(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的活性物質及び粘度向上対イオンの調製物を含んでなり、かつ、該調製物が治療的有効濃度の該生物学的活性物質を有し、
前記生物学的活性物質がＰＴＨ、ＰＴＨ（１〜３４）、それらの類似体及び製薬学的に許容できるそれらの塩からなる群から選択され、
前記粘度向上対イオンが、クエン酸、酒石酸及びリンゴ酸からなる群から選択されるか、又は塩酸及び第２の酸を含んでなり、かつ第２の酸がクエン酸、酒石酸、リンゴ酸及び酢酸からなる群から選択されるか、又は塩酸及び酢酸を含んでなる、角質層貫通マイクロプロジェクションを有する経皮送達装置上に固体の乾燥したコーティングを形成するための組成物。
【請求項２】
調製物が２０ｃｐ〜２００ｃｐの範囲内の粘度を有する請求項１の組成物。
【請求項３】
前記粘度向上対イオンが少なくとも２種の酸性のｐＫａ値を有する請求項１の組成物。
【請求項４】
前記粘度向上対イオンがクエン酸、酒石酸及びリンゴ酸からなる群から選択されるとき、前記粘度向上対イオンが更に、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、塩酸及び酢酸からなる群から選択される第２の酸を包含する請求項１の組成物。
【請求項５】
第２の酸が少なくとも１種の酸性のｐＫａ値を有する請求項４の組成物。
【請求項６】
生物学的活性物質の電荷を中和するのに十分な量の粘度向上対イオンを含んでなる請求項１の組成物。
【請求項７】
生物学的活性物質がＰＴＨ（１〜３４）を含んでなる請求項１の組成物。
【請求項８】
被験体の角質層を貫通するようになっている複数のマイクロプロジェクションを有するマイクロプロジェクション部材を含んでなり、かつ、該マイクロプロジェクション部材が少なくとも１種の生物学的活性物質を有する生物学的適合性の固体の乾燥したコーティングを包含し、該固体の乾燥したコーティングが少なくとも１種の粘度向上対イオンを有する調製物から形成され、
前記生物学的活性物質がＰＴＨ、ＰＴＨ（１〜３４）、それらの類似体及び製薬学的に許容できるそれらの塩からなる群から選択され、
前記粘度向上対イオンが、クエン酸、酒石酸及びリンゴ酸からなる群から選択されるか、又は塩酸及び第２の酸を含んでなり、かつ第２の酸がクエン酸、酒石酸、リンゴ酸及び酢酸からなる群から選択されるか、又は塩酸及び酢酸を含んでなる、被験体に生物学的活性物質を経皮送達するための装置。
【請求項９】
調製物が２０〜２００ｃｐの範囲内の粘度を有する請求項８の装置。
【請求項１０】
生物学的適合性コーティングが１０ミクロン未満のコーティングの厚さを有する請求項８の装置。
【請求項１１】
前記粘度向上対イオンが少なくとも２種の酸性のｐＫａ値を有する請求項８の装置。
【請求項１２】
前記粘度向上対イオンがクエン酸、酒石酸及びリンゴ酸からなる群から選択されるとき、調製物が第２の粘度向上対イオンを包含し、かつ、該第２の粘度向上対イオンが少なくとも１種の酸性のｐＫａ値を有する請求項１１の装置。
【請求項１３】
前記粘度向上対イオンが生物学的活性物質の電荷を中和するのに十分な活性を有する請求項８の装置。
【発明の詳細な説明】
【関連出願に対するクロスレファランス】
【０００１】
本出願は２００３年１１月１３日出願の米国特許仮出願第６０／５２０，１９６号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は概括的に生物学的活性物質の経皮送達に関する。より特定には、本発明は経皮物質送達装置及びそれに適用される物質含有調製物に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的活性物質又は薬剤の経皮送達は皮下注射及び経口送達のような、より伝統的な送達方法に対して改良点を提供する。経皮薬剤送達は経口薬剤送達に伴って遭遇される肝臓の第一通過効果及び胃腸管中の分解を回避する。経皮薬剤送達はまた皮下注射に伴う患者の不快感、感染の危険及び侵襲性を回避する。本明細書で使用される用語「経皮」は広義には動物の皮膚、粘膜又は爪のような体表を通る物質又は薬剤の送達を包含する。
【０００４】
当該技術分野で周知のように、皮膚は身体中への物質の経皮透過に対する主要なバリヤーとして働く。一番外側の皮膚層の角質層は、脂質の２層により囲まれたケラチン繊維（ケラチン生成細胞）で充填された平坦な死滅細胞からなる。脂質の２層の著しく整列された構造が角質層に相対的に不透過性の特徴を与える。
【０００５】
しかし、治療的物質の経皮送達は重要な医薬の投与経路である。経皮薬剤送達は胃腸内の分解及び肝臓の代謝を迂回する。大部分の市販の経皮薬剤送達システムは受動的拡散により薬剤を送達する。薬剤は、存在する濃度勾配によりパッチ中のレザボアから患者の皮膚中に拡散する、すなわち薬剤はパッチのレザボア中の高濃度から患者の身体中の低濃度に拡散する。患者の皮膚を通る薬剤の流れは、薬剤の分配係数、溶解度の特徴及び皮膚の透過性を包含する多数のファクターにより決定される。従って、受動的拡散送達システムは患者の血流への緩徐なしかし制御された薬剤の送達を提供する。
【０００６】
不幸なことには、多数の薬剤は治療的に有効であるためには低すぎる経皮拡散流量を示す。これは特にポリペプチド及びタンパク質のような高分子の薬剤について言える。経皮薬剤流量を促進するために、経皮送達される物質の量を高めるために、一番外側の皮膚層の機械的透過又は破壊を使用して、皮膚中への経路を形成してきた。スカリファイアーとして知られる初期のワクチン接種装置は概括的に適用の部分に引っ掻く又は小切開を形成するために皮膚に適用される複数の歯又は針を有した。ワクチンはＲａｂｅｎａｕに対して発行された特許文献１のように皮膚上に局所的にあるいはＧａｌｙに対して発行された特許文献２、又はＣｈａｃｏｒｎａｃに対して発行された特許文献３又はＫｒａｖｉｔｚに対して発行された特許文献４のようなスカリファイアーの歯に適用される湿った液体としてのいずれかで適用された（特許文献１、２、３及び４参照）。一部は、患者に接種する際に有効であるために非常に少量のみのワクチンが皮膚中に送達される必要があるために、スカリファイアーが皮膚内ワクチン送達のために示唆されてきた。更に、過剰量が最少量と同様に、満足な免疫を達成するので、送達されるワクチンの量は特に重要ではない。
【０００７】
経皮薬剤送達を高めるために小型の皮膚貫通要素を利用する他の装置は特許文献５、Ｇｏｄｓｈａｌｌ等に発行された特許文献６、Ｇａｎｄｅｒｔｏｎ等に発行された特許文献７、Ｇｒｏｓｓ等に発行された特許文献８、Ｌｅｅ等に発行された特許文献９、Ｇｅｒｓｔｅｌ等に発行された特許文献１０、Ｋｒａｖｉｔｚ等に発行された特許文献１１及び特
許文献１２〜２４及び２５に開示されており、それらすべてが全体を引用により本明細書に取り込まれている（特許文献５〜２５参照）。これらの装置は角質層を貫通するための種々の形状及びサイズの貫通要素を使用する。これらの参考文献中に開示された貫通要素は概括的にパッド又はシートのような薄い平坦な部材から垂直に延伸する。貫通要素は、約２５〜４００ミクロンのみの長さ及び幅並びに約５〜５０ミクロンのみの厚さを有するマイクロプロジェクションのように極めて小さくすることができる。これらのマイクロプロジェクションはそれに対応して、そこを通過する促進された経皮物質送達のために角質層中に小さい微小スリットを形成する。
【０００８】
更にマイクロプロジェクションに生物学的活性物質のコーティングを適用することは皮膚中への物質の送達を許すことが見いだされた。コートされたマイクロプロジェクションからの生物学的活性物質の送達の効率は少なくとも一部は皮膚中に延伸するマイクロプロジェクションの領域（ａｒｅａ）に左右される。プロジェクションが十分に長い場合は、生物学的活性物質はその下に横たわる毛細血管床中に挿入され、それにより生物学的活性物質に対する全身的暴露（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ）をもたらすことができる。これは薬剤を投与する際の望ましい特徴である。
【０００９】
コートされたマイクロプロジェクションを使用する成功した経皮薬剤送達は多数の特徴を有する薬剤調製物を必要とする。例えば、調製物は、角質層を通って移動される治療的に有効量の薬剤がマイクロプロジェクション上にコートされるように十分に濃厚でなければならない。更に調製物はマイクロプロジェクション上に対する均一で正確なコーティングの適用を容易にしなければならない。これらの条件を満たすために、有効なコーティング調製物は適当な粘度をもたなければならない。生物学的活性物質の濃度を増加することはまた粘度を増加する。しかし、物質の濃度は通常、物質の特定の治療量を提供する必要により指令される。従って、適当な粘度を達成するためには、しばしば粘度変更物質を使用しなければならない。
【００１０】
通常の粘度変更物質はヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、カルボキシメチルセルロース、Ｐｏｖｉｄｏｎｅ（Ｒ）、Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｒ）及び他のポリマー物質を包含する。これらの先行技術の物質はタンパク質又はペプチドの調製物の粘度を高めるために使用される時に重大な欠点を示す。調製物は角質層貫通マイクロプロジェクション上の経皮送達のために使用されるので、ＨＥＣ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）等は、それらが非経口適用に対して承認された賦形剤ではないために、使用することができない。Ｄｅｘｔｒａｎ（Ｒ）及びＰｏｖｉｄｏｎｅ（Ｒ）のような非経口送達に対して承認されている他の通常の粘度向上物質は必要な粘度を提供するためには調製物中に実質的な量を必要とすると考えられる。
【００１１】
間質液の限定された量のために、物質の化学的安定性を高めない物質（すなわち工程を促進する賦形剤）は薬剤の妥協する分解を回避するために最少にする必要がある。従って、有意な量の粘度変更物質の添加は物質の送達を妨げる。例えば、適当な粘度を達成するための調製物中には概括的に、送達を許容できないほど妨げると考えられる量の、５〜１０％のＤｅｘｔｒａｎ（Ｒ）又はＰｏｖｉｄｏｎｅ（Ｒ）の添加を必要とすると考えられる。
【００１２】
従って、マイクロプロジェクション上の所望のコートを容易にするために十分な粘度を有する生物学的活性物質の調製物を提供することが本発明の目的である。
【００１３】
物質の十分な安定性を維持しながら、生物学的活性物質の調製物の粘度を増加する方法を提供することが本発明の更なる目的である。
【００１４】
治療的に有効であるために十分な物質濃度を維持しながら、マイクロプロジェクションを有効にコートするために十分な粘度を有する生物学的活性物質の調製物を提供することが本発明の更にもう１つの目的である。
【００１５】
揮発性の低い対イオンを添加することによりマイクロプロジェクションをコートするための生物学的活性物質の調製物の粘度を高めることが本発明の更なる目的である。
【００１６】
物質の調製物の粘度を高めることによりマイクロプロジェクション上にコートされた生物学的活性物質の送達を最適にすることが更にもう１つの目的である。
【特許文献１】米国特許第５，４８７，７２６号明細書
【特許文献２】米国特許第４，４５３，９２６号明細書
【特許文献３】米国特許第４，１０９，６５５号明細書
【特許文献４】米国特許第３，１３６，３１４号明細書
【特許文献５】欧州特許第０４０７０６３号明細書
【特許文献６】米国特許第５，８７９，３２６号明細書
【特許文献７】米国特許第３，８１４，０９７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２７９，５４４号明細書
【特許文献９】米国特許第５，２５０，０２３号明細書
【特許文献１０】米国特許第３，９６４，４８２号明細書
【特許文献１１】再発行（Ｒｅｉｓｓｕｅ）第２５，６３７号
【特許文献１２】国際公開第９６／３７１５５号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第９６／３７２５６号パンフレット
【特許文献１４】国際公開第９６／１７６４８号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第９７／０３７１８号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第９８／１１９３７号パンフレット
【特許文献１７】国際公開第９８／００１９３号パンフレット
【特許文献１８】国際公開第９７／４８４４０号パンフレット
【特許文献１９】国際公開第９７／４８４４１号パンフレット
【特許文献２０】国際公開第９７／４８４４２号パンフレット
【特許文献２１】国際公開第９８／００１９３号パンフレット
【特許文献２２】国際公開第９９／６４５８０号パンフレット
【特許文献２３】国際公開第９８／２８０３７号パンフレット
【特許文献２４】国際公開第９８／２９２９８号パンフレット
【特許文献２５】国際公開第９８／２９３６５号パンフレット
【発明の開示】
【００１７】
以上の目的及び以下に記述され、明白になるであろう事項に従うと、本発明は複数の角質層貫通マイクロプロジェクションを有する経皮送達装置をコートするための物質含有コート用調製物に関し、そこでコート用調製物が生物学的活性物質及び粘度向上対イオンを包含し、そこで調製物が治療的有効濃度の生物学的活性物質を有する。調製物は好ましくは約２０ｃｐ〜約２００ｃｐの範囲内の粘度を有する。
【００１８】
好ましい態様において、活性物質は調製物のｐＨにおいて正の電荷を有し、そして粘度向上対イオンは少なくとも２種の酸性のｐＫａを有する酸を含んでなる。適当な酸にはマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、酒石酸、アジピン酸、シトラコン酸、フマル酸、グルタル酸、イタコン酸、メグルトール、メサコン酸、コハク酸、シトラマル酸、タルトロン酸、クエン酸、トリカルバリル酸、エチレンジアミン四酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、炭酸、硫酸及びリン酸が包含される。
【００１９】
他の好ましい態様において、活性物質は調製物のｐＨにおいて負の電荷を有し、そして
粘度向上対イオンは少なくとも２種の塩基性のｐＫａを有する塩基を含んでなる。適当な塩基にはリシン、ヒスチジン、アルギニン、水酸化カルシウム及び水酸化マグネシウムが包含される。
【００２０】
もう１つの好ましい態様は、活性物質が調製物のｐＨにおいて正の電荷を有し、そして少なくとも１種の対イオンが少なくとも２種の酸性のｐＫａを有する酸である、対イオンの粘度向上性混合物に関する。他方の対イオンは１種又は複数のｐｋａをもつ酸である。適当な酸の例には塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、マレイン酸、リン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、クエン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、グルクロン酸、乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、ペンタン酸、炭酸、マロン酸、アジピン酸、シトラコン酸、レブリン酸、グルタル酸、イタコン酸、メグルトール、メサコン酸、シトラマル酸、クエン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリカルバリル酸及びエチレンジアミン四酢酸が包含される。
【００２１】
もう１つの好ましい態様は、活性物質が調製物のｐＨにおいて負の電荷を有し、そして少なくとも１種の対イオンが少なくとも２種の塩基性のｐＫａを有する塩基である、対イオンの粘度向上性混合物に関する。他方の対イオンは１種又は複数のｐｋａをもつ塩基である。適当な塩基の例には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、メチルグルカミン、グルコサミン、アンモニア及びモルホリンが包含される。
【００２２】
概括的に本発明の前記の態様において、対イオンの量は生物学的活性物質の電荷を中和しなければならない。
【００２３】
対イオン又は対イオンの混合物は調製物のｐＨにおいて物質上に存在する電荷を中和するのに必要な量だけ存在する。ｐＨを調整し、適当な緩衝能を提供するためには過剰な対イオン（遊離酸として又は塩としての）をペプチドに添加することができる。
【００２４】
本発明の１つの態様において、生物学的活性物質はＡＣＴＨ（１〜２４）、カルシトニン、デスモプレッシン、ＬＨＲＨ、ゴセレリン、ロイプロリド、ブセレリン、トリプトレリン、他のＬＨＲＨ類似体、ＰＴＨ、ＰＴＨ（１〜３４）、バソプレッシン、デアミノ［ｖａｌ４，Ｄ−Ａｒｇ８］アルギニンバソプレッシン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＦＳＨ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、グルカゴン、ＧＲＦ、それらの類似体及び製薬学的に許容できるそれらの塩からなる群から選択される。
【００２５】
１つの好ましい態様において、物質はＰＴＨ（１〜３４）を含んでなり、そして対イオンはクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、塩酸、グリコール酸及び酢酸の群から選択される対イオンの粘度向上混合物である。
【００２６】
本発明は更に、角質層を通って皮膚の、下に横たわる表皮及び真皮層中に貫通するようになっている複数のマイクロプロジェクションを包含するマイクロプロジェクション部材を有する経皮送達装置に関し、そこでマイクロプロジェクション部材が更に生物学的活性物質を包含し、コーティングが少なくとも１種の粘度向上対イオンを有する調製物から形成される。
【００２７】
更なる特徴物及び利点は、付記の図面に具体的に示され、そしてそこで類似の参考文字が概括的に図面全体を通して同様な部品又は要素を表わす、本発明の好ましい態様の以下の及び更に特定の説明から明白になるであろう。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、物質、方法又は構造物はもちろん変動する可能性があるので、本発明は特に例示された物質、方法又は構造物に限定されないことを理解しなければならない。従って、本明細書に記載されたものと類似した又は等しい多数の物質及び方法を本発明の実施に使用することができるが、本明細書には好ましい物質及び方法が記載される。
【００２９】
更に、本明細書で使用される用語は本発明の特定の態様を説明する目的のためだけのものであり、限定する意図はもたれないことを理解しなければならない。
【００３０】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は本発明が関与する当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００３１】
更に、本明細書に引用されるすべての刊行物、特許及び特許出願物は上記又は下記に拘わらず、それら全体を引用により本明細書中に取り入れられている。
【００３２】
最後に、本明細書及び付記の請求の範囲中に使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には文脈が明白に他の場合を指定しない限り、複数の指定物が含まれる。従って例えば、「ａｎ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ」に対する意味は２種以上のこのような物質を包含し；「ａ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ」は２種以上のこのようなマイクロプロジェクションを包含する、等である。
【００３３】
定義
本明細書で使用される用語「経皮的」は局所又は全身治療のための皮膚中へのそして／又は皮膚を通る物質の送達を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される用語「経皮流量」は経皮送達の速度を意味する。
【００３５】
本明細書で使用される用語「生物学的活性物質」は治療的に有効量を投与される時に薬理学的に有効な薬剤を含有する物質の組成物又は混合物を表わす。本発明の現在好ましい物質はペプチド及びタンパク質を含んでなる。このような活性物質の例には、限定されずに、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ＬＨＲＨ類似体（ゴセレリン、ロイプロリド、ブセレリン、トリプトレリン、ゴナドレリン、及びナプファレリン、メノトロピン（ウロフォリトロピン（ＦＳＨ）及びＬＨ）のような）、バソプレッシン、デスモプレッシン、コスチコトロピン（ＡＣＴＨ）、ＡＣＴＨ（１〜２４）のようなＡＣＴＨ類似体、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、バソプレッシン、デアミノ［Ｖａｌ４，Ｄ−Ａｒｇ８］アルギニンバソプレッシン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）及びグルカゴンが包含される。本発明の方法における物質の調製物中には１種を超える物質を取り入れることができ、そして用語「活性物質」の使用は３種以上のこのような物質又は薬剤の使用を全く排除しないことを理解しなければならない。
【００３６】
本明細書で使用される用語「生物学的活性物質」は更に、ワクチン又は他の免疫学的活性物質又は、免疫学的活性物質の産生の引き金を引くことができ、そして免疫学的に有効量を投与される時に直接又は間接的に免疫学的に有効である物質を含有する物質の組成物又は混合物を表わす。
【００３７】
本明細書で使用される用語「ワクチン」はそれらに限定はされないが、インフルエンザワクチン、ライム病ワクチン、狂犬病ワクチン、ハシカワクチン、オタフクカゼワクチン、水痘ワクチン、天然痘ワクチン、肝炎ワクチン、百日咳ワクチン及びジフテリアワクチン、組み換えタンパク質ワクチン、ＤＮＡワクチン及び治療的癌ワクチンを包含する通常の及び／又は市販のワクチンを表わす。従って用語「ワクチン」は限定されずに、タンパク質、リポタンパク質、シトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、風疹ウイルス及び水痘ウイルスのような弱毒化又は死滅ウイルス、百日咳菌、破傷風菌、ジフテリア菌、Ａ群連鎖球菌、レジオネラ・ニューモフィラ、ナイセリア髄膜炎菌、緑膿菌、肺炎連鎖球菌、梅毒トレポネーマ及びコレラ菌のような弱毒化又は死滅バクテリア、の形態の抗原並びにそれらの混合物を包含する。
【００３８】
用語「生物学的有効量」又は「生物学的有効速度」は生物学的活性物質が製薬学的に活性な物質であり、そして所望される治療的な、しばしば有益な結果をもたらすために必要な薬理学的に活性な物質の量又は速度を表わす時に使用されることとする。コーティング中に使用される物質の量は所望の治療的結果を達成するための治療的有効量の物質を送達するために要する量であろう。
【００３９】
実際に、これは、送達される特定の生物学的活性物質、送達部位、処置されている状態の重篤度、所望される治療効果並びにコーティングから皮膚組織中への物質の送達に対する溶解及び放出動態に応じて様々に異なるであろう。本明細書に記載された方法に従ってマイクロプロジェクション中に取り入れられ、経皮送達される生物学的活性物質の治療的に有効量の正確な範囲を規定することは実際的ではない。
【００４０】
本明細書で使用される用語「マイクロプロジェクション」は生存動物、特に哺乳動物そして更に特にはヒトの皮膚の角質層を通ってその下の表皮層又は表皮と真皮層中に穿孔又は切開するようになっている貫通要素を表わす。
【００４１】
本発明の１つの態様において、貫通要素は１０００ミクロン未満のプロジェクションの長さを有する。更なる態様において、貫通要素は５００ミクロン未満の、より好ましくは２５０ミクロン未満のプロジェクションの長さを有する。マイクロプロジェクションは典型的には約５〜５０ミクロンの幅及び厚さを有する。マイクロプロジェクションは針、中空の針、刃、ピン、パンチ及びそれらの組み合わせ物のような異なる形状に形成することができる。
【００４２】
本明細書で使用される用語「マイクロプロジェクションアレー」は角質層を貫通するためにアレーに配列された複数のマイクロプロジェクションを表わす。マイクロプロジェクションアレーは薄いシートから複数のマイクロプロジェクションをエッチング又はパンチし、そしてシートの平面からマイクロプロジェクションを折るか又は曲げて、図１に示すような形態を形成することにより形成することができる。マイクロプロジェクションアレーはまた、Ｚｕｃｋ、米国特許第６，０５０，９８８号明細書に開示されたような１又は複数の各ストリップの縁に沿ってマイクロプロジェクションを有する１又は複数のストリップを形成することによるような他の知られた方法で形成することができる。マイクロプロジェクションアレーは乾燥した薬理学的活性物質を保持する中空の針を包含することができる。
【００４３】
シート又は部材の領域に対する言及及びシート又は部材の領域に関する何かの特性に対する言及はシートの外周又は境界により囲まれた領域に関する。
【００４４】
用語「溶液」又は「調製物」は完全に溶解された成分の組成物のみならずまた、それらに限定はされないが、タンパク質のウイルスの粒子、不活性ウイルス及び分割ビリオンを
包含する成分の懸濁物をも包含することとする。
【００４５】
本明細書で使用される用語［パターンコートする」はマイクロプロジェクションの選択された領域上に物質をコートすることを意味する。２種以上の物質を単一のマイクロプロジェクションアレー上にパターンコートすることができる。パターンコーティングはミクロピペット処理及びインクジェットコートのような知られたミクロ−流体分配法を使用してマイクロプロジェクションに適用することができる。
【００４６】
前記のように、本発明は、調製物が、複数の角質層貫通マイクロプロジェクション上のコートを容易にするために高められた粘度を有する、治療を要する患者に対する生物学的活性物質の調製物を提供する。
【００４７】
本発明に従うと、生物学的活性物質の調製物の粘度は対イオンの添加により高められる。物質は好ましくは、ペプチド又はタンパク質を含んでなる。対イオンとのペプチド又はタンパク質の相互作用が二次結合又は水素結合の形成により粘度の増加をもたらす。使用される対イオンは調製物の粘度に対して著しい増加を有するためにごく少量を必要とする。前記の浸漬コート法を使用するコート性のためには、調製物は特定の粘度範囲内になければならない。本発明で好ましい粘度は約２０〜２００センチポアズ（ｃｐ）の範囲内にある。例えば、約２０ｃｐ未満又は約２００ｃｐを超える、許容できない粘度を有する調製物を使用するとコーティングの高いばらつきをもたらす。
【００４８】
好ましい態様において、物質は調製物のｐＨにおいて正の電荷を有し、そして粘度向上対イオンは少なくとも２種の酸性のｐＫａを有する酸を含んでなる。適する酸にはそれらに限定はされないが、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、酒石酸、アジピン酸、シトラコン酸、フマル酸、グルタル酸、イタコン酸、メグルトール、メサコン酸、コハク酸、シトラマル酸、タルトロン酸、クエン酸、トリカルバリル酸、エチレンジアミン四酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、炭酸、硫酸及びリン酸が包含される。
【００４９】
他の好ましい態様において、物質は調製物のｐＨにおいて負の電荷を有し、そして粘度向上対イオンは少なくとも２種の塩基性のｐＫａを有する塩基を含んでなる。適する塩基にはそれらに限定はされないが、リシン、ヒスチジン、アルギニン、水酸化カルシウム及び水酸化マグネシウムが包含される。
【００５０】
もう１つの好ましい態様は、物質が調製物のｐＨにおいて正の電荷を有し、そして少なくとも第１の対イオンが少なくとも２種の酸性のｐＫａを有する酸である、対イオンの粘度向上混合物に関する。第２の対イオンは１種又は複数のｐｋａをもつ酸である。適する酸の例にはそれらに限定はされないが、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、マレイン酸、リン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、クエン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、グルクロン酸、乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸、酒石酸、タルトロン酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、ペンタン酸、炭酸、マロン酸、アジピン酸、シトラコン酸、レブリン酸、グルタル酸、イタコン酸、メグルトール、メサコン酸、シトラマル酸、クエン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリカルバリル酸及びエチレンジアミン四酢酸が包含される。
【００５１】
もう１つの好ましい態様は、物質が調製物のｐＨにおいて負の電荷を有し、そして第１の対イオンが少なくとも２種の塩基性のｐＫａを有する塩基である、対イオンの粘度向上混合物に関する。第２の対イオンは１種又は複数のｐｋａをもつ塩基である。適する塩基の例にはそれらに限定はされないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、メチルグルカミン、グルコ
サミン、アンモニア及びモルホリンが包含される。
【００５２】
概括的に、本発明の前記の態様において、対イオン（又は対イオンの混合物）の量は生物学的活性物質のネットの電荷を中和しなければならない。
【００５３】
対イオン又は対イオンの混合物は調製物のｐＨにおいて物質上に存在するネットの電荷を中和するのに必要な量で存在する。ｐＨを調整し、適当な緩衝能を提供するためには、過剰な対イオン（遊離酸として又は塩としての）をペプチドに添加することができる。
【００５４】
生物学的活性物質に対する対イオン又は対イオンの混合物間のネット電荷の比率は好ましくは、１〜２０である（例えば、生物学的活性物質上に存在する各ネット電荷に対し、少なくとも１〜２０ネット電荷までの対イオン又は対イオンの混合物が存在する）。より好ましくは、生物学的活性物質に対する対イオン（又は対イオンの混合物）間のネット電荷の比率は１〜１０である。更により好ましくは、生物学的活性物質に対する対イオン（又は対イオンの混合物間）のネット電荷の比率は１〜５である。
【００５５】
本発明の１つの態様において、生物学的活性物質はＡＣＴＨ（１〜２４）、カルシトニン、デスモプレッシン、ＬＨＲＨ、ゴセレリン、ロイプロリド、ブセレリン、トリプトレリン、他のＬＨＲＨ類似体、ＰＴＨ、ＰＴＨ（１〜３４）、バソプレッシン、デアミノ［ｖａｌ４，Ｄ−Ａｒｇ８］アルギニンバソプレッシン、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、ＦＳＨ、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、グルカゴン、ＧＲＦ、それらの類似体及び製薬学的に許容できるそれらの塩からなる群から選択される。
【００５６】
好ましい態様において、物質はＰＴＨ（１〜３４）を含んでなり、そして対イオンはクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、塩酸、グリコール酸及び酢酸を含んでなる群から選択される対イオンの粘度向上混合物である。
【００５７】
本発明はまた、生物学的活性物質の調製物を提供する工程、生物学的活性物質の治療的有効濃度を維持しながら対イオンを添加することにより調製物の粘度を高める工程及びマイクロプロジェクションに調製物を適用する工程を含んでなる、複数の角質層貫通マイクロプロジェクションを有する経皮送達装置に生物学的活性物質のコーティングを適用する方法を含んでなる。対イオンは好ましくは、約２０〜２００ｃｐの範囲内の粘度を達成するように調製物に添加される。
【００５８】
本発明の方法は好ましくは、約１０ミクロン未満のコーティングの厚さをもたらす。
【００５９】
本発明に従うと、物質の調製物はマイクロプロジェクション経皮送達装置に好ましくは均一なコーティングを適用するために使用される。マイクロプロジェクションは角質層を通り、下に横たわる表皮層又は表皮及び真皮層中へ貫通するようになっている。適用される調製物はマイクロプロジェクション上で乾燥されて、その上に生物学的活性物質を含有する乾燥したコーティングを形成する。皮膚の角質層を貫通する時に、物質含有コーティングが体液（細胞内液及び、間質液のような細胞外液）により溶解され、局所的又は全身治療のために皮膚中に放出される。
【００６０】
物質含有コーティングの溶解及び放出の動態は、生物学的活性物質の性状、コート法、コーティングの厚さ及びコーティングの組成物（例えば、コーティング調製物の添加剤の存在）を包含する多数のファクターに左右されるであろう。放出動態のプロファイルに応じて、長期間にわたり（例えば、約８時間までも）コートされたマイクロプロジェクションを皮膚と貫通関係に維持することが必要かも知れない。これは接着剤を使用して皮膚に
マイクロプロジェクション部材を固定するか又はその全体を引用により取り込まれている国際公開第９７／４８４４０号パンフレットに記載されたような固定されたマイクロプロジェクションを使用することにより実施することができる。
【００６１】
図１は本発明とともに使用のための角質層貫通マイクロプロジェクション部材の１態様を表わす。図１は複数のマイクロプロジェクション１０を有する部材の一部を示す。マイクロプロジェクション１０は開口部１４を有するシート１２から実質的に９０°の角度で延伸する。シート１２はシート１２の裏打ちを包含する送達パッチに取り入れることができ、そして更に皮膚にパッチを接着するための接着剤を包含することができる。本態様において、マイクロプロジェクションは薄い金属シート１２から複数のマイクロプロジェクション１０をエッチング又はパンチし、そしてシートの平面からマイクロプロジェクション１０を折り出すことにより形成される。
【００６２】
図示されたパンチを構成するために好ましい材料はステンレス鋼及びチタンのような金属である。金属のマイクロプロジェクション部材は、Ｔｒａｕｔｍａｎ等の米国特許第６，０８３，１９６号明細書、Ｚｕｃｋの米国特許第６，０５０，９８８号明細書及びＤａｄｄｏｎａ等の米国特許第６，０９１，９７５号明細書に開示されており、それらの開示は引用により本明細書に取り入れられている。
【００６３】
本発明とともに使用することができる他のマイクロプロジェクション部材はシリコンチップエッチング法を使用してシリコンをエッチングすることにより、又はエッチングされた微小金型を使用してプラスチックを成型することにより形成される。シリコン及びプラスチックのマイクロプロジェクション部材はＧｏｄｓｈａｌｌ等の米国特許第５，８７９，３２６号明細書に開示されており、その開示は引用により本明細書に取り入れられている。
【００６４】
図２は、好ましくは、少なくとも１種の生物学的活性物質及び場合により血管収縮剤を含有するコーティング１６を伴うマイクロプロジェクション１０を有するマイクロプロジェクション部材を表わす。コーティング１６はマイクロプロジェクション１０を一部又は全体を覆うことができる。例えば、コーティングはマイクロプロジェクション上の乾燥パターンコーティング１８であることができる。コーティングはマイクロプロジェクションが形成される前又は後に適用することができる。
【００６５】
本発明に従うと、本発明の発明的調製物は種々の知られた方法によりマイクロプロジェクション１０上にコートすることができる。１つのこのような方法は浸漬コート法である。浸漬コート法はマイクロプロジェクションをコート溶液中に一部又は全体を浸漬することによりマイクロプロジェクションをコートする手段として説明することができる。あるいはまた、装置全体をコート溶液中に浸漬することができる。好ましくは、皮膚を貫通するマイクロプロジェクション部材の部分のみがコートされる。
【００６６】
前記の部分的浸漬法の使用により、コーティングをマイクロプロジェクションの先端のみに限定することができる。更にマイクロプロジェクションの先端にコーティングを限定するローラーコート機構が存在する。この方法は２００１年３月１６日出願の米国特許仮出願第６０／２７６，７６２号明細書に記載されており、その全体が引用により本明細書に取り入れられている。
【００６７】
他のコート法にはマイクロプロジェクション上にコート溶液を噴霧する工程が包含される。噴霧はコート用組成物のエアゾール懸濁液の形成を包含することができる。好ましい態様において、約１０〜２００ピコリッターの液滴度を有するエアゾール懸濁液がマイクロプロジェクション上に噴霧され、次に乾燥される。
【００６８】
もう１つの態様において、パターンコーティング１８として図２に示すように、非常に少量のコート用溶液をマイクロプロジェクション１０上にメッキすることができる。パターンコーティング１８はマイクロプロジェクションの表面上にメッキ液を配置するために浸漬システムを使用して適用することができる。メッキ液の量は好ましくは、０．５〜２０ナノリッター／マイクロプロジェクションの範囲内にある。適した、正確に計量される液体分配装置の例は米国特許第５，９１６，５２４号、第５，７４３，９６０号、第５，７４１，５５４号及び第５，７３８，７２８号明細書に開示されており、それらの開示は引用により本明細書に全体を取り入れられている。
【００６９】
マイクロプロジェクションのコート用溶液はまた、知られたソレノイド弁分配装置、場合による流体動力手段（ｆｌｕｉｄ  ｍｏｔｉｖｅ  ｍｅａｎｓ）及び概括的に電界の使用により制御される配置手段を使用するインクジェット法を使用して適用することができる。印刷工業からの他の液体分配法又は当該技術分野で知られた同様な液体分配法を本発明のパターンコーティングを適用するために使用することができる。
【００７０】
所望のコーティングの厚さはシートの単位面積当たりのマイクロプロジェクションの密度並びにコート用組成物の粘度及び濃度並びに選択されるコート法に左右される。より厚いコーティングは角質層の貫通時にマイクロプロジェクションを捨て去る傾向をもつので、コーティングの厚さは好ましくは、５０ミクロン未満、より好ましくは、２５ミクロン未満でなければならない。概括的にコーティングの厚さはコートされたマイクロプロジェクション上で測定される平均のコーティングの厚さとして言及される。
【００７１】
前記のように、１つの態様において、コーティングの厚さは好ましくは、マイクロプロジェクションの表面から測定されて１０ミクロン未満である。より好ましくは、コーティングの厚さは約１〜１０ミクロンの範囲内にある。
【００７２】
本発明に使用される活性物質はマイクロプロジェクションアレーのすべてのマイクロプロジェクション上にコートされた物質の総量が１ミクログラム〜１ミリグラムの範囲内にあることを必要とする。
【００７３】
この範囲内の量を１０ｃｍ２までの面積及び１０００個までのマイクロプロジェクション／ｃｍ２のマイクロプロジェクション密度をもつシート１２を有する、図１に示したタイプのマイクロプロジェクションアレー上にコートすることができる。
【００７４】
前記のように、本発明のコーティングは少なくとも１種の生物学的活性物質及び少なくとも１種の粘度向上対イオンを含んでなる。対イオンの添加は物質の調製物の粘度を増加して、マイクロプロジェクションの経皮送達装置上のコーティングのコンシステンシーを改善することが見いだされた。
【００７５】
更に、好ましくは、マイクロプロジェクションアレー１０はアプリケーター、例えば片寄った（例えば、バネに駆動される）衝撃アプリケーターの使用により患者に再現可能にそして均一に適用される。このような装置はＴｒａｕｔｍａｎ等の２００１年１０月１２日出願の米国特許出願第０９／９７６，６７３号明細書に記載されており、その開示は引用により本明細書に取り入れられている。もっとも好ましくは、コートされたマイクロプロジェクションアレーは１０ｍｓｅｃ以内にマイクロプロジェクションアレー１ｃｍ２当たり少なくとも０．０５ジュールの衝撃で適用される。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は当業者に本発明をより明白に理解し、実施させるために提供される。そ
れらは本発明の範囲を限定するものと考えるべきではなく、単にそれらの代表として説明されるものと考えるべきである。
【００７７】
実施例は粘度を高めるためのペプチド又はタンパク質の物質を含む弱酸の使用を示す。弱酸のアニオンと正に荷電したペプチド又はタンパク質との相互反応は明らかに、二次結合、例えば、水素結合の形成をもたらし、それが溶液の粘度の増加をもたらす。酸性基の数が多いほど、アニオンとペプチド又はタンパク質の間に形成される二次結合の数が多く、従って粘度の増加が大きい。従って、一酸、二酸、三酸及び四酸を比較すると、理論的粘度向上能が増加する。
【００７８】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は石灰化した骨マトリックスの再吸収を高めることにより腎臓中のカルシウム再吸収の刺激により血清中のカルシウムのホメオスタシスを制御する８４個のアミノ酸のポリペプチドである。更にそれはまた、骨形成過程を刺激する。ホルモン活性に寄与するのは最初の（Ｎ−末端の）３４個のアミノ酸である。その結果、最初の３４個のアミノ酸の、ＰＴＨ（１〜３４）の合成的調製が評価された。
【００７９】
これらの実験で種々の弱酸バッファーを幾つかのＰＴＨ（１〜３４）調製物中に取り入れた。蔗糖とともにＰＴＨ（１〜３４）アセテートを包含する対照調製物も調製した。実験は一酸、二酸及び三酸の種々の混合物によりＰＴＨ（１〜３４）に与えられた物理化学的特性並びに２〜８℃で４８時間の期間にわたる溶液調製物の安定度を研究する。ＰＴＨ（１〜３４）調製物はｐＨ５．２に緩衝された。
【００８０】
表１は使用された原料のロット番号及び製造会社を与える。表２は溶液の安定度の研究のために製造された８種の調製物を提供する。調製物は１．５ｍｌのポリプロピレンのエッペンドルフ遠心分離管中にＰＴＨ（１〜３４）２０ｍｇを分配することにより調製した。もう１つの１．５ｍｌのポリプロピレンのエッペンドルフ遠心分離管に適当量の滅菌水、バッファー（調製に必要な場合）、蔗糖（調製に必要な場合）及びポリソルベート２０の溶液を充填した。賦形剤を含有する遠心分離バイアルを放置溶解させ、Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのミニ遠心分離装置、モデルＭｉｃｒｏＶを利用して７０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。賦形剤溶液をＰＴＨ（１〜３４）を含有する遠心分離バイアル中に分配し、それを次に回転装置、Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ、モデルＮｏ．０９９Ａ  ＲＤ４５１２中に入れた。賦形剤溶液によるＰＴＨ（１〜３４）の溶解は２〜８℃で実施した。
【００８１】
ＰＴＨ（１〜３４）溶液の調製物をＦｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのミニ遠心分離装置、モデルＭｉｃｒｏＶを利用して７０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。溶液の調製物の粘度測定をＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ粘度計、モデルＣＡＰ２０００を使用して実施した。すべての粘度測定を０．４５°の円錐角及び半径１．５１１ｃｍをもつ円錐及びプレート幾何学法を使用して実施した。粘度測定中、ずり速度を２６６７ｓ−１に設定し、温度を１０℃に維持した。粘度をＣＡＰＣＡＬＣＴＭソフトウエアにより計算した。粘度測定はＰＴＨ（１〜３４）溶液の調製物７０μｌを利用した。
【００８２】
すべての調製物中の酸化によるＰＴＨの分解を、安定度を示す逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により測定した（２１５ｎｍにおけるＵＶ検出）。酸化ＰＴＨを５５℃で維持されたＺｏｒｂａｘ  ３００  ＳＢ−Ｃ８逆相カラム（４．６ｍｍＩＤ×１５０ｍｍ、３．５μｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．ＣＡ，米国）を使用して天然の（ｎａｔｉｖｅ）ＰＴＨから分離した。最終クロマトグラフィー条件は溶媒Ａ：水中０．１％トリフルオロ酢酸及び溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．０９％のトリフルオロ酢酸を使用する勾配溶離を伴った。ポンプの流速は１ｍＬ／分であった。可溶性凝集物（共有結合の二量体及びそれより高次の）を０．２ＭのＮａＣｌ及びアセトニトリル（７０／３０容量比）中０．１％トリフルオロ酢酸からなる定組成移動相によるＴＣＫ−ゲル  Ｇ２０００  ＳＷＸＬカラム（７．９ｍｍＩＤ×３００ｍｍ、５μｍ）（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ，日本）を使用して０．５ｍＬ／分の流速でサイズ排除（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定した（２１４ｎｍでＵＶ検出）。双方のアッセイのためのクロマトグラフィーを二重ポンプ、定温自動採取装置、定温カラムコンパートメント及び複数波長ＤＡＤ／ＵＶ検出装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ、米国）で実施した。データを収集し、Ｔｕｒｂｏｃｈｒｏｍ  Ｃｌｉｅｎｔ  Ｓｅｒｖｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，バージョン６．２（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ）を使用して分析した。
【００８３】
【表１】
0005388415.tif 000002
【００８４】
【表２】
0005388415.tif 000003
【００８５】
調製物の粘度の結果は表３に示す。クエン酸及びリンゴ酸に緩衝された調製物は対照の調製物（ロット番号７５２８０６９Ａ）に比較して最大の粘度向上を示した。三酸のクエン酸が最大の粘度をもつ調製物をもたらしたことを注目することは興味深い。表３に与えた結果に基づいて、弱酸バッファーの添加後の粘度向上の傾向は三酸から二酸から一酸である。
【００８６】
【表３】
0005388415.tif 000004
【００８７】
恐らく、弱酸のバッファーの粘度の増加は弱酸のアニオンの、正に荷電したＰＴＨとの相互反応により達成される。これは二次結合、例えば、Ｈ−結合の形成をもたらし、それが溶液の粘度の増加をもたらす。酸性基の数が多いほど、アニオンとＰＴＨ間に形成される二次結合の数が多く、従って粘度向上が大きい。
【００８８】
ＰＴＨ調製物の全体の安定性を測定し、結果を図３〜５に示す。酸化ＰＴＨ（１〜３４）の総量及び調製物の純度はＲＰＨＰＬＣにより測定され、結果をそれぞれ図３及び４に示す。
【００８９】
図３から結果のばらつきの範囲内で、４８時間にわたり酸化生成物の総量は著しくは増加せず、同様にＰＴＨ（１〜３４）溶液の調製物の図４に示した純度は研究の経過期間中一定に留まったことが明白である。凝集及び共有結合の高分子塊生成物の形成に対するＰＴＨ（１〜３４）溶液の調製物の傾向を測定するためにＳＥＣが使用された。結果は図５に要約され、それはＰＴＨ（１〜３４）の調製物が、２〜８℃に貯蔵されると、４８時間にわたり目立つほどには凝集しなかったことを示す。
【００９０】
上記のデータは、クエン酸／酢酸、リンゴ酸／酢酸、酒石酸／酢酸及び塩酸／酢酸の対イオン混合物が対照調製物に対してｈＰＴＨ（１〜３４）の粘度を増加することを示す。酸化ＰＴＨ（１〜３４）生成物の総量、純度及び凝集は研究の全工程を通して全調製物に対して均一に留まった。
【００９１】
本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、当業者は本発明を種々の用途及び条件に適合させるために本発明に種々の変更及び修正を実施することができる。従ってこれらの変更及び修正は適切に、同様に、以下の請求の範囲の同等物の完全な範囲内に入ることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】本発明の実施に適するマイクロプロジェクションアレーの１つの態様の一部の透視図である。
【図２】マイクロプロジェクション上にメッキされたコーティングを伴う図１に示したマイクロプロジェクションアレーの透視図である。
【図３】時間の関数としての本発明の種々の組成物の酸化を示すグラフである。
【図４】時間の関数としての本発明の種々の組成物の純度を示すグラフである。
【図５】時間の関数としての本発明の種々の組成物の凝集を示すグラフである。
【図１】
0005388415.tif 000005
【図２】
0005388415.tif 000006
【図３】
0005388415.tif 000007
【図４】
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【図５】
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