(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害する、ヌクレオチド数が３８〜８０のアプタマーであって、ＨＧＡＡＮＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０６）で表される配列を含み、ここでＮは任意のヌクレオチド、ＨはＧを除くヌクレオチド、Ｙはピリミジンヌクレオチドであり、前記配列は、
ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）、
ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）、
ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号９３）、
ＵＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣ（配列番号９４）、
ＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号９５）、
ＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣ（配列番号９６）、
ＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＵ（配列番号９７）、
ＵＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣ（配列番号９８）、
ＵＧＡＡＡＵＡＡＡＣＣ（配列番号９９）、
ＵＧＡＡＡＵＡＡＡＣＵ（配列番号１００）、
ＵＧＡＡＡＡＡＡＵＣＵ（配列番号１０１）、
ＡＧＡＡＵＧＡＡＡＣＵ（配列番号１０２）、
ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＵ（配列番号１０３）、
ＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号１０４）、又は
ＵＧＡＡＡＧＧＡＡＣＣ（配列番号１０５）
であり、前記配列の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されているアプタマー。
【請求項２】
前記配列が、
ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）、
ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）、
ＵＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣ（配列番号９４）、
ＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号９５）、又は
ＵＧＡＡＡＧＧＡＡＣＣ（配列番号１０５）
であり、当該配列が下記式（Ｉ）：
0005602020.tif 000010
（式中、ＶはＡ、Ｇ又はＣを示す。）
で表わされる潜在的二次構造をとり得る、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記配列が、
ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）、
ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）、又は
ＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号９５）
である、請求項２記載のアプタマー。
【請求項４】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項５】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項６】
ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害するアプタマーであって、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、アプタマー：
（ａ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、ＨＧＡＡＮＮＮＡＮＣＹ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＨはＧを除くヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンヌクレオチドである）で表される配列を除く１〜４個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と９０％以上の同一性を有する（但し、ＨＧＡＡＮＮＮＡＮＣＹ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＨはＧを除くヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンヌクレオチドである）で表わされる配列は同一である）、ヌクレオチド配列。
【請求項７】
少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、請求項６に記載のアプタマー。
【請求項８】
各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項１０】
ＮＧＦに結合し、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性を阻害する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１００ｎＭ以下である、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１２】
５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１０ｎＭ以下である、請求項１０に記載のアプタマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマー及びそれと結合する標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物を含む複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含む医薬。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含む抗疼痛剤。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含む抗炎症剤。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含む診断薬。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含むＮＧＦ検出用プローブ。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含む、ＮＧＦ精製用固相担体。
【請求項２０】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＮＧＦの検出方法。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＮＧＦの精製方法。
【請求項２２】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１３に記載の複合体を含む、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＧＦに対するアプタマー及びその利用方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
神経成長因子ＮＧＦ(nerve growth factor)は１９５１年に同定された最初のニューロトロフィンであり、末梢および中枢ニューロンの発達・生存に係わる重要な分泌タンパク質である。１１８個のアミノ酸からなり、分子量は１３ｋＤａで、分子内に３ヶ所のＳ−Ｓ結合を有する。ファミリータンパク質にＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４/５が存在し、これらは構造上よく保存されており、非共有結合によるホモ二量体を形成する。３つの別方向を向いたβシート構造を持ち、この部分で二量体化していると考えられている。またファミリー間でホモロジーの低い４つのループ構造をもち、この部分が受容体に対する特異性を規定していると考えられている。【０００３】
ＮＧＦの受容体には高親和性のチロシンキナーゼ型受容体ＴｒｋＡと低親和性の腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属するｐ７５が知られている。これらの受容体はホモ二量体もしくはヘテロ二量体として作用し神経系の発生と維持に深く係わっている。ＴｒｋＡは一回膜貫通型受容体で細胞内ドメインにチロシンキナーゼ構造を持つ。ＮＧＦが結合するとチロシンリン酸化が起こり、下流にシグナルが伝わり、その細胞の分化促進や生存維持に働く。
ＴｒｋＡのファミリー受容体としてＴｒｋＢとＴｒｋＣが知られている。ＴｒｋＢはＢＤＮＦおよびＮＴ−４/５と結合し、ＴｒｋＣはＮＴ−３と結合する。ｐ７５はＴｒｋＡに比べてリガンド特異性が低く、ＮＧＦ以外にもＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４/５と結合する。ｐ７５は一回膜貫通型受容体であるが、細胞質側にチロシンキナーゼドメインはない。ＴｒｋＡ同様、神経細胞だけでなく非神経細胞にも発現している。この受容体は細胞の分化促進や生存維持に関与しているほか、アポトーシスの誘導や細胞遊走とも関係していることが知られている。結晶構造解析の結果から、ホモ二量体のＮＧＦはＴｒｋＡと２：２で結合するが、ｐ７５とは２：１で結合することが示唆された。ホモ二量体のＮＧＦがＴｒｋＡとｐ７５のヘテロ二量体に結合することもある。【０００４】
ＮＧＦはシュワン細胞、角化細胞、気管支上皮細胞、線維芽細胞、Ｔリンパ球、マクロファージ、肥満細胞、Ｂリンパ球、ケラチノサイト、平滑筋細胞、腎糸球体細胞、骨格筋細胞などにより産生される。一方、ＴｒｋＡは神経細胞のほか、神経細胞以外の単球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、肥満細胞にも発現していることが知られている。ｐ７５も同様に神経細胞だけでなく非神経細胞にも発現している。【０００５】
ＮＧＦは神経系において重要な役割を担っていることはよく知られている。コリン作動性ニューロンの生存を維持する作用を有することが明らかにされており、アルツハイマー病と何らかの関連があると考えられている。また、老齢ラットの脳内にＮＧＦを投与すると、記憶障害の改善が認められることから、老人性痴呆の治療薬としても期待されている。【０００６】
ＮＧＦは神経系以外の組織や細胞にも作用し、生体防御や組織修復過程に関与していることがわかっている。例えば、ＮＧＦを動物に投与すると、血管透過性の増大、Ｔ細胞やＢ細胞の免疫応答の増強、リンパ球の分化誘導、肥満細胞の増殖誘導、肥満細胞からの各種サイトカインの放出誘導などが起こることが知られている。【０００７】
ＮＧＦは炎症と関連があり、炎症性疾患の患者や炎症性動物モデルでＮＧＦの発現上昇が観察されている。例えば、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、関節炎、間質性膀胱炎、喘息などがそれに当たる。関節リウマチの患者の滑液中のＮＧＦの濃度が上昇していることが報告されている。また、関節リウマチモデルラットのＮＧＦの発現の向上、関節炎モデルマウスで肥満細胞の増加とＮＧＦの発現の向上が報告されている。【０００８】
ＮＧＦは痛みと深く関わる。ヒトにＮＧＦを皮下投与すると、筋肉痛のような深部痛が数日続き、注入部位の痛覚過敏が生じる。ＮＧＦノックアウトマウスとＴｒｋＡノックアウトマウスは無髄神経が欠損し痛みを感じなくなる。成熟ラットに１ｍｇ/ｋｇのＮＧＦを腹腔内投与すると、侵害性熱や機械刺激に対する痛覚過敏が生じる。ＮＧＦのトランスジェニックマウスは炎症症状を伴わない痛覚過敏を示す。また、先天性無痛無汗症（ＣＩＰＡ）の患者のＴｒｋＡ遺伝子に異常があること、ＮＧＦの遺伝子に異常があると痛覚が低下することが知られている。【０００９】
以上より、ＮＧＦ阻害剤は侵害受容性疼痛、炎症性疼痛、神経因性疼痛、癌性疼痛、線維筋痛などの疼痛の治療薬として利用可能である。ＮＧＦ抗体とＮＳＡＩＤの併用療法（国際公開ＷＯ０４／０７３６５３号パンフレット）、ＮＧＦ抗体とオピオイド鎮痛剤の併用療法（国際公開ＷＯ０４／０９６１２２号パンフレット）、ＮＧＦ抗体を用いた手術後の疼痛の治療法（国際公開ＷＯ０４／０３２８７０号パンフレット、国際公開ＷＯ０５／０００１９４号パンフレット）、ＮＧＦ抗体を用いた骨癌の疼痛治療法（国際公開ＷＯ０５／１１１０７７号パンフレット）、ＮＧＦ抗体を用いた変形性関節炎の疼痛治療法（国際公開ＷＯ０６／１１０８８３号パンフレット）が報告されている。
Ｔａｎｅｚｕｍａｂ（ＰＦ−４３８３１１９またはＲＮ６２４）はＮＧＦに対する抗体で、変形性関節炎モデル動物を用いた疼痛モデル実験で効果を示し、現在臨床試験が行われている。また、ＮＧＦとＮＧＦ受容体の阻害活性の有無は不明であるが、ＮＧＦに結合する天然のＲＮＡに関する報告がある（非特許文献１）。【００１０】
ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）を用いて作製することができる（特許文献１〜３）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。【００１１】
アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外因子を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも結合力と特異性が高い場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こらない。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１/１０程度のサイズであるので、目的の部位まで薬物を送達させることはより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、各種修飾を容易に入れることができ、大量生産によるコストダウンが可能である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９１／１９８１３号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ９４／０８０５０号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ９５／０７３６４号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Binkley J et al., (1995) Nucleic Acids Res, 23, 3198-3205
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ＮＧＦに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ＮＧＦに対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。【００１６】
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである：
［１］  ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害するアプタマー；
［２］  ＮＧＦに結合し、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性を阻害するアプタマー；
［３］  ５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１００ｎＭ以下である、［２］に記載のアプタマー；
［４］  ５０％阻害濃度（ＩＣ５０）が１０ｎＭ以下である、［２］に記載のアプタマー；
［５］  少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマー；
［６］  ＨＧＡＡＮＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０６）で表される配列を含み、ここでＮは任意のヌクレオチド、ＨはＧを除くヌクレオチド、Ｙはピリミジンヌクレオチドであり、前記配列の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマー；
［７］  ＵＧＡＡＡＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０７）、ＣＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０８）又はＡＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０９）で表される配列を含み、ここでＮは任意のヌクレオチド、Ｙはピリミジンヌクレオチドであり、前記配列の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマー；
［８］  ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＹ（配列番号１１０）、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＹ（配列番号１１１）、ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＹ（配列番号１１２）又はＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＹ（配列番号１１３）で表される配列を含み、ここでＹはピリミジンヌクレオチドであり、前記配列の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［４］のいずれか一に記載のアプタマー；
［９］  各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［５］〜［８］のいずれか一に記載のアプタマー；
［１０］  各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［５］〜［８］のいずれか一に記載のアプタマー；
［１１］  以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］に記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列；又は
（ｃ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
［１２］  少なくとも１つのヌクレオチドが修飾されている、［１１］に記載のアプタマー；
［１３］  各ピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［１２］に記載のアプタマー；
［１４］  各プリンヌクレオチドのリボースの２’位のヒドロキシル基が、同一又は異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、［１２］に記載のアプタマー；
［１５］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体；
［１６］  機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［１５］に記載の複合体；
［１７］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む医薬；
［１８］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む抗疼痛剤；
［１９］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む抗炎症剤；
［２０］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む診断薬；
［２１］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含むＮＧＦ検出用プローブ；
［２２］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を含む、ＮＧＦ精製用固相担体；
［２３］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＮＧＦの検出方法；
［２４］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を用いることを特徴とする、ＮＧＦの精製方法；
［２５］  ［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体を、それを必要とする対象に投与することを特徴とする、疼痛や炎症を伴う疾患を治療又は予防する方法；
［２６］  疼痛や炎症を伴う疾患の治療又は予防用医薬のための、［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体の使用；
［２７］  疼痛や炎症を伴う疾患の治療又は予防用医薬としての使用のための、［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体；
［２８］  疼痛や炎症を伴う疾患を治療又は予防するための、［１］〜［１４］のいずれか一に記載のアプタマーあるいは［１５］又は［１６］に記載の複合体の使用；
［２９］  疼痛や炎症を伴う疾患に対する治療剤又は予防剤の製造のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアプタマーあるいは請求項１５又は１６に記載の複合体の使用。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のアプタマー及び複合体は、疼痛や炎症性疾患などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮、並びにＮＧＦの検出及び定量に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】配列番号１で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図２】配列番号２で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。
【図３】配列番号３で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図４】配列番号４で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図５】配列番号５で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図６】配列番号６で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図７】配列番号７で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図８】配列番号８で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。
【図９】配列番号９で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図１０ａ】配列番号１２で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。
【図１０ｂ】配列番号１２で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。
【図１１】配列番号６で表されるアプタマー（Ａｐｔ）がヒトＮＧＦに結合することを示すセンサーグラム。４０Ｎは４０ヌクレオチドのランダム配列を含んだＲＮＡである。リガンドにＡｐｔまたはネガティブコントロールとしての４０Ｎ、アナライトにヒトＮＧＦを用い、ＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００で測定した。
【図１２】配列番号６で表されるアプタマー（Ａｐｔ）がヒトＮＧＦとヒトＴｒｋＡ受容体の結合を阻害する様子を示す図である。４０Ｎは４０ヌクレオチドのランダム配列を含むＲＮＡ。リガンドにＴｒｋＡ、アナライトにＮＧＦとＡｐｔを混ぜたもの、ネガティブコントロールとしてＮＧＦのみ、およびＮＧＦと４０Ｎを混ぜたものを用い、ＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００で測定した。
【図１３】配列番号６で表されるアプタマー（Ａｐｔ）がヒトＮＧＦとヒトＰ７５受容体の結合を阻害する様子を示す図である。４０Ｎは４０ヌクレオチドのランダム配列を含むＲＮＡ。リガンドにＴｒｋＡ、アナライトにＮＧＦとＡｐｔを混ぜたもの、ネガティブコントロールとしてＮＧＦのみ、およびＮＧＦと４０Ｎを混ぜたものを用い、ＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００で測定した。
【図１４】配列番号３１で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【図１５】配列番号３６で表されるアプタマーのＭＦＯＬＤプログラムにより予想される二次構造を示す図である。共通配列を黒丸で示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ＮＧＦに対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの活性を阻害し得る。
【００２０】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。
【００２１】
ＮＧＦは公知のニューロトロフィンであり、末梢および中枢ニューロンの発達・生存に係わる重要な分泌タンパク質である。ＮＧＦはＮｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒの略である。本発明において、ＮＧＦは、特にβタイプのＮＧＦを意味する。ヒトβ−ＮＧＦのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ００２４９７、Ｐ０１１３８、ＡＡＩ２６１５１、ＡＡＩ２６１４９、ＣＡＢ７５６２５で表されるものであるが、変異の入ったものや、そのドメイン、ペプチドであってもよい。また、モノマーだけでなくダイマーや多量体であってもよい。
【００２２】
本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液（例えば溶液Ａ：実施例１参照）中で、ＮＧＦへ結合する。本発明のアプタマーは、以下の試験により検出可能な程度の強度で、ＮＧＦへ結合する。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いる。センサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は１０００ＲＵとする。０．３ＭのＮａＣｌを含有する生理的な緩衝液（溶液Ａ：実施例１参照）によりＮＧＦ溶液（０．５μＭ）を調製する。このＮＧＦ溶液を２０μＬ注入し、ＮＧＦのアプタマーへの結合を検出する。４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してＮＧＦが有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはＮＧＦへの結合能を有すると判定する。
【００２３】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの活性を阻害する。本明細書中、「ＮＧＦに対する阻害活性」とはＮＧＦが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することを阻害する活性である。
また、他の「ＮＧＦに対する阻害活性」としては、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することによって生じる、ＮＧＦ受容体の下流のシグナル伝達（Ｒａｓ−ＭＡＰキナーゼ経路、ＰＩ３キナーゼ経路）の阻害、ＴＲＰＶ１、ＳＰ、ＢＤＮＦなどの発現上昇の阻害、肥満細胞などから放出されるＨＡ、ＢＫ、ＰＧ、ＮＧＦ、その他サイトカインの発現の阻害活性などが挙げられる。
更に、ＮＧＦにより誘導される神経細胞の分化、生存、神経突起伸長、血管透過性の増大、Ｔ細胞やＢ細胞の免疫応答の増強、リンパ球の分化、肥満細胞や赤白血病細胞、癌細胞など各種細胞の増殖などの阻害、疼痛、痛覚過敏の軽減などが挙げられる。
本発明のアプタマーが有する好ましい「ＮＧＦに対する阻害活性」は、ＮＧＦがＮＧＦ受容体に結合することを阻害する活性であり、ＮＧＦにより誘導される神経突起伸長活性を阻害する活性である。
【００２４】
本明細書中、「ＮＧＦ受容体」とはＮＧＦが結合する細胞表面タンパク質を意味する。ＮＧＦ受容体としては、ＴｒｋＡとｐ７５が知られている。本発明でいうＮＧＦ受容体とは、天然のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよいし、その変異体であってもよい。ここで「その変異体」とは、「ＮＧＦ受容体」のアミノ酸が数個置換されたものやその一部分のアミノ酸配列であって、ＮＧＦに対して結合活性を有し、かつＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するタンパク質またはペプチドを意味する。
【００２５】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーである。ＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合をアプタマーが阻害するか否かは、以下の試験により評価することができる。
測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いる。ＣＭ５センサーチップにＮＧＦ受容体とＦｃとの融合タンパク質（例えば、Ｔｒｋ  Ａ−Ｆｃ（１７５−ＴＫ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ)）又はｐ７５−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ））を固定化する。固定化量は１１００ＲＵとする。生理的な緩衝液（溶液Ａ：実施例１参照）中でＮＧＦ（０．１μＭ）とアプタマー（０．３３μＭ）を混合し、３０分調製する。この混合液２０μＬを注入し、ＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合を検出する。阻害活性％が６０％以上だった場合、該アプタマーはＮＧＦのＮＧＦ受容体への結合を阻害すると判定する。阻害活性％は、アプタマーを含まないＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合量を０、ＮＧＦを含まない溶液をインジェクションした場合の結合量を１００として計算される。ここで結合量は、ＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムのピークトップでのＲＵ値（ＮＧＦのインジェクション終了直後のＲＵ値）を意味する。
【００２６】
一態様において、本発明のアプタマーは、ＮＧＦとＴｒｋＡとの結合およびＮＧＦとｐ７５との結合を両方阻害し得る。
【００２７】
本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するＮＧＦに対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
【００２８】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦの任意の部分に結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害し得るものである限り特に限定されない。
【００２９】
一つの好ましい態様において、本発明のアプタマーは、ＨＧＡＡＮＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０６）（Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＨはＧを除くヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンヌクレオチドである。）で表される配列を含み、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーである。配列番号１０６で表されるヌクレオチド配列は、後述するＳＥＬＥＸ法により獲得される、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーに含まれる。前記配列の少なくとも一つのヌクレオチドは修飾されていることが好ましい。
【００３０】
一つの好ましい態様において、本発明のアプタマーは、ＵＧＡＡＡＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０７）、ＣＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０８）又はＡＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０９）（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｙはピリミジンヌクレオチドである。）で表される共通配列を含み、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーである。配列番号１０７、配列番号１０８および配列番号１０９で表されるヌクレオチド配列は、後述するＳＥＬＥＸ法により獲得される、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーに含まれる。これらの配列の少なくとも一つのヌクレオチドは修飾されていることが好ましい。
【００３１】
一つの好ましい態様において、本発明のアプタマーは、ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＹ（配列番号１１０）、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＹ（配列番号１１１）、ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＹ（配列番号１１２）又はＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＹ（配列番号１１３）（Ｙは、ピリミジンヌクレオチドである。）で表される共通配列を含み、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーである。配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２および配列番号１１３で表されるヌクレオチド配列は、後述するＳＥＬＥＸ法により獲得される、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマーに含まれる。これらの配列の少なくとも一つのヌクレオチドは修飾されていることが好ましい。
【００３２】
また本発明のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性を阻害するアプタマーであり得る。ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性をアプタマーが阻害するか否かは、実施例7又は実施例８に記載の試験により評価することができる。
【００３３】
また、神経細胞突起伸長活性が５０％となる際のアプタマー濃度（ＩＣ５０）についても、実施例８に記載の試験をアプタマー濃度を変えて行うことによりすることができる。本発明のアプタマーのＩＣ５０は、好ましくは１００ｎＭ以下であり、より好ましくは１０ｎＭ以下である。
【００３４】
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１０〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約６０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約４５ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。
【００３５】
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。
【００３６】
本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。
【００３７】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されているヌクレオチドであり得る。
【００３８】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一または異なって、ヒドロキシ基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子または基で置換されるヌクレオチドであり得る。
【００３９】
本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。
【００４０】
尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置換は、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置換として読み替えられる。
【００４１】
本発明のアプタマーはまた、
（ａ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；
（ｃ）配列番号１〜９、１２、２４〜５５、５７〜９０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；或いは
（ｄ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ｃ）の複数の連結物、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物
であり得る。
【００４２】
上記（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーは、ＮＧＦに結合し且つ／又はＮＧＦの活性（ＮＧＦ受容体との結合活性等）を阻害し得る。
また好ましくは、上記（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーは、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害するアプタマー、および／またはＮＧＦに結合し、ＮＧＦの神経細胞突起伸長活性を阻害するアプタマーである。
さらに好ましくは、上記（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーは、ＮＧＦの神経細胞突起伸長の阻害濃度が１００ｎＭ以下であるアプタマーであり、より好ましくは、ＮＧＦの神経細胞突起伸長の阻害濃度が１０ｎＭ以下であるアプタマーである。
【００４３】
上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、アプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦの活性（ＮＧＦ受容体との結合活性等）を阻害し得る限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。
【００４４】
上記（ｃ）において、「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
【００４５】
本明細書において、ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ−２（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
【００４６】
上記（ｄ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。上記（ａ）〜（ｄ）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。
【００４７】
本発明のアプタマーは、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経細胞突起伸長阻害活性、アプタマーの安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２，５１３８−５１４５参照）。
【００４８】
本発明のアプタマーはまた、ＮＧＦに対する結合性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、ＮＧＦの神経細胞突起伸長阻害活性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６および／または８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
【００４９】
改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。
【００５０】
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合および水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換または削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
【００５１】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４６，８１８−８２２；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用することで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
【００５２】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ＮＧＦは塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられる。活性部位に結合しないアプタマーはその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、コントロールで用いたＲＮＡはＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害しなかった。
【００５３】
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するために更にプライマーを変えてＳＥＬＥＸを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
【００５４】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では３８ヌクレオチドでも活性を保持しているアプタマーを得ることができた。
【００５５】
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測することで、どのヌクレオチドを置換または欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうか既存のアッセイ系により確認することができる。
【００５６】
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。特に、前述したＨＧＡＡＮＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０６）、ＵＧＡＡＡＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０７）、ＣＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０８）、ＡＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０９）、ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＹ（配列番号１１０）、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＹ（配列番号１１１）、ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣ（配列番号１１２）、ＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣ（配列番号１１３）で表される配列は、本発明のアプタマーがＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害する上で重要な部分であるが、これらの配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。
【００５７】
修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。
【００５８】
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。
【００５９】
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
【００６０】
【化１】
0005602020.tif 000002
【００６１】
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
【００６２】
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）、FactorXなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
【００６３】
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬、飲料水や食品の添加剤、増強剤、緩和剤として使用され得る。
【００６４】
本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦに結合し、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合を阻害することによって、ＮＧＦの機能を阻害する活性を有し得る。上述のように、ＮＧＦは疼痛や炎症と深く関わっている。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、疼痛や炎症を伴う疾患を治療又は予防するための医薬（抗疼痛剤、抗炎症剤等）として有用である。
【００６５】
ここで疼痛としては侵害受容性疼痛（筋肉痛、背部痛、上肢痛、鞭打ち損傷、関節痛、変形性関節症、痛風、慢性関節リウマチ、頭痛、片頭痛、緊張型頭痛、群発頭痛、二次性頭痛、口腔顔面痛、歯痛、抜歯後カウザルギー、幻歯痛、内臓痛、心臓痛、腹痛、中間痛、月経困難、陣痛、腎臓痛、尿管痛、膀胱痛など）、炎症性疼痛、神経因性疼痛（糖尿病性ニューロパチー、中毒性ニューロパチー、術後痛、幻肢痛、断片部痛、反射性交感神経性ジストロフィー、カウザルギー、帯状疱疹後痛、三叉神経痛、中枢性疼痛）、癌性疼痛（内臓器官への癌浸潤による痛み、癌組織の血管浸潤による血管閉塞で生じる痛み、骨転移の痛み、脳内転移に伴う痛み、癌組織の末梢神経浸潤による痛み）、線維筋痛などが挙げられる。
【００６６】
ここで炎症に伴う疾患としては、特に限定されるものではないが、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬、変形性関節症、慢性関節リウマチ、間質性膀胱炎、喘息などが挙げられる。
【００６７】
上記癌としては、特に限定されるものではないが、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌などが挙げられる。
【００６８】
ＮＧＦはその受容体ＴｒｋＡに結合するとＴｒｋＡのチロシンリン酸化およびＴｒｋＡ下流のRas-MAPK、PLC-γ、PI3Kなどを活性化させ、神経細胞の生存や分化といった生理的作用を発揮する。一方、ｐ75受容体を介するシグナル経路では細胞死を誘導する。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。これらのシグナル伝達経路の活性化に関係した疾患としては、上記疼痛や癌が挙げられる。
【００６９】
本発明のアプタマー及び複合体が医薬、診断薬、検査薬、試薬などとして用いられる場合、それが投与される対象としては特に限定されないが、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。
【００７０】
本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦに特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、ＮＧＦ検出用プローブとして有用である。該プローブは、ＮＧＦのインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ＥＬＩＳＡ等に有用である。また、該プローブは、ＮＧＦが関与する疾患（疼痛や炎症を伴う疾患等）の診断薬、検査薬、試薬等として有用である。
【００７１】
また、そのＮＧＦへの特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はＮＧＦの分離精製用リガンドとして使用され得る。
【００７２】
また、本発明のアプタマー及び複合体は、恋愛などの精神的状態を調べるための検査薬や精神状態を調整するための医薬、調整剤、増強剤、緩和剤として使用され得る。
【００７３】
また、本発明のアプタマー及び複合体は、薬物送達剤として使用され得る。
【００７４】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００７５】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００７６】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、ＰＬＧＡなどが挙げられる。
【００７７】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤としては、人工骨や生体分解性もしくは非分解性スポンジ、バッグ、薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態、あるいは体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等が挙げられる。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。更に注射液剤や徐放製剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来より使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。
【００７８】
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウレート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。
【００７９】
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー及び複合体を粉末または液状にして、吸入噴射剤および／または担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー及び複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
【００８０】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００８１】
本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ＮＧＦの精製、及びＮＧＦの検出、定量に有用であり得る。
【００８２】
本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
【００８３】
本発明はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はＮＧＦを他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にＮＧＦを吸着させ、吸着したＮＧＦを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのＮＧＦの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＮＧＦを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。ＮＧＦの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ＮＧＦの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｆｅｒ  ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ  ２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
【００８４】
本発明はまた、ＮＧＦの検出及び定量方法を提供する。特に本発明はＮＧＦを他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ＮＧＦを測定することを含み得る。ＮＧＦの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、ＰＥＴ等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＮＧＦ量の測定、ＮＧＦが関連する疾患の診断に有用であり得る。
【００８５】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【実施例】
【００８６】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。【００８７】
実施例１：ＮＧＦに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製１
ＮＧＦに特異的に結合するＲＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，５０５−５１０，１９９０）を参考にして行った。標的物質としてヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
最初のラウンドで用いたＲＮＡ（４０Ｎ−ＲＮＡ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型として以下に示す４０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ７９ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。【００８８】
DNA鋳型：5’-ccagttgttggtgacaatgc-40N-gcagctccacaggcttccc-3’（配列番号１１４）
プライマーFwd：5’-taatacgactcactatagggaagcctgtggagctgc-3’（配列番号１１５）
プライマーRev：5’-ccagttgttggtgacaatgc-3’（配列番号１１６）【００８９】
ＮはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴのいずれか一つを示す。プライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。【００９０】
ＳＥＬＥＸを１０ラウンド行った後に配列を調べたところ、配列に収束が見られた。４８クローンのうち、配列番号１で表される配列は６配列存在し、配列番号２で表される配列は５配列存在した。配列番号３〜５は３配列存在し、配列番号６〜８で表される配列は２配列存在した。配列番号９〜２３で表される配列は１配列であった。多くの配列にＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列が含まれていた。これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−３４１５，２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分がよく似たバルジ構造となった。配列番号１〜９と１２で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図１〜１０に示す。共通配列を丸で囲った。【００９１】
以下にそれぞれの配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。なお、ヌクレオチドにおける括弧は、その２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子を示す（以下同様）。
配列番号１：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaaac(F)aaagac(F)aau(F)gau(F)u(F)gagu(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号２：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号３：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)aagu(F)agaaau(F)gac(F)agaau(F)ggc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号４：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)au(F)gac(F)aaau(F)aaaac(F)ggc(F)aac(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号５：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)agc(F)aaau(F)gu(F)aaaaagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号６：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)aaau(F)aaaaaau(F)agac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号７：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)agau(F)aaaaaau(F)agac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号８：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号９：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)aau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１０：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)u(F)aaagagc(F)u(F)u(F)gac(F)aaaac(F)au(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１１：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)aau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１２：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)gaaac(F)agu(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)ac(F)agac(F)u(F)gagaaagc(F)agu(F)aac(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１３：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)aaau(F)aaaaaaaaau(F)ggac(F)ggu(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１４：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)gaau(F)u(F)ggau(F)ac(F)agau(F)agu(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)aau(F)gau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１５：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)au(F)au(F)u(F)u(F)gau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１６：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)c(F)aaau(F)aau(F)gu(F)au(F)u(F)u(F)aau(F)c(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１７：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)ggaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)aagu(F)agaaau(F)gac(F)agaau(F)ggc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１８：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)gaaau(F)ggac(F)u(F)gu(F)aaagc(F)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)au(F)u(F)c(F)aau(F)c(F)gaggc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号１９：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaac(F)u(F)aaagu(F)u(F)u(F)aaaac(F)u(F)gau(F)ac(F)gagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号２０：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)u(F)aaaaac(F)u(F)u(F)gc(F)c(F)gagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号２１：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaaac(F)aaagac(F)aac(F)gau(F)u(F)gagu(F)agc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号２２：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)gu(F)c(F)c(F)ac(F)agaaaau(F)ggau(F)u(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg
配列番号２３：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)gaaac(F)agu(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)ac(F)agac(F)u(F)gagaaagc(F)agu(F)aaaagc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)aac(F)aac(F)u(F)gg【００９２】
配列番号１〜９と１２で表される核酸のＮＧＦに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。測定にはＢＩＡｃｏｒｅ社製のＢＩＡｃｏｒｅ２０００を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているＳＡチップを用いた。これに、５’末端にビオチンが結合している１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ  ｄＴを１５００ＲＵ程度結合させた。リガンドとなる核酸は、３’末端に１６ヌクレオチドのＰｏｌｙ  Ａを付加し、ＴとＡの結合によりＳＡチップに固定化した。固定化量は約１０００ＲＵとした。アナライト用のＮＧＦは０．５μＭに調製し、非特異吸着を軽減するために最終濃度０．３Ｍ  ＮａＣｌを加えたものを２０μＬインジェクトした。ランニングバッファーには溶液Ａを用いた。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０の混合溶液である。測定の結果、配列番号１〜９と１２で表される核酸の全てが、コントロールの４０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合することがわかった。ここで４０Ｎとは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む、１ラウンド目に使用した核酸プールのことである。一例として配列番号６で表されるアプタマーがＮＧＦと結合する様子を示すセンサーグラムを図１１に示す。以上より、これらの核酸はＮＧＦに結合するアプタマーであることが示された。【００９３】
実施例２：ＮＧＦに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製２
ランダム配列が３０ヌクレオチドでプライマー配列を実施例１で用いたものと変えた鋳型を用いて、実施例１と同様のＳＥＬＥＸをおこなった。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。鋳型には３０ヌクレオチドのランダム配列を用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。【００９４】
ＤＮＡ鋳型：5’-tgaggatccatgtatgcgcacata-30N-cttctggtcgaagttctccc-3’（配列番号１１７）
プライマーＦｗｄ：5’-cggaattctaatacgactcactatagggagaacttcgaccagaag-3’（配列番号１１８）
プライマーＲｅｖ：5’-tgaggatccatgtatgcgcacata-3’（配列番号１１９）【００９５】
ＳＥＬＥＸ１３ラウンド終了後に配列を調べたところ、まだ配列に収束は見られなかった。しかし、多くの配列でＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列が見られた。また、いくつかの配列はＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）、ＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号９５）、ＵＧＡＡＡＧＧＡＡＣＣ（配列番号１０５）などのＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列に変異を含んだ配列であった。
また、一次配列は少し異なるが、ＭＦＯＬＤプログラムにより同じようなバルジ構造が予想された配列としてＡＧＡＡＵＧＡＡＡＣＵ（配列番号１０２）が存在した。
それらの一部の配列を配列番号３７〜４２に示す。【００９６】
ＳＥＬＥＸ１６ラウンド終了後に再度配列を調べたところ、配列番号４３、５１で表される配列が２つ存在している以外、他の配列は収束していなかった。これらの配列の多くは、１３ラウンド終了後の配列同様、ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列を含んでいた。また、いくつかの配列はＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）、ＵＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣ（配列番号９４）、ＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号９５）、ＵＧＡＡＡＧＧＡＡＣＣ（配列番号１０５）、ＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＵ（配列番号９７）、などのＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列に変異を含んだ配列であった。
それらの配列の一部を配列番号４３〜５３に示す。【００９７】
ＳＥＬＥＸ１９ラウンド終了後に再度配列を調べたところ、配列番号５６で表される配列が３配列、配列番号５４、５７、６７で表される配列がそれぞれ２配列ずつ存在した。他の配列は収束していなかった。これらの配列の多くはＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）やＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号９５）の共通配列を含んでいた。
これらの配列の一部を配列番号５４〜５９に示す。【００９８】
ＳＥＬＥＸ２２ラウンド終了後に再度配列を調べたところ、配列番号６７で表される配列が６配列、配列番号６８で表される配列が３配列存在した。これらの配列は配列番号９１で表わされる共通配列によく似た、ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＵ（配列番号１０３）とＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号１０４）の配列を含んでいた。他の配列は収束していなかったが、多くの配列はＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）とＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）の共通配列を含んでいた。
これらの配列の一部を配列番号６０〜６８に示す。【００９９】
以上の配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を、以下に示す。なお、ヌクレオチドにおける括弧はその２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子を示す。
配列番号３７：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaggu(F)gaaac(F)aac(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号３８：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F)u(F)c(F)c(F)ac(F)aaagu(F)ac(F)au(F)aaaac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号３９：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)aaau(F)aaaac(F)aac(F)aau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４０：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aggaaaau(F)ggaagac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４１：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaggaac(F)c(F)c(F)aaagc(F)gaaac(F)aaaac(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４２：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaagagc(F)agc(F)agagau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４３：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)u(F)u(F)gaaaaaac(F)c(F)c(F)c(F)aau(F)au(F)gagaau(F)c(F)au(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４４：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)agc(F)ac(F)c(F)au(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４５：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagagaau(F)gaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaau(F)c(F)aaggac(F)aau(F)gau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４６：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)c(F)aaagu(F)u(F)ac(F)gc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４７：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)gagc(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４８：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)gaaaaac(F)gc(F)au(F)aau(F)aau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号４９：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aagac(F)ggu(F)aac(F)gaaagu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５０：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaac(F)c(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aau(F)ac(F)aaac(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５１：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaaaaac(F)aac(F)au(F)au(F)gaac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５２：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)au(F)ac(F)aaaac(F)ac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５３：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaggaac(F)c(F)c(F)aaaaac(F)ac(F)aaaau(F)gu(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５４：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)aac(F)gaaagc(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５５：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaaau(F)gaau(F)gc(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggac(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５６：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aac(F)ac(F)aaau(F)gc(F)ac(F)aac(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５７：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaac(F)ac(F)c(F)gaagc(F)ac(F)aaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５８：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaagaac(F)c(F)c(F)aaau(F)ac(F)agaau(F)aaau(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号５９：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gaaac(F)gu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaggaggau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６０：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)gaau(F)aaagau(F)aac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６１：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggu(F)c(F)gu(F)aac(F)gaau(F)aaaac(F)u(F)c(F)c(F)u(F)gc(F)ac(F)aaaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６２：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)u(F)aaagu(F)gaac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６３：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagau(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaac(F)u(F)aagc(F)ac(F)aaaau(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６４：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)c(F)aaaac(F)au(F)u(F)agc(F)ac(F)ac(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６５：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaau(F)c(F)gagc(F)ac(F)aaaau(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６６：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaagc(F)aagc(F)ac(F)aac(F)au(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６７：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gau(F)aac(F)gaac(F)aaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaggaau(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a
配列番号６８：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)c(F)gagagc(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aaaac(F)ac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)a【０１００】
配列番号３７〜６８で表される核酸のＮＧＦに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。実験は実施例１で示した方法と同様の方法を用いた。その結果、その全ての配列がコントロールの３０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合することがわかった。【０１０１】
実施例３：ＮＧＦに特異的に結合するＲＮＡ−ＤＮＡモザイクアプタマーの作製
プリンヌクレオチドがＲＮＡ、ピリミジンヌクレオチドがＤＮＡのモザイクアプタマーをＳＥＬＥＸ法により作製した。鋳型は４０ヌクレオチドのランダム配列を含みプライマーが実施例１と２で用いたものと異なるものを使用した。最初のラウンドで用いたＲＮＡ−ＤＮＡモザイク核酸のプールは、化学合成によって得られたＤＮＡを鋳型とし、ｒＡＴＰ、ｒＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰを基質として転写して得た。ここでｒＮＴＰはリボヌクレオチド、ｄＮＴＰはデオキシリボヌクレオチドを示す。その他の実験方法は実施例１で示した方法とほぼ同じである。用いた鋳型とプライマー配列を以下に示す。【０１０２】
ＤＮＡ−ＲＮＡ鋳型：5’-tcctaatgtctcttctcttcac-40N-gccctattcttgcctctccc-3’（配列番号１２０）
プライマーFwd：5’-taatacgactcactatagggagaggcaagaatagggc-3’（配列番号１２１）
プライマーRev：5’-tcctaatgtctcttctcttcac-3’（配列番号１２２）【０１０３】
ＳＥＬＥＸ７ラウンド終了後に配列を調べたところ、収束は見られなかったが、ＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列を含む配列が多く見られた。ＳＥＬＥＸを１０ラウンドまで進め再度配列を調べたところ、配列番号７２で表される配列が６配列、配列番号７０および７１で表される配列がそれぞれ５配列、配列番号６９および７３で表される配列が２配列存在した。その他、１配列のみ存在するものが２２配列存在したが（配列番号７４で表される配列を含む）、その多くはＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列を含んでいた。【０１０４】
以下に配列番号６９〜７４に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。大文字のＴおよびＣはデオキシリボヌクレオチドを示し、小文字のａおよびｇはリボヌクレオチドを示す。
配列番号６９：
gggagaggCaagaaTagggCCCagCTgaaaaaaaCCTggaCgTaCaCCgTTCgCCgagCgggTgaagagaagagaCaTTagga
配列番号７０：
gggagaggCaagaaTagggCTggaaaTagaaCCgCgCTgTCTTCaTTaagCCgCCCaaCggTgaagagaagagaCaTTagga
配列番号７１：
gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaaTTTaCCgTCTTCagCgTCgggTgTgaagagaagagaCaTTagga
配列番号７２：
gggagaggCaagaaTagggCTggaTgggCagTaaCCTgaaaaaaaCCaCCCaCCTCTaCCgTgaagagaagagaCaTTagga
配列番号７３：
gggagaggCaagaaTagggCaCTTgaaaaaaaCCCaaagaaagaaTaCTTaCCCggCgCgTgaagagaagagaCaTTagga
配列番号７４：
gggagaggCaagaaTagggCaTagTgTagaCCCCTCTCaagaTaCCCCaTgaaTTgCCCCgTgaagagaagagaCaTTagga【０１０５】
配列番号６９〜７４で表される核酸のＮＧＦに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により評価した。実験は実施例１で示した方法と同様の方法を用いた。その結果、その全てがコントロールの４０Ｎよりも有意にＮＧＦに結合することがわかった。【０１０６】
実施例４：より活性の高いＮＧＦアプタマーの作製
配列番号３６で表される配列に３０％のランダム配列をドープし、その両端に新しいプライマー配列を付加したＲＮＡプールを用いてＳＥＬＥＸをおこなった。ＳＥＬＥＸは実施例１とほぼ同様におこなった。その鋳型とプライマーの配列を以下に示す。【０１０７】
鋳型：
5’- GAGGATCCATGTATGCGCACATAgggtttttttcatcctgcagctccacaggcttcccCTTCTGGTCGAAGTTCT-3’
a:a(70%), g(10%), c(10%), t(10%)
g:g(70%), a(10%), c(10%), t(10%)
c:c(70%), a(10%), g(10%), t(10%)
t:t(70%), a(10%), c(10%), g(10%)
(配列番号１２３)
プライマーＦｗｄ：
５’−CGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACTTCGACCAGAAG−３’（配列番号１２４）
プライマーＲｅｖ：５’−GAGGATCCATGTATGCGCACATA−３’ （配列番号１２５）【０１０８】
１０ラウンド終了後に４８クローンの配列を確認したところ収束は見られなかった。しかし、その多くの配列はＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列を含んでいた。
また、ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列に変異が入ったＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号９３）、ＵＧＡＡＡＡＣＡＡＣＣ（配列番号９８）、ＵＧＡＡＡＵＡＡＡＣＣ（配列番号９９）、ＵＧＡＡＡＵＡＡＡＣＵ（配列番号１００）、ＵＧＡＡＡＡＡＡＵＣＵ（配列番号１０１）なども存在した。
その中から１２配列をランダムに選び、表面プラズモン共鳴法でＮＧＦに対する結合活性を調べた。測定方法は実施例１に示した通りである。測定の結果、これら１２配列の全てが、３０％のランダム配列をドープした最初の鋳型よりも有意にＮＧＦに結合することがわかった。以下に各配列番号に対応する実際に得られたヌクレオチド配列を示す。【０１０９】
配列番号７５：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaau(F)c(F)u(F)c(F)c(F)aaagac(F)aagau(F)aaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号７６：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)aaac(F)gc(F)au(F)gu(F)au(F)u(F)u(F)gc(F)agu(F)au(F)u(F)aaaaau(F)gc(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号７７：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaaaau(F)c(F)u(F)c(F)c(F)agu(F)u(F)gc(F)aagac(F)gaaac(F)aaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号７８：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gu(F)gu(F)au(F)u(F)gu(F)u(F)c(F)agggu(F)gu(F)gc(F)c(F)c(F)agc(F)c(F)u(F)au(F)aac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号７９：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggau(F)agc(F)c(F)au(F)gu(F)ggaggu(F)gaagac(F)u(F)gaaau(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号８０：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaaac(F)aac(F)c(F)u(F)c(F)c(F)c(F)aau(F)aau(F)gau(F)c(F)ac(F)agaaau(F)c(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号８１：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagau(F)gac(F)u(F)gu(F)gu(F)aac(F)c(F)ac(F)agu(F)au(F)gaaau(F)aaac(F)u(F)c(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号８２：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagaggau(F)gc(F)u(F)u(F)gu(F)u(F)u(F)ggu(F)u(F)ac(F)aagc(F)u(F)gaaagaaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号８３：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)u(F)gaagc(F)u(F)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aggau(F)u(F)aaac(F)agac(F)agu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号８４：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagu(F)gaaagaaac(F)u(F)c(F)c(F)c(F)gau(F)gaaagau(F)gu(F)aac(F)aaac(F)c(F)au(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号８５：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaagc(F)ggaagc(F)c(F)u(F)gc(F)gu(F)aac(F)c(F)gc(F)aggau(F)gaaaac(F)aac(F)c(F)gu(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)
配列番号８６：
gggagaac(F)u(F)u(F)c(F)gac(F)c(F)agaaggagu(F)agc(F)c(F)agu(F)gaac(F)c(F)u(F)ggaau(F)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)u(F)u(F)au(F)gu(F)gc(F)gc(F)au(F)ac(F)au(F)ggau(F)c(F)c(F)u(F)c(F)【０１１０】
実施例５：ＮＧＦに特異的に結合するＤＮＡアプタマーの作製
ＮＧＦに特異的に結合するＤＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸ法はＦｉｔｚｗａｔｅｒとＰｏｌｉｓｋｙらの方法（Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ  ａｎｄ  Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７，２７５−３０１，１９９６）を改良して行った。標的物質として実施例１で用いたヒトＮＧＦを用いた。最初のラウンドのプールには、４０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を付加した長さ７１のＤＮＡ（４０Ｎ−ＤＮＡ）を用いた。一本鎖ＤＮＡを得るために、プライマーＲｅｖの５’末端にはビオチン（ｂｉｏ）を付加した。【０１１１】
鋳型：5’-GGGATCGACAGGGCT-40N-CCGAGTCGTGCCATCT-3’（配列番号１２６）
プライマーＦｗｄ：5’-GGGATCGACAGGGCT-3’（配列番号１２７）
プライマーＲｅｖ：bio-AGATGGCACGACTCGG-3’（配列番号１２８）【０１１２】
７ラウンド終了後、実施例１と同様にして４６クローンの配列を調べたところ、配列番号８７で表される配列が２０配列存在した。その配列を以下に示す。【０１１３】
配列番号８７：
GGGATCGACAGGGCTGCAGCACTGGCGTAGGTTGGAATATGGGTATTTTTGTGGTCCGAGTCGTGCCATCT【０１１４】
実施例６：ＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害するアプタマー
配列番号１〜９、１２、３７〜５５、５７〜８７で表されるアプタマーがＮＧＦとＮＧＦ受容体（ＴｒｋＡおよびＰ７５）の結合を阻害するかどうか表面プラズモン共鳴法を用いて調べた。ＢＩＡｃｏｒｅ社のプロトコールに従って、ＣＭ５センサーチップにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（２１１８１，ＰＩＥＲＣＥ）を固定化した。そこに、ＩｇＧのＦｃ部分が融合したヒトＴｒｋ  Ａ−Ｆｃ（１７５−ＴＫ，Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を約１１００ＲＵ固定化した。アナライトとしてＮＧＦ（０．１μＭ）とアプタマー（０．３３μＭ）を混合して３０分保持したものをインジェクションした。もしアプタマーがＮＧＦとＴｒｋＡの結合を阻害する場合はセンサーグラムのシグナルは上がらないが、もし阻害しない場合は三者複合体を形成しシグナルが上がることが予想される。また、ＮＧＦがアプタマーよりも受容体に強く結合する場合は、アプタマーがはずれて、ＮＧＦが受容体と結合する場合もある。阻害実験を開始する前にＴｒｋＡにＮＧＦが結合することを確認した。アプタマーを含まないＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合量を１００とし、アプタマーを添加した場合のＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合量を補正値として求めた。ここで結合量は、ＢＩＡｃｏｒｅのセンサーグラムのピークトップでのＲＵ値（ＮＧＦのインジェクション終了直後のＲＵ値）とした。１００からこの補正値を引いた値を阻害活性％とし、６０％以上を阻害活性ありとした。実験の結果、配列番号１〜９、１２、３７〜５５、５７〜８７で表されるアプタマーの全てがＮＧＦとＴｒｋＡの結合を阻害することがわかった（表１）。一例として配列番号６で表されるアプタマーがＮＧＦとＴｒｋＡの結合を阻害している様子を図１２に示す。もう一つの受容体Ｐ７５（ｐ７５−Ｆｃ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に対しても同様な実験をおこなった。その結果、配列番号１〜９、１２、３７〜５５、５７〜８７で表されるアプタマーの全てがＮＧＦとＰ７５の結合を６０％以上阻害することがわかった（表１）。一例として配列番号６で表されるアプタマーがＮＧＦとＰ７５の結合を阻害している様子を図１３に示す。【０１１５】
【表１】
0005602020.tif 000003
【０１１６】
表１は、ＴｒｋＡまたはｐ７５とＮＧＦとの結合を阻害するアプタマーを示す。“＋”は阻害活性％が６０％以上のもの、“−”は６０％未満のものを表す。【０１１７】
配列番号８７で表されるアプタマーに関しては、ＮＧＦとアプタマーのモル比が１：１（０．１μＭ）の条件で上記と同様の阻害実験をおこなった。ＮＧＦとアプタマーの混合溶液はＴｒｋＡとＰ７５の実験で同じ調製溶液を用い、サンプル調製の誤差の影響がない状態で実験をおこなった。その結果、配列番号８７で表されるアプタマーはＮＧＦとＴｒｋＡの結合は９３％阻害したが、ＮＧＦとｐ７５の結合は２９％しか阻害しなかった。【０１１８】
実施例７：ＰＣ−１２細胞を用いたアプタマーの生理活性評価
ＰＣ−１２細胞を用いた突起伸長抑制実験でアプタマーの生理活性を評価した。ラット副腎褐色細胞腫由来の細胞株であるＰＣ−１２細胞は、神経系のモデル細胞であり、ＮＧＦ刺激によって突起を伸長し、神経細胞様に分化する。この突起伸長をアプタマーが阻害するか否か評価した。ＰＣ−１２細胞をコラーゲンコートした９６ウェル平底プレートに播種し、そこに１時間３７℃で予め反応させたＮＧＦ（最終濃度２５ｎｇ／ｍＬまたは１．９ｎＭ）とアプタマー（最終濃度５００ｎＭ）の混合溶液を添加し細胞培養を開始した。その後２４時間おきに２回、同量のアプタマーを添加し、３日目に突起伸長の程度を顕微鏡で観察し評価した。評価にはスコア０〜３を用い、スコア０は突起伸長なし、スコア１はわずかに突起伸長あり、スコア２は近傍の細胞まで突起が伸長、スコア３は突起伸長が著しく網状、とした。ＮＧＦのみの添加でＰＣ−１２細胞を３日間培養する系をネガティブコントロールとし、ＮＧＦ無添加で同細胞を３日間培養する系をポジティブコントロールとした。また、ＮＧＦ阻害剤によって突起伸長が抑制されることを確認するために、コントロールのＮＧＦ阻害剤として１３３ｎＭの抗ＮＧＦ抗体（ＭＡＢ２５６１，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＮＧＦと共に添加して同細胞を３日間培養し、突起伸長が抑制されることを確認した。ネガティブコントロールのスコアを阻害活性０％、ポジティブコントロールのスコアを阻害活性１００％と設定し、アプタマーの阻害活性％を算出した。その結果を表２に示す。阻害活性が５０％以上を＋、５０％未満を−と表記した。配列番号１、３〜９および１２で表されるアプタマーが突起伸長を顕著に阻害することが明らかとなった（表２）。共通配列を含まない配列番号２で表わされるアプタマーは阻害活性を示さなかった。一方、共通配列を含む配列番号５や６などで表わされるアプタマーは阻害活性を示した。配列番号８で表わされるアプタマーは共通配列を含んでいないが阻害活性を示した。以上より、配列番号１、３〜９および１２で表されるアプタマーはＮＧＦの阻害剤となり得ることが示された。【０１１９】
【表２】
0005602020.tif 000004
【０１２０】
表２は、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長を阻害するアプタマーを示す。阻害活性が５０％以上のものを“＋”、５０％未満のものを“−”とした。【０１２１】
実施例８：Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞を用いたアプタマーの生理活性評価
ＰＣ１２細胞のサブクローンであるＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞を用いて、アプタマーの神経突起伸長阻害活性を評価した。コラーゲンタイプＩＶでコートした９６ウェル平底プレートに１ウェルあたり２５００個の細胞を２．５％ウマ血清と１．２５％胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で１日培養した。そこに室温もしくは３７℃にて３０分間から１時間無血清のＲＰＭＩ−１６４０培地中で予め反応させたＮＧＦ（最終濃度１５ｎｇ／ｍＬまたは１．１ｎＭ）とアプタマー（最終濃度５００〜３ｎＭ）の混合溶液を添加した。２日後もしくは３日後にＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｎｅｕｒｉｔｅ  Ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  Ｋｉｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用して細胞質と核を染色し、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によって１細胞あたりの神経突起長を測定した。ＮＧＦのみの添加で細胞を２日間培養して得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性０％、ＮＧＦ無添加で２日間培養して得られた１細胞あたりの神経突起長を阻害活性１００％として、ＮＧＦとアプタマーを混合添加した場合に得られた１細胞あたりの神経突起長から、アプタマーの阻害活性を算出した。アプタマー濃度が１００ｎＭと１０ｎＭの場合の阻害活性と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を表３に示す。阻害活性が０％以下の場合は０％とした。１００％以上の場合は１００％とした。５０％阻害濃度は、５０％阻害活性を挟む上下二点の濃度より求めた。ＩＣ５０値を＜と記載したものは、測定最低濃度においても阻害活性が５０％以上であった場合で、表示数字は最低測定濃度を示す。実験の結果、ＩＣ５０が１０ｎＭ以下の高い活性を有するアプタマーが存在することがわかった。
これらのアプタマーはＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号９３）、ＵＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣ（配列番号９５）、ＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＣ（配列番号９６）、ＵＧＡＡＡＧＧＡＡＣＣ（配列番号１０５）、ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＵ（配列番号１０３）、ＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＵ（配列番号１０４）、ＡＧＡＡＵＧＡＡＡＣＵ（配列番号１０２）、の共通配列を含んでいた。ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）とＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）の共通配列を含むアプタマーはそれぞれ６種類および５種類存在した。【０１２２】
【表３】
0005602020.tif 000005
【０１２３】
表３は、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞の神経突起伸長を阻害するアプタマーの濃度が１００ｎＭと１０ｎＭの場合の阻害活性（％）と５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。【０１２４】
実施例９：アプタマーの短鎖化
配列番号２、５、６、８で表されるアプタマーの短鎖化を行った。配列番号５、６で表されるアプタマーはＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の共通配列を含む。配列番号２および８はこれらの共通配列を含まないアプタマーである。改変体の配列は以下の通りである。【０１２５】
配列番号２４：配列番号２で表されるアプタマーの改変体で６９ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)
配列番号２５：配列番号２で表されるアプタマーの改変体で４７ヌクレオチドの長さのアプタマー
ggagc(F)u(F)gc(F)c(F)u(F)ac(F)ac(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)au(F)gac(F)aaac(F)c(F)u(F)agagu(F)gu(F)aaau(F)gc(F)u(F)u(F)c(F)
配列番号２６：配列番号５で表されるアプタマーの改変体で４６ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggc(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)agc(F)c(F)c(F)
配列番号２７：配列番号６で表されるアプタマーの改変体で４５ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)u(F)aaau(F)
配列番号２８：配列番号６で表されるアプタマーの改変体で４０ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaaau(F)
配列番号２９：配列番号８で表されるアプタマーの改変体で６１ヌクレオチドの長さのアプタマー
ggu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)gc(F)au(F)u(F)gu(F)c(F)ac(F)c(F)
配列番号３０：配列番号８で表されるアプタマーの改変体で４１ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)
配列番号３１：配列番号２６で表されるアプタマーの改変体で３４ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)
配列番号３２：配列番号２６で表されるアプタマーの改変体で３８ヌクレオチドの長さのアプタマー
u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a
配列番号３３：配列番号２６で表されるアプタマーの改変体で３６ヌクレオチドの長さのアプタマー
u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)aaac(F)agc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a
配列番号３４：配列番号２６で表されるアプタマーの改変体で３４ヌクレオチドの長さのアプタマー
gu(F)ggagc(F)u(F)gu(F)u(F)aaac(F)aac(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)
配列番号３５：配列番号２８で表されるアプタマーの改変体で３８ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa
配列番号３６：配列番号２８で表されるアプタマーの改変体で３５ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)
配列番号８８：配列番号３６で表されるアプタマーの改変体で３３ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggaagc(F)c(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)ggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)
配列番号８９：配列番号３６で表されるアプタマーの改変体で３４ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)
配列番号９０：配列番号３６で表されるアプタマーの改変体で３２ヌクレオチドの長さのアプタマー
gggagc(F)c(F)u(F)gu(F)aaac(F)agc(F)aggu(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)【０１２６】
配列番号３１と３６で表されるアプタマーの二次構造予測を図１４と図１５に示す。共通配列は黒丸で示した。【０１２７】
４０ヌクレオチド以上の長さのアプタマーは転写により、それ以下の長さのアプタマーは化学合成により作製した。これらの核酸がＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害するかどうか、実施例６と同様に表面プラズモン共鳴法により調べた。その結果、これら全ての核酸が阻害活性を有していることがわかった（表１）。
また、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長阻害活性を実施例７と同様に調べたが、配列番号２８〜３０、３２、３５に強い阻害活性が認められた（表２）。
配列番号３２で表わされるアプタマーは配列番号５で表わされるアプタマーの共通配列を残して３８ヌクレオチドまで短鎖化したものである。また、配列番号３５で表わされるアプタマーは配列番号６で表わされるアプタマーの共通配列を残して３８ヌクレオチドまで短鎖化したものである。以上より、少なくとも配列番号５および６に関しては共通配列が重要であることが示された。
一方、配列番号３０で表わされるアプタマーは、共通配列を含まない配列番号８で表わされるアプタマーを短鎖化したものであり、４１ヌクレオチドの長さで活性が確認された。これらのアプタマーはＮＧＦ阻害剤として使用可能であることが示された。【０１２８】
実施例１０：短鎖化したアプタマーの修飾
配列番号３０、３２、３５で表されるアプタマーの血液中での安定性を高めるために、リボースの２’位の水酸基をｏ−メチル基に置き換えた改変体を作製した。実施例７と同様に、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長阻害を調べたところ、これらのアプタマー全てに強い阻害活性があることがわかった。【０１２９】
以下にそれぞれの修飾体の配列は示す。ヌクレオチドにおける括弧は、その２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、Ｍはｏ−メチル基、ｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴを示す。【０１３０】
配列番号３０(１)：
idT-gggau(F)aaaaau(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)-idT
配列番号３０(２)：
gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)aaaac(F)c(F)c(F)
配列番号３０(３)：
gggau(F)aaaaau(F)agagu(F)u(F)u(F)gau(F)aaac(F)ac(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c(F)
配列番号３０(４)：
idT-gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)au(F)u(F)a(M)a(M)aac(F)c(F)c(F)-idT
配列番号３０(５)：
idT-gggau(F)aaaa(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(F)a(F)c(F)c(F)c(F)-idT
配列番号３０(６)：
idT-g(M)g(M)g(M)au(F)a(M)aa(M)a(M)a(M)u(F)a(M)g(M)a(M)g(M)u(F)u(F)u(F)g(M)a(M)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)c(F)c(F)u(F)gu(F)a(M)u(F)u(F)a(M)a(M)a(F)a(F)c(F)c(F)c(F)-idT
配列番号３２(１)：
idT-u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M)c(F)a(M)a(M)g(M)u(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a-idT
配列番号３２(２)：
u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a(M)
配列番号３２(３)：
u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaa(M)a(M)aac(F)c(F)ac(F)a
配列番号３２(４)：
u(F)gu(F)gga(M)gc(F)u(F)gc(F)u(F)u(F)aaac(F)aagc(F)aagu(F)gaaaaaaac(F)c(F)ac(F)a
配列番号３２(５)：
idT-u(F)g(M)u(F)gga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M)c(F)aagu(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F)a-idT
配列番号３２(６)：
idT-u(F)g(M)u(F)g(M)ga(M)gc(F)u(F)g(M)c(F)u(F)u(F)a(M)a(M)a(M)c(F)a(M)a(M)g(M)c(F)a(M)a(M)g(M)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)ac(F)a-idT
配列番号３５(１)：
idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)aaa-idT
配列番号３５(２)：
idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)ggagc(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)aaa-idT
配列番号３５(３)：
gggaagc(F)c(F)u(F)gu(F)ggagc(F)u(F)gc(F)aggau(F)gaaaaaaac(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)
配列番号３５(４)：
idT-ggga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-idT
配列番号３５(５)：
idT-g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)au(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-idT
配列番号３５(６)：
idT-g(M)g(M)ga(M)a(M)g(M)c(F)c(F)u(F)g(M)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)c(F)u(F)g(M)c(F)a(M)g(M)g(M)a(F)u(F)gaaaa(M)a(M)a(M)a(M)c(F)c(F)c(F)a(M)a(M)a(M)-idT【０１３１】
実施例１１：フットプリント法によるアプタマーのＮＧＦ結合部位の特定
共通配列がＮＧＦの結合部位であることを確認するために、ＮＧＦ非存在下および存在下で酵素消化実験を行った。共通配列がＮＧＦの結合部位である場合、ＮＧＦ非存在下では酵素消化されるが、ＮＧＦ存在下ではヌクレアーゼが共通配列に結合することができないので、酵素消化されないという結果を得るはずである。配列番号６２で表わされるアプタマーの５’末端または３’末端に蛍光物質（ＦＡＭ６）を結合したアプタマーを用いて実験を行った。配列番号６２で表わされるアプタマーはＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）の共通配列を含んでいる。ヌクレアーゼとしては、一本鎖を選択的に切断するＳ１ヌクレアーゼ（タカラバイオ社製）、二本鎖を選択的に切断するＶ１ヌクレアーゼ（アンビオン社製）、一本鎖のＧを選択的に切断するＴ１ヌクレアーゼ（アンビオン社製）の３種類を用いた。各酵素反応は添付の仕様書を参考にして、表４の条件で行った。Ｓ１ヌクレアーゼの反応溶液には０．８３３ｍＭのＺｎＣｌ２を添加した。【０１３２】
【表４】
0005602020.tif 000006
【０１３３】
ＮＧＦを添加する実験では、アプタマーとＮＧＦのモル比を１：２とし、結合バッファーである溶液Ｂに溶解した。ここで溶液Ｂとは１４５ｍＭ塩化ナトリウム、５．４ｍＭ塩化カリウム、１．８ｍＭ塩化カルシウム、０．８ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。
酵素反応後、フェノール・クロロホルム処理により反応を停止し、水溶性画分を回収して濃縮した後、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）により末端のリン酸を取り除いた。アルカリホスファターゼによる酵素処理は、添付の仕様書を参考にして、３７℃で１．５時間行った。これらのサンプルは２０％の変性ポリアクリルアミド電気泳動法により分析した。蛍光検出にはＳｔｏｒｍ８５０（ＧＥヘルスケアー社製）を用いた。実験の結果、ＮＧＦ非存在下ではＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号９２）のＧＡＡＡＧＡがＳ１およびＴ１ヌクレアーゼにより切断された。一方、ＮＧＦ存在下ではこれらの切断は顕著に抑制された。ここで、ピリミジンヌクレオチドはフルオロ修飾体である。以上より、共通配列部分はＮＧＦの結合部位であることが示された。【０１３４】
実施例１２：共通配列部分への変異導入による活性変化
共通配列の部分に変異を導入し、活性の変化を実施例８と同様にＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞を用いて評価した。共通配列ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）を含むアプタマーとして配列番号３５で表わされる３８ヌクレオチド長のものを用いた。その結果を表５に示す。
変異導入していないアプタマーを３００ｎＭ添加した場合、９２％の神経突起伸長の阻害が見られた。一方、１ヌクレオチドの変異を導入すると活性は完全に消失した。また、ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＣ（配列番号９１）の３〜５番目のＡをＤＮＡタイプに置換すると活性が完全に消失した。以上より、共通配列はＮＧＦの活性を阻害する上で重要であることが示された。【０１３５】
【表５】
0005602020.tif 000007
【０１３６】
表５は、Ｎｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞を用いた神経突起伸長阻害実験の結果を示す。配列番号３５で表わされるアプタマーおよびその変異体を３００ｎＭ添加した。ピリミジンヌクレオチドはフルオロ修飾体、プリンヌクレオチドの大文字はＲＮＡタイプ、小文字はＤＮＡタイプを示す。下線の部分に変異を導入した。【０１３７】
実施例１３：共通配列に関する検討
本実験において、プールやプライマー配列など、条件を変えたＳＥＬＥＸで常に高頻度に共通配列が出現した（実施例１〜４）。ＳＥＬＥＸで得られた７４配列中、ＵＧＡＡＡＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０７）の共通配列を含むアプタマーは５９配列存在した。ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕの任意のヌクレオチドで、ＵはＴであってもよい。Ｙはピリミジンヌクレオチドを示す。このうち、ＵＧＡＡＡＡＡＡＡＣＹ（配列番号１１０）は２９配列、ＵＧＡＡＡＧＡＡＡＣＹ（配列番号１１１）は１３配列存在した。
一方、一般式ＣＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０８）およびＡＧＡＡＮＮＡＡＡＣＹ（配列番号１０９）で表わされる共通配列もそれぞれ３個と２個存在していた。このうち、ＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＹ（配列番号１１２）は１配列、ＣＧＡＡＡＧＡＡＡＣＹ（配列番号１１３）は１配列存在した。これらはＨＧＡＡＮＮＮＡＮＣＹ（配列番号１０６）という一般式で表示できる。
これらの共通配列は、３８ヌクレオチド長の短鎖化体に必要であること（実施例９）、酵素消化の実験でＮＧＦを添加することで保護されること（実施例１１）、変異導入で生理活性が大きく低下すること（実施例１２）からも、ＮＧＦの機能を阻害する上で重要であることがわかる。【０１３８】
実施例１４：短鎖化アプタマーへの変異導入
短鎖化したアプタマーに変異を導入した場合、活性が保持できるかどうか確認した。配列番号３０（６）のアプタマーは４１ヌクレオチドの長さで共通配列を含んでいない。５’及び３’末端はｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴが付加している。活性は実施例８と同様にＮｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ−１細胞を用いて評価した。結果を表６に示す。
ＭＦＯＬＤプログラムで予測されたステム部分のＧ１：Ｃ４１、Ａ１０：Ｕ３３、Ａ１２：Ｕ３１塩基対をＣ１：Ｇ４１、Ｕ１０：Ａ３３、Ｕ１２：Ａ３１に入れ替えたところ、活性の顕著な低下は見られなかった。また、ループ部分のＧ２０とＧ２３をＡ２０とＡ２３に置換したところ、同様に活性の顕著な低下は見られなかった。以上より、配列番号３０（６）で表わされるアプタマーは数個の変異が入っても活性が保持されていることが示された。【０１３９】
【表６】
0005602020.tif 000008
【０１４０】
実施例１５：先行文献に記載されたＮＧＦアプタマーとの比較
配列番号３０、３２、３５で表わされるアプタマーと、先行文献（Ｂｉｎｋｌｅｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，  ３１９８）に記載のＮＧＦアプタマーの、ＮＧＦへの結合活性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害活性、神経突起伸長阻害活性の比較を行った。
先行文献記載のアプタマーは全て未修飾ＲＮＡであり、本明細書記載の配列と一致するものはない。先行文献記載のアプタマーとして結合活性が高いＨ１、Ｌ２、Ｌ６を選び、Ｔ７ポリメラーゼで転写して作製した。結合活性は実施例１、ＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合阻害活性は実施例６、神経突起伸長阻害活性は実施例８と同様な方法で評価した。
その結果、Ｈ１、Ｌ２、Ｌ６はＮＧＦと結合するものの配列番号３０、３２、３５で表わされるアプタマーよりも活性が低いことがわかった（表７）。また、Ｈ１、Ｌ２、Ｌ６はＮＧＦとＮＧＦ受容体の結合を阻害せず、突起伸長阻害実験において５００ｎＭ添加した場合でも阻害活性を示さなかった（表７）。以上より、本明細書記載のアプタマーは先行文献記載のアプタマーよりも高い活性を有していることが示された。【０１４１】
【表７】
0005602020.tif 000009
【０１４２】
表７は、配列番号３０、３２、３５で表わされるアプタマーと非特許文献１に記載のアプタマーＨ１、Ｌ２、Ｌ６の、ＮＧＦとの結合活性、ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害、及びＮＧＦによる神経突起伸張の阻害活性を示す。
ＮＧＦとの結合活性については、ＮＧＦに配列番号３５が結合した場合の最大ＲＵ値を１００％として評価した。８０％以上の場合は“＋＋”、５０％以上の場合は“＋”、５０％以下の場合は“−”で表す。ＮＧＦとＮＧＦ受容体との結合阻害については、“＋”は阻害活性％が６０％以上であること、“−”は６０％未満であることを表す。
ＮＧＦによる神経突起伸張の阻害活性は、それぞれのアプタマーの最終濃度が５００ｎＭおよび２５０ｎＭである場合の阻害活性（％）を示す。
【産業上の利用可能性】
【０１４３】
本発明のアプタマー及び複合体は、疼痛や炎症性疾患などの疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、ＮＧＦの精製及び濃縮、並びにＮＧＦの検出及び定量に有用であり得る。【０１４４】
本出願は、日本で出願された特願２００８−２４４９８２（出願日：２００８年９月２４日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
0005602020.tif 000011
【図２】
0005602020.tif 000012
【図３】
0005602020.tif 000013
【図４】
0005602020.tif 000014
【図５】
0005602020.tif 000015
【図６】
0005602020.tif 000016
【図７】
0005602020.tif 000017
【図８】
0005602020.tif 000018
【図９】
0005602020.tif 000019
【図１０ａ】
0005602020.tif 000020
【図１０ｂ】
0005602020.tif 000021
【図１１】
0005602020.tif 000022
【図１２】
0005602020.tif 000023
【図１３】
0005602020.tif 000024
【図１４】
0005602020.tif 000025
【図１５】
0005602020.tif 000026
【配列表】
0005602020000001.app