(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
後天性免疫反応の誘導を相乗的に刺激する一つまたはそれ以上のリポペプチド及びポリＩ：Ｃ（ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ：ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ）を含むワクチン用アジュバントであって、前記リポペプチドが、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８であることを特徴とするワクチン用アジュバント。
【請求項２】
ポリＩ：Ｃは、その長さが５０〜２，０００ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載のワクチン用アジュバント。
【請求項３】
請求項１のアジュバント及び少なくとも一つの抗原を含むワクチン組成物。
【請求項４】
抗原が、病原体のタンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、ハプテン、多糖類、糖タンパク質、脂質多糖類、ＤＮＡ分子（ポリヌクレオチド）、癌細胞、及び微生物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
抗原が、Ｌ−ＨＢｓＡｇ、インフルエンザＨＡ、Ｓ−タンパク質及びｐｒｅＳからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
細胞性免疫を効果的に誘導して、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを含む、抗原特異的抗体を生産することができることを特徴とする、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂタイプであることを特徴とする、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
請求項１のアジュバント及び少なくとも一つのウイルス抗原または寄生虫抗原を含むウイルスまたは寄生虫感染治療剤。
【請求項９】
前記ウイルス抗原が、インフルエンザウイルス抗原（ＨＡ：ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼ抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原（ＧＰ−１２０、ＧＰ−１６０）、水疱性口内炎ウイルス抗原（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎ウイルス抗原［肝炎Ａ（ＨＡＶ），Ｂ（ＨＢＶ），Ｃ（ＨＣＶ），Ｄ（ＨＤＶ）及びＧ（ＨＧＶ）抗原：Ｌ−ＨＢｓＡｇ、Ｓ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇ及びｐｒｅＳ抗原］、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、又はヘルペスシンプレックス抗原であることを特徴とする、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１０】
前記寄生虫が、原生動物、線虫類、吸虫類または条虫類であることを特徴とする、請求項８に記載の治療剤。
【請求項１１】
請求項１のアジュバント及び少なくとも一つの癌特異的抗原を含む癌の予防または治療用ワクチン。
【請求項１２】
前記癌が、腎臓癌、悪性黒色腫、慢性リンパ球性白血病、肺癌、子宮頚部癌、胃癌、甲状腺癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胆管癌、肝臓癌、結腸癌、または直腸癌であることを特徴とする、請求項１１に記載の予防または治療用ワクチン。
【請求項１３】
前記癌特異的抗原が、ｇｐｌＯＯ、ＭＡＲＴ−Ｉ及びＭＡＧＥ−Ｉ、チロシナーゼ、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−Ｉ、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＭＵＣ−Ｉ、ＳＡＲＴ−ＩまたはＳＡＲＴ−３、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）またはＴＥＲＴに由来した部分ペプチド、ＷＴｌまたはＷＴｌに由来した部分ペプチド、サバイビン２Ｂまたはサバイビン２Ｂに由来した部分ペプチド、ｇｐ７５、ＭＤＭ２、テロメラーゼ、ａｌｐｈ−１胎児タンパク質、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｇ２５０又はＮＹ−ＥＳＯ−Ｉであることを特徴とする、請求項１１に記載の予防または治療用ワクチン。
【請求項１４】
請求項１のアジュバント及び少なくとも一つのウイルスまたは寄生虫抗原の、ウイルスまたは寄生虫感染治療用治療剤の製造における使用。
【請求項１５】
請求項１のアジュバント及び少なくとも一つの癌特異的抗原の、癌の予防または治療用免疫学的薬剤の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リポペプチドとポリＩ：Ｃ（ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ：ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を含むアジュバント及びそれを含むワクチンに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは、免疫反応を誘導する多くの工程中の一つまたはそれ以上の特定工程を促進させたり増幅させたりして、窮極的に免疫反応がさらによく発生するようにするものを意味する。したがって、抗原と一緒に投与される場合、抗原に対する免疫反応を増進させて抗原に対する免疫反応の形態を変化させることができる。典型的なアジュバントの例としては、オイルエマルジョン（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｑサポニン、水酸化アルミニウム、アルミニウムのリン酸塩またはカルシウム塩（ａｌｕｍ）、非イオンブロック重合体活性剤、脂質多糖類、マイコバクテリア、破傷風トキソイド、ＣｐＧなどが知られている。
【０００３】
タンパク質抗原を単独で用いることは、しばしば十分に強い免疫反応と所望の類型の免疫反応を誘導することができず、一般にワクチン組成物は、抗原とアジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を含む。免疫反応に関する２種の信号モデルにしたがい、ＭＨＣにより提示される抗原エピトープと抗原受容体の結合を通じて伝達される信号は、免疫反応を誘導できる程度に十分なものではない。これは、共刺激分子から発生する追加の信号を必要とする。ここで、アジュバントは、共刺激分子により発生した信号強度を増強させて及び／又は共刺激分子を誘導し、また、免疫反応の類型を決定するサイトカイン類を誘導できる。脂タンパク質、糖タンパク質、または全微生物のような特定の抗原は、エピトープ及び免疫増強機能をいずれも病原菌関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の形態で提供できる。タンパク質抗原の一次構造、即ち、抗原のアミノ酸の配列は変わることができないが、抗原のＰＡＭＰは、適切なアジュバントまたは免疫原性に影響を与える補助構造剤を添加することによって改質または補充できる（Ｄｅｍｐｓｅｙ  ＰＷ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６年，第１１１巻，ｐ．３４８−３５０；Ｄｅｒｅｓ  Ｋ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９年，第３４２巻，ｐ．５６１−５６４）。抗原の分子パターンの変形は、免疫原性を増加させることができ、また免疫反応類型に影響を与えることができることは、すでによく知られた事実である。例えば、ＨＢＶ表面抗原の場合、ｐｒｅＳ１とｐｒｅＳ２を含まないＳタンパク質は、類似遺伝子形マウス種では、免疫原性が現われない一方、ｐｒｅＳ１とｐｒｅＳ２を含むＬタンパク質は、ｐｒｅＳ１とｐｒｅＳ２に対する抗体を誘導するだけでなく、Ｓ抗原に対する抗体形成も誘導する（Ｍｉｌｉｃｈ  ＤＲ等，１９８６年．Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，ｐｐ３７７−３８２．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。また、病原性微生物全体が抗原に使用される場合、このような抗原には、リポポリサッカライド、核酸、脂質タンパク質または複合タンパク質のような多くの種類のＰＡＭＰリガンドが混じっている。ここで、ＡＰＣ（抗原提示細胞）表面にあるＰＲＲ（病原体認識受容体）は、前記ＰＡＭＰを認知して多様な共同刺激分子とサイトカインを誘導するための信号を起こし、免疫反応の類型に影響を与えるようになる。例えば、インターフェロンγとＩＬ−１２は、ウイルス感染に対する免疫反応に重要なＴｈ１（ヘルパーＴ細胞１）細胞反応を誘導するようになり、Ｔｈ１タイプ免疫反応は、より多くのＩｇＧ２ａ生成と強力な細胞性免疫反応として現われる。ＴｈＩ類型の免疫反応は、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂの生成をリードし、強い細胞媒介免疫反応を誘導する。ここで、抗原と関連したＰＡＭＰの多様な類型は、アジュバントの機能として作用しており、そのようなアジュバントは、免疫反応の制御に役立つ。しかし、抗原と関連した天然アジュバントの機能のこのような類型は、しばしば免疫反応の所望の強度と質を誘導できるほど強力なものではなく、ワクチンの製造に適したアジュバントが求められている。
【０００４】
したがって、優れたアジュバントの開発は、よいワクチンを開発するにおいて非常に重要なことではあるが、アジュバントの開発は、依然として主に実験的作業に依存しなければならない。例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性、及びＡＰＣによる抗原提示にかかわる抗原提示細胞（ＡＰＣ）上にある最も重要なＰＲＲである。しかし、強力な抗体反応は、ＴＬＲ信号に全く依存しない（Ｇａｖｉｎ．Ａ．Ｌ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００６年，第３１４巻，ｐ．１９３６−１９３８）。しかも、ＴＬＲ２リガンドの１つであるＰａｍ３ｃｙｓは、免疫反応を誘導するにおいてＴＬＲ２と関係なく作用する（Ｙｏｄｅｒ等，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２００３年，第７１巻，ｐ．３８９４−３９００）。さらに問題を複雑にするものとしては、優れた防御的免疫反応は、強い細胞媒介免疫反応及び体液性抗原反応の両方を含み、バランスの取れた免疫反応を要求している。したがって、バランスの取れた適応性（後天的）免疫反応を誘導するのに役立つアジュバントを開発することは、依然として合理的予想を越える問題を有している。
【０００５】
本発明では、最もよく知られたアジュバントの水酸化アルミニウムに関し、良質の抗原特異的抗体を多量生産することができるワクチン製剤として強力なワクチンを定義した。適合した良質の抗体形成は、予防目的または治療目的の強力なワクチンを作るのに重要な要素である。例えば、腫瘍を除去するにおいて、ＩｇＧアイソタイプ等は、互いに異なる効力を示すが、その中でＩｇＧ２ａは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３に比較して最も効果的である（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  Ｆ  ＆ Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５年，第３１０巻，ｐ．１５１０−１５１２）。また、抗ウイルス免疫には、ＩｇＧ２ａとＩｇＧ２ｂが最も効果的なことが知られているが（Ｃｏｕｔｅｌｉｅｒ  ＪＰ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８７年，第１６５巻，ｐ．６４−６９；Ｍａｒｋｉｎｅ−Ｇｏｒｉａｎｏｆｆ  Ｄ  ＆ Ｃｏｕｔｅｌｉｅｒ  ＪＰ，Ｊ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌ  ２００２年，第７６巻，ｐ．４３２−４３５）、これらは、細胞性免疫反応によって形成されたＴｈ１細胞が生産するサイトカインの影響で生成される。したがって、良質の抗体形成は、細胞性免疫反応誘導が隋伴する。したがって、Ｔｈ１細胞反応の誘導は、適合した良質の抗体形成のための卓越した試みである。最も広く使用されているアジュバントであるＡｌｕｍは、Ｔｈ２形態免疫反応を誘導し、誘導された抗体は、主にＩｇＧ１である。
【０００６】
ゆえに、本発明において強力なワクチン製剤は、生産される抗原特異的抗体の量とＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１の割合によって判断され、同時に本発明で良いアジュバントの基準は、強力な抗体反応及び細胞性免疫反応を誘導し、免疫グロブリンクラスを変更してＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを生産するものである。
【０００７】
発明者らは、リポペプチド及びポリＩ：Ｃ（ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ：ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を含むアジュバントの組成物が、通常のアジュバントの水酸化アルミニウムよりはるかに強力であることを確認することにより、リポペプチド及びポリＩ：Ｃが、添加物の代わりに、後天的免疫反応の刺激に相乗作用的であるということをさらに確認することによって本発明を完成した。たとえＰａｍ３Ｃｙｓ及びポリＩ：Ｃが大食細胞でＴＮＦ−α及びＩＬ−６を誘導するにおいて相乗作用的であることが知られているとしても（Ｂａｇｃｈｉ，Ａ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．２００７年，第１７８巻，ｐ．１１６４−１１７１）、リポペプチド及びポリＩ：Ｃで構成される類似の組み合わせのバランスの取れた強力な免疫増強機能は、予想し得ない発見である。さらに本発明者等は、リポペプチドを抗原に共有結合的に連結することが要求されないことを確認した。リポペプチド、ポリＩ：Ｃ及び少なくとも一つの抗原との混合物の形態である単純な組成であれば十分なのである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、抗原が強力な免疫反応を誘導する助けをするアジュバントを提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記アジュバントと抗原を含むワクチン組成物を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記アジュバントを用いて相応しい良質の抗体を形成させる方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記アジュバントを用いてＴｈ１免疫反応を増進させる方法を提供することである。
また、本発明の他の目的は、前記アジュバント及び少なくとも一つのウイルスまたは寄生虫抗原を含む、ウイルスまたは寄生虫感染用治療ワクチンを提供することである。
同時に、本発明の他の目的は、前記アジュバント及び少なくとも一つの癌特異的抗原を含む、癌の予防または治療ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、リポペプチド及びポリＩ：Ｃ（ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ：ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を含むアジュバントを提供する。
また、本発明は、前記アジュバントと少なくとも一つの相応しい抗原を含むワクチン組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、前記ワクチン組成物をそれを必要とする個体に投与する工程を含む相応しい良質の抗体を形成させる方法を提供する。
また、本発明は、前記ワクチン組成物をそれを必要とする個体に投与する工程を含むＴｈ１免疫反応を増進させる方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、前記アジュバント組成物及び少なくとも一つのウイルスまたは寄生虫抗原を含む、ウイルスまたは寄生虫感染に対する治療ワクチンを提供する。
【００１２】
また、本発明は、前記アジュバント組成物及び少なくとも一つの癌特異的抗原を含む、癌の予防または治療ワクチンを提供する。
【００１３】
また、本発明は、前記アジュバント及び少なくとも一つのウイルスまたは寄生虫抗原をウイルスまたは寄生虫感染治療剤の製造に用いる用途を提供する。
同時に、本発明は、前記アジュバント及び少なくとも一つの癌特異的抗原を癌の治療用治療剤の製造に用いる用途を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のアジュバントを同時に使用する場合、抗原特異的抗体の量が増加してＴｈ１タイプ免疫反応が誘導される効果が現われるので、ウイルスまたは寄生虫感染及び癌の予防または治療のためのワクチン用アジュバントとして有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】アジュバントとして、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの両方で、Ｌ−タンパク質（Ｓ−タンパク質−ｐｒｅＳ２−ｐｒｅＳｌ）、Ｍ−タンパク質（Ｓ−タンパク質−ｐｒｅＳ２）、及びＳ−タンパク質からなるＬ−ＨＢｓＡｇを含む多様なワクチン組成物により誘導されたＳ−タンパク質の抗体価を示すグラフである。
【図２】Ｌ−ＨｂｓＡｇ、及びアジュバントとして、Ａｌｕｍ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの両方を有する多様なワクチン組成物により誘導されたｐｒｅＳ抗原に対する抗体価を示すグラフである。このような実験から、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃ間の相乗作用の効果が確認され得る。
【図３】Ｌ−ＨＢｓＡｇ及びアジュバントとして、Ａｌｕｍ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの両方を有する多様な異なるワクチン組成物により誘導された抗体のアイソタイプを示すグラフである。ａ；各アイソタイプの抗体価、ｂ；ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧｌ、ｃ；ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧｌ。
【図４】異なるアジュバント；Ａｌｕｍ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの両方で組成されたインフルエンザウイルスＨＡ抗原に対する免疫原性を示すグラフである。
【図５】異なる類型のアジュバント：Ａｌｕｍ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの両方で組成されたインフルエンザウイルス抗原により誘導された抗体のアイソタイプを示すグラフである。ａ；各アイソタイプの抗体価、ｂ；ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧｌ。
【図６】異なるアジュバント：Ａｌｕｍ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫの両方で組成されたハンセヌラ・ポリモルファのＨＢｓＡｇ抗原（Ｓ−タンパク質）及びサッカロマイセス・セレビシエのｐｒｅＳに対する免疫原性を示すグラフである。
【図７】異なるアジュバント：Ａｌｕｍ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫの両方で、ハンセヌラのＳ−タンパク質及び酵母のｐｒｅＳで組成されたワクチンによるｐｒｅＳに対する免疫原性を示すグラフである。
【図８】異なるアジュバント；Ａｌｕｍ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫの両方で、ハンセヌラのＨＢｓＡｇ（Ｓ−タンパク質）及び酵母のｐｒｅＳで組成されたワクチンにより誘導された抗体のアイソタイプを示すグラフである。ａ；各アイソタイプの抗体価、ｂ；ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧｌ、ｃ；ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧｌ。
【図９】アジュバントとして、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８単独、ＦＳＬ−Ｉ単独、ポリＩ：Ｃ単独、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃの組み合わせ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８とポリＩ：Ｃの組み合わせ、またはＦＳＬ−ＩとポリＩ：Ｃの組み合わせを用い、Ｌ−タンパク質（Ｓ−タンパク質−ｐｒｅＳ２−ｐｒｅＳｌ）、Ｍ−タンパク質（Ｓ−タンパク質−ｐｒｅＳ２）、及びＳ−タンパク質からなるＬ−ＨＢｓＡｇを含む多様なワクチン組成物により誘導されたＳ−タンパク質の抗体価を示すグラフである。
【図１０】Ｌ−ＨｂｓＡｇ、及びアジュバントとして、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８単独、ＦＳＬ−Ｉ単独、ポリＩ：Ｃ単独、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃの組み合わせ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８とポリＩ：Ｃの組み合わせ、またはＦＳＬ−ＩとポリＩ：Ｃの組み合わせで組成された多様なワクチン組成物により誘導されたｐｒｅＳ抗原に対する抗体価を示すグラフである。このような実験から、リポペプチドとポリＩ：Ｃ間の相乗作用の前記効果が確認され得る。
【図１１】Ｌ−ＨＢｓＡｇ及びアジュバントとして、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８単独、ＦＳＬ−Ｉ単独、ポリＩ：Ｃ単独、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃの組み合わせ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８とポリＩ：Ｃの組み合わせ、またはＦＳＬ−ＩとポリＩ：Ｃの組み合わせで組成された多様に異なるワクチン組成物により誘導された抗体のアイソタイプを示すグラフである。ａ；各アイソタイプの抗体価、ｂ；ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧｌ、ｃ；ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧｌ。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１７】
本発明は、一つまたはそれ以上のリポペプチド及びポリＩ：Ｃを含むワクチン用アジュバントを提供する。
【００１８】
本発明の実施例で、リポペプチドの一種であるＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃを混合してアジュバントに使用してＢ型肝炎ウイルス抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ）、インフルエンザ抗原またはＨＢｓＡｇ  Ｓ−タンパク質及びＰｒｅＳ混合抗原を対象に製剤化したワクチンが、前記アジュバントを単独で使用した場合または従来から強力なアジュバントとして知られた水酸化アルミニウムを使用した場合より、抗原特異的抗体生産量を顕著に増加させた（図１、２、４、６及び７、表１、２及び３参照）。
【００１９】
Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃの混合物を用いる場合、免疫反応を刺激するにおいて相乗作用を示した。すなわち、前記混合物により誘導されたｐｒｅＳ抗体価は、混合物の個別成分により誘導された抗体価の合計値より数倍も高かった。これは、図２に最もよく例示されており、ここで、ｐｒｅＳ抗体価は、混合物または個別成分について評価されている。このような相乗効果は、Ｓ−タンパク質抗体の誘導については、十分に言及されていない（図ｌ）。これは、全ての実験に用いた抗原の量が、アジュバントの依存性を示す正確な量ではなく飽和量であるためである。Ｌ−タンパク質でのｐｒｅＳの含量は、全体の１０％未満である（５ｍｇ）。
【００２０】
Ｔｈ２の免疫反応を誘導すると知られている水酸化アルミニウムを用いてワクチンを組成する場合、ＩｇＧｌ抗体は、優勢なＩｇＧのアイソタイプであった。その反面、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃを含む混合物を用いてワクチンを組成する場合、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂが優勢に生成された。したがって、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫの割合及びポリＩ：Ｃの混合物から得られるＩｇＧ２ａ／ＩｇＧｌ及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧｌの割合は、通常のアジュバントである水酸化アルミニウムで得た割合に比較してさらに高かった（図３、５と８、及び表１、２と３参照）。ウイルス性感染及び癌に対する防御に非常に効果的なものと知られているＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂのこのような増加は、前記新規なアジュバントで免疫反応の質が向上したことを提示している。このような発見は、本発明によるリポペプチド及びポリＩ：Ｃを含むアジュバントが強力な治療及び予防ワクチンの剤形を開発するのに効果的に用いられ得るということを示している。
【００２１】
前記リポペプチドは、バクテリアとマイコプラズマに由来したリポペプチドの合成類似体でＭｅｔｚｇｅｒなどによって初めて合成され（Ｍｅｔｚｇｅｒ  Ｊ等，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ  １９９１年，第３７巻，ｐ．４６−５７）、以後、多様な類似体が合成された（ＥＭＣ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ  Ｓｉｎｄｅｌｆｉｎｇｅｒ  Ｓｔｒ．３  ７２０７０  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）。リポペプチドの一種であるＰａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＳｅｒをインフルエンザウイルスＴ細胞エピトープと結合させてマウスに投与した場合、ウイルス特異的な細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が誘導されたと報告されたことがあり（Ｓｃｈｉｌｄ  Ｈ等，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９１年，第２１巻，ｐ．２６４９−２６５４）、一般的にリポペプチドは、ＴＬＲ２に対するリガンドで知られている（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ  Ｇ  ＆ Ｓｈｅｒ  Ａ，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７年，第７巻，ｐ．１７９−１９０）。
【００２２】
本発明において、前記リポペプチドは、グリセロール分子に結合された脂肪酸及び多くのアミノ酸で構成されたもので、分子内に前記脂肪酸の数は、一つまたはそれ以上であり得る。前記リポペプチドは、グラム陽性やグラム陰性のバクテリアやマイコプラズマから由来した分子の一部または分子全体形態からなる脂質タンパク質であり得、また前記脂肪酸とアミノ酸は、化学的に変形して合成されたものであり得る。前記リポペプチドの例としては、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ（化学式１；分子構造：Ｎ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイロキシ）−（２ＲＳ）−プロピル］−［Ｒ］−システイン−ＳＫＫＫＫ）、ＰＨＣ−ＳＫＫＫＫ、Ｏｌｅ２ＰａｍＣｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＣｙｓ（Ｐａｍ）−ＳＫＫＫＫ、Ｏｌｅ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｍｙｒ２Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＤｈｃ−ＳＫＫＫＫ、ＰａｍＣＳＫＫＫＫ、Ｄｈｃ−ＳＫＫＫＫなどが含まれ得るが、これに限定されるのではない。
【００２３】
【化１】
0005485165.tif 000002
【００２４】
また、ポリＩ：Ｃは、インビボとインビトロ研究でタイプ１インターフェロンの強力な誘導体として使用されてきて（Ｍａｇｅｅ  ＭＥ  ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ＭＪ，ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＩＩ，１９７２年，第１１巻，ｐ．１０８１−１０８６；Ｍａｎｅｔｔｉ  ＹＲ等，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５年，第２５巻，ｐ．２６５６−２６６０）、ホ乳類で最も強力なＡＰＣである樹状細胞を免疫反応を効果的に誘導することができる成熟型に作ることが報告された（Ｒｏｕｓ  Ｒ等，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００４年，第１６巻，ｐ．７６７−７７３）。すなわち、ポリＩ：Ｃは、強力なＩＬ−１２誘導物質であり、前記ＩＬ−１２は、免疫反応をＴｈ１が発達するように推進して細胞性免疫反応とＩｇＧ２ａ抗体形成を誘導する重要なサイトカインである。また、ポリＩ：Ｃは、ペプチド抗原に対する強力なアジュバント活性を有することが報告された（Ｃｕｉ  Ｚ  ＆ Ｑｕｉ  Ｆ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００５年，第１６巻，ｐ．１−１３）。
前記ポリＩ：Ｃは、二重ラセン構造を有する合成ＲＮＡで、その長さが５０〜２，０００ｂｐであることが相応しく、１００〜５００ｂｐが好ましい。
【００２５】
また、本発明は、リポペプチド及びポリＩ：Ｃ及び少なくとも一つの抗原で構成された前記アジュバントを含むワクチン組成物を提供する。より詳細には、本発明は、それぞれのアジュバント成分による相加的効果を提供する代りに相乗的に免疫反応を誘導することができる一つまたはその以上のリポペプチド及びポリＩ：Ｃで構成されたアジュバントを提供する。
【００２６】
本発明の好ましい実施例において、本発明のアジュバントを用いて製造されたワクチンは、抗原特異性抗体の生成を相乗的に増加させることはもとより、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを誘導しながら、免疫反応の質を変更したことが証明された（図１−８及び表１−３参照）。したがって、本発明の前記アジュバントの成分を含むアジュバントの組成物は、抗原の免疫原性を増加させ、それによってワクチンの効能を改善させるのに効果的に用いられ得る。前記抗原は、宿主の体内に入った時、宿主の免疫系によって認識されて免疫反応を起こすことができるすべての物質を意味し、前記抗原の全長または断片であり得る。
【００２７】
また、前記抗原は、精製されたまたは精製されていない形態で提供することができ、精製された形態で提供されることが好ましい。
【００２８】
前記抗原には、例えば、病原体のタンパク質、組換えタンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、脂質多糖類及びＤＮＡ分子、癌細胞、生ウイルス、またはハプテン分子などがあり得る。前記病原体のタンパク質は具体的に、インフルエンザウイルス抗原（ＨＡ：ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼ抗原）、百日咳菌抗原、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヘリコバクテリアピロリ抗原（ｃａｐｓｕｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  ｓｅｒｏｇｒｕｐ  Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｙ及びＷ−１３５）、破傷風菌抗原、ジフテリア菌抗原（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｏｉｄ）、肺炎菌抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ  ３  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、結核菌抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原（ＧＰ−１２０、ＧＰ−１６０）、コレラ抗原（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ）、ブドウ球菌抗原（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  Ｂ）、赤痢菌抗原（ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、水疱性口内炎ウイルス抗原（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）抗原［肝炎Ａ（ＨＡＶ），Ｂ（ＨＢＶ），Ｃ（ＨＣＶ），Ｄ（ＨＤＶ）及びＧ（ＨＧＶ）抗原：Ｌ−ＨＢｓＡｇ、Ｓ−ＨＢｓＡｇ、Ｍ−ＨＢｓＡｇ及びｐｒｅＳ抗原］、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原、ヘルペスシンプレックス抗原またはその組み合わせ（例えば、ジフテリア、百日咳菌及び破傷風菌、ＤＰＴ）などを含むことができるが、これに限定されるのではない。
【００２９】
本発明のワクチン組成物は、本発明のアジュバント及び抗原以外に追加で同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含むことができる。また、前記ワクチン組成物は、投与のために前記記載した有効成分以外に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール及びこれら成分の中で１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤成分を添加することができる。また希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形などに製剤化することができる。さらに、当分野の適正な方法で、またはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（最近版）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡに開示されている方法を用いて各疾患によってまたは成分によって好ましく製剤化することができる。
【００３０】
本発明のワクチン組成物は、非経口で投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式による。非経口投与用剤形に製剤化するためには、本発明のワクチン組成物を安定剤または緩衝剤とともに混合して溶液または懸濁液に製造してそれをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製剤化する。
本発明のワクチン組成物は、投与経路によって多様な形態に製造することができる。例えば、本発明のワクチン組成物は、注射用途に相応しい滅菌水溶液または分散液の形態に製造することができ、または凍結乾燥技術を用いてフリーズドライされた形態に製造することができる。フリーズドライされたワクチン組成物は、典型的に約４℃で維持され、補助剤を含むか含まない安定化溶液、例えば、食塩水または／及びＨＥＰＥＳによって復元することができる。
【００３１】
本発明の方法を実施するのにおいて、投与されるワクチン組成物の量に影響を及ぼす因子としては、これに限定されるのではないが、投与方式、投与頻度、治療が進行中の特定疾病、疾病の深刻性、疾病の病歴、個体が他の治療剤とともに協力治療法を進行中かどうか、及び治療が進行中の個体の年齢、身長、体重、健康、及び身体条件を含む。一般的に治療が進行中の患者の体重が増加するほど、この製剤をより多く投薬することが好ましい。
【００３２】
また、本発明は、前記ワクチン組成物を個体に投与する工程を含む相応しい良質の抗体を形成させる方法を提供する。
【００３３】
本発明の実施例で、本発明のアジュバントを使用して製剤化したワクチン組成物を用いる場合、抗原特異的抗体生産量及びＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの生成が非常に高いことが示された（図１ないし１０及び表１ないし４参照）。それで、本発明のワクチン組成物は、免疫原性を改善するため、相応しい良質の抗体を多量生産するのに効果的に用いることができる。
【００３４】
本発明の方法を実施するにおいて、本発明のワクチン組成物は、非経口投与することができ、腹腔内注射、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射によって投与することができる。また、本発明のワクチン組成物は、個体で免疫反応を刺激するのに効果的な量で投与することができる。例えば、ワクチンは、ヒトに一回ないし数回に分けて投与することができ、投与量は、１〜２５０μｇで、より好ましくは１０〜１００μｇである。
【００３５】
また、本発明は、前記ワクチン組成物をそれを必要とする個体に投与する工程を含む  Ｔｈ１免疫反応を増進させる方法を提供する。
本発明の実施例で、本発明のアジュバントを使用して製剤化したワクチン組成物を用いる場合、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの生成が非常に高いことが示された（図３、５、８及び１０、表１、２、３及び４）。ゆえに、本発明のワクチン組成物は、免疫原性を改善するため、Ｔｈ１免疫反応を増進させるのに効果的に用いることができる。
【００３６】
また、本発明は、前記アジュバント及び少なくとも一つのウイルスまたは寄生虫抗原組成物を有効成分として含む、ウイルスまたは寄生虫感染免疫治療剤を提供する。
また、本発明は、前記アジュバント及び少なくとも一つのウイルスまたは寄生虫抗原をウイルスまたは寄生虫感染治療用治療剤の製造に用いる用途を提供する。
【００３７】
本発明の実施例で、本発明のアジュバントを使用して製剤化した治療剤組成物を用いる場合、抗原特異的抗体生産量及びＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの生成が非常に高いことが示された（図１ないし１０及び表１ないし４参照）。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは、ウイルス感染及び細胞感染に対する防御に効果的であることが知られている。それで、本発明のワクチン用アジュバントと少なくとも一つのウイルスまたは寄生虫抗原を含むワクチン組成物は、ウイルスまたは寄生虫感染治療剤として効果的に用いることができる。本発明の好ましい実施例において、ウイルス性抗原は、インフルエンザウイルス抗原（ＨＡ：ヘマグルチニンまたはノイラミニダーゼ抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原（ＧＰ−１２０，ＧＰ−１６０）、水疱性口内炎ウイルス抗原（水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原、肝炎ウイルス抗原［肝炎Ａ（ＨＡＶ）、Ｂ（ＨＢＶ）、Ｃ（ＨＣＶ）、Ｄ（ＨＤＶ）及びＧ（ＨＧＶ）：Ｌ−ＨｂｓＡｇ、Ｓ−ＨｂｓＡｇ、Ｍ−ＨｂｓＡｇ、ｐｒｅＳ］、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）抗原または単純ヘルペスウイルス抗原である。
【００３８】
本発明の好ましい実施例において、前記寄生虫は、原生動物、線虫類、吸虫綱または条虫綱であるが、これに限るものではない。
【００３９】
原生動物は、好ましくは根足虫類、鞭毛虫類、繊毛虫類または胞子虫類であるが、これに限るものではない。
【００４０】
根足虫類は、赤痢アメーバと大腸アメーバを含む。鞭毛虫類は、ランブル鞭毛虫、膣トリコモナス、腸トリコモナス及びＨａｅｍｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓを含む。
【００４１】
繊毛虫類は、大腸繊毛虫を含む。条虫綱は、好ましくは三日熱マラリア原虫及び熱帯熱マラリア原虫を始めとするマラリア原虫、トキソプラズマ原虫、カリニ肺炎菌、ヒトイソスポラ、及び小形クリプトスポリジウムとＣ．ｍｕｒｉｓを始めとするクリプトスポリジウム属である。
【００４２】
線虫類は、好ましくは鞭虫、鈎虫、蟯虫、回虫または糸状虫であるが、これに限るものではない。
【００４３】
鞭虫は、好ましくはヒト鞭虫またはＴｒｉｃｈｏｃｅｐｈａｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｉｕｒｉｓであるが、これに限るものではない。しかし、犬、猫及び豚のような動物に感染する他の鞭虫を含み得る。
【００４４】
鈎虫は、好ましくはズビニ（十二指腸）鈎虫またはアメリカ鈎虫であるが、これに限るものではない。
【００４５】
蟯虫は、好ましくはヒト蟯虫またはＥｎｔｅｒｏｂｉｕｓ  ｇｒｅｇｏｒｉｉである。回虫は、好ましくは、通常豚に感染するＡ．ｓｕｕｍ及びヒトに感染するＡ．ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓである。
【００４６】
糸状虫は、好ましくはバンクロフト糸状虫、回旋糸状虫、ロア糸状虫または犬糸状虫である。
【００４７】
吸虫綱は、好ましくは二生亜綱であるが、これに限るものではない。二生亜綱は、住血吸虫または非−住血吸虫を含む。
【００４８】
住血吸虫は、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｎ及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍを含むが、これに限るものではない。
【００４９】
前記非−住血吸虫は、肥大吸虫、Ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｅｓ、Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ  ｙｏｋｏｇａｗａｉｉ、Ｇａｓｔｒｏｄｉｓｃｏｉｄｅｓ  ｈｏｍｉｎｉｓ、肝ジストマ、肝蛭及びウェステルマン肺吸虫を含むが、これに限るものではない。条虫綱は、好ましくはテニア科または裂頭条虫科であるが、これに限るものではない。
【００５０】
条虫綱は、有鈎条虫及び無鈎条虫を含む。裂頭条虫科は、広節裂頭条虫、サナダムシ（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ）、日本海裂頭条虫、太平洋裂頭条虫、カメロン裂頭条虫、ヒグマ裂頭条虫、槍形吸虫、ダリア裂頭条虫、及びＤ．ｙｏｎａｇｏｅｎｓｉｓのような頭条虫属を含む。「寄生虫抗原」は、宿主で体液性反応を誘導できる寄生虫から誘導された分子を意味する。寄生虫抗原は、表面糖タンパク質またはこれの炭水化物または脂質分子であり得る。
【００５１】
特定の寄生虫抗原について、先行技術は、多様な寄生虫抗原を開示している。特に、ＷＯ９５２６４０２Ａ１は、（ｉ）自然な状態で、内在性膜タンパクであること；（ｉｉ）寄生虫の内臓で天然的部位を有すること；（ｉｉｉ）チオール親和性媒体に結合できること；及び（ｉｖ）免疫化された動物の宿主の血清により認知されることと特徴づけられる蠕虫類の寄生虫抗原を開示している。ＷＯ９５１２６７１Ａｌは、アミノペプチダーゼ−類似活性を持つ蠕虫類の寄生虫を開示している。ＵＳ６３９９０７７は、トキソプラズマ原虫に感染した細胞培養物の分解物の中で非感染性の溶解分を開示している。ＵＳ６４１３５２１は、選択的な被供給蠕虫類に対して防御免疫性を提供し、アミノペプチダーゼ−類似活性を持つことを特徴とする、分離されて精製された抗原を開示している。ＵＳ２００７００８７０１２Ａ１は、マラリア原虫及び関連寄生虫に由来した新規のファシクリン関連粘性タンパク質（ＦＲＡＰ）を開示する。ＷＯ９４０２１６９Ａ１は、ペプスタチンに結合できる防御性後生動物の寄生虫抗原を開示している。ＵＳ４６５６２５１は、犬糸状虫の寄生虫抗原を開示している。ＵＳ４８３９２７５は、犬糸状虫の循環性寄生虫抗原を開示している。
【００５２】
前記ウイルスまたは寄生虫感染治療剤は、非経口投与することができ、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射注入方式を選択することが好ましい。非経口投与用剤形に製剤化するためには、本発明のワクチン組成物をオイルエマルジョンで製造し、それをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製剤する。本発明による有効成分の投与量は、体内で活性成分の吸収度、不活性化率、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度によって適切に選択される。
【００５３】
また、本発明は、前記アジュバント及び少なくとも一つの癌特異的抗原組成物を有効成分として含む癌の予防または治療剤を提供する。
【００５４】
本発明は、また、アジュバント及び活性成分として、少なくとも一つの癌特異性抗原の組成を含有する癌の予防または治療剤を提供する。前記癌は、好ましくは、腎細胞癌、黒色腫、慢性リンパ性白血病、肺癌、子宮頚部癌、胃癌、甲状腺癌、膵贓癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胆管（細胞）癌、肝臓癌、結腸癌、または直腸癌であるが、これに限るものではない。
【００５５】
前記「癌特異性抗原」は、正常組織よりは癌性組織で差別的に発現されるタンパク質またはその免疫学的活性分体である。多様な癌特異性抗原が、当該分野で公知されている。例えば、ｇｐｌＯＯ、ＭＡＲＴ−Ｉ及びＭＡＧＥ−Ｉは、黒色腫に特異的であることが公知された抗原である。他の癌特異性抗原としては、チロシナーゼ、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ−Ｉ、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＮＹ−ＥＳＯ−Ｉ、ＭＵＣ−Ｉ、ＳＡＲＴ−ＩまたはＳＡＲＴ−３、ＴＥＲＴ（テロメラーゼ逆転写酵素）またはＴＥＲＴに由来した部分ペプチド、ＷＴｌまたはＷＴｌに由来した部分ペプチド、サバイビン２Ｂまたはサバイビン２Ｂに由来した部分ペプチド、ｇｐ７５、ＭＤＭ２、テロメラーゼ、ａｌｐｈ−１胎児タンパク質、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、Ｇ２５０及びＮＹ−ＥＳＯ−Ｉを含むが、これに限るものではない（参照ＷＯ２００６／０７８０５９及びＷＯ２００７／０６５９５７）。
【００５６】
さらに癌関連抗原（ＣＡＡ）及びＣＡＡを鑑別する方法としては、Ｍｉｌｌｅｒ（Ｄｒｉｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，２００３年，第８巻，ｐ．３１−３８）、カワカミとローゼンベルグ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２００３年，第１６巻，ｐ．３１３）、及びＳｌｉｎｇｌｕｆｆなど（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４年，第６巻，ｐ．７３３）に開示されており、これら文献は、参照文献に含まれている。
【００５７】
同時に、本発明は、ワクチン組成物として前記アジュバントを、強力な細胞免疫反応が求められる癌治療用免疫学的治療剤の製造に用いる用途を提供する。
【００５８】
本発明の実施例で、本発明のアジュバントを使用して製剤化した免疫学的治療剤組成物を用いる場合、抗原特異的抗体生産量及びＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの生成が非常に高いことが示された（図１ないし１０及び表１ないし４参照）。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは、抗癌免疫反応に効果的なことが知られている。それで、本発明のワクチン用アジュバントと相応しい癌特異的抗原を含む免疫学的治療剤組成物は、癌予防または治療用予防または治療剤として効果的に用いることができる。
【００５９】
前記癌の予防または治療用免疫学的薬剤は、非経口投与することができ、皮下注射、静脈注射または筋肉内注射注入方式を選択することが好ましい。非経口投与用剤形に製剤化するためには、本発明のワクチン組成物をオイルエマルジョンに製造し、それをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製剤する。本発明による有効成分の投与量は、体内で活性成分の吸収度、不活性化率、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度によって適切に選択される。
【００６０】
以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明する。
【００６１】
但し、下記実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記実施例によって限定されるのではない。
＜実施例１＞Ｂ型肝炎ウイルス抗原の免疫原性の刺激
Ｂ型肝炎ウイルス抗原及び水酸化アルミニウム（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、ドイツ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ（リポペプチド）（ＥＭＣ  ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）単独、ポリＩ：Ｃ（Ｓｉｇｍａ，米国）単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫまたはポリＩ：Ｃ混合物を含む多様なアジュバントを使用してワクチンを製造し、それぞれのワクチン製剤の誘導された抗体価を比較した。
＜１−１＞ワクチンの製造及び投与
Ｂ型肝炎ウイルス全体表面抗原（Ｌ−ＨＢｓＡｇ；韓国第１０−０８３６７４５号）と前記アジュバントを混合してワクチンを製造した後、マウスに投与した。ここで、Ｌ−ＨＢｓＡｇは、Ｓ−タンパク質（ｐｒｅＳ１及びｐｒｅＳ２がない小さなタンパク質）、Ｍ−タンパク質（ｐｒｅＳ２のみを有する中間タンパク質）、及びＬ−タンパク質（ｐｒｅＳ１及びｐｒｅＳ２をすべて有する巨大タンパク質）で構成される。
具体的に、下記表１に示されたように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫまたはポリＩ：ＣまたはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃ混合物２０μｇとＬ−ＨＢｓＡｇ０．５μｇを混合してオイルエマルジョン製剤形態のワクチンを製造した後、他の剤形によって誘導された抗体価を比較した。陽性対照群として、同一な量の抗原を水酸化アルミニウムで製剤化した。ワクチンは、６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスのメスに２週間隔で３回筋肉注射した。陰性対照群は、抗原とアジュバントなしにＰＢＳ緩衝溶液のみを投与した。
【００６２】
【表１】
0005485165.tif 000003
【００６３】
＜１−２＞免疫反応分析
＜１−２−１＞ＨＢｓＡｇ（Ｓ−タンパク質）に対する抗体価
ワクチン投与前と３次ワクチン投与完了後２週目に血清を分離して抗原特異的な抗体形成をＥＬＩＳＡ法で分析して抗体価を決定した。
【００６４】
具体的に、組換えＳ−タンパク質（（株）ドゥビエル、韓国）を９６ウェルマイクロプレートに１００ｎｇ／ウェルの濃度でコーティングした後、１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。マイクロプレートを洗浄した後、各ウェルに順次に希釈した血清を入れて３７℃で２時間反応させた。２次抗体に抗マウスヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅ  Ｒａｄｉｓｈ  Ｈｅｒｏｘｉｄａｓｅ；Ｓｉｇｍａ，米国）を入れて１時間同一な条件で反応させた。ＰＢＳＴ（ツイーン２０を含んだＰＢＳ）で洗浄後、発色試薬ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）ペルオキシダーゼ基質溶液（ＫＰＬ，米国）を入れて、２０分間常温で反応させた後、ＥＬＩＳＡリーダー器を用いて４５０ｎｍでＯＤ値を測定した。抗体価は、陰性対照群のＯＤ値の３倍に該当するＯＤ値を示す抗体希釈倍数の逆数で定義した。
【００６５】
その結果、表１及び図１に示されたように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫまたはポリＩ：Ｃを用いる場合、水酸化アルミニウムを使用した時よりさらに高いＨＢＶ表面タンパク質のＳ−タンパク質に対する抗体価を誘導することができる効果を示した。特に、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃを混合して使用する場合、単独で使用したよりさらに高い抗体価を誘導することができる相乗効果を示した。Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの混合の相乗効果は、ＰｒｅＳ抗体の誘導においてさらに明確だった。Ｌ−ＨＢｓＡｇ製造において、ｐｒｅＳの量が総量の１０％以下なので、これは使用された抗原の量によるものであるといえる。０．５μｇの抗原は、マウスにおける免疫反応のためのほぼ飽和用量である。
＜１−２−２＞ｐｒｅＳに対する抗体価
抗原にｐｒｅＳ抗原（（株）ドゥビエル、韓国）を用いたことを除いて、実施例１−２−１と同一な方法で抗体価を決定した。
その結果、表１及び図２に示されたように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃを混合して使用する場合、ｐｒｅＳに対するさらに高い抗体価を誘導するのにさらに効果的だった。前記アジュバント混合物によるｐｒｅＳタンパク質の誘導は、相乗効果を有し、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独及びポリＩ：Ｃ単独によって誘導されたｐｒｅＳ抗体価の増加した値と比較して、ｐｒｅＳ抗体の４倍以上誘導した。
＜１−２−３＞誘導されたＨＢｓＡｇ抗原特異的抗体のアイソタイプ  
２次抗体にアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ（ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ｓｉｇｍａ，米国）を用いたことを除いて、実施例１−２−１と同一な方法で抗体価を決定した。また、前記抗体価を用いてＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１を計算した。
その結果、図３ａに示されたように、アイソタイプＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂは、水酸化アルミニウムで得られた値と比較して、前記アジュバント混合物によってさらに高かった。特に、ＩｇＧ２ｂの誘導は、水酸化アルミニウムと比較して２０倍以上高かった。Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃを混合して使用する場合、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の割合は、水酸化アルミニウムより１０倍高かった。特に、ＩｇＧ２ｂの生成が顕著に高く、ＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１の割合が、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１より非常に高かった（図３ｂ及び図３ｃ）。
＜実施例２＞インフルエンザウイルス抗原に対する強力なワクチンの製造
インフルエンザ抗原を対象に、水酸化アルミニウム、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、またはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの混合をアジュバントに使用してワクチンを製造し、ＨＢｓＡｇ抗体分析のためにキャプチャリング抗原としてインフルエンザウイルス抗原を使用して誘導された抗体価を測定した。
＜２−１＞試験ワクチンの製造及び投与
組換え分割ワクチン抗原（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｐｌｉｔ  Ｖａｃｃｉｎｅ；Ｋｏｒｅａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏ．，ｌｔｄ，韓国）と前記アジュバントを混合してワクチンを製造した後、マウスに投与した。ここで、前記抗原は、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）及びＢ／Ｍａｌａｙｓｉａ／２５０６／２００４を発育卵の尿膜腔内に接種して培養、精製及び不活性化して製造されたものである。
具体的に、下記表２に示されたように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ単独、ポリＩ：Ｃ単独、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの混合、または水酸化アルミニウム２０μｇと分割ワクチン抗原１．８μｇを混合してオイルエマルジョン製剤形態のワクチンを製造した後、ワクチンは、５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスのメスに３週間隔で２回筋肉注射した。ここで、陰性対照群は、ＰＢＳ緩衝溶液のみを投与し、陽性対照群は他のアジュバントなしに前記抗原のみ投与した。すべてのグループは、６匹のマウスで構成した。
【００６６】
【表２】
0005485165.tif 000004
【００６７】
＜２−２＞体液性免疫反応分析
ワクチン投与前と２次ワクチン投与完了後、２週目に血清を分離して抗原特異的な抗体形成をＥＬＩＳＡ法で分析して抗体価を決定した。
＜２−２−１＞ＨＡ抗原に対する抗体価
抗原にＨＡ抗原（Ｋｏｒｅａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｏ．，ｌｔｄ，韓国）を用いたことを除いて、実施例１−２−１と同一な方法で抗体価を決定した。
その結果、表２及び図４に示されたように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃを混合して使用する場合、単独で使用した場合及び水酸化アルミニウムを使用した場合よりさらに高いＨＡ抗原に対する抗体価を誘導することができる相乗効果を示した。
＜２−２−２＞誘導されたＨＡ抗原特異的抗体のアイソタイプ
２次抗体にアイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａを用いたことを除いて、実施例２−２−１と同一な方法で抗体価を決定した。また、前記抗体価を用いてＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１を計算した。
その結果、図５ａに示されたようにアイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａに対する抗体価を得た。前記抗体価を用いてアイソタイプの割合を計算した結果、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃを混合して使用する場合、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１が特異的に高かった（図５ｂ）。
＜実施例３＞組換えＨＢｓＡｇ（ハンセヌラ・ポリモルファ由来Ｓ−タンパク質）及び組換えｐｒｅＳタンパク質（サッカロマイセス・セレビシエ由来）に対する強力なワクチンの製造
組換えＨＢｓＡｇ及び組換えｐｒｅＳタンパク質を対象に、水酸化アルミニウム、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃをアジュバントに使用して製造されたワクチンの効果を比較した。
＜３−１＞試験ワクチンの製造及び投与
組換えＨＢｓＡｇ（（株）ドゥビエル、韓国）及び組換えｐｒｅＳタンパク質（（株）ドゥビエル、韓国）と前記アジュバントを混合してワクチンを製造した後、マウスに投与した。ここで、組換えＨＢｓＡｇは、ｐｒｅＳ抗原なしにＳ−タンパク質のみを含み、組換えｐｒｅＳタンパク質はコロイダルゴールドにコンジュケーションしてパーティクル形態に製造した。
【００６８】
具体的に、下記に記載したように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫまたはポリＩ：Ｃ及び水酸化アルミニウム２０μｇと組換えＳ−タンパク質０．５μｇ及びｐｒｅＳ抗原５μｇを混合してオイルエマルジョン製剤形態のワクチンを製造した後、各試験ワクチンは、一回用量当り組換えＳ−タンパク質０．５μｇ及びｐｒｅＳ抗原５μｇを使用して５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスのメスに２週間隔で３回筋肉注射した。
【００６９】
陰性対照群は、ＰＢＳ緩衝溶液のみを投与した。陽性対照群は、水酸化アルミニウム、Ｓ−タンパク質、及びコロイダルゴールドにコンジュケーションされた組換えｐｒｅＳ抗原を混合して投与した。実験群１は、Ｓ−タンパク質、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃと混合した後オイルエマルジョン形態に製造し、コロイダルゴールドにコンジュケーションされた組換えｐｒｅＳ抗原を混合して投与した。実験群２は、Ｓ−タンパク質とコロイダルゴールドにコンジュケーションされた組換えｐｒｅＳ抗原をＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃと混合した後オイルエマルジョン形態に製造して投与した。
＜３−２＞体液性免疫反応分析
ワクチン投与前と３次ワクチン投与完了後２週目に血清を採取し、抗原特異的な抗体形成をＥＬＩＳＡ法で分析して抗体価を決定した。
＜３−２−１＞Ｓ−タンパク質に対する抗体価
実施例１−２−１と同一な方法で、Ｓ−タンパク質に対する抗体価を決定した。
その結果、表３及び図６に示されたように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃを混合して使用した場合、水酸化アルミニウムを使用したより１０倍さらに高いＳ−タンパク質に対する抗体価を誘導した。特に、Ｓ−タンパク質とｐｒｅＳ抗原を前記アジュバントとともに混合して製剤化したワクチンが、Ｓ−タンパク質のみ前記アジュバントとともに混合して製剤化したワクチンよりさらに高い抗体価を示した。
【００７０】
【表３】
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【００７１】
＜３−２−２＞ｐｒｅＳに対する抗体価
実施例１−２−２と同一な方法でｐｒｅＳ抗原に対する抗体価を決定した。
その結果、表３及び図７に示されたように、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃを混合して使用した場合、水酸化アルミニウムを使用したよりさらに高いｐｒｅＳ抗原に対する抗体価を誘導した。特に、ＨＢｓＡｇとｐｒｅＳ抗原を前記アジュバントとともに混合してエマルジョンして製剤化したワクチンが、水酸化アルミニウムより３倍高いｐｒｅＳ抗体を効果的に誘導した。
＜３−２−３＞誘導されたＨＢｓＡｇ抗原特異的抗体のアイソタイプ
実施例１−２−３と同一な方法で抗体価を決定した後、前記抗体価を用いてＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１を計算した。
その結果、図８ａに示されたようにアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂに対する抗体価を得た。前記抗体価を用いてアイソタイプの割合を計算した結果、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫとポリＩ：Ｃを混合して使用した場合、水酸化アルミニウムを使用したよりＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１とＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧ１が高く誘導され、特に、ＨＢｓＡｇとｐｒｅＳ抗原を前記アジュバントとともに混合して製剤化したワクチンが、ｐｒｅＳ抗原のみ前記アジュバントとともに混合して製剤化したワクチンよりさらに高く示された（図８ｂ及び図８ｃ）。
＜実施例４＞多様なリポペプチドを用いたアジュバントの組成物
多様なリポペプチド類のポリＩ：Ｃとの相乗作用的免疫増強の効果を試験するために、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８またはＦＳＬ−Ｉ（線維芽細胞−刺激リポペプチド）を肝炎Ｂウイルス抗原と剤形化した。
＜４−１＞ワクチンの製造及び投与
水酸化アルミニウムに予め吸着させた肝炎Ｂウイルスの全表面抗原と前記アジュバントの成分とを混合することによってワクチンを製造し、それをマウスに投与した。実験中に、水酸化アルミニウムの吸着抗原は、より安定であり、前記水酸化アルミニウムは、リポペプチド及びポリＩ：Ｃの混合物の免疫増強に顕著な効果を奏しないことが明らかになった（データは未提示）。
【００７２】
特に、表４に示されたように、水酸化アルミニウムに吸着したＬ−ＨＢｓＡｇの０．５μｇを前記リポペプチド類またはポリＩ：Ｃの２０μｇと剤形化した（実験群１−４）。また、同量の抗原をリポペプチド及びポリＩ：Ｃの混合物と剤形化した（実験群５−７）。
【００７３】
ワクチンを６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスのメスに２週間間隔で３回筋肉内に注射した。陰性対照群は、ワクチンと抗原なしにＰＢＳのみ投与し、陽性対照群は、水酸化アルミニウムと剤形化した前記抗原を投与した。
【００７４】
【表４】
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【００７５】
＜４−２＞免疫反応の分析
ワクチンの投与前と最後のワクチン投与２週間後に血清をそれぞれのマウスから収集し、抗原特異性抗体の生成をＥＬＩＳＡで分析し、抗体価を決定した。
＜４−２−ｌ＞ＨＢｓＡｇ（Ｓ−タンパク質）に対する抗体価
実施例＜ｌ−２−ｌ＞と同一な方法で抗体価を決定した。
表４及び図９に示されたように、リポペプチド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８のような）及びポリＩ：Ｃの混合物を用いた場合、誘導された抗体価は、個別的に誘導された抗体の和よりも若干高く、これは、このような二つの成分の相乗効果を示している。
＜４−２−２＞ｐｒｅＳに対する抗体価
ｐｒｅＳ抗原（（株）ドゥビエル、韓国）を抗体捕獲の抗原として用いたことを除き、実施例＜１−２−１＞と同一な方法で抗体価を決定した。
表４及び図１０に示されたように、前記リポペプチド類の一つ及びポリＩ：Ｃを含むアジュバントの混合物は、ｐｒｅＳに対してより高い抗体価を誘導するのにさらに効果的であった。
Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫよりは、他のリポペプチド及びポリＩ：Ｃの組み合わせの使用による相乗作用が、実施例＜ｌ−２−２＞でＰａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃで示されたように、ｐｒｅＳ抗体に対してより顕著である。
＜４−２−３＞誘導されたＨＢｓＡｇ特異性抗体のアイソタイプ
ＩｇＧｌ５、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを二次抗原として用いたことを除き、実施例＜１−２−１＞と同一な方法で抗体価を決定した。また、得た抗体価を用いてＩｇＧ２ａ／ＩｇＧｌ及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧｌの割合を計算した。
図１１ａに示されたように、アイソタイプのＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの抗体価は、前記リポペプチド及びポリＩ：Ｃの組み合わせをアジュバントとして用いた場合、アジュバントとして水酸化アルミニウムで誘導された値と比較して、はるかに高かった。結論として、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧｌ及びＩｇＧ２ｂ／ＩｇＧｌの割合も、前記アジュバントの混合物を用いた場合にさらに高かった（図ｌ１ｂ、ｃ）。前記相乗効果は、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＲ８またはＦＬＳ−Ｉをリポペプチドの成分として用いた場合と類似であった。特に、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＳＫＫＫＫ及びポリＩ：Ｃの組み合わせが最も効果的であった。
【００７６】
当該分野の熟練者は、前記説明で開示された概念及び特定の実施例は、本発明の同じ目的を遂行するための他の実施例を変形して考案する基礎として容易に用いられ得ることを理解するだろう。当該分野の熟練者はまた、各同等の実施例は、添付された請求の範囲に設定されたような本発明の思想と範囲を逸脱しないことを理解するだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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