(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクターとＳｐｏ１１タンパク質の融合タンパク質と、宿主大腸菌内で同時に発現させ、該宿主大腸菌細胞を破砕し、可溶性成分を回収し、該可溶性成分から可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製する方法。
【請求項２】
前記Ｓｐｏ１１タンパク質をコードする核酸と、前記トリガーファクターとＳｐｏ１１タンパク質の融合タンパク質をコードする核酸が同一の組換えベクターに、同時発現可能に挿入されており、該組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｓｐｏ１１タンパク質をコードする核酸が以下の（ａ）又は（ｂ）で示される核酸を含む組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することにより達成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸と、９０〜９９％の相同性を有する配列からなる核酸であって、該核酸がコードするポリペプチドがＤＮＡ結合能を有する核酸
【請求項４】
前記Ｓｐｏ１１タンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するポリペプチド
【請求項５】
前記トリガーファクターが、配列番号１２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の調製法に関する。より詳細には、活性を保持したＳｐｏ１１類縁タンパク質の調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
交配による品種改良において、減数分裂期の相同ＤＮＡ組換え（遺伝的組換え、普遍的組換え、相同的組換えともいう）は重要な働きをしていると考えられている。その相同ＤＮＡ組換えは、ゲノムＤＮＡに多数存在する特定の部位にＤＮＡ二本鎖切断が導入されることで開始される。このＤＮＡ二本鎖切断は、真核生物では、パン酵母で発見されたＳｐｏ１１タンパク質若しくはその類縁タンパク質、又は、該タンパク質が核になったタンパク質複合体が行うと考えられている（非特許文献１〜３）。
相同ＤＮＡ組換えのメカニズムをより詳細に解明する上で、Ｓｐｏ１１タンパク質（及び類縁タンパク質）及び該タンパク質を含む複合体の機能を明らかにすることは、極めて重要なことであるが、そのためには、まず、Ｓｐｏ１１タンパク質の生化学的な機能解析を行う必要がある。活性を保持したＳｐｏ１１タンパク質を調製する試みは、これまでに多数行われているが、Ｓｐｏ１１タンパク質の発現自体が困難な上、発現した場合でも、可溶化したタンパク質を調製することに成功した例がない。Ｗｕらは、大腸菌内で発現させた不溶性のＳｐｏ１１（Ｒｅｃ１２）タンパク質を、尿素、グアニジン塩酸等による変性−再折りたたみの過程を経て、可溶性のＳｐｏ１１タンパク質を調製したことを報告している（非特許文献４）。Ｗｕらは、調製されたＳｐｏ１１タンパク質には、一本鎖ＤＮＡへニックを入れる活性及び二本鎖のスーパーコイルＤＮＡに切断を入れる活性を有するとも報告しているが、精製タンパク質とＤＮＡとが実際に接触あるいは結合したとの証拠は示されておらず、活性を有するとの報告には疑問が残る（非特許文献４）。
【０００３】
遺伝子の組み換え技術の進歩により、所望のタンパク質を自由に設計し、大腸菌を用いて大量に取得し得る可能性が示されてきたが、実際には、大腸菌内で発現したタンパク質は正常な立体構造を取らず、その結果、本来の活性を発揮しないことが多かった。そこで、大腸菌内で発現したタンパク質の構造を正常に折りたたませるために、分子シャペロンを利用する試みが行われ、ある程度の成果を上げている。トリガーファクター（以下、ＴＦ：ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆａｃｔｏｒ）は、大腸菌由来の分子シャペロンの１種で、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現において、発現タンパク質を可溶化した状態で取得するために利用することができ、目的のタンパク質にＴＦを融合させて発現させることで、可溶化型の目的タンパク質を得ることができる。しかし、タンパク質の生化学的特徴を正確に解明するためには、ＴＦを融合させずに目的タンパク質のみを可溶化した形態で取得し、機能解析を行う必要がある。
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｅｅｎｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９２：１１２７４−１１２７８，１９９５
【非特許文献２】Ｋｅｅｎｅｙら，Ｃｅｌｌ，８８：３７５−３８４，１９９７
【非特許文献３】Ｋｅｅｎｅｙら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６１：１７０−１８２，１９９９
【非特許文献４】Ｗｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，３８：１３６−１４４，２００４
【非特許文献５】Ｍｅｒｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：３１９６３−３１９７１，２００６
【非特許文献６】Ｈｅｓｔｅｒｋａｍｐら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２１８６５−２１８７１，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み、ＤＮＡ結合能を保持したＳｐｏ１１タンパク質を調製する方法について鋭意研究を行った結果、大腸菌由来のＴＦと融合させたＳｐｏ１１タンパク質とＳｐｏ１１タンパク質のみを同時に発現させることで、Ｓｐｏ１１タンパク質単独の可溶化形態の調製が可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、ＤＮＡ結合能を持つ可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質（ＴＦと融合していない）の提供を目的とする。
また、本発明は、ＤＮＡ結合能を持つ可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質（ＴＦと融合していない）を調製する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すでに、発明者らはＴＦと融合した可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製することを見出し、該タンパク質がＤＮＡとの結合能を有することを明らかにしている。このようなＴＦとの融合タンパク質（以下、ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質とも記載する）については、ＴＦとＳｐｏ１１タンパク質との間にプロテアーゼの認識部位を導入し、ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質を調製後、プロテアーゼによって、ＴＦとＳｐｏ１１タンパク質を分離することも可能であると考えられた。しかしながら、ＴＦと融合して発現させた可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質は、ＴＦと分離すると不安定となり、Ｓｐｏ１１タンパク質を単独で取得することは困難であった。そこで、発明者らは、ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質とＳｐｏ１１タンパク質のみを同時に発現させたところ、Ｓｐｏ１１タンパク質を単独で可溶化できることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクター又はトリガーファクターとＳｐｏ１１タンパク質の融合タンパク質と、宿主大腸菌内で同時に発現させ、該宿主大腸菌細胞を破砕し、可溶性成分を回収し、該可溶性成分から可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製する方法」である。
（２）本発明の第２の態様は、「Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクターとＳｐｏ１１タンパク質の融合タンパク質と、宿主大腸菌内で同時に発現させ、該宿主大腸菌細胞を破砕し、可溶性成分を回収し、該可溶性成分から可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製することを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記Ｓｐｏ１１タンパク質をコードする核酸と、前記トリガーファクターとＳｐｏ１１タンパク質の融合タンパク質をコードする核酸が同一の組換えベクターに、同時発現可能に挿入されており、該組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記Ｓｐｏ１１タンパク質をコードする核酸が以下の（ａ）又は（ｂ）で示される核酸を含む組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することにより達成されることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードするポリペプチドがＤＮＡ結合能を有する核酸」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記Ｓｐｏ１１タンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するポリペプチド」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記トリガーファクターが、配列番号１２で表されるアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「上記（１）乃至（６）に記載のいずれかの方法により調製された可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質」である。
（８）本発明の第８の態様は、「配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体」である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、可溶性であり、かつ完全長のＳｐｏ１１タンパク質であって、ＤＮＡ結合能を保持したタンパク質を調製することができる。
【０００９】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、可溶性であり、かつ、完全長の形態を備えているため、完全長のＳｐｏ１１タンパク質に対する抗体の作製の用に供することができる。
【００１０】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質を用いることで、減数分裂期相同ＤＮＡ組換えにおいて誘導されるＤＮＡの二本鎖切断の分子メカニズムを明らかにすることが可能となる。
【００１１】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質を用いることで、これまで明らかにされていなかった、Ｓｐｏ１１タンパク質との相互作用因子（活性化因子など）の同定、及び、Ｓｐｏ１１タンパク質を含む機能複合体の作用機序の解明が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の実施態様の１つは、「Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクター又はトリガーファクターとＳｐｏ１１タンパク質の融合タンパク質と、宿主大腸菌内で同時に発現させ、該宿主大腸菌細胞を破砕し、可溶性成分を回収し、該可溶性成分から可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製する方法」である。なお、本明細書中では、ＴＦとＳｐｏ１１タンパク質（又は、Ｓｐｏ１１−１タンパク質若しくはＳｐｏ１１−２タンパク質など）との融合タンパク質を、ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質（又は、ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質若しくはＴＦ−Ｓｐｏ１１−２タンパク質など）と記載する。
本発明の「Ｓｐｏ１１タンパク質」とは、配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するタンパク質である。
あるいは、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質としては、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するタンパク質である。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、タンパク質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
【００１３】
本発明の調製方法において、Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクター（ＴＦと称する）又はＴＦとＳｐｏ１１タンパク質との融合タンパク質と、同一の宿主大腸菌内で、同時に発現させることで、Ｓｐｏ１１タンパク質のみの可溶性の形態が調製される。ここで、ＴＦは大腸菌由来のものが好ましい。Ｓｐｏ１１タンパク質とＴＦ、あるいは、Ｓｐｏ１１タンパク質とＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質を、同一の宿主大腸菌内で発現させる方法は、当業者であれば容易に選択することができ、Ｓｐｏ１１タンパク質をコードする核酸（以下、ここではＳｐｏ１１核酸と称する）とＴＦをコードする核酸（以下、ここではＴＦ核酸と称する）、あるいは、Ｓｐｏ１１核酸とＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質をコードする核酸（以下、ここでは、ＴＦ−Ｓｐｏ１１核酸と称する。ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質等についても同様。）を、同時に発現することができるように、各々、異なる２つのプロモーターの制御下にてコントロールし、発現を誘導することができる。この場合、両タンパク質をコードする核酸は、同一の発現ベクターに挿入されていても、異なる発現ベクターに個別に挿入されていてもよいが、同一の発現ベクターに挿入されている方が好ましい。
【００１４】
ＴＦ−Ｓｐｏ１１核酸の発現コンストラクト部分については、Ｓｐｏ１１核酸とＳｐｏ１１核酸の５’側にＴＦ核酸を配置し、同一の発現ベクターに組み込むことができる。当該コンストラクト部分の構築において、Ｓｐｏ１１核酸とＴＦ核酸との間に介在配列（介在ヌクレオチド配列）を配置させてもよいが、Ｓｐｏ１１タンパク質及びＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質が正しいアミノ酸配列によって構成される状態で発現可能なように、読み枠を合わせて構築する必要がある。また、この介在ヌクレオチド配列の部分を特定のペプチダーゼ（例えば、トロンビンなど）が認識し得るペプチド配列をコードする配列として構築することもできる。このように構築することにより、生産された融合タンパク質に特定のペプチダーゼ（例えば、トロンビン）を作用させることで、Ｓｐｏ１１タンパク質とＴＦを分離し、Ｓｐｏ１１タンパク質のみの形態を取得することが可能となる。さらに、該融合タンパク質のコード領域の５’側、３’側等に、タンパク質の精製に有効なタグ配列（例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列を配置してもよい。本発明のＳｐｏ１１タンパク質には、Ｓｐｏ１１タンパク質の全長が含まれているものであれば、Ｓｐｏ１１タンパク質のみの形態、ＴＦ及び／又はタグ配列との融合した形態のいずれも含まれるものとする。
【００１５】
本発明に使用されるＴＦは、大腸菌のｔｉｇ遺伝子に由来するもので（配列番号１１及び１２）、ｐＴＩＧ２（Ｇｕｔｈｒｉｅら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，７：１８３１−１８３５，１９８８）などのｔｉｇ遺伝子を保持するベクターから取得することが好適である。取得したｔｉｇ遺伝子を適当なタンパク質発現用のベクターに導入することで、ＴＦとの融合タンパク質発現用のベクターを構築するができる。あるいは、ｔｉｇ遺伝子が予め構築された市販の発現プラスミド（例えば、ｐＣｏｌｄＴＦ  ＤＮＡ、ＴａＫａＲａ社）にＳｐｏ１１核酸を構築して、発現用のベクターを調製することもできる。本発明で使用可能なＴＦは、ＴＦの部分アミノ酸から構成されるものであっても、シャペロン活性を有するものであれば、使用することができる。例えば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列において、２４８〜４３２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｃ領域と称する）を必須構成部分とし、１〜１４４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｎ領域と称する）又は１４５〜２４７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｐ領域と称する）と融合した形態を用いてもよい。
【００１６】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質をコードする核酸は、配列番号１、３、５、７又は９で表される核酸配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１、３、５、７又は９で表される核酸配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ＤＮＡ結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるものも含まれる。配列番号１、３、５、７又は９で表わされる核酸配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７又は９で表わされるヌクレオチド配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％の核酸配列相同性を有する配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。
【００１７】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高い核酸を得ることができる。
【００１８】
本発明のＳｐｏ１１核酸は、全ての真核生物のゲノムデータベース、又は、ｃＤＮＡバンクデータからの抽出により推認することができる。なお、本願出願時点までに、パン酵母（出芽酵母）、分裂酵母、ヒトを含む哺乳類、又はショウジョウバエにおいては、各々、１種類、イネからは４種類以上、シロイヌナズナからは３種類の遺伝子が推認できている。本発明の調製方法において使用可能なＳｐｏ１１核酸は、真核生物由来のものであれば、使用可能であるが、特に、イネ又はシロイヌナズナ由来のものが好ましい。
【００１９】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質を発現させるための発現ベクターは、予めＴＦをコードする核酸が挿入されている市販のベクター（例えば、ｐＣｏｌｄＴＦ  ＤＮＡ、ＴａＫａＲａ社）を利用し、Ｓｐｏ１１をコードする核酸を該ベクターに挿入することで取得することができる。その他使用可能なベクターとしては、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等を用いることもできる。
また、発現ベクターに用いられるプロモーターとしては、目的の核酸の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。例えば、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｃｓプロモーター、Ｔ７プロモーター等が挙げられる。
【００２０】
上述のベクターに対するＳｐｏ１１核酸又はＴＦ核酸の挿入は、クローニングされたＤＮＡをそのまま、又は制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを構築することができる。また、本発明のＳｐｏ１１タンパク質をコードする核酸を保持した発現ベクターを宿主大腸菌に導入する方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用可能である。
【００２１】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、宿主大腸菌を破砕して得られる可溶性画分から取得するこができる。宿主大腸菌を培養するにあたり、培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、宿主大腸菌に適した条件下で行う。例えば、培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。培養は、通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【００２２】
Ｓｐｏ１１タンパク質を培養菌体から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液からＤＮＡ結合能を保持したＳｐｏ１１タンパク質を精製するにあたり、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｈｉｓタグを用いた場合には、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂やＣｏベースの樹脂を、ＨＡタグを用いた場合には、抗ＨＡ抗体結合カラムが使用可能である）などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。ただし、本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、プロテアーゼ等によるタンパク質分解の影響を受け易いため、Ｓｐｏ１１タンパク質の完全長を安定に取得するためには、ヘパリンカラムクラマトグラフィーを精製過程のいずれかの工程で用いることが望ましい。また、ＴＦタンパク質と有効に分離するためには、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いてグラジエント溶出を行うことが有効である。グラジエントは、例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌなどの塩による濃度勾配により実施することができ、例えば、塩濃度の下限を０Ｍ、０．３Ｍ、０，５Ｍ又は０．７Ｍとし、上限を０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．２Ｍ又は１．５Ｍとすることができ、好ましくは、下限が０Ｍ、０．３Ｍ、０，５Ｍ又は０．７Ｍ、上限が０．９Ｍ、１．０Ｍ又は１．２Ｍであり、より好ましくは、下限が０，５Ｍ又は０．７Ｍ、上限が０．９Ｍ又は１．０Ｍであり、最も好ましくは下限が０．７Ｍ、上限が１．０Ｍである。
【００２３】
本発明の他の実施態様は、「本発明のＳｐｏ１１タンパク質に対する抗体」である。本発明の抗体には、完全長のＳｐｏ１１タンパク質と特異的に結合する抗体、及びそのＦａｂ又はＦ(ａｂ’)２などの抗体断片が含まれる。
本発明の「抗体」（Ｓｐｏ１１タンパク質の活性（ＤＮＡ結合能）を促進又は阻害する抗体を含む）には、ＤＮＡ結合能を保持するＳｐｏ１１タンパク質に対するモノエピトープ特異抗体、ポリエピトープ特異抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原には本発明のＤＮＡ結合能を保持した可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を使用することができる。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。
【００２４】
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。
【００２５】
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、定法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
【００２６】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質に対する抗体には、Ｓｐｏ１１タンパク質とＤＮＡの結合を阻害する抗体も含まれる。そのような抗体としては、例えば、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４又は配列番号２５で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、特異的に認識し結合する抗体が含まれる。
【００２７】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
１．ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質
シロイヌナズナのＳｐｏ１１−１核酸（配列番号１）及びＳｐｏ１１−２核酸（配列番号３）をＡ．ｔｈａｌｉａｎａから調製した総ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行って取得した。
Ｓｐｏ１１−１核酸は、ＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを含む以下のプライマーセットにより、さらに、増幅を行ったのち、増幅産物をＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトで切断後、ｐＣｏｌｄＴＦベクター（ＴａＫａＲａ社）にクローニングした。
Ｓｐｏ１１−１に対するプライマー対
Ａｔ１Ｆ−Ｎ：５’− ＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴ    −３’（配列番号１３）
Ａｔ１Ｒ−Ｂ：５’−  ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＴＡＣＴＴＣ−３’（配列番号１４）
下線部はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩサイトを示す。
また、Ｓｐｏ１１−２核酸についても、以下のプライマーセットを用いて、Ｓｐｏ１１−１核酸と同様に、ｐＣｏｌｄＴＦベクターにクローニングした。
Ｓｐｏ１１−２に対するプライマー対
Ａｔ２Ｆ−Ｎ：５’−  ＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴ    −３’（配列番号１５）
Ａｔ２Ｒ−Ｂ：５’−  ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１６）
下線部はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩサイトを示す。
【００２９】
上述の方法で構築したＴＦ−Ｓｐｏ１１発現ベクターを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、ＯｒｉｇａｍｉＢ（ＤＥ３）、及びＲｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３））（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入した。
形質転換した大腸菌をＯＤ６００＝０．４になるまで、３７℃で液体培養し、ＩＰＴＧを０．４ｍＭになるように加え、さらに、１５℃にて２４時間培養した。次に、培養した大腸菌を、遠心分離によって回収し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｂｒｉｊｉ５８に懸濁し、菌体の粘性が低下するまで、氷上にて、ソニケーションを行った。その後、２２，０００×ｇ、３０分間、４℃にて遠心分離を行い、その上清を回収した。回収された上清を、ＴＦのＮ末端に付随しているＨｉｓ−ｔａｇ（ｐＣｐｌｄＴＦに予めコードされている）を利用し、ＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に通した。５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、３００ｍＭＮａＣｌにてカラムの洗浄を行い、その後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、３００ｍＭＮａＣｌ、０〜１５０ｍＭイミダゾールによって、グラジエント溶出を行った。
目的サイズのタンパク質が溶出されているフラクションを、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）カラムに通し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて洗浄を行った。その後、０〜１Ｍ  ＮａＣｌグラジエント溶出を行った。得られたＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質は、脱塩後、ＹＭ−３０カラム（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮した。
【００３０】
２．可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質の発現
上述のＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質は、ＴＦとＳｐｏ１１タンパク質間でトロンビンにより切断できるようにデザインされているので、理論的には、トロンビン切断により、ＴＦを含まない可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を取得できるはずであった。しかし、ＴＦを除去したＳｐｏ１１タンパク質は不安定なため、わずかな量しか得ることができなかった。そこで、Ｓｐｏ１１タンパク質をＴＦ又はＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質と、同一宿主大腸菌内で同時に発現させることを試みた。
同時発現用のベクターとして、コールドショックプロモーター（Ｃｓ）のコントロール下でＴＦ核酸が発現され、Ｓｐｏ１１−１又はＳｐｏ１１−２核酸（ＴＦと融合されていない）のＯＲＦがＴ７プロモーターのコントロール下で発現されるベクター構築し（ＣＶ１、図１Ａ）、大腸菌ＢＬ２１に導入し、発現を行った。図１に示されるように、量的には少ないがＳｐｏ１１−１及びＳｐｏ１１−２タンパク質が可溶性画分（図１、レーン２及び４）に回収された。次に、コールドショックプロモーター（Ｃｓ）のコントロール下でＴＦ−Ｓｐｏ１１−１核酸が発現され、Ｓｐｏ１１−１又はＳｐｏ１１−２核酸（ＴＦと融合されていない）のＯＲＦがＴ７プロモーターのコントロール下で発現されるベクター構築し（ＣＶ２、図１Ａ）、同様に発現を行ったところ、ほとんどのＳｐｏ１１−１タンパク質（ＴＦと融合されていない）を可溶性画分に回収することができた（図１Ｂ、レーン６）。
以上の結果から、本発明により、ＴＦと融合することなく、Ｓｐｏ１１タンパク質を可溶性の形態で取得できることが示される。
【００３１】
３．ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質のＤＮＡ結合活性
調製したＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質のＤＮＡ結合能について検討を行った。
ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質（０−１２ｐｍｏｌ）を、ネガティブスーパーコイル型閉環状二重鎖ＤＮＡであるｐＵＣ１８（ＴａＫａＲａ社）（７０ｆｍｏｌ）、Ｍ１３ｍｐ１８一本ＤＮＡ（ＴａＫａＲａ社）（２０ｆｍｏｌ）又は１８０ｂｐ−ＤＮＡ（７０ｆｍｏｌ）と、反応液（１０μｌ）（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０２ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で、３７℃、５分間反応させた後、エチジウムブロマイドの存在下、アガロースゲル電気泳動を行った。なお、１８０ｂｐ−ＤＮＡ（直鎖状二重鎖ＤＮＡ）は、以下のプライマーセットを用いて、ｐＵＣ１８からＰＣＲにより増幅した。
１８０ｂｐ−ＤＮＡ増幅プライマーセット
１８０−Ｆ：５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１７）
１８０−Ｒ：５’−ＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣ−３’（配列番号１８）
【００３２】
アガロース電気泳動の結果、ｐＵＣ１８にＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質が結合して、量依存的に上方にシフトしたＤＮＡのバンドが確認された（図２Ａ、ＴＦ−ＳＰＯ１１−１）。一方、Ｓｐｏ１１−１タンパク質を欠いたＴＦのみを発現させた調製物では、バンドのシフトが起こらなかった（図２Ａ、ＴＦ）。また、１８０ｂｐ−ＤＮＡに関しても、同様の結果が得られた（図２Ｂ）。さらに、一本鎖ＤＮＡに関しても、二重鎖ＤＮＡに比べると弱いものの、ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質が結合し得ることが分かった（図３Ａ）
一方、ＴＦ−Ｓｐｏ１１−２タンパク質に関しても、ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質と同様の結果が得られた（図３Ａ，Ｂ）。ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質とＴＦ−Ｓｐｏ１１−２タンパク質のＤＮＡ結合能に顕著な相違は認められず、両タンパク質を混合した場合においても、相乗的効果は認められなかった（図３Ｂ）。
以上のことから、本発明の方法により調製したＳｐｏ１１タンパク質は可溶性の状態で取得することができ、かつ、ＤＮＡ結合能を保持していることが明らかとなった。
【００３３】
４．Ｓｐｏ１１タンパク質のＤＮＡ結合部位の同定
分裂酵母のＳｐｏ１１（Ｒｅｃ１２）タンパク質に関する研究により、２０２番目のＧｌｙがＤＮＡ結合との結合に重要であることが示唆されていたが（ＤｅＷａｌｌら，Ｇｅｎｅ  ３５６：７７−８４  ２００５）、この点を生化学的に証明したとの報告は未だにない。Ｓｐｏ１１ファミリータンパク質は５つの保存されたアミノ酸配列モチーフ（Ｉ−Ｖ）（図４Ａ）を有しており、モチーフＩＩＩ及びＩＶがＤＮＡ結合部位を形成していると予想される（ＤｅＷａｌｌら，Ｇｅｎｅ  ３５６：７７−８４  ２００５）。
そこで、モチーフＩに含まれる１３０番目のＡｒｇ、モチーフＩＶに含まれる２１５番目のＧｌｙ、２２２番目のＡｒｇ、２２３番目のＡｒｇ、２２２６番目のＡｒｇ、及びモチーフ外に存在する２０７番目のＡｒｇ及び２５４番目のＡｒｇを、各々、酸性アミノ酸であるグルタミン酸に置換した変異体ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質を作成し、各変異体のＤＮＡ結合能について検討した。その結果、モチーフＩＶに変異を持つ全ての変異体（Ｇ２１５Ｅ，Ｒ２２２Ｅ，Ｒ２２３Ｅ，Ｒ２２６Ｅ）がＤＮＡ結合能を喪失又は低下させたのに対し、それ以外の変異体（Ｒ１３０Ｅ，Ｒ２０７Ｅ，Ｒ２５４Ｅ）は、野生型と同等のＤＮＡ結合能を示した（図５）。以上の結果から、２１５番目のＧｌｙ、２２２番目のＡｒｇ、２２３番目のＡｒｇ、２２６番目のＡｒｇがＤＮＡ結合において重要な役割を果たしており、モチーフＩＶ（図４Ｂ）のアミノ酸領域がＳｐｏ１１タンパク質のＤＮＡ結合能に重要であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、ＴＦなどの他のタンパク質と融合させることなく、ＤＮＡ結合能を保持した可溶性のタンパク質として、初めて調製されたものである。Ｓｐｏ１１タンパク質は、減数分裂期相同ＤＮＡ組換えにおけるＤＮＡ二重鎖の切断過程において、重要な働きを行っていることから、本発明のＳｐｏ１１タンパク質を用いた作用メカニズムの解明により、高等動植物の減数分裂期相同ＤＮＡ組換えの人為的な制御方法を開発することが可能となる。さらに、本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、ゲノムの特定部位や特定核酸を標的とした効率的な遺伝情報修飾技術の開発の促進に多大なる効果をもたらすものである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＴＦと融合していない可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質とＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質との共発現の結果を示す。（Ａ）共発現ベクターのＯＲＦを模式的に示した図である。ＴＦ−ＳＰＯ１１−１はコールドショックプロモーター（ＣｓＰ）のコントロール下にあり、ＴＦと融合していないＳＰＯ１１−１又はＳＰＯ１１−２はＴ７プロモーター（Ｔ７Ｐ）のコントロール下にある。（Ｂ）ＴＦ、ＴＦ−ＳＰＯ１１−１及びＳＰＯ−１１−１又はＳＰＯ−１１−２（ＴＦと融合していない）の共発現の結果を抗Ｈｉｓタグ抗体によるイムノブロッティグにより解析した結果である。ｓｕｐ（レーン２、４、６、８）とｐｐｔ（レーン１、３、５、７）は、各々、タンパク質を発現させた大腸菌を破砕し、遠心後に得られた、可溶性画分（上清）と不溶性画分（ｐｐｔ）である。矢印は、各々、Ｈｉｓ−ＴＦ−ＳＰＯ１１−１（９４ｋＤａ）、Ｈｉｓ−ＴＦ（５３ｋＤａ）、Ｈｉｓ−ＳＰＯ１１−１（４４ｋＤａ）又はＨｉｓ−ＳＰＯ１１−２（４５ｋＤａ）の位置を示す。
【図２】ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質を用いたＤＮＡ結合アッセイの結果を示す。（Ａ）二重鎖ＤＮＡとの結合アッセイの結果を示す。ｐＵＣ１８（７０ｆｍｏｌ）をＴＦのみ又はＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質（０、４、８、１２ｐｍｏｌ）と３７℃、５分間反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した結果である。（Ｂ）１８０ｂｐ−ＤＮＡとの結合アッセイの結果を示す。１８０ｂｐ−二重鎖ＤＮＡ（７０ｆｍｏｌ）をＴＦのみ又はＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質（０、４、８、１２ｐｍｏｌ）と３７℃、５分間反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した結果である。
【図３】ＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質又はＴＦ−Ｓｐｏ１１−２タンパク質を用いたＤＮＡ結合アッセイの結果を示す。（Ａ）一本鎖ＤＮＡとの結合アッセイの結果を示す。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（２０ｆｍｏｌ）をＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質又はＴＦ−Ｓｐｏ１１−２タンパク質（０、４、８、１２ｐｍｏｌ）と３７℃、５分間反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した結果である。（ｂ）ｐＵＣ１８（７０ｆｍｏｌ）をＴＦ−Ｓｐｏ１１−１タンパク質又はＴＦ−Ｓｐｏ１１−２タンパク質（各０、４、８、１２ｐｍｏｌ）の混合物と３７℃、５分間反応させ、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した結果である。
【図４】Ｓｐｏ−１１−１タンパク質のアミノ酸置換変異体の模式図及びモチーフＩＶのアミノ酸配列を示す。（Ａ）Ｓｐｏ１１−１タンパク質の各モチーフの位置とアミノ酸変異の位置を示す。（Ｂ）異なる種に由来するＳｐｏ１１−１タンパク質のモチーフＩＶのアミノ酸配列を比較した図である。ＳＰＯ１−１及びＳＰＯ１１−２はＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ由来、ＤｍＳｐｏ１１はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来、ＨｓＳｐｏ１１はＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ由来、ＳｃＳｐｏ１１はＳａｃｃｈａｒａｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来、ＳｐＳｐｏ１１はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来、ＭｊＴｏｐ６はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のモチーフＩＶの配列を示す。
【図５】変異体ＴＦ−Ｓｐｏ−１１−１タンパク質の二重鎖ＤＮＡに対する結合能を検討した結果を示す。ｐＵＣ１８ＤＮＡを各変異体ＴＦ−Ｓｐｏ１−１タンパク質（８又は１２ｆｍｏｌ）と３７℃で５分間反応させた後、アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色した結果である。ｗｉｌｄは、変異を導入していないＴＦ−Ｓｐｏ−１１−１タンパク質のことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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