(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択的な抗腫瘍薬として有用な式1で表される新規なピロロ［2, 1−c］［1, 4］ベンゾジアゼピン−グリコシドプロドラッグ。
0005404624.tif 000014
式中、Rはフェニルまたはメチレンおよびnは1または2である。
【請求項２】
式1の化合物が次の化合物である請求項1に記載の化合物：
（11S）−10−（4−β−D−ガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−［11−ヒドロキシ−8−ベンジルオキシ−7−メトキシ−1, 2, 3, −10, 11, 11a−ヘキサヒドロ−5H−ピロロ［2, 1−c］［1, 4］−ベンゾジアゼピン−5−オン］（1a）および1, 1’− ［［（プロパン−1, 3−ジイル）ジオキシ］−ビス（11S, 11aS）−10−（4−β−D−ガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−1, 2, 3, −10, 11, 11a−ヘキサヒドロ−5H−ピロロ［2, 1−c］［1, 4］−ベンゾジアゼピン−5−オン］（1b）。
【請求項３】
前記化合物が癌の選択的治療のための抗腫瘍薬として有用である請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物が酵素大腸菌β−ガラクトシダーゼによって薬剤に活性化される請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
前記化合物が大腸菌β−ガラクトシダーゼの存在下でヒト癌細胞株A375に有毒である請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が大腸菌β−ガラクトシダーゼの非存在下でヒト癌細胞株HepG2に有毒である請求項1に記載の化合物。
【請求項７】
選択的な抗腫瘍薬として有用な式1のピロロ ［2, 1−c］［1, 4］ ベンゾジアゼピン−グリコシドプロドラッグの製造法であって、
0005404624.tif 000015
式中、Rはフェニルまたはメチレンおよびnは1または2であり、前記製造法は次のステップからなることを特徴とする製造方法。
ａ．式 2a−bの化合物を乾燥ジクロロメタン中でトリエチルアミンおよびトリホスゲンと20−30分間、攪拌下で反応させ、得られた混合物からジクロロメタンを留去し、テトラヒドロフランに再溶解し、引き続いて濾過して白色固形物を除去し、得られた濾液からテトラヒドロフランを留去し、得られた残渣をジクロロメタンに再溶解し、これを式5の化合物と触媒量のジラウリン酸ジブチルすずの存在下で6−7時間、攪拌下で反応させて、式 3a−bで表わされる所望の化合物を得る。
0005404624.tif 000016
b．ステップ（a）で得られた式3a,bの化合物をアセトニトリルと水およそ3：1の比の混合溶媒中で炭酸カルシウムおよび塩化第二水銀と10−14時間、攪拌下で反応させ、続いて濾過し、濾液からアセトニトリルを留去し、最後に酢酸エチルで抽出し、乾燥し、得られた抽出物を公知の方法で精製して、式4a,bで表わされる所望の化合物を得る。
0005404624.tif 000017
c．ステップ（b）で得られた式4a,bの化合物をメタノール中、触媒量のNaOMeと0−5℃の温度で20−35分間反応させて、式1aで表わされる所望の化合物を得る。
【請求項８】
ステップ（a）で用いられる式2の化合物は、［（2−アミノ−4−ベンジルオキシ−5−メトキシ−1, 4−フェニレン）カルボニル］（2S）−ピロリジン−2−カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタール （2a） および 1, 1β−［（プロパン−1, 3−ジイル）ジオキシ］−ビス［（2−アミノ−5−メトキシ−1, 4−フェニレン）カルボニル］−ビス［（2S）−ピロリジン−2−カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタール］（2b）から選ばれる請求項7に記載の製造方法。
【請求項９】
ステップ（a）で用いられる式5の化合物は、（4−β−D−2, 3, 4, 6−テトラ−O−アセチルガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メタノールである請求項7に記載の製造方法。
【請求項１０】
ステップ（a）で得られた式3の化合物は、［2−アミノ−N−（4−β−D−2, 3, 4, 6−テトラ−O−アセチルガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−4−ベンジルオキシ−5−メトキシ−1, 4−フェニレンカルボニル］ （2S）−ピロリジン−2−カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタール（3a）および 1, 1β−［（プロパン−1,3−ジイル）イオキシ］−ビス［（2−アミノ−N−（4−β−D−2, 3, 4, 6−テトラ−O−アセチルガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−5−メトキシ−1, 4−フェニレン）カルボニル］−ビス［（2S）−ピロリジン−2−カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタール］ （3b）から選ばれる請求項7に記載の製造方法。
【請求項１１】
ステップ（b）で得られた式4の化合物は、（11S）−10−（4−β−D−2, 3, 4, 6−テトラ−O−アセチルガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−［11−ヒドロキシ−8−ベンジルオキシ−7−メトキシ−1, 2, 3, −10, 11, 11a−ヘキサヒドロ−5H−ピロロ［2, 1−c］［1, 4］−ベンゾジアゼピン−5−オン］（4a）および 1, 1β−［（プロパン−1, 3−ジイル）ジオキシ］−ビス（11S, 11aS）−10−（4−β−D−2, 3, 4, 6−テトラ−O−アセチルガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−［11−ヒドロキシ−7−メトキシ−1, 2, 3, −10, 11, 11a−ヘキサヒドロ−5H−ピロロ［2, 1−c］［1, 4］−ベンゾジアゼピン−5−オン］ （4b） から選ばれる請求項7に記載の製造方法。
【請求項１２】
得られた式1の代表化合物は、（11S）−10−（4−β−D−ガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−［11−ヒドロキシ−8−ベンジルオキシ−7−メトキシ−1, 2, 3, −10, 11, 11a−ヘキサヒドロ−5H−ピロロ［2, 1−c］［1, 4］−ベンゾジアゼピン−5−オン］（1a）および 1, 1’− ［［（プロパン−1, 3−ジイル）ジオキシ］−ビス（11S, 11aS）−10−（4−β−D−ガラクトピラノシルオキシ−3−ニトロフェニル）メトキシカルボニル−11−ヒドロキシ−7−メトキシ−1, 2, 3, −10, 11, 11a−ヘキサヒドロ−5H−ピロロ［2, 1−c］［1, 4］−ベンゾジアゼピン−5−オン］（1b）である請求項7に記載の製造方法。
【請求項１３】
得られた式1a−bの化合物は、酵素大腸菌β−ガラクトシダーゼによって薬剤に活性化される請求項7に記載の製造方法。
【請求項１４】
得られた式1a−bの化合物は、大腸菌β−ガラクトシダーゼの存在下でヒト癌細胞株A375に有毒である請求項7に記載の製造方法。
【請求項１５】
得られた式1a−bの化合物は、大腸菌β−ガラクトシダーゼの非存在下でヒト癌細胞株HepG2に有毒である請求項7に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療のための選択的な抗腫瘍薬として有用な新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピンプロドラッグに関する。特に本発明は、(11S)-10-(4-β-D-ガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-[11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3, -10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジアゼピン-5-オン]および 1, 1’-[[(プロパン-1, 3-ジイル)ジオキシ]-ビス(11S, 11aS)-10-(4-β-D-ガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3,-10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジアゼピン-5-オン] に関する。本発明はまた、癌治療のための選択的な抗腫瘍薬として有用な新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピン(PBD-グリコシド)プロドラッグの製造方法に関する。本発明はまた、酵素β-ガラクトシダーゼによる薬剤へのPBD-グリコシドプロドラッグの活性化工程に関する。
【０００２】
新規なPBD-グリコシドプロドラッグの構造式を次に示す。
0005404624.tif 000002
【背景技術】
【０００３】
プロドラッグは改質された薬剤であり、活性型薬剤に関する。近年、酵素β-ガラクトシダーゼによって活性化されないPBDsの幾つかのプロドラッグが報告されている(Marina J. Sagnou, Philip W. Howard, Stephen J. Gregson, Ebun Eno-Amooquaye, Philip J. Burke, David E. Thurston, Bioorg Med Chem. Lett. 2000,10, 2083-2086; Jane M. Berry, Philip W. Howard, Lloyd R. Kelland, David E. Thurston, Bioorg Med Chem. Lett. 2002, 12, 1413-1416;  Luke A. Masterson, Victoria J. Spanswick, John A. Hartley, Richard H. Begent, Philip W. Howard, David E. Thurston, Bioorg.Med. Chem. Lett. 2006, 16, 252-256)。
【０００４】
ピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピン抗腫瘍抗生物質はアントラマイシンというクラスの化合物として一般に知られている。特に近年、新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピン(PBDs)の開発に関する関心が高まってきている。これらPBDsは、N10-C11位で電子親和性イミンに酸に不安定なアミノ結合を介してDNAのマイナーグローブで環外のN2-グアニンに排他的に結合する配列選択的DNA-結合抗腫瘍抗生物質のファミリーに属する(Kunimoto, S.; Masuda, T.; Kanbayashi, N.; Hamada, M.; Naganawa, H.; Miyamoto, M.; Takeuchi, T.; Unezawa, H. J. Antibiot., 1980, 33, 665.; Kohn, K. W.; Speous, C. L. J. Mol. Biol., 1970, 51, 551.; Hurley, L. H. Gairpla, C.; Zmijewski, M. Biochem. Biophys. Acta., 1977, 475, 521.; Kaplan, D. J.; Hurley, L. H. Biochemistry, 1981, 20, 7572.; Ahmed Kamal, G. Ramesh, N. Laxman, P. Ramulu, O. Srinivas, K. Neelima, Anand K. Kondapi, V. B. Sreenu, H. A. Nagarajaram. J. Med. Chem. 2002, 45, 4679-4688)。
【０００５】
生物学的に活性なPBDsは全て、キラルであるC11a位は(S)配置を有しており、3塩基対にまたがるB-フォームの二本鎖DNAのマイナーグローブの湾曲をたどるようにした、右方向のねじれを有する分子を与えることになる。PBDsは、二本鎖DNAの特異的な塩基配列を認識し、結果として共有結合を形成する能力に起因して現在かなり関心がもたれている。天然に見出されるピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピンは、アントラマイシン、トマイマイシン、シビロマイシン、キカマイシン、ネオトラマイシンAおよびB、およびDC-81を含む科のストレプトミセス属に由来する抗腫瘍抗生物質群に属する。
【０００６】
0005404624.tif 000003
【０００７】
しかしながら、それら抗生物質の臨床効果は低水溶性および心毒性および薬剤耐性の発現、腫瘍選択性の欠如、代謝不活化のような幾つかの制限があることで妨げられている。それゆえ酵素β-ガラクトシダーゼによって活性化されるPBDsのグリコシドプロドラッグをデザインし製造することに相当の関心が注がれている。この酵素はとりわけ肝臓のような幾つかの組織に見出されるか悪性細胞への酵素-抗体抱合体として運ばれる。これらのプロドラッグは酵素によって活性化されて活性型となり、DNAと相互作用することが予想される。
【０００８】
［発明の目的］
本発明の主な目的は、選択的な抗腫瘍薬として有用な水溶性を向上させた新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピンプロドラッグを提供するものである。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、酵素β-ガラクトシダーゼの存在下で薬剤に活性化される新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピンプロドラッグを提供するものである。
【００１０】
さらに本発明のもう一つの目的は、選択的な癌治療のための抗腫瘍薬として有用な新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピン-グリコシドプロドラッグの製造法を提供するものである。
【発明の概要】
【００１１】
したがって本発明は、選択的な抗腫瘍薬として有用な式1で示す新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピン-グリコシドプロドラッグを提供するものである。
【００１２】
0005404624.tif 000004
式中、Rはフェニルまたはメチレンおよびnは1または2である。
【００１３】
本発明の実施形態として、式1の代表化合物を次に示す：
(11S)-10-(4-β-D-ガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-[11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3, -10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジアゼピン-5-オン] (1a)、および 
1, 1’- [[(プロパン-1, 3-ジイル)ジオキシ]-ビス(11S, 11aS)-10-(4-β-D-ガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3, -10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジアゼピン-5-オン] (1b).
【００１４】
さらにもうひとつの実施形態において、式1の化合物は選択的癌治療のための抗腫瘍薬として有用である。
【００１５】
さらにもうひとつの実施形態において、式1の化合物は酵素大腸菌β-ガラクトシダーゼによって薬剤に活性化される。
【００１６】
さらにもうひとつの実施形態において、式1の化合物は大腸菌β-ガラクトシダーゼの存在下でヒト癌細胞株A375に有毒である。
【００１７】
さらにもうひとつの実施形態において、式1の化合物は大腸菌β-ガラクトシダーゼの非存在下でヒト癌細胞株HeG2に有毒である。
【００１８】
本発明はさらに、選択的な抗腫瘍薬として有用な式1で示すピロロ[2, 1-c][1, 4] ベンゾジアゼピン-グリコシドプロドラッグの製造法を提供するものである。
0005404624.tif 000005
【００１９】
式中、Rはフェニルまたはメチレンおよびnは1または2であり、前記製造法は以下のステップからなることを特徴とする：
a．式2a-bの化合物を乾燥ジクロロメタン中でトリエチルアミンおよびトリホスゲンと20-30分間、攪拌下で反応させ、得られた混合物からジクロロメタンを留去し、テトラヒドロフランに再溶解し、引き続いて濾過して白色固形物を除去し、得られた濾液からテトラヒドロフランを留去し、得られた残渣をジクロロメタンに再溶解し、これを式5の化合物と触媒量のジラウリン酸ジブチルすずの存在下で6-7時間、攪拌下で反応させて、式3a-bで表される所望の化合物を得る。 
【００２０】
0005404624.tif 000006
【００２１】
b．ステップ(a)で得られた式3a,bの化合物をアセトニトリルと水およそ3：1の比の混合溶媒中で炭酸カルシウムおよび塩化第二水銀と10-14時間、攪拌下で反応させ、続いて濾過し、濾液からアセトニトリルを留去し、最後に酢酸エチルで抽出し、乾燥し、得られた抽出物を公知の方法で精製して、式4a,bで表わされる所望の化合物を得る。 
【００２２】
0005404624.tif 000007
【００２３】
c．ステップ(b)で得られた式4a,bの化合物をメタノール中、触媒量のNaOMeと0-5℃の温度で20-35分間反応させて、式1aで表わされる所望の化合物を得る。 
【００２４】
本発明の実施形態において、ステップ(a)で用いられる式2の化合物は[(2-アミノ-4-ベンジルオキシ-5-メトキシ-1, 4-フェニレン) カルボニル] (2S)-ピロリジン-2-カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタール(2a) および1, 1β-[(プロパン-1, 3-ジイル)ジオキシ]-ビス[(2-アミノ-5-メトキシ-1, 4-フェニレン)カルボニル]-ビス[(2S)-ピロリジン-2-カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタール](2b)から選ばれる。
【００２５】
本発明の更なる実施形態において、ステップ(a)で用いられる式5の化合物は(4-β-D-2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチルガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メタノールである。
【００２６】
更にもう一つの実施形態において、ステップ(a)で得られた式3の化合物は[2-アミノ-N-(4-β-D-2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチルガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-4-ベンジルオキシ-5-メトキシ-1, 4-フェニレンカルボニル](2S)-ピロリジン-2-カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタール(3a)および1, 1β-[(プロパン-1, 3-ジイル)イオキシ]-ビス[(2-アミノ-N-(4-β-D-2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチルガラクトピラノシルオキシ -3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-5-メトキシ-1, 4-フェニレン)カルボニル]-ビス[(2S)-ピロリジン-2-カルボキシアルデヒドジエチルチオアセタ
ール](3b)から選択される。
【００２７】
更にもう一つの実施形態において、ステップ(b)で得られた式4の化合物は(11S)-10-(4-β-D-2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチルガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-[11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3, -10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジアゼピン-5-オン](4a)および1, 1β-[(プロパン-1, 3-ジイル)ジオキシ]-ビス(11S, 11aS)-10-(4-β-D-2, 3, 4, 6-テトラ-O-アセチルガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-[11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3, -10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジアゼピン-5-オン] (4b)から選ばれる。
【００２８】
更にもう一つの実施形態において、得られる式1の代表化合物は(11S)-10-(4-β-D-ガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-[11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3, -10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジアゼピン-5-オン] (1a)および1, 1’-[[(プロパン-1, 3-ジイル)ジオキシ]-ビス(11S, 11aS)-10-(4-β-D-ガラクトピラノシルオキシ-3-ニトロフェニル)メトキシカルボニル-11-ヒドロキシ-7-メトキシ-1, 2, 3, -10, 11, 11a-ヘキサヒドロ-5H-ピロロ[2, 1-c][1, 4]-ベンゾジア
ゼピン-5-オン](1b)である。
［発明の詳細な説明］
【００２９】
本発明は、固形腫瘍の選択的治療のための薬剤として有用な式1aおよび1bで表わされる新規なピロロ[2, 1-c][1, 4]ベンゾジアゼピン-グリコシドプロドラッグの製造法を提供するものである。
【００３０】
0005404624.tif 000008
【００３１】
本発明に関する詳細な反応式を以下に示す：
0005404624.tif 000009
【００３２】
以下、本発明の実施例を記すがこれによって本発明を制限するものと解釈されるものではない。
【実施例】
【００３３】
プロドラック1aおよび1bを製造するための合成手順
化合物2aおよび/または2b(0.9gで1.95m.molの2aまたは1.3gで1.66m.molの2b)を乾燥CH2Cl2に加え、この溶液にトリエチルアミン(2aに対しては4.29m.molの0.6mlおよび 2bに対しては7.30m.molの1.02ml)およびトリホスゲン(2aに対しては0.64m.molの0.19gおよび2bに対しては1.09m.molの0.32g)を加え、25分間攪拌し、CH2Cl2を留去し、反応混合物をTHFに溶解し濾過して不溶の白色固体を除去した。濾過したTHFを留去し、残渣をCH2Cl2に再溶解し、化合物6(2aでは1.95m.molの0.97gおよび2bでは3.32m.molの1.65g)および触媒量のジラウリン酸ジブチルすずを加え、所望の化合物を得るために6時間攪拌した。反応混合物を食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、カラムクロマトグラフィで精製した(3aは1.53gで1.56m.mol(収率80%)および3bは2.46gで1.16m.mol(収率70%))。
【００３４】
化合物3a 収率=1.53g(80%);1H NMR(CDCl3, 300MHz)δ7.95(bs, 1H), 7.84(d, 1H, J=2.26), 7.56(dd, 1H, J1=2.07, J2=8.49), 7.49-7.45(m, 2H), 7.41-7.31(m, 4H), 6.92 (s, 1H), 5.55(dd, 1H,J1= 7.93, J2=10.57), 5.47(dd, 1H, J1=0.94, J2=3.21), 5.18 (s, 2H), 5.15(s, 2H), 5.10(dd, 1H, J1=3.39, J2=10.57), 5.06(d, 1H, J =7.93), 4.68(m, 2H), 4.28-4.04(m, 3H), 3.83(s, 3H), 3.61-3.54(m, 2H), 2.80-2.59(m, 4H), 2.33-1.86(m, 16H), 1.97-1.36 (m, 6H), ESI-MS：m/z=1008(M+Na)+
【００３５】
化合物3b 収率=2.46g(70%); 1H NMR,(CDCl3, 400MHz)δ9.18 (bs, 1H, NH), 7.9-7.82 (m, 4H), 7.59-7.54 (m, 4H), 7.37 (s, 1H), 7.34 (s, 1H), 6.90 (s, 2H), 5.58-5.45 (m, 4H), 5.18-5.04 (m, 8H), 4.73-4.63 (m, 4H), 4.35-4.04 (m, 10H), 3.81 (s, 6H), 3.60-3.53 (m, 4H), 2.79-2.59 (m, 8H), 2.44-1.55 (m, 22H), 1.35-1.20 (m, 12H),  ESI-MS：m/z=1853 (M+Na)+
【００３６】
化合物3a および/または 3b(1.4gで1.42m.molの3aまたは2gで1.09m.molの3b)をCH3CN/H2O(3:1)の混液に加え、この溶液にCaCO3 (3aに対しては3.55m.molの0.35gおよび3bに対しては5.45m.molの0.54g)およびHgCl2(3aに対しては3.12m.molの0.84gおよび3bに対しては4.90 m.molの1.33g)を加え12時間攪拌した。反応混合物をセライト層を通して濾過させた。アセトニトリルを濾液から留去し酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を留去し化合物をカラムクロマトグラフィで精製した(4aは0.95gで 1.09m.mol、収率76%および4bは1.31gで0.81m.mol、収率75%)。
【００３７】
化合物4a 収率=1.09g(76%); 1H NMR(CDCl3, 300MHz)δ7.57(s, 1H), 7.42-7.23(m, 8H), 6.63(s, 1H), 5.59(d, 1H, J=9.82), 5.52(dd, 1H, J1=7.55, J2=10.57), 5.16-4.90(m, 6H), 4.23-4.10(m,3H), 3.93(s, 3H), 3.75-3.43(m, 3H), 2.20-1.55(m, 16H), ESI-MS: m/z=902(M+Na)+
【００３８】
化合物4b 収率=1.31g(75%);1H NMR(CDCl3, 500MHz)δ7.73-7.69(m, 2H), 7.54-7.48(m, 4H), 7.35-7.11(m, 2H), 6.85(s, 2H), 5.71(d, 2H, J=9.82), 
5.59(dd, 2H, J1=8.54, J2=9.97), 5.46(d, 2H, J=3.02), 5.30(d, 2H, J1= 12.84), 5.07(dd, 2H, J1= 3.02, J2=10.57), 5.01(d, 2H, J=7.55), 4.83(d, 2H, J=12.08), 4.27-3.95 (m, 10H), 3.87(s, 6H), 3.35-1.95(m, 34H); ESI-MSm/z:1641[M+Na]+
【００３９】
化合物4a および/または 4b(0.9gで1.02m.molの4aまたは1gで0.61m.molの4b)をメタノールに溶解し、触媒量のNaOMeを0℃で加え、最終化合物1aおよび/または1bを得るために30分間攪拌した。化合物1aはカラムクロマトグラフィで精製して85％の収率で0.61g、0.86m.molを得、一方1bは、80％の粗収率で0.63g、0.49m.molを得た。化合物1bは分取逆相HPLCで精製した。
【００４０】
化合物1a 収率=0.61g(85%); 1H NMR(CD3OD, 500MHz)δ7.60-7.53(m, 1H), 7.45-7.24 (m, 7H), 7.21(s, 2H), 6.91-6.81(m, 1H), 5.66(d, 1H; J=9.73), 5.13-4.92(m, 5H), 3.89(s, 3H), 3.84-3.39(m, 9H), 2.17-1.97(m, 4H); HRMS[M+Na]+計算値：C34H38N3O14 m/z=712.2353, 実験値：(FAB)m/z=712.2336
【００４１】
化合物1b 収率=0.63g(80%); 1H NMR(CD3OD, 500MHz)δ7.72-7.32(m, 6H), 7.21(s, 2H), 7.00-6.90(m, 2H), 5.70(d, 2H, J=8.97), 5.22(d, 2H, J=11.73), 5.07-4.91(m, 4H), 4.29-4.03(m, 4H), 3.96-3.92(m, 2H), 3.90-3.82(m, 8H), 3.78-3.71 (s, 6H), 3.66-3.58(m, 4H), 3.54-3.42(m, 4H), 2.30-2.23(m, 2H), 2.20-1.99(m, 8H); ESI-MS: m/z=1305(M+Na)+; HRMS[M+Na]+ 計算値：C57H66N6O28Na m/z = 1305.3822, 実験値(FAB) m/z=1305.3802.
【００４２】
酵素 β-ガラクトシダーゼによるプロドラッグの活性化
プロドラッグである構造式1aおよび1bは、以下に示す条件でそれらの親イミンに相当する対応するカルビノールアミンに活性化された：
1．酵素β-ガラクトシダーゼの存在下
2．60-90分の継続時間
3．37℃の温度
4．pH7.2(リン酸緩衝液)
【００４３】
プロドラッグ1aから6aへの活性化のメカニズム
0005404624.tif 000010
【００４４】
プロドラッグ1bから6bへの活性化のメカニズム
0005404624.tif 000011
【００４５】
プロドラッグ1a 1μmoleを大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素2単位で処理し、加水分解の過程を逆相HPLCで監視した。その結果をグラフで表した。
0005404624.tif 000012
HPLC 条件：C18逆相カラム。移動相40：60 CH3CN/ H2O、流速 1ml/分。UV検出：波長254nm。
【００４６】
プロドラッグの生物学的研究
新規に合成した化合物1aおよび1bおよびそれらのそれぞれのPBDイミンの細胞毒性効果は、β-ガラクトシダーゼ酵素の非存在下および存在下で蛍光活性化細胞識別(FACS)解析を用いて、ヒト腫瘍細胞上の細胞周期進行試験によって調べた。基礎的なフローサイトメトリーの研究において、細胞のDNA量は細胞数の主な決定子として用いられた。細胞死に対して分かりやすい指標で、おそらくアポトーシスであるsubG1集団、およびG2/M集団はまたHepG2およびA375細胞株で測定された。
【００４７】
大腸菌β-ガラクトシダーゼとともにプロドラッグ1aおよび1bで処理したA375細胞の細胞数測定評価は、それぞれ親薬剤である6aおよび6bのそれと同一になってアポトーシスに帰着するだけではなく、細胞死の量は酵素の非存在下では取るに足らないものであり、たとえ高い濃度(1aは42μMおよび1bは23.4μM)でも無毒なプロドラッグであることを示していた。
【００４８】
次に、我々はヒト肝癌HepG2細胞で細胞内β-ガラクトシダーゼによる活性化効率に対するプロドラッグを評価した。大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素の存在および非存在下でプロドラッグ1aを用いたHepG2細胞の細胞数測定評価では親薬剤6aのそれに匹敵するアポトーシス応答を示すことが判明した。大腸菌β-ガラクトシダーゼの存在下でのHepG2細胞株中のプロドラッグ1bは、親薬剤6bと匹敵するプロフィールを示した。酵素を含まないプロドラッグは架橋した薬剤の特性として細胞周期のG2/M期でブロックした。
【００４９】
画像は化合物1a, 6aおよび1a＋大腸菌β-ガラクトシダーゼ酵素で処理したHepG2細胞のヒストグラムの重ね合わせを示している。酵素が加えられなかったプロドラッグの効果は、DC-81のベンジルエーテルである活性分子のそれと同様であることが観察される。大腸菌酵素が加えられたプロドラッグのプロフィールはまたDC-81のそれと類似している。
【００５０】
0005404624.tif 000013
【００５１】
PBDグリコシドプロドラッグ1aおよび1bは正常組織での最少毒性作用で癌、特に固形腫瘍の選択的な治療に有用であることが分かる。