(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉで表される化合物、又は該化合物の溶媒和物、水和物、エステル若しくは医薬上許容される塩：
【化１】
0005404634.tif 000047
式中、
Ｒ1は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ2は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3である。
【請求項２】
Ｒ1がＦであり、
Ｒ3がＣＦ3である、請求項１に記載の化合物、又は該化合物の溶媒和物、水和物、エステル若しくは医薬上許容される塩。
【請求項３】
（Ｒ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、
（Ｓ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、
２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、
２−［４’−クロロ−５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−３’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、からなる群から選択される、請求項２に記載の化合物、又は該化合物の溶媒和物、水和物、エステル若しくは医薬上許容される塩。
【請求項４】
薬剤として使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
γ−セクレターゼを調節する薬剤を調製するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項６】
Ａβ４２の産生レベルの上昇を伴う疾患の治療用薬剤を調製するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項７】
アルツハイマー病の治療用薬剤を調製するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物を不活性の担体との混合物中に含む医薬組成物。
【請求項９】
薬剤の調製方法であって、
ａ）請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物を調製する工程と、
ｂ）前記化合物を含有する薬剤を製剤化する工程と、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００７年１０月１７日出願の米国仮特許出願第６０／９８０，５８７号の出願に対する優先権の利益を主張するものである。上述の関連する米国特許出願の完全な開示内容を本明細書に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｒ1〜Ｒ4の定義が下記に与えられるような、一般式Ｉを有する化合物、及び／又はその塩若しくはエステルに関する。
【０００３】
更に本発明は、アルツハイマー病の治療における前記化合物の使用、及びγ−セクレターゼ活性の調節における前記化合物の使用に関する。本願は、国際特許出願公開第ＷＯ２００６／０４５５５Ａ１号に開示される係属中の化合物群のサブセットに関するものである。
【背景技術】
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶、認知、行動安定性の喪失を特徴とする進行性の神経変性疾患である。ＡＤは６５歳以上の人口の６〜１０％、８５歳以上の人口では最大で５０％が発症する。ＡＤは痴呆の最大の原因であり、心血管疾患及び癌に続く３番目の死因である。ＡＤに対する有効な治療方法は現在のところ確立されていない。米国におけるＡＤに関連する全体の総費用は年間１０００億円を上回る。
【０００５】
ＡＤには単純な原因があるわけではなく、（１）年齢、（２）家族歴、及び（３）頭部外傷などの特定の危険因子が関係している。他の因子としては環境毒素及び低い教育水準などがある。具体的な大脳辺縁皮質及び大脳皮質の神経病理学的病変として、過剰リン酸化されたタウタンパク質からなる細胞内神経原線維変化、及びアミロイドβペプチドの線維状凝集体の細胞外沈着（アミロイドプラーク）がある。アミロイドプラークの主成分は長さの異なるアミロイドベータ（Ａ−ベータ、Ａベータ又はＡβ）ペプチドである。その変異体の１つであるＡβ１−４２ペプチド（Ａベータ４２）は、アミロイド形成の主要な原因物質であると考えられている。別の変異体は、Ａβ１−４０ペプチド（Ａベータ４０）である。アミロイドベータは前駆体タンパク質であるベータアミロイド前駆体タンパク質（ベータＡＰＰ又はＡＰＰ）のタンパク質分解産物である。
【０００６】
ＡＤの家族性の早発性常染色体優性型は、β−アミロイド前駆体タンパク質（β−ＡＰＰ又はＡＰＰ）及びプレセニリンタンパク質１及び２におけるミスセンス変異との関連が示されている。一部の患者において、ＡＤの遅発型がアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）遺伝子の特定の対立遺伝子と関連していることが示されており、より最近になってアルファ２−マクログロブリンの突然変異が見出され、ＡＤ患者群の少なくとも３０％と関連している可能性が示唆されている。こうした異質性にも関わらず、ＡＤのすべての型は同様の病理学的所見を示す。遺伝子解析により、ＡＤに対する論理的な治療的アプローチの最もよい手掛かりが与えられている。これまでに発見されている突然変異はすべて、Ａベータペプチド（Ａβ）として知られるアミロイド形成性ペプチド、具体的にはＡβ４２の質的又は量的産生に影響するものであり、ＡＤの「アミロイドカスケード仮説」を強力に支持するものである（タンシ及びバートラム  ２００５年  セル１２０、５４５（Tanzi and Bertram, 2005,Cell 120,545））。Ａβペプチド生成とＡＤの病理が関連している可能性が高いことは、Ａβ産生の機構のより深い理解の必要性を強調するものであり、Ａβ濃度を調節することによる治療的アプローチを強力に裏付けるものである。
【０００７】
Ａβペプチドの放出は、それぞれＡβペプチドのＮ末端（Ｍｅｔ−Ａｓｐ結合）及びＣ末端（３７〜４２番目の残基）を開裂する、β−及びγ−セクレターゼと呼ばれる少なくとも２種類のタンパク質分解活性によって調節されている。分泌経路では、β−セクレターゼによる開裂が最初に行われることを示す証拠があり、これによりｓ−ＡＰＰβ（ｓβ）が分泌され、１１ｋＤａの膜結合カルボキシ末端フラグメント（ＣＴＦ）が保持される。ＣＴＦはγ−セクレターゼによる開裂によってＡβペプチドを生ずるものと考えれられる。より長いアイソフォームであるＡβ４２の量は、特定のタンパク質（プレセニリン）に特定の突然変異を有する患者において選択的に増大しており、これらの突然変異が早発型家族性アルツハイマー病と関連していることが示されている。したがって多くの研究者によってＡβ４２がアルツハイマー病の原因の主たるものであると考えられている。
【０００８】
γ−セクレターゼ活性は、単一の特定のタンパク質に帰することができるものではなく、実際には異なるタンパク質のアセンブリによるものであることが現在では明らかとなっている。
【０００９】
γ−セクレターゼ活性は、プレセニリン（ＰＳ）へテロ２量体、ニカストリン、ａｐｈ−１及びｐｅｎ−２の少なくとも４つの成分を含む多タンパク質複合体によるものである。プレセニリン（ＰＳ）へテロ２量体は、前駆体タンパク質の細胞内タンパク質分解によって生ずるアミノ末端のＰＳフラグメントと、カルボキシ末端のＰＳフラグメントからなる。触媒部位の２個のアスパラギン酸はこのヘテロ２量体の境界面にある。ニカストリンがγ−セクレターゼ基質の受容体として機能することが最近になって示唆されている。γ−セクレターゼの他の要素の機能は分かっていないが、活性を示すにはこれらはすべて必要である（Ｓｔｅｉｎｅｒ，  ２００４．  Ｃｕｒｒ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １（３）：  １７５−１８１）。
【００１０】
第２の開裂段階の分子機構は現在まで明らかとなっていないが、γ−セクレターゼ複合体はアルツハイマー病の治療用の化合物の探索における主要なターゲットの１つとなっている。
【００１１】
触媒部位を直接ターゲティングすることから、γ−セクレターゼ活性の基質特異的な阻害物質及び調節物質を開発することに至る、アルツハイマー病におけるγ−セクレターゼをターゲティングするための様々な手法が提唱されている（Ｍａｒｊａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ：  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  １，  １−６）。したがって、セクレターゼを標的とする各種の化合物が述べられている（（Ｌａｒｎｅｒ，２００４アルツハイマー病の治療ターゲットとしてのセクレターゼ（Secretases as therapeutics targets in Alzheimer's disease）：ｐａｔｅｎｔｓ  ２０００  −  ２００４．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ  １４，１４０３〜１４２０）。
【００１２】
実際、この知見は、γ−セクレターゼに対する特定のＮＳＡＩＤの作用が示された生化学的研究によって最近になって支持されている（Ｗｅｇｇｅｎ等（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，６８６０，２１２並びに国際特許出願公開第ＷＯ０１／７８７２１号、及び米国特許出願第２００２／０１２８３１９号；Ｍｏｒｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８３，１００９；Ｅｒｉｋｓｅｎ（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１２，４４０）。ＡＤを防止又は治療する上でのＮＳＡＩＤの使用における潜在的な制約は、不要な副作用を生じうるＮＳＡＩＤのＣｏｘ酵素に対する阻害活性、及びＮＳＡＩＤのＣＮＳへの低い浸透性である（Ｐｅｒｅｔｔｏ等，２００５年，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８，５７０５〜５７２０）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、γ−セクレターゼ活性を調節することによって、アルツハイマー病の治療の新たな道筋を開く新規な化合物が強く求められている。
【００１４】
本発明の目的はこうした化合物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、式Ｉに示される化合物：
【００１６】
【化１】
0005404634.tif 000002
式中、
Ｒ1は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ2は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
並びに、溶媒和物、水和物、エステル、及びそれらの医薬上許容される塩に関する。
【００１７】
本発明の化合物の亜属は、効能及び生体内での有効性が予想外に向上している。詳細には、効能及び有効性の向上は、Ｒ1及びＲ2がＦ、Ｃｌ又はＣＦ3などの電子吸引基であり、カルボキシレート基のα位の炭素がｓｅｃ−ブチルで置換されている場合に見られる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、式Ｉに示される化合物：
【００１９】
【化２】
0005404634.tif 000003
式中、
Ｒ1は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ2は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ3は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
並びに、溶媒和物、水和物、エステル、及びそれらの医薬上許容される塩に関する。
【００２０】
本発明の一実施形態では、
Ｒ1は、Ｆであり、
Ｒ2は、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
Ｒ3は、ＣＦ3であり、
Ｒ4は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、又はＣＦ3であり、
並びに、溶媒和物、水和物、エステル、及びそれらの医薬上許容される塩である。
【００２１】
本発明の別の実施形態は、
（Ｒ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、
（Ｓ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、
２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、
２−［４’−クロロ−５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−３’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸、
からなる群から選択される、化合物、並びに、溶媒和物、水和物、エステル、及びそれらの医薬上許容される塩である。
【００２２】
当業者であれば、式Ｉの化合物は１以上の不斉炭素原子をその構造中に有しうる点は認識されるであろう。本発明はその範囲内に、化合物の単一のエナンチオマー、ラセミ混合物、及びエナンチオマー過剰が存在するエナンチオマーの混合物を含むものとする。
【００２３】
本発明の化合物、及び／又はその塩若しくはエステルの一部のものは、異なる光学異性体として存在する。これらの形態はすべて本発明の対象である。
【００２４】
本明細書に含まれる本発明に基づく化合物の例示的な塩について下記に述べる。下記に述べる異なる塩の一覧は、完全なもの及び限定することを意図したものではない。
【００２５】
１以上の酸性基を有する本発明に基づく化合物は、例えば化合物のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、又はアンモニウム塩として、本発明に基づいて使用することができる。これらの塩のより正確な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、又は、アンモニア若しくはエチルアミン、エタノールアミン、トリエタノールアミン若しくはアミノ酸などの有機アミン類との塩が挙げられる。
【００２６】
「医薬上許容される」なる用語は、ＥＭＥＡ（欧州）及び／又はＦＤＡ（米国）などの監督官庁、及び／又は他の任意の国内監督官庁によって動物、好ましくはヒトにおける使用が認可されていることを意味する。
【００２７】
本発明に基づく化合物のそれぞれの塩は、例えば溶媒又は分散媒中でこれらの塩を有機又は無機塩基と接触させる、あるいは他の塩とカチオン交換するなどの当業者には周知の従来の方法によって得ることができる。
【００２８】
更に、本発明は、生理学的適合性が低いことにより医薬品での使用には直接適していないが、例えば化学反応の中間体として、若しくは医薬上許容される塩の調製に使用することができるか、又は、任意の適当なインビトロアッセイなどの任意の適当な方法によって本発明に基づく化合物のγ−セクレターゼ調節活性を研究するのに適した、本発明に基づく化合物のすべての塩を含むものである。
【００２９】
本発明は更に、本発明に基づく化合物のすべての溶媒和物を含む。
【００３０】
本発明は更に、生理学的に許容される開裂可能な基を有し、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて本発明に基づく化合物に代謝される、本発明に基づく化合物の誘導体／プロドラッグ（それらの塩を含む）を含む。
【００３１】
本発明は更に、本発明に基づく化合物の代謝産物を含む。
【００３２】
「代謝産物」なる用語は、細胞又は生物、好ましくは哺乳動物によって本発明に基づく化合物の任意のものから誘導されるすべての分子を指す。
【００３３】
好ましくは、「代謝産物」なる用語は、生理学的条件下で任意のこうした細胞又は生物に存在するあらゆる分子とは異なる分子に関連する。
【００３４】
本発明に基づく化合物の代謝産物の構造は、各種の適当な方法を用いることにより当業者には明らかとなろう。
【００３５】
一般式（Ｉ）の化合物は、文献に発表されている方法又はこれに類する方法にしたがって調製することができる。
【００３６】
個々の場合の状況に応じて、一般式（Ｉ）の化合物を合成する間の副反応を防止する目的で、保護基を導入することによって官能基を一時的にブロックし、合成の後の段階で官能基を脱保護するか、あるいは、前駆体基の形で官能基を導入し、後の段階で前駆体基を所望の官能基に転換することが必要又は有利となる場合がある。好適な合成法、保護基、及び前駆体基は当業者には周知のものである。
【００３７】
必要に応じ、式（Ｉ）の化合物は、例えば再結晶化又はクロマトグラフィーによる従来の精製法によって精製することができる。式（Ｉ）の化合物を調製するための開始物質は市販のものを用いるか、又は文献の方法に従うか若しくはこれに類する方法によって調整することができる。
【００３８】
これらは、当業者には周知の幾つかの方法による本発明に基づく他の化合物の調製の基礎をなし得るものである。
【００３９】
本発明は、本発明の化合物の薬剤としての使用にも関する。化合物は上記に定義したものであり、更に薬剤に関しては本発明の使用に関して下記に述べる、例えば製剤、用途、及び組み合わせなどの実施形態もまた本発明のこの態様に該当する。
【００４０】
詳細には、本発明に基づく化合物はアルツハイマー病の治療に適している。
【００４１】
前記使用に関する詳細については更に後述する。
【００４２】
本化合物はγ−セクレターゼ活性を調節するために使用することができる。
【００４３】
本明細書で用いる「γ−セクレターゼ活性の調節」なる用語は、γ−セクレターゼ複合体によるＡＰＰのプロセシングに対する作用のことを指す。好ましくは、この用語は、ＡＰＰの全体のプロセシング速度が本化合物を用いない場合とほぼ同じに保たれるが、プロセシングされた産物の相対量が変化する作用、より好ましくは、生成されるＡβ４２ペプチドの量が減少するように変化するような作用のことを指す。例えば、異なるＡベータ種（例、Ａベータ４２の代わりにＡベータ３８又はより短いアミノ酸配列を有する他のＡベータ種）が生成するか、あるいは、生成物の相対量が異なる（例、Ａベータ４２に対するＡベータ４０の比が変化、好ましくは大きくなる）。
【００４４】
γ−セクレターゼ活性は、例えば生成するＡベータペプチド種の濃度、最も重要なものとしてＡベータ４２の濃度（下記実施例の項を参照）を求めることで、例えば、ＡＰＰプロセシングを求めることによって測定することができる。
【００４５】
γ−セクレターゼ複合体はノッチ（Notch）タンパク質のプロセシングにも関与していることがこれまでに示されている。ノッチは、発生過程において重要な役割を担うシグナル伝達タンパク質である（Ｓｃｈｗｅｉｓｇｕｔｈ  Ｆ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１４，Ｒ１２９にまとめられている）。
【００４６】
治療法においてγ−セクレターゼ活性を調節するための前記化合物の使用に関し、想定される望ましくない副作用を防止するにはγ−セクレターゼ活性のノッチプロセシング活性を阻害しないことが特に有利であると考えられる。
【００４７】
したがって、γ−セクレターゼ複合体のノッチプロセシング活性に作用を及ぼさない化合物が好ましい。
【００４８】
本発明の意味の範囲内では、「ノッチプロセシング活性への作用」とは、特定の因子によるノッチプロセシング活性の阻害又は活性化の両者を含む。
【００４９】
ある化合物は、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，２０：６９１３に述べられる対応するアッセイにおいて３０μＭの濃度における前記因子が２０未満、好ましくは１０未満、より好ましくは５未満、最も好ましくは２未満である場合にノッチプロセシング活性に対する作用を有さないものと定義される。
【００５０】
このようなγ−セクレターゼの調節は例えば哺乳動物などの動物において行うことができる。哺乳動物の例としては、マウス、ラット、モルモット、サル、イヌ、ネコがある。この調節はヒトで行うこともできる。本発明の特定の実施形態では、前記調節はインビトロ又は細胞培養中で行われる。当業者には周知であるように、複数のインビトロ及び細胞培養アッセイが利用可能である。
【００５１】
特定の細胞株又は形質転換動物によるＣ末端ＡＰＰフラグメントの産生をウエスタンブロット分析によって測定するうえで有用なアッセイの例としては、これに限定されるものではないがＹａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，５３３〜５３７に述べられるようなものがある。
【００５２】
インビトロでのγ−セクレターゼアッセイの一例が国際特許出願公開第ＷＯ０３／００８６３５号に述べられている。このアッセイでは、適当なペプチド基質にγ−セクレターゼ調製物を接触させ、基質を開裂する能力を測定する。
【００５３】
γ−セクレターゼによる開裂の異なる産物（Ａβペプチド）の濃度を当業者には周知の様々な方法によって求めることが可能である。こうした方法の例としては、質量分析又は抗体による検出によるペプチドの判定法が挙げられる。
【００５４】
培養細胞培地又は生物学的液体中の可溶性Ａβペプチドのプロファイルの特徴付けに有用なアッセイの例としては、これに限定されるものではないが、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，３１８９４−３１９０２に述べられるものがある。このアッセイでは、特定の抗体によるＡベータペプチドの免疫沈降と、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析法によるペプチド種の検出及び定量化の組み合わせを用いる。
【００５５】
ＥＬＩＳＡによってＡベータ４０及びＡベータ４２ペプチドの産生を測定するうえで有用なアッセイの例としては、これに限定されるものではないが、Ｖａｓｓａｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６，７３５−７４１に述べられるものがある。更なる情報が例えば、Ｎ．Ｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２２９０８，ａｎｄ  Ｍ．Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．６，２９１に開示されている。好適な抗体は例えばザ・ジェネティクス・カンパニー社（The Genetics Company, Inc.）（スイス）から販売されている。抗体を用いたキットがイノジェネティクス社（Innogenetics）（ベルギー）からも販売されている。
【００５６】
こうしたアッセイで使用できる細胞としては、γ−セクレターゼ複合体を内因性に発現する細胞、及びγ−セクレターゼ複合体の相互作用因子の一部またはすべてのものを一過性又は安定的に発現するトランスフェクト細胞が挙げられる。こうしたアッセイに適した多くの入手可能な細胞株が当業者に知られている。神経細胞及びグリア細胞由来の細胞及び細胞株が特に好適である。更に、脳の細胞及び組織、並びに脳のホモジネート及び膜調製物を使用することもできる（Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７，  １６４６５〜１６４７１）。
【００５７】
こうしたアッセイは、例えば、異なる実験条件及び構成における本発明に基づく化合物の作用を調べる目的で行うことができる。
【００５８】
更に、こうしたアッセイはγ−セクレターゼ複合体についての機能的研究の一部として行うこともできる。
【００５９】
例えば、動物、好ましくは哺乳動物、好ましくはヒトのγ−セクレターゼ複合体の１以上の相互作用因子（野生型、又は特定の突然変異及び／又は改変を有するもの）を特定の細胞株で発現させ、本発明に基づく化合物の作用を調べることができる。
【００６０】
用いる相互作用因子の突然変異型は、特定の動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおいてこれまでに述べられているものであってもよく、これらの動物においてこれまでに述べられていないものであってもよい。
【００６１】
γ−セクレターゼの相互作用因子の改変には、相互作用因子のあらゆる生理学的改変、及び生物学的システムにおけるタンパク質の改変としてこれまでに述べられている他の改変の両方が含まれる。
【００６２】
こうした改変の例としてはこれらに限定されるものではないが、グリコシル化、リン酸化、プレニル化、ミリスチル化、及びファルネシル化が挙げられる。
【００６３】
更に、本発明に基づく化合物はγ−セクレターゼ活性を調節するための薬剤の調製に使用することができる。
【００６４】
本発明は更に、γ−セクレターゼ活性を調節するための薬剤の調製における前記化合物の使用に関する。
【００６５】
γ−セクレターゼの活性は異なる方法で調節することが可能であり、これにより異なるＡβペプチドが異なるプロファイルで得られる。
【００６６】
Ａβ４２ペプチドの相対量が減少するようにγ−セクレターゼ活性を調節するような化合物の使用が好ましい。
【００６７】
それぞれの用量、投与経路、処方などについて下記に更に開示する。
【００６８】
本発明は、Ａβ４２産生レベルの上昇に伴う疾患の治療における本発明に基づく化合物の使用に更に関する。Ａベータ産生レベルの上昇及び脳への沈着に伴う疾患は、一般的にはアルツハイマー病（ＡＤ）、脳アミロイド血管症、多発脳梗塞性認知症、ボクサー認知症又はダウン症候群であり、好ましくはＡＤである。
【００６９】
本明細書で用いる「治療」なる用語は、必ずしもすべての症状の完全な消失を示すものではないが疾患の進行を遅延、妨害、阻止、又は停止させうるすべてのプロセスを指すものである。
【００７０】
本明細書で用いる「Ａβ４２産生レベルの上昇」なる用語は、ＡＰＰのプロセシングの全体的な増大によりＡβ４２ペプチド産生の速度が増大する状態を指し、好ましくは、野生型ＡＰＰ及び非病原性の状況と比較してＡＰＰのプロセシングプロファイルの改変によってＡβ４２ペプチド産生の速度が増大する状態を指す。
【００７１】
上記に概略を述べたように、こうしたＡβ４２レベルの上昇は、アルツハイマー病を発症又は罹患している患者の特徴である。
【００７２】
本発明の化合物又は化合物の一部の利点の１つは、ＣＮＳへの浸透性が高いことにある。
【００７３】
更に、本発明は、本発明に基づく化合物を不活性担体との混合物中に含む医薬組成物に関する。
【００７４】
好ましい一実施形態では、本発明は、本発明に基づく化合物を不活性担体との混合物中に含む医薬組成物であって、前記不活性担体が医薬用担体である医薬組成物に関する。
【００７５】
「担体」なる用語は、本化合物が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、又は溶媒を指す。こうした医薬用担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含むがこれらに限定されない、石油、動物油、植物油又は合成油由来の油及び水などの滅菌液であってよい。医薬組成物が経口投与される場合には水が好ましい担体である。医薬組成物が静脈内投与される場合には生理食塩水及びＤ−グルコース水溶液が好ましい担体である。生理食塩水及びＤ−グルコース水溶液及びグリセリン溶液が、注射溶液用の液体担体として好ましく用いられる。好適な医薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じ、組成物は少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を更に含んでもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形を取りうる。組成物は、従来の結合剤及びトリグリセリドなどの担体とともに坐剤として処方することもできる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含みうる。好適な医薬用担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「レミントンの医薬品科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences）に述べられている。こうした組成物は、治療上の有効量の本化合物を、好ましくは精製された形態で、適量の担体とともに含むことによって患者に適切に投与される形態を与えるものである。その配合は、投与方法に適したものである必要がある。
【００７６】
場合に応じて他の医薬的に活性な化合物と組み合わされる本発明に基づく化合物及び医薬上許容されるその塩は、アルツハイマー病又はその症状を治療又は防止する上で適している。こうした更なる化合物としては、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（例、ドネペジル、タクリン、ガランタミン、リバスチグミン）、ＮＭＤＡアンタゴニスト（例、メマンチン）、ＰＤＥ４阻害剤（例、アリフロ）などの認知能力向上薬、又はアルツハイマー病の治療又は防止に適した当業者には周知の他の任意の薬剤が挙げられる。こうした化合物には、スタチン（例、シンバスタチン）などのコレステロール低下薬も含まれる。これらの化合物は、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに、それ自体で薬剤として、互いの混合物として、又は医薬製剤の形態で投与することが可能である。
【００７７】
例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの封入などの各種の送達システムが知られており、アルツハイマー病の治療又はγ−セクレターゼ活性の調節のために本発明の化合物を投与する目的で使用することができる。
【００７８】
医薬化合物が中枢神経系、好ましくは脳に直接送達されない場合には、医薬化合物が血液脳関門を通過できるように投与方法を選択及び／又は改変することが有利である。
【００７９】
導入方法としてはこれらに限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が挙げられる。
【００８０】
本化合物は、例えば輸液、ボーラス注入、上皮又は皮膚粘膜ライニングを通じた吸収などの任意の便宜よい経路によって投与することができ、他の生物学的に活性な物質と共に投与することができる。
【００８１】
投与は全身性又は局所的であってよい。更に、本発明の医薬組成物は、脳室内注射及びくも膜下腔内注射などの任意の適当な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合がある。脳室内注射は、例えばオンマイヤリザーバなどのリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易に行うことができる。例えば、吸入器又はネブライザー、及びエアロゾル化剤の配合による経肺投与を用いることもできる。
【００８２】
別の実施形態では、化合物を小胞、特にリポソームで投与することができる（Ｌａｎｇｅｒ  （１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，  １５２７）。
【００８３】
更なる別の実施形態では、化合物を放出制御システムによって投与することができる。一実施形態ではポンプを使用することができる（Ｓｅｆｔｏｎ（１９８７）ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４，  ２０１；  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８，  ５０７；  Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１，  ５７４）。別の実施形態では高分子材料を使用することができる（Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ（１９８３）Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｒｅｖ．  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２３，  ６１；  Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８，１９０；  Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２５，３５１；  Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７１，８５８）。更に別の実施形態では、放出制御システムを治療ターゲット、すなわち脳の近傍に配置することによって全身投与用の用量の何分の１かの量のみを要するだけとなる（例、Ｇｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｉｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，Ｖｏｌ．２，１１５）。他の放出制御システムがＬａｎｇｅｒ（１９９０，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，  １５２７）による概説において考察されている。
【００８４】
適切な投与方法を選択するため、当業者であれば他の公知の抗アルツハイマー薬に対して選択されている投与経路も考慮されよう。
【００８５】
例えば、アリセプト／ドネペジル及びコグネクス／タクリン（いずれもアセチルコリンエステラーゼ阻害剤）は経口で服用されており、アクスラ／メマンチン（Axura/Memantine）（ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト）はいずれも錠剤／液剤及びＩＶ溶液として発売されている。
【００８６】
更に、当業者であれば、臨床治験及びアルツハイマー病に対するその効果を調べた他の研究におけるＮＳＡＩＤファミリーのメンバーの投与経路に関して入手可能なデータが考慮されるであろう。
【００８７】
適切な用量を選択するため、当業者であれば、前臨床及び／又は臨床研究において毒性のないことが示され、かつ事前に与えられた値に基づいた用量、あるいはこれらとは異なりうる用量を選択するであろう。
【００８８】
製剤において使用される正確な用量は、投与経路、及び病気又は疾患の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に基づいて決定されなければならない。しかしながら、静脈内投与に適した用量の範囲は一般的に体重１ｋｇ当たり活性化合物が約２０〜５００μｇである。鼻腔内投与に適した用量の範囲は一般的に約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。
【００８９】
動物モデルの一例として、２重突然変異ＫＭ６７０／６７１ＮＬを有するＡＰＰ６９５型を有する形質転換マウス系統「Ｔｇ２５７６」がある。参考として、米国特許第５８７７３９９号、及びＨｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４，９９、更に  Ｋａｗａｒａｂａｙａｈｓｉ  Ｔ（２００１）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１，３７２；Ｆｒａｕｔｓｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｍ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，３０７；Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｎｅｕｒｏｌ．５６，９６５；Ｌｅｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ２４，６４５を参照されたい。
【００９０】
複数の研究からの相当のデータが当業者に利用可能であり、当業者が選択された治療レジメンに対する適切な用量を選択するうえで有益である。
【００９１】
γ−セクレターゼ活性に対する分子の作用について述べた多くの研究が発表されている。こうした研究の例としては以下のものがある。Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ  ２２，９８３；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０，５７０９；Ｗｅｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，２１２；Ｅｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１２，４４０；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２３，７５０４。
【００９２】
一般的な合成法の説明
以下の一般的説明はあくまで説明を目的としたものであって決して発明を限定するためのものではない。
【００９３】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、及びＲ4が式Ｉに定義されるような式Ｉの化合物は、室温で数時間、水、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）及びメタノールなどの適当な溶媒混合物中でＮａＯＨと反応させるなどの標準的な酸性又は塩基性の加水分解条件下でエステルＩＩの加水分解によって得ることができる。
【００９４】
【化３】
0005404634.tif 000004
【００９５】
アルキルがメチル及びエチルを含む化合物ＩＩは、一般的なベンジル化条件下、例えば、２５〜１２０℃の温度範囲で炭酸カリウム又は炭酸セシウムなどの塩基の存在下、ＤＭＦ又はＴＨＦ中で、臭化ベンジル、塩化ベンジル、ベンジルトシラート、又はベンジルメシラートによる化合物ＩＩＩのアルキル化によって得ることができる。化合物ＩＩは、光延条件下、例えばカルボン酸ジエチル及びトリフェニルホスフィンの存在下、ＴＨＦ又はトルエン中で、化合物ＩＩＩとベンジルアルコールとの反応によっても得られる。
【００９６】
【化４】
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【００９７】
化合物ＩＩＩは、Ｐｄ−Ｃの存在下、例えばメタノール（ＭｅＯＨ）又はエタノール（ＥｔＯＨ）などのアルコール中で水素化することによって化合物ＩＶを脱ベンジル化することによって調製することができる。脱ベンジル化は、ＤＣＭ中、ＢＢｒ3、ＤＭＳＯ中、ＮａＣＮ／１２０〜２００℃、又はＤＭＦ中、ＬｉＣＮ／１２０〜２００℃などの他の条件で行うこともできる。
【００９８】
【化５】
0005404634.tif 000006
【００９９】
化合物ＩＶは、臭化ｓｅｃ−ブチル又は臭化ｓｅｃ−ブテニルにより化合物Ｖをアルキル化することによって調製することができる。化合物Ｖを、ＴＨＦ又は別の非プロトン性溶媒中、例えばビス（トリスメチルシリル）リチウムアミド、ビス（トリスメチルシリル）ナトリウムアミド、又はリチウムジイロプロピルアミドなどの塩基により−７８℃で処理した後、臭化ｓｅｃ−ブチル又は臭化ｓｅｃ−ブテニルを加えることによってアルキル化された化合物ＩＶが得られる。
【０１００】
【化６】
0005404634.tif 000007
【０１０１】
化合物Ｖは、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4の存在下、炭酸ナトリウム水溶液をＤＭＥに加える鈴木条件下でアリールボロン酸とのカップリング反応によって化合物ＶＩから調製することができる。
【０１０２】
【化７】
0005404634.tif 000008
【０１０３】
中間化合物ＶＩは、化合物ＶＩＩを、１当量のピリジンの存在下、０℃で無水トリフルオロメタンスルホン酸とＤＣＭ中で反応させることによって調製することができる。
【０１０４】
【化８】
0005404634.tif 000009
【０１０５】
中間フェノール性エステルＶＩＩは、化合物ＶＩＩＩのモノ脱ベンジル化によって調製することができる。化合物ＶＩＩＩの選択的モノ脱ベンジル化は、Ｐａｒｒシェーカー中で水素雰囲気（４１３．７  ｋＰａ  （＜６０ｐｓｉ））下、Ｐｄ−Ｃ触媒の存在下、１．１当量の例えば水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基により、エタノール又はメタノール溶液中で処理することによって行うことができる。この反応を１当量の水素が消費されるまで進行させる。
【０１０６】
【化９】
0005404634.tif 000010
【０１０７】
中間体ＶＩＩＩは、３，５−ジヒドロキシフェニル酢酸メチルエステル（市販されている）を、室温でＤＭＦ中、臭化ベンジル及び炭酸カリウムと反応させることによって容易に調製することができる。
【０１０８】
化合物Ｉは、カルボキシル基のα位にキラル中心を有し、２つのエナンチオマーの一方として存在しうる（又はエナンチオマー過剰が存在するかあるいはしないエナンチオマーの混合物として）。エナンチオマーＩａ（Ｒエナンチオマー）及びＩｂ（Ｓエナンチオマー）を示す。純粋なエナンチオマーＩａ及びＩｂはキラルカラムを用いたキラル分離によって得られる。エナンチオマーＩａとＩｂとは、分別再結晶によってキラルアミン塩を形成する分割法によって分離することもできる。エナンチオマーＩａ及びＩｂは、例えば水性ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ｔ−ブチル−エチルエーテル、又はトリトンＸ−１００水溶液などの水性有機溶媒中で、例えば、ＡｍａｎｏＡｋ、ＡｍａｎｏリパーゼＰＳ、ＡｍａｎｏリパーゼＡ、ＡｍａｎｏリパーゼＭ、ＡｍａｎｏリパーゼＦ−１５、ＡｍａｎｏリパーゼＧ（バイオカタリティックス社（Biocatalytics Inc））を用いて、対応するエステルのラセミ体を反応速度論的に分割することによっても得られる。
【０１０９】
化合物Ｉの両方のエナンチオマーを、不斉合成によって調製することができる。化合物Ｉａ及びＩｂは、水性ＴＨＦ中、過酸化水素の存在下で水酸化リチウムによってそれぞれ化合物ＩＸａ及びＩＸｂからキラル補助基を除去することによって得ることができる。
【０１１０】
【化１０】
0005404634.tif 000011
【０１１１】
化合物ＩＸａ及びＩＸｂは、一般的な塩基性条件下、例えば２５〜１２０℃の温度範囲で例えば炭酸カリウム又は炭酸セシウムなどの塩基の存在下、ＤＭＦ又はＴＨＦ中で、臭化ベンジル、塩化ベンジル、ベンジルトシラート、又はベンジルメシラートと化合物Ｘａ及びＸｂをカップリングすることによって得ることができる。化合物ＩＸａ及びＩＸｂは、光延条件下、例えばアゾジカルボン酸ジエチル及びトリフェニルホスフィンの存在下、ＴＨＦ又はトルエン中で、化合物Ｘａ及びＸｂをベンジルアルコールとカップリング反応させることによっても得られる。
【０１１２】
【化１１】
0005404634.tif 000012
【０１１３】
化合物Ｘａ及びＸｂは、Ｐｄ−Ｃの存在下、例えばＭｅＯＨ又はＥｔＯＨなどのアルコール溶媒中での水素化により化合物ＸＩａ及びＸＩｂをそれぞれ脱ベンジル化することによって調製することができる。
【０１１４】
【化１２】
0005404634.tif 000013
【０１１５】
化合物ＸＩａ及びＸＩｂは、臭化ｓｅｃ−ブチル又は臭化ｓｅｃ−ブテニルで化合物ＸＩＩａ及びＸＩＩｂをそれぞれアルキル化することによって調製することができる。化合物ＸＩＩａ及びＸＩＩｂを、ＴＨＦ又は別の非プロトン性溶媒中、例えばビス（トリスメチルシリル）リチウムアミド、ビス（トリスメチルシリル）ナトリウムアミド、又はリチウムジイロプロピルアミドなどの塩基により−７８℃で処理した後、臭化ｓｅｃ−ブチル又は臭化ｓｅｃ−ブテニルなどの求電子物質を加えることによってアルキル化された化合物ＸＩａ及びＸＩｂがそれぞれ得られる。
【０１１６】
【化１３】
0005404634.tif 000014
【０１１７】
化合物ＸＩＩａ及びＸＩＩｂは、エバンス法によって、４−ベンジル−オキサゾリジン−オンのＲ異性体ＸＩＶａ、又は４−ベンジル−オキサゾリジン−オンのＳ異性体ＸＩＶｂとカップリングすることによって共通の中間体ＸＩＩＩから調製することができる。中間体ＸＩＩＩは、例えばトリエチルアミン又はＮ−メチルモルフォリンなどの塩基の存在下、ＴＨＦ中で塩化ピバロイル、塩化オキザリル、又はクロロギ酸イソプロピルと反応させて、混合無水物又は酸塩化物とした後、これをＸＩＶａ又はＸＩＶｂのリチウム塩とＴＨＦ中で反応させる。Ａ．Ｇ．マイヤーズ（Myers）条件により、例えば偽エフェドリンなどの他のキラル補助基を不斉合成に使用することもできる（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６，９３６１−９３６２）。偽エフェドリンのエナンチオマーの一方をカルボン酸塩化物又は無水物で処理することによりアミド誘導体ＸＶが得られる。このアミドを塩化リチウムの存在下で例えばリチウムジイソプロピルアミドなどの強塩基で処理した後、アルキル化剤を加えることによって、対応するアルキル化生成物が得られる。次いでキラル補助基を酸加水分解で除去することによってキラルな標的化合物が得られる。
【０１１８】
【化１４】
0005404634.tif 000015
【０１１９】
中間化合物ＸＩＩＩは、例えば水酸化リチウム又は水酸化ナトリウムの水性メタノール溶液などの塩基の水性アルコール溶液で化合物Ｖをエステル加水分解することによて得ることができる。
【０１２０】
合成法
特に断らないかぎり、反応はすべて不活性雰囲気中で行った。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒ  ｄｐｘ４００によって得た。ＬＣＭＳは、Ａ法についてＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ−Ｃ１８、４．６×７５ｍｍ、３．５ミクロンのカラムを使用し、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００で行った。カラム流量を１ｍｌ／分とし、溶媒として水及びアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）を１０μｌの注入体積で使用した。波長は２５４及び２１０ｎｍとした。キラルカラムによってキラル純度分析を行った。
【０１２１】
【表１】
0005404634.tif 000016
【実施例】
【０１２２】
（実施例１）
（Ｒ）２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
【０１２３】
【化１５】
0005404634.tif 000017
【０１２４】
ラセミ体合成及びキラル分離
ａ）  （３，５−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−酢酸メチルエステル
【０１２５】
【化１６】
0005404634.tif 000018
【０１２６】
（３，５−ジヒドロキシ−フェニル）−酢酸メチルエステル（アルドリッチ社（Aldrich）、７０ｇ、０．３８５ｍｏｌ）、臭化ベンジル（１３７ｍＬ、１．１６ｍｏｌ）、炭酸カリウム（１６０ｇ、１．１６ｍｏｌ）、及びＤＭＦ（１．５Ｌ）の混合物をＮ2下、室温で一晩、機械的に攪拌した。得られた反応混合物を攪拌しながら１．５Ｌの氷水混合物中に注いだ。濾過により沈殿物を得て、ヘプタンで連続して洗浄して臭化ベンジルを除去することによって標題化合物（１２３．７ｇ）を褐色固体として得た。これを風乾して次の反応で用いた。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ３．６０（ｓ，２Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ），５．０５（ｓ，４Ｈ），６．６０（ｓ，３Ｈ），７．３５−７．５０（ｍ，１０Ｈ）；Ｃ２３Ｈ２２Ｏ４（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値３６３．１５，実測値３６３
【０１２７】
ｂ）  ３−ベンジルオキシ−５−ヒドロキシ−フェニル）−酢酸エチルエステル
【０１２８】
【化１７】
0005404634.tif 000019
【０１２９】
５０ｇ（１．３８ｍｏｌ）の３，５−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−酢酸メチルエステル及び水酸化ナトリウム（６．６ｇ、１．６５ｍｏｌ）を１Ｌのエタノール（ＥｔＯＨ）に加えた溶液を１０％のＰｄ−Ｃの存在下、Ｐａｒｒシェーカー中で１当量の水素が消費されるまで水素化した。混合物を濃塩酸で酸性とした後、触媒及び溶媒を除去して油状残渣を得た。粗生成物を、酢酸エチル−ヘプタンを溶離剤（酢酸エチルが１０％〜７５％の勾配）として用いてＩＳＣＯシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ）で精製して２５ｇ（収率６５％）の標題化合物（１ｂ）を得た。1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．１５−１．２０（ｔ，３Ｈ），３．４−（ｓ，２Ｈ），４．０５−４．１（ｑ，２Ｈ），４．９（ｓ，２Ｈ），５．５（ｓ，１Ｈ），６．４（ｓ，２Ｈ），６．５（ｓ，１Ｈ），７．２０７．３５（ｍ，５Ｈ）；Ｃ１７Ｈ１８Ｏ４（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値２８７．３，実測値２８７
【０１３０】
ｃ）  （３−ベンジルオキシ−５−トリフロオロメタンスルホニルオキシ−フェニル）−酢酸エチルエステル
【０１３１】
【化１８】
0005404634.tif 000020
【０１３２】
３−（ベンジルオキシ−５−ヒドロキシ−フェニル）−酢酸エチルエステル（７４．４ｇ、０．２６ｍｏｌ）をジクロロメタン（７００ｍＬ）に加えた溶液に、ピリジン（６２．５ｍＬ、０．７８ｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃にまで冷却した。内温を５℃より低く保ちながらこの冷却溶液に無水トリフロオロメタンスルホン酸（６５．６ｍＬ、０．３９ｍｏｌ）を１．５時間かけて加えた。この反応混合物を１ＮのＨＣｌ（４２０ｍＬ）と湿氷（１０５ｇ）との混合物に注ぎ、０．５時間攪拌した。水層をジクロロメタン（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた画分を水（２×１００ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）の飽和水溶液（２×１００ｍＬ）、及び食塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空下で濃縮して赤茶色の液体（１０８ｇ）を得、これを更に精製することなく次の工程で用いた。
【０１３３】
Ｃ１８Ｈ１７Ｆ３Ｏ６Ｓ（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４１９．０７，実測値４１９．１
ｄ）  （５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸エチルエステル
【０１３４】
【化１９】
0005404634.tif 000021
【０１３５】
（３−ベンジルオキシ−５−トリフロオロメタンスルホニルオキシ−フェニル）−酢酸エチルエステル（１０８ｇ、０．２６ｍｏｌ）、４−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（５５．６ｇ、０．２９ｍｏｌ）、１，２−ジメトキシエタン（１．１Ｌ）、及び炭酸ナトリウム水溶液（２Ｍ、１２９ｍＬ、０．２６ｍｏｌ）の混合物を、Ｎ2でパージしながら室温で１０分間、機械的に攪拌した。この系に、Ｐｄ（Ｐｈ3）4（４８０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を加え、加熱して（９５℃）２．５時間環流した。得られた赤褐色の混合物を酢酸エチル（０．５Ｌ）で希釈し、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）の飽和水溶液（３×２００ｍＬ）及び食塩水（２×２００ｍＬ）で洗浄した。有機画分を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮した。粗混合物をＩＳＣＯカラムクロマトグラフィーで精製して（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸エチルエステルを得た（１０７ｇ、１００％）。
【０１３６】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．２６（ｔ，３Ｈ），３．６６（ｓ，２Ｈ），４．１７（ｑ，２Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），６．９９（ｓ，１Ｈ），７．１２（ｓ，２Ｈ），７．３４−７．４９（ｍ，５Ｈ），７．６７（ｓ，４Ｈ）；Ｃ２４Ｈ２１Ｆ３Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４１５．１４，実測値４１５．２
【０１３７】
ｅ）  ２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタ−４−エン酸エチルエステル
【０１３８】
【化２０】
0005404634.tif 000022
【０１３９】
化合物１ｄ（４．９ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）に加えた溶液に−７８℃で、Ｌｉ［Ｎ（ＳｉＭｅ3）2］（１Ｎ  ＴＨＦ中、１４．２ｍＬ、１４．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を−７８℃で１時間攪拌した後、３−ブロモ−２−メチル−プロペン（１．２５ｍＬ、１２．４ｍｍｏｌ）を滴下した。この溶液を−３５℃にまで徐々に昇温し、−３５℃で０．５時間攪拌した。反応を飽和塩化アンモニウム溶液で停止させ、酢酸エチルで抽出した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮、及びカラムクロマトグラフィーにより精製して化合物１ｅを透明な油状物として得た（５．１ｇ、９２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ−Ｄ）δｐｐｍ  １．１９−１．２９（ｍ，３Ｈ），１．７４（ｓ，３Ｈ），２．４７（ｍ，１Ｈ），２．８５（ｍ，１Ｈ），３．８３（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｍ，２Ｈ），４．７２（ｓ，１Ｈ），４．７７（ｓ，１Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），７．０３（ｓ，１Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），７．１５（ｓ，１Ｈ），７．３５−７．４８（ｍ，５Ｈ），７．６７（ｓ，４Ｈ）；Ｃ２８Ｈ２７Ｆ３Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４６９．１９，実測値４６９
【０１４０】
ｆ）  ２−（５−ヒドロキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタン酸エチルエステル
【０１４１】
【化２１】
0005404634.tif 000023
【０１４２】
化合物１ｅ（５．１ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）と１０％Ｐｄ／Ｃ（５００ｍｇ）のエタノール（ＥｔＯＨ）溶液（５０ｍＬ）との混合物を、Ｐａｒシェーカー中、Ｈ2下（２７５．８ｋＰａ（４０ｐｓｉ））で２０時間水素化した。得られた反応混合物をセライトで濾過し、濾液を濃縮して化合物１ｆを透明な油状物として得た（４．２ｇ、１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ−Ｄ）δｐｐｍ  ０．９２（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．２５（ｍ，３Ｈ），１．４９−１．６１（ｍ，１Ｈ），１．６５−１．７０（ｍ，１Ｈ），１．９５−２．０５（ｍ，１Ｈ），３．６７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），４．１０−４．２９（ｍ，２Ｈ），６．９１（ｓ，１Ｈ），６．９７（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｓ，４Ｈ）；Ｃ２１Ｈ２３Ｆ３Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値３８１．１６，実測値３８１
【０１４３】
ｇ）  ２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
化合物１ｆ（４ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、炭酸セシウム（ｇ、１５ｍｍｏｌ）、次いで臭化３，５−ジフルオロベンジルを加えた。得られた溶液を室温で１８時間攪拌した後、水で反応を停止させた。この水溶液を酢酸エチルで抽出した。有機層を洗浄、乾燥、及び蒸発させて残渣を得た（５ｇ）。次いで粗生成物を１Ｎ水酸化カリウム（ＫＯＨ）／メタノール溶液（ＭｅＯＨ）（３当量）中、室温で一晩置いた。溶液を濃塩酸で酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。次いで有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した後、ロータリーエバポレータで蒸発させて粗生成物を得た。粗生成物をヘプタン中で粉砕し、４．３ｇ（収率９１％）の（Ｒ）及び（Ｓ）生成物を得た。
【０１４４】
このラセミ混合物を、メタノール及び０．１％のギ酸を含むアセトニトリルを溶離剤として用いてＣｈｉｒａｌｐａｋＡＤカラムによりキラル分離して（Ｒ）エナンチオマーである化合物１及び（Ｓ）エナンチオマーである化合物２をそれぞれ得た。
【０１４５】
（Ｒ）エナンチオマーはメタノール中での旋光度が−２７．２９°であり、（Ｓ）エナンチオマーはメタノール中での旋光度が＋２５．２°であった。絶対的な立体化学中心を、以下に述べる合成用物質との関連によって指定した。
【０１４６】
（Ｒ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸の不斉合成
ｈ）５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸
【０１４７】
【化２２】
0005404634.tif 000024
【０１４８】
（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸エチルエステル（１２０ｇ、０．２９ｍｏｌ）をＴＨＦ（１．２Ｌ）に加えた溶液に、水（２４０ｍＬ）、ＬｉＯＨ．Ｈ2Ｏ（１６ｇ、０．３２ｍｏｌ）を加え、得られた混合物を室温で１６時間攪拌した。この溶液を濾過し、真空下で濃縮してＴＨＦを除去した。得られた粘稠液に２Ｎ塩酸水溶液を加えてｐＨ２まで酸性化し、得られた白色懸濁液を室温で１時間機械的に攪拌した。濾過により湿った白色生成物を回収し、これを酢酸エチル（５００ｍＬ）に溶解した。有機層を水から分離し、硫酸マグネシウム上乾燥（）して、真空下で濃縮することによって（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（１０５ｇ、９４％）を得た。
【０１４９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6−ＤＭＳＯ）：δ３．６４（ｓ，２Ｈ），５．１８（ｓ，２Ｈ），７．０２（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｄ，２Ｈ），７．３４−７．５０（ｍ，５Ｈ），７．８１（ｄ，２Ｈ），７．８９（ｄ，２Ｈ），１２．２５（ｂｓ，０．６Ｈ）；Ｃ２２Ｈ１７Ｆ３Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値３８７．１１，実測値３８７．１
ｉ）  ４−ベンジル−３−［２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−アセチル］−オキサゾリジン−２−オン
【０１５０】
【化２３】
0005404634.tif 000025
【０１５１】
（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−酢酸（２０ｇ、５２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０４ｍＬ）に加えたものを機械的に攪拌した溶液に−７８℃でＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（６．３ｍＬ、５７ｍｍｏｌ）及びトリメチルアセチルクロリド（７．０ｍＬ、５７ｍｍｏｌ）を、内温を−７０℃より低く保ちながら加えた。この混合物を−７８℃で１５分、更に０℃で１時間攪拌した。白色固体を濾去して濾液中に無水物を得、これを再び−７８℃に冷却した。別のフラスコ中で、（Ｒ）−（＋）−４−ベンジル−２−オキサゾリジノン（９．６ｇ、５４．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０９ｍＬ）に加えた溶液に−７８℃で、内温を−７０℃より低く保ちながらｎＢｕＬｉ（１．６Ｍ、ヘキサン中、３４ｍＬ、５４．４ｍｏｌ）を滴下し、−７８℃で４５分間攪拌した。この金属化されたキラル補助剤を上記の無水物に−７８℃でカニューレで加え、１．５時間かけて０℃にまで昇温した。得られた混合物を更に０℃で３０分間攪拌し、過剰量の飽和塩化アンモニウム水溶液を加えることによって反応を停止させた。この溶液を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３×１００ｍＬ）及び食塩水（２×１００ｍＬ）で洗浄した。溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を真空下で除去した。粗物質をＩＳＣＯシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して２０．３ｇ（７２％）の４−ベンジル−３−［２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−アセチル］−オキサゾリジン−２−オンを白色の固体として得た。
【０１５２】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．７６（ｄｄ，１Ｈ），３．２６（ｄｄ，１Ｈ），４．１９（ｍ，２Ｈ），４．３５（ｑ，２Ｈ），４．６９（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｓ，２Ｈ），７．０４−７．４６（ｍ，１３Ｈ），７．６７（ｓ，４Ｈ）；Ｃ３２Ｈ２６Ｆ３ＮＯ４（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値５４６．１８，実測値５４６．３
【０１５３】
ｊ）  ４−ベンジル−３−［２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタ−４−エノイル］−オキサゾリジン−２−オン
【０１５４】
【化２４】
0005404634.tif 000026
【０１５５】
４−ベンジル−３−［２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−アセチル］−オキサゾリジン−２−オン（６．０ｇ、１１．００ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（２２ｍＬ）に加えた無色の溶液に−７８℃でヘキサメチルジシラザンナトリウム（ＮａＨＭＤＳ）（１Ｍ、ＴＨＦ溶液中、１２．１１ｍＬ、１２．１１ｍｍｏｌ）を、内温を−７５℃よりも低く保ちながら滴下した。得られた赤色の溶液を−７８℃で３０分攪拌した。これに３−ブロモ−２−メチル−プロペン（４．４４ｍＬ、４４ｍｍｏｌ）を内温を−７５℃よりも低く保ちながら加えた。添加がほぼ完了に近くなった時点で反応混合物は緑色に変わった。この時点でドライアイス槽を速やかに取り外し、水／氷浴槽と交換して添加を完了した。反応混合物を０℃で更に３０分攪拌し、飽和塩化アンモニウム水溶液で反応を停止させた。反応系を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、有機相を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を真空下で除去し、粗混合物をＩＳＣＯシリカゲルカラムにより精製して４−ベンジル−３−［２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタ−４−エノイル］−オキサゾリジン−２−オン（６．３ｇ、９５  ％）を得た。
【０１５６】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ１．８０（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｄｄ，１Ｈ），２．７５（ｄｄ，１Ｈ），３．０５（ｄｄ，１Ｈ），３．３２（ｄｄ，１Ｈ），４．０８（ｍ，２Ｈ），４．５９（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｄ，２Ｈ），５．１３（ｓ，２Ｈ），５．４８（ｄｄ，１Ｈ），７．１１（ｄ，２Ｈ），７．２１−７．４９（ｍ，１１Ｈ），７．６７（ｓ，４Ｈ）；Ｃ３６Ｈ３２Ｆ３ＮＯ４（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値６００．２３，実測値６００．３
【０１５７】
ｋ）  ４−ベンジル−３−［２−（５−ヒドロキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタノイル］−オキサゾリジン−２−オン
【０１５８】
【化２５】
0005404634.tif 000027
【０１５９】
４−ベンジル−３−［２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタ−４−エノイル］−オキサゾリジン−２−オン（６．７ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）をメタノール（１５０ｍＬ）に加えた溶液に１０％Ｐｄ／Ｃ（６７０ｍｇ、１０ｗ％）を加えた。得られた黒色懸濁液を３１０．３〜３１０．３ｋＰａ（４５〜４５ｐｓｉ）で一晩水素化した。この混合物をセライトで濾過し、溶媒を真空下で除去して比較的純度の高い４−ベンジル−３−［２−（５−ヒドロキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタノイル］−オキサゾリジン−２−オン（５．４ｇ、９３％）を得た。
【０１６０】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．９４（ｄ，３Ｈ），０．９８（ｄ，３Ｈ），１．５４（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｍ，１Ｈ），２．１２（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），３．３６（ｄｄ，１Ｈ），４．１１（ｍ，２Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｔ，１Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），７．２１−７．３７（ｍ，６Ｈ），７．６７（ｓ，４Ｈ）；Ｃ２９Ｈ２８Ｆ３ＮＯ４（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値５１２．２０，実測値５１２．３
【０１６１】
ｌ）  ４−ベンジル−３−｛２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−  ４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オン
【０１６２】
【化２６】
0005404634.tif 000028
【０１６３】
４−ベンジル−３−［２−（５−ヒドロキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタノイル］−オキサゾリジン−２−オン（１８．７７ｇ、３６．７３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１８４ｍＬ）に加えた溶液に、０℃で１−ブロモメチル−３，５−ジフルオロ−ベンゼン（７．１３ｍＬ，５５．１０ｍｍｏｌ）及びＣｓ2ＣＯ3 （２３．９４ｇ、７３．４６ｍｍｏｌ）を少量ずつ、５分間かけて加えた。得られた白色懸濁液を室温で２時間攪拌した。得られた白色固体を濾去し、溶媒を真空下で除去して比較的純度の高い４−ベンジル−３−｛２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オンを得た。
【０１６４】
ｍ）  ２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
【０１６５】
【化２７】
0005404634.tif 000029
【０１６６】
４−ベンジル−３−｛２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オン（２３．４０ｇ、３６．７３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１８０ｍＬ）に加えた溶液に水（６０ｍＬ）を加えた。この系を０℃に冷却した。この冷却溶液に、ＬｉＯＨ．Ｈ2Ｏ（１．５４ｇ、３６．７３ｍｍｏｌ）及び３０％Ｈ2Ｏ2（１６．６５ｍＬ、１４６．９２ｍｍｏｌ）を内温を５℃よりも低く保ちながら滴下した。得られた濁った溶液を０℃で２０分間攪拌した。過剰なＨ2Ｏ2に１．５Ｍの亜硫酸ナトリウム水溶液（９７．９ｍＬ、１４６．９２ｍｍｏｌ）を加えることにより反応を停止させ、室温で１５分間攪拌した。有機溶媒を真空下で除去した。得られた液体に１Ｎ塩酸水溶液を加えることによってｐＨ２にまで酸性化した。水層を酢酸エチル（３×２００ｍＬ）で抽出し、硫酸マグネシウム上で乾燥して真空下で濃縮して得られた粗混合物をＩＳＣＯシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して（Ｒ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸（１２．２５ｇ、７０％）を得た。
【０１６７】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．９３（ｄ，６Ｈ），１．５１（ｍ，１Ｈ），１．７２（ｍ，１Ｈ），１．９８（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｔ，１Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），６．７６（ｍ，１Ｈ），６．９８（ｍ，３Ｈ），７．０７（ｔ，１Ｈ），７．１７（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｍ，４Ｈ）；Ｃ２６Ｈ２３Ｆ５Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４７９．４５，実測値４７９．２
【０１６８】
（実施例２）
（Ｓ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
【０１６９】
【化２８】
0005404634.tif 000030
【０１７０】
ａ）  ４−ベンジル−３−［２−（５−ヒドロキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタノイル］−オキサゾリジン−２−オン
【０１７１】
【化２９】
0005404634.tif 000031
【０１７２】
実施例１のパート（ｋ）の合成法と同様の手順にしたがって標題化合物を４−ベンジル−３−［２−（５−ベンジルオキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタ−４−エノイル］−オキサゾリジン−２−オンから調製した。
【０１７３】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．９４（ｄ，３Ｈ），０．９８（ｄ，３Ｈ），１．５４（ｍ，１Ｈ），１．７４（ｍ，１Ｈ），２．１２（ｍ，１Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），３．３６（ｄｄ，１Ｈ），４．１１（ｍ，２Ｈ），４．６２（ｍ，１Ｈ），５．２５（ｔ，１Ｈ），６．９７（ｍ，２Ｈ），７．２１−７．３７（ｍ，６Ｈ），７．６７（ｓ，４Ｈ）；Ｃ２９Ｈ２８Ｆ３ＮＯ４（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値５１２．２０，実測値５１２．３
【０１７４】
ｂ）  ４−ベンジル−３−｛２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−  ４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オン
【０１７５】
【化３０】
0005404634.tif 000032
【０１７６】
４−ベンジル−３−［２−（５−ヒドロキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタノイル］−オキサゾリジン−２−オン（０．４００ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３ｍＬ）に加えた溶液に、室温で１−ブロモメチル−３，５−ジフルオロ−ベンゼン（０．２４３ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）及びＣｓ2ＣＯ3（０．５０８ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた白色懸濁液を１時間攪拌した。得られた白色固体を濾去し、溶媒を真空下で除去して比較的純度の高い４−ベンジル−３−｛２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オンを得た。
【０１７７】
ｃ）  ２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
【０１７８】
【化３１】
0005404634.tif 000033
【０１７９】
４−ベンジル−３−｛２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−  ４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オン（０．４２５ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に加えた溶液に水（３．５ｍＬ）を加えた。この系を０℃に冷却した。この冷却溶液に、ＬｉＯＨ．Ｈ2Ｏ（０．０２８ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）及び３０％Ｈ2Ｏ2（３０４ｍＬ、２．６８ｍｍｏｌ）を内温を５℃よりも低く保ちながら滴下した。得られた濁った溶液を０℃で２０分間攪拌した。過剰なＨ2Ｏ2に１．５Ｍの亜硫酸ナトリウム水溶液（１．７９ｍＬ、２．６８ｍｍｏｌ）を加えることにより反応を停止させ、室温で５分間攪拌した。有機溶媒を真空下で除去した。得られた液体に１Ｎ塩酸水溶液を加えることによってｐＨ２にまで酸性化した。水層を酢酸エチル（３×２５ｍＬ）で抽出して硫酸マグネシウムで乾燥した。混合物を真空下で濃縮して粗生成物を得、これをＩＳＣＯシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して（Ｓ）−２−［５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸を得た（０．２９５ｇ，９２％）。
【０１８０】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．９３（ｄ，６Ｈ），１．５１（ｍ，１Ｈ），１．７２（ｍ，１Ｈ），１．９８（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｔ，１Ｈ），５．０９（ｓ，２Ｈ），６．７６（ｍ，１Ｈ），６．９８（ｍ，３Ｈ），７．０７（ｔ，１Ｈ），７．１７（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｍ，４Ｈ）；Ｃ２６Ｈ２３Ｆ５Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４７９．４５，実測値４７９．２
【０１８１】
（実施例３）
（Ｒ）−２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
【０１８２】
【化３２】
0005404634.tif 000034
【０１８３】
ａ）  ４−ベンジル−３−｛２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オン
【０１８４】
【化３３】
0005404634.tif 000035
【０１８５】
４−ベンジル−３−［２−（５−ヒドロキシ−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル）−４−メチル−ペンタノイル］−オキサゾリジン−２−オン（実施例１の工程（ｋ）と同様に調製したもの）（０．４００ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．９ｍＬ）に加えた溶液に１−ブロモメチル−４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンゼン（０．１８１ｍＬ、１．１７ｍｍｏｌ）及びＣｓ2ＣＯ3（０．５０８ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）を加えた。得られた白色懸濁液を室温で１時間攪拌した。得られた白色固体を濾去し、溶媒を真空下で除去して比較的純度の高い４−ベンジル−３−｛２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オンを得た。
【０１８６】
ｂ）  ２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
【０１８７】
【化３４】
0005404634.tif 000036
【０１８８】
４−ベンジル−３−｛２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−  ４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタノイル｝−オキサゾリジン−２−オン（０．５３５ｇ，０．７８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（９ｍＬ）に加えた溶液に水（３ｍＬ）を加えた。この系を０℃に冷却した。この冷却溶液にＬｉＯＨ．Ｈ2Ｏ（３３ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）及び３０％Ｈ2Ｏ2（０．３５４ｍＬ、３．１２ｍｍｏｌ）を加え、０℃で２０分攪拌した。過剰なＨ2Ｏ2に１．５Ｍの亜硫酸ナトリウム水溶液（２．０８ｍＬ、３．１２ｍｍｏｌ）を加えることにより反応を停止させ、室温で５分間攪拌した。有機溶媒を真空下で除去した。得られた液体に１Ｎ塩酸水溶液を加えることによってｐＨ２にまで酸性化した。水層を酢酸エチル（３×５０ｍＬ）で抽出して硫酸マグネシウムで乾燥した。混合物を真空下で濃縮して粗生成物を得、これをＩＳＣＯシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して（Ｒ）−２−［５−（４−フルオロ−２−トリフルオロメチル−ベンジルオキシ）−４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸（３１０ｍｇ）を得た。
【０１８９】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．９２（ｄ，６Ｈ），１．５２（ｍ，１Ｈ），１．７１（ｍ，１Ｈ），１．９９（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｔ，１Ｈ），５．２７（ｓ，２Ｈ），６．９８（ｂｓ，１Ｈ），７．０６（ｂｓ，１Ｈ），７．１７（ｂｓ，１Ｈ），７．２９（ｍ，１Ｈ），７．４２（ｍ，１Ｈ），７．６８（ｍ，５Ｈ）；Ｃ２７Ｈ２３Ｆ７Ｏ３（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値５２９．４６，実測値５２９．２
【０１９０】
（実施例４）
２−［４’−クロロ−５−（３，５−ジフルオロ−２−ベンジルオキシ）−３’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
【０１９１】
【化３５】
0005404634.tif 000037
【０１９２】
ａ）  ２−（３，５−ビス−ベンジルオキシ−フェニル）−４−メチル−ペンタ−４−エン酸メチルエステル
【０１９３】
【化３６】
0005404634.tif 000038
【０１９４】
（３，５−ビス−ベンジルオキシフェニル）酢酸メチルエステル（実施例１の工程（ａ）で調製したもの）（１３．０ｇ，３５．９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（８０ｍＬ）中で攪拌した溶液に、ＴＨＦ−ヘプタン−エチルベンゼン（２１．５ｍＬ、４３．０ｍｍｏｌ）に２ＭのＬＤＡを加えた溶液を−７８℃で１２分かけて窒素雰囲気下で滴下した。温度を更に５０分間−７０℃よりも低く保った後、３−ブロモ−２−メチルプロペン（４．０ｍＬ，３９．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、反応混合物を０℃にまで昇温した。２時間後に混合物を真空下で濃縮し、飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチル（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥して、真空下で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ、石油エーテル中０〜１０％酢酸エチル）により精製して標題化合物を黄色の油状物として得た（１４．１ｇ、９４％）。
【０１９５】
1Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．４２−７．２５（ｍ，１０Ｈ），６．５８（ｓ，２Ｈ），６．５２（ｓ，１Ｈ），５．０２（ｓ，４Ｈ），４．７４（ｓ，１Ｈ），４．６６（ｓ，１Ｈ），３．７４（ｔ，１Ｈ），３．６４（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｄｄ，１Ｈ），２．３８（ｄｄ，１Ｈ），１．７０（ｓ，３Ｈ）．
【０１９６】
ｂ）  ２−（３−ベンジルオキシ−５−ヒドロキシ−フェニル）−４−メチル−ペンタン酸エチルエステル
【０１９７】
【化３７】
0005404634.tif 000039
【０１９８】
中間体４ａ（２０ｇ、４８ｍｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（２．３ｇ、５７ｍｍｏｌ）をエタノール（５００ｍＬ）に加えた混合物にＮ2下、活性炭に吸着させた０．５ｇのＰｄ−Ｃ（１０％）を加えた。混合物を２７５．８ｋＰａ（４０ｐｓｉ）で３０分水素化した。ＬＣ／ＭＳによってこの時点で開始物質が消費されたことが示された。触媒を濾去してエタノールを蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（０〜４０％酢酸エチル／ヘプタン）により、１１．８ｇ（収率７５％）の無色の油状物を、メチル及びエチルエステルと未還元の二重結合エステルとの混合物として得た。ＭＨ+３４１（未還元の二重結合を有するエチルエステル）；３４３（還元されたイソプロピル分枝を有するエチルエステル）；３２７（未還元の二重結合を有するメチルエステル）
【０１９９】
ｃ）  ２−［３−ベンジルオキシ−５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−４−メチル−ペンタン酸エチルエステル
【０２００】
【化３８】
0005404634.tif 000040
【０２０１】
エチルエステル（メチルエステルと混合された）４ｂ（５ｇ、１５ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（４．１ｇ、３０ｍｍｏｌ）及び臭化３，５−ジフルオロベンジル（２．９ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（７０ｍＬ）に加えた溶液を８０℃に１時間加熱した。ＤＭＦを真空により除去し、粗生成物をカラムクロマトグラフィー（０〜３０％酢酸エチル／ヘプタン）で精製して４．５ｇの生成物を得た（収率６６％）。ＭＨ+４５３．１及び他の分子イオン（メチルエステル及び対応するオレフィン）
【０２０２】
ｄ）  ２−［３−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−５−トリフロオロメタンスルホニルオキシ−フェニル］−４−メチル−ペンタン酸エチルエステル
【０２０３】
【化３９】
0005404634.tif 000041
【０２０４】
中間体４ｃ（４．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）のメタノール（１００ｍＬ）溶液にＮ2下、活性炭に吸着させた０．４５ｇのＰｄ−Ｃ（１０％）を加え、混合物を１３７．９ｋＰａ（２０ｐｓｉ）で２時間水素化した。触媒を濾去し、メタノールを蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（０〜５０％酢酸エチル／ヘプタン）により、３．０ｇのフェノールを無色油状物として得た。これを５０ｍＬのＤＣＭに溶解して０℃に冷却した。ピリジン（２ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）及び無水トリフルオロメタンスルホン酸（２ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を０℃で１時間攪拌した後、１Ｎ塩酸溶液（２０ｍＬ）に注ぎ、ＤＣＭ（２００ｍＬ）で抽出し、炭酸水素ナトリウム／塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。ＤＣＭ層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、蒸発させて４．０ｇの黄色油状物を得た（２工程での収率７８％）。ＭＨ+５１１．２
【０２０５】
ｅ）  ２−［４’−クロロ−５−（３，５−ジフルオロ−ベンジルオキシ）−３’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸エチルエステル
【０２０６】
【化４０】
0005404634.tif 000042
【０２０７】
３−ＣＦ3−４−Ｃｌ−ベンゼンボロン酸（３．６ｇ、１６ｍｍｏｌ）、トリフラート４ｄ（４ｇ、７．８ｍｍｏｌ）、（ＰＰｈ3）4Ｐｄ（０．５ｇ、０．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．２ｇ、１６ｍｍｏｌ）をトルエン／エタノール／水（２０／１０／５ｍＬ）に加えた溶液を密封された反応チューブに入れ、８０℃に１時間加熱した。酢酸エチル（２００ｍＬ）を加えて食塩水で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸マグネシウム上で乾燥して蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（０〜２０％／酢酸エチル／ヘキサン）により３．０５ｇの無色油状物が得られた（７４％）。ＭＨ+５４１．３
【０２０８】
ｆ）  ２−［４’−クロロ−５−（３，５−ジフルオロ−２−ベンジルオキシ）−３’−トリフルオロメチル−ビフェニル−３−イル］−４−メチル−ペンタン酸
中間体４ｅ（３ｇ、５．５ｍｍｏｌ）、１Ｎ水酸化ナトリウム（１６ｍＬ）をＴＨＦ／メタノール（５０／５０ｍＬ）に加えた溶液を室温で１日攪拌した。溶液を濃縮し、酢酸エチル（５００ｍＬ）を加えた。１Ｎ塩酸及び食塩水で洗浄した後、酢酸エチル層を硫酸マグネシウム上で乾燥して蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（０〜３０％／酢酸エチル／ヘキサン）により２．７ｇの白色固体（７１％）を得た。次いでこの固体を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウム（５．２６ｍＬ、５ｍｍｏｌ）に加え、室温で１０分攪拌した。次いで溶媒を真空により除去し、化合物をナトリウム塩として得た。ＭＨ+５１３．２（弱いピーク）．1ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）：δ０．９４（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５１Ｈｚ），δ１．５−１．６７（ｍ，２Ｈ），δ１．９−２．０（ｍ，１Ｈ），δ３．６７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８５Ｈｚ），δ５．２（ｓ，２Ｈ），δ６．８９（ｍ，１Ｈ），δ７．１（ｍ，４Ｈ），δ７．２７（ｓ，１Ｈ），δ７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４２Ｈｚ），δ７．８５（ｍ，１Ｈ），δ７．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）．
【０２０９】
シクロオキシゲナーゼ−１及びシクロオキシゲナーゼ−２（Ｃｏｘ−１、Ｃｏｘ−２）に対する本発明の化合物の作用の決定
【０２１０】
Ｃｏｘ−１及びＣｏｘ−２の阻害を、ケイマンケミカル社（Cayman Chemical Company）（米国ミシガン州アナーバー所在）によって提供されるＣｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｃｏｘ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒスクリーニングアッセイ（カタログＮｏ．７６０９１１１）を製造者の指示にしたがって使用して調べた。
【０２１１】
本発明の実施例１は１００μＭで５０％阻害率を示した。
【０２１２】
本発明の化合物のγ−セクレターゼ活性についてのスクリーニング
１％非必須アミノ酸を添加した５％血清／Ｆｅを含む、ギブコ社（Gibco）によって提供されるＤＭＥＭ／Ｎｕｔ−ｍｉｘ  Ｆ１２（ＨＡＭ）培地（カタログＮｏ．３１３３０−３８）で増殖させた、ＡＰＰ６９５−野生型を有するＳＫＮＢＥ２細胞を用いてスクリーニングを行った。
【０２１３】
細胞はコンフルエンス近くにまで増殖させた。
【０２１４】
スクリーニングは、Ｃｉｔｒｏｎ等（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６７に述べられるようなアッセイを用いて行った。
【０２１５】
【表２】
0005404634.tif 000043
【０２１６】
上記と比較して、選択されたＲ1及びＲ2の値を有さず、ｓｅｃ−ブチル基も有さない
【０２１７】
【化４１】
0005404634.tif 000044
では、上記のＷＴＡＰＰ細胞アッセイにおけるＩＣ50は２．５ｕＭであった。
【０２１８】
インビボの有効性の実証
本発明のＡβ４２低下剤は、ヒトなどの哺乳動物におけるＡＤを治療するために使用することが可能であるか、あるいは、これらに限定されるものではないがマウス、ラット又はモルモットなどの動物モデルにおける有効性を実証するものである。その場合の哺乳動物はＡＤを診断されていなくともよく、ＡＤの遺伝的素因を有していなくともよいが、ＡＤを発症したヒトに見られるのと同様にＡβを過剰生産してやがて沈着するような形質転換体であってよい。
【０２１９】
Ａβ４２低下剤は任意の標準的な方法を用いて任意の標準的な形態で投与することができる。例えば、Ａβ４２低下剤は、これらに限定されるものではないが経口又は注射により投与される液体、錠剤又はカプセル剤の形態であり得る。Ａβ４２低下剤は血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、又は脳内のＡβ４２の濃度を有意に低下させるうえで充分な任意の容量で投与することができる。
【０２２０】
Ａβ低下剤の急性投与がインビボでＡβ４２濃度を低下させるか否かを調べるため、例えばマウス又はラットなどの形質転換されていないげっ歯類を用いた。別法として、「Ｓｗｅｄｉｓｈ」変異を含むＡＰＰ６９５を発現する生後２〜３ヶ月のＴｇ２５７６マウス、又は、フレッド・バン・ルーベン（Fred Van Leuven）博士（Ｋ．Ｕ．ルーベン社（K. U. Leuven）ベルギー）と共同研究者らによって開発された、ヒトアミロイド前駆体タンパク質の臨床的突然変異体［Ｖ７１７Ｉ］を神経細胞特異的に発現する形質転換マウスモデルを用いることができる（Ｍｏｅｃｈａｒｓ等，１９９９  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６４８３）。若齢の形質転換マウスは脳に高濃度のＡβが見られるが検出可能なＡβの沈着は認められない。形質転換マウスは、生後約６〜８ヶ月で脳内に自然発生的に進行性のβ−アミロイド（Ａβ）の沈着が見られ始め、やがて鉤状回、海馬及び皮質内にアミロイドプラークが形成される。Ａβ低下剤で処理した動物を調べ、非処理の動物又は賦形剤で処理した動物と比較し、例えばＥＬＩＳＡの使用など標準的な方法によって脳内の可溶性Ａβ４２及び全Ａβレベルを定量化する。処理期間は数時間〜数日で異なり得るものであり、作用の出現の時間的経過が一旦確立されれば、Ａβ４２低下の結果に基づいて調節することができる。
【０２２１】
インビボでのＡβ４２低下を測定するための一般的なプロトコールを示すが、これは検出可能なＡβの濃度を最適化するために使用することが可能な多くの変形例の内の１つに過ぎない。例として、Ａβ４２低下化合物を遊離酸又はナトリウム塩として５％Ｓｏｌｕｔｏｌ水溶液又は２０％ヒドロキシプロピルβシクロデキストリンに配合した。Ａβ低下剤は例えば、経験的に求められているように屠殺及び分析の３〜４時間前に単回の経口投与として又は任意の許容可能な投与経路によって投与するか、あるいは、数日間にわたって投与して最後の投与を行った３〜４時間後に動物を屠殺してもよい。
【０２２２】
マウスをケタラー（ケタミン）、ロムパン（キシラジン２％）及びアトロピン（２：１：１）の混合物で麻酔し、４℃の生理学的血清を経心臓的に灌流する。屠殺して血液を採取する。血液の採取は、麻酔下に心臓穿刺によりＥＤＴＡ処理した採取用チューブに行う。血液を４℃、４０００ｇで５分間遠心し、血漿を回収して後の分析用に急速冷凍する。脳を頭蓋から取り外し、後脳と前脳を前頭面に切れ目を入れて分離する。小脳を取り出し、試験化合物濃度の定量的分析のために確保しておく。前脳を正中矢状断して左右の半球に均等に分割する。
【０２２３】
両半球を直ちに液体窒素に浸漬し、生化学的アッセイ用にホモジナイズするまで−７０℃で保存する。
【０２２４】
マウスの脳を、組織１ｇ当たりプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ−１１９４８６９９）を含んだ１０検体の０．４％ＤＥＡ（ジエチルアミン）／５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ１０（非形質転換動物に対して）、又は、ＴＢＳ中０．１％ＣＨＡＰＳ（形質転換動物に対して）に再懸濁する（例えば０．１５８ｇの脳には１．５８ｍｌの０．４％ＤＥＡを加える）。試料はすべて、３０％の出力で３０秒間氷上で超音波処理する。ホモジネートを３５５，０００×ｇで３０分、遠心する。次いで得られた高速上清を後の精製又は直後に行われるアッセイ用に新しいチューブに移す。
【０２２５】
得られた上清はＷａｔｅｒＯａｓｉｓ  ＨＬＢ逆相カラム（ウォーターズ社（Waters Corp.）マサチューセッツ州ミルフォード所在）で精製することによって、後のＡβ検出に先立って脳破砕物から非特異的な免疫反応物質を除去する。真空マニホルドを用い、真空圧が実験全体を通じて適宜調節されるようにして、すべての溶液を約１ｍＬ／分の速度でカラムに通過させた。各カラムは１ｍＬの１００％メタノールで予め調整した後、１ｍＬの水で平衡化した。中和していない脳破砕物をカラムに導入した。導入した試料は、最初の洗浄を１ｍＬの５％メタノールで行い、２回目の洗浄を１ｍＬの３０％メタノールで行うことで２回洗浄した。最後に、Ａβを２％ＮＨ4ＯＨを含む９０％メタノール溶液でカラムから１００×３０ｍｍのガラスチューブに溶出させた。次いで溶出液を１．５ｍＬのチューブに移し、高温のＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮装置で約２時間濃縮した。次いで濃縮されたＡβを、製造者の推奨するところにしたがってプロテアーゼ阻害剤を加えたＵｌｔｒａＣＵＬＴＵＲＥ汎用無血清培地（カムブレックス社（Cambrex Corp.）メリーランド州ウォーカーズビル所在）に再懸濁した。
【０２２６】
脳ホモジネートの可溶性画分中のＡβ４２の量を定量化するため、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）用キットを使用する（Ｉｎｎｏｔｅｓｔ（登録商標）β−Ａｍｙｌｏｉｄ(1〜42)、イノジェネティクス社（Innogenetics N. V.）ゲント（Ghent，）、ベルギー）。Ａβ  ＥＬＩＳＡは製造者のプロトコールに基本的にしたがって行う。簡単に述べると、スタンダード（合成Ａβ１−４２の希釈液）及び試料を、キットと共に供給される９６穴ポリプロピレンコーティングプレート上に調製する（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ、Ａ／Ｓナンク社（A/S Nunc）、デンマーク）。最終濃度を１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．３、及び１５．６ｐｇ／ｍｌとしたスタンダード希釈液及び各試料を、ＥＬＩＳＡキットに同梱された試料希釈剤中で最終体積が６０μｌとなるように調製する。各試料、スタンダード、及びブランク（５０μｌ）を抗Ａβ４２コーティングしたプレート（捕捉された抗体が抗原のＣ末端を選択的に認識する）に加える。プレートを４℃で一晩インキュベートして抗体−アミロイド複合体を形成させる。このインキュベーション及びこれに続く洗浄工程の後、選択的抗Ａβ抗体複合体（ビオチン化検出抗体、例、ビオチン化４Ｇ８（コバンス・リサーチプロダクツ社（Covance Research Products）マサチューセッツ州デドハム所在））を加え、最低でも１時間インキュベートすることによって抗体−アミロイド−抗体複合体を形成させる。インキュベーション及び適当な洗浄工程の後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を加え、その３０分後にＴＭＢ／ペルオキシド混合物を加えることで、基質が着色生成物に変換される。この反応を硫酸（１Ｍ）を加えることで停止させ、４５０ｎｍのフィルターを用いたＥＬＩＳＡリーダーによる光度測定によって色の強度を測定する。吸光度を、合成Ａβ１−４２について作成した基準曲線と比較することによって試料のＡβ含量を定量化することができる。また、Ｐｉｅｒｃｅ  ＱｕａｎｔＢｌｕ蛍光性ペルオキシダーゼ基質及び検出試薬（ピアース社（Pierce Corp.）イリノイ州ロックフォード所在）を製造者の指示にしたがって使用することによって検出を行うこともできる。
【０２２７】
こうしたモデルでは、非処理の動物と比較して少なくとも２０％のＡβ４２の低下率が有利である。
【０２２８】
インビボのデータ
４時間の時点における経口用量３０ｍｇ／ｋｇ
【０２２９】
【表３】
0005404634.tif 000045
【０２３０】
上記と比較して、
【０２３１】
【化４２】
0005404634.tif 000046
は、マウスにおけるＡβ４２の血漿濃度を４０％低下させるのに１００ｍｇ／ｋｇの投与を必要とした。
【０２３２】
上記の明細書は説明を目的として与えられる実施例と共に本発明の原理を教示するものであるが、本発明の実施には、以下の特許請求の範囲及びその均等物の範囲に含まれるすべての通常の変形例、適合例及び／又は改変例が包含される点は理解されるであろう。
【０２３３】
上記明細書で開示したすべての刊行物はその全容を本明細書に援用するものである。