(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光トモグラフィのためのシステムで対象（４１４）を追跡する方法であって、前記対象（４１４）は、回転中心（４２２）を有する管（４１０）内に収容され、前記対象（４１４）はセントロイド（４１５）を有し、そして、前記対象（４１４）は前記回転中心からオフセットされ、前記方法は、
前記対象（４１４）が回転させられている間に、拡張被写界深度を通って前記対象（４１４）を走査することによって画像データを取得するステップと、
前記回転中心からの前記対象（４１４）セントロイド（４１５）の距離値を計算するステップであって、前記距離値は、前記取得された画像データから計算されるステップと、
選択された位置（Ｐｎ）にある前記対象（４１４）の回転角度値（βｎ）を計算するステップとを含み、前記回転角度値（βｎ）は、前記取得された画像データから計算されており、前記方法はさらに、
前記対象（４１４）の広さを決定するステップと、
結果として得られる疑似投影画像における画像分解能を高めるように、走査されている前記拡張被写界深度を前記対象（４１４）の前記広さ以下に制限するステップとを含む方法。
【請求項２】
画像データを取得する前記ステップが、焦点面（Ｆｎ）に対物レンズ（４２０）の焦点を合わせることを含み、前記方法が、前記距離値および１組の回転角度値（βｎ）を、前記焦点面が前記対象（４１４）の中心を追跡するように前記対物レンズ（４２０）の平行移動を制御するための制御信号に変換するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象（４１４）の広さを決定する前記ステップが、次の関係式に従って計算され、
【数１】
0005404400.tif 000005
ここで、
ｏｂｊｅｃｔ＿ｅｘｔｅｎｔは、前記対象（４１４）の前記広さを表し、
ｅｘｔｅｎｔθは、選択された回転角θにおいて取られる前記対象（４１４）広さの第１の測定を表し、
ｅｘｔｅｎｔθ＋９０°は、選択された回転角θ＋９０°において取られる前記対象（４１４）広さの第２の測定を表す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対物レンズ（４２０）が、前記対象（４１４）の平行移動するセントロイド（４１５）に従って正弦波的に移動する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記管（４１０）が回転周期を有し、前記距離値および１組の角度値が、対物レンズ（４２０）位置のための正弦波関数を計算するために使用され、前記正弦波関数が、前記回転周期に比例する波長を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記正弦波関数が、疑似投影を形成するために前記対物レンズ（４２０）の走査を制御するために追加の関数によって変調される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
回転させられている前記対象（４１４）の投影画像を創出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
１組の画像を生成するために１組の視角で前記対象（４１４）の少なくとも１つの特徴を走査するステップと、
前記１組の画像から、少なくとも１つの特徴が管軸から最大距離で測定されるところに存在する０度視角を決定するステップと、
前記決定された０度視角に対して前記疑似投影システムを較正するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記管（４１０）が管軸を含み、
１組の画像を生成するために１組の視角で前記対象（４１４）の少なくとも１つの特徴を走査するステップと、
前記１組の画像から、少なくとも１つの特徴が前記管（４１０）の中間の第１の画像内に現れるところで、前記対物レンズ（４２０）に最も近い９０度位置（Ｐ９０）を決定するステップと、
０度位置に戻るために前記管（４１０）を９０度回転させることに対応する第２の画像を選択するステップと、
半径を決定するために前記管軸からの対象距離に対して前記第２の画像を測定するステップと、
前記決定された０度位置に対して前記疑似投影システムを較正するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１組の画像を生成するために１組の視角で前記対象（４１４）の少なくとも１つの特徴を走査するステップと、
前記１組の画像から、前記１組の視角に対応する前記画像に対して管軸からの前記少なくとも１つの特徴の距離を測定するステップと、
前記１組の視角の少なくとも１つに対して半径および角度を求めるために余弦関数フィットを計算するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記管（４１０）内に最初に置かれるとき、画像を取得し、前記対象（４１４）の少なくとも１つの特徴を探すステップと、
前記少なくとも１つの特徴から管軸までの距離を測定するステップと、
前記少なくとも１つの特徴に対して深さを求めるために対物レンズ（４２０）をその光軸に沿って走査するステップと、
前記少なくとも１つの特徴の半径および角度を前記距離および深さ測定から決定するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記管（４１０）が内管壁（４１２）を有し、
初期焦点面（Ｆ０）が、その中心軸を通って前記管（４１０）を横切る平面上に置かれるところの断面において、前記内管壁（４１２）に焦点を合わせることによって焦点を前記初期焦点面（Ｆ０）に設定するステップと、
セントロイド（４１５）を有する興味のある構造が、前記内管壁（４１２）の１つに近接して現れるまで、前記管（４１０）を回転させるステップと、
前記興味のある構造の前記セントロイド（４１５）に印を付けるステップと、
前記回転中心までの前記セントロイド（４１５）の距離（ａ）を測定するステップと、
式Ｆｎ＝Ｆ０＋（ａ  ｓｉｎ（βｎ））に従って、回転角（β）当たりの焦点面の変化（ｈｎ）を計算するステップと、
前記興味のある構造の前記平行移動するセントロイド（４１５）に従って、前記対物レンズを正弦波関数で移動させる対物レンズ・ポジショナー（４２１）に送られる信号にｈｎを変換するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記管（４１０）が回転周期を有し、前記距離値および１組の角度値が、対物レンズ（４２０）位置のための正弦波関数を計算するために使用され、前記正弦波関数が、前記回転周期に比例する波長を有し、前記正弦波関数が、全視野にわたる最良焦点の軸方向シフトを修正するために事前補償値で事前に変形される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記管（４１０）が回転周期を有し、前記距離値および１組の角度値が、対物レンズ（４２０）位置のための正弦波関数を計算するために使用され、前記正弦波関数が、前記回転周期に比例する波長を有し、前記正弦波関数を調節するための事前補償ルックアップ・テーブルが、視野の異なる領域に置かれた孤立微小球を使用して較正される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記管（４１０）が回転周期を有し、前記距離値および１組の角度値が、対物レンズ（４２０）位置のための正弦波関数を計算するために使用され、前記正弦波関数が、前記回転周期に比例する波長を有し、前記正弦波関数を調節するための事前補償が、前記管（４１０）が回転している間に実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記管（４１０）が回転周期を有し、前記距離値および１組の角度値が、対物レンズ（４２０）位置のための正弦波関数を計算するために使用され、前記正弦波関数が、前記回転周期に比例する波長を有し、前記正弦波関数が、前記管（４１０）の回転中のゲルの厚さ変化に対する事前補償である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府後援研究に関する説明
本発明は、（米）国立衛生研究所／（米）国立癌研究所（ＮＩＨ／ＮＣＩ）によって与えられるＳＢＩＲフェーズＩ補助金番号ＨＨＳＮ２６１２００４３３０１０６のもとに政府援助を受けて行われた。合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
本出願は、「ＯＰＴＩＣＡＬ  ＴＯＭＯＧＲＡＰＨＹ  ＯＦ  ＳＭＡＬＬ  ＯＢＪＥＣＴＳ  ＵＳＩＮＧ  ＰＡＲＡＬＬＥＬ  ＲＡＹ  ＩＬＬＵＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＯＳＴ−ＳＰＥＣＩＭＥＮ  ＯＰＴＩＣＡＬ  ＭＡＧＮＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」と題する２００５年８月１５日出願のＭｅｙｅｒ他の同時係属米国出願第１１／２０３８７８号の一部継続出願の優先権を主張し、それは今度は、「ＯＰＴＩＣＡＬ  ＴＯＭＯＧＲＡＰＨＹ  ＯＦ  ＳＭＡＬＬ  ＯＢＪＥＣＴＳ  ＵＳＩＮＧ  ＰＡＲＡＬＬＥＬ  ＲＡＹ  ＩＬＬＵＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＯＳＴ−ＳＰＥＣＩＭＥＮ  ＯＰＴＩＣＡＬ  ＭＡＧＮＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」と題する２００５年９月１３日発行のＪｏｈｎｓｏｎおよびＮｅｌｓｏｎの米国特許第６９４４３２２号の一部継続であり、それは今度は、２００３年２月１８日発行のＡｌａｎ  Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎの米国特許第６５２２７７５号の一部継続であり、それは今度は、２００１年３月２８日出願のＡｌａｎ  Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎの米国仮出願第６０／２７９２４４号に関連し、両方とも「ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＩＭＡＧＩＮＧ  ＳＭＡＬＬ  ＯＢＪＥＣＴＳ  ＩＮ  Ａ  ＦＬＯＷ  ＳＴＲＥＡＭ  ＵＳＩＮＧ  ＯＰＴＩＣＡＬ  ＴＯＭＯＧＲＡＰＨＹ」と題する。Ｍｅｙｅｒ他の米国出願第１１／２０３８７８号は、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第６９４４３２２号および米国特許第６５２２７７５号もまた、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は一般に、光トモグラフィ（ＯＴ）撮像システムに関し、さらに詳細には、例えば生体細胞などの小さな対象が、電磁スペクトルの可視または紫外部分内の光ビームによって照射され、回転させられかつ追跡されて、投影像が生成される、微視的な光トモグラフィに関する。
【背景技術】
【０００４】
この参照により本明細書に組み込まれている、２００４年４月２２日に米国特許出願公開第２００４／００７６３１９号として公開されたＦａｕｖｅｒ他の特許出願は、単一の検出器露出中に試料の厚さを通って前記平面に垂直な軸に沿って光学撮像システムの焦点面を連続的に走査するための方法および装置を開示する。
【０００５】
１つのそのような方法は、単一の検出器露出間隔中に全試料厚さが連続的に走査されるように、対物レンズを移動させ、それによって試料領域の厚さを通って焦点面を走査することによって遂行される。疑似投影画像がそれによって生成され、その分解能は、横方向分解能（即ち、焦点面内での分解能）と同様に、移動する焦点面の焦点深度にも依存する可能性がある。その手順は、光源および検出器アレイの１つまたは複数の対を同時に使用して、１８０度までの円弧にわたるいくつかの視点から繰り返される。試料は、追加の視点を得るために回転させるおよび／または平行移動することができる。このようにして、１組の疑似投影が生成され、それは、三次元画像を生成するために、フィルター補正逆投影などのトモグラフィ画像再構成アルゴリズムに入力することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００７６３１９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｌａｓｓ、Ｍ．編集長、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ」第２版、第ＩＶ巻、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
既知の技術は、回転毛細管の中央に置かれた試料に対しては、試料が回転中に最初の焦点面から出て行かないであろうから、有効に働く。しかしながら、多くの試料は、中心をはずれて置かれ、最初の焦点面から平行移動して出るであろう。そのようなオフセット位置は、焦点誤差を引き起こす可能性があり、試料の撮像取得後の再構成に悪影響を与える可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、光トモグラフィのためのシステムで対象を追跡するための方法を提供し、ここで対象は、回転中心を有する管内に収容され、対象は、セントロイドを有し、対象は、回転中心からオフセットされる。画像データは、対象が回転させられている間に、拡張被写界深度を通って対象を走査することによって取得される。回転中心からの対象セントロイドの距離値は、画像データから計算される。回転角度値は、取得された画像データから計算される。対象の広さは、結果として得られる疑似投影画像における画像分解能を高めるように、走査されている拡張被写界深度を対象の広さ以下に制限して決定される。
【００１０】
本発明は一般に、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ検出器と連動して、レーザーまたは他の照射システムによって生成される平行ビーム投影を使用する三次元光トモグラフィに関し、さらに詳細には、流れの中のまたは剛性媒体で運ばれる生物細胞を含む微視的対象の三次元トモグラフィ撮像に関する。
【００１１】
明細書の一部分に組み込まれ、明細書を形成する添付の図面は、本発明のいくつかの態様を例示し、記述とともに、発明の原理を説明する働きをする。さらに、図面では、同様の参照数字は、いくつかの図にわたって対応する部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施形態によって検討されるような、平行ビーム・フロー光トモグラフィ・システムの例となる説明図を概略的に示す図である。
【図２】本発明の実施形態によって検討されるような、可変運動平行ビーム光トモグラフィ・システムの例となる説明図を概略的に示す図である。
【図３】本発明の例となる一実施形態によって検討されるような、単一の光源−拡大凹状光学系の対を含む、システム照射幾何学配置の例となる説明図を概略的に示す図である。
【図４】本発明の代替実施形態によって検討されるような、単一の光源−拡大凸状光学系の対を含む、システム照射幾何学配置の例となる説明図を概略的に示す図である。
【図４Ａ】本発明の別の代替実施形態によって検討されるような、単一の光源−拡大凸状光学系の対を含む、システム照射幾何学配置の別の例となる説明図を概略的に示す図である。
【図５】本発明の実施形態によって検討されるような、複数の光源−拡大凹状光学系の対を持つ照射幾何学配置および撮像標本体積の例となる説明図を概略的に示す図である。
【図５Ａ】本発明の実施形態によって検討されるような、複数の光源−拡大凸状光学系の対を持つ照射幾何学配置および撮像標本体積の別の例となる説明図を概略的に示す図である。
【図６】本発明の実施形態によって検討されるような、再構成円筒の例となる説明図を示す非常に概略的な図である。
【図７】本発明の実施形態によって検討されるような、ＴＤＩ画像センサの動作を説明する例となる流れ図を概略的に示す図である。
【図８】本発明の実施形態によって検討されるような、平行光線ビーム光源システムの例となる説明図を概略的に示す図である。
【図９】本発明の実施形態によって検討されるような、細胞などの流れる対象を収容する流管を囲む再構成円筒の一例を概略的に示す図である。
【図１０】対象収容管を通るＺ軸に沿って配列された一連の部分的円周を含む再構成円筒の一例を概略的に示す図であって、各部分的円周は、１つよりも多い光源−検出器の対を含んでもよい。
【図１１】本発明の実施形態によって検討されるような、少なくとも１つの検査用試料が、非診断素子を除去するために処理され、固定され、染色される、システムおよび方法の別の例となる実施形態を概略的に示す図である。
【図１２Ａ】平行ビーム照射および非平行ビーム照射を伴う微小毛細管３０４の端面図を概略的に示す図である。
【図１２Ｂ】平行ビーム照射および非平行ビーム照射を伴う微小毛細管３０４の端面図を概略的に示す図である。
【図１３】本発明の例となる一実施形態によって検討されるような、管内の対象の配置を記述する追跡パラメータの例となる説明図を概略的に示す図である。
【図１４】興味のある対象に対する焦点面の誤認をもたらすＲ、Θの間違った認識を特徴づける図での誤差の例となる説明図を概略的に示す図である。
【図１５】本発明の別の代替実施形態によって検討されるような、ＲｒａｔｉｏおよびΘへのＦ＿ＡｌｌＥｒｒｏｒの依存性を表す等高線図を概略的に示す図である。
【図１６】本発明の実施形態によって検討されるような、興味のある対象を分割するための図を概略的に示す図であり、興味のある対象の疑似投影画像ＰＰ０と関連するグレースケール画素に対する質量中心の計算が示される。
【図１７】本発明の実施形態によって検討されるような、疑似投影から疑似投影への質量中心のＸ成分の傾向のグラフ表示を概略的に示す図である。
【図１８】本発明の実施形態によって検討されるような、測定されたおよびモデル化されたＸｍ間の近接した対応を示す図である。
【図１９】本発明の方法の焦点追跡ブロック図の動作を説明する例となる流れ図を概略的に示す図である。
【図２０】回転中の毛細管を概略的に示す図である。
【図２１】光トモグラフィ顕微鏡での撮像中の単一扁平上皮細胞の画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図面で例示されるように、本発明の記述の参照が今から詳細になされるであろう。本発明は、これらの図面に関連して述べられるであろうが、そこで開示される実施形態または複数の実施形態にそれを限定する意図はない。それどころか、その意図は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神および範囲内に含まれるすべての代替、変更、および同等のものをカバーすることである。
【００１４】
本発明は、生体細胞に関連する特定の実施例に関して本明細書でさらに述べられる。しかしながら、これらの実施例は、本発明の原理を例示する目的のためであり、本発明は、そのようには限定されないことが理解されるであろう。一実施例では、微視的体積内の光学濃度の三次元分布を構成することは、興味のある構造、分子または分子プローブの位置の定量化および決定を可能にする。タグ付き分子プローブを使用することによって、微視的対象内の特定の構造に付着するプローブの量が測定されてもよい。例示の目的のために、生体細胞などの対象は、少なくとも１つの染色液またはタグ付き分子プローブを使ってラベルを付けられてもよく、このプローブの測定された量および位置は、肺、胸、前立腺、頸部および卵巣の癌などの様々な癌を含むが、それらには限定されない細胞の病状に関する重要な情報をもたらしてもよい。
【００１５】
一般に本明細書で使用されるように、次の術語は、光学顕微鏡処理の文脈で使用されるとき次の意味を有する。即ち、
「毛細管」は、その一般的に認められた意味を有し、１００ミクロン以下の内径を持つ微小毛細管および同等のものを含むことが意図される。そのような微小毛細管は、アリゾナ州のＰｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＬＣによって製造されている。
「対象」は、個々の細胞または他の実体を意味する。１つまたは複数の対象は、試料を含んでもよい。
「疑似投影」は、光学系の自然な被写界深度よりも大きな広さの標本化体積を表す単一画像を含む。
「試料」は、個々の患者からの単一検査または処置から得られる完全な生成物（例えば、分析のために提出される痰、生検、または鼻腔用綿棒）を意味する。試料は、１つまたは複数の対象でできていてもよい。試料診断の結果は、症例診断の一部となる。
「標本」は、アリコートまたは試料のすべてまたは一部を含む、分析の準備が整っている完成した細胞準備品を意味する。
【００１６】
本発明の一実施例では、撮像されるべき細胞または他の試料または対象を収容してもよい対象体積の通過後までは、選ばれた照射は、平行、またはほとんど平行である。対象の通過後、システムの光軸に垂直で、試料後光学系から下流に置かれる任意の平面内の光強度の拡大パターンを生成するために、試料後光学系は、光強度の出現パターンを発散させる。しかしながら、本発明は、平行ビーム放射に限定されず、実際には、本明細書で述べられる実施形態は、様々な波長での照射の多くの形に有用である。
【００１７】
図１を参照すると、本発明の実施形態によって検討されるような、平行ビーム・フロー光トモグラフィ（ＰＢＯＴ）システムの例となる説明図が概略的に示される。本発明は、点光源または平行ビーム投影、例えば、時間遅延および積分（ＴＤＩ）画像センサまたはＣＣＤもしくはＣＭＯＳ固体画像センサおよび同様のものなどの画像センサ、ならびにトモグラフィ画像再構成を使用して、流れの中のまたは剛性媒体で運ばれる小さな対象を撮像するための装置および方法を提供する。光トモグラフィ（ＯＴ）システムは、例となる一実施形態では、対象収容管２の周りに置かれる、再構成円筒１２を含む、フロー・サイトメータを含む。対象収容管２は、例えば、光トモグラフィ・システムの型に応じて、細胞がゲル内に保持される細胞輸送管、または細胞流動のための毛細管を含んでもよい。
【００１８】
ＰＢＯＴシステム４は、Ｘ、ＹおよびＺ方向に座標を有する座標系４０を参照して向きを合わせられる。動作時には、例えばヒト細胞を含む細胞などの興味のある対象１は、注入管３内へ注入される。対象収容管２は、注入端５においてより広くてもよく、圧力キャップ６を含む。対象収容管２内に層流を創出するために、シース流体７が管８に導入される。第１の光子源９ａおよび第１の光検出器１０ａは、トリガー装置として動作するために波高分析器１１と一緒に働く。波高分析器１１は、それが管を通って移動するとき、細胞などの対象の始まりまたは先端のための第１の信号３０ａおよび対象の終端または後端のための第２の信号３０ｂを提供するように動作する。信号３０ａ、３０ｂ、３１ａおよび３１ｂは、波高分析器１１内で光強度「Ｉ」対「ＴＩＭＥ」関数として表わされる。波高分析器１１は、従来通りに設計された電子回路または同様のものであってもよい。波高分析器１１は、コンピュータ１３に送られる複数の信号１４を生成し、そのコンピュータは、移動する対象の速度および光検出器と再構成円筒１２との間の距離に関連する遅延後に、興味のあるその特定の対象に対するデータ収集を開始し、終了するために、トリガー信号を配線１５で再構成円筒１２に送る。さらに、第３の信号３１ａをトリガーするおよび第４の信号３１ｂをトリガーする対象間の間隔が有利には、対象の速度を計算するために、またＴＤＩ画像センサの線転送速度を同期させるためのタイミング信号としても使用されてもよいように、第２の光子源９ｂおよび第２の光検出器１０ｂは有利には、第１の組から下流側に既知の距離に置かれてもよい。タイミング信号は、複数の信号１４でコンピュータ１３に送られる。任意の有用なパーソナル・コンピュータまたは同等のものでよいコンピュータ１３は順に、同期信号を配線１６で再構成円筒１２に送る。配線１５および１６は、コンピュータとＰＢＯＴシステムとの間でデータ、画像情報、制御信号および他の信号をやりとりする、ＰＢＯＴシステムとコンピュータとの間の通信および制御配線を表すことが理解されるであろう。このようにして、例えば、流動軸２０に沿った対象の移動は、図７を参照して以下でさらに詳細に述べられ、示されるように、ＴＤＩセンサの１つの段から次への電荷の転送速度によって適合されてもよい。
【００１９】
次に図２を参照すると、本発明の例となる一実施形態によって検討されるような、可変運動平行ビーム光トモグラフィ・システムの例となる説明図が概略的に示される。可変運動ＰＢＯＴシステム１００は、管内の剛性媒体で運ばれる細胞を撮像システムに１つずつ提示するために、機械的ポジショナーをうまく利用する。図１を参照して述べられる流動システムと比較すると、可変運動ＰＢＯＴシステム１００では、ヒト細胞などの対象の速度は、再構成円筒１２内の照射源および画像センサと同期させるように正確に制御することができるから、光子源９および光検出器１０を含むただ１つのトリガー機構が必要とされる。ここでのトリガーは、波高分析器１１およびコンピュータ１３によって処理され、データ収集を開始および停止するために使用される。その波高分析器１１は、それがより少ない入力および出力を必要とするということを除いては、波高分析器１１に似た設計の電子回路である。二重矢印線によって示されるように、この実施形態での対象収容管２は、コンピュータ制御モータ１７によって駆動されるねじ伝動１８によって、再構成円筒１２を通ってｚ軸に沿って平行移動させられる。対象収容管２はまた、コンピュータ制御モータ１７によってｚ軸周りに回転させられてもよい。コンピュータ制御モータ１７は、制御情報１９をコンピュータ１３から受け取る。対象収容管２を平行移動させ、回転させることができる任意の機構が、ねじ伝動の代わりに使用できることが、この開示の利益を有する当業者には理解されるであろう。再構成円筒１２からの信号は、興味のある細胞および他の対象に関する二次元または三次元情報を提供するために、直接分析されてもよく、または画像処理、画像分析および／またはコンピュータ・トモグラフィ画像再構成技術を使用して処理されてもよい。
【００２０】
次に図３を参照すると、興味のある対象１を撮像するための平行ビーム光トモグラフィ・システムで使用するための再構成円筒１２Ａ内のシステム照射幾何学配置が概略的に示される。再構成円筒１２Ａは、複数の平行放射ビーム３６で興味のある対象１を照射するための平行光線ビーム放射源３５を含む。外管３２は、光学的に平坦な入射面６０および凹状出射面２９を有し、ここで凹状出射面２９は、興味のある対象１を通過後外管３２から出現する放射６１を発散させる。対象収容管２は、外管３２内に置かれ、ここで興味のある対象１は、対象収容管２内に保持される。
【００２１】
ここで二重矢印３４によって概略的に示されるモータは、興味のある対象１の異なる像面を提示するために対象収容管２を回転させるように結合される。検出器アレイ３９は、凹状出射面２９から出現する放射６１を受け取るように置かれる。一実施形態では、平行光線ビーム放射源３５は、レーザーを含む。別の例となる実施形態では、レーザーは、電磁スペクトルの可視部分で放射を出すように選択されてもよい。さらに別の例となる実施形態では、レーザーは、電磁スペクトルの紫外部分で放射を出すように選択されてもよい。検出器アレイ３９は有利には、固体センサ、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサ、相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）センサならびに時間遅延および積分センサからなる群から選択されるセンサを含んでもよい。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、撮像されるべき細胞または他の対象は、流管、毛細管、線状容器、または輸送管内のいずれかに存在する。平行ビーム光トモグラフィ・システムの一実施形態では、興味のある対象１は、細胞核３０を有するヒト細胞を含む。細胞はまた、細胞内特徴または成分を含んでもよい。少なくとも１つの蛍光または吸収分子プローブ３１が、１つまたは複数の細胞成分に結合されてもよい。
【００２３】
対象収容管２、例えば流管、毛細管、線状容器、または輸送管は、実質的に矩形の外側断面を有し、矩形または円形のどちらかの内側断面を有してもよい外管３２内に実質的に同心状に置かれる。外管３２に対する他の断面形状も可能である。対象収容管２の湾曲した表面は、投影システムでは望ましくない可能性がある合焦効果を生成する円筒レンズとして働く。もし光源と外管３２との間および管３２と検出器表面３９との間の空間３７および３３が、対象収容管２のそれに適合する屈折率を有する材料で充填されるならば、対象収容管２による光子の曲がりは、実質的に低減することができることが、この開示の利益を有する当業者なら理解するであろう。さらに、管は、空間充填材料に光学的に結合することができる。そのような光学的結合は、例えば、油またはゲルを使って遂行されてもよい。例えば油などの、空間３３内の屈折率適合流体は有利には、細胞または他の微視的対象が収容される管２と外管３２との間の空間を完全に充填するために、ポート３８を通って導入されてもよい。屈折率適合流体、管２および３２の両方、ならびに撮像されるべき細胞を囲む任意のゲルまたは流動性液状媒体は、同一の、またはほとんど同一の屈折率を有する。管２内に収容される対象は、コンピュータ制御に基づく軸性および回転運動の両方を使って、屈折率適合流体および外管３２内で回転させられるおよび／または平行移動させられてもよい。
【００２４】
動作時には、レーザーまたは他の光源３５は、空間３７内の屈折率適合結合素子によってオプションとして配送される、外管３２に衝突する平行照射ビーム３６を生成する。散乱のない場合には、光は、管２および３２の両方を通って平行光線経路を横断する。光路内のすべての材料の屈折率は適合されるから、屈折率適合流体および撮像されるべき体積内の対象空間を横断する光線は平行である。管２および３２の両方は、照射波長に関して透明な、またはほとんど透明な材料を含む。管２および３２の両方は、溶融石英、ガラスまたは他の同様の光学材料を含んでもよい。
【００２５】
外側の矩形管３２の出射面２９は有利には、発散または拡大光学系を提供されてもよく、それは、検討された一実施形態では、溶融石英または他の光学材料内の円対称の研磨凹部、またはくぼみであってもよい。くぼみは、平凹レンズとして働き、光線経路６１がその出射面２９において発散性となるようにする。そのようなくぼみまたは任意の他の光学素子または複合体もしくは同じ機能を果たすように設計された他の同等な素子を含む光学素子の組合せは、本明細書で試料後光学系と呼ばれる。試料後光学系は一般に、拡大光学系を含む。
【００２６】
既知の光学設計原理を使用して、試料後光学系の曲率半径は、出射光線経路６１に所望の発散度を与えるように決定され、設計されてもよい。発散度は、試料後光学系とＴＤＩ、ＣＣＤ、ＣＭＯＳまたは他の画像センサ３９との間の距離とともに、投影画像の倍率を決定する。必要とされる倍率は、投影画像の所望の空間分解能と検出器画素寸法との間の関係によって決定され、倍率は、画素寸法と投影の所望の空間分解能との商の２倍よりはるかに大きいことが有利である。
【００２７】
例えば、本発明の検討された一実施形態では、もし投影での所望の空間分解能が０．５ミクロンであり、検出器画素寸法が１０ミクロンであるならば、倍率は、４０倍より著しく大きいことが有利である。この実施例では、倍率は、８０倍、１００倍、またはさらに大きいことが望ましい可能性がある。
【００２８】
試料後光学系が、外管３２の出射面２９上の円対称研磨くぼみであり、この試料後光学系が、平凹発散レンズとして機能する、本発明の検討された実施形態に対しては、レンズの前焦点面は、無限遠にある。後焦点面はない。それゆえに、それが撮像されるべき細胞または他の対象１を通過するときの照射の吸収に関する情報を含む、拡大投影画像、疑似投影画像、またはシャドウグラムは、ＴＤＩ、ＣＣＤもしくはＣＭＯＳ検出器または他のデジタル撮像検出器３９に送られた光強度のこの出現パターンを獲得することによって生成することができる。検出器の光変換面は、システムの光軸に垂直で、試料後光学系から下流側の任意の平面内に置くことができる。さらに、倍率は、検出器平面の配置によって選択することができ、即ち、検出器平面が、対象から下流側に遠いほど、倍率は大きくなる。
【００２９】
単一の光源−検出器の対を有する、図３および図４で概略的に描かれるような本発明の実施形態では、細胞または他の微視的対象の二次元または三次元トモグラフィ撮像は、様々な画角から画像を取得することによって実施される。光軸に関して第１の回転角で静止して保持された対象収納管２で第１の投影を取得した後、対象収納管２は、二重矢印３４によって示されるように軸の周りで離散的な角度で回転させられてもよい。有用な軸は、図２ではＺ軸と識別され、ならびに／または図３および図４ではページの外へ向いており、それは、光軸に関して第２の回転角で細胞または他の対象１の向きを合わせるためにシステムの光軸に垂直である。次の送られる投影画像は、対象収納管２の回転後に取得されてもよい。回転および撮像の処理は、対象収納管２が離散的増分で繰り返し回転させられて、繰り返されてもよい。細胞もしくは他の対象１、またはそれの一部分の三次元画像を生成するために、または撮像された対象内部内の吸収パターンの薄片を描く二次元画像を生成するために十分な数の投影が取得されるまで、二次元投影画像が、各角度において記録される。
【００３０】
三次元再構成は、既知の三次元画像再構成アルゴリズムを使った複数の二次元投影画像の画像処理によって生成される。撮像対象を通る横断薄片の二次元画像は、複数の投影から抽出されるデータの線を処理することによって生成され、ここでこれらのデータの線は、図１および図２で示されるように、ＸおよびＹ軸の回転バージョンに平行に向きを合わせられる。データの線は一般に、検出器データの行と呼ばれる。検出された投影データの行から細胞または他の対象を通る軸横断薄片を再構成できる能力は、検出器データの多くの線が、対象空間を通る各横断画像平面に寄与するであろう円錐状ビーム幾何学配置と比較して、本発明で述べられる方法の利点である。
【００３１】
次に図４を参照すると、本発明によって検討されるような、再構成円筒１２Ｂ内のシステム照射幾何学配置の代替実施形態が概略的に示され、ここで撮像されるべき細胞または他の対象１は、流管または輸送管２内に存在してもよい。再構成円筒１２Ｂは、興味のある対象１を複数の平行放射ビーム３６で照射するための平行光線ビーム放射源３５を含む。外管３２Ａは、光学的に平坦な入射面６０および凸状出射面２８を有し、ここで凸状外面２８は、興味のある対象１を通過後外管３２Ａから出現する放射を焦点に合わせる。図３に関して述べられた上の実施形態でのように、対象収容管２は、外管３２Ａ内に置かれ、ここで興味のある対象１は、対象収容管２内に保持されるまたはそれを通って流れる。二重矢印３４によって概略的に示されるモータは有利には、興味のある対象１の異なる像面を提示するように、対象収容管２を回転させるおよび／または平行移動させるために結合されてもよい。ピンホール開口１２７は、凸レンズの焦点１２８に置かれ、出現放射１２５の円錐状ビームを生成するように配置される。上で述べられたように、検出器アレイ３９は、ピンホール開口１２７からの出現放射１２５の円錐状ビームを受け取るために置かれる。例となる一実施形態では、外管３２Ａは有利には、ポート３８を有してもよく、対象収容管２の周りの空間３３は、外管３２Ａおよび対象収容管２と同じ屈折率を有する光学油などの流体で充填される。
【００３２】
次に図４Ａを参照すると、本発明によって検討されるような、再構成円筒１２Ｄ内のシステム照射幾何学配置の別の代替実施形態が概略的に示され、ここで撮像されるべき細胞または他の対象１は、流管または輸送管２内に存在してもよい。再構成円筒１２Ｄは、光学素子１２６の追加とともに、図４に関して述べられた上の実施形態でのような素子のすべてを含む。光学素子１２６は有利には、ピンホール開口１２７とセンサ・アレイ３９との間に置かれる平凹または他の発散もしくは拡大光学系を含んでもよい。図４でのように、ピンホール開口１２７は、凸レンズ２８の焦点１２８に置かれ、出現放射１２５の円錐状ビームを生成するように配置される。出現放射１２５は、平凹光学素子１２６によって受け取られ、それによってそれはさらに放射ビーム２２５内へ発散される。上で述べられたように、検出器アレイ３９は、ピンホール開口１２７からの出現放射２２５の円錐状ビームを受け取るために置かれる。
【００３３】
図５は、本発明の別の実施形態によって検討されるような、複数の光源−拡大凹状光学系の対を持つ照射幾何学配置および撮像標本体積の例となる説明図を概略的に示す。興味のある対象１を撮像するための平行ビーム光トモグラフィ・システムは一般に、図３を参照して上で述べられた照射幾何学配置および興味のある対象１を照射するための、Ｎが少なくとも２である、複数の平行光線ビーム放射源１〜Ｎ  ３５を含む。複数の平行光線ビーム放射源１〜Ｎ  ３５の各々は、興味のある対象１に関して異なる画角で複数の平行放射ビームを生成する。本明細書で図８に関して以下で述べられるように、複数の平行光線ビーム放射源１〜Ｎ  ３５の各々は、レーザー、または１つもしくは複数の光ファイバーもしくは光ファイバー束を通って光が送られる少なくとも１つのレーザーなどの、個別の光源であってもよい。外管４１は、複数の光学的に平坦な入射面６３および複数の対応する凹状出射面６５を有し、ここで複数の対応する凹状出射面６５は、対象１の拡大投影画像を生成するように、外管４１から出現する放射が興味のある対象１を通過後発散するようにする。別法として、図３に関して上で述べられたように、試料後光学系は、レンズ複合体または他の同等のものを含む、任意の拡大光学素子または素子の組合せを含んでもよい。
【００３４】
本明細書で述べられる他の実施例でのように、対象収容管２は、外管４１内に置かれ、ここで興味のある対象１は、対象収容管２内に保持され、複数の検出器アレイ１〜Ｎ３９は、出現する放射３６Ｅを受け取るために配置される。複数の検出器アレイ１〜Ｎ３９の各々は、複数の凹状出射面６５の１つまたは複数から出現する放射３６Ｅを受け取るために置かれる。
【００３５】
図５Ａは、本発明の実施形態によって検討されるような、複数の光源−拡大凸状光学系の対を持つ照射幾何学配置および撮像標本体積の別の例となる説明図を概略的に示す。外管４１Ａが、複数の光学的に平坦な入射面６６および複数の対応する凸状出射面６７を有し、ここで複数の対応する凸状出射面６７が、興味のある対象１を通過後外管４１Ａから出現する放射６８を焦点に合わせることを除いては、図５Ａは、実質的に図５と同様に構成される。対象収容管２は、外管４１Ａ内に置かれ、ここで興味のある対象１は、対象収容管２内に保持される。複数のピンホール開口１２７は、凸状出射面６７のそれぞれの焦点６９に置かれ、ここで複数のピンホール開口１２７の各々は、出現円錐状ビーム７０を生成するように、複数の対応する凸状出射面６７の１つから放射を受け取る。
【００３６】
複数の検出器アレイ１〜Ｎ３９は、円錐ビーム７０を受け取るために配置される。複数の検出器アレイ１〜Ｎ３９の各々は、本明細書の上で述べられたように構成され、複数のピンホール開口１２７の１つまたは複数からの出現放射を受け取るために置かれる。
【００３７】
図６を参照すると、本発明の実施形態によって検討されるような、再構成円筒１２Ｃの有用な設計が示される。ここでは、点光源２７の輪は、対象収容管２の周囲に配置され、画像センサ２５の輪は、点光源２７を含む平面より上に、平面に、または平面より下に位置する平面内に置かれる。４点光源および４センサだけが、説明図で示されているが、光源および画像センサの輪は有利には、撮像対象のトモグラフィ再構成を可能にするのに十分な、もっと多くの数を含んでもよいことが理解されるであろう。画像センサは、点光源の平面より下または上または平面内とすることができる。点光源２７および画像センサ２５を別個の平面上に置くことによって、円筒の対向する側面上の点光源は、他の照射ビームと物理的に干渉しないであろう。本明細書で図３、４、４Ａ、５および５Ａを参照して上で述べられたように、点光源の各々は有利には、撮像対象を通過後に拡大されてもよい平行光線ビーム１３５を生成してもよい。
【００３８】
再構成円筒を通って移動する過程中に、細胞１は、少なくとも１つの点光子源を通過する。本発明の主眼点は、選択可能な波長の多数の点光子源２７が、対象収容管の周囲におよびそれと同心状に配置されることである。点光子源は、光スペクトルの選択可能な部分に敏感である、対向するＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＴＤＩまたは他の画像センサ２５と連動して動作し、それゆえに細胞１を通って送られる光の投影２１の取得を可能にする。このようにして、投影光線を、光源点を個々の感知素子に接続する直線として記述できるところの、１組の投影光線１３５を生成することができる。特定の投影光線に沿って光源点を出発する光子の数と特定の感知素子で受け取られる光子の数との間の差は、投影光線経路に沿って対象収容管２の細胞および他の内容物との相互作用が原因で失われるまたは減らされる光子の数に関係する。
【００３９】
しかしながら、複雑な状況が、光散乱、光子エネルギー・シフト、不完全な幾何学配置および不十分な平行性から生じる可能性があり、複数光源点が同時に活性化されるとき、異なる光源からの光子が、特定の感知素子に到着する可能性がある。例えば本明細書で述べられるような点光源およびそれらの対向する検出器のパターンに対する幾何学配置の思慮深い選択による、ならびに複数点光源の活性化およびセンサ・アレイの読み出しの適切なタイミングまたは多重化による、再構成円筒の注意深い構成で、これらの問題に起因する光子汚染は、最小化することができる。
【００４０】
光子汚染は、例えば細胞が存在しないシステムの較正により部分的に対処することができる。即ち、各光源は、順に照射されてもよく、センサの各々へのその効果を測定することができ、それによってシステムを標準化する際に使用するためのオフセット・データを提供する。追加の較正ステップは、例えば、その光学特性が既知であるラテックス高分子ビーズまたは他の微小球または扁平回転楕円体を撮像することを伴ってもよく、細胞撮像のために興味のある密度範囲に及んでもよい。
【００４１】
次に図７を参照すると、ＴＤＩ画像センサの動作を説明する流れ図５０の一実施例が概略的に示される。細胞の画像素子に対応する電荷は、画像と同期してＴＤＩセンサの画素素子の列の下方へ転送される。電荷転送は、列から蓄積された電荷がセンサの底部レジスタ２６で詠み出されるまで連続して起こる。
【００４２】
本発明によって検討される光トモグラフィ・システムの一実施形態では、各センサが、ｚ軸に沿った細胞移動２０のそれに平行な線転送５２の方向を有するように、複数のＴＤＩセンサ２５は、向きを合わせられる。ＴＤＩ画像センサの線転送速度は、コンピュータ１３からのタイミングまたはクロック信号によって細胞の速度と同期させられる。
【００４３】
図７の流れ図は、時間軸１３３４に沿った様々な時間における移動する細胞およびＴＤＩセンサ２５に対するその位置を示す。時間＝０には、細胞１はＴＤＩセンサ２５の真上にあり、画像は感知されない。時間＝１には、細胞１は、ＴＤＩセンサ２５によって部分的に撮像される。細胞１のシャドウグラム５１は、一度に一線ずつ撮像される。各画像線に対応する電荷２２は、時間＝０から時間＝５までＴＤＩ画像センサの下方へのその画像線の移動に同期してセンサ画素素子２３の次の線に転送される。このようにして、各画素に対応する電荷は、それが時間＝５に底部レジスタ２６で読み出されるまで、ＴＤＩセンサ２５の各列２４の下方へ蓄積される。
【００４４】
線転送５２の方向が、ｚ軸に沿った細胞移動２０のそれと平行であるように、ＴＤＩセンサは、向きを合わせられる。ＴＤＩ画像センサの線転送速度は、細胞の速度と同期させられる。ＴＤＩ画像センサ内の線または段の数に応じて、追加の光生成電荷が蓄積され、信号が押し上げられる（例えば、Ｄａｌｓａ  ＩＬ−Ｅ２センサなどの９６段ＴＤＩセンサでは９６倍まで）。
【００４５】
光源
次に図８を参照すると、本発明の実施形態によって検討されるような、平行光線ビーム光源の例となる実施形態が、概略的に示される。この実施例では、平行光線ビーム光源は、光ファイバー１１０に結合されるレーザー１０５を含む。光ファイバー１１０は、個々のファイバーまたは光ファイバー束または同等のものを含んでもよい。動作時には、複数の光ファイバー１１０は、レーザー・ビーム１０７を受け取り、流管または毛細管を囲む光源位置へ平行放射ビーム３６を配送する。このようにして、例えば、図５および図５Ａに関して上で述べられたような複数光源システムに必要なレーザーの数は有利には、多数の光ファイバーを通って単一のレーザーから光ビームを送ることによって低減されてもよい。レンズおよび／またはミラーなどの光学素子は、光ファイバー１１０の入射または出射、または両方に組み込まれてもよい。
【００４６】
動作時には、各レーザー・ビーム直径は、２分の１から数ミリメータ程度でよく、単一レーザーが、各レーザー光源から約３０ミクロンから１００ミクロンに及ぶ開口を有する多数の光ファイバーを結合することを可能にする。
【００４７】
各光源は、同じ一般的な特性を有してもよく、好ましくは、
・それは、小さな円形点光源に近似してもよく、
・それは、レーザー、レーザー・ダイオードまたは発光ダイオードでもよく、
・それは、既知のスペクトル成分で光ってもよく、
・光源から放出される光子は、すべての光子線が平行である鉛筆ビームのような既知の幾何学形状のビームを形成してもよい。
各光源は、１つの投影角度に対してデータを創出する。例となるデータ収集幾何学配置では、その軸が対象収容管の中心軸であるらせんに沿って配列された複数の光源は、細胞がモジュールを通って移動するとき複数投影角度からのデータを創出する。センサ幾何学形状に応じて、投影がセンサにおいて重複しないように、いくつかの点光源は、同じ円周の周囲に角度分離を持たせて配置することが可能である可能性がある。光源の所望の数は、各平面再構成（ｘ−ｙ平面）または体積再構成内で必要とされる分解能の関数である。さらに、光源の波長は、様々なダイオードもしくは他のレーザーの使用によってまたは白色もしくは他の広帯域光源、例えば水銀もしくはキセノン・アーク・ランプの帯域通過フィルタリングによってのどちらかで選択可能である。点光源を創出するために用いることができるいくつかのオプションがあり、例えば、
・レーザーまたはレーザー・ダイオード、
・レーザー−ファイバー束の組合せ、
・レーザーまたは他の高強度光子源の前にある開口、
・ピンホールの入口および出口の両側で光子の表面プラズモン集束を利用する開口、
・小さな断面を持つ光ファイバー、
・光子源の前の短焦点距離レンズからの仮想点光源、
・リン光体表面上の点を照射する電子ビーム（ＣＲＴの形態）、および
・上記の様々な組合せである。
【００４８】
光の発散ビームを使用する幾何学配置は、点光源が興味のある対象１（例えば、細胞）に近いほど、光源により近い対象によって範囲を定められる、より広い幾何学的角度に起因して倍率がより高くなるようなものである。簡単な投影システムでの倍率は、近似的にＭ＝（Ａ＋Ｂ）／Ａであり、ここでＡは、点光源と対象（細胞）との間の距離であり、Ｂは、対象と検出器との間の距離である。逆に、もし必要とされる分解能が、システム設計より前に既知であるならば、その時には幾何学配置は、その特定の分解能に対して最適化することができる。背景については、当業者には、Ｂｌａｓｓ、Ｍ．編集長、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｏｐｔｉｃｓ」（第２版、第ＩＶ巻、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１年）を参照されたい。
【００４９】
次に図９を参照すると、本発明の実施形態によって検討されるような、細胞などの流動する対象１を収容する流管２を囲む、再構成円筒１２Ｅの実施例が概略的に示される。再構成円筒１２Ｅは、例えば、所定のらせんピッチで配置される複数の平行光線ビーム源７２を含むらせん７０を含む。図３、４、４Ａ、５および５Ａを参照して上で述べられたように、感知素子３９は、点光源からの光を、それが細胞または興味のある対象１を通過し、試料後光学素子によって拡大された後、受け取るために配置される。
【００５０】
複数の平行光線ビーム源７２の配列はらせん状であるが、本発明によって検討されるような、再構成円筒内で使用される平行光線ビーム源のアレイは、一部分において電子機器の速度、細胞速度およびセンサ（検出器）における非重複投影信号を達成する幾何学配置に応じて、多種多様の幾何学パターンを採用してもよい。
【００５１】
例えば、図１０を参照すると、対象収容管２を通るＺ軸に沿って配列される一連の部分的円周７４を含む再構成円筒１２Ｆが示され、ここで各部分的円周７４は、１つより多い光源−検出器の対を含んでもよい。
【００５２】
固定点光源７２は、管の円周の周囲に取り付けられた対向する検出器３９と連動して、それが光源を過ぎて流れるとき、細胞全体を通る複数投影角度を標本化することができる。光源ならびに減衰され送られたおよび／または散乱されたおよび／または放出された光の放出もしくは読み出し、または両方のタイミングによって、各検出信号は、流動細胞のｚ方向の軸に沿った特定の、既知の位置と一致するであろう。このようにして、同期して放出しまたは検出されるようになされる光源に垂直な既知の軸に沿って既知の速度で流れる細胞は、ｘ−ｙ平面内で２Ｄ薄片を形成するように再構成することができる細胞を通る投影で光学的に区切ることができる。連続した薄片を積み重ねるまたは数学的に組み合わせることによって、細胞の３Ｄ像が出現するであろう。細胞の３Ｄ像を創出するために、例えばらせん方式で再構成することができるデータを生成するために、細胞の移動を流動軸の周りの光源（または複数光源）の位置決めと組み合わせることもまた可能である。三次元再構成は、線形（１Ｄ）投影から再構成される隣接した平面画像を積み重ねることによって、または平面（２Ｄ）投影から直接のどちらかで行うことができる。細胞の３Ｄ像は、細胞内構造の定量的測度ならびに診断情報を提供するタグ付き分子プローブの位置および量をもたらすことができる。
【００５３】
焦点面および対象追跡
興味のある対象を撮像するための光トモグラフィ・システムは、本明細書で述べられるように本発明によってさらに検討される。光トモグラフィ・システムは、興味のある対象を複数の放射ビームで照射するための光源、対象物収容管を含み、ここで対象収容管から出現する放射を生成するために、それが複数の放射ビームによって照射されるように、興味のある対象は、対象収容管内に保持される。検出器アレイは、出現する放射を受け取り、撮像データを生成するために置かれる。興味のある対象を追跡するための手段は、撮像データを受け取り、それに応答するために結合される。
【００５４】
興味のある対象の画像は、投影画像または疑似投影画像を含んでもよい。疑似投影画像は典型的には、光軸に沿って積分された一連の焦点面からの一連の画像を積分することによって生成される。焦点面は好ましくは、背中合わせに配列される。本明細書で述べられるような追跡手段は、疑似投影画像中心を追跡するための手段、投影画像中心を追跡するための手段、または焦点面を追跡するための手段を含んでもよい。
【００５５】
次に図１１を参照すると、本発明のシャドウグラム光トモグラフィ・システムの別の例となる実施形態が示され、ここで例えば、細胞または複数の細胞のような、検査のための少なくとも１つの試料３０１は、非診断素子を除去するために処理され、固定され、染色される。試料３０１は次いで、ゲル媒体３０２内にけん濁される。ゲル混合物内の細胞は次いで、約４０μｍ〜６０μｍ内径のガラス微小毛細管３０４内に挿入される。一実施形態では、本明細書では対物レンズ３０６によって表わされる高倍率顕微鏡の光路内に試料３０１を移動させるために、圧力がゲルに加えられる。代替実施形態では、試料が管に対して相対的に静止したままで、管は、対物レンズに対して相対的に平行移動されてもよい。
【００５６】
いったん試料が適当な位置に置かれると、管３０４は、管回転の所定の範囲にわたって取得される所望の対象の複数の高分解能画像の獲得を許容するために回転させられる。有用な一実施形態では、約２５０画像が、１８０度の管回転範囲にわたって取得される。光軸に沿って積分されるとき、画像は、疑似投影画像を形成する。画像は典型的には、試料の３−Ｄトモグラフィ表現をもたらすためにフィルター補正逆投影を使用して処理される。トモグラフィ再構成に基づいて、癌およびその前駆体の特性を持つ細胞を検出するために、特徴が計算され、使用されてもよい。これらの特徴は、その出力が、検査中の対象が癌細胞である可能性を明示する分類器で使用される。数ある中でも、良質の再構成および分類は、ステップ３で取得される全画像に対する良好な焦点に依存する。本明細書で述べられるように、本発明は、処理中に取得される全疑似投影にわたって良好な焦点を確立するための方法を提供する。
【００５７】
次に図１２Ａおよび図１２Ｂを参照すると、それぞれ平行ビーム照射および非平行ビーム照射での微小毛細管３０４の端面図が示される。どちらの場合にも、それが試料３０１などの興味のある対象から離れた後、光の回折を最小限にするために、画像獲得周期の継続時間にわたって積分される、対象と対物レンズとの間の距離を最小限にするように、管を回転させることが有利である。それゆえに、画像獲得は、興味のある対象、試料３０１が、ゼロ軸３１０内に置かれる位置Ｐ１にあるときに開始されなければならず、ここでゼロ軸３１０は、対物レンズ３０６の光軸を横断して、好ましくはそれに垂直に走る。興味のある対象は次いで、進行の経路３１２を示す点線によって示されるように回転させられ、位置２で終了する。そのようにする際には、システムに対する焦点面は、進行の経路３１２に対応するように変えられなければならないことに留意されたい。
【００５８】
有用な一実施形態では、焦点追跡システムは、本発明の光トモグラフィ・システムおよび方法に組み込まれ、対象中心がゼロ軸３１０と整列されるとき、疑似投影画像の獲得をトリガーするように動作する。焦点追跡システムはまた、それが管の周りで回転するときそれが対象中心を追跡するように、焦点を調節するためにも動作する。本明細書で述べられるような追跡システムは、平行ビーム照射または光学系、扇状ビーム、点光源および当業者には既知の他の同等な光源を含む、任意の適切な形の照射または光学系を使用する光トモグラフィ・システムで用いられてもよいことに留意されたい。
【００５９】
次に図１３を参照すると、管内の対象の配置を記述する追跡パラメータが、概略的に示され、
Ｒ−管中心から対象中心までの半径、
Θ−シータ、画像獲得の開始時に測定されるときの０度軸に対する対象の角度配置または角度誤差値（画像獲得は最も好ましくは、Θが０のときに開始され、それで画像獲得の開始時の任意の他の値は、角度誤差の表示である）、
を含む。
【００６０】
次に図１４を参照すると、興味のある対象に対する焦点面の誤認をもたらすＲ、Θの間違った認識を特徴づける図で、誤差が概略的に例示される。対象は、円形経路上を進むから、Ｒが対象中心に対して正しく認識され、対象中心がゼロ軸と整列されるとき、画像獲得が開始されるべきである。対象がゼロ軸上に位置すると仮定されるが、しかし実際にはゼロ軸からΘだけオフセットしているとき、誤差が生じる。Θがゼロ（０）以外の場合、対象に対する進行の真の経路３１４と進行の仮の経路３１６との間には差がある。そのような場合には、Ｒもまた、関係式Ｒ＝Ｒｔｒｕｅｃｏｓ（Θ）によって示されるように過小評価される。画像獲得が開始される時点においては、対象は焦点が合っているけれども、もし対象が１８０°を通って回転されるとき、Θに対する調節が行われないならば、対象中心と追跡システムによって割り当てられる焦点面との間には増加する誤差が進展する。
対象に対する焦点面Ｆは次のようにモデル化されてもよい。
式１
Ｆ＝Ｆｔｕｂｅ ｃｅｎｔｅｒ−Ｒｔｒｕｅｃｏｓ（Θ）ｓｉｎ（πＰＰ／２４９）
ただしＰＰは画像数であり、ＰＰ＝０、１、２、・・・、２４９。
この経路は、Ｒが真の値（Ｒｔｒｕｅ）であり、Θ＝０のときの対象の真のおよび所望の経路に対応する。この軌道は、式２でのようにモデル化されてもよい。
式２
Ｆｔｒｕｅ＝Ｆｔｕｂｅ ｃｅｎｔｅｒ−Ｒｔｒｕｅｓｉｎ（πＰＰ／２４９）
焦点誤差Ｆｅｒｒｏｒは、式１および２を使用して差（Ｆ−Ｆｔｒｕｅ）のようにモデル化されてもよい。
式３
Ｆｅｒｒｏｒ＝Ｒｔｒｕｅｓｉｎ（πＰＰ／２４９）（１−ｃｏｓ（Θ））
焦点誤差の全体的な重大性を評価するための測定基準は、式３を全ＰＰにわたって積分することによって見出されてもよい。
式４
ＦＡｌｌＥｒｒｏｒ＝（２π×Ｒｔｒｕｅ／２４９）×（１−ｃｏｓ（Θ））
Ｒｔｒｕｅ／Ｒｔｕｂｅ＝Ｒｒａｔｉｏと取ると、この式の第２の半分は、−３０°≦Θ≦３０°および０≦Ｒｒａｔｉｏ≦０．８にわたる等高線図として表わされる。これは、図１５で表わされ、ＦＡｌｌＥｒｒｏｒのＲｒａｔｉｏおよびΘへの依存性に対する感度を与える。この実施例の目的のために、２４９は、２５０疑似投影画像が入手される場合を表すことに留意されたい。もし異なる数の疑似投影画像が入手されるならば、定数２４９は、それに応じて調節されなければならない。
【００６１】
対象の感知できるほどの平行移動が観察される前には、かなり大きなΘ誤差が必要とされるから、目視検査によるＲ、Θの推定は、誤差を起こしやすい企てである。他方では、Θの確実性なしに真の対象中心までの距離を表示することは困難な可能性がある。したがって、
１．Ｒを推定する、および
２．対象中心がゼロ軸３１０を通過するときデータが取得されるように、画像獲得をトリガーするための手段を確立する
ための方法を提供することが、本発明の目的である。
【００６２】
次に図１６を参照すると、興味のある対象を分割する、および興味のある対象の疑似投影画像ＰＰ０に関連するグレースケール画素に対する質量中心を計算するための図が示される。Ｒを推定するために必要とされる最初のことは、対象の質量中心を求めることである。これは、興味のある対象を分割し、興味のある対象に関連するグレースケール画素に対する質量中心を計算することによって遂行される。
１．しきい値：疑似投影ＰＰ０に対するしきい値は、箱領域３２０内の平均光レベルを求めることによって求められる。
２．全非ゼロ画素が接続される対象を分割するために、接続成分アルゴリズムが、しきい値化画像３２２に適用される。この処理は、ラベル付き画像３２４をもたらす。例えば特長３２３のような、異質の非接続特徴は、しきい値および接続成分アルゴリズムによって実質的に除去されたおよび／または暗くされた。
３．興味のある対象に対応する成分は、興味のある対象内の画素３２５を認識することに基づいて選択される。
４．対象の選択３２６は、次いで最初のグレー値画像に適用されるマスクをもたらす。対象中心は、反転グレー値に基づいて質量中心Ｃｍを計算することによって求められる。
【００６３】
例となる一実施形態では、平均光レベルは、上部左角から７５画素を超えて下方へ移動し反対の縁までの最初の７５画素を含む箱領域を使用して、平均光レベルを測定することによって決定される。しきい値は、箱領域内の画素の平均グレー値の約８５％に設定される。もちろん、本発明は、そのようには限定されず、当業者は、同等なしきい値設定方法を使用してもよい。
【００６４】
興味のある対象を選択するステップは、ユーザー入力、例えば、コンピュータ表示画面上でまたはパターン認識アルゴリズムもしくは同等なソフトウエア・アルゴリズムを使って自動的にユーザーが画素を活性化することに基づいてもよい。いったん興味のある対象が、最初の疑似投影の入手中に選択されたなら、毛細管を通る窓３２５が確立されてもよく、ここで対象全体の像は提供するが、興味のない情報を含む画像の部分は提供しないように、窓は、興味のある対象よりも大きく作られる。その後は、連続した画像入手の間、窓を通じて対象を見ることが必要なだけであり、選択ステップは飛ばすことができる。
【００６５】
次に図１７を参照すると、疑似投影から疑似投影への質量中心のＸ成分の傾向のグラフ表示が示される。単一の疑似投影画像に対する質量中心は、本明細書で上述された方法に従うようにして求められる。画像獲得が開始される時間に、対象のＲおよびΘを計算することは、疑似投影から疑似投影への質量中心のＸ成分Ｘｍの傾向を分析することによって行われてもよい。対象の移動の経路は円形であるから、回転を伴う対象中心の平行移動は、その移動が対物レンズの視野から見られるとき、余弦関数によって記述されてもよい。
【００６６】
Ｘｍデータの傾向は、Ｘ’ｍとしてモデル化されてもよい。
式５
Ｘ’ｍ＝Ｒ×ｃｏｓ（πＰＰ（１＋ζ）／２４９＋π＋Θ）＋３４．７＋Ａ＋Ｂ×ＰＰ＋Ｃ×ＰＰ２
式５において、モデルのパラメータは、表１で示されるような意味を有する。
【００６７】
【表１】
0005404400.tif 000002
【００６８】
焦点追跡パラメータ解
表１のパラメータは、次の式に従って、すべての２５０疑似投影に対するＸｍとＸ’ｍとの間のＲＭＳ誤差を最小化することによって解かれてもよい。
【００６９】
式６
誤差＝√Σ（Ｘｍ−Ｘ’ｍ）２／２５０
式６において、ボールドフェースＸｍは、すべてのＰＰにわたるＸｍのアンサンブルを表すために使用される。図１７の場合に対しては、モデルに対して次のパラメータをもたらす探索が行われた。図１８は、測定されたＸｍとモデル化されたＸ’ｍとの間の密接な対応を示す。
【００７０】
【表２】
0005404400.tif 000003
この解に対して、３．３５ｅ−３の全ＲＭＳ誤差が達成された。パラメータＢおよびＣは、結果に実質的な影響を及ぼすことなく式から除外されて（または０に設定されて）もよいことに留意されたい。それゆえに、本発明の方法の有用な実施は、パラメータＢおよびＣの考慮なしに行われてもよい。
【００７１】
焦点追跡の実施
次に図１９を参照すると、本発明の方法の焦点追跡ブロック図が示される。前節の分析は、適切な焦点追跡のためのパラメータが、Ｘｍに対する測定値を式５のモデルと適合させることによって小さな誤差で推定されてもよいことを示す。本発明によって検討されるような光トモグラフィ・システムでは、所望の対象が視界に入ってくるとき、再構成のための画像獲得が開始されてもよいように、Ｒを求め、対象中心がゼロ軸を通過するときを推定することが必要である。対象が獲得のために認識された直後に、１組のｋ画像ｐｐ１〜ｐｐｋが収集され、ここでｋは、３−Ｄ画像を再構成するために有用な画像の任意の数であってもよい。１組のｋ画像は、Ｒに対する初期推定とともに収集される。１組のｋ画像は、Ｒの真値を推定し、再構成のために使用されるべき疑似投影画像を収集するためのトリガー点を確立するために使用されるだろうから、対象が任意の特定の方法で置かれるときは、１組のｋ画像を収集する必要はない。Ｘ成分に対する質量中心値Ｘｍ１、Ｘｍ２、Ｘｍ３・・・Ｘｍｋは、疑似投影ｐｐ１〜ｐｐｋ内の対象に対して求められ、各画像に対する収集時間ｔ１、ｔ２、ｔ３、・・・、ｔｋもまたステップ３３２で記録される。時間ｔｋにおけるＲおよびΘの値は、ステップ３３４で計算される。このデータおよびＰＰ収集に対するクロック３３６に基づいて、Θの実時間値が、ステップ３３８で推定される。この値は、ステップ３４０で値０に近いことを検査される。Θが次のクロック周期で０であると予想されるとき、疑似投影の２５０組の獲得に対するトリガーは、ステップ３５０で有効にされる。
【００７２】
微小毛細管を回転させるコントローラの適切な働きは、基準に対して値ζを比較することによって調べられてもよい。基準を超えるζでは、点検要求を開始し、データが放棄されるようにする。
【００７３】
パラメータＡは、微小毛細管の中心出しに対する平均誤差を与える。この値は、それに対する仕様と比較されてもよい。仕様を超えるＡの値では、データ収集を停止し、管が再度中心出しされる必要があることをユーザーに警告する。
【００７４】
次に図２０を参照すると、回転中の毛細管の概略図が、本発明のさらに別の実施形態を説明する目的のために示される。毛細管４１０は、直径ｄおよび毛細管の中心である回転中心４２２とともに内壁４１２を有する。
【００７５】
対象４１４を含む試料は、毛細管４１０を実質的に充填する適切なゲル４１６または同等な物質によって、毛細管内壁４１２に対して適当な位置に保持される。対物レンズ４２０は、対象４１４を見るように置かれる。そのように限定はされないが、対象４１４は、例えば細胞を含む生物試料、またはさらに詳細には吸収性染料で染色された細胞核などの細胞内の興味のある構造を含んでもよい。
【００７６】
対象４１４は、複数の位置Ｐ０、Ｐｎ、Ｐ９０、およびＰ１８０に示され、ここで複数の位置の各々は、毛細管４１０の回転中の異なる時間での位置を例示する。例えば、位置Ｐ０は、対象４１４の質量中心が毛細管を二等分する焦点面と一致する位置を表す。焦点面Ｆ０は有利には、対物レンズ４２０の光軸に垂直な平面内に置かれてもよい。対照的に、位置Ｐ９０は、対物レンズ４２０の光軸に沿ったまたは焦点面Ｆ０に対して９０°の角度の平面内にある。Ｆ０とＦｎとの間の距離ｈは、９０°で最大であり、ここでそれは値ａに等しい。位置Ｐｎは、焦点面Ｆ０に対して角度βｎの位置に対応する。毛細管の内壁だけが示されている。試料の経路は、回転中心４２２までのその距離に依存する。
【００７７】
焦点面追跡を調節するための本発明の処理の有用な例となる一実施形態では、焦点は、最初にＦ０に設定され、それは、それらが最も遠くに離れる断面における内管壁に焦点を合わせることによって達成される。Ｆ０を決定するためのオプションの方法は、内管壁における光学的コントラスト反転ゼロ交差点を求めることである。最適焦点は、レンズを通じてのオペレータ注視によって、またはさらに好ましくは焦点がコンピュータ制御によって調節されながら画像内の最も急峻な縁を探すマシン・ビジョン・アルゴリズムによって達成されてもよい。管は次いで、試料が中心４２２までの最大距離にあり、最も広い間隔での管壁と同じ焦点面Ｆ０内にあるまで回転４２７させられる。興味のある構造のセントロイドは、カーソルでまたは標準的なマシン・ビジョン・アルゴリズムを使用して探され、印を付けられる。セントロイドの回転中心までの距離は、利用できるマシン・ビジョン・ツールを使用して測定される。有用なマシン・ビジョン・ツールは、例えば、テキサス州オースティンのＮａｔｉｏｎａｌ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓからのＬａｂｖｉｅｗ（商標）ソフトウエアなどの言語から構成されてもよい。測定された距離値は、式Ｆｎ＝Ｆ０＋（ａ  ｓｉｎ（βｎ））を使用して、対応する回転角（βｎ）における焦点面の変化（ｈｎ）を計算するために使用される。ｈｎは次いで、圧電対物レンズ・ポジショナー４２１に送られる信号に変換され、それは、試料の平行移動するセントロイドに従って正弦波関数で対物レンズを動かす。
【００７８】
例えば、もしａが１０μｍであると測定されるならば、試料は、１°の回転中に焦点面から外へ０．１７４μｍ移動するであろう。９０°では、Ｆｎは、Ｆ０から１０μｍ離れ、１８０°ではＦ０およびＦｎは等しいであろう。
【００７９】
次に図２１ａ、ｂおよびｃを参照すると、光投影トモグラフィ顕微鏡での撮像中の単一扁平上皮細胞の画像が示される。細胞は、毛細管壁ｔｗ内で細胞質ｃｙｔによって囲まれた細胞核ｎｕｃを含む。図２１ａは、その細胞核が管の中心までの最大距離にある位置まで細胞が回転させられる開始位置での細胞を示す。図２１ｂは、９０°回転後の細胞を示す。細胞核は、今は管の中心に見える。図２１ｃは、細胞核の位置が１８０°回転周期の終わりにあるところの細胞を示す。管壁ｔｗは、図２１ａから図２１ｃにおいて細胞の上方および下方の水平線として示される。破線は、毛細管の中心を象徴する（ｔｗ＝管壁、ｃｙｔ＝細胞質、ｎｕｃ＝細胞核）。
【００８０】
焦点面追跡を検査する方法は、対象４１４を開始位置Ｐ０内に持ち込むことである。セントロイド４１５は印を付けられ、試料が次いで、焦点を変えることなくそれが２つの管壁間の中間に正確に置かれるまで回転させられる。一実施形態では、データ取得は、毛細管の回転が始まる前に開始される。管を回転させると、対象は、周期の中間において焦点が合うはずである。もし疑似投影が取得されるならば、対象は、２５０疑似投影の中で数１２５において焦点が合うはずである。
【００８１】
回転中の対象の移動方向および対象の速度などの変数はまた、対象の半径および角度を決定するのに役立つこともできる。典型的には、カメラへの単一露出中に対物レンズを走査することによって得られる、例えば疑似投影のような拡張被写界深度画像は、対象位置の予備的知識が必要とされないので、画像を創出するために使用される。画像の最大被写界深度は、管の内径である。
【００８２】
過剰走査はしばしば、拡張被写界深度画像での分解能およびコントラストの損失をもたらすから、それが著しい過剰走査なしに対象を網羅するように、被写界深度拡張を最適化することが有利である。最適化被写界深度拡張は、対象の広さを測定することによって決定されてもよい。対象の広さは次いで、拡張被写界深度疑似投影画像を創出するために走査の範囲を最小化するために使用されてもよい。対象追跡のための較正中に取得される画像データを使用して（またはもし望むならば追加の画像データを取得することができる）、対象の広さが決定されてもよい。少なくとも２つの角度に対する管軸に垂直な方向に沿った対象の広さを決定することによって、最小走査範囲を求めることができる。選択される２つの視角は、９０度離れていなければならない。
【００８３】
例えば、０度位置における対象の広さを求めることによって、最小走査範囲は、対象を９０度位置まで回転させることによって求められる。同様に、対象が９０度位置にあるときの対象の広さを測定することによって、０および１８０度における最小走査範囲が決定されてもよい。対象の最大広さを決定するために９０度の最小回転を通じて多くの画像を取得することを除いて、対象の広さ（ｏｂｊｅｃｔ  ｅｘｔｅｎｔ）の２つの拡張被写界深度測定は、第１の回転角θおよび第２の回転角θ＋９０°で行われてもよく、対象の広さに対する最悪値は、次の関係式に従って計算されてもよい、
【００８４】
【数１】
0005404400.tif 000004
対物レンズ走査範囲を低減することは、較正精度または３Ｄ再構成に使用される疑似投影でのコントラスト保存のどちらかのために画像品質を高めるのに必要とされる可能性がある。この場合には、走査範囲は部分に細分化され、複数拡張被写界深度画像が取得される。
【００８５】
本発明の方法の別の実施形態では、制御信号は、対象の平行移動するセントロイドに従って正弦波的に対物レンズを動かす。管が回転周期を有する場合には、距離値および１組の角度値は、対物レンズ位置に対する比例正弦波関数を計算するために使用されてもよい。正弦波関数は、回転周期に比例する波長を有するであろう。
【００８６】
本発明の方法のさらに別の実施形態では、回転させられている対象の投影画像を創出するステップは、トモグラフィ再構成中に再構成の円内の投影画像を中心に置くことを含む。正弦波関数は、疑似投影を形成するために対物レンズの走査をさらに制御するために、例えば正弦波関数の導関数などの追加の関数によって変調されてもよい。導関数などの二次的な関数を使用することは、回転中の対象、細胞、構造または他の興味のある事項の結果として得られる画像でのより高い空間周波数および画像コントラストをもっと正確に保存する働きをする。
【００８７】
本発明の方法の他の変形形態は一般に、焦点面の移動が、対物レンズの移動と同等ではない可能性があることを認識している。さらに詳細には、光投影トモグラフィ撮像にとって重要であることは、対象を通る焦点面の移動である。撮像誤差は、一次の球面収差に起因する可能性があるから、例示の一変形形態では、上で述べられたような基本的な正弦波関数焦点面調節は、全視野にわたる最良焦点の軸方向シフトを修正するために事前補償値で事前に変形される。
【００８８】
さらに別の実施例では、焦点面を調節するための事前補償ルックアップ・テーブルは、視野の異なる領域に置かれた孤立微小球を使用して実施される。さらに別の実施例では、特定の毛細管サンドイッチを使用する事前補償較正は、各標本を走査する前に実施される。さらに別の実施例では、焦点面を調節するための事前補償は、管の偏心に対処するためにサンドイッチ内の静止管を使用するよりもむしろ管が回転している間に実施される。さらに別の実施例では、焦点面は、細胞が回転させられるときのゲルの厚さ変化に対する事前補償である。
【００８９】
本発明は、特許法に適合するために、ならびに本発明の新規な原理を応用するために必要な情報を当業者に提供するために、ならびにそのような例示のおよび専門化した部品を必要とされるように構成し、使用するために、かなり詳細に本明細書で述べられてきた。しかしながら、本発明は、明確に異なる装置、ならびにデバイスおよび再構成アルゴリズムによって行われてもよく、装置詳細および動作手順の両方に関して様々な変更が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく遂行されてもよいことが理解されるべきである。
【図１】
0005404400.tif 000006
【図２】
0005404400.tif 000007
【図３】
0005404400.tif 000008
【図４】
0005404400.tif 000009
【図４Ａ】
0005404400.tif 000010
【図５】
0005404400.tif 000011
【図５Ａ】
0005404400.tif 000012
【図６】
0005404400.tif 000013
【図７】
0005404400.tif 000014
【図８】
0005404400.tif 000015
【図９】
0005404400.tif 000016
【図１０】
0005404400.tif 000017
【図１１】
0005404400.tif 000018
【図１２Ａ】
0005404400.tif 000019
【図１２Ｂ】
0005404400.tif 000020
【図１３】
0005404400.tif 000021
【図１４】
0005404400.tif 000022
【図１５】
0005404400.tif 000023
【図１６】
0005404400.tif 000024
【図１７】
0005404400.tif 000025
【図１８】
0005404400.tif 000026
【図１９】
0005404400.tif 000027
【図２０】
0005404400.tif 000028
【図２１】
0005404400.tif 000029