(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．マウスにフロイント完全アジュバント（ｃＦＡ）中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の混合物を注射する工程；
ｂ．該マウスに、フロイント不完全アジュバント（ｉＦＡ）中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の混合物を注射する工程；および
ｃ．該マウスに、フロイント不完全アジュバント中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と、５つの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）（各ＭＡＰ単位は配列番号４９〜５３のポリペプチドから選択される１種の独立した配列を有する）のセットとの混合物を注射する工程；
ｄ．該マウスからＢ細胞を単離する工程；
ｅ．該Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程；および
ｆ．該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む、五重特異性抗体の作製方法。
【請求項２】
ａ．マウスにフロイント完全アジュバント中、５つの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）（各ＭＡＰ単位は配列番号４９〜５３のポリペプチドから選択される１種の独立した配列を有する）のセット（ＭＡＰセット）を注射する工程；
ｂ．該マウスに、フロイント不完全アジュバント中、ＭＡＰセットを注射する工程；
ｃ．該マウスに、フロイント不完全アジュバント中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の全てとＭＡＰセットとの混合物を注射する工程；
ｄ．該マウスからＢ細胞を単離する工程；
ｅ．該Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程；および
ｆ．該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む、五重特異性抗体の作製方法。
【請求項３】
請求項１または２の方法により作製された抗体。
【請求項４】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマ。
【請求項５】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核細胞。
【請求項６】
それぞれ配列番号１３、１４および１５と、配列番号１６、１７および１８のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８に対して多重特異性を有する五重特異性抗体。
【請求項７】
ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの増悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を治療または予防するための医薬を製造するための請求項６に記載の五重特異性抗体の使用。
【請求項８】
それぞれ配列番号１３、１４および１５、または配列番号１６、１７および１８のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体の可変重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項９】
配列番号３４、３５および３６のポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号３１、３２、３３、３４、３５および３６の群から選択される少なくとも４つのポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１１】
単一の宿主細胞において五重特異性抗体（免疫グロブリン）を生産する方法であって、  （ｉ）前記の単一の宿主細胞を、配列番号１３、１４および１５のＣＤＲドメインを含む該免疫グロブリン重鎖の可変ドメインを少なくともコードする第一のＤＮＡ配列と、配列番号１６、１７および１８のＣＤＲドメインを含む該免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第二のＤＮＡ配列とで形質転換する工程；および
（ｉｉ）前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のＤＮＡ配列と前記第二のＤＮＡ配列を発現させる工程
を含む、方法。
【請求項１２】
該第一および第二のＤＮＡ配列が異なるベクター中に存在するか、または該第一および第二のＤＮＡ配列が単一のベクター中に存在する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
好中球の走化性を低下させるための医薬を製造するための請求項６に記載の五重特異性抗体の使用。
【請求項１４】
それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞。
【請求項１５】
それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞。
【請求項１６】
それぞれ配列番号１１と、配列番号４７、５９、６１または６３の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
それぞれ配列番号１１と、配列番号４７、５９、６１または６３の配列と、少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
配列番号１１、４７、５９、６１または６３の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項１９】
それぞれ配列番号１１，４７、５９、６１または６３の配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２０】
それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２１】
それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２２】
単一の宿主細胞において抗体（免疫グロブリン）を生産する方法であって、
（ｉ）前記の単一の宿主細胞を、配列番号４６のポリペプチドを含む重鎖をコードする第一のＤＮＡ配列と、配列番号４８、６０、６２または６４のポリペプチドを含む軽鎖をコードする第二のＤＮＡ配列とで形質転換する工程；および
（ｉｉ）前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のＤＮＡ配列と前記第二のＤＮＡ配列を発現させる工程
を含む、方法。
【請求項２３】
該第一および第二のＤＮＡ配列が異なるベクター中に存在するか、または該第一および第二のＤＮＡ配列が単一のベクター中に存在する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
それぞれ配列番号４６と配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項６記載の抗体。
【請求項２５】
それぞれ配列番号４６と配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項６記載の抗体。
【請求項２６】
それぞれ配列番号４６と配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項６記載の抗体。
【請求項２７】
それぞれ配列番号４６と配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、請求項６記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００７年４月１７日に出願された米国仮出願６０／９１２２２９および２００８年４月１１日に出願された６１／０４４１３２の優先権を主張するものであり、これらは出典明示よりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００２】
技術分野
本発明は、多重特異性を有する抗体に関する。特に、本発明の抗体はヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合する（交差反応する）。本発明はまた、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の１以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾病または障害、特に、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を、前記抗体で処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
公開されているデータおよび報告書で、いくつかの疾病においてＣＸＣＬケモカインのＥＬＲＣＸＣサブファミリーのメンバーが上昇していることが示されている。ＣＸＣＬファミリーメンバーは全部で１６ある。ケモカインは、ＣＯＰＤを含むいくつかの炎症性疾患においてアップレギュレーションされていることが報告されており、ここで、ＣＸＣＬ１−３、５および８はそれぞれ、Ｇｒｏ−α、−β、−γ(Haskill, S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1990: 87, 7732-7736)、ＥＮＡ−７８(Wang, D. and Richmond, A., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1023-1027, Powerm C.A. et al. Gene., 1994: 151, 333-334)、およびＩＬ−８(Iizasa, H. and Matsushima, K., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1061-1067, Matsushima, K. et al., J. Exp. Med. 1988: 167, 1883-1893)としても知られる(Am. J. Respir. Crit Care Med., 163: 349-355, 2001, Am. J. Respir. Crit Care Med., 168: 968-975, 2003, Thorax, 57: 590-595, 2002)。これらのケモカインの発現の延長および上昇がＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害または子宮内膜症などの疾病の発症に関与している可能性があると仮定されている。これらのＣＸＣケモカインは、ＣＸＣＲ１受容体および／またはＣＸＣＲ２受容体と結合し、それを活性化することにより好中球の走化性を刺激することが知られている。従って、これらのケモカインの阻害は、炎症細胞が肺組織へ浸潤するのを防ぎ、かくして組織損傷を防ぎ得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Haskill, S., et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1990: 87, 7732-7736
【非特許文献２】Wang, D. and Richmond, A., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1023-1027
【非特許文献３】Powerm C.A. et al. Gene., 1994: 151, 333-334
【非特許文献４】Iizasa, H. and Matsushima, K., Cytokine Reference. Oppenheim, J.J. and Feldman, M. ed., Academic Press, London, 1061-1067
【非特許文献５】Matsushima, K. et al., J. Exp. Med. 1988: 167, 1883-1893
【非特許文献６】Am. J. Respir. Crit Care Med., 163: 349-355, 2001
【非特許文献７】Am. J. Respir. Crit Care Med., 168: 968-975, 2003
【非特許文献８】Thorax, 57: 590-595, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合する能力を有する抗体、すなわち、五重特異性抗体を使用することによってＣＸＣＲ１受容体およびＣＸＣＲ２受容体の活性化を阻害することに向けられる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、１つの免疫グロブリン内に含まれる多重特異性を有する抗体（免疫グロブリン）に関する。特に、本発明の抗体は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合する（交差反応する）。本発明はまた、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の１以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾病または障害、特に、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を前記抗体で処置する方法に関する。
【０００７】
一態様では、本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８に対して多重特異性を有する（または交差反応する）単離された抗体に関し、従って、本発明者らは本発明の抗体を五重特異性（またはｐａｎ−ＥＬＲ）抗体と定義する。この抗体の定義は、抗原結合部分（またはフラグメント）がヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合するような抗原結合部分（またはフラグメント）を含む。本発明の五重特異性抗体は好ましくは、ネズミモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。紛らわしさを避けるため、本発明の五重特異性抗体は必ずしもヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８抗原だけに結合する必要はなく、他の関連タンパク質と結合してもよく（ヒトＧＣＰ−２など、またはＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＥＮＡ−７８およびＧＣＰ−２の非ヒト相同分子種とさえ結合してもよい）、言い換えれば、本発明の五重特異性抗体は少なくともヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合する。
【０００８】
好ましくは、本発明の五重特異性抗体はヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８のそれぞれと、表面プラズモン共鳴により測定した際に１０−７Ｍ未満、より好ましくは１０−８Ｍ未満、いっそうより好ましくは１０−９Ｍ未満の平衡定数ＫＤ値で結合する。一般に、表面プラズモン共鳴測定は下記のように行われる。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２およびＥＮＡ−７８を本発明の五重特異性抗体で中和することにより、ＣＸＣＲ１およびＣＸＣＲ２受容体の活性化の阻害を介して好中球の走化性を低下させる方法を含む。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、本発明の五重特異性抗体を投与することより、それを必要とする患者において好中球の走化性を低下させる方法に関する。
【００１１】
一実施形態では、五重特異性抗体は、ヒトＩＬ−８のエピトープKELRCQCIKTYSKP（配列番号５４）内で結合する。
【００１２】
一実施形態では、本発明の五重特異性抗体は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と、５つの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）（各ＭＡＰ単位は配列番号４９〜５３のポリペプチドに由来する１つの独立した配列を有する）のセットとの混合物（カクテル）を用いるＲＩＭＭ(Kilpatrick, K.E., et al. Hybridoma. 1997: 16, 381.)型のプロトコールを使用する工程を含む方法によって作出される。
LATELRSQSLQTLQG    配列番号４９
SAKELRSQSIKTYSK    配列番号５０
LRELRSVSLQTTQG     配列番号５１
SPGPHSAQTEVIAT     配列番号５２
ESGPHSANTEIIVK     配列番号５３
【００１３】
特定の理論に縛られるものではないが、ＭＡＰは免疫プロトコール内の２つの機能に役立つ。第一に、ＭＡＰは宿主免疫系に対して既知の標的アミノ酸配列の選択的多重提示を可能とする。第二に、限定されるものではないがリシンなどの、核を介して結合された多重コピーの配列による質量増は、その配列の免疫原性を個々のペプチドの場合よりも高める(Francis, J.P., et al., Immunology, 1991: 73; 249, Schott, M.E., et al., Cell. Immuno. 1996: 174: 199-209, Tam, J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988: 85; 5409-5413)。
【００１４】
本発明を作出するために用いられるＭＡＰは、標的ケモカインのＥＬＲＣＸＣおよびＧＰＨＣＡ領域とともに、またその前後に見られる、多重コピーの保存された標的配列（例えば、配列番号４９〜５３）からなる。ＭＡＰセットの例を図１に示す。
【００１５】
一実施形態では、本発明の五重特異性抗体は、
ａ．マウスにフロイントの完全アジュバント（ｃＦＡ）中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の混合物を注射する工程；
ｂ．該マウスに、フロイントの不完全アジュバント（ｉＦＡ）中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の混合物を注射する工程；および
ｃ．該マウスに、フロイントの不完全アジュバント中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と、５つの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）（各ＭＡＰ単位は配列番号４９〜５３のポリペプチドに由来する１つの独立した配列を有する）のセットとの混合物を注射する工程；
ｄ．該マウスからＢ細胞を単離する工程；
ｅ．該Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程；および
ｆ．該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む方法により作出される。
【００１６】
所望により、工程ｃとｄの間に、マウスに、ＰＢＳ中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と、配列番号４９〜５３のアミノ酸配列を含むＭＡＰのセットとの混合物を注射することができる。
【００１７】
別の実施形態では、本発明の五重特異性抗体は、
ａ．マウスにフロイントの完全アジュバント中、５つの多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）（各ＭＡＰ単位は配列番号４９〜５３のポリペプチドに由来する１つの独立した配列を有する）のセット（以下、ＭＡＰセットとも呼ぶ）を注射する工程；
ｂ．該マウスに、フロイントの不完全アジュバント中、ＭＡＰセットを注射する工程；
ｃ．該マウスに、フロイントの不完全アジュバント中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の全てとＭＡＰセットとの混合物を注射する工程；
ｄ．該マウスからＢ細胞を単離する工程；
ｅ．該Ｂ細胞を骨髄腫細胞と融合させて、所望の五重特異性抗体を分泌する不死のハイブリドーマ細胞を形成させる工程；および
ｆ．該ハイブリドーマの培養上清から該五重特異性抗体を単離する工程
を含む方法により作出される。
【００１８】
所望により、工程ｃとｄの間に、マウスに、ＰＢＳ中、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と、配列番号４９〜５３を有するＭＡＰのセットとの混合物を注射することができる。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、以上の方法により作製された五重特異性抗体に関する。
【００２０】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号１および配列番号３の配列、またはその保存的配列改変を含むヌクレオチド配列によりコードされている重鎖および軽鎖可変領域を有する。
【００２１】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号５および配列番号７の配列、またはその保存的配列改変を含むヌクレオチド配列によりコードされている重鎖および軽鎖可変領域を有する。
【００２２】
一実施形態では、五重特異性抗体は、配列番号９の配列、またはその保存的配列改変を含むヌクレオチド配列によりコードされている重鎖可変領域を有する。
【００２３】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列、またはその保存的配列改変を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する。
【００２４】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含む重鎖および軽鎖可変領域を有する。
【００２５】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列、またはその保存的配列改変を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する。
【００２６】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号６および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含む重鎖および軽鎖可変領域を有する。
【００２７】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号１０および１２のアミノ酸配列、またはその保存的配列改変を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００２８】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号１０および１２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のポリペプチド配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を有する。
【００２９】
一実施形態では、五重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２のアミノ酸；または（ｉｉ）上記（ｉ）のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列、から選択される少なくとも１つの可変領域を含む。
【００３０】
一実施形態では、五重特異性抗体は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８のＣＤＲ配列を含むか、またはこれらの１以上のＣＤＲ配列は配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８の保存的配列改変であり得る。
【００３１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマに関する。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核細胞に関する。
【００３３】
一実施形態では、五重特異性抗体は、（ｉ）配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８；または（ｉｉ）（ｉ）に挙げられている配列の保存的配列改変、から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む。
【００３４】
一実施形態では、五重特異性抗体は配列番号１５のポリペプチドを含む。
【００３５】
一実施形態では、五重特異性抗体は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される少なくとも４つのＣＤＲ配列を含むか、またはこれらのＣＤＲ配列の１以上が配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８に挙げられている配列の保存的配列改変であり得る。
【００３６】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号１３、１４および１５と、配列番号１６、１７および１８のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００３７】
一実施形態では、五重特異性抗体は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４のＣＤＲ配列を含むか、またはこれらのＣＤＲ配列の１以上が配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４に挙げられている配列の保存的配列改変であり得る。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマに関する。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核細胞に関する。
【００４０】
一実施形態では、五重特異性抗体は、（ｉ）配列番号１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４；または（ｉｉ）（ｉ）に挙げられている配列の保存的配列改変、から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む。
【００４１】
一実施形態では、五重特異性抗体は配列番号２１のポリペプチドを含む。
【００４２】
一実施形態では、五重特異性抗体は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４からなる群から選択される少なくとも４つのＣＤＲ配列を含むか、またはこれらのＣＤＲ配列の１以上が配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４に挙げられている配列の保存的配列改変であり得る。
【００４３】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号１９、２０および２１と、配列番号２２、２３および２４のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００４４】
一実施形態では、五重特異性抗体は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０のＣＤＲ配列を含むか、またはこれらのＣＤＲ配列の１以上が配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０に挙げられている配列の保存的配列改変であり得る。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生するハイブリドーマまたはトランスフェクトーマに関する。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核細胞に関する。
【００４７】
一実施形態では、五重特異性抗体は、（ｉ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０；または（ｉｉ）（ｉ）に挙げられている配列の保存的配列改変、から選択される少なくとも１つのＣＤＲ配列を含む。
【００４８】
一実施形態では、五重特異性抗体は配列番号２７のポリペプチドを含む。
【００４９】
一実施形態では、五重特異性抗体は、配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０からなる群から選択される少なくとも４つのＣＤＲ配列を含むか、またはこれらのＣＤＲ配列の１以上が配列番号２５、２６、２７、２８、２９および３０に挙げられている配列の保存的改変であり得る。
【００５０】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号２５、２６および２７と、配列番号２８、２９および３０のＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【００５１】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号１、５もしくは９、または配列番号３もしくは７のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列によりコードされている重鎖または軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号２、６もしくは１０、または配列番号４、８もしくは１２のアミノ酸配列およびその保存的配列改変を含む重鎖または軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
【００５３】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号２、６もしくは１０、または配列番号４、８もしくは１２のアミノ酸配列およびその保存的配列改変を含む重鎖または軽鎖可変領域を有する五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞に関する。
【００５４】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号１３、１４および１５、または配列番号１６、１７および１８のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体の可変重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８から選択される五重特異性抗体のＣＤＲ配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００５６】
一実施形態では、本発明は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７および１８からなる群から選択される五重特異性抗体の少なくとも４つのＣＤＲ配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００５７】
一実施形態では、本発明は、配列番号３１、３２または３３のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、配列番号３４、３５および３６のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、配列番号３１、３２、３３、３４、３５および３６の群から選択される少なくとも４つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号１９、２０および２１、または２２、２３および２４のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体の可変重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３または２４から選択される五重特異性抗体のＣＤＲ配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３および２４からなる群から選択される五重特異性抗体の少なくとも４つのＣＤＲ配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６３】
一実施形態では、本発明は、配列番号３７、３８および３９のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６４】
一実施形態では、本発明は、配列番号４０、４１および４２のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６５】
一実施形態では、本発明は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１および４２の群から選択される少なくとも４つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６６】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５、２６および２７のＣＤＲ配列を含む五重特異性抗体の可変重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６７】
一実施形態では、本発明は、配列番号２５、２６または２７から選択される五重特異性抗体のＣＤＲ配列をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、配列番号４３、４４および４５のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００６９】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号１１と、配列番号４７、５９、６１または６３の配列を含むヌクレオチド配列によりコードされている重鎖および軽鎖を有する。
【００７０】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号１１と、配列番号４７、５９、６１または６３の配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を含むヌクレオチド配列によりコードされている重鎖および軽鎖を有する。
【００７１】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸を含む重鎖および軽鎖を有する。
【００７２】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号４６と配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する。
【００７３】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号４６と配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する。
【００７４】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号４６と配列番号６２のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する。
【００７５】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号４６と配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する。
【００７６】
一実施形態では、五重特異性抗体は、それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のポリペプチドを含む重鎖および軽鎖を有する。
【００７７】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号４６、または配列番号４８、６０、６２もしくは６４のアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖を有する五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞に関する。
【００７８】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞に関する。
【００７９】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号４６、または配列番号４８、６０、６２もしくは６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖または軽鎖を有する五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞に関する。
【００８０】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を有する五重特異性抗体を産生する組換え真核または原核宿主細胞に関する。
【００８１】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号１１と、配列番号４７、５９、６１または６３の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号１１と、配列番号４７、５９、６１または６３の配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８３】
一実施形態では、本発明は、配列番号１１、４７、５９、６１または６３の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８４】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号１１、４７、５９、６１または６３の配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８５】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む五重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８６】
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号４６と、配列番号４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む五重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８７】
一実施形態では、本発明は、配列番号４６、４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、配列番号４６、４８、６０、６２または６４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。
【００８９】
一実施形態では、本発明は、単一の宿主細胞において五重特異性抗体（免疫グロブリン）を生産する方法であって、
（ｉ）前記の単一の宿主細胞を、配列番号４６のポリペプチドを含む重鎖をコードする第一のＤＮＡ配列と、配列番号４８、６０、６２または６４のポリペプチドを含む軽鎖をコードする第二のＤＮＡ配列とで形質転換する工程；および
（ｉｉ）前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のＤＮＡ配列と前記第二のＤＮＡ配列を発現させる工程
を含む方法に関し、さらにこの方法は、前記の第一のＤＮＡ配列と第二のＤＮＡ配列が異なるベクターに存在するか、または前記の第一のＤＮＡ配列と第二のＤＮＡ配列が単一のベクターに存在するようにして行うことができる。
【００９０】
一実施形態では、本発明は、単一の宿主細胞において五重特異性抗体（免疫グロブリン）を生産する方法であって、
（ｉ）前記の単一の宿主細胞を、配列番号１３、１４および１５のＣＤＲドメインを含む免疫グロブリン重鎖の可変ドメインを少なくともコードする第一のＤＮＡ配列と、配列番号１６、１７および１８のＣＤＲドメインを含む免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第二のＤＮＡ配列とで形質転換する工程；および
（ｉｉ）前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のＤＮＡ配列と前記第二のＤＮＡ配列を発現させる工程
を含む方法に関し、さらにこの方法は、前記の第一のＤＮＡ配列と第二のＤＮＡ配列が異なるベクターに存在するか、または前記の第一のＤＮＡ配列と第二のＤＮＡ配列が単一のベクターに存在するようにして行うことができる。
【００９１】
一実施形態では、本発明は、単一の宿主細胞において五重特異性抗体（免疫グロブリン）を生産する方法であって、
（ｉ）前記の単一の宿主細胞を、配列番号１９、２０および２１のＣＤＲドメインを含む免疫グロブリン重鎖の可変ドメインを少なくともコードする第一のＤＮＡ配列と、配列番号２２、２３および２４のＣＤＲドメインを含む免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインを少なくともコードする第二のＤＮＡ配列とで形質転換する工程；および
（ｉｉ）前記の免疫グロブリン重鎖および軽鎖が前記の形質転換された単一の宿主細胞において独立した分子として産生されるように、前記第一のＤＮＡ配列と前記第二のＤＮＡ配列を発現させる工程
を含む方法に関し、この方法は、前記の第一のＤＮＡ配列と第二のＤＮＡ配列が異なるベクターに存在するか、または前記の第一のＤＮＡ配列と第二のＤＮＡ配列が単一のベクターに存在するようにして行うことができる。
【００９２】
一実施形態では、本発明は、ＥＬＩＳＡアッセイなどのイムノアッセイにおいて、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＥＮＡ−７８およびＧＣＰ−２に対する上述の五重特異性抗体のいずれか１つの結合を完全にまたは部分的に遮断する抗体に関する。一実施形態では、部分的遮断は、抗体が五重特異性抗体の結合を１０％、２０％、４０％または５０％を超えて遮断する場合に起こる。
【００９３】
一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＥＮＡ−７８およびＧＣＰ−２に対する上述の五重特異性抗体のいずれかの結合と競合する抗体に関する。
【００９４】
一実施形態では、本発明は、ＥＬＩＳＡアッセイなどのイムノアッセイにおいて、ヒトＩＬ−８のエピトープKELRCQCIKTYSKP（配列番号５４）に対する上述の五重特異性抗体のいずれか１つの結合を完全にまたは部分的に遮断する抗体に関する。一実施形態では、部分的遮断は、抗体が五重特異性抗体の結合を１０％、２０％、４０％または５０％を超えて遮断する場合に起こる。
【００９５】
一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−８のエピトープKELRCQCIKTYSKP（配列番号５４）に対する上述の五重特異性抗体のいずれかの結合と競合する抗体に関する。
【００９６】
一実施形態では、本発明は、上述の五重特異性抗体と薬学上許容される担体とを含む組成物に関する。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、哺乳類において、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を治療または予防する方法であって、該哺乳類に有効量の上述の五重特異性抗体を投与することを含む方法に関する。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２およびＥＮＡ−７８の１以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾病または障害、特に、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害または子宮内膜症の処置に用いるための上述の五重特異性抗体に関する。
【００９９】
一態様では、本発明は、哺乳類において、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を予防および／または治療する際に用いるための上述の五重特異性抗体に関する。
【０１００】
一態様では、本発明は、哺乳類において、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を予防および／または治療する際に用いるための薬剤の製造における上述の五重特異性抗体の使用に関する。
【０１０１】
一態様では、本発明は、哺乳類において、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を予防および／または治療するための薬剤の製造における上述の五重特異性抗体の使用に関する。
【０１０２】
一実施形態では、上記哺乳類はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】五重特異性抗体を作出するためのＭＡＰセットの例を示す。紛らわしさを避けるため、５つのＭＡＰペプチド単位を示す。核単位は配列番号４９〜５３の直鎖ペプチドから選択される同一のアミノ酸配列を１つ含む。
【図２】ＢＡＬサンプル中に存在する好中球を比較したフローサイトメトリーデータを示す。セッション１、２および３を示す。黒い実線のバーは、ＬＰＳ投与５日前のベースライン示す。グレーの実線のバーは、ＬＰＳ投与６時間後のＢＡＬデータを示す。キメラ抗体（ＨｃＬｃ）処置は有意に、かつ、用量依存的に好中球の浸潤を阻害した。グレーの斜線を施したバーは２４時間でのデータを示す（ｎ＝６、＊ｐ≦０．０５、†ｐ≦０．０１、エラーバーは標準偏差を表す）。
【図３】全循環好中球（細胞総数）の血液学的分析を示す。キメラ抗体（ＨｃＬｃ）１ｍｇ／ｋｇ（白四角、□）および１０ｍｇ／ｋｇ（黒丸、●）のＩＶ注射は循環好中球のＬＰＳ刺激を妨げた。１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでの処置は双方ともビヒクルＮＨＰ（†）に比べて有意に低くなり、１０ｍｇ／ｋｇでの処置は１ｍｇ／ｋｇ用量（＊）に比べても有意に低くなった。データは、血液１μｌ当たりの総数として表されている（ｎ＝６、＊１ｍｇ／ｋｇに対してｐ≦０．０５、†ビヒクルに対してｐ≦０．０１、エラーバーは標準偏差を表す）。
【図４】ヒトＩＬ−８により刺激された好中球活性化（ＣＤ１１ｂ表面発現の増加）の阻害を示す。精製ヒト好中球の添加前に、種々の濃度のヒト化五重特異性抗体を１０ｎＭのｈＩＬ−８とともにプレインキュベートした。データは４個体の異なるドナー（ｎ＝４）の平均値として表されている。バーは標準誤差を表す。全サンプルを、ｈＩＬ−８のみで刺激した精製好中球（精製好中球を加える前にｍＡｂが無い）と比較している。ヒト化構築物Ｈ０Ｌ１０およびＨ０Ｍ０が、ｈＩＬ−８により刺激されたＣＤ１１ｂ表面発現の阻害に効果が高い。
【図５Ａ】標的ヒトケモカインと結合するマウス６５６．３５ｍＡｂを示す。
【図５Ｂ】ヒト標的ケモカインと結合するキメラ抗体（ＨｃＬｃ）ｍＡｂを示す。
【図５Ｃ】ヒト標的ケモと結合するヒト化ｍＡｂを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０４】
本明細書において「単離された五重特異性抗体」または単に「五重特異性抗体」とは、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合し、従って、それらと交差反応し、かつ、抗原特異性の異なる他の抗体を実質的に含まず、さらに、単一の組成物である抗体を指すものとする。紛らわしさを避けるため、本発明の五重特異性抗体は必ずしもヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８抗原だけに結合する必要はなく、ヒトＧＣＰ−２などの他の関連タンパク質と偶然結合してもよく、あるいはＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＥＮＡ−７８およびＧＣＰ−２の非ヒト相同分子種とさえ結合してもよく、言い換えれば、本発明の五重特異性抗体は少なくともヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合する。さらに、単離された五重特異性抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まない。本明細書で用いる五重特異性抗体はまた、抗原結合フラグメントおよび／またはそれらの「親」五重特異性抗体の結合特性を有する誘導体も含む。本発明の五重特異性抗体は、それぞれ重鎖と軽鎖からなる２つのヘテロ二量体からなる典型的な左右対称の免疫グロブリン分子を形成する２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖を含み得る。よって、本発明の五重特異性抗体は、１つの重鎖と１つの軽鎖の会合によって形成された２コピーの同じ抗原結合ドメインを含み得る。本発明の五重特異性抗体は、１種類の結合ドメインだけを有するが、なお、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合可能であり、従って、それらと交差反応可能である。
【０１０５】
本明細書において「抗体」は、「免疫グロブリン」とも呼ばれる。
【０１０６】
本明細書において「〜と交差反応する抗体」とは、１つの抗原と結合するだけではなく、他の抗原とも同様に結合する抗体を意味する。
【０１０７】
本明細書において「中和する」とは、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２またはＥＮＡ−７８の少なくとも１つの生物活性の部分的または完全な阻害を指すものとする。例えば、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２またはＥＮＡ−７８の生物活性の１つは、その好中球走化性誘導能である。
【０１０８】
抗体の結合動態を測定する１つの方法は、表面プラズモン共鳴による。本明細書において「表面プラズモン共鳴」とは、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.、さらに詳しくは、Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277参照)を用いて、バイオセンサーマトリックス内でのタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイム生体特異的相互作用の分析を可能とする光学的現象を指す。
【０１０９】
「エピトープ」とは、抗体と特異的に結合することができるタンパク質決定因子を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面グループの分子からなり、通常、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な荷電特性を有する。
【０１１０】
本明細書において「モノクローナル抗体」またはｍＡｂ（ポリクローナル抗体とは対照的に）とは、単一の分子組成の抗体分子の調製物を指すものとする。例えば、ネズミ由来モノクローナル抗体（マウスモノクローナル抗体）は、標準的なKohler and  Milsteinのハイブリドーマ法などのハイブリドーマ技術によって作製することができる。
【０１１１】
抗体産生細胞を被験体から得、これを用い、Kohler and Milstein (1975, Nature 256:495-497) （Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31;およびYeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75も参照）により最初に記載されているハイブリドーマ技術などの標準的な技術によって、モノクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマ作製技術は周知のものである（一般に、R. H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36参照）。
【０１１２】
本明細書において「トランスフェクトーマ」とは、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、植物細胞または真菌（酵母細胞を含む）など、抗体を発現する組換え真核宿主細胞を含む。
【０１１３】
本明細書において「特異的に」結合するとは、所定の抗原と結合する抗体を指す。一般に、抗体は、約１×１０−７Ｍ以下に相当する平衡定数ＫＤで結合し、所定の抗原または近縁の抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）と結合するためのその親和性よりも少なくとも２桁低いＫＤに相当する親和性で所定の抗原と結合する。「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」という語句と「抗原と特異的に結合する抗体」という用語は本明細書では互換的に用いられる。
【０１１４】
本明細書において「ｋｄ」（ｓｅｃ−１）とは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度定数を指すものとする。
【０１１５】
本明細書において「ｋａ」（Ｍ×ｓｅｃ−１）とは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度定数を指すものとする。
【０１１６】
本明細書において「ＫＤ」（Ｍ）とは、特定の抗体−抗原相互作用の平衡定数を指すものとし、ｋｄをｋａで割ることにより得られる。
【０１１７】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列改変に関する「保存的配列改変」とは、そのヌクレオチド配列によりコードされている、またはそのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさない、または有意に変化させない変化を意味する。このような保存的配列改変は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。改変は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準的な技術によって配列に導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものを含む。類似の側鎖を有するアミノ酸残基群は当技術分野で定義されている。これらの群には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。よって、配列が具体的に開示されている抗体において、推定される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖群からの別のアミノ酸残基で置換されていることが好ましい。よって、一態様では、本発明の五重特異性抗体は、具体的に開示されているアミノ酸配列のあらゆる保存的配列改変を含む。
【０１１８】
本発明はまた、具体的に開示されているアミノ酸配列の「誘導体」も包含し、そこでは、それらのアミノ酸残基の１以上が、それらのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさずに、または有意に変化させずに、例えばアシル化またはグリコシル化により誘導体化されている。
【０１１９】
核酸に関して「実質的同一性」とは、２つの核酸またはその表された配列が、最適にアラインし、比較した際に、適当なヌクレオチド挿入または欠失を伴うが、そのヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常には少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、そのヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９．５％において同一であることを示す。あるいは、それらのセグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、その鎖の相補物とハイブリダイズする場合に実質的同一性が存在する。
【０１２０】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列に関して、「同一性」とは、最適にアラインし、比較した際に、適当な挿入または欠失を伴うが、２つの核酸またはアミノ酸配列間の同一性の程度を示す。あるいは、それらのＤＮＡセグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で、その鎖の相補物とハイブリダイズする場合に実質的同一性が存在する。
【０１２１】
２配列間の同一性％は、それらの配列に共通している同一の位置の数の関数であり（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）、２配列の最適アライメントのために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さが考慮されている。配列の比較および２配列間の同一性％の決定は、下記の限定されない例に記載されているように、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。
【０１２２】
２つのヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップウェイト４０、５０、６０、７０または８０とおよびレングスウェイト１、２、３、４、５または６を用いて決定することができる。２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の同一性％も、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウエイト・レシジュ・テーブル、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))アルゴリズムを用いＢｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスかＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかと、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４およびレングスウェイト１、２、３、４、５または６を用いて決定することができる。
【０１２３】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に、「作動可能なように連結」されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼすならば、その配列と作動可能なように連結されている。調節配列の転写に関して、作動可能なように連結されているとは、連結されるＤＮＡ配列が連続しており、タンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、連続していて、かつ、リーディングフレーム内にあることを意味する。スイッチ配列に関して、作動可能なように連結されているとは、それらの配列がスイッチ組換えを果たし得ることを示す。
【０１２４】
本明細書において「ベクター」とは、それに連結されている別の核酸を運び得る核酸分子を指すものとする。ベクターの１つのタイプが「プラスミド」であり、プラスミドは、付加的ＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターのもう１つのタイプがウイルスベクターであり、付加的ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。あるベクターは、それらが導入される宿主細胞で自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、それと作動可能なように連結されている遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターはプラスミドの形であることが多い。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるが、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は互換的に用いることができる。しかしながら、本発明は、同等の機能の果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの他の形態の発現ベクターも含むものとする。
【０１２５】
本明細書において「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の後代も指すものとすると理解すべきである。突然変異または環境的影響のいずれかのために次の世代である特定の改変が起こる場合があるので、このような後代は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それらもなお、本明細書において「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞には、例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞およびリンパ細胞などのトランスフェクトーマが含まれる。
【０１２６】
本明細書において「被験体」とは、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」とは、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【０１２７】
１．抗体構造
完全抗体
完全抗体は、通常、少なくとも２つの重鎖と２つの軽鎖を含むヘテロ多量体糖タンパク質である。ＩｇＭの他、完全抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる、およそ１５０Ｋｄａのヘテロ四量体糖タンパク質である。一般に、各軽鎖は、１つの共有結合的ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖は鎖内ジスルフィド橋も有する。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続くいくつかの定常領域を有する。各軽鎖は、そのもう一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）と定常領域を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の第一の定常領域とアラインされ、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとアラインされる。ほとんどの脊椎動物に由来する抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づきκおよびλと呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り付けることができる。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、ヒト抗体は、５つの異なるクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り付けることができる。ＩｇＧおよびＩｇＡは、サブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに細分することができる。少なくともＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂを有するマウスおよびラットでは変種は存在する。抗体の可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる特定の多様性を示すある領域を有する抗体に結合特異性を付与する。可変領域のうち、より保存性の高い部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。完全重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ３つのＣＤＲによって接続された４つのＦＲを含む。各鎖のＣＤＲは、これらのＦＲ領域によって近接して保持され、他の鎖に由来するＣＤＲは、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常領域は抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、Ｆｃγ受容体との結合を介した食作用、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を介した半減期／クリアランス速度および補体カスケードのＣ１ｑ成分を介した補体依存性細胞傷害性における関与などの種々のエフェクター機能を発揮する。ヒトＩｇＧ２定常領域には、従来経路により補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力が無い。ＩｇＧ４定常領域には従来経路により補体を活性化する能力が無く、抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力は微弱でしかない。これらのエフェクター機能は「非溶解型」抗体と呼ぶことができる。
【０１２８】
ヒト抗体
ヒト抗体は、当業者に公知のいくつかの方法によって作製することができる。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫またはマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統を用い、ハイブリドーマ法によって作製することができる（Kozbor J.Immunol 133, 3001, (1984)およびBrodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987)参照）。別法としてはファージライブラリーまたはトランスジェニックマウスの使用が含まれ、双方ともヒトＶ領域レパートリーを用いる（Winter G, (1994), Annu.Rev.Immunol 12,433-455, Green LL (1999), J.Immunol.methods 231, 11-23参照）。
【０１２９】
現在、マウス免疫グロブリン遺伝子座がヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントで置換された数系統のトランスジェニックマウスが入手可能である（Tomizuka K, (2000) PNAS 97,722-727; Fishwild D.M (1996) Nature Biotechnol. 14,845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156参照）。抗原を投与すると、これらのマウスはヒト抗体のレパートリーを産生することができ、そこから目的の抗体を選択することができる。
【０１３０】
照射マウスにヒトリンパ球を移植するＴｒｉｍｅｒａ（商標）系（Eren R et al, (1998) Immunology 93:154-161参照）、ヒト（または他の種）リンパ球に対して大規模プールin vitro抗体生成法を効果的に行った後に、デコンヴォルーション、制限希釈および選択法を行う選択リンパ球抗体系（ＳＬＡＭ、Babcook et al, PNAS (1996) 93:7843-7848参照）ならびにＸｅｎｏｍｏｕｓｅ  ＩＩ（商標）(Abgenix Inc)が特に注目される。Ｍｏｒｐｈｏｄｏｍａ（商標）技術を用いる別のアプローチがMorphotek Incから入手可能である。
【０１３１】
ファージディスプレー技術を用いてヒト抗体（およびそのフラグメント）を作製することもできる（McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990)およびGriffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260参照）。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子が、Ｍ１３またはｆｄなどの繊維状バクテリオファージの主要または微量コートタンパク質遺伝子のフレーム内にクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとしてディスプレーされる（通常は、ヘルパーファージの助けを伴う）。この抗体の機能特性に基づいて選択すれば、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択される。このファージディスプレー技術を用い、上記の疾病または障害に罹患した個体から、あるいはまた非免疫ヒトドナーから採取したヒトＢ細胞からなるライブラリーから抗原特異的抗体を選択することができる（Marks; J.Mol.Bio. 222,581-597, 1991参照）。Ｆｃドメインを含む完全ヒト抗体が望まれる場合は、ファージディスプレー由来フラグメントを、所望の定常領域を含む哺乳類発現ベクターに再クローニングし、安定に発現する細胞系統を確立する必要がある。
【０１３２】
親和性成熟技術(Marks; Bio/technol 10,779-783 (1992))を用いて結合親和性を改良することもでき、ここでは、ＨおよびＬ鎖Ｖ領域を天然に存在する変異体で連続的に置換し、結合親和性の改良に基づいて選択することにより、ヒト一次抗体の親和性が改良される。現在、「エピトープインプリンティング」などのこの技術の変型も利用可能である（ＷＯ９３／０６２１３参照、また、Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993)も参照）。
【０１３３】
キメラおよびヒト化抗体
ヒト疾病または障害の処置における完全非ヒト抗体の使用には、特に抗体を繰り返し投与した際の潜在的免疫原性（すなわち、患者の免疫系が非ヒト完全抗体を非自己と認識し、中和応答を惹起する）という今や十分認識された問題を伴う。完全ヒト抗体の開発（上記参照）の他、これらの問題を克服するための様々な技術が長年にわたって開発されており、一般に、例えばマウス、ラットまたはウサギなどの免疫動物から非ヒト抗体を得る際の比較的容易さを保ちながら、完全な治療用抗体における非ヒトアミノ酸配列の組成を減らすことを含む。広義には、これを達成するために２つのアプローチが用いられてきた。第一には、キメラ抗体であり、これは一般にヒト定常領域に融合された非ヒト（例えば、マウスなどの齧歯類）可変ドメインを含む。抗体の抗原結合部位は可変領域内にあるので、キメラ抗体は抗原に対するその結合親和性を保持しているが、ヒト定常領域のエフェクター機能を獲得し、従って、前記のものなどのエフェクター機能を遂行することができる。キメラ抗体は一般に組換えＤＮＡ法を用いて作製される。抗体をコードするＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）を常法を用いて単離および配列配列決定する（例えば、本発明の抗体のＨ鎖およびＬ鎖可変領域をコードする遺伝子と特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの典型的な供給源として役立つ。ひと度単離されれば、ＤＮＡは発現ベクターに入れ、次にこれを、そうでなければ、その抗体の合成を得るための免疫グロブリンタンパク質を産生することができない、大腸菌(E.Coli)、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞へトランスフェクトされる。ＤＮＡは、対応する非ヒト（例えば、ネズミ）ＨおよびＬ定常領域をヒトＬおよびＨ鎖のコード配列で置換することにより改変してもよい（例えば、Morrison; PNAS 81, 6851 (1984)参照）。よって、本発明の別の実施形態は、配列番号２、６または１０の配列を有するＶＨドメインと配列番号４、８または１２の配列を有するＶＬドメインをヒト定常領域（ＩｇＧイソ型、例えばＩｇＧ１のものであり得る）と融合させて含むキメラ抗体を提供する。
【０１３４】
第二のアプローチは、可変領域をヒト化することによって抗体の非ヒト内容物が減ったヒト化抗体の作製を含む。ヒト化には２つの方法が知られている。第一には、ＣＤＲグラフティングによるヒト化である。ＣＤＲは抗体のＮ末端付近でループを形成し、そこでそれらはフレームワーク領域により提供されたスキャフォールドに埋め込まれた表面を形成する。抗体の抗原結合特異性は、主として、そのＣＤＲ表面の形態学および化学特性によって定義される。そしてこれらの特徴は、個々のＣＤＲのコンフォメーション、ＣＤＲの相対的配置、およびＣＤＲを含む残基の側鎖の性質と配置によって決定される。免疫原性の大きな低減は、非ヒト（例えば、ネズミ）抗体（「ドナー」抗体）のＣＤＲだけを好適なヒトフレームワーク（「アクセプターフレームワーク」）および定常領域にグラフトすることによって果たすことができる（Jones et al (1986) Nature 321,522-525およびVerhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536参照）。しかしながら、ＣＤＲグラフティングはそれ自体、抗原結合特性の完全な保持を招かない場合があり、有意な抗原結合親和性が回復すべきであれば、ドナー抗体のいくつかのフレームワーク残基はヒト化分子内で保存される必要がある（「復帰突然変異」と呼ばれることがある）ということがしばしば見られる（Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502参照）。この場合、ヒトフレームワーク（ＦＲ）を提供するために、非ヒトドナー抗体と最高（一般に６０％以上）の配列相同性を示すヒトＶ領域がデータベースから選択され得る。ヒトＦＲの選択はヒトコンセンサスか個々のヒト抗体のいずれかから行うことができる。必要であれば、ドナー抗体由来の重要な残基をヒトアクセプターフレームワークに置換してＣＤＲコンフォメーションを保存する。このように構造上重要な残基を特定する助けとして抗体のコンピューターモデリングを用いることができる（ＷＯ９９／４８５２３参照）。
【０１３５】
あるいは、ヒト化は、「ベニアリング(veneering)」のプロセスによっても果たすことができる。ユニークなヒトおよびネズミ免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域の統計学的分析により、露出している残基の厳密なパターンはヒト抗体とネズミ抗体とでは異なり、個々の表面部位のほとんどのものは、少数の異なる残基に強い選択性を有することが明らかになった（Padlan E.A. et al; (1991) Mol.Immunol.28, 489-498およびPedersen J.T. et al (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973参照）。従って、ヒト抗体で通常見られるものとは異なる、フレームワーク領域内の露出残基を置換することにより、非ヒトＦｖの免疫原性を低減することができる。タンパク質の抗原性は表面の接近性と相関し得ることから、表面残基の置換は、マウス可変領域をヒト免疫系には「見えない」ようにするのに十分なものであり得る（Mark G.E. et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134も参照）。このヒト化法は、抗体の表面だけを変化させ、支持している残基はそのままであることから、「ベニアリング」と呼ばれる。さらに別のアプローチがＷＯ０４／００６９５５に示されている。
【０１３６】
さらに別のアプローチとしては、ＷＯ０４／００６９５５に示されているもの、および細菌発現系を用い、配列がヒト生殖細胞系に近い抗体を産生するＨｕｍａｎｅｅｒｉｎｇ（商標）(Kalobios)(Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego,California)が含まれる。ヒト化の別のアプローチは、フレームワーク領域などの抗体の他の領域間の相同性ではなく、ヒトＣＤＲ領域とドナーマウス抗体ＣＤＲ領域との構造的類似性に基づいてヒトアクセプターフレームワークを選択することを含む。このプロセスはＳｕｐｅｒｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ（商標）(Evogenix Inc.; Hwang et al (2005) Methods 36:35-42)としても知られる。
【０１３７】
当業者には、「由来する」とは、それがその材料の物理的起源であるという意味で供給源を定義するだけでなく、その材料と構造的に同一であるが、参照供給源には起源していない材料を定義するものとすることが明らかであろう。よって、「ドナー抗体に見られる残基」は、必ずしもドナー抗体から精製されたものである必要はない。
【０１３８】
抗体フラグメント
本発明の特定の実施形態では、抗原結合フラグメントである治療用抗体が提供される。このようなフラグメントは、完全抗体および／またはヒト化抗体および／またはキメラ抗体の機能的抗原結合フラグメント、例えば、前記の抗体のＦａｂ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖフラグメントであり得る。定常領域を欠くフラグメントは、従来経路により補体を活性化する能力または抗体依存性細胞傷害性を媒介する能力を欠いている。従来、このようなフラグメントは、例えばパパイン消化（例えば、ＷＯ９４／２９３４８参照）によるなど、完全抗体のタンパク質加水分解消化により作製されるが、組換え的に形質転換された宿主細胞から直接生産することもできる。ＳｃＦｖの作製に関しては、Bird et al ;(1988) Science, 242, 423-426を参照。さらに、抗体フラグメントは、下記のように種々の工学技術を用いて作製することもできる。
【０１３９】
Ｆｖフラグメントは、Ｆａｂフラグメントよりもそれらの２鎖の相互作用エネルギーが小さいと思われる。ＶＨドメインとＶＬドメインの会合を安定化させるために、それらはペプチド(Bird et al, (1988) Science 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85, 5879-5883)、ジスルフィド橋(Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367)および「knob in hole」突然変異(Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788)で結合されている。ＳｃＦｖフラグメントは当業者に周知の方法によって作製することができる（Whitlow et al (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105およびHuston et al (1993) Int.Rev.Immunol 10, 195-217参照）。ＳｃＦｖは、大腸菌などの細菌細胞で生産することができるが、より一般には真核細胞で生産される。ＳｃＦｖの欠点の１つは生成物が一価であることであり、これにより、多価結合および短い半減期のために高いアビジティーが妨げられる。これらの問題を克服する試みとしては、付加的なＣ末端システインを含むＳｃＦＶから化学的カップリングにより作製される(Adams et al (1993) Can.Res 53, 4026-4034およびMcCartney et al (1995) Protein Eng. 8, 301-314)、または不対Ｃ末端システイン残基を含むＳｃＦｖの自発的な部位特異的二量体化により作製される(Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204参照)、二価（ＳｃＦｖ’）２を含む。あるいは、ペプチドリンカーを３〜１２残基に短くすることでＳｃＦｖに多量体を形成させ、「ダイアボディー」を形成させることができる（Holliger et al PNAS (1993), 90, 6444-6448参照）。このリンカーをさらに短くすると、ＳｃＦＶ三量体（「トリアボディー」、Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433参照）および四量体（「テトラボディー」、Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168参照）が得られる。二価ＳｃＦＶ分子の構築はまた、タンパク質二量体化モチーフとの遺伝子融合により、「ミニ抗体」（Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584参照）および「ミニボディー」（Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 3055-3061参照）を形成させることによって果たすこともできる。また、ＳｃＦｖ−Ｓｃ−Ｆｖタンデム（（ＳｃＦＶ）２）も、２つのＳｃＦｖ単位を第三のペプチドリンカーにより連結することによって作製することができる（Kurucz et al (1995) J.Immol.154, 4576-4582参照）。二重特異性ダイアボディーは、短いリンカーによりある抗体のＶＬドメインと接続された別の抗体に由来するＶＨドメインからなる２つの一本鎖融合産物の非共有結合的会合を介して作製することができる（Kipriyanov et al (1998), Int.J.Can 77,763-772参照）。このような二重特異性ダイアボディーの安定性は、前記のようなジスルフィド橋または「knob in hole」突然変異の導入により、または２つのハイブリッドＳｃＦｖフラグメントがペプチドリンカーを介して接続されている一本鎖ダイアボディー（ＳｃＤｂ）の形成によって高めることができる（Kontermann et al (1999) J.Immunol.Methods 226 179-188参照）。四価二重特異性分子は、例えばＳｃＦｖフラグメントをＩｇＧ分子のＣＨ３ドメインと、またはＦａｂフラグメントと、ヒンジ領域を介して融合させることによって得られる（Coloma et al (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163参照）。あるいは、四価二重特異性分子は、二重特異性一本鎖ダイアボディーの融合によって作出されている（Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94参照）。より小さな四価二重特異性分子もまた、ヘリックス−ループ−ヘリッ��スモチーフを含むリンカーを用いたＳｃＦｖ−ＳｃＦｖタンデム（ＤｉＢｉミニ抗体、Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49参照）か、または分子内対合を防ぐ配向で４つの抗体可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む一本鎖分子（タンデムダイアボディー、Kipriyanov et al, (1999) J.Mol.Biol. 293, 41-56参照）のいずれかの二量体化によって形成させることができる。二重特異性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントの化学的カップリングにより、またはロイシンジッパーを介したヘテロ二量体化（Shalaby et al, (1992) J.Exp.Med. 175, 217-225およびKostelny et al (1992), J.Immunol. 148, 1547-1553参照）により作出することができる。また、単離されたＶＨまたはＶＬドメインに基づく、いわゆるドメイン抗体(Domantis Ltd.)も利用可能である（米国特許第６，２４８，５１６号、同第６，２９１，１５８号、同第６，１７２，１９７号参照）。
【０１４０】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は誘導体であり、これも本発明の一実施形態をなす。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の便宜な架橋法を用いて形成された、共有結合的に連結された２つの抗体からなる。米国特許第４，６７６，９８０号参照。
【０１４１】
他の改変
本発明の抗体は、それらの定常領域に他のいずれの改変を組み込んでもよい。例えば、それらの定常領域の保存された位置における抗体のグリコシル化は、抗体機能、特に、上記のものなどのエフェクター機能に対して著しい影響を及ぼすことが知られている（例えば、Boyd et al (1996), Mol.Immunol. 32, 1311-1318参照）。本発明の治療用抗体の変異体（１以上の炭水化物部分が付加、置換、欠失または修飾されている）のグリコシル化が意図される。アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−トレオニンモチーフの導入は、炭水化物部分の酵素的付加のための潜在的部位を作り出し、従って、抗体のグリコシル化を操作するために使用することができる。Raju et al (2001) Biochemistry 40, 8868-8876では、ＴＮＦＲ−ＩｇＧイムノアドヘシンの末端シアル化(sialyation)は、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ(beta-1,4-galactosyltransferace)および／またはα−２，３−シアリルトランスフェラーゼを用いた再ガラクトシル化および／または再シアリル化のプロセスを介して高められた。末端シアリル化が高まると、免疫グロブリンの半減期が長くなると考えられている。抗体は、ほとんどの糖タンパク質と共通して、一般に、本来グリコフォームの混合物として産生される。この混合物は特に、抗体が真核細胞、特に、哺乳類細胞で産生される場合に明らかである。定義されたグリコフォームを製造するために様々な方法が開発されている（Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem.Res 34, 727参照）。よって、本発明は、該抗体の所定数（例えば７以下、例えば５以下、例えば２または１）のグリコフォームを含む、本明細書に記載の複数の治療用抗体（ＩｇＧイソ型、例えばＩｇＧ１のものであり得る）に関する。
【０１４２】
本発明の誘導体はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの非タンパク質性ポリマーに結合された本発明の治療用抗体も含む。タンパク質とＰＥＧのコンジュゲーションは、タンパク質の半減期を延長し、ならびにタンパク質の抗原性および免疫原性を低減するために確立された技術である。種々の分子量および形式（直鎖または分枝）を有するペグ化の使用が完全抗体ならびにＦａｂ’フラグメントで検討されてきた（Koumenis I.L. et al (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95参照）。特定の実施形態は、ＰＥＧに結合された、ａ）従来経路による補体の活性化；およびｂ）抗体依存性細胞傷害性の媒介のエフェクター機能が無い、本発明の抗原結合フラグメント（ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖなど）を含む。
【０１４３】
抗体のＦｃ領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃγＲ）の間の相互作用は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体の固定、食作用および抗体の半減期／クリアランスを含む抗体のエフェクター機能を媒介すると考えられている。本発明の抗体のＦｃ領域に対する種々の改変は、所望のエフェクター特性に基づいて行うことができる。特に、ａ）従来経路による補体の活性化；およびｂ）抗体依存性細胞傷害性の媒介機能を本質的に欠くヒト定常領域は、例えば、ＥＰ０３０７４３４（ＷＯ８８０７０８９）、ＥＰ０６２９２４０（ＷＯ９３１７１０５）およびＷＯ２００４／０１４９５３に開示されている２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および／または３２２番の位置の突然変異などの特定の突然変異を含むＩｇＧ４定常領域、ＩｇＧ２定常領域およびＩｇＧ１定常領域を含む。重鎖定常領域のＣＨ２ドメイン内の２３５または２３７番の残基（Ｋａｂａｔナンバリング；EU Index system）における突然変異は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩへの結合を低減し、従って、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を低減することが、それぞれ記載されている(Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168)。さらに、いくつかの報告には、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の動員または介在におけるこれらの残基の関与も記載されている(Morgan et al., 1995; Xu et al., Cell. Immunol. 2000; 200:16-26; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168)。よって、補体媒介効果とＦｃγＲ媒介効果の双方を低減するために、残基２３５と２３７が双方ともアラニン残基に変異されている(Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew et al. Immunology 1995, 85; 41-48;およびWO9958679)。これらの定常領域を含む抗体は「非溶解型」抗体と呼ばれることがある。
【０１４４】
血清半減期を延長するために、抗体にサルベージ受容体結合エピトープを組み込むことができる（米国特許第５，７３９，２７７号参照）。
【０１４５】
現在認識されているヒトＦｃγ受容体にはＦｃγＲ（Ｉ）、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａおよび新生児ＦｃＲｎの５つがある。Shields et al, (2001) J.Biol.Chem 276, 6591-6604は、全てのＦｃγＲへの結合には共通のＩｇＧ１残基セットが関与しているが、ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩはこの共通セット以外の異なる部位を利用することを示している。ＩｇＧ１残基のある群：Ｐｒｏ−２３８、Ａｓｐ−２６５、Ａｓｐ−２７０、Ａｓｎ−２９７およびＰｒｏ−２３９は、アラニンへ変更された場合、全てのＦｃγＲに対する結合を低下させた。全てがＩｇＧ  ＣＨ２ドメイン内にあり、ＣＨ１とＣＨ２をつないできるヒンジ付近にクラスターをなしていた。ＦｃγＲＩは結合に共通のＩｇＧ１残基セットのみを利用するが、ＦｃγＲＩＩとＦｃγＲＩＩＩはこの共通セットの他の異なる残基と相互作用する。いくつかの残基の変更は、ＦｃγＲＩＩ（例えば、Ａｒｇ−２９２）またはＦｃγＲＩＩＩ（例えば、Ｇｌｕ−２９３）に対する結合だけを低下させた。いくつかの変異体はＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対して結合の向上を示したが、他の受容体に対する結合には影響を及ぼさなかった（例えば、Ｓｅｒ−２６７ＡｌａはＦｃγＲＩＩに対する結合を向上させたが、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合には影響が無かった）。他の変異体はＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩに対して結合の向上を示したが、他の受容体に対する結合は低下させた（例えば、Ｓｅｒ−２９８ＡｌａはＦｃγＲＩＩＩに対する結合を向上させ、ＦｃγＲＩＩに対する結合を低下させた）。ＦｃγＲＩＩＩａでは、最も良く結合するＩｇＧ１変異体は、Ｓｅｒ−２９８、Ｇｌｕ−３３３およびＬｙｓ−３３４におけるアラニン置換を組み合わせたものである。新生児ＦｃＲｎ受容体は、ＩｇＧ分子を分解から保護し、よって、血清半減期および組織間のトランスサイトーシスを高めることに関与していると考えられる（Junghans R.P (1997) Immunol.Res 16. 29-57およびGhetie et al (2000) Annu.Rev.Immunol. 18, 739-766参照）。ヒトＦｃＲｎと直接相互作用すると判断されているヒトＩｇＧ１残基としては、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５が含まれる。
【０１４６】
本発明の治療用抗体には上記のいずれの定常領域の改変を組み込んでもよい。
【０１４７】
２．生産方法
本発明の抗体は、ヤギ（Pollock et al (1999), J.Immunol.Methods 231:147-157参照）、ニワトリ（Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55参照）、マウス（Pollock et al前掲参照）または植物（Doran PM, (2000) Curr. Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol.Biol. 42:583-590参照）などのトランスジェニック生物で生産することができる。また、抗体は化学合成によっても生産することができる。しかしながら、本発明の抗体は一般に、当業者に周知の組換え細胞培養技術を用いて生産される。抗体をコードするポリヌクレオチドを単離し、宿主細胞でのさらなるクローニング（増幅）または発現のための、プラスミドなどの複製可能なベクターに挿入する。有用な発現系の１つにグルタミン酸シンセターゼ系（Lonza Biologicsが販売しているものなど）があり、特に、この場合、宿主細胞はＣＨＯまたはＮＳ０である（下記参照）。抗体をコードするポリヌクレオチドは容易に単離され、常法（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ）を用いて配列決定される。使用可能なベクターとしては、プラスミド、ウイルス、ファージ、トランスポゾンが含まれ、プラスミドのミニ染色体は典型的な実施形態である。一般に、このようなベクターは、発現を助けるために軽鎖および／または重鎖ポリヌクレオチドに作動可能なように連結されたシグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列をさらに含む。軽鎖および重鎖をコードするポリヌクレオチドを別個のベクターに挿入し、同じ宿主細胞に同時にまたは逐次に導入してもよいし（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは形質導入による）、あるいは所望により、このような導入の前に重鎖および軽鎖の双方を同じベクターに挿入することもできる。
【０１４８】
当業者には、遺伝コードの縮重のために、本発明のポリペプチドをコードする、本明細書に開示されているものとは別のポリヌクレオチドも利用可能であることがすぐに明らかになるであろう。
【０１４９】
シグナル配列
本発明の抗体は、成熟タンパク質のＮ末端に特異的切断部位を有する異種シグナル配列との融合タンパク質として生産してもよい。このシグナル配列は宿主細胞によって認識および処理されるはずである。原核宿主細胞では、シグナル配列はアルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性内毒素ＩＩリーダーであり得る。酵母分泌に関しては、シグナル配列は酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダーまたは酸性ホスファターゼリーダーであり得る（例えば、ＷＯ９０／１３６４６参照）。哺乳類細胞系では、単純ヘルペスｇＤシグナルおよび天然免疫グロブリンシグナル配列（ヒトＩｇ重鎖など）などのウイルス分泌リーダーが利用可能である。一般に、シグナル配列は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドとリーディングフレーム内で連結される。
【０１５０】
複製起点
複製起点は当技術分野で周知のものであり、グラム陰性菌にはｐＢＲ３２２が、ほとんどの酵母には２μプラスミドが、また、ほとんどの哺乳類細胞にはＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶなどの種々のウイルス起点が好適である。一般に、複製起点成分は、大腸菌でベクターの増殖が必要とされない限り、組込型哺乳類発現ベクターには必要でない。しかしながら、ＳＶ４０  ｏｒｉは、初期プロモーターを含むので使用可能である。
【０１５１】
選択マーカー
典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するか、または（ｂ）栄養要求性欠陥を補足する、もしくは複合培地で利用できない栄養素を供給するか、または（ｃ）双方を組み合わせたタンパク質をコードする。選択スキームは、ベクターを含まないまたは含む宿主細胞の増殖を停止させることを含み得る。本発明の治療用抗体をコードする遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、例えば、同時に運ばれた選択マーカーによって付与された薬剤耐性のために生存する。一例として、ＤＨＦＲ陰性宿主株で形質転換体が生成されるＤＨＦＲ選択系がある（例えば、Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68参照）。この系では、本発明の抗体ポリヌクレオチド配列と同時にＤＨＦＲ遺伝子が運ばれ、その後、ヌクレオシドを抜き取ることではＤＨＦＲ陽性細胞が選択される。必要であれば、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅を伴う形質転換体を選択するために、ＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートも用いられる。本発明の抗体コード配列またはその機能的誘導体にＤＨＦＲ遺伝子を作動可能なように連結することにより、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅は所望の目的抗体配列の同時増幅をもたらす。ＣＨＯ細胞は、このＤＨＦＲ／メトトレキサート選択に特に有用な細胞系統であり、このＤＨＦＲ系を用いて宿主細胞を増幅および選択する方法は当技術分野で十分確立されている（Kaufman R.J. et al J.Mol.Biol. (1982) 159, 601-621参照、総説としては、Werner RG, Noe W, Kopp K,Schluter M,“Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals”, Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug参照）。さらなる例として、グルタミン酸シンセターゼ発現系(Lonza Biologics)がある。酵母での使用に好適な選択遺伝子はｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979参照）。
【０１５２】
プロモーター
本発明の抗体を発現させるのに好適なプロモーターを、抗体をコードするＤＮＡ／ポリヌクレオチドに作動可能なように連結させる。原核生物宿主のプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、Β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファンおよびハイブリッドプロモーター（Ｔａｃなど）が挙げられる。酵母細胞での発現に好適なプロモーターとしては、とりわけ、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース６リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセル酸ムターゼおよびグルコキナーゼが挙げられる。誘導酵母プロモーターとしては、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネインおよび窒素代謝またはマルトース／ガラクトース利用を担う酵素が挙げられる。
【０１５３】
哺乳類細胞系での発現のためのプロモーターとしては、とりわけ、ポリオーマ、鶏痘およびアデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（特に、前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、アクチン、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターおよび初期または後期シミアンウイルス４０などのウイルスプロモーター、ならびにＥＦ−１α(Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322)などの非ウイルスプロモーターを含むＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが挙げられる。プロモーターの選択は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【０１５４】
エンハンサーエレメント
適宜であれば、例えば、高等真核生物(eukaroytics)で発現させる場合、上記のプロモーターにあることが分かっているものの代わりに、またはその上に、付加的なエンハンサーエレメントを含めることができる。好適な哺乳類エンハンサー配列としては、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質、メタロチオニンおよびインスリン由来のエンハンサーエレメントが挙げられる。あるいは、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、バキュロウイルスエンハンサーまたはネズミＩｇＧ２ａ遺伝子座（ＷＯ０４／００９８２３参照）などの真核(eukaroytic)細胞ウイルス由来のエンハンサーエレメントを用いてもよい。このようなエンハンサーは一般にベクターの、プロモーターより上流の部位に位置するが、例えば、非翻訳領域内またはポリアデニル化(polydenalytion)シグナルの下流など他の場所に配置することもできる。エンハンサーの選択および配置は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【０１５５】
ポリアデニル化／ターミネーション
真核生物系では、ポリアデニル化シグナルを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドに作動可能なように連結させる。このようなシグナルは一般に、オープンリーディングフレームの３’に置かれる。哺乳類系では、シグナルの限定されない例として、成長ホルモン、延長因子−１αおよびウイルス（例えば、ＳＶ４０）遺伝子またはレトロウイルスの長い末端反復配列に由来するものが挙げられる。酵母系では、ポリアデニル化(polydenalytion)／ターミネーションシグナルの限定されない例としては、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）およびアルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ）遺伝子に由来するものが挙げられる。原核生物系では、ポリアデニル化シグナルは一般に必要でなく、その代わりに、もっと短い、もっと定義されたターミネーター配列を用いるのが通常である。ポリアデニル化／ターミネーション配列の選択は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【０１５６】
収量を高めるためのその他の方法／エレメント
上記の他、収量を高めるために使用可能なその他の特徴として、クロマチンリモデリングエレメント、イントロンおよび宿主細胞特異的コドン改変が含まれる。転写物および／または生成物の収量を増すためなど、宿主細胞のコドンの偏りを順応させるために、本発明の抗体のコドン使用を改変することができる（例えば、Hoekema A et al Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24）。コドンの選択は、発現に用いる宿主細胞との好適な適合性に基づき得る。
【０１５７】
宿主細胞
本発明の抗体をコードするベクターをクローニングまたは発現させるのに好適な宿主細胞は、例えば、原核細胞、酵母細胞または高等真核細胞である。好適な原核細胞としては、真正細菌、例えば、エシェリキカ属、例えば、大腸菌(E.Coli)（例えば、ＡＴＣＣ３１，４４６；３１，５３７；２７，３２５）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレビシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium)）、セラチア属（例えば、レイ菌(Serratia marcescans)）および赤痢菌属などの腸内細菌科、ならびにバチルス属、例えば、枯草菌(B.subtilis)およびＢ．リケニフォルミス(B. licheniformis)（ＤＤ２６６７１０参照）など、シュードモナス、例えば、緑膿菌(P.aeruginosa)および放線菌(Streptomyces)などが挙げられる。酵母宿主細胞としては、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)（例えば、ＡＴＣＣ１６，０４５；１２，４２４；２４１７８；５６，５００）、ヤロウイア属(yarrowia)（ＥＰ４０２，２２６）、ピキア・パストリス(Pichia Pastoris)（ＥＰ１８３，０７０、Peng et al J.Biotechnol. 108 (2004) 185-192も参照）、カンジダ(Candida)、トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)（ＥＰ２４４，２３４）、ペニシリン、トリポクラジウム属(Tolypocladium)およびアスペルギルス属(Aspergillus)宿主、例えば、Ａ．ニデュランス(A.nidulans)およびＡ．ニガー(A.niger）も意図される。
【０１５８】
原核および酵母宿主細胞は本発明により特に意図されるものであるが、一般には、本発明の宿主細胞は脊椎動物細胞である。好適な脊椎動物宿主細胞としては、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胎児腎臓系統２９３、ＰｅｒＣ６(Crucell)、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ．１６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ  ＮＯ：  ＣＲＬ  １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ  ＮＯ．ＣＲＬ  １５７３）、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  ＮＯ：  ＣＣＬ  ６１、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞系統、例えば、ＤＧ４４（Urlaub et al, (1986)同書参照）、特に、懸濁培養に順応したＣＨＯ細胞系統、マウスセルトリ細胞、サル腎臓細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ＨＥＬＡ細胞、イヌ腎臓細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、ヒト肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、Ｈｅｐ  Ｇ２および骨髄腫またはリンパ腫細胞、例えば、ＮＳ０（米国特許第５，８０７，７１５号参照）、Ｓｐ２／０、Ｙ０などの哺乳類細胞が挙げられる。
【０１５９】
よって、本発明の一実施形態では、上記のような治療用抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするベクターを含む、安定形質転換された宿主細胞が提供される。一般に、このような宿主細胞は、軽鎖をコードする第一のベクターと重鎖をコードする第二のベクターとを含む。
【０１６０】
このような宿主細胞はまた、本発明の抗体の品質、機能および／または収量を改良するためにさらに操作または順応させることができる。限定されない例としては、特定の改変（例えば、グリコシル化）酵素の発現およびタンパク質折りたたみシャペロンが含まれる。
【０１６１】
細胞培養法
本発明の治療用抗体をコードするベクターで形質転換された宿主細胞は、当業者に公知のいずれの方法によって培養してもよい。宿主細胞はスピナーフラスコ、振盪フラスコ、回転瓶または中空繊維系で培養可能であるが、特に懸濁培養には攪拌タンクリアクターまたはバッグリアクター（例えば、Wave Biotech, Somerset, New Jersey USA）が用いられ、大規模培養には好ましい。一般に、攪拌タンカーは、例えば、スパージャー、バッフルまたは低剪断性回転翼を用いた曝気に順応している。気泡カラムおよびエアーリフトリアクターでは、空気または酸素気泡を用いた直接曝気が使用可能である。宿主細胞を血清不含培養培地で培養する場合には、曝気プロセスの結果としての細胞損傷を防ぐ助けとするために、プルロニックＦ−６８などの細胞保護剤を培地に供給するのが好ましい。宿主細胞の特徴によっては、足場依存性細胞系統のための増殖基板としてマイクロキャリアーを用いてもよいし、あるいはそれらの細胞を懸濁培養に順応させてもよい（これが一般的）。宿主細胞、特に、脊椎動物宿主細胞の培養には、回分法、流加法、反復回分法（Drapeau et al (1994) cytotechnology 15: 103-109参照）、延長回分法または灌流培養法などの種々の操作様式が使用可能である。組換え的に形質転換された哺乳類宿主細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地など、血清含有培地で培養可能であるが、このような宿主細胞は、Keen et al (1995) Cytotechnology 17:153-163に開示されているものなどの合成血清不含培地、またはＰｒｏＣＨＯ−ＣＤＭもしくはＵｌｔｒａＣＨＯ（商標）(Cambrex NJ, USA)などの市販の培地に、必要であれば、グルコースなどのエネルギー源および組換えインスリンなどの合成増殖因子を加えたもので培養するのが好ましい。宿主細胞の血清不含培養では、それらの細胞が血清不含条件での増殖に順応している必要があり得る。１つの順応アプローチが、このような宿主細胞を血清含有培地で増殖させ、その培養培地の８０％を血清不含培地に繰り返し交換し、それにより、宿主細胞が血清不含条件への順応を学ぶというものである（例えば、Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E.C. et al eds), pp619-623, Kluwer Academic publishers参照）。
【０１６２】
培地中に分泌された本発明の抗体は、意図する使用に好適な精製度を提供するための種々の技術を用いて培地から回収および精製することができる。例えば、ヒト患者の処置のための本発明の治療用抗体の使用では、一般に、治療用抗体を含む培養培地に比べ、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した際に少なくとも９５％の純度、より一般的には９８％または９９％の純度が要される。まず、一般的に遠心分離を用いて培養培地から細胞残渣を除去した後、例えば、精密濾過、限外濾過および／または深層濾過を用いて上清を明澄化する。あるいは、事前の遠心分離を行わずに、精密濾過、限外濾過および／または深層濾過によって抗体を採取することもできる。透析およびゲル電気泳動およびクロマトグラフィー技術、例えば、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、アフィニティークロマトグラフィー（所望により、ポリヒスチジンなどのアフィニティータグ系を含む）および／または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ、米国特許第５，４２９，７４６参照）などの種々の他の技術も利用可能である。一実施形態では、本発明の抗体は、種々の明澄化工程の後、Ａタンパク質またはＧタンパク質アフィニティークロマトグラフィー、次いで、イオン交換および／またはＨＡクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換、サイズ排除クロマトグラフィーおよび硫酸アンモニウム沈殿法などのさらなるクロマトグラフィー工程を用いて捕捉させる。一般に、種々のウイルス除去工程も用いられる（例えば、ＤＶ−２０フィルターを用いたナノフィルトレーション）。これらの種々の工程の後、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ以上、例えば１００ｍｇ／ｍｌ以上の本発明の抗体を含む精製（一般に、モノクローナル）調製物が提供され、よって、本発明の一実施形態をなす。１００ｍｇ／ｍｌ以上の濃度は、超遠心分離によって作出可能である。このような調製物は凝集形態の本発明の抗体を実質的に含まないことが好適である。
【０１６３】
抗体フラグメントの発現には細菌系は特に適している。このようなフラグメントは細胞内または周辺質内に存在する。不溶性の周辺質タンパク質は、当業者に公知の方法に従って抽出し、再折りたたみをして活性なタンパク質を形成させることができる（Sanchez et al (1999) J.Biotechnol. 72, 13-20およびCupit PM et al (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277参照）。
【０１６４】
３．医薬組成物および投与様式
前記のような本発明の抗体の精製調製物は、上記で概説したものなどのヒト疾病および障害の処置に用いるための医薬組成物へと配合することができる。一般にこのような組成物はさらに、既知のような、また、許容される薬務により要求されるような薬学上許容される（すなわち不活性の）担体を含む（例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980), Mack Publishing Co.参照）。このような担体の例としては、好適なバッファーで５〜８の範囲のｐＨに緩衝させた生理食塩水、リンゲル溶液またはデキストロース溶液などの無菌担体が挙げられる。注射（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内または門脈内による）または点滴用の医薬組成物は好適には目に見える粒状物質を含まず、０．１ｍｇ〜１０ｇの治療用抗体、一般には５ｍｇ〜２５ｍｇの間の抗体を含み得る。このような医薬組成物の調製方法は当業者によく知られている。一実施形態では、医薬組成物は、単位投与形中に、０．１ｍｇ〜１０ｇの本発明の治療用抗体を、所望により使用説明書とともに含む。本発明の医薬組成物は、周知の、当業者に自明の方法に従い、投与前に再構成するために、凍結乾燥させてもよい。本発明の実施形態は本発明の抗体をＩｇＧ１イソ型とともに含むが、このイソ型の抗体の銅媒介性の分解の程度を低減するために、該医薬組成物にクエン酸（例えば、クエン酸ナトリウム）またはＥＤＴＡまたはヒスチジンなどの銅キレート剤を加えてもよい（ＥＰ０６１２２５１参照）。
【０１６５】
本発明の抗体の投与に有効な用量および処置計画は一般に経験的に決定され、患者の年齢、体重および健康状態ならびに処置される疾病または障害などの因子によって異なる。このような因子は担当医の裁量の範囲内である。適当な用量を選択する際の指針は例えばSmith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New Yorkに見出せるが、一般には０．１ｍｇ〜１ｇの間であろう。一実施形態では、ヒト患者の処置のための投与計画は、本発明の治療用抗体０．１ｍｇ〜１０ｇを１週間に１回または２週間おきに皮下投与、または１か月おきまたは２か月おきに点滴により投与する。また、本発明の組成物は予防的使用も可能である。
【０１６６】
４．臨床使用
本発明は、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８と結合する抗体に関する。本発明はまた、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の１以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾病または障害、特に、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害および／または子宮内膜症を該抗体、該抗体を含む医薬組成物で処置する方法、ならびに製造方法に関する。
【０１６７】
本発明はまた、ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８の１以上のレベルの上昇または不均衡を特徴とする疾病または障害、特に、ＣＯＰＤ、変形性関節症、関節リウマチ、びらん性関節炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、乾癬、移植拒絶、痛風、癌、急性肺傷害、急性肺疾患、敗血症、ＡＲＤＳ、末梢動脈疾患、全身性硬化症、新生児呼吸窮迫症候群、喘息およびＣＯＰＤの憎悪、嚢胞性繊維症、びまん性汎細気管支炎、再潅流傷害または子宮内膜症の処置のための薬剤の製造における抗体の使用に関する。本発明を主としてヒト疾病または障害の処置に関して記載してきたが、本発明は非ヒト哺乳類の類似の疾病または障害の処置にも適用可能である。
【実施例】
【０１６８】
特定の実施形態
実施例１．  マウスモノクローナル抗体６５６．３５、１９７．２および８１．１の作製
標的ケモカイン（ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γおよびＥＮＡ−７８）に対する五重特異性ｍＡｂの作製
【０１６９】
汎特異的(pan-specific)ｍＡｂを作製する試みでマウスを免疫するために複数の方法およびスキームを用いた。汎特異的遺伝子ｍＡｂの作製は、ＳＪＬ／ＪＯｒｌＣｒｌマウス株での反復免疫多重部位（ＲＩＭＭＳ）プロトコールの改良法に従い、フロイントの完全または不完全アジュバント（ｃＦＡまたはｉＦＡ）中で混合した、多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）および／または完全標的ケモカイン（ＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、−β、−γおよびＥＮＡ−７８）の種々の混合物を用いて行った。
【０１７０】
ＭＡＰまたは多重抗原ペプチドは免疫プロトコール内で２つの機能を果たす。第一に、ＭＡＰは既知の標的アミノ酸配列の選択的多重提示を可能とする。第二に、例えばリシン核を介して連結された多重コピーの配列による質量増加があり、これも個々のペプチドの免疫原性以上の配列の免疫原性を高める(Francis, J.P., et al., Immunology, 1991: 73; 249, Schott, M.E., et al., Cell. Immuno. 1996: 174: 199-209, Tam, J.P. Proc. Natl. Acad. Sci. 1988: 85; 5409-5413)。図Ｉは、配列番号４９〜５３のアミノ酸配列を有するＭＡＰセットの概略図である。
【０１７１】
一般の免疫タイムライン
上記のタイムラインに従い、２つの異なる免疫プロトコールにより汎特異的ｍＡｂを生産した。
１．初期免疫（０日目）は、ｃＦＡ中に混合した全標的ケモカイン（各１０μｇ）の複数回の皮下注射（後躯、背部および頚部）からなる。その後の４回の追加免疫は、ｉＦＡ中に混合した全標的ケモカイン（各１０μｇ）の混合物からなった。５回目およびその後の全追加免疫は、ｉＦＡ中、全標的ケモカインと５種類全ての直鎖ＭＡＰ（各１０μｇ）のカクテルからなった。屠殺および融合３日前の最後の追加免疫は、ＰＢＳ中、全標的ケモカインと直鎖ＭＡＰからなり、腹腔内（ＩＰ）注射によって送達した。
【０１７２】
２．初期免疫（０日目）は、ｃＦＡ中、５種類全ての直鎖ＭＡＰ（各１０μｇ）の複数回の皮下注射（後躯、背部および頚部）からなる。その後の４回の追加免疫は、ｉＦＡ中、５種類全ての直鎖ＭＡＰの混合物からなった。５回目およびその後の全追加免疫は、ｉＦＡ中、種類全ての直鎖ＭＡＰと全標的ケモカイン（各１０μｇ）のカクテルからなった。屠殺および融合３日前の最後の追加免疫は、ＰＢＳ中、５種類全ての直鎖ＭＡＰと全標的ケモカイン（各１０μｇ）のカクテルからなり、腹腔内（ＩＰ）注射によって送達した。
【０１７３】
実施例２．  標的ケモカイン（ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２およびＥＮＡ−７８）に対するｍＡｂの汎結合は時間分解蛍光免疫蛍光アッセイ（ＴＲＦＩＡ）により確認された
要するに、各抗原（ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−α、Ｇｒｏ−β、Ｇｒｏ−γ、ＧＣＰ−２およびＥＮＡ−７８ならびに陰性対照として用いる場合のｈＩＬ−１８）を個々に９６ウェル免疫蛍光プレートにコーティングする。次に、これらのプレートを洗浄し、市販のブロッキング溶液でブロッキングした。ブロッキング溶液を取り出し、ｍＡｂを含有するサンプルを各ウェルに加え、４０〜６０分間インキュベートした（これによりｍＡｂを標的ケモカインと結合させる）。その後、これらのプレートを再び洗浄し、各ウェルに検出Ａｂを加える。検出試薬は、２Ｘ６５６．３５、キメラ（ＨｃＬｃ）およびヒト化ＭＡｂのそれぞれに関して次の通りであった：ビオチン化抗マウスＩｇＧ、ビオチン化抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ２試薬およびユウロピウム抗ヒトＩｇＧ。検出抗体はユウロピウムまたはビオチンのいずれかにコンジュゲートさせる。結合していない検出Ａｂを除去するためにもう一度洗浄を行った後、ビオチン検出アッセイにストレプトアビジン−ユウロピウムの溶液を加えた。ストレプトアビジン−ユウロピウムはビオチンと結合し、検出が可能となる。結合していないストレプトアビジン−ユウロピウムを除去するために最終の洗浄を行った後、またはヒト化ＭＡｂアッセイの場合には、ユウロピウム二次コンジュゲートを洗浄した後に、各ウェルにキレート洗剤溶液を満たし、ユウロピウムを活性化させて蛍光を生じさせる。記録される蛍光が大きいほど、ウェル中に存在する、直接連結されている検出Ａｂの量と直接比例し、ｍＡｂと結合しているケモカインの量に比例する。
【０１７４】
図５Ａは、標的ヒトケモカインと結合するマウス６５６．３５ｍＡｂを示す。
図５Ｂは、ヒト標的ケモカインと結合するキメラ抗体（ＨｃＬｃ）ｍＡｂを示す。
図５Ｃは、ヒト標的ケモカインと結合するヒト化ｍＡｂを示す。
【０１７５】
実施例３．  ネズミｍＡｂによる機能的汎阻害を種々の方法：ＣＸＣＲ２により媒介されるＣａ２＋の動員、ヒト好中球の走化性およびヒト好中球活性化（ＣＤ１１ｂ表面発現）を用いて確認した
ｈＣＸＣＲ２およびＧα１６でトランスフェクトされ、それらを安定発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、ＥＬＲ＋ケモカインにより誘導される［Ｃａ２＋］ｉ動員に対する抗体の中和作用の機能的同定のため、マイクロタイタープレートに基づくカルシウム動員アッセイ、ＦＬＩＰＲ(Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale CA, [Schroeder,1996])を用いた。
【０１７６】
アッセイの前日に、細胞を９６ウェルの黒壁、透明底のプレート(Packard View)に４００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。１８〜２４時間後、細胞から培地を吸引し、Ｅａｒｌの塩およびＬ−グルタミン、０．１％ＢＳＡ(Serologicals Corporation)、４μＭ  フロ−４−アセトキシメチルエステル蛍光インジケーター色素（Ｆｌｕｏ−４  ＡＭ）および２．５ｍＭプロベネシドとともにイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）を含有する１００μｌのロード培地に置き換えた。細胞をこの色素含有培地中、３７℃で１時間インキュベートした。次に、色素含有培地を細胞から吸引し、Ｆｌｕｏ−４  ＡＭを含まず、０．１％ゼラチン（ＢＳＡを除去）および２．５ｍＭプロベネシドを含む同じ培地に置き換えた。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした後、ＫＲＨアッセイバッファー［０．１％ゼラチンおよび２．５ｍＭプロベネシドを含むＫｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．０３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））］で３回洗浄した。最後のバッファー洗浄の後、０．１％ゼラチンおよび２．５ｍＭプロベネシドを含む１００μｌのＫＲＨアッセイバッファーを細胞に加え、３７℃で１０分間温めた後、ＦＬＩＰＲに入れ、色素負荷細胞を６ワットのアルゴンレーザーから励起光（４８８ｎｍ）を当てた。［Ｃａ２＋］ｉの動員は、Ｃａ２＋と結合した際のＦｌｕｏ−４の５１６ｎｍ発光強度の増加の結果としてモニタリングした。発光強度の変化はサイトゾルカルシウムレベル［Ｃａ２＋］ｉと直接的な関連がある。１０秒間ベースラインをモニタリングした後、一定の濃度範囲の抗体とともにプレインキュベートした５０μｌの３×ＥＬＲ＋ケモカインを細胞プレートに加え、１分間毎秒データを採取した後、さらに３０秒間３秒おきに記録を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖ４．０３）でプロットするため、基底読み取り値を超える最大細胞応答をエクスポートした。
【０１７７】
ＩＣ５０は、３×ＥＣ８０ケモカインの前処理中、ＥＬＲ＋ケモカインのＥＣ８０濃度の、ＣＸＣＲ２により媒介される刺激作用を５０％中和するのに必要な抗体の濃度として定義した。２５μＭのＡＴＰに対する二次的な細胞応答をモニタリングして細胞の生存率を調べた[Sarau, 1999]。
【表１】
0005441885.tif 000002
【０１７８】
ＩＬ−８により刺激されたヒト好中球走化性の阻害もまた、ｍｉｃｒｏ−Ｂｏｙｄｅｎチャンバーを用いて証明した。このｍｉｃｒｏ−Ｂｏｙｄｅｎ装置は２つの小チャンバーからなり、１つは３ミクロンの多孔質膜の上に、１つは下にある。下のチャンバーには走化性薬剤（すなわち、ＩＬ−８）またはケモカインと五重特異性ｍＡｂの混合物を入れる。上のチャンバーには精製非活性化ヒト好中球を入れる。チャンバーを組み立てると、ウェルの底から上へ濃度勾配が生じ、好中球が膜を通って走化するよう刺激される。このアッセイは、無刺激の走化性細胞数に対する、刺激剤に応答して走化する細胞の数の比であるＣＩ（走化性指数）として表される。下のチャンバーでケモカイン（すなわち、ＩＬ−８）を五重特異性ｍＡｂとともにインキュベートすると、ＩＬ−８により刺激された好中球の走化性が用量依存的に阻害された。１０ｎＭのＩＬ−８では、ＣＩ３．６±０．８に達した。ＩＬ−８を漸増濃度の五重特異性ｍＡｂ（６５６．３５）とともにプレインキュベートすると、ヒト好中球の走化性が用量依存的に阻害され、有意性は１μｇ／ｍｌでＣＩ２．２±０．６に達した。このアッセイの量および感度のため、その他のケモカイン（Ｇｒｏ−α、−β、−γおよびＥＮＡ−７８）は検討できなかった。
【０１７９】
ＣＤ１１ｂの表面発現のモニタリングによる精製ヒト好中球の活性化の阻害。ＣＤ１１ｂまたはＭａｃ−１は、基板への接着、凝集および走化性を媒介し、表面活性化好中球上でアップレギュレーションされていることが知られている（Molad, Y., J., et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1994: 71; 281−286）。要するに、非活性化ヒト好中球を精製し、ex vivoにおいて標的ケモカイン（すなわち、ＩＬ−８）か、またはケモカイン五重特異性ｍＡｂとともにプレインキュベートしたケモカインのいずれかで刺激する。データは、ＩＬ−８刺激による最大ＣＤ１１ｂ表面発現に対する活性化セットの％として表す。ＩＬ−８を６５６．３５ｍＡｂとともにプレインキュベートとすると、ＣＤ１１ｂの高レベルの表面発現が用量依存的に阻害され、従って、好中球の活性化の阻害を示す（０．０１、０．１、１、１０および５０μｇ／ｍｌでそれぞれ７９．９％±３．７、４８．５％±７．２、２８．７％±３．２および３１．６％±３．４）。
【０１８０】
実施例４．  各標的ケモカイン（ヒトＩＬ−８、Ｇｒｏ−βおよびＥＮＡ−７８）に関する五重特異性ｍＡｂの会合／解離値
Ｂｉａｃｏｒｅ分析の方法
ＫＬと呼ばれる実験に関しては、ウサギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＢＲ−１００５−１４）を、製造者の説明書に従い、第一級アミンカップリングによってＣＭ５チップに固定する。
【０１８１】
ＢＥと呼ばれる実験に関しては、アミンカップリングによってチップに直接固定された精製抗体を用いた。
【０１８２】
親マウスｍＡｂからの上清または精製抗体がこの抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ表面に捕捉される。所定濃度の各アナライト（ＩＬ８、Ｇｒｏ−ｂおよびＥＮＡ−７８）を、固定または捕捉された抗体表面に流し、各アナライトの注入ごとに別個の捕捉事象を用いる。各アナライト注入後に、弱酸性溶液を注入することにより（これにより捕捉された抗体は除去されるが、抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ表面の、別の捕捉事象を行う能力には有意な影響は無く、直接固定された抗体にも影響は無い）表面を再生する。また、抗体捕捉表面にバッファーの注入を行い、これを二重参照に用いる。このデータを、１：１結合モデルを用い、機械に内蔵された分析ソフトウエアを用いて分析する。
【表２】
0005441885.tif 000003
【０１８３】
実施例５
エピトープマッピング
６５６．３５  ｍＡｂはエピトープマッピングされ、ヒトＩＬ−８のKELRCQCIKTYSKP（配列番号５４）と結合することが判明した。よって、別の実施形態では、本発明は、ヒトＩＬ−８の配列番号５４のエピトープ内で結合する五重特異性抗体に関する。
【０１８４】
実施例６．  配列番号５６の重鎖配列と配列番号５８の軽鎖配列を有する６５６．３５から作製されたキメラ抗体の有効性研究（この抗体はキメラ抗体と呼ばれる）
吸入ＬＰＳ急性肺炎症モデルを用い、好中球の、非ヒト霊長類（ＮＨＰ−カニクイザル）の肺への浸潤を阻害する五重特異性抗体の能力を調べた。要するに、ＮＨＰ（非ヒト霊長類）を健康と外的に加えたカニクイザルＩＬ−８（ｃｙｎｏＩＬ−８）に対する応答性に関してプレスクリーニングした。次に、選択されたＮＨＰに対して、最初のＬＰＳ投与の５日前にベースラインサンプル採取（血液および気管支肺胞洗浄−ＢＡＬ）を行った。ＬＰＳ投与は、ケタミンＨＣｌ（〜１０ｍｇ／ｋｇ）１回のＩＭ注射でＮＨＰを鎮静させることからなった。ＮＨＰが鎮静したところで、プロポホールの静注（必要に応じて〜０．２ｍｇ／ｋｇ／分）により麻酔を施す。麻酔動物を循環温水加熱ブランケット上に置くか、かつ／または循環温風ブランケット内に入れ、各眼に眼用潤滑剤を投与する。その後、これらの動物に挿管し、抗原投与処置のために人工呼吸させる。処置の間、容量調節陽圧呼吸を用いる(Stoelting Cat/Rabbit ventilator www.stoeltingco.comカタログ番号5019510)。リポ多糖類（ＬＰＳ）投与は、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ  Ｕｌｔｒａｎｅｂ−９９超音波ネブライザーを用いたエアゾール吸入により行う。エアゾール化ＬＰＳを１００μｇ／ｍｌで５分間投与する。抗原投与処置の間、心拍数、体温および呼吸数をモニタリングし、記録する。初期抗原投与では、ＮＨＰがＬＰＳに応答することを確認する（好中球の肺への浸潤の増加およびｃｙｎｏＩＬ−８レベルの上昇）。個々のＮＨＰ応答は、抗原投与６時間後と２４時間後のサンプル採取によって確認した。
【０１８５】
最初のＬＰＳ投与を行ったＮＨＰを、次に、無作為に２群に分けた。４週間回復させた後、関与する全てのＮＨＰにおいてもう一度ベースラインサンプル（血液およびＢＡＬ）を採取した。ベースライン測定の４日後に、被験群にビヒクルまたはキメラ抗体１ｍｇ／ｋｇのいずれかのＩＶ注射を施した。翌日、ＮＨＰに吸入ＬＰＳで再び抗原投与を行い、抗原投与６時間後と２４時間後に分析用サンプルを採取した。さらなる回復期間の後、ビヒクルＮＨＰからベースラインサンプルを採取し、４日後にこれらのＮＨＰを１０ｍｇ／ｋｇのキメラ抗体のＩＶボーラス注射１回で処置した。翌日、これらの動物をＬＰＳ抗原に曝し、６時間および２４時間で分析用のサンプルを採取した。
【０１８６】
ＬＰＳ吸入は、ＩＬ−８などの走化性ケモカインの上昇を刺激して、好中球の肺への浸潤増加をもたらす急性炎症モデルである。キメラ抗体処置の主要な有効性パラメーターは、ＬＰＳ投与したＮＨＰの肺への好中球の浸潤の阻害である。この急性炎症モデルにおける好中球の浸潤はＬＰＳ投与後、最初の２４時間に起こり、この時点で他の炎症プロセスが
【０１８７】
キメラ抗体による前処置は有意、かつ、用量依存的に、ＬＰＳ投与されたＮＨＰの肺への好中球の浸潤を阻害した。キメラ抗体による処置はまた、実際の好中球機能（すなわち、細胞の食作用能）には影響を及ぼさずに、循環好中球の上昇も妨げた。また、処置は、肺または循環中のマクロファージ／単球などの他の細胞種にも大きな影響を及ぼさなかった（図２参照）。
【０１８８】
実施例７
ヒト化ｍＡｂに対するさらなる研究
複数のヒト化五重特異性抗体構築物を作製したところ、そのうち４つは全標的ケモカインと強固に結合し、それらを阻害することが示された（各配列に関しては、下記の配列情報を参照）。この分析は親和性測定（ＢｉａＣｏｒｅ）、カルシウム動員アッセイ（in vitro機能アッセイ、ＦＬＩＰＲ）およびＣＤ１１ｂヒトおよびＮＨＰ好中球刺激アッセイ（ex vivo機能アッセイ、フローサイトメトリー）からなった。
【０１８９】
ＢｉａＣｏｒｅ
Ａタンパク質捕捉法を用い、下記のようにヒト化およびキメラ構築物の動態を作製した：Ａタンパク質を、製造者の説明書に従い、第一級アミンカップリングによってＣＭ５チップに固定する。精製ヒト化またはキメラ抗体をＡタンパク質表面に捕捉する。捕捉後、所定の濃度の各アナライト（ＩＬ８、Ｇｒｏ−βおよびＥＮＡ−７８）を抗体捕捉表面に流し、各アナライトの注入ごとに別個の捕捉事象を用いる。各アナライト注入後に、弱酸性溶液を注入することにより（これにより捕捉された抗体は除去されるが、Ａタンパク質の、別の捕捉事象を行う能力には有意な影響は無い）表面を再生する。また、抗体捕捉表面にバッファーの注入を行い、これを二重参照に用いる。このデータを、１：１結合モデルを用い、機械に内蔵された分析ソフトウエアを用いて分析する。
【０１９０】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表４】
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【表５】
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【０１９１】
ＨｃＬｃは、配列番号５６の重鎖配列と配列番号５８の軽鎖配列を有する６５６．３５から作製したキメラ抗体を指す。
【０１９２】
機能アッセイ：ＣＨＯ−Ｋ１  ＣＸＣＲ２（ｗ／Ｇ  α１６）を用いたカルシウム動員（ＦＬＩＰＲ）
ｈＣＸＣＲ２およびＧα１６でトランスフェクトされ、それらを安定発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞において、ＥＬＲ＋ケモカインにより誘導される［Ｃａ２＋］ｉ動員に対する抗体の中和作用の機能的同定のため、マイクロタイタープレートに基づくカルシウム動員アッセイ、ＦＬＩＰＲ(Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale CA, [Schroeder,1996])を用いた。
【０１９３】
アッセイの前日に、細胞を９６ウェルの黒壁、透明底のプレート(Packard View)に４００００細胞／ウェルの密度でプレーティングした。１８〜２４時間後、細胞から培地を吸引し、Ｅａｒｌの塩およびＬ−グルタミン、０．１％ＢＳＡ(Serologicals Corporation)、４μＭ  フロ−４−アセトキシメチルエステル蛍光インジケーター色素（Ｆｌｕｏ−４  ＡＭ）および２．５ｍＭプロベネシドとともにイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）を含有する１００μｌのロード培地に置き換えた。細胞をこの色素含有培地中、３７℃で１時間インキュベートした。次に、色素含有培地を細胞から吸引し、Ｆｌｕｏ−４  ＡＭを含まず、０．１％ゼラチン（ＢＳＡを除去）および２．５ｍＭプロベネシドを含む同じ培地に置き換えた。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした後、ＫＲＨアッセイバッファー［０．１％ゼラチンおよび２．５ｍＭプロベネシドを含むＫｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（１２０ｍＭＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、１．０３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１１ｍＭグルコース、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））］で３回洗浄した。最後のバッファー洗浄の後、０．１％ゼラチンおよび２．５ｍＭプロベネシドを含む１００μｌのＫＲＨアッセイバッファーを細胞に加え、３７℃で１０分間温めた後、ＦＬＩＰＲに入れ、色素負荷細胞を６ワットのアルゴンレーザーから励起光（４８８ｎｍ）を当てた。［Ｃａ２＋］ｉの動員は、Ｃａ２＋と結合した際のＦｌｕｏ−４の５１６ｎｍ発光強度の増加の結果としてモニタリングした。発光強度の変化はサイトゾルカルシウムレベル［Ｃａ２＋］ｉと直接的な関連がある。１０秒間ベースラインをモニタリングした後、一定の濃度範囲の抗体とともにプレインキュベートした５０μｌの３×ＥＬＲ＋ケモカインを細胞プレートに加え、１分間毎秒データを採取した後、さらに３０秒間３秒おきに記録を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖ４．０３）でプロットするため、基底読み取り値を超える最大細胞応答をエクスポートした。
【０１９４】
ＩＣ５０は、３×ＥＣ８０ケモカインの前処理中、ＥＬＲ＋ケモカインのＥＣ８０濃度の、ＣＸＣＲ２により媒介される刺激作用を５０％中和するのに必要な抗体の濃度として定義した。２５μＭのＡＴＰに対する二次的な細胞応答をモニタリングして細胞の生存率を調べた[Sarau, 1999]。
【表６】
0005441885.tif 000008
【０１９５】
ex vivoＣＤ１１ｂヒト好中球刺激アッセイ
フローサイトメトリーを用い、物理的細胞変化（大きさおよび形状−顆粒化）を追跡することにより、また、表面活性化マーカーを調べることにより（ＣＤ１１ｂ表面発現の増加）、ケモカインにより誘導されたヒト精製好中球活性化を妨げるヒト化五重特異性抗体の能力を調べた。好中球制御刺激剤ｆＭＬＰを用い、精製ヒト好中球の活性化能を確認した（図４参照）。
【０１９６】
配列情報
６５６．３５、１９７．２および８１．１ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを抽出した後、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により重鎖および軽鎖可変ドメインｃＤＮＡ配列を作製した。ＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマーは、ネズミ免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な縮重プライマーの混合物であり、リバースプライマーは、抗体定常領域、この場合にはＩｇＧ２ａ／κであった。プライマーは、Jones and Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991)により記載されている戦略に従って設計した。ＲＴ−ＰＣＲは、その後に正しいＶ領域配列の確認ができるように両Ｖ領域配列について２回行った。ＲＴ−ＰＣＲにより作出されたＶ領域鎖産物をクローニングし(Invitrogen TA Cloning Kit)、配列データを得た。このプロセスは８１．１軽鎖可変ドメインでは上手くいかなかった。従って、下記に示すアミノ酸配列（配列番号１２）は、還元条件下で泳動させたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で単離した軽鎖のタンパク質配列決定を行うことにより作製した。
【０１９７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示す。
６５６．３５の重鎖および軽鎖可変領域（それぞれ配列番号１および３）のポリヌクレオチド配列
配列番号１
CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCTCTGGTCACTGTCTCTGCA
配列番号３
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCTGGTATCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTACGCTACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG
【０１９８】
６５６．３５の重鎖および軽鎖可変領域（それぞれ配列番号２および４）のポリペプチド配列
配列番号２
QVQLQQSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFTNYWIVWVKQRPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKGKATLTADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAHWGQGSLVTVSA
配列番号４
DIKMTQSPSSMSASLGERVTITCQASQDIESYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPPTFGAGTKLELKR
【０１９９】
６５６．３５の重鎖ＣＤＲ（それぞれ配列番号１３、１４、１５）のポリペプチド配列
配列番号１３
NYWIV
配列番号１４
DLYSGGGYTFYSENFKG
配列番号１５
SGYDRTWFAH
【０２００】
６５６．３５の軽鎖ＣＤＲ（配列番号１６、１７、１８）のポリペプチド配列
配列番号１６
QASQDIESYLS
配列番号１７
YATRLAD
配列番号１８
LQHGESPPT
【０２０１】
６５６．３５の重鎖ＣＤＲ（配列番号３１、３２、３３）のポリヌクレオチド配列
配列番号３１
AACTACTGGATAGTT
配列番号３２
GATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGG
配列番号３３
TCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCAC
【０２０２】
６５６．３５の軽鎖ＣＤＲ（配列番号３４、３５、３６）のポリヌクレオチド配列
配列番号３４
CAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGC
配列番号３５
TACGCTACAAGGTTGGCAGAT
配列番号３６
CTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACG
【０２０３】
１９７．２の重鎖および軽鎖可変領域（それぞれ配列番号５および７）のポリヌクレオチド配列
配列番号５
GAGTTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACAACATGAACTGGGTGAAGCAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGAGTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACGTTGACTGTAGACCAATCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATCACTGTGCAAGAGGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCTCTGTCACCGTCTCCTCA
配列番号７
GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGAGTGTGTCAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCARAAGAACTACTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACGGGGCATCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACCGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG
【０２０４】
１９７．２の重鎖および軽鎖可変領域（それぞれ配列番号６および８）のポリペプチド配列
配列番号６
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVINPKYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYHCARGMGLLFGMDYWGQGTSVTVSS
配列番号８
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRKSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDHSFPCTFGGGTKLEIKR
【０２０５】
１９７．２の重鎖ＣＤＲ（それぞれ配列番号１９、２０、２１）のポリペプチド配列
配列番号１９
DYNMN
配列番号２０
VINPKYGTTSYNQKFKG
配列番号２１
GMGLLFGMDY
【０２０６】
１９７．２の軽鎖ＣＤＲ（それぞれ配列番号２２、２３、２４）のポリペプチド配列
配列番号２２
KSSQSLLNSGNQKNYLA
配列番号２３
GASTRKS
配列番号２４
QNDHSFPCT
【０２０７】
１９７．２の重鎖ＣＤＲ（配列番号３７、３８、３９）のポリヌクレオチド配列
配列番号３７
GACTACAACATGAAC
配列番号３８
GTAATTAATCCTAAGTATGGTACTACTAGTTACAATCAGAAGTTCAAGGGC
配列番号３９
GGAATGGGACTCCTCTTTGGTATGGACTAC
【０２０８】
１９７．２の軽鎖ＣＤＲ（配列番号４０、４１、４２）のポリヌクレオチド配列
配列番号４０
AAGTCCAGTCAGAGTCTGTTAAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGGCC
配列番号４１
GGGGCATCCACTAGGAAATCT
配列番号４２
CAGAATGATCATAGTTTTCCGTGCACG
【０２０９】
８１．１の重鎖可変領域（配列番号９）のポリヌクレオチド配列
配列番号９
GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAACTGGAGAAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCTTTCACTGTCTACGGCATGAACTGGGTGAGACAGAGCAATGGAAAGAGCCTTGAATGGATTGGAAATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGACAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAAGAACCTCACATCTGAAGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGAGGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
【０２１０】
８１．１の重鎖可変領域（配列番号１０）のポリペプチド配列
配列番号１０
EVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTVYGMNWVRQSNGKSLEWIGNFDPYFSVTSYNQKFQDKATLTVDKSSSTAYMQLKNLTSEDSAVYFCARGSWETIFAYWGQGTLVTVSA
【０２１１】
８１．１の重鎖ＣＤＲ（それぞれ配列番号２５、２６、２７）のポリペプチド配列
配列番号２５
VYGMN
配列番号２６
NFDPYFSVTSYNQKFQD
配列番号２７
GSWETIFAY
【０２１２】
８１．１の重鎖ＣＤＲ（配列番号４３、４４、４５）のポリヌクレオチド配列
配列番号４３
GTCTACGGCATGAAC
配列番号４４
AATTTTGATCCTTACTTTAGTGTCACTTCCTACAACCAGAAGTTCCAGGAC
配列番号４５
GGGAGCTGGGAAACCATTTTTGCTTAC
【０２１３】
８１．１の軽鎖可変領域（配列番号１２）のポリペプチド配列
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHVFGGGTKLTVLQPK
【０２１４】
８１．１の軽鎖ＣＤＲ（それぞれ配列番号２８、２９および３０）のポリペプチド配列
配列番号２８
RSSTGAVTTSNYAN
配列番号２９
GTNNRAP
配列番号３０
ALWYSNHV
【０２１５】
キメラ*ポリヌクレオチド配列（重鎖可変領域＋コドン至適化ＩｇＧ１）配列番号５５
CAGGTCCAGTTGCAGCAGTCTGGAGCTGAACTGGTAAGGCCTGGGACTTCAGTGACGATATCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAACTACTGGATAGTTTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATCTTTACTCTGGAGGTGGTTATACTTTCTACAGTGAAAATTTCAAGGGGAAGGCCACACTGACTGCAGACACATCCTCCAGCACTGCCTACATGCACCTCATTAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGTGCAAGATCGGGTTACGACAGAACCTGGTTTGCTCACTGGGGCCAAGGGTCACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
【０２１６】
キメラ*ポリペプチド配列（重鎖可変領域＋コドン至適化ＩｇＧ１）配列番号５６
QVQLQQSGAELVRPGTSVTISCKASGYTFTNYWIVWVKQRPGHGLEWIGDLYSGGGYTFYSENFKGKATLTADTSSSTAYMHLISLTSEDSAVYFCARSGYDRTWFAHWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２１７】
キメラ*ポリヌクレオチド配列（軽鎖可変領域＋コドン至適化ヒトｃＫ）配列番号５７
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGTCAGGCGAGTCAGGACATTGAAAGCTATTTAAGCTGGTATCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATTACGCTACAAGGTTGGCAGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGTCAAGATTATTCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAACATGGTGAGAGCCCTCCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
【０２１８】
キメラ*ポリペプチド配列（軽鎖可変領域＋コドン至適化ヒトｃＫ）配列番号５８
DIKMTQSPSSMSASLGERVTITCQASQDIESYLSWYQQKPWKSPKTLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLESDDTATYYCLQHGESPPTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２１９】
キメラ*とは、ネズミ６５６．３５抗体から作製されたキメラ抗体を指す。
成熟重鎖のＨ０  ＤＮＡ配列  配列番号１１
CAGGTGCAGCTCGTGCAGAGCGGCGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGGGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCGTGTGGGTCAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGACCTGTATAGCGGCGGCGGCTACACCTTCTACAGCGAGAACTTCAAGGGCAGGGTGACCATGACCAGGGACACCAGCACCAGCACCGTGTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGAGCGGCTACGACAGGACTTGGTTTGCTCACTGGGGCCAGGGCACACTAGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGTAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGTGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCTGCCCCCGAGCTGCTGGGAGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCACGAGGACCCTGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCCTGGCAAG
【０２２０】
成熟重鎖のＨ０  タンパク質配列  配列番号４６
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYWIVWVRQAPGQGLEWMGDLYSGGGYTFYSENFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSGYDRTWFAHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【０２２１】
成熟軽鎖のＬ７  ＤＮＡ配列  配列番号４７
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTGACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCaagCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
【０２２２】
成熟軽鎖のＬ７  タンパク質配列  配列番号４８
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２２３】
成熟軽鎖のＬ８  ＤＮＡ配列  配列番号５９
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGACAGACTTCACCttcACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATatcGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCaagCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
【０２２４】
成熟軽鎖のＬ８  ＤＮＡ配列  配列番号６０
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２２５】
成熟軽鎖のＬ１０  ＤＮＡ配列  配列番号６１
GATATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCTCCCTCAGCGCATCAGTCGGCGACAGAGTGACAATCACCTGCCAGGCATCCCAGGACATCGAGTCTTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGAAAGGCCCCAAAGCTCCTGATCTACTACGCCACTCGGCTGGCAgacGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCTCAGGGTCTGGGcagGACtacACCCTGACCATCAGCTCACTGCAGCCCGAGGATTTCGCCACCTACTACTGTCTGCAGCACGGAGAGAGCCCCCCAACCTTTGGCCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
【０２２６】
成熟軽鎖のＬ１０  タンパク質配列  配列番号６２
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIESYLSWYQQKPGKAPKLLIYYATRLADGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【０２２７】
成熟軽鎖のＭ０  ＤＮＡ配列  配列番号６３
GAGATCGTGCTGACCCAGTCTCCCGCCACCCTGTCACTGTCTCCCGGCGAAAGGGCAACCCTGAGCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCGAGAGCTACCTGAGCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACTACGCCACCAGGCTGGCCGACGGCATTCCCGCCAGGTTCAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACTCTGACCATCAGCAGCCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCTGCAGCACGGCGAGAGCCCTCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTCGAGATCAAGCGTACGGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCCCCCAGCGATGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGT
GTCTGCTGAACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGTGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGC
【０２２８】
成熟軽鎖のＭ０  タンパク質配列  配列番号６４
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCQASQDIESYLSWYQQKPGQAPRLLIYYATRLADGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQHGESPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
【図１】
0005441885.tif 000009
【図２】
0005441885.tif 000010
【図３】
0005441885.tif 000011
【図４】
0005441885.tif 000012
【図５Ａ】
0005441885.tif 000013
【図５Ｂ】
0005441885.tif 000014
【図５Ｃ】
0005441885.tif 000015
【配列表】
0005441885000001.app