(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコヘモグロビン分析装置用の標準物質であって、Ｌ−システイン及びグリコヘモグロビンを含有した凍結乾燥物であることを特徴とする、グリコヘモグロビン分析装置用の標準物質。
【請求項２】
前記Ｌ−システインを、グリコヘモグロビンの１重量部に対して０．０１〜０．００００１重量部含有する、請求項１に記載の標準物質。
【請求項３】
グリコヘモグロビン分析装置用のコントロール物質であって、Ｌ−システイン及びグリコヘモグロビンを含有した凍結乾燥物であることを特徴とする、グリコヘモグロビン分析装置用のコントロール物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野 
本発明は、グリコヘモグロビン分析装置用の標準物質およびコントロール物質に関するものである。
【０００２】
背景技術 
ヘモグロビンは、赤血球に存在するヘムタンパク質であり、α鎖およびβ鎖と命名されるポリペプチド鎖（各鎖はヘム１分子と結合している）２対からなる四量体で構成されており、分子量６５、０００である。ヘモグロビンは、血液中に成人男性で１６〜１８ｇ／ｄＬ、女性で１４〜１６ｇ／ｄＬ含まれており、可逆的に酸素を鉄分子に脱着することにより、生体中において酸素運搬機能を果たしている。
【０００３】
このような役割を有することから、臨床検査において、ヘモグロビンの測定は基本的な測定項目の一つとなっており、赤血球数やヘマトクリット値などと組み合わせて貧血（例えば、鉄欠乏性貧血、再生不良性貧血、溶血性貧血など）の診断に利用されている。また、最近では、便に含まれている微量のヘモグロビンを測定することにより、大腸ガンなどの診断にも利用されている。
【０００４】
一方、グリコヘモグロビンは、ヘモグロビンとグルコースとの非酵素的反応より生じる。血中でのグリコヘモグロビンの測定は過去３〜４週間の血糖コントロールを反映し、食事に影響されない長期の血糖コントロールの指標として極めて有用である。以後このヘモグロビンとグリコヘモグロビンを合わせてヘモグロビン類と称する。
【０００５】
現在、臨床検査の現場では上記ヘモグロビン類の測定は、ＨＰＬＣ法、免疫学的方法、アフィニティ法、電気泳動法、等電点分画法、ＴＢＡ（２−ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓｓａｙ）法、Ｐｈｏｔｉｃ ａｃｉｄｅ法、ｆｕｒｏｓｉｎｅ測定法などにより行われている。
【０００６】
上記ヘモグロビン類の測定に際しては、基準となる標準物質やコントロール物質が必要となる。しかし、ヘモグロビン類は不安定な物質であり、酸化により、ヘム鉄がＦｅ２＋からＦｅ３＋となり、鮮赤色から暗褐色のメトヘモグロビンになって、酸素結合能を失う。更にヘモグロビンは空気中にさらしておくだけでもメトヘモグロビンに酸化され、更には凍結乾燥することでもメトヘモグロビンに酸化されることが知られている。
【０００７】
このような酸化を防止する方法として、Ｏ２が結合する部位にＣＯやＮＯまたはＣＮなどの酸素とほとんど大きさの等しい二分子原子を結合させる方法や、凍結乾燥時にアジ化ナトリウムを添加して行う方法がある。しかし上記方法は、操作が煩雑であったり、一部の測定法で顕著な低値を与えたり測定が不能であったり、更にアジ化ナトリウムが有する毒性のため廃棄の問題などがある。また、含窒素化合物を添加する方法（特開昭６０−３５２７０号公報）が開示されているものの、ヘモグロビンからの鉄の遊離を防ぐ効果が開示されているのみである。糖類およびアミノ酸類を含有させる方法（特開昭６１−１６２０号公報）はヘモグロビンのメト化防止剤を開示しているが、この方法は代用血液として利用するヘモグロビンの安定化を目的としており、ヘモグロビンとしてｍｇ／ｍＬレベルの濃度を対照としたものであり、臨床検査における標準物質またはコントロール物質などに要求されるｎｇ〜μｇ／ｍＬレベルのヘモグロビンを安定化するには適当ではない。また、アミノ酸およびアルブミンを含有させる方法（特開平８−２４５４２１号公報）によりヘモグロビン類を安定化させる方法があるが、これは、アミノ酸の他にアルブミンを添加する必要があり試薬組成に制限ががかる。
【０００８】
このように、従来のヘモグロビン類を安定化させる方法は、ヘモグロビン類を高精度で測定する必要のある臨床検査のコントロール物質および標準物質の安定化法としては適当でない。そのため、ヘモグロビン類を含むコントロール物質および標準物質の安定化方法の開発が、医薬分野および臨床検査の分野などで求められている。
【０００９】
発明の開示  本発明者らは、コントロール物質や標準物質の安定化について研究した結果、グリコヘモグロビンにＬ−システインを添加した凍結乾燥物とすることによりグリコヘモグロビンの安定性が向上することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明の態様の一は、グリコヘモグロビン分析装置用の標準物質であって、Ｌ−システイン及びグリコヘモグロビンを含有した凍結乾燥物であることを特徴とするグリコヘモグロビン分析装置用の標準物質である。
【００１２】
本発明は、グリコヘモグロビンの１重量部に対して０．０１〜０．００００１重量部含有することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明の態様の一は、グリコヘモグロビン分析装置用のコントロール物質であって、Ｌ−システイン及びグリコヘモグロビンを含有した凍結乾燥物であることを特徴とする、グリコヘモグロビン分析装置用のコントロール物質である。
【００１５】
発明を実施するための最良の形態
本発明においてヘモグロビン類とは、ヘモグロビンとグリコヘモグロビンを意味する。グリコヘモグロビンとしては、ＨｂＡ１ｃが例示される。さらに、その他、ヘモグロビン類として、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、オキシヘモグロビン、カルボニルヘモグロビン、アルカリ変性ヘモグロビンなどや、その他異常ヘモグロビンが例示される。さらに、修飾ヘモグロビン類、すなわちヘモグロビン類のリン酸エステル誘導体、ヘモグロビン−ポリアルキレン結合体、ヘモグロビン−イヌレン結合体、ヘモグロビン−ハプトグロビン複合体も本発明の範囲に含まれる。また、本発明は、ヒト由来に限らず種々の動物由来、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、サル、ウサギ、ニワトリなどのヘモグロビン類についても適用可能である。これらヘモグロビン類は、各種臨床検査などのための標準物質またはコントロール物質として使用に供される。これら使用に供せられる製品は、より好ましくは凍結乾燥製剤のような乾燥製剤として提供されるが、所望により凍結製剤、液状製剤などであってもよい。
【００１６】
本発明のヘモグロビン類の安定化方法および安定化剤の第一義的な意義は、ヘモグロビン類の溶液状態における安定性の確保にある。その意味は、液状製剤としての、または乾燥製剤・凍結製剤の溶解時における溶液状態のヘモグロビン類の安定性を確保する事にある。
【００１７】
本発明のヘモグロビン類の安定化方法は、含硫化合物をヘモグロビン類の安定化のために共存させることである。含硫化合物の添加は、製剤調製時に行うことがより一般的で簡便であるが、所望により、製剤を溶解後、適宜添加することによっても目的は達成できる。製剤調製の段階で含硫化合物を添加すれば、ヘモグロビン類を主剤とし、含硫化合物を安定化剤として含む、ヘモグロビン類標準物質またはコントロール物質が提供される。また、用時添加型の製剤とするのであれば、主剤と含硫化合物を含む安定化剤とを別々の製剤としたキット製品として提供可能である。
【００１８】
含硫化合物とは、ＳＨ化合物が一般的であり、広く利用できる。ＳＨ化合物としては、システイン、メチオニン、シスチンなどの含硫アミノ酸、および、チオ安息香酸、チオグリコール酸、１−チオグリセリン、チオジグリコール、メルカプトエタノール、グルタチオン、ジチオスレイトールなどの含硫化合物、ならびにこれらの類縁体が挙げられる。これらは単独でまたは複数を組み合わせて使用できる。このなかで、好ましい化合物はシステイン、メチオニン、シスチンなどの含硫アミノ酸およびこれらの類縁体であり、特に好ましい化合物はシステインおよびその類縁体である。
【００１９】
含硫化合物の使用量は、ヘモグロビン類の１重量部に対して、０．０１〜０．００００１重量部であり、好ましくは０．００１〜０．０００１重量部である。また、溶液状態に調製した時の濃度としては、２〜１０重量％濃度のヘモグロビン類に対して０．０１〜１００ｍＭ、好ましくは０．１〜１０ｍＭである。
【００２０】
本発明において提供される安定性が確保されたヘモグロビン類を含む標準物質またはコントロール物質は、ヘモグロビン類を含有する組成物ともいえるものであり、該組成物は、そのベース成分としての主剤および安定化剤に加えて、賦形剤、溶解時の濁り防止などのためのｐＨ調製剤、蛋白質、糖類、高分子化合物、無機塩、キレート化剤などを、所望により、公知技術を応用して、製剤調製時に配合されるかまたは用時配合されてもよい。
【００２１】
これらの例示としては、ｐＨを５〜９に調整しうる各種緩衝液またはｐＨ調製剤、アルブミン、ゼラチンなどのタンパク質、グリセロール、シュークロース、好ましくはシュークロースなどの二糖類、デキストラン硫酸ナトリウム、ヘパリン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、デキストランなどの多糖類、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールなどの高分子化合物を、単独または組み合わせて使用することができる。さらに、適宜、グルコース、マルトース、イノシトール、マンノース、フルクトース、グルシトール、グルコノ−δ−ラクトン、トレハロース、マルチトール、ラフィノース、マンニトールなどの糖類、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化カリウム、乳酸カルシウムなどの無機塩、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＮＴＡ（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＤＤＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＣｙＤＴＡ（ｔｒａｎｓ−１，２−Ｄｉａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、ＤＰＴＡ−ＯＨ（１，３−Ｄｉａｍｉｎｏ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＤＴＰＡ（Ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＤＤＰ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＥＤＤＰＯ〔Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ｈｅｍｉｈｙｄｒａｔｅ〕、ＥＧＴＡ〔ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｓ−（β−ａｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ〕、ＨＢＥＤ〔Ｎ，Ｎ’−Ｂｉｓ（２−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ−ｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ〕、ＨＤＴＡ（１，６−Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＨＩＤＡ〔Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ〕、ＩＤＡ（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、ＮＴＰ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ＮＴＰＯ〔Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉｓ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ），ｔｒｉｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ〕、ＴＴＨＡ（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｍｉｎｅ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’，Ｎ’’’−ｈｅｘａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）などのキレート剤、α−、β−、γ−ＣＤ（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、またはこれらのＣＤがヒドロキシルプロピル基またはジメチル基で修飾されたもの、α−ＣＤポリマー、β−ＣＤポリマー、γ−ＣＤポリマーなどのＣＤ類を、単独または組み合わせて用いることができる。
【００２２】
実施例 
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（実施例１）
下記に示す試薬に安定化剤としてＬ−システインを１ｍＭ添加したものおよび添加していないものを調製し、５ｍｌガラス容器に１ｍｌ分注し、凍結乾燥を行い、凍結乾燥製剤とした。なお、ヘモグロビン類として、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０を含むヘモグロビン標品を用い、ヘモグロビン濃度が７％になるように添加した。
１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
２５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ 
７％   ヘモグロビン標品（ＪＭＬ社）
２５％   シュークロース
【００２４】
（試験例１）
実施例１で調製した、安定化剤としてＬ−システインを含むおよび含まない凍結乾燥製剤をそれぞれ精製水１ｍｌで溶解し、溶液状態で２５℃２５時間経過後のヘモグロビンの安定性を比較した。ヘモグロビンの測定は、５７７ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ値）を測定することにより行った（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８６，２６５−２７２）。その結果、表１に示すように、Ｌ−システインの添加により、溶液状態でのヘモグロビンの充分な安定化効果が確認された。また、東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＩＩＩにより各画分の分析を行ったが、クロマトグラムは変化なく、各成分とも安定であった。
【００２５】
0005410647.tif 000002
【００２６】
（実施例２）
下記に示す試薬に安定化剤として、Ｌ−システインを１ｍＭ添加したものおよび添加していないものを調製した。実施例１同様、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ１ａ、ＨｂＡ１ｂ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０を含むヘモグロビン標品を用い、ヘモグロビン濃度が７％になるように添加した。
１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
２５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ 
７％   ヘモグロビン標品（ＪＭＬ社）
【００２７】
（試験例２）
実施例２で調製した、Ｌ−システインを含むおよび含まない試薬について、調製直後および２５℃２５時間経過後のヘモグロビンの安定性を、試験例１と同様のヘモグロビン測定法で検討した。結果は表２に示した。Ｌ−システインの添加により、糖（シュークロース）の有無に関係なく充分なヘモグロビンの安定性が得られた。また、東ソー自動グリコヘモグロビン分析計ＨＬＣ−７２３ＧＨｂＩＩＩにより各画分の分析を行ったが、クロマトグラムは変化なく、各成分とも安定であった。
【００２８】
0005410647.tif 000003
【００２９】
産業上の利用の可能性
本発明のＬ−システイン及びグリコヘモグロビンを含有した凍結乾燥物からなることを特徴とするグリコヘモグロビン分析装置用の標準物質やコントロール物質により、グリコヘモグロビンの安定性が確保された標準物質やコントロール物質が提供される。従って、本発明により、グリコヘモグロビン分析装置のための標準物質やコントロール物質の安定性が向上し、より確度の高い検査結果を得ることができる。このように、本発明は、臨床検査分野に寄与する有用な発明である。