(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光透過性材料と、
該光透過性材料に連結される基板と、
三次元空間において少なくとも１０μｍの寸法を有する骨組と
を備える、マイクロ流体デバイスであって、
該基板は、複数の支柱を備え、
該骨組は、該基板と、該複数の支柱と、該光透過性材料とに接触させ、
該基板は、第１の流体流路と、第２の流体流路とを備え、
該第１の流体流路は、該第２の流体流路と交差せず、
該骨組は、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間に配置され、
該複数の支柱は、千鳥状アレイに配列されており、
該複数の支柱の千鳥状アレイは、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間に配置されている、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記第１の流体流路および前記第２の流体流路は、前記基板におけるチャネルである、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記基板は、プラスチックを含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記基板は、ＰＤＭＳを含む、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項５】
前記基板は、修正される、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記修正された基板は、ポリ−Ｄ−リシンへの該基板の暴露、またはプラズマへの該基板の暴露の結果である、請求項５に記載のデバイス。
【請求項７】
前記骨組は、固体または半固体の生体または生体適合性ポリマーを含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項８】
前記骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９】
前記骨組は、光硬化性ポリマーを含む、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
前記骨組は、第１の生物学的実体を含み、該第１の生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、請求項１〜９のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記骨組は、前記基板に付着させられる、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
圧力調整器をさらに備える、請求項１〜１１のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記圧力調整器は、流体が前記流体流路へ導入される時に、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間の圧力差を作成する弁である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記圧力調整器は、流体が前記流体流路へ導入される時に、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間の流速の差を作成する弁である、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記第１の流体流路または前記第２の流体流路は、抵抗チャネルを備える、請求項１〜１４のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記第１の流体流路は、前記第２の流体流路とは異なる寸法を有する、請求項１〜１５のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記第１の流体流路に動作可能に接続される第１の流体入口をさらに備える、請求項１〜１６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記第１の流体流路に動作可能に接続される第１の流体出口をさらに備える、請求項１〜１７のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記第２の流体流路に動作可能に接続される第２の流体入口をさらに備える、請求項１〜１８のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記第２の流体流路に動作可能に接続される第２の流体出口をさらに備える、請求項１〜１９のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記第１の流体流路に動作可能に接続される第１の貯留部をさらに備える、請求項１〜２０のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記第２の流体流路に動作可能に接続される第２の貯留部をさらに備える、請求項１〜２１のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記骨組は、固体または半固体の生体適合性ポリマーを含み、該固体または半固体の生体適合性ポリマーは、第２の生物学的実体の通過を可能にし、該第２の生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、請求項１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを含み、前記第２の生物学的実体は、真核細胞を含む、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記骨組は、コラーゲンを含み、前記第２の生物学的実体は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、および酵素から成る群より選択される、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２６】
前記光透過性材料は、ガラスを含む、請求項１〜２５のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２７】
第３の流体流路と、第３の流体入口と、第３の流体出口とをさらに備え、該第３の流体入口および該第３の流体出口は、各々、該第３の流体流路に動作可能に接続される、請求項１〜２６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記骨組は、前記第３の流体流路の全体を占有する、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
請求項１〜２８のうちのいずれか一項に記載の複数のデバイスを含む、ハイスループット分析のためのシステム。
【請求項３０】
細胞の有向移動を測定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のデバイスを提供するステップと、
ｂ）細胞を前記第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）生物学的実体を前記第２の流体流路に導入するステップと、
ｄ）前記骨組への該細胞の該有向移動を測定するステップと
を含み、
該生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、方法。
【請求項３１】
前記細胞は、好中球であり、前記生物学的実体は、内皮細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞は、糖尿病を有する被験者から得られ、前記生物学的実体は、糖尿病を有さない被験者から得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞は、糖尿病を有さない被験者から得られ、前記生物学的実体は、糖尿病を有する被験者から得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は、癌を有する被験者から得られ、前記生物学的実体は、癌を有さない被験者から得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞は、癌を有さない被験者から得られ、前記生物学的実体は、癌を有する被験者から得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞は、内皮細胞であり、前記生物学的実体は、第２の細胞であり、該第２の細胞は、腫瘍細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞および前記第２の細胞は、同じ被験体から得られる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
血管形成を測定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のデバイスを提供するステップと、
ｂ）内皮細胞または内皮細胞前駆体を前記第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）生物学的実体を前記第２の流体流路に導入するステップと、
ｄ）前記骨組における血管の形成を測定するステップと
を含み、
該生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、方法。
【請求項３９】
前記デバイスは、
第３の流体流路と、
前記基板および前記光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する第２の骨組であって、該第２の骨組は、前記第１の流体流路と前記第２の流体流路との間に配置される、第２の骨組と
をさらに備える、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１に記載のデバイスを製造する方法であって、
ａ）液体骨組材料を、第１の流体流路、第２の流体流路、および支柱を備える基板に接触させるステップと、
ｂ）光透過性材料を該基板に動作可能に接続するステップと
を含む、方法。
【請求項４１】
前記液体骨組材料は、単量体コラーゲンを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記基板を前記液体骨組材料に接触させる前に、該基板を修正し、それにより、該基板の疎水性、親水性、細胞親和性、または骨組付着性を改変するステップをさらに含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記基板を修正する前記ステップは、該基板をポリ−Ｄ−リシンに暴露するステップ、または該基板をプラズマに暴露するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記液体骨組材料を前記基板に接触させる前記ステップは、該液体骨組材料を、前記第１および第２の流体流路と隣接していない該基板の画定された領域へ圧力下で注入するステップを含む、請求項４０〜４３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
浸透性を測定する方法であって、
ａ）請求項１に記載のデバイスを提供するステップと、
ｂ）第１の物質を前記第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）前記骨組の中への該第１の物質の該浸透性を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項４６】
前記第１の物質は、流体または小分子である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記骨組は、細胞単層を含む、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の物質は、細胞を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞は、内皮細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記骨組は、第２の細胞を含む、請求項４５、４８、または４９のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２の細胞は、腫瘍細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１の物質は、細胞を含み、該細胞は、内皮細胞であり、前記骨組は、第２の細胞を含み、該第２の細胞は、腫瘍細胞であり、該内皮細胞および該腫瘍細胞は、同じ被験体から得られる、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
細胞追跡剤を評価するための方法であって、
ａ）請求項１に記載のデバイスを提供するステップと、
ｂ）細胞追跡剤を前記第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）前記骨組の中への該細胞追跡剤の拡散を測定するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００８年４月８日に出願された米国仮特許出願第６１／１２３，３４４号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（政府支援）
本発明は、米国国立衛星研究所、米国国立画像生物医学・生物工学研究所に授与された助成Ｎｏ．Ｉ−Ｒ０１−ＥＢ−００３８０５−０１Ａ１の下、政府支援を伴ってなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
細胞移動は、血管形成、癌転移、創傷治癒、および炎症等の種々の生理学的および病理学的過程に対して不可欠である。血管系では、顕著な努力が、毛細血管形態形成の関連において細胞移動に集中している。これらの研究を通して、単一または複数の成長因子の走化性または化学運動性効果[１（非特許文献１）]、間質流体流動[２（非特許文献２）、３（非特許文献３）]、およびマトリクス剛性[４（非特許文献４）、５（非特許文献５）]等、様々な機械的および生化学的要因が、内皮細胞移動および管形成を調節する際に重大であると特定されている。個々の構成要素の詳細な理解にもかかわらず、どのようにしてこれらの要因が一体化し、特定の細胞応答を引き起こすのかは、まだ解明されておらず、これらの環境要因が制御された方法で研究されることができる多様な体外系の必要性をもたらす。これに到達することは、どのようにして生化学的および機械的要因が、生理学的および病態生理学的過程において共に作用し、最終的に組織工学および治療方針の改善に貢献するかに関するより良い理解につながる調査を容易にする。
【０００４】
毛細血管形態形成における細胞移動を理解することは、ヒトの疾病および発生現象[６（非特許文献６）]とのその関係のために、治療上重要である。通常の細胞移動検定は、複雑な環境要因、特に、三次元環境内の事前に形成された毛細血管または細胞単層からの新規の管様構造の形成を容易にするものを一体化することができない。現在の毛細血管形態形成検定の１つは、ＥＣＭ様基板に対する平面的な管状ネットワークを作成する[７（非特許文献７）、８（非特許文献８）、９（非特許文献９）]。しかしながら、この技法で形成される毛細血管様構造は、培地が外側にあり、骨組材料が内側にある逆の細胞極性を有する[７（非特許文献７）]。他の手段は、１つの細胞単層を２層の骨組材料の間に挟むこと[８（非特許文献８）]、および化学勾配を導入することによって毛細血管侵入を誘発すること[９（非特許文献９）]を含む。これらの実験は、毛細血管形態形成を理解するための基礎を提供したが、この生物学的過程に影響を与える要因のより詳細な特徴付けにつながる、面内で細胞侵入を画像化することができないことによって制限される。
【０００５】
歴史的に、創傷検定[１１（非特許文献１１）、１２（非特許文献１２）]、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）フェンス検定[１３（非特許文献１３）]およびボイデンチャンバ[１４（非特許文献１４）、１５（非特許文献１５）]等の多くの検定は、細胞移動[１０（非特許文献１０）]を研究するために使用されている。創傷検定およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）フェンス検定は、両方とも、２Ｄにおける細胞移動の研究に制限される。ボイデンチャンバは、生理学的３Ｄ環境を最も精密に模倣するが、リアルタイムで細胞移動を定量化する助けとならない。コラーゲンゲルに組み込まれる内皮細胞で被覆されたビーズまたは球状物による別の検定は、三次元環境における管様構造を生成することができた。検定は、安定した管様構造の生成、および他の細胞型による共培養を可能にしたが[１６（非特許文献１６）、１７（非特許文献１７）、１８（非特許文献１８）]、初期の内皮細胞播種表面は、体内で内皮細胞によって経験される流体−マトリックス界面および流体流動等の生理学的要因を可能にしない剛性ビーズである。さらに、現在の検定では、化学運動性および走化性効果は、分化し難い。細胞移動の関連において、走化性は、化学誘引物質へ向かって移動する細胞を表すが、化学運動性は、特定の生化学的要因の存在下で運動性の増加を表す。制御された勾配を維持することの技法的困難により、２つの効果は、容易に区別されない。既存の技法への課題は、（ｉ）生理学的に関連する状態における機械的および生化学的要因の精密制御を有すること、（ｉｉ）リアルタイムの優れた光学的分解能を有すること、および（ｉｉｉ）サンプル変動性を最小限にし、定量化のための感度を強化することである。
【０００６】
マイクロ加工およびマイクロ流体技術は、複数の環境要因の精密制御を可能にすることによって、細胞移動の研究のこれらの課題を克服する可能性を有する。しかしながら、この分野における現在の努力は、他に類のない要因を調査し続けている。例えば、微細加工パターンは、高い剛性の方向への優先的移動の証明を可能にした[１９（非特許文献１９）、２０（非特許文献２０）]。マイクロ流体技術も、生化学的勾配の精密制御およびもたらされた細胞移動の定量化を可能にした[２１（非特許文献２１）]。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｈ．，Ｇｏｌｄｉｎｇ，Ｍ．，Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，Ｍ．，Ｒｕｈｒｂｅｒｇ，Ｃ，Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ，Ａ．，Ａｂｒａｍｓｓｏｎ，Ａ．，Ｊｅｌｔｓｃｈ，Ｍ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｃ，Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｍａ，Ｄ．＆Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ，Ｃ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６１，１１６３−１１７７（２００３）．
【非特許文献２】Ｈｅｌｍ，Ｃ−Ｌ．Ｅ．，Ｆｌｅｕｒｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｚｉｓｃｈ，Ａ．Ｈ．，Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２，１５７７９−１５７８４（２００５）．
【非特許文献３】Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１７，４４−５０（２００７）．
【非特許文献４】Ｓｉｅｍｉｎｓｋｉ，Ａ．Ｌ．，Ｈｅｂｂｅｌ，Ｒ．Ｐ．＆Ｇｏｏｃｈ，Ｋ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２９７，５７４−５８４（２００４）．
【非特許文献５】Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｎ．，Ｓｕｄｏ，Ｒ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．＆Ｔａｎｉｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，１３，１４４３−１４５３（２００７）．
【非特許文献６】Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｃｈｌｅｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｈｏｃｋｅｌ，Ｍ．＆Ｙｕａｎ，Ｆ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ，３，１２０３−１２０８（１９９７）．
【非特許文献７】Ｎａｋａｙａｓｕ，Ｋ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｏｋｉｓａｋａ，Ｓ．＆Ｓａｔｏ，Ｎ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３３，３０５０−３０５７（１９９２）．
【非特許文献８】Ｓｈｉｕ，Ｙ．Ｔ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｙｉｎｇ，Ｊ．Ｂ．，Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｎ．，Ｊｏｕｎｇ，ＬＳ．＆Ｑｕａｍ，Ｃ．Ｔ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．３３，４３１−５１０（２００５）．
【非特許文献９】Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｂｌａｃｋ，Ｓ．Ｍ．＆Ｂａｙｌｅｓｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ａｎ．，３６，５１３−５１９（２０００）．
【非特許文献１０】ＤｉＭｉｌｌａ，Ｐ．Ａ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｊ．Ａ．，Ａｌｂｅｉｄａ，Ｓ．Ｍ．＆Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｄ．Ａ．，ＡＩＣｈｅ  Ｊ．，３８，１０９２−１１０４，（１９９２）．
【非特許文献１１】Ｓｈｉｚｕｋｕｄａ，Ｙ．，Ｔａｎｇ，Ｓ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｒ．＆Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｗａｒｅ，Ｊ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８４，２４７−２５６（１９９９）．
【非特許文献１２】Ｒｏｊａｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｅｎｎｏｕｎｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｍａｌｔｉ，Ｄ．，Ｂａｋｕｎｔｓ，Ｋ．，Ｒｅｕｖｅｎｉ，Ｍ．，Ｓａｎｋａ，Ｓ．Ｃ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ｇ．Ｍ．，Ｓｅｆｔｏｒ，Ｅ．Ａ．，Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｇ．，Ｗｅｓｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．＆Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｇｕｉｌａｎ，Ｒ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９１，Ｈｌ  １４７−Ｈ１１５７（２００６）．
【非特許文献１３】Ｓａｇｎｅｌｌａ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｌｉｇｍａｎ，Ｆ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｕｒｕｇｅｓａｎ，Ｇ．，Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｒ．Ｅ．＆Ｋｏｔｔｋｅ−Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｋ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，１２４９−１２５９（２００４）．
【非特許文献１４】Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．Ｊ．Ｃ，Ｓｅｆｔｏｒ，Ｅ．Ａ．，Ｓｅｆｔｏｒ，Ｒ．Ｅ．Ｂ．＆Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，３８，１３７−１４７（１９８７）．
【非特許文献１５】Ｍａｃｅ，Ｋ．Ａ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｃ，Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｍ．＆Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｎ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１１８，２５６７−２５７７（２００５）．
【非特許文献１６】Ｂａｙｌｅｓｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｓａｌａｚａｒ，Ｒ．＆Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｅ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５６，１６７３−１６８３（２０００）．
【非特許文献１７】Ｗｅｎｇｅｒ，Ａ．，Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．，Ｆｉｎｋｅｎｚｅｌｌｅｒ，Ｇ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｂ．＆Ｋｎｅｓｅｒ，Ｕ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，１０，１５３６−１５４７（２００４）．
【非特許文献１８】Ｇｈａｊａｒ，ＣＭ．，Ｂｌｅｖｉｎｓ，Ｋ．Ｓ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｃ．Ｃ．Ｗ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｓ．Ｃ  ＆Ｐｕｔｎａｍ，Ａ．Ｊ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，１２．２８７５−２８８８（２００６）．
【非特許文献１９】Ｃｈｉｃｕｒｅｌ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５，６０６−６０９（２００２）．
【非特許文献２０】Ｓｅｌｍｅｃｚｉ，Ｄ．，Ｍｏｓｉｅｒ，Ｓ．，Ｈａｇｅｄｏｍ，Ｐ．Ｈ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｎ．Ｂ．＆Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ，Ｈ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，８９，９１２−９３１（２００５）．
【非特許文献２１】Ｊｅｏｎ，ＮＸ．，Ｂａｓｋａｒａｎ，Ｈ．，Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｗ．，Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗａｔｅｒ，Ｌ．＆Ｔｏｎｅｒ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，８２６−８３０（２００２）．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（概要）
原核および真核細胞移動、増殖、および分化を含む、三次元の生物学的応答の形成および研究のため、ならびに重要な生物学的機能を復元することが可能な体外系の開発のためのデバイスおよび方法を提供する。
【０００９】
本発明のさらなる目的および利点は、詳細な説明および請求項から明らかとなる。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
光透過性材料と、
該光透過性材料に連結される基板と、
三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組と
を備える、マイクロ流体デバイスであって、
該基板は、支柱を備え、
該骨組は、該基板と、該支柱と、該光透過性材料とに接触させ、
該基板は、第１の流体流路と、第２の流体流路とを備え、
該第１の流体流路は、該第２の流体流路と交差せず、
該骨組は、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間に配置される、マイクロ流体デバイス。
（項目２）
上記第１の流体流路および上記第２の流体流路は、上記基板におけるチャネルである、項目１に記載のデバイス。
（項目３）
上記基板は、プラスチックを含む、項目１または２に記載のデバイス。
（項目４）
上記基板は、ＰＤＭＳを含む、項目１または２に記載のデバイス。
（項目５）
上記基板は、修正される、項目１〜４のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目６）
上記修正された基板は、ポリ−Ｄ−リシンへの該基板の暴露、またはプラズマへの該基板の暴露の結果である、項目５に記載のデバイス。
（項目７）
上記骨組は、固体または半固体の生体または生体適合性ポリマーである、項目１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目８）
上記骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを含む、項目１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目９）
上記骨組は、光硬化性ポリマーを含む、項目１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１０）
上記骨組は、第１の生物学的実体を含む、項目１〜９のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１１）
上記骨組は、上記基板に実質的に付着させられる、項目１〜１０のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１２）
圧力調整器をさらに備える、項目１〜１１のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１３）
上記圧力調整器は、流体が上記流体流路へ導入される時に、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間の圧力差を作成する弁である、項目１２に記載のデバイス。
（項目１４）
上記圧力調整器は、流体が上記流体流路へ導入される時に、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間の流速の差を作成する弁である、項目１２に記載のデバイス。
（項目１５）
上記第１の流体流路または上記第２の流体流路は、抵抗チャネルを備える、項目１〜１４のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１６）
上記第１の流体流路は、上記第２の流体流路とは異なる寸法を有する、項目１〜１５のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１７）
上記第１の流体流路に動作可能に接続される第１の流体入口をさらに備える、項目１〜１６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１８）
上記第１の流体流路に動作可能に接続される第１の流体出口をさらに備える、項目１〜１７のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目１９）
上記第２の流体流路に動作可能に接続される第２の流体入口をさらに備える、項目１〜１８のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目２０）
上記第２の流体流路に動作可能に接続される第２の流体出口をさらに備える、項目１〜１９のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目２１）
上記第１の流体流路に動作可能に接続される第１の貯留部をさらに備える、項目１〜２０のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目２２）
上記第２の流体流路に動作可能に接続される第２の貯留部をさらに備える、項目１〜２１のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目２３）
上記骨組は、固体または半固体の生体適合性ポリマーを含み、該固体または半固体の生体適合性ポリマーは、第２の生物学的実体の通過を可能にする、項目１〜６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目２４）
上記骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを含み、上記第２の生物学的実体は、真核細胞を含む、項目２３に記載のデバイス。
（項目２５）
上記骨組は、コラーゲンを含み、上記第２の生物学的実体は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、および酵素から成る群より選択される、項目２３に記載のデバイス。
（項目２６）
上記光透過性材料は、ガラスを含む、項目１〜２５のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目２７）
第３の流体流路と、第３の流体入口と、第３の流体出口とをさらに備え、該第３の流体入口および該第３の流体出口は、各々、該第３の流体流路に動作可能に接続される、項目１〜２６のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
（項目２８）
上記骨組は、上記第３の流体流路の実質的に全体を占有する、項目２７に記載のデバイス。
（項目２９）
光透過性材料と、
該光透過性材料に連結される基板と、
三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組と
を備える、マイクロ流体デバイスであって、
該骨組は、該基板または該光透過性材料もしくは両方に接触させ、該基板は、第１の流体流路と、第２の流体流路と、第３の流体流路とを備え、
該骨組は、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間に配置される第１の固体または半固体の生体適合性ポリマーと、該第２の流体流路と該第３の流体流路との間に配置される第２の固体または半固体の生体適合性ポリマーとを含み、
該固体または半固体の生体適合性ポリマーは、１つ以上の生物学的実体の通過を可能にする、マイクロ流体デバイス。
（項目３０）
項目１〜２９のうちのいずれか一項に記載の複数のデバイスを含む、ハイスループット分析のためのシステム。
（項目３１）
細胞の有向移動を測定する方法であって、
ａ）
ｉ）第１の流体流路と、第２の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ｉｉ）該基板および該光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
ｂ）細胞を該第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）生物学的実体を該第２の流体流路に導入するステップと、
ｄ）該骨組への該細胞の該有向移動を測定するステップと
を含む、方法。
（項目３２）
上記生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
上記細胞は、好中球であり、上記生物学的実体は、内皮細胞である、項目３１に記載の方法。
（項目３４）
上記細胞は、糖尿病を有する被験者から得られ、上記生物学的実体は、糖尿病を有さない被験者から得られる、項目３１に記載の方法。
（項目３５）
上記細胞は、糖尿病を有さない被験者から得られ、上記生物学的実体は、糖尿病を有する被験者から得られる、項目３１に記載の方法。
（項目３６）
上記細胞は、癌を有する被験者から得られ、上記生物学的実体は、癌を有さない被験者から得られる、項目３１に記載の方法。
（項目３７）
上記細胞は、癌を有さない被験者から得られ、上記生物学的実体は、癌を有する被験者から得られる、項目３１に記載の方法。
（項目３８）
上記細胞は、内皮細胞であり、上記生物学的実体は、第２の細胞であり、該第２の細胞は、腫瘍細胞である、項目３１に記載の方法。
（項目３９）
上記細胞および上記第２の細胞は、同じ被験体から得られる、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
血管形成を測定する方法であって、
ａ）
ｉ）第１の流体流路と、第２の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ｉｉ）該基板および該光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組であって、該骨組は、該第１の流体流路と該第２の流体流路との間に配置される、骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
ｂ）内皮細胞または内皮細胞前駆体を該第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）生物学的実体を該第２の流体流路に導入するステップと、
ｄ）該骨組における血管の形成を測定するステップと
を含む、方法。
（項目４１）
上記生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
上記デバイスは、
第３の流体流路と、
上記基板および上記光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する第２の骨組であって、該第２の骨組は、上記第１の流体流路と上記第２の流体流路との間に配置される、第２の骨組と
をさらに備える、項目４０または４１に記載の方法。
（項目４３）
デバイスを製造する方法であって、
ａ）液体骨組材料を、第１の流体流路、第２の流体流路、および支柱を備える基板に接触させるステップと、
ｂ）光透過性材料を該基板に動作可能に接続するステップと
を含む、方法。
（項目４４）
上記液体骨組材料は、単量体コラーゲンを含む、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
上記基板を上記液体骨組材料に接触させる前に、該基板を修正し、それにより、該基板の疎水性、親水性、細胞親和性、または骨組付着性を改変するステップをさらに含む、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
上記基板を修正する上記ステップは、該基板をポリ−Ｄ−リシンに暴露するステップ、または該基板をプラズマに暴露するステップを含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
上記液体骨組材料を上記基板に接触させる上記ステップは、該液体骨組材料を、上記第１および第２の流体流路と実質的に隣接していない該基板の画定された領域へ圧力下で注入するステップを含む、項目４３〜４６のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
浸透性を測定する方法であって、
ａ）
ｉ）第１の流体流路と、第２の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ｉｉ）該基板および該光透過性材料に接触させ、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
ｂ）第１の物質を該第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）該骨組の中への該第１の物質の該浸透性を測定するステップと
を含む、方法。
（項目４９）
上記第１の物質は、流体または小分子である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
上記骨組は、細胞単層を含む、項目４８または４９に記載の方法。
（項目５１）
上記第１の物質は、細胞を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
上記細胞は、内皮細胞である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
上記骨組は、第２の細胞を含む、項目４８、５１、または５２のうちのいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
上記第２の細胞は、腫瘍細胞である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
上記第１の物質は、細胞を含み、該細胞は、内皮細胞であり、上記骨組は、第２の細胞を含み、該第２の細胞は、腫瘍細胞であり、該内皮細胞および該腫瘍細胞は、同じ被験体から得られる、項目４８に記載の方法。
（項目５６）
細胞追跡剤を評価するための方法であって、
ａ）
ｉ）第１の流体流路と、第２の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ｉｉ）該基板および該光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
ｂ）細胞追跡剤を該第１の流体流路に導入するステップと、
ｃ）該骨組の中への該細胞追跡剤の拡散を測定するステップと
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、２つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの概略図である。
【図２】図２は、２つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの写真である。対象の細胞は、２つの流路のうちのいずれか、または両方において導入（または「播種」）されるか、またはゲル骨組において懸濁される。
【図３】図３は、３つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの写真である。対象の１つ以上の細胞型は、３つの流路のうちの１つ以上の任意の組み合わせにおいて導入（または「播種」）されるか、またはゲル骨組において懸濁される。
【図４】図４Ａは、３つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの概略図である。図４Ｂは、３つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの写真である。真核細胞は、内部流路に導入され、外部流路へ走化的に移動させられた。
【図５】図５は、３つの流体流路および２つの横断経路を有し、流路のうちの１つ以上における流体流動を制御するための入口（加圧または非加圧空気のため等）および弁を提供するマイクロ流体デバイスの概略図である。
【図６】図６は、細菌に対する走化性検定における、３つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの使用を示す棒グラフである。細菌は、内部流路に導入（または「播種」）され、１つの外部流路に配置された刺激（または「条件」）へ向かう細菌の走化性移動は、他の外部流路に配置された対照へ向かう細菌移動に対して測定された。
【図７】図７Ａは、血管形成検定におけるマイクロ流体デバイスの使用を示すグラフである。図７Ｂおよび７Ｃは、どのようにして管形成が、単純細胞移動から計算され、分化されるかの描写である。
【図８】図８は、細胞共培養検定における、３つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの使用の概略図である。Ｕ８７ＭＧ細胞は、内部流路に導入され、ヒト上皮成長因子（「ｈＥＧＦ」）は、１つの外部流路に導入され、一次皮質ニューロンは、他の外部流路に導入される。
【図９】図９Ａは、細胞共培養検定における、２つの流体流路を有するマイクロ流体デバイスの使用の概略図である。本デバイスでは、骨組は、コラーゲンを含み、光透過性材料は、顕微鏡カバーガラスであり、基板（ポリジメチルシロキサンまたは「ＰＤＭＳ」）およびカバーガラスは両方とも、コラーゲンまたはポリ−Ｄ−リシン（「ＰＤＬ」）等の様々な材料で被覆される。肝細胞は、第１の流体流路に導入され、それらがコラーゲン骨組の表面で少なくとも１つの細胞層を形成するような条件下で成長する。ヒト微小血管内皮細胞（「ＭＶＥＣ」）は、第２の流路に導入され、流路を通る流体流動があるか、流体流動がない（「静止」条件）条件下で成長する。肝細胞の方向での骨組への内皮細胞移動、および小管への内皮細胞分化が描写される。図９Ｂは、ＭＶＥＣ肝細胞共培養実験の時間経過の概略図である。細胞型の異なる組み合わせは、本発明の様々な実施形態においてデバイスに導入される。
【図１０】図１０は、マイクロ流体デバイスが、マルチウェル組織培養プレートの隣接するウェルに配置される、本発明の実施形態の写真であり、さらなる修正が、デバイスのハイスループット使用を可能にするために提供される。
【図１１】図１１Ａは、骨組にわたる勾配の形成を明示する線グラフである。図１１Ｂは、マイクロ流体デバイスの一部分における細胞部位を示す概略図である。流体流路に導入される細胞は、骨組の表面に付着し得、骨組材料に侵入し得る。あるいは、細胞は、流体流路と接触している光透過性材料（ここでは、ガラスカバースリップ）に付着し得る。図１１Ｃは、流体（培地貯留部からの）が、毛管現象によるか、または流体出口での真空（ポンプ源からの）の適用によってデバイスに導入される本発明の一実施形態を明示する概略図である。
【図１２】図１２Ａは、どのようにして温度および湿度が、デバイスを制御するかを明示する、マイクロ流体デバイスの一部分の概略断面図である。図１２Ｂは、マイクロ流体デバイス環境において生理学的条件を維持するためのマイクロ流体デバイスおよび関連システムの写真である。
【図１３】図１３は、図１２Ｂに組み立てられて示されるマイクロ流体デバイスおよび関連システムの写真である。
【図１４】図１４Ａは、骨組が形成される千鳥状マイクロピラーアレイを明示するマイクロ流体デバイスの一部分の概略図である。図１４Ｂは、マイクロ流体デバイスの骨組およびアセンブリの形成を示す配置図である。図１４Ｃは、マイクロ流体デバイスおよび関連システムの写真である。図１４Ｄは、クーマシーブルーで染色されたコラーゲンを含有する骨組を示すマイクロ流体デバイスの一部分の写真である。
【図１５】図１５は、内皮細胞が、ＭＴＬｎ３ラット乳腺腺癌細胞、Ｕ８７ＭＧヒト膠芽腫細胞、または平滑筋細胞（ＳＭＣ）と共に共培養される、マイクロ流体デバイスの一連の写真である。
【図１６】図１６Ａ〜Ｌは、マイクロ流体デバイスの骨組において小管を形成した内皮細胞の一連の微速度撮影の写真である。
【図１７】図１７Ａ〜Ｋは、マイクロ流体デバイスの骨組において小管を形成した内皮細胞の一連の微速度撮影の写真である。
【図１８】図１８Ａ〜Ｃは、マイクロ流体デバイスの骨組において小管を形成した内皮細胞の一連の写真である。
【図１９】図１９Ａは、複数の（例えば、３つの）流体流路および骨組を明示する、マイクロ流体デバイスの一部分の概略断面図である。図１９Ｂは、マイクロ流体デバイスの骨組の写真である。図１９Ｃ〜Ｄは、経時的な骨組を通る溶質拡散を示す線グラフである。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃは、複数の流体流路および骨組を明示する、マイクロ流体デバイスの一部分を示す一連の写真である。図２０Ｄ〜Ｇは、ＶＥＧＦ等の刺激に応答した、経時的な骨組を通る有向細胞移動を示す一連の線グラフである。
【図２１】図２１Ａ〜Ｄは、内腔を含む小管に分化するように、０．２％コラーゲン骨組を通って移動する内皮細胞を示す一連の写真である。
【図２２】図２２Ａは、ゲル「ケージ」にわたる勾配の証明を描写する。蛍光デキストラン（４０ｋＤａ）を使用して、μＦＤにおける生成勾配の能力を証明した。ゲル「ケージ」にわたるデキストラン（その大きさの範囲内で非反応性溶質をシミュレートするために使用された）の蛍光強度および濃度の時間経過を示す。プロットは、４０時間以上表示された代表的な実験曲線を示す。図２２Ｂは、細胞培養検定の概略図を描写する。（上）ＥＣ発芽検定。細胞は、生理学的な関連極性を伴う三次元のゲル上で培養される。（中）３Ｄカプセル化検定。細胞は、ゲルに懸濁され、最初に互いから分離される。（下）２Ｄ移動検定。細胞は、ＥＣＭ材料（フィブロネクチン）で被覆されるガラス基板（不適合）上で主に単分子層を形成する。図２２Ｃは、様々な培養流れ構造を描写する。（１）静置培養のために、培地の液滴は、入口および出口ポート上に配置される。デバイスは、培養器内の局所高湿度（水を伴うペトリ皿）二次的容器に保たれる。（２）液体貯留部の高さが異なる、ゲルケージにわたって圧力勾配をかけるために使用される設定。（３）マイクロ流体プラットホーム。マイクロチャネルにおけるせん断応力の生理学的レベルを生成するために使用されるプラットホームの概略図。図２２Ｄは、ゲル領域における固定部位での正規化強度の値を表すプロットを描写し、例示的なデバイスに対し、実線は、理論予測、および形状マーカ（円形（白丸−中間、黒丸−シンクチャネル付近）正方形）である。図２２Ｅは、ＤＦＤにおける三次元の骨組を通る間質流を生成するための正規化圧力差（ｄＰ／ｄＰｍａｘ）の発生に対する実験結果を描写し、Ｐａの値は、初期圧力差を示す。
【図２３】図２３は、マイクロ流体検定発展のための実験プロトコルを描写する。図２３ａは、ソフトリソグラフィおよび表面処理によって作製された、調製されたＰＤＭＳデバイスを示す。図２３ｂは、チャネルの間にある骨組チャネルにおける充填されたゲル骨組（影付き）を描写する。図２３ｃは、両チャネルを充填する培地（左、右、中央）を示す。図２３ｄは、中央細胞チャネルにおける細胞播種（球形）を描写する。図２３ｅは、条件チャネルに適用される化学的要因（右）を描写する。図２３ｆは、培地および化学的要因の充填後のマイクロ流体デバイスを描写する。液滴は、チャネルからの培地の蒸発を回避するために全ての入口ポート上に配置される。培地は、単に既存の液滴を吸引し、新しい液滴を追加することによって生成さえる毛細管力により置換することができる。図２３ｇは、条件と対照側との間の細胞移動挙動の直接比較を可能にする、マイクロ流体細胞移動検定の概略図を描写する。
【図２４】図２４は、（ａ）ｐＨ７．４で重合された０．２％（２．０ｍｇ／ｍＬ）コラーゲンゲル骨組の正規化相対周囲のグラフを描写する。「ＶＥＧＦ無し」は、ＶＥＧＦ勾配を伴わない負の対照としての機能を果たす。「ｎ日目のＶＥＧＦ」は、ＶＥＧＦが、最初に、細胞播種後ｎ日に適用され、実験の最後まで継続したことを意味する。（ｂ）コラーゲンゲル骨組における移動細胞の正規化相対面積のグラフ。（ｃおよびｄ）コラーゲンゲル骨組における移動細胞の正規化相対周囲および面積のグラフ。各点は、各条件に対するｎ１／４  ８（８つの骨組；４つのデバイス）での平均を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図２５】図２５は、ＶＥＧＦ勾配と組み合わせた他の細胞型（Ｕ８７ＭＧ、ＭＴＬｎ３、１０Ｔ１／２）からの信号に応答したＨＭＶＥＣ細胞の移動を描写する。条件チャネルにおける異なる細胞型（Ｕ８７ＭＧ細胞、異なる播種密度を伴うＭＴＬｎ３細胞、および１０Ｔ１／２細胞）、細胞を伴わない対照培地のみ（対照培地）、および２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを伴う対照培地（ＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ）による、細胞チャネルにおいて培養されたＨＭＶＥＣの相対正規化面積の変化。高密度で播種されたＶＥＧＦ含有培地およびＭＴＬｎ３細胞は、ＨＭＶＥＣを強く引き付けたが、低密度のＭＴＬｎ３細胞およびＵ８７ＭＧ細胞は、引き付けなかった。条件チャネルにおける１０Ｔ１／２細胞により、ＨＭＶＥＣは、対照側に移動する傾向があった。各点は、各条件に対するｎ１／４  ８（８つの骨組；４つのデバイス）での平均を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図２６】図２６は、組織工学によって作製されたコンストラクトの血管新生のためのマイクロ流体共培養プラットホームを描写する。Ａ）ＰＤＭＳで作製されたマイクロ流体デバイスの概略図および寸法。２つの平行マイクロ流体チャネルは、マイクロパターン化ＰＤＭＳデバイスとカバースリップとの間に形成される。ゲル骨組（例えば、Ｉ型コラーゲン）は、ＰＤＭＳ支柱の機械的支持を伴うマイクロ流体チャネルの間に位置する。Ｂ）静止（左）および流動（右）条件下で培養されたマイクロ流体デバイスの写真。培養培地の液滴は、静置培養のためにマイクロ流体チャネルの各出口上に配置される。貯留部は、流動培養のためにマイクロ流体チャネルに接続される。
【図２７】図２７は、２つのマイクロ流体チャネルの間の５ｍｍのＨ２Ｏ気圧差によって生成されるゲル骨組にわたる間質流を描写する。肝細胞を伴うコラーゲンゲルの浸透性は、貯留部における培地レベルの変位を測定することによって決定され、速度は、ゲル浸透性および分析溶液に基づいて計算された。速度は、経時的に低下したが、培養培地を交換することによって復元される。
【図２８】図２８は、肝細胞による３Ｄ組織様構造の形成に対する間質流方向の効果を描写する。Ａ）前方流（矢印、０日目）、その後の逆流（矢印、＞１日目）において培養された肝細胞の対応する位相差画像。肝細胞は、徐々に３Ｄ組織様構造に組織化したことに留意されたい。Ｂ）逆流において培養された肝細胞の対応する位相差画像。細胞は、２日目にマイクロ流体チャネル上で分散し始めた（矢じり、２日目）。細胞が、マイクロ流体チャネル上を移動するにつれて、細胞構造は、薄くなった。
【図２９】図２９は、Ｃ）３日目の肝細胞形態形成の定量化を描写する。マイクロ流体チャネル上を分散する肝細胞の面積は、測定され、マイクロ流体チャネルの面積によって正規化された。エラーバー＝ＳＥＭ（ｎ＝１０、Ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５対前方流そして逆流。Ｄ）アクチンフィラメントを染色し、ｚスタック画像を底部のｚ平面（カバースリップ付近）１０μｍおよび４０μｍの上昇で共焦点レーザー走査顕微鏡によって撮った。矢じりは、肝細胞組織様構造の端部を示す。細胞は、前方流、その後の逆流において、逆流のみより厚い構造を形成した。
【図３０】図３０は、マイクロ流体プラットホームにおいて作製された３Ｄ血管形成モデルを描写する。Ａ）静止条件下で培養されたｈＭＶＥＣの対応する位相差画像。細胞は、コラーゲンゲル骨組に浸透し、血管発芽を形成した（矢じり、１日目）。芽は、伸展し、毛細血管様構造を形成した（矢じり、２および３日目）。Ｂ）対応する位相差および蛍光画像。ｈＭＶＥＣは、５日目に固定され、アクチンフィラメントおよび核に対して染色された。断面画像は、ｈＭＶＥＣは、内腔を伴う毛細血管様構造を形成したが（ｉ、ｉｉ）、端細胞は、内腔を形成しなかった（ｉｉｉ）ことを示した。Ｃ）静止条件下で培養されたｒＭＶＥＣの対応する位相差画像。細胞は、シート様構造としてゲル骨組に移動した（矢じり）。Ｄ）対応する位相差および蛍光画像。ｒＭＶＥＣは、７日目に固定され、アクチンフィラメントに対して染色された。断面画像は、細胞がシート様構造を形成したことを示した（ｉ〜ｉｉｉ）。
【図３１】図３１は、マイクロ流体プラットホームにおける肝細胞ｒＭＶＥＣ共培養を描写する。Ａ）共培養のための実験プロトコル。Ｂ）対応する位相差画像。肝細胞は、コラーゲンゲル骨組の側壁上に播種され、間質流が適用された（矢印、０日目）。流れ方向は、１日目は逆流であった（矢印、１日目）。間質流は、停止され、ｒＭＶＥＣは、２日目にゲル骨組の反対側に添加された（２−０日目）。肝細胞は、３Ｄ組織様構造を形成した（３−１日目）。いくつかのｒＭＶＥＣは、４−２日目に血管発芽を形成し始めた（矢じり、４−２日目）。血管発芽は、ゲル骨組にわたって伸展し、肝細胞組織様構造に近づいた（矢じり）。いくつかの肝細胞も、ｒＭＶＥＣの毛細血管様構造へ向かって移動した（矢印、７−５日目および８−６日目）。
【図３２】図３２は、ｒＭＶＥＣ形態形成の定量化を描写する。グラフは、ｎ日目の移動するｒＭＶＥＣの正規化面積増加Ａ〜ｎと周囲増加Ｐ〜ｎとの間の関係を示す。共培養では、データは、対照培養より大きいＰ〜ｎおよびより小さいＡ〜ｎを表す。各プロットは、各日の値を表す。「３−１日目」は、肝細胞の３日目およびｒＭＶＥＣの１日目を表す。エラーバー＝ＳＥＭ（肝細胞ｒＭＶＥＣ共培養に対してｎ＝１６、Ｎ＝４；ｒＭＶＥＣ培養に対してｎ＝１５、Ｎ＝３）。写真は、肝細胞組織様構造の対応する位相差および蛍光画像を示す。左パネル：共培養の１３−１１日目の肝細胞におけるＢＣ（矢じり）に分泌したＦＤの代謝産物。右パネル：共培養の１０−８日目の肝細胞のＥＲＯＤ活性。
【図３３】図３３は、肝細胞ｒＭＶＥＣ共培養におけるｒＭＶＥＣの管形成過程を描写する。Ａ）共培養におけるｒＭＶＥＣの位相差画像。Ｂ）ローダミン−ファロイジンで染色された毛細血管様構造のｚ投影画像。細胞は、静止条件下で培養され、共培養の１２−１０日目に固定された。画像フィールドは、Ａにおける点線枠に対応する。Ｃ）構造の方向に沿った毛細血管様構造の断面画像。ｒＭＶＥＣは、内腔構造を形成したが、先端領域に内腔は見られなかったことに留意されたい。Ｄ）Ｂにおける毛細血管様構造の垂直断面画像。数字は、Ｂにおける点線に対応する。スケールバー＝５０μｍ（Ｂ）；２０μｍ（Ｃ）。
【図３４】図３４は、ゲル骨組における拡散分析を描写する。Ａ）０、５、および３０分でのマイクロ流体プラットホームにおけるゲル骨組にわたる４０ｋＤａ蛍光デキストランの分布。Ｂ）定常状態（左）および対応する数値シミュレーション（右）における実験結果。強度は、実験結果とシミュレーションを比較するために最大値に正規化された。画像は、正規化濃度に対して示される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（詳細な説明）
本明細書において明確に規定されない限り、全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、発明者は、その用語の複数形も意図する。
【００１２】
本発明の一局面は、デバイスまたはシステム、特に、マイクロ流体デバイスを対象とする。本明細書において使用される「マイクロ流体デバイス」は、１０または５ミリメートル（ｍｍ）未満の寸法（例えば、高さ、長さまたは深さ）を有する少なくとも１つの流体流路を含むデバイス、装置またはシステムを指す。概して、流体流路は、１ｍｍ未満の幅を有する。本明細書において使用される「流体流路」、「流体管路」、または「流路」は、液体またはガスを含む流体が通過し得る、任意のチャネル、管、領域、空間もしくは通路、またはそれらの一部分を指す。
【００１３】
一実施形態では、マイクロ流体デバイスは、基板を含み、少なくとも２つの流体流路が、基板上、またはその中に配置される。デバイスは、基板に連結される光透過性材料も含む。デバイスは、概して、デバイスの画定された領域内の基板および光透過性材料に接触する（例えば、間の空間を充填することによって）骨組をさらに含む。この骨組は、概して、少なくとも約１μｍの最小の直交高さ、長さ、および深さ寸法を有する。本明細書において使用されるように、「三次元空間において」という表現は、これらの寸法が、三次元ユークリッド幾何において存在するため、三次元である質を有することを指す。しかしながら、非ユークリッド空間および形状も、本発明に含められる。任意で、デバイスは、各流体流路に対する、流体管路への入口、および流体管路からの出口を有する。
【００１４】
基板は、概して、ソフトリソグラフィ過程によって形成される、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等の固体材料であり、流体流路は、基板におけるチャネルである。２つの流体流路が、同じ基板において存在する場合、これらの流体流路は、それらの長さの少なくとも一部に沿って実質的に平行である。各流体流路は、流体入口および流体出口を含有し得る。流体入口は、デバイスの外側から流体流路へ伝導される細胞培養培地等の流体のための穴、チャネルまたは他の手段である。流体出口も、デバイスから離れるように伝導される調整済みか、または不用な細胞培養培地等の流体のための穴、チャネルまたは他の手段である。当業者は、マイクロ加工またはマイクロ流体の分野において使用される他の材料は、本発明の基板を製造する際に有用であることを認識する。例えば、基板は、シリコン、ガラス、石英、またはプラスチック（例えば、基板としての機能に対する必要な構造的属性を有する任意の合成または半合成ポリマー）から形成されるか、または含有し得る。有用なプラスチックは、当業者に周知である。
【００１５】
流体流路は、所望の流れ抵抗を生成するように、任意の寸法（例えば、長さ、幅または深さ）において異なり得る。例えば、流路を通る流速は、入口および出口にわたる静水圧勾配の機能として調節されることができる。１つ以上の流体流路は、抵抗チャネルとして機能し得、流体流路が、天然の状態で連続的または不連続的（拍動）のいずれかの流体流動への抵抗を増加したことを意味する。抵抗チャネルは、例えば、流体抵抗性を増加させる蛇行性曲線または他の幾何学的形態を含有し得る。
【００１６】
ある実施形態では、本発明は、圧力調整器を含有するマイクロ流体デバイスを提供する。本明細書において使用されるように、圧力調整器は、流動流体の１つ以上の特徴（例えば、圧力または体積）の調節を可能にする任意の機械的、化学的、または他のシステムを含む。圧力調整器は、２つまたはそれ以上の流体流路の間の圧力差を生じる１つ以上の弁を含むことができる。
【００１７】
デバイス内に含有される骨組は、流体流路を分離し、細胞が、デバイスにおいて提供される生理学的条件によって、移動、増幅または分化することができる多機能支持を提供する。細菌を含む原核細胞は、真核細胞のように、含まれる。２つ以上の細胞型は、共に、または連続してのいずれかで、骨組に導入され得る。概して、骨組は、しばしば、ポリマー形で、固体または半固体生体または生体適合性材料（またはバイオマテリアル）を含有する。有利なポリマーは、コラーゲンであり、モノマーに富んだ溶液中に存在し得、骨組を形成するために原位置で重合され得る。コラーゲンまたは他のポリマー、および任意で他の構成要素を含有する骨組は、生物学的実体の拡散、および細菌および動物細胞の有向移動を可能にする。例えば、生物学的実体は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、または酵素等の細胞または細胞内構成要素である。成長因子または他の生物学的実体は、骨組において均一にか、または制御された勾配で分布され得るか、または骨組に拘束され得る。骨組は、流体流路内に含有される細胞と相互作用し得る薬物および他の小分子の拡散を可能にする。本明細書において記載されるデバイスは、薬物および他の化合物の細胞単層または骨組浸透性を測定することに加えて、試験化合物の拡散係数を計算するために有用である。
【００１８】
ある実施形態では、骨組は、種々の細胞との骨組材料の相互作用を評価するために使用されてもよい。様々な骨組材料が使用され得る。種々の骨組材料との様々な生物学的実体の結合親和性が試験され得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、骨組は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を含有する。ある実施形態では、骨組は、ジメタクリラート等の光硬化性ポリマーを含有するか、またはそれから形成される。Ｇｅｒｅｃｈｔ，ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８（３２）：４８２６−４８３５（２００７）を参照されたい。ある実施形態では、骨組は、ペプチドを含有するか、またはそれから形成される。ある実施形態では、骨組は、ＰＥＧ等の合成ポリマーを含有するか、またはそれから形成される。
【００２０】
そのため、マイクロ流体デバイスは、骨組の包含前の形で提供されることができる。例えば、流体流路は、骨組の構成要素が、配置、注入、充填、またはそうでなければ挿入される横断経路も提供する、リソグラフィによって基板において生成される。デバイスが、３つまたはそれ以上の流体流路、したがって、２つまたはおそらくそれ以上の介在骨組を含む場合、１つ、２つまたはそれ以上の横断経路が、任意でデバイスに提供される。横断経路は、流体入口、第１の流体流路から第２の流体流路へ延びる横断通路、および流体出口を含み得る。横断経路は、流路における流れを制御するように作製されることができる。例えば、横断経路は、統合弁またはポンプとして機能することができる。
【００２１】
基板の内面は、その上、またはその中に骨組を形成する前に修正され得る。例えば、ポリ−Ｄ−リシン（ＰＤＬ）の被覆は、骨組と基板との間の結合の強度を増加させる。基板の内面への他の修正は、基板の疎水性、親水性、骨組付着性、または細胞親和性を改変（すなわち、増加または低下のいずれか）する。ある実施形態では、基板の内面は、プラズマに暴露され、それにより、基板の内面の表面の親和性を増加させる。ある実施形態では、基板の内面は、ポリ−Ｄ−リシンに暴露される。
【００２２】
骨組が形成する、デバイス内の空間は、骨組の機械的安定性を改善する、リソグラフィ過程において形成される構造である、１つ以上の「マイクロピラー」も含有し得る。例えば、マイクロピラーは、骨組を形成するために使用される材料の表面張力を増加させ、そのため、流体流路への骨組材料の流れが減少する。パターンにおける複数のマイクロピラーの存在は、骨組が、「ゲルケージ」の形であることを視覚的に示唆する。図１を参照されたい。マイクロピラーの形状は、より良い骨組安定性を提供するように修正され得る。例えば、六角形は、より強い表面張力を伴う骨組材料を提供し得る。
【００２３】
本発明は、細胞挙動の分析に有用な方法も対象とする。実施形態では、方法は、マイクロ流体デバイスにおける細胞の有向移動の測定のために提供される。概して、細胞は、第１の流体流路に導入され、流路における表面のうちの少なくとも１つに付着し得る。細胞は、骨組にも付着し得る。同時か、または異なる時間のいずれかで、細胞は、第１の流体流路に導入され、生物学的実体は、第２の流体流路に導入される。この生物学的実体は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、および酵素等の細胞または細胞内構成要素、ならびに薬物および他の小分子であり得る。所与の時点で、例えば、骨組への、任意で第２の流体流路への細胞の移動の程度が測定される。ある実施形態では、内皮細胞または内皮細胞前駆体は、第１の流体流路に導入され、細胞移動を測定する代わりに、新規の血管の形成が測定される。本発明の方法は、変化した免疫応答に関与する疾病の診断および特徴付け、および潜在的治療化合物の特定を含む。例えば、好中球は、第１の流体流路に導入され、内皮細胞の単分子層は、好中球の導入と共にか、または連続して、第２の流体流路または骨組に導入される。好中球は、例えば、免疫疾病もしくは疾患を有するか、またはそれを発症するリスクがある哺乳類の被験体（すなわち、被験体）からか、または免疫疾病もしくは疾患を有さないか、またはそれを発症するリスクがない哺乳類の被験体（すなわち、対照被験体）から得られる。好中球移動動力学の測定は、被験体および対照被験体に対してデバイスにおいて測定され、潜在的治療化合物は、有効性に対して試験されることができる。別の実施形態では、細胞は、糖尿病および非糖尿病被験体から単離される。また、細胞は、所与の被験体の癌の転移潜在性が、本発明のデバイスを使用して判断されることができるような条件下で、転移または非転移のいずれかの癌を有する哺乳類の被験体から得られ得る。癌を有さない被験体から単離される細胞は、対照細胞として機能する。
【００２４】
ある実施形態では、内皮細胞は、第１の流体流路に導入され得る。腫瘍細胞は、その後、第１の流体流路、第２の流体流路、または骨組に導入され得る。腫瘍細胞および内皮細胞は、同じ被験体または異なる被験体から得られ得る。これらの実施形態は、腫瘍細胞が内皮を通過して、循環に入る（浸入）か、または循環から出る（浸出）、または両方の能力を低下させる、化合物または生体分子の能力を試験することを可能にする。
【００２５】
本発明のデバイスは、組織工学等の体外および体内システムにおいて有用な、複数の細胞型バイオマテリアルの生成にも有用である。本明細書において記載されるデバイスは、２つまたはそれ以上の種類の真核細胞を含有する生体または生体適合性材料を製造するために使用される。１つ以上の細胞型（例えば、２つの、３つの、４つ、またはそれ以上の細胞型）を含有するこれらのデバイスは、診断または治療目的で、生きている動物に移植、またはそうでなければ導入されることが可能である。さらに、本明細書において記載される体外系は、組織または臓器系の生理学的機能を複製し、そのため、例えば、試験化合物の薬物試験または毒性スクリーニングに有用である。
【００２６】
（例示的なデバイス）
ある実施形態では、本発明は、マイクロ流体デバイスに関し、
光透過性材料、
光透過性材料に連結される基板、および
三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組、
を備え、
基板は、支柱を備え、
骨組は、基板、支柱、および光透過性材料に接触し、
基板は、第１の流体流路および第２の流体流路を備え、
第１の流体流路は、第２の流体流路と交差せず、
骨組は、第１の流体流路と第２の流体流路との間に配置される。
【００２７】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第１の流体流路および第２の流体流路は、基板におけるチャネルである。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第１の流体流路および第２の流体流路は、実質的に平行である。
【００２９】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、プラスチックを備える。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、ＰＤＭＳを備える。
【００３０】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、一時的または恒久的に修正される。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、修正された基板は、ポリ−Ｄ−リシンへの基板の暴露、プラズマへの基板の暴露、または基板の表面パターン化の結果である。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、一時的に修正される。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、恒久的に修正される。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板の内面は、一時的または恒久的に修正される。
【００３１】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、固体または半固体の生体または生体適合性ポリマーを備える。
【００３２】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを備える。
【００３３】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、光硬化性ポリマーを備える。
【００３４】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、第１の生物学的実体を備える。
【００３５】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、基板に実質的に付着される。
【００３６】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、圧力調整器をさらに備える。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、圧力調整器は、流体が流体流路へ導入される時に、第１の流体流路と第２の流体流路との間の圧力差を生じる弁である。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、圧力調整器は、流体が流体流路へ導入される時に、第１の流体流路と第２の流体流路との間の流速の差を生じる弁である。
【００３７】
ある実施形態では、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第１の流体流路または第２の流体流路は、抵抗チャネルを備える。
【００３８】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第１の流体流路は、第２の流体流路とは異なる寸法を有する。
【００３９】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第１の流体流路に動作可能に接続される第１の流体入口をさらに備える。
【００４０】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第１の流体流路に動作可能に接続される第１の流体出口をさらに備える。
【００４１】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第２の流体流路に動作可能に接続される第２の流体入口をさらに備える。
【００４２】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第２の流体流路に動作可能に接続される第２の流体出口をさらに備える。
【００４３】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第１の流体流路に動作可能に接続される第１の貯留部をさらに備える。
【００４４】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第２の流体流路に動作可能に接続される第２の貯留部をさらに備える。
【００４５】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、固体または半固体生体適合性ポリマーを備え、固体または半固体生体適合性ポリマーは、第２の生物学的実体の通過を可能にする。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを備え、第２の生物学的実体は、真核細胞を供える。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、コラーゲンを備え、第２の生物学的実体は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、および酵素から成る群より選択される。
【００４６】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板における区画をさらに備え、それにより、第３の生物学的実体の配置のための面積を提供する。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板における区画をさらに備え、それにより、組織または生検標本のための面積を提供する。
【００４７】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、光透過性材料は、ガラスを備える。
【００４８】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、第３の流体流路、第３の流体入口、および第３の流体出口をさらに備え、第３の流体入口および第３の流体出口は、それぞれ、第３の流体流路に動作可能に接続される。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、第３の流体流路の実質的に全体を占有する。
【００４９】
ある実施形態では、本発明は、マイクロ流体デバイスに関し、
光透過性材料、
光透過性材料に連結される基板、および
三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組、
を備え、
基板は、支柱を備え、
骨組は、基板または光透過性材料もしくは両方に接触し、骨組は、支柱に接触し、基板は、第１の流体流路、第２の流体流路、および第３の流体流路を備え、
骨組は、第１の流体流路と第２の流体流路との間に配置される第１の固体または半固体生体適合性ポリマー、および第２の流体流路と第３の流体流路との間に配置される第２の固体または半固体生体適合性ポリマーを備える、
固体または半固体生体適合性ポリマーは、１つ以上の生物学的実体の通過を可能にする。
【００５０】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、骨組は、三次元空間において少なくとも２μｍ、少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも５μｍ、または少なくとも１０μｍの寸法を有する。
【００５１】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、複数の支柱を備える。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、一定の方法で配列される複数の支柱を備える。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、基板は、無作為の方法で配列される複数の支柱を備える。
【００５２】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、支柱は、六角形、円形、正方形、長方形、または不整形である。
【００５３】
ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、支柱の寸法はｍ約０．０１μｍ２から約１ｍｍ２である。ある実施形態では、本発明は、前述のデバイスのうちのいずれか１つに関し、支柱の寸法は、約０．０１μｍ２、約０．０５μｍ２、約０．１μｍ２、約０．５μｍ２、約１．０μｍ２、約５．０μｍ２、約１０．０μｍ２、約２５．０μｍ２、約５０．０μｍ２、約１００μｍ２、約２５０μｍ２、約５００μｍ２、約１０００μｍ２、約２５００μｍ２、約５，０００μｍ２、約１０，０００μｍ２、約２０，０００μｍ２、約２２，５００μｍ２、約２５，０００μｍ２、約５０，０００μｍ２、約６２，５００μｍ２、約７５，０００μｍ２、約０．１ｍｍ２、約０．５ｍｍ２から約１ｍｍ２である。
【００５４】
ある実施形態では、本発明は、ハイスループット分析のためのシステムに関し、複数の任意の前述のデバイスを備える。
【００５５】
ある実施形態では、本発明は、細胞の有向移動を測定する方法に関し、
ａ）
ｉ）第１の流体流路および第２の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、
ｉｉ）基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
ｂ）細胞を第１の流体流路に導入するステップ、
ｃ）生物学的実体を第２の流体流路に導入するステップ、および
ｄ）骨組への細胞の有向移動を測定するステップ、
を含む。
【００５６】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される。
【００５７】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞は、好中球であり、生物学的実体は、内皮細胞である。
【００５８】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞は、糖尿病を有する被験者から得られ、生物学的実体は、糖尿病を有さない被験者から得られる。
【００５９】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞は、糖尿病を有さない被験者から得られ、生物学的実体は、糖尿病を有する被験者から得られる。
【００６０】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞は、癌を有する被験者から得られ、生物学的実体は、癌を有さない被験者から得られる。
【００６１】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞は、癌を有さない被験者から得られ、生物学的実体は、癌を有する被験者から得られる。
【００６２】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞は、内皮細胞であり、生物学的実体は、第２の細胞であり、第２の細胞は、腫瘍細胞である。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞および第２の細胞は、同じ被験体から得られる。
【００６３】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、癌を有する被験者から得られる生物学的実体は、単一細胞、球状体、または腫瘍組織である。
【００６４】
ある実施形態では、本発明は、血管形成を測定する方法に関し、
ａ）
ｉ）第１の流体流路および第２の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、
ｉｉ）基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組であって、骨組は、第１の流体流路と第２の流体流路との間に配置される骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
ｂ）内皮細胞または内皮細胞前駆体を第１の流体流路に導入するステップ、
ｃ）生物学的実体を第２の流体流路に導入するステップ、および
ｄ）骨組における血管の形成を測定するステップ、
を含む。
【００６５】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される。
【００６６】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、デバイスは、
第３の流体流路、および
基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する第２の骨組であって、第２の骨組は、第１の流体流路と第２の流体流路との間に配置される第２の骨組、
をさらに備える。
【００６７】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第２の生物学的実体を第１の流体流路に導入するステップをさらに含む。
【００６８】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、内皮細胞または内皮細胞前駆体は、共培養における異種混合物として導入される。
【００６９】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、血管断片を第１の流体流路に導入するステップをさらに含む。
【００７０】
ある実施形態では、本発明は、浸透性を測定する方法に関し、
ａ）
ｉ）第１の流体流路および第２の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、および
ｉｉ）基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
ｂ）第１の物質を第１の流体流路に導入するステップ、および
ｃ）骨組への第１の物質の浸透性を測定するステップ、
を含む。
【００７１】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第１の物質は、流体または小分子である。
【００７２】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、骨組は、細胞単層を備える。
【００７３】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第１の物質は、細胞を備える。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、細胞は、内皮細胞である。
【００７４】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、骨組は、第２の細胞を備える。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第２の細胞は、腫瘍細胞である。
【００７５】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第１の物質は、細胞を備え、細胞は、内皮細胞であり、骨組は、第２の細胞を備え、第２の細胞は、腫瘍細胞であり、内皮細胞および腫瘍細胞は、同じ被験体から得られる。
【００７６】
ある実施形態では、本発明は、浸透性を測定する方法に関し、
ａ）
ｉ）第１の流体流路および第２の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、および
ｉｉ）基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
ｂ）第１の物質を第１の流体流路に導入するステップ、
ｃ）第２の物質を第１の流体流路に導入するステップ、および
ｃ）骨組への第２の物質の浸透性を測定するステップ、
を含む。
【００７７】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第１の物質は、第１の細胞である。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第１の細胞は、内皮細胞である。
【００７８】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第２の物質は、第２の細胞である。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第２の細胞は、腫瘍細胞である。
【００７９】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、第１の細胞および第２の細胞は、同じ被験体から得られる。
【００８０】
ある実施形態では、本発明は、細胞追跡剤を評価するための方法に関し、
ａ）
ｉ）第１の流体流路および第２の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、および
ｉｉ）基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも１μｍの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
ｂ）細胞追跡剤を第１の流体流路に導入するステップ、および
ｃ）骨組への細胞追跡剤の拡散を測定するステップ、
を含む。
【００８１】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、パラメータを監視するステップをさらに含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、少なくとも２つのパラメータを監視するステップをさらに含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、パラメータは、リアルタイムの、表面せん断応力、骨組を通る間質流、非反応性溶質における勾配、細胞培養骨組の特性、または細胞の特性である。
【００８２】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、デバイスは、前述のデバイスのうちのいずれか１つである。
【００８３】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、骨組は、三次元空間において少なくとも２μｍ、少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも５μｍ、または少なくとも１０μｍの寸法を有する。
【００８４】
ある実施形態では、本発明は、デバイスを製造する方法に関し、
ａ）液体骨組材料を、第１の流体流路、第２の流体流路、および支柱を備える基板に接触させるステップ、および
ｂ）光透過性材料を基板に動作可能に接続するステップ、
を含む。
【００８５】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、デバイスは、前述のデバイスのうちのいずれか１つである。
【００８６】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、液体骨組材料は、単量体コラーゲンを備える。
【００８７】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、基板を液体骨組材料に接触させる前に、基板を修正し、それにより、基板の疎水性、親水性、細胞親和性、または骨組付着性を改変するステップをさらに含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、基板を修正するステップは、基板をポリ−Ｄ−リシンに暴露するステップ、基板をプラズマに暴露するステップ、または基板をパターン化するステップを含む。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、基板は、基板を液体骨組材料に接触させる前に、一時的または恒久的に修正され、それにより、基板の疎水性、親水性、細胞親和性、または骨組付着性を一時的または恒久的に改変する。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、基板は、基板を液体骨組材料に接触させる前に、一時的に修正され、それにより、基板の疎水性、親水性、細胞親和性、または骨組付着性を一時的に改変する。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、基板は、基板を液体骨組材料に接触させる前に、恒久的に修正され、それにより、基板の疎水性、親水性、細胞親和性、または骨組付着性を恒久的に改変する。ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、基板の内面は、修正される。
【００８８】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、液体骨組材料を基板に接触させるステップは、液体骨組材料を、第１および第２の流体流路と実質的に隣接していない基板の画定された領域へ圧力下で注入するステップを含む。
【００８９】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、液体骨組材料を基板に接触させるステップは、液体骨組材料のマイクロ注入を含む。
【００９０】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、液体骨組材料を基板に接触させるステップは、第１の流体流路または第２の流体流路への液体骨組材料の導入を含む。
【００９１】
ある実施形態では、本発明は、前述の方法のうちのいずれか１つに関し、骨組は、三次元空間において少なくとも１μｍ、少なくとも２μｍ、少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも５μｍ、または少なくとも１０μｍの寸法を有する。
【実施例】
【００９２】
（例示）
概説された本発明は、本発明のある局面および実施形態の説明の目的のためのみに含まれ、いかなる方法でも本発明を限定するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され得る。全ての見出しは、読者の便利のためであり、特定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
【００９３】
（実施例１：マイクロ流体デバイス製造および表面修正）
マイクロ流体ネットワークの設計は、表１に提供されるマイクロ流体流路（または「チャネル」）、ゲル「ケージ」、およびマイクロピラーの寸法によりＡｕｔｏＣＡＤ（登録商標）ソフトウェア（Ａｕｔｏｄｅｓｋ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）において作製した。
【００９４】
【表１】
0005602718.tif 000002
当業者は、デバイスの各構成要素の寸法および形状が、所与の用途に対して特定されることができることを認識する。チャネル幅および高さは、単独で、数ミクロン（μｍ）から数ｍｍであり得、長方形、円形、または製造されることが可能な他の形状であり得る。ゲルケージの寸法は、支柱、ピラー、または他の構造を含めてか、またはそれらに加えて、数μｍ以下から数ｍｍ以上に特定されることができる。ピラーの大きさは、μｍ以下から数ｍｍ以上（１００μｍ、１５０μｍ、または２５０μｍ等であり、長方形、円形または他の形状として製造される）の範囲であり得る。ゲルケージの高さは、所与のチャネルと同等、それ以上、またはそれ未満であり得る。骨組も、１つ以上のマイクロ流体チャネルを含有し得る。
【００９５】
透明マスクは、約数百μｍの最小の幾何学的特徴大きさによりＣＡＤファイルから作製し、高解像度プリンタ（ＰａｇｅＷｏｒｋｓ，ＭＡ）によって印刷した。他の種類のマスクは、位相シフトマスク、および液浸フォトリソグラフィ液浸、ならびにＭｏＳｉおよびＴａ／ＳｉＯ２マスクである。この透明マスクを、ＳＵ−８フォトレジストのフォトリソグラフィにおいて使用して、シリコンウエハマスターを作製した。マイクロ流体デバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）を複製成形１８し、脱気エラストマーミックス（１０：１、ベース：硬化剤）をシリコンマスターに対して８０℃のオーブンにおいて２時間硬化することによって作製した。ＰＤＭＳは、生体適合性であり、優れた光透過性を有する。重合ＰＤＭＳ装置は、シリコンマスターから剥離し、個々の生物反応装置（直径３５ｍｍ、高さ０．８〜１ｃｍ）は、切り抜き、入口および出口は、鋭利な１６ゲージ平先針を使用して個々の流体流路まで下方に中心を抜き取った。細胞培養の前に、ＰＤＭＳ装置は、湿式周期において１２０℃で２０分、その後、１２０℃で３５分（滅菌２０分／乾燥１５分）の乾式周期においてクリーニングされ、滅菌した。次に、ＰＤＭＳ表面は、骨組形成を容易にするために、空気プラズマへの暴露によって親水性にさせた。滅菌済みデバイスは、プラズマクリーナー（Ｈａｒｒｉｃｋ，ＣＡ）チャンバ内のトレー上に配置した（パターン側を上）。ポンプダウン周期（約２分）を開始し、その後、ピンクプラズマによって２分間照射した。表面処理された装置は、滅菌容器に保存し、プラズマ処理後０．５〜２ｈ内で使用した。重合後、平坦ＰＤＭＳ表面は、疎水性であり、弱い湿潤性を提示し得、未処理ＰＤＭＳ装置への骨組注入は、しばしば、流体流路に染み出すゲルをもたらし、しばしば、ゲルケージを充填せず、マイクロピラーに隣接する小気泡をもたらした。ＰＤＭＳの疎水性は、調節可能であり、ＰＤＭＳ表面は、空気プラズマへの暴露によって一時的に親水性にさせることができる１９。プラズマ処理の後、疎水性回復時間は、調製および保存の方法による。例えば、熱劣化、より長い酸化時間、および窒素における保存は、疎水性の回復を遅延させる際に効果的である２０。ここで、ＰＤＭＳは、ガラスとの即時の結合に通常必要とされるより長い、２分間、空気プラズマで表面処理した。常量法の配管に接続される場合の密閉を維持するために、通常のマイクロ流体デバイスは、漏洩を防止するために、ガラスまたはＰＤＭＳの層と恒久的に結合または真空密閉２１される。しかしながら、骨組拡散および充填を含有するために使用されるプラズマ処理は、ガラスとの結合を促進するために十分であり、したがって、さらなる接着ステップは、必要としないことが判断された。
【００９６】
（実施例２：マイクロ流体デバイスにおける骨組の形成）
マイクロ注入台は、細胞培養骨組（サブμＬ体積）をデバイスに無菌状態で装填するために作製した。システム構成要素は、手動の極微操作デバイス（Ｈ−７ピペットホルダ付きＭＮ−１５１ジョイスティック極微操作デバイス、ＮＡＲＩＳＨＩＧＥ，ＮＹ）、マイクロリットルシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、６２ＲＮＲ、２．５μＬ  ＳＹＲ、２２ｓ／２’’／３、ＶＷＲ）、デジタル顕微鏡（Ｂｉｇ  Ｂｌｕｅ  ＱＸ５、ＣＯＭＰＵＶＩＳＯＲ．ＣＯＭ，ＴＸ）（全て層流フードに収容される）、および視線誘導のためのモニタを含んだ。ＭＮ−１５１ジョイスティックの特色は、Ｘ、Ｙ、およびＺ軸に沿った付加的な粗調整と共に、ＸＹ平面における微調整の制御を提供した。
【００９７】
（骨組マイクロ注入）
表面を上述のように親水性にした滅菌済みＰＤＭＳデバイスは、「ゲルケージ」がビデオモニタ上ではっきりする状態で顕微鏡台状に位置付ける（パターン表面を上）。極微操作デバイスに取り付けられたマイクロリットルシリンジ（プレポリマー溶液が予め組み込まれている）の先端は、「ゲルケージ」の数ミクロン上に位置付け、プレポリマー溶液の小液滴は、手動で作製し、液滴が最初にマイクロピラーに接触するまで下げる。液滴の大きさは、その直径がゲルケージの幅とほぼ同等から半分になるように制御する。小液滴は、ゲルケージの真上で作製し、下げ、分配し、この過程は、ゲルケージが満杯になるまで繰り返す。
【００９８】
（骨組装填およびデバイスアセンブリ）
ゲルプレポリマー溶液（これらの実験においてはコラーゲンＩ型、ラット尾）は、ゲルケージにマイクロ注入し、流体チャネルは、清潔なガラスカバースリップ（３５ｍｍ、ＶＷＲ）で密閉し、機械クランプで固定する。これは、一度に複数の装置に対して繰り返す。骨組注入の後、組み立てられたＰＤＭＳ装置は、ゲルが乾燥しないように二次的加湿容器に配置する。ゲルは、加湿培養器において３７℃で３０分重合する。
【００９９】
（骨組にわたる勾配の形成の証明）
コラーゲンを含有する骨組の重合の後、流体流路は、細胞培養培地で充填した（補充無し）。勾配研究は、１つの流路における培地を、２０μｇ  ｍＬ−１の初期濃度の蛍光デキストラン（４０ｋＤａ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の希釈溶液で置換し、静止条件下で行った。蛍光強度は、Ｎｉｋｏｎ  ＴＥ３００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ）で視覚化した。ゲル領域の一連の蛍光画像（４倍率）は、Ｏｐｅｎｌａｂ（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，ＭＡ）データ取得ソフトウェアを使用してＨａｍａｍａｔｓｕカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）で取得し、さらなる分析のために保存した。画像を処理し、各時点でのゲルにわたる蛍光強度の変化を得た。微速度撮影の蛍光画像の画像処理は、特注のＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，ＭＡ）コードを使用して行った。つまり、ゲル領域の各蛍光画像は、ＰＤＭＳマイクロピラーを除いた長方形の区分に分割した。ピクセル強度および「ソース」チャネルからの対応する場所は、これらの長方形の区分のために記録した。平均蛍光強度は、ゲルの長さにわたる全てのピクセルのためのデキストランチャネルから同じ距離のピクセルに対して計算した。各時点で、ゲルにわたる正規化平均強度プロファイルのプロットを生成した。実験的拡散曲線は、ＦＥＭＬＡＢ（Ｃｏｍｓｏｌ，ＵＳＡ）において生成した有限要素モデルから得た理論曲線と一致した。
【０１００】
ゲルケージにおける濃度プロファイルの通常の時間経過、その後の１つのチャネルへの蛍光デキストランの導入を図１１Ａに示す。ゲルにおける正規化蛍光強度（Ｃ−Ｃｍｉｎ）／（Ｃｍａｘ−Ｃｍｉｎ）は、デキストラン（４０ｋＤａ）「ソース」流体管路からの正規化距離（ｘ／ｘｍａｘ）の機能として表示される。定常状態濃度プロファイルは、４０分以内で到達した。本研究では、４０ｋＤａデキストランは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＩＧＦ２２を含む対象のいくつかの成長因子と大きさにおいて同様であるため、選択した。
【０１０１】
定常状態実験データは、１×１０−６ｃｍ２ｓ−１の拡散係数を仮定する有限要素モデルからの結果と比較した。この値は、参考文献２３，２４において報告される値の範囲とよく一致する。三次元マトリクスにわたる可溶性因子の勾配を生成する能力は、発芽血管形成、腫瘍転移、および免疫応答を含む方向性のある移動中の生理学的に関連のある機構をシミュレートする潜在性を提供する。遊走細胞の動的運動性は、制御されたマイクロ環境において綿密に調べ、リアルタイムで監視することができる。さらに、そのような要因の空間的および時間的提示は、最新のシステムにおいて生理学的に関連するが可能ではない制御の別のレベルを提供するが、１つの団体は、マイクロ流体ラダーチャンバにおいて濃度勾配を生成する能力を証明している２５。
【０１０２】
（実施例３：二重流体流路デバイスにおける毛細血管形態形成の研究）
（デバイスおよび骨組形成の説明）
二重流体流路デバイスは、本明細書において記載される標準的ソフトリソグラフィおよび複製成形技術を使用してＰＤＭＳから製造した。デバイスは、２つの平行流路、および細胞培養のための注入可能な生物学的に誘導されたか、または合成の骨組（ここでは、軟性ヒドロゲル）を含有するための中央「ゲルケージ」横断経路を含有する。本明細書において記載されるデバイスを使用して、（１）表面せん断応力、（２）マトリクスを通る間質流、（３）化学誘引物質またはケモレペラントにおける勾配、（４）骨組の特性、を制御し、（５）リアルタイムで細胞を同時に監視し、および（６）共培養され細胞の効果を監視することができる。
【０１０３】
マイクロピラーの千鳥状アレイは、骨組のための機械的安定化を提供するためにゲルケージへ組み込まれ、骨組が水の数センチメートル（ｃｍ）の超過における圧力差に耐えることを可能にする。骨組が定位置にある状態で、２つの流路は、液体が２つの流路の間で動くことができないという点において、互いから原則的に単離されるが、１つの流路から他の流路への多孔性骨組を通る可溶性因子の拡散または対流は、抑制されない。全ての細胞培養は、５％ＣＯ２および３７℃で加湿培養器において維持した。ヒト成人皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−ａｄ、ＬＯＮＺＡ，ＵＳＡ）は、５％ウシ胎仔血清を伴うＥＧＭ−２ＭＶ培地システムにおいて繁殖した。細胞は、コラーゲン被覆フラスコ上で増加させ、６〜８継代で使用した。細胞は、２ｍｇ／ｍＬ−１の最終ゲル濃度で、氷冷液体Ｉ型ラット尾コラーゲンにおいて１×１０６細胞ｍＬ−１でよく懸濁した。液体コラーゲンは、コラーゲン原液を１０Ｘ  ＰＢＳ、１Ｍ  ＮａＯＨ、および組織培養級水の混合物に添加することによって調製し、２．５ｍｇ／ｍＬ−１溶液を得た。その後、高密度細胞懸濁液の所定の体積は、コラーゲン溶液と混合し、必要な播種密度を得た。コラーゲン／細胞混合物は、マイクロリットルシリンジに装填し、ゲルは、本明細書において記載されるように成型した。マイクロ注入プロトコルは、指定された空間に直接、細胞を伴うか、または伴わずに、骨組材料の極めて小さい体積を装填する能力を提供した。あるいは、骨組の還流装填が提供される。ゲル化の後、流体流路は、細胞培養培地で充填し、２４時間培養した。生化学的要因の効果を証明するために、細胞は、完全培地（対照）または血管新生促進要因（全て５０ｎｇ  ｍＬ−１のｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＰＭＡ）で強化された培地により静止条件下で培養した。細胞は、２４時間の時点で補給された、完全培地、またはｂＦＧＦ／ＶＥＧＦ／ＰＭＡカクテルを補充された培地において数日間培養物内で維持した。サンプルは、固定し、蛍光マーカで標識し、撮像した。
【０１０４】
（３Ｄカプセル化細胞に対する表面せん断応力）
生物物理学的刺激の効果を証明するために、細胞は、小レベルの表面せん断応力に供した。骨組の表面上の内皮細胞を伴うデバイスを形成し、貯留部カラムにおける培養培地の高さの差を変化させることによって、圧力差（５０Ｐａ）を骨組にわたってかけた。
【０１０５】
（内皮細胞単分子層形成）
２つの異なる細胞播種プロトコルを使用して、内皮細胞が最初に融合性単分子層、すなわち、２Ｄおよび３Ｄ基板単分子層播種を形成する基板を制御した。コラーゲンゲル骨組は、前述されるように形成した。ゲル化の後、流体流路は、２ｍｇ／ｍＬ−１フィブロネクチン被覆溶液で充填し、一晩培養した。細胞播種の前に、被覆溶液は、完全培地で置換し、さらに２〜４時間平衡化した。２−３×１０６細胞ｍＬ−１の細胞懸濁液は、１つの流体流路に流し、細胞は、引力によって懸濁液懸濁から沈殿するため、剛性ガラスまたは適合骨組表面に付着させた。内皮細胞は、さらなる処理の前に、剛性（２Ｄ単分子層播種）または適合（３Ｄ単分子層播種）表面上で２４〜４８時間培養した。血管新生促進要因は、勾配としてか、または均一の濃度でのいずれかで提示された。この検定のために、ＶＥＧＦ（１０〜５０ｎｇ  ｍＬ−１）およびＳｌＰ（２５０ｎＭ）を使用して、形態形成を促進した。
【０１０６】
毛細血管形態形成の特徴付けおよび管様構造。新規の血管または毛細血管が体内で形成される一次機構、血管形成２６は、マトリクス分解、細胞移動、増殖、および内腔形成を含む、一連の明確なステップを含む。これは、代謝的応力２７，２８、機械的応力２９−３１、可溶性因子３２、およびＥＣＭマトリクス構成要素３３，３４によって影響を受ける、しっかりと調節された過程である。位相差、落射蛍光、および共焦点顕微鏡検査を使用して、毛細血管形態形成、および内皮細胞構造の三次元形態を特徴付けた。蛍光および位相差画像は、ＨａｍａｍａｔｓｕカメラおよびＯｐｅｎｌａｂ画像取得ソフトウェアを装備したＮｉｋｏｎ  ＴＥ３００顕微鏡で取得した。生きているサンプの微速度撮影の画像は、位相差顕微鏡検査により、１２〜２４時間おきに撮った。サンプルは、４．０％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、アクチン細胞骨格および細胞核のための蛍光マーカで標識した。共焦点画像は、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｕｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎｓＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）取得ソフトウェアを備えた回転盤共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ）を使用して収集した。一連の１００の光学的連続切片（厚さ１μｍ）を得た。整列された画像は、積み重ね、Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ，ＭＮ）を使用して３Ｄ可視化のためにレンダリングした。ＨＭＶＥＣ−ａｄは、ＥＧＭ−２ＭＶ完全培地におけるコラーゲン被覆フラスコ上でのサブ合流まで培養し、収穫し、その後、マイクロ流体デバイスにおいて培養した。ＨＭＶＥＣ−ａｄは、数日間、生存能力を有するままであった。細胞播種後の数時間以内に、内皮細胞は、コラーゲンゲル上に単分子層を形成する。
【０１０７】
微速度撮影の動画は、マイクロ流体デバイスの特徴付ける能力を証明し、芽形成中の細胞機構を研究するために作製した。伝統的な発芽モデルでは、細胞は、単分子層を通して見られるため、この能力は制限される。マイクロ流体本発明のデバイスを使用して、方向性のある発芽および移動が、顕微鏡の視面において生じる。微速度撮影の画像化は、下層の３Ｄコラーゲンマトリクスに侵入するにつれて「リード細胞」を示す。単一の芽形成の場合、リード細胞は、糸状仮足の突起を下層のマトリクスに伸展させるが、単分子層上の隣接内皮細胞は、非侵襲性のままである。細胞侵入は、単分子層との接触を維持し、高度に偏向したまま、動的突起および糸状仮足の収縮の期間に続く。初期の根様構造は、より動的な小さい伸展による、数分間持続する移動の方向に形成される。その後の形態学的変化は、侵入深さ、糸状仮足の直径、および単分子層からの細胞の転移（核の動作により明白）の増加を含み、円錐構造（内腔形成の開始）が続く。侵入してくる細胞は、その後、開いた内腔構造を伴う芽を形成する。このシステムにより、体内での発芽血管形成中に生じる全ての逐次的細胞機構が観察され、証明された。数日間培養状態に維持された内皮細胞は、多細胞毛細血管様構造を形成する。終点Ｆ−アクチンおよびＤＡＰＩ標識化は、これらの構造の組織および複雑性を示す。しかしながら、静止条件下で維持される毛細血管は、単分子層へのそれらの接続を退行させ、損失する。毛細管形成の特質のうちの１つは、内腔構造の発達である。開いた内腔の存在を証明するために、蛍光微小球を、単分子層の頂端表面上のチャネルに添加した。
【０１０８】
コラーゲンゲルに集中した内皮細胞の培養は、常量システム３５において過去に研究されているが、微量デバイスでは未だになされていない。三次元の骨組において培養された単離細胞は、多細胞コードおよび内皮細胞環を形成した。生化学的刺激の効果を証明するために、三次元にカプセル化された内皮細胞は、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、およびＰＭＡを補充された培地において培養した。予想通りに、対照サンプルと比較して、形態の動的差があった。対照サンプルでは、細胞は、移動し、組織して、単離多細胞環様構造を形成する。血管新生促進要因によって刺激される細胞は、再構築して、複雑な相互接続した多細胞毛細血管様構造を形成する。間質流の存在において、内皮細胞は、ゲル内の多細胞構造およびゲル／液体界面での単分子層を形成する。
【０１０９】
マイクロ流体デバイスにおいて培養された微小血管内皮細胞は、広範囲にわたる形態形成を経験した。フィブロネクチン被覆チャネル上の内皮細胞は、それらの特有の玉石状表現型を保持するが、形態の著しい差は、ゲル表面で明白であった。シートまたは管形成の前に、細胞は、空胞および水疱の顕著な増加を伴うゲル領域へ隣接構造として移動した。これらの構造は、極めて動的であったが、最終的に、より安定したシートおよび管に発展した。内皮細胞ネットワークの共焦点画像化およびその後の３Ｄ再構成から得られた固定サンプルの連続切片は、血管の長さ全体に伸展する円形の扁平な内腔様構造の存在を確認する。連続的な内腔の存在は、小さい圧力降下の下で血管を通してビーズを流すことによってさらに証明される。いくつかは、ゲルケージにわたって最後まで流れることが観察することができ、他は血管構造におけるネックダウン領域で収集される。
【０１１０】
（微小血管内皮細胞発芽ビデオ）
リアルタイムで細胞を監視する能力を証明するために、発芽血管形成中に内皮細胞の微速度撮影のビデオ画像を記録した。内皮単分子層は、本明細書において記載されるコラーゲンゲル骨組上に形成した。マイクロ流体デバイスは、３７℃および５％ＣＯ２で特注の環境制御チャンバにおいて保ち、細胞は、Ｚｅｉｓｓ倒立顕微鏡で可視化した。実験の経過中の蒸発を最小限にするために、培地貯留部（高さの差を伴わない）を、各入口および出口ポートを直接接続した。その後、デバイスは、加湿局所環境、および可視化のための底部にある切り抜きガラス窓を伴う二次的容器に配置した。明視野画像は、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ画像取得ソフトウェアにより、２分間隔でＡｘｉｏＣａｍ  ＭＲｍ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）（単一の光軸面で）で撮った。
【０１１１】
（細胞骨格および核染色）
Ｆ−アクチン分布、および「毛細血管様」ネットワークまたは管構造に関与する細胞の数を、デバイスにおける２〜７日の培養後に評価した。Ｆ−アクチンおよび核染色を、４．０％ＰＦＡ（３０分）での固定の後に行った。固定サンプルは、ＩＸリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回濯ぎ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（１〜２分）で処理し、ＩＸ  ＰＢＳで濯ぎ、その後、ＤＡＰＩおよびローダミン−ファロイジンの混合物の注入（３０分）、およびＩＸ  ＰＢＳでの最終洗浄ステップを行った。
【０１１２】
（実施例４：多重流体流路デバイスにおける細胞移動の研究）
（ＰＤＭＳマイクロ流体検定調製）
マイクロ流体検定は、ＳＵ−８パターン化ウエハによる一般的なソフトリソグラフィ過程によってＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン、Ｓｉｌｇａｒｄ１８４、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＭＩ）で作製された。４インチのシリコンウエハは、２００℃のホットプレートで５分間脱水し、その後、ＳＵ−８  ２０５０フォトレジスト（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ，ＭＡ）によって被覆した。被覆されたウエハは、ホットプレート上でソフトベークし、ＵＶアライナ（ＥＶＧｒｏｕｐ，ＡＺ）によって暴露させ、再度ベークした。パターンは、ＰＭアセテートによって発展させ、イソプロピルアルコールで濯いだ。その後、ウエハは、トリデカフルオロ−１，１，２，２，−テトラヒドロオクチル−１−トリクロロシランで被覆して、ウエハから容易に取り外せる硬化ＰＤＭＳを作製した。ＰＤＭＳ硬化キットは、混合し、ウエハ上に注ぎ、その後、それを、８０℃で２時間オーブン内において硬化させた。硬化ＰＤＭＳは、ウエハから取り外し、整え、マイクロ流体チャネルの入口および出口を画定するために穴を開けた。製造されたＰＤＭＳデバイスおよびガラスカバースリップは、加圧滅菌し、８０℃で一晩、オーブン内で乾燥させた。その後、大気環境においてプラズマクリーナー（Ｈａｒｒｉｃｋ，ＣＡ）によって４０秒間、プラズマ処理し、結合させて、閉じたマイクロ流体チャネルを形成した。結合したデバイスは、結合強度を強化するために、８０℃で１０分間、オーブン内に保ち、その後、被覆溶液をチャネルに充填して、チャネルを細胞播種に好適にした。その後、デバイスを吸引し、滅菌水で洗浄した。その後、被覆されたデバイスは、８０℃で２４時間、オーブン内で乾燥させて、チャネル表面を疎水性にした。その後、骨組材料をゲル領域に充填して、ゲル骨組を形成した。実験では、Ｉ型コラーゲン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＡ）は、ピペットによって充填し、３０分間、培養器内に保った。ゲル重合の後、細胞培養培地は、マイクロ流体チャネルに充填し、デバイスは、細胞播種のために培養器内に保った。
【０１１３】
（培地交換、デキストラン拡散実験、および流れの適用）
充填された培地は、培地の蒸発を回避するために入口および出口上の液滴として保つべきである。既存の液滴を吸引し、培地の新規の液滴を片側に添加することは、細胞に対する最小のせん断応力で、チャネルにおける古い培地を置換する毛細管力のために微小の流れを生成することができる。流体せん断応力または圧力勾配等の機械的血管新生因子を適用するために、管およびポンプから成る流体回路は、精密に制御された流れを適用するために、デバイスの入口および出口に接続することができる。条件チャネルから細胞チャネルへの生化学的要因の拡散を可視化するために、４０ｋＤａの分子量を伴うデキストランは、０．５μｇ／ｍＬの最終濃度まで内皮成長培地と混合し、条件チャネルに添加した。拡散プロファイルは、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＮＹ）によって取り、Ｍａｔｌａｂで分析し、画像から強度グラフを得た。コラーゲンゲル骨組への蛍光デキストランの微速度撮影の拡散を測定した。安定した線状勾配を得て、数時間維持した。画像は、デキストラン混合培地を条件チャネルに適用した１０時間後に得た。デキストランの分子量は、４０ｋＤａであり、ＶＥＧＦと類似した分子量である。使用したコラーゲン骨組は、ｐＨ７．４で重合された２．０ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。コラーゲンゲル骨組へのデキストランの一時的拡散曲線は、デキストランが、３０分で、１つの流体流路から骨組を通って別の流体流路へ移動することを示す。
【０１１４】
（内皮細胞培養）
細胞懸濁培地は、２×１０６細胞／ｍＬで調製し、細胞培養チャネルに充填した。充填の後、デバイスは、培地が置換される前に細胞が沈殿し、基板上に付着するように、３０分間培養器内に保った。細胞付着時間は、細胞型により、３０分から数時間の範囲である。ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）は、市販され（Ｌｏｎｚａ，ＮＪ）、コラーゲンＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＭＡ）で事前に被覆された通常の培養フラスコ上の内皮成長培地（例えば、ＥＧＭ−２ＭＶ；Ｌｏｎｚａ，ＮＪ）により９継代以下で増加させた。組み換えヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）は、２０ｎｇ／ｍＬの作用濃度の細胞培養培地と混合し、その後、条件チャネルに充填して、勾配を生成した。
【０１１５】
（細胞移動の測定および定量化）
デバイスは、３７℃で５％ＣＯ２を含有する培養器内に保ち、細胞移動を、位相差顕微鏡検査（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＮＹ）によって毎日監視した。移動細胞外観の長さおよび面積は、ＩｍａｇｅＪによって測定した。免疫蛍光染色を行い、最終細胞移動結果を視覚化した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でそれぞれ染色した。
【０１１６】
（共培養実験）
１）ＭＴＬｎ３／Ｕ８７ＭＧおよびＨＭＶＥＣ共培養；ラット乳腺腺癌細胞株（ＭＴＬｎ３）は、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１ｍＭのＮａ（ＨＣＯ３）２、４ｍＭのＬ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたα−最小必須培地（α−ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）において成長させた。ヒト膠芽腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ）は、１０％ＦＢＳ、１ｍＭのＮａ（ＨＣＯ３）２、４ｍＭのＬ−グルタミン、およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させた。Ｕ８７ＭＧ細胞懸濁液は、１×１０６細胞／ｍＬの濃度で調製し、条件チャネルに充填した。高密度用ＭＴＬｎ３細胞懸濁液は、１×１０６細胞／ｍＬの濃度であり、低密度用は、０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度であった。ＨＭＶＥＣ懸濁液は、上述のように２×１０６細胞／ｍＬの濃度で調製し、ＭＴＬｎ３またはＵ８７ＭＧ細胞播種１日後に細胞培養チャネルに充填した。細胞培養チャネルは、内皮成長培地で充填し、対照／条件チャネルは、上述のＭＴＬｎ３またはＵ８７ＭＧ成長培地で充填した。培地は、毎日交換した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジンおよびＤＡＰＩでそれぞれ染色し、ＧＦＰ発現ＭＴＬｎ３およびＵ８７ＭＧ細胞は、ＨＭＶＥＣと区別するために使用した。平滑筋細胞（ＳＭＣ）は、上述のＨＭＶＥＣ培地において成長させ、懸濁液は、０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で調製した。懸濁液は、細胞チャネルへのＨＭＶＥＣ播種１日前に条件チャネルに充填した。培地は、毎日交換した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジンおよびＤＡＰＩで染色した。上述の同じ細胞懸濁液を調製し、Ｕ８７ＭＧ細胞の走化性評価のために細胞チャネルに充填した。対照チャネルは、細胞チャネルと同じ培地で充填し、条件チャネルは、２０ｎｇ／ｍＬまたは２００ｎｇ／ｍＬのｈＥＧＦを補充された培地で充填した。ｈＥＧＦ勾配は、細胞播種の１日後に適用し、チャネルにおける全ての培地は、毎日交換した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジンおよびＤＡＰＩでそれぞれ染色した。実験において使用した全てのコラーゲンゲル骨組は、ｐＨ７．４または１１．０、２．０ｍｇ／ｍＬまたは２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で重合した。
【０１１７】
細胞移動を研究するためのマイクロ流体生物反応器は、以下の利点を有するように設計し製造した。１）容易な定量化およびリアルタイムでの目視検査、２）細胞型および培養条件の多様性、および３）生化学的および生体力学的刺激に対する精密制御。細胞は、ＥＣＭ様材料で作製される骨組と直接接触させ、１つのマイクロ流体チャネル（細胞チャネル）において播種し、培養する。細胞チャネルにおける細胞は、生化学的および機械的要因の影響下で骨組を通って反対のチャネルへ向かって移動する。流体せん断応力および圧力勾配によって生じる間質流等の機械的要因を適用することができるが、生化学的合図は、細胞応答を研究するために、空間的に均一か、または制御された勾配においてかのいずれかで導入することができる。ゲル骨組は、移動を固定化リガンドの勾配に向けるように機能的にするか、または機能性ＥＣＭでもあり得る。最後に、第２の細胞型は、ゲル領域内で懸濁するか、または反対のチャネルにおいて培養し、共培養依存性細胞移動および相互作用を高めることができる。
【０１１８】
「細胞チャネル」は、細胞が、機械的および生化学的要因（例えば、流体せん断応力、間質流、化学誘引物質または成長因子（ＶＥＧＦ、Ｓ１Ｐ）の骨組剛性および固定勾配、）の精密に制御された条件下でいずれの側にも移動することができるように、ゲル骨組を両側にして中央に位置する。３つのチャネル設計は、対照および条件実験が、同じサンプル上で同時に行われることを可能にする独特な特色を有する。外部チャネルのうちの１つ（「条件チャネル」）は、検査薬を含有し、他方（「対照チャネル」）は、対照培地を含有する。条件チャネルまたは対照チャネルに向かう細胞移動は、直接比較することができ、細胞活性、細胞播種密度、培地組成、および他の環境条件のわずかな差によるチップ間誤差を最小限にする。
【０１１９】
生化学的拡散および勾配生成の特徴付けは、蛍光標識デキストランを使用して評価した。４０ｋＤａ分子量のデキストランを使用して、成長因子拡散をシミュレートした。デキストランは、条件チャネルに提供し、三次元の骨組領域内の得られた蛍光強度は、デキストランが細胞チャネルに拡散されるにつれて監視した。中央細胞チャネルへのデキストラン初期拡散は、３０分以内に生じた。均衡は、数時間後に確立され、線状濃度プロファイルは、１０時間維持された。
【０１２０】
（内皮細胞内での定量化走化性実験）
毛細血管形態形成の検定において、本明細書において記載されるマイクロ流体デバイスの機能性を証明するために、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）を細胞チャネルに播種し、融合性単分子層が、細胞播種後１〜２日で形成された。周知の内皮細胞移動２３，２４の刺激剤である血管内皮成長因子−Ａ（ＶＥＧＦ）を条件チャネルに適用し、細胞チャネルと条件チャネルとの間のゲル骨組におけるＶＥＧＦ勾配を生成した。対照チャネルは、対照としてＶＥＧＦを伴わない正常細胞培養培地で充填した。培地液滴（４０μＬ）は、チャネルに沿った、その間の気圧差を制御するために、チャネル入口および出口上に配置し（すなわち、培地交換および細胞播種中の流れを生成するため、および実験の間にわたって流動条件を維持しないため）、培地を補給するために十分強く、同時に、骨組または細胞へのいかなる損傷を回避するために十分弱い、安定した流れを生成するための、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２５によって上記に示される技術である。異なる剛性（ｐＨ７．４およびｐＨ１１）のコラーゲン骨組への移動細胞の長さおよび面積変化を数日にわたって観察し、定量化した。条件側では、細胞は、急速に骨組に移動したが、有意に少ない移動が、対照側で観察された。
【０１２１】
図２０Ａ〜Ｇに示されるように、内皮細胞をコラーゲン骨組に移動するように刺激した。図２０Ａは、内皮細胞播種１日後、融合性単分子層が、細胞チャネルにおいて形成され、その後、成長因子（２０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ）を条件チャネルに適用したことを示す。図２０Ｂは、ｐＨ７．４および（ｃ）ｐＨ１１．０で重合されたコラーゲンゲル骨組における微小血管細胞の移動結果を示す。細胞は、５日間のＶＥＧＦ勾配適用を含む６日間の培養後に固定し、ローダミン−ファロイジンおよびＤＡＰＩによって染色した。白い点線は、ゲル骨組の外観を示し、骨組における小さい長方形は、１５０μｍ×１５０μｍのＰＤＭＳ支柱を示す。「０．２％」は、２．０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン濃度を示す。両方の場合において、細胞は、ＶＥＧＦ勾配に向かって条件側のゲルに優先的に移動したことに留意されたい。図２０Ｄは、２．０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ｐＨ７．４で重合されたコラーゲンゲル骨組における移動細胞の正規化相対長さのグラフである。「ＶＥＧＦ無し」は、ＶＥＧＦ勾配を伴わない負の対照としての機能を果たす。ＶＥＧＦは、様々な期間で毎日適用した。「１日目のＶＥＧＦ」は、ＶＥＧＦを、最初に、細胞播種１日後に適用したことを意味する。２または３日目のＶＥＧＦは、ＶＥＧＦを、最初に、細胞播種２または３日後に適用したことを意味する。相対長さは、対照側からの差として計算する。図２０Ｅは、２．０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ｐＨ７．４で重合されたコラーゲンゲル骨組における移動細胞の正規化相対面積のグラフである。図２０ＦおよびＧは、２．０ｍｇ／ｍＬの濃度の、ｐＨ１１．０で重合されたコラーゲンゲル骨組における移動細胞の正規化相対長さおよび面積のグラフである。全てのグラフは、１つの条件下でｎ＝８（合計８つの骨組）を伴う４つのデバイスにおける値の平均によって作製した。
【０１２２】
この検定の感度を評価するために、ＶＥＧＦを細胞播種１、２または３日後に条件チャネルに適用した。結果は、正規化値および相対正規化値の２つの方法で提示する。正規化値に対して、測定データは、最初の時点でのそれら自体のベースラインデータに正規化した（式１）。相対正規化値は、条件側と対照側との正規化データの間の差として評価した（式２）。
【０１２３】
【数１】
0005602718.tif 000003
【０１２４】
【数２】
0005602718.tif 000004
式中、Ｆ０は、最初の時点での値であり、ＦＢは、基本値であり、Ｆｎは、時点ｎでの値であり、［Ｆｎ］は、正規化値である。Ｆは、細胞の外殻の長さＬまたは投影細胞面積Ｓのいずれかである。正規化値のみでは、静的有意差は見られなかった。しかしながら、相対正規化値は、ＶＥＧＦ適用の異なる期間での細胞移動の長さおよび面積変化を比較すると、静的有意差を生じた。長さおよび面積変化の相対正規化値は、ｐＨ７．４で重合されたコラーゲンゲルでは、細胞播種後１日目および２日目に適用されたＶＥＧＦは、細胞移動を誘発したが、３日後に添加されたＶＥＧＦは、誘発しなかったことを暗示する。ｐＨ１１．０で重合されたコラーゲン骨組では（堅いゲル）、長さ変化の相対正規化値は、様々な時点で細胞移動の有意差を示した。しかしながら、面積変化の相対正規化値は、小さすぎてｐＨ１１．０で重合されたコラーゲン骨組において検出されなかった。相対正規化値は、正規化値のみを研究する場合では明らかではなかった見識を提供する。高感度は、同じデバイス上での対照実験を比較することによって得ることができ、チップ間変動性を排除した。
【０１２５】
（コラーゲン骨組の機械的特性による誘発性血管形成）
ここで証明される、観察された内皮細胞移動パターンは、コラーゲンゲル剛性による。ゲル剛性は、より高いｐＨ値での重合の前にコラーゲン溶液のｐＨを調整することによって制御されることができ、より堅いゲルを生じる５。ｐＨ７．４およびｐＨ１１ゲルの初期のゲル化条件を比較することは、より堅いコラーゲンゲル（ｐＨ１１で重合された）は、内皮細胞集団移動を制限するが、２０〜３０μｍの範囲にある直径を伴う管様構造の生成を促進することを明らかにした。形成された構造は、他の体内検定または３Ｄマクロ検定９，１８において見られる管様毛細血管に類似し、内腔の存在は、その後、２μｍのマイクロビーズを培養培地に導入し、蛍光顕微鏡検査を使用してマイクロビーズの動きを追跡することによって確認した。この確認のために、低間質流は、液滴の大きさ制御２５により細胞培養チャネルと条件チャネルとの間の気圧差を維持することによって、細胞培養チャネルから条件チャネルへ適用した。マイクロビーズの微速度撮影の粒子追跡を行い、ビーズは、経時的に毛細血管構造の端部で蓄積されている管様構造内のみで流れた。
【０１２６】
移動内皮細胞の構造に対するゲル剛性の役割は、移動細胞の外観の差によっても示されることができる。より柔軟な骨組では、外観は、広く、骨組の両端に到達するが、より堅い骨組における外観は、非常に細い管様構造を示した。この観察は、異なる機械的特性を伴う骨組における細胞移動の異なるモード、および骨組の異なる機械的特性を伴う移動細胞の構造および管様構造を制御する能力を暗示する。骨組の機械的特性は、核の位置に影響を与えることも留意する価値がある。より柔軟な骨組では、移動細胞の核は、細胞の中央付近に位置した。
【０１２７】
移動細胞の異なるモードまたは構造を定量的に記載する試みにおいて、正規化面積は、正規化長さに対して表示される。式３に示されるように、２つの新規のパラメータ、ａ（移動細胞外観の想定された長さ）、およびＫ（移動細胞外観の幅の想定された合計）が規定される。想定の下、管様構造は、３つの限界、Ｋ＝５０、Ｋ＝１５０、［Ｓｎ］＝８による実験結果によって特徴付けられる。
【０１２８】
【数３】
0005602718.tif 000005
（新規のマイクロ流体プラットホームの様々な用途）
この新規の設計の主要な利点は、３Ｄマトリクスを通し、および内皮層にわたる細胞移動を研究するその能力である。癌細胞血管外漏出は、内皮細胞との相互作用に依存することが過去に示されている２６，２７。癌間質細胞が、血管形成のための内皮細胞に信号を送ることは十分に確立している。癌療法において、血管形成を妨げることは、化学療法および他の治療と共に重大である２８。これらの効果を調査するために、癌細胞および内皮細胞の相互作用を、マイクロ流体デバイスにおいて２つの細胞型を共培養することによって研究した。ラット乳腺腺癌細胞株（ＭＴＬｎ３）およびヒト天然癌細胞（Ｕ８７ＭＧ）を条件チャネルにおいて培養し、ＨＭＶＥＣを細胞チャネルにおいて培養した。予備の観察では、高密度ＭＴＬｎ３は、ＨＭＶＥＣをコラーゲン骨組に誘導したが、移動率は、ＶＥＧＦ勾配（２０ｎｇ／ｍＬ）誘発ＨＭＶＥＣ移動と比較して有意に遅く、ＭＴＬｎ３細胞によって生成された走化性要因は、ＶＥＧＦ勾配より刺激的ではないことが示唆された。移動の程度は、条件チャネルにおけるＭＴＬｎ３細胞の数に正に相関した。低密度ＭＴＬｎ３細胞は、ＨＭＶＥＣの有意な移動を誘発しなかった。Ｕ８７ＭＧ細胞は、条件チャネルにおける高細胞密度およびコラーゲン骨組に移動する能力にもかかわらず、ＨＭＶＥＣを引き付けないように思われた。ＭＴＬｎ３細胞と比較して、Ｕ８７ＭＧ細胞は、より活性を有し、容易に骨組へ移動した。
【０１２９】
内皮細胞上の血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）の走化性効果も、条件チャネルにおける播種ヒト大動脈ＳＭＣおよび細胞チャネルにおけるＨＭＶＥＣによって証明された。条件および対照ゲル領域におけるＨＭＶＥＣ移動を監視することは、ＨＭＶＥＣへのＳＭＣの安定化能力を証明した。ＨＭＶＥＣの移動は、条件側において抑制された。ＨＭＶＥＣに対するＳＭＣの、またはＳＭＣに対するＨＭＶＥＣの応答は、さらなる研究のために現在調査中である。今後、この共培養戦略は、新規に形成された毛細血管を安定化する際の、内皮細胞に対するＳＭＣ漸増の役割を調査するために使用することができる２９−３２。
【０１３０】
Ｕ８７ＭＧ細胞の移動速度および変位を調査するために、ＨＭＶＥＣを条件チャネルにおいて培養し、ｈＥＧＦ勾配を生成した。まず、ＨＭＶＥＣを条件チャネルに配置した時に、Ｕ８７ＭＧ細胞の限定された移動を観察し、ＨＭＶＥＣがＵ８７ＭＧ細胞を引き付けないことを示唆した。ｈＥＧＦにおける勾配が、条件チャネルにおける２０または２００ｎｇ／ｍＬのｈＥＧＦを添加することによって生成した場合、条件側のＵ８７ＭＧ細胞の移動速度は、対照側のそれより高く、両方とも、ＨＭＶＥＣ共培養による速度より高かった。これは、ｈＥＧＦが、マトリクスにわたって分散し、条件側だけではなく対照側の細胞に到達し、および観察された移動速度差は、おそらく、走化性ではなく化学運動性によることが証明された。細胞移動に対するコラーゲン骨組の機械的特性の効果も観察された。より高い濃度の骨組（０．２５％コラーゲン）では、Ｕ８７ＭＧ細胞の移動速度は、抑制され、対照および条件側での移動速度の有意な化学運動性差を示すために長い時間を必要とした。これらの結果は、細胞移動に対するＥＣＭの機械的または化学的特性の効果を調査する、本明細書において記載されるマイクロ流体デバイスの能力を証明する。癌細胞に関して、ＥＣＭ剛性が、癌細胞活性と関連する３３ということは、過去に証明されている。
【０１３１】
細胞を異なる時点、異なる密度、および異なる播種配置で導入することによって、癌進行のモデルシステムを開発することができ、血管形成、脈管内への侵入および溢出の連続のステップを組み込むことが予期し得る３４。癌の脈管内への侵入検定を開発する予備実験では、Ｕ８７ＭＧ細胞を条件チャネルにおいて培養し、ＨＭＶＥＣを細胞チャネルにおいて培養した。ＨＭＶＥＣ単分子層への、ＧＦＰにより緑色に色付けられたＵ８７ＭＧ細胞の脈管内への侵入が観察された。いくつかのＵ８７ＭＧ細胞は、単分子層を通過し、その後、細胞チャネルにおける培地の流れによって離れるように移動したか、またはＨＭＶＥＣ単分子層に付着したまま成長した。このエビデンスは、体内で示された、内皮細胞単分子層の内腔側への癌細胞の移動を研究し、分析する際のこの検定の有用性を証明した３５。
【０１３２】
このマイクロ流体プラットホームは、様々な生物学的用途に対する細胞移動を研究するための多様かつ強力な手段でることを証明する。それは、リアルタイムで観察されることができる、よく制御された細胞培養環境を提供する。さらに、それは、細胞が、それらの可溶性および不溶性環境の両方から信号を常に受信するため、生理学的条件を模倣する際に不可欠である、生物物理学的および生化学的要因の一体化を可能にする。本デバイスは、血管形成、動脈形成、癌の脈管内への侵入、および癌の溢出等の生理学的および病態生理学的現象のためのモデルシステムとして使用することができる。
【０１３３】
（均等論）
当業者は、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態との多くの均等物を認識するか、またはただの日常の実験を使用して把握することができる。対象の発明の特定の実施形態が記載されたが、上記の明細書は、例示的なものであり、限定的なものではない。本発明の多くの変形は、本明細書の再考により、当業者にとって明らかとなる。本発明の全範囲は、均等物の全範囲と共に請求項、およびそのような変形と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。そのような均等物は、以下の請求項によって包含されることを意図する。
【０１３４】
（引用文献）
以下に記載されるそれらの参考文献を含む、本明細書に言及される全ての公表文献および特許は、各個々の公表文献または特許が、特別および個々に参考として援用されるかのように、それらの全体が本明細書に参考として援用される。矛盾する場合、本明細書における任意の規定を含む本出願が統括する。
【０１３５】
１．    Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｈ．，Ｇｏｌｄｉｎｇ，Ｍ．，Ｆｒｕｔｔｉｇｅｒ，Ｍ．，Ｒｕｈｒｂｅｒｇ，Ｃ，Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ，Ａ．，Ａｂｒａｍｓｓｏｎ，Ａ．，Ｊｅｌｔｓｃｈ，Ｍ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｃ，Ａｌｉｔａｌｏ，Ｋ．，Ｓｈｉｍａ，Ｄ．＆Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ，Ｃ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６１，１１６３−１１７７（２００３）．
２．    Ｈｅｌｍ，Ｃ−Ｌ．Ｅ．，Ｆｌｅｕｒｙ，Ｍ．Ｅ．，Ｚｉｓｃｈ，Ａ．Ｈ．，Ｂｏｓｃｈｅｔｔｉ，Ｆ．＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０２，１５７７９−１５７８４（２００５）．
３．    Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｍ．＆Ｓｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１７，４４−５０（２００７）．
４．    Ｓｉｅｍｉｎｓｋｉ，Ａ．Ｌ．，Ｈｅｂｂｅｌ，Ｒ．Ｐ．＆Ｇｏｏｃｈ，Ｋ．Ｊ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２９７，５７４−５８４（２００４）．
５．    Ｙａｍａｍｕｒａ，Ｎ．，Ｓｕｄｏ，Ｒ．，Ｉｋｅｄａ，Ｍ．＆Ｔａｎｉｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，１３，１４４３−１４５３（２００７）．
６．    Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｓｃｈｌｅｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｈｏｃｋｅｌ，Ｍ．＆Ｙｕａｎ，Ｆ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ，３，１２０３−１２０８（１９９７）．
７．    Ｎａｋａｙａｓｕ，Ｋ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｎ．，Ｏｋｉｓａｋａ，Ｓ．＆Ｓａｔｏ，Ｎ．，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３３，３０５０−３０５７（１９９２）．
８．    Ｓｈｉｕ，Ｙ．Ｔ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｙｉｎｇ，Ｊ．Ｂ．，Ｉｗａｍｏｔｏ，Ｍ．Ｎ．，Ｊｏｕｎｇ，ＬＳ．＆Ｑｕａｍ，Ｃ．Ｔ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．３３，４３１−５１０（２００５）．
９．    Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｅ．，Ｂｌａｃｋ，Ｓ．Ｍ．＆Ｂａｙｌｅｓｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．−Ａｎ．，３６，５１３−５１９（２０００）．
１０．    ＤｉＭｉｌｌａ，Ｐ．Ａ．，Ｑｕｉｎｎ，Ｊ．Ａ．，Ａｌｂｅｉｄａ，Ｓ．Ｍ．＆Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｄ．Ａ．，ＡＩＣｈｅ  Ｊ．，３８，１０９２−１１０４，（１９９２）．
１１．    Ｓｈｉｚｕｋｕｄａ，Ｙ．，Ｔａｎｇ，Ｓ．，Ｙｏｋｏｔａ，Ｒ．＆Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｗａｒｅ，Ｊ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８４，２４７−２５６（１９９９）．
１２．    Ｒｏｊａｓ，Ｊ．Ｄ．，Ｓｅｎｎｏｕｎｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｍａｌｔｉ，Ｄ．，Ｂａｋｕｎｔｓ，Ｋ．，Ｒｅｕｖｅｎｉ，Ｍ．，Ｓａｎｋａ，Ｓ．Ｃ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ，
Ｇ．Ｍ．，Ｓｅｆｔｏｒ，Ｅ．Ａ．，Ｍｅｉｎｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．，Ｗｕ，Ｇ．，Ｗｅｓｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．，Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．Ｊ．Ｃ．＆Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｇｕｉｌａｎ，Ｒ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９１，Ｈｌ  １４７−Ｈ１１５７（２００６）．
１３．    Ｓａｇｎｅｌｌａ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｌｉｇｍａｎ，Ｆ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｈ．，Ｋｉｎｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｕｒｕｇｅｓａｎ，Ｇ．，Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｒ．Ｅ．＆Ｋｏｔｔｋｅ−Ｍａｒｃｈａｎｔ，Ｋ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２５，１２４９−１２５９（２００４）．
１４．    Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｍ．Ｊ．Ｃ，Ｓｅｆｔｏｒ，Ｅ．Ａ．，Ｓｅｆｔｏｒ，Ｒ．Ｅ．Ｂ．＆Ｆｉｄｌｅｒ，Ｉ．Ｊ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，３８，１３７−１４７（１９８７）．
１５．    Ｍａｃｅ，Ｋ．Ａ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｃ，Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ｍ．＆Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｎ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ，１１８，２５６７−２５７７（２００５）．
１６．    Ｂａｙｌｅｓｓ，Ｋ．Ｊ．，Ｓａｌａｚａｒ，Ｒ．＆Ｄａｖｉｓ，Ｇ．Ｅ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ，１５６，１６７３−１６８３（２０００）．
１７．    Ｗｅｎｇｅｒ，Ａ．，Ｓｔａｈｌ，Ａ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｈ．，Ｆｉｎｋｅｎｚｅｌｌｅｒ，Ｇ．，Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｂ．＆Ｋｎｅｓｅｒ，Ｕ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，１０，１５３６−１５４７（２００４）．
１８．    Ｇｈａｊａｒ，ＣＭ．，Ｂｌｅｖｉｎｓ，Ｋ．Ｓ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｃ．Ｃ．Ｗ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｓ．Ｃ  ＆Ｐｕｔｎａｍ，Ａ．Ｊ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．，
１２．２８７５−２８８８（２００６）．
１９．    Ｃｈｉｃｕｒｅｌ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５，６０６−６０９（２００２）．
２０．    Ｓｅｌｍｅｃｚｉ，Ｄ．，Ｍｏｓｉｅｒ，Ｓ．，Ｈａｇｅｄｏｍ，Ｐ．Ｈ．，Ｌａｒｓｅｎ，Ｎ．Ｂ．＆Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ，Ｈ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，８９，９１２−９３１（２００５）．
２１．    Ｊｅｏｎ，ＮＸ．，Ｂａｓｋａｒａｎ，Ｈ．，Ｄｅｒｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｗ．，Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｖａｎ  Ｄｅ  Ｗａｔｅｒ，Ｌ．＆Ｔｏｎｅｒ，Ｍ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０，８２６−８３０（２００２）．
２２．    Ｌａｍａｌｉｃｅ，Ｌ．，Ｌｅ  Ｂｏｅｕｆ，Ｆ．＆Ｈｕｏｔ，Ｊ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１００，７８２−７９４（２００７）．
２３．    Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｄａｖｉｓ，Ｓ．，Ｇａｌｅ，Ｎ．Ｗ．，Ｒｕｄｇｅ，Ｊ．Ｓ．，Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｓ．Ｊ．，Ｊ．Ｈｏｌａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，４０７，２４２−２４８，２０００．
２４．    Ｃｏｕｌｔａｓ，Ｌ．，Ｃｈａｗｅｎｇｓａｋｓｏｐｈａｋ，Ｋ．＆Ｒｏｓｓａｎｔ，Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３８，９３７−９４５（２００５）．
２５．    Ｗａｌｋｅｒ，Ｇ．Ｍ．＆Ｂｅｅｂｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２，１３１−１３４（２００２）．
２６．    Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．＆Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０７，２４９−２５７（２０００）．
２７．    Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３８，９３２−９３６（２００５）．
２８．    Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．，Ｋｅｒｂｅｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３８，９６７−９７４（２００５）．
２９．    Ｍｏｎｔｅｓａｎｏ，Ｒ．，Ｏｒｃｉ，Ｌ．＆Ｖａｓｓａｌｌｉ，Ｐ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，９７，１６４８−１６５２（１９８３）．
３０．    Ｚｈａｏ，Ｙ．，Ｔａｎ，Ｙ．Ｚ．，Ｚｈｏｕ，Ｌ．Ｆ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｊ．，Ｍａｏ，Ｙ．，Ｓｔｒｏｋｅ，３８，１３１３−１３１９（２００７）．
３１．    Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６，３８９−３９５（２０００）．
３２．    Ｇｅｒｔｈｏｆｆｅｒ，Ｇ．Ｔ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１００，６０７−６２１（２００７）．
３３．    Ｈｕａｎｇ，Ｓ．，Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．８，１７５−１７６（２００５）．
３４．    Ｓｕｒｅｓｈ，Ｓ．，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．，３，４１３−３８（２００７）．
３５．    Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｊ．＆Ｃｏｎｄｅｅｌｉｓ，Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１７，５５９−５６４（２００５）．
３６．    Ｃａｖａｌｌａｒｏ，Ｕ．，Ｌｉｅｂｎｅｒ，Ｓ．＆Ｄｅｊａｎａ，Ｅ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，３１２，６５９−６６７（２００６）．
３７．    Ｖｉｃｋｅｒｍａｎ，Ｖ．，Ｂｌｕｎｄｏ，Ｊ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．，Ｋａｍｍ，Ｒ．Ｄ．Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，８（９），１４６８−１４７７（２００８）．
３８．    Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．，Ｓｕｄｏ，Ｒ．，Ｍａｃｋ，Ｐ．Ｊ．，Ｗａｎ，Ｃ−Ｒ．，Ｖｉｃｋｅｒｍａｎ，Ｖ．，Ｋａｍｍ，Ｒ．Ｄ．Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，９，２６９−２７５（２００９）．
３９．    Ｓｕｄｏ，Ｒ．，Ｃｈｕｎｇ，Ｓ，Ｚｅｒｖａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ｉ．Ｋ．，Ｖｉｃｋｅｒｍａｎ，Ｖ．，Ｔｏｓｈｉｍｉｔｓｕ，Ｙ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｌ．Ｇ．，Ｋａｍｍ，Ｒ．Ｄ．Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｆｊ．０８−１２２８２０，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２６，２００９．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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