(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドサイトーシス促進表面を有する安定なペルフルオロカーボンナノエマルションであって、
（ｉ）少なくとも１つのペルフルオロカーボン化合物を含むペルフルオロカーボン成分；
（ｉｉ）乳化成分；及び
（ｉｉｉ）エンドサイトーシスを介したナノエマルションの細胞取り込みを誘導するエンドサイトーシス促進成分としてのトランスフェリン又はそのフラグメント若しくは誘導体
を含有し、且つ
以下の工程：
（ａ）乳化成分を含む緩衝水溶液を調製すること、
（ｂ）ペルフルオロカーボン成分を添加すること、
（ｃ）その後、工程（ｂ）の反応生成物を混合し、高圧均質化すること、及び
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物にエンドサイトーシス促進成分を添加し、生じた混合物を均質化すること
を含む方法によって得られる、安定なペルフルオロカーボンナノエマルション。
【請求項２】
１００ｎｍ未満の粒径を有する、請求項１に記載のナノエマルション。
【請求項３】
５０ｎｍの平均粒径を有する粒子からなる、請求項２に記載のナノエマルション。
【請求項４】
前記緩衝水相がナノエマルションの２５〜６０重量％を占める、請求項１から３のいずれか一項に記載のナノエマルション。
【請求項５】
前記エンドサイトーシス促進成分が、トランスフェリンである、請求項１から４のいずれか一項に記載のナノエマルション。
【請求項６】
前記少なくとも１つのペルフルオロカーボン化合物が、ＣｍＦ２ｍ＋１Ｘ、ＸＣｍＦ２ｍＸ、ＸＣｎＦ２ｎＯＣｏＦ２ｏＸ、Ｎ（ＣｏＦ２ｏＸ）３及びＮ（ＣｏＦ２ｏ＋１Ｘ）３（式中、ｍは３〜１０の整数であり、ｎ及びｏは１〜５の整数であり、Ｘは、存在する各々の場合に独立してＣｌ、Ｂｒ及びＩから選択される）から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載のナノエマルション。
【請求項７】
前記ペルフルオロカーボン化合物が、ペルフルオロオクチルブロマイド及びペルフルオロトリブチルアミン及びそれらの混合物から選択される、請求項６に記載のナノエマルション。
【請求項８】
前記乳化成分が、必須乳化成分としての少なくとも１つのリン脂質及び１又はそれ以上のヘルパー脂質を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のナノエマルション。
【請求項９】
前記少なくとも１つのリン脂質が、式Ｉ：
【化１】
0005546534.tif 000006
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ及びＣ１６〜２４アシル残基（前記アシル残基は飽和であってもよく又は不飽和であってもよく、１〜３個の残基Ｒ３を担持してもよく、Ｃ原子の１又はそれ以上は、Ｏ又はＮＲ４によって置換されてもよい）から選択され、Ｘは、Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ（Ｒ４）３＋、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（Ｎ（Ｒ４）３＋）−ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ及び−ＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｐ−ＣＨ２ＯＨ（式中、ｐは１〜５の整数であり；Ｒ３は、独立してＨ、低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ及びＯＨから選択され；Ｒ４は、独立してＨ、ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ３から選択される）から選択される）
によって表される化合物又は薬理学的に許容されるその塩から選択される、請求項８に記載のナノエマルション。
【請求項１０】
Ｒ１及びＲ２が、独立してＨ及び非置換Ｃ１６〜２４アシル残基（前記アシル残基は飽和であってもよく又は不飽和であってもよい）から選択され、Ｘが、コリン、セリン、エタノールアミン及びイノシトール残基から選択される、請求項９に記載のナノエマルション。
【請求項１１】
前記リン脂質成分が、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びそれらの混合物から選択される、請求項９又は１０に記載のナノエマルジョン。
【請求項１２】
前記ヘルパー脂質が、脂肪酸、ステロイド類、ビタミン類及びそれらの混合物から選択される、請求項８から１１のいずれか一項に記載のナノエマルション。
【請求項１３】
ペルフルオロカーボン成分（ａ）としてペルフルオロオクチルブロマイド、リン脂質としてホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール及びリゾホスファチジルコリンを含む乳化成分（ｂ）、並びにエンドサイトーシス促進成分（ｃ）としてトランスフェリンを含有する、請求項１から１２のいずれか一項に記載のナノエマルション。
【請求項１４】
医薬品及び遺伝物質を含む、親水性化合物をインビボ及びインビトロで細胞に導入するのに適する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のナノエマルション。
【請求項１５】
ＲＮＡ及びＤＮＡ配列並びにそれらの組合せ及び誘導体から選択される遺伝物質の導入に適する、請求項１４に記載のナノエマルション。
【請求項１６】
ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡの導入に適する、請求項１５に記載のナノエマルション。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のナノエマルションを含有する遺伝子導入剤又は医薬組成物。
【請求項１８】
インビボ及びインビトロで細胞に導入される医薬品及び遺伝物質をさらに含有する、請求項１７に記載の遺伝子導入剤又は医薬組成物。
【請求項１９】
ＲＮＡ及びＤＮＡ配列並びにそれらの組合せ及び誘導体から選択される遺伝物質を含有する、請求項１８に記載の遺伝子導入剤又は医薬組成物。
【請求項２０】
ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡを含有する、請求項１９に記載の遺伝子導入剤又は医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれか一項に記載のナノエマルション、及び請求項１７から２０のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤又は医薬組成物を調製するための方法であって、以下の工程：
（ａ）乳化成分を含む緩衝水溶液を調製すること、
（ｂ）ペルフルオロカーボン成分を添加すること、及び
（ｃ）その後、工程（ｂ）の反応生成物を混合し、高圧均質化すること
を含む方法。
【請求項２２】
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物にエンドサイトーシス促進成分及び／又は導入のための親水性化合物を添加し、生じた混合物を均質化すること
をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
親水性化合物をインビトロで細胞に導入するための方法であって、細胞を請求項１から１６のいずれか一項に記載のナノエマルション又は請求項１７から２０のいずれか一項に記載の遺伝子導入剤と接触させることを含む方法。
【請求項２４】
医薬品及び遺伝物質を患者に導入するための薬剤を調製するための、請求項１から１６のいずれか一項に記載のナノエマルションの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入に適する安定なペルフルオロカーボンナノエマルション、その作製及び使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
従来のオリゴヌクレオチド及び最近の短い干渉ＲＮＡは、遺伝子導入のための有望で且つ広く使用される物質である。現在までのところ、この遺伝物質を生きている動物に適用する可能性は非常に限られている。
【０００３】
遺伝物質の送達のために、ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）エマルションは酸素運搬剤として成功裏に使用されているので、これらのエマルションは有望なツールである(Daugherty, W. P., et al., Neurosurgery 54: 1223-1230 (2004); Riess, J. G., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 33:47-63 (2005))。気管内適用後、従来のペルフルオロカーボンエマルションは薬剤を肺に運搬することができる (Dickson, E. W. et al., Acad. Emerg. Med. 10: 1019-1023 (2003))。さらに、ＰＦＣエマルションは、呼気による安全な排出という利点を有する (Putyatina, T. K. et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 22: 1281-1285 (1994))。
【０００４】
従って、ペルフルオロカーボンは、生存動物への遺伝物質の送達のための有効で安全なツールとして機能することができる。酸素運搬剤としてのそれらの機能のために、従来のＰＦＣエマルションは血管床から離れるのを妨げる大きさを有し、従ってそのようなエマルションは生きている生物の細胞に物質を輸送するができない。
【０００５】
それよりは有効でないいくつかの運搬システム、例えばコレステロールに結合した又はアポリポタンパク質Ａによって媒介される肝臓への輸送(Kim, S. I. et al., A-I. Mol. Ther. 15: 1145-1152 (2007))がここ数年間に提起されてきた。
【０００６】
欧州特許第Ｂ−０７８８３４７号は、平均直径１０ｎｍまでの水滴を含有する油中水型フルオロカーボンエマルションの作製を開示する。フッ素化界面活性剤又は少なくとも１つのフッ素化界面活性剤を含む界面活性剤の混合物が乳化剤として利用される。
【０００７】
欧州特許第Ａ−１８４４７７２号は、乳化剤がＣ１０〜Ｃ３６炭化水素鎖又はフルオロカーボン鎖を有するイミダゾリウム誘導体である、オリゴヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションのための組成物を開示する。
【０００８】
欧州特許第Ｂ−００８３１７７０号は、医薬活性化合物を担持する不連続相を含むフッ素化化合物の連続マイクロディスパージョンを開示する。
【０００９】
米国特許出願第２００４／０１１５１５９号は、化粧品及び医薬品のための運搬剤として適する三成分系の界面活性物質からなる水中油型ナノエマルションを開示する。この三成分系は、アニオン、カチオン及び両親媒性界面活性剤を含有する。
【００１０】
米国特許第７，２１１，２４８号は、超音波造影剤に、血漿ＤＮＡを担持するタンパク質安定化マイクロ粒子を添加する、ＤＮＡによる肝細胞のトランスフェクションのための方法を開示する。トランスフェクションは肝細胞の超音波処理によって実施される。
【００１１】
米国特許出願第２００７／０１８４０７６号は、フルオロカーボンと治療活性物質、例えば抗癌剤の生物学的に許容される油性混合物からなるナノドロップの混合物を開示する。
【００１２】
米国特許出願第２００６／００１３８２０号は、様々なフルオロカーボン、治療薬として適切な抗原、及び場合により付加的な医薬担体を含有する組成物を開示する。この組成物は、特にＨＩＶを治療するためのワクチンとして適切であると述べられている。
【００１３】
国際公開第９６／４００５７号、同第９６／４００５３号及び欧州特許第Ａ−１３０６０８３号は、治療活性物質のための担体としての安定なペルフルオロカーボン（ナノ）エマルションを開示する。
【００１４】
米国特許第６，０７１，８９０号は、体内でＤＮＡ及びＲＮＡ及びさらに生物学的に活性な化合物の運搬を支持する両親媒性カチオン物質を開示する。これらの物質はステロイドに結合されている。
【００１５】
国際公開第０１／７２２８１２号は、トランスフェクション剤としての、ポリマー物質、生物学的に活性な治療因子及び脂質タンパク質を含有するマイクロ粒子を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】欧州特許第Ｂ−０７８８３４７号
【特許文献２】欧州特許第Ａ−１８４４７７２号
【特許文献３】欧州特許第Ｂ−００８３１７７０号
【特許文献４】米国特許出願第２００４／０１１５１５９号
【特許文献５】米国特許第７，２１１，２４８号
【特許文献６】米国特許出願第２００７／０１８４０７６号
【特許文献７】米国特許出願第２００６／００１３８２０号
【特許文献８】国際公開第９６／４００５７号
【特許文献９】国際公開第９６／４００５３号
【特許文献１０】欧州特許第Ａ−１３０６０８３号
【特許文献１１】米国特許第６，０７１，８９０号
【特許文献１２】国際公開第０１／７２２８１２号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Daugherty, W. P., et al., Neurosurgery 54: 1223-1230 (2004)
【非特許文献２】Riess, J. G., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 33:47-63 (2005)
【非特許文献３】Dickson, E. W. et al., Acad. Emerg. Med. 10: 1019-1023 (2003)
【非特許文献４】Putyatina, T. K. et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 22: 1281-1285 (1994)
【非特許文献５】Kim, S. I. et al., A-I. Mol. Ther. 15: 1145-1152 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
生物における遺伝子導入のための信頼できる運搬ビヒクルが今もなお必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
今や、エンドサイトーシス促進表面を有するペルフルオロカーボンナノエマルション、特に乳化剤としてリン脂質を有するペルフルオロカーボンナノエマルションがインビボでの遺伝物質の適用のために適切であることが見出された。
【００２０】
エンドサイトーシス促進表面を提供する分子をナノエマルションに添加することは、細胞内へのペルフルオロカーボンナノエマルションの取り込みを有意に上昇させる。本発明は、従って、
（１）エンドサイトーシス促進表面を有する安定なペルフルオロカーボンナノエマルション；
（２）前記ナノエマルションが、連続ペルフルオロカーボン相と緩衝不連続水相を有し、且つ
（ａ）少なくとも１つのペルフルオロカーボン化合物を含むペルフルオロカーボン成分；
（ｂ）乳化成分；及び
（ｃ）エンドサイトーシスを介したナノエマルションの細胞取り込みを誘導する少なくとも１つの化合物を含むエンドサイトーシス促進成分
を含有する、上記（１）の好ましい実施形態；
（３）上記（１）又は（２）で定義されたナノエマルションを含有する遺伝子導入剤又は医薬組成物；
（４）以下の工程：
（ａ）乳化成分を含む緩衝水溶液を調製すること、
（ｂ）ペルフルオロカーボン成分を添加すること、及び
（ｃ）工程（ｂ）の反応生成物を混合し、高圧ホモジナイザーによって均質化すること
を含む、上記（１）若しくは（２）のナノエマルション又は上記（３）の遺伝子導入剤若しくは医薬組成物を調製するための方法；
（５）遺伝物質を患者に導入するための薬剤を調製するための、上記（１）又は（２）で定義されたナノエマルションの使用；
（６）上記（１）若しくは（２）で定義されたナノエマルション又は上記（３）で定義された遺伝子導入剤若しくは医薬組成物を患者に投与することを含む、遺伝物質を患者に導入するための方法；並びに
（７）細胞を上記（１）若しくは（２）で定義されたナノエマルション又は上記（３）で定義された遺伝子導入剤と接触させることを含む、親水性化合物をインビトロで細胞に導入するための方法
を提供する。
また、本発明によって、以下が提供される。
［１］
エンドサイトーシス促進表面を有する安定なペルフルオロカーボンナノエマルションであって、連続ペルフルオロカーボン相と緩衝不連続水相を有し、且つ
（ａ）少なくとも１つのペルフルオロカーボン化合物を含むペルフルオロカーボン成分；
（ｂ）乳化成分；及び
（ｃ）エンドサイトーシスを介したナノエマルションの細胞取り込みを誘導する少なくとも１つの化合物を含むエンドサイトーシス促進成分
を含有するナノエマルション。
［２］
１００ｎｍ未満の粒径を有し、好ましくは約５０ｎｍの平均粒径を有する粒子からなる、［１］に記載のナノエマルション。
［３］
前記緩衝水相がナノエマルションの２５〜６０重量％を占める、［１］又は［２］に記載のナノエマルション。
［４］
エンドサイトーシスを介した細胞取り込みを誘導する前記少なくとも１つの化合物が、トランスフェリン、アポリポタンパク質Ａ１、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＩＰ）アンカー型タンパク質、メガリン結合タンパク質、アンテナペディアタンパク質、前記化合物のフラグメント及び誘導体並びに類似作用を有する化合物から選択され、最も好ましくは前記化合物がトランスフェリン又はそのフラグメント若しくは誘導体である、［１］から［３］のいずれか一項に記載のナノエマルション。
［５］
前記少なくとも１つのペルフルオロカーボン化合物が、ＣｍＦ２ｍ＋１Ｘ、ＸＣｍＦ２ｍＸ、ＸＣｎＦ２ｎＯＣｏＦ２ｏＸ、Ｎ（ＣｏＦ２ｏＸ）３及びＮ（ＣｏＦ２ｏ＋１Ｘ）３（式中、ｍは３〜１０の整数であり、ｎ及びｏは１〜５の整数であり、Ｘは、存在する各々の場合に独立してＣｌ、Ｂｒ及びＩから選択される）から選択され、好ましくはペルフルオロカーボンがペルフルオロオクチルブロマイド及びペルフルオロトリブチルアミン及びそれらの混合物から選択される、［１］から［４］のいずれか一項に記載のナノエマルション。
［６］
前記乳化成分が、必須乳化成分としての少なくとも１つのリン脂質及び１又はそれ以上のヘルパー脂質を含む、［１］から［５］のいずれか一項に記載のナノエマルション。
［７］
前記少なくとも１つのリン脂質が、式Ｉ：
【化０】
0005546534.tif 000002
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ及びＣ１６〜２４アシル残基（前記アシル残基は飽和であってもよく又は不飽和であってもよく、１〜３個の残基Ｒ３を担持してもよく、Ｃ原子の１又はそれ以上は、Ｏ又はＮＲ４によって置換されてもよい）から選択され、Ｘは、Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ（Ｒ４）３＋、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（Ｎ（Ｒ４）３＋）−ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ及び−ＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｐ−ＣＨ２ＯＨ（式中、ｐは１〜５の整数であり；Ｒ３は、独立してＨ、低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ及びＯＨから選択され；Ｒ４は、独立してＨ、ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ３から選択される）から選択される）
によって表される化合物又は薬理学的に許容されるその塩から選択され、好ましくは、Ｒ１及びＲ２が、独立してＨ及び非置換Ｃ１６〜２４アシル残基（前記アシル残基は飽和であってもよく又は不飽和であってもよい）から選択され、Ｘが、コリン、セリン、エタノールアミン及びイノシトール残基から選択され、最も好ましくは、リン脂質成分が、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びそれらの混合物から選択される、［６］に記載のナノエマルション。
［８］
前記ヘルパー脂質が、脂肪酸、ステロイド類、ビタミン類及びそれらの混合物から選択される、［６］又は［７］に記載のナノエマルション。
［９］
ペルフルオロカーボン成分（ａ）としてペルフルオロオクチルブロマイド、リン脂質としてホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール及びリゾホスファチジルコリンを含む乳化成分（ｂ）、並びにエンドサイトーシス促進成分（ｃ）としてトランスフェリンを含有する、［１］から［８］のいずれか一項に記載のナノエマルション。
［１０］
医薬品及び遺伝物質を含む、親水性化合物をインビボ及びインビトロで細胞に導入するのに適する、好ましくはＲＮＡ及びＤＮＡ配列並びにそれらの組合せ及び誘導体から選択される遺伝物質の導入に適する、最も好ましくはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡの導入に適する、［１］から［９］のいずれか一項に記載のナノエマルション。
［１１］
［１］から［１０］のいずれか一項に記載のナノエマルションを含有する遺伝子導入剤又は医薬組成物。
［１２］
インビボ及びインビトロで細胞に導入される医薬品及び遺伝物質をさらに含有する、好ましくはＲＮＡ及びＤＮＡ配列並びにそれらの組合せ及び誘導体から選択される遺伝物質を含有する、最も好ましくはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡを含有する、［１１］に記載の遺伝子導入剤又は医薬組成物。
［１３］
［１］から［１０］に記載のナノエマルション、及び［１１］又は［１２］に記載の遺伝子導入剤又は医薬組成物を調製するための方法であって、以下の工程：
（ａ）乳化成分を含む緩衝水溶液を調製すること、
（ｂ）ペルフルオロカーボン成分を添加すること、及び
（ｃ）その後、工程（ｂ）の反応生成物を混合し、高圧均質化すること
を含む方法。
［１４］
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物にエンドサイトーシス促進成分及び／又は導入のための親水性化合物を添加し、生じた混合物を均質化すること
をさらに含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
親水性化合物をインビトロで細胞に導入するための方法であって、細胞を［１］から［１０］に記載のナノエマルション又は［１１］若しくは［１２］に記載の遺伝子導入剤と接触させることを含む方法。
［１６］
医薬品及び遺伝物質を患者に導入するための薬剤を調製するための、［１］から［１０］のいずれか一項に記載のナノエマルションの使用。
［１７］
医薬品及び遺伝物質を患者に導入するための方法であって、［１］から［１０］のいずれか一項に記載のナノエマルション又は［１１］若しくは［１２］に記載の遺伝子導入剤若しくは医薬組成物を患者に投与することを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】加熱ユニットの温度プロフィール及び５匹の麻酔マウスの平均体温と標準偏差を示す。
【図２】冷却期間中の５匹の麻酔マウスの平均動脈圧を標準偏差と共に示す（対照）。
【図３】ＡＣＥ遮断薬カプトプリル（Captoperil）の適用（ｎ＝５、１０ｍｇ／ｋｇカプトプリル）から６から７時間後の平均動脈圧（±ＳＤ）を示す。灰色の点＝対照値、黒い点＝実測値。
【図４】アンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡを有するナノ担体（ｎ＝５、ナノ担体３００μｌ、Ａｇｔ  ｓｉＲＮＡ  ６０μｇ、表面：フォルテコルチン（Fortecortin）によって保護されたトランスフェリン）の適用から２４時間後の平均動脈圧（±ＳＤ）を示す。灰色の点＝対照値、黒い点＝実測値。
【図５】「ハイドロダイナミックトランスフェクション」の２秒以内に注射した、ナノ担体なしでのアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡ（ｎ＝５、Ａｇｔ  ｓｉＲＮＡ  ６０μｇ）の適用から２４時間後の平均動脈圧（±ＳＤ）を示す。灰色の点＝対照値、黒い点＝実測値。
【図６】ナノ担体の表面がエンドサイトーシス促進タンパク質トランスフェリンを有さない、不完全なナノ担体を使用したアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡ（ｎ＝５、ナノ担体３００μｌ、Ａｇｔ  ｓｉＲＮＡ  ６０μｇ、表面：トランスフェリンなし、フォルテコルチンの添加）の適用から２４時間後の平均動脈圧（±ＳＤ）を示す。灰色の点＝対照値、黒い点＝実測値。
【図７】ナノ担体を使用した非コードｓｉＲＮＡ（ｎ＝５、ナノ担体３００μｌ、Ａｇｔ  ｓｉＲＮＡ  ６０μｇ、表面：フォルテコルチンによって保護されたトランスフェリン）の適用から２４時間後の平均動脈圧（±ＳＤ）を示す。灰色の点＝対照値、黒い点＝実測値。
【図８】ナノ担体だけ（ｎ＝５、ナノ担体３００μｌ、Ａｇｔ  ｓｉＲＮＡ  ６０μｇ、表面：フォルテコルチンによって保護されたトランスフェリン）の適用から２４時間後の平均動脈圧（±ＳＤ）を示す。灰色の点＝対照値、黒い点＝実測値。
【図９】ナノ担体の粒子を示す電子顕微鏡画像。粒子は約５０ナノメートルの大きさを有する。
【図１０】画像は、４６，０００倍率での肝細胞を示す。ｓｉＲＮＡを含有するナノ担体の静脈内注射の３０分後に肝臓を外植した。矢印は、ｓｉＲＮＡを担持するナノ担体の粒子を含む、受容体媒介性エンドサイトーシス後のエンドソームを示す。細胞表面近傍の粒子の周囲の膜及び自由間隙は、受容体を介したエンドサイトーシスによって取り込みが起こることを実証する。
【図１１】５０，０００倍率での肝細胞の電子顕微鏡画像。ナノ担体及びｓｉＲＮＡの静脈内注射の２時間後に肝臓を外植した。周囲の膜を有さない暗構造体を含むナノ担体の円形小胞。図１０の画像におけるナノ担体小胞と異なり、粒子は膜によって覆われていない。明らかに、すべての可視ナノ担体はサイトゾル中に放出された。
【図１２】図１０で提示した電子顕微鏡切片の拡大詳細画像。１７５，０００倍率で、肝細胞の細胞質中に放出されたｓｉＲＮＡ担持ナノ担体の粒子を示す。図１０及び１１においても可視である粒子内の暗構造体は、組み込まれたｓｉＲＮＡに相当する。
【図１３】５０，０００倍率での肝細胞の電子顕微鏡画像。静脈内注射の４時間後に、動物を犠死させ、肝臓を抽出した。この時点でナノ担体はもはや図１０から１２において可視であった暗構造体を含まない。おそらくナノ担体によって送達されたｓｉＲＮＡは細胞質中に放出されたと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の態様（１）又は（２）の安定なペルフルオロカーボンナノエマルション（以下では簡単に「本発明のナノエマルション」と称する）は、連続ペルフルオロカーボン相と緩衝不連続水相を有する。緩衝水相はナノエマルションの２５〜６０重量％に相当することが好ましい。水相のための適切な緩衝剤は、リン酸緩衝剤、例えばリン酸二水素ナトリウムを含む。
【００２３】
本発明のナノエマルションは、１００ｎｍ未満の粒径を有することを意味するナノエマルションである。本発明のナノエマルションは、約５０ｎｍの平均粒径を有する粒子からなる。
【００２４】
本発明のナノエマルションは、少なくとも１つのペルフルオロカーボン化合物を含むペルフルオロカーボン成分（ａ）、好ましくは必須乳化成分としてリン脂質を含み、ヘルパー脂質をさらに含んでもよい乳化成分（ｂ）、及びナノエマルションの細胞取り込みを誘導する少なくとも１つの化合物を含むエンドサイトーシス促進成分（ｃ）からなる。
【００２５】
成分（ａ）の少なくとも１つのペルフルオロカーボン化合物は、好ましくは、構造：
ＣｍＦ２ｍ＋１Ｘ、ＸＣｍＦ２ｍＸ、ＸＣｎＦ２ｎＯＣｏＦ２ｏＸ、Ｎ（ＣｏＦ２ｏＸ）３及びＮ（ＣｏＦ２ｏ＋１Ｘ）３
（式中、ｍは３〜１０の整数であり、ｎ及びｏは１〜５の整数であり、Ｘは、存在する各々の場合に独立してＣｌ、Ｂｒ及びＩから選択される）
を有する化合物から選択される。
【００２６】
成分（ａ）は、前記ペルフルオロカーボン化合物の混合物を含み得る。特に好ましいペルフルオロカーボン化合物は、ペルフルオロオクチルブロマイド及びペルフルオロトリブチルアミン及びそれらの混合物である。
【００２７】
乳化成分（ｂ）は、当分野で公知の多種多様な乳化化合物、特に導入部の中で引用した参考文献に開示されているものを含み得る。好ましい乳化化合物はリン脂質であり、さらには、前述したように、リン脂質が乳化成分（ｂ）の必須乳化化合物であることが特に好ましい。従って、乳化成分（ｂ）は、好ましくは、式Ｉ：
【化１】
0005546534.tif 000003
（式中、
Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ及びＣ１６〜２４アシル残基（前記アシル残基は飽和であってもよく又は不飽和であってもよく、１〜３個の残基Ｒ３を担持してもよく、Ｃ原子の１又はそれ以上は、Ｏ又はＮＲ４によって置換されてもよい）から選択され、
Ｘは、Ｈ、−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ（Ｒ４）３＋、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（Ｎ（Ｒ４）３＋）−ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｐ−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２ＯＨ及び−ＣＨ２（ＣＨＯＨ）ｐ−ＣＨ２ＯＨ（式中、ｐは１〜５の整数であり；
Ｒ３は、独立してＨ、低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、ＣＮ及びＯＨから選択され；
Ｒ４は、独立してＨ、ＣＨ３及びＣＨ２ＣＨ３から選択される）
から選択される）
によって表される少なくとも１つのリン脂質化合物又は薬理学的に許容されるその塩を含む。
【００２８】
上記構造において、Ｒ１及びＲ２は、独立してＨ及び非置換Ｃ１６〜２４アシル残基から選択され、前記アシル残基は飽和であってもよく又は不飽和であってもよく、Ｘは、コリン、セリン、エタノールアミン及びイノシトール残基から選択されることが好ましい。リン脂質成分は、ホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びそれらの混合物から選択されることが最も好ましい。
【００２９】
乳化成分（ｂ）は、脂肪酸、ステロイド類、ビタミン類及びそれらの混合物から選択される１又はそれ以上のヘルパー脂質をさらに含んでもよい。
【００３０】
エンドサイトーシス促進成分（ｃ）において、細胞取り込みを誘導する前記少なくとも１つの化合物は、エンドサイトーシスを介した細胞取り込みを促進する化合物から選択される。これらの化合物は、トランスフェリン、そのフラグメント及び誘導体及び類似の作用／活性を有する化合物；アポリポタンパク質Ａ１、そのフラグメント及び誘導体及び類似の作用／活性を有する化合物；グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＩＰ）アンカー型タンパク質、そのフラグメント及び誘導体及び類似の作用／活性を有する化合物；メガリン結合タンパク質、そのフラグメント及び誘導体及び類似の作用／活性を有する化合物；並びにアンテナペディアタンパク質、そのフラグメント及び誘導体及び類似の作用／活性を有する化合物を含むが、これらに限定されない。特に好ましいのは、鉄輸送タンパク質トランスフェリン並びにそのフラグメント及び誘導体、特に、鉄担持シデロトランスフェリンとして特異的受容体に結合し、その結果としてエンドサイトーシスを誘導する、ヒトホロトランスフェリン並びにそのフラグメント及び誘導体である。
【００３１】
これらの輸送タンパク質は、インビボ及びインビトロで細胞エンドサイトーシスを促進するために表面に結合される可変物質を有するペルフルオロカーボンナノ担体の表面において提供される。
【００３２】
本発明の特に好ましいナノエマルションは、ペルフルオロカーボン成分（ａ）としてペルフルオロオクチルブロマイド、リン脂質としてホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、コレステロール、リゾホスファチジルコリン、ＤＬ−α−トコフェロール及びホスファチジルエタノールアミンを含む乳化成分（ｂ）、並びにエンドサイトーシス促進成分（ｃ）としてトランスフェリンを含有する。
【００３３】
本発明のナノエマルションは、インビボ及びインビトロで細胞を標的するための、医薬品及び遺伝物質を含む親水性化合物の導入に適し、特に本発明のナノエマルションは、ＲＮＡ及びＤＮＡ配列並びにそれらの組合せ及び誘導体から選択される、好ましくはすべての種類のオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ等から選択される遺伝物質の導入に適する。
【００３４】
本発明のナノエマルションは、ｍＲＮＡ内の相補的配列を同定し、それがタンパク質に翻訳されるのを妨げる又はタンパク質複合体によるｍＲＮＡの切断を生じさせる、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の導入のために特に好ましい。対応する遺伝子は、２１〜２３ヌクレオチドを含むこれらの二本鎖のＲＮＡの使用によって沈黙化される。遺伝子サイレンシングのためにｓｉＲＮＡを使用する場合、投与のための局所経路及びビヒクルの選択は、無傷生存哺乳動物細胞及び器官においてｓｉＲＮＡの有効な細胞内濃度を得るために極めて重要である。
【００３５】
本発明のナノエマルションを調製するための本発明の態様（４）の方法は、以下の工程：
（ａ）乳化成分を含む緩衝水溶液を調製すること、
（ｂ）ペルフルオロカーボン成分を添加すること、及び
（ｃ）その後、工程（ｂ）の反応生成物を混合し、次に均質化して（例えば超音波処理によって）、最後に高圧均質化すること
を含む。
【００３６】
ナノエマルションにエンドサイトーシス促進成分又は親水性化合物を担持させるために、前記方法は、工程：
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物に、エンドサイトーシス促進成分及び／又は導入のための親水性化合物（特に遺伝物質）を添加すること、及び生じた混合物を均質化すること（例えば超音波処理によって）
の１又はそれ以上をさらに含む。
【００３７】
エンドサイトーシス促進成分及び親水性化合物は、単一工程（ｄ）又は別々の工程（ｄ）で添加してもよく、またそれらを工程（ａ）の緩衝水溶液に含めてもよい。
【００３８】
本発明の態様（３）の遺伝子導入剤又は医薬組成物及び態様（５）の薬剤は、医薬的に許容される添加物、担体等をさらに含有してもよい。
【００３９】
ナノ担体の作用機構を説明し、その有効性を明らかにするために、トランスフェリンをエンドサイトーシス促進物質とするその使用を以下の「実施例」で示す。
【００４０】
例示的な遺伝子導入は、平均動脈圧の明らかな低下を生じさせるアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡの適用である。
【００４１】
本発明を以下の「実施例」においてより詳細に説明し、実施例では、トランスフェリンをエンドサイトーシス促進物質として及び短い干渉ＲＮＡを遺伝物質として使用する。これらの実施例は、しかし、本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００４２】
ペルフルオロカーボン／トランスフェリンナノ担体の調製：
ペルフルオロカーボンナノ担体の調製のために、ペルフルオロオクチルブロマイド（Ｐｅｒｆｌｕｂｒｏｎ）をリン脂質の混合物で乳化する。混合物１ｇは、蒸留水及び７５ｍＭ リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）緩衝液中にホスファチジルコリン（９８０ｍｇ）、スフィンゴミエリン（１０ｍｇ）、コレステロール（５ｍｇ）及びリゾホスファチジルコリン（５ｍｇ）を含む。ペルフルオロカーボンナノ担体１０００μｌを得るために、ペルフルオロオクチルブロマイド４７５μｌ、リン脂質３６ｍｇ、７５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ２００μｌ、ｐＨ７．４及び蒸留水３２５μｌを使用する。
【００４３】
最初に、リン脂質、リン酸二水素ナトリウム及び蒸留水を混合し、その後ペルフルオロカーボン（ＰＦＣ）溶液を添加する。４０秒以内に、複合物質を振とう機によって６０秒間混合し、中断することなく超音波装置によって１１００ｋＨｚの周波数で１２０秒間、３０秒の間隔をおいて２回均質化しなければならない。音波処理ユニットを４℃の温度に保持する。そうでなければ不溶性のＰＦＣの最終的な乳化のために、混合物を高圧ホモジナイザーに入れる。２５００バールで６回以内の均質化工程で、乳状複合物質は透明な青みがかったエマルションになる。この透明性への変化が、ペルフルオロカーボン粒子の大きさが可視波長未満になることの肉眼的マーカーである。λ＝４００ｎｍの最低可視波長（青／紫）は、混合物が透明になったとき粒径をλ／２と定義する。この時点でさらに４サイクルの均質化を追加する。粒径は、１００ｎｍ未満のすべての粒子に関して電子顕微鏡検査で５０ｎｍ（平均）と測定された。機能性ナノ担体を得るために、ホロトランスフェリン４ｍｇを滅菌０．９％ＮａＣｌ ６０μｌに溶解する。その直後に、冷却した超音波装置によってトランスフェリンを２秒間均質化する。溶解したトランスフェリンをペルフルオロカーボンエマルション１０００μｌに添加して、４ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得る。再び、化合物を３０秒間直接振とう機上に置く。
【実施例２】
【００４４】
遺伝子導入
例示的遺伝子導入：レニンは、血圧低下に応答して腎臓によって合成されるホルモンである。レニンはアンギオテンシノーゲンをアンギオテンシン１に変換し、アンギオテンシン１は、最終的にアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンギオテンシン２へと活性化される。アンギオテンシン２は中期的血圧調節のために極めて重要である。ナノ担体によって送達されるｓｉＲＮＡを介したアンギオテンシノーゲン翻訳の抑制は、従来のＡＣＥ遮断薬と同様の血圧低下を生じさせるはずである。作用の比較のために、動物の群をアンギオテンシン変換酵素遮断薬カプトプリルで処置した。この低分子水溶性物質を腹腔内注射として適用した。注射の６時間後、規定された温度調節プロフィール（以下参照）を使用して血圧への作用を測定した。
【００４５】
ｓｉＲＮＡの添加：雄性ＣＤ１マウスへのｓｉＲＮＡの導入を明らかにする。３５ｇのマウスにおける使用のために、インビボ試験の直前にｓｉＲＮＡ ６０μｇを等張ＮａＣｌ ３０μｌに添加する。この溶液をナノ担体３００μｌに添加し、超音波装置によって４℃で２秒間均質化する。
【００４６】
マウスの尾静脈へのナノ担体及び遺伝物質の注射：全身吸入麻酔のために、半閉鎖系において動物に６３％ Ｎ２Ｏ、３５％ Ｏ２及び２％ ＣＯ２中のイソフルランの混合物を自発的に吸入させた。
【００４７】
ｓｉＲＮＡとナノ担体からなる化合物を全身吸入麻酔下で微静脈に注射した。安定な呼吸循環状態を確保するため、マウスを温度調節ベッドに横たわらせ、赤外線ランプによって加温した。注射の間及び注射後に呼吸頻度を観測した。静脈内注射の直後に麻酔を停止し、動物はその後２分以内に回復した。
【００４８】
種々の配列のアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡを商業的に合成し、各々を５匹の動物の群において試験した。対照動物は、ｓｉＲＮＡを含まない若しくは非コードｓｉＲＮＡを含む完全なナノ担体、ｓｉＲＮＡの高流量注射、又はトランスフェリンを含まないＰＦＣナノ担体中のｓｉＲＮＡを摂取した。
【００４９】
遺伝子導入の標的；アンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡの適用後の血圧の低下：アンギオテンシノーゲンｍＲＮＡの翻訳が成功裏に阻止されるか否かを評価するため、規定された温度プロフィール（以下参照）の間の血圧調節への作用を測定した。温度調節ベッドを使用して、レニン−アンギオテンシノーゲン系が活性化して血圧を安定に保持するように、マウスの体温を低下させることが可能であった。機能的レニン−アンギオテンシン系の不活性化は、温度プロフィールの間に明らかに目に見える血圧の有意の低下を生じさせる。
【００５０】
静脈内注射によって動物に種々の前記化合物を投与した２４時間後に、動物に全身吸入麻酔を実施した。温度調節ベッドを４２℃に調整し、従って測定の最初の１５分間はマウスの体温を安定に保持し、基礎血圧を確認した。１５分後、ベッドの温度を３０℃に調整した。それにより加熱されたベッドの温度は継続的に低下し、血圧プロフィールが開始してから３０分後に３０．５℃に達する。この時点（３０分目）で再び血圧を測定した。ベッドの温度が３０℃に達していれば、この低温を１０分間保持した。この期間中、ベッドの温度が３０℃に達した５分後及び１０分後（プロフィールを開始してから３５分後及び４０分後）に血圧を測定した。ベッドの温度が３０℃に達した１０分後に、ベッドの温度を再び４２℃に調整した。ベッドの温度が４１．５℃に達したとき、従ってプロフィールの開始時点から４７分後に、その次の血圧値を測定した。従って、さらに３回の血圧値を５分の間隔で、すなわち血圧プロフィールを開始した５２分後、５７分後及び６２分後に評価した。加熱ベッドの温度プロフィールを表１に示す。
【表１】
0005546534.tif 000004
【００５１】
例示的遺伝子導入の結果：アンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡが生存動物の細胞に成功裏に送達されるか否かを評価するため、温度調節ベッドを利用した動物の体温低下による血圧の低下を誘導した。温度プロフィールは、麻酔したマウスの平均体温を３８℃から３５℃へと有意に低下させ、ベッドを再加熱した後の回復を生じさせた。図１は、加温ユニットにおける前記温度プロフィール後の平均体温を示す。
【００５２】
血圧へのアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡの作用を比較するため、ヒトにおいてレニン−アンギオテンシン系を抑制するための一般的な治療選択肢である、アンギオテンシン変換酵素遮断薬カプトプリルで処置した動物における温度プロフィールの影響を試験した。その後、ペルフルオロカーボンナノエマルション及びトランスフェリンを含有する又はナノエマルションだけを含有するナノ担体中のアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡを摂取した動物において温度プロフィールの影響を試験した。データを、ナノ担体、ナノ担体と非コードｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ単独で処置した対照動物の血圧値と比較した。機能的ナノ担体及びｓｉＲＮＡは動物によって良好に耐容された。
【００５３】
未処置動物における血圧プロフィール：図２は、未処置マウスの平均動脈圧を示す。
【００５４】
アンギオテンシン変換酵素遮断薬で処置した動物における血圧プロフィール：アンギオテンシン変換酵素遮断薬カプトプリルで処置したマウスは、レニン−アンギオテンシン系の障害を有する。規定された温度プロフィールの間の血圧への体温低下の影響を試験した。それにより、ベッドの温度が３０℃に達した５分後及び１０分後に血圧の著明な低下が明らかにされた。これらの動物おいて正常基礎血圧値への回復は緩やかに起こったため、動物は５２分目でまだ低血圧であった（図３）。
【００５５】
ナノ担体を介したアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡ送達後のマウスにおける血圧プロフィール：動物は、ナノ担体によって送達されたアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡ配列ＣＣＧ  ＧＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＧＡＧ  ＡＡＡ（配列番号１）を摂取した。静脈内注射により、ナノ担体３００μｌ中でｓｉＲＮＡ ６０μｇを適用した。２４時間のインキュベーション期間により、ｓｉＲＮＡはアンギオテンシノーゲンの翻訳を妨げ、それによってレニン−アンギオテンシン系に影響を及ぼした。対照と比較して、動物は基礎血圧の障害を有し、体温の低下後に明確な血圧の低下があった。さらに、血圧は５７分目まで低い値のままであった。従って、測定された血圧値は、アンギオテンシン変換酵素阻害剤で処置した動物とナノ担体を介して送達されたアンギオテンシンｓｉＲＮＡを摂取した動物との間で同様であった。図４は、ｓｉＲＮＡ後の動脈圧の低下がアンギオテンシノーゲンの阻害を誘導したことを示す。
【００５６】
さらなる対照動物における血圧プロフィール：４つの群の対照動物に、表２に示す複合物質を与えた。これらの群の動物では、体温低下に対する応答として３５分目及び４０分目に血圧が低下した。３７℃〜４２℃の正常値への回復により血圧は再び急速に上昇し、動物は４７分目からプロフィールが終了するまで正常基礎値を有していた。体温低下に関連して認められた血圧低下はわずかであり、温度が再び正常値に達した直後に正常基礎値への回復が起こり、従ってこれらのプロフィールは未処置動物のものと同様であった（統計的に差がなかった）。
【表２】
0005546534.tif 000005
【００５７】
エンドサイトーシス促進分子を有さないペルフルオロカーボンナノエマルション：エンドサイトーシス促進表面を有さないペルフルオロカーボンナノエマルションに関する実験データを、血圧調節性レニン−アンギオテンシノーゲン系に対するｓｉＲＮＡの例示的使用について図６に示す。
【００５８】
エンドサイトーシス促進表面を有さないペルフルオロカーボンナノエマルションで処置した動物の血圧プロフィールを対照動物の血圧プロフィールと比較した。この実験データは、エンドサイトーシス促進表面を有さないペルフルオロカーボンナノエマルションは、この物質を摂取した動物の血圧プロフィールが対照の血圧プロフィールと有意に異ならなかったことから、生存動物の細胞への遺伝物質の送達に関して機能性ではないことを明らかにする。
【００５９】
マウスの肝細胞へのアンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡ送達の電子顕微鏡可視化：体重３５ｇのマウスに、アンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡを担持するナノ担体の尾静脈注射を実施した。３０分間及びそれぞれ４時間ずつ２回の間隔を置いた後、動物を犠死させ、肝臓を外植した。肝組織をエポキシ樹脂で包埋し、ミクロトームによって薄切片を得た。これらの切片の電子顕微鏡検査は、細胞に組み込まれたナノ粒子の特殊な外観を明確に示した。生存動物の無傷器官にｓｉＲＮＡを送達するためのナノ担体の効率性が電子顕微鏡画像において明らかにされた：最初の３０分以内にナノ担体は受容体媒介性取り込みによって細胞内エンドソームに組み込まれた。注射後最初の２時間に、ナノ担体はエンドソームを離れ、細胞質中に遊離された。次の２時間の後に、ナノ担体の高電子密度の構造体はもはや目に見えず、おそらく運搬されたｓｉＲＮＡが放出されて、サイトゾル内に遊離されたことを示唆する。
【００６０】
図９から１３に示す電子顕微鏡画像は、ナノ担体の構造を示し、生存マウスにおける静脈内注射後のその受容体を介した取り込み、細胞内エンドソームからの遊離及び送達されたｓｉＲＮＡの放出を明らかにする。
【００６１】
図１０から１３は、マウスの肝組織からの横断面の電子顕微鏡画像を示す。
配列表、フリーテキスト
配列番号１  アンギオテンシノーゲンｓｉＲＮＡ配列
【図１】
0005546534.tif 000007
【図２】
0005546534.tif 000008
【図３】
0005546534.tif 000009
【図４】
0005546534.tif 000010
【図５】
0005546534.tif 000011
【図６】
0005546534.tif 000012
【図７】
0005546534.tif 000013
【図８】
0005546534.tif 000014
【図９】
0005546534.tif 000015
【図１０】
0005546534.tif 000016
【図１１】
0005546534.tif 000017
【図１２】
0005546534.tif 000018
【図１３】
0005546534.tif 000019
【配列表】
0005546534000001.xml