(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端に下記一般式（５）で表される重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基と、を有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
【化１】
0005388126.tif 000018
［式中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ５は置換基を表し、ｉは０、１又は２を表す］
【請求項２】
前記ポリアルキレングリコール基の４以上を有する請求項１に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
【請求項３】
前記ポリアルキレングリコール基は、下記一般式（１）で表される請求項１又は請求項２に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
【化２】
0005388126.tif 000019
［式中、Ｘ１は前記一般式（５）で表される重合性置換基を表し、ｍは２〜４の整数を、ｎは５〜１０００の整数をそれぞれ表す］
【請求項４】
下記一般式（２）で表される請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体。
【化３】
0005388126.tif 000020
［式中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表し、ｑは１〜７０の整数を表す。Ｒ２は末端に前記一般式（５）で表される重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す］
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の感光性組成物を硬化させて形成された架橋体。
【請求項７】
基材と、前記基材上に配置された請求項６に記載の架橋体とを含む基板。
【請求項８】
前記基材は、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材である請求項７に記載の基板。
【請求項９】
前記基材は、細胞接着性タンパク質で表面処理された基材である請求項７または請求項８に記載の基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Technical Field
本発明は、分岐ポリアルキレングリコール誘導体、感光性組成物、架橋体及び基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
Background Art
近年の細胞工学の発展および再生医療への注目と相まって、生体外にて細胞を適切な形で培養し、治療への応用および生体反応のシュミレーターとして使用する試みが現在活発に行われている。このような目的において、培養される細胞は各種臓器機能の担い手である実質細胞が中心であるが、一般に生体外にて実質細胞の機能を維持した状態で長期の培養を行うことは困難であり、この点を解決するための様々な試みがなされている。【０００３】
例えば、多数の細胞の三次元的凝集状態を作って培養を行うスフェロイド（細胞凝集塊）培養系は、細胞極性および細胞間相互作用の維持という観点から、生体外における優れた実質細胞培養系として、様々な報告がなされており、膵細胞、骨芽細胞、肝細胞、など多種の細胞に適用された例が存在する。いずれも単層培養系とは異なった生物学的応答を示し、分化マーカーが高レベルで維持されている例も報告されている。【０００４】
スフェロイド形成の手法としては、細胞接着性Ｕ字底を有する９６穴プレートに細胞数を定めて細胞を播種することによってサイズをコントロールしたスフェロイドを形成する手法（例えば、非特許文献１参照）や、温度感応性高分子と細胞接着性物質からなる培養基材を用いる手法（例えば、特許文献１参照）などが報告されている。また、プラズマエッチングによるフォトリソグラフィーを用いて、細胞非接着性表面上、数十〜数百マイクロのサイズを有する細胞接着性マイクロドメインを有する培養基材を作製し、その基板上にスフェロイドを形成する手法（例えば、特許文献２参照）が知られており、高い効率でスフェロイドを形成可能とされている。
一方、光架橋により親水性で生体適合性の高い表面コーティングを形成可能な感光性樹脂が知られている（例えば、特許文献３及び４参照）。
【特許文献１】特開平７−３１４６４号公報
【特許文献２】特開２００６−６７９８７号公報
【特許文献３】特開２００６−３０７１８４号公報
【特許文献４】特開２００７−２６９９７３号公報
【非特許文献１】Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４７（２００１）１６５−１７１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Disclosure of Invention
しかしながら、特許文献１や非特許文献１に記載の方法ではスフェロイド形成の培養面積当たりの効率が極めて低いという問題点があった。また特許文献２に記載の方法では、基板を作製する工程が複雑であり、細胞非接着性表面の環境安定性が不十分であるという問題点があった。更に特許文献３又は４に記載の感光性樹脂では、細胞非接着性表面の経時安定性が不十分であるという問題点があった。
本発明は、高精度にパターニング可能で、細胞の非接着状態を経時安定的に維持可能な親水性領域を有する基板、該親水性領域を形成する架橋体、並びに該架橋体を形成可能な感光性組成物及びそれに含まれる分岐ポリアルキレングリコール誘導体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基と、を有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体である。前記ポリアルキレングリコール基は４以上であることが好ましく、前記ポリアルキレングリコール基は、下記一般式（１）で表されることがより好ましい。【０００７】
【化１】
0005388126.tif 000002
【０００８】
［式中、Ｘ１は重合性置換基を表し、ｍは２〜４の整数を、ｎは５〜１０００の整数をそれぞれ表す］【０００９】
また、本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は下記一般式（２）で表されることが好ましい。【００１０】
【化２】
0005388126.tif 000003
【００１１】
［式中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表し、ｑは１〜７０の整数を表す。Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す］【００１２】
前記重合性置換基は、下記一般式（３）及び一般式（４）の少なくとも１種で表される置換基であることが好ましく、前記重合性置換基の少なくとも１つは、下記一般式（５）で表されることがより好ましい。【００１３】
【化３】
0005388126.tif 000004
【００１４】
［式中、Ｌ３は単結合又は２価の連結基を表し、Ｌ４は２価の連結基を表し、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す］【００１５】
【化４】
0005388126.tif 000005
【００１６】
［式中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表し、Ｒ５は置換基を表し、ｉは１又は２を表す］【００１７】
また本発明の第２の態様は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含有する感光性組成物である。
また本発明の第３の態様は、前記感光性組成物を硬化させて形成された架橋体である。【００１８】
更に本発明の第４の態様は、基材と、前記基材上に配置された前記架橋体とを含む基板である。前記基材は、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材であることが好ましく、前記基材は、細胞接着性タンパク質で表面処理された基材であることがより好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、高精度にパターニング可能で、細胞の非接着状態を経時安定的に維持可能な親水性領域を有する基板、該親水性領域を形成する架橋体、並びに該架橋体を形成可能な感光性組成物及びそれに含まれる分岐ポリアルキレングリコール誘導体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
Brief Description of Drawings
【図１】重合性置換基の吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】実施例１０で作製した基板表面の拡大写真である。
【図３】基板上に形成されたスフェロイドの拡大写真である。
【図４】基板上に形成された内皮細胞集合体の拡大写真である。
【図５】基板上の内皮細胞集合体上に形成されたスフェロイドの拡大写真である。
【図６】培養１日後のスフェロイドの拡大写真である。
【図７】培養３日後のスフェロイドの拡大写真である。
【図８】培養４週間後のスフェロイドの拡大写真である。
【図９】培養１日後のスフェロイドの拡大写真である。
【図１０】培養３日後のスフェロイドの拡大写真である。
【図１１】培養４週間後のスフェロイドの拡大写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
Best Mode of Carrying Out the Invention
本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の３以上と、前記ポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基とを有することを特徴とする。
かかる構成の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性の架橋体を形成することができる。かかる親水性の架橋体は、細胞非接着性の経時安定性が良好であり、例えば、本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いて基材上に親水性領域と疎水性領域とが高精度に形成された基板は、該基板上で細胞を培養した場合に、疎水性領域にのみ特異的に細胞が接着するため、高精度に区画化された細胞集合体を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が良好であり、長期に渡って区画化された細胞集合体を維持することができる。更に前記細胞集合体は、例えば、単層の細胞集合体とすることもできるし、細胞が３次元的凝集状態を形成した細胞凝集塊（スフェロイド）とすることもできる。【００２２】
本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体において、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基の含有数は３以上である。前記ポリアルキレングリコール基の含有数が２以下では、これによって形成された親水性領域の細胞非接着性の経時安定性が不十分であり、区画化された細胞集合体を長期間維持することができない。
また前記ポリアルキレングリコール基の含有数は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の点から、４以上であることが好ましく、４以上６４以下であることがより好ましく、４以上１６以下であることが更に好ましい。【００２３】
本発明における前記ポリアルキレングリコール基は、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。
また前記重合性置換基としては重合性の官能基を有する置換基であってポリアルキレングリコールの末端に結合可能なものであれば特に制限はない。重合性置換基のポリアルキレングリコールの末端への結合態様としては、ポリアルキレングリコールに由来する酸素原子を介した結合態様であっても、ポリアルキレングリコールの末端水酸基が他の元素に置換された結合態様であってもよい。【００２４】
前記重合性置換基は、重合性の官能基そのものであっても、重合性の官能基と連結基とを含んで構成された置換基であってもよい。
本発明における重合性の官能基としては、通常用いられる重合性官能基を特に制限なく用いることができ、例えば、エチレン性不飽和結合を有する基、アジド基等を挙げることができる。本発明においては、親水性領域のパターン形成性の観点から、エチレン性不飽和結合を有する基及びアジド基から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、アジド基であることがより好ましい。【００２５】
また前記重合性置換基における連結基としては重合性の官能基とポリアルキレングリコール基とを連結可能な基であれば特に制限はなく、例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、硫黄原子、ジスルフィド及び水素原子から選ばれる少なくとも１種を含んで構成することができる。
具体的には例えば、カルボニル基、アリーレン基、アルキレンカルボニル基、カルボニルアリーレン基、カルバモイルアリーレン基等を挙げることができる。
更に連結基の価数としては少なくとも２価であればよく、３価以上の連結基であってポリアルキレングリコールと２以上の重合性官能基とを連結する連結基であってもよい。【００２６】
末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を構成するポリアルキレングリコール基は、本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体に親水性を付与可能なポリアルキレングリコール基であれば特に制限はない。例えば、炭素数２〜４のアルキレングリコール構造単位（例えば、エチレンオキシ、ｎ−プロピレンオキシ、イソプロピレンオキシ、ブチレンオキシ、イソブチレンオキシ等）を含むポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができる。【００２７】
前記ポリアルキレングリコール基におけるアルキレングリコール構造単位は、１種のアルキレングリコール構造単位からなるものであっても、２種以上アルキレングリコール構造単位の組合せからなるものであってもよい。ポリアルキレングリコール基が２種以上のアルキレングリコール構造単位の組合せからなる場合、ブロックポリマーであってもランダムポリマーであってもよい。
また、ポリアルキレングリコール基の重合度としては、親水性の観点から５以上であればよく、５〜１０００の重合度を有するポリアルキレングリコール基を好ましく用いることができ、より好ましくは１０〜５００である。【００２８】
本発明における、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基と結合する３価以上の連結基は、少なくとも３つの前記ポリアルキレングリコール基における重合性置換基が結合していない方の末端と結合し、前記ポリアルキレングリコール基を互いに連結可能なものであれば特に制限はない。結合様式としては共有結合、配位結合、イオン結合のいずれであってもよい。
具体的には例えば、糖類に由来する連結基、多価アルコールに由来する連結基、多価カルボン酸に由来する連結基、配位結合を介して前記ポリアルキレングリコール基を含む基を結合可能な金属原子等を挙げることができる。【００２９】
前記糖類としては、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、リボース、グルコース等を挙げることができる。また、多価アルコールとしては、グリセリン、ペンタエリスリトール、キシリトール、ソルビトール等を挙げることができる。更に、多価カルボン酸としては、プロパントリカルボン酸、クエン酸、ベンゼントリカルボン酸等を挙げることができる。また、前記金属原子としては、金、銀、白金、ニッケル、銅等を挙げることができる。【００３０】
本発明においては、親水性と経時安定性の観点から、多価アルコールに由来する連結基であることが好ましく、グリセリンに由来する連結基又はペンタエリスリトールに由来する連結基がより好ましく、グリセリン、ポリグリセリン、ペンタエリスリトール、及びポリペンタエリスリトールから選ばれる化合物に由来する連結基であることが特に好ましい。【００３１】
本発明における末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基は、経時安定性と良好なスフェロイド形成性の観点から、下記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることが好ましい。【００３２】
【化５】
0005388126.tif 000006
【００３３】
一般式（１）中、ｍは２〜４の整数を表すが、２又は３であることが好ましく、２であることがより好ましい。またｎは５〜１０００の整数を表すが、１０〜５００であることが好ましく、１０〜３００であることがより好ましい。【００３４】
一般式（１）中、Ｘ１は重合性置換基を表す。本発明において前記重合性置換基は、本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋硬化性の観点から、下記一般式（３）及び一般式（４）の少なくとも１種で表される重合性置換基であることが好ましい。【００３５】
【化６】
0005388126.tif 000007
【００３６】
一般式（３）中、Ｌ３は単結合又は２価の連結基を表す。前記２価の連結基としてはエチレン性不飽和基とポリアルキレングリコール基とを連結可能であれば特に制限はない。例えば、アルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、カルボニル基、酸素原子、窒素原子、イミノ基、及び水素原子の少なくとも１種を含んで構成される２価の連結基を挙げることができ、カルボニル基、エステル基、アミド基、フェニレン基、炭素数２〜４のアルキレン基、から選ばれる２価の連結基又はこれらの組合せからなる２価の連結基であることが好ましい。
本発明においてＬ３は、単結合、又は、カルボニル基、カルボニルフェニレン基、カルバモイルフェニレン基から選ばれる２価の連結基であることがより好ましい。【００３７】
また、Ｒ３は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基を表す。炭素数１〜３のアルキル基としては、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基を挙げることができる。本発明においては、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の架橋反応性の観点から、Ｒ３は水素原子又はメチル基であることが好ましく、水素原子であることがより好ましい。【００３８】
一般式（４）におけるＬ４は２価の連結基を表すが、その定義及びその好ましい範囲は前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。【００３９】
また本発明においては、前記重合性置換基の少なくとも１つは下記一般式（５）で表される置換基であることが好ましい。これにより、重合性置換基の反応開始がより長波長の光照射によって可能となる。【００４０】
【化７】
0005388126.tif 000008
【００４１】
一般式（５）中、Ｌ５は単結合又は２価の連結基を表す。Ｌ５で表される２価の連結基は、前記Ｌ３における２価の連結基と同様である。
また、ｉは１又は２を表す。【００４２】
一般式（５）中、Ｒ５は置換基を表すが、一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を変化させることができる置換基であれば特に制限はない。中でも一般式（５）で表される重合性置換基の極大吸収波長を長波長側にシフト可能な置換基であることが好ましい。具体的には例えば、ニトロ基、水酸基、アルキルオキシ基、ジアルキルアミノ基、シアノ基、ニトロソ基等を好適に挙げることができる。
ｉが２の場合、２つのＲ５は同一でも異なっていてもよい。【００４３】
また、本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、親水性と架橋反応性の観点から、下記一般式（２）で表される化合物であることが好ましい。【００４４】
【化８】
0005388126.tif 000009
【００４５】
一般式（２）中、Ｌ２は単結合又はメチレン基を表し、ｐは１又は２を表す。ｐが１のときＬ２は単結合であることが好ましく、ｐが２のときＬ２はメチレン基であることが好ましい。
ｑは１〜７０の整数を表す。本発明においては、親水性と架橋反応性の観点から、ｐが１のとき、ｑは１〜６４であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましい。またｐが２のとき、ｑは１〜３２であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。【００４６】
一般式（２）中、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基又は末端に水酸基を有するポリアルキレングリコール基を表す。中でも架橋反応性の観点から、Ｒ２は末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基であることが好ましく、前記一般式（１）で表される置換ポリアルキレングリコール基であることがより好ましい。【００４７】
本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、経時安定性とスフェロイド形成性の観点から、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上１６以下有し、前記ポリアルキレングリコール基が前記一般式（１）で表されるものであって、前記重合性置換基が前記一般式（３）、一般式（４）及び一般式（５）の少なくとも１種で表されるものであることが好ましい。【００４８】
本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体の具体例を以下に例示するが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、下記具体例中のポリアルキレングリコールの重合度（ｎ）は分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量から算出される平均重合度を意味する。また、分岐ポリアルキレングリコール誘導体の重量平均分子量は、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定することができる。【００４９】
【化９】
0005388126.tif 000010
【００５０】
【化１０】
0005388126.tif 000011
【００５１】
【化１１】
0005388126.tif 000012
【００５２】
本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、３以上のポリエチレングリコール基を有する化合物（以下、「マルチアームＰＥＧ」ということがある。例えば、日油（株）製、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥシリーズ、ＨＧＥＯシリーズ等）の末端水酸基に対して、重合性置換基を、通常用いられる方法を用いてエステル結合、エーテル結合等で結合することによって合成することができる。例えば、エステル結合の形成は酸塩化物法、活性エステル法等で行うことができる。【００５３】
本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体は、例えば、後述の感光性組成物の成分とすることができる。また、架橋反応により親水性の架橋体を形成することができる。【００５４】
本発明の感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の少なくとも１種を含有することを特徴とする。本発明の感光性組成物を用いることで、例えば、基材上に高精度に区画化された親水性領域と疎水性領域とを形成することができる。
本発明の感光性組成物においては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を１種単独で含有することもできるし、２種以上を含有することもできる。
また本発明の感光性組成物は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体に加えて、光重合開始剤、溶剤、細胞培養液、界面活性剤、緩衝液、消泡剤、防腐剤等の各種の添加剤等を含んで構成することができる。【００５５】
前記光重合開始剤としては、光照射によって重合反応を開始可能なものであれば特に制限はないが、生細胞に対する障害性が低いものであることが好ましい。具体的には、例えば、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  １８４（いずれもチバ・スペシャリティー・ケミカルズ社製）等を挙げることができ、細胞毒性と水溶性の点からＩＲＧＡＣＵＲＥ  ２９５９が好ましい。【００５６】
前記溶剤としては、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を溶解可能であれば特に制限はない。ここでいう溶解可能とは前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を質量基準で０．１％以上溶解できることをいう。
前記溶剤として具体的には、ベンゼン、トルエン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、クロロホルム等の有機溶媒、及び水を好ましく用いることができる。また、溶剤は１種単独でも２種以上を混合して用いてもよい。【００５７】
本発明の感光性組成物における前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体の含有率としては、例えば０．１〜５０質量％とすることができ、０．１〜２０質量％であることが好ましい。【００５８】
本発明の架橋体は、前記感光性組成物を架橋硬化させて形成されたものである。前記架橋硬化は光照射による重合反応に起因するものであれば特に制限はなく、感光性組成物に応じて適宜架橋硬化条件を選択することができる。【００５９】
本発明の架橋体は、例えば、基材上に形成された前記感光性組成物からなる観光性組成物層を硬化させたものであっても、媒体中で分散状態とした前記感光性組成物を硬化させたものであってもよい。基材上に形成された前記感光性組成物層を硬化させることで、基材上に架橋体からなる親水性領域を形成することができる。また、媒体中で分散状態とした前記感光性組成物を硬化させることで、親水性表面を有する粒子状の架橋体を形成することができる。【００６０】
本発明の基板は、基材と、前記基材上に配置された前記架橋体とを含むことを特徴とする。本発明における基材としては、通常用いられる基材を特に制限なく用いることができる。基材の材質としては、例えば、ガラス、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、シリコーン、ダイヤモンド、金属、及びセラミックス等を挙げることができる。本発明においては、基材と架橋体との接着性の観点から、ガラス又は熱可塑性樹脂であることが好ましく、ガラスであることがより好ましい。【００６１】
また本発明における基材は、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材であることが好ましい。これにより、基材とその上に形成された架橋体との結合安定性を向上させることができる。
また、前記基材は、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で表面処理された基材であることもまた好ましく、アミノ基を有するシランカップリング剤、エチレン性不飽和基を有するシランカップリング剤、及びポリリジンから選ばれる少なくとも１種で表面処理された基材を、細胞接着性タンパク質の少なくとも１種で更に表面処理した基材であることがより好ましい。
表面処理された基材を用いて、基板を構成することにより、例えば、基板上で細胞を培養する場合に、より効率的に細胞集合体を形成することができる。
ここで、細胞接着性タンパク質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、テイネシン及びエラスチン等を挙げることができ、中でも、細胞集合体の形成性の観点から、コラーゲン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチンが好ましく、コラーゲン、ゼラチンがより好ましい。【００６２】
本発明の基板を作製する方法は、例えば、基材上に前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を付与して感光性組成物層を形成する工程と、前記感光性組成物層を、露光処理する硬化工程とを含むことができる。これにより、基材上に、前記架橋体が形成された基板を作製することができる。
本発明の基板を作製する方法は、必要に応じて、前記硬化工程後に加熱工程、洗浄工程、乾燥工程、滅菌工程等を更に含むことができる。【００６３】
本発明において、基材上に感光性組成物層を形成する工程には、特に制限なく通常の薄膜形成方法を適用することができ、例えば、塗布法、ディップコート法、スピンコート法等を好適に適用することができる。
基材上に形成された感光性組成物層の層厚としては、特に制限はなく基板の使用目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５ｎｍ〜１０００μｍとすることができる。特に、本発明の基板を後述の細胞培養基板として使用する場合には、１０ｎｍ〜１０００ｎｍとすることが好ましく、１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。【００６４】
前記基材上に感光性組成物層を形成する工程は、必要に応じて、感光性組成物中の溶剤を除去する工程を含むことができる。前記溶剤を除去する工程としては、前記溶剤に応じて適宜その条件を選択することができ、常温乾燥であっても、加熱乾燥であってもよい。例えば、３０℃〜１５０℃で１分〜１０時間とすることができ、好ましくは３５℃〜１２０℃で３分〜１時間である。【００６５】
前記硬化工程における露光処理は、前記感光性組成物層を全面露光する工程であっても、所望のパターン様に部分露光する工程であってもよい。本発明においては、所望のパターン様に部分露光する工程であることが好ましく、前記部分露光する工程後に更に現像工程を含むことがより好ましい。これにより、前記架橋体からなる親水性領域と架橋体が形成されていない疎水性領域とが、パターン様に基材上に形成された基板を作製することができる。【００６６】
前記所望のパターン様に部分露光する工程は、所望のパターン様に光透過性を有するマスク（フォトマスク）を介して、部分露光する工程であることが好ましい。また、前記マスクを感光性組成物層に密着させて部分露光を行うことにより、より高精度でパターン様に露光することができる。【００６７】
露光に用いる光源としては、前記感光性組成物層を硬化可能な光源であれば特に制限はない。光源として例えば、Ｘ線、電子線、エキシマレーザー、キセノンランプ、メタルハライドランプ、低圧水銀ランプ及び高圧水銀ランプ等を挙げることができる。中でも低圧又は高圧水銀ランプを好適に用いることができ、１０Ｗ〜２０００Ｗの高圧水銀ランプであることが好ましい。
また露光波長及び露光量についても特に制限はなく、前記感光性組成物に応じて適宜選択することができる。露光波長としては、例えば２００ｎｍ〜４００ｎｍとすることができ、２８０ｎｍ〜４００ｎｍであることが好ましい。露光量としては、例えば、０．１ｍＪ／ｃｍ２〜１０００ｍＪ／ｃｍ２とすることができ、１ｍＪ／ｃｍ２〜２００ｍＪ／ｃｍ２であることが好ましく、１０ｍＪ／ｃｍ２〜２０ｍＪ／ｃｍ２であることがより好ましい。【００６８】
前記現像工程は、前記感光性組成物層における未露光領域を基材上から除去できる方法であれば特に制限はなく、例えば、溶剤を用いた洗浄、及び溶剤への浸漬等を挙げることができ、本発明においては、溶剤として水を用いる洗浄及び水への浸漬であることが好ましい。【００６９】
本発明の基板は、例えば、架橋体からなる親水性領域と、基材が露出した疎水性領域とが区画化（パターニング）されて基材上に形成された基板として作製することにより、細胞培養基板として好適に用いることができる。すなわち、前記疎水性領域にのみ細胞が配置され、前記親水性領域には細胞が接着しないことにより、所望のパターン様に細胞が配置可能な細胞培養基板とすることができる。【００７０】
本発明の基板を細胞培養用基板として用いる方法としては、通常の細胞培養方法を制限なく適用することができる。例えば、本発明の基板上に細胞培養培地を配置し、前記細胞培養培地へ所望の細胞を播種した後、所望の細胞に応じて選択される培養条件を適用することで、基板上の疎水性領域に所望の細胞を選択的に配置することができる。【００７１】
本発明における前記細胞は、接着性細胞であれば、種および由来組織は特に限定されない。例えば、生体より採取した直後の細胞および癌化した樹立細胞系等を挙げることができ、好ましくは特定の臓器の機能発現および病態に関連する細胞である。より具体的には、薬物代謝に関連する肝実質細胞、血糖値制御に関連する膵臓β細胞、骨再生に関連する骨芽細胞、軟骨細胞、神経伝達にかかわる神経幹細胞、発毛に関連する毛母細胞、がん細胞、繊維芽細胞、および様々な細胞へ分化誘導できる胚性幹細胞、及び間葉系幹細胞等を挙げることができる。またこれら細胞と相互作用する非実質細胞も用いることができる。
また本発明においては、前記疎水性領域に配置された細胞は、単層を形成していてもよく、また、細胞凝集塊（スフェロイド）を形成していてもよい。【００７２】
各種細胞の通常の細胞培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｍｅｍ−α、ＲＰＭＩ１６４０等を挙げることができ、培養対象となる細胞種に応じて適宜選択される。またこれらの培地に対しては、必要に応じて、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。これらの添加剤の濃度は通常用いられる濃度であればよく、例えば、血清は培地量の５〜１０容量％とすることができる。
また各種細胞の培養条件は、細胞に応じて適宜選択できるが、例えば、５％ＣＯ２、３７℃とすることができる。【００７３】
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、疎水性領域を円状、三角形をはじめとする多角形状、楕円状、ストライプ状等に形成することができる。また親水性領域及び疎水性領域の大きさについても特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。【００７４】
例えば、本発明の基板を前記細胞培養基板として使用する場合、疎水性領域を円状に形成した場合の大きさとしては、直径として５μｍ〜１０００μｍとすることが好ましく、５０μｍ〜５００μｍとすることがより好ましい。また、隣接する疎水性領域を隔てる親水性領域の幅としては、５０μｍ〜５００μｍであることが好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがより好ましい。更に前記親水性領域における層の厚みとしては、１０ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましく１０ｎｍ〜５００ｎｍであることがより好ましい。
本発明における親水性領域及び疎水性領域の形状及び大きさは、上述の硬化工程における露光処理を、マスクを介した露光処理とすることで、容易にかつ高い精度で制御することができる。【００７５】
本発明の基板は、特にスフェロイド形成用の細胞培養用基板として好適に用いることができる。本発明の基板は、前記分岐ポリアルキレングリコール誘導体からなる親水性領域を有するため、高精度にパターニングされた疎水性領域を形成することができる。また、前記親水性領域は細胞非接着性の経時安定性が極めて良好であり、長期間にわたって良好な機能性を示すスフェロイドを維持することが可能となる。すなわち、スフェロイドを形成する各実質細胞に特異的な機能が維持されうる。例えば、肝細胞にあっては高レベルの肝細胞機能（例えば、高レベルのアルブミン産生能、薬物代謝活性）、膵β細胞にあってはインスリン分泌機能、心筋細胞にあっては拍動運動機能等が長期間にわたって維持される。
このようなスフェロイドが形成された基板は、例えば、各種細胞に影響を及ぼし得る環境又は物質のスクリーニングに用いることができる。各種細胞に対する影響は、スフェロイドの形態の変化や産生物（例えば、肝細胞におけるアルブミン、モデル薬物の代謝生成物等）の産生能の変化をモニターすることで評価することができる。【００７６】
本発明の基板においては、前記親水性領域を、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上有する化合物を用いて形成することで、形成されたスフェロイドの経時安定性が顕著に向上する。【００７７】
本発明の基板をスフェロイド形成用基板として使用する場合、疎水性領域を例えば、円状に形成した場合の大きさとしては、直径として５μｍ〜１０００μｍとすることが好ましく、５０μｍ〜５００μｍとすることがより好ましい。また、隣接する疎水性領域を隔てる親水性領域の幅としては、５０μｍ〜５００μｍであることが好ましく、１００μｍ〜２００μｍであることがより好ましい。また親水性領域における層の厚みとしては１０ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好ましく１０ｎｍ〜５００ｎｍがより好ましい。
親水性領域と疎水性領域とを前記大きさで構成することにより、機能性の高いスフェロイドをより効率的に作成することができ、更により長期に渡って維持することが可能となる。【００７８】
本発明の基板をスフェロイド形成用基板として用いる場合、前記疎水性領域に予めフィーダー細胞を配置することが好ましい。すなわち本発明においては、本発明の基板上の疎水性領域にフィーダー細胞層を形成し、形成されたフィーダー細胞層上で、該細胞層を形成する細胞とは異なる細胞、好ましくは実質細胞を培養することが好ましい。
予めフィーダー細胞層を形成することで、実質細胞のスフェロイド形成がより効率的に進行する。前記フィーダー細胞は、スフェロイドを形成させる細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、肝細胞や軟骨細胞のスフェロイドを形成する場合には、フィーダー細胞としてＣＯＳ−１細胞、血管内皮細胞（例えば、大日本製薬製「ヒト臍帯静脈血管内皮細胞」）、繊維芽細胞等を好適に用いることができる。【００７９】
また、本発明の基板上でスフェロイドを形成する場合、通常の培養条件で数十分〜４８時間程度培養を行うことでスフェロイドを形成することができる。更に培地中の細胞の播種濃度としては例えば、１×１０４〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとすることができ、１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが好ましい。
【実施例】
【００８０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り「％」は質量基準であり、平均分子量は重量平均分子量である。【００８１】
（実施例１）
〜分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）の合成〜
４−アジド−安息香酸１２ｇ（９３．６ｍｍｏｌ）を４０ｍＬの塩化チオニルに溶解し、１．５時間、加熱還流した。反応混合物を減圧で濃縮、少量のヘキサンを加えて再度減圧で濃縮した後、真空下で乾燥し、白色固体として目的物の４−アジド−安息香酸クロリド９．３ｇ（５１．２ｍｍｏｌ、収率７０％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.11-8.15 (2H, ｍ), 7.11-7.16 (2H, m).【００８２】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた４−アジド−安息香酸クロリド３６３ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).【００８３】
（実施例２）
実施例１において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに下記表１に示したマルチアームＰＥＧを用いた以外は、実施例１と同様にして分岐ポリアルキレングリコール誘導体を合成した。収率、性状等を表１に示した。【００８４】
【表１】
0005388126.tif 000013
【００８５】
（実施例３）
実施例１において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに下記表２に示したマルチアームＰＥＧを用いた以外は、実施例１と同様にして分岐ポリアルキレングリコール誘導体を合成した。収率、性状等を表２に示した。【００８６】
【表２】
0005388126.tif 000014
【００８７】
（比較例１）
実施例１において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに下記表３に示したマルチアームＰＥＧを用いた以外は、実施例１と同様にして分岐ポリアルキレングリコール誘導体を合成した。収率、性状等を表３に示した。【００８８】
【表３】
0005388126.tif 000015
【００８９】
（実施例４）
５−アミノ−サリチル酸１５．３ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−サリチル酸を白色固体として１２．０ｇ（６７．０ｍｍｏｌ、収率＝６７％）得た。
５−アジド−サリチル酸及び４−アジド安息香酸の紫外吸収スペクトルを図１に示した。溶媒として光学分析用メタノールを用いて、濃度は１μｍｏｌ／Ｌとして測定した。また併せて３６５ｎｍにおける吸光度を表４に示した。
1H-NMR(DMSO-d6) δ: 11.14(1H, bs), 7.41 (1H, d, J = 3.0 Hz), 6.88 (1H, dd, J = 8.5, 3.0 Hz), 6.68 (1H, d, J = 8.4 Hz).【００９０】
得られた５−アジド−サリチル酸５ｇ（２７．９ｍｍｏｌ）を塩化チオニル５０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 2.9 Hz), 7.26 (1H, dd, J = 8.8, 2.9 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.8 Hz).【００９１】
【表４】
0005388126.tif 000016
【００９２】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−サリチル酸クロリド３５８ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）１．７７ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).【００９３】
（実施例５）
実施例４において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は実施例４と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＢ２０Ｋ）１．７２ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).【００９４】
（実施例６）
５−アミノ−２−ニトロ安息香酸１８．１ｇ（０．１ｍｏｌ）を蒸留水８０ｍＬと濃塩酸２０ｍＬの混合溶液に懸濁させ、室温で３０分攪拌した。混合溶液を氷浴中で冷却した後、亜硝酸ナトリウム６．９ｇ（０．１ｍｏｌ）の水溶液１０ｍＬを溶液の反応液の液温が５℃を超えないような速度で滴下し、そのまま１時間攪拌した。続いて、アジ化ナトリウム７．１５ ｇ（０．１１ｍｏｌ）の水溶液３０ｍＬを反応液の液温が１０℃を超えない速度で滴下した。氷浴を外して室温に戻しつつ、気泡が発生しなくなるまで激しく攪拌した。生成した沈殿を濾取し、さらに沈殿を蒸留水で洗浄した。得られた固体は、暗所で風乾した後、減圧下で完全に乾燥し、５−アジド−２−ニトロ安息香酸を白色固体として１９．２ｇ（９２．４ｍｍｏｌ、収率＝９２％）を得た。
５−アジド−２−ニトロ安息香酸の紫外吸収スペクトルを図１に示した。溶媒として光学分析用メタノールを用いて、濃度は１μｍｏｌ／Ｌとして測定した。また併せて３６５ｎｍにおける吸光度を表４に示した
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 13.99(1H, bs), 8.09-8.06 (1H, m), 7.45-7.42 (2H, m).【００９５】
得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸１．０ｇ（４．８ｍｍｏｌ）を塩化チオニル１０ｍＬに懸濁し、７０℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで放冷し、過剰の塩化チオニルを減圧で除き、５−アジド−サリチル酸クロリドの赤色固体を定量的に得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 8.10-8.07 (1H, m), 7.46-7.42 (2H, m).【００９６】
次に、３ｍＬのジクロロメタン（脱水）に、トリエチルアミン８１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン１４７ｍｇ（１．２ｍｏｌ）を加え、氷浴で冷却しながら攪拌した。この溶液に、上記で得られた５−アジド−２−ニトロ安息香酸クロリド４１７ｍｇ（２ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のジクロロメタン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有する化合物）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）１．８１（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).  【００９７】
（実施例７）
実施例６において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりにＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は実施例６と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＣ２０Ｋ）１．７１ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).【００９８】
（実施例８）
アクリロイルクロリド１８１ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ、マルチアームＰＥＧの末端ＯＨ基に対して５モル当量）のベンゼン（脱水）溶液（５ｍＬ）を滴下し、そのまま５分攪拌を続けた後、反応容器を遮光し、マルチアームＰＥＧ（日油（株）製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＰＴＥ−２００００、４つのポリエチレングリコール基を有するペンタエリスリトール誘導体）２ｇ（０．１ｍｍｏｌ）のベンゼン（脱水）溶液（２０ｍＬ）をゆっくり滴下した。反応溶液を氷浴からはずし、そのまま室温で１８時間攪拌した。反応混合物を減圧で濃縮し、ベンゼンを加えて懸濁させたものをろ過して塩を除いた後、再び減圧で濃縮した。粗生成物を少量のベンゼンに溶解し、０℃に冷却したイソプロピルエーテルに滴下して得られた沈殿を濾取する工程を３回繰り返して、得られた白色固体を減圧下で乾燥し、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).【００９９】
（実施例９）
実施例８において、マルチアームＰＥＧとしてＰＴＥ−２００００の代わりに、ＨＧＥＯ−２００００（日油（株）製、８つのポリエチレングリコール基を有するヘキサグリセリン誘導体）を用いた以外は、実施例８と同様にして、目的物とする分岐ポリアルキレングリコール誘導体（８ＰＤ２０Ｋ）１．７４ｇ（収率８５％）を得た。
１Ｈ-ＮＭＲの積分比より算出した末端水酸基の重合性置換基への置換率は、８５％であった。
1H-NMR (CDCl3) δ: 8.05 (8H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (8H, d, J = 8.6 Hz), 4.46 (8H, t, J = 4.9 Hz), 3.89-3.39 (2145H, m).【０１００】
（実施例１０）
以下の作業は、すべてイエロールーム内で行った。
実施例１で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（マルチアームＰＥＧ−アジド：４ＰＡ２０Ｋ）をトルエンに溶解し、感光性組成物Ａとして４ＰＡ２０Ｋのトルエン溶液（１％）を調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ａを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた（図２）。【０１０１】
（実施例１１）
実施例１０において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、アミノプロピルシランコートガラス（松浪硝子工業（株）製。ＡＰＳコートＮＯ．１カバーガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＡＰＳコートガラス」と略す）を用いた以外は、実施例１０と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１０２】
（実施例１２）
実施例１０において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＭＡＳコートガラス（松浪硝子工業（株）製）を用いた以外は、実施例１０と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１０３】
（実施例１３）
実施例１０において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にコラーゲンをさらにコーティングした「コラーゲンコートガラス」を用いた以外は、実施例１０と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、コラーゲンコートガラスは、ＰＬＬコートガラス上にブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．１％水溶液を４００μL滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥する工程を２回繰り返して作製した。【０１０４】
（実施例１４）
実施例１０において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＰＬＬコート上にゼラチンをさらにコーティングした「ゼラチンコートガラス」を用いた以外は、実施例１０と同様にして基板を作製し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。
尚、ゼラチンコートガラスは、ＰＬＬコートガラスを用い、ゼラチン（新田ゼラチン社製）の０．１％溶液を４００μL滴下し、スピンコート法（３５０ｒｐｍ×５秒＋５００ｒｐｍ×５秒＋１０００ｒｐｍ×１０秒＋１５００ｒｐｍ×１０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）にて成膜した後、室温で乾燥して作製した。【０１０５】
（実施例１５）
実施例１３において、コラーゲンコートガラスの作製方法を、ＰＬＬコートガラスをブタＩ型コラーゲン（日本ハム（株）製）の０．０２％水溶液に３時間浸漬後、脱イオン水の流水で洗浄、乾燥させる方法に変更した以外は、実施例１３と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１０６】
（実施例１６）
実施例１３、実施例１４、実施例１５において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＡＰＳコートガラスを用いた以外は、実施例１３、実施例１４、実施例１５とそれぞれ同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、いずれの基板においても良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１０７】
（実施例１７）
実施例１３、実施例１４、実施例１５において、基材としてＰＬＬコートガラスに代えて、ＭＡＳコートガラスを用いた以外は、実施例１３、実施例１４、実施例１５とそれぞれ同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、いずれの基板においても良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１０８】
（実施例１８）
実施例１０において、露光時間を１０秒に変更した以外は、実施例１０と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１０９】
（実施例１９）
実施例１０において、感光性組成物Ａに代えて、マルチアームＰＥＧ−アジド（４ＰＡ２０Ｋ）の濃度を０．５％とした感光性組成物Ｂを用いた以外は、実施例７と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１１０】
（実施例２０）
実施例１０において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体として４ＰＡ２０Ｋに代えて、実施例２、実施例３、及び実施例４〜７で合成した各種の分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いた以外は実施例１０と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１１１】
（実施例２１）
実施例１０において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、実施例６で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件として高圧水銀灯（２００Ｗ）で３秒間とした以外は、実施例１０と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１１２】
（実施例２２）
実施例１０において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、実施例６で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、実施例１０と同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１１３】
（実施例２３）
実施例１１〜１７において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）に代えて、実施例４で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＢ２０Ｋ）又は実施例６で合成した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＣ２０Ｋ）を用い、露光条件をフォトマスク上にフィルター（シグマ光機（株）製、ＵＴＶＡＦ３６Ｕ）を配置して、高圧水銀灯（２００Ｗ）で１０秒間の露光とした以外は、実施例１１〜１７とそれぞれ同様の方法で基板を作製した。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡により観察したところ、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１１４】
（実施例２４）
実施例８及び実施例９で作製した分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＤ２０Ｋ、８ＰＤ２０Ｋ）の濃度が１％であって、光重合開始剤としてＩＲＧＡＣＵＲＥ２９５９の濃度が０．０５％となるようにトルエンに溶解して、感光性組成物Ｄを調製した。基材としてポリ−Ｌ−リジンコートスライドガラス（松浪硝子工業（株）製。白切放ＮＯ．１スライドガラス丸型２１ｍｍΦ。以下「ＰＬＬコートガラス」と略す）を使用し、ＰＬＬコートガラス上に、感光性組成物Ｄを１１０μＬ滴下後、スピンコート法（５００ｒｐｍ×５秒＋３０００ｒｐｍ×２０秒＋６０００ｒｐｍ×１秒）により成膜し、常温で放置して乾燥させた。これに、石英ガラス製フォトマスク（直径１００μｍの円形パターンが多数配置されたもの）を密着させ、高圧水銀灯（２００Ｗ）を用いて４０秒間露光を行った後、脱イオン水で洗浄（現像工程：流水１５秒間＋浸漬２０分間）した。常温で乾燥し、表面に微細加工された親水性の架橋体を有する基板を得た。当該基板の表面を、位相差光学顕微鏡（倍率×１００）により観察したところ、いずれの分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いた場合にも、良好なマイクロパターンが高精度に形成されていることが確認できた。【０１１５】
（実施例２５）
〜基板の滅菌作業〜
実施例１０〜１２、１８〜２４で作製した基板（表面にコラーゲンコート又はゼラチンコートを施さなかった基板）については、オートクレーブ（１２１℃、２０分）による滅菌作業を行った。
また実施例１３〜１７で作製した基板（表面にコラーゲンコート又はゼラチンコートを施しているもの）に関しては、クリーンベンチに設置されているＵＶランプを１５分間照射し、滅菌作業を行った。【０１１６】
〜スフェロイド形成〜
実施例１０〜２４において作製した後、滅菌作業を行った基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭを添加し、ウシ関節軟骨細胞（コンドロサイト）を細胞濃度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養したところ、いずれの実施例で作製した基板を用いた場合においても、２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ軟骨細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。代表的な顕微鏡写真（倍率×４０）を図３に示した。【０１１７】
（実施例２６）
実施例２５と同様にして滅菌作業を行った実施例１０〜２４で作製した基板を、ＦＡＬＣＯＮ社製１２ウェルプレート底面にセットし、培地としてＤＭＥＭを添加し、ウシ動脈血管内皮細胞（株名：ＨＨ）を細胞濃度５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）にて播種した。培養条件５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養したところ、基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に接着した血管内皮細胞集合体が確認できた（図４）。
続けて、初代肝実質細胞をラットから常法により採取し、細胞濃度５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）で播種した。５時間後に培地交換を行い、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養したところ、基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ肝細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。代表的な顕微鏡写真（倍率×４０）を図５に示した。【０１１８】
（実施例２７）
〜軟骨細胞スフェロイドアレイの染色〜
通常のカルチャーディッシュで培養したウシ関節軟骨細胞（コンドロサイト）を２％トリプシン処理し、細胞懸濁液の状態でＳＩＧＭＡ社製ＰＫＨ−２６キットにて染色した。細胞懸濁液はＰＢＳ（−）またはタンパク質不含の培地で洗浄後、細胞数をカウントし、２×１０７ｃｅｌｌｓに調製した。これを遠心分離（４００Ｇ、５分）し、上澄みを除去し、キット中のＤｉｌｕｅｎｔＣ  １ｍＬにて分散させた。ここに４×１０−６ＭのＰＫＨ−２６染色液を調製して、細胞懸濁液に１ｍＬ加えた。これを室温で２〜５分間静置することで反応させ、タンパク質含有の培地にて反応を止めた。この後、タンパク質含有の培地で３回の洗浄をし、実施例２５と同様にして播種を行った。培養後２４時間以内に基材上に形成した疎水性領域に対応するパターン状に並んだ軟骨細胞の細胞塊（スフェロイド）が得られた。これを蛍光顕微鏡（倍率×４０）で観察したところ、スフェロイドが染色された状態で観察された。すなわち、スフェロイドは軟骨細胞によって形成されていた。【０１１９】
（実施例２８）
実施例１０で作製した基板、実施例２０において、分岐アルキレングリコール誘導体として４ＰＡ２０Ｋ、４ＰＢ２０Ｋ、４ＰＣ２０Ｋ、８ＰＡ２０Ｋ、８ＰＢ２０Ｋ、及び８ＰＣ２０Ｋを用いてそれぞれ作製した基板、並びに実施例２４で作製した基板を用いて、実施例２５と同様にしてスフェロイドを形成した。
得られたスフェロイドを、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を更に継続し、スフェロイドの状態を顕微鏡で観察した。
いずれの基板を用いた場合も、１日後〜４週間後のいずれにおいても、区画化されたスフェロイドが維持されていた。また、スフェロイドを形成していない細胞は浮遊状態のままで、スフェロイド間の親水性領域への付着は観察されなかった。
代表的例として分岐アルキレングリコール誘導体として８ＰＡ２０Ｋを用いた場合の顕微鏡写真として、１日後（図６、１００倍）、３日後（図７、４０倍）、４週間後（図８、４０倍）をそれぞれ示した。【０１２０】
（実施例２９）
実施例２０において、分岐アルキレングリコール誘導体として３ＰＡ５Ｋ、及び３ＰＡ２０Ｋを用いてそれぞれ作製した基板を用いて、実施例２５と同様にしてスフェロイドを形成した。
得られたスフェロイドを、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を更に継続し、スフェロイドの状態を顕微鏡で観察した。
３日後までは良好に区画化されたスフェロイドが維持されたが、４週間後にはスフェロイド間の親水性領域に付着した軟骨細胞が観察された。【０１２１】
（比較例２）
実施例１０において、分岐ポリアルキレングリコール誘導体（４ＰＡ２０Ｋ）の代わりに、比較例１で合成したポリアルキレングリコール誘導体（２ＰＡ２Ｋ、及び２ＰＡ３Ｋ）を用いて、実施例１０と同様にして基板を作製した。
次いで得られた基板を用いて実施例２５と同様にして、スフェロイドを形成した。得られたスフェロイドを、培養条件５％ＣＯ２、３７℃で培養を更に継続し、スフェロイドの状態を顕微鏡で観察した。
１日後にはスフェロイド間の親水性領域に付着した軟骨細胞が観察され、区画化されたスフェロイドを維持することができなかった。
代表的例として分岐アルキレングリコール誘導体として２ＰＡ３Ｋを用いた場合の顕微鏡写真として、１日後（図９、１００倍）、３日後（図１０、４０倍）、４週間後（図１１、４０倍）をそれぞれ示した。【０１２２】
（実施例３０）
実施例２５において、コンドロサイトの代わりに下記表５に示した細胞種を用いて、実施例２５と同様にしてスフェロイドを形成した。形成されたスフェロイドを下記評価基準に従って評価した。結果を表５に示した。
＜評価基準＞
＋＋＋  ：  極良好
＋＋    ：  良好
＋      ：  普通【０１２３】
【表５】
0005388126.tif 000017
【０１２４】
上記の結果から、本発明の分岐ポリアルキレングリコール誘導体を含む感光性組成物を用いることで、高精度にパターニングされた疎水性領域と親水性領域とを基材上に有する基板を形成できることがわかる。
また、本発明の基板を用いることで、高精度にパターニングされたスフェロイドを効率よく形成することができることが分かる。
更に、本発明の基板を用いることで、形成されたスフェロイドを長期に渡って経時安定的に維持することができることがわかる。特に、末端に重合性置換基を有するポリアルキレングリコール基を４以上有する分岐ポリアルキレングリコール誘導体を用いることで、形成されたスフェロイドの経時安定性が飛躍的に向上することが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
0005388126.tif 000024
【図５】
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【図６】
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【図７】
0005388126.tif 000027
【図８】
0005388126.tif 000028
【図９】
0005388126.tif 000029
【図１０】
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【図１１】
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