(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物を、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換することを特徴とする、光学活性アミン化合物の製造方法：
（Ａ）α−アミノ酸をアミノ基供与体とし、前記ケトン化合物に作用して前記光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ）の作用によってα−アミノ酸より生じるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨに変換する能力、または前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＰＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）をＮＡＤＰＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項２】
前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素が、それぞれ下記の（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素である、請求項１に記載の製造方法：
（Ａ’）α−アラニンをアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ’）の作用によってα−アラニンより生じるピルビン酸を乳酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ’）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ’）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項３】
前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡを別々に含有する複数の組換えベクター、もしくは前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡの全てを含有する１つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる、前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を同一形質転換体内で発現する形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項５】
前記（Ｂ）の酵素が乳酸脱水素酵素であり、前記（Ｃ）の酵素がグルコース脱水素酵素あるいはギ酸脱水素酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記（Ｂ）の酵素がＬ−乳酸脱水素酵素であり、前記（Ｃ）の酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記（Ｂ）の酵素が、ペディオコッカス・アクディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物由来の酵素である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記（Ｃ）の酵素が、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）もしくはチオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）に属する微生物由来の酵素である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、シュードモナス（Pseudomonas）属もしくはアースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物由来の酵素である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）KNK08-18株（FERM BP-10599）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KNK425株（FERM BP-6525）もしくはアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）KNK168株（FERM BP-5228）由来の酵素である、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法：
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、当該アミノ酸配列は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１２】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、下記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法：
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法：
（ｄ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、且つ当該アミノ酸配列は、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｆ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１４】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、下記（３）または（４）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法：
（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡと配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法：
（ｇ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなり、且つ当該アミノ酸配列は、配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｉ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１６】
前記（Ａ）のアミノ基転移酵素が、下記（５）または（６）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法：
（５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡと配列同一性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ケトン化合物が一般式（１）：
【化１】
0005410089.tif 000018
（式中、Ｒ１及びＲ２は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ１とＲ２の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ１とＲ２は構造が異なる。）で表され、前記対応する光学活性アミン化合物が一般式（２）：
【化２】
0005410089.tif 000019
（式中、Ｒ１及びＲ２は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記ケトン化合物が一般式（３）：
【化３】
0005410089.tif 000020
（式中、Ｒ３及びＲ４は置換されていてもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、メチル基またはカルボキシル基を示す。ｑは０〜７の整数を示し、ｒは０〜２の整数を示し、かつｑ≧ｒである。但し、Ｒ３とＲ４が同一で、かつｑ＝ｒのときは除く。また、ｑ＝０のとき、Ｒ３はカルボキシル基ではなく、ｒ＝０のとき、Ｒ４はカルボキシル基ではない。）で表され、前記対応する光学活性アミン化合物が一般式（４）：
【化４】
0005410089.tif 000021
（式中、Ｒ３、Ｒ４、ｑ及びｒは前記式（３）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
前記一般式（３）および（４）において、Ｒ４がハロゲン原子、ニトロ基、水酸基及びカルボキシル基からなる群より選ばれた置換基により置換されていてもよいメチル基かつｒが０もしくは１である、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記一般式（３）および（４）において、Ｒ４がメチル基かつｒ＝０である、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２１】
前記一般式（３）および（４）において、ｑは０〜５の整数を示し、かつＲ３が、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、シアノ基、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基及びトリフルオロメチル基からなる群より選ばれた置換基で置換されていてもよいアリール基である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２２】
前記一般式（３）および（４）において、ｑは０〜５の整数を示し、かつＲ３がメチル基、メトキシ基、エトキシ基、フェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、ピリジル基、ピラジル基からなる群より選ばれた基である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２３】
前記ケトン化合物が一般式（５）：
【化５】
0005410089.tif 000022
（式中、ｍは０〜２の整数を示し、ｎは２〜５の整数を示す（但し、ｎ＞ｍである）。Ｒ５及びＲ６は、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、水素原子、または、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、または炭素数５〜７のシクロアルキル基を示し、これらは置換基を有していてもよい。また、Ｒ５とＲ６は両者が互いに結合して、単環式もしくは多環式の炭化水素、または複素環を形成していてもよく、かつ置換基を有していてもよい。）で表され、前記対応する光学活性アミン化合物が一般式（６）：
【化６】
0005410089.tif 000023
（式中、Ｒ５、Ｒ６、ｍ及びｎは前記式（５）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２４】
前記一般式（５）および（６）において、Ｒ５とＲ６は両者が互いに結合し、置換されていてもよいベンゼン環を形成する、請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記一般式（５）および（６）において、ｍ＝１かつｎ＝２、ｍ＝０かつｎ＝３、またはｍ＝０かつｎ＝２、のいずれかの組み合わせである、請求項２３または２４に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記一般式（６）で表される光学活性アミノ化合物が、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、または１−アミノインダンである、請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記ケトン化合物が一般式（７）：
【化７】
0005410089.tif 000024
（式中、ｊおよびｋはそれぞれ１〜３の整数を示し（但し、ｋ＞＝ｊである）、Ｒ７は、水素原子、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜１５のアシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数７〜１５のアラルキル基、炭素数８〜１６のアラルキルオキシカルボニル基、又は、炭素数１〜６のアルキル基もしくは炭素数６〜１４のアリール基で置換されたスルホニル基を示す。）で表され、前記対応する光学活性アミン化合物が一般式（８）：
【化８】
0005410089.tif 000025
（式中、ｊ、ｋおよびＲ７は前記式（７）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項２８】
前記一般式（７）および（８）において、ｋ＝１かつｊ＝１、またはｋ＝２かつｊ＝１のいずれかの組み合わせである、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
前記一般式（７）および（８）において、Ｒ７が水素原子、フェニル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、メシル基、及びトシル基からなる群より選ばれる基である、請求項２７または２８に記載の製造方法。
【請求項３０】
下記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡを含む組換えベクター：
（Ａ）α−アミノ酸をアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ）の作用によって生じるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨに変換する能力、または前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＰＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）をＮＡＤＰＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項３１】
前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素が、下記の（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素である、請求項３０に記載の組換えベクター：
（Ａ’）α−アラニンをアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ’）の作用によってα−アラニンより生じるピルビン酸を乳酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ’）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ’）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）をＮＡＤＨに変換する能力を有する酵素。
【請求項３２】
前記（Ｂ）の酵素が乳酸脱水素酵素、前記（Ｃ）の酵素がグルコース脱水素酵素あるいはギ酸脱水素酵素、である、請求項３０または３１に記載の組換えベクター。
【請求項３３】
前記（Ｂ）の酵素がＬ−乳酸脱水素酵素、前記（Ｃ）の酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項３２に記載の組換えベクター。
【請求項３４】
前記（Ｂ）の酵素がペディオコッカス・アクディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物由来である、請求項３３に記載の組換えベクター。
【請求項３５】
前記（Ｃ）の酵素が、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）もしくはチオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）に属する微生物由来である、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項３６】
前記（Ａ）の酵素が、シュードモナス（Pseudomonas）属もしくはアースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物から得られる酵素である、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の組換えベクター。
【請求項３７】
前記（Ａ）の酵素が、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）KNK08-18株（FERM BP-10599）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KNK425株（FERM BP-6525）もしくはアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）KNK168株（FERM BP-5228）から得られる酵素である、請求項３６に記載の組換えベクター。
【請求項３８】
前記（Ａ）の酵素が、配列表の配列番号１、配列番号６もしくは配列番号２５に記載のポリペプチドである、請求項３７に記載の組換えベクター。
【請求項３９】
請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項４０】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項３９に記載の形質転換体。
【請求項４１】
請求項３９または４０に記載の形質転換体を培地中で培養し、当該培地中および／または形質転換体内に前記（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素を蓄積させることを特徴とする、（Ａ）〜（Ｃ）の酵素の混合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性アミン化合物の製造方法に関する。また本発明は、前記光学活性アミン化合物の製造方法において用いる組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性アミノ化合物は、各種の医薬品、農薬の合成中間体として非常に有用な化合物である。【０００３】
アミノ基転移酵素を用いた光学活性アミン化合物の製造方法、とりわけ光学活性α−アミノ酸の製造方法は数多く報告されている。アミノ基転位酵素によるアミノ化反応は可逆的な反応（平衡反応）であるため、目的のアミン化合物を高収率で得るには、反応平衡を目的アミン化合物の生成方向に偏らせる必要がある。これを実現する方法のひとつとして、副生する化合物を反応系から除去する方法があり、いくつか報告されている。【０００４】
アミノ基転移酵素を用いたα−ケト酸のアミノ化による光学活性α−アミノ酸の製造方法では、例えば、以下のような方法が挙げられる。
（１）２つのアミノ酸トランスアミナーゼを組み合わせた方法において、副生するα−ケト酸を除去することにより、反応平衡を偏らせる方法（特許文献１：国際公開第ＷＯ８７／０１７２７号パンフレット）。
（２）Ｌ−アスパラギン酸をアミノドナーとした方法において、副生するオキザロ酢酸の化学的な脱炭酸により生じるピルビン酸に、アセト乳酸シンターゼを作用させることにより、反応平衡を偏らせる方法（特許文献２：特表２００２−５１４９２１号公報）。
（３）Ｄ−アミノ酸をアミノドナーとした方法において、副生するα−ケト酸にアミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸ラセマーゼなどを作用させてアミノドナーであるＤ−アミノ酸へ変換することにより、反応平衡を偏らせる方法（特許文献３：特公平７−８５７１８号公報）。
（４）ＤＬ−アラニンをアミノドナーとした方法において、副生するピルビン酸に乳酸脱水素酵素及び高価なＮＡＤＨを作用させることにより乳酸へ変換し、反応平衡を偏らせる方法（特許文献４：国際公開第ＷＯ９１／０５８７０号パンフレット）。【０００５】
上記の方法は、Trends biotechnol., 16, 412〜418 (1998)（非特許文献１）においても記載されている。【０００６】
また、アミノ基転移酵素を用いた光学活性α−アミノ酸以外の光学活性アミン化合物の製造方法では、例えば、以下のような方法が挙げられる。
（ａ）微生物 Vibrio fluvialis の無細胞抽出液を使用し、Ｌ−アラニンをアミノドナーとしたアセトフェノンのアミノ化反応において、副生するピルビン酸に乳酸脱水素酵素及び高価なＮＡＤＨを作用させて乳酸へ変換し、反応平衡を偏らせる方法（非特許文献２：Biotechnol. Bioeng., 65(2), 206-211 (1999)）。
（ｂ）２−アミノプロパンをアミノドナーとした（Ｓ）−メトシキイソプロピルアミンの製造において、反応温度を上げることにより副生するアセトンを反応系より除去し、反応平衡を偏らせる方法（非特許文献３：Chimia, 53(12), 584-589 (1999)）。【０００７】
上記（ａ）の非特許文献２において、無細胞抽出液と乳酸脱水素酵素を共役させた反応の場合はＮＡＤＨの再生システムを必要とするが、別酵素の添加などにより反応系（反応システム）がより複雑となってしまうため、Vibrio fluvialis の生菌体を用いた反応のほうが優れている、と筆者らは結論付けている。このように当業者である本非特許文献２の筆者らは、アミノ基転移酵素、乳酸脱水素酵素及び補酵素再生システムを組み合わせた反応には否定な見解を示している。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ８７／０１７２７号パンフレット
【特許文献２】特表２００２−５１４９２１号公報
【特許文献３】特公平７−８５７１８号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ９１／０５８７０号パンフレット
【非特許文献１】Trends biotechnol., 16, 412〜418 (1998)
【非特許文献２】Biotechnol． Bioeng., 65(2), 206-211 (1999)
【非特許文献３】Chimia, 53(12) ,584-589 (1999)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、効率的な光学活性アミノ化合物の製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、該製造方法において用いる組換えベクター、該ベクターを含む形質転換体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は上記課題につき鋭意検討を行った結果、特定の性質を有するアミノ基転移酵素及び２種類の還元酵素を併用することにより、ＮＡＤＨのような高価な化合物を用いることなく、ケトン化合物から、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物を高収率で製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
〔１〕本発明の一つの特徴は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物を、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換することを特徴とする、光学活性アミン化合物の製造方法である：
（Ａ）α−アミノ酸をアミノ基供与体とし、前記ケトン化合物に作用して前記光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ）の作用によってα−アミノ酸より生じるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力、または前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＰＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）をＮＡＤＰＨに変換する能力を有する酵素。【００１１】
〔２〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素が、それぞれ下記の（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素である前記製造方法である：
（Ａ’）α−アラニンをアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ’）の作用によってα−アラニンより生じるピルビン酸を乳酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ’）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ’）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力を有する酵素。【００１２】
〔３〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）〜（Ｃ）または（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素をコードする各ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする前記製造方法である。【００１３】
〔４〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）〜（Ｃ）または（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素をコードする各ＤＮＡを別々に含有する複数の組換えベクター、もしくは前記（Ａ）〜（Ｃ）または（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素をコードする各ＤＮＡの全てを含有する１つの組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる、前記（Ａ）〜（Ｃ）または（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素を同一菌体内で発現する形質転換体および／またはその培養物を酵素源として用いることを特徴とする前記製造方法である。【００１４】
〔５〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｂ）または（Ｂ’）の酵素が乳酸脱水素酵素、前記（Ｃ）または（Ｃ’）の酵素がグルコース脱水素酵素あるいはギ酸脱水素酵素である前記製造方法である。【００１５】
〔６〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｂ）または（Ｂ’）の酵素がＬ−乳酸脱水素酵素、前記（Ｃ）または（Ｃ’）の酵素がグルコース脱水素酵素である前記製造方法である。【００１６】
〔７〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｂ）または（Ｂ’）の酵素が、ペディオコッカス・アクディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物由来の酵素である前記製造方法である。【００１７】
〔８〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｃ）または（Ｃ’）の酵素が、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）もしくはチオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）に属する微生物由来の酵素である前記製造方法である。【００１８】
〔９〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、シュードモナス（Pseudomonas）属もしくはアースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物由来の酵素である前記製造方法である。【００１９】
〔１０〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）KNK08-18株（FERM BP-10599）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KNK425株（FERM BP-6525）もしくはアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）KNK168株（FERM BP-5228）由来の酵素である前記製造方法である。【００２０】
〔１１〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドである前記製造方法である：
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００２１】
〔１２〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、下記（１）または（２）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである前記製造方法である：
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。【００２２】
〔１３〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、下記（ｄ）〜（ｆ）のいずれかに記載のポリペプチドである前記製造方法である：
（ｄ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｅ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｆ）配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００２３】
〔１４〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、下記（３）または（４）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである前記製造方法である：
（３）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（４）配列表の配列番号５に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。【００２４】
〔１５〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、下記（ｇ）〜（ｉ）のいずれかに記載のポリペプチドである前記製造方法である：
（ｇ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｈ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｉ）配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００２５】
〔１６〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）のアミノ基転移酵素が、下記（５）または（６）に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである前記製造方法である：
（５）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（６）配列表の配列番号２６に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。【００２６】
〔１７〕本発明の一つの特徴は、前記ケトン化合物が一般式（１）：【００２７】
【化９】
0005410089.tif 000002
【００２８】
（式中、Ｒ1及びＲ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ1とＲ2の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ1とＲ2は構造が異なる。）で表され、前記対応する光学活性アミノ化合物が一般式（２）：【００２９】
【化１０】
0005410089.tif 000003
【００３０】
（式中、Ｒ1及びＲ2は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される、請求項１〜１６のいずれかに記載の製造方法である。【００３１】
〔１８〕本発明の一つの特徴は、前記ケトン化合物が一般式（３）：【００３２】
【化１１】
0005410089.tif 000004
【００３３】
（式中、Ｒ3及びＲ4は置換されていてもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、メチル基またはカルボキシル基を示す。ｑは０〜７の整数を示し、ｒは０〜２の整数を示し、かつｑ≧ｒである。但し、Ｒ3とＲ4が同一で、かつｑ＝ｒのときは除く。また、ｑ＝０のとき、Ｒ3はカルボキシル基ではなく、ｒ＝０のとき、Ｒ4はカルボキシル基ではない。）で表され、前記対応する光学活性アミノ化合物が一般式（４）：【００３４】
【化１２】
0005410089.tif 000005
【００３５】
（式中、Ｒ3、Ｒ4、ｑ及びｒは前記式（３）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される前記製造方法である。【００３６】
〔１９〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（３）および（４）において、Ｒ4がハロゲン原子、ニトロ基、水酸基及びカルボキシル基からなる群より選ばれた置換基により置換されていてもよいメチル基かつｒが０もしくは１である前記製造方法である。【００３７】
〔２０〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（３）および（４）において、Ｒ4がメチル基かつｒ＝０である前記製造方法である。【００３８】
〔２１〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（３）および（４）において、ｑは０〜５の整数を示し、かつＲ3が、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、シアノ基、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基及びトリフルオロメチル基からなる群より選ばれた置換基で置換されていてもよいアリール基である前記製造方法である。【００３９】
〔２２〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（３）および（４）において、ｑは０〜５の整数を示し、かつＲ3がメチル基、メトキシ基、エトキシ基、フェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、ピリジル基、ピラジル基からなる群より選ばれた基である前記製造方法である。【００４０】
〔２３〕本発明の一つの特徴は、前記ケトン化合物が一般式（５）：【００４１】
【化１３】
0005410089.tif 000006
【００４２】
（式中、ｍは０〜２の整数を示し、ｎは２〜５の整数を示す（但し、ｎ＞ｍである）。Ｒ5及びＲ6は、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、水素原子、または、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、または炭素数５〜７のシクロアルキル基を示し、これらは置換基を有していてもよい。また、Ｒ5とＲ6は両者が互いに結合して、単環式もしくは多環式の炭化水素、または複素環を形成していてもよく、かつ置換基を有していてもよい。）で表され、前記対応する光学活性アミノ化合物が一般式（６）：【００４３】
【化１４】
0005410089.tif 000007
【００４４】
（式中、Ｒ5、Ｒ6、ｍ及びｎは前記式（５）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される前記製造方法である。【００４５】
〔２４〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（５）および（６）において、Ｒ5とＲ6は両者が互いに結合し、置換されていてもよいベンゼン環を形成する前記製造方法である。【００４６】
〔２５〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（５）および（６）において、ｍ＝１かつｎ＝２、ｍ＝０かつｎ＝３、またはｍ＝０かつｎ＝２、のいずれかの組み合わせである前記製造方法である。【００４７】
〔２６〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（６）で表される光学活性アミノ化合物が、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、または１−アミノインダンである前記製造方法である。【００４８】
〔２７〕本発明の一つの特徴は、前記ケトン化合物が一般式（７）：【００４９】
【化１５】
0005410089.tif 000008
【００５０】
（式中、ｊおよびｋはそれぞれ１〜３の整数を示し（但し、ｋ＞＝ｊである）、Ｒ7は、水素原子、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜１５のアシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数７〜１５のアラルキル基、炭素数８〜１６のアラルキルオキシカルボニル基、又は、炭素数１〜６のアルキル基もしくは炭素数６〜１４のアリール基で置換されたスルホニル基を示す。）で表され、前記対応する光学活性アミノ化合物が一般式（８）：【００５１】
【化１６】
0005410089.tif 000009
【００５２】
（式中、ｊ、ｋおよびＲ7は前記式（７）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される前記製造方法である。【００５３】
〔２８〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（７）および（８）において、ｋ＝１かつｊ＝１、またはｋ＝２かつｊ＝１のいずれかの組み合わせである前記製造方法である。【００５４】
〔２９〕本発明の一つの特徴は、前記一般式（７）および（８）において、Ｒ7が水素原子、フェニル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、メシル基、及びトシル基からなる群より選ばれる基である前記製造方法である。【００５５】
〔３０〕本発明の一つの特徴は、下記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡを含む組換えベクターである：
（Ａ）α−アミノ酸をアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ’’）の作用によって生じるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力、または前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＰＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）をＮＡＤＰＨに変換する能力を有する酵素。【００５６】
〔３１〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素が、下記の（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素である前記組換えベクターである：
（Ａ’）α−アラニンをアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ’）の作用によってα−アラニンより生じるピルビン酸を乳酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ’）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ’）の作用によって前記ＮＡＤＨから生じる酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力を有する酵素。【００５７】
〔３２〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｂ）または（Ｂ’）の酵素が乳酸脱水素酵素であり、前記（Ｃ）または（Ｃ’）の酵素がグルコース脱水素酵素あるいはギ酸脱水素酵素、である前記組換えベクターである。【００５８】
〔３３〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｂ）または（Ｂ’）の還元酵素がＬ−乳酸脱水素酵素であり、前記（Ｃ）または（Ｃ’）の還元酵素がグルコース脱水素酵素である前記組換えベクターである。【００５９】
〔３４〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｂ）または（Ｂ’）の酵素がペディオコッカス・アクディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物由来である前記組換えベクターである。【００６０】
〔３５〕本発明の一つの特徴は、前記（Ｃ）または（Ｃ’）の酵素が、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）もしくはチオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）に属する微生物由来である前記組換えベクターである。【００６１】
〔３６〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）の酵素が、シュードモナス（Pseudomonas）属もしくはアースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物から得られる酵素である前記組換えベクターである。【００６２】
〔３７〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）の酵素が、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）KNK08-18株（FERM BP-10599）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KNK425株（FERM BP-6525）もしくはアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）KNK168株（FERM BP-5228）から得られる酵素である前記組換えベクターである。【００６３】
〔３８〕本発明の一つの特徴は、前記（Ａ）または（Ａ’）の酵素が、配列表の配列番号１、配列番号６もしくは配列番号２５に記載のポリペプチドである前記組換えベクターである。【００６４】
〔３９〕本発明の一つの特徴は、前記組換えベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。【００６５】
〔４０〕本発明の一つの特徴は、前記宿主細胞が大腸菌である前記形質転換体である。【００６６】
〔４１〕本発明の一つの特徴は、前記形質転換体を培地中で培養し、当該培地中および／または形質転換体内に前記（Ａ）〜（Ｃ）または（Ａ’）〜（Ｃ’）の各酵素を蓄積させることを特徴とする、（Ａ）〜（Ｃ）または（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素の混合物の製造方法である。【００６７】
本発明のその他の特徴およびその利点は、以下の明細書の記載および図面によって明らかにされる。
【発明の効果】
【００６８】
本発明は、効率的な光学活性アミノ化合物の製造方法を提供する。また、該製造方法に用いる組換えベクター、該ベクターを有する形質転換体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】組換えプラスミドpNMTA、pNTPS及びpNTASのそれぞれの構築手順の概略図である。
【図２】組換えプラスミドpNG、pNPAG、pUCPAG及びpSTVPAGのそれぞれの構築手順の概略図である。
【図３】組換えプラスミドpNMTAPAG、pNTPSPAG及びpNTASPAGのそれぞれの構築手順の概略図である。
【図４】組換えプラスミドpNF、pNPAF、及びpNMTAPAFのそれぞれの構築手順の概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
以下、本発明を実施形態で詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。【００７１】
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００７２】
１．光学活性アミン化合物の製造方法
本発明は、下記の（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を同一反応系中で利用することにより、ケトン化合物を、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ効率的に変換し、光学活性アミン化合物を高収率で製造する方法である：
（Ａ）α−アミノ酸をアミノ基供与体とし、前記ケトン化合物に作用して前記光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ）の作用によってα−アミノ酸より得られるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ）前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＨから変換される酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力、または前記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）の作用によって前記ＮＡＤＰＨから変換される酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）をＮＡＤＰＨに変換する能力を有する酵素。【００７３】
上記アミノ基転移酵素（Ａ）は、アミノ基供与体であるα−アミノ酸のアミノ基をケトン化合物へ立体選択的に転移し、その結果、α−アミノ酸の脱アミノ体であるα−ケト酸、及びケトン化合物のアミノ化体である光学活性アミノ化合物が生成する。アミノ基転移酵素（Ａ）による該反応は一般的に可逆反応（平衡反応）である。そのため、４つの化合物、すなわちα−アミノ酸、α−ケト酸、ケトン化合物及び光学活性アミン化合物が反応系中に混在した特定の状態で反応は停止し、添加したケトン化合物のすべてが対応する光学活性アミン化合物に変換されることは無い。このため、添加したケトン化合物に対するアミン化合物のモル収率は低く、工業的生産においては生産性の面で問題となる。【００７４】
上記反応系に、生成物であるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有する上記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）を更に加えることにより、反応系中のα−ケト酸濃度を下げることができ、これにより上記のアミノ基転移反応をアミン化合物の生成方向に偏らせることが実現可能となる。【００７５】
上記のα−ケト酸還元酵素（Ｂ）によるα−ケト酸の還元反応には、補酵素であるＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨが不可欠である。ＮＡＤ+もしくはＮＡＤＰ+をＮＡＤＨもしくはＮＡＤＰＨへ変換する能力を有する上記酵素（Ｃ）を反応系に添加することにより、補酵素が再生可能となり、これにより、上記α−ケト酸還元酵素（Ｂ）によるα−ケト酸の還元反応が速やかに進行する。【００７６】
以上のように、アミノ基転移酵素（Ａ）によるアミノ化反応について、反応平衡を生成物側に偏らせるためには（Ｂ）及び（Ｃ）の両酵素の働きが不可欠である。すなわち、（Ａ）〜（Ｃ）の３つの酵素を同一反応系中で協働させて利用することにより、初めて光学活性アミン化合物を高収率で生産することが可能となり、生産性の向上が実現できる。【００７７】
本方法で製造可能な光学活性アミン化合物については、後に詳説する。【００７８】
なお、α−ケト酸還元酵素（Ｂ）がＮＡＤＨを補酵素とする場合は、酵素（Ｃ）はＮＡＤ+をＮＡＤＨへ変換する能力を有する酵素を用いる。また、α−ケト酸還元酵素（Ｂ）がＮＡＤＰＨを補酵素とする場合は、酵素（Ｃ）はＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへ変換する能力を有する酵素を用いる。【００７９】
前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素として、好ましくは下記の（Ａ’）〜（Ｃ’）の酵素である：
（Ａ’）α−アラニンをアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素、
（Ｂ’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ’）の作用によってα−アラニンより得られるピルビン酸を乳酸へ還元する能力を有し、かつ前記ケトン化合物に対して作用しないα−ケト酸還元酵素、
（Ｃ’）前記還元酵素（Ｂ’）の作用によって前記ＮＡＤＨから変換される酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力を有する酵素。【００８０】
２．反応に用いる３種類の酵素
以下に、反応に用いる上記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素について、より詳しく説明する。【００８１】
反応に用いる（Ａ）〜（Ｃ）の酵素は、微生物起源の酵素であってもよいし、動物起源の酵素であってもよいし、植物起源の酵素であっても良い。これらの酵素の純度あるいは形態については、目的とする活性を有していれば特に制限されるものではない。本発明の反応に用いる「酵素」として、例えば精製酵素、または粗酵素の形態で用いることができる。本発明の反応に用いる「酵素源」の例示として、酵素含有物、微生物培養液、培養物、菌体、培養液、酵素遺伝子が導入されることによって目的とする反応の活性を獲得した組換え微生物（形質転換体）、またはそれらの処理物など、種々の形態で用いることができる。ここで「処理物」とは、例えば、凍結乾燥品、アセトン乾燥品、摩擦物、自己消化物、超音波破砕物またはアルカリ処理物などを言い、目的とする活性が残存する限りは、本発明の反応に用いることができる。また、市販の酵素を用いても良いし、実験者が調製した酵素でも良い。【００８２】
反応に用いる（Ａ）〜（Ｃ）の酵素の形態として、好ましくは（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および／またはその培養物である。例えば、以下のようなものがあげられる。
・（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の酵素それぞれを別々の形質転換体で発現させた３つの形質転換体および／またはその培養物。
・（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のいずれか２つを発現させた形質転換体および／またはその培養物、及び残り１つの酵素を発現させた形質転換体および／またはその培養物。
・（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の酵素を同一細胞内で発現する形質転換体および／またはその培養物。【００８３】
上記のうち、より好ましくは、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の酵素を同一形質転換体内で発現する形質転換体および／またはその培養物である。【００８４】
（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の酵素を同一形質転換体内で発現する形質転換体は、例えば、前記（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡの全てを含有する１つの酵素発現ベクターを作成し、これを用いて宿主細胞を形質転換することにより得られる。または、（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡを別々に含有する複数の酵素発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによっても得られる。【００８５】
得られた形質転換体の培養は、その形質転換体が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素等を含む液体栄養培地を用いて行い得る。また、培養温度は、目的酵素の発現量により調節すれば良く、一般的には４〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃である。【００８６】
なお、形質転換方法、宿主-ベクター系、各酵素遺伝子の発現方法、酵素発現ベクターなどに関しては、後に詳説する。【００８７】
３．アミノ基転移酵素（Ａ）
以下、（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素についてそれぞれ説明する。【００８８】
アミノ基転移酵素（Ａ）は、α−アミノ酸をアミノ基供与体とし、ケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素であれば、いずれも含まれる。【００８９】
アミノ基転移酵素が、上記理化学的性質を有するか否かの判定方法について、アミノ基供与体としてアラニン、ケトン化合物としてアセトフェノンを用いた場合を例に、以下に説明する。なお、アミノ基供与体であるアラニンは、Ｄ型、Ｌ型もしくはＤＬ型のいずれを用いても良いが、評価するアミノ基転移酵素の立体選択性に応じて最適なものを選択する。【００９０】
酵素を含む溶液にアセトフェノン１％、アラニン１５％を添加し、ｐＨを７．０に調整後、３０℃で一晩攪拌する。反応後の反応液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液で１１以上に調整後、トルエンなどの溶剤を加えてよく混合し、有機層の一部を下記のキャピラリーカラムクロマトグラフィー分析条件で分析することにより、フェネチルアミンの生成を確認する。【００９１】
［キャピラリーカラムクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＲＥＳＴＥＫ社製  Ｒｔｘ−５  Ａｍｉｎｅ（３０ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ）
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：ヘリウム（１５０ｋＰａ）
カラム温度：１００℃
気化室温度：２５０℃
溶出時間：フェネチルアミン  ８．４分、アセトフェノン  ９．５分
また、フェネチルアミンの生成が認められた場合は、上記有機層に１規定塩酸を加えてよく混合し、水層の一部を下記の高速液体クロマトグラフィー分析条件で分析することにより、フェネチルアミンの光学純度を確認する。【００９２】
［高速液体クロマトグラフィー分析条件］
カラム：ダイセル化学社製ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ（＋）
検出波長：２５４ｎｍ
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（体積
比）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ。【００９３】
これら２つの分析結果より、アミノ基転移酵素が（Ａ）の上記理化学的性質を有するかどうかを容易に判定することができる。【００９４】
上記判定法において、上記アラニンを別のα−アミノ酸に変えても同様に実施可能である。また、アセトフェノンを別のケトン化合物に置き換えて実施することもできる。これらの場合、適宜他の反応条件、生成するアミン化合物の分析条件を、必要に応じて別途調整する。【００９５】
アミノ基転移酵素（Ａ）は、α−アミノ酸のアミノ基をケトン化合物に転移する生物から単離することができる。該酵素は、例えば、微生物より以下の方法で見出すことができる。微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下で、α−アミノ酸とケトン化合物とを反応させる。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの既知の方法で分析することにより、ケトン化合物に対応するアミン化合物の生成を確認すればよい。また、アミノ基転移酵素による反応が平衡反応であるため、アミン化合物のアミノ基をα−ケト酸に転移する微生物からも単離することができる。上記と同様に反応を行い、反応後にα−ケト酸がアミノ化されたα−アミノ酸の生成を確認すればよい。微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。【００９６】
アミノ基転移酵素（Ａ）の起源は限定されるものではないが、好ましくはシュードモナス（Pseudomonas）属もしくはアースロバクター（Arthrobacter）属に属する微生物である。より好ましくは、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）KNK08-18株（FERM BP-10599）、シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KNK425株（FERM BP-6525）もしくはアースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）KNK168株（FERM BP-5228）などが挙げられる。上記受託番号FERM BP-10599（後述の実施例１参照）、FERM BP-6525（実施例２参照）、FERM BP-5228（実施例３）で特定される微生物は、独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。【００９７】
アミノ基転移酵素（Ａ）は、α−アミノ酸をアミノ基供与体とし、ケトン化合物を、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有すれば、いずれでも含まれるが、好ましくは、（Ａ’）α−アラニンをアミノ基供与体とし、ケトン化合物を、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換するケトン化合物に作用して、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物へ変換する能力を有するアミノ基転移酵素である。このような酵素として、例えば、国際公開第ＷＯ００／２６３５１号パンフレットに記載されている（Ｓ）−α−フェネチルアミン−ピルビン酸トランスアミナーゼ、及び国際公開第ＷＯ９８／４８０３０号パンフレットの請求項２８や請求項２９に記載されているトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチドや同パンフレットの請求項２３に記載のＤＮＡにコードされているトランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド、などが挙げられる。【００９８】
その他には、下記（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドが挙げられる：
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／または付加したアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。【００９９】
更に、下記（１）または（２）のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが挙げられる：
（１）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（２）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。【０１００】
４．α−ケト酸還元酵素（Ｂ）
α−ケト酸還元酵素（Ｂ）は、理化学的性質として、還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）もしくは還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を補酵素とし、前記アミノ基転移酵素（Ａ）の作用によってα−アミノ酸より得られるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する能力を有し、かつアミノ基転移酵素（Ａ）の基質となるケトン化合物に対して作用しない還元酵素である。上記活性を有する還元酵素であれば、いずれを用いても良い。【０１０１】
アミノ基転移酵素（Ａ）の基質となるケトン化合物に対して作用しないとは、アミノ基転移酵素（Ａ）の基質となるケトン化合物を還元する活性が、アミノ基転移酵素（Ａ）の作用によってα−アミノ酸より得られるα−ケト酸をα−ヒドロキシ酸へ還元する活性にくらべて、大きく下回っていることを意味する。具体的には、下記の活性測定法により測定できるケトン化合物およびα−ケト酸に対する活性値を比較し、ケトン化合物に対する活性値がα−ケト酸に対する活性値の１／１００以下である場合に、ケトン化合物に対して作用しないと判断する。【０１０２】
α−ケト酸還元酵素（Ｂ）が、上記の理化学的性質を有するか否かの判定方法について、補酵素としてＮＡＤＨ、α−ケト酸としてピルビン酸を用いた場合を例にし、以下に説明する。【０１０３】
ピルビン酸に対する還元活性の値は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）にピルビン酸２０ｍＭ、ＮＡＤＨ０．２５ｍＭ及び酵素溶液０．０５ｍｌを含む３．０ｍｌの反応液中、３０℃で３分間反応させた際の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出することができる。【０１０４】
ケトン化合物に対する還元活性の値は、上記の活性測定系において、ピルビン酸の代わりにケトン化合物を添加して実施することにより測定できる。【０１０５】
これら両条件下での酵素活性を測定することにより、酵素が上記の理化学的性質を有するかどうかを容易に判定することができる。【０１０６】
上記判定法において、上記ＮＡＤＨをＮＡＤＰＨに置き換えて測定して判定を行うことも出来る。更に、上記ピルビン酸を別のα−ケト酸、例えばヒドロキシピルビン酸などに置き換えた場合、ピルビン酸還元活性以外のα−ケト酸還元活性（例えば、ヒドロキシピルビン酸還元活性）が判定される。この場合、適宜他の反応条件も必要に応じて別途調整する。【０１０７】
α−ケト酸還元酵素（Ｂ）は、α−ケト酸に対して還元活性を有する生物から単離することができる。該酵素は、例えば、微生物より以下の方法で見出すことができる。微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下でα−ケト酸と反応させる。反応後、反応液を高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどの既知の方法で分析することにより、α−ヒドロキシ酸の生成を確認すればよい。微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。【０１０８】
α−ケト酸還元酵素（Ｂ）は、α−ケト酸を還元してα−ヒドロキシ酸へ変換するが、反応生成物であるα−ヒドロキシ酸により阻害を受けにくいものを選択するのが、より好ましい。このようなα−ケト酸還元酵素としては、例えば、ラクトバシラス（Lactobacillus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属及びアクロモバクター（Achromobacter）属からなる群より選ばれた微生物より得られるα−ケト酸還元酵素が挙げられる。より詳しくは、ラクトバシラス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）及びアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans）からなる群より選ばれた微生物より得られるα−ケト酸還元酵素が挙げられる。【０１０９】
更に詳しくは、ラクトバシラス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）JCM1120、ラクトバシラス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）JCM1132、ラクトバシラス・ブレビス（Lactobacillus brevis）JCM1059、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）JCM8797、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）JCM5890、エンテロコッカス・ファエカリス（Enterococcus faecalis）JCM5803及びアクロモバクター・キシロソキシダンス・サブスピー・キシロソキシダンス（Achromobacter xylosoxidans subsp. xylosoxidans）NBRC13495より得られるα−ケト酸還元酵素が挙げられる。【０１１０】
これらの微生物は、さまざまな寄託機関より当業者が入手可能である。寄託機関としては、例えば、以下に示す機関が挙げられる。
・上記中、ＪＣＭ番号で特定される微生物：独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター
・上記中、ＮＢＲＣ番号で特定される微生物：独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門。【０１１１】
α−ケト酸還元酵素（Ｂ）として、好ましくは、（Ｂ’）還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を補酵素とし、ピルビン酸を乳酸へ還元する能力を有し、かつアミノ基転移酵素（Ａ）の基質となるケトン化合物に対して作用しない還元酵素である。【０１１２】
より好ましくはα−ケト酸還元酵素であり、例えば、Ｌ−またはＤ−乳酸脱水素酵素、Ｌ−またはＤ−ヒドロキシイソカプロン酸脱水素酵素、Ｌ−またはＤ−マンデル酸脱水素酵素などが挙げられる。更に好ましくは乳酸脱水素酵素であり、特にＬ−乳酸脱水素酵素（後述の実施例４参照）が良い。ペディオコッカス・アクディラクティシ（Pediococcus acidilactici）に属する微生物由来のＬ−乳酸脱水素酵素、更には上記のペディオコッカス・アクディラクティシ（Pediococcus acidilactici）JCM8797由来のＬ−乳酸脱水素酵素（ＰＡＬＤＨ）がより好適である（実施例４参照）。【０１１３】
５．酵素（Ｃ）について
上記酵素（Ｃ）としては、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力、または酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ+）をＮＡＤＰＨに変換する能力（以後、補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素であれば、いずれを用いても良い。【０１１４】
酵素（Ｃ）が、補酵素再生能力を有するか否かの判定方法について、補酵素としてＮＡＤＨ、還元化合物の基質としてグルコースを用いた場合を例にし、以下に説明する。【０１１５】
ＮＡＤ+からＮＡＤＨへの還元活性の値は、１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）にグルコース１００ｍＭ、ＮＡＤ+２ｍＭ及び酵素溶液０．０５ｍｌを含む３．０ｍｌの反応液中、３０℃で３分間反応させた際の波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度から算出することができる。【０１１６】
本条件下での酵素活性を測定することにより、本発明の理化学的性質、つまり補酵素再生能力を有するかどうかを容易に判定することができる。【０１１７】
上記判定法において、上記ＮＡＤ+をＮＡＤＰ+に置き換えて測定して判定を行うことも出来る。更に、上記グルコースを別の基質、例えばギ酸などに置き換えて実施することもできる。この場合、適宜他の反応条件も必要に応じて別途調整する。【０１１８】
酵素（Ｃ）は、ほとんどの生物から単離することができる。該酵素は、例えば、微生物より以下の方法で見出すことができる。微生物を適当な培地で培養し、集菌後、無細胞抽出液を調製し、上記の判定方法を実施すればよい。微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。【０１１９】
酵素（Ｃ）として、好ましくは、（Ｃ’）酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）をＮＡＤＨに変換する能力を有し、かつアミノ基転移酵素（Ａ）の基質となるケトン化合物に対して作用しない還元酵素する還元酵素である。【０１２０】
このような酵素としては、例えば、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素などが挙げられる。好適には、グルコース脱水素酵素（実施例４参照）、ギ酸脱水素酵素（実施例２８参照）が使用される。【０１２１】
ギ酸脱水素酵素としては、例えば、キャンディダ（Candida）属、クロイッケラ（Kloeckera）属、ピキア（Pichia）属、リポマイセス（Lipomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、モラキセラ（Moraxella）属、ハイホマイクロビウム（Hyphomicrobium）属、パラコッカス（Paracoccus）属、チオバシラス（Thiobacillus）属、アンシロバクター（Ancylobacter）属、などの微生物、特にチオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）から得られる酵素（実施例２８参照）が挙げられる。【０１２２】
グルコース脱水素酵素としては、例えば、バシラス（Bacillus）属などの微生物、特にバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）から得られる酵素（実施例４参照）が挙げられる。【０１２３】
６．各酵素の起源となる生物からの酵素の単離
本発明の（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素は、それぞれ上述した生物から単離される。酵素の単離は、当業者に周知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明の酵素を単離する。【０１２４】
７．各酵素の遺伝子クローニング
（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該酵素を発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該酵素が取得できれば、該酵素の起源となる生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。【０１２５】
まず、上記で単離された（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ABI492型プロテインシークエンサー（Applied Biosystems社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。【０１２６】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Visser等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、ABI373A型  DNA Sequencer（Applied Biosystems社製）等を用いて行うことができる。【０１２７】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【０１２８】
既に（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードするＤＮＡが単離され、その単離方法が報告されている場合は、その記載の方法に従って実施することにより、目的酵素のＤＮＡが取得できる。【０１２９】
このようにして得られる酵素のＤＮＡとして、例えば、アミノ基転移酵素（Ａ）では配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、（Ａ）のアミノ基転移酵素としては、例えば、配列表の配列番号２に示す塩基配列によってコードされる配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、配列表の配列番号５に示す塩基配列によってコードされる配列表の配列番号６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、などを挙げることができる。【０１３０】
以下に、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列及び配列番号２に示す塩基配列について説明する。【０１３１】
８．配列表の配列番号１のアミノ酸配列
アミノ基転移酵素（Ａ）の一つとして、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げたが、この他に、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個（例えば、６０個、好ましくは２０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、さらに好ましくは５個、４個、３個、または２個以下）のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、アミノ基転移酵素（Ａ）の上記「３．アミノ基転移酵素（Ａ）」の項目で説明した理化学的性質を有するポリペプチドであってもよい。【０１３２】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、アミノ基転移酵素（Ａ）の活性を有する限り上記ポリペプチドに包含される。【０１３３】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素ついて、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、前述した他の微生物由来のアミノ基転移酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。【０１３４】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。【０１３５】
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。
（第１群：中性非極性アミノ酸）Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Pro, Phe 
（第２群：中性極性アミノ酸）Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr
（第３群：酸性アミノ酸）Glu, Asp
（第４群：塩基性アミノ酸）His, Lys, Arg。【０１３６】
置換、挿入、欠失及び／または付加されるアミノ酸の数としては、改変後のポリペプチドがアミノ基転移酵素（Ａ）の活性を有する限り、特に制限されないが、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と、配列同一性が８５％以上であることが好ましい。配列同一性９０％以上がより好ましく、９５％以上が更に好ましく、９９％以上がより最も好ましい。配列同一性は、前記の高度保存領域の確認と同様にして、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と改変されたアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除し、さらに１００を乗じた値で表される。【０１３７】
アミノ基転移酵素（Ａ）の活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、アミノ基転移酵素（Ａ）の上記活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。【０１３８】
配列表の配列番号６のアミノ酸配列および配列表の配列番号２５に記載のアミノ酸配列、に対しても上記のことが適用される。なお、配列番号２５のアミノ酸配列で特定されるタンパク質、およびそのタンパク質の由来となる微生物およびその菌学的性質は、国際公開第ＷＯ９８／４８０３０号パンフレットに記載されている。【０１３９】
９．配列表の配列番号２の塩基配列
アミノ基転移酵素（Ａ）をコードするＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡ、又は、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡをあげることができる。【０１４０】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。【０１４１】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。【０１４２】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。【０１４３】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、アミノ基転移酵素（Ａ）の活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。【０１４４】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。【０１４５】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG Wisconsin Package（Program Manual for The Wisconsin Package, Version8, 1994年9月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medison, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England）、及び、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland）。【０１４６】
配列表の配列番号５の塩基配列、および配列表の配列番号２６に記載の塩基配列、に対しても上記のことが適用される。なお、配列番号２５のアミノ酸配列で特定されるタンパク質、およびそのタンパク質の由来となる微生物およびその菌学的性質は、国際公開第ＷＯ９８／４８０３０号パンフレットに記載されている。【０１４７】
１０．宿主−ベクター系
（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することにより酵素発現ベクターが作成できる。また、この酵素発現ベクターで宿主生物を形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素を発現させることができる。【０１４８】
（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素を同一生物内で発現する形質転換体を得る場合は、（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素をコードするポリヌクレオチドをひとつの発現ベクターに挿入して作成した酵素発現ベクターにより、宿主生物を形質転換すればよい。また、不和合性を避けるために複製起源の異なる複数のベクターに別々にポリヌクレオチドを挿入した複数の酵素発現ベクターを作成し、これらで宿主生物を形質転換しても得られる。更に、これら両方、もしくは、（Ａ）〜（Ｃ）の各酵素をコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入する方法なども利用できる。【０１４９】
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【０１５０】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例１参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（国際公開第ＷＯ９４／０３６１３号パンフレット）などが挙げられる。【０１５１】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【０１５２】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【０１５３】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学」（共立出版、１９８７）などに詳細に記述されている。【０１５４】
各酵素を発現させるために用いる宿主生物は、各酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、及びラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Rhodococcus)属及びストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、及びキャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、及びトリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature315,592-594(1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。【０１５５】
本発明のＤＮＡを含む酵素発現ベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のE. coli HB101コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。【０１５６】
１１．合成可能な光学活性アミン化合物
以下に、本発明により合成できる光学活性アミン化合物及びその合成原料であるケトン化合物について説明する。【０１５７】
本発明の製造方法により、下記一般式（１）：【０１５８】
【化１７】
0005410089.tif 000010
【０１５９】
（式中、Ｒ1及びＲ2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアラルキル基もしくは置換されていてもよいアリール基を示し、Ｒ1とＲ2の両者が互いに結合して環を形成していてもよい。但し、Ｒ1とＲ2は構造が異なる。）で表されるケトン化合物より、対応する光学活性アミン化合物である下記一般式（２）：【０１６０】
【化１８】
0005410089.tif 000011
【０１６１】
（式中、Ｒ1及びＲ2は前記式（１）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）が製造できる。【０１６２】
一般式（１）および（２）において、Ｒ1および/またはＲ2が、カルボキシル基ではない場合が好ましい。【０１６３】
例えば、下記一般式（３）：【０１６４】
【化１９】
0005410089.tif 000012
【０１６５】
（式中、Ｒ3及びＲ4は置換されていてもよい、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数２〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、炭素数５〜７のシクロアルキル基、メチル基またはカルボキシル基を示す。ｑは０〜７の整数を示し、ｒは０〜２の整数を示し、かつｑ≧ｒである。但し、Ｒ3とＲ4が同一で、かつｑ＝ｒのときは除く。また、ｑ＝０のとき、Ｒ3はカルボキシル基ではなく、ｒ＝０のとき、Ｒ4はカルボキシル基ではない。）で表されるケトン化合物より、下記一般式（４）：【０１６６】
【化２０】
0005410089.tif 000013
【０１６７】
（式中、Ｒ3、Ｒ4、ｑ及びｒは前記式（３）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される光学活性アミン化合物を製造することである。【０１６８】
一般式（３）および（４）において、Ｒ4がハロゲン原子、ニトロ基、水酸基及びカルボキシル基からなる群より選ばれた置換基により置換されていてもよいメチル基、ｒが０もしくは１の場合が好ましい。ハロゲン原子としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子などが挙げられる。より好ましくは、Ｒ4がメチル基かつｒ＝０の場合である。【０１６９】
また、一般式（３）および（４）において、ｑが０〜５の整数であり、かつＲ3が、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、シアノ基、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基及びトリフルオロメチル基からなる群より選ばれた置換基で置換されていてもよいアリール基の場合が好ましい。より好ましくは、ｑが０〜５の整数であり、かつＲ3がメチル基、メトキシ基、エトキシ基、フェニル基、２−クロロフェニル基、３−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基、２−メトキシフェニル基、３−メトキシフェニル基、４−メトキシフェニル基、３，４−ジメトキシフェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、ピリジル基、ピラジル基からなる群より選ばれた基の場合である。【０１７０】
上記光学活性アミン化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−フェニル−１−アミノエタン、２−アミノ−３−フェニルプロパン、２−アミノ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロパン、２−アミノ−３−（４−メトキシフェニル）プロパン、２−アミノ−４−フェニルブタン、２−アミノへキサン、２−アミノ−１−フェニルオキシプロパン、２−アミノブタン酸ベンジルエステルなどが挙げられる。【０１７１】
また、下記一般式（５）：【０１７２】
【化２１】
0005410089.tif 000014
【０１７３】
（式中、ｍは０〜２の整数を示し、ｎは２〜５の整数を示す（但し、ｎ＞ｍである）。Ｒ5及びＲ6は、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、水素原子、または、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数６〜１４のアリールオキシ基、炭素数４〜１４のヘテロアリールオキシ基、炭素数１〜５のアルキル基、炭素数１〜５のアルコキシ基、炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基、炭素数３〜５の分岐鎖アルキル基、炭素数２〜５のアルケニル基、炭素数２〜５のアルキニル基、または炭素数５〜７のシクロアルキル基を示し、これらは置換基を有していてもよい。また、Ｒ5とＲ6は両者が互いに結合して、単環式もしくは多環式の炭化水素、または単環式もしくは多環式の複素環を形成していてもよく、かつ置換基を有していてもよい。）で表されるケトン化合物より、下記一般式（６）：【０１７４】
【化２２】
0005410089.tif 000015
【０１７５】
（式中、Ｒ5、Ｒ6、ｍ及びｎは前記式（５）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される光学活性アミン化合物を製造することができる。【０１７６】
一般式（５）および（６）において、Ｒ5とＲ6は両者が互いに結合し、置換されていてもよい単環式もしくは多環式の炭化水素、または単環式もしくは多環式の複素環を形成していても良い。単環性の炭化水素としては、例えば、脂環式炭化水素であるシクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環など、また芳香族炭化水素であるベンゼン環などが挙げられる。多環性の炭化水素としては、例えば、ナフタレン環、インデン環などが挙げられる。また、単環性の複素環としては、例えば、フラン環、チオフェン環、ピロール環、ピラン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環などが挙げられる。多環性の複素環としては、例えば、インドール環、キノリン環、インドリン環などが挙げられる。これらの置換基としては、例えば、ハロゲン原子、ニトロ基、水酸基、炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜３のアルコキシ基及びトリフルオロメチル基などが挙げられる。このうち、Ｒ5とＲ6は両者が互いに結合して、置換されていてもよいベンゼン環を形成する場合が好ましい。この場合の置換基は、前記と同じである。【０１７７】
また、一般式（５）および（６）において、ｍ＝１かつｎ＝２、ｍ＝０かつｎ＝３、またはｍ＝０かつｎ＝２、のいずれかの組み合わせの場合が好ましい。【０１７８】
上記光学活性アミン化合物の具体的な化合物としては、例えば、１−アミノテトラリン、２−アミノテトラリン、５−メトキシ−２−アミノテトラリン、６−メトキシ−２−アミノテトラリン、７−メトキシ−２−アミノテトラリン、８−メトキシ−２−アミノテトラリン、または１−アミノインダンなどが挙げられる。【０１７９】
また、下記一般式（７）：【０１８０】
【化２３】
0005410089.tif 000016
【０１８１】
（式中、ｊおよびｋはそれぞれ１〜３の整数を示し（但し、ｋ≧ｊである）、Ｒ7は、水素原子、炭素数６〜１４のアリール基、炭素数４〜１４のヘテロアリール基、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、炭素数２〜１５のアシル基、炭素数１〜６のアルコキシカルボニル基、炭素数７〜１５のアラルキル基、炭素数８〜１６のアラルキルオキシカルボニル基、又は、炭素数１〜６のアルキル基もしくは炭素数６〜１４のアリール基で置換されたスルホニル基を示す。）で表されるケトン化合物より、下記一般式（８）：【０１８２】
【化２４】
0005410089.tif 000017
【０１８３】
（式中、ｊ、ｋおよびＲ7は前記式（７）と同じ。＊は不斉炭素原子を示す。）で表される光学活性アミン化合物を合成することができる。【０１８４】
一般式（７）および（８）において、ｋ＝１かつｊ＝１、またはｋ＝２かつｊ＝１のいずれかの組み合わせである場合が好ましい。【０１８５】
また、一般式（７）および（８）において、Ｒ7が水素原子、フェニル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、メトキシカルボニル基、メシル基、及びトシル基からなる群より選ばれる基である場合が好ましい。【０１８６】
上記光学活性アミン化合物の具体的な化合物としては、例えば、Ｎ−ベンジル−３−アミノピロリジン、Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジン、Ｎ−ベンジル−３−アミノピペリジン、Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンなどが挙げられる。【０１８７】
１２．（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を用いたアミノ化反応
（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を用いて、ケトン化合物をアミノ化することにより、アミノ基が結合する炭素原子が不斉点である対応する光学活性アミン化合物を製造する場合、以下のように実施されうる。但し、以下の方法により限定されるわけではない。【０１８８】
適当な溶媒、例えば水や緩衝液中に、基質であるケトン化合物、アミノ基転移酵素（Ａ）のアミノ基供与体となるα−アミノ酸、α−ケト酸還元酵素（Ｂ）がα−ケト酸を還元するのに必要な補酵素、酵素（Ｃ）がＮＡＤ+をＮＡＤＨへ、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへ還元するのに必要な基質、及び（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。【０１８９】
アミノ基転移酵素（Ａ）のアミノ基供与体となるα−アミノ酸は、アミノ基転移酵素（Ａ）がアミノ基供与体として用いるものであればいずれも含まれる。このうちα−アラニンが、得られる光学活性アミン化合物の収率が高くなり、好ましい。反応系へは、ケトン化合物の１．０等量以上添加すれば良い。【０１９０】
α−ケト酸還元酵素（Ｂ）がα−ケト酸を還元するのに必要な補酵素の種類は、その酵素（Ｂ）の補酵素依存性により決定する。ＮＡＤＨを補酵素とするものではＮＡＤＨもしくはＮＡＤ+を、ＮＡＤＰＨを補酵素とするものではＮＡＤＰＨもしくはＮＡＤＰ+を添加する。また、両種類の補酵素を添加しても問題はない。酵素（Ｃ）の補酵素再生能力により、反応系中の補酵素は常に酸化型から還元型に変換される。そのため、反応系に添加すべき補酵素は還元型、酸化型のいずれでも良く、かつその添加量は非常に少なくて良い。反応系への添加量は、基質であるケトン化合物に対して０．０１等量以下、好ましくは０．００１等量以下、より好ましくは０．０００５等量以下である。【０１９１】
酵素（Ｃ）がＮＡＤ+をＮＡＤＨへ、ＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨへ還元するのに必要な基質としては、例えば、酵素（Ｃ）としてグルコース脱水素酵素を用いる場合ではグルコース、ギ酸脱水素酵素を用いる場合ではギ酸、が挙げられる。これらは、ケトン化合物の１．０等量以上添加すればよい。【０１９２】
反応に添加する（Ａ）〜（Ｃ）の形態は、精製酵素、粗酵素、酵素含有物、微生物培養液、培養物、菌体、培養液、酵素遺伝子が導入されることによって目的とする反応の活性を獲得した組換え微生物（形質転換体）およびそれらの処理物、市販の酵素など、それぞれ目的の活性を有するものであればいずれの形態のものを用いても良い。このうち、酵素が容易に多量に入手できる、（Ａ）〜（Ｃ）の酵素をコードする各ＤＮＡを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換体および／またはその培養物、例えば、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の酵素それぞれを別々の形質転換体で発現させた３つの形質転換体および／またはその培養物、（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）のいずれか２つを発現させた形質転換体および／またはその培養物、及び残り１つの酵素を発現させた形質転換体および／またはその培養物、及び（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の酵素を同一菌体内で発現する形質転換体および／またはその培養物、などが好適に使用できる。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）の酵素を同一菌体内で発現する形質転換体および／またはその培養物を用いれば、ケトンから光学活性アミンへの変換速度が他に比べて速く、時間当たりのアミンの生産性が高く、より好ましい。【０１９３】
上記の（Ａ）〜（Ｃ）の酵素を用いたアミノ化反応は、５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中、反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８に維持する。反応温度、反応ｐＨ共に、使用する酵素、基質などにより適時決定すればよい。【０１９４】
反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ式の場合は、基質であるケトン化合物は０．０１〜５０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．１〜３０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５〜３０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で適時追加添加しても良い。【０１９５】
反応液からの光学活性アミン化合物の採取方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、塩化メチレン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば、高純度の光学活性アミン化合物が容易に得られる。
【実施例】
【０１９６】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、以下の記載において、「％」は特に断らない限り、「重量％」を意味する。【０１９７】
（実施例１）  シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）KNK08-18（FERM BP-10599）由来アミノ基転移酵素ＭＴＡの精製、構造遺伝子のクローニング及び組換えベクター（pNMTA）の構築
（Ｓ）−α−フェネチルアミンをアミノドナーとして１−ベンジル−３−ピロリジノンをアミノ化する微生物として、シュードモナス・フルオレッセンス  KNK08-18（FERM BP-10599）を土壌より分離した。この受託番号FERM BP-10599で特定される微生物は、独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。上記の反応を触媒するアミノ基転移酵素の酵素精製、その構造遺伝子のクローニング、及び構造遺伝子を含む組換えベクターの構築を行った。なお、本酵素を今後ＭＴＡと称する。このＭＴＡは、本発明の「アミノ基転移酵素（Ａ）」の一実施例である。【０１９８】
（精製工程における活性測定方法）
精製酵素液０．１ｍＬを、下記組成を有する基質溶液０．９ｍｌに添加し、３０℃で１時間反応させた。３Ｎ塩酸を０．１ｍｌ添加して反応を停止させ、生成した１−ベンジル−３−アミノピロリジンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した。この値より活性値を算出した。【０１９９】
［基質溶液組成］
（Ｓ）−α−フェネチルアミン            ２８．３ｍＭ
１−ベンジル−３−ピロリジノン          ２８．３ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．０２ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）        ０．１Ｍ。【０２００】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ  (日本分光社製)
溶離液：蒸留水１２６０ｍＬ／アセトニトリル７４０ｍＬ／
ＫＨ2ＰＯ4  １０ｇ／ＳＤＳ  ２．８８ｇ（ｐＨ３．６）
流速：１ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ
カラム温度：４０℃。【０２０１】
（アミノ基転移酵素ＭＴＡの精製取得）
上記シュードモナス・フルオレッセンス  KNK08-18（FERM BP-10599）を５００ｍＬ容坂口フラスコ中５０ｍＬのＳ１７培地（組成：５ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、５ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、０．１６ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１８ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０１２ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０２ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｇ／Ｌ  グリセリン、１０ｇ／Ｌ  イーストエキス（日本製薬社製）、５００ｍｇ／Ｌ  （Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリン（ｐＨ７．２））に植菌し、３０℃で１日培養し、前培養液を得た。次に、５リットル容ミニジャー中３．０Ｌの培地（前記と同組成）に、得られた前培養液を植菌し、通気量０．６ｖｖｍ、撹拌回転数４００ｒｐｍ条件下、３０℃で２８時間培養した。ついで、遠心分離により培養液から菌体を集め、０．０１％２−メルカプトエタノール、および、０．０２ｍＭピリドキサルリン酸を含む０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。得られた懸濁液を超音波破砕により破砕した。次に、該破砕物中の固形物を遠心分離により除去し、無細胞抽出液を調製した。【０２０２】
得られた無細胞抽出液に硫酸プロタミンを添加し、核酸を除去した。得られた硫酸プロタミン処理液に３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させ、ついで生じた沈殿を遠心分離により除去した。この上清に６０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、これを溶解させて、ついで遠心分離により生じた沈殿を回収した。【０２０３】
この沈殿を０．０１％２−メルカプトエタノール、２０ｍＭ  ピリドキサルリン酸、０．１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解させ、さらに同緩衝液に対して透析を行なった。これを、同じ緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（３００ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから０．３Ｍまで）により活性画分を溶出させた。【０２０４】
溶出させた活性画分を集めて、これに、終濃度１．２Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解し、１．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．０１％２−メルカプトエタノール、２０ｍＭピリドキサルリン酸、０．１ｍＭＰＭＳＦを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（１２０ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１．２Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、０．０１％２−メルカプトエタノール、２０ｍＭピリドキサルリン酸、０．１ｍＭＰＭＳＦを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析を行なった。【０２０５】
上記で得られた粗酵素液を０．０１％２−メルカプトエタノール、２０ｍＭピリドキサルリン酸、０．１ｍＭＰＭＳＦを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化させたQ-sepharose 16/10HPカラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、塩化ナトリウムのリニアグラジエント（０Ｍから０．７Ｍまで）により活性画分を溶出させた。【０２０６】
溶出させた活性画分を集めて、これに、終濃度１．０Ｍとなるように硫酸アンモニウムを溶解し、１．０Ｍ硫酸アンモニウム、０．０１％２−メルカプトエタノール、２０ｍＭピリドキサルリン酸、０．１ｍＭＰＭＳＦを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したButyl-TOYOPEARL 650S（東ソー株式会社製）カラム（２５ｍＬ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（１．０Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させた。得られた活性粗酵素液を限外ろ過にて濃縮した。【０２０７】
濃縮した粗酵素液を、０．０１％２−メルカプトエタノール、２０ｍＭピリドキサルリン酸、０．１ｍＭＰＭＳＦ、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化させたHi LOAD 16/60 Superdex200p/gカラム（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）に供し、電気泳動的に単一な精製酵素標品を得た。【０２０８】
（ＭＴＡ構造遺伝子の塩基配列決定）
上記で得られた精製ＭＴＡのＮ末端アミノ酸配列をABI492型プロテインシーケンサー（Applied Biosystems社）により決定した。また、上記で得られた精製ＭＴＡを８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＮ末端アミノ酸配列と同様の方法で決定した。このアミノ酸配列から予想される塩基配列を考慮し、ＭＴＡ遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１（配列表の配列番号３）、および、プライマー２（配列表の配列番号４）を合成した。【０２０９】
上記シュードモナス・フルオレッセンス  KNK08-18（FERM BP-10599）の培養液から、Murray等の方法（Nucl. Acids Res., 8, 4321, 1980）に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型に、上記で合成したプライマー１および２を用いてＰＣＲを行った。その結果、ＭＴＡ遺伝子の一部と考えられる約５４０ｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【０２１０】
このＤＮＡ断片を、プラスミドpT7Blue T-Vector（Novagen社製）にクローニングし、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）およびABI 310 DNA Sequencer（Applied Biosystems社製）を用いてその塩基配列を決定した。【０２１１】
シュードモナス・フルオレッセンスKNK08-18の染色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＦｂａＩ、ＮｃｏＩまたはＳｐｈＩを用いて完全消化し、得られた消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）を用いて各々分子内環化させた。これを鋳型として用い、上記で判明したＭＴＡ遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、染色体ＤＮＡ上のＭＴＡ遺伝子の全塩基配列を決定した。ＰＣＲは、TaKaRa LA Taq with GC buffer（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。決定した塩基配列を配列表の配列番号５に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号６に示した。【０２１２】
（ＭＴＡ構造遺伝子を含む組換えベクターの作製）
上記で決定した塩基配列に基づき、ＭＴＡ構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点を付加したプライマー３（配列表の配列番号７）と、ＭＴＡ遺伝子の終止コドンの直後にＥｃｏＲＩ切断点を付加したプライマー４（配列表の配列番号８）とを合成した。先に得たシュードモナス・フルオレッセンス  KNK08-18の染色体ＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＭＴＡ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点を付加し、かつ終止コドンの直後にＥｃｏＲＩ切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、TaKaRa LA Taq with GC buffer（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドpUCN18（ＰＣＲ法によりpUC18（タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩ切断点を破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩ切断点を導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ切断点とＥｃｏＲＩ切断点の間に挿入し、組換えベクターｐＮＭＴＡを得た。組換えベクターｐＮＭＴＡの構築手順を図１に簡単に示す。
【０２１３】
（実施例２）  シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KNK425（FERM BP-6525）由来アミノ基転移酵素ＴＰＳの構造遺伝子のクローニング及び組換えベクター（pNTPS）の構築
国際公開第ＷＯ００／２６３５１号パンフレットに記載のシュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.）KNK425（FERM BP-6525）由来のアミノ基転移酵素である（Ｓ）−α−フェネチルアミン：ピルビン酸トランスアミナーゼについて、その構造遺伝子をクローニングした。更に、本構造遺伝子を含む組換えベクターも構築した。なお、本酵素を今後ＴＰＳと称する。このＴＰＳは、本発明の「アミノ基転移酵素（Ａ）」の一実施例である。上記受託番号FERM BP-6525で特定される微生物は、独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。【０２１４】
（ＴＰＳ構造遺伝子の塩基配列決定）
国際公開第ＷＯ００／２６３５１号パンフレットの配列番号１には、ＴＰＳのＮ末端アミノ酸配列が記載されている。これを元にｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ用のプライマー５（配列表の配列番号９）、および、プライマー６（配列表の配列番号１０）を合成した。【０２１５】
上記シュードモナス・エスピー  KNK425の培養液から、Murray等の方法（Nucl. Acids Res., 8, 4321, 1980）に記載の方法に従って染色体ＤＮＡを抽出した。これを、制限酵素ＡａｔＩ、ＡｐａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｐｈＩ、ＸｈｏＩまたはＮｓｐＶを用いて完全消化し、得られた消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）を用いて各々分子内環化させた。これを鋳型として用い、上記のプライマー５およびプライマー６を用いたｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法により、染色体ＤＮＡ上のＴＰＳ構造遺伝子の一部の塩基配列を決定した。なお、ＰＣＲは、TaKaRa LA Taq with GC buffer（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）およびABI 310 DNA Sequencer（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を解読した。【０２１６】
更に、上記で調製した、染色体ＤＮＡをＡｐａＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩまたはＮｓｐＶを用いて完全消化後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）により各々分子内環化させた環化ＤＮＡを鋳型として用い、上記で判明したＴＰＳ遺伝子の部分塩基配列情報をもとに、ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法により、染色体ＤＮＡ上のＴＰＳ遺伝子の全塩基配列を決定した。ＰＣＲ、塩基配列は上記の方法と同様である。決定した塩基配列を配列表の配列番号２に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示した。【０２１７】
（ＴＰＳ構造遺伝子を含む組換えベクターの作製）
上記で決定した塩基配列に基づき、ＴＰＳ構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点を付加したプライマー７（配列表の配列番号１１）と、ＴＰＳ構造遺伝子の終止コドンの直後に終止コドンＴＡＡ及びＳａｃＩ切断点を付加したプライマー８（配列表の配列番号１２）とを合成した。先に得たシュードモナス・エスピー  KNK425の染色体ＤＮＡを鋳型とし、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＴＰＳ構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点を付加し、かつ終止コドンの直後に終止コドンＴＡＡ及びＳａｃＩで切断点を付加した二本鎖ＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化し、プラスミドpUCN18（ＰＣＲ法によりpUC18（タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩ切断点を破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩ切断点を導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ切断点とＳａｃＩ切断点の間に挿入し、組換えベクターｐＮＴＰＳを得た。組換えベクターｐＮＴＰＳの構築手順を図１に簡単に示す。
【０２１８】
（実施例３）  アースロバクター・エスピー（Arthrobacter sp.）KNK168（FERM BP-5228）由来アミノ基転移酵素ＴＡＳの構造遺伝子を含む組換えベクター（pNTAS）の構築
国際公開第ＷＯ９８／４８０３０号パンフレットの配列番号２に記載の塩基配列のＤＮＡがコードするアミノ基転移活性を有するポリペプチドについて、このポリペプチドを効率的に発現させるために、新たに組換えベクターを構築した。なお、本アミノ基転移活性を有するポリペプチドを今後ＴＡＳと称する。このＴＡＳは、本発明の「アミノ基転移酵素（Ａ）」の一実施例である。上記受託番号BP-5228で特定される微生物は、独立法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（〒305-8566  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託されている。【０２１９】
（ＴＡＳ構造遺伝子を含む組換えベクターの作製）
国際公開第ＷＯ９８／４８０３０号パンフレットの配列番号２に記載された塩基配列に基づき、ＴＡＳ構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点を付加したプライマー９（配列表の配列番号１３）と、ＴＡＳ構造遺伝子の終止コドンの直後に終止コドンＴＡＡ及びＳａｃＩ切断点を付加し、かつ３塩基に対してサイレント変異を導入してＳａｃＩサイトを破壊したプライマー１０（配列表の配列番号１４）とを合成した。国際公開第ＷＯ９８／４８０３０号パンフレットに記載の方法で得られたプラスミドpAT28を鋳型とし、これらのプライマーを用いてＰＣＲを行った。これによりＴＡＳ構造遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点を付加し、かつ終止コドンの直後に終止コドンＴＡＡ及びＳａｃＩ切断点を付加し、かつ３塩基に対してサイレント変異を導入した二本鎖ＤＮＡを取得した。ＰＣＲは、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化し、プラスミドpUCN18（ＰＣＲ法によりpUC18（タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩ切断点を破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩ切断点を導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ切断点とＳａｃＩ切断点の間に挿入し、組換えベクターpNTASを得た。組換えベクターpNTASの構築手順を図１に簡単に示す。ベクターpNTASに導入したＴＡＳ構造遺伝子の塩基配列を、配列表の配列番号２５に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列、つまりＴＡＳのアミノ酸配列を、配列表の配列番号２６に示した。
【０２２０】
（実施例４）ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）JCM8797株由来Ｌ−乳酸脱水素酵素ＰＡＬＤＨの構造遺伝子及びバシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）IAM1030株由来のグルコース脱水素酵素ＧＤＨの構造遺伝子、の両遺伝子を含む３種類の組換えベクター（pNPAG、pUCPAG及びpSTVPAG）の構築
（４−１．グルコース脱水素酵素遺伝子を含む発現ベクター（pNG）の構築）
プライマー１１（配列表の配列番号１５）とプライマー１２（配列表の配列番号１６）を用い、ベクターpGDK1（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）IAM1030株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌＩ切断点が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。このＧＤＨは、本発明の「酵素（Ｃ）」の一実施例である。【０２２１】
得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、プラスミドpUCN18（ＰＣＲ法によりpUC18（タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩ切断点を破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩ切断点を導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＥｃｏＲＩ切断点とＳａｌＩ切断点の間に挿入し、組換えベクターpNGを構築した。【０２２２】
（４−２．ペディオコッカス・アシディラクティシ  JCM8797株からのＬ−乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニング）
ペディオコッカス・アシディラクティシ  JCM8797株より、α−ケト酸還元酵素の一つであるＬ−乳酸脱水素酵素（以下ＰＡＬＤＨと略す）の遺伝子を、以下の方法でクローニングした。このペディオコッカス・アシディラクティシ  JCM8797株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（〒305-0074 茨城県つくば市高野台3丁目1番地の1）より当業者が入手可能である。このＰＡＬＤＨは、本発明の「α−ケト酸元酵素（Ｂ）」の一実施例である。【０２２３】
遺伝子データバンクに登録されている既知のＬ−乳酸脱水素酵素の推定アミノ酸配列情報をもとに、ＰＡＬＤＨをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１３（配列表の配列番号１７）およびプライマー１４（配列表の配列番号１８）を合成した。【０２２４】
市販のキットであるUltraClean Microbiol DNA Isolation kit（MO BIO社製）を用いて、その取り扱い説明書に従って実施することにより、ペディオコッカス・アシディラクティシ  JCM8797株の染色体ＤＮＡを調製した。上記で調製したＤＮＡプライマー１３および１４を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．３ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、ベクターpT7Blue T-Vector（Novagen社製）にクローニングし、BigDye Terminator Sequencing Standard Kit（Applied Biosystems社製）およびABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いてその塩基配列を解析した。
【０２２５】
上記で調製したペディオコッカス・アシディラクティシ  JCM8797株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＦｂａＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号１９に示した。Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号１９に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号２０に示した。【０２２６】
（４−３．ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＧＤＨ構造遺伝子を含む発現ベクターpNPAGの構築）
プライマー１５（配列表の配列番号２１）とプライマー１６（配列表の配列番号２２）を用い、上記で得たペディオコッカス・アシディラクティシ  JCM8797株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号１９に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点が付加され、かつ終止コドンの直後に終止コドンＴＡＡ及びＥｃｏＲＩ切断点が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa Ex Taq（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで部分消化し、これを先に作成した組換えベクターpNGのＮｄｅＩ切断点とＥｃｏＲＩ切断点の間に挿入して、組換えベクターpNPAGを構築した。
【０２２７】
（４−４．ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＧＤＨ構造遺伝子を含む発現ベクターpUCPAG及びpSTVPAGの構築）
プライマー１７（配列表の配列番号２３）とプライマー１８（配列表の配列番号２４）を用い、上記で作成した組換えベクターpNPAGを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＳａｃＩ切断点が付加され、かつ、ＧＤＨ構造遺伝子の終止コドンの直後に終止コドンＴＡＡ及びＳｐｈＩ切断点が付加された、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＧＤＨ構造遺伝子が繋がった二本鎖ＤＮＡを取得した。この二本鎖ＤＮＡをＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化後、プラスミドpUC19（タカラバイオ社製）のＳａｃＩ切断点とＳｐｈＩ切断点の間に挿入することにより組換えベクターpUCPAGを構築した。更に、プラスミドpUC19の代わりにpSTV28（タカラバイオ社製）を用いて上記と同様に処理して組換えベクターpSTVPAGを構築した。
【０２２８】
上述の組換えプラスミドpNG、pNTPAG、pUCPAG及びpSTVPAGの構築手順を図２に簡単に示した。【０２２９】
（実施例５）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの３つの構造遺伝子を含む組換えベクター（pNMTAPAG）の構築
実施例４で得られたｐＵＣＰＡＧをＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化することにより得られる、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＧＤＨ構造遺伝子が繋がった二本鎖ＤＮＡを、実施例１で得られた組換えベクターpNMTAのＳａｃＩ切断点とＳｐｈＩ切断点の間に挿入することにより、組換えベクターpNMTAPAGを構築した。組換えベクターpNMTAPAGの構築手順を図３に簡単に示した。【０２３０】
（実施例６）  ＴＰＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの３つの構造遺伝子を含む組換えベクター（pNTPSPAG）の構築
実施例４で得られたpUCPAGをＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化することにより得られる、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＧＤＨ構造遺伝子が繋がった二本鎖ＤＮＡを、実施例２で得られた組換えベクターpNTPSのＳａｃＩ切断点とＳｐｈＩ切断点の間に挿入することにより、組換えベクターpNTPSPAGを構築した。組換えベクターpNTPSPAGの構築手順を図３に簡単に示した。【０２３１】
（実施例７）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの３つの構造遺伝子を含む組換えベクター（pNTASPAG）の構築
実施例４で得られたpUCPAGをＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化することにより得られる、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＧＤＨ構造遺伝子が繋がった二本鎖ＤＮＡを、実施例３で得られた組換えベクターpNTASのＳａｃＩ切断点とＳｐｈＩ切断点の間に挿入することにより、組換えベクターpNTASPAGを構築した。組換えベクターpNTASPAGの構築手順を図３に簡単に示した。【０２３２】
（実施例８）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌の育種（１）
実施例５で作成した組換えプラスミドpNMTAPAGを用いて、大腸菌 E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌E. coli HB101 (pNMTAPAG)を得た。比較例として、上記プラスミドpUCN18を用いて、大腸菌E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101 (pUCN18)を得た。【０２３３】
上記の形質転換体E. coli HB101(pNMTAPAG)、および、比較例であるE. coli HB101(pUCN18)を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌにそれぞれ接種し、３２℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＭＴＡ活性、ＰＡＬＤＨ活性及びＧＤＨ活性を下記の方法でそれぞれ測定し、比活性を求めた。なお、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアッセイキット（BIO-RAD社製）を用いて測定した。【０２３４】
（ＭＴＡ活性測定法）
酵素液０．２ｍｌを、下記組成を有する基質溶液０．８ｍｌに添加し、３０℃で１時間反応させた。６Ｎ塩酸を５０μｌ添加して反応を停止させ、生成したアセトフェノンを高速液体クロマトグラフィーにより定量する。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのアセトフェノンが生成する活性を、１Ｕと定義した。
［基質溶液組成］
（Ｓ）−α−フェネチルアミン            ２５ｍＭ
ピルビン酸                              ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．０６３％
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）          ０．１Ｍ。【０２３５】
［高速液体クロマトグラフィーによる測定条件］
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８  Ａ３０３  (ＹＭＣ社製)
溶離液：蒸留水７００ｍＬ／アセトニトリル３００ｍＬ／
ＫＨ2ＰＯ4  ３．０５ｇ／リン酸  １．２５ｇ
流速：１ｍＬ／分
検出：２１０ｎｍ
カラム温度：室温。【０２３６】
（ＰＡＬＤＨ活性測定法）
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、ピルビン酸を終濃度３０ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨを終濃度０．２５ｍＭとなるよう溶解し、さらに酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行った際の、当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨをＮＡＤ+に酸化する活性を、１Ｕと定義した。【０２３７】
（ＧＤＨ活性測定法）
１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコースを終濃度０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤＰ+を終濃度２ｍＭとなるように溶解し、さらに酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰ+をＮＡＤＰＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。【０２３８】
比較例である E. coli HB101 (pUCN18)のＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの比活性は、３酵素共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であり、事実上活性を有さなかった。一方、E. coli HB101 (pNMTAPAG)では、３酵素すべての発現が認められ、それぞれＭＴＡ：５５Ｕ／ｍｇ、ＰＡＬＤＨ：７１３Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ：１５３Ｕ／ｍｇの比活性を有した。【０２３９】
（実施例９）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌の育種（２）
実施例１で作成したＭＴＡ発現用組換えベクターpNMTA、及び、実施例４で作成したＰＡＬＤＨ、ＧＤＨの両酵素発現用の組換えベクターpSTVPAGの両組換えベクターを用いて、大腸菌 E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101 (pNMTA,pSTVPAG)を得た。比較例として、上記プラスミドpUCN18およびプラスミドpSTV28（タカラバイオ社製）を用いて、大腸菌 E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101(pUCN18,pSTV28)を得た。【０２４０】
上記の形質転換体 E. coli HB101(pNMTA,pSTVPAG)、および、比較例である E. coli HB101(pUCN18,pSTV28)を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌにそれぞれ接種し、３２℃で２４時間振盪培養した。実施例８と同様の方法により、無細胞抽出液を調製後、各酵素の比活性を測定した。【０２４１】
比較例である E. coli HB101(pUCN18,pSTV28)のＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの比活性は、３酵素共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であり、事実上活性を有さなかった。一方、E. coli HB101(pNMTA,pSTVPAG)では、３酵素すべての発現が認められ、それぞれＭＴＡ：１５．７Ｕ／ｍｇ、ＰＡＬＤＨ：８２Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ：９Ｕ／ｍｇの比活性を有した。【０２４２】
（実施例１０）  ＴＰＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌の育種
実施例６で作成した組換えプラスミドpNTPSPAGを用いて、大腸菌 E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101(pNTPSPAG)を得た。比較例として、上記プラスミドpUCN18を用いて、大腸菌 E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101(pUCN18)を得た。
【０２４３】
上記の形質転換体 E. coli HB101(pNTPSPAG)、および、比較例であるE. coli HB101(pUCN18)を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌにそれぞれ接種し、３２℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＴＰＳ活性、ＰＡＬＤＨ活性及びＧＤＨ活性をそれぞれ測定し、比活性を求めた。なお、ＰＡＬＤＨ活性、ＧＤＨ活性の測定方法、及び蛋白質濃度の測定方法は実施例８に記載の方法で行なった。また、ＴＰＳの活性測定は、実施例８に記載のＭＴＡ活性測定法と同一の方法で測定した。【０２４４】
比較例である E. coli HB101(pUCN18)のＴＰＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの比活性は、３酵素共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であり、事実上活性を有さなかった。一方、E. coli HB101(pNTPSPAG)では、３酵素すべての発現が認められ、それぞれＴＰＳ：１１Ｕ／ｍｇ、ＰＡＬＤＨ：３２３Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ：１１３Ｕ／ｍｇの比活性を有した。【０２４５】
（実施例１１）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌の育種
実施例７で作成した組換えプラスミドpNTASPAGを用いて、大腸菌 E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101(pNTASPAG)を得た。比較例として、上記プラスミドpUCN18を用いて、大腸菌 E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌 E. coli HB101(pUCN18)を得た。【０２４６】
上記の形質転換体 E. coli HB101(pNTASPAG)、および、比較例であるE. coli HB101(pUCN18)を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌにそれぞれ接種し、３２℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＴＡＳ活性、ＰＡＬＤＨ活性及びＧＤＨ活性をそれぞれ測定し、比活性を求めた。なお、ＰＡＬＤＨ活性、ＧＤＨ活性の測定方法、及び蛋白質濃度の測定方法は実施例８に記載の方法で行なった。また、ＴＡＳの活性測定は、以下の方法で測定した。【０２４７】
（ＴＡＳ活性測定法）
酵素液０．２ｍｌを、下記組成を有する基質溶液０．８ｍｌに添加し、３０℃で１時間反応させた。６Ｎ塩酸を５０μｌ添加して反応を停止させ、生成したアセトフェノンを実施例８に記載の高速液体クロマトグラフィーにより定量する。本反応条件において、１分間に１μｍｏｌのアセトフェノンが生成する活性を、１Ｕと定義した。
［基質溶液組成］
（Ｒ）−α−フェネチルアミン            ２５ｍＭ
ピルビン酸                              ２５ｍＭ
ピリドキサルリン酸                      ０．０６３％
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）          ０．１Ｍ。【０２４８】
比較例であるE. coli HB101(pUCN18)のＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの比活性は、３酵素共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であり、事実上活性を有さなかった。一方、E. coli HB101(pNTASPAG)では、３酵素すべての発現が認められ、それぞれＴＡＳ：８Ｕ／ｍｇ、ＰＡＬＤＨ：６３９Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ：２５０Ｕ／ｍｇの比活性を有した。【０２４９】
（実施例１２）  ＭＴＡを発現する組換え大腸菌の育種
実施例１で作成した組換えプラスミドpNMTAを用いて、大腸菌E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTA)を得た。比較例として、実施例８にて説明したE. coli HB101(pUCN18)を用いた。【０２５０】
上記の形質転換体E. coli HB101(pNMTA)、および、比較例であるE. coli HB101(pUCN18)を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌにそれぞれ接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＭＴＡの比活性を、実施例８と同様の方法で測定した。【０２５１】
比較例であるE. coli HB101(pUCN18)のＭＴＡの比活性は０．１Ｕ／ｍｇ以下であり、事実上活性を有さなかった。一方、E. coli HB101(pNMTA)では、ＭＴＡの発現が認められ、その比活性は３８Ｕ／ｍｇであった。【０２５２】
（実施例１３）  ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを共発現する組換え大腸菌の育種
実施例４で作成した組換えプラスミドpNPAGを用いて、大腸菌E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌E. coli HB101(pNPAG)を得た。比較例として、実施例８にて説明したE. coli HB101(pUCN18)を用いた。【０２５３】
上記の形質転換体E. coli HB101(pNPAG)、および、比較例であるE. coli HB101(pUCN18)を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌにそれぞれ接種し、３３℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＰＡＬＤＨとＧＤＨの比活性を、実施例８と同様の方法で測定した。【０２５４】
比較例であるE. coli HB101(pUCN18)のＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの比活性は共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であり、事実上、両酵素活性を有さなかった。一方、E. coli HB101(pNPAG)では、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの発現が認められ、その比活性はそれぞれＰＡＬＤＨ：１１００Ｕ／ｍｇ、ＧＤＨ１３０Ｕ／ｍｇであった。【０２５５】
（比較例１）  ＭＴＡを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの製造
実施例１２で得られたＭＴＡを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTA)について、実施例１２と同様に培養後、遠心分離により菌体を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁して体積５ｍｌの菌体懸濁液とした。このような菌体懸濁液を３０ｍｌ調製した。【０２５６】
あらかじめ基質である７−メトキシ−２−テトラロン３００ｍｇ、及び、Ｄ−グルコース４６０ｍｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）３ｍｌ、Ｌ−アラニン９１０ｍｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、上記菌体懸濁液６ｍｌを入れて、脱イオン水を加えて全体積を３０ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で２５時間攪拌した。反応終了後、反応液中に生成した７−メトキシ−２−アミノテトラリンを下記のＨＰＬＣ条件で分析し、変換率及び光学純度を測定した。その結果、７−メトキシ−２−アミノテトラリンの生成は認められたものの、その生成量は非常に少なく、７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率は１．５％であった。その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は７４．１％ｅ．ｅ．であった。【０２５７】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ８−ＭＳ（ナカライテスク社製）
溶離液：３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル
／メタノール  ＝  ４／１／１（体積比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２５４ｎｍ。【０２５８】
＜光学純度分析＞
カラム：Ｃｒｏｗｎｐａｋ  ＣＲ（＋）（ダイセル化学工業社製）
溶離液：過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）／メタノール＝８５／１５（体積
比）
流速：０．９ｍＬ／分
検出：２２０ｎｍ
カラム温度：４７℃。【０２５９】
Ｌ−アラニンをアミノドナーとしたアミノ基転移酵素ＭＴＡによる７−メトキシ−２−テトラロンのアミノ化反応では、Ｓ体の７−メトキシ−２−アミノテトラリンの生成は認められたものの、その生産性は低かった（考察については実施例１４参照）。【０２６０】
（比較例２）  ＭＴＡを発現する組換え大腸菌、及び市販のＬ−乳酸脱水素酵素を用いた（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの製造
比較例１で実施した反応系に、更に市販の豚心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素（オリエンタル酵母社製）２ｍｌ（１００００Ｕ）を加えて、比較例１と同様に反応を行なった。反応終了後、７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率及びその光学純度を測定した。その結果、７−メトキシ−２−アミノテトラリンの生成は認められたものの、その生成量は非常に少なく、７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率は２．０％であった。その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は８０．１％ｅ．ｅ．であった。【０２６１】
Ｌ−アラニンをアミノドナーとしたアミノ基転移酵素ＭＴＡによる７−メトキシ−２−テトラロンのアミノ化反応の系に、α−ケト酸還元酵素の一つであるＬ−乳酸脱水素酵素を添加して反応させたが、７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率は１．７％と低く、生成量の向上は認められなかった（考察については実施例１４参照）。【０２６２】
（実施例１４）  ＭＴＡを発現する組換え大腸菌、及びＰＡＬＤＨとＧＤＨの共発現組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの製造
比較例１で実施した反応系に、更に実施例１３で得られたＰＡＬＤＨとＧＤＨの共発現組換え大腸菌E. coli HB101(pNPAG)の培養液６ｍｌを加えて、比較例１と同様に反応を行なった。反応終了後、７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率及びその光学純度を測定した。その結果、７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率は９０．３％と非常に高かった。その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９５．６％ｅ．ｅ．であった。【０２６３】
Ｌ−アラニンをアミノドナーとしたアミノ基転移酵素ＭＴＡによる７−メトキシ−２−テトラロンのアミノ化反応において、α−ケト酸還元酵素の一つであるＰＡＬＤＨだけでなく、ＧＤＨを更に共存させることにより、７−メトキシ−２−アミノテトラリンの生成量が飛躍的に向上し、高い生産性を実現することができた。【０２６４】
（実施例１５）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの製造（１）
あらかじめ基質である７−メトキシ−２−テトラロン３００ｍｇ、及び、Ｄ−グルコース４６０ｍｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、Ｌ−アラニン９１０ｍｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例８で得られたＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTAPAG)の培養液を加えて全体積を３０ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後の７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率は９２．３％であり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９７．０％ｅ．ｅ．であった。【０２６５】
ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨの３つの酵素をひとつの組換え大腸菌で発現させることにより、実施例１４の場合と比べて、（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの生成量が若干向上し、より光学純度が高いものが得られた。【０２６６】
（実施例１６）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの製造（２）
あらかじめ基質である７−メトキシ−２−テトラロン３００ｍｇ、及び、Ｄ−グルコース４６０ｍｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、Ｌ−アラニン９１０ｍｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例９で得られたＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTA,pSTVPAG)の培養液を加えて全体積を３０ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で２５時間攪拌した。反応終了後の７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率は６０．２％であり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９７．１％ｅ．ｅ．であった。【０２６７】
（実施例１７）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジンの製造
あらかじめ基質であるＮ−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン１．２５ｇ、Ｄ−グルコース１．８２ｇ、ＮＡＤ+１０ｍｇ、Ｌ−アラニン３．６１ｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例８で得られたＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTAPAG)の培養液を加えて全体積を２５ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。【０２６８】
反応２．５時間目に、Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン０．６２５ｇ、Ｄ−グルコース０．９１ｇ、Ｌ−アラニン１．８ｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを追加した。また、反応５時間目には、Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン０．６２５ｇ、Ｄ−グルコース０．９１ｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを追加した。更に、反応９時間目に、Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン０．２５ｇ、Ｄ−グルコース０．３６ｇ、ＮＡＤ+１９ｍｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを追加した。反応中、反応液をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にした後に酢酸エチルを加えて抽出し、下記のＧＣ条件で分析することによりＮ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジンの生成量を測定した。また定法により、得られたＮ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジンに３，５−ジニトロベンゾイルクロリドを作用させて、ジニトロベンゾイル誘導体とした後、下記のＨＰＬＣ条件で分析し、その光学純度を測定した。その結果、反応２３時間目におけるＮ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジンの生成量は２．１４ｇであり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９９．４％ｅ．ｅ．であった。【０２６９】
［ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による定量分析条件］
カラム：Ｒｔｘ−５  Ａｍｉｎｅ（３０ｍ，０．２５ｍｍＩＤ）（ＲＥＳＴ
ＥＫ社製）
カラム温度：１５０℃
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：Ｈｅ、１５０ｋＰａ
溶出時間：Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン（９．２分）、
Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジン（１１．５分）。【０２７０】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度測定条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝７５／２５／０．１
（体積比）
流速：０．７ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃
溶出時間：Ｓ体（１５．０分）、Ｒ体（８．９分）。【０２７１】
（実施例１８）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジンの製造
あらかじめ基質であるＮ−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン０．５ｇ、Ｄ−グルコース０．７３ｇ、ＮＡＤ+４ｍｇ、Ｄ−アラニン１．４４ｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを入れたフラスコに、実施例１１で得られたＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTASPAG)の培養液を加えて全体積を２５ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。反応９時間目に、Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピロリジノン０．２５ｇ、Ｄ−グルコース０．３７ｇ、Ｄ−アラニン０．３７ｇ及びピリドキサールリン酸３ｍｇを追加した。【０２７２】
反応２３時間目におけるＮ−Ｂｏｃ−３−アミノピロリジンの生成量及びその光学純度について、実施例１７に記載の方法で測定した結果、生成量は０．５４ｇであり、その絶対立体配置は（Ｒ）体で、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２７３】
（実施例１９）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの製造
あらかじめ基質であるＮ−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン１．２５ｇ、Ｄ−グルコース１．７ｇ、ＮＡＤ+９ｍｇ、Ｌ−アラニン３．３６ｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを入れたフラスコに、実施例８で得られたＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTAPAG)の培養液を加えて全体積を２５ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。【０２７４】
反応２時間目に、Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン１．２５ｇ、Ｄ−グルコース１．７ｇ、Ｌ−アラニン１．０ｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを追加した。また、反応５時間目には、Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン１．２５ｇ、Ｄ−グルコース１．７ｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを追加した。反応中、反応液をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にした後に酢酸エチルを加えて抽出し、下記のＧＣ分析条件で分析することによりＮ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの生成量を測定した。また定法により、得られたＮ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンに３，５−ジニトロベンゾイルクロリドを作用させて、ジニトロベンゾイル誘導体とした後、下記のＨＰＬＣ条件で分析し、その光学純度を測定した。その結果、反応２３．５時間目におけるＮ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの生成量は３．１３ｇであり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２７５】
［ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による定量分析条件］
カラム：Ｒｔｘ−５  Ａｍｉｎｅ（３０ｍ，０．２５ｍｍＩＤ）（ＲＥＳＴ
ＥＫ社製）
カラム温度：１５０℃
注入口温度：２５０℃
検出器温度：２５０℃
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：Ｈｅ、１５０ｋＰａ
溶出時間：Ｎ−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン（１３．２分）、
Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン（１２．５分）。【０２７６】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度測定条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝７５／２５／０．１
（体積比）
流速：０．７ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃
溶出時間：Ｓ体（１９．１分）、Ｒ体（７．７分）。【０２７７】
（実施例２０）  ＴＰＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの製造
あらかじめ基質であるＮ−Ｂｏｃ−３−ピペリジノン０．６ｇ、Ｄ−グルコース０．８２ｇ、ＮＡＤ+４ｍｇ、Ｌ−アラニン１．６２ｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例１０で得られたＴＰＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTPSPAG)の培養液を加えて全体積を３０ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で２０時間攪拌した。Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジンの生成量及びその光学純度について、実施例１９に記載の方法で測定した結果、生成量は０．５４ｇであり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９９．４％ｅ．ｅ．であった。【０２７８】
（実施例２１）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アミノピペリジンの製造
あらかじめ基質であるＮ−ベンジル−３−ピペリジノン塩酸塩２６．９ｇ、Ｄ−グルコース３２．２ｇ、ＮＡＤ+７９ｍｇ、Ｄ−アラニン６３．７ｇ及びピリドキサールリン酸７５ｍｇを入れたセパラブルフラスコに、実施例１１で得られたＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTASPAG)の培養液５６４ｍｌを加えた。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。【０２７９】
反応中、反応液をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にした後に酢酸エチルを加えて抽出し、下記のＨＰＬＣ条件で分析することによりＮ−ベンジル−３−アミノピペリジンの生成量を測定した。また定法により、得られたＮ−ベンジル−３−アミノピペリジンに３，５−ジニトロベンゾイルクロリドを作用させて、ジニトロベンゾイル誘導体とした後、下記のＨＰＬＣ条件で分析し、その光学純度を測定した。その結果、反応２０時間目におけるＮ−ベンジル−３−アミノピペリジンの生成量は２０．２ｇであり、その絶対立体配置は（Ｒ）体で、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２８０】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ（日本分光社製）
溶離液：水／アセトニトリル／ＫＨ2ＰＯ4／ＳＤＳ
＝  １２６０ｍｌ／７４０ｍｌ／１０ｇ／２．８８ｇ
混合後、リン酸でｐＨを３．６に調整
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２１０ｎｍ
カラム温度：３０℃。【０２８１】
＜光学純度分析＞
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝７５／２５／０．１
（体積比）
流速：０．７ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃
溶出時間：Ｒ体（９．６分）、Ｓ体（１４．４分）。【０２８２】
５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加えて反応液のｐＨを１３とした後、トルエン１Ｌで抽出し、水相を更にトルエン１Ｌで抽出した。有機相を合わせて減圧下で溶媒を留去後、蒸留により精製を行なった。そして、（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アミノピペリジン１７．７ｇを無色のオイルとして取得した。【０２８３】
（実施例２２）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｒ）−１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンの製造
あらかじめ基質である１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン１．５ｇ、Ｄ−グルコース４．１７ｇ、ＮＡＤ+５．１ｍｇ、Ｄ−アラニン４．１３ｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例１１で得られたＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTASPAG)の培養液３０ｍｌを加えた。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。【０２８４】
反応１０時間目に、１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−プロパノン１．５ｇ、Ｄ−グルコース４．１７ｇ、Ｄ−アラニン４．１３ｇ及びピリドキサールリン酸３．３ｍｇを追加した。反応中、反応液をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にした後に酢酸エチルを加えて抽出し、下記のＨＰＬＣ条件で分析することにより１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンの生成量を測定した。また定法により、得られた１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンに３，５−ジニトロベンゾイルクロリドを作用させて、ジニトロベンゾイル誘導体とした後、下記のＨＰＬＣ条件で分析し、その光学純度を測定した。その結果、反応２７時間目における１−（３，４−ジメトキシフェニル）−２−アミノプロパンの生成量は２．４２ｇであり、その絶対立体配置は（Ｒ）体で、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２８５】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（ＹＭＣ社製）
溶離液：水／アセトニトリル／ＫＨ2ＰＯ4／ヘキサンスルホン酸ナトリウム
＝  １０００ｍｌ／２００ｍｌ／３．１５ｇ／１．１３ｇ
混合後、リン酸でｐＨを２．５に調整
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃。【０２８６】
＜光学純度分析＞
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝７５／２５／０．１
（体積比）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃
溶出時間：Ｒ体（７．２分）、Ｓ体（１０．２分）。【０２８７】
（実施例２３）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｒ）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパンの製造
あらかじめ基質である１−（４−メトキシフェニル）−２−プロパノン１．５ｇ、Ｄ−グルコース４．９４ｇ、ＮＡＤ+６．１ｍｇ、Ｄ−アラニン４．８８ｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例１１で得られたＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTASPAG)の培養液３０ｍｌを加えた。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。反応中、反応液をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にした後に酢酸エチルを加えて抽出し、下記のＨＰＬＣ条件で分析することにより１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパンの生成量を測定した。また定法により、得られた１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパンに３，５−ジニトロベンゾイルクロリドを作用させて、ジニトロベンゾイル誘導体とした後、下記のＨＰＬＣ条件で分析し、その光学純度を測定した。【０２８８】
その結果、反応６８時間目における１−（４−メトキシフェニル）−２−アミノプロパンの生成量は１．４８ｇであり、その絶対立体配置は（Ｒ）体で、光学純度は９９．６％ｅ．ｅ．であった。【０２８９】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｊ’ｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳ−Ｈ８０（ＹＭＣ社製）
溶離液：水／アセトニトリル／ＫＨ2ＰＯ4／ヘキサンスルホン酸ナトリウム
＝  １０００ｍｌ／２００ｍｌ／３．１５ｇ／１．１３ｇ
混合後、リン酸でｐＨを２．５に調整
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃。【０２９０】
＜光学純度分析＞
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝７５／２５／０．１
（体積比）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃
溶出時間：Ｒ体（７．８分）、Ｓ体（１４．８分）。【０２９１】
（実施例２４）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｒ）−Ｎ−ベンジル−３−アミノピロリジンの製造
あらかじめ基質であるＮ−ベンジル−３−ピロリジノン０．６ｇ、Ｄ−グルコース１．８５ｇ、ＮＡＤ+２．３ｍｇ、Ｄ−アラニン１．８３ｇ及びピリドキサールリン酸４．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例１１で得られたＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTASPAG)の培養液３０ｍｌを加えた。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。反応中、反応液をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にした後に酢酸エチルを加えて抽出し、下記のＨＰＬＣ条件で分析することによりＮ−ベンジル−３−アミノピロリジンの生成量を測定した。また定法により、得られたＮ−ベンジル−３−アミノピロリジンに３，５−ジニトロベンゾイルクロリドを作用させて、ジニトロベンゾイル誘導体とした後、下記のＨＰＬＣ条件で分析し、その光学純度を測定した。【０２９２】
その結果、反応２４時間目におけるＮ−ベンジル−３−アミノピロリジンの生成量は０．４８ｇであり、その絶対立体配置は（Ｒ）体で、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０２９３】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定条件］
＜定量分析＞
カラム：Ｆｉｎｅｐａｋ  ＳＩＬ  Ｃ１８−Ｔ（日本分光社製）
溶離液：水／アセトニトリル／ＫＨ2ＰＯ4／ＳＤＳ
＝  １２６０ｍｌ／７４０ｍｌ／１０ｇ／２．８８ｇ
混合後、リン酸でｐＨを３．６に調整
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２１０ｎｍ
カラム温度：３０℃。【０２９４】
＜光学純度分析＞
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝７５／２５／０．１
（体積比）
流速：１．５ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：４０℃
溶出時間：Ｒ体（７．３分）、Ｓ体（１４．９分）。【０２９５】
（実施例２５）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−２−アミノヘプタンの製造
あらかじめ基質である２−ヘプタノン０．２ｇ、Ｄ−グルコース４８０ｇ、ＮＡＤ+５ｍｇ、Ｌ−アラニン０．９４ｇ及びピリドキサールリン酸２．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例８で得られたＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTAPAG)の培養液を加えて全体積を１０ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。【０２９６】
反応中、反応液をサンプリングし、６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液で塩基性にした後に酢酸エチルを加えて抽出し、下記のＧＣ条件で分析することにより２−アミノヘプタンの生成量を測定した。また、定法により、得られた２−アミノヘプタンに３，５−ジニトロベンゾイルクロリドを作用させて、ジニトロベンゾイル誘導体とした後、下記のＨＰＬＣ条件で分析し、その光学純度を測定した。その結果、反応２０時間目における２−アミノヘプタンへの変換率は９８％であり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９８．８％ｅ．ｅ．であった。【０２９７】
［ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）による定量分析条件］
カラム：Ｒｔｘ−５  Ａｍｉｎｅ（３０ｍ，０．２５ｍｍＩＤ）（ＲＥＳＴＥＫ社製）
カラム温度：５０℃
注入口温度：２５０℃
検出器温度：３００℃
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：Ｈｅ、１５０ｋＰａ
溶出時間：２−ヘプタノン（１５．２分）、
２−アミノヘプタン（１４．０分）。【０２９８】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学純度測定条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学工業社製）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール／ジエチルアミン＝９０／１０／０．１
（体積比）
流速：１．０ｍＬ／分
検出：２４０ｎｍ
カラム温度：３５℃
溶出時間：Ｓ体（１５．３分）、Ｒ体（９．３分）。【０２９９】
（実施例２６）  ＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｒ）−２−アミノヘプタンの製造
あらかじめ基質である２−ヘプタノン０．２ｇ、Ｄ−グルコース４８０ｇ、ＮＡＤ+５ｍｇ、Ｄ−アラニン０．９４ｇ及びピリドキサールリン酸２．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例１１で得られたＴＡＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTASPAG)の培養液を加えて全体積を１０ｍｌとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。【０３００】
２−アミノヘプタンへの変換率及びその光学純度について、実施例２５に記載の方法で測定した結果、変換率は９７．５％であり、その絶対立体配置は（Ｒ）体で、光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０３０１】
（実施例２７）  ＴＰＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−２−アミノヘプタンの製造
あらかじめ基質である２−ヘプタノン０．２ｇ、Ｄ−グルコース４８０ｇ、ＮＡＤ＋５ｍｇ、Ｌ−アラニン０．９４ｇ及びピリドキサールリン酸２．０ｍｇを入れたフラスコに、実施例１０で得られたＴＰＳ、ＰＡＬＤＨ及びＧＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNTPSPAG)の培養液を加えて全体積を１０mlとした。これを、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の滴下によりｐＨ６．８に調整しつつ、３０℃で攪拌した。
【０３０２】
２−アミノヘプタンへの変換率及びその光学純度について、実施例２５に記載の方法で測定した結果、変換率は９７．５％であり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９７．７％ｅ．ｅ．であった。
【０３０３】
（実施例２８）ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びチオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）KNK65MA株（FERM BP-7671）由来のギ酸脱水素酵素ＦＤＨ、の３つの構造遺伝子を含む組換えベクター（pNMTAPAF）の構築
（２８−１．ギ酸脱水素酵素遺伝子を含む発現ベクター（pNF）の構築）
プライマー１９（配列表の配列番号２７）とプライマー２０（配列表の配列番号２８）を用い、プラスミドpFT002（国際公開公報2003/031626号パンフレットに記載の方法で当業者が取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、チオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.） KNK65MA株（FERM BP-7671）由来のギ酸脱水素酵素（以後、ＦＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＫｐｎＩ切断点が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳｐｈＩ切断点が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。このＦＤＨは、本発明の「酵素（Ｃ）」の一実施例である。【０３０４】
得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩおよびＳｐｈＩで消化し、プラスミドpUCN18（ＰＣＲ法によりpUC18（タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩ切断点を破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩ切断点を導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＫｐｎＩ切断点とＳｐｈＩ切断点の間に挿入し、組換えベクターpNFを構築した。【０３０５】
（２８−２．ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＦＤＨ構造遺伝子を含む発現ベクターｐＮＰＡＦの構築）
プライマー２１（配列表の配列番号２９）とプライマー２２（配列表の配列番号３０）を用い、実施例４で得たペディオコッカス・アシディラクティシ  JCM8797株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号１９に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ切断点が付加され、かつ終止コドンの直後にＫｐｎＩ切断点が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaKaRa Pyrobest（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡをＮｄｅＩ及びＫｐｎＩで部分消化し、これを先に作成した組換えベクターpNFのＮｄｅＩ切断点とＫｐｎＩ切断点の間に挿入して、組換えベクターpNPAFを構築した。
【０３０６】
（２８−３．ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＦＤＨの３つの構造遺伝子を含む組換えベクター（pNMTAPAF）の構築）
プライマー２３（配列表の配列番号３１）とプライマー２０（配列表の配列番号２８）を用い、上記で作成した組換えベクターpNPAFを鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＳａｃＩ切断点が付加され、かつ、ＦＤＨ構造遺伝子の終止コドンの直後にＳｐｈＩ切断点が付加された、ＰＡＬＤＨ構造遺伝子及びＦＤＨ構造遺伝子が繋がった二本鎖ＤＮＡを取得した。この二本鎖ＤＮＡをＳａｃＩ及びＳｐｈＩで消化後、実施例１で得られた組換えベクターpNMTAのＳａｃＩ切断点とＳｐｈＩ切断点の間に挿入することにより、組換えベクターpNMTAPAFを構築した。組換えベクターpNMTAPAFの構築手順を図４に簡単に示す。
【０３０７】
（実施例２９）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＦＤＨを発現する組換え大腸菌の育種
実施例２８で作成した組換えプラスミドpNMTAPAFを用いて、大腸菌E. coli HB101（タカラバイオ社製）を形質転換し、組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTAPAF)を得た。
上記の形質転換体E. coliHB101(pNMTAPAF)、および、比較例である実施例８で得たE. coli HB101(pUCN18)を、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５０ｍｌにそれぞれ接種し、３２℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５０ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＭＴＡ活性、ＰＡＬＤＨ活性及びＦＤＨ活性をそれぞれ測定し、比活性を求めた。ＭＴＡ活性及びＰＡＬＤＨ活性は、実施例８に記載の方法で実施した。また、ＦＤＨ活性は下記方法で実施した。なお、無細胞抽出液中の蛋白質濃度は、プロテインアッセイキット（BIO-RAD社製）を用いて測定した。
【０３０８】
（ＦＤＨ活性測定法）
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、ギ酸を終濃度０．５Ｍ、補酵素ＮＡＤ+を終濃度２ｍＭとなるように溶解し、さらに酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤ+をＮＡＤＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。【０３０９】
比較例であるE. coli HB101(pUCN18)のＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＦＤＨの比活性は、３酵素共に０．１Ｕ／ｍｇ以下であり、事実上活性を有さなかった。一方、E. coli HB101(pNMTAPAF)では、３酵素すべての発現が認められ、それぞれＭＴＡ：２５Ｕ／ｍｇ、ＰＡＬＤＨ：８２０Ｕ／ｍｇ、ＦＤＨ：１５Ｕ／ｍｇの比活性を有した。【０３１０】
（実施例３０）  ＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＦＤＨを発現する組換え大腸菌を用いた（Ｓ）−７−メトキシ−２−アミノテトラリンの製造
あらかじめ基質である７−メトキシ−２−テトラロン５２０ｍｇ、及び、ギ酸ナトリウム１００ｍｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、Ｌ−アラニン１．５７ｇ及びピリドキサールリン酸２０ｍｇを入れたフラスコに、実施例２９で得られたＭＴＡ、ＰＡＬＤＨ及びＦＤＨを発現する組換え大腸菌E. coli HB101(pNMTAPAF)の培養液を加えて全体積を３０ｍｌとした。これを、５Ｎのギ酸水溶液の滴下によりｐＨ６．３に調整しつつ、３５℃で２８時間攪拌した。反応終了後の７−メトキシ−２−アミノテトラリンへの変換率は９２．６％であり、その絶対立体配置は（Ｓ）体で、光学純度は９８．１％ｅ．ｅ．であった。【０３１１】
Ｌ−アラニンをアミノドナーとしたアミノ基転移酵素ＭＴＡによる７−メトキシ−２−テトラロンのアミノ化反応において、α−ケト酸還元酵素の一つであるＰＡＬＤＨだけでなく、ＦＤＨを更に共存させることにより、７−メトキシ−２−アミノテトラリンの生成量が飛躍的に向上し、高い生産性を実現することができた（比較例２との比較より）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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