(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬理学上許容可能な担体と抗ＣＤ２００抗体とを含む、癌細胞がＣＤ２００を発現する癌の治療における使用のための医薬品組成物であって、該抗ＣＤ２００抗体は、ＣＤ２００とＣＤ２００Ｒとの間の相互作用を阻害し、該抗ＣＤ２００抗体は、改変Ｆｃ定常領域を含み、該改変Ｆｃ定常領域は、対応する天然Ｆｃ定常領域のエフェクター機能と比較して（ｉ）低減した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を示すか、または（ｉｉ）ＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性を示さない、医薬品組成物。
【請求項２】
前記改変Ｆｃ定常領域が、
（ａ）Ｇ２／Ｇ４定常領域であるか；
（ｂ）２３４Ａ変異および２３５Ａ変異のうちの一方または両方を含むか；
（ｃ）ＣＨ２ドメインにおけるＫ３２２Ａ変異を含むか；あるいは
（ｄ）ヒンジ領域を欠失している；
請求項１に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項３】
前記抗ＣＤ２００抗体が、
（ａ）グリコシル化が欠損した細胞株から調製されるか；
（ｂ）グリコシル化を欠失しているか；または
（ｃ）フコシル化されている；
請求項１に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項４】
前記抗ＣＤ２００抗体が、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、脱免疫変異抗体、またはヒト抗体である、請求項１に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項５】
前記改変Ｆｃ定常領域がＧ２／Ｇ４定常領域である、請求項２に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項６】
前記Ｇ２／Ｇ４定常領域が、配列番号１３のアミノ酸残基１３７〜４６２を含む、請求項５に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の使用のための医薬品組成物であって、前記抗ＣＤ２００抗体は、（ａ）軽鎖および（ｂ）重鎖を含み、
該（ａ）軽鎖は、
（ｉ）配列番号２４の残基４４〜５４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の残基７０〜７６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号２４の残基１０９〜１１７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号２４の残基２１〜１２７を含むアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号２４の残基２１〜２３４を含むアミノ酸配列；
を含み、
該（ｂ）重鎖は、
（ｉ）配列番号１５の残基４６〜５５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の残基７０〜８６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１５の残基１１９〜１２６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号１５の残基２１〜１３７を含むアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号１５の残基２１〜４６３を含むアミノ酸配列；
を含む、医薬品組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の使用のための医薬品組成物であって、前記抗ＣＤ２００抗体は、（ａ）軽鎖および（ｂ）重鎖を含み、
該（ａ）軽鎖は、
（ｉ）配列番号３２の残基４４〜５４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２の残基７０〜７６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号３２の残基１０９〜１１７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（ｉｉ）配列番号３２の残基２１〜１２７を含むアミノ酸配列；または
（ｉｉｉ）配列番号３２の残基２１〜２３４を含むアミノ酸配列；
を含み、
該（ｂ）重鎖は、
（ｉ）配列番号２０の残基４６〜５５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０の残基７０〜８６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号２０の残基１１９〜１３１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；または
（ｉｉ）配列番号２０の残基２１〜１４２を含むアミノ酸配列；
を含む、医薬品組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の使用のための医薬品組成物であって、前記抗ＣＤ２００抗体は、（ａ）軽鎖および（ｂ）重鎖を含み、
該（ａ）軽鎖は、
（ｉ）配列番号２８の残基２３〜１２９を含むアミノ酸配列；または
（ｉｉ）配列番号２８の残基２３〜２３６を含むアミノ酸配列；
を含み、
該（ｂ）重鎖は、
（ｉｉｉ）配列番号１３の残基２０〜１３６を含むアミノ酸配列；または
（ｉｖ）配列番号１３の残基２０〜４６２を含むアミノ酸配列；
を含む、医薬品組成物。
【請求項１０】
前記癌が、形質細胞癌、リンパ腫、または白血病である、請求項１に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項１１】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、神経堤細胞由来の組織または器官の癌、神経芽細胞腫、および骨髄腫からなる群より選択される、請求項１に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項１２】
前記使用が、前記患者に対する第二の薬剤または療法の投与を包含する、請求項１に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項１３】
前記第二の薬剤が化学療法剤である、請求項１２に記載の使用のための医薬品組成物。
【請求項１４】
前記療法が放射線療法である、請求項１２に記載の使用のための医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００６年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／７５８，４２６号、および２００６年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／８０１，９９１号の利益を請求し、これらの出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、ＯＸ−２／ＣＤ２００（本明細書においてＣＤ２００と呼ばれる）アンタゴニスト、および、癌または自己免疫疾患の被験体においてＣＤ２００を過剰発現する細胞を除去または排除する方法に関する。癌治療の療法は、二つの機序の組み合わせを提供する。より具体的には、本開示は、（１）ＣＤ２００とその受容体の間の相互作用を妨げて免疫抑制を阻止することにより、癌細胞の根絶を促進する療法、および／または（２）（ａ）抗体依存性細胞傷害または補体媒介性細胞傷害、または（ｂ）ＣＤ２００を標的とする部分を含む融合分子を用いた細胞標的化のいずれかにより癌細胞を直接破壊する療法を用いた、癌治療に関する。本開示は、ＣＤ２００陽性免疫細胞の抗体依存性細胞傷害および／または補体媒介性細胞傷害を増加させる療法により、自己免疫不全を治療する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
癌をはじめとする疾病状態に対する体の反応においては、様々な機序がその役割を果たす。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、エフェクター細胞に刺激因子を提供することにより、様々な悪性腫瘍に対する有効な免疫反応において重要な役割をする。細胞傷害性Ｔ細胞は、癌細胞を排除する最も有効な細胞であると考えられており、Ｔヘルパー細胞は、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインを分泌することにより、細胞傷害性Ｔ細胞に指令を出す。様々な悪性腫瘍においては、Ｔヘルパー細胞が、健康な個人に見られる細胞と比較して変更された表現型を有することが示されている。変更された特徴の顕著なものの一つは、Ｔｈ１サイトカイン産生の減少と、Ｔｈ２サイトカイン産生へのシフトである。（たとえば、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９を参照。）サイトカインのＴｈ１プロフィルへのこのようなシフトを逆行させることにより、Ｔ細胞の抗癌効果が増大することが示されている。（非特許文献１０；非特許文献１１を参照。）
Ｔヘルパー細胞のサイトカイン発現をＴｈ１からＴｈ２に移行させる腫瘍細胞の能力の根底にある機序には、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−βなどのサイトカインの分泌、ならびに免疫系の細胞と相互作用する表面分子の発現が含まれる。樹状細胞の表面に発現される分子であり、免疫グロブリン遺伝子ファミリーの分子に対する高度な相同性をもつＣＤ２００は、免疫抑制に関係している（非特許文献１２）。例えば、ＣＤ２００発現細胞が、Ｔｈ１サイトカイン産生の刺激を阻害しうることが示されている。
【０００４】
免疫細胞は癌細胞を攻撃および排除するのに役立ちうるが、自己免疫不全、アレルギー、および、組織または臓器移植の拒絶反応など一定の場合には、免疫系が病気の原因となりうる。このような場合には、有害な免疫反応を抑制するために、コルチコステロイドおよびサイトカインアンタゴニストなどの免疫抑制剤が患者に投与されうる。しかし、これらの一般的な免疫抑制薬は、毒性および感染に対する抵抗力の低下を含む、有害な副作用を誘発しうる。したがって、自己免疫を治療する代替的、およびおそらくはより特異的な方法が必要である。
【０００５】
抗体療法を含むいくつかの免疫調節療法は、一定の癌および自己免疫不全の治療における成功が証明されている。しかし、癌および自己免疫不全の両方の治療のための、さらなる抗体療法が臨床的に必要とされている。さらに、ヒト化または他のキメラ型ヒト／マウス単クローン抗体が、関連して必要とされる。よく知られた研究においては、マウス抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）単クローン抗体を投与された患者に、投与された抗体に対する抗マウス抗体反応が認められた。（非特許文献１３）。一般にヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応と呼ばれる、治療計画に対するこの種の免疫反応は（非特許文献１４）、治療の効果を減少させ、治療を全く無効にすることもありうる。ヒト化またはキメラ型のヒト／マウス単クローン抗体は、ＨＡＭＡ反応を大幅に減少させ、抗体治療の治療効果を高めることが示されている。たとえば、非特許文献１５を参照。さらに、特定の機能が増強または低減された抗体が、臨床的に有用でありうる。
【非特許文献１】Ｋｉａｎｉ等，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ８８：７５４−７６１（２００３年）
【非特許文献２】Ｍａｇｇｉｏ等，Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １３  Ｓｕｐｐｌ  １：５２−５６（２００２年）
【非特許文献３】Ｉｔｏ等，Ｃａｎｃｅｒ  ８５：２３５９−２３６７（１９９９年）
【非特許文献４】Ｐｏｄｈｏｒｅｃｋａ等，Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  ２６：６５７−６６０（２００２年）
【非特許文献５】Ｔａｔｓｕｍｉ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ１９６：６１９−６２８（２００２年）
【非特許文献６】Ａｇａｒｗａｌ等，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ  ３２：１７−３０（２００３年）
【非特許文献７】Ｓｍｙｔｈ等，Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １０：４５５−４６２（２００３年）
【非特許文献８】Ｃｏｎｔａｓｔａ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １８：５４９−５５７（２００３年）
【非特許文献９】Ｌａｕｅｒｏｖａ等，Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  ４９：１５９−１６６（２００２年）
【非特許文献１０】Ｗｉｎｔｅｒ等，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０８：４０９−４１９（２００３年）
【非特許文献１１】Ｉｎａｇａｗａ等，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：３９５７−３９６４（１９９８年）
【非特許文献１２】Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ等，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６５：１１０６−１１１４（１９９８年）
【非特許文献１３】Ｅｘｌｅｙ  Ａ．Ｒ．等，Ｌａｎｃｅｔ  ３３５：１２７５−１２７７（１９９０年）
【非特許文献１４】Ｍｉｒｉｃｋ等．Ｑ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ２００４；４８：２５１−７
【非特許文献１５】ＬｏＢｕｇｌｉｏ等，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８６：４２２０−４２２４（１９８９年６月）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本開示は、ＣＤ２００の機能を調節する薬剤および方法に関する。ＣＤ２００の機能を調節する薬剤には、ＣＤ２００および／またはそのレセプター（ＣＤ２００Ｒ）の活性および／または発現を調節する薬剤が含まれる。いくつかの実施形態においては、薬剤が、ＣＤ２００の機能または活性を阻害する。したがって、ある態様では、当該薬剤が、ＣＤ２００に対するアンタゴニストとして作用する。一定のアンタゴニストは、ＣＤ２００に結合し、ＣＤ２００とそのレセプターの相互作用を阻害または妨害しうる。他のアンタゴニストは、ＣＤ２００に結合するが、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用を妨害し得ない。したがって、ＣＤ２００アンタゴニストには、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用のブロックを含むか含まない機序によってＣＤ２００の効果を調節できる任意の薬剤が含まれる。ＣＤ２００アンタゴニストには、ポリペプチド、小分子、有機金属化合物、オリゴヌクレオチドコンストラクト、ＲＮＡｉコンストラクト、アプタマー、スピーゲルマー、アンチセンス核酸、ロックト核酸（ＬＮＡ）阻害剤、ペプチド核酸（ＰＮＡ）阻害剤、免疫調節剤、抗体、抗原結合フラグメント、プロドラッグ、および／または擬似ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）化合物が含まれるがこれに限られない。
【０００７】
ある実施形態では、当該アンタゴニストは、抗ＣＤ２００抗体である。本明細書にいう抗体には、抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、単クローンおよび多クローン抗体、改変抗体（キメラ、一本鎖、ＣＤＲ移植、ヒト化、完全ヒト抗体、および人工的に選択された抗体を含む）、および合成または半合成抗体が含まれる。
【０００８】
ある態様においては、本開示は、キメラ、ヒト化、ヒトおよび脱免疫抗ＣＤ２００抗体およびその抗原結合フラグメントに関する。さらなる実施形態においては、本開示の抗体には、配列番号７、９、１１、および２０、の中から選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖が含まれる。配列番号７、９、１１、および２０に提供されるアミノ酸配列またはそのフラグメント（リーダー配列のない配列に対応するフラグメントを含むがこれに限らない）と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗体が含まれる。当該抗体には、配列番号２４、２６、２８、および３２の中から選択されるアミノ酸配列またはそのフラグメントと少なくとも約９０％同一または類似のアミノ酸配列を含む軽鎖がさらに含まれうる。同様に、前述のアミノ酸配列は、フラグメントを含めた配列番号２４、２６、２８、および３２に提供されるアミノ酸配列（リーダー配列のない配列に対応するフラグメントを含むがこれに限らない）と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一または類似でありうる。
【０００９】
一実施形態においては、本開示は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号２４と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号７および２４に提供される一つ以上のアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列を伴わない配列番号７および２４に記載される配列に対応する配列が含まれるがこれに限られない。したがって、本開示は、配列番号６の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号２３の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号６に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２３に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。本発明は、フラグメントおよび補体を含む配列番号６または２３に提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体にも関する。
【００１０】
別の実施形態においては、本開示は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、配列番号２６と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号９および２６に提供される一つ以上のアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列を伴わない配列番号９および２６に記載される配列に対応する配列が含まれるがこれに限られない。したがって、本開示は、配列番号８の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号２５の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号８に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２５に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。本発明は、フラグメントおよび補体を含む配列番号８または２５に提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体にも関する。
【００１１】
さらなる実施形態においては、本開示は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２６と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号１１および２６に提供される一つ以上のアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列を伴わない配列番号１１および２６に記載される配列に対応する配列が含まれるがこれに限られない。したがって、本開示は、配列番号１０の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号２５の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号１０に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２５に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。本発明は、フラグメントおよび補体を含む配列番号１０または２５に提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体にも関する。
【００１２】
さらなる実施形態においては、本開示は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２８と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号１１および２８に提供される一つ以上のアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列を伴わない配列番号１１および２８に記載される配列に対応する配列が含まれるがこれに限られない。したがって、本開示は、配列番号１０の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号２７の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号１０に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２７に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。本発明は、フラグメントおよび補体を含む配列番号１０または２７に提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体にも関する。
【００１３】
さらに別の実施形態においては、本開示は、配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号３２と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号２０および３２に提供される一つ以上のアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列を伴わない配列番号２０および３２に記載される配列に対応する配列が含まれるがこれに限られない。したがって、本開示は、配列番号１９の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、配列番号３１の核酸配列（そのフラグメントおよび補体を含む）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号１９に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号３１に提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、フラグメントおよび補体を含む配列番号１９または３１に提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同または類似の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体が含まれる。
【００１４】
本開示において提供される抗ＣＤ２００抗体は、エフェクター機能が改変されているかこれをもたない抗体および抗原結合フラグメントを含む。エフェクター機能が増大または低減した、改変された定常またはＦｃ領域を含む抗体が含まれる。本開示は、可変領域の変化から生じうる結合能の増加または低下により、エフェクター機能が改変されているかエフェクター機能をもたない抗体にも関する。エフェクター機能の改変には、たとえば、一つ以上のＦｃレセプター（ＦｃＲ）またはエフェクター細胞と結合する能力の増大または低減、抗原依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）の増大または低減、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の増大または低減が含まれる。変異抗体には、定常領域またはＦｃ領域に一つ以上のアミノ酸の挿入、欠失および／または置換を含む抗体が含まれるが、これに限られない。さらなる実施形態では、これらの変異抗体には、ＣＨ１およびヒンジ領域がヒトＩｇＧ２に由来し、ＣＨ２およびＣＨ３領域がヒトＩｇＧ４に由来する定常領域が含まれる。定常またはＦｃ領域のグリコシル化が改変された抗体も含まれる。前述の抗体および抗原結合フラグメント（一本鎖抗体を含む）は、マウス、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または脱免疫であり得、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥフレームワークを含む抗体が含まれる。さらに、フラグメントおよび変異体を含む当該抗体は、ブロッキング抗体または非ブロッキング（ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ）抗体、またはそのフラグメントでありうる。
【００１５】
ある態様においては、本開示は、エフェクター機能が低減しているかエフェクター機能をもたない抗ＣＤ２００抗体を提供する。エフェクター機能が低減しているかエフェクター機能をもたない抗体には、たとえば一つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を伴う定常領域、またはグリコシル化の一つ以上の変更を伴う定常領域など、変異または改変されたＦｃまたは定常領域が含まれうる。変異した定常領域には、たとえば、本明細書に記載のＡｌａ−Ａｌａ変異のように、一つ以上のアミノ酸がアラニンで置換され、または、一つ以上の炭水化物基が変更、追加、または除去された領域が含まれる。翻訳後修飾が抑制されるか、不在であるか、増大された特定の細胞型において当該抗体を産生することにより、炭水化物基の数および／または位置の変更が達成されうる。一実施形態においては、ＩｇＧ１定常ドメインをＩｇＧ２／４融合ドメインに置き換えることにより、抗ＣＤ２００抗体のエフェクター機能が排除される。例えば、ＦｃＲと相互作用することが知られる部位の変異、またはヒンジ領域へのペプチドの挿入により、ＦｃＲ相互作用に必要な重要部位を排除するなど、エフェクター機能を排除する他の方法も想定できる。
【００１６】
本開示のある態様および方法では、エフェクター機能が改変されているかエフェクター機能がない抗ＣＤ２００抗体には、一つ以上のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を伴う抗ＣＤ２００抗体が含まれる。ある実施形態においては、このような変異抗ＣＤ２００抗体は、エフェクター機能が低減しまたエフェクター機能をもたない。ある実施形態においては、（当該変異抗体の）変異定常領域は、天然配列の定常またはＦｃ領域および／または親抗体またはそのフラグメントの定常またはＦｃ領域と少なくとも約７０％の相同性を有し、他の実施形態においては、変異定常またはＦｃ領域は、これと少なくとも約８０％の相同性または類似性を有し、他の実施形態においては、これと少なくとも約９０％の相同性または類似性を有し、さらなる実施形態においては、これと少なくとも約９５％の相同性または類似性を有する。特定の実施形態においては、変異抗体は、Ｇ２／Ｇ４コンストラクトを含む。したがって、本開示は、エフェクター機能が低減されているかエフェクター機能がない抗ＣＤ２００抗体の定常またはＦｃ領域に関し、当該定常領域には、配列番号１３、１５、１８、２２、およびそのフラグメントからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖が含まれる。本開示は、配列番号１３、１５、１８、２２、およびそのフラグメントの中から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体の、変異定常領域にも関する。配列番号１３、１５、１８、２２、およびそのフラグメントにおいて提供されるアミノ酸配列と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一または類似のアミノ酸配列を含む抗体も、本開示に含まれる。フラグメントには、リーダー配列のない配列が含まれるが、これに限られない。さらに、いくつかの実施形態においては、エフェクター機能が低減されているかエフェクター機能がなく、Ｇ２／Ｇ４コンストラクトを含む抗ＣＤ２００抗体の定常領域は、配列番号１２、１４、１６、１７、および２１からなる群より選択される核酸またはそのフラグメントおよび補体によりコードされる。ある実施形態においては、エフェクター機能が低減されているかエフェクター機能がない抗ＣＤ２００抗体は、フラグメントおよび補体を含む配列番号１２、１４、１６、１７、および２１より選択される配列と少なくとも約８０％相同または類似の核酸配列を含む核酸によりコードされる。他の実施形態においては、変異抗ＣＤ２００抗体は、フラグメントおよび補体を含む配列番号１２、１４、１６、１７、および２１からなる群より選択される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９１％、９８％、９９％、または１００％相同または類似の配列を含む核酸配列によりコードされる。さらに他の実施形態においては、変異抗ＣＤ２００抗体をコードする核酸は、フラグメントおよび補体を含む配列番号１２、１４、１６、１７、および２１からなる群より選択される核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む。抗原結合フラグメントならびにブロッキング抗体および非ブロッキング抗体の両者またはそのフラグメントが含まれる。
【００１７】
一実施形態においては、本開示は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号１３および２８において提供されるアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の一つ以上のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列のない配列番号１３および２８に記載される配列に対応する配列が含まれるが、これに限られない。したがって、本開示は、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号１２の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号２７の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号１２において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２７において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、フラグメントおよび補体を含む配列番号１２または２７において提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体が含まれる。
【００１８】
別の実施形態においては、本開示は、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号１５および２４において提供される一つ以上のアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列のない配列番号１５および２４に記載される配列に対応する配列が含まれるが、これに限られない（たとえば、アミノ酸２０または２１で始まる配列番号１５のフラグメント）。したがって、本開示は、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号１４の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号２３の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号１４において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２３において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、フラグメントおよび補体を含む配列番号１４または２３において提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体が含まれる。
【００１９】
さらなる実施形態においては、本開示は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号１３および２８において提供されるアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の一つ以上のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。フラグメントには、リーダー配列のない配列番号１３および２８に記載される配列に対応する配列が含まれるが、これに限られない。したがって、本開示は、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号１６の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号２７の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号１６において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２７において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、フラグメントおよび補体を含む配列番号１６または２７において提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体が含まれる。
【００２０】
さらに別の実施形態においては、本開示は、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号１８および３０において提供されるアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一の一つ以上のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、本開示は、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号１７の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号２９の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号１７において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号２７において提供される核酸配列と少なくとも８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、フラグメントおよび補体を含む配列番号１７または２９において提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体が含まれる。
【００２１】
別の実施形態においては、本開示は、配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含み、配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。配列番号２２および３４において提供されるアミノ酸配列またはそのフラグメントと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、本開示は、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号２１の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、（フラグメントおよび補体を含む）配列番号３３の核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、変異抗ＣＤ２００抗体に関する。フラグメントおよび補体を含む配列番号２１において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、フラグメントおよび補体を含む配列番号３３において提供される核酸配列と少なくとも約８０％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列も含む、抗ＣＤ２００抗体も含まれる。したがって、フラグメントおよび補体を含む配列番号２１および３３において提供される核酸配列と約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む抗ＣＤ２００抗体が含まれる。
【００２２】
改変されたエフェクター機能を伴う抗ＣＤ２００抗体は、増大されたエフェクター機能も示しうる。エフェクター機能の増大には、一つ以上のＦｃレセプターに対する結合の増大、ＡＤＣＣを誘発する能力の増大、および／またはＣＤＣを誘発する能力の増大が含まれるが、これに限られない。増大したエフェクター機能を伴う抗ＣＤ２００抗体には、本明細書に記載の変異Ｆｃまたは定常領域も含まれうる。前述の改変されたエフェクター機能を示す抗ＣＤ２００抗体は、さらに、ブロッキング抗体または非ブロッキング抗体でありうる。たとえば、増大したエフェクター機能を示す抗ＣＤ２００抗体は、ＣＤ２００と結合しうるが、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用をブロックし得ない。このような抗体は、エフェクター機能（例えばＡＤＣＣまたはＣＤＣ）をＣＤ２００発現細胞に標的化する場合に有用でありうる。既に述べたように、前述の改変されたエフェクター機能を伴う抗ＣＤ２００抗体を含む、本明細書に記載される抗体には、いずれもブロッキングおよび非ブロッキング抗体の形の、マウス、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および脱免疫抗体、およびそのフラグメントが含まれる。
【００２３】
ある態様においては、本開示は、ＣＤ２００陽性細胞を調節または除去する方法および組成物を提供する。ＣＤ２００アンタゴニストを被験体に投与することにより、ＣＤ２００陽性細胞が調節または除去されうる。当該アンタゴニストは、ＣＤ２００陽性細胞をエフェクター機能の標的とし、および／またはＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用を妨害しうる。ある実施形態では、当該アンタゴニストは、抗ＣＤ２００抗体である。当該抗ＣＤ２００抗体は、その任意のフラグメントおよび変異体を含む本明細書に記載の抗体でありうる。エフェクター機能が低減されているかエフェクター機能がない抗ＣＤ２００抗体など、改変されたエフェクター機能（単数まはた複数）を伴う抗体および抗原結合フラグメントが含まれる。一本鎖抗体を含むマウス、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および脱免疫抗体および抗原結合フラグメントも含まれる。前述の抗体は、ブロッキング抗体または非ブロッキング抗体であり得、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥフレームワークを含む抗体を含む。
【００２４】
ＣＤ２００陽性細胞は、一定の種類の癌および一定の自己免疫疾患に関係する。したがって、ＣＤ２００陽性細胞には免疫細胞（例えばＢ細胞およびＴ細胞など）および癌細胞（例えば卵巣、皮膚、肺、腎臓、乳腺、前立腺、神経芽細胞腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、甲状腺、および形質細胞癌の癌細胞など）が含まれるが、これに限られない。神経堤細胞に由来する任意の組織または臓器の癌細胞も含まれる。したがって、ＣＤ２００陽性細胞を調節または除去する方法を必要とする被験体は、癌または自己免疫疾患の患者、または、臓器移植を受けているか受ける予定の患者でありうる。
【００２５】
一態様では、本開示は、自己免疫疾患を治療する方法および組成物を提供する。本明細書に提供される方法および組成物により治療できる自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、悪性貧血、アジソン病、I型糖尿病、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、紅班性狼瘡、重症筋無力症、ライター症候群、グレーブス病、乾癬、および自己免疫性溶血性疾患が含まれるがこれに限られない。いくつかの実施形態においては、自己免疫疾患の患者は、ＣＤ２００のアンタゴニストを与えられ、ある実施形態では、アンタゴニストは抗ＣＤ２００抗体である。抗ＣＤ２００抗体は、本明細書に記載されるように変異定常領域を含みうる。したがって、抗ＣＤ２００抗体は、たとえば増大されたエフェクター機能など、改変されたエフェクター機能を示しうる。当該抗体は、例えば、一つ以上のＦｃレセプターに対する結合の増大を示しうる。さらに、当該抗体は、増大したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発しうる。当該抗体は、さらに、ブロッキングまたは非ブロッキング抗体、またはそのフラグメントであり得、マウス、キメラ、ヒト化、完全ヒト、または脱免疫抗体のいずれか、またはそのフラグメントでありうる。
【００２６】
本開示の方法を使用できる癌には、黒色腫、卵嚢癌、腎癌、神経芽細胞腫、肺癌、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、骨髄腫、白血病、および形質細胞癌が含まれるが、これに限られない。神経堤細胞に由来する癌、およびＣＤ２００を発現する任意の癌も含まれる。ある実施形態では、本開示は、例えば慢性リンパ球性白血病を含む白血病などの、血液癌を治療する方法を提供する。
【００２７】
特に有用な実施形態においては、本開示による癌療法には、（１）ＣＤ２００とそのレセプターとの間の相互作用を妨げて免疫抑制をブロックする抗ＣＤ２００抗体またはアンタゴニストを投与し、これにより癌細胞の根絶を促進するステップ、および／または（２）癌細胞を直接破壊するために、ＣＤ２００標的化部分を含む融合分子を投与するステップが含まれる。あるいは抗体が、補体媒介性および／または抗体依存性細胞傷害により、癌細胞を直接破壊する。様々な実施形態において、抗ＣＤ２００抗体のエフェクター機能が改変される。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ２００抗体は、エフェクター機能が低減または排除された、変異または改変された定常領域を含む。このような抗体は、たとえば上の（１）および（２）に記載の方法において有用でありうる。
【００２８】
ある実施形態では、本開示は、抗ＣＤ２００抗体または抗原結合フラグメントが第二分子に結合される融合分子に関する。当該融合分子には、たとえば、小分子、ポリペプチド、擬似ペプチド、ヘテロクリティックペプチド、化学療法剤、免疫調節剤、標的化部分、または核酸コンストラクト（たとえばアンチセンス、ＲＮＡｉ、または遺伝子標的コンストラクト）が含まれる。本開示には、フラグメントがポリペプチド、タンパク質ドメイン、血清タンパク質、アルブミン、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、または生体内で当該フラグメントの半減期を増大させる他の任意の分子に結合された、ＣＤ２００の抗原結合フラグメントも含まれる。当該抗原結合フラグメントには、たとえば、Ｆａｂ、Ｆｖ、一本鎖フラグメントまたはｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２が含まれる。
【００２９】
本開示は、抗ＣＤ２００抗体を用いて、患者から得られた細胞または組織試料のＣＤ２００発現状態を測定する方法にも関する。このような方法には、組織試料の免疫組織化学的染色、およびＣＤ２００を染色した患者の細胞のフローサイトメトリ分析が含まれるがこれに限られない。患者は、例えば癌患者でありうる。
【００３０】
本明細書に記載の方法および組成物によれば、本開示は、移植または同種移植の患者を治療する方法にも関する。移植臓器または組織に対する患者の寛容を低下させるＣＤ２００陽性免疫細胞を減少させまたは排除するために、本開示の抗ＣＤ２００抗体または他のＣＤ２００アンタゴニストを、移植または同種移植の処置前または処置後に患者に投与しうる。特定の実施形態では、エフェクター機能が増強された抗ＣＤ２００抗体が、移植患者に与えられる。
【００３１】
さらなる実施形態においては、抗ＣＤ２００療法を含む併用療法の方法が提供される。例えば、ＣＤ２００アンタゴニスト（例えば本明細書に記載の抗ＣＤ２００抗体）を含む第一療法を受ける患者が、第二療法も受けうる。ＣＤ２００アンタゴニストは、第二療法と同時に与えられうる。あるいは、ＣＤ２００アンタゴニストは、第二療法の前または後に与えられうる。第二療法には、化学療法剤、放射線療法、ワクチン、抗生物質および抗ウイルス剤、および免疫調節療法が含まれるがこれに限られない。
【００３２】
本開示の別の実施形態においては、治療の進行をモニタリングするための方法が提供される。方法には、療法（例えば免疫調節療法、化学療法など）を行うステップと、療法の有効性を測定するために、被験体におけるＣＤ２００レベルを少なくとも二度測定するステップを伴う。療法の有効性を測定する他の方法には、癌細胞、全リンパ球数、脾臓、肝臓、および／またはリンパ節の大きさ、制御性Ｔ細胞の数、細胞内サイトカインまたは血清サイトカインプロフィル、または、サイトカインまたは他の分泌された分子を細胞あたりで検出できるアッセイシステムであるＥＬＩＳＰＯＴで測定される、ＴまたはＢ細胞によるサイトカインの分泌の検出が含まれるがこれに限られない。
【００３３】
本実施形態に記載される組成物および方法によれば、本開示は、抗ＣＤ２００抗体を含む任意の医薬品組成物にも関する。一本鎖抗体を含む、キメラ、ヒト化、ヒトおよび脱免疫抗ＣＤ２００抗体および抗原結合フラグメントが含まれる。本明細書に記載される、エフェクター機能が改変されたマウス、キメラ、ヒト化、ヒトおよび脱免疫変異抗ＣＤ２００抗体および抗原結合フラグメントも含まれる。前述の抗体および変異抗体は、ブロッキングまたは非ブロッキング抗体、または抗原結合フラグメントのいずれかでありうる。
【００３４】
ある実施形態では、抗ＣＤ２００療法が有用な患者、またはＣＤ２００アンタゴニストを含む療法（例えば、抗ＣＤ２００抗体を含む）を受ける予定の患者は、一定の事前治療および処置または現在の医学的状態により、スクリーニングされうる。一実施形態においては、例えば女性患者が、妊娠および避妊への同意により事前にスクリーニングされうる。ＣＤ２００が、流産を防ぐ上で重要な役割をするためである。したがって、当該療法を受ける患者は、一つ以上の避妊方法に同意すればよい。当該患者は、当該療法を始める前および／または当該療法の間に、指定の期間一つ以上の避妊方法を用いることに同意すればよい。ある実施形態では、女性患者が、このような抗ＣＤ２００療法に胎児をさらすことに関するリスクについて、カウンセリングを受ける。さらなる実施形態においては、このような患者が、このような治療の前にインフォームドコンセント・フォームに署名することが求められうる。他の態様では、患者に抗ＣＤ２００療法に関するカウンセリングをする健康診断が、このような患者に、抗ＣＤ２００療法を行う前に、避妊デバイスまたは製剤を使用することを求めうる（例えば、参照により内容が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９０８，４３２号および関連特許を参照）。同様に、他の実施形態では、患者をスクリーニングして、脳手術および／または脳への放射線療法を以前に受けている患者を特定しうる。そのような患者には、抗ＣＤ２００療法は処方されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（好適な実施形態の詳細な説明）
Ｉ．ＣＤ２００アンタゴニスト
ＣＤ２００は、免疫系の細胞（例えばＴ細胞、Ｂ細胞および樹状細胞（Ｂａｒｃｌａｙ等，ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年：２３））ならびに本明細書に示される一定の癌細胞を含む様々な細胞型に発現する、高度に保存されたＩ型膜貫通糖タンパク質である。このタンパク質は、骨髄細胞およびＴ細胞の亜集団のレセプターＣＤ２００Ｒと相互作用する（Ｗｒｉｇｈｔ等．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３年（１７１）：３０３４−３０４６およびＷｒｉｇｈｔ等，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０００年（１３）：２３３−２４２）。ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用は、免疫調節シグナルを細胞に送達し、アポトーシスに関連する免疫寛容を含む免疫抑制を誘起する（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ等．２００４年Ｂｌｏｏｄ（１０３）：２６９１−２６９８）。したがって、ＣＤ２００および／またはそのレセプターの機能または活性を妨げる薬剤により、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用の免疫抑制効果を阻害または抑制しうる。さらに、ＣＤ２００に特異的に結合する薬剤（しかし、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用を阻害するとは限らない）により、ＣＤ２００の効果を抑制または除去する下流の事象を誘発しうる。
【００３６】
一定の態様においては、本開示は、ＣＤ２００アンタゴニストに関する。本明細書で用いられるところのアンタゴニストという用語には、ＣＤ２００またはそのレセプターの活性、機能および／または発現を阻害できる任意の薬剤が含まれる。例としてはポリペプチド、抗体、小分子、アプタマー、スピーゲルマー、ロックト核酸（ＬＮＡ）阻害剤、ペプチド核酸（ＰＮＡ）阻害剤、核酸コンストラクト（たとえば、遺伝子標的コンストラクト、アンチセンスコンストラクト、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）コンストラクト等）およびペプチドミメティクスが含まれるがこれに限られない。ある実施形態では、アンタゴニストは、ＣＤ２００とＣＤ２００Ｒの相互作用を妨害する。他の実施態様においては、ＣＤ２００アンタゴニストは、ＣＤ２００の免疫抑制効果を低減させうるか、ＣＤ２００発現細胞を標的として除去または排除しうる。
【００３７】
ある態様においては、ＣＤ２００アンタゴニストは、ポリペプチドである。本開示において利用されるポリペプチドは、当業者に公知の様々な技術を用いて作製されうる。一実施形態においては、化学合成によりポリペプチドが得られる。他の実施態様においては、ポリペプチドは、一つ以上の抗体のフラグメントまたはいくつかのフラグメントから作製される抗体である。さらなる実施形態においては、ポリペプチドは、本明細書に記載される抗ＣＤ２００抗体である。
【００３８】
したがってある実施形態では、ＣＤ２００アンタゴニストは、抗ＣＤ２００抗体である。本明細書において使用されるところの「抗体」という用語は、ＣＤ２００またはＣＤ２００Ｒに結合できる完全抗体または抗体フラグメントを指す。Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、単クローンおよび多クローン抗体、改変抗体（キメラ、一本鎖、ＣＤＲ移植、ヒト化、完全ヒト抗体、および人工的に選択された抗体を含む）、およびファージディスプレイおよび代替技術を用いて作製される合成または半合成抗体が含まれる。一つ以上のエフェクター細胞に結合する能力が増大または低減された変異または改変された定常またはＦｃ領域を含む方法により改変または生産された抗体も含まれ、このような変異抗体には、定常またはＦｃ領域が改変されたグリコシル化パターンを含む抗体が含まれるがこれに限られない。ＦｖおよびｓｃＦｖなどの小さなフラグメントは、小さなサイズとそれに伴う優れた組織分布のため、診断および治療的応用に有利な性質を持つ。改変または変異定常またはＦｃ領域をもつ抗体は、例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣなど、エフェクター機能を調節する上で有用でありうる。改変または変異定常またはＦｃ領域をもつこのような抗体は、例えば、ＣＤ２００が正常組織に発現される場合に有用でありうる。これらの場合には、エフェクター機能を伴わない変異体抗ＣＤ２００抗体が、正常組織を損傷せずに所望の治療反応を導きうる。さらに、抗体、変異抗体、およびそのフラグメントは、ブロッキング（すなわち、当該抗体またはフラグメントがＣＤ２００およびＣＤ２００Ｒの相互作用を阻害する）または非ブロッキング（すなわち、当該抗体またはフラグメントがＣＤ２００に結合するが、ＣＤ２００Ｒとの相互作用をブロックしない）でありうる。
【００３９】
本開示は、本明細書に提供される重鎖および軽鎖を含む抗ＣＤ２００抗体にも関し、これには、本明細書に提供される重および／または軽鎖と相同または類似の重および軽鎖が含まれる。「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、二つのペプチド間、または二つの核酸分子間の、配列類似性をさす。相同性および同一性は、比較のためにアライニングされうる各配列における位置を比較することにより、それぞれ測定されうる。比較される配列の同じ位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められている場合には、分子はその位置で同一であり、同じ部位が同じまたは類似のアミノ酸残基により占められている場合には（例えば、立体化学的および／または電子的性質において類似）、分子はその位置で相同（類似）であるといえる。相同性／類似性または同一性の割合としての表現は、比較される配列により共有される位置における、多数の同一または類似のアミノ酸の機能を意味する。「相同性」という用語は、類似の機能またはモティーフをもつ遺伝子またはタンパク質を同定するために用いられる、配列類似性の数学にもとづく比較を示す。本明細書で使用されるところの「同一性」は、配列マッチングを最大化するために配列がアライニングされる場合、すなわちギャップおよび挿入が考慮された場合の、二つ以上の配列の対応する位置における、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味する。したがって、同一性を測定する方法は、テストされる配列間に最大のマッチを与えるように設計される（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８年；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３年；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４年；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７年；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１年；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３  １９８８年，Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４年），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．等，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ等．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７年）)およびＢＬＡＳＴ  Ｘ（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．等，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）を参照。「関連がない」または「非相同」の配列は、本開示の配列と４０％未満の同一性を共有するが、２５％未満の同一性を共有するのが好ましい。二つの配列の比較においては、残基（アミノ酸または核酸）の非存在または余分な残基の存在によっても、同一性および相同性／類似性が減少する。
【００４０】
したがって、本開示は、本明細書に記載されるリーダー配列を伴わない抗体に関する。したがって、本開示の抗体は、リーダー配列が存在しないか異なるリーダー配列で置き換えられた、（本明細書に記載の）重鎖および軽鎖を含みうる。したがって、宿主細胞を用いて本開示の抗体が産出される場合には、使用される特定の宿主細胞によって適切なリーダー配列が選択されうる。
【００４１】
公知技術の方法により、抗体を産出できる。例えば、ＣＤ２００陽性細胞、ＣＤ２００ポリペプチド、またはＣＤ２００ポリペプチドのフラグメントを免疫原として用いて、これにより動物の免疫反応を高め、抗体産生細胞、次に単クローン抗体を単離することにより、単クローン抗ＣＤ２００抗体を生成しうる。このような抗体の配列が決定され、抗体またはその変異体が、組換え技術により生産されうる。組換え技術を用いて、ＣＤ２００に結合できる単クローン抗体ならびにポリペプチドの配列に基づいて、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化および完全ヒト抗体を産出できる。
【００４２】
さらに、ＣＤ２００陽性細胞またはこれに由来するポリペプチドを、抗体またはポリペプチドを標的特異性に基づいて単離するためのベイトとして用いて、組み換えライブラリに由来する抗体（「ファージ抗体」）が選択されうる。非ヒトおよびキメラ抗ＣＤ２００抗体の産出および単離は、熟練者の技術の範囲内である。
【００４３】
組換えＤＮＡ技術を用いて、非ヒト細胞において産生される抗体が改善される。したがって、診断または治療用途において免疫原性を低減させるために、キメラ抗体が作製されうる。さらに、ＣＤＲ移植、および、選択的にフレームワーク改変により抗体をヒト化することにより、免疫原性が最小化されうる。参照により内容が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２５，５３９号を参照。
【００４４】
抗体は、動物血清から得られ、または、単クローン抗体またはそのフラグメントの場合には、細胞培養において産出されうる。組換えＤＮＡ技術を用いて、細菌または好ましくは哺乳類細胞の培養の手順を含む確立された手順に従って、抗体を産出しうる。選択された細胞培養系が、抗体産物を分泌するのが好ましい。
【００４５】
他の実施形態においては、本明細書に開示される抗体の産出プロセスには、ハイブリッドベクターにより形質転換された宿主、たとえば大腸菌または哺乳類細胞を培養するステップが含まれる。ベクターには、抗体タンパク質をコードする第二ＤＮＡ配列に適当な読み枠で結合された、シグナルペプチドをコードする第一ＤＮＡ配列に操作可能に結合されたプロモータを含む、一つ以上の発現カセットが含まれる。その後、抗体タンパク質が集められ、単離される。選択的に、発現カセットには、各々が適当な読み枠でシグナルペプチドに操作可能に結合された抗体タンパク質をコードする多シストロン性、例えばバイシストロン性のＤＮＡ配列に操作可能に結合されたプロモータが含まれうる。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるハイブリドーマ細胞または哺乳動物宿主細胞の増殖は、適切な培地で行われ、これには、哺乳類血清（例えばウシ胎仔血清）、または微量元素および増殖を維持する補助剤（たとえば正常マウスの腹腔浸出細胞、脾臓細胞などのフィーダー細胞、骨髄マクロファージ、２−アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、オレイン酸等）を選択的に補充した、慣例の標準的な培地（たとえば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＲＰＭＩ１６４０培地など）が含まれる。細菌細胞またはイースト細胞である宿主細胞の増殖も同様に、従来技術において知られている適切な培地で行われる。例えば、細菌の適切な培地には、ＬＥ、ＮＺＣＹＭ、ＮＺＹＭ、ＮＺＭ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ、ＳＯＢ、ＳＯＣ、２ｘＹＴ、またはＭ９、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍの培地が含まれる。イーストの場合は、適切な培地には、ＹＰＤ、ＹＥＰＤ、Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、またはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｄｒｏｐｏｕｔ  Ｍｅｄｉｕｍの培地が含まれる。
【００４７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産出により、比較的純粋な抗体調製が提供され、スケールアップ産出により所望の抗体を大量に得ることが可能になる。細菌細胞、イースト、植物、または哺乳類細胞培養の技術は周知であり、（例えばエアーリフトリアクターまたは連続撹拌リアクターにおける）均一懸濁培養、（たとえば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースミクロビーズ、またはセラミックカートリッジにおける）固定化または封入細胞培養が含まれる。
【００４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳類細胞を増殖させることによっても、大量の所望の抗体が得られる。この目的で、抗体を産生する腫瘍を増殖させるために、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が組織適合の哺乳類に注射される。注射の前に、動物に炭化水素、特にプリスタン（テトラメチル−ペンタデカン）等の鉱油を選択的に与える。一から三週後に、それらの哺乳類の体液から抗体が単離される。例えば、適切な骨髄腫細胞とＢａｌｂ／ｃマウスからの抗体産生脾臓細胞との融合により得られたハイブリドーマ細胞、または、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクション細胞が、選択的にプリスタンで前処置されたＢａｌｂ／ｃマウスの腹膜内に注射される。一から二週後に、動物から腹水がとられる。
【００４９】
前述またはその他の技術は、たとえばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６:４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒに述べられており、その開示は全て参照により本明細書に組み込まれる。組換え抗体分子の調製のための技術は、上記の参考文献のほか、たとえば国際公開第９７／０８３２０号；米国特許第５，４２７，９０８号；米国特許第５，５０８，７１７号；Ｓｍｉｔｈ，１９８５年，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２５，ｐｐ１３１５−１３１７；ＰａｒｍｌｅｙおよびＳｍｉｔｈ，１９８８年，Ｇｅｎｅ  ７３，ｐｐ３０５−３１８；Ｄｅ  Ｌａ  Ｃｒｕｚ等，１９８８年，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３  ｐｐ４３１８−４３２２；米国特許第５，４０３，４８４号；米国特許第５２２３４０９号；国際公開第８８／０６６３０号；国際公開第９２／１５６７９号；米国特許第５７８０２７９号；米国特許第５５７１６９８号；米国特許第６０４０１３６号；Ｄａｖｉｓ等，１９９９，Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．，１８（４）：４２１−５；Ｔａｙｌｏｒ，等，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０（１９９２年）：６２８７−６２９５；Ｔｏｍｉｚｕｋａ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ９７（２）（２０００年）：７２２−７２７にも記載されている。これら全ての参照文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
細胞培養上清が、好ましくはＣＤ２００陽性細胞の免疫蛍光染色により、免疫ブロットにより、エンザイムイムノアッセイ、たとえば、サンドイッチアッセイまたはドットアッセイ、またはラジオイムノアッセイにより、所望の抗体につきスクリーニングされる。
【００５１】
抗体を単離するために、例えば硫酸アンモニウムによる沈殿、ポリエチレングリコールなどの吸湿性物質による透析、選択膜による濾過などにより、培養上清または腹水中の免疫グロブリンが濃縮されうる。必要および／または所望の場合には、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ＤＥＡＥ−セルロースによるクロマトグラフィ、および／または（免疫）アフィニティークロマトグラフィ、たとえばＣＤ２００陽性細胞株に由来する一つ以上の表面ポリペプチド、またはプロテインＡまたはＧによるアフィニティークロマトグラフィなど、慣例のクロマトグラフィ法により、抗体が精製される。
【００５２】
別の実施形態は、適切な哺乳類における、ＣＤ２００に対する抗体を分泌する細菌細胞株を調製するプロセスを提供する。例えば、ＣＤ２００陽性組織または細胞、またはＣＤ２００ポリペプチドまたはそのフラグメントからプールされた試料により、ウサギが免疫される。従来技術で周知の方法（例えば参照により本明細書に組み込まれる様々な参考文献において開示される方法）により、免疫されたウサギから作られたファージディスプレイライブラリが構築され、所望の抗体がパニングされる。
【００５３】
単クローン抗体を分泌するハイブリドーマ細胞も、開示される。好ましいハイブリドーマ細胞は遺伝的に安定し、本明細書に記載の所望の特異性の単クローン抗体を分泌し、解凍および再クローニングによって急速冷凍培養から活性化されうる。
【００５４】
別の実施形態においては、ＣＤ２００に対する単クローン抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を調製するプロセスが提供される。そのプロセスおいては、例えばＢａｌｂ／ｃマウスなどの適切な哺乳類が、ＣＤ２００の一つ以上のポリペプチドまたは抗原フラグメントにより、または、ＣＤ２００陽性細胞に由来する一つ以上のポリペプチドまたは抗原フラグメント、ＣＤ２００陽性細胞自体、または記載のように精製されたポリペプチドを含む抗原担体により、免疫される。免疫された哺乳類の抗体産生細胞は、培養において短時間増殖させられ、または適切な骨髄腫細胞株の細胞と融合される。融合において得られたハイブリッド細胞がクローニングされ、所望の抗体を分泌する細胞クローンが選択される。例えば、ＣＤ２００陽性慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞株により免疫されたＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞が、骨髄腫細胞株ＰＡＩまたは骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４の細胞と融合される。その後、得られたハイブリッド細胞が、所望の抗体の分泌につきスクリーニングされ、陽性のハイブリドーマ細胞がクローニングされる。
【００５５】
１０６〜１０７のＣＤ２００陽性細胞株の細胞を皮下および／または腹膜内に数回、たとえば四回〜六回、数ヶ月にわたり、たとえば二〜四ヶ月の間にわたり注射することによりＢａｌｂ／ｃマウスが免疫されることを特徴とする、ハイブリドーマ細胞株を調製するためのプロセスが好ましい。最後の注射から二〜四日後に、免疫マウスからの脾臓細胞がとられ、融合プロモータ、好ましくはポリエチレングリコールの存在下で、骨髄腫細胞株ＰＡＩの細胞と融合される。好ましくは、骨髄腫細胞が、三〜二十倍多い免疫マウスの脾臓細胞と、４０００前後の分子量の約３０％〜約５０％のポリエチレングリコールを含む溶液中で融合される。融合の後、普通の骨髄腫細胞が所望のハイブリドーマ細胞より増殖することを防ぐために一定の間隔で選択培地、例えばＨＡＴ培地を添加した、本明細書に前述した適切な培地で細胞を増殖させる。
【００５６】
抗体およびそのフラグメントは、「キメラ」でありうる。キメラ抗体およびその抗原結合フラグメントは、二つ以上の異なる種（例えばマウスおよびヒト）からの部分を含む。キメラ抗体は、所望の特異性のマウス可変領域が、ヒト定常領域の遺伝子セグメントに挿入されることにより産出されうる（例えば米国特許第４，８１６，５６７号）。このようにして、非ヒト抗体を修飾して、ヒトの臨床用途により適するようにすることができる。
【００５７】
本開示の単クローン抗体には、非ヒト（すなわち、マウス）抗体の「ヒト化」形態が含まれる。ヒト化またはＣＤＲ移植ｍＡｂｓは、マウス抗体ほど速やかに循環から除去されず、有害な免疫反応を通常は引き起こさないため、ヒト用の治療薬として特に有用である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外のソースから導入された一つ以上のアミノ酸残基を有する。これらのヒト以外のアミノ酸残基は、しばしば「移入」残基と呼ばれ、通常は「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化抗体を調製する方法は、一般に公知の技術である。例えば、ヒト化は、基本的に、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８年）；Ｖｅｒｈｅｏｅｙｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８年））にしたがって、齧歯目のＣＤＲｓまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより行われうる。Ｓｔａｅｌｅｎｓ等．２００６年  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４３：１２４３−１２５７も参照。特定の実施形態においては、非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、レシピエント抗体の超可変（ＣＤＲ）領域残基が、所望の特異性、親和性、および結合能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または人間以外の霊長類など、ヒト以外の種（ドナー抗体）の超可変領域残基により置換されるヒト抗体（レシピエント抗体）である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域残基も、対応する非ヒト残基により置換される（いわゆる「復帰変異」）。さらに、ファージディスプレイライブラリを用いて、抗体配列の選択された位置のアミノ酸を変更しうる。ヒト化抗体の性質は、ヒトフレームワークの選択にも影響される。さらに、たとえば親和性またはエフェクター機能など、抗体の性質をさらに改善するために、ヒト化およびキメラ化された抗体を、レシピエント抗体またはドナー抗体にはない残基を含むように修飾しうる。
【００５８】
本開示においては、完全ヒト抗体も提供される。「ヒト抗体」という用語には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（あれば）を有する抗体が含まれる。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含みうる（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのランダムまたは部位特異的変異、またはｉｎ  ｖｉｖｏの体細胞変異により導入された変異）。しかし、「ヒト抗体」という用語は、  マウスなど、別の哺乳類の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体（すなわちヒト化抗体）を含まない。完全ヒトまたはヒト抗体は、ヒト抗体遺伝子をもつ遺伝子導入マウス（可変（Ｖ）、多様（Ｄ）、結合（Ｊ）、および定常（Ｃ）エクソンをもつ）から、またはヒト細胞から得られる。例えば、現在では、免疫されると体内の免疫グロブリン産出の非存在下でヒト抗体の全てのレパートリを生産できる遺伝子導入動物（例えばマウス）を作製することが可能である（たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等，ＰＮＡＳ，９０：２５５１（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３年）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ等Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２年）を参照。遺伝子導入マウス系統を、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子配列を含むように改変しうる。ヒト配列は、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードし、ヒトにおけるのと同様の広い抗体のレパートリを提供するように再配列を経て、マウスにおいて正しく機能する。標的タンパク質（例えばＣＤ２００、そのフラグメント、またはＣＤ２００を発現する細胞）で遺伝子導入マウスが免疫され、多様な特異抗体およびそれをコードするＲＮＡが作られうる。そして、そのような抗体の抗体鎖の成分をコードする核酸が、動物からディスプレイベクターにクローニングされうる。通常は、重鎖および軽鎖の配列をコードする別々の核酸集団がクローニングされた後、ベクターの任意のコピーが重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせを受け取るように、別々の集団が再結合されてベクターに挿入される。ベクターを含むディスプレイパッケージの外表面に集められてディスプレイされるように抗体鎖が発現されるように、ベクターが設計される。例えば、抗体鎖が、ファージの外表面のファージコートタンパク質との融合タンパク質として発現されうる。その後、標的に結合する抗体のディスプレイにつき、ディスプレイパッケージがスクリーニングされうる。
【００５９】
さらに、ファージディスプレイライブラリからヒト抗体が得られる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１年）；Ｍａｒｋｓ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１年）；Ｖａｕｇｈａｎ等Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６年））。人工ヒト抗体Ｖ−領域のランダムな組み合わせを使用する、人工ファージライブラリが作製されうる。抗原の選択により、可変領域が事実上極めてヒトに類似した完全ヒト抗体が作られうる。参照により内容が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，７９４，１３２号、６，６８０，２０９号、４，６３４，６６６号、およびＯｓｔｂｅｒｇ等（１９８３年），Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：３６１−３６７を参照。
【００６０】
ヒト抗体の生成については、参照により開示内容が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚ等Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７年），ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８年）も参照。ヒト抗体は、米国特許第５，９３９，５９８号および第６，６７３，９８６号においてさらに論じられ、概説されている。いずれも１９９５年６月５日に出願の、米国特許第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号および第６，１６２，９６３号も参照。１９９６年１０月２日に出願の米国特許第６，１５０，５８４号、および米国特許第６，７１３，６１０号および第６，６５７，１０３号、ならびに、米国特許出願第１０／４２１，０１１号（米国特許出願公開第２００３−０２２９９０５（Ａ１）号）、第１０／４５５，０１３号（米国特許出願公開第２００４−００１０８１０（Ａ１）号）、第１０／６２７，２５０号（米国特許出願公開第２００４−００９３６２２（Ａ１）号）、第１０／６５６，６２３号（米国特許出願公開第２００６−００４０３６３（Ａ１）号）、第１０／６５８，５２１号（米国特許出願公開第２００５−００５４０５５（Ａ１）号）、第１０／９１７，７０３号（米国特許出願公開第２００５−００７６３９５（Ａ１）号）、および第１０／９７８，２９７号（米国特許出願公開第２００５−０２８７６３０（Ａ１）号）も参照。１９９３年７月２３日に出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６号、１９９６年６月１２日公開の欧州特許第０４６３１５１（Ｂ１）号、１９９４年２月３日に公開の国際特許出願第９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開の国際特許出願第９６／３４０９６号、および１９９８年６月１１日に公開の国際特許出願第９８／２４８９３号も参照。以上に引用された特許、出願および参考文献の各々の開示は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００６１】
代替的なアプローチにおいては、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ.を含めた他者は、「ミニ遺伝子座」アプローチを利用している。ミニ遺伝子座アプローチでは、Ｉｇ遺伝子座からの小片（個々の遺伝子）を含むことにより、外来性Ｉｇ遺伝子座が模倣される。したがって、一つ以上のＶＨ遺伝子、一つ以上のＤＨ遺伝子、一つ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域、および第二の定常領域（好ましくはγ定常領域）が、動物に挿入するためのコンストラクトに形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉ等に対する米国特許第５，５４５，８０７号、およびＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙに対する米国特許第５，５４５，８０６号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号および第５，８１４，３１８号、ＫｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔおよびＢｅｍｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号、Ｂｅｒｎｓ等に対する米国特許第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、第５，７８９，２１５号、およびＣｈｏｉおよびＤｕｎｎならびにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌに対する米国特許第５，６４３，７６３号に記載されている。また、参照により開示内容が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６９，８２５号、第５，８７７，３９７号、第６，３００，１２９号、第５，８７４，２９９号、第６，２５５，４５８号および第７，０４１，８７１号も参照。参照により開示内容の全体が本明細書に組み込まれる、欧州特許第０５４６０７３（Ｂ１）号、国際特許出願第９２／０３９１８号、第９２／２２６４５号、第９２／２２６４７号、第９２／２２６７０号、第９３／１２２２７号、第９４／００５６９号、第９４／２５５８５号、第９６／１４４３６号、第９７／１３８５２号、および第９８／２４８８４号も参照。参照により開内容の全体が本明細書に組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ等（１９９２年  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０：６２８７）、Ｃｈｅｎ等（１９９３年  Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６４７）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ等（１９９３  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．９０：３７２０−４）、Ｃｈｏｉ等，（１９９３年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７）、Ｌｏｎｂｅｒｇ等（１９９４年  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）、Ｔａｙｌｏｒ等（１９９４年  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ等（１９９５年  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６４５３−６５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等（１９９６年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ等（２０００年  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２９９８−３００５）をさらに参照。
【００６２】
ある実施形態では、脱免疫抗ＣＤ２００抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。脱免疫抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗体またはその抗原結合フラグメントの特定の種に対する免疫原性をなくしまたは低減させるために、修飾されうる。脱免疫は、当業者に公知の様々な技術の任意のものを利用して、抗体またはその抗原結合フラグメントを修飾することにより達成されうる（たとえば、国際公開第０４／１０８１５８号および第００／３４３１７号を参照）。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントのアミノ酸配列における潜在的Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを同定し、たとえば組換え技術を用いて、抗体またはその抗原結合フラグメントから潜在的Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープの一つ以上を除去することにより、抗体またはその抗原結合フラグメントを脱免疫しうる。そして、修飾された抗体またはその抗原結合フラグメントが選択的に産出およびテストされて、例えば結合能などの一つ以上の所望の生物活性を維持するが、免疫原性が低減した抗体またはその抗原結合フラグメントが同定されうる。潜在的Ｔ細胞エピトープおよび／またはＢ細胞エピトープを同定する方法は、たとえば、コンピュータ使用の方法（たとえば国際公開第０２／０６９２３２号を参照）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ技術、およびバイオアッセイまたは物理的方法（たとえば、ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合の測定、抗体またはその抗原結合フラグメントを受ける種のＴ細胞レセプターに対する、ペプチド：ＭＨＣ複合体の結合の測定、抗体またはその抗原結合フラグメントを受ける種のＭＨＣ分子をもつ遺伝子導入動物を用いた、タンパク質またはそのペプチド部分のテスト、または、抗体またはその抗原結合フラグメントを受ける種の免疫系細胞により再構築された遺伝子導入動物によるテストなど）など、周知の技術を用いて実施されうる。様々な実施形態においては、本明細書に記載の脱免疫抗ＣＤ２００抗体には、脱免疫された抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、単クローン抗体、マウス抗体、改変抗体（たとえばキメラ、一本鎖、ＣＤＲ移植、ヒト化、完全ヒト抗体、および人工的に選択された抗体）、合成抗体および半合成抗体が含まれる。
【００６３】
さらなる実施形態においては、ＣＤ２００またはＣＤ２００陽性細胞株に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡが産出される。ＤＮＡという用語には、コーディング一本鎖ＤＮＡｓ、該コーディングＤＮＡｓとその相補ＤＮＡｓとからなる二本鎖ＤＮＡｓ、またはこれらの相補（一本鎖）ＤＮＡｓ自体が含まれる。
【００６４】
さらに、ＣＤ２００またはＣＤ２００陽性細胞株に対する抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡは、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする真正のＤＮＡ配列、またはその変異体を有する酵素的または化学的に合成されたＤＮＡでありうる。真正のＤＮＡの変異体は、一つ以上のアミノ酸が欠失、挿入、または一つ以上の他のアミノ酸と交換された、上述の抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡである。当該修飾が、ヒト化および発現最適化の用途においては、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインのＣＤＲｓの外であるのが好ましい。変異ＤＮＡという用語には、一つ以上のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置換され、その新しいコドンが同じアミノ酸をコードするサイレント変異体も包含される。変異配列という用語には、縮重配列も包含される。縮重配列は、無数のヌクレオチドが、元々コードされるアミノ酸配列の変化を生じることなく、他のヌクレオチドで置換されるという点で、遺伝コードの意味において縮重している。このような縮重配列は、それらの異なる制限部位および／または特定の宿主、特に大腸菌により好まれる特定のコドンの頻度に起因して、重鎖マウス可変ドメインおよび／または軽鎖マウス可変ドメインの最適発現を得るために有用でありうる。
【００６５】
変異体という用語は、従来技術で公知の方法による真正のＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発により得られたＤＮＡ変異体を含むものとする。
【００６６】
完全なテトラマー免疫グロブリン分子のアセンブリおよびキメラ抗体の発現のために、重および軽鎖可変ドメインをコードする組換えＤＮＡインサートが、重および軽鎖定常ドメインをコードする対応するＤＮＡｓと融合された後、例えばハイブリッドベクターへの組み込み後に、適切な宿主細胞に移入される。
【００６７】
例えば、γ１、γ２、γ３またはγ４などのヒト定常ドメインＩｇＧ；特定の実施形態においてはγ１またはγ４に融合された、ＣＤ２００またはＣＤ２００陽性細胞株に対する抗体の重鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡｓが、使用されうる。ヒト定常ドメインκまたはλ、好ましくはκに融合された、本明細書に開示の細胞株に対する抗体の軽鎖マウス可変ドメインをコードするインサートを含む組換えＤＮＡも、提供される。
【００６８】
別の実施形態は、組換えポリペプチドをコードする組換えＤＮＡｓに関し、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインが、宿主細胞における抗体のプロセシングを促進するシグナル配列、および／または抗体の精製を促進するペプチドをコードするＤＮＡ、および／または切断部位、および／またはペプチドスペーサー、および／または薬剤を選択的に含むスペーサー基により結合された組換えＤＮＡｓに関する。薬剤をコードするＤＮＡは、診断または治療用途に有用な薬剤をコードするＤＮＡであることが予定される。従って、毒素または酵素、特にプロドラッグの活性化を触媒し得る酵素である薬剤が、特に示唆される。そのような薬剤をコードするＤＮＡは、天然に存在する酵素または毒素をコードするＤＮＡあるいはその変異体の配列を有し、公知技術の方法により調製されうる。
【００６９】
したがって、本開示の単クローン抗体または抗原結合フラグメントは、他の薬剤、例えば治療薬または検出可能な標識に結合されていない裸の抗体または抗原結合フラグメントでありうる。あるいは、単クローン抗体または抗原結合フラグメントは、たとえば細胞毒性薬、小分子、ホルモン、酵素、成長因子、サイトカイン、リボザイム、擬似ペプチド、化学物質、プロドラッグ、コード配列を含む核酸分子（アンチセンス、ＲＮＡｉ、遺伝子標的コンストラクト等）、または検出可能な標識（たとえばＮＭＲまたはＸ線造影剤、蛍光分子等）などの薬剤に結合されうる。ある実施形態では、抗ＣＤ２００ポリペプチドまたは抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆｖ、一本鎖ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２）が、当該ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントの半減期を増加させる分子に結合される。当該抗ＣＤ２００ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントに結合されうる分子には、アルブミンを含む血清タンパク質、ポリペプチド、他のタンパク質またはタンパク質ドメイン、およびＰＥＧが含まれるがこれに限られない。
【００７０】
クローニングされた重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳類細胞に発現させるための、いくつかの使用可能なベクター系がある。ベクターの一つのクラスは、宿主細胞ゲノムへの所望の遺伝子配列の組込みに依存する。大腸菌ｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１年））またはＴｎ５ｎｅｏ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．,J．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７（１９８２年））等の薬剤耐性遺伝子を同時に導入することにより、ＤＮＡが安定的に組込まれた細胞が選択されうる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列に結合されても、同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入されてもよい（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．等，Ｃｅｌｌ，１６：７７（１９７９年））。ベクターの第二のクラスは、染色体外のプラスミドに自己複製能力を与えるＤＮＡ要素を利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス（Ｓａｒｖｅｒ，Ｎ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９：７１４７（1９８２年））、ポリオーマウイルス（Ｄｅａｎｓ，Ｒ．Ｊ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１：１２９２（１９８４））、またはＳＶ４０ウイルス（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．およびＢｏｔｃｈａｎ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：７９（１９８１年））などの動物ウイルスから得られる。
【００７１】
免疫グロブリンｃＤＮＡは、抗体タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの配列だけからなるため、遺伝子の転写およびＲＮＡのプロセシングを調節するさらなる遺伝子発現要素が、免疫グロブリンｍＲＮＡの合成に必要である。これらの要素には、スプライスシグナル、誘導性プロモータを含む転写プロモータ、エンハンサおよび終結シグナルが含まれる。このような要素が組み込まれたｃＤＮＡ発現ベクターには、Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３：２８０（１９８３年）；Ｃｅｐｋｏ，Ｃ．Ｌ．等，Ｃｅｌｌ，３７：１０５３（１９８４）；およびＫａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２：６８９（１９８５年）により記載されるものが含まれる。
【００７２】
ある実施形態では、抗ＣＤ２００抗体は、ブロッキングまたは非ブロッキング抗体でありうる。本明細書で使用されるところのブロッキング抗体とは、ＣＤ２００とＣＤ２００Ｒの間の相互作用をブロックするものである。非ブロッキング抗体は、ＣＤ２００と結合および／または相互作用するが、ＣＤ２００とＣＤ２００Ｒの相互作用をブロックしない。したがって、ある実施形態では、抗ＣＤ２００抗体は、ブロッキングまたは非ブロッキングのマウス、キメラ、ヒト化ヒトまたは脱免疫抗体である。
【００７３】
ＩＩ．エフェクター機能が改変されたＣＤ２００アンタゴニスト
ＣＤ２００アンタゴニストは、元のまたは親アンタゴニストに対して増大または低減された効果を誘発するように改変されうる。例えば、ＣＤ２００に結合するアンタゴニストが、ＣＤ２００に結合した後で二次的機能を誘発し、いくつかの場合には、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用を阻害しうる。例えば、アンタゴニストは、レセプターまたは細胞外タンパク質を含む、他のリガンドのさらなる結合部位を含みうる。これらの他のリガンドに対する結合により、他の細胞の誘致または動員、および細胞死を含む様々な事象の活性化など、他の事象が誘発されうる。したがって一定の態様では、本開示は、改変された二次的機能（または以下でエフェクター機能とよばれる）を誘発するＣＤ２００アンタゴニストに関する。ある実施形態においては、二次的またはエフェクター機能が改変されたＣＤ２００アンタゴニストは、二次的またはエフェクター機能が増大、低減され、または無く、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用をさらにブロックし、またはし得ない。特定の実施形態においては、二次的またはエフェクター機能が改変されたＣＤ２００アンタゴニストは、抗ＣＤ２００抗体である。
【００７４】
Ａ）エフェクター機能
抗体および抗体−抗原複合体の、免疫系の細胞との相互作用は、本明細書においてエフェクター機能と呼ばれる様々な反応に影響する。例示的なエフェクター機能には、Ｆｃレセプター結合、食作用、細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが含まれる。他のエフェクター機能には、抗体がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはマクロファージのＦｃレセプターに結合して細胞死をもたらすＡＤＣＣ、および補体カスケードの活性化により誘起される細胞死であるＣＤＣが含まれる（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７年）；ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７７−９４（１９９５年）；およびＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１年）に概説される）。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と組み合わされることを必要とし、たとえば、本明細書に開示される様々なアッセイを用いて評価されうる。
【００７５】
ＡＤＣＣを含むいくつかの抗体のエフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と結合するＦｃレセプター（ＦｃＲｓ）により媒介される。ＡＤＣＣにおいては、ＮＫ細胞またはマクロファージが抗体複合体のＦｃ領域に結合し、標的細胞の溶解を促進する。ＮＫ細胞のＦｃＲｓの架橋により、パーフォリン／グランザイム媒介性細胞傷害が誘発されるが、マクロファージにおいては、この架橋により、一酸化窒素（ＮＯ）、ＴＮＦ−α、および活性酸素種などの媒介物質の放出が促進される。ＣＤ２００陽性標的細胞においては、抗ＣＤ２００抗体が標的細胞に結合し、Ｆｃ領域がエフェクター機能を標的細胞に誘導する。抗体のＦｃおよび／または定常領域のアミノ酸配列および／または翻訳後修飾を改変することにより、特定のＦｃＲに対する抗体の親和性、したがって抗体により媒介されるエフェクター活性が変調されうる。
【００７６】
ＦｃＲｓは、免疫グロブリンアイソタイプに対する特異性により定義され、ＩｇＧ抗体のＦｃレセプターはＦｃγＲ、ＩｇＥの場合はＦｃεＲ、ＩｇＡの場合はＦｃαＲ等々と呼ばれる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲｌＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）という、ＦｃγＲの三つのサブクラスが同定されている。各ＦｃγＲサブクラスが二つまたは三つの遺伝子によりコードされ、選択的ＲＮＡスプライシングにより複数の転写産物が生じるため、ＦｃγＲアイソフォームには様々な種類が存在する。ＦｃγＲＩサブクラス（ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、およびＦｃγＲＩＣ）をコードする三つの遺伝子は、染色体１の長腕の領域１ｑ２１．１に集まっており、ＦｃγＲＩＩアイソフォーム（ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、およびＦｃγＲＩＩＣ）をコードする遺伝子およびＦｃγＲＩＩＩ（ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ）をコードする二つの遺伝子は全て領域１ｑ２２に集まっている。これらの異なるＦｃＲサブタイプは、異なる細胞型に発現される（ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１年）に概説される）。例えば、ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球のみに見られるが、ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＴ細胞の亜集団に見られる。特に、ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＡＤＣＣに関係する細胞型の一つであるＮＫ細胞に存在する唯一のＦｃＲである。
【００７７】
ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩは、免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）レセプターである。ＦｃγＲＩは、その細胞外ドメインに三つのＩｇＳＦドメインを有し、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、その細胞外ドメインに二つだけＩｇＳＦドメインを有する。別の種類のＦｃレセプターは、新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）である。ＦｃＲｎは、主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）と構造的に類似し、β２−ミクログロブリンに非共有的に結合したα−鎖からなる。
【００７８】
ヒトおよびマウス抗体上のＦｃγＲの結合部位は、残基２３３−２３９（Ｋａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａl  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１年）のＥＵインデックスの数字）からなる、いわゆる「下方ヒンジ領域」にすでにマップされている。Ｗｏｏｆ等．Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３１９−３３０（１９８６年）；Ｄｕｎｃａｎ等．Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３（１９８８年）；ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３−１４９１（１９９１年）；Ｃｈａｐｐｅｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：９０３６−９０４０（１９９１年）。残基２３３−２３９のうち、Ｐ２３８およびＳ２３９が、結合に関係する可能性があるとしてあげられている。
【００７９】
既述の領域でＦｃγＲに対する結合に関係する可能性がある他のものは、ヒトＦｃγＲＩの場合のＧ３１６−Ｋ３３８（ヒトＩｇＧ）（配列比較のみにより、置換変異体は評価されなかった）(Ｗｏｏｆ等．Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：３１９−３３０（１９８６年）)；ヒトＦｃγＲＩＩＩの場合のＫ２７４−Ｒ３０１（ヒトＩｇＧ１）（ペプチドに基づく）（Ｓａｒｍａｙ等．Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：４３−５１（１９８４年））；ヒトＦｃγＲＩＩＩの場合のＹ４０７−Ｒ４１６（ヒトＩｇＧ）（ペプチドに基づく）（Ｇｅｒｇｅｌｙ等．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１２：７３９−７４３（１９８４年））;ならびにマウスＦｃγＲＩＩの場合のＮ２９７およびＥ３１８（マウスＩｇＧ２ｂ）（Ｌｕｎｄ等，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：５３−５９（１９９２年））である。
【００８０】
ヒトエフェクター細胞は、一つ以上のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を行う白血球である。ある実施形態では、細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれる。例えば血液またはＰＢＭＣｓなど、天然のソースからエフェクター細胞が単離されうる。
【００８１】
ＣＤＣにおいては、抗体−抗原複合体が補体に結合し、補体カスケードの活性化および膜侵襲複合体の生成が生じる。同種抗原に結合した（適切なサブクラスの）抗体に対する、補体系（Ｃ１ｑ）の第一成分の結合により、古典補体経路の活性化が開始される。したがって、Ｃ１ｑタンパク質に対する免疫グロブリンの結合能により、補体カスケードの活性化が部分的に調節される。Ｃ１ｑおよび二つのセリンプロテアーゼ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓが、ＣＤＣ経路の第一成分である複合体Ｃ１を形成する。Ｃ１ｑは、分子量が約４６０，０００で、六つのコラーゲンの「柄」が六つの球状のヘッド領域に連結された構造をもつ六価分子である。ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４（１９９２年）。補体カスケードの活性化には、Ｃ１ｑがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３の少なくとも二つの分子と結合し、しかし抗原性標的に結合したＩｇＭの一つの分子とだけ結合することが必要である（ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７−９４（１９９５年）ｐ．８０）。補体活性化を評価するために、たとえばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６年）に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われうる。
【００８２】
ＩｇＧ分子の様々な残基がＣ１ｑとの結合に関与することが提唱されており、これには、ＣＨ２ドメインのＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、およびＬｙｓ３２２残基、同じβ鎖の近くのターン上に位置するアミノ酸残基３３１、下方ヒンジ領域に位置するＬｙｓ２３５およびＧｌｙ２３７残基、およびＣＨ２ドメインのＮ末端領域に位置する残基２３１〜２３８が含まれる（たとえば、Ｘｕ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：１５２Ａ（Ａｂｓｔｒａｃｔ）（１９９３年），国際公開第９４／２９３５１号；Ｔａｏ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７８：６６１−６６７（１９９３年）；Ｂｒｅｋｋｅ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２４：２５４２−４７（１９９４年）；Ｂｕｒｔｏｎ等；Ｎａｔｕｒｅ，２８８：３３８−３４４（１９８０年）；ＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：７３８−４０（１９８８年）；米国特許第５，６４８，２６０号および第５，６２４，８２１号を参照）。Ｃ１ｑに結合し、補体カスケードを活性化するＩｇＧの能力が、二つのＣＨ２ドメインの間に位置する炭化水素部分（通常Ａｓｎ２９７で結合）の存在、非存在、または修飾にも依存することが、さらに提唱されている（ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７−９４（１９９５年）。ある実施形態では、本明細書に提供される抗ＣＤ２００抗体のＣＤＣ活性が増強または低減されるように、これらの残基の一つ以上が修飾、置換、または除去され、または一つ以上のアミノ酸残基が挿入されうる。
【００８３】
Ｂ）エフェクター機能が調節された抗ＣＤ２００抗体
標的特異的抗体の定常領域に関連するエフェクター機能は、定常またはＦｃ領域の性質を変更することにより調節されうる。エフェクター機能の改変には、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシス、一つ以上のＦｃレセプターに対する結合、および炎症誘発反応の活性のうち一つ以上の調節が含まれる。調節とは、第二抗体の活性と比較した活性の増大、低減または排除をいう。ある実施形態では、第二抗体は、エフェクター機能を伴う抗体である。第二抗体は、改変抗体または天然の抗体であり得、非変異、天然、または親抗体と呼ばれうる。特定の実施形態においては、調節には、活性が除去され、または完全に存在しない場合が含まれる。さらに、いくつかの場合には、非変異抗体は、本明細書に開示のｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１またはｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１抗体の活性と類似または同等のエフェクター機能活性を有しうる。同様に、機能的または非変異定常またはＦｃ領域は、天然の定常またはＦｃドメインのエフェクター機能を有しうる。いくつかの場合には、ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１またはｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１の定常またはＦｃ領域は、非変異ドメインでありうる。本発明の目的においては、ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１およびｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１が、他の抗体の活性と比較する標準であり、ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１が好ましい標準である。
【００８４】
改変されたＦｃＲ結合能および／またはＡＤＣＣ活性および／または改変されたＣＤＣ活性を有するポリペプチド変異体は、天然または親ポリペプチドと比較して、または天然配列のＦｃまたは定常領域を含むポリペプチドと比較して、増強または低減されたＦｃＲ結合活性および／またはＡＤＣＣ活性および／またはＣＤＣ活性を有するポリペプチドである。ＦｃＲに対する結合の増大を示すポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも高い親和性で少なくとも一つのＦｃＲと結合する。ＦｃＲに対する結合の低減を示すポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも低い親和性で少なくとも一つのＦｃＲと結合する。ＦｃＲに対する結合の低減を示すこのような変異体は、ＦｃＲに対する評価可能な結合をほとんどまたは一切有さず、たとえば、天然配列の免疫グロブリン定常またはＦｃ領域のＦｃＲに対する結合のレベルと比較して、ＦｃＲに対する結合が０−２０％である。同様に、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が改変されたポリペプチド変異体は、天然または親ポリペプチドと比較して、増大または低減されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を有しうる。ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの低減を示すポリペプチド変異体は、本明細書の実施例に示されるように、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が低減され、またはない。ある実施形態では、親または天然ポリペプチドおよびその変異体は、抗体または抗原結合フラグメントである。特定の実施形態においては、当該抗体または抗原結合フラグメントは、ＣＤ２００に結合し、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用をブロックしまたはブロックし得ない。
【００８５】
天然配列Ｆｃまたは定常領域には、自然に見られるＦｃまたは定常鎖領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列が含まれる。変異または改変されたＦｃまたは定常領域には、例えば、少なくとも一つのアミノ酸修飾、挿入、または欠失によって天然配列の重鎖領域のものと異なるアミノ酸配列が含まれる。ある実施形態では、変異または改変された定常領域は、天然配列の定常領域または親ポリペプチドの定常領域と比較して、少なくとも一つのアミノ酸置換、挿入、および／または欠失、たとえば、天然配列の定常領域または親ポリペプチドの定常領域における約一〜約百のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有する。いくつかの実施形態においては、本明細書の変異または改変された定常領域は、天然配列の定常領域および／または親ポリペプチドの定常領域と少なくとも約７０％の相同性（類似性）または同一性を有し、いくつかの場合には少なくとも約７５％、その他の場合には約８０％の相同性または同一性、他の実施形態では少なくとも約８５％、９０％または９５％の相同性または同一性を有する。変異または改変された定常領域には、一つ以上のアミノ酸欠失または挿入も含まれうる。さらに、変異定常領域には、例えばグリコシル化パターンの改変を含む翻訳後修飾の改変を生じる一つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入が含まれうる。
【００８６】
本明細書に開示の変異抗ＣＤ２００抗体は、天然または親ポリペプチド配列と比較して一つ以上のアミノ酸が挿入、欠失または置換されたポリペプチドをコードする核酸配列によりコードされうる。さらに、変異抗体は、変異抗ＣＤ２００抗体をコードする核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされうる。様々な条件を用いて、ハイブリダイゼーションを検出でき、主にハイブリダイゼーションアッセイの洗浄ステージによりストリンジェンシーが決定されうる。一般に、高温および低塩濃度で高ストリンジェンシーとなり、低温および高塩濃度で低いストリンジェンシーとなる。例えば、約２．０ｘＳＳＣ、５０℃での洗浄により低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションが達成され、約０．２ｘＳＳＣ、５０℃で高ストリンジェンシーが達成される。
【００８７】
変異定常、Ｆｃ、または重鎖領域を有する抗体を設計または産出することにより、エフェクター機能が改変されまたはエフェクター機能がない抗体またはその抗原結合フラグメントが生成されうる。組換えＤＮＡ技術および／または細胞培養および発現条件を用いて、改変された機能および／または活性をもつ抗体が産出されうる。例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて、エフェクター機能を含む抗体機能に影響を及ぼす領域（例えばＦｃまたは定常領域）に一つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入を行いうる。あるいは、抗体が産出される細胞培養および発現条件を操作することにより、たとえばグリコシル化パターンなど翻訳後修飾の変更が達成されうる。
【００８８】
したがって、本開示のある態様および方法は、一つ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含む、エフェクター機能が改変された抗ＣＤ２００抗体に関する。ある実施形態では、そのような変異抗ＣＤ２００抗体は、エフェクター機能が低減され、またはエフェクター機能がない。特定の実施形態においては、変異抗体には、Ｇ１ドメインの代わりにＧ２／Ｇ４コンストラクトが含まれる（例えば図１０、１１、１２、１３、および１５を参照）。
【００８９】
本明細書に示されるようにＧ１ドメインをＧ２／Ｇ４と交換するほか、抗体の一定の領域のアミノ酸配列に他のタイプの変更を導入することにより、エフェクター機能が低減された抗ＣＤ２００抗体が産出されうる。このようなアミノ酸配列の変更には、Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ等により説明されるＡｌａ−Ａｌａ変異（国際公開第９４／２８０２７号および第９８／４７５３１号を参照；Ｘｕ等．２０００年  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００；１６−２６も参照）が含まれるがこれに限られない。したがって、ある実施形態では、Ａｌａ−Ａｌａ変異を含め、定常領域が変異した抗ＣＤ２００抗体を用いて、エフェクター機能を低減または除去しうる。これらの実施形態によれば、抗ＣＤ２００抗体の定常領域には、２３４位でのアラニンの変異または２３５位でのアラニンの変異が含まれる。さらに、定常領域は、二重変異：２３４位でのアラニンの変異および２３５位でのアラニンの第二変異を含みうる。一実施形態においては、抗ＣＤ２００抗体は、ＩｇＧ４フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位でのフェニルアラニンからアラニンへの変異および／または２３５位でのロイシンからアラニンへの変異である。別の実施形態においては、抗ＣＤ２００抗体は、ＩｇＧ１フレームワークを含み、Ａｌａ−Ａｌａ変異は、２３４位でのロイシンからアラニンへの変異および／または２３５位でのロイシンからアラニンへの変異である。抗ＣＤ２００抗体は、ＣＨ２ドメインにおける点突然変異Ｋ３２２Ａを含む、代替的または追加的に他の変異をもちうる(Ｈｅｚａｒｅｈ等．２００１年  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７５：１２１６１−８)。定常領域にこのような変異を有する抗体は、さらにブロッキングまたは非ブロッキング抗体でありうる。
【００９０】
ヒンジ領域の変更も、エフェクター機能に影響を及ぼす。例えば、ヒンジ領域の欠失により、Ｆｃレセプターに対する親和性が低減され、補体活性化が低減されうる（Ｋｌｅｉｎ等．１９８１年  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７８：５２４−５２８）。したがって、本開示は、ヒンジ領域が改変された抗体にも関する。
【００９１】
特定の実施形態においては、抗ＣＤ２００抗体を修飾して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強または阻害しうる。抗体のＦｃ領域に一つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を導入することにより、ＣＤＣ活性の調節が達成されうる（たとえば、米国特許第６，１９４，５５１号を参照）。代替的または追加的に、システイン残基がＦｃ領域に導入され、これにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になりうる。こうして生成されたホモ二量体抗体は、改善または低減したインターナリゼーション能力および／または増大または低下した補体媒介性細胞破壊活性を有しうる。Ｃａｒｏｎ等，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５（１９９２年）およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２年），国際公開第９９/５１６４２号，Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８年）；米国特許第５，６４８，２６０号；第 ５，６２４，８２１号；および国際公開第９４/２９３５１号を参照。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ等，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３年）に記載されるようなヘテロ二機能性架橋剤を用いても調製され得る。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、これにより補体溶解およびＡＤＣＣ能力を増強した抗体が設計されうる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ等．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９年）を参照。
【００９２】
抗体のエフェクター機能を調節する別の考えうる手段には、グリコシル化の変更が含まれる。この点は、ヒトＩｇＧが有するオリゴ糖の重要性の提唱を、エフェクター機能の程度とともにまとめたＲａｊｕにより近年概説されている（Ｒａｊｕ，ＴＳ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００３年４月．４４−５３）。ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎによると、ヒトＩｇＧのオリゴ糖の微小不均一性が、ＣＤＣおよびＡＤＣＣ、様々なＦｃレセプターに対する結合、およびＣ１ｑタンパク質に対する結合などの生物学的機能に影響しうる（Ｗｒｉｇｈｔ  Ａ．およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １９９７年，１５  ２６−３２）。産出細胞および細胞培養条件により抗体のグリコシル化パターンが異なりうることが、十分に説明されている（Ｒａｊｕ，ＴＳ．ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００３年４月．４４−５３）。このような違いにより、エフェクター機能および薬物動態の両方に変化が生じうる（Ｉｓｒａｅｌ等．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９６年；８９（４）：５７３−５７８；Ｎｅｗｋｉｒｋ等．Ｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．１９９６年；１０６（２）：２５９−６４）。エフェクター機能の違いは、エフェクター細胞上のＦｃγレセプター（ＦｃγＲｓ）に結合するＩｇＧｓの能力に関係しうる。Ｓｈｉｅｌｄｓ等により、ＦｃγＲに対する結合が改善されたアミノ酸配列の変異体を伴うＩｇＧが、最大１００％のＡＤＣＣの増強を示しうることがヒトエフェクター細胞を用いて分かっている（Ｓｈｉｅｌｄｓ等．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１年  ２７６（９）：６５９１−６０４）。これらの変異体には結合界面では見られないアミノ酸の変更が含まれるが、糖成分の性質ならびにその構造パターンの両者も、観察される違いに寄与しうる。さらに、ＩｇＧのオリゴ糖成分におけるフコースの存在または非存在により、結合およびＡＤＣＣが改善されうる（Ｓｈｉｅｌｄｓ等．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２年；２７７（３０）：２６７３３−４０）。Ａｓｎ２９７に結合されたフコシル化された炭水化物を欠くＩｇＧは、Ｆｃγレセプターに対する普通の受容体結合を示した。これに対して、特に低い抗体濃度で、ＦｃγＲＩＩＡレセプターに対する結合が５０％改善され、ＡＤＣＣの増強が伴った。
【００９３】
Ｓｈｉｎｋａｗａらによる研究により、ラットハイブリドーマで産出されたヒトＩＬ−５レセプターに対する抗体が、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）で産出された抗体と比較して、５０％以上高いＡＤＣＣを示すことが証明された（Ｓｈｉｎｋａｗａ等．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３年  ２７８（５）：３４６６−７３）。単糖成分およびオリゴ糖プロファイリングにより、ラットハイブリドーマにより産出されたＩｇＧは、ＣＨＯにより産出されたタンパク質よりもフコースの含量が低いことが示された。著者は、ＩｇＧ１のフコシル化の欠如がＡＤＣＣ活性の増強に重要な役割をはたすと結論づけた。
【００９４】
Ｕｍａｎａらは異なるアプローチをとり、キメラＩｇＧ１抗神経芽細胞腫抗体ｃｈＣＥ７のグリコシル化パターンを変更した（Ｕｍａｎａ等．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９年２月；１７（２）：１７６−８０）。彼らはテトラサイクリンを用いて、ＡＤＣＣ活性に関与するオリゴ糖を分岐させるグリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＧｎｎＩＩ）の活性を調節した。親抗体のＡＤＣＣ活性は、バックグラウンドレベルをかろうじて上回った。異なるテトラサイクリンレベルで産出されたｃｈＣＥ７のＡＤＣＣ活性の測定により、最大のｃｈＣＥ７のｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣ活性のためのＧｎＴＩＨ発現の最適範囲が示された。この活性は、定常領域に伴う、切断複合オリゴ糖のレベルと関係した。新たに最適化された変異体は、十分なＡＤＣＣ活性を示した。同様に、ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎは、グリコシル化が欠損したＣＨＯ細胞株で抗体を産出し（１９９４年  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０：１０８７−１０９６）、この細胞株で産出された抗体は補体媒介性細胞溶解ができないことを示した。したがって、エフェクター機能に影響する公知の改変には、グリコシル化パターンの修飾またはグリコシル化残基の数の変更が含まれるが、本開示は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを含むエフェクター機能を増強または低減するためにグリコシル化が改変された、ＣＤ２００抗体に関する。グリコシル化の改変には、グリコシル化残基の数の増加または減少、ならびにグリコシル化残基のパターンまたは位置の変更が含まれる。
【００９５】
抗体のエフェクター機能を改変するための、さらに他のアプローチが存在する。例えば、抗体産生細胞は超変異誘発性であり得、そのために抗体分子全体でヌクレオチドおよびポリペプチド残基がランダムに改変された抗体を生成しうる（国際公開第２００５／０１１７３５号を参照）。超変異誘発性の宿主細胞には、ＤＮＡミスマッチ修復が欠損した細胞が含まれる。このように産出された抗体は抗原性が低く、および／または有益な薬物動態学的性質を有しうる。さらに、エフェクター機能の増強または低減などの性質により、このような抗体が選択されうる。
【００９６】
さらに、当然のことながら、抗体の結合能によりエフェクター機能が異なりうる。例えば、高親和性を有する抗体は、相対的に低い親和性を有する抗体と比較して、補体系の活性化においてより効率的でありうる（Ｍａｒｚｏｃｃｈｉ−Ｍａｃｈａｄｏ等．１９９９年  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２８：８９−１０１）。したがって、抗原に対する結合能が減少するように抗体が改変されうる（たとえば、一つ以上のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失などの方法により、抗体の可変領域を変更することによる）。結合能が低減した抗ＣＤ２００抗体は、たとえばＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの低減を含め、エフェクター機能が低減しうる。
【００９７】
ＩＩＩ．ＣＤ２００を過剰発現する細胞を除去または排除する方法
本開示によれば、被験体にＣＤ２００アンタゴニストを含む治療を行うことにより、被験体においてＣＤ２００を発現する細胞を除去する方法が提供される。前述のとおり、ＣＤ２００は、一定の免疫細胞に発現され、本開示に示されるとおり、ＣＤ２００は、一定の悪性細胞にも発現される。ＣＤ２００の異種発現は、治療において癌細胞（すなわちＣＤ２００陽性細胞）を標的化するための道を提供する。同様に、自己免疫不全を治療する方法において、ＣＤ２００陽性免疫細胞が除去の標的とされうる。
【００９８】
ＣＤ２００は、骨髄細胞のＣＤ２００Ｒとの相互作用を通じて骨髄活性および／または移動の阻害シグナルを送達することにより、免疫抑制を調節する。例えばＣＤ２００ノックアウトマウスは、免疫原の刺激後の免疫反応がより活発になり（Ｈｏｅｋ等．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００年）、ＣＤ２００発現細胞は、活性化免疫細胞のサイトカインプロフィルのシフトを誘発することにより、免疫抑制を誘起する（本明細書に示されるデータを参照）。特に、ＣＤ２００陽性細胞は、混合細胞集団アッセイにおいて、Ｔｈ１からＴｈ２サイトカイン生産へのシフトを誘発できる。ＣＤ２００陽性細胞は免疫反応を抑制できるが、そのためにＣＤ２００陽性癌細胞が免疫細胞の攻撃を逃れうる。しかし、癌細胞ならびに免疫細胞の膜上のＣＤ２００発現を利用して、治療でこれらの細胞を標的化しうる。たとえば、抗ＣＤ２００アンタゴニストは、ＣＤ２００陽性細胞を特異的に標的化し、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用を妨害し、これにより免疫抑制ならびに免疫エフェクター細胞の標的ＣＤ２００陽性細胞を阻害しうる。したがって、本開示の実施形態は、ＣＤ２００に結合し、いくつかの場合においてはＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用を妨害するアンタゴニストを含む、ＣＤ２００陽性細胞を標的化して除去する方法に関する。
【００９９】
ある実施形態では、本開示は、免疫反応を増強する方法に関する。このような方法には、ＣＤ２００アンタゴニストを含む療法を行うことが含まれ、特定の実施形態においては、アンタゴニストは本明細書に記載の抗ＣＤ２００抗体または抗原結合フラグメントである。特定の機序にとらわれるものではないが、抗ＣＤ２００ブロッキング抗体、抗原結合フラグメント、ポリペプチド、または他のアンタゴニストは、免疫抑制をブロックして免疫細胞にＣＤ２００陽性細胞を攻撃および排除させることにより、ＣＤ２００陽性細胞を排除しうる。代替的に、あるいは前述の機序と合わせて、抗ＣＤ２００抗体（ブロッキングまたは非ブロッキング）または他のアンタゴニストは、エフェクター細胞または他のリガンド（例えば補体成分）を、抗体またはアンタゴニストが結合するＣＤ２００陽性細胞に補充し、ＣＤ２００陽性細胞をエフェクター媒介性細胞死の標的としうる。
【０１００】
一態様では、本開示は、マウス、キメラ、ヒト化、またはヒト抗ＣＤ２００抗体を必要な被験体に投与することにより、ＣＤ２００陽性標的細胞のＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを調節する方法に関する。本開示は、増大したＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発する変異抗ＣＤ２００抗体、およびＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が低減しているかない変異抗ＣＤ２００抗体に関する。
【０１０１】
一実施形態においては、変異抗ＣＤ２００抗体には、変異または改変されたＦｃまたは定常領域が含まれ、変異Ｆｃまたは定常領域は、増大されたエフェクター機能を示す。このような変異領域は、一つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含みうる。代替的または追加的に、変異または改変されたＦｃまたは定常領域には、たとえばグリコシル化パターンの改変を含む、翻訳後修飾の改変が含まれうる。グリコシル化パターンの改変には、グリコシド（ｇｌｙｃｏｓｙｄｉｃ）結合の数の増加または減少、および／または一つ以上のグリコシド（ｇｌｙｃｏｓｙｄｉｃ）結合の位置（すなわちアミノ酸残基番号）の修飾が含まれる。
【０１０２】
別の実施形態においては、本開示は、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が低減されているか、ない変異抗ＣＤ２００抗体を含む、ＣＤ２００陽性細胞を除去または排除する方法に関する。一実施形態においては、変異抗ＣＤ２００抗体には、変異または改変されたＦｃまたは定常領域が含まれ、変異または改変されたＦｃまたは定常領域は、エフェクター機能が低減しているか、ない。このような変異または改変されたＦｃまたは定常領域は、一つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を含みうる。代替的または追加的に、変異Ｆｃまたは定常領域には、グリコシル化パターンの改変などを含む、翻訳後修飾の改変が含まれうる。グリコシル化パターンの改変の例は、上述されている。
【０１０３】
さらなる実施形態においては、患者に投与されるマウス、キメラ、ヒト化、ヒトまたは脱免疫抗ＣＤ２００抗体は、非ブロッキング抗体である。抗ＣＤ２００非ブロッキング抗体は、上述の変異抗体であり得、したがって調節されたエフェクター機能を有しうる。例えば、変異抗ＣＤ２００抗体は、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用をブロックしえず、例えばＡＤＣＣの増大など、エフェクター機能の増大を誘発する変異定常領域も含みうる。
【０１０４】
Ａ）自己免疫不全の患者を治療する方法
ある態様においては、本開示は、ＣＤ２００アンタゴニストを含む療法による、自己免疫不全患者の治療に関する。ある実施形態では、アンタゴニストは、抗ＣＤ２００抗体またはその抗原結合フラグメントである。他の実施態様においては、抗ＣＤ２００抗体またはそのフラグメントは、エフェクター活性が調節された変異抗ＣＤ２００抗体である。例えば、変異抗体には、例えばＡＤＣＣなど、エフェクター機能の増大または増強を誘発できる変異または改変された定常領域が含まれうる。さらに、当該抗体は、非ブロッキング抗体であり得、マウス、キメラ、ヒト化、ヒトまたは脱免疫抗ＣＤ２００抗体でありうる。したがって、自己免疫不全の患者を治療する方法には、本開示に記載の任意のＣＤ２００アンタゴニストおよび抗体が含まれうる。
【０１０５】
ある実施形態では、抗ＣＤ２００抗体またはＣＤ２００アンタゴニストを用いて、たとえばＴ細胞、Ｂ細胞、および樹状細胞などの免疫細胞を含めて、ＣＤ２００を表面上に発現する任意の種類の細胞を除去しうる。一実施形態においては、抗ＣＤ２００抗体は、たとえば自己免疫不全、移植、アレルギー、または炎症性疾患に関連する免疫反応など、望ましくない免疫反応に関わる免疫細胞の標的破壊に有用でありうる。本明細書に提供される抗ＣＤ２００抗体で治療できる例示的な自己免疫疾患および障害には、例えば、乾癬および皮膚炎（たとえば過敏性皮膚炎）を含む炎症性皮膚病などの炎症反応；皮膚筋炎；汎発性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患に関連する反応（クローン病および潰瘍性大腸炎など）；呼吸窮迫症候群（成人呼吸窮迫症候群；ＡＲＤＳを含む）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；湿疹および喘息などのアレルギー状態およびＴ細胞浸潤および慢性的炎症反応を含む他の状態；アテローム性動脈硬化；白血球接着不全症；慢性関節リウマチ；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病（たとえばＩ型糖尿病またはインシュリン依存性糖尿病ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｉｓ）；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン症候群；若年型糖尿病；および結核、多臓器肉芽腫性疾患、多発性筋炎、鉄沈着性肉芽腫および脈管炎に典型的に見られるサイトカインおよびＴリンパ球により媒介される急性および遅延過敏症に関連する免疫反応；悪性貧血（アジソン病）；白血球血管外遊出を伴う病気；中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患；多臓器損傷症候群；溶血性貧血（クリオグロブリン血症ｃｒｙｏｇｌｏｂｉｎｅｍｉａまたはクームス陽性貧血を含むがこれに限られない）；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート−イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡；天疱瘡；自己免疫性多腺性内分泌障害；ライター病；全身強直性症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経炎；免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）または自己免疫性血小板減少症および自己免疫性溶血性疾患、橋本甲状腺炎などが含まれる。
【０１０６】
本明細書に記載の方法および組成物によれば、本開示は、移植または同種移植の患者を治療する方法にも関する。本開示の抗ＣＤ２００抗体または他のＣＤ２００アンタゴニストは、移植臓器または組織に対する患者の寛容を低減しうるＣＤ２００陽性免疫細胞を減少または排除するために、移植または同種移植処置の前または処置の後に患者に投与されうる。特定の実施形態では、エフェクター機能が増大された抗ＣＤ２００抗体が、移植患者に与えられる。さらに、抗ＣＤ２００抗体は、非ブロッキング抗体である。
【０１０７】
ＣＤ２００アンタゴニストまたは抗体を含む療法は、併用療法において患者に行われうる。したがって、自己免疫不全を治療または防止し、移植片の生存を増強または延長し、アレルギーを治療または防止し、または炎症性疾患を治療または防止するための免疫細胞の一定の集団の標的破壊が、併用療法の一部として実施されうる。例えば、ＣＤ２００アンタゴニスト（例えば本明細書に記載の抗ＣＤ２００抗体）を含む第一療法を受ける患者に、第二療法も行いうる。ＣＤ２００アンタゴニストは、第二療法と同時に与えられうる。あるいは、ＣＤ２００アンタゴニストは、第二療法の前または後に与えられうる。第二療法には、抗炎症剤、免疫抑制剤、および／または抗感染剤が含まれるがこれに限られない。
【０１０８】
本開示の併用療法には、例えば、ステロイド、抗マラリア薬、アスピリン、非ステロイド系抗炎症薬、免疫抑制剤、または細胞毒性薬と同時または順次に投与される、本明細書に記載のＣＤ２００アンタゴニストが含まれる。コルチコステロイド（例えばプレドニソン、デキサメサゾン、およびプレジゾロン（ｐｒｅｄｉｓｏｌｏｎｅ））、メトトレキセーテム（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅｍ）、メチルプレドニゾロン、マクロライド系免疫抑制剤（例えばシロリムスおよびタクロリムス）、分裂阻害剤（例えばアザチオプリン、シクロホスファミド、およびメトトレキサート）、Ｔリンパ球の活性を阻害する菌類の代謝産物（例えばサイクロスポリン）、ミコフェノール酸モフェチル、酢酸グラチラマー、および細胞毒性およびＤＮＡ傷害剤（例えばクロランブシル）が含まれる。自己免疫疾患および同種移植または移植患者においては、抗ＣＤ２００療法が、インターロイキン２レセプターのα鎖に特異的に結合する遺伝子操作されたヒトＩｇＧ１単クローン抗体であるダクリズマブ、ならびに免疫細胞または他の細胞を標的とする様々な他の抗体を含む抗体治療と組み合わされうる。このような併用療法は、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、狼瘡、および特発性血小板減少性紫斑病、およびその他の自己免疫の徴候の治療において有用でありうる。本開示は、一つ以上の薬剤に結合されたＣＤ２００アンタゴニスト（例えば本開示に記載の抗体およびその変異体）を含む、自己免疫不全および移植患者のための療法にも関する。
【０１０９】
Ｂ）癌患者を治療する方法
一態様では、本開示は、ＣＤ２００のレセプターとの相互作用を妨害または阻害する薬剤が被験体に投与される、癌を治療する方法を提供する。ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用の妨害により、その後免疫抑制が解除または阻害され、したがって免疫反応が増強される。ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用の妨害に考えられる薬剤には、例えば、小分子、化学物質、ポリペプチド、無機分子、および有機金属化合物が含まれる。アンチセンス、ＲＮＡｉ、または遺伝子治療を介して膜タンパク質またはそのレセプターの発現を抑制することによっても、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用が阻害されうる。さらに、抗ＣＤ２００または抗ＣＤ２００Ｒ特異的抗体またはそのフラグメントなど、ＣＤ２００またはＣＤ２００Ｒに対して特異的なポリペプチドは、ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用の免疫抑制効果を阻害しうる。
【０１１０】
ＣＤ２００アンタゴニストにより治療できる癌細胞には、ＣＤ２００の発現またはＣＤ２００のアップレギュレーションが見られる任意の癌細胞が含まれる。抗ＣＤ２００療法が用いられうる癌には、例えば、卵巣、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、腎臓、乳腺、前立腺、血液癌（例えばリンパ腫および白血病）、および形質細胞癌が含まれる。神経堤細胞に由来する任意の癌細胞も含まれる。いくつかの実施形態においては、ＣＤ２００アンタゴニストは、抗ＣＤ２００抗体である。抗癌治療として用いられるこのような抗体は、ＣＤ２００とそのレセプターの相互作用を妨害できる。この妨害が、ＣＤ２００の免疫抑制効果をブロックしうる。このように免疫反応を高めることにより、このような抗体は、癌細胞の根絶を促進しうる。また、抗ＣＤ２００抗体は、癌細胞を標的としてエフェクター媒介性細胞死を誘導しうる。
【０１１１】
一実施形態においては、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性が調節された変異抗ＣＤ２００抗体が、ＣＤ２００陽性癌細胞をもつ被験体に投与されうる。例えば、癌療法において用いられる変異抗ＣＤ２００抗体は、親または自然抗体と比較して増強されたエフェクター活性をもちうる。別の実施形態においては、変異体ＣＤ２００抗体は、自然抗体と比較して低減されたＡＤＣＣを含む、低減されたエフェクター機能をもちうる。当該抗体は、マウス、キメラ、ヒト化、ヒトまたは脱免疫抗体でありうる。変異抗ＣＤ２００抗体を治療に使用できる癌には、神経堤細胞癌が含まれるがこれに限られない。形質細胞癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、リンパ腫、骨髄腫、および白血病も含まれる。
【０１１２】
本抗体は、癌患者、特にＣＬＬ、形質細胞癌、卵巣癌、皮膚癌、肺癌、腎癌、乳癌、前立腺癌、神経芽細胞腫、リンパ腫、骨髄腫、白血病、および神経堤細胞に由来する任意の癌の患者への治療として投与されうる。特に有用な実施形態においては、本開示による癌療法には、（１）免疫抑制をブロックするためにＣＤ２００とそのレセプターの間の相互作用を妨げる抗ＣＤ２００抗体またはアンタゴニストを投与し、これにより癌細胞の根絶を促進するステップ、および／または（２）癌細胞を直接破壊するために、ＣＤ２００を標的とする部分を含む融合分子を投与するステップが含まれる。あるいは、抗体は、補体媒介性または抗体依存性細胞傷害により、直接癌細胞を破壊する。ＣＤ２００は、内皮細胞のような正常細胞にも、癌細胞より低次ではあるが発現するため、正常細胞への損傷を制限するためにＡＤＣＣまたはＣＤＣが低減または排除されるように定常領域が修飾された抗ＣＤ２００抗体を投与することも有利でありうる。例えば、ＣＤ２００の発現が、一部の活性化された正常細胞（例えば活性化Ｔ細胞）でアップレギュレートされ、このような細胞がエフェクター機能を有する抗ＣＤ２００抗体により破壊されやすい場合には、癌細胞の破壊を助けるこれらの細胞が除去されるのを回避するために、エフェクター機能を欠く抗ＣＤ２００抗体を用いることも有利でありうる。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＩｇＧ１定常ドメインをＩｇＧ２／４融合ドメインに交換することにより、抗ＣＤ２００抗体のエフェクター機能が排除される。たとえば、ＦｃＲと相互作用することが知られている部位の変異またはペプチドのヒンジ領域への挿入により、ＦｃＲ相互作用に必要な重要部位を排除するなど、エフェクター機能を排除するための他の方法も考えられる。エフェクター機能が低減されているかない変異抗ＣＤ２００抗体には、本明細書に前述した変異体も含まれる。
【０１１４】
ＣＤ２００：ＣＤ２００Ｒ相互作用を阻害または妨害するための前述の薬剤は、他の療法または他の薬剤と組み合わせて使用されうる。他の薬剤には、ポリペプチド、小分子、化学物質、金属、有機金属化合物、無機化合物、核酸分子、オリゴヌクレオチド、アプタマー、スピーゲルマー、アンチセンス核酸、ロックト核酸（ＬＮＡ）阻害剤、ペプチド核酸（ＰＮＡ）阻害剤、免疫調節剤、抗原結合フラグメント、プロドラッグ、および擬似ペプチド化合物が含まれるがこれに限られない。
【０１１５】
一定の態様においては、本開示は、本明細書に記載の抗体と、免疫調節化合物、ワクチンまたは化学療法とを含む、ＣＤ２００アンタゴニストを含む併用療法に関する。このような併用療法において使用されうる適切な免疫調節剤の代表例には、Ｔ細胞または抗原提示細胞の負の調節をブロックする薬剤（例えば抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤＬ−２抗体、抗ＰＤ−１抗体など）またはＴ細胞の正の副刺激を増強する薬剤（例えば抗ＣＤ４０抗体または抗４−１ＢＢ抗体）またはＮＫ細胞数またはＴ細胞活性を増大する薬剤（たとえば、単独、またはＩＭｉＤｓ、サリドマイド、またはサリドマイドアナログなどの阻害剤と組み合わせた抗ＣＤ２００抗体）が含まれる。さらに、免疫調節療法には、腫瘍細胞を取り込んだ樹状細胞などの癌ワクチン、そのような細胞から得たタンパク質、ペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡ、患者から得た熱ショックタンパク質（ｈｓｐ’ｓ）、またはＣｐＧ、Ｌｕｉｖａｃ、Ｂｉｏｓｔｉｍ、Ｒｉｂｏｍｉｎｙｌ、Ｉｍｕｄｏｎ、Ｂｒｏｎｃｈｏｖａｘｏｍなど、様々なレベルで免疫系を刺激する一般的な補助剤、および先天性免疫系のレセプターを活性化する他の任意の化合物または他の補助剤（例えば、トールライクレセプターアゴニスト、抗ＣＴＬＡ−４抗体など）が含まれうる。また、免疫調節療法には、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどのサイトカインによる治療が含まれうる。
【０１１６】
さらなる実施形態においては、抗ＣＤ２００治療を開始する前に、抗ＣＤ２５、フルダラビン、またはシクロホスファミドなどの試薬による現存する制御性Ｔ細胞の除去が達成される。また、骨髄移植またはＣＬＬ細胞と反応するＴ細胞の養子移入に先立つ骨髄機能を廃絶する療法の治療効力が、抗ＣＤ２００療法により増強される。さらに他の実施形態においては、抗ＰＤＬ１および／または２抗体、抗ＩＬ−１０抗体、抗ＩＬ−６抗体などの薬剤で免疫抑制機序をブロックすることにより、抗ＣＤ２００による治療の効力が改善される。さらに、癌の環境で免疫を抑制することが示されている形質細胞様樹状細胞を排除することが有利でありうる。抗ＣＤ２００抗体の送達が、免疫抑制をブロックすることにより免疫反応を高めることを目的とするこれらの実施形態においては、例えば、エフェクター機能を欠く変異抗ＣＤ２００抗体が用いられてもよい。
【０１１７】
特に有用な実施形態においては、免疫反応を増強する療法は、ＣＤ２００に結合するポリペプチドの単独での投与、または前述の免疫調節療法の一つと組み合わせた投与である。したがって、ＣＤ２００アンタゴニスト（本明細書に記載の抗ＣＤ２００抗体を含む）は、結合単クローン抗体（例えばゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、またはトシツモマブ）を含む単クローン抗体（例えばリツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、またはベバシズマブ）と組み合わせて使用されうる。
【０１１８】
さらに、抗ＣＤ２００療法の化学療法剤との組み合わせは、全体的な腫瘍の量を減らし、血管新生を制限し、腫瘍への到達可能性を高め、ＡＤＣＣへの感受性を高め、より多くの腫瘍抗原を提供することにより免疫機能の増大をもたらし、またはＴ細胞誘引物質ＬＩＧＨＴの発現を増加させる上で、特に有用でありうる。抗ＣＤ２００療法が、別の従来の抗腫瘍剤と組み合わせて被験体に同時または順次に投与される場合には、抗ＣＤ２００療法によって、いずれの薬剤の治療効力も単独の場合よりも増強されることが示されうる。併用抗腫瘍療法に使用されうる医薬化合物には、例として、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ｂｃｇ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロナート、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエネストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エクセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが含まれる。
【０１１９】
これらの化学療法の抗腫瘍化合物は、その作用機序によって、たとえば以下の薬剤のクラスを含む群に分類されうる：ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）およびプリンアナログ、葉酸きっ抗体および関連する阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、および２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン））などの抗代謝拮抗剤／抗癌剤；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）などの天然産物、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロンおよびナベルビンなどの微小管破壊剤、エピジポドフィロトキシン（エトポシド、テニポシド）、ＤＮＡ傷害剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メクロレタミン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６））を含む抗増殖／抗有糸分裂剤；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシンなどの抗生物質；酵素（Ｌ型アスパラギンを全身的に代謝し、アスパラギンを合成する能力をもたない細胞を枯渇させるＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロランブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびアナログ、（ストレプトゾシン））、トラゼン−ダカルバジニン（ＤＴＩＣ）などの抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤；葉酸アナログ（メトトレキサート）などの抗増殖／抗有糸分裂抗代謝拮抗剤；プラチナ配位化合物（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害薬（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝血物質（ヘパリン、合成ヘパリンの塩および他のトロンビンの阻害剤）；繊維素溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗転移剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（サイクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル）；免疫調節剤（レナリドマイド（レブリミド、ＣＣ−５０１３）およびＣＣ−４０４７（アクチミド）などのサリドマイドおよびそのアナログ）、シクロホスファミド；抗血管新生化合物（ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン）および成長因子阻害剤（血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）阻害剤）；アンギオテンシンレセプターブロッカー；一酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導物質（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシンおよびミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメサゾン、ハイドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニソンおよびプレニゾロンｐｒｅｎｉｓｏｌｏｎｅ）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘発物質およびカスパーゼ活性化物質；およびクロマチン破壊剤。
【０１２０】
ある実施形態では、併用抗血管新生療法に使用できる医薬化合物には、（１）ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）などの「血管新生分子」放出の阻害剤；（２）抗βｂＦＧＦ抗体などの血管新生分子の中和剤；および（３）コラゲナーゼ阻害剤、基底膜代謝回転阻害剤、血管抑制性ステロイド、真菌由来血管新生阻害剤、血小板第４因子、トロンボスポンジン、Ｄ−ペニシラミンおよび金製剤などの関節炎薬、ビタミンＤ３アナログ、α−インターフェロンなどを含む、血管新生刺激に対する内皮細胞応答の阻害剤が含まれる。その他の血管新生の阻害剤として考えられるものについては、Ｂｌｏｏｄ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３２：８９−１１８（１９９０年），Ｍｏｓｅｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１４０８−１４１０（１９９０年），Ｉｎｇｂｅｒ等，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ，５９：４４−５１（１９８８年），および米国特許第５，０９２，８８５号，第５，１１２，９４６号，第５，１９２，７４４号，第５，２０２，３５２号，および第６，５７３，２５６号を参照。さらに、たとえば、ＶＥＧＦにより媒介される血管新生経路を遮断するペプチドまたは薬剤、エンドスタチンタンパク質または誘導体、アンジオスタチンのリシン結合フラグメント、メラニンまたはメラニン促進化合物、プラスミノーゲンフラグメント（例えばプラスミノーゲンのクリンゲル１−３）、トロポニンサブユニット、ビトロネクチンαｖβ３のアンタゴニスト、サポシンＢに由来するペプチド、抗生物質またはアナログ（例えばテトラサイクリン、またはネオマイシン）、ジエノゲストを含む組成物、ペプチドに結合されたＭｅｔＡＰ−２を抑制する核を含む化合物、化合物ＥＭ−１３８、カルコンおよびそのアナログ、ｎａａｌａｄａｓｅ阻害剤など、血管新生を阻害するために様々な化合物を使用できる。たとえば、米国特許第６，３９５，７１８号、第６，４６２，０７５号、第６，４６５，４３１号、第６，４７５，７８４号、第６，４８２，８０２号、第６，４８２，８１０号、第６，５００，４３１号、第６，５００，９２４号、第６，５１８，２９８号、第６，５２１，４３９号、第６，５２５，０１９号、第６，５３８，１０３号、第６，５４４，７５８号、第６，５４４，９４７号、第６，５４８，４７７号、第６，５５９，１２６号、および第６，５６９，８４５号を参照。
【０１２１】
組み合わせ療法の性質に応じて、他の療法の実施の間および／または後に、抗ＣＤ２００抗体の投与が続けられうる。抗体の投与は、単回投与または多回投与で行われうる。いくつかの場合には、抗ＣＤ２００抗体の投与は、従来の療法よりも少なくとも数日前に開始され、他の場合には、従来の療法の直前または実行時に投与が開始される。いくつかの場合には、抗ＣＤ２００抗体は他の療法の後に投与され、または他の療法と交互に投与されうる。
【０１２２】
本抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで癌細胞を直接破壊または除去しうる。直接的な破壊には、このような治療を必要とする被験体に、（選択的に細胞毒性薬に融合された）抗体を投与することを伴う。抗体が、癌細胞上のＣＤ２００を認識するため、抗体が結合したそのような細胞がいずれも破壊される。癌細胞を破壊または除去するために抗体が単独で使用される場合には、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣなどの宿主体内の免疫機能を引き起こすことにより、このような破壊または除去が行われうる。抗体がこのようにして細胞を破壊するかを測定するアッセイは、当業者の技術の範囲内である。
【０１２３】
したがって、一実施形態においては、本開示の抗体を用いて、様々な細胞毒性化合物を送達しうる。任意の細胞毒性化合物を、本抗体に融合しうる。融合は、化学的または遺伝子的に達成されうる（例えば、単一の融合分子としての発現による）。細胞毒性化合物は、ポリペプチドなどの生物学的製剤、または小分子でありうる。当業者に公知であるように、小分子には化学的融合が用いられ、生物学的化合物には化学的または遺伝子的融合のいずれも用いられうる。
【０１２４】
細胞毒性化合物の非限定的な例には、治療薬、放射線を発する化合物、植物、真菌、細菌の分子、生体タンパク質、およびこれらの混合物が含まれる。細胞毒性薬は、例えば、短飛程高エネルギーのα放射体を含む短飛程放射体など、細胞内に作用する細胞毒性薬でありうる。酵素活性毒素およびそのフラグメントの例は、ジフテリアトキシンＡフラグメント、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、（シュードモナス−アエルギノーザの）外毒素Ａ、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サクリン（ａｌｐｈａ−ｓａｃｒｉｎ）、一定のシナアブラギリタンパク質、一定のジアンシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（Ｍｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）の阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、マイトジリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシンなどである。イムノトキシンの酵素活性ポリペプチドを調製するための手順は、国際公開第８４／０３５０８号および第８５／０３５０８号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。一定の細胞毒性部分は、例えばアドリアマイシン、クロランブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルチノスタチン、およびプラチナから得られる。
【０１２５】
抗体を細胞毒性薬と結合するための手順は既述されており、当業者の技術の範囲内である。
【０１２６】
あるいは、抗体は、腫瘍部位に局在化するといくつかの細胞直径の破壊がもたらされる高エネルギー放射体、たとえばγ放射体１３１ｌなどのラジオアイソトープに結合されうる。たとえば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ等．（編），ｐｐ３０３−３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照。他の適切なラジオアイソトープには、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉおよび２１１Ａｔなどのα放射体、および１８６Ｒｅおよび９０Ｙなどのβ放射体が含まれる。
【０１２７】
いくつかの実施形態においては、本ＣＤ２００結合抗体は、ＣＤ２００を介して白血病細胞を直接標的とすることにより、ＣＬＬにおいて免疫抑制をブロックする利益を提供する。特に、免疫系の刺激により、脾臓およびリンパ節からのＣＬＬ細胞の根絶が可能になる。出願人は、単純にＢ細胞を標的とする薬剤（アレムツズマブなど）により達成された、これらの微細環境からのＣＬＬ細胞の根絶の成功を知らない。これに対して、ＣＬＬ反応性Ｔ細胞は、抗体よりも良好にこれらの臓器に到達しうる。他の実施態様においては、抗ＣＤ２００抗体によりＣＬＬ細胞を標識することにより、直接的な細胞破壊が達成される。
【０１２８】
本開示の組成物および方法によれば、特に有用な実施形態では、直接的な細胞破壊と免疫反応のＴｈ１プロフィルへのシフトの組み合わせは、癌治療に特に強力なアプローチを提供する。したがって、一実施形態においては、ＣＤ２００に結合し、ａ）ＣＤ２００とそのレセプターの間の相互作用をブロックし、かつｂ）ＣＤ２００を発現する癌細胞を直接破壊する抗体または抗体フラグメントが癌患者に投与される癌治療が提供される。癌細胞が破壊される機序には、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ；毒素との融合；放射標識との融合；グランザイムＢまたはパーフォリンなど、細胞破壊に関わる生物学的薬剤との融合；細胞傷害性ウイルスとの融合；ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αなどのサイトカインとの融合が含まれるが、これに限られない。代替的実施形態では、癌治療には、ａ）ＣＤ２００とそのレセプターの間の相互作用をブロックし、かつｂ）腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞活性を増強する抗体の投与が含まれる。このような細胞傷害性Ｔ細胞またはＮＫ細胞活性の増強は、例えば抗体をＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５などのサイトカインと融合させることにより組み合されうる。さらに、このような増強は、ＩＭｉＤｓ、サリドマイド、またはサリドマイドアナログなどの阻害剤と組み合わせた抗ＣＤ２００抗体の投与により達成されうる。
【０１２９】
さらに別の実施形態においては、癌治療には、（１）ＣＤ２００とそのレセプターの間の相互作用をブロックし、かつ（２）Ｔ細胞を腫瘍細胞に誘引する抗体の投与を伴う。抗体をＭＩＧ、ＩＰ−１０、Ｉ−ＴＡＣ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ５またはＬＩＧＨＴなどのケモカインと融合させることにより、Ｔ細胞の誘引が達成されうる。また、化学療法剤による治療が、ＬＩＧＨＴの所望のアップレギュレーションをもたらしうる。免疫抑制をブロックし、抗体による腫瘍細胞標的化により直接破壊するという行為の組み合わせは、効力の増大を提供する固有のアプローチである。
【０１３０】
本開示による抗ＣＤ２００抗体は、診断ツールとしても使用できる。単独または他の薬剤または方法（化学療法剤、放射線療法、免疫調節療法など）と組み合わせた抗ＣＤ２００療法の効力を予測するために、治療前に生検または癌細胞組織サンプルのＣＤ２００発現を試験しうる。例えば、造血癌の患者から得た血液を用いて、ＣＬＬ細胞にＣＤ３８およびＣＤ１９などの適切な癌細胞マーカーと組み合わせた抗ＣＤ２００抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって、癌細胞上のＣＤ２００発現が評価されうる。ＣＤ２００レベルが正常Ｂ細胞に見られるレベルを少なくとも１．４倍上回る患者は、抗ＣＤ２００抗体による治療に選択されうる。別の例としては、患者の悪性および正常細胞のＣＤ２００の発現を測定するために、患者からの組織サンプルが抗ＣＤ２００抗体で染色されうる。
【０１３１】
本抗ＣＤ２００抗体を診断または予測のツールとして使用する別の例においては、悪性腫瘍の患者からの生検が得られ、抗ＣＤ２００抗体を用いたＦＡＣＳ分析、または抗ＣＤ２００を用いた免疫組織化学により、ＣＤ２００の発現が測定される。腫瘍細胞が、対応する正常組織を少なくとも１．４倍上回るレベルでＣＤ２００を発現する場合には、癌患者は免疫調節療法（抗ＣＤ２００療法を含む療法を含むがこれに限らない）に選択される。ＣＤ２００を通常発現しない細胞に由来する癌の場合には、癌生検における任意の検出可能なＣＤ２００は、抗ＣＤ２００療法の潜在的有用性を示す。免疫調節療法は、抗ＣＤ２００療法でありうるが、患者の免疫系に作用する任意の他の療法でもありうる。好適な免疫調節療法の例には、Ｔ細胞または抗原提示細胞の負の調節をブロックする薬剤（例えば抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＤＬ−２、抗ＰＤ−１）の投与、またはＴ細胞の正の副刺激を増強する薬剤（例えば抗ＣＤ４０または抗４−１ＢＢ）の投与が含まれる。さらに、免疫調節療法は、細胞傷害性Ｔ細胞を生成するヘテロクリティックペプチド（ｈｅｒｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）または腫瘍細胞ペプチドまたは腫瘍細胞を取り込んだ樹状細胞などの癌ワクチン、またはＮＫ細胞数またはＴ細胞活性を増大させる薬剤（例えば、単独またはＩＭｉＤｓ、サリドマイド、またはサリドマイドアナログなどの阻害剤と組み合わせた抗ＣＤ２００抗体）の投与、または制御性Ｔ細胞（例えば単独またはＯＮＴＡＫと組み合わせた抗ＣＤ２００抗体）または形質細胞様樹状細胞を除去する薬剤の投与でありうる。例えばＳＰＡＲＣをブロックする任意の薬剤など、Ｔ細胞または樹状細胞の移動を増加させる薬剤との組み合わせも有利である。さらに、免疫調節療法は、腫瘍細胞を取り込んだ樹状細胞などの癌ワクチン、患者から得たエキソソームの腫瘍ＲＮＡまたは腫瘍ＤＮＡ、腫瘍タンパク質または腫瘍ペプチド、患者から得た熱ショックタンパク質（ｈｓｐ’ｓ）、腫瘍抗原を取り込んだｈｓｐ’ｓ、またはＣｐＧ、Ｌｕｉｖａｃ、Ｂｉｏｓｔｉｍ、Ｒｉｂｏｍｉｎｙｌ、Ｉｍｕｄｏｎ、Ｂｒｏｎｃｈｏｖａｘｏｍなど様々なレベルで免疫系を刺激する一般的な補助剤、または先天性免疫系のレセプターを活性化する他の任意の化合物（例えば、トールライクレセプター）でありうる。また、療法には、サイトカイン、たとえばＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γなどによる治療が含まれうる。たとえばＭＡＰキナーゼ阻害剤など、腫瘍の環境において低下した樹状細胞の活性を回復する薬剤との組み合わせも考えられる。
【０１３２】
一実施形態においては、本抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏで癌細胞を検出することもできる。ｉｎ  ｖｉｖｏの検出は、抗体を標識し、標識抗体を被験体に投与してから、被験体を画像診断することにより達成される。本開示による画像診断に有用な標識の例は、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、および１８８Ｒｈなどの放射標識、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放出断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナにより検出可能なポジトロン放出同位元素、ルシフェリンなどの化学発光物質、および、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼなどの酵素マーカーである。経直腸プローブ等の短距離検出用プローブによって検出可能な同位体などの短飛程放射体も使用されうる。従来技術で周知の方法を使用して、抗体をこのような試薬により標識しうる。抗体の放射標識に関する技術については、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷｅｎｓｅｌおよびＭｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８３年）を参照。参照により本明細書に組み込まれる、Ｄ．Ｃｏｌｃｈｅｒ等，“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  Ａｔｈｙｍｉｃ  Ｍｉｃｅ”，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６（１９８６年）も参照。
【０１３３】
本開示による放射標識抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断検査に用いられうる。抗体、その結合部分、プローブ、またはリガンドの比放射能は、放射性標識の半減期、同位体の純度、および標識が生物学的薬剤にどのように組み込まれるかに依存する。イムノアッセイ試験においては、比放射能が高いほど、一般に感受性が高い。放射性同位元素により抗体を標識するための手順は、従来技術において一般に公知である。
【０１３４】
放射標識された抗体は、患者に投与され、抗体が反応する抗原をもつ癌細胞に局所化され、たとえばガンマ線カメラまたは放射トモグラフィーを用いた放射性核スキャン（ｒａｄｉｏ  ｎｕｃｌｉｄｅ）などの公知の技術を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで検出または「造影」される。たとえば、参照により本明細書に組み込まれるＡ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ等，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ等，（編），ｐｐ．６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５年）を参照。あるいは、放射標識が陽電子（例えば１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、および１３Ｎ）を放射する場合には、ブルックヘブン国立研究所にある所定のＰｅｔＶＩなどの陽電子放射形体軸横断断層撮影法スキャナが使用されうる。
【０１３５】
従来技術で周知の標準的な成分から、蛍光団および発色団で標識された生物学的薬剤が調製されうる。抗体および他のタンパク質は、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するため、３１０ｎｍ、および好ましくは４００ｎｍを超える波長で実質的吸収を有するように蛍光部分が選択されなければならない。様々な適切な蛍光剤および発色団が、参照により本明細書に組み込まれるＳｔｒｙｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６（１９６８年）およびＢｒａｎｄ，Ｌ．等，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８（１９７２年）により記載される。抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，９４０，４７５号、第４，２８９，７４７号、および第４，３７６，１１０号に開示されるものなどの従来の手順により、蛍光発色団群で標識されうる。
【０１３６】
本開示による別の実施形態においては、治療の進行および／または有効性をモニタする方法が提供される。方法には、免疫調節療法を行うステップと、療法の有効性を測定するために、被験体におけるＣＤ２００レベルを少なくとも二回測定するステップを伴う。例えば、ＣＤ２００の治療前のレベルが確認され、療法を少なくとも一回行った後、ＣＤ２００のレベルが再測定されうる。ＣＤ２００レベルの減少は、治療の有効性を表す。実務家は、ＣＤ２００レベルの測定を、療法の投与量または頻度を増加させる上でのガイドとして使用しうる。当然のことながら、ＣＤ２００レベルが直接モニタされても、あるいは、ＣＤ２００と関連する任意のマーカーがモニタされてもよい。この療法の有効性を測定する他の方法には、癌細胞、全リンパ球数、リンパ節サイズ、制御性Ｔ細胞の数、血清または細胞内のサイトカインプロフィル、または  ＥＬＩＳＰＯＴで測定されるＴまたはＢ細胞によるサイトカインの分泌の検出が含まれるがこれに限られない。
【０１３７】
Ｃ．他のＣＤ２００アンタゴニスト
本開示において利用されるＣＤ２００アンタゴニストおよびポリペプチドおよび／または抗体は、本明細書に記載の診断および治療用途に特に適用される。したがって、ＣＤ２００アンタゴニストおよび抗ＣＤ２００抗体およびその変異体は、併用療法を含む療法、病気の診断および予測、ならびに病気進行のモニタリングにおいて使用されうる。
【０１３８】
本開示の治療の実施形態においては、二重特異性抗体が考えられる。二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、単クローン、好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。本ケースでは、結合特異性の一つは、細胞（例えば癌細胞または免疫細胞など）上のＣＤ２００抗原に対するものであり、もう一つは、他の任意の抗原、および好ましくは細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットに対するものである。
【０１３９】
二重特異性抗体を作製する方法は、当業者の技術の範囲内である。従来は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を有する、二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３年））。所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）が、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合されうる。融合は、少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインとなされるのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合、および、必要な場合には免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡｓが、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物へ同時トランスフェクションされる。二重特異性抗体を作製するための、代表的な現在公知の方法のさらなる詳細については、たとえばＳｕｒｅｓｈ等，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６年）；国際公開第９６／２７０１１号；Ｂｒｅｎｎａｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５年）；Ｓｈａｌａｂｙ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２年）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２年）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３年）；およびＧｒｕｂｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４年）；およびＴｕｔｔ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１年）を参照。二重特異性抗体には、架橋またはヘテロ結合抗体も含まれる。ヘテロ結合抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて作製されうる。適切な架橋剤は公知技術であり、多くの架橋技術とともに、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に開示されている。
【０１４０】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離する様々な技術も記載されている。例えば、ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体が産出されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２年）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、遺伝子融合により二つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合されうる。抗体ホモ二量体がヒンジ領域で還元されてモノマーが形成された後、再酸化されて抗体ヘテロ二量体が形成されうる。この方法は、抗体ホモ二量体の産出にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３年）に記載の「ダイアボディー」技術によって、二重特異性抗体フラグメントを作製する代替的な仕組みが提供されている。フラグメントは、同じ鎖上の二つのドメイン間では対を形成できない短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合された、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対を形成させられ、その結果、二つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用して二重特異性抗体フラグメントを作製する別の方法も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４年）を参照。あるいは、抗体は、Ｚａｐａｔａ等．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５年）に記載される「リニア抗体」でありうる。簡単にいうと、これらの抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメントの対を含む（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）。リニア抗体は、二重特異性または単一特異性でありうる。
【０１４１】
Ｄ．投与および製剤の方法
本開示の抗体の投与経路は（純粋な抗体、標識抗体、毒素に融合された抗体などいずれでも）、例えば経静脈、腹腔内、脳内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、髄腔内、吸入または病巣内経路による注射または注入、または徐放システムなど、公知の方法による。抗体が、注入またはボーラス注射により連続投与されるのが好ましい。局所的または全身的に抗体を投与しうる。
【０１４２】
本抗体は、薬理学上許容可能な担体との混合物において調製されうる。本出願の化合物の製剤および投与の技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡの最新版に見られる。本治療組成物は、静脈内または鼻または肺から、好ましくは液体または粉剤エアゾール（凍結乾燥）として投与されうる。組成物は、必要に応じて、非経口または皮下投与されてもよい。全身投与される場合には、治療組成物は無菌であり、発熱性物質を実質的に含まず、ｐＨ、等張性、および安定性を考慮した、非経口的に許容できる溶液でなければならない。例えば、製剤は、人間の治療薬としての投与に適するように、発熱性物質を実質的に含まない。これらの条件は、当業者に公知である。
【０１４３】
使用に適しする医薬組成物には、本抗体の一つ以上が、その目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。より具体的には、治療的に有効な量とは、病気の症状を防止、緩和、または改善する上で、または治療される被験体の生存を延長する上で有効な、抗体の量を意味する。治療的に有効な量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示を考慮した当業者の能力の範囲内である。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法を用いて、治療的に有効な投与量が決定されうる。
【０１４４】
以上の開示は抗体に関するが、いくつかの実施形態では、このような抗体に由来するポリペプチドを本開示にしたがって利用できる。
【実施例】
【０１４５】
マウスモデルおよびＣＤ２００＋細胞の構築
Ｒａｊｉ／ＰＢＬモデル
ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、４×１０６ＲＡＪＩ細胞（ＡＴＣＣ）を０、１００、５００または１，０００万のＰＢＬｓとともに含む２００μｌのＲＰＭＩがｓ．ｃ．注射された。一群あたり九匹または十匹のマウスが含まれた。ヒストパック勾配により２５０ｍｌの全血液からＰＢＬｓが単離された後、０．９％の塩化アンモニウムを用いて赤血球が溶解された。ノギスで長さおよび幅を測定することにより、腫瘍成長が一週間に三回モニタされた。長さ×幅×幅／２に基づいて腫瘍の体積が計算された。
【０１４６】
腫瘍細胞のみを受けた群と比較した、ＰＢＬｓを注射された群の差が、不対両側スチューデントのｔ検定により分析された。５００または１，０００万のＰＢＬｓを受けた群において有意差が観察されたが、３２日目以降１，０００万のＰＢＬｓを受けた群では観察されなかった。
【０１４７】
Ｎａｍａｌｗａ  ＰＢＬモデル
ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバー）に、４×１０６Ｎａｍａｌｗａ細胞（ＡＴＣＣ）を０、２００または１，０００万のＰＢＬｓとともに含む２００μｌのＲＰＭＩがｓ．ｃ．注射された。一群あたり９〜１０匹のマウスが含まれた。ヒストパック勾配により２５０ｍｌの全血液からＰＢＬｓが単離された後、０．９％の塩化アンモニウムを用いて赤血球が溶解された。ノギスで長さおよび幅を測定することにより、腫瘍成長が一週間に三回モニタされた。長さ×幅×幅／２に基づいて腫瘍の体積が計算された。
【０１４８】
安定したＣＤ２００発現細胞株の作製
Ｖｉｒａｐｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、安定したＣＤ２００発現ＲａｊｉおよびＮａｍａｌｗａ細胞株が作製された。フォワードプライマー
【０１４９】
【化１】
0005404052.tif 000002
（配列番号３４）およびリバースプライマー
【０１５０】
【化２】
0005404052.tif 000003
（配列番号３５）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより、初代ＣＬＬ細胞からＣＤ２００のｃＤＮＡが単離された。ＧａｔｅｗａｙエントリベクターｐＣＲ８／ＧＷ／ＴＯＰＯ−ＴＡにＰＣＲ産物がクローニングされ、個々のクローンの配列が決定された。Ｇａｔｅｗａｙ技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、正しい配列を有するクローンが、レンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴおよびｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ／Ｖ５／ＤＥＳＴに、センスおよびアンチセンス方向に組み込まれた。これらの二つのベクター間の主な違いは、ＣＤ２００を発現させるために用いられるプロモータである。ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５／ＤＥＳＴは、ヒトＣＭＶ最初期プロモータを含み、ｐＬｅｎｔｉ６／ＵｂＣ／Ｖ５／ＤＥＳＴは、ヒトユビキチンＣプロモータを含む。
【０１５１】
製造者により推奨されるように、２９３−ＦＴ細胞の一時的同時トランスフェクションにより、高力価のＶＳＶ−Ｇ偽型レンチウイルスストックが産出された。１２μｇ／ｍｌのポリブレンを含む１ｍｌの増殖培地に１０６細胞を再懸濁し、１ｍｌのレンチウイルスストックを加えることにより、ＲａｊｉまたはＮａｍａｌｗａ細胞が形質導入された。３７℃で一晩細胞をインキュベートした後、ウイルスを含む培地が除去され、４ｍｌの新しい培地に交換された。二日後に、フローサイトメトリにより、感染細胞のＣＤ２００発現が分析された。全ての実験において、細胞の≧７０％がＣＤ２００＋であったが、親細胞株、および陰性対照（アンチセンスＣＤ２００）ウイルスで形質導入された細胞においては、ＣＤ２００が検出されなかった。
【０１５２】
ＣＤ２００を過剰発現するクローン細胞株を単離するために、１３日間ブラストサイジンにより感染細胞が選択された。使用されたブラストサイジンの濃度は、Ｒａｊｉ細胞の場合には６μｇ／ｍｌ、またはＮａｗａｌｗａ細胞の場合には２μｇ／ｍｌであった。そして、９６穴プレートでのブラストサイジン耐性細胞の限界希釈により、安定したクローンが単離された。ＰＥ結合マウス抗ヒトＣＤ２００（クローンＭＲＣ  ＯＸ１０４、Ｓｅｒｏｔｅｃ）およびハイスループットサンプラを備えるＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いたフローサイトメトリにより、９６穴フォーマットにおいてクローンがスクリーニングされた。合計２０００のＲａｊｉおよび２０００のＮａｍａｌｗａクローンがスクリーニングされた後、ＣＤ２００発現が最も多いクローンが、さらなる特徴づけのために従来の技術を用いて増殖させられた。
【０１５３】
実施例１
ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００／ＰＢＬモデルにおけるヒト化型のＣ２ａＢ７の効力
Ａ）Ｃ２ａＢ７のヒト化型が、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルにおいて効力を維持するかを評価するために、キメラＣ２ａＢ７（米国特許出願公開第２００５／０１２９６９０号を参照）および三つのヒト化型（Ｃ２ａＢ７Ｖ４Ｖ１、Ｃ２ａＢ７Ｖ３Ｖ１およびＣ２ａＢ７Ｖ３Ｖ２）、ならびに陰性対照の抗体ａｌｘｎ４１００が、ＲＡＪＩ−ＣＤ２００／ＰＢＬモデルにおいて試験された。ＣＤ２００を形質導入されたＲＡＪＩ細胞が、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウスにｓ．ｃ．注射され、キメラまたはヒト化Ｃ２ａＢ７抗体または対照抗体ａｌｘｎ４１００（腫瘍細胞に結合しない）の存在または非存在下において、ＰＢＬｓが腫瘍成長を抑える能力が評価された。以下に示される濃度の抗体が、最初に腫瘍細胞とともに、その後は二回／週ｉ．ｖ．投与された。以下の群が、それぞれ１０匹のマウスで構成された：
群１：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．
群２：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ
群３：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇＣ２ａＢ７
群４：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇＣ２ａＢ７Ｖ４Ｖ１
群５：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇＣ２ａＢ７Ｖ４Ｖ１
群６：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇＣ２ａＢ７Ｖ３Ｖ１
群７：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇＣ２ａＢ７Ｖ３Ｖ１
群８：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇＣ２ａＢ７Ｖ３Ｖ２
群９：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇａｌｘｎ４１００。
【０１５４】
腫瘍の長さおよび幅が、週に３回測定され、腫瘍の長さ＊幅＊幅／２に基づいて腫瘍の体積が計算された。図１８は、予期されたとおり、腫瘍細胞上のＣＤ２００発現により、免疫細胞による腫瘍成長の抑制が妨げられたことを示す。Ｃ２ａＢ７のヒト化型は全て、２０ｍｇ／ｋｇの投与量で、腫瘍成長を最高９７％ブロックした。対照抗体ａｌｘｎ４１００は、腫瘍成長に影響しなかった。これらのデータは、全てのヒト化抗体が、腫瘍成長を非常に有効にブロックすることを示す。
【０１５５】
Ｂ）ＣＤ２００による免疫回避
ヒトの免疫系は、多くの癌の種類に対して免疫反応を高めうるが、その反応は、大部分の患者においては、癌を根絶するのに不十分である。これはおそらく、腫瘍による免疫系の負の調節による免疫回避が原因である。我々は、検査された全ての患者（ｎ＝８０）において、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞の免疫抑制分子ＣＤ２００が１．５〜５．４倍にアップレギュレーションされることを特定した。ＣＤ２００の、そのレセプターとの相互作用は、混合リンパ球反応においてサイトカインプロフィルをＴｈ１からＴｈ２に変化させ、腫瘍特異的エフェクターＴ細胞の免疫を妨げると考えられる制御性Ｔ細胞の誘発をもたらすことが知られている。本研究においては、異種移植ｈｕ／ＳＣＩＤマウスモデルにおいて、腫瘍細胞上のＣＤ２００発現が免疫回避に関与し、これにより免疫系による腫瘍細胞の排除を妨げるのか、および、抗ＣＤ２００アンタゴニスト抗体による治療がこのモデルにおける腫瘍成長に影響するかを調べた。
【０１５６】
ヒト非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫細胞株ＲＡＪＩおよびＮａｍａｌｗａに、ヒトＣＤ２００が形質導入され、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）と共に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下注射された。ＣＤ２００を発現する腫瘍細胞を受けたマウスにおける腫瘍成長が、ＣＤ２００を発現しない腫瘍細胞を受けたマウスの腫瘍成長と、時間とともに比較された。後の実験においては、キメラまたはヒト化抗ＣＤ２００抗体（投与量範囲１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射により、マウスが治療された。腫瘍細胞の注射の直後または７日後に、治療が開始された。
【０１５７】
ＰＢＭＣｓは、ＣＤ２００発現の非存在下では、ＲＡＪＩまたはＮａｍａｌｗａの腫瘍成長を最高７５％抑制した。これに対して、ＣＬＬに相当するレベルでＣＤ２００を発現するＲＡＪＩまたはＮａｍａｌｗａの腫瘍成長は、ＰＢＭＣｓにより抑制されなかった。５ｍｇ／ｋｇでの抗ＣＤ２００抗体の投与により、腫瘍細胞の注射から７日後に治療が開始された場合であっても、研究の間にほぼ完全な腫瘍成長阻害が生じた（１／１０のマウスに小さな腫瘍が生じた）。
【０１５８】
腫瘍細胞上のヒトＣＤ２００の存在は、腫瘍細胞を根絶するヒトリンパ球の能力を阻害する。抗ＣＤ２００アンタゴニスト抗体による、ＣＤ２００を発現する腫瘍の治療は、腫瘍成長を阻害し、抗ＣＤ２００療法がＣＬＬへの有望なアプローチである可能性を示す。
【０１５９】
Ｃ）Ｃ２ａＢ７Ｇ１コンストラクトの効力対Ｃ２ａＢ７Ｇ２／Ｇ４コンストラクトの効力
エフェクター機能を伴わない抗ＣＤ２００抗体（以下に述べるＣ２ａＢ７のＧ２／Ｇ４融合コンストラクト）が、Ｇ１コンストラクトと同じくらい有効、またはより有効かを評価するために、Ｇ１およびＧ２／Ｇ４型ならびにヒト化型のＣ２ａＢ７（ａｌｘｎ５２００）が、Ｒａｊｉ＿ＣＤ２００／ＰＢＬモデルで試験された。上述のようにＣＤ２００を形質導入したＲＡＪＩ細胞が、ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃ＜ｓｃｉｄ＞マウスにｓ．ｃ．注射され、キメラ抗ＣＤ２００抗体ｃ２ａＢ７Ｇ１（ｃ２ａＢ７）、ｃ２ａＢ７Ｇ２／Ｇ４またはヒト化型ｈＣ２ａＢ７Ｖ３Ｖ１Ｇ１（Ｖ３Ｖ１）、またはｈＣ２ａＢ７Ｖ３Ｖ２Ｇ１（Ｖ３Ｖ２）または対照抗体ａｌｘｎ４１００の存在または非存在下で、ＰＢＬｓが腫瘍成長を抑える能力が評価された。以下に示される濃度の抗体が、最初に腫瘍細胞とともに、その後は二回／週ｉ．ｖ．投与された。以下の群が、それぞれ１０匹のマウスで構成された：
群１：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．
群２：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ
群３：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ｈＶ３Ｖ２−Ｇ１
群４：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇ  ａｌｘｎ５２００
群５：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２．５ｍｇ／ｋｇ  ａｌｘｎ５２００
群６：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋１ｍｇ／ｋｇ  ａｌｘｎ５２００
群７：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ｃｈＣ２ａＢ７Ｇ２／Ｇ４
群８：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇ  ｃｈＣ２ａＢ７Ｇ２／Ｇ４
群９：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２．５ｍｇ／ｋｇ  ｃｈＣ２ａＢ７Ｇ２／Ｇ４
群１０：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋１ｍｇ／ｋｇ  ｃｈＣ２ａＢ７Ｇ２／Ｇ４
群１１：４×１０６ＲＡＪＩ＿ＣＤ２００ｓ．ｃ．＋６×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ａｌｘｎ４１００。
【０１６０】
腫瘍の長さおよび幅が、週に三回測定され、腫瘍の長さ＊幅＊幅／２に基づいて腫瘍の体積が計算された。図１９は、予期されたとおり、腫瘍細胞上のＣＤ２００発現により、免疫細胞による腫瘍成長の抑制が妨げられたことを示す。しかし、抗ＣＤ２００抗体を加えたことにより、腫瘍体積が最大で１００％減少した。２０ｍｇ／ｋｇのＣ２ａＢ７Ｇ１により、６／１０のマウスにおいて小さな腫瘍の成長が生じたが、２０ｍｇ／ｋｇのＣ２ａＢ７Ｇ２／Ｇ４で治療された群では１匹のマウスだけ腫瘍が成長し、Ｇ２／Ｇ４型が、Ｇ１型を上回るか、少なくとも同程度の効力をもたらしうることが示唆された。ヒト化型を含めた全ての抗ＣＤ２００抗体が、５ｍｇ／ｋｇで腫瘍成長を完全にブロックした。対照抗体による治療は、腫瘍成長を抑制しなかった。これらのデータは、Ｃ２ａＢ７のＧ２／Ｇ４型が、ＣＤ２００を発現する腫瘍の腫瘍成長を非常に有効にブロックすることを裏付ける。これらのデータにより、Ｃ２ａＢ７のヒト化型が、このモデルにおいて腫瘍成長を非常に有効にブロックすることも確認される。
【０１６１】
Ｄ）Ｇ２／Ｇ４コンストラクトの作製
まずヒトＣＨ１領域のＡｇｅＩ部位から、終止コドンを通って、ＳＶ４０ポリＡシグナル後に位置するＢａｍＨＩ部位までのＩｇＧ１領域を置換することにより、二つのステップでプラスミドが改変された。Ｃ２ａＢ７−６およびｃＣ７  Ｇ２Ｇ４（Ｌ−ＳＩＧＮ抗体）が、ＡｇｅＩおよびＢａｍＨＩにより消化され、Ｃ２ａＢ７−６がＣＩＰにより処理された。Ｃ２ＡＢ７−６の１０，３１５ｂｐフラグメントおよびｃＣ７  Ｇ２Ｇ４の１７５２ｂｐフラグメントが、電気泳動およびゲル抽出により精製された。これらのフラグメントがライゲーションされ、ＸＬ１Ｂｌｕｅ大腸菌にエレクトロポレーションされ、ＬＢ／ｃａｒｂ／ｇｌｕｃプレートにプレートされた。溶液中でコロニーが増殖させられ、Ｑｉａｇｅｎミニプレップカラムを用いてＤＮＡが単離された。１４１９ｂｐの一つのバンドに対して２６７および１１５２ｂｐの二つのバンドを生成するＰｖｕＩＩ消化により、ＩｇＧ１フラグメントに対する、ＩｇＧ２Ｇ４  ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントの存在が確認された。クローン２１が、さらなる使用のために選択された。
【０１６２】
可変領域の末尾からＡｇｅＩ部位までのＣＨ１領域の残部は、重複ＰＣＲを用いてＩｇＧ２／Ｇ４フォーマットで作製された。プラスミドｃＣ７  Ｇ２Ｇ４の産出において、ＣＨ１領域の始まりからＡｇｅＩ部位を通るＣＨ１領域を含むＰＣＲフラグメントが前もって作製された。Ｇ２Ｇ４  ６３Ｌ１Ｄをテンプレートとして、Ｃ７ｍｈＨＦ（
【０１６３】
【化３】
0005404052.tif 000004
，配列番号１）およびＲｅｖ  Ａｇｅ  Ｐｒｉ（
【０１６４】
【化４】
0005404052.tif 000005
，配列番号２）をプライマーとして用いてＰＣＲ反応が行われ、１４２ｂｐフラグメントが生成された。Ｆａｂ  Ｃ２ａＢ７をテンプレートとして、Ｃ２ａＢ７ｒｅｖ（
【０１６５】
【化５】
0005404052.tif 000006
，配列番号３）およびｌａｃｐｒｉ（
【０１６６】
【化６】
0005404052.tif 000007
，配列番号４）をプライマーとして用いて、約１２５０ｂｐのフラグメントのマウス重鎖可変領域（および上流）が生成された。これらのフラグメントは、電気泳動およびゲル抽出により精製され、プライマーＲｅｖＡｇｅＰｒｉ（
【０１６７】
【化７】
0005404052.tif 000008
，配列番号２）およびＬｅａｄＶＨｐＡＸ（
【０１６８】
【化８】
0005404052.tif 000009
，配列番号５）による重複ＰＣＲにおいて用いられて５５８ｂｐのフラグメントが作製され、ＰＣＲ精製カラムで精製された。この５５８ｂｐのフラグメントおよびクローン２１が、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩにより消化されて４５８ｂｐのフラグメントが生成され、電気泳動およびゲル抽出により精製された。また、クローン２１は、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩにより消化され、ＣＩＰで処理され、１１．６ｋｂのフラグメントが電気泳動およびゲル抽出により精製された。これらのフラグメントがライゲーションされ、ＸＬ１Ｂｌｕｅ大腸菌にエレクトロポレーションされ、ＬＢ／ｃａｒｂ／ｇｌｕｃプレートにプレートされた。クローンＣ２ａＢ７Ｇ２Ｇ４．１１は、ＰｖｕＩＩにより消化すると、期待通りの制限フラグメントを有することが認められた。
【０１６９】
最終コンストラクトＣ２ＡＢ７Ｇ２Ｇ４．１１の配列が決定された。軽鎖のカルボキシ末端に追加的な６アミノ酸が加えられるように、軽鎖のＴＡＡ終止コドンが配列ＴＣＡに変異していることが分かった。それは、Ｃ２ＡＢ７Ｇ２Ｇ４．１１の親であるＩｇＧ１型のクローンＣ２ＡＢ７−６に存在することが分かった。Ｇ２Ｇ４コンストラクトを含む抗体が、図１０、１１、１２、１３、および１５に示される。
【０１７０】
実施例２
癌細胞のＣＤ２００発現
Ａ．ＣＬＬ患者におけるＣＤ２００アップレギュレーションの測定
１５人のＣＬＬ患者からのリンパ球が、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ５（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ結合抗ＣＤ１９（ｅ−ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＰＥ結合抗ＣＤ２００（Ｓｅｒｏｔｅｃ）により染色された。健康なドナーからのリンパ球が、同様に染色された。ＣＤ５＋ＣＤ１９＋細胞のＣＤ２００発現が測定された。図２０に示されるように、ＣＤ２００の発現レベルはＣＬＬ患者試料の間で異なったが、全てのＣＬＬ試料に、正常Ｂ細胞のＣＤ２００発現と比較して高いレベル（１．６〜４倍の範囲）のＣＤ２００発現が見られた。高いレベルのＣＤ２００発現が見られるＣＬＬ患者が、本明細書に記載される方法による抗ＣＤ２００治療に選択される。
【０１７１】
Ｂ．癌細胞株のＦＡＣＳ分析
黒色腫癌患者、前立腺癌患者、神経グリア芽細胞腫患者、神経膠星状細胞腫患者、神経芽細胞腫患者、卵巣癌患者、肺癌患者および腎臓癌患者からのＮＣＩ６０細胞株のパネルを用いたＦＡＣＳ分析により、ＣＤ２００発現が評価された。製造者の説明（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にしたがい、Ｚｅｎｏｎ−Ａｌｅｘａ４８８により、Ｃ２ａＢ７が標識された。５０万〜１００万細胞が、１μｇの標識抗体で２０分間染色された後、ＰＢＳで洗浄された。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて、細胞染色が評価された。抗体で標識された細胞の染色が、標識されないままの試料と比較され、染色／非染色の比率が測定された。図２１においては、１より大きいが２より小さい比率が＋／−、２と３の間の比率が＋、３と１０の間は＋＋、＞１０が＋＋＋と表わされる。神経グリア芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、前立腺または肺癌について試験された細胞株はいずれもＣＤ２００を発現せず、下に列挙されていない。試験された黒色腫細胞株の４／５、卵巣癌細胞株の２／２、腎臓細胞株の２／３、神経芽細胞腫細胞株の２／２、および乳癌細胞株の１／３が、細胞表面上にＣＤ２００を検出可能なレベルで発現し、固形腫瘍もＣＤ２００を免疫回避機序として用いる可能性があることが示唆された。
【０１７２】
Ｃ．患者試料のＲＴ−ＱＰＣＲ
細胞株だけでなく、一次患者試料においてもＣＤ２００がアップレギュレーションされているかを確認するために、一次患者試料のＲＴ−ＱＰＣＲおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）が行われた。Ｃｙｔｏｍｉｘから、卵巣および黒色腫患者からの試料が得られた。ｃＤＮＡが調製され、１０ｎｇ／ｒｎｌイーストＲＮＡで、試料が１：１００および１：１０００に希釈された。ＡＢＩにより提供されるＣＤ２００アッセイＨｓ００２４５９７８＿ｍｌにより、試料のＱＰＣＲが行われた。１８Ｓ標準化のために、１：１０，０００に希釈された試料で、１８Ｓアッセイ（ＡＢＩ）が行われた。各希釈につき、アッセイが並行して二回実施された。卵巣および黒色腫患者試料が、ＣＬＬ患者試料とともに１８Ｓで標準化され、正常ＰＢＬと比較した発現倍率が測定された。図２２は、卵巣癌試料のＣＤ２００発現を示す。漿液性／漿液性転移／漿液性乳頭状は、ＣＤ２００の発現が正常ＰＢＬよりも１０〜２０倍多く、最も多いよう見受けられた。類内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｏｉｄ）、粘液性、および明細胞試料においては、ＣＤ２００発現が比較的低く、いずれも正常卵巣の発現レベル以下（正常ＰＢＬの１〜５倍）であった。
図２３は、いくつかの黒色腫転移試料のＣＤ２００発現レベルを示す：空腸、小腸、リンパ節、肺、皮膚、および脳）。これらの試料のいくつかは、対応対照／腫瘍であり、数（−１の対または−２の対）で表わされる。対応対照を伴わないその他の試料も、比較が行われた。空腸試料は、正常臓器よりもＣＤ２００発現レベルが有意に高く、転移試料は正常空腸よりも約４〜７倍高かった。
【０１７３】
Ｄ．一次患者試料の免疫組織化学
二つの冷凍された黒色腫患者試料（ＬｉｆｅＳｐａｎ）で、ＩＨＣが行われた。Ｄ１Ｂ５およびＣ２ａＢ７Ｆａｂフラグメントが、染色に用いられた。ＩｇＧ１抗体が、アイソタイプ対照として用いられた。一次抗体の結合が、抗マウス二次抗体およびＤＡＢクロマジェンにより検出された。
【０１７４】
図２４に示されるように、試験された両方の黒色腫試料で、抗ＣＤ２００抗体による強い膜の染色が見られたが、アイソタイプ対照による染色は見られなかった。正常皮膚組織には、ＣＤ２００染色が見られなかった。これらのデータにより、黒色腫および卵巣癌細胞株でだけでなく、一次的患者試料においてもＣＤ２００がアップレギュレーションされていることが示される。
【０１７５】
Ｅ．免疫抑制分子ＣＤ２００のアップレギュレーションによる黒色腫および卵巣腫瘍細胞の免疫回避
免疫回避は、癌進行の重要な特徴である。腫瘍は複数の機序により免疫系を回避でき、それぞれが免疫療法に対する重大な障害である。免疫療法の新規のより有効な形を実現するには、これらのプロセスならびに癌の間でのその類似性や相違の理解が必要である。慢性リンパ球性白血病細胞において免疫抑制分子ＣＤ２００がアップレギュレーションされることは、既に特定した。ＣＤ２００の存在が、有効な細胞傷害性Ｔ細胞反応に必要なＴｈ１サイトカイン産生をダウンレギュレーションする。我々は動物モデルにおいて、ヒト腫瘍細胞のＣＤ２００発現が、ヒトリンパ球による腫瘍拒絶を妨げ、抗ＣＤ２００アンタゴニスト抗体による治療が、腫瘍成長を阻害することを示した。この研究においては、他の癌にＣＤ２００のアップレギュレーションが見られるか、およびこれらの癌細胞のＣＤ２００発現が免疫反応に影響するかを評価した。
【０１７６】
卵巣腺癌（漿液性／漿液性転移／漿液性乳頭状、類内膜、粘液性、明細胞）および悪性黒色腫転移の患者試料のＲＴ−ＱＰＣＲにより、相対的ＣＤ２００メッセージレベルが定量された。
【０１７７】
ＣＤ２００の細胞表面発現が、二つの黒色腫および三つの卵巣悪性腫瘍（漿液性）患者凍結組織試料のＩＨＣにより、正常皮膚および正常卵巣と比較して評価された。黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２４およびＳＫ−ＭＥＬ−２８、および卵巣癌細胞株ＯＶ−ＣＡＲ−３の細胞表面上のＣＤ２００発現が、ＰＥで標識した抗ＣＤ２００抗体を用いたＦＡＣＳ分析により評価された。ヒト単球由来の樹状細胞と同種ヒトＴ細胞の培養に細胞を加えることにより、混合リンパ球反応においてサイトカインプロフィルに対するＣＤ２００発現癌細胞株の効果が評価された。ＥＬＩＳＡにより、上清中にサイトカイン産生（Ｔｈ１のＩＬ−２およびＩＦＮ−γ、Ｔｈ２のＩＬ４およびＩＬ１０）が検出された。
【０１７８】
定量ＰＣＲにより、漿液性卵巣腺癌試料において、正常ＰＢＬの最大２０倍、および、正常卵巣と同じかまたは最大４倍高いＣＤ２００発現レベルが示された。卵巣類内膜腺癌、卵巣粘液性腺癌、および卵巣明細胞腺癌試料のＣＤ２００発現は、正常卵巣のレベル以下だった。空腸への悪性黒色腫転移においては、ＣＤ２００発現レベルが、正常試料より大幅に高いように見受けられた。悪性黒色腫肺転位においては、２／６に正常試料を上回るＣＤ２００発現が見られた。
【０１７９】
ＩＨＣでは、両方の黒色腫患者の悪性細胞に、強い、特異的な、膜結合ＣＤ２００の染色が見られた。正常皮膚試料は、内皮細胞のわずかな染色が見られた。三人の卵巣癌患者の中では、一人に強いＣＤ２００染色が見られ、一人がやや陽性であり、一人にわずかに染色された腫瘍細胞の亜集団が見られた。三人いずれのケースにおいても、間質に強い染色が見られた。
【０１８０】
ＣＤ２００は、黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−２４およびＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞表面上、ならびに卵巣癌細胞株ＯＶ−ＣＡＲ−３上に高度に発現し、黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−５上に中等度に発現された。これらの細胞株の任意のものを混合リンパ球反応に加えると、Ｔｈ１サイトカイン産生がダウンレギュレーションされたが、ＣＤ２００を発現しない細胞株ではそうはならず、直接の相関関係が示された。抗ＣＤ２００アンタゴニスト抗体を培養中に含むことにより、効果が失われた。
【０１８１】
黒色腫および卵巣腫瘍細胞は、ＣＤ２００をアップレギュレーションでき、これにより有効な免疫反応を潜在的に抑制する。抗ＣＤ２００アンタゴニストによる療法により、免疫系の腫瘍細胞に対する有効な細胞傷害反応を高めうる。
【０１８２】
Ｆ．混合リンパ球反応におけるサイトカインプロフィルに対するＣＤ２００発現癌細胞株の影響
サイトカイン反応をＴＨ１反応（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）からＴｈ２反応（１ｌ−４、ＩＬ−１０）にシフトさせるＣＤ２００過剰発現細胞の能力が、混合リンパ球反応において評価された。ＣＤ２００発現細胞のソースとして、ＣＤ２００トランスフェクション細胞またはＣＤ２００細胞陽性癌細胞株に由来する細胞が使用された。
【０１８３】
ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γおよび１ｘ１０６応答細胞を用いてヒト末梢単球から熟成させた２５０，０００樹状細胞を用いて、２４穴プレートで混合リンパ球反応が行われた。応答細胞は、フィコールを用いて末梢血から精製された、Ｔ細胞を増やしたリンパ球であった。細胞を組織培養フラスコで１時間インキュベートし、非付着細胞分画を取り出すことにより、Ｔ細胞が増やされた。黒色腫細胞株ＳＫ−ＭＥＬ−１、ＳＫ−ＭＥＬ−２４、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３および非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫細胞株Ｎａｍａｌｗａからの５００，０００細胞または正の対照としての一次ＣＬＬ細胞が、３０μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２００抗体の存在または非存在下で樹状細胞に加えられた。４８および６８時間後に上清が集められ、サイトカインの存在が分析された。
【０１８４】
組織培養上清に見られるＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１０などのサイトカインが、ＥＬＩＳＡを用いて定量化された。Ｒ＋Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から、各サイトカインの対応捕捉および検出抗体対が得られ、組換え型ヒトサイトカインを用いて各サイトカインの標準曲線が作成された。抗サイトカイン捕捉抗体が、ＰＢＳ中に最適濃度でプレートにコートされた。一晩インキュベーション後、プレートが洗浄され、１％ＢＳＡおよび５％スクロースを含むＰＢＳで１時間ブロックされた。０．０５％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳで三回洗浄したあと、１％のＢＳＡを含むＰＢＳに上清が二倍または十倍の希釈で加えられた。適切なビオチン化抗サイトカイン抗体に続き、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジンおよびＳｉｇｍａＳ基質を加えることにより、捕捉されたサイトカインが検出された。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、発色現象が評価された。
【０１８５】
図２５Ａに示されるように、ＣＤ２００が高度に発現した細胞株（ＭＥＬ−２４、ＭＥＬ−２８、ＯＶＣＡＲ−３）の存在により、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインのダウンレギュレーションが生じた。これに対して、ＭＥＬ−１（低ＣＤ２００発現）またはＮａｍａｌｗａ（ＣＤ２００発現なし）を加えても、サイトカインプロフィルに影響はなかった。抗ＣＤ２００抗体ｈＢ７ＶＨ３ＶＬ２を５０μｇ／ｍｌで加えることにより、Ｔｈ１反応が完全に回復し（図２５Ｂ）、抗ＣＤ２００抗体による黒色腫または卵巣癌患者の治療が、治療上有益でありうることが示された。
【０１８６】
実施例３
Ｃ２ａＢ７−Ｇ１およびその誘導体による活性化Ｔ細胞の排除
ＣＤ２００を発現しない腫瘍細胞を用いた癌モデルに、抗ＣＤ２００治療が影響するかを評価するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＮａｍａｌｗａ細胞およびヒトＰＢＬｓが注射され、以下に概説されるようにマウスが治療された。このモデルにおいては、Ｂ細胞および濾胞ヘルパーＴ細胞など、ＣＤ２００を自然に発現する免疫細胞のみに、ＣＤ２００が存在する。
【０１８７】
群設計：
動物１０匹／群
群１：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．
群２：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ
群３：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ｈＶ３Ｖ２−Ｇ１
群４：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇｈＶ３Ｖ２−Ｇ１
群５：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ＋２．５ｍｇ／ｋｇ  ｈＶ３Ｖ２−Ｇ１
群６：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋４×１０６ＰＢＬ
群７：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ｃｈＣ２ａＢ７−Ｇ２Ｇ４
群８：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ＋５ｍｇ／ｋｇｃｈＣ２ａＢ７−Ｇ２Ｇ４
群９：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ＋２．５ｍｇ／ｋｇ  ｃｈＣ２ａＢ７−Ｇ２Ｇ４
群１０：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋４×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ｃｈＣ２ａＢ７−Ｇ２Ｇ４
群１１：４×１０６Ｎａｍａｌｗａ  ｓ．ｃ．＋８×１０６ＰＢＬ＋２０ｍｇ／ｋｇ  ａｌｘｎ４１００
投与量のｌ／１０が、注射混合物に含まれた。その後の投与は、２回／週で３週間ｉ．ｖ．で行われた。
【０１８８】
腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）が、３回／週測定され、Ｌ＊Ｗ＊Ｗ／２により腫瘍の体積が計算された。図２６は、すでに明らかなように、ヒトＰＢＬｓとＮａｍａｌｗａ細胞の同時注射により、腫瘍成長が阻害されることを示す。ＰＢＬによる腫瘍成長阻害に対する、ｃｈＣ２ａＢ７−Ｇ２Ｇ４の影響は観察されなかった。これに対して、ＡＬＸＮ５２００（ｈＢ７ＶＨ３ＶＬ２−Ｇ１）の投与は、ＰＢＬによる腫瘍成長阻害をブロックした。腫瘍細胞上のＣＤ２００の非存在下では、Ｇ１コンストラクトなどのエフェクター機能を媒介する抗体による抗ＣＤ２００抗体の治療、ＰＢＬ集団の主なエフェクター細胞が排除されるように見受けられる。これらのデータは、エフェクター機能を伴う抗体が用いられる場合には、エフェクター機能を伴わない抗体が用いられる場合と比較して、抗ＣＤ２００癌療法の有効性が低いことを示唆する。しかし、移植の場合または自己免疫疾患の場合など、免疫細胞の排除が望ましい場合には、エフェクター機能を伴うコンストラクトを用いた抗ＣＤ２００治療が治療的に有益でありうる。
【０１８９】
実施例４
ｈＢ７ＶＨ３ＶＴＬ２によるＴ細胞破壊
活性化Ｔ細胞を、エフェクター機能を媒介する定常領域を含む抗ＣＤ２００抗体（例えばＧ１）とともにインキュベートすることにより、Ｔ細胞の破壊が生じるかを評価するために、Ｔ細胞が活性化され、以下に述べられるように破壊アッセイが行われた。
【０１９０】
Ａ）．ＣＤ３＋Ｔ細胞の単離
Ａｃｃｕｓｐｉｎ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍを用いたヘパリン化全血液の密度勾配遠心分離により、正常な健常ボランティアからヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が得られた。１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス；ｃａｔ＃Ｈ８８８９）が、各Ａｃｃｕｓｐｉｎチューブ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス；ｃａｔ＃Ａ２０５５）に加えられた後、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅがフリットを通過できるように１５００ｒｐｍで２分間遠心分離された。３０ｍｌの全血液がフリットに重ねられ、チューブが２０００ｒｐｍで、室温で１５分間ブレーキなしで遠心分離された。ＰＢＬインタフェイスが集められ、単核細胞が２％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ；ｃａｔ＃Ｆ−０５００−Ｄ）を含むＰＢＳで二回洗浄され、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。製造者の説明に従ってＨＴＣＣ−５カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に通すことにより、ＣＤ３＋Ｔ細胞が単離された。溶出された細胞が洗浄およびカウントされ、５％の熱不活性化シングルドナー血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁された。
【０１９１】
Ｂ．プレート結合ｍＯＫＴ３による活性化
１２−ウェルプレートのウェル（Ｆａｌｃｏｎ）が、ＰＢＳに希釈された１０μｇ／ｍＬのｍＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ）で、４℃での一晩のインキュベーションによりコートされた。残留抗体が除去され、プレートがＰＢＳで穏やかにすすがれた。上述の通りに単離された、精製ＣＤ３＋Ｔ細胞が、５％の熱不活性化シングルドナー血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０中、２×ｌ０６／ウェルの最終濃度でプレートに加えられた。細胞は、５％のＣＯ２を含む加湿されたインキュベータに、３７℃で７２時間維持された。
【０１９２】
Ｃ．ｍＯＫＴ３活性化ＣＤ３＋標的細胞の５１クロミウム標識
培養期間終了後、ｍＯＫＴ３活性化ＣＤ３＋細胞が採取され、洗浄され、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０に１０７細胞／ｍＬで再懸濁された。５１クロミウム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，マサチューセッツ州ビルリカ）／１０６細胞を加えることにより、細胞が３７℃で２時間クロメート処理された。標識された細胞が採取され、５％の熱不活性化シングルドナー血清を含むＲＰＭＩで洗浄され、同じ培地に２×１０５細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁された。
【０１９３】
Ｄ．自己ＮＫエフェクター細胞の調製
同じ個人からのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が、密度勾配遠心分離により上述のように得られた。ＰＢＬインタフェイスが集められ、２％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｆｔ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ；ｃａｔ＃Ｆ−０５００−Ｄ）を含むＰＢＳで、単核細胞が二回洗浄され、１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離された。メーカーの説明にしたがって、抗ＣＤ５６結合磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，カリフォルニア州オーバーン、Ｃａｔ＃１２０−０００−３０７）によるポジティブ選択により、ＣＤ５６＋細胞が単離された。溶出された細胞が洗浄およびカウントされ、５％の熱不活性化シングルドナー血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０に１．３×１０６細胞／ｍＬで再懸濁された。細胞は、同じ培地３ｍＬ中４×１０６細胞／ウェルの最終濃度で、５％のＣＯ２を含む加湿されたインキュベータにおいて３７℃で一晩インキュベートされた。培養期間終了後、細胞が採取、洗浄、カウントされ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノールおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含む無血清のＲＰＭＩに再懸濁された。
【０１９４】
Ｅ．ＡＤＣＣアッセイ
上述のように調製された、５１Ｃｒ標識されたｍＯＫＴ３活性化ＣＤ３＋標的細胞が、９６ウェルプレートのウェルに５０μＬ中１０４細胞／ウェルで分散された。ＣＤ５６＋エフェクター細胞が採取、洗浄、カウントされ、２．５×１０６細胞／ｍＬ（エフェクター：標的細胞比率２５：１）または１０６細胞／ｍＬ（エフェクター：標的細胞比率１０：１）で再懸濁され、標的細胞を含むウェルに分散された（１００μＬ／ウェル）。１０倍希釈抗のＣＤ２００抗体（Ｖ３Ｖ２−Ｇ１またはＶ３Ｖ２−Ｇ２／Ｇ４）が、１０、１、０．１および０．０１μｇ／ｍＬの最終濃度で、エフェクターおよび標的に加えられた。アッセイ対照には以下が含まれた：１）抗体の非存在下（０Ａｂ）でのエフェクターおよび標的；２）エフェクターの非存在下での標的細胞（自発溶解）および３）０．２％のＴｗｅｅｎ−８０とともにインキュベートされたエフェクターおよび標的（最大放出）。全ての細胞培養条件が、トリプリケートで行われた。５％のＣＯ２を含む加湿されたインキュベータにおいて、３７℃で４時間細胞がインキュベートされた。培養期間終了後、プレートが遠心分離されて細胞がペレット化され、１５０μＬの細胞上清がシンチレーションバイアルに移され、γシンチレーションカウンタ（Ｗａｌｌａｃ）でカウントされた。結果は、以下の式：
（平均試料毎分カウント（ｃｐｍ）−平均自発溶解）×１００
平均最大溶解−平均自然溶解
による特異的溶解％として表される。
【０１９５】
Ｆ．フローサイトメトリ
上述のように調製された細胞懸濁液１００μｌ（ｍＯＫＴ３活性化ＣＤ３＋細胞または精製ＣＤ５６＋ＮＫ細胞）が、９６ウェル丸底プレート（Ｆａｌｃｏｎ，ニュージャージー州フランクリンレイク；ｃａｔ＃３５３０７７）のウェルに分散された。細胞が、以下のフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合抗体（いずれもＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カリフォルニア州サンノゼ）の指定の組み合わせ；抗ヒトＣＤ２５−ＦＩＴＣ（ｃａｔ＃５５５４３１）；抗ヒトＣＤ３−ＡＰＣ（ｃａｔ＃５５５３３５）；抗ヒトＣＤ２００−ＰＥ（ｃａｔ＃５５２４７５）；抗ヒトＣＤ８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ｃａｔ＃３４１０５１）；抗ヒトＣＤ４−ＡＰＣ（ｃａｔ＃５５５３４９）；抗ヒトＣＤ５−ＡＰＣ（ｃａｔ＃５５５３５５）および抗ヒトＣＤ５６−ＡＰＣ（ｃａｔ＃３４１０２５）とともに、４℃で３０分間インキュベートされた。各標識抗体のアイソタイプ対照も含まれた。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で二回洗浄（３分間１８００ｒｐｍで遠心分離）した後、３００μｌのＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，ヴァージニア州ハーンドン；ｃａｔ＃２１−０３１−ＣＶ）に細胞が再懸濁され、ＦａｃｓＣａｌｉｂｅｒマシンおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カリフォルニア州サンノゼ）を用いたフローサイトメトリにより分析された。
【０１９６】
図２７に示されるように、活性化Ｔ細胞には、表面上にＣＤ２００の高度発現が見られる。ＮＫ細胞がエフェクター細胞として用いられる場合には、ＶＨ３ＶＬ２−Ｇ１の存在下では活性化Ｔ細胞が効率的に破壊されるが、ＶＨ３ＶＬ２−Ｇ２Ｇ４ではそうではない（図２８）。これらのデータは、エフェクター機能を伴う抗ＣＤ２００抗体が、活性化Ｔ細胞を排除しうることを示す。移植の場合、または自己免疫疾患の治療において、このような抗体が使用されうる。
【０１９７】
制御性Ｔ細胞に加え、形質細胞様樹状細胞が、ヒトの癌において負の免疫調節の役割をすることが示されている（Ｗｅｉ  Ｓ，Ｋｒｙｃｚｅｋ  Ｉ，Ｚｏｕ  Ｌ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｂ，Ｃｈｅｎｇ  Ｐ，Ｍｏｔｔｒａｍ  Ｐ，Ｃｕｒｉｅｌ  Ｔ，Ｌａｎｇｅ  Ａ，Ｚｏｕ  Ｗ  Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ＣＤ８＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５年６月１６日；６５（１２）：５０２０−６）。したがって、抗ＣＤ２００療法と形質細胞様樹状細胞を除去する療法の組み合わせが有利でありうる。
【０１９８】
実施例５
形質細胞のＣＤ２００
１０人の多発性骨髄腫患者および３人の正常ドナーからの骨髄細胞が、まず塩化アンモニウムを用いて赤血球細胞を溶解させることにより調製された。ＦＡＣＳ緩衝液に細胞が再懸濁され、以下の抗体カクテルで標識された：
・κ−ＦＩＴＣ／ＣＤ３８−ＰＥ／ＣＤ  １３８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５
・λ−ＦＩＴＣ／ＣＤ３８−ＰＥ／ＣＤ１３８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５
・アイソタイプ対照−ＦＩＴＣ／ＣＤ３８−ＰＥ
・ＣＤ２００−ＦＩＴＣ／ＣＤ３８−ＰＥ
ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏを用いてデータが集められ、ＢＤ  ＤｉＶＡソフトウェアを用いて分析された。ＣＤ３８が光る細胞（形質細胞）のＣＤ２００の発現が分析された。図２９に示されるように、正常ドナーにおいては、形質細胞の一部がＣＤ２００を強度に発現する。多発性骨髄腫患者においては、大多数の形質細胞が、ＣＤ２００を発現する。
【０１９９】
多発性骨髄腫の場合には、ＣＤ２００を発現するＣＬＬまたはその他の癌と同様、腫瘍細胞によるＣＤ２００発現が、免疫系による腫瘍細胞の根絶を妨げうる。抗ＣＤ２００アンタゴニストによる療法により、その後の免疫系による癌細胞の排除が可能になりうる。自己免疫または移植の場合においては、形質細胞を標的とする抗ＣＤ２００による除去療法が治療的に有益でありうる。
【０２００】
実施例６
ウイルスのＣＤ２００
粘液腫ウイルスＭ１４１Ｒまたはヒトヘルペスウイルス８など、多くのウイルスにもＣＤ２００が発現される。腫瘍細胞のＣＤ２００発現と同様、ウイルスに発現したＣＤ２００は、免疫系によるウイルスの効果的な除去を妨げうる。抗ＣＤ２００アンタゴニスト抗体による治療は、ＣＤ２００発現ウイルスによる感染において治療的に有益であり得、免疫系によるウイルスの除去を可能としうる。あるいは、抗ＣＤ２００除去抗体が用いられうる。
【０２０１】
当然のことながら、本明細書に開示される実施形態に対して様々な修正がなされうる。例えば、当業者には当然のことながら、本明細書に記載の特定の配列は、ＯＸ−２／ＣＤ２００の結合に用いられるポリペプチド、抗体または抗体フラグメントの機能に悪影響を与えずに僅かに改変されうる。例えば、抗体またはフラグメントの機能を破壊することなく、抗体配列の単数または複数のアミノ酸の置換がなされうることが多い。したがって、本明細書に記載される特定の抗体との同一性の程度が７０％を上回るポリペプチドまたは抗体が、本開示の範囲内であることが理解されなければならない。特に有用な実施形態においては、本願明細書に記載される特定の抗体との同一性が約８０％を上回る抗体が予定される。他の有用な実施形態においては、本明細書に記載される特定の抗体との同一性が約９０％を上回る抗体が予定される。したがって、以上の記載は制限的と解釈されてはならず、単に好ましい実施形態の例示として解釈されなければならない。その他の修正は、本開示の範囲および趣旨の範囲内で当業者により考えられる。
【０２０２】
参考文献
本発明が関連する最高水準の技術をより完全に説明するために、以下の参考文献が、参照により本明細書に組み込まれる。以下のこれらの刊行物または上で参照により組み込まれるものと、本開示との間に矛盾があれば、本開示が優先するものとする。
【０２０３】
【表１】
0005404052.tif 000010
【０２０４】
【表２】
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【０２０５】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図１は、Ｇ２／Ｇ４コンストラクトを作製する際に使用されたプライマーＣ７ｍｈＨＦの核酸配列（配列番号１）を提供する。
【図２】図２は、Ｇ２／Ｇ４コンストラクトを作製する際に使用されたプライマーＲｅｖ  Ａｇｅ  Ｐｒｉの核酸配列（配列番号２）を提供する。
【図３】図３は、Ｇ２／Ｇ４コンストラクトを作製する際に使用されたプライマーＣ２ａＢ７  ｒｅｖの核酸配列（配列番号３）を提供する。
【図４】図４は、Ｇ２／Ｇ４コンストラクトを作製する際に使用されたｌａｃｐｒｉの核酸配列（配列番号４）を提供する。
【図５】図５は、ＬｅａｄＶＨｐＡＸの核酸配列（配列番号５）を提供する。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号６、７、２３、２４、３７、および３８）。図６Ｃは、配列番号３７（核酸配列）および配列番号７（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号７は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図６Ｆは、配列番号３８（核酸配列）および配列番号２４（アミノ酸配列）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号６、７、２３、２４、３７、および３８）。図６Ｃは、配列番号３７（核酸配列）および配列番号７（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号７は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図６Ｆは、配列番号３８（核酸配列）および配列番号２４（アミノ酸配列）を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号６、７、２３、２４、３７、および３８）。図６Ｃは、配列番号３７（核酸配列）および配列番号７（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号７は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図６Ｆは、配列番号３８（核酸配列）および配列番号２４（アミノ酸配列）を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号６、７、２３、２４、３７、および３８）。図６Ｃは、配列番号３７（核酸配列）および配列番号７（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号７は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図６Ｆは、配列番号３８（核酸配列）および配列番号２４（アミノ酸配列）を示す。
【図６Ｅ】図６Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号６、７、２３、２４、３７、および３８）。図６Ｃは、配列番号３７（核酸配列）および配列番号７（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号７は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図６Ｆは、配列番号３８（核酸配列）および配列番号２４（アミノ酸配列）を示す。
【図６Ｆ】図６Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号６、７、２３、２４、３７、および３８）。図６Ｃは、配列番号３７（核酸配列）および配列番号７（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号７は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図６Ｆは、配列番号３８（核酸配列）および配列番号２４（アミノ酸配列）を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ４Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号８、９、２５、２６、３９、および４０）。図７Ｃは、配列番号３９（核酸配列）および配列番号９（アミノ酸配列）を示す。図７Ｆは、配列番号４０（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ４Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号８、９、２５、２６、３９、および４０）。図７Ｃは、配列番号３９（核酸配列）および配列番号９（アミノ酸配列）を示す。図７Ｆは、配列番号４０（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ４Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号８、９、２５、２６、３９、および４０）。図７Ｃは、配列番号３９（核酸配列）および配列番号９（アミノ酸配列）を示す。図７Ｆは、配列番号４０（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ４Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号８、９、２５、２６、３９、および４０）。図７Ｃは、配列番号３９（核酸配列）および配列番号９（アミノ酸配列）を示す。図７Ｆは、配列番号４０（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図７Ｅ】図７Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ４Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号８、９、２５、２６、３９、および４０）。図７Ｃは、配列番号３９（核酸配列）および配列番号９（アミノ酸配列）を示す。図７Ｆは、配列番号４０（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図７Ｆ】図７Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ４Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号８、９、２５、２６、３９、および４０）。図７Ｃは、配列番号３９（核酸配列）および配列番号９（アミノ酸配列）を示す。図７Ｆは、配列番号４０（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２５、２６、４０、および４１）。図８Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図８Ｆは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２５、２６、４０、および４１）。図８Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図８Ｆは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２５、２６、４０、および４１）。図８Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図８Ｆは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２５、２６、４０、および４１）。図８Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図８Ｆは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２５、２６、４０、および４１）。図８Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図８Ｆは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図８Ｆ】図８Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ１−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２５、２６、４０、および４１）。図８Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図８Ｆは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号２６（アミノ酸配列）を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２７、２８、４１、および４２）。図９Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図９Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２７、２８、４１、および４２）。図９Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図９Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２７、２８、４１、および４２）。図９Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図９Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２７、２８、４１、および４２）。図９Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図９Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２７、２８、４１、および４２）。図９Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図９Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図９Ｆ】図９Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１０、１１、２７、２８、４１、および４２）。図９Ｃは、配列番号４１（核酸配列）および配列番号１１（アミノ酸配列）を示す。図９Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１２、１３、２７、２８、４２、および４３）。図１０Ｃは、配列番号４３（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号１３は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１０Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１２、１３、２７、２８、４２、および４３）。図１０Ｃは、配列番号４３（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号１３は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１０Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１２、１３、２７、２８、４２、および４３）。図１０Ｃは、配列番号４３（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号１３は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１０Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１２、１３、２７、２８、４２、および４３）。図１０Ｃは、配列番号４３（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号１３は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１０Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１２、１３、２７、２８、４２、および４３）。図１０Ｃは、配列番号４３（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号１３は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１０Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１２、１３、２７、２８、４２、および４３）。図１０Ｃは、配列番号４３（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号１３は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１０Ｆは、配列番号４２（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１４、１５、２３、２４、４４、４５、４６、および４７）。図１１Ｃは、配列番号４４（核酸配列）および配列番号４５（アミノ酸配列）を示す。配列番号４５は、配列番号１５のアミノ酸１〜３３７に対応する。概略図に示されるように、配列番号４５は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１１Ｆは、配列番号４６（核酸配列）および配列番号４７（アミノ酸配列）を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１４、１５、２３、２４、４４、４５、４６、および４７）。図１１Ｃは、配列番号４４（核酸配列）および配列番号４５（アミノ酸配列）を示す。配列番号４５は、配列番号１５のアミノ酸１〜３３７に対応する。概略図に示されるように、配列番号４５は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１１Ｆは、配列番号４６（核酸配列）および配列番号４７（アミノ酸配列）を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１４、１５、２３、２４、４４、４５、４６、および４７）。図１１Ｃは、配列番号４４（核酸配列）および配列番号４５（アミノ酸配列）を示す。配列番号４５は、配列番号１５のアミノ酸１〜３３７に対応する。概略図に示されるように、配列番号４５は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１１Ｆは、配列番号４６（核酸配列）および配列番号４７（アミノ酸配列）を示す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１４、１５、２３、２４、４４、４５、４６、および４７）。図１１Ｃは、配列番号４４（核酸配列）および配列番号４５（アミノ酸配列）を示す。配列番号４５は、配列番号１５のアミノ酸１〜３３７に対応する。概略図に示されるように、配列番号４５は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１１Ｆは、配列番号４６（核酸配列）および配列番号４７（アミノ酸配列）を示す。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１４、１５、２３、２４、４４、４５、４６、および４７）。図１１Ｃは、配列番号４４（核酸配列）および配列番号４５（アミノ酸配列）を示す。配列番号４５は、配列番号１５のアミノ酸１〜３３７に対応する。概略図に示されるように、配列番号４５は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１１Ｆは、配列番号４６（核酸配列）および配列番号４７（アミノ酸配列）を示す。
【図１１Ｆ】図１１Ａ〜Ｆは、抗体ｃｈＣ２ａＢ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１４、１５、２３、２４、４４、４５、４６、および４７）。図１１Ｃは、配列番号４４（核酸配列）および配列番号４５（アミノ酸配列）を示す。配列番号４５は、配列番号１５のアミノ酸１〜３３７に対応する。概略図に示されるように、配列番号４５は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１１Ｆは、配列番号４６（核酸配列）および配列番号４７（アミノ酸配列）を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｃＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１３、１６、２７、２８、４８、および４９）。図１２Ｃは、配列番号４８（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。図１２Ｆは、配列番号４９（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｃＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１３、１６、２７、２８、４８、および４９）。図１２Ｃは、配列番号４８（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。図１２Ｆは、配列番号４９（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｃＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１３、１６、２７、２８、４８、および４９）。図１２Ｃは、配列番号４８（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。図１２Ｆは、配列番号４９（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｃＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１３、１６、２７、２８、４８、および４９）。図１２Ｃは、配列番号４８（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。図１２Ｆは、配列番号４９（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｃＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１３、１６、２７、２８、４８、および４９）。図１２Ｃは、配列番号４８（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。図１２Ｆは、配列番号４９（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１２Ｆ】図１２Ａ〜Ｆは、抗体ｈＢ７Ｖ３Ｖ２−ｃＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１３、１６、２７、２８、４８、および４９）。図１２Ｃは、配列番号４８（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）を示す。図１２Ｆは、配列番号４９（核酸配列）および配列番号２８（アミノ酸配列）を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｄは、抗体ｃｈＣ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１７、１８、２９、および３０）。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｄは、抗体ｃｈＣ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１７、１８、２９、および３０）。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｄは、抗体ｃｈＣ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１７、１８、２９、および３０）。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜Ｄは、抗体ｃｈＣ７−ｈＧ２Ｇ４の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１７、１８、２９、および３０）。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｆは、抗体Ｄ１Ｂ５−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１９、２０、３１、３２、５０、および５１）。図１４Ｃは、配列番号５０（核酸配列）および配列番号２０（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号２０は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１４Ｆは、配列番号５１（核酸配列）および配列番号３２（アミノ酸配列）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｆは、抗体Ｄ１Ｂ５−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１９、２０、３１、３２、５０、および５１）。図１４Ｃは、配列番号５０（核酸配列）および配列番号２０（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号２０は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１４Ｆは、配列番号５１（核酸配列）および配列番号３２（アミノ酸配列）を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜Ｆは、抗体Ｄ１Ｂ５−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１９、２０、３１、３２、５０、および５１）。図１４Ｃは、配列番号５０（核酸配列）および配列番号２０（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号２０は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１４Ｆは、配列番号５１（核酸配列）および配列番号３２（アミノ酸配列）を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜Ｆは、抗体Ｄ１Ｂ５−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１９、２０、３１、３２、５０、および５１）。図１４Ｃは、配列番号５０（核酸配列）および配列番号２０（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号２０は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１４Ｆは、配列番号５１（核酸配列）および配列番号３２（アミノ酸配列）を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ａ〜Ｆは、抗体Ｄ１Ｂ５−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１９、２０、３１、３２、５０、および５１）。図１４Ｃは、配列番号５０（核酸配列）および配列番号２０（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号２０は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１４Ｆは、配列番号５１（核酸配列）および配列番号３２（アミノ酸配列）を示す。
【図１４Ｆ】図１４Ａ〜Ｆは、抗体Ｄ１Ｂ５−ｈＧ１の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号１９、２０、３１、３２、５０、および５１）。図１４Ｃは、配列番号５０（核酸配列）および配列番号２０（アミノ酸配列）を示す。概略図に示される配列番号２０は連続するが、イントロンを含む対応するヌクレオチド配列とともに示される。図１４Ｆは、配列番号５１（核酸配列）および配列番号３２（アミノ酸配列）を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｄは、抗体Ｇ２Ｇ４  ６３Ｌ１Ｄの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号２１、２２、３３、および３４）。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｄは、抗体Ｇ２Ｇ４  ６３Ｌ１Ｄの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号２１、２２、３３、および３４）。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜Ｄは、抗体Ｇ２Ｇ４  ６３Ｌ１Ｄの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号２１、２２、３３、および３４）。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜Ｄは、抗体Ｇ２Ｇ４  ６３Ｌ１Ｄの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す（配列番号２１、２２、３３、および３４）。
【図１６】図１６は、ＣＤ２００のｃＤＮＡをクローニングするためのフォワードプライマーの核酸配列を提供する（配列番号３５）。
【図１７】図１７は、ＣＤ２００のｃＤＮＡをクローニングするためのリバースプライマーの核酸配列を提供する（配列番号３６）。
【図１８】図１８は、ＲＡＪＩ−ＣＤ２００／ＰＢＬモデルにおける、ヒト化ＣＤ２００抗体の投与の効果を示す。ヒト化抗ＣＤ２００抗体により、腫瘍成長の阻害が生じた。
【図１９】図１９は、Ｎａｍａｌｗａ＿ＣＤ２００動物モデルにおける、エフェクター機能を伴うか伴わないヒト化ＣＤ２００抗体の投与の効果を示す。エフェクター機能のない抗体が、腫瘍成長を阻害する効力を示した。
【図２０】図２０は、正常試料と比較した、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）患者の試料におけるＣＤ２００の発現レベルを示す表である。
【図２１】図２１は、癌細胞株に検出されたＣＤ２００発現の相対的レベルを示す。
【図２２】図２２は、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に検出された発現レベルと比較した、ヒト卵巣癌試料におけるＣＤ２００抗原の発現レベルを示す。
【図２３】図２３は、ＰＢＬに検出された発現レベルと比較した、ヒト黒色腫患者試料におけるＣＤ２００抗原の発現レベルを示す。
【図２４】図２４は、黒色腫患者試料のＣＤ２００の免疫組織化学的染色を示す。
【図２５】図２５は、サイトカイン産生における抗ＣＤ２００抗体の影響を示す。混合細胞集団アッセイにおけるＩＬ−２産生のレベルが、ＣＤ２００抗体の存在または非存在下で測定された。使用された抗体は、エフェクター機能のないキメラ抗ＣＤ２００抗体である。
【図２６】図２６は、腫瘍がＣＤ２００を発現しないＮａｍａｌｗａ／ＰＢＬモデルにおける、エフェクター機能を伴うか伴わない抗ＣＤ２００抗体の投与の効果を示す。
【図２７】図２７は、活性化Ｔ細胞上のＣＤ２００発現のフローサイトメトリ解析を示す。ＣＤ３＋細胞が、ｍＯＫＴ３により活性化され、採取、洗浄され、ヒトＣＤ２５、ＣＤ２００、ＣＤ５、ＣＤ４およびＣＤ８に特異的な指定の結合抗体で染色された。細胞を洗浄し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＦａｃｓＣａｌｉｂｅｒフローサイトメータで免疫蛍光を分析した。
【図２８】図２８は、活性化Ｔ細胞のＡＤＣＣに対する抗ＣＤ２００抗体の効果を示す。ＣＤ３＋ヒトＴ細胞が、１０μｇ／ｍＬの固定化（プレート被覆）ｍＯＫＴ３により７２時間刺激された。その後、活性化Ｔ細胞を、標的として使用するためにクロメート処理し、エフェクター細胞としての精製された自己ＣＤ５６＋（ＮＫ）細胞とともにインキュベートした。細胞は、エフェクター：標的細胞の比率２５：１（Ａ）または１０：１（Ｂ）において、エフェクター機能を媒介できる（Ｖ３Ｖ２−Ｇ１）、またはエフェクター機能を欠くように改変された（Ｖ３Ｖ２−Ｇ２Ｇ４）ヒト化抗ＣＤ２００抗体の存在または非存在下で、３７℃で４時間コインキュベートされた。データは、％別の融解として表される。抗ＣＤ２００抗体は、活性化Ｔ細胞のＡＤＣＣを増大させたが、エフェクター機能のない抗ＣＤ２００抗体はＡＤＣＣを誘起しなかった。
【図２９】図２９は、形質細胞のＣＤ２００の発現レベルを示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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