(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４）。
【請求項２】
請求項１に記載のラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４）である乳酸菌、或いは、その菌体処理物または菌体の抽出残渣を含有する組成物。
【請求項３】
乳酸菌が生菌または死菌である請求項２記載の組成物。
【請求項４】
乳酸菌由来成分が、乳酸菌の熱水抽出残渣であることを特徴とする請求項２記載の組成物。
【請求項５】
抗アレルギー剤として使用するための、請求項２〜４いずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
抗関節炎剤として使用するための、請求項２〜４いずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
糖尿病改善剤として使用するための、請求項２〜４いずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項２〜７いずれか１項に記載の組成物を含有する食品。
【請求項９】
機能性食品またはサプリメントである請求項８記載の食品。
【請求項１０】
請求項２〜７いずれか１項に記載の組成物を含有する飼料。
【請求項１１】
請求項２〜７いずれか１項に記載の組成物を含有する医薬品または動物用医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規乳酸菌及び該乳酸菌由来成分を有効成分とする製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化、住居環境、運動不足、過度のストレス等、生活環境の変化により、アレルギー性疾患やメタボリックシンドロームといった、国民病の患者数並びにその予備軍数は年々増加傾向にある。【０００３】
アレルギー性疾患、なかでも花粉症やアトピー性皮膚炎の患者数は年々増加傾向にあり、患者のＱＯＬの観点からも、治療・予防策が求められている。花粉症やアトピー性皮膚炎などのI型にグループ分けされるアレルギー性疾患は、生体内に侵入した物質をアレルゲンと認識し、ＩｇＥ抗体産生を誘導する事から始まる。再度アレルゲンが浸入すると、肥満細胞や顆粒球上のレセプター分子と結合したＩｇＥ抗体とアレルゲンが結合、その結果、肥満細胞や顆粒球より過剰なヒスタミンやロイコトリエンなどのケミカルメディエーターが放出され、喘息・皮膚炎・鼻水などのアレルギー症状を呈する。【０００４】
現在、これらケミカルメディエーターの遊離を抑えることでアレルギー症状を緩和する抗アレルギー剤、ケミカルメディエーターが末梢神経に情報伝達するのを阻害する抗ヒスタミン剤、炎症を抑えるステロイド剤などが開発されているが、これらの薬剤には副作用が認められ、使用方法や長期にわたる使用では安全性にも問題があるのが現状である。【０００５】
また、糖尿病・高脂血症・高血圧などのいわゆる生活習慣病の患者数もまた、増加の一途をたどっている。これら疾患の原因としてあげられるのが、偏った食生活、運動不足、飲酒や喫煙等の好ましくない生活習慣の積み重ねなどであると考えられている。これら疾患の治療・予防方法として食事療法及び運動療法が有効な手段とされているが、こういった療法を根気良く続ける事は難しく、心理的、肉体的苦痛を伴うことなく治療・予防する方法が求められている。【０００６】
一方、乳酸菌を用いた発酵食品の中には、整腸作用や生活習慣病予防効果、免疫賦活効果などの健康効果を示すものがあり注目されている。例えば、ヨーグルトでは、発酵に用いた乳酸菌体や、発酵乳中の乳ペプチドが上記のような健康機能を示す事が報告されている。現在では、乳酸菌や発酵食品の抗アレルギー機能（例えば特許文献１、２：特開平９−２９５９号公報、特許第３５８５４８７号公報）、抗高脂血症機能（特許文献３：特開平１０−２９８０８３号公報）、抗糖尿病機能（特許文献４：特開平１０−７５７７号公報）などが注目されている。それらの中でも、特許文献２に記載のラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４）は特に抗アレルギー作用が高いと報告されているが、まだ充分なものとは言えない。また、１つの乳酸菌で複数の高機能を有するものはあまり知られていない。
【特許文献１】特開平９−２９５９号公報
【特許文献２】特許第３５８５４８７号公報
【特許文献３】特開平１０−２９８０８３号公報
【特許文献４】特開平１０−７５７７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、安全性が高い乳酸菌またはその乳酸菌由来成分を含有する、有用な組成物を提供する事にある。さらには、抗アレルギー機能、抗自己免疫疾患機能、糖尿病改善機能または中性脂肪低減機能などを有する乳酸菌及びその該乳酸菌由来成分を含有する製剤を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、特定のラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスの乳酸菌が、優れた抗アレルギー機能を有し、さらには、抗自己免疫疾患機能、糖尿病改善機能、中性脂肪低減機能など少なくとも１つは併せ持つことを発見し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、本発明は、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−０３７株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９５）、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４）、およびそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1つの乳酸菌またはその乳酸菌由来成分を含有する組成物に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、安全性が高い乳酸菌またはその乳酸菌由来成分を含有する組成物が提供できる。本発明の組成物は、今や国民病とされているアレルギーの予防・改善に有効な抗アレルギー剤として使用できるのみならず、抗自己免疫疾患剤、糖尿病改善剤、中性脂肪低減剤などの製剤として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】アトピー性皮膚炎を誘発したマウスの皮膚炎スコアの経時変化に対する本発明の組成物の効果
【図２】アトピー性皮膚炎を誘発したマウスの耳介厚の経時変化に対する本発明の組成物の効果
【図３】マルトース水溶液を経口投与してからの血糖値の経時変化に対する本発明の組成物の効果
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。【００１３】
本発明の組成物は、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−０３７株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９５）、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４）、およびそれらの変異体からなる群より選択される少なくとも1つの乳酸菌またはその乳酸菌由来成分を含有する組成物である。【００１４】
本発明の組成物に含有されるラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−０３７株（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KR-037、以下「ＫＲ−０３７株」ともいう）は、発酵乳より分離された、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスに属する新規な乳酸菌であり、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９５として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている（原寄託日２００７年８月９日の国内寄託株をブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管（２００８年９月２２日））。なお、本発明においてＫＲ−０３７株は、該株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基より５４４番目の塩基までをシーケンスし、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティス標準株と９０％以上の相同性を確認したため、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスと同定した。【００１５】
また、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KLAB-4、以下「ＫＬＡＢ−４株」ともいう）は、発酵乳より分離された、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスに属する新規な乳酸菌であり、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４として独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている（原寄託日２００７年８月９日の国内寄託株をブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管（２００８年９月２２日））。なお、本発明において、ＫＬＡＢ?４株は、該株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の５’末端の塩基より５４４番目の塩基までをシーケンスし、ラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティス標準株と９０％以上の相同性を確認したためラクトバチルス属デルブリッキー種亜種ラクティスと同定した。【００１６】
上記２種の乳酸菌は、後述の実施例で示すとおり、いずれも優れた抗アレルギー機能を有しているだけでなく、ＫＲ−０３７株は中性脂肪低減機能を、ＫＬＡＢ−４株は抗自己免疫疾患機能と糖尿病改善機能を有している。【００１７】
本発明において、抗アレルギー機能は、例えば後述する実施例のように、卵白アルブミン（ＯＶＡ）を免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞を、ＯＶＡならびに被検物質とを添加した培地で培養し、脾細胞の産生したサイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−４）を測定することで評価できる。被検物質を添加していない培地で培養した脾細胞の産生したサイトカインＩＬ−１２、ＩＬ−４産生量に比べて、被検物質を添加することにより、脾細胞のＩＬ−１２の産生が誘導され、かつＩＬ−４の産生が抑制されていれば、被検物質は抗アレルギー機能を有すると評価する。【００１８】
また、抗アレルギー機能は、被検物質を経口投与したマウスにＯＶＡを免疫し、そのマウスの血中総ＩｇＥ量を測定することでも評価できる。被検物質を投与していないマウスと比べて血中総ＩｇＥ量が減少していれば、被検物質は、抗アレルギー機能を有すると評価する。【００１９】
抗自己免疫疾患機能は、通常の方法に準じて、例えば、後述する実施例のように、以下の方法で評価できる。まず、コラーゲン誘発関節炎モデルマウス（ＤＢＡ／１Ｊマウス）をウシＩＩ型コラーゲンで免疫し、関節炎を誘発したマウスに被検物質を経口投与する。被検物質を投与していないマウスの関節炎の発症率に対し、被検物質を経口投与したマウスにおいて、関節炎の発症率が低減していることを確認できた場合に、抗自己免疫疾患機能を有すると評価することができる。また、上記処理を行ったマウスの病態変化を観察する事でも抗自己免疫効果を評価する事ができる。即ち、被検物質を投与していないマウスの、関節炎の病態スコアが上昇しつづけるのに対し、被検物質を経口投与したマウスの病態スコアが安定し病体が悪化を防ぐ事が確認できた場合に抗自己免疫疾患機能を有すると評価することもできる。【００２０】
糖尿病改善機能（抗糖尿病機能）は、例えば、後述する実施例のように、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）の糖負荷試験による血糖値の経時的推移を測定し、糖負荷により上昇した血糖値が速やかに低下することを確認することで評価する事ができる。【００２１】
中性脂肪低減機能は、後述する実施例のように、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）の血液中中性脂肪量を測定し、被検物質を投与していないマウスの血液中中性脂肪量と比べて有意に低下することで評価できる。【００２２】
抗アレルギー機能を有する乳酸菌としては、上記ＫＲ−０３７株とＫＬＡＢ−４株の他、ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−１８８株（Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis KR-188、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−３９６）、エンテロコッカス・デュランス  ＫＲ−２１１株（Enterococcus durans KR-211、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−３９７）、ロイコノストック・メセントロイデス・サブスピーシーズ・メセントロイデス  ＫＬＡＢ−２株（Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides KLAB-2、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−３９３）などが挙げられる。  【００２３】
本発明においては、上記ＫＲ−０３７株またはＫＬＡＢ−４株だけでなく、それらの変異体も同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属し、上記ＫＲ−０３７株またはＫＬＡＢ−４株の代わりに本発明の組成物に含有させることができる。このような変異体としては、特に限定されず、自然突然変異によるもの、放射線や突然変異誘導物質などの公知の方法で人為的に突然変異を誘導させて得られたものなどが挙げられる。【００２４】
上記ＫＲ−０３７株、ＫＬＡＢ−４株またはそれらの変異体の培養には、それらが生育可能な培地であればいかなる培地を使用してもよく、培養方法については、試験管培養、フラスコ培養、発酵槽による培養等により培養することができ、特に制限されるものではないが、たとえば乳酸菌培養に一般的に使用されているＭＲＳ培地を用い、一般的な条件で通常の乳酸菌培養を行えばよい。【００２５】
本発明の組成物に含有される、ＫＲ−０３７株、ＫＬＡＢ−４株またはそれらの変異体は、生菌でも死菌（死滅菌）  でもよい。ここで生菌とは、生きたままの乳酸菌のことであり、死菌（死滅菌）とは、加熱、加圧、薬物処理などにより殺菌処理をした菌体のことである。【００２６】
さらに本発明においては、上記ＫＲ−０３７株、ＫＬＡＢ−４株またはそれらの変異体の乳酸菌由来成分も、同等の機能を有する限り、本発明の技術範囲に属し、上記ＫＲ−０３７株、ＫＬＡＢ−４株またはその変異体の代わりに本発明の組成物に含有させることができる。ここでいう乳酸菌由来成分とは、これら乳酸菌の磨砕や破砕、抽出などによる液状物化、濃縮、ペースト化、乾燥（スプレードライ、凍結乾燥、真空乾燥、ドラム乾燥など）、希釈から選ばれる少なくとも一つの処理を施した処理物（菌体処理物）の他、乳酸菌の抽出残渣を用いても上記乳酸菌またはその変異体と同様の効果を得ることができる。このうち抽出残渣として、例えば、菌体を煮沸水または熱水で処理し、菌体からエキスを抽出した後の残渣を遠心分離により回収した沈殿物である熱水抽出残渣が好ましい。【００２７】
ＫＲ−０３７株、ＫＬＡＢ−４株、それらの変異体、またはそれらの乳酸菌由来成分を含有する本発明の組成物（以下、単に「本発明の組成物」ともいう）は、優れた抗アレルギー効果を有することから、抗アレルギー機能を有する製剤、すなわち抗アレルギー剤として使用できる。本発明の抗アレルギー剤は、その抗アレルギー機能のレベルが非常に高いことが特徴である。本発明の抗アレルギー剤は、Ｔｈ２型に傾いた生体内免疫系において、抗原刺激に対する免疫応答をＴｈ１型免疫応答に変える作用を有し、また、抗原特異的ＩｇＥの産生量（抗体価）を抑えることができる。従って、花粉症やアトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎といったアレルギー性疾患を予防または改善することが出来る。【００２８】
さらに本発明の組成物は、抗アレルギー機能に加えて、抗自己免疫疾患機能、抗糖尿病機能、中性脂肪低減機能などを少なくとも１つは併せ持つことから、抗アレルギー剤としてだけでなく、抗自己免疫疾患剤や、糖尿病改善剤、中性脂肪低減剤としても使用できる。【００２９】
本発明の抗自己免疫疾患剤は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、橋本氏病、潰瘍性大腸炎、クローン病などの自己免疫疾患の発症を予防したり、発症時期を遅らせたり、その病態スコアの上昇を抑制し、病体の悪化を防いだり、病態を改善する作用を有する。本発明の糖尿病改善剤は、糖負荷後の上昇した血糖値を速やかに低下させ、糖代謝異常を改善するなど、糖尿病を改善する効果またはその発症を予防する作用を有する。本発明の中性脂肪低減剤は、血液中の中性脂肪量を低減させ、血中中性脂肪濃度をコントロールし、脂質代謝異常や高脂血症を予防または改善する効果を有する。【００３０】
本発明の組成物は、飼料（ペットフードを含む）、動物用医薬品、または医薬品として使用できる。【００３１】
本発明の組成物を飼料または動物用医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。そして該製剤は、配合飼料や混合飼料に混合することもできるし、飲水に懸濁して与える事もできる。あるいは、本発明の組成物をそのまま飼料に混合してもよい。これらの場合、本発明の組成物は、乳酸菌或いは乳酸菌由来成分として、動物の種類に関わらず、一日あたり、好ましくは０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、が摂取できるよう１回ないし数回に分けて与える。【００３２】
本発明の組成物を医薬品として用いる場合は、その剤形は特に限定されず、例えばカプセル剤、シロップ剤、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、ドリンク剤、注射剤、輸液、点鼻剤、点眼剤、座薬、貼付剤、噴霧剤などが挙げられる。製剤化においては、薬剤学的に許容されるほかの製剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、酸化防止剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、安定化剤などを適宜添加して調製することができる。その場合本発明の組成物の投与量としては、乳酸菌或いは乳酸菌由来成分として、成人一人一日当たり、好ましくは０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１０〜３００ｍｇ／ｋｇ体重を摂取できるよう１回ないし数回に分けて投与する。【００３３】
さらに本発明の組成物は、食品として日常的に摂取することも出来る。本発明の組成物を含有する食品の形態は、特には限定されず、例えば、食用油脂組成物、調理油類、スプレー油類、バター類、マーガリン類、ショートニング類、ホイップクリーム類、濃縮乳類、ホワイトナー類、ドレッシング類、ピックル液類、パン類、ケーキ類、パイ類、クッキー類、和菓子類、スナック菓子類、油菓子類、チョコレート及びチョコレート菓子類、米菓類、ルウ類、ソース類、たれ類、トッピング類、氷菓類、麺類、ベーカリーミックス類、フライ食品類、加工肉製品類、豆腐・こんにゃくなどのその他加工品、水産練り製品類、冷凍アントレ類、畜産冷凍食品、農産冷凍食品などの冷凍食品類、米飯類、ジャム類、チーズ、チーズフード、チーズ様食品、ガム類、キャンディー類、発酵乳類、缶詰類、飲料類などの一般食品形態の他、カプセル剤や錠剤などのサプリメント形態で、特定保健用食品、栄養機能食品などの保健機能食品や、健康食品、栄養補助食品などの機能性食品とすることができる。上記機能性食品やサプリメントの場合、アレルギー症状の予防や改善のために用いるものであるとの表示をすることもできる。本発明の組成物を食品とする場合の乳酸菌或いは乳酸菌由来成分の含有量は特に限定されないが、例えば食品中、０．００００１〜１００重量％、好ましくは０．００１〜５０重量％、さらに好ましくは０．１〜３０重量％の割合となるように含有させることが出来る。【００３４】
本発明の組成物は、投与対象に投与することによって、ＩＬ−４の産生を抑制し、ＩＬ−１２の産生を促進させるため、Ｔｈ２型に傾いた生体内免疫をＴｈ１型の免疫応答に変えることができ、また抗原特異的ＩｇＥの産生量を抑制することで、アレルギー症状をコントロールまたは改善し、アトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患を予防または改善することが出来る。すなわち、本発明の組成物を投与対象に投与する、アレルギー性疾患の処置方法もまた本発明の一態様である。この場合の投与対象としては特に限定されないが、アレルギー性疾患患者、アレルギー症状を呈しているものや、現在、アレルギー症状は出ていないが、抗体検査等でそのリスクを潜在的に有していることが確認されている健常者または健常動物などが挙げられる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお実施例においては、以下に示す方法で、抗アレルギー機能、抗自己免疫疾患機能、糖尿病改善機能、中性脂肪低減機能を評価した。【００３６】
＜抗アレルギー機能の評価＞
ＯＶＡを抗原として免疫したアレルギーモデルマウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス）の脾細胞を、ＯＶＡと被検物質で共培養した際に、ＩＬ−４の産生を抑制し、ＩＬ−１２の産生を促進する事ができるかどうかで評価した。【００３７】
また、被検物質を経口投与したマウスにＯＶＡを経時的に免疫し、血清中ＩｇＥを測定し、被検物質を投与していないマウスの血清中ＩｇＥ量は経時的に増加するのに対して、被検物質を経口投与したマウスの血清中ＩｇＥ量の増加が抑制されるかどうかでも評価した。【００３８】
＜アトピー性皮膚炎改善機能の評価＞
被検物質を経口投与したアトピー性皮膚炎モデルマウス（Ｎｃ／Ｎｇａ系ＳＰＦ雄性マウス）に、ピクリルクロライドを背部および左右の耳介（内外両側）に塗布することでマウスにアトピー性皮膚炎を誘発させ、皮膚炎スコアならびに耳介厚を調べた。被検物質を投与していないマウスは、皮膚炎スコアならびに耳介厚が経時的に増加するのに対して、被検物質を経口投与したマウスの皮膚炎スコアならびに耳介厚の経時的増加の抑制傾向が見られるか否かで評価した。【００３９】
＜抗自己免疫疾患機能の評価＞
コラーゲン誘発関節炎モデルマウス（ＤＢＡ／１Ｊマウス）をウシＩＩ型コラーゲンで免疫し、関節炎を誘発したマウスに被検物質を経口投与し、４０〜４５日後の関節炎の発症率を調べた。通常、コラーゲン誘発関節炎モデルマウスは、４０〜４５日後にかけて関節炎を１００％発症するのに対して、被検物質を経口投与することで、関節炎の発症率が低減するかどうかで評価した。また、上記マウスの病態スコアの経時変化を観察することでも抗自己免疫疾患機能を評価した。【００４０】
＜糖尿病改善機能の評価＞
糖尿病改善機能は、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）の糖負荷試験による血糖値の経時的推移を測定することで評価した。即ち、被検物質の代わりに水を経口投与したマウスでは、糖負荷試験により上昇した血糖値の経時的降下が鈍いのに対して、被検物質を経口投与したマウスの、糖負荷試験により上昇した血糖値がその後速やかに低下するか否かで評価した。【００４１】
＜中性脂肪低減機能の評価＞
中性脂肪低減機能は、２型糖尿病モデルマウス（ＫＫ−Ａｙマウス）の血液中中性脂肪量を測定することで評価した。即ち、被検物質の代わりに水を経口投与したマウスの血液中中性脂肪量と比べて、被検物質を経口投与したマウスの血液中中性脂肪量が有意に低下しているか否かで評価した。【００４２】
（製造例１〜５）  各乳酸菌の調製
表１に記載の乳酸菌（製造例１：ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−０３７株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９５）、製造例２：ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＬＡＢ−４株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３９４）、製造例３：ラクトバチルス・デルブリッキー・サブスピーシーズ・ラクティス  ＫＲ−１８８株（ＮＩＴＥ  Ｐ−３９６）、製造例４：エンテロコッカス・デュランス  ＫＲ−２１１株（ＮＩＴＥ  Ｐ−３９７）、製造例５：ロイコノストック・メセントロイデス・サブスピーシーズ・メセントロイデス  ＫＬＡＢ−２株（ＮＩＴＥ  Ｐ−３９３）を、それぞれ、ＭＲＳ培地（ＭＲＳブイヨン（関東化学株式会社製）５２ｇを１Ｌの水に溶解し１２１℃、１５分オートクレーブ滅菌したもの）で４８時間培養し、培養後の乳酸菌細胞を滅菌した蒸留水で３回洗浄後、凍結乾燥して、それぞれの乳酸菌の凍結乾燥菌体を得た。【００４３】
さらに、これら凍結乾燥菌体を、１ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）（商品名：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ社製）で懸濁して、沸騰浴中で１０分間殺菌後、遠心分離して得られた残渣を再びＰＢＳ（−）に懸濁し、乳酸菌液１〜５を調製した。
（実施例１〜２、参考例１〜３）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギーの測定
本実験には、５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間の馴化飼育後用いた。アレルギーモデルマウスは、１００μｇのＯＶＡと２ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを混合し、生理食塩水で２００μｌとした抗原液を、上記ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に免疫し（一次免疫）、一週間後更に同量の抗原液を腹腔内に免疫（二次免疫）することで作製した。二次免疫より１週間後、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定、抗体価の確認を行った。抗体価の上昇が確認されたマウス（アレルギーモデルマウス）より脾細胞を調製後、２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地（商品名：ＲＰＭＩ１６４０、Ｓｉｇｍａ社製）に懸濁、抗原刺激としてＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と、表１に示す乳酸菌液１〜５（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加えた。さらに脾細胞を、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７日間培養し、培養後の上清を回収し、上清に含まれるＩＬ−４ならびにＩＬ−１２をＥＬＩＳＡ法（製品名：Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）にて測定し、その測定値を評価値とした。それらの結果は表１に示した。【００４４】
【表１】
0005554994.tif 000002
【００４５】
（比較例１）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能の測定
ネガティブコントロールとして、乳酸菌液を添加せずＰＢＳ（−）を用いた以外は、実施例１〜２と同様にして抗アレルギー機能の測定を行った。結果は表１にまとめた。【００４６】
（参考例４）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能の測定
ポジティブコントロールとして、乳酸菌液を添加せず、Ｔｈ１活性化能を有する免疫賦活剤ピシバニール（中外製薬株式会社製）１μｇ／ｍｌを用いた以外は、実施例１〜２と同様にして抗アレルギー機能の測定を行った。結果は表１にまとめた。【００４７】
（参考例５）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験による乳酸菌群の抗アレルギー機能の測定
特許第３５８５４８７号と比較するために、乳酸菌を用いたポジティブコントロールとして、製造例１〜５で使用した乳酸菌の代わりに、抗アレルギー活性を有するとされる乳酸菌ラクトバチルス・カゼイ・Ｌ１４株（乳業技術協会、ラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４と同一）を用いて、製造例１〜５と同様に乳酸菌液を作製し、実施例１〜２と同条件で抗アレルギー機能の測定を行った。結果は表１にまとめた。【００４８】
表１は、アレルギーモデルマウス脾細胞のＯＶＡと乳酸菌の共培養に対するＩＬ−４、ＩＬ−１２の産生量を示したものである。乳酸菌を添加しなかった比較例１において、アレルギーモデルマウス脾細胞はＯＶＡ刺激に対して、ＩＬ−４の産生が誘導され、一方ＩＬ−１２の産生量は検出限界以下と、強いＴｈ２型免疫応答を示した。一方、ピシバニールを用いた参考例４において、アレルギーモデルマウス脾細胞は、ＯＶＡ刺激に対して、ＩＬ−４の産生抑制、ＩＬ−１２の産生誘導を示す、Ｔｈ１型免疫応答を示した。また、ラクトバチルス・カゼイ・Ｌ１４株を用いた参考例５においては、参考例４と同様Ｔｈ１型免疫応答を示した。実施例１、２、参考例１〜３においても、ＩＬ−４の産生抑制、ＩＬ−１２の産生誘導を示した。特に、実施例１の結果より、ＫＲ−０３７株には、Ｔｈ１型免疫応答を誘導する強い抗アレルギー活性が確認され、参考例５の乳酸菌と比較して、ＩＬ−１２の産生を約２倍に活性化させ、ＩＬ−４産生を３分の２に抑制したことより、その抗アレルギー活性レベルは高いことがわかった。また、実施例２の結果より、ＫＬＡＢ−４株は、ＩＬ−１２の産生活性の誘導は弱いものの、ＩＬ−４産生の抑制活性が参考例５の乳酸菌より強く、強い抗アレルギー機能を有する可能性が示唆された。【００４９】
（実施例３）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗アレルギー機能の測定
まず、製造例１で調製したＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体０．０５重量部と賦形剤（商品名：パインデックス＃２  松谷化学工業株式会社製）０．４５重量部を予め良く混合し、乳酸菌製剤を作製した。作製した乳酸菌製剤０．５重量部と、粉末マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母株式会社製）９９．５重量部を混合し、乳酸菌製剤の含有量が０．５重量％の乳酸菌製剤混合飼料を調製した。【００５０】
５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールス・リバー株式会社製）を１週間馴化飼育した後、乳酸菌製剤混合飼料の投与を開始し（乳酸菌製剤として、平均約１５ｍｇ／日程度を自由摂取）、その開始日より１週間後（Ｄａｙ７）に１００μｇのＯＶＡと２ｍｇの水酸化アルミニウムゲルを混合し、生理食塩水で２００μｌとした抗原液を、腹腔内に免疫した。同様にして、２週間後（Ｄａｙ１４）、４週間後（Ｄａｙ２８）、６週間後（Ｄａｙ４２）、８週間後（Ｄａｙ５６）にＯＶＡ抗原液を免疫した。そして、血中総ＩｇＥ量測定のために、３週間後（Ｄａｙ２１）、５週間後（Ｄａｙ３５）、７週間後（Ｄａｙ４９）、９週間後（Ｄａｙ６３）にマウス頸静脈より採血した。採血した血液を遠心分離により血清を回収し、免疫グロブリンＥ／ＥＩＡキット「ヤマサ」（ヤマサ醤油株式会社製）を用いて血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。【００５１】
【表２】
0005554994.tif 000003
【００５２】
（実施例４）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗アレルギー機能の測定
ＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体の代わりに、製造例２で調製したＫＬＡＢ−４株の凍結乾燥菌体を用いた以外は、実施例３と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。【００５３】
（参考例６〜８）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗アレルギー機能の測定
ＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体の代わりに、製造例３〜５で調製した各乳酸菌の凍結乾燥菌体をそれぞれ用いた以外は、実施例３と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。【００５４】
（比較例２）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗アレルギー機能の測定
乳酸菌製剤混合飼料の代わりに、乳酸菌製剤を添加しない粉末マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母株式会社製）を用いた以外は、実施例３と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。【００５５】
（参考例９）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗アレルギー機能の測定
特許第３５８５４８７号と比較するために、乳酸菌製剤混合飼料としてラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０からなる健康補助食品（製品名：ノアレカプセル、キリンヤクルトネクストステージ株式会社製）０．０７５重量部と粉末マウス飼料９９．９２５重量部とを混合した乳酸菌混合飼料を用いた以外は、実施例３と同様にして、回収した血清中に含まれる総ＩｇＥ量を測定した。各測定値は表２に示した。【００５６】
なお、実施例３〜４、比較例２、参考例６〜９の実験間における、マウスの体重、総摂餌量に差は認められなかった。【００５７】
表２の結果より、以下のことがわかった。飼料に乳酸菌製剤を混合していないコントロール群（比較例２）と比べて、Ｄａｙ６３の時点で参考例９の飼料を与えたマウスの血中総ＩｇＥ量は減少していた。また、実施例３，４、参考例６〜８の乳酸菌製剤混合飼料を与えたマウスの血中総ＩｇＥ量も同様に、比較例２のコントロールと比べて、Ｄａｙ６３時点での血中総ＩｇＥ量が減少していた。表２の結果から、特に製造例１のＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体を含有する製剤は、参考例９の製剤同様、抗アレルギー活性の高い製剤であることが確認できた。なお本実験における総ＩｇＥ量の変化は、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量の変化と考えられることから、本発明の組成物に抗アレルギー効果が認められたことを示している。【００５８】
（実施例５）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗アトピー性皮膚炎機能の測定
まず、製造例１で調製したＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体０．３３重量部と粉末マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  日本クレア株式会社製）９９．６７重量部を混合し、凍結乾燥菌体の含有量が０．３３重量％の乳酸菌混合飼料を調製した。【００５９】
７週齢のＮｃ／Ｎｇａ系ＳＰＦ雄性マウス（日本チャールス・リバー株式会社製）を１週間馴化飼育した後、上記乳酸菌混合飼料の投与を開始（製剤として平均１０ｍｇ／日程度を自由摂取）し、開始日より１日後（Ｄａｙ１）にマウスをイソフラン麻酔し、剃毛した腹部および足蹠に感作用ＰｉＣｌ溶液（５％（ｗ／ｖ）ＰｉＣｌ溶液（溶媒：エタノール／アセトン＝４：１））、１５０μｌを塗布した。アトピー性皮膚炎の誘発は感作後４日（Ｄａｙ５）にマウスの背部および左右の耳介（内外両側）に誘発用ＰｉＣｌ溶液（０．８％（ｗ／ｖ）ＰｉＣｌ溶液（溶媒：オリーブ油））、１５０μｌを塗布することで行った。このアトピー性皮膚炎誘発操作を１週間毎に７回実施した。感作開始日（Ｄａｙ１）より週２回、皮膚の状態を観察し、ヒトのアトピー性皮膚炎の臨床状評価基準に基づき、掻痒症、発赤・出血、浮腫、擦傷・組織欠損、痂皮形成・乾燥の５項目に関して、無症状（０点）、軽度（１点）、中等度（２点）、高度（３点）と点数化し、加算したものを皮膚炎トータルスコアとして評価した。また、試験開始日（Ｄａｙ０）より、週１回、マイクロメーターを用いて耳介厚の測定を行った。皮膚炎トータルスコアの測定結果を図１に、耳介厚の測定結果を図２に示した。【００６０】
（比較例３）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗アトピー性皮膚炎機能の測定
乳酸菌の凍結乾燥菌体を添加しない粉末マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  日本クレア株式会社製）を用いた以外は、実施例５と同様にして、トータルスコア、耳介厚を測定し、その結果は図１、図２に示した。【００６１】
なお、実施例５、比較例３の実験間における、マウスの体重、総摂餌量に差は認められなかった。【００６２】
図１、図２の結果より、以下のことがわかった。飼料に乳酸菌を混合していないコントロール群（比較例３）は、４回目のアトピー性皮膚炎誘発以降トータルスコアならびに耳介厚が上昇していくのに対して、ＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体を混合した飼料を与えた群（実施例５）のマウスにおいて、トータルスコア、耳介厚とも上昇は抑えられ、トータルスコアではDay３４以降で、耳介厚では、Ｄａｙ３５以降で有意に上昇を抑制した。以上の結果から、本発明の組成物の抗アトピー性皮膚炎効果が認められた。【００６３】
（実施例６）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗自己免疫疾患機能の測定
コラーゲン誘発関節炎モデルマウスであるＤＢＡ／１Ｊマウス（８週齢、雄性、日本エスエルシー株式会社製）を本実験に用いた。関節炎の誘発には、ウシＩＩ型コラーゲン（コスモバイオ株式会社製）を０．０５Ｍ酢酸に溶解して２．７ｍｇ／ｍｌに調製し、容量換算で同量のＦｒｅｕｎｄ’ｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｂａｎｔ（和光純薬工業株式会社製）を混合した関節炎誘発用コラーゲン液１５０μｌを背皮内注射（Ｄａｙ０）し、１４日後（Ｄａｙ１４）に、Ｄａｙ０と同様の関節炎誘発用コラーゲン液１５０μｌを尾根部皮内へ免疫する事で、関節炎発症を誘発した。７日後（Ｄａｙ７）より、製造例２で調製した乳酸菌（KLAB-4株）の凍結乾燥菌体４０重量部と賦形剤（商品名：パインデックス＃２  松谷化学工業株式会社製）６０重量部を混合して作製した乳酸菌製剤を、１ｍｇ／ｍｏｕｓｅ／ｄａｙになるようにＰＢＳ（−）に懸濁し、プラスチック製マウス用経口ゾンデ及び、１ｍＬツベルクリン注射筒を用いて強制投与した。【００６４】
４４日後（Ｄａｙ４４），４６日後（Ｄａｙ４６），４８日後（Ｄａｙ４８）における対象マウスの関節炎の発症有無を評価し、発症率（ｎ＝５）を求めた。結果を表３に示した。【００６５】
【表３】
0005554994.tif 000004
【００６６】
（参考例１０）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗自己免疫疾患機能の測定
乳酸菌として製造例５で調製した乳酸菌の乾燥菌体を用いた以外は、実施例６と同様にして、４４日後（Ｄａｙ４４），４６日後（Ｄａｙ４６），４８日後（Ｄａｙ４８）における対象マウスの関節炎の発症有無を評価し、発症率（ｎ＝６）を求めた。結果を表３に示した。【００６７】
（比較例４）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の抗自己免疫疾患機能の測定
乳酸菌製剤を投与せず、ＰＢＳ（−）のみを強制投与した以外は、実施例６と同様にして、４４日後（Ｄａｙ４４），４６日後（Ｄａｙ４６），４８日後（Ｄａｙ４８）における対象マウスの関節炎の発症有無を評価し、発症率（ｎ＝６）を求めた。結果を表３に示した。【００６８】
自己免疫疾患マウスにおける関節炎の発症率の経時変化（表３）より、乳酸菌製剤は投与せずにＰＢＳ（−）のみを強制投与した比較例４では、４４日後（Ｄａｙ４４）で６６％のマウスの肢に腫脹が確認され、４６日後（Ｄａｙ４６）で全てのマウスで関節炎の発症が確認された。参考例１０では、４４日後（Ｄａｙ４４）で３３％のマウスの肢に腫脹が確認されたものの、４８日後（Ｄａｙ４８）においても発症率は３３％であった。一方、実施例６において、４６日後（Ｄａｙ４６）で初めて発症が確認され、その発症率は、２０％であり、４８日後（Ｄａｙ４８）においても発症率は２０％であった。これらより、製造例２のＫＬＡＢ−４株を用いた製剤は、製造例５の乳酸菌製剤よりもよりすぐれた抗自己免疫疾患機能を有していることがわかった。【００６９】
さらに、実施例６、参考例１０、比較例４の各群における発症マウスの関節炎病態を、関節炎病態スコアで評価した。関節炎病態スコアは、前後左右の肢の病態を４段階で評点化（０：変化なし、１：足指の腫脹、２：足指および足裏の腫脹、３：足全体の腫脹、４：重度の腫脹）して加算、更に骨変性の有る場合には１を加算して評価した。その結果を、表４に示した。上記比較例４のマウスの平均スコアは４４日後（Ｄａｙ４４）で、１．３であったが、４日後の４８日後（Ｄａｙ４８）には、２．５まで上昇した。また、実施例６のマウスでは、病態スコアが４６日後（Ｄａｙ４６）で０．２、４８日後（Ｄａｙ４８）においても０．２と病態スコアの上昇は見られなかった。以上より、特に製造例２のＫＬＡＢ−４株を用いた製剤は、関節炎の発症を抑制し、さらのその病態の進行を遅らせる優れた機能を有していた。【００７０】
【表４】
0005554994.tif 000005
【００７１】
（実施例７）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の糖尿病改善機能の測定
まず、製造例２で調製したＫＬＡＢ−４株の凍結乾燥菌体を０．１重量部と脱脂粉乳４．９重量部、賦形剤（商品名：パインデックス＃２  松谷化学工業株式会社製）５重量部を混合し、乳酸菌製剤を調製した。上記製剤１０重量部に粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母株式会社製）を９０重量部混合し、乳酸菌製剤の含有量が混合飼料全体中１０重量％の乳酸菌製剤混合飼料を調製した。【００７２】
６週齢のＫＫ−Ａｙ雄性マウス（日本クレア株式会社製）を１週間馴化飼育した後、上記乳酸菌製剤混合飼料の投与を開始し（製剤として平均約１５０ｍｇ／日程度を自由摂取）、その開始日より４週間後に糖負荷試験によるマウスの糖尿病改善機能の評価を行った。該評価は、１８時間絶食後、採血を行い（０分）、０．３ｇ／ｍｌに調製したマルトース水溶液をマウス１匹当たり１００μｌ経口投与し、１５、３０、６０、９０、及び１２０分後に採血を行い、各々の血液サンプル中の血糖値を簡易式血糖測定器（商品名：グルテストエース  株式会社三和化学研究所製）を用いて測定した。その血糖値の経時変化を図３に示した。【００７３】
（実施例８）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による発酵乳の糖尿病改善機能の測定
１０％還元脱脂乳を９０℃で殺菌し、３７℃になるまで冷却後、予め１０％還元脱脂乳で培養していたＫＬＡＢ−４株を、１重量％添加し、３７℃で４８時間発酵させ発酵乳を作成した。作製した発酵乳は、重曹でｐＨを６．８付近に調整したのち、凍結乾燥して発酵乳粉末とした。【００７４】
該ＫＬＡＢ−４株の発酵乳粉末５重量部と、賦形剤（商品名：パインデックス＃２  松谷化学工業株式会社製）５重量部を混合し、発酵乳製剤を調製した。なお、該発酵乳製剤中の乳酸菌濃度は、実施例７で作成した乳酸菌製剤中の乳酸菌濃度とほぼ同じである。上記発酵乳製剤に粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母株式会社製）９０重量部を混合して発酵乳製剤混合飼料を調製した以外は、実施例７と同様にして評価した。【００７５】
（比較例５）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の糖尿病改善機能の測定
乳酸菌製剤を混合しない粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母株式会社製）を用いた以外は、実施例７と同様にして評価した。【００７６】
（比較例６）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の糖尿病改善機能の測定
発酵乳製剤の代わりに脱脂粉乳５重量部と、賦形剤（商品名：パインデックス＃２  松谷化学工業株式会社製）５重量部を使用し、粉末マウス飼料（製品名：ＭＦ  オリエンタル酵母株式会社製）９０重量部に混合して用いた以外は、実施例８と同様にして評価した。【００７７】
糖尿病モデルマウスにおける糖負荷試験の結果を図３に示した。飼料に乳酸菌製剤を混合していないコントロール群（比較例５，６）と比べて、実施例７、実施例８のマウスの血糖値は経時的に降下しており、糖負荷後２０〜４０分で最大血糖値を示すも、１２０分での血糖値は、０分での血糖値（空腹時血糖）レベルまで降下していた。【００７８】
本実験で用いた２型糖尿病モデルマウスにおいて、比較例５、６のマウスでは、マルトース負荷により上昇した血糖値の速やかな経時的降下が見られなかったのに対して、実施例７，８のマウスはマルトース負荷１２０分後の血糖値は空腹時血糖まで降下していたことから、乳酸菌ＫＬＡＢ−４株の凍結乾燥菌体や発酵乳粉末を含有する製剤の抗糖尿病効果が認められた。【００７９】
（実施例９）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の中性脂肪低減機能の測定
まず、製造例１で調製したＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体６７部、賦形剤（商品名:パインデックス＃2  松谷化学工業株式会社製）３３部を混合した乳酸菌製剤を、濃度１０重量％になるように蒸留水で懸濁して乳酸菌製剤混合液を調製した。【００８０】
８週齢のＫＫ−Ａｙ雄性マウス（日本クレア株式会社製）を、マウス飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母株式会社製）と滅菌水を自由摂取で２週間馴化飼育後、上記乳酸菌製剤混合液を毎日マウス体重１ｋｇ当たり７．５ｍｌになるよう、プラスチック製マウス用経口ゾンデ及び、１ｍＬツベルクリン注射筒を用いて強制投与した（マウス１匹あたり平均約３０ｍｇ／日の製剤を強制投与）。【００８１】
実験期間中マウスはマウス用飼料（製品名：ＣＥ−２  オリエンタル酵母社製）ならびに滅菌水を自由摂取とした。２週間の連続強制投与後、採血して血液を回収、血清中中性脂肪は測定キット（トリグリセライトＥ−テストワコー  和光純薬工業株式会社製）を用いて測定した。測定値は表５に示した。【００８２】
【表５】
0005554994.tif 000006
【００８３】
（参考例１１）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の中性脂肪低減機能の測定
ＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体の代わりに製造例３で調製した乳酸菌の凍結乾燥菌体を用いた以外は実施例９と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。【００８４】
（参考例１２）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の中性脂肪低減機能の測定
ＫＲ−０３７株の凍結乾燥菌体の代わりに製造例４で調製した乳酸菌の凍結乾燥菌体を用いた以外は、実施例９と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。【００８５】
（比較例７）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の中性脂肪低減機能の測定
乳酸菌製剤混合液の代わりに、乳酸菌製剤を混合していない蒸留水を用いた以外は、実施例９と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。【００８６】
（参考例１３）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の中性脂肪低減機能の測定
乳酸菌製剤混合液の代わりに、インスリン抵抗性改善薬であり、血中中性脂肪を下げる効果のある、ピオグリタゾン（武田薬品工業株式会社製）を濃度０．４重量％になるように蒸留水で希釈したものを用いた以外は実施例９と同様にして、回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。【００８７】
（参考例１４）  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験による製剤の中性脂肪低減機能の測定
乳酸菌製剤混合液の代わりに、ラクトバチルス・パラカゼイ・ＫＷ３１１０からなる健康補助食品（製品名：ノアレカプセル、キリンヤクルトネクストステージ株式会社製）を、濃度１０重量％になるように蒸留水で懸濁した乳酸菌液を用いた以外は実施例９と同様にして回収した血清中に含まれる中性脂肪量を測定した。測定値は表５に示した。【００８８】
なお、実施例９，参考例１１〜１４，比較例９のいずれの実験においても、マウスの体重、総摂餌量に差は認められなかった。【００８９】
表５の結果より、以下のことがわかった。蒸留水のみを強制投与した比較例７のマウスの血中中性脂肪と比べて、中性脂肪低減効果を有するピオグリタゾンを強制投与した参考例１３のマウスの血中中性脂肪量は低下しており、ピオグリタゾンの中性脂肪低減作用が確認された。また、製造例１のＫＲ−０３７株を用いて調製した製剤を強制投与した実施例９のマウス、製造例３の乳酸菌を用いて調製した製剤を強制投与した参考例１１のマウスにおいても、参考例１３のマウス同様、血中中性脂肪量は低下していた。【００９０】
こられの結果より、製造例１の乳酸菌（ＫＲ−０３７株）を用いて調製した製剤に中性脂肪低減効果があること、またその効果は他の乳酸菌製剤と比較して優れていることが確認できた。
【図１】
0005554994.tif 000007
【図２】
0005554994.tif 000008
【図３】
0005554994.tif 000009