(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感知対象である標的分子の存在に起因する物理的変化が発生した場合に、この物理的変化を機械的に検知可能な変化に変換するための基材であって、この物理的変化を感知するための感知領域のある表面を有する基材と、
細胞膜を有するモリクテス綱を前記感知領域上に固定化するための接着材料と、
前記接着材料で前記感知領域上に固定化された前記モリクテス綱とを有し、
前記モリクテス綱の前記細胞膜が、感知対象である標的分子に対して特異的に結合可能な生体機能的インターフェイスを構成する、
前記標的分子を感知するためのバイオセンサチップ。
【請求項２】
前記感知領域に属さない前記基材の前記表面の部分上に前記モリクテス綱が固定化されるのを防止するための抗細胞材料、
をさらに有してなる請求項１に記載のバイオセンサチップ。
【請求項３】
前記接着材料が、
前記モリクテス綱の本体部を前記感知領域上に固定化するための第１の接着材料であって、前記モリクテス綱の本体部に特異的に結合する第１の接着材料、及び、
前記モリクテス綱の先端部を前記基材の前記表面に固定化するための第２の接着材料であって、前記モリクテス綱の先端部に特異的に結合する第２の接着材料、
を有してなる請求項１に記載のバイオセンサチップ。
【請求項４】
前記モリクテス綱の前記細胞膜中へ埋め込まれた、特異的認識を行うことのできる生体分子、
を有してなる請求項３に記載のバイオセンサチップ。
【請求項５】
複数の感知領域が前記基材中へ埋め込まれ、
前記接着材料が、前記複数の感知用領域の一部のみに配置されている、
請求項１に記載のバイオセンサチップ。
【請求項６】
前記基材が、光学的キャビティを画定するための表面を有し、共鳴再循環により光を該粒子の該表面内に封ずる粒子を備え、および
該粒子の該表面の一部が、該基材の該表面の外側へ露出されて該粒子の該表面の前記一部によって前記感知領域を構成する、
請求項１に記載のバイオセンサチップ。
【請求項７】
請求項４に記載のバイオセンサチップと、
該感知領域における質量または屈折率の変化を検出するためのトランスデューサと、
前記バイオセンサチップに分析対象物を供給するフローセルと、
を有してなる標的分子を感知するためのバイオセンサ。
【請求項８】
感知対象である標的分子の存在に起因する物理的変化が発生した場合に、この物理的変化を機械的に検知可能な変化に変換するための基材であって、この物理的変化を感知するための感知領域のある表面を有する基材を調製する工程、および
細胞膜を有するモリクテス綱を前記感知領域上に固定化するために前記感知領域上に接着材料を配置する工程と、
前記接着材料で前記感知領域上に前記モリクテス綱を固定化する工程とを有し、
前記モリクテス綱の前記細胞膜が、感知対象である標的分子に対して特異的に結合可能な生体機能的インターフェイスを構成する、
前記標的分子を感知するためのバイオセンサチップの製造方法。
【請求項９】
前記感知領域に属さない前記基材の前記表面の一部に、前記モリクテス綱が前記基材の前記表面の一部に固定化されるのを防止するための抗細胞材料を配置する工程、
をさらに有してなる請求項８に記載のバイオセンサチップの製造方法。
【請求項１０】
前記接着材料が、
前記モリクテス綱の本体部を前記感知領域上に固定化するための第１の接着材料であって、前記モリクテス綱の本体部に特異的に結合する第１の接着材料、及び、
前記モリクテス綱の先端部を前記基材の前記表面に固定化するための第２の接着材料であって、前記モリクテス綱の先端部に特異的に結合する第２の接着材料、
を有してなる請求項８に記載のバイオセンサチップの製造方法。
【請求項１１】
特異的認識を行うことのできる生体分子を、脂質分子がモリクテス綱の細胞膜中に組織化され得るように該生体分子を該脂質分子に結合させることにより、該モリクテス綱の該細胞膜中に埋め込む工程、
を有してなる請求項８に記載のバイオセンサチップの製造方法。
【請求項１２】
特異的認識を行うことのできる生体分子を、モリクテス綱が該モリクテス綱の細胞膜中に該生体分子を発現させ得るように、該細胞膜中の該生体分子の発現に必要な少なくとも１つの配列によって内在性ＤＮＡ配列を変更するか、または、プラスミドもしくはバクテリオファージにて前記モリクテス綱を形質転換することによって、前記モリクテス綱の前記細胞膜中へ埋め込む工程、
を有してなる請求項８に記載のバイオセンサチップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、バイオセンサおよびバイオセンサチップ、ならびに標的分子を感知するためのバイオセンサチップの製造方法に関するものである。
【０００２】
先の米国仮出願である、２００６年５月１日に提出された第６０／７９６，１６２号出願および２００６年１２月２２日に提出された第６０／８７１，７６５号出願の全内容は、引用によってこの明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
バイオセンサのバイオインターフェイスとしてのホールセル（細胞全体）は多くの著者によって提案されてきた。最近の論評については、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．の２００３年第１９巻の第２４３〜２５３ページにおけるＴ．Ｈ．Ｐａｒｋ氏およびＭ．Ｌ．Ｓｈｕｌｅｒ氏による論文を参照されたい。この論文によれば、生体内データを感知するための細胞の可能性についての検討に加えて、細胞のマイクロパターン化および表面接合について用いられた技術についての洞察もまたもたらされている。この状況における１つの興味深い取り組みはいわゆる細胞培養類似体（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅ）（ＣＣＡ）であり、これは細胞機能を模倣する人工装置である。ＣＣＡは、主に薬学的研究を対象にしているが、適切な適応の後には、生体内データを感知するための可能性をも有している。
【０００４】
生体内データを感知するための細胞の利用についての１つの重大な局面は、マイクロパターンあるいはナノパターン上への制御されたそれらの接着である。このような技術は、細胞接着、細胞成長、代謝、およびアポトーシスのような細胞生物学における基礎研究のために重要であるのみならず、組織工学、神経科学における適用、およびマンマシン・インターフェイスの開発をさらに目的とする点でも重要である。ナノパターンは、細胞結合箇所の分子画定および多価相互作用が重大であるときに特に有用である〔ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．の２００３年第４巻の第３３９〜３４３ページにおけるＳ．Ｓｖｅｄｈｅｍ氏らによる論文、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓの２００６年第６巻の第２６７〜２７０ページにおけるＣｈ．Ｓｅｌｈｕｂｅｒ氏らによる論文〕。しかしながら、これらの研究における接着のために用いられた細胞は、平均直径が通常数十μｍから２〜３百μｍまでであるメゾスコピックサイズである。文献には、ナノパターン上に接合された細胞が単独でサブミクロンの寸法を有するどのような試みも報告されていない。
【０００５】
ホールセルに加えて、細胞膜もまた、活性および高い選択性をバイオセンシングシステムの生物学的認識プロセスに導入するために用いることができる。ここではさらに、天然細胞の表面吸着〔Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．の２００１年第３巻の第４０９１〜４０９５ページにおけるＭ．Ｔａｎａｋａ氏らによる論文〕から、細胞膜の代用として人工的に形成された脂質二重層の拡散〔Ｓｃｉｅｎｃｅの１９９６年第２７１巻の第４３〜４８ページにおけるＥ．Ｓａｃｋｍａｎｎ氏による論文〕までの範囲にわたって、さまざまな方法が適用されてきた。後者の利用は、制御がいっそう単純かつ容易ではあるが、それらは、機械的および化学的な安定性が比較的低く、上記二重層の流動性、とりわけ凍結および解凍のサイクルの適用の後におけるそれが不充分である、という点で不利益を示している。より詳しい情報については、次の論評および論文を参照されたい。Ｓｃｉｅｎｃｅの１９９６年第２７１巻の第４３〜４８ページにおけるＥ．Ｓａｃｋｍａｎｎ氏によるもの、Ｓｃｉｅｎｃｅの１９９７年第２７５巻の第６５１〜６５３ページにおけるＪ．Ｔ．Ｇｒｏｖｅｓ氏らによるもの、Ｎａｔｕｒｅの２００５年第４３７巻の第６５６〜６６３ページにおけるＭ．Ｔａｎａｋａ氏およびＥ．Ｓａｃｋｍａｎｎ氏によるもの、Ｌａｎｇｍｕｉｒの２００６年第２２巻の第７０７８〜７０８３ページにおけるＯ．Ｗｏｒｓｆｏｌｄ氏らによるもの、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．の２００４年第１２６巻の第３２５７〜３２６０ページにおけるＭ．Ｔａｎａｋａ氏らによるもの。
【０００６】
モリクテス綱（ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ）については、それらの寄生的性質によって、特に生体医科学において広範囲に研究されてきた。それらのほとんどは、植物、動物、およびヒトにおけるマイコプラズマ肺炎あるいはマイコプラズマ関節炎などの疾患を引き起こすものである。しかしながら、宿主生物にとって直接的に悪性であるのみでなく、モリクテス綱は、他の病原体、とりわけウイルスにおいて簡潔な侵入手段をもまた与え、侵入後にその宿主の深刻な感染症を引き起こしうる。これらの主題に関する広範囲な論評について、この発明の発明者らは、ニューヨークのＫｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社のＳｈｍｕｅｌ  Ｒａｚｉｎ氏およびＲｉｃｈａｒｄ  Ｈｅｒｒｍａｎｎ氏によって編集された書籍である２００３〔ＩＳＢＮ  ０−３０６−４７２８７−２〕「マイコプラズマの分子生物学および病原性」（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ”）および同主題についてのＳ．Ｒａｚｉｎ氏らによる論評〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．Ｒｅｖ．の１９９８年第６２巻の第１０９４〜１１５６ページにおけるＳ．Ｒａｚｉｎ氏らによるもの、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．の２００３年第８３巻の第４１７〜４３２ページにおけるＳ．Ｒａｚｉｎ氏によるもの〕を参照している。
【０００７】
モリクテス綱が大いに研究された他の科学分野の１つは、細胞膜の性質および機能に関する研究である。このことは、モリクテス綱が外側細胞壁の恒久的欠如を示しているという事実に基づいている。それらには、外側から直接接触可能な、生物学的に活性で充分に機能的な原形質膜が基本的に備わっている。細胞膜二重層の流動性および機能についての今日の知識の大部分は、モリクテス綱に関する研究によって得られたものである。モリクテス綱の細胞膜をバイオセンシングに直接適用することは、これまでのところまったく試みられていないが、この研究分野が有益であることから、この文書において示唆された取り組みの実現可能性が強調されている。さらに別の情報について、この発明者らは、ニューヨークのＰｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社のＳｕｂｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．の１９９３年第２０巻の第１〜３１４ページにおけるＳ．Ｒｏｔｔｅｍ氏およびＩ．Ｋａｈａｎｅ氏（編集者）による「マイコプラズマ細胞膜」（“Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”）および、例えばＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．の１９７０年第６６巻の第９０９〜９１６ページにおけるＭ．Ｅ．Ｔｏｕｒｔｅｌｌｏｔｔｅ氏らによる論文を参照している。
【０００８】
これまでに刊行されたバイオナノテクノロジの大いに進歩している分野へのモリクテス綱の知られた唯一の応用は、バイオセンシングに関するものではなく、分子移送と分子機械の開発とに関するものである。Ｈｉｒａｔｓｕｋａ氏とその協力者らは、マイクロトラックにおける生物学的薬剤についての移送体としての迅速滑走マイコプラズマ（マイコプラズマモバイル）の使用について報告している〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．の２００５年第３３１巻の第３１８〜３２４ページにおけるＹ．Ｈｉｒａｔｓｕｋａ氏らによる論文〕。
【０００９】
ナノバイオセンサの開発は、工業的関連性に加えて学問的な複数の理由によって行われている。明らかなことであるが、センサが小さければ小さいほど、それはより少量の分析対象物を必要とし、信号対雑音比が改善されることが約束され、製造コストがより低くなり、かつ、ますます縮小化されたわれわれの世界において全体としてより良好に適合する。さらに、生物医学的研究および薬学的研究には、例えば１つのバイオチップの上における全ヒトゲノムのスクリーニングの様に、分析対象物の高いスループットスクリーニングが要求される。このような巨大データの処理には、扱いやすくするために小さい形状が厳しく要求される。しかしながら、最も刺激的な局面は、ナノスケールセンサが、われわれのナノ構造型の生物学的世界における寸法に達し、それによって、生物学的プロセスをプロセスの行われるまさにその現場で局所的に検出する機会を開く、という事実に関連している。数多くのナノバイオセンサは、物質移行と生物学的分析対象物の濃度の変化とを局所的に、例えば１つの細胞にわたって追跡するであろう。このような高分解能センシングによれば、基礎科学から、臨床的研究、薬剤開発、組織工学、人工臓器およびインプラント開発、ならびにマンマシン装置までの範囲にわたる多くの相異なる分野で働いている科学者および研究者にとって、全く新しい世界が開かれるであろう。
【００１０】
バイオセンサの構成に関する典型的な構想は、所望の分子を標的にする特異的結合用リゲートを支持する充分機能的な生化学的構造を、生物学的事象を機械可読データへ変換するためのトランスデューサとして作用する物理的装置へ組み合わせることである。ナノバイオセンサについては、このことは、生物学的および物理学的複合物の混成がサブミクロン水準で起きる必要があるということを意味する。ナノテクノロジおよび情報処理における急速な進歩により、主に電子的、光学的、あるいは光電子的な、サブミクロン規模の分解能を有するトランスデューサ機構をもたらすさまざまな物理的装置が利用可能である一方で、結果として、そのような装置を充分に作動可能な生化学的構造で機能化することはどちらかというと困難になる。このことは、いっそう驚くべきことであるが、その理由は、特に生物学的状況が、その構造における巨大な階層のために、分子寸法から巨視的規模まで達するとみなされているからである。従って、ナノバイオセンシングが作用する規模は容易に達成することができるであろう。しかしながら、特異的認識プロセスなどの生化学的事象は、事実上、極めて動的であり、また、単一反応よりはむしろ多くの競合的プロセスの微妙な均衡である傾向が強い。従って、この課題は、サブミクロン寸法の範囲内で、関連するすべての基本構成要素から構成された、充分に機能的な生化学的ユニットを提供することである。
【００１１】
実際には、標的分子を高い特異性で選択的に結合することのできる生化学的インターフェイスを製造するという課題は、２つの基本的な要件に、すなわち、特定のリゲートの存在と、同じ試料の中に存在するかもしれない複数の他の分子の非特異的結合を抑制する可能性とに狭めることができる。商品化のためにいっそう重要である２番目の要件は、製造プロセスの高い信頼性および再現性に加えて、寿命および保存の問題に関連している。
【００１２】
特定のリゲートが必要であるという第１の基本的要件は比較的容易に満たされるが、その理由は、自然現象それ自体が特異的認識プロセスに関するロックキー原理の発明者であるからである。従って、上記の全課題は、所望のリゲートが適した宿主生物の中で製造された後におけるこれらの単離および処理へ削減することができる。過去数１０年の間に、さまざまな技術、例えば、第２工程において物理センサへ物理的にあるいは化学的に取り付けることのできる単クローン抗体の成長および採取についての技術が開発されている。しかしながら、この挑戦は、非特異的結合事象を抑制することによって高い特異性を保証するためのものである。後者は、物理的トランスデューサ機構が、特異的相互作用あるいは非特異的相互作用のためにセンサへ付着する分子どうしを区別することが一般にできないため、最重要なものであるが、その理由は、関係する力（静電気の、ファン・デル・ワールスの、疎水性の）の性質がこれら両方の種類の相互作用において基本的に同じであるからである。このため、特異性は、センサの生物学的及び物理学的複合物との間におけるインターフェイスとしてのごく選択的に作用する生化学構造によってのみ、導入することができる。
【００１３】
非特異的相互作用を抑制するための標準的な方法は、非特異的吸着部位を遮るために、リゲートを保持する生化学的構造をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの他の接着性蛋白質へさらすことに基づいている。しかしながら、この方法の効率は、使用される基材と研究中の生物学的系との両方に左右され、また、溶解している種と表面に結合している種との間で交換プロセスが起きることがある（フローマン効果（Ｖｒｏｍａｎ  ｅｆｆｅｃｔ））。従って、特定のリゲートを非特異的蛋白質吸着に抵抗するマトリックス材料の中へ一体化するさまざまな試みが近年、行われている。すぐれた蛋白質反発特性の備わった候補マトリックス材料は例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）の薄膜〔ニューヨークのＰｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社のＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ氏によって編集された１９９２年のＥ．Ｗ．Ｍｅｒｒｉｌｌ氏による「ポリ（エチレンオキサイド）および血液接触」（“Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｏｘｉｄｅ）  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｎｔａｃｔ”）の第１９９〜２２０ページ、ニューヨークのＰｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社のＪ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ氏によって編集された１９９２年のＣ．Ｇ．Ｇｏｌａｎｄｅｒ氏、Ｊ．Ｎ．Ｈｅｒｒｏｎ氏、Ｋ．Ｌｉｍ氏、Ｐ．Ｃｌａｅｓｓｏｎ氏、Ｐ．Ｓｔｅｎｉｕｓ氏、Ｊ．Ｄ．Ａｎｄｒａｄｅ氏による「固定化されたＰＥＧ膜の性質および蛋白質との相互作用：実験およびモデル化」（“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＰＥＧ  Ｆｉｌｍｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）の第２２１〜２４５ページ〕およびオリゴ（エチレングリコール）（ＯＥＧ）の薄膜〔Ｓｃｉｅｎｃｅの１９９１年第２５２巻の第１１６４〜１１６７ページにおけるＫ．Ｌ．Ｐｒｉｍｅ氏およびＧ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ氏によるもの；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．の１９９３年第１１５巻の第１０７１４〜１０７２１ページにおけるＫ．Ｌ．Ｐｒｉｍｅ氏およびＧ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ氏によるもの〕である。
【００１４】
しかしながら、簡単な生物学的モデルの流体での実験室規模におけるいくつかの成功の他に、そのような膜を用いる生化学的インターフェイスは、工業的規模での用途に適したものになるであろう充分な安定性および再現性を示すことがなかった。エチレングリコール誘導体の特定の問題は例えば、酸化についてのそれらの不安定性である。
【００１５】
これまで言及されなかったこのような人工的生化学的インターフェイスについての別の問題は、特異的結合に使用されるリゲートの活性である。このようなリゲートの製造および採取については問題がないものの、吸着あるいは化学結合による生化学的インターフェイスの中へリゲートを組み込むことによって、リゲートの変質、さらに、そのためリゲートの活性の損失が引き起こされることがある。すべてのこれらの問題、すなわち、バイオセンサの生化学的インターフェイスの不充分な特異性および活性は、リゲートを埋め込むための天然の宿主マトリックスが選択されたときに、克服可能である。例えば、細胞膜には、きわめて複雑な生物学的環境が存在するにもかかわらず、完全に活性であってきわめて特異なままである、相異なった複数の特異的に作用するリゲートが含まれている〔Ｓｃｉｅｎｃｅの１９９６年第２７１巻の第４３〜４８ページにおけるＥ．Ｓａｃｋｍａｎｎ氏の論文〕。
【００１６】
従って、バイオセンシングにおける生化学的インターフェイスとして細胞膜を利用することは道理に適った試みであるように思われる。しかしながら、ヒトあるいは動物の細胞から採取された天然の細胞膜は、特に工業的規模での製造の観点では、利用するのが困難である。第１に、そのような細胞膜は、きわめて複雑であるとともに、バイオセンシングにおいて好ましくない特異的相互作用などの副作用を引き起こすかもしれないさまざまな蛋白質および受容体を含んでいる。さらに、それらの組成における自然の変動によって、信頼性およびプロセス制御が複雑になる。
【００１７】
このため、細胞表面モデルとして使用することができるとともにそれぞれの研究のために必要なそれらの分子が富化された人工的な表面支持型細胞膜を製造する多くの試みが行われてきた〔Ｎａｔｕｒｅの２００５年第４３７巻の第６５６〜６６３ページにおけるＭ．Ｔａｎａｋａ氏およびＥ．Ｓａｃｋｍａｎｎ氏の論文〕。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
現在の技術によれば、人工的な表面支持型細胞膜を大規模に、すなわち均一表面で製造することが可能になるが、パターン化された細胞膜は、これまでのところミクロン寸法の状況に制限されている。人工細胞膜のナノパターン化は、これまでのところ達成されておらず、また、不充分な安定性のために困難であるように思われる。さらに、そのような小規模での人工細胞膜の機能性は、その細胞膜の流動性がその適切な機能のために最も重要であるため、疑わしい。しかしながら、流動性は、人工細胞膜で達成することが困難であることがわかっている〔Ｌａｎｇｍｕｉｒの２００６年第２２巻の第７０７８〜７０８３ページにおけるＯ．Ｗｏｒｓｆｏｌｄ氏、Ｎ．Ｈ．Ｖｏｅｌｃｋｅｒ氏、Ｔ．Ｎｉｓｈｉｙａ氏の論文〕。細胞膜の全寸法をサブミクロンの寸法に制限することもまた、この問題をさらに複雑にするだろう。
【００１９】
上記のことから、バイオセンシングのために必要であるような一体化型リゲートの高い活性と特異性とが備わっている、完全に作用することのできる生化学的インターフェイスの製造が依然として主要な挑戦のままであることが明らかになる。このことは、上記要件に加えて、良好な保存機能、長い寿命、容易な製造性などのような重要な実際的特性についてのさらに別の要件が必要であるバイオセンサの工業的規模製造に関して特に真実である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
この発明は、上記の従来技術において生じるであろう上記諸問題を解決するためになされたものである。
【００２１】
この発明の１つの態様による標的分子を感知するためのバイオセンサチップは、感知用領域が備わった表面を有す基材と、細胞膜を有すモリクテス綱を上記感知用領域上に固定化するための接着性材料と、を含む。
【００２２】
この発明の別の態様による標的分子を感知するためのバイオセンサは、上記バイオセンサチップと、上記感知用領域における質量あるいは屈折率の変化を検出するためのトランスデューサと、上記バイオセンサチップに分析対象物を供給するフローセルと、を含む。
【００２３】
この発明の別の観点による標的分子を感知するためのバイオセンサチップの製造方法は、感知用領域が備わった表面を有す基材を用意する工程と、細胞膜を有すモリクテス綱を上記感知用領域上に固定化するために、接着性材料を上記感知用領域上に配置する工程と、を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明のある実施形態による、ナノパターン上にモリクテス綱を固定化するための第１の基本方式を描写している概略図であり、ここで、図１（ａ）は、基材の上における接着性材料および抗細胞材料によって形成されたナノパターンを示しており、図１（ｂ）は、基材の上における上記接着性材料によって固定化されたモリクテス綱のあるナノパターンを示している。
【００２５】
【図２】図２は、本発明の別の実施形態による、ナノパターン上にモリクテス綱を固定化するための第２の基本方式を描写している概略図であり、ここで、図２（ａ）は、基材上における２つの相異なる接着性材料および上記抗細胞材料によって形成されたナノパターンを示しており、図２（ｂ）は、先端部が基材上における上記接着性材料の一方によって固定化され、本体部が基材上における上記接着性材料の他方によって固定化されたモリクテス綱のあるナノパターンを示している。
【００２６】
【図３】図３は、リゲートをモリクテス綱の細胞膜の中へ埋め込むための第１の基本方式を描写している概略図であり、ここで、図３（ａ）は、脂質分子が細胞膜を組織する前に上記脂質分子へ共有結合的に取り付けられたリゲートを示しており、図３（ｂ）は、細胞膜へと組織化された脂質分子へ取り付けられたリゲートを示している。
【００２７】
【図４】図４は、リゲートを遺伝子工学によってモリクテス綱の中へ埋め込むための第２の基本方式を描写している概略図であり、ここで、図４（ａ）は、天然ＤＮＡを有するモリクテス綱を示しており、図４（ｂ）は、異質な配列が上記ＤＮＡの中へ挿入されたモリクテス綱を示しており、図４（ｃ）は、その細胞膜における好ましいリゲートの発現の後の変性ＤＮＡを有するモリクテス綱を示している。
【００２８】
【図５】図５は、モリクテス綱を生化学的インターフェイスとして利用してバイオセンサチップを製造するための基本方式（Ｉ）を描写している概略図である。
【００２９】
【図６】図６は、基材上に２つの感知用表面があるバイオセンサチップを製造するための基本方式（ＩＩ）を描写している概略図である。
【００３０】
【図７】図７は、モリクテス綱が方位付けられた方式で固定化されたバイオセンサチップを製造するための基本方式（ＩＩＩ）を描写している概略図である。
【００３１】
【図８】図８は、バイオセンサチップの利用を描写している概略図である。
【００３２】
【図９】図９は、バイオセンサチップを利用して標的分子を感知するためのバイオセンサについての一例を描写している概略図である。
【００３３】
【図１０】図１０は、キャビティ表面の見込まれる反射特性を描写している概略図であり、ここで、図１０（ａ）は、非金属キャビティの事例における上記特性を示しており、図１０（ｂ）は、金属被覆キャビティの事例における上記特性を示している。
【００３４】
【図１１】図１１は、マイクロキャビティのキャビティモードの波長についての簡易見積を描写している概略図であり、ここで、図１１（ａ）は、金属被覆キャビティについての概算を示しており、図１１（ｂ）は、非金属キャビティについての概算を示している。
【００３５】
【図１２】図１２は、異なる成長期間の後にシリコン基材上に固定化されたアコレプラズマ・レイドラウィイ（ＡＰＬ）細胞の、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による顕微鏡写真を示しており、図１２（ａ）は、培地中での２日間の成長後におけるＡＰＬ細胞を示しており、図１２（ｂ）は、６日間の成長後におけるＡＰＬ細胞を示しており、図１２（ｃ）は、図１２（ｂ）の右上隅のクローズアップである。
【００３６】
【図１３】図１３は、脂質標識化プローブ分子をＡＰＬ細胞膜の中へ一体化する実現可能性を実証しており、図１３（ａ）は、脂質標識化蛍光体で染色されたＡＰＬ細胞のクラスタの共焦点蛍光画像であり、図１３（ｂ）は、その蛍光画像と同時に取得された同一のクラスタの共焦点透過画像である。
【００３７】
【図１４】図１４は、懸濁状態にある脂質−ビオチン標識化ＡＰＬ細胞を使用する生物特異的相互作用に関する実験の結果を示しており、図１４（ａ）は、特異的結合標的分子（ローダミンＢ検出用にプレートリーダ設定）として蛍光標識化ストレプトアビジンを使用する実験の結果を与え、また図１４（ｂ）は、非特異的相互作用標的分子（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８検出用にプレートリーダ設定）として蛍光ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する結果を示しており、示された蛍光強度は、ＰＢＳ緩衝剤のみについて同一条件下で測定された強度に対して標準化されている。
【００３８】
【図１５】図１５は、表面が固定化された脂質−ビオチン標識化ＡＰＬ細胞（ローダミンＢ検出用にプレートリーダ設定）を使用する生物特異的相互作用に関する実験の結果を与え、示された蛍光強度は、ＰＢＳ緩衝剤のみについて同一条件下で測定された強度に対して標準化されている。
【００３９】
【図１６】図１６は、図１５において評価された表面のＳＥＭの顕微鏡写真を示している。図１６の顕微鏡写真と同一標示のある図１５の結果バーとは互いに対応している。
【００４０】
【図１７】表面に固定化された脂質−ビオチン標識化ＡＰＬ細胞を使用する生物特異的相互作用に関する実験の結果。（Ｉ）ローダミンＢ標識化ストレプトアビジンに曝露された細胞、ローダミンＢ検出用にプレートリーダ設定。（ＩＩ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＢＳＡに曝露された細胞、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の検出用にプレートリーダ設定。（ＩＩＩ）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化ＢＳＡへ付加的に曝露された後の（Ｉ）の細胞、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８検出用にプレートリーダ設定。（ＩＶ）ローダミンＢ標識化ストレプトアビジンへ付加的に曝露された後の（ＩＩ）の細胞、ローダミンＢ検出用にプレートリーダ設定。示された蛍光強度は、ＰＢＳ緩衝剤のみについて同一条件下で測定された強度に対して標準化されている。
【００４１】
【図１８】図１５に示された実験のために使用された表面吸着ＡＰＬ細胞のクローズアップを示しているＳＥＭの顕微鏡写真。
【００４２】
【図１９】ナノパターン化されたＡＰＬ細胞のＳＥＭの顕微鏡写真であり、ここで、図１９（ａ）は、公称直径が３μｍであるＳｉパッチ上にパターン化されたＡＰＬ細胞を示しており、図１９（ｂ）は、培地のみにさらされた３μｍのＳｉパッチの制御パターンを示しており、図１９（ｃ）および（ｄ）は、公称直径が約１μｍであるＳｉパッチ上にパターン化されたＡＰＬ細胞を示しており、図１９（ｅ）は、５００ｎｍまでのＳｉパッチ上にパターン化されたＡＰＬ細胞を示している。
【００４３】
【図２０】−３０℃で３日間、凍結された細胞のプローブから成長したＡＰＬ細胞。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明に関連する代表的ないくつかの実施形態が、添付図面を参照しながら、以下に詳しく説明される。
【００４５】
基本概念
まず、これらの実施形態の基本概念が以下に説明される。上記の知見に基づいて、発明者らは、これらすべての問題点、とりわけサブミクロン寸法の生化学的インターフェイスの製造に関する問題点に対する、驚くほど容易かつ単純な解決法に気付いた。加えて、この解決法によれば、モノクローナル抗体のようなリゲート生産物をもこれらの生化学的インターフェイスの製造の中へ組み入れる可能性がもたらされる。
【００４６】
発明者らによる提案は、生化学的インターフェイスとして、マイコプラズマあるいはアコレプラズマのようなモリクテス綱を利用することである。モリクテス綱は、サイズが下に２〜３百ナノメートルまで至ることが知られている最小の自己複製細胞である。それらの小さい寸法のために、それらのゲノムの長さはこれまでに知られていた最も短いものに属している。このため、モリクテス綱は、その生合成能力が制限されてきたうえに、それらの大部分は、それら自体による生存および自己複製のために必要なすべての蛋白質を生産することができない。その代わりに、モリクテス綱は、成熟した植物、動物あるいはヒトの細胞へ膜融合によってドッキングする寄生体として、それらの生涯を費やす（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  の２００３年第８３巻の第４１７〜４３２ページにおけるＳ．Ｒｏｔｔｅｍ氏の論文）。より高度に成長した細胞へドッキングされると、これらのモリクテス綱は、それら自体に、必須の蛋白質および生体分子のすべてを宿主細胞から供給する。おそらく、この理由のために、すなわち細胞膜融合のために、モリクテス綱には、植物あるいは動物の細胞のような外側細胞壁が備わっていない（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  の１９９８年第６２巻の第１０９４〜１１５６ページにおけるＳ．Ｒａｚｉｎ氏らによる論文）。それらは脂質膜の二重層によって簡単に閉じ込められる。
【００４７】
要するに、モリクテス綱におけるこれらの独自の特性によって、モリクテス綱は、さまざまな研究のためにきわめて魅力あるものになった。ゲノム研究は、自己複生のために必要な最小ゲノムに関心が持たれている。このような状況において、モリクテス綱は、「生命の量子ビット」を有するものと呼ばれる。外側細胞壁がないことから、それらは、細胞膜の研究にとってごく一般的なものである。
【００４８】
細胞膜の流動性および物理化学的諸特性に関するわれわれの知識のほとんどすべては、モリクテス綱についての研究に由来している（ニューヨークのＰｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社のＳ．Ｒｏｔｔｅｍ氏およびＩ．Ｋａｈａｎｅ氏によって編集されたＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙの１９９３年第２０巻の第１０９〜１６６ページにおけるＬ．Ｒｉｌｆｏｒｓ氏らによる「アコレプラズマ・レイドラウィイにおける極性脂質の調整および物理化学的諸特性」（“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  Ｌａｉｄｌａｗｉｉ”）、およびＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａの１９８４年第７７９巻第１〜４２ページのＲ．Ｎ．ＭｃＥｌｈａｎｅｙ氏による論文）。最後に、それらの寄生的生活もまた、生物医学的研究にとって興味のあることである。外側細胞壁がないことから、モリクテス綱は、ウイルスによってきわめて容易に侵入される。したがって、成熟した植物、動物あるいはヒトの細胞へドッキングされると、モリクテス綱は、ＨＩＶ、ＳＡＲＳなどの、宿主細胞を標的とするウイルス感染のための容易な進入口をもたらす。このため、モリクテス綱は、ウイルス性疾患の感染経路において重要な役割を果たすと考えられている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  の１９９８年第６２巻の第１０９４〜１１５６ページにおけるＳ．Ｒａｚｉｎ氏らによる論文）。
【００４９】
バイオセンシングについてのナノスケールの生化学的インターフェイスとしてモリクテス綱を使用するこの発想は、これらの独自の諸特性のいくつかに依存している。ある種のモリクテス綱は成熟細胞にドッキングすることから、それらの細胞膜には、多数の細胞接着分子および受容体が存在している（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  の２００３年第８３巻の第４１７〜４３２ページにおけるＳ．Ｒｏｔｔｅｍ氏の論文）。このため、それらは、平坦な表面、すなわち物理的信号のトランスデューサの感知用表面をインテグリンあるいは他の好適なリゲートなどの適切な細胞接着分子でパターン化することによって、ナノパッチ上へきわめて容易に表面吸着され得る。宿主細胞の中への侵入を促進するために、いくつかのモリクテス綱はいわゆる「先端部」をさらに呈示するが、この「先端部」には、それらの本体部には存在していない特定のリゲートが含まれている（例えば、Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎの２００２年第８９巻の第４５３〜４５８ページにおけるＪ．Ｈｅｇｅｒｍａｎｎ氏らによる論文とその中の参考文献、およびＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓの２００３年第８３巻の第４１７〜４３２ページにおけるＳ．Ｒｏｔｔｅｍ氏の論文を参照）。従って、モリクテス綱の先端部および本体部における相異なる種類のリゲートの存在をうまく利用して、方位付けられかつ制御された方式で表面固定化を達成することは、実現可能であるように思われる。
【００５０】
モリクテス綱の表面吸着についての基本方式
モリクテス綱は、以下で説明する少なくとも２つの相異なる基本方式によって、基材の表面において固定化することができる。
【００５１】
図１は、基材１の表面に形成されたナノパターン上に不揃いな向きで固定化されたモリクテス綱４の固定化についての第１の基本方式を表示している。図１（ａ）に示すように、当業者に公知の標準的ナノパターン化技術によって適切な基材１上に形成されたナノパターンは、細胞接着材料２と抗細胞材料３とからなる。この細胞接着材料２は、例えば細胞接着分子の存在によってモリクテス綱の接着を促進するためのナノスケールのパッチである。抗細胞材料３は、モリクテス綱４が基材１の表面に接着されるのを防止するためのものである。このため、図１（ｂ）に示すように、モリクテス綱４は、細胞接着材料２上に付着可能だが、抗細胞材料３の上に付着できない。従って、基材１上におけるモリクテス綱４の配置は、この第１の基本方式で達成することができる。
【００５２】
図２は、上記第１の方式の概念を拡張する第２の基本方式を表示している。この第２の方式は、それぞれが相異なる細胞接着分子を利用する２つの相異なる接着材料２ａおよび２ｂを含む細胞接着材料２を利用するものである。第１の接着材料２ａは、モリクテス綱４の本体部４ａを標的としており、第２の接着材料２ｂは、適切な細胞接着分子によってモリクテス綱４の先端部４ｂのみに対して特異的である。従って、モリクテス綱４の方位付け固定化は、この第２の基本方式で達成することができる。
【００５３】
次に、基材１、細胞接着材料２、抗細胞材料３、あるいはモリクテス綱４として使用可能な材料の詳細が説明される。
【００５４】
基材１としては、ナノパターン化することのできる任意の材料を使用することができる。好ましいのは、シリコンウェハ、ガラス、石英、インジウムスズ酸化物、ゲルマニウム、ガリウムヒ素およびこれらに関連した複合半導体、ならびにポリメチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ポリイミド、およびその他のナノ加工に適したポリマーなどの、マイクロ加工およびナノ加工において確立された材料が使用されることである。さらに、半導体のあるいは絶縁性の基材（例えば、上に記載されたそれらの材料）の上に蒸着された、貨幣金属（金、銀、銅、白金）、アルミニウム、コバルト、ニッケル、鉄、チタニウム、ならびにこれらの酸化物のような、金属およびそれらの薄膜を使用することができる。基材１上に上記接着材料２ａおよび２ｂならびに抗細胞材料３を制御されたやり方で蒸着するためには、基材１は、上記材料の適切な任意の複合物が基材として加工されかつ使用することができるという意味で、例えばナノパターン形成されうる。そして、上記表面へさらされた基材１のそれぞれの構成要素は、細胞接着材料２および抗細胞材料３それぞれのただ１つについて選択的なものである。従って、細胞接着材料２および抗細胞材料３によって、それらの蒸着の後に基材１上に形成されたパターンは、複合基材１のパターンに類似している。
【００５５】
一般に、当業者に公知のマイクロ／ナノパターン形成のための他の加工方式は、任意的または配向性を持ったモリクテス綱のパターン形成に適したパターンを加工するために使用することができ、例えばそれらの加工方式は、直接書込リソグラフィ（例えばイービームあるいはディップペンリソグラフィ）を利用することおよび／または反応性イオンエッチングなどの破壊的パターン化プロセスの工程を適用することである。
【００５６】
細胞接着材料２ａおよび２ｂとしては、蛋白質、ペプチド、抗体、ヌクレオチド、および受容体などのモリクテス綱へ特異的に結合する任意の種類の生体分子を使用することができる。例えば、直鎖状および環状のＲＧＤおよびＰＨＳＲＮなどの短いペプチド配列は、インテグリンのような細胞表面の細胞接着分子へ特異的に結合することが知られている。
【００５７】
インテグリンに加えて、免疫グロブリン（ＩｇＣＡＭ）、セレクチン、カドヘリン、硫酸ヘパリンプロテオグリカン、ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよび金属プロテアーゼを含有している細胞表面蛋白質）、および蛋白チロシンホスファターゼのなどの他のさまざまな細胞接着分子が細胞膜の中に存在しうる。これらは、上記のような特定のリンカー分子の適切な選択によって、特異的に標的にされ得る。例えば、抗体をそれが特に単一型の細胞接着分子を標的とするように設計することができる。単一型のインテグリンを特異的に標的にする抗体はすでに市販されている。さらに、細胞外マトリックス蛋白質、例えばコロニー形成モリクテス綱によって生産されるそれらを、モリクテス綱パターン化に適した表面官能化をもたらすために使用することができる。近年、いくつかのモリクテス綱ゲノムが完全に配列決定された（例えば、アコレプラズマ・レイドラウィイＰＧ−８Ａ：ロシア、モスクワ、Ｋｈａｒｋｅｖｉｃｈ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＧ．Ｙ．Ｋｏｖａｌｅｖａ氏らによるもの：ＮＣＢＩ参照番号ＮＣ＿０１０１６３）ので、バイオ形成学および／または遺伝子工学の方法も、モリクテス綱の細胞膜の全体またはその先端部もしくは本体部のみにおけるかのいずれかの適切な表面リンカー分子を特定しおよび／または（過剰）発現するために使用することができる。選択された方法に関係なく、モリクテス綱の先端部および本体部の選択的標的設定は、如かしてモリクテス綱にわたる細胞接着分子の分布、即ち相対濃度によって達成することができる。モリクテス綱の先端部は、その本体部の中に存在しないかあるいはほんの少しの量のみ存在する特定の細胞接着分子を含有することが知られている。
【００５８】
抗細胞材料３については、ポリエチレングリコール、ＢＳＡ、デキストラン、ホスホリルコリン〔Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂの２０００年第１８巻の第２６１〜２７５ページにおけるＡ．Ｌ．Ｌｅｗｉｓ氏の論文〕、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド〔Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．の１９９６年第８巻の第１９〜３９ページにおけるＴ．Ｂｏｈａｎｏｎ氏らによる論文〕およびそれらの誘導体等、任意の種類の公知材料を使用することができる。
【００５９】
モリクテス綱４については、公知の最も小さいモリクテス綱の１つはアコレプラズマ・レイドラウィイ（ＡＰＬ）であり、これは、動物の中に認められ、また、例えば畜牛、牛乳および関連製品の中に存在しており、さらに、米国基準培養株収集機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）によって生物学的安全性レベル１として分類されている。このため、その寄生的性質にもかかわらず、それは病原性のものではなく、また、その利用について特別な注意が必要なものでもない。従って、以下において、発明者らは、一例としてＡＰＬを使用することで、彼らの取り組みについて検討する。しかしながら、現在ほとんど研究されていない他のモリクテス綱によってこの目的が将来いっそう良好に果たされる可能性があるという点について、留意しておくべきである。表面吸着されたＡＰＬの直径は、約３５０〜１２００ｎｍの範囲にあり、それゆえ、サブミクロンの生化学的インターフェイスの要件に合致し得る。さらに、Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ氏および協力者らによって概要が説明されたように、ＡＰＬの寸法は、脂質分子の添加によってこの方式で制御することができる〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙの２００３年第２７８巻の第８４２０〜８４２８ページにおけるＥｄｍａｎ氏らによる論文〕。ＡＰＬはきわめて丈夫であり、すなわち、それは、その細胞膜の流動性を、それゆえ活性を損なうことなく、凍結しかつ融解させることができる。さらに、過酷な環境において生存する自然物として、ＡＰＬ（およびモリクテス綱一般）は、それらの細胞膜を変性から防止するために、それらの細胞膜の中に酸化防止剤をもたらす。酸化は実際に、人工細胞膜の利用における主な問題である。
【００６０】
リゲートをモリクテス綱の細胞膜の中に埋め込むための方式
特定のリゲートは、以下で説明される少なくとも２つの相異なる方式によって、モリクテス綱の細胞膜の中へ埋め込むことができる。
【００６１】
図３は、上記リゲートを埋め込むための第１の方式を示している。この埋め込み用の第１の方式では、特定のリゲート７が、それらを脂質分子６へ付着させることで、ＡＰＬ（あるいは他のモリクテス綱）４の細胞膜４ｃの中へそのまま埋め込まれる。水溶液の中において、次いで、脂質分子６は、細胞膜４ｃの中へ侵入し、水溶性リゲート７を外側へ残す。このような技術の例は例えば、Ｗｏｒｓｆｏｌｄ氏らによる論文〔Ｂｉｏｓｅｎｓ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．の第１９巻（２００４）の第１５０５〜１５１１ページ〕において与えられている。図３（ａ）に示すように、リゲート７は脂質分子６へ共有結合的に付着される。その後、図３（ｂ）に示すように、リゲート７を有する脂質分子６は、水性環境においてモリクテス綱４の細胞膜４ｃを組織する。
【００６２】
図４は、上記リゲートを埋め込むための第２の方式を示している。この埋め込み用の第２の方式では、特定のリゲート７が、遺伝子工学によってＡＰＬ（あるいは他のモリクテス綱）４の細胞膜４ｃの中へ導入される。マイコプラズマ肺炎などの、いくつかのモリクテス綱のＤＮＡ配列は、すでに知られている。ＤＮＡ配列の挿入および置換についての簡単な切断手法が開発されてきた（例えば、ニューヨークのＫｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社のＳｈｍｕｅｌ  Ｒａｚｉｎ氏およびＲｉｃｈａｒｄ  Ｈｅｒｒｍａｎｎ氏によって編集された書籍である２００３〔ＩＳＢＮ  ０−３０６−４７２８７−２〕「マイコプラズマの分子生物学および病原性」（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ”）およびその中の参考文献を参照のこと）。従って、遺伝子工学による抗体様分子、蛋白質、またはハイブリッド（例えば、Ｎａｔｕｒｅの１９７５年第２５６巻の第４９５ページにおけるＧ．Ｋｏｈｌｅｒ氏およびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ氏による論文、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ氏によるＥＰ０３２４１６２号明細書、Ｉｎａｂａ氏らによるＵＳ２００５／００６４５５７  Ａ１号明細書、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの２００３年第９巻の第１２９〜１３４ページにおけるＰ．Ｊ．Ｈｕｄｓｏｎ氏およびＣ．Ｓｏｕｒｉａｕ氏による論文を参照のこと）の生産と同様に、バイオセンシングに好ましいリゲートの直接的な発現は、実現可能であるように思われる。例えば、図４（ａ）に示すように、天然ＤＮＡ４ｄを有しているモリクテス綱４が調製される。その後、図４（ｂ）に示すように、天然ＤＮＡ４ｄは切断されて、外来配列８がモリクテス綱４の中へ挿入される。適切な条件の下では、図４（ｃ）に示すように、モリクテス綱４は、その細胞膜４ｃの中において上記の所望のリゲート７を発現し始める。さらに、プラスミドあるいはバクテリオファージなどの外来ＤＮＡを同一目的のために使用することができる。この方式では、モリクテス綱が、モリクテス綱の細胞膜において生体分子を発現できるように、細胞膜における生体分子の発現に必要な少なくとも１つの配列により内在性ＤＮＡ配列を変更すること、または、プラスミドもしくはバクテリオファージをモリクテス綱に形質転換することによる方法を含め、リゲートは任意の遺伝子工学的方法によって、モリクテス綱の細胞膜中へ埋め込むことができる。この状況における用語「変更すること」には、内在性ＤＮＡ配列を生体分子の発現のために必要な配列に置換することと、生体分子の発現のために必要な配列を細胞膜の中へ挿入することとが含まれる。
【００６３】
バイオセンサチップを製造するための方式
バイオセンサチップを製造するための簡単な３つの方式が図５〜図７に表示されている。
【００６４】
図５に示された第１の方式では、キャビティ１０（キャビティ１０を画定するための粒子）が、基材(主体材料)１に、その表面のサブミクロンのパッチのみが基材１の表面の外側へ露出されるように埋め込まれている(工程１)。次いで、基材１の表面は抗細胞材料３で被覆され、一方、キャビティ１０の露出領域は細胞接着材料２で被覆される(工程２)。細胞接着材料２上へのモリクテス綱４の固定化(工程３)の後に、適切なリゲート７が、外側から細胞膜の中へ埋め込まれるか、あるいはそのＤＮＡの先行する遺伝子工学に基づいてこのモリクテス綱によって生産される(工程４)。抗細胞材料３による被覆はモリクテス綱４の固定化プロセスを通してのみ適切に機能しなければならないことに留意すべきである。特異的相互作用を後に感知するために、抗細胞材料３による被膜上への非特異的吸着は容認することができるが、その理由は光学トランスデューサがこれらの領域では感度がよくないためである。
【００６５】
図６に示された第２の方式では、上記方式の原理は、基材１の中に埋め込まれた第２の光キャビティ１１の存在へ拡張される(工程１)。次いで、第２のキャビティ１１の露出領域を含む基材１の表面は、抗細胞材料３で被覆され、一方、キャビティ１０の露出領域は細胞接着材料２で被覆される(工程２)。細胞接着材料２上へのモリクテス綱４の固定化(工程３)の後に、適切なリゲート７が細胞膜の中へ埋め込まれる(工程４)。第２の光キャビティ１１は、生体機能化されるのではなく、媒体の温度あるいは屈折率などにおける変化を明らかにする参照センサとして働く。また、その参照は、抗細胞材料３による被膜上への非特異的吸着の量を測定するものであってよい。
【００６６】
最後に、図７に示された第３の方式では、方位付けられたマイコプラズマ吸着の適用が示されている。第１のキャビティ１０および第２の光キャビティ１１が基材１の中に埋め込まれた(工程１)後に、図２に示された方式と同様に、第１の接着材料２ａおよび第２の接着材料２ｂがナノパターンへ導入される(工程２)。第２接着材料２ｂはモリクテス綱４の先端部４ｂを特異的に標的としており、一方、第１接着材料２ａはモリクテス綱４の本体部４ａのみを特異的に標的としている。従って、モリクテス綱４は方位付けられた方式で接着される（工程３）。その後、リゲート７が細胞膜の中へ埋め込まれる（工程４）。この第３の方式では、例えば、第２の光キャビティ１０からもたらされる、モリクテス綱４の好ましくない活性によって引き起こされたあらゆる変化についてのバイオセンサ信号を補正するために、先端部４ｂが参照キャビティ１１へ接着する、ということが例示される。
【００６７】
このセンサは保存のために凍結させることができる。解凍の後に、ＡＰＬは、例えば新鮮なリゲートを生産するためになお生存していてもよく、またはその代わりに、自己再生あるいは他の好ましくない活性を防止するために細胞死を受けてもよい。いずれにせよ、細胞膜の流動性、従って、抗体／抗原あるいはリゲート／リガンド結合についてのその特有の活性および特異性は維持されるであろう。
【００６８】
モリクテス綱を使用する利点
以下に、生化学的インターフェイスとしてバイオセンシングにモリクテス綱をサブミクロン寸法で使用する利点の概要を示す。
【００６９】
【表１】
0005445131.tif 000002
【００７０】
バイオセンサチップを利用するバイオセンサ
次に、上記のバイオセンサチップを利用して標的分子を感知するバイオセンサが説明される。ここで、基本的な物理的トランスデューサ機構は光マイクロキャビティによる光学的感知に基づいている〔Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．の２００２年第８０巻の第４０５７〜４０５９ページにおけるＦ．Ｖｏｌｌｍｅｒ氏らによる論文、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓの２００３年第２８巻の第２７２〜２７４ページにおけるＳ．Ａｒｎｏｌｄ氏らによる論文〕。さらに、バイオセンサに利用される光学素子の詳細は、上記仮出願第６０／７９６，１６２号によっている。
【００７１】
図８に示すように、キャビティ１０には、蛍光物質１０ｂが収容されている非金属コア１０ａと、この非金属コア１０ａを包囲している金属被膜１０ｃとが含まれている。基材１は蛍光物質１０ｂの励起および放射波長について透明である。キャビティ１０の露出部は、抗細胞材料３（抗蛋白質マトリックス）および細胞接着材料２で被覆されている。モリクテス綱４は細胞接着材料２によって固定化されており、リゲート７はモリクテス綱４の細胞膜へ埋め込まれている。基材１の表面は、キャビティ１０の露出された生体機能化表面（すなわちリゲート７）が液体セル１２の中に含まれる分析対象物に接するように、液体セル１２の中に設置される。蛍光物質１０ｂは、基材１を通って伝播しそれによってキャビティ１０をも横断する光ビーム１３によって、光学的に励起される。蛍光物質１０ｂから放射されて、キャビティ１０の有限Ｑ因子（以下の定義を参照）によってキャビティ１０の金属被膜１０ｃを透過する光は、光ファイバ１５によってある立体角１４の内側に収集される。この立体角１４は、ファイバ１５の開口数とキャビティ１０の中心からのその距離とによって与えられる。１μｍ未満の直径を有する小さいキャビティ１０について、光ファイバ１５の先端部１５ａは、ノイズからの信号の適切な識別をもたらすために、サブ波長分解能が可能になるように製造することができる（光学的近視野の先端部）。典型的には、このような鋭利な先端部は、走査型光学近視野顕微鏡（ＳＮＯＭ）によって制御することができる。代わりに、キャビティによって放射された光は、適切な対物レンズが装備された顕微鏡などの遠視野の設定によって収集することができる。いずれにせよ、光は分析のための検出システムへ導くことができる。
【００７２】
固体基材１の中に埋め込まれるか、または支持された粒子あるいは粒子系は、図９に示す以下の設定によってバイオセンサとして機能させ得る。基材１は、潜在的な特異的結合相手が含有されている媒体にリゲート７をさらすことが可能になるように、液体セル１２の中へ設置される。蛍光物質１０ｂは、レーザあるいは別の適切な光源２０により生成された光ビームによって励起され、一方、キャビティ１０からの放射光は、適切な光学系、例えば光ファイバ１５によって収集される。次いで、このファイバは、上記の光を、検出した光の強度を波長および時間の関数として記録する光学的分析システム（光学顕微鏡２１、スペクトル分離・検出システム２２、およびパーソナルコンピュータ２３）へ導く。
【００７３】
好ましい実施態様において、蛍光物質１０ｂの励起に使用される光源は超短時間パルスレーザであり、一方、検出ユニット２２は超短時間信号をノイズから識別することができる。後者は、ボックスカー積分器などの高速処理用電子部品へ接続されたゲートＣＣＤカメラあるいは光電子増倍管によって実施することができる。ナノ秒、ピコ秒、およびフェムト秒範囲の充分に短いパルスを有する超短時間パルスレーザは、市販されている。
【００７４】
用語の定義
上記説明の中で使用されている用語の定義が次に記載される。他の用語の定義は上記仮出願第６０／７９６，１６２号によっている。
【００７５】
リゲート：リゲートとは、受容体、抗体、あるいは蛋白質などの、「リガンド」とも呼ばれる標的分子を特異的に結合することのできる（生体）分子である。従って、リゲートは、バイオセンサによってリガンドを検出することができるように、所望のリガンドを捕捉するために、バイオセンサにおいて使用することができる。
【００７６】
プローブ分子：リゲートについての同義語として使用される。
【００７７】
生体機能的インターフェイス：生体機能的インターフェイスとは、生体事象の検出のために使用される物理的トランスデューサと生体環境との間における、所望の標的分子（リガンド）を特異的に結合することができ、一方で、他の好ましくない非特異的相互作用を抑制することができる表面あるいはインターフェイスである。
【００７８】
キャビティ（光学的キャビティ）：光学的キャビティとは、電磁スペクトルの紫外線（ＵＶ）領域、可視光（ｖｉｓ）領域あるいは赤外線（ＩＲ）領域における光に対して高反射性の閉じられた境界区域（キャビティの「表面」）によって制限された閉鎖容積部である。その波長依存性に加えて、この境界区域の反射率はまた、局部的表面の法線に対して衝突する光の入射角に依存する（図１０を参照）。光キャビティの内容積は、真空、空気、または、ＵＶ、ｖｉｓ、もしくはＩＲの領域において高い透過率を示す任意の材料から構成することができる。具体的には、透過率は、そのキャビティの表面が高い反射率を示す電磁スペクトルのそれらの領域の少なくとも一部について高いものでなければならない。
【００７９】
光学的キャビティは２つのパラメータによって特徴付けられる。第１はその容積Ｖであり、第２はその線質係数Ｑである。以下において、用語「光学的キャビティ」は、線質係数Ｑ＞１である光学的キャビティを意味している。
【００８０】
光学的キャビティの容積：光学的キャビティの容積は、そのキャビティの表面、すなわち高反射性の境界区域によって制限されるそのキャビティ内側の幾何学的容積として定義される。
【００８１】
線質係数：光学的キャビティの線質係数（あるいはＱ係数）は、光子をそのキャビティの内側に捕捉するポテンシャルの程度である。これは次のように定義される。
【００８２】
【数１】
0005445131.tif 000003
ここで、ωｍおよびλｍはそれぞれ、キャビティモードｍの周波数および波長であり、また、ΔωｍおよびΔλｍは対応する線幅である。後者の２つの等式は、Ｑ係数とキャビティの内側における光学的モードの位置および線幅とを結び付けている。明らかに、キャビティの蓄積ポテンシャルはその表面の反射率によって決まる。従って、Ｑ係数は波長依存性である。
【００８３】
光学的キャビティモード：光学的キャビティモードあるいは単に「キャビティモード」とは、所定のキャビティについての電磁場方程式（マックスウェル方程式）の波動解である。これらのモードは、キャビティ表面における制限的境界条件のために離散的であり、整数ｍで番号を付けることができる。従って、キャビティの存在下における電磁スペクトルは、許容帯域および禁制帯域に分割することができる。マックスウェル方程式の完全解は、キャビティの内側および外側のそれぞれにおける内部および外部の電磁界からなっている。以下において、用語「キャビティモード」は、特に明記しない限り、キャビティの内側における内部電磁場を意味している。波動解は、境界区域、すなわちキャビティ表面の反射率に加えて、キャビティの形状および容積に依存する。従って、その解は、キャビティのＱ係数およびその波長依存性に依存する。
【００８４】
球状キャビティについては、波長依存性を容易に予測することのできる、主として２種類の解法が存在する。簡単にするために、これらの予測は以下の検討において用いられる。図１１には、これら２つのものの相違が示されている。われわれは、両方の事例において定常波が形成されたということを仮定する。図１１（ａ）では、定常波は半径方向に形成されており、一方、図１１（ｂ）では、それは、球と環境との間における内側境界の周縁に沿って形成されている（金属シェルで被覆された球の事例では、定常波は内側シェル境界に沿って形成される）。これらの定常波は、半径方向か方位角方向かのいずれかにおける対向伝播する進行モードの重ね合わせとしてそれぞれ観察することができる。以下において、われわれは、半径方向におけるモードを、ファブリー−ペロー干渉計との類似性に基づき、「ファブリー−ペローモード」（ＦＰＭ）と呼ぶことにする。球体の周縁に沿って形成されるモードは、ロード・レイリー氏によって発見された音響現象との類似性から、「ささやきの回廊（ウィスパリングギャラリー）モード」（ＷＧＭ）と呼ばれる。これらのモードの波長依存性の簡単な数学的説明のために、われわれは、以下のような定常波境界条件を用いる（例示のために、図１１を参照）：ＦＰＭについては、
【００８５】
【数２】
0005445131.tif 000004
であって、これは、内側粒子表面における電場が、例えば金属被膜のあるキャビティについての事例のように、いつも消滅しなければならない、ということを説明している。ＷＧＭについては、上記の定常波条件は、
【００８６】
【数３】
0005445131.tif 000005
になる。ＷＧＭについて、この等式は、波動が完全な周回の後に同位相に戻らなければならない、ということを基本的に説明している。両方の数式において、「ｍ」は整数であって、モードの番号付けのためにも用いられており、Ｒは球半径であり、また、ｎｃａｖはキャビティの内側における反射率である。
【００８７】
キャビティモードのモード容積：キャビティモードのモード容積は、そのモードの場の強度が消滅していないその幾何学的容積としてとして定義される。一般に、この場は指数関数的に減衰するため、実際的には「ゼロ強度」を定義するあるカットオフ値が設定されなければならない。例えば、そのカットオフ値は最大場強度の０．１％に固定することができる。
【００８８】
バイオセンサチップを利用する一般的バイオセンサ
上記のバイオセンサに加えて、バイオセンサチップへの特異的な結合を感知することができるあらゆる種類のバイオセンサを適用することができる。上記のセンサはナノスケールの方位分解能で感知することができ、すなわち、その感知区域がサブミクロン寸法を有して１つのモリクテスを含みうるものではあるが、そのような高い分解能は要求されない。低い方位分解能の場合、すなわち、マイクロメートルまたは更にミリメートルの寸法の感知区域である場合には、バイオセンサチップは、大スケール表面に互いに適切な間隔を以って、それぞれが１つあるいはいくつかのモリクテスを含んでいる上記のような多くのサブミクロン感知用区域を置くことによって、それぞれのスケールに応じて作ることができる。ひいては、センサは、複数の個々のサブミクロン感知区域への特異的結合度を平均して測定する。上記のようなバイオセンサとの唯一の相違点は、この大スケール表面における非特異的結合を防止するために特別な注意を払う必要があるということであるが、その理由は、非特異的結合が上記大スケール表面にわたる低い方位分解能のバイオセンサによって測定された平均信号に影響を及ぼすからである。
【００８９】
低い方位分解能（すなわち、ミクロンあるいはミリメートル領域の分解能）を有する適切なセンサの例は、ファイバセンサおよび表面プラズモンセンサ（ＳＰＲ；例えばビアコアシステム、http://www.biacore.com を参照）などのエバネッセントフィールドセンサ；反射率計および偏光解析器などの反射率計センサ；ホログラフィーおよび干渉に基づいたセンサ（例えば、Ｓｍａｒｔ  Ｈｏｌｏｇｒａｍｓ社によって開発されたような表面ホログラム、http://www.smartholograms.com を参照）；水晶微量天秤のような質量感知用センサ（例えば、Ｑ感知システム、http://www.q-sense.com を参照）および関連する音波センサである。
【００９０】
高い方位分解能がある、すなわち、わずか１つのモリクテスを含んでいる単一のサブミクロン感知区域を感知することのできる適切なセンサの例は、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、近視野光学顕微鏡法（ＳＮＯＭ）、電子・Ｘ線顕微鏡法および局所表面プラズモンセンサなどの走査用プローブ技術である。
【００９１】
実施例
【００９２】
実施例１：アコレプラズマ・レイドラウィイ（ＡＰＬ）の成長
バイオセンシングのために用いることのできるサブミクロン寸法のモリクテス綱の一例として、アコレプラズマ・レイドラウィイ（ＡＰＬ）が選択された。ＡＰＬを用いる特別な利点は、流動性および接触性の観点におけるその細胞膜の特有の性質（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａの１９８４年第７７９巻の第１〜４２ページにおけるＲ．Ｎ．ＭｃＥｌｈａｎｅｙの論文、ニューヨークのＰｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社のＳ．Ｒｏｔｔｅｍ氏およびＩ．Ｋａｈａｎｅ氏によって編集されたＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  の１９９３年第２０巻の第１０９〜１６６ページにおけるＬ．Ｒｉｌｆｏｒｓ氏らによる「アコレプラズマ・レイドラウィイにおける極性脂質の調整および物理化学的諸特性」（“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  Ｌａｉｄｌａｗｉｉ”）、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙの１９８９年第１７巻の第３２ページにおけるＲ．Ｎ．ＭｃＥｌｈａｎｅｙ氏による論文）、培養の容易性（Ｔｈｅ  Ｙａｌｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの１９８３年第５６巻の第７２９〜７３５ページにおけるＥ．Ｂ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ氏らによる論文）、ならびに遺伝子工学についてのその可能性（アメリカ合衆国、ニュージャージー州、トトワのＨｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ社のＲ．Ｊ．Ｍｉｌｅｓ氏およびＲ．Ａ．Ｊ．Ｎｉｃｏｌａｓ氏によって編集された書籍であるＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ＰｒｏｔｏｃｏｌｓにおけるＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第１０４巻第２４７〜２５８ページにおけるＴ．Ｋ．Ｊａｒｈｅｄｅ氏およびＡｋｅ  Ｗｉｅｓｌａｎｄｅｒ氏による論文）に関連する。この例では、ＡＰＬを培養し、かつ成長させるための手順が、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によってそれらの形状および外観を研究するために表面吸着細胞を固定するための方法とともに説明されている。
【００９３】
実験：
アコレプラズマ・レイドラウィイの培地調製
１７．５ｇのハート・インフュージョン・ブイヨン（ＨＩＢ（ＢＤ  ２３８４００））を７００ｍｌのミリＭｉｌｌｉＱ（ＭＱ）水中に溶解した。ＨＩＢ溶液の３８ｍｌの分別量を、加圧滅菌し、必要になるまで４℃で保存した。マイコプラズマ培地（ＭｙｃｏＭ（アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）培地２４３））を、このＨＩＢ分別量に５．５ｍｌの酵母エキス溶液（Ｇｉｂｃｏ  １８１８０−０５９）と１１ｍｌのウマ血清（加熱不活性化されたもの）（Ｇｉｂｃｏ  ２６０５０−０７０）とを添加することにより調製した。
【００９４】
アコレプラズマ・レイドラウィイの成長
−８０℃に維持されたアコレプラズマ・レイドラウィイの菌株Ａ（ＡＰＬ（ＡＴＣＣ  １４０８９））のグリセロール貯蔵物を、伸長フィルターチップを用いた１ｍｌのギルソンピペットで穿刺し、次いで、ブンゼン炎の上にかざしたねじ込みキャップ付きの２００ｍｌ円錐ビンの中にあるＭｙｃｏＭの溶液に接種するために使用した。ＡＰＬ培養物を、わずかにゆるめられた蓋のあるビン中に、３７℃に設定された水浴（ＩＷＡＫＩ，ＳＨＫ−１０１Ｂ）の中において８０回転／分で振盪しつつ、必要になるまで放置した。
【００９５】
走査型電子顕微鏡のための表面におけるアコレプラズマ・レイドラウィイの固定化
ＡＰＬ培養物を、１ｍｌのエッペンドルフ中に分取し、次いで、１０，０００ｇで２０分間、遠心分離（ＫＵＢＯＴＡ  ３７４０）した。このＭｙｃｏＭの上澄みを廃棄し、次いで、それぞれのチューブ中のＡＰＬを１ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の中に再懸濁した。これらのチューブを、前と同じように再度遠心分離した。ＰＢＳの清浄物を棄却し、次いで、ＡＰＬを所望容積のＰＢＳの中に再懸濁した。次いで、２６０ｎｍに設定された分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いてＡＰＬ溶液の吸光度を測定し、およそ２．０の読取値が得られた。次いで、ＡＰＬ懸濁液を、６穴プレート（３５３０４６，Ｆａｌｃｏｎ）のウエルの中においてシリコンチップへ添加し、そして２時間放置した。次いでこれらのチップを、ＰＢＳの４％グルタルアルデヒドの中へそのまま１時間浸漬した。固定化の後、これらのチップを洗浄ビンからのＭＱ水にて洗浄し、次いで、加圧シリンダからの窒素で乾燥させた。次いで、表面を約４×１０−５ヘクトパスカル（ｈＰａ）の窒素圧力にてエバポレータを使用することにより、１０ｎｍの金で被覆し、細胞および表面を金にて等方的に被覆した。これらのチップを次いで、ＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−４２００）を使用して観察した。
【００９６】
結果：
図１２は、２日間の成育後（図１２（ａ））および６日間の成育後（図１２（ｂ）および図１２（ｃ））の細胞を示している。これらの細胞はブドウ状のコロニーを形成しているように見える。培養物中には２つの主要寸法を認めることができる。大きい方の寸法は１つの細胞について直径が約１．２μmであり、小さい方の寸法は直径が３００〜５００ｎｍである。このことは、図１２（ｃ）に示された図１２（ｂ）のクローズアップにおいてよくわかる。これら２つの寸法は、例えば、１つの細胞からの異なった外延の生体機能的インターフェイスを調製するために使用することができる。
【００９７】
実施例２：アコレプラズマ・レイドラウィイの細胞膜の接触性
モリクテス綱はそれらの外側細胞壁の恒久的欠如を呈するので、脂質膜は、直接接触することができ、また、例えば図３に示されたように膜を自己組織化する脂質あるいは脂肪酸分子へそれらを結合することによって、特異的プローブ分子の組み込みのために、容易に使用することができる。
【００９８】
実験：一例として、ＡＰＬを成長させ、２日後に洗浄し、次いで、実施例１に記述したようにＰＢＳ中に再懸濁した。その後、ＤＭＳＯ中の、蛍光体標識付き脂肪酸、４，４−ジフロロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカン酸（ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８  Ｃ１２；Ｄ３８３５，分子プローブ）を上記ＡＰＬ懸濁液へ０．０１ミリモル（ｍＭ）にて添加し、次いで、１時間緩やかに振盪しつつ放置した。その後、これらのチューブを前に説明したように遠心分離し、上澄みを廃棄して、細胞を１ｍｌのＰＢＳの中に再懸濁した。この最後の工程を、細胞膜へ付着していないすべての色素分子が上記懸濁液から除去されることを保証するために、繰り返した。次いで、この細胞懸濁液を、６穴プレートのプレート穴へ添加し、ＰＢＳを加えて３ｍｌとし、ＬＵＭＰｌａｎ  Ｆｌ  ６０ｘ／０．９０  Ｗの対物レンズがあるＯｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  １０００を使用して、レーザ自動読取共焦点顕微鏡法および光透過顕微鏡法によって観察した。
【００９９】
結論：
図１３は、蛍光体標識付き脂肪酸による染色後のＡＰＬ細胞のクラスタにおける同時に得られた共焦点の蛍光像および透過像を示している。明らかなことであるが、色素分子は細胞を完全に、すなわちその外側細胞表面をすべて染色した。われわれは、細胞膜の中へ組み込まれる以外は細胞と反応しないことが知られている脂肪酸分子を使用しているので、膜組み込みプローブ分子を介する生体機能的インターフェイスとしてＡＰＬ細胞膜を使用する実現可能性が、この実施例で実証されている。
【０１００】
実施例３：脂質固定化プローブ分子を使用する特異的相互作用
ＡＰＬの脂質細胞膜への接触の実現可能性の実証の後、次の工程は、細胞膜をその細胞膜の中へ人為的に組み込まれたプローブ分子を使用して標的分子の特異的認識のために使用することができることを示す。特異的に相互作用する対として、ビオチン／ストレプトアビジンが選択された。ビオチンは、脂質へ共有結合状に付着され、一方でストレプトアビジンは、成功裏の結合事象の追跡を可能にするために蛍光体標識が付けられた。
【０１０１】
実施例２に記述したように、ＰＢＳ中にＡＰＬ懸濁液を調製した。エタノール中の２ｍｇ／ｍｌの脂質−ビオチン（ＬｉＢ）（１６：０  Ｂｉｏｔｉｎｙｌ  Ｃａｐ  ＰＥ（８７０２７７，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．））、あるいは１ｍｇ／ｍｌの脂質（１６：０  ＰＥ（８５０７０５Ｐ，Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．））、もしくはビオチン（Ｓｉｇｍａ）、または何ら添加しないものを１０分間超音波処理し、そして、エッペンドルフ中に０．０４ｍＭで３個組にて所望の容積をもってＡＰＬ溶液へ添加する前に、簡単にボルテックス処理された。この溶液はその後、１時間の緩やかな振盪に供した。
【０１０２】
１時間後に、上記脂質−ビオチン標識付きＡＰＬ（ＡＰＬ−ＬｉＢ）の溶液および対照を前に説明したように遠心分離し、溶液を廃棄し、ＡＰＬ−ＬｉＢおよび対照を１ｍｌのＰＢＳの中に再懸濁した。ＡＰＬ−ＬｉＢおよび対照の懸濁液を前に説明したように遠心分離し、また、細胞を、所望容積のＰＢＳ中に再懸濁し、貯蔵した。
【０１０３】
ストレプトアビジン−ローダミンＢ（ＳＲＢ）（Ｓ８７１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）をエッペンドルフ中の２００μｌのＡＰＬ−ＬｉＢおよび対照へ０．０００１ｍＭにて添加し、１時間の緩やかな振盪に供した。次いで、先に説明されたように、チューブを遠心分離にかけた。１００μｌの上澄みを９６穴プレートのウエルへ添加し（３５３０７２，Ｆａｌｃｏｎ）。この上澄みの残りを廃棄却し、また、ＡＰＬを１ｍｌのＰＢＳの中での再懸濁によって洗浄した。その後、この細胞懸濁液を前に説明したように遠心分離した。次いで、この洗浄液の１００μｌを、９６穴プレートのウエルへ添加し、残りを廃棄した。ＡＰＬを元々の体積のＰＢＳ中に再懸濁し、９６穴プレートのウエルへ添加した。その後、それぞれのウエルにおける相対蛍光度をプレートリーダ（ＳＡＦＩＲＥ，ＴＥＣＡＮ）を使用して測定した。
【０１０４】
非特異的感知についての試験として、ＳＲＢの代わりに、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  標識ＢＳＡ（ＢＳＡ４８８）（Ａ１３１００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を使用したことを除き上記段落で説明されたのと同一のプロトコルに従って実施した。
【０１０５】
結果：
図１４は、このプレートリーダ測定の結果を示している。上澄みおよび洗浄液の信号は、最大信号および最小信号についての推定値として観察することができ、すなわち、それらはおおよその測定範囲を表示している。従って、残るほとんどの信号はこれら２つの結果の間にあった。図１４（ａ）からわかるように、残る信号は、脂質結合ビオチンにて標識されたそれらのＡＰＬ細胞を除いて、洗浄液と同一の強度、すなわち最小強度を基本的に有していた。純粋な脂質も純粋なビオチンも、あるいは上記対照の他のものも、顕著な蛍光強度を達成することができなかった。これは、ストレプトアビジンが、ＡＰＬの細胞膜の中へ挿入された上記ビオチンへ特異的に結合することを表わしている。上記相互作用が実際に、特異的であるということは、脂質−ビオチン標識細胞が、ストレプトアビジンの代わりに、蛍光ＢＳＡ分子へさらされた場合の図１４（ｂ）からわかる。しかしながら、上記洗浄液によって表示されたようにバックグラウンドより高い蛍光強度の増大は観察することができなかった。このことは、細胞が、ストレプトアビジンを特異的相互作用により、それらの脂質細胞膜の中へ挿入された脂質固定ビオチンと結合したことを立証している。従って、ＡＰＬの脂質細胞膜の中へ人為的に導入されたプローブ分子による特異的認識の実現可能性が、首尾よく実証された。
【０１０６】
実施例４：表面固定化アコレプラズマ・レイドラウィイおよび脂質固定化プローブ分子を使用する特異的相互作用
実施例３は、ＡＰＬが、細胞膜組み込みプローブ分子を使用する特異的相互作用のための基体として使用することができることを示している。オンチップバイオセンサの開発のためには、表面固定化モリクテス綱もまた同一目的のために使用できるということを実証することが重要である。それゆえ、実施例３において提示された実験を、表面吸着型ＡＰＬ細胞を用いて以下の通り繰り返す。
【０１０７】
実験：
ＡＰＬを、実施例３において説明したように、ＬｉＢで標識した。同一の対照もまた含めた。この標識付け工程の間に、１００μｌの上澄み、洗浄液および最終ＡＰＬ懸濁液を維持し、ポリ−Ｄ−リジンの９６穴プレート（３５４４６１、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のウエルへ添加し、２時間、維持した。この溶液を次いで、それぞれのウエルから除去し、１００μｌのＰＢＳを添加した。その後、ＰＢＳ洗浄液を除去し、それぞれのウエルへ２００μｌのＰＢＳ１％ＢＳＡ（Ａ−７０３０，Ｓｉｇｍａ）を添加し、緩やかに振盪しつつ２時間放置した。次いで、ＢＳＡ遮断緩衝剤を除去し、１００μｌのＰＢＳを添加した。その後、ＰＢＳ洗浄液を除去し、０．０００２ｍＭのＳＲＢが含有する１００μｌのＰＢＳをそれぞれのウエルへ添加し、緩やかに振盪しつつ１時間放置した。次いで、この溶液を除去し、将来の参照のために別の９６穴プレートへ添加した。その後、１００μｌのＰＢＳ洗浄液をそれぞれのウエルへ添加した。このプレートを軽くたたき、また、この洗浄液を、次いで除去し、将来の参照のために別の９６穴プレートへ添加した。その後、１００μｌのＰＢＳ洗浄液をこれらのウエルへ添加し、また、そのプレートは、前述のようにプレートリーダを使用して読み取った。
【０１０８】
プレートの読み取りの後に、上記表面におけるＡＰＬを、それぞれのウエルの中の溶液を除去し、１００μｌのＰＢＳ４％グルタルアルデヒドを添加し、１時間維持することによって、固定した。１時間後に、その固定剤を除去し、ウエルをＭＱ水で数回洗浄し、次いで、空気乾燥に付した。ウエルの底部を、ダイアモンド刃が備え付けられた小型丸鋸で切り離し、１０ｎｍの金をウエルの底部上に蒸着した（実施例１を参照）。その後、これらの表面をＳＥＭを使用して観察した。
【０１０９】
図１７に示されたように、非特異的相互作用に関する試験のために、同一のプロトコルを実行したが、以下のことを含めた：今回は、対照を含めてＡＰＬ標識付けを３つ組物の２つのロットにおいて遂行した。３つ組物の上澄み、洗浄液および最終ＡＰＬ懸濁液を、ポリ−Ｄ−リジンの９６穴プレートの等しい半分へ添加した。このプレートの第１の半分に０．０００２ｍＭのＳＲＢを含む１００μｌのＰＢＳを加え、更に上記プレートの第２の半分へ０．０００２ｍＭのＢＳＡ４８８を含む１００μｌのＰＢＳを添加した。第１プレートの読み取りの後に、それぞれの蛍光体をプレートへ再度添加したが、今回はは逆に行った。すなわち、０．０００２ｍＭのＢＳＡ４８８を含む１００μｌのＰＢＳを上記プレートの第１の半分へ添加し、また、０．０００２ｍＭのＳＲＢを含む１００μｌのＰＢＳを上記プレートの第２の半分へ添加した。第２プレートの読み取りを行った。
【０１１０】
結果：
図１５はプレートリーダ実験の結果を示している。前述の通り、上澄み液および洗浄液の読取値は、同実験の感度範囲についての大まかな指針として使用することができる。残余は、表面固定化ＡＰＬ細胞に対して、それらの脂質細胞膜の中に組み込まれた脂質−ビオチンプローブを介して付着されたストレプトアビジンの蛍光を表わしている。前と同様に、脂質−ビオチンを保持する細胞の場合にのみ、洗浄液の信号により示されるバックグラウンドを越えた蛍光強度の増大を観察することができた。これは、ストレプトアビジンを表面固定化ＡＰＬ細胞へ結合するためには脂質−ビオチンが必要であることを示している。上記対照は、ストレプトアビジンが上記表面において非特異的に吸着せず、しかして該相互作用が本来的に特異的であるという結論をさらに裏付ける証拠を与える。脂質−ビオチンのみを使用すると、表面における蛍光強度のいくらかの増大を観察することができるが、このことは、その表面のＢＳＡ不動態化が蛋白質について最もよく機能するとともに小さい分子の場合には機能しないために生じる、その表面における脂質−ビオチンの非特異的吸着によって説明することができる。その為、該細胞は、膜結合ビオチンのみがその表面に存在することを保証するために、表面固定化に先行してビオチン化された。
【０１１１】
これらの知見が実際に表面吸着細胞に関連するということの確証を得るべく、プレートリーダ実験の後に、該細胞培養プレートの底部を、ＳＥＭによって分析した。これに関して、細胞を、実施例１に詳細に説明しように、まず固定した。次いで、プレート底部を、切り出し、１０ｎｍの金を蒸着し、その表面をＳＥＭによって分析した。図１６は、相異なる表面から得られた像を示している。番号標識は、像が図１５の何れのプレートリーダ結果に対応するものであるかを表わしている。細胞ではなく脂質−ビオチンのみを使用する対照実験であった最後の像（図１６（ｖ））を除き、すべての像はＡＰＬ細胞の高い密度を示している。
【０１１２】
ビオチン標識ＡＰＬ細胞に結合しているストレプトアビジンの特異性の更なる検証として、ひいては、生体機能的インターフェイスとしてのＡＰＬ細胞の有用性の更なる実証として、上記実験を反復したが、今度は、ＢＳＡ４８８を利用する非特異的相互作用試験を含めた。図１７はこの実験の結果を表示している。図１７（Ｉ）においては、表面吸着型ＡＰＬ細胞が、図１５にすでに示されたようにＳＲＢへさらされている。前述のように、脂質標識付きビオチンをそれらの膜の中に保持する細胞のみが、そのバックグラウンドを越える蛍光の増大を示しており、従って、結合されたＳＲＢを表わしている。図１７（ＩＩ）においては、同一の操作により調製した表面固定細胞がＢＳＡ４８８にさらされた。しかしながら、今度は、蛍光の増大を観察されず、ＢＳＡ４８８が、脂質−ビオチン標識ＡＰＬ細胞に非特異的に吸着しないことを示している。第２の工程では、まずＳＲＢへさらされたそれらの細胞をＢＳＡ４８８にさらし、また、その逆の操作を行った。図１７（ＩＩＩ）からわかるように、ＳＲＢの結合の後であっても、表面固定化ＡＰＬ細胞は、ＢＳＡ４８８の非特異的結合に関して不活性のまま残り、それによって、表面吸着型ＡＰＬ細胞の細胞膜の流動性および機能性が示されている。これに対して、図１７（ＩＶ）に示されたように、まずＢＳＡ４８８へさらされたそれらの表面吸着型ＡＰＬ細胞は、なおもＳＲＢを特異的に結合することができ、如かして、表面吸着型ＡＰＬ細胞膜の高い選択性が実証されている。使用されたこれら２つの蛍光性色素は相異なる励起波長域を有し、ＢＳＡ４８８についての適切な設定で得られた図１７（ＩＩＩ）における脂質−ビオチン標識細胞についての低い蛍光反応は、先に結合されたストレプトアビジンがその表面に残されることを示唆するものではないことに留意すべきである。実際に、ＳＲＢの検出のために適切に設定された上記プレートリーダによるこの試料の読み取りは、図１７（Ｉ）に示されたようにＢＳＡ４８８曝露に先立つ第１の読み取りにおいて得られたのと同一の結果を与えた（図示略）。それゆえ、結局のところこの実験は、高度に特異的な生体機能性インターフェイスとして表面吸着型ＡＰＬ細胞を利用する実現可能性がきわめて良好に実証している。
【０１１３】
実施例５：アコレプラズマ・レイドラウィイのナノパターン化
ＡＰＬ細胞のナノパターン化の実現可能性を実証するために、ナノパターンを次のように調製した。
【０１１４】
実験：
異なった寸法（５００ｎｍ−１０μm）のポリスチレン（ＰＳ）ビーズを、清浄なシリコンウェハピースの上にドロップコーティング法によって付着させた。これらのＰＳビーズを、引続くＳｉウェハピースの上への５０ｎｍの金蒸着におけるコロイド状マスクとして使用した。５ｎｍのＣｒを定着剤として使用さした。エバポレータから取り出した後に、コロイド状マスクを、純クロロホルム中における１０分間の超音波処理により、除去し、連続する５０ｎｍの金薄膜中にコロイド粒子の直径のＳｉパッチを残した。この無機パターンを、１０分間のＵＶオゾンプラズマ処理によってさらに清浄化し、次いで、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ，ＣＡＳ−ｎｏ．１３８２２−５６−５）に対して、液相からの蒸着によるか、あるいは２ｍＭのＡＰＴＭＳ／トルエン溶液からの吸着によるかのいずれかにより、直ちにさらした。純クロロホルム中における更なる１０分間の清浄化処理の後に、ＥＤＣ／ＮＨＳカップリングによって、Ｓｉパッチ上のＡＰＴＭＳにビオチンを結合させた。次いで、これらの試料を、金薄膜に抗細胞性を付与すべく、ＰＥＧ−チオール溶液の中に浸漬した。その後、Ｓｉパッチ上の表面固定化ビオチンにストレプトアビジンを結合させ、これによって、ビオチン標識ＡＰＬ細胞のための固定部位を与えた。将来のバイオセンサでは、マイコプラズマ細胞膜の中へ挿入されたそのようなビオチン標識は、更にその細胞膜中へのリゲートの組み込みのために使用され得る。
【０１１５】
ＡＰＬ−ＬｉＢ細胞懸濁液を、実施例３において説明したように調製した。ナノパターンを、６穴プレートまたは２４穴プレート（３５３５０４，Ｆａｌｃｏｎ）のいずれかのウエル中のＡＰＬ−ＬｉＢ懸濁液にそれらを添加することによってＡＰＬ−ＬｉＢにさらし、３７℃で一晩（Ｏ／Ｎ）、維持した。翌日、これらのチップを、洗浄ビンからのＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ４％のグルタルアルデヒド中に１時間、浸漬した。固定化の後に、これらのチップを、洗浄ビンからのＭＱ水で洗浄し、次いで、加圧シリンダからの窒素で乾燥させた。その後、これらの表面を、実施例１に記述したように１０ｎｍの金で被覆した。
【０１１６】
別法において（その結果は図１９（ｃ）および（ｄ）に示される）、ＡＰＴＭＳ被覆ＳｉパッチとＰＥＧ被覆金とからなるナノパターンを、最初に異なった電荷の水溶性高分子電解質溶液（第１層がポリ（スチレンスルホン酸エステル）であり、第２層がポリ（アリルアミンハイドロクロライド））にさらし、Ｓｉパッチ上に高密度のアミノ基を付与した。次いで、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化ＡＰＬ細胞の懸濁液を、上記パッチへの細胞の直接結合のために、上記パターン上に載せた。
【０１１７】
結果：
図１９はパターン化実験のいくつかの結果を示している。非パターン化表面の曝露は、典型的には細胞のクラスタの固定化を引き起こす（図１２，１６および１８を参照）が、ナノパターン化は主として、個々の細胞の吸着をもたらす。この傾向は、図１９（ｄ）および１９（ｅ）に示された知見によって示されるように、パターン化パッチの実際の寸法にいくぶん依存していないように見える。後者の像では、Ｓｉパッチの寸法（公称直径が５００ｎｍ）と同一である１つの細胞は、そのパッチを取り巻いている金構造体によって維持されかつ中心化されているように見えるが、図１９（ｄ）における細胞は、約１μmというそのパッチのいっそう大きい寸法のために、必ずしも金構造体に接触していない。吸着細胞の密度は、例えば懸濁液中の非クラスタ化細胞の割合を増加させることによって、さらに改善することができる。また、接着プロトコルは将来、最適化される必要があろう。いずれにしても、表面のＰＥＧ被覆金領域では細胞吸着が観察されていないので、現在の結果によって、Ｓｉパッチの上へのＡＰＬ細胞吸着についての表面の選択性が実証されており、それによって、単一のＡＰＬ細胞をパターン化することによって、サブミクロン寸法のバイオセンシングのための生体機能的インターフェイスを生成する方法の実現可能性が証明されている。
【０１１８】
実施例６：アコレプラズマ・レイドラウィイの凍結および解凍
この実施形態の実際の用途について、バイオセンシングのために調製された生体機能的インターフェイスの寿命および諸特性の持続性は、長い保存時間の後においても最高に重要なものである。以下に、われわれは、ＡＰＬ培養物をその生命力を失うことなく数日間、凍結することができる、ということを示す。従って、これらの細胞は、バイオセンシングのためにもまた必要である、特異性および流動性などのすべての細胞膜機能をもまたもたらし、そのような諸特性は、増殖および成長などのいっそう高い細胞機能のために必要である。
【０１１９】
実験：
ＭｙｃｏＭにおける３日間ＡＰＬ培養物を３７℃の水浴から取り出し、−３０℃の冷凍庫の中に置いた。３日後、その凍結培養物の最小部分を取得し、実施例１に説明されたように、ＭｙｃｏＭに植菌するために使用した。２日後、その培養物を、実施例２の第１段落に説明されたように処理した。ＯＤ２６０ｎｍでおよそ２．０の吸収度のある細胞懸濁液をシリコンチップへ添加し、３７℃で２時間、維持した後、ＰＢＳ４％のグルタルアルデヒドの中へのそのまま移送した。このチップはその後、１０ｎｍの金で被覆され、次いでＳＥＭによって観察された。
【０１２０】
結果：
図２０は、このようにして得られた培養物のＳＥＭ像を示している。これらの細胞には、成長の前に凍結されなかった培養物（図１２）の場合と同じ外観があるので、ＭｙｃｏＭ培養基における凍結は細胞機能へのどのような不都合も引き起こさない、と結論付けることができる。
【０１２１】
これまで、この発明は上記実施形態を参照して説明されている。しかしながら、さまざまな変更および改善をこれらの実施形態へ適用することが可能である。
【図１】
0005445131.tif 000006
【図２】
0005445131.tif 000007
【図３】
0005445131.tif 000008
【図４】
0005445131.tif 000009
【図５】
0005445131.tif 000010
【図６】
0005445131.tif 000011
【図７】
0005445131.tif 000012
【図８】
0005445131.tif 000013
【図９】
0005445131.tif 000014
【図１０】
0005445131.tif 000015
【図１１】
0005445131.tif 000016
【図１２】
0005445131.tif 000017
【図１３】
0005445131.tif 000018
【図１４】
0005445131.tif 000019
【図１５】
0005445131.tif 000020
【図１６】
0005445131.tif 000021
【図１７】
0005445131.tif 000022
【図１８】
0005445131.tif 000023
【図１９】
0005445131.tif 000024
【図２０】
0005445131.tif 000025