(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）宿主細胞において、内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現を低めるための遺伝的修飾であって、前記修飾が欠失変異、置換変異、又は挿入変異である、遺伝的修飾、及び
ｉｉ）異種スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＤｓｂＡポリペプチドをコードしている核酸、を含む遺伝的に修飾されたバチルス宿主細胞。
【請求項２】
ＴｒｘＡポリペプチドが、
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号２に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、及び
ｉｖ）配列番号１の核酸配列に少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記ＤｓｂＡポリペプチドが
ｉ）配列番号４のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号３の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、及び
ｉｖ）配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１の宿主細胞。
【請求項４】
前記宿主細胞がバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１、２、および３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現を低めるための遺伝的修飾が遺伝子発現のための誘発プロモーターの挿入である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現が減少している、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の宿主細胞の培養物。
【請求項８】
前記培養が酸化還元活性化合物を含む培地中で行われる、請求項７の培養物。
【請求項９】
前記酸化還元活性化合物がシステイン、シスチン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、チオサルフェート、メタビスルフィット、スルフィット、及びマイコチオールからなる群から選択される、請求項８の培養物。
【請求項１０】
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＴｒｘＡポリペプチドの活性を低める、宿主細胞中での遺伝的修飾であって、前記修飾が欠失変異、置換変異、又は挿入変異である、遺伝的修飾、及び
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する異種スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＤｓｂＡポリペプチドをコードしている核酸配列、を含む遺伝的に修飾されたバチルス宿主細胞。
【請求項１１】
ジスルフィド結合含有タンパク質をコードしている核酸配列を更に含む、請求項１乃至６又は請求項１０の宿主細胞。
【請求項１２】
酸化還元活性化合物を含む培地中で請求項１１の宿主細胞を培養する工程を含む、ジスルフィド結合含有タンパク質の生産方法であって、前記宿主細胞がジスルフィド結合含有タンパク質を生産し、培地中に分泌することを特徴とする方法。
【請求項１３】
ｉ）欠失変異、置換変異、又は挿入変異である遺伝的修飾により、内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現を低めて、宿主細胞中の細胞質リダクターゼの活性を減少させる工程、
ｉｉ）宿主細胞中で異種スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＤｓｂＡポリペプチドをコードしている核酸配列を導入する工程、及び
ｉｉｉ）酸化還元活性化合物を含む培地中で宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞がジスルフィド結合含有タンパク質を生産し、培地中に分泌する工程
からなるバチルス宿主細胞中でジスルフィド結合含有タンパク質を生産する方法。
【請求項１４】
前記ＴｒｘＡポリペプチドが
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、及び
ｉｖ）配列番号１の核酸配列に少なくとも９０％同一である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記異種スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＤｓｂＡポリペプチドが該ポリペプチドをコードしている遺伝子を含むプラスミドを用いた形質転換により導入される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤｓｂＡポリペプチドが
ｉ）配列番号４のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号３の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、及び
ｉｖ）配列番号３の核酸配列に少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１３の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞がバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現の減少を誘発プロモーターにより制御する、請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記酸化還元活性化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、チオサルフェート、亜ジチオン酸塩、メタビスルフィット、スルフィット、及びマイコチオールからなる群より選択される、請求項１３乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
バチルス宿主細胞中でジスルフィド結合含有タンパク質を生産する方法であって、
ｉ）欠失変異、置換変異、又は挿入変異である遺伝的修飾により、配列番号２のアミノ酸配列を有するＴｒｘＡポリペプチドの内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現を減少させる工程、
ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を有する異種スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＤｓｂＡポリペプチドを宿主細胞中で発現させる工程、
ｉｉｉ）酸化還元活性化合物を含む培地中で前記宿主細胞を培養する工程であって、前記宿主細胞はジスルフィド結合含有タンパク質を生産し、培地中にこのタンパク質を分泌する工程、からなる方法。
【請求項２１】
組換えタンパク質の折りたたみを改善する方法であって、
ａ）遺伝的に修飾されたバチルス宿主細胞を酸化還元活性化合物を含む培地中で培養して、ジスルフィド結合タンパク質を発現させ、タンパク質の折りたたみを改善する工程であって、前記宿主細胞が（ｉ）内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現が減少し、及び（ｉｉ）異種スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＤｓｂＡポリペプチドをコードしている核酸を導入してその発現が増加されたものであり、異種ジスルフィド結合含有タンパク質を分泌する工程、並びに
ｂ）前記タンパク質を培地から単離する工程、より構成される、方法。
【請求項２２】
前記ＴｒｘＡポリペプチドが
ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列、及び
ｉｖ）配列番号１の核酸配列に少なくとも９０％同一な核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記異種スタフィロコッカスカルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）ＤｓｂＡポリペプチドが該ポリペプチドをコードしている遺伝子を含むプラスミドを用いた形質転換により導入される、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤｓｂＡポリペプチドが
ｉ）配列番号４のアミノ酸配列、
ｉｉ）配列番号３の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、
ｉｖ）配列番号３の核酸配列に少なくとも９０％同一である核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞がバチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項２１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記内性チオレドキシンＡ（ＴｒｘＡ）ポリペプチドの細胞内発現の減少が誘発プロモーターにより制御される、請求項２１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記酸化還元活性化合物が、システイン、シスチン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＴ）、１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、チオサルフェート、亜ジチオン酸塩、メタビスルフィット、スルフィット、又はマイコチオールからなる群より選択される、請求項２１乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は減少したＴｒｘＡ活性のような、減少した細胞質リダクターゼ活性及びスタフィロコカール（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）オキシダーゼのような、異種オキシダーゼをエンコードしている核酸を有する遺伝的に修飾されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を提供する。本発明は本発明の宿主細胞を用いたジスルフィド結合含有タンパク質を生成する方法、及び本発明の宿主細胞を用いたそのようなジスルフィド結合含有タンパク質の折りたたみを改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジスルフィド結合は天然に存在する数多くのタンパク質の正しい折りたたみ、構造の完全性、及び活性に極めて重要である。ジスルフィド結合へとシステインをつなげる正確な酸化なしにこれらのタンパク質は安定もしないし、生物学的に活性にもならない。重要なことに、生物医薬品における興味は、複数のジスルフィド結合を含む多くの真核生物タンパク質に向けられている。このようなタンパク質は、ヒトインシュリン、インシュリン様成長因子、ヒト成長因子、ヒト成長ホルモン、脳由来神経栄養性因子、神経成長因子、リパーゼ、ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター、及び抗体フラグメントを含む。
【０００３】
ジスルフィド結合は同時に形成することもできるが、このプロセスは非常に遅く、非特異的である。この理由ために、ｉｎ  ｖｉｖｏでジスルフィド結合の形成（酸化）を触媒する酵素が開発されてきた。これらの酵素はチオール−ジスルフィドオキシドリダクターゼ（ＴＤＯＲ）のクラスに属する。酵素のこのクラスはジスルフィド結合を壊す（還元する）又は異性化する酵素も含む。細胞質ＴＤＯＲは、通常リダクターゼとして機能するが、これらの細胞外等価物はオキシダーゼ又はイソメラーゼである（Ｄｏｒｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）ｐ．２３７−２６９．Ｉｎ  Ｓ．Ｇ．Ｐａｎｄａｌａｉ（ｅｄ．），Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｇｎｐｏｓｔ，Ｋｅｒａｌａ，  Ｉｎｄｉａ；  Ｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：２１−４８，２００１；  Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．５：１４７９−１４８７，２００４）。このジスルフィド結合の酵素依存形成は実際のところ、バクテリア細胞製品において、このような結合を含んでいるタンパク質の大量生産が未だに困難となっている原因の一つである。バクテリア細胞工業において、過剰発現されたタンパク質の緩やかな及び／又は非特異的な酸化はタンパク質の緩やか及び／又は不正確な折りたたみとなり、それらはタンパク質分解活性を劣化させ、そのためｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、折りたたみを修正し、活性を付与しなければならない。
【０００４】
バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のジスルフィド結合形成における、従来の研究はこの微生物が疑似的酸化活性を有する少なくとも４つのＴＤＯＲを含むことを示している。これらのタンパク質はＢｄｂ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）と呼ばれ、ＢｄｂＡ−Ｄと記される。ｂｄｂＡ及びｂｄｂＢ遺伝子は、ＳＰβプロファージ領域に位置しており、配列決定されているバチルススブチリス様１６８にのみ存在する。生物学的機能はＢｄｂＢ、ＢｄｂＣ、及びＢｄｂＤについて同定されているが、ＢｄｂＡについては同定されていない。異なるＢｄｂタンパク質は異なる機能を実施するために、協力するという意味において、このＢｄｂ機能は相補的である（Ｋｏｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９）。インテグラル膜タンパク質ＢｄｂＢはＢｄｂＣと高度に類似した配列を有している。両者は分泌されたＳＰＢコードランチビオテック（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ）サブランシン（ｓｕｂｌａｎｃｉｎ）１６８の折りたたみに重要である。これは、２つのジスルフィド結合を含む（Ｂｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４５３１−２４５３８，１９９９；Ｄｏｒｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１６６８２−１６６８８，２００２，Ｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：８４５−８５７，２００５）。対象的に、ＢｄｂＣとＢｄｂＤは共にプソイドフィリン（ｐｓｅｕｄｏｐｉｌｉｎ）ＣｏｍＧＣの生物学的合成に重要であり、一方でＢｄｂＢはこのプロセスには重要ではない（Ｍｅｉｍａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：６９９４−７００１，２００２）。ＣｏｍＧＣはバチルススブチリスＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の機械的なＤＮＡ取込みの重要なエレメントであり、プロテアーゼ耐性構造のための折りたたみに必要なＴＤＯＲと一緒に働き、それは必須の分子内ジスルフィド結合を含む（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：９０５−９１３，１９９８）。ＢｄｂＣ及びＢｄｂＤはバチルススブチリスにより分泌された異種タンパク質、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡアルカリプロテアーゼの折りたたみにも必要とされる（Ｂｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４５３１−２４５３８，１９９９；Ｄａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７２：６８７６−６８８５，２００６，；Ｋｏｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９．，２００７；  Ｍｅｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１１：６９９４−７００１，２００２）。この，の必要性はＥ．ｃｏｌｉのｐｈｏＡが酵素活性及びタンパク質の安定性の両方に必要な２つのジスルフィド結合を含む事実に関係している（Ｓｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６１７４−６１７８，１９９７）。これらの従前の観察事項は、組み合わせたＢｄｂ−Ａ−Ｄタンパク質はバチルススブチリスにおける相同及び異種の両方のジスルフィド結合含有タンパク質における基本的な機構を提供することを示している。
【０００５】
バチルス微生物もチオレドキシンを含んでいる。チオレドキシンは小さな熱安定なユビキタスＴＤＯＲである。このＴＤＯＲは酵素活性からミトコンドリア依存アポトーシスの範囲の幅広いプロセスに包含される（Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１，１６９５−１７０３，２００２）。触媒作用の間、これらのＣｘｘＣ活性部位のシステイン残基は可逆的な酸化還元反応を受ける。バクテリア細胞質において、チオレドキシンは細胞性タンパク質に置けるジスルフィド結合の形成を阻害するために還元された状態で存在している。
【０００６】
ＢｄｂＣ及びＢｄｂＢはバチルススブチリスの酵素経路における酸化還元ペアとして協力すると報告されている（Ｓａｒｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６９４：３１１−３２７，２００４）。ＢｄｂＤは分泌されたシステイン含有タンパク質の酸化に主に機能しており、従って、ジスルフィド結合の形成を促進すること報告されている。引き続き、還元されたＢｄｂＤはキノンリダクターゼ相同ＢｄｂＣにより再酸化される。次の触媒反応のために再度酸化するために、ＢｄｂＣは電子伝達鎖において、キノンにその電子を与える。このシステムはＥ．ｃｏｌｉのＤｓｂＡ及びＤｓｂＢに似ている（Ｉｎａｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １２７：７８９−８０１，２００６；Ｒｅｇｅｉｍｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３２７０６−３２７１３，  ２００２；Ｒｉｅｔｓｃｈ＆Ｂｅｃｋｗｉｔｈ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３２：１６３−１８４，１９９８）。４つのＢｂｄタンパク質の存在にも関わらず、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の総酸化経路はむしろ限定されている。チオール酸化キャパシティーを増加する試みにおいて、Ｂｄｂタンパク質の個々の又は組み合わせを過剰発現させることが試みられてきた。しかしながら、ジスルフィド結合を有するタンパク質の生産を有意に改善する結果とはなっていない（Ｄａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：６８７６−６８８５，２００６；Ｄｏｒｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１６６８２−１６６８８，２００２；Ｍｅｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：６９９４−７００１，２００２）。
【０００７】
バクテリア等の宿主細胞がジスルフィド結合を有するタンパク質の生成において、比較的不利なパフォーマンスを有するという他の研究もある（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３７６−３８１，１９９９；Ａｎｆｉｎｓｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １８１：２２３−２３０，１９７３；  Ｗｅｓｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６９４：２９９−３１０，２００４）。
【０００８】
発明の概要
本発明はバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の宿主細胞のチオール酸化能力を高める方法に関する。
【０００９】
宿主細胞において、酸化のレベルを高めることに加えて、本発明はチオレドキシン等（例えば、主要細胞質ジスルフィド結合リダクターゼＴｒｘＡ）の還元活性を有するＴＤＯＲのレベルが低められた宿主細胞を提供する。本明細書で立証されているデータはチオレドキシン活性を低くすることが、ジスルフィド結合含有タンパク質である、分泌されたＥ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡの生産性を高め、一方、ジスルフィド結合を含まないタンパク質の生産に影響を与えないことを示している。更に、ジスルフィド結合含有タンパク質の生産はスタフィロコッカスＤｓｂＡポリペプチドをエンコードしている核酸の導入により改善される。ＤｓｂＡポリペプチドは強力なバクテリアチオールオキシダーゼの１つとして知られている（Ｄｕｍｏｕｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８４：１１７−１２８，２００５）。本発明は更に酸化還元化合物を宿主細胞の育成培地に添加することにより達成される、タンパク質を含むジスルフィド結合の生産性を改善する方法を提供する。
【００１０】
本明細書で示すデータはバチルスにおいてジスルフィド結合含有タンパク質の改善された生産方法の開発を開示する。この改善された生産は（１）バチルス宿主細胞のＴｒｘＡポリペプチドの消失及び／又は（２）スタフィロコカールチオールオキシダーゼ、例えば、ＤｓｂＡポリペプチドと生産されるべきジスルフィド結合タンパク質とのバチルス宿主細胞中での共発現、及び／又はシステイン等の酸化還元活性化合物を補充した育成培地の使用、及びこれらの３つのアプローチの組み合わせにより達成される。原理の証明はＥ．ｃｏｌｉ由来ジスルフィド結合含有タンパク質ＰｈｏＡの最適な分泌のためにこれらの３つのアプローチの組み合わせにより得られる。これは育成培地中で活性ＰｈｏＡタンパク質の量を約３．５倍高める結果となる。
【００１１】
本明細書で開示するデータはＥ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡとＳ．ａｕｒｅｓの強力なオキシダーゼＤｓｄＡとの共発現を示し、このこことが活性ＰｈｏＡ分泌を高めることを示す。特に、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中でＳ．ａｕｒｅｕｓ又はＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓのいずれかのＰｈｏＡタンパク質との共発現は活性細胞外ＰｈｏＡタンパク質のレベルを高くする。更に、特定のＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓＤｓｄＡの共発現はＰｈｏＡの分解を低め、未処理ＰｈｏＡプロセス中間体の蓄積を高める。このことは、スタフィロコカールＤｓｂＡタンパク質の存在が、おそらく改善されたチオール酸化により、ＰｈｏＡのより効果的な折りたたみを促進することを示している。この側面において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓ由来ＤｓｄＡは同様の効果を示すが、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のＧＲＡＳ株を有する食品使用グレードの微生物由来であるという利点からはＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓ由来ＤｓｄＡの使用が有利である。それゆえ、非病原性スタフィロココッカス由来ＤｓｂＡは生物化学関連製品におけるバチルス細胞を用いる産業の改善の好適なチオール酸化酵素である。
【００１２】
本発明は、ジスルフィド結合含有タンパク質の製造に有用な、バチルス宿主細胞等の遺伝的に修飾された宿主細胞に関する。ここにおいて、宿主細胞は（ｉ）細胞質リダクターゼが遺伝的に修飾され、その活性又は細胞内発現が減少又は消失されている、及び／又は（ｉｉ）スタフィロコカールオキシダーゼ又はオキシダーゼ活性を有するこれらの変異体等の異種オキシダーゼをコードしている核酸を含む。そのような遺伝的に修飾された宿主細胞を更に修飾して異種のジスルフィド結合含有タンパク質をコードしている核酸を含むようにすることもできる。本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は任意のタイプでよい。しかしながら、好適な宿主細胞は、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスアカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｉｉｓ）、バチルスプミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、又はバチルスアロヂュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｏｄｕｒａｎｓ）等のバチルス宿主細胞である。１つの態様において、宿主細胞はバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。遺伝的に修飾された宿主細胞は細胞質還元酵素の活性を低める遺伝的修飾を含む。この遺伝的修飾は細胞質リダクターゼをコードしている遺伝子又は例えば、プロモーター等の、発現を制御する領域における欠失変異、置換変異、又は挿入変異である。本発明は、遺伝子発現を制御する誘発プロモーターの挿入を遺伝的修飾とする宿主細胞にも関する。幾つかの態様において、細胞質リダクターゼ活性が減少すると、細胞質リダクターゼポリペプチドの発現が減少する（即ち、欠失する）。他の態様では、この活性の減少は不活性な細胞質リダクターゼポリペプチドの発現であり、又は細胞質リダクターゼの分解が高められることであり、又は細胞質リダクターゼの抑制物質の発現を高めることである。この細胞質リダクターゼは宿主細胞中で活性である任意の細胞質リダクターゼでもよい。例示的な態様において、この細胞質還元酵素はＴｒｘＡ、ＴｒｘＣ、ＹｂｄＥ、ＹｄｂＰ、ＹｄｆＥＱ、ＹｋｕＶ、ＹｏｓＲ、ＹｔｐＰ、ＹｕｓＥ、ＢｄｂＡ、ＲｅｓＡ、ＳｔｏＡ、ＳｐｏＩＶＨ、又はＹｎｅＮなどのチオールジスルフィドリダクターゼである。他の態様において、この細胞質リダクターゼはＧｒｘＡ、ＧｒｘＢ、又はＧｒｘＣ等のグルタレドキシン又はＧｏｒ等のグルタチオンオキシドリダクターゼである。幾つかの態様において、減少した活性を有する宿主細胞の細胞質リダクターゼは、リダクターゼ活性を有する他の微生物由来の相同体又は変異体を含む、ＴｒｘＡポリペプチドである。このＴｒｘＡポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は表１に列挙されているアミノ酸配列のいずれか、配列番号１の核酸又は表１に列挙され���いる核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列又は表１に列挙されているアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列、配列番号１で定義される核酸配列又は表１に列挙されている核酸配列によりコードされるアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列、配列番号１の相補体に過酷な条件でハイブリダイズする核酸配列によりエンコードされるアミノ酸配列からなる群より選択される。幾つかの態様において、遺伝的に修飾された宿主細胞はスタフィロコカールオキシダーゼである異種オキシダーゼを発現する。好ましくは、スタフィロコカールオキシダーゼは例えば、スタフィロコッカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）のような非病原性スタフィロコッカスバクテリウムである。この異種オキシダーゼをコードしている核酸配列はトランスフォーメーション、トランスフェクション、又はインフェクションにより宿主細胞内に導入された、プラスミド又は発現ベクターである。幾つかの態様において、この異種オキシダーゼはリダクターゼ活性を有する他のバクテリア又は微生物由来の相同体を含む、スタフィロコカールＤｓｂＡポリペプチドである。このＤｓｂＡポリペプチドは配列番号４で定義されるアミノ酸配列、表２に列挙されているアミノ酸配列、配列番号３で定義される核酸配列又は表２で列挙されている核酸配列のいずれかによりエンコードされるアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列又は表２に列挙されているアミノ酸配列のいずれかに少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列、配列番号３で定義される核酸配列又は表２に列挙されている核酸配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一な核酸配列によりエンコードされるアミノ酸配列、配列番号３の相補体に過酷な条件でハイブリダイズする核酸配列によりエンコードされるアミノ酸配列からなる群より選択される。
【００１３】
本発明は前述の遺伝的に修飾された宿主細胞の培養物にも関する。１つの態様において、この培養物は酸化還元活性化合物を含む培地で育成される。例示的な態様において、酸化還元活性化合物はシステイン、シスチン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、チオスルファート、亜ジチオン酸塩、メタビスルフィット、スルフィット、Ｎ−エチルマレイミド、又はマイコチオールからなる群より選択される。
【００１４】
本発明は宿主細胞中でＴｒｘＡポリペプチドの活性を減少させる遺伝的修飾を含む、例えばバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス宿主細胞も提供する。ＴｒｘＡポリペプチドは配列番号２定義されるアミノ酸配列及び異種の非病原性スタフィロコカールＤｓｂＡポリペプチドをコードしている核酸配列を含む。このＤｓｂＡポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
本発明は還元活性化合物を含む培地中で前述の本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞のいずれかを育成する工程を含む、ジスルフィド結合含有タンパク質を生成する方法も提供する。遺伝的に修飾された宿主細胞はジスルフィド結合含有タンパク質を生成し、このタンパク質を培地に分泌し、任意で培地からこのタンパク質を単離する。例示的な態様において、還元活性化合物はシステイン、シスチン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、チオスルファート、亜ジチオン酸塩、メタビスルフィット、スルフィット、Ｎ−エチルマレイミド、又はマイコチオールからなる群より選択される。幾つかの態様において、この宿主細胞はタンパク質を分泌しない。このタンパク質は細胞から単離される。
【００１６】
本発明は、宿主細胞中で細胞質リダクターゼの活性を減少させるために遺伝的修飾をする工程、異種スタフィロコカールオキシダーゼ又は酸化活性を有しているこれらの変異体をエンコードしている核酸配列を宿主細胞へ導入する工程、及び酸化還元化合物を含む撥中でこの宿主細胞を育成する工程を含むバチルススブチリス宿主細胞等のバチルス宿主細胞においてタンパク質を含むジスルフィド結合を製造する方法も提供する。このオキシダーゼは非病原性スタフィロコッカスバクテリウム由来である。この宿主細胞はジスルフィド結合含有タンパク質を生成し、培地にこのタンパク質を分泌する。これらの方法は本発明の発明の宿主細胞のいずれかを用いて行うことができる。幾つかの態様において、この宿主細胞はタンパク質を分泌せず、タンパク質は細胞から単離される。幾つかの態様において、宿主細胞の遺伝的修飾により減少させられた細胞性リダクターゼの活性はＴｒｘＡ細胞性リダクターゼの活性であり、他のバクテリア由来又はリダクターゼ活性を有している変異体からの相同体を含む。このＴｒｘＡポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列又は表１に列挙されているアミノ酸配列のいずれか、配列番号１の核酸配列又は表１に列挙されている核酸配列によりコードされているアミノ酸配列、配列番号２又は表１に列挙されているアミノ酸配列に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０５、９５％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列、配列番号１の核酸配列又は表１に列挙されている核酸配列のいずれかに少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０５、９５％、９８％、又は９９％同一な核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、配列番号１の相補体に過酷な条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列からなる群より選択される。減少された細胞質リダクターゼ活性は細胞質リダクターゼ遺伝子の変異により引き起される。例えば、欠失変異、置換変異、及び挿入変異がリダクターゼ活性を減らすための細胞質リダクターゼ遺伝子においてなされている。幾つかの態様において、減少されたリダクターゼ活性は誘発プロモーターのより制御される。幾つかの態様において、異種スタフィロコカールオキシダーゼ、又はオキシダーゼ活性を有するこれらの変異体はオキシダーゼをコードしている遺伝子を含むプラスミドで宿主細胞を形質転換することにより宿主細胞へ導入される。好ましくは、スタフィロコカールオキシダーゼは例えば、スアタフィロコッカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）等の非病原性スタフィロコッカスバクテリウムである。オキシダーゼは、ＢｄｂＡ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、ＤｉｐＺ、ＤｓｂＥ、ＣｃｍＧ、ＤｓｂＧ、ＢｄｂＢ、ＢｄｂＣ、又はＢｄｂＤ等のオキシダーゼでよい。幾つかの態様において、異種オキシダーゼは他のバクテリア由来の相同体又はリダクターゼ活性を有している他の変異体を含むスタフィロコカールＤｓｂＡポリペプチドである。このＤｓｄＡポリペプチドは配列番号４又は表２に列挙されているアミノ酸配列のいずれか、配列番号３の核酸配列又は表２に列挙されている核酸配列のいずれかによりコードさ���るアミノ酸配列、配列番号４又は表２に列挙されているアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列、配列番号３又は表２に列挙されている核酸配列に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一な核酸によりコードされるアミノ酸配列、配列番号３の相同体に過酷な条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列からなる群より選択される。前述の方法は宿主細胞を酸化還元活性化合物を含む培地中で育成して行われる。例示的な態様において、この還元活性酵素は、システイン、シスチン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、チオスルファート、亜ジチオン酸塩、メタビスルフィット、スルフィット、Ｎ−エチルマレイミド、又はマイコチオールからなる群より選択される。１つの態様において、本発明は、（ａ）宿主細胞中で低減されたＴｒｘＡポリペプチドを発現する（ＴｒｘＡポリペプチドは配列番号２で定義されるアミノ酸配列を含む）及び／又は（ｂ）宿主細胞で異種スタフィロコカールＤｓｂＡポリペプチドの発現が低められている（このＤｓｂＡポリペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を含む）、ジスルフィド結合含有タンパク質を製造する方法を提供する。そのような方法は還元活性化合物を含む培地でこの宿主細胞を育成する工程、及び任意でこの培地からジスルフィド結合含有タンパク質を単離する工程を含む。該宿主細胞はジスルフィド結合含有タンパク質を生成し培地中に分泌する。そのような方法は組換えタンパク質の折りたたみを改善すること、又は活性な組換えタンパク質の生産を、例えば、少なくとも約２培、３倍、４倍、５倍、又はより高いレベルにまで改善する方法を含む。幾つかの態様において、この宿主細胞はこのタンパク質を分泌しない、このタンパク質は細胞から単離される。
【００１７】
本発明は組換えタンパク質の折りたたみ又は活性な組換えタンパク質の生産性を改善する方法も提供する。そのような方法は前述の方法を含んでいてもよい。この活性な組換えタンパク質はジスルフィド結合含有タンパク質であり、遺伝的に修飾されたバチルス宿主細胞（例えば、前述のもの）が適切な折りたたみを有するジスルフィド結合含有タンパク質を発現する条件下で育成される。このタンパク質はその後任意で培地から単離される。この側面の方法は、活性なジスルフィド結合含有タンパク質を発現させ生産性を改善させる条件下で、還元活性化合物を含む培地中で、バチルススブチリス宿主細胞等の遺伝的に修飾されたバチルス宿主細胞を育成する工程を含む。前記宿主細胞は（ｉ）細胞質リダクターゼ活性が低減されている、及び／又は（ｉｉ）異種スタフィロコカールオキシダーゼ又はオキシダーゼ活性を有するそれらの変異体の発現が高められている、及び／又は（ｉｉｉ）異種ジスルフィド結合含有タンパク質を分泌する。任意で、前記タンパク質は培地から単離される。この方法は本発明の発明の宿主細胞のいずれかを用いて行うことができる。タンパク質折りたたみを適切に改善することは活性な組換えジスルフィド結合含有タンパク質の生産性が、酸化還元活性化合物を添加していない培地中の未修飾宿主細胞の生産性と比較して、少なくとも約２培、３倍、４倍、５倍、又はより高くなったことをにより決定することができる。（例えば、ｍｇ活性タンパク質／Ｌ細胞培養、又は細胞培養１リットル当たりの組換えタンパク質の活性がより高いこと）。幾つかの態様において、低減された活性を有する宿主細胞の細胞質リダクターゼは他のバクテリア又はリダクターゼ活性を有している変異体を含む、ＴｒｘＡポリペプチドである。このＴｒｘＡポリペプチドは配列番号２又は表１に列挙されているアミノ酸配列のいずれか、配列番号２又は表１に列挙されているアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列、配列番号１又は表１に列挙されているアミノ酸配列に対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一な核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、配列番号１の相同体に過酷な条件下でハイブリダイゼズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列からなる群より選択される。低減された細胞質リダクターゼは細胞質リダクターゼ遺伝子の変異により引き起される。例えば、欠失変異、置換変異、及び挿入変異はリダクターゼ活性を低めるための細胞質リダクターゼ遺伝子においてなされる変異の例である。幾つかの態様において、減少されたリダクターゼ活性は誘発プロモーターにより制御される。幾つかの態様において、異種スタフィロコカールオキシダーゼ、又はオキシダーゼ活性を有しているこれらの変異体がオキシダーゼをコードしている異伝相同体を含むプラスミドを有する宿主細胞を形質転換することにより導入される。好ましくは、このスタフィロコカールオキシダーゼは例えば、スタフィロコッカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）等の非病原性スタフィロコッカスバ���テリウムである。オキシダーゼは、ＢｄｂＡ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、ＤｉｐＺ、ＤｓｂＥ、ＣｃｍＧ、ＤｓｂＧ、ＢｄｂＢ、ＢｄｂＣ、又はＢｄｂＤ等のオキシダーゼでよい。幾つかの態様において、異種オキシダーゼは他のバクテリア由来の相同体又はリダクターゼ活性を有している他の変異体を含むスタフィロコカールＤｓｂＡポリペプチドである。このＤｓｂＡポリペプチドは配列番号４又は表２に列挙されているアミノ酸配列のいずれか、配列番号３の核酸又は表２に列挙されている核酸配列のいずれかによりコードされるアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列又は表２に列挙されているアミノ酸配列のいずれかに少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一なアミノ酸配列、配列番号３の核酸配列又は表２に列挙されている核酸配列のいずれかに少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％同一な核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、配列番号３の相同体に過酷な条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列からなる群より選択される。前述の方法は酸化還元活性化合物を含む培地で宿主細胞を育成することにより行うことができる。例示的な態様において、この酸化還元活性化合物はシステイン、シスチン、グルタチオン、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１，４−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、チオスルファート、亜ジチオン酸塩、メタビスルフィット、スルフィット、Ｎ−エチルマレイミド、又はマイコチオールからなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１はバチルススブチリスのチオレドキシン様タンパク質の間の配列関連性を示す。タンパク質間の矢印は疑義が生じている配列におけるタンパク質のＢｌａｓｔＰによる陽性同一を示す。トランスメンブラン（ＴＭ）セグメントを有するタンパク質は示されている。
【図２】図２はバチルススブチリスによるＰｈｏＡのＢｄｂＣ依存分泌を示す。アルカリフォスファターゼ活性アッセイによりＩｔｒｘＡを測定する。
【図３】図３は遺伝的に修飾されたバチルススブチリス株のアルカリセリンフォスファターゼ活性により測定されるＥ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡの高められた生成を示す。バチスルスブチリスＩｔｒｘＡ、Ｘ−ＳａｄｓｂＡ、ＩｔｒｘＡ  Ｘ−ＳａｄｓｂＡ、及びＸ−ＳａｄｓｂＡ株又は親株１６８（ＰｈｏＡ）をｐＰＳＰｈｏＡ５で形質転換してＥ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡを生成した。全ての株及び親株１６８（１６８）は０．５％キシロース（ホワイトバー）と追加的な１００ｍｇ／ｍｌシスチン（グレイバー）又システイン（ブラックバー）を含むＬＢ培地で育成した。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
本発明の発明は遺伝的に修飾された宿主細胞及びジスルフィド結合含有タンパク質を生成するためにこの宿主細胞を使用する方法、及び組換えタンパク質の折りたたみを改善する方法を提供する。本発明の宿主細胞は細胞質リダクターゼの活性を低めるため及び異種のオキシダーゼポリペプチドを発現するための遺伝的修飾を含む。本発明の宿主細胞は更に異種ジスルフィド結合含有タンパク質を含む。本発明は更に還元活性化合物を宿主細胞の育成培地に添加することにより活性ジスルフィド結合含有タンパク質を製造するための改善された方法も提供する。
【００２０】
従来の研究において、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡの分泌における膜関連ＴＤＯＲの役割が研究され、ＢｄｂＣ及びＢｄｂＤが膜を横断して移行するＰｈｏＡの分解の阻害に重要であることが示された（Ｂｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４５３１−２４５３８，１９９９；Ｍｅｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：６９９４−７００１，２００２）。これらの研究はＢｄｂＣＤのＰｈｏＡ折りたたみ活性にもかかわらず、相当量の移行ＰｈｏＡが分解されていることを明らかにした（Ｄａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ，．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７２：６８７６−６８８５，２００６；Ｋｏｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９，２００７）。このことはバチルススブチリスのジスルフィド結合形成能力が限られていることに依存しているようであった（Ｓａｒｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６９４：３１１−３２７，２００４）。このときは、細胞質ＴＤＯＲ類はＰｈｏＡの折りたたみを促進するチオールオキシダーゼよりもむしろリオールリダクターゼとしての機能であると信じられてきたので、これらはが研究に含まれていなかった。本明細書で開示するデータはバチルススブチリスのチオール酸化力をどのようにして高められるかを示している。細胞質ＴＤＯＲ類の細胞レベルを低めることはチオール還元力を低め、付随して酸化力を高めることになる。驚くべきことに、試験されたバチルススブチリスのチオール様タンパク質の、ＰｈｏＡの分泌にのみ有意にインパクトを与えた。これは必須チオレドキシンＴｒｘＡであった。しかしながら、このデータは本発明の他のチオレドキシン様タンパク質の役割を除外することはできなかった。本発明の明細書で提供されるデータは、ＴｒｘＡは、細胞質中の遺伝的なチオール還元機能に依存して分泌された活性ＰｈｏＡの生成を阻害することを示している。
【００２１】
本明細書で提供されるデータはバチルススブチリスにおけるＴｒｘＡの欠失がＥ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡの細胞外レベルを約１．５乃至２倍高めることを示している。ジスルフィド結合を含まないＡｍｙＱの分泌及び１Ｄ又は２Ｄにより欠失できる他の全ての分泌されたバチルススブチリスタンパク質はこれらの条件では影響されないことから（実施例２）、
ＴｒｘＡ欠失の効果は、ジスルフィド結合含有タンパク質ＰｈｏＡに特異的であるようだ。実際は、高められたＰｈｏＡレベルはＰｈｏＡ分解生成物の消滅と同時に起こり、培地中に不完全に処理されたｐｒｏ−ＰｈｏＡが現れる。このことは、ＰｈｏＡの折りたたみがＴｒｘＡ欠失で改善されたことを示している。従来のＤＮＡ配列解析は主要な分泌機構成分に関する遺伝子ではないもの又はバチルススブチリスのタンパク質ではないものの発現がＴｒｘＡ欠失により影響されると示していた（Ｓｍｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３９２１−３９３０，２００５）。総合すれば、これらの発見はＴｒｘＡがＰｈｏＡ分泌に特異的に含まれている分泌機構成分の活性（しかし量ではない）に影響を与えていることを示している。即ち、ＴｒｘＡ欠失が酸化されたＢｄｂＤ分子の細胞レベルを高めることから、ＴｒｘＡは、細胞質外のチオール−ジスルフィド酸化還元酵素ＢｄｂＤの酸化還元状態に有意に影響を与えていることを示している。これらの観察は細胞質の還元の能力を限定し、ＴｒｘＡ欠失をさせることは、酸化されたＢｄｂＤ分子のレベルを高めることになることを示している。従って、ＴｒｘＡ消失はｂｄｂＣ変異の逆の効果を有し、ＰｈｏＡの強力な還元された（減少された）折りたたみを生成し（Ｂｏｌｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２４５３１−２４５３８，１９９９）、同時に還元されたＢｄｂＤのレベルを有意に高める。特に、ＴｒｘＡ欠失細胞による改善されたＰｈｏＡ分泌は依然としてＢｄｂＣの存在に依存している。それ故、ＴｒｘＡ欠失細胞中の酸化されたＢｄｂＤ分子のレベルを高めることが、ＰｈｏＡ等の酸化にさらされたタンパク質の細胞質キャパシティーを高める。ＰｈｏＡは２つのジシルフィド結合を含むが、ジスルフィド結合はＡｍｙＱ及びバチスルスブチリスが分泌する大部分のタンパク質にはないので、このデータはＴｒｘＡ欠失細胞によるＰｈｏＡの改善された分泌が改善されたＰｈｏＡ膜移行よりも、翻訳後のＰｈｏＡにおけるジスルフィド結合の形成に貢献できることを示している。
【００２２】
本発明は、対応する未修飾宿主細胞における細胞質リダクターゼの活性よりも細胞質リダクターゼの活性を低める又は抑制する遺伝的修飾を含む、遺伝的に修飾された宿主細胞を提供する。本発明は宿主細胞中で任意の細胞質リダクターゼの活性を減少又は抑制することにより行われる。低減された活性は本発明の明細書で示すような細胞質リダクターゼの発現が低められていること、又は本発明の明細書で示すように、細胞質リダクターゼの活性が低められていることにより、検出できる。
【００２３】
「リダクターゼ」の語は、所定の環境中で分子を還元する酵素を意味する。リダクターゼは電子を提供して作用する、それいえ、基質を還元することにより酸化される。幾つかの態様において、細胞質リダクターゼはチオールジスルフィドリダクターゼ、チオレドキシン、又はＴｒｘＡ、ＴｒｘＣ、ＹｂｄＥ、ＹｄｂＰ、ＹｄｆＱ、ＹｋｕＶ、ＹｏｓＲ、ＹｔｐＰ、ＹｕｓＥ、ＢｄｂＡ、ＲｅｓＡ、ＳｔａＡ、ＳｐｏＩＶＨ、又はＹｎｅＮ等のチオレドキシン様タンパク質、又は特定の宿主細胞中の等しいタンパク質である。他の態様において、細胞質リダクターゼはＧｒｘＡ、ＧｒｘＢ、又はＧｒｘＣ等のグルタレドキシン、又はＧｏｒ等のグルタチオンオキシドリダクターゼ、又は特定の宿主細胞の等しいタンパク質である。
【００２４】
幾つかの態様において、この細胞質リダクターゼは表１に示すタンパク質のようなバチルスＴｒｘＡタンパク質、又は他の真核又は原核細胞由来の相同体、又はリダクターゼ活性を有するこれらの変異体である。
【００２５】
幾つかの態様において、この細胞質リダクターゼはジェンバンク登録番号Ｎｏ．Ｐ１４９４９で定義されるアミノ酸配列
0005546037.tif 000002
を有するバチルスＴｒｘＡポリペプチド又はジェンバンク登録番号Ｎｏ．ＰＸ９９２７５で定義される核酸配列
0005546037.tif 000003
によりコードされるアミノ酸配列を有するバチルスＴｒｘＡポリペプチドである。
【００２６】
ジェンバンクにおける相同ポリペプチドを同定することにより、又は例えば、配列番号３をハイブリダイズプローブとして用いる、宿主細胞の核酸ライブラリーの相同核酸配列を同定することにより、他の相同体も同定できる。変異体は既知のＴｒｘＡの配列中に変異（挿入、欠失、又は置換）を作成して生成できる。幾つかの態様において、保存置換が、例えば、触媒領域外に作成される。約約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０５、９５％、９８％、又は９９％同一な変異体が意図される。
【００２７】
0005546037.tif 000004
本発明は異種オキシダーゼをコードしている核酸配列を含む遺伝的に修飾された宿主細胞も提供する。「オキシダーゼ」の語は所定の環境中で分子を酸化する酵素を意味する。オキシダーゼは電子を受け取ることにより作用し、それ故基質を酸化するとより還元される。「異種」の語は親宿主細胞のように、正常（未修飾）又は野性方の宿主細胞では生成されないタンパク質を意味する。異種オキシダーゼは宿主細胞とは違う任意の種又は株由来である。代替的に、異種オキシダーゼは宿主細胞の同じ種又は株由来であるがこの宿主細胞の導入された核酸配列により発現される。例示的な態様において、異種オキシダーゼはスタフィロコカールオキシダーゼである。幾つかの態様において、異種オキシダーゼはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ等の非病原性スタフィロコッカスバクテリウム由来のスタフィロコカールオキシダーゼである。
【００２８】
幾つかの態様において、このオキシダーゼはＢｄｂＡ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、ＤｉｐＺ、ＤｓｂＥ、ＣｃｍＧ、ＤｓｂＧ、ＢｄｂＢ、ＢｄｂＣ、、又はＢｄｂＤである。１つの態様において、このオキシダーゼは表２に示す他のタンパク質等のスタフィロコカールＤｓｂＡタンパク質又はスタフィロコカールＤｓｂＡ様タンパク質、又は他の真核又は原核細胞由来の相同体、又はオキシダーゼ活性を有するこれらの変異体である。
【００２９】
幾つかの態様において、このオキシダーゼは配列番号４：
0005546037.tif 000005
のアミノ酸配列を有する、又は配列番号３：
0005546037.tif 000006
で定義される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を有するスタフィロコカールカルノーサスＤｓｂＡ、又はオキシダーゼ活性を有するこれらの変異体である。ジェンバンクにおける相同ポリペプチドを同定することにより、又は例えば、配列番号３をハイブリダイズプローブとして用いる、宿主細胞の核酸ライブラリーの相同核酸配列を同定することにより、他の相同体も同定できる。変異体は既知のＴｒｘＡの配列中に変異（挿入、欠失、又は置換）を作成して、生成できる。幾つかの態様において、保存置換が、例えば、触媒領域外に作成される。約約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０５、９５％、９８％、又は９９％同一な変異体が意図される。
【００３０】
0005546037.tif 000007
細胞の状態に依存して１つの酵素が還元活性及び酸化活性の両方を有することがあることは重要である。それ故、タンパク質はある条件ではリダクターゼとして働き、異なる条件下ではオキシダーゼとして働く。
【００３１】
本発明の細胞質リダクターゼポリヌクレオチド又はオキシダーゼポリヌクレオチドは前述のポリヌクレオチドに実質的に等しい核酸配列も含む。本発明のポリスヌクレオチドは本明細書で引用されている核酸配列に対して、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％、より典型的には少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、又は９４％、及び更に典型的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一である。前記ポリヌクレオチドは還元活性又は酸化活性を有するポリペプチドをコードしている。
【００３２】
本発明の発明の細胞質リダクターゼ又はオキシダーゼポリペプチドは本明細書で引用するヌクレオチド配列に過酷な条件下でハイブリダイズする核酸配列フラグメントを含む。このフラグメントは約５ヌクレオチド、又は７ヌクレオチド、又は９ヌクレオチドより多い、又は１７ヌクレオチドより多い。例えば、１５、１７、又は２０ヌクレオチド以上のフラグメント（即ち、本発明のポリヌクレオチド配列のいずれか１つに特異的にハイブリダイズするもの）が意図される。
【００３３】
「過酷」の語は本発明の分野において過酷であると理解されている条件を意味する。過酷な条件は高度な過酷条件（即ち、０．５ＭＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭＥＤＴＡ中、６５℃でフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイズし、６８℃で０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄）、及び中程度の過酷条件（４２℃で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄）を含む。場合によっては、デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイズが意図された場合、追加的な例示的過酷ハイブリダーゼション条件は、３７℃で６ｘＳＳＣ／０．５％リン酸ナトリウム中の洗浄（１４ベースオリゴについて）、（１７ベースオリゴについて）４８℃、（２０ベースオリゴについて）５５℃、及び（２３ベースオリゴについて）６０℃が含まれる。
【００３４】
本発明の範囲内の配列はこれらの配列に限定されない、しかし所望の生物学的活性を有するこれらの変異体を含む。「変異体」の語はアレル変異体、株変異体、他の原核又は真核細胞由来の相同体、及び実質的な等価物を含む。アレル及び株変異体は上で提供された配列、これらの代表的なフラグメント、又は同じ種の別の単離配列を有する前述の配列に少なくとも９０％、又は９５％同一な核酸配列と比較して決定することができる。更に、コドンの多様性により、本発明は本明細書で開示される特定のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のようなアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。他の言葉で言えば、ＯＲＦのコード領域において、同じアミノ酸をコードする他のコドン置き換わった場合も本発明の範囲内である。
【００３５】
開示のポリヌクレオチド及びタンパク質の種及び宿主細胞株のホモロガス（又はオーソロガス）も本発明により提供される。種又は株のホモロガスは単離され、本明細書で提供される配列から好適なプローブ又はプライマーを作成し、所望の種から好適な核酸源をスクリーニングする。
【００３６】
本発明のリダクターゼ及びオキシダーゼポリペプチドは前述のアミノ酸配列、又は前述の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、又は対応する完全長又は成熟タンパク質を含むがこれらに限定されない。本発明は、前記のアミノ酸配列、又は対応する完全長又は成熟タンパク質の生物学的に活性な変異体：及び生物学的活性を有するこれらの「実質的等価物」（例えば、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８５、８９％、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、典型的には少なくとも約組換え９５％、９６％、９７％、より典型的には少なくとも約組換え９８％、最も典型的に約９９％のアミノ酸配列同一性を有するもの）も提供する。アレル変異体によりコードされるポリペプチドは上で定義されるポリペプチドと比較して同様の、高められた、又は低められた活性を有している。
【００３７】
宿主細胞
本発明は遺伝的に修飾された宿主細胞及びジスルフィド結合含有タンパク質を生成するための方法を提供する。宿主細胞の語はトランスフォーム、トランスフェクト、インフェクトされ、あるいは核酸配列でトランスフォーム、トランスフェクト、又はインフェクトされ、所望のタンパク質を組換え生成する選択された所望の遺伝子を発現する。この語は親細胞の子孫も含む。選択された遺伝子又は遺伝子修飾が存在する限り、この子孫は親細胞と相同であるか、又は遺伝的に修飾されているかは問題ではない。
【００３８】
本発明は異種ポリペプチドを発現でき、遺伝的に修飾することができる任意の宿主微生物を用いて実施することができる。宿主微生物は、好ましくは単核宿主生物であるが、多核生物も本願発明に包含される。提供された生物が本明細書のように修飾することができ、その中で発現された所望のポリペプチドが提供される。明確にするために説明すると、宿主細胞の語は本明細書を通じて使用されているが、宿主微生物は技術的理由で困難ではない限り、宿主細胞に変えて用いることができる。
【００３９】
幾つかの態様において、この宿主細胞はバクテリア細胞等の原核細胞である。この宿主細胞はバチルス等のグラム陽性又はＥ．ｃｏｌｉ等のグラム陰性バクテリアである。この宿主生物は好気性又は嫌気性微生物である。幾つかの態様において、宿主細胞は他の対タイプの細胞よりも少ないプロテアーゼを有する宿主細胞のような、ポリペプチドの発現に好ましいものである。本発明に好適なバクテリアは古細菌及び真正細菌、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）を含む。他の有用なバクテリアはエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）、ビトレオシラ（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ）、及びパラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）を含む。追加的な有用なバクテリアはコリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種を含み、特に、コリネバクテリウムグルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、ラクトコッカスラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルスパンタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトマイセスコエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。好適なＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉのＤＨＢ４、Ｅ．ｃｏｌｉのＢＬ−２１（両イオン及びｏｍｐＴプロテアーゼを欠いている）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：２８３，１９８４）、Ｅ．ｃｏｌｉのＡＤ４９４、Ｅ．ｃｏｌｉのＷ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉの２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉのＢ、及びＥ．ｃｏｌｉのＸｌ７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）を含む。他の株はメチオニン欠失株であり、それゆえ３５Ｓメチオニン又はセレノメチオニンで標的タンパク質を標識することができるＥ．ｃｏｌｉＢ８３４（Ｌｅａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：９８７，１９９２）である。所望の株の他の態様はＢＬＲ株、及びＫ−１２株ＨＮＳ１７４及びＮｏｖａＢｌｕｅを含み、これらはプラスミドモノマー生産性を改善し、繰返し配列を含む標的プラスミドを安定化するのを助けるｒｅｃ−Ａ誘導体である。
【００４０】
好適なバチルス株は、バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスアカロフィリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスクラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｅｉｉ）、バチルスセレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルスプミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルスツリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、又はバチルスハロヂュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎ）を含む。グラム陽性バクテリアであるバチルススブチリスはバイオテクノロジー産業において分泌タンパク質の生成に好適な生物である。このことは単に、バチルススブチリスが外膜がないという事実に基づいている。外膜はＥ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性バクテリアのペリプラスムにおいて、多くのタンパク質を保持する。従って、細胞質膜を横切って移動するバチルススブチリスの大部分のタンパク質は直接培地中に分泌される。即ち、外膜がないということはバチルススブチリスにおいて生成されたタンパク質はリポポリサッカライド（エンドトキシン）がない。バチルススブチリスをタンパク質生成の宿主細胞として使用することにおける他の利点は、遺伝的順応性が高いということである。４１００遺伝子までのほとんどの変異を有する株が利用可能であり、株及び遺伝子発現のツールボックスとしても利用可能である。更にこのバクテリアは一般的に安全であると認識されている（Ｂｒａｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：３７６−３８１，１９９９；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１００：４６７８−４６８３，２００３；Ｋｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９０：２４９−２５６，１９９７；Ｚｅｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  Ｅ．Ｇｏｌｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｌ．Ｇｒｅｅｎ（ｅｄ．）３  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ，  ２００８）。
【００４１】
他の態様において、この宿主細胞は酵母又は哺乳動物等の真核生物細胞である。哺乳動物細胞の例としてはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６−４２２０（１９８０）），ヒト胚性キドニー（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬｌ５７３）又は３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ９２）である。好適な哺乳動物細胞及び形質転換方法の選択、培養、増幅スクリーニング、及び生成物の精製は当業者に知られている。他の好適な哺乳動物細胞株はサルＣＯＳ−Ｉ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬｌ６５０）及びＣＯＳ−７セルライン（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）及びＣＶ−Ｉセルライン（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。他の好適な哺乳動物細胞の例としては形質転換された細胞株を含む、プライムセル株及びげっ歯類細胞株を含む。通常の２倍体細胞株、プライム組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養由来細胞株、並びにプライム外来移植片も好適である。哺乳動物細胞は選択された遺伝子を失活させていてもよく、又は選択された遺伝子が優勢に作用していてもよい。他の好適な哺乳動物細胞株はマウス神経芽細胞Ｎ２Ａセル、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９セルＳｗｉｓｓＢａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウス由来３Ｔ３ライン、ＢＨＫ又はＨａＫハムスターセルラインを含むがこれらに限定されない。これらの細胞はＡＴＣＣによる入手可能である。これらの細胞株のそれぞれはタンパク質発現の分野における当業者に知られており、利用可能である。
【００４２】
当業者に知られている多くの酵母細胞も本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。酵母細胞の例としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。アスペルギルス等の糸状菌も本発明のポリペプチドの発現に対する宿主細胞をして利用可能である。
【００４３】
追加的に、好ましくは、昆虫細胞システムも本発明の方法に用いられる。このようなシステムは例えば、Ｋｉｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｌｄｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，４：５６４−５７２（１９９３）；及びＬｕｃｌｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９（１９９３）代表的な昆虫細胞はＳｆ−９及びＨｉ−５（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）である。本発明は本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞の培養も提供する。宿主細胞の「培養」はコロニーである、選択的又は異なる培地を含む栄養培地で行われる宿主細胞の育成である。「培養」の語はプライマリーセル及びそれらの子孫を含み、移動の数に関係なくそれら由来の培養を含む。宿主細胞の全ての子孫は意図して又は意図していない変異体によりＤＮＡ含量が正確に同一ではないことが理解されている。元の形質転換された細胞においてスクリーニングされた同じ機能又は同じ生物学的活性を有する変異体の子孫も含まれる。
【００４４】
栄養培地は固形培地又は準固形培地、又は液体培地のいずれでもよい。例示的な栄養培地はＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地、ブロッドアガー、チョコレートアガー、セアーマーチン（ＴＭ）、バイルエスクリンアガー（Ｂｉｌｅ  Ｅｓｃｕｌｉｎ  Ａｇａｒ）（ＢＥＡ）、システインラクトースエテクトロライトデフィシエントアガー（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ａｇａｒ）（ＣＬＥＤ）、ヘクトンエンテリック（Ｈｅｋｔｏｅｎ  Ｅｎｔｅｒｉｃ）（ＨＥ）マックコンキーアガー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ  ａｇａｒ）（ＭＡＣ）、マンニトールソルトアガー（Ｍａｎｎｉｔｏｌ  Ｓａｌｔ  Ａｇａｒ）（ＭＳＡ）、ミュラーヒントンアガー、オンゾアガー（Ｏｎｏｚ  ａｇａｒ）、フェニルエチルアルコールアガー（ＰＥＡ）及びキシロース−リジン−デオキシコーレートアガー（ＸＬＤ）を含む。一般的に、宿主細胞の培養は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）に記載のこの分野において標準的な技術を用いて、インキュベーター中で行われる。
【００４５】
本発明の培養は例えば、Ｑｕｉ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：４８９１に記載のように、振とうフラスコ内で組換えタンパク質を生成する。代替的に、本発明の培地は、Ｑｕｉ  ｅｔ  ａｌに記載のように、発酵機器中で育成及び組換えタンパク質の生成を行ってもよい。
【００４６】
遺伝的修飾
本発明は細胞質リダクターゼの低減された活性を有する遺伝的に修飾された宿主細胞も提供する。「低減された活性」の語は宿主細胞の細胞質でのリダクターゼ活性が低められている、又は抑制されている、又は完全に排除されていることを意味する。この低減された活性は対応する野生型又は未修飾バチルス宿主細胞等の未修飾宿主細胞における活性と比較される。低減された細胞質リダクターゼ活性はリダクターゼポリペプチドの発現の低減、細胞質リダクターゼアミノ酸配列をコードしている遺伝子転写の低減、このリダクターゼアミノ酸配列をコードしているＲＮＡの翻訳の低減又は抑制、又は細胞質リダクターゼポリペプチドの不活性化又は抑制により達成することができる。リダクターゼ活性の低減は特定のリダクターゼの活性を直接低減又は欠失させることにより、あるいは特定のリダクターゼのリダクターゼ経路の上流又は下流を修飾することにより間接的に実施することができる。遺伝的に修飾された宿主細胞の低減された活性を測定するためのガイダンスは、実施例２で示すように、４−アセトアミド−４’−マレイミジル−スチルベン−２，２’−ジスルホネート（ＡＭＳ）でラベルしている細胞抽出物でアッセイするような方法で行うことができる。
【００４７】
宿主細胞の内性リダクターゼ活性の低減又は喪失はリダクターゼをコードしている遺伝子の機能的欠失又は不活性化により達成することができる。１つの態様において、プラスミドを染色体の特定の位置において宿主細胞の染色に取り込ませて、細胞質リダクターゼを阻害する。他の態様において、少なくとも１つの変異をリダクターゼの活性を変更するようにリダクターゼコード配列に導入する。例えば、ポイント変異がこの活性を不活性化する位置に導入される。細胞質リダクターゼにおけるこれらの変異体又は阻害は、挿入、欠失、又は置換変異である。この変異体は部位特定変異誘発、ＰＣＲ増幅、又は他の好適な方法を用いて生成され、プライマーは所望のポイント変異を含む（変異誘発の技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．前記及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．参照）。
【００４８】
核酸配列の修飾は自然派生又は野生型配列に対するアミノ酸配列の保存的及び／又は非保存的修飾となる。アミノ酸配列の保存的修飾は自然発生ポリペプチドに似た機能及び／又は化学的性質を有する変異タンパク質幾つかの又は変異ポリペプチドを生成する。反対に、ポリペプチドの機能及び／又は化学的性質における実質的な修飾は、（ａ）シート又はヘリックス構造等の置換の領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は水和性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しつつ、その影響を有意に違わせるアミノ酸配列を選択して置換することにより達成される。
【００４９】
例えば、「保存アミノ酸置換」はその位置においてアミノ酸残基の極性又は電荷にわずかに又は全く影響しない、外来残基で天然のアミノ酸残基の置換することを含む。更に、ポリペプチドにおいて、任意の天然残基は前述の「アラニンスキャニング変異誘発」で説明するように、アラニンで置換することもできる。
【００５０】
保存アミノ酸置換は生物学的システム中の合成よりもむしろ化学的ペプチド合成により通常取り込まれる非自然発生アミノ酸配列も含む。これらはペプチド模倣体及びアミノ酸配列の他の保存された又は逆の形態を含む。当業者は本明細書で説明する核酸又はポリペプチドは組換え手段による製造のほかに化学的に合成できることを理解している。
【００５１】
自然派生残基は一般的な側鎖の性質に基づいて分類されている：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、ＧＩｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、ＧＩｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の伸長に影響する残基：ＧＩｙ、Ｐｒｏ
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
例えば、非保存的置換は他のクラスのメンバーの１つのメンバーを交換することを含む。そのようにして置換された残基は非ヒトＩＬ−１７様ポリペプチドオーソログと相同なポリペプチド領域へ、又はこの分子の非相同領域へ導入される。
【００５２】
そのような変化を行う際に、アミノ酸のハイドロパシックインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ハイドロパシックインデックスを割り当てられる。これらの指数は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【００５３】
ポリペプチドに相互作用生物学的機能が与えられる場合の、ハイドロパシックアミノ酸インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｅｘ）の重要性は、本技術分野で一般的に理解されている。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。あるアミノ酸が、同様のハイドロパシックインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換されても結果として依然同様の生物学的活性を持つポリペプチドとなりうることが知られている。そのような変化において、そのハイドロパシックインデックスが、±２以内でのアミノ酸の置換が好ましく、特に±１以内の置換が好ましく、また±０．５以内の置換がとりわけ好ましい。
【００５４】
類似アミノ酸の置換はまた、特にそれによって作製された生物学的機能的等価ポリペプチドまたはペプチドを、免疫学的実施形態で使用することを意図する時に、親水性に基づいて実施することも可能である。その隣接するアミノ酸のハイドロフィリティーにより制御された、タンパク質のハイドロフォリシティーの最大ローカルアベレージはその免疫原性及び抗原性、即ち、タンパク質の生物学的性質で補正される。
【００５５】
以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。そのような変化において、その親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１内の置換が特に好ましく、±０．５内の置換がとりわけ好ましい。ヒドロフィリシティーの根拠に基づいて一次アミノ酸配列のからエピトープを同定することができる。これらの領域は「エピトープコア領域」と呼ばれている。
【００５６】
所望のアミノ酸置換（保持又は非保存）は当業者にそのような置換が好まれる位置においてなされる。例えば、アミノ酸置換はポリペプチドの重要な残基を同定するために用いられる。
【００５７】
代表的なアミノ酸置換を以下の表３に定義する。
【００５８】
0005546037.tif 000008
当業者は既知の方法を用いてポリペプチドの好適な変異体を決定することができる。修飾される分子の好適な領域を同定するために、活性に重要ではないと知られている領域を標的とする。例えば、同じ種又は他の主由来の同じ活性を有する類似のポリペプチドが知られている場合、当業者はそのような類似のポリペプチドのアミノ酸配列を比較するであろう。そのような比較を用いて、当業者は類似のタンパク質間で保存されている分子の残基又は部分を同定することができる。そのような類似のポリペプチドに対して非相同であるポリペプチドの領域における変化はポリペプチドの生物学的活性及び／又は構造に好ましくない影響を与える可能性があると理解されている。当業者は比較的に保存的な領域にさえ、活性を維持したまま、自然発生残渣に化学的に類似したアミノ酸を置換できることを理解している（保存アミノ酸残渣置換）。それゆえ、生物学的活性又は構造に重要である領域は生物学的活性を失わずに、又はポリペプチド構造を不利に変化させずに、保存アミノ酸残基置換が行われる。
【００５９】
更に、当業者は活性又は構造に重要な類似のポリペプチドにおける残基の同定する構造―機能研究を参照する。そのような研究の参照において、当業者は類似のポリペプチドにおいて、活性又は構造の重要性を予測することもできる。当業者は類似のポリペプチドにおける構造に関連して三次構造及び／又はアミノ酸配列を解析することもできる。この情報の参照において、当業者は当業者はこれらの次元構造に関してＩＬ−１７様ポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。アミノ酸配列の解析から多くの文献が二次構造又はエピトープの同定の予測を開示している。Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５，１９７４；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２，１９７４；  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，４７：４５−１４８，１９７８；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６；Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ，２６：３６７−３８４，１９７９参照。更に、コンピュータープログラムでは近年抗体タンパク質及びタンパク質のエピトープコア領域を予測することを助けることが可能になった。例としては、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ解析（（Ｊａｍｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．，４（１）：１８１−１８６，１９９８  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４（１）：１８７−１９１，１９８８），プログラム  ＰｅｐＰｌｏｔ（商標）（Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ，ＣＡＢＳ，６：２３７−２４５，１９９０），及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：７４０−７４２，１９８５），及びタンパク質３次構造のための他のプログラム（Ｆｅｔｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：４７９−４８３，１９９３）を含む。
【００６０】
転写及び翻訳は宿主細胞へアンチセンス核酸配列を導入又は発現させることで抑制することができる。代替的に、これらのプロセスはこれらのプロセスを阻害する小さな有機分子に宿主細胞を接触させることにより行うこともできる。更に、宿主細胞中のリダクターゼの発現はしの調節において、リダクターゼ遺伝子を作用させることにより、宿主細胞中のリダクターゼの発現を制御する１つ以上のタンパク質の発現を修飾することにより低減又は排除することができる。例えば、リダクターゼの発現はこれらのリダクターゼの発現に必須な因子の発現又は活性を低減することにより減少させることができる。代替的に、リダクターゼ発現はリダクターゼを分解するプロテアーゼの発現又は活性化のための構築物の使用により低減又は排除することができる。このことは、例えば、リダクターゼ中のプロテアーゼ感受性を有する部位を挿入することにより行われる（例えば、Ｅｈｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３１１１，１９９７参照）。
【００６１】
更なる態様において、宿主細胞中のリダクターゼ活性の低減又は排除は所望の時期に宿主細胞中でその活性のスイッチを入れる又は切ることができる誘発プロモーターを用いて行うことができる。更に、前記活性は逆のやり方で誘発又は抑制することができる。本発明は誘発可能なリダクターゼ活性を有する宿主細胞を提供する。幾つかの態様において、誘発可能なリダクターゼ活性を有する宿主細胞は前記宿主細胞の内性リダクターゼ活性を初めに欠失し、次いで誘発プロモーター配列に作動可能に結合しているリダクターゼタンパク質をコードしている組換え核酸を有する宿主細胞を提供することにより得られる。「誘発」プロモーターは転写因子又は誘発物質に結合して、高められた又は低められた速度で転写をさせるプロモーターである。宿主細胞中の転写因子の合成又はプロモーター結合能力は、宿主細胞中でインデューサーを発現又は宿主細胞培地からインデューサーを取り除くことにより制御することができる。従って、誘発可能プロモーターの発現を調節するために、インデューサーが宿主細胞の育成培地に添加又はここから取り除かれる。
【００６２】
「インデューサー」の語は細胞の集団に添加した場合、特定の遺伝子からの転写の量を増やす化学的又は物理的因子である。これらは通常小さな分子であり、特定のオペロン又は遺伝子のグループに特異的に作用し、糖、リン酸、アルコール、金属イオン、ホルモン、熱、冷却等を含む。代謝されないという理由から、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）がインデューサーとして通常用いられている。本明細書（実施例２）で説明するように、特定の好適なプロモーター配列はＰＳＰＡＣ等のＩＰＴＧ誘発プロモーター配列を含む。追加的な例示的誘発プロモーターは核酸配列がＬ−アラビノースの存在下でのみ発現するアラビノースプロモーター、ラクトースにより誘発されるｔａｃｌＩプロモーター、培地中の低いリン酸濃度により誘発されるｐｈｏ遺伝子プロモーター、ＵＶ感受性誘発プロモーター、温度感受性誘発プロモーター、及び２、３例を挙げると構成物質誘発プロモーターである。従来のｔｒｘＡ変異宿主細胞株（ＩｔｒｘＡ）はプラスミドのＩＰＴＧ依存ＰＳＰＡＣプロモーターの転写を調節してこの必須遺伝子を置き換えて構築される。
【００６３】
更なる態様において、本発明の方法又は宿主細胞は抑制可能なシステムを介して調節されるリダクターゼ活性を有する宿主細胞を含む。抑制可能システム及び誘発可能システムの主な違いはエフェクター分子がリプレッサーに結合したときに起こる結果である。誘発可能システムでは、エフェクター分子、即ち、インデューサーがリプレッサーに結合すると、リプレッサーのオペレーターへの親和性が大きく減少して、リプレッサーが放出され、転写が促進される。ｌａｃオペロンは誘発可能システムの例である。抑制可能システムでは、エフェクター分子のリプレッサーへの結合がリプレッサーのオペレーターへの親和性を高め、リプレッサーが結合し転写が停止する。従って、ｔｒｐオペロンについて、トリプトファン（エフェクター分子）を宿主細胞環境に添加すると、リプレッサーがオペレーターに結合してシステムが停止する。
【００６４】
更なる態様において、宿主細胞は、オキシダーゼ活性を有している変異体（オーソログ又はホモログ）の異種オキシダーゼポリペプチドのオーソログ又はホモログを発現している。所望のオキシダーゼ活性を有している変異体の決定するためのガイダンスを本明細書で開示する。
【００６５】
所望のポリペプチドに同一なアミノ酸配列を同定する方法はこの分野で知られている。同一性及び／又は類似性を決定するための幾つかの方法は試験される配列間での最大一致を提供するために設計されている。同一性及び類似性を決定するための方法は公に利用可能なコンピュータープログラムで説明されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好適なコンピュータープログラム法は、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムパッケー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７，１９８４）；ジェネティクスコンピューターグループ（ウィスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ），ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＩＮプログラムは全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及は他の源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，前記）から利用可能である。良く知られているスミスウォーターマンアルゴリズムも同一性を決定するのに用いられる。
【００６６】
２つのアミノ酸配列を整列させたための特定のアラインメントスキームは２つの配列の短い領域にのみが一致する結果となり、この小さな整列された領域は２つの完全長配列の間に有意な関係がないとしても、高い配列同一性がある。即ち、好適な態様において、選択されたアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）が標的ポリペプチドの即ち、５０連続アミノ酸に渡る（を測る）ことになる。
【００６７】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰを用いて（ジェネティクスコンピューターグループ、ウインスコンシン大学、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、配列同一性のパーセンテージの測定のために２つのポリペプチドが個々のアミノ酸の最適適合のために整列させる（アルゴリズムにより決定される「適合スパン」）。ギャップオープンペナルティー（３Ｘ平均ダイアゴナルとして計算される；「平均ダイアゴナル」は用いられる比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」は特定の比較マトリックスによりマッチする個々のアミノ酸にアサインされた源又は数である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常１／１０倍のギャップオープニングペナルティー）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリックスがアルゴリズムと一緒に用いられる。標準的なコンピューターマトリックス（PAM  250比較マトリックスについてＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）； ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスについてＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２参照）もこのアルゴリズムに使用される。
【００６８】
リダクターゼ及びオキシダーゼ活性の測定のためのアッセイ
遺伝的に修飾された宿主細胞が対応する未修飾宿主細胞におけるリダクターゼと比較して低減された、抑制された、又は喪失してリダクターゼ活性を有する場合、この修飾及び未修飾宿主細胞は発現されたリダクターゼの量を測定する又は好適な基質の還元能力を測定して、発現されたリダクターゼの相対的な量又は相対的な活性を測定する。発現されたリダクターゼ酵素の相対的な量は、ウエスタンブロット解析、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動、非変異性ゲル電気泳動、高圧液体クロマクグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降法、及び／又はＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ、及びアルカリフォスファターゼアッセイ等の活性を測定する。
【００６９】
還元反応アッセイの基質は解析される酵素の種類に依存し、当業者はどの基質がアッセイに適しているかを理解している。例えば、細胞質リダクターゼＴｒｘＡの基質はＡｃｃＢ、ＡｈｐＣ、ＡｈｐＦ、ＡｒｓＣ、ＣｙｓＨ、ＭｓｒＡ、ＮｒｄＥＦ、ＰｄｈＤ、ＯｄｈＢ、Ｓｐｘ、ＹｄｆＱ及びオキシダーゼＤｓｂＡの基質はＥ．ｃｏｌｉＰｈｏＡである。
【００７０】
１つの代表的アッセイにおいて、細胞抽出物等の精製されたタンパク質又はタンパク質の複合体サンプルが、非還元状態でのＤＳＤ−ＡＰＧＥによる分離の前に、４−アセトアミド−４’−マレイミジル−スチルベン−２，２’−ジスルホネート（ＡＭＳ）でラベルしてモニターされる。ＡＭＳは還元されたタンパク質分子において遊離チオール基にのみ共有結合的に結合し、それゆえ酸化されたものよりも高い嵩をタンパク質に提供し、リダクターゼの割合を測定できる。ＡＭＳラベリングの質は２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のプロテイン５０アッセイチップを用いるような、本分野の標準的な技術を用いて測定される。
【００７１】
更に、タンパク質がより還元されるか又は酸化されるかを測定する、タンパク質の酸化還元電位はネルンストの式を用いた既知の酸化還元電位を有する参考文献を含む酸化還元反応の平衡定数からの計算等の各種方法により決定することができる。一般的に用いられている参考文献は所定のグルタチオン／グラウタチオンジスルフィド（ＧＳＨ／ＧＳＳＧ）緩衝液又は好適なリダクターゼによるＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋カップル（Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．６３：６９，１９９０）である。他の方法はＫｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９９：  ９４９４，１９９１．に定義されている。例えば、チオレドキシンスーパファミリー及びそれらの変異体等のタンパク質の酸化還元電位を決定するための１つの方法はＡｓｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０７８０，１９９７  ａｎｄ  ｉｎ  Ｍｏｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｓｅｔ  ７：１２３３，１９９８に記されている。手短に言えば、Ｅ°’を得るための、Ａｓｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌに記載のペアワイズ平衡化の方法が酸化還元タンパク質の各種ペアの間の可逆的なチオールジスルフィド結合交換に対する反応平衡定数Ｋ１２の正確な決定に基づいている。標準的な安定な酸化還元電位はその後既知の方法、例えば、Ｔｒｘ“ＰＤＩ”又はＴｒｘのいずれかを用いた平衡化により得られる。これらの酸化還元電位は別個に決定されている（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９４９４，１９９１）  ｖｉａ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ＮＡＤＰＨ  （Ｅ°’＝−３１５ｍＶ）。
【００７２】
特定のケースにおいて、タンパク質の酸化還元電位はｐＫａ値と連動している。例えば、ＤｓｂＡの場合、活性部位の求電子性チオールの酸化還元電位とｐＫａ値との間には線形相関がある（Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９４９４，１９９１）。活性部位モチーフの主な機能は求電子性チオールのｐＫａ値を中程度にしてそれ故、酸化された形態に対して還元された形態のタンパク質の安定性を中程度にする。従って、ＤｓｂＡの場合、３．５（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５９７４，１９９４）の非常に低いｐＫａ値はその高い酸化性質にとって重要な因子である。従って、タンパク質の同定、例えば、酸化性質を有しているチオレドキシン変異体又は突然変異体等のタンパク質の同定は低いｐＫａ値を有する変異体を選択することにより同定できる。Ｐｋａは例えば、前述のＮｅｌｓｏｎらに記載されているように、本分野で既知の方法で同定することができる。
【００７３】
酵素の還元活性を測定する追加的なアッセイはＨｏｌｍｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４，３６６４，１９７９）に記載のベータヒドロキシエチレンジスルフィド（ＨＥＤ）還元アッセイ、Ｌｕｔｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：６６８６，１９７９  ａｎｄ  Ｍｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１Ａ：２５２５４，１９９９に記載のインシュリンジスルフィドの減少についてのｉｎ  ｖｔｒｏでの分光光度モニタリング（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ）を含む。更に、酵素の還元能力アッセイは、Ｔｈｅｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ５１  ：  ２２７，  １９７８，  ａｎｄ  Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：９１１３，１９７９に記載のように、リボヌクレオチドリダクターゼの１０μｇを［3Ｈ］ＣＤＰから［3Ｈ］ｄＣＤＰへの転換をモニタリングすることによる、リボヌクレオチドリダクターゼ活性で測定される。酵素の還元能力を決定するための用いることができる他の基質はＭｏｅｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１  Ａ：２５２５４，１９９９に記載の方法のようなリポ酸及び酸化されたＤＴＴを含む。
【００７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるジスルフィド結合異性化のアッセイは方法分野で知られている。１つの代表的なアッセイはＺａｐｕｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：５０７５，１９９５に記載のような、ボバインパンクレアチントリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の誤酸化形態に異性化する酵素の能力を測定することである。ジスルフィド結合の形成を触媒する酵素の能力を決定するための追加的なアッセイはＺａｐｕｎ  ａｎｄ  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５２０２，１９９４，  ａｎｄ  Ｊｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１８：３２７１，１９９９に記載されている。一般的に、酵素及び還元基質は一緒にインキュベーションされ、還元された及び酸化された基質の量が、例えば、ＨＰＬＣ又はマススペクトロコピー等により決定される。例示的な基質はリボヌクレアーゼ又はヒルジンを含む。
【００７５】
組換えジスルフィド結合含有タンパク質の生成
本発明はジスルフィド結合含有タンパク質の生成のための方法を提供する。この方法は宿主細胞が培養培地へタンパク質を分泌するような条件下で遺伝的に修飾された宿主細胞を育成する工程を含む。「ジスルフィド結合形成」の語は１つ又は２つのポリペプチド中に存在する２つのシステインの間に共有結合が形成されるプロセスを意味する。ジスルフィド結合の酸化は酵素の活性部位のシステイン及び標的タンパク質のシステインとの間のチオールジスルフィド交換により仲介される。ジスルフィド結合形成はジスルフィド結合形成を触媒するとの好適な酵素により促進される。
【００７６】
遺伝的に修飾された宿主細胞はジスルフィド結合含有タンパク質をコードしている核酸配列を含む。本発明は、ヒトインシュリン、インシュリン様成長因子、ヒト成長因子、脳由来神経栄養性因子、神経成長因子、リパーゼ、ボウマンブリックプロテアーゼインヒビター、及び抗体フラグメントを含む任意のジスルフィド結合含有タンパク質の生成を意図している。以下の説明に従って行う組換え発現技術がジスルフィド結合含有タンパク質の生成について行われる。例えば、ジスルフィド結合含有タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸配列を好適なベクターに挿入することにより、当業者は所望の核酸配列を大量に生成することができる。代替的に、ジスルフィド結合含有タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが好適なベクターに挿入される。本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞へ発現ベクターを導入することにより、コードされたジスルフィド結合含有タンパク質が大量に生成される。
【００７７】
ジスルフィド結合含有タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸も標準的な結合技術を用いて好適な発現ベクターに挿入される。発現ベクターのレビューには、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，ｖ．１８５，Ｄ．Ｖ．  Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）参照。ベクター又は核酸はトランスフォーメーション、トランスフェクション、又はインフェクションの標準的な方法を用いて、遺伝的に修飾された宿主細胞に挿入される。「トランスフェクション」の語はコード配列が実際には発現されているかどうかにより、宿主細胞による発現ベクターに取り込まれることを意味する。例示的なトランスフェクション方法はＣａＣｌ２及びエレクトロポレーションを含む。「トランスフォーメーション」はＤＮＡが染色体外エレメントとして又は染色体に取り込まれるように、複製できるようにＤＮＡを有機生命体に導入することを意味する。用いられる宿主細胞に依存して、トランスフォーメーションはそのような細胞に好適な標準的技術を用いて行われる。例示的な形質転換方法はエレクトロポレーションを含み、塩化カルシウムを用いたカルシウムトリートメントが相当量の細胞壁バリアを含むバクテリア細胞について用いられる。他の例示的なトランスフォーメーションはＣｈｕｎｇ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３５８０，１９８８に記載のように、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。
【００７８】
ベクターは特定の宿主細胞における機能に対して通常選択されている（即ち、ベクターは遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こる様に宿主機構に適合したものである）。ベクターの１つのタイプはプラスミドである。一般的に、プラスミドベクターは宿主細胞の適合した種由来のレプリコン及び制御配列を含む。このベクターは形質転換細胞中で遺伝的選択を提供することができるマーカー配列のほかに、複製部位も運ぶ。例示的なプラスミドｐＢＲ３２２、Ｅ．ｃｏｌｉ由来プラスミド（例えば、Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ，２：９５，１９７７参照）、アンピリシン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２２、又は他の微生物プラスミド又はファージを含む。代替的に、このプラスミドは選択マーカー遺伝子の発現に対する微生物有機体により用いることができるプロモーターを含むように修飾される。
【００７９】
幾つかの態様において、培養培地は酸化還元活性化合物を含む。「酸化還元」の語は酸化／還元反応を意味する。この反応は分子がその酸化状態を変化させる化学的反応である。「還元活性化合物」の語は、還元又は酸化をすることができると思われる又はすることができる化合物である。例示的な酸化還元化合物はシステイン、シスチン、シスタミン（ｃｙｔａｍｉｎｅ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオビスＧＳＨ、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ジチオβ（ＭＥ）、１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチアンＤＴＴ、チオサルファート、亜ジチオン酸塩、メタビスルフィット、フルフィット、Ｎ−メチルマレイミド、及びマイコチオールを含む。
【００８０】
本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞により生成される組換えタンパク質の量は本分野で既知の標準的方法を用いて評価することができる。そのような方法の非限定的な例としては、ウエスタンブロット解析、非変性ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈澱、及び／又はＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイ及び／又はアルカリフォスファターゼアッセイ等の活性解析を含む。
【００８１】
幾つかの態様において、遺伝的に修飾された宿主細胞は組換えタンパク質を培地へ分泌する。しかしながら、この組換えタンパク質が宿主細胞から分泌されない場合、細胞質及び／又は核（原核生物の場合）、又は細胞質ソル中（真核生物の場合）に存在する。この宿主細胞は通常機械的に破壊され又は洗剤を用いて細胞内内容物を緩衝溶液へ放出させる。組換えタンパク質は培養培地又は細胞溶解により精製又は単離される。
【００８２】
代替的に、宿主細胞細胞質及び／又は核（原核生物の場合）、又は細胞質ゾル（真核生物の場合）における組換えタンパク質のために、細胞内物質（グラム陰性バクテリアに対するボディーを含む）は当業者に知られている標準的な技術を用いて宿主細胞から抽出される。例えば、宿主細胞はフレンチプレス、ホモジネーション、及び／又は超音波を用いてペリペラズム／サイトプラズムの内容物を放出するために溶解され、その後延伸分離される。
【００８３】
もし組換えタンパク質が再細胞質ゾル中に成形された包含体を有する場合、この包含体はしばしば細胞内部及び／又は外部細胞膜に結合することができ、従って、延伸分離の後にペレット状の物質が主に見られる。この及びペレット様物質はその後、極端なｐＨあるいはアルカリｐＨにおけるジチオスレイトール又は賛成ｐＨにおけるトリカルボキシエチルフォスフェート等の還元剤の下で界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、ウレア又はウレア誘導体等のカオトロピック因子で処理される。この組換えタンパク質は可溶状態となり、ゲル電気泳動、免疫沈降法等で解析される。もし単離組換えタンパク質が好ましい場合、単離はＭａｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）に記載の標準的な方法を用いて行われる。
【００８４】
もし包含体が組換えタンパク質発現において有意な程度に形成されない場合、このタンパク質は細胞ホモジネートの遠心分離の後の上清に主に見られる。このタンパク質は本明細書に記載の方法を用いて上清から更に単離され、又は精製される。
【００８５】
溶液からの組換えタンパク質の精製は各種技術を用いることによって達成される。ポリペプチドがそのカルボキシ末端又はアミノ末端のいずれかに、ヘキサヒスチジン（ｈｅｘａＨｉｓ）等のタグ、あるいはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ，  Ｃｏ．，  Ｎｗｅ  Ｈａｖｅｎ  ＣＴ）又はｍｙｃ（インビトロジェン、カールスバッド、ＣＡ）等の小ペプチドを含むように合成されていれば、マトリックスがこれらのタグに高い親和性を有する親和カラムに溶液を通すことにより必ず一工程で精製ができる。
【００８６】
例えば、ポリヒスチジンはニッケルに対して親和性が高く特性があることから、ニッケル親和カラム（キアゲン（商標）ニッケルカラム等）をポリＨｉｓで標識された組換えタンパク質の精製に用いることができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １０．１１．８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）参照。更に、この組換えタンパク質はこの例えば、を特異的に認識し結合することができるモノクローナル工程を用いて精製することができる。
好適な精製方法は、親和クロマトグラフィー、免疫親和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（非変性ゲル電気泳動を含む）次いでゲル溶解、及び等電点電気泳動を含むがこれらに限定されない。幾つかのケースにおいて、２つ以上の精製技術を組み合わせて精製度を高める。
【００８７】
組換えタンパク質のタンパク質折りたたみを改善する方法
本発明は組換えタンパク質の折りたたみを改善する方法も提供する。この方法はジスルフィド結合含有タンパク質を発現させ、折りたたみを改善する条件下で本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞を育成する工程を含む。これらの方法は一般的に組み替えタンパク質精製のための前述の方法を用いて行われる。本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞は促進されたジスルフィド結合の形成に依存して改善されたタンパク質折りたたみを有するタンパク質を精製することができる。
【００８８】
組換えタンパク質の折りたたみを改善する方法において、宿主細胞は活性なジスルフィド結合含有タンパク質を発現させその生産性を高めるような条件下で酸化還元活性化合物を含む培地中で育成される。適正なタンパク質の折りたたみの改善は活性な組換えジスルフィド結合含有タンパク質のより高い生産性（例えば、より高いｍｇ活性タンパク質／Ｌ細胞培地又は培養培地１リットル当たりのより高い組換えタンパク質の活性）を決定することで評価できる。条件が改善さえているかを試験するために、活性タンパク質の生産性、が改善された条件下の修飾細胞の育成により生産された組換え活性タンパク質のレベルがノーマル又は未修飾条件下で育成された未修飾細胞により精製される組換えタンパク質のレベルと比較される。例えば、活性な組換えタンパク質の生産性が少なくとも２培、３倍、４倍、５倍高いことが好ましく。この増加分は追加的な酸化還元活性化合物を補っていない未修飾宿主細胞の生産性に対するものである。この活性組換えタンパク質は修飾された宿主細胞の培地により精製された活性組換えタンパク質のμｇ／ｍｌμｍｇ／リットルで表される。
【００８９】
バクテリアの細胞質で適正なジスルフィド結合の程度を決定する方法はこの分野の標準である。１つの例示的な態様において、このバクテリアは通常少なくとも１つのジスルフィド結合を含むポリペプチド（「試験」ペプチド）をコードしている遺伝子で形質転換される。例示的な試験ペプチド又はタンパク質は通常細胞から分泌されるもの又は膜タンパク質である。本明細書で開示するアッセイにおける使用において、これらのポリペプチドはタンパク質が細胞の細胞質の外に運び去らないようにシグナル配列の欠失又は変異により修飾される。この試験は変異ジスルフィド結合を有するタンパク質のような、複雑なポリペプチドの発現を含む。更に、この試験ポリペプチドはジスルフィド結合が正確に形成されない場合生物学的活性を欠く。従って、試験タンパク質が野生型バクテリアの細胞質で発現された場合、ジスルフィド結合が形成されず、これらのタンパク質は活性にならない。
【００９０】
更に、ジスルフィド結合含有タンパク質を生成するために遺伝的に修飾された宿主細胞の能力は宿主細胞の細胞質の酸化還元電位を決定することにより解析される。Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．ＲｅＬ  Ａｒｅａｓ  ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．６３：６９，１９９０；Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｆｇｅｓｔｅｄｔ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：６９２６，１９８２；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１４９６，１９９２に記載のように、細胞酸化還元状態を測定する任意の異なる方法がある。
【００９１】
本発明の遺伝的に修飾された宿主細胞により生成される組換えタンパク質の物理的性質を試験するために、宿主細胞により新たに合成された全てのポリペプチドはタンパク質ラジオアイソトープ標識される。一般的なラジオアイソト宿主細胞内で合成されるラベルされたポリペプチドに用いることができるラジオアイソトープはチタニム（３Ｈ）、カーボンー１４（１４Ｃ）、サルファー３５（３５Ｓ）等を含む。
【００９２】
改善されたタンパク質折りたたみは野生型細胞、未修飾又は部分的に修飾された細胞（即ち、例えば、ヌル変異又は挿入された遺伝子等の２、３の修飾のみを有する細胞）と比較して、少なくとも２倍以上、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、１００倍以上、高いレベルであると特徴付けられる。
【実施例】
【００９３】
実施例１
バチルススブチリスにおける潜在的に還元性のあるＴＤＯＲの一覧
ジスルフィド結合含有タンパク質のより効果的な分泌のためのバチルススブチリスの酸化力を高めるための最初のアプローチとして、有機体の潜在的な還元システムを解析した。対応する遺伝子の欠失又はそれらの発現の低減はバチルススブチリスをより非還元的にすると仮定される。次に、このことはジスルフィド結合を有するタンパク質の折りたたみを改善すると考えられた。この目的のために、他の微生物から知られている可能性のある３つのシステムが排除できた；第一にバチルススブチリスはグラム陰性バクテリア又は真核生物においてグルタチオンの合成のために必要とされている酵素の相同体を欠失している；第二にバチルススブチリスはストレプトマイセス種及び糸状菌の細胞質に見られる還元剤マイトチオールを欠いている（Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８：１９９０−１９９５，１９９６）；第三はバチルススブチリスはＥ．ｃｏｌｉに見られるような異性化経路に含まれるタンパク質を欠いている。
【００９４】
バチルススブチリス又はＥ．ｃｏｌｉのチオレドキシンアミノ酸配列は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅ．。  ２５：３３８９−３４０２，１９９７）により開示されているアルゴリズムを用いて、バチルススブチリス配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｌｉｓｔ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ／）においてＢｌａｓｔサーチのために用いられた。１０−３以下の低い任意のＥ値を更なる改正のための配列の数を限定するために用いた。第一実施の後、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＴｒｘＡ又はＥ．ｃｏｌｉ  ＴｒｘＡ又はＴｒｘＣのいずれかが発見された配列をサブリストデータベースのブラストＰサーチに疑いのある配列であるとして用いた。マルチプルアラインメントをＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：４８７６−４８８２，１９９６）を用いて行った。各種タンパク質重量マトリクスを対合及びマルチプルアラインメントパラメーターに用いた。最も低いスコアにより決定されるベストアラインメントをＰＡＭ３５０マトリクス（ギャップオープニング＝１０）の両方の対合（ギャップエクステンション＝０．１）及びマルチプル（ギャップエクステンション＝０．２）アラインメントパラメーターで得た。可能性のあるシグナルペプチドＩ切断部位の存在がＮｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｙｓｔ．８：５８１−５９９，１９９７）に記載のアルゴリズムを用いて解析された。可能性のある透過膜の存在をＫｒｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．３０５：５６７−５８０，２００１）に記載のアルゴリズムで解析した。
【００９５】
このことはチオレドキシン及びチオレドキシン様タンパク質の解析に焦点を当てている。ブラストＰサーチはバチルススブチリス１６８ゲノムが１２のチオレドキシン様タンパク質をコードしていることを明らかにした。これらは４つの膜タンパク質（ＢｄｂＡ，ＲｅｓＡ，ＳｔｏＡ／ＳｐｏＩＶＨ  ａｎｄ  ＹｎｅＮ）及びチオレドキシン及び／又はＲｅｓＡに非常に類似している８つの予測された細胞質タンパク質（Εｒｌｅｎｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８６：６２３０−６２３８，２００４；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１：８２９６−８３０４，２００６）を含む。図１は同定されたチオレドキシン様タンパク質のアミノ酸配列の関係性をまとめている。バチルススブチリスのＴｒｘＡ（１０４残基）及びバチルススブチリスのＴｒｘＡ様タンパク質の間の配列同一性のレベルは６１％の同一性プラス７７残基のストレッチにおける保存残基（ＹｏｓＲ−ＴｒｘＡ）及び４１％の同一性プラス１０２残基のストレッチにおける保存残基（ＳｔｏＡ−ＴｒｘＡ）の間で変化した。
【００９６】
実施例２
ＰｈｏＡ分泌のレベルを決定するＴｒｘＡの細胞レベル
ジスルフィド結合含有タンパク質の分泌において前述の可能性のあるＴＤＯＲの影響を試験するために、ｔｒｘＡ、ｙｂｄＥ、ｙｄｂＰ、ｙｄｆＱ、ｙｋｕＶ、Ｓｔｏ  A  （ｙｋｖＶｏｒ、ｓｐｏＩＶＨ）、ｙｎｅＮ、ｙｔｐＰ、ｙｕｓＥの一部位変異体及びｂｄｂＡ及びｙｏｓＲ遺伝子をキャリーしているＳＰβファージを欠いている株をｐＰＳＰｈｏＡ５で形質転換した。
【００９７】
変異体の構築
ＤＮＡ技術は前述のように実施された（Ｋｏｕｗｅｎ，  ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：９８４−９９９，２００７）。可能性のある細胞質ＴＤＯＲの変異株を以下のように構築して、得た。必須ｔｒｘＡ遺伝子を劣化させたバチルススブチリス１６８誘導体株ＩｔｒｘＡ（Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１８６９−１８７７，１９９８）を前述のように構築した（Ｓｍｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３９２１−３９３０，２００５）。ＩｔｒｘＡ株において、ｔｒｘＡ遺伝子をｔｒｘＡ遺伝子の前のシングルクロスオーバー（キャンベルタイプ）統合ｐＭｕｔｉｎ２ｍｃｓに依存するＩＰＴＧ誘発ＰＳＰＡＣプロモーターの制御下においた。２５μＭのＩＰＴＧの存在下で育成したとき、Ｐｓｐａｃは活性であったが充分には誘発されていなかった。ＩｔｒｘＡ  ｄｂｄＣ株をｄｂｄＣ：：Ｋｍｒ変異体の染色体ＤＮＡでＩｔｒｘＡ株を形質転換し、その後ＰＴＧ劣化及びＫｍ耐性形質転換の選択を行った。
【００９８】
バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｕｓＥを以下のように構築した。ｙｕｓＧ遺伝子より開始しｙｕｓＤ遺伝子をコードしている１３８４−ｂｐＤＮＡフラグメントをプライマーｇｇｇｇａａｔｔｃａｔａａｇａｃａｇｃｃｇａｔｇｔｇｇｔｃ（配列番号９）及びｇｇｇｇｇａｔｃｃｇｔａｇａａｔａｇｃｔｃｇｇｃｇａａｔｇ（配列番号１０）を用いて増幅した。これらはそれぞれＥｃｏＲＩ及びＢａｎＨＩ制限部位を含む。このフラグメントをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断ｐＵＣ１８に結合した。プラスミドｐＤＧ１７２７からのＳｐ耐性カセットをＢｍａＨＩ及びＸｈｏＩＩで摘出し、ｙｕｓＥのｐＵＣ１８ボーンコピーの内部ＢｃｌＩフラグメントを置き換えた。得られたプラスミドｐＵＳＥをバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８を形質転換するために用いた。ＰＣＲにより示したように、全ての形質得転換試験された（バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｕｓＥ）のｙｕｓＥ遺伝子はｐＵＳＥ−ＳｐｅｃのＳｐ耐性カセットで阻害され、その結果として二重交差組換えイベントが起きた。
【００９９】
バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｋｕＶを構築するために、ｙｋｕＵ遺伝子に始まり、ｒｏｋ遺伝子をコードしている１５１６−ｐｂＮＤＡフラグメントをプライマーｇｇｇｇｇａｔｃｃｃｇｇｃａａａｇｔａａｇｔｃｔｔｇａｇｇ（配列番号１１）及びｇｇｇｇｔｃｇａｃａｔｔｇｔｔｃｔａａｃｃｇｃａａｇｃｇｃ（配列番号１２）で増幅した。これらはそれぞれＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで制限部位を含む。増幅されたフラグメントをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで切断し、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ切断ｐＵＣ１８に結合した。ｐＤＧ１７２７由来のＳｐ制限カセットをＥｃｏＲＩ及びＢｓａＷＩを用いて摘出し、ｙｋｕＶのｐＵＣ１８ボーンコピーの内部ＭｕｎＩ−ＮｇｏＭＩＶフラグメントを置き換えた。得られたプラスミドｐＫＵＶ−Ｓｐｅｃをバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の形質転換に用いた。ＰＣＲにより示されるように、全ての形質得転換試験された（バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｋｕＶ）のｙｋｕＶ遺伝子はｐＵＳＥ−ＳｐｅｃのＳｐ耐性カセットで阻害され、その結果として二重交差組換えイベントが起きた。
【０１００】
バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｐＰを構築するために、ｙｔｏＰ遺伝子に始まり、ｙｔｏＱ遺伝子をコードしている１３８６−ｐｂＮＤＡフラグメントをプライマーｇｇｇｇｇｔａｃｃｃａｔｔｇｃｃｇｔｇｔｔｃｃａｃｔｇｔｔ（配列番号１３）及びｇｇｇｃｔｇｃａｇｇｇｃａａｃｃｇｔａｔｃｃｔｃｔｔｔｇａ（配列番号１４）で増幅した。これらはそれぞれＫｐｍＩ及びＰｓｔＩ制限部位を含む。増幅されたフラグメントをＫｐｎＩ及びＰｓｔＩで切断し、ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ切断ｐＵＣ１８に結合した。ｐＤＧ１７２７由来のＳｐ制限カセットをＨｉｎｃＩＩ及びＳｔｕＩを用いて摘出し、ｙｔｐＰ遺伝子の中央の独特のＢｓａＡＩ制限部位においてクローンが作られた。得られたプラスミドｐＴＰＰ−Ｓｐｅｃをバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８の形質転換に用いた。ＰＣＲにより示されるように、全ての形質得転換試験された（バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｙｔｐＰ）のｙｔｐＰ遺伝子はｐＴＰＰ−ＳｐｅｃのＳｐ耐性カセットで阻害され、その結果として二重交差組換えイベントが起きた。
【０１０１】
ｙｂｄＥ、ｙｄｂＰ、ｙｄｆＱ、sｔｏＡ（ｙｋｖＶ）、ｙｎｅＮ、およびｙｕｓＥ一部位変異体及びｂｄｂＡ及びｙｏｓＲ遺伝子を運んでいるＳＰＢプロファージを欠いた株をＢＳＦＡ又はＪＡＦＡＮ株コレクションのいずれかより入手した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：４６７８−４６８３，２００３）。プラスミド又は抗生物質耐性マーカーの正しい染色体組み込みをＰＣＲにより評価した。
【０１０２】
Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ由来の酸化力のあるＴＤＯＲ  ＤｓｂＡを過剰発現させるために、ｐＸＴＣ発現システムを用いた（Ｄａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：６８７６−６８８５，２００６，  Ｋｏｕｗｅｎ，  ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９，２００７）。リボゾーム結合部位及びバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｍｎｔＡのシグナル配列に結合しているＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓのｄｓｂＡを運んでいるｐＸＴＣ−ＳｃｄｓｂＡをｘｙｌＡプロモーター（ＰｘｙｌＡ）の制御下で以下のように構築した。第一ＰＣＲにおいて、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｍｎｔＡのリボゾーム結合部位及びシグナル配列を含んでいる９２ｐｂのフラグメントをｐＸＴＣ＿ＭｎｔＡ＿Ｆ（ＧＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＣＡＡ；配列番号５）及びｐＸＴＣ＿ＭｎｔＡ＿Ｓｃａｒ＿Ｒ（ＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＡＴＣＣＣＧＴＴＡＡＡＧＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣ；配列番号６）のプライマーを用いて増幅した。プライマーｐＸＴＣ＿Ｓｃａｒ＿Ｆ（ｔｔａａｃｇｇｇａｔｇｃＴＣＡＣＡＡＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＴＴＡ；配列番号７）及びｐＸＴＣ＿Ｓｃａｒ＿Ｒ  （ＧＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＧＴＡＡＡＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＣＴＴ；配列番号８）を用いて、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓのｄｓｂＡ遺伝子増幅から５６６ｂｐの第二ＰＣＲフラグメントが得られた。得られた２つのＰＣＲ生成物は２１ヌクレオチドが重複していた。この重複部分を用いて、プライマーを添加せずに１０ＰＣＲサイクルで結合した。次に、融合された生成物をｐＸＴＣ＿ＭｎｔＡ＿Ｆ及びｐＸＴＣ＿Ｓｃａｒ＿Ｒのプライマーを用いて追加的な２０ＰＣＲサイクルで増幅した。６３７ｂｐの得られた生成物をｐＴＯＰＯでクローンを生成した。配列を検査した後、融合されたｄｓｂＡ遺伝子をＢＡｍＨＩ及びＳｐｅＩでこのプラスミドから摘出し、ＰｘｙｌＡの下流の、プラスミドｐＸＴＣの同じ制限部位に結合し、プラスミドｐＸＴＣ−ＳｃｄｓｂＡを得た。
【０１０３】
プラスミドｐＸＴＣ−ＳｃｄｓｂＡを二重交叉組換えにより、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８及びバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩｔｒｘＡのａｍｙＥ位置へ、ＰｘｙｌＡＳｃｄｓｂＡカセットをｐＸＴＣのＴｃ耐性マーカーと一緒に組み込むのに用いた（以下ＸＴＣ−ＳｃｄｓｂＡカセットという）。テトラサイクリン耐性の選択し、ＡｍｙＥ−ネガティブフェノタイプをデンプン含有培地上でスクリーニングすることにより、それぞれ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｘ−ＳｃｄｓｂＡ  及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩｔｒｘＡ  Ｘ−ＳｃｄｓｂＡを得た。
【０１０４】
実験結果
プラスミドｐＰＳＰｈｏＡ５はＤａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：６８７６−６８８５，２００６）に記載のようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ由来リパーゼパー請求項のプレプロ領域及び成熟Ｅ．ｃｏｌｉＰｈｏＡタンパク質の間の融合を含む。このタンパク質は２つのジスルフィド結合を含みプロテアーゼ耐性構造への折りたたみのための酸化力のあるＴＤＯＲを必要とすることから、Ｅ．ｃｏｌｉＰｈｏＡはバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＴＤＯＲ活性について感受性のあるレポーターである。特に、ＢｄｂＣ及び／又はＢｄｂＳの欠失において、折りたたみのないＰｈｏＡはバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞壁及び／又は細胞培地の高い細胞分解性の環境において、容易に分解される（Ｓａｒｖａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１６９４：３１１−３２７、２００４）。このことは基本的に酸化能力のあるＴＤＯＲ活性により分泌されたＰｈｏＡの折りたたみが効果的に提供するためのｉｎ  ｖｉｖｏプロテアーゼアッセイを提供する。興味深いことに、インタクトｂｄｂＡ、ｙｂｄＥ、ｙｄｂＰ、ｙｄｆＱ、ｙｋｕＶ、ｓｔｏＡ、ｙｎｅＮ、ｙｏｓＲ、ｙｔｐＰ、又はｙｕｓＥ遺伝子を欠失している株はＥ．ｃｏｌｉの活性ＰｈｏＡの分泌に有意に影響していなかった。
【０１０５】
予期しないことに、ＴｒｘＡの消失はＰｈｏＡのレベルを増加した。このことは、ＴｒｘＡはバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の育成及び生存能力に必須であることから（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４:１１８５７−１１８６２，１９９７，  Ｓｃｈａｒｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：１８６９−１８７７）、Ｓｍｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３９２１−３９３０，２００５）に記載のように、条件付きのｔｒｘＡ変異体株（ＩｔｒｘＡ）を用いて観察された。この株において、ｔｒｘＡプロモーター領域（ＰｔｒｘＡ）はＩＰＴＧ−依存Ｐｓｐａｃプロモーターで置き換えられた。プレート又はブロス中でバチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩｔｒｘＡを育成するとＩＰＴＧ依存が強く、親１６８株のようにはならない。バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩｔｒｘＡの細胞をＬＢブロス中で育成するとＩＰＴＧ濃度が２５μＭ以上の濃度で野生型の成長が観察された。
【０１０６】
ＰｈｏＡ分泌のＴ ｒｘＡレベルの重要性を評価するために、プラスミドｐＰＳＰｈｏＡ５で形質転換したＩｔｒｘＡ変異体を更に解析した。培地へのＰｈｏＡ分泌のレベルをＤａｒｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：６８７６−６８８５，２００６）に記載の方法及びウエスタンブロット法により決定した。この目的のために、細胞を２５、１００、又は５００μＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で育成した。この結果は親株１６８と比べて、ＩｔｒｘＡ株は、２５μＭＩＰＧＴの存在下で育成したときに１．５倍のより活性なＰｈｏＡを分泌したことを示している。これらの条件下で、細胞質ＴｒｘＡはウエスタンブロッティングでかろうじて検出された。Ｐｈｏａの分泌は、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩｔｒｘＡが５００μＭＩＰＧＴの存在下で育成されたときは親株と同じレベルの分泌を示した。対照的に、親株１６８によりＰｈｏＡ分泌は育成培地においてＩＰＧＴに依存しておらず、培地におけるＩＰＧＴの欠失又は存在（２５μＭ乃至５００μＭ）はこの株におけるＴｒｘＡレベルの検出可能な影響は与えていない。これらの観察は試験されたＩＰＴＧ濃度内で、ＩｔｒＡ変異体におけるＰｈｏＡ分泌の量は可逆的に細胞中のＴｒｘＡの量に比例することを示している。
【０１０７】
ジスルフィド結合を欠失しているバチルスアミロリケファシエンスのＡｍｙＱαアミラーゼをコードしているプラスミドｐＫＴＨ１０を用いた形質転換において、ＩｔｒｘＡ変異体（２５μＭＩＰＴＧ）及び／又は親１６８株の育成培地は相当量のＡｍｙＱを含んでいた。後者の観察はＩｔｒｘＡへ株による改善されたＰｈｏＡ分泌が遺伝的に改善された合成又はタンパク質の分泌に依存していないが、成熟ＰｈｏＡタンパク質のプロテアーゼ耐性となる改善された翻訳後折りたたみに依存していることを示唆している。この観察は２５μＭＩＰＴＧの存在下で育成されたＩｔｒｘＡ変異体の細胞外プロテオームは親株１６８とは区別が付かないことを示している（図２Ｄ）。
【０１０８】
２５μＭのＩＰＴＧの存在下におけるＩｔｒｘＡ変異体株育成による活性ＰｈｏＡ分泌ｎ観察された改善はこの増加がＢｄｂＣの活性を依然として必要としているのかという質問を生じる。この問題に答えるべく、ｐＰＳＰｈｏＡ５含有ＩｔｒｘＡｂｄｂＣ２重変異体を構築した。重要なことは、この２重変異体がＩＰＴＧ依存成長を示さなかった。このことはｂｄｂＣ変異体はＩｔｒｘａ変異体を抑制しなかったことを示している。図２に示すように、ＰｈｏＡ分泌はＩｔｒｘＡ変異体の存在又は欠失に関係なく、強力にＢｄｂＤ依存のままであることを示している。更に、ＩｔｒｘＡｂｄｂＣ変異体によるＰｈｏＡの分泌は、育成培地中に異なる量のＩＰＴＧが存在したときには変化しなかった。このことはＢｄｂＣＤチオール酸化経路がＴｒｘＡ消失の条件下でＰｈｏＡ折りたたみにも必要とされていることを示している。
【０１０９】
実施例３
ＴｒｘＡ及びＢｄｂＣの細胞レベルはＢｄｂＤの酸化還元状態に影響する
ＴｒｘＡの存在又は欠失がＢｄｂＣチオール酸化経路の活性化に影響するかどうかを試験するために、ＢｄｂＤの酸化還元状態をＫｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｐｒ  ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：４６７８−４６８３，２００３）に記載の方法により、チオール特異的架橋剤４−アセトアミド４’−マレイミジル−スチルベン−２，２’−ジスルホネート（ＡＭＳ；モレキュラープローブ）を用いて評価した。ＡＭＳの分子量マスに依存して、タンパク質中でシステイン残基を還元するこの試薬の架橋はＳＤＳ−ＰＡＧＥの間のこのタンパク質の移動性を有意に減らす（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  １００：４６７８−４６８３，２００３）。ＢｄｂＤはＣｘｘＣ活性部位である２つのシステイン残基しか含まない。ＢｄｂＤの酸化還元部位を研究するために、一晩培養を行って、ＩｔｒｘＡ株（２５μＭＩＰＴＧ）、ｂｄｂＣ一部位変異体、ＩｔｒｘＡ  ｂｄｂＣ二重変異体、又は親株１６８由来の新しい細胞溶解液を調製した。
【０１１０】
細胞をＬＢ培地中で育成し、延伸分離で収集した。溶解物は１５ｍＭ  ＡＭＳの存在下又は不存在のいずれかで、細胞ペレットを２５ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．５Ｍグリセロール、０．２５ｍｇ／ｍｌリゾザイム（ｐＨ０．８）、及び１５ｍＭＡＭＳに再懸濁して調製した。３０分のインキュベーションの後、サンプルを還元剤を含まないＳＤＳ−ＰＡＧＥの緩衝液と混合した。細胞溶解の間の共標識はＢｄｂＤの異なる酸化還元状態を区別するのに十分であった。特に、ＡＭＳは還元されたＢｄｂＤ分子における遊離チオールに共有結合するのみである。７分間サンプルの結合において、ＭＡＳの結合を含む又は含まないＢｄｂＤ分子は非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。最終的に、異なるＢｄｂＤ種がウエスタンブロット及び特定のポリクローナル抗体を用いたイムノ検出で確認された。ＡＭＳ結合を含む又は含まないＢｄｂＤ株の相対的な量はＣｈｅｍｉＧｅｎｉｕｓ  ＸＥ２  Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ  （Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ）を用いて決定された。全ての実験は少なくとも４回繰り返した。
【０１１１】
親株１６８のＢｄｂＤ分子の５０％未満はＡＭＳでラベルされていた。接触することにより、有意に減少したＢｄｂＤ分子がＩｔｒｘＡ株におけるＡＭＳラベルされた。一方、有意に増加したＢｄｂＤ分子はｂｄｂＣ又はＩｔｒｘＡｄｂｄＣ変異株でＡＭＳラベルされた。際立っていたのは、これらの相対的な違いはＢ．スブチリス１６８、ＩｔｒｘＡ、及びｂｄｂＣの指数関数的な細胞成長においてさえ、明確であった。これらの観察は有意に増加しているＢｄｂＤ分子は親株よりもＩｔｒｘＡ株で酸化されやすく、逆に言えば、ｂｄｂＣ変異は酸化されたＢｄｂＤ分子の数を少なくすることを示している。更に、ＡＭＳの不存在下で調製された株の溶解物を用いた対照実験はＢｄｂＤが単一のバンドとして移動したことを示した。これらを考えあわせると、これらの結果は細胞質ＴｒｘＡレベルはＢｄｂＣ依存的に、ＢｄｂＤの酸化還元状態に影響することを示している。
【０１１２】
実施例４
ＤｓｂＡの発現はＰｈｏＡの分泌を高める
チオール酸化のためのバチルススブチリスの能力を高めるためのほかの可能性のあるアプローチは既知のチオールオキシダーゼの過剰生成を誘発することである。しかしながら、ＢｄｂＣ及びＢｄｂＤのレベルを高めるための試みは、今日まで成功していない。それ故、異種オキシダーゼを発現している可能性を評価した。
【０１１３】
これまでの研究ではバチルススブチリスＢｄｂＤの相同体であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  （以下SaＤｓｂＡで示す）の主要なオキシダーゼが活性ＰｈｏＡの分泌においてＢｄｂＣオキシダーゼＢｄｂＤの両方の損失を補うことができることを示していた（Ｋｏｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  ＭｏＩ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９，２００７）。更に、ＳａＤｓｂＡを親株１６８で発現させたときに、Ｅ．ｃｏｌｉ内でＰｈｏＡ分泌の増加が約１．５−２．０倍であったことが観察されている。ＴｒｘＡ小室において観察されたのと同じ増加である（実施例２）。
【０１１４】
しかしながら、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは危険な病原性細菌として知られているので、（Ｍａｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４：９５３−９５８，２００６；Ｓｉｂｂａｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７０：７５５−７８８，２００６）、ＳａＤｓｂＡの生物学的目的の適用可能性は限られている。この理由から、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに近い非病原性細菌からＤｓｂＡタンパク質をサーチすることが行われている。ｄｓｂＡ遺伝子に対する最も良い源はチーズ又はドライソーセージの発酵にスターターとして用いられているＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓである。従って、この微生物は通常安全なものとみなされている（ＧＲＡＳ）。このＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ株由来の遺伝子を含むバチルススブチリス株をそれ故工業的製品により幅広く利用可能である。
【０１１５】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓＤｓｂＡのＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓ相同体（ＳｃＤｓｂＡ；配列番号４で定義される）はＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓ株ＴＭ３００の配列決定されたゲノムにおいて、ＢｌａｓｔＰサーチにより同定された（５１％のアミノ酸同一性）。ＳａＤｓｂＡのように、ＳｃＤｓｂＡタンパク質はＢ．スブチリスＢｄｂＤに相同であった（３６％アミノ酸配列同一）。バチルスにおけるＳｃＤｓｂＡを発現させるために、キシロース誘発ｐＸＴＣ発現システムをＫｏｕｗｅｎらにおいて開示されているＳ．ａｕｒｅｕｓＳａＤｓｂＡを発現するために用いた（ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９，２００７）。この目的のために、成熟ＳｃＤｓｂＡリポタンパク質をコードしている配列をリボゾーム結合部位と、この微生物の豊富に発現されているリポタンパク質をコードしているＢ．スブチリスｍｎｔＡ遺伝子のシグナル配列に結合した（Ａｎｔｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１４８４−１５０２，２００１）。このハイブリッドＳｃｄｓｂＡｉｄｅｎｎｓｉ  を含むＸＴＣ−ＳｃｄｓｂＡ遺伝子をバチルススブチリス１６８染色体に組み込むにあたり、細胞融合型ＳｃＤｓｂＡのキシロール誘導発現を得た（このカセットを含む株は以下でＸ−ＳｃｄｓｂＡと呼ぶ）。
【０１１６】
ＳａＤｓｂＡに対する抗体をＳｃＤｓｂＡの免疫検出に用いた。これらの抗体はＳｃＤｓｂＡをクロス反応性である。期待されたとおり、ＳｃＤｓｂＡの細胞レベルは育成培地に添加されたキシロースの量に依存していた。細胞質ＳｃＤｓｂＡの最も高いレベルはＸ−ＳｃｄｓｂＡ細胞が１．０％キシロース以上の培地でインキュベートされたときに、観察された。一方、キシロースを含まない培地で育成した場合、ＳｃＤａｂＡは検出されなかった。
【０１１７】
活性Ｅ．ｃｏｌｉＰｈｏＡの細胞外蓄積にＳｃＤｓｂＡ発現の影響を評価する目的で、バチルススブチリス株Ｘ−ＳｃｄｓＡをプラスミドｐＰＳＰｈｏＡ５で形質添加した。比較のために、Ｘ−ＳａｄｓｂＡ，ＩｔｒｘＡ（２５μＭＩＰＴＧ）によるＰｈｏＡ生成及びプラスミドｐＰＳＰｈｏＡ５で形質転換されたＸ−ＳｃｄｓｂＡＩｔｒｘＡ及びＸ−ＳＣｄｓｂＡ  ＩｔｒｘＡ株の結合体を並行してアッセイした。得られた結果はＳｃＤｓｂＡの発現が活性ＰｈｏＡの分泌を親株よりも高めることを示した（図３、ホライトバー）。ＳｃＤｓｂＡ発現が細胞外ＰｈｏＡのレベルを高めたことは、ＳａＤｓｂＡの発現における結果と同じであった。このことはこれらのタンパク質はバチスルスブチリス中で発現された場合に機能的に交換可能であることを示している。更に、ＳｃＤｓｂＡμＳａＤｓｂＡの発現及びＴｒｘＡの消失は細胞外ＰｈｏＡのレベルを約１．５−２．０倍に高めた。特筆すべきは、ＴｒｘＡ欠失がＳｃＤｓｂＡμＳａＤｓｂＡ発現と比較した時に、高い活性細胞外ＰｈｏＡのレベルが達成された、特に、Ｘ−ＳｃｄｓｂＡＩｔｒｘＡ株と組み合わせたときに（図５、ホワイトバー）。
【０１１８】
ウエスタンブロットにより示されるように、異なる育成培地のサンプルのＰｈｏＡ活性のレベルは個々のサンプルにおける成熟ＰｈｏＡタンパク質のレベルと相関関係がある。ＰｈｏＡを発現している親株と比べて、ＰｈｏＡの有意に低い細胞外分解生成物が試験された全ての変異株で観察された。ＰｈｏＡ分解生成物の最も低い量はＴｒｘＡを消失させたＩｔｒｘＡ株で観察された。更に、ＩｔｒｘＡ変異を含む株におけるｐｒｏ−ＰｈｏＡタンパク質の未処理形態がそれほどにないにせよ観察された、このことはＸ−ＳａｄｓｂＡ及びＸ−ＳｃｄｓｂＡ株と同じであった。ＰｈｏＡタンパク質の最も高い量はＴｒｘＡの欠失されたＸ−ＳｃｄｓｂＡＩｔｒｘＡ株の培地分画において観察された。これらを考えあわせると、これらの結果は細胞質ＴｒｘＡ及び／又は細胞外プラスミミックＴＤＯＲレベルは分泌された活性ＰｈｏＡのレベルを高める結果となることを示している。
【０１１９】
実施例５
分泌されたＰｈｏＡの最適なレベルは酸化還元活性培地化合物のより促進される
Ｅ．ｃｏｌｉのＰｈｏＡの細胞外地区製を促進しているスタフィロコカールＤｓｂＡの活性は育成培地における酸化還元活性化合物に依存していることが報告されている。このことはシステイン／シスチンを添加又は無添加の合成培地においてＤｓｂＡを生成するバチスルスブチリスを育成することにより示された。それ故、このＤｓｂＡ活性が細胞がリッチなＬＢ培地において育成された場合、このＤｓｂＡ活性がシステイン又はシスチンのような追加的な酸化還元活性化合物の添加により高めることができるかを評価した。この目的のために、すべてのＴｒｘＡ欠失及び／又はＤｓｂＡ−発現株を育成し、並行培養で、１００μｇ／ｍｌのシステイン（即ち、酸化されたシスチン）／シスチンの存在下で行った。システイン又はシスチンをＩｔｒｘＡ  Ｘ−ＳｃｄｂｓＡ株に添加すると、ＰｈｏＡの細胞外蓄積が強く高められた。この増加はシステインが添加された場合が顕著であった。更に、このポジティブトレンドはＸ−ＳｃｄｓｂＡ株でも見られた。しかし、刺激の程度はＩｔｒｘＡ  Ｘ−ＳｃｄｓｂＡ株よりも低かった。育成培地にシステイン又はシスチンを添加した他の株については、細胞外ＰｈｏＡレベルは統計的に有意な増加は示さなかった。このＰｈｏＡ活性データはウエスタンブロッティングで確認され、観察された全ての増加はＰｈｏＡタンパク質の高められたレベルに関係していることを示している。特に、システインの添加はＰｈｏＡ分解生成物の蓄積を親は部１６８よりも減らした。
【０１２０】
システイン又はシスチンを育成培地に添加することが活性ＰｈｏＡの分泌に影響を及ぼす既知のＴＤＯＲ類に影響するかどうかを評価するために、ＤｓｂＡ、ＢｄｂＤ、及びＴｒｘＡの細胞レベルを評価した。これらのタンパク質のレバルはシステイン又はシスチンを添加しても、しなくても影響されなかった。
【０１２１】
Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓＤｓｂＡを発現している株の培地にシステイン又はシスチンを添加すると活性ＰｈｏＡの細胞外レベルを高めることになるという観察は活性について報告されたＳ．ａｕｒｅｕｓＤｓｂＡのシステイン依存性と一致する（Ｋｏｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ，ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９，２００７）。おそらく、このことはすべての（配列決定された）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌが触媒反応中のＤｓｂＡ酸化還元に対するＢｄｂＤ様キノンリダクターゼを書いているという事実と関係する（Ｋｏｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  ＭｏＩ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：９８４−９９９，２００７）。ＤｓｂＡ活性に酸化還元活性培地化合物が必要であるということはＬＢ培地は既にそのような成分を含んでいることから、細胞がＬＢ培地で育成される場合は自明ではなかった。しかしながら、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓＤｓｂＡを用いた我々の発見はこのチオールオキシダーゼの最適な活性に限られた量で存在することを示した。システイン又はシスチンの（両方の）培地への添加は同様の効果を有する。おそらく、このことは酸素分子の存在下でシステインが容易にシスチンに酸化されることに依存している。実際に、システインｎの添加はシスチン自体の添加よりも効果的である。このことはシスチンの可溶性が乏しいことからも説明される。更に、Ｓｍｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３９２１−３９３０，２００５）による最近の研究は育成培地にシステインを添加することにより、システイン合成及び取り込みの遺伝子が有意に高いレベルで発現し、ＴｒｘＡ欠失細胞の大幅な抑制が回復されたことから、ＴｒｘＡ依存の細胞がシステインに対して栄養要求性であることを示唆している。
【０１２２】
これらの条件下において、システインは実際に不可逆性のチオール酸化に対する各種細胞質タンパク質を提供するために提供する（Ｈｏｃｈｇｒａｆｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：２５９８１−２５９８５，２００７，  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  １０４：８７４３−８７４８，２００７）。システインの添加はそれゆえＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓＤｓｂＡを発現している株の酸化電子を高めるために、シスチンよりも好ましい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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