(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(II)：
【化１】
0005542832.tif 000141
{式中：
Ｒ１はＨまたはアミノ末端修飾基であり；
Ｒ２はＯＨまたはカルボキシ末端修飾基であり；
ｎは１〜５０００の整数であり；
各ＢＢは独立してアミノ酸基、式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｄ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｅ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｆ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｇ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｈ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｉ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｊ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｋ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基または式(Ｌ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択され；
【化２】
0005542832.tif 000142
【化３】
0005542832.tif 000143
〔式中：
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)、シクロアルキルまたは−ＬＸ１から選択され；
Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルであり；
Ａは場合により−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)、シクロアルキルまたは−ＬＸ１から独立して選択される１〜３個の置換基により置換されていてよいフェニルであり；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、
【化４】
0005542832.tif 000144
−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−または−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり、そして
Ｘ１はポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、脂質、細胞毒性化合物、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、炭水化物、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、スピン標識、フルオロフォア、フォトケージド部分、ビオチン、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、免疫原性ハプテン、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２または−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕；そして
ここで、少なくとも１個のＢＢが式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基または式(Ｄ−１)または式(Ｅ−１)または式(Ｆ−１)または式(Ｇ−１)または式(Ｈ−１)または式(Ｉ−１)または式(Ｊ−１)または式(Ｋ−１)または式(Ｌ−１)である。}
の構造を有する化合物。
【請求項２】
環Ａが−ＬＸ１で置換されているフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
各ＢＢが独立してアミノ酸基、式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｄ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｅ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｆ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｇ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｈ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｉ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｊ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｋ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基または式(Ｌ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択される、請求項１に記載の化合物；
【化５】
0005542832.tif 000145
〔式中、
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)、シクロアルキルまたは−ＬＸ１から選択され；
Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルであり；
存在するとき各Ｒ７は独立して−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)、シクロアルキルまたは−ＬＸ１から選択され；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、
【化６】
0005542832.tif 000146
−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−または−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり、そして
Ｘ１はポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、脂質、細胞毒性化合物、ペプチド、タンパク質、抗体または抗体フラグメント、炭水化物、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、スピン標識、フルオロフォア、フォトケージド部分、ビオチン、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、免疫原性ハプテン、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２または−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕。
【請求項４】
Ｒ６がＨである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ６がＣ１アルキルである、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ７が−ＬＸ１である、請求項３〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ１がポリエチレングリコール、フルオロフォア、免疫調節剤、リボ核酸(ＲＮＡ)、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、タンパク質、ペプチド、ビオチン、リン脂質、ＴＬＲ７アゴニスト、免疫原性ハプテン、Ｔ細胞エピトープ、脂質、炭水化物、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、スピン標識または細胞毒性化合物である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
ＬがＣ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、
【化７】
0005542832.tif 000147
である、請求項７に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００８年１０月２４日出願の米国仮特許出願番号６１／１０８,４３４に対する３５  Ｕ.Ｓ.Ｃ. §１１９(ｅ)の下の優先権の利益を主張する。優先権主張出願の開示は、引用により、その全体として、かつすべての目的に関して、本明細書に包含される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、遺伝的にコード化されたアミノ酸類のタンパク質への選択的導入に関する。本発明はまた、かかるアミノ酸類の化学誘導体化にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
メタノサルシナ科のメタン生成古細菌のメチルアミンメチルトランスフェラーゼ類は、自然にピロリシン(ＰＹＬ)を含む。ピロリシンは、同時翻訳によって各ｍＲＮＡのフレーム内ＵＡＧコドンで取り込まれるリシン類似体であり、２２番目の天然アミノ酸であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】ピロリシン(ＰＹＬ)およびピロリシン類似体ピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ：ＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂ)の構造。
【図２】ピロリシン(Ａ)およびＰＣＬ(Ｂ)の可能性のある生合成経路の比較。
【図３】ピロリシン(Ａ)およびＰＣＬ(Ｂ)でのｐｙｌＴ  ｔＲＮＡのアミノアシル化。
【図４】図４Ａ：モデルタンパク質ｈＲＢＰ４についての哺乳動物細胞への生合成により生成したＰＣＬまたはピロリシンの取り込みのためのｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを担持する、および一部位ＴＡＧ変異体遺伝子構築物を担持するプラスミド。図４Ｂ：ｈＲＢＰ４、ｍＥＰＯ、ｈＥＰＯ、およびｍＩｇＧ１のための一部位ＴＡＧ変異体遺伝子構築物。一部位は矢印で示す。
【図５】大腸菌(Escherichia coli)細胞への生合成により生成したＰＣＬまたはピロリシンの取り込みのためのｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを担持するプラスミド。
【図６】図６Ａ：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞でのｈＲＢＰ４の発現。ｈＲＢＰ４のＴＡＧ変異体構築物(＃１−９)。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット。２６kDaの矢印は完全長ｈＲＢＰ４を示す。図６Ｂおよび６Ｃ：Ｄ−オルニチン存在下、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で生成した精製ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ６２ＰＣＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Ａ)および質量スペクトル(Ｂ)。
【図７】ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬのトリプシン消化物の質量分光分析は、標的Ｐｈｅ１２２ＴＡＧ部位でのＰＣＬの取り込みを示す。ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫ(Ｆ＊＝ＰＣＬ)(配列番号１７)の割り当てられたＭＳ／ＭＳスペクトル
【図８】ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬのトリプシン消化物の質量スペクトル分光分析(ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫの２＋イオンのＴＩＣおよびＥＩＣ)(配列番号１７)は、標的Ｐｈｅ１２２ＴＡＧ部位でのＰＣＬの取り込みを示す。
【図９】ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬのトリプシン消化物の質量分光分析。質量スペクトルは、ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫ(配列番号１７)の３＋および２＋前駆体を示し、標的Ｐｈｅ１２２ＴＡＧ部位でのＰＣＬの取り込みを示す。
【図１０】ＨＥＫ２９３Ｆ細胞からの溶解物における、Ｄ−オルニチンから生合成したＰＣＬの検出。
【図１１】ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における種々のｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体タンパク質へのＮ−ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(ＣＹＣ)の取り込み。図１１Ａは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｈｉｓタグおよび抗ＲＢＰ４抗体を用いるウェスタンブロッティングで検出して、ｈＲＢＰ４の種々の部位でのＣＹＣ取り込みを示す。図１１Ｂは、精製ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ６２ＣＹＣ(変異体＃２)のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図１１Ｃは、ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ６２ＣＹＣの質量スペクトルを示す。
【図１２】ｈＲＢＰ４変異体Ｐｈｅ６２ＣＹＣのＴＡＧ部位でのＣＹＣ取り込みの質量分析検証。
【図１３】ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用したｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体タンパク質への種々のピロリシン類似体(ＣＹＣを含む)の種々の前駆体の関数としてのＰＣＬ取り込みおよび直接取り込み(図１３Ａおよび図１３Ｂ)、および生合成遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの異なる組合せを使用したＰＣＬ取り込み(図１３Ｃ)。図１３Ａは、未精製サンプルの抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットであり、図１３Ｂは、Ｎｉ−ＮＴＡ精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図１４】ＰＣＬ生合成のための可能性のある前駆体(Ａ)および種々のピロリシン類似体(Ｂ)。
【図１５】ＨＫ１００細胞のＦＡＳＴＥへのＰＣＬの取り込みのための種々の前駆体および遺伝子組合せの評価。
【図１６】ＰＣＬ(ＰＣＬ−Ａ)形成のための可能性のある生合成スキーム。
【図１７】図１７Ａ：マウスＩｇＧ１のＦｃドメインにおける一ＴＡＧコード化部位(４部位)での生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。図１７Ｂ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出したエリスロポエチン(ＥＰＯ)の一ＴＡＧコード化部位(１１部位)での生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。
【図１８】ヒト脂肪酸シンセターゼ(ＦＡＳ−ＴＥ)のチオエステラーゼドメインにおける一ＴＡＧコード化部位(２部位)での生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。図１８は、ＰＣＬ取り込みのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Ａ)およびマススペクトル(Ｂ)を示す。
【図１９】ＦＫＢＰ−１２における一ＴＡＧコード化部位(１部位)での生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。図１９は、ＰＣＬ取り込みについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Ａ)およびマススペクトル(Ｂ)およびＦＫＢＰ１２−Ｉ９０ＰＣＬの結晶(Ｃ)を示す。
【図２０】線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)における一ＴＡＧコード化部位(２０部位)での生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＦＧＦ２１への複数部位でのＰＣＬ取り込みを示す。
【図２１】図２１Ａは、ｐｙｌＢの存在下および非存在下でのＴＡＧ停止コドンに変異されたグルタミンＧｌｎ２１(ＣＡＡ)を伴うｍＴＮＦ−ａへのＰＹＬ−またはＰＣＬ−取り込みのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。図２１Ｂ：タンパク質の純度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価。図２１Ｃは、大腸菌で発現されたｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧのインタクト・マススペクトルを示し、ＰＹＬおよびＰＣＬ取り込み(図２１Ｃ、下部)および優勢にＰＣＬ(図２１Ｃ、上部)を伴うタンパク質の混合物を示唆する。
【図２２】２−アミノ−ベンズアルデヒドを用いるＰＣＬの化学誘導体化のための可能性のある反応スキーム。
【図２３】２−アミノベンズアルデヒド、２−アミノアセトフェノンおよび２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノンでのＰＣＬの誘導体化後に過程されるタンパク質コンジュゲートおよび質量変化。
【図２４】２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)で誘導体化したｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの質量分光分析。
【図２５】２−ＡＢＡ誘導体化ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ  タンパク質のトリプシン消化物の質量分光分析は、ＴＡＧ部位に取り込まれたＰＣＬ基の誘導体を証明する。ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫ  ペプチド(配列番号１７)
【図２６】ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの２−ＡＢＡでの誘導体化のｐＨ依存性の評価。
【図２７】反応体対タンパク質濃度比関数としての反応効率、ならびに２−ＡＢＡ、２−ＡＮＢＰおよび２−ＡＡＰとの反応性の評価。
【図２８】４７００(Ａ：２−ＡＢＡがタンパク質より４７００倍過剰)より大きいモル比での誘導体化およびＯＭｅＰｈｅが取り込まれたｈＲＢＰ４(Ｂ：１５４００倍過剰)について。
【図２９】２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)でのＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬの誘導体化。未反応サンプル(ＡおよびＣ)および２−ＡＡＰでｐＨ５.０(Ｂ)およびｐＨ７.４(Ｄ)で誘導体化したサンプルのマススペクトル。
【図３０】２−アミノ−ベンズアルデヒドまたは２−アミノ−ベンズアルデヒド類似体でのピロリシンおよび／またはＰＣＬの化学誘導体化を介するタンパク質の部位特異的修飾についての一般的反応スキーム。
【図３１】タンパク質に取り込まれたＰＣＬ基を介してタンパク質に結合した官能化ＰＥＧポリマー、２−アミノ−アセトフェノン類−ＰＥＧ８(２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８；ＴＵ３２０５−０４４)の一態様の図説。
【図３２】２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８でのｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの誘導体化。未反応ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ  タンパク質(Ｃ)および２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８の付加有り(ＤおよびＥ)および無しの野生型ｈＲＢＰ４と比較したｐＨ７.５(Ａ)およびｐＨ５.０(Ｂ)で２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８誘導体化後の１２２位に取り込まれたＰＣＬを有するｈＲＢＰ４のマススペクトル。
【図３３】２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８でのＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬの誘導体化。未反応タンパク質(Ａ)および２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８と反応させたＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬ  タンパク質(ＴＵ３２０５−０４４)(Ｂ)の質量スペクトル。図３３Ｃおよび３３Ｄは、２.４kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧでのＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬの誘導体化を示す(ＴＵ３２０５−０４８)(図３３Ｃは室温で、および図３３Ｄは４℃で誘導体化)。
【図３４】示すモル比での０.５kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧ(２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８)、２.４kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧおよび２３kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧでのＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬのペグ化。
【図３５】２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８でのＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８１ＰＣＬの誘導体化。未反応ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬ(Ａ)および２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８で誘導体化後のＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬ(Ｂ)のマススペクトル。
【図３６】部分的精製前(Ａ)および後(Ｂ)のＰＥＧ−ＦＧＦ２１、完全長(ＦＬ)ＦＧＦ２１−ＰＣＬおよび切断型(ＴＲ)ＦＧＦ２１−ＰＣＬを示すＦＧＦ２１タンパク質のペグ化。２３kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧでのＦＧＦ２１  ＰＣＬ変異体の７個の誘導体化後に得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果。
【図３７】ＥＰＯタンパク質のペグ化。２３kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧでのマウスＥＰＯＰＣＬ変異体誘導体化後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図３８】アミノ糖類でのＰＣＬの誘導体化。Ｄ−マンノサミンが取り込まれたＰＬＣを有するタンパク質(Ｒ１として図説)に結合している一般化された反応スキーム。
【図３９】Ｄ−マンノサミンでのｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの誘導体化。マンノサミンとの反応後に１２２位に取り込まれたＰＣＬを有するｈＲＢＰ４の質量スペクトル。
【図４０】Ｄ−マンノサミンでのＦＡＳ−ＴＥ  Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬの誘導体化。２２２２位に取り込まれたＰＣＬを有する未反応ヒト脂肪酸シンセターゼ(ＦＡＳ−ＴＥ)(ＦＡＳ−ＴＥ  Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬ／Ｌｅｕ２２２３Ｉｌｅ)(Ａ)およびマンノサミンと反応させたタンパク質(Ｂ)の質量スペクトル。
【図４１】オリゴ糖類に結合した２−ＡＢＡ部分とタンパク質に取り込まれたＰＣＬの反応による、オリゴ糖類のタンパク質への部位特異的結合の一態様の図説。
【図４２】取り込まれたＰＬＣを有するタンパク質の架橋により形成されたタンパク質−タンパク質コンジュゲート(ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ホモ三量体)のある態様の図説。
【図４３】ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬタンパク質について図説し、ＰＣＬ特異的、二官能性クロスリンカーを用いたホモ二量体形成。ホモ二量体を形成するために使用する二官能性クロスリンカーの例をＡに示すが、これに限定されない。この二官能性リンカーを使用した架橋ＦＧＦ−２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬの反応混合物の質量スペクトルをＢに示す。
【図４４】二官能性クロスリンカーを用いたＦＧＦ−２１  ＰＣＬ変異体タンパク質のホモ二量体形成。図４４Ａは、反応条件を図４３において使用したものから変えている、架橋ＦＧＦ−２１の質量スペクトルを示す。
【図４５】三量体の形成に使用したクロスリンカーの態様。
【図４６】部位特異的標識の種々の態様およびここに記載する方法で使用する標識の図説。
【図４７】図４７Ａは、ビオチンとコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。図４７Ｂは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)接合ヤギ抗ビオチン抗体を使用したｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−ビオチンコンジュゲートのウェスタンブロット。図４７Ｃは、フルオレセインとコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。図４７Ｄは、二糖とコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。
【図４８】図４８Ａは、モノ−ニトロフェニルハプテンとコンジュゲートしたｍＴＮＦ−Ｑ２１ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。図４８Ｂは、モノ−ニトロフェニルハプテンとコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。図４８Ｃは、ジ−ニトロフェニルハプテンとコンジュゲートしたｍＴＮＦ−Ｑ２１ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。図４８Ｄは、ジ−ニトロフェニルハプテンとコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。
【図４９】図４９Ａは、ＴＬＲ７アゴニストとコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示し、図４９Ｂは、リン脂質とコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。
【図５０】図５０Ａおよび図５０Ｂは、異なる２個のｐＨ値(図５０Ａ：ｐＨ５.０；図５０Ｂ：ｐＨ７.５)でＰＸ２−ＰＡＤＲＥとコンジュゲートしたｍＴＮＦ−Ｑ２１ＰＣＬのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析を示す。図５０Ｃは、ＢＨＡ−ｅｘＰＡＤＲＥとコンジュゲートしたｍＴＮＦ−Ｑ２１ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。
【図５１】図５１は、ＢＨＡ−ｅｘＰＡＤＲＥのｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬへの結合を示すＥＳＩ質量スペクトルを示す。
【図５２】図５２Ａは、ＢＨＡ−ＢＧ１(７.４kDa)およびＢＨＡ−ＢＧ２(７.４kDa)のｍＴＮＦ−Ｑ２１ＰＣＬ(１９.３kDa)への結合のゲルシフトアッセイである。図５２Ｂは、ＢＨＡ−ＢＧ２(７.４kDa)のｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬ(７.２kDa)への結合のゲルシフトアッセイである。
【図５３】図５３は、かかる部位特異的配向結合の一態様を図説する。
【図５４】図５４Ａは、２−ＡＢＡに結合し、２０mM  ＮａＣＮＢＨ３で１時間還元させたｈＦＧＦ２１−Ｋ１５０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。図５４Ｂは、１０mM  リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)で透析し、５０℃で１日間インキュベートした後の還元ｈＦＧＦ２１−Ｋ１５０ＰＣＬ  ２−ＡＢＡコンジュゲートのＥＳＩ質量分光分析を示す。
【図５５】図５５は、ＮａＣＮＢＨ３を用いる還元有りおよび無しのペグ化ＦＧＦ２１に対するＰＣＬ結合の安定性を証明する。還元サンプルおよび非還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図５５Ａに示す。加えて、図５５Ｂは、４℃、室温、３７℃および５０℃、および９５℃で６０時間インキュベートした非還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図５６】ＰＣＬ−Ａの２−ＡＢＡとの反応のＮＭＲ解析。
【図５７】図５７Ａは、ＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡの反応によりもたらされる生成物の提案される構造である。図５７Ｂは、ＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡの反応によりもたらされる生成物の提案される平衡構造を示す。図５７Ｃは還元生成物の提案される構造である。
【図５８】ＰＣＬ−Ｂの２−ＡＢＡとの反応のＮＭＲ解析。
【図５９】ｍＥＧＦに取り込まれたピロリシン(Ｐｙｌ)およびＰＣＬの誘導体化。
【発明の概要】
【０００５】
発明の要約
ここに提供されるのは１個以上の取り込まれたＰＣＬを有するタンパク質および／またはポリペプチドであって、ここで、該ＰＣＬを生合成的に製造し、該タンパク質および／またはポリペプチドに取り込まれている。またここに提供されるのは、１個以上の取り込まれたピロリシン(ＰＹＬ)を有するタンパク質および／またはポリペプチドであって、ここで、該ＰＹＬを生合成的に製造し、該タンパク質および／またはポリペプチドに取り込まれている。また提供されるのは、１個以上の取り込まれたＰＣＬおよび１個以上の取り込まれたＰＹＬを有するタンパク質および／またはポリペプチドであって、ここで、該ＰＣＬおよびＰＹＬを生合成的に製造し、該タンパク質および／またはポリペプチドに取り込まれている。
【０００６】
またここで提供されるのは、１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質および／またはポリペプチドであって、ここで、該ＰＣＬを生合成的に製造し、該タンパク質および／またはポリペプチドに取り込まれ、そして１個以上のＰＣＬ部分がそれによりタンパク質および／またはポリペプチドに、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物か；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド(photocaged)部分、化学線(actinic radiation)励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター(radiotransmitter)、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、および−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される基を結合することにより誘導体化されている。
【０００７】
ある態様において、かかる１個以上の取り込まれたＰＹＬ部分を有するタンパク質および／またはポリペプチドであって、ここで、該ＰＹＬを生合成的に製造し、タンパク質および／またはポリペプチドに取り込まれ、該ピロリシンは、それにより１個以上の取り込まれたＰＣＬ部分を有するタンパク質および／またはポリペプチドについて上記した基の１個をタンパク質および／またはポリペプチドに結合することにより誘導体化されている。
【０００８】
ある態様において、かかる取り込まれた１個以上のＰＣＬおよび１個以上のＰＹＬ部分を有するタンパク質および／またはポリペプチドであって、ここで、該ＰＣＬおよびＰＹＬを生合成的に製造し、タンパク質および／またはポリペプチドに取り込まれ、該ＰＣＬおよびピロリシンは、それにより１個以上の取り込まれたＰＣＬ部分を有するタンパク質および／またはポリペプチドについて上記した基の１個をタンパク質および／またはポリペプチドに結合することにより誘導体化されている。
【０００９】
ある態様において、かかる上記生合成は真核細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞または昆虫細胞で起こる。ある態様において、細胞は大腸菌細胞であり、他の態様において酵母細胞は出芽酵母またはピチア・パストリス(Pichia pastoralis)細胞である。ある態様において、細胞はＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞またはｓｆ９細胞である。
【００１０】
ここに提供される一面は、式(Ｉ)または式(II)：
【化１】
0005542832.tif 000002
{式中：
Ｒ１はＨまたはアミノ末端修飾基であり；
Ｒ２はＯＨまたはカルボキシ末端修飾基であり；
ｎは１〜５０００の整数であり；
各ＡＡは独立してアミノ酸基、式(Ａ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基および式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択され；
各ＢＢは独立してアミノ酸基、式(Ａ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｄ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｅ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｆ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｇ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｈ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｉ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｊ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｋ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基および式(Ｌ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択され；
【００１１】
【化２】
0005542832.tif 000003
〔式中：
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルであり；
ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５−６員単環式アリール、５−６員単環式ヘテロアリール、９−１０員縮合二環式環または１３−１４員縮合三環式環であり、ここで、Ａは、場合により−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から独立して選択される１〜５個の置換基により置換されていてよく；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール),−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり、そして
Ｘ１は標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕；そして
ここで、少なくとも１個のＡＡが式(Ａ−２)または式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基であるか、または少なくとも１個のＢＢが式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基または式(Ｄ−１)または式(Ｅ−１)または式(Ｆ−１)または式(Ｇ−１)または式(Ｈ−１)または式(Ｉ−１)または式(Ｊ−１)または式(Ｋ−１)または式(Ｌ−１)である。}
の構造を有する化合物である。
【００１２】
かかる化合物のある態様において、環Ａはフラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、ジオキソラン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラン、ピリジン、ピペリジン、ジオキサン、モルホリン、ジチアン、チオモルホリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、トリアジン、トリチアン、インドリジン、インドール、イソインドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、ナフチリジン、プテリジン、キヌクリジン、カルバゾール、アクリジン、フェナジン、フェンチアジン、フェノキサジン、フェニル、インデン、ナフタレン、アズレン、フルオレン、アントラセン、フェンアントラセン、ノルボランおよびアダマンチンから選択される。
【００１３】
かかる化合物の他の態様において、環Ａはフェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、ジオキソラン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラン、ピリジン、ピペリジン、ジオキサン、モルホリン、ジチアン、チオモルホリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、トリアジンおよびトリチアンから選択される。
【００１４】
かかる化合物のさらに別の態様において、環Ａはインドリジン、インドール、イソインドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、ナフチリジン、プテリジン、キヌクリジン、カルバゾール、アクリジン、フェナジン、フェンチアジン、フェノキサジン、インデン、ナフタレン、アズレン、フルオレン、アントラセン、フェンアントラセン、ノルボランおよびアダマンチンから選択される。
【００１５】
かかる化合物のある態様において、環Ａはフェニル、ナフタレンおよびピリジンから選択される。
【００１６】
かかる化合物のある態様において、各ＢＢは独立してアミノ酸基、式(Ａ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｄ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｅ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｆ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｇ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｈ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｉ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｊ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｋ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基および式(Ｌ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択される；
【化３】
0005542832.tif 000004
〔式中、
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルであり；
存在するとき各Ｒ７は独立して−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり、そして
Ｘ１は標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕。
【００１７】
かかる化合物のある態様において、Ｒ６はＨであり、かかる化合物の他の態様において、Ｒ６はＣ１アルキルである。
【００１８】
かかる化合物のある態様において、Ｒ５は−ＬＸ１である。かかる化合物のある態様において、Ｒ７は−ＬＸ１である。かかる化合物のある態様において、Ｘ１は糖、ポリエチレングリコール、蛍光部分、免疫調節剤、リボ核酸、デオキシリボ核酸、タンパク質、ペプチド、ビオチン、リン脂質、ＴＬＲ７アゴニスト、免疫原性ハプテンまたは固体支持体である。かかる化合物のある態様において、Ｌはポリ(アルキレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレンまたはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレンである。
【００１９】
ここに提供される他の面はタンパク質を誘導体化する方法であって、ここで、該タンパク質は式(Ｉ)の構造を有し、該方法は、該タンパク質と式(III)または式(IV)の反応材を反応させることを含み；ここで式(Ｉ)は：
【化４】
0005542832.tif 000005
｛式中：
Ｒ１はＨまたはアミノ末端修飾基であり；
Ｒ２はＯＨまたはカルボキシ末端修飾基であり；
ｎは１〜５０００の整数であり；
各ＡＡは独立してアミノ酸基、ピロリシンアミノ酸基、式(Ａ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基および式(Ｂ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択され；
【化５】
0005542832.tif 000006
(式中、Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルである)、そして
少なくとも１個のＡＡはピロリシンアミノ酸基または式(Ａ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基または式(Ｂ−１)であり；
そして、ここで、式(II)および式(III)は：
【化６】
0005542832.tif 000007
〔式中：
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５−６員単環式アリール、５−６員単環式ヘテロアリール、９−１０員縮合二環式環または１３−１４員縮合三環式環であり、ここで、Ａは、場合により−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から独立して選択される１〜５個の置換基により置換されていてよく；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−でから選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり、そして
Ｘ１は標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕
に対応する。｝
に対応する。
【００２０】
上記方法のある態様において、式(Ａ−１)のアミノ酸は、式(Ａ−２)または式(Ａ−３)：
【化７】
0005542832.tif 000008
の構造を有するアミノ酸基である。
【００２１】
上記方法のある態様において、式(Ｂ−１)のアミノ酸基は式(Ｂ−２)または式(Ｂ−３)：
【化８】
0005542832.tif 000009
の構造を有するアミノ酸基である。
【００２２】
上記方法のある態様において、式(Ａ−１)のアミノ酸は、式(Ｖ)のアミノ酸基であり、そして式(Ｂ−１)のアミノ酸基は式(VI)のアミノ酸基である：
【化９】
0005542832.tif 000010
〔式中、Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルである。〕。
【００２３】
ある態様において、式(Ｖ)または式(VI)のアミノ酸をｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で生合成的に製造し、そして細胞は前駆体を含む増殖培地と接触している。他の態様において、式(Ｖ)または式(VI)のアミノ酸をｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で生合成的に製造し、そして該細胞を前駆体を含む増殖培地と接触させる。
【００２４】
ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(VII)：
【化１０】
0005542832.tif 000011
の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はオルニチン、アルギニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−アルギニン、(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸または(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【００２５】
ある態様において、式(VI)のアミノ酸は式(VIII)の構造を有するアミノ酸であり：
【化１１】
0005542832.tif 000012
そして前駆体はオルニチン、アルギニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−アルギニン、(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸または(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【００２６】
ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(VII)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンである。ある態様において、式(VI)のアミノ酸は式(VIII)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンである。ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(VII)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(VII)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、式(VI)のアミノ酸は式(VIII)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、式(VI)のアミノ酸は式(VIII)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【００２７】
ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(IX)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はオルニチン、アルギニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−アルギニンまたは２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である：
【化１２】
0005542832.tif 000013
【００２８】
ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(Ｘ)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はオルニチン、アルギニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−アルギニンまたは２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である：
【化１３】
0005542832.tif 000014
【００２９】
ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(IX)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はＤ−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(Ｘ)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はＤ−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。
【００３０】
ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(IX)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｒ,３Ｓ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(Ｘ)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｒ,３Ｓ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。
【００３１】
ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(IX)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(Ｘ)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体は(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(IX)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンまたは(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、式(Ｖ)のアミノ酸は式(Ｘ)の構造を有するアミノ酸であり、そして前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンまたは(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【００３２】
上記方法のある態様において、式(Ｖ)、式(VI)、式(VII)、式(VII)、式(IX)または式(Ｘ)のアミノ酸が、直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により細胞内のタンパク質に取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳは、式(Ｖ)または式(VI)のアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【００３３】
上記方法のある態様において、細胞はさらにｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含み、そして式(Ｖ)、式(VI)、式(VII)、式(VII)、式(IX)または式(Ｘ)のアミノ酸がアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡにより細胞内のタンパク質に取り込まれ、これは細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識し、ここで、該アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼはｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そして該ｔＲＮＡはｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。
【００３４】
上記方法のある態様において、セレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。
【００３５】
上記方法のある態様において、細胞は原核細胞であり、他の態様において細胞は真核細胞である。ある態様において、細胞は大腸菌細胞であり、他の態様において細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である。ある態様において、酵母細胞は出芽酵母またはピチア・パストリス(Pichia pastoralis)細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。ある態様において、昆虫細胞はｓｆ９細胞である。
【００３６】
ここに提供される他の面は、上記方法を使用して得られる誘導体化タンパク質であり、ここで、かかる誘導体化タンパク質は式(II)：
【化１４】
0005542832.tif 000015
〔式中：
Ｒ１はＨまたはアミノ末端修飾基であり；
Ｒ２はＯＨまたはカルボキシ末端修飾基であり；
ｎは１〜５０００の整数であり；
各ＢＢは独立してアミノ酸基、式(Ａ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｂ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｄ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｅ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｆ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｇ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｈ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｉ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｊ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｋ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基および式(Ｌ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択され；
【化１５】
0005542832.tif 000016
ここで、少なくとも１個のＢＢは式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基または式(Ｄ−１)または式(Ｅ−１)または式(Ｆ−１)または式(Ｇ−１)または式(Ｈ−１)または式(Ｉ−１)または式(Ｊ−１)または式(Ｋ−１)または式(Ｉ−Ｌ)である。〕
に従う構造を有する。
【００３７】
上記方法およびかかる誘導体化タンパク質のある態様において、環Ａはフラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、ジオキソラン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラン、ピリジン、ピペリジン、ジオキサン、モルホリン、ジチアン、チオモルホリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、トリアジン、トリチアン、インドリジン、インドール、イソインドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、ナフチリジン、プテリジン、キヌクリジン、カルバゾール、アクリジン、フェナジン、フェンチアジン、フェノキサジン、フェニル、インデン、ナフタレン、アズレン、フルオレン、アントラセン、フェンアントラセン、ノルボランおよびアダマンチンから選択される。
【００３８】
上記方法およびかかる誘導体化タンパク質のある態様において、環Ａはフェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピロリン、ピロリジン、ジオキソラン、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、イソオキサゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、ピラン、ピリジン、ピペリジン、ジオキサン、モルホリン、ジチアン、チオモルホリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピペラジン、トリアジンおよびトリチアンから選択される。
【００３９】
上記方法およびかかる誘導体化タンパク質のある態様において、環Ａはインドリジン、インドール、イソインドール、インドリン、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンゾイミダゾール、ベンゾチアゾール、プリン、キノリジン、キノリン、イソキノリン、シンノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、ナフチリジン、プテリジン、キヌクリジン、カルバゾール、アクリジン、フェナジン、フェンチアジン、フェノキサジン、インデン、ナフタレン、アズレン、フルオレン、アントラセン、フェンアントラセン、ノルボランおよびアダマンチンから選択される。
【００４０】
上記方法およびかかる誘導体化タンパク質のある態様において、環Ａはフェニル、ナフタリルおよびピリジルから選択される。
【００４１】
上記方法のある態様において、各ＢＢは独立してアミノ酸基、式(Ａ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｄ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｅ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｆ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｇ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｈ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｉ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｊ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｋ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基および式(Ｌ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基から選択される；
【化１６】
0005542832.tif 000017
〔式中、
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルであり；
存在するとき各Ｒ７は独立して−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり、そして
Ｘ１は標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕。
【００４２】
上記方法およびかかる誘導体化タンパク質のある態様において、Ｒ６はＨであり、他の態様においてＲ６はＣ１アルキルである。
【００４３】
上記方法およびかかる誘導体化タンパク質のある態様において、Ｒ５は−ＬＸ１である。上記方法およびかかる誘導体化タンパク質のある態様において、Ｘ１は糖、ポリエチレングリコール、蛍光部分、免疫調節剤、リボ核酸、デオキシリボ核酸、タンパク質、ペプチド、ビオチン、リン脂質、ＴＬＲ７アゴニスト、免疫原性ハプテンまたは固体支持体である。ある態様において、Ｌはポリ(アルキレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレンまたはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレンである。
【００４４】
上記方法のある態様において、式(IV)の反応材は
【化１７】
0005542832.tif 000018
〔式中、ＬおよびＸ１はここで記載した通りである。〕
である。
【００４５】
かかる反応材のある態様において、Ｌは結合であり、そしてＸ１はポリエチレングリコールである。
【００４６】
ある態様において、式(IV)の反応材は
【化１８】
0005542832.tif 000019
【化１９】
0005542832.tif 000020
【化２０】
0005542832.tif 000021
であり、ここで、１個以上のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分を有する該化合物は、１０００Da〜５０kDaの範囲の平均分子量を有し、そしてｎは２０〜１２００であり、ここで、ｅｘＰＡＤＲＥはＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙ(ＤＡｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨであり、ＰＡＤＲＥはＧｌｙ(ＤＡｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨ、ＢＧ１は５'＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ−３'であり、そしてＢＧ２は５'＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ−３'であり、ここで＊はホスホチオエート架橋を意味する。
【００４７】
ある態様において、式(IV)の反応材は以下：
【化２１】
0005542832.tif 000022
の構造を有する化合物であり、ここで、該化合物は１０００Da〜３０kDaの範囲の平均分子量を有し、ｎは２０〜６７９である。他の態様において、式(IV)の反応材は以下：
【化２２】
0005542832.tif 000023
の構造を有する化合物であり、ここで、該化合物は１０００Da〜４５kDaの範囲の平均分子量を有し、そしてｎは２０〜１０１８である。
【００４８】
ここに提供される他の面は式(VII)または式(VIII)：
【化２３】
0005542832.tif 000024
の構造を有し、ここで、該式(VII)または式(VIII)の化合物をｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で生合成的に製造し、そして細胞は前駆体を含む増殖培地と接触している。
【００４９】
かかる化合物のある態様において、細胞はｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む。
【００５０】
かかる化合物のある態様において、前駆体はオルニチンまたはアルギニンであり、他の態様において前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンまたは(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【００５１】
かかる化合物のある態様において、式(VII)または式(VIII)の化合物が直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により細胞内のタンパク質に取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳが式(Ｖ)または式(VI)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、そして該Ｏ−ｔＲＮＡが細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【００５２】
かかる化合物のある態様において、細胞はさらにｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含み、そして式(Ｖ)または式(VI)の化合物がアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡにより細胞内のタンパク質に取り込まれ、これは細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識し、ここで、該アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。
【００５３】
ある態様において、セレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。ある態様において、細胞は原核細胞であり、他の態様において細胞は真核細胞である。ある態様において、細胞は大腸菌細胞であり、他の態様において細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である。ある態様において、酵母細胞は出芽酵母またはピチア・パストリス(Pichia pastoralis)細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。ある態様において、昆虫細胞はｓｆ９細胞である。
【００５４】
ここで提供される他の面は、式(Ｖ)または式(VI)：
【化２４】
0005542832.tif 000025
を有する化合物であり、ここで、該式(VII)または式(VIII)の化合物を生合成的に製造し、第一細胞の前駆体および第二細胞を含む増殖培地との接触により分泌され、ここで、該第一細胞はｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含むフィーダー細胞である。
【００５５】
かかる化合物のある態様において、第一細胞はｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む。
【００５６】
かかる化合物のある態様において、前駆体はオルニチンまたはアルギニンである。かかる化合物の他の態様において、前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンである。かかる化合物の他の態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。かかる化合物の他の態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【００５７】
かかる化合物のある態様において、式(VII)または式(VIII)の化合物は直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により第二細胞のタンパク質内に取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳは式(VII)または式(VIII)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、そしてＯ−ｔＲＮＡは第二細胞中のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【００５８】
かかる化合物のある態様において、第二細胞はｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含み、そして式(VII)または式(VIII)の化合物は第二細胞内のタンパク質に取り込まれる。
【００５９】
かかる化合物のある態様において、式(VII)または式(VIII)の化合物はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡにより第二細胞内のタンパク質に取り込まれ、これは細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識し、ここで、該アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。
【００６０】
かかる化合物のある態様において、セレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。
【００６１】
かかる化合物のある態様において、第一細胞または第二細胞は原核細胞である。かかる化合物のある態様において、第一細胞および第二細胞は原核細胞である。かかる化合物のある態様において、第一細胞または第二細胞は真核細胞である。かかる化合物のある態様において、第一細胞および第二細胞は真核細胞である。
【００６２】
ある態様において、原核細胞は大腸菌細胞である。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である。ある態様において、酵母細胞は出芽酵母またはピチア・パストリス(Pichia pastoralis)細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。ある態様において、昆虫細胞はｓｆ９細胞である。
【００６３】
ここに提供される他の面は、式(IX)：
【化２５】
0005542832.tif 000026
の構造を有する化合物であり、ここで、該式(IX)の化合物をｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で生合成的に製造し、そして細胞を２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸またはＤ−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸を含む増殖培地と接触させる。
【００６４】
かかる化合物のある態様において、２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸は(２Ｒ,３Ｓ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。
【００６５】
かかる化合物のある態様において、２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸は(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。
【００６６】
かかる化合物のある態様において、細胞はｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含み、そして細胞をオルニチン、アルギニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−アルギニン、(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸またはＤ−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸を含む増殖培地と接触させる。
【００６７】
かかる化合物のある態様において、式(IX)の化合物が直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により細胞内のタンパク質に取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳは、式(IX)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、そしてＯ−ｔＲＮＡが細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【００６８】
かかる化合物のある態様において、細胞はさらにｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含み、そして式(IX)の化合物がアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡにより細胞内のタンパク質に取り込まれ、これは細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識し、ここで、該アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。
【００６９】
ある態様において、セレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。ある態様において、細胞は原核細胞であり、他の態様において、細胞は真核細胞である。ある態様において、原核細胞は大腸菌細胞である。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である。ある態様において、酵母細胞は出芽酵母またはピチア・パストリス(Pichia pastoralis)細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。ある態様において、昆虫細胞はｓｆ９細胞である。
【００７０】
ここに提供される他の面は式(IX)：
【化２６】
0005542832.tif 000027
の構造を有する化合物であり、ここで、該式(IX)の化合物を生合成的に製造し、そして２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸またはＤ−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸を含む増殖培地、および第二細胞と接触させることにより第一細胞から分泌させ、そしてここで、該第一細胞はｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含むフィーダー細胞である。
【００７１】
かかる化合物のある態様において、２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸は(２Ｒ,３Ｓ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。
【００７２】
かかる化合物のある態様において、２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸は(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。
【００７３】
かかる化合物のある態様において、細胞はｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含み、そして細胞をオルニチン、アルギニン、Ｄ−オルニチン、Ｄ−アルギニン、(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸またはＤ−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸を含む増殖培地と接触させる。
【００７４】
かかる化合物のある態様において、式(IX)の化合物は直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により第二細胞のタンパク質内に取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳは、式(IX)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、そしてＯ−ｔＲＮＡは第二細胞中のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【００７５】
かかる化合物のある態様において、第二細胞はｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含み、そして式(IX)の化合物は第二細胞内のタンパク質に取り込まれる。
【００７６】
かかる化合物のある態様において、式(IX)の化合物はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよびｔＲＮＡにより第二細胞内のタンパク質に取り込まれ、これは細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識し、そしてここで、該アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。
【００７７】
ある態様において、セレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。
【００７８】
ある態様において、第一細胞または第二細胞は原核細胞である。ある態様において、第一細胞および第二細胞は原核細胞である。ある態様において、第一細胞または第二細胞は真核細胞である。ある態様において、第一細胞および第二細胞は真核細胞である。ある態様において、原核細胞は大腸菌細胞である。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である。ある態様において、酵母細胞は出芽酵母またはピチア・パストリス(Pichia pastoralis)細胞である。ある態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞である。ある態様において、昆虫細胞はｓｆ９細胞である。
【００７９】
ここに提供される他の面は、次の式(IV)の化合物であり：
【化２７】
0005542832.tif 000028
【化２８】
0005542832.tif 000029
【化２９】
0005542832.tif 000030
ここで、１個以上のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分を有する化合物は１０００Da〜５０kDaの範囲の平均分子量を有し、そしてｎは２０〜１２００であり、ここで、ｅｘＰＡＤＲＥはＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙ(ＤＡｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨであり、ＰＡＤＲＥはＧｌｙ(ＤＡｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨであり、ＢＧ１は５'＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ−３'であり、そしてＢＧ２は５'＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ−３'であり、そして＊はホスホチオエート架橋を意味する。
【００８０】
発明の詳細な説明
ここに提供されるのは、部位特異的に修飾したタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを使用する方法および組成物であり、ここで、かかる方法は、遺伝的にコード化されたピロリシンまたはピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)基の部位特異的修飾を含み、ここで、該ピロリシンおよびＰＣＬアミノ酸類生合成的に製造されている。ここに提供されるのは、生合成的に取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分またはピロリシンを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに部位特異的に結合した種々の分子である。ある態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、部位特異的にタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを標識する。ある態様において、標識は蛍光部分、リン光部分、化学発光部分、キレート化部分、挿入部分、放射活性部分、発色団部分、放射活性部分、スピン標識部分、ＮＭＲ活性部分、ＰＥＴまたはＭＲＩイメージング剤である。ある態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、免疫調節剤をタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに結合させる。他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用してポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)をタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに結合させる。他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、糖類(グリコシル化)をタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに結合させる。
【００８１】
他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、部位特異的にタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを架橋し、それによりヘテロ二量体およびヘテロ三量体を含み、これに限定されないヘテロオリゴマーを形成する。ある態様において、かかる部位特異的修飾を意匠して、部位特異的に抗体をタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに架橋する。他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、部位特異的にタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを架橋し、それによりタンパク質−タンパク質コンジュゲート、タンパク質−ポリペプチドコンジュゲート、タンパク質−ペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ポリペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ペプチドコンジュゲートまたはペプチド−ペプチドコンジュゲートを形成させる。
【００８２】
他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して部位特異的に抗体をタンパク質に結合させ、ここで、該タンパク質はここで提供される毒性タンパク質であり、それにより抗体−医薬コンジュゲートを形成させる。他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して部位特異的に抗体をタンパク質に結合させ、ここで、該抗体は低分子量医薬に結合しており、それにより抗体−医薬コンジュゲートを形成させる。
【００８３】
他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、部位特異的に受容体−リガンドをタンパク質に結合させ、ここで、該タンパク質はここで提供される毒性タンパク質であり、それにより受容体−リガンド−医薬コンジュゲートを形成させる。他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して部位特異的に受容体−リガンドをタンパク質に結合させ、ここで、該受容体−リガンドは低分子量医薬に結合しており、それにより受容体−リガンド−医薬コンジュゲートを形成させる。
【００８４】
ここに提供されるのは、ここに記載した方法を使用する、取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドである。かかるタンパク質は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、インターフェロンアルファ(ＩＮＦ−α)、インターロイキン２(ＩＬ−２)、インターロイキン４(ＩＬ−４)、インターロイキン６(ＩＬ−６)、インターロイキン１０(ＩＬ−１０)、インターロイキン１７(ＩＬ−１７)、インシュリン様増殖因子１(ＩＧＦ−１)、およびインターフェロンベータ(ＩＮＦ−β)を含み、これらに限定されない。
【００８５】
ここに提供されるのは、ここに記載する方法を使用した取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬを有し、そしてここに記載する方法を使用してさらに誘導体化されているタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドである。かかる誘導体化は、ペグ化を含み、これに限定されない。かかるタンパク質は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、インターフェロンアルファ(ＩＮＦ−α)、インターロイキン２(ＩＬ−２)、インターロイキン４(ＩＬ−４)、インターロイキン６(ＩＬ−６)、インターロイキン１０(ＩＬ−１０)、インターロイキン１７(ＩＬ−１７)、インシュリン様増殖因子１(ＩＧＦ−１)、およびインターフェロンベータ(ＩＮＦ−β)を含み、これらに限定されない。
【００８６】
さらにここに提供されるのは取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドであり、ここで、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、ここに提供する方法を記載して架橋されている。かかるタンパク質は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、インターフェロンアルファ(ＩＮＦ−α)、およびインターフェロンベータ(ＩＮＦ−β)を含み、これらに限定されない。
【００８７】
他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用してタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを製造し、ここで、ここで、該ピロリシンまたはＰＣＬを部位特異的に取り込む位置は、固体支持体の表面へのかかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの制御された配向および結合を可能にする。ある態様において、かかる固体支持体はプラスチックマイクロタイタープレート、スライド・ガラス、シリカ表面、ポリマービーズ、金粒子または被覆されたまたは被覆されていないナノ粒子である。ある態様において、かかる制御された配向および結合を、ＥＬＩＳＡまたは他の抗体アッセイによるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの解析に使用する。ある態様において、かかる制御された配向および結合を使用して、固定化タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドのリガンドを精製および／または同定する。ある態様において、かかる制御された配向および結合を使用して、表面プラズモン共鳴解析を使用した無標識解析を含み、これに限定されない、エバネセント波によるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドおよびそれらの相互作用を解析する。ある態様において、表面へのかかる制御された配向および結合を使用して、微量てんびん(電気的、光学的および／または機械的)、赤外線分光学、表面増感ラマン分光学を含むラマン分光学、エバネッセンス(evanescence)共鳴、蛍光、インターフェロメトリー、質量分析および他の分光学法を使用して、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドおよびそれらの相互作用を解析する。かかる解析方法を使用して、固定化タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドと他のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸類、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子、医薬、代謝物、糖類、炭水化物、オリゴ糖類、多糖類および／または他の分子の、相互作用により誘発される構造変化を含む相互作用を試験する。かかる解析を使用して、また固定化タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドと多サブユニットタンパク質複合体の相互作用を試験し、天然、組み換え、合成またはタグ付組み換え分子を試験し、体液、細胞培養上清または粗抽出物中の新規相互作用相手を発見し、小分子、例えば医薬候補とその標的の相互作用を試験し、天然膜、人工膜または小胞を使用して膜生化学または膜結合受容体相互作用を試験し、複製、転写および翻訳を試験し、タンパク質複合体形成中の分子相関関係およびそれらとＤＮＡとの相互作用を決定し、ＤＮＡおよびＲＮＡのハイブリダイゼーションを試験し、全細胞またはウイルスが関与する相互作用を試験し、分子相互作用に対するグリコシル化の影響を試験し、そして細胞表面炭水化物の特異的認識特性を試験する。
【００８８】
他の態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、部位特異的に核酸類をタンパク質に結合させる。ある態様において、かかる部位特異的修飾を使用して、部位特異的に核酸類を抗体または抗体フラグメントに結合させる。ある態様において、タンパク質または抗体に結合した核酸を使用して、タンパク質または抗体を、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡアレイ上の定められた位置に固定化する。ある態様において、タンパク質または抗体に結合した核酸を使用して、ＰＣＲ、鎖置換増幅(ＳＤＡ)、リガーゼ連鎖反応(ＬＣＲ)、近接ライゲーション免疫ＰＣＲ、ローリング・サークル増幅、転写介在増幅、ＮＥＮのチラミドシグナル増幅または他のシグナル増幅法を介するタンパク質または抗体結合を検出する。ある態様において、ＰＣＲプローブの抗体へのかかる部位特異的結合を使用して、免疫ＰＣＲ反応用試薬を製造する(M. Adler, R. Wacker, Ch.M. Niemeyer, Sensitivity by combination： Immuno-PCR and related technologies, Analyst, 2008, 133, 702-718参照)。ある態様において、タンパク質または抗体に結合した核酸は、並行した多くの免疫ＰＣＲまたは他の免疫アッセイを可能にする(多重免疫ＰＣＲまたは多重免疫アッセイ)。
【００８９】
ある態様において、タンパク質または抗体に結合した核酸は、ホモおよびヘテロ二量体の形成を仲介する。
【００９０】
定義
ここで使用する用語“アルキル”は、飽和分枝鎖または直鎖炭化水素を意味する。ここで使用する用語“Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ７アルキル”および“Ｃ１−Ｃ８アルキル”は、それぞれ少なくとも１個、そして最大３個、４個、５個、６個、７個または８個の炭素原子を含むアルキル基を意味する。ここで使用するアルキル基の例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
ここで使用する用語“アルキレン”は、飽和分枝鎖または直鎖二価炭化水素基を意味し、ここで、該基は、２個の炭素原子のそれぞれからの１個の水素原子の除去に由来する。ここで使用する用語“Ｃ１−Ｃ３アルキレン、Ｃ１−Ｃ４アルキレン、Ｃ１−Ｃ５アルキレン”、および“Ｃ１−Ｃ６アルキレン”は、それぞれ少なくとも１個、そして最大３個、４個、５個または６個の炭素原子を含むアルキレン基を意味する。ここで使用するアルキレン基の例は、メチレン、エチレン、ｎ−プロピレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン、イソブチレン、ｓｅｃ−ブチレン、ｔ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、イソペンチレン、ヘキシレンなどを含むが、これらに限定されない。
【００９２】
ここで使用する用語“アルコキシ”は、基−ＯＲａ(ここで、Ｒａはここで定義したアルキル基である)を意味する。ここで使用する用語“Ｃ１−Ｃ３アルコキシ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｃ１−Ｃ５アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ７アルコキシ”および“Ｃ１−Ｃ８アルコキシ”は、該アルキル部分が少なくとも１個、そして最大３個、４個、５個、６個、７個または８個の炭素原子を含むアルコキシ基を意味する。ここで使用するアルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、ヘプトキシなどを含むが、これらに限定されない。
【００９３】
ここで使用する用語“アミノ末端修飾基”は、末端アミン基と架橋を形成する任意の分子を意味する。一例として、かかる末端アミン基は、アミン保護基、重合分子の末端(ここで、かかる重合分子はポリペプチド、ポリヌクレオチド、および多糖類を含み、これらに限定されない)を含み、これらに限定されない。アミノ末端修飾基はまた、種々の水溶性ポリマー、ペプチドまたはタンパク質も含み、これらに限定されない。ほんの一例として、末端修飾基はポリエチレングリコールまたは血清アルブミンを含む。ある種のアミノ末端修飾基を使用して、血清半減期の延長を含み、これらに限定されないタンパクの治療特性を修飾する。
【００９４】
ここで使用する用語“アリール”は、合計５〜１４個の環員を含む単環式、二環式、および三環式環系を意味し、ここで、環系内の少なくとも１個の環が芳香族性であり、系内の各環が３〜７個の環員を有する。アリール基は、“場合により置換されていてよく”、ここで、かかるアリール基は、１個以上の置換基を含む。特にことわらない限り、適当な置換基は、一般にハロゲン、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＣ(Ｏ)Ｒ、−ＮＲＣ(Ｓ)Ｒ、−ＮＲＣ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＣ(Ｓ)Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＣＯ２Ｒ、−ＮＲＮＲＣ(Ｏ)Ｒ、−ＮＲＮＲＣ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＮＲＣＯ２Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｃ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｓ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−Ｃ(Ｓ)Ｎ(Ｒ)２、−ＯＣ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｎ(ＯＲ)Ｒ、−Ｃ(ＮＯＲ)Ｒ、−Ｓ(Ｏ)２Ｒ、−Ｓ(Ｏ)３Ｒ、−ＳＯ２Ｎ(Ｒ)２、−Ｓ(Ｏ)Ｒ、−ＮＲＳＯ２Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−Ｎ(ＯＲ)Ｒ、−Ｃ(＝ＮＨ)−Ｎ(Ｒ)２、−Ｐ(Ｏ)２Ｒ、−ＰＯ(Ｒ)２、−ＯＰＯ(Ｒ)２、−(ＣＨ２)０−２ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ、フェニル(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)、−Ｏ(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)、−(ＣＨ２)１−２(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)、または−ＣＨ＝ＣＨ(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)から選択され、ここで、各Ｒは独立して水素、場合により置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、場合により置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、非置換５−６員ヘテロアリール、フェニル、−Ｏ(Ｐｈ)、または−ＣＨ２(Ｐｈ)から選択されるか、または２個のＲが、同じ置換基にあっても異なる置換基にあっても、各Ｒが結合している原子と一体となって、場合により置換されていてよい０〜４個の窒素、酸素、または硫黄から独立して選択されるヘテロ原子を有する３−１２員飽和、部分的に不飽和、または完全に不飽和の単環式または二環式環を形成する。ここで使用するアリール基の例は、フェニル、ナフチル、フルオレニル、インデニル、アズレニル、アントラセニル、フェンアントラセニルなどを含むが、これらに限定されない。
【００９５】
ここで使用する用語“アリーレン”は、アリール基に由来する二価基を意味する。
【００９６】
ここで使用する“二官能性ポリマー”とも呼ぶ“二官能性リンカー”は、特異的に他の部分と反応し、共有または非共有結合を形成できる２個の官能基を含むリンカーを意味する。かかる部分は、アミノ酸側鎖基を含み、これに限定されない。ほんの一例として、二官能性リンカーは、第一ペプチド上の基と反応性の官能基、および第二ペプチド上の基と反応性の他の官能基を有し、それにより、第一ペプチド、二官能性リンカーおよび第二ペプチドを含むコンジュゲートを形成する。二官能性リンカーは、任意の所望の長さまたは分子量であり、特定の所望の間隔または配座を提供するように選択する。
【００９７】
ここで使用する“多官能性ポリマー”とも呼ぶ“多官能性リンカー”は、他の部分と反応し、共有または非共有結合を形成できる２個以上の官能基を含むリンカーを意味する。かかる部分は、アミノ酸側鎖基を含み、これに限定されない。多官能性リンカーは、任意の所望の長さまたは分子量であり、特定の所望の間隔または配座を提供するように選択する。
【００９８】
ここで使用する用語“シアノ”は、−ＣＮ基を意味する。
【００９９】
ここで使用する用語“シクロアルキル”は、飽和または部分的に不飽和の、単環式、縮合二環式、縮合三環式または架橋多環式環集合体を意味する。ここで使用する用語“Ｃ３−Ｃ５シクロアルキル”、“Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル”、“Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル”、“Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル”、“Ｃ３−Ｃ９シクロアルキル”および“Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル”は、該飽和または部分的に不飽和、単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合体が少なくとも３個、そして最大５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子を含む、シクロアルキル基を意味する。ここで使用するシクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、デカヒドロナフタレニル、２,３,４,５,６,７−ヘキサヒドロ−１Ｈ−インデニルなどを含むが、これらに限定されない。
【０１００】
ここで使用する用語“シクロデキストリン”は、環構造の少なくとも６〜８個のグルコース分子を含む環状炭水化物を意味する。環の外部は水溶性基を含む；環の中心は、相対的に非極性の空洞であり、小分子が入ることを可能にする。
【０１０１】
ここで使用する用語“ハロゲン”は、フッ素(Ｆ)、塩素(Ｃｌ)、臭素(Ｂｒ)、またはヨウ素(Ｉ)を意味する。
【０１０２】
ここで使用する用語“ハロ”は、ハロゲン基：フルオロ(−Ｆ)、クロロ(−Ｃｌ)、ブロモ(−Ｂｒ)、およびヨード(−Ｉ)を意味する。
【０１０３】
ここで使用する用語“ハロアシル”は、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ３、−Ｃ(Ｏ)ＣＦ３、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２ＯＣＨ３などを含み、これらに限定されないハロゲン部分を含むアシル基を意味する。
【０１０４】
ここで使用する用語“ハロアルキル”または“ハロ−置換アルキル”は、少なくとも１個のハロ基またはそれらの組合せで置換されたここで定義したアルキル基を意味する。ここで使用するかかる分枝鎖または直鎖ハロアルキル基の例は、トリフルオロメチル、ペンタフルオロエチルなどを含み、これらに限定されない１個以上のハロ基またはそれらの組合せで置換されたメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチルおよびｎ−ブチルを含む。
【０１０５】
ここで使用する用語“ハロアルコキシ”は、１個以上のハロ基またはそれらの組合せで置換された上で定義したアルコキシ基を意味する。ここで使用するかかる分枝鎖または直鎖ハロアルキニル基の例は、１個以上の基またはそれらの組合せで置換されたメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、ヘプトキシなどを含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
ここで使用する用語“ヘテロアルキル”は、１個以上の炭素原子が、１個以上の酸素、硫黄、窒素、またはそれらの組合せで置き換わっている、ここで定義したアルキル基を意味する。
【０１０７】
ここで使用する用語“ヘテロアルキレン”は、ヘテロアルキル由来の二価基を意味する。
【０１０８】
ここで使用する用語“ヘテロアリール”は、環系の少なくとも１個の環が芳香族性であり、環系の少なくとも１個の環が１個以上の窒素、酸素および硫黄から選択されるヘテロ原子を含み、そして環系の各環が３〜７環員を有する、単環式、二環式、および三環式環系を意味する。上でおよび本明細書で特に定義しない限り、ヘテロアリール基上の不飽和炭素原子の適当な置換基は、一般にハロゲン；−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＣ(Ｏ)Ｒ、−ＮＲＣ(Ｓ)Ｒ、−ＮＲＣ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＣ(Ｓ)Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＣＯ２Ｒ、−ＮＲＮＲＣ(Ｏ)Ｒ、−ＮＲＮＲＣ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＮＲＣＯ２Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｃ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)ＣＨ２Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｓ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−Ｃ(Ｓ)Ｎ(Ｒ)２、−ＯＣ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)Ｎ(ＯＲ)Ｒ、−Ｃ(ＮＯＲ)Ｒ、−Ｓ(Ｏ)２Ｒ、−Ｓ(Ｏ)３Ｒ、−ＳＯ２Ｎ(Ｒ)２、−Ｓ(Ｏ)Ｒ、−ＮＲＳＯ２Ｎ(Ｒ)２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−Ｎ(ＯＲ)Ｒ、−Ｃ(＝ＮＨ)−Ｎ(Ｒ)２、−Ｐ(Ｏ)２Ｒ、−ＰＯ(Ｒ)２、−ＯＰＯ(Ｒ)２、−(ＣＨ２)０−２ＮＨＣ(Ｏ)Ｒ、フェニル(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)、−Ｏ(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)、−(ＣＨ２)１−２(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)、または−ＣＨ＝ＣＨ(Ｐｈ)(場合によりＲで置換されていてよい)から選択され、ここで、各Ｒは独立して水素、場合により置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、場合により置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルコキシ、非置換５−６員ヘテロアリール、フェニル、−Ｏ(Ｐｈ)から選択されるか、または２個のＲが、同じ置換基にあっても異なる置換基にあっても、各Ｒが結合している原子と一体となって、場合により置換されていてよい０〜４個の窒素、酸素、または硫黄から独立して選択されるヘテロ原子を有する３−１２員飽和、部分的に不飽和、または完全に不飽和の単環式または二環式環を形成する。ここで使用するヘテロアリール基の例は、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾピラニル、ベンズチアゾリル、ベンゾチエニル、ベンズアゼピニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチオピラニル、ベンゾ[１,３]ジオキソール、ベンゾ[ｂ]フリル、ベンゾ[ｂ]チエニル、シンノリニル、フラザニル、フリル、フロピリジニル、イミダゾリル、インドリル、インドーリジニル、インドリン−２−オンインダゾリル、イソインドリル、イソキノリニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、１,８−ナフチリジニル、オキサゾリル、オキサインドリル、オキサジアゾリル、ピラゾリル、ピロリル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピリジル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジル、ピリミジニル、キノキサリニル、キノリニル、キナゾリニル、４Ｈ−キノリジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエニル、トリアジニル、トリアゾリルおよびテトラゾリルを含むが、これらに限定されない。
【０１０９】
ここで使用する用語“ヘテロシクロアルキル”は、環炭素の１個以上が、−Ｏ−、−Ｎ＝、−ＮＲ−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｓ−、−Ｓ(Ｏ)−または−Ｓ(Ｏ)２−(式中、Ｒは水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたは窒素保護基である)から選択される部分で置き換わった、ここで定義するシクロアルキルであるが、ただし、該基の環は２個の隣接するＯ原子またはＳ原子を含まない。ここで使用するヘテロシクロアルキル基の例は、モルホリノ、ピロリジニル、ピロリジニル−２−オンピペラジニル、ピペリジニル、ピペリジニロン、１,４−ジオキサ−８−アザ−スピロ[４.５]デク−８−イル、２Ｈ−ピロリル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、１,３−ジオキソラニル、２−イミダゾリニル、イミダゾリジニル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１,４−ジオキサニル、１,４−ジチアニル、チオモルホリニル、アゼパニル、ヘキサヒドロ−１,４−ジアゼピニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、チオキサニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、オキセパニル、チエパニル、１,２,３,６−テトラヒドロピリジニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、ジオキサニル、１,３−ジオキソラニル、ジチアニル、ジチオラニル、ジヒドロピラニル、ジヒドロチエニル、ジヒドロフラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、３−アザビシクロ[３.１.０]ヘキサニル、および３−アザビシクロ[４.１.０]ヘプタニルを含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
ここで使用する用語“ヘテロ原子”は、１個以上の酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素を意味する。
【０１１１】
ここで使用する用語“ヒドロキシル”は、基−ＯＨを意味する。
【０１１２】
ここで使用する用語“ヒドロキシアルキル”は、少なくとも１個のヒドロキシルで置換されたここで定義したアルキル基を意味し、ヒドロキシルはここに定義した通りである。ここで使用する分枝鎖または直鎖“Ｃ１−Ｃ６ヒドロキシアルキル基”の例は、１個以上のヒドロキシル基で独立して置換されたメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチルおよびｎ−ブチルを含むが、これらに限定されない。
【０１１３】
ここで使用する用語“場合により置換されていてよい”は、その基がアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、メルカプチル、シアノ、ハロ、カルボニル、チオカルボニル、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、ペルハロアルキル、ペルフルオロアルキル、およびアミノ(モノ−およびジ−置換アミノ基を含む)、およびそれらの保護誘導体から個々にそして独立して選択される１個移住尾のさらなる基で置換されているか、または置換されていないことを意味する。ここで使用する場合による置換基の例は、ハロ、−ＣＮ、−ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＯＣ(Ｏ)Ｒ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−ＯＣ(Ｏ)ＮＨＲ、−Ｃ(Ｏ)Ｎ(Ｒ)２、−ＳＲ−、−Ｓ(＝Ｏ)Ｒ、−Ｓ(＝Ｏ)２Ｒ、−ＮＨＲ、−Ｎ(Ｒ)２、−ＮＨＣ(Ｏ)−、ＮＨＣ(Ｏ)Ｏ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＨ−、Ｓ(＝Ｏ)２ＮＨＲ、−Ｓ(Ｏ)２Ｎ(Ｒ)２、−ＮＨＳ(＝Ｏ)２、−ＮＨＳ(Ｏ)２Ｒ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ハロ−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロ−置換Ｃ１−Ｃ６アルコキシを含み、ここで、各Ｒは独立してＨ、ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ハロ−置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロ−置換Ｃ１−Ｃ６アルコキシを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
ここで使用する用語“親和性標識”は、他の分子に可逆的または非可逆的に結合する標識を意味する。
【０１１５】
ここで使用する用語“アンバーコドン”は、ピロリシン、ＰＣＬおよび他のピロリシン類似体の取り込み部位を意味し、メッセンジャーＲＮＡ内のヌクレオチドトリプレットであるＵＡＧに対応する。ヌクレオチド配列ＴＡＧは、ＤＮＡでコード化され、ＲＮＡでＵＡＧに転写され、それがタンパク質に翻訳される。ＴＡＧおよびＵＡＧコドンを、ピロリシン、ＰＣＬおよび他のピロリシン類似体の取り込み部位を言及するためにここでは交換可能に使用する。
【０１１６】
ここで使用する用語“アミノ酸”は、天然に存在するアミノ酸類、非天然アミノ酸類、アミノ酸類似体および天然に存在するアミノ酸類と類似の方法で機能するアミノ酸摸倣体を意味し、構造により立体異性形態が可能であるならば、全てそのＤおよびＬ立体異性体である。アミノ酸類は、ここでは、その名前、一般的に既知の三文字表記またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨される一文字表記で記載する。天然に存在するアミノ酸類は、遺伝暗号によりコード化されるアミノ酸類、ならびに後に修飾されるコード化アミノ酸類である。天然に存在するアミノ酸類は、アラニン(Ａｌａ)、アルギニン(Ａｒｇ)、アスパラギン(Ａｓｎ)、アスパラギン酸(Ａｓｐ)、システイン(Ｃｙｓ)、グルタミン(Ｇｌｎ)、グルタミン酸(Ｇｌｕ)、グリシン(Ｇｌｙ)、ヒスチジン(Ｈｉｓ)、イソロイシン(Ｉｌｅ)、ロイシン(Ｌｅｕ)、リシン(Ｌｙｓ)、メチオニン(Ｍｅｔ)、フェニルアラニン(Ｐｈｅ)、プロリン(Ｐｒｏ)、セリン(Ｓｅｒ)、スレオニン(Ｔｈｒ)、トリプトファン(Ｔｒｐ)、チロシン(Ｔｙｒ)、バリン(Ｖａｌ)、ピロリシン(Ｐｙｌ)、セレノシステイン(selenocycteine)(Ｓｅｃ)およびピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)を含み、これらに限定されない。修飾コード化アミノ酸類は、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級−ブチルグリシン、２,４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２,２'−ジアミノピメリン酸、２,３−ジアミノプロピオン(proprionic)酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、アロ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフトアラニン、ノルパリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンを含み、これらに限定されない。用語アミノ酸はまた、ある生物における代謝物であるが、タンパク質への取り込みについて遺伝暗号によりコード化されない天然に存在するアミノ酸類も含む。かかるアミノ酸類は、オルニチン、Ｄ−オルニチン、およびＤ−アルギニンを含み、これらに限定されない。
【０１１７】
ここで使用する用語“アミノ酸類似体”は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、ほんの一例として、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合するα−炭素を有する化合物を意味する。アミノ酸類似体は、可逆的または非可逆的に、化学的に遮断された、またはそのＣ末端カルボキシ基、そのＮ末端アミノ基および／またはその側鎖官能基が化学的に修飾された天然および非天然アミノ酸類を含む。かかる類似体は、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−(カルボキシメチル)−システイン、Ｓ−(カルボキシメチル)−システインスルホキシド、Ｓ−(カルボキシメチル)−システインスルホン、アスパラギン酸−(ベータ−メチルエステル)、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシン、およびメチオニンメチルスルホニウムを含み、これらに限定されない。ある種の遮断試薬は、ｔ−ブチルオキシカルボニル(Ｂｏｃ)および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)を含み、これらに限定されない。
【０１１８】
ここで使用する用語“アミノ酸摸倣体”は、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸に類似する方法で機能する化学化合物を意味する。
【０１１９】
ここで使用する用語“非天然アミノ酸”は、同一であるかまたは異なるいかなる生物からの非修飾または修飾遺伝子を使用しても生合成により製造できない、アミノ酸構造を意味する。加えて、かかる“非天然アミノ酸類”は、タンパク質への取り込みのために修飾ｔＲＮＡおよび修飾ｔＲＮＡシンセターゼ(ＲＳ)を必要とすると解釈すべきである。これらの“選択”直交性ｔＲＮＡ／ＲＳ対は、非天然アミノ酸に特異的であり、Schultz et al.により開発された選択方法または類似の方法を使用により生成する。一例として、ピロリン−カルボキシ−リシンは、生物から宿主細胞内に移された遺伝子による生合成により生成され、天然ｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子を使用してタンパク質に取り込まれるために“天然アミノ酸”であるのに対し、ｐ−アミノフェニルアラニン(Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29；125(4)：935-9参照)は、生合成により生成されても、“選択”直交性ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンセターゼ対によりタンパク質に取り込まれるため、“非天然アミノ酸”である。
【０１２０】
ここで使用する用語“アミノ酸基”は、次の構造：
【化３０】
0005542832.tif 000031
を有する部分を意味し、ここで、かかる部分はアミノ酸類に由来し、Ｒ基は、ここに記載する任意のアミノ酸の側鎖である。かかるアミノ酸基は、アラニニル、アルギニル、アスパラギニル、アスパルチル、システイニル、グルタミニル、グルタミル、グリシニル、ヒスチジニル、イソロイシニル、ロイシニル、リシニル、メチオニニル、フェニルアラニニル、プロリニル、セリニル、トレオニル、トリプトファニル、チロシニル、バリニル、ピログルタメート、ホルミルメチオニン、ピログリシニルおよびセレノシステイニルを含み、これらに限定されない。
【０１２１】
ここで使用する用語“アミノ末端修飾基”は、末端アミノ基に結合できる任意の分子を意味する。かかるアミノ末端修飾基は、アミン保護基、重合分子の末端(ここで、かかる重合分子はポリペプチド、ポリヌクレオチド、および多糖類を含み、これらに限定されない)を含み、これらに限定されない。末端修飾基はまた、種々の水溶性ポリマー、ペプチドまたはタンパク質を含み、これらに限定されない。ほんの一例として、アミノ末端修飾基はポリエチレングリコールまたは血清アルブミンを含む。ある種のアミノ末端修飾基を使用して、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの血清半減期を延長することを含み、これに限定されない、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの治療特性を修飾する。
【０１２２】
ここで使用する用語“抗体フラグメント”は、完全長形態以外の任意の抗体の形態を意味する。ここで抗体フラグメントは、完全長抗体内に存在する小さい一部である抗体、および操作されている抗体を含む。抗体フラグメントは、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、および(Ｆａｂ')２、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、二重特異性抗体、トリアボディ(triabodies)、テトラボディ(tetrabodies)、二官能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組合せ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域、重鎖、軽鎖、および可変領域、および別の足場非抗体分子、二重特異性抗体などを含み、これらに限定されない。他の機能的構造は、ペプチドリンカーにより共有結合的に連結された免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域から成る、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)である。これらの小さい(ＭＷ＜２５,０００Da)タンパク質は、一般に一ポリペプチドにおける抗原に対する特異性および親和性を保持し、大きな抗原特異的分子のための簡便な構成要素を提供し得る。特にことわらない限り、用語“抗体”または“抗体群”を使用する記載および請求項は、“抗体フラグメント”および“抗体フラグメント群”も含む。
【０１２３】
ここで使用する用語“バイオアベイラビリティ”は、物質またはその活性部分が医薬投与形態から送達され、作用部位でまたは一般的循環において利用可能となる割合および程度を意味する。バイオアベイラビリティの増加は、医薬投与形態から送達され、作用部位でまたは一般的循環において利用可能となる物質またはその活性部分の割合および程度の増加を意味する。一例として、バイオアベイラビリティの増加は、他の物質または活性部分と比較したとき、血中の物質またはその活性部分の濃度の増加により示され得る。
【０１２４】
ここで使用する用語“生物学的活性分子”、“生物学的活性部分”または“生物学的活性剤”は、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトを含み、これらに限定されない生物に関連する生物学的系、経路、分子、または相互作用の何らかの物理的または生化学的特性に影響を与えることができる任意の物質を意味する。特に、ここで使用する生物学的活性分子は、ヒトまたは他の動物の疾患の診断、治癒、緩和、処置、または予防に対して意図される、または、ヒトまたは動物の肉体的または精神的健康を他の点で高める全ての物質を含み、これらに限定されない。生物学的活性分子の例は、ペプチド、タンパク質、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子医薬、硬医薬、軟医薬、多糖類、オリゴ糖類、二糖類、炭水化物、無機原子または分子、色素、脂質類、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子およびミセルを含み、これらに限定されない。ここに記載する方法および組成物を用いて使用するのに適当な生物学的活性剤群は、医薬、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管剤、抗不安剤、ホルモン類、増殖因子、ステロイド剤、微生物由来毒素などを含み、これらに限定されない。
【０１２５】
ここで使用する用語“生物学的活性の修飾”は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、糖類、代謝物、前駆体、補因子または他の生物学的活性化学物質または物の濃度または反応性を高めるまたは低める、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、糖類、代謝物、前駆体、補因子または他の生物学的活性化学物質または物の選択性を変える、またはタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖類、糖類、代謝物、前駆体、補因子または他の生物学的活性化学物質または物の基質選択性を高めるまたは低下させることを意味する。
【０１２６】
ここで使用する用語“生体材料”は、バイオリアクターおよび／または組み換え方法および技術により得られる物質を含み、これらに限定されない生物学由来物質を意味する。
【０１２７】
ここで使用する用語“生物物理学的プローブ”は、物理的検出法により分子の構造変化を検出またはモニターすることを可能とするプローブを意味する。かかる分子は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み、これらに限定されない。かかる“生物物理学的プローブ”を使用して、また、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡと高分子を含み、これに限定されない他の分子の相互作用を検出またはモニターできる。生物物理学的プローブの例は、分子質量、核スピン、ＵＶ吸光度、蛍光、円偏光二色性、熱容量、融点または他の内因性分子特性を含み、これらに限定されない。生物物理学的プローブの例はまた、分子に付加された標識でもある。かかるプローブは、スピン標識、フルオロフォア、同位体標識、および光活性可能基を含み、これらに限定されない。
【０１２８】
ここで使用する用語“生合成により生成された”は、アミノ酸の生成のための細胞または酵素を利用する全ての方法を意味する。かかる方法は、次の要素の少なくとも１個の使用を含む：前駆体および酵素。ある態様において、かかるアミノ酸類が、その後タンパク質に取り込まれる。ある態様において、アミノ酸の生合成および取り込みは同じ細胞で起こり、他の態様においてアミノ酸は別の細胞(“フィーダー細胞”)または別の細胞培養で生合成的に製造され、該アミノ酸が他の細胞のタンパク質に取り込まれる。後者の場合、アミノ酸を、場合により別の細胞培養から精製してよく、その後、精製アミノ酸をタンパク質内にアミノ酸を取り込む細胞培養の培地に添加する。
【０１２９】
ここで使用する用語“ビオチン類似体”は、“ビオチン摸倣体”とも言うが、アビジンおよび／またはストレプトアビジンに高親和性で結合するビオチン以外の全ての分子を意味する。
【０１３０】
ここで使用する用語“カルボキシ末端修飾基”は、末端カルボキシ基に結合できる全ての分子を意味する。かかるカルボキシ末端基は、カルボキシレート保護基、重合分子の末端(ここで、かかる重合分子はポリペプチド、ポリヌクレオチド、および多糖類を含み、これらに限定されない)を含み、これらに限定されない。末端修飾基はまた、種々の水溶性ポリマー、ペプチドまたはタンパク質を含み、これらに限定されない。ほんの一例として、末端修飾基はポリエチレングリコールまたは血清アルブミンを含む。ある種のカルボキシ末端修飾基を使用して、血清半減期の延長を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの治療特性を修飾する。
【０１３１】
ここで使用する用語“化学的開裂可能基”は、“化学的に不安定”とも言うが、酸、塩基、酸化剤、還元剤、化学イニシエーター、またはラジカルイニシエーターへの暴露により破壊または開裂する基を意味する。
【０１３２】
ここで使用する用語“化学発光基”は、熱を加えないで化学反応の結果として発光する基を意味する。ほんの一例として、ルミノール(５−アミノ−２,３−ジヒドロ−１,４−フタラジンジオン)は、過酸化水素(Ｈ２Ｏ２)のような酸化剤と塩基および金属触媒存在下で反応して、励起状態生成物(３−アミノフタラート、３−ＡＰＡ)を生成し、その後検出可能な光を発光する。
【０１３３】
ここで使用する用語“発色団基”は、可視波長、ＵＶ波長またはＩＲ波長の光を吸収する分子を意味する。
【０１３４】
ここで使用する用語“補因子”は、大きな分子の作用に必須の原子または分子を意味する。補因子は、無機イオン類、コエンザイム、タンパク質、または酵素活性に必要な幾つかの他の因子を含み、これらに限定されない。
【０１３５】
ここで使用する用語“コフォールディング”は、互いに相互作用する少なくとも２個の分子を用い、折りたたまれていないまたは不適切に折りたたまれた分子から適切に折りたたまれた分子への変換をもたらす、再折り畳み工程、反応、または方法を意味する。ほんの一例として、“コフォールディング”は、互いに相互作用し、折りたたまれていないまたは不適切に折りたたまれたポリペプチドから適切に折りたたまれたポリペプチドへの変換をもたらす少なくとも２個のポリペプチドを用いる。
【０１３６】
ここで使用する用語“細胞毒性”は、細胞を傷つける化合物を意味する。
【０１３７】
ここで使用する用語“変性剤”または“デナチュラント”は、タンパク質の可逆性の非折り畳みをもたらす全ての化合物または物質を意味する。変性剤またはデナチュラントの強度は、特定の変性剤またはデナチュラントの特性および濃度の両方により決定される。一例として、変性剤またはデナチュラントは、カオトロープ、界面活性剤、有機、水混和性溶媒、リン脂質、またはそれらの組合せを含み、これらに限定されない。ここで使用するカオトロープの例は、ウレア、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムを含み、これらに限定されない。ここで使用する界面活性剤の例は、強界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム、またはポリオキシエチレンエーテル(例えばＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎ界面活性剤)、サルコシル、穏やかな非イオン性界面活性剤(例えば、ジギトニン)、穏やかなカチオン性界面活性剤、例えばＮ−２,３−(ジオレイオキシ)−プロピル−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウム、穏やかなイオン性界面活性剤(例えばコール酸ナトリウムまたはデオキシコール酸ナトリウム)またはスルホベタイン類(Zwittergent)、３−(３−クロロアミドプロピル)ジメチルアミノ−１−プロパンスルフェート(ＣＨＡＰＳ)、および３−(３−クロロアミドプロピル)ジメチルアミノ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート(ＣＨＡＰＳＯ)を含み、これらに限定されない双性イオン性界面活性剤を含み、これらに限定されない。ここで使用する有機、水混和性溶媒の例は、アセトニトリル、低級アルカノール(特にＣ２−Ｃ４アルカノール、例えばエタノールまたはイソプロパノール)、または低級アルカンジオール(Ｃ２−Ｃ４アルカンジオール類、例えばエチレン−グリコール)を含み、デナチュラントとして使用し得るが、これらに限定されない。ここで使用するリン脂質の例は、天然に存在するリン脂質類、例えばホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールまたは合成リン脂質誘導体または変異体、例えばジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンを含み、これらに限定されない。
【０１３８】
ここで使用する用語“検出可能標識”は、蛍光、化学ルミネセンス、電子スピン共鳴、紫外／可視吸光度分光学、赤外線分光学、質量分析、核磁気共鳴、磁気共鳴、放射分析および電気化学的方法を含み、これらに限定されない分析技術を使用して観察可能な標識を意味する。
【０１３９】
ここで使用する用語“医薬”は、疾患または状態の予防、診断、軽減、処置、または治癒に使用する全ての物質を意味する。
【０１４０】
ここで使用する用語“色素”は、発色団基を含む可溶性の、着色物質を意味する。
【０１４１】
ここで使用する用語“高電子密度基”は、電子ビームで照射したとき電子を散乱させる基を意味する。かかる基は、モリブデン酸アンモニウム、次硝酸ビスマス  ヨウ化カドミウム、９９％、カルボヒドラジド、塩化第二鉄六水和物、ヘキサメチレンテトラミン、９８.５％、三塩化インジウム無水、硝酸ランタン、酢酸鉛三水和物、クエン酸鉛三水和物、硝酸鉛、過ヨウ素酸、ホスホモリブデン酸、ホスホタングステン酸、カリウムフェリジアニド、カリウムフェロシアニド、ルテニウム赤、硝酸銀、タンパク銀(Ａｇアッセイ：８.０−８.５％)“Strong”、銀テトラフェニルポルフィン(Ｓ−ＴＰＰＳ)、金塩化ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド(ＴＳＣ)、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、および硫酸バナジルを含み、これらに限定されない。
【０１４２】
ここで使用する用語“エネルギー移動剤”は、他の分子にエネルギーを供給できるか、他の分子のエネルギーを受け入れることができる分子を意味する。ほんの一例として、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)は、蛍光ドナー分子の励起状態エネルギーが非放射性に非励起アクセプター分子に伝達され、それがその後蛍光的に寄与されたエネルギーを長波長で放出する、双極子−双極子カップリング工程である。
【０１４３】
ここで使用する用語“増強”または“増強する”は、所望の効果の有効性または期間のいずれかを増強させるまたは延長することを意味する。一例として、治療剤の効果の“増強”は、疾患、障害または状態の処置に対する治療剤の効果を、有効性または期間のいずれかで、増強または延長する能力を意味する。ここで使用する“増強有効量”は、疾患、障害または状態の処置における治療剤の効果の増強に適切な量を意味する。患者に意匠するとき、この使用に有効な量は、疾患、障害または状態の重症度および経過、治療歴、患者の健康状態および医薬に対する応答、および処置医の判断による。
【０１４４】
ここで使用する用語“真核”は、系統発生上真核(Eucarya)領域に属する生物に由来する物質を意味し、動物(哺乳動物、昆虫、爬虫類、および鳥類を含み、これらに限定されない)、繊毛虫類、植物(単子葉植物、双子葉植物、および藻類を含み、これらに限定されない)、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、および原生生物を含み、これらに限定されない。
【０１４５】
ここで使用する用語“脂肪酸”は、約Ｃ６またはそれより長い炭化水素側鎖のカルボン酸類を意味する。
【０１４６】
ここで使用する用語“フルオロフォア”は、励起により光子を放出し、それにより蛍光である分子を意味する。
【０１４７】
用語“官能基”、“活性部分”、“活性化基”、“脱離基”、“反応性部位”、“化学的反応性基”および“化学的反応性部分”は、化学分野では幾分類義語であり、ある機能を行うかまたは活性であり、他の分子と反応性である分子の部分を示すためにここで使用する。
【０１４８】
ここで使用する用語“同一”は、同じである２個以上の配列または部分配列を意味する。加えて、ここで使用する用語“実質的に同一”は、比較アルゴリズムまたは手動位置合わせおよび目視検査を使用して測定して、比較窓または指定領域にわたり比較し、最大対応に整列したときに、または、配列単位のある割合を有する２個以上の配列を意味する。ほんの一例として、２個以上の配列は、特定の涼気にわたり配列単位が約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一であるならば、“実質的に同一”である。かかるパーセンテージは、２個以上の配列の“同一性パーセント”を記載するためである。配列の同一性は、少なくとも約７５−１００配列単位長である領域、約５０配列単位長である領域、または、特定しない限り、全配列にわたり存在し得る。ほんの一例として、２個以上のポリペプチド配列は、アミノ酸基が同じであれば同一であり、アミノ酸基が特定領域にわたり約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一であるならば、２個以上のポリペプチド配列は“実質的に同一”である。同一性は、少なくとも約７５−１００アミノ酸長である領域、約５０アミノ酸長である領域、または、特定しない限り、ポリペプチド配列の全配列にわたり存在し得る。加えて、ほんの一例として、２個以上のポリヌクレオチド配列は、核酸基が同じであるとき同一であり、核酸基が特定領域にわたり約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、または約９５％同一であるならば、２個以上のポリヌクレオチド配列は“実質的に同一”である。同一性は、少なくとも約７５−１００核酸長である領域、約５０核酸長である領域、または、特定しない限り、ポリヌクレオチド配列の全配列にわたり存在し得る。
【０１４９】
ここで使用する用語“免疫原性”は、治療剤の投与に対する抗体応答を意味する。治療用タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドに対する免疫原性は、生物学的液体中の該治療用タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドに対する抗体の検出のための定量的および定性的アッセイを使用して得られる。かかるアッセイは、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)、酵素架橋免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、発光免疫アッセイ(ＬＩＡ)、および蛍光免疫アッセイ(ＦＩＡ)を含み、これらに限定されない。かかる免疫原性の解析は、ここに提供される治療用タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの投与による抗体応答と、対照治療用タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドまたは送達媒体または送達緩衝液の投与による抗体応答の比較を含む。
【０１５０】
ここで使用する用語“挿入剤”は、“挿入基”とも呼ぶが、他の分子の分子内間隙に入る、または複数分子間の分子間間隙に入る分子または基を意味する。ほんの一例として、挿入剤または基は、ＤＮＡ二重螺旋の並べられた複数塩基に入る分子を意味する。
【０１５１】
ここで使用する用語“標識”は、化合物に取り込まれ、容易に検出され、それによりその物理的分布が検出および／またはモニターできる、物質を意味する。
【０１５２】
ここで使用する用語“架橋”は、第一分子の官能基と第二分子の官能基の間の化学反応により形成される結合または化学部分を意味する。かかる結合は、共有結合的架橋および非共有結合的結合を含み、これらに限定されず、一方化学部分は、エステル、カーボネート、イミンホスフェートエステル、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド架橋、オリゴヌクレオチド架橋およびここに記載する表１に記載されるものを含み、これらに限定されない。“加水分解に安定な架橋”は、架橋が、水中で実質的に安定であり、長期間、生理学的条件下を含み、これに限定されない有用なｐＨ値で水と反応しないことを意味する。“加水分解に不安定または分解可能架橋”は、架橋が水または、例えば、血液を含む水溶液中で分解可能であることを意味する。“酵素に不安定または分解可能架橋”は、架橋が１個以上の酵素により分解されることを意味する。ほんの一例として、ある種のＰＥＧおよび関連ポリマーは、ポリマー骨格に、ＰＥＧポリマー骨格と、ここに提供されるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの１個以上の末端官能基の間のリンカー基に分解可能架橋を含む。かかる分解可能架橋は、ＰＥＧカルボン酸類または活性化ＰＥＧカルボン酸類と生物学的活性剤のアルコール基の反応により形成されたエステル架橋であり、ここで、かかるエステル基は、一般に生理学的条件下で加水分解して、生物学的活性剤を放出する。他の加水分解により分解可能な架橋は、カーボネート架橋；アミンとアルデヒドの反応由来のイミン架橋；アルコールとホスフェート基の反応により形成されたホスフェートエステル架橋；ヒドラジドとアルデヒドの反応産物であるヒドラゾン架橋；アルデヒドとアルコールの反応産物であるアセタール架橋；ホルメートとアルコールの反応産物であるオルトエステル架橋；ポリマー、例えばＰＥＧの末端に、およびペプチドのカルボキシル基にアミン基により形成されたペプチド架橋を含み、これらに限定されない架橋；およびポリマーの末端におよびオリゴヌクレオチドの５'ヒドロキシル基に、ホスホロアミデート基により形成されたオリゴヌクレオチド架橋を含み、これらに限定されない架橋を含む。
【０１５３】
ここで使用する用語“培地”または“媒体”は、細胞を増殖させ、回収するおよび／またはかかる細胞により発現および／または分泌される生成物を回収するための全ての培養培地を含む。かかる“培地”または“媒体”は、溶液、固体、半固体、または、一例として、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、大腸菌、またはシュードモナス宿主細胞を含む何らかの宿主細胞および細胞内容物を支持または包含し得る硬い支持体を含み、これらに限定されない。かかる“培地”または“媒体”は、増殖過程前または後の培地を含む、宿主細胞が増殖しており、その中にポリペプチドが分泌されている培地または媒体も含み、これに限定されない。かかる“培地”または“媒体”はまた、宿主細胞溶解物、一例として細胞内に生成したポリペプチドを含み、宿主細胞が融解またはポリペプチドを放出する緩衝液または試薬も含む。
【０１５４】
ここで使用する用語“金属キレート剤”は、金属イオン類と錯体を形成する分子を意味する。一例として、かかる分子は、中央の金属イオンと２個以上の配位結合を形成し、場合により環構造を形成する。
【０１５５】
ここで使用する用語“金属含有部分”は、金属イオン、原子または粒子を含む基を意味する。かかる部分は、シスプラチン、キレート化金属イオン類(例えばニッケル、鉄、および白金)、および金属ナノ粒子(例えばニッケル、鉄、および白金)を含み、これらに限定されない。
【０１５６】
ここで使用する用語“重原子を含む部分”は、通常炭素より重いイオンまたは原子を含む基を意味する。かかるイオン類または原子は、ケイ素、タングステン、金、鉛、およびウランを含み、これらに限定されない。
【０１５７】
ここで使用する用語“修飾”は、アミノ酸またはアミノ酸基に変換が存在することを意味し、ここで、かかる変換、または修飾は、化学的または生化学的方法により得られる。
【０１５８】
ここで使用する用語“血清半減期調節”は、その非修飾形態と比較した修飾生物学的活性分子の循環半減期の正のまたは負の変化を意味する。一例として、修飾生物学的活性分子は、ここに提供される化合物を含み、これに限定されない。一例として、血清半減期は、生物学的活性分子または修飾生物学的活性分子の投与後種々の時点で血液サンプルを採り、各サンプル内のその分子の濃度を決定することにより測定する。血清濃度と時間の相関により血清半減期の計算が可能となる。一例として、血清半減期調節は血清半減期の延長であってよく、これは投薬レジメンの改善を低級尾するか、または毒性効果を避ける。かかる血清中の延長は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍であり得る。
【０１５９】
ここで使用する用語“ナノ粒子は、約５００nm〜約１nmの粒子径を有する粒子を意味する。
【０１６０】
ここで使用する用語“ほぼ化学量論”は、化学反応に関与する複数化合物のモル比が約０.７５〜約１.５であることを意味する。
【０１６１】
ここで使用する用語“非真核”は、非真核生物を意味する。一例として、非真核生物は、大腸菌、高度好熱菌、またはバチルス・ステアロサーモフィルス、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・プチダを含み、これらに限定されない真正細菌系統発生上ドメイン、またはメタノコッカス・ジャナスキイ、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム、アーケオグロブス・フルギダス、パイロコッカス・フリオサス、パイロコッカス・ホリコシイ、アエロパイラム・ペルニクス(Aeuropyrum pernix)、またはハロバクテリウム、例えばハロフェラックス・ボルカニおよびハロバクテリウム種ＮＲＣ−１を含み、これらに限定されない古細菌系統発生上ドメインに属する。
【０１６２】
ここで使用する用語“核酸”は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。ほんの一例として、かかる核酸類および核酸ポリマーは、(ｉ)参照核酸と類似の特性を有する天然ヌクレオチド類似体；(ii)ＰＮＡ(ペプチド核酸)、アンチセンス法に使用するＤＮＡ類似体(ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど)を含み、これらに限定されないオリゴヌクレオチド類似体；(iii)その保存的に修飾された変異体(変性コドン置換を含み、これらに限定されない)および相補配列および明示した配列。一例として、変性コドン置換は、１個以上の選択した(または全)コドンが、塩基混合物および／またはデオキシイノシン基で置換されている、配列を製造することにより達成し得る。
【０１６３】
ここで使用する用語“酸化剤”は、酸化される化合物から電子を除去できる化合物または物質を意味する。一例として酸化剤は、酸化グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化ジチオスレイトール、酸化エリスリトール(erythreitol)、および酸素を含み、これらに限定されない。広範な酸化剤がここに記載する方法および組成物に使用するのに適する。
【０１６４】
ここで使用する用語“光親和性標識”は、光に暴露することにより標識が親和性を有する分子と架橋を形成する基での標識を含む。ほんの一例として、かかる架橋は共有結合的でも非共有結合的でもよい。
【０１６５】
ここで使用する用語“フォトケージド部分”は、特定波長での照射により、共有結合的にまたは非共有結合的にイオンまたは他の分子と結合する基を意味する。
【０１６６】
ここで使用する用語“光開裂可能基”は、光に曝すと破壊する基を意味する。
【０１６７】
ここで使用する用語“光クロスリンカー”は、光に曝すと、反応性であり、２個以上の単量体または多量体分子と共有結合的または非共有結合的架橋を形成する２個以上の官能基を含む化合物を意味する。
【０１６８】
ここで使用する用語“光異性化可能部分”は、光を照射すると、一つの異性体形態から多のものに変換する基を意味する。
【０１６９】
ここで使用する用語“ポリアルキレングリコール”は、直線状または分枝重合体ポリエーテルポリオール類を含む。かかるポリアルキレングリコールは、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体を含み、これらに限定されない。
【０１７０】
ここで使用する用語“ポリマー”は、反復サブユニットから成る分子を意味する。かかる分子は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、または多糖類またはポリアルキレングリコールを含み、これらに限定されない。
【０１７１】
ここで使用する用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は、ここでは、同義的に、アミノ酸基のポリマーを意味する。すなわち、ポリペプチドに関する記載はペプチドの記載およびタンパク質の記載に適用しなければならず、その逆もそうである。アミノ酸基は、天然および非天然アミノ酸類由来の基を含む。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーならびに１個以上のアミノ酸基がここに提供される化合物であるアミノ酸ポリマーに適用される。さらに、かかる“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含み、ここで、該アミノ酸基は共有結合的ペプチド結合または他の架橋により架橋している。
【０１７２】
ここで使用する用語“翻訳後修飾”は、アミノ酸がポリペプチド鎖に翻訳により取り込まれた後に起こるかかるアミノ酸の任意の修飾を意味する。かかる修飾は、翻訳後インビボ修飾、および翻訳後インビトロ修飾を含み、これらに限定されない。
【０１７３】
ここで使用する用語“保護された”は、“保護基”またはある反応条件下での化学的反応性官能基の反応を阻止する部分の存在を意味する。保護基は、保護される化学的反応性基のタイプにより変わる。ほんの一例として、(ｉ)化学的反応性基がアミンまたはヒドラジドであるならば、保護基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル(ｔ−Ｂｏｃ)および９−フルオレニルメトキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)から選択してよく；(ii)化学的反応性基がチオールであるならば、保護基はオルトピリジルジスルフィドであってよく；そして(iii)化学的反応性基がカルボン酸、例えば酪酸またはプロピオン酸、またはヒドロキシル基であるならば、保護基はベンジルまたはアルキル基、例えばメチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチルであり得る。ほんの一例として、遮断／保護基はまた：アセトアミド、アリルオキシカルボニル、アリルエーテル、ベンジル、ベンジルアミン、ベンジリデンアミン、ベンジルカルバメート、ベンジルエステル、メチルエステル、ｔ−ブチルエステル、Ｓ−ｔ−ブチルエステル、２−アルキル−１,３−オキサゾリン、ジメチルアセタール、１,３−ジオキサン、１,３−ジチアン、Ｎ.Ｎ−ジメチルヒドラゾン、フタルイミド、トリチル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、カルボベンジルオキシ、ｐ−トルエンスルホンアミド、トリフルオロアセトアミド、トリフェニルメチルアミン、ｔ−ブチルエーテル、ベンジルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、２−(トリメチルシリル)エトキシカルボニル、酢酸エステル、ピバル酸エステル、安息香酸エステル、アセトニド、ベンジリデンアセタール、および光遊離可能基、例えばＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃから選択される。
【０１７４】
ここで使用する用語“放射活性部分”は、その核が本質的に核放射、例えばアルファ粒子、またはベータ粒子、またはガンマ放射を放出する基を意味する。
【０１７５】
ここで使用する用語“反応性化合物”は、適当な条件下で、他の原子、分子または化合物に対して反応性である化合物を意味する。
【０１７６】
“組み換え宿主細胞”は、“宿主細胞”とも呼び、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を意味し、ここで、外因性ポリヌクレオチドを細胞に挿入する方法は、直接取り込み、トランスダクション、ｆメーティング、または組み換え宿主細胞を製造するための当分野で既知の他の方法を含み、これらに限定されない。ほんの一例として、かかる外因性ポリヌクレオチドは、プラスミドを含み、これに限定されない非統合ベクターであってよく、または宿主ゲノムに統合されていてよい。
【０１７７】
ここで使用する用語“酸化還元活性剤”は、他の分子を酸化または還元する分枝を意味し、それにより酸化還元活性剤が還元または酸化される。酸化還元活性剤の例は、フェロセン、キノン類、Ｒｕ２＋／３＋複合体、Ｃｏ２＋／３＋複合体、およびＯｓ２＋／３＋複合体を含み、これらに限定されない。
【０１７８】
ここで使用する用語“還元剤”は、還元される化合物に電子を付加できる化合物または物質を意味する。一例として還元剤は、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン(２−アミノエタンチオール)、および還元グルタチオンを含み、これらに限定されない。かかる還元剤は、ほんの一例として、スルフヒドリル基を還元状態に維持し、分子内または分子間ジスルフィド結合を還元するために使用し得る。
【０１７９】
ここで使用する用語“再折りたたみ”は、不適切に折りたたまれたまたは折りたたまれていない状態を天然のまたは適切に折りたたまれた配座に変換する全ての過程、反応または方補を意味する。ほんの一例として、再折りたたみは、ジスルフィド結合含有タンパク質またはポリペプチドを、不適切に折りたたまれたまたは折りたたまれていない状態から、ジスルフィド結合に関して天然のまたは適切に折りたたまれた配座に変換する。かかるジスルフィド結合含有タンパク質またはポリペプチドは、取り込まれたここに提供される化合物を有するタンパク質またはポリペプチドを含む。再折りたたみは、しばしば、タンパク質を可溶化し、非折りたたみ状態にするためにタンパク質溶液に前もって添加したカオトロピック剤、例えばウレアまたはグアニジニウムヒドロクロライドの除去により開始する。
【０１８０】
ここで使用する用語“樹脂”は、高分子量、不溶性ポリマービーズを意味する。ほんの一例として、かかるビーズは、固相ペプチド合成用支持体、または精製前の分子の結合位置として使用し得る。
【０１８１】
ここで使用する用語“糖類”は、糖類、単糖類、オリゴ糖類、および多糖類を含み、これらに限定されない一連の炭水化物を意味する。
【０１８２】
ここで使用する用語“スピン標識”は、電子スピン共鳴分光学により検出でき、他の分子に結合できる不対電子スピン(すなわち安定常磁性基)を示す原子または原子群を含む分子意味する。かかるスピン標識分子は、ニトリル基およびニトロキシドを含み、これらに限定されず、一スピン標識または二重スピン標識であり得る。
【０１８３】
ここで使用する用語“化学量論”は、化学反応に関与する複数化合物のモル比が約０.９〜約１.１であることを意味する。
【０１８４】
ここで使用する用語“実質的に精製されている”は、精製前は通常目的成分に付随するかまたは相互作用する多の成分が実質的にまたは本質的にない目的成分を意味する。ほんの一例として、目的成分は、目的成分の調製物が約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満(乾燥重量で)の汚染成分を含むとき、“実質的に精製されている”。それ故に、“実質的に精製されている”目的成分は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％またはそれより大きい純度を有する。ほんの一例として、ここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、天然細胞または宿主細胞から精製される。ほんの一例として、ここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの調製物は、調製物が約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満(乾燥重量で)の汚染物質を含むとき、“実質的に精製されている”。ほんの一例として、ここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを宿主細胞により組み換えにより生成したとき、ここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％またはそれ未満で存在する。ほんの一例として、ここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを宿主細胞により組み換えにより生成したとき、ここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、培養培地に約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０mg／Ｌ、約５００mg／Ｌ、約２５０mg／Ｌ、約１００mg／Ｌ、約５０mg／Ｌ、約１０mg／Ｌ、または約１mg／Ｌまたはそれ未満で存在する。ほんの一例として、“実質的に精製されている”ここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動を含み、これらに限定されない適当な方法で決定して、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０、約９５％、約９９％またはそれより大きい純度を有する。
【０１８５】
ここで使用する用語“毒性部分”は、傷害または死をもたらし得る化合物を意味する。
【０１８６】
ここで使用する用語“処置し”、“処置する”または“処置”は、疾患または状態の症状を軽減し、無くし、または改善する、さらなる症状を防止する、症状の原因の根底代謝を軽減または防止する、疾患または状態を阻止する、例えば、疾患または状態の発症を阻止する、疾患または状態を軽減する、疾患または状態の緩解をもたらす、疾患または状態によりもたらされる症状を軽減する、または疾患または状態の症状を停止することを含む。用語“処置し”、“処置する”または“処置”は、予防的および／または治療的処置を含み、これらに限定されない。
【０１８７】
ここで使用する用語“水溶性ポリマー”は、水性溶媒に可溶性である全てのポリマーを意味する。かかる水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ、それらの誘導体モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸類、ジビニルエーテルマレイン無水物、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンフラグメント、多糖類、オリゴ糖類、グリカン類、セルロースおよびメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含み、これらに限定されないセルロース誘導体、血清アルブミン、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびそれらの誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ[(２−ヒドロキシエチル)−ＤＬ−アスパルタミドなど、またはそれらの混合物を含み、これらに限定されない。ほんの一例として、かかる水溶性ポリマーのここに提供される化合物を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへの結合は、水溶性増加、非修飾系対と比較した血清半減期延長または調節、治療半減期延長または調節、バイオアベイラビリティ増加、生物学的活性調節、循環時間延長、免疫原性調節、凝集および多量体形成を含み、これらに限定されない物理的会合特性の調節、受容体結合改変、１個以上の結合のパートナーへの結合改変、および受容体二量体化または多量体化改変を含み、これらに限定されない変化をもたらす。
【０１８８】
ここに記載する方法、組成物および組合せの他の目的、特性および利点は、以下の詳細な記載から明らかになる。しかしながら、詳細な記載および具体例は、特異的態様を記載するが、例示の目的のみで示されることは理解すべきである。
【０１８９】
生合成的に製造したピロリシンおよびＰＣＬの部位特異的取り込み
ピロリシン(ＰＹＬ)は、メタノサルシナ科のメタン生成古細菌および２種の非関連細菌種から発見された２２番目の天然の、遺伝的にコード化されたアミノ酸である。具体的に、ピロリシンはかかる古細菌でのメタンを開始させるモノメチルアミン(ＭＭＡ)メチルトランスフェラーゼであるＭｔｍＢ１に見られる(Srinivasan, G., James, C. M., and Krzycki, J. A. (2002), “Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea： charging of a UAG-decoding specialized tRNA,” Science, 296, 1459-62； Soares, J. A., Zhang, L., Pitsch, R. L., Kleinholz, N. M., Jones, R. B., Wolff, J. J., Amster, J., Green-Church, K. B., and Krzycki, J. A. (2005), “The residue mass of L-pyrrolysine in three distinct methylamine methyltransferases,” Journal of Biological Chemistry, 280, 36962-9； Hao, B., Gong, W., Ferguson, T. K., James, C. M., Krzycki, J. A., and Chan, M. K., (2002), “A new UAG-encoded residue in the structure of a methanogen methyltransferase”, Science, 296, 1462-6； Krzycki, J. A., (2005), “The direct genetic encoding of pyrrolysine,” Current Opinion in Microbiology, 8, 706-12； Krzycki, J. A., (2004), “Function of genetically encoded pyrrolysine in corrinoid-dependent methylamine methyltransferases,” Current Opinion in Chemical Biology, 8, 484-91, and Ambrogelly, A., Palioura, S., and Soll, D., (2007), “Natural expansion of the genetic code,” Nature Chemical Biology 3, 29-35)。ピロリシンは、リシンのε−アミンが４−メチル−ピロリン−５−カルボキシレートのＤ−異性体にアミド結合を介して結合しているジペプチドであると見なされる(Polycarpo, C. R., Herring, S., Berube, A., Wood, J. L., Soll, D., and Ambrogelly, A., (2006), “Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase,” FEBS Letters, 580, 6695-700参照)。ピロリシンの構造(図１)は、ＭｔｍＢ１の結晶構造および基の質量から推測した(J. Biol. Chem. 2005, 44, 36962-36969；PNAS, 2007, 104, 1021-1026参照)。
【０１９０】
ＭｔｍＢ１をコードするｍｔｍＢ１遺伝子は、フレーム内アンバー(ＴＡＧ)コドンを有し、これは通常標準的停止コドンである。しかしながら、ｍｔｍＢ１  ｍＲＮＡにおいて、ＤＮＡレベルではＴＡＧとコードされるＵＡＧコドンは、ＭｔｍＢ１タンパク質の生成中翻訳を停止させず、その代わり、ＵＡＧコドンは、ピロリシンをコードし、それはタンパク質に取り込まれている。ピロリシンは、内因性に合成され、その後同時翻訳によってかかるフレーム内ＵＡＧコドンによって遊離アミノ酸として取り込まれる。
【０１９１】
ピロリシンの生合成および取り込みは天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤにより促進される。ｐｙｌＴはピロリシル−ｔＲＮＡをコードし、ｐｙｌＳはピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼをコードし、一方ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤは、ピロリシン生合成に必要なタンパク質をコードする。これらの遺伝子はメタノサルシナ・マゼイから誘導されている(Longstaff, D. G., Larue, R. C., Faust, J. E., Mahapatra, A., Zhang, L., Green-Church, K. B., and Krzycki, J. A., (2007), “A natural genetic code expansion cassette enables transmissible biosynthesis and genetic encoding of pyrrolysine,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 1021-6, and Namy, O., Zhou, Y., Gundllapalli, S., Polycarpo, C. R., Denise, A., Rousset, J. P., Soll, D., and Ambrogelly, A., (2007), “Adding pyrrolysine to the Escherichia coli genetic code,” FEBS Letters, 581, 5282-8参照)。ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ遺伝子は、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子と共にｐｙｌＴＳＢＣＤ遺伝子集団を形成し、それは、天然遺伝暗号伸長カセットであり、その伝達によりＵＡＧコドンが、内因性に合成された遊離アミノ酸であるピロリシンとして翻訳されることが可能となり、それがＵＡＧ部位でタンパク質に取り込まれる。
【０１９２】
ピロリシンの生合成は、天然遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの遺伝子産物により促進されることが示唆され、Ｄ−オルニチンが前駆体として提案されていた(Namy, O., Zhou, Y., Gundllapalli, S., Polycarpo, C. R., Denise, A., Rousset, J. P., Soll, D., and Ambrogelly, A., (2007), “Adding pyrrolysine to the Escherichia coli genetic code,” FEBS Letters, 581, 5282-8参照)。Ｄ−グルタメート、Ｄ−イソロイシン、Ｄ−プロリンおよびＤ−オルニチンのようなピロリシンに対する種々の前駆体が提案され、Ｄ−オルニチンは、天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを担持するプラスミドで形質転換した大腸菌でのピロリシン生合成のための最も有効な前駆体であると述べられた。この試験は、天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを担持するプラスミドで形質転換した大腸菌中でピロリシンが生合成され、タンパク質内に取り込まれる証明としてＴＡＧ取り込みまたは短縮化シグナルでの読み過ごし、すなわち完全長タンク質の生成を使用し、そしてＤ−オルニチンを前駆体として使用した。ピロリシンの取り込みは、質量分析では直接的に確認されなかったが、Ｄ−オルニチン非存在下で、ピロリシンが、天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを有するプラスミドで形質転換した大腸菌内で、低レベルではあるが、生合成され、タンパク質に９取り込まれるとの先の質量分析データによりその結論は支持された(Longstaff, D. G., Larue, R. C., Faust, J. E., Mahapatra, A., Zhang, L., Green-Church, K. B., and Krzycki, J. A., (2007), “A natural genetic code expansion cassette enables transmissible biosynthesis and genetic encoding of pyrrolysine,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 1021-6参照)。
【０１９３】
しかしながら、先に記載した通り、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子の大腸菌または哺乳動物細胞への導入、およびＤ−オルニチンの増殖培地への付加は、質量分析を使用して同定して、“デメチル化ピロリシン”の生合成および取り込みに終わった(図１、ＰＣＬ−ＡおよびＰＣＬ−Ｂ)。この観察は、Longstaff et al.により示された結果の点から驚くべきことであり、予測できない。それ故に、ここに提供されるのは、天然遺伝子、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ、および前駆体としてＤ−オルニチンを使用して、天然にコード化され、生合成的に製造し、タンパク質に取り込まれるピロリシン類似体、ピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)である。他の態様において、Ｄ−アルギニンがＤ−オルニチンの前駆体であるため、ここに提供されるのは、天然遺伝子、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ、および前駆体としてＤ−アルギニンを使用して、天然にコード化され、生合成的に製造し、タンパク質に取り込まれるピロリシン類似体である。
【０１９４】
Ｄ−オルニチンからのピロリシンのピロリン環は、最初は、Ｌ−オルニチンからのプロリンの形成に準ずると考えられていた(Longstaff, D. G., Larue, R. C., Faust, J. E., Mahapatra, A., Zhang, L., Green-Church, K. B., and Krzycki, J. A., (2007), “A natural genetic code expansion cassette enables transmissible biosynthesis and genetic encoding of pyrrolysine,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 1021-6)。多くの細菌が、１−ピロリン−５−カルボキシレート中間体を介してＬ−オルニチンをＬ−プロリンに変換する。オルニチンから１−ピロリン−５−カルボキシレートの形成は、Ｌ−プロリンの生合成における二工程過程の第一工程である。Ｌ−オルニチンからの１−ピロリン−５−カルボキシレートの形成は、経路を介して起こり得る；第一は、Ｌ−オルニチンのシクロデアミノ化に由来する１−ピロリン−５−カルボキシレートの形成を介し、そして第二は、Ｌ−オルニチンアミノトランスフェラーゼによるＬ−グルタメートセミアルデヒドの形成を介する。その後グルタメートセミアルデヒドが１−ピロリン−５−カルボキシレートを形成する。ピロリン−５−カルボキシレートレダクターゼによる１−ピロリン−５−カルボキシレートの還元は、Ｌ−プロリンの形成をもたらす。
【０１９５】
現時点で、Ｌ−オルニチンアミノトランスフェラーゼに対する相同性は、メタン生成古細菌におけるピロリシンの形成で同定されていない。しかしながら、類似酵素の関与が推測される。ピロリシンの生合成は、細胞性前駆体を使用した協調した過程およびｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子の生成物の協調した作用であると考えられ、ここで、１−ピロリン−５−カルボキシレートを介するＤ−プロリンからのピロリシンの生合成についての提案されるスキームを図２Ａに示す(Longstaff, D. G., Larue, R. C., Faust, J. E., Mahapatra, A., Zhang, L., Green-Church, K. B., and Krzycki, J. A., (2007), “A natural genetic code expansion cassette enables transmissible biosynthesis and genetic encoding of pyrrolysine,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, 1021-6参照)。ｐｙｌＢ、ｐｙｌＤおよびｐｙｌＤ遺伝子産物は、数種のタンパク質ファミリーのメンバーである。ＰｙｌＢは、ラジカル触媒反応を仲介することが知られているＦｅ−ＳラジカルＳＡＭ酵素ファミリーのサイン基を有する。また、ＰｙｌＢはビオチンシンターゼと幾分相同性があり、それ故にＰｙｌＢがピロリシンピロリン環の形成またはメチル化に関与することが示唆されている。ｐｙｌＤ遺伝子産物ＰｙｌＤは、デヒドロゲナーゼ類の数ファミリーのＮＡＤＨ結合ドメインを有し、ＰｙｌＤが１−ピロリンイミン結合に関与することを示唆する。ＰｙｌＣはカルバモイルホスフェートシンテターゼおよびＤ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ類に類似し、リシンと４−メチル−１−ピロリン−５−カルボキシレートのＤ−異性体の間のピロリシンアミド結合形成への役割が示唆される。それ故に、推定ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子産物は、ラジカルＳＡＭタンパク質、タンパク質形成アミド類およびアミノ酸デヒドロゲナーゼ類にそれぞれ類似性を有し、それにより、ピロリシン生合成のための類似経路に酸化すると考えられる。
【０１９６】
しかしながら、先に記載した通り、ピロリシンを前駆体としてＤ−オルニチンとして使用して大腸菌およびＨＥＫ２９３Ｆ細胞内で生合成する試みはピロリシンではなく、ここでは、ピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)と呼ぶ“デメチル化ピロリシン”の形成をもたらした(ＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂ：図１参照)。ここに示す通り、ＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂの生合成はｐｙｌＢ遺伝子の存在を必要とせず、それ故にＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂの生合成のための一つの可能性のあるスキームを図２Ｂに示す。何らかの特定の理論に縛られることなく、この可能性のある経路は、Ｄ−オルニチンから５−アミノ−２−オキソペンタン酸への、内因性Ｄ−アミノ−酸オキシダーゼ(Ｅ.Ｃ。１.４.３.３)を介する変換、および５−アミノ−２−オキソペンタン酸の１−ピロリン−２−カルボキシレートおよび水への自発的な環化を含む。ほとんどの生物で利用可能なこの前駆体は、恐らく酵素ＰｙｌＤの助けによる、二重結合の再配置によりＤ−１−ピロリン−５−カルボキシレートに変換する。ＰｙｌＣおよびＡＴＰによるＤ−１−ピロリン−５−カルボキシレートのＬ−リシンのイプシロンアミンへのライゲーションはピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ：ＰＣＬ−Ａ)をもたらす。あるいは、１−ピロリン−２−カルボキシレートのライゲーションは、ＰＣＬ−Ａと分子質量が等しいＰＣＬ−Ｂをもたらす。ＰｙｌＤおよびＰｙｌＣの両方がＰＣＬ取り込みに必要であること、およびＰｙｌＳがＰＣＬの１−ピロリン環のＣ−５に等しい位置でｓｐ２炭素を有するピロリシン類似体を基質として受け入れることができないことの両方の観察は(ここに示す通り)、最初、ＰＣＬが、主にＰＣＬ−Ａの形態でタンパク質に取り込まれること可能性を示唆した。何らかの特定の理論に縛られることなく、デメチル化ＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂは、添加Ｄ−オルニチンの存在下で、メチル提供ＰｙｌＢ基質の非存在下ＰｙｌＢの脱活性化、必要な補因子(複数もある)またはそれらの組合せの非存在下のいずれかで得られると考えられる。しかしながら、これは他の機構の存在を妨げるものではない。実際、数種の中間体(ここに示す通り)を用いた取り込み試験は、図２Ｂに示唆される以外のＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂの生合成経路を示唆する。この別の経路をここに示す。
【０１９７】
ＵＡＧコドンに応答したピロリシンのタンパク質への取り込みは天然遺伝子ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳにより促進されることが示されており、ここで、ピロリシンとして翻訳されるＵＡＧは、ピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼ(ＰｙｌＳ)によるピロリシンでのアンバー解読ｔＲＮＡｐｙｌのアミノアシル化を必要とする(図３Ａ)。ｐｙｌＴ遺伝子は、専用天然サプレッサーｔＲＮＡｐｙｌ(ＰｙｌＴ)をコードし、そのＣＵＡアンチコドンは、ピロリシンに対応するＵＡＧセンスコドンを補う。ｐｙｌＳ遺伝子は、特異的クラスII  ｔＲＮＡシンセターゼであるピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼ(ＰｙｌＳ)によりコードされ、それはｔＲＮＡｐｙｌをピロリシン(化学的にまたは生合成的に合成された)に入れ、またピロリシン依存的ＡＴＰ：ピロホスフェート交換反応を行う。同様に、ＵＡＧコドンに応答したピロリシン類似体ＰＣＬ−ＡまたはＰＣＬ−Ｂのタンパク質への取り込みは天然遺伝子ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳにより促進されると考えられる(図３Ｂ)。
【０１９８】
ピロリシンおよびＰＣＬの生合成およびタンパク質への部位特異的取り込み
原核および真核細胞により発現
ここに提供されるのを生合成的に製造したピロリシンおよび／またはピロリン−カルボキシ−リシン((Ｓ)−２−アミノ−６−(３,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド)ヘキサン酸(ＰＣＬ−Ａ)または(Ｓ)−２−アミノ−６−(３,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−５−カルボキサミド)ヘキサン酸(ＰＣＬ−Ｂ))の部位特異的取り込みのための方法である。ピロリシン類似体ＰＣＬ−ＡおよびＰＣＬ−Ｂ(ここでは両方ともＰＣＬと呼ぶ)は、ピロリシン(ＰＹＬ)のメチル基を欠く(図１)。かかる方法のある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞である。他の態様において、ここで提供される方法において使用される哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞、ヒト類上皮細胞癌腫(ＨｅＬａおよびＧＨ３)細胞、サル腎臓(ＣＯＳ)細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ−２１)細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、ここで提供される方法で使用する酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、ここで提供される方法で使用する昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ(ｓｆ９およびｓｆ２１)細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、原核細胞は細菌であり、他の態様において、ここで提供される方法で使用する細菌は、大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌を含み、これらに限定されない。
【０１９９】
ある態様において、生合成的に製造したピロリシンおよびＰＣＬの部位特異的取り込みのためのかかる方法は、遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ、および所望のタンパク質のための遺伝子の、原核細胞および／または真核細胞への導入、および場合によりトランスフェクト細胞の増殖培地へのピロリシンまたはＰＣＬの前駆体の添加を含む。ある態様において、前駆体はＤ−オルニチンであり、他の態様において前駆体はＬ−オルニチン。ある態様において、前駆体はＤ,Ｌ−オルニチンである。ある態様において、前駆体はＤ−アルギニン、他の態様において前駆体はＬ−アルギニンである。ある態様において、前駆体はＤ,Ｌ−アルギニンである。ある態様において、前駆体は：
【化３１】
0005542832.tif 000032
(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、前駆体は：
【化３２】
0005542832.tif 000033
(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、前駆体は：
【化３３】
0005542832.tif 000034
２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、前駆体は(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞である。他の態様において、ここで提供される方法で使用する哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ヒト類上皮細胞癌腫ＨｅＬａおよびＧＨ３細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞およびチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、ここで提供される方法で使用する酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、ここで提供される方法で使用する昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、原核細胞は細菌であり、他の態様において、ここで提供される方法で使用する細菌は、大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌を含み、これらに限定されない。
【０２００】
ある態様において、生合成的に製造したピロリシンおよびＰＣＬの部位特異的取り込みのためのかかる方法は、遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ、および所望のタンパク質のための遺伝子の原核細胞および／または真核細胞への導入、およびピロリシンまたはＰＣＬの前駆体のトランスフェクト細胞の増殖培地への添加を含む。ある態様において、前駆体はＤ−オルニチン、他の態様において前駆体はＬ−オルニチンである。ある態様において、前駆体はＤ,Ｌ−オルニチンである。ある態様において、前駆体はＤ−アルギニン、他の態様において前駆体はＬ−アルギニンである。ある態様において、前駆体はＤ,Ｌ−アルギニン。ある態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、前駆体は２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、前駆体は(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞である。他の態様において、ここで提供される方法で使用する哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ヒト類上皮細胞癌腫ＨｅＬａおよびＧＨ３細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞およびチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、ここで提供される方法で使用する酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、ここで提供される方法で使用する昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、原核細胞は細菌であり、他の態様において、ここで提供される方法で使用する細菌は大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌を含み、これらに限定されない。
【０２０１】
ある態様において、生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込みのためのかかる方法は、遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ、および所望のタンパク質のための遺伝子の、原核細胞および／または真核細胞への導入、およびＤ−オルニチンの、ＰＣＬの前駆体としての増殖培地への添加を含む。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞である。他の態様において、ここで提供される方法で使用する哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ヒト類上皮細胞癌腫ＨｅＬａおよびＧＨ３細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞およびチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、ここで提供される方法で使用する酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、ここで提供される方法で使用する昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、原核細胞は細菌であり、他の態様において、ここで提供される方法で使用する細菌は大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌を含み、これらに限定されない。ピロリシンが生合成的に生成され、取り込まれるよりむしろ天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを使用するかかる態様において、代わりにデメチル化ピロリシン類似体ＰＣＬを生合成的に製造し、そして取り込む。
【０２０２】
ある態様において、生合成的に製造したピロリシンおよびＰＣＬの部位特異的取り込みのためのかかる方法は、遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ、および所望のタンパク質のための遺伝子の原核細胞および／または真核細胞への導入、およびＤ−オルニチン、Ｌ−オルニチン、Ｄ,Ｌ−オルニチン、Ｄ−アルギニン、Ｌ−アルギニン、Ｄ,Ｌ−アルギニン、(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸、(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸または２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸または(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸の、ピロリシンおよび／またはＰＣＬの前駆体としての増殖培地への添加を含む。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞である。他の態様において、ここで提供される方法で使用する哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ヒト類上皮細胞癌腫ＨｅＬａおよびＧＨ３細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞およびチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、ここで提供される方法で使用する酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、ここで提供される方法で使用する昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、原核細胞は細菌であり、他の態様において、ここで提供される方法で使用する細菌は大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌を含み、これらに限定されない。ピロリシンが生合成的に生成され、取り込まれるよりむしろ天然遺伝子天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを使用するかかる態様において、変わりにデメチル化ピロリシン類似体ＰＣＬを生合成的に製造し、そして取り込む。
【０２０３】
ある態様において、生合成的に製造したピロリシンの部位特異的取り込みのためのかかる方法は、遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ、および所望のタンパク質のための遺伝子の原核細胞および／または真核細胞への導入、および２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸または(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸のピロリシンの前駆体としての増殖培地への添加を含む。ある態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞または植物細胞である。他の態様において、ここで提供される方法で使用する哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ヒト類上皮細胞癌腫ＨｅＬａおよびＧＨ３細胞、サル腎臓ＣＯＳ細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞およびチャイニーズハムスター卵巣ＣＨＯ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、ここで提供される方法で使用する酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、ここで提供される方法で使用する昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、原核細胞は細菌であり、他の態様において、ここで提供される方法で使用する細菌は大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌を含み、これらに限定されない。
【０２０４】
生合成的に製造したＰＣＬの、モデルタンパク質(ｈＲＢＰ４)におけるＴＡＧコード化部位への部位特異的取り込みは、天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤおよび前駆体として増殖培地に添加されたＤ−オルニチンを使用して哺乳動物細胞で達成される(実施例２参照)。一態様において、モデルタンパク質、ｈＲＢＰ４へのＰＣＬの部位特異的取り込みは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞とＵＡＧ認識ｔＲＮＡＰｙｌＴをコードするＤＮＡ、その特異的アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼＰｙｌＳ、生合成遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤならびに標的タンパク質をコードするＤＮＡとＴＡＧによりコード化される取り込み部位の同時導入により達成された。かかるインビボ生合成および哺乳動物細胞でのモデルタンパク質ｈＲＢＰ４への、ＴＡＧコドンにより特定される一部位への取り込みに使用する遺伝子構築物を図４Ａに示す。ｈＲＢＰ４、ｍＥＰＯ、ｈＥＰＯ、およびｍＩｇＧ１のＦｃドメインの種々の一部位ＴＡＧ変異体の発現のために哺乳動物で使用する他の遺伝子構築物を図４Ｂに示す。大腸菌細胞での生合成により生成したＰＣＬまたはピロリシンの取り込みのためのｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを担持するプラスミドを図５に示す。
【０２０５】
ピロリシンの生合成のための推定前駆体であるＤ−オルニチンを、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤならびに標的タンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の培養培地に添加したとき、ピロリシンよりむしろＰＣＬが、ＴＡＧコドンの部位でｈＲＢＰ４に取り込まれる(実施例２、図６Ａ参照)。取り込み効率は、図６Ａに見られる通り、取り込み部位毎に変わる。
【０２０６】
モデルタンパク質(ｈＲＢＰ４)におけるＴＡＧコード化部位での生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込みは、哺乳動物細胞において、天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤおよび前駆体として増殖培地に添加されたＤ−オルニチンの使用により達成されている(実施例２参照)。一態様において、モデルタンパク質、ｈＲＢＰ４へのＰＣＬの部位特異的取り込みは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞とＵＡＧ認識ｔＲＮＡＰｙｌＴをコードするＤＮＡ、その特異的アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼＰｙｌＳ、生合成遺伝子ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤならびに標的タンパク質をコードするＤＮＡとＴＡＧによりコード化される取り込み部位の同時導入により達成された。ピロリシンの生合成のための推定前駆体であるＤ−オルニチンをトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｆ細胞の培養培地に添加したとき、ピロリシンではなくＰＣＬが、ＴＡＧコドンの部位でｈＲＢＰ４に取り込まれる。図６ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、そして図６Ｃは、Ｄ−オルニチンの非存在下(Ｂ、レーン１)または存在下(Ｂ、レーン２)でＨＥＫ２９３Ｆ細胞で生成した精製ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ６２ＰＣＬ(変異体＃２)の質量スペクトルを示す。矢印は完全長ｈＲＢＰ４を示し、得られた質量は２３１６６.０Daであり、２３１６８Daの予測される質量と近似した。図７−９に示す質量分析データは、さらに、ピロリシンではなくＰＣＬが、ｈＲＢＰ４の６２残基のＴＡＧ部位で取り込まれたことを説明する(実施例２参照)。
【０２０７】
図１は、ピロリシン(ＰＹＬ)およびデメチル化ピロリシン類似体、ピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)(構造ＰＣＬ−Ａまたは別の構造ＰＣＬ−Ｂ)を示す。ＰＣＬ−Ａ(または別の構造ＰＣＬ−Ｂ)の構造は、ピロリシンと、取り込み部位のペプチドフラグメントの高精度質量分光分析の使用により区別された(図７−９)。加えて、ＰＣＬの構造は、ピロリシンの構造と、細胞溶解物中の遊離アミノ酸としての質量分析によるＰＣＬの検出により区別された(図１０、実施例３参照)。また、細胞溶解物におけるＰＣＬの観察は、ＰＣＬが、翻訳後修飾による形成ではなく、遊離アミノ酸として生合成的に製造されることを証明する。図１０Ａおよび１０Ｃは、Ｄ−オルニチンから生合成されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞からの溶解物におけるＰＣＬの検出を示す。図１０Ａは、生合成遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤでトランスフェクトし、Ｄ−オルニチン存在下(下部トレース)およびＤ−オルニチン非存在下(上部トレース)増殖させた細胞からの溶解物のＨＰＬＣトレースを示す。Ｄ−オルニチン存在下で増殖させた細胞から得た溶解物クロマトグラムは、４.１３分溶出時間(アスタリスクで印)でのピークを特徴とし、それは、Ｄ−オルニチン非存在下で培養した同一細胞の溶解物にはない。図１０Ｃは、４.１３分でピークのＨＰＬＣのフル・スキャン質量スペクトルであり、ここで、得られた質量(ｍ＋１)はＰＣＬの理論的質量と一致する。図１０Ｂは、リシンが両方のサンプルで等しく豊富であることを示すＨＰＬＣクロマトグラムであり、１.４４分でのリシンＨＰＬＣのフル・スキャン質量(ｍ＋１)スペクトル(図１０Ｄ)はこの方法の正確さを説明する。
【０２０８】
図１１は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の種々のｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体タンパク質におけるＮ−ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(ＣＹＣ)の取り込みを示す。図１２は、ｈＲＢＰ４変異体Ｐｈｅ６２ＴＡＧのＴＡＧ部位でのＣＹＣ取り込みの質量分析検証を示す。図１３Ａおよび図１３Ｂ(実施例４参照)は、表に記載したおよび図１４Ａに示した種々の前駆体の関数としてのＰＣＬ取り込みを示す。図１３Ａおよび図１３Ｂはまた、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用し、ｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体タンパク質への種々のピロリシン類似体(ＣＹＣを含む)の直接取り込みを示す。Ｄ−オルニチンがＰＣＬ生合成のための前駆体であることを証明するために、ＰＣＬの可能性のある前駆体(図１４Ａ)を、ピロリシン生合成ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子、ｐｙｌＴ／ｐｙｌＳ  ｔＲＮＡ／ピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対およびｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体ＤＮＡでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の増殖培地に添加した。加えて、ｐｙｌＴ／ｐｙｌＳ  ｔＲＮＡ／ａａ−ｔＲＮＡシンセターゼ対およびｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体ＤＮＡのみでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の増殖培地に添加した種々のピロリシン類似体を図１４Ｂに示す。図１３Ａは、抗Ｈｉｓタグ抗体を有する完全長ｈＲＢＰ４タンパク質のウェスタンブロットであり、図１３Ｂは、同じサンプルのＮｉ−ＮＴＡ精製後のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。示される通り、Ｄ−オルニチン(レーン２)は、ＰＣＬ生合成の良好な前駆体であるが、Ｄ−オルニチンに代謝され得るＤ−アルギニン(レーン４)はバックグラウンドを超えるタンパク質生成をもたらす。ピロリシン類似体の中で、ＣＹＣのみがＤ−オルニチンと同等レベルまでのタンパク質生成をもたらし、３−オキソブタン酸類似体ＴＵ３０００−０１６は、測定可能ではあるが、はるかに低い取り込みを示す。種々の類似体の合成の記載は、実施例３３にある。全てのレーンは、恐らく、Ｄ−オルニチンおよびＰｙｌＳ基質として許容される代謝物または培地成分の低内因性レベルのため、完全長タンパク質の低レベル生成を示す。
【０２０９】
ＰＣＬの取り込みを、生合成遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの種々の組合せを使用して評価した(図１３Ｃ)。データは、遺伝子ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤのみがＰＣＬ生合成およびその後のタンパク質取り込みに必須であることを示す。最も注目すべきはＤ−プロリンが、他のＤ−プロリン類似体およびＤ−グルタミン酸(図１３および１４)と同様、バックグラウンドを超える完全長タンパク質生成をもたらさなかったことである。これは、ＰＣＬ−ＡおよびＰＣＬ−Ｂの生合成が、図２Ａに示した経路に従わないことを示唆する。しかしながら、３,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−５−カルボキシレート(Ｐ２Ｃ)および１−ピロリン−５−カルボキシレート(Ｐ５Ｃ)を用いた取り込み試験もまた大腸菌での完全長タンパク質の合成に失敗し、一方合成ＰＣＬ−ＡおよびＰＣＬ−Ｂは両方とも高効率で取り込まれた(図１５Ａ、実施例１５)。それ故に、図２Ｂに示す生合成経路はまた顕著な経路ではない可能性がある。
【０２１０】
前駆体(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸(Ｌｙｓ−Ｎε−Ｄ−ｏｒｎとも呼ぶ)の取り込みは、相当量の完全長タンパク質を生成した(図１５Ａ、実施例１５)。加えて、(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸の取り込みはｐｙｌＳ、ｐｙｌＴおよびＰｙｌＤ遺伝子の存在しか必要としないことも判明した(図１５Ｂ、実施例１５)。合わせて、これらの観察は、図１６Ａおよび１６Ｂに示す別の経路を示唆する。これらの経路は、Ｄ−オルニチンが、推定Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼであるＰｙｌＣの助けを借りて、最初にＬ−リシンのイプシロンアミノ基と結合して(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸を形成するとの概念に基づく。図１６Ａにおいて、(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸中間体はＤ−オルニチン：酸素酸化還元酵素(EC 1.4.3.3)またはＤ−アミノ−トランスアミナーゼ(ＥＣ  ２.６.１.２１)により活性化され、自発的に環化してＰＣＬ−Ｂを形成する。あるいは、図１６Ｂにおいて、(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸中間体は、Ｄ−オルニチン：２−オキソグルタレート５−トランスアミナーゼ(ＥＣ  ２.６.１.１３)により活性化され、自発的に環化してＰＣＬ−Ａを形成する。環化反応の両方とも、Ｄ−グルタメート５−セミアルデヒドのものに類似する。環化前のいずれかの活性化工程は、推定上ＰＣＬ生合成の第二の必須酵素であるＰｙｌＤにより触媒される。図１６に示す通り、ＰｙｌＢによるＰＣＬ−Ａのメチル化により、ＰＹＬの生合成が終了する。図１６Ａにおける経路の場合、他の、ＰＣＬ−ＢからＰＣＬ−Ａを形成する未発見のＰｙｌ酵素の存在が必要となる可能性があることに注意すべきである。しかしながら、このさらなる酵素は、図１６Ｂに示す別の経路では必要ない。ＰｙｌＤ活性化および自発的な環化後に形成されたＰＣＬ−Ａは、ＰｙｌＢにより直接的にメチル化されてピロリシンを形成する。あるいは、中間体のいずれかまたはＤ−オルニチンが、その後の酵素がかかる基質の修飾に抵抗性であるならば、ＰｙｌＢによるメチル化のための基質であろう。
【０２１１】
ピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼＰｙｌＳは、ｔＲＮＡＰｙｌへの帯電について数種のピロリシン類似体を許容することが示されている。しかしながら、かかる試験はまた、Ｄ−配座を必要とする、シンセターゼＰｙｌＳの認識のためのピロリシン環Ｃ−５立体中心の重要性も示す(Polycarpo, C. R., Herring, S., Berube, A., Wood, J. L., Soll, D., and Ambrogelly, A., (2006), “Pyrrolysine analogues as substrates for pyrrolysyl-tRNA synthetase,” FEBS Letters, 580, 6695-700参照)。先に記載した通り、およびこの解釈に一致して、芳香族性５員環および６員環ピロリシン類似体を含む種々のピロリシン類似体(図１３)を取り込む試みは、かかる芳香族性５および６員環類似体が、ＰｙｌＳのための許容される基質ではないことを証明する(図１４)。これは、恐らくＣ−５キラル中心の欠如、またはある場合には、類似体の大きなサイズのためであろう。示す通り、Ｎ−ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(ＣＹＣ)、ＰｙｌＳの既知基質、および３−オキソブタン酸類似体、ＴＵ３０００−０１６は、ＰｙｌＴ／ＰｙｌＳ  ｔＲＮＡ／ピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼ対を使用して取り込まれた(図１４)。しかしながら、Ｎ−ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(ＣＹＣ)に類似するサイズおよびかさ高さである評価した類似体は、恐らく、Ｃ−５立体中心の欠如のために取り込まれなかった。それ故に、ＰｙｌＳは、ピロリン環の結合点でのキラリティーに選択的であるように見える。しかしながら、合成ＰＣＬ−Ｂはまた高効率で取り込まれ、Ｃ−５位でのアキラル炭素であるｓｐ２が、全ての場合で取り込みを阻むものではないことを示唆する。現在、合成ＰＣＬ−Ａ(実施例４４、図５６および５８および図１６ＡにおけるＰＣＬ−ＢからＰＣＬ−Ａへの変換のための既知酵素の非存在下)と比較したときの、合成ＰＣＬ−Ｂと２−ＡＢＡの低反応性は、ＰＣＬ−Ａとしてのピロリシン類似体の取り込みの割り当てに好都合である。
【０２１２】
先に記載した通り、ある態様において、Ｄ−オルニチンを増殖培地に前駆体として添加したとき、哺乳動物細胞(実施例２)および細菌細胞(実施例８、９および１０)におけるピロリシン生合成のための天然遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの使用は、ピロリシンよりむしろＰＣＬの生成をもたらす。加えて、天然遺伝子ｐｙｌＢおよびｐｙｌＣ、天然遺伝子ｐｙｌＢおよびｐｙｌＤまたは天然遺伝子ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤのいずれかを使用したＰＣＬの生合成の評価は、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子産物が存在したときのみＰＣＬの生成をもたらした。これは、ｐｙｌＢの遺伝子産物が、Ｄ−オルニチンを前駆体として増殖培地に添加したとき、ＰＣＬの生合成に必要ではないことを示唆する(図１３Ｃ、実施例４参照)。これは、遺伝子ｐｙｌＢの哺乳動物細胞への同時導入無しで達成されたＰＣＬの３種のモデルタンパク質、ｈＲＢＰ４(図６、実施例２参照)、ｍＩｇＧ１  Ｆｃドメイン(図１７Ａ、実施例５参照)およびｍＥＰＯ(図１７Ｂ、参照実施例６)への取り込みにより支持される。大腸菌において、ＦＡＳ−ＴＥ、ＦＧＦ２１およびＦＫＢＰが、天然遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを使用して排他的にＰＣＬを生成する例である(図１８Ｂ、１９および２０、実施例８、９および１０)。
【０２１３】
ＰＣＬ生合成は、宿主細胞への、生合成遺伝子ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの存在を必要とするが、ｐｙｌＢは必要としない。メタノサルシナ内でのピロリシンの生合成において、ＰｙｌＤがデヒドロゲナーゼ類のＮＡＤＨ結合ドメインを含み、それによりＤ−プロリンからＤ−１−ピロリン−５−カルボキシレートを生成することが示唆されている。しかしながら、Ｄ−プロリンの増殖培地への添加は、顕著なＰＣＬ取り込みをもたらさない(図１３)。３,４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロール−５−カルボキシレート(ここでは１−ピロリン−２−カルボキシレート；Ｐ２Ｃとも呼ぶ)およびＤ−１−ピロリン−５−カルボキシレート(Ｐ５Ｃ)の増殖培地への添加も、完全長タンパク質の生成に失敗するが、(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸は、ＰＣＬ含有タンパク質を生成する。ＰｙｌＣは、Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンリガーゼ類と配列相同性を有し、ＰＣＬまたはピロリシンの生合成において、Ｄ−オルニチンの、リシンのイプシロン−アミノ基への結合を触媒し、(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸をもたらす。それ故に、ここでの仮説であり、いかなる理論にも縛られないが、哺乳動物または大腸菌細胞内でのＤ−オルニチンからのＰＣＬの生合成は、恐らくＰｙｌＣによるＤ−オルニチンから(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸への変換が関与している可能性がある(図１６Ｂ)。ＰｙｌＤは、(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸の、図１６Ｂに示す通りＰＣＬ−Ａに自発的に環化するセミアルデヒド(semialdeyhdye)((Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２−アミノ−５−オキソペンタンアミド)ヘキサン酸)への活性化に関与する可能性がある。あるいは、ＰＣＬ−Ｂは、ＰｙｌＤがＤ−アミノ−酸トランスアミナーゼまたはＤ−オルニチン：酸素酸化還元酵素様活性を有するならば、自発的に形成される(図１６Ａ)。
【０２１４】
他の態様において、大腸菌でのマウスＥＧＦおよびマウスＴＮＦ−αの発現(図２１および実施例１３および１４)は、ＴＡＧ部位に取り込まれたＰＣＬまたはピロリシンのいずれかを含むタンパク質混合物をもたらした。ピロリシンの取り込みはｐｙｌＢ遺伝子の存在に依存し、一方ＰＣＬ含有タンパク質の均一調製物がｐｙｌＢ非存在下で観察された(図２１および実施例１１および１２)。これは、それ故に、ピロリシン生合成におけるメチルトランスフェラーゼとしてのＰｙｌＢを実験的に確認する。ｐｙｌＢ遺伝子存在下でさえ、ＰＣＬおよびピロリシン含有タンパク質の量は発酵毎に異なり、ＰＣＬタンパク質が典型的により顕著であった。これらの観察は、メチルトランスフェラーゼ活性またはメチル供与基質または必要な補因子が、大腸菌および哺乳動物細胞における効率的なピロリシン生合成の制限であることを示唆する。
【０２１５】
加えて、ｐｙｌＢの遺伝子産物は、効率的に発現されない可能性がある。それ故に、ある態様において、修飾ｐｙｌＢ遺伝子をピロリシンまたは他のピロリシン類似体の生合成に使用する。それ故に、ここに提供されるのは、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子の１個以上が修飾されている、大腸菌、哺乳動物および他の宿主細胞における、ピロリシン、ＰＣＬおよび他のピロリシン類似体の生合成方法である。かかる修飾は、メタノサルシナ属(Methanosarcinae)の他の種を含み、これに限定されない他の生物からの相同遺伝子、または変異遺伝子の使用を含み得る。ある態様において、部位特異的変異誘発を使用し、他の態様において選択と組み合わせたランダム変異誘発を使用する。かかる方法はまた、所望のタンパク質のＤＮＡの添加およびタンパク質にピロリシン、ＰＣＬまたはピロリシン類似体を取り込むためのｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ遺伝子の導入を含む。ある態様において、修飾ｐｙｌＢ遺伝子、天然ｐｙｌＣ、ｐｙｌＤ、ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ遺伝子をピロリシンの生合成的生成および取り込みに使用する。他の態様において、修飾ｐｙｌＢおよびｐｙｌＣ遺伝子、天然ｐｙｌＤ、ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ遺伝子を、ＰＣＬ以外のピロリシン類似体の生合成的生成および取り込みに使用する。他の態様において、修飾ｐｙｌＢおよびｐｙｌＤ遺伝子、天然ｐｙｌＣ、ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ遺伝子を、ＰＣＬ以外のピロリシン類似体の生合成的生成および取り込みに使用する。他の態様において、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子を、場合により修飾して、ピロリシン、ＰＣＬまたは他のピロリシン類似体のタンパク質への取り込みを改善する。
【０２１６】
加えて、ある態様に関して、Ｄ−オルニチンからのピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体の生合成、またはピロリシンの生合成における中間体の形成は、宿主酵素およびタンパク質の機能により制限され得る。ある態様において、低活性または低濃度の１個以上の宿主酵素が、ピロリシン、ＰＣＬまたは他のピロリシン類似体の生合成に必要な中間体の形成を限定し得る。ある態様において、宿主酵素の活性が、中間体をピロリシン、ＰＣＬまたは他のピロリシン類似体に至るある経路から他の代謝経路に逸脱させ得るか、かかる中間体の形成を阻止し得る。それ故に、ここに提供されるのは、１個以上の宿主酵素が修飾されている、大腸菌、哺乳動物または他の宿主細胞でピロリシン、ＰＣＬおよび他のピロリシン類似体を生合成する方法である。かかる方法は、遺伝的または化学的手段によるかかる宿主酵素の過発現、活性化、抑制または阻害、かかる宿主酵素をコードするＤＮＡの付加、ｍＲＮＡ翻訳を抑制するためのサイレンシングＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)の付加、およびＤ−オルニチンから該中間体を形成するのに必要な補因子の付加を含み、これらに限定されない。
【０２１７】
生合成的に製造したＰＣＬのＴＡＧコード化部位での部位特異的取り込みは、マウスＩｇＧ１のＦｃドメインの４部位(実施例５および図１７Ａ参照)およびエリスロポエチン(ＥＰＯ)の１１部位(実施例６および図１７Ｂ参照)でも達成されている。タンパク質の両セットについてのＰＣＬ取り込みは、天然遺伝子ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ哺乳動物細胞で、培地に前駆体として添加されたＤ−オルニチンを使用して達成された。図１７Ａは、ｍＦｃ、ｐＣＭＶｐｙｌＴ、ｐＣＭＶｐｙｌＳ、ｐＣＭＶｐｙｌＣおよびｐＣＭＶｐｙｌＤのそれぞれのＴＡＧ変異体構築物(図４Ａ)と同時導入されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して、そして細胞をＤ−オルニチン存在下で増殖させた、ＰＣＬがマウスＩｇＧ１  Ｆｃドメインの４部位に取り込まれている４個の完全長(ＦＬ)ｍＦｃタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。図１７Ｂは、ｍＥＰＯ、ｐＣＭＶｐｙｌＴ、ｐＣＭＶｐｙｌＳ、ｐＣＭＶｐｙｌＣおよびｐＣＭＶｐｙｌＤのＴＡＧ変異体構築物と同時導入されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を使用して、細胞をＤ−オルニチン存在下で増殖させた、ＰＬＣがマウスＥＰＯの１１部位に取り込まれている、１１個の完全長(ＦＬ)ｍＥＰＯタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０２１８】
ＴＡＧコード化部位での生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込みは、大腸菌細胞でも達成されている(実施例７参照)。プラスミド、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、ｐｙｌＤ、ｐｙｌＳおよびｐｙｌＴをコードするｐＡＲＡ−ｐｙｌＳＴＢＣＤを構築した(図６Ａ)。ヒト脂肪酸シンセターゼのチオエステラーゼドメイン(ＦＡＳ−ＴＥ)の２部位(実施例８および図１８参照)、ＦＫＢＰ−１２の１部位(実施例９および図１９参照)および線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)の２０部位(実施例１０および図２０参照)でのＰＣＬ−Ａ(またはＰＣＬ−Ｂ)取り込みが、大腸菌細胞をｐＡＲＡ−ｐｙｌＳＴＢＣＤおよび目的タンパク質のための遺伝子を有する第二発現プラスミドで形質転換し、タンパク質発現中のＤ−オルニチンの増殖培地へ添加して、達成した。
【０２１９】
図１８は、ヒト脂肪酸シンセターゼのチオエステラーゼ(ＦＡＳ−ＴＥ)の２部位でのＰＣＬ取り込みについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトルを示す。ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬが発現され、可溶性および不溶性タンパク質フラクションの両方をＮｉ−ＮＴＡにより精製した。ＦＡＳ−ＴＥ  Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬ／Ｌｅｕ２２２３Ｉｌｅが、デュプリケート培養でＤ−オルニチン存在下および非存在下で発現された。Ｎｉ−ＮＴＡ溶出をゲル上に示す。各々について得た質量は予測したものと一致する。図１９は、ＦＫＢＰ−１２の一部位でのＰＣＬ取り込みについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトルを示す。得られた質量(１２０８５.６Da)は、ＰＣＬの一部位取り込みについて予測したものと一致する(１２０８４Da)。また、図１９に示されるのは、ＦＫＢＰ１２−Ｉｌｅ９０ＰＣＬの結晶である。図２０は、ＦＧＦ２１の複数部位でのＰＣＬの取り込みを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【０２２０】
ピロリシン(Ｐｙｌ)およびＰＣＬの取り込みは、発現系中のｐｙｌＢ遺伝子の存在に依存することが判明した。図２１Ａは、ＴＡＧ停止コドンに変異したＧｌｎ２１(ＣＡＡ)のコドンを有するｍＴＮＦ−ａへの、ＰｙｌまたはＰＣＬ取り込みのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す(実施例１３)。レーン２および４は、Ｄ−オルニチンが存在するとき、ｐｙｌＢの存在下および非存在下での同等のタンパク質発現レベルを示す。レーン３(ｐｙｌＢ存在)および５(ｐｙｌＢ非存在)は、Ｄ−オルニチン非存在下で、タンパク質が発現されないことを示す。
【０２２１】
加えて、ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧが、前駆体としてＤ−オルニチンを使用して、大腸菌内でｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、ｐｙｌＤ、ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ遺伝子の存在下で発現された(実施例１４)。インタクトＭＳスペクトル(図２１Ｃ、下部)は、取り込まれたＰＹＬおよびＰＣＬとのタンパク質の混合物を示した。Ｐｙｌ含有ｍＥＧＦの７３０９DaでのＭＳピークは、７２９５DaでのＰＣＬ含有ｍＥＧＦのピークより約６倍大きい。ＴＡＧ位置でのＰＹＬおよびＰＣＬの取り込みは、ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧ変異体タンパク質のＮ末端ペプチドMNSYPGCPSS(PCL)DGYCLNGGVCM(配列番号３２)およびMNSYPGCPSS(Pyl)DGYCLNGGVCM(配列番号３３)のタンデムＭＳスペクトルにより確認した。種々のペプチドの相対的前駆体質量存在度からの定量は、ＰＹＬがＰＣＬより５〜１０倍豊富であることを確認し、これはインタクト・マス測定とほぼ一致する(図２１Ｃ、下部)。ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧがｐｙｌＢ存在下で発現したとき、インタクトＭＳスペクトル(図２１Ｃ、ｔｏｐ)はＰＣＬ取り込みのみを示す。
【０２２２】
同様に、ｍＴＮＦ−ａ  Ｇｌｎ２１ＴＡＧがＤ−オルニチンを使用して大腸菌内でｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、ｐｙｌＤ、ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ遺伝子の存在下で発現されたとき、タンデムＭＳは、ｍＴＮＦ  Ｇｌｎ２１ＰＣＬのペプチドNH(Pyl)VEEQLEWLSQR(配列番号３４)およびNH(PCL)VEEQLEWLSQR(配列番号３５)におけるＰＹＬおよびＰＣＬ取り込みを確認した。ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧと対照的に、タンデムＭＳで同定した種々のペプチドの相対的前駆体質量存在度からの定量は、ＰＣＬがｍＴＮＦ−ａ  Ｇｌｎ２１ＴＡＧタンパク質内でＰＹＬより７倍豊富であることを証明する。ｍＴＮＦ−ａ  Ｇｌｎ２１ＴＡＧをｐｙｌＢ遺伝子の非存在下で発現させ、タンデムＭＳでの種々のペプチドの相対的前駆体質量存在度から定量して、本実験のダイナミック・レンジ内でＰＣＬタンパク質しか示さない。これらの実験は、明らかにＰＹＬ取り込みが厳密にＰｙｌの生合成における推定メチルトランスフェラーゼであるｐｙｌＢの存在に依存することを示す。ｐｙｌＢ遺伝子の存在下でタンパク質に取り込まれたＰＣＬとＰＹＬの相対的比率は、しかしながらタンパク質毎および発酵実験毎に異なるように見え、それ故に発現ベクター、増殖条件および／または宿主細胞培養の他の特性による可能性がある。
【０２２３】
ここに提供されるのは、式(Ｖ)および式(VI)
【化３４】
0005542832.tif 000035
を有するアミノ酸類であり、ここで、かかる式(Ｖ)または式(VI)の化合物を、ｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子、およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で、細胞を前駆体を含む増殖培地と接触させて、生合成的に製造する。他の態様において、かかる式(Ｖ)または式(VI)の化合物を、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で、細胞を前駆体を含む増殖培地と接触させて生合成的に製造する。かかる生合成のある態様において、前駆体はオルニチンまたはアルギニンである。かかる生合成のある態様において、前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンである。かかる生合成のある態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。かかる生合成の他の態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【０２２４】
またここで提供されるのは、式(Ｖ)および(VI)の化合物が生合成され、さらに、ｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子および式(Ｖ)または式(VI)の化合物が、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよび細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識するｔＲＮＡにより細胞内のタンパク質に取り込まれることを含む、細胞である。かかるアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼはｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。ある態様において、かかる式(Ｖ)または式(VI)の化合物は、細胞内のタンパク質に直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳが式(Ｖ)または式(VI)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、そして該Ｏ−ｔＲＮＡが細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【０２２５】
式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含む、ピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体の取り込みのためのセレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。
【０２２６】
式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体の生合成および／または取り込みに使用する細胞は原核細胞または真核細胞である。ある態様において、原核細胞は、大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞または昆虫細胞を含み、これらに限定されない。かかる哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞、ヒト類上皮細胞癌腫(ＨｅＬａおよびＧＨ３)細胞、サル腎臓(ＣＯＳ)細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ−２１)細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、昆虫細胞は、ポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。
【０２２７】
他の面において、ここで提供されるのは、式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体が、前駆体を含む増殖培地との接触によりフィーダー細胞で生合成され、そして該フィーダー細胞はｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む。他の態様において、式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／またはピロリシン類似体が、前駆体を含む増殖培地との接触によりフィーダー細胞で生合成され、そしてフィーダー細胞がｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む。かかる生合成された式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体は、フィーダー細胞により増殖培地に分泌され、それにより第二細胞にとりこまれ、その後第二細胞内で合成されたタンパク質に取り込まれる。かかる第二細胞はｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含む。式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体は、第二細胞内のタンパク質に、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよび第二細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識するｔＲＮＡにより取り込まれる。かかるアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼはｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。ある態様において、かかる式(Ｖ)または式(VI)の化合物は、第二細胞内のタンパク質に直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳが式(Ｖ)または式(VI)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、そして該Ｏ−ｔＲＮＡは第二細胞中のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【０２２８】
フィーダー細胞を使用するかかる生合成のある態様において、前駆体はオルニチンまたはアルギニンである。かかる生合成のある態様において、前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンである。ある態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【０２２９】
フィーダー細胞を使用して生合成された式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体の取り込みのためのセレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。
【０２３０】
ある態様において、第二細胞はフィーダー細胞と同じ細胞型であり、他の態様において、第二細胞はフィーダー細胞と異なる細胞型である。かかる式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体の生合成および／または取り込みに使用する細胞は原核細胞または真核細胞である。ある態様において、原核細胞は、大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞または昆虫細胞を含み、これらに限定されない。かかる哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞、ヒト類上皮細胞癌腫(ＨｅＬａおよびＧＨ３)細胞、サル腎臓(ＣＯＳ)細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ−２１)細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、昆虫細胞は、ポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。
【０２３１】
ここで提供される他の面において、式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体がフィーダー細胞で生合成され、かかる生合成された式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシンおよび／またはＰＣＬは続いてフィーダー細胞培養から精製され、第二細胞を含む第二培養の増殖培地に添加される。かかる精製ピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体がその後第二細胞内で合成されたタンパク質に取り込まれる。ある態様において、式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体が、前駆体を含む増殖培地と接触したフィーダー細胞で生合成され、フィーダー細胞がｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む。他の態様において、式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体が、前駆体を含む増殖培地と接触したフィーダー細胞で生合成され、フィーダー細胞がｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む。この面で使用する第二細胞はｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含む。式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体が、第二細胞内のタンパク質にアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよび第二細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識するｔＲＮＡにより取り込まれる。かかるアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。ある態様において、かかる式(Ｖ)または式(VI)の化合物が第二細胞内のタンパク質内に直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳが式(Ｖ)または式(VI)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化し、そして該Ｏ−ｔＲＮＡは第二細胞中のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【０２３２】
フィーダー細胞を使用するかかる生合成のある態様において、前駆体はオルニチンまたはアルギニンである。かかる生合成のある態様において、前駆体はＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニンである。ある態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。ある態様において、前駆体は(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸である。
【０２３３】
フィーダー細胞を使用して生合成した式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体の取り込みのためのセレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。
【０２３４】
ある態様において、第二細胞はフィーダー細胞と同じ細胞型であり、他の態様において、第二細胞はフィーダー細胞と異なる細胞型である。かかる式(Ｖ)および式(VI)の化合物を含むピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体の生合成および／または取り込みに使用する細胞は原核細胞または真核細胞である。ある態様において、原核細胞は、大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞または昆虫細胞を含み、これらに限定されない。かかる哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞、ヒト類上皮細胞癌腫(ＨｅＬａおよびＧＨ３)細胞、サル腎臓(ＣＯＳ)細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ−２１)細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、昆虫細胞は、ポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。
【０２３５】
またここに提供されるのは式(VII)；
【化３５】
0005542832.tif 000036
の構造を有するアミノ酸であり、ここで、該式(VII)の化合物、またはその異性体または互変異性体を、ｐｙｌＢ遺伝子、ｐｙｌＣ遺伝子、およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で生合成的に製造し、細胞をＤ−オルニチンまたはＤ−アルギニン(argnine)または(２Ｓ)−２−アミノ−６−((Ｒ)−２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸または２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸または(２Ｓ)−２−アミノ−６−(２,５−ジアミノペンタンアミド)ヘキサン酸を含む増殖培地と接触させる。他の態様において、かかる式(VII)の化合物をｐｙｌＣ遺伝子およびｐｙｌＤ遺伝子を含む細胞内で生合成し、細胞を２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸を含む増殖培地と接触させる。ある態様において、細胞は、Ｄ−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸を含む増殖培地と接触している。ある態様において、２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸は(２Ｒ,３Ｓ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。ある態様において、２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸は(２Ｒ,３Ｒ)−２,５−ジアミノ−３−メチルペンタン酸である。
【０２３６】
式(VII)の化合物が生合成により生成される細胞は、さらに、ｐｙｌＳ遺伝子およびｐｙｌＴ遺伝子を含み、式(VII)の化合物がアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼおよび細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識するｔＲＮＡにより細胞内のタンパク質に取り込まれる。かかるアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｐｙｌＳ遺伝子の遺伝子産物であり、そしてｔＲＮＡがｐｙｌＴ遺伝子の遺伝子産物である。ある態様において、かかる式(VII)の化合物が直交性ｔＲＮＡ(Ｏ−ｔＲＮＡ)および直交性アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ(Ｏ−ＲＳ)により細胞内のタンパク質に取り込まれ、ここで、該Ｏ−ＲＳが式(VII)の化合物を有するＯ−ｔＲＮＡをアミノアシレート化し、Ｏ−ｔＲＮＡが細胞内のｍＲＮＡの少なくとも１個のセレクター・コドンを認識する。
【０２３７】
式(VII)の化合物の取り込みのためのセレクター・コドンはアンバーコドン(ＴＡＧ)である。
【０２３８】
式(VII)の化合物の生合成および／または取り込みに使用する細胞は、原核細胞または真核細胞である。ある態様において、原核細胞は、大腸菌、スメグマ菌、ラクトコッカス・ラクティスおよび枯草菌細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、真核細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞または昆虫細胞を含み、これらに限定されない。かかる哺乳動物細胞は、ヒト胎児由来腎臓(ＨＥＫ２９３Ｆ)細胞、ヒト類上皮細胞癌腫(ＨｅＬａおよびＧＨ３)細胞、サル腎臓(ＣＯＳ)細胞、ラットＣ６神経膠腫細胞、ベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ−２１)細胞およびチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を含み、これらに限定されない。ある態様において、酵母細胞は、出芽酵母およびピチア・パストリス細胞を含み、これらに限定されない。他の態様において、昆虫細胞は、ポドプテラ・フルギペルダｓｆ９およびｓｆ２１細胞、イラクサギンウワバ(BTI TN-5B1-4またはHigh-FiveTM)細胞およびヨトウガ細胞を含み、これらに限定されない。
【０２３９】
ある態様において、１個以上のピロリシン、ＰＣＬおよび／または他のピロリシン類似体が、ここに記載の方法を使用してタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれ、そしてかかるピロリシンおよび／またはＰＣＬはここに記載する方法で誘導体化される。
【０２４０】
ＰＣＬおよびピロリシンの誘導体化
ここに提供されるのは式(Ｉ)：
【化３６】
0005542832.tif 000037
〔式中：
Ｒ１はＨまたはアミノ末端修飾基であり；
Ｒ２はＯＨまたはカルボキシ末端修飾基であり；
ｎは１〜５０００の整数であり；
各ＡＡは独立して選択されるアミノ酸基、式(Ａ−１)の構造を有する部分および式(Ｂ−１)の構造を有する部分；
【化３７】
0005542832.tif 000038
であり、ここで、Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルであり、そして少なくとも１個のＡＡはピロリシンまたは式(Ａ−１)または式(Ｂ−１)の構造を有するピロリシン類似体、またはその異性体である。〕
の構造を有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。
【０２４１】
かかる式(Ｉ)の化合物のある態様において、Ｒ６はＨであり、式(Ａ−１)の構造を有する部分および式(Ｂ−１)の構造を有する部分は、それぞれ式(Ａ−２)および式(Ｂ−２)；
【化３８】
0005542832.tif 000039
の構造を有するか、またはその異性体である。
【０２４２】
それ故に、またここに提供されるのは、式(Ｉ)：
【化３９】
0005542832.tif 000040
〔式中：
Ｒ１はＨまたはアミノ末端修飾基であり；
Ｒ２はＯＨまたはカルボキシ末端修飾基であり；
ｎは１〜５０００の整数であり；
各ＡＡは独立して選択されるアミノ酸基、式(Ａ−２)の構造を有する部分および式(Ｂ−２)の構造を有する部分であり；
そして少なくとも１個のＡＡがピロリシンまたは式(Ａ−２)または式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体、またはその異性体である。〕
の構造を有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。
【０２４３】
ある態様において、ｎは１〜４０００の整数である。ある態様においてｎは１〜３０００の整数である。ある態様においてｎは１〜２０００の整数である。ある態様においてｎは１〜１０００の整数である。ある態様においてｎは１〜７００の整数である。ある態様においてｎは１〜８００の整数である。ある態様においてｎは１〜６００の整数である。ある態様においてｎは１〜５００の整数である。ある態様においてｎは１〜４００の整数である。ある態様においてｎは１〜３００の整数である。ある態様においてｎは１〜２００の整数である。ある態様においてｎは１〜１００の整数である。ある態様においてｎは１〜９０の整数である。ある態様においてｎは１〜８０の整数である。ある態様においてｎは１〜７０の整数である。ある態様においてｎは１〜６０の整数である。ある態様においてｎは１〜５０の整数である。ある態様においてｎは１〜４０の整数である。ある態様においてｎは１〜３０の整数である。ある態様においてｎは１〜２０の整数である。ある態様においてｎは１〜１０の整数である。ある態様においてｎは１〜５の整数である。
【０２４４】
また、ここに提供されるのは、式(Ｉ)のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの部位特異的標識方法であり、ここで、該は、かかる１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬ基を含むタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドと、式(III)：
【化４０】
0005542832.tif 000041
〔式中：
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり；
Ｘ１は標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕
を有する試薬と混合することを含む。
【０２４５】
さらにここに提供されるのは、式(Ｉ)のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの部位特異的標識方法であって、ここで、該方法は、適当な条件下、かかる１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬ基を含むタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドと式(IV)：
【化４１】
0005542832.tif 000042
〔式中：
Ｒ５は−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５−６員単環式アリール、５−６員単環式ヘテロアリール、９−１０員縮合二環式環または１３−１４員縮合三環式環であり、ここで、Ａは、場合により−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から独立して選択される１〜５個の置換基により置換されていてよく；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり；
Ｘ１は標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕
の構造を有する試薬と混合および反応させることを含む。
【０２４６】
ある態様においてｋは１〜１１の整数である。ある態様においてｋは１〜１０の整数である。ある態様においてｋは１〜９の整数である。ある態様においてｋは１〜８の整数である。ある態様においてｋは１〜７の整数である。ある態様においてｋは１〜６の整数である。ある態様においてｋは１〜５の整数である。ある態様においてｋは１〜４の整数である。ある態様においてｋは１〜３の整数である。ある態様においてｋは１〜２の整数である。
【０２４７】
ある態様においてｐは１〜８０００の整数である。ある態様においてｐは１〜７０００の整数である。ある態様においてｐは１〜６０００の整数である。ある態様においてｐは１〜５０００の整数である。ある態様においてｐは１〜４０００の整数である。ある態様においてｐは１〜３０００の整数である。ある態様においてｐは１〜２０００の整数である。ある態様においてｐは１〜１０００の整数である。ある態様においてｐは１〜５００の整数である。ある態様においてｐは１〜４００の整数である。ある態様においてｐは１〜３００の整数である。ある態様においてｐは１〜２００の整数である。ある態様においてｐは１〜１００の整数である。ある態様においてｐは１〜９０の整数である。ある態様においてｐは１〜８０の整数である。ある態様においてｐは１〜７０の整数である。ある態様においてｐは１〜６０の整数である。ある態様においてｐは１〜５０の整数である。ある態様においてｐは１〜４０の整数である。ある態様においてｐは１〜３０の整数である。ある態様においてｐは１〜２０の整数である。ある態様においてｐは１〜１０の整数である。ある態様においてｐは１〜５の整数である。
【０２４８】
式(IV)の化合物の例は以下のものを含む：
【化４２】
0005542832.tif 000043
【化４３】
0005542832.tif 000044
【化４４】
0005542832.tif 000045
を含み、これらに限定されない。ここで、１個以上のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分を有する化合物は１０００Da〜５０kDaの範囲の平均分子量を有し、そしてｎは２０〜１２００であり、そして、ｅｘＰＡＤＲＥはＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙ(ＤＡｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨであり、ＰＡＤＲＥはＧｌｙ(ＤＡｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨであり、ＢＧ１は５'＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ−３'であり、そしてＢＧ２は５'＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ−３'であり、ここで、＊はホスホチオエート架橋を意味する。
【０２４９】
ある態様において、ここで提供される方法で誘導体化した１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬを含むタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、式(II)：
【化４５】
0005542832.tif 000046
｛式中：
Ｒ１はＨまたはアミノ末端修飾基であり；
Ｒ２はＯＨまたはカルボキシ末端修飾基であり；
ｎは１〜５０００の整数であり；
各ＢＢは独立してアミノ酸基、式(Ａ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｄ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｅ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｆ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｇ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｈ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｉ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｊ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、式(Ｋ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基および式(Ｌ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基、またはその異性体であり；
【化４６】
0005542832.tif 000047
〔式中：
Ｒ３、Ｒ５および各Ｒ４は独立してＨ、−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から選択され；
Ｒ６はＨまたはＣ１アルキルであり；
ＡはＣ３−Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクロアルキル、５−６員単環式アリール、５−６員単環式ヘテロアリール、９−１０員縮合二環式環または１３−１４員縮合三環式環であり、ここで、Ａは、場合により−ＯＨ、−ＮＯ２、ハロ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル(alkly)またはシクロアルキルおよび−ＬＸ１から独立して選択される１〜５個の置換基により置換されていてよく；
Ｌは結合、Ｃ１−８アルキレン、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキレン、Ｃ２−８アルケニレン、ハロ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ヒドロキシ−置換−Ｃ２−８アルケニレン、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｓ(Ｏ)ｋ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−Ｏ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋＣ(Ｏ)ＮＲ１１−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｓ)−、−Ｃ(Ｓ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)−、−ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＣＯＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｎ(Ｒ１１)ＣＯ(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ１１(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−、−ＮＲ１１Ｃ(Ｏ)(ＣＲ１１Ｒ１２)ｋ−から選択され、ここで、各Ｒ１１およびＲ１２は独立してＨ、Ｃ１−８アルキル、ハロ−置換−Ｃ１−８アルキル、またはヒドロキシ−置換−Ｃ１−８アルキルであり、そしてｋは１〜１２の整数であり、そして
Ｘ１は標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)から選択される。〕
ここで、少なくとも１個のＡＡは式(Ａ−２)または式(Ｂ−２)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基であるか、または少なくとも１個のＢＢは式(Ｃ−１)の構造を有するピロリシン類似体アミノ酸基または式(Ｄ−１)または式(Ｅ−１)または式(Ｆ−１)または式(Ｇ−１)または式(Ｈ−１)または式(Ｉ−１)または式(Ｊ−１)または式(Ｋ−１)または式(Ｌ−１)、またはその異性体である。｝
の構造を有する。
【０２５０】
ある態様においてｋは１〜１１の整数である。ある態様においてｋは１〜１０の整数である。ある態様においてｋは１〜９の整数である。ある態様においてｋは１〜８の整数である。ある態様においてｋは１〜７の整数である。ある態様においてｋは１〜６の整数である。ある態様においてｋは１〜５の整数である。ある態様においてｋは１〜４の整数である。ある態様においてｋは１〜３の整数である。ある態様においてｋは１〜２の整数である。
【０２５１】
ある態様においてｐは１〜８０００の整数である。ある態様においてｐは１〜７０００の整数である。ある態様においてｐは１〜６０００の整数である。ある態様においてｐは１〜５０００の整数である。ある態様においてｐは１〜４０００の整数である。ある態様においてｐは１〜３０００の整数である。ある態様においてｐは１〜２０００の整数である。ある態様においてｐは１〜１０００の整数である。ある態様においてｐは１〜５００の整数である。ある態様においてｐは１〜４００の整数である。ある態様においてｐは１〜３００の整数である。ある態様においてｐは１〜２００の整数である。ある態様においてｐは１〜１００の整数である。ある態様においてｐは１〜９０の整数である。ある態様においてｐは１〜８０の整数である。ある態様においてｐは１〜７０の整数である。ある態様においてｐは１〜６０の整数である。ある態様においてｐは１〜５０の整数である。ある態様においてｐは１〜４０の整数である。ある態様においてｐは１〜３０の整数である。ある態様においてｐは１〜２０の整数である。ある態様においてｐは１〜１０の整数である。ある態様においてｐは１〜５の整数である。
【０２５２】
ある態様においてｎは１〜４０００の整数である。ある態様においてｎは１〜３０００の整数である。ある態様においてｎは１〜２０００の整数である。ある態様においてｎは１〜１０００の整数である。ある態様においてｎは１〜７００の整数である。ある態様においてｎは１〜８００の整数である。ある態様においてｎは１〜６００の整数である。ある態様においてｎは１〜５００の整数である。ある態様においてｎは１〜４００の整数である。ある態様においてｎは１〜３００の整数である。ある態様においてｎは１〜２００の整数である。ある態様においてｎは１〜１００の整数である。ある態様においてｎは１〜９０の整数である。ある態様においてｎは１〜８０の整数である。ある態様においてｎは１〜７０の整数である。ある態様においてｎは１〜６０の整数である。ある態様においてｎは１〜５０の整数である。ある態様においてｎは１〜４０の整数である。ある態様においてｎは１〜３０の整数である。ある態様においてｎは１〜２０の整数である。ある態様においてｎは１〜１０の整数である。ある態様においてｎは１〜５の整数である。
【０２５３】
ある態様において、ここで提供される誘導体化方法に使用する式(III)の化合物は、アミノ糖類を含み、これに限定されない。ある態様において、かかるアミノ糖類は、Ｄ−マンノサミンおよびＤ−ガラクトサミンを含み、これらに限定されない。
【０２５４】
ある態様において、ここで提供される誘導体化方法に使用する式(IV)の化合物は、２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)、２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)の誘導体、ここで提供される２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)の誘導体、２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)、２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)の誘導体、ここで提供される２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)の誘導体、２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン(２−ＡＮＢＰ)、２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン(２−ＡＮＢＰ)の誘導体およびここで提供される２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン(２−ＡＮＢＰ)の誘導体を含み、これらに限定されない。
【０２５５】
図２２は、ＰＣＬ−Ａの２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)での化学誘導体化のための反応スキームであり、ここで、１個以上のＰＣＬ−Ａがタンパク質に部位特異的に取り込まれている。セミアルデヒドと２−ＡＢＡの環化反応は、フリートレンダー型反応であり、キナゾリン型部分(２２−Ａまたは２２−Ｂ)の形成をもたらし、これは、さらに適当な還元剤で還元して、テトラヒドロキナゾリン型部分(２２−Ｄ)または置換アニリン類(２２−Ｅ)を形成し得る。あるいは、キナゾリン型部分２２−Ｂのさらなる反応は、縮合環部分(２２−Ｃ)の形成をもたらす。キナゾリン型部分の還元に適当な還元剤は、ナトリウムシアノボロハイドライドおよび水素化ホウ素ナトリウムを含み、これらに限定されない。
【０２５６】
加えて、図２３は、ＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡ、２−ＡＡＰまたは２−ＡＮＢＰの反応後に形成されたタンパク質コンジュゲートの種々の構造を示す。かかる基の結合により予測される質量増加も示す。かかる基を使用して得た構造をＮＭＲ分光学で特徴付けした(実施例４５参照)。また、ＮａＣＮＢＨ３還元がＰＣＬベースのタンパク質コンジュゲートを安定化し、高温においてさえＰＣＬ−ＡＢＡとＰＣＬ−ＡＡＰの架橋の解離を阻止することが判明した(実施例４４参照)。
【０２５７】
２−ＡＢＡとΔ１−ピロリン−５−カルボン酸(Ｌ−１−ピロリン−５−カルボン酸)(Strecker, H. J., (1971), Methods in Enzymology 27B, 254-257； Vogel, H. J., and Davis, B. D. (1953), “Glutamic gamma-semialdehyde and delta1-pyrroline-5-carboxylic acid, intermediates in the biosynthesis of proline,” J. Am. Chem. Soc. 74, 109-112； and Schoepf, C., and Oechler, F., (1936), Ann. Chem. 523, 1参照)、および他のピロリン類(Schoepf, C., and Oechler, F., (1936), Ann. Chem. 523, 1； and Schoepf, C., and Steuer, H., (1947), Ann. Chem. 558, 124参照)の反応は、プロリン代謝および生合成におけるΔ１−ピロリン−５−カルボン酸の役割の研究における比色分析アッセイとして使用されている(Vogel, H. J., and Davis, B. D. (1953), “Glutamic gamma-semialdehyde and Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid, intermediates in the biosynthesis of proline,” J. Am. Chem. Soc. 74, 109-112； Strecker, H. J., (1960), “The interconversion of glutamic acid and proline,” J. Biol. Chem. 235, 2045-2050； Mezl, V. A., and Knox, W. E., (1976), “Properties and analysis of a stable derivative of pyrroline-5-carboxylic acid for use in metabolic studies,” Analytical Biochemistry 74, 430-40； Wu, G. Y., and Seifter, S., (1975), “A new method for the preparation of delta 1-pyrroline 5-carboxylic acid and proline,” Analytical Biochemistry 67, 413-21； Williams, I., and Frank, L., (1975), “Improved chemical synthesis and enzymatic assay of Δ1-pyrroline-5-carboxylic acid,” Anal. Biochem. 64, 85-97, and Strecker, H. J., (1957), “The interconversion of glutamic acid and proline,” J. Biol. Chem. 225, 825参照)。本反応スキームはグルタミン−ガンマ−セミアルデヒド中間体の形成を示しているが、本反応をピロリン−カルボキシ−リシンからかかる中間体の形成なしに直接進め得る。
【０２５８】
モデルタンパク質ｈＲＢＰ４の高解像度質量分析試験は、２−ＡＢＡでのＰＣＬ基の化学誘導体化を確認し、ここで、該ＰＣＬは、タンパク質ｈＲＢＰ４に部位特異的に取り込まれた(図２５−２６、実施例１１参照)。図２４は、２−ＡＢＡで誘導体化したｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの質量分光分析を示し、ここで、２−ＡＢＡで誘導体化したタンパク質は２３２６９.２Daでの主要なピークをもたらし、極少量の非修飾タンパク質が２３１６６.８Daで観察される。誘導体化タンパク質についての１０２.４Daの質量増加は、図２３に示す通り２−ＡＢＡ部分の結合についての１０３Daの予測される増加と一致する。それ故に、部位特異的に取り込まれたＰＣＬを有するタンパク質は、ＰＣＬ部位で部位特異的に修飾されることが証明される。２−ＡＢＡ誘導体化ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬタンパク質のトリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ解析後に得たＭＳ／ＭＳ解析(図２５)は、予測されるＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫペプチド(ここで、Ｆ＊は２−ＡＢＡ修飾ＰＣＬに一致する質量を有する)を同定した。図２５Ａは、ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫペプチド(ここで、Ｆ＊は２−ＡＢＡ修飾ＰＣＬに一致する質量を有する)のフラグメンテーションパターンである。図２５Ｂは、ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫ(Ｆ＊＝ＰＣＬおよびＰＣＬ−２−ＡＢＡ付加物)の２＋イオンのＴＩＣ(全イオンクロマトグラム)およびＥＩＣ(抽出イオンクロマトグラム)であり、ここで、誘導体化および非誘導体化(検出不可能)種のＥＩＣの比較は、反応の終了を示す。図２５Ｃは、２−ＡＢＡで誘導体化したｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの質量分光分析であり、それぞれｍ／ｚ  ４５９.９２(３＋)および６８９.３７(２＋)でＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫの３＋および２＋前駆体を示し(Ｆ＊＝ＰＣＬ−２−ＡＢＡ付加物)、それにより、観察される２−ＡＢＡとの反応は、基１２２での所望のＴＡＧ部位で、取り込まれたＰＣＬ基と部位特異的に起こることを証明する。
【０２５９】
誘導体化のｐＨ依存性の評価を図２６に示す。１２２位に取り込まれたＰＣＬを有するｈＲＢＰ４(ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ)の質量スペクトルを図２６Ａに示し、ここで、該ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬは２−ＡＢＡと反応しており、一方図２６Ｂおよび図２６Ｃはそれぞれ酢酸緩衝液、ｐＨ５.０中での１０mM  ２−ＡＢＡおよびリン酸緩衝液、ｐＨ７.４中での１０mM  ２−ＡＢＡとの反応後のｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬのマススペクトルである。ｈＲＢＰ４タンパク質のＰＣＬ基と２−ＡＢＡの反応は、ｐＨ５に調節した水性緩衝液中で、室温で９５％終了まで急速に起こり、ｐＨ７.４では約８７％までいくぶん低い程度まで起こる。２−ＡＢＡとの反応は、６２位で不活性非天然アミノ酸であるＯ−メチル−フェニルアラニン(ＯＭｅＰｈｅ)で標識したおよび野生型フェニルアラニン(Ｐｈｅ)基で１２２位を標識したｈＲＢＰ４について２−ＡＢＡとの反応が観察されない図２７Ｄ−Ｆで見られる通り、ＰＣＬ基に選択的である。
【０２６０】
反応体対タンパク質濃度比の関数としての反応効率、および２−ＡＢＡ様反応体との反応性の評価を図２７に示す。０.１mM  ２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)との反応後の１２２位に取り込まれたＰＣＬを有するｈＲＢＰ４(ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ)のマススペクトルを図２７Ａに示し、０.１mM  ２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)および０.１mM  ２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン(２−ＡＮＢＰ)との反応後のｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬのマススペクトルをそれぞれ図２７Ｂおよび図２７Ｃに示す。全反応を、２００mM  酢酸ナトリウム、ｐＨ５.０中で行った。図２３に示す通りタンパク質コンジュゲートが正しい質量で、予測される質量増加を伴い、検出される。加えて、２−ＡＢＡおよび２−ＡＡＰについて８８％変換を超える収率が達成されるが、恐らく低溶解性のために、２−ＡＮＢＰについて約５％の収率が得られた。しかしながら、これは、２−ＡＢＡ類似体が、効率的にＰＣＬ取り込み部位で反応体対タンパク質濃度比６対１で反応することを証明する。反応の程度は、反応体対タンパク質比６００対１で行ったものよりわずかに低いのみである(図２６)。
【０２６１】
誘導体化剤を、タンパク質よりも６〜６００倍モル過剰に対応する０.１〜１０mMの範囲の最終濃度で添加したとき、誘導体化の程度の顕著な改善はなかった。加えて、４７００より大きなモル比で、さらなるタンパク質基、恐らくリシン類が、２−ＡＢＡにより誘導体化される(図２８)。図２８において、１０×ＰＢＳ中のタンパク質を超える大過剰の２−ＡＢＡは、ＰＣＬが取り込まれたｈＲＢＰ４についてのさらなる部位(Ａ、〜１７μM、タンパク質を超える４７００倍過剰の２−ＡＢＡ)およびＯＭｅＰｈｅが取り込まれたｈＲＢＰ４(Ｂ、〜６.５μM、１５４００倍過剰)についてのさらなる部位でのコンジュゲーションをもたらし、これらのさらなる部位でのコンジュゲーションがＰＣＬ以外の基により仲介されることを説明する。
【０２６２】
ここで提供される方法の有用性をさらに説明するために、図２９は、ｐＨ５.０およびｐＨ７.４でＦＡＳ−ＴＥに取り込まれたＰＬＣの２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)での誘導体化前および後のマススペクトルを示す(実施例１２参照)。図２９Ａは、未反応ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬの質量スペクトルを示し、図２９Ｂは、ｐＨ５.０での反応混合物の質量スペクトルを示す。ここで、観察可能なピーク強度の１００％が３３３１８.８Daで起こり、これは、２−ＡＡＰ修飾ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬについて予測される１１７Da質量増加について予測される通り、未反応物質より１１６.８Da大きい。同様に、ｐＨ７.４で、反応は９５％終了まで起こる(図２９Ｃ(未反応)および図２９Ｄ(反応))。
【０２６３】
図３０は、ピロリシンおよび／またはＰＣＬの２−アミノ−ベンズアルデヒドまたは２−アミノ−ベンズアルデヒド類似体での化学誘導体化を介するタンパク質の部位特異的修飾についての一般的反応スキームである。かかる類似体のある種の態様をここに提供する。ピロリシンおよびＰＣＬのピロリン環と２−ＡＢＡの反応は、Δ１−ピロリン−５−カルボン酸と２−ＡＢＡの反応に類似する。同様に、ピロリシンおよびＰＣＬと２−ＡＡＰおよび２−ＡＮＢＰの反応は、図２３のそれぞれの置換部分を有するタンパク質修飾をもたらす。
【０２６４】
ある態様において、２−ＡＢＡ官能性を使用して、種々の基を取り込まれたピロリシンまたはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに部位特異的に結合させる。かかる基は、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)を含み、これらに限定されない。
【０２６５】
ある態様において、２−ＡＡＰ官能性を使用して、種々の基を取り込まれたピロリシンまたはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに部位特異的に結合させる。かかる基は、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)を含み、これらに限定されない。
【０２６６】
ある態様において、２−ＡＮＰＡ官能性を使用して、種々の基を取り込まれたピロリシンまたはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに部位特異的に結合させる。かかる基は、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリアルキレングリコール、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(エチレングリコール)の誘導体、糖、脂質、光クロスリンカー、細胞毒性化合物、医薬、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物；樹脂、ペプチド、第二タンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類似体、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＣＲプローブ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボ−オリゴヌクレオチド、デオキシリボ−オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ、修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ、ペプチド核酸、糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、水溶性デントリマー、シクロデキストリン、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的にまたは非共有結合的に相互作用する基、フォトケージド部分、化学線励起可能部分、リガンド、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子包含部分、化学的開裂可能基、光開裂可能基、伸長側鎖、炭素架橋糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、発色団基、化学発光基、蛍光部分、高電子密度基、磁性基、挿入基、キレート化基、発色団基、エネルギー移動剤、生物学的活性剤、検出可能標識、小分子、阻害性リボ核酸、ｓｉＲＮＡ、放射性ヌクレオチド、中性子捕獲剤、ビオチンの誘導体、量子ドット(群)、ナノトランスミッター、ラジオトランスミッター、アブザイム、酵素、活性錯体アクティベーター、ウイルス、毒素、アジュバント、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、リン脂質、ＬＰＳ様分子、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、アグリカン、アレルゲン、アンジオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、高分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル、界面活性剤、免疫応答増強剤、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、ラジオ・イメージングプローブ、他の分光学プローブ、プロドラッグ、免疫療法用毒素、固体支持体、−ＣＨ２ＣＨ２−(ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐ−ＯＸ２、−Ｏ−(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｐＣＨ２ＣＨ２−Ｘ２、およびそれらの任意の組合せ(ここで、ｐは１〜１０,０００であり、そしてＸ２はＨ、Ｃ１−８アルキル、保護基または末端官能基である)を含み、これらに限定されない。
【０２６７】
図３０に示す結合点Ｒ７〜Ｒ１１のいずれかを、２−ＡＢＡ、２−ＡＡＰおよび２−ＡＮＰＡのいずれかの結合に使用する。他の態様においてベンゼン環を、ナフタレンを含み、これに限定されないここに提供する任意の他の環構造に置き換える。他の態様においてベンゼン環を糖類に置き換える。
【０２６８】
タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシンおよびＰＣＬの誘導体化のためのここで提供される方法に使用する誘導体化剤の濃度は、約０.００５mM〜約５０mMの範囲である。ある態様において、ピロリシンまたはＰＣＬの誘導体化のためのここで提供される方法で使用する誘導体化剤の濃度は約０.００５mM〜約２５mMの範囲である。ある態様において、ピロリシンまたはＰＣＬの誘導体化のためのここで提供される方法で使用する誘導体化剤の濃度は約０.００５mM〜約１０mMの範囲である。ある態様において、ピロリシンまたはＰＣＬの誘導体化のためのここで提供される方法で使用する誘導体化剤の濃度は約０.００５mM〜約５mMの範囲である。ある態様において、ピロリシンまたはＰＣＬの誘導体化のためのここで提供される方法で使用する誘導体化剤の濃度は約０.００５mM〜約２mMの範囲である。ある態様において、ピロリシンまたはＰＣＬの誘導体化のためのここで提供される方法で使用する誘導体化剤の濃度は約０.００５mM〜約１mMの範囲である。
【０２６９】
ここで提供される誘導体化方法において誘導体化剤対１個以上のピロリシンまたは取り込まれたＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約１００００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約８０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約６０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約４０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約２０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約１０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約８００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約６００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約４００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約２００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約１００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約５０の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約２５の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約１０の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約０.０５〜約１の範囲である。
【０２７０】
さらに他の態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約１００００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約８０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約６０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約４０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約２０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約１０００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約８００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約６００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約４００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約２００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約１００の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約５０の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約２５の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約１.５〜約１０の範囲である。ある態様において、誘導体化剤対かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのモル比は約６〜約６００の範囲である。
【０２７１】
ここに提供される方法および組成物を使用するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの誘導体化に使用する緩衝液のｐＨは約ｐＨ２〜約ｐＨ１０の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ８の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ７.５の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ７の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ６.５の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ６の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ５.５の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ５の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ４〜約ｐＨ４.５の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ６〜約ｐＨ８の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ６〜約ｐＨ７.５の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ６〜約ｐＨ７の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ６〜約ｐＨ６.５の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ７〜約ｐＨ８の範囲である。ある態様において、ｐＨは約ｐＨ７〜約ｐＨ７.５の範囲である。
【０２７２】
ここに提供される誘導体化方法は、タンパク質に部位特異的に取り込まれたピロリシンまたはＰＣＬの誘導体化に有用である。ある態様において、かかる誘導体化方法は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの一部位に取り込まれたＰＣＬ基の誘導体化に使用する。他の態様において、かかる誘導体化方法は、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの複数部位に取り込まれたＰＣＬ基の誘導体化に使用する。ある態様において、ここに提供される方法および組成物を使用して誘導体化したタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、６個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個またはそれ以上のピロリシンまたはピロリシン類似体を含む。
【０２７３】
ここで提供される他の面において、取り込まれた１個以上のピロリシンまたはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、少なくとも１個の同時翻訳または翻訳後修飾により誘導体化される。ここで使用するかかる同時翻訳または翻訳後修飾の例は、グリコシル化、アセチル化、アシル化、メチル化、ニトロ化、硫酸化、脂質−修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質−架橋修飾などを含み、これらに限定されない。この面にまた包含されるのは、少なくとも１個のかかる同時翻訳または翻訳後修飾を含むかかるタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの製造、精製、特徴付けおよび使用のための方法である。
【０２７４】
部位特異的修飾を有するバイオセラピューティック
タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたＰＣＬおよびピロリシンに結合した高分子ポリマー
ある態様において、ここに記載した組成物、方法、技術および戦略を使用して、高分子ポリマーを、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基に付加する。広範な高分子ポリマーを、ここに記載するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基およびＰＣＬ基に結合できる。かかる修飾を使用して、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの生物学的特性を修飾する、および／またはかかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに新規生物学的特性を提供する。ある態様において、高分子ポリマーを、ここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基への直接結合を介して結合させる。他の態様において、高分子ポリマーを、ここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに、ピロリシン基またはＰＣＬ基に結合した二、三、四、および多官能性リンカーを介して結合させる。他の態様において、高分子ポリマーを、ここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに、ピロリシン基またはＰＣＬ基に結合した二官能性リンカーを介して結合させる。ある態様において、かかる二、三、四、および多官能性リンカーは、全末端がピロリシン基またはＰＣＬ基との反応に特異的である置換基である一官能性リンカーである。ある態様において、かかる二、三、四、および多官能性リンカーは、１個以上の末端がピロリシン基またはＰＣＬ基との反応に特異的な置換基であり、他の末端がピロリシン基またはＰＣＬ基と反応しない他の官能性置換基であるヘテロ二官能性リンカーである。ピロリシンまたはＰＣＬ特異的反応性基であるある種の置換基をここに提供し、かかる二、三、四、および多官能性リンカーに使用される他の官能性置換基および得られる結合は、表１に記載するものを含み、それらに限定されない。
【表１】
0005542832.tif 000048
【表２】
0005542832.tif 000049
【０２７５】
高分子ポリマーの生物学的活性分子、例えばここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへの共有結合的結合は、水溶性(例えば生理学的環境における)増加、バイオアベイラビリティ増加、血清半減期延長、治療半減期延長、免疫原性調節、生物学的活性の修飾、またはかかる生物学的活性分子の循環時間延長のための試みを示す。かかる高分子ポリマーの重要な特性は、生体適合性、毒性の欠如、および免疫原性の欠如であり、ピロリシン基またはＰＣＬ基を介して高分子ポリマーに結合したここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの治療的使用のために、かかる高分子ポリマーは薬学的に許容される。
【０２７６】
ここに記載されたタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基に結合したある種の高分子ポリマーは水溶性ポリマーである。ある態様において、かかる水溶性ポリマーは、ここに提供されたタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基を介して結合し、他の態様においてかかる水溶性ポリマーは、ここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基に結合した任意の官能基または置換基を介して結合する。ある態様において、ここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、水溶性ポリマーおよび水溶性ポリマーに結合した１個以上の天然に存在するアミノ酸に結合した１個以上のＰＣＬ基を有する。
【０２７７】
タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基に結合した高分子ポリマーの構造形は、直線状、フォーク形または分枝ポリマーを含み、これらに限定されない。ある態様において、かかる分枝またはフォーク形水溶性ポリマーの骨格は２〜約３００個の末端を有する。ある態様において、２個の末端を有する直線状ポリマーを含み、これに限定されないかかる多官能性ポリマー誘導体の各末端は、官能基を含む。ある態様においてかかる官能基は同一であり、他の態様においてかかる官能基は異なる。ここで使用するかかる末端官能基の例は、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート類、アミン類、ヒドラジド類、スクシンイミジルプロピオネート類およびスクシンイミジルブタノエート類、スクシンイミジルスクシネート類、スクシンイミジルエステル類、ベンゾトリアゾールカーボネート類、グリシジルエーテル類、オキシカルボニルイミダゾール類、ｐ−ニトロフェニルカーボネート類、アルデヒド類、マレイミド類、オルトピリジル−ジスルフィド類、アクリロール類およびビニルスルホン類を含み、これらに限定されない。他の態様において、官能基は表１に記載するものを含む。
【０２７８】
水溶性ポリマー(ここでは親水性ポリマーとも呼ぶ)の、ここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドのような生物学的活性分子への共有結合的結合は、水溶性(例えば生理学的環境)増加、バイオアベイラビリティ増加、血清半減期延長、治療半減期延長、免疫原性調節、生物学的活性の修飾、またはかかる生物学的活性分子の循環時間延長を表す。かかる水溶性ポリマーの重要な特性は、生体適合性、毒性の欠如、および免疫原性の欠如であり、ピロリシン基またはＰＣＬ基を介して水溶性ポリマーに結合したここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの治療的使用のために、かかる高分子ポリマーは薬学的に許容される。
【０２７９】
ピロリシン基またはＰＣＬ基を介してタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに結合した親水性ポリマーは、ポリアルキルエーテルおよびそのアルコキシキャップ類似体、ポリビニルピロリドン類、ポリビニルアルキルエーテル類、ポリオキサゾリン類、ポリアルキルオキサゾリン類、ポリヒドロキシアルキルオキサゾリン類、ポリアクリルアミド類、ポリアルキルアクリルアミド類、ポリヒドロキシアルキルアクリルアミド類、ポリヒドロキシアルキルアクリレート類、ポリシアル酸類およびその類似体、親水性ペプチド配列；多糖類およびそれらの誘導体、セルロースおよびその誘導体、キチンおよびその誘導体、ヒアルロン酸およびその誘導体、デンプン類、アルギネート類、硫酸コンドロイチン、アルブミン、プルラン、カルボキシメチルプルラン、ポリアミノ酸類およびそれらの誘導体、マレイン無水物コポリマー、ポリビニルアルコールおよびそれらのコポリマー、ポリビニルアルコールおよびそれらのターポリマー、およびそれらの組合せを含み、これらに限定されない。
【０２８０】
かかるポリアルキルエーテル類およびそのアルコキシキャップ類似体は、ポリオキシエチレングリコール(ポリ(エチレングリコール)またはＰＥＧとしても既知)、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、およびそのメトキシまたはエトキシキャップ類似体を含み、これらに限定されない。かかるポリヒドロキシアルキルアクリルアミド類は、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよびそれらの誘導体を含み、これらに限定されない。かかる多糖類およびそれらの誘導体は、デキストランおよびデキストラン誘導体(例えば、ほんの一例として、カルボキシメチルデキストラン、硫酸デキストランおよびアミノデキストラン)を含み、これらに限定されない。かかるセルロースおよびそれらの誘導体は、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシアルキルセルロース類を含み、これらに限定されない。かかるキチンおよびそれらの誘導体は、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチンおよびカルボキシメチルキトサンを含み、これらに限定されない。かかるポリアミノ酸類およびそれらの誘導体は、ポリグルタミン酸類、ポリリシン類、ポリアスパラギン酸類およびポリアスパルタミド類を含み、これらに限定されない。かかるマレイン無水物コポリマーは、スチレンマレイン無水物コポリマーおよびジビニルエチルエーテルマレイン無水物コポリマーを含み、これらに限定されない。
【０２８１】
ある態様において、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基を介してここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに直接的または間接的に結合した水溶性ポリマーはポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)である。ポリ(エチレングリコール)は生体適合性であると考えられ、ここでＰＥＧは生存組織または生物と害にならずに共存できる。ＰＥＧはまた実質的に非免疫原性であり、それ故に体内で免疫応答を生ずる傾向にない。ＰＥＧは、医薬、人工インプラントおよび生体適合性、毒性の欠如、および免疫原性の欠如が重要である多の適用に広く使用されている親水性ポリマーである。ＰＥＧコンジュゲートは、実質的な免疫応答、凝血または他の望ましくない作用を生ずる傾向にない。それ故に、体内である望ましい機能を有する分子、例えば生物学的活性剤に結合したとき、ＰＥＧは薬剤をマスクする傾向にあり、生物が該薬剤の存在に耐容性であり得るように何らかの免疫応答を減らすか無くすことができる。
【０２８２】
ある態様において、ここに提供するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドにかかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基を介して直接的または間接的に結合したポリ(エチレングリコール)は、直鎖ポリマーであり、他の態様においてかかるＰＥＧポリマーは分枝ポリマーである。かかる直鎖および分枝ＰＥＧポリマーの分子量または分子量分布は約１００Da〜約１００,０００Daまたはそれより大である。ある態様において、かかるＰＥＧポリマーの分子量または分子量分布は約１００Da〜５０,０００Daである。ある態様において、かかるＰＥＧポリマーの分子量または分子量分布は約１００Da〜４０,０００Daである。ある態様において、かかるＰＥＧポリマーの分子量または分子量分布は約１,０００Da〜４０,０００Daである。ある態様において、かかるＰＥＧポリマーの分子量または分子量分布は約５,０００Da〜４０,０００Daである。ある態様において、かかるＰＥＧポリマーの分子量または分子量分布は約１０,０００Da〜４０,０００Daである。ある態様において、かかるＰＥＧポリマーの分子量は１００,０００Da、９５,０００Da、９０,０００Da、８５,０００Da、８０,０００Da、７５,０００Da、７０,０００Da、６５,０００Da、６０,０００Da、５５,０００Da、５０,０００Da、４５,０００Da、４０,０００Da、３５,０００Da、３０,０００Da、２５,０００Da、２０,０００Da、１５,０００Da、１０,０００Da、９,０００Da、８,０００Da、７,０００Da、６,０００Da、５,０００Da、４,０００Da、３,０００Da、２,０００Da、１,０００Da、９００Da、８００Da、７００Da、６００Da、５００Da、４００Da、３００Da、２００Da、または１００Daである。
【０２８３】
タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基に結合したＰＥＧポリマーの構造形態は、直線状、フォーク形または分枝を含み、これらに限定されない。ある態様において、かかる分枝またはフォーク形ＰＥＧポリマーの骨格は２〜約３００個の末端を有する。ある態様において、２個の末端を有する直線状ポリマーを含み、これに限定されないかかる多官能性ポリマー誘導体の各末端は官能基を含む。ある態様においてかかる官能基は同一であり、他の態様において少なくとも１個のかかる官能基は異なる。さらに別の態様においてかかる官能基は異なる。
【０２８４】
ある態様においてタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへの結合前に、ＰＥＧポリマーの１個以上の末端は官能基を含む。ある態様において、ＰＥＧは官能基を有を有する一末端を有する直線状ポリマーであり、他の態様においてＰＥＧは、官能基を有し、それにより二官能性ＰＥＧポリマーを形成する各末端を有する直線状ポリマーである。他の態様において、ＰＥＧは、官能基を有する一末端を有するフォーク形ポリマーであり、他の態様においてＰＥＧは、官能基を有する２個以上の末端を有するフォーク形ポリマーである。さらに他の態様において、ＰＥＧは、官能基を有する各末端を有し、それ故に多官能性ＰＥＧポリマーを形成する、フォーク形ポリマーである。他の態様において、ＰＥＧは、官能基を有する１個の末端を有する分枝ポリマーであり、他の態様においてＰＥＧは、官能基を有する２個以上の末端を有する分枝ポリマーである。さらに他の態様において、ＰＥＧは、官能基を有する各末端を有し、それ故に多官能性ＰＥＧポリマーを形成する分枝ポリマーである。かかる上記ＰＥＧポリマーのある態様において、官能基は同一であり、かかる官能基の他の態様において少なくとも１個の官能基が異なる。かかる上記ＰＥＧポリマーのさらに別の態様において、官能基は異なる。しかしながら、ＰＥＧポリマーの少なくとも１個の末端は、少なくとも１個のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシン基またはＰＣＬ基との反応に利用可能である。
【０２８５】
ここで使用する末端官能基の例は、Ｎ−スクシンイミジルカーボネート類、アミン類、ヒドラジド類、スクシンイミジルプロピオネート類、スクシンイミジルブタノエート類、スクシンイミジルスクシネート類、スクシンイミジルエステル類、ベンゾトリアゾールカーボネート類、グリシジルエーテル類、オキシカルボニルイミダゾール類、ｐ−ニトロフェニルカーボネート類、アルデヒド類、マレイミド類、オルトピリジル−ジスルフィド類、アクリロール類、ビニルスルホン類、活性化カーボネート類(ｐ−ニトロフェニルエステルを含み、これに限定されない)、活性化エステル類(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルを含み、これに限定されない)、オキシム類、カルボニル類、ジカルボニル類、ヒドロキシルアミン類、ヒドロキシル、メトキシ、ベンズアルデヒド類、アセトフェノン類、２−アミノ−ベンズアルデヒド類、２−アミノ−アセトフェノン類および２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン類を含み、これらに限定されない。
【０２８６】
図３１は、タンパク質にかかるタンパク質に取り込まれた少なくとも１個のＰＣＬ基を介して結合し、官能化ＰＥＧポリマー、２−アミノ−アセトフェノン類−ＰＥＧ８(２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８；ＴＵ３２０５−０４４)の一態様を説明する。示す通り、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８の２−アミノ−アセトフェノン部分は、ＰＥＧ８とタンパク質の間のスペーサーとしてキナゾリン型部分を形成する。このキナゾリン型部分をさらに反応させて、縮合環構造を形成できる。２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８の結合の場合、かかる誘導体化は、タンパク質質量に５５６Da付加する。ここに提供する方法に使用する他の官能化ＰＥＧは実施例２０に記載のものを含み、それらに限定されない。
【０２８７】
図３２は、ｐＨ７.５(図３２Ａ)およびｐＨ５.０(図３２Ｂ)で２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８で誘導体化する前および後の１２２位に取り込まれたＰＣＬを有するｈＲＢＰ４(ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ)のマススペクトルである。これらの結合反応をｐＨ７.５およびｐＨ５で行い、ここで８９〜１００％の変換が起こり、未反応タンパク質に対して５５６Daの予期される重量増加をもたらした(図３２Ｃ)。野生型ｈＲＢＰ４は、４５０または２３００倍過剰の２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８と反応しない(図３２Ｄ−Ｆ)。この特性は、ＰＣＬが存在しないとき結合が観察されないため、ＰＣＬと２ＡＡＰ−ＰＥＧ８の結合反応の特異性を説明する。
【０２８８】
標識方法の有用性をさらに説明するために、大腸菌内で生成した２４５４位にＰＣＬが取り込まれたヒト脂肪酸シンセターゼのチオエステラーゼドメイン(ＦＡＳ−ＴＥ)(ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬ)を、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８で誘導体化した(図３３、実施例１４参照)。図３３Ａは、未反応タンパク質(質量３３２０２Da)の質量スペクトルを示し、図３３Ｂは、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８と終了するまで反応させたＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬの質量スペクトルを示し(ＴＵ３２０５−０４４)、予測された質量３３７５６Daとなる。さらなる説明は図３３Ｃおよび図３３Ｄにあり、これは、室温(図３３Ｃ)および４℃(図３３Ｄ)で２.４kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧ(ＴＵ３２０５−０４８)で誘導体化し、大腸菌中で生成した２４５４位にＰＣＬが取り込まれたＦＡＳ−ＴＥ(ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬ)のマススペクトルを示す。使用した条件下で、約２５％しか変換が起こらず、３５５８５Daの予測される質量を有するタンパク質を得た。
【０２８９】
加えて、図３４は、示すモル比での２.４kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧおよび２３kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧでのＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬのペグ化を示す。０.５kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧ(２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８)ペグ化生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して解像可能ではなかったが、しかしながら質量分析を使用して確認された。
【０２９０】
ここで提供される方法を使用して、ＰＣＬが線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ−２１)の２０個所へ挿入され、その後の対応するＰＣＬ基のペグ化のために使用されている(実施例１５参照)。図３５は、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８でのＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬの誘導体化前および後に得られたマススペクトルを示す。図３５Ａは未反応ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬの質量スペクトル(２１２３５.６Da)であり、図３５Ｂは２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８と反応させたＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬの質量スペクトルである。ペグ化反応は終了まで進み、２１７９２.４Daのタンパク質をもたらす。５５６.８Da増加は、この誘導体化について予測される５５６Da増加に一致する。図３６は、ＦＧＦ２１  ＰＣＬ変異体の７個の２３kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧでの誘導体化後に得たＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。図３６Ａは、２３kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧ(ｐＨ７.４、４℃、６０時間)と反応させたＦＧＦ２１  ＰＣＬ変異体(０.１〜０.４mM)の反応混合物のＳＤＳゲルであり、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１、完全長(ＦＬ)ＦＧＦ２１−ＰＣＬおよび切断型(ＴＲ)ＦＧＦ２１−ＰＣＬを示す。図３６Ｂは、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１、完全長(ＦＬ)および切断型(ＴＲ)ＦＧＦ２１の部分精製後の８個のＦＧＦ２１  ＰＣＬ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。
【０２９１】
ここで提供される方法を使用して、ＰＣＬがマウスエリスロポエチン(ＥＰＯ)の１１個所に挿入され、その後の３個のＥＰＯＰＣＬ変異体の対応するＰＣＬ基のペグ化のために使用されている(実施例６参照)。図３７は、マウスＥＰＯＰＣＬ変異体のペグ化後に得たＳＤＳゲルである。異なる３個所でＨＥＫ２９３Ｆ細胞に取り込まれたＰＣＬを有するマウスＥＰＯを２−ＡＡＰ−ｍＰＥＧ２３ｋ(ＴＵ３２０５−０５２)と反応させた。ペグ化ＥＰＯおよび非ペグ化ＥＰＯは矢印で示す。
【０２９２】
ある態様において、ＰＣＬ基を介してタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに結合した二官能性または多官能性ＰＥＧポリマーを、未反応末端上の残った官能基を使用して、さらに誘導体化するか、または置換する。ある態様において、ＰＣＬ基とベンズアルデヒド、ベンゾフェノンまたはアセトフェノン部分の反応を介してタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに結合した二官能性または多官能性ＰＥＧポリマーを、未反応末端上の残った官能基を使用して、さらに誘導体化するか、または置換する。
【０２９３】
ここに記載する方法および組成物は、ＰＥＧ誘導体でのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの選択的修飾のための極めて効率的な方法を低級し、これは、セレクター・コドンに応答したタンパク質へのアミノ酸ＰＣＬまたはピロリシンの選択的取り込みおよび続く好都合に官能化されたＰＥＧ誘導体での対応するアミノ酸基の修飾を含む。それ故に、ここに提供されるのは取り込まれたＰＣＬ基またはピロリシン基を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドであり、またここに提供されるのは、かかるＰＣＬ基またはピロリシン基を介して水溶性ポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)類(ＰＥＧｓ)に結合したかかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドである。
【０２９４】
ここに記載するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドのペグ化の程度(すなわちタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに結合したＰＥＧポリマーの数)を、改変された薬理学的、薬物動態学的または薬力学的特徴を提供するために調節可能である。ある態様において、かかる改変はかかる特徴の増加であり、他の態様において、かかる改変はかかる特徴の厳守である。ある態様において、かかる特徴はインビボ半減期である。ある態様において、ここに提供される方法および組成物を使用してペグ化したタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの半減期は、非修飾タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドより少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍または少なくとも約２００倍延長している。
【０２９５】
ある態様において、ここに提供される方法および組成物を使用してペグ化したタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、疎水性クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー；アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、Ｑ第四級アンモニウム樹脂、ＤＥＡＥセファロース、シリカクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過(SEPHADEX G-75, Sephacryl S-100, SUPERDEX 75, 100および200の使用を含み、これらに限定されない)、疎水性相互作用クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外濾過／ダイアフィルトレーション、エタノール沈殿、等電点電気泳動、置換クロマトグラフィー、電気泳動的方法(分取等電点電気泳動を含み、これに限定されない)、差示的溶解度(硫酸アンモニウム沈殿を含み、これに限定されない)、および抽出を含み、これらに限定されない方法を使用して、精製する。
【０２９６】
他の面において、ここで提供される方法で使用するＰＥＧポリマーは、骨格に弱いまたは分解可能な架橋を有する。ほんの一例として、かかるＰＥＧポリマーは、加水分解に付され、この加水分解がＰＥＧが結合していたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの放出のための架橋の開裂をもたらす、ポリマー骨格中のエステル架橋である。
【０２９７】
他の面において、ここに記載する方法および組成物を使用して、ポリマー−タンパク質コンジュゲートの実質的に均一な調製物を製造する。ここで使用する“実質的に均一”は、ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子が全タンパク質の半分より大きいと観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質コンジュゲートは生物学的活性を有し、ここに提供される本発明の“実質的に均一”のペグ化ポリペプチド調製物は、ほんの一例として、ロット毎の薬物動態学が予測可能な臨床適用の容易さのような、均一製剤の利点を示すのに充分に均一であるものである。
【０２９８】
他の面において、ここに記載する方法および組成物を使用して、ポリマー：タンパク質コンジュゲートの実質的に均一な調製物を製造する。ここで使用する“実質的に均一”は、ポリマー：タンパク質コンジュゲート分子が全タンパク質の半分より大きいと観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質コンジュゲートは生物学的活性を有し、ここに提供される本発明の“実質的に均一”のペグ化ポリペプチド調製物は、ほんの一例として、ロット毎の薬物動態学が予測可能な臨床適用の容易さのような、均一製剤の利点を示すのに充分に均一であるものである。
【０２９９】
他の面において、ここに記載する方法および組成物を使用して、ポリマー−タンパク質コンジュゲート分子の混合物を製造し、ここで提供される利点は混合物に包含させるモノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲートが選択可能であることである。それ故に、ある態様において種々のタンパク質と種々の数の結合したポリマー部分(すなわち、ビ−、トリ−、テトラ−など)の混合物を製造し、これらのコンジュゲートを場合によりここに記載する方法で正常したモノ−ポリマー−タンパク質コンジュゲートと組合せ、それにより、モノ−ポリマー：タンパク質コンジュゲートの予定された比の混合物を提供する。
【０３００】
ポリ(エチレングリコール)分子対タンパク質分子の比は、反応混合物中のその濃度と同様変化する。ある態様において、最適比(最小限過剰の未反応タンパク質またはポリマーが存在する反応効率の点で)を、選択したポリ(エチレングリコール)の分子量および利用可能な多くの反応性基で決定する。ポリマーの分子量が大きい程、タンパク質に結合するポリマー分子の数が少ない。同様に、他の態様においてＰＥＧポリマー上の分枝を、これらのパラメータを最適化するとき考慮する。この場合、分子量が高い程(または分枝が多いほど)、ポリマー：タンパク質比が高い。
【０３０１】
タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬへのアミノ糖類の直接結合
ここで提供される他の面において、取り込まれた１個以上のピロリシン基および／またはＰＣＬ基を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、アミノ糖類で誘導体化される。図３８は、取り込まれたＰＣＬを有するＤ−マンノサミンがタンパク質(Ｒ１と記載)に結合し、一般的反応スキームである。かかる態様において、Ｄ−マンノサミンのアミノアルデヒド部分がＰＣＬ基と結合し、それによりタンパク質が１６１Da増加する。かかる対照に使用する他のアミノ糖類は、マンノサミン、ガラクトサミン、およびグルコサミンを含み、これらに限定されない。図３９は、マンノサミンと反応後の１２２位に取り込まれたＰＣＬを有するｈＲＢＰ４(ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ)の質量スペクトルを示し、図４０は、２２２２位にＰＣＬが取り込まれたヒト脂肪酸シンセターゼ(ＦＡＳ−ＴＥ)(ＦＡＳ−ＴＥ  Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬ／Ｌｅｕ２２２３Ｉｌｅ)のマンノサミンとの反応前(図４０Ａ)および後(図４０Ｂ)の質量スペクトルを示す。
【０３０２】
タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシンおよびＰＣＬとの結合を介するグリコシル化
ここに記載する方法および組成物を使用して、糖類基を担持する１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬ基を有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを得る。糖類基は天然(Ｎ−アセチルグルコサミンおよびＤ−マンノサミンを含み、これらに限定されない)または非天然(３−フルオロガラクトースを含み、これに限定されない)でもよい。ある態様において、糖類は、ピロリシンおよび／またはＰＣＬ基に、キナゾリン型部分の形成によるものを含み、これに限定されない非天然架橋により結合する。ある態様において、糖類は、ピロリシンおよび／またはＰＣＬ基に、還元剤でさらに還元されているキナゾリン型部分の形成によるものを含み、これに限定されない非天然架橋により結合する。ある態様において、糖類は、ピロリシンおよび／またはＰＣＬ基に、先に記載した通りさらに反応して縮合環系を形成しているキナゾリン型部分の形成によるものを含み、それに限定されない非天然架橋により結合する(図２２、２３および３０参照)。ある態様において、グリコシル部分を含み、これに限定されない糖または糖類の付加は、取り込まれた１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドへの添加は、インビボで起こる。他の態様において、取り込まれた１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドに添加されたグリコシル部分を含み、これに限定されない糖または糖類の付加は、インビトロで起こる。他の態様において、ピロリシンおよび／またはＰＣＬ基に結合したら、糖類をグリコシルトランスフェラーゼ類および／または他の酵素での処理によりさらに修飾して、取り込まれた１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに結合したオリゴ糖類を製造する。
【０３０３】
図４１は、同時翻訳または翻訳後修飾が、オリゴ糖類のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドへのキナゾリン型部分の形成を介する結合を含む態様を説明する。ある態様において、糖類は、さらに還元剤で還元されているキナゾリン型部分の形成によるものを含み、これに限定されない非天然架橋によりピロリシンおよび／またはＰＣＬ基に結合している。ある態様において、糖類は、先に記載した通りさらに反応して、それにより縮合環系を形成するキナゾリン型部分の形成によるものを含み、これに限定されない非天然架橋によりピロリシンおよび／またはＰＣＬ基に結合する(図２２、２３および３０)。かかる態様において、ほんの一例として、オリゴ糖類は、２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)に結合した(ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ)２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃコアが、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬ基とコンジュゲートする。他の態様において、オリゴ糖類は、２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)に結合した(ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ)２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃコアを含み、タンパク質コンジュゲートは、２−ＡＢＡとタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬ基の反応により形成される。さらに別の態様において、オリゴ糖類は２−アミノ−ベンゾフェノン(２−ＡＢＰ)に結合した(ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ)２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃコアを含み、タンパク質コンジュゲートは、２−ＡＢＰとタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬ基の反応により形成される。かかる態様で使用する他のオリゴ糖類は、２−ＡＢＡ部分、２−ＡＡＰ部分または２−ＡＮＢＰ部分を含む。
【０３０４】
ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ多量体、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ多量体、非対称ホモ二量体、非対称ホモ三量体および非対称ホモ多量体におけるタンパク質の志向性共有結合的結合
ここで提供される方法の他の面において、１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへの部位特異的取り込みを使用して、ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ多量体、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ多量体、非対称ホモ二量体、非対称ホモ三量体および非対称ホモ多量体を含み、これらに限定されないタンパク質−タンパク質コンジュゲートを形成する。かかるタンパク質−タンパク質コンジュゲート形成は、取り込まれたピロリシン基およびＰＣＬ基を有する複数タンパク質間の部位特異的架橋により達成される。図４２は、取り込まれたＰＣＬ基を有するタンパク質が架橋している、かかるタンパク質−タンパク質コンジュゲート形成のある態様(ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ホモ三量体)を説明する。図４２において、かかる架橋により形成されたタンパク質コンジュゲート架橋は、タンパク質を互いに結合するキナゾリン型部分であるが、しかしながら他の態様において架橋はキナゾリン型部分の還元形態である(図２２、２３および３０)。他の態様において、架橋は縮合環部分である(図２２、２３および３０)。
【０３０５】
ここで使用するかかるタンパク質−タンパク質コンジュゲートの例は、タンパク質−タンパク質コンジュゲート、サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、癌遺伝子生成物、ペプチドホルモン、シグナルトランスダクション分子、ステロイドホルモン受容体、転写アクティベーター、転写サプレッサー、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、レプチン、インスリン、ヒト成長ホルモン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロフィン(pleiotropin)、ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＫＧＦ(ケラチン生成細胞増殖因子)、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ；ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、および／またはコルチコステロンを含み、これらに限定されない。他の一連の態様において、タンパク質は、治療用または他のタンパク質、例えば：アルファ−１抗トリプシン、アンジオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、上皮性好中球活性化ペプチド、剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子Ｘ、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、インターフェロン、ＩＦＮ−α.、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチン生成細胞増殖因子(ＫＧＦ)、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球阻害因子(ＮＩＦ)、オンコスタチンＭ、骨原性タンパク質、癌遺伝子生成物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロフィン(pleiotropin)、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、発熱性外毒素Ａ、Ｂ、またはＣ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ  １、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキサイドディスムターゼ、毒素ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍増殖因子(ＴＧＦ)、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ；ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、および／またはコルチコステロンに相同である。
【０３０６】
ヘテロ二量体、ヘテロ三量体、ヘテロ多量体、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ多量体、非対称ホモ二量体、非対称ホモ三量体および非対称ホモ多量体を含み、これらに限定されないタンパク質−タンパク質コンジュゲートの形成に使用されるクロスリンカーは、各末端のベンズアルデヒド、アセトフェノンおよび／またはベンゾフェノン部分を含み、これらに限定されない。かかる部分は、タンパク質に取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬ基とここで提供される方法で反応し、そしてかかるタンパク質はここに提供するものを含む。ホモ二量体の形成に使用する二官能性クロスリンカーの例は図４３Ａに示すが、これに限定されない。この二官能性リンカーを使用して、線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ−２１)と、８４位に取り込まれたＰＣＬ基の反応に使用した(ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬ)。図４３Ｂは、反応混合物の質量スペクトルであり、ここで、予測質量４３０３７.２Daでの共有結合的ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ４８ＰＣＬ二量体のピークが優占種である。未反応ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬ  を２１２３５.２Daで検出し、結合したクロスリンカーの一端で修飾したいくつかの単量体ＦＧＦ２１を２１８２０.０Daで検出する。反応条件の修飾により、ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬの反応の終了が可能となる。図４３において、かかる架橋により形成されたタンパク質コンジュゲート架橋はキナゾリン型部分であるが、しかしながら他の態様において架橋はキナゾリン型部分の還元形である(図２２、２３および３０)。他の態様において、架橋は縮合環部分である(図２２、２３および３０)。
【０３０７】
図４４Ａは、反応混合物の質量スペクトルであり、ここで、予測質量４３０３４Daでの共有結合的ＦＧＦ２１二量体のピークが優占種である。未反応ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬは２１２３４Daで検出されないが、結合したクロスリンカーの一端で修飾した単量体ＦＧＦ２１が２１８１８Daに検出される。図４３ＢはｐＨ５.０およびｐＨ７.５での反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、ｐＨ５.０での良好な変換を示す。ＰＣＬ特異的架橋は、ＦＧＦ２１の二量体の形成に使用されている。しかしながら、この方法論は上記タンパク質のいずれにも適用可能であり、二量体、三量体、および多量体の形成に使用できる。かかる架橋を使用して、生物学的活性タンパク質の活性を増強する。加えて、この豊富を使用して、構造試験のための複合体安定化および／または受容体デコイ安定化に使用する。図４５は、三量体の形成に使用するクロスリンカーの態様を示す。
【０３０８】
部位特異的標識
ここで提供される方法を使用する他の面において、１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへの部位特異的取り込みを使用して、かかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの部位特異的標識を可能にする。かかる標識は、ピロリシンおよび／またはＰＣＬ基とピロリシンおよび／またはＰＣＬ基と選択的に反応する官能基で誘導体化した標識の反応に由来する。使用する標識は、色素、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、化学線励起可能部分、リガンド、ビオチン、ビオチン類似体、酸化還元活性剤、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基、発色団基；エネルギー移動剤、量子ドット(群)、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、およびそれらの任意の組合せを含み、これらに限定されない。標識はまたここで定義する任意のＸ１である。
【０３０９】
かかる１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬを含むタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチド基のかかる部位特異的標識の一態様において、ピロリシンおよび／またはＰＣＬ基と、ベンズアルデヒド、アセトフェノンまたはベンゾフェノン部分で誘導体化した標識の反応である。使用する標識は、色素、抗体または抗体フラグメント、金属キレート剤、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、化学線励起可能部分、リガンド、ビオチン、ビオチン類似体、酸化還元活性剤、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基、発色団基；エネルギー移動剤、量子ドット(群)、蛍光色素、ＦＲＥＴ試薬、およびそれらの任意の組合せを含み、これらに限定されない。標識はまたここで定義する任意のＸ１である。
【０３１０】
ここに提供されるかかる部位特異的標識のさらなる面において、ピロリシンおよび／またはＰＣＬ基とピロリシンおよび／またはＰＣＬ基と選択的に反応する部分で誘導体化した標識の反応は、検出感度の増加を可能にする。具体的に、かかる反応は、反応前に存在した反応体と異なるスペクトル特性を有する検出可能部分を形成し、それにより、検出可能部分シグナルに関連する背景シグナルの最小化よりシグナル対ノイズ比を増強する。ここで提供されるかかる部位特異的標識のある態様において、ピロリシン基またはＰＣＬ基と、ベンズアルデヒド、アセトフェノンまたはベンゾフェノン部分で誘導体化した標識との反応はキナゾリン型部分(図２２、２３および３０)を形成し、それは、ベンズアルデヒド、アセトフェノンまたはベンゾフェノン部分と異なるスペクトル特性を有する。ここで提供されるかかる部位特異的標識のある態様において、ピロリシン基またはＰＣＬと、ベンズアルデヒド、アセトフェノンまたはベンゾフェノン部分で誘導体化した標識の反応は還元キナゾリン型部分(図２２、２３および３０)を形成し、それは、ベンズアルデヒド、アセトフェノンまたはベンゾフェノン部分と異なるスペクトル特性を有する。ここで提供するかかる部位特異的標識のある態様において、ピロリシン基またはＰＣＬ基と、ベンズアルデヒド、アセトフェノンまたはベンゾフェノン部分で誘導体化した標識の反応は縮合環部分(図２２、２３および３０)を形成し、それは、ベンズアルデヒド、アセトフェノンまたはベンゾフェノン部分と異なるスペクトル特性を有する。
【０３１１】
ある態様において、かかる標識タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを診断および造影に使用し、他の態様においてかかる標識タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドをハイスループットスクリーニングに使用する。他の態様において、かかる標識タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを輸送特性の評価に使用し、他の態様においてかかる標識タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを局在化試験に使用する。
【０３１２】
図４６は、かかる部位特異的標識のある態様を説明する。図４６Ａは、蛍光部分での標識を説明する。図４６Ｂは、ＰＣＬ基と、反応により蛍光となる非蛍光部分との反応を説明する。図４６Ｃは、タンパク質のビオチニル化を説明する。図４６Ｄは、放射活性部分での標識を説明する。図４６Ｅは、１−(２−アミノ−５−ヨードフェニル)エタノンでの標識を説明し、図４６Ｆは、１−(２−アミノ−５−ブロモフェニル)エタノンでの標識を説明する；両方ともタンパク質のＸ線結晶構造の決定の工程における位相情報を得るために使用できる。１−(２−アミノ−５−ヨードフェニル)エタノンはまた、放射活性部分でタンパク質を標識するためにも使用できる。図４６において、かかる標識により形成されたタンパク質コンジュゲート架橋はキナゾリン型部分であるが、しかしながら他の態様において架橋はキナゾリン型部分の還元形である(図２２、２３および３０)。他の態様において、架橋は縮合環部分である(図２２、２３および３０)。
【０３１３】
１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬ基を含むかかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドのかかる部位特異的標識の態様において、ピロリシン基またはＰＣＬ基自体、標識前駆体を使用して標識できる。図４６Ｇおよび図４６Ｈは、ほんの一例として、異なって標識された前駆体から放射活性または安定同位体での標識を説明する。
【０３１４】
本発明の他の面は、何らかの入手可能なタンパク質と相同であるが、１個以上のピロリシン基またはＰＣＬ基を含むタンパク質の生成を提供する。例えば、ある態様において、１個以上のピロリシンまたはＰＣＬを含み、１個以上の治療用タンパク質と相同である治療用タンパク質を製造する。例えば、一面において、タンパク質は：サイトカイン、増殖因子、増殖因子受容体、インターフェロン、インターロイキン、炎症性分子、癌遺伝子生成物、ペプチドホルモン、シグナルトランスダクション分子、ステロイドホルモン受容体、転写アクティベーター、転写サプレッサー、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、レプチン、インスリン、ヒト成長ホルモン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、プレイオトロフィン(pleiotropin)、ＳＣＦ、ｃ−ｋｉｔリガンド、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、ＦＧＦ(線維芽細胞増殖因子)、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ(上皮細胞増殖因子)、ＫＧＦ(ケラチン生成細胞増殖因子)、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルリン／ＣＤ４４、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ；ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、および／またはコルチコステロンのような治療用または他のタンパク質と相同である。他の一連の態様において、タンパク質は：アルファ−１抗トリプシン、アンジオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、上皮性好中球活性化ペプチド、インターフェロンアルファ(ＩＮＦ−α)、またはインターフェロンベータ(ＩＮＦ−β)、剥脱毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子Ｘ、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、���殖因子、増殖因子受容体、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インシュリン様増殖因子(ＩＧＦ)、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−II、インターフェロン、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチン生成細胞増殖因子(ＫＧＦ)、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球阻害因子(ＮＩＦ)、オンコスタチンＭ、骨原性タンパク質、癌遺伝子生成物、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン、プレイオトロフィン(pleiotropin)、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、発熱性外毒素Ａ、Ｂ、またはＣ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ  １、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキサイドディスムターゼ、毒素ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍増殖因子(ＴＧＦ)、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体(ＴＮＦＲ)、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、ウロキナーゼ、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｔ；ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、および／またはコルチコステロンのような治療用または他のタンパク質と相同である。
【０３１５】
一面において、ここに記載する組成物は、１個以上のピロリシン基またはＰＣＬ基を含む、上記のタンパク質のいずれかを含むタンパク質と、薬学的に許容される賦形剤を含む。
【０３１６】
ある態様において、タンパク質は治療用タンパク質であり、他の態様において治療用タンパク質はエリスロポエチン(ＥＰＯ)、線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)、インターフェロンアルファ(ＩＮＦ−α)、またはインターフェロンベータ(ＩＮＦ−β)である。ある態様において、治療用タンパク質は、抗体またはＦａｂ'ｓを含み、これに限定されない抗体フラグメントである。ある態様において、治療用タンパク質は融合タンパク質として製造され、ここで、該融合相手は修飾されている。ある態様において、治療用タンパク質はＦｃドメインと融合している。
【０３１７】
タンパク質またはポリペプチドへの相同性は、例えば、デフォルトパラメーターに設定し、例えば、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰを使用して、配列アラインメントを行うことにより推定できる。例えば、一態様において、タンパク質は、既知治療用タンパク質(例えば、Genebankまたは他の入手可能なデータベースに存在するタンパク質)と少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％同一である。
【０３１８】
部位特異的標識を種名するために、ＰＣＬを、ここで提供される方法を使用してｍＥＧＦに取り込み(実施例１２参照)、ＰＣＬ部分を、ＡＢＡ部分で官能化したポリエーテルによりビオチンと結合させた(Ｘ３６２６−１４０、実施例４０参照)。図４７Ａは、ビオチンとコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す(実施例２４参照)。図４７Ｂは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)接合ヤギ抗ビオチン抗体を使用したｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−ビオチンコンジュゲートのウェスタンブロットを示す。非結合ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬおよびフルオレセイン−コンジュゲートｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬは、ネガティブコントロールとして働く。
【０３１９】
さらに部位特異的標識を種汚名するために、ＰＣＬを、ここで提供される方法を使用してｍＥＧＦに取り込み(実施例１２参照)、ＰＣＬ部分を、ＡＢＡ部分で官能化したポリエーテルを介して結合とコンジュゲートさせた(Ｘ３７５７−４８、実施例４１参照)。図４７Ｃは、フルオレセインとコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す(実施例２５参照)。加えて、ＰＣＬを、ここで提供される方法を使用してｍＥＧＦに取り込み(実施例１２参照)、ＰＣＬ部分を、ＡＢＡ部分で官能化した二糖類と結合させた(３７９３−０５０、実施例４２参照)。図４７Ｄは、二糖類とコンジュゲートしたｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す(実施例２６参照)。二糖類の結合に使用する結合化学を他の糖類および複合オリゴおよび多糖類の結合に容易に的湯できると解釈される。
【０３２０】
免疫調節剤のタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシンおよび／またはピロリシン類似体への結合およびかかる結合を介した免疫原性増強
ここで提供される他の面において、取り込まれた１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを、１個以上の免疫調節剤で誘導体化する。ここで提供される方法を使用して、免疫刺激部分をピロリシンおよび／またはＰＣＬ基を介してタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに油負いに結合できる。かかる免疫刺激部分は、１個以上のニトロ基、脂質類、リン脂質類、ＬＰＳ様分子、アジュバント、アジュバント様分子、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、ハロゲン類、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含み、これらに限定されない。ある態様において、ピロリシンおよび／またはＰＣＬに結合した免疫調節剤を使用して、タンパク質に取り込まれたｐ−ニトロ−フェニルアラニンと類似の方法で自己抗原に対する免疫応答を刺激する(Gruenewald J, Tsao ML, Perera R, Dong L, Niessen F, Wen BG, Kubitz DM, Smider VV, Ruf W, Nasoff M, Lerner RA, Schultz PG, Immunochemical termination of self-tolerance, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Aug 12；105(32)：11276-80)。ある態様において、ピロリシンおよび／またはＰＣＬに結合した免疫調節剤を伴う自己抗原を癌ワクチンとして使用する。他の態様において、ピロリシンおよび／またはＰＣＬに結合した免疫調節剤を有する抗原を感染症用ワクチンとして使用する。他の態様において、ピロリシンおよび／またはＰＣＬに結合した免疫調節剤を有する抗原を、アルツハイマー病を含み、これに限定されないアミロイド形成が関与する疾患用ワクチンとして使用する。
【０３２１】
一つの態様において免疫刺激部分のライブラリーを、２−アミノベンズアルデヒド化合物のライブラリーを作り、このライブラリーと目的の抗原に取り込まれたピロリシンまたはＰＣＬを結合させ、該修飾および非修飾抗原に対する続いて高力価抗体を生成する結合生成物をスクリーニングすることにより製造する。かかる態様において、２−アミノベンズアルデヒド部分を、１個以上のニトロ基、脂質類、リン脂質類、ＬＰＳ様分子、アジュバント、アジュバント様分子、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、ハロゲン類、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含み、これらに限定されない種々の置換基で置換する。
【０３２２】
他の態様において免疫刺激部分のライブラリーを、２−アミノ−アセトフェノン化合物のライブラリーを作り、このライブラリーと目的の抗原に取り込まれたピロリシンまたはＰＣＬを結合させ、該修飾および非修飾抗原に対する続いて高力価抗体を生成する結合生成物をスクリーニングすることにより製造する。かかる態様において、２−アミノ−アセトフェノン部分を、１個以上のニトロ基、脂質類、リン脂質類、ＬＰＳ様分子、アジュバント、アジュバント様分子、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、ハロゲン類、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含み、これらに限定されない種々の置換基で置換する。
【０３２３】
他の態様において免疫刺激部分のライブラリーを、２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン化合物のライブラリーを作り、このライブラリーと目的の抗原に取り込まれたピロリシンまたはＰＣＬを結合させ、該修飾および非修飾抗原に対する続いて高力価抗体を生成する結合生成物をスクリーニングすることにより製造する。かかる態様において、２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン部分を、１個以上のニトロ基、脂質類、リン脂質類、ＬＰＳ様分子、アジュバント、アジュバント様分子、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、Ｔ細胞エピトープ、キーホールリンペットヘモシアニン(ＫＬＨ)、免疫原性ハプテン、ハロゲン類、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基を含み、これらに限定されない種々の置換基で置換する。
【０３２４】
この面を証明するために、ここで提供される方法を使用してＰＣＬをｍＴＮＦ−αおよびｍＥＧＦに取り込み(実施例１１および１２参照)、ＰＣＬ部分を１個以上のニトロフェニル基を含むハプテンと結合させた(実施例２７および２８参照)。図４８Ａおよび図４８Ｂは、ｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬ(図４８Ａ)およびｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(図４８Ｂ)におけるＰＣＬ取り込み部位でのモノ−ニトロフェニルハプテン(３７９３−００１、実施例３８−８参照)の結合を証明する。図４８Ｃおよび図４８Ｄは、ｍＴＮＦ−α(図４８Ｃ)およびｍＥＧＦ(図４８Ｄ)に取り込まれたＰＣＬ部位でのジ−ニトロフェニルハプテン(ＴＵ３６２７−０８８、実施例３８−７)の結合を示す。
【０３２５】
図４９Ａは、ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例２９参照)のＰＣＬ取り込み部位でのＴＬＲ７アゴニスト(Ｘ３６７８−１１４；実施例３８−３参照)の結合を証明する。図４９Ｂは、ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例３１参照)のＰＣＬ取り込み部位でのリン脂質(ＴＵ３６２７−０９２；実施例４３−１参照)の結合を証明する。
【０３２６】
図５０−５１は、ＰＡＤＲＥペプチド：ＰＸ２−ＰＡＤＲＥ(ＭＷ＝１５８５)(３４６５−１４３；実施例３８−１１参照)、およびＢＨＡ−ｅｘＰＡＤＲＥ(ＭＷ＝２０６０)(３６４７−１０４；実施例３８−１０参照)のｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬまたはｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬへのコンジュゲーションを証明する。図５０Ａおよび図５０Ｂは、２つの異なるｐＨ値(実施例３０参照)でのＰＸ２−ＰＡＤＲＥとのｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬコンジュゲーション反応のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析を示し、図５０Ｃは、ＢＨＡ−ｅｘＰＡＤＲＥ(実施例３０参照)とのｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬコンジュゲーション反応のＥＳＩ質量分光分析を示す。図５１は、ＢＨＡ−ｅｘＰＡＤＲＥのｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例３０参照)への結合を示す。ＰＡＤＲＥペプチド(配列番号２８)の配列はGly(DAla)LysXValAlaAlaTrpThrLeuLysAla(D-Ala)Gly-OH(ここで、Ｘはシクロヘキシル−アラニンである)である。ｅｘＰＡＤＲＥペプチド(配列番号２９)の配列はAlaGlySerArgSerGly(DAla)LysXValAlaAlaTrpThrLeuLysAla(D-Ala)Gly-OH(ここで、Ｘはシクロヘキシル−アラニンである)である。ある態様において、既知免疫原性ペプチドエピトープを、抗原の免疫原性を増強するために抗原と結合させる。ある態様において、抗原由来ペプチドを免疫原性担体タンパク質と結合させる。ある態様において、免疫原性担体タンパク質はＫＬＨである。ＰＡＤＲＥペプチドの結合に使用した結合化学は、他のペプチドのＰＣＬおよびピロリシンへの結合に容易に適用できると解釈される。
【０３２７】
免疫ＰＣＲ：ＤＮＡおよび他のオリゴヌクレオチドのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシンおよび／またはピロリシン類似体への結合
ここで提供される他の面において、取り込まれた１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを、ここで提供される方法を使用してＤＮＡで誘導体化する。ＤＮＡは、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドに取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬと反応する末端２−アミノ−ベンズアルデヒド、２−アミノ−アセトフェノンまたは２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン部分を有するように修飾し、そこで、ＤＮＡがタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドとキナゾリン型架橋、還元キナゾリン架橋または縮合環架橋を介して結合する(図２２、２３および３０参照)。
【０３２８】
ＤＮＡのＰＣＬへの結合を証明するために、ＰＣＬを、ここで提供される方法を使用してｍＴＮＦ−αおよびｍＥＧＦに取り込み(実施例１１および１２参照)、ＰＣＬ部分を免疫刺激部分でもあるＣｐＧオリゴヌクレオチドと結合させた(実施例３２参照)。ＢＨＡ−ＢＧ１(３６４７−０５７；実施例３８−１２参照)およびＢＨＡ−ＢＧ２(３５９７−１６７；実施例３８−１４参照)は、ＣｐＧをｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬおよびｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬにＰＣＬ取り込み部位で結合させるために使用したＣｐＧ試薬であった。ＢＨＡ−ＢＧ１(７.４kDa)およびＢＨＡ−ＢＧ２(７.４kDa)のｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬ(１９.３kDa)への結合を、ＢＨＡ−ＢＧ２(７.４kDa)のｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(７.２kDa)への結合と同様(図５２Ｂ)、ゲルシフトアッセイ(図５２Ａ)で確認した。ＢＧ１(配列番号３０)の配列は５'−＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ−３'(ここで、＊はホスホチオエート架橋を意味する)である。ＢＧ２(配列番号３１)の配列は５'−＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ−３'(ここで、＊はホスホチオエート架橋を意味する)である。ある態様において、結合するオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸、リボ核酸、ペプチド核酸または他の修飾オリゴヌクレオチドである。最初にピロリシンまたはＰＣＬに一本鎖オリゴヌクレオチドとして結合させ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはハイブリッドポリマーを、相補鎖とのハイブリダイゼーションにより容易に製造できる。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの結合に使用する結合化学は、他のオリゴヌクレオチドの結合に容易に適用できると解釈される。
【０３２９】
ある態様において、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは抗体であり、かかる連結したＤＮＡを有する抗体を免疫ＰＣＲ解析の実施に使用する。免疫ＰＣＲは、ここに記載された方法でＤＮＡを抗体に連結させ、その後ＤＮＡ結合抗体と標的抗原を結合させて、行う。結合後、ＤＮＡをＤＮＡ増幅技術を使用して増幅させ、得られた増幅生成物を電気泳動的技術、マイクロプレート方法またはリアルタイムＰＣＲを使用して分析する。
【０３３０】
部位特異的および志向性結合
ここで提供される他の面において、１個以上のピロリシンおよび／またはＰＣＬのタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへの部位特異的取り込みを使用して、支持体表面への結合に際しかかるタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの配向を制御するために使用する。かかる結合は、ピロリシン基またはＰＣＬ基と、ベンズアルデヒド部分、アセトフェノン部分、ベンゾフェノン部分またはそれらの組合せで誘導体化した表面の反応に由来し、それにより表面上のタンパク質に結合し、かつ配向するキナゾリン部分を形成する。ピロリシンおよび／またはＰＣＬをタンパク質の特異的位置に取り込むことにより、表面上のタンパク質の配向が制御される。かかるタンパク質結合の配向の制御を、タンパク質特性の評価のためのタンパク質操作ツールキットの要素として使用する。図５３は、かかる部位特異的配向結合の一態様を示し、ここで、表面がタンパク質に取り込まれたＰＣＬ基と反応する２０アミノ−アセトフェノン(acetophnone)部分で誘導体化されており、それによりタンパク質をキナゾリン型架橋を介して表面に結合させる。図５３において、形成されたタンパク質コンジュゲート架橋はキナゾリン型部分であるが、しかしながら他の態様において架橋はキナゾリン型部分の還元形である(図２２、２３および３０参照)。他の態様において、架橋は縮合環部分である(図２２、２３および３０参照)。
【０３３１】
ここで使用する支持体の例は、固体および半固体マトリックス、例えばエアロゲルおよびヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ(薄層被覆バイオチップを含む)、マイクロ流体チップ、ケイ素チップ、多ウェルプレート(マイクロタイタープレートまたはマイクロプレートとも呼ぶ)、膜、細胞、導電性および非導電性金属、ガラス(顕微鏡スライドを含む)および磁気支持体を含み、これらに限定されない。ここに記載する方法および組成物で使用する固体支持体の他の例は、シリカゲル、重合体膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、誘導体化ガラス、誘導体化シリカ、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類、例えばセファロース、ポリ(アクリレート)、ポリスチレン、ポリ(アクリルアミド)、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリビニルクロライド、ポリプロピレン、ポリエチレン(ポリ(エチレングリコール)を含む)、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどを含み、これらに限定されない。ある態様において、ここに記載する方法および組成物に使用する支持体は、表面音波装置または表面プラズモン共鳴解析のようなエバネセント波解析を用いる装置のような表面解析に使用する支持体である。
【０３３２】
取り込まれたピロリシンおよび／またはピロリシン類似体を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの結合に使用する固体支持体の表面は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、ウレア、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミドおよびスルホキシドを含み、これらに限定されない反応性官能基を有する。かかる官能基を使用して、ピロリシンまたはピロリシン類似体と反応する２−アミノ−ベンズアルデヒド部分、２−アミノ−アセトフェノン部分および／または２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン部分を共有結合的に結合させて、キナゾリン部分を形成する。ある態様において、かかる２−アミノ−ベンズアルデヒド部分、２−アミノ−アセトフェノン部分および２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン部分は、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、ウレア、カーボネート、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホネート、スルホンアミドおよびスルホキシドを含み、これらに限定されない、固体支持体反応性官能基との反応により固体支持体に結合した重合体リンカーの一部である。
【０３３３】
他の態様において、固体支持体の表面は、結合したストレプトアビジンまたはアビジンを有し、取り込まれたピロリシンおよび／またはピロリシン類似体を有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの結合に使用でき、ここで、該ピロリシンおよび／またはピロリシン類似体を使用して、タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドへのビオチンの部位特異的結合をする。
【０３３４】
ここに記載する方法および組成物に使用する他の支持体は、ほんの一例として、ポリスチレン、ＰＡＭ−樹脂、ポリＨＩＰＥTM樹脂、ポリアミド樹脂、ポリ(エチレングリコール)とグラフトされたポリスチレン樹脂、ポリジメチル−アクリルアミド樹脂およびＰＥＧＡビーズのような、ペプチド合成に使用する樹脂を含む。
【０３３５】
ある態様において、取り込まれたピロリシンおよび／またはＰＣＬを有するタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを、アレイ形式で固体支持体上に沈着させる。ある態様において、かかる沈着を、支持体表面と送達機構、例えばピンまたは毛細管を直接表面させることにより、または液体を小型ノズルから固体表面に移すために圧電性および他の推進力形態を利用する、インクジェット技術により達成する。コンタクトプリントの場合、ロボット制御系および多重印字ヘッドが、自動化マイクロアレイ組立てを可能にする。圧電性推進力技術による非接触沈着の場合、ロボット系がまた、連続的またはドロップ・オン・デマンド装置を使用した自動化マイクロアレイ組立てを可能にする。
【実施例】
【０３３６】
ここに記載する態様および以下の実施例は説明のためのみであり、それを踏まえた種々の修飾または変化が当業者には示唆され、本出願の精神および範囲内および添付する特許請求の範囲の範囲内に入ると解釈すべきである。ここに引用するすべての刊行物、特許、および特許出願は、示す目的のために引用により本明細書に包含させる。
【０３３７】
実施例１：哺乳動物細胞を使用した生合成的に製造したＰＣＬのタンパク質への部位特異的取り込み。
本実施例は、哺乳動物細胞内にトランスフェクトしたとき、ＰＣＬの標的タンパク質のＴＡＧコード化部位への取り込みを可能にする遺伝子構築物を記載する。複数部位での同時取り込みが可能であるが、ここに記載する全実施例は、タンパク質分子あたり一部位へのＰＣＬの取り込みのみを記載する。本実施例はまた、哺乳動物細胞を使用したタンパク質へのＰＣＬ取り込みの一般的方法も記載する。
【０３３８】
構築物：
完全長ｐｙｌＴおよびｐｙｌＳ、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤのコード領域を、メタノサルシナ・マゼイＧｏ１のゲノムＤＮＡから、メタノサルシナ・マゼイＧｏ１のｐｙｌＳ、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤのヌクレオチド配列に基づき設計したプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した(NC_003901、下記参照)。遺伝子の開始コドンをＡＴＧに変えた。ＰｙｌＴを、ＣＭＶプロモーターの上流でｐＣＭＶベクターにクローン化した。転写は、ベクターｐＣＭＶＵ６を形成するためのＵ６プロモーター制御下にある。ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤを同様にｐＣＭＶＵ６にクローン化した。ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの転写はＣＭＶプロモーターの制御下にある(図４Ａ)。
【０３３９】
標的遺伝子であるヒトレチノール結合タンパク質(ｈＲＢＰ４)、ヒトおよびマウスエリスロポエチン(ＥＰＯ)、およびｍＩｇＧ１  Ｆｃ(ｍＦｃ)のコード領域をｐＲＳベクターに、ＣＭＶプロモーターの制御下、Ｃ末端にＨｉｓタグを付してクローン化した(図４Ｂ)。ＴＡＧコドンへの変異のための残基を、表２に示す通り既存の構造モデルにおけるその溶媒暴露に基づき選択した。ＴＡＧコドンを標的遺伝子にＰＣＲ方法により導入した。
【表３】
0005542832.tif 000050
【０３４０】
図４Ｂは、ｈＲＢＰ４、ｍＥＰＯ、ｈＥＰＯ、およびｍＩｇＧ１のＴＡＧ変異体構築物を示す。変異部位を表２に記載し、図４Ｂで矢印により示す。各構築物について、Ｈｉｓタグを、精製および検出ツールとしてＣ末端に結合する。完全長タンパク質のみがＨｉｓタグを有し得る。ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、およびｐｙｌＤを、ｐＣＭＶＵ６にＣＭＶの制御下にクローン化した(図４Ａ)。それらを同時導入試験に使用する。
【０３４１】
細胞培養およびトランスフェクション：
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、293 Freestyle発現培地中の懸濁液で、３７℃で５％ＣＯ２下に増殖させた。トランスフェクション１日前、細胞を０.７×１０６細胞／mlに分割した。プラスミドＤＮＡを、Qiagen Maxiプラスミド調製キットを使用して製造した。トランスフェクションをＰＥＩ方法により行った。ＰＥＩをプラスミドＤＮＡと、２対１比でＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、ＤＮＡ複合体をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に１μg  プラスミドＤＮＡ／ml細胞培養で添加し、細胞を４日間、５mM  ＣｙｃまたはＤ−オルニチン存在下で培養した。細胞を、数プラスミドで同時導入したとき、ＰＥＩ対プラスミドＤＮＡ総量の比は常に２対１であった。
【０３４２】
タンパク質精製および解析：
トランスフェクション４日間後、細胞培養を２０００ｇで２０分間遠心分離し、媒体をＨｉｓタグ付加タンパク質の精製のために集めた。媒体を、予め２０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ(７.５)、１０mM  イミダゾール含有１５０mM  ＮａＣｌで平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムに載せた。カラムを同じ緩衝液で洗浄し、溶出緩衝液(２０mM  ＴｒｉｓＨＣｌ  ７.５、１５０mM  ＮａＣｌ、３００mM  イミダゾール)で溶出した。溶出タンパク質をBradford方法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイした。数例で、媒体および精製タンパク質をＨｉｓタグまたはタンパク質に対する抗体を用いるウェスタンブロットで分析した。
【０３４３】
メタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina maize)由来のゲノムＤＮＡからクローン化したｐｙｌ遺伝子の配列を以下に示す：
ｐｙｌＳの配列：(配列番号１)
【表４】
0005542832.tif 000051
ｐｙｌＢの配列：(配列番号２)
【表５】
0005542832.tif 000052
ｐｙｌＣの配列：(配列番号３)
【表６】
0005542832.tif 000053
ｐｙｌＤの配列：(配列番号４)
【表７】
0005542832.tif 000054
ｐｙｌＴの配列：(配列番号５)
【表８】
0005542832.tif 000055
【０３４４】
実施例２：哺乳動物細胞を使用した生合成的に製造したＰＣＬのｈＲＢＰ４への部位特異的取り込み。
本実施例は、モデルタンパク質ヒトＲＢＰ４(ヒトレチノール結合タンパク質４)のＴＡＧコード化部位でのＰＣＬの部位特異的取り込みを証明する。ｈＲＢＰ４は分泌タンパク質であり、その構造は特徴付けられており、ｈＲＢＰ４における溶媒露出基はよく定義されている。
【０３４５】
ｈＲＢＰ４を、Ｃ末端にＦｌａｇ−Ｈｉｓタグを有するｐＲＳベクターにクローン化した(図４Ａ)。ｈＲＢＰ４は、一過性トランスフェクションを使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞でよく発現された。ＴＡＧコドンを、異なるｈＲＢＰ４構築物の９個所に表２および以下の配列に示す通り導入した。個々のＴＡＧコドンは、下線を引いたアミノ酸基のコドンで導入されたことに注意。
(Ａ)。ｈＲＢＰ４アミノ酸配列：(配列番号６)
【表９】
0005542832.tif 000056
(Ｂ)。ｈＲＢＰ４およびＴＡＧ変異体のヌクレオチド配列
野生型ｈＲＢＰ４：(配列番号７)
【表１０】
0005542832.tif 000057
ｈＲＢＰ４変異体１：(配列番号８)
【表１１】
0005542832.tif 000058
ｈＲＢＰ４変異体２：(配列番号９)
【表１２】
0005542832.tif 000059
ｈＲＢＰ４変異体３：(配列番号１０)
【表１３】
0005542832.tif 000060
ｈＲＢＰ４変異体４：(配列番号１１)
【表１４】
0005542832.tif 000061
ｈＲＢＰ４変異体５：(配列番号１２)
【表１５】
0005542832.tif 000062
ｈＲＢＰ４変異体６：(配列番号１３)
【表１６】
0005542832.tif 000063
ｈＲＢＰ４変異体７：(配列番号１４)
【表１７】
0005542832.tif 000064
ｈＲＢＰ４変異体８：(配列番号１５)
【表１８】
0005542832.tif 000065
ｈＲＢＰ４変異体９：(配列番号１６)
【表１９】
0005542832.tif 000066
【０３４６】
Ｔｙｒ１０８およびＰｈｅ５４は、ｈＲＢＰ４のレチノール結合部位を並べるが他のＴＡＧ変異全て溶媒露出タンパク質基であった。哺乳動物細胞で発現したとき、これらのＴＡＧ部位での翻訳停止が、Ｃ末端Ｈｉｓタグを欠く切断型タンパク質をもたらす。その結果、切断型タンパク質は抗Ｈｉｓ抗体により認識されない。リードスルー翻訳は、Ｈｉｓタグを有する完全長生成物で製造される。それ故に、抗Ｈｉｓ抗体での検出は、リードスルー活性のインディケーターとして働く。
【０３４７】
ｈＲＢＰ４の発現：
ｐＲＳＲＢＰを、ｐＣＭＶｐｙＳ、ｐＣＭＶｐｙＢ、ｐＣＭＶｐｙＣおよびｐＣＭＶｐｙＤを用いてＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時導入し、細胞を実施例１に記載の通り５mM  Ｄ−オルニチン存在下で増殖させた。次いでＨｉｓタグ付加ｈＲＢＰ４をウェスタンブロットおよび抗Ｈｉｓ抗体を使用して分析し、切断型ｈＲＢＰ４がＨｉｓタグを含まなかったため、ＴＡＧコドンでＰＣＬが取り込まれた完全長ｈＲＢＰ４のみが該ウェスタンブロットにより検出された。それ故に、完全長ｈＲＢＰ４の存在は、ＰＣＬ取り込みを証明する。図６Ａに示す通り、抗Ｈｉｓ抗体は、完全長ｈＲＢＰ４の予測サイズである２６kDaでバンドを示し、変異ＴＡＧコドンでのＰＣＬ取り込みを示した。ＰＣＬは、９種のｈＲＢＰ４構築物(表２)に異なる割合で、＃２、＃６および＃９変異体構築物が高割合で、そして＃７および＃８変異体構築物が低割合で取り込まれた。＃２、＃６および＃９のタンパク質収量は４〜８mg／Ｌであり、野生型ｈＲＢＰ４の収量の約２０％であった。これらのタンパク質を精製し、質量分析(ＭＳ)解析に付した。タンパク質について得られた質量は、ＰＣＬ取り込みについて予測されたものに一致し、そしてタンデムＭＳ解析は、ＰＣＬの予測部位での取り込みを証明した(図６Ａ〜１１)。
【０３４８】
図６Ｂは、ＨＲＢＰ４内にＰＣＬが取り込まれたＨＥＫ２９３Ｆ細胞で生成されたｈＲＢＰ４のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、図６Ｃは質量スペクトルを示す。ｈＲＢＰ４を、Ｄ−オルニチン非存在下(Ａ、レーン１)または存在下(Ａ、レーン２)同時導入ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の培地から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。矢印は完全長ｈＲＢＰ４を示す。精製タンパク質を質量分析(Ｂ)で分析した：観察された質量は２３１６６.０Daであり、予測質量２３１６８Daに近似する。
【０３４９】
ｈＲＢＰ４に部位特異的に取り込まれたＰＣＬの質量分析検出：
ｐｙｌＳ、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子およびｈＲＢＰ４変異体＃６のためのＤＮＡ(表２：ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ)でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の５００ml  培養を、５mM  Ｄ−オルニチンを補った媒体で増殖させた。媒体を２個のＮｉ−ＮＴＡカラムを通して、全完全長ｈＲＢＰ４タンパク質を捕捉した。溶出フラクションは、集めたとき、４.３mg  総タンパク質を含んだ。タンパク質の観察された質量は２３１６６.８Da(予測値２３１６８Da)であり、一ＰＣＬ基取り込みと一致した(データは示していない)。サンプルのアリコートをトリプシン消化およびＬＣ−ＭＳ解析に付した。図７のＭＳ／ＭＳスペクトルはペプチドＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫ(配列番号１７)に相当し、それにより基Ｆ＊はＰＣＬに一致する質量をゆうし、基１２２での所望のＴＡＧ部位でのＰＣＬの部位特異的取り込みを確認する。ペプチドＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫについての割り当てを以下に示す：
ｍ／ｚ  ６４７.８６でのＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫの割り当て(Ｆ＊＝ＰＣＬ)
中性ペプチドのモノアイソトピック質量Ｍｒ(計算)：１２７３.６８１９
可変修飾：
Ｆ７：ＦでのＰＣＬ(Ｆ)
イオンのスコア：６０  予測：０.００１３
マッチ(太字)：３２の最も強いピークを使用した２２／７４フラグメンテーション
【表２０】
0005542832.tif 000067
【０３５０】
図８は、ヒトＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬトリプシン消化物の質量分光分析(ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫの２＋イオンのＴＩＣおよびＥＩＣ)を示し、ＰＣＬの標的Ｐｈｅ１２２ＴＡＧ部位での取り込みを示す。図９は、ヒトＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬのトリプシン消化物の質量分光分析を示す。質量スペクトルは、それぞれｍ／ｚ  ４２５.５７(３＋)および６３７.８５(２＋)でのＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫの３＋および２＋前駆体を示し(Ｆ＊＝ＰＣＬ)、さらにＰＣＬの標的Ｐｈｅ１２２ＴＡＧ部位での取り込みを示す。
【０３５１】
実施例３：哺乳動物細胞溶解物における生合成的に製造したＰＣＬの検出。
本実施例は、ＰＣＬが哺乳動物細胞で生合成的に生成され、かかる細胞の溶解物において遊離アミノ酸として検出可能であることを証明する。本実施例は、それ故にＰＣＬがピロリシンおよび他の２０種の天然に存在するアミノ酸類と同様に取り込まれ、ＰＣＬ取り込みが翻訳後タンパク質修飾によるものではないことを示唆する。
【０３５２】
細胞溶解物におけるＰＣＬ検出
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の６０ml  培養を、５mM  Ｄ−オルニチン存在下または非存在下、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ遺伝子と共に増殖させた。細胞を回収し、２５０μl  ダブル脱イオン化Ｈ２Ｏに超音波により溶解した。細胞残骸を遠心によりペレット化した。タンパク質を冷メタノールを最終濃度８０％まで添加することにより沈殿させ、遠心により取った。次いで、可溶性溶解物をspeedvacにより濃縮し、質量分析と組み合わせた高速液体クロマトグラフィーで分析して、ＰＣＬの存在を示した。
【０３５３】
乾燥サンプルを、最初に１００μl  ９８／２移動相Ａ／移動相Ｂ(移動相Ａ：水と０.１％ギ酸；移動相Ｂ：アセトニトリルと０.１％ギ酸)で再構成した。次いでサンプルを２０倍に希釈し、２μLをＨＰＬＣに注入した。検体分離を、Agilent zorbax 300SB_C18逆ＨＰＬＣカラムで以下の溶液勾配を使用して達成した：０分間２％Ｂ；５分間２％Ｂ；６０分間１００％Ｂ；流速：０.２５ml／分。ＨＰＬＣトレースの比較(図１０Ａ)は、４.１３分でのピークを示し(アスタリスクにより示す)、それは、生合成遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤでトランスフェクトし、Ｄ−オルニチン存在下で増殖させた細胞由来の溶解物では存在したが(下部ＥＩＣ(抽出イオンクロマトグラム)トレース)、Ｄ−オルニチン非存在下で増殖させた細胞からの溶解物には存在しなかった(上部ＥＩＣトレース)。４.１３分ＨＰＬＣピークのフル・スキャン質量スペクトル(図１０Ｃ)は、ＰＹＬのデメチル化体であるＰＣＬの理論的質量(２４２.１４９９２Da)に一致する２４２.１４９４３Daの質量を示す。リシン(ＨＰＬＣピーク  １.４４分)は、両方のサンプルで等しく豊富であり(図１０Ｂ)、リシンの完全質量スペクトル(図１０Ｄ)は、内部較正として働き、この方法の正確さを説明する。この解析は、ＰＣＬが、細胞溶解物において遊離アミノ酸として検出可能にＤ−オルニチンから生成されることを示す。
【０３５４】
実施例４：推定ＰＣＬおよびピロリシン前駆体、合成ピロリシン類似体および生合成遺伝子の種々の組合せを用いた取り込み試験
本実施例は、Ｄ−オルニチンがヒトＲＢＰ４への部位特異的取り込みにより測定して、ＰＣＬ生合成のための好ましい前駆体であることを証明する。本実施例でまた説明されるのは、哺乳動物細胞を使用したモデルタンパク質ヒトＲＢＰ４、ヒトレチノール結合タンパク質４でのＴＡＧコード化部位での、ＣＹＣを含むある種のピロリシン類似体の部位特異的取り込みである。本実施例はまた、ｐｙｌＳ  ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性への理解も提供する。
【０３５５】
Ｎ−ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(ＣＹＣ)取り込み
９個のｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体についてのＤＮＡ構築物(表３)を、実施例２に記載したｐｙｌＴ／ｐｙｌＳ  ＤＮＡと共にＨＥＫ２９３Ｆ細胞に個々に同時導入し、ピロリシン類似体である４mM  Ｎ−ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(ＣＹＣ)の非存在下または存在下で培養した。培養培地を回収し、抗Ｈｉｓおよび抗ｈＲＢＰ４抗体を用いるウェスタンブロットにより分析した(図１１Ａ)。抗Ｈｉｓ抗体を用いるウェスタンブロットは、９個のｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体構築物中６個について２４kDaタンパク質を確認した。このタンパク質のサイズは野生型ｈＲＢＰ４と等しく、リードスルー翻訳を介する完全長タンパク質の生成を示す。リードスルー活性はｈＲＢＰ４変異体構築物(表３)毎に異なり、ＣＹＣおよびｐｙｌＳに依存する。特に、完全長ｈＲＢＰ４タンパク質は変異体＃１、５および７について検出されなかった。ＰＣＬ取り込み(実施例２、図６Ａ)で見られた結果と同様、高収量の完全長タンパク質が変異体＃２、６および９で観察された。
【表２１】
0005542832.tif 000068
【０３５６】
ＣＹＣ含有発現タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより媒体から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとその後のクーマシーブルー染色により分析した。図１１Ｂは、精製ｈＲＢＰ４  ＴＡＧ変異体＃２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。精製調製物は、２４kDaのサイズに一タンパク質バンドを示す。精製タンパク質の質量スペクトルは、ＣＹＣの一部位取り込みと一致した(図１１Ｃ)。Ｐｈｅ６２の変わりの一部位ＣＹＣ取り込みの予測分子量は(２３１１４.６Da(野生型)−１６５.２Da(Ｐｈｅ)＋２５８.３Da(ＣＹＣ))２３２０８.７Daであり、観察値は２３１８２.０Daであった。観察質量は、Ｎ末端Ｑ基のピロリドンカルボン酸への環化が、１８Daの減少をもたらし、３個のインタクトジスルフィド結合が６Daの減少をもたらすことを示唆する(２３２０８.７Da−６Da−１８Da＝２３１８４.７Da)。精製タンパク質のタンデムＭＳ解析は、ＣＹＣがｈＲＢＰ４構築物の指定したＴＡＧ部位に取り込まれたことを証明した(図１２)。一過性トランスフェクションからのタンパク質収量は約５mg／Ｌと概算された。ＫＤＰＥＧＬＦＬＱＤＮIVＡＥＦＳＶＤＥＴＧＱＭＳＡＴＡＫ(配列番号１８)のＭＳ／ＭＳフラグメンテーションは次の通りである：
中性ペプチドのモノアイソトピック質量Ｍｒ(計算)：３２４８.５６４６  可変修飾：
Ｆ７：ＦでのＣｙｃ(Ｆ)
Ｑ９：脱アミド化(ＮＱ)
Ｎ１１：脱アミド化(ＮＱ)
Ｍ２４：酸化(Ｍ)、中性は０.００００を損失
(表に示す)、６３.９９８３
イオンのスコア：１１３  予測：４.６ｅ−００９
マッチ(太字)：１５６の最も強いピークを使用した１１０／４９８フラグメンテーション
【表２２】
0005542832.tif 000069
【０３５７】
推定ＰＣＬおよびピロリシン前駆体を用いた取り込み試験
完全長ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬタンパク質(変異体＃６)の生成を、推定ＰＣＬ前駆体Ｄ−オルニチン、Ｄ−プロリン、Ｄ−アルギニン、Ｄ−グルタミン酸、４−ヒドロキシル−Ｄ−プロリンおよび２−ピロリドン−５−カルボン酸(図１３ＡおよびＢ、図１４Ａ)の存在下で測定した。ｐＲＳＲＢＰを、ｐＣＭＶｐｙＳ、ｐＣＭＶｐｙＢ、ｐＣＭＶｐｙＣおよびｐＣＭＶｐｙＤとＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時導入し、実施例２に記載の通り細胞を５mMの推定前駆体(図１４Ａ)存在下で増殖させた。ＰＣＬが取り込まれたＨｉｓタグ付加および故に完全長であるｈＲＢＰ４を、次いでウェスタンブロットおよび抗Ｈｉｓ抗体およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１３Ｂに示す通り、Ｄ−オルニチンのみがＮｉ−ＮＴＡ精製サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定可能なタンパク質バンドをもたらした。未精製サンプルのウェスタンブロットによる検出(図１３Ａ)は、他の全ての前駆体の存在下では完全長ｈＲＢＰ４タンパク質の低レベルの形成しか示さず、Ｄ−オルニチンがＰＣＬ生合成および取り込みのための最も効率的な前駆体であることを明らかに示す。ウェスタンブロットおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析から、５mM  Ｄ−オルニチン(レーン２)からのＰＣＬの生合成生成および続くタンパク質取り込みは、ｐＣＭＶｐｙＳでトランスフェクトした細胞の培地に５mMで添加した既知ＰｙｌＳ基質ＣＹＣ(レーン９)の取り込みより効率的であるように見える。本実施例は、Ｄ−オルニチンがＰＣＬ生合成のための好ましい前駆体であることを証明する。
【０３５８】
合成ピロリシン類似体での取り込み試験
上記実験に並行して、完全長ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬタンパク質(変異体＃６)の生成が、タンパク質取り込み後の化学誘導体化のためにアセチル部分を有して設計された一連の合成ピロリシン類似体の存在下でも測定された(図１４Ｂ)。合成類似体を実施例１９に記載する通り製造した。ｐＲＳＲＢＰを、ｐｙｌＴ  ｔＲＮＡおよびｐｙｌＳ  ｔＲＮＡシンテターゼの一遺伝子コピーを供給するｐＣＭＶｐｙＳと共にＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時導入した。溶解度によって、合成類似体を媒体に２mMまたは５mM最終濃度で添加した。ＰＣＬが取り込まれたＨｉｓタグ付加およびそれ故に完全長のｈＲＢＰ４の検出を、次いで、ウェスタンブロットおよび抗Ｈｉｓ抗体およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図１３Ｂに示す通り、ＣＹＣ(レーン９)のみが、Ｎｉ−ＮＴＡ精製サンプルの解析で測定可能なタンパク質バンドをもたらした。未精製サンプル(図１３Ａ)のウェスタンブロット解析は、ＴＵ３０００−０１６(レーン１５)がまたｐｙｌＳ  ｔＲＮＡシンテターゼの実行可能な基質であることを示唆する。しかしながら、取り込み効率は低く、異なるバッチ(ＴＵ２９８２−１５０)では核磁気共鳴分光学による測定により分解し、ｈＲＢＰ４への１１個の低取り込み(レーン１０)となったため、化合物は安定ではない。本実施例は、発表された報告に一致し、類似体の環部分の結合点でｓｐ２炭素を特徴とするピロリシン類似体は、ｐｙｌＳ  ｔＲＮＡシンテターゼの基質として耐容性ではないことを証明する。
【０３５９】
生合成遺伝子の種々の組合せを用いた取り込み試験
完全長ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの生成をまた、５mM  Ｄ−オルニチンで細胞培を用い、生合成遺伝子ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの種々の組合せで同時導入した細胞培養でも試験した(図１３Ｃ)。全培養を、ｐｙｌＴ  ｔＲＮＡおよびｐｙｌＳ  ｔＲＮＡシンテターゼの一遺伝子コピーを供給するｐＣＭＶｐｙＳと同時導入した。完全長ｈＲＢＰ４タンパク質は、ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤの両方が同時導入されたときのみ、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロットで検出される。ｐｙｌＢは、ＰＹＬ生合成に必要である可能性があるが、ＰＣＬ生合成およびその後の取り込みに必須ではない。本観察は、さらに、ｍＩｇＧ１  Ｆｃドメインタンパク質(実施例５)およびマウスおよびヒトＥＰＯ(実施例６)の完全長ＰＣＬ変異体の生成により確認される。全３個の実施例は、遺伝子ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤのみがＰＣＬ生合成およびタンパク質取り込みに必須であることを説明する。
【０３６０】
実施例５：哺乳動物細胞を使用したマウスＩｇＧ１のＦｃドメインへの生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。
本実施例は、ここで提供される方法を使用する哺乳動物細胞における生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込みが一般的な方法であり、タンパク質ｈＲＢＰ４に限定されないことを証明する。
【０３６１】
ｍＩｇＧ１  Ｆｃの発現
４個のＴＡＧ変異体を、マウスＩｇＧ１のＦｃドメインのＫ３３３(変異体＃１)、Ｋ３３６(変異体＃２)、Ｔ３９４(変異体＃３)およびＬ４２６(変異体＃４)で生成した(表２および図１７Ａ)。ｐＲＳＦｃ＃１−４(表２)を、ｐＣＭＶｐｙＴ、ｐＣＭＶｐｙＳ、ｐＣＭＶｐｙＣおよびｐＣＭＶｐｙＤとＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時導入し、細胞を５mM  Ｄ−オルニチン存在下で増殖させた(ｐＣＭＶｐｙＢ添加せず)。Ｈｉｓタグ付加Ｆｃドメインタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより培地から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。各構築物についてのゲル上でのタンパク質バンドのサイズはそれらの予測されるサイズに一致する(図１７Ａ)。発現構築物はＣ末端Ｈｉｓ６タグを精製の特色とし、それ故に完全長タンパク質のみが回収される。図１７Ａに示す通り、変異体＃１の発現は増殖培地へのＤ−オルニチンの添加に依存する。全４種の変異体の発現レベルは同等である。質量分光分析は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞で生成されたとき、Ｆｃドメインのグリコシル化のために行わなかった。
【０３６２】
実施例６：哺乳動物細胞を使用したエリスロポエチン(ＥＰＯ)への生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。
本実施例において、ＰＣＬがエリスロポエチンに部位特異的に取り込まれ、さらに、ここに提供される方法が、哺乳動物細胞内のタンパク質への生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込みの一般的方法であることを証明する。
【０３６３】
マウスエリスロポエチン(ＥＰＯ)の発現
ＥＰＯ変異体タンパク質へのＰＣＬ取り込みをＨＥＫ２９３Ｆ細胞で達成した。ＴＡＧ変異を、ＥＰＯ受容体結合界面と逆向きの１１個の表面露出ＬｙｓまたはＡｒｇ基に導入した。取り込み部位を以下に示し、表２に記載する。マウスＥＰＯタンパク質を、ｐｙｌＢ遺伝子を添加した以外実施例１に記載の通り発現させた：ｐＲＳＥＰＯ＃１−１１(表２)を、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にｐＣＭＶｐｙＴ、ｐＣＭＶｐｙＳ、ｐＣＭＶｐｙＣおよびｐＣＭＶｐｙＤと同時導入し、細胞を５mM  Ｄ−オルニチン存在下で増殖させた。Ｈｉｓタグ付加ＥＰＯをＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより培地から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。ＥＰＯ構築物はＣ末端Ｈｉｓタグを含む。それ故にＰＣＬが成功裏に取り込まれたタンパク質のみが完全長タンパク質を生成し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製され、そしてそれ故にＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出可能バンドを生じる。完全長マウスＥＰＯのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、全１１種の変異体についてＰＣＬの成功裏の取り込みを示す(図１７Ｂ)。各構築物についてのゲル上でのタンパク質バンドのサイズはそれらの予測されるサイズに一致する。変異体＃１について、完全長タンパク質の形成はＤ−オルニチンに依存することを説明する。全１１種の変異体タンパク質の発現レベルは同等であり、〜４０mg／Ｌで発現されたｗｔタンパク質の１０〜２０％であった(図１７Ｂ)。質量分光分析は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞内でのＥＰＯのグリコシル化のために行わなかった。成熟ヒト(配列番号１９)およびマウス(配列番号２０)ＥＰＯタンパク質の配列を以下に示し、ＰＣＬ取り込み部位を太字で、グリコシル化部位を下線で示す。変異体の番号付けはＮ末端から始める(表２も参照)。
【表２３】
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【０３６４】
実施例７：大腸菌細胞を使用したタンパク質への生合成的に製造したＰＣＬの取り込みのためのプラスミド。
本実施例で提供されるのは、大腸菌細胞に形質転換したとき、同じ大腸菌細胞に同時形質転換された第二プラスミドから発現される標的タンパク質中のＴＡＧコード化部位へのＰＣＬの取り込みを可能にするプラスミドに関する記載である。
【０３６５】
ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤ構築
大腸菌細胞へのＰＣＬの取り込みのためのプラスミドを図５に示し、これは次の通り構築した：ｐｒｏＫプロモーター下でｐｙｌＴをコードするカセットを、該プロモーター、ｔＲＮＡ、および重複プライマーを有するｐＳＵＰからの３'配列の増幅により製造した。次いで、完全インサートを合成するために、３片をＡｐａＬＩおよびＸｈｏＩの制限部位をコードする末端プライマーと混合した。ＡｐａＬＩおよびＸｈｏＩで消化後、カセットを、同一酵素を用いて製造したｐＳＵＰ骨格とライゲートし、ｐＳＵＰ−ｐｙｌＴを製造した。メタノサルシナ・マゼイからのｐｙｌＳ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、およびｐｙｌＤのコーディング配列を、先に製造した適当なｐＣＭＶＵ６プラスミド(実施例１)から増幅し、タグなしでｐＭＨ４に導入した(Lesley SA, Kuhn P, Godzik A, Deacon AM, Mathews I, Kreusch A, Spraggon G, Klock HE, McMullan D, Shin T, Vincent J, Robb A, Brinen LS, Miller MD, McPhillips TM, Miller MA, Scheibe D, Canaves JM, Guda C, Jaroszewski L, Selby TL, Elsliger MA, Wooley J, Taylor SS, Hodgson KO, Wilson IA, Schultz PG, and Stevens RC, “Structural genomics of the Thermotoga maritima proteome implemented in a high-throughput structure determination pipeline”, Proc Natl Acad Sci USA 2002； 99： 11664-11669参照)。次いで、それぞれの完全プロモーター−ＣＤＳ−ターミネーターを、種々の制限部位を有するプライマー(ＫｐｎＩ−ｐｙｌＳ−ＳｂｆＩ、ＮｄｅＩ−ｐｙｌＤ−ＢｇｌII、ＢｇｌII−ｐｙｌＢ−ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩ−ｐｙｌＣ−ＫｐｎＩ)と増幅した。ｐｙｌＳ  ＰＣＲ生成物をＫｐｎＩおよびＳｂｆＩで消化し、ｐＳＵＰ−ｐｙｌＴにＫｐｎＩ部位とＰｓｔＩ部位の間にライゲートして、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴを得た。ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、およびｐｙｌＤ生成物をそれぞれの酵素で切断し、ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩを用いて製造したプラスミドバックボーンにライゲートした。この４方向ライゲーションのプラスミド生成物のシークエンシングおよび診断的(diagnositic)ＰＣＲでの検証後、全カセットをｐｙｌＤ−ｐｙｌＢ−ｐｙｌＣカセットの両端にＫｐｎＩ部位を添加するためのプライマーと増幅した。それをＫｐｎＩで消化させ、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴにＫｐｎＩ部位でライゲートして、最終ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤを得た(図５)。最終プラスミドは、各々別のアラビノース誘導性およびＴ７ハイブリッドプロモーターの制御下にあり、それぞれの下流にｒｒｎＢターミネーターを伴う(ｐＭＨ４の状況と同一)ｐｙｌＤ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、およびｐｙｌＳおよびｐｒｏＫプロモーター下にｐｙｌＴ遺伝子を含む(一ｔＲＮＡコピーを有するｐＳＵＰ／ｐＳＵＰＡＲの状況に類似)(Cellitti et al., “In vivo incorporation of unnatural amino acids to probe structure, dynamics, and ligand binding in a large protein by nuclear magnetic resonance spectroscopy”, J Am Chem Soc. 2008 Jul 23； 130(29)：9268-81)。
【０３６６】
実施例８：大腸菌細胞を使用したＦＡＳ−ＴＥへの生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。
本実施例は、同一大腸菌細胞内に第二プラスミド同時形質転換から発現されたヒト脂肪酸シンセターゼ(ＦＡＳ−ＴＥ)のＴＡＧコード化部位へのＰＣＬ取り込みを記載する。
【０３６７】
ヒト脂肪酸シンセターゼの２２２１〜２５０２残基をコードするチオエステラーゼドメイン(ＦＡＳ−ＴＥ)を、Ｎ末端タグを用いてｐＭＨ４ベクターから発現させる(MGDSKIHHHHHHENLYFQG)(配列番号２１)(Lesley SA, Kuhn P, Godzik A, Deacon AM, Mathews I, Kreusch A, Spraggon G, Klock HE, McMullan D, Shin T, Vincent J, Robb A, Brinen LS, Miller MD, McPhillips TM, Miller MA, Scheibe D, Canaves JM, Guda C, Jaroszewski L, Selby TL, Elsliger MA, Wooley J, Taylor SS, Hodgson KO, Wilson IA, Schultz PG, and Stevens RC, “Structural genomics of the Thermotoga maritima proteome implemented in a high-throughput structure determination pipeline”, Proc Natl Acad Sci USA 2002； 99： 11664-11669参照)。ＴＡＧコドンを、Cellitti et al., “In vivo incorporation of unnatural amino acids to probe structure, dynamics, and ligand binding in a large protein by nuclear magnetic resonance spectroscopy”, J Am Chem Soc. 2008 Jul 23；130(29)：9268-81に詳述される通り、ＰＩＰＥクローニングを使用して変異させた(Klock, HE, Koesema EJ, Knuth MW, and Lesley, SA, “Combining the polymerase incomplete primer extension method for cloning and mutagenesis with microscreening to accelerate structural genomics efforts”, Proteins. 2008 May 1；71(2)：982-94参照)。ＰＣＬ取り込みについて試験した変異体は、Ｌｅｕ２２２２ＴＡＧ／Ｌｅｕ２２２３ＩｌｅおよびＹ２４５４ＴＡＧであった(図１８Ａ)。ＨＫ１００細胞を、ｐＭＨ４−ＦＡＳ−ＴＥプラスミドおよびｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤと同時形質転換し、ＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｃｍプレートで選択した。液体培養を、誘導前に５mM  Ｄ−オルニチン(SigmaまたはNova Biochem)を補ったＴＢ(Sigma)＋Ｋａｎ＋Ｃｍで３７℃で増殖させた。ＯＤ５９５＝０.８で、細胞を３０℃移し、１５〜３０分後０.２％アラビノースで誘導した。細胞を誘導後約２０時間増殖し、その後遠心により回収した。細胞をＴＢＳ＋５％グリセロールｐＨ８中、音波処理により溶解させた。可溶性タンパク質フラクションを製造者のプロトコールに従いＮｉ−ＮＴＡ(Qiagen)クロマトグラフィーで精製した。収量は、ＦＡＳ−ＴＥ  Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬ／Ｌｅｕ２２２３Ｉｌｅについて４６〜８０mg／ＬおよびＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬについて１５５〜１８６mg／Ｌであり、野生型タンパク質の５０〜８０％の収率と同等であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子サイズおよび質量分析で決定したタンパク質の分子量は、所望の位置でのＰＣＬの一部位取り込みと一致する(図１８Ｂ)。
【０３６８】
２個のＰＣＬ取り込み部位(太字および下線)を有するＦＡＳ−ＴＥの配列(配列番号２２)を以下に示す(Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬについて、Ｌｅｕ２２２３残基はＩｌｅ２２２３に変異している)：
【表２４】
0005542832.tif 000071
【０３６９】
実施例９：大腸菌細胞を使用したＦＫＢＰ１２への生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。
本実施例は、同一大腸菌細胞内に同時形質転換した第二プラスミドから発現されるＦＫＢＰ１２のＴＡＧコード化部位へのＰＣＬの取り込みを記載する。
【０３７０】
ＦＫＢＰ１２を、ｐＥＴベクター(Novagen)にＮ末端タグを用いて発現させる(MGSSHHHHHHLEVLFQGP)(配列番号２３)。ＴＡＧコドンを、ＰＩＰＥクローニングを使用してＩｌｅ９０位置に導入した(Klock, HE, Koesema EJ, Knuth MW, Lesley, SA, “Combining the polymerase incomplete primer extension method for cloning and mutagenesis with microscreening to accelerate structural genomics efforts”, Proteins. 2008 May 1；71(2)：982-94)。ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞(Invitrogen)を、ｐＥＴ−ＦＫＢＰ１２およびｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤと同時形質転換し、ＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｃｍプレート上で選択した。液体培養を、５mM  Ｄ−オルニチンを補ったＴＢ＋Ｋａｎ＋Ｃｍで３７℃で培養した。ＯＤ５９５＝０.４で、細胞を３０℃に移し、３０分後１mM  ＩＰＴＧで誘導した。細胞をさらに２０時間増殖させ、回収した。細胞をＦＡＳ−ＴＥについてと同様に溶解し、精製した。次いで、精製タンパク質をＴＢＳで透析し、ＨＲＶ−３Ｃプロテアーゼ(２Ｕ／１mg  ＦＫＢＰ１２)で４８時間、４℃で切断して、Ｈｉｓタグを除去した。切断物質をＮｉ−ＮＴＡカラムと通し、回収し、濃縮し、さらに精製するためにＳ７５分子ふるいカラム(GE Healthcare)を通した。最終タンパク質をさらに１５−２０mg／mlに濃縮し、結晶化した。ＦＫＢＰ  Ｉｌｅ９０ＰＣＬの収量は、粗製で１２０mg／Ｌであった。結晶化ＦＫＢＰ  Ｉｌｅ９０ＰＣＬを使用して、ＰＣＬ含有タンパク質のＸ線構造を得た。図１９Ａ−Ｃは、ＦＫＢＰ１２に生合成的に取り込まれたＰＣＬについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析データおよび結晶化結果を示す。得られた質量は１２０８５.６Daであり、これはＰＣＬの一部位取り込みについて予測される１２０８４Daに一致する。
【０３７１】
ＰＣＬ取り込み部位(太字および下線)を有するＦＫＢＰ１２の配列(配列番号２４)を以下に示す：
【表２５】
0005542832.tif 000072
【０３７２】
実施例１０：大腸菌細胞を使用した線維芽細胞増殖因子２１(ＦＧＦ２１)への生合成的に製造したＰＣＬの部位特異的取り込み。
本実施例は、同一大腸菌細胞への同時形質転換により第二プラスミドから発現されるヒト線維芽細胞増殖因子、ＦＧＦ２１への、２０個の別々のＴＡＧコード化部位へのＰＣＬの取り込みの例を提供する。
【０３７３】
線維芽細胞増殖因子２１、ＦＧＦ２１をｐＳｐｅｅｄＥＴベクター(Klock, HE, Koesema EJ, Knuth MW, Lesley, SA, “Combining the polymerase incomplete primer extension method for cloning and mutagenesis with microscreening to accelerate structural genomics efforts”, Proteins. 2008 May 1；71(2)：982-94)からＮ末端タグ(MGDSKIHHHHHHENLYFQG)(配列番号２１)、翻訳ヒトタンパク質のコード化３３〜２０９残基を用いて発現させた。ＰＹＬ類似体取り込みおよびその後のＰＥＧ結合のためのＴＡＧコドンを、次の個々の位置でＦＧＦ２１(配列番号２５)ａａ３３−２０９構築物に挿入した：Ｓｅｒ３５、Ｇｌｎ３９、Ａｒｇ４７、Ｇｌｎ５６、Ａｒｇ６４、Ａｓｐ７４、Ｌｙｓ８４、Ｌｙｓ８７、Ｌｙｓ９７、Ａｒｇ１００、Ａｒｇ１０５、Ｈｉｓ１１５、Ａｒｇ１２４、Ｇｌｕ１２９、Ｌｙｓ１５０、Ａｒｇ１５４、Ｌｅｕ１６７、Ｌｅｕ１７０、Ｌｅｕ１８１およびＧｌｎ１８４。ＦＧＦ２１(３３−２０９ａａ)構築物の配列を以下に示し、２０個の別の構築物の取り込み部位を太字および下線で強調した。
【表２６】
0005542832.tif 000073
【０３７４】
ＨＫ１００またはＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、ｐＳｐｅｅｄｅｔ−ＦＧＦ２１プラスミドおよびｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤで同時形質転換し、ＬＢ＋Ｋａｎ＋Ｃｍで選択した。液体培養を実施例８に記載の通り、５mM  Ｄ−オルニチンを誘導前に添加して増殖させた。３０℃に切り替えるＯＤ５９５を、０.２〜１.０で、試験し、その後０.２％アラビノースまたは１mM  ＩＰＴＧで１５〜３０分後におよびＯＤ５９５＝０.４−２.０で誘導した。細胞を誘導後約２０時間増殖し、回収した。細胞を５％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、または２.５％デオキシコレートを含むＴＢＳに溶解した。不溶性ペレットをＴＢＳ＋６Ｍ  グアニジン−ＨＣｌ  ｐＨ８に再懸濁した。タンパク質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂で精製し、カラム上でまたはカラムから溶出後に再折りたたみした。タグをＴＥＶプロテアーゼで除去し、生成物をＮｉ−ＮＴＡ、イオン交換、および分子ふるいクロマトグラフィーで精製した。
【０３７５】
ＰＣＬのＦＧＦ２１への取り込みを示す代表的データを図２０に示す。予備的発現収量を表４に記録する。完全長および切断型両方のＦＧＦ２１タンパク質が、Ｎ末端Ｈｉｓタグの特性を有する構築物のために精製された。ＴＡＧコドンを停止コドンとして使用する程度(切断型タンパク質を製造)およびＰＣＬ取り込みに使用する程度(完全長タンパク質を製造)は、異なる取り込み部位による(図２０)。変異体のうち３個(表４)でＦＧＦ２１タンパク質が観察されず、残りの１７個の変異体の得られたタンパク質の総収量は５.７〜１４３mg／Ｌで変わり、所望の完全長タンパク質の収量は４〜５６mg／Ｌであると計算された。全変異体について、ＰＣＬ取り込みを質量分析で確認した。
【表２７】
0005542832.tif 000074
【０３７６】
実施例１１：ｍＴＮＦ−αへのＰＣＬ取り込み。
ｍＴＮＦ−α  Ｇｌｎ２１ＰＣＬ変異体を発現するために、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、ｐＥＴ２２ｂプラスミドベクター上でｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤおよびそれぞれの変異体ｍＴＮＦ−α遺伝子で同時形質転換した。形質転換細胞を５mM  Ｄ−オルニチン存在下で、ＴＢ培地で３７℃で誘発させ、ＯＤ６００が０.５に到達したとき１mM  ＩＰＴＧおよび０.２％(ｗ／ｖ)アラビノースで誘導させた。次いで、細胞を３０℃で１２〜１６時間連続的に振盪させ、回収した。細胞ペレットを使用するまで−２０℃で貯蔵した。ｍＴＮＦ−αのＸ線結晶構造は、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグと続く第Ｘａ因子切断部位(ＧＩＥＧＲ)を含むタンパク質の配列組み換えｍＴＮＦ−αにおける、以下に示すＰＣＬ取り込み部位Ｌｙｓ１１およびＧｌｎ２１を示した(配列番号２６)：
【表２８】
0005542832.tif 000075
【０３７７】
実施例１２：ｍＥＧＦへのＰＣＬの取り込み。
ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ変異体を発現させるために、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、ｐＥＴ２２ｂプラスミドベクター上でｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤおよびそれぞれの変異体ｍＥＧＦ遺伝子で同時形質転換させた。形質転換細胞を５mM  Ｄ−オルニチン存在下でＴＢ培地で３７℃で増殖させ、ＯＤ６００が０.５に到達したとき１mM  ＩＰＴＧおよび０.２％(ｗ／ｖ)アラビノースで誘導させた。細胞を３０℃で１２〜１６時間連続的に振盪させ、回収した。細胞ペレットを使用するまで−２０℃で貯蔵した。ｍＥＧＦのＸ線結晶構造は、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを有するタンパク質の配列組み換えｍＥＧＦにおける以下に示す通りのＰＣＬ取り込み部位Ｔｙｒ１０およびＴｙｒ２９を示した(配列番号２７)：
【表２９】
0005542832.tif 000076
【０３７８】
実施例１３：ｍＴＮＦ−αへのピロリシン(Ｐｙｌ)またはＰＣＬの取り込み。
ＰＹＬをｍＴＮＦ−αに挿入するために、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、ｐＥＴ２２ｂプラスミドベクター上で、変異体ｍＴＮＦ−α遺伝子と、停止コドン(ＴＡＧ)に変異させたＧｌｎ２１のコドン(ＣＡＡ)ならびにメタノサルシナ・マゼイｐｙｌＳ、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、およびｐｙｌＤを含むｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤと同時形質転換した。ＰＣＬを変異体に排他的に取り込ませるために、ｍＴＮＦ−α  ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤを、推定メチルトランスフェラーゼＰｙｌＢの遺伝子を欠くｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＣＤに置き換えた。形質転換細胞を５mM  Ｄ−オルニチン存在下でＴＢ培地で３７℃で増殖させ、Ｄ６００が０.５に到達したとき１mM  ＩＰＴＧおよび０.２％(ｗ／ｖ)アラビノースで誘導させた。細胞を３０℃で１２〜１６時間連続的に振盪させ、回収した。細胞ペレットを−２０℃で貯蔵した。細胞ペレットを１５分間氷上で融解させた後、細胞を溶解緩衝液(２０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８.０)に、３ml／ｇ湿重量で再懸濁した。リソザイムを１mg／mlまで添加し、細胞を２分間氷上で音波処理した。溶解物を３０,０００×ｇで２０分間、４℃で遠心分離して、細胞残骸をペレット化した。１mlの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー(Qiagen)を透明溶解物に添加し、４℃で６０分間浸透することにより穏やかに混合した。溶解物−Ｎｉ−ＮＴＡ混合物をカラムに載せ、フロー・スルーを回収した。樹脂を２０mLの２５mM  イミダゾールのＰＢＳ溶液(ｐＨ８.０)で洗浄後、タンパク質を２.５mlの２５０mM  イミダゾールのＰＢＳ溶液(ｐＨ８.０)で溶出し、ＰＤ−１０カラム(GE Healthcare)を使用して緩衝液をＰＢＳ、ｐＨ７.４に変えた。ｐｙｌＢの存在下または非存在下ならびにＤ−オルニチンの存在下または非存在下でのｍＴＮＦ−α  Ｇｌｎ２１ＴＡＧの発現を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)で分析した(図２１Ａ)。図２１Ａにおいて、レーン１は分子量標準SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standardである；レーン２は、ｐｙｌＢおよびＤ−オルニチンの両方の存在下での発現である；レーン３は、ｐｙｌＢの存在下、Ｄ−オルニチン非添加での発現である；レーン４は、ｐｙｌＢの非存在下、５mMのＤ−オルニチンを添加した発現である；およびレーン５、はｐｙｌＢおよびＤ−オルニチン両方の非存在下の発現である。データは、完全長ｍＴＮＦ−αの発現がＤ−オルニチンの存在に依存し、ｐｙｌＢ遺伝子の非存在下または存在下では同等であることを説明する。
【０３７９】
実施例１４：ｍＥＧＦへのピロリシン(Ｐｙｌ)またはＰＣＬの取り込み
大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、ｐＥＴ２２ｂプラスミドベクター上でｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤおよびそれぞれの変異体ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧおよびＴｙｒ２９ＴＡＧ遺伝子と同時形質転換した。両方の構築物を、ＯＤ６００が０.５に到達したとき、５mM  Ｄ−オルニチンの存在下、ＴＢ培地で３７℃で１mM  ＩＰＴＧおよび０.２％(ｗ／ｖ)アラビノースの添加により発現させた。次いで温度を３０℃に下げ、細胞を誘導１６時間後に回収した。細胞ペレットを２０mLの２０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ８.５)に再懸濁し、５分間音波処理した。３０,０００×ｇで２０分間遠心分離後、上清を廃棄した。ペレットを、音波処理により２％(ｖ／ｖ)  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含む２０mLの２０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ８.５)に再懸濁した。もう１回３０,０００×ｇで２０分間遠心後、ペレットを音波処理により１０mLの８Ｍ  ウレア、２０mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１０mM  β−メルカプトエタノール、ｐＨ８.５に可溶化した。不溶性細胞残骸を得殷賑分離により除去し(３０,０００×ｇで２０分間)、上清を再折りたたみ緩衝液(１００mM  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、４mM  還元グルタチオン、０.４mM  酸化グルタチオン、２０％(ｖ／ｖ)  エタノール、ｐＨ８.５)で２倍に希釈した。希釈サンプルを、再折りたたみ緩衝液に対して一夜、４℃でslide-a-lyzer透析カセット(３５００Da分子量カットオフ、Pierce)を使用して透析した。不溶性タンパク質を３０,０００×ｇで２０分間の遠心により除去し、上清に、β−メルカプトエタノールを最終濃度２mMまで添加した。１mlの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー(Qiagen)を再折りたたみしたタンパク質に添加し、４℃で６０分間浸透することにより穏やかに混合した。タンパク質−Ｎｉ−ＮＴＡ混合物をカラムに載せ、フロー・スルーを回収した。樹脂を２０mLの２５mM  イミダゾールのＰＢＳ溶液(ｐＨ８.０)で洗浄後、タンパク質を２.５mlの２５０mM  イミダゾールのＰＢＳ溶液(ｐＨ８.０)で溶出した。最後に、タンパク質を、ＰＤ−１０カラム(GE Healthcare)を使用して、ＰＢＳ(ｐＨ７.４)に緩衝液交換した。タンパク質調製物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験した(図２１Ｂ)。図２１Ｂにおいて、レーン１は分子量標準SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standardであり、レーン２は、Ｎｉ−ＮＴＡ精製後のｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧ変異体タンパク質である。
【０３８０】
加えて、ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧ、ＥＳＩ−ＭＳスペクトルを、ｍＴＮＦαに関して上記の方法を使用して得たＰｙｌＢ発現の存在下または非存在下に得たタンパク質について得た(図２１Ｃ)。図２１Ｃの下部質量スペクトルは、ＰＹＬ取り込みが、ｐｙｌＢ遺伝子存在下で優勢に起こることを説明し(ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０Ｐｙｌの予測質量＝７３１０Da)、図２１Ｃの上部質量スペクトルは、ＰＣＬ取り込みがｐｙｌＢの非存在下でのみ起こることを説明する(ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０Ｐｙｌの予測質量＝７２９６Da)。それ故に、図２１Ｂ、レーン２に見られるタンパク質は、さらにＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により確認した通り、ＰＹＬが取り込まれたｍＥＧＦである。同様に、図２１Ａ、レーン２に見られるタンパク質は、恐らくＰＹＬが取り込まれたｍＴＮＦαであり、レーン４は、恐らくＰＣＬが取り込まれたｍＴＮＦαである。
【０３８１】
さらに、全遺伝子(メタノサルシナ・マゼイｐｙｌＳ、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、およびｐｙｌＤ)を発現するＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧサンプルに取り込まれたＰＣＬおよびＰＹＬのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ抽出イオンクロマトグラム質量解析からのＰＣＬ／ＰＹＬ比の定量は、ＰＹＬがＰＣＬより５〜１０倍豊富であることを示し、全遺伝子(メタノサルシナ・マゼイｐｙｌＳ、ｐｙｌＴ、ｐｙｌＢ、ｐｙｌＣ、およびｐｙｌＤ)を発現するｍＴＮＦ  Ｇｌｎ２１ＴＡＧサンプルに取り込まれたＰＣＬおよびＰＹＬのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ抽出イオンクロマトグラム質量解析からのＰＣＬ／ＰＹＬ比の定量は、ＰＣＬがＰｙｌより約７倍豊富であることを証明する。ＰｙｌＢ遺伝子比存在下の定量は、ＰＣＬタンパク質のみを示し、ＰＹＬ取り込みが厳密にｐｙｌＢに依存することを示し、これは、さらに、ＰｙｌＢが実際にＰｙｌの生合成に必要なメチルトランスフェラーゼであることを示唆する。
【０３８２】
実施例１５：他の類似体および前駆体の取り込み：
ＨＫ１００細胞(Genehogs由来；Invitrogen)を、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤ、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＣＤ、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＣ、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＤ、またはｐＳＵＰＡＲ−ｐｙｌＳＴおよびｐＭＨ４−ＦＡＳＴＥ−Ｌ２２２２ＴＡＧ−Ｌ２２２３Ｉで同時形質転換した。細胞を、テリフィックブロス(ＴＢ)(Sigma)の２５ml培養で、３７℃で、ＯＤ５９５〜０.６まで増殖させた。細胞を３０℃に移し、類似体または前駆体化合物をそれぞれ個々の培養に図１５に示す濃度で添加した。評価した化合物は、Ｎ−ε−シクロペンチルオキシカルボニル−Ｌ−リシン(ＣＹＣ；Sigma)、Ｄ−オルニチン(Chem-Impex)、ＰＣＬ−Ａ(実施例３６−１、化合物３６４７−１２５参照)、ＰＣＬ−Ｂ(実施例３６−２、化合物３７９３−０１１参照)、Ｐ２Ｃ(実施例３６−２、化合物３６４７−１６４参照)、Ｐ５Ｃ(実施例３５−１、化合物３７９３−００７参照)およびＬｙｓ−Ｎε−Ｄ−オルニチン(実施例３５−２、化合物３７９３−０３１参照)であった。細胞を２０分後に０.２％アラビノースで誘導した。１８〜２０時間後、細胞を遠心により回収した。細胞を音波処理により溶解し、自然条件下でＮｉ−ＮＴＡ(Qiagen)で精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと続くクーマシー染色(０.２５ml  Ｎｉ−ＮＴＡ、０.７５ml溶出、ゲル上２０μl)で評価した。図１５Ａは、示すｐｙｌ遺伝子(ｐｙｌＳ／ｐｙｌＴまたはｐｙｌＢ／ｐｙｌＣ／ｐｙｌＤ／ｐｙｌＳ／ｐｙｌＴ)存在下、示す化合物を添加して増殖させた細胞由来の精製タンパク質(ＦＡＳ−ＴＥ)を示す。ＣｙｃおよびＤ−オルニチン(Ｄ−Ｏｒｎ)をポジティブコントロールとして使用した。化合物を添加していないものをネガティブコントロールとして示す。レーン１−１１および１２−１８のゲルサンプル容積は、それぞれ内部的に一致する。
【０３８３】
レーン２および３は、それぞれｐｙｌＳおよびｐｙｌＴ遺伝子のみおよびＰＣＬ−Ｂ(Ｌｙｓ−Ｐ２Ｃ)またはＰＣＬ−Ａ(Ｌｙｓ−Ｐ５Ｃ)で増殖させた細胞から得たタンパク質を示す。両方の化合物がタンパク質に取り込まれ、それによりＰｙｌＳが２種の化合物を利用する能力が証明される。レーン５〜１１は、ｐｙｌ生合成遺伝子(ｐｙｌＢ／ｐｙｌＣ／ｐｙｌＤ／ｐｙｌＳ／ｐｙｌＴ)の全セットと、前駆体Ｌｙｓ−Ｎε−Ｄ−Ｏｒｎ(レーン１０)、またはピロリン環のみを有する前駆体：Ｐ２Ｃ(レーン６)およびＰ５Ｃ(レーン８)の存在下の細胞におけるタンパク質合成を示す。ピロリン環のみを有する前駆体：Ｐ２Ｃ(レーン６)およびＰ５Ｃ(レーン８)はＰＣＬ生合成の支持に不十分であり、これらがこの経路での中間体でないことを示唆する。しかしながら、Ｌｙｓ−Ｎε−Ｄ−Ｏｒｎ(レーン１０)は、アンバーコドンでＰＣＬが取り込まれたタンパク質の発現をもたらし、これがＰＣＬ生合成経路の中間体であることを証明する。表５は、得られたタンパク質の量(Bradford)、観察された質量および得られたＰＣＬ：ＰＹＬ：ＣＹＣの比を示す。
【表３０】
0005542832.tif 000077
【０３８４】
Ｌｙｓ−Ｎε−Ｄ−Ｏｒｎが必要な遺伝子(ｐｙｌＣおよびｐｙｌＤ)のいずれかの生合成経路生合成経路の上流での中間体であるか否かを決定するために、ＨＫ１００細胞(Genehogs由来；Invitrogen)をｐＳＵＰＡＲ−ｐｙｌＳＴ、ｐＭＨ４−ＦＡＳＴＥ−Ｌ２２２２ＴＡＧ−Ｌ２２２３Ｉ、およびｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢ、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＣ、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＤ、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＣＤまたはｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤのいずれかと同時形質転換した。図１５Ｂは、ｐｙｌＤ(レーン１５)のみがＬｙｓ−Ｎｅ−Ｄ−ＯｒｎからのＰＣＬの形成に必要であることを示し、これが生合成経路におけるｐｙｌＣの上流の中間体であることを示唆する。さらに、ＮＭＲ評価は、Ｌｙｓ−Ｎｅ−Ｄ−ＯｒｎがＰｙｌＤの基質であることを確認した。
【０３８５】
実施例１６：２−アミノベンズアルデヒド、２−アミノ−アセトフェノンおよび２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノンでのｈＲＢＰ４に取り込まれたＰＣＬの誘導体化。
本実施例に提供されるのは、２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)、２−アミノ−アセトフェノンおよび２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノンでのＰＣＬの標識である。この反応は、図２２に示す一般的スキームに従うと考えられる。質量分析およびＮＭＲを使用して、形成された構造を評価した。図２３は、３個の異なる２−アミノ−ベンズアルデヒド(benzyaldehyde)部分から形成されたタンパク質コンジュゲートを示し、そして予測されたおよび観察された質量変化を示す。
【０３８６】
ｈＲＢＰ４における２−ＡＢＡによる部位特異的に修飾されたＰＣＬの質量分析検出
レチノール結合タンパク質(ｈＲＢＰ４)を、実施例２に記載する通りＨＥＫ２９３Ｆ細胞で発現された。質量分析により確認して、Ｐｈｅ１２２(ｈＲＢＰ４変異体＃６)ではなくＰＣＬが取り込まれた(図６Ａ−１１)。１０μlのｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ貯蔵溶液を８９μlの２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液、ｐＨ５.０および１μlの１Ｍ  ２−ＡＢＡ溶液と混合し、１６時間、室温でインキュベートした。反応混合物中の最終濃度は、１７μM  ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬタンパク質および１０mM  ２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)であった。誘導体化ｈＲＢＰ４の質量スペクトルを図２４に示し、ここで、得られた質量は、ＰＣＬの２−ＡＢＡ付加物に対応する(２３２６９.２Da)。非修飾ｈＲＢＰ４は２３１６６.８Daの質量を有し、それ故に観察された１０２.４Daの質量増加(予測＋１０３Da)は、ｈＲＢＰ４が２−ＡＢＡで修飾されていることを証明する。質量スペクトルのピーク強度の少なくとも９６％がＰＣＬの２−ＡＢＡ付加物によるものであり、これは反応がほぼ終了するまで進行したことを証明した。
【０３８７】
２−ＡＢＡ誘導体化ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬタンパク質のトリプシン消化物のＬＣ−ＭＳ解析を行い、ＭＳ／ＭＳ解析(図２５Ａ)は、予測ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫペプチド(配列番号１７)を同定し、ここで、Ｆ＊は図２３に示す通り２−ＡＢＡ修飾ＰＣＬに一致する質量を有する。反応は、非誘導体化ＰＣＬ基が検出不可能であったため終了した。ＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫ(Ｆ＊＝ＰＣＬ−２−ＡＢＡ付加物)の割り当てられたＭＳ／ＭＳスペクトルを以下に示す：
中性ペプチドのモノアイソトピック質量Ｍｒ(計算)：１３７６.７２４１
可変修飾：
Ｆ７：ＦでのＰＣＬ−２−ＡＢＡ付加物(Ｆ)
イオンのスコア：４４  予測：０.０５９
マッチ(太字)：２８の最も強いピークを使用した１３／７４フラグメンテーション
【表３１】
0005542832.tif 000078
図２５ＢはＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫ(Ｆ＊＝ＰＣＬおよびＰＣＬ−２−ＡＢＡ付加物)の２＋イオンのＴＩＣおよびＥＩＣであり、誘導体化および非誘導体化(検出不可能)のＥＩＣ(抽出イオンクロマトグラム)の比較により、反応の終了が示される。図２５Ｃは２−ＡＢＡで誘導体化したｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬの質量分光分析であり、それぞれｍ／ｚ  ４５９.９２(３＋)および６８９.３７(２＋)でＹＷＧＶＡＳＦ＊ＬＱＫの３＋および２＋前駆体を示す(Ｆ＊＝ＰＣＬ−２−ＡＢＡ付加物)。本実施例は、２−ＡＢＡとの観察された反応が１２２残基での所望のＴＡＧ部位に取り込まれたＰＣＬ基と部位特異的に起こることを証明する。
【０３８８】
ｐＨの関数としての反応効率：
ｐＨの関数としての反応効率(図２６)を、１０mM  ２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)存在下または非存在下で、１７μM  ｈＲＢＰ４  ＰＣＬ変異体タンパク質と２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液、ｐＨ５.０を、または１０mM  ２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)１０×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７.４を、１２時間、室温で反応させることにより評価した。反応混合物のマススペクトルは、全ピーク強度の少なくとも８７％が２−ＡＢＡ部分で修飾されたタンパク質に対応することを示した(予測通り＋１０２Da)(図２６Ａ、ＢおよびＣ)。ｐＨ７.４反応混合物は約１３％未反応タンパク質(図２６Ｃ)を含んだが、ｐＨ５.０では４.２％しか未反応タンパク質が反応中に検出されず(図２６Ｂ)、ＰＣＬの反応性がｐＨ７.４と比較してｐＨ５.０で僅かに大きいことを示唆する。反応は、Ｐｈｅ６２の変わりにＯＭｅＰｈｅが取り込まれたｈＲＢＰ４では１０mM  ２−ＡＢＡの存在により修飾されなかったためＰＣＬの存在に特異的である(図２６Ｄ、ＥおよびＦ)。
【０３８９】
反応体対タンパク質の濃度の関数としての反応効率および他の２−ＡＢＡ様部分との反応：
反応体対タンパク質濃度比の関数としての反応効率、および２−ＡＢＡ様反応体との反応性を、１７μM  ｈＲＢＰ４  ＰＣＬ変異体タンパク質と０.１mM  ２−アミノ−ベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ)、０.１mM  ２−アミノ−アセトフェノン(２−ＡＡＰ)または０.１mM  ２−アミノ−５−ニトロ−ベンゾフェノン(２−ＡＮＢＰ)を、２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液、ｐＨ５.０中で反応させることにより評価した。１２時間、室温の後、反応混合物の質量スペクトルは、コンジュゲートタンパク質の予測質量を示した(図２７)。２−ＡＢＡについて、正確にコンジュゲートしたピークの相対的強度は、全強度の８８％であった；タンパク質の４.２％のみが未反応で残った(図２７Ａ)。２−ＡＡＰについて、９３％が反応；４.５％未反応であることが明らかであった(図２７Ｂ)。２−ＡＮＢＰについて、２−ＡＮＢＰがｈＲＢＰ４  ＰＣＬ変異体タンパク質含有溶液への添加直後に沈殿することから、恐らく反応材の低溶解度の低溶解度のために５.４％しか反応しなかった(図２７Ｃ)。
【０３９０】
本実施例は、ＰＣＬ修飾タンパク質が種々の２−アミノ−ベンズアルデヒド類似体と反応し、ＰＣＬが取り込まれた部位で誘導体化されることを証明する。全例で、修飾タンパク質の測定された質量は、図２３に記載した構造についての予測質量と一致した。データはまた、コンジュゲーション反応が、わずか６対１の低反応体対タンパク質比で高効率で、ほぼ終了まで進行することも証明する。データはまた、各タンパク質サンプルが１回しか誘導体化されていないことも証明する。しかしながら、複数反応体分子の結合(図２８Ａ)が極めて高い反応体対タンパク質比(４７００倍)およびｐＨ７.５で得られることも観察された。ｐＨ５.０での同一サンプルの沈殿は、同様の複数反応を示唆する。同様にＰｈｅ６２ではなくＯＭｅＰｈｅで修飾したｈＲＢＰ４(６.５μM)は、ｐＨ７.５で１５４００倍モル過剰の２−ＡＢＡと反応させたとき、図２８Ａで観察されるものに類似したコンジュゲートパターンを示した(図２８Ｂ)。これは、これらの条件下(タンパク質を超える大モル過剰の反応体)で、結合はＰＣＬ側鎖の存在に依存せず、むしろリシン側鎖が関与する可能性を証明する。しかしながら、本実施例反応は、タンパク質に取り込まれたＰＣＬ基が、小モル過剰で添加された２−アミノ−ベンズアルデヒド(benzyaldehyde)含有分子との反応により特異的かつほぼ定量的に誘導体化され得ることを説明する。
【０３９１】
実施例１７：ＦＡＳ−ＴＥに取り込まれたＰＬＣの２−アミノ−アセトフェノンでの誘導体化
実施例８の通り大腸菌内で生成した１６μMのＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬを、１mM  ２−ＡＡＰと１６時間、室温および２４時間、４℃で、ｐＨ５.０で、２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液中反応させた。図２９Ａは、未反応ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬの質量スペクトルを示し、図２９Ｂは反応混合物の質量スペクトルを示す：観察可能なピーク強度の１００％は３３３１８.８Daで起こり、未反応物質より１１６.８Da大きく、２−ＡＡＰ修飾ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬについて予測される１１６Daの質量増加の誤差範囲内である。同様に、ｐＨ７.４で、反応は９５％終了まで進行する(図２９Ｃ(未反応)および図２９Ｄ(反応))。
【０３９２】
実施例１８：ＨＲＢＰ４に取り込まれたＰＣＬの２−アミノ−アセトフェノン−ＰＥＧ８での誘導体化
本実施例は、ＨＲＢＰ４に取り込まれたＰＣＬが、２−アミノ−アセトフェノンのポリエチレングリコール(ＰＥＧ)誘導体で一部位での終了まで誘導体化できることを証明する。本実施例において、ＰＥＧは８個のエチレングリコール単位を有し、その構造を図３１に示す。本実施例はまた、野生型ｈＲＢＰ４が、ｐＨ５.０およびｐＨ７.５で、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８と、試薬対タンパク質比が２３００までで反応しないことも証明する。
【０３９３】
ｈＲＢＰ４変異体＃６を実施例２に記載の通り製造した。２−アミノ−アセトフェノンＰＥＧ８(ＴＵ３２０５−０４４)を実施例２０に記載の通り製造した。反応を１４時間、室温および７２時間、４℃で進行させ、反応混合物の質量スペクトルを得た。
【０３９４】
ｐＨ７.５で行う反応について、１０μLのｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ(０.２２mg／mL、ＰＢＳ中、ｐＨ７.５)を１０μlの１０×ＰＢＳで希釈した。０.２μlまたは２μlの２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８の１００mM貯蔵溶液(水中)を、最終濃度それぞれ１および９.１mMまで添加した。タンパク質濃度はそれぞれ４.７μMおよび４.３μMであり、２１０または２１００モル過剰の反応体対タンパク質となった。図３２Ａは、２１０対１比の反応混合物のマススペクトルを示し、反応の約９５％終了を示し、観察された５５６Daの質量増加は予測値と同一であった(図３１)。１００％終了が２１００モル過剰の反応で得られた(データは示していない)。
【０３９５】
同様に、反応をｐＨ５.０で行った。この場合、１０μLのｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ(０.２２mg／mL、ＰＢＳ中、ｐＨ７.５)を、９０μlの２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液、ｐＨ５.０で希釈した。１μlまたは１０μlの２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８の１００mM貯蔵溶液(水中)を、それぞれ最終濃度１および９.１mMまで添加した。タンパク質濃度はそれぞれ０.９４および０.８６μMであり、１０５０または１０５００モル過剰の反応体対タンパク質となった。図３２Ｂは、１０５０対１比での反応混合物のマススペクトルｏを示す。両方の反応とも１００％終了し、観察された５５６Daの質量増加は予測値と同一であった(図３１)。
【０３９６】
２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８と野生型ｈＲＢＰ４タンパク質の反応性を試験するために、試験反応を上記のものに準じて設定した。ｐＨ７.５反応について、最終野生型タンパク質濃度は２０μMであり、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８濃度は１または９.１mMであり、４６および４６０対１のモル比となった。ｐＨ５反応を４μMタンパク質濃度および１および９.１mM  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧ(２３０および２３００対１の反応体対タンパク質)で行った。全４例の反応で、非修飾野生型ｈＲＢＰ４タンパク質のみが予測質量で観察された(図３２Ｄ−Ｆ)。本実施例は、２−ＡＡＰ−ＰＥＧの結合反応が、標的タンパク質におけるＰＣＬ基の存在に極めて特異的であることを証明する。
【０３９７】
実施例１９：分子量が異なる２−アミノ−アセトフェノン−ＰＥＧ類でのＦＡＳ−ＴＥに取り込まれたＰＬＣの誘導体化
本実施例は、ＰＣＬ側鎖と２−アミノ−アセトフェノンＰＥＧ類の反応性の普遍性を証明する。本実施例は、さらに、生物治療用タンパク質の修飾に充分な長さの２−ＡＡＰ−ＰＥＧ類が、ＰＣＬ修飾タンパク質にコンジュゲートできることを証明する。
【０３９８】
実施例８に記載の通り大腸菌内で生成した１６μMのＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬを１mM  ＴＵ３２０５−０４４(２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８)と１６時間、室温で、ｐＨ５.０で、２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液中反応させた。図３３Ａは未反応ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬの質量スペクトルを示し、図３３Ｂは反応混合物の質量スペクトルを示す：図３３Ｂにおいて、観察可能なピーク強度の１００％は３３７５８.４Daで起こり、未反応物質より５５６Da大きい。本質量差異は、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８修飾ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬについて予測されるものである(図３１)。
【０３９９】
さらなる実施例において、Ｔｙｒ２４５４でＦＡＳ−ＴＥに取り込まれたＰＬＣを、０.５kDa、２.４kDaおよび２３kDaのＭＷの三種の異なる２−ＡＡＰ−ＰＥＧ類で誘導体化した。ＦＡＳ−ＴＥ一部位ＰＣＬ変異体を、実施例８に記載する通り、大腸菌内で約１６０mg／Ｌの収量で生成した(ｗｔ収量の〜８０％に対応)。ＦＡＳ−ＴＥ  Ｔｙｒ２４５４ＰＣＬ(ＰＢＳ中０.１６mM、ｐＨ７.５)のアリコートをＴＵ３２０５−０４４(０.５kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧ)、ＴＵ３２０５−０４８(２.４kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧ)およびＴＵ３２０５−０５２(２３kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧ)とモル比１０：１または１００：１で６日間、４℃または室温で反応させた。ＰＥＧ類の構造およびその合成は実施例３７に記載する。
【０４００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析(図３４)前に、過剰のＰＥＧ試薬を、Ｈｉｓタグ付加ＦＡＳ−ＴＥタンパク質をＮｉ−ＮＴＡビーズに結合させ、ビーズをＰＢＳ緩衝液で繰り返し洗浄して除去した。ゲルおよび質量分光分析について、過剰な緩衝液をＮｉ−ＮＴＡビーズから除去し、タンパク質をイミダゾール緩衝液で溶出した。具体的に、５０μLのＮｉ−ＮＴＡビーズを５０μLの反応混合物に添加し、２時間インキュベートし、反応混合物および緩衝液を遠心分離により分離した。次いでビーズを３回１mL  ＰＢＳで洗浄した；７０μLの２５０mM  イミダゾール緩衝液、２０mM  ＴＲＩＳ、ｐＨ８をビーズに添加して、ゲルおよび質量分光分析のためにタンパク質を溶出させた。０.５kDa２−ＡＡＰ−ＰＥＧでのペグ化はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解像可能ではなかったが、しかしながら質量分析を使用して確認された。反応の程度は１００：１  室温反応で約５７％であり、１００：１  ４℃反応で４３％であった(データは示していない)。大きな２−ＡＡＰ−ＰＥＧ類について、ペグ化生成物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解像できた(図３４)。全反応とも不完全であり、２.４kDaおよび２３kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧで約２５−３０％であった。ＰＣＬ部位での一部位コンジュゲーションおよび反応の程度は、２.４kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧについて質量分析で確認した(図３３)。２３kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧ誘導体化タンパク質の質量分析データは、ＰＥＧの不均一性のために得られなかった。
【０４０１】
報告された反応収率は、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ抽出強度が、ペグ化のＨｉｓタグに対する親和性が低い可能性があるため未反応ＦＡＳ−ＴＥの抽出に有利であり得るために、概算より低い(ＦＡＳ−ＴＥ  Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬでのペグ化の場合と同様；データは示していない)。しかしながら、抽出後のペグ化物質の検出は、ＰＣＬ−２−ＡＡＰ−ＰＥＧ架橋の安定性を証明する。
【０４０２】
実施例２０：種々の分子量の２−アミノ−アセトフェノン−ＰＥＧ類でのＦＧＦ２１に取り込まれたＰＣＬの誘導体化
本実施例は、種々の位置にＰＣＬが取り込まれたＦＧＦ２１を、２−ＡＡＰ−ＰＥＧ試薬でペグ化できることを示す。本実施例はまた、ペグ化ＦＧＦ２１変異体が未反応完全長ＦＧＦ２１および切断型ＦＧＦ２１から、イオン交換および分子ふるいクロマトグラフィーを組み合わせることにより分離できることも示す。
【０４０３】
リシン８４の位置にＰＣＬが取り込まれたＦＧＦ２１を、タンパク質をＴＥＶプロテアーゼ開裂に付さない以外、実施例１０に記載の通り大腸菌内で発現させ、再折りたたみおよび精製した。タンパク質貯蔵は、ＰＢＳ中約６.６mg／mLであり、約２０％の８４残基で切断されたＦＧＦ２１タンパク質切を含んだ。５μlのＦＧＦ２１貯蔵を４５μl  ２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液、ｐＨ５.０および０.５μlの１００mM  ＴＵ３２０５−０４４(２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８、実施例２０参照)貯蔵溶液と混合した。最終モル比は、１mM  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８対約３０μM  ＦＧＦ２１であった。反応を１６時間、室温で進行させ、終了させた。
【０４０４】
図３５Ａは、未反応ＦＧＦ２１の質量スペクトルを示し、図３５Ｂは反応混合物の質量スペクトルを示す：ペグ化反応は終了まで進み、２１７９２.４Daのタンパク質を生成し、未反応物質より５５６Da大きい。本質量差異は２−ＡＡＰ−ＰＥＧ８修飾ＦＧＦ２１について予測された。
【０４０５】
種々のＦＧＦ２１  ＰＣＬ変異体(実施例１０の通り発現させ、精製した)を、２３kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧ(ＴＵ３２０５−０５２、実施例３７−３参照)でペグ化した。典型的に、タンパク質濃度は１００〜４００μMであり、２３kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧを最終濃度ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７.４中１mMで添加した。反応を４℃で３日間インキュベートした。７種の代表的ＦＧＦ２１  ＰＣＬ変異体とのペグ化反応のＳＤＳ−ＰＡＧＥを図３６Ａに示し、完全長(ＦＬ)未反応ＦＧＦ２１および切断型(ＴＲ)ＦＧＦ２１から分離した８種の精製ペグ化ＦＧＦ２１タンパク質を図３６Ｂに示す。
【０４０６】
実施例２１：ＥＰＯに取り込まれたＰＣＬの２−アミノ−アセトフェノン−ＰＥＧ類での誘導体化
実施例６に記載する通り、マウスＥＰＯの種々の位置にＰＣＬを取り込んだ。Ｎｉ−ＮＴＡ精製後、ｍＥＰＯ構築物(＃６、＃９および＃１０変異体構築物)を、さらにＰＢＳ中Ｓ−３００ゲル濾過カラムで精製した。精製ｍＥＰＯタンパク質を約１mg／mlに濃縮した。活性化２３kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧ(ＴＵ３２０５−０５２、実施例３７−３参照)を精製タンパク質に１mMで添加し、表６に示す条件でインキュベートした。
【表３２】
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全ｍＥＰＯ構築物を、カラム内で単量体として流した。２３kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧを精製タンパク質とインキュベートしたとき、ｍＥＰＯは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６５kDaバンドとして移動したため、一部位でペグ化された(図３７)。反応効率は条件によって１０％〜１５％で変わり、ｐＨ５.５が、ｐＨ７およびｐＨ８.５と比較して高いペグ化程度をもたらした。加えて、４℃より高い温度はペグ化の程度を有意に高めなかった。
【０４０７】
実施例２２：ＨＲＢＰおよびＦＡＳ−ＴＥに取り込まれたＰＣＬのＤ−マンノサミンでの誘導体化。
本実施例は、２個の標的タンパク質に取り込まれたＰＣＬへのアミノ糖であるＤ−マンノサミン(mannosomine)の直接結合を証明する。本実施例は、ＰＣＬ含有タンパク質グリコシル化の一般的反応スキームを示す(図３８)。
【０４０８】
ヒトＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬ(変異体＃６)を、実施例２の通りＨＥＫ２９３Ｆ細胞で生成した。１０μLの１７０μMタンパク質貯蔵を８９μL  １０×ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７.５に添加し、１μlの１Ｍ  Ｄ−マンノサミンと混合した。ｈＲＢＰ４  Ｐｈｅ１２２ＰＣＬタンパク質(１７μM)を１０mM  Ｄ−マンノサミンと１４時間、室温で(反応観察されず)、続いて４８時間、３７℃でインキュベートした。図３９は、３７℃インキュベーション期間後の反応混合物の質量スペクトルを示す。２３１６５.６Daでの未反応ｈＲＢＰ４の予測ピーク(予測２３１６６Da)に加えて、推定上Ｄ−マンノサミン付加物に割り当てられるピークが２３３００.０Daで観察される。１６４.４Daの質量増加は、図３８に記載する推定反応産物について予測される１６１.１Da増加と同一ではないが近似する。加えて、一部のタンパク質が２１００７.８Daで検出される化学種に分解する。
【０４０９】
第二実施例において、実施例８のとおり大腸菌内で発現させ、生成した２２２２位をＰＣＬで修飾されたＦＡＳ−ＴＥ(１１μM)を、１０mM  Ｄ−マンノサミンと７２時間、室温でインキュベートした。未反応サンプルの質量スペクトルを図４０Ａに示し、未反応タンパク質に対応する３３２５０.４Daの予測シグナルおよびサンプル内の汚染タンパク質に起因する３３３６０.４Daでのピークを含む。反応混合物の質量分析は、未反応タンパク質に対応する３３２５０.４Daでの予測シグナルを示す(図４０Ｂ)。さらなるピークが３３４０８.８Da、１５８.４Daで見られ、出発物質より大きく、恐らく図３７に示す反応産物のものである。これら２個のサンプルの比較により、これらの反応条件下で、約５０％の収率でのＦＡＳ−ＴＥ  Ｌｅｕ２２２２ＰＣＬからＤ−マンノサミン付加物への変換が示唆される。
【０４１０】
実施例２３：ＦＧＦ２１のＰＣＬ仲介共有結合的架橋
本実施例は、タンパク質が、二官能性ＰＣＬ特異的クロスリンカーを介して共有結合的に二量体化できることを証明する。リシン８４にＰＣＬが取り込まれたＦＧＦ２１を、タンパク質をＴＥＶプロテアーゼ開裂に付さなかった以外実施例１０に記載の通り大腸菌内で発現させ、再折りたたみおよび精製した。ＦＧＦ２１  Ｌｙｓ８４ＰＣＬをクロスリンカーＴＵ６３３−０１０で誘導体化した(図４３Ａ；合成について実施例３７−４参照)。タンパク質貯蔵はＰＢＳ中約６.６mg／mLであり、約２０％の残基８４で切断されたＦＧＦ２１タンパク質を含んだ。５μlのＦＧＦ２１貯蔵を４５μl  ２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液、ｐＨ５.０と混合した。クロスリンカーＴＵ６３３−０１０の０.１μlの５mM貯蔵溶液(ＤＭＳＯ中)を最終濃度１０μMクロスリンカーおよび約３０μM  ＦＧＦ２１で添加した。同様にＰＢＳ中の５０μlのＦＧＦ２１貯蔵溶液、ｐＨ７.４を１μlの５mM  ＴＵ６３３−０１０と１００μMクロスリンカーおよび約３００μM  ＦＧＦ２１の濃度で反応させた。２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液で希釈したＦＧＦ２１サンプルを対照として調製し、同様に処理した。１６時間、室温の後、反応サンプルおよび対照サンプルのアリコートを精製せずに質量分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により分析した。ｐＨ５.０サンプルから得られた質量スペクトル(図４３Ｂ)は、共有結合的二量体の予測質量(４３０３７.２Da；全ＦＧＦ２１ピークの相対的強度５３％)、一端にクロスリンカーが結合したＦＧＦ２１の予測質量(２１８２０.０Da；３３％)および未反応ＦＧＦ２１(２１２３５.２Da；１４％)でのピークを明らかに示した。ｐＨ７.４サンプルについて、共有結合的二量体は検出されない；２８％のＦＧＦ２１がクロスリンカーと一反応するが、ほとんどのタンパク質が未反応である(データは示していない)。
【０４１１】
反応体対タンパク質濃度の調製は、さらに共有結合的二量体の収量を増加させた。具体的に、１０μlのＦＧＦ２１貯蔵を９０μl  ２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液、ｐＨ５.０と反応させた。クロスリンカーＴＵ６３３−０１０の０.３μlのmM貯蔵溶液(ＤＭＳＯ中)を最終濃度１５μMクロスリンカーおよび約３０μM  ＦＧＦ２１で添加した。第一サンプルを４日間、室温でインキュベートし、第二サンプルを４℃でインキュベートした。１０×ＰＢＳ、ｐＨ７.５中のサンプルも同様に調製し、インキュベートした。室温でインキュベートしたｐＨ５.０サンプルについて、４３０３４.４Daの予測質量での共有結合的ＦＧＦ２１二量体のピークが優占種であり、未反応ＦＧＦ２１は２１２３３.６Daで検出されない。幾分かの結合したクロスリンカーの一端が修飾されたＦＧＦ２１が２１８１８.４Daで検出された(図４４Ａ)。本反応は、約１９％のＦＧＦ２１が未反応であったためｐＨ５.０および４℃で同程度まで進行しない；４０％が結合したクロスリンカーの一端が修飾され、マススペクトルピーク強度の約４１％が共有結合的二量体のものである。ｐＨ７.５での反応は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示す通り共有結合的二量体を何も形成しなかった(図４４Ｂ)。
【０４１２】
他の多様な分子でのピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)含有タンパク質の部位特異的修飾。
他の態様において、ここで提供される２−アミノベンズアルデヒド(ＡＢＡ)コンジュゲートおよび２−アミノアセトフェノン(ＡＡＰ)コンジュゲートのＰＣＬ含有タンパク質との結合を、１０×リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中、ｐＨ７.０および２５℃で行った。コンジュゲーション反応を１０μM  ＰＣＬ含有タンパク質および１００μM  ＡＢＡ／ＡＡＰコンジュゲートの添加により開始させた。タンパク質コンジュゲートの完全な形成をエレクトロスプレーイオン化−質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ)またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化(ＭＡＬＤＩ)により確認した。ＡＢＡ／ＡＡＰ  ＤＮＡコンジュゲートの結合を、ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用するゲルシフトアッセイにより分析した。定量的結合後、タンパク質コンジュゲートを１０mM  ナトリウムリン酸緩衝液(ｐＨ７.５)に対して透析し、１０kDaカットオフ(Millipore Corporation, Bedford, MA)のAmicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unitを使用して１００μMに濃縮した。新たに調製した２００mM  ＮａＣＮＢＨ３の溶液(１０mMリン酸緩衝液、ｐＨ７.５に溶解)を次いで最終濃度２０mMで添加した。還元反応を２−４時間、２５℃進行させた後、反応を６容積の１０mM  ナトリウムリン酸緩衝液(ｐＨ７.５)の添加により停止させた。ＮＡＰ−５カラムまたはＰＤ１０カラム(GE Healthcare、Piscataway, NJ)を使用して、還元タンパク質コンジュゲートを最後に所望の緩衝液に緩衝液交換した。ここで使用するかかる２−アミノベンズアルデヒド(ＡＢＡ)コンジュゲートおよび２−アミノアセトフェノン(ＡＡＰ)コンジュゲートの種々のタンパク質への結合の例を以下示すが。これらに限定されない。
【０４１３】
実施例２４：ビオチン剤の結合
ビオチンが取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質と結合できることを証明するために、ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１２参照)を、ＡＢＡ−ビオチン剤(Ｘ３６２６−１４０、実施例４０)を使用してビオチンとコンジュゲートさせた。ビオチンの結合を以下の通り行った、５００μM  ＡＢＡ−ビオチンをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.０)および０.５％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ中の１０μM  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬに添加し、２５℃で１６時間反応させた。ビオチンコンジュゲートの完全な形成をＥＳＩ−ＭＳで確認した(図４７Ａ；非結合タンパク質の予測質量＝７２９６；結合タンパク質の予測質量＝７９０２)。
【０４１４】
定量的結合後、新たに調製した２００mM  ＮａＣＮＢＨ３の溶液(ＰＢＳ、ｐＨ７.０に溶解)を最終濃度２０mMまで添加した。還元反応を３時間、２５℃で進行させた後、反応を６容積のＰＢＳ(ｐＨ７.０)添加により停止させた。過剰なＮａＣＮＢＨ３をSlide-A-Lyzer透析カセット(３,５００Da分子量カットオフ、Pierce)を使用するＰＢＳ(ｐＨ７.０)に対する、４℃での透析により除去した。還元ビオチンコンジュゲートを３.５kDaカットオフ(Millipore Corporation)のAmicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unitを使用して濃縮した。ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル(Invitrogen)を通した電気泳動後、ビオチニル化タンパク質をポリビニリデンジフルオライド(ＰＶＤＦ)膜にiBlot Gel Transfer System(Invitrogen)を使用して移した。次いでビオチンコンジュゲートをホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)接合ヤギ抗ビオチン抗体(１：１００希釈、Cell Signaling Technologies)を使用して検出し、Hyperfilm ECL(GE Healthcare)で可視化した(図４７Ｂ)。非結合ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬおよびフルオレセイン−コンジュゲートｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬはネガティブコントロールとして働いた。レーン１、２０pmol  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−ビオチンコンジュゲート；レーン２、８pmol  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−ビオチンコンジュゲート；レーン３、２nmｏｌ  ｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬ；レーン４、２０pmol  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−フルオレセインコンジュゲート。
【０４１５】
実施例２５：蛍光分子結合
蛍光分子が取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質に結合できることを証明するために、ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１２参照)を、ＡＢＡ−フルオレセイン剤(３７９３−０５０、実施例４２参照)を使用してフルオレセインとコンジュゲートさせた。フルオレセインの結合を次の通り行った、１mMのＡＢＡ−フルオレセインをリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.０)および０.５％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ中の１０μM  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬに添加し、２５℃で１６時間反応させた。フルオレセインコンジュゲートの形成をＥＳＩ−ＭＳにより確認した(図４７Ｃ；非結合タンパク質の予測質量＝７２９６；結合タンパク質の予測質量＝８０６２)。
【０４１６】
フルオレセインコンジュゲートを２０mM  ＮａＣＮＢＨ３で３時間、２５℃で還元した。還元反応を６容積のＰＢＳ(ｐＨ７.０)で停止後、残存ＮａＣＮＢＨ３をSlide-A-Lyzer透析カセット(３,５００Da分子量カットオフ、Pierce)を使用するＰＢＳ(ｐＨ７.０)に対する、４℃での透析により除去した。次いで、コンジュゲートを３.５kDaカットオフのAmicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unitを使用して１μMに濃縮した。１μM  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−フルオレセインおよび１０μM  ＡＢＡ−フルオレセインの３５０−７００nmの範囲の吸光度スペクトルをSpectraMax Plus(Molecular Devices)を使用して得た。両方とも５００nmで最大の吸光度であった。
【０４１７】
次いで、蛍光スペクトルをSpectraMax GEMINI蛍光光度計(Molecular Devices)で記録した。１μM  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−フルオレセインおよび１０μM  ＡＢＡ−フルオレセインの放出スペクトルを、４９０nmの励起波長を維持し、その間に２nmの刻み幅を使用して５１０nm〜７５０nmの放出波長を走査することにより得た。両方とも５２２nmで最大の放出であった。加えて、１μM  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ−ＡＢＡ−フルオレセインおよび１０μM  ＡＢＡ−フルオレセインの励起スペクトルを放出波長を５２２nmに維持し、その間に２nmの刻み幅を使用して３００nm〜５１０nmの励起波長を走査することにより得た。
【０４１８】
実施例２６：多糖類結合
多糖類が取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質に結合できることを証明するために、ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１２参照)を、ＡＢＡ−二糖類(３７９３−０５０；実施例４２、ＭＷ  ５４６.５２)を使用して二糖類とコンジュゲートした。結合反応を、１mM  ＡＢＡ−二糖類のＰＢＳおよび１％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ、ｐＨ７.０中の１０μM  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ変異体タンパク質に添加することにより開始した。反応を室温で１６時間進行させ、ＥＳＩ−ＭＳにより分析した(図４７Ｄ)。質量スペクトルは、コンジュゲートタンパク質の予測質量で主ピークを示す(７８２５Da)。非結合タンパク質の質量は７２９６Daである。
【０４１９】
実施例２７：免疫調節剤の結合：モノ−ニトロフェニルハプテンコンジュゲート
免疫調節剤が取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質に結合できることを証明するために、ｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬおよびｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１１および１２参照)を、ＡＢＡ−モノ−ニトロフェニルハプテン剤(３７９３−００１、実施例３８−８)を使用してモノ−ニトロフェニルハプテンと結合させた。モノ−ニトロフェニルハプテンコンジュゲートの結合を上記の通り行った。図４８Ａは、ｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬにコンジュゲートした３７９３−００１のＥＳＩマススペクトルであり(非結合タンパク質の予測質量＝１９２７５；結合タンパク質の予測質量＝１９６１４)、図４８ＢはｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬにコンジュゲートした３７９３−００１のＥＳＩマススペクトルである(非結合タンパク質の予測質量＝７２９６；結合タンパク質の予測質量＝７６３５)。
【０４２０】
実施例２８：免疫調節剤の結合：ジ−ニトロフェニルハプテンコンジュゲート
免疫調節剤が取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質に結合できることを証明するために、ｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬおよびｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１１および１２参照)を、ジ−ニトロフェニルハプテン(ＴＵ３６２７−０８８、実施例３８−７)を使用してジ−ニトロフェニルハプテンとコンジュゲートした。ジ−ニトロフェニルハプテンコンジュゲートの結合を上記の通り行った。図４８Ｃは、ｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬにコンジュゲートしたＴＵ３６２７−０８８のＥＳＩマススペクトルであり(非結合タンパク質の予測質量＝１９２７５；結合タンパク質の予測質量＝１９６８８)、図４８ＤはｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬにコンジュゲートしたＴＵ３６２７−０８８のＥＳＩマススペクトルである(非結合タンパク質の予測質量＝７２９６；結合タンパク質の予測質量＝７７０９)。
【０４２１】
実施例２９：免疫調節剤の結合：ＴＬＲ７アゴニスト
免疫調節剤が取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質に結合できることを証明するために、ｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬ(実施例１２参照)を、ＡＢＡＴＬＲ７アゴニスト剤(Ｘ３６７８−１１４；実施例３８−３参照)を使用して、ＴＬＲ７アゴニストとコンジュゲートした。結合反応を、１００μM  ＡＢＡ−ＴＬＲ７アゴニストの、２００mM  ナトリウム酢酸緩衝液および１％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ、ｐＨ４.５中の１０μM  ｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬ変異体タンパク質への添加により行った。反応を室温で１６時間進行させ、ＥＳＩ−ＭＳにより分析した(図４９Ａ)。質量スペクトルは、コンジュゲートタンパク質の予測質量で主ピークを示し(８７６３Da)、非結合タンパク質の質量は７２９６Daである。
【０４２２】
実施例３０：免疫調節剤の結合：ＰＡＤＲＥペプチド
免疫調節剤およびペプチドが取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質に結合できることを証明するために、ｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬおよびｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１１および１２参照)をＰＡＤＲＥペプチドと結合させた。ＰＡＤＲＥペプチドの結合を、“他の多様な分子でのピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)含有タンパク質の部位特異的修飾”なる副題のすぐ下の段落に記載する通り行った。図５０Ａは、ｐＨ５.０で、ＰＸ２−ＰＡＤＲＥとコンジュゲートしたｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析であり(３４６５−１４３；実施例３８−１１参照)、図５０Ｂは、ｐＨ７.５でＰＸ２−ＰＡＤＲＥとコンジュゲートしたｍＴＮＦ−Ｑ２１ＰＣＬのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析である。非結合タンパク質の予測質量は１９２７５Daであり、結合タンパク質の予測質量は２０８４２Daである。図５０Ｃは、ＢＨＡ−ｅｘＰＡＤＲＥとコンジュゲートしたｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析である(３６４７−１０４；実施例３８−１０参照)。ここで、非結合タンパク質の予測質量は１９２７５Daであり、結合タンパク質の予測質量は２１３１７Daである。加えて、図５１は、ＢＨＡ−ｅｘＰＡＤＲＥのｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬへの結合を示すＥＳＩ質量スペクトルである(非結合タンパク質の予測質量７２９６Da；結合タンパク質の予測質量９３３８Da)。
【０４２３】
実施例３１：免疫調節剤の結合：リン脂質
免疫調節剤およびリン脂質が取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質と結合できることを証明するために、ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１２参照)を、ＡＢＡリン脂質剤(ＴＵ３６２７−０９２；実施例４３−１)を使用してリン脂質(ＤＯＰＥ)とコンジュゲートした。ＡＢＡ−ＤＯＰＥのｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(ＭＷ＝７２９６Da)への結合を、２０mM  ＨＥＰＥＳ(ｐＨ７.０)および１％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ中、２５℃で１６時間行った。コンジュゲーション反応を、１０mM  ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬおよび１００mM  ＡＢＡ−ＤＯＰＥの添加により開始した。タンパク質コンジュゲートの形成を、ＤＯＰＥのｍＥＧＦ−Ｙ１０ＰＣＬへのコンジュゲーションのエレクトロスプレーイオン化−質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ)解析により確認した(図４９Ｂ；非結合タンパク質の予測質量＝７２９６；コンジュゲートタンパク質の予測質量＝８２２７Da)。
【０４２４】
実施例３２：オリゴヌクレオチドのタンパク質への結合：ＣｐＧペプチド
オリゴヌクレオチドおよびＣｐＧ免疫調節剤が、取り込まれた１個以上のＰＣＬ部分を有するタンパク質に結合できることを証明するために、ｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬおよびｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(実施例１１および１２参照)を、ＣｐＧ剤ＢＨＡ−ＢＧ１(３６４７−０５７；実施例３８−１２参照)またはＣｐＧ剤ＢＨＡ−ＢＧ２(３５９７−１６７；実施例３８−１４参照)のいずれかを使用して、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした。ＣｐＧオリゴヌクレオチドの結合を、“他の多様な分子でのピロリン−カルボキシ−リシン(ＰＣＬ)含有タンパク質の部位特異的修飾”なる副題のすぐ下の段落に記載する通り行った。ＢＨＡ−ＢＧ１(７.４kDa)およびＢＨＡ−ＢＧ２(７.４kDa)のｍＴＮＦ−Ｇｌｎ２１ＰＣＬ(１９.３kDa)への結合を、ゲルシフトアッセイにより確認し(図５２Ａ)、ＢＨＡ−ＢＧ２(７.４kDa)のｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ(７.２kDa)への結合をまたゲルシフトアッセイによって確認した(図５２Ｂ)。
【０４２５】
実施例３３：反応性ピロリシン類似体の合成
実施例３３−１：(Ｓ)−２−アミノ−６−(３−オキソブタンアミド)ヘキサン酸ヒドロクロライド(ＴＵ３０００−０１６)の合成
【化４７】
0005542832.tif 000080
(Ｓ)−メチル６−アミノ−２−(２,２,２−トリフルオロアセトアミド)ヘキサノエートヒドロクロライド(ＴＵ２９８２−１２６)を、ＨＣｌ塩を得るためにＣｂｚ基の除去がＨＣｌ存在下で実施したこと以外、Bing Hao et al., ChemBio 2004, 11, 1317-24その補足物に記載される方法に従い製造した。
【０４２６】
(Ｓ)−メチル６−アミノ−２−(２,２,２−トリフルオロアセトアミド)ヘキサノエートヒドロクロライド(０.９４３ｇ、３.２２mmol)、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＥＡ、１.３９mL)およびジクロロメタン(ＤＣＭ、１０mL)に、４０mL  ガラスバイアル中、ジケテン(０.３７mL)をＮ２雰囲気下添加し、反応を環境温度で１６時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル(ＥｔＯＡ)で希釈し、連続的にＨ２Ｏ、１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３、および飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残留物をＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィーで精製して、(Ｓ)−メチル−６−(３−オキソブタンアミド)−２−(２,２,２−トリフルオロアセトアミド)ヘキサノエート(ＴＵ３０００−０１２)を黄色油状物として得た。MS (ESI+)：計算値341.12, 実測値341.10 (MH+). H-NMR (400 MHz, CDCl3)：1.33 (2H, m), 1.55 (2H, m), 1.89 (2H, m), 2.259(3H, s), 3.31 (2H, m), 3.410 (2H, s), 3.783 (3H, s), 4.543 (1H, dt, J=4.4, 8.0 Hz). 7.091 (1H, br.s), 7.279 (1H, br.d, J=7.6 Hz). F-NMR (376 MHz, CDCl3)：-75.609。
【０４２７】
(Ｓ)−メチル６−(３−オキソブタンアミド)−２−(２,２,２−トリフルオロアセトアミド)ヘキサノエート(０.７３６ｇ、２.１６mmol)を１Ｎ水性ＮａＯＨ(６.５mL)および１０mL  Ｈ２Ｏで、環境温度で１８時間処理した。ＬＣ−ＭＳ解析を使用して、反応の終了を確認した。反応混合物を減圧下濃縮した。残留物を過剰な１Ｎ水性ＨＣｌで処理し、減圧下濃縮乾固して、(Ｓ)−２−アミノ−６−(３−オキソブタンアミド)ヘキサン酸ヒドロクロライド(ＴＵ３０００−０１６)を得た。MS (ESI+)：計算値231.13, 実測値231.10 (MH+)。
【０４２８】
実施例３３−２：(Ｓ)−５−(４−アセチルベンズアミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−００４)の合成
【化４８】
0005542832.tif 000081
(Ｓ)−メチル６−アミノ−２−(２,２,２−トリフルオロアセトアミド)ヘキサノエートヒドロクロライド(ＴＵ２９８２−１２６)(３０３mg、１.０３mmol)、４−アセチル安息香酸(１９０mg)、ＨＡＴＵ(４１８mg)、ＤＩＥＡ(５２３μL)およびＤＭＦ(８mL)を合わせ、環境温度で１８時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡで希釈し、Ｈ２Ｏ、１Ｎ  ＨＣｌ、Ｈ２Ｏ、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３、および飽和水性ＮａＣｌで連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残留物をＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィーで精製して、(Ｓ)−メチル−６−アミノ−２−(２,２,２−トリフルオロアセトアミド)ヘキサノエートヒドロクロライド(ＴＵ２９８２−１３６)を得た。MS (ESI+)：計算値403.14, 実測値403.20 (MH+). H-NMR (400 MHz, CDCl3)：1.44 (2H, m), 1.68 (2H, m), 1.90 (1H, m), 2.00 (1H, ) 2.64 (3H, s), 3.31 (2H, m), 3.50 (2H, m), 3.80 (3H, s), 4.60 (1H, dt, J=4.8, 7.6 Hz). 6.35 (1H, br.s), 7.21 (2H, br.d, J=7.64 Hz), 7.86 (21H, d, J=8.4 Hz), 8.01 (2H, d, J=8.8 Hz). F-NMR (376 MHz, CDCl3)：-75.625。
【０４２９】
(Ｓ)−メチル６−(４−アセチルベンズアミド)−２−(２,２,２−トリフルオロアセトアミド)ヘキサノエート(ＴＵ２９８２−１３６)(０.４７３ｇ)を、１０mL  ＭｅＯＨ中１Ｎ水性ＮａＯＨ(２.３６mL)で環境温度で１８時間処理した。ＬＣ−ＭＳ解析を使用して、トリフルオロアミド部分をそのまま残しながらメチルエステルの加水分解が終了するのを確認した。反応を６０℃で５時間加熱し、その時点でアミド加水分解ＬＣ−ＭＳ解析でほとんど終了したことが示された。反応混合物を冷却し、減圧下濃縮した。残留物を過剰な１Ｎ水性ＨＣｌで処理し、減圧下濃縮乾固して、((Ｓ)−５−(４−アセチルベンズアミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−００４)を僅かに黄色の固体として得た。MS (ESI+)：計算値293.14, 実測値293.20 (MH+)。
【０４３０】
実施例３３−３：((Ｓ)−５−(５−アセチルチオフェン−２−カルボキサミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−００６)、(Ｓ)−５−(３−アセチルベンズアミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−００８)、および(Ｓ)−５−(４−アセチル−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−０１０)の合成
【化４９】
0005542832.tif 000082
(Ｓ)−５−(５−アセチルチオフェン−２−カルボキサミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−００６)、(Ｓ)−５−(３−アセチルベンズアミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−００８)、および(Ｓ)−５−(４−アセチル−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボキサミド)−１−カルボキシペンタン−１−アミニウムクロライド(ＴＵ３０００−０１０)を、４−アセチル安息香酸の代わりに対応する酸類を使用する以外、ＴＵ３０００−００４と同じ方法で製造した。使用した酸はＴＵ３０００−００６、ＴＵ３０００−００８、およびＴＵ３０００−０１０についてそれぞれ４−アセチル−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−カルボン酸、５−アセチルチオフェン−２−カルボン酸および３−アセチル安息香酸であった。TU3000-006：MS(ESI+)：m/z 293.20 (MH+)；TU3000-008：MS(ESI+)：m/z 299.10 (MH+)；およびTU3000-010：MS(ESI+)：m/z 296.20 (MH+)。
【０４３１】
実施例３３−４：(Ｓ)−２−アミノ−６−(３−オキソシクロブタンカルボキサミド)ヘキサン酸(ＴＵ３２０５−０３０)の合成。
【化５０】
0005542832.tif 000083
ヨードメタン(２.０mL)、Ｋ２ＣＯ３(５.６０ｇ)、(Ｓ)−６−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸(１)(NovaBiochem、Ａ２９３４０)、および無水ＤＭＦ(２０mL)を合わせ、環境温度で２時間撹拌した。反応混合物を水性後処理(work-up)に付して、(Ｓ)−メチル６−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエート(ＴＵ３０００−０９０)を透明油状物として得た。MS (ESI+)：計算値417.20, 実測値417.20 (MNa+), 計算値295.16, 実測値295.209((M-Boc)H+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：1.372 (2H, m), 1.425 (9H, s), 1.515 (2H, m), 1.623 (1H, m), 1.785 (1H, br.s), 3.175(2H, m), 3.723 (3H, s), 4.284 (1H, m), 4.848 (1H, br.s), 5.084 (3H, overlapping br.s and s), 7.344 (5H, m). C-NMR (100MHz, CDCl3)：22.340, 28.268, 29.307, 32.313, 40.569, 52.272, 53.099, 66.597, 79.897, 128.061, 128.100, 128.471, 136.519, 155.435, 156.426, 173.230。
【０４３２】
(Ｓ)−メチル６−(ベンジルオキシカルボニルアミノ)−２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエート(８.６０ｇ)１５０mL  ＭｅＯＨ中、５％パラジウム活性化炭素(１.０８ｇ)で、１気圧水素下環境温度で３時間水素化した。消費した触媒をセライトパッドを通す真空濾過により除去し、パッドをＭｅＯＨで洗浄した。合わせた濾液および洗液を減圧下で濃縮して、(Ｓ)−メチル６−アミノ−２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエート(ＴＵ３０００−１２８)を透明粘性油状物として得た。MS (ESI+)：計算値261.17, 実測値261.20 (MH+). H-NMR (600MHz, CDCl3)：1.328 (2H, m), 1.375 (9H, s), 1.390 (2H, m), 1.55 (1H, m), 1.74(1H, m), 2.623(2H, d, J=6.9Hz), 3.671 (3H, s), 4.237 (1H, m), 5.007 (1H, m)。
【０４３３】
２０mL  ＤＭＦ中の(Ｓ)−メチル６−アミノ−２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエートの１Ｍ貯蔵溶液を製造し、使用した。２mLアリコートの(Ｓ)−メチル６−アミノ−２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサノエート貯蔵溶液、３−オキソシクロブタンカルボン酸(２)(Parkway *BX-102、２８３mg)、ＨＡＴＵ(８００mg)、ＤＩＥＡ(１.０mL)および８mL  ＤＭＦを４０mL  ガラスバイアルで合わせ、環境温度で一夜撹拌した。ＬＣ−ＭＳ解析で反応の終了を確認した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水、飽和水性ＮａＣｌで連続的に洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗物質をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン／ＥｔＯＡｃ)で精製して、(Ｓ)−メチル２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)−６−(３−オキソシクロブタンカルボキサミド)ヘキサノエート(ＴＵ３０００−１４０)を透明粘性油状物として得た。MS (ESI+)：計算値379.18, 実測値379.20 (MNa+), 計算値257.15, 実測値257.20((M-Boc)H+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.245 (4H, m), 1.371 (9H,s), 1.579 (2H, m), 3.065 (3H, m), 3.135 (4H, m), 3.608 (3H, s), 3.895 (1H, m), 7.209 (1h, d, J=8.0Hz), 8.123 (1H, t, J=5.4Hz). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：22.850, 27.185, 28.111, 28.551, 30.209, 38.276, 50.859, 51.639, 53.412, 53.529, 78.137, 155.507, 172.992, 173.167, 205.576。
【０４３４】
(Ｓ)−メチル２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ)−６−(３−オキソシクロブタンカルボキサミド)ヘキサノエート(０.５０１ｇ)を１,４−ジオキサン中２０mL  ４Ｍ  ＨＣｌで環境温度で２０分間処理し、溶媒を減圧下除去した。得られた粘性油状物を１０mL  ＣＨ３ＣＮに取り込み、小規模で製造した表題化合物の結晶の少量を種晶添加した。得られた結晶を真空濾過により回収し、ＣＨ３ＣＮで洗浄し、減圧下乾燥させて、(Ｓ)−メチル２−アミノ−６−(３−オキソシクロブタンカルボキサミド)ヘキサノエート(ＴＵ３２０５−０１６)を無色固体として得た。MS (ESI+)：計算値257.15, 実測値257.20 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.267 (1H, m), 1.419 (3H, m), 1.753 (2H, m), 3.114 (7H, m), 3.752 (3H, m), 4.023 (1H, t, J=6.4Hz), 8.169 (1H, t, J=5.5Hz), 8.365 (3H, br.s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：21.499, 27.160, 28.390, 29.548, 38.067, 50.858, 51.721, 52.727, 169.949, 173.034, 205.586。
【０４３５】
(Ｓ)−メチル２−アミノ−６−(３−オキソシクロブタンカルボキサミド)ヘキサノエート(０.２９７ｇ)および１８mL  Ｈ２Ｏを４０mL  ガラスバイアルに入れた。得られた透明溶液に、２.２mL  １Ｎ  ＮＨ４ＯＨを添加し、反応を環境温度で２２時間振盪させ、その時点でＬＣＭＳ解析で反応の終了を確認した。反応混合物を凍結および凍結乾燥させて、(Ｓ)−２−アミノ−６−(３−オキソシクロブタンカルボキサミド)ヘキサン酸(ＴＵ３２０５−０３０)を無色結晶として得た。MS (ESI+)：m/z 243.20 (MH+)。
【０４３６】
実施例３４：反応性ピロリシン中間体の合成
実施例３４−１：リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０４２)の合成
【化５１】
0005542832.tif 000084
１−(４−ヒドロキシ−２−ニトロフェニル)エタノン(Carbocore、１８１mg、１.００mmol)、エチル２−ブロモアセテート(１８３mg、１.１０mmol)、炭酸カリウム(１３８mg。１.００mmol)およびＤＭＦ(５mL)を２０mL  ガラスバイアルで合わせ、６０℃で２時間撹拌し、その時点でＬＣ−ＭＳ解析により明瞭な反応の終了が示された。反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄した。反応を１−(４−ヒドロキシ−２−ニトロフェニル)エタノン(０.８０２ｇ、４.４３mmol)、エチル２−ブロモアセテート(０.８１３ｇ、４.８７mmol)、炭酸カリウム(０.６１２ｇ、４.４３mmol)およびＤＭＦ(２５mL)を使用して繰り返し、同じ方法で後処理した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出物を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、エチル２−(４−アセチル−３−ニトロフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０３４)を暗黄色油状物として得た。MS (ESI+)：計算値268.07, 実測値268.10 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：1.317 (3H, t, J=7.2 Hz), 2.512 (3H, s), 4.294 (2H, q, J=7.2 Hz), 4.722 (2H, s), 7.192 (1H, dd, J=8.4 Hz, 2.4 Hz), 7.455 (1H, d, J=8.4 Hz), 7.462 (1H, d, J=2.8 Hz). C-NMR (100 MHz, CDCl3)：14.133, 29.695, 61.922, 65.499, 110.105, 119.735, 129.461, 130.154, 147.793, 159.356, 167.474, 198.352。
【０４３７】
エチル２−(４−アセチル−３−ニトロフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０３４)(１１１mg)のＭｅＯＨ(５mL)溶液を、１０％パラジウム炭(１１mg)を使用して、大気圧のＨ２存在下、環境温度で水素化した。３０分間後、ＬＣ−ＭＳ解析により明らかな反応の終了が確認された。反応をＴＵ３２０５−０３４(１.４５ｇ)、１０％パラジウム炭(１４０mg)、およびＭｅＯＨ(８０mL)を使用して繰り返した。二つの反応混合物を合わせ、消費した触媒をセライドパッドを通す濾過により除去した。濾液を減圧下で濃縮して、エチル２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０３６)を暗黄色油状物として得た。MS (ESI+)：計算値238.10, 実測値238.10 (MH+). H-NMR (400 MHz, CDCl3)：1.295 (3H, t, J=7.0 Hz), 2.507 (3H, s), 4.269 (2H, q, J=7.2 Hz), 4.603 (2H, s), 6.047 (1H, d, J=2.8 Hz), 6.236 (1H, dd, J=8.8 Hz, 2.8 Hz), 6.396 (2H, br.s), 7.647 (1H, d, J=9.2 Hz). C-NMR (100 MHz, CDCl3)：14.135, 27.658, 61.532, 64.939, 100.237, 104.030, 113.586, 134.286, 152.468, 162.294, 168.310, 199.055。
【０４３８】
エチル２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０３６)(１.０２ｇ)をＴＨＦ(１７mL)に溶解し、水性ＬｉＯＨ(１Ｍ、４.３mL)で環境温度で１時間処理した。ＬＣ−ＭＳ解析により明瞭な反応の終了が示された。反応混合物を減圧下濃縮して、リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０４２)を帯黄色固体として得た。MS (ESI+)：遊離酸の計算値210.10, 実測値210.10 (MH+)。
【０４３９】
実施例３４−２：リチウム２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)アセテート(ＴＵ３６２７−０１８)の合成。
【化５２】
0005542832.tif 000085
４−メトキシ−２−ニトロベンズアルデヒド(Carbocore、ＣＯ−０１１９、５.５ｇ)および２００mL  ＤＣＭに、５００mL丸底フラスコ中、三臭化ホウ素(２４ｇ)を、氷上で冷却しながら滴下した。反応をその温度で３０分間および環境温度で３時間撹拌した。反応混合物を注意深く氷水に注ぎ、環境温度で３日間静置した。水性混合物をＥｔＯＡｃで抽出し、飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗物質をＳｉＯ２ゲルフラッシュクロマトグラフィーでヘキサン中２０〜６０％ＥｔＯＡｃの直線勾配を使用して精製して(Ｒｆ. ０.３２、５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)、ＴＵ３６２７−００２をオレンジ色結晶として得た。MS (ESI+)：計算値168.02, 実測値168.10 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 7.211 (1H, dd, J=2.4, 8.4Hz), 7.362 (1H, d, J=2.4Hz), 7.866 (1H, d, 8.8Hz), 9.998 (1H, s), 11.466 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：δ 110.726, 119.683, 120.770, 132.616, 151.225, 162.650, 187.885。
【０４４０】
ＴＵ３６２７−００２(１.８７ｇ)、エチルブロモアセテート(Aldrich、１.５mL)、炭酸カリウム(２.３２ｇ)およびＤＭＦを合わせ、環境温度で１８時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水に分配した。有機層を分離し、飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗物質をＳｉＯ２ゲルフラッシュクロマトグラフィーで、ヘキサン中５〜３５％ＥｔＯＡｃの直線勾配を使用して精製して(Ｒｆ. ０.３２、３５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)、ＴＵ３６２７−００８を暗黄色油状物として得た。MS (ESI+)：計算値254.1, 実測値254.1 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 1.304 (3H, t, J=7.0Hz), 4.285 (2H, q, J=7.2Hz), 4.767 (2H, s), 7.233 (1H, dd, 2.0, 8.4Hz), 7.522 (1H, d, J=2.4Hz), 7.967 (1H, 8.4Hz), 10.286 (1H, s). C-NMR (100MHz, CDCl3)：δ 14.082, 61.971, 65.482, 69.302, 110.427, 119.520, 124.321, 131.525, 151.286, 161.66, 167.172, 186.841。
【０４４１】
ＴＵ３６２７−００８をMerlic(C.A.Merlic et al., J.Org.Chem., 1995, 60, 3365-69)に記載の方法により還元した。具体的に、ＴＵ３６２７−００８(１.７１７ｇ)、鉄粉(３.７９ｇ)、ＥｔＯＨ(４５mL)、Ｈ２Ｏ(１１mL)および濃ＨＣｌ(１８０μL)を合わせ、２時間加熱還流した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで溶媒Ａ中５〜６０％溶媒Ｂの直線勾配を使用して精製して(溶媒Ａ：５％ＮＥｔ３のヘキサン溶液；溶媒Ｂ：５％ＮＥｔ３のＥｔＯＡｃ溶液)(Ｒｆ. ０.３４、３５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)、ＴＵ３６２７−０１４を明黄色結晶として得た。MS (ESI+)：計算値224.10, 実測値224.10 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 1.216 (3h, t, J=7.2Hz), 4.173 (2H, q, 7.2Hz), 4.777 (2H, s), 6.168 (1H, d, J=2.4Hz), 6.248 (1H, dd, J=2.4, 8.8Hz), 7.183 (2H, br.s), 7.441 (1H, d, J=8.4hz), 9.646 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：δ 13.976, 60.711, 64.354, 98.521, 103.988, 113.256, 137.699, 152.665, 162.849, 168.176, 191.670。
【０４４２】
５mL  ＴＨＦ中のＴＵ３６２７−０１４(０.６０８ｇ)を、２.７２mLアリコートの１Ｍ  水性ＬｉＯＨで環境温度で処理した。２０分間後、ＬＣ−ＭＳ解析で反応の終了を確認した。反応混合物を減圧下濃縮乾固して、リチウム２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)アセテート(ＴＵ３６２７−０１８)を黄色固体として得た。MS (ESI+)：m/z 196.1 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：4.132 (2H, s), 6.110 (1H, d, J=2.0Hz), 6.145 (1H, dd, J=2.0, 8.8Hz), 7.155 (2H, br.s), 7.33 (1H, d, J=8.8hz), 9.576 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：67.675, 98.354, 105.031, 112.386, 137.042, 152.914, 164.589, 169.349, 191.056。
【０４４３】
実施例３４−３：リチウム４−(３−アセチル−４−アミノフェノキシ)ブタノエート(ＴＵ３６２７−０６４)の合成。
【化５３】
0005542832.tif 000086
４'−クロロ−２'−ニトロアセトフェノン(Bionet cat# 3W0333、１.００ｇ)、酢酸カリウム(４.９１ｇ)およびＤＭＳＯの混合物を、１７０℃で２０分間マイクロ波照射下に加熱した。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水に分配した。有機層を分離し、飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。別の反応を同じ方法で行い、二つの反応からの粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(ＥｔＯＡｃ)での精製のために合わせた。表題化合物をオレンジ色固体として得た。MS (ESI+)：計算値182.15, 実測値182.10 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 2.474 (3H, s), 6.837 (1H, d, J=2.4Hz), 6.973 (1H, dd, J=2.4, 8.8Hz), 8.078 (1H, d, J=8.8Hz), 11.307 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：δ 30.155, 113.264, 116.446, 127.386, 136.211, 140.986, 163.417, 200.099。
【０４４４】
４'−ヒドロキシ−２'−ニトロアセトフェノン(１.１２ｇ)、エチル４−ブロモブタノエート(１.３３ｇ)、炭酸カリウム(０.９４ｇ)および４.mL  ＤＭＦの混合物を６０℃で６.５時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水に分配した。有機層を分離し、飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン／ＥｔＯＡｃ)で精製して、表題化合物を黄色結晶として得た。MS (ESI+)：計算値296.11, 実測値296.20 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl３)：δ 1.255 (3H, t, J=7.2Hz), 2.141 (2H, quint, J=6.6Hz), 2.506 (2H, t, J=7.2Hz), 2.512 (3H, s), 4.116 (2H, t, J=6.0Hz), 4.143 (2H, q, J=7.2Hz), 6.757 (1H, d, J=2.8Hz), 6.973 (1H, dd, J=2.8, 9.2Hz), 8.125 (1H, d, J=8.8Hz). C-NMR (100MHz, CDCl3)：δ 14.182, 24.136, 30.282, 30.360, 60.616, 67.907, 112.305, 115.150, 127.023, 138.036, 141.205, 163.580, 172.730, 200.054。
【０４４５】
ＴＵ６３３−１４８(１.４８ｇ)を、ここに記載するMerlic(C.A.Merlic et al., J.Org.Chem., 1995, 60, 3365-69)に記載された方法で還元した。ＴＵ３６２７−０５６を、溶媒Ａ中５〜６０％溶媒Ｂの直線勾配(溶媒Ａ：５％ＮＥｔ３のヘキサン溶液；溶媒Ｂ：５％ＮＥｔ３のＥｔＯＡｃ溶液)を使用したシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー後に明黄色油状物として得た。MS (ESI+)：計算値266.13, 実測値266.20 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 1.258 (3H, t, J=7.2Hz), 2.085 (2H, quint, J=6.8Hz), 2.512 (2H, t, J=7.2Hz), 2.556 (3H, s), 3.955 (2H, t, J=6.0Hz), 4.146 (2H, q, J=7.2Hz0, 6.066 (2H, br.s), 6.632 91H, d, J=8.8Hz), 6.954 (1H, dd, J=2.8, 8.8Hz), 7.186 (1H, d, J=2.8Hz). C-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 14.218, 24.688, 27.990, 30.729, 60.434, 67.790, 115.933, 118299, 118.621, 123.550, 144.593, 149.271, 173.213, 200.283。
【０４４６】
ＴＨＦ中のＴＵ３６２７−０５６(０.５０ｇ)３mLを１.９mLアリコートの１Ｍ  水性ＬｉＯＨで環境温度で１８時間処理した。ＬＣ−ＭＳ解析により明らかな反応の終了が確認された。反応混合物を減圧下濃縮乾固して、リチウム４−(３−アセチル−４−アミノフェノキシ)ブタノエート(ＴＵ３６２７−０６４)を黄色固体として得た。MS (ESI+)：m/z 238.10 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.823 (2H, quint, J=6.8Hz), 2.008 (2H, t, J=6.8Hz), 2.489 (3H, s), 3.871, (2H, t, J=6.8Hz), 6.694 (1H, d, 9.2Hz), 6.808 (2H, s), 6.962 (1H, dd, J=2.8, 8.8Hz), 7.177 (1h, d, J=2.8Hz). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：26.079, 28.014, 34.164, 68.394, 114.896, 116.388, 118.059, 123.861, 145.529, 147.995, 176.119, 199.756。
【０４４７】
実施例３４−４：リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエート(ＴＵ３６２７−０７４)の合成。
【化５４】
0005542832.tif 000087
２−ニトロ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド(２.８５ｇ)、エチル４−ブロモブタノエート(３.６６ｇ)、炭酸カリウム(２.８４ｇ)およびＤＭＦ(２０mL)の混合物を環境温度で５０時間撹拌した。反応混合物をＨ２ＯおよびＥｔＯＡｃに分配した。有機層を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水性で洗浄し、合わせた水性層をＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層を希クエン酸、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーでヘキサン中２０〜４０％ＥｔＯＡｃの直線勾配を使用して精製して(Ｒｆ：０.３５、３５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)、表題化合物を黄色油状物として得た。MS (ESI+)：計算値282.09, 実測値282.10 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：δ 1.261 (3H, t, J=7.2Hz), 2.170 (2H, quint, J=6.8Hz), 2.528 (2H, t, J=7.2Hz), 4.153 (2H, d, J=7.2Hz), 4.167 (2H, t, 6.4Hz), 7.217 (1H, dd, J=2.4, 8.4Hz), 7.498 (1h, d, J=2.4Hz), 7.964 (1H, d, J=8.8Hz), 10.277 (1H, s).C-NMR (100MHz, CDCl3)：δ 14.190, 24.112, 27.712, 30.291, 32.443, 32.771, 60.648, 68.075, 110.024, 119.397, 123.405, 131.455, 151.572, 162.916, 172.710, 186.943。
【０４４８】
ＴＵ３６２７−０６２(３.８９ｇ)を、ここに記載するMerlic(C.A.Merlic et al., J.Org.Chem., 1995, 60, 3365-69)に記載された方法で還元した。ＴＵ３６２７−０６６を、溶媒Ａ中２０〜６０％溶媒Ｂの直線勾配(溶媒Ａ：５％ＮＥｔ３のヘキサン溶液；溶媒Ｂ：５％ＮＥｔ３のＥｔＯＡｃ溶液；Ｒｆ：０.５１、５０％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)を使用したシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーの後に黄色固体として得た。MS (ESI+)：計算値252.12, 実測値252.20 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：δ 1.177 (3H, t, J=7.2Hz), 1.962 (2H, quint, J=6.8hz), 2.441 (2H, t, J=7.2Hz), 3.979 (2h, t, J=6.4Hz), 4.064 (2H, q, J=7.2Hz), 6.206 (1H, s), 6.219 (1H, d, J=8.8Hz), 7.411 (1H, d, J=8.8Hz), 9.623 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：δ 14.041, 24.028, 30.002, 59.837, 66.459, 98.075, 104.394, 112.822, 137.558, 152.871, 163.809, 172.404, 191.535。
【０４４９】
６mL  ＴＨＦ中のＴＵ３６２７−０６６(１.００ｇ)を、３.９８mLの１Ｍ  水性ＬｉＯＨで、環境温度で４時間処理した。ほとんどの溶媒を減圧下除去し、得られた濁った混合物を二回脱イオン化した水で希釈し、凍結および凍結乾燥して、リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエート(ＴＵ３６２７−０７４)を濁った黄色の固体として得た。MS (ESI+)：m/z 224.20 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.852 (2H, quint, J=6.8Hz), 2.040 (2H, t, 6.8Hz), 3.949 (2H, t, J=6.8Hz), 6.191 (1H, dd, 2.4, 8.8Hz), 6.239 (1H, d, J=2.4Hz), 7.208 (2H, br.s), 7.367 (1H, d, J=8.8Hz), 9.597 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：25.624, 33.706, 67.799, 97.997, 104.677, 112.589, 137.427, 153.003, 164.195, 176.575, 191.394。
【０４５０】
実施例３４−５：リチウム３−(３−アセチル−４−アミノフェニル)プロパノエート(Ｘ３５４７−１)の合成。
【化５５】
0005542832.tif 000088
１−(２−アミノ−５−ブロモフェニル)エタノン(６４２mg)、Ｐｄ(ＯＡｃ)２(３３.７mg)、およびＰ(ｏトリル)３(１３７mg)の無水ＤＭＦ(１０mL)中の混合物に、圧力管中、メチルアクリレート(crylate)(３５１μL)およびＴＥＡ(１.４mL)を添加した。混合物をＮ２で３分間フラッシュし、密閉し、１１０℃で４時間加熱した。反応混合物を環境温度に冷却し、酢酸エチルおよび水に分配した。水性層を１回酢酸エチルで抽出し、合わせた有機層を塩水で洗浄し、乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濾過し、溶媒を真空で除去した。粗残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(ＥｔＯＡｃ／ヘキサン)で精製して、生成物を得た。1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 7.96 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.63 (d, J=16.0 Hz, 1H), 6.67 (dd, J=8.8 Hz, J'=2.0 Hz, 1H), 6.77 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.29 (d, J=16.0 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.59 (s, 3H)；MS-ESI+220.24 (MH+)。
【０４５１】
(Ｅ)−メチル３−(３−アセチル−４−アミノフェニル)アクリレート(２１９mg)を、ＭｅＯＨ中、５％Ｐｄ／Ｃ(２１.９mg)で、水素バルーンを用い、室温で還元して、濾過および濃縮後生成物(定量的)を得た。生成物をさらに精製せずに次工程に使用した。1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 7.59 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.13 (dd, J=8.4 Hz, J'=2.0 Hz, 1H), 6.67 (d, J=8.4 Hz, 1H), 3.64 (s, 3H), 2.81 (dd, J=7.6 Hz, J'=7.6 Hz, 2H), 2.60 (dd, J=7.6 Hz, J'=7.6 Hz, 2H), 2.54 (s, 3H)；MS-ESI+222.25 (MH+)。
【０４５２】
メチル３−(３−アセチル−４−アミノフェニル)プロパノエート(２２１mg)および４Ｍ  ＬｉＯＨ(０.２７５mL)を３mL  ＴＨＦ／水(ｖ／ｖ＝３／１)に添加した。溶媒を反応終了後に減圧下除去して、リチウム３−(３−アセチル−４−アミノフェニル)プロパノエート(Ｘ３５４７−１)を得た。1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 7.62 (d, J=2.0 Hz, 1H), 7.17 (dd, J=8.4 Hz, J'=2.0 Hz, 1H), 6.67 (d, J=8.4 Hz, 1H), 2.80 (dd, J=7.6 Hz, J'=9.0 Hz, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.41 (dd, J=7.6 Hz, J'=9.0 Hz, 2H)；MS-ESI+207.22 (MH+)。
【０４５３】
実施例３４−６：リチウム３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)プロパノエート(Ｘ３５４７−８)の合成。
【化５６】
0005542832.tif 000089
ＣＨ３ＣＮ(１５mL)に溶解させたエチルトリフェニルホスホロアニリデンアセテート(１.７４２ｇ)溶液を、撹拌しながら、４−ブロモ−３−ニトロベンズアルデヒド(１.１５０ｇ)含有ＣＨ３ＣＮ溶液(１０mL)に添加した。反応混合物を一夜還流した。混合物冷却後、溶媒を減圧下除去して、粗固体を得た。純粋生成物Ｘ３４７１−１４６を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、９：１)後白色固体として得た。
【０４５４】
上記工程からの生成物Ｘ３４７１−１４６(６３２mg)およびＰｄＣｌ２(ＰＰｈ３)２(１４８mg)を、ＤＭＦ(５.０mL)に、Ｎ２下、シュレンク管で溶解させた。トリブチル(１−エトキシビニル)スタンナン(７１１μL)を撹拌しながら添加した。混合物を１００℃で一夜加熱した。混合物冷却後、溶媒を減圧下除去し、ＤＣＭで希釈し、水および塩水で洗浄した。ＤＣＭ除去後、残留物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(１５％−２５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)で精製して、化合物Ｘ３４７１−１５４を得た。
【０４５５】
化合物Ｘ３４７１−１５４Ａを、２０mL  １Ｎ  ＨＣｌで、室温で４時間処理した。溶媒の除去により、(Ｅ)−エチル３−(４−アセチル−３−ニトロフェニル)アクリレートＸ３４７１−１５４Ｂを得た。1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 8.31 (d, J=1.6 Hz, 1H), 8.04 (dd, J'=1.6 Hz, J"=8.0 Hz, 1H), 7.76 (d, J=16.0 Hz, 1H), 7.67 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.74 (d, J=16.0 Hz, 1H), 4.27 (q, J=7.2 Hz, 2H), 2.57 (s, 3H), 1.34 (t, J=7.2 Hz, 3H)；ESI-MS (m/z) 264.07 (MH+)。
【０４５６】
化合物Ｘ３４７１−１５４Ｂ(２６３mg)を、エチル３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)プロパノエートＸ３５４７−２に、１気圧水素下、５.０mL  ＭｅＯＨ中５％Ｐｄ／Ｃ(２６mg)を用いて還元した。ESI-MS (m/z) 236.30 (MH+)。
【０４５７】
化合物Ｘ３５４７−２を、４Ｍ  ＬｉＯＨ(０.２４８mL)、ＴＨＦ(３.０mL)および水(１.０mL)の混合物を室温で処理した。反応終了後、反応混合物を凍結乾燥して、リチウム３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)プロパノエート(Ｘ３５４７−８)を得た。MS (ESI+)：m/z 208.10 (MH+)。
【０４５８】
実施例３４−７：リチウム５−(３−アミノ−４−ホルミルフェニル)ペンタノエート(Ｘ３５４７−３０)の合成。
【化５７】
0005542832.tif 000090
ＴＥＡ(５.０mL)中の４−ブロモ−２−ニトロベンズアルデヒド(４６０mg)、Ｐｄ(ＰＰｈ３)２Ｃｌ２(７０mg)、およびＣｕＩ(３８mg)、メチルペント−４−イノエート(２６９mg)の混合物を、室温で反応が終了するまで撹拌した。粗残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(１５％ＥｔＯＡｃのヘキサン溶液)で精製して、メチル５−(４−ホルミル−３−ニトロフェニル)ペント−４−イノエートを得た。ESI-MS m/z 262.23 (MH+)。
【０４５９】
メチル５−(４−ホルミル−３−ニトロフェニル)ペント−４−イノエート(５２２mg)を、ＭｅＯＨ中５％Ｐｄ／Ｃ(５３mg)で、室温で水素バルーンを用いて還元した。濾過と減圧下の濃縮により、メチル５−(３−アミノ−４−ホルミルフェニル)ペンタノエートを得た。MS-ESI m/z 236.28 (MH+)。
【０４６０】
メチル５−(３−アミノ−４−ホルミルフェニル)ペンタノエート(４４７mg)を、８.０mL  ＴＨＦ／水(ｖ／ｖ＝３／１)中、ＬｉＯＨ(８８mg)で処理した。反応終了後溶媒の除去により、リチウム５−(３−アミノ−４−ホルミルフェニル)ペンタノエート(Ｘ３５４７−３０)を得た。MS (ESI+)：222.10 (MH+). H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 9.72 (s, 1H), 7.37 (d, J=8.0 Hz, 1H), 6.57 (s, 1H), 6.55 (d, J=8.0 Hz, 1H), 2.56 (m, 2H), 2.19 (m, 2H), 1.64 (m, 4H)。
【０４６１】
実施例３４−８：３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)−２−アミノプロパン酸(Ｘ３１７９−９６)の合成。
【化５８】
0005542832.tif 000091
水素化ナトリウム(鉱油中６０％、１.７４ｇ)をヘキサンで洗浄し、ＤＭＦ(１２ml)に懸濁した。ＤＭＦ(３０ml)中ジエチルアセトアミドマロネート(１０.４ｇ)およびＤＭＦ(１０ml)中４−(ブロモメチル)−１−フルオロ−２−ニトロベンゼン(１０.２ｇ)を連続的に添加し、反応混合物を４時間、室温で撹拌し、溶媒を減圧下除去した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(１０−２０％ＥｔＯＡｃのＤＣＭ溶液)で精製して、ジエチル２−アセトアミド−２−(４−フルオロ−３−ニトロベンジル)マロネートを得た。1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 7.77 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7.42 (s, 1H), 6.54 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.25 (q, J=7.2 Hz, 4H), 3.65 (s, 2H), 2.03 (s, 3H), 1.28 (t, J=7.2Hz, 6H) ；13C NMR：δ 172.95, 168.23, 157.33, 154.72, 138.68, 134.19, 128.45, 119.31, 68.64, 63.88, 38.04, 22.31, 14.38；ESI-MS (m/z) 371.33(MH+)。
【０４６２】
ＥｔＯＡｃ中のジエチル２−アセトアミド−２−(４−フルオロ−３−ニトロベンジル)マロネート(７.４１ｇ)およびニトロエタン(６.０mL)に、ＤＢＵ(９.０mL)を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をメタノール(３５mL)に溶解した。水性Ｈ２Ｏ２(３０％、１０.２mL)および１０％水性ＮａＨＣＯ３(１０.２mL)を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮した。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(１０−２０％ＥｔＯＡｃのＤＣＭ溶液)で精製して、ジエチル２−アセトアミド−２−(４−アセチル−３−ニトロベンジル)マロネートを得た。1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 7.73 (s, 1H), 7.55 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.47 (d, J=8.0 Hz, 1H), 4.25 (q, J=7.2 Hz, 4H), 3.72 (s, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.28 (t, J=7.2Hz, 6H) ；13C NMR：δ 172.99, 168.22, 153.68, 147.48, 140.96, 137.31, 136.82, 128.99, 126.79, 68.62, 63.95, 54.01, 38.58, 22.32, 14.36；ESI-MS (m/z) 395.38(MH+)。
【０４６３】
ジエチル２−アセトアミド−２−(４−アセチル−３−ニトロベンジル)マロネート(２.０ｇ)を１０mL  ３７％ＨＣｌに溶解し、１００℃で一夜加熱し、冷却した。得られた固体を濾過により回収して、３−(４−アセチル−３−ニトロフェニル)−２−アミノプロパン酸を得た。1H NMR (400 MHz, D2O)：δ 8.01(s, 1H), 7.53 (d, J=7.6 Hz, 1H), 7.50 (d, J=7.6 Hz, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.20-3.34 (m, 2H), 2.52 (s, 3H) ；13C NMR：δ 201.39, 170.78, 174.89, 140.02, 137.84, 136.28, 129.59, 126.46, 54.46, 36.56, 30.01；ESI-MS (m/z) 253.22 (MH+)。
【０４６４】
３−(４−アセチル−３−ニトロフェニル)−２−アミノプロパン酸を、ＭｅＯＨ中５％Ｐｄ炭素で、１気圧Ｈ２下還元した。濾過と減圧下の濃縮により、３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)−２−アミノプロパン酸(Ｘ３１７９−９６)を得た。MS (ESI+)：m/z 223.22 (MH+). 1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 7.78 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.54 (d, J=8.4 Hz, 1H), 4.25 (dd, J'=8.4 Hz, J"=5.2 Hz, 1H), 3.23 (dd, J'=14.4 Hz, J"=5.2 Hz, 1H), 3.02 (dd, J'=14.4 Hz, J"=8.4 Hz, 1H), 2.54 (s, 3H) ；13C NMR：δ 202.14, 171.20, 152.93, 142.51, 134.40, 118.78, 118.23, 116.91, 54.63, 37.42, 27.90。
【０４６５】
実施例３４−９：１−(２−アミノ−５−ブロモフェニル)エタノン(Ｘ１４３６−１３２)の合成。
【化５９】
0005542832.tif 000092
１−(２−アミノフェニル)エタノン(１３５mg)およびＤＣＭ(２.５mL)を入れたフラスコを−１０℃に冷却し、ＮＢＳ(１７８mg)を３０分間にわたり数回に分けて添加した。反応混合物を１０mL  ＤＣＭで希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物を得た。MS(ESI+)：m/z 215.06 (MH+). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.79 (s, 1H), 7.31 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.54 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.30 (br, 2H), 2.55 (s, 3H)。
【０４６６】
実施例３４−１０：１−(２−アミノ−５−ヨードフェニル)エタノン(Ｘ１４３６−１３４)の合成。
【化６０】
0005542832.tif 000093
１−(２−アミノフェニル)エタノン(４０５mg)およびＤＣＭ(２０mL)を入れたフラスコを氷／水浴で冷却し、ＮＩＳ(６７５mg)を３回に分けて添加した。反応を０℃で撹拌した。反応混合物を３０mL  ＤＣＭで希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗物質を分取ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、表題化合物を得た。MS(ESI+)：m/z 262.06 (MH+). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 7.94 (s, 1H), 7.44 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.43 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.32 (br, 2H), 2.53 (s, 3H)。
【０４６７】
実施例３４−１１：２−アミノ−４−ブロモベンズアルデヒド(Ｘ３５４７−１５８)の合成。
【化６１】
0005542832.tif 000094
鉄粉(１.２０ｇ)、水(２.０mL)、およびＨＣｌ(１２Ｎ、４０μL)を、２−ニトロベンズアルデヒド(２３０mg)のエタノール(８.０mL)溶液に連続的に添加した。９５℃で９０分間撹拌後、反応混合物を熱濾過した。エタノール洗浄後、濾液を合わせ、溶媒を真空で除去した。粗物質をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(４０：５５：５ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン)で精製して、２−アミノ−４−ブロモベンズアルデヒドを黄色結晶として得た。MS(ESI+)：m/z 199.96 (MH+). 1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 9.77 (s, 1H), 7.40 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.95 (d, J=1.6 Hz, 1H), 6.78 (dd, J=8.4 Hz, J'=1.6 Hz, 1H)。
【０４６８】
実施例３５：ＰＣＬおよびピロリシン生合成前駆体の合成
実施例３５−１：アンモニウムＤＬ−１−ピロリン−５−カルボキシレート(３７９３−００７)の合成。
【化６２】
0005542832.tif 000095
Ｈ−ＤＬ−δ−ＤＬ−ヒドロキシＬｙｓ−ＯＨのＨＣｌ塩(１１８mg、０.５mmol)をカチオン交換ＳＰＥカートリッジに載せ、アミノ酸を水酸化アンモニウムで溶出した。ＮａＩＯ４(１０７mg)をアンモニウム溶出液に添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応混合物を凍結乾燥し、粗生成物をＨＣｌでｐＨ２.６に酸性化し、カチオン交換ＳＰＥで精製した。最初に１０mL  Ｈ２Ｏ溶離剤を廃棄し、続いて３０ml  Ｈ２Ｏ溶離剤を回収し、１Ｎ  ＮＨ４ＯＨ(水性)(０.５mL)で直ぐに中和した。凍結乾燥後、所望の生成物を明黄色粉末として得た。ESI-MS C5H7NO2 [MH]+の計算値：114.1；観察値：114.1。
【０４６９】
実施例３５−２：Ｈ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｎε−(Ｄ−Ｏｒｎ)−ＯＨ(３７９３−０３１)の合成
【化６３】
0005542832.tif 000096
Ｂｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ(Ｂｏｃ)−ＯＨ(１.０９７ｇ)を、ＤＭＦ(５mL)中、ＨＡＴＵ(１.２５５ｇ)およびＤＩＥＡ(１.５３mL)で１時間処理した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ(アセテート塩、１.０５７ｇ)およびＤＩＥＡ(６２７μL)のＤＭＦ溶液(５mL)を反応混合物に添加し、反応を室温で２時間撹拌した。反応混合物を１０％ＮａＣｌ(水性)(３０mL)およびＥｔＯＡｃ(６０mL)に分配した。ＥｔＯＡｃ層を５％クエン酸(３０mL)、１０％ＮａＨＣＯ３(水性)(３０mL)、および塩水(３０mL)で洗浄した。ＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４(ｓ)で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残留物を８０ｇシリカカラムで０−１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出を用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ(Ｂｏｃ))−ＯＭｅ(３７９３−０２６)を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3)：6.54 (br s, 1H), 5.17 (br, 2H), 4.76 (br s, 1H), 4.24(quartet, J=6.7 Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.34-3.02 (m, 4H), 1.83-1.30 (m, 37H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3)：173.2, 172.3, 156.6, 155.8, 155.5, 79.8, 79.2, 53.3, 53.0, 52.3, 39.2, 38.8, 32.0, 30.4, 29.1, 28.4, 28.3, 26.4, 22.5. ESI-MS  C27H50N4O9 [MH]+の計算値：575.4；観察値：575.4。
【０４７０】
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ−Ｄ−Ｏｒｎ(Ｂｏｃ))−ＯＭｅ(２１４mg)の６５％アセトニトリル水溶液(５mL)に、濃ＨＣｌ(１mL)を添加し、反応混合物を２時間激しく撹拌した。反応混合物を凍結乾燥し、カチオン交換クロマトグラフィーで、ＳＣＸ  ＳＰＥカートリッジを１Ｎ  ＮＨ４ＯＨの２０％ＭｅＣＮ(水性)溶液とともに用いて精製した。メチルエステルを、一夜、ＮＨ４ＯＨ溶出液中で加水分解させた。凍結乾燥後、Ｈ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｎε−(Ｄ−Ｏｒｎ)−ＯＨ(３７９３−０３１)を白色粉末として得た。1H NMR (400 MHz, D2O)：3.33-3.30 (m, 2H), 3.29-3.22 (m, 1H), 3.20-3.12 (m, 1H), 2.86(t, J=7.0 Hz, 2H), 1.65-1.48 (m, 8H), 1.36-1.25 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, D2O)：181.5, 176.9, 55.5, 54.3, 39.4, 38.9, 33.2, 31.4, 28.1, 24.5, 22.1. ESI-MS C11H24N4O3 [MH]+の計算値：261.2；観察値：261.2。
【０４７１】
実施例３５−３：Ｎ−((６−クロロピリジン−３−イル)メチル)−１−ピロリン−５−カルボキサミド(３６４７−０６１)の合成。
【化６４】
0005542832.tif 000097
ジオキサン(１０mL)中のｔ−ブチルピロカーボネート(６.５５ｇ)を、１Ｎ  ＮａＯＨ(水性)(５０mL)中のＤＬ−δ−ＤＬ−ヒドロキシＬｙｓ(１.９９ｇ)に滴下し、反応を室温で一夜撹拌した。反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ(水性)でｐＨ３.０に酸性化し、ＥｔＯＡｃ(２００mL)で２回抽出した。ＥｔＯＡｃ層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４(ｓ)で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を０−１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出を用いるシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｂｏｃ−ＤＬ−δ−ＤＬ−ヒドロキシＬｙｓ(Ｂｏｃ)(３５９７−１０９)を白色固体として得た。ESI-MS C16H30N2O7 [MNa]+の計算値：385.2；観察値：385.2。
【０４７２】
Ｂｏｃ−ＤＬ−δ−ＤＬ−ヒドロキシＬｙｓ(Ｂｏｃ)(４３５mg)を、３.５mL  ＤＭＦ中、ＨＡＴＵ(４５６mg)およびＤＩＥＡ(５２３μL)で１時間処理した。得られた溶液を６−クロロピリジン−３−イルメチルアミン(１４３mg)の１.５mL  ＤＭＦ溶液に室温で添加し、反応を２日間撹拌した。反応混合物を１０％ＮａＣｌ(水性)(１５mL)およびＥｔＯＡｃ(３０mL)で抽出した。ＥｔＯＡｃ層を５％クエン酸(１５mL)、１０％ＮａＨＣＯ３(１５mL)、および塩水(１５mL)で洗浄した。ＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４(ｓ)で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー０−１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出を用いて精製して、所望の生成物(３６４７−０１６)を白色固体として得た。ESI-MS C22H35N4O6Cl [MH]+の計算値：487.2；観察値：487.3。
【０４７３】
上記からの生成物(３６４７−０１６)(２６３mg)をＥｔ２Ｏ(７mL)および１Ｎ  ＨＣｌ(水性)(７mL)の溶液中、室温で一夜撹拌した。反応混合物を蒸発させ、凍結乾燥し、残留物をカチオン交換ＳＰＥカートリッジで精製して、所望の生成物(３６４７−０３７)を白色固体として得た。ESI-MS C12H19N4O2Cl [MH]+の計算値：287.1；観察値：287.2。
【０４７４】
上記からの生成物(３６４７−０３７)(６９.６mg)を２mL  Ｈ２Ｏ(２mL)に溶解し、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨ(水性)で１２に調節した。ＰＬ−ＩＯ４樹脂(Varian、３８１mg、０.４８mmol)を添加し、反応を室温で２時間撹拌した。樹脂を濾過により除去し、濾液の半分を分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物(３６４７−０６１)を白色固体として得た。ESI-MS C11H12N3OCl [MH]+の計算値：238.1；観察値：238.1。
【０４７５】
実施例３６：ＰＣＬモデル化合物の合成
実施例３６−１：Ｈ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｎε−(ＤＬ−１−ピロリン−５−カルボニル)−ＯＨ(３６４７−１２５)の合成。
【化６５】
0005542832.tif 000098
ｏｃ−ＤＬ−δ−ＤＬ−ヒドロキシＬｙｓ(Ｂｏｃ)(３５９７−１０９)(８８６mg)を、ＤＩＥＡ(１０６８μL)の存在下、３.０mL  ＤＭＦ中ＨＡＴＵ(９３２mg)により１時間活性化し、３.０mL  ＤＭＦ(３.０mL)中のＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ(５４９mg)に添加した。反応を室温で３６時間撹拌した。反応混合物を１０％ＮａＣｌ(水性)(３０mL)およびＥｔＯＡｃ(６０mL)に分配した。ＥｔＯＡｃ層を５％クエン酸(１５mL)、１０％ＮａＨＣＯ３(１５mL)、および塩水(１５mL)で洗浄した。ＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４(ｓ)で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで０−１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用して、続いてＲＰ−Ｃ１８  ＳＰＥで、２５％および６５％ＭｅＣＮ(水性)で溶出して精製して、所望の生成物(３６４７−０９９)を白色固体として得た。ESI-MS C28H52N4O10 [MH]+の計算値：605.4；観察値：605.4。
【０４７６】
１mL  Ｅｔ２Ｏ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ(Ｂｏｃ−ＤＬ−δ−ＤＬ−ヒドロキシＬｙｓ(Ｂｏｃ))−ＯＭｅ(３６４７−０９９)(８４.１mg)に、４Ｎ  ＨＣｌ(水性)(３mL)を添加し、反応を室温で３時間撹拌した。溶媒の除去により、６１.１mgの粗生成物(３６４７−１２０)を白色固体として得た。ESI-MS C13H28N4O4 [MH]+の計算値：305.2；観察値：305.2。
【０４７７】
上記からの粗生成物(３６４７−１２０)(６１.１mg)を１mL  Ｈ２Ｏに溶解し、ｐＨを１Ｎ  ＮａＯＨ(水性)で１２に調節した。混合物を室温で１時間撹拌し、メチルエステル加水分解をさせた。ＮａＩＯ４(２９.９mg)を反応混合物に添加し、反応を室温でさらに１５分間撹拌した。反応混合物を１Ｎ  ＨＣｌ(水性)で中和し、精製のためにカチオン交換ＳＰＥに載せて、Ｈ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｎε−(ＤＬ−１−ピロリン−５−カルボニル)−ＯＨ(３６４７−１２５)を得た。ESI-MS C11H19N3O3 [MH]+の計算値：242.2；観察値：242.2。
【０４７８】
実施例３６−２：Ｈ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｎε−(ＤＬ−１−ピロリン−２−カルボニル)−ＯＨ(３７９３−０１１)の合成。
【化６６】
0005542832.tif 000099
ナトリウム１−ピロリン−２−カルボキシレート(３６４７−１６４)を、Gyoergy Szoelloesi et al. (Chirality, 2001, 13(10), 619-624)による方法に従い製造した。
【０４７９】
トリエチルアミン(８.４mL)を、エーテル(２７mL)中Ｈ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ  ＨＣｌ(７.５１２ｇ)に添加し、反応を２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、Ｅｔ２Ｏを蒸発により除去した。残留物を真空蒸留により精製して、４.１１９ｇのＨ−Ｐｒｏ−ＯＭｅを無色油状物として得た。ｔ−ＢｕＯＣｌ(３.５９mL)を、Ｈ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ(４.０８９ｇ)のＥｔ２Ｏ(１００mL)溶液に滴下し、反応を−５０℃で１時間撹拌した。反応混合物を室温に温め、トリエチルアミン(４.６４mL)を反応混合物に添加し、３日間撹拌した。反応混合物を濾過し、減圧下濃縮した。残留物を真空蒸留により精製して、メチルピロリン−２−カルボキシレート(３６４７−１５４)を無色油状物として得た。ESI-MS C6H9NO2 [MH]+：128.1の計算値；観察値：128.2. 1H NMR (400 MHz, CDCl3)：4.09 (tt, J=7.6 Hz, 2.5 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 2.81 (tt, J=8.2 Hz, 2.8 Hz, 2H), 1.97 (quintet, J=8.0 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3)：168.2, 163.1, 62.5, 52.5, 35.2, 22.1. ESI-MS C5H7NO2 [MH]+の計算値：114.1；観察値：114.2. 1H NMR (400 MHz, D2O)：3.84 (tt, J=7.4 Hz, 2.5 Hz, 2H), 2.73 (tt, J=8.2 Hz, 2.6 Hz, 2H), 1.92 (quintet, J=7.8 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, D2O)：175.5, 171.8, 60.1, 35.6, 21.8ESI-MS C5H7NO2 [MH]+の計算値：114.1；観察値：114.2. 1H NMR (400 MHz, D2O)：3.84 (tt, J=7.4 Hz, 2.5 Hz, 2H), 2.73 (tt, J=8.2 Hz, 2.6 Hz, 2H), 1.92 (quintet, J=7.8 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, D2O)：175.5, 171.8, 60.1, 35.6, 21.8。
【０４８０】
メチルピロリン−２−カルボキシレート(２.２６５ｇ)を１Ｎ  ＮａＯＨ(水性)(１７.８mL)に溶解し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を凍結乾燥して、粗ナトリウムピロリン−２−カルボキシレート(３６４７−１６４)を白色粉末として得た。ESI-MS C5H7NO2 [MH]+の計算値：114.1；観察値：114.2。
【０４８１】
ナトリウム１−ピロリン−２−カルボキシレート(４５９mgｌ)およびＤＰＰＡ(８８６μL)を、２０mL  ＤＭＦ中のＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ(アセテート塩、８９７mg)およびＤＩＥＡ(１１８４μL)に添加し、反応を、Ｎ２下、２４時間室温で撹拌した。反応混合物を１０％ＮａＣｌ(水性)(５０mL)およびＥｔＯＡｃ(１００mL)に分配した。ＥｔＯＡｃ層をＮａ２ＳＯ４(ｓ)で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗生成物を明オレンジ色油状物として得た。粗生成物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで０−１５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出を用いて、続いてＲＰ−Ｃ１８  ＳＰＥで精製して、所望の生成物(３６４７−１６７)を無色油状物として得た。ESI-MS C17H29N3O5 [MH]+の計算値：356.2；観察値：356.0. 1H NMR (400 MHz, CDCl3)：7.14 (s, 1H), 5.08 (d, d=4 Hz), 4.27 (quartet, J=5.2 Hz, 1H), 3.99 (td, J=7.2 Hz, 1.6 Hz, 2H), 3.72 (d, J=1.6 Hz, 3H), 3.31 (quartet, J=6.9 Hz, 2H), 2.83 (td, J=8.3 Hz, 1.3 Hz, 2H), 1.97 (quintet, J=8.2 Hz, 2H), 1.88-1.72 (m, 2H), 1.69-1.51 (m, 2H), 1.48-1.33 (m, 11H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3)：171.6, 162.4, 155.4, 129.7, 79.8, 61.7, 53.2, 52.3, 38.7, 34.0, 32.2, 29.0, 28.3, 22.6, 22.5。
【０４８２】
ＨＣｌ(濃、１mL)を、上記からの生成物(３６４７−１６７)(４９.３mg)の５０％ＭｅＣＮ(水性)溶液(５mL)に添加し、反応を室温で２時間撹拌した。凍結乾燥後、残留物をカチオン交換ＳＰＥカートリッジで精製した。メチルエステルを溶離剤中、一夜ＮＨ４ＯＨ(水性)により加水分解した。凍結乾燥後、所望の生成物(３７９３−０１１)を明黄色粉末として得た。ESI-MS C11H19N3O3 [MH]+の計算値：242.2；観察値：242.2. 1H NMR (400 MHz, D2O)：3.94 (tt, J=7.6 Hz, 2.5 Hz, 2H), 3.65 (t, J=6.2 Hz, 1H), 3.30 (t, J=6.8 Hz, 2H), 2.78 (tt, J=8.4 Hz, 2.6 Hz, 2H), 1.97 (quintet, J=7.9 Hz, 2H), 1.87-1.77 (m, 2H), 1.59 (quintet, J=7.2 Hz, 2H), 1.46-1.34 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, D2O)：175.7, 172.2, 165.1, 60.9, 54.7, 38.9, 34.3, 30.5, 27.9, 21.8, 21.7。
【０４８３】
実施例３７：２−ＡＡＰ−ＰＥＧ剤の合成
ここに提供される実施例で使用する種々の２−ＡＡＰ−ＰＥＧ誘導体の合成を以下に記載する。約５００、２４００、２３０００Daならびに５０００および１００００Daの分子量のＰＥＧ類の２−アミノ−アセトフェノン誘導体を以下の通り合成した：
【０４８４】
実施例３７−１：ＴＵ３２０５−０４４(０.５kDa  ２−ＡＡＰ−ｍＰＥＧ)の合成
【化６７】
0005542832.tif 000100
リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０４２)(５５.９mg)を、１０mL丸底フラスコに入れ、ＤＭＦ(３mL)およびＨＡＴＵ(９８.９mg)を添加した。得られたスラリーを環境温度で４０分間撹拌した。反応はこの間に黄色溶液に変わった。反応に、２mL  ＤＭＦ中ｍＰＥＧ−アミン(Quanta Biodesign、ＭＷ  ３８３.５、１００mg)を添加した。５分間後、ＬＣ−ＭＳ解析により反応の終了が示された。反応混合物をさらに４０分間撹拌し、減圧下濃縮した。残留物をＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィー(３％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液)で精製して、ＴＵ３２０５−０４４(０.５kDa２−ＡＡＰ−ｍＰＥＧ)を黄色粘性油状物として得た。MS(ESI+)：計算値575.31, 実測値575.30 (MH+). H-NMR (400 MHz, CDCl3)：2.210 (3H, s), 3.370 (3H, s), 3.544 (4H, m), 3.650 (28H, m), 4.499 (2H, s), 6.172 (1H, d, J=2.4 Hz), 6.243 (1H, dd, J=8.8 Hz, 2.8 Hz), 6.540 (2H, br.s). 7.034 (1H, br.s), 7.649 (1H, d, J=8.8 Hz)。
【０４８５】
実施例３７−２：ＴＵ３２０５−０４８(２.４kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧ)の合成
【化６８】
0005542832.tif 000101
リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０４２)(１２.２mg)を、１０mL丸底フラスコに入れ、ＤＭＦ(１mL)およびＨＡＴＵ(２１.５mg)を添加した。得られたスラリーを環境温度で３５分間撹拌した。反応はこの間に黄色溶液に変わった。反応に、２mL  ＤＭＦ中のｍＰＥＧ−アミン(Quanta Biodesign、ＭＷ  ２２０９、１００mg)を添加した。反応混合物を１８時間撹拌し、減圧下濃縮した。残留物をＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィー(ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液)で精製して、ＴＵ３２０５−０４８(２.４kDa  ２−ＡＡＰ−ｍＰＥＧ)を黄色粘性油状物として得た。MS(ESI+)：計算値800.8, 実測値800.5 (M+3H+/3), 計算値600.9, 実測値600.7 (M+4H+/4)。
【０４８６】
実施例３７−３：ＴＵ３２０５−０５２(２３kDa  ２−ＡＡＰ−ＰＥＧ)の合成
【化６９】
0005542832.tif 000102
リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０４２)(２１.５mg)およびＨＡＴＵ(３８.０mg)を１０mL丸底フラスコに入れ、ＤＭＦ(０.５mL)を添加した。得られたスラリーを環境温度で５０分間撹拌した。得られた黄色溶液を、５mL  ＤＭＦ中ｍＰＥＧ−ＮＨ２(Laysan Bio、平均ＭＷ  ２３ｋ、平均ｎ＝５２０、０.５０ｇ)に、２０mL  ガラスバイアルで添加した。反応を環境温度で２.５時間振盪した。反応混合物を１０mL  水で希釈し、それぞれ２.５mLずつの溶液をＰＤ−１０カラム(GE Healthtech)に載せ、所望の生成物を供給者の指示に従い水で溶出した。溶出水溶液を合わせ、凍結し、凍結乾燥して、ＴＵ３２０５−０５２(２３kDa２−ＡＡＰ−ｍＰＥＧ)を白色固体として得た。(注；高ＭＷ  ＰＥＧ剤の特徴付けは、それらをＰＣＬ含有タンパク質にコンジュゲートした後にのみ得た。)
【０４８７】
【化７０】
0005542832.tif 000103
(ＴＵ６３３−００６)(１０kDa２−ＡＡＰ−ｍＰＥＧ)および
【化７１】
0005542832.tif 000104
(ＴＵ６３３−００８)(５kDa２−ＡＡＰ−ｍＰＥＧ)を、ＴＵ３２０５−０５２と同様の方法で、対応する１０,０００(平均ｎ＝２２５)および５,０００(平均ｎ＝１１１)ＭＷ  ｍＰＥＧ−ＮＨ２を使用して行った。(注；高ＭＷ  ＰＥＧ剤の特徴付けは、それらをＰＣＬ含有タンパク質にコンジュゲートした後にのみ得た。)
【０４８８】
実施例３７−４：ＴＵ６３３−０１０の合成：二官能性リンカー
【化７２】
0005542832.tif 000105
リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(ＴＵ３２０５−０４２)(９４.６mg)およびＨＡＴＵ(１６７mg)を１０mL丸底フラスコに入れ、およびＤＭＦ(２mL)を添加した。得られたスラリーを環境温度で４５分間撹拌した。得られた黄色溶液に、１mL  ＤＭＦ中４,７,１０−トリオキサ−１,１３−トリデカンジアミン(Fluka、４４mg)に添加した。反応混合物を環境温度で１８時間撹拌し、減圧下濃縮した。残留物をＳｉＯ２フラッシュクロマトグラフィー(ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液)、続いて分取逆相ＬＣ精製により精製した。ＬＣ精製物質をＥｔＯＡｃに溶解し、飽和水性ＮａＨＣＯ３で処理して、トリフルオロ酢酸を除去した。溶媒の蒸発により、二官能性リンカーＴＵ６３３−０１０を透明油状物として得た。MS(ESI+) 計算値603.3, 実測値603.3 (MH+)。
【０４８９】
実施例３７−５：ｍ−ＰＥＧ−ＡＡＰ  ２９ｋ(ＴＵ６３３−０８４)の合成。
【化７３】
0005542832.tif 000106
リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(１８７mg)およびＨＢＴＵ(３３０mg)を２０mL  ガラスバイアルに入れ、１０mL乾燥ＤＭＦを添加した。得られたスラリーを環境温度で撹拌した。２０分間以内に、反応は黄色溶液に変わり、８０分間後、９.５mLアリコートの反応混合物を、１００mL丸底フラスコで、４０mL乾燥ＤＭＦに溶解したｍＰＥＧ−ＮＨ２(Laysan Bio、ＭＷ２８,７００)に添加した。反応を環境温度で１９時間振盪させた。反応混合物を２４個のＰＤ−１０カラム(GE Helthtech)に載せ、所望の生成物を供給者の指示に従い水で溶出した。貯留溶離剤を凍結および凍結乾燥させて、白色固体を得た。固体を二回脱イオン化した水に溶解し、２回脱イオン水に対して、ＭＷＣＯ  ３５００の透析膜を使用して徹底的に透析した。透析溶液を凍結および凍結乾燥させて、ＴＵ６３３−０８４を白色の綿毛状固体として得た。(注；高ＭＷ  ＰＥＧ剤の特徴付けは、それらをＰＣＬ含有タンパク質にコンジュゲートした後にのみ得た。)
【０４９０】
実施例３７−６：ｍＰＥＧ−ＡＡＰ−３０ｋ(ＴＵ６３３−１２０)の合成
【化７４】
0005542832.tif 000107
リチウム３−(３−アセチル−４−アミノフェニル)プロパノエート(１３９mg)およびＨＢＴＵ(２４７mg)を２０mL  ガラスバイアルに入れ、１３mL乾燥ＤＭＦを添加した。得られたスラリーを環境温度で撹拌で３０分間し、得られた溶液をＴＵ６３３−１２０、ＴＵ６３３−１２２、ＴＵ６３３−１２４およびＴＵ６３３−１２６の調製に使用した。４５mL  ガラスバイアルにｍＰＥＧアミン(NOF Corp., SUNBRIGHT MEPA-30T MW 30,298、３.０ｇ)を入れ、２０mL乾燥ＤＭＦを添加し、穏やかに加熱してｍＰＥＧアミンをＤＭＦに溶解した。得られたｍＰＥＧアミン溶液に、２.２mLアリコートの活性化エステル溶液を添加し、バイアルを環境温度で１８時間、続いて３７℃で２４時間振盪させた。反応混合物を透析膜チュービング(Fisher Scientific, cat # 21-152-9, MWCO 3500)に移し、二回脱イオン化した水に対し、２日間徹底的に透析した。透析溶液を凍結および凍結乾燥させて、ＴＵ６３３−１２０を白色綿様固体として得た。(注；高ＭＷ  ＰＥＧ剤の特徴付けは、それらをＰＣＬ含有タンパク質にコンジュゲートした後にのみ得た。)
【０４９１】
【化７５】
0005542832.tif 000108
(ＴＵ６３３−１２２)、
【化７６】
0005542832.tif 000109
(ＴＵ６３３−１２４)および
【化７７】
0005542832.tif 000110
(ＴＵ６３３−１２６)
を、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−３０Ｔの変わりにそれぞれNOF Corp.からのＳＵＮＢＲＩＧＨＴＭＥＰＡ−４０Ｔ(ＭＷ  ４２０３６)、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＰＡ(ＭＷ  ４２３４８)、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−４００ＰＡである対応する活性化ＰＥＧ類を使用する以外、同様に製造した。
(注；高ＭＷ  ＰＥＧ剤の特徴付けは、それらをＰＣＬ含有タンパク質にコンジュゲートした後にのみ得た。)
【０４９２】
実施例３７−７：ｍＰＥＧ−ＡＢＡ−３０ｋＤ  (ＴＵ３６２７−０２４)の合資得。
【化７８】
0005542832.tif 000111
表題化合物を、ＴＵ６３３−１２０と同じ方法で、リチウム２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)アセテートをリチウム３−(３−アセチル−４−アミノフェニル)プロパノエートの変わりに使用して製造した。(注；高ＭＷ  ＰＥＧ剤の特徴付けは、それらをＰＣＬ含有タンパク質にコンジュゲートした後にのみ得た。)
【０４９３】
実施例３７−８：ｍＰＥＧ−ＡＢＡ−３０ｋ  (ＴＵ３６２７−０８４)の合成。
【化７９】
0005542832.tif 000112
表題化合物を、ＴＵ６３３−１２０と同じ方法で、リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエートをリチウム３−(３−アセチル−４−アミノフェニル)プロパノエートの変わりに使用して製造した。Ｈ  ＮＭＲ解析は、生成物中に非修飾出発ＰＥＧがないことを確認した。最終活性：Ｈ−ＮＭＲにより＞９５％。
【０４９４】
実施例３７−９：ｍＰＥＧ−ＡＢＡ−４０ｋ  (ＴＵ３６２７−０８６)の合成。
【化８０】
0005542832.tif 000113
表題化合物を、ＴＵ３６２７−０８４と同じ方法で、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＭＥＰＡ−４０ＴをＳＵＮＢＲＩＧＨＴＭＥＰＡ−３０Ｔの変わりに使用して製造した。Ｈ  ＮＭＲ解析は、生成物中に非修飾出発ＰＥＧがないことを確認した。最終活性：Ｈ−ＮＭＲにより＞９５％。
【０４９５】
実施例３７−１０：Ｎ１−(１８−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−１５−オキソ−４,７,１０−トリオキサ−１４−アザオクタデシル)−Ｎ１９−(１８−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−１５−オキソ−４,７,１０−トリオキサ−９,１４−ジアザオクタデシル)−４,７,１０,１３,１６−ペンタオキサノナデカン−１,１９−ジアミド(Ｘ３６７８−４０)の合成
【化８１】
0005542832.tif 000114
リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエート(９４.５mg)を、４mL  ＤＭＦ中ＨＢＴＵ(１５１.７mg)で活性化した。ジアミド−ｄＰＥＧＴＭ１１−ジアミン(QuantaBiodesign, Cat# 10361、７４.３mg)を反応混合物に添加し、室温で一夜撹拌した。ＤＩＥＡ(１７.５μL、０.１mmol)を添加し、混合物を４０℃で数時間加熱した。表題化合物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離し、ＴＦＡをＰＬ−ＨＣＯ３  ＭＰ  ＳＰＥカートリッジ(Varian Inc.)を通すことにより除去した。ＭＳ(ＥＳＩ＋)  ｍ／ｚ  １１５３.６０  (ＭＨ＋)。
【０４９６】
実施例３８：免疫調節剤をタンパク質に結合させるための薬剤の合成
実施例３８−１：Ｎ−(１−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−２−オキソ−７,１０,１３−トリオキサ−３−アザヘキサデカン−１６−イル)−４−((４−(２−(５−アミノ−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−２−イル)エチル)−３−メチルフェノキシ)メチル)ベンズアミド(ＴＵ３６２７−０４２)の合成。
【化８２】
0005542832.tif 000115
１０mL  ＤＣＭ中のｔ−ブチル３−(２−(２−(３−アミノプロポキシ)エトキシ)エトキシ)プロピルカルバメート(QuantaBiodesign, cat # 10225、５００mg)およびＤＩＥＡ(３４８μL)に、２mL  ＤＣＭ中４−クロロメチルベンゾイルクロライドを氷浴で冷却しながら添加した。反応をその温度で１時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、連続的にＨ２Ｏ、希水性クエン酸、水性ＮａＨＣＯ３および飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮して、生成物(Ａ)を透明粘性油状物として得た。MS(ESI+)：計算値473.2, 実測値473.3 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：1.405 (9H, s), 1.685 (2H, m), 1.879 (2H, m), 3.173 (2H, m), 3.438 (4H, m), 3.567 (4H, m), 3.633 (6H, m), 4.584 (2H, s), 4.933 (1H, br.s), 7.246 (1H, br.s), 7.411 (2H, d, J=8.4Hz), 7.789 (2H, d, J=8.4Hz). C-NMR (100MHz, CDCl3)：28.385, 28.673, 29.553, 38.430, 39.087, 45.447, 69.474, 70.042, 70.216, 70.379, 70.516, 70.798, 78.882, 127.430, 128.496, 134.745, 140.341, 155.966, 166.550。
【０４９７】
上記からの生成物Ａ(３０３mg)、化合物Ｂ(２００mg)、炭酸セシウム(２０８mg)および無水ＤＭＳＯを合わせ、反応を環境温度で撹拌した。１８時間後、さらに８mL  ＤＭＳＯに溶解した６０mgの化合物Ａおよびさらに３０mgの炭酸セシウムを反応に添加し、反応を４０時間、環境温度で撹拌し、その時点でＬＣＭＳ解析によって痕跡量の化合物Ｂしか残っていないことが示された。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、連続的にＨ２Ｏ、飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで、Ａ中１〜５％溶媒Ｂの直線勾配で精製して(Ａ：ＤＭＣ；Ｂ：２％ＮＨ３のＭｅＯＨ溶液)、部分的に精製された所望の化合物を得た。ＭＴＢＥから再結晶後、わずかに黄色がかった結晶としての生成物を得た。MS(ESI+)：計算値780.43, 実測値780.50 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.357 (9H, s), 1.578 (2H, quint, J=6.8Hz), 1.751 (2H, quint, J=6.8Hz), 2.264 (3H, s), 2.439 (3H, s), 2.94 (4H, m), 3.08 (2H, m), 3.34 (4H, m), 3.45 (4H, m), 3.50 (6H, m), 5.105 (2H, s), 6.757 (1H, dd, J=2.4, 8.4Hz), 6.77 (1H, br.s), 6.836 (1H, d, J=2.8Hz), 7.060 (2H, br.s), 7.091 (1H, d, J=8.4Hz), 7.138 (1H, dd, J=2.4, 8.4Hz), 7.349 (1H, s), 7.495 (2H, d, J=8.4Hz), 7.837 (2H, d, J=8.4Hz), 8.330 (1H, d, J=8.4Hz), 8.439 (1H, t, J=5.6Hz), 8.701 (1H, d, J=2.0Hz), 8.827 (1H, d, J=1.6Hz). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：19.153, 21.206, 28.178, 29.297, 29.638, 33.166, 33.336, 36.584, 37.085, 67.989, 68.200, 68.455, 69.495, 69.678, 69.703, 77.307, 111.863, 116.456, 117.005, 122.743, 123.321, 125.292, 127.047, 127.178, 127.764, 129.725, 129.823, 131.414, 132.600, 133.883, 137.040, 138.775,139.426, 140.303, 144.984, 149.405,155.471, 155.663, 156.341, 165.783。
【０４９８】
化合物ＣのＢｏｃ基を、３Ｍ  メタノール性ＨＣｌで環境温度で処理することにより除去した。反応混合物の減圧下での濃縮により、化合物Ｄを二塩酸塩として得た。MS(ESI+)：計算値680.4, 実測値680.4 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.77 (4H, m), 2.289 (3H, s), 2.504 (overlapping with DMSO-d6 signal), 2.85 (2H, m), 2.98 (2H, m), 3.14 (2H, m), 3.31 (2H, m), 3.5 (12H, m), 5.109 (2H, s), 6.768 (1H, dd, J=2.4, 8.4Hz), 6.852 (1H, d, J=2.4Hz), 7.107 (1H, d, J=2.4Hz), 7.427 (1H, d, J=8.4Hz0, 7.496 (2H, d, 8.4Hz), 7.532 (1H, s), 7.858 (2H, d, J=8.0Hz), 7.89 (3H, br.s), 8.53 (2h, m), 8.872 (1H, s), 9.01 (1H, br.s), 9.03 (1H, s), 9.731 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：19.183, 21.127, 27.076, 29.325, 32.793, 33.290, 36.601, 67.251, 68.198, 68.423, 69.389, 69.480, 69.587, 69.693, 111.903, 115.654, 116.491, 117.597, 124.065, 126.488, 127.058, 127.227, 129.646, 129.818, 130.877, 131.129, 131.841, 132.733, 133.850, 137.112, 140.296, 141.702, 143.879, 151.265, 153.598, 156.424, 165.789。
【０４９９】
リチウム２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)アセテート(２０mg)およびＨＢＴＵ(３８mg)を２０mL  ガラスバイアルに入れ、２mL乾燥ＤＭＦを添加した。得られたスラリーを環境温度で３０分間撹拌し、化合物Ｄ(３８mg)およびＤＩＥＡ(５２μL)を添加した。反応を環境温度で１７時間撹拌した。ＬＣＭＳ解析により出発物質が残っていないが、所望の生成物と共にビス−アシル化副産物が形成されていることが確認された。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、連続的にＨ２Ｏおよび飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残留物を５mL  ＴＨＦに取り込み、１mLアリコートの１Ｍ  水性ＬｉＯＨで、環境温度で２時間処理し、その時点で、ＬＣ−ＭＳ解析により、ビス−アシル化生成物の所望の生成物への加水分解が示された。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水に分配し、有機層を分離し、飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗物質を精製のために分取ＲＰ−ＨＰＬＣに載せた。所望の生成物を含むＨＰＬＣ溶離剤をＥｔＯＡで希釈し、飽和水性ＮａＨＣＯ３および飽和水性ＮａＣｌで洗浄して、トリフルオロ酢酸を除去し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物Ｎ−(１−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−２−オキソ−７,１０,１３−トリオキサ−３−アザヘキサデカン−１６−イル)−４−((４−(２−(５−アミノ−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−２−イル)エチル)−３−メチルフェノキシ)メチル)ベンズアミド(ＴＵ３６２７−０４２)を得た。MS(ESI+)：m/z 857.40 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.651 (2H, quint, J=6.6Hz), 1.747 (2H, quint, J=6.6Hz), 2.264 (3H, s), 2.443 (3H, s), 2.96 (2H, m), 3.08 (2H, m), 3.16 (3H, m) 3.27-3.29 (m overlapping with H2O signal), 3.45 (4H, m), 3.50 (7H, m), 4.451 (2H, s), 5.102 (2H, s), 6.198 (1H, d, J=2.0Hz), 6.268 (1H, dd, J=2.0, 8.8Hz), 6.755 (1H, 2.4, 8.4Hz), 6.836 (1H, d, J- 2.4Hz), 7.095 (1H, d, J=8.4Hz), 7.158 (1H, d, J=8.0Hz), 7.208 (2H, br.s), 7.362 (1H, s), 7.435 91H, d, J=8.8Hz), 7.493 (2H, d, J=8.4Hz), 7.834 (2H, d, J=8.0Hz) 8.070 (1H, t, J=5.6Hz), 8.349 (1H, d, J=8.4Hz), 8.440 (t, J=5.6Hz), 8.711 (1H, d, J=1.6Hz), 8.840 (1H, d, J=1.6Hz), 9.636 (1H, s)。
【０５００】
４−(２−(５−アミノ−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−２−イル)エチル)−３−メチルフェノール(化合物Ｂ)の合成
隔膜で蓋をした丸底フラスコに、１−エチニル−４−メトキシ−２−メチルベンゼン(市販品)(１.１当量)、３,５−ジクロロピコリノニトリル(１当量)、トリエチルアミン(５当量)、および無水ＤＭＦ(０.２Ｍ)を添加した。３回真空にし、窒素でフラッシュした。ＣｕＩ(０.０５当量)およびビス(トリフェニルホスフィン)ジクロロ−パラジウム(II)(０.０５当量)を添加した。隔膜を還流冷却器に変え、フラスコを窒素雰囲気下、６０℃で一夜加熱した。ＴＬＣでモニターして反応が終了したら、フラスコの内容物をヘキサンで前処理した大シリカゲルカラムに載せた。フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ(１：４％))により、生成物３−クロロ−５−((４−メトキシ−２−メチルフェニル)エチニル)ピコリノニトリルを得た。
【０５０１】
還流冷却器を備えた丸底フラスコに、３−クロロ−５−((４−メトキシ−２−メチルフェニル)エチニル)ピコリノニトリル(先の工程から)(１当量)、ｔｅｒｔ−ブチル２−(４,４,５,５−テトラメチル−１,３,２−ジオキサボロラン−２−イル)フェニルカルバメート(１.２５当量)、Ｋ３ＰＯ４(２当量)、トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(０)(０.０５当量)、および２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２',６'−ジメトキシビフェニル(０.１当量)を入れた。ｎ−ブタノールおよび水(５：２、０.２Ｍ)を添加し、内容物を３回脱気した(真空と続く窒素フラッシュ)。反応混合物を窒素下、１００℃で一夜、油浴中激しく撹拌した。内容物を冷却し、２００mLの水に取り込み、塩化メチレンで抽出した。合わせた有機層を乾燥させ(Ｎａ２ＳＯ４)、濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、０−５０％ＥｔＯＡｃのＣＨ２Ｃｌ２溶液)により、生成物２−((４−メトキシ−２−メチルフェニル)エチニル)−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−５−アミンを得た。
【０５０２】
丸底フラスコに、２−((４−メトキシ−２−メチルフェニル)エチニル)−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−５−アミン(先の工程から)(１当量)を撹拌棒と共に入れた。エタノールおよび塩化メチレン(１：２、０.２Ｍ)を添加し、パラジウム炭素(活性化粉末、湿、炭素上１０％、０.１当量)を添加した。内容物を３回真空にし、続いて水素フラッシュした。反応混合物を水素バルーン下、室温で一夜激しく撹拌した。その後反応混合物をセライトパッドを通して濾過し、セライトパッドを連続的に塩化メチレンおよびＥｔＯＡｃで、濾液のＵＶ吸収がなくなるまで洗浄した。合わせた有機洗液を濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、０−５０％ＥｔＯＡｃのＣＨ２Ｃｌ２溶液)により、生成物２−(４−メトキシ−２−メチルフェネチル)−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−５−アミンメチル(.hyl)フェネチル)−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−５−アミンを得た。1H NMR (CDCl3)：δ 8.53 (d, 1H), 8.29 (d, 1H), 8.01 (d, 1H), 7.44 (s, 1H), 7.12 (dd, 1H), 6.93 (d, 1H), 6.67 (d, 1H), 6.60 (dd, 1H), 5.93 (bs, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.05 - 3.00 (dd, 2H), 2.93 - 2.88 (dd, 2H), 2.44 (s, 3H), 2.19 (s, 3H). LRMS [M+H]=358.2
【０５０３】
撹拌している２−(４−メトキシ−２−メチルフェネチル)−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−５−アミンの塩化メチレン(０.２Ｍ)溶液に、氷水浴中、ＣＨ２Ｃｌ２中ＢＢｒ３の１Ｎ溶液(２当量)を滴下した。３０分間で、反応をメタノールにより洗浄し、真空で濃縮して、粗残留物を得た。粗物質を、COMBIFLASH(登録商標)系(ＩＳＣＯ)で、０−２０％メタノールのジクロロメタン溶液を使用するフラッシュクロマトグラフィーで精製して、４−(２−(５−アミノ−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−２−イル)エチル)−３−メチルフェノールを白色固体として得た。1H NMR (DMSO-d6)：δ 8.99 (s, 1H), 8.75 (d, 1H), 8.60 (d, 1H), 8.27 (d, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.09 (dd, 1H), 6.99 (bs, 2H), 6.88 (d, 1H), 6.49 (d, 1H), 6.42 (dd, 1H), 3.02 - 2.96 (dd, 2H), 2.86 - 2.81 (dd, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.13 (s, 3H). LRMS [M+H]=344.2
【０５０４】
実施例３８−２：４−((４−(２−(５−アミノ−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−２−ｙｌ)エチル)−３−メチルフェノキシ)メチル)−Ｎ−(１−(アミノオキシ)−２−オキソ−７,１０,１３−トリオキサ−３−アザヘキサデカン−１６−イル)ベンズアミドヒドロクロライド(ＴＵ３６２７−０４４)の合成。
【化８３】
0005542832.tif 000116
ＨＢＴＵ(３８mg)、２−(ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシ)酢酸(Fluka、２５mg)、ＤＩＥＡ(４４μL)および５mL  ＤＭＦを２０mL  ガラスバイアル中で合わせた。反応を環境温度で３０分間撹拌し、化合物Ｄ(３８mg)を添加した。反応を環境温度で１７時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ解析により発物質は残っていないが、所望の生成物と共に数種の過アシル化副産物が形成されたことが示された。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、連続的にＨ２Ｏおよび飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。残留物を５mL  ＴＨＦに取り込み、１mLアリコートの１Ｍ  水性ＬｉＯＨで、環境温度で２時間処理し、その時点で、ＬＣ−ＭＳ解析により、過アシル化生成物の所望の生成物への加水分解が示された。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水に分配し、有機層を分離し、飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗物質を、Ａ中５％溶媒Ｂ(Ａ：ＤＭＣ；Ｂ：２％ＮＨ３のＭｅＯＨ溶液)を使用するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、所望の化合物Ｅを得た。MS(ESI+)：計算値853.44, 実測値853.50 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.401 (9H, s), 1.643 (2H, quint. J=6.8Hz), 1.750 (2H, quint. J=6.8Hz), 2.269 (3H, s), 2.453 (3H, s), 2.96 (2H, m), 3.09 (2H, m), 3.162 (2H, q, J=6.0Hz), 3.298 (overlapping with H2O signal), 3.393 (2H, t, J=5.6Hz), 3.45 (4H, m), 3.51 (6H, m), 4.219 (2H, s), 5.106 (2H, s), 6.758 (1H, dd, J=2.4, 8.4Hz), 6.840 (1H, d, J=2.8Hz), 7.094 (1H, d, J=8.4Hz), 7.102 (1H, br.d, J=8.0Hz), 7.394 (1H, s), 7.495 (2H, d, J=8.4Hz), 7.837 (2H, d, J=8.4Hz), 7.994 91H, br.t, 5.2Hz), 8.379 (1H, d, 8.4Hz), 8.441 (1H, t, 5.4Hz), 8.737 (1H, s), 8.869 (1H, s), 10.307 (1H, br.s)。
【０５０５】
化合物Ｅ(２８mg)を３Ｍ  メタノール性ＨＣｌで、環境温度で３０分間処理し、減圧下濃縮した。この操作を繰り返した。表題化合物４−((４−(２−(５−アミノ−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−２−イル)エチル)−３−メチルフェノキシ)メチル)−Ｎ−(１−(アミノオキシ)−２−オキソ−７,１０,１３−トリオキサ−３−アザヘキサデカン−１６−イル)ベンズアミドヒドロクロライド(ＴＵ３６２７−０４４)を黄色固体として得た. MS(ESI+)：m/z 753.40 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.651 (2H, quint, J=6.6Hz), 1.752 (2H, quint, J=6.6Hz), 2.290 (3H, s), 2.5 (one methyl peak overlapping with DMSO signal), 2.98 (2H, m), 3.15 (4H, m), 3.155 (2H, q, J=7.2Hz), 3.47 (12H, m), 4.463 (2H, s), 5.109 (2H, s), 6.767 (1H, dd, J=2.8, 8.4Hz), 6.854 (1H, d, J=2.8Hz), 7.108 (1H, d, 8.4Hz), 7.431 (1H, d, J=8.4Hz), 7.498 (2H, d, J=8.4Hz), 7.545 (1H, s), 7.848 (2H, d, J=8.4Hz), 8.240 (1H, t, 5.6Hz), 8.467 (1H, t, J=5.6Hz), 8.542 (1H, d, J=8.4Hz0, 8.875 (1H, 2d, J=2.0Hz), 8.993 (1H, br.s), 9.027 (1H, d, J=2.0Hz), 9.729 (1H, br.s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：19.177, 21.141, 29.034, 29.322, 32.851, 33.345, 35.615, 36.581, 67.843, 68.199, 68.426, 69.470, 69.503, 69.685, 69.713, 71.237, 111.909, 115.691, 116.495, 117.691, 124.022, 126.495, 127.069, 127.212, 129.652, 129.824, 130.850, 131.127, 131.872, 132.820, 133.883, 137.116, 140.285, 141.689, 143.895, 151.303, 153.491, 156.438, 165.784, 166.659。
【０５０６】
実施例３８−３：Ｎ−(５８−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−１５,５５−ジオキソ−４,７,１０,１８,２１,２４,２７,３０,３３,３６,３９,４２,４５,４８,５１−ペンタデカオキサ−１４,５４−ジアザオクタペンタコンチル−４−((４−(２−(５−アミノ−８−メチルベンゾ[ｆ][１,７]ナフチリジン−２−イル)エチル)−３−メチルフェノキシ)メチル)ベンズアミド(Ｘ３６７８−１１４)の合成。
【化８４】
0005542832.tif 000117
ｄＰＥＧ−酸Ｆ(１００mg)、ＨＡＴＵ(５２.８mg)およびＤＩＥＡ(９７μL)の２.０mL  ＤＭＦ中の混合物を室温で３０分間撹拌した。アミンＤ(１０９mgの化合物Ｃから製造)を添加し、反応を、ＨＰＬＣでモニターして終了するまで室温で撹拌した。生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより単離した。先の工程からの生成物ＧのＢｏｃ基(１３８mg)を、メタノール中３Ｎ  ＨＣｌでの処理により除去し、濃縮乾固した。２.０mL  ＤＭＦ中のリチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエート(２５.２mg)、ＨＡＴＵ(３８.０mg)およびＤＩＥＡ(６９.７μL)の混合物を室温で３０分間撹拌した。アミンＨを添加し、反応を、ＨＰＬＣでモニターして終了するまで室温で撹拌した。生成物(Ｘ３６７８−１１４)を分取ＨＰＬＣにより単離した。MS(ESI+)：m/z 743.00 (MH22+/2)。
【０５０７】
実施例３８−４：２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)−Ｎ−(３−ニトロベンジル)アセトアミド(ＴＵ６３３−０６８)の合成。
【化８５】
0005542832.tif 000118
リチウム２−(４−アセチル−３−アミノフェノキシ)アセテート(２１５mg)、ＨＢＴＵ(３７９mg)、および１０mL  ＤＭＦを２０mL  ガラスバイアルで合わせ、得られたスラリーを環境温度で１時間で撹拌し、その時点で反応混合物はほとんど均一になった。バイアルに、３'−ニトロベンジルアミンＨＣｌ(１９２mg)およびＤＩＥＡ(１９１μL)を添加し、反応を環境温度で３０分間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、水、飽和水性ＮａＣｌで連続的に洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下濃縮した。粗物質をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン／ＥｔＯＡｃ)で精製して、表題化合物を黄色固体として得た。MS(ESI+)：m/z 344.10 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：2.526 (3H, 3), 4.587 (2H, s), 4.641 (2H, d, J=6.4Hz), 6.091 (1H, d, J=2.8Hz), 6.239 (1H, dd, J=2.8Hz, 8.8Hz), 6.969 (1H, br.s), 7.511 (1H, t, J=7.6Hz), 7.624 (1H, d, J=7.6Hz), 7.678 (1H, d, J=8.8Hz), 7.849 (1H, m), 8.131 (1H, s), 8.141 (1H, d, J=7.6hz)。
【０５０８】
実施例３８−５：２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−Ｎ−(４−ニトロベンジル)アセトアミド(ＴＵ３６２７−０２０)の合成。
【化８６】
0005542832.tif 000119
リチウム２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)アセテート(４４.２mg)およびＨＢＴＵ(７９.６mg)を２０mL  ガラスバイアルに入れ、乾燥ＤＭＦ(５mL)を添加した。得られたスラリーを環境温度で撹拌し、１０分間以内に均質になった。１５分間後、ＤＩＥＡ(５０μL)および４'−ニトロベンジルアミンＨＣｌ(３７.７mg)を反応混合物に添加し、反応を環境温度で撹拌した。３０分間後、ＬＣ−ＭＳ解析で反応の終了を確認した。反応混合物をＥｔＯＡｃおよび水に分配した。有機層を分離し、連続的に希水性クエン酸、飽和水性ＮａＨＣＯ３、および飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物を黄褐色固体として得た。MS(ESI+)：m/z 330.10 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：4.463 (2H, d, J=6.0Hz), 4.597 (2H, s), 6.246 (1H, d, J=2.4hz), 6.308 (1H, dd, J=2.4Hz, 8.8Hz), 7.235 (1H, br.s), 7.465 (1H, d, 8.8Hz), 7.518 (2H, d, J=8.8Hz), 8.173 (2H, d, J=8.8Hz), 8.821 (1H, t, J=6.2Hz), 9.657 (1H, s). C-NMR (400MHz, DMSO-d6)：41.415, 66.627, 98.724, 104.297, 113.217, 123.267, 128.056, 137.581, 146.303, 147.287, 152.698, 162.872, 167.526, 191.685。
【０５０９】
実施例３８−６：２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−Ｎ−(２−(２,４−ジニトロフェニルアミノ)エチル)アセトアミド(ＴＵ３６２７−０２２)の合成。
【化８７】
0005542832.tif 000120
表題化合物を、Ｎ１−(２,４−ジニトロフェニル)エタン−１,２−ジアミン(Oakwood, cat # 015083、４５.２mg)を、４'−ニトロベンジルアミンＨＣｌの変わりにＤＩＥＡ非存在下で使用する以外、ＴＵ３６２７−０２０と同様に製造した。ＴＵ３６２７−０２２を黄色固体として得た。Rf. 0.15 (SiO2, 5%MeOHのDCM溶液). MS(ESI+)：m/z 404.10 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：3.420 (2H, m), 3.593 (2H, m), 4.467 (2H, s), 6.181 (1H, d, 2.0Hz), 9.248 (1H, dd, J=2.4, 8.8Hz), 7.173 (2H, br.s), 7.302 (1H, d, J=9.6Hz), 7.406 (1H, d, J=8.4hz), 8.230 (1H, dd, J=2.4, 9.6Hz), 8.370 (1H, t, J=6.0Hz), 8.841 (1H, d, J=2.8Hz), 8.924 (1H, t, J=5.6Hz), 9.618 (1H, s)。
【０５１０】
実施例３８−７：４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−Ｎ−(２−(２,４−ジニトロフェニルアミノ)エチル)ブタンアミド(ＴＵ３６２７−０８８)の合成。
【化８８】
0005542832.tif 000121
リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエート(５０mg)、ＨＢＴＵ(８０mg)およびＤＭＦ(２mL)を２０mL  ガラスバイアルで合わせ、環境温度で撹拌した。３０分間後、Ｎ１−(２,４−ジニトロフェニル)エタン−１,２−ジアミン(Oakwood、４５mg)を一度に添加し、反応を環境温度で一夜撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、連続的に希水性クエン酸、水、飽和水性ＮａＨＣＯ３、水、および飽和水性ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、表題化合物を黄色固体として得た。Rf：0.18 (SiO2, EtOAc). MS(ESI+)：m/z 432.20 (MH+). H-NMR (400MHz, DMSO-d6)：1.914 (2H, quint, J=7.0Hz), 2.224 (2H, t, J=7.0Hz), 3.349 (2H, q, J=6.0Hz), 3.538 (2H, q, J=6.0Hz), 3.928 (2H, t, J=6.4Hz), 6.165 (1H, s), 6.176 (1H, dd, J=2.4, 10.0Hz), 7.133 (1H, br.s), 7.268 (1H, d, J=10.0Hz), 7.371 (1H, d, J=8.4Hz), 8.167 (1H, t, J=5.8Hz), 8.250 (1H, dd, J=2.8, 8.8Hz), 8.835 (1H, d, J=2.8Hz), 8.913 (1H, t, J=5.6Hz), 9.599 (1H, s). C-NMR (100MHz, DMSO-d6)：24.489, 31.436, 37.331, 42.745, 66.782, 98.040, 104.339, 112.751, 115.130, 123.472, 123.564, 129.725, 134.731, 137.484, 148.305, 152.824, 163.873, 172.251, 191.400。
【０５１１】
実施例３８−８：４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−Ｎ−(４−ニトロベンジル)ブタンアミド(３７９３−００１)の合成。
【化８９】
0005542832.tif 000122
ＨＡＴＵ(１１４.１mg)を、リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−ブタノエート(６８.７mg)の１mL  ＤＭＦ溶液に添加し、反応を室温で１時間振盪した。得られた溶液を４−ニトロベンジルアミンＨＣｌ塩(５６.６mg)およびトリエチルアミン(８４μL)の１mL  ＤＭＦ溶液に添加し、さらに１mL  ＤＭＦで移動を助けた。反応を室温で２時間撹拌した。終了後、反応混合物を４mLの１０％ＮａＣｌ(水性)および８mLのＥｔＯＡｃに分配した。相を分離し、水性層を８mL  ＥｔＯＡｃで再び抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗オレンジ色油状物を得た。粗油状物を、シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで、０−１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭの勾配溶出で精製して、所望の生成物を明黄色固体として得た。MS(ESI+)：m/z 358.2. 1H NMR (400 MHz, CDCl3)：9.70 (s, 1H), 8.14 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.40 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.35 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.26 (dd, J=2.2 Hz, 8.8 Hz, 1H), 6.20 (br, 2H), 6.03 (d with br, J=2.0 Hz, 2H), 4.54 (d, J=6.0 Hz, 2H), 4.02 (t, J=5.8 Hz, 2H), 2.47 (t, J=7.0 Hz, 2H), 2.17 (quintet, J=6.5 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3)：192.0, 172.2, 164.4, 152.2, 147.2, 145.8, 137.8, 128.2, 123.9, 113.9, 105.3, 98.9, 66.7, 42.8, 32.5, 24.8。
【０５１２】
実施例３８−９：３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)−２−(４−ニトロベンズアミド)プロパン酸の合成(Ｘ３４７１−１１６)。
【化９０】
0005542832.tif 000123
４−ニトロ安息香酸(５０.１mg)、ＨＡＴＵ(１１４mg)およびＤＩＥＡ(１０５μL)に１mL  ＤＭＦを添加し、混合物を３０分間撹拌した。得られた溶液を１.０mL  ＤＭＦ中３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)−２−アミノプロパン酸(６６.７mg、１.０当量)に添加し、反応を室温で撹拌し、ＬＣ−ＭＳでモニターした。表題生成物を分取ＨＰＬＣにより単離した。1H NMR (400 MHz, MeOD)：δ 8.28 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.93 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.72 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.69 (d, J=1.6 Hz, 1H), 6.61 (dd, J'=8.4 Hz, J"=1.6 Hz, 1H), 3.28 (dd, J'=13.8 Hz, J"=10.0 Hz, 1H), 3.02 (dd, J'=13.8 Hz, J"=10.0 Hz, 1H), 2.51 (s, 3H)；ESI-MS(m/z) 372.34 (MH+)。
【０５１３】
実施例３８−１０：４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノイル−ＡｌａＧｌｙＳｅｒＡｒｇＳｅｒＧｌｙ(Ｄ−Ａｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨ(３６４７−１０４)の合成。
【化９１】
0005542832.tif 000124
Ｆｍｏｃ−ｅｘＰＡＤＲＥ  ＣＬＥＡＲ樹脂(５４９.３mg、０.１mmol、Peptide International Inc.から購入)のＦｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦ(８mL×３)により除去した。樹脂をＤＭＦ(１.５mL×５)で洗浄した。樹脂を、リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−ブタノエート(３４.４mg)、ＨＢＴＵ(４５.５mg)、ＨＯＢｔ(１６.２mg)、およびＤＩＥＡ(５２μL)の３mL  ＤＭＦ溶液で６時間、室温で処理した。樹脂をＤＭＦで洗浄し、ペプチドを、Ｈ２Ｏ／Ｍｅ２Ｓ／ＴＦＡ(１０／１０／８０  ｖ／ｖ％、１０mL)を２時間、室温で使用して開裂させた。開裂スラリーをグラスウールを通して濾過し、ＴＦＡの大部分を蒸発により濾液から除去した。残留物を１Ｎ  ＮａＯＨ(水性)で中和し、アセトニトリルで希釈し、SpectraProＴＭ  ７透析膜(１０００のＭＷＣＯ)を使用して、５０％ＭｅＣＮ(水性)(４Ｌ×１０)で透析した。膜透析膜内に残った溶液を凍結乾燥して、所望の生成物を白色固体として得た。ESI-MS C94H150N26O26 [M+2H]2+/2の計算値：1030.6, [M+3H]3+/3：687.4；観察値：1030.7, 687.6。
【０５１４】
実施例３８−１１：３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)プロパノイル−Ｇｌｙ(Ｄ−Ａｌａ)ＬｙｓＣｈａＶａｌＡｌａＡｌａＴｒｐＴｈｒＬｅｕＬｙｓＡｌａ(Ｄ−Ａｌａ)Ｇｌｙ−ＯＨ(３４６５−１４３)の合成。
【化９２】
0005542832.tif 000125
Ｆｍｏｃ−ＰＡＤＲＥ  ＣＬＥＡＲ樹脂(１０５.３mg、０.０２mmol、Peptide International Inc.から購入)のＦｍｏｃ基を、２０％ピペリジン／ＤＭＦ(８mL×３)により除去した。樹脂をＤＭＦ(１.５mL×５)で洗浄した。樹脂を、リチウム３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)プロパノエート(５.１mg)、ＨＢＴＵ(９.１mg)、およびＨＯＢｔ(３.３mgｌ)の０.５mL  ＤＭＦ溶液と、７時間、室温で結合させた。樹脂をＤＭＦで洗浄し、ペプチドを、２時間ＴＩＰＳ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡ(５／５５／９０  ｖ／ｖ％、３mL)により樹脂から開裂させた。開裂スラリーをグラスウールを通して濾過し、ＴＦＡの大部分を蒸発により濾液から除去した。残留物をヘキサン(３mLｘ３)で洗浄し、５０％ＭｅＣＮ(水性)に溶解した。凍結乾燥後、粗生成物を得て、それを分取ＨＰＬＣで精製して、所望の生成物を明黄色粉末として得た。ESI-MS C77H120N18O18 [M+2H]2+/2の計算値：793.5, [M+3H]3+/3：529.3；観察値：793.6, 529.4。
【０５１５】
実施例３８−１２：６−(４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタンアミド)ヘキシル−５'−＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ａ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｇ＊Ａ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ−３'(＊：ホスホチオエート)(３６４７−０５７)の合成。
【化９３】
0005542832.tif 000126
ＨＢＴＵ(６.１mg)、ＨＯＢｔ(２.２mg)、およびトリエチルアミン(７μL)を、リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−ブタノエート(４.６mg)の１mL  ＤＭＳＯ溶液に添加し、反応を室温で１時間振盪した。２７６μLアリコートの得られた溶液を、アミノ−修飾ＢＧ１オリゴ(１２.１mg、１.８μmol、Integrated DNA Technologies, Inc.から購入)およびトリエチルアミン(１５μL)の１.２mL  ＤＭＳＯ溶液に添加し、反応を室温で２日間振盪した。反応混合物を水で希釈し、Slide-A-LyzerＴＭ(３５００のＭＷＣＯ)を使用して水(４Ｌ×１０)に対して透析した。透析溶液を凍結乾燥して、所望の生成物を白色固体として得た。ESI-Q-TOF C211H273N69O108P20S20の計算値：6759.7；観察値：6759.1。
【０５１６】
実施例３８−１３：６−(３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)プロパンアミド)ヘキシル−５'−＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ−３'(＊：ホスホチオエート)(３５９７−０３３)の合成。
【化９４】
0005542832.tif 000127
ＨＢＴＵ(５.９mg)およびＨＯＢｔ(２.１mg)を、リチウム３−(４−アセチル−３−アミノフェニル)プロパノエート(３.３mg)の１mL  ＤＭＳＯ溶液に添加し、反応を室温で１時間振盪した。２０μLアリコートの得られた溶液をアミノ−修飾ＢＧ２オリゴ(１.８８mg、０.２６μmol、Integrated DNA Technologies, Inc.から購入)およびトリエチルアミン(２μL)の０.２mL  ＤＭＳＯ溶液に添加し、反応を室温で２０時間振盪させた。反応混合物をＨ２Ｏで平衡化したＮＡＰ−２５ＴＭカラムに載せ、Ｈ２Ｏで溶出した。全ての１mL  フラクションをＬＣ−ＭＳでモニターし、所望の生成物を含むフラクションを合わせ、凍結乾燥して、所望の生成物を白色固体として得た。MS(ESI+)：m/z 1858.8 ([M+4H]4+/4)。
【０５１７】
実施例３８−１４：６−(４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタンアミド)ヘキシル−５'−＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ−３'(＊：ホスホチオエート)(３５９７−１６７)の合成。
【化９５】
0005542832.tif 000128
ＨＡＴＵ(７.４mg)を、リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−ブタノエート(５.５mg)の１mL  ＤＭＳＯ溶液に添加し、反応を室温で１時間振盪した。６０μLアリコートの得られた溶液をアミノ−修飾ＢＧ２オリゴ(６.９mg、１.０μmol)およびトリエチルアミン(７.５μL)の０.６mL  ＤＭＳＯ溶液に添加し、反応を室温で２０時間振盪した。さらに、ＨＡＴＵの変わりにＨＢＴＵを使用する以外同じ方法で新たに調製した６０μLアリコートの活性化エステル溶液を反応混合物に添加し、反応をさらに２日間振盪した。反応混合物を３分割した。各部分をＨ２Ｏで平衡化したＮＡＰ−２５ＴＭカラムに載せ、Ｈ２Ｏで溶出した。全ての１mL  フラクションをＬＣ−ＭＳでモニターし、所望の生成物を含むフラクションを合わせ、凍結乾燥して、所望の生成物を白色固体として得た。ESI-Q-TOF C229H296N78O120P22S22の計算値：7442.8；観察値：7442.7。
【０５１８】
実施例３９：スピン標識−ＡＢＡ剤の合成
実施例３９−１：Ｎ−(３−アミノ−４−ホルミルフェニル)−１−ヒドロキシ−２,２,５,５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボキサミド(Ｘ３６２６−１１２ｂ)の合成。
【化９６】
0005542832.tif 000129
２,２,５,５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸(５５.３mg)、ＨＢＴＵ(１０２mg)およびＤＩＥＡ(１０５μL)に、２.０mL  ＤＭＦを添加した。室温で３０分間撹拌後、２,４−ジアミノベンズアルデヒド(４０.８mg)を添加した。混合物をＨＰＬＣでモニターして、反応が終了するまで室温で撹拌した。表題生成物を分取ＨＰＬＣにより単離した。MS(ESI+)：m/z 303.15 (MH+)。
【０５１９】
実施例４０：ビオチン−ＡＢＡ剤の合成
実施例４０−１：Ｎ−(３−アミノ−４−ホルミルフェニル)−１−(ビオチンアミド)−３,６,９,１２−テトラオキサペンタデカン−１５−アミド(Ｘ３６２６−１４０)の合成。
【化９７】
0005542832.tif 000130
２,４−ジアミノベンズアルデヒド(１１.５mg)、ＮＨＳ−ｄＰＥＧＴＭ４  ビオチン(QuantaBiodesign, cat # 10200、５０mg)およびＤＭＡＰ(１０.４mg)に、１.０mL  ＤＭＦを添加した。反応混合物をＨＰＬＣでモニターして、反応が終了するまで室温で撹拌した。生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。MS(ESI+)：610.28 (MH+)。
【０５２０】
実施例４０−２：Ｎ−(１−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)−２−オキソ−７,１０,１３−トリオキサ−３−アザヘキサデカン−１６−イル)−ビオチンアミド(Ｘ３６２６−１４２)の合成。
【化９８】
0005542832.tif 000131
リチウム２−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)アセテート(４５.３mg)、ＨＢＴＵ(７７.８mg)およびＤＩＥＡ(３１μL)に、１mL  ＤＭＦを添加し、混合物を３０分間撹拌した。得られた溶液を１.０mL  ＤＭＦ中ビオチン−ｄＰＥＧＴＭ３−ＮＨ３＋ＴＦＡ(QuantaBiodesign, cat# 10193、１００mg)、ＤＩＥＡ(４７μL)に添加し、反応をＬＣＭＳによりモニターして、室温で撹拌した。生成物を分取ＨＰＬＣにより単離した。MS(ESI+)：624.30 (MH+)。
【０５２１】
実施例４１：蛍光−ＰＥＧ−ＡＢＡ剤の合成
実施例４１−１：フルオレセイン−ＰＥＧ−ＡＢＡ(Ｘ３７５７−４８)の合成。
【化９９】
0005542832.tif 000132
ＤＭＦ(２.０mL)を、ＮＨＳ−フルオレセインＡ(２３.６mg)、アミンＢ(１７.６mg)およびＤＩＥＡ(８.７μL)に添加した。混合物を、ＨＰＬＣでモニターして、Ａが消費されるまで室温で撹拌した。生成物Ｃを分取ＨＰＬＣにより単離した。ESI-MS(m/z) 679.72 (MH+)。得られた生成物(Ｃ、７.４mg)を３Ｍ  ＨＣｌ(１.０mL)に溶解し、５分間、室温で撹拌後メタノールを蒸発により除去した。この操作を繰り返し、Ｂｏｃを除去して、アミンＤを得た。アミンＤに、リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエート(２.３mg)、ＨＢＴＵ(３.８mg)、ＤＩＥＡ(７.０μL)およびＤＭＦ(２mL)を室温で添加した。表題生成物を分取ＨＰＬＣにより単離した。MS(ESI+)：784.30 (MH+)。
【０５２２】
実施例４２：オリゴ糖類−ＡＢＡ剤の合成
実施例４２−１：３−アミノ−４−ホルミルフェノキシブチレートのＧａｌ−Ｇｌｕ−１−アミド(３７９３−０５０)の合成。
【化１００】
0005542832.tif 000133
ＮａＢＨ３ＣＮ(９４.３mg)を、ＮＨ４ＯＡｃ(７７１mg)およびラクトース(１８０mg)のＨ２Ｏ(１０mL)溶液にｐＨ７で添加し、反応を３５℃で７日間撹拌した。反応混合物を凍結乾燥し、残留物をＨ２Ｏに溶解し、Dowex 1X8-400アニオン交換樹脂(ＯＨ−形、４５ｇ)を通して過剰なＢＨ３ＣＮ−、その副産物およびアセテートを除去した。溶離剤を凍結乾燥して、粗生成物を得て、それをDowex 50WX8-400樹脂(Ｈ＋形、３０ｇ)を使用するカチオン交換クロマトグラフィーで精製して、所望の生成物(３７９３−０４８)を明黄色粉末として得た。ESI-MS C12H25NO10 [MH]+の計算値：344.1；観察値：344.2。
リチウム３−アミノ−４−ホルミルフェノキシブチレート(６.０mg)を、無水ＤＭＳＯ(２００μL)中ＨＢＴＵ(９.９mg)およびＤＩＥＡ(７.７μL)で、１時間処理した。上記からのＧａｌ−Ｇｌｕ−１−アミン(３７９３−０４８)(７.７mg)のＤＭＳＯ(２５０μL)溶液を反応混合物に室温で添加し、１日間撹拌した。反応混合物を凍結乾燥し、分取ＨＰＬＣ−ＭＳでＮＨ４ＯＡｃ溶出を用いて精製して、所望の生成物(３７９３−０５０)を黄色粉末として得た。ESI-MS C23H36N2O13 [MH]+の計算値：549.2；観察値：549.3
【０５２３】
実施例４３：リン脂質−ＡＢＡ剤の合成
実施例４３−１：ＤＯＰＥ−ＡＢＡ(ＴＵ３６２７−０９２)の合成。
【化１０１】
0005542832.tif 000134
リチウム４−(３−アミノ−４−ホルミルフェノキシ)ブタノエート(３４mg)およびＨＢＴＵ(５７mg)を２０mL  ガラスバイアルに入れ、２mL  ＤＭＦを添加した。反応を活性化のために環境温度で３０分間撹拌した。別の２０mL  バイアルに、ＤＯＰＥ(７６mg、１,２,−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン、NOF Corp.)を添加し、ＤＩＥＡ(３５μL)および３mL  ＤＣＭを添加した。第一バイアル中の活性化エステルの黄色溶液を第二バイアルに移し、反応を環境温度で撹拌した。２４時間後、全反応混合物を溶媒Ａ(溶媒Ａ：５％ＮＥｔ３のＤＭＣ溶液、溶媒Ｂ：５％ＮＥｔ３のＭｅＯＨ溶液)で平衡化した１２ｇ  予充填ＳｉＯ２カラムに載せ、１５分間にわたるＡ中０〜１５％Ｂの直線勾配で溶出して、部分的に精製された生成物を明黄色の極めて粘性の油状物として得た。本生成物を再び１２ｇ  ＳｉＯ２カラム(溶媒Ａ：５％ＮＥｔ３のＤＭＣ溶液、溶媒Ｂ：５％ＮＥｔ３のＭｅＯＨ溶液)および１５分間にわたるＡ中２〜１０％Ｂの直線勾配での溶出を使用するフラッシュクロマトグラフィーで精製した。純粋生成物含有フラクションを減圧下で濃縮して、表題化合物のトリエチルアンモニウム塩を得た。Rf：0.43 (SiO2, 10%MeOHのDCM溶液). MS(ESI+)：m/z 949.60 (MH+). H-NMR (400MHz, CDCl3)：0.875 (6H, t, J=6.8Hz), 1.28 (40H, broad multiple peaks), 1.318 (9H, t, J=7.4Hz), 1.582 (4H, m), 2.00 (m, 8H), 2.124 (2H, quint, J=6.8Hz), 2.28 (4H, m), 2.373 (2H, t, J=7.0Hz), 3.042 (6H, q, J=7.2Hz), 3.476 (2H, m), 4.00 (6H, m), 4.154 (1H, dd, J=6.8, 12.0Hz), 4.373 (1H, dd, J=3.2, 12.0Hz), 5.233 (1H, m), 5.337 (4H, m), 6.217 (1H, d, J=2.0Hz), 6.255 (1H, dd, J=2.0, 8.4Hz), 6.56 (2H, very broad peak), 7.313 (1H, d, J=8.8Hz), 7.432 (1H, br.t, J=8.4Hz), 9.674 (1H, s), 11.97 (1H, br.s)
【０５２４】
実施例４４：ＰＣＬ結合架橋の還元
ＰＣＬ結合架橋の還元は、ＰＣＬベースのタンパク質コンジュゲートの解離を阻止することが判明した。図５４Ａは、２−ＡＢＡに結合し、２０mM  ＮａＣＮＢＨ３で１時間還元したｈＦＧＦ２１−Ｌｙｓ１５０ＰＣＬのＥＳＩ質量分光分析を示す。図５４Ｂは、１０mMリン酸緩衝液(ｐＨ７.５)で透析し、５０℃で１日間インキュベートした後の還元ｈＦＧＦ２１−Ｌｙｓ１５０ＰＣＬ２−ＡＢＡコンジュゲートのＥＳＩ質量分光分析を示す。
【０５２５】
図５５は、ＮａＣＮＢＨ３を使用して還元したおよびしていないペグ化ＦＧＦ２１についてのＰＣＬ架橋を示す。ＦＧＦ２１変異体Ａｒｇ１５４ＰＣＬを３０.３kDa−２−ＡＢＡ−ＰＥＧ(ＴＵ３６２７−０２４；実施例３７−７参照)と反応させ、精製した。精製ＦＧＦ２１Ａｒｇ１５４ＰＣＬ−３０.３kDa−２−ＡＢＡ−ＰＥＧを、２０mM  ＮａＢＨ３ＣＮで１６時間還元した(室温、ｐＨ７.５、１００mMタンパク質)。サンプルを１６時間、４℃、室温、３７℃および５０℃で、および９５℃で５分間インキュベートした。還元サンプルおよび非還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図５５Ａに示す。加えて、図５５Ｂは、６０時間、４℃、室温、３７℃および５０℃で、および９５℃でインキュベートした非還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０５２６】
実施例４５：２−ＡＢＡにより共有結合的に修飾したＰＣＬ−Ａ(Ｌｙｓ−Ｐ５Ｃ)およびＰＣＬ−Ｂ(Ｌｙｓ−Ｐ２Ｃ)のＮＭＲ試験。
ＰＣＬ−Ａ(３６４７−１２５、実施例３６−１参照)およびＰＣＬ−Ｂ(３７９３−０１１、実施例３６−２参照)と２−アミノベンズアルデヒド(benzyaldehyde)(２−ＡＢＡ)および得られたＰＣＬ−ＡＢＡ付加物の構造を、標準１Ｄおよび２Ｄ核磁気共鳴(ＮＭＲ)分光学により試験した。
【０５２７】
ＰＣＬ−ＡおよびＰＣＬ−Ｂと２−ＡＢＡの反応および続く生成物の特徴付けについて、ＮＭＲデータを、３００Ｋで、１Ｈ／１３Ｃ／１９Ｆ／３１Ｐ−ＱＮＰ−クリオプローブを備えたBruker Avance 400 MHz NMR装置(Bruker Biospin, Billerica, MA)で記録した。１Ｈ  １Ｄスペクトルを、典型的に１６スキャン、５秒間の弛緩遅延、１２ppmの掃引幅の１６３８４複合データ点で記録した。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルを、典型的に４スキャン、２５６  ｔ１実験および１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹスペクトルを８スキャン、５１２  ｔ１実験で記録した。１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣスペクトルを、典型的に３２スキャン、２５６  ｔ１実験で記録し、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣスペクトルを、典型的に４スキャン、１２８  ｔ１実験で、炭素次元で２２２ppmおよびプロトン次元で１２ppmまたは７.５ppmのスペクトル幅で記録した。
【０５２８】
還元付加物の特徴付けのために、全スペクトルを、３００Ｋで、１Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ−ＴＸＩ−クリオプローブを備えたBruker Avance 600 MHz装置で記録した。１Ｈスペクトルを、典型的に６４スキャン、２秒の弛緩遅延、水抑制のために励起スカルプティング(scalpting)されたと共に、１４ppmの掃引幅の１６３８４複合データ点で記録した。１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹスペクトルは、典型的に１６スキャン、１０２４  ｔ１実験で、１０ppmのスペクトルを用いて記録した。１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣスペクトルを、典型的に８スキャン、２５６  ｔ１実験で、炭素次元で１６０ppmおよびプロトン次元で１０ppmのスペクトル幅を使用して記録した。１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣスペクトルを、典型的に８８スキャン、２５６  ｔ１実験で、３００Ｋで、炭素次元で１８０ppmおよびプロトン次元で１０ppmのスペクトル幅を使用して記録した。
【０５２９】
ＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡの反応を、次の通りモニターした：実施例３６−１にキサニオ通り合成した１.０mgのＰＣＬ−ＡをＤ２Ｏ中０.５mLの１×ＰＢＳに溶解した。Ｄ２Ｏ中１０μLの１０mM  ３−(トリメチルシリル)プロピオン酸(ＴＳＰ)を内部標準として、およびＮＭＲによる濃度決定のために添加した。３.７mgの２−アミノベンズアルデヒド(２−ＡＢＡ；Sigmaから購入)をＤ２Ｏ中の０.５mLの１×ＰＢＳおよび１０μLの１０mM  ＴＳＰに溶解した。両サンプルの濃度をＮＭＲにより決定した。出発物質のＮＭＲシグナル(表７)は、１Ｈ  １Ｄ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣおよび１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣ実験を含む標準ＮＭＲ方法を使用して割り当てた。
【表３３】
0005542832.tif 000135
【０５３０】
反応を開始するために、３２５μLのＰＣＬ−Ａ溶液を１７５μLの２−ＡＢＡ溶液と混合した。得られた反応混合物をＮＭＲチューブに移し、約１：１モル比でＰＣＬ−Ａおよび２−ＡＢＡを含んだ。反応を室温で進行させ、ＮＭＲスペクトルを記載した時間に定期的に獲得した(図５６)。反応中出発ＰＣＬ−Ａ物質(点)および２−ＡＢＡ反応体(星)のシグナルは急速に消失し、反応は終了まで進行して、全ＰＣＬ−Ａが変換された(サンプル中わずかに過剰な２−ＡＢＡが存在した)。混合後０.５時間に得た第一時点で、新規な２個の化学種が約２：１の比で検出された(代表的共鳴を矢印により示す)。数日の経過中に、副次化学種は完全に主要化学種に変化した。
【０５３１】
ＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡの最終反応産物を、標準１Ｄ  １Ｈおよび１３Ｃ、２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１Ｈ  ＲＯＥＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣおよび１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣ  ＮＭＲ分光学で、Ｄ２Ｏおよびｄ６−ＤＭＳＯ中で調製したサンプルで特徴付けした。ｄ６−ＤＭＳＯ中のサンプルをＨＰＬＣで精製した。プロトンおよび炭素共鳴のシグナル割り当ておよびｄ６−ＤＭＳＯ中の１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣスペクトルで観察された相関を表８に要約する。
【表３４】
0005542832.tif 000136
【０５３２】
ＨＭＢＣにおける原子の番号付けおよび選択したスルーボンド(through bond)相関を図５７Ａに示す。ＰＣＬ−Ａ出発物質での観察とは対照的に、炭素１７の２個のメチレンプロトンが２個の異なる化学シフト値として観察される。これらのプロトンはまた、ＨＭＢＣスペクトルにおける炭素７へのヘテロ核スルーボンド相関を示し、窒素１６と炭素７の間の共有結合的結合を示す。炭素７のプロトンは５.６ppm(プロトン７は、図２０１で強調したＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物のシグナルである)であり、炭素２、８、９、５および１３に対する相関を示す。同様に、炭素２のプロトンは、炭素９にＨＭＢＣ相関を示す。Ｄ２ＯおよびＤ６−ＤＭＳＯ中で特徴付けした２個のサンプルのこれらの観察および全ての他のＮＭＲ観察は、ＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物の主要生成物を記載した図５７Ａの構造に一致する。それ故に、全体として、ＮＭＲ証拠は、ＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡの反応瀬産物について以下の構造を示す：
【化１０２】
0005542832.tif 000137
【０５３３】
反応混合物で観察された副次形態の構造特徴付け(図５６)も試みている。解析は、副次形態の低濃度および主要形態にゆっくり変換するとの事実により複雑である。解析は確定的ではない。副次および主要形態は、炭素７に１個のプロトンを有し、両方の化学シフトは極めて類似する(図５６における５.６ppmの矢印)。空間経由ＲＯＥＳＹ接触も同様に両形態で類似する。炭素１７の２個のメチレンプロトンは変性され、それらは、ＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物の副次形態ならびに未反応ＰＣＬ−Ａで同一化学シフトを有することを意味する。これらのプロトンは、しかしながら主要形態では異なる化学シフトを有する。これらのプロトンはまた、副次および主要形態の両方で炭素７とＨＭＢＣ相関を有し、炭素７と窒素１６の間の共有結合的結合を示唆する。副次形態での炭素１７のメチレンプロトンの変性化学シフトは、炭素７と窒素１６の間の共有結合的結合が幾分安定であり、副次形態のＮＭＲ観察が２個以上の化学種の間の化学交換の結果であり得ることを意味し得る。副次形態が、ＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物のプロトン化形態と化学交換した主要形態の別の幾分安定な立体異性体であると考えられる(図５７Ｂ)。
【０５３４】
加えて、Ｄ２Ｏ中の合成ＰＣＬ−Ａおよび２−ＡＢＡの溶液を上記の通り混合し、反応をＮＭＲでモニターして終了まで進行させた。一定量のＤ２Ｏ中のナトリウムシアノボロハイドライド(ＮａＣＮＢＨ３)溶液のＮＭＲチューブへの添加により、ＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物を新規化学種に還元した。さらにＮａＣＮＢＨ３アリコートを、ＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物の特徴である５.６ppmの共鳴(図５６、矢印)が完全に消失するまで添加した。完全に還元したＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物のＮＭＲサンプルを、サンプルを再濃縮し、水を除去するために凍結乾燥および乾燥Ｄ２Ｏ中への再溶解を繰り返した。最終サンプルを０.５mLの乾燥Ｄ２Ｏ中に再構成した。還元形態を、標準２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣおよび１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＱＣ  ＮＭＲ分光学により特注付けした。プロトンおよび炭素共鳴のシグナル割り当ておよび１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣスペクトルからのヘテロ核スルーボンド相関を表９に要約する。
【表３５】
0005542832.tif 000138
【０５３５】
原子の番号付けを図５７Ｃに示す。ＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物の主要形態における観察された相関との重要な差異は、炭素１７と炭素７のメチレンプロトンの間のヘテロ核スルーボンド相関の欠失および炭素２と炭素９のプロトンの間のスルーボンド相関の不在である。これらのおよび全ての他のＮＭＲ観察は、還元ＰＣＬ−Ａ／２−ＡＢＡ付加物の次の構造に一致する(同様に図５７Ｃ)：
【化１０３】
0005542832.tif 000139
【０５３６】
ＰＣＬ−Ｂと２−ＡＢＡの反応を、またＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡの反応と同一条件で試験した。実施例３６−２に記載の通り合成したＰＣＬ−ＢをＤ２Ｏ(上記の通り)に溶解し、ＰＣＬ−Ｂと２−ＡＢＡの１：１のおおよそのモル比の反応混合物をＮＭＲチューブに移した。出発物質のシグナル割り当てを表１０に記載する。
【表３６】
0005542832.tif 000140
【０５３７】
反応を室温で進行させ、ＮＭＲスペクトルを記載した時間に定期的に獲得した(図５８)。ＰＣＬ−Ａサンプルと対照的に、ＰＣＬ−Ｂは２−ＡＢＡと容易に反応しなかった。１７日間後でさえ、少量が新しい化学種に変換する(矢印)が、ほとんどの出発物質(２−ＡＢＡは星印；ＰＣＬ−Ｂは点)がまだ存在する。本化学種はさらに特徴付けしなかった。しかしながら、２個の反応のＮＭＲ解析は、ＰＣＬ−Ａと２−ＡＢＡの反応性がＰＣＬ−Ｂよりもはるかに高いことを明らかに示す。
【０５３８】
実施例４６：ｍＥＧＦに取り込まれたピロリシン(Ｐｙｌ)およびＰＣＬの誘導体化
ピロリシン(Ｐｙｌ)およびＰＣＬのｍＥＧＦへの取り込みを、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、ｐＥＴ２２ｂベクター上、ｐＡｒａ−ｐｙｌＳＴＢＣＤおよび変異体ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＴＡＧ遺伝子で同時形質転換した以外、実施例１４と同様に行った。得られたｍＥＧＦ変異体を以下ｍＥＧＦ−Ｔｙｒ１０ＰＣＬ／Ｐｙｌと呼ぶ。ＥＳＩ−ＭＳ解析は、ＰＣＬおよびＰＹＬの両方がｍＥＧＦの１０位に取り込まれたことを確認した(図５９Ａ；ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＰＣＬの予測質量＝７２９６Da；ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０Ｐｙｌの予測質量＝７３１０Da)。それ故に、ＰＣＬまたはＰＹＬのいずれかが取り込まれたｍＥＧＦタンパク質の混合物を得た。この特定のサンプルにおいて、優占種は、ＰＣＬが取り込まれたｍＥＧＦであった。
【０５３９】
この混合物の誘導体化を証明するために、およびＰＹＬがここで提供される方法を使用して修飾されることを証明するために、ＡＢＡ剤ＴＵ３６２７−０１４(実施例３４−２参照)のｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＰＣＬ／ＰＹＬを、１０×ＰＢＳ(ｐＨ７.０)および１％(ｖ／ｖ)ＤＭＳＯ中、２５℃で１６時間行った。コンジュゲーション反応を、１０mM  ｍＥＧＦ  Ｔｙｒ１０ＰＣＬ／ＰＹＬおよび１mM  ＴＵ３６２７−０１４の添加により開始した。タンパク質コンジュゲートの形成を、エレクトロスプレーイオン化−質量分析(ＥＳＩ−ＭＳ)(図５９Ｂ)により確認した。ＰＣＬとＰＹＬ付加物の比は未反応タンパク質中のＰＣＬとＰＹＬの比に類似し(図５８Ａ)、それによりＰＣＬおよびＰｙｌの同等な反応性が示された。
【０５４０】
ここに記載する実施例および態様は説明の目的のみであり、それを踏まえた種々の修飾またはが当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内および添付する特許請求の範囲の範囲内であることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
0005542832.tif 000171
【図２１Ｂ】
0005542832.tif 000172
【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
0005542832.tif 000179
【図２６Ｃ】
0005542832.tif 000180
【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
0005542832.tif 000182
【図２６Ｆ】
0005542832.tif 000183
【図２７Ａ】
0005542832.tif 000184
【図２７Ｂ】
0005542832.tif 000185
【図２７Ｃ】
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【図２８Ａ】
0005542832.tif 000187
【図２８Ｂ】
0005542832.tif 000188
【図２９Ａ】
0005542832.tif 000189
【図２９Ｂ】
0005542832.tif 000190
【図２９Ｃ】
0005542832.tif 000191
【図２９Ｄ】
0005542832.tif 000192
【図３０】
0005542832.tif 000193
【図３１】
0005542832.tif 000194
【図３２Ａ】
0005542832.tif 000195
【図３２Ｂ】
0005542832.tif 000196
【図３２Ｃ】
0005542832.tif 000197
【図３２Ｄ】
0005542832.tif 000198
【図３２Ｅ】
0005542832.tif 000199
【図３２Ｆ】
0005542832.tif 000200
【図３３Ａ】
0005542832.tif 000201
【図３３Ｂ】
0005542832.tif 000202
【図３３Ｃ】
0005542832.tif 000203
【図３３Ｄ】
0005542832.tif 000204
【図３４】
0005542832.tif 000205
【図３５Ａ】
0005542832.tif 000206
【図３５Ｂ】
0005542832.tif 000207
【図３６】
0005542832.tif 000208
【図３７】
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【図３８】
0005542832.tif 000210
【図３９】
0005542832.tif 000211
【図４０】
0005542832.tif 000212
【図４１】
0005542832.tif 000213
【図４２】
0005542832.tif 000214
【図４３】
0005542832.tif 000215
【図４４】
0005542832.tif 000216
【図４５】
0005542832.tif 000217
【図４６】
0005542832.tif 000218
【図４７Ａ】
0005542832.tif 000219
【図４７Ｂ】
0005542832.tif 000220
【図４７Ｃ】
0005542832.tif 000221
【図４７Ｄ】
0005542832.tif 000222
【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
0005542832.tif 000224
【図４８Ｃ】
0005542832.tif 000225
【図４８Ｄ】
0005542832.tif 000226
【図４９Ａ】
0005542832.tif 000227
【図４９Ｂ】
0005542832.tif 000228
【図５０】
0005542832.tif 000229
【図５１】
0005542832.tif 000230
【図５２】
0005542832.tif 000231
【図５３】
0005542832.tif 000232
【図５４】
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【図５５】
0005542832.tif 000234
【図５６】
0005542832.tif 000235
【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８】
0005542832.tif 000239
【図５９Ａ】
0005542832.tif 000240
【図５９Ｂ】
0005542832.tif 000241
【配列表】
0005542832000001.app