(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞株においてハイブリッドプラスミドの延長されたエピソーム複製を与える発現系であって、
a）配列番号2に示されるポリオーマウイルスのコア起点、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のE2結合部位を含むパピローマウイルスMME、任意の選択マーカー、および真核細胞内で発現するように調節領域と機能的に連結された目的遺伝子からなる異種ベクター；および
b）上記ベクターが発現される適合性細胞株であって、選択圧の存在または非存在下で構成的にBPV E2タンパク質およびPyV LTタンパク質を発現する上記細胞株、を含む上記発現系。
【請求項２】
上記細胞株におけるBPV E2およびPyV LTの発現が、BPV E2およびPyV LTタンパク質のコード配列を含む1つ又は複数のベクターにより与えられる、請求項１に記載の発現系。
【請求項３】
MMEがBPV MMEである、請求項１または２に記載の発現系。
【請求項４】
E2結合部位が本質的に配列番号１に示されるものである、請求項３に記載の発現系。
【請求項５】
E2結合部位が本質的に配列番号５に示されるものである、請求項４に記載の発現系。
【請求項６】
MMEが、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のHPV E2結合部位を含む、請求項１または２に記載の発現系。
【請求項７】
E2結合部位が本質的に配列番号9に示されるものである、請求項６に記載の発現系。
【請求項８】
細胞株がマウス、ハムスターまたはヒト起源のものである、請求項１〜７のいずれか1項に記載の発現系。
【請求項９】
細胞株がCHO、COPおよびヒト細胞株293からなる群より選択される、請求項８に記載の発現系。
【請求項１０】
真核細胞株においてハイブリッドプラスミドの延長されたエピソーム複製を与える発現系であって、
a）配列番号2に示されるポリオーマウイルスのコア起点、少なくとも16個のEBNA1結合部位を含むEBVのFRエレメント、任意の選択マーカー、および真核細胞内で発現するように調節領域と機能的に連結された目的遺伝子を含む異種ベクター；および
b）上記ベクターが発現される適合性細胞株であって、選択圧の存在または非存在下で構成的にEBV EBNA1タンパク質およびPyV LTタンパク質を発現する上記細胞株、を含む上記発現系。
【請求項１１】
EBNA1結合部位が、配列番号：10、11、12および13からなる群より選択される配列に示されるものである、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１２】
細胞株がマウス、ハムスターまたはヒト起源のものである、請求項１０または１１に記載の発現系。
【請求項１３】
細胞株におけるEBV EBNA1およびPyV LTの発現がEBV EBNA1およびPyV LTタンパク質のコード配列を含むベクターにより与えられる、請求項１０に記載の発現系。
【請求項１４】
真核細胞株においてハイブリッドプラスミドの延長されたエピソーム複製を与える発現系であって、
a）配列番号2に示されるポリオーマウイルスのコア起点、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のE2結合部位を含むパピローマウイルスMME、任意の選択マーカー、および真核細胞内で発現するように調節領域と機能的に連結された第1の目的遺伝子を含む第1の異種ベクター；および
b）配列番号2に示されるポリオーマウイルスのコア起点、少なとも16個のEBNA1結合部位を含むEBVのFRエレメント、任意の選択マーカー、および真核細胞内で発現するように調節領域と機能的に連結された第2の目的遺伝子を含む第2の異種ベクター；および
c）上記ベクターが発現される適合性細胞株であって、選択圧の存在または非存在下で構成的にBPV E2タンパク質、EBV EBNA1タンパク質およびPyV LTタンパク質を発現する上記細胞株を含む上記発現系。
【請求項１５】
上記細胞株におけるBPV E2、EBV EBNA1およびPyV LTの発現がBPV E2、EBV EBNA1およびPyV LTタンパク質のコード配列を含むベクターにより与えられる、請求項１４に記載の発現系。
【請求項１６】
MMEがBPV MMEである、請求項１４または１５に記載の発現系。
【請求項１７】
E2結合部位が本質的に配列番号1に示されるものである、請求項１６に記載の発現系。
【請求項１８】
E2結合部位が配列番号5に示されるものである、請求項１７に記載の発現系。
【請求項１９】
MMEが少なくとも5個のHPV E2結合部位を含む、請求項１４または１５に記載の発現系。
【請求項２０】
E2結合部位が本質的に配列番号9に示されるものである、請求項１９に記載の発現系。
【請求項２１】
EBNA1結合部位が配列番号10、11、12および13からなる群より選択される配列に示されるものである、請求項１４に記載の発現系。
【請求項２２】
細胞株がマウス、ハムスターまたはヒト起源のものである、請求項１４〜２１のいずれか1項に記載の発現系。
【請求項２３】
細胞株がCHO、COPおよびヒト細胞株293からなる群より選択される、請求項２２に記載の発現系。
【請求項２４】
系がさらに第3のベクターを含み、該第3のベクターはパピローマウイルスの最小のコア起点、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のE2結合部位を含むパピローマウイルスMMEおよび、真核細胞内で発現するように調節領域と機能的に連結された第3の目的遺伝子を含み；そして細胞株が構成的にBPV E2タンパク質、BPV E1タンパク質、EBV EBNA1タンパク質およびPyV LTタンパク質を発現する、請求項１４〜２３のいずれか1項に記載の発現系。
【請求項２５】
細胞株におけるBPV E2、BPV E1、EBV EBNA1およびPyV LTの発現がBPV E1、BPV E2、EBV EBNA2およびPyV LTタンパク質のコード配列を含むベクターにより与えられる、請求項２４に記載の発現系。
【請求項２６】
発現系がさらに第4のベクターを含み、該第4のベクターがパピローマウイルスの最小のコア起点、少なくとも16個のEBNA1結合部位を含むEBV FR-エレメント；および真核細胞内で発現するように調節領域と機能的に連結された第4の目的遺伝子を含む、請求項２４または２５に記載の発現系。
【請求項２７】
遺伝子産物の産生を延長する方法であって、
a）構成的にBPV E2タンパク質およびPyV LTを発現する哺乳動物の宿主細胞を準備するステップ；
b）哺乳動物の宿主細胞に、配列番号2に示さるポリオーマウイルスのコア起点、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のE2結合部位を含むパピローマウイルスMME、遺伝子産物をコードする目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含む異種ベクターを導入するステップ；および
c）哺乳動物の宿主細胞を適当な培養条件下で培養するステップ
を含む上記方法。
【請求項２８】
遺伝子産物の産生を延長する方法であって、
a）構成的にPyV LTおよびEBV EBNA1タンパク質を発現する哺乳動物の宿主細胞を準備するステップ；
b）哺乳動物の宿主細胞に、配列番号2に示さるポリオーマウイルスのコア起点、少なくとも16個のEBNA1結合部位を含むEBVのFR-エレメント、遺伝子産物をコードする目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含む異種ベクターを導入するステップ；および
c）哺乳動物の宿主細胞を適当な培養条件下で培養するステップ
を含む上記方法。
【請求項２９】
2種の遺伝子産物の産生を延長する方法であって、
a）構成的にPyV LT、BPV E2およびEBV EBNA1タンパク質を発現する哺乳動物の宿主細胞を準備するステップ；
b）哺乳動物の宿主細胞に、完全なポリオーマウイルス起点からエンハンサーエレメントを除去することにより得られたポリオーマウイルスのコア起点、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のE2結合部位を含むパピローマウイルスMME、第1の遺伝子産物をコードする第1の目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含む第1の異種ベクターを導入するステップ；
c）哺乳動物の宿主細胞に、配列番号2に示されるポリオーマウイルスのコア起点、少なくとも16個のEBNA1結合部位を含むEBVのFR-エレメント、第2の遺伝子産物をコードする第2の目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含む第2の異種ベクターを導入するステップ、ただし上記第1および第2のベクターを、同時にまたは任意の順序で連続的に細胞に導入する；および
哺乳動物の宿主細胞を適当な培養条件下で培養するステップ
を含む上記方法。
【請求項３０】
3種または4種の遺伝子産物の産生を延長する方法であって、
a）構成的にPyV LT、BPV E2、BPV E1およびEBV EBNA1タンパク質を発現する哺乳動物の宿主細胞を準備するステップ；
b）哺乳動物の宿主細胞に、配列番号2に示されるポリオーマウイルスのコア起点、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のE2結合部位を含むパピローマウイルスMME、第1の遺伝子産物をコードする第1の目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含む第1の異種ベクターを導入するステップ；
c）哺乳動物の宿主細胞に、配列番号2に示されるポリオーマウイルスのコア起点、少なくとも16個のEBNA1結合部位を含むEBVのFR-エレメント、第2の遺伝子産物をコードする第2の目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含む第2の異種ベクターを導入するステップ；および
d）哺乳動物の宿主細胞に第3のベクターおよび場合により第4のベクターを導入するステップであって、該第3のベクターはBPVの最小起点、E2結合部位間がスペーサー配列によって分離された少なくとも5個のE2結合部位を含むパピローマウイルスMME、第3の遺伝子産物をコードする第3の目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含み；そして該第4のベクターはBPVの最小起点、少なくとも16個のEBNA1結合部位を含むEBV FR-エレメント、および第4の遺伝子産物をコードする第4の目的遺伝子、ならびに場合により選択マーカーを含む上記ステップ；
ただし、上記第1、第2、第3および第4のベクターを、同時にまたは任意の順序で連続的に細胞に導入する；および
哺乳動物の宿主細胞を適当な培養条件下で培養するステップ
を含む上記方法。
【請求項３１】
第1、第2、第3および第4の目的遺伝子のいずれか1つが構成的プロモーター下に存在する、請求項２７〜３０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３２】
構成的プロモーターがCMVである、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明はハイブリッドプラスミドの延長された維持複製に関する。本発明はまた、真核細胞株におけるハイブリッドプラスミドの延長されたエピソーム複製に関する。本発明はまた、真核細胞株における遺伝子産物の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
いくつかの真核生物DNAウイルスは、そのゲノムを増殖宿主細胞内に染色体外の多コピー核エピソームとして維持する。かかるエピソーム維持はウシパピローマウイルス1型（BPV-1）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）ならびにカポジ肉腫関連ヒトヘルペスウイルス8型（HHV8）の潜伏感染の特徴である。分裂細胞集団におけるウイルスゲノムの潜伏は、細胞周期の2つの期におけるウイルスゲノムの活動（すなわち、S期の間のウイルスゲノム複製、および宿主細胞の有糸分裂の間の複製ゲノムの娘細胞への適当な分離と分配）を必要とする。BPV-1およびγヘルペスウイルスファミリーの2種のメンバーであるEBVおよびHHV8については、有糸分裂の間のウイルスゲノムの娘細胞への効果的な分離および核保持は、ウイルスゲノムを宿主の有糸分裂染色体に結合する分子リンカーの役割を果たす単一のウイルスタンパク質によって仲介される。このリンカータンパク質は、BPV-1についてはウイルス調節タンパク質E2、EBVについてはウイルストランス活性化因子EBNA1、そしてHHV8については、ウイルス転写抑制因子LANA1である。
【０００３】
in vivoでのBPV-1 DNA複製の開始のためには、シス作用性の最小起点領域およびトランス作用性の2つのウイルスタンパク質であるE1およびE2が絶対に必要である。しかし、最小起点（MO）は分裂細胞における安定な染色体外複製にとって十分でない。追加のエレメントであるミニ染色体維持エレメント（MME）が分裂細胞においてウイルスE1およびE2タンパク質の存在の下でのゲノムの長期にわたるエピソームの持続性を保証する。BPV-1ゲノムにおいて、E2に対して異なる親和性をもつ全17個のE2タンパク質結合部位を同定することができる（これらのうちの12個は非コード上流調節領域（URR）に位置する）。本発明者らはミニ染色体維持エレメント（MME）活性をE2結合部位のサブセットにより提供できることを示した。BPV-1ゲノムの安定な維持における多量体のE2タンパク質結合部位の機能は、E2タンパク質にアンカー機能を与えることであり、それによってMME含有プラスミドを有糸分裂染色体に繋げる。BPV-1ゲノムと宿主クロマチンの間のこの連結はまた、有糸分裂の間に核膜が再構築されるときに、ウイルスゲノムが核を標的化することを保証する。EBVの場合、複製されたゲノムの安定な維持は、EBNA1タンパク質とFR-エレメント（多量体のEBNA1タンパク質結合部位から成る）によって達成される。
【０００４】
本発明者らは、BPV1 E2タンパク質依存性MME（Abroiら、2004）およびEBV EBNA1依存性FR（Mannik、JaniksonおよびUstav、未刊行）の分離／分配活性はプラスミドの複製とは独立して機能することを示した。EBNA1／FRの安定維持機能は、細胞複製起点の長期エピソーム維持を保証するために用いられている。E2／MME依存性の安定維持機能は、今まで異種複製起点について試験されたことは一度もなかった。
【０００５】
ポリオーマウイルスゲノムまたは複製因子による許容細胞のトランスフェクションまたは感染は、増幅的複製をもたらして過複製による細胞死に導く。BPV-1起点に基づくエピソーム複製の機構はさらに複雑でありかつ制御されている。一方では、多くの面でポリオーマウイルス細胞溶解性過複製に似ている第１増幅複製ステップは、パピローマウイルスDNAの安定なエピソーム複製の確立にとって極めて重要である。かかる複製はウイルスタンパク質の発現レベルおよびウイルスゲノムのコピー数の増加に導く。しかし、特定の限度を超えるE1タンパク質濃度の増加は、BPV-1起点の「タマネギ肌（onion-skin）」型複製および高頻度のDNA再配列の傾向を有する複製中間物の形成およびウイルスDNA断片の染色体DNAへの組み込みを誘発する。ウイルスゲノムの安定性と完全性を維持するために、ウイルスを特定の機構に適用して、複製フォークの開始と延長の間の適当なバランスならびに細胞分裂期間のウイルスプラスミドの分離／分配を保証しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先に記載された安定なエピソーム維持系（米国特許第6,479,279号）は同種の複製起点を備えていた。これらの系の特徴は例えば高い突然変異頻度、とりわけ組換えである。さらに、上記系は単一細胞において安定な複製を与えるのでなく、細胞の一部はそのプラスミドを毎世代に失う。この事実は例えばタンパク質生産に利用される系に対して深刻な制限を生じる。Nilssonら（1991）はエンハンサー機能を与える系を記載しているが、この系は安定性の点で深刻な制限を有する。本開示は、従来の系が直面している問題を克服する改良を提供する。本開示は、異種複製起点を有する延長エピソーム維持系を提供する。本開示による異種系は同種系と併用することができる。本開示は、コアポリオーマウイルス起点を含有する（エンハンサー機能を含有しない）プラスミドが娘細胞に分割する系を提供する。本開示による系には、ポリオーマウイルス起点（エンハンサー機能を含有しないコアポリオーマウイルス起点）の固有の立体配置は安定でありかつヘルパータンパク質の存在下で分離される系を提供する。本発明の系の利点はキメラ起点のエピソーム状態が再配列なしに維持されることである。本発明はさらに、ポリオーマウイルス起点およびパピローマ起点をもつベクターを単一の細胞中に組み合わせ、それにより、2種以上の異なる組換えタンパク質またはRNAを1つの細胞内に発現できる可能性を提供する。本開示の系のさらなる利点は、最大で2、3週間しか維持できない従来の全ての系（例えば、米国特許出願第10/938,864号は約2週間存続する安定なエピソーム複製が可能な系を記載する）と異なり、細胞内で数ヶ月まで存続する安定なエピソーム維持を提供することである。
【０００７】
本発明者らが解決を目指す問題は、細胞系における遺伝子産物の安定な発現が高価でかつ時間のかかることである。この問題は本開示において、細胞内の遺伝子産物の一過性発現により解決された。目的の遺伝子は核においてクロマチンの外側で複製されかつ維持され、ベクターは細胞分裂および分離で子孫に移るので、本開示の方法により、遺伝子産物の発現を数ヶ月間継続することができる。
【０００８】
細胞株における安定な発現の開発は、通常、数ヶ月またはさらに数年を要する。本発明者らが本明細書に記載する一過性の系はそれらより遥かに速くそれ故に有用でありかつ新規である。他方では、今までに知られる一過性系は非常に限られた、すなわち、最大で数日の半減期しか有しない。さらに、これらの系は組換えウイルスの構築を必要としうるので、系は高価かつ非常に時間のかかるものになりうる。本発明者らの系は既存技術に対して著しく改善されており、本開示による系はその発現レベルを数週間そして数ヶ月まで維持する一過性発現系を提供する。
【０００９】
本開示は、本開示によるベクターが選択マーカーを含有しかつ細胞を選択剤を含有する培地で培養するときに、安定な細胞株を開発する可能性を提供する。本開示はまた、ベクターが選択マーカーを含有しないときに、短時間、遺伝子産物を細胞株において発現する可能性も提供する。しかし、選択圧を使わなくても、本系は従来公知の他のいずれの比較しうる系より長く存続する安定な維持を提供する。
【００１０】
本開示はさらに、１以上の遺伝子産物が異なるレプリコンから発現されかつ上記レプリコンが同じ細胞内に位置する、多レプリコン発現系の開発を可能にする。かかる機構は、例えば、1つの細胞内で異なる抗体サブユニットまたは酵素サブユニットを発現させるのに、または細胞に発現された高分子の相互作用を研究するのに有用である。
【００１１】
本開示の目的は、ポリオーマウイルスコア起点の延長エピソーム維持を与えるための機構を提供することである。
【００１２】
本開示の他の目的は、選択圧なく、ポリオーマウイルスコア起点の延長エピソーム維持を与えるための機構を提供することである。
【００１３】
本開示の他の目的は、BPV1またはEBV由来の分離／分配エレメントと結合した構築物を提供することである。
【００１４】
本開示のさらなる目的は、ハイブリッドプラスミドの複製およびエピソーム維持を支援できる細胞株を提供することである。
【００１５】
本開示のさらなる目的は、真核細胞における遺伝子産物の発現を長期にわたって存続するための一過性の系を提供することである。
【００１６】
本開示のさらなる目的は、2以上の異なるベクターを保持する細胞株を提供して、それにより2以上の異なる目的の遺伝子の発現を提供することである。
【００１７】
本開示のさらなる目的は、真核細胞における診断および他の用途のために、治療用の、予防用のまたは内毒素を含まない遺伝子産物を長期にわたって持続的に産生する一過性の系を提供することである。遺伝子産物はキメラまたは天然の遺伝子産物であってもよい。
【００１８】
本開示の他の目的は、真核細胞においてRNAまたはタンパク質を長期にわたって持続的に産生する一過性の系を提供することである。上記細胞は培養することができ、遺伝子産物を小規模または大規模に（実験室フラスコおよびペトリ皿から大発酵槽まで）発現させることができる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
複製の開始および伸長とエピソーム起点プラスミドの分離／分配との間の協調関係を研究する目的で、本発明者らは、ポリオーマウイルス複製起点とBPV1のミニ染色体維持エレメント（MME）とを含むいくつかのハイブリッド複製起点を設計した。本発明者らは、ハイブリッド起点の延長エピソーム維持複製を確立する際に、PyVエンハンサーおよびE2依存性エンハンサーのPyVコア起点の機能性に与える効果を、E2タンパク質およびPyVラージT（LT）抗原を発現する細胞株において分析した。さらに本発明者らはハイブリッド起点の維持機能に必要なBPV1 E2タンパク質の機能を研究し、そしてE2タンパク質の転写活性化機能は安定な複製の確立を促進できないことを見出した。EBV FR-エレメントとポリオーマウイルス複製起点とを含む類似のハイブリッド起点を構築して、EBNA1およびポリオーマウイルスラージT（LT）抗原を発現する細胞株において研究した。本発明者らのデータは、BPV-1およびEBVの分離／分配機能が、ポリオーマウイルスのコア起点の延長エピソーム維持に効果的に利用できることを納得させるものである。
【００２０】
ウシパピローマウイルス1型、エプスタイン・バーウイルスおよびヒトヘルペスウイルス8型のゲノムは潜伏感染の間、分裂宿主細胞においてエピソームとして安定して維持される。分離／分配機能は、単一のウイルス特異的DNA結合タンパク質と多量体のタンパク質結合部位とにより、これらの起点に与えられる。本開示は、多量体のE2結合部位を含むBPV-1 E2タンパク質依存性MMEは、BPV-1 E2タンパク質およびPyVラージT-抗原（LT）の存在下で、マウスポリオーマウイルス（PyV）コア起点プラスミドに対して長期維持複製機能を提供できるが、現在までに完全なPyV起点に対しては提供できないことを示す。PyV LTおよびBPV-1 E2（COP5/E2）を発現するマウス繊維芽細胞株において、少なくとも5個の多量体E2タンパク質結合部位と連結したPyVコア起点を保持するプラスミドは、（選択条件下で）5ヶ月を超えて観察できる長期エピソーム複製の能力を示す。BPV-1 E2のドメインの全体構造の保全性ならびに完全性が効果的なエピソーム維持に必要である。本発明者らのデータは明らかに、ポリオーマウイルスのラージT抗原依存性複製機能およびBPV-1の延長維持機能は、特定の立体構造に適合しうることを示す。ハイブリッド起点を保持するエピソームプラスミドの消失のさらなる定量分析は、MME依存性プラスミドが毎世代6％の頻度で失われることを示した。本発明者らはまた、PyVコア起点の維持機能／複製活性化をエプスタイン・バーウイルスファミリーの反復体（repeats）（FR-エレメント）とEBNA1タンパク質とにより与えることができるプラスミドを構築した。これらのプラスミドの場合、ポリオーマウイルスのコア起点プラスミドの維持は、1細胞世代間のプラスミドの13％消失により特徴付けられた。本発明者らのデータは明らかに、異なるウイルス由来の維持機能は互換性があり、様々な細胞における異なる異種起点に対して分離／分配機能を与えることができかつ遺伝子産物の発現に利用できることを示す。
【００２１】
図面の簡単な説明
図面の簡単な説明については下記参照。
【００２２】
配列表
本出願はコンピューター読取可能なディスケットによるおよび文書による配列データを含む。文書版の配列データはディスケットにより提供されるものと同一である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の詳細な説明
定義：
本開示においては次の用語は下記に定義されるように使用される。
【００２４】
「パピローマウイルス」はパピローマファミリーのウイルスのメンバーを意味し、限定されるものでないが、ウシパピローマウイルス（BPV）およびヒトパピローマウイルス（HPV）を含む。
【００２５】
「ポリオーマウイルス」はポリオーマファミリーのウイルスのメンバーを意味し、限定されるものでないが、マウスポリオーマウイルス（PyV）を含む。
【００２６】
「ポリオーマウイルスのコア起点（core origin）」は、DNA合成の開始に必要なポリオーマウイルス内の最小のcis配列を意味する。PyVコア起点は本質的に配列番号2に示される。PyVのコア起点は、配列PLY2CG（Genebank受託番号J02288）中のヌクレオチド5232〜5297／1〜88に位置して全154bp（5232および88を含む）である。ポリオーマのコア起点はまた、PyVコア起点または最小コア起点とも呼ばれる。
【００２７】
BPV1の最小起点（MO）は米国特許第6,479,279号に記載の通り定義される。
【００２８】
FRエレメントはエプスタイン・バーウイルスファミリーの反復体を意味する。FRエレメントは少なくとも16個のEBNA1結合部位を含む。配列番号14は1つの代替的な合成FR-エレメントのヌクレオチド配列を与える。このエレメントでは20個のEBNA結合部位が使用された。FR-エレメント中のEBNA1-結合部位は互いに類似する必要はない。EBNA1結合部位は配列番号10〜13のいずれに示されるものであってもよい。
【００２９】
「EBNA1」はEBVのウイルストランス活性化因子を意味し、Genbank受託番号V01555をもつEBV配列のnt 7421〜8043にコードされる。
【００３０】
「E1」は、BPVサブタイプ1のnt 849〜2663もしくはHPVのサブタイプ11のnt 932〜2779によりコードされるタンパク質、他のパピローマウイルスの同等なE1タンパク質、またはパピローマウイルスのE1タンパク質の機能性断片もしくは突然変異体、すなわちE1の複製特性を持つE1の断片または突然変異体を意味する。
【００３１】
「E2」は、BPVサブタイプ1のnt 2594〜3837もしくはHPVのサブタイプ11のnt 2723〜3823によりコードされるタンパク質、他のパピローマウイルスの同等なE2タンパク質、またはパピローマウイルスのE2タンパク質の機能性断片もしくは突然変異体、すなわちE2の複製特性を持つE2の断片または突然変異体を意味する。
【００３２】
「ミニ染色体維持エレメント」（MME）は、パピローマウイルスの複製に必須なウイルスまたはヒトタンパク質が結合するパピローマウイルスゲノムの領域を意味し、この領域は本発明によれば宿主細胞におけるコア起点の安定なエピソーム維持にとって必須である。好ましくは、上記MMEはE2に対する複数の結合部位を含有する配列である。本開示によれば、MMEは少なくとも5個のE2結合部位を含有する。MMEを構成する配列結合部位は配列が同一である必要はないが、E2と結合できなければならない。
【００３３】
「E2結合部位」（E2BS）は、E2タンパク質が結合するパピローマウイルス２本鎖DNAの最小の配列を意味する。E2結合部位はBPVのものであってもまたはHPVのものであってもよい。E2結合部位の親和性は様々でありそして本開示によればE2結合部位は高親和性結合部位を意味する。E2結合部位は配列番号1、好ましくは配列番号5に示される。また、配列番号9に示されるものでもよい。本開示によるベクターにおいて、反復E2結合部位はスペーサー（配列番号6および配列番号7）により分離されている。
【００３４】
「異種複製起点」は、複製起点が他のウイルス種のMMEまたはFR-エレメントを含有するベクター内に置かれている系を意味する。
【００３５】
本開示に従って安定して形質転換される「宿主細胞」は真核細胞、そして好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト、マウスまたはハムスター細胞である。細胞はいずれの組織由来であってもよい。宿主細胞はCHO（ハムスター）、COP（マウス）またはヒト細胞株293由来であってもよい。
【００３６】
「目的遺伝子」は、目的のタンパク質またはRNAなどの目的の遺伝子産物をコードする遺伝子を意味する。
【００３７】
「遺伝子産物」は目的遺伝子の産物を意味する。産物はRNAレベルの発現産物であってもよく、または発現されたタンパク質またはペプチドであってもよい。遺伝子産物は例えば治療用または予防用に利用することができる。遺伝子産物は内毒素を含まない診断用の産物であってもよい。これらの用途は例示であって当業者は本開示によるのと同様に他の目的があることを理解するであろう。
【００３８】
「ヘルパータンパク質」は、ウイルス調節タンパク質E1、E2、EBNA1、およびLTを含む様々なウイルスタンパク質を意味する。
【００３９】
本発明者らは本明細書に、キメラ起点の延長複製の機構を記載する。本発明者らは、BPV-1またはEBV由来の分離／分配エレメントと連結したPyV起点ベースの構築物、ならびにこれらのプラスミドの複製およびエピソーム維持を支援できる細胞株を開発した。ポリオーマウイルスは宿主細胞の調節機構に依存しない複製パターンを表すので、それぞれのウイルスゲノムは多くの場合それぞれの細胞周期内で最高レベルまで複製する。完全なポリオーマウイルス起点（野生型起点）は転写および複製エンハンサー配列を含み、これが特定の細胞において、複製因子およびヌクレオチドの利用度を決定することにより起点活性および複製の効率を指令する。パピローマウイルス起点複製制御は、最初の複製の増幅期においてポリオーマウイルス複製に類似する。しかし潜在複製期ではコピー数制御機構が適用されて、潜在複製期におけるエピソームウイルスゲノムの複製開始の制御を確かなものにする。エプスタイン・バーウイルス（EBV）は完全に細胞複製機構を潜在起点oriP複製の開始に用いて、厳密に1細胞周期当たり1回複製する。BPV-1およびポリオーマウイルスはウイルスゲノム複製のために宿主複製機構を利用するが、複製の開始はウイルス因子により行う一方、EBVによる安定な維持のために、細胞の開始と伸張機構が完全に利用される。ポリオーマウイルス複製エンハンサーは、複製を促進する能力を失うことなく、c-JunおよびGal4などの異なる因子に対する結合部位と交換することができる（Guoら、1996）。本開示における進歩性は、野生型PyVエンハンサーを、BPV-1タンパク質E2に対する少なくとも5個の合成結合部位（配列番号1）で置き換えると、複製エンハンサー機能を置き換えることができ、従って上記機能をE2タンパク質依存性にするという発見を含む。驚くべきことに、5または10個のE2結合部位をPyV wt起点に加えてもさらなる複製活性化は生じなかった。それ故に、ウイルス起点は、強力なエンハンサーが存在すると宿主細胞で最大活性を達成し、そしてその時点後には、たとえ追加のエンハンサーエレメントが加えられても複製の増強は不可能であるようである。これは細胞因子の制限また核の活性遺伝エレメントによる飽和によるものでありうる。かくして、本発明者らはPyV wt起点構築物によるトランスフェクション後に多数の死細胞を観察した。
【００４０】
BPV-1のE2タンパク質およびEBVのEBNA1タンパク質が、MME含有プラスミドをクロマチンに連結するために必要かつ十分であることは公知である。本開示の新規性には、MMEがその天然の複製起点外に対して機能するという発見が含まれ、全ての従来の研究は、BPV-1起点との関連でまたは非複製プラスミドを用いて行われている。MMEと連結したPyV起点を用いることにより、MMEの普遍的機能および異なる複製因子とのその適合性を研究するツールが得られる。PyV起点ベースのキメラ構築物を用いることにより、他のBPV-1タンパク質およびゲノム配列の非存在下での複製系におけるMME機能を研究することができる。本開示はMMEがPyV起点ベースの系で機能的であることを示す。興味深いことに、異種系MMEはPyV最小コア起点を含有する構築物にだけ延長維持機能を与える。wt PyV起点の場合、非常に強力な一過性複製は観察されたが、起点構築物に対する抗生物質選択の後ですら、これらのプラスミドの安定なエピソーム複製を取り戻すことはできなかった。注目すべき重要なことは、安定に維持された構築物はエピソーム状態にあって、宿主染色体への組込みは検出されなかったことである。明らかに、増殖細胞における複製MMEレポーターの核維持と分配の成功は、複製レベルに敏感である。したがって、MMEの適当な機能にとって、複製開始／活性化とエピソーム遺伝エレメントの機能を確保する安定性エレメントとの間のバランスを保つことが重要である。
【００４１】
E2タンパク質の構造的完全性はMME依存性分配を与えるために非常に重要である。本発明者らの研究室の最近の研究は、単一の点突然変異はE2タンパク質クロマチン結合またはURRクロマチン結合に影響を与えうるが、複製または転写活性を適度に変化させることを示す。E2タンパク質が転写活性化特性を加減するために、かかる突然変異体タンパク質、E39AおよびR68Aを用いて、MMEと連結したPyV起点が安定して維持される可能性を分析した。本発明者らの研究結果は、明らかに、E2タンパク質のクロマチン結合活性が、本研究に使用したキメラ構築物に安定な維持を与えるために必須であって、エピソームプラスミドのランダムな分配は、エピソーム選択マーカーの選択の存在下ですら、プラスミドの延長エピソーム維持のための信頼性のある機構を与えることができないことを示す。それ故に、本開示に示したように、PyVコア起点またはその天然のBPV-1起点と連結したMME仲介型分配は、本明細書に記載したものと同じ方法を用いることにより達成される。
【００４２】
ミニ染色体維持エレメントは色々な複製因子と適合しうる
本開示によると、BPV-1 E2タンパク質-依存性ミニ染色体維持エレメント（MME）およびEBV EBNA1タンパク質-依存性FR-エレメントは、ウイルストランス因子の存在下で、PyVコア起点プラスミドに延長維持機能を与えることができる。本発明者らはエピソームの維持延長の動力学を分析するために、安定複製アッセイおよびフローサイトメトリーEGFPレポーター発現アッセイを用いた。BPV-1およびPyVの場合、宿主細胞S-期におけるそれらの増幅複製の間およびBPV-1の安定な複製の間ですら、複製起点が数回起動され、起点は各細胞周期中に正確に1回に制限されることはない。同時に、EBV潜在起点oriPは厳格に細胞周期毎に1回、染色体のDNAと同じ様式で複製する。本開示は、MMEまたはFR-エレメントの機能により与えられるエピソームの延長維持が、エピソームの複製様式に関係ないことを示唆する。FR-エレメントは両タイプの起点（すなわちEBV潜在起点oriP内の天然の起点およびPyV最小起点を伴う本発明者らのハイブリッドレプリコン（配列番号2））に延長維持機能を与えることができる。本開示はまた、複製機能がウイルスの安定維持機能と関係していないこと、従って、異なるウイルスの複製起点を異なる安定維持エレメントと、いずれの機能も失うことなく組み合せることができることを示す。既に、エピソームを有糸分裂の宿主クロマチンと連結してそれによって安定維持機能を与える、BPV-1 E2タンパク質とEBV EBNA1タンパク質の細胞レセプターは異なることが示されている。本開示は、有糸分裂の染色体上のエピソームの異なる局在はPyV最小複製起点の複製を干渉しないことを示唆する。
【００４３】
エピソームプラスミドの消失率は対照プラスミドの消失率より低い
本発明者らはジェネティシン選択なしで培養した細胞におけるpMMEG、pMMEG*およびpFRG*プラスミド（材料および方法）のエピソーム維持を分析した。これらのプラスミドはPyV最小コア起点（配列番号2）、およびBPV-1ミニ染色体維持エレメント（MME）またはEBV FR-エレメントのいずれかを含有した。ウイルスのトランス因子（PyV LTおよびBPV1 E2またはPyV LTおよびEBV EBNA1タンパク質）を細胞株において安定的に発現させた。プラスミド消失を分析するために、本発明者らはレポーター遺伝子EGFP（またはd1EGFP）の発現をフローサイトメトリーを用いて測定した。PyV最小コア起点とBPV-1 MMEとを含有するプラスミドの場合、エピソーム消失率は、ジェネティシン選択の非存在下で、細胞分裂毎にほぼ6％であった。PyV最小起点とEBV FR-エレメントを含有するプラスミドについては、エピソーム消失速度はより速かったが（約13％）、複製起点も分離エレメントも含有しない対照プラスミド（pEGFP-C1およびpd1EGFP-N1）の消失率22〜30％と比較すると、まだ有意に低い。PyV最小コア起点とFR-エレメント（pFRG*）を含有するプラスミドの消失率はまた、既に報告されているFR-エレメントを安定維持因子として含有するいくつかの複製プラスミドの消失率（2.1〜7.8％（Wade-Martinsら、1999））の結果と異なるが、既に評価されているoriP含有プラスミドの消失率（15％（Hungら、2001））と非常に類似している。
【実施例】
【００４４】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するものでありこれらに限定することを意味しない。
【００４５】
実施例1  パピローマウイルス1型E2タンパク質とその多量体結合部位はポリオーマウイルスのコア起点複製を活性化しかつ起点プラスミドに分離／分配機能を付与する
BPV-1 E2タンパク質は多機能性タンパク質であって、転写調節、ウイルスDNA複製および分離に関わる。BPV-1の安定なエピソーム複製には、E1およびE2タンパク質と多量体E2タンパク質結合部位を含むMMEエレメントが必要であることが示されている。
【００４６】
E2タンパク質は、多量体E2結合部位に依存する様式で、ポリオーマウイルスのコア起点の一過性複製をin vivoで活性化できることが実証されている（Nilsson、1991）。しかし、従来技術において、ハイブリッドマウスポリオーマウイルス起点中のBPV-1 E2結合部位が、複製開始の活性化に加えて、ラージT抗原およびE2タンパク質を発現する細胞において、長期維持機能をポリオーマウイルス複製因子に提供できることについて何の示唆も確証もない。
【００４７】
図1は、本研究のために構築したPyVハイブリッド起点を示す模式図である。第１グループのプラスミドには、pUC19プラスミドにクローニングされたPyV野生型起点およびさらに1個、5個または10個のE2結合部位を含む起点構築物が含まれる（図1B）。第２グループのプラスミドには、PyVエンハンサーエレメントが取除かれてoriコアおよび1個、5個または10個のE2結合部位がpUC19プラスミドに加えられた起点構築物が含まれる（図1C）。第３グループのプラスミドには（図1D）、ネオマイシン耐性遺伝子などの真核生物選択カセットを一緒に含む起点構築物が含まれ、これにより、安定維持アッセイ（材料および方法を参照）においてプラスミド陽性形質転換細胞の選択が可能になる（図1D）。
【００４８】
PyV起点の複製は、ラージT抗原（LT）を唯一のウイルスの複製因子として必要とし、他の全ての成分は宿主細胞に由来する。LTは起点認識因子、DNAヘリカーゼであり、したがってウイルス起点の複製の開始と伸張に直接関与する。本発明者らは、組み込まれたポリオーマウイルスゲノムの複製欠損突然変異体由来のラージT抗原を構成的に産生する細胞株COP5を用いて、ラージT抗原とBPV-1 E2タンパク質とを発現するマウス細胞株を構築した。真核生物選択マーカーを含有するベクターpBabeNeoE2またはpBabePuroを線状化し、そして線状E2発現プラスミド（pCGE2）と高濃度でコンカテマー化した。ライゲーション混合物を精製して、エレクトロポレーションによりCOP5細胞中にトランスフェクトした（材料および方法）。個々のコロニーを選択（ピューロマイシンまたはG418）の存在下で増殖させ、PyV LTおよびBPV-1 E2陽性二重発現細胞株を同定して特徴付けた。E2タンパク質を最高レベルで発現する細胞株（ピューロマイシンまたはG418選択マーカーについて選択されたものをそれぞれCOP5/E2/PuroまたはCOP5/E2/Neoと名付けた）をさらなるアッセイに用いた。同じ手法を用いて、E2タンパク質の突然変異形態であるE39AおよびR68Aを発現するする細胞株を構築した（COP5/E39/PuroおよびCOP5/R68/Puroと名付けた）。先に記載したように、これらの両方の突然変異体は少なくとも部分的にE2結合部位依存性転写活性化およびBPV-1起点複製の開始、ならびにPyVコア起点複製の開始の活性化の機能を有するが、これらはMMEプラスミドの分離／分配を支援することができない（Abroiら、2004）。細胞株におけるE2およびE2突然変異体タンパク質の発現をウェスタンブロット分析を用いて実証した（図2B）。E2またはE2突然変異体を発現する細胞株を5ヶ月間G418またはピューロマイシン選択圧なしで増殖した。E2タンパク質の発現は、検出しうるレベルで長期間選択なしに維持した。これはエピソームプラスミドの維持を研究するための必須の要件である。
【００４９】
構築した細胞株をさらなる実験に用いて、構築されたプラスミドの複製開始および維持に対する、BPV-1 E2タンパク質およびE2結合部位の効果を研究した。最初に、本発明者らは、PyV野生型（wt）起点（図1B）または異なる数のE2結合部位と連結したコア起点（図1C）を含むキメラ起点を、それぞれ細胞株COP5/E2/Neo（構成的にPyV LTおよびBPV-1 E2を発現する）またはCOP5（構成的にPyV LTを発現する）において試験した。トランスフェクション後96時間で、wt起点プラスミドの強い複製シグナルが両細胞株において検出された（図3AおよびB、4日時点、レーン1〜4）。E2タンパク質結合部位を追加するとむしろwt PyV起点の複製に対する阻害効果があった。しかし、複製のE2タンパク質依存性活性化は、PyVエンハンサーの無いコア起点（配列番号2）がスペーサー（配列番号6および7）を介して異なる数のE2結合部位（配列番号1）と連結されている場合に、明らかに検出された。1つのE2結合部位の付加はコア起点の複製の開始に影響を与えないが、5個または10個のE2結合部位の付加は、E2タンパク質依存性の様式で、コア起点複製をほとんど野生型起点複製レベルまで活性化した（図3Aおよび3B、レーン5-9を比較されたい）。E2タンパク質を欠くCOP5細胞株においては、コア起点に対するE2結合部位の複製エンハンサー機能は検出されなかった（図3B）。結果は、PyVコア起点の複製がBPV1 E2とその結合部位により活性化できることを示す。
【００５０】
本発明者らはさらに、構築物を含有する異なるPyV起点の安定なエピソーム維持を、2種の設定で、すなわち、第1に、トランスフェクトされた細胞の選択なしに、第2に、pBabePuro選択マーカーと起点プラスミドの共トランスフェクション後に、トランスフェクトされた細胞の選択を可能にして研究した（材料および方法）。PyV起点を含有するプラスミドのエピソーム持続性をサザンブロットにより分析した。COP5E2/NeoおよびCOP5細胞内での野生型起点プラスミドは、選択および非選択条件のもとで細胞から非常に速く消失した（図3AおよびB）。しかし、コア起点および5個または10個のE2結合部位を含むハイブリッド起点は、エピソームDNA抽出またはトランスフェクトされた細胞からの全DNA分析により分析すると、COP5E2/Neo細胞内で長期残存が可能であった（11日および34日、少なくとも27倍加）。選択がないと、21日および34日後に、唯一維持された起点構築物はコア起点と10個のE2結合部位とのハイブリッドであった（図3A、選択なしの21日および34日の時点、レーン5）。5個のE2結合部位を伴うPyV起点については、弱い複製シグナルがより長い曝露で検出された（データは示してない）。本発明者らは、培養物中のエピソームプラスミドの平均コピー数を、全DNAサザンブロットを用いて評価した（図3A全DNA時点）。重要なことには、5個および10個のE2結合部位をもつプラスミドは、34日後にそれぞれ1細胞当たり平均5および17コピーを有した。このデータは、E2とその結合部位が、キメラPyV起点構築物に維持機能を提供でき、そうでなければ該構築物は細胞増殖中に細胞集団から消失されることを示す。細胞中のコピー数が高いので、本開示による系は効率的な一過性発現系として利用することができる。
【００５１】
重要なことには、パピローマウイルス分離／分配エレメントがPyV wt起点と連結されると（図3Aの短期複製シグナル、4日時点、レーン1〜4）、これらのレプリコンはそれらの複製開始が強力であるにも関わらず、存続することができない（図3A、レーン1〜4）。これは、過剰に効果的なエンハンサー活性によって起点プラスミドの過複製を生じて細胞死に導くためである。トランスフェクトされた培養物の検査は、実際にwt PyV起点プラスミドが後の時点で広範な細胞死を誘導することを示した。
【００５２】
実施例2  エピソーム選択マーカーを保持する起点プラスミドの複製
COP5E2/Puro細胞をジェネティシン選択マーカーを保持する3種類の異なる構築物でトランスフェクトした（図1D）。真核生物のネオマイシンに対する選択カセットは、G418の存在下で、トランスフェクトされた細胞においてエピソームプラスミドを保持する細胞の選択を可能にする。ネオマイシン-レポータープラスミドによるCOP5E2/Puroの一過性トランスフェクションは、コア起点構築物に対するかなり低い複製シグナル（図4A、48および72時間の時点、レーン2）に比較して、wt起点構築物に対して強い複製シグナルをもたらした（図4A、48および72時間の時点、レーン1）。10個のE2結合部位をコア起点に加えるとwt起点と比較しうるレベルまで一過性複製シグナルを増加した（図4A、48および72時間時点、レーン3）。トランスフェクトされた細胞をG418選択を含有する培地中で増殖し、その後、それらを選択ありおよび選択なしで一連の細胞分裂により維持した。2および5ヶ月の培養後に、これらの細胞株をプラスミド安定維持機能について、サザンブロットによりおよびハイブリダイゼーション用の起点プローブにより分析した。10個のE2結合部位を含有するレポータープラスミドは、2ヵ月後、そして5ヵ月後ですら、E2陽性細胞集団中に自律性エピソームの染色体外の維持を確立することができた（図4B、レーン3、2ヶ月後の分析）。選択を除去してもクローン細胞株中の複製シグナルの検出を変えることはできなかった（図4B、レーン3、2ヶ月時点）。図4DはCOP5E2/Puro細胞株のプラスミドレスキュー分析（材料および方法を参照）を示し、トランスフェクションから5ヵ月後、プラスミドの再配列が検出されなかったことを証明する。注目すべきこととして、本発明者らは、LTおよびE2タンパク質を発現する細胞株において、BPV-1からのミニ染色体維持エレメントをPyVのコア起点へ加えると、異常な特徴、すなわちエピソームの長期複製の特徴をPyV複製因子に与えることを見出した。
【００５３】
本発明者らは、野生型E2、またはN-末端ドメインに保存された帯電残基のアラニン置換を保持するE2の突然変異型、を発現する細胞株において、ハイブリッド起点の延長エピソーム維持を比較した。これらの突然変異体は、既に、パピローマウイルス複製、トランス活性化、配列特異的DNA結合および分配アッセイで特徴付けられていた。E2突然変異体E39AおよびR68A（図2の模式図A）はクロマチン結合機能が不活性であって、BPV1 URRレポータープラスミドの分離／分配を仲介することはできないが、依然として一過性複製の開始および転写の活性があり、その場合、それらの相対活性は野生型E2と比較できる程度であった。COP5のピューロマイシン耐性クローンをLTおよびBPV-1 E2突然変異型R68AまたはE39Aについて選択した。陽性細胞株をクローニングして特徴付け（図2Bのタンパク質発現）、最良の発現細胞株をその後のアッセイのために選択した。本発明者らはネオマイシン-構築物（図1D）を、2種のE2突然変異型を発現する二重発現マウス細胞株において短期および長期複製アッセイに用いた。発現された両E2突然変異型R68AおよびE39Aは、E2結合部位に依存する様式でPyVコア起点複製を活性化した（図4Aレーン3、および図5レーン3および6、48および72時間時点）。これらの結果は、E2突然変異型R68AおよびE39Aが複製活性化に対してwt E2タンパク質と同様の効果を有することを示す。トランスフェクトされた細胞を、ネオマイシン選択有りおよび無しの培地で最大5ヶ月の期間増殖させた。2ヶ月後、非常に弱い複製シグナルがネオマイシン選択有りについてさえ観察された（図4B、レーン1〜3、2ヶ月時点）。5ヶ月の培養後に、E2の突然変異型を発現する細胞型においてエピソーム複製シグナルは観察されなかった（図5）。ハイブリッドタンパク質変異体であるVP16/E2およびp53/E2を発現する細胞株（図2A）を用いることにより、突然変異体E2タンパク質R68AおよびE39Aを発現する細胞株と同じ結果を得た（データは示してない）（上記細胞株はそれぞれE2タンパク質の全トランス活性化ドメインをVP15またはp53タンパク質由来の各活性化ドメインにより置換されている）。ウェスタンブロットによる増殖5ヶ月後のウイルスタンパク質の発現の持続性を図2Bに示した。結論として、E2のドメインの全体構造の保全性ならびに完全性が効率的な分離に必要であり、何故ならwt E2だけが、トランス作用（in trans）でPyV LTと一緒に、安定維持機能をPyVコア起点に提供できるからである。他方、これらの結果は、E2タンパク質のクロマチン結合機能がキメラPyV起点の安定維持を保証するために必要であることを示した。
【００５４】
実施例3  キメラ起点のエピソーム状態は再配列なしに維持された
高い突然変異頻度、とりわけ組換えはパピローマウイルスおよびポリオーマウイルス起点ベースのベクター系からの複製に関連することが多い。本発明者らの複製アッセイに使用した染色体外低分子量DNAはHirtの手順を用いて抽出した。二重発現細胞株COP5/E2/Puroにおいて、エピソーム状態で残存するハイブリッド起点由来のベクターを図4Cおよび6Aで分析した。線状DNA断片は、マーカーと比較して、唯一の非常に明確な単位サイズのバンドを示した（図4C、レーン1および10および図6A、レーン1および9を比較されたい）。無切断サンプルと非切断酵素（プラスミドDNAに対する制限酵素切断部位を持たない酵素）を用いて消化したサンプルを比較すると、同じパターンを与え（4C、レーン2と3、さらに5と6を比較されたい）、ここで開環（OC）および共有結合による閉環（CCC）型は検出することができ（図6Aレーン2、10および11）、これは組み込まれた物質でなかったことを示す（キャピラリーブロットの前にゲルをEtBr染色により分析して、使用した酵素の完全な制限部位を示した）。しかし、無切断プラスミドマーカー（図4C、レーン11および12）は、移動のさらに遅い分析サンプルの無切断DNAと正確に整合しない（図4Aおよび6Aレーン2および3）。したがって、本発明者らは、いくつかの細胞株のBPV-1ウイルスゲノムについて実証されているように、これらはオリゴマー化エピソームまたはエピソームのカテネート（cateanate）であることを示唆する。
【００５５】
エピソームDNAの存在はまた、wt E2およびLTの二重発現細胞株で増殖したポリオーマコア起点と10個のE2結合部位とのハイブリッドレプリコンの無切断全DNAから、大腸菌中へのプラスミドレスキューにより確認した。無傷の、未編成のDNAは異なる制限酵素の組み合わせを用いて検出できた（図4C）。無切断のレスキューされたプラスミドの分析は、インプットDNAと比較してオリゴマー化したパターンを示した（図6B）。エンドヌクレアーゼBglIによるレスキューされたプラスミドの制限分析は、インプットDNAと比較してプラスミド骨格のいくらかの再配列を観察できることを示した（図6C、レーン1〜3、5、6、10および12）。したがって、いくつかの細胞は再配列したプラスミドを保持した。さらに、無傷の、未編成のDNA型も検出された（図6C、レーン4、7〜9、および11）。レスキューされたプラスミドが依然PyV起点とMMEとを含有することを確認するために、本発明者らはBglI消化パターンを、MME-またはPyV-特異的プローブを用いて、サザンブロット分析により分析した（それぞれ、図6DおよびE、）。サザンブロット分析は、全てのレスキューレポータープラスミドがMMEおよびPyV起点断片を含有することを示した（図4Dおよび6DおよびE）。wt PyV起点を有するレポータープラスミドを保持する細胞からの全DNAを用いるプラスミドレスキューアッセイ（全DNAは、エピソームDNAを図6A、レーン4〜6で分析した細胞から抽出した）は唯一のコロニーを表し、これをMMEまたはPyV起点断片の存在について分析した（図6DおよびE、レーン13）。サザンブロット分析は、このコロニーからのプラスミドDNAはMMEまたはPyV起点を含有しないことを示した（図6DおよびE、レーン13をレーンwtインプットおよびインプットと比較されたい）。選択圧を除去しても、誘導された分子のエピソーム状態に影響を与えなかった。これらの実験の結果は、本発明者らが使用した細胞株はインプットベクターを染色体外エレメントとして保持することを強く示唆する。
【００５６】
実施例4  フローサイトメトリー分析を用いるエピソームプラスミド消失の測定
PyVコア起点、MME、選択マーカー（ジェネティシン耐性）および緑色蛍光タンパク質マーカー（長半減期EGFPまたは短半減期d1EGFPのいずれか）を含有するプラスミドの維持を、フローサイトメトリーにより分析した。これらのプラスミド（図7）のCOP5E2/Puro細胞株中へのトランスフェクションは、これらのプラスミドの両方の効率的な一過性複製をもたらし、これはサザンブロット分析（データは示してない）により検出、ならびにEGFP蛍光により測定することができた。EGFPタンパク質マーカーの2種の異なる変異体を比較して使用し、短期実験の場合におこる長半減期EGFPの副次的蛍光による潜在的問題を回避した。トランスフェクトされた細胞をジェネティシンの存在または非存在下で最大96日間連続培養で増殖させた。細胞を2日毎に継代して活発な増殖を確かなものにした。各継代の間に、100,000〜200,000個の細胞を分析用に採取して、EGFP-陽性細胞の比率をフローサイトメトリーにより測定した。バックグラウンドを超えてEGFPを発現する細胞（COP5E2/Puro）の百分率を、それぞれのトランスフェクトされた細胞培養について各時点で計算した。ジェネティシン選択がないと、EGFP蛍光細胞の数はかなり急速に減少した。選択なしのトランスフェクションの11日後に、培養物中のEGFP陽性細胞の最初の約50％と比較して、わずかなEGFP陽性細胞をFACS（蛍光活性化セルソーター）分析を用いて検出することができた（図7BおよびC）。neo-選択マーカーを保持するプラスミドを用いてトランスフェクトされたCOP5E2/Puro細胞の選択によって得た細胞培養は、長い半減期のEGFPを発現するプラスミドの場合、ほぼ100％ EGFP陽性細胞を有し、そしてプラスミドが短い半減期のd1EGFPを発現する場合はほぼ50％であった（図7BおよびC）。注目すべきことに、EGFP-陽性細胞の百分率は、20細胞世代を超えて一定にとどまり、明らかにPyVコア起点とMMEを含有するこれらの細胞がエピソーム遺伝エレメントの長期維持を可能にすることを示した。さらに、この結果は、この系を用いてタンパク質またはRNAなどの遺伝子産物を長期にわたり発現できることを示す。この実施形態によれば、ベクター中に選択マーカーを与えることにより、安定な細胞株を開発することを可能にする。しかし、この結果は、遺伝子産物の発現を、選択マーカーなしで相当な時間継続できることも示す。これは、抗生物質の使用が認められない状況では重要な用途となる。ジェネティシン選択を除去すると、EGFP-陽性細胞の百分率は55日で90％から約1％へ（d1EGFPの場合、37日で64％から2.4％へ）減少する。エピソームの組込みの場合、EGFP-蛍光細胞の百分率は選択を除去すると一定にとどまるはずである（Wade-Martinsら、1999）。EGFP蛍光の消失がEGFPのプロモーターの不活性化またはプラスミドの不均一な分布による可能性を排除するために、本発明者らは細胞中のDNA含量も分析した。図9に示したように、ジェネティシン選択なく増殖させた細胞からのエピソームプラスミドDNAの消失はフローサイトメトリー分析と相関がある。エピソームの消失の動力学を研究するために、非選択条件の間におけるそれぞれのエピソーム構築物の消失率を計算した。結果を図8に掲げた。2つの対照プラスミドpEGFP-C1およびpd1EGFP-N1（複製起点およびMMEを欠くClontech製の対照プラスミド）をフローサイトメトリー研究に用いて、COP5E2/Puro細胞株におけるエピソームの消失率を比較した。COP5E2/Puro細胞株のトランスフェクションにおけるこれらの対照プラスミドの消失率も図8に示す。フローサイトメトリー分析により示されたのと同様に、COP5E2/PuroMMEGおよびCOP5E2/PuroMMEG* 細胞を選択無しで55日間、そしてCOP5E2/PuroMMEG* 細胞を37日間増殖した後に、細胞の1％は依然としてエピソームを含有した。（pMMEGまたはpMMEG*プラスミドのいずれかを用いてトランスフェクトされた）COP5E2/Puro細胞株に対するジェネティシン選択をこの時点で回復すると、EGFPを発現する細胞の比率は増加して最初のレベルに戻った（図7BおよびC）。
【００５７】
実施例5  PyVコア起点プラスミドに分離／分配機能を付与する上でのBPV-1 MMEとEB VFRエレメントの比較
PyV LTおよびEBV EBNA1を発現するCOP5細胞株に基づいて同様の細胞株を構築し、ならびにBPV1 MMEの代わりにEBV FR-エレメントを保持するプラスミドを作製した。PyVコア起点、FR-エレメント、選択マーカー（ジェネティシン耐性）および緑色蛍光タンパク質マーカー（短半減期d1EGFP）を含有するプラスミド（pFRG*）を有するCOP5EBNA1/Puro 細胞株についてフローサイトメトリー分析を実施した。この場合、プラスミドの複製機能はPyVコア起点とLTタンパク質により与えられ、そして分離／分配機能はEBVのFR-エレメントとEBNA1タンパク質により与えられる。結果は、COP5E2/Puro細胞株におけるプラスミドpMMEGおよびpMMEG*によるフローサイトメトリー分析に類似した。トランスフェクトされた細胞を、ジェネティシンの存在または非存在下で、最大75日間連続培養で75日間増殖させた。トランスフェクトされたCOP5EBNA1／PuroFRG*のジェネティシンに対する選択は、約40％ d1EGFP陽性細胞を有する細胞培養物を生じた（図7D）。ジェネティシン選択を除去すると、d1EGFP-陽性細胞の百分率は30日間で40％から1％へ低下した。COP5E2/PuropFRG* 細胞株に対するジェネティシン選択をこの時点で回復すると、EGFPを発現する細胞の比率は増加して最初にレベルに戻った（図7D）。これらの結果は、プラスミドのエピソーム持続性は、100％と異なる特定の効率で起こることを示す。明らかにまた、EBNA1/FRとE2/MMEエレメントは細胞モデルにおいて、比較しうる分離／分配機能をPyVコア起点レポータープラスミドに与える。
【００５８】
EGFP蛍光の消失がEGFPのプロモーターの不活性化による可能性を排除するために、本発明者らは細胞中のDNA含量も分析した。ジネティシン選択を除去した後、細胞から全DNAを抽出し、そしてMluI（pMMEG*およびpFRG*プラスミドを線状化する）およびDpnIを用いて消化した。次いで、等量の全DNAを、サザンブロットによりpMMEG*またはpFRG*プラスミドに対する放射標識したプローブを用いて分析した。図8に掲げたように、ジェネティシン選択なしに増殖させた細胞からのエピソームプラスミドDNAの消失はフローサイトメトリー分析と相関がある。他方、これらの結果は、EGFP蛍光は、実際に、エピソーム状態で存在するプラスミドから測定されたことを示す。プラスミド組込みの場合、ハイブリダイゼーションシグナルは一定のままであった。
【００５９】
実施例6  目的の遺伝子を含有するハイブリッド発現ベクターでトランスフェクトした細胞株は、その遺伝子産物を発現することができる
本発明者らはルシフェラーゼ遺伝子を目的の遺伝子（レポーター遺伝子）として用いて、これを、細胞株にトランスフェクトするベクター中に挿入した。
【００６０】
BPV E1、BPV E2を発現するCHO細胞株に基づく細胞株、ならびに、HPV 11E2 BS、CMVプロモーター、BPV MO、BPV URR、SV40エンハンサーおよび組換えEGFP-ルシフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドを構築した（図10、パネルA）。
【００６１】
上記細胞をそれぞれの発現ベクターによりエレクトロポレーションを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞のアリコートを、トランスフェクション後2日、5日および7日にルシフェラーゼ活性について分析した。発現の差異（図10）は、ベクターによってレポーターを産生する能力が1オーダーを超えて異なることを示した。レポーター遺伝子の発現効率は、HPV E2多量体結合部位とBPV MOとを保持するベクターである11BS-MO-CMV-EGFP-lucおよび11BS-MO-CMV-EGPF-Luc-enhで効果的である。本実施例に使用されたE2結合部位はHPVに由来し、そして本質的にACCGAAACGGT（配列番号9）であるnt配列を有する。このベクターにおいては、多重結合部位は、限定されるものでないが、配列番号6および配列番号7による配列であってもよいスペーサーにより分離されている。
【００６２】
実施例に用いた材料と方法
プラスミド  PyV起点（野生型またはコア起点）を含有するハイブリッドレプリコン（図1グループBおよびD）を構築するために、本発明者らは、基本骨格としてベクターpUC19を使用し、その場合、高親和性E2結合部位9の1個、5個または10個の頭部-対-尾部コピーをクローニングした。PyV wtおよびコア起点は、プライマーPy4963（5'-AGGGAGCTACTCCTGATG-3'）（配列番号3）およびPy174（-CTACCACCACTCCGACTT-3'）（配列番号4）を用いたPCRにより、ベクターpmu1046/CATおよびpmu1047/CATから増幅した。増幅したPyV起点断片を酵素EheIおよびBclIにより消化し、そして異なる数のBPV-1E2結合部位を含有するpUC19ベクターのBamHIとHincII部位の間に挿入した。E2結合部位は好ましくは、ACCGNNNNCGGT（配列番号1）（式中、Nは任意のヌクレオチドである）に示されるものである。好ましくは、配列は配列番号5（ACCGTTGCCGGT）に示されるものである。ベクター中に、これはGATCTGT（配列番号6）およびCG（配列番号7）などのスペーサーと共に存在し、反復ユニットGATCTGT ACCNNNNNNGGT CG（配列番号8）を形成する。
【００６３】
ネオマイシン遺伝子を含有するハイブリッドレプリコン（図1D）は、プラスミドpNeoBgl40中のURRをPyV wt起点、コア起点または10個のE2結合部位を含むコア起点で置換し、これらをPCRにより増幅し、酵素BamHIおよびEcl136IIを用いて消化し、そしてpNeoBgl40のBamHIおよびHindIII部位中にクローニングすることにより確立した。
【００６４】
3つのタイプのEGFP（緑色蛍光タンパク質）マーカーを含有するプラスミドを設計した。最初に、PyV最小起点（配列番号2）と10個のE2結合部位から成る断片を、ジェネティシン耐性マーカーを含有するプラスミドに加えた（サルウイルス40プロモーターSV40から発現した）。次いで、EGFPまたは脱安定化した緑色蛍光タンパク質（d1EGFP）マーカーのいずれかを加えた（pMMEGまたはpMMEG*プラスミドと名付けた、図7A）。サイトメガロウイルス前初期プロモーター（CMV）の制御下にあるEGFP発現カセットをpEGFP-C1またはpd1EGFP-N1プラスミド（Clontech）から得た。第3のプラスミドについては、最初にエプスタイン・バーウイルス（EBV）のFR-エレメントをPyVコア起点を含有するpUC19プラスミドに付加した。次いで、プラスミドpMMEG*から、PyV最小コア起点および10個のE2結合部位を含有する断片を、PyV最小コア起点とEBV FR-エレメントを含有する断片により置換した（プラスミドpFRG*、図7A）。
【００６５】
細胞株の構築
BPV-1 wt E2タンパク質およびその突然変異型E39AおよびR68Aを発現する細胞株の構築については、ベクターpBabePuroを酵素SalIを用いて線状化し、そして等量のE2発現ベクター（pCGE2、pCGE2/R68、pCGE2/E39）とライゲートし、これをXhoIエンドヌクレアーゼを用いて線状化した。1μgのライゲートしたハイブリッドプラスミドをCOP5細胞株中にエレクトロポレーションで導入した。COP5細胞株はマウスC127細胞（ATCCC RL-1804）由来であり、Tyndallら、1981に記載されている。エレクトロポレーション実験は、Bio-Rad遺伝子パルサーを用いてそれぞれ975μFおよび220Vの静電容量と電圧の設定により実施した。選択のためにピューロマイシン（2μg/ml）を加えた。タンパク質の発現はウェスタンブロットにより分析した。
【００６６】
wt E2を発現しかつネオマイシン選択カセットを保持する細胞株は、上記と同じプロトコルにより、pBabePuroの代わりにベクターpBabeNeoを用いて構築した。
【００６７】
PyV T-抗原およびEBV EBNA1タンパク質を発現する細胞株は、NotIで線状化したプラスミドpBabePuro/EBNA1（EBNA1コード配列がpBabePuroベクターのEcorI/SalI部位中に挿入されたもの）のCOP5細胞株中へのトランスフェクションとピューロマイシン（2μg/ml）に対する選択の結果として作製された。タンパク質の発現はウェスタンブロットにより分析した。この細胞株をCOP5EBNA1/Puroと名付けた。
【００６８】
実施例６（図10）において、細胞株CHO4.15を用いた。この細胞株はCHO-K1細胞株（ATCC CCL61）由来であり、Ustav、1993に記載されている。EBV EBNA1、PyV LT、BPV E2を発現するCHO由来の細胞株は、COP由来の細胞株の構築に使用したのと同じ方法を用いて構築した。
【００６９】
細胞とトランスフェクション
ポリオーマウイルスT-抗原およびBPV-1 wt E2もしくはその突然変異型またはEBNA1を発現する、COP5細胞（Tyndallら、1981）およびその誘導体COP5E2/Puro、COP5E2/Neo、COP5R68/Puro、COP5E39/Puro、COP5EBNA1/Puroは、10％ウシ胎児血清を補充したIscoveのダルベッコ改変培地（「Difco」）で増殖した。選択については、選択マーカーに応じてG418（500μg/ml）またはピューロマイシン（2μg/ml）を加えた。エレクトロポレーション実験は、Bio-Rad遺伝子パルサーを用いてそれぞれ975μFおよび220Vの静電容量と電圧の設定により実施した。
【００７０】
ネオマイシン-構築物を用いてトランスフェクトしたCOP5E2/Puro細胞をG418により500μg/mlにて選択した。pBabePuro（Morgenstern, J.P.およびH.Land.1990）を用いて共トランスフェクトしたCOP5E2/Neo細胞を、ピューロマイシンを用いて2μg/mlにて選択した。ジェネティシン耐性マーカーおよびGFPコード配列を保持するプラスミドによるトランスフェクション後に、COP5EBNA1/Puro細胞株を500μg/ml G418を含有するIMDM培地（培地はピューロマイシンを含まない）で増殖した。
【００７１】
サザンブロット分析
全DNAは標準プロトコルに従って細胞から抽出した。低分子量DNAの細胞からの抽出、ならびに、低分子量および全DNA調製物両方の起点構築物レベルの分析は既に記載された通り実施した（UstavおよびStenlund、1991；PiirsooおよびUstav、1996）。特異的プローブは、DecaLabelキット（Fermentas、Lithuania）を用い、ランダムヘキサマープライマー合成により、[32P]dCTPで標識した。ハイブリダイズ種はオートラジオグラフィーにより可視化した。ブロットの放射性シグナルは、ImageQuantソフトウエア（Molecular Dynamics、Amersham Biosciences、UK）を用い、PhosphorImagerで数値化した。
【００７２】
免疫沈降
細胞（1.5 x107）を氷上の氷冷1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-リン酸緩衝化生理食塩水で溶解し、15mlの組織培養チューブ中に回収し、そして音波処理した。このステップからBradfordアッセイ用のアリコートを採取した。SDSを、氷冷放射性免疫沈降アッセイ（RIPA）バッファー（50mM Tris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％デキシコーレート、0.1mMジチオトレイトール（DDT）、0.5mMフェニルメチレンスルホニルフルオリド、プロテアーゼ阻害剤）を加えることにより0.1％に希釈した。不溶画分は5,000 X g、15分間の遠心分離により沈殿させた。可溶画分は新しいチューブに移して、5H4、3E8、1E4および3F12抗体とともに一晩4℃にてインキュベートした。次いでタンパク質G-セファロース（Amersham Biosciences）を加えて、1時間インキュベートした。セファロースビーズを3回RIPAバッファーを用いて洗浄し、そしてSDSローディングバッファーに再懸濁し、そして西洋わさびペルオキシダーゼ抱合型eE11（MAb 3F12抗体（Quattromed AS、Tartu、Estonia）のサブクローン）を用いて免疫ブロット分析を行った。
【００７３】
免疫ブロット
100mM DDTを補充した標準ローディングバッファー中で溶解した同じ数の細胞から得た全タンパク質を、電気泳動により8％ポリアクリルアミド-SDSゲル上で分離し、そしてImmobilon-Pメンブレン（Millipore、USA）に移した。抗体1E4（Kurgら、1999）を用いてE2タンパク質を検出した。抗体BM3167およびBM1083（DPC Biermann）を用いてEBNA1タンパク質を検出した。ペルオキシダーゼ抱合型ヤギ抗マウス抗体および増強化学発光検出キット（Amersham Biosciences）を使用し、その後、販売元から与えられた標準プロトコルを用いてブロットを発色した。
【００７４】
プラスミドレスキューアッセイ
既にMannikら2003に記載の通り、プラスミドレスキューアッセイを実施して、プラスミドのエピソーム状態を検出した。2μgの無切断のゲノムDNAを大腸菌株 DH10B中にエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロコンピテント細胞を調製し、そして形質転換をパルサー装置と2mmエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad Laboratoires、Hercules、CA）とを製造業者の取扱説明書に従って用いて実施した。細胞を遠心分離により回収し、アンピシリン100μg/mlを含有する培地で増殖した。単一コロニーから得たプラスミドDNAを精製し、制限エンドヌクレアーゼを用いて分析した。
【００７５】
フローサイトメトリー分析
EGFP発現を、関連のCellQuestソフトウエアと共にBecton-Dickinson FACSCaliburフローサイトメーターを用い、フローサイトメトリーにより分析した。各サンプルから100,000〜200,000シグナルを分析した。自己蛍光の閾値は擬トランスフェクトした対照細胞からのシグナルの99％に設定した。この閾値を超える全シグナルはEGFP-陽性細胞に相当するとみなした。図8のエピソーム消失率を計算するために、EGFP発現データを0日および12日（pEGFP-C1、pd1EGFP-N1）、pMMEGについて0日および55日、pMMEG*について0日および37日、ならびにpFRG*について0日および30日に分析した。この計算には1次消失率モデル（first order rate-of-loss model）を用いた：消失率λ＝（-1/t）（ln Nt/No）。式中、Noは非選択条件の実験開始時の緑色細胞百分率であり、Ntはt世代後の緑色細胞百分率である。
【００７６】
ルシフェラーゼ発現の分析
上記発現分析を、異なる調節エレメントおよび組換えEGFP-ルシフェラーゼ遺伝子を保持するプラスミドを有するCHO4.15E2細胞株において行った。細胞を等モル量のEGFP-ルシフェラーゼ・ベクターを用いてエレクトロポレーション処理した。陰性対照については、細胞を担体DNAだけでトランスフェクトした。異なる時点で、細胞をPBSを用いて洗浄し、そして適当量の1*CCLR試薬（Promega）を用いて溶解した。サンプル中のルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイ系キット（Promega）およびプレート読み取り光度計（Tecan）を用いて測定した。1*CCLRバッファー中の異なる希釈率のサンプルを用いて、全測定値が直線域で行われることを確認した。サンプル中の全タンパク質の活性を正規化するために、これらを水で4倍希釈した。その後、BCAアッセイキット（Pierce）を用いて測定した。
【００７７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】PyVハイブリッド起点構築物の模式図。(A)エンハンサー配列とコア起点とを含むPyV野生型起点の模式図。全てのプラスミドは、材料と方法の項に記載の通り、pUC19を骨格として用いて構築した。(B)PyV野生型起点（白色の楕円環として表したエンハンサーエレメント、黒塗り長方形として表したコア起点）とさらに1個、5個または10個のE2結合部位（E2BS）（シャドーを施した正方形として示し；E2結合部位の数を対応する数字で示した）を共有するプラスミド。(C)野生型エンハンサーエレメントを除去するかまたはE2結合部位により置換した構築物。(D)ネオマイシン耐性遺伝子（白色の長方形として示した）などの真核生物の選択カセットを保持するレポーター構築物。本構築物は延長維持アッセイにおいてトランスフェクトされた細胞をスクリーニングできるようにする。
【図２】（A）設計されたE2点突然変異の模式図とAbroiら、2004に詳しく記載されているBPV-1の生活環におけるその特性。（B）構築されたCOP5由来の細胞株における野生型（レーン2および3）および突然変異体E2タンパク質（レーン4および5）の発現のウェスタンブロット分析。セミコンフルエントの60mm直径ディッシュからの細胞を100μlのLaemmliサンプルバッファーに溶解し、そして細胞溶解物の1/3をそれぞれのレーンに充填した。陰性対照溶解物はCOP5細胞（レーン6）から調製した。細菌に発現された精製E2タンパク質を陽性対照（レーン1）として用いた。発現レベルの比較ならびに野生型および突然変異体E2タンパク質の完全性の評価は3F12抗体（Kurgら、1999）を用いて実施した。
【図３】サザンブロット分析。BPV-1 E2タンパク質とその結合部位がPyV起点プラスミドの延長維持に必要である。(A)野生型E2タンパク質を発現する細胞株COP5E2/Neoにおける、PyVキメラプラスミドの一過性のかつ安定な複製特性。エピソームまたは全DNAを、トランスフェクション後4日、11日、21日および34日に細胞から抽出した。PyV起点を含有する細胞を全集団から選択するために、線状ベクターpBabePuroによる共トランスフェクションおよびピューロマイシン選択を用いた。精製DNAを制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびDpnIを用いて消化した。フィルターを、放射標識したPyVコア起点および10個のE2結合部位を含有するプラスミドで精査した。3〜300ピコグラムの線状PyVコア起点および10個のE2結合部位を含有するプラスミドをマーカーとして用いた。トランスフェクトした構築物を図の上側に模式図で示した（ライン1〜9、図1の説明も参照）。(B)LTタンパク質のみでは、PyV起点を含有するプラスミドに維持機能を与えるために十分でない。トランスフェクション後4日および19日に、低分子量DNAを抽出して制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびDpnIで消化した。フィルターを放射標識したPyVコア起点および10個のE2結合部位を含有するプラスミドで精査した。1〜300ピコグラムの線状PyVコア起点と10個のE2結合部位を含有するプラスミドをマーカーとして用いた。トランスフェクトした構築物を図の上側に模式図で示した（ライン1〜9、図1の説明も参照）。
【図４】MMEと連結したPyVコア起点はプラスミド再配列なしに安定して維持される。(A)LTとwt E2もしくはその突然変異形態E39AまたはR68Aを発現する細胞株における、ネオマイシン選択カセットを含有するプラスミドの一過性複製。低分子量DNAをトランスフェクション後48時間および72時間に抽出し、単一切断酵素HindIIIを用いておよびDpn1（細菌によりメチル化した非複製インプットDNAを消化する）を用いて消化し、そしてサザンブロットにより分析した（レーン1〜3）。トランスフェクトされたプラスミドを図の上側に模式図で表した（図1Dも参照されたい）。マーカーレーンはPyVコア起点、10個のE2 BSおよびネオマイシン選択カセットを含有する125、250もしくは500pgの線状プラスミドを含む。(B)E2クロマチン結合機能はMMEと連結したPyVコア起点の安定な維持を与えるために必要である。LTとwt E2もしくは突然変異体E2タンパク質R68AもしくはE39Aを発現する細胞株を、図の上部に模式図で示した構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をジェネティシンの存在（+）または非存在（-）下で増殖し、そして安定な複製について分析した（レーン1〜3）。トランスフェクション後2ヶ月に、低分子量DNAを抽出して単一切断酵素HindIIIを用いておよびDpnIを用いて消化し、そしてサザンブロットにより分析した。PyVコア起点、10個のE2 BSおよびジェネティシン選択カセットを含有する500pgの線状プラスミドをマーカーとして用いた。（C）PyV起点を含むプラスミドの状態。LT-およびwtE2-を発現する細胞を図の上部に模式的に示したプラスミドでトランスフェクトした。ジェネティシンの存在の下で細胞を2ヶ月増殖した後、全DNAを抽出しそして線状化酵素HindIII（レーン1、4および7）および非切断酵素EspI（レーン3、6および9）により分析した（2μg）。無切断サンプルをレーン2、5および8に示す。PyVコア起点、10個のE2 BSおよびジェネティシン選択カセットを含有するプラスミドをマーカーとして用い、そして250ngの線状型（レーン10）および250pgまたは125pgの無切断型（レーン11および12）として示した。（D）COP5E2／Puro細胞株のプラスミドレスキュー分析。10個のE2 BS、PyVコア起点およびジェネティシン選択カセットを含有するプラスミドをCOPE2／Puro細胞株にトランスフェクトした後5ヶ月に全DNAを抽出し、そして既にMannikら、2003が記載したプラスミドレスキューアッセイのために切断した。レスキューしたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼBglIIを用いて分析した。レーン1に、インプットプラスミドのパターンを示す。レーン2〜5に、4つの別個のコロニーからレスキューしたプラスミドを示す。レーン「M」はマーカーλDNA／EcoRI+HindIII （Fermentas、Lithuania）を含む。
【図５】MMEと連結したPyVコア起点の長期維持を与えるためにはE2クロマチン結合機能が必要である。突然変異体E2タンパク質R68AおよびE39Aを発現する細胞株を、図の上部に示した模式図の構築物でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をG418の存在（+）または非存在（-）下で増殖し、そして一過性複製を（レーン1〜3、COP5R68／Puro細胞株において48および72時間の時点で；レーン4〜6、COP5E39／Puro細胞株において48および72時間の時点で）、ならびに安定な複製（レーン1〜3、COP5R68／Puro細胞株においてG418選択有りまたは無しで2および5ヶ月の時点で；レーン4〜6、COP5E39／Puro細胞株においてG418選択有りまたは無しで2および5ヶ月の時点で）分析した。マーカーレーンはPyVコア起点、10個のE2結合部位およびネオマイシン選択カセットを含有する125、250または500pgの線状プラスミドを含む。
【図６】MMEと連結したPyVコア起点はエピソームとして安定に維持される。(A)LTとwt E2を発現する細胞を、図の上側の模式図で示したプラスミドでトランスフェクトした。ジェネティシンなしで細胞を2ヶ月間増殖した後に、エピソームDNAを抽出し、そして線状化酵素HindIIIにより（レーン1および4）、非切断NdeIを用いて（レーン2および5）、およびプラスミドニッキング酵素Nb.Bpu10Iと非切断NdeIとを一緒に用いて（レーン3および6）分析した。PyVコア起点、10個のE2 BSおよびジェネティシン選択カセットを含有するプラスミドをマーカーとして用いて（各レーン当たり100pg、レーン7〜12）、次のように示した：線状型（レーン7）、線状化酵素HindIIIおよびニッキング酵素Nb.Bpu10Iを用いて消化した環状型（レーン8）、COP5E2／PuroエピソームDNAの存在下で線状化酵素HindIIIを用いて消化した環状型（レーン9）、非切断型（レーン10）、非切断NdeIを用いて消化した環状型（レーン11）および非切断NdeIおよびニッキング酵素Nb.Bpu10Iを用いて消化した環状型（レーン12）。共有結合で閉環した環状型（CCC）、線状型（Lin.）、開環型（OC）およびオリゴマー型のDNAを矢印で示した。全ての制限酵素処理反応物は2ユニットのDpnIを含有した。（B、C、D、E）COP5E2/Puro細胞株のプラスミドレスキュー分析。10個のE2 BS、PyVコア起点およびジェネティシン選択カセットを含有するプラスミドをCOPE2／Puro細胞株にトランスフェクトした2ヶ月後に、全DNAを抽出した。2μgの無切断全DNAを材料および方法で記載されるようにプラスミドレスキューアッセイのために切断した。(B)レーン1〜12に、12種の別個のコロニーから取り出した無切断のレスキュープラスミドを示した。レーン「M」はマーカーλDNA／HindIII（Fermentas、Lithuania）を含有する。(C)エンドヌクレアーゼBglIを用いてレスキューしたプラスミドの分析（レーン1〜12）。レーン13は、対照プレート上のコロニーから抽出されたDNAのBglI消化物を示す（wt PyV起点およびジェネティシン選択カセットを有するレポータープラスミドを保持する細胞からの無切断全DNAによるプラスミドレスキューアッセイ）。(D) MME特異的プローブを用いたサザンブロットにより分析したレスキューされたプラスミドのBglI消化断片（レーン1〜13）。(E)PyV起点特異的プローブを用いたサザンブロットにより分析したレスキュープラスミドのBglI消化断片（レーン1〜13）。インプットまたはwtインプットのレーンは、それぞれ、PyVコア起点、10個のE2 BSおよびジェネティシン選択カセットをもつプラスミド、またはPyV wt起点およびジェネティシン選択カセットをもつプラスミドを含有する。
【図７】フローサイトメトリー分析に用いたPyVハイブリッド起点構築物の模式図（A）。G418選択の存在または非存在下での、様々な細胞株に対する長期EGFP（B）または短期d1EGFP（C,D）発現の時間経過。COP5E2／PuroMMEG（B）；COP5E2／PuroMMEG*（C）；COP5EBNA1／PuroFRG*（D）細胞株。
【図８】図7のデータから計算したプラスミド消失率。複製起点を欠く2つの対照プラスミドについて観察された割合も同様に示した。
【図９】COP5E2／PuroMMEG*細胞株（A）およびCOP5EBNA／PuroFRG*（B）細胞株のG418選択除去後のサザンブロット分析。選択除去後の示した時点に、全DNAを細胞から抽出してDpnIおよびMluIを用いて二重消化した（pMMEG*およびpFRG*プラスミドを線状化する）。A.レーン1〜5：COP5E2／PuroMMEG*細胞株からの10μgの全DNA（24〜336h時点）、レーン6〜10：MluIにより線状化したマーカープラスミドpMMEG*（100〜500pg）。B.レーン1〜4：COP5EBNA／PuroFRG*細胞株からの3μgの全DNA（24〜228h時点）、レーン5〜7：MluIで線状化したマーカープラスミドpFRG*（50〜150pg）。同時に、d1EGFPを発現する細胞の百分率の低下がFACSで観測された（サザンブロット分析で表した）。
【図１０】CHO4.15E2細胞株におけるルシフェラーゼの発現。発現分析に用いた組換えプラスミド構築物の模式図（A）。CHO4.15E2細胞のエレクトロポレーションによるトランスフェクション後2日、5日および7日に分析したルシフェラーゼ発現の時間経過（B）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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