(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のａ）酢酸キナーゼ、ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、ｃ）アルコールデヒドロゲナーゼ、ｄ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｅ）メチルグリオキサールシンターゼ、ｆ）ピルビン酸オキシダーゼ、ｇ）クエン酸リアーゼ、ｈ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ｉ）ギ酸輸送体、ｊ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ｋ）リンゴ酸酵素、およびｌ）プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼをコードする標的遺伝子に対する遺伝的改変（該遺伝的改変は該標的遺伝子により生産されるポリペプチドの酵素活性を不活性化する）を含む、遺伝的に改変された細菌株であって、大腸菌である細菌株。
【請求項２】
前記標的遺伝子もしくはその一部、または前記の複数の標的遺伝子もしくはそれらの一部が欠失、フレームシフト突然変異、点突然変異、停止コドンの挿入またはそれらの組合せにより不活性化されている、請求項１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項３】
外因性の遺伝子もしくはそのフラグメントを含まない、または天然の遺伝子のみを含む、請求項１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項４】
１）遺伝的に改変された細菌株が不活性化された以下の遺伝子：ａ）フマル酸レダクターゼ；ｂ）ＡＴＰシンターゼ；ｃ）２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ；ｄ）コハク酸デヒドロゲナーゼ；ｅ）グルコース輸送体；ｆ）イソクエン酸リアーゼレプレッサーの１以上を有していなくともよく；かつ／または２）遺伝的に改変された株がリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼおよび／またはクエン酸シンターゼをコードし、かつ／または過剰発現するプラスミドまたは多重コピープラスミドを含まない、請求項１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項５】
代謝的に進化されている、請求項２、３または４に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項６】
少なくとも２００ｍＭ濃度のコハク酸を生産する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【請求項７】
ＫＪ０１２（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２２）、ＫＪ０１７（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２３）、ＫＪ０３２（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２４）、ＫＪ０６０（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２５）、ＫＪ０７０（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２６）、ＫＪ０７１（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２７）、ＫＪ０７２（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２８）、ＫＪ０７３（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２９）、ＫＪ０９１（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１０）、ＫＪ０９８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１１）、ＫＪ１０４（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１２）、ＫＪ１１０（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１３）、ＫＪ１１９（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１４）、ＫＪ１２２（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１５）またはＫＪ１３４（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１６）である、遺伝的に改変された細菌株。
【請求項８】
遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させる方法であって、請求項１に記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株を培養培地に接種すること、および該遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させることを含む、方法。
【請求項９】
コハク酸、フマル酸またはマレイン酸を生産する方法であって、請求項１に記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株を、コハク酸またはマレイン酸またはフマル酸の生産を可能とする条件下で培養することを含む、方法。
【請求項１０】
前記の１以上の遺伝的に改変された細菌株がＫＪ０１２（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２２）、ＫＪ０１７（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２３）、ＫＪ０３２（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２４）、ＫＪ０６０（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２５）、ＫＪ０７０（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２６）、ＫＪ０７１（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２７）、ＫＪ０７２（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２８）、ＫＪ０７３（ＮＲＲＬ Ｂ−５００２９）、ＫＪ０９１（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１０）、ＫＪ０９８（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１１）、ＫＪ１０４（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１２）、ＫＪ１１０（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１３）、ＫＪ１１９（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１４）、ＫＪ１２２（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１５）またはＫＪ１３４（ＮＲＲＬ Ｂ−５０１１６）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記の遺伝的に改変された細菌株が無機塩培地で培養される、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
無機塩培地が２％〜２０％（ｗ／ｖ）の間の炭水化物を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
無機塩培地が２％〜２０％（ｗ／ｖ）の間の糖を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炭水化物がグルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロースまたは組合せである、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ濃度のコハク酸を生産する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ濃度のマレイン酸を生産する、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ濃度のフマル酸を生産する、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
増殖培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸のための基質としてグリセロールを含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸の生産のための基質としてグリセロールをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株と培地を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コハク酸およびリンゴ酸を効率的に生産するための材料および方法に関する。
関連出願の相互参照
本願は、２００７年３月２０日に出願された米国仮出願第６０／８９５，８０６号の利益を主張するものであり、その開示内容は全ての図、表およびアミノ酸または核酸配列を含めそのまま出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、エネルギー省助成金第ＵＳＤＯＥ−ＤＥ  ＦＧ０２−９６ＥＲ２０２２２号およびエネルギー省・米国農務省合同助成金第ＵＳＤＡ  ＆  ＤＯＥ  Ｂｉｏｍａｓｓ  ＲＤＩ  ＤＥ  ＦＧ３６−０４ＧＯ１４０１９号から認められた助成のもと、政府支援を受けてなされた。政府は本発明の一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
再生可能な供給原料からのコハク酸の発酵生産は、石油価格が高騰するにつれ、ますます競争性が増すであろう。コハク酸は、プラスチック、溶媒および現在石油から製造されているその他の化学物質への変換のための基質として役立ち得る(Leeら, 2004; Leeら, 2005; McKinlayら, 2007; Wendischら, 2006; Zeikusら, 1999)。多くの細菌は、主要な発酵生成物としてコハク酸を天然に生産し得ることが記載されている（米国特許第５，７２３，３２２号；表１）。しかしながら、多くの場合、複雑なプロセス、複雑な培地および長いインキュベーション時間が必要である。
【０００４】
これまでに、コハク酸の生産向けに大腸菌(Escherichia coli)株を操作するために様々な遺伝学的アプローチが用いられて来、成功の程度は様々であった（表１）。ほとんどの研究では、達成された力価は低く、酵母抽出物またはコーンスティープリカーなどの複雑な培地成分複合体が必要であった。ＮＺＮ１１１株は、代謝されたグルコース１モル当たりコハク酸０．９８モルのモル収率で１０８ｍＭのコハク酸を生産した(Chatterjeeら, 2001; Millardら, 1996; Stols and Donnelly, 1997)。この株は、２つの遺伝子（ピルビン酸ギ酸開裂酵素をコードするｐｆｌＢおよび乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ）を不活性化し、多重コピープラスミドから２つの大腸菌遺伝子、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）とホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）を過剰発現させることにより操作されたものである。ＨＬ２７６５９ｋ株は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ｓｄｈＡＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、グルコース輸送体（ｐｔｓＧ）およびイソクエン酸リアーゼレプレッサー（ｉｃｌＲ）を突然変異させることにより操作されたものである。この株は１００ｍＭ未満のコハク酸を生産し、酸素により制限される発酵条件を必要とした(Coxら, 2006; Linら, 2005a, 2005b, 2005c; Yunら, 2005)。Mannheimia succiniciproducensにおける天然のコハク酸経路に類似した大腸菌経路を作り出すべく遺伝子ノックアウトを設計するためにin silico代謝分析が用いられてきた(Lee et al., 2005および2006)。しかしながら、得られた株が生産するコハク酸は極めて少なかった。Andersson et al. (2007)は、天然遺伝子だけを含む操作大腸菌が最高レベル（３３９ｍＭ）のコハク酸を生産することを報告した。
【０００５】
他の研究者らは、大腸菌において異種遺伝子を発現する別のアプローチを行った。炭素流をコハク酸に向けるために、Rhizobium etelotiのピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）が多重コピープラスミドから過剰発現された(Gokarnら, 2000; Vemuriら, 2002a, 2002b)。ＳＢＳ５５０ＭＧ株は、イソクエン酸リアーゼレプレッサー（ｉｃｌＲ）、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡおよびａｃｋＡを不活性化し、枯草菌(Bacillus subtilis)ｃｉｔＺ（クエン酸シンターゼ）およびR. etli  ｐｙｃを多重コピープラスミドから過剰発現させることにより構築されたものである(Sanchez et al., 2005a)。この株を用いたところ、グルコースからモル収率１．６で１６０ｍＭのコハク酸が生産された。
【０００６】
コハク酸生産のための、より複雑なプロセスも検討されている（表１）。これらのプロセスの多くは、好気性増殖期とその後に嫌気性生産期を含む。嫌気性期には多くの場合、二酸化炭素、水素またはその双方が供給される(Anderssonら, 2007; Sanchezら, 2005aおよび2005b; Sanchezら, 2006; U.S. Patent 5,869,301; Vemuriら, 2002aおよび2002b)。天然コハク酸生産株A. succiniciproducensを用いた最近の研究では、電気透析、ＣＯ２散布、細胞再生および回分法が組み合わせられた(Meynial-Sallesら, 2007)。
【０００７】
本発明は、異種遺伝子またはプラスミドの必要なく、簡単な、ｐＨ制御された回分発酵の無機塩培地にて高力価および高収率でコハク酸を生産する、大腸菌株などの種々の形態の微生物を提供する。開発中、主生成物としてマレイン酸を生産した中間体株を同定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５７２３３２２号
【特許文献２】米国特許第５８６９３０１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Lee, S.Y., Hong, S.H., Lee, S.H., Park, S.J. (2004) “Fermentative production of chemicals that can be used for polymer synthesis” Macromol. Biosci. 4:157-164
【非特許文献２】Lee, S.J, Lee ,D.Y., Kim, T.Y., Kim, B.H., Lee, J., Lee, S.Y. (2005) “Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in silico gene knockout simulation” Appl Environ Microbiol 71:7880-7887
【非特許文献３】McKinlay, J.B., Zeikus, J.G., Vieille, C. (2005) “Insights into Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism in a chemically defined growth medium” Appl Environ Microbiol. 71(11):6651-6656
【非特許文献４】Wendisch, V.F., Bott, M., Eikmanns, B.J. (2006) “Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids” Curr Opin Microbiol 9:1-7
【非特許文献５】Zhang, X., Jantama, K., Moore, J.C., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2007) “Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli” Appl. Microbiol. Biotechnol. 77: 355-366
【非特許文献６】Chatterjee, R., Cynthia, S.M., Kathleen, C., David, P.C., Donnelly, M.I. (2001) “Mutation of the ptsG gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli.” Appl. Environ. Microbiol. 67:148-154
【非特許文献７】Millard, C.S., Chao, Y.P., Liao, J.C., Donnelly, M.I. (1996) “Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli” Appl. Environ. Microbiol. 62:1808-1810
【非特許文献８】Stols, L., Donnelly, M.I. (1997) “Production of succinic acid through overexpression of NAD dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant” Appl. Environ. Microbiol. 63:2695-2701
【非特許文献９】Cox, S.J., Levanon, S.S., Sanchez, A.M., Lin, H., Peercy, B., Bennett, G.N., San, K.Y. (2006) “Development of a metabolic network design and optimization framework incorporating          implement constraints: A succinate production case study” Metab. Engin. 8:46-57
【非特許文献１０】Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005a) “Chemostat culture characterization of Escherichia coli mutant strains metabolically engineered for aerobic succinate production: A study of the modified metabolic network based on metabolite profile, enzyme activity, and gene expression profile” Metab. Engin. 7:337-352
【非特許文献１１】Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005b) “Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield” Metab. Engin. 7:116-127
【非特許文献１２】Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005c) “Effect of carbon sources differing in oxidation state and transport route on succinate production in metabolically engineered Escherichia coli” J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 32:87-93
【非特許文献１３】Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005d) “Fed-batch culture of a metabolically engineered Escherichia coli strain designed for high-level succinate production and yield under aerobic conditions” Biotechnol Bioeng 90:775-779
【非特許文献１４】Lee, S.J., Song, H., Lee, S.Y. (2006) “Genome-based metabolic engineering of Mannheimia            succiniciproducens for succic acid production” Appl Environ Microbiol 72(3):1939-1948
【非特許文献１５】Andersson, C., Hodge, D., Berglund, K.A., Rova, U. (2007) “Effect of different carbon sources on the production of succinic acid using metabolically engineered Escherichia coli.” Biotechnol Prog 23(2):381-388
【非特許文献１６】Gokarn, R.R., Eiteman, M.A., Altman, E. (2000) “Metabolic analysis of Escherichia coli in the presence and absence of carboxylating enzymes phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate carboxylase” Appl. Environ. Microbiol. 66:1844-1850
【非特許文献１７】Vemuri, G.N., Eiteman, M.A., Altman, E. (2002a) “Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli.” Appl. Environ. Microbiol. 68:1715-1727
【非特許文献１８】Vemuri, G.N., Eiteman, M.A., Altman, E. (2002b) “Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions” J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28, 325-332
【非特許文献１９】Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005a) “Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity” Metabolic Engineering 7:229-239
【非特許文献２０】Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005b) “Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant” Biotechnol. Prog. 21: 358-365.
【非特許文献２１】Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2006) “Batch culture characterization and metabolic flux analysis of succinate-producing Escherichia coli strains” Metabolic Engineering 8: 209-226
【非特許文献２２】Meynial-Salles, I., Dorotyn, S., Soucaille, P. (2007) “A new process for the continuous production of succinic acid from glucose at high yield, titer and productivity” Biotechnol Bioeng. 99(1):129-135
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、乳酸の生産に有用な新規な微生物、例えば、大腸菌を提供する。よって、本発明の材料および方法は様々な適用に用いるためのコハク酸およびマレイン酸の生産に使用できる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ある特定の実施形態では、コハク酸、マレイン酸およびアラニンを生産する株の構築には大腸菌の誘導体(Escherichia coli)(本明細書ではE. coliとも呼ぶ）が使用できる。種々の実施形態では、種々の寄託機関または商業的供給源から入手可能な他の大腸菌株が使用可能であることから、大腸菌Ｃ（例えばＡＴＣＣ８７３９）が使用可能である。本発明の操作微生物は、いくつかの実施形態では、また、天然の遺伝子だけを含む（すなわち、他の生物に由来する遺伝材料を含まない）。本発明のさらなる利点は、以下の記載から容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】グルコースのコハク酸への発酵。図１Ａは、大腸菌によるグルコースの発酵の標準的経路を示す。この経路はUnden and Kleefeld (2004)から描き直したものである。太い矢印は、中心的発酵経路を表す。×印は、ＫＪ０１２を操作するためにこの研究で行った遺伝子欠失（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ）を表す。遺伝子および酵素：ｌｄｈＡ，乳酸デヒドロゲナーゼ；ｐｆｌＢ，ピルビン酸ギ酸リアーゼ；ｆｏｃＡ，ギ酸輸送体；ｐｔａ，リン酸アセチルトランスフェラーゼ；ａｃｋＡ，酢酸キナーゼ；ａｄｈＥ，アルコールデヒドロゲナーゼ；ｐｐｃ，ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｄｈ，ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；ｇｌｔＡ，クエン酸シンターゼ；ｍｄｈ，リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢおよびｆｕｍＣ，フマラーゼアイソザイム；ｆｒｄＡＢＣＤ，フマル酸レダクターゼ；ｆｄｈ，ギ酸デヒドロゲナーゼ；ｉｃｄ，イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；ａｃｓ，アセチル−ＣｏＡシンセターゼ；ｍｇｓＡ，メチルグリオキサールシンターゼ；ｐｏｘＢ，ピルビン酸オキシダーゼ；ａｌｄＡ，アルデヒドデヒドロゲナーゼ；およびａｌｄＢ，アルデヒドデヒドロゲナーゼ。図１Ｂは、大腸菌操作株におけるＡＴＰ生産および増殖とコハク酸およびマレイン酸生産の結びつきを示す。実線矢印は、ＮＡＤＨプールをつないでいる。点線矢印は、ＮＡＤ＋プールをつないでいる。嫌気性条件下での解糖の際には、増殖はＡＴＰの生産およびＮＡＤＨの酸化と絶対的に結びついている。
【図２】大腸菌によるコハク酸生産の可能性のあるカルボキシル化経路。鍵となるカルボキシル化酵素をコードする遺伝子を太字で示す。図２Ａは、ＰＥＰカルボキシラーゼを示す。ＡＴＰはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）から生成されない。これはグルコース発酵の際に大腸菌によるコハク酸生産の主要経路と考えられる。図２Ｂは、リンゴ酸酵素（ＮＡＤＨ）を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦ）によるＡＤＰおよびＰＥＰからのＡＴＰの生産の際、エネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）はＮＡＤＨ関連の還元的カルボキシル化を触媒してマレイン酸を生産する。図２Ｃは、リンゴ酸酵素（ＮＡＤＰＨ）を示す。ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦ）によるＡＤＰおよびＰＥＰからのＡＴＰの生産の際、エネルギーは保存される。リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）はＮＡＤＰＨ関連の還元的カルボキシル化を触媒してマレイン酸を生産する。図２Ｄは、ＰＥＰカルボキシキナーゼを示す。オキサロ酢酸を生産するためのＰＥＰのカルボキシル化の際、ＡＴＰの生産によりエネルギーは保存される。
【図３】ＫＪ０１７、ＫＪ０３２およびＫＪ０６０を作出するためＫＪ０１２の代謝進化中の増殖。ＫＪ０１２株を、それぞれ５％（ｗ／ｖ）（図３Ａ）および１０％（ｗ／ｖ）（図３Ｂ）グルコースを含有するＮＢＳ培地に順次移植し、ＫＪ０１７を作出した。ｆｏｃＡおよびｐｆｌＢ欠失後、生じた株（ＫＪ０３２）をまず酢酸を添加した培地で継代培養した（図３Ｃ）。酢酸レベルが低下し、その後、さらなる移植の際に消失し、ＫＪ０６０が作出された。波線は、比較のために加えた酢酸無しのＫＪ０１７による発酵を表す。記号：ＯＤ５５０ｎｍでの光学密度●。
【図４】コハク酸およびマレイン酸生産に関する株の代謝進化中の発酵生成物の概要。指標として培養物に酢酸ナトリウムを加えた。黒い矢印は、テキストで示されているように発酵条件の移植を表す。ＫＪ０３２の代謝進化中には、ギ酸は検出されず、乳酸は少量しか検出されなかった。ＫＪ０７０およびＫＪ０７２の代謝進化中には、ギ酸も乳酸も検出されなかった。図４Ａ（５％ｗ／ｖグルコース）および図４Ｂ（１０％ｗ／ｖグルコース）、ＫＪ０１２〜ＫＪ０１７；図４Ｃ（５％ｗ／ｖグルコース）および図４Ｄ（１０％ｗ／ｖグルコース）、ＫＪ０３２〜ＫＪ０６０；図４Ｅ、１０％グルコース、ＫＪ０７０〜ＫＪ０７１；図４Ｆ、１０％グルコース、ＫＪ０７２〜ＫＪ０７３。記号は全てについて：■、コハク酸；□、ギ酸；Δ、酢酸；▲、マレイン酸；◆、乳酸；および▼、ピルビン酸。
【図５】コハク酸およびマレイン酸生産の生物触媒としての大腸菌Ｃの遺伝子工学および代謝進化における段階をまとめた図。このプロセスは、２０００世代の増殖に基づく選択を与える２６１回の連続的移植を表す。各計画の最終培養物からクローンを単離し、株名を割り当て、表３の括弧内に示した。
【図６】グルコースの発酵および関連の経路。コハク酸生産のために操作された構築物において欠失した遺伝子を示す中心的代謝。実線矢印は、中心的発酵経路を表す。波線矢印は、ピルビン酸の酢酸への酸化の微好気性経路を表す（ｐｏｘＢ）。点線矢印は、好気性代謝中に通常働く経路であるピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｄｈ）およびグリオキシル酸バイパス（ａｃｅＡＢ）を示す。四角で囲んだ×印は、ＫＪ０１２およびＫＪ０１７の構築に用いた最初の３つの遺伝子欠失（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ）を表す。何も付いていない×印は、ＫＪ０１７誘導体の構築の際に欠失した他の遺伝子：ＫＪ０３２（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｃｋＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ）およびＫＪ０７０（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｍｇｓＡ）およびＫＪ０７２（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｍｇｓＡ、ｐｏｘＢ）を示す。遺伝子および酵素：ｌｄｈＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ｆｏｃＡ、ギ酸輸送体；ｐｆｌＢ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ；ｐｔａ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ；ａｃｋＡ、酢酸キナーゼ；ａｄｈＥ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ｐｐｃ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｄｈ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ｍｄｈ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢおよびｆｕｍＣ、フマラーゼアイソザイム；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｆｄｈ、ギ酸デヒドロゲナーゼ；ｍｇｓＡ、メチルグリオキサールシンターゼ；ｇｌｏＡＢ、グリオキシラーゼＩおよびＩＩ；ｐｏｘＢ、ピルビン酸オキシダーゼ；ａｃｅＡ、イソクエン酸リアーゼ；ａｃｅＢ、マレイン酸シンターゼ；ａｃｎＡＢ、アコニターゼ；およびａｃｓ、アセチル−ＣｏＡシンセターゼ。
【図７】大腸菌Ｃの誘導体による無機塩培地（１０％グルコース）でのコハク酸およびマレイン酸の生産。図７Ａは、ＡＭ１培地におけるＫＪ０６０によるコハク酸生産を示す。図７Ｂは、ＡＭ１培地におけるＫＪ０７３によるコハク酸生産を示す。図７Ｃは、ＮＢＳ培地におけるＫＪ０７１によるマレイン酸生産を示す。発酵物は３３ｍｇ  ＤＣＷ  ｌ−１のレベルで接種した。記号は全てについて：○、グルコース；●、コハク酸；■、マレイン酸；Δ、細胞塊。
【図８】ｐＬＯＩ４１６２の構築。ｐＥＬ０４とｐＬＯＩ４１５２をつないでいる短い実線矢印は、ＤＮＡ増幅に用いたプライマーを表す。
【図９】ＫＪ０７３のコハク酸生産経路。本研究においてコハク酸生産に関与する主要なカルボキシル化酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードするｐｃｋ遺伝子をリバース型で示す。実線矢印は、グルコースの嫌気性発酵の際に機能すると予測される反応を示す。実線×印は、欠失した遺伝子を示す。四角で囲まれた×印は、コハク酸生産のための始原株ＫＪ０１７（ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ）の構築に用いた鍵となる欠失を表す。破線は、一般に微好気性条件下のみで機能するプロセスである、ＰｏｘＢによるピルビン酸の酢酸への酸化を表す。点線は、主として好気性代謝に関連する反応を示す。遺伝子および酵素：ｌｄｈＡ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ｐｆｌＢ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ；ｆｏｃＡ、ギ酸輸送体；ｐｔａ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ；ａｃｋＡ、酢酸キナーゼ；ｄｈＥ、アルコールデヒドロゲナーゼ；ｐｐｃ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｄｈ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ｍｄｈ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ；ｆｕｍＡ、ｆｕｍＢおよびｆｕｍＣ、フマラーゼアイソザイム；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｆｄｈ、ギ酸デヒドロゲナーゼ；ｉｃｄ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ；ａｃｓ、アセチル−ＣｏＡシンセターゼ；ｍｇｓＡ、メチルグリオキサールシンターゼ；ｐｏｘＢ、ピルビン酸オキシダーゼ；ａｌｄＡ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ；およびａｌｄＢ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ。ｔｄｃＥ遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｐｆｌＢと相同）およびｔｃｄＤ遺伝子（プロピオン酸キナーゼ、ａｃｋＡと相同）が括弧で示されているが、これらは一般にトレオニン分解の際に発現される。
【図１０】欠失したさらなる遺伝子（実線×印）の経路を示す代謝の延長部分。コハク酸および酢酸はＫＪ０７３の発酵からの主生成物（四角で囲まれている）である。遺伝子および酵素：ｃｉｔＤＥＦ、クエン酸リアーゼ；ｇｌｔＡ、クエン酸シンターゼ；ａｓｐＣ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ｐｃｋ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ｓｆｃＡ、ＮＡＤ＋関連リンゴ酸酵素；ｆｕｍＡおよびｆｕｍＢ、フマラーゼ；ｆｒｄＡＢＣＤ、フマル酸レダクターゼ；ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ、ピルビン酸キナーゼ；ｔｄｃＥ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢのホモログ）；ｐｔａ、リン酸トランスアセチラーゼ；ｔｃｄＤ、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡのホモログ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、炭素流をコハク酸および／またはマレイン酸などの目的生成物へ向けるためにユニークかつ有利な遺伝子突然変異の組合せが用いられる材料および方法を提供する。本発明の技術は、天然経路ならびに組換え経路から生成物を得るために使用できる。有利には、本発明は、栄養素として無機塩および糖のみを用いてこれらの生成物を生産するための多用途のプラットフォームを提供する。
【００１４】
本発明の微生物は、大腸菌属に属するものなどの細菌における１以上の標的遺伝子の改変によって得ることができる。いくつかの実施形態では、改変される細菌は大腸菌、または大腸菌Ｂ、大腸菌Ｃもしくは大腸菌Ｗなどのようなその特定の株であり得る。本発明の他のいくつかの実施形態では、本発明に従って改変され得る細菌としては、限定されるものではないが、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter asaii、Achromobacter delmarvae、Achromobacter viscosus、Achromobacter lacticum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Alcaligenes faecalis、Arthrobacter citreus、Arthrobacter tumescens、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter oxydans、Aureobacterium saperdae、Azotobacter indicus、Brevibacterium ammoniagenes、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium globosum、Brevibacterium fuscum、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、Brevibacterium linens、Brevibacterium protopharmiae、Corynebacterium acetophilum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamium、Enterobacter aerogenes、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Erwinia chrysanthemi、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、Flavobacterium rhenanum、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、ミクロコッカス種ＣＣＭ８２５、Morganella morganii、Nocardia opaca、Nocardia rugosa、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、Propionibacterium shermanii、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas acidovolans、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas testosteroni、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１９０７０、Sporosarcina ureae、Staphylococcus aureus、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、Actinomadura madurae、Actionomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、Streptomyces coelicolor、Streptomyces flavelus、Streptomyces griseolus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivaceus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces virginiae、Streptomyces antibioticus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces lavendulae、Streptomyces viridochromogenes、Aeromonas salmonicida、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、Bacillus thiaminolyticus、Escherichia freundii、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Salmonella typhimurium、Salmonella schottmulleri、Xanthomonas citriなどが挙げられる。
【００１５】
ある特定の実施形態では、本発明は、プラスミド、抗生物質耐性遺伝子および／またはコハク酸もしくはマレイン酸の生産に好適な他の生物に由来する材料を欠いた細菌株（大腸菌など）を提供する。他の微生物系とは違い、本発明の微生物は、基質として糖を用いて一段階生産において使用でき、高い生成物生産率、高収率、単純な栄養要求（例えば、無機塩培地）および六炭糖、五炭糖および多くの二糖類の生物変換を可能とする強い代謝を有する。
【００１６】
よって、本開示に従って作出される微生物は、当技術分野で公知の種々の方法によって不活性化された１以上の標的遺伝子を有し得る。例えば、標的遺伝子は、標的遺伝子へ挿入、欠失またはランダム突然変異を導入することによって不活性化することができる。よって、本発明のある特定の態様は、標的遺伝子への少なくとも１つの停止コドン（例えば、１〜１０個またはそれを超える停止コドン）の挿入を提供する。本発明のいくつかの態様は、標的遺伝子にフレームシフト突然変異を導入するために、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０またはそれを超える塩基の挿入または欠失を提供する。本発明の他の態様は、標的遺伝子にフレームシフト突然変異を導入するために、１、２、４、５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、１７、１９、２０、２２、２３、２５、２６、２８、２９またはそれを超える塩基の挿入または欠失を提供する。本願のさらに他の実施形態は、標的遺伝子内に１以上の点突然変異（例えば１〜３０またはそれを超える）の導入を提供し、本発明の他の態様は、本発明の微生物からの標的遺伝子の部分的、全面的または完全な欠失を提供する。本発明のこれらの態様のそれぞれにおいて、代謝経路は標的遺伝子によりコードされているポリペプチドの酵素活性の不活性化により不活性化される。
【００１７】
本明細書において「標的遺伝子」とは、酢酸キナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、クエン酸リアーゼ、ギ酸輸送体、乳酸デヒドロゲナーゼ、メチルグリオキサールシンターゼ、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、リンゴ酸酵素および／またはプロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子を指す。ある特定の好ましい実施形態では、これらの遺伝子はａｃｋＡ（酢酸キナーゼ）、ａｄｈＥ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ａｓｐＣ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ｃｉｔＣＤＥＦ（クエン酸リアーゼ）、ｆｏｃＡ（ギ酸輸送体）、ｌｄｈＡ（乳酸デヒドロゲナーゼ）、ｍｇｓＡ（メチルグリオキサールシンターゼ）、ｐｆｌＢ（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）、ｐｏｘＢ（ピルビン酸オキシダーゼ）、ｐｔａ（リン酸アセチルトランスフェラーゼ）、ｓｆｃＡ（リンゴ酸酵素）および／またはｔｄｃＤＥ（プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼ）である。よって、本発明のある特定の態様では、微生物（このような遺伝子を含む任意の細菌株、例えば大腸菌）においてこれらの遺伝子の１以上が不活性化される。増殖およびコハク酸またはマレイン酸の生産が改善された株に関する選択プロセスは、「代謝進化」（その例は、開示されている実施例の中で示されている）と呼ばれる。「天然大腸菌遺伝子」または「天然大腸菌遺伝子」は、大腸菌以外のいずれかの微生物から得られ、大腸菌へ導入される「異種遺伝子」に対して、大腸菌微生物に天然に見られる遺伝子であると理解される。
【００１８】
本発明の種々の非限定的実施形態は次の通りである。
１．以下の標的遺伝子：ａ）酢酸キナーゼ、ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、ｃ）アルコールデヒドロゲナーゼ、ｄ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｅ）メチルグリオキサールシンターゼ、ｆ）ピルビン酸オキシダーゼ、および／またはｇ）クエン酸リアーゼの１以上に遺伝的改変（該遺伝的改変は該標的遺伝子により生産されるポリペプチドの酵素活性を不活性化する）を含む遺伝的に改変された細菌株。
【００１９】
２．前記遺伝的に改変された細菌株が大腸菌、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter asaii、Achromobacter delmarvae、Achromobacter viscosus、Achromobacter lacticum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Alcaligenes faecalis、Arthrobacter citreus、Arthrobacter tumescens、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter oxydans、Aureobacterium saperdae、Azotobacter indicus、Brevibacterium ammoniagenes、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium globosum、Brevibacterium fuscum、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、Brevibacterium linens、Brevibacterium protopharmiae、Corynebacterium acetophilum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamium、Enterobacter aerogenes、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Erwinia chrysanthemi、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、Flavobacterium rhenanum、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、ミクロコッカス種ＣＣＭ８２５、Morganella morganii、Nocardia opaca、Nocardia rugosa、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、Propionibacterium shermanii、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas acidovolans、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas testosteroni、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１９０７０、Sporosarcina ureae、Staphylococcus aureus、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、Actinomadura madurae、Actionomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、Streptomyces coelicolor、Streptomyces flavelus、Streptomyces griseolus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivaceus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces virginiae、Streptomyces antibioticus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces lavendulae、Streptomyces viridochromogenes、Aeromonas salmonicida、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、Bacillus thiaminolyticus、Escherichia freundii、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Salmonella typhimurium、Salmonella schottmulleriまたはXanthomonas citriである、実施形態１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００２０】
３．前記改変細菌株が大腸菌Ｂである、実施形態１または２に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００２１】
４．以下の標的遺伝子：ａ）酢酸キナーゼ、ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、ｃ）アルコールデヒドロゲナーゼ、ｄ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ、およびｅ）ピルビン酸オキシダーゼが不活性化されている、実施形態１、２または３の遺伝的に改変された細菌株。
【００２２】
５．前記細菌株が不活性化されたメチルグリオキサールシンターゼ遺伝子をさらに含む、実施形態４の遺伝的に改変された細菌株。
【００２３】
６．前記細菌株が不活性化されたクエン酸リアーゼ遺伝子をさらに含む、実施形態４または５の遺伝的に改変された細菌株。
【００２４】
７．前記遺伝的に改変された細菌株が代謝的に進化されている、実施形態１、２、３、４または５に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００２５】
８．前記遺伝子またはその一部が欠失されている、実施形態１、２、３、４、５、６または７に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００２６】
９．前記遺伝子がフレームシフト突然変異、点突然変異、停止コドンの挿入またはそれらの組合せで不活性化されている、実施形態１、２、３、４、５、６または７に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００２７】
１０．大腸菌株であり、外因性の遺伝子もしくはそのフラグメントを含まない（または天然の大腸菌遺伝子のみを含む）、実施形態２、３、４、５、６、７、８または９に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００２８】
１１．１）遺伝的に改変された細菌株が不活性化された以下の遺伝子：ａ）フマル酸レダクターゼ；ｂ）ＡＴＰシンターゼ；ｃ）２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＡＢ）；ｄ）コハク酸デヒドロゲナーゼ（例えばｓｄｈＡＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（例えばｐｔａ）；ｅ）グルコース輸送体（例えばｐｔｓＧ）；ｆ）イソクエン酸リアーゼレプレッサー（例えばｉｃｌＲ）の１以上を有していなくともよく；かつ／または２）遺伝的に改変された株がリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍｄｈ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）および／またはクエン酸シンターゼ（例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)ｃｉｔＺ）などの遺伝子をコードし、かつ／または過剰発現するプラスミドまたは多重コピープラスミドを含まない、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００２９】
１２．ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０３２、ＫＪ０４４、ＫＪ０５９、ＫＪ０６０、ＫＪ０７０、ＫＪ０７１、ＫＪ０７２またはＫＪ０７３である、実施形態１〜１１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００３０】
１３．遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させる方法であって、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれか１つに記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株を培養培地に接種すること、および該遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させることを含む方法。
【００３１】
１４．コハク酸またはマレイン酸を生産する方法であって、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれか１つに記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株をコハク酸またはマレイン酸の生産を可能とする条件下で培養することを含む方法。
【００３２】
１５．前記の１以上の遺伝的に改変された細菌株がＫＪ０１２、ＫＪ０３４、ＫＪ０４４、ＫＪ０５９、ＫＪ０６０、ＫＪ０７０、ＫＪ０７１、ＫＪ０７２またはＫＪ０７３である、実施形態１４に記載の方法。
【００３３】
１６．前記の遺伝的に改変された細菌株が無機塩培地で培養される、実施形態１３、１４または１５のいずれか１つに記載の方法。
【００３４】
１７．前記無機塩培地が２％〜２０％（ｗ／ｖ）の間の炭水化物を含む、実施形態１６に記載の方法。
【００３５】
１８．前記無機塩培地が２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％または２０％（ｗ／ｖ）の糖を含む、実施形態１７に記載の方法。
【００３６】
１９．炭水化物がグルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロースまたはその種々の組合せである、請求項１７または１８に記載の方法。
【００３７】
２０．コハク酸またはマレイン酸が少なくとも０．２０Ｍ、０．２５Ｍ、０．３０Ｍ、０．３５Ｍ、０．４０Ｍ、０．４５Ｍ、０．５０Ｍ、０．５５Ｍ、０．６０Ｍ、０．６５Ｍまたは０．７０Ｍの濃度で生産される、実施形態１４、１５、１６、１７、１８または１９に記載の方法。
【００３８】
２１．培養培地がＮＢＳ無機塩培地またはＡＭ１培地（表４参照）である、実施形態１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０        に記載の方法。
【００３９】
２２．コハク酸またはマレイン酸の収率が少なくとも９０％もしくはそれより高い（または９０％以上）である、実施形態１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１に記載の方法。
【００４０】
２３．収率が少なくとも９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％または９９％である、実施形態２２に記載の方法。
【００４１】
２４．増殖培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸の生産のための基質としてグリセロールを含む、請求項１３〜１６または２０〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【００４２】
２５．前記培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸の生産のための基質としてグリセロールをさらに含む、請求項１７〜１９に記載の方法。
【００４３】
２６．実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれか１つに記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株と培地を含む組成物。
【００４４】
以下のさらなる実施形態も本願により提供される。
１．以下のａ）酢酸キナーゼ、ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、ｃ）アルコールデヒドロゲナーゼ、ｄ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｅ）メチルグリオキサールシンターゼ、ｆ）ピルビン酸オキシダーゼ、ｇ）クエン酸リアーゼ、ｈ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ｉ）ギ酸輸送体、ｊ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ｋ）リンゴ酸酵素、およびｌ）プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼをコードする標的遺伝子に対する遺伝的改変（該遺伝的改変は該標的遺伝子により生産されるポリペプチドの酵素活性を不活性化する）を含む遺伝的に改変された細菌株。
【００４５】
２．大腸菌、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter asaii、Achromobacter delmarvae、Achromobacter viscosus、Achromobacter lacticum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Alcaligenes faecalis、Arthrobacter citreus、Arthrobacter tumescens、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter oxydans、Aureobacterium saperdae、Azotobacter indicus、Brevibacterium ammoniagenes、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium globosum、Brevibacterium fuscum、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、Brevibacterium linens、Brevibacterium protopharmiae、Corynebacterium acetophilum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamium、Enterobacter aerogenes、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Erwinia chrysanthemi、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、Flavobacterium rhenanum、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、ミクロコッカス種ＣＣＭ８２５、Morganella morganii、Nocardia opaca、Nocardia rugosa、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、Propionibacterium shermanii、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas acidovolans、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas testosteroni、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１９０７０、Sporosarcina ureae、Staphylococcus aureus、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、Actinomadura madurae、Actionomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、Streptomyces coelicolor、Streptomyces flavelus、Streptomyces griseolus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivaceus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces virginiae、Streptomyces antibioticus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces lavendulae、Streptomyces viridochromogenes、Aeromonas salmonicida、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、Bacillus thiaminolyticus、Escherichia freundii、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Salmonella typhimurium、Salmonella schottmulleriまたはXanthomonas citriである、実施形態１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００４６】
３．大腸菌である、実施形態２に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００４７】
４．（ａ）クエン酸リアーゼ遺伝子と、以下のａ）酢酸キナーゼ、ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、ｃ）アルコールデヒドロゲナーゼ、ｄ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ、ｅ）メチルグリオキサールシンターゼ、ｆ）ピルビン酸オキシダーゼ、ｇ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ｈ）ギ酸輸送体、ｉ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ｊ）リンゴ酸酵素、および／またはｋ）プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼをコードする標的遺伝子の１以上に対する遺伝的改変；または
（ｂ）クエン酸リアーゼ遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、酢酸キナーゼ遺伝子、ギ酸輸送体遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子、メチルグリオキサールシンターゼ遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子と、以下の標的遺伝子：ａ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ｂ）リン酸アセチルトランスフェラーゼ、ｃ）リンゴ酸酵素、および／またはｄ）プロピオン酸キナーゼ／α−ケト酪酸ギ酸リアーゼの１以上に対する遺伝的改変（該遺伝的改変は該標的遺伝子により生産されるポリペプチドの酵素活性を不活性化する）
を含む遺伝的に改変された細菌株。
【００４８】
５．大腸菌、Gluconobacter oxydans、Gluconobacter asaii、Achromobacter delmarvae、Achromobacter viscosus、Achromobacter lacticum、Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium radiobacter、Alcaligenes faecalis、Arthrobacter citreus、Arthrobacter tumescens、Arthrobacter paraffineus、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、Arthrobacter oxydans、Aureobacterium saperdae、Azotobacter indicus、Brevibacterium ammoniagenes、divaricatum、Brevibacterium lactofermentum、Brevibacterium flavum、Brevibacterium globosum、Brevibacterium fuscum、Brevibacterium ketoglutamicum、Brevibacterium helcolum、Brevibacterium pusillum、Brevibacterium testaceum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium immariophilium、Brevibacterium linens、Brevibacterium protopharmiae、Corynebacterium acetophilum、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamium、Enterobacter aerogenes、Erwinia amylovora、Erwinia carotovora、Erwinia herbicola、Erwinia chrysanthemi、Flavobacterium peregrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacterium aurantinum、Flavobacterium rhenanum、Flavobacterium sewanense、Flavobacterium breve、Flavobacterium meningosepticum、ミクロコッカス種ＣＣＭ８２５、Morganella morganii、Nocardia opaca、Nocardia rugosa、Planococcus eucinatus、Proteus rettgeri、Propionibacterium shermanii、Pseudomonas synxantha、Pseudomonas azotoformans、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas ovalis、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas acidovolans、Pseudomonas mucidolens、Pseudomonas testosteroni、Pseudomonas aeruginosa、Rhodococcus erythropolis、Rhodococcus rhodochrous、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１５５９２、ロドコッカス種ＡＴＣＣ１９０７０、Sporosarcina ureae、Staphylococcus aureus、Vibrio metschnikovii、Vibrio tyrogenes、Actinomadura madurae、Actionomyces violaceochromogenes、Kitasatosporia parulosa、Streptomyces coelicolor、Streptomyces flavelus、Streptomyces griseolus、Streptomyces lividans、Streptomyces olivaceus、Streptomyces tanashiensis、Streptomyces virginiae、Streptomyces antibioticus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces lavendulae、Streptomyces viridochromogenes、Aeromonas salmonicida、Bacillus pumilus、Bacillus circulans、Bacillus thiaminolyticus、Escherichia freundii、Microbacterium ammoniaphilum、Serratia marcescens、Salmonella typhimurium、Salmonella schottmulleriまたはXanthomonas citriである、実施形態４に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００４９】
６．大腸菌である、実施形態５に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００５０】
７．代謝的に進化されている、実施形態１、２、３、４、５または６に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００５１】
８．前記標的遺伝子もしくはその一部、または前記の複数の標的遺伝子もしくはそれらの一部が欠失、フレームシフト突然変異、点突然変異、停止コドンの挿入またはそれらの組合せにより不活性化されている、実施形態１、２、３、４、５または６に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００５２】
９．外因性の遺伝子もしくはそのフラグメントを含まない、または天然の遺伝子のみを含む、実施形態１、２、３、４、５または６に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００５３】
１０．１）遺伝的に改変された細菌株が不活性化された以下の遺伝子：ａ）フマル酸レダクターゼ；ｂ）ＡＴＰシンターゼ；ｃ）２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ；ｄ）コハク酸デヒドロゲナーゼ；ｅ）グルコース輸送体；ｆ）イソクエン酸リアーゼレプレッサーの１以上を有していなくともよく；かつ／または２）遺伝的に改変された株がリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼおよび／またはクエン酸シンターゼをコードし、かつ／または過剰発現するプラスミドまたは多重コピープラスミドを含まない、実施形態１、２、３、４、５または６に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００５４】
１１．代謝的に進化されている、実施形態７、８、９、１０または１１に記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００５５】
１２．ａ）少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭ濃度のコハク酸；
ｂ）少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭ濃度のフマル酸；
ｃ）少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭ    濃度のマレイン酸
を生産する、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の遺伝的に改変された細菌株。
【００５６】
１３．ＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０３２、ＫＪ０４４、ＫＪ０５９、ＫＪ０６０、ＫＪ０７０、ＫＪ０７１、ＫＪ０７２、ＫＪ０７３、ＫＪ０７６、ＫＪ０７９、ＫＪ０９１、ＫＪ０９８、ＫＪ１０４、ＫＪ１１０、ＫＪ１１９、ＫＪ１２２またはＫＪ１３４である、遺伝的に改変された細菌株。
【００５７】
１４．遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させる方法であって、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株を培養培地に接種すること、および該遺伝的に改変された細菌株を培養するまたは増殖させることを含む方法。
【００５８】
１５．コハク酸、フマル酸またはマレイン酸を生産する方法であって、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株を、コハク酸またはマレイン酸またはフマル酸の生産を可能とする条件下で培養することを含む方法。
【００５９】
１６．前記の１以上の遺伝的に改変された細菌株がＫＪ０１２、ＫＪ０１７、ＫＪ０３２、ＫＪ０４４、ＫＪ０５９、ＫＪ０６０、ＫＪ０７０、ＫＪ０７１、ＫＪ０７２、ＫＪ０７３、ＫＪ０７６、ＫＪ０７９、ＫＪ０９１、ＫＪ０９８、ＫＪ１０４、ＫＪ１１０、ＫＪ１１９、ＫＪ１２２またはＫＪ１３４である、実施形態１５に記載の方法。
【００６０】
１７．前記の遺伝的に改変された細菌株が無機塩培地で培養される、実施形態１４〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【００６１】
１８．無機塩培地が２％〜２０％（ｗ／ｖ）の間の炭水化物を含む、実施形態１７に記載の方法。
【００６２】
１９．無機塩培地が２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％または２０％（ｗ／ｖ）の糖を含む、実施形態１８に記載の方法。
【００６３】
２０．炭水化物がグルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、ラムノース、スクロース、セロビオース、ヘミセルロースまたは組合せである、実施形態１８または１９に記載の方法。
【００６４】
２１．コハク酸またはマレイン酸の収率が９０％以上である、実施形態１５〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
２２．収率が少なくとも９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％または９９％である、実施形態２１に記載の方法。
【００６６】
２３．前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭの濃度のコハク酸を生産する、実施形態１５〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００６７】
２４．前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭまたは５００ｍＭ濃度のマレイン酸を生産する、実施形態１５〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００６８】
２５．前記の遺伝的に改変された細菌株が少なくとも２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭまたは７００ｍＭ濃度のフマル酸を生産する、実施形態１５〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００６９】
２６．増殖培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸のための基質としてグリセロールを含む、実施形態１４〜１７または２１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
【００７０】
２７．前記培地がコハク酸、マレイン酸またはフマル酸の生産のための基質としてグリセロールをさらに含む、実施形態１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【００７１】
２８．実施形態１〜１３に記載の１以上の遺伝的に改変された細菌株と培地を含む組成物。
【００７２】
微生物は、実施例に示されているように、Examples with the Agricultural Research Service Culture Collection, 1815 N. University Street, Peoria, Illinois, 61604 U.S.A.に寄託された。これらの培養物は、本特許出願の係属中、３７  ＣＦＲ  １．１４および３５  ＵＳＣ  １２２の下、米国特許商標庁長官が適格と判断する者に対して当該培養物が入手可能であることを保証する条件下で寄託されている。これらの寄託物は本願の写しまたはその所産が提出される国の外国特許法の求めに応じて入手可能である。しかしながら、寄託物が入手可能であるからといって、政府措置によって付与される特許権を減損して、本発明を実施を許可するものではないと理解されるべきである。
【００７３】
さらに、本培養寄託物は、微生物の寄託に関するブタペスト条約の条項に従って保管され、一般に入手可能となる。すなわち、本培養寄託物は、寄託物試料の分譲に関する最新の請求から少なくとも５年間、そしていかなる場合でも、寄託日から少なくとも３０年の期間または当該培養物を開示している、発行の可能性のある特許の権利行使可能期間、それらを生存能があり、汚染のない状態で維持するために必要なあらゆる注意を払って保管される。寄託者は、請求時にその寄託物の状態のために寄託機関が試料を分譲できない場合、寄託物を交換する義務を認めている。本培養寄託物の一般への入手可能性に関する全ての制限は、それらを開示する特許の発行時に不可逆的に取り除かれる。
【００７４】
以下は、本発明を実施するための手順を示す実施例である。これらの実施例は限定とみなされるべきではない。特に断りのない限り、％は全て重量に対するものであり、溶媒混合比は容量に対するものである。
【００７５】
実施例１
微生物は次のようにARS Culture Collectionに寄託された。
【表１】
0005546871.tif 000002
【００７６】
材料および方法
株、培地および増殖条件
本研究で用いた株を表２にまとめる。大腸菌Ｃの誘導体（ＡＴＣＣ８７３９）は、遺伝子欠失のユニークな組合せと高い生産性に対する選択により、コハク酸生産のために開発したものである。培養物は、株が構築されるまでの間のみ、改変Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養液（１リットル当たり：１０ｇ  Ｄｉｆｃｏトリプトン、５ｇ  Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物、５ｇ塩化ナトリウム）(Miller, 1992)中、３７℃で増殖させた。適宜、抗生物質を含めた。
【００７７】
ほとんどの研究では、発酵培養液として、また、株の維持のために、１００ｍＭ  ＫＨＣＯ３、１ｍＭベタインＨＣｌおよび糖（２％〜１０％）を添加したＮＢＳ無機塩培地(Causey et al., 2004)を用いた。本研究の後期には新しい低塩培地、ＡＭ１（全塩４．２ｇ／ｌ；Martinez et al., 2007）を開発し、ＫＪ０６０およびＫＪ０７３を用いた発酵に用いた。この培地には示されているように１００ｍＭ  ＫＨＣＯ３と糖が添加され、初めの糖濃度が５％以上である場合は１ｍＭベタインを含む。構築中の中間体を除き、コハク酸生産用に開発された株には、抗生物質耐性遺伝子、プラスミドまたは他の外来遺伝子をコードする遺伝子は存在しない。
【００７８】
遺伝学的方法
本研究で用いたプラスミドおよびプライマーを表２にまとめる。染色体の欠失、組込みおよび抗生物質耐性遺伝子の除去の方法は、これまでに記載されている(Datsenko and Wanner, 2000; Grabar et al. 2006; Posfai et al., 1997; Zhou et al. 2006)。センスプライマーは、各標的遺伝子のＮ末端に相当する配列（太字）と、その後にＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットに相当する２０ｂｐ（下線）を含む。アンチセンスプライマーは、各標的遺伝子のＣ末端領域に相当する配列（太字）と、その後にカセットに相当する２０ｂｐ（下線）を含む。増幅されたＤＮＡフラグメントの、Ｒｅｄレコンビナーゼを担持する大腸菌株（ｐＫＤ４６）へのエレクトロポレーションを行う。得られた組換え体では、ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットが相同組換え（ダブルクロスオーバー事象）により、標的遺伝子の欠失領域に取って代わっていた。次に、染色体から耐性遺伝子（ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ）を、プラスミドｐＦＴ−Ａを用いてＦＬＰレコンビナーゼで切り出したところ、１つのＦＲＴ部位を含む瘢痕領域が残った。染色体の欠失および組込みは、抗生物質マーカーに関する試験、ＰＣＲ分析および発酵生成物の分析によって確認した。一般化されたＰ１ファージ形質導入(Miller, 1992)を用い、ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ突然変異をＳＺ２０４株からＫＪ０１７株へ移入し、ＫＪ０３２を作出した。
【００７９】
ｍｇｓＡおよびｐｏｘＢ遺伝子の欠失
二段階相同組換え法を用いて大腸菌染色体遺伝子を欠失させるために改変法が開発された(Thomason et al., 2005)。この方法を用いれば、遺伝子欠失の後に抗生物質遺伝子または瘢痕配列は染色体上に残らない。最初の組換えでは、標的遺伝子の部分がクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）およびレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含有するＤＮＡカセットにより置換された。２回目の組換えでは、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットが、該欠失領域を欠く天然配列で置換された。ｓａｃＢ遺伝子を含む細胞は、スクロースとともにインキュベーションした際にレバンを蓄積し、死滅する。生き残っている組換え体はｃａｔ−ｓａｃＢカセットの欠損頻度が極めて高い。
【００８０】
遺伝子欠失を促進するためにカセットを構築した。ＪＭｃａｔｓａｃＢプライマーセット（表２）を用い、ＰＣＲによりｐＥＬ０４(Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005)からｃａｔ−ｓａｃＢ領域を増幅し、ＮｈｅＩで消化し、ｐＬＯＩ３４２１の対応する部位に連結し、ｐＬＯＩ４１５１を作出した。ｐＬＯＩ４１５１（鋳型）とｃａｔ−ｕｐ２／ｓａｃＢ−ｄｏｗｎ２プライマーセット（各プライマーにはＥｃｏＲＶ部位が含まれる）を用い、ＰＣＲによりｃａｔ−ｓａｃＢカセットを増幅し、ＥｃｏＲＶで消化し、これに続く連結に用いた。
【００８１】
プライマーセットｍｇｓＡ−ｕｐ／ｄｏｗｎを用い、ｍｇｓＡ遺伝子および隣接する５００ｂｐ領域（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ−ｈｅｌＤ’、１４３５ｂｐ）を増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター(Invitrogen)にクローニングし、プラスミドｐＬＯＩ４２２８を作出した。このプラスミドＤＮＡの１０００倍希釈調製物を、ｍｇｓＡ−１／２プライマーセット（両プライマーともｍｇｓＡ遺伝子内にあり、外側を向いている）を用いるインサイドアウト増幅の鋳型とした。得られたレプリコンを含む４９５８ｂｐのフラグメントを増幅された、ｐＬＯＩ４１５１由来の、ＥｃｏＲＶ消化ｃａｔ−ｓａｃＢカセットに連結し、ｐＬＯＩ４２２９を作出した。この４９５８ｂｐのフラグメントも、第二のプラスミドｐＬＯＩ４２３０の構築に用いた（リン酸化および自己連結）。ｐＬＯＩ４２３０では、ｍｇｓＡの中心領域は存在しない（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ’−ｍｇｓＡ”−ｈｅｌＤ’）。
【００８２】
ｐＬＯＩ４２２９およびｐＬＯＩ４２３０をＸｍｎＩで消化した後（ベクター内）、それぞれを、ｍｇｓＡ−ｕｐ／ｄｏｗｎプライマーセットを用いる増幅の鋳型とし、それぞれ組込み段階Ｉ（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ’−ｃａｔ−ｓａｃＢ−ｍｇｓＡ”−ｈｅｌＤ’）および段階ＩＩ（ｙｃｃＴ’−ｍｇｓＡ’−ｍｇｓＡ”−ｈｅｌＤ’）のための線状ＤＮＡフラグメントを作出した。段階Ｉのフラグメントの、ｐＫＤ４６（Ｒｅｄレコンビナーゼ）を含有するＫＪ０６０へのエレクトロポレーション、発現を可能とするための３０℃で２時間のインキュベーション、および分離を行った後、組換え体をプレート上でクロラムフェニコール（４０ｍｇ／ｌ）およびアンピシリン（２０ｍｇ／ｌ）耐性に関して選択した（３０℃、１８時間）。３つのクローンを選択し、アンピシリンおよび５％ｗ／ｖアラビノースを含むＬｕｒｉａ培養液で増殖させ、エレクトロポレーション向けに調製した。段階ＩＩのフラグメントを用いたエレクトロポレーション後、細胞を３７℃で４時間インキュベートし、１０％スクロースを含有する１００ｍｌの改変ＬＢ（１００ｍＭ  ＭＯＰＳバッファーを加え、ＮａＣｌを除く）の入った２５０ｍｌフラスコに移した。一晩のインキュベーション（３７℃）後、クローンを、６％スクロースを含有する改変ＬＢプレート（ＮａＣｌ不含；１００ｍＭ  ＭＯＰＳ添加）上で選択した（３９℃、１６時間）。得られたクローンをアンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性の欠損に関して試験した。構築をＰＣＲ分析によりさらに確認した。ｍｇｓＡ遺伝子を欠いたクローンを選択し、ＫＪ０７０と呼称した。
【００８３】
ｍｇｓＡ遺伝子を欠失させるのに用いたものと同様の方法で、ＫＪ０７１からｐｏｘＢ遺伝子を欠失させた。ｐｏｘＢ欠失を構築するために用いた付加的プライマーセット（ｐｏｘＢ−ｕｐ／ｄｏｗｎおよびｐｏｘＢ−１／２）は表２に、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４２７４、ｐＬＯＩ４２７５およびｐＬＯＩ４２７６）とともに含まれている。得られた株をＫＪ０７２と呼称した。
【００８４】
酵素アッセイ
細胞を、５％または１０％グルコースを含むＮＢＳ培地で増殖させ、対数増殖中期に遠心分離（８，０００ｇ、５分間、４℃）により採取し、冷１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）バッファーで洗浄し、同じバッファー（５ｍｌ）に再懸濁させた。細胞を、ガラスビーズを用いたビーズ処理(MP Biomedicals; Solon, Ohio)により破砕した後、１３，０００ｇで１５分遠心分離し、粗抽出物を得た。ウシ血清アルブミンを標品として用い、ＢＣＡ法によりタンパク質を測定した（Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット）。
【００８５】
ＰＥＰカルボキシラーゼ活性をこれまでに記載されているように測定した(Canovas and Kornberg, 1969)。反応混合物は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、２０Ｕリンゴ酸デヒドロゲナーゼを含み、祖抽出物を加えることで１０ｍＭ  ＰＥＰ反応を開始させた。ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性をこれまでに記載されているように測定した(Van der Werf, et al., 1997)。反応混合物は１００ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．６）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０ｍＭ  ＡＤＰ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、２０Ｕリンゴ酸デヒドロゲナーゼおよび１０ｍＭ  ＰＥＰを含む。反応は粗抽出物を加えることで開始させた。
【００８６】
ＮＡＤ＋依存性リンゴ酸酵素活性は、これまでに記載されているように(Stols and Donnelly, 1997)双方向で測定した。カルボキシル化方向については、反応混合物は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨおよび２５ｍＭピルビン酸を含む。粗抽出物を加えることで反応を開始させた。しかしながら、このアッセイ方法では、野生型大腸菌Ｃにおいては、乳酸デヒドロゲナーゼの存在のためにリンゴ酸酵素活性を測定することができない。脱炭酸については、反応混合物は１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、２．５ｍＭ  ＮＡＤ＋、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＫＣｌおよび２０ｍＭ  Ｌ−マレイン酸を含む。粗抽出物を加えることで反応を開始させた。
【００８７】
ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素活性は、ＮＡＤ（Ｈ）＋をＮＡＤＰ（Ｈ）＋に置き換えること以外、ＮＡＤＰ＋依存性リンゴ酸酵素の場合と同様に測定した。１単位の活性は、１分当たりに１ｎｍｏｌの基質を酸化または還元する酵素量と定義した。
【００８８】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
これまでに記載されているように(Jarboe et al., 2008)、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてｍＲＮＡレベルを測定した。細胞を、５％または１０％グルコースを含むＮＢＳ培地で増殖させ、対数増殖中期に、ドライアイス／エタノール浴内で揺することにより採取した後、遠心分離し、精製までＲＮＡＬａｔｅｒ(Qiagen, Valencia CA)中、−８０℃で保存した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉカラム(Qiagen)でＲＮＡの精製を行った後、ＤＮアーゼＩ(Invitrogen)で消化した。スーパースクリプトＩＩ(Invitrogen, Carlsbad CA)による逆転写では、鋳型として５０ｎｇの全ＲＮＡを用いた。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒにてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲミックス(Bio-Rad, Hercules CA)を用い、リアルタイムＰＣＲを行った。逆転写の不在下でＲＴ−ＰＣＲを行うことで、ＲＮＡのゲノムＤＮＡ混入を確認した。転写物の存在量は標品としてゲノムＤＮＡを用いて評価し、発現レベルを転写レプレッサーであるｂｉｒＡ遺伝子(Jarboe et al., 2008)によりノーマライズした。ｐｃｋおよびｂｉｒＡに用いたＲＴ−ＰＣＲプライマーを表２に示す。
【００８９】
ｐｃｋ領域の配列決定
ＫＪ０７３のｐｃｋ遺伝子に生じた突然変異があるかどうかを知るために、ＫＪ０１２およびＫＪ０７３双方のｐｃｋ遺伝子のコード領域およびプロモーター領域（コード領域の手前約８００ｂｐ）をＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ(Strata遺伝子; Wilmington, DE)により増幅した。プライマーセットｐｃｋ−Ｆ／Ｒを用いてコード領域から転写ターミネーターまでを増幅した。プライマーセットｐｃｋ−２を用いてプロモーター領域を増幅した。ＤＮＡ配列決定は、フロリダ大学Interdisciplinary Center for Biotechnology Research（Applied Biosystemsオートシーケンサーを使用）により提供された。
【００９０】
発酵
種培養および発酵は３７℃、グルコース、１００ｍＭ  ＫＨＣＯ３および１ｍＭベタインＨＣｌを含有するＮＢＳまたはＡＭ１無機塩培地中、１００ｒｐｍで増殖させた。最初の実験中、ＫＯＨを自動添加することによりこれらをｐＨ７．０に維持した。その後、ｐＨは、３Ｍ  Ｋ２ＣＯ３および６Ｎ  ＫＯＨの１：１混合物を添加することにより維持した。実容量３５０ｍｌの発酵の小型発酵槽で行った。発酵は、示されているように、初期ＯＤ５５０  ０．０１（３．３ｍｇ  ＣＤＷ／ｌ）または０．１（３３．３ｍｇ  ＣＤＷ／ｌ）のいずれかで接種した。試験した株には抗生物質耐性遺伝子は存在していなかった。発酵槽は、サンプルを取り出す排出口として用いる１６ゲージのニードルを除いて密閉した。増殖中、ＣＯ２雰囲気を確保するために用いる重炭酸を加えて迅速に嫌気生活を達成した。
【００９１】
分析
細胞を、Bausch ＆ Lomb Spectronic 70分光光度計を用い、５５０ｎｍでの光学密度から評価した（ＯＤ１．０＝細胞乾重３３３ｍｇ／ｌ）。有機酸および糖類は、高速液体クロマトグラフィーを用いることで測定した(Grabar et al., 2006)。
【００９２】
結果および考察
コハク酸生産用ＫＪ０１２の構築：ｌｄｈＡ、ａｄｈＥおよびａｃｋＡの欠失
大腸菌の科学的知識の大多数は、本明細書で報告されている研究で用いられた５％（ｗ／ｖ）グルコース（２７８ｍＭ）および１０％ｗ／ｖ（５５５ｍＭ）ではなく低濃度の糖基質（一般に０．２％ｗ／ｖ；１１ｍＭ）を用い、無機塩培地ではなくＬｕｒｉａ培養液などの複雑な培地での検討から得られたものである。商業上有意なレベルの生成物を生産するには多量の糖が必要である。これまでの研究者らは、複雑な培地でコハク酸を生産するための多くの大腸菌誘導体の構築を記載している（表１）。複雑な培地を用いると、主要な経路に基づく合理的デザインが代謝操作の学術的証明に応分の成功を収めてきた。しかしながら、細菌発酵生成物の生産のための複雑な栄養素の使用は材料コスト、精製コストおよび廃棄物処分に関するコストを引き上げる。複雑な培地成分を含まない無機塩培地を使用すれば、はるかに良いコスト効率となるはずである。
【００９３】
大腸菌Ｃは、グルコースを含有するＮＢＳ無機塩培地でよく増殖し、発酵生成物として乳酸、酢酸、エタノールおよびコハク酸の混合物を生産する（図１Ａ；表３）。大腸菌を用いた他の研究（表１）とは対照的に、本明細書で報告されている研究は、材料、コハク酸精製および廃棄物処分のコストを最小限とするために無機塩培地を用い、高レベルの糖をコハク酸へ変換することができる株の開発に焦点を当てた。一般に受け入れられている大腸菌の標準的な発酵経路を示す図１を調べることで、択一的生成物：乳酸（ｌｄｈＡ）、エタノール（ａｄｈＥ）および酢酸（ａｃｋＡ）の全ての最終段階をコードする遺伝子に欠失が作り出されたコハク酸生産株の代謝操作の合理的デザインが考案された。合理的デザインによるこの代謝操作からの結果は全く予期されないものであった。得られた株（ＫＪ０１２）は、嫌気性条件下、５％グルコース（２７８ｍＭ）を含有する無機塩培地中で増殖が極めて低く、主要発酵生成物としてコハク酸の代わりに酢酸を生じた。合理的デザインからの予測に反して、コハク酸は副生成物に留まった。代謝されたグルコースに対するコハク酸のモル収率はこれらの突然変異の結果として不変で、親株およびＫＪ０１２について、５％グルコースを含有するＮＢＳ無機塩培地で発酵させた際、グルコース１モル当たり０．２モルのコハク酸であった。本発明者らは、ＮＢＳ無機塩培地が、好気性条件（好気性振盪フラスコ；５％グルコース）下でインキュベートすることにより、ＫＪ０１２の増殖に必要な全ての無機栄養素を含んでいることを確認した。好気性振盪フラスコでは、ＫＪ０１２の細胞収率は、嫌気性増殖よりも５倍高く、嫌気性増殖の大腸菌Ｃ（親株）の７５％であった。また、これらの結果から、ＫＪ０１２ではあらゆる中枢的生合成経路が機能的なままであることが確認された。
【００９４】
複雑な栄養素が存在する場合（Ｌｕｒｉａ培養液）、ＫＪ０１２による発酵的コハク酸生産は最小塩培地におけるＫＪ０１２に比べて２０倍に高まり、コハク酸のモル収率は３．５倍高まった。明らかに、主要経路に基づく合理的デザインは学術的証明に、または複雑な栄養素の使用を意図したデザインプロセスにより適合する。
【００９５】
無機塩培地での嫌気性代謝中のＫＪ０１２（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ）による低増殖、低コハク酸生産および酢酸生産の増加の基礎は知られていない。これらは、標準的な経路チャートに基づく合理的デザインを用いた代謝操作から得られた予期できない結果であった。最小培地において、代謝操作の合理的デザインは明らかに予測できるものではない。得られたＫＪ０１２株は、親株よりも増殖が劣り、コハク酸生産も親株より良くない。
【００９６】
ＫＪ０１２の増殖に基づく選択によるコハク酸生産用のＫＪ０１７の開発
ＫＪ０１２（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ  ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ）は、親大腸菌Ｃに比べて増殖が低く、低率のコハク酸生産を示し、モル収率も良くない（表３）。これらの結果にもかかわらず、以下の原理に基づき、増殖の向上とコハク酸生産の同時選択のための方法としてこの株の一連の移植を試した。コハク酸へのグルコース発酵の主要経路（図１Ａおよび図２Ａ）は一般に、カルボキシル化段階のためにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）を使用すると考えられる(Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler et al., 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk, 1985; Karp et al., 2007)。このカルボキシル化酵素はホスホエノールピルビン酸中に高エネルギーのリン酸を保存せず、増殖に利用できる正味のＡＴＰを減らす。コハク酸生産のもう１つの経路は、ＡＴＰ収量を高めることができ、それにより増殖を高めることができる既知の大腸菌遺伝子のレパートリーを用いて構想することができる（図１Ａ；図２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ）。しかしながら、これらの別経路の中で、天然大腸菌株による発酵の際にコハク酸生産のために働くことが知られているものはない。これらの別経路の鍵となる酵素はグルコースにより抑制され、通常、糖新生の際に活性となる。一般に、これらの糖新生酵素のレベルは、グルコースおよびその他の代謝産物のアベラビリティー(Goldie and Sanwal, 1980a; Wright and Sanwal, 1969; Sanwal and Smando, 1969a)ならびに逆方向の作用である脱炭酸(Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols and Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie and Sanwal, 1980b; Sanwal and Smando, 1969b; Sanwal 1970b)と逆比例して変化する。
【００９７】
これらの１つの鍵となる酵素であるＮＡＤＨ依存性リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）（図２Ｂ）は、大腸菌においてコハク酸生産を高め得るが、そのためにプラスミドからの過剰発現を必要としたことが示されている(Stols and Donnelly, 1997)。しかしながら、これらの別経路には、高レベルのグルコースを用いた嫌気性増殖の際に、天然大腸菌株またはＫＪ０１２において機能すると予測されるものはない。増殖の向上に関する選択を伴うＫＪ０１２の一連の移植は、酸化還元バランスを維持し、ＡＴＰ収量を高めたコハク酸生産（図１Ｂ）の別経路の突然変異の活性化に関して選択する機会を与えた。
【００９８】
ＫＪ０１２は、許される限り増殖の速い発酵条件下でＮＢＳグルコース培地に順次移植した（図３Ａ；図４Ａ；図５）。最初の９回の移植間では必要インキュベーション４〜５日で増殖は遅いままであり、その後、劇的に上昇し、２４時間間隔で移植が行えた。この現象は酢酸の増加により達成され（図４Ａ）、コハク酸生産はほとんど向上しなかった。２７回の移植（６０日）後、二酸化炭素を追加するために（最初に全ＮＢＳ無機塩培地に１００ｍＭを添加）、ＫＯＨを３Ｍ  Ｋ２ＣＯ３および６Ｎ  ＫＯＨの１：１混合物に置き換えた。移植を続けると、コハク酸生産に向上が見られた。５％グルコース（２２７ｍＭ）で合計４０回の移植を行った後、１０％グルコース（５５５ｍＭ）でさらに４０回の移植を行った。１０％グルコースでの移植中、コハク酸収率は、同時生成物として乳酸、酢酸およびギ酸を伴い、代謝されたグルコース１モル当たりおよそ０．７モルを維持した（表３）。この収率は大腸菌ＣおよびＫＪ０１２より３倍高かった。クローンを単離し、ＫＪ０１７と呼称した。コハク酸生産（速度、力価およびモル収率）の向上に関して同時選択されたＫＪ０１７を作出するため、ＫＪ０１２の増殖の向上に関して選択を行った。
【００９９】
ＫＪ０１７によるコハク酸生産増加の生理学的基礎
一般に天然発酵経路（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｐｃ）とみなされる経路を用いて大腸菌が生産したコハク酸は、無機リン酸を生産することによりホスホエノールピルビン酸のエネルギーを消耗する。この経路により生産されるコハク酸当たり１つのＡＴＰが失われる（図１；図６）。別の酵素系を用いることでこのエネルギーをＡＴＰとして保存することは、細胞増殖を高め、かつ、コハク酸生産の増加に関しても同時選択する機会となる。大腸菌の既知遺伝子に基づき、ＡＴＰを保存し、それにより増殖を高めるコハク酸生産のための他の３つの酵素経路が構想された（図１；図６）。しかしながら、これらの別経路におけるカルボキシル化の全段階は、有機酸などの基質上で増殖させた際に、主として糖新生のための逆方向（脱炭酸）において働くと考えられる(Keseler et al., 2005; Oh et al., 2002; Kao et al., 2005; Stols and Donnelly, 1997; Samuelov et al., 1991; Sanwal, 1970a; Delbaere et al., 2004; Goldie and Sanwal, 1980b; Sanwal and Smando, 1969b; Sanwal 1970b)。ＫＪ０１７を開発するための増殖に基づく選択がこれらの別経路の１以上を本当に活性化したという仮説を検証するため、鍵となるカルボキシル化段階の比活性を比較した（表４）。これらのうちの３つは大腸菌Ｃ、ＫＪ０１２およびＫＪ０１７で同等かまたは低かった。増殖の向上に関する選択が、コハク酸生産のためのエネルギー保存経路の発現が増強される結果としてのＡＴＰ収量の増加を介して、コハク酸生産の増加に関しても同時選択するという仮説に一致して、エネルギーを保存するホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）はＫＪ０１２に比べてＫＪ０１７で４倍に高まった。
【０１００】
さらに、増殖に基づく選択および付加的な遺伝子欠失を用い、増殖およびコハク酸生産がさらに向上した多くのさらなる株を構築した（図３および図４）。これらの１つ、ＫＪ０７３における酵素レベルも調べた。この株では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのin vitro活性はＫＪ０１７の８倍までさらに増強したが、他のカルボキシル化酵素は本質的に不変であった（表４）。
【０１０１】
このｐｃｋおよび周辺領域をＫＪ０１２およびＫＪ０７３からクローニングし、配列決定を行った。コード領域に変化は見られなかった。翻訳後修飾がなければ、この酵素の触媒特性は不変のはずである。ｐｃｋプロモーター領域において、翻訳開始部位に対して−６４ｂｐの部位におけるＧ→Ａの単一の突然変異が検出された。この突然変異は翻訳開始部位に対して−１３９ｂｐの部位である転写開始部位の後にあった。ＫＪ０７３のこの配列（Ａ→Ｇ）を大腸菌Ｃのものに復帰しても細胞増殖、発酵またはコハク酸生産に影響はなく、このことは、この突然変異が必須ではないことを示している（データは示されていない）。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＫＪ０７３においてメッセージレベルが高まっていたことが確認された。これらの結果は、ｐｃｋの発現の増強の基礎として調節突然変異と一致している。
【０１０２】
これまでの研究者らは、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）の動態パラメーターがカルボキシル化およびコハク酸生産に重要な影響を持ち得ることを示している(Millard et al., 1996; Kim et al., 2004)。大腸菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）の重炭酸方向のＫｍは０．１５ｍＭ(Morikawa et al., 1980)であり、大腸菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）（１３ｍＭ）の９分のいち１である(Krebs and Bridger 1980)。多重コピープラスミドにおける大腸菌からのｐｃｋの過剰発現はホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性を５０倍増強したが、コハク酸生産には影響が無かったことが報告されている(Millard et al., 1996)。コハク酸生産はまた、大腸菌Ｋ１２においてAnaerobiospirillum succiniciproducens由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼが過剰発現された場合にも増強されなかった(Kim et al., 2004)。この酵素はまた、重炭酸に関して高いＫｍを持っている(３０ｍＭ; Laivenieks et al., 1997)。しかしながら、大腸菌Ｋ１２のｐｐｃ変異株でA. succiniciproducensのｐｃｋが過剰発現された場合には、コハク酸生産は６．５倍増強した(Kim et al., 2004）。ＫＪ０１７および後続誘導体では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、機能的天然ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの存在下でさえ、明らかに主要なカルボキシル化活性である。
【０１０３】
大腸菌Ｃの酵素測定からの結果は全く驚くべきものであった。一般に、増殖中に天然大腸菌によるコハク酸生産の主要なカルボキシル化活性（ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ｐｐｃ）とみなされている酵素は(Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Keseler et al., 2005; Millard et al., 1996; Gottschalk 1985; Karp et al., 2007)、大腸菌Ｃに関してin vitroで最も活性な酵素ではなかった。従って、代謝操作の合理的デザインおよび代謝フラックスの評価が一般にそれに基づく、大腸菌の一般に受け入れられている代謝経路(Unden and Kleefeld, 2004; Fraenkel 1996; Sanchez et al., 2006; Cox et al., 2006; Vemuri et al., 2002a; Wang et al, 2006; Sanchez et al., 2005ab; Gokarn et al., 2000; Karp et al., 2007)は全ての株で代謝を厳密に反映しているわけではない。in vitroにおける基質飽和条件下では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ活性の活性が最も高かった。大腸菌Ｋ１２では、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの両活性がin vitroにおいて同等であり（１４０ｎｍ／分／ｍｇ細胞タンパク質；Van der Werf et al., 1997）、前者がコハク酸への主要経路として働くことが報告されている。
【０１０４】
これまでの研究で、大腸菌における天然ｐｐｃ遺伝子の過剰発現は、ＴＣＡサイクル中間体を補充するためのＰＥＰのより高いカルボキシル化のため、高い特異的コハク酸生産(Millard et al., 2000)、より高い比増殖速度、および低い特異的酢酸生産をもたらしたことを示している(Farmer and Liao, 1997)。しかしながら、グルコース輸送系にはＰＥＰが必要とされるので、過剰発現するｐｐｃはまた、同質遺伝子型対照と比べた場合に、コハク酸収率（グルコース当たり）を有意に高めることなく、グルコースの取り込み率を１５〜４０％低下させる(Chao and Liao, 1993; Gokarn et al., 2000)。このようにホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼがコハク酸収率を高めることができなかったことは、大腸菌遺伝子の天レパートリーを用いたさらなる研究を行うよりも、然大多数の研究の注意を新たな代謝デザイン、すなわち、カルボキシル化段階としての乳酸桿菌(Lactobacillus lactis)またはリゾビウム・エトリ(Rhizobium etli)からのＰＹＣ（ピルビン酸カルボキシラーゼ）の過剰発現(Vemuri et al., 2002ab; Gokarn et al., 2000; Lin et al., 2005abc)に向けた。
【０１０５】
アクチノバチルス・スクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)などのルーメン細菌は、カルボキシル化にエネルギー保存性のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを用いたグルコース発酵の際に主生成物としてコハク酸を生産する(Kim et al., 2004; McKinlay et al., 2005; McKinlay and Vieille, 2008)。報告されているこの生物の活性はＫＪ０１７の５倍であり、ＫＪ０７３の連続増殖に基づく選択（代謝進化）によって得られたものの半分である。よって、代謝操作（ｌｄｈＡ  ａｄｈＥ  ａｃｋＡ）と代謝進化（ＡＴＰ生産の効率の上昇に向けた増殖に基づく選択）の組合せを用いることにより、本明細書に報告されている研究は、大腸菌遺伝子の天然レパートリーのみを用いて、Ａ．スクシノゲネスなどのルーメン生物に似た大腸菌のコハク酸生産株の開発を示す。大腸菌ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）の過剰発現は、ホスホエノールピルビン酸シンターゼの突然変異がなければコハク酸生産に役立たない(Chao and Liao, 1993; Kim et al., 2004; Gokarn et al., 2000; Millard et al., 1996)というこれまでの報告にもかかわらず、ＫＪ０１７および誘導体は、コハク酸およびマレイン酸生産の主生成物としてホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを用いるように操作された。
【０１０６】
ＫＪ０３２およびＫＪ０６０の構築
１０％（ｗ／ｖ）グルコースを用いて増殖させた際、ＫＪ０１７（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ  ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ）を用いた発酵では、主要な乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）および酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）活性をコードする遺伝子が欠失されているにもかかわらず、望まない同時生成物（酢酸、ギ酸および乳酸）が多かった（表３）。乳酸および酢酸の生産はまた、増殖に基づく選択の基礎である高いＡＴＰ収量をもたらす（図１Ａ）。
【０１０７】
ギ酸として還元物および酢酸の潜在的供給源である過剰なアセチル−ＣｏＡの損失をなくすため、ＫＪ０１７からピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（ｐｆｌＢ）を欠失させた。このオペロンにおける上流ギ酸輸送体（ｆｏｃＡ）も欠失させた。予測されたように、この欠失株（ＫＪ０３２）は酢酸無しでは増殖せず、これがＫＪ０１７におけるアセチル−ＣｏＡ生産の主要経路であることが確認された（図３Ｃ）。ｐｆｌＢの欠失は嫌気性条件下で酢酸要求性を生じることがよく知られている(Sawers and Bock, 1988)。ＫＪ０３２による増殖およびコハク酸生産は２０ｍＭ酢酸の添加によって回復された（図３Ｃ、図４Ｃおよび図５）。ギ酸および酢酸の生産は、ｐｆｌＢ（およびｆｏｃＡ）の欠失の結果として実質的に低下した。この株は増殖に酢酸を必要としたが、発酵中にさらなる酢酸も生産された。同じ現象がこれまでに、ピルビン酸生産のための大腸菌Ｋ−１２生物触媒の構築の際のｐｆｌＢ欠失株に関して報告されている(Causey et al., 2004)。ＫＪ０３２では、乳酸レベルもまた低下した（表３；図４Ｃ）。以降の移植には増殖とコハク酸生産の改善を伴った。以降の移植では、添加酢酸が減り、接種量が少なくなり、グルコース濃度が２倍になった（１０％ｗ／ｖ）（４Ｄ）。酢酸量を５ｍＭまで減らした後、コハク酸を使って高レベルのマレイン酸を生産する不安定な集団が現れた。さらなる移植後、酢酸を除いたが、おそらくは別の遺伝子の発現が高まったためにもはや酢酸要求性ではない株が発達した。しかしながら、酢酸の添加を止めるとコハク酸収量が低下し、一方、マレイン酸および酢酸レベルが高まった。この酢酸の供給源およびマレイン酸の増加の基礎は分かっていない。また、少量のピルビン酸も生産された。最後の移植からクローンを単離し、ＫＪ０６０（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ  ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ  ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ）と呼称した。この株は１０％グルコースを含むＮＢＳ無機塩培地で代謝グルコース１モル当たり１モルのコハク酸を生産した。
【０１０８】
メチルグリオキサールシンターゼ（ｍｇｓＡ）の欠失によるＫＪ０７０およびＫＪ０７１の構築物
種々の株の発酵培養液中に存在する少量の乳酸はメチルグリオキサールシンターゼ経路に起源すると推定される（図６；Grabar et al. 2006）。これは収量の小さな損失に当たるが、この経路による乳酸生産は、増殖と解糖双方の阻害剤であるメチルグリオキサールの蓄積の指標となる(Egyud and Szent-Gyorgyi, 1966; Grabar et al., 2006; Hopper and Cooper, 1971)。ＫＪ０６０においてｍｇｓＡ遺伝子（メチルグリオキサールシンターゼ）を欠失させることによりメチルグリオキサールおよび乳酸の生産を除去し、ＫＪ０７０（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ  ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ  ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ  ΔｍｇｓＡ）を作出した。ＫＪ０７０株はまず、５％（ｗ／ｖ）グルコースで継代培養した（図４Ｅおよび図５）。ｍｇｓＡの欠失は、培地中のピルビン酸の蓄積により裏付けられるように解糖フラックスが増加していると予測される（表３）。この解糖フラックスの増加はまた、フマル酸レダクターゼアロステリック阻害剤であるオキサロ酢酸の生産の増加によってコハク酸／マレイン酸比のさらなる低下の原因となり得る(Iverson et al., 2002; Sanwal, 1970c)。
【０１０９】
移植２１回目で、グルコースを２倍の１０％（ｗ／ｖ）とし、移植を続けた。この高レベルのグルコースとそれに続く移植は、その後の移植でコハク酸を超えてマレイン酸生産のさらなる増加をもたらした（図４Ｅ）。１０％ｗ／ｖグルコース中でのコハク酸に対するマレイン酸の生産の増加は解糖フラックスの増加およびオキサロ酢酸によるフマル酸レダクターゼの阻害とも一致する。移植５０回目で、代謝グルコース１モル当たり１．３モルのマレイン酸と０．７１モルのコハク酸が生産された（表３）。有意な量の酢酸も生産された。最終の継代培養物から新たな株を単離し、ＫＪ０７１（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ  ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ  ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ  ΔｍｇｓＡ）と呼称した。この株はマレイン酸生産に有用であり得る。
【０１１０】
ｐｏｘＢの欠失によるＫＪ０７２およびＫＪ０７３の構築
グルコースの酢酸への変換は酸化還元的に中性であるが、酢酸への炭素分配はコハク酸およびマレイン酸の収量を低下させる。ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）は、微好気性条件下でのインキュベーションの際に酢酸およびＣＯ２の潜在的供給源となる(Causey et al., 2004)。それは嫌気性条件下ではピルビン酸の酸化に機能しないはずであるが、ｐｏｘＢを遺伝子欠失の標的とした（図６）。予測されたように、ＫＪ０７２（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ  ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ  ΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ：：ＦＲＴ  ΔｍｇｓＡ  ΔｐｏｘＢ）の作出のためのｐｏｘＢの欠失は酢酸の生産を低下させず、このことは酢酸の生産に別の経路が関与することを示す。しかしながら、ｐｏｘＢの削除は、発酵生成物においてコハク酸の増加およびマレイン酸の現象という予測されない変化をもたらした（表３；図４Ｆ）。このコハク酸生産における改善の機構はまだ分かっていないが、アセトインの生産、脱炭酸および炭素連結などのピルビン酸オキシダーゼの他の活性に関係している可能デイがある(Ajl and Werkman, 1948; Chang and Cronan, 2000)。
【０１１１】
ＫＪ０７２株は、１０％（ｗ／ｖ）グルコースを含む低塩培地であるＡＭ１培地でさらに４０回の代謝進化を受けた（表３；図４Ｆおよび図５）。これらの移植中に、増殖、細胞収量およびコハク酸生産の改善が見られた。マレイン酸、ピルビン酸および酢酸レベルも増加した。最終移植からクローンを単離し、ＫＪ０７３（ΔｌｄｈＡ：：ＦＲＴ  ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ  ΔａｃｋＡ：：ＦＲＴ  ΔｐｆｌＢ：：ＦＲＴ  ΔｍｇｓＡ  ΔｐｏｘＢ）と呼称した。この株はカルボキシル化のためのホスフェノールピルビン酸カルボキシキナーゼ経路を保持していた（表４）。この株のin vitro活性は、ＫＪ０１２よりも４５倍高くＫＪ０１７よりも１０倍高く、コハク酸生産へのエネルギー変換と増殖との強い結びつきの証拠となり、さらに選択に用いる基礎が確立された。
【０１１２】
１０％（ｗ／ｖ）グルコースを含有するＡＭ１培地におけるＫＪ０６０およびＫＪ０７３の発酵
図７は、コハク酸生産の最良の２つの生物触媒であるＫＪ０６０およびＫＪ０７３を用いた回分発酵を示す。最初の４８時間のインキュベーションでは増殖は完全であったが、コハク酸生産が９６時間続いた。細胞増殖がない場合には、見られたコハク酸生産は３分の１であった。これらの株は６６８〜７３３ｍＭのコハク酸力価をもたらし、モル収率は代謝グルコースに対して１．２〜１．６であった。ＡＭ１培地では、収量は一般にＮＢＳ無機塩培地よりも高かった。酢酸、マレイン酸およびピルビン酸は望まない同時生成物として集積し、コハク酸の潜在的収量から差し引いた（表３）。グルコースおよびＣＯ２（過剰量）からのコハク酸の最大理論収量は、下式：
７Ｃ６Ｈ１２Ｏ６＋６ＣＯ２→１２Ｃ４Ｈ６Ｏ４＋６Ｈ２Ｏ
に基づけば、グルコース１モル当たり１．７１モルである。しかしながら、この収量を達成する大腸菌の直接的コハク酸経路は無い（図６）。
【０１１３】
他の基質のコハク酸への変換
本研究では主としてグルコースのコハク酸への変換に焦点を当てたが、大腸菌は植物の細胞壁の成分であるあらゆる六炭糖および五炭糖を代謝する本来の能力を有することがよく知られている(Asghari et al., 1996; Underwood et al., 2004)。大腸菌のいくつかの株はスクロースも代謝可能である(Moniruzzaman et al., 1997）。ＫＪ０７３株を血清試験管中、２％の六炭糖および五炭糖の利用に関して試験した。全ての場合で、これらの糖類は主としてコハク酸へ変換された。ＫＪ０７３株はまた、グリセロールもコハク酸へ代謝した。２％グリセロールとともにインキュベートした際、１４３ｍＭのグリセロールが代謝され、１２７ｍＭのコハク酸が生産され、モル収率は０．８９であり、理論最大値の８９％であった。
【０１１４】
１ｍＭベタインおよび１０％グルコースを含有するＮＢＳ培地でのマレイン酸の生産
増殖に基づく選択中、培養物は、有用な可能性のある他の生成物として様々なマレイン酸生産を示した（表３）。マレイン酸は１０％グルコースを用いた場合のＫＪ０７１からの最も多い生成物であり（表３；図４Ｅ）、コハク酸のほぼ２倍であった。この株は５１６ｍＭのマレイン酸を生産し、モル収率は代謝グルコースに対して１．４４であった（表３）。
【０１１５】
結論
大腸菌の発酵代謝は、著しく順応性があることが示されている。誘導体を、天然発酵経路に関連する遺伝子の多くの欠失を回避し、酸化還元バランスを維持するよう酵素を保持することによってフラックスを高め、ＡＴＰ生産の効率を高め、増殖を増すように操作し、進化させた。多大な挑戦ではあるが、細胞は、全ての生合成要求を満たすように炭素分配のバランスをとりながら、無機塩培地においてこのような適応変換を果たし得る。ＮＡＤＨ酸化（乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）および酢酸生産（酢酸キナーゼ）の主要経路を除去した後も、増殖およびＡＴＰ生産は、ＮＡＤＨ酸化および酸化還元バランスのためのマレイン酸またはコハク酸の生産に関連し続ける（図１Ｂ）。嫌気性増殖に基づく選択は酸化還元バランスを確保し、増殖増加の基礎であるＡＴＰ生産の効率の上昇および速度の上昇に関して選択する。この酸化還元バランスおよびＡＴＰ生産に関する選択は、最終産物としてのマレイン酸とコハク酸の間で容易に区別することはできないが、これは双方の前駆体が電子受容体として働くからである。これらの検討の際、コハク酸よりも多くのマレイン酸を生産する１つの株（ＫＪ０７１）が発達した。この株およびさらなる誘導体はマレイン酸生産に有用であり得る。ＫＪ０７３およびＫＪ０６０などの他の株は主生成物としてコハク酸を、グルコース１モル当たり１．２〜１．６モルの収率で生産する。
【０１１６】
嫌気性増殖の際にアセチル−ＣｏＡの主要な供給源となるｐｆｌＢの欠失は、酢酸栄養要求性をもたらした(Sawers and Bock, 1988)。この要求は、おそらくはピルビン酸デヒドロゲナーゼなどの他の経路によるアセチル−ＣｏＡの生産の増加のために、代謝進化を通じて除去された(de Graef et al., 1999)。この栄養要求に取って代わった酢酸またはアセチル−ＣｏＡの代謝源は分かっていない。代謝生成物の多くのシフトは予期されないものであった。ｍｇｓＡ欠失後の選択中のマレイン酸の増加は説明できない。メチルグリオキサールは、代謝のアンバランスに応答して生産される代謝阻害剤である(Grabar et al., 2006)。メチルグリオキサール生産の排除が、増殖速度の増加、接種後の短い誘導期などの増殖関連の利点をもたらした可能性がある。ｐｏｘＢ欠失後のマレイン酸の現象およびより高いコハク酸生産へのシフトも驚くべきことであった。酢酸レベルにはほとんど変化が見られなかったが、このことは、この酵素が酢酸の副次的な供給源であったか、あるいはそれが別の酢酸生産経路に機能的に取って代わられたかのいずれかであることを示す。ｐｏｘＢの欠失後には、コハク酸が再び主要なジカルボン酸として生産された。コハク酸生産のための最良の株であるＫＪ０６０およびＫＪ０７３を用いた場合、マレイン酸および酢酸は豊富な同時生成物として維持された（表３；図４Ｄおよび４Ｆ）。これらの排除は、収量を高めるためのさらなる機会となる。
【０１１７】
コハク酸生産用に開発された予め操作された大腸菌は全て、維持のために抗生物質を含む複雑な培地およびプラスミドを用いたものであった。ほとんどのものは、単純な回分発酵では低力価のコハク酸しか達成せず、高い力価を達成するにはより複雑なプロセスを要した（表１）。複雑な培地で組換え大腸菌によるグルコースからのコハク酸生産を高める種々の遺伝学的アプローチが報告されている。本発明者らの最初の構築物において、増殖および糖代謝は無機塩培地では極めて低かったが、複雑な培地（Ｌｕｒｉａ培養液）では極めて強壮であった。ビタミン、アミノ酸および他の高分子前駆体を含有する複雑な培地は、代謝操作によって作り出された代謝および生合成の潜在的な調節問題をマスクし得る。
【０１１８】
また、他の多くの研究者が異種遺伝子と、ガス（ＣＯ２、Ｈ２、Ｏ２または空気）散布を含む煩雑なプロセスならびに好気性と嫌気性の二重プロセスを用いている。このプロセスおよび栄養素の複雑性は構築、材料、精製および廃棄物処理のコストを増大させることが予測される。これに対し、ＫＪ０６０株およびＫＪ０７３株は、複雑な栄養素または外来遺伝子を用いずに無機塩培地を用いた単純な回分発酵（１０％糖）で高い力価のコハク酸（６００〜７００ｍＭ）を生産した。
【０１１９】
実施例２
微生物は次のようにARS Culture Collectionに寄託された。
【表２】
0005546871.tif 000003
【０１２０】
材料および方法
株、培地および増殖条件
大腸菌Ｃ（ＡＴＣＣ８７３９）は、遺伝子欠失のユニークな組合せと増殖に基づく選択を組み合わせて用い、コハク酸生産のために開発したものである。本研究に用いた株、プラスミドおよびプライマーを表１にまとめる。株の構築中、培養物は、抗生物質を適宜加えた(Jantama et al., 2008; Zhang et al., 2007)、改変Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培養液（１リットル当たり：１０ｇ  Ｄｉｆｃｏトリプトン、５ｇ  Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物、５ｇ塩化ナトリウム）(Miller, 1992)中、３７℃で増殖させた。コハク酸生産用に発達させた最終株には、抗生物質耐性、プラスミドまたは外来遺伝子をコードする遺伝子は無かった。構築後、株はＡＭ１培地(Martinez et al., 2007)で増殖させ、維持した。この培地には１００ｍＭ  ＫＨＣＯ３およびグルコース（示された通り）を添加した。初めの糖濃度が５％以上である場合はベタイン（１ｍＭ）も加えた。
【０１２１】
ａｄｈＥ、ｌｄｈＡおよびｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ領域におけるＦＲＴマーカーの欠失
一連の遺伝子欠失を作出し、ａｄｈＥ、ｌｄｈＡおよびｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ遺伝子座からＦＲＴマーカーを除去するために用いた戦略はこれまでに記載されている(Datsenko and Wanner, 2000; Grabar et al., 2006; Jantama et al., 2008; Zhang et al., 2007)。ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの供給源としてプラスミドｐＬＯＩ４１５１を用い、ダブルクロスオーバー相同組換え事象を促進するためにＲｅｄレコンビナーゼ（ｐＫＤ４６）を用いた。組込みの選択にはクロラムフェニコール耐性を用いた。ｓａｃＢの欠損に関して選択するため、スクロースによる増殖を用いた。このアプローチを用いて一連の欠失を構築し、全ＦＲＴ部位が除去されたＫＪ０７９の誘導体を作製した。プライマーおよびプラスミドを表１に示す。
【０１２２】
ΔａｄｈＥ領域においてＦＲＴ部位を除去するため、ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ標的領域のためのハイブリッドプライマー（ＷＭａｄｈＥＡ／Ｃ）を、ΔａｄｈＥ：：ＦＲＴ部位の５’および３’領域に相同なおよそ５０ｂｐとｐＬＯＩ４１５１由来のｃａｔ−ｓａｃＢ遺伝子に相当する２０を含むように設計した。これらのプライマーを、鋳型としてｐＬＯＩ４１５１を用いるｃａｔ−ｓａｃＢカセットのＰＣＲ増幅に用いた。得られたＰＣＲ産物を用い、ΔａｄｈＥ領域のＦＲＴ部位を、ダブルクロスオーバー相同組換え事象によりｃａｔ−ｓａｃＢカセットで置換し、クロラムフェニコール耐性の選択を伴ってＴＧ２００を作出した。
【０１２３】
ａｄｈＥ遺伝子と周辺配列を大腸菌Ｃから、ｕｐ／ｄｏｗｎ  ａｄｈＥプライマーを用いて増幅した。ｙｃｈＥ’−ａｄｈＥ−ｙｃｈＧ’を含有するＰＣＲ産物（３．４４ｋｂ）をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯへクローニングし、ｐＬＯＩ４４１３を得た。プライマーの第二のセット（ＩＯ−ａｄｈＥｕｐ／ｄｏｗｎ）を用い、鋳型としてのｐＬＯＩ４４１３とＰｆｕポリメラーゼを用いてインサイドアウト産物を増幅し、ａｄｈＥ配列の２．６ｋｂの内部セグメントが欠失された平滑末端産物を得た。このインサイドアウトＰＣＲ産物をキナーゼで処理し、自己連結し、ｐＬＯＩ４４１９を得た。ｐＬＯＩ４４１９から増幅されたＰＣＲ産物（ｕｐ／ｄｏｗｎ  ａｄｈＥプライマー）を用い、ｓａｃＢの欠損に関するスクロース選択を伴うもう１つの二重相同組換え事象により、ＴＧ２００のｃａｔ−ｓａｃＢカセットを所望の染色体配列で置換した。得られた株をＴＧ２０１（ΔａｄｈＥ領域からＦＲＴが除去されたＫＪ０７９）と呼称した。
【０１２４】
ΔｌｄｈＡおよびΔ（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）領域のＦＲＴ部位を、ａｄｈＥ：：ＦＲＴ部位を欠失させるのに用いたものと同様の方法で除去した。ΔｌｄｈＡのＦＲＴ部位を除去するのに用いたさらなるプライマーセット（ｌｄｈＡＡ／ＣおよびＩＯ−ｌｄｈＡｕｐ／ｄｏｗｎ）は、対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４４３０およびｐＬＯＩ４４３２）とともに表１に含まれている。ＴＧ２０２株は、ＴＧ２０１のこの領域をｐＬＯＩ４１５１からのＰＣＲ産物（ＷＭｌｄｈＡＡ／Ｃプライマー）で置換することにより作出された。ＴＧ２０２のｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、ｓａｃＢの欠損に関するスクロース選択を伴い、ｐＬＯＩ４４３２からのＰＣＲ産物（ｌｄｈＡＡ／Ｃプライマー）で置換し、ＴＧ２０３を作出した。
【０１２５】
Δ（ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）のＦＲＴ部位を除去するために用いたプライマーセット（ｕｐｆｏｃＡ／ＭｉｄｐｆｌＡおよびＩＯ−ｙｃａＯｕｐ／ＩＯ−ｍｉｄｐｆｌＡｄｏｗｎ）および対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４４１５およびｐＬＯＩ４４２１）が表１に含まれている。ＴＧ２０４株は、ＴＧ２０３のこの領域をｐＬＯＩ４１５１からのＰＣＲ産物（ＷＭｐｆｌＢＡ／Ｃプライマー）で置換することにより作出した。ＴＧ２０４のｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、ｓａｃＢの欠損に関するスクロース選択を伴い、ｐＬＯＩ４４２１からのＰＣＲ産物（ｕｐｆｏｃＡ／ＭｉｄｐｆｌＡプライマー）で置換し、ＫＪ０９１を作出した。ＫＪ０９１は、染色体のΔａｄｈＥ、ΔｌｄｈＡおよびΔｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ領域から全ＦＲＴ部位が除去されたＫＪ０７３の誘導体である。
【０１２６】
無マーカー遺伝子欠失のためのｃａｔ−ｓａｃＢカセットを含有するｐＬＯＩ４１６２の構築
染色体ＤＮＡの一連の欠失を促進するため、除去可能なｃａｔ−ｓａｃＢカセットを用い、所望により全てのリーディングフレームに合成ＤＮＡの１８ｂｐセグメントを停止コドンとともに含むプラスミドｐＬＯＩ４１６２（図１）を構築した。このプラスミドは合成配列とプラスミドｐＬＯＩ２２２８(Martinez-Morales et al., 1999)、ｐＬＯＩ２５１１(Underwood et al., 2002)およびｐＥＬ０４(Lee et al., 2001; Thomason et al., 2005)の部分からなる。ｐＥＬ０４を鋳型として用い、ＪＭｐＥＬ０４Ｆ１／Ｒ１プライマーを用い、インサイドアウトＰＣＲを行って、ｃａｔ遺伝子とｓａｃＢ遺伝子の間の不要なＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ部位を除去した。増幅産物をＢｇｌＩＩで消化し（両プライマー内）、自己連結させてｐＬＯＩ４１５２を作出した。プラスミドｐＬＯＩ４１３１は、ｐＬＯＩ２２２８由来のＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴフラグメント（クレノウ処理ＢａｎＩ、ＣｌａＩ）をｐＬＯＩ２５１１の適合部位（クレノウ処理ＮｈｅＩ、ＣｌａＩ）に連結することにより構築した。次に、プラスミドｐＬＯＩ４１３１をＥｃｏＲＩで消化し、自己連結させてＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴフラグメントを除去し、ＫａｓＩ部位とＸｍａＩ部位を保持したｐＬＯＩ４１４５を作出した。ポリリンカーセグメント（ＳｆＰＢＸＰＳ）は、相補的オリゴヌクレオチド（ＳｆＰＢＸＰＳｓｅｎｓｅとＳｆＰＢＸＰＳｃｏｍｐ）をアニーリングすることにより作製した。ＫａｓＩおよびＸｍａＩで消化した後、このセグメントをｐＬＯＩ４１４５の対応する部位に連結し、ｐＬＯＩ４１５３を作出した。ｐＬＯＩ４１５２中の改変ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを、ＪＭｃａｔｓａｃＢｕｐ３／ｄｏｗｎ３プライマーセットを用い、ＰＣＲにより増幅させた。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化した後、このカセットをｐＬＯＩ４１５３の対応する部位に連結し、ｐＬＯＩ４１４６を作出した。６つのリーディングフレームの全てに停止コドンを有する１８ｂｐ領域(5’GCCTAATTAATTAATCCC3’)（配列番号１）を作出するために、ｐＬＯＩ４１４６をＰａｃＩで消化し、自己連結させて、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットが除去されたｐＬＯＩ４１５４（示されていない）を作出した。突然変異誘発プライマー（ＪＭ４１６１ｓｅｎｓｅ／ｃｏｍｐ）と線状プラスミド増幅を用い、ｐＬＯＩ４１５４のＳｆｏＩ部位とＰａｃＩ部位の間に２つの付加的塩基（ＴおよびＡ）を挿入し、ｐＬＯＩ４１６１を作出した。最後に、ＰａｃＩ消化した、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを含むｐＬＯＩ４１４６由来のフラグメントをｐＬＯＩ４１６１のＰａｃＩ消化部位に連結し、ｐＬＯＩ４１６２（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＵ５３１５０６）を作出した。
【０１２７】
ｔｄｃＤＥおよびａｓｐＣにおける遺伝子欠失の構築
ｔｄｃＤＥ遺伝子および隣接する１０００ｂｐ領域（ｔｄｃＧ’−ｔｄｃＦＥＤ−ｔｄｃＣ’、５３２５ｂｐ）を、ｔｄｃＤＥｕｐ／ｄｏｗｎプライマーを用いて増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、プラスミドｐＬＯＩ４５１５を作出した。このプラスミドＤＮＡの１０００倍希釈調製物を、ｔｄｃＤＥＦ７／Ｒ７プライマー（両プライマーともｔｄｃＤＥ遺伝子内にあり、外側を向いている）を用いるインサイドアウト増幅の鋳型とした。得られたレプリコンを含む６８６１ｂｐのフラグメントを、増幅した（ＪＭｃａｔｓａｃＢｕｐ３／ｄｏｗｎ３プライマー）、ｐＬＯＩ４１６２由来のＳｍａＩ／ＳｆｏＩ消化ｃａｔ−ｓａｃＢカセットに連結し、ｐＬＯＩ４５１６を作出した。この６８６１ｂｐのフラグメントを用いて、ｔｃｄＤおよびｔｄｃＥの欠失を含む第二のプラスミドｐＬＯＩ４５１７（キナーゼ処理、自己連結）もまた構築した。ｐＬＯＩ４５１６およびｐＬＯＩ４５１７から増幅されたＰＣＲフラグメント（ｔｄｃＤＥｕｐ／ｄｏｗｎプライマー）を用い、ＫＪ０９１のｔｄｃＤＥ領域を置換した。得られたクローンをアンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性に関して試験し、ＫＪ０９８と呼称した。
【０１２８】
ａｓｐＣ遺伝子も、ｔｄｃＤＥ遺伝子の欠失に用いたものと同様の方法でＫＪ１０４から欠失させた。ａｓｐＣ欠失の構築に用いた他のプライマーセット（ａｓｐＣｕｐ／ｄｏｗｎおよびａｓｐＣ１／２）は、その対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４２８０、ｐＬＯＩ４２８１およびｐＬＯＩ４２８２）とともに表１に含まれている。得られた株をＫＪ１１０と呼称した。ＫＪ０９８もＫＪ１１０も、それぞれの欠失領域（ｔｄｃＤＥおよびａｓｐＣ）内に介在配列は分でいなかった。
【０１２９】
ａｃｋＡ領域におけるＦＲＴ部位の除去ならびにｃｉｔＦ、ｓｆｃＡおよびｐｔａ−ａｃｋＡ遺伝子欠失の構築
ＫＪ０７３のａｃｋＡ領域においてＦＲＴ部位を除去するために、所望の突然変異の配列を含むプラスミドを次のように構築した。大腸菌ＣゲノムＤＮＡを、ａｃｋＡ遺伝子のおよそ２００ｂｐ上流と下流を結合させるＪＭａｃｋＡＦ１／Ｒ１プライマーを用いるａｃｋＡのＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。この線状産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ(Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングし、ｐＬＯＩ４１５８を作出した。次に、プラスミドｐＬＯＩ４１５８を、ＪＭａｃｋＡｕｐ１／ｄｏｗｎ１プライマーとＰｆｕポリメラーゼを用いるインサイドアウトＰＣＲの鋳型として用い、ａｃｋＡの８０８ｂｐの内部セグメントを欠いた平滑末端産物を作出した。次に、ＰａｃＩフランキングｃａｔ−ｓａｃＢカセット（ｐＬＯＩ４１６２由来のＳｍａＩ／ＳｆｏＩフラグメント）を平滑ＰＣＲ産物に連結し、ｐＬＯＩ４１５９を作出した。プラスミドｐＬＯＩ４１５９をＰＣＲ増幅（ＪＭａｃｋＡＦ１／Ｒ１プライマー）の鋳型とした。このＰＣＲ産物を用い、クロラムフェニコール耐性に関する選択を伴うダブルクロスオーバー相同組換えにより、ＫＪ０７３のａｃｋＡ領域におけるＦＲＴ部位を置換した。得られたクローンをＫＪ０７６と呼称した。
【０１３０】
また、プラスミドｐＬＯＩ４１５９をＰａｃＩで消化し、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを除去し、自己連結させて、１８ｂｐの翻訳停止配列を保持したｐＬＯＩ４１６０を作出した。プラスミドｐＬＯＩ４１６０をＰＣＲ鋳型とした（ＪＭａｃｋＡＦ１／Ｒ１  プライマー）。この増幅フラグメントを用い、ｓａｃＢの欠損に関する選択を伴うダブルクロスオーバー相同組換えにより、ＫＪ０７６におけるｃａｔ−ｓａｃＢカセットを置換した。高温下での増殖によりｐＫＤ４６を除去した後、得られた株をＫＪ０７９と呼称した。この株では、欠失領域が１８ｂｐの翻訳停止配列で置換されていた。
【０１３１】
上記でａｃｋＡ領域からＦＲＴ部位を除去するために用いた戦略を、ｃｉｔＦ、ｓｆｃＡおよびｐｔａ−ａｃｋＡの一連の欠失を作出し、欠失領域を１８ｂｐの翻訳停止配列で置換するために用いた。ｃｉｔＦ欠失の構築に用いた他のプライマーセット（ｃｉｔＦｕｐ／ｄｏｗｎおよびｃｉｔＦ２／３）は、その対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４６２９、ｐＬＯＩ４６３０およびｐＬＯＩ４６３１）とともに表１に含まれている。得られた株をＫＪ１０４と呼称した。
【０１３２】
ＫＪ１０４株およびＫＪ１１０株からｓｆｃＡ遺伝子を欠失させ、得られた株をそれぞれＫＪ１１９およびＫＪ１２２と呼称した。ｓｆｃＡ欠失の構築に用いた他のプライマーセット（ｓｆｃＡｕｐ／ｄｏｗｎおよびｓｆｃＡ１／２）は、その対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４２８３、ｐＬＯＩ４２８４およびｐＬＯＩ４２８５）とともに表１に含まれている。
【０１３３】
ＫＪ１２２からａｃｋＡ−ｐｔａオペロン（合成翻訳停止配列を含む）を欠失させ、ＫＪ１３４株を作出した。この欠失の構築に用いた他のプライマーセット（ａｃｋＡｕｐ／ｐｔａｄｏｗｎおよびａｃｋＡ２／ｐｔａ２）は、その対応するプラスミド（ｐＬＯＩ４７１０、ｐＬＯＩ４７１１およびｐＬＯＩ４７１２）とともに表１に含まれている。ＫＪ１３４株はＦＲＴ部位または外来遺伝子を含んでいない。
【０１３４】
発酵
種培養物および発酵物は、１０％（ｗ／ｖ）グルコース（５５５ｍＭ）、１００ｍＭ  ＫＨＣＯ３および１ｍＭベタインＨＣｌを含有するＡＭ１無機塩培地(Martinez et al., 2007)中、３７℃（１００ｒｐｍ）にてインキュベートした。ｐＨを維持し、ＣＯ２を供給するために３Ｍ  Ｋ２ＣＯ３と６Ｎ  ＫＯＨの混合物を加えた。塩基組成の違い（１：１、４：１、６：１混合物）は発酵にはほとんど影響が無かった。発酵は実容量３５０ｍｌの小型槽で行った。発酵物は特に断りのない限り、初期ＯＤ５５０  ０．０１（３．３ｍｇ  ＣＤＷ／ｌ）で接種した。発酵槽は、サンプルを取り出す排出口として用いる１６ゲージのニードルを除いて密閉した。増殖中、嫌気生活が急速に達成された。ＣＯ２雰囲気を確保するため、重炭酸添加を行った。
【０１３５】
分析
細胞重量は、Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ７０分光光度計を用いることにより、５５０ｎｍでの光学密度から評価した（ＯＤ１．０＝細胞乾重３３３ｍｇ／ｌ）。有機酸および糖は、高速液体クロマトグラフィーを用いることにより測定した(Grabar et al., 06)。
【０１３６】
結果および考察
コハク酸生産のための無マーカー株の構築
大腸菌Ｃ野生型の中心的嫌気性発酵遺伝子を、ＰＣＲ産物および除去可能な抗生物質マーカーを用い（ＦＲＴ認識部位およびＦＬＰレコンビナーゼの使用による）、Datsenko & Wanner (2000)の戦略によって順次欠失させた。これらの構築を代謝進化（増殖に基づく、ＡＴＰの生産効率の上昇に関する選択）と組み合わせて用い、エネルギーを保存するホスホエニルピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）を補充して増殖およびコハク酸生産を高めた突然変異株を選択した（図９）。得られた株ＫＪ０７３は代謝ｐグルコース１モル当たり１．２モルのコハク酸を生産し(Jantama et al., 2008)、この場合には、ルーメン細菌であるアクチノバチルス・スクシノゲネス(van der Werf et al., 1997)およびマンヘイミア・スクシニシプロズセンス(Mannheimia succiniciproducens)(Song et al., 2007)およびほとんど類似のコハク酸経路を用いる。しかしながら、これらの遺伝子欠失の構築に用いた方法は、各欠失遺伝子の領域に８２〜８５ｎｔの遺伝子瘢痕またはＦＲＴ部位を残した（ａｃｋＡ、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ）を残した。これらのＦＲＴ部位は、抗生物質遺伝子の除去の際にＦＬＰレコンビナーゼの認識部位として働いた(Storici et al., 1999)。これらの外来配列の全てをＫＪ０７３から順次除去し、これまでに記載されている方法(Grabar et al., 2006; Zhang et al., 2007; Jantama et al., 2008)を用いて、所望の遺伝子欠失だけを有する天然ＤＮＡで置換した。得られたＫＪ０９１株は、ａｃｋＡ、ｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ｆｏｃＡ−ｐｆｌＢ、ａｃｋＡ、ｍｇｓＡおよびｐｏｘＢに特異的欠失を含み、全てのＦＲＴ部位を欠く。この株は、ａｃｋＡ内の１８ｂｐの翻訳停止配列を除き、あらゆる外来ＤＮＡおよび合成ＤＮＡを欠いている。ＫＪ０９１株によるコハク酸生産はＫＪ０７３と同等であった（表７）。この株を、コハク酸生産をさらに改良するための親株として用いた。
【０１３７】
ｔｄｃＤおよびｔｄｃＥの欠失によるコハク酸生産の際の酢酸の減少
大腸菌によるグルコースの嫌気性発酵の際、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌＢ）は、アセチル−Ｐの前駆体であるアセチル−ＣｏＡの主要な供給源として働き、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はアセチル−Ｐからの酢酸生産の主要経路として働く(Karp et al., 2007; Kessler & Knappe, 1996)。ＫＪ０７３株およびＫＪ０９１株における発酵生成物としての酢酸の存在量は、これらの株はａｃｋＡおよびｐｆｌＢの双方の欠失を含んでいることから驚くべきものであった（図９）。この発酵終了時の残留酢酸は、代謝をコハク酸収量の向上にさらに向け直す、可能性のある機会と言える。
【０１３８】
酢酸キナーゼ（およびプロプリオネートキナーゼ）活性を有する関連酵素は、ｔｄｃＤによりコードされているが、一般にトレオニンの分解のためにのみ生産される(Hesslinger et al., 1998; Reed et al., 2003)。選択中に起こる突然変異は図１０に示されているように、ｔｄｃＤの発現の増強を示す可能性がある。１０％（ｗ／ｖ）グルコースでの嫌気性増殖中、ｔｄｃＤの発現が機能的にａｃｋＡに取って代わり、アセチル−Ｐからの酢酸の生産を増大させる。同じオペロンにおいて隣接するｔｄｃＥ遺伝子はｐｆｌＢに類似し、トレオニン分解中に同時発現されるピルビン酸（およびα−ケト酪酸）ギ酸リアーゼ活性をコードしている(Hesslinger et al., 1998)。１０％（ｗ／ｖ）グルコースでの嫌気性増殖中のこの遺伝子の発現の増強は、アセチル−Ｐの中間前駆体であるアセチル−ＣｏＡの生産を増大させ、ギ酸としての還元物を消耗する可能性がある（図１０）。ｔｄｃＤおよびｔｄｃＥ（隣接）をＫＪ０９１から同時に欠失させ、ＫＪ０９８を作出した。これら２つの遺伝子の欠失は、ＫＪ０９８ではＫＪ０９１に比べて酢酸の生産を半分減らし、コハク酸の収量を１０％引き上げ、炭素流をコハク酸から転用するこの予期されない経路の重要性を確かなものとする。驚くことに、ＫＪ０９１によるマレイン酸の生産も、ＫＪ０９８の新たな欠失の結果として排除された。ＫＪ０９８により生産されたピルビン酸（ピルビン酸代謝、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性（ｔｄｃＤ）および酢酸キナーゼ活性（ｔｄｃＥ）の別の２つの経路が排除された際に増大すると予想される中間体）のレベルも４０％低下した。マレイン酸（コハク酸精製の際に問題となる夾雑物）の排除、ピルビン酸の減少、ならびにｔｄｃＤおよびｔｄｃＥの同時欠失の結果起こったコハク酸の増加を担う機構はまだ分かっていない。
【０１３９】
コハク酸生産の際の酢酸収量に対するクエン酸リアーゼ（ｃｉｔＤＥＦ）欠失の影響
ＫＪ０９８はＫＪ０９１を超える有意な改善を示すが、酢酸レベルのさらなる減少およびコハク酸収量のさらなる増大の可能性がある。嫌気性条件下で、オキサロ酢酸は還元生成物（マレイン酸）および酸化中間体（クエン酸）へ分配される（図９）。クエン酸は、他の代謝機能のために細胞内ＯＡＡプールを再循環させるために、クエン酸リアーゼ（ｃｉｔＤＥＦ）によりオキサロ酢酸および酢酸へと逆変換され得る(Nilekani et al., 1983)。有意な量のクエン酸リアーゼの発現はクエン酸上での増殖に関連している(Lutgens and Gottschalk, 1980; Kulla and Gottschalk, 1977)。クエン酸リアーゼは３つの異なるポリペプチド鎖からなる多重酵素複合体である、αまたは大サブユニットは、第一段階を触媒するクエン酸−ＡＣＰトランスフェラーゼである。βまたは中サブユニットは、第二段階を触媒するシトリル−ＡＣＰリアーゼである。γまたは小サブユニットはアシル担体タンパク質として働き、補欠分子族成分を有する。反応が起こるには、３つのサブユニットの全てが必要である(Quentmeier et al., 1987)。これらのサブユニットの１以上をコードする遺伝子の欠失はクエン酸リアーゼ活性を排除し、コハク酸生産の際の酢酸レベルをさらに引き下げ得る。ｃｉｔＦ遺伝子をＫＪ０９８から欠失させ、ＫＪ１０４を作出した。しかしながら、この欠失は、酢酸生産または他のコハク酸収量に影響しなかった（表７）。ｃｉｔＦの欠失は酢酸の減少を引き起こさなかったことから、この中間体は他の経路から生じた(arise form)ものと思われた。理由はまだ分かっていないが、ｃｉｔＦの欠失はＫＪ１０４の増殖に悪影響を及ぼし（細胞収量が２２％減少）、発酵の終了時のピルビン酸レベルをＫＪ０９８と比較してほぼ５０％増加させた。しかしながら、ＫＪ１０４を用いた場合のコハク酸収量、力価、平均生産性および酢酸レベルは、ＫＪ０９８を用いた場合に匹敵した（表７）。
【０１４０】
コハク酸収量に対するａｓｐＣおよびｓｆｃＡ欠失の影響
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）は、アミノ基転移によりアスパラギン酸、フェニルアラニンおよびその他の化合物の合成を触媒する多機能酵素である。この反応では、Ｌ−グルタミン酸とのアミノ基転移反応により、ＰＥＰカルボキシル化からの中間体であるオキサロ酢酸からＬ−アスパラギン酸が合成される。アスパラギン酸はタンパク質の構成要素であり、他のいくつかの生合成経路に携わる。細胞窒素の約２７％がアスパラギン酸から供給されると見積もられている(Reitzer, 2004)。アスパラギン酸生合成とコハク酸生産は共通のオキサロ酢酸細胞内プールを有する。ａｓｐＣの欠失はコハク酸生産の増加をもたらし得るだけでなく、ＡＭ１などの最小塩培地での嫌気性増殖を回避する栄養要求性を作り出し得る。
【０１４１】
このアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（ａｓｐＣ）をＫＪ１０４から欠失させ、ＫＪ１１０を作出した。予期しないことに、ａｓｐＣの欠失は、ＫＪ１０４に比べＫＪ１１０でコハク酸収量または細胞収量に影響を及ぼさなかった（表７）。このように、本発明者らの株では、アスパルターゼは、コハク酸生産から有意なレベルのオキサロ酢酸を転用するとは思われない。元々アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼにより触媒される生合成要求に採って代わるもう１つの酵素が利用できると思われる。
【０１４２】
ＫＪ１０４およびコハク酸生産用に操作された他の大腸菌株を用いた発酵の終了時には有意な量のピルビン酸が存在する（表７）。このピルビン酸は不要な生成物であり、コハク酸収量を高めるさらなる機会であると言える。発酵培養液中のこの高レベルのピルビン酸は、図１０で示されるように、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）によるマレイン酸のピルビン酸への脱炭酸から生じ得る。この酵素は、グルコースの嫌気性異化作用の際ではなく、主として糖新生中に働くと思われる(Unden and Kleefeld, 2004; Stols and Donnelly, 1997; Oh et al., 2002)。ピルビン酸の還元的カルボキシル化によるマレイン酸の形成は熱力学的に有利であり、この酵素の動態パラメーターは生理学的条件下での脱水素および脱炭酸に好ましい(Stols and Donnelly, 1997)。この酵素のカルボン酸ピルビン酸への過剰発現は、大腸菌のコハク酸生産のための株の構築の基礎としてこれまでに用いられている(Stols and Donnelly 1997)。
【０１４３】
リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）がＫＪ１０４（および関連株）においてカルボキシル化し、コハク酸生産に寄与していれば、この遺伝子の欠失はコハク酸収量を低下させ、ピルビン酸などの他の生成物のレベルを増加させると予想される。あるいは、リンゴ酸酵素（ｓｃｆＡ）がＫＪ１０４において脱炭酸し、マレイン酸をピルビン酸へ転用していれば、この酵素をコードする遺伝子は、コハク酸収量を高め、ピルビン酸レベルを低下させると予想される。予期しないことに、ＫＪ１０４からｓｆｃＡ遺伝子を欠失させてＫＪ１１９を作出したところ、ＫＪ１０４に比べてコハク酸生産、増殖、ピルビン酸レベルなどに測定可能な影響は無かった（表７）。これらの結果は、ＫＪ１０４および関連株でのコハク酸生産にとってリンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ）は重要でないことを明らかに示した。この結果は、リンゴ酸酵素の生産の増大がコハク酸生産の主要経路として用いられたStols et al. (1997)により開発されたコハク酸生産株とは全く対照的である。
【０１４４】
ＫＪ１０４におけるｓｆｃＡ欠失またはａｓｐＣ欠失のいずれからも有意な利益は得られなかったが、両遺伝子を組み合わせて欠失させる影響を調べるために検討を行った。これは、ＫＫＪ１１０においてｓｆｃＡ遺伝子を欠失させてＪ１２２を作出することで行い、利益は見られないものと思われた。しかしながら、ｓｆｃＡおよびａｓｐＣの双方を組み合わせて欠失させた結果（ＫＪ１２２株）、親株ＫＪ１１０および関連株（ＫＪ１０４およびＫＪ１１９）に比べて、酢酸の若干の減少ととともに、コハク酸収量および力価に予期されない増加が起こった（表７）。ＫＪ１２２における組合せ欠失（ａｓｐＣおよびｓｆｃＡ）は、ＫＪ１０４に比べ、コハク酸収量、コハク酸力価および平均生産性にそれぞれ１８％、２４％および２４％の有意な増加をもたらした。その機構はまだ分かっていないが、単一の突然変異が１つには、残留するリンゴ酸酵素またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性によって流量が増し、潜在的利益を減衰することにより補償されるために無効となった可能性がある。コハク酸収量および力価の増大は、オキサロ酢酸のアベラビリティーが高まり、より多くのものをコハク酸へ進ませることによるものであると推測される。マレイン酸レベルも極めて低く維持された。
【０１４５】
ＫＪ１２２株（表７）は、グルコース１モル当たり１．５モルのコハク酸を生産し、最大理論収率（グルコース１モル当たり１．７１モル）の８８％であった。このように高レベルのコハク酸を生産し、マレイン酸を完全に低下させるためには、さらなる還元剤が必要であった。このさらなる還元剤の供給源はまだ分かっていないが、これらの結果はピルビン酸デヒドロゲナーゼを介したピルビン酸流の増加と一致している。この酵素は主として好気性代謝中に働く(Guest et al., 1989)と考えられるだけでなく、発酵中にも低レベルで働くことも報告されている(de Graef et al., 1999)。
【０１４６】
ｐｔａの欠失によるピルビン酸および酢酸の減少
ＫＪ１２２は優れたコハク酸収率をもたらし（１．５モル／グルコースモル）、かつ、酢酸およびピルビン酸の量は少ない。コハク酸の最大理論収率は１．７１モル／グルコースモルであり、これらの３つの炭素中間体は収量をさらに増大させる機会となる。ピルビン酸は代謝のオーバーフローとしての解糖から蓄積すると推測され、酢酸の蓄積と関係がある可能性がある。アセチル−ＣｏＡは多くの酵素のアロステリックレギュレーターである。この酢酸および酢酸キナーゼ活性の高級源は、酢酸キナーゼの主な２つの活性をコードする遺伝子（ｔｄｃＤおよびａｃｋＡ）が欠失されているので、分かっていない（図９および図１０）。この酢酸がホスホトランスアセチラーゼの産物であるアセチル−Ｐから生産されたと仮定し、ＫＪ１２２にｐｔａ遺伝子を不活性化するさらなる欠失を構築した。得られたＫＪ１３４株は理論レベルに近いコハク酸を生産した（表７）。この株においては、ピルビン酸および酢酸レベルは実質的に低かった。容量的生産性も１７％減少した。ＫＪ１３４株を用いた場合のコハク酸収率は、発酵プロセス、培地または増殖条件の複雑性によらず、他の全ての株と同等かまたはそれより良かった。
【０１４７】
【表３−１】
0005546871.tif 000004
【表３−２】
0005546871.tif 000005
【表３−３】
0005546871.tif 000006
ａ  略号：ＣＳＬ、コーンスティープリカー；ＹＥ、酵母抽出物；ＮＲ、報告されず
ｂ  平均容量的生産性を、コハク酸力価の下の括弧内に示す［ｇ  ｌ−１  ｈ−１］
ｃ  モル収率は、好気性および嫌気性条件の双方の際に代謝された糖からのコハク酸の生産に基づいて算出した。バイオマスは主として好気性増殖中に生成された。コハク酸は主として、ＣＯ２、Ｈ２または両者の混合物を伴う嫌気性インキュベーション中に生産された。
【０１４８】
【表４−１】
0005546871.tif 000007
【表４−２】
0005546871.tif 000008
【０１４９】
【表５−１】
0005546871.tif 000009
【表５−２】
0005546871.tif 000010
【０１５０】
【表６】
0005546871.tif 000011
ａデータはvan der Werf et al., 1997から
ｂ乳酸デヒドロゲナーゼの存在のため、野生型大腸菌Ｃでは測定不能
【０１５１】
【表７】
0005546871.tif 000012
ａＮＢＳ＋１ｍＭベタイン：ベタイン（１ｍＭ）で修正したＮＢＳ培地
ｂ計算にはベタインＨＣｌ原液を中和するのに用いたＫＯＨを含む。
ｃ微量金属原液（１０００倍）は１２０ｍＭ  ＨＣｌで作製した。
【０１５２】
【表８−１】
0005546871.tif 000013
【表８−２】
0005546871.tif 000014
【表８−３】
0005546871.tif 000015
【表８−４】
0005546871.tif 000016
【０１５３】
【表９−１】
0005546871.tif 000017
【表９−２】
0005546871.tif 000018
【０１５４】
（リファレンス）
U.S. Patent No. 5,723,322
U.S. Patent No. 5,869,301
U.S. Patent No. 5,143,834, Glassner et al., 1992
U.S. Patent No. 5,723,322, Guettler et al., 1998
U.S. Patent No. 5,573,931, Guettler et al., 1996a
U.S. Patent No. 5,505,004, Guettler et al., 1996b
Ajl, S. J., Werkman, C. H. (1948) “Enzymatic fixation of carbon dioxide in -ketoglutaric acid” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 34:491-498.
Andersson, C., Hodge, D., Berglund, K.A., Rova, U. (2007) “Effect of different carbon sources on the production of succinic acid using metabolically engineered Escherichia coli.” Biotechnol Prog 23(2):381-388.
Asghari, A., Bothast, R. J., Doran, J. B., Ingram, L. O. (1996) “Ethanol production from  hemicellulose hydrolysates of agricultural residues using genetically engineered Escherichia coli strain KO11” J. Industrial Microbiol. 16:42-47.
Causey, T.B., Shanmugam, K.T., Yomano, L.P, Ingram, L.O. (2004) “Engineering Escherichia coli for efficient conversion of glucose to pyruvate” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:2235-2240.
Chao, Y and Liao,  J.C. (1993) “Alteration of growth yield by overexpression of phosphoenol pyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in Escherichia coli” Appl Environ Microbiol. 59:4261-4265.
Chang, Y.Y., Cronan, J. E., Jr. (2000) “Conversion of Escherichia coli pyruvate decarboxylase to an alpha-ketobutyrate oxidase’” Biochem. J. 352:717-724. 
Chatterjee, R., Cynthia, S.M., Kathleen, C., David, P.C., Donnelly, M.I. (2001) “Mutation of the ptsG gene results in increased production of succinate in fermentation of glucose by Escherichia coli.” Appl. Environ. Microbiol. 67:148-154.
Cox, S.J., Levanon, S.S., Sanchez, A.M., Lin, H., Peercy, B., Bennett, G.N., San, K.Y. (2006) “Development of a metabolic network design and optimization framework incorporating implement constraints: A succinate production case study” Metab. Engin. 8:46-57.
Datsenko, K.A., Wanner, B.L. (2000) “One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645.
de Graef, M.R., Alexeeva, S., Snoep, J.L., de Mattos, M.J.T. (1999) “The steady-state internal redox state (NADH/NAD) reflects the external redox state and is correlated wit catabolic adaptation in Escherichia coli.” J. Bacteriol. 181:2351-235.
Delbaere, L.T.J., Sudom, A.M., Prasad, L., Leduc, Y., Goldie, H. (2004) “Structure/function studies of phosphoryl transfer by phosphoenolpyruvate carboxykinase” Biochimica et Biophysica Acta. 1679:271-278.
Du, C., Lin, S.K., Koutinas, A., Wang, R., Webb, C. (2007) “Succinic acid production from wheat using a biorefining strategy” Appl Microbiol Biotechnol. 76(6):1263-1270.
Egyud, L.G., Szent-Gyorgyi, A. (1966) “On the regulation of cell division” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 56:203-207.
Farmer, W. and Liao, J.C. (1997) “Reduction of aerobic acetate production by Escherichia coli” Appl. Environ. Microbiol. 63:3205-3210.
Fraenkel, D.G. (1996) Chapter 14, Glycolysis. In A. Bock, R. Curtiss III, J. B. Kaper, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, K.E. Rudd, and C. L. Squires (ed.), EcoSal-Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. [Online.] http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, D.C.
Gokarn, R.R., Eiteman, M.A., Altman, E. (2000) “Metabolic analysis of Escherichia coli in the presence and absence of carboxylating enzymes phosphoenolpyruvate carboxylase and pyruvate carboxylase” Appl. Environ. Microbiol. 66:1844-1850. 
Goldie, A.H. and Sanwal, B.D. (1980a) “Genetic and physiological characterization of Escherichia coli mutants deficient in phosphoenolpyruvate carboxykinase activity” J Bacteriol. 141(3):1115-1121.
Goldie, A.H. and Sanwal, B.D. (1980b) “Allosteric control by calcium and mechanism of desensitization of phosphoenolpyruvate carboxykinase of Escherichia coli.” J Biol Chem. 255(4):1399-1405.
Gottschalk, G. (1985) Bacterial metabolism. 2nd ed. Springer-Verlag, New York.
Grabar, T.B., Zhou, S., Shanmugam, K.T., Yomano, L.P., Ingram, L.O. (2006) “Methylglyoxal bypass identified as source of chiral contamination in L(+) and D(-) lactate fermentations by recombinant Escherichia coli.” Biotechnol. Lett. 28:1527-1535.
Guest, J.R., Angier, S.J., Russell (1989) “Structure, expression, and protein engineering in the pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli.” Ann. N. Y. Acad. Sci. 573:76-99.
Hesslinger, C., Fairhurst, S.A., Sawers, G. (1998) “Novel keto acid formate-lyase and propionate kinase enzymes are components of an anaerobic pathway in Escherichia coli that degrades L threonine to propionate” Mol Microbiol 27(2):477-492.
Hopper, D.J., Cooper, R.A. (1971) “The regulation of Escherichia coli methylglyoxal synthase: a new control site in glycolysis” FEBS Lett 13:213-216.
Iverson, T. M., Luna-Chavez, C., Croal, L. R., Cecchini, G., Rees, D. C. (2002) “Crystallographic studies of the Escherichia coli quinol-fumarate reductase with inhibitors bound to the quinol-binding site. 2002” J. Biol. Chem. 277:16124-16130.
Jantama, K., Haupt, M.J., Svoronos, S.A., Zhang, X., Moore, J.C., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2008) “Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of E. coli C that produce succinate and malate” Biotech. Bioeng. 99(5):1140-1153.
Jarboe, L.R., Hyduke, D.R., Tran, L.M., Chou, K.J., Liao, J.C. (2008) “Determination of the Escherichia  coli S-nitrosoglutathione response network using integrated biochemical and systems analysis” J Biol Chem. 283: 5148-5157.
Kao, K.C., Tran, L.M., Liao, J.C. (2005) “A global regulatory role of gluconeogenic genes in     Escherichia coli revealed by transcriptome network analysis” J Biol Chem 280:36079-36087.
Karp, P.D., Keseler, I.M., Shearer, A., Latendresse, M., Krummenacker, M., Paley, S.M., Paulsen, I.T., Collado-Vides, J., Gamma-Castro, S., Peralta-Gil, M., Santos-Zavaleta, A., Penaloza-Spinola, M., Bonavides-Martinez, C., Ingraham, J. (2007) “Multidimensional annotation of Escherichia coli K-12 genome” Nucl Acids Res. 35(22):7577-7590.
Keseler, I.M., Collado-Vides, J., Gamma-Castro, S., Ingraham, J., Paley, S., Paulsen, I.T., Peralta-Gil, M., Karp, P.D. (2005) “Ecocyc: A comprehensive database resource for Escherichia coli” Nucl Acids Res 33:D334-D337.  
Kessler, D., and Knappe, J. (1996) Anaerobic dissimilation of pyruvate. In Neidhardt FC, Curtiss III R, Ingraham JL, Lin ECC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M, Umbarger HE, editors. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. ASM Press, Washington, D.C. p. 199-205.
Kim, P., Laivebieks, M., Vieille, C., Zeikus, J.G. (2004) “Effect of overexpression of Actinobacillus succinogenes phosphoenolpyruvate carboxykinase on succinate production in Escherichia coli” Appl Environ Microbiol. 70(2): 1238-41.
Krebs, A., Bridger, W.A. (1980) “The kinetic properties of phosphoenolpyruvate carboxykinase of Escherichia coli” Can J Biochem 58(4): 309-318.
Kulla, H., and Gottschalk, G. (1977) “Energy-dependent inactivation of citrate lyase in Enterobacter aerogenes” J. Bacteriol. 132(3): 764-770.
Laivenieks, M., Vieille, C., Zeikus, J.G. (1997) “Cloning, sequencing, and overexpression of the Anaerobiospirillum succiniciproducens phosphoenolpyruvate carboxykinase (pckA) gene” Appl Environ Microbiol 63(6): 2273-2280.
Lee, E-C., Yu, K., Martinez de Velasco, J., Tessarollo, L., Swing, D.A., Court, D.L., Jenkins, N.A., and Copeland, N.G. (2001) “A highly efficient Escherichia coli-based chromosome engineering system adapted for recombinogenic targeting and subcloning of BAC DNA”° Genomics 73: 56-65. 
Lee, S.Y., Hong, S.H., Lee, S.H., Park, S.J. (2004) “Fermentative production of chemicals that can be used for polymer synthesis” Macromol. Biosci. 4:157-164.
Lee, S.J, Lee ,D.Y., Kim, T.Y., Kim, B.H., Lee, J., Lee, S.Y. (2005) “Metabolic engineering of Escherichia coli for enhanced production of succinic acid, based on genome comparison and in silico gene knockout simulation” Appl Environ Microbiol 71:7880-7887.
Lee, S.J., Song, H., Lee, S.Y. (2006) “Genome-based metabolic engineering of Mannheimia succiniciproducens for succic acid production” Appl Environ Microbiol 72(3):1939 1948.
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005a) “Chemostat culture characterization of Escherichia coli mutant strains metabolically engineered for aerobic succinate production: A study of the modified metabolic network based on metabolite profile, enzyme activity, and gene expression profile” Metab. Engin. 7:337-352. 
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005b) “Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield” Metab. Engin. 7:116-127.
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005c) “Effect of carbon sources differing in oxidation state and transport route on succinate production in metabolically engineered Escherichia coli” J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 32:87-93. 
Lin, H., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005d) “Fed-batch culture of a metabolically engineered Escherichia coli strain designed for high-level succinate production and yield under aerobic conditions” Biotechnol Bioeng 90:775-779.
Lutgens, M., and Gottschalk, G. (1980) “Why a co-substrate is required for the anaerobic growth of Escherichia coli on citrate” J. Gen Microbiol. 119: 63-70.
Martinez, A., Grabar, T.B., Shanmugam, K.T., Yomano, L.P., York, S.W., Ingram, L.O. (2007) “Low salt medium for lactate and ethanol production by recombinant Escherichia coli” Biotechnol. Lett. 29:397-404.
Martinez-Morales, F., Borges, A.C., Martinez, A., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (1999) “Chromosomal integration of heterologous DNA in Escherichia coli with precise removal of markers and replicons used during construction” J Bacteriol. 181:7143-7148.
McKinlay, J.B., Zeikus, J.G., Vieille, C. (2005) “Insights into Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism in a chemically defined growth medium” Appl Environ Microbiol. 71(11):6651-6656.
McKinlay, J.B., Vieille, C. (2008) “13C-metabolic flux analysis of Actinobacillus succinogenes fermentative metabolism at different NaHCO3 and H2 concentrations” Metab. Eng. 10:55-68.
McKinlay, J.B., Vieille, C., Zeikus, J.G. (2007) “Prospects for a bio-based succinate industry” Appl Microbiol Biotechnol. 76(4):727-740.
Meynial-Salles, I., Dorotyn, S., Soucaille, P. (2007) “A new process for the continuous production of succinic acid from glucose at high yield, titer and productivity” Biotechnol Bioeng. 99(1):129-135.
Miller, J.H. (1992) A short course in bacterial genetics: A laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria, Cold Spring Harbor Press.
Millard, C.S., Chao, Y.P., Liao, J.C., Donnelly, M.I. (1996) “Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli” Appl. Environ. Microbiol. 62:1808-1810.
Morikawa, M., K. Izui, et al. (1980) “Regulation of Escherichia coli phosphoenolpyruvate carboxylase by multiple effectors in vivo. Estimation of the activities in the cells grown on various compounds” J Biochem (Tokyo) 87(2): 441-449.
Moniruzzaman, M. et al. (1997) “Isolation and molecular characterization of high-performance cellobiose-fermenting spontaneous mutants of ethanologenic Escherichia coli K011 containing the Klebsiella oxytoca casAB operon” Appl. Environ. Microbiol. 63:4633-4637.
Nilekani, S., Sivaraman, C. (1983) “Purification and properties of citrate lyase from Escherichia coli” Biochemistry 22(20);4657-63. 
Oh, M.K., Rohlin, L., Kao, K.C., Liao, J.C. (2002) “Global expression profiling of acetate-grown  Escherichia coli” J Biol Chem 277: 13175-13183.
Okino, S., Inui, M., Yukawa, H. (2005) “Production of organic acids by Corynebacterium glutanicum under oxygen deprivation” Appl Microbiol Biotechnol 68:475-480.
Posfai, G., Koob, M.D., Kirkpatrick, H.A., Blattner, F.C. (1997) “Versatile insertion plasmids for targeted genome manipulations in bacteria: Isolation, deletion, and rescue of the pathogenicity island LEE of the Escherichia coli O157:H7 genome” J. Bacteriol. 179:4426-4428.
Quentmeier, A., Holzenburg, A., Mayer, F., Antranikian, G. (1987) “Reevaluation of citrate lyase from Escherichia coli” Biochim Biophys Acta 913(1): 60-5.
Reed, J.L., Vo, T.D., Schilling, C.H., Palsson, B.O. (2003) “An expanded genome-scale model of Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM/GPR)” Genome Biol. 4(9):R54.
Reitzer, L. 2004. 6 July 2004, posting date. Chapter 3.6.1.3, Biosynthesis of Glutamate, Aspartate, Asparagine, L-Alanine, and D-Alanine. In A. Bock, R. Curtiss III, J. B. Kaper, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, K. E. Rudd, and C. L. Squires (ed.), EcoSal−Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. [Online.] http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, D.C.
Samuelov, N.S., Lamed, R., Lowe, S., Zeikus, J.G. (1991) “Influence of CO2-HCO3 levels and pH on growth, succinate production, and enzyme-activities of Anaerobiospirillum succiniproducens” Appl. Environ. Microbiol. 57: 3013-3019.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005a) “Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity” Metabolic Engineering 7:229-239.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2005b) “Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant” Biotechnol. Prog. 21: 358-365.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N., San, K.Y. (2006) “Batch culture characterization and metabolic flux analysis of succinate-producing Escherichia coli strains” Metabolic Engineering 8: 209-226.
Sanwal, B.D. and Smando, R. (1969a) “Malic enzyme of Escherichia coli: Possible mechanism for allosteric effects” J Biol Chem. 244(7):1824-1830.
Sanwal, B.D. and Smando, R. (1969b) “Malic enzyme of Escherichia coli: Diversity of the effectors controlling enzyme activity” J Biol Chem. 244(7):1817-1823.
Sanwal, B.D. (1970a) “Allosteric controls of amphibolic pathways in bacteria” Bacteriol. Rev. 34:20-39.
Sanwal, B.D. (1970b) “Regulatory characteristics of the diphosphopyridine nucleotide-specific malic enzyme of Escherichia coli” J Biol Chem. 245(5):1212-1216.
Sanwal, B.D. (1970c) “Regulatory mechanisms involving nicotinamide adenine nucleotide as allosteric effectors: A control of glucose 6-phosphate dehydrogenase” J Biol Chem 245(7):1625-1631.
Sawers, G., Bock, A. (1988) “Anaerobic regulation of pyruvate formate-lyase from Escherichia coli K-12” J. Bacteriology. 170:5330-5336.
Song, H., Lee, J.W., Choi, S., You, J.K., Hong, W.H., Lee, S.Y. (2007) “Effects of dissolved CO2 levels on the growth of Mannheimia succiniciproducens and succinic acid production” Biotechnol Bioeng. 98(6):1296-1304.
Storici, F., Coglievina, M., Bruschi, C.V. (1999) “A 2-μm DNA-based maker recycling system for multiple gene disruption in the yeast Saccharomyces cerevisiae” Yeast 15:271-283.
Stols, L., Donnelly, M.I. (1997) “Production of succinic acid through overexpression of NAD dependent malic enzyme in an Escherichia coli mutant” Appl. Environ. Microbiol. 63:2695-2701.
Thomason, L., Court, D.L., Bubunenko, M., Constantino, N., Wilson, H., Datta, S., Oppenheim, A. (2005) “Recombineering: Genetic Engineering in Bacteria Using Homologous Recombination”, sections 1.16.1-1.16.21. In F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Klingston, D. D. Moore, J. G. Deidman, J. A. Smith, and K. Struhl (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons Inc., New York.
Underwood, S.A., Buszko, M.L., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2004) “Lack of protective osmolytes limits final cell density and volumetric productivity of ethanologenic Escherichia coli KO11 during xylose fermentation” Appl. Environ. Microbiol. 70(5): 2734-40.
Underwood, S.A., Buszko, M.L., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2002) “Genetic changes to optimize carbon partitioning between ethanol and biosynthesis in ethanologenic Escherichia coli” Appl Environ Microbiol. 68(12): 6263-6272.
Unden, G. and Kleefeld, A. 30 July 2004, posting date. Chapter 3.4.5, C4-Dicarboxylate Degradation in Aerobic and Anaerobic Growth. In A. Bock, R. Curtiss III, J. B. Kaper, F. C. Neidhardt, T. Nystrom, K. E. Rudd, and C. L. Squires (ed.), EcoSal−Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. [Online.] http://www.ecosal.org. ASM Press, Washington, D.C.
van der Werf, M. J., M. V. Guettler, M. K. Jain, and J. G. Zeikus (1997) “Environmental and physiological factors affecting the succinate product ratio during carbohydrate fermentation by Actinobacillus sp . 130Z” Arch. Microbiol. 167:332-342.
Vemuri, G.N., Eiteman, M.A., Altman, E. (2002a) “Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of Escherichia coli.” Appl. Environ. Microbiol. 68:1715-1727. 
Vemuri, G.N., Eiteman, M.A., Altman, E. (2002b) “Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions” J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 28, 325-332.
Wang, Q., Chen, X., Yang, Y., Zhao, X. (2006) “Genome-scale in silico aided metabolic analysis and flux comparisons of Escherichia coli to improve succinate production” Appl Microbiol Biotechnol 73:887-894.
Wendisch, V.F., Bott, M., Eikmanns, B.J. (2006) “Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for biotechnological production of organic acids and amino acids” Curr Opin Microbiol 9:1-7. 
Wood, B.E., Yomano, L.P., York, S.W., Ingram, L.O. (2005) “Development of industrial medium required elimination of the 2,3-butanediol fermentation pathway to maintain ethanol yield in an ethanologenic strain of Klebsiella oxytoca” Biotechnol. Prog. 21:1366-1372.
Wright, J.A. and Sanwal, B.D. (1969) “Regulatory mechanisms involving nicotinamide adenine nucleotide as allosteric effectors: Control of phosphoenolpyruvate carboxykinase” J Biol Chem. 244(7):1838-1845.
Yun, N.R., San, K.Y., Bennett, G.N. (2005) “Enhancement of lactate and succinate formation in adhE or pta-ackA mutants of NADH dehydrogenase-deficient Escherichia coli” J. Appl. Microbiol. 99:1404-1412.
Zhang, X., Jantama, K., Moore, J.C., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2007) “Production of L-alanine by metabolically engineered Escherichia coli” Appl. Microbiol. Biotechnol. 77: 355-366.
Zhou, S., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2003) “Functional replacement of the Escherichia coli D-(-)-lactate dehydrogenase gene (ldhA) with the L-(+)-lactate dehydrogenase gene (ldhL) from Pediococcus acidilactici” Appl. Environ. Microbiol. 69:2237-2244.
Zhou, S., Grabar, T.B., Shanmugam, K.T., Ingram, L.O. (2006) “Betaine tripled the volumetric productivity of D-(-)-lactate by Escherichia coli strain SZ132 in mineral salts medium” Biotechnol. Lett. 28:671-676.
【図１Ａ】
0005546871.tif 000019
【図１Ｂ】
0005546871.tif 000020
【図２】
0005546871.tif 000021
【図３Ａ】
0005546871.tif 000022
【図３Ｂ】
0005546871.tif 000023
【図３Ｃ】
0005546871.tif 000024
【図４Ａ】
0005546871.tif 000025
【図４Ｂ】
0005546871.tif 000026
【図４Ｃ】
0005546871.tif 000027
【図４Ｄ】
0005546871.tif 000028
【図４Ｅ】
0005546871.tif 000029
【図４Ｆ】
0005546871.tif 000030
【図５】
0005546871.tif 000031
【図６】
0005546871.tif 000032
【図７Ａ】
0005546871.tif 000033
【図７Ｂ】
0005546871.tif 000034
【図７Ｃ】
0005546871.tif 000035
【図８】
0005546871.tif 000036
【図９】
0005546871.tif 000037
【図１０】
0005546871.tif 000038
【配列表】
0005546871000001.app