(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法において、
（ａ）磁場により磁力線方向に磁化される磁性物質であって、ナノ単位で粒子化され、表面が改質された磁性物質を複数個準備する段階と、
（ｂ）生きた細胞内における結合可否の確認対象となる第１の物質および第２の物質を準備する段階と、
（ｃ）前記磁性物質を生きた細胞内に取り込み、かつ前記磁性物質を前記第１の物質と結合させた状態で一つの生きた細胞を基準に複数個取り込む段階と、
（ｄ）前記磁力線方向への磁性物質のパターンをイメージ化できる標識物質を前記第２の物質と結合させた後、前記磁性物質とは別途に前記生きた細胞内に提供する段階と、
（ｅ）前記生きた細胞に収束された磁場を印加し、磁力線束(bundle)が前記生きた細胞に対して一定方向に通過するようにする段階と、
（ｆ）前記生きた細胞内で前記磁場の磁力線方向に複数個の磁性物質が配列になるようにする段階と、
（ｇ）前記磁性物質の配列パターンをイメージ化できる前記標識物質のイメージ化されたパターンを確認する段階と、
（ｈ）前記（ｇ）段階の確認を通し、前記標識物質が、前記生きた細胞内で前記磁性物質に結合した第１の物質と前記標識物質に結合した第２の物質との結合により、前記磁性物質に標識されたか否かを決定する段階とを、含み、
前記磁性物質のパターンと、前記標識物質のイメージ化されたパターンを確認し、前記磁性物質のパターンと、前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳(co−localization)すると、前記第１の物質と前記第２の物質とが生きた細胞内で結合すると決定することを特徴とする、生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項２】
前記磁性物質は、鉄、マンガン、クロム、ニッケル、コバルトおよび亜鉛の第４周期遷移金属、該遷移金属の酸化物、硫化物、リン化物および該遷移金属の合金、そして該遷移金属の合金の酸化物、硫化物およびリン化物からなる群から選択される遷移金属化合物である、またはこれらを含む組成物であることを特徴とする、請求項１に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項３】
前記磁性物質は、マグネタイト(Fe3O4)、マグヘマイト(gamma−Fe3O4)、コバルトフェライト(CoFe2O4)、マンガンオキサイド(MnO)、マンガンフェライト(MnFe2O4)、アイアン−プラチナ合金(Fe-Pt alloy)、コバルト−プラチナ合金(Co-Pt alloy)およびコバルト(Co)からなる群の中から選択されたいずれか一つまたは少なくとも2つの混合物を含む、請求項２に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項４】
前記磁性物質は、1ないし1,500nmの直径を有することを特徴とする、請求項１に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項５】
前記磁性物質は、20ないし350nmの直径を有することを特徴とする、請求項４に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項６】
前記磁性物質は、40emu(electromagnetic unit)／g以上の飽和磁化を有することを特徴とする、請求項１に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項７】
前記生きた細胞内に提供された前記磁性物質は、黒点状に観察されることを特徴とする、請求項１に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項８】
前記黒点は、300ないし1,500nm以上の直径を有することを特徴とする、請求項７に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項９】
前記黒点は、単一の磁性物質で構成される、または多数の磁性物質が位置的にお互い隣接した形態で構成されることを特徴とする、請求項７に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項１０】
前記黒点は、前記生きた細胞内に複数個として存在することを特徴とする、請求項９に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項１１】
前記生きた細胞に収束された磁場を印加するとき、磁場の印加方向は前記生きた細胞が置かれている底面に対して水平方向に印加されることを特徴とする、請求項１に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【請求項１２】
前記生きた細胞に収束された磁場の印加は、磁場印加装置により行われ、前記磁場印加装置は生きた細胞が受容された容器を固定し、磁場の強さを強化するための非磁化性磁性体からなる円筒形コア、または前記容器を支持する複数個の延長部が設けられた磁場勾配増大手段を具備することを特徴とする、請求項１に記載の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生きた細胞内で磁力線方向に磁化される磁性物質のパターンを形成する方法および磁性物質のパターンをイメージ化する方法、およびこれに用いられる装置に関するものであって、さらに詳しくは、生きた細胞内で磁性物質に磁場を印加し、磁性物質が磁力線方向にパターンを形成するようにし、標識物質を利用してこのような磁力線方向への磁性物質のパターンをイメージ化する方法およびこれに用いられる装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞はヒトを含む有機体の基本構造であり、活動単位である。生きた細胞は細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）と多様な細胞小器官（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）、例えば、核（ｎｕｃｌｅｕｓ）、核小体（ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ）、ゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）、ミトコンドリア（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ）、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）、ペルオキシソーム（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ）、リソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）、細胞骨格（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）などで構成された複雑な構造を有する。
【０００３】
生きた細胞の生命現象は、このような細胞小器官と細胞小器官を構成する、または細胞小器官に存在する多様な細胞内物質（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）、例えば、蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）などの高分子化合物と、アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ビタミン（ｖｉｔａｍｉｎｓ）、アミン（ａｍｉｎｅｓ）、その他、低分子有機化合物（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）などの低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）により調節され、維持される。
【０００４】
細胞の細胞質は、粘弾性（ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）と揺変性（ｔｈｉｘｏｔｒｏｐｙ）の特性を有するゲル様（ｇｅｌ−ｌｉｋｅ）物質として知られており（Ｌｕｂｙ−Ｐｈｅｌｐｓら、  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８６）１０２，  ２０１５−２０２２）、細胞質は、水より約４倍高い液状粘性（ｆｌｕｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）を有するものとして知られている。また、細胞質に溶けている巨大分子の大きさによって自由拡散（ｆｒｅｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）を制限する障壁を有するものとして知られている（Ｌｕｂｙ−Ｐｈｅｌｐｓら、  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８６）１０２，  ２０１５−２０２２）。前記細胞内障壁は、フィラメント状の網目（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｍｅｓｈｗｏｒｋ）からなるものと推定され、網目の平均細孔（ｐｏｒｅ）径は３０〜４０ｎｍであるものと推算される（Ｌｕｂｙ−Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８６）１０２，２０１５−２０２２）。
【０００５】
このような細胞質の特性に起因し、蛋白質重合体（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、多酵素複合体（ｍｕｌｔｉ−ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、ｍＲＮＡなどを含む長鎖ポリマー（ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ）、リボソーム、ウイルスなどは極めてゆっくり動いているか、ほとんど動いていないものと推算され、半径が２５−３０ｎｍ以上である粒子はほとんど動くことができないものと報告されている（Ｌｕｂｙ−Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８６）１０２，  ２０１５−２０２２；  Ａｒｒｉｏ−Ｄｕｐｏｎｔら、  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．（２０００）７８，  ９０１−９０７；  Ｌｕｂｙ−Ｐｈｅｌｐｓら、  Ｈｉｎｄｅｒｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｅｒｔ  ｔｒａｃｅｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （１９８７）８４，  ４９１０−４９１３；  Ｗｅｉｓｓら、  Ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｓｕｂｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  （２００４）８７，  ３５１８−３５２４）。
【０００６】
伝統的に細胞の構造と細胞内物質の機能を研究するため、生物学では多様な方法が用いられており、特に多様な生命現象が起きる重要な部分である細胞質の特性と構造を研究するため、光学的道具として走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）、蛍光顕微鏡（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）または光学顕微鏡（Ｌｉｇｈｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）などが用いられてきた。
【０００７】
これと関連し、細胞質の物理的特性を糾明するための努力の一環として磁性物質を用いた細胞質の粘弾性測定（Ｃｒｉｃｋ，ｅｔ．  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ：  ａ  ｓｔｕｄｙ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ．  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（１９５０）１，  ５０５−５３３）、細胞質のアクチンフィラメント溶液のレオロジー（ｒｈｅｏｌｏｇｙ）測定（Ｚｉｅｍａｎｎ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｌｏｃａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ  ｍｏｄｕｌｉ  ｏｆ  ｅｎｔａｎｇｌｅｄ  ａｃｔｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｍｉｃｒｏ−ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．（１９９４）６６，  ２２１０−２２１６）などの事例があるが、磁性物質を利用して細胞の動きを追跡したり、磁性物質の動きを利用した細胞内の構造と代謝過程を糾明し、細胞質の生物学的特性を糾明するなどの努力は低調であった。
【０００８】
一方、細胞内の構造と代謝過程を理解するためのもう１つの努力の一環として、特定物質を蛍光標識した後、顕微鏡での観察を行う蛍光プローブ技術（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚら、  Ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００１）２，  ４４４−４５６；  Ｚｈａｎｇら、  Ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２）３，  ９０６−９１８）が開発され、用いられている。蛍光プローブ技術は、細胞を破砕することなく、細胞内で特定物質の位置を把握できるという長所があるが、細胞内で起きる多様な生命現象および代謝過程の糾明と、信号伝達（Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）などに関与する物質を追跡するには限界があるという短所がある。また、最近、多様な類型のナノ粒子／ナノクリスタルを利用する蛍光プローブ技術（Ｃｈａｎら、  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２）１３，  ４０−４６；  Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．（２００３）３６，  Ｒ１９８−Ｒ２０６；  Ｒｕｄｉｎ  ＆  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．（２００３）２，  １２３−１３１；  Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ．  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００４）２２，  ４７−５２）と、細胞標識および細胞小器官トラッキング技術（Ｄｅｒｆｕｓら、  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔｓ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｅｌｌｅ  ｔｒａｃｋｉｎｇ．  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．（２００４）１６，  ９６１−９６６）も試みられているが、前記のような短所をそのまま有する。
【０００９】
このような問題点に対する代案として、磁性物質が注目を受けているが、磁性物質は研究用および医学用への使用が試みられている  （Ａｌｅｘｉｏｕら、  Ｌｏｃｏｒｅｇｉｏｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２０００）  ６０，  ６６４１−６６４８；  Ｌｅｗｉｎら、  Ｔａｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｌｌｏｗ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  （２０００）  １８，  ４１０−４１４；  Ｂｅｒｒｙ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｄ  Ａｐｐｌ．  Ｐｈｙｓ．  （２００３）  ３６，  Ｒ１９８−Ｒ２０６；  Ｂｅｃｋｍａｎｎら、  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｒｅａｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  （２００４）  ９，  ３５−４２；  Ｋｅｌｌｏｆｆら、  Ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｅ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００５）  １１，  ７９６７−７９８５）。例えば、細胞の分離や細胞破砕液から特定物質を分離する用途で磁性物質の使用が試みられている（Ｓａｉｙｅｄら、  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ＢｉｏＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  （２００３）  １，  ２）。しかしながら、磁性物質を効率的に細胞内に取り込んで操作することでその動きを観察し、細胞内の構造と代謝過程を糾明しようとする研究は、そのレベルがまだ未熟である。なぜならば、細胞質そのものの特性と、用いられる磁性物質に移動性の限界があるためである。
【００１０】
これと関連し、細胞表面上にある磁性物質の動きを利用して細胞表面受容体（Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）の物理的特性を測定したり（米国特許第５，４８６，４５７号）（特許文献１）、細胞内で磁場による磁性物質の動きを利用して細胞質の粘性を測定したり（Ｇｅｈｒ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ：  ａ  ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  （１９８３）  ３０２，  ３３６−３３８（非特許文献１）；  Ｖａｌｂｅｒｇ，  ＰＡ．  Ｍａｇｎｅｔｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ｉｎｇｅｓｔｅｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８４）  ２２４，  ５１３−５１６  （非特許文献２）；  Ｖａｌｂｅｒｇ  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ．  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍｏｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｉｌｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  （１９８７）  ５２，  ５５１−５６１  （非特許文献３）；  Ａｎｄｒｅａｓ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌｏｃａｌ  Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｏｒｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｔｗｅｅｚｅｒｓ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  （１９９９）  ７６，  ５７３−５７９）  （非特許文献４）、細胞内の特定部分に磁性物質を移動させようとした試み（Ｇａｏら、  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｔｉａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  （２００８）  １３０，  ３７１０−３７１１）（非特許文献５）が報告されたところがあるが、磁性物質を効率的に細胞内に取り込み、その動きを適切に操作してモニターリングするという観点では、満足なものではなかった。
【００１１】
具体的に、マクロファージ（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）系列を除いたＨｅＬａなどの一般的な細胞の初期エンドソーム（Ｅａｒｌｙ  Ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の直径は、普通２００ないし３００ｎｍで（Ｌｏｄｉｓｈ等前掲書、７２７頁；  Ｂｒａｎｄｈｏｒｓｔ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ：  ＳＮＡＲＥｓ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  （２００６）  １０３，  ２７０１−２７０６）、後期エンドソーム（Ｌａｔｅ  Ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の直径は平均７５０ｎｍであるため（Ｇａｎｌｅｙ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｒａｂ９  ＧＴＰａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｌａｔｅ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ  ｓｉｚｅ  ａｎｄ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  （２００４）  １５，  ５４２０−５４３０）、極めて大きい直径の磁性物質を細胞内に取り込むことは難しい。それに対し、光学顕微鏡の解像度は略２００ｎｍであるため、数ｎｍ  ないし数十ｎｍの小さな直径を有する磁性物質は、独立的に離れている場合、細胞内でその位置を判別することが極めて難しい。例えば、細胞内の小器官の中、球状のエンドソーム、リソソームなどの小胞体は、光学顕微鏡上で細胞内に散発的に散在した黒点状に見られ得るため、黒点状に観察される、小径の磁性粒子を細胞内で細胞小器官と区別してモニターリングすることは極めて難しい。
【００１２】
これに本発明者は、磁性物質を生きた細胞内に取り込み、磁場の印加により磁力線方向に磁性物質が生きた細胞内でパターンを形成する方法およびこのような磁性物質のパターンをイメージ化する方法と、これに用いられる装置を発明するに至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許公報ＵＳ５，４８６，４５７号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｇｅｈｒ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ：  ３０２，  ３３６−３３８，  １９８３
【非特許文献２】Ｖａｌｂｅｒｇ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ：  ２２４，  ５１３−５１６，  １９８４
【非特許文献３】Ｖａｌｂｅｒｇ  ＆  Ｆｅｌｄｍａｎ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ５２，  ５５１−５６１，  １９８７
【非特許文献４】Ａｎｄｒｅａｓ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ７６，  ５７３−５７９，  １９９９
【非特許文献５】Ｇａｏら、  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３０，  ３７１０−３７１１，  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、生きた細胞内に取り込まれた磁性物質が磁場による磁化方向にパターンを形成するようにする方法、およびこのような磁性物質のパターンをイメージ化する方法、およびこれに用いられる装置を提供することにその目的がある。
【００１６】
また、本発明は、生きた細胞内に取り込まれた磁性物質に磁場を印加し、磁性物質が磁力線方向にパターンを形成するようにし、このような磁力線方向に磁性物質のパターンを標識物質でイメージ化する方法を提供することによって生きた細胞内の構造および物質の代謝過程を容易にモニターすることができる技術を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の生きた細胞内で磁性物質のパターンを形成する方法は、磁場により磁力線方向に磁化される磁性物質であって、ナノ単位で粒子化され、表面が改質された磁性物質を複数個準備する段階と、前記磁性物質を生きた細胞内に提供し、かつ、１つの生きた細胞を基準に前記磁性物質を複数個提供する段階と、前記生きた細胞に収束された磁場を印加し、磁力線束（ｂｕｎｄｌｅ）が前記生きた細胞に対して一定方向に通過するようにする段階と、前記生きた細胞内で前記磁場の磁力線方向に複数個の磁性物質が配列になるようにする段階と、前記磁性物質の配列パターンを確認する段階を含む。
【００１８】
また、本発明の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法は、磁場により磁力線方向に磁化される磁性物質であって、ナノ単位で粒子化され、表面が改質された磁性物質を複数個準備する段階と、前記磁性物質を生きた細胞内に提供するものの、ただし、１つの生きた細胞を基準に前記磁性物質を複数個提供する段階と、前記磁性物質と結合して前記磁力線方向に磁性物質のパターンをイメージ化することができる標識物質を生きた細胞内に提供する段階と、前記生きた細胞に収束された磁場を印加し、磁力線束（ｂｕｎｄｌｅ）が前記生きた細胞に対して一定方向に通過するようにする段階と、前記生きた細胞内で前記磁場の磁力線方向に複数個の磁性物質が配列になるようにする段階と、前記磁性物質の配列パターンをイメージ化できる前記標識物質のイメージ化されたパターンを確認する段階を含む。
【００１９】
本発明の一実施例の方法において、前記磁性物質は磁場により磁化できる物質で構成されなければならず、鉄、マンガン、クロム、ニッケル、コバルトおよび亜鉛などの第４周期遷移金属、該遷移金属の酸化物、硫化物、リン化物および該遷移金属の合金、そして該遷移金属の合金の酸化物、硫化物およびリン化物からなる群から選択される遷移金属化合物、或いはこれらを含む組成物とすることもできる。
【００２０】
好ましくは、前記磁性物質はマグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、マグヘマイト（ｇａｍｍａ−  Ｆｅ３Ｏ４）、コバルトフェライト（ＣｏＦｅ２Ｏ４）、マンガンオキサイド（ＭｎＯ）、マンガンフェライト（ＭｎＦｅ２Ｏ４）、鉄−プラチナ合金（Ｆｅ−Ｐｔ  ａｌｌｏｙ）、コバルト−プラチナ合金（Ｃｏ−Ｐｔ  ａｌｌｏｙ）およびコバルト（Ｃｏ）からなる群の中から選択されたいずれか１つまたは少なくとも２つの混合物を含む。
【００２１】
本発明の一実施例の方法において、前記磁性物質は１ないし１，５００ｎｍの直径を有する。好ましくは前記磁性物質は２０ないし３５０ｎｍの直径を有する。
【００２２】
本発明の一実施例の方法において、前記磁性物質は４０ｅｍｕ（ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｕｎｉｔ）／ｇ以上の飽和磁化（Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）を有することが好ましく、超常磁性（Ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｓｍ）または強磁性（Ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｓｍ）の特性を有することができる。
【００２３】
本発明の一実施例の方法において、前記生きた細胞内に提供された前記磁性物質は、光学顕微鏡により黒点（Ｂｌａｃｋ  ｄｏｔ）状に観察され、前記黒点は１５０ないし３，０００ｎｍ以上の直径を有する。光学顕微鏡の理論的解像度が約２００ｎｍであることから（Ｌｏｄｉｓｈ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４ｔｈ  ｅｄ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｎｙ，  （２０００）  １４０−１４１）、前記黒点は３００ないし１，５００ｎｍ以上の直径を有することが好ましい。前記黒点は単一の磁性物質で構成されることもでき、多数の磁性物質が位置的にお互い隣接した形態で構成されることができる。
【００２４】
一方、前記磁性物質がＲＩＴＣ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）などのような蛍光性を含む場合、細胞内に存在する前記磁性物質は蛍光顕微鏡の下、固有の蛍光を表す蛍光点（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｏｔ）の形態に観察され得、蛍光顕微鏡を利用して観察した場合、前記蛍光点は前記磁性粒子の直径よりさらに大きく見え得る。
【００２５】
本発明の一実施例の方法において、前記黒点は前記生きた細胞内に複数個存在する。
【００２６】
本発明の一実施例の方法において、前記生きた細胞に収束された磁場を印加する時、磁場の印加方向は前記生きた細胞が置かれている底面に対して水平方向に印加され得る。
【００２７】
本発明の好ましい一実施例において、前記生きた細胞に収束された磁場を印加するのは磁場印加装置により行われ、前記磁場印加装置は生きた細胞が受容された容器を固定し、磁場の強さを強化するための非磁化性磁性体からなる円筒形コア、または前記容器を支持する複数個の延長部が設けられた磁場勾配増大手段を具備し、磁場を前記容器に対して集中させ、前記容器の特定方向に前記磁性物質を移動および維持させる力を強化させることによって、前記磁性物質の磁力線方向への磁化を容易にすることができる。また、前記永久磁石または電磁石は細胞に近接させて位置づけるのが好ましい。
【００２８】
本発明の一実施例の方法において、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンを確認し、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンが重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）するか否かを確認する段階をさらに含む。
【００２９】
本発明の一実施例の方法において、前記標識物質はメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を利用して前記磁性物質に標識することができる。前記メディエータは１つまたは複数個のリンカー物質を含む。例えば、該メディエータは２つのリンカー物質で構成されることができる。
【００３０】
本発明の一実施例の方法において、前記メディエータを利用して前記標識物質を前記磁性物質に標識するのは、前記磁性物質と前記標識物質を生きた細胞内に提供する前に行うことができる。
【００３１】
代案として、前記メディエータを利用して前記標識物質を前記磁性物質に標識するのは、前記磁性物質と前記標識物質を各々生きた細胞内に提供した後、前記メディエータにより生きた細胞内で前記磁性物質に前記標識物質が標識されて行うこともできる。前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンとが重畳しているのが確認された場合、前記メディエータを構成するリンカー物質は生きた細胞内で結合するものと判断することができる。
【００３２】
本発明の一実施例の方法において、前記メディエータを構成するリンカー物質としては、蛋白質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄｓ）などの高分子化合物と、アミノ酸（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）、ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ビタミン（ｖｉｔａｍｉｎｓ）、アミン（ａｍｉｎｅｓ）、その他の低分子有機化合物（ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）などの低分子化合物（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）などを含む。
【００３３】
一方、本発明の生きた細胞内で磁性物質のパターンをイメージ化する方法に用いられる装置は、生きた細胞を培養する容器であって、磁場により磁力線方向に磁化される磁性物質であって、ナノ単位で粒子化され、表面が改質された複数個の磁性物質と、前記磁性物質と結合して前記磁力線方向への磁性物質のパターンをイメージ化できる標識物質が提供される生きた細胞を培養する容器と、前記生きた細胞に収束された磁場を印加する磁場印加装置であって、磁力線束（ｂｕｎｄｌｅ）が前記生きた細胞に対して一定方向に通過するようにする磁場印加装置と、前記生きた細胞内で前記磁場の磁力線方向に配列になった複数個の磁性物質のパターンおよび／または前記磁性物質の配列になったパターンをイメージ化できる前記標識物質のイメージ化されたパターンをモニターする装置を含む。
【００３４】
本発明の一実施例の装置において、前記モニター装置は、前記磁性物質のパターンと前記標識物質のイメージ化されたパターンとが重畳（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）するか否かを確認することができる。
【００３５】
本発明の好ましい一実施例の装置において、前記磁場印加装置は、生きた細胞が受容された容器を固定し、磁場の強さを強化するための非磁化性磁性体からなる円筒形コア、または前記容器を支持する複数個の延長部が設けられた磁場勾配増大手段を具備することを特徴とする。これによって、本発明の装置は、磁場を前記容器に対して集中させ、前記容器の特定方向に前記磁性物質を移動および維持させる力を強化させることによって前記磁性物質の磁力線方向への磁化パターンの形成を容易にすることができる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、生きた細胞内に取り込まれた磁性物質に磁場を印加し、磁性物質が磁力線方向にパターンを形成し、このような磁力線方向への磁性物質のパターンを標識物質を用いてイメージ化することができる。
【００３７】
また、本発明によれば、生きた細胞内に取り込まれた磁性物質の磁力線方向へのパターンを標識物質でイメージ化する方法を提供することにより、生きた細胞内の構造および物質の代謝過程を容易にモニターすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の一実施例の方法により合成された磁性粒子の走査電子顕微鏡写真である。
【図２】本発明の一実施例の方法により合成された磁性粒子の透過電子顕微鏡写真である。
【図３】本発明の一実施例の方法および装置に用いられる磁場印加装置の概略的な斜視図である。
【図４】本発明の一実施例の方法および装置に用いられるもう１つの磁場印加装置（磁場勾配増大手段を具備するもの）の概略的な斜視図である。
【図５】磁性物質が取り込まれたＨｅＬａ細胞に磁場をかけずに細胞を固定した後に撮影した透過光顕微鏡写真（Ａ）と、磁場を垂直方向にかけ、細胞を固定した後に撮影した透過光顕微鏡写真（Ｂ）と、磁場を水平方向にかけ、細胞を固定した後に撮影した透過光顕微鏡写真（Ｃ）とを比較して示す。
【図６】磁性物質が取り込まれたＨｅＬａ細胞に磁場をかけ、細胞を固定した後に撮影した光学顕微鏡写真（磁場＋）と、磁場をかけずに細胞を固定した後に撮影した光学顕微鏡写真（磁場−）とを比較して示す。左方のイメージは、プルシアンブルー染色を施す前の細胞の透過光イメージの原色写真であり、右方のイメージは、細胞を固定した上、プルシアンブルー染色を施した後に撮影した細胞の透過光イメージの原色写真である。矢印は水平方向の磁力線方向を指す。
【図７】磁場の方向に沿って細胞内に取り込まれた磁性物質がパターンを形成することが表れた蛍光／透過光顕微鏡写真である。矢印は磁力線方向を指す。
【図８】蛍光が標識された磁性粒子複合体が取り込まれたＨｅＬａ細胞に磁場をかけ、細胞を固定した後に撮影した蛍光および透過光顕微鏡写真（磁場＋）と、磁場をかけずに細胞を固定した後に撮影した蛍光および透過光顕微鏡写真（磁場−）とを比較して示す。
【図９】ダサチニブ−ビオチン合成の概略図である。
【図１０】図１０のＡは、ダサチニブ−磁性粒子（Ｄａｓ−ＭＮＰ）複合体またはビオチン−磁性粒子（Ｂｉｏ−ＭＮＰ）複合体とＣＳＫ−ＥＧＦＰ発現ベクターが取り込まれたＨｅＬａ細胞に磁場をかけた場合の蛍光および透過光顕微鏡写真を比較して示す。図１０のＢは、ダサチニブ−磁性粒子（Ｄａｓ−ＭＮＰ）複合体またはビオチン−磁性粒子（Ｂｉｏ−ＭＮＰ）複合体とＳＮＦ１ＬＫ−ＥＧＦＰ発現ベクターが取り込まれたＨｅＬａ細胞に磁場をかけた場合の蛍光および透過光顕微鏡写真を比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく記述する。本発明の下記の実施例は本発明を具体化するだけのものであって、本発明の権利範囲を制限または限定するものでないことはもちろんである。本発明の詳細な説明および実施例から本発明が属する技術分野の専門家が容易に類推できるのは、本発明の権利範囲に属するものと解釈される。本発明にて引用された参考文献は、本発明に参考として統合される。
【００４０】
実施例
【実施例１】
【００４１】
磁性物質の合成
（１）磁性粒子の合成
細胞内で磁場によりパターンを形成することができる磁性物質の一実施例として、モールデーなどの方法（Ｍｏｌｄａｙ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ−ｄｅｘｔｒａｎ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  （１９８２）  ５２，  ３５３−３６７）を変形して磁性粒子を次の通り、合成して用いた。
【００４２】
温度の調節と超音波強度の調節が可能な水槽型超音波洗浄機（Ｋｏｄｏ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ  、ｍｏｄｅｌ  Ｎｏ．ＪＡＣ２０１０）に５０ｍｌコニカルチューブ（ＳＰＬ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ（京畿道抱川市所在）、製品番号５００５０）を位置させ、１０ｍｌの５０％（ｗ／ｗ）デキストラン（Ｆｌｕｋａ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．３１３８９，  平均分子量４００００）水溶液を入れる。
【００４３】
前記チューブの中に実験室用攪拌機［ＰＯＯＮＧ  ＬＩＭ商社（ソウル市鍾路区長沙洞所在）、モデル番号ＰＬ−Ｓ１０］と連結したプロペラを装着した上、１０ｍｌの１．５１ｇ  ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．２３６４８９）と０．６４ｇ  ＦｅＣｌ２．４Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．２２０２９９）水溶液を一滴ずつ入れ、約２，０００ｒ．ｐ．ｍ．の速度で撹はんする。この過程において超音波をかけることができる。
【００４４】
撹はんしながら溶液のｐＨが１０．５に達する時まで７．５％（ｖ／ｖ）  ＮＨ４ＯＨで一滴ずつ添加する。この過程において水槽の温度を４０ないし６５℃に調節することができる。
【００４５】
溶液のｐＨが１０．５に達すれば、あらかじめ温度を６５ないし９０℃に合せておいた水槽に１５分間湯煎する。
【００４６】
湯煎の終わった溶液は、常温でゆっくり温度が下がるよう定置させる。
【００４７】
遠心分離機［韓日科学産業株式会社（仁川市桂陽区鵲田洞所在）、製品番号ＭＦ−８０］を用いて６００  ｘ  ｇで５分間ずつ全部で３回の遠心分離を進行し、沈殿物を除去した上、上層液を集め、さらに２，０００  ｘ  ｇで１０分間遠心分離し、沈殿物を除去する。結合していないデキストランを除去するため、  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１００Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．ＵＦＣ９１００２４）  を用いて卓上用遠心分離機（韓日科学産業、モデル名Ｃｏｍｂｉ  ５１４Ｋ）において３，９００ｒ．ｐ．ｍ．で２０分間遠心分離した後、磁性粒子を精製水、リン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）または２Ｍ炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）（Ｎａ２ＣＯ３）溶液（ｐＨ  １１）に浮游した。この他にもＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００を利用したゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）方法でデキストランを除去することができる。
【００４８】
図１は、前記方法で合成された磁性粒子の走査電子顕微鏡写真であり、図２は前記方法を変形してデキストランを添加することなく合成された磁性粒子の透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）写真である。
【００４９】
（２）磁性粒子の表面改質
前記（１）の方法により合成された磁性粒子の表面をストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）または蛍光蛋白質などの蛋白質で改質するために当業界にてよく知られた方法（Ｍａｒｃｈ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ａ  Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｙａｎｏｇｅｎ  ｂｒｏｍｉｄｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇａｒｏｓｅ  ｆｏｒ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  （１９７４）  ６０，  １４９−１５２；  Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ，  Ｐ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  （１９７０）  ２４５，  ３０５９−３０６５）を変形して用いた。磁性粒子の表面改質の過程は次の通りである。
【００５０】
磁性粒子の表面に露出されたヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙ  ｇｒｏｕｐ）を活性化させるため、ドラフトチャンバー内で前記（１）の過程において用意したような２Ｍ炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）（Ｎａ２ＣＯ３  溶液（Ｐｈ  １１）に浮遊された磁性粒子に、反応体積全体の２％に該当する体積で５ＭのＣＮＢｒ溶液［２ｇ  シアノゲンブロマイド（ｃｙａｎｏｇｅｎ  ｂｒｏｍｉｄｅ）を１ｍｌのアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌ）に溶かした溶液］を添加した。
【００５１】
反応を遅らすため、４ないし２０℃の比較的低い温度で８ないし１２分間反応させ、未反応のＣＮＢｒ（ｃｙａｎｏｇｅｎ  ｂｒｏｍｉｄｅ）は、当業界にてよく知られた透析、遠心分離、ＨＧＭＳ技術（Ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ、米国特許第４，２４７，３９８号；  Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，  ｅｔ．  ａｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ．  Ｎａｔｕｒｅ  （１９７５）  ２５５，  ７０６）または限外濾過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などの方法で除去した。
【００５２】
未反応のＣＮＢｒが除去された活性化された磁性粒子をリン酸緩衝生理食塩水または０．１Ｍ重炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）溶液に浮遊させた後、１０ないし２００ｍｇ／ｍｌ濃度でリン酸緩衝生理食塩水に希釈された蛋白質溶液と混ぜ、４℃で１４時間の間反応させて磁性粒子の表面が蛋白質により改質されるようにする。この時、蛋白質の最終濃度は０．１ないし１００ｍｇ／ｍｌになるようにする。好ましくは反応する蛋白質の最終濃度が１ないし１０ｍｇ／ｍｌになるようにする。
【００５３】
蛋白質による磁性粒子表面の改質反応を終結させるためにグリシンを添加し、かつ、グリシンの最終濃度が前記蛋白質の最終濃度の５ないし５０倍になるように添加し、室温で２時間の間反応させる。好ましくは、グリシンの最終濃度が前記蛋白質の最終濃度の１０ないし２５倍になるように添加する。
【００５４】
未反応の蛋白質とグリシンは、当業界にてよく知られた遠心分離またはＨＧＭＳ等の方法で除去した。
【００５５】
前記方法により磁性粒子の表面をストレプトアビジンで改質し、ストレプトアビジン−磁性粒子を製作し、磁性粒子の表面を当業界にて広く知られた蛍光蛋白質の中の１つであるＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で改質し、ＥＧＦＰ−磁性粒子を製作した。
【００５６】
前記方法により磁性粒子の表面が蛋白質で改質されたか否かはＳＤＳ−不連続電気泳動法（ＳＤＳ−ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認することができる。
【００５７】
この他にも本発明にて使用可能な蛋白質で表面が改質された磁性粒子は、当業界にてよく知られた方法（米国特許第５，６６５，５８２号；米国特許公開第２００３／００９２０２９Ａ１号）で直接製作する、または磁性粒子を製作販売している会社から購入して用いることができる。
【実施例２】
【００５８】
細胞内に取り込まれた磁性物質の磁力線方向へのパターン形成
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入、Ｃａｔ．  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）を９６−ウェルプレートに５，０００個細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）単位で継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）し、３７℃、５％  ＣＯ２  培養器において１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を含有したＤＭＥＭ培地を用いて培養した。
【００５９】
翌日、実施例１にて合成した磁性物質に最終濃度０．１ｍＭになるよう蛋白質伝達ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ）を有するペプチド（アミノ酸の序列：ＰＫＫＫＲＫＶＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ）を添加した上、室温で３０分間反応させた後、ＨＧＭＳ方法を用いて結合しない蛋白質伝達ドメインを除去した。本発明の実施例において蛋白質伝達ドメインとしては、前記序列以外にも当業界にてよく知られた蛋白質伝達ドメインを用いることができ、またペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）とも呼ばれるペプチドを用いることができることは、本発明が属する技術分野の当業者ならば容易に理解できるはずである。
【００６０】
次に、培養されたＨｅＬａ細胞を１ｘＤ−ＰＢＳで洗浄した後、前記磁性物質と蛋白質伝達ドメインが含まれたＯＰＴＩ  ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）培地を添加し、３７℃、５％  ＣＯ２の培養器で培養した。
【００６１】
翌日、磁性物質が処理された細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、Ｃａｔ．  Ｎｏ．３１９８５−０７０）培地を利用して２回洗浄した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ培地が入っている状態で当業界にてよく知られた方法により、永久磁石または電磁石を利用して磁場をかけた（大韓民国特許第１０−０７９２５９４号；大韓民国特許第１０−０８６２３６８号；米国特許第４，２４７，３９８号）。
【００６２】
磁性物質が細胞内で磁場によって動くようにするためには、細胞質の粘度と細胞内の構造により、水溶液中に存在していた時より大きい磁気力を受けなければならない。
【００６３】
細胞内で磁性物質が受ける磁気力（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｏｒｃｅ）は、磁性物質の磁化率（Ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）と磁場の磁束密度（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｌｕｘ  ｄｅｎｓｉｔｙ）に比例する。磁場の磁束密度は磁石を構成する金属物質の磁気飽和度により影響を受けるため、高磁束密度を作るためには磁気飽和度の大きい金属を用いて磁石を作らなければならない。
【００６４】
また、磁束密度は磁石から細胞間の距離の二乗に反比例するため、できるだけ高磁束密度を細胞内に存在する磁性物質に印加するためには、なるべく細胞と磁石との距離を近くしなければならない。
【００６５】
これと関連し、図３には本発明の一実施例にて用いられる磁場印加装置（大韓民国特許第１０−０７９２５９４号参照）が示されている。前記磁場印加装置には多数のウェル（１５２）が形成されたウェルプレート（１５０）を受け入れるための筒体（１００）と、ウェルプレート（１５０）を固定し、非磁化性磁性体でなされた磁場の強さを強化するためのコア（１４０）が設けられている。図示しなかったが、前記筒体（１００）の周囲に数回ないし数十万回巻線され、電源の供給時、ウェルプレート（１５０）を含む領域に磁場を形成するためのコイルと、コイルに電源を供給するための電源供給装置も提供される。前記コア（１４０）は電流が流れる間だけ、磁化される非磁化性磁性体で構成され、このようなコア（１４０）の設置により磁場がコア（１４０）側に集中する現象が発生し、コア（１４０）近辺の磁場の強さを高めるようになる。したがって、コア（１４０）を設置することによって磁場がコア（１４０）側に集中し、このように磁場の強さが急激に強くなると、ウェルプレート（１５０）内に存在する磁性物質の移動および維持させる力を強化させることによって、前記磁性物質の磁力線方向に磁化パターンの形成を容易にすることができる。
【００６６】
また、図４には本発明の一実施例にて用いられるもう１つの形態の磁場印加装置（大韓民国特許第１０−０８６２３６８号参照）が示されている。前記磁場印加装置（１０００ａ）には多数のウェル（１５２）が形成されたウェルプレート（１５０）を収容するための筒体（１００）と、前記筒体（１００）の底面に対して上方方向に突出され、ウェルプレート（１５０）を支持する複数個の延長部で構成された磁場勾配増大手段（１４４）が設けられている。図示しないが、前記筒体（１００）の周囲に数回または数十万回巻線され、電源の供給時、ウェルプレート（１５０）を含む領域に磁場を形成するためのコイルと、コイルに電源を供給するための電源供給装置も提供される。前記磁場勾配増大手段（１４４）は複数個の延長部により磁場勾配を増大させ、ウェルプレート（１５０）のウェル（１５２）内の磁性物質の移動および維持させる力を強化させることにより、前記磁性物質の磁力線方向への磁化パターンの形成を容易にすることができる。
【００６７】
磁場をかけた状態で１Ｘ  Ｄ−ＰＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．ＬＢ００１−０２）で１回洗浄し、３７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａから購入）を１ＸＤ−ＰＢＳで１０倍希釈し、３．７％ホルムアルデヒド溶液を作った。前記ホルムアルデヒド溶液で５分間細胞に処理し、細胞を固定した。前記細胞固定後、細胞を１Ｘ  Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄した上、顕微鏡の観察を行った。
【００６８】
本実施例においては、対物レンズＵｐｌａｎ  Ａｐｏ  ４０Ｘ／０．８５が装着されたオリンパス社の蛍光顕微鏡ＦＶ１０００を利用して細胞の透過光イメージを得、その結果を図５に例示した。磁場をかけない細胞からは、細胞の核周辺から磁性粒子は確認されるものの、磁力線方向へのパターンは観察されないことが確認された（図５の（Ａ））。一方、磁場を細胞に対して垂直方向にかけた細胞からも細胞の核周辺から磁性粒子は確認されたが、磁力線方向へのパターンは観察されないことが確認された（図５の（Ｂ））。それに対し、磁場を細胞に対して水平方向にかけた細胞からは磁力線方向に磁性粒子がパターンを形成することがはっきりと観察することができた（図５の（Ｃ））。このような結果は、細胞内で誘導磁化（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｚａｔｉｏｎ）によって磁性物質が磁力線方向にパターンを形成することを意味する。
【００６９】
細胞内の小器官の中、球状を帯びたエンドソーム、リソソームなどの小胞体は、光学顕微鏡上から細胞内に散発的に散在した黒点状に見られ得る。したがって、磁性物質が磁力線方向にパターンを形成するのかを確認するためには、複数の磁性物質が１つの細胞に効率的に取り込まれなければならず、収束された磁場の磁力線束（ｂｕｎｄｌｅ）が細胞に対して一定方向に通過できなければならない。本発明の実施例においては、黒点が磁力線方向に配列になってパターンを形成することを確認することができ、球状の細胞内の小器官と明確に区別することができた。
【実施例３】
【００７０】
プルシアンブルー染色を利用した細胞内に取り込まれた磁性物質の磁力線方向パターンの確認
図５に示すように透過光顕微鏡で観察される黒色の点が磁性物質であることを確認するため、プルシアンブルー染色（Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ）を施した。プルシアンブルー染色は、細胞内に取り込まれた酸化鉄成分の磁性粒子（ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を特異的に染色して観察することに用いられる（Ｆｒａｎｋ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｂ．  Ｒ．，  Ａｒｂａｂ，  Ａ．  Ｓ．，  Ｚｙｗｉｃｋｅ，  Ｈ．  Ａ．，  Ｊｏｒｄａｎ，  Ｅ．  Ｋ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｂ．  Ｋ．，  Ｂｒｙａｎｔ，  Ｌ．  Ｈ．，  ＆  Ｂｕｌｔｅ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｍ．  （２００３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔｓ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２２８：  ４８０−４８７）。磁性物質が取り込まれた細胞は、実施例２の通り準備した。磁場をかけて３時間後、細胞をホルムアルデヒドで固定した。そして、プルシアンブルー染色前に細胞を光学顕微鏡で観察し、プルシアンブルー染色後、同じ視野（ｆｉｅｌｄ）で細胞を光学顕微鏡で観察した。プルシアンブルー染色は、プルシアンブルー鉄ステインキット［Ｐｒｕｓｓｉａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｉｒｏｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．２４１９９）］を用いて行った。
【００７１】
本実施例においては対物レンズＬＵＣＰｌａｎ  Ｆ１  ６０Ｘが装着されたオリンパス社のＩＸ５１倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５１  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ＤＰ７０  ＣＣＤ  ｃａｍｅｒａ，  Ｊａｐａｎ）を利用して細胞の透過光イメージを得た。図６で確認されるように、磁場をかけた細胞からは磁性物質のパターンが磁化方向（矢印方向）に形成され、光学顕微鏡で観察され、このようなパターンはプルシアンブルー染色により特異的に染色されることが確認された。したがって、磁場をかけることにより形成されるパターンは細胞内に取り込まれた磁性物質によるものであることが確認された。磁場をかけない細胞からは細胞内に取り込まれた磁性物質がプルシアンブルー染色により染色されることが観察されたが、磁力線方向に形成されたパターンは見られないことが確認された。
【実施例４】
【００７２】
細胞内に取り込まれた磁性物質の磁力線方向の変化に伴うパターン変化の観察
磁力線方向の変化に伴う磁性物質のパターンの変化が次の通り確認された。磁性物質が取り込まれた細胞は、実施例２の通り準備した。実施例２の通り細胞が生きた状態で磁場を印加した後、細胞を固定した。
【００７３】
本実施例においては対物レンズＰｌａｎ−Ｎｅｏｆｌｕａｒ  ２０Ｘが装着されたＺｅｉｓｓ社のＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ  ＮＬＯ顕微鏡を利用して細胞の蛍光および透過光イメージを得た。図７で確認されるように、磁場をかけると細胞内で磁性粒子のパターンが磁力線方向（矢印方向）に形成されることが観察され、このようなパターンは磁場の方向に沿って再形成されることが確認された。
【実施例５】
【００７４】
蛍光標識された磁性物質の磁力線方向への蛍光パターンの観察
蛍光標識された磁性物質の磁化方向パターンが蛍光物質によりイメージ化されることを観察するため、次のような実験を行った。９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒから購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０９０）にＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣから購入、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣＬ−２）を４，０００個細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）単位で継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）した。翌日、培養されたＨｅＬａ細胞に磁性物質を次のような過程に従って処理した。
【００７５】
１）ストレプトアビジン−磁性粒子をビオチン−ＳＳ−ＦＩＴＣ（ビオチン−ＳＳ−ＦＩＴＣ）と混合して反応させ、磁性粒子を蛍光標識させた。
【００７６】
２）前記反応３０分経過後、混合液を当業界にて知られた磁性物質分離方法、例えばＨＧＭＳ技術（Ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）を利用して精製した。
【００７７】
３）精製された蛍光標識された磁性粒子を実施例２の通り細胞に処理し、磁場をかけた後、ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定した。
【００７８】
本実施例では対物レンズＵｐｌａｎ  Ａｐｏ  ４０Ｘ／０．８５が装着されたオリンパス社の蛍光顕微鏡ＦＶ１０００を利用して細胞の蛍光イメージと透過光イメージを得た。図８に示すように、ＦＩＴＣで蛍光標識された磁性粒子は磁場をかけることにより蛍光パターンが磁力線方向（矢印方向）に形成されることが確認された。しかし、磁場をかけない細胞からはＦＩＴＣ蛍光は観察されたものの、特異的な蛍光パターンは観察されなかった。したがって、本実施例においては細胞内で収束された磁場印加により形成された複数の磁性粒子の磁化パターンが標識物質である蛍光物質によりイメージ化されることを確認することができた。
【実施例６】
【００７９】
メディエータを利用して蛍光標識された磁性物質の磁力線方向への蛍光パターンの観察
本実施例においては表面が改質された磁性物質に蛍光物質が直接標識された場合のみならず、表面が改質された磁性物質にメディエータ（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を利用して蛍光物質を標識した場合にも磁場印加により形成された複数の磁性粒子の磁化パターンが標識物質である蛍光物質によりイメージ化されるか否かを観察した。また、磁性物質が形成する磁力線方向のパターンと重畳する蛍光パターンが形成されるか否かも確認した。
【００８０】
メディエータは本発明が属する技術分野において使用可能なものと認識されるリンカー物質を１つまたは複数個用いて構成することができる。以下、その一例としてメディエータを２つのリンカー物質で構成したものを用いて実験を行った。メディエータを利用して蛍光物質を、表面が改質された磁性粒子に標識することは、磁性粒子と蛍光物質を細胞内に提供する前に行われることもでき、磁性粒子と蛍光物質を各々細胞内に提供した後、メディエータにより細胞内で表面が改質された磁性粒子に蛍光物質が標識されて行われることもできる。
【００８１】
メディエータを構成するリンカー物質の１つとしては、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）の治療剤として使われているダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）［Ｌｏｍｂａｒｄｏ，  Ｌ．  Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｆ．  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．ら、  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｎ−（２−ｃｈｌｏｒｏ−６−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｈｅｎｙｌ）−２−（６−（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−４−４−ｙｌａｍｉｎｏ）ｔｈｉａｚｏｌｅ−５−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  （ＢＭＳ−３５４８２５），  ａ  ｄｕａｌ  Ｓｒｃ／Ａｂｌ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｓｓａｙｓ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４７，  ６６５８−６６６１  （２００４）；  Ｓｈａｈ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｔｒａｎ，  Ｃ．，  Ｌｅｅ，  Ｆ．  Ｙ．  Ｃｈｅｎ，  Ｐ．，  Ｎｏｒｒｉｓ，  Ｄ．，  Ｓａｗｙｅｒｓ，  Ｃ．  Ｌ．  Ｏｅｒｒｉｄｉｎｇ  ｉｍａｔｉｎｉｂ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＡＢＬ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，  ３９９−４０１  （２００４）］を選択した。また、メディエータを構成するもう１つのリンカー物質としては、前述したリンカー物質であるダサチニブと結合するＳＲＣ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＮＭ＿１９８２９１）またはＳＮＦ１ＬＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＣ０３８５０４）を用いた。また、磁性粒子の表面をダサチニブで改質するため、ダサチニブ−ビオチンを合成した。
ダサチニブ−ビオチン（Ｄａｓａｔｉｎｉｂ−ｂｉｏｔｉｎ）は図９の概略図の通り合成した。
【００８２】
図９に示されたダサチニブ−ビオチン合成の過程を説明すれば、次の通りである。
【００８３】
まず、ダサチニブ−ビオチンを合成するため、まず、２，３，５，６−テトラフルオロフェニルトリフルオロアセテート（２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）形態のビオチンリンカーを合成した。
【００８４】
（１）窒素大気状態でトリフルオロ酢酸無水物（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）に溶けられた２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（２，３，５，６−ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｏｌ）に  ＢＦ３エチルエーテル（ＢＦ３  ｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）を添加した。
【００８５】
（２）溶媒を除去した後、ビオチンリンカー化合物をＴＥＡ／ＤＭＦ混合液に溶かされた化合物１とカップリングして化合物２を生産した。
【００８６】
それから、ダサチニブ−ビオチン（ｄａｓａｔｉｎｉｂ−  ｂｉｏｔｉｎ）は、次の通り合成した。
【００８７】
（１）ダサチニブはＴＨＦとＤＭＦの混合液に溶かした上、トリエチルアミンを添加した後、冷却させた。
【００８８】
（２）ダサチニブ溶液にメタンスルホニルクロリド（ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）をゆっくり滴加した後、常温で一晩、撹はんした。
【００８９】
（３）反応液にＮａＮ３を入れて摂氏５０℃で一晩、撹はんした。
【００９０】
（４）反応液を減圧濃縮した後、残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製した。
【００９１】
（５）精製された産物をＴＨＦに溶解し、過量のトリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）を添加し、常温で５時間撹はんした。
【００９２】
（６）反応液に水を添加し、摂氏７０℃で一晩撹はんした後、減圧濃縮した。
【００９３】
（７）残渣を窒素大気状態でＤＭＦに溶解させた後、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）を添加した。
【００９４】
（８）化合物２をＤＭＦに溶解して添加した後、常温で３日間撹はんした。
【００９５】
（９）反応液を減圧濃縮した後、ＭｅＯＨ／ＭＣカラムクロマトグラフィーで精製した。
【００９６】
それから、合成された化合物はＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳを利用して確認した。
【００９７】
ＣＳＫ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＮＭ＿００４３８３．１）はＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。停止コドンが除去されたＣＳＫ  ＯＲＦクローンを製作するため、次のような実験を行った。ＣＳＫ  ＯＲＦ増幅に必要なプライマーは次の通りであり、コスモジンテック（株）から購入して用いた：ＣＳＫ−Ｆプライマー，  ５’−ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  Ｔ−３’；  ＣＳＫ−Ｒプライマー，  ５’−ＣＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＴＴＴ  Ｇ−３’．  ＣＳＫ  ｃＤＮＡを鋳型として用い、前記プライマーを利用して次の通りＰＣＲ増幅を行った：９５℃、５分、１サイクル；９５℃、０．５分、５０℃、０．５分、７２℃、２分、１０〜３０サイクル；７２℃、７分１サイクル。  ＰＣＲ増幅に用いられたＤＮＡ重合酵素はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｃｏｓｍｏ  Ｇｅｎｅｔｅｃｈ、ＥＬＰＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈなどから購入して製造社の用法に基づいて使用した。
【００９８】
上記の通りに増幅されたＣＳＫ  ＯＲＦを次のようなプライマーで再増幅した：ａｔｔＢ１−Ｆ２プライマー、５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴ  ＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡ  ＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣ  ＣＡＣＣＡＴＧ−３’；  ａｔｔＢ２−Ｒ２  プライマー、５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴ  ＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡ  ＡＡＧＣＴＧＧＧＴＧ−３’。前記増幅されたＣＳＫ  ＯＲＦのＰＣＲ産物を鋳型とし、ａｔｔＢ１−Ｆ２およびａｔｔＢ２−Ｒ２プライマーを利用して次の通り、ＰＣＲ増幅を行った：９５℃、２分、１サイクル；９５℃、０．５分、４５℃、０．５分、７２℃、２分、５〜１０サイクル；９５℃、０．５分、５０℃、０．５分、７２℃、２分、５〜１０サイクル；７２℃、７分、１サイクル。上記の通りに増幅されたＣＳＫ  ＯＲＦのＰＣＲ産物を電気泳動して分離した後、ｐＤＯＮＲ２０１あるいはｐＤＯＮＲ２２１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に公知の方法（Ｈａｒｔｌｅｙら、  （２０００）  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０，  １７８８−１７９５）でクローニングして停止コドンが除去されたＣＳＫ  ＯＲＦクローンを製作した。完成されたＣＳＫ  ＯＲＦクローンは塩基序列分析により確認した。
【００９９】
停止コドンが除去されたＳＮＦ１ＬＫ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＢＣ０３８５０４）  ＯＲＦ（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）クローンはＯｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。
【０１００】
ＳＮＦ１ＬＫ  ＯＲＦクローンとＣＳＫ  ＯＲＦクローンは再び公知の方法（Ｈａｒｔｌｅｙら、  （２０００）  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０，  １７８８−１７９５）によりｐＣＭＶ−ＤＥＳＴ−ＥＧＦＰベクターを利用してＣＭＶ−ＳＮＦ１ＬＫ−ＥＧＦＰおよびＣＭＶ−ＣＳＫ−ＥＧＦＰ発現ベクターにクローニングした。ｐＣＭＶ−ＤＥＳＴ−ＥＧＦＰベクターはｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、Ｃａｔ．  Ｎｏ．Ｖ８６０−２０）にａｔｔＲ１−ｃｃｄＢ−ａｔｔＲ２序列を挿入し、ａｔｔＲ２序列後にＥＧＦＰ遺伝子を挿入して製作した。
【０１０１】
ＨｅＬａ細胞を９６−ウェルプレートに５，０００〜１０，０００細胞／ウェル濃度に継代培養した後、前記用意された発現ベクターＤＮＡを形質導入した。ＤＮＡ形質導入は公知の方法、その一例として、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）あるいはＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅから購入）を利用して行うことができる。ＤＮＡが形質導入された細胞にダサチニブ−ビオチンがコーティングされた磁性物質を実施例２に記述された方法で取り込み、ＮＤＧＡ（Ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａから購入）を最終２５〜５０μＭになるように処理した。また、実施例２に記述された方法のように磁場を印加した後、顕微鏡観察を行った。
【０１０２】
本実施例においては対物レンズＵｐｌａｎ  Ａｐｏ  ４０Ｘ０．８５が装着されたオリンパス社の蛍光顕微鏡ＦＶ１０００を利用して細胞の蛍光イメージを得た。図１０のＡに示すように、表面が改質された磁性物質にメディエータ（ダサチニブ−ＣＳＫ）を用いて蛍光物質であるＥＧＦＰ蛋白質を標識した場合、磁化方向（磁力線方向）にＥＧＦＰの蛍光パターンが形成されることが確認された。しかし、メディエータのないネガティブコントロール（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）としてビオチン−磁性粒子複合体（ｂｉｏ−ＭＮＰ）を用いた場合、このようなＥＧＦＰの蛍光パターンが確認されなかった。
【０１０３】
また、図１０のＢに示すように、表面が改質された磁性物質にメディエータ（ダサチニブ−ＳＮＦ１ＬＫ）を利用して蛍光物質であるＥＧＦＰ蛋白質を標識した場合、磁化方向（磁力線方向）にＥＧＦＰの蛍光パターンが形成されることが確認された。しかしながら、メディエータのないネガティブコントロールとしてビオチン−磁性粒子複合体（ｂｉｏ−ＭＮＰ）を用いた場合、このようなＥＧＦＰの蛍光パターンが確認されなかった。
【０１０４】
一方、このような蛍光パターンは透過光イメージから観察される磁性物質のパターンと重畳して現れ、これは表面が改質された磁性物質に蛍光物質がメディエータのダサチニブ−ＣＳＫまたはダサチニブ−ＳＮＦ１ＬＫにより正確に標識され、磁化パターンをイメージ化した結果であることが分かる。したがって、本発明によれば、生きた細胞内に取り込まれた磁性物質の磁力線方向へのパターンを標識物質でイメージ化する方法を提供することにより、生きた細胞内の構造および物質の代謝過程をモニターすることに応用することができる。例えば、本実施例においてはリンカー物質であるダサチニブとＣＳＫまたはダサチニブとＳＮＦ１ＬＫとが結合してメディエータを構成する点を利用して蛍光物質を磁性物質に標識し、蛍光パターンを観察したが、結合するか否かが不明なリンカー物質をメディエータで構成した場合、蛍光物質が磁性物質に標識されるか否かを蛍光パターンの形成可否と磁性物質の磁化パターンおよび蛍光パターンの重畳可否で確認することができ、さらにはこれを利用してリンカー物質の細胞内の代謝における反応および役割と信号伝達過程などをモニターすることができるものである。
【０１０５】
以上、本発明を前記実施例を挙げて説明したが、本発明はこれに制限されるものでない。当業者であれば本発明の趣旨および範囲を外れることなく修正、変更することができ、このような修正と変更もまた本発明に属するものであることを知ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図９】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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