(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスのゲノムのＥ１領域の一部を含み、かつ、５´ＩＴＲを含まない補足要素を含んでなる補足細胞であって、
Ｅ１領域の一部が、Ｅ１Ａ領域の一部と、初期Ｅ１Ｂタンパク質をコードするＥ１Ｂ領域の全体とを含んでなり、
Ｅ１Ａ領域の一部が天然プロモーターを欠き、
前記Ｅ１Ａ領域の一部が、非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパク質により誘導しうる非アデノウイルスプロモーターのコントロール下におかれてなるＥ１Ａタンパク質をコードする領域を含み、
上記補足要素が欠陥アデノウイルスベクターをトランスで補うことができ、かつ、上記補足要素が、上記補足細胞のゲノムに組込まれているかまたは発現ベクター中に挿入されてなる、補足細胞。
【請求項２】
欠陥アデノウイルスベクターを補う補足要素を含んでなる補足細胞であって、
該補足要素が、発現ベクター中に挿入されてなるか、または、補足細胞のゲノムに組込まれており、かつ、該補足要素が、Ｅ１遺伝子産物をコードしているアデノウイルスのゲノムの断片を含み、かつ、５´ＩＴＲをコードしているアデノウイルスのゲノムの断片を含まず、
Ｅ１遺伝子産物をコードしているアデノウイルスのゲノムの断片が、Ｅ１Ａ領域の一部と、初期Ｅ１Ｂタンパク質をコードするＥ１Ｂ領域の全部とを含んでなり、
Ｅ１Ａ領域の一部が天然プロモーターを欠き、
前記ＥＡ１領域の一部が、ＳＶ４０ウイルス、ＴＫ−ＨＳＶ−１およびＰＧＫ遺伝子プロモーターからなる群から選択される非アデノウイルスプロモーターのコントロール下におかれてなるＥ１Ａタンパク質をコードする領域を含む、補足細胞。
【請求項３】
Ｅ４タンパク質をコードする領域を少なくとも含むアデノウイルスのゲノムのＥ４領域の全部または一部を含んでなり、かつ
Ｅ４領域が、Ｅ４タンパク質を発現させる適当な要素のコントロール下におかれてなる、請求項１または２に記載の補足細胞。
【請求項４】
前記アデノウイルスゲノムのＥ１領域の一部または前記Ｅ１遺伝子産物をコードしているアデノウイルスゲノムの断片および前記Ｅ４領域が、イヌ、トリおよびヒトアデノウイルスから選択されるアデノウイルスのゲノムの部分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の補足細胞。
【請求項５】
前記アデノウイルスゲノムのＥ１領域の一部または前記Ｅ１遺伝子産物をコードしているアデノウイルスゲノムの断片および前記Ｅ４領域が、ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分である、請求項４に記載の補足細胞。
【請求項６】
前記アデノウイルスゲノムのＥ１領域の一部または前記Ｅ１遺伝子産物をコードしているアデノウイルスゲノムの断片が、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド４０３４
にわたるヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分である、請求項５に記載の補足細胞。
【請求項７】
前記Ｅ４領域がヌクレオチド３２８００〜ヌクレオチド３５８２６にわたるヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムのＥ４領域の部分を含んでなる、請求項５または６に記載の補足細胞。
【請求項８】
Ｅ１Ａタンパク質をコードする領域を含むＥ１Ａ領域の一部が、下記のアデノウイルスベクターによりコードされる転写をトランス活性化するタンパク質により誘導しうる非アデノウイルスプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の補足細胞であって、
前記アデノウイルスベクターが、補足細胞中における増殖に必要な複製に欠陥がある、アデノウイルスベクターであって、
５´から３´にかけて、５´ＩＴＲ、包膜化領域、Ｅ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域、および３´ＩＴＲを含んでなるアデノウイルスのゲノムから、
Ｅ１Ａ領域の全部または一部、Ｅ１Ｂ領域の全部または一部、およびＥ４領域の全部または一部、および必要に応じてＥ３領域の全部または一部の欠失（ここでＥ４の欠失は、Ｅ４機能の補足が必要となるようにＥ４機能を妨げている）
により誘導されてなる、アデノウイルスベクターであり、
転写のトランス活性化剤である非アデノウイルス性タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでなり、その遺伝子が宿主細胞で上記タンパク質の発現に必要な要素のコントロール下におかれてなる、アデノウイルスベクターである、補足細胞。
【請求項９】
Ｅ１Ａタンパク質をコードする領域を含むＥ１Ａ領域の一部が、転写をトランス活性化するSaccharomyces cerevisiae Gal4 タンパク質により誘導しうる非アデノウイルスプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項８に記載の補足細胞。
【請求項１０】
選択マーカーをコードする遺伝子をさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の補足細胞。
【請求項１１】
選択マーカーをコードする遺伝子がプロマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするものである、請求項１０に記載の補足細胞。
【請求項１２】
選択マーカーをコードする遺伝子が、野生型アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域によりコードされる転写をトランス活性化するタンパク質により誘導されうるプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項１０または１１に記載の補足細胞。
【請求項１３】
選択マーカーをコードする遺伝子が、野生型アデノウイルスのゲノムのＥ２領域のプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項１２に記載の補足細胞。
【請求項１４】
薬学的観点から許容される細胞系に由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の補足細胞。
【請求項１５】
Vero、ＢＨＫ、Ａ５４９、ＭＲＣ５、Ｗ１３８およびＣＨＯ系から選択される細胞系に由来する、請求項１４に記載の補足細胞。
【請求項１６】
ヒト胚網膜細胞に由来する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の補足細胞。
【請求項１７】
アデノウイルスベクターを含んでなるアデノウイルス粒子の生産方法であって、
前記アデノウイルスベクターが、補足細胞中における増殖に必要な複製に欠陥がある、アデノウイルスベクターであって、
５´から３´にかけて、５´ＩＴＲ、包膜化領域、Ｅ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域、および３´ＩＴＲを含んでなるアデノウイルスのゲノムから、
Ｅ１Ａ領域の全部または一部、Ｅ１Ｂ領域の全部または一部、およびＥ４領域の全部または一部、および必要に応じてＥ３領域の全部または一部の欠失（ここでＥ４の欠失は、Ｅ４機能の補足が必要となるようにＥ４機能を妨げている）
により誘導されてなる、アデノウイルスベクターであり、
(i) 前記アデノウイルスベクターが、トランスフェクトされた補足細胞を得るために、上記アデノウイルスベクターをトランスで補える補足細胞中に導入され、
ここで、請求項３〜７および１０〜１６のいずれか一項に記載の補足細胞が用いられ、
(ii) 上記トランスフェクトされた補足細胞がアデノウイルス粒子の生産を行うために適した条件下で培養され、
(iii) 上記アデノウイルス粒子が細胞培養物中で回収される、
ことを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は宿主真核細胞または生物への対象遺伝子の移入と発現とが可能な新規欠陥アデノウイルスベクター、およびこれら組換えアデノウイルスのゲノムから欠失された必須ウイルス機能をイントランス(in trans)で補う新規補足系に関する。本発明は、特にヒトにおける、遺伝子治療の展望上特別な関心がもたれるものである。
【０００２】
アデノウイルスは広い宿主範囲を示すＤＮＡウイルスである。それらは多数の動物種および多数の細胞で実証されている。ゲノム配列に関して特に異なる多数の血清型が存在する。ほとんどのヒトアデノウイルスはほんのわずかに病原性であり、通常良性の症状を示すだけである。
【０００３】
アデノウイルスは特定レセプターを介して受容宿主細胞に入り、その後それはエンドソーム中に取り込まれる。それらの酸性化が、ウイルスのコンホメーション変化と細胞質中へのその出現に寄与している。複製サイクルの第一工程に必要とされるある種のウイルスタンパク質に関係するウイルスＤＮＡが、次いで感染細胞の核に入り、そこでその転写が細胞酵素により開始される。アデノウイルスＤＮＡの複製は感染細胞の核で起こり、細胞複製を必要としない。新たなビリオンのアセンブリーも核で起こる。第一段階において、ウイルスタンパク質は二十面体構造の中空キャプシドを形成するように集合化して、それからアデノウイルスＤＮＡが包膜(encapsidated)される。ウイルス粒子またはビリオンが感染細胞から放出され、他の受容細胞に感染することができる。
【０００４】
アデノウイルスの感染サイクルは二つの工程、即ち：
‐アデノウイルスゲノムの複製の開始の前であって、かつウイルスＤＮＡの複製および転写に関与する調節タンパク質の生産が行なわれる前期、および
‐構造タンパク質の合成を導く後期
で生じる。
【０００５】
一般的には、アデノウイルスゲノムは、３０以上のタンパク質をコードする配列を含んだ、長さ約３６kbの二本直鎖ＤＮＡ分子からなる。その両末端には、ＩＴＲ（逆方向末端反復）と呼ばれる、血清型に応じた１００〜１５０ヌクレオチドの短逆方向配列が存在している。ＩＴＲはアデノウイルスゲノムの複製に関与する。約３００ヌクレオチドの包膜化領域は、ゲノムの５´末端において５´ＩＴＲの直後に位置している。
【０００６】
初期遺伝子は、アデノウイルスゲノム中に分散した、Ｅ１〜Ｅ４（Ｅは“初期”を表す）と表示される４領域に分布している。初期領域はそれら自体のプロモーターを有した少くとも６つの転写単位を含んでいる。初期遺伝子の発現はそれ自体調節され、一部の遺伝子は他よりも前に発現される。３つの領域Ｅ１、Ｅ２およびＥ４は各々ウイルス複製にとり必須である。このため、アデノウイルスがこれら機能の１つに欠陥がある場合、即ちアデノウイルスがこれら領域の１つによりコードされる少くとも１つのタンパク質を生産できない場合には、このタンパク質はイントランスでそれに供給されねばならない。
【０００７】
Ｅ１初期領域はアデノウイルスゲノムの５´末端に位置し、２つのウイルス転写単位Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂを各々含んでいる。この領域はウイルスサイクルに非常に初期に関与するタンパク質をコードし、アデノウイルスのほぼすべての他の遺伝子の発現にとり必須である。特に、Ｅ１Ａ転写単位は、他のウイルス遺伝子の転写をトランス活性化するタンパク質をコードしており、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２ＢおよびＥ４領域のプロモーターからの転写を誘導する。
【０００８】
２つの転写単位Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂをもまた含んだＥ２領域の産物は、ウイルスＤＮＡの複製に直接関与している。この領域は、一本鎖ＤＮＡと強い親和性を示す７２kDa タンパク質と、ＤＮＡポリメラーゼの合成とを特に支配している。
【０００９】
Ｅ３領域はウイルスの複製にとり必須ではないがアデノウイルス感染の際に宿主免疫反応の阻害に関与するらしい少くとも６つのタンパク質をコードしている。特に、ｇｐ１９kDa 糖タンパク質は、宿主細胞毒性Ｔ細胞による感染細胞の細胞溶解に関与するＣＴＬ応答を妨げると考えられる。
【００１０】
Ｅ４領域はアデノウイルスゲノムの３´末端に位置する。そして、それは後期遺伝子の発現、後期メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性、前期から後期への移行、そして更に細胞タンパク質合成の阻害に関与する多数のポリペプチドをコードしている。
【００１１】
ウイルスＤＮＡの複製が開始されると、後期遺伝子の転写が始まる。これらはアデノウイルスゲノムの大部分を占め、初期遺伝子の転写単位と一部重複している。しかし、それらは異なるプロモーターから別のスプライシング様式に従い転写され、そのため同一配列が異なる目的に用いられる。後期遺伝子のほとんどは主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から転写される。このプロモーターは長鎖一次転写産物の合成を行い、その後これは約２０のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形で成熟化され、そこからビリオンのキャプシドタンパク質が生産される。キャプシドを構成する構造タンパク質IXをコードする遺伝子は、アデノウイルスゲノムの５´末端に位置し、その３´末端でＥ１Ｂ領域と重っている。タンパク質IX転写単位は、Ｅ１Ｂ転写単位と同じ転写終結シグナルを利用している。
【００１２】
いくつかのアデノウイルスは現在遺伝的および生化学的にかなり特徴付けされている。ヒトアデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）の場合、その配列は参照番号M73260としてGenebankデータバンクで開示されている。アデノウイルスゲノムで異なる遺伝子を正確に位置決めすることができた。そこでは５´から３´にかけて１０３bp５´ＩＴＲ、その後に約３００bp包膜化領域(Hearing et al.,1987,J.Virol.,61,2555-2558)、次いでその位置が図１に示されている初期および後期領域と、最後に３´ＩＴＲを含んでいる。
【００１３】
アデノウイルスが、対象遺伝子移入用の選択ベクターとしうる有利な特徴を備えていることは、前記から明らかである。多数の組換えアデノウイルスが文献に記載されている(Rosenfeld et al.,1991,Science,252,431-434；Rosenfeld et al.,1992,Cell,68,143-155)。一般的に言えば、それらはＡｄ５から誘導され、環境および宿主生物でのそれらの伝播を避けうるようにＥ１機能に欠陥がある。加えて、非必須Ｅ３領域も欠失させることができる。外来配列が、Ｅ１またはＥ３領域に代えて組み込まれる。
【００１４】
このため、これらの欠陥アデノウイルスは、ウイルス複製に必須であるＥ１機能をイントランスで補うセルラインでのみ増殖させることができる。現在、使用しうる唯一の補足系は胚腎臓系２９３(Graham et al.,1977,J．Gen ．Virol.,36,59-72)であって、これは特にウイルスゲノムの５´末端を含んだＡｄ５ゲノムの断片の染色体への組込みにより得られ、それによって系２９３はＥ１機能に欠陥があるアデノウイルスを補う。２９３細胞は欠陥組換えアデノウイルスにおいてまた見出される配列、例えば５´ＩＴＲと、包膜化領域と、初期タンパク質をコードする配列を含んだＥ１Ｂ領域の３´末端側の部分とを含んでいる。
【００１５】
アデノウイルスを用いた遺伝子移入の実施の可能性は現在確立されている。しかしながら、それらの安全性の問題はなお解決されていない。実際に、それらは培養で一部の細胞系を形質転換することができ、少くとも一部の血清型において、本質的にＥ１とおそらくＥ４領域におけるアデノウイルスゲノムの発現産物の一部のものとしての潜在的な発癌性がもたらされる。更に、従来の欠陥アデノウイルス（特に組換えアデノウイルス）と、天然もしくは野生型アデノウイルス（宿主生物の偶発的汚染または日和見感染に起因する）または補足系２９３に組込まれたアデノウイルスゲノム断片との間の遺伝子組換えの蓋然性は微々たるものではない。実際に、１回の組換え現象は、Ｅ１機能を回復させ、環境に伝播しうる非欠陥組換えアデノウイルスを生じるのに十分である。欠陥アデノウイルスと同様の細胞に同時感染する野生型天然アデノウイルスがＥ１機能に関して前者を補って、２ウイルスの同時伝播を起こすという状況も考えられるさらに、一部タイプの真核細胞はＥ１Ａ様活性を示すタンパク質を生産し、これはそれらに感染する欠陥アデノウイルスを部分的に補うこともできる。
【００１６】
このため、有効な治療方法がないin vivo の重度の遺伝子欠陥を修正して、ある障害を治療するための遺伝子治療に用いるにあたり、最少の危険性を示し、自由に扱える有用なアデノウイルスベクターが望まれている。ヒトに適用される遺伝子治療の成否は、それを入手できるかどうかに依存している。
【００１７】
更に、系２９３の入手に関しては疑問が存在している。その疑問により、それに由来するヒト用とされる産物の受容性が損なわれる傾向にある。ヒト用の組換えアデノウイルス粒子を生産するためには、起源および由来が正確に知られている、自由に扱える補足系があることが有用である。
【００１８】
今般、（１）アデノウイルスゲノムのある特定領域が欠失された、インビボでの外来ヌクレオチド配列の移入により適した新規欠陥アデノウイルスベクター、および（２）薬学的観点から許容され、このためヒト用の産物の生産上要求されるすべての安全性を示す、新規の特徴付けされた補足系が見出された。
【００１９】
これら新規ベクターの価値は、それらが１以上の大きな対象遺伝子の挿入が可能な高いクローニング能力を示し、かつ使用上最大の安全性を示すことである。有害変異は、対象遺伝子を移入および発現しうるそれらの能力を損うことなく、アデノウイルスを自律複製および細胞形質転換できなくする。
【００２０】
このため、本発明の主題は、複製に欠陥があり、補足細胞中に包膜することができて、５´から３´にかけて５´ＩＴＲ、包膜化領域、Ｅ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域、および３´ＩＴＲを含んだアデノウイルスのゲノムから、
(i) Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするＥ１Ｂ領域の部分全体、または
(ii) Ｅ１Ａ領域の全部または一部、およびＥ２およびＥ４領域から選択される少くとも１つの領域の全部または一部、または
(iii) Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および包膜化領域の部分
の欠失により誘導される、アデノウイルスベクターである。
【００２１】
本発明の目的において、“欠失”または“欠く”という用語は標的領域における少くとも１つのヌクレオチドの除去に関し、欠失は当然ながら連続でもまたは不連続でもよい。全部または一部とは、該当する領域の全体または部分のみの場合を意味する。上記領域によりコードされる少くとも１つの発現産物の生産を妨げる欠失が好ましい。このため、それらはコード領域または調節領域、例えばプロモーター領域に存在してよく、遺伝子の読取枠を壊すかまたはプロモーター領域を無機能化するように少くとも１つのヌクレオチドに影響を与えてもよい。欠失には、上記領域の１以上の遺伝子の部分的欠失またはその領域の全体の部分的欠失をも含む。
【００２２】
本発明によるアデノウイルスベクターは複製に欠陥があるが、しかし補足細胞で複製および包膜することができる。宿主細胞にそのベクターを送達しうる能力を有しているために、宿主細胞で自律複製できないにもかかわらず感染性であるアデノウイルス粒子（欠陥アデノウイルスとも呼ぶこととする）を生じるように、欠陥があるものに産物をイントランスでそれを提供する。
【００２３】
第一の例によると、本発明によるアデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードする配列の全体を含んだＥ１Ｂ領域部分の欠失により、天然または野生型アデノウイルスのゲノムから誘導される。好ましい態様によれば、欠失はＥ１Ｂ領域の発現産物（即ち初期タンパク質をコードする配列）とプロモーターとに影響を与え、後期タンパク質IXをコードする配列と重複する転写終結シグナルの全部または一部を含まない。ヒトアデノウイルスタイプ５から誘導される本発明によるアデノウイルスベクターに関して、上記欠失にはアデノウイルスゲノムのヌクレオチド１６３４〜３５０９間にある配列から少くともなり、その配列は参照番号M73260としてGenebankデータバンクで開示されている。この欠失の目的は、本発明によるアデノウイルスベクターと、補足系（例えば系２９３）に組み込まれるアデノウイルスゲノム断片とに共通した配列を減少または消失させることである。更に、少くともＥ１Ａ領域の発現産物と一緒に、発現産物が潜在的に発癌性である配列を本発明によるアデノウイルスベクターから除去することである。
【００２４】
しかも、本発明によるアデノウイルスベクターは、天然または野生型アデノウイルスのゲノムから、：
‐Ｅ３領域の、および／または
‐Ｅ２領域の、および／または
‐Ｅ４領域の
全部または一部の欠失によって更に誘導される。
【００２５】
本発明によるアデノウイルスベクターが上記３欠失のうち１つ、またはいずれかの組合せでそれらのうち２つ、またはすべての欠失を含むことができることは自明である。
【００２６】
特に有利な態様によると、Ｅ３領域の一部のみ、好ましくはｇｐ１９kDa タンパク質、をコードする配列を含まない部分が、本発明によるアデノウイルスベクターから欠失される。本発明によるアデノウイルスベクターにｇｐ１９kDa タンパク質をコードする配列が存在することにより、感染細胞は宿主の免疫監視（即ち治療プロトコールがいくつかの反復投与を要するときの重要な基準）からのがれることができる。選択は、ｇｐ１９kDa をコードする配列を、宿主細胞でそれらを発現させる適切な要素、即ちｍＲＮＡへの上記配列の転写とタンパク質への後者の翻訳に必要な要素のコントロール下において行うことが好ましい。これらの要素には特にプロモーターがある。このようなプロモーターは当業者に周知であり、遺伝子工学の慣用的技術で上記コード配列の上流に挿入される。選択されるプロモーターはＥ１Ａ領域の発現産物の１つにより活性化されない構成プロモーターであることが好ましい。例として、ＨＭＧ（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ）遺伝子プロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）ウイルス初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ（長反復末端）または高等真核生物のＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【００２７】
更に、プロモーター領域に相当するＥ３領域の部分は本発明によるアデノウイルスベクターから場合により欠失させることができ、そのプロモーター領域は上記のような異種プロモーター領域に代えられる。
【００２８】
第二の例によると、本発明によるアデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の全部または一部と、少くともＥ２および／またはＥ４領域の全部または一部とにおける連続または不連続欠失により、天然または野生型アデノウイルスのゲノムから誘導される。このような欠失により、対象遺伝子のクローニング可能性を増加させることができる。更に、Ｅ４領域の全部または一部の除去により、潜在的な発癌性産物をコードする配列を減少または消失させることもできる。
【００２９】
上記のように、本発明によるアデノウイルスベクターは、特に上記のような態様に従い、Ｅ１Ｂおよび／またはＥ３領域の全部または一部を更に欠くことができる（例えば、初期タンパク質をコードする配列の全体を含むＥ１Ｂ領域の部分、およびｇｐ１９kDa タンパク質をコードしないＥ３領域の部分の欠失）。
【００３０】
最後に、第三の例によると、本発明によるアデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の全部または一部と、包膜化領域の部分の欠失とにより、アデノウイルスのゲノムから誘導される。
【００３１】
包膜化領域の部分的欠失により、本発明によるアデノウイルスベクターの無制御の伝播の可能性を、野生型アデノウイルスの存在下にあるとき有意に減少させることができる。このような欠失は、野生型アデノウイルスによるベクターの欠陥機能のイントランス相補によっても、競合野生型アデノウイルスのゲノムと比べて効率的に包膜できないように、その包膜化機能に影響を与えることができる。
【００３２】
包膜化領域からの欠失は、２つの基準、即ち包膜される能力の減少と、同時に工業的生産に適合する残りの効力とに基づいて選択される。換言すれば、本発明によるアデノウイルスベクターの包膜化機能は実質上、但しもっと低い程度に維持される。弱毒化は、慣用的滴定技術により、適切な系を感染させて溶解プラークの数を調べることにより判定できる。このような技術は当業者に知られている。本発明において、包膜化効力は、野生株包膜化領域を有するコントロールアデノウイルスと比較して、２〜５０分の１、有利には３〜２０分の１、好ましくは５〜１０分の１に減少している。
【００３３】
当然ながら、本発明による弱毒化アデノウイルスベクターは上記欠失の少くとも１つまたは何らかの組合せも更に含むことができる。
【００３４】
本発明によるアデノウイルスベクターは、天然または野生型アデノウイルス、有利にはイヌ、トリまたはヒトアデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルスタイプ２、３、４、５または７、最も好ましくはヒトアデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）のゲノムから誘導される。この後者の場合には、本発明によるアデノウイルスベクターの欠失は参照番号M73260としてGenebankデータバンクで特定されているＡｄ５ゲノムのヌクレオチドの位置を参照して示される。
【００３５】
ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから、
(i) Ｅ１Ｂ領域の初期タンパク質をコードし、ヌクレオチド１６３４から始まり、ヌクレオチド４０４７で終わる部分の全体、および／または
(ii) ヌクレオチド３２８００〜３５８２６にわたるＥ４領域、および／または
(iii) ヌクレオチド２７８７１〜３０７４８にわたるＥ３領域の部分、および／または
(iv) 下記包膜化領域の部分：
‐ヌクレオチド２７０〜ヌクレオチド３４６の範囲、または
‐ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３の範囲、または
‐ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３５８の範囲
の欠失により誘導される本発明によるアデノウイルスベクターが最も好ましい。
【００３６】
好ましくは、本発明によるアデノウイルスベクターは野生型または天然アデノウイルスのゲノムから、そのゲノムの少くとも１８％、少くとも２２％、少くとも２５％、少くとも３０％、少くとも４０％、少くとも５０％、少くとも６０％、少くとも７０％、少くとも８０％、少くとも９０％または少くとも９５％、特に９８．５％の欠失により誘導される。
【００３７】
特に好ましい態様によると、本発明によるアデノウイルスベクターは、５´および３´ＩＴＲと、包膜化領域の全部または一部とを除いたアデノウイルスゲノムの全体の欠失により、アデノウイルスのゲノムから誘導される。この例によると、それは組換えのリスクおよび発癌性のリスクを制限して最大のクローニング能力を有するような最少数のウイルス配列のみを含んでいる。このようなベクターは“最小”アデノウイルスベクターと称され、３０kb以内の外来ヌクレオチド配列を挿入することが可能である。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、ヌクレオチド４５９〜３５８３２にわたるウイルスゲノムの部分の欠失により、ヒトアデノウイルスタイプ５から誘導される。
【００３８】
本発明に関して、本発明によるアデノウイルスベクターは、宿主細胞への外来ヌクレオチド配列の移入と、そこでのその発現をその目的として有する。“外来ヌクレオチド配列”は、コード配列とそのコード配列を発現させる調節配列を含んだ、コード配列がアデノウイルスのゲノムに通常存在しない配列である核酸を意味すると理解されている。調節配列はいかなる起源であってもよい。外来ヌクレオチド配列は、包膜化領域と３´ＩＴＲとの間に、遺伝子工学の標準技術で本発明によるアデノウイルスベクター中に導入される。
【００３９】
外来ヌクレオチド配列は対象の、好ましくは治療対象の遺伝子１以上からなる。本発明に関して、対象遺伝子はアンチセンスＲＮＡ、または対象タンパク質に翻訳されるｍＲＮＡのいずれかをコードすることができる。対象遺伝子はゲノムタイプ、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）タイプまたは混合タイプ（少くとも１つのイントロンが欠失されているミニ遺伝子）である。それは成熟タンパク質、成熟タンパク質の前駆体、特に分泌されてこのためシグナルペプチドを含む前駆体、別起源の配列の融合によるキメラタンパク質、あるいは改善または改質された生物学的性質を示す天然タンパク質の変異体をコードすることができる。このような変異体は天然タンパク質をコードする遺伝子の１以上のヌクレオチドの変異、欠失、置換および／または付加により得られる。
【００４０】
対象遺伝子は、宿主細胞でのその発現に適した要素のコントロール下においてよい。“適切な要素”とは、ＲＮＡ（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）へのその転写とタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳とに必要な一連の要素を意味すると理解されている。転写に必要な要素の中では、プロモーターが特に重要と思われる。それは構成プロモーターまたは調節プロモーターであって、真核生物またはウイルス起源と更にはアデノウイルス起源の遺伝子から単離することができる。一方、それは該当する対象遺伝子の天然プロモーターであってもよい。一般的に言えば、本発明で用いられるプロモーターは調節配列を含むように修飾してもよい。例として、本発明で使用の対象遺伝子は、リンパ球宿主細胞へのその移入を目標にすることが望まれるときに、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターのコントロール下におかれる。多数の細胞タイプで発現を行う、ＴＫ‐ＨＳＶ‐１（ヘルペスウイルス、タイプ１チミジンキナーゼ）遺伝子プロモーター、または一方で特にヒトアデノウイルスタイプ２のアデノウイルスＭＬＰプロモーターも挙げられる。
【００４１】
本発明に関して使用しうる対象遺伝子の中では、以下が挙げられる：
‐サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンγ、インターロイキンをコードする遺伝子、  ‐膜レセプター、例えば病原生物（ウイルス、細菌または寄生虫）、好ましくはＨＩＶウイルス（ヒト免疫不全ウイルス）により認識されるレセプターをコードする遺伝子、
‐凝固因子、例えば因子VIIIおよび因子IXをコードする遺伝子、
‐ジストロフィンをコードする遺伝子、
‐インスリンをコードする遺伝子、
‐細胞イオンチャンネルに直接または間接的に関与するタンパク質、例えばＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症経膜伝達レギュレーター）タンパク質をコードする遺伝子、
‐病原生物のゲノムに存在する病原遺伝子によるかまたは発現が調節解除される細胞遺伝子、例えば癌遺伝子により生産されるタンパク質の活性を阻害できるアンチセンスＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子、
‐酵素活性を阻害するタンパク質、例えばα１‐アンチトリプシンまたはウイルスプロテアーゼ阻害物質をコードする遺伝子、
‐生物学的機能を損うように変異された病原タンパク質の変異体、例えば標的配列に結合する上で天然タンパク質と競合して、それによりＨＩＶの活性化を妨げうる、例えばＨＩＶウイルスのＴＡＴタンパク質のトランス優性変異体をコードする遺伝子、
‐宿主細胞免疫を増加させるために抗原性エピトープをコードする遺伝子、
‐主要組織適合性複合体クラスＩおよびIIタンパク質をコードする遺伝子と、これら遺伝子のインデューサーであるタンパク質をコードする遺伝子、
‐細胞酵素または病原生物により生産されるものをコードする遺伝子、および
‐自殺遺伝子。ＴＫ‐ＨＳＶ‐１自殺遺伝子が特に挙げられる。ウイルスＴＫ酵素は、あるヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビアまたはガンシクロビア）に対して細胞ＴＫ酵素と比べ著しく大きな親和性を示す。それはそれらを一リン酸分子に変換するが、これは毒性であるヌクレオチド前駆体にそれ自体が細胞酵素により変換されうる。これらのヌクレオチドアナログは合成中のＤＮＡ分子、ひいては主に複製状態にある細胞のＤＮＡ中に組み込むことができる。この組込みにより分裂細胞、例えば癌細胞を特に破壊することができる。
【００４２】
上記リストは限定的なものではなく、他の対象遺伝子も本発明に関して用いてよい。
【００４３】
更に、本発明のもう１つの態様によると、本発明によるアデノウイルスベクターは、非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパク質をコードする非治療遺伝子を更に含むことができる。当然ながら、トランス活性化タンパク質をコードするＥ１Ａ領域の遺伝子、その発現はアデノウイルスを非欠陥にするリスクを生じる、は避けられる。Saccharomyces cerevisiae Gal4 タンパク質をコードする遺伝子が選択されることが好ましい。その発現により、ベクターを補足系、例えば下記で増殖させることができる。このような系はより洗練させて、アデノウイルス補足性タンパク質の連続生産による起こりうる毒性の問題を軽減することができる。転写をトランス活性化するタンパク質をコードする遺伝子は、必要であれば、その発現に適した要素、例えば対象遺伝子を発現させる要素のコントロール下においてもよい。
【００４４】
本発明は、アデノウイルス粒子に加えて、本発明によるアデノウイルスベクターを含んだ真核宿主細胞にも関する。上記細胞は有利には哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞であり、ゲノム中に組込み形で、または好ましくは非組込み（エピソーム）形で上記ベクターを含むことができる。
【００４５】
本発明によるアデノウイルス粒子は、本発明によるアデノウイルスベクターに欠陥がある機能をイントランスで付与するいずれかの補足系、例えば従来の系２９３、で継代により生産してもよい。これらの生産技術は当業者に知られている(Graham and Prevec,1991,Methods inMolecular Biology,vol.7,109-128,Ed:E.J.Murey,The Human Press Inc.) 。場合により、本発明によるアデノウイルス粒子は、下記のような本発明による補足系で作製してもよい。
【００４６】
よって、本発明は、特に５´ＩＴＲを除くアデノウイルスのゲノムのＥ１領域の部分を含む補足要素を含んだ補足系にも関し、上記補足要素は欠陥アデノウイルスベクターをイントランスで補い、上記補足系のゲノムに組込むかまたは発現ベクター中に挿入することができる。
【００４７】
本発明に関して、“補足系”という用語は、アデノウイルスベクターに欠陥がある機能をイントランスで付与しうる真核細胞に関する。換言すれば、それは上記アデノウイルスベクターの複製および包膜に必要なタンパク質、それ自ら生産できないウイルス粒子を作る上で要求される初期および／または後期タンパク質を生産することができる。当然ながら、上記部分はヌクレオチドの変異、欠失および／または付加により修飾してもよいが、但しこれらの修飾は補足性に関してその能力を損ってはならない。このため、Ｅ１機能に欠陥があるアデノウイルスベクターは（ベクターが生産できないＥ１領域によりコードされるタンパク質または一連のタンパク質をイントランスで供給できる）Ｅ１用の補足系で増殖されなければならず、Ｅ１およびＥ４機能に欠陥があるベクターは（Ｅ１およびＥ４領域によりコードされる必要タンパク質を供給する）Ｅ１およびＥ４用の補足系で増殖され、最後にＥ１、Ｅ２およびＥ４機能に欠陥があるベクターはその３機能用の補足系で増殖される。冒頭に挙げられたＥ３領域は非必須であり、特に補足される必要はない。
【００４８】
本発明による補足系は、無制限に分裂しうる不死化細胞系または一次系から誘導される。本発明により追求される目的によると、本発明による補足系はいずれかの欠陥アデノウイルスベクター、特に本発明による欠陥アデノウイルスベクターの包膜に有用である。このため、“欠陥アデノウイルスベクター”という用語が以下で用いられるとき、それは従来または本発明いずれかの欠陥ベクターに関すると理解されるべきである。
【００４９】
“補足要素”は、本発明に関して使用上アデノウイルスゲノムの部分を少くとも含んだ核酸を意味すると理解される。それは例えばプラスミドまたはウイルスタイプのベクター、例えばレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター、あるいはポックスウイルスに由来するものに挿入することができる。それでも、それが本発明による補足系のゲノムに組込まれている場合が好ましい。ベクターまたは核酸を細胞系中に導入して、できればそれを細胞のゲノムに組込む方法は、このような目的に使用できるベクターのように、当業者に周知の慣用的技術である。補足要素は本発明による補足系中に予めまたは欠陥アデノウイルスベクターに伴い導入することができる。
【００５０】
特別の態様によると、本発明による補足系はＥ１機能に関して欠陥アデノウイルスベクターをイントランスで補うように考えられている。このような系は組換えのリスクを減少させるという利点を有しているが、その理由は従来の系２９３と異なりベクター中に存在する５´ＩＴＲを欠いているからである。
【００５１】
本発明に関して、本発明による補足系はアデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の全部または一部と、
（ｉ）Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域から選択されるアデノウイルスのゲノムのうち少くとも１領域の全部または一部、または
（ii）上記ゲノムのＥ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域のうち少くとも２領域の全部または一部、または
(iii) 上記ゲノムのＥ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域の全部または一部
を含むことができる。
【００５２】
本発明に関して、上記領域はそれらを発現させる適切な要素のコントロール下に必要であればおいてもよいが、Ｅ１Ａ領域によりコードされる転写をトランス活性化するタンパク質により誘導しうるそれら自体のプロモーターのコントロール下にそれらをおくことが好ましい。
【００５３】
指針として、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ４領域を含んだ例(ii)による補足系は、Ｅ１およびＥ４領域に欠陥があって対応領域の全部または一部が欠失されたアデノウイルスの生産に向けられる。
【００５４】
有利な態様によると、本発明による補足系は、特にＥ１Ａ領域の全部または一部と、Ｅ１Ｂ領域の初期タンパク質をコードする配列の全体を含んでいる。
【００５５】
更に、この態様の例によると、本発明による補足系はＥ１Ａ領域のプロモーター領域を更に欠くことができる。この場合に、上記Ｅ１Ａ領域の初期タンパク質をコードするアデノウイルスのゲノムの部分は、上記補足系で機能する適切な異種プロモーターのコントロール下におかれる。それはいずれの真核またはウイルス遺伝子からも単離することができる。しかしながら、初期領域のアデノウイルスプロモーターの使用は避けうる。該当するプロモーターは構成プロモーターである。例として、ＳＶ４０ウイルス、ＴＫ‐ＨＳＶ‐１遺伝子およびネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターも挙げられる。
【００５６】
一方、選択されるプロモーターは、非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパク質により調節および有利には誘導しうる。それは天然誘導性遺伝子から単離されたプロモーターであっても、あるいは上記トランス活性化タンパク質に応答する活性化配列（または上流活性化配列を表すＵＡＳ）の付加により修飾されたいずれのプロモーターであってもよい。更に具体的には、Saccharomyces cerevisiae Gal4 タンパク質により誘導されうるプロモーター、好ましくは何らかの種類の遺伝子（例えば、ＴＫ‐ＨＳＶ‐１遺伝子またはＡｄ２  ＭＬＰ）の転写開始配列（ＴＡＴＡボックスおよび開始部位）のみを含むいわゆる“最小”プロモーターからなるハイブリッドプロモーターを用いることが好ましく、その上流にはSaccharomyces cerevisiae Gal10遺伝子の少くとも１つの活性化配列が挿入される(Webster et al.,1988,Cell,52,169-178) 。後者の配列は化学的に合成しても、または遺伝子工学の標準技術に従いGal10 遺伝子から単離してもよい。こうしてハイブリッドプロモーターは活性化され、Ｇａｌ４タンパク質の存在下のみで、そのコントロール下におかれたＥ１Ａ領域によりコードされる遺伝子の発現を誘導する。次いでＥ１Ａ領域の発現産物は、本発明による補足系に場合により含まれる他のＥ１Ｂ、Ｅ２および／またはＥ４初期領域の発現を誘導することができるようになる。本発明のこの具体的態様は、補足性に必要なアデノウイルスタンパク質の構成的生産（おそらく毒性）を回避する。このため、誘導はＧａｌ４タンパク質を発現する本発明による欠陥アデノウイルスベクターの存在下で誘発される。しかしながら、このような系はイントランスでＧａｌ４タンパク質を供給する条件でいずれかの欠陥アデノウイルスベクターを生産するために用いてもよい。イントランスでタンパク質を供給する手段は当業者に知られている。
【００５７】
一般的に、補足系は動物アデノウイルスから有利に誘導されるアデノウイルス、例えばイヌまたはトリアデノウイルス、あるいは好ましくはヒトアデノウイルス、最も好ましくはタイプ２または５のゲノムの部分を含んでなる。
【００５８】
本発明による補足系は、
(i) 参照番号M73260としてGenebankデータバンクで開示されている配列のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５２９７、または
(ii) ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド４０３４、または
(iii) ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド４０３４
にわたるヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分を特に含んでいる。
【００５９】
有利には、(ii)によるゲノムの部分は転写終結シグナル、例えばＳＶ４０（シミアンウイルス４０）またはウサギβ‐グロビン遺伝子のポリアデニル化シグナルの上流に挿入される。一方、Ｅ１Ａ領域のプロモーター配列もＥ１Ｂ領域の転写終結シグナルも含まない(iii) の部分は、適切なプロモーター、特にＧａｌ４タンパク質により誘導しうるプロモーターと、転写終結シグナル、例えばウサギβ‐グロビン遺伝子とのコントロール下におかれる。このような補足系は特に安全であると考えられ、その理由はそれが欠陥アデノウイルスと共通した配列の大部分を欠いているからである。
【００６０】
更に、本発明による補足系は、参照番号M73260としてGenebankデータバンクで開示されている配列のヌクレオチド３２８００から始まりヌクレオチド３５８２６で終わるヒトアデノウイルスタイプ５のＥ４領域の部分を含むことができる。
【００６１】
更に、本発明による補足系は、包膜化領域と、５´および３´ＩＴＲと、そして最も好ましくは参照番号M73260としてGenebankデータバンクで開示されている配列のヌクレオチド５０５から始まりヌクレオチド３５８２６で終わるヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分とを除いて、天然アデノウイルスのゲノムの全体を含むことができる。本発明の目的から、この部分は適切なプロモーターのコントロール下におかれる。Saccharomyces cerevisiae Gal4 タンパク質により誘導されうるプロモーターを用いるのが好ましい。このような系によれば、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４機能に欠陥があるアデノウイルスベクター、特に本発明による最小アデノウイルスベクターの複製および包膜化に必須な機能のすべてをイントランスで補うことができる。
【００６２】
好ましい態様によると、本発明による補足系は、それを含有した細胞を検出および単離できる選択マーカーをコードする遺伝子を更に含んだ補足要素を含有することができる。本発明に関して、これは選択マーカーをコードするいずれの遺伝子であってもよく、このような遺伝子、有利には抗生物質耐性に関する遺伝子、好ましくはプロマイシン耐性を付与するプロマイシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ遺伝子）をコードする遺伝子は通常当業者に知られている。
【００６３】
本発明に関して、選択マーカーをコードする遺伝子は、その発現を行う適切な要素のコントロール下においてもよい。これらには構成プロモーター、例えばＳＶ４０ウイルス初期プロモーターがある。しかしながら、Ｅ１Ａ領域によりコードされるトランス活性化タンパク質で誘導されうるプロモーター、特にＥ２Ａアデノウイルスプロモーターが好ましい。このような組合せは、本発明による補足系でＥ１Ａ領域の遺伝子の発現を維持するための選択の圧力を誘導する。本発明の目的から、選択されるプロモーターはヌクレオチドの欠失、変異、置換および／または付加により修飾されていてもよい。
【００６４】
最も好ましい態様によると、本発明による補足系は薬学的観点から許容される細胞系から誘導される。“薬学的観点から許容される細胞系”は、特徴付けられて（その起源および由来が知られている）および／またはヒト用の産物の大規模生産（高度臨床試験用バッチまたは販売用バッチのアセンブリー）に既に用いられた細胞系を意味すると理解されている。このような系はＡＴＣＣのような組織から入手できる。この点においては、Veroアフリカミドリザル腎臓、ＢＨＫゴールデンまたはSyrianハムスター腎臓系、肺癌腫に由来するＡ５４９ヒト系と、ＭＲＣ５ヒト肺、Ｗ１３８ヒト肺およびＣＨＯチャーニーズハムスター卵巣系が挙げられる。
【００６５】
一方、本発明による補足系は一次細胞、特にヒト胚から採取される網膜細胞から誘導することができる。
【００６６】
本発明は本発明によるアデノウイルス粒子の生産方法にも関し、それによれば
‐本発明によるアデノウイルスベクターが、トランスフェクトされた補足系を得るために、上記ベクターをイントランスで補える補足系中に導入され、
‐上記補足系が上記アデノウイルス粒子の生産を行うために適した条件に従い培養され、および
‐上記粒子が細胞培養で回収される。
【００６７】
当然ながら、アデノウイルス粒子は培養上澄から、但し慣用的プロトコールにより細胞からも回収される。
【００６８】
好ましくは、本発明による方法では本発明による補足系を用いる。
【００６９】
本発明の主題は、本発明によるアデノウイルスベクター、アデノウイルス粒子、真核宿主細胞または補足系の治療または予防のための使用にも関する。
【００７０】
最後に、本発明は、薬学的観点から許容されるビヒクルとともに、本発明によるアデノウイルスベクター、アデノウイルス粒子、真核細胞または相補細胞を治療または予防剤として含んでなる、医薬組成物に関する。
【００７１】
本発明による組成物は、疾患、例えば
‐遺伝障害、例えば血友病、嚢胞性繊維症またはデュシェーヌおよびベッカータイプ筋障害、
‐癌、例えば癌遺伝子またはウイルスにより誘導される癌、
‐レトロウイルス疾患、例えばエイズ（ＨＩＶ感染に起因する後天性免疫不全症候群）、および
‐再発ウイルス疾患、例えばヘルペスウイルス誘導感染の予防または治療用として特に考えられている。
【００７２】
本発明による医薬組成物は常法で製造される。特に、治療有効量の治療または予防剤が、ビヒクル、例えば希釈剤と組み合わされる。本発明による組成物はエアゾールにより、あるいは当業界で使用上慣用的ないずれかの経路、特に経口、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、肺内または気管内経路により投与される。投与は１回分の用量で、またはある時間間隔後に１回以上繰返される用量で行う。適切な投与経路および投与量は様々なパラメーター、例えば治療される個体または治療される障害、あるいは移入される対象遺伝子に応じて変わる。一般的に言えば、本発明による医薬組成物は１０４〜１０14、有利には１０５〜１０13、好ましくは１０６〜１０11の本発明によるアデノウイルスの投与量を含む。医薬組成物、特に予防目的に用いられるものは、薬学的観点から許容されるアジュバントを更に含むことができる。
【００７３】
本発明は、本発明によるアデノウイルスベクター、アデノウイルス粒子、真核細胞または補足系の治療有効量がこのような治療を要する患者に投与される治療方法も包含している。
【実施例】
【００７４】
下記例は本発明の一態様のみを示している。
【００７５】
下記構築は、Maniatis et al.(1989,Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY) で詳述された遺伝子工学および分子クローニングの一般的技術に従い行う。細菌プラスミドを用いるクローニングの選択工程はEscherichia coli (E.coli)株５ＫまたはＢＪで継代により行なわれ、一方ファージＭ１３から誘導されたベクターを用いる場合はE.coli ＮＭ５２２で継代により行なわれる。ＰＣＲ増幅の工程に関しては、PCR Protocols - A guide to methods and applications(1990,edited by Innis, Gelfand,Sninsky and White,Academic Press Inc.)で記載されたプロトコールが適用される。
【００７６】
更に、細胞は当業者に周知の標準技術に従いトランスフェクトする。リン酸カルシウム技術(Maniatis et al.,supra) も挙げられる。しかしながら、核酸を細胞内に 導入させうる他のプロトコール、例えばＤＥＡＥデキストラン技術、エレクトロポレーション、浸透圧ショックに基づく方法、選択細胞のマイクロインジェクションまたはリポソームの使用に基づく方法も用いてよい。
【００７７】
下記の異なる構築体に挿入された断片は、
‐参照番号M73260としてGenebankデータバンクで開示されているＡｄ５ゲノム、
‐参照番号J01949としてGenebankデータバンクで開示されているアデノウイルスタイプ２（Ａｄ２）ゲノム、  ‐参照番号J02400としてGenebankデータバンクで開示されているＳＶ４０ウイルスゲノム
のヌクレオチド配列でそれらの位置に従い正確に示されている。
【００７８】
例１：包膜化領域の部分の欠失を含んだ“弱毒化”アデノウイルスの作製
１．包膜化領域のヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立て
以下を含んだベクター：
‐Ａｄ５ゲノムの５´ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１０３）、
‐ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３にわたる部分が欠失されて、１７６位のチミン（Ｔ）がＡａｔII制限部位を作るためにシトシン（Ｃ）に変えられた、ヌクレオチド１０４〜４５８にあるＡｄ５包膜化領域、
‐５´から３´にかけてＡｄ２  ＭＬＰ（ヌクレオチド５７７９〜６０３８）、ＫｐｎＩ‐ＸｂａＩ‐ＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ制限部位、ＣＦＴＲタンパク質をコードするヒトｃＤＮＡ（Riordan et al.,1989,Science,245,1066-1073で公表された配列に相当するアミノ酸組成；但し４７０位はメチオニンの代わりにバリン）、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩ部位と、最後にＳＶ４０ウイルス転写終結シグナル（ヌクレオチド２６６５〜２５３８）を含んでなる、対象遺伝子の発現用カセット、および
‐ヌクレオチド３３２９〜ヌクレオチド６２４１にわたるＡｄ５ゲノムの断片
を組み立てる。
【００７９】
第一段階では、ｐＭＬＰ１１から単離されたＥｃｏＲＩ‐ＳｍａＩ断片をベクターＭ１３ＴＧ１３１(Kieny et al.,1983,Gene,26,91-99)  のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位間に組み込んでクローニングする。この組立てはｐＭＬＰ１０(Levrero et al.,1991,Gene,101,195-202)から始めるが、ＨｉｎｄIII 部位におけるＳｍａＩ部位の導入により親ベクターとは異なる。ベクターＭ１３ＴＧ６５０１を得る。後者は、包膜化領域のヌクレオチド１８４〜２７３間にある配列を欠失させるために、特定部位変異誘発に付す。特定部位変異誘発では供給業者の勧めに従い市販キット(Amersham)を用いて行い、配列確認No.１（配列番号１）で示されたオリゴヌクレオチドＯＴＧ４１７４を用いる。変異ベクターをＭ１３ＴＧ６５０２と命名した。こうして欠失された包膜化領域はＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで切断されたベクターｐＭＬＰ１１中にＥｃｏＲＩ‐ＢｇｌII断片の形で再導入するが、そのＢｇｌII部位はクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されている。
【００８０】
得られたベクターｐＴＧ６５００をＰｓｔＩで部分的に切断し、ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後ＰｖｕＩで切断する。（ｐＭＬＰ１１から誘導された）ｐＴＧ５９５５から単離されたＰｖｕＩ‐ＨｐａＩ断片をこのベクター中に挿入する。この断片はＳＶ４０ウイルス転写終結シグナルとヌクレオチド３３２９〜ヌクレオチド６２４１にわたるＡｄ５ゲノムの部分を含んでいる。こうして形成されたベクターｐＴＧ６５０５をＳｐｈＩで部分的に切断し、ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理し、再結合させるが、この目的はポリリンカーの５´末端に位置するＳｐｈＩ部位を壊すことである。これによりｐＴＧ６５１１を得て、その中に、ＢａｍＨＩ切断およびクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理後に、ヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡをＸｈｏＩ‐ＡｖａＩ切断およびクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理により形成された平滑末端化断片の形で組み込んでクローニングする。ｐＴＧ６５２５を得る。指針として、ＣＦＴＲ  ｃＤＮＡは従来のプラスミド、例えばｐＴＧ５９６０(Dalemans et al.,1991,Nature,354,526-528) から単離する。
【００８１】
２．包膜化領域のヌクレオチド２７０〜ヌクレオチド３４６の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立て
ベクターＭ１３ＴＧ６５０１を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ４１７３（配列番号２）を用いる特定部位変異誘発に付す。次いで変異断片を前記のようにｐＭＬＰ１１中に再導入して、ベクターｐＴＧ６５０１を得る。後者をＳｐｈＩで切断し、ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、その後ＰｖｕＩで処理する。ｐＴＧ６５４６（図２）は、ｐＴＧ６５２５から単離されたＰｖｕＩ‐ＫｐｎＩ断片（ＫｐｎＩ部位は平滑化されている）をクローニングして、ヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡを含有させることにより得る。
【００８２】
３．包膜化領域のヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３５８の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立て
ベクターＭ１３ＴＧ６５０１を、包膜化領域のヌクレオチド２８７〜３５８間にある配列を欠失させるために特定部位変異誘発に付し、ＮｃｏＩ部位を導入するために２７５および２７６位のチミンをグアニンに変えて、ＮｃｏＩ部位を導入する。変異誘発はオリゴヌクレオチドＯＴＧ４１９１（配列番号３）を用いて行い、Ｍ１３ＴＧ６５０７を得る。後者をＢｇｌIIで開裂させ、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後ＥｃｏＲＩで切断し、対応変異断片を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで切断されたｐＭＬＰ１１中に導入する。ｐＴＧ６５０４を得て、それからＳｐｈＩ（ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化された部位）‐ＰｖｕＩ断片を単離し、ｐＴＧ６５１１のＫｐｎＩ部位（Ｔ４ポリメラーゼ処理で平滑化）とＰｖｕＩ部位との間に挿入する。ｐＴＧ６５１３を得て、これをＢａｍＨＩおよびクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してから、ｐＴＧ５９６０のＡｖａＩおよびＸｈｏＩ断片を挿入して、ｐＴＧ６５２６を得る。
【００８３】
４．欠陥および弱毒化組換えアデノウイルスの作製
欠陥組換えアデノウイルスは、相同的組換えで組換えウイルスを得るために、ＣｌａＩおよびＡｄ‐ｄｌ３２４ゲノムＤＮＡ(Thimmappaya et al.,1982,Cell,31,543-551) で直鎖化されて更にＣｌａＩで切断されたｐＴＧ６５２５、ｐＴＧ６５２６またはｐＴＧ６５４６の２９３細胞中へのコトランスフェクションにより作製する。８〜１０日後、個々のプラークを単離し、２９３細胞で増幅させ、制限地図作製により分析する。ウイルスストック（ＡｄＴＧ６５２５、ＡｄＴＧ６５２６およびＡｄＴＧ６５４６）を集め、それらの力価を慣用的技術に従い調べる。
【００８４】
ＡｄＴＧ６５４６ウイルスは、野生型包膜化領域を含むＡｄ‐ＣＦＴＲ(Rosenfeld et al.,1992,Cell,68,143-155) との同時感染により、競合状況下におく。２９３細胞を細胞当たり５pfu(プラーク形成単位）のＡｄ‐ＣＦＴＲおよび５pfu のＡｄＴＧ６５４６で感染させる。並行して、全ウイルスＤＮＡをHirt´s法(Gluzman and Van Doren,1983,J.Virol.,45,91-103)により単離し、包膜化ウイルスＤＮＡを０．２％デオキシコール酸とその後１０μg/mlのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）Ｉで細胞を処理した後に単離して、ビリオンで保護されていないＤＮＡを除去する。全Ａｄ‐ＣＦＴＲおよびＡｄＴＧ６５４６  ＤＮＡの量は同一であるが、包膜化ＡｄＴＧ６５４６  ＤＮＡの約３倍の包膜化Ａｄ‐ＣＦＴＲ  ＤＮＡがある。
【００８５】
ＡｄＴＧ６５４６感染２９３細胞の細胞抽出物中におけるＣＦＴＲタンパク質の発現のレベルを測定する。分析はDalemans et al.(1991,Nature,supra)に記載された技術に従いウエスタンブロッティングによりモノクローナル抗体ＭＡＴＧ１０３１を用いて行う。しかしながら、ＣＦＴＲタンパク質の抗原性エピトープを認識するいずれの他の抗体も用いてよい。約１７０kDa の予想分子量の産物を検出する。指針として、生産のレベルは未弱毒化Ａｄ‐ＣＦＴＲウイルスで感染された細胞抽出物で得られる場合におおよそ等しい。
【００８６】
例２：Ｅ１Ａ領域とＥ１Ｂ領域の初期タンパク質をコードする配列の全体が欠失された欠陥アデノウイルスの作製
１．ＣＦＴＲタンパク質発現用の組換えアデノウイルス（ＡｄＴＧ６５８１）の生産
このようなアデノウイルスは、５´から３´にかけて‐Ａｄ５  ５´ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１０３）、‐Ａｄ５包膜化領域（ヌクレオチド１０４〜４５８）、‐下記要素を含んだ発現カセットを含む外来ヌクレオチド：
・Ａｄ２  ＭＬＰ（ヌクレオチド５７７９〜６０３８）、その後Ａｄ２の３つの三部分リーダー（ヌクレオチド６０３９〜６０７９；ヌクレオチド７１０１〜７１７５；ヌクレオチド９６３７〜９７１２）；これらのリーダーは下流に挿入された配列の翻訳の効率を増加させるために含まれる、
・対象遺伝子のクローニングに使用しうるＸｂａＩ、ＨｉｎｄIII 、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｐａＩおよびＮｏｔＩ制限部位を５´から３´にかけて含んだポリリンカー、
・対象遺伝子、例えばＣＦＴＲタンパク質をコードする遺伝子、
・ＳＶ４０ウイルスから単離された転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜２６１８）、
‐ヌクレオチド４０４７〜６２４１にわたるＡｄ５アデノウイルスゲノムの部分
を含んだプラスミドベクターｐＴＧ６５８１から作製する。
【００８７】
ヌクレオチド４０４７〜ヌクレオチド４６１４にわたるＡｄ５ゲノムの断片をＡｄ５ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅させる。ＰＣＲ反応では、後のクローニング工程を容易にするためにＢａｍＨＩ部位を５´末端に含むセンスプライマーＯＴＧ５０２１（配列番号４）とアンチセンスプライマーＯＴＧ５１５７（配列番号５）を用いる。こうして形成された断片をクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してから、Ｍ１３ｍｐ１８(Gibco BRL) のＳｍａＩ部位中に組み込んでクローニングして、Ｍ１３ＴＧ６５１７を得る。ＰＣＲで形成された断片の配列は、標準酵素方法(Sanger et al.,1977,Proc.Natl.Acad．Sci.USA,74,5463)に従い確認する。
【００８８】
別に、ＰｖｕＩ‐ＳｍａＩ断片をｐＭＬＰ１１から単離する。それをｐＴＧ６５１１（例１．１）のＰｖｕＩと〜ｐｎＩ部位間に組み込んでクローニングするが、ＫｐｎＩ部位は標準方法に従いファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されている。ベクターｐＴＧ６５４７はこうして形成する。
【００８９】
後者を酵素ＳａｌＩおよびＢｓｔＸＩで切断し、２つの断片に結合させるが、一方はＭ１３ＴＧ６５１７の精製ＢａｍＨＩ‐ＢｓｔＸＩ断片で、他方はｐＴＧ６１８５のＸｈｏＩ‐ＢｇｌII断片である。後者はＸｈｏＩおよびＢｇｌII制限部位に隣接するＳＶ４０ウイルス転写終結シグナルを特に含んでいる。しかしながら、同様の終結配列と適切な制限部位を含んだいずれか他のプラスミドも使用できる。ベクターｐＴＧ６５５５を得るが、その中に、２つの制限部位形成平滑末端ＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを含むアダプターを唯一のＢａｍＨＩ部位に挿入する。このアダプターはオリゴヌクレオチドＯＴＧ５５６４およびＯＴＧ５５６５（配列番号:6および7)の組換えから形成する。ｐＴＧ６５８０を得る。最後に、末端が平滑化されてヒトＣＦＴＲ  ｃＤＮＡを含むｐＴＧ６５２５のＳａｃＩ‐ＰｓｔＩ断片を、ｐＴＧ６５８０のＥｃｏＲＶ部位中に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ６５８１（図３）を得る。
【００９０】
対応組換えアデノウイルスＡｄＴＧ６５８１は、標準プロトコールに従い、Ｅ１機能用の補足系、例えば系２９３または例６の系中への、双方ともＣｌａＩで開裂されたｐＴＧ６５８１およびＡｄ  ｄ１３２４のコトランスフェクションにより得る。
【００９１】
２．ＩＦＮ‐γ発現用の組換えアデノウイルスの生産
ベクターｐＴＧ６３０３（図４）を、Ｍ１３ＴＧ２４３７のＨｐａＩ‐ＳｍａＩ断片をｐＴＧ６５８０のＨｐａＩ部位中に組み込んでクローニングすることにより得る。上記断片は、配列がGray et al.(1982,Nature,295,503-508)で特定されているインターフェロンγ（ＩＦＮ‐γ）をコードする遺伝子をベクターＭ１３ＴＧ１３０(Kieny et al.,1983,supra) に組み込んでクローニングすることにより得る。組換えアデノウイルスＡｄＴＧ６３０３は、標準技術に従い、Ｅ１機能に関する補足系中へのＣｌａＩで直鎖化されたｐＴＧ６３０３およびＡｄ  ｄ１３２４のコトランスフェクションに基づく相同的組換えにより得る。
【００９２】
３．Ｅ１領域が欠失されてＥ３領域が構成プロモーターのコントロール下におかれているアデノウイルスの作製
ベクターｐＴＧ１６７０は、ベクターｐポリII(Lathe et al.,1987,Gene,57,193-201) のＡａｔII〜ＢａｍＨＩ部位間にＲＳＶウイルス（ラウス肉腫ウイルス）３´ＬＴＲ（長末端反復）を含むＰＣＲ断片をクローニングすることにより得る。ＰＣＲ反応では、鋳型としてベクターｐＲＳＶ／Ｌ(De Wet et al.,1987,Mol.Cell.Biol.7,725-737)と、プライマーＯＴＧ５８９２およびＯＴＧ５８９３（配列番号８および９）を用いる。
【００９３】
別に、Ｅ３領域の５´部分（ヌクレオチド２７５８８〜２８６０７）は、ベクターｐＴＧ１６５９からプライマーＯＴＧ５９２０およびＯＴＧ５８９１（配列番号10および11) を用いたＰＣＲにより増幅させる。後者のベクターは数工程で組み立てる。ＢａｍＨＩ‐ＡｖｒII断片（ヌクレオチド２１５６２〜２８７５２）をＡｄ５ゲノムＤＮＡから得て、その後ｐＴＧ７４５７の同部位間に組み込んでクローニングして、ｐＴＧ１６４９を得る。ベクターｐＴＧ７４５７は、特にＡｖｒII部位を含むようにポリリンカー中で修飾されたｐＵＣ１９(Gibco BRL) である。次いでＭ１３ＴＧ１６４６（例８）のＥｃｏＲＩ（クレノウ）‐ＡｖｒII断片をＡｖｒII‐ＮｄｅＩ（クレノウ）で開裂されたｐＴＧ１６４９中に導入して、ベクターｐＴＧ１６５１を得る。最後に、ｐＴＧ１６５９を、ＡｖｒIIで直鎖化されたｐＴＧ１６５１中にＡｄ５ゲノムＤＮＡの精製ＡｖｒII断片（ヌクレオチド２８７５２〜３５４６３）を挿入することにより得る。ＰＣＲ断片をｐポリIIのＸｂａＩ〜ＢａｍＨＩ部位間に組み込んで、ｐＴＧ１６７１を得る。次いでｐＴＧ１６７０から得られたＥｃｏＲＶ‐ＡａｔII断片をｐＴＧ１６７１のＡａｔII部位に挿入して、ｐＴＧ１６７６を得る。
【００９４】
ヌクレオチド２７３３１〜３００４９に相当するＡｄ５のＥｃｏＲＩ断片をゲノムＤＮＡ調製物から単離し、ＥｃｏＲＩで既に開裂されたｐBluescript‐Ｓｋ+ (Stratagene)中に組み込んでサブクローニングする。ｐＴＧ１６６９を得る。後者は２７８６７位（変異原性オリゴヌクレオチドＯＴＧ６０７９；配列番号12）または２８２４９位（変異原性オリゴヌクレオチドＯＴＧ６０８０；配列番号13）でＢａｍＨＩ部位を導入することにより変異させる(Amersham kit)。ｐＴＧ１６７２およびｐＴＧ１６７３３を各々得る。ＲＳＶ  ３´ＬＴＲに続いてＥ３領域の５´部分を含むＢａｍＨＩ‐ＢｓｉＷＩ断片をベクターｐＴＧ１６７６から単離し、先の工程で得られたベクターのＢａｍＨＩ部位（２７３３１または３００４９位）とＢｓｉＷ部位（２８３９０位）との間に挿入して、ｐＴＧ１９７７およびｐＴＧ１９７８を得る。次いでこれら２つのベクターの各々から得られたＥｃｏＲＩ断片を野生型ＥｃｏＲＩ断片の代わりとしてｐＴＧ１６７９に組込む。ｐＴＧ１６７９‐Ｅ３+ を得る。参考のため、ベクターｐＴＧ１６７９はｐＴＧ６５８４（例３．１）のＢｓｔＥII部位とＢａｍＨＩ部位（クレノウポリメラーゼ処理により平滑化された部位）との間に組み込まれたｐＴＧ６５９０（例３．１）のＢｓｔＥII‐ＫｐｎＩ断片（Ｔ４ポリメラーゼ処理により平滑化された部位）のクローニングから得る。
【００９５】
アデノウイルス粒子は、ｐＴＧ１６７９‐Ｅ３+ のＡａｔII断片とアデノウイルスベクター、例えばＡｄ  ｄ１３２４またはＡｄ‐ＲＳＶβ‐ｇａｌとの間でＥ１機能用の補足系における相同的組換えにより作製する。後者はＥ１領域の代わりにβ‐ガラクトシダーゼ遺伝子を含んでいる(Stratford-Perricaudet et al.,1992，J.Clin.Invest.,90,626-630)。
【００９６】
例３：Ｅ１およびＥ３領域の部分的欠失による改善されたクローニング能力を有した組換えアデノウイルスベクターの組立て
１．ｐＴＧ６５９０ΔＥ３の組立て
ヌクレオチド２７３２５〜２７８７１間にあるＡｄ５ゲノムの部分を有した断片を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマーＯＴＧ６０６４およびプライマーＯＴＧ６０６５（配列番号14および15）を用いたＰＣＲにより増幅させる。ＯＴＧ６０６５はその５´末端にＢｓｍＩ部位を含むが、これはＥ３領域でも（３０７５０位に）存在している。
【００９７】
増幅された断片をＭ１３ｍｐ１８のＳｍａＩ部位に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５２３を得る。ＥｃｏＲＩ‐ＢｓｍＩ断片を後者から単離し、同酵素で開裂されたベクターｐＴＧ６５９０中に導入する。ｐＴＧ６５９０Δ３が得られ、これはアデノウイルスゲノムの３´部分（ヌクレオチド２７０８２〜３５９３５）を含んでいるが、その部分からはヌクレオチド２７８７２〜３０７４０間にあるＥ３領域が欠失され、一方Ｅ３領域のもっと小さな部分（２８５９２〜３０４７０位）はｐＴＧ６５９０から欠失されていた。ベクターｐＴＧ６５９０は下記のようにして得る。ヌクレオチド３５２２８〜３５９３５にわたる断片（３´ＩＴＲを含む）をＡｄ５ゲノム調製物からプライマーＯＴＧ５４８１およびＯＴＧ５４８２（配列番号16および17) によるＰＣＲで形成する。次いでこの断片をＭ１３ｍｐ１８のＳｍａＩ部位に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５１９を得る。別に、ベクターｐＴＧ６５８４をＸｂａＩで切断し、その後Ｅ３領域の対応断片を除去するために再結合させる。ｐＴＧ６５８９を得て、これをＢａｍＨＩで開裂させ、クレノウで処理し、その後ＢｓｔＥIIで切断する。Ｍ１３ＴＧ６５１９の精製ＥｃｏＲＩ（クレノウ）‐ＢｓｔＥII断片をこうして処理されたベクター中に導入して、ｐＴＧ６５９０を得る。
【００９８】
参考のため、ベクターｐＴＧ６５８４は唯一のＳｐｅＩ部位（２７０８２位）〜Ｅ４領域のプロモーター領域の開始部（３５８２６位）にわたるＡｄ５配列を含んだｐＵＣ１９ベクター(Gibco BRL) である。それはｐＴＧ１６５９（例２．３）をＳａｌＩおよびＳｐｅＩで切断し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後再結合させることにより得る。
【００９９】
２．Ｅ１領域とｇｐ１９kDa タンパク質を発現しないＥ３の部分が欠失されたアデノウイルスベクターの組立て
ｇｐ１９kDa をコードするＡｄ５のＥ３領域の部分（ヌクレオチド２８７３１〜２９２１７）を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマーＯＴＧ５４５５およびＯＴＧ５４５６（配列番号18および19) を用いたＰＣＲにより得る。形成された断片をＭ１３ｍｐ１８のＳｍａＩ部位中に導入して、Ｍ１３ＴＧ６５２０を得る。後者のＥｃｏＲＩ‐ＸｂａＩ断片を単離して、ｐＴＧ１６７０（例２．３）のＡａｔII部位に組み込んでクローニングするが、その部位はクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されている。次いで先の工程のベクターの精製ＸｂａＩ断片をベクターｐＴＧ６５９０ΔＥ３（例３．１）のＸｂａＩ部位中に挿入する。
【０１００】
３．アデノウイルス粒子の生産
組換えウイルス粒子を、ＡｄＴＧ６３０３またはＡｄＴＧ６５８１ゲノムＤＮＡから単離されたＳｐｅＩ断片と例３．１および３．２のベクターのどれかとの結合により得る。次いで結合混合物をＥ１機能に関する補足系中にトランスフェクトする。
【０１０１】
例４：Ｅ１およびＥ４領域が欠失されたアデノウイルスの作製
ヌクレオチド３１８０３〜３２７９９および３５８２７〜３５９３５にわたるアデノウイルスゲノムの部分を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマーＯＴＧ５７２８およびＯＴＧ５７２９（配列番号20および21) とＯＴＧ５７３０およびＯＴＧ５７８１（配列番号22および16) を各々用いて増幅させる。約１０回の増幅サイクル後に、反応はオリゴヌクレオチドＯＴＧ５７２８およびＯＴＧ５７８１を用いて２反応混合物の一部に基づき続ける。増幅断片はヌクレオチド３１８０３〜３５９３５にわたり、Ｅ４領域の全部（３２８００〜３５８２６位）が欠失している。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII 切断後に、それをＭ１３ｍｐ１８の同部位間に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５２１を得る。
【０１０２】
Ｍ１３ＴＧ６５２１をＥｃｏＲＩで切断し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後ＢｓｔＸＩで開裂する。３´ＬＴＲを含んだ０．４６kb断片をクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されたＢａｍＨＩ部位とｐＴＧ６５８４（例３．１）のＢｓｔＸＩ部位との間に挿入する。ｐＴＧ６５８７を得て、これをＸｂａＩで切断し、その後それ自体と再結合させ、ｐＴＧ６５８８（Ｅ３の欠失）を得る。
【０１０３】
オリゴヌクレオチドＯＴＧ６０６０、ＯＴＧ６０６１、ＯＴＧ６０６２およびＯＴＧ６０６３（発列番号23〜26）の組換えから得た合成ＤＮＡ断片をｐＴＧ６５８８のＰａｃＩ部位中に導入する。これによりｐＴＧ８５００を得て、その中におけるＬ５後期遺伝子の転写終結シグナルを改善する。
【０１０４】
Ｅ４領域の全部（ヌクレオチド３２８００〜３５８２６）とＥ３領域のＸｂａＩ断片（ヌクレオチド２８５９２〜３０４７０）が欠失されたゲノムを有するアデノウイルス粒子（ＡｄΔＥ４）を、ｐＴＧ８５００またはｐＴＧ６５８８とＡｄ５から単離されたＳｐｅＩ断片の結合により形成する。結合混合物をＥ４機能に関する相補細胞系、例えば系Ｗ１６２(Weinberg and Ketner,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,5383-5386)中にトランスフェクトする。Ｅ１およびＥ４機能に欠陥があるアデノウイルス（ΔＥ１、ΔＥ４）は、Ａｄ  ｄ１３２４ゲノムとＳｐｅＩで直鎖化されたプラスミドｐＴＧ８５００またはｐＴＧ６５８８との結合混合物のＥ１およびＥ４に関する補足系（例えば、例８の系）中へのトランスフェクションにより得る。
【０１０５】
更に、下記のように行うことも可能である。ｐＴＧ１６５９（例２．３）から単離されたＳｐｅＩ‐ＳｃａＩ断片をこれら同酵素で開裂されたベクターｐＴＧ６５８８中に組み込んでクローニングし、ｐＴＧ６５９１を得る。後者はヌクレオチド２１０６２〜３５９３５のＡｄ５配列を含んでいるが、そこからは上記のようにＥ４領域の全部とＥ３領域のＸｂａＩ断片が欠失されている。上記の合成ＤＮＡ断片をＰａｃＩで切断されたベクターｐＴＧ６５９１中に導入して、ｐＴＧ６５９７を形成する。アデノウイルス粒子は、ＳｐｅＩで開裂されたＡｄ  ｄ１３２４ゲノムＤＮＡとＢａｍＨＩで開裂されたプラスミドｐＴＧ６５９１またはｐＴＧ６５９７との相同的組換えにより得てもよい。
【０１０６】
例５：“最小”ウイルスの作製
いわゆる“最小”アデノウイルスベクターは、プラスミド中に下記要素：
‐Ａｄ５  ５´ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１０３）、
‐Ａｄ５包膜化領域（ヌクレオチド１０４〜４５８）、‐下記を含む外来ヌクレオチド配列：
・自然調節にできるだけ近い発現の調節を得るために、好ましくは自己のプロモーターの存在下におかれた、治療対象の第一遺伝子、
・ＴＫ‐ＨＳＶ‐１遺伝子からなる対象の第二遺伝子、
・場合により、包膜化されるゲノムの全サイズが３０〜３６kbであるような包膜化または複製の効率の理由から加えられる、何らかの種類のヌクレオチド配列、
・高等真核細胞で機能的なプロモーターのコントロール下におかれたSaccharomyces cerevisiae Gal4 タンパク質(Laughon and Gesteland,1984,Mol.Cell.Biol.,4, 260-267)をコードする配列、および‐Ａｄ５  ３´ＩＴＲ（ヌクレオチド３５８３３〜３５９３５）
を組み込んでクローニングすることにより形成する。
【０１０７】
これらの異なる要素のアセンブリーは分子生物学の標準技術に従い行う。このようなベクターを含んだ感染性ビリオンの生産は例７の補足系で上記のように行う。
【０１０８】
例６：Ｅ１機能をイントランスで補える相補細胞の形成
１．ヌクレオチド１００〜５２９７のＥ１領域（ｐＴＧ６５３３）を含んだ相補細胞の形成
この細胞は以下を含んでいる：
‐遺伝子がＳＶ４０ウイルス初期プロモーター（ヌクレオチド５１７１〜５２４３）のコントロール下におかれて、３´末端にＳＶ４０転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜２６１８）を含んだ、ｐａｃ遺伝子の発現用カセット。用いられたｐａｃ遺伝子は、Lacalle et al.(1989,Gene,79,375-380)に開示された配列のヌクレオチド２５２〜ヌクレオチド９０５にわたり、公表配列と比べて４つの変更点（３０５位でＣの代わりにＡ；３６７位でＣの代わりにＴ；８０４位でＧの挿入；８２０位でＧの欠失）を含んだ断片に相当する。
【０１０９】
‐ヌクレオチド１００〜５２９７にわたるＡｄ５ゲノムの断片。この断片は、自己のプロモーターおよび転写終結シグナルをもったＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域と、Ｅ２領域のフラクションを含んでおり、このためタンパク質IXをコードする配列と重複している。指針として、系２９３は機能性タンパク質IXを生産することができないらしい。
【０１１０】
組立ては以下で詳述されたいくつかの工程で行う。ベクターｐポリIII-Ｉ* (Lathe et al.,1987,Gene,57, 193-201)を酵素ＡｃｃＩおよびＥｃｏＲＩによる切断に付す。プラスミドｐＴＧ６１６４から単離されたＥｃｏＲＩ‐ＣｌａＩ断片をこうして処理されたベクター中に組み込んでクローニングする。ベクターｐＴＧ６５２８を得る。
【０１１１】
プラスミドｐＴＧ６１６４はｐＬＸＳＮ(Miller D,1989,Bio/Techniques,7,980)から誘導し、ＳＶ４０ウイルス初期プロモーターのコントロール下におかれたｐａｃ遺伝子を含んでいる。簡単に言えば、ｐＬＸＳＮのＨｉｎｄIII-ＫｐｎＩ断片をＭ１３ＴＧ１３１中に導入して、Ｍ１３ＴＧ４１９４を得る。ｐＭＰＳＶ  Ｈ２  Ｋ  ＩＬ２Ｒ(Takeda et al.,1988,Growth Factors, 1,59-66)  のＮｈｅＩ‐ＫｐｎＩ断片を後者に挿入し、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで切断して、Ｍ１３ＴＧ４１９６を得る。後者をＨｉｎｄIII-ＫｐｎＩで切断し、ＨｉｎｄIII 切断および部分的ＫｐｎＩ切断から得たｐＬＸＳＮの精製断片をクローニングする。ｐＴＧ５１９２を得る。後者をＨｉｎｄIII と部分的にＮｈｅＩで切断し、ｐBabe Puro(Land et al.,1990,Nucleic Acids Res.,18,3587)のＨｉｎｄIII-ＮｈｅＩ断片を導入して、ｐＴＧ６１６４を得る。
【０１１２】
ベクターｐＴＧ６５２８をＰｓｔＩで切断し、ＳＶ４０転写終結シグナルを含んだｐＴＧ６１８５（例２．１）から単離されたＰｓｔＩ断片をこの部位に導入する。ｐＴＧ６５２９を得る。後者をＥｃｏＲＩ‐ＨｐａＩ切断に付し、２断片と結合させるが、一方はＡｄ５ゲノムＤＮＡの精製ＢｓｐＥＩ‐ＢｃｇＩ断片（８２６〜５２９７位）で、他方はＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩ末端でＰＣＲにより形成された断片であって、ｐＴＧ６５３１を得る。ＰＣＲ断片はＡｄ５ゲノムＤＮＡとプライマーＯＴＧ４５６４およびＯＴＧ４５６５（SEQ ID NO:27および28で記載）からの遺伝子増幅により得る。増幅断片を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩで切断し、先の段落で記載されたように結合させる。
【０１１３】
ベクターｐＴＧ６５３１は同方向に２つの転写単位（Ｅ１領域の単位とｐａｃ遺伝子の単位）を含んでいる。転写で干渉を避けるためには、それらはｐＴＧ６５３１をＢａｍＨＩで処理して再結合させることにより頭‐尾（互いに逆）方向におく。ベクターｐＴＧ６５３３は２単位の逆方向を示すクローンに相当する。
【０１１４】
ベクターｐＴＧ６５３３をリン酸カルシウム技術により哺乳動物細胞系、例えばVero(ATCC,CCL81)またはＡ５４９(ATCC,CCL185) 系中にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を供給業者の勧めに従い培養し、プロマイシン（濃度６μg/ml）含有選択培地にトランスフェクション後２４時間おく。耐性クローンを選択し、そこではＥ１領域の遺伝子の発現について最も生産的なクローンを調べるために評価するが、これはＥ１機能に欠陥があるアデノウイルス、例えば例２で詳述されたものの生産用の補足系として用いてよい。
【０１１５】
Ｅ１領域の初期タンパク質をコードする配列の発現は、アイソトープ32Ｐで標識された適切なプローブを用いて、ノーザンブロッティングにより分析する。Ｅ１Ａ領域でコードされたタンパク質の生産は、細胞をアイソトープ35Ｓで標識した後に市販抗体(Oncogene Science Inc.,reference DP11)を用いた免疫沈降により検出する。
【０１１６】
（Ｅ１Ｂ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析により）Ｅ１Ｂ領域のプロモーターを活性化するか、または（Ｅ２プロモーターのコントロール下におかれたＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含む“リポーター”プラスミドの一時トランスフェクション後に酵素活性を調べることにより）Ｅ２領域のプロモーターを活性化する、Ｅ１Ａ領域の発現産物の能力を確認することもできる。
【０１１７】
最後に、これらの細胞をＡｄ‐ＲＳＶ‐βｇａｌ(Stratford-Perricaudet et al.,1992,supra) で感染させて、細胞変性効果が観察されるとすぐに寒天技術でウイルスを滴定することができる。一般的に、操作は下記のとおりである。細胞を１０のmoi(感染多重度）で感染させる。感染の約４８時間後、細胞変性効果がみられたときに、細胞を溶解させて、β‐ガラクトシダーゼ活性を慣用的プロトコールに従い調べる（例えば、Maniatis et al.,1989,supra参照）。陽性クローンをもっと低いmoi で再感染させる。感染の約４８時間後に、上澄および細胞を標準技術に従い集める。ウイルス力価は２９３細胞を用いて寒天積層法により決める。得られた力価対初期力価の比率が増幅ファクターになる。
【０１１８】
２．ヌクレオチド５０５〜４０３４のＥ１領域を含んだ補足系（ｐＴＧ６５５７、ｐＴＧ６５５８、ｐＴＧ６５５９、ｐＴＧ６５６４およびｐＴＧ６５６５）の組立て
ベクターｐＴＧ６５５７、ｐＴＧ６５５８およびｐＴＧ６５５９は以下を含んでいる：
(i) 以下のコントロール下にあるｐａｃ遺伝子（前記のようなヌクレオチド２５２〜９０５）の発現用カセット：
‐Ａｄ２  Ｅ２Ａプロモーター（ヌクレオチド２７３４１〜２７０３０）（ｐＴＧ６５５８の場合）
‐ヌクレオチド２７１６３〜２７１８２間にある配列が欠失されたＡｄ２  Ｅ２Ａプロモーター（ｐＴＧ６５５７の場合）。このような変異から、Ｅ１Ａでコードされたトランス活性化タンパク質による誘導能に影響を与えることなく、Ｅ２Ａプロモーターの基準レベルを減少させることができる。または
‐ｐＴＧ６５５９の場合ＳＶ４０初期プロモーター
【０１１９】
上記３つの場合において、それは３´末端にＳＶ４０ウイルス転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜２６１８）も含んでいる；および
(ii) ヌクレオチド５０５〜４０３４にわたるＡｄ５  Ｅ１領域の部分を含んだ発現カセット。アデノウイルスゲノムのこの部分は、Ｅ１Ａ領域の初期タンパク質をコードする配列の全部、Ｅ１Ａ単位の転写終結シグナル、Ｅ１Ｂプロモーター（Ｅ１Ａでコードされるトランス活性化タンパク質により誘導しうる）と、Ｅ１Ｂ領域のコード配列の全部を含んでいる。それはタンパク質IXをコードする配列も含んでおり、Ｅ１Ｂ領域と重複している。しかしながら、それはＥ１Ａ領域のプロモーターとＥ１ＢおよびIX転写単位の転写終結シグナルを欠く。Ｅ１領域の配列を発現させるためには、ネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターをアデノウイルス断片の５´末端に導入し、ウサギβ‐グロビン遺伝子の転写終結シグナル（Genebankデータバンクで参照番号K03256として開示されている配列のヌクレオチド１５４２〜２０６４）を３´末端に導入する。
【０１２０】
場合により、何らかの種類の、例えばｐＢＲ３２２(Bolivar et al.,1977,Gene,2,95-113) から単離されたヌクレオチド配列も、転写で生じうる干渉を避けるために、ｐａｃ遺伝子とＥ１領域との発現用カセット間に導入してよい。
【０１２１】
これらベクターの組立ては下記のいくつかの工程で行う。
【０１２２】
最初に、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド８２６にわたるＡｄ５ゲノムの部分は、ゲノム調製物から、後のクローニング工程に有用なＰｓｔＩ部位を５´末端に含むプライマーＯＴＧ５０１３（配列番号29）とＢｓｐＥＩ部位と重複するＯＴＧ４５６５（配列番号28）を用いたＰＣＲにより増幅させる。ＰＣＲにより形成された断片をクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後Ｍ１３ｍｐ１８のＳｍａＩ部位中に挿入して、Ｍ１３ＴＧ６５１２を得る。ＰＣＲ断片の配列を確認する。
【０１２３】
ベクターｐＴＧ６５３３（例６．１）を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩで切断する。こうして処理されたベクターを、一方ではＭ１３ＴＧ６５１２から単離されたＰｓｔＩ‐ＢｓｐＥＩ断片、他方ではｐＫＪ‐１から単離されたＥｃｏＲＩ‐ＰｓｔＩ断片と結合させる。後者の断片はヌクレオチド−５２４〜−１９間にあるネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターの部分を含んでいるが、その配列はAdra et al.(1987,Gene,60,65-74) で報告されている。この工程ではｐＴＧ６５５２を生じ、ヌクレオチド５０５で始まるＡｄ５のＥ１領域の上流にネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターを挿入することができる。  別に、ＸｈｏＩで形成された末端がクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理後に平滑化されているＸｈｏＩ‐ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＣＭＧ  Ｎｅｏ(Karasuyama et al.,1989,J.Exp.Med.,169,13-25) から精製する。ウサギβ‐グロビン遺伝子の転写終結シグナルを含んだこの断片を、ベクターｐポリII-Sfi/Not-14 * (Lathe et al.,1987,Gene,57,193-201) のＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位間に導入する。得られたベクターｐＴＧ６５５１は、ヌクレオチド３６６５〜ヌクレオチド４０３４にわたるＡｄ５ゲノムの断片をその中に挿入するために、酵素ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＶでその一部について切断する。この断片は標準プロトコールに従いＰＣＲで形成する。用いられた操作では、鋳型としてＡｄ５ゲノムＤＮＡ調製物と、３６６５位で内部ＳｐｈＩ部位と重複するプライマーＯＴＧ５０１５（配列番号30）および５´末端にＢｇｌII部位を含むＯＴＧ５０１４（配列番号31）を用いる。
【０１２４】
ＰＣＲ断片をクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してから、Ｍ１３ｍｐ１８のＳｍａＩ部位中に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５１６を得る。その配列の確認後に、ＰＣＲ断片をＢｇｌII切断、クレノウＤＮＡポリメラーゼ処理およびＳｐｈＩ切断により抽出する。それをｐＴＧ６５５１のＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＶ部位間に挿入する。これによりｐＴＧ６５５４を得る。
【０１２５】
別に、ベクターｐＴＧ６５２９（例６．１）を酵素ＨｐａＩおよびＨｉｎｄIII 切断に付す。ｐａｃ遺伝子とその後にＳＶ４０ウイルス転写終結シグナルを含んだ２．９kb断片を精製する。この断片を、Ａｄ２  Ｅ２Ａプロモーターを有するｐＥ２  Ｌａｃ(Boeuf et al.,1990,Oncogene,5,691-699)から単離されたＳｍａＩ‐ＨｉｎｄIII 断片に結合させる。ベクターｐＴＧ６５５６を得る。一方、それはＡｄ２の変異Ｅ２Ａプロモーターを有するｐＥ２  Ｌａｃ  Ｄ９１７０(Zajchowski et al.,1985,EMBO J,,4,1293-1300)から単離されたＳｍａＩ‐ＨｉｎｄIII 断片に結合させてもよい。この場合には、ベクターｐＴＧ６５５０を得る。
【０１２６】
ｐＴＧ６５５６を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで切断する。ｐＴＧ６５５２から単離されたＥｃｏＲＩ‐ＳａｃII断片とｐＴＧ６５５４から単離されたＳａｃII‐ＢａｍＨＩ断片をこれらの部位間に挿入する。ベクターｐＴＧ６５５８を得る。ｐＴＧ６５５０およびｐＴＧ１６４３（例７．１）で行う同様の工程では、各々ｐＴＧ６５５７およびｐＴＧ６５５９を得る。
【０１２７】
ｐＴＧ６５５７およびｐＴＧ６５５８をＥｃｏＲＶで切断するが、唯一の部位は２つの発現カセット（ｐａｃ遺伝子およびＥ１領域）間に位置している。ｐＢＲ３２２(Bolivar et al.,supra)から単離された１．８８kbＥｃｏＲＶ‐ＰｖｕII断片は、２プロモーター間の距離をあけるために、この部位中に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ６５６４およびｐＴＧ６５６５を各々得る。
【０１２８】
ベクターｐＴＧ６５５７、ｐＴＧ６５５８、ｐＴＧ６５５９、ｐＴＧ６５６４およびｐＴＧ６５６５を細胞系Ａ５４９中にトランスフェクトする。前記のように、プロマイシン耐性クローンを選択し、Ｅ１領域の発現を確認する。Ｅ１発現クローンは、Ｅ１機能に欠陥があるアデノウイルスを増幅および増殖させるためにある。Ｅ１発現産物の生産には細胞毒性効果を伴うが、サザン分析ではベクター再配列を実証できない。Ａｄ‐ＲＳＶ‐βｇａｌ感染後、いくつかのクローンはウイルスを１００倍以上増幅させることができる。
【０１２９】
３．Saccharomyces cerevisiae Gal4 タンパク質により誘導しうる相補細胞の作製
これらのベクターは、前記のように、ヌクレオチド５０５〜４０３４にわたるＡｄ５  Ｅ１領域の部分を含んでいる。しかしながら、Ｅ１Ａ領域の配列の発現は、一方ではＡｄ２  ＭＬＰ最小プロモーター（ＴＡＴＡボックスおよび転写開始シグナル；ヌクレオチド−３４〜＋３３）と他方ではＧａｌ４タンパク質により活性化できるＧａｌ１０遺伝子の活性化配列からなる誘導性プロモーターのコントロール下におかれている。Ｇａｌ４結合部位に相当する１７ヌクレオチド（１７MX）の共通活性化配列はWebster et al.(1988,Cell,52,169)で特定されている。ウサギβ‐グロビン遺伝子の転写終結シグナルをＥ１Ｂ転写単位の３´末端におく。
【０１３０】
１７MX配列のダイマー（配列番号32および33）とその後にＡｄ２  ＭＬＰ最小プロモーターを含み、その５´末端にＳａｌＩ部位およびその３´末端にＢａｍＨＩ部位を含んだ第一ＤＮＡ断片を合成する。ＳａｌＩ部位をクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理により平滑化する。別に、配列のペンタマーとその後に同様のプロモーターを含み、その５´および３´末端にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部位を含んだ第二ＤＮＡ断片を合成する。ＸｂａＩ切断後に、その末端をクレノウポリメラーゼ処理で平滑化する。
【０１３１】
これら断片の各々をｐポリIIのＢｇｌII部位中に導入して、ｐＴＧ１６５６およびｐＴＧ１６５７を各々得る。次いで下記２断片、即ちｐＴＧ６５５２（例６．２）から単離されたＰｓｔＩ‐ＸｂａＩ断片とｐＴＧ６５５９（例６．２）から単離されたＸｂａＩ‐ＢａｍＨＩ断片をＰｓｔＩ‐ＢａｍＨＩで既に切断されたベクターの各々の中に導入する。ｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１を各々得る（図５）。
【０１３２】
Ａ５４９細胞をｐＴＧ１６４３（ｐａｃ遺伝子発現用のベクター）とｐＴＧ１６６０またはｐＴＧ１６６１でコトランスフェクトする。クローンをそれらのプロマイシン耐性について選択し、上記のように試験する。Ａ５４９‐１６６０およびＡ５４９‐１６６１の約５０％はＥ１領域の発現産物を生産する。しかしながら、生産には細胞毒性効果を伴い、細胞の形態的外観を変える。
【０１３３】
細胞ゲノムにおけるプラスミドの組込みおよび非再配列をサザン分析により確認する。組込みプラスミド（ｐＴＧ１６４３、ｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１）の実質的変化は、分析された生産クローンで実証できない。Ｇａｌ４の存在下でＥ１Ａ領域によりコードされた配列の発現の誘導能も（Ｇａｌ４タンパク質の構成的発現を行うプラスミドでの形質転換により）確認することができる。
【０１３４】
約２のmoi でＡｄ‐ＲＳＶ‐βｇａｌによるいくつかの生産クローンの感染後に、２つのＡ５４９‐１６６０クローンはウイルスストックを１００倍以上増幅させることができる。
【０１３５】
例７：アデノウイルスの複製に必須な機能のすべてに関する補足系の形成
５´ＩＴＲ、３´ＩＴＲおよび包膜化領域を除いてＡｄ５アデノウイルスゲノムの全部を含んだベクターを組み立てる。
【０１３６】
ベクターｐＴＧ６５２８（例６．１）を酵素ＰｓｔＩおよびＢｇｌIIで切断するが、その間にはＯＴＧ５０３９およびＯＴＧ５０４０（配列番号34および35）のオリゴヌクレオチドからなる標準プロトコールに従い化学的に合成されたＤＮＡ断片が挿入されている。オリゴヌクレオチド配列はＰｓｔＩクローニング部位を再形成せずにＥｃｏＲＶ部位を導入できるようにデザインされている。ｐＴＧ１６３９を得て、これをＥｃｏＲＶ切断で直鎖化し、末端がクレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されたＸｂａＩ‐ＢａｍＨＩ断片に結合させる。この断片はＳＶ４０ウイルス転写終結シグナルを有している。適切な制限部位で囲まれたシグナルを含むいずれのプラスミドもこの工程で用いてよい。
【０１３７】
こうして形成されたベクターｐＴＧ１６４０をＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで切断し、ｐａｃ遺伝子発現用のカセットを有する断片をベクターｐポリII-Sfi/Not-14 * のＢｇｌII部位中に導入する。ｐＴＧ１６４１を得る。後者をＮｏｔＩで直鎖化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼで処理する。ｐＢＲ３２２(Bolivar et al.,supra)から単離されて更にクレノウＤＮＡポリメラーゼで処理された０．２７６kbＢａｍＨＩ‐ＳａｌＩ断片を導入する。これによりｐＴＧ１６４３を得る。
【０１３８】
ｐＴＧ１６４３をＸｈｏＩで直鎖化し、１７MXダイマーとその後にＴＫ‐ＨＳＶ‐１遺伝子最小プロモーター（Genebankデータバンクで参照番号V00467として開示された配列のヌクレオチド３０３〜４５０、３´末端においてＸｈｏＩ部位で補充されている）を含んだＸｈｏＩハイブリッド断片をこの部位中に挿入する。ｐＴＧ１６４７を得るが、そこでは２×１７MX‐ＴＫ‐ＨＳＶ‐１ハイブリッドプロモーターがｐａｃ遺伝子発現用のカセットと同方向に挿入されている。
【０１３９】
この組立体ｐＴＧ１６４７は、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド３５８２６にわたるＡｄ５ゲノムの断片をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ部位間に導入するための親ベクターとして用いる。第一段階では、ｐＴＧ１６４７をＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し、その後一方ではヌクレオチド５０５〜９１８のＡｄ５ゲノムの部分を含んだｐＴＧ６５５２（例６．２）のＰｓｔＩ‐ＣｌａＩ断片と、他方ではＡｄ５ゲノムＤＮＡから調製されたＣｌａＩ‐ＢａｍＨＩ断片（９１８〜２１５６２位）とに結合させる。それにより得られたベクターは、５´ＩＴＲおよび包膜化領域を除いたＡｄ５の５´部分を含んでいる。
【０１４０】
別に、Ａｄ５ゲノムの３´部分をベクターｐポリII-Sfi/Not-14* でアセンブリー化する。後者をＢａｍＨＩで直鎖化し、Ａｄ５ゲノムのＢａｍＨＩ‐ＡｖｒII断片（ヌクレオチド２１５６２〜２８７５２）とＡｄ５のヌクレオチド３５４６３〜３５８２６に相当するＰＣＲ断片を導入する。後者の断片はＡｄ５ゲノムＤＮＡからプライマーＯＴＧ５０２４（配列番号36）およびＯＴＧ５０２５（配列番号37）を用いて形成し、５´末端にＢａｍＨＩ部位を含んでいる。得られたベクターをＡｖｒIIで切断し、Ａｄ５ゲノムＤＮＡから単離された２８７５３〜３５４６２位にわたるＡｖｒII断片を挿入する。
【０１４１】
アデノウイルス配列を含んだＢａｍＨＩ断片を、５´ＩＴＲおよび包膜化領域を欠くアデノウイルスゲノムの５´部分を含んだ先の工程のベクターのＢａｍＨＩ部位中に導入する。
【０１４２】
欠陥アデノウイルスの機能のすべてを補える補足系は、前例で記載されたプロトコールに従い、細胞系、例えばＡ５４９中へのトランスフェクションにより形成する。
【０１４３】
アデノウイルスゲノムの事実上全体を含む下記４つのベクターを組み立てることにより行うことも可能であり、これは最終工程において単一ベクターでリアセンブリー化させる：
‐ｐＴＧ１６６５は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＢｓｐＥＩ断片（ヌクレオチド８２６〜７２６９）をｐポリII-Sfi/Not-14* のＸｍａＩ部位中に組込むクローニングに相当する；
‐ｐＴＧ１６６４は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＮｏｔＩ断片（ヌクレオチド６５０３〜１５０４）を同ベクターのＮｏｔＩ部位中に挿入することにより形成する；
‐ｐＴＧ１６６２は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＡａｔII断片（ヌクレオチド１０７５４〜２３９７０）をｐポリIIのＡａｔII部位中に導入することにより得る；
‐Ａｄ５ゲノムの３´部分を含むｐＴＧ１６５９（例２．３）
【０１４４】
次いで誘導発現系、例えばＧａｌ４により誘導しうる例６．３または７で記載されたプロモーター、あるいは従来のプロモーター、例えばメタロチオネインまたはテトラサイクリンプロモーターを含んだ断片を導入する。このような断片はＡａｔIIおよびＣｌａＩで切断されたベクターｐＴＧ１６６５においてＡｄ５の５´配列（ヌクレオチド５０５〜９１８）の上流に位置させる。最後に、ｐＴＧ１６６４のＮｏｔＩ断片、ｐＴＧ１６６２のＡａｔII断片と、最後にｐＴＧ１６５９のＢａｍＨＩ断片を上記ベクター中に対応部位で連続的に組み込んでクローニングする。
【０１４５】
補足系を上記ベクターおよびｐＴＧ１６４３のコトランスフェクションにより形成し、プロマイシン耐性クローンを単離する。この系は、更に詳しく言うと、Ｅ１、Ｅ２およびＥ４機能と後期機能に欠陥がある例５のアデノウイルスベクターを増幅および包膜化するためにある。
【０１４６】
例８：Ｅ１およびＥ４機能に関する補足系の形成
ベクターｐＴＧ１６４７（例７）を酵素ＰｓｔＩ‐ＢａｍＨＩで切断し、下記３つの断片：
‐ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド１３３９のＡｄ５配列を有するｐＴＧ６５５２（例６．２）のＰｓｔＩ‐ＸｂａＩ断片、
‐ヌクレオチド１３４０〜ヌクレオチド３６６５のＡｄ５配列を有するｐＴＧ６５５２のＸｂａＩ‐ＳｐｈＩ断片、および
‐ヌクレオチド３６６５〜ヌクレオチド４０３４のＡｄ５配列と転写終結シグナルを有するｐＴＧ６５５４（例６．２）のＳｐｈＩ‐ＢａｍＨＩ断片をこうして処理されたベクター中に導入する。
【０１４７】
それにより得られたベクターをＢａｍＨＩで切断し、下記３つの断片：
‐３２８００〜３３１０４位間に位置するＡｄ５配列に相当する、ＰＣＲにより形成される、ＢａｍＨＩ‐ＡｆｌIIで切断された断片。用いられる操作では、鋳型としてＡｄ５ゲノムＤＮＡとプライマーＯＴＧ５０７８（配列番号38）およびＯＴＧ５０７９（配列番号39）を用いる。
【０１４８】
‐Ａｄ５ゲノムＤＮＡから単離されたＡｆｌII‐ＡｖｒII断片（ヌクレオチド３３１０５〜３５４６３）、
‐プライマーＯＴＧ５０２４およびＯＴＧ５０２５  （例７参照）を用いるＰＣＲにより形成されたＡｖｒII‐ＢａｍＨＩ断片
をこの部位中に導入する。
【０１４９】
これにより形成されたベクターを上記プロトコールに従い細胞系中に導入して、Ｅ１およびＥ４機能に関する補足系を形成する。
【０１５０】
しかも、このような系は下記プロトコールに従い得てもよい：
Ａｄ５ゲノムのＥ４領域（ヌクレオチド３２８００〜３５８２６）をいくつかの工程で再形成させる。ヌクレオチド３３１１６〜３２８００にわたる部分をＡｄ５ゲノムＤＮＡからプライマー対ＯＴＧ５０７８およびＯＴＧ５０７９（配列番号38および39）でＰＣＲにより合成し、その後Ｍ１３ＴＧ１３０のＥｃｏＲＶ部位中に挿入して、Ｍ１３ＴＧ１６４５を得る。
【０１５１】
後者のＢａｍＨＩ‐ＡｆｌII断片をＡｄ５のＡｆｌII‐ＡｖｒII断片（ヌクレオチド３３１０４〜３５４６３）との結合反応に付し、ベクターｐＴＧ７４５７をＢａｍＨＩおよびＡｖｒIIで切断する。ｐＴＧ１６５０を得る。
【０１５２】
次いでＥ４領域を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマーＯＴＧ５０２４およびＯＴＧ５０２５（配列番号36および37）を用いるＰＣＲでヌクレオチド３５８２６〜３５４５７に相当する断片を得ることにより完成させる。この断片をＭ１３ｍｐ１８のＳｍａＩ部位に挿入して、Ｍ１３ＴＧ１６４６を得る。ＡｖｒII‐ＥｃｏＲＩ断片を後者から単離し、ｐＴＧ１６５０のＡｖｒIIおよびＥｃｏＲＩ部位間に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ１６５２を得る。
【０１５３】
Ａｄ５のＥ４領域を含んだＢａｍＨＩ断片をｐＴＧ１６５２から単離し、ｐＴＧ１６４３およびｐＴＧ６５５９（例６．２）のＢａｍＨＩ部位またはｐＴＧ６５６４（例６．２）のＳｓｐＩ部位中に、その部位が平滑化された後に組み込んでクローニングし、ｐＴＧ１６５３、ｐＴＧ１６５４およびｐＴＧ１６５５（図６）を各々得る。
【０１５４】
Ｅ１およびＥ４機能をイントランスで補える相補細胞は、慣用的技術で：
(1) 細胞系２９３へのｐＴＧ１６５３の形質転換、または
(2) 細胞系Ａ５４９へのｐＴＧ１６５４またはｐＴＧ１６５５の形質転換
により作製する。
【０１５５】
一般的に言えば、Ｅ１およびＥ４領域の産物の発現には細胞毒性効果を伴う。いくつかの２９３‐１６５３クローンは、Ｅ１が欠失されたアデノウイルスとＥ４が欠失されたアデノウイルスの双方を補うことができる。
【０１５６】
別法では下記のように行う。
【０１５７】
ベクターＭ１３ＴＧ１６４６を、Ｅ４領域のプロモーターを欠失させてＨｐａＩ部位を挿入する目的から、変異原性オリゴヌクレオチドＯＴＧ５９９１（配列番号40）で特定部位変異誘発に付す。変異ベクターはＭ１３ＴＧ６５２２と命名する。それをＰｓｔＩで切断し、ファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼとその後ＡｖｒIIで処理し、ｐＴＧ１６５２（例８）の精製ＥｃｏＲＩ（クレノウ）‐ＡｖｒII断片と結合させて、ｐＴＧ６５９５を得る。後者をＨｐａＩで開裂し、ＢｇｌIIおよびＢａｍＨＩ切断とクレノウ処理後にｐＴＧ５９１３（図７）から得られた０．８kb断片を導入する。ｐＴＧ６５９６を得るが、そこではＥ４領域（３２８００〜３５８２６位）はＴＫプロモーターのコントロール下にある。参考のため、ｐＴＧ５９１３はＴＫ‐ＨＳＶ‐１遺伝子を有し、ＢｇｌII‐ＢａｍＨＩ断片はこの遺伝子のプロモーターに相当する(Wagner et al.,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,78,1441-1445) 。
【０１５８】
並行して、ベクターｐＴＧ１６４３およびｐＴＧ６５５９（例６）をＢａｍＨＩで直鎖化し、オリゴヌクレオチドＯＴＧ６１４１およびＯＴＧ６１４２（配列番号41および42）の組換えから得た合成断片を挿入して、ｐＴＧ８５０８およびｐＴＧ８５０７を各々得る。
【０１５９】
これらの後者をＢａｍＨＩで開裂してから、Ｅ４発現用のカセットを含んだｐＴＧ６５９６の精製ＢａｍＨＩ断片を導入する。ベクターｐＴＧ８５１２（図８）およびｐＴＧ８５１３（例９）を得る。
【０１６０】
更に、同酵素で直鎖化されたベクターｐＴＧ８５０８またはｐＴＧ８５０７中へのｐＴＧ１６５２のＢａｍＨＩ断片の導入から、ｐＴＧ８５１４およびｐＴＧ８５１５を各々得る（図１０および１１）。
【０１６１】
ｐＴＧ８５１２またはｐＴＧ８５１５でトランスフェクトされた細胞系はＥ４機能に欠陥があるアデノウイルスを補うことができ、一方ｐＴＧ８５１３またはｐＴＧ８５１４トランスフェクションによるものはＥ１およびＥ４機能に欠陥があるアデノウイルスを増幅および増殖させるためにある。同様に、２９３細胞中へのｐＴＧ８５１２またはｐＴＧ８５１５のトランスフェクションでは、Ｅ１およびＥ４に欠陥があるアデノウイルスを補うことができる。
【０１６２】
［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【０１６３】
本発明は下記図面を参照して下記例により詳細に記載されている。
【図１】図１は、異なる遺伝子の位置を示した、ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの（０〜１００の任意単位で表される）略図である。
【図２】図２はベクターｐＴＧ６５４６の略図である。
【図３】図３はベクターｐＴＧ６５８１の略図である。
【図４】図４はベクターｐＴＧ６３０３の略図である。
【図５】図５はベクターｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１の略図である。
【図６】図６はベクターｐＴＧ１６５３、ｐＴＧ１６５４およびｐＴＧ１６５５の略図である。
【図７】図７はベクターｐＴＧ５９１３の略図である。
【図８】図８はベクターｐＴＧ８５１２の略図である。
【図９】図９はベクターｐＴＧ８５１３の略図である。
【図１０】図１０はベクターｐＴＧ８５１４の略図である。
【図１１】図１１はベクターｐＴＧ８５１５の略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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