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩等の無機酸塩、例えば酢酸塩、シュウ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、p−トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩等が好ましく挙げられる。【００１１】
一般式［１］に於いて、Xで示されるアミノ酸のN-末端保護基としては、アミノ酸やペプチドのN-末端保護基として通常この分野で用いられる基であれば特に限定されないが、例えばアセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、トシル基、グルタリル基、t-ブトキシカルボニル基等が挙げられ、中でもt-ブトキシカルボニル基等が好ましい。【００１２】
一般式［１］に於いて、A1で示されるアミノ酸残基としては、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、セリン残基、トレオニン残基、シスチン残基、メチオニン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、チロシン残基、プロリン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン酸残基、グルタミン残基、アスパラギン残基、リジン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基等が挙げられ、中でもロイシン残基、イソロイシン残基、セリン残基、トレオニン残基等が好ましく、ロイシン残基、セリン残基、トレオニン残基等がより好ましく、トレオニン残基が特に好ましい。また、A1で示されるアミノ酸残基２〜３個から構成されるペプチド残基としては、通常この分野で用いられるものでクロッティング酵素により切断されないものであればよく、例えばバリン−ロイシン残基、ロイシン−ロイシン残基、イソロイシン−ロイシン残基、バリン−セリン残基、バリン−トレオニン残基等のジペプチド残基、又はグリシン−イソロイシン−ロイシン残基、グリシン−バリン−セリン残基、グリシン−バリン−トレオニン残基等のトリペプチド残基が挙げられ、中でもバリン−ロイシン残基、バリン−トレオニン残基、グリシン−バリン−セリン残基、グリシン−バリン−トレオニン残基等が好ましく、バリン−トレオニン残基、グリシン−バリン−トレオニン残基等がより好ましい。上記A1の具体例の中でも、ロイシン残基、イソロイシン残基、セリン残基、トレオニン残基、バリン−トレオニン残基、グリシン−バリン−トレオニン残基等が好ましく、中でもロイシン残基、イソロイシン残基、セリン残基、トレオニン残基等のアミノ酸残基が好ましく、ロイシン残基、セリン残基、トレオニン残基等がより好ましく、トレオニン残基が特に好ましい。【００１３】
一般式［１］に於けるA２としては、グリシン残基、リジン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基又はアラニン残基が挙げられるが、中でもグリシン残基が好ましい。【００１４】
一般式［１］に於けるEで示される結合手又はスペーサーは、Dで示される蛍光色素由来の置換基の元となる蛍光色素が有する官能基（以下、単に「元となる蛍光色素中の官能基」と略記する場合がある）がA2−OHで示されるアミノ酸の末端カルボン酸と容易に結合し得る場合には、結合手となり、元となる蛍光色素中の官能基がA2−OHのアミノ酸の末端カルボン酸と結合し得ない場合には、一方がA2−OHのアミノ酸の末端カルボン酸と容易に結合し得る反応性基を持ち、もう一方が元となる蛍光色素中の官能基と容易に結合し得る反応性基を持つ化合物由来のスペーサーとなる。このようなスペーサーの元となる化合物としては、下記一般式［３］
R1-A-R2            ［３］
［式中、R1はカルボキシル基と反応性を有する基（以下、R1で示される反応性基と略記する場合がある）を、Aは炭素数１〜６の直鎖アルキレン基を、R2はDで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基と反応性を有する基（以下、R2で示される反応性基と略記する場合がある）をそれぞれ示す］で示される化合物が挙げられる。【００１５】
一般式［３］に於けるR1で示される反応性基は、A２で示されるアミノ酸（グリシン残基、リジン残基、トレオニン残基、アスパラギン残基又はアラニン残基）中のカルボキシル基と反応性を有する基を有するものであればよく、例えばアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基等が挙げられる。【００１６】
一般式［３］においてAで示される炭素数１〜６の直鎖アルキレン基としては、例えばメチレン基、エチレン基、n-プロピレン基、n-ブチレン基、n-ペンチレン基、n-へキシレン基等が挙げられる。【００１７】
R2で示される反応性基は、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基（例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、マレイミド基等。以下、「色素由来の置換基の官能基」と略記する場合がある。）と結合し得るものであれば特に限定されず、通常この分野で用いられるもの全てが挙げられ、例えばアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、マレイミド基、下記一般式［４］で示される基
−ＣＯＯＲ３            ［４］
（式中、Ｒ３は水素原子、アルカリ金属原子、有機アンモニウムイオン又はアンモニウムイオンを示す）、−COO−等が好ましいものとして挙げられ、これらは元となる蛍光色素中の官能基に応じて適宜選択される。【００１８】
一般式［４］に於いて、Ｒ３で示されるアルカリ金属原子としては、例えばリチウム原子、ナトリウム原子、カリウム原子、ルビジウム原子等が挙げられ、中でもナトリウム原子又はカリウム原子が好ましく、ナトリウム原子がより好ましい。【００１９】
一般式［４］に於いて、Ｒ３で示される有機アンモニウムイオンとしては、例えばトリアルキルアンモニウムイオン等が挙げられる。当該トリアルキルアンモニウムイオンとしては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れでもよく、通常炭素数１〜１０のもの、好ましくは１〜６のものが挙げられ、具体的には、例えばトリメチルアンモニウムイオン、トリエチルアンモニウムイオン、トリn-プロピルアンモニウムイオン、トリイソプロピルアンモニウムイオン、トリブチルアンモニウムイオン、トリペンチルアンモニウムイオン、トリヘキシルアンモニウムイオン、トリヘプチルアンモニウムイオン、トリオクチルアンモニウムイオン、トリノニルアンモニウムイオン、トリデシルアンモニウムイオン、トリシクロプロピルアンモニウムイオン、トリシクロブチルアンモニウムイオン、トリシクロペンチルアンモニウムイオン、トリシクロヘキシルアンモニウムイオン、トリシクロヘプチルアンモニウムイオン、トリシクロオクチルアンモニウムイオン、トリシクロノニルアンモニウムイオン、トリシクロデシルアンモニウムイオン等が挙げられ、中でもトリメチルアンモニウムイオン又はトリエチルアンモニウムイオンが好ましく、就中、トリエチルアンモニウムイオンがより好ましい。【００２０】
上記一般式［４］のＲ３の具体例の中でも、ナトリウム原子、カリウム原子等のアルカリ金属原子、水素原子、トリエチルアンモウムイオン等が好ましく、中でも、ナトリウム原子、水素原子等が好ましい。【００２１】
一般式［３］に於けるR2で示される反応性基は、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基（例えばアミノ基、カルボキシル基、チオール基、ヒドロキシル基、マレイミド基等）と反応させやすいように、適当な化合物と反応させて適当な反応活性基（以下、R2の反応活性基と略記する場合がある。）を導入し、当該官能基と反応させてもよい。このようにR2で示される反応性基に反応活性基が導入された基（即ち、−反応性基−反応活性基）も「R2で示される反応性基」に含まれる。【００２２】
R2の反応活性基としては、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基と結合させることができ、該官能基と反応性基の反応性を活性化し得るものであれば特に限定されず、通常この分野で用いられるものが全て挙げられる。具体的には、例えばDで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基がアミノ基の場合、スクシンイミド基、スルホスクシンイミド基、ノルボルネン基、4-ニトロフェノキシ基、カルボン酸無水物由来の基（例えばアセトキシカルボニルメチル基、プロピオニルオキシカルボニルエチル基、ベンゾイルオキシベンジル基等）、イソチオシアネート基、イソシアネート基、モノハロゲン、ホスホリルハライド等が挙げられ、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基がチオール基の場合、例えばカルボン酸無水物、マレイミド基、2-ピリジルジチオ基等が挙げられる。また、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基がヒドロキシル基の場合の反応活性基としては、例えばカルボン酸無水物、炭素数１〜３のハロスルホニルアルキル基、ハロスルホニルアリール基、ホスファアミダイト基、炭素数１〜３のハロカルボニルアルキル基、ハロカルボニルアリール基、イソチオシアネート基、イソシアネート基、ホスホリルハライド基等が挙げられ、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基がカルボキシル基の場合、例えばアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基等が挙げられ、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基がマレイミド基の場合、チオール基等が挙げられる。【００２３】
また、Dで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基に上記の如き反応活性基を導入した後にR2の反応性基と反応させることにより、色素由来の置換基とスペーサーを結合することも可能であり、この場合のDで示される置換基の元となる蛍光色素中の官能基に結合される反応活性基としては、R2の反応性基の種類に応じて上記の如き反応活性基が用いられる。【００２４】
一般式［３］の好ましい具体例としては、例えばNH2-(CH2)4-NH2、NH2-(CH2)3-NH2、NH2-(CH2)2-NH2等が挙げられる。【００２５】
一般式［１］で示されるペプチド誘導体に於いてDで示される蛍光色素由来の置換基としては、通常この分野で用いられる色素由来のものであれば何れでもよいが、該色素の励起波長が500〜800nmのものが好ましく、中でも、600〜800nmのものがより好ましい。色素の励起波長が上記範囲内であると、血清中に含まれる測定対象物以外の成分による影響を回避することができるため、高感度測定が可能となる。また、上記色素は、その極大吸収波長でのモル吸光係数が100,000〜500,000であるものが好ましく、100,000〜300,000であるものがより好ましい。尚、該モル吸光係数は、通常この分野でなされている方法により測定された値を表し、例えば濃度既知の色素試料溶液の吸光度を常法に従い分光光度計で測定し、次式により算出した値を表す。 
ε＝(１/ cl) log 10 (Ｉ0 /Ｉ) 
ε ; モル吸光係数、 c ; 試料濃度(mol/L)、 l ; 光路長(cm)、Ｉ0 ; 入射光強度、 I ; 試料通過吸収後光強度
Dで示される蛍光色素由来の置換基における蛍光色素の好ましい具体例としては、例えばシアニン色素が挙げられる。ここでいうシアニン色素とは、２個の複素環をメチン基又はポリメチン基で結合し、且つ該複素環の少なくとも１個が含窒素複素環である化合物であり、前記２個の複素環の両者が含窒素複素環であるものが好ましい。上記シアニン色素由来の置換基としては、例えばUS4,981,977、US 5,268,486、US5,486,616等に記載のCy系色素由来のもの、US6,083,485等に記載のDy系色素由来のもの、WO2006/047452等に記載のHiLyte系色素由来のもの、Alexa系色素由来のもの等が好ましい。また、市販のものに由来するものを用いてもよく、例えばCy系色素由来のものを用いる場合としては、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等由来のもの〔何れもアマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）商品名〕が、Dy系色素由来のものとしては、DY-700、DY-701、DY-730、DY-731、DY-732、DY-734、DY-750、DY-751、DY-752、DY-776、DY-780、DY-781、DY-782等由来のものが、HiLyte系色素由来のものとしては、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750等由来のもの〔何れもアナスペック社（AnaSpec製）商品名〕が、Alexa系色素由来のものとしては、Alexa Fluor Dye 532、Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye 594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等由来のもの〔何れもモレキュラープローブス社（Molecular Probes）商品名〕が好ましいものとして挙げられる。【００２６】
上記Dで示される蛍光色素由来の置換基の中でもHiLyte系色素由来のものが好ましく、具体的にはHiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750等由来のものが好ましく、HiLyte Fluor 647由来のものが特に好ましい。尚、前記色素が、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基等のカルボキシル基と反応性を有する基を有する場合、スペーサーを介さずに色素をA2に直接結合し得るのでEは結合手となり、色素がカルボキシル基と反応性を有さない基のみ有する場合、スペーサーが必要となるためEはスペーサーとなる。【００２７】
一般式［１］で示されるペプチド誘導体は、上記の如きX、A1、A2、Ｅ及びDであれば何れでもよいが、好ましい具体例として以下のものが挙げられる。
Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647
Boc-Thr-Gly-Arg-Lys-NH(CH2)4NH-Hilyte647
Boc-Thr-Gly-Arg-Thr-NH(CH2)4NH-Hilyte647
Boc-Thr-Gly-Arg-Asn-NH(CH2)4NH-Hilyte647
Boc-Thr-Gly-Arg-Thr-NH(CH2)4NH-Hilyte647
Boc-Ser-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647
Boc-Leu-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647
尚、上記ペプチド誘導体に於いて、Bocはt-ブトキシカルボニル基、Thrはトレオニン残基、Glyはグリシン残基を、Argはアルギニン残基、Lysはリジン残基、Asnはアスパラギン残基を、−Hilyte647は、Hilyte647中のカルボキシル基がアミノ基とアミド結合しているものをそれぞれ示す。【００２８】
一般式［１］で示されるペプチド誘導体の製造は、従来用いられているペプチド合成で慣用されている方法に準じて行えばよいが、例えば以下のようにして合成される。【００２９】
即ち、下記一般式［６］
X-A１-Gly-Arg-A２-OH        ［６］
（式中、X、A１、Gly、Arg、A２は上記と同じ。）
で示されるペプチド誘導体を合成し、その後、該ペプチド誘導体に上記一般式［１］の-E-Dで示されるスペーサーを有していてもよい色素由来の置換基を導入することにより、合成される。【００３０】
一般式［６］の合成方法としては、Gly及びArgの各アミノ酸残基並びにA１及びA２で示されるペプチド残基又はアミノ酸残基を、上記一般式［６］の順となるように通常この分野で行われている方法に準じて結合させればよく、その結合させる順序は、N-末端保護基を有するA１に順次Gly、Arg、A２を結合させても、N-末端保護基を有するA１とGlyを結合させたものに、ArgとA２を結合させたものを結合させてもよく、取り扱いの容易さ、回収率の高い方法等を適宜選択して行えばよい。好ましい方法として、例えば、N-末端保護基を有するA１とGlyを結合させたものに、ArgとA２を結合させたものを結合して一般式［６］のペプチド誘導体を得る方法を以下で説明する。【００３１】
即ち、まず、N-末端保護基を有するA１で示される、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜３個から構成されるペプチド残基とグリシンとを結合させ、下記一般式［７］で示されるペプチド誘導体を合成する。
X-A１-Gly-OH          ［７］
（式中、X、A１及びGlyは、前記と同じ）
具体的には、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の保護基によりカルボキシル基が保護されたグリシンと、グリシンの１〜２倍当量の、t-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等の適当な保護基によりアミノ基が保護された、上記A１で示される、アミノ酸残基又はアミノ酸残基２〜３個から構成されるペプチド残基に由来するX- A１-OHとを、ペプチド誘導体の合成に於いて通常用いられる溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン或はこれらの混合溶媒中、グリシンに対して１〜２倍モル量の例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のペプチド合成に慣用される縮合剤の存在下、０〜25℃で、12〜24時間反応させる。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、次いでこれをペプチド誘導体の精製方法として通常用いられている方法、例えばヘキサン等の有機溶媒により結晶化する方法、或いはシリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー等により精製する方法に供することにより、下記一般式［８］で示されるグリシン誘導体が得られる。
X-A１-Gly-Z          ［８］
（式中、Zはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル等のC-末端保護基を表し、X、A１及びGlyは、前記と同じ。）
尚、一般式［８］で示されるグリシン誘導体は、上記した方法以外の、ペプチド化学の分野で汎用される方法、例えば活性エステル法、混合酸無水物法、アジド法、ホスファゾ法等により合成してもよい。以下で説明する合成方法についても、同様に、具体的に記載した方法以外のこの分野で汎用される方法により行っても構わない。【００３２】
その後、得られた一般式［８］で示されるグリシン誘導体を、例えばメタノール等の溶媒に溶解した後、水酸化ナトリウム等の強塩基を添加して反応させ、Zで示されるC-末端保護基を脱離させ、塩酸等の強酸で中和した後、酢酸エチルとn-ブタノール等の適当な溶媒で抽出することにより、一般式［７］で示されるペプチド誘導体が得られる。【００３３】
次いで、アルギニンとA２で示されるアミノ酸とを結合させ、下記一般式［９］
H-Arg-A２-Z        ［９］
（Arg, A２,Zは前記と同じ。）
で示されるペプチド誘導体を合成する。具体的には、例えば以下のごとく合成すればよい。【００３４】
即ち、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等の保護基によりカルボキシル基が保護されたA２に由来するH- A２-Zで示されるアミノ酸と、該アミノ酸の１〜２倍等量の、t-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等の適当な保護基によりアミノ基或いはアミノ基及びグアニジノ基両基が保護されたアルギニンとを、ペプチド誘導体の合成に於いて通常用いられる溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジクロロメタン或はこれらの混合溶媒中、アルギニンに対して１〜２倍モル量の例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のペプチド合成に慣用される縮合剤の存在下、０〜25℃で、12〜24時間反応させる。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、次いでこれをペプチド誘導体の精製方法として通常用いられている方法、例えばヘキサン等の有機溶媒により結晶化する方法、或いはシリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー等により精製する方法等に供することにより、下記一般式［１０］で示されるアルギニン誘導体が得られる。
X-Arg-A２-Z        ［１０］
（X、Arg、A２、Zは前記と同じ。）
得られた一般式［１０］で示されるアルギニン誘導体を、更に、例えばジオキサン等の溶媒に溶解した後、塩酸等の強酸性溶液を添加して反応させ、Xで示されるN-末端保護基を脱離させ、酢酸エチル等の適当な溶媒で抽出することにより、一般式［９］で示されるペプチド誘導体を得られる。【００３５】
上記の如く得られた、一般式［７］及び［９］で示されるペプチド誘導体を、上記一般式［７］及び［９］で示されるペプチド誘導体の合成方法と同様に、両ペプチド誘導体を溶媒中、縮合剤の存在下反応させ、減圧濃縮、精製し、更に、一般式［８］で示されるグリシン誘導体から一般式［７］で示されるペプチド誘導体を合成する方法と同様に、強塩基と反応させてC-末端保護基を脱離させることにより、上記一般式［６］で示される化合物を容易に且つ高収率で得ることができる。【００３６】
このようにして得られた一般式［６］で示されるペプチド誘導体にスペーサーを有していてもよい色素由来の置換基(-E-D基)を結合させることにより、上記一般式［１］で示されるペプチド誘導体は得られる。その方法は、例えばR5-D'で示される色素化合物（R5は色素中の官能基を表し、D'は色素化合物から官能基を除いた構造を表す。）を用いて、例えばR5がアミノ基又はヒドロキシル基の場合は導入先のペプチド誘導体のC末端側にあるカルボキシル基と常法により反応させれば良い。また、R5がカルボキシル基の場合には、R5-D'にスペーサー（例えばジアミン化合物）を結合してR1-A-R'2-D（但し、R1、A、Dは上記と同じ。R'2はDで示される蛍光色素由来の置換基中の官能基と反応性を有する２価の基を示す。例えば、H２N−A−NH−D）を合成した後にペプチド誘導体のC末端側のカルボキシル基と反応させる、或いはペプチド誘導体のC末端側のカルボニル基にスペーサーを結合させた後、該スペーサーにR5-D'を結合させる等、この分野で通常用いられる方法に準じて結合させればよい。また、精製が必要な場合もこの分野で通常用いられる精製法に準じて適宜生成すればよい。更に、スペーサー導入時に反応活性基を用いる場合には、通常用いられている方法により、R1又は／及びR2で示される反応性基に反応活性基を導入した後、上記方法と同様に反応させればよい。例えば、スペーサーのR1及びR2両者に反応活性基を導入する場合には、例えばペプチド誘導体のC末端側にあるカルボキシル基と反応活性基を導入したR1で示される反応性基とを反応させてペプチド誘導体とスペーサーとを結合させ、次いで、反応活性基が導入されたR2で示される反応性基と色素由来の置換基の官能基（- R5）とを結合させてペプチド誘導体に付加されたスペーサーと色素由来の置換基とを結合させることによりなされればよい。尚、反応活性基は、色素由来の置換基の官能基に導入してもよく、その場合も上記と同様に、反応活性基が導入された色素由来の置換基の官能基（- R5）とR2で示される反応性基とを結合させればよい。【００３７】
一般式［６］で示されるペプチド誘導体にスペーサーを有していてもよい色素由来の置換基(-E-D基)を結合させる方法は、より具体的には以下の如くなされる。即ち、例えば、一般式［６］で示されるペプチド誘導体と、該ペプチド誘導体の１〜２倍モル量のスペーサーを有していてもよい色素化合物（例えばR5-D'やH２N-A-R'2-Dで示される化合物。但し、R5、D'、A、R'2及びDは上記と同じ。）とを、ペプチド誘導体の合成に於いて通常用いられる溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、或はこれらの混合溶媒中、一般式［６］で示されるペプチド誘導体に対して１〜２倍モル量の例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のペプチド合成に慣用される縮合剤の存在下、０〜25℃で、12〜24時間反応させる。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、次いでこれをペプチド誘導体の精製方法として通常用いられている方法、例えばヘキサン等の有機溶媒により結晶化することにより、或いはシリカゲルカラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー等により精製することにより、一般式［１］で示されるペプチド誘導体が得られる。【００３８】
尚、一般式［６］で示されるペプチド誘導体に色素由来の置換基を結合させる際にスペーサーを介して結合させる場合、上記の如きスペーサーを有する色素化合物を用いて反応に供してもよいが、スペーサーを一般式［６］で示されるペプチド誘導体中のA2に結合させたものを用いて色素由来の置換基と結合させてもよい。また、一般式［９］で示されるペプチド誘導体中のA2にスペーサーを結合させて於いて、スペーサーを有する一般式［６］で示されるペプチド誘導体を合成してもよく、一般式［９］で示されるペプチド誘導体を調製する前のA2に予めスペーサーを結合させておき、スペーサーを有する一般式［９］で示されるペプチド誘導体を経てスペーサーを有する一般式［６］で示されるペプチド誘導体を合成してもよい。副産物生成のリスクを低減させるためには予めA2にスペーサーを結合させておくのが好ましく、その方法としては、例えば以下の如く行えばよい。即ち、例えばスペーサーとしてブタンジアミン残基を用いる場合には、例えばトリフルオロメチルカルボニル等の保護基により何れか一方のアミノ基のみが保護されたブタンジアミンと、t-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等の適当な保護基によりアミノ基が保護された例えば下記一般式［１１］
X-A2-OH    ［１１］
（X及びA2は上記と同じ）で示されるアミノ酸誘導体を、上記一般式［７］及び［９］で記載したような調製方法と同様に、縮合反応、減圧濃縮、精製反応に付すことにより、スペーサー(ブタンジアミン残基)が付与された、保護基によりアミノ基が保護された下記一般式［１２］
X-A2-E-Tfa      ［１２］
（Eはブタンジアミン残基を、Tfaはトリフルオロメチルカルボニル基を示す。X及びA2は上記と同じ。）で示されるアミノ酸誘導体を得ることができる。得られた一般式［１２］で示されるアミノ酸誘導体を、上記一般式［１０］で示されるペプチド誘導体から一般式［９］で示されるペプチド誘導体を得る方法と同様にして、塩酸等の強酸性溶液を添加して反応させ、Xで示されるN-末端保護基を脱離させることにより、ブタンジアミン残基（スペーサー）が結合されたA2を得ることができる。該スペーサーが結合されたA2を用いて上記の方法と同様にして合成を行うことにより、スペーサーを有する一般式［９］で示されるペプチド誘導体を得、スペーサーを有する一般式［６］で示されるペプチド誘導体を得ることができ、一般式［１］で示されるペプチド誘導体を得ることができる。【００３９】
上記の如く得られた本発明のペプチド誘導体は、β-グルカン及び／又はエンドトキシンの高感度測定に於いて有用なものであるが、本発明の試薬は、本発明のペプチド誘導体を含んでなるものである。その濃度は通常1nM〜10mM、好ましくは10nM〜1mMである。また、該試薬には、カブトガニ血球成分を含んでいてもよい。尚、カブトガニの血球成分としては、通常のエンドトキシン及び／又はβ-グルカンの測定に使用できるものであれば特に限定されることなく用いることができるが、例えば、ＡＣＣ社、ヘマケム社、ロンザ社、エンドセイフ社等によって製造された市販のカブトガニ血球成分の凍結乾燥品から調製されたものを用いてもよいし、リムルス（Limulus）属、タキプレウス（Tachypleus）属或はカルシノスコルピウス（Carcinoscorpius）属 に属するカブトガニの血球から得られたもので、エンドトキシン及び／又はβ-グルカンとの反応により酵素（プロテアーゼ等）の活性化が生じるものであれば、特に限定されることなく挙げられる。【００４０】
本発明の試薬には、更に緩衝剤やアルカリ土類金属塩等この分野で通常用いられるその他の適当な試薬類が含まれていてもよく、これら試薬類はいわゆる合成基質法等で使用されるものの中から適宜選択して用いればよい。上記緩衝剤としては、具体的には、通常この分野で用いられるトリスヒドロキシルアミノメタン緩衝液、りん酸緩衝液、ほう酸緩衝液、Good's緩衝液等が挙げられ、該緩衝剤の試薬中の濃度は、用いられる緩衝剤により多少異なるが、通常5mM〜500mMであり、好ましくは20mM〜200mMである。尚、試薬中の本発明のペプチド誘導体は凍結乾燥品であっても構わない。（試薬とキットの話は別になりますので、凍結乾燥品の記載を残しました）
本発明のエンドトキシン及び／又はβ-グルカン定量用試薬キットは、上記本発明のペプチド誘導体を含む試薬とカブトガニ血球成分を含む試薬とからなるものである。必要に応じて、通常この分野で用いられる、マンニトールやソルビトールのような糖アルコール類、ショ糖やトレハロースのような糖類、デキストランのような多糖類、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質等の安定化剤等の試薬を付加してもよく、その濃度等は通常この分野で用いられている範囲に準じて設定されればよい。また、本発明のペプチド誘導体を含む試薬及びカブトガニ血球成分を含む試薬には、上記本発明の試薬の項で記載した、緩衝剤やアルカリ土類金属塩等を用いてもよく、その濃度等も上記と同じ範囲で用いればよい。カブトガニ血球成分を含む試薬に於けるカブトガニの血球成分は、上記試薬の項で述べたものと同じものが挙げられる。更に、検量線作成用の標準エンドトキシン及び／又は標準β-グルカンを組み合わせたキットとしてもよい。該標準エンドトキシン及び標準β-グルカンは、USP Reference Standard Endotoxin、日本薬局方エンドトキシン標準品等の公的なエンドトキシン標準品、生化学工業株式会社、ASSOCIATES OF CAPE COD, INC（ＡＣＣ社）、和光純薬工業株式会社等によって製造された市販のエンドトキシン及びβ-グルカンの標準品を用いても、日本特許第3652738号に記載の方法に従って製造されたものを用いても構わない。また、これら試薬キットにおける試薬類は凍結乾燥品であってもよい。【００４１】
本発明のβ−グルカン及び／又はエンドトキシン測定方法としては、公知の合成基質法に準じて、β−グルカン及び／又はエンドトキシンを含む試料とカブトガニ血球成分と本発明のペプチド誘導体とを混合して反応させ、その結果遊離する下記一般式［２］で示される化合物
H-A２-E-D        ［２］
（式中、A２、E及びDは前記と同じ。）
を未反応物質と分離し、定量し、この結果に基づいてなされればよい。尚、上記β−グルカン及び／又はエンドトキシンを含む試料とカブトガニ血球成分と本発明のペプチド誘導体の反応に於いては、β−グルカン及び／又はエンドトキシンを含む試料とカブトガニ血球成分を混合反応させた後、更に本発明のペプチド誘導体を加えて反応させてもよい。【００４２】
上記反応時の本発明のペプチド誘導体の濃度は、エンドトキシンの測定範囲をどの程度にするかによっても異なるが、通常0.01〜1000μM、好ましくは0.1〜500μMより好ましくは0.2〜200μMである。その用量は、β−グルカン及び／又はエンドトキシンを含む試料100μLに対して、本発明のペプチド誘導体が通常10〜1000μL、好ましくは50〜500μL、カブトガニ血球成分が通常10〜1000μL、好ましくは、50〜500μLである。また、反応時の温度は25〜40℃、好ましくは30〜37℃であり、反応時間は、通常5〜60分、好ましくは5〜30分、より好ましくは5〜10分である。該反応時間は通常5〜60分であるが、本発明のβ−グルカン及び／又はエンドトキシン測定方法によれば、遊離されてくる一般式［２］で示される化合物を夾雑物の影響を受けることなく高感度に測定することができるため、反応時間が短くても検出が可能となるので、反応時間を短くすることが可能となる。また、反応後直ちに後述の一般式［２］で示される化合物の分離を行うこともできるが、反応後、反応停止液を用いて反応を停止するのがより好ましく、該反応停止液としては、例えば塩酸溶液や酢酸溶液のような酸水溶液、安息香酸アミジノフェニル塩酸塩、ベンズアミジン塩酸塩等のプロテアーゼ阻害剤溶液、ドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤溶液等が挙げられる。反応停止液の濃度は、β-グルカン及び／又はエンドトキシンがカブトガニ血球成分に作用した結果生じたクロッティング酵素の活性が十分に抑制される濃度であれば特に限定されないが、酸水溶液の場合は停止液添加後の濃度で通常10mM〜2000mM、好ましくは50mM〜1000mMであり、プロテアーゼ阻害剤溶液の場合は停止液添加後の濃度で通常0.001mM〜100mM、好ましくは0.1mM〜10mM、界面活性剤溶液の場合は停止液添加後の濃度で通常0.1%〜10%、好ましくは0.5%〜5%である。用量は、反応全容量に対して1〜200v/v％、好ましくは10〜100v/v％添加すればよい。一般式［２］で示される化合物の分離方法としては、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、キャピラリーチップ電気泳動による方法等が挙げられるが、中でも液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、キャピラリーチップ電気泳動による方法が好ましく、キャピラリーチップ電気泳動による方法が感度の点から特に好ましい。尚、これら分離方法の条件は、自体公知の方法に準じて行えばよく、例えばキャピラリーチップ電気泳動は、WO2007/027495等に記載の方法に準じて行えばよい。一般式［２］で示される化合物の検出は、示差屈折検出器、蛍光検出器、UV検出器等の機器によりなされればよく、中でも、UV検出器、蛍光検出器が好ましく、蛍光検出器がより好ましい。【００４３】
本発明のβ−グルカン及び／又はエンドトキシン測定方法は、具体的には例えばキャピラリーチップ電気泳動で分離し、蛍光検出器で測定する場合、以下の如くなされればよい。即ち、β−グルカン及び／又はエンドトキシンを含む試料50μLとカブトガニ血球成分を含む溶液20〜50μLと通常0.01〜10μM、好ましくは0.01〜1μMの本発明のペプチド誘導体20〜50μLとを混合し、25〜40℃保温下に5〜30分、好ましくは５〜15分反応させる。その後、反応液に、酢酸、塩酸等の酸水溶液、プロテアーゼ阻害剤溶液、界面活性剤溶液等の反応停止液を添加して反応を停止させ、得られた最終溶液を、適当な分離方法、例えばキャピラリーチップ電気泳動により分離し、例えば蛍光検出器等により測定する。得られた測定値を、濃度既知のβ−グルカン及び／又はエンドトキシン溶液を使用して予め作成しておいたβ−グルカン及び／又はエンドトキシン濃度と該測定値との関係を表す検量線に当てはめることにより、試料中のβ−グルカン及び／又はエンドトキシン濃度を求めることができる。【００４４】
以下に実施例、参考例等により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
実施例１．Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647の合成
Boc-Thr-OH、H-Gly-OEt、Boc-Arg(NO2)-OH、Boc-Gly-OH、Boc-NH-(CH2)4-NH2、Hilyte647を原料としてBoc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647を合成した。その模式図を図１に示した。尚、図１中の(1)〜(12)は、下記(i)〜(xii)の合成により得られた化合物(1)〜(12)を表す。【００４６】
(i) Boc-Thr-Gly-OEtの合成
11.0g(50mmol)のBoc-トレオニン (和光純薬工業（株）製)と8.4g(60mmol)のグリシンエチルエステル塩酸塩 (和光純薬工業（株）製)をジクロロメタン(250mL)に溶解し、更に、トリエチルアミン(8.4mL,60mmol)，N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、12.4g,60mmol）及びヒドロキシベンゾトリアゾール(9.2g,60mmol)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、酢酸エチルで抽出した。得られた抽出物を減圧濃縮した後、ヘキサンで結晶化し、Boc-Thr-Gly-OEt(1) 13.0gを得た(収率；85.1%)。【００４７】
(ii) Boc-Thr-Gly-OHの合成
10.0g (33mmol)の化合物(1)をメタノール(150mL)に溶解し、更に1N-水酸化ナトリウム水溶液(33mL,33mmol)を添加した後、室温で3時間攪拌し反応させた。反応終了後、1N-塩酸で中和し、酢酸エチルとn-ブタノールの混合溶媒（混合比＝7：3）で抽出した。得られた抽出物を減圧濃縮後乾燥し、Boc-Thr-Gly-OH(2) 5.4gを得た(収率；60.2%)。【００４８】
(iii) Boc-NH-(CH2)4-NH-Tfaの合成
5.0g(27mmol)のN-Boc-ブタンジアミン (東京化成工業（株）製)をクロロホルム(50mL)に溶解し、更にトリフルオロ酢酸メチルエステル(25g,195mmol)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、反応液を洗浄し、ヘキサンで結晶化し、N-Boc-N'-Tfa-ブタンジアミン(3) 7.5gを得た(収率；99.3%)。【００４９】
(iv) H2N-(CH2)4-NH-Tfaの合成
7.3gの化合物(3)を4N-塩酸/ジオキサン溶液(50mL)に溶解し、氷冷下で3時間攪拌し反応させた。反応終了後、ジエチルエーテルを投入し、析出した結晶を濾取することで、N-Tfa-ブタンジアミン(4) 5.4gを得た(収率；96.8%)。【００５０】
(v) Boc-Gly-NH(CH2)4NHTfaの合成
2.2g(10mmol)の化合物(4)と1.6g(9.1mmol)のBoc-グリシン(和光純薬工業（株）製)をDMF(30mL)に溶解し、更にトリエチルアミン(1.4mL,10mmol)，DCC(2.5g,12mmol)及びヒドロキシベンゾトリアゾール(1.9g,12mmol)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、酢酸エチルで抽出した。残渣をシリカゲルカラムで精製することで、Boc-Gly-NH(CH2)4NHTfa(5) 3.2gを得た。【００５１】
(vi) H-Gly-NH(CH2)4NHTfaの合成
3.0g(8.8mmol)の化合物(5)を4N-塩酸/ジオキサン溶液(50mL)溶液に溶解し、氷冷下で3時間攪拌し反応させた。反応終了後、ジエチルエーテルを投入し、析出した結晶を濾取することで、H-Gly-NH(CH2)4NHTfa(6) 2.4gを得た。【００５２】
(vii) Boc-Arg(NO2)-Gly-NH(CH2)4NHTfaの合成
2.3g(8.3mmol)の化合物(6)と2.6g(8.1mmol)のBoc-Arg(NO2)-OH(和光純薬工業（株）製)とをDMF(30mL)に溶解し、更にトリエチルアミン(1.1mL,8.3mmol)，DCC(1.7g,8.3mmol)，及びヒドロキシベンゾトリアゾール(1.3g,8.3mmol)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、酢酸エチルで抽出した。残渣をシリカゲルカラムで精製することで、Boc-Arg(NO2)-Gly-NH(CH2)4NHTfa(7) 3.7gを得た。【００５３】
(viii) H-Arg(NO2)-NH(CH2)4NHTfa:HClの合成
3.5g(6.5mmol)の化合物(7)を4N-塩酸/ジオキサン溶液(40mL)に溶解し、氷冷下で3時間攪拌し反応させた。反応終了後、ジエチルエーテルを添加し、析出した結晶を濾取した。得られた粗体をシリカゲルカラムで精製することで、H-Arg(NO2)-NH(CH2)4NHTfa:HCl(8) 3.0gを得た(収率；98.1%)。【００５４】
(ix) Boc-Thr-Gly-Arg(NO2)-Gly-NH(CH2)4NHTfaの合成
1.35g(2.8mmol)の化合物(8)と650mg(2.4mmol)のBoc-Thr-Gly-OH(2) とをDMF(20mL)に溶解し、氷冷下でトリエチルアミン(0.4mL,2.9mmol)，DCC(580mg,2.8mmol)及びヒドロキシベンゾトリアゾール(430mg,2.8mmol)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、酢酸エチル/n-ブタノール=6/1で抽出した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムで精製することで、Boc-Thr-Gly-Arg(NO2)-Gly-NH(CH2)4NHTfa(9) 1.0gを得た(収率；63.0%)。【００５５】
(x) Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NHTfaの合成
1.0g(1.4mmol)の化合物(9)をメタノール(50mL)に溶解し、パラジウム炭素(1.3g)を添加した後、水素ガス置換下、室温で4日間攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製することで、Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NHTfa(10) 160mgを得た(収率；17.1%)。本品をMSスペクトルで解析した結果、目的物のピークが確認された(M−=656.3)。【００５６】
(xi) Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH2の合成
150mg(0.22mmol)の化合物(10)をメタノール(5mL)に溶解し、25%-アンモニア水(5mL)を添加した後、室温で3時間攪拌し反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製した後、凍結乾燥することで、Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH2(11) 26mgを得た(収率；20.3%)。本品をMSスペクトルで解析した結果、目的物のピークが確認された(M＋=560.3)。【００５７】
(xii) Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647の合成
8.0mg(14μmol)の化合物(11)をDMF(0.5mL)に溶解し、更にトリエチルアミン(4.0μL,28μmol)及び4mg(4μmol)のHilyte647-OSE(AnaSpec製)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣をODSカラムワコーシル50C18（和光純薬工業社製)，次いでSephedex LH-20（ファルマシア社製）で精製した。残渣を注射用水に溶解し、0.2μmのメンブレンフィルターで濾過した。濾液を凍結乾燥することで、Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH(CH2)4NH-Hilyte647(12) 2.6mgを得た。【００５８】
参考例１．Boc-Thr-Gly-Arg-NH(CH2)4NH-Hilyte647の合成
Boc-Thr-OH、Gly-OEt、Boc-Arg(NO2)-OH、Boc-NH-(CH2)4-NH2、Hilyte647を原料としてBoc-Thr-Gly-Arg-NH(CH2)4NH-Hilyte647を合成した。即ち、既知基質中の蛍光基（又は発色基）を「本発明に係る蛍光色素由来の置換基」で置換したものを得た。その模式図を図2に示した。尚、図２中の(2)及び(4)は実施例１の(ii)及び(iv)で得られた化合物(2)及び(4)を、(C1)〜(C6)は下記参考例(i)〜(vi)の合成で得られた化合物(C1)〜(C6)を表す。【００５９】
(i) C端ペプチドユニットの合成
3.0g(9.4mmol)のBoc-Arg(NO2)-OH（和光純薬工業（株））と2.2g(10mmol)のN-Tfa-ブタンジアミン(4)とをDMF(40mL)に溶解し、更にトリエチルアミン(1.4mL,10mmol)，DCC(2.5g,12mmol)，及びヒドロキシベンゾトリアゾール(1.9g,12mmol)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、酢酸エチルで抽出した。残渣をシリカゲルカラムで精製することで、Boc-Arg(NO2)-NH(CH2)4NHTfa(C1) 4.3gを得た(収率；95.2%)。【００６０】
(ii) C端ペプチドユニットの合成
4.0g(8.2mmol)の化合物(C1)を4N-塩酸/ジオキサン溶液(40mL)に溶解し、氷冷下で3時間攪拌し反応させた。反応終了後、ジエチルエーテルを添加し、析出した結晶を濾取した。減圧乾燥することで、H-Arg(NO2)-NH(CH2)4NHTfa:HCl(C2) 3.47gを得た(収率；99.8%)【００６１】
(iii) トリペプチドユニットの合成
1.2g(2.8mmol)の化合物(C2)と650mg(2.4mmol)のBoc-Thr-Gly-OH(2)をDMF(30mL)に溶解し、氷冷下でトリエチルアミン(0.4mL,2.9mmol)，DCC(580mg,2.8mmol)及びヒドロキシベンゾトリアゾール(430mg,2.8mmol)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、酢酸エチル/n-ブタノール=6/1で抽出した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムで精製することで、Boc-Thr-Gly-Arg(NO2)-NH(CH2)4NHTfa(C3) 660mgを得た(収率；43.7%)。【００６２】
(iv) 脱ニトロ化反応
600mg(0.9mmol)の化合物(C3)をメタノール(20mL)に溶解し、パラジウム炭素(500mg)を添加した後、水素ガス置換下、室温で2日間攪拌し反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、濾液を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムで精製することで、Boc-Thr-Gly-Arg-NH(CH2)4NHTfa(C4) 530mgを得た(収率；95.0%)。本品をMSスペクトルで解析した結果、目的物のピークが確認された(M−=599.3)。【００６３】
(v) 脱トルフルオロアセチル化反応
500mg(0.8mmol)の化合物(C4)をメタノール(10mL)に溶解し、25%-アンモニア水(10mL)を添加した後、室温で3時間攪拌し反応させた。反応終了後、反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムで精製した。更に、凍結乾燥し、Boc-Thr-Gly-Arg-NH(CH2)4NH2(C5) 330mgを得た(収率；78.6%)。本品をMSスペクトルで解析した結果、目的物のピークが確認された(M＋=503.2)。【００６４】
(vi)蛍光標識化反応
5.1mg(10μmol)の化合物(C5)をDMF(0.5mL)に溶解し、更にトリエチルアミン(2.8μL,20μmol)及び4mg(4μmol)のHilyte647-OSE(AnaSpec製)を添加した後、室温で終夜攪拌し反応させた。反応液を減圧濃縮し、残渣をODSカラム，次いでSephedex LH-20で精製した。残渣を注射用水に溶解し、0.2μmのメンブレンフィルターで濾過した。濾液を凍結乾燥することで、Boc-Thr-Gly-Arg-NH(CH2)4NH-Hilyte647(C6) 2.2mgを得た。【００６５】
実験例１  基質によるクロッティング酵素との反応性検討
(i)各種試薬溶液の調製
a) β-グルカンフリー水：日本薬局方注射用水（大塚蒸留水、株式会社大塚製薬工場）を用いた。
b) 本発明のペプチド誘導体（以下、本発明の基質と略記する場合がある）水溶液：実施例１で得られたBoc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH-(CH2)4-NH -HiLyte647をβ-グルカンフリー水に溶解し、640μＭとなるように調製した。
c) 公知基質類似の基質水溶液：参考例１で得られたBoc-Thr-Gly-Arg-NH-(CH2)4-NH-HiLyte647をβ-グルカンフリー水に溶解し、640μＭとなるように調製した。
d) β-グルカン標準液：レンチナン静注用１mg「アステラス」（アステラス製薬株式会社）を0.1M水酸化ナトリウム水溶液で溶解し50μg／mLとしたものを、β-グルカンフリー水で適宜希釈しβ-グルカン標準液とした。
e) β-グルカン特異LAL分画物溶液：アメリカカブトガニ（Limulus polyphemus）血球から、”T.Kitagawa et al. Journal of Chromatography, 567 (1991) 267-273”の268-269頁に記載のLAL抽出方法及びイオン交換クロマトグラフィーによる分画方法に従って、β-グルカン依存のクロッティング酵素活性が検出された画分を回収しLAL分画物の20mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）を得た（上記文献中のフラクション7-20に相当する分画）。
なお、β-グルカン依存のクロッティング酵素活性の検出は以下の如く行った。即ち、得られた画分25容、硫酸マグネシウムを1M含有する1M Tris塩酸緩衝液(pH8.0) 5容、10mM t-Boc-Leu-Gly-Arg-パラニトロアニリド水溶液2容およびβ-グルカンフリー水18容を混合した混液とβ-グルカン標準液又はエンドトキシン水溶液（Escherichia coli O55:B5株由来のフェノール抽出精製品、Difco Labs製を水で溶解し適宜希釈）を等量混合し37℃で30分反応させた。次いで、等量の1M酢酸を添加後、405nmの吸光度を測定し、その結果に基づいてβ-グルカンあるいはエンドトキシン依存のクロッティング酵素活性を検出した。その結果、エンドトキシン依存のクロッティング酵素活性はエンドトキシン濃度1ng/mLから100μg/mLの範囲で検出されないが、β-グルカンに対してはレンチナン1ng/mL当たり遊離パラニトロアニリン濃度74μMのβ-グルカン濃度依存的なクロッティング酵素活性が検出されたものを上記「β-グルカン依存のクロッティング酵素活性が検出された画分」とした。
f) 反応用試薬１： β-グルカン特異ＬＡＬ分画物溶液を31.25容、本発明のペプチド誘導体水溶液を25容、硫酸マグネシウムを625mM含有する625mM Tris塩酸緩衝液(pH8.0) 10容 及びβ-グルカンフリー水33.75容を混合したものを、反応用試薬１(本発明の基質濃度は160μM)とした。【００６６】
(ii)クロッティング酵素との反応性の検討
上記試薬溶液を用い、β-グルカン特異ＬＡＬ分画物による分解物の量を測定した。
即ち、反応用試薬１ 80μLと25ng/mLβ-グルカン標準液20μLを混合し37℃で所定時間反応させ、その後5mM安息香酸アミジノフェニル塩酸塩水溶液を10μL添加することにより反応を停止させた。
反応を停止させた溶液を、液体クロマトグラフィーにより処理し［注入量：20μL、カラム：Wakosil ODS 5C18（150mmφ×4.6mm；和光純薬工業（株）製）、移動相Ａ：0.1% トリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂ：0.1%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル、グラジエント条件：0分→20分→25分で移動相Aが0%→80%→80%、流速：1mL/分、蛍光検出波長：647nm］、基質分解産物の量を測定した。【００６７】
また、比較例として本発明の基質水溶液の代わりに公知基質類似の基質水溶液を用いて、上記方法と同じ方法により、分解産物の量を測定した。
本発明の基質水溶液を用いた場合と公知基質類似の基質水溶液を用いた場合について、反応時間と分解物質量（総面積に対する分解産物面積）の関係を図３に示した。なお、−◆−は、本発明の基質（Boc-Thr-Gly-Arg-Gly-NH-(CH2)4-HiLyte647）を用いた時の結果を、--◇--は、参考例１で得た公知基質類似の基質（Boc-Thr-Gly-Arg-NH-(CH2)4-HiLyte647）を用いた時の結果をそれぞれ表す。【００６８】
図３の結果から明らかなように、本発明のペプチド誘導体を基質として用いた場合、該基質はクロッティング酵素により約20分で分解されたが、参考例１で得た基質、即ち、従来用いられていたトリペプチド型基質中の蛍光基（若しくは発色基）を本発明に係る蛍光色素由来の置換基で置換したものでは２時間経過してもその分解率は20％以下であった。この結果より、本発明の基質は、β-グルカンと反応したカブトガニ血球成分の作用により、即ち活性化されたクロッティング酵素により、既知のトリペプチド型基質よりも速やかに切断されることがわかった。【００６９】
実施例２  本発明のペプチド誘導体を基質として用いた(1→3)-β-D-グルカンの定量方法［マイクロチップ電気泳動による分離測定］
(i)各種試薬溶液の調製
本発明の基質水溶液、β-グルカンフリー水、β-グルカン標準液及びβ-グルカン特異ＬＡＬ分画物は実施例２(i)に記載の試薬溶液と同じものを用いた。
a)反応用試薬２： β-グルカン特異ＬＡＬ分画物溶液を50容、32%トレハロース水溶液を1.5625容、20%ポリエチレングリコール6000を2.5容、本発明のペプチド誘導体水溶液を0.0625容、塩化マグネシウムを0.5M含有する0.75Mトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）20容、β-グルカンフリー水25.875容を混合したものを、反応用試薬２（本発明の基質濃度：400nM）とした。
b)反応停止液：ポリ-（N,N-ジメチルアクリルアミド）（以下pDMAという）を2.5％、グリセロールを2.5％、Tween20を0.25％、牛血清アルブミンを0.05％、ヘパリンリチウムを5％含有する、1.25mM安息香酸アミジノフェニル塩酸塩水溶液を用いた。【００７０】
(ii) β-グルカン標準液と試薬の反応
所定濃度のβ-グルカン標準液（0、1、3、10、30、100、300pgレンチナン／mL）50μLと反応用試薬２ 50μＬを混合し、30℃で５分間反応させた。反応後直ちに反応停止液25μLを添加し反応を停止した。
反応停止後の溶液を試料として、以下のようにマイクロチップ電気泳動に供し、β-グルカン特異ＬＡＬ分画物により生成された本発明のペプチド誘導体の酵素分解産物と未分解の本発明物質のペプチド誘導体とを分離し、本発明のペプチド誘導体の酵素分解産物量を測定した。【００７１】
(iii)電気泳動
(iii-1) キャピラリーチップ
図４に示すレイアウトを有するキャピラリーチップを、「マイクロ科学チップの技術と応用」185〜217頁［北森武彦ほか  2004年出版（丸善株式会社）］に記載の方法に従い、以下のように作成した。【００７２】
即ち、石英基板上に成膜したSi上にフォトレジスト膜を成膜した。このフォトレジストに図４に示すキャピラリデザイン（レイアウト）を有するマスクを用いて露光し、現像を行った。現像によりフォトレジストが除かれた部分のSiをスパッタによって除去した後、フッ化水素溶液を用いてウエットエッチングを行って石英基板にキャピラリチャンネル溝（細管）を作製した。石英基板上に残るフォトレジスト及びSi膜を除去した後、当該石英基板と、各種ウェルへの各種試薬類の導入又は排出用の穴を有するカバープレートとをHF接合法によって張り合わせてキャピラリーチップを作製した。
尚、図４中、Ｌ１及びＬ２はリーディングバッファー導入用ウェルを、Ｒ１はトレーリングバッファー導入用ウェルを、Ｓは泳動用試料導入用ウェルを、Ｗ１及びＷ２は、ドレイン用ウェルをそれぞれ示す。また、図４中のＬ１−Ｒ１間は6.3cm 、Ｌ１−Ｌ２間は2.8cmである。【００７３】
(iii-2) 泳動用試料
a) トレーリングバッファー：75mM Tris base, 0.5% pDMA 22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSAを含む125mM HEPPSO
b) リーディングバッファー：50mM NaCl, 0.5% pDMA22, 3% Glycerol, 0.05% Tween20, 0.01% BSA, 1% Heparin Liを含む75mM Tris-HCl （pH8.0）【００７４】
(iii-3) 泳動用試料及び試液の導入
図４のＳウェル（泳動用試料導入用ウェル）に前記(ii)で得られた反応停止後の溶液  10μLを、Ｒ１ウェル（試液導入用ウェル）にトレーリングバッファー  10μLを、Ｌ１ウェル及びＬ２ウェルにリーディングバッファー  10μLをそれぞれを滴下し、Ｗ１（ドレイン用ウェル）−Ｗ２（ドレイン用ウェル）間に  100秒間、−５psiの圧力を印加して、泳動用試料及びリーディングバッファーをチャンネルに導入した。
キャプラリー内の泳動用試料と試液の配置関係を、図５に模式的に示す。尚、図５中、斜線部分は泳動用試料の配置部分を示す。【００７５】
(iii-4) 濃縮・分離・検出
図４のＲ１ウェル−Ｌ１ウェル間に、2000Vの電圧を印加して、10℃で、Ｒ１→Ｌ１方向に泳動用試料を濃縮させながら、Ｌ２チャンネルとメインチャンネルとのクロス部分を通過したところで、Ｌ２ウェル−Ｌ１ウェル間に1000Vの電圧を150秒間印加して、Ｌ２→Ｌ１方向に泳動して当該試料中の本発明のペプチド誘導体と本発明のペプチド誘導体の酵素分解産物とを分離し、分解産物の検出を行った。
尚、検出は、Ｌ２チャンネルクロス部分からＬ１よりに２cmのキャピラリー部分で、蛍光顕微鏡（BX-50；KSオリンパス（株）製）を使用して650nmレーザー励起により蛍光強度を経時的に測定することによって行った。【００７６】
〔測定結果〕
上記測定により得られた本発明のペプチド誘導体の酵素分解産物濃度とβ-グルカン濃度との関係を図６に示した。この結果から、酵素分解産物濃度とβ-グルカンの間に直線性があり、本発明のペプチド誘導体を基質として用いた上記の如き方法でβ-グルカンを測定すれば、反応時間が５分であっても、β-グルカンの定量が可能であることが分かった。更に、β-グルカンを数pg/mL単位で測定できることが分かり、高感度な測定を可能とすることが分かった。【００７７】
実施例３  本発明のペプチド誘導体を基質として用いた(1→3)-β-D-グルカンの定量方法［液体クロマトグラフィーによる分離測定］
(i)各種試薬溶液の調製
本発明の基質水溶液、(1→3)-β-D-グルカンフリー水、(1→3)-β-D-グルカン標準液及び(1→3)-β-D-グルカン特異ＬＡＬ分画物、反応停止液は実施例２(i)に記載の試薬溶液と同じものを用いた。
a)反応用試薬３： (1→3)-β-D-グルカン特異ＬＡＬ分画物溶液を31.25容、本発明のペプチド誘導体水溶液を25容、硫酸マグネシウムを1M含有する1Mトリス塩酸緩衝液（pH 8.0）6.25容、 β-グルカンフリー水37.5容を混合したものを、反応用試薬３（本発明の基質濃度：160μM）とした。【００７８】
(ii) 液体クロマトグラフィー
所定濃度のβ-グルカン標準液（0、15、50、150、500、1500、5000pgレンチナン／mL）20μLと反応用試薬３ 80μＬを混合し、37℃で30分間反応させた。反応後直ちに反応停止液25μLを添加し反応を停止した。
反応停止後の溶液を試料とし液体クロマトグラフィーにより［注入量：20μL、カラム：Wakosil ODS 5C18（150mmφ×4.6mm；和光純薬工業（株）製）、移動相Ａ：0.1% トリフルオロ酢酸水溶液、移動相Ｂ：0.1%トリフルオロ酢酸を含有するアセトニトリル、グラジエント条件：0分→20分→25分で移動相Aが0%→80%→80%、流速：1mL/分、蛍光検出波長：647nm］、基質分解産物の量を測定した。【００７９】
上記測定により得られた本発明のペプチド誘導体の酵素分解産物濃度と(1→3)-β-D-グルカン濃度との関係を図７に示した。この結果から、本発明のペプチド誘導体を基質として用い上記の如きHPLCを用いた方法であっても、(1→3)-β-D-グルカンを高感度に測定できることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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