(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞がネトリン−１を発現または過剰発現する癌の予防または治療のための化合物を選択する方法であって、
ａ）ネトリン−１またはその断片と、ネトリン−１受容体またはその断片とを含む媒体を得る工程であって、
該ネトリン−１もしくはその断片および該ネトリン−１受容体もしくはその断片は、ともに特異的に相互作用して結合対を形成することができ、並びに／または
該ネトリン−１もしくはその断片は、該ネトリン−１受容体もしくはその断片の二量体化もしくは多量体化を誘導することができる、工程；
ｂ）該媒体と供試化合物とを接触させる工程；
ｃ）ネトリン−１もしくはその断片と該ネトリン−１受容体もしくはその断片との間の相互作用の阻害を測定する工程、および／または
該化合物が、該ネトリン−１受容体もしくはその断片の二量体化もしくは多量体化を阻害するかどうかを判定する工程；並びに
ｄ）工程ｃ）における測定が、該化合物の存在下で、ネトリン−１もしくはその断片とネトリン−１受容体もしくはその断片の間の相互作用の有意な阻害を示す場合、および／または
工程ｃ）における判定が、該化合物の存在下で、該ネトリン−１受容体もしくはその断片の二量体化または多量体化の有意な阻害を示す場合
にその化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
予防または治療される癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性骨髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌、膵臓腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、腎臓腺癌および直腸腺癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予防または治療される癌が、転移性乳癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
予防または治療される癌が、転移性癌または侵攻性癌である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）において、該ネトリン−１受容体が、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）において、該ネトリン−１受容体が、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３の群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）において、
該ネトリン−１受容体断片が、ネトリン−１受容体の細胞外ドメイン、またはネトリン−１と相互作用可能なその一部を含むか、またはそのものであり；および／または
該ネトリン−１受容体断片が、ネトリン−１受容体の細胞内ドメイン、またはネトリン−１の存在下で二量体化もしくは多量体化可能なその一部を含むか、またはそのものである、
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程ａ）において、該ネトリン−１または／および該ネトリン−１受容体が、哺乳類由来のものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）において、該ネトリン−１が、ニワトリ由来のものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
該ネトリン−１または／および該ネトリン−１受容体および／または供試化合物が、直接的または間接的に測定可能なマーカーにより標識される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）において、
ネトリン−１もしくはその断片と該ネトリン−１受容体もしくはその断片の間の相互作用の阻害の測定が、イムノアッセイ、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって行われること；および／あるいは
該ネトリン−１受容体またはその断片の二量体化もしくは多量体化またはその阻害が免疫沈降またはＦＲＥＴにより行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ネトリン−１受容体の断片が、細胞内ドメインである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程ａ）において、該媒体が、それらの表面膜で内因性ネトリン−１受容体または組換えネトリン−１受容体を発現する細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）において、該媒体が、組換えネトリン−１受容体を発現する細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
工程ａ）において、該媒体が、それらの膜表面で該ネトリン−１受容体を内因的に発現し、かつ、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞を含み、さらに、工程ｃ）において、供試化合物の存在下で、ネトリン−１とそのネトリン−１受容体の間の相互作用の阻害が、供試化合物の存在により誘発されるアポトーシスまたは細胞死により測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
工程ａ）において、該媒体が、転移性腫瘍細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
癌の予防または治療のための化合物を選択するための請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法であって、
ａ）内因性もしくは組換えネトリン−１受容体、または少なくともその細胞内ドメインを含むその断片を発現する哺乳類細胞を含む媒体を得る工程；
ｂ）該媒体と供試化合物とを接触させる工程；
ｃ）該供試化合物の存在下で該ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化が阻害されるかどうかを判定する工程；
および
ｅ）工程ｃ）における判定が、該ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化もしくは多量体化の有意な阻害を示す場合、および／または工程ｄ）における判定が、該哺乳類細胞の細胞死を示す場合
にその化合物を選択する工程
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
腫瘍細胞がネトリン−１を発現または過剰発現する癌の予防または治療のための化合物の選択に用いるためのキットであって、
ネトリン−１受容体タンパク質、またはネトリン−１タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成し得るその断片；および
ネトリン−１タンパク質、または該ネトリン−１受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成し得るその断片
を含んでなる、キット。
【請求項１９】
腫瘍細胞がネトリン−１を発現または過剰発現する癌の予防または治療のための化合物の選択に用いるためのキットであって、
ネトリン−１受容体を発現し、かつ、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞；および
ネトリン−１タンパク質、または該ネトリン−１受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成し得るその断片
を含んでなる、キット。
【請求項２０】
ネトリン−１とＤＣＣ受容体の間の相互作用を特異的に阻害し、および／または該ＤＣＣ受容体の二量体化もしくは多量体化を阻害し得る、ＤＣＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片を含んでなる化合物を含んでなる、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞を有する癌の予防または治療に用いるための医薬組成物。
【請求項２１】
ネトリン−１とＤＣＣ受容体の間の相互作用を特異的に阻害し、および／または該ＤＣＣ受容体の二量体化もしくは多量体化を阻害し得る、ＤＣＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片を含んでなる化合物を含んでなる、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞のアポトーシスまたは細胞死を誘発し、癌を治療することに用いるための医薬組成物。
【請求項２２】
ネトリン−１とＤＣＣ受容体の間の相互作用を特異的に阻害し、および／または該ＤＣＣ受容体の二量体化もしくは多量体化を阻害し得る、ＤＣＣ受容体の細胞外ドメインまたはその断片を含んでなる化合物を含んでなる、ヒトを含む哺乳類においてネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞を有する癌の予防または治療に用いるための医薬組成物。
【請求項２３】
ＤＣＣ受容体の細胞外ドメインを含んでなる化合物が、ＤＣＣ−ＥＣ−ＦｃまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
該癌が、転移性癌または侵攻性癌である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
予防または治療される癌が、転移性乳癌である、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
予防または治療される癌が、乳癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、白血病、肉腫、黒色腫、または腺癌である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
該癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性骨髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌、膵臓腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、腎臓腺癌および直腸腺癌からなる群から選択される、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
該癌の原発腫瘍細胞が、ネトリン−１を発現または過剰発現する、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の対象は、ネトリン−１と相互作用する、および／または腫瘍細胞で発現されるネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体形成を阻害する化合物の能力に基づいた、抗癌化合物のスクリーニングのためのin vitro法に関する。本発明はまた、ネトリン−１の発現レベルの測定に基づき、転移性癌の存在を予測する方法、または抗癌治療の有効性を判定する方法に関する。本発明はさらに、腫瘍細胞によるネトリン−１の過剰発現に関連する、乳癌などの転移性癌の治療のための薬剤としてのキットおよび化合物を含む。
【０００２】
ネトリン−１（Ｎｅｔｒｉｎ−１）は、拡散性ラミニン関連タンパク質であり、その主要な受容体、ＤＣＣ(Deleted in Colorectal Cancer)１，２，３およびＵＮＣ５Ｈ４，５  との相互作用により、神経系の発達中のニューロンナビゲーションの制御に主要な役割を果たすことが示されている３１。しかしながら、最近になって、細胞の生存を調節する全く異なる分子としてネトリン−１が現れた。実際、ネトリン−１受容体ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ、すなわち、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３は、いわゆる依存性受容体ファミリーに属す６，７。依存性受容体は、それらのリガンドが利用できない状況で発現された場合に細胞死を誘発する能力を共通して持つ受容体群である４４。このような受容体は、ＲＥＴ８、β−インテグリン９、Ｐａｔｃｈｅｄ１０、ネオゲニン１１、ｐ７５ＮＴＲ  １２およびアンドロゲン受容体４０を含み、それらのリガンドから解離した際に細胞死を誘発する機能特性を共通して持ち、一方、それらのリガンドが存在すれば、このアポトーシス促進活性は遮断される。従って、このような受容体はそれらの個々のリガンドに依存した細胞状況を作り出す１３，１４。
【０００３】
この依存作用は、リガンドが利用できない状況で発達する腫瘍細胞、リガンドの存在が一定で限定されている細胞環境での腫瘍細胞の増殖、またはリガンドが発現されない組織への転移性腫瘍細胞の移動を排除するための機構として働くということが示唆されている。そして、腫瘍細胞の選択的優位性は、その依存性受容体のアポトーシス促進活性を喪失させる。遺伝的スクリーニングから、Ｃ．エレガンス(C.elegans)ネトリン−１−ＵＮＣ６−がＵＮＣ４０およびＵＮＣ５と相互作用したことが推定された４２。哺乳類ではＵＮＣ５の４つのオーソログ、ＵＮＣ５Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４が同定されており、ＵＮＣ４０は脊椎動物ＤＣＣ(Deleted in Colorectal Cancer)のオーソログであることが分かっている３９。この系統で、ＤＣＣは１９９０代の初期に腫瘍抑制遺伝子であることが提案され、大多数のヒト癌でその発現が失われている１５，１６。この仮説は、ＵＮＣ５Ｈ遺伝子が大多数の結腸直腸腫瘍でダウンレギュレーションされているという最近の所見と一致しており、従って、ＵＮＣ５Ｈ遺伝子の欠損が腫瘍発達の選択的優位性に相当することが示唆される１７。興味深いことに、マウスでは、胃腸管におけるＵＮＣ５Ｈ３の不活性化とネトリン−１の過剰発現の双方が腸腫瘍の進行に関連しており１８，１９、従って、それ自体、ヒト病態におけるネトリン−１依存性受容体の欠損が腫瘍進行の原因因子であることを示す。しかしながら、初期の一連の報告は、ＤＣＣが腫瘍抑制因子として働いたということを裏付けた（総説としては２９参照）が、主としてＤＣＣコード配列における点突然変異がまれであるため、また、ＤＣＣ半接合マウスでは腫瘍素因がない４１ことから、疑いが出てきた。
【０００４】
しかしながら、上記のモデルから、ネトリン−１受容体の欠損とリガンド発現の獲得、すなわち、自己分泌発現は、類似の選択的優位性を表すので、ヒト癌で見られるはずであることが予測される。この疑問は基礎的知識として重要なだけでなく、療法のためにも極めて重要であり、実際、ネトリン−１依存性受容体とネトリン−１の間の細胞外相互作用の阻害は、腫瘍退縮を誘発する興味深い戦略となり得る。
【０００５】
癌の治療に使用可能な新規な化合物を同定および特性決定する簡単かつ一貫性のある手段を提供することが特に望ましい。
【０００６】
驚くことに、本発明者らは、最初に、大多数の転移性乳癌が、ネトリン−１依存性受容体の欠損よりもむしろ、転移性腫瘍の死滅を誘発するための療法に使用可能な形質である、ネトリン−１発現の上昇を示すことを実証した。
【０００７】
ＤＣＣおよび／またはＵＮＣ５Ｈのアポトーシス促進シグナル伝達が記載され始めたとすれば、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈによって、また、より一般には、他の既知の依存性受容体によって指示されるこの死／生のサインにおける重要な疑問は、リガンドの存在がどのようにしてそれらのアポトーシス促進活性を阻害するかということである５０。
【０００８】
次に、本発明者らは、ネトリン−１が誘導するＤＣＣおよび／またはＵＮＣ５Ｈの多量体化（multimerization）が、ＤＣＣおよび／またはＵＮＣ５Ｈアポトーシス促進活性を阻害する重要なステップであり得るかどうかを分析した。驚くことに、本発明者らは、アポトーシスを阻害するのに十分なプロセスである、ＤＣＣおよび／またはＵＮＣ５Ｈなどのネトリン−１受容体はネトリン−１に応答して多量体を形成することを示した。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、癌の予防または治療のための化合物を選択するin vitro法に向けられ、該方法は、
ａ）ネトリン−１またはその断片と、ネトリン−１受容体またはその断片とを含む媒体（medium）を得る工程
（該ネトリン−１もしくはその断片および該ネトリン−１受容体もしくはその断片は、ともに特異的に相互作用して結合対を形成することができ、並びに／または
該ネトリン−１もしくはその断片は、該ネトリン−１受容体もしくはその断片、特に、該ネトリン−１受容体の細胞内ドメイン、の二量体化もしくは多量体化を誘導することができる）；
ｂ）該媒体を供試化合物と接触させる工程；
ｃ）ネトリン−１もしくはその断片と該ネトリン−１受容体もしくはその断片との間の相互作用の阻害を測定する工程、並びに／または
該化合物が該ネトリン−１受容体もしくはその断片の二量体化もしくは多量体化、特に、該ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化を阻害するかどうかを判定する工程；並びに
ｄ）工程ｃ）における測定が、該化合物の存在下で、ネトリン−１もしくはその断片とネトリン−１受容体もしくはその断片との間の相互作用の有意な阻害を示す場合、並びに／または
工程ｃ）における判定が、該化合物の存在下で、該ネトリン−１受容体もしくはその断片の二量体化もしくは多量体化、特に、該ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化、の有意な阻害を示す場合に
その化合物を選択する工程
を含む。
【００１０】
ネトリン−１とそのネトリン−１受容体の相互作用とは、本願において、腫瘍細胞にネトリン−１依存性受容体により誘発されるアポトーシスを回避する選択的優位性をもたらす、好ましくは高ネトリン−１レベルによる、相互作用を意味する。
【００１１】
従って、この相互作用の阻害は、例えば、ネトリン−１とその受容体の結合の完全な、または部分的な阻害によって、特に、競合リガンド（該ネトリン−１受容体の細胞外膜ドメインに向けられた抗体など）の存在下、またはネトリン−１と特定の複合体を形成し得る化合物（例えば、そのネトリン−１受容体の可溶性細胞外膜ドメインまたはその一部など）の存在下で、得ることができる。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明による方法は、予防または治療される癌が、腫瘍細胞がネトリン−１を発現または過剰発現する癌であることを特徴とする。
【００１３】
別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、予防または治療される癌が、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性骨髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌、膵臓腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、腎臓腺癌および直腸腺癌からなる群から選択されることを特徴とする。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、予防または治療される癌が転移性癌または侵攻性癌であることを特徴とする。
【００１５】
本発明による方法では、該ネトリン−１受容体は、好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ（特に、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３）、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択され、より好ましくはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３の群から選択される。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、工程ａ）において、
該ネトリン−１受容体断片は、ネトリン−１受容体の細胞外ドメイン、またはネトリン−１と相互作用可能なその一部を含むか、またはそのものであり、および／または
該ネトリン−１受容体断片は、ネトリン−１受容体の細胞内ドメイン、またはネトリン−１の存在下で二量体化もしくは多量体化可能なその一部を含むか、またはそのものである
ことを特徴とする。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、該ネトリン−１または／および該ネトリン−１受容体が哺乳類、特にマウス、ラットまたはヒト由来のものであることを特徴とする。
【００１８】
本発明の方法の特定の態様では、工程ａ）において、該ネトリン−１はニワトリ由来のものである。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、該ネトリン−１または／および該ネトリン−１受容体および／または供試化合物が直接的または間接的に測定可能なマーカーにより標識されることを特徴とする。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、本発明による方法は、工程ｃ）において、
ネトリン−１またはその断片と該ネトリン−１受容体またはその断片との間の相互作用の阻害の測定がイムノアッセイ（特に、ＥＬＩＳＡまたは免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ））、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）または蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって行われること；および／または
該ネトリン−１受容体またはその断片、特に、細胞内ドメインの二量体化または多量体化、あるいはその阻害が免疫沈降またはＦＲＥＴにより行われること
を特徴とする。
【００２１】
別の特定の好ましい実施形態では、本発明による方法は、工程ａ）において、媒体が細胞の表面膜で内因性または組換えネトリン−１受容体、特に、該ネトリン−１受容体の組換え細胞外ドメインを発現する細胞を含むことを特徴とする。
【００２２】
好ましい実施形態では、該組換えネトリン−１受容体はまた、該ネトリン−１受容体の細胞内ドメインも含んでなる。
【００２３】
別の特定の好ましい実施形態では、本発明による方法は、工程ａ）において、媒体が、それらの膜表面でネトリン−１受容体を内因的に発現し、かつ、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞、好ましくは転移性腫瘍細胞を含み、かつ、工程ｃ）において、供試化合物の存在下でのネトリン−１とそのネトリン−１受容体の間の相互作用の阻害が、供試化合物の存在により誘発されるアポトーシスまたは細胞死により測定される、好ましくは、下記の例に示されるようなトリパンプルー染色法を用いて分析されることを特徴とする。
【００２４】
好ましい実施形態では、該腫瘍細胞は、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃの存在に応答して細胞死を極めて受けやすい、４Ｔ１細胞、ＣＡＬ５１細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＳＫＢＲ７細胞、ＩＭＲ３２細胞、ＧＬ２６細胞およびＨ３５８細胞、特に、ＣＡＬ５１−３６細胞系統などのＣＡＬ５１細胞系統からなる群から選択される。
【００２５】
本発明はまた、癌の予防または治療のための化合物を選択するin vitro法に向けられ、該方法は、
ａ）内因性もしくは組換えネトリン−１受容体、または少なくともその細胞内ドメインを含むその断片を発現する哺乳類細胞、好ましくは腫瘍細胞、より好ましくは、そのネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化もしくは多量体化を呈する細胞またはそのネトリン−１受容体細胞内ドメインがネトリン−１の存在下で二量体または多量体を形成し得る細胞を含む媒体を得る工程；
ｂ）該媒体を供試化合物と接触させる工程（場合により、該媒体はさらにネトリン−１またはネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用可能なその断片を含む）；
ｃ）該ネトリン−１受容体細胞内ドメインの二量体化または多量体化が該供試化合物の存在下阻害されるかどうかを判定する工程；
ｄ）場合により、供試化合物の存在が該哺乳類細胞の細胞死を誘発するかどうかを判定する工程（例えば、ブルートリパン法による）；および
ｅ）工程ｃ）における判定が該ネトリン−１受容体の細胞内ドメインの二量体化または多量体化の有意な阻害を示す場合、および／または工程ｄ）における判定が該哺乳類細胞の細胞死を示す場合に、その化合物を選択する工程
を含む。
【００２６】
第２の態様において、本発明は、原発腫瘍を有する患者において原発腫瘍細胞を含む患者の生検から、転移性癌または侵攻性癌（神経芽細胞腫など）の存在を推定するin vitro法に向けられ、該方法は、
（ａ）該生検におけるネトリン−１発現レベルを測定する工程
を含む。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明による推定方法は、工程ａ）において、該生検におけるネトリン−１発現レベルの上昇が、非転移性原発腫瘍生検または侵攻性癌生検におけるネトリン−１の発現と比べて、転移性癌または侵攻性癌の存在が有意であることを特徴とする。
【００２８】
より好ましい実施形態では、本発明による推定方法は、供試生検および非転移性または侵攻性参照生検におけるネトリン−１発現の間の比が２、好ましくは２．５、３、３．５、４、４．５および５を超えると転移性癌または急速進行性癌の存在が有意である。
【００２９】
第３の態様では、本発明は、患者の抗癌治療の有効性をin vitroで判定するため、または特定の抗癌治療に応答する患者を選択するための方法に向けられ、該方法は、
（ａ）該被処置患者の原発腫瘍生検を得る工程；および
（ｂ）該生検においてネトリン−１発現レベルを測定する工程
を含み、該抗癌治療の有効性が、該生検において測定されたネトリン−１発現レベルの量の低下と相関するか、または
特定の抗癌治療に応答する選択された患者が、それらの生検において測定されたネトリン−１発現レベルの量は、該特定の治療後に低減されている。
【００３０】
好ましい実施形態では、患者の抗癌治療の有効性をin vitroで判定するため、または特定の抗癌治療に応答する患者を選択するための方法は、該癌がネトリン−１の過剰発現を誘発し、および／または転移性癌または侵攻性癌であることを特徴とする。
【００３１】
好ましい実施形態では、患者の抗癌治療の有効性をin vitroで推定または判定するこの方法は、測定されたネトリン−１発現産物がネトリン−１をコードするＲＮＡであり、特に、定量的リアルタイム逆ＰＣＲ法により測定されたものであること、または測定されるネトリン−１の発現レベルが、特に該ネトリン−１タンパク質を特異的に認識し得る特定の抗体を用いた方法による、ネトリン−１タンパク質レベルの測定値であることを特徴とする。
【００３２】
好ましい実施形態では、患者の抗癌治療の有効性をin vitroで推定または判定するこの方法は、原発腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性骨髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌（renal adenocarcinoma）、膵臓腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、腎臓腺癌（kidney adenocarcinoma）および直腸腺癌からなる群から選択される癌の原発腫瘍であることを特徴とする。
【００３３】
別の態様では、本発明は、癌の予防または治療のための化合物の選択のためのキットに向けられ、該キットは、
ネトリン−１受容体タンパク質、またはネトリン−１タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成し得るその断片、好ましくは、組換えタンパク質；および
ネトリン−１タンパク質、または該ネトリン−１受容体タンパク質と特異的に相互作用して結合対を形成し得るその断片、好ましくは、組換えタンパク質
を含む。
【００３４】
該ネトリン−１受容体はまた、好ましくは、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ（特に、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３）、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択され、より好ましくは、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３の群から選択され、より好ましくは、マウス、ラットまたはヒトなどの哺乳類由来のものである。
【００３５】
好ましい実施形態では、該キットは、
ネトリン−１受容体を発現し、かつ、ネトリン−１を発現または過剰発現する腫瘍細胞、特に、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃの存在に応答して細胞死を極めて受けやすい、好ましくは、４Ｔ１細胞、ＣＡＬ５１細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＳＫＢＲ７細胞、ＩＭＲ３２細胞、ＧＬ２６細胞およびＨ３５８細胞、特に、ＣＡＬ５１−３６細胞系統などのＣＡＬ５１細胞系統からなる群から選択される、転移性腫瘍細胞系統に由来する細胞
を含む。
【００３６】
別の態様では、本発明は、薬剤として、
ネトリン−１とネトリン−１受容体の間の相互作用を特異的に阻害することができ、および／または該ネトリン−１受容体またはその断片の二量体化または多量体化を阻害することができる、特に、該ネトリン−１受容体の細胞内ドメインを阻害することができるネトリン−１受容体の細胞外ドメインまたはその断片を含む化合物；および
ネトリン−１またはネトリン−１受容体に特異的に向けられた、特に、該ネトリン−１受容体の細胞外ドメインに、または該ネトリン−１受容体の細胞外ドメインと相互作用し得るネトリン−１断片に向けられたモノクローナルまたはポリクローナル抗体
からなる群から選択される化合物を含む。
【００３７】
ヒトネトリン−１またはＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３（Ｕｎｃ−５ホモログＡ、ＢおよびＣに等しいＵｎｃ−５ホモログ１、２および３）などのヒトネトリン受容体のアミノ酸配列は当業者によく知られている。これらのアミノ酸配列の例はそれらの特定のドメインの位置とともに、Ｇｅｎｂａｎｋに、ヒトネトリン−１は受託番号ＡＡＤ０９２２１またはＮＰ＿００４８１３として、ヒトネトリン受容体Ｕｎｃ−５ホモログ１はＮＰ＿５８８６１０として、ネトリン受容体Ｕｎｃ−５ホモログ２はＱ８ＩＺＪ１として、そして、Ｕｎｃ−５ホモログ３はＯ９５１８５として見出すことができる。
【００３８】
好ましくは、本発明の化合物において、該ネトリン−１受容体またはその断片の細胞外ドメインはＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ（特に、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３）、ネオゲニンおよびアデノシンＡ２ｂの群から選択され、より好ましくは、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ１、ＵＮＣ５Ｈ２およびＵＮＣ５Ｈ３の群から選択され、より好ましくは、マウス、ラットまたはヒトなどの哺乳類由来のものである。
【００３９】
より好ましい実施形態では、本発明による化合物は、ＤＣＣ由来のネトリン−１受容体の細胞外ドメインを含み、好ましくは、該化合物はＤＣＣ−ＥＣ−ＦｃまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎである。
【００４０】
別の態様では、本発明は、患者における転移性癌、好ましくは転移性乳癌または結腸直腸癌、最も好ましくは転移性乳癌の同定のためのマーカーとしてネトリン−１の発現レベルを使用することに関する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、患者において、好ましくは高ネトリン−１レベルによって、ネトリン−１依存性受容体により誘発されるアポトーシスを回避する選択的優位性を獲得した腫瘍細胞のアポトーシスまたは細胞死を、誘発するための治療法に関し、該方法は、それを必要とする患者に、ネトリン−１とそのネトリン−１受容体の間の相互作用を阻害し得る化合物、ネトリン−１受容体の二量体化または多量体化を阻害し得る化合物、本発明による化合物、または本発明の方法により選択された化合物を投与することを含む。
【００４２】
別の態様では、本発明は、患者において癌を予防または治療する方法に関し、該方法は、それを必要とする患者に、本発明による化合物または本発明の方法により選択された化合物を投与することを含む。
【００４３】
本発明はまた、ヒトを含む哺乳類において癌を予防または治療するための薬剤の製造のための、本発明による化合物または本発明の方法により選択された化合物の使用を含む。好ましくは、該癌は転移性癌または侵攻性癌である。
【００４４】
より好ましくは、本発明の治療方法または本発明による化合物の使用において、該癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性骨髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌、膵臓腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、腎臓腺癌および直腸腺癌からなる群から選択される。
【００４５】
より好ましくは、本発明の治療方法または本発明による化合物の使用において、該癌の原発腫瘍細胞はネトリン−１を発現または過剰発現する。
【００４６】
本明細書において「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ネトリン−１タンパク質またはその受容体と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を意味する。
【００４７】
「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体またはヒト化抗体も含む。
【００４８】
単離されたネトリン−１タンパク質もしくはネトリン−１受容体タンパク質、またはその特異的断片は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体作製のための標準的な技術を用い、このようなタンパク質と結合する抗体を作製するための免疫原として使用可能である。少なくとも１つの抗原決定基を含むこれらのタンパク質のいずれの断片でも、これらの特異的抗体を作製するために使用可能である。
【００４９】
タンパク質免疫原は一般に、好適な被験体、（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳類）に免疫原を感作させることによって抗体を作製するために用いられる。適当な免疫原調製物としては該タンパク質またはその断片を含むことができ、さらにフロイントの完全アジュバントまたは不完全アジュバントなどのアジュバント、または類似の免疫刺激剤を含むことができる。
【００５０】
よって、本発明で使用するための抗体は、ネトリン−１タンパク質またはその受容体のアミノ酸配列の少なくとも８〜１０のアミノ酸の連続の長さを含むポリペプチドを含むエピトープと選択的に結合するか、または特異的に結合する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体のいずれかを含む。
【００５１】
ネトリン−１タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはｃＤＮＡを検出および定量するために好ましい薬剤は、このｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリダイズし得る標識された核酸プローブまたはプライマーである。この核酸プローブは少なくとも１０、１５、３０、５０または１００ヌクレオチド長であり、ストリンジェント条件下でこのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。この核酸プライマーは、少なくとも１０、１５または２０ヌクレオチド長であり、ストリンジェント条件下でこのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡまたはその相補的配列と特異的にハイブリダイズするに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。
【００５２】
ネトリン−１タンパク質を検出および定量するために好ましい薬剤は、このタンパク質と特異的に結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル抗体であってよく、あるいはより好ましくは、モノクローナル抗体である。完全抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用可能である。プローブまたは抗体に関して「標識される」とは、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に結合させる）ことによるプローブまたは抗体の直接的標識、ならびに直接的に標識された別の試薬との反応によるプローブまたは抗体の間接的標識を含むものとする。間接的標識の例としては、蛍光標識二次抗体を用いた一次抗体の検出およびビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識（これは蛍光標識ストレプトアビジンで検出することができる）が挙げられる。
【００５３】
例えば、候補ｍＲＮＡを検出するためのin vitro技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびin situハイブリダイゼーションが挙げられる。候補タンパク質を検出するためのin vitro技術としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降法および免疫蛍光法が挙げられる。候補ｃＤＮＡを検出するためのin vitro技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００５４】
本発明がネトリン−１タンパク質レベルを定量するためのキットを含む場合、このキットは、これらのタンパク質を定量し得る標識化合物または薬剤を含み得る。該薬剤は好適な容器にパッケージングすることができる。このキットはさらにネトリン−１タンパク質またはネトリン−１転写物のレベルを定量するために該キットを用いることに関する使用説明書を含み得る。
【００５５】
本発明の方法の特定の実施形態では、ネトリン−１転写物の判定に、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、あるいはまた、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegran et al., 1988, Science 241:23-1080;およびNakazawa et al, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:360-364参照）、あるいはまた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおけるプローブ／プライマーの使用を含む。この方法は、患者から細胞サンプルを採取する工程、その細胞サンプルから核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を単離する工程、場合により、ｍＲＮＡを対応するｃＤＮＡに変換する工程、その核酸サンプルとネトリン−１またはｍＲＮＡまたはそれらの対応するｃＤＮＡと特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーとを、ネトリン−１  ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのハイブリダイゼーションおよび増幅が起こる条件下で接触させる工程、および増幅産物の存在を定量する工程を含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、核酸検出を定量するために用いられるいずれかの技術と組み合わせて増幅工程として使用するのが望ましいと考えられる。
【００５６】
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも１つのプローブ核酸または本明細書に記載のプライマーセットまたは抗体試薬を含むプレパッケージ診断キットを用いることによって行うことができ、これらは例えば患者を追跡調査または診断する臨床状況で便宜に使用することができる。
【００５７】
最後に、本発明は、転移性癌または侵攻性癌の予防または治療を意図した薬剤の製造のためのネトリン−１タンパク質をコードする核酸に特異的なアンチセンスまたはｉＲＮＡ（干渉ＲＮＡ）オリゴヌクレオチドの使用に関し、好ましくは、該癌は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、神経芽腫、神経膠腫、急性骨髄性白血病、肉腫、黒色腫、卵巣腺癌、腎腺癌、膵臓腺癌、子宮腺癌、胃腺癌、腎臓腺癌および直腸腺癌からなる群から選択される。
【００５８】
干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、その相補的配列を有する遺伝子の発現を特異的に抑制する現象である。ｉＲＮＡはそれゆえ多くの生物の有用な研究ツールとなっている。ｄｓＲＮＡが遺伝子発現を抑制する機構は完全には理解されていないが、実験データが重要な洞察を示している。この技術は哺乳類細胞における遺伝子機能を研究するためのツールとして大きな可能性を持ち、ｓｉＲＮＡ(small interfering RNA)に基づく薬理因子の開発をもたらし得る。
【００５９】
患者に投与する際、本発明の化合物は好ましくは、場合により薬学上許容されるビヒクルを含む組成物の成分として投与される。この組成物は経口投与することもできるし、あるいは他の便宜な経路のいずれかで投与することもでき、別の生物的に活性な薬剤とともに投与することもできる。投与は全身投与でも局所投与でもよい。例えば、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどの種々の送達経路が知られ、選択された本発明の化合物またはその薬学上許容される塩を投与するために使用することができる。
【００６０】
投与方法としては、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、大脳内、腟内、経皮、直腸、吸入、または局所投与が挙げられる。この投与様式は医師の裁量に任される。ほとんどの場合、投与は血流中、または直接的に原発腫瘍への化合物の放出をもたらす。
【００６１】
本発明の、または本発明の方法によって選択された化合物を含む組成物も本発明の一部をなす。これらの組成物はさらに、患者への適切な投与のための形態を提供するよう好適な量の薬学上許容されるビヒクルを含み得る。「薬学上許容される」とは、規制当局によって認可されているか、または動物、哺乳類、より詳しくは、ヒトにおける使用に関して国の、または認知されている薬局方に挙げられていることを意味する。「ビヒクル」とは、本発明の化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を指す。このような医薬ビヒクルは、水および油（石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油、など）などの液体であり得る。医薬ビヒクルは生理食塩水、ゼラチン、デンプンなどであり得る。さらに、助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤および着色剤も使用可能である。生理食塩水およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も液体ビヒクルとして、特に、注射溶液に使用可能である。好適な医薬ビヒクルはまた、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水などの賦形剤も含む。試験化合物組成物は、所望により、微量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含み得る。本発明の組成物は溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル剤、液体含有カプセル剤、散剤、徐放性処方物、坐剤、エマルション、エアゾール、スプレー、懸濁液の形態、または使用に好適な他のいずれかの形態をとり得る。該組成物は一般に、経口投与または静脈投与のためにヒトに適合された医薬組成物として、常法に従って処方される。有効化合物の量、すなわち治療に有効な量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに場合によっては、至適用量範囲を特定する助けとしてin vitroまたはin vivoアッセイを使用してもよい。使用する厳密な用量はまた、投与経路および疾病の重篤度によっても異なり、医師の判断および各患者の状況によって判断すべきである。しかしながら、経口、鼻腔内、皮内または静脈投与のための好適な用量範囲は一般に約０．０１ミリグラム〜約７５ミリグラム／体重キログラム／日、より好ましくは、約０．５ミリグラム〜５ミリグラム／体重キログラム／日である。
【００６２】
本発明を上記の実施形態に関して記載してきたが、以上の記載および以下の実施例は例示を意図したものであり、本発明を限定するものではないと理解される。本発明が属する当業者には、他の態様、利点および本発明の範囲内の改変が明らかである。
【実施例】
【００６３】
実施例１：材料および方法
細胞系統、細胞培養物、トランスフェクション手順、試薬および免疫ブロット：
４Ｔ１および６７ＮＲ細胞はF. Miller (Detroit, MI, USA)から厚意により譲渡されたものである。標準的な手順を用いてＣａｌ５１、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、４５３、３６１、１５７、ＳＫ−ＢＲ３、ＣＡＭＡ−１、Ｔ４７Ｄを培養した。図８Ｂに挙げられたヒト乳房細胞系統、より具体的にはＴ４７ＤおよびＳＫＢ７細胞系統をD. Birnbaunから得た。６７ＮＲ細胞を、リポフェクタミン試薬(Invitrogen)およびピューロマイシン(Sigma)選択を用いて安定的にトランスフェクトした。ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）の一時的トランスフェクションは、従前に記載されているように１０、改良リン酸カルシウム法の従い、または製造業者の説明書(Invitrogen)に従ってリポフェクタミンを用いて行った。乳癌４Ｔ１細胞系統は従前に記載されている２０。ハイグロマイシン耐性を有するＣＭＶ−ルシフェラーゼベクターの安定トランスフェクションにより４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を得た。luminoskan Ascent Station (Labsystems)を用い、発光強度によりクローンを選択した。免疫ブロットは、従前に記載されているように６、抗ｃ−ｍｙｃ（Sigma；１／２００）、抗ＦｌａｇＭ２（Sigma、１／２００）または抗ＨＡ（Sigma；１／５００）を用いて行った。人工的二量体化剤ＡＰ２０１８７はAriad Pharmaceuticals製のものであった。ＤＣＣの完全細胞外ドメイン（ＤＣＣ−ＥＣ）、ＤＣＣ−ＥＣ−ＦｃはR&D systemから、ネトリン−１はApotech corpから得た。細胞死分析、カスパーゼ活性測定および免疫沈降では、ＡＰ２０１８７を終濃度１０ｎＭで用い、ネトリン−１を終濃度３００ｎｇ／ｍＬで用いた。
【００６４】
ヒト乳癌サンプル：
５１のヒト乳癌サンプルはCentre Leon Berardの腫瘍バンクにより提供されたものである。全身療法前の乳房手術の際に新鮮な腫瘍組織を得、液体窒素中で急速冷凍した。
【００６５】
部位特異的突然変異誘発およびプラスミド構築物：
ＰＧＮＥＴ−１  ｐＣＭＶおよびｐＧＮＥＴ−１をコードするニワトリネトリン−１は従前に記載されている６。ｐＫｋも記載されている２２。ＤＣＣのドミナントネガティブ突然変異体（ｐＣＲ−ＤＣＣ−ＩＣ−Ｄ１２９０Ｎ）およびＵＮＣ５Ｈのドミナントネガティブ突然変異体（ｐＣＲ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣ−Ｄ４１２Ｎ）も従前に記載されている６，２７，７。ＨＡ−ＤＣＣは、以下のプライマー：ＤＣＣ−ＨＡ  Ｆ：５’−ＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＡＣＣＧＧＡＴＴＡＴＧＣＡＴＡＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１）；ＤＣＣ−ＨＡ  Ｒ：５’−ＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＡＴＧＣＡＴＡＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＴＣＡＴＡＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２）を用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発系(Stratagene)により、鋳型ｐＣＭＶ−ＤＣＣ６にＨＡタグを導入することによって得た。ｃ−ｍｙｃ−ＤＣＣもまた、以下のプライマー：ＤＣＣ−ｍｙｃ  Ｆ：５’−ＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＴＧ−３’（配列番号３）；ＤＣＣ−ｍｙｃ  Ｒ：５’−ＣＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＣＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号４）を用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅにより鋳型ｐＣＭＶ−ＤＣＣにｃ−ｍｙｃを導入することによって得た。
【００６６】
Argent Regulated HomodimerizationキットのＨＡ−Ｆｖ２Ｅをコードする発現ベクター（ｐＣ４Ｍ中）は、Ariad Pharmaceuticalsからのものである。このプラスミドから、ＨＡ−Ｆｖ２Ｅ−ＤＣＣ−ＩＣプラスミドを構築した。ＤＣＣの細胞内ドメインのＰＣＲ断片（１１２２−１４４７）を、プライマー：Ｆ  ５’−ＴＡＴＧＴＣＧＡＣＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡ−３’（配列番号５）およびＲ  ５’−ＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＴＣＧＡＧＴＧＣＧＴＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣＧＴＡＣＧＧＡＴＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＡＧ−３’（配列番号６）を用いて得た。
【００６７】
リバースプライマーは、ＤＣＣのＣ末端にＨＡタグを融合させた。このＰＣＲ断片を、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限消化によりＨＡ−Ｆｖ２Ｅにサブクローニングした。ｃ−ｍｙｃ−Ｆｖ２Ｅ−ＤＣＣ−ＩＣは、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発系(Stratagen)を、鋳型としてのｐＣ４Ｍ−Ｆｖ２Ｅ−ＤＣＣ−ＩＣ−ＨＡおよび以下のプライマー：プライマーＦ：５’−ＣＴＴＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＡＡＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＧＡＴＣＴＧＴＡＡＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＴ−Ｓ  ’（配列番号７）とプライマーＲ：５’−ＡＴＴＧＣＣＣＴＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＴＡＡＧ−３’（配列番号８）とともに用いて得た。
【００６８】
ＨＡ−ＵＮＣ５Ｈ２（ｐｃＤＮＡ３．１中）はすでに記載されており７、ＦｌａｇＭ２−ＵＮＣ５Ｈ２をコードする構築物を、鋳型としてのＨＡ−ＵＮＣ５Ｈ２に由来するＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ  ＰＣＲ断片および以下のプライマー：プライマーＦ  ５’−ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＧＣＧＧＧ−３’（配列番号９）およびプライマーＲ  ５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１０）をｐ３ｘＦｌａｇ−ＣＭＶＴＭ−７．１(Sigma)にクローニングすることにより作製した。
【００６９】
ｐＣ４Ｍ中のＨＡ−Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣ−およびｃ−ｍｙｃ−Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣは、それぞれ以下のプライマー：ＵＮＣ５Ｈ２−ＨＡ  Ｆ  ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１１）とＵＮＣ５Ｈ２−ＨＡ  Ｒ  ５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＡＴＡＡＴＣＣＧＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１２）、およびＵＮＣ５Ｈ２−ｍｙｃ  Ｆ  ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＡＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１３）およびＵＮＣ５Ｈ２−ｍｙｃ  Ｒ  ５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡ  ＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１４）を用い、ＵＮＣ５Ｈ２細胞内ドメインのＰＣＲ増幅により作製した。これらのＰＣＲ断片をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ制限消化によりＨＡ−Ｆｖ２Ｅにクローニングした。
【００７０】
次に、ＨＡ−Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣおよびｃ−ｍｙｃ−Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、それぞれ以下のプライマー：Ｆｖ２Ｅ  Ｆ  ５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＧＣＡ−３’（配列番号１５）とＵＮＣ５Ｈ２−ＨＡ  Ｒ  ５’−ＴＣＡＴＧＣＡＴＡＡＴＣＣＧＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＣＧＧＡＴＡＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１６）、およびＦｖ２Ｅ  Ｆ  ５’−ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＴＡＧＣＡ−３’（配列番号１５）とＵＮＣ５Ｈ２−ｍｙｃ  Ｒ  ５’−ＴＣＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＧＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１７）、および各鋳型としてｐＣ４Ｍ中のＨＡ−Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣおよびｃ−ｍｙｃ−Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣを用いたＰＣＲにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＯＰＯへサブクローニングした。
【００７１】
ＤＣＣの第５のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインの細菌発現を可能とするＰｓ９７４−ＤＣＣ−５Ｆｂｎを、鋳型としてｐＤＣＣ−ＣＭＶ−Ｓを用いたＰＣＲにより作製したＰｓｔ１／ＢａｍＨ１  ＤＮＡ断片を挿入することにより得た。
【００７２】
ＤＣＣ−５Ｆｂｎの産生：
ＤＣＣ−５Ｆｂｎの産生は、標準的な手順を用いて行った。要するに、ＢＬ２１細胞は、イミダゾールに応答してＤＣＣ−５Ｆｂｎを強制的に発現し、このＢＬ２１溶解液に対してＦｌａｇ−アガロース(Sigma)を用い、アフィニティークロマトグラフィーを行った。
【００７３】
免疫沈降：
従前に記載されたように２１、種々のタグ付き構築物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して免疫沈降を行った。要するに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、プロテアーゼ阻害剤の存在下、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＮＰ−４０に溶解させ、さらに抗ＨＡ(Sigma)、抗ｃ−ｍｙｃ抗体(Sigma)、抗ＦｌａｇＭ２(Sigma)およびタンパク質Ａセファロース(Sigma)とともにインキュベートした。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄を行った。
【００７４】
結合アッセイおよびＥＬＩＳＡ競合アッセイ：
結合アッセイでは、ＤＣＣ−５Ｆｂｎ（１００ｎｇ）またはＩＬ３−Ｒ（R&D systems、６００ｎｇ）をｍａｘｉｓｏｒｐプレート(Nunc)にコーティングし、漸増用量のネトリン−１(Apotech)を加えた（０〜８００ｎｇ）。ＥＬＩＳＡ競合アッセイでは、ＤＣＣ−ＥＣ（R&D systems、１２５ｎｇ）をｍａｘｉｓｏｒｐプレートにコーティングした。次に、ネトリン−１−ＦｌａｇＭ２（５０ｎｇ）および競合物ＤＣＣ−ＥＣ（１２５ｎｇ）またはＤＣＣ−５Ｆｂｎ（６２５ｎｇ）を同時に加えた。洗浄後、結合アッセイまたはＥＬＩＳＡ競合アッセイの双方で、なお固定されている残存ネトリン−１−ＦｌａｇＭ２を抗ＦｌａｇＭ２抗体(Sigma)で明らかにした。
【００７５】
ＤＣＣ／ネトリン−１  ＥＬＩＳＡアッセイ：
ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ（１．２５ｎｇ／ｍｌ）またはＵＮＣ５Ｈ２−ＥＣ−Ｆｃ（０．５ｎｇ／ｍｌ）を、製造業者の説明書に従い、９６ウェルｍａｘｉｓｏｒｐプレート(Nunc)に吸収させた。次に、Ｆｌａｇタグ付きネトリン−１（０．５ｎｇ／ｍｌ）を漸増濃度のＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃとともに加えた。１時間インキュベーションした後、プレートを十分洗浄し、結合したネトリン−１を、抗ｆｌａｇＭ２抗体(Sigma)およびＨＲＰ−ヤギ抗マウス(Jackson)を用いた免疫標識により検出した。比色定量測定はマルチラベルビクターステーション(Wallac)で行った。
【００７６】
細胞死アッセイ：
６７ＮＲ、４Ｔ１、ＣＡＬ５１、Ｔ４７ＤおよびＳＫＢＲ７を血清不足培地で増殖させ、２４時間ＤＣＣ−ＥＣ−ＦｃまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎで処理した（または処理なし）。細胞死は、従前に記載されているような６トリパンプルー染色法を用いて分析した。細胞死の程度は、種々の細胞集団におけるトリパンプルー陽性細胞の割合％として表す。トランスフェクト細胞を選択するため、細胞を表面マーカーｐＫｋと目的遺伝子をコードするプラスミドで同時トランスフェクトした。マーカーを発現するトランスフェクト細胞をＭＡＣＳｅｌｅｃｔマイクロビーズで磁気標識し、ＭＡＣＳセパレーターおよびセパレーションカラム(Miltenyi Biotec)を用いて分離した。これらの精製細胞でトリパンプルー排除をアッセイした。また、細胞生存率も、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＭＴＴアッセイキット(Molecular Probes)を製造業者の手順に従って用い、ＭＴＴアッセイにより測定した。
【００７７】
カスパーゼ活性の測定：
相対カスパーゼ活性を次のようにフローサイトメトリー分析により測定した：２×１０５個の処理細胞を採取し、１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、ＦＩＴＣ−ＶＡＤ−ｆｍｋ(CaspACE, Promega)を含有する２００μｌの染色溶液に再懸濁させた。３７℃で６０分インキュベーションした後、細胞を１ｍｌのＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリー分析のために２００μｌのＰＢＳに再懸濁させた。染色細胞を、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ(Becton Dickinson)ならびに励起および発光設定をそれぞれ４８８ｎｍおよび５２５〜５５０ｎｍ（フィルターＦＬ１）としたＣｅｌｌＱｕｅｓｔ分析ソフトウエアを用いて計数した。カスパーゼ−３活性は、BioVisionからのカスパーゼ−３アッセイを用いて測定した。カスパーゼ活性は、サンプルのカスパーゼ活性とｐＣＭＶでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で測定されたカスパーゼ活性の間の比として表す。細胞死分析およびカスパーゼ活性測定では、ＡＰ２０１８７または／およびネトリン−１または／およびＤＣＣ−５Ｆｂｎを細胞培養培地に２０時間加え、１時間後に細胞を採集した。
【００７８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
ヒト乳癌におけるネトリン−１発現をアッセイするため、乳癌手術を受けた患者の生検から、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡＩＩキット(Macherey-Nagel)を用いて全ＲＮＡを抽出し、１μｇを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット(BioRad)を用いて逆転写させた。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ２．０装置(Roche)にて、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＥＲＧｒｅｅｎ  Ｉキット(Roche)を用いて行った。
【００７９】
あらゆる最適な増幅に関する反応条件ならびにネトリン−１のプライマー選択はすでに記載されているように１８して決定した。正常組織と乳癌組織間で発現の変動が小さい偏在発現性のヒトＰＢＧＤ、ＴＢＰおよびマウスＲＰＬＰ０遺伝子２５，２８を内部対照として用いた。以下のプライマーを用いた。
【００８０】
ＰＢＧＤ：
ＦＯＲ：５’−ＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＧＴＡＴＴＣＧＧＧＧ−３’（配列番号１８）
ＲＥＶ：５’−ＣＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＴＧＧＴＣＣＴＴ−３’（配列番号１９）
ＴＢＰ：
ＦＯＲ：５’−ＣＡＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＣＡＣＴＧＡＴＴ−３’（配列番号２０）
ＲＥＶ：５’ＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＣＴＧＧＡＣ−３’（配列番号２１）
ヒトネトリン−１−ＮＴＮ  １：
ＦＯＲ：５’−ＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＡＴＧＣＣＧＴＣ−３’（配列番号２２）
ＲＥＶ：５’−ＧＣＴＣＧＴＧＣＣＣＴＧＣＴＴＡＴＡＣＡＣ−３’（配列番号２３）
ＵＮＣ５Ｂ：
ＦＯＲ：５’−ＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＣＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号２４）
ＲＥＶ：５’−ＧＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号２５）
ＤＣＣ：
ＦＯＲ：５’−ＡＧＣＣＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＴＡＣ−３’（配列番号２６）
ＲＥＶ：５’−ＡＧＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号２７）
ＵＮＣ５Ｃ：
ＦＯＲ：５’−ＧＣＡＡＡＴＴＧＣＴＧＧＣＴＡＡＡＴＡＴＣＡＧＧＡＡ−３’（配列番号２８）
ＲＥＶ：５−ＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＧＧＣＴＡＡＡＴＣＴＴ−３’（配列番号２９）
【００８１】
マウス、静脈内および乳腺注射、転移発生の測定：
同系マウスモデル。Jackson Laboratoryからの８〜１１週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスを外科術に用いた。６７ＮＲ細胞の乳腺注射では、マウスを２，２，２−トリブロモエタノールで麻酔し、５０μｌのＰＢＳ中１０６細胞の乳腺に注射し、腫瘍が１．５ｃｍを超え、動物の運動に障害が生じた時にマウスを犠牲にした。静脈注射では、１５０μｌのＰＢＳ中１０５個の腫瘍４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を尾の静脈に注射し、１３〜１５日目（４Ｔ１細胞注射後）または２０〜２３日目（６７ＮＲ細胞注射後）のいずれかにマウスを犠牲にし、発光記録を用いて分析した。動物を犠牲にした際、肺を摘出し、秤量し、動物の全体重と比較し、転移結節（nodules）を計数した。
【００８２】
ヌードマウスにおける異種移植：
５週齢（体重２０〜２２ｇ）の雌無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスをCharles Riverから入手した。これらのマウスを無菌フィルタートップのケージで飼育し、病原体フリーの動物施設で維持した。ヒト乳癌細胞系統（ＳＫＢＲ７、Ｔ４７ＤおよびＨ３５８）を、マウスの左側腹部へのＰＢＳ２００μＬ中の５×１０６細胞の皮下注射により移植した。腫瘍が確立された際に（Ｔ４７Ｄでは５週間、ＳＫＢＲ７では２週間、Ｈ３５８では５日間）、ＰＢＳまたは２０μｇのＤＣＣ−５Ｆｂｎをその腫瘍（ｉ．ｔ．）に１４日間毎日投与した。腫瘍の大きさをカリパスで測定した。腫瘍体積は、式ｖ＝（０．５＊（長さ＊幅２）で算出した。
【００８３】
腫瘍分析：
４μｍ厚の肺切片を作製し、ヘマトキシリン−エオジン−サフランで染色した。組織学的分類および腫瘍性病変の等級付けは標準的な手順に従い、盲検として行った。４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を用いた転移のin vivoイメージングでは、腹腔内注射した内毒素不含ルシフェリン(Promega)（１２０ｍｇ／体重ｋｇ）の生物発光酸化から得られた光を検出し、Berthold Technologies製のＮｉｇｈｔＯＷＬ  ＬＢ  ９８１  ＮＣ  １００システムにて、ＴＥＭ  ＳＥＧＡ製のイソフランガスによる麻酔系を用いて定量した（注射１０分後）。
【００８４】
実施例２：ネトリン−１はアポトーシス阻害による乳癌の転移を指示する
本発明者らは、まず、３０の乳房原発腫瘍のパネル（そのうち１５は既知の転移発達がなく、１５は診断上転移を持つ）でネトリン−１およびその依存性受容体、すなわち、ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈの発現をＱ−ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＤＣＣはかろうじて検出可能なだけであり、ＵＮＣ５Ｈは２種類の腫瘍間で有意な差を示さなかったが、ネトリン−１は、非転移性乳癌の場合よりも転移製乳癌で有意に発現が高いことが明らかであった（図１Ａ）。
【００８５】
供試した転移製乳癌の６０％が、ネトリン−１の過剰発現を示した（１．４〜９．６倍の範囲、ｐ＜０．０１５）（表１）。
【００８６】
表１：過剰発現の範囲と同様に、非転移性生検における平均発現よりも高いネトリン−１発現を示すサンプルの割合％を示す。
【表１】
0005602368.tif 000002
【００８７】
マウスでは、Millerおよび共同研究者らが転移性腫瘍と非転移性腫瘍の生物学を研究するための有力なモデルを開発している。ＢＡＬＢ／ｃマウスで天然に生じた単一の原発乳癌から、同系マウスに注射した際に種々の転移能を示す一連の細胞系統が得られた。特に、６７ＮＲ細胞は原発乳癌を形成するが、転移はなく、４Ｔ１細胞は原発腫瘍を形成し、特に肺、骨髄および肝臓に転移する２０。興味深いことに、ネトリン−１は６７ＮＲ細胞では検出できないが、４Ｔ１細胞では、ネトリン−１の発現が高かった（図１Ｂ）。
【００８８】
６７ＮＲ細胞に比べ、４Ｔ１細胞の転移能がネトリン−１発現に関連しているかどうかをアッセイするため、６７ＮＲ細胞にネトリン−１を強制的に安定発現させた。Ｍｏｃｋトランスフェクト６７ＮＲ細胞またはネトリン−１を発現する６７ＮＲ−ｎｅｔ細胞（図２Ａ、２Ｂ）を乳腺に注射するか、静脈投与し、転移を肺の解剖病理学的検査によりモニタリングした。脂肪体に注射した際には、両細胞系統とも、転移を形成しなたかったが、このことは、６７ＮＲにおけるネトリン−１の存在が、原発部位から肺転移を形成させるに十分ではないことを示唆している。しかしながら、細胞を静脈注射した際には、ネトリン−１発現６７ＮＲで肺における有意な転移増加が検出された（図２Ｃ）。
【００８９】
胸膜下（肺外の転移）および実質性結節内（肺内の転移）の数を示す表２を参照。
【００９０】
表２：
【表２】
0005602368.tif 000003
【００９１】
よって、ネトリン−１発現は、おそらくは静脈注射(intravation)後に腫瘍細胞を指向することにより転移形成を補助する重要な事象であることが明らかである。
ネトリン−１は静脈注射後の６７ＮＲ細胞の転移能に十分であることが明らかであり、ネトリン−１はネトリン−１依存性受容体により誘発される細胞死を阻害することが示されている６，７，１８ことから、本発明者らは次に、これらの細胞においてＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈにより誘発される細胞死を阻害することにより、ネトリン−１の自己分泌産生が４Ｔ１細胞に選択的優位性をもたらすかどうかを検討した。ネトリン−１のＮ末端に位置するドメイン（いわゆるラミニン−ＶＩドメイン）はＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ受容体の双方と相互作用し（図３Ａ；２１）、その結果、ＤＣＣの可溶性細胞外ドメイン（ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ）はＤＣＣ／ネトリン−１およびＵＮＣ５Ｈ／ネトリン−１双方の相互作用を阻害することができる（示されていない）。次に、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃを４Ｔ１細胞の培養物に加え、トリパンプルー排除アッセイ（図３Ｂ）またはカスパーゼ活性の測定（図３Ｃ）のいずれかにより細胞死をモニタリングした。図３Ｃに示されるように、培養培地中への競合タンパク質の添加は、用量依存的に４Ｔ１細胞の細胞死を誘発する。さらに、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃは６７ＮＲ細胞死に影響を及ぼさず、また、ＩＬ３Ｒ−ＥＣ−Ｆｃ（ＩＬ３受容体の細胞外ドメイン）は４Ｔ１の細胞死を誘発できないことから、この作用は特異的なものである（図３Ｂ、３Ｃ）。４Ｔ１細胞において過剰量のネトリン−１をＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃとともに加えると、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃのアポトーシス促進活性を阻害した（示されていない）ことから、この作用はネトリン−１の阻害によるものである。競合をより小さなドメインに限定するため、本発明者らは、ネトリン−１と相互作用することが知られている２１、ＤＣＣの第５のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを作製した。このドメイン−ＤＣＣ−５Ｆｂｎ−の添加は４Ｔ１細胞に同様なアポトーシス促進活性を示した（図３Ｄ）。よって、ネトリン−１はマウスにおいて腫瘍細胞に転移能を付与することは明らかであるが、これらのネトリン−１を発現する転移性腫瘍細胞はネトリン−１／受容体相互作用の阻害によってアポトーシスへ向かうことが約束される。
【００９２】
このことがヒト乳癌細胞でも同じかどうかをさらに分析するために、ネトリン−１の発現をヒト転移性乳癌細胞系統のパネルで分析した（表３参照）。
【００９３】
表３：
【表３】
0005602368.tif 000004
【００９４】
表３は、図１Ａ、１Ｂと同様に、Ｑ−ＲＴ  ＰＣＲによりネトリン−１発現に関して分析した種々のヒト転移性乳癌細胞系統およびトリパンプルー排除による細胞死の測定によるＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ感受性を示す。ネトリン−１発現の相対量およびＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ感受性は（＋）で示し、これらの基準が存在しない場合は（−）で示す。いくつかの細胞系統において、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃは判定されなかった（不検出）。
【００９５】
予測されたように、ネトリン−１は大多数の転移性細胞系統で発現し、それらのいくつかがＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃの存在下で培養した際にアポトーシスを受ける。一例として、ＣＡＬ５１細胞はＤＣＣ−Ｅｃ−Ｆｃに応答して用量依存的にアポトーシスを受けた。上記のように、過剰量のネトリン−１を加えるとＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃの作用が復帰するが、このことは、競合タンパク質がネトリン−１／ネトリン−１受容体相互作用を阻害することによりこれらのヒト細胞系統を死滅させるという見解を裏付ける。さらに、ＣＡＬ５１細胞からのクローン選択により、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃに応答した細胞死を極めて受けやすいＣＡＬ５１−３６細胞系統の確立が可能であった（図４Ｂ）。結果として、ＤＣＣ−ＥＣ−ＦｃまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎは、ヒト転移性腫瘍細胞の選択的アポトーシスを誘発する優れたツールとなり得る。
【００９６】
ここで、本発明者らは、ネトリン−１発現が乳癌拡散のマーカーとして考えられ得ることを示す。転移性を有する乳癌の半数以上がネトリン−１発現の上昇を示した。上記のマウスモデルおよびヒト乳癌細胞系統で得られたデータは双方とも、このネトリン−１レベルの上昇が、癌細胞が獲得したネトリン−１依存性受容体により誘発されるアポトーシスを回避し、その結果、ネトリン−１の利用可能性とは独立して生存するための選択的優位性であるという見解を裏付ける。機構的観点から、このネトリン−１の自己分泌発現は、ＵＮＣ５Ｈにより誘発される細胞死を阻害する。実際に、ＤＣＣは、研究した乳癌の転移性および非転移性の２群ではかろうじて検出可能なだけであり、ゆえに、ＤＣＣは乳房腫瘍形成の初期にダウンレギュレーションされるか、または乳房組織では弱い発現しか示さないかのいずれかであることが示唆される。さらに、ＵＮＣ５Ｈにより誘発されるアポトーシスの、ＵＮＣ５Ｈアポトーシス促進活性のドミナントネガティブ突然変異型の共発現による阻害は、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃに応答したＣＡＬ５１細胞死を阻害する（示されていない）。このことは、ＵＮＣ５Ｈ２アポトーシス促進活性の一部が、転移調節に関与する２３タンパク質であるセリン／トレオニンＤＡＰＫ２２の活性化を通り抜けるという最近の知見と一致していると考えられる。
【００９７】
これらの知見は腫瘍発達の調節におけるリガンド／依存性受容体の重要性の証拠となるだけでなく、新たな治療戦略も啓発する。実際に、現在、転移性乳癌患者に効果的な治療は無く、治療法が無いことが世界で年間４００，０００人の女性の死をもたらしている２４。ここで、本発明者らは、ネトリン−１とその依存性受容体の間の相互作用の阻害に基づく治療が、転移性乳癌に苦しむ患者の半数にプラスの影響を及ぼすことを提案する。これらの治療は、本明細書に示される化学薬剤、モノクローナル抗体またはＤＣＣ−５Ｆｂｎタンパク質を含み得る。これは、原発乳癌を有すると診断された女性に対して長期予防処置を与えるような転移形成を予防する戦略として考えるべきか、転移の退縮を誘発するために使用可能な戦略として考えるべきかはまだ分かっていない。今後の臨床試験もこの点に答えなければならない。
【００９８】
ここで、本発明者らは、ヒト非転移性乳癌とは異なり、大多数の転移性乳癌はネトリン−１の過剰発現を示すことを述べる。マウスモデルでは、本発明者らは、非転移性乳房腫瘍細胞において、強制的なネトリン−１発現が肺における転移と関連していることを示す。さらに、ネトリン−１発現が高いことが示されたマウスまたはヒト転移性腫瘍細胞系統は、ネトリン−１／受容体相互作用が競合タンパク質により阻害される場合にアポトーシスを受ける。よって、ネトリン−１は転移性乳癌などのヒト転移性癌のマーカーであり、ネトリン−１／受容体相互作用の阻害は転移性細胞の死を誘発するための治療アプローチとなる。
【００９９】
実施例３：転移性乳癌においてネトリン−１依存性受容体経路の回復はアポトーシスを誘発する
５１の乳癌パネルにおいて、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲにより、ネトリン−１およびその依存性受容体、すなわち、ＤＣＣ、ＵＮＣ５Ｈ２、ＵＮＣ５Ｈ３の発現を分析した。それは腫瘍が乳房に局在している患者（Ｎ０、１６人）、節が関与している（nodal involvement）患者（Ｎ＋、１９人）または診断時に遠位転移症を有する患者（Ｍ＋、１６人）を含む。ＤＣＣはかろうじて検出可能なだけであり、ＵＮＣ５Ｈ発現はことなる腫瘍種間で有意な変化を示さない（示されていない）が、ネトリン−１はＮ０腫瘍よりもＮ＋腫瘍で有意に発現が高く（中央値：１．８と０．５、ｐ＝０．００７）、ネトリン−１発現の範囲はＮ＋腫瘍で高かった（図５および表４）。
【０１００】
表４：過剰発現の範囲と同様、Ｎ０生検での平均発現よりも高い、５倍高いまたは１５倍高いネトリン−１発現を示すサンプルの割合％を示す。
【表４】
0005602368.tif 000005
【０１０１】
Ｎ＋腫瘍の３１．５％はネトリン−１発現において少なくとも５倍の上昇を示すが、このような上昇は供試したＮ０腫瘍では検出されなかった（図５および表４）。Ｍ＋とＮ０腫瘍におけるネトリン−１発現を比較した場合にずっと著しい違いが見られる（中央値：７．８と０．５、ｐ＜０．０００１）。この線に沿って、Ｍ＋腫瘍の６２．５％がネトリン−１発現において少なくとも５倍の上昇を示す。Ｎ＋腫瘍とＭ＋腫瘍の間にもネトリン−１発現の有意な違いが存在する（中央値：１．８と７．８、ｐ＝０．００９）。さらに、ネトリン−１過剰発現は、Ｍ＋腫瘍の３７．５％がネトリン−１レベルに１５倍を超える上昇を示すが、このような上昇はＮ＋腫瘍では検出されないことから、Ｎ＋腫瘍よりもＭ＋腫瘍で高い（図５および表４）。よって、ネトリン−１のアップレギュレーションは、ヒト乳癌における節の関与および遠位転移症のマーカーである。
【０１０２】
マウスでは、Millerおよび共同研究者らが転移性腫瘍と非転移性腫瘍の生物学を研究するための有力なモデルを開発している。ＢＡＬＢ／ｃマウスで天然に生じた単一の原発乳癌から、同系マウスに注射した際に種々の転移能を示す一連の細胞系統が得られた。特に、６７ＮＲ細胞は原発乳癌を形成するが、転移はなく、４Ｔ１細胞は原発腫瘍を形成し、特に肺、肝臓および骨髄に転移する２０。興味深いことに、ネトリン−１は６７ＮＲ細胞では検出できないが、４Ｔ１細胞では、ネトリン−１の発現が高かった（図１Ｂ）。
【０１０３】
まず、６７ＮＲ細胞に比べ、４Ｔ１細胞の転移能がネトリン−１発現に関連しているかどうかをアッセイするため、６７ＮＲ細胞にネトリン−１を強制的に安定発現させた。Ｍｏｃｋトランスフェクト６７ＮＲ細胞またはネトリン−１を発現する６７ＮＲ細胞（図２Ａおよび２Ｂ）を乳腺に注射し、転移を解剖病理学的検査によりモニタリングした。両細胞系統とも、マウスの脂肪体に注射した際に肝臓または肺において有効に転移を形成しなたかった（１９匹にネトリン−１を発現する６７ＮＲ細胞を注射し、肺１件、肝臓１件の２件の微小転移の疑いしか検出されなかった）（表５）。
【０１０４】
表５：脂肪体に注射された６７ＮＲとネトリン−１発現細胞の肺および肝臓転移。ピューロマイシン耐性を有する対照細胞クローン（６７ＮＲ−ｍｏｃｋ）１つ、ネトリン−１発現細胞クローン（６７ＮＲｎｅｔ１）１つ、およびネトリン−１で安定トランスフェクトされた６７ＮＲポリクローナル集団（６７ＮＲ−ｎｅｔ１−ポリクローナル）１つをマウスの脂肪体に注射し、肺または肝臓環境における転移を分析した。
【表５】
0005602368.tif 000006
【０１０５】
よって、腫瘍細胞におけるネトリン−１発現は原発部位からの転移形成を可能とするに十分でない。
【０１０６】
ネトリン−１はネトリン−１依存性受容体により誘発される細胞死を阻害することが示されている６，７，８ことから、本発明者らは次に、転移性４Ｔ１細胞で検出されたネトリン−１の自己分泌産生が、ＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈにより誘発される細胞死を阻害することにより、これらの細胞に選択的優位性を付与するかどうかを検討した。これをアッセイするため、本発明者らはネトリン−１を滴定することができる化合物を探した。ネトリン−１のＮ末端に存在するドメイン（いわゆるラミニン−ＶＩドメイン）はＤＣＣ受容体およびＵＮＣ５Ｈ受容体の双方と相互作用することが報告されている（図３Ａ；２１）。本発明者らは、ＤＣＣの可溶性細胞外ドメイン（ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ）は、ＥＬＩＳＡアッセイにより測定されるように、ＤＣＣ／ネトリン−１相互作用およびＵＮＣ５Ｈ２／ネトリン−１相互作用の双方を阻害し得ることを示す（図６Ａ）。次に、４Ｔ１細胞の培養物にＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃを加え、トリパンプルー排除アッセイ（図３Ｂおよび６Ｂ）またはフローサイトメトリーによるカスパーゼ活性の測定（図３Ｃおよび６Ｃ）のいずれかによって細胞死をモニタリングした。図３Ｂ、３Ｃ、６Ｂおよび６Ｃに示されているように、培養培地への競合タンパク質の添加は、４Ｔ１細胞の細胞死を用量依存的に誘発する。ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃは６７ＮＲ細胞死に作用を示さず（図３Ｂ、３Ｃ、６Ｂおよび６Ｃ）、ＩＬ３  Ｒ−ＥＣ−Ｆｃ（ＩＬ３受容体の細胞外ドメイン）は４Ｔ１細胞死を誘発できない（図３Ｄ）ことから、この作用は特異的である。よって、ネトリン−１受容体により誘発される細胞死を遮断するネトリン−１の自己分泌産生によって生存する。
【０１０７】
ＤＣＣの完全細胞外ドメインはin vivoおよび療法における使用としてはそれほど注目されていないので（ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃは約１１００アミノ酸の大きさである）、本発明者らはＤＣＣ細胞外ドメインから、４Ｔ１細胞においてアポトーシスを誘発し得る代わりのポリペプチドを探した。本発明者らはその結果、ネトリン−１と相互作用することが知られている２１、ＤＣＣの第５のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインであるＤＣＣ−５Ｆｂｎを作製した（図３Ａ）。興味深いことに、この１００アミノ酸のタンパク質は、ＤＣＣ／ネトリン−１またはＵＮＣ５Ｈ／ネトリン−１の結合に干渉しないが、ネトリン−１の、これらの受容体の多量体化を誘発する能力に影響を及ぼす（実施例４参照）。ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈの多量体化は、ＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈにより誘発される細胞死に対するネトリン−１阻害活性の先行条件であるので、ＤＣＣ−５Ｆｂｎの添加はネトリン−１の存在下で培養されたＤＣＣ発現細胞においてアポトーシスを誘発し２２、両４Ｔ１の死を誘発する（図７Ａ）。
【０１０８】
本発明者らは次に、in vitroで見られた細胞死作用がin vivoに拡張可能かどうかを検討した。そのために、４Ｔ１細胞をルシフェラーゼに基づくベクターで安定トランスフェクトし、および４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内に（ｉ．ｖ．）注射した。次に、マウスに０日目から１３日目に、ＰＢＳバッファーまたはＦｌａｇタグ付きＤＣＣ−５Ｆｂｎ（１．２５μｇ／マウスｇ／注射）のいずれかを腹腔内（ｉ．ｐ．）および静脈内に注射した（２日ごとに１注射、一度ｉ．ｖ．、一度ｉ．ｐ．）。その後、発光記録を用いて転移形成を分析した。図７Ｂおよび７Ｃに示されるように、静脈注射した際に、４Ｔ１−ｌｕｃ細胞は効果的に肺に定着する。これに対し、ＤＣＣ−５Ｆｂｎで処理したマウスは肺転移の劇的な低下を示す（図７Ｂおよび７Ｃ）。次に、この転移形成の阻害を肺の解剖病理学的検査により確認した（示されていない、表６参照）。
【０１０９】
表６：個々のマウスにおける肺転移節の総数を２つの処理集団（＋ＰＢＳ、＋ＤＣＣ−５Ｆｂｎ）において解剖顕微鏡下で計数した。
【表６】
0005602368.tif 000007
【０１１０】
Ｆｌａｇタグ付きＤＣＣ−５Ｆｂｎの代わりにＧＳＴタグ付きＤＣＣ−５ＦｂｎおよびＰＢＳの代わりにＧＳＴ−ＦＡＤＤを毎日腹腔内注射したところ、同様の結果が得られた（示されていない）。よって、マウスにおいて、ネトリン−１の自己分泌発現により付与された生存活性のＤＣＣ−５Ｆｂｎによる阻害は転移の予防に関連する。
【０１１１】
このネトリン−１自己分泌発現を介して獲得された生存の有意性は、ヒト乳癌細胞系統でも検出されるので、ネズミ腫瘍細胞に限定されない。実際、ネトリン−１はヒト乳癌系統のかなりの部分で発現することが示されており（図８Ａ）、天然にネトリン−１を発現するヒト乳腺癌Ｔ４７ＤまたはＳＫＢＲ７細胞培養物にＤＣＣ−ＥＣ−ＦｃまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎを加えると、カスパーゼ−３活性アッセイまたはＭＴＴアッセイのいずれかにより測定される細胞死の誘導が誘発される（図８Ｂおよび示されていない）。過剰量のネトリン−１を添加するとこのＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ／ＤＣＣ−５Ｆｂｎのアポトーシス促進活性は阻害された（示されていない）ので、この作用はネトリン−１阻害によるものである。ＤＣＣ−５Ｆｂｎの抗腫瘍作用をモニタリングするため、Ｔ４７Ｄ細胞の異種移植片をヌードマウスに移植した。腫瘍が触知可能な大きさに達したところで、マウスをＰＢＳまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎで毎日処理し、腫瘍体積を１８日間測定した。上記の同系モデルで得られたデータと同様に、ＤＣＣ−５Ｆｂｎは腫瘍増殖を完全に阻害する（表７）。
【０１１２】
表７：ＰＢＳまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎのいずれかで処理された異種移植Ｔ４７Ｄ腫瘍の数および挙動を示す。４０％を超える大きさに成長した腫瘍の数と退縮した（３０％を超えて）腫瘍の数を示す。
【表７】
0005602368.tif 000008
【０１１３】
ここで、本発明者らは、ネトリン−１発現が乳癌が拡散する能力のマーカーとして考えられ得ることを示す。転移性を有する乳癌のほとんどが、ネトリン−１発現の上昇を示した。上記のヒト／マウス乳癌細胞系統および同系／ヒト異種移植マウスモデルの双方で得られたデータは、このネトリン−１レベルの上昇が、癌細胞が獲得したネトリン−１依存性受容体により誘発されるアポトーシスを回避し、その結果、ネトリン−１の利用可能性とは独立して生存するための選択的優位性であるという見解を裏付ける。機構的観点から、ヒト病態において、このネトリン−１の自己分泌発現は、おそらくＵＮＣ５Ｈにより誘発される細胞死を阻害する。実際に、ＤＣＣは、研究した種々の乳癌群（Ｎ０、Ｎ＋、Ｍ＋）ではかろうじて検出可能なだけであり、ゆえに、ＤＣＣは乳房腫瘍形成の初期にダウンレギュレーションされるか、または乳房組織では弱い発現しか示さないかのいずれかであることが示唆される。さらに、ＵＮＣ５Ｈにより誘発されるアポトーシスの、ＵＮＣ５Ｈアポトーシス促進活性のドミナントネガティブ突然変異型の共発現による阻害は、ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃに応答したヒト乳癌の細胞死を阻害する（示されていない）。
【０１１４】
従って、依存性受容体モデルにより推定されるように、本発明者らはここで、腫瘍細胞は少なくとも３つの様式で依存性受容体の依存性を回避し得ることを示した。第一に、依存性受容体の発現はＤＣＣおよびより最近ではＵＮＣ５Ｈに関して包括的に記載されているように１５，１７，１９，２９、ダウンレギュレートされ得る。第二に、この下流細胞死シグナルが遮断され得る。この線に沿って、本発明者らは最近、ＵＮＣ５Ｈ２アポトーシス促進活性が、ヒト悪性腫瘍において転移調節に関与し、ダウンレギュレーションされている２３ことが示されているタンパク質であるセリン／トレオニンＤＡＰＫ２２に対するＵＮＣ５Ｈ２の結合によることを示した。この線に沿って、Stupackおよび共同研究者らによる最近の報告は、依存性受容体として働くいくつかのインテグリンの場合、これらのインテグリンにより媒介される細胞死を誘発するカスパーゼ−８が神経芽腫転移に重要であることを示している３０。ここで、本発明者らは、腫瘍細胞の第三の選択的優位性が依存性リガンドの自己産生であることを示している。１つの興味深い問題はなお、結腸直腸癌ではネトリン−１発現の獲得よりもむしろ、たいていの場合受容体の選択された欠損を有しているのに対し（実際、ネトリン−１発現増加を示すのは、結腸直腸癌の７％に過ぎない１８）、なぜ転移性を有する乳癌は受容体の欠損よりもむしろ好ましくは選択されたネトリン−１の自己産生を有していると思われるかということである。可能性のある説明としては、ネトリン−１発現は移動中の細胞に対して生存増を付与するだけでなく、おそらくはネトリン−１受容体の非アポトーシス／陽性シグナル伝達増も付与する。この線に沿って、ネトリン−１が、完全には分かっていないまでも転移性細胞の向性に役割を果たし得る手掛かりとして最初に記載されたということに着目することが重要である。提案されている他のネトリン−１の役割としては、接着および形態形成調節があり３２，３４、両機構とも転移の発生に重要である可能性がある。同様に、最近、ネトリン−１は胚の脈管形成中に役割を果たすということが提案されており、たとえ矛盾する結果が発表されているとしても３６〜３８、本発明者らはこの段階で、ともかく二次的部位における転移の発生を指向し得る脈管形成因子としてのネトリン−１の役割を排除することはできない。しかしながら、非転移性細胞でネトリン−１を強制的に発現させても転移形成は伴わないことから、このネトリン−１の自己分泌発現による「陽性」シグナル伝達増は、おそらくそれ自体では転移促進には十分でない。
【０１１５】
これらの知見は腫瘍発達の調節におけるリガンド／依存性受容体の重要性の証拠となるだけでなく、新たな治療戦略も啓発する。実際に、現在、転移性乳癌患者に効果的な治療は無く、治療法が無いことが世界で年間４００，０００人の女性の死をもたらしている２４。ここで、本発明者らは、ネトリン−１とその依存性受容体の間の相互作用の阻害に基づく治療が、乳癌などの転移性癌に苦しむ患者、すなわち、原発腫瘍において高いネトリン−１発現を示す患者の多くにプラスの影響を及ぼすことを提案する。これらの治療は、本明細書に示される化学薬剤、モノクローナル抗体またはＤＣＣ−５Ｆｂｎタンパク質を含み得る。
【０１１６】
実施例４：他のヒト腫瘍におけるネトリン−１発現およびネトリン−１活性の阻害
Ａ）ネトリン−１はヒト神経芽腫の悪性度のマーカーであり（図９Ａ、その説明文および表８参照）、ネトリン−１活性を阻害することにより神経芽腫細胞死が促進される（図１０Ｂおよびその説明文参照）。
【０１１７】
表８：２６の神経芽腫細胞系統（Centre Leon Berardで患者の腫瘍から直接得られたもの（ＣＬＢ−Ｘ）または典型的な神経芽腫細胞系統（ＩＭＲ３２、ＳＨＥＰ、ＳＨＳＹもしくはＳＫＮＡＳ））を、（ａ）Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによるネトリン−１発現に関する場合と同じように試験した。ネトリン−１レベルを（−）ネトリン−１なし、（＋、＋＋、＋＋＋）低〜高ネトリン−１レベルとして表示する。細胞系統のかなりの割合が高発現のネトリン−１を示すことが分かる。
【表８】
0005602368.tif 000009
【０１１８】
Ｂ）ネトリン−１は神経膠腫の大部分において過剰発現され（図１０Ａおよびその説明文参照）、ネトリン−１活性を阻害することにより神経膠腫細胞死が促進される（図１０Ｂおよびその説明文参照）。
【０１１９】
Ｃ）ネトリン−１はヒト肺癌において過剰発現され（図１１Ａ、その説明文および表９参照）、ネトリン−１活性を阻害することにより肺癌細胞死が促進され、肺癌発達が抑制される（図１２Ｃならびに図１２Ｄおよびそれらの説明文参照）。
【０１２０】
表９：小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）由来の肺癌細胞系統を、（ａ）Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲによるネトリン−１発現に関する場合と同じように試験した。ネトリン−１レベルを（−）ネトリン−１なし、（＋、＋＋）低〜高ネトリン−１レベルとして表示する。細胞系統のかなりの割合が高発現のネトリン−１を示すことが分かる。
【表９】
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【０１２１】
Ｄ）他のヒト腫瘍におけるネトリン−１発現
ネトリン−１の発現を、図１０Ａ〜図１０Ｂ、図１１Ａ〜図１１Ｃ、図１２Ａ〜図１２Ｂにおいて見られるような異なるヒト腫瘍から抽出された全ＲＮＡを用いてＱ−ＲＴ  ＰＣＲによって調べた。表１０では各病理における（ｎ）試験した腫瘍の数とネトリン−１の過剰発現を示す腫瘍の割合を示している。
【０１２２】
表１０：
【表１０】
0005602368.tif 000011
【０１２３】
実施例５：
ＤＣＣは、ネトリン−１が存在しない限り、単量体形態であるかどうかを分析するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＨＡタグ付き全長ＤＣＣをｃ−ｍｙｃタグ付き全長ＤＣＣとともに一時的に同時発現させた。次に、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降を行い、図１２Ａに示されるように、ＨＡタグ付きＤＣＣおよびｃ−ｍｙｃタグ付きＤＣＣの両方の良好な発現にもかかわらず、ＨＡ−ＤＣＣはリガンドの不在下ではｃ−ｍｙｃ−ＤＣＣプルダウンにわずかばかり含まれ、ＤＣＣは、ＨＥＫ２９３Ｔにおいてネトリン−１の不在下で発現させると、大部分はモノマーとして存在したということを示唆している。同じ試験条件において、ネトリン−１を培養培地に加えた際（示されていない、図１５Ｃ）またはネトリン−１発現構築物をＤＣＣ発現構築物と同時発現させた（図１１Ａ）際には、ＨＡ−ＤＣＣはｃ−ｍｙｃ  ＤＣＣプルダウンに明らかに含まれ、それゆえにネトリン−１がＤＣＣの二量体化または多量体化を誘発することを示している。この結果は、ネトリン−１による多量体化を最初に報告したTessier-Lavigneおよび共同研究者らのデータ４６と一致しており、本発明者らの培養条件および免疫沈降条件でも、ＤＣＣは、ネトリン−１の不在下で、検出可能ではあるがわずかなレベルの多量体化を示す。この構成的な低い多量体化レベルは、リガンドの不在下でのＤＣＣ受容体の自己に対する低親和性または高レベルの膜貫通型受容体の強制発現に基づいた、使用する系のいずれかに起因すると考えられた。
【０１２４】
本発明者らは、次に、他のＵＮＣ５Ｈ  ネトリン−１受容体が類似した挙動を有するかどうかを調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ネトリン−１の存在下または不在下でＨＡタグ付き全長ＵＮＣ５Ｈ２とＦｌａｇタグ付き全長ＵＮＣ５Ｈ２で一時的にトランスフェクトした。次に、抗ＦｌａｇＭ２抗体を用いて免疫沈降を行った。図１１Ｂに示されるように、ネトリン−１の存在はＨＡ−ＵＮＣ５Ｈ２とＦｌａｇ−ＵＮＣ５Ｈ２との効率的な免疫沈降を誘発する。そのため、ネトリン−１の不在下では、ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２は大部分は単量体形態であるが、ネトリン−１の存在下では、ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２の両方が多量体形成する傾向の増加を示す。
【０１２５】
ネトリン−１による多量体形成がＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２アポトーシス促進性細胞死の阻害に重大な工程であるかどうかを判定するために、本発明者らはタンパク質の二量体形成が化学薬品によって引き起こされ得るキメラ系を開発した。この系を使用して、カスパーゼ−８の活性化におけるカスパーゼ−８の二量体形成の役割４９とｐ７５ｎｔｒアポトーシス促進活性におけるｐ７５ｎｔｒ−多量体形成の重要性４８の両方を示すことに成功した。この系は、ＦｋＢＰモチーフを交差二量体形成するＦｋ１０１２化合物の能力によって得られる。ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２細胞内ドメインをそれらのＮ末端で融合して、Ｆｖ２ｅ  ＦｋＢＰモチーフ(motives)を得、ＡＰ２０１８７化学化合物を用いて二量体形成をもたらした（図１３Ａ）。本発明者らはまず、開発された系がネトリン−１によるＵＮＣ５Ｈ２細胞内ドメインの多量体形成を繰り返すかどうかを分析した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＨＡタグ付きＦｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣとｃ−ｍｙｃタグ付きＦｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣとで同時トランスフェクトし、抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて共免疫沈降を行った。図１３Ｂに示されるように、ＡＰ２０１８７を加えない場合には、ｃ−ｍｙｃ−Ｆｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣプルダウンにおいてＨＡ−Ｆｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣはほとんど検出されず、それゆえに、Ｆｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣがＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、大部分はモノマーとして発現されることを裏付けている。予想通り、ＡＰ２０１８７を加えることによりｃ−ｍｙｃ−Ｆｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣとのＨＡ−Ｆｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣの効率的なプルダウンにつながった。Ｆｖ２ｅ−ＤＣＣ−ＩＣとでも同様の結果が得られた（示されていない）。よって、この二量体形成系はネトリン−１受容体  ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２の細胞内ドメインの二量体形成を繰り返す。
【０１２６】
この化学的に誘発したＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２二量体形成系はネトリン−１によるＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２多量体形成に十分によく似た働きをするように思われるため、本発明者らは、さらに、ＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２の二量体形成がＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２アポトーシス促進活性を阻害するのに十分なものであるかどうかを評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＡＰ２０１８７の存在下または不在下でＦｖ２ｅ−ＤＣＣ−ＩＣを強制発現させ、ＤＣＣによる細胞死を測定するために、前述したように、トリパンプルー染色により細胞死を評価した６，２７。図１４Ａに示されるように、Ｆｖ２ｅ−ＤＣＣ−ＩＣの発現は、ＤＣＣ−ＩＣ融合を行わないＦｖ２ｅモチーフの発現と比較して細胞死の増加と関連していた。興味深いことに、ＡＰ２０１８７を加えた場合、Ｆｖ２ｅ−ＤＣＣ−ＩＣによってもたらされる細胞死は劇的に減少した（図１４Ａ）。同様に、Ｆｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣは、ＡＰ２０１８７の不在下でＨＥＫ２９３Ｔで発現させた場合、細胞死（図１４Ｂ）またはカスパーゼ活性化（図１４Ｃ）を誘発するが、二量体化剤の添加はＦｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣによる細胞死（図１４Ｂ）またはカスパーゼ活性化（図１４Ｃ）を大幅に減少させるのに十分である。上記のことから、単量体ＤＣＣ−ＩＣおよびＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣはアポトーシス促進するが、多量体形態のＤＣＣ−ＩＣまたはＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣはアポトーシス促進活性をもはや示さない。従って、この多量体化プロセスがＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２アポトーシス促進活性を遮断するのに十分であるように、ＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２−アポトーシス促進活性を阻害するネトリン−１の能力は、ＤＣＣまたはＵＮＣ５Ｈ２を多量体化するネトリン−１の能力と本質的に関連する。
【０１２７】
魅力的なモデルは、単量体形態のＤＣＣまたはＵＮＣ５Ｈ２が、その受容体の細胞内ドメインの初期カスパーゼ切断を受けやすい空間的コンフォメーションを有するというものであろう。逆に、リガンドの存在はその細胞内ドメインの多量体形成をもたらし、その細胞内ドメインが何らかの形でカスパーゼ切断を受けにくくなると思われる。この線に沿って、Arakawaおよび共同研究者らは、ＵＮＣ５Ｈ２のカスパーゼ切断がネトリン−１の存在によって阻害されることを示した４７。しかし、技術的な制限により、本発明者らはＦｖ２ｅ融合タンパク質を強制発現させた細胞ではＤＣＣまたはＵＮＣ５Ｈ２切断を検出することができなかった。切断阻害の代替モデルは、ネトリン−１による受容体の多量体化が生存シグナルを誘発し、その生存シグナルが何らかの形で構成的カスパーゼ切断に関連するＤＣＣまたはＵＮＣ５Ｈ２の構成的アポトーシス促進活性を阻害するというものであろう。しかしながら、本発明者らはネトリン−１の結合においてＤＣＣによって活性化される既知の陽性シグナル伝達経路が、ＤＣＣアポトーシス促進活性に対するネトリン−１の阻害活性に関与するということを示すことができなかった。例えば、ネトリン−１は、抗アポトーシス効果を示すことが分かっているキナーゼであるＥＲＫ−１／２のＤＣＣ媒介活性化を引き起こす３。しかしながら、ＥＲＫ−１／２経路の典型的な阻害剤は、ネトリン−１によるＥＲＫ−１／２リン酸化に作用するが、ＤＣＣアポトーシス促進活性に対するネトリン−１の阻害効果を遮断することができなかった（Forcet and Mehlen、未発表）。よって、ネトリン−１によるＤＣＣ多量体化がＤＣＣの細胞内での利用しやすさに影響を及ぼしていると思われる。しかしながら、これが簡単な化学量論の問題であるかどうか、または細胞外ドメインの接近によって細胞内コンパートメント内でコンフォメーションの変化がもたらされるかどうかはまだ証明されていない。
【０１２８】
ネトリン−１による受容体多量体化の基礎にある機構がまだ記載されていないならば、ネトリン−１によるＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２多量体化がＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ２による細胞死を阻害するのに十分であるという観察結果は、ネトリン−１が自己分泌により発現される腫瘍でのin vivoでのＤＣＣまたはＵＮＣ５Ｈアポトーシス促進活性に関心をもたせる興味深いツールかもしれない。実際、本発明者らは、マウス消化管におけるネトリン−１過剰発現がアポトーシス阻害を理由に腸腫瘍発生と関連することを証明し１８、本発明者らは、最近になって、ヒト転移性乳癌の大部分でネトリン−１が過剰発現されることを観察した。さらに、ネトリン−１過剰発現の機構は、ネトリン−１の環境不在の設定における生存に関して転移性腫瘍細胞の獲得した選択的優位性であるように思われる（実施例２および実施例３参照）。従って、ＤＣＣ／ＵＮＣ５Ｈ二量体化を阻害することが腫瘍細胞アポトーシスを誘発する興味深い方法であると想定される。
【０１２９】
この線に沿って、ＤＣＣの第５フィブロネクチンドメインが、ネトリン−１との相互作用のドメインであることが証明されている（図１５Ａおよび２１）が、相反するデータも報告されている４３。そのため、本発明者らは、まず、ＤＣＣの組換え可溶性第５フィブロネクチンドメイン（ＤＣＣ−５Ｆｂｎ）が組換えネトリン−１と結合することができるかどうかを評価した。ＥＬＩＳＡアッセイでは、関連のない受容体、ＩＬ３−Ｒの細胞外ドメインとは対照的に、ＤＣＣ−５Ｆｂｎがネトリン−１と特異的に結合することが証明される（図１５Ａ）。ＤＣＣ−５Ｆｂｎ／ネトリン−１のＫｄの近似値は、記載されたＤＣＣ／ネトリン−１のＫｄの桁と一致して、概算で５ｎＭであった。本発明者らは、次に、このドメインがＤＣＣ／ネトリン−１相互作用と置き換えるのに十分であるかどうかを調べた。図１５Ｂに示されるように、ＤＣＣの細胞外ドメインをコーティングし、ネトリン−１の免疫反応性によってネトリン−１／ＤＣＣ相互作用を検出するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、本発明者らは、陽性対照としてＤＣＣの完全細胞外ドメイン（ＤＣＣ−ＥＣ）はＤＣＣ／ネトリン−１相互作用と置き換えるに十分であるが、ＤＣＣ−５Ｆｂｎは干渉することができないことを観察した。よって、ＤＣＣ−５Ｆｂｎはネトリン−１と相互作用するが、ＤＣＣ／ネトリン−１相互作用を阻害するには十分でない。本発明者らは、次に、ＤＣＣ−５ＦｂｎがＤＣＣ多量体化に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。本発明者らは、ネトリン−１の存在下または不在下でＨＡタグ付き全長ＤＣＣとｃ−ｍｙｃタグ付き全長ＤＣＣとで一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔにおいて共免疫沈降を行った。図１Ａにも記載されるように、ネトリン−１の存在がｃ−ｍｙｃ−ＤＣＣとのＨＡ−ＤＣＣの免疫沈降を誘発し、ネトリン−１によるＤＣＣ多量体化を証明している（図１５Ｃ）。しかしながら、ネトリン−１とともにインキュベートした細胞をＤＣＣ−５Ｆｂｎで同時に処置した場合も、ＨＡ−ＤＣＣ／ｃ−ｍｙｃ−ＤＣＣ相互作用はネトリン−１無処置レベルに戻る。従って、ＤＣＣ−５Ｆｂｎは２つ以上のＤＣＣ分子のネトリン−１媒介による接近に関与する領域においてネトリン−１と相互作用し、ネトリン−１によるＤＣＣ多量体化を阻害することができる。
【０１３０】
本発明者らは、さらに、ＤＣＣ−５Ｆｂｎがネトリン−１受容体による細胞死を結果として誘発し得るかどうかを試験した。このために、ネトリン−１の存在下または不在下、ＤＣＣ−５Ｆｂｎを加えてまたは加えずに、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＤＣＣを強制発現させ、トリパンプルー排除アッセイにより細胞死を判定した（図１６Ａ）。図１６Ａにて示されるように、ＤＣＣは、ネトリン−１、すなわち、ネトリン−１の存在によって遮断されるアポトーシス促進活性の不在下でアポトーシスを誘発するが、ＤＣＣ−５Ｆｂｎの存在はネトリン−１の阻害活性を遮断するのに十分であり、その結果、ＤＣＣによる細胞死に至る。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系はネトリン−１の異所発現を用いるため、本発明者らは、次に、より生物学的に関連したモデルにおいてＤＣＣ−５Ｆｂｎを試験した。本発明者らは、最近、非転移性乳癌と比較して、ヒト転移性乳癌の大部分がネトリン−１を過剰発現することを証明した。また、本発明者らは、過剰発現されたネトリン−１の滴定(titrating)がin vitroでは腫瘍細胞アポトーシスを、マウスにおいては転移阻害を誘発することも示した（実施例２および実施例３参照）。多くの乳房腫瘍細胞系統がネトリン−１を発現するものと思われ、本発明者らは、マウス乳癌４Ｔ１細胞におけるネトリン−１の滴定がアポトーシス誘発することを示した（実施例２および実施例３参照）。図１６Ｂにて示されるように、４Ｔ１細胞培養物にＤＣＣ−５Ｆｂｎを加えることは細胞死の増加に関連する。
【０１３１】
まとめると、本発明者らは、本明細書において、依存性受容体ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈの多量体化がそれらのアポトーシス促進活性を遮断するのに十分な機構であることを示した。興味深いことに、この阻害機構は、細胞死受容体で観察されるものに酷似しているように思われる。実際に、ＴＮＦｒまたはＦａｓではアポトーシスを引き起こすのに三量体化が必要であることは知られている４５。そのため、この本質的相違は、依存性受容体を用いた治療方針に見合う付加価値に相当し得る。実際に、これまでの治療分子の調査では、アクチベーターではなく、例えばキナーゼ阻害薬、ＩＡＰ阻害薬など、主に細胞プロセスの阻害に基づいて作用するヒットが得られた。結果として、組換えＤＣＣ−５Ｆｂｎの使用によるまたは受容体多量体化を干渉するためにスクリーニングされた任意の化合物によるネトリン−１受容体多量体化の阻害は、ネトリン−１自己分泌発現を獲得している癌の治療に魅力的な戦略であると思われる。
【０１３２】
本明細書において、本発明者らは、ネトリン−１がＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ受容体の両方の多量体化を誘発することを示している。二量体化が化学的に誘発される系を用いることによって、本発明者らは、ネトリン−１受容体、例えばＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２の細胞内ドメインの多量体化がそれらのアポトーシス促進活性を阻害するのに重要な工程であることを証明した。本発明者らは、その結果、単量体ネトリン−１−依存性受容体がアポトーシスを促進する一方で、ネトリン−１によってもたらされるそれらの多量体化がそれらのアポトーシス促進活性を破壊するモデルを提示した。この特性を用いて、本発明者らは、腫瘍細胞のアポトーシスを誘発するために、（ｉ）ネトリン−１と相互作用し、（ｉｉ）ネトリン−１による多量体化を阻害するＤＣＣ細胞外領域の組換え特異的ドメインの使用を提案する。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ネトリン−１はヒト転移性乳癌において過剰発現する。図１Ａ：定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲで調べたネトリン−１の発現プロフィール。１５の転移性（黒いバー）および１５の非転移性（白いバー）原発腫瘍生検から抽出した全ＲＮＡを、特異的ヒトネトリン−１プライマー２６およびヒトＴＢＰ遺伝子に相当するプライマー（ＴＡＴＡ結合タンパク質）とともに用いてＱ−ＲＴ  ＰＣＲを行った。ここでは、２５に記載されているように、ＴＢＰが正常組織と腫瘍組織の間のｍＲＮＡレベルに変動が小さいことから、これを対照として用いた。ネトリン−１発現は、各サンプルにおけるネトリン−１発現と非転移性サンプル中のネトリン−１発現の平均の間の割合として示す。図１Ｂ：Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲは、６７ＮＲおよび４Ｔ１マウス細胞系統から抽出した全ＲＮＡを、特異的マウスネトリン−１プライマーおよび標準としてのマウス遺伝子ＲＰＬＰ０とともに用いて行った。
【図２】６７ＮＲマウス細胞系統におけるネトリン−１の強制的発現が転移の発生をもたらす。図２Ａおよび２Ｂ：偽（ｍｏｃｋ）トランスフェクト６７ＮＲ細胞またはネトリン−１で安定トランスフェクトされた６７ＮＲ細胞（６７ＮＲ−ｎｅｔ）に対してネトリン−１発現分析を行った。図２Ａ、特異的ニワトリネトリン−１プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを、６７ＮＲ−ｎｅｔｌおよび６７ＮＲ−ｍｏｃｋから抽出した全ＲＮＡを用いて行った。図２Ｂ、抗ｍｙｃ（ニワトリネトリン−１）または抗ｎｅｔｒｉｎ１抗体を用いたウエスタンブロットを行った。図２Ｃ：親６７ＮＲおよび４Ｔ１細胞系統と比較した場合の２つのクローン６７ＮＲ−ｎｅｔ１および６７ＮＲ−ｎｅｔ２の顕微鏡写真。図２Ｄ：転移性４Ｔ１細胞、ピューロマイシン耐性を有する２つの対照細胞クローン（６７ＮＲ１および６７ＮＲ２）および２つのネトリン−１発現細胞クローン（６７ＮＲｎｅｔ１および６７ＮＲｎｅｔ２）を１６匹のマウス（各細胞種あたり４匹）の脂肪体に注射し、肺環境における転移を分析した。各細胞クローン（４Ｔ１、６７ＮＲ１、６７ＮＲｎｅｔ１、６７ＮＲｎｅｔ２）の注射後の胸膜下および実質性結節内の代表的な顕微鏡写真。ＩＰＬ：実質内病巣、ＵＰＬ：胸膜下病巣。
【図３】ネトリン−１／受容体相互作用を阻害することによるマウス転移性細胞死の誘導。図３Ａ：ネトリン−１およびその受容体、ＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈを表すスキーム。図３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ：ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃおよび対照としての非特異的ＩＬ３−ＥＣ−Ｆｃを用いた場合（図３Ｂ）、種々の濃度で用いた場合（図３Ｃ）、またはネトリン−１／受容体相互作用の競合因子としてより限定されたＤＣＣ−５Ｆｂｎドメイン（図３Ｄ）を用いた場合の、６７ＮＲおよび４Ｔ１細胞における細胞死の定量的分析。細胞死は、トリパンプルー排除アッセイ（図３Ｂ、３Ｄ）またはカスパーゼ活性アッセイ（図３Ｃ）のいずれかによって定量した。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図４】ネトリン−１／受容体相互作用を阻害することによるヒト転移性細胞死の誘発。図４Ａ：トリパンプルー排除アッセイによる、種々の濃度のＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃで処理したＣＡＬ５１細胞死の定量測定。図４Ｂ：培養培地中でＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ競合因子で処理した、または処理していないＣＡＬ５１親細胞系統またはクローン細胞系統ＣＡＬ５１−３６において、トリパンプルー排除によりモニタリングした細胞死の定量的分析。
【図５】ネトリン−１はヒト転移性乳癌において過剰発現する。定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲで調べたネトリン−１の発現プロフィール。５１の腫瘍生検から抽出した全ＲＮＡを用いてＱ−ＲＴ  ＰＣＲを行った。それらは腫瘍が乳房に局在している患者（Ｎ０、白いバー）、腋窩節のみ関与している患者（Ｎ＋、グレーのバー）、および診断時に遠位転移を有する患者（Ｍ＋、黒いバー）から得られたものであった。特異的ヒトネトリン−１プライマー３９およびヒトＰＢＧＤ遺伝子に相当するプライマー（ＴＡＴＡ結合タンパク質）を用いた。ここでは、３８に記載されているように、ＰＢＧＤが正常組織と乳房腫瘍組織の間のｍＲＮＡレベルに変動が小さいことから、これを参照として用いた。他の参照ＴＢＰも用いたが、同様の結果であった（示されていない）。ネトリン−１発現は、各サンプルのネトリン−１発現とＮ０サンプルのネトリン−１発現の平均の間の比として示す。ノンパラメトリック統計有意性検定（マン−ホイットニー）を用い、ｐ値を示す。
【図６】ネトリン−１／受容体相互作用を阻害することによる転移性細胞死の誘発。図６Ａ：ＤＣＣ−ＥＣ−ＦｃはＤＣＣ／ネトリン−１およびＵＮＣ５Ｈ２／ネトリン−１相互作用に取って代わる。ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃ（一番上のパネル）またはＵＮＣ５Ｈ２−ＥＣ−Ｆｃ（下のパネル）でコーティングした場合のＥＬＩＳＡアッセイ、および漸増濃度のＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃの存在下で抗ネトリン−１抗体を用いた場合の結合ネトリン−１の定量。図６Ｂおよび６Ｃ：ＤＣＣ−ＥＣ−Ｆｃおよび対照としての非特異的ＩＬ３−ＥＣ−Ｆｃのいずれかを用いた６７ＮＲおよび４Ｔ１細胞における細胞死の定量的分析。トリパンプルー排除アッセイ（図６Ｂ）またはカスパーゼ活性アッセイ（図６Ｃ）のいずれかにより細胞死を定量した。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図７】ＤＣＣ−５Ｆｂｎ処理によるマウスにおける転移形成の阻害。図７Ａ：ＤＣＣ−５Ｆｂｎで処理した６７ＮＲおよび４Ｔ１細胞における細胞死の定量的分析。漸増用量のＤＣＣ−５Ｆｂｎ（μｇ／ｍｌ）で処理した後の６７ＮＲまたは４Ｔ１細胞に対してＭＴＴアッセイを行った。細胞生存率％を示す。標準偏差を示す（ｎ＝３）。図７Ｂおよび７Ｃ：０日目に４Ｔ１−ｌｕｃ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈注射し、０日目から始めて２日置きにＰＢＳまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎを静脈注射１回、腹腔内注射１回を行った。１３日後、発光記録（図７Ｂ、７Ｃ）または内視鏡下での肺の検査により転移の発生を調べた。図７Ｂ：ＰＢＳ処理マウス（右）またはＤＣＣ−５Ｆｂｎ処理マウス（左）の発光記録の代表的画像。図７Ｃ：ＮｉｇｈｔＯｗＬＢシステムにより測定された発光シグナルの定量。各動物で光子／画素／秒の数値を定量し、発光シグナル指数を、ＰＢＳ処理マウスの平均光子／マウスとＤＣＣ−５Ｆｂ処理マウスで検出された平均シグナルの間の比で示す。２回の独立した実験を示す（実験１では２０匹を、実験２では８匹を分析した）。ＰＢＳ処理マウスまたはＤＣＣ−５Ｆｂｎ処理マウスの肺の代表的な肉眼的写真を撮り（示されていない）、ＰＢＳ処理マウスの肺で証明され得る。
【図８】ネトリン−１を発現するヒト乳癌細胞系統に対するＤＣＣ−５Ｆｂｎの作用。図８Ａ：４８の異なる乳癌細胞系統から抽出した全ＲＮＡを用いたＱ−ＲＴ  ＰＣＲによって調べたネトリン−１の発現。ネトリン−１の発現を、各サンプルにおけるネトリン−１発現とハウスキーピング遺伝子ＨＭＢＳ発現（ヒドロキシメチルビランシンターゼ）の間の比として示す。ここでは、対照としてＴＢＰも用い、同様の結果が得られた。高レベルのネトリン−１に関して選択された２つの細胞系統を星印で示す。図８Ｂ：ＳＫＢＲ７およびＴ４７Ｄ細胞系統におけるＤＣＣ−５Ｆｂｎによる細胞死の誘発。細胞死は、図４Ａに記載のようなＭＴＴアッセイ（右のパネル）または図３Ｄに記載のようなカスパーゼ活性測定（左のパネル）のいずれかにより定量した。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図９】ヒト神経芽腫。図９Ａ：ネトリン−１はヒト神経芽腫における侵攻性のマーカーである。定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲで調べたネトリン−１の発現プロフィール。１０１の病期４または４ｓの神経芽腫生検から抽出した全ＲＮＡを用いてＱ−ＲＴ  ＰＣＲを行った。腫瘍は、１歳未満の患者で診断された病期４（４＜１歳）または１歳を超える患者で診断された病期４（４＞１歳）のいずれかであった。予後の悪い癌（病期４＞１歳）は、ネトリン−１の有意な過剰発現を示すと言える。スチューデントのｔ検定を用い、ｐ値を示す。図９Ｂ：ネトリン−１を内因的に産生するＩＭＲ３２細胞をＤＣＣ−５Ｆｂｎまたは対照としてのＩＬＲ３（インターロイキン−３受容体エクトドメイン）で処理するか、または処理せずに、カスパーゼ活性の測定（上）またはＭＴＴアッセイによる細胞生存の測定（下）のいずれかにより細胞死に関して分析した。ＩＬ３ＲはＩＭＲ３２細胞の死に作用を示さないが、ＤＣＣ−５Ｆｂｎは有意なＩＭＲ３２細胞死を誘発することに着目されたい。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１０】神経膠腫。図１０Ａ：ネトリン−１は大多数の神経膠腫で過剰発現する。定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲで調べたネトリン−１の発現プロフィール。病期ＩＩおよび病期ＩＩＩ乏突起神経膠腫および病期ＩＶ膠芽腫生検から抽出した全ＲＮＡを用いてＱ−ＲＴ  ＰＣＲを行い、正常なヒト脳と比較した。図１０Ｂ：ネトリン−１を内因的に産生するＧＬ２６細胞（示されていない）を、過剰量の組換えネトリン−１存在下または不在下で、ＤＣＣ−５Ｆｂｎで処理するか、または処理せずに、カスパーゼ活性の測定（上）またはＭＴＴアッセイによる細胞生存の測定（下）のいずれかにより細胞死に関して分析した。ＤＣＣ−５Ｆｂｎは有意なＧＬ２６細胞死を誘発し、この作用はネトリン−１の添加により完全に阻害され、従って、このＤＣＣ−５Ｆｂｎの作用は内因性のネトリン−１の阻害に直接関連していることを示す。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１１】肺癌。図１１Ａ：ネトリン−１はヒト肺癌の相当な部分で過剰発現する。定量的リアルタイム逆転写ＰＣＲで調べたの発現プロフィール。肺癌生検から抽出した全ＲＮＡを用いてＱ−ＲＴ  ＰＣＲを行い、正常な組織と比較した。図１１Ｂ：２つのＮＳＣＬＣ細胞系統、Ｈ３５８とＨ４６０を細胞死アッセイにさらに用いた。ネトリン−１を内因的に発現するＨ３５８細胞および検出可能なネトリン−１発現を示すことができないＨ４６０細胞を過剰量の組換えネトリン−１の存在下または不在下で、ＤＣＣ−５Ｆｂｎで処理するか、または処理せずに、カスパーゼ活性の測定（上）またはＭＴＴアッセイによる細胞生存の測定（下）のいずれかにより細胞死に関して分析した。ＤＣＣ−５Ｆｂｎは有意なＨ３５８細胞死を誘発するが、Ｈ４６０細胞に対して作用を示すことができないことに着目されたい。さらに、Ｈ３５８細胞で見られた細胞死作用はネトリン−１の添加により完全に阻害される。Ｈ４６０細胞はＤＣＣ−５Ｆｂｎに感受性がないという事実と合わせると、これらのデータは、ネトリン−１を発現する肺腫瘍細胞はＤＣＣ−５Ｆｂｎに応答してアポトーシスを受けることを裏付ける。標準偏差を示す（ｎ＝３）。図１１Ｃ：ＤＣＣ−５Ｆｂｎはヌードマウスにおいて異種移植されたＨ３５８腫瘍の増殖を阻害する。５週齢（体重２０〜２２ｇ）の雌無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した。これらのマウスを無菌フィルタートップのケージで飼育し、病原体フリーの動物施設で維持した。Ｈ３５８細胞を、マウスの左側腹部へのＰＢＳ２００μＬ中の５×１０６細胞の皮下注射により移植した。腫瘍が確立された際に、ＰＢＳまたは２０μｇのＤＣＣ−５Ｆｂｎをその腫瘍（ｉ．ｔ．）に毎日投与した（処置期間は矢印で示されている）。４１日間、腫瘍の大きさをカリパスで測定した。腫瘍体積は、６匹のＤＣＣ−５Ｆｂｎ処理マウスと４匹のＰＢＳ処理マウスに対し、式ｖ＝（０．５＊（長さ＊幅２））±ＳＥ，＊）で算出した。ＰＢＳ処理腫瘍は増殖を示したが、ＤＣＣ−５Ｆｂｎ処理腫瘍は著しい退縮を示したことに着目されたい。
【図１２】ネトリン−１はＤＣＣおよびＵＮＣ５Ｈ２の多量体化を媒介する。図１２Ａ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるネトリン−１の存在下でのＤＣＣの多量体化。ネトリン−１発現構築物とともに、または伴わずにＨＡ−ＤＣＣおよび／またはｃ−ｍｙｃ−ＤＣＣ発現構築物で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液に対してｍｙｃプルダウン（ＩＰ  α−ｍｙｃ）を行った。ＤＣＣ−ＨＡの存在を抗ＨＡ抗体で明らかにした。図１２Ｂ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるネトリン−１の存在下でのＵＮＣ５Ｈ２の二量体化。細胞トランスフェクションおよび細胞溶解液の調製は、ＨＡ−Ｕｎｃ５Ｈ２および／またはＦｌａｇＭ２−ＵＮＣ５Ｈ２発現構築物を用いること以外は（Ａ）と同様に行った。細胞溶解液に対してＦｌａｇＭ２プルダウン（ＩＰ  α−Ｆｌａｇ）を行った。ＨＡ−ＵＮＣ５Ｈ２の存在を抗ＨＡ抗体で明らかにした。全体：プルダウン前の細胞溶解液に対するウエスタンブロット。
【図１３】ＵＮＣ５Ｈ２の二量体化に対する化学誘導系の検証。図１３Ａ：人工的二量体化系の検証に用いる２つの構築物（一方はタグ付きＨＡ、他方はタグ付きｃ−ｍｙｃ）を示すＦｖ２ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２融合構築物の模式図。図１３Ｂ：二量体化剤（ＡＰ２０１８７）とともに、または伴わずにＦｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２タグ付きＨＡまたはｃ−ｍｙｃで一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解液に対してｃ−ｍｙｃプルダウン（ＩＰ  α−ｍｙｃ）を行った。全体：プルダウン前の細胞溶解液に対するウエスタンブロット。ＨＡ−Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２の存在を抗ＨＡ抗体で明らかにした。
【図１４】強制的なＤＣＣの二量体化はそのアポトーシス促進活性を遮断する。図１４Ａ：ＤＣＣにより誘発される細胞死は、トリパンプルー排除により測定されるように、ＡＰ２０１８７により誘発される二量体化により阻害される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＰ２０１８７（ＡＰ）とともに、または伴わずに、ｍｏｃｋプラスミド（対照）、Ｆｖ２Ｅ（Ｆｖ）、Ｆｖ２Ｅ−ＤＣＣ−ＩＣ（Ｆｖ−ＤＣＣ）でトランスフェクトした。全ての条件で、細胞を表面マーカーｐＫｋでもトランスフェクトした。このマーカーを発現するトランスフェクト細胞をＭＡＣＳｅｌｅｃｔマイクロビーズで磁気標識し、ＭＡＣＳセパレーターおよびセパレーションカラムを用いて分離した。これらの精製細胞に対してトリパンプルー排除をアッセイした。図１４Ｂ：ＵＮＣ５Ｈ２により誘発される細胞死は、（Ａ）と同様のトリパンプルー排除により測定されるように、ＡＰ２０１８７により誘発される二量体化により阻害される。細胞を、ＡＰ２０１８７（ＡＰ）とともに、または伴わずに、ｐＭＡＣＳＫｋおよびＦｖ２Ｅ（Ｆｖ）、Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣ（Ｆｖ−ＵＮＣ５Ｈ２）でトランスフェクトした。図１４Ｃ：ＵＮＣ５Ｈ２により誘発されるカスパーゼ活性化は、相対カスパーゼ−３活性により測定されるように、ＡＰ２０１８７により誘発される二量体化により阻害される。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＡＰ２０１８７（ＡＰ）とともに、または伴わずに、ｍｏｃｋベクターｐＣＭＶ（対照）、Ｆｖ２Ｅ（Ｆｖ）、Ｆｖ２Ｅ−ＵＮＣ５Ｈ２−ＩＣ（Ｆｖ−ＵＮＣ５Ｈ２）でトランスフェクトした。相対カスパーゼ活性指数は、サンプルのカスパーゼ活性とｐＣＭＶでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞で測定されたカスパーゼ活性の間の比として表す。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【図１５】ＤＣＣの第５の組換え可溶性フィブロネクチンドメイン（ＤＣＣ−５Ｆｂｎ）はネトリン−１により誘発されるＤＣＣ多量体化を阻害する。図１５Ａ：ＥＬＩＳＡ試験により測定されたＤＣＣ−５Ｆｂｎに対するネトリン−１の親和性曲線は、ＤＣＣ−５Ｆｂｎがネトリン−１と結合し得ることを示す。ＤＣＣ−５Ｆｂｎ（１００ｎｇ）またはＩＬ３−Ｒ（６００ｎｇ）をコーティングし、漸増用量のネトリン−１を加えた（０〜８００ｎｇ）。ＩＬ３値を差し引き、ＤＣＣ−５Ｆｂｎ値とした。ＤＣＣ−５Ｆｂｎ／ネトリン−１のおよそのＫｄは５ｎＭと見積もられた。図１５Ｂ：競合アッセイ。ＤＣＣ−５Ｆｂｎの代わりにＤＣＣの完全細胞外ドメイン（ＤＣＣ−ＥＣ、１２５ｎｇ）をコーティングしたこと以外は（Ａ）と同様に、ＤＣＣ−５Ｆｂｎ（６２５ｎｇ）または完全ＤＣＣ−ＥＣ（１２５ｎｇ）のいずれかの存在下でネトリン−１を加えた（５０ｎｇ）。ＤＣＣ−５ＦｂｎはＤＣＣ／ネトリン−１相互作用と競合できないことに着目されたい。図１５Ｃ：ネトリン−１により誘発されるＤＣＣの多量体化は、ＤＣＣ−５Ｆｂｎにより阻害される。ネトリン−１（３００ｎｇ／ｍＬ）および／またはＤＣＣ−５Ｆｂｎ（９００ｎｇ／ｍＬ）とともに、または伴わずに、ＨＡ−ＤＣＣおよび／またはｃ−ｍｙｃ−ＤＣＣ発現構築物で一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解液に対してＨＡプルダウン（ＩＰ  α−ＨＡ）を行った。ｃ−ｍｙｃ−ＤＣＣの存在を抗ｃ−ｍｙｃ抗体で明らかにした。全体：プルダウン前の溶解液に対するウエスタンブロット。
【図１６】ＤＣＣ−５Ｆｂｎは、ＤＣＣにより誘発される細胞死に対するネトリン−１の遮断作用に拮抗する。
【図１６Ａ】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｍｏｃｋ（対照）または全長ＤＣＣ構築物で一時的にトランスフェクトし、ネトリン−１（３００ｎｇ／ｍｌ）および／またはＤＣＣ−５Ｆｂｎ（８００ｎｇ／ｍＬ）とともに、または伴わずにインキュベートした。細胞死をトリパンプルー染色により評価した。
【図１６Ｂ】転移性乳癌細胞４Ｔ１をＤＣＣ−５Ｆｂｎ（３００ｎｇ／ｍＬ）の存在下（＋ＤＣＣ−５Ｆｂｎ）または不在下（−ＤＣＣ−５Ｆｂｎ）で２４時間培養し、細胞死もまたトリパンプルー排除アッセイにより測定した。標準偏差を示す（ｎ＝３）。
【参照文献】
【０１３４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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