(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において免疫寛容を誘導するためまたは抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患を処置するための薬剤、メディカルフードまたはニュートラシューティカルを調製するための、抗原と組み合わせたＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）の使用であって、該抗原が、アレルゲン、アロ抗原、セルフ抗原または自己抗原であり、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である、使用。
【請求項２】
抗原が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギーまたはセリアック病の誘導に関与する、請求項１記載の使用。
【請求項３】
直腸デリバリー、頬デリバリー、肺デリバリー、眼デリバリー、鼻デリバリー、膣デリバリーおよび経口デリバリーからなる群より選択される粘膜デリバリーのための、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、口中錠、ボーラス、錠剤、サシェ、液剤、懸濁剤、乳剤またはトローチ剤によりデリバリーされる、請求項１から３のいずれか記載の使用。
【請求項５】
ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である、請求項１から４のいずれか記載の使用。
【請求項６】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物をさらに含む、請求項１から５のいずれか記載の使用。
【請求項７】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、コレラ毒素Ｂサブユニットをさらに含む、請求項１から６のいずれか記載の使用。
【請求項８】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、少なくとも１０フェムトグラム/日から１００mg/日の用量でデリバリーされる、請求項１から７のいずれか記載の使用。
【請求項９】
ＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）を抗原と組み合わせて含む、抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患であって、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である疾患に関与する疾患もしくは障害を処置、予防および／もしくは緩和するための組成物であって、該抗原が、アレルゲン、アロ抗原、セルフ抗原または自己抗原である、組成物。
【請求項１０】
ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物をさらに含む、請求項９または１０記載の組成物。
【請求項１２】
コレラ毒素Ｂサブユニットをさらに含む、請求項１０または１１記載の組成物。
【請求項１３】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、少なくとも１０フェムトグラムから１００mgの用量で存在する、請求項１０から１２のいずれか記載の組成物。
【請求項１４】
抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患であって、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である疾患に関与する疾患もしくは障害を処置、予防および／もしくは緩和するための、または免疫寛容を誘導するための、少なくとも抗原をＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）と組み合わせて含む薬剤。
【請求項１５】
哺乳動物において抗原に対する望まれない免疫反応により起こる疾患であって、該疾患が、自己免疫疾患、アレルギー反応、移植片対宿主病または薬物療法の免疫活性化である疾患に関与する疾患もしくは障害を処置、予防および／もしくは緩和するための、または免疫寛容を誘導するための薬剤、メディカルフードまたはニュートラシューティカルを調製するための、組成物の使用であって、該組成物が、少なくともＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）および抗原を含むことを特徴とする使用であって、該抗原が、アレルゲン、アロ抗原、セルフ抗原または自己抗原である、使用。
【請求項１６】
抗原が、アレルギー性喘息、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギーまたはセリアック病の誘導に関与する、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
直腸デリバリー、頬デリバリー、肺デリバリー、眼デリバリー、鼻デリバリー、膣デリバリーおよび経口デリバリーからなる群より選択される粘膜デリバリーのための、請求項１５又は１６記載の使用。
【請求項１８】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、口中錠、ボーラス、錠剤、サシェ、液剤、懸濁剤、乳剤またはトローチ剤によりデリバリーされる、請求項１５から１７のいずれか記載の使用。
【請求項１９】
ラクトコッカスが、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である、請求項１５から１８のいずれか記載の使用。
【請求項２０】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物をさらに含む、請求項１５から１９のいずれか記載の使用。
【請求項２１】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、コレラ毒素Ｂサブユニットをさらに含む、請求項１５から１９のいずれか記載の使用。
【請求項２２】
抗原および／またはＩＬ−１０分泌ラクトコッカス（Lactococcus）が、少なくとも１０フェムトグラム/日から１００mg/日の用量でデリバリーされる、請求項１５から２１のいずれか記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘膜による、好ましくは免疫モデュレーション化合物産生微生物と組み合わせた抗原の経口デリバリーによる、抗原に対する寛容の誘導に関するものである。さらに具体的には、本発明は、免疫抑制サイトカイン分泌微生物と組み合わせた前記抗原の経口デリバリーによる、抗原に対する望まれない免疫反応を抑制することができるＦｏｘｐ３+ならびに／またはＩＬ−１０および／もしくはＴＧＦ−β産生抗原特異的調節性Ｔ細胞の誘導に関するものである。
【０００２】
発明の分野
免疫系は、自己と非自己とを識別する課題を有する。呼吸器、消化器および尿生殖器に沿って存在する粘膜免疫系は、食物、空気中の抗原または共生細菌フロラなどの多数の細菌および無害な抗原と共に共存する追加の負担を負う。粘膜免疫系の主要な特徴は、それがこれらの抗原に対して寛容であり続けるが、効果的に病原体を忌避する能力を保持できることである。注射によろうと損傷によろうと、抗原の導入は、全身的に炎症細胞の局所浸潤および特異的免疫グロブリン産生に至る。対照的に、消化管および尿生殖器などの粘膜表面に導入された抗原は、それらの抗原に対する免疫反応の能動的な阻害を全身的に誘発する。消化管を介した抗原の投与によるこれらの調節された反応の特異的誘導は、経口寛容として公知である。抗原の経口投与は、全身不反応性に至ることがあり、（ステロイドのように）望まれない副作用を有する免疫抑制性医学発明物の魅力的な代替物である。本発明は、特に、低用量の抗原への繰り返し曝露により得られる低用量寛容の分野にある。粘膜を介する寛容の誘導は、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患および炎症性疾患に対する処置戦略として提案されてきた。
【背景技術】
【０００３】
技術の現状
経口寛容は１９１１年に最初に記載されたが、研究者が、関係するメカニズムに取り組み始めたのは１９７０年代後半になってからであった（Mayer and Shao, 2004a）。経口寛容の発生には、抗特異的Ｔ細胞の除去、過大な免疫偏向、およびアネルギーの誘導からＴｒｅｇによる抑制までいくつかのメカニズムが提案されてきた（Mucida et al., 2005）。大部分の研究者は、経口寛容を得る二つの別個の方法があることに意見が一致しており、それらは、抗原の単回高用量後に得られる、アネルギーおよび／または除去に基づく高用量寛容（Friedman and Weiner, 1994）ならびに低用量の抗原への繰り返し曝露によって得られる、Ｆｏｘｐ３+、ＩＬ−１０および／またはＴＧＦ−β産生調節性Ｔ細胞を含めたＣＤ４+Ｔ細胞による免疫反応の能動的な抑制によって仲介される低用量寛容である。重要なことに、粘膜寛容により誘導される調節性Ｔ細胞は、あるタンパク質に特異的な調節性細胞が別のタンパク質に対する近くのエフェクター細胞の反応を抑制する過程であるバイスタンダー抑制を仲介することが示された。器官特異的自己免疫を誘導する抗原のプールが主として未知であることから、バイスタンダー抑制は抗原誘導性抑制の重要な特徴であり、これはエピトープスプレッディングの現象を無効にする。エピトープスプレッディングは、初期の免疫反応が時間と共に拡大し、他の抗原に対する反応を含むようになる、自己免疫性疾患およびアレルギー性疾患の合併症である。
【０００４】
経口寛容の誘導に果たす樹状細胞の役割は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＦｌｔ３Ｌが駆動するＤＣのエクスパンション（Viney et al. 1998）およびＲＡＮＫ−Ｌ介在性ＤＣ活性化（Williamson et al., 2002）の後に高まった経口寛容が示される研究により示唆された。特に未熟樹状細胞は、おそらく調節性Ｔ細胞の誘導により寛容を仲介することができる。さらにＩＬ−１０は、調節性Ｔ細胞の誘導に関与する寛容化樹状細胞の局在を拡充しながら未熟樹状細胞の機能をモデュレーションし、未熟樹状細胞の終末分化を阻害することができる（De Smedt et al. 1997）。
【０００５】
粘膜寛容の誘導は、アレルギー性疾患および自己免疫性疾患の多数の実験モデルで評価されてきたが、ヒトでの試験からの臨床データは、一般に期待外れであった。経口寛容を実現するために、免疫モデュレーション化合物と組み合わせて、または組み合わせずに抗原をデリバリーするいくつかの試みがなされたが、大部分の場合でその効果は有意ではない。どの事象でも、結果はヒトに移すための方法として十分ではない。全てのこれらの実験における主要な問題は、ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導およびその後の抗原特異的調節性Ｔ細胞の産生を介した能動的な抑制が観察されていないことである。これが観察されている場合に限り、ヒトにおいて抗原に対する免疫反応の真の能動的な抑制を得ることができる。
【０００６】
治療的適用および予防的適用のための、ターゲティングされた、さらに効率的な分子のデリバリーは、製薬業界にとって優先事項である。有効な戦略は、所望の作用部位に分子を集中させることにより必要な用量を減少させ、安全性を上げ、かつ有効性を高めるはずである。粘膜経路の薬物デリバリーおよびワクチンデリバリーは、注射に比べて多くの物流の利点および生物学的利点を与える。経口デリバリーは、投与の容易さを受けて特に魅力的である。しかし、消化管分解および低レベルの吸収は、一般にこの経路のペプチド性およびタンパク質性薬物のデリバリーを無効にする。鼻、直腸、肺および眼経路などの代替的な粘膜経路もまた研究されている。タンパク質性およびペプチド性ワクチン抗原の粘膜デリバリーは、一般に免疫反応をあまり刺激せず、免疫寛容を誘導することができる。
【０００７】
ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０（Slavin et al., 2001）および抗ＩＬ−１２の粘膜デリバリーは、全て寛容を高めると仮定されてきた。インターロイキン１０（ＩＬ−１０）は、低用量寛容の発生に重大な役割を果たす（Slavin et al., 2001 ; Mauer et al., 2003）。低用量経口ミエリン塩基性タンパク質および同時の経口ＩＬ−１０を用いたマウスの処置は、実験的自己免疫性脳脊髄炎の重症度および発生を低下させるが、治療効果は低く、ヒトに決して十分に有効ではないことが示された。これらの実験において、ＩＬ−１０の補給量は高い（１μgから１０μg）が、数値は高用量の投与の方が有効であることを示唆している。増殖、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γ分泌に及ぼす０．１μgのＩＬ−１０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抑制効果が観察されたが、疾患に対して０．１μgのＩＬ−１０およびＭＢＰ処置の併用効果は見られなかった。低用量経口ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）と組み合わせたＩＬ−１０の経口投与を用いて同じマウス実験が行われたが、その実験は、ＭＯＧ誘導性マウスモデルにおいて再発減少を招いた。ここでもまた治療効果は低く、ＩＬ−１０補給量は高く、高用量の使用の方が有効な数値を示している。両実験において、長期持続免疫寛容による免疫反応の能動的な抑制はないか、またはその抑制はヒトに有効であるには少なくとも不十分である。特になぜかというと、ヒトに移すのに十分な実際の治療効果を断定するためには、最終的に調節性Ｔ細胞の産生を招く抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導が観察されなければならないからである。そのようなメカニズムだけが、ヒトにおける免疫反応を能動的に抑制することができるであろう。前述の例の全てにおいて、ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導は観察されなかった。
【０００８】
ミクロフロラが経口寛容の誘導に役割を果たすことは、一般に合意されている（Moreau and Corthier, 1988; Gaboriau-Routhiau et al., 2003）。Di Giacintoら(2005)は、プロバイオティクスがＩＬ−１０およびＩＬ−１０依存性ＴＧＦ−β保持調節性細胞を誘導しうることを示唆している。しかし、この効果がどのように発揮されるかは全く明らかではなく、腸管での微生物の単なる存在では不十分である（Rask et al., 2005）。さらに、プロバイオティクスはアレルギーおよび喘息の症状を改善することがあるが、その結果は必ずしも明確ではなく、プロバイオティクス単独の使用は、信頼できる経口寛容反応を誘導するには十分ではない。アレルギー性免疫反応を予防するために乳酸菌により低用量抗原をデリバリーするいくつかの試みがなされ（Daniel et al., 2006）、それは低下したアレルゲン特異的ＩｇＥ反応および高まったアレルゲン特異的分泌性ＩｇＡ反応に至った。Ｔヘルパー２型反応からより大きいＴヘルパー１型反応へ免疫の均衡を望ましく移動させることがマウスで実現されているが、遊離アレルゲンのデリバリーに関して顕著な改善はない。一般に、アレルゲンのそのような単独デリバリーのアプローチは、ヒトに同一の結果を実現するには不十分であろう。これは、そのような戦略が非常に長期の間欠性の処置を必要とするものであるが、調節性Ｔ細胞の誘導は実現されないか、または真の能動的な長期持続性の免疫寛容の効果を実現する調節性区画を設置するには少なくとも不十分であるという事実による。別の例では、ミエリン抗原を発現しているリコンビナント乳酸菌の経口投与は、マウスモデルにおいて低下した実験的自己免疫性脳脊髄炎を招いた（Maassen et al., 2003）。しかし、治療効果は低く、ヒトに移すには不十分とみなされる。特になぜかというと、ヒトに移すのに十分な実際の治療効果を断定するためには、最終的に調節性Ｔ細胞の産生を招く抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導が観察されなければならないからである。そのようなメカニズムだけが、ヒトにおける免疫反応を能動的に抑制することができるであろう。前述の例の全てにおいて、ＣＤ４+Ｔ細胞の誘導は観察されなかった。
【０００９】
したがって、当技術分野において抗原の寛容を効果的に誘導する問題が残る。
【００１０】
発明の概要
驚くことに本発明者らは、免疫モデュレーション化合物産生微生物の粘膜デリバリーと組み合わせた抗原の粘膜デリバリーが、好ましくは当該抗原が微生物により発現され、好ましくは当該粘膜デリバリーが経口的に行われるならば、安定な粘膜寛容反応を誘導することができることを見い出した。本発明者らは、抗原発現微生物単独の粘膜デリバリーに比べて、そのような組み合わせの粘膜デリバリーの方が抗原特異的免疫反応の有意に良好な抑制を与えることを観察した。なおさらに驚くことに、抗原の経口デリバリーとの組み合わせであろうとなかろうと、遊離の免疫モデュレーション化合物の経口デリバリーに比べて、本発明により得られる免疫抑制の方が有意に有効である。
【００１１】
本発明者らは、抗原もしくはＩＬ−１０産生Ｌ．ｌａｃｔｉｓ単独を用いた単独療法よりも、または経口投与された遊離ＩＬ−１０と組み合わせた抗原よりもずっと高い効率で、本発明が経口寛容を誘導することができることを実証する。抗原特異的調節性Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化は強く高まった。これらの細胞は、免疫適格レシピエントに優性寛容を伝達し、バイスタンダー抑制さえも仲介する。本発明の有効性は、自己免疫性疾患およびアレルギー性疾患マウスモデルにおいて、ならびに治療薬の免疫不活性化に関連して実証された。
【００１２】
本発明の詳細な説明
この開示全体にわたり、様々な公報、特許および公開された特許明細書は、確認引用文献により参照される。これらの公報、特許および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術の現状をさらに完全に説明するために、これによって本開示への参照により組み入れられる。
【００１３】
Ａ．一般的な技法
本発明の実施は、特に示さない限り、当該技術の熟練の範囲内である有機化学、薬理学、分子生物学（リコンビナント技法を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技法を採用する。そのような技法は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Second Edition(Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)のシリーズ; "Handbook of Experimental Immunology" (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987および定期刊行物); "Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., eds., 1994); および "Current Protocols in Immunology" (J. E. Coligan et al., eds., 1991）などの文献に十分に説明されている。
【００１４】
Ｂ．定義
本明細書に使用するある用語は以下の特定の意味を有することがある。明細書および特許請求の範囲に使用する単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、状況が明らかに別のものを指示しない限り複数の参照を含む。例えば、「細胞」という用語は、その混合物を含めた複数の細胞を含む。同様に、本明細書に記載される処置または薬剤の調製のための「化合物」の使用は、状況が明らかに別のものを指示しない限り、そのような処置または調製のために本発明の一つまたは複数の化合物を使用することを考えている。
【００１５】
本明細書に使用する用語「含んでいる」は、その組成物および方法が、引用された要素を含むが、その他を排除しているわけではないことを意味することを意図する。組成物および方法を定義するために使用されるときの「本質的になる」は、その組み合わせから任意の本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離精製法からの微量混入物、およびリン酸緩衝生理食塩水、保存料などの薬学的に許容され得る担体を除外しない。
【００１６】
「からなる」は、他の成分の微量を超える要素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法のステップを除外することを意味するものとする。
【００１７】
これらの転換する用語のそれぞれにより定義される態様は、本発明の範囲内に属する。
【００１８】
本発明の第一の局面は、抗原に対する免疫寛容を誘導するための方法であり、その方法は、免疫モデュレーション化合物産生微生物の粘膜デリバリーと組み合わせた前記抗原の粘膜デリバリーを含む。
【００１９】
好ましくは本発明は、免疫寛容を誘導する粘膜デリバリー用の薬剤を調製するための、抗原と組み合わせた免疫モデュレーション化合物産生微生物の使用に関するものである。
【００２０】
好ましくは、前記免疫寛容は動物に誘導される。前記動物は哺乳動物であり、好ましくは、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヒトからなる群より選択される。好ましくは、前記哺乳動物はヒトである。
【００２１】
好ましくは、前記免疫寛容は粘膜寛容である。
【００２２】
本明細書に使用する「粘膜」は、口腔粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、膣粘膜、眼粘膜、頬粘膜、肺粘膜および鼻粘膜などの任意の粘膜でありうる。本出願にわたり使用される「粘膜デリバリー」は、粘膜へのデリバリーを包含する。経口粘膜デリバリーには、頬、舌下および歯肉経路のデリバリーが含まれる。したがって、本発明は、前記粘膜デリバリーが、直腸デリバリー、頬デリバリー、肺デリバリー、眼デリバリー、鼻デリバリー、膣デリバリーおよび経口デリバリーからなる群より選択される方法に関するものである。好ましくは、前記粘膜デリバリーは経口デリバリーであり、前記寛容は経口寛容である。
【００２３】
本出願にわたり本明細書に使用する「粘膜寛容」は、（ヒトを含む）動物が粘膜経路で抗原に曝露された後の、前記動物における前記抗原に対する特異的免疫反応性の阻害である。好ましくは、前記粘膜寛容は全身寛容である。抗原のその後の曝露は、非経口注射、粘膜デリバリー、または自己抗原の場合などの内因生産性による曝露などの、当業者に公知のそれぞれの曝露でありうる。「経口寛容」は、（ヒトを含む）動物が経口経路で抗原に曝露された後の、前記動物における前記抗原に対する特異的免疫反応性の阻害である。「低用量経口寛容」は、低用量の抗原により誘導される経口寛容であり、ナイーブなホストに寛容を伝達することができるシクロホスファミド感受性調節性Ｔ細胞により仲介される能動的な免疫抑制を特徴とする。「高用量経口寛容」は、高用量の抗原により誘導される経口寛容であり、シクロホスファミド処置に非感受性であり、抗原特異的Ｔ細胞のアネルギーおよび／または除去によりＴ細胞反応性低下の誘導に取りかかる。シクロホスファミドに対する感受性の差は、低用量および高用量寛容を識別するために使用することができる（Strobel et al., 1983）。好ましくは前記経口寛容は、Mayer及びShao（2004b）により記載された低用量経口寛容である。
【００２４】
したがって本発明は、本明細書に記載される方法または使用に関するものであり、ここで、免疫寛容の前記誘導は、前記誘導の前の少なくとも１．５倍、好ましくは２倍、またはさらに好ましくは３倍以上である。または前記抗原は、前記誘導の前の少なくとも１．５、２、または３倍以上寛容化されている。免疫寛容の誘導は、当技術分野で公知の方法により測定することができる。好ましくは、免疫寛容の前記誘導は、前記動物におけるサイトカインレベルのモデュレーションにより測定することができる。それとしてそのモデュレーションは、サイトカインレベルの増加のことがあり、例えばサイトカインレベルの前記増加は、前記誘導前の少なくとも１．５、２、または３倍以上である。または前記モデュレーションは、特定のサイトカインレベルのレベルの減少であり、例えばサイトカインレベルの前記減少は、前記誘導前の少なくとも１．５分の１、２分の１、または３分の１以下である。サイトカインは、任意の関連するサイトカインから選択することができ、好ましくは前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＭＣＰ−１、ＴＧＦβ、ＲＡＮＫ−ＬおよびＦｌｔ３Ｌからなる群より選択される。
【００２５】
抗原は、当業者に公知の任意の抗原でありうる。本出願を通して本明細書に使用する「抗原」は、好ましくは動物の身体に導入された場合に免疫反応を誘発する任意の物質であり、ここで、前記免疫反応は、Ｔ細胞仲介性および／またはＢ細胞仲介性反応のことがある。Ｔ細胞仲介性反応は、Ｔｈ１および／またはＴｈ２反応を包含する。抗原は、アレルゲン（食物アレルゲンを含む）、アロ抗原、セルフ抗原、自己抗原、および免疫反応を誘導する治療用分子または抗原を非限定的に含めた任意の抗原でありうる。好ましくは、前記抗原は免疫反応関連疾患の誘導に関与する。なおさらに好ましくは、前記抗原はアレルギー性喘息、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギー、セリアック病または移植片対宿主病の誘導に関与する。
【００２６】
本明細書に使用する免疫反応関連疾患は、抗原に対する身体の望まれない免疫反応により起こる疾患であり、ここで前記抗原は、異種抗原または自己抗原のいずれかでありうる。免疫反応関連疾患には、食物アレルギーを含めたアレルギー反応、セリアック病、アレルギー性喘息、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病および多発性硬化症が含まれるが、それに限定されるわけではない。免疫反応関連疾患には、移植片対宿主病または非内因性第ＶＩＩＩ因子に対する抗体産生などの薬物療法の免疫活性化などの望まれない免疫反応もまた含まれる。好ましくは、その疾患は、アレルギー性喘息、食物アレルギー、セリアック病、Ｉ型糖尿病および治療薬の免疫不活性化からなる群より選択される。したがって、免疫反応関連疾患には、食物アレルギーを含めたアレルギー反応、セリアック病、アレルギー性喘息、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病および多発性硬化症が含まれるが、それに限定されるわけではないと認識されよう。免疫反応関連疾患には、移植片対宿主病または非内因性第ＶＩＩＩ因子に対する抗体産生などの薬物療法の免疫活性化などの望まれない免疫反応もまた含まれる。好ましくはその疾患は、アレルギー性喘息、食物アレルギー、セリアック病、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病および治療薬の免疫不活性化からなる群より選択される。
【００２７】
さらなる態様では、前記抗原は、抗原発現微生物によりデリバリーされる。好ましくは前記抗原は、抗原分泌微生物または抗原表出微生物によりデリバリーされる。したがって本発明は、前記抗原が前記抗原発現微生物の表面で表出されているか、または前記抗原が発現される、本明細書に記載される方法に関するものである。免疫モデュレーション化合物および抗原は、同じ微生物によりデリバリーされることができるし、その微生物は異なる微生物であってもよい。
【００２８】
したがって上記を考慮して、本発明は本明細書に記載される方法または使用に関することが認識されているものであり、ここで、前記方法または使用は、治療的および／または予防的である。
【００２９】
「化合物」は、単純または複合の有機分子および無機分子、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、タンパク質複合体、抗体、糖質、核酸またはその誘導体を含めた任意の化学的または生物学的な化合物または複合体を意味する。免疫モデュレーション化合物は、免疫系の機能を改変する化合物である。本明細書に使用する免疫モデュレーション化合物は、寛容誘導化合物であり、寛容の誘導は、非限定的な例としてＴｒｅｇ、Ｔｒ１もしくはＴｒ３などの調節性Ｔ細胞を誘導することによる、またはＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１に傾けることによる直接的な方法で、あるいは未熟樹状細胞から寛容化樹状細胞への活性化および／または成熟樹状細胞上の「共刺激」因子の発現を誘導しているＴｈ２免疫反応を阻害することによる間接的な方法で得ることができる。免疫モデュレーション化合物および免疫抑制化合物は、当業者に公知であり、それらには、スペルグアリンなどの細菌代謝物、タクロリムスまたはシクロスポリンなどの真菌およびストレプトミセス代謝物、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮα、ＴＧＦβ（調節性Ｔ細胞に関する選択的アジュバントとして）、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰおよびＲａｎｋ−Ｌ（選択的寛容原性ＤＣ誘導因子として）、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ３などの抗体および／またはアンタゴニスト、ならびにＣＴＬ−４  ＩｇまたはＣＴＬＡ−４アゴニスト融合タンパク質などのタンパク質、ペプチドまたは融合タンパク質が含まれうるが、それに限定されるわけではない。
【００３０】
したがって免疫モデュレーション化合物は、当業者に公知の任意の免疫モデュレーション化合物でありうる。好ましくは、前記免疫モデュレーション化合物は免疫抑制化合物であり、なおさらに好ましくは、前記化合物は免疫抑制サイトカインまたは抗体である。好ましくは、前記免疫抑制サイトカインは、寛容増強サイトカインまたは抗体である。免疫抑制サイトカインは当業者に公知であり、それらには、調節性Ｔ細胞に対する選択的アジュバントとしてのＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−αおよびＴＧＦβ；ならびに選択的寛容原性ＤＣ誘導因子としてのＦｌｔ３Ｌ、ＴＳＬＰおよびＲａｎｋ−Ｌが含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、前記免疫抑制サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮαおよびＦｌｔ３Ｌからなる群より選択される。本発明が、その機能的ホモログにもまた関することは、当業者に認識されていよう。機能的ホモログは、少なくとも意図される目的について本質的に同一または類似の機能を有するが構造的に異なりうる分子を意味する。最も好ましくは、前記免疫抑制寛容増強サイトカインは、ＩＬ−１０またはその機能的ホモログである。好ましくは、前記免疫抑制抗体は、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ１２、抗ＩＬ６および抗ＩＦＮ−γからなる群より選択される。
【００３１】
本明細書に使用する「デリバリー」は、当業者に公知のデリバリーの任意の方法を意味し、それには、所望により粘膜デリバリーおよび／または粘膜取り込みを高めることができる化合物の存在下での、デリバリーする化合物のコーティングされた、またはコーティングされていない薬学的製剤、デリバリーする化合物を含むか、もしくは保有するカプセル、リポソーム、油体もしくはポリマー粒子、またはデリバリーする化合物を分泌、表出もしくは蓄積している微生物が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００３２】
本明細書に記載される化合物または組成物は、純粋な形態で、他の活性成分と組み合わせて、または薬学的に許容され得る無毒性賦形剤もしくは担体と組み合わせて投与することができる。経口組成物は、一般に不活性な希釈担体または食用担体を含むものである。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または類似の性質の化合物のいずれかを含むことがある：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはトウモロコシデンプンなどの分散剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（glidant）；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ香味料などの香味料。ユニット投薬形態がカプセルの場合、カプセルは、上記の種類の物質に加えて、脂肪油などの液体担体を含むことがある。加えて、ユニット投薬形態は、投薬ユニットの物理的形態を改変する様々な他の物質、例えば砂糖、セラックまたは腸溶剤などのコーティングを含むことがある。さらにシロップは、活性化合物に加えて、甘味料としてショ糖およびある種の保存料、色素、着色料および香味料を含むことがある。薬学的に許容され得る担体の形態および性質は、その担体が組み合わされる活性成分の量、投与経路、および他の周知の変数により指示されることが認識されているものである。担体は、その製剤の他の成分と適合する意味で「許容され」なければならず、そのレシピエントに有害であってはならない。
【００３３】
投与のための代替調製物には、滅菌した水性または非水性の液剤、懸濁剤および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、ジメチルスルホキシド、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、アルコールおよび水の混液、緩衝媒質および生理食塩水が含まれる。静注用ビヒクルには、液体栄養補液、リンゲルデキストロースに基づく補液のような電解質補液などが含まれる。保存料、および例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの他の添加物もまた存在しうる。これらのデリバリー法のために、生理食塩水、アルコール、ＤＭＳＯおよび水性溶液を含めた様々な液体製剤が可能である。
【００３４】
好ましくは、前記免疫抑制サイトカインは、低量で、好ましくはマウスの実験設定で投与される細菌用量あたり０．１μg以下で発現され、ヒトの疾患設定においてその量を変換することができる。本発明が、抗原もしくはL.lactis単独などのＩＬ−１０産生微生物を用いた単独療法よりも、または経口投与した遊離ＩＬ−１０と組み合わせた抗原よりもずっと高い効率を有して経口寛容を誘導することができることを実証する。抗原特異的調節性Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ活性化は強く高まった。これらの細胞は、免疫適格レシピエントに優性寛容を伝達し、バイスタンダー抑制さえも仲介する。本発明の有効性は、自己免疫性疾患およびアレルギー性疾患のマウスモデルにおいて、ならびに治療薬の免疫不活性化に関連して実証された。
【００３５】
本明細書に使用する「処置」および「処置する」などの用語には、発生した精神病もしくは状態が一度樹立したならばその改善もしくは除去、または当該疾患または状態の特徴的な症状の緩和が含まれる。本明細書に使用するこれらの用語は、患者の状態に応じて、疾患または状態に伴う苦痛の前にそれに関連する疾患もしくは状態または症状の重症度を低減することを含めて、前記疾患もしくは状態またはそれに関連する症状の開始を予防することもまた包含する。苦痛の前のそのような予防または低減は、投与時にその疾患もしくは状態に苦しんでいない患者に本発明の化合物または組成物を投与することを表す。「予防」は、例えば回復期後に疾患もしくは状態、またはそれに関連する症状の再発を予防すること、すなわち再燃予防もまた包含する。精神状態が身体愁訴を担いうることも明らかなはずである。この点で、「処置する」という用語には、身体疾患もしくは状態の予防、または発生した身体疾患もしくは状態が一度樹立したならばその身体疾患または状態の改善もしくは除去、またはその当該状態の特徴的な症状の緩和もまた含まれる。
【００３６】
本明細書に使用する「薬剤」という用語は、「薬物」、「治療薬」、「一服」または治療もしくは予防効果を有する調製物を示すために医学の分野で使用される他の用語もまた包含する。
【００３７】
本発明の化合物、すなわち抗原および免疫モデュレーション化合物は、治療有効量でデリバリーまたは発現されることもまた認識されているものである。本明細書に使用する「治療有効量」という用語は、所望の処置方式により投与した場合に所望の治療的または予防的な効果または反応を誘発するものである、本発明の化合物または組成物の量を表すことを意味する。好ましくは、その化合物または組成物は、ユニット投薬形態、例えば錠剤、カプセル剤または定量エアロゾル用量で提供されることにより、１回用量が対象、例えば患者に投与される。
【００３８】
本出願にわたり本明細書に使用する「組み合わせて」は、ある瞬間に粘膜レベルで抗原および免疫モデュレーション化合物が同時に存在することを意味する。これは、抗原および免疫モデュレーション化合物の両方が常に粘膜レベルで同時に存在する必要があることを意味しない。したがってこの方法は、抗原および免疫モデュレーション化合物産生微生物の同時投与と、抗原および免疫モデュレーション化合物産生微生物の連続投与との両方、またはその任意の組み合わせに及ぶ。
【００３９】
さらなる態様では、前記抗原は、前記免疫モデュレーション化合物分泌微生物と同時に、またはそれと連続的にデリバリーされる。
【００４０】
好ましい態様は、抗原および免疫モデュレーション化合物産生微生物の同時投与である。この場合、抗原および免疫モデュレーション化合物産生微生物は、同一の薬学的製剤に、または一緒に摂取される一つを超える薬学的製剤に含まれていることがある。好ましい態様は、抗原および免疫モデュレーション化合物の両方を産生する微生物によるデリバリーである。
【００４１】
抗原および免疫モデュレーション化合物発現微生物、または両要素を含む組成物が同時に投与される場合、その化合物または活性成分は、単一の薬学的組成物または製剤に存在してもよい。
【００４２】
またはその化合物または活性成分は、同時または別々に使用するための別々の薬学的組成物または製剤の形で投与される。したがって本発明は、抗原および本発明の免疫モデュレーション分子発現微生物を含む薬学的組成物、ならびにこれらの薬学的組成物の使用にも関するものである。
【００４３】
連続投与の場合、抗原または免疫モデュレーション化合物産生微生物のいずれかを最初に投与することができる。連続投与の場合、抗原および免疫モデュレーション化合物産生微生物の投与間の時間は、好ましくは３時間を超えず、なおさらに好ましくは２時間を超えず、最も好ましくは１時間を超えない。
【００４４】
活性成分は、所望の活性を示すのに十分な、１日に１〜６回投与されることがある。これらの１日量は、１日１回の単回投与として与えることもできるし、全体で特定の１日量となる２回以上の小用量として、１日の同じ時間または異なる時間に与えることもできる。好ましくは、活性成分は１日に１回または２回投与される。両方の活性薬剤は同時に、または非常に接近した時間で投与されることが考えられている。または、一つの化合物は朝に摂取し、もう一つはその後に日中に摂取することもできよう。または別のシナリオでは、一つの化合物は１日２回摂取し、もう一つは１日２回投薬を行ううちの１回と同時または別々のいずれかで１日１回摂取することができよう。好ましくは、両方の化合物は同時に一緒に摂取され、混合物として投与される。一態様では、第２の化合物は、前記第１の化合物と同時に、別々に、または連続的に投与される。
【００４５】
本発明の全ての局面において、１日維持用量は、患者に臨床的に望まれる期間、例えば１日間から最長数年間（例えばその哺乳動物の全残存寿命）；例えば約（２もしくは３もしくは５日間、１もしくは２週間、または１年間）より長く、かつ／または例えば最長約（５年間、１年間、６ヶ月、１ヶ月、１週間、または３もしくは５日間）与えることができる。約３から約５日間または約１週間から約１年間の１日維持用量の投与が典型的である。液体製剤の他の構成要素には、保存料、無機塩、酸、塩基、緩衝液、栄養素、ビタミンまたはその他の医薬品が含まれることがある。
【００４６】
免疫モデュレーション化合物および／または抗原を分泌している微生物は、１日に少なくとも１０4コロニー形成単位（cfu）から１０12cfu、好ましくは１日に１０6cfuから１０12cfu、最も好ましくは１日に１０9cfuから１０12cfuの用量でデリバリーすることができる。Steidlerら（Science 2000）に記載された方法に従って、例えば約１０9cfuの免疫モデュレーション化合物は、少なくとも１ngから１００ngまで分泌される。当業者に公知のELISAにより、例えば１０9cfuの抗原が少なくとも１ngから１００ngまで分泌される。当業者は、任意の他の用量のcfuに関して免疫モデュレーション化合物および／または抗原の分泌範囲を計算することができる。
【００４７】
抗原は低用量反応を誘導する用量でデリバリーすることができる。好ましくは、前記抗原は、少なくとも１日１０fgから１００μg、好ましくは１日１pgから１００μg、最も好ましくは１日１ngから１００μgの用量でデリバリーすることができる。
【００４８】
本発明の免疫モデュレーション化合物は、少なくとも１日１０fgから１００μg、好ましくは１日１pgから１００μg、最も好ましくは１日１ngから１００μgの用量でデリバリーすることができる。
【００４９】
好ましくは化合物または組成物は、ユニット投薬形態、例えば錠剤、液剤、カプセル剤または定量エアロゾル用量で提供されることにより、１回用量が対象、例えば患者に投与される。
【００５０】
投与様式、例えば経口または上記の投与様式のうち任意のものに応じて、当業者は、患者に投与される実際の用量を規定または計算する方法を知っている。当業者は、患者、微生物、ベクターなどに応じて用量を調整することに精通しているものである。
【００５１】
本発明の化合物は、薬理学的に許容され得る塩、水和物、溶媒和物または代謝物の形態を採ることもある。薬理学的に許容され得る塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、リンゴ酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、コハク酸、マレイン酸、サリチル酸、安息香酸、フェニル酢酸およびマンデル酸などを非限定的に含めた無機酸および有機酸の塩基性塩が含まれる。本発明の化合物がカルボキシ基などの酸性官能基を含む場合、カルボキシ基についての適切な薬学的に許容され得る陽イオンの対は、当業者に周知であり、それらには、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび第四アンモニウム陽イオンなどが含まれる。
【００５２】
微生物は、粘膜デリバリーに適した、細菌、酵母または真菌を含めた任意の微生物でありうる。好ましくは、前記微生物は非病原微生物であり、なおさらに好ましくは、前記微生物はプロバイオティック微生物である。プロバイオティック生物は、当業者に公知である。プロバイオティック生物には、Lactobacillus sp.、Lactococcus sp.、Bifidobacterium sp.などの細菌およびSaccharomyces cerevisiae亜種boulardiiなどの酵母が含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、前記細菌は乳酸菌である。なおさらに好ましくは、前記乳酸菌は、Lactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Lactococcus、Streptococcus、Aerococcus、Carnobacterium、Enterococcus、Oenococcus、Teragenococcus、VagococcusおよびWeisellaからなる群より選択される。さらに好ましい一態様では、前記微生物はLactococcus lactisである。別の好ましい態様では、前記微生物はSaccharomyces cerevisiaeである。
【００５３】
好ましい態様では、免疫抑制サイトカインは、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−１２および／または抗ＩＦＮγなどの免疫誘導サイトカインに対する拮抗抗体ならびに抗ＣＤ４０Ｌおよび抗ＣＤ３などの共刺激分子に対する拮抗抗体と組み合わされる。または、コレラ毒素Ｂサブユニットなどの、免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物、ならびにＩＣＯＳアゴニストおよびＣＴＬＡ−４アゴニストなどの調節性Ｔ細胞の機能を刺激する分子をデリバリーしてもよい。上記のように好ましくは、前記微生物は非病原微生物であり、なおさらに好ましくはそれはプロバイオティック微生物である。プロバイオティック生物は当業者に公知であり、それにはLactobacillus sp.、Lactococcus sp.、Bifidobacterium sp.などの細菌、およびSaccharomyces cerevisiae亜種boulardiiなどの酵母が含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましい一態様では、前記微生物はLactococcus lactisである。別の好ましい態様では、前記微生物はSaccharomyces cerevisiaeである。乳酸菌による、経口および膣デリバリーの両方を含めた粘膜への異種タンパク質（すなわち非乳酸菌タンパク質）のデリバリーが記載されており（Steidler and Rottiers, 2006; Liu et al., 2006）、それによりこれらの乳酸菌は抗原および免疫抑制化合物の両方のデリバリーに極めて適したものになっていることから、最も好ましくは、前記プロバイオティック微生物は乳酸菌である。
【００５４】
本発明の別の局面は、免疫反応関連疾患を処置するための薬剤の調製に、抗原と組み合わせた免疫モデュレーション化合物産生微生物を使用することである。好ましくは、前記免疫モデュレーション化合物は免疫抑制サイトカインである。好ましくは、前記抗原は抗原分泌微生物によりデリバリーされる。免疫モデュレーション化合物および抗原は、同一の微生物によってデリバリーしてもよいし、それは異なる微生物であってもよい。好ましくは、前記免疫抑制サイトカインは免疫抑制寛容増強サイトカインである。免疫抑制寛容増強サイトカインは当業者に公知であり、それらにはＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮαおよびＴＧＦβ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＲａｎｋ−Ｌが含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましくは、前記免疫抑制サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮαおよびＦｌｔ３Ｌからなる群より選択される。最も好ましくは、前記免疫抑制サイトカインは、ＩＬ−１０またはその機能的ホモログである。好ましい一態様では、免疫抑制サイトカインは、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ−１２および／または抗ＩＦＮγなどの免疫誘導サイトカインに対する拮抗抗体、ならびに抗ＣＤ４０Ｌおよび抗ＣＤ３などの、共刺激分子に対する拮抗抗体と組み合わされる。好ましくは前記免疫抑制サイトカインは、低量、好ましくはマウスの実験設定で０．１μg以下で発現され、ヒトの疾患設定においてその量を変換することができる。
【００５５】
本発明の化合物および組成物は、ニュートラシューティカル（nutraceutical）、機能性食品もしくはメディカルフードとして、または前記ニュートラシューティカル、機能性食品、もしくはメディカルフード中の添加物として使用されうることが認識されよう。別の態様は、好ましくはヒトの消費に適合する、ニュートラシューティカルおよび香味料を含む食品または飲料を提供し、ここで、そのニュートラシューティカルは、農産物からの抽出物を含む。
【００５６】
液体抽出物の形態であろうと乾燥組成物の形態であろうと、ニュートラシューティカルは食用であり、ヒトに直接食べられてもよいが、好ましくは添加物または栄養補助食品の形態で、例えば健康食品店で販売されている類の錠剤の形態で、または食用固形物中の成分、より好ましくはシリアル、パン、豆腐、クッキー、アイスクリーム、ケーキ、ポテトチップ、プレッツェル、チーズなどの加工食品として、および飲用液体、例えば牛乳、ソーダ、スポーツ飲料および果汁などの飲料に入れてヒトに提供される。したがって一態様では、有効な量のニュートラシューティカルと食品または飲料を混合して、食品または飲料の栄養価を高めることによる、食品または飲料の栄養価を高めるための方法が提供される。
【００５７】
別の態様は、ニュートラシューティカルと食品または飲料を混合して栄養的に高まった食品または飲料を生産することを含む、食品または飲料の栄養価を高めるための方法を提供し、ここで、そのニュートラシューティカルは、その食品または飲料の栄養価を高めるために有効な量で混合され、ここで、そのニュートラシューティカルは、本発明の抗原を含む農作物からの抽出物を含み、ここで、栄養的に高まった食品または飲料は、さらに香味料を含むことがある。好ましい香味料には、砂糖、コーンシロップ、果糖、デキストロース、マルトデキストロース、シクラメート、サッカリン、フェニルアラニン、キシリトール、ソルビトール、マルチトールおよびハーブ甘味料、例えばステビアなどの甘味料が含まれる。
【００５８】
本明細書に記載されるニュートラシューティカルは、ヒトの消費を意図され、したがってそれらを得るための工程は、好ましくは優良製造規範（ＧＭＰ）および当該工程に適用される任意の適用可能な政府規制にしたがって行われる。特に好ましい工程は、天然由来溶媒のみを利用する。本明細書に記載されるニュートラシューティカルは、好ましくは比較的高レベルの健康増進物質を含む。ニュートラシューティカルを、相互に混合してその健康増進効果を増大することができる。
【００５９】
ニュートラシューティカルとは対照的に、いわゆる「メディカルフード」は、一般の人々に使用されることを予定しておらず、店舗やスーパーマーケットでは入手できない。メディカルフードは、低脂肪食品または低ナトリウム食品などの、疾患のリスクを減少させるための健康食の中に含まれる食品ではなく、体重減少製品でもない。疾患状態または健康状態を管理するために患者が特殊な栄養要求を有し、その患者が医師の継続的な治療を受けている場合に、その医師はメディカルフードを処方する。ラベルは、その製品が特定の医学的障害または状態を管理するために使用されることを意図することをはっきりと提示しなければならない。メディカルフードの例は、慢性炎症状態を有する患者のためにターゲティングされた栄養支援を提供するように計画された栄養的に多様なメディカルフードである。この製品の活性化合物は、例えば本明細書に記載される化合物の一つまたは複数である。機能性食品は、低脂肪食品もしくは低ナトリウム食品、または体重減少製品などの、疾患のリスクを減らす健康食の中に含まれる食品を包含することがある。したがって本発明は、本発明によるニュートラシューティカルを含む食品または飲料を考えている。
【００６０】
したがって本発明は、免疫寛容を誘導するための、または免疫反応関連疾患を処置するための薬剤、メディカルフードまたはニュートラシューティカルの調製のために、抗原と組み合わせた免疫モデュレーション化合物分泌微生物の使用に関する。好ましくは本発明は、免疫反応関連疾患が関与する疾患または障害を処置、予防および／または緩和するための薬剤、メディカルフードまたはニュートラシューティカルの調製および／または製造のための組成物の使用に関するものであり、その使用は、前記組成物が少なくとも免疫モデュレーション化合物分泌微生物および抗原を含むことを特徴とする。
【００６１】
さらなる局面では、本発明は、免疫反応関連疾患を含む疾患または障害を処置、予防および／または緩和するための、少なくとも免疫モデュレーション化合物分泌微生物および抗原の使用に関するものである。したがって本発明は、それを必要とする動物における免疫反応関連疾患を処置するための方法にもまた関するものであり、その方法は、免疫モデュレーション化合物分泌微生物の粘膜デリバリーと組み合わせた抗原の粘膜デリバリーを含む。
【００６２】
さらなる態様では、本発明は、抗原と組み合わせて免疫モデュレーション化合物分泌微生物を含む組成物に関するものである。好ましくは、前記組成物は薬学的組成物である。好ましくは、前記抗原はアレルゲン、アロ抗原、セルフ抗原または自己抗原である。なおさらに好ましくは、前記抗原は、アレルギー性喘息、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性重症筋無力症、関節リウマチ、食物アレルギーまたはセリアック病の誘導に関与する。好ましい一態様では、前記抗原は治療用抗原、好ましくは抗ＣＤ３である。好ましくは、本発明による抗原は、抗原発現微生物によりデリバリーされる。この場合、抗原は前記抗原発現微生物の表面に表出されていることもあるし、前記生物により分泌されることもある。好ましくは前記組成物は、噴霧剤、カプセル剤、エアロゾル、口中錠（lozenge）、ボーラス、錠剤、サシェ（sachet）、液剤、懸濁剤、乳剤またはトローチ剤の形で、好ましくはユニット投薬形態で、例えば錠剤、カプセル剤または定量エアロゾル用量で提示される。好ましくは、本発明による組成物の免疫モデュレーション化合物は、免疫抑制化合物または抗体である。好ましい一態様では、前記免疫抑制化合物は、寛容増強サイトカインまたは寛容増強抗体であり、最も好ましくは、それは、ＩＬ−４、ＩＬ１０、ＩＦＮ−α、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＧＦβおよびＲＡＮＫ−Ｌからなる群より選択される。別の好ましい態様では、前記免疫抑制化合物は、抗ＩＬ−２、抗ＩＬ１２および抗ＩＦＮ−γからなる群より選択される免疫抑制抗体である。好ましい一態様では、本発明による組成物の免疫モデュレーション化合物分泌微生物はプロバイオティック微生物である。別の好ましい態様では、本発明による組成物の免疫モデュレーション化合物分泌微生物は細菌または酵母であり、好ましくは前記細菌は乳酸菌であり、なおさらに好ましくは、それはLactobacillus、Leuconostoc、Pediococcus、Lactococcus、Streptococcus、Aerococcus、Carnobacterium、Enterococcus、Oenococcus、Teragenococcus、VagococcusおよびWeisellaからなる群より選択される乳酸菌であり、最も好ましくは前記LactococcusはLactococcus lactisである。好ましくは、前記酵母はSaccharomyces cerevisiaeである。好ましくは、本発明による組成物の前記抗原および前記免疫モデュレーション化合物は、同じ微生物により発現される。好ましくは、本発明による組成物は、アジュバント、薬学的に許容され得る担体および／または賦形剤をさらに含む。好ましくは、本発明による組成物は、免疫抑制サイトカインの産生を刺激する化合物をさらに含み、好ましくは免疫抑制サイトカインの産生を刺激する前記化合物は、コレラ毒素Ｂサブユニットである。好ましくは、本発明による組成物において前記抗原および／または前記免疫モデュレーション化合物分泌微生物は、少なくとも１０フェムトグラムから１００mgの用量で存在する。
【００６３】
最後の態様では、本発明は、免疫反応関連疾患を含む疾患または障害を処置、予防および／または緩和するための、免疫モデュレーション化合物分泌微生物と組み合わせて少なくとも抗原を含む薬剤、ニュートラシューティカルまたはメディカルフードに関するものである。
【００６４】
当業者は、本発明の好ましい態様に多数の変更および改変を加えることができ、そのような変更および改変は本発明の精神から逸脱せずに行うことができることを認識しているものである。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲の中に属するそのような均等な改変の全てを包含することが意図される。
【００６５】
加えて、本発明の化合物の記載に使用される全ての用語は、当技術分野において周知であるそれらの意味を有する。
【００６６】
実施例
実施例Ａ：ｉｎ  ｓｉｔｕデリバリーされたＩＬ−１０と組み合わせた、卵アルブミンを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓの経口投与後の前記卵アルブミンに対する寛容の誘導
実施例への材料および方法
細菌およびプラスミド
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３株をこの研究にわたり使用した。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で培養した。全ての株の保存用懸濁液は、ＧＭ１７中の５０%グリセロールに入れて−２０℃で保存した。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮ＧＭ１７で５００倍に希釈し、３０℃でインキュベーションした。これらは１６時間以内に２×１０9コロニー形成単位（CFU）/mlの飽和密度に達した。この研究にわたり、混合した細菌懸濁液を使用した。したがって、混合しなければならない細菌を遠心分離により採集し、両細菌培養物のペレットをＢＭ９培地に入れて１０倍濃縮した（Schotte, et al., 2000）。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μlの投与を受けた。
【００６７】
Gallus gallus（ニワトリ）卵アルブミンをコードしているｍＲＮＡ配列は、Genbank（アクセッション番号AY223553）から検索した。総ＲＮＡをニワトリ子宮部から単離し、ｃＤＮＡは、体積２５μl中の総ＲＮＡ  ２μg、２μMオリゴｄＴプライマー（Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands）、０．０１mM  ＤＴＴ（Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands）、０．５mM  ｄＮＴＰ（Invitrogen, Merelbeke, Belgium）、Rnasin（Promega Incorporation Benelux）２０U、およびsuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）１００Uを使用して合成した。ＯＶＡ  ｃＤＮＡフラグメントは、以下の条件を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた：以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて９４℃２分に続いて、９４℃４５秒、６２℃３０秒、および７２℃９０秒を３０サイクル。
【００６８】
【表１】
0005410759.tif 000002
【００６９】
増幅されたフラグメントは、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流で、エリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させた。ＯＶＡ  ｃＤＮＡを保有するプラスミドを用いて、およびＩＬ−１０を保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたＭＧ１３６３株は、ＯＶＡを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ（ＬＬ−ＯＶＡ）およびＬＬ−ＩＬ１０と呼んだ。空のベクターであるｐＴ１ＮＸを含むＭＧ１３６３であるＬ．ｌａｃｔｉｓ−ｐＴ１ＮＸ（ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ）を対照として利用した。
【００７０】
動物
７週齢雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスは、Charles River Laboratories（Italy）から得た。これらのマウスをＳＰＦ条件で飼育し、標準的な実験室用飼料および水道水を自由摂取させた。動物実験は、Ghent大学、the Department for Molecular Biomedical Researchの倫理委員会により承認された。
【００７１】
経口寛容の誘導および評価
マウスは、第−４６から−４２、−３９から−３５、−３２から−２８、−２５から−２１、−１８から−１４、−１１から−７、−４から−１日に混合Ｌ．ｌａｃｔｉｓ懸濁液の投与を受け、ＬＬ−ｐＴ：ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ（ベクター対照）およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液；ＬＬ−ＯＶＡ：卵アルブミンを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ株およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液；ＬＬ−ＯＶＡ＋ＬＬ−ｍＩＬ１０：ＬＬ−ＯＶＡおよびマウスインターロイキン１０を分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ株の混合細菌懸濁液。経口寛容誘導のための二つの陽性対照をこの研究に含めた。陽性対照１は、第−７日にＢＭ９培地１００μl中の卵アルブミン２０mgの投与を受けた。陽性対照２は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ補給と同じ日にＢＭ９培地１００μl中の卵アルブミン１μgの投与を受けた。マウスは、カテーテルにより胃内に補給を受けた。対照マウスは経口処置しなかった。第０日に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７ＲＡ（Difco）１００μgを含む完全フロイントアジュバント中に１：１で乳化させたＯＶＡ  １００μgをマウスにｓ．ｃ．免疫した。免疫の１１日後に腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）ならびに膝窩および鼠径リンパ節（ＰＬＮ／ＩＬＮ）を採取し、ＯＶＡ特異的増殖およびサイトカイン産生について細胞を評価した。
【００７２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＯＶＡ特異的増殖
所属膝窩および鼠径リンパ節の単細胞懸濁液を調製した。細胞を計数し、１０%ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０U/mlペニシリン、１０μg/mlストレプトマイシン、２mM  Ｌ−ｇｌｕｔａｍａｘ、０．４mMピルビン酸ナトリウムを含む、単独または１１、３３、１００もしくは３００μg/ml ＯＶＡ存在下のいずれかのＲＰＭＩ−１６４０（ＲＰＭＩ完全培地）２００μlの中に２×１０5細胞となるように再懸濁した。細胞は、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中でＵ底９６ウェル組織培養プレート（Becton Dickinson）に入れて９０時間培養した。増殖は、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により培養の最終１８時間に評価した。ＤＮＡに結合した放射能は、ガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer）上に採集し、チミジンの取込みをシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定した。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＣＤ４精製Ｔ細胞のＯＶＡ特異的増殖
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec）を使用してＰＬＮ／ＩＬＮ由来の全細胞調製物から精製した。２×１０5個のＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞として作用する、ＯＶＡをロードされたマイトマイシンＣ処理脾臓細胞と共に、１／３、１／１、１／０．３、１／０．１および１／０のＣＤ４＋Ｔ細胞／ＡＰＣ比でＲＰＭＩ完全培地２００μlに入れて培養した。これらの細胞は、３７℃の５％ＣＯ２加湿インキュベーター中のＵ底９６ウェル組織培養プレート（Becton Dickinson）に入れて９０時間培養した。増殖は、培養の最終１８時間に１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により評価した。ＤＮＡに結合した放射能をガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer）上に採集し、チミジンの取込みをシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定した。
【００７４】
ＯＶＡ特異的サイトカイン産生の測定
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）ならびに所属膝窩および鼠径リンパ節由来のリンパ節細胞を調製し、２×１０6細胞/mlで再懸濁し、部分量１００μlを、３００μg/ml  ＯＶＡと共にＵ底９６ウェル組織培養プレートに入れて７２時間培養した。マウス炎症キットを使用したCytometric Bead Array（BD Bioscience）によりサイトカインレベルを定量するまで、上清を−２０℃で保存した。
【００７５】
実施例Ａ１：ＬＬ−ＩＬ１０はＬＬ−Ｏｖａの寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、ＧＭ  Ｌ．ｌａｃｔｉｓ（ＬＬ−ｐｔ：ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ［全］（＝ベクター対照）およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液；ＬＬ−ＯＶＡ：ＯＶＡを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ［全てイタリック］およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液；ＬＬ−ＯＶＡ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０：ＯＶＡを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓおよびマウスＩＬ−１０を分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓの混合細菌懸濁液）を連続する５日間に６回（第−４６から−４２、−３９から−３５、−３２から−２８、−２５から−２１、−１８から−１４、−１１から−７、および−４から−１日）、または−７日にＯＶＡ単回量２０mg（陽性対照１）またはＬ．ｌａｃｔｉｓ補給と同じ日にＯＶＡ１μgを多回量（陽性対照２）マウスに経口補給した。対照マウスは経口処置しなかった。０日目に、完全フロイントアジュバント中のＯＶＡをマウスにｓ．ｃ．免疫し、ＰＬＮ／ＩＬＮ細胞のＯＶＡ特異的増殖を１１日目に評価した。ＬＬ−ＩＬ−１０の添加はＯＶＡへの寛容誘導を有意に高めた。それは、ＬＬ−ＯＶＡ［全］＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるＰＬＮ／ＩＬＮ細胞のＯＶＡ特異的増殖反応（図１）が、対照群およびＬＬ−ｏｖａ群に比べて有意に減少したからであった。
【００７６】
実施例Ａ２：ＬＬ−ＩＬ１０はＯｖａに反応した炎症性サイトカインの産生減少と関連して経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実施例１）のようにＧＭ  Ｌ．ｌａｃｔｉｓまたはＯＶＡをマウスに経口補給し、続いて完全フロイントアジュバント中のＯＶＡをｓ．ｃ．免疫した。免疫の１１日後に、ＭＬＮおよびＰＬＮ／ＩＬＮ中のＯＶＡに反応したサイトカイン産生は、マウス炎症キットを使用したＣｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙにより定量した。ＭＬＮにおいて、炎症性サイトカインであるＩＬ−１２，ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−６の産生は、ＬＬ−ｏｖａ群に比べてＬＬ−ｏｖａ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群では検出されないか、または強く減少し、ＬＬ−ｏｖａ群ではこれらの炎症性サイトカインの強い産生が観察された（図２Ａ）。ＰＬＮでは、ＬＬ−ｏｖａ＋Ｌｌ  ｍＩＬ−１０群における炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６の産生が、ＬＬ−ｏｖａ群に比べて強く減少し、この群においてＴＮＦ−α、ＭＣＰ−１およびＩＬ−６レベルは対照群で観察されるレベルよりも低い（図２Ｂ）。
【００７７】
実施例Ａ３：ＬＬ−ＩＬ１０はＣＤ４＋Ｔ細胞により経口寛容を高める
経口寛容の誘導がＣＤ４＋［全］Ｔ細胞により仲介されたかどうかを評価するために、ＭＬＮおよびＰＬＮ／ＩＬＮにおけるＯＶＡ特異的増殖ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究した。したがって、上に示した日にＧＭ  Ｌ．ｌａｃｔｉｓまたはＯＶＡをマウスに経口補給した（実施例１）。第０日に完全フロイントアジュバント中のＯＶＡをマウスにｓ．ｃ．免疫し、１１日後にＭＬＮおよびＰＬＮ／ＩＬＮからＣＤ４  Ｔ細胞を精製し、続いてＯＶＡをロードされたマイトマイシンＣ処理脾臓細胞の存在下で培養した。ＬＬ−ｏｖａ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるＯＶＡ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、ＬＬ−ｏｖａ群および対照群に比べて有意に減少した（図３）。
【００７８】
実施例Ｂ：ｉｎ  ｓｉｔｕデリバリーされたＩＬ−１０と組み合わせた、第ＶＩＩＩ凝固因子および第ＩＸ凝固因子を分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓの経口投与後の前記因子に対する寛容の誘導
緒言
インターフェロン、第ＶＩＩＩ／ＩＸ因子、および抗体（レミケード）などのいくつかの治療用（リコンビナント）タンパク質は、長期処置期間にわたり高用量で投与される。しかし、その使用に伴う合併症は、抗体などのタンパク質特異的免疫反応の発生である。阻害物質とも呼ばれるこれらの抗体（Ａｂ）は、治療用タンパク質をあまり有効でないようにする。例には、血友病における第ＶＩＩＩ／ＩＸ因子、慢性腎不全の治療を受けている患者におけるエリスロポイエチン（Ｅｐｏ）、および多発性硬化症のための治療を受けている患者におけるＩＦＮ−βに対する阻害物質の形成が含まれる。ここでは、ＩＬ−１０産生Ｌ．ｌａｃｔｉｓと組み合わせた第ＶＩＩＩ因子（および第ＩＸ因子）の経口デリバリーが、抗原特異的ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞の誘導により前記因子に対する阻害物質の形成を抑制することを実証する。
【００７９】
実施例への材料および方法
細菌およびプラスミド
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３株をこの研究全体にわたり使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、ＧＭ１７中の５０%グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベーションする。これらは１６時間以内に２×１０9コロニー形成単位（cfu）/mlの飽和密度に達する。この研究にわたり、混合した細菌懸濁液を使用する。したがって、混合した細菌を遠心分離により採集し、両細菌培養物のペレットをＢＭ９培地に入れて１０倍濃縮する（Schotte, Steidler et al. 2000）。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μlの投与を受ける。
【００８０】
ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを代表するヒトＦＶＩＩＩおよびＦＩＸのｃＤＮＡまたはｃＤＮＡフラグメントを増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。
【００８１】
マウスＩＬ−１０、ＦＶＩＩＩ（および／またはエピトープフラグメント）、ＦＩＸ（および／またはエピトープフラグメント）を保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたＭＧ１３６３株は、ＩＬ１０分泌Ｌ．ｌａｃｔｉｓすなわちＬＬ−ＩＬ１０、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸと呼んだ。空のベクターｐＴ１ＮＸを含むＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。
【００８２】
ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの定量
それぞれＬＬ−ＦＶＩＩＩおよびＬＬ−ＩＸ由来のＦＶＩＩＩまたはＦＩＸは、以前に記載されたヒトＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（Chuah et al., 2003）を使用して判定する。リコンビナントタンパク質は、記載されたようにウエスタンブロット分析およびＣＯＡＴｅｓｔおよびａＰＴＴアッセイ（Chuah et al., 2003; VandenDriessche et al., 1999）によっても分析する。このタンパク質のＮＨ２末端は、自動エドマン分解により判定する。ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸは、肝臓に通常発現し、そこでそれらは大規模な翻訳後修飾を受けることから、操作されたＬ．ｌａｃｔｉｓから産生された凝固因子は、生物学的に不活性なおそれがある。しかし、これらの翻訳後の差は、これらのＬ．ｌａｃｔｉｓに産生されたリコンビナントタンパク質が免疫寛容を誘導する能力に影響をもたない見込みがある。実際に、これまでに詳細に特徴づけられた大部分の阻害物質は、典型的にはグリコシル化部分よりもアミノ酸残基を認識する（Villard et al., 2003）。
【００８３】
動物
Biら（1995）およびWangら（1997）により記載されたように、ＥＳ細胞における相同組換えを使用してマウスＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ遺伝子をノックアウトすることによって得た血友病ＡまたはＢマウスは、研究室で繁殖させる。これらのレシピエントマウスは、ＣＦＡの存在下で精製リコンビナントＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ抗原を用いてチャレンジしたときに中和抗体を産生する（Mingozzi et al., 2003）。この阻害物質の状態は、Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイまたは抗ＦＶＩＩＩ／抗ＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡを使用して経時的にモニターすることができる。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ（＋ＣＦＡ）を用いてチャレンジされたレシピエントマウスは、典型的には抗原チャレンジの２〜３週間後に阻害物質を発生する。
【００８４】
実験の設定
４〜６週齢のマウスに、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸもしくはＬＬ−ｐＴ１ＮＸまたはＬＬ−ＯＶＡ（無関係の抗原）の投与を、陰性対照として、またはＬＬ−ＩＬ１０もしくはＩＬ−１０タンパク質（１または１０μg）と組み合わせて、または組み合わせずに受けさせる。寛容誘導のための陽性対照として、肝細胞特異的プロモーターからＦＩＸを発現しているアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）をマウスに注射する。レシピエント動物は、ＦＩＸ＋ＣＦＡを用いたその後のチャレンジの際の抗ＦＩＸ抗体の誘導を防止するＦＩＸ特異的免疫寛容を発生する。
【００８５】
予防の設定では、ＬＬ−ＦＶＩＩＩおよびＬＬ−ＦＩＸを単独で、またはＬＬ−ＩＬ１０もしくはＩＬ−１０と一緒に、胃内カテーテルを使用して異なる処置間隔および用量を使用して血友病ＡまたはＢマウスに経口投与する。続いてＣＦＡの存在下で精製リコンビナントＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ抗原を用いてこれらのレシピエントマウスをチャレンジする（Mingozzi et al., 2003）。対照動物は、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸおよびＬＬ−ＯＶＡに曝露する。眼窩後採血により血漿を採集する。ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに対する抗体の産生は、Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ（Kasper et al., 1975）を使用して、または改変抗ＦＶＩＩＩまたは抗ＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡ（VandenDriessche et al., 1999）を使用して異なる時間間隔で評価する。
【００８６】
治療の設定では、記載されたようにＦＶＩＩＩまたはＦＩＸを血友病ＡまたはＢマウスに最初に免疫する（Mingozzi et al., 2003）。Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイまたは抗ＦＶＩＩＩ／抗ＦＩＸ特異的ＥＬＩＳＡを使用して阻害物質の状態を経時的にモニターする。低いまたは高い阻害物質力価を有するマウスは、続いてＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸで、単独またはＬＬ−ＩＬ１０もしくはＩＬ−１０と一緒に異なる処置間隔および用量を使用して処置し、阻害物質の力価を経時的に判定する。ＬＬ−ＦＶＩＩＩ、ＬＬ−ＦＩＸの投与を単独またはＬＬ−ＩＬ１０と一緒に受けたマウスを、無関係な抗原（破傷風トキソイドまたはＯｖａ）を用いてチャレンジすることによって、可能な免疫寛容の特異性を評価する。陽性対照として、マウスを精製ＦＶＩＩＩまたはＦＩＸに経口曝露する。
【００８７】
細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ
脾臓およびリンパ節の単細胞懸濁液は、細胞に７０μmフィルター細胞ストレーナー（Becton/Dickinson Labware）を通過させることにより調製する。赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることによって、脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去する。
【００８８】
総脾臓細胞集団の増殖アッセイ、２×１０5個の細胞を、単独または精製ＶＩＩＩもしくはＦＩＸと一緒のいずれかで、抗ＩＬ−１０または抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下または不在下のいずれかで、９６ウェルＵ底プレート中で総体積２００μlの完全培地に入れて培養する。ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸを１から１００μg/mlの範囲の濃度で加える。中和抗体は、１、０．１および０．０１μg/mlで加える。ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団の増殖アッセイのために、０．２×１０5個のＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を、抗原提示細胞として作用する１×１０5個の放射線照射ＣＤ４−細胞およびＦＶＩＩＩまたはＦＩＸ（０または１００μg/ml）と共に、中和抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５%ＣＯ2加湿インキュベーターに入れて７２時間後に、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能を１６〜１８hr後にガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みをシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【００８９】
サイトカイン測定のために、異なる増殖アッセイに使用される細胞培養物の上清を培養の２４、４８および７２h後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−２０℃で凍結する。サイトカイン産生は、Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量する。
【００９０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ調節性活性アッセイ
マウスにおける抗体形成の能動的な抑制を試験するために、異なる実験のＬ．Ｌａｃｔｉｓ処置群から単離した脾臓細胞、ビーズ精製ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をナイーブＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに養子移入する。未処置マウスを対照として使用する。移入された細胞数は、全脾臓細胞、亜集団枯渇脾臓細胞、または正の選択をされたＣＤ４＋細胞ならびにＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞について１０７個である。養子移入の３６時間後にｃＦＡ中のｈＦ．ＩＸ  ５μgをレシピエントマウス（実験コホートあたりｎ＝４〜５）に皮下注射した。免疫の２．５週間後に血漿中の抗ｈＦ．ＩＸ  ＩｇＧ力価を測定した。
【００９１】
実施例Ｂ１：ＬＬ−ＩＬ１０は血友病ＡまたはＢマウスにおいてＬＬ−ＦＶＩＩＩおよびＬＬ−ＩＸの寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ＩＬ−１０の添加は、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸに対する寛容誘導を有意に高める。それは、対照およびＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＩＸ群に比べてＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群において脾臓細胞の因子特異的増殖反応が有意に減少するからである。
【００９２】
実施例Ｂ２：ＬＬ−ＩＬ１０は、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸの特異的力価とＩＦＮ−γとの減少ならびに前記因子に反応したＩＬ１０およびＴＧＦ−βのより多い産生に関連して経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるＦＶＩＩＩおよびＦＩＸ特異的抗体ならびに前記因子に反応したサイトカインの産生は、上記のように定量する。対照群およびＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＩＸ群に比べてＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群では、阻害物質の形成および炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γの産生は強く減少し、免疫抑制サイトカインであるＩＬ−１０およびＴＧＦ−βは有意に増加する。
【００９３】
実施例Ｂ３：ＬＬ−ＩＬ１０はＣＤ４＋Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４＋Ｔ細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節における因子特異的増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるように因子特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を判定する。ＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における因子特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、対照群およびＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＩＸ群に比べて有意に減少する。
【００９４】
実施例Ｂ４：ＩＬ−１０は経口寛容の強化にＬＬ−ＩＬ１０よりも有効ではない
ＬＬ−ＩＬ１０がＩＬ−１０と同様に有効であるかどうかを評価するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節における因子特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。ＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における因子特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、ＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＩＸ＋ＩＬ−１０群に比べて有意に減少する。
【００９５】
実施例Ｂ５：ＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸとＬＬ−ＩＬ−１０との組み合わせ治療後に抗原に誘導されるＴ調節性細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ阻害物質形成からの防御を伝達することができる
経口寛容プロトコールで処置されたマウスにおける抗体形成の能動的な抑制について試験するために、上記の異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ調節性活性アッセイ）。対照およびＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＩＸ群に比べて、抗因子ＩｇＧの形成はＬＬ−ＦＶＩＩＩ／ＦＩＸ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群で有意に減少し、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を示している。
【００９６】
実施例Ｃ：アレルゲンＤｅｒ  ｐ１を分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓを、ｉｎ  ｓｉｔｕデリバリーされたＩＬ−１０と組み合わせて経口投与後の前記アレルゲンに対する寛容の誘導
緒言
アレルギー性喘息は、気道の慢性炎症性障害である。アレルギー性喘息は、可逆性気道閉塞、アレルゲン特異的免疫グロブリンＥの血清レベルの上昇、粘液の過剰分泌、および気管支痙攣原性刺激に対する気道反応亢進（ＡＨＲ）を特徴とする。その症状は、患者が感作されたアレルゲン（例えば樹木、草、雑草の花粉、塵、塵性ダニ、カビ、動物のフケ）への曝露により悪化する。２型Ｔヘルパー（Ｔｈ２）リンパ球は、この疾患の開始、進行および持続に重大な役割を果たす。現在のデータは、アレルゲンに対するＴｈ２反応が通常は調節性Ｔ細胞により抑制されることを示唆している。さらにアレルギーの個体では、このサブセットによる抑制は減少する。ここでは、ＩＬ−１０産生Ｌ．ｌａｃｔｉｓと組み合わせたアレルゲンの経口デリバリーが、抗原特異的ＣＤ４+調節性Ｔ細胞の誘導により喘息様反応を抑制することを実証する。
【００９７】
実施例への材料および方法
ヒト疾患を模倣するアレルギー性喘息の二つのマウスモデルは、Ｏｖａアレルゲンモデルおよびヒト化ＳＣＩＤモデルである。
【００９８】
Ｏｖａアレルゲンモデル
ヒトアレルギー性喘息に高度に特徴的な所見であるＴｈ２サイトカイン依存性好酸球性気道炎症、気管支反応性亢進、およびＩｇＥ産生に至るＯＶＡエアロゾルを用いてＯＶＡ感作マウスを吸入チャレンジする（Brusselle, 1994, Clin Exp Allergy 24:73; Kips et al. 1996, Am J Respir Crit Care Med 153:535; Brusselle et al. 1995, Am J Respir Cell Mol Biol 12:254）。
【００９９】
細菌
この研究にわたりＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３株を使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、ＧＭ１７中の５０％グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベーションする。これらは１６時間以内に２×１０9コロニー形成単位（CFU）/mLの飽和密度に達する。細菌は遠心分離により採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μlの投与を毎日受ける。
【０１００】
プラスミド
Gallus gallus卵アルブミンをコードしているｍＲＮＡ配列はＧｅｎｂａｎｋ（アクセッション番号ＡＹ２２３５５３）から検索する。総ＲＮＡはニワトリ子宮部から単離し、ｃＤＮＡは、体積２５μl中の総ＲＮＡ  ２μg、２μＭオリゴｄＴプライマー（Promega Corporation Benelux, Leiden, The Netherlands）、０．０１mM  ＤＴＴ（Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, The Netherlands）、０．５mM  ｄＮＴＰ（Invitrogen, Merelbeke, Belgium）、Rnasin（Promega Incorporation Benelux）２０U、およびsuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）１００Uを使用して合成する。ＯＶＡ  ｃＤＮＡフラグメントは、以下の条件を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させる：以下のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて９４℃２分に続いて９４℃４５秒、６２℃３０秒、および７２℃９０秒を３０サイクル
【０１０１】
【表２】
0005410759.tif 000003
【０１０２】
増幅されたフラグメントは、ラクトコッカスＰ１プロモーター下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。
【０１０３】
マウスＩＬ−１０およびＯＶＡ  ｃＤＮＡを保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたＭＧ１３６３株は、ＬＬ−ＩＬ１０およびＬＬ−ＯＶＡと呼ぶ。空のベクターｐＴ１ＮＸを有するＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。
【０１０４】
ＯＶＡの定量
ＬＬ−ＯＶＡからのＯＶＡは社内で開発したＯＶＡ特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して判定する。リコンビナントタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
【０１０５】
ＯＶＡアレルゲンモデル
マウス
ＢＡＬＢ／ｃマウス（６から８週齢）は、Charles River Laboratories（Calco, Italy）から購入する。マウスは、特定病原体未感染の状態で維持する。
【０１０６】
マウスの免疫
水酸化アルミニウム（ミョウバン）２mg中のＯＶＡ（グレードＶ；Sigma-Aldrich）２μgをマウスにｉ．ｐ．免疫する。この免疫は、１０日感覚で繰り返す（０日および１０日）。対照マウスは、ＯＶＡ／ミョウバン溶液の代わりに生理食塩水の注射を受ける。免疫の７日後に、感作されたマウスは、３%ＯＶＡのエアロゾル化ＰＢＳ溶液を１０分間吸入する。ＯＶＡの吸入は、３日連続で行う（１８日、１９日および２０日）。対照マウスは実験群に使用するものと同じ条件でＰＢＳ単独を吸入する。
【０１０７】
経口寛容の誘導
単独またはＩＬ−１０（１または１０μg）もしくはＬＬ−ＩＬ１０と組み合わせたＬＬ−ＯＶＡ、ＬＬ−ＩＬ１０単独、ＩＬ−１０単独（１または１０μg）、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ、または水（非補給対照）の投与をマウスに受けさせる。予防の設定では、二つの異なる方式の間の最初のｉ．ｐ免疫の前にマウスを補給する。補給方式１および２は、５日間の毎日投与と２日間の非投与が交互になったそれぞれ４および６サイクルからなる。経口寛容誘導のための陽性対照として、胃内カテーテルによる最初の免疫（合計５回の補給）の１０から２日前まで１日おきにＯＶＡの１mg（低用量）または３０mg（高用量）をマウスに補給し、その補給は気管支好酸球および気道反応性亢進を減少させ、高用量補給の方が低用量補給よりも有効である。
【０１０８】
治療の設定では、予防の設定について記載したものと同じＬ．ｌａｃｔｉｓ株をマウスに毎日補給するが、最初の免疫から初めて免疫の８日後までのみとする。
【０１０９】
経口寛容の誘導のための陽性対照として、ＯＶＡ３０mgをマウスに補給する。
【０１１０】
気道反応性亢進（ＡＨＲ）の測定
最後の吸入（２１日目）の２４h後に、メタコリン誘導性気流閉塞により気道反応性亢進を評価する。噴霧した生理食塩水（Otsuka Pharmaceutical）にマウスを２．５min曝露し、続いて漸増する用量（１〜３０mg/ml）の噴霧したメタコリンに曝露する。噴霧後にこれらのマウスを体プレチスモグラフに２．５min入れ、Biosystem XA WBPシステム（Buxco Electronics）を使用してPenh（enhanced pause）を測定する。「Penh」は肺気流閉塞を表し、次式を使用して計算される：Penh＝（（Ｔｅ−Ｔｒ）／（Ｔｒ×ＰＥＦ／ＰＩＦ）)［ここで、Penh=enhanced pause（無次元）、Ｔｅ＝呼気時間（秒）、Ｔｒ＝緩和時間（秒）、ＰＥＦ＝最大呼気流量（ミリリットル/秒）、およびＰＩＦ＝最大吸気流量（ミリリットル/秒）である］。ほぼ５秒毎にPenhを測定し、平均し、累積値を各時点についてのPenhの値として平均する。気道反応性亢進はＰＣ２００Ｍｃｈ（メタコリン誘発濃度２００%）として表現し、これは、ベースラインのPenh値を２倍にしたメタコリン濃度である。
【０１１１】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分析
気道反応性亢進の測定後に、気管支肺胞洗浄液試料を得る。１００mg/kgケタミンおよび１０mg/kgキシラジンのｉ．ｐ．注射によりマウスを麻酔し、それから生理食塩水０．５mlで４回肺を洗浄する。洗浄液を遠心分離し、１%ＢＳＡを有する生理食塩水１mlに細胞を再懸濁する。総細胞数は、血球計数器を使用して計数する。サイトスピン試料は、この懸濁液を３００rpmで５分間遠心分離することによって調製する。好酸球を好中球とはっきりと識別するために、三つの異なる染色、すなわちDiff-Quick、メイ−グリュンワルト−ギムザ、およびハンセル（エオシン）染色を適用する。標準的な形態基準に基づき、少なくとも３００個の白血球を光学顕微鏡により識別する。ＢＡＬＦ中のＩＬ−１３、ＩＬ−４およびＩＬ−５レベルは、製造業者の説明書通りにCytometric Bead Assay（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）により検出する。
【０１１２】
血清総ＩｇＥおよびＯＶＡ特異的Ｉｇの測定
２１日目に、麻酔下で眼窩後静脈叢（retro-orbital sinus）から血液試料を得る。試料が完全に凝固した後で、試料を遠心分離し、血清を収集し、使用まで−８０℃で保存する。総ＩｇＥは、ペアＡｂ（BD Pharmingen）を使用して製造業者の説明書通りにＥＬＩＳＡによりアッセイする。血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａを測定するために、マイクロタイタープレート（Maxisorp, Nunc, VWR International, Haasrode, Belgium）を２μg/ml ＯＶＡでコーティングする。その後、ウェルをＰＢＳ中の０．１%カゼインで遮断し、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ［Southern Biotechnology Associates (SBA), Imtec ITK Diagnostics, Antwerpen, Belgium、１：５０００希釈］、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ、またはヤギ抗マウスＩｇＥ−ＨＲＰ（ＳＢＡ、１：５０００希釈）と共に０．１%カゼインおよび０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＣＴ）で１：１０から１：２０４８０希釈したマウス血清試料と共に、そのプレートをインキュベーションする。洗浄後、基質［３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質試薬、Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium］を各ウェルに加える。最後に、ウェルに１M  Ｈ2ＳＯ4を加えることによって反応を停止させる。４５０nmで吸光度を読み取る。ＥＬＩＳＡスコアは、計算されたカットオフ値よりも高いＯＤ450をまだ有した最高希釈の逆数である力価として表現する。カットオフは、５匹の非免疫マウスの平均ＯＤ450にＳＤの３倍を加えたものとして計算する。
【０１１３】
肺組織の組織学的検査
肺胞洗浄液試料を得た後に、生理食塩水で肺を潅流し、マウスから切除する。この肺を中和緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋する。切片（厚さ３μm）をＨ＆Ｅまたは過ヨウ素酸−シッフ（ＰＡＳ）で染色する。肺における組織学的変化の強度は、１）上皮剥離または気管支上皮細胞核の凹凸、２）杯細胞数の増加、３）血管から気管支および気管支周囲間質の粘膜および粘膜下領域への炎症細胞の浸潤、ならびに４）平滑筋細胞層の肥大および肥厚という所見の分布および強度にしたがって、四つの等級スコア（０：炎症なし、１：微弱／軽度、２：中度、および３：重度）で評価する。
【０１１４】
肺におけるサイトカインおよびケモカイン遺伝子発現の分析のためのＲＴ−ＰＣＲ
生理食塩水で潅流後に肺を取り出し、製造業者の説明書通りにＩＳＯＧＥＮ（Nippon Gene）を使用して総ＲＮＡを抽出する。総ＲＮＡ（１０μg）は、オリゴ（ｄＴ）１５プライマー（Promega）およびSuperscript II Rnase H逆転写酵素（Invitrogen Life Technologies）を使用して４２℃で２時間逆転写する。各試料が同量のｃＤＮＡを含んでいたことを確認するために、β−アクチン特異的プライマーを使用して各試料のβ−アクチンｃＤＮＡ濃度を最初に判定する。適切なサイクル数の間増幅させることによって、これらの試料はＰＣＲ産物の量が増幅曲線の直線部に残った。ＰＣＲ産物を２%アガロースゲルで電気泳動させ、臭化エチジウム染色により視覚化した。以下の特異的プライマーセットを使用してＩＬ−１３、エオタキシン、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βのレベルを判定する。
βアクチンについてのセンスプライマー
【０１１５】
【表３】
0005410759.tif 000004
【０１１６】
および
アンチセンスプライマー
【０１１７】
【表４】
0005410759.tif 000005
【０１１８】
ＩＬ−１３についてのセンスプライマー
【０１１９】
【表５】
0005410759.tif 000006
【０１２０】
および
アンチセンス
【０１２１】
【表６】
0005410759.tif 000007
【０１２２】
エオタキシンについてのセンスプライマー
【０１２３】
【表７】
0005410759.tif 000008
【０１２４】
および
アンチセンスプライマー
【０１２５】
【表８】
0005410759.tif 000009
【０１２６】
ＩＬ−１０についてのセンスプライマー
【０１２７】
【表９】
0005410759.tif 000010
【０１２８】
および
アンチセンス
【０１２９】
【表１０】
0005410759.tif 000011
【０１３０】
ＩＦＮ−γについてのセンスプライマー
【０１３１】
【表１１】
0005410759.tif 000012
【０１３２】
および
アンチセンス
【０１３３】
【表１２】
0005410759.tif 000013
【０１３４】
ＴＧＦ−βについてのセンスプライマー
【０１３５】
【表１３】
0005410759.tif 000014
【０１３６】
および
アンチセンス
【０１３７】
【表１４】
0005410759.tif 000015
【０１３８】
細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ
最後の吸入（第２１日）の１日後に、細胞に７０μmフィルター細胞ストレーナー（Becton/Dickinson Labware）を通過させることにより、脾臓および縦隔リンパ節の単細胞懸濁液を調製する。赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることにより脾臓細胞懸濁液から赤血球を除去する。それぞれＣＤ４+Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）またはＣＤ４+ＣＤ２５+調節性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）、およびＭＡＣＳカラム（midiMACS; Miltenyi Biotec）を使用して、ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を濃縮する。
【０１３９】
バルク脾臓細胞集団およびＬＮ集団の増殖アッセイ、２×１０5個の細胞は、総体積２００μlの完全培地に入れて、単独または精製ＯＶＡの存在下のいずれかで、かつ抗ＩＬ−１０または抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下または不在下のいずれかで９６ウェルＵ底プレート中で培養する。ＯＶＡは１から１００μg/mlの範囲の濃度で添加する。中和抗体は、１、０．１および０．０１μg/mlで加える。ＣＤ４+Ｔ細胞集団およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団の増殖アッセイのために、２×１０5個のＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞は、抗原提示細胞として作用する、１mg/ml  ＯＶＡを１６hロードされたマイトマイシン処理脾臓細胞と共に、ＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞／ＡＰＣの比が１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３、１／０で、中和抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で１６h培養する。３７℃の５%ＣＯ２加湿インキュベーター中で７２h後に、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能は、１８h後にガラス繊維フィルターマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みはシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０１４０】
サイトカイン測定のために、異なる増殖アッセイに使用される細胞培養物の上清を培養の２４、４８および７２h後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量する。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ調節性活性のアッセイ
最後の吸入（第２１日）の１日後に、処置マウスの脾臓を０．１%コラゲナーゼ（Sigma-Aldrich）を用いて３７℃で２０分間消化する。一部の実験では、全脾臓細胞の単細胞懸濁液を調製し、ＣｏｎＡ（２μg/ml; Sigma-Aldrich）と共に４８h培養する。細胞を収集し、１０7個をナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｖ．で養子移入する。負の選択のために、ビオチン化抗マウスＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９およびＣＤ１１ｂ  ｍＡｂ（BD Pharmingen）を有する磁気ビーズ（MACS; Miltenyi Biotec）を製造業者の説明書通りに使用して、全脾臓細胞からＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ１１Ｃ+、ＣＤ１９+またはＣＤ１１ｂ+細胞を枯渇させる。枯渇の効率は、フローサイトメトリーにより調べる（＞９９%）。ＣＤ４+Ｔ細胞単離キット、調節性Ｔ細胞単離キットを製造業者の説明書通りに使用してＣＤ４+細胞、ＣＤ４+ＣＤ２５-細胞を精製する。正の選択をされた細胞の純度は、フローサイトメトリーを使用してチェックする。細胞移入実験のために、ＯＶＡ／ミョウバンを用いたそれらの最初の免疫の直前またはそれらの２回目の免疫の直後にＢＡＬＢ／ｃマウスに尾静脈から細胞を移入する。移入された細胞数は、全脾臓細胞、亜集団枯渇脾臓細胞、または正の選択をされたＣＤ４＋細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５-細胞について１０７個である。
【０１４２】
ヒト化ＳＣＩＤ（ｈｕ−ＳＣＩＤ）モデルにおいて（Duez et al., 2000; Hammad et al., 2000に記載された通り）
このモデルでは、屋内塵性ダニ（ＨＤＭ）アレルゲンであるＤｅｒ  ｐ１に対するアレルギー性免疫反応を研究することができる。ＨＤＭアレルギー患者からのＰＢＭＣを用いてｉ．ｐ．再構成し、続いてＨＤＭエアロゾルに曝露した当該ｈｕ−ＳＣＩＤマウスはヒトＩｇＥを産生し、活性化Ｔ細胞およびＤＣを含む肺浸潤液を発生し、気管支収縮剤に反応してＡＨＲを示す（Pestel et al. 1994, J Immunol, 153:3804; Duez et al., Am J Respir Crit Care Med, vol 161 , ppp 200-206, 2000）。
【０１４３】
細菌
この研究にわたりＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３株を使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５%グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MＩ）で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、ＧＭ１７中の５０%グリセロール中に入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベーションする。これらは１６時間以内に２×１０9コロニー形成単位（CFU）/mLの飽和密度に達した。細菌を遠心分離により採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、各マウスは胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μLの投与を毎日受ける。
【０１４４】
プラスミド
２２２アミノ酸残基の球状糖タンパク質であるＤｅｒ  ｐ１は、Dermatophagoides pteronyssinus（Ｄｐｔ）ダニ由来の主要アレルギンの一つである。Ｄｅｒ  ｐ１タンパク質をコードしている、最適のＬ．ｌａｃｔｉｓコドン利用を有するＤＮＡ配列を合成し、増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーター下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。マウスＩＬ−１０、Ｄｅｒ  ｐ１、Ｄｅｒ  ｐ１  ａａ５２−７１およびＤｅｒ  ｐ１  ａａ１１７−１３３  ｃＤＮＡを保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたＭＧ１３６３株は、ＬＬ−ＩＬ１０、ＬＬ−Ｄｅｒｐ１、ＬＬ−Ｄｅｒｐ１  ａａ５２−７１、およびＬＬ−  Ｄｅｒｐ１  ａａ１１７−１３３と呼ぶ。空のベクターｐＴ１ＮＸを有するＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。
【０１４５】
Ｄｅｒ  ｐ１の定量
ＬＬ−Ｄｅｒｐ１由来のＤｅｒ  ｐ１は、社内で開発したＤｅｒ  ｐ１特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して判定する。リコンビナントタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
【０１４６】
患者
血液は、屋内塵性ダニに感受性または非感受性のドナーから収集する。アレルギー患者は、屋内塵性ダニ感作の通常の特徴を提示する。Dermatophagoides pteronyssinus（Ｄｐｔ）アレルゲンに関する皮膚穿刺試験（Stallergenes, Fresnes, France）（直径≧１０mm)は陽性であり、全ての患者は血清中特異的ＩｇＥ抗体を有する。総ＩｇＥ濃度は１５０IU/ml（１５０〜１６００IU/ml）を超える。健康なドナーは陰性対照として試験する（合計ＩｇＥレベルは１５０IU/ml未満であり、彼らは通常に吸入されたアレルギンに関して陰性の皮膚穿刺試験を有する）。
【０１４７】
ヒト末梢血単核細胞の増殖
遠心分離（１２０×ｇ、１５分間）後に血小板に富む血漿を得て、捨てる。それから血球をＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies, Paisley, Scotland）（vol/vol）で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ勾配（Pharmacia, Uppsala, Sweden）の上に重層する。遠心分離（４００×ｇ、３０分間）後に、界面でＰＢＭＣを採集し、滅菌ＲＰＭＩ培地で３回洗浄してから移し替える。
【０１４８】
マウス
Ｃ．Ｂ．−１７  ＳＣＩＤマウス（６〜８週齢）を、特定動物施設の中で無菌床敷を有する隔離飼育器で維持する。ＥＬＩＳＡによりマウス血清免疫グロブリンの不在についてＳＣＩＤコロニーを定期的にチェックする。
【０１４９】
ＳＣＩＤマウスへの末梢血単核細胞の移入：ＰＢＭＣ  ｈｕ−ＳＣＩＤマウス
ＳＣＩＤマウスは、細胞移入時に６から８週齢である。アレルギー患者または健康ドナーからの単核細胞１０×１０6個をＲＰＭＩ  ４００μlに入れたものを２３ゲージの針を通して腹腔内注射することにより、マウスを再構成する。同じ日に、これらのマウスに２反応性指数［ＩＲ］ユニットのＤｐｔの投与を腹腔内に受けさせる。細胞の再構成の４日後に、１００ＩＲユニットのＤｐｔ（１００ＩＲユニットはＤｐｔ抽出物に含まれるタンパク質約２００μgに等しい）を含むアレルゲンエアロゾルにＳＣＩＤマウスを連続４日間毎日曝露する（第０日から第４日）。対照群はＤｐｔに曝露しない。気道反応性の測定（第３５日および第６０日）の１日前に、１００ＩＲユニットのＤｐｔ溶液の別のエアロゾルにｈｕ−ＳＣＩＤマウスを曝露する。
【０１５０】
実験の設定
Ｄｅｒ  ｐ１または陰性対照として無関係の抗原（ＯＶＡ）を発現するように操作されたＬ．ｌａｃｔｉｓを、ＬＬ−ＩＬ１０またはＩＬ−１０タンパク質（１または１０μg）と組み合わせるか、または組み合わせずにマウスに投与を受けさせる。
操作されたＬ．ｌａｃｔｉｓ細菌は、ＰＢＭＣ再構成の１日後に開始して、異なる処置間隔および用量を使用して胃内カテーテルを使用してＳＣＩＤマウスに経口投与する。経口寛容の誘導は、ヒト血清ＩｇＥ抗体の測定、肺浸潤の分析、ＡＨＲの測定、ならびにＢＡＬＦ中の細胞集団およびサイトカイン産生の分析により評価する。さらに、寛容の誘導は、Ｄｅｒ  ｐ１に対する増殖Ｔ細胞反応の分析により評価する。
【０１５１】
気道反応性（ＡＨＲ）の評価
気道反応性（肺抵抗に５０%の増加を引き起こすカルバコールの誘発用量として表現）は、Ｄｕｅｚら（２０００）により記載されたように第３５日または第６０日に測定する。
【０１５２】
ヒトＩｇＥの測定
ヒト細胞の移植の数日後に、エーテル麻酔下でマウスの眼窩後静脈叢から採血する。ε鎖に特異的な二つの異なるマウスｍＡｂ（Immunotech International, Luminy, France）を使用して二部位免疫放射定量法によりヒトＩｇＥを研究する。少なくとも２０μlの血清を２回繰り返しの試験に使用する。方法の感度は、０．１IUiml（０．２４ng/ml）の検出を許す。
【０１５３】
Ｄｐｔアレルゲンに対する特異的ＩｇＥ  Ａｂは、ＥＬＩＳＡにより定量する。簡潔には、０．１M炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中のＤｐｔアレルゲンでプラスチック試験管（Maxisorb Startube, Nunc, Denmark）を４℃で一晩コーティングし、０．１M ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の1%ＢＳＡで室温で２h飽和させる。洗浄後、ＢＳＡ（１%）およびＴｗｅｅｎ（０．０１%）を含むＰＢＳで希釈したＨｕ−ＳＣＩＤマウス血清と共に試験管を室温で２h、および４℃で一晩インキュベーションする。大規模に洗浄後、ＨＲＰラベル抗ヒトＩｇＥ  Ａｂを加える。洗浄後、基質［３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質試薬、Pharmingen, Becton Dickinson, Erembodegem, Belgium]を各ウェルに加える。最後に、ウェルに１M Ｈ2ＳＯ4を加えることによって反応を停止する。吸光度を４５０nmで読み取る。
【０１５４】
肺の組織検査
肺を３５日目に切除し、パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン包埋用に加工する。パラフィン組織切片は、ヒトＣＤ４５＋細胞の検出用に染色し、その後、マウス肺切片上のヒト細胞は、Ｄｕｅｚら（２０００）に記載されたように組織スコア付けにより定量した。
【０１５５】
気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分析
ＯＶＡアレルゲンモデルに記載したようにＢＡＬＦを分析する。
【０１５６】
細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ：
脾臓の単細胞懸濁液は、細胞に７０μmのフィルター細胞ストレーナー（Becton/Dickinson Labware）を通過させることによって調製する。赤血球は、赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることによって脾臓細胞懸濁液から除去する。ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞は、それぞれヒトＣＤ４+Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）またはヒトＣＤ４+ＣＤ２５+調節性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）、およびＭＡＣＳカラム（midiMACS; Miltenyi Biotec）を使用して濃縮する。
【０１５７】
バルク脾臓細胞の増殖アッセイ、２×１０5個の細胞は、単独または精製Ｄｅｒ  ｐ１存在下のいずれかで、かつ抗ＩＬ−１０または抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。Ｄｅｒ  ｐ１は、１から１００μg/mlの範囲の濃度で加える。中和抗体は、１、０．１および０．０１μg/mlで加える。ヒトＣＤ４+Ｔ細胞集団およびヒトＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団の増殖アッセイのために、２×１０5個のＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞は、中和抗体の存在下または不在下のいずれかの合計２００μlの完全培地に入れて、抗原提示細胞として作用する、１mg/ml  Ｄｅｒ  ｐ１を１６hロードされたマイトマイシン処理ヒトＰＢＭＣと共に、ＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞／ＡＰＣの比が１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３、１／０で９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５%ＣＯ２加湿インキュベーター中で７２h後に、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能は、１８h後にガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みは、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０１５８】
サイトカイン測定のために、異なる増殖アッセイに使用される細胞培養物の上清を培養の２４、４８および７２h後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、Human Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量する。
【０１５９】
実施例Ｃ１：ＬＬ−ＩＬ１０は、喘息についてのＯＶＡモデルおよびｈｕＳＣＩＤマウスモデルにおいてそれぞれＬＬ−ＯＶＡおよびＬＬ−Ｄｅｒ  ｐ１の寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ＩＬ−１０の添加はＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１への寛容誘導を有意に高める。それは、対照群およびＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１群に比べてＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群において脾臓細胞のアレルゲン特異的増殖反応が有意に減少するからである。
【０１６０】
実施例Ｃ２：ＬＬ−ＩＬ１０は、前記アレルゲンに反応したＡＨＲ、好酸球浸潤、血清ＩｇＥレベルの減少、ならびにＩＬ−１３、ＩＬ−４およびＩＬ−５サイトカイン産生の低下と関連して経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。前記因子に反応したＡＨＲ、好酸球のＢＡＬＦ浸潤、ＩｇＥ力価、およびサイトカイン産生を判定する。ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群では、対照およびＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１群に比べてＡＨＲ、好酸球ＢＡＬＦ浸潤、ＩｇＥ力価は大きく減少し、ＩＬ−１３、ＩＬ−４およびＩＬ−５は有意に低下する。
【０１６１】
実施例Ｃ３：ＬＬ−ＩＬ１０はＣＤ４＋Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４  Ｔ細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるようにアレルゲン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を判定する。ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるアレルゲン特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、対照群およびＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１群に比べて有意に減少する。
【０１６２】
実施例Ｃ４：ＩＬ−１０は経口寛容の強化にＬＬ−ＩＬ１０よりも有効ではない
ＬＬ−ＩＬ１０がＩＬ−１０と同様に有効であるかどうかを評価するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるアレルゲン特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、ＬＬ−ＯＶＡ／Ｄｅｒｐ１＋ＩＬ−１０群に比べて有意に減少している。
【０１６３】
実施例Ｃ５：ＬＬ−ＯＶＡとＬＬ−ＩＬ１０との組み合わせ治療後に抗原に誘導されたＴ調節性細胞は、喘息様反応からの防御をｉｎ  ｖｉｖｏで伝達することができる。
経口寛容プロトコールで処置されたマウスにおける喘息様反応の能動的な抑制について試験するために、上記（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ調節性活性アッセイ）の異なる処置群由来の脾臓細胞を養子移入する。対照群およびＬＬ−ＯＶＡ群と比べて、喘息様反応は、ＬＬ−ＯＶＡ＋ＬＬ−ｍＩＬ１０群において有意に減少しており、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を示している。
【０１６４】
実施例Ｄ：ｉｎ  ｓｉｔｕデリバリーされたＩＬ−１０と組み合わせた、α−グリアジンを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓの経口投与後の前記アレルゲンに対する寛容の誘導
緒言
セリアックスプルーまたはグルテン過敏性腸症としても知られているセリアック病は、グルテンを含む特定の食用穀類に対する免疫反応を発生する慢性炎症性疾患である。セリアックは、ヒト白血球抗原変異体ＨＬＡ−ＤＱ２またはＨＬＡ−ＤＱ８をコードする遺伝子と強く関連する複合多遺伝子障害である。セリアックの病因の最も重要な局面の一つは、Ｔヘルパー１型免疫反応の活性化である。これは、ＨＬＡ−ＤＱ２／ＤＱ８分子を発現する抗原提示細胞がＣＤ４（＋）Ｔ細胞に毒性グルテンペプチドを提示するときに生じる。グリアジンおよびグルテニンという両方のクラスのグルテンタンパク質は、ＤＱ２およびＤＱ８と結合するペプチドを含む。セリアック病患者の小腸においてグルテン特異的Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ産生などの免疫反応が、粘膜の破壊をトリガーすることが一般に受け入れられている。したがって、セリアック病患者の腸における有害な免疫Ｔ細胞反応の活性化は、この疾患の開始および進行に重要と思われる。
【０１６５】
ここに、ＩＬ−１０産生Ｌ．ｌａｃｔｉｓと組み合わせたグリアジンペプチドの経口デリバリーが、抗原特異的ＣＤ４+調節性Ｔ細胞の誘導を介してグリアジン特異的免疫反応を抑制することを実証する。
【０１６６】
実施例への材料および方法
細菌
この研究全体にわたりＬ．ｌａｃｔｉｓＭＧ１３６３株を使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５％グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、ＧＭ１７中の５０%グリセロール中で−２０℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベーションする。それらは、１６時間以内に２×１０9コロニー形成単位（CFU）/mLの飽和密度に達した。遠心分離により細菌を採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液の１００μLの投与を各マウスに毎日受けさせる。
【０１６７】
プラスミド
α−グリアジンタンパク質をコードしている、最適なＬ．ｌａｃｔｉｓコドン利用を有するＤＮＡ配列（Triticum aestivumの配列ＡＪ１３３６１２に基づく）、ＨＬＡ−ＤＱ８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬエントリーＱ９Ｍ４Ｌ６の残基２０３〜２２０の配列
【０１６８】
【表１５】
0005410759.tif 000016
【０１６９】
に対応する）およびＨＬＡ−ＤＱ８脱アミド形態（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬエントリーＱ９Ｍ４Ｌ６の残基２０３〜２２０の配列
【０１７０】
【表１６】
0005410759.tif 000017
【０１７１】
に対応する）のグリアジンペプチドを合成し、増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーター下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。
【０１７２】
マウスＩＬ−１０、α−グリアジン、ＨＬＡ−ＤＱ８および脱アミノＨＬＡ−ＤＱ８を保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたＭＧ１３６３株は、ＬＬ−ＩＬ１０、ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８、ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄと呼ぶ。空のベクターｐＴ１ＮＸを含むＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。
【０１７３】
ＨＬＡ−ＤＱ８およびＤＱ８ｄの定量
ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８およびＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ由来のＨＬＡ−ＤＱ８およびＨＬＡ−ＤＱ８ｄは、社内で開発したＥＬＩＳＡを使用して判定する。リコンビナントタンパク質の産生は、ウエスタンブロット分析によっても評価する。
【０１７４】
マウス
ＨＬＡ−ＤＱ８トランスジェニックマウス（Senger et al. 2003）は、無グルテン食で特定病原体未感染の状態で維持し、８〜１４週齢で使用する。ＣＦＡ（Difco; BD）５０μl中の粗グルテン（Sigma-Aldrich）５０μgを足底内注射によりマウスに免疫する。
【０１７５】
経口寛容の誘導
寛容化実験のために、免疫の前後に、異なる処置間隔および用量を使用してＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８、ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄを単独またはＩＬ−１０（１または１０μg）もしくはＬＬ−ＩＬ１０と組み合わせたもの、ＬＬ−ＩＬ１０単独、ＩＬ−１０単独（１または１０μg）、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ、または水（無補給対照）を投与する。経口寛容誘導のための陽性対照として、免疫（第０日）前の第−７、−６、−５、−４日に、保存溶液から水に溶解させた小麦グリアジンまたはリコンビナントα−グリアジンの５０mg用量をマウスに補給する。
【０１７６】
血清グリアジン特異的Ｉｇの測定
粗グリアジン（Sigma-Aldrich）をメタノールに１０mg/mlで再懸濁し、それから１μg/mlの濃度で無水エタノールに希釈する。１μg/mlグリアジンのエタノール溶液１００μlをＩｍｍｕｌｏｎ２プレート（Fisher Scientific International Inc.）の各ウェルに入れ、それからフードの下で乾燥させる。それから、プレートを４%ＢＳＡ／ＰＢＳで３７℃で２時間遮断する。プレートを１×ＰＢＳ、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄する。試料血清は、０．１%ＢＳＡ／ＰＢＳに１：２００、１：４００および１：８００希釈し、３７℃で１時間インキュベーションする。検出抗体は、Accurate Chemical & Scientific Corp.からのビオチン化ラット抗マウスＩｇＡおよびJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.からのビオチン化抗マウスＩｇＧである。酵素コンジュゲートはストレプトアビジン−ＨＲＰであり、基質はＴＭＢである。
【０１７７】
細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ
脾臓および縦隔リンパ節の単細胞懸濁液は、細胞に７０μmフィルター細胞ストレーナー（Becton/Dickinson Labware）を通過させることにより調製する。赤血球は赤血球溶解緩衝液と共にインキュベーションすることにより脾臓細胞懸濁液から除去する。それぞれＣＤ４+Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）またはＣＤ４+ＣＤ２５+調節性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）およびＭＡＣＳカラム（midiMACS; Miltenyi Biotec）を使用して、ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞を濃縮する。
【０１７８】
バルク脾臓細胞集団およびＬＮ集団の増殖アッセイ。２×１０5個の細胞は、単独、または粗グリアジンもしくは合成ＨＬＡ−ＤＱ８／ＤＱ８ｄ存在下で、かつ抗ＩＬ−１０または抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。抗原を１から１００μg/mlの範囲の濃度で加える。中和抗体は、１、０．１および０．０１μg/mlで加える。ＣＤ４+Ｔ細胞集団およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団の増殖アッセイのために、２×１０5個のＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞は、抗原提示細胞として作用する、１mg/ml粗グリアジンまたは合成ＨＬＡ−ＤＱ８／ＤＱ８ｄを１６hロードされたマイトマイシン処理脾臓細胞と共に、ＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞／ＡＰＣの比が１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３、１／０で、中和抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて、９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５％加湿ＣＯ2インキュベーター中で７２時間後に、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡと結合した放射能は、１８h後にガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みはシンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０１７９】
サイトカインの測定のために、異なる増殖アッセイに使用される細胞培養物の上清を培養の２４、４８および７２h後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカインの産生は、Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量する。
【０１８０】
実施例Ｄ１：ＬＬ−ＩＬ１０はＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄの寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（経口寛容の誘導）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ＩＬ−１０の添加は、ＨＬＡ−ＤＱ８ｄへの寛容誘導を有意に高める。それは、ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における脾臓細胞のＨＬＡ−ＤＱ８ｄ特異的増殖反応が、対照群およびＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ群に比べて有意に減少するからである。
【０１８１】
実施例Ｄ２：ＬＬ−ＩＬ１０は前記アレルギンに反応したＩＦＮ−γの産生減少と関連して経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記（経口寛容の誘導）のようにマウスに経口補給する。ＨＬＡ−ＤＱ８ｄに反応したサイトカイン産生は、上記（細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ）のように定量する。脾臓細胞およびリンパ節において、ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における炎症性サイトカインＩＦＮ−γの産生は、対照群およびＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ群に比べて強く減少する。
【０１８２】
実施例Ｄ３：ＬＬ−ＩＬ１０はＣＤ４＋Ｔ細胞を介した経口寛容を高める
ＣＤ４  Ｔ細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節におけるＤＱ８特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（経口寛容の誘導）のようにマウスに経口補給し、ＤＱ８特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるように判定する。ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるＤＱ８特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、対照群およびＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ群に比べて有意に減少する。
【０１８３】
実施例Ｄ４：ＩＬ−１０は経口寛容の強化にＬＬ−ＩＬ１０よりも有効ではない
ＬＬ−ＩＬ１０がＩＬ−１０と同様に有効かどうかを評価するために、上記（経口寛容の誘導）のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるＤＱ８特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるＤＱ８特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応は、ＬＬ−ＨＬＡ／ＤＱ８ｄ＋ＩＬ−１０群に比べて有意に減少する。
【０１８４】
実施例Ｅ：ｉｎ  ｓｉｔｕデリバリーされたＩＬ−１０と組み合わせた、ＢＬＧ食物アレルゲンを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓの経口投与後の前記食物アレルゲンに対する寛容の誘導
【０１８５】
緒言
食物アレルギーは、人口の約２%から５%を苦しめる疾患である。ヒトでは、高いＩｇＥ抗体およびＩＬ−４産生抗原特異的Ｔリンパ球の存在はＴｈ２偏向メカニズムを示唆する。
【０１８６】
ここで、ＩＬ−１０産生Ｌ．ｌａｃｔｉｓと組み合わせた食物アレルゲンの経口デリバリーが、抗原特異的ＣＤ４+調節性Ｔ細胞の誘導を介してアレルゲン特異的免疫反応を抑制することを実証する。
【０１８７】
実施例への材料および方法
細菌およびプラスミド
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３株をこの研究にわたり使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５%グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、ＧＭ１７中の５０%グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベーションする。それらは、１６時間以内に２×１０9コロニー形成単位（CFU）/mLの飽和密度に達する。遠心分離により細菌を採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液の１００μLの投与を各マウスに毎日受けさせる。ウシβ−ラクトグロブリンｃＤＮＡを増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流でエリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。マウスＩＬ−１０またはＢＬＧを保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたＭＧ１３６３株は、ＬＬ−ＩＬ１０およびＬＬ−ＢＬＧと呼ぶ。空のベクターｐＴ１ＮＸを含むＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。
【０１８８】
ウシβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）の定量
ＬＬ−ＢＬＧ由来のＢＬＧは、社内で開発したＢＬＧ特異的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびウエスタンブロット分析を使用して判定する。
【０１８９】
実験の設定
L.lactisの防御効果を探求するために使用する食物アレルギーのマウスモデルは、Frossardら（J Allergy Clin Immunol 113:958-964, 2004）に記載された食物誘導ＩｇＥ型反応のマウスモデルである。マウスは、ＬＬ−ＩＬ１０またはリコンビナントＩＬ−１０（１または１０μg）と組み合わせてまたは組み合わせずに、ＬＬ−ＢＬＧまたは陰性対照として無関係の抗原（ＯＶＡ）の投与を受ける。寛容誘導の陽性対照として、飲料水に入れた高用量のＢＬＧの投与をマウスに受けさせ、その飲料水はＢＬＧの経口チャレンジの際のアナフィラキシーからマウスを予防する。
【０１９０】
予防の設定では、ＢＬＧを産生する操作をされたＬ．ｌａｃｔｉｓ細菌を、異なる処置間隔および用量を使用して、胃カテーテルを用いてマウスに経口投与する。その後、コレラ毒素の存在下で、精製ＢＬＧ抗原を用いてこれらのレシピエントマウスを経口チャレンジする。ＢＬＧを発現せず（代わりにＯＶＡを発現する）対照ベクターで操作されたＬ．ｌａｃｔｉｓに対照動物を曝露する。寛容の誘導は、胃内抗原チャレンジ後のアナフィラキシーの分析により、血清および便中のＢＬＧ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＥ力価の測定により、脾臓およびＰＰ中の抗体分泌細胞数の判定により、ＭＬＮ、ＰＰおよび脾臓におけるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生の分析により評価する。
【０１９１】
ＢＬＧへの免疫寛容の誘導がＩＬ−１０により高まりうるかどうかを評価するために、ＬＬ−ＢＬＧをＬＬ−ＩＬ１０と共にマウスに投与する。
【０１９２】
ＢＬＧに対する経口感作
０．２mol/L  ＮａＨＣＯ3中のＢＬＧ（Sigma）２０mgおよびList Biological Laboratoriesから購入したＣＴＸ  １０μgを、第０、７、１４および２１日目に５週齢雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪマウス（Charles River）に胃管栄養により免疫する。陽性対照群（寛容化マウス）は飲料水に入れた０．８mg/mL ＢＬＧを４週間自由に与えられる。与えるタンパク質の合計量（２２．４mg）は感作されたマウスに投与されたＢＬＧの合計量と類似している。この寛容化手順が永続的に末梢性免疫系もまた活性化し、粘膜免疫系だけを活性化するわけではないことを実証するために、ミョウバン１mgに吸着させたＢＬＧ  ８０μgを寛容化マウスの群に第２８日および第４２日に２回注射する。
【０１９３】
抗原のチャレンジ
第２８日に、０．２mol  ＮａＨＣＯ３  ０．４ml中のＢＬＧ  １００mgを用いて全てのマウスを胃内強制投与によりチャレンジする。アナフィラキシーを観察し、他（Frosssard et al., 2001）に詳細に記載された反応スコア（０：無反応〜３：重度の反応または死亡）を使用することにより等級分けする。中核体温は、チャレンジ前および強制投与の３０分後に耳で赤外線により測定する。動物を屠殺し、心穿刺により血液をＥＤＴＡ含有試験管に収集し、市販のＥＬＩＳＡキット（Immunotech, Marseille, France）によるヒスタミン測定のために血漿を得る。
【０１９４】
細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ
脾臓、腸間膜リンパ節およびＰＰの単細胞懸濁液は、Frossardら（２００４）により記載されたように調製する。ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞は、それぞれＣＤ４+Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）またはＣＤ４+ＣＤ２５+調節性Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec, Germany）およびＭＡＣＳカラム（midiMACS; Miltenyi Biotec）を使用して濃縮する。
【０１９５】
バルク脾臓細胞およびＬＮ集団の増殖アッセイ、２×１０5個の細胞は、単独または精製ＢＬＧの存在下のいずれかで、かつ抗ＩＬ−１０または抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。ＢＬＧは１から１００μg/mlの範囲の濃度で加える。中和抗体は、１、０．１および０．０１μg/mlで加える。ＣＤ４+Ｔ細胞集団およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団の増殖アッセイのために、２×１０5個のＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞は、抗原提示細胞として作用する、１mg/ml ＢＬＧを１６hロードされたマイトマイシン処理脾臓細胞と共に、ＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞／ＡＰＣの比率が１／１、１／０．３、１／０．１、１／０．０３、１／０で、中和抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５%ＣＯ2加湿インキュベーター中で３７℃で７２h後に、１μCi/ウェル［3Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡと結合した放射能は、１８h後にガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、チミジンの取込みは、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）で測定する。
【０１９６】
サイトカイン測定のために、異なる増殖アッセイに使用される細胞培養物の上清を培養の２４、４８および７２h後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量する。
【０１９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ調節性活性のアッセイ
マウスにおける抗体形成の能動的な抑制について試験するために、異なる実験のＬ．Ｌａｃｔｉｓ処置群から単離した脾臓細胞、ビーズ精製ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞またはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞をナイーブＣ３Ｈ／ＨｅＯｕＪマウスに養子移入する。未処置マウスは対照として使用する。移入した細胞数は、全脾臓細胞、亜集団を枯渇させた脾臓細胞、または正の選択をされたＣＤ４＋細胞ならびにＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞について１０7個である。Ｔｒｅｇが関係しているならば、ＢＬＧ抗原を用いたこれらのマウスのその後のチャレンジは、ＢＬＧに対する体液性免疫反応およびアナフィラキシーの誘導を予防するはずである。
【０１９８】
ＢＬＧ特異的な血清抗体および便抗体についての酵素結合免疫吸着検定
第０、７、１４、２１および２８日目の尾採血から血清を得る。同時に便を得て、ペプスタチン１：１０００（Fluka）を０．１mg/mL補充したＰＢＳ＋１%ＦＣＳ（Life technologies）に再懸濁する。試料を機械的に脱凝集させ、２分間ボルテックス処理し、続いて１４０００rpmで４℃で２０分間、２回の遠心分離を行う。
【０１９９】
Adel-Patientら（2000, J. Immunol Methods）から改良した方法により、ＢＬＧ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡ抗体レベルについて血清および便をアッセイする。簡潔には、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Nunc）に２５０ng/ウェルのストレプトアビジン（Fluka）を室温で１８時間、続いてポリビニルピロリドンＫ２５（Fluka）溶液３００μLを一晩コーティングする。ビオチン化ＢＬＧ １μgを３時間インキュベーションし、０．５μg/mLヤギ抗マウスＩｇＡ、ラット抗マウスＩｇＧ１、または抗マウスＩｇＧ２ａペルオキシダーゼラベル抗体（Southern Biotechnologies）の存在下でＰＢＳ＋１０%ウマ血清に希釈した血清（ＩｇＧ１について１：６６６６および１：２２２２、ＩｇＧ２ａについて１：６６６および１：２２２、ＩｇＥについて１：６６および１：２２）または便（１：３、１：１０、および１：３３）を、２回の繰り返しで２時間加える。ＩｇＥの測定のために、ラット抗マウスＩｇＥモノクローナルＡｂ（clone R35-72, BD Pharmingen）に続いてペルオキシダーゼ結合抗ラットＡｂ（Caltag）を加える。吸光度を４９０nmで測定する。結果は任意の単位として表現し、ＢＬＧ＋ミョウバンを免疫したマウス由来のプール血清を基準血清として使用する。
【０２００】
ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した抗原特異的抗体の産生
腸管からパイエル板を機械的に切除し、５mmol ＥＤＴＡ（Life Technologies）を補充したＨＢＳＳ培地中で３０分間インキュベーションする。同様に、Ｐｅｙｅｒ板および腸間膜リンパ節を穏やかに破砕し、７０μmのナイロンフィルターを通して濾過する。脾臓細胞は、トリス緩衝ＮＨ4Ｃｌ中で５分間予備インキュベーションして赤血球を除去する。リンパ芽球は、Ｐｅｒｃｏｌｌの６０%/６６%勾配（Amersham）で単離する。
【０２０１】
ＢＬＧ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＡ抗体の測定のために、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Millipore）にストレプトアビジンを３７℃で一晩コーティングし、続いてビオチン化ＢＬＧ １μgを３時間加える。Ｐｅｒｃｏｌｌの６０%/６６%勾配で単離したリンパ芽球は、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢおよび５%ＦＣＳを補充したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地中で二つの異なる濃度、すなわち１×１０6および２×１０6個で３７℃で２４時間再懸濁し、続いて抗ＩｇＡ、抗ＩｇＧ１および抗ＩｇＧ２ａ抗体（Southern Biotechnology）と共に４℃で一晩インキュベーションする。１００μL/ウェルのアミノエチルカルバゾールを１０分間加え、ＫＳ  ＥＬＩＳＰＯＴ４．２．１ソフトウェア（Zeiss）を使用してスポットを自動計数し、細胞１０6個あたりの細胞形成単位（CFU）として表わす。
【０２０２】
実施例Ｅ１：ＬＬ−ＩＬ１０は食物アレルギーのマウスモデルにおいてＬＬ−ＢＬＧの寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ＩＬ−１０の添加はＢＬＧへの寛容誘導を有意に高める。それは、ＬＬ−ＢＬＧ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における脾臓細胞のアレルゲン特異的増殖反応は対照群およびＬＬ−ＢＬＧ群に比べて有意に減少するからである。
【０２０３】
実施例Ｅ２：ＬＬ−ＩＬ１０はＢＬＧ特異的抗体反応の減少および前記アレルゲンに反応したＩＬ−４サイトカイン産生の低下に関連する経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記のようにマウスを経口補給する（実験の設定）。ＢＬＧ特異的抗体反応および前記因子に反応したサイトカイン産生は上記のように判定する。ＬＬ−ＢＬＧ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるＢＬＧ特異的抗体レベルおよびＩＬ−４は、対照群およびＬＬ−ＢＬＧ群に比べて有意に低下する。
【０２０４】
実施例Ｅ３：ＬＬ−ＩＬ１０はＣＤ４＋Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４  Ｔ細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性ＣＤ４ Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給し、「細胞培養、増殖およびサイトカインアッセイ」に記載されるようにアレルゲン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を判定する。ＬＬ−ＢＬＧ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるアレルゲン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞反応は、対照群およびＬＬ−ＢＬＧ群に比べて有意に減少する。
【０２０５】
実施例Ｅ４：ＩＬ−１０は経口寛容の強化にＬＬ−ＩＬ１０よりも有効ではない
ＬＬ−ＩＬ１０がＩＬ−１０と同様に有効かどうかを評価するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。脾臓細胞およびリンパ節におけるアレルゲン特異的増殖性ＣＤ４ Ｔ細胞反応を研究する。ＬＬ−ＢＬＧ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるアレルゲン特異的ＣＤ４ Ｔ細胞反応は、ＬＬ−ＢＬＧ＋ＩＬ−１０群に比べて有意に減少する。
【０２０６】
実施例Ｅ５：ＬＬ−ＢＬＧとＬＬ−ＩＬ１０との組み合わせ治療後に抗原に誘導されるＴ調節性細胞はｉｎ  ｖｉｖｏアレルギー様反応からの防御を伝達することができる
経口寛容プロトコールで処置したマウスにおけるアレルギー様反応の能動的な抑制について試験するために、上記（ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ調節性活性アッセイ）の異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する。ＬＬ−ＢＬＧ＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群におけるアレルギー様反応は、対照群およびＬＬ−ＢＬＧ群に比べて有意に減少し、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を示している。
【０２０７】
実施例Ｆ：前記アレルゲンを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓをｉｎ  ｓｉｔｕデリバリーされたＩＬ−１０と組み合わせて経口投与後の、インスリンに対する寛容性の誘導
緒言
自己免疫は、自発性の炎症性組織損傷およびセルフ抗原に対する寛容の欠如に起因する生理学的機能不全を特徴とする。自己免疫は、部分的に活動しすぎる免疫系と関連し、その免疫系は、過剰のＴヘルパー（Ｔｈ）細胞を特徴とする。感受性遺伝子などの素因および環境因子は影響することが困難であるため、免疫療法を開発する近年の努力は、病原性エフェクター細胞を枯渇させ、かつ／または免疫調節性Ｔ細胞を高めることにより、前者細胞と後者細胞との間の機能的均衡を再樹立することに向けられている。膵島β細胞の自己免疫性破壊は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の主要な原因である。この破壊は、いくつかのβ細胞自己抗原に対する細胞性および体液性免疫反応と関連し、両方の免疫反応が疾患の臨床的発症に先行することがある。
【０２０８】
ここでは、ＩＬ−１０産生Ｌ．ｌａｃｔｉｓと組み合わせた自己抗原の経口デリバリーが、抗原特異的ＣＤ４+調節性Ｔ細胞の誘導により糖尿病特異的免疫反応を抑制することを実証する。
【０２０９】
実施例への材料および方法
細菌およびプラスミド
この研究全体にわたりＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３株を使用する。細菌は、ＧＭ１７培地、すなわち０．５%グルコースを補充したＭ１７（Difco Laboratories, Detroit, MI）で培養する。全ての株の保存用懸濁液は、ＧＭ１７中の５０%グリセロールに入れて−２０℃で保存する。胃内接種のために、保存用懸濁液を新鮮ＧＭ１７で２００倍に希釈し、３０℃でインキュベーションする。それらは、１６時間以内に２×１０9コロニー形成単位（CFU）/mLの飽和密度に達する。遠心分離により細菌を採集し、ＢＭ９培地に入れて１０倍に濃縮する。処置のために、胃内カテーテルによりこの懸濁液１００μLの投与を各マウスに毎日受けさせる。ヒトプロインスリンＩＩ  Ｂ２４−Ｃ３６ペプチド（ｈｐＩＩｐ）、ブタインスリンおよび免疫優性ペプチドＩｎｓＢ9-23（Ｂ9-23は、ヒト、ラットおよびマウスという多種にわたり本質的に同一である）をコードしている、最適のＬ．ｌａｃｔｉｓコドン利用を有するＤＮＡ配列を合成し、増幅させ、ラクトコッカスＰ１プロモーターの下流で、エリスロマイシン耐性ｐＴ１ＮＸベクターのＵｓｐ４５分泌シグナルに融合させる。
【０２１０】
マウスＩＬ−１０、ｈｐＩＩｐ、インスリン、ＩｎｓＢ9-23を保有するプラスミドを用いてトランスフォーメーションされたＭＧ１３６３株は、ＬＬ−ＩＬ１０、ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−ｉｎｓｕｌｉｎ、ＬＬ−ＩｎｓＢ9-23と呼ぶ。空のベクターｐＴ１ＮＸを含むＭＧ１３６３であるＬＬ−ｐＴ１ＮＸは対照として役立つ。これらのタンパク質の発現は、抗原特異的ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析を使用して判定する。
【０２１１】
マウス
雌性および雄性非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスおよびＮＯＤ−重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）（Ｂａｌｂ／ｃバックグラウンド）マウスは、Jackson laboratoryから購入する。Ｂａｌｂ／ｃ野生型（ＷＴ）マウスは、Charles River Italyから購入する。マウスは、特定病原体を除去した中央動物施設で維持する。施設のガイドラインに沿ってマウスを処置および使用する。
【０２１２】
実験の設定
予防の設定では、ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−ｉｎｓｕｌｉｎ、ＬＬ−ＩｎｓＢ9-23を単独で、またはＬＬ−ＩＬ１０またはリコンビナントマウスＩＬ−１０（１〜１０μg）と共に、２１日齢（離乳）から開始して、最適な補給方式を使用して、または（大部分のマウスが糖尿病を発生する）１００日齢までＮＯＤマウスに経口投与する。加えて、ＬＬ−ｐＴ１ＮＸを陰性対照として経口投与する。陽性（寛容化）対照群について、３週齢のＮＯＤマウスをヒトインスリン０．８mgで週３回２または４週間経口処置する。糖尿病の発生は、週３回および血中グルコースレベルの糖尿モニタリングの場合に、尿グルコースレベルの連続モニタリングにより判定する。１２〜２３週および実験の終了時（３５週）に膵臓を収集し、連続切片をヘマトキシリン／エオシンで染色し、単核細胞の浸潤を評点するか、または免疫組織化学によりT細胞の浸潤を分析する。治療の設定では、ＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−ｉｎｓｕｌｉｎ、ＬＬ−ＩｎｓＢ9-23を、単独またはＬＬ−ＩＬ１０もしくはリコンビナントマウスＩＬ−１０と共に、安定した糖尿および高血糖を示している糖尿病ＮＯＤ雌に経口投与する（１２〜２３週）。加えて、陰性対照としてＬＬ−ｐＴ１ＮＸを経口投与する。陽性（寛容化）対照群について、Bressonら(2006)に記載されたように糖尿病ＮＯＤマウスを処置する。完全寛解は、糖尿の消失および正常血糖への復帰と定義する。
【０２１３】
寛容誘導の詳細なメカニズムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、特異的自己抗原をＮＯＤマウスに再チャレンジ後にｉｎ  ｖｉｖｏで、およびＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにＴ細胞を養子移入することにより分析する。
【０２１４】
糖尿病の検出：
グルコースのモニタリング：尿グルコースはDiastix（Miles）により測定し、血中グルコースモニタリングシステムOneTouch Ultra（LifeScan Inc.）を用いた血中グルコース測定により確認する。糖尿病は、２５０mg/dlを超える２回の連続する血中グルコース値として定義する。
【０２１５】
膵島炎：マウスは、ＣＯ2を用いた窒息により屠殺し、膵臓を１０%ホルマリン中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、５μmの連続切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。膵島炎スコア（平均±ＳＤ）は、以下のように１０〜１５膵島/マウスにおける細胞浸潤度を顕微鏡で等級分けすることにより判定する：０：膵島浸潤の徴候はみられない、１：膵島周囲への浸潤、２：＜５０%の浸潤、３：＞５０%の浸潤。
【０２１６】
免疫組織化学
膵臓β細胞におけるインスリン、ＣＤ４およびＣＤ８の発現を検出するために、一次Ａｂ（Ｄａｋｏからのモルモット抗ブタインスリン［希釈１：３００］、抗ＣＤ４  ＲＭ４．５、およびBD Biosciencesからの抗ＣＤ８ａ  ＩＨＣ［希釈１：５０］）を、Christenら(2004)に記載されたように凍結組織切片に適用する。
【０２１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ
脾臓、腸間膜ＬＮ（ＭＬＮ）およびＰＬＮの単細胞懸濁液を調製する。総脾臓細胞集団の増殖アッセイ、２×１０5個の細胞は、完全培地単独あるいは段階濃度（１〜１００μg/ml）の精製ヒトインスリンまたはＣＤ４  Ｔ細胞もしくはＣＤ８  Ｔ細胞に特異的なペプチド（それぞれＩｎｓＢ9-23（Ｈ−２dまたはＨ−２g拘束性）およびＩｎｓＢ15-23（Ｋd拘束性））（Sigma）の存在下で、かつ抗ＩＬ−１０または抗ＴＧＦ−β中和モノクローナル抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μlの完全培地に入れて、９６ウェルＵ底プレート中で培養する。中和抗体は、１、０．１および０．０１μg/mlで加える。総ＣＤ３+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団の増殖アッセイのために、０．２×１０5個のＴ細胞は、インスリンまたはＧＡＤ６５またはＣＤ４+Ｔ細胞もしくはＣＤ８+Ｔ細胞に特異的なペプチドをロードされたＷＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスからの照射した脾臓細胞１×１０5個と共に、中和抗体の存在下または不在下のいずれかの合計体積２００μl完全培地に入れて９６ウェルＵ底プレート中で培養する。３７℃の５%ＣＯ2加湿インキュベーター中で７２hr後に、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能を１６〜１８hr後にガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）でチミジンの取込みを測定する。Ｔ細胞は、ＣＤ３+、ＣＤ４+またはＣＤ８+単離キット（MACS; Milteny Biotec, Auburn, CA）を使用した磁気ビーズ分離による負の選択によりＰＬＮまたは脾臓から精製する。ＣＤ４+Ｔ細胞は、総細胞として使用するか、またはＣＤ２５+単離キット（Milteny Biotec）を使用したＭＡＣＳによりＣＤ２５+およびＣＤ２５-にさらに分離する。細胞集団の純度（＞９０%）は、フローサイトメトリー分析により判定する。
【０２１８】
サイトカイン測定のために、上記の異なる増殖アッセイ（抗原特異的刺激）に使用される細胞培養物の上清を培養の７２h後に収集し、サイトカイン分析を行うまで−８０℃で凍結する。サイトカイン産生は、Mouse Inflammation Cytometric Bead Assay（BD Biosciences, Mountain View, CA, USA）を使用して定量する。精製ＣＤ３+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞またはＣＤ８+Ｔ細胞を培養し、それらの細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８混合物（各１μg/ml）で２４時間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非特異的に刺激するか、または対照として未刺激のままとする。上清を採集し、ＢＤ（商標）Cytometric Bead ArrayフレックスセットをBD FACSArray Bioanalyzerで使用して、ＦＣＡＰアレイソフトウェア（BD Biosciences）を使用して、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮγ産生について分析する。捕捉ＥＬＩＳＡ実験は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅキット（R&D Systems）を使用してＴＧＦ−βを判定するために使用する。
【０２１９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞増殖阻害アッセイ
最近糖尿病になった雌性ＮＯＤ（８〜１２週）から単離した精製総脾臓ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞２×１０4個は、ＷＴ  Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の、Ｔ細胞を枯渇され、放射線照射され、インスリンまたはペプチドをロードされた脾臓細胞２×１０4個の存在下で、異なる実験群からの脾臓、ＭＬＮまたはＰＬＮから単離した様々な数のＣＤ８+Ｔ細胞集団、ＣＤ４+Ｔ細胞集団およびＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞集団と共に、共培養する。３７℃の５%ＣＯ2加湿インキュベーター中で７２hr後に、１μCi/ウェルの［3Ｈ］チミジンの添加により増殖を評価する。ＤＮＡに結合した放射能を、１６〜１８hr後にガラス繊維製フィルターマット（Perkin Elmer, Boston, USA）上に採集し、シンチレーションカウンター（Perkin Elmer）でチミジンの取込みを測定する。
【０２２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ
使用するリンパ芽球ターゲットは、Ｂａｌｂ／ｃマウスからのＣｏｎＡ活性化脾臓細胞である。合計１０6個のターゲット細胞を１００μCiの51Ｃｒ（Amersham International, Buckinghamshire, U.K）で３７℃で９０minラベルし、３回洗浄し、それから１μg/mlのペプチド（ＩｎｓＢ15-23または無関係のペプチド）と共に３７℃で１hインキュベーションする。ターゲット細胞を２回洗浄し、１０4個/ウェルで蒔く。脾臓、ＭＬＮおよびＰＬＮから単離したＣＤ８+Ｔ細胞を各ウェルに３回の繰り返しで様々なエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比で加える。プレートを５００rpmで２min遠心分離し、３７℃で４hインキュベーションする。インキュベーション後に、51Ｃｒの放出［%溶解＝１００×（試験cpm−自発cpm）／（総cpm−自発cpm）］の判定のために上清を収集する。間接的殺滅アッセイのために、ＣＤ８+Ｔ細胞は、エフェクターと共にインキュベーションする前に５μg/ml抗ＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、Pharmingen）と共にインキュベーションする。
【０２２１】
糖尿病の養子移入
８〜１０wkのＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに、糖尿病雌性ＮＯＤマウス（６週、１２週および１８週）から単離した脾臓細胞２×１０7個をｉ．ｖ．で、または５×１０6個をｉ．ｐ．で、異なるＬ．ｌａｃｔｉｓ処置実験群から単離した、段階数のビーズ精製ＣＤ３+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ２５-Ｔ細胞、またはＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞と組み合わせて、または組み合わせずに注射する。未処置マウスを対照として用いる。糖尿病の発症を週に３回、血中グルコースレベルの連続モニタリングにより決定する。
【０２２２】
実施例Ｆ１：ＬＬ−ＩＬ１０は、非肥満糖尿病マウスにおけるＬＬ−ｈｐＩＩｐ、ＬＬ−ｉｎｓｕｌｉｎ、ＬＬ−ＩｎｓＢ9-23の寛容誘導能を有意に高める
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。ＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における脾臓細胞の自己抗原特異的増殖反応は、対照群およびＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23群に比べて有意に減少することから、ＬＬ−ＩＬ１０の添加は、自己抗原への寛容誘導を有意に高める。
【０２２３】
実施例Ｆ２：ＬＬ−ＩＬ１０は、膵島炎の低減、β細胞破壊の速度減少、および脾臓細胞によるＩＬ−１０産生増加と関連して経口寛容を強化する
経口寛容の誘導を研究するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。膵島炎の存在、β細胞破壊速度、および前記自己抗原に対するサイトカイン産生は、上記のように判定する。組織学的分析は、対照群およびＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23群に比べてＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群において有意に低度の膵島炎およびβ細胞破壊、ならびにＩＬ−１０産生増加を示す。
【０２２４】
実施例Ｆ３：ＬＬ−ＩＬ１０はＣＤ４+Ｔ細胞を介して経口寛容を高める
ＣＤ４  Ｔ細胞が経口寛容の誘導を仲介するかどうかを評価するために、脾臓細胞およびリンパ節における自己抗原特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。したがって、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給し、自己抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を上記（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイ）の様に判定する。対照群およびＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23群に比べたＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における自己抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応。
【０２２５】
実施例Ｆ４：ＩＬ−１０は経口寛容の強化にＬＬ−ＩＬ１０よりも有効ではない
ＬＬ−ＩＬ１０がＩＬ−１０と同様に有効であるかどうかを評価するために、上記（実験の設定）のようにマウスに経口補給する。脾臓およびリンパ節における自己抗原特異的増殖性ＣＤ４  Ｔ細胞反応を研究する。ＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23＋ＩＬ−１０群に比べたＬＬ−ｈｐＩＩｐ／ｉｎｓｕｌｉｎ／ＩｎｓＢ9-23＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群における自己抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞反応。
【０２２６】
実施例Ｆ５：ＬＬ−ＩｎｓＢ15-23とＬＬ−ＩＬ１０との組み合わせ治療後のＮＯＤマウスにおいて自己攻撃性ＣＤ８+反応は抑制される
本発明者らの組み合わせアプローチが、バイスタンダー抑制メカニズムにより糖尿病をモデュレーションすることができる抑制性ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導するかどうかを調べるために、ＣＤ８＋自己攻撃性Ｔ細胞が受ける効果を分析する。抗原特異的自己攻撃性ＣＤ８＋Ｔ細胞の率および／または活性は、組み合わせ治療後に強く減少する。
【０２２７】
実施例Ｆ６：ＬＬ−ＩｎｓＢ15-23とＬＬ−ＩＬ１０との組み合わせ治療後の抗原誘導性Ｔ調節性細胞は、アレルギー様反応の防御をｉｎ  ｖｉｖｏで伝達することができる。
経口寛容プロトコールで処置したマウスにおける糖尿病様反応の能動的抑制を試験するために、上記のように異なる処置群からの脾臓細胞を養子移入する（糖尿病の養子移入）。対照およびＬＬ−ＩｎｓＢ9-23群に比べて、ＬＬ−ＩｎｓＢ9-23＋ＬＬ−ｍＩＬ−１０群では、糖尿病様反応は有意に減少し、これは、本発明者らの組み合わせ経口寛容プロトコールにおける調節性ＣＤ４+Ｔ細胞の活性化を示している。
【０２２８】
【表１７】
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【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】Ｂａｌｂ／ｃマウスにＧＭ  Ｌ．ｌａｃｔｉｓまたは卵アルブミンタンパク質（ＯＶＡ）を経口補給後の膝窩および鼠径部リンパ節（ＰＬＮ／ＩＬＮ）における増殖性免疫反応を示す図である。ＯＶＡ特異的増殖反応は、完全フロイントアジュバント中のＯＶＡを用いてマウスを皮下チャレンジ（第０日）した１１日後に測定した。第−４６から−４２、−３９から−３５、−３２から−２８、−２５から−２１、−１８から−１４、−１１から−７、−４から−１日に混合Ｌ．ｌａｃｔｉｓ懸濁液の投与をマウスに受けさせた。ＬＬ−ｐＴ：ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ（ベクター対照）およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液、ＬＬ−ＯＶＡ：卵アルブミンを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ株およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液、ＬＬ−ＯＶＡ＋ＬＬ−ｍＩＬ１０：ＬＬ−ＯＶＡおよびマウスインターロイキン１０を分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ株の混合細菌懸濁液。陽性対照１には第−７日にＯＶＡ ２０mgの投与を受けさせた。陽性対照２にはＬ．ｌａｃｔｉｓ補給と同日にＯＶＡ １μgの投与を受けさせた。示した結果は、マウス４匹を有する群から３回の繰り返しで培養したプール細胞についての、ｃｐｍ単位（±ＳＤ）の平均［3Ｈ］チミジン取り込みである。
【図２】Ｂａｌｂ／ｃマウスにＧＭ  Ｌ．ｌａｃｔｉｓまたはＯＶＡを経口補給後のＭＬＮおよびＰＬＮ／ＩＬＮにおけるサイトカイン反応を示す図である。対照マウスおよびＧＭ  Ｌ．ｌａｃｔｉｓまたはＯＶＡを補給したマウスにおけるＩＬ１２ｐ７０（ａ）、ＴＮＦ−α（ｂ）、ＩＦＮ−γ（ｃ）、ＭＣＰ−１（ｄ）、ＩＬ−１０（ｅ）およびＩＬ−６（ｆ）の分泌を評価した。３００μg/ml  ＯＶＡでｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激後に、マウス炎症キットを使用してＣＢＡ（BD Bioscience）によりサイトカインの存在についてＭＬＮ（Ａ）およびＰＬＮ／ＩＬＮ（Ｂ）細胞の細胞培養上清を試験した。示した結果は、マウス４匹を有する群からのプール細胞によるサイトカイン産生である。
【図３】Ｂａｌｂ／ｃマウスにＧＭ  Ｌ．ｌａｃｔｉｓまたは卵アルブミンタンパク質（ＯＶＡ）を経口補給後のＰＬＮ／ＩＬＮにおけるＯＶＡ特異的増殖性ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示す図である。ＯＶＡ特異的増殖性反応は、完全フロイントアジュバント中でＯＶＡを用いてマウスを皮下チャレンジ（第０日）した１１日後に測定した。第−４６から−４２、−３９から−３５、−３２から−２８、−２５から−２１、−１８から−１４、−１１から−７、−４から−１日に混合Ｌ．ｌａｃｔｉｓ懸濁液の投与をマウスに受けさせた。ＬＬ−ｐＴ：ＬＬ−ｐＴ１ＮＸ（ベクター対照）およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液、ＬＬ−ＯＶＡ：卵アルブミンを分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ株およびＬＬ−ｐＴ１ＮＸの混合細菌懸濁液、ＬＬ−ＯＶＡ＋ＬＬ−ｍＩＬ１０：ＬＬ−ＯＶＡおよびマウスインターロイキン１０を分泌しているＬ．ｌａｃｔｉｓ株の混合細菌懸濁液。陽性対照１には第−７日にＯＶＡ ２０mgの投与を受けさせた。陽性対照２にはＬ．ｌａｃｔｉｓ補給と同日にＯＶＡ １μgの投与を受けさせた。示した結果は、マウス４匹を有する群から３回の繰り返しで培養したプール細胞についての、ｃｐｍ単位（±ＳＤ）の平均［3Ｈ］チミジン取り込みである。
【図１】
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【図２Ａ（ａ）】
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【図２Ａ（ｂ）】
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【図２Ａ（ｃ）】
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【図２Ａ（ｄ）】
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【図２Ａ（ｅ）】
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【図２Ａ（ｆ）】
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【図２Ｂ（ａ）】
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【図２Ｂ（ｂ）】
0005410759.tif 000029
【図２Ｂ（ｃ）】
0005410759.tif 000030
【図２Ｂ（ｄ）】
0005410759.tif 000031
【図２Ｂ（ｅ）】
0005410759.tif 000032
【図２Ｂ（ｆ）】
0005410759.tif 000033
【図３】
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【配列表】
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