(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3を酸性条件下で加熱処理してラクトシルセラミドに変換するにあたり、ｐＨ３〜５、温度70℃〜100℃の範囲で30分〜180分加熱処理することを特徴とするラクトシルセラミドの製造方法。
【請求項２】
乳由来原料中においてガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3をｐＨ３〜５、温度70℃〜100℃の範囲で30分〜180分加熱処理し、ラクトシルセラミドに変換することを特徴とする、全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物の製造方法。
【請求項３】
乳由来原料が、ホエータンパク質濃縮物、バターミルク、バターゼーラム、脱脂乳又は、これら乳由来原料に対して有機溶媒で脂質画分を高含有化した素材から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする請求項２に記載の全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物の製造方法。
【請求項４】
ｐＨ３〜５、温度70℃〜100℃の範囲で30分〜180分加熱処理を行った後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、限外濾過膜、精密濾過膜から選ばれる方法で濃縮することを特徴とする請求項２又は３記載の全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載の方法で製造された全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ３に対して、加熱処理を行い、ラクトシルセラミドに変換することによるラクトシルセラミドの製造方法、また、乳由来原料中においてガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ３をラクトシルセラミドに変換することにより高濃縮されたラクトシルセラミドの製造方法及び得られた高濃縮されたラクトシルセラミドに関する。
本発明の製造方法によって得られるラクトシルセラミドや高濃縮されたラクトシルセラミドは、医学、薬学及び生化学等の分野で試薬としても有用であり、また、医薬品、化粧品、飲食品及び飼料等の素材として有用である。
【背景技術】
【０００２】
ラクトシルセラミドは、セラミドに乳糖の還元末端を持つスフィンゴ糖脂質で、動物組織に存在するが、特に神経系器官でその含有量が高いことが知られているが、このラクトシルセラミドは、グロボシド群、ガングリオシド群、血液型活性糖脂質群の共通前駆体であることも知られている。
また、ラクトシルセラミドは、さまざまな生理機能が報告されており、ピロリ菌に対する特異的結合性や、破骨細胞分化や好中球の成熟化に必須な成分であることが報告されている（非特許文献１〜３）。
一方、ガングリオシドＧＭ3は、セラミドに乳糖の還元末端が結合し、かつ乳糖の非還元末端にシアル酸がα２−３結合した構造を有しており、ガングリオシドＧＤ3は、ガングリオシドＧＭ3の非還元末端にさらにシアル酸がα２−８結合した構造を有しており、分子全体としてはシアル酸を２分子含んでいる。  
【０００３】
従来、ラクトシルセラミドの製造のための代表的な方法は、酢酸又はトリクロル酢酸等の酸で蛋白質と複合体を形成している糖脂質を沈殿させ、その沈殿物に、クロロホルム−メタノール混合液等のアルコールを含む有機溶媒を加えて、蛋白質との複合体から糖脂質を分離、抽出する方法が一般的であるが、このような方法では、比較的高含有量の組成物を得ることはできず、効率よく精製できず、ラクトシルセラミドが経済的に得られないという問題があった。
また、ラクトシルセラミドの製造の別法として、牛乳等に由来する中性スフィンゴ糖脂質を含む物質に蛋白質加水分解酵素を作用させ、精製する方法も提案されているが、精製工程が複雑であり、必然的に製造コストが高くなるという問題があった（特許文献１）。
上述するように、従来のラクトシルセラミドの製造方法は、手間もかかり、しかも高濃縮されたラクトシルセラミドを製造する経済的な方法は開発されていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開平２−１６９５９６号公報
【非特許文献１】J.Phar.Macol.Sci.2006 Vol.100,No3,p195-200
【非特許文献２】生化学  Vol.77,N0.8,p872
【非特許文献３】Ｇlycobiology. 1998 Apr;8(4):297-309
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、従来方法では、高濃縮されたラクトシルセラミドを得るための精製工程が複雑であったり、効率よく精製する方法が確立されていなかった。              
従って、本発明は、上記従来技術の問題点を解決し、簡便な方法を用いて、比較的安価に、しかも高濃縮されたラクトシルセラミドを効率よく製造する方法を提供することを課題とする。また、このような製造方法によって得られる高濃縮されたラクトシルセラミドを含む組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、高濃縮されたラクトシルセラミドを比較的安価に、かつ簡便に、効率よく、経済的に製造する方法について鋭意研究を進めたところ、酸性条件下で加熱処理することにより、原料中のガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ３をラクトシルセラミドに変換させて高濃縮されたラクトシルセラミドが得られることを見出した。
【０００７】
従って、本発明は下記の構成からなる発明である。
（１）ガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3を酸性条件下で加熱処理してラクトシルセラミドに変換するにあたり、ｐＨ３〜５、温度70℃〜100℃の範囲で30分〜180分加熱処理することを特徴とするラクトシルセラミドの製造方法。
（２）乳由来原料中においてガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3をｐＨ３〜５、温度70℃〜100℃の範囲で30分〜180分加熱処理し、ラクトシルセラミドに変換することを特徴とする、全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物の製造方法。
（３）乳由来原料が、ホエータンパク質濃縮物、バターミルク、バターゼーラム、脱脂乳又は、これら乳由来原料に対して有機溶媒で脂質画分を高含有化した素材から選ばれる１種又は２種以上であることを特徴とする（２）に記載の全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物の製造方法。
（４）ｐＨ３〜５、温度70℃〜100℃の範囲で30分〜180分加熱処理を行った後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、限外濾過膜、精密濾過膜から選ばれる方法で濃縮することを特徴とする（２）又は（３）記載の全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物の製造方法。
（５）（２）〜（４）のいずれかに記載の方法で製造された全固形中のラクトシルセラミドが０．０１〜８重量％であるラクトシルセラミド組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法は、ガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3から比較的安価に、かつ簡便に、ラクトシルセラミドを製造することができる。特に、タンパク質を比較的多量に含む乳や乳製品を原料としてラクトシルセラミドを製造することができるので、本発明の方法は、工業的にきわめて有用な高濃縮されたラクトシルセラミドの製造方法として有用である。
本発明の製造方法によって製造されたラクトシルセラミドや高濃縮されたラクトシルセラミドは、感染防御能等の生理機能を有するので、医薬品、化粧品、飲食品及び飼料等の素材として有用であり、組成物におけるラクトシルセラミドの高濃縮により適用範囲の拡大が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の製造方法の特徴は、加熱処理、好ましくは酸性条件下でガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3をラクトシルセラミドに変換させることにある。
すなわち、本発明では、ガングリオシドＧＤ３及び／又はガングリオシドＧＭ３の加熱処理を酸性条件下に行うことにより、ガングリオシドＧＤ3のシアル酸部分の非還元末端に結合するシアル酸１分子を脱シアル化し、さらにガングリオシドＧＭ3の乳糖の非還元末端にあるシアル酸１分子を脱シアル化して、ガングリオシドＧＤ3又はガングリオシドＧＭ3をラクトシルセラミドに効率的に変換させることができる。
上記製造方法において、使用する原料としては、ガングリオシドＧＤ3やガングリオシドＧＭ3の他、全乳や脱脂乳等のタンパク質を多量に含有するが、ガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3を余り多量には含まない素材も用いることもできるが、乳由来原料、特にホエータンパク質濃縮物やバターミルク、バターゼーラム、脱脂乳等ガングリオシドＧＤ3又はガングリオシドＧＭ3を比較的多量に含む乳由来原料であることが好ましい。
また、ガングリオシドＧＤ3及び／又はガングリオシドＧＭ3を含む素材をエタノール等の有機溶媒で抽出する方法（特開平２−２０７０９０号公報）で調製したものを原料として用いることもできる。
【００１０】
本発明の製造方法では、加熱処理時のｐＨ及び温度の設定が非常に重要となる。ｐＨが、低ければ低い程、また、温度が高ければ高い程、ラクトシルセラミドの生成速度は大きくなるが、ラクトシルセラミドの分解速度も大きくなる。したがって、ラクトシルセラミドを高収率で製造するためには、酸性条件下、例えばｐＨを３〜５の範囲、好ましくは３〜４の範囲に調整し、温度を70℃〜 100℃の範囲に調整することが好ましい。
そして、生成速度及び分解速度を考慮して、この加熱処理条件に応じた30分〜180分の処理時間を適宜、設定すればよい。
【００１１】
また、乳由来原料の場合、低ｐＨの条件下、例えばｐＨ３未満の状態で加熱処理を行った場合、主要蛋白質であるカゼインを沈殿させて除去する際に、沈殿が上清を抱きこんでしまい、十分に沈殿と上清を分離できないため、ラクトシルセラミドを含む画分の収率が下がってしまうことがある。これはカゼインがｐＨ３未満であると、粒子径が小さく、また、タンパク質として安定なため沈殿が起こりにくく、上清を抱き込んだままの不完全な沈殿となってしまうからである。
【００１２】
目的とする組成物中のラクトシルセラミドの濃度を高めるため、乳由来原料の場合には、加熱処理終了後にｐＨをカゼインの等電点であるｐＨ4.5〜5.0に調整し、カゼインの粒子径を大きくさせ、また、タンパク質として不安定にさせることにより、凝集させ、沈殿しやすくした後に除去することが好ましい。又、カゼインの凝集性をさらに高めるために塩化カルシウム等を0.01〜0.1％加えるとより好ましい。
上記沈殿したカゼイン沈殿物は、遠心分離機、クワルクセパレーターや、ノズルセパレーター、フィルタープレス、静置又は濾過布等の、一般的な除去方法によって除去することができる。
【００１３】
さらに、目的とするラクトシルセラミドを含む画分の濃度を高めるためには、限外濾過膜、精密濾過膜、透析膜又は電気透析等の膜処理を行うことが有効である。このときの膜処理としては、孔径0.1〜2.0μｍの精密濾過（ＭＦ）膜又は分画分子量５〜500ｋＤａの限外濾過（ＵＦ）膜を用いるとよい。
なお、水酸化カリウム、塩化カリウム等、一般的な中和剤で濃縮液を中和することもできる。
【００１４】
得られたラクトシルセラミドを含む濃縮液は、真空乾燥又は凍結乾燥等の適宜の手段により濃縮、乾固することができるが、このような方法により、全固形中のラクトシルセラミドが0.01〜８重量％という高濃縮されたラクトシルセラミドを得ることができる。なお、ラクトシルセラミドは、HPLCにより測定を行った。
【００１５】
次に実施例を示し、本発明を詳細に説明する。
なお、以下に記載する実施例は本発明を説明するものであり、実施例の記述に限定するものではない。
【実施例１】
【００１６】
ガングリオシドＧＭ3組成物及びその製造法(特開平５−２７９３７９)に従って調製したガングリオシドGM3組成物500mgを水２リットルに溶解し、15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、88℃にて180分間加熱処理を行った。その後、上清を10％水酸化カリウムにて中和し、凍結乾燥して、白色粉末372mgを得た。
HPLCを用いた定量によると、この白色粉末には99重量％以上のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例２】
【００１７】
１リットル当たり 230mgのガングリオシドＧＤ3を含有する10重量％バターゼーラム水溶液に15％塩酸を加えてｐＨを4.5に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、88℃にて180分間加熱処理を行った。その後、生成したカゼインの沈殿は遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、16重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には0.5重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例３】
【００１８】
１リットル当たり 230mgのガングリオシドＧＤ3を含有する10重量％バターゼーラム水溶液に15％塩酸を加えてｐＨを4.5に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、88℃にて180分間加熱処理を行った。その後、生成したカゼインの沈殿は遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、分画粒子径0.1μＭの精密濾過膜（Ｍilipore社製）処理を行ない、濃縮液を得た。
そして、この濃縮液を凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、60重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には1重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例４】
【００１９】
１リットル当たり 230mgのガングリオシドＧＤ3を含有する10重量％バターゼーラム水溶液に15％塩酸を加えてｐＨを3.5に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、88℃にて180分間加熱処理を行った。その後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、原料中の主要蛋白質であるカゼインを凝集させた。生成したカゼインの沈殿は、遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、分画粒子径0.1μＭの精密濾過膜（Ｍilipore社製）処理を行ない、濃縮液を得た。
そして、この濃縮液を凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、60重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には1.5重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例５】
【００２０】
１リットル当たり 230mgのガングリオシドＧＤ3を含有する10重量％バターゼーラム水溶液に15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、88℃にて180分間加熱処理を行った。その後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、原料中の主要蛋白質であるカゼインを凝集させた。生成したカゼインの沈殿は遠心分離機（Beckman社製）で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、分画粒子径0.1μＭの精密濾過膜（Ｍilipore社製）処理を行ない、濃縮液を得た。
そして、この濃縮液を凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、60重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には3.6重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例６】
【００２１】
１リットル当たり 230mgのガングリオシドＧＤ3を含有する10重量％バターゼーラム水溶液に15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、88℃にて180分加熱処理を行った。その後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、原料中の主要蛋白質であるカゼインを凝集させた。生成したカゼインの沈殿は、遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、16重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には0.9重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例７】
【００２２】
１リットル当たり 200mgのガングリオシドＧＤ3を含有する10重量％バターゼーラム水溶液に15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、80℃にて180分間加熱処理を行った。その後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、原料中の主要蛋白質であるカゼインを凝集させた。生成したカゼインの沈殿は遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、分画粒子径0.1μＭの精密濾過膜（Ｍilipore社製）処理を行ない、濃縮液を得た。そして、この濃縮液を凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、60重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には３重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例８】
【００２３】
ガングリオシドＧＤ3を酸加水分解してガングリオシドＧＭ3を製造する方法（特開平５−２７９３７９号公報）に従い、バターゼーラムから１リットル当たり360mgのガングリオシドＧＭ3を含有するガングリオシド素材を調製した。その後、原料中の主要蛋白質であるカゼインを凝集させ、生成したカゼインの沈殿は遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、分画粒子径0.1μＭの精密濾過膜（Ｍilipore社製）処理を行ない、濃縮液を得た。そして、この濃縮液を凍結乾燥して粉末状とした。得られたガングリオシド素材粉末を10重量％水溶液とし、15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、88℃にて180分間加熱処理を行った。
その後、10％水酸化カリウムにて中和し、凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、60重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には4.8重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例９】
【００２４】
１リットル当たり 3.8mgのガングリオシドＧD3と0.1mgのガングリオシドＧＭ3を含有する脱脂乳５リットルに15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、88℃にて180分間加熱処理を行った。その後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、原料中の主要蛋白質であるカゼインを凝集させた。生成したカゼインの沈殿は遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、0.1重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には0.01重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例１０】
【００２５】
１リットル当たり90mgのガングリオシドＧD3を含有する10重量％バターミルク溶液に15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、同時に塩化カルシウムを全体量の0.03重量％になるように添加し、88℃にて180分間加熱処理を行った。その後、ｐＨを4.5〜5.0に調整し、原料中の主要蛋白質であるカゼインを凝集させた。生成したカゼインの沈殿は遠心分離機で処理することにより完全に除去して上清を得た。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、７重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には0.2重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。
【実施例１１】
【００２６】
１リットル当たり130mgのガングリオシドＧD3を含有する10重量％ホエータンパク質濃縮溶液（ＷＰＣ溶液）に、15％塩酸を加えてｐＨを3.0に調整し、88℃にて180分間加熱処理を行った。
この上清を10％水酸化カリウムにて中和し、凍結乾燥して、本発明の高濃縮されたラクトシルセラミド粉末を得た。
得られた粉末に含まれる脂質含量をレーゼゴットリーブ法により測定した結果、10重量％の脂質が含まれていた。
HPLCを用いた定量によると、この組成物には0.3重量％のラクトシルセラミドが含まれていた。