(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有し、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換したコリネ型細菌を培養する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
【請求項２】
前記コリネ型細菌が、変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されたコリネ型細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コリネ型細菌が、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化したコリネ型細菌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡがgriI遺伝子およびgriH遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記griI遺伝子およびgriH遺伝子が放線菌由来である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス由来である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記griI遺伝子およびgriH遺伝子がストレプトマイセス・グリセウス由来である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法により製造した３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を有する、ポリベンゾオキサゾールポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法に関する。さらに詳しくは、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体や、高性能耐熱性高分子ポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用な、アミノヒドロキシ安息香酸類を簡便安価に製造する方法に関する。具体的には、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドを基質として、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を合成する酵素活性を有するコリネ型細菌を用いて、３−アミノ−４−ヒドロキシ芳香族カルボン酸類を製造する方法を提供する。
本発明は、さらに、アミノヒドロキシ安息香酸類から、ポリベンゾオキサゾールポリマーを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体や、ポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用であるアミノヒドロキシ安息香酸類の製造方法としては、アミノヒドロキシ安息香酸類が３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の場合、原料である４−ヒドロキシ安息香酸やそのエステルを硝酸でニトロ化して３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸やその誘導体とし、その後、該中間体のニトロ基をパラジウムカーボンなどの還元剤で還元し、リン酸塩として単離する方法（特許文献１参照）が知られている。また原料として４−ハロ安息香酸やそのエステルをもちいた場合、硝酸でニトロ化して３−ニトロ−４−クロロ安息香酸を得た後、ハロ基をアルカリ金属水酸化物で処理して３−ニトロ−４−ヒドロキシ安息香酸としこれを還元する方法（特許文献２参照）も知られている。
しかしながら、これらの方法ではいずれもニトロ化の際に生成するポリニトロ化物の危険性を回避するため、また生成物の純度を向上させるために単離、精製などの反応操作が数段階におよびコスト高になるという問題がある。また異性体生成による収率の大幅な低下といった問題点もある。
また、アミノヒドロキシ安息香酸類中の不純物の存在は、ポリマー形成反応を妨げることが知られている。
ポリベンゾオキサゾール類は、高強度の特性を有する剛性ポリマーとしてよく知られており、プリント配線板用フィルム、半導体素子の保護膜などの用途が考えられている。しかし、化学触媒を用いた従来の製造方法は危険な触媒を用いた過激な反応であり、しかもモノマー前駆体の純度の高い安価な製造方法がないことが、これらポリマーの実用化を遅らせている原因となっている。
３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸について、各種の化学合成法が報告されている。合成法では多段階の反応が必要となるためコスト高となり、製造に不適である。
一般に、化学的合成法に比べて生合成による物質生産はいくつかの利点が挙げられる。例えば、安価で再生可能な原料の使用、温和な反応条件下で合成が可能であることである。
微生物等の生合成反応を利用し、アミノヒドロキシ安息香酸類を生産する方法が知られている。例えば、放線菌が３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生合成することが報告されている（非特許文献１参照）。しかしながら、この３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸は弱酸性からアルカリ性付近において不安定であるため、培養液中で酸化されダイマー化しやすく、収率が低くなるという問題がある。また、２−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸（３−ヒドロキシアントラニル酸）も放線菌の培養により得られることが知られている（例えば、特許文献３参照）。この場合は培養によって２−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸が直接生産されるのではなく、２，３−ジヒドロキシ−３−アントラニル酸を培養により得て、それをパラジウムカーボン触媒により脱水素反応させることにより製造するものである。ここで使用されるパラジウムカーボン触媒は高価であり、しかも反応を効率的に行うには多くの触媒量が必要となることから、工業的には不適である。
最近、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成に関与する遺伝子が放線菌より見出され、その生合成経路が明らかにされた。具体的には、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドを基質として、アミノ基を持ったＣ４化合物とＣ３あるいはＣ４化合物との炭素−炭素結合反応を触媒する酵素であるＧｒｉＩとＣ７化合物の環化あるいはＣ８化合物の脱炭酸を伴った環化を触媒する酵素であるＧｒｉＨとによって２段階で生合成されることが解明された（非特許文献２）。また、ｇｒｉＩ遺伝子とｇｒｉＨ遺伝子を組み込んだ組換えベクターを用いて形質転換した放線菌の一種である、ストレプトマイセス・リビダンスが、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生産することも知られている（特許文献４参照）。しかしながら、生産培地の組成、培養方法等の検討にも関わらず、その生産性は、培地あたり最高でも５ｇ／Ｌと、実用生産には未だ課題が多い。また、得られた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸は、生合成の過程でできるアセチル化体との混合物であり、脱アセチル化処理が不可避であった。これらの問題点により、生合成法による効率的な製造プロセスが確立されたとは言えない状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３３５４５６８号
【特許文献２】特公平８−１１７４５号公報
【特許文献３】特開平７−３０９９４６号公報
【特許文献４】特開２００４−２８３１６３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＹｏｎｇｆｕＬｉ  ｅｔ．ａｌ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅ  ｒｓ、４１、ｐ５１８１−５１８５（２０００）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，４８，３６９４４−３６９５１，２００６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みてなされたものであり、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸などのアミノヒドロキシ安息香酸類を簡便安価に製造する方法を提供す
ることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた。その結果、フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有し、ｇｒｉＩ遺伝子とｇｒｉＨ遺伝子を組み込んだ組換えベクターで形質転換したコリネ型細菌を培養することにより、アセチル化されていない３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を大量生産する方法を見出し、本発明を完成するにいたった。
すなわち本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有し、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換したコリネ型細菌を培養する工程を含む、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
（２）前記コリネ型細菌が、変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されたコリネ型細菌である、（１）に記載の方法。
（３）前記コリネ型細菌が、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化したコリネ型細菌である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記ＤＮＡがｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子を含む、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子が放線菌由来である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法により製造した３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を有する、ポリベンゾオキサゾールポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ｇｒｉＩ遺伝子ホモログ並びに共通配列のアラインメントを示す図。
【図２】ｇｒｉＩ遺伝子ホモログ並びに共通配列のアラインメントを示す図（続き）。
【図３】ｇｒｉＨ遺伝子ホモログ並びに共通配列のアラインメントを示す図。
【図４】ｇｒｉＨ遺伝子ホモログ並びに共通配列のアラインメントを示す図（続き）。
【図５】コリネバクテリウム・グルタミカムによる３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の生産を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを用いて形質転換したコリネ型細菌を培養することによって３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を製造する方法に係るものである。
本発明における３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類には、以下の構造を有する３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸（以下、「３，４−ＡＨＢＡ」と略すことがある）並びにその誘導体およびその塩が含まれる。
0005445453.tif 000002
誘導体としては、例えば、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸のカルボキシル基がアルデヒド化された３−アミノ−４−ヒドロキシベンズアルデヒドなども含まれる。塩としては、カルボン酸のアルカリ金属（ナトリウム、カリウム、リチウム）塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム）塩などの塩基塩および塩酸塩、硫酸塩、硝酸鉛、リン酸塩などの酸付加塩が例示される。
＜１＞３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
本発明に用いるＤＮＡは、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類生合成に関与する遺伝子を含む。換言すると、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成を回復、付与、促進又は調節する機能を有する遺伝子を含むＤＮＡである。
具体的には、本発明に用いるＤＮＡは、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成する活性（以下、「３，４−ＡＨＢＡ生成活性」ともいう。）を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む。当該ＤＮＡには、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、および、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子が含まれる（特許文献４参照）。以下、両酵素活性をあわせて、３，４−ＡＨＢＡ生合成能ともいうことがある。
ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドの炭素−炭素結合形成を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＩ遺伝子（配列番号８、９）、又は、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログが挙げられる。ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとしては、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、同酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、配列番号８、９の配列を用いてＢｌａｓｔ検索を行うことにより、相同性の高い遺伝子を探索することもできる。例えば、フランキア・エスピー由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８３２８２、配列番号１０，１１）、同Ｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７２、配列番号１２，１３）、ストレプトマイセス・スカビエス由来のＦｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ、配列番号１４、１５
）、バークホルデリア・エスピー３８３由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ３９ＮＱ９、配列番号１６，１７）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のｆｒｕｃｔｏｓｅ−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｌｄｏｌａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ＿２４７３７４、配列番号１８、１９）、エシェリヒア・コリ由来のｄｈｎＡ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３、配列番号２０、２１）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄａｔａ）。
ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドの炭素−炭素結合を形成させることによって得られたＣ７化合物の環化を触媒する酵素活性を有する蛋白質をコードする遺伝子としては、ストレプトマイセス・グリセウス由来のｇｒｉＨ遺伝子（配列番号２２、２３）、又は、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログが挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとしては、他の微生物に由来し、上記ストレプトマイセス・グリセウス由来の遺伝子と高い相同性を示し、同酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をいう。そのような遺伝子は、配列番号２２，２３の配列を用いてＢｌａｓｔ検索を行うことにより、相同性の高い遺伝子を探索することもできる。例えば、フランキア・エスピー由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８３２８３、配列番号２４、２５）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿４８１１７１、配列番号２６、２７）、バークホルデリア・エスピー３８３由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿３６６５５２、配列番号２８、２９）、同３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ，ＹＰ＿３６６５５３、配列番号３０、３１）、ストレプトマイセス・スカビエス由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（〈ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｂｌａｓｔ／ｓｕｂｍｉｔｂｌａｓｔ／ｓ＿ｓｃａｂｉｅｓ〉、配列番号３２、３３）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来の３−ｄｅｈｙｄｒｏｑｕｉｎａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＮＰ＿２４８２４４、配列番号３４、３５）などが挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．２８１，ＮＯ．４８，ｐｐ．３６９４４−３６９５１，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｄａｔａ）。
また、ｇｒｉＩ遺伝子ホモログとしては、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９又は２１のアミノ酸配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、前述の酵素活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。ｇｒｉＨ遺伝子ホモログとしては、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５のアミノ酸配列に対して、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、前述の酵素活性を有するタンパク質をコードするものが挙げられる。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））やＦＡＳＴＡ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている（〈ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ〉参照）。
配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９および２１のアミノ酸配列のアラインメントを図１及び図２に、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３および３５のアミノ酸配列のアラインメントを図３及び図４に示す。また、これらのコンセンサス（共通）配列を配列番号３６、３７に示す。前記ｇｒｉＩ遺伝子ホモログには、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子、ｇｒｉＨ遺伝子ホモログには配列番号３７のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む。
ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、上記のとおり、既にいくつかの配列が明らかにされているので、それらの塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いて得ることができる。例えば、配列番号１及び２に示すプライマーを用いて、ストレプトマイセス・グリセウスの染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．５，１８５（１９８９）参照）によって、ストレプトマイセス・グリセウスのｇｒｉＩおよびｇｒｉＨのコード領域と、その制御領域を含む隣接領域を同時に取得することができる。ストレプトマイセス・グリセウスの具体例としては、ＩＦＯ１３３５０（ＮＲＢＣ１３３５０）株が挙げられる。同株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオロジカルリソースセンターから入手することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｒｃ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｅ／ｇｅｎｅ−ｅ．ｈｔｍｌ）。他の微生物に由来するｇｒｉＩまたはｇｒｉＨのホモログも、同様にして取得され得る。
微生物の種や菌株によってｇｒｉＩ遺伝子やｇｒｉＨ遺伝子の塩基配列に差異が存在することがあるため、本発明の方法に用いるコリネ型細菌を得るために使用するｇｒｉＩ遺伝子は、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９もしくは２１、ｇｒｉＨ遺伝子は、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３もしくは３５のアミノ酸配列をコードする遺伝子に限られず、コリネ型細菌内で共に発現することにより、好ましくは発現を増強することにより、コリネ型細菌の３，４−ＡＨＢＡの生産能を向上させることができる限り、それぞれ、配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９もしくは２１、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３もしくは３５のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、好ましくは１から５０個、さらに好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、特に好ましくは１から５個である。また、このようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。
上記置換は機能的に変化しない中性変異である保存的置換が好ましい。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、ｐｈｅ，ｔｒｐ，ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、ｌｅｕ，ｉｌｅ，ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、ｇｌｎ，ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、ｌｙｓ，ａｒｇ，ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、ａｓｐ，ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、ｓｅｒ，ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。より具体的には、保存的置換としては、ａｌａからｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇからｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎからｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐからａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎからａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕからｇｌｙ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙからｐｒｏへの置換、ｈｉｓからａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅからｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕからｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓからａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔからｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅからｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒからｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒからｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐからｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒからｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、及び、ｖａｌからｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換が挙げられる。
さらに、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、それぞれ導入する宿主により、遺伝子の縮重性が異なるので、それぞれｇｒｉＩおよびｇｒｉＨが導入される宿主で使用しやすいコドンに置換したものでもよい。同様にｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、双方の遺伝子の発現を増強することによりコリネ型細菌の３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させる機能を有する限り、Ｎ末端側、Ｃ末端側が延長したタンパク質、あるいは削られているタンパク質をコードする遺伝子でもよい。例えば延長・削除する長さは、アミノ酸残基で５０以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下、特に好ましくは５以下である。より具体的には、Ｎ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸、又はＣ末端側５０アミノ酸から５アミノ酸が延長又は削除されたタンパク質をコードする遺伝子でもよい。
このようなｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子と相同な遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように配列番号９、１１、１３、１５、１７、１９もしくは２１、および、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３もしくは３５のアミノ酸配列をコードする遺伝子を改変することによって取得することができる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、ｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばコリネ型細菌を、紫外線またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法、エラ−プローンＰＣＲ（Ｃａｄｗｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２，２８（１９９２））、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９（１９９４））、ＳｔＥＰ−ＰＣＲ（Ｚｈａｏ，Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，２５８（１９９８））によって、遺伝子組換えにより人工的にｇｒｉＩ遺伝子もしくはｇｒｉＨ遺伝子に変異を導入して活性の高い酵素をコードする遺伝子を取得することが出来る。
また、ｇｒｉＩ遺伝子およびｇｒｉＨ遺伝子は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０、および、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２もしくは３４の塩基配列に相補的な塩基配列又はこれらの配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、双方を発現することによりコリネ型細菌の３，４−ＡＨＢＡ生合成能を向上させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
プローブとして、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８もしくは２０、または、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２もしくは３４の塩基配列に相補的な塩基配列の一部の配列を用いることもできる。そのようなプローブは、これらの塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとして、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件は、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
上記遺伝子ホモログ及び保存的変異に関する記載は、本明細書に記載された他の遺伝子についても同様に適用される。
これらのｇｒｉＩおよびｇｒｉＨ相同遺伝子が発現することにより３，４−ＡＨＢＡ生産能を向上させるタンパク質をコードしているか否かは、これらの遺伝子をフィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有するコリネ型細菌、例えばＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５株（特開２００４−２６１１５０号公報参照）等に導入し、３，４−ＡＨＢＡ生成活性が向上するかどうかを調べることにより、確かめることができる。その場合、例えば鈴木らの方法［Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２８１，８２３−８３３（２００６）］に従い、３，４−ＡＨＢＡを逆相クロマトグラフィーにより定量することでより明確に効果を検証することができる。
＜２＞組換えベクター
本発明に用いるＤＮＡを、発現ベクターであるプラスミドに導入することによって、本発明に用いる組換えベクターを得ることができる。本発明に用いるＤＮＡに含まれてもよい、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨは、それぞれ発現可能な状態で形質転換体に含まれる限り、それぞれ別の組換えベクターに搭載して形質転換に用いても良いし、ｇｒｉＩとｇｒｉＨを適当なスペーサーにより連結して、同一の組換えベクターに搭載し、形質転換に用いても良い。また、ｇｒｉＩとｇｒｉＨは同一の微生物に由来する遺伝子であってもよいし、異種微生物に由来する遺伝子であってもよい。同一の微生物に由来する遺伝子であり、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨは染色体上の近接した位置に存在する場合は、ｇｒｉＩおよびｇｒｉＨの双方を含む部位においてＤＮＡを切り出し、ベクターに搭載しても良い。
本発明に使用する組換えベクターは、一般にプロモーター、前述の本発明のＤＮＡ、例えばｇｒｉＩおよびｇｒｉＨ、およびコリネ型細菌中で該遺伝子を発現させるために必要な制御領域（オペレーターやターミネーター）を、それらが機能し得るように適切な位置に有するものである。
組換えベクターとして使用できる発現ベクターは特に制限されず、コリネ型細菌中で機能し得るベクターであればよく、プラスミドのように染色体外で自立増殖するものであっても細菌染色体に組み込まれるものであってもよい。コリネ型細菌由来のプラスミドは特に好ましい。これらには、例えばｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４）、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，２９０１−２９０３（１９８４））、およびこれらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドが含まれる。
本発明に使用できるプロモーターは特に限定されず、コリネ型細菌の菌体内で機能し得るプロモーターであれば一般に使用でき、更に異種由来の、例えばｔａｃプロモーター等の大腸菌由来のプロモーターであってもよい。
コリネ型細菌由来のプロモーターとしては、例えば、細胞表層タンパク質のＰＳ１、ＰＳ２、ＳｌｐＡの遺伝子のプロモーター、各種アミノ酸生合成系の遺伝子のプロモーターが挙げられる。
＜３＞形質転換体
本発明に用いるコリネ型細菌は、フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を有し、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターで形質転換することにより、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸生産能が付与されるコリネ型細菌であれば特に制限されない。親株となるコリネ型細菌としては、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属に統合された細菌を含み（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４１，２５５（１９９１））、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含み、具体的には以下のものが例示される。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
親株となるコリネ型細菌は、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となるジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドを効率的に供給できる菌株であることが好ましい。コリネ型細菌のアスパルトキナーゼは、本来、リジンとスレオニンによる協奏的フィードバック阻害を受けるが、フィードバック阻害を実質的に解除する変異を持ったアスパルトキナーゼ遺伝子を有するコリネ型細菌が特に好ましい。
コリネ型細菌のアスパルトキナーゼは、αサブユニットとβサブユニットからなるヘテロ蛋白質であり、αサブユニットとβサブユニットの遺伝子上のコード領域は一部重複している。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９由来のアスパルトキナーゼαサブユニット野生型の配列を配列番号３８に示す。アスパルトキナーゼのフィードバック阻害を解除するには、αサブユニット上の位置で表すと、Ｎ末端から２７９番目のアラニン残基がスレオニン残基に、あるいはＮ末端から３１１番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に、あるいはＮ末端から３０１番目のセリン残基がチロシン残基に、あるいはＮ末端から３８０番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に、あるいはＮ末端から３０８番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に、あるいはＮ末端から３２０番目のアルギニン残基がグリシン残基に、あるいはＮ末端から３４５番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に、それぞれ置換するような変異を導入することにより達成される（ＷＯ９４／２５６０５号公開パンフレット、ＷＯ００／６３３８８号公開パンフレット、米国特許６８４４１７６号公報、ＷＯ０１／０４９８５４号公開パンフレット等）。なお、アスパルトキナーゼは、野生型であってもその由来するコリネ型細菌の種類や株によって配列番号３８に示した配列と比較して数個のアミノ酸残基の相違があるものがあり、このようなアレル変異体であってもよい。このような変異の定義は、前述のｇｒｉＩおよびｇｒｉＨについて述べたものと同義であり、前記フィードバック阻害を解除するための改変部位は、当業者にとって公知の配列アラインメントを実施することにより対応する箇所を特定することができる。アスパルトキナーゼのフィードバック阻害を解除するための改変は、当業者にとって公知の方法、例えば、２−アミノエチルシステイン等のリジンアナログに耐性を有する変異株の取得や相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入によって達成できる。また、フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いてコリネ型細菌を形質転換することによっても、フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼの活性を強化したコリネ型細菌を得ることができる。なお、実施例においては、Ｎ末端から２７９番目のアラニン残基をスレオニン残基に置換することによりフィードバック阻害が解除されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＪ１１０１３５株（特開２００４−２６１１５０号公報）を使用した。また、ＡＪ１１０１３５株は、リジンパーミアーゼをコードする遺伝子であるｌｙｓＩを欠失している。
また、フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を有するコリネ型細菌は、さらにピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化したコリネ型細菌であってもよい。
親株となるコリネ型細菌は、ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドを効率的に供給できる菌株であればいずれも使用可能である。
ジヒドロキシアセトンリン酸とアスパラギン酸セミアルデヒドから３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを用いた上記コリネ型細菌の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、プロトプラスト法（Ｇｅｎｅ，３９，２８１−２８６（１９８５））、エレクトロポレーション法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７，１０６７−１０７０（１９８９））等を使用することができる。アスパルトキナーゼのフィードバック阻害を解除するための形質転換を行う場合、３，４−ＡＨＢＡ生成活性を付与するための形質転換とアスパルトキナーゼのフィードバック阻害を解除するための形質転換のいずれを先に行っても良い。
＜４＞３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の製造方法
前述のようにして得たコリネ型細菌の形質転換体を培養し、培地中で生産される３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収することによって、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を製造することができる。
形質転換体を培養するための培地は、該宿主細胞が生育する培地であれば特に制限はなく、当該技術分野で公知の方法に従って培養することができる。例えば、炭素源、窒素源、無機イオンを含有する通常の培地で培養することができる。さらに高い増殖を得るために、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を必要に応じて添加することもできる。培養温度は、通常、２５℃〜３４℃であり、ｐＨは６．５〜７．５に制御することが望ましい。培養時間は、通常、２０時間〜９０時間である。
形質転換体の培養は、酸素供給律速条件下で行うことが望ましい。具体的には菌体生育が対数増殖期に移行した段階で２．０ｐｐｍ以下に保持されることが望ましい。
該培養液から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を回収・精製する工程で用いる回収方法は、公知の方法から適宜選択すればよい。例えば、該培養液を３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の溶解性の高い酸性ｐＨに調整してから、菌体を遠心分離や膜ろ過等の方法により除去した培養液上清から回収することが好ましい。菌体を除去した培養液上清からからの３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸の回収方法としては、多孔性吸着剤による精製、晶析、沈殿化などが挙げられる。
本発明において使用される多孔性吸着剤とは、表面積の大きな多孔質の固型吸着剤であり、具体的には、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、ボーキサイト、マグネシア、活性白土、アクリル系合成吸着剤等に代表される親水性吸着剤、木炭、骨炭、活性炭、芳香族系合成吸着剤等に代表される疎水性吸着剤が挙げられる。本発明においては、不純物を吸着することよって３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上できるものであれば特に限定なく使用できる。ただし、多孔性吸着剤によって吸着される不純物とは、主として生化学的合成の過程において生産される芳香族系化合物が多く含有されるので、本発明においてはこれらの化合物が吸着しやすい活性炭や芳香族系合成吸着剤に代表される疎水性吸着剤が好適に用いられる。これら疎水性吸着剤は単独で使用してもよいし、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
活性炭が使用される場合には、その原料としては特に限定はなく、例えば木粉、ヤシ殻などの植物原料、無煙炭、石油ピッチ、コークス等の石炭、石油系原料、アクリル樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂などの合成樹脂系原料などが挙げられる。また活性炭の形状としては粉末状、粒状、繊維状、フィルターやカートリッジ状の二次加工品等があるが特に限定はなく適宜取り扱いやすいものを選択すればよい。
一方、芳香族系合成吸着剤が使用される場合には、その原料としては特に限定はないが、例えば１）無置換基型の芳香族系樹脂、２）疎水性置換基を有する芳香族系樹脂、３）無置換基型に特殊処理を施した芳香族系樹脂等の多孔性樹脂が使用できる。具体的化合物としては、例えばスチレン‐ジビニルベンゼン系樹脂等が挙げられる。
前述したように該培養液中の３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を多孔性吸着剤に接触させる目的は、不純物を多孔性吸着剤に吸着せしめ、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類の純度を向上させることにあるが、不純物と同時に目的生成物である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類も該多孔性吸着剤に少なからず吸着されてしまう場合がある。そこで該培養液中の３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を接触させた後、該多孔性吸着剤に極性有機溶媒を接触させ、該多孔性吸着剤から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に溶離させることでも３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を単離、回収することが可能である。本発明において使用される極性有機溶媒とは高い誘電率をもつ極性分子からなる有機溶媒のことをいい、上記したように、多孔性吸着剤から３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を脱着し、極性有機溶媒中に３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を溶離させることができるものであれば特に限定されることなく使用できる。極性有機溶媒は単独で使用しても構わないし、２種類以上を所望の配合比で組み合わせて使用しても良い。
本発明における晶析または沈殿化とは、目的物質が溶解している溶媒を蒸発させて濃縮したり、あるいは温度を下げたり、あるいは目的物質が溶解している溶媒に貧溶媒を加えたりすることによって、飽和溶解度よりも濃度を高くすることにより結晶または沈殿を生じさせる操作のことを言い、従来公知の方法を含め特に限定されるものではない。また生成した結晶または沈殿は、沈降、濾過、遠心分離などによって分離することができる。
本発明におけるポリベンゾオキサゾールポリマーの製造方法とは、前述の本発明の方法により得られる３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類をポリマー化する工程を含む製造方法であって、前述したように、本発明のコリネ型細菌の培養液中から多孔性吸着剤を用いて、あるいは、晶析、沈殿化などによって純度を向上させた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を、高温においてメタンスルフォン酸、もしくは、ポリリン酸のような非酸化溶媒酸中で、重縮合によって重合することによってポリマー化される（特許文献１参照）。ポリマー化の方法は種々の公知の方法を適用することによって実施可能である（米国特許５１４２０２１号公報、米国特許５２１９９８１号公報、米国特許５４２２４１６号公報）。
【実施例】
【０００９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
［実施例１］  Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子発現プラスミドの構築
（１）Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子の取得
Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来ｇｒｉＩ遺伝子及びｇｒｉＨ遺伝子（以下、両遺伝子をあわせて３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子という。）の配列は既に決定されている［Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２８１，８２３−８３３（２００６）］。この配列を参考にして、配列番号１と配列番号２に示したプライマーを合成し、常法に従って（斉藤、三浦の方法［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２，６１９（１９６３）］）調製したＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０の染色体ＤＮＡから３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子配列をコードする領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
その結果、約２．１ｋｂのＰＣＲ増幅断片が得られ、この断片の塩基配列を決定したところ、ｇｒｉＩＨ遺伝子を含む断片であることが確認された。尚、塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。ｇｒｉＩＨ遺伝子の配列を配列番号７に示す。
（２）３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子プロモーター領域の変換
Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来３，４−ＡＨＢＡ合成酵素遺伝子をコリネバクテリウムで効果的に発現させる必要がある。そのため、コリネバクテリウム・グルタミカムのＰＳ２の遺伝子のプロモーターをｇｒｉＩＨ遺伝子の上流に導入することにした。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの細胞表層タンパク質であるＰＳ２の遺伝子の配列は既に決定されている［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９，９７−１０９（１９９３）］。この配列を参考にして配列番号３と配列番号４に示したプライマーを合成し、常法に従って調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからＰＳ２タンパク質遺伝子のイニシエーションコドンの５｀−上流域のプロモーターを含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
その結果、約０．５ｋｂのＰＣＲ増幅断片が得られ、この断片の塩基配列を決定したところ、ＰＳ２タンパク質遺伝子のイニシエーションコドンの５｀−上流域のプロモーターを含む領域を含む断片であることが確認された。塩基配列の決定は前述の方法に従った。
実施例１（１）で決定したｇｒｉＩＨの遺伝子配列をもとに配列番号６、ＰＳ２タンパク質遺伝子のイニシエーションコドンの５｀−上流域のプロモーターを含む領域の塩基配列をもとに配列番号５に示したプライマーをそれぞれ合成した。配列番号５と配列番号６はＫｐｎＩのカセットプライマーである。
次に、増幅させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２遺伝子のプロモーターを含む領域と、やはり増幅させたｇｒｉＩＨ遺伝子領域のＰＣＲ反応液１μｌを混ぜて鋳型とし、配列番号５と配列番号６を用いてクロスオーバーＰＣＲを行い、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の細胞表層タンパク質遺伝子のプロモーターを含む領域に接続されたｇｒｉＩＨの融合遺伝子を増幅させた。アガロースゲル電気泳動により、約２．６ｋｂの増幅断片を検出した。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−３２２７７４記載のプラスミドｐＰＫ４のＫｐｎＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを構築した。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
［実施例２］  Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来ｇｒｉＩＨ遺伝子をコードする融合遺伝子を用いたコリネバクテリウム・グルタミカムによる３，４−ＡＨＢＡの生産
（１）Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来ｇｒｉＩＨ遺伝子をコードする融合遺伝子を用いたコリネバクテリウム・グルタミカムの形質転換
実施例１にて構築されたプラスミドｐＰＫ４ｇｒｉＩＨ（プロモーターはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９のＰＳ２遺伝子由来で、ｇｒｉＩＨ遺伝子はＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来）でコリネバクテリウム・グルタミカム野生株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９あるいはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキストラクト１０ｇ、トリプトン１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天１５ｇ、水で１Ｌに調整し、１２０℃、２０分間滅菌処理）で生育した菌株を選択した。なお、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５は特開２００４−２６１１５０に記載されているように２７９番目のアラニン残基がスレオニン残基に置換させるような変異を導入することでアスパルトキナーゼを脱感作し且つリジンパーミアーゼ遺伝子を欠損させている。当該菌株は、特開２００４−２６１１５０に記載された方法により、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９より構築することができる。
（２）フラスコを用いたコリネバクテリウム・グルタミカムによる３，４−ＡＨＢＡの生産
実施例２（１）で選択したｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９あるいはｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５をフラスコ評価培地（グルコース１００ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ、硫酸アンモニウム５５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ、チアミン塩酸塩２ｍｇ、ビオチン０．５ｍｇ、ニコチンアミド５ｍｇ、豆濃（大豆蛋白加水分解物、トータル窒素含有量として）１．０５ｇ、炭酸カルシウム５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．２に調整し、１１５℃、１５分間滅菌処理）でそれぞれ３０℃、７１時間、１２０ｒｐｍで培養した。対照実験としてｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを導入していないＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の培養も実施した。ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９あるいはｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を培養する際にはカナマイシン濃度が２５ｍｇ／Ｌになるようフラスコ評価培地に添加した。７１時間培養した結果、すべての条件でグルコースは完全に消費されていた。ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを導入したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９は３，４−ＡＨＢＡを０．７ｇ／Ｌ、ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを導入したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５は３，４−ＡＨＢＡを１．４ｇ／Ｌそれぞれ蓄積した（表１）。一方、ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを導入していないＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９では３，４−ＡＨＢＡを生成しなかった。尚、３，４−ＡＨＢＡの分析は鈴木らの方法［Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２８１，８２３−８３３（２００６）］に従い、逆相クロマトグラフィーにより定量した。以上の結果より、コリネバクテリウム・グルタミカムにＳ．ｇｒｉｓｅｕｓ  ＩＦＯ１３３５０由来ｇｒｉＩＨ遺伝子を導入することで、３，４−ＡＨＢＡを生産可能であることが示された。また、野生株であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９にくらべ、フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼ遺伝子を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５のほうがｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを導入することで３，４−ＡＨＢＡをより多く蓄積した。
【表１】
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（３）ジャーファーメンターを用いたコリネバクテリウム・グルタミカムによる３，４−ＡＨＢＡの生産
実施例２（１）で得られたｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を用いて以下の実験を行った。
グルコース５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、ＤＬ−メチオニン０．２ｇ及び蒸留水１０００ｍＬ（ｐＨ７．２）の培地を５０ｍＬずつ坂口フラスコに分注し、１２０℃、２０分間滅菌処理した。この培地にｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を植菌し、３０℃にて２４時間振とう培養した。
グルコース４０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．４ｇ及び蒸留水１００ｍＬのＡ培地と硫酸アンモニウム１．２ｇ、リン酸二水素カリウム０．４ｇ、硫酸鉄七水和物４ｍｇ、硫酸マンガン五水和物４ｍｇ、チアミン塩酸塩８００μｇ、ビオチン２０μｇ、ニコチンアミド２００μｇ、豆濃（大豆蛋白加水分解物、トータル窒素含有量として）０．４２ｇ、ＧＤ−１１３Ｋ  ４０μＬ及び蒸留水２６０ｍＬのＢ培地をそれぞれ１２０℃、２０分間滅菌処理した。滅菌後のＡ培地およびＢ培地を同じく１２０℃、２０分間滅菌処理した１．５Ｌ容のジャーファーメンターに入れて混合し、カナマイシン濃度が２５ｍｇ／Ｌになるように添加した。この混合培地に上記培養液を４０ｍＬ植菌し、以下の条件で培養を実施した。０．５ｖｖｍの速度で空気を供給しながら３０℃、ｐＨ７．２、撹拌数６００ｒｐｍ一定の酸素供給律速条件下で培養管理を行った。混合培地中のグルコースがほぼ消費された段階で、グルコース７０％液の流加を開始し、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌから３０ｇ／Ｌになるように流速を手動で制御した。グルコース７０％液を約１８０ｍＬ添加した時点で流加を停止した。培養中に適宜サンプリングを実施した。サンプリングした培養液を０．１Ｎ  ＨＣｌで１００倍に希釈し、遠心分離（１４０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）して得られた培養上清液中の３，４−ＡＨＢＡ濃度を分析した。分析は実施例２（２）の方法に従った。その結果、ｐＰＫ４ｇｒｉＩＨを有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を８７時間培養した培養上清液には３，４−ＡＨＢＡが約１７．７ｇ／Ｌ蓄積していた（図５）。
［実施例３］  フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼ遺伝子の発現を強化あるいはピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の発現を強化することによるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５の３，４−ＡＨＢＡ生成向上効果の確認
（１）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５由来フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼ遺伝子発現プラスミドの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５由来フィードバック阻害を解除した変異型アスパルトキナーゼ遺伝子（以下、ＡＫｆｂｒ遺伝子と記述する）の配列は既に決定され、変異点も明らかにされている（特開２００４−２６１１５０）。この配列を参考にして配列番号３９と配列番号４０に示したプライマーを合成し、常法に従って調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５の染色体ＤＮＡからＡＫｆｂｒ遺伝子のイニシエーションコドンの５｀−上流域のプロモーターを含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
その結果、約１．８ｋｂのＰＣＲ増幅断片が得られ、この断片の塩基配列を決定したところ、ＡＫｆｂｒ遺伝子を含む断片であることが確認された。尚、塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。ＡＫｆｂｒ遺伝子の塩基配列を配列番号４１に、対応するアミノ酸配列を配列番号４２に示す。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−０７０２９１記載のプラスミドｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐＶＣ７ＡＫｆｂｒを構築した。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
（２）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５由来ＡＫｆｂｒ遺伝子をコードする融合遺伝子を用いたコリネバクテリウム・グルタミカムの形質転換
実施例３（１）にて構築されたプラスミドｐＶＣ７ＡＫｆｂｒでＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン、５．０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキストラクト１０ｇ、トリプトン１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天１５ｇ、水で１Ｌにする）で生育した菌株（ＡＫｆｂｒ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５）を選択した。
（３）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子発現プラスミドの構築
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（以下、ＰＣ遺伝子と記述する）の配列は既に決定されている［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５０，３４６−３５２（１９９８）］。この配列を参考にして配列番号４３と配列番号４４に示したプライマーを合成し、常法に従って調製したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡからＰＣ遺伝子のイニシエーションコドンの５｀−上流域のプロモーターを含む領域をＰＣＲ法にて増幅した。ＰＣＲ反応にはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）を用い、反応条件は業者の推奨するプロトコルに従った。
その結果、約４．１ｋｂのＰＣＲ増幅断片が得られ、この断片の塩基配列を決定したところ、ＰＣ遺伝子を含む断片であることが確認された。尚、塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）とＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。ＰＣ遺伝子の塩基配列を配列番号４５に、対応するアミノ酸配列を配列番号４６に示す。この断片をＥＡＳＹＴＲＡＰ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてアガロースゲルから回収し、特開平９−０７０２９１記載のプラスミドｐＶＣ７のＳｍａＩ部位に挿入することによって、プラスミドｐＶＣ７ＰＣを構築した。前述の方法に従って、挿入断片の塩基配列の決定を行い、予想通りの融合遺伝子が構築されていることを確認した。
（４）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ＰＣ遺伝子をコードする融合遺伝子を用いたコリネバクテリウム・グルタミカムの形質転換
実施例３（３）にて構築されたプラスミドｐＶＣ７ＰＣでＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシン、５．０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＣＭ２Ｇ寒天培地（酵母エキストラクト１０ｇ、トリプトン１０ｇ、グルコース５ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天１５ｇ、水で１Ｌにする）で生育した菌株（ＰＣ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５）を選択した。
（５）フラスコを用いたＡＫｆｂｒ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５とＰＣ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５の３，４−ＡＨＢＡ生成向上効果の確認
実施例３（２）および（３）で選択したＡＫｆｂｒ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５、ＰＣ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５を用い、フラスコ評価培地（グルコース１００ｇ、硫酸マグネシウム七水和物１ｇ、硫酸アンモニウム５５ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸鉄七水和物０．０１ｇ、硫酸マンガン五水和物０．０１ｇ、チアミン塩酸塩２ｍｇ、ビオチン０．５ｍｇ、ニコチンアミド５ｍｇ、豆濃（大豆蛋白加水分解物、トータル窒素含有量として）１．０５ｇ、炭酸カルシウム５０ｇ、水で１ＬにしてｐＨ７．２に調整し、カナマイシン濃度が２５ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール濃度が５．０ｍｇ／Ｌになるよう添加）でそれぞれ３０℃、７１時間、１２０ｒｐｍで培養した。また、対照実験として、ｐＶＣ７を導入したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５も上記フラスコ評価培地にカナマイシン濃度が２５ｍｇ／Ｌになるように添加し培養を実施した。７１時間培養した結果、すべての条件でグルコースは完全に消費されていた。ＡＫｆｂｒ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５は３，４−ＡＨＢＡを１．０ｇ／Ｌ、ＰＣ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５は３，４−ＡＨＢＡを０．６ｇ／Ｌそれぞれ蓄積していた（表２）。一方、対照実験として行ったｐＶＣ７を導入したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５は３，４−ＡＨＢＡを０．５ｇ／Ｌ蓄積していた。以上の結果より、ＡＫｆｂｒ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５、ＰＣ遺伝子を増強したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５では、対照であるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＪ１１０１３５にくらべＡＨＢＡ生成能が向上した。
【表２】
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〔配列表の説明〕
配列番号１：ｇｒｉＩＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号２：ｇｒｉＩＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号３：ＰＳ２タンパク質遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号４：ＰＳ２タンパク質遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号５：ＰＳ２タンパク質遺伝子のプロモーター領域及びｇｒｉＩＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用ＰＣＲプライマー
配列番号６：ＰＳ２タンパク質遺伝子のプロモーター領域及びｇｒｉＩＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号７：ｇｒｉＩＨ遺伝子
配列番号８：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来ｇｒｉＩ遺伝子配列
配列番号９：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来ｇｒｉＩアミノ酸配列
配列番号１０：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＩ遺伝子配列
配列番号１１：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＩアミノ酸配列
配列番号１２：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＩ遺伝子配列
配列番号１３：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＩアミノ酸配列
配列番号１４：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ由来ｇｒｉＩ遺伝子配列
配列番号１５：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ由来ｇｒｉＩアミノ酸配列
配列番号１６：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．３８３由来ｇｒｉＩ遺伝子配列
配列番号１７：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．３８３由来ｇｒｉＩアミノ酸配列
配列番号１８：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ｇｒｉＩ遺伝子配列
配列番号１９：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ｇｒｉＩアミノ酸配列
配列番号２０：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来ｄｈｎＡ遺伝子配列
配列番号２１：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来ｄｈｎＡアミノ酸配列
配列番号２２：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来ｇｒｉＨ遺伝子配列
配列番号２３：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ由来ｇｒｉＨアミノ酸配列
配列番号２４：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＨ遺伝子配列
配列番号２５：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＨアミノ酸配列
配列番号２６：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＨ遺伝子配列
配列番号２７：Ｆｒａｎｋｉａ  ｓｐ．由来ｇｒｉＨアミノ酸配列
配列番号２８：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．３８３由来ｇｒｉＨ遺伝子配列
配列番号２９：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．３８３由来ｇｒｉＨアミノ酸配列
配列番号３０：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．３８３由来ｇｒｉＨ遺伝子配列
配列番号３１：Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．３８３由来ｇｒｉＨアミノ酸配列
配列番号３２：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ由来ｇｒｉＨ遺伝子配列
配列番号３３：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｃａｂｉｅｓ由来ｇｒｉＨアミノ酸配列
配列番号３４：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ｇｒｉＨ遺伝子配列
配列番号３５：Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ｇｒｉＨアミノ酸配列
配列番号３６：ｇｒｉＩコンセンサス配列
配列番号３７：ｇｒｉＨコンセンサス配列
配列番号３８：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来アスパルトキナーゼαサブユニットアミノ酸配列
配列番号３９：ＡＫｆｂｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号４０：ＡＫｆｂｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号４１：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ＡＫｆｂｒ遺伝子の塩基配列
配列番号４２：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ＡＫｆｂｒタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号４４：ＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片増幅用プライマー
配列番号４５：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ＰＣ遺伝子の塩基配列
配列番号４６：Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９由来ＰＣタンパク質のアミノ酸配列
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明によって、染料、農薬、医薬品その他有機合成品の中間体やポリベンゾオキサゾールのモノマーとして有用であるアミノヒドロキシ安息香酸類を簡便安価に製造することができる。よって、例えば、本発明によって得られた３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸を重合することでポリベンゾオキサゾール（ＰＢＯ）が得られ、これにより高強度、高弾性率、高耐熱性を有するＰＢＯ繊維やＰＢＯフィルムなどを安価に提供することが可能となる。また、原料である３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸類を生合成によって製造することが可能であることから、本発明の方法は環境低負荷型のプロセスとなり、地球環境に対して優しい製造方法である。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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