(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における、破骨細胞の成熟又は分化の割合における増加、より成熟した破骨細胞の産生、及び／又は成熟破骨細胞による吸収活性の増加によりもたらされる、骨吸収と骨形成の不均衡を是正するためのキットであって、
（ａ）（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン及び（ｉｉ）（ｉ）の医薬的に許容される塩から選択される少なくとも１つの化合物；及び
（ｂ）ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドから成る群から選択されるほかの薬剤、を含み、
ここで、前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が、骨吸収の阻害；破骨細胞の分化の阻害；骨塩密度（ＢＭＤ）の増加；骨塩量（ＢＭＣ）の増加；純粋な皮質骨の密度の増加；全骨の平均密度の増加；皮質骨厚の増加；皮質骨に配置する純粋な皮質骨領域の増加；脛骨骨幹全骨領域の増加；石灰化付加速度の増加；骨形成速度／骨表面の増加；皮質骨内表面又は骨膜表面のための石灰化表面の増加；血清アルカリホスファターゼの減少；低石灰化類骨の皮質骨内領域の減少；類骨厚の減少及び類骨凝縮の減少の少なくとも１つを含む、キット。
【請求項２】
前記キットが、（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリンを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
対象における、破骨細胞の成熟又は分化の割合における増加、より成熟した破骨細胞の産生、及び／又は成熟破骨細胞による吸収活性の増加によりもたらされる、骨吸収と骨形成の不均衡を是正するための組成物であって、
（ａ）（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン；（ｉｉ）（ｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかの組み合わせ；及び
（ｂ）ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドから成る群から選択される治療的有効量の薬剤、を含み、
ここで、前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が、骨吸収の阻害；破骨細胞の分化の阻害；骨塩密度（ＢＭＤ）の増加；骨塩量（ＢＭＣ）の増加；純粋な皮質骨の密度の増加；全骨の平均密度の増加；皮質骨厚の増加；皮質骨に配置する純粋な皮質骨領域の増加；脛骨骨幹全骨領域の増加；石灰化付加速度の増加；骨形成速度／骨表面の増加；皮質骨内表面又は骨膜表面のための石灰化表面の増加；血清アルカリホスファターゼの減少；低石灰化類骨の皮質骨内領域の減少；類骨厚の減少及び類骨凝縮の減少の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項４】
対象における、破骨細胞の成熟又は分化の割合における増加、より成熟した破骨細胞の産生、及び／又は成熟破骨細胞による吸収活性の増加によりもたらされる、骨吸収と骨形成の不均衡を是正するための組成物であって、（ａ）（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン；（ｉｉ）（ｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかの組み合わせ；及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含み、
ここで、前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が、骨吸収の阻害；破骨細胞の分化の阻害；骨塩密度（ＢＭＤ）の増加；骨塩量（ＢＭＣ）の増加；純粋な皮質骨の密度の増加；全骨の平均密度の増加；皮質骨厚の増加；皮質骨に配置する純粋な皮質骨領域の増加；脛骨骨幹全骨領域の増加；石灰化付加速度の増加；骨形成速度／骨表面の増加；皮質骨内表面又は骨膜表面のための石灰化表面の増加；血清アルカリホスファターゼの減少；低石灰化類骨の皮質骨内領域の減少；類骨厚の減少及び類骨凝縮の減少の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項５】
（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン；及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記対象が骨粗鬆症に罹患している、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
前記対象がパジェット病に罹患している、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項８】
前記対象が溶骨性骨癌に罹患している、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項９】
前記対象が破骨細胞を誘発する炎症性サイトカインの存在により特徴付けられる関節炎に罹患している、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が単回ボーラス投与用である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が連日投与用である、請求項４〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン；（ｉｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリンの医薬的に許容される塩；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかの組み合わせが、０．００１〜５００ｍｇ／対象１ｋｇ／日の量である、請求項４に記載の組成物。
【請求項１３】
前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が骨吸収の阻害を含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が破骨細胞の分化の阻害を含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が骨塩密度（ＢＭＤ）の増加を含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が骨塩量（ＢＭＣ）の増加を含む、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドから成る群から選択されるほかの薬剤をさらに含む、請求項５〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記対象がヒトである、請求項４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
対象における、破骨細胞の成熟又は分化の割合における増加、より成熟した破骨細胞の産生、及び／又は成熟破骨細胞による吸収活性の増加によりもたらされる、骨吸収と骨形成の不均衡を是正するための骨標的組成物であって、
（ａ）（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン；（ｉｉ）（ｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかの組み合わせ；及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含み、
ここで、前記骨吸収と骨形成の不均衡の是正が、骨吸収の阻害；破骨細胞の分化の阻害；骨塩密度（ＢＭＤ）の増加；骨塩量（ＢＭＣ）の増加；純粋な皮質骨の密度の増加；全骨の平均密度の増加；皮質骨厚の増加；皮質骨に配置する純粋な皮質骨領域の増加；脛骨骨幹全骨領域の増加；石灰化付加速度の増加；骨形成速度／骨表面の増加；皮質骨内表面又は骨膜表面のための石灰化表面の増加；血清アルカリホスファターゼの減少；低石灰化類骨の皮質骨内領域の減少；類骨厚の減少及び類骨凝縮の減少の少なくとも１つを含む、骨標的組成物。
【請求項２０】
（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリンを含む、請求項１９に記載の骨標的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．＄１１９（ｅ）のもと、２００７年２月１５日に出願された米国仮出願第６０／８９０，１００号、２００７年４月１７日に出願された米国仮出願第６０／９１２，２６７号、２００７年５月１日に出願された米国仮出願第６０／９１５，１９６号及び２００７年５月１５日に出願された米国仮出願第６０／９３８，０２５号の優先権を主張する。上記出願の内容は、それらの全体が本明細書に参考として組み込まれている。
【０００２】
本発明は、骨吸収と骨形成の不均衡を是正するための方法ならびにキット及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
骨は、古い骨の破壊と新しい骨の再構築から成る恒常的な再形成の過程を経る。この吸収（破骨細胞による）と形成（骨芽細胞による）は大体等しい割合で生じ、これにより全体的な骨格の強度を維持している。骨の再形成は骨量を再生し、多くのホルモンや成長因子の影響下に置くことを可能にする。メラトニンは、骨芽細胞における作用を介して骨形成を刺激することが示されている。
【０００４】
骨粗鬆症は、世界保健機関（ＷＨＯ）により、女性において、二重エネルギーＸ線吸収（ＤＸＡ）により測定した場合、骨塩密度２．５標準偏差以下のピーク骨量（性別が同じ２０歳の健康な人間の平均）として定義されている；「確立された骨粗鬆症」の用語は、脆弱性骨折の存在を含む。
【０００５】
骨粗鬆症には２種類が存在する：（１）原発性骨粗鬆症−通常の老化作用の結果として生じる骨量の減少であって、ほとんどの場合閉経後の女性に影響する、及び（２）後発性骨粗鬆症−他の要因、例えば慢性内科疾患、栄養失調、又は一定の薬剤による結果として生じる骨量の減少。
【０００６】
現在、米国において、骨粗鬆症の予防及び治療のために、いくつかの医薬が米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認されており、第一選択医薬として考えられている。これらの医薬は、ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドを含む。
【０００７】
治療モダリティー（例えばビスホスホネート）が利用できるようになっているが、いまだ予防が骨折を減少するための最も有効な方法であると考えられている。
【０００８】
したがって、骨疾患、例えば骨粗鬆症を予防及び／又は治療するための新規な方法が必要である。
【０００９】
本明細書は、いくつかの文献を参照しており、これらはその全体において参考として本明細書に組み込まれている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、骨吸収と骨形成の不均衡を是正するための方法ならびにキット及び組成物に関する。
【００１１】
より具体的には、本発明の態様に従い、（ａ）骨吸収と骨形成の不均衡を患う対象を識別すること；及び（ｂ）前記対象に対して治療的有効量の（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン（４−Ｐ−ＰＤＯＴ）；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせを投与すること、を含む方法であって、ここで骨吸収と骨形成の不均衡が前記対象において是正されることを特徴とする方法が提供される。
【００１２】
１実施形態において、上記方法は、前記対象に対して（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかの組み合わせを投与することを含む。
【００１３】
１実施形態において、上記投与は単回ボーラス投与である。他の実施形態において、上記投与は連日投与である。
【００１４】
１実施形態において、上記治療的有効量は、約０．００１〜約５００ｍｇ／対象１ｋｇ／日である。
【００１５】
１実施形態において、上記方法は、ＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニスト、ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドから成る群から選択されるほかの薬剤の投与をさらに含む。
【００１６】
他の態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；及び（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩から選択される少なくとも１つの化合物；及び（ｂ）骨石灰化異常を是正又は予防するために前記化合物を対象に投与するための取扱説明書、を含むキット又はパッケージを提供する。
【００１７】
１実施形態において、上記キット又はパッケージは、（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかの組み合わせを含む。
【００１８】
１実施形態において、上記取扱説明書は、骨吸収と骨形成の不均衡を是正するために前記化合物を対象に投与するための取扱説明書である。
【００１９】
他の態様において、上記キット又はパッケージは、ＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニスト、ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドから成る群から選択されるほかの薬剤をさらに含む。
【００２０】
他の態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ；及び（ｂ）ＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニスト、ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドから成る群から選択される治療的有効量の薬剤、を含む組成物を提供する。
【００２１】
他の態様において、本発明は、対象における骨吸収と骨形成の不均衡を是正するための組成物であって、（ａ）（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ；及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００２２】
他の態様において、本発明は、（ａ）（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせ；及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む、骨標的組成物を提供する。
【００２３】
１実施形態において、上記組成物は、（ａ）（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの医薬的に許容される塩；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）のいずれかの組み合わせ；及び（ｂ）医薬的に許容される担体を含む。
【００２４】
他の態様において、本発明は、骨吸収と骨形成の不均衡を治療するための医薬の製造における、治療的有効量の（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせの使用を提供する。
【００２５】
他の態様において、本発明は、骨吸収と骨形成の不均衡の治療における、治療的有効量の（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩；あるいは（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの組み合わせの使用を提供する。
【００２６】
１実施形態において、上記使用は、（ｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴ；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの医薬的に許容される塩；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせの使用である。
【００２７】
１実施形態において、上記骨吸収と骨形成の不均衡の是正は、骨吸収の阻害；破骨細胞の分化の阻害；骨塩密度（ＢＭＤ）の増加；骨塩量（ＢＭＣ）の増加；純粋な皮質骨の密度の増加；全骨の平均密度の増加；皮質厚の増加；皮質に配置する純粋な皮質領域の増加；脛骨骨幹全骨領域（tibial diaphyseal total bone area）の増加；石灰化付加速度の増加；骨形成速度／骨表面レファレントの増加；皮質内又は骨膜表面のための石灰化表面の増加；血清アルカリホスファターゼの減少；低石灰化類骨の皮質内領域の減少；類骨厚の減少及び類骨凝縮の減少の少なくとも１つを含む。
【００２８】
さらなる実施形態において、上記骨吸収と骨形成の不均衡の是正は、骨吸収の阻害を含む。ほかの実施形態において、上記骨吸収と骨形成の不均衡の是正は破骨細胞の分化の阻害を含む。ほかの実施形態において、上記骨吸収と骨形成の不均衡の是正は骨塩密度（ＢＭＤ）の増加を含む。ほかの実施形態において、上記骨吸収と骨形成の不均衡の是正は骨塩量（ＢＭＣ）の増加を含む。
【００２９】
１実施形態において、上記使用は、ＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニスト、ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドから成る群から選択されるほかの薬剤の使用をさらに含む。
【００３０】
他の態様において、本発明は、（ａ）骨吸収と骨形成の不均衡を患う対象を識別すること；及び（ｂ）前記対象に対して治療的有効量の少なくとも１つのＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニストを投与することを含み、これにより対象における骨吸収と骨形成の不均衡が是正される、方法を提供する。
【００３１】
他の態様において、本発明は、骨吸収と骨形成の不均衡を治療するための医薬の製造における、治療的有効量の少なくとも１つのＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニストの使用を提供する。
【００３２】
他の態様において、本発明は、骨吸収と骨形成の不均衡の治療における、治療的有効量の少なくとも１つのＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニストの使用を提供する。
【００３３】
本発明は、さらに、骨吸収と骨形成の不均衡を治療するための組成物であって、前記組成物が少なくとも１つのＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニスト及び医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００３４】
本発明は、さらに、少なくとも１つのＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニスト及び骨吸収と骨形成の不均衡を治療するための取扱説明書を含むキット又はパーケージを提供する。
【００３５】
１実施形態において、上記対象は骨粗鬆症に罹患している。他の実施形態において、上記対象はパジェット病に罹患している。他の実施形態において、上記対象は溶骨性骨癌に罹患している。他の実施形態において、上記対象は破骨細胞を誘発する炎症性サイトカインの存在により特徴付けられる関節炎に罹患している。
【００３６】
１実施形態において、上記対象は哺乳類である。さらなる実施形態において、上記対象はヒトである。
【００３７】
本明細書において使用される「対象」の用語は、哺乳類、例えばヒト、マウス、ラット、イヌ、ブタ、サル、ウマ等を含むことを意味する。特定の実施形態において、これはヒトを意味する。
【００３８】
本明細書において使用される「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の冠詞は、その冠詞の文法上の１又は複数（少なくとも１つ）の目的語を意味する。
【００３９】
本明細書において、「含む」及び「含んで成る」は、「制限することなく含む」及び「制限することなく含んで成る」と互換的に使用される。
【００４０】
本明細書において使用される「例えば」の用語は、「制限することなく、例えば」と互換的に使用される。
【００４１】
「アゴニスト」は、リガンドが、リガンドの不存在下において供するベースライン値以上のリガンド依存性受容体−特性活性を亢進することを意味する。「アンタゴニスト」は、リガンドが受容体に結合し、受容体−特性アゴニスト活性の競合性又は非競合性の阻害剤として機能することを意味する。「インバースアゴニスト」又は「リバースアゴニスト」は、リガンドが問題の受容体と結合し、そして受容体リガンドの不存在下において見られる活性量よりも低い受容体活性の抑制を生じることを意味する。本明細書において使用される「ＭＴ２メラトニン受容体特異的アンタゴニスト」の用語は、他のメラトニン受容体、例えばルジンドール（luzindole）に結合する他のアンタゴニストと対立するようにＭＴ２受容体に特異的に結合するアンタゴニストを意味する。
【００４２】
本明細書において使用される「破骨細胞前駆体」の用語は、破骨細胞に成長することができる細胞を意味する。制限することなく、このような細胞は、ＲＡＷ２６４．７、脾臓細胞、破骨細胞に成長することができる造血細胞及びＣＤ１４+単球を含む。
【００４３】
破骨細胞への破骨細胞前駆体の分化を誘発することが知られるいくつかの薬剤が存在する。制限することなく、これらは、核因子カッパＢリガンド受容体アクチベーター（ＲＡＮＫＬ）、マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、炎症性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及び破骨細胞活性を刺激することができる多様なインターロイキンを含む。
【００４４】
商業的に入手可能ないくつかの吸収性骨類似体、例えば制限することなくBioCoatTMが存在する。他の吸収性骨類似体は、象牙質断片及びヒドロキシアパタイトを含む。
【００４５】
骨吸収と骨形成の不均衡のためのいくつかの動物モデルが存在し、極めて低い骨塩密度（ＢＭＤ）を示すことが知られるＣ５７Ｂｌ／６ｊマウス、及び骨粗鬆症動物モデルを含む。
【００４６】
いくつかの骨粗鬆症動物モデルが知られており、卵巣切除マウス及びラットを含む。
【００４７】
本発明の範囲には、４−フェニル−プロピオンアミドテトラリン（４−Ｐ−ＰＤＯＴ）の誘導体、類似体、接合体、又はプロドラッグ及びこれらの塩が含まれ、これらは、本明細書において記載されるとおり、対象における骨吸収と骨形成の不均衡を治療するための能力を有する。本明細書において言及される塩は、医薬的に許容される塩を含む。４−Ｐ−ＰＤＯＴの多様な類似体、誘導体、接合体及びプロドラッグは既知であり、例えば８−メトキシ−２−プロピオンアミド−テトラリン；２−クロロアセトアミド−テトラリン；８−メトキシ−２−ｎ−ブチルアミド−テトラリン；８−メトキシ−２−シクロプロパンカルボニルアミド−テトラリン；８−メトキシ−２−クロロアセトアミド−テトラリン；４−フェニル−２−アセトアミド−テトラリン（４−Ｐ−ＡＤＯＴ）；４−ベンジル−２−アセトアミドテトラリン；４−フェニル−２−クロロアセトアミド−テトラリン（４−Ｐ−ＣＡＤＯＴ）；及び４−ベンジル−２−プロピオンアミド−テトラリンを含み、米国特許第５，０７１，８７５号に記載されている。１実施形態において、上記誘導体は４−Ｐ−ＡＤＯＴ又は４−Ｐ−ＣＡＤＯＴである。
【００４８】
キット
本発明はまた、骨吸収と骨形成の不均衡を治療／予防するため（例えば、骨吸収又は破骨細胞の成熟／分化を阻害するため）のキット又はパッケージであって、（ｉ）４−フェニル−２−プロピオンアミドテトラリン（４−Ｐ−ＰＤＯＴ）；（ｉｉ）４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；及び（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の医薬的に許容される塩から選択される少なくとも１つの化合物；及び骨吸収又は破骨細胞の成熟／分化を阻害するために上記化合物を対象に投与するための取扱説明書を含むキット又はパッケージに関する。このようなキットはまた、少なくとも１つの上記化合物及び医薬的に許容される担体を含む組成物（例えば医薬組成物）を含んでよい。このようなキットはまた、骨吸収又は破骨細胞の成熟／分化を阻害することができる少なくとも１つのほかの薬剤を含んでよい。骨粗鬆症を有する対象において骨吸収又は破骨細胞の成熟／分化を阻害するために該キットが使用される場合、該キットはまた、いずれかの他の骨粗鬆症の有害な症状を予防又は是正することができる少なくとも１つの他の活性剤を含んでよい。このような薬剤は、制限することなく、ビスホスホネート、ラロキシフェン、経鼻カルシトニン及びテリパラチドを含む。さらに、本発明の区分されたキットは、別々の容器において薬剤が入れられている、いずれかのキットを含む。このような容器は、小さなガラス容器、プラスチック容器又はプラスチック又は紙のストリップを含む。このような容器は、試料及び薬剤が互いに混じり合わないように、あるコンパートメントから他のコンパートメントへの薬剤の有効な移動を許容し、各々の容器の薬剤又は溶液をあるコンパートメントから他に定量的に添加することができる。
【００４９】
本明細書において使用される「骨吸収と骨形成の不均衡」の用語は、破骨細胞の成熟又は分化の割合における増加、より成熟した破骨細胞の産生、ならびに成熟破骨細胞による吸収活性の増加を意味する。
【００５０】
本明細書において、骨吸収と骨形成の不均衡の是正として使用される「是正」の用語は、骨吸収と骨形成の不均衡の部分的又は完全な改善を意味する。このような改善は、制限することなく、骨吸収の阻害、破骨細胞の分化の阻害、骨塩密度（ＢＭＤ）の増加、骨塩量（ＢＭＣ）の増加、純粋な皮質骨の密度の増加、全骨の平均密度の増加、皮質厚の増加、皮質に配置する純粋な皮質領域の増加、脛骨骨幹全骨領域の増加、石灰化付加速度の増加、骨形成速度／骨表面レファレントの増加、皮質内又は骨膜表面のための石灰化表面の増加、血清アルカリホスファターゼの減少、低石灰化類骨の皮質内領域の減少、類骨厚の減少及び類骨凝縮の減少に対応してよい。
【００５１】
投与経路
本発明の医薬組成物は、例えば経口、経鼻、静脈内、筋肉内、皮下、舌下、髄腔内、又は皮内の経路により投与することができる。投与経路は、環境や治療目的といった要因の変化に依存してよい。
【００５２】
例として、本発明の医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、ピル、カプセル、錠剤、ジェルキャップ、粉末、ジェル、軟膏、クリーム、ネビュラ、ミスト、霧状蒸気、エアロゾル、又はフィトソームの形態としてよい。経口投与のために、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤、注入剤、潤滑剤、崩壊剤、又は湿潤剤と共に慣習的な手段により錠剤又はカプセルを調製することができる。錠剤は、当業界に既知な方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形態としてもよく、あるいはこれらは、使用の前に生理食塩水又は他の適当な液体媒体により構成するための乾燥製品として提供することもできる。本発明の栄養補助食品もまた、医薬的に許容される添加物、例えば適当なものとして、懸濁剤、乳化剤、非水性媒体、保存剤、緩衝溶液塩、着色料、及び甘味料を含有してよい。経口投与用調製物はまた、活性成分の制御放出を与えるために適当に処方することができる。
【００５３】
投与量
いずれかの量の医薬組成物を対象に投与することができる。投与量は、多くの要因、例えば投与方法及び対象の年齢に依存する。若い人においては、骨の成長による骨代謝回転が存在する。典型的には、単回用量中に含有される本発明の化合物又は薬剤（例えば、４−Ｐ−ＰＤＯＴ、４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；これらの医薬的に許容される塩）の量は、有意な毒性を誘発することなく、治療が必要な対象において骨の吸収を有効に予防、遅延又は是正する量となる。本明細書において使用される「治療的有効量」の用語は、所望の治療効果を達成するために有効な量を意味する。治療的有効量はまた、治療的に有利な効果が化合物のいずれかの副作用を上回るものである。典型的には、本発明の化合物又は薬剤（例えば、４−Ｐ−ＰＤＯＴ、４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；これらの医薬的に許容される塩）は、対象に対して、０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量において、より具体的な実施形態においては、１ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ／日において投与される。Mahmood et alの相対成長率（allometric scaling）法（J. Clin. Pharmacol. 2003, 43（7）: 692-7）は、マウスからヒトへの用量を推定するために用いることができる。本発明の小分子の医薬的に許容される調製物及び塩は本発明の範囲であり、当業界に周知である（Remington's Pharmaceutical Science, 16th Ed., Mack Ed.）。投与量は、慣習的な要因、例えば疾患の程度及び患者由来の異なるパラメーターに従い医師により選択される。
【００５４】
本発明の化合物又は薬剤（例えば、４−Ｐ−ＰＤＯＴ、４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；これらの医薬的に許容される塩）の治療的有効量は、直接測定することもできる。該有効量は、毎日又は毎週又はその一部において与えることもできる。典型的には、本発明の医薬組成物は、約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重／日（例えば１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、又は２５０ｍｇ）の量において投与することができる。投与量は、単回又は複数回投薬計画のいずれかにおいて提供することができる。例えば、いくつかの実施形態において、該有効量は、約１ｍｇ〜約２５ｇの薬剤／日、約５０ｍｇ〜約１０ｇの薬剤／日、約１００ｍｇ〜約５ｇの薬剤／日、約１ｇの薬剤／日、約１ｍｇ〜約２５ｇの薬剤／週、約５０ｍｇ〜約１０ｇの薬剤／週、約１００ｍｇ〜約５ｇの薬剤を一日おき、及び約１ｇの薬剤を週に一回の用量である。
【００５５】
実際の用量は、各患者に特有の臨床的な要因に基づき、医師により注意深く選択し、漸増する必要があるため、これらは単なるガイドラインである。最適な１日用量は当業界に既知の方法により決定され、そして上述のとおり患者の年齢等の要因及び他の臨床的に関連する要因により影響される。さらに、患者は、他の疾患又は状態のための医薬を摂取していてもよい。他の医薬は、該薬剤が患者に与えられる期間続けることができるが、副作用が生じるか否かを調べるために低用量で開始することが特に望ましい。
【００５６】
担体／媒体
本発明の化合物又は薬剤（例えば、４−Ｐ−ＰＤＯＴ、４−Ｐ−ＰＤＯＴの誘導体、類似体、接合体又はプロドラッグ；これらの医薬的に許容される塩）は、医薬製剤に慣習的に用いられるいずれかの媒体、例えばタルク、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性又は非水性溶媒、油、パラフィン誘導体又はグリコールと共に剤形に組み込むことが出来る。エマルション、例えば米国特許第５，４３４，１８３号に記載されるものもまた使用することができ、ここで植物油（例えば大豆油又はベニバナ油）、乳化剤（例えば卵黄リン脂質）及び水がグリセロールと組み合わされる。さらに、本発明の医薬製剤に組み込むことができる、制限されない医薬的に適当な物質は、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、緩衝溶液、浸透圧調節剤、保存料、安定化剤、抗酸化剤、界面活性剤、増粘剤、皮膚軟化剤、分散剤、香味剤、着色剤、及び湿潤剤を含む。適当な製剤を調製するための方法は当業界に周知である（例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., 1980, A. Oslo Ed., Easton, Pa.を参照のこと）。
【００５７】
非経口投与が投与経路として選択される場合、該薬剤を含有する調製物は、医薬的に許容される無菌水性又は非水性溶媒、懸濁液又はエマルションと組み合わせて患者に供することができる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注射用有機エステルを含む。水性担体は、水、水−アルコール溶液、エマルション又は懸濁液、例えば生理食塩水、及び緩衝化医薬用非経口媒体、例えば塩化ナトリウム溶液、リンガー・デキストロース溶液、デキストロース＋塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンガー溶液、又は固定油を含む。静脈注射媒体は、液体及び栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンガー・デキストロース等に基づくものである。
【００５８】
さらに他の実施形態において、本発明の医薬組成物は、放出制御系において送達することができる。実施形態において、ポリマー材料、例えばポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋両親媒性ブロック共重合体及びヒドロゲル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリジヒドロピランが使用でき（例えば、Smolen and Ball, Controlled Drug Bioavailability, Drug product design and performance, 1984, John Wiley & Sons; Ranade and Hollinger, Drug Delivery Systems, pharmacology and toxicology series, 2003, 2<nd> edition, CRRC Pressを参照のこと）、他の実施形態においてポンプを使用することができる（Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321 : 574）。本発明の化合物はまた、薬剤がカップリング／結合する個々の担体として標的分子及び／又は部分（例えば、モノクローナル抗体、ペプチド）の使用により送達することができる。１実施形態において、上記標的分子／部分は、骨に対する薬剤の伝達を増加及び／又は促進する（すなわち、骨標的分子／部分）。本発明はまた、これらの溶解及び／又はこれらの循環時間を増大するように修飾した化合物、例えばペグ化化合物を包含する。
【００５９】
本明細書において使用される場合、「対象」又は「治療が必要な対象」は、骨吸収異常の予防、遅延又は治療が所望される動物、例えばヒトを意味する。特定の実施形態において、疾患又は症状、例えば骨粗鬆症、バジェット病及び溶骨性骨癌を有する対象は、本発明の化合物、組成物、方法及び使用により利益を得るものと考えられる。
【００６０】
本発明の他の目的、利益及び特性は、参考として供される実施例及び付随の図面の以下の具体的な実施形態の制限されない記載によって、さらに明らかになるものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、Ｍｅｌ１ｂ（ＭＴ２）のみがＲＡＷ２６４．７細胞中で発現されることを示すＲＴ−ＰＣＲの結果を表す。ポジティブコントロール（＋コントロール）として脳組織が与えられる。
【００６２】
【図２】図２は、ＭＴ２受容体について陽性に染色された分化したＲＡＷ２６４．７細胞を表す。パネルＡ：一次抗体を伴わないネガティブコントロール。パネルＣ：タンパク質の膜局在を示すＭＴ２抗体で染色された細胞。パネルＢ及びＤ：ネガティブコントロールとＭＴ２ポジティブ細胞のＤＡＰＩ核染色。パネルＥ及びＦ：ネガティブコントロール（抗体により認識されるペプチドの存在下におけるインキュベーション及びＭＴ２受容体との競合）及びネガティブコントロールのＤＡＰＩ核染色。
【００６３】
【図３−１】図３は、ＴＲＡＰ陽性ＲＡＷ２６４．７細胞の数を表す。該細胞はＲＡＮＫＬと共に、２．５日間（パネルＡ）又は６日間（パネルＢ）、１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴの存在下（白色）及び不存在下（黒色）において培養した。大まかな数（上部パネル）及びコントロール細胞の％（下部パネル）が示される。これらの結果は３回の独立した実験の平均を示す。
【図３−２】図３−１に同じ。
【００６４】
【図４−１】図４は、骨吸収の結果を表す。パネルＡは骨吸収ピット（pit）の数を示し、パネルＢは吸収面積（μｍ2＊１０００）を示し、そしてパネルＣは全吸収面積（ピットの数×吸収面積（μｍ2＊１０００））を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＡＮＫＬと共に１０日間（黒色）、及び１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴと共に４日間（白色）又は１０日間（斜線）において培養した。２回ずつカウントした８つの顕微鏡視野の結果を示す。結果は２つの独立した実験を概要する。
【図４−２】図４−１に同じ。
【００６５】
【図５−１】図５は、破骨細胞分化におけるメラトニンの効果を表す。ＲＡＷ２６４．７細胞は、２．５日間（パネルＡ）又は６日間（パネルＢ）、ＲＡＮＫＬと共に（黒色）、１０-9Ｍのメラトニンと共に（白色）及びメラトニン＋１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ（灰色）と共に培養した。大まかな数（上部パネル）及びコントロール細胞の％（下部パネル）が示される。これらの結果は４回の独立した実験の平均を示す。
【図５−２】図５−１に同じ。
【００６６】
【図６】図６は、コントロール（ＲＡＮＫＬのみで処理した細胞）に対する、ＴＲＡＰ陽性細胞のパーセンテージに関する、１０-9Ｍのメラトニン、１０-9Ｍのメラトニン＋１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ、又は１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴと共に６日間、ＲＡＮＫＬと共に培養したＲＡＷ２６４．７細胞の分化を比較する。上部パネルは、各処理後の細胞を示す顕微鏡視野を表す。これらの結果は、３〜６回の独立した実験の平均を表す。
【００６７】
【図７−１】図７は、破骨細胞機能におけるメラトニンの効果を表す。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＡＮＫＬと共に（黒色）１０日間、１０-9Ｍのメラトニンと共に（白色）又は１０-9Ｍのメラトニン＋１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ（灰色）と共に４日間又は１０日間培養した。２回ずつカウントした８つの顕微鏡視野の吸収ピットの数（パネルＡ）、吸収面積（μｍ2＊１０００）（パネルＢ）及び全吸収面積（ピットの数×吸収面積（μｍ2＊１０００））（パネルＣ）を示す。これらの結果は、２回の独立した実験を概要する。
【図７−２】図７−１に同じ。
【００６８】
【図８】図８は、コントロール（ＲＡＮＫＬのみで処理した細胞）に対する、吸収ピット数（中央のパネル）又は全吸収面積（下部パネル）のパーセンテージに関する、１０-9Ｍのメラトニン、１０-9Ｍのメラトニン＋１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ、又は１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴと共に６日間、ＲＡＮＫＬと共に培養したＲＡＷ２６４．７細胞の分化を比較する。上部パネルは、各々の処理後の細胞を示す顕微鏡視野を表す。これらの結果は、２回の独立した実験を概要する。
【００６９】
【図９−１】図９は、ホルスコリン刺激ＲＡＷ２６４．７細胞のアデニリル・シクラーゼ活性におけるメラトニン（パネルＡ）、４−Ｐ−ＰＤＯＴ（パネルＢ）又はその両方（パネルＣ）の増加濃度の効果を示す。
【図９−２】図９−１に同じ。
【図９−３】図９−１に同じ。
【００７０】
【図１０】図１０は、メラトニン（上部パネルＡ）、４−Ｐ−ＰＤＯＴ（中央パネルＢ）又はその両方（下部パネルＣ）の増加濃度からもたらされるホルスコリン刺激ＲＡＷ２６４．７細胞の標準化ｃＡＭＰ値を示す。
【００７１】
【図１１】図１１は、分化したＲＡＷ２６４．７における細胞アポトーシスの比較を示す。一次抗体を伴わないネガティブコントロール（パネルＡ）。アポトーシスのポジティブコントロールとしてＤＮアーゼ−処理細胞（パネルＢ）。ＲＡＮＫＬのみで処理した細胞（パネルＣ）、４−Ｐ−ＰＤＯＴ  １０-6Ｍ（パネルＤ）、メラトニン  １０-9Ｍ（パネルＥ）及びメラトニン  １０-9Ｍ＋４−Ｐ−ＰＤＯＴ  １０-6Ｍ（パネルＦ）。
【００７２】
【図１２】図１２は、ＲＡＮＫＬのみ、１０-7Ｍ（＋ｍｅｌ−７）又は１０-9Ｍ（＋ｍｅｌ−９）メラトニン、１０-6Ｍ  ルジンドール（Ｌｕｚ−６）、１０-6Ｍ  ４−Ｐ−ＰＤＯＴ（ＰＰ−６）、１０-9Ｍ  メラトニン＋１０-8Ｍ  ルジンドール（＋ｍｅｌ−９＋Ｌｕｚ−８）又は１０-9Ｍ  メラトニン＋１０-6Ｍ  ４−Ｐ−ＰＤＯＴ（＋ｍｅｌ−９＋ＰＰ−６）で処理したＲＡＷ２６４．７におけるトリチウム化チミジンの取り込みを表す。
【００７３】
【図１３】図１３は、ＲＡＮＫＬのみ、１０-9Ｍ  メラトニン（ｍｅｌ−９）、１０-6Ｍ  ４−Ｐ−ＰＤＯＴ（ＰＰ−６）又は１０-9Ｍ  メラトニン＋１０-6Ｍ  ４−Ｐ−ＰＤＯＴ（＋ｍｅｌ−９＋ＰＰ−６）にかけられたＲＡＷ２６４．７の核の数の頻度を表す。
【００７４】
【図１４】図１４は、コントロール（下部パネル）に対する発現のパーセンテージ（β−アクチンの発現に対する標準化）に関する、１０-9Ｍのメラトニン、１０-9Ｍのメラトニン＋１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ、又は１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴと共に、ＲＡＮＫＬと共に培養したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＲＡＮＫ  ｃＤＮＡ発現を表す。上部パネルは、異なる処理後の細胞中のアガロースゲルにおけるＲＡＮＫ  ｃＤＮＡ発現（ＲＴ−ＰＣＲ後）を表す。これらの結果は、３回の独立した実験を概要する。
【００７５】
【図１５】図１５は、コントロール及び処理マウスにおける０日〜３５日間の体重増加の変化を表す。
【００７６】
【図１６−１】図１６は、コントロール及び処理マウスの全身における０日〜３５日間の骨塩量（ＢＭＣ）、骨面積、及び骨塩密度（ＢＭＤ）変化を表す。
【図１６−２】図１６−１に同じ。
【００７７】
【図１７−１】図１７は、コントロール及び処理マウスの脊柱における０日〜３５日間のＢＭＣ、骨面積、及びＢＭＤ変化を表す。
【図１７−２】図１７−１に同じ。
【００７８】
【図１８−１】図１８は、コントロール及び処理マウスの左右の大腿骨における０日〜３５日間のＢＭＣ、骨面積、及びＢＭＤ変化を表す。
【図１８−２】図１８−１に同じ。
【図１８−３】図１８−１に同じ。
【００７９】
【図１９】図１９は、雄のＣ５７Ｂｌ６／ｊマウスの右大腿骨切片におけるＴＲＡＰ染色を表す。パネルＡはコントロールマウス（未処理）の右大腿骨切片を表す。パネルＢは体重１ｋｇあたり１０ｍｇの４−Ｐ−ＰＤＯＴで処理したマウスの右大腿骨切片を表す。４−Ｐ−ＰＤＯＴで処理したマウスにおける破骨細胞の数において有意な減少が見られる。倍率２０×。
【００８０】
【図２０】図２０は、雄のＣ５７Ｂｌ６／ｊマウスの右大腿骨切片のゴールドナー染色を表す。上部パネル（Ａ、Ｂ及びＣ）は、未処理マウス（ｎ＝３、コントロール）の組織切片を表し、下部パネル（Ｄ、Ｅ及びＦ）は、４−Ｐ−ＰＤＯＴで処理したマウス（ｎ＝３）の組織切片を表す。骨梁は、４−Ｐ−ＰＤＯＴで処理した動物において増加する（週に３回、体重１ｋｇあたり１０ｍｇのＩＰ注射）。
【００８１】
【図２１】図２１は、全破骨細胞の数対活性破骨細胞における４−Ｐ−ＰＤＯＴの効果を示す。膳破骨細胞数はゴールドナー染色切片において測定し、そして活性破骨細胞は、ＴＲＡＰ+細胞の数に基づき計算した。
【実施例】
【００８２】
本発明は、以下の制限のない実施例によりさらに詳細に説明される。
【００８３】
細胞モデルＲＡＷ２６４．７（マウス・マクロファージ細胞株、ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−７１）。これらの細胞は、核因子−カッパＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）の受容体アクチベーターの添加において破骨細胞様細胞に分化する。細胞分化は通常２日以内に生じる。ＲＡＮＫＬの添加から、２．５日（初期）、６日及び１０日（終期）後に細胞を調査した。
【００８４】
実験処理：いくつかの実験において、ＲＡＮＫＬと同時に１０-6Ｍの濃度で４−Ｐ−ＰＤＯＴを該細胞に添加した。ＲＡＮＫＬのみと共に培養した細胞はコントロールとした。
【００８５】
例１
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるメラトニン受容体の遺伝子及びタンパク質の発現
ＲＡＷ２６４．７細胞におけるメラトニン受容体の存在を測定するために、遺伝子及びタンパク質の発現を調査した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＲＡＮＫＬの存在又は不存在下において６日間培養した。製造業者の取扱説明書に従いTrizolTM試薬を用いてＲＮＡを抽出した。ThermoscriptTMシステム（Invtrogen）を用いて２μｇの全ＲＮＡを逆転写した。メラトニン受容体１ａ（ＭＴ１）及び１ｂ（ＭＴ２）のＰＣＲ反応はイントロン・スパニングプライマーを使用して設定した。ＭＴ２フォワード：５’−ＧＣＡＧＧＴＡＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＧＧＴ−３’（配列番号１）；ＭＴ２リバース：５’−ＡＧＡＴＧＣＧＴＧＧＡＴＣＡＴＡＣＴＣＴ−３’（配列番号２）；ＭＴ１フォワード：５’−ＴＧＴＡＣＣＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＴＣＡＧＧＡ−３’（配列番号３）；ＭＴ１リバース：５’−ＴＧＧＣＧＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＡＴＣＣＡＴＡ−３’（配列番号４）。ＲＡＷ２６４．７試料を両方の受容体にポジティブな脳組織試料と比較した。結果を図１に示す。この結果、ＭＴ２は検出されたが、ＭＴ１は検出されなかった。
【００８６】
その後、免疫蛍光によりＭＴ２受容体の局在化を調査した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、３日間、LabTekTMチャンバー中、ＲＡＮＫＬの存在又は不存在下において成長させた。細胞を３．７％のパラホルムアルデヒド中で固定し、そして０．１％のTritonTM-X-100で透過処理した。その後、細胞を、３７℃におけるＰＢＳＡ中の１：２５の抗メラトニン１ｂの希釈液による２時間のインキュベーション前に１％ウシ・アルブミン（ＰＢＳＡ）を添加したＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。ネガティブコントロールは、ＰＢＳＡ単独と共にインキュベートした。ＰＢＳ中で４回リンスした後、細胞を、AlexaTM594蛍光色素と結合したロバ抗ヤギの１：５００希釈液と共に３７℃で１時間インキュベートした。細胞をマウントし、そして蛍光顕微鏡を使用して４０×の対物レンズでイメージを視覚化した。各々の色の暴露時間は全て同じとした。結果を図２に示す。
【００８７】
実施例２
酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性により測定した破骨細胞分化における４−Ｐ−ＰＤＯＴの効果
破骨細胞の形成を評価するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴの存在及び不存在下において、ＲＡＮＫＬと共に２．５又は６日間培養した。ＲＡＷ２６４．７細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、そしてＴＲＡＰ活性のために、分化の２．５及び６日目に染色した（活性破骨細胞のマーカー）。３以上の核を有する陽性に染色した細胞を、８つの異なる顕微鏡視野において４回ずつカウントした。２．５又は６日の実験について、それぞれの結果を図３Ａ及びＢに示す。該データは、ＲＡＷ２６４．７細胞の分化中の４−Ｐ−ＰＤＯＴの添加が、ＴＲＡＰ+細胞の数を減少することを示す。
【００８８】
例３
破骨細胞機能：骨吸収圧政
吸収性骨類似体（BioCoatTM OsteologicTM ディスク, BD Biosciences）を使用して破骨細胞活性を測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞を、この類似体でコーティングした１６ウェルプレートにプレーティングした。プレーティングから２４時間後、細胞をＲＡＮＫＬ単独又はＲＡＮＫＬ＋１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴで１０日間処理した。ほかの実験セットにおいて、ＲＡＮＫＬを伴う培養の６日後に１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴを添加し、そしてより成熟した細胞における４−Ｐ−ＰＤＯＴの効果を調べるために、細胞を更に４日間培養した。培養期間の終了後、細胞を漂白剤で分離し、そして吸収した骨面積（吸収ピット）の存在を明らかとするために製造業者の取扱説明書に従い５％硝酸銀で骨類似体を染色した。吸収した骨のピットの数及び面積は、BioquantTMソフトフェアを使用して２回ずつ８つの顕微鏡視野において定量した。結果を図４に示す。さらなる結果を図８に示す。
【００８９】
例４
メラトニン及び４−Ｐ−ＰＤＯＴにおける破骨細胞の分化及び機能における結果の比較
細胞を、ＲＡＮＫＬに追加して１０-9Ｍのメラトニンの存在下において成長させたことを除き、上記例２及び３に記載したのと同じ方法により、破骨細胞形成及び破骨細胞機能におけるメラトニンの効果を評価した。同じ実験において、メラトニンを１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴと共に添加した。ＲＡＮＫＬ単独で処理した細胞をコントロールとした。メラトニンの添加は破骨細胞形成における有意な効果を有さなかった（図５Ａ及び５Ｂ及び図６）が、骨吸収を有意に減少した（図７）。
【００９０】
例５
メラトニン及び４−Ｐ−ＰＤＯＴにより誘発されるｃＡＭＰ生成物の比較
ＲＡＮＫＬを伴わない培養培地中でＲＡＷ２６４．７細胞をコンフルエンスまで成長させた（７日間）。その後、多様な濃度のメラトニン（図９、パネルＡ）、４−Ｐ−ＰＤＯＴ（図９、パネルＢ）またはその両方（図９、パネルＣ）の存在下において、１０-4Ｍのホルスコリンと共に細胞をインキュベートした。濃度は、メラトニンについて１０-11〜１０-5Ｍ、及び４−Ｐ−ＰＤＯＴについて１０-10〜１０-4Ｍの範囲とした。２重の処理群において、１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴに添加した増加濃度のメラトニン（１０-11〜１０-5Ｍ）で細胞を処理した。３７℃３０分間のインキュベーション後、プロテアーゼ及びホスホジエステラーゼで補ったトリス−ＥＤＴＡ緩衝液中に４℃で細胞を溶解させた。酵素免疫アッセイキットを用いて上清の２００μＬのアリコットにおいて２回ずつｃＡＭＰ含有量を測定した。
【００９１】
図１０は、メラトニン、４−Ｐ−ＰＤＯＴ又はメラトニン＋４−Ｐ−ＰＤＯＴで処理したＲＡＷ２６４．７細胞における標準化ｃＡＭＰ活性値を示し、ここで各々のパネルＡ、Ｂ及びＣにおいて、用量１はホルスコリン単独のｃＡＭＰ値に対応し；用量２は１０-11Ｍのメラトニン、１０-10Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ、又は１０-11Ｍのメラトニンと１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴの組み合わせにそれぞれ対応し；用量３は１０-9Ｍのメラトニン、１０-8Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ、又は１０-9Ｍのメラトニンと１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴの組み合わせにそれぞれ対応し；用量４は１０-7Ｍのメラトニン、１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ、又は１０-7Ｍのメラトニンと１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴの組み合わせにそれぞれ対応し；そして用量５は１０-5Ｍのメラトニン、１０-4Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴ、又は１０-5Ｍのメラトニンと１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴの組み合わせにそれぞれ対応する。ｃＡＭＰ値は、ブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して測定した全タンパク質濃度に対して標準化した。
【００９２】
図９及び１０から解るように、ｃＡＭＰ生成物の測定は、これらの細胞がメラトニン及び４−Ｐ−ＰＤＯＴに対して別々に応答することを示した。増加用量の４−Ｐ−ＰＤＯＴの存在下において、ｃＡＭＰ生成物は増加する一方で、該生成物は増加用量のメラトニンにより阻害される。
【００９３】
その後、ＲＡＮＫＬ単独、又はＲＡＮＫＬとメラトニン（１０-9Ｍ）、メラトニン（１０-9Ｍ）及び４−Ｐ−ＰＤＯＴ（１０-6Ｍ）又は４−Ｐ−ＰＤＯＴ（１０-6Ｍ）単独を伴うLabTekTM容器においてＲＡＷ２６４．７細胞を６日間成長させた。細胞を３．７％のパラホルムアルデヒド中で固定し、そして０．１％のTritonTM-X-100で透過処理した。その後、細胞を、３７℃におけるＰＢＳＡ中の１：４０の抗フォロイジンとの３０分間のインキュベーション前に１％ウシ・アルブミン（ＰＢＳＡ）を補足したＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。ＰＢＳにおいて４回リンス後、細胞をＤＡＰＩを含有する培地と共にマウントし、そして蛍光顕微鏡を使用して６３×の対物レンズでイメージを視覚化した。イメージは、１０の独立した顕微鏡視野から得、そして多核細胞において核をカウントした（２以上の核）。図１３は、全多核の％としての核の数の頻度を表す。
【００９４】
例６
処理及び未処理細胞におけるアポトーシスの比較
ＲＡＷ２６４．７細胞を、１０-6Ｍの４−Ｐ−ＰＤＯＴを伴い又は伴わずに、ＲＡＮＫＬを伴う培養培地中で６日間成長させた。細胞を３．７％のパラホルムアルデヒド中で固定し、そして０．２％のTritonTM-X-100で透過処理した。細胞のサブセットをＤＮアーゼで１０分間室温で処理し、そしてポジティブコントロールとした。DeadEndTM蛍光分析TUNELシステムを用いて細胞アポトーシスを測定した。この方法は、蛍光標識化ｄ−ＵＴＰの組み込みを介して断片化ＤＮＡを測定する。透過性細胞を、ヌクレオチド・ミックス及び３７℃で１時間反応を触媒する酵素を伴う平衡緩衝液中でインキュベートした。ネガティブコントロールは酵素を伴わずにインキュベートした。ＳＳＣ及びＰＢＳにおける数回のリンス後、細胞をマウントし、蛍光顕微鏡により視覚化した。結果を図１１に示す。
【００９５】
例７
処理及び未処理細胞における細胞増殖の比較
２４時間付着後、ＲＡＷ２６４．７細胞を一晩血清不足にし、その後ＲＡＮＫＬ及びメラトニン（１０-7〜１０-9Ｍ）、又はメラトニン（１０-9Ｍ）及びメラトニン受容体非特異的アンタゴニスト、ルジンドール（１０-8Ｍ）、又はメラトニン（１０-9Ｍ）及び４−Ｐ−ＰＤＯＴ（１０-6Ｍ）、又はルジンドール（１０-6Ｍ）、又は４−Ｐ−ＰＤＯＴ（１０-6Ｍ）単独を含有する培養培地において２．５日間成長させた。細胞を収穫する８時間前に０．０２μＣｉ／μＬのトリチウム化チミジンを培地に添加することにより、チミジンの取り込みをアッセイした。その後、細胞を氷冷ＰＢＳで２回、及び冷５％トリクロロ酢酸で３回洗浄した。細胞を、０．５Ｎ  ＮａＯＨと０．５％ＳＤＳの混合物に溶解し、そしてベータ−カウンターを用いて溶解物の放射能を測定した。結果を図１２に示す。
【００９６】
図１１及び１２は、破骨細胞機能／骨吸収における４−Ｐ−ＰＤＯＴの効果が、増加したアポトーシス又は減少した細胞増殖によっては、これのパラメーターが４−Ｐ−ＰＤＯＴ処理細胞と未処理細胞の間で同程度であったことから、説明されないことを示す。
【００９７】
例８
破骨細胞マーカーの発現
破骨細胞の分化及び活性に関係する多様な遺伝子の発現におけるメラトニン及び４−Ｐ−ＰＤＯＴの効果を、６日間の処理後のＲＴ−ＰＣＲにより評価した。図１４は、メラトニンと４−Ｐ−ＰＤＯＴが、ＲＡＷ２６４．７細胞由来破骨細胞におけるＲＡＮＫの発現の有意な低下を誘発することを示す。
【００９８】
例９
骨吸収と骨形成の不均衡のための動物モデルにおける４−Ｐ−ＰＤＯＴの効果
メラトニンの生産を制限する自然変異のために極めて低い骨塩密度（ＢＭＤ）を示すことが知られている３週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６ｊマウスに、１０ｍｇ／ｋｇの４−Ｐ−ＰＤＯＴを１週間に３回１ヶ月間腹腔内注射した。平行して、コントロール動物には水とエタノール（２０％）から作成した溶液を注射した。
【００９９】
この期間、動物は、毎週、PixiMusTMII骨密度計を用いて骨密度（ＢＭＤ及び骨塩量（ＢＭＣ））を測定し、そして採血及び採尿を行った。個々の脊柱、長骨（大腿骨）のスキャンを行った。また脛骨、橈骨及び下顎骨のスキャンも行った。
【０１００】
骨形成率をモニターするために、２５ｍｇ／ｋｇの塩酸テトラサイクリンを、注射の開始から１０及び２０日後に注射した。また骨形成及び吸収の静的及び動的パラメーターのための骨組織形態を測定した。骨形成のために使用した生物学的マーカーはアルカリ性ホスファターゼであり、そして骨吸収のために使用した生物学的マーカーは尿中デオキシピリジノリンである。
【０１０１】
最初の３５日間の実験は、媒体注射動物と比較して、処理マウスにおいて脊柱及び全身レベルにおいて体重増加、骨塩癒着の増加を明らかにした（図１６〜１８を参照のこと）。
【０１０２】
上記分析は１２ヶ月間にわたり継続する。６又は１２ヶ月後、マウスを犠牲にし、そして個々の骨及び脊柱をmicroCTTM （SkyScan CT アナライザー）によりスキャンし、その後、メチルメタクリル樹脂に固定及び包埋し、組織形態計測分析をおこなった（骨細胞：類骨、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞の表面及び体積、皮質及び柵状織の厚さを含む）。
【０１０３】
また、離乳後の４週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウスを用いて、骨の形成における４−Ｐ−ＰＤＯＴの効果を試験した。１０ｍｇ／ｋｇの４−Ｐ−ＰＤＯＴを週に３回４週間（２８日間）マウスに腹腔内注射した。その後、大腿骨部分を染色し、酒石酸塩耐性酸ホスファターゼ−（ＴＲＡＰ−）陽性破骨細胞（すなわち「活性」破骨細胞）を定量した。図１９は、４−Ｐ−ＰＤＯＴで処理したマウスが、コントロールマウスと比較して、活性破骨細胞の数において有意な減少を有することを示す。また、破骨細胞の総数を定量するために、大腿骨部分においてゴールドナー染色をおこなった。図２０に示されるとおり、４−Ｐ−ＰＤＯＴによる処理はまた、全破骨細胞の数及び骨梁の増加をもたらす。さらに、図２１に提供される結果は、４−Ｐ−ＰＤＯＴで処理したマウスが、媒体処理マウスと比較して、（全破骨細胞の相対数は増加するが）生体内における活性破骨細胞の相対数において有意な減少（約３倍）を表すことを明確に示す。
【０１０４】
本発明は、具体的な実施形態により記載しているが、付随の特許請求の範囲に定義される発明の精神及び本質から離れることなく改変することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１】
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【配列表】
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