(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域および配列番号：４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含んでなる、ＥｐｈＢ３特異性アンタゴニスト抗体。
【請求項２】
ＥｐｈＢ３受容体に対するエフリンＢ２結合を阻止しないが、ＥｐｈＢ３リン酸化および／または二量体化のレベルを低減させる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
１０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）でＥｐｈＢ３の細胞外ドメインに結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体がキメラ抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントである、請求項１から３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
ヒト抗体配列の定常領域を含んでなる、請求項１から４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
ヒト抗体配列が個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖細胞系列の配列またはヒト生殖細胞系列のコンセンサス配列である、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号：３のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域における３個のＣＤＲおよび配列番号：４のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域における３個のＣＤＲを含んでなるＥｐｈＢ３特異性アンタゴニスト抗体であって、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントである、抗体。
【請求項８】
ＥｐｈＢ３受容体に対するエフリンＢ２結合を阻止しないが、ＥｐｈＢ３リン酸化および／または二量体化のレベルを低減させる、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
１０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）でＥｐｈＢ３の細胞外ドメインに結合する、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒト抗体配列の定常領域ならびにヒト抗体配列の１つ以上の重および軽鎖可変フレームワーク領域を含んでなる、請求項７から９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
ヒト抗体配列が個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖細胞系列の配列またはヒト生殖細胞系列のコンセンサス配列である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
重鎖定常領域が修飾または非修飾ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである、請求項１から１１のいずれかに記載の抗体。
【請求項１３】
ＥｐｈＢ３に対して１０−７、１０−８または１０−９Ｍ以下の結合親和性を有する、請求項１から１２のいずれかに記載の抗体。
【請求項１４】
軽鎖定常領域が修飾または非修飾ラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである、請求項１から１３のいずれかに記載の抗体。
【請求項１５】
ＥｐｈＢ３リン酸化を阻止する、請求項１から１４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１６】
ＥｐｈＢ３二量体化を阻止する、請求項１から１５のいずれかに記載の抗体。
【請求項１７】
ＥｐｈＢ３リガンド誘起受容体活性化を阻止する、請求項１から１６のいずれかに記載の抗体。
【請求項１８】
ＥｐｈＢ３シグナリングを阻止する、請求項１から１７のいずれかに記載の抗体。
【請求項１９】
別の診断薬または治療薬と抱合される、請求項１から１８のいずれかに記載の抗体。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれかに記載の抗体のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子。
【請求項２１】
調節制御配列に作動可能なように連結された請求項２０に記載の核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２１に記載のベクターまたは請求項２０に記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の宿主細胞を培養することおよび抗体を回収することを含んでなる、抗体を生成するための方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法により生成された抗体。
【請求項２５】
少なくとも９５重量％の均一性まで精製された、請求項１から１９および２４のいずれかに記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥｐｈＢ３アンタゴニスト抗体を投与することによりＥｐｈＢ３関連疾患または障害を予防および処置するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥｐｈＢ３はエフリン受容体チロシンキナーゼファミリーの受容体である。現在、ヒトにおいて１４個のＥｐｈ受容体および９個のエフリンリガンドが公知である。エフリン受容体（Ｅｐｈ）およびそのリガンド、エフリンはとりわけ神経系および血管系における非常に多くの発達過程を媒介する。エフリンが腫瘍発達、血管形成、転移増殖および細胞生存において役割を果たすことも知られている。その構造および配列関連性に基づいてエフリンは、グリコシルホスファチジルイノシトール結合により膜に繋留されているエフリンＡ（ＥＦＮＡ）クラス、および膜貫通タンパク質であるエフリンＢ（ＥＦＮＢ）クラスに分けられる。受容体のＥｐｈファミリーはその細胞外ドメイン配列の類似性ならびに結合性エフリンＡおよびエフリンＢリガンドの結合に関するその親和性に基づいて２群に分けられる。Ｅｐｈ受容体は受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの最大のサブグループを成す。
【０００３】
Ｅｐｈは活性化時のシグナリングにより機能すると考えられる。エフリン結合はＥｐｈ受容体オリゴマー化を誘起し、Ｅｐｈの膜近傍残基のリン酸化を引き起こす。活性化されたＥｐｈはシグナリングタンパク質（例えばＲａｓＧＡＰ、Ｓｒｃ、ＬＭＷ−ＰＴＰ、ＰＬＣｇ、ＰＩ３−キナーゼ、Ｇｒｂ２およびＰＤＺ含有タンパク質）に関するドッキング部位として作用する複数のリン酸化チロシンを有する。
Ｅｐｈ受容体（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２）の過剰発現は受容体が過剰リン酸化されない場合に変換を引き起こす。リン酸化されたＥｐｈＢ受容体はＲａｓ−ＭＡＰ−キナーゼ経路およびＦＡＫシグナリングを負に調節し、細胞増殖を損なう。
【０００４】
ＥｐｈＢ３は種々の疾患状態で役割を果たすとして意味づけられている。例えばＥｐｈＢ３発現はセリアック病において認められる特徴的な過形成および絨毛萎縮症に関連する（Diasdado et al., Gut, ５３（７）：９４４−９５１（２００４））。ＥｐｈＢ３はまた脳卒中および神経変性疾患において神経保護性であることが示唆されている。傷害後のＥｐｈＢ３発現の上方調節はまた軸索再生を阻止する脊髄の環境にも寄与し得る（Willson et al., Cell Transplant, １２（３）：２７９−９０（２００３））。ＥｐｈＢ３リガンド、エフリンＢ２は眼の血管形成疾患において上方調節されることが観察される（Ozaki et al., Am. J. Opthalmol., １３８（２）：２７０−９（２００４））。
故にＥｐｈＢ３を調整する組成物および方法ならびにかかる疾患におけるその役割を同定する必要がある。本発明はこれらのおよびその他の重要な必要性を志向する。
【発明の概要】
【０００５】
ＥｐｈＢ３に関するヌクレオチド配列を配列番号：１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号：２に示す。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は配列番号：２のアミノ酸１から５５９からなる。これに代えて、ＥＣＤは配列番号：２の３４から５５５からなる（タンパク質配列のＮＣＢＩ  EntrezデータベースではヒトＥｐｈＢ３に相当する二つの遺伝子座番号があることに留意されたい）。双方の場合で研究者は（ａ）ＡＴＧ出発コドンから終止コドンまでのコード化領域によりコードされるアミノ酸の数；（ｂ）その前駆配列におけるどのアミノ酸の広がりが分泌シグナル配列を示すのか（この配列は成熟過程の間に切り取られて成熟タンパク質を創成する）；および（ｃ）どの残基の広がりが膜貫通領域を示すのか；に関して配列を提示する予測を行った。成熟タンパク質の「細胞外」ドメインはシグナル配列と膜貫通ドメインの間にあれば何でもよいので、ＥＣＤの予測される程度はシグナルおよびＴＭ領域をどこに置くかに依存する。双方の遺伝子座提示（ＮＰ  ００４４３４およびＰ５４７５３）により、前駆体が９９８アミノ酸長であり、そして分泌シグナルが残基１−３３に及ぶことが予測される。故にそれらは共に、ＥＣＤの出発が残基３４であることで一致する。しかしながら、それらはＴＭ領域の出発では一致しない：ＮＰ  ００４４３４により出発は残基５５６である（ＥＣＤアミノ酸の終わりは５５５番になる）ことが予測されるが、Ｐ５４７５３によりＴＭは残基５６０で出発する（ＥＣＤアミノ酸の終わりは５５９番になる）ことが予測される。本明細書の実施例に記載されるように、アミノ酸３７−５５８からなるＥＣＤを抗体作成のための免疫化に使用した。
【０００６】
本発明の材料および方法は当分野において前記のおよびその他の関連する必要性を満足させる。本発明は一般的にはＥｐｈＢ３受容体の活性を低減させるＥｐｈＢ３アンタゴニスト抗体、かかる抗体を作成する方法、およびＥｐｈＢ３アンタゴニスト抗体を用いてＥｐｈＢ３関連疾患または障害を処置する方法に関する。
【０００７】
本発明の１つの実施態様では、１０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）でＥｐｈＢ３の細胞外ドメインに結合し、そしてＥｐｈＢ３に対する結合に関して抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９のいずれかと７５％を超えて競合するアンタゴニスト抗体が提供される。「１０−６Ｍ以下の親和性（ＫＤ）」なる用語は例えば１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ（すなわち１０−６Ｍより少ない数字）の親和性を意味する。別の実施態様では、アンタゴニスト抗体は抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９のいずれかと同一のＥｐｈＢ３のエピトープに結合する。なお別の実施態様では、抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９のいずれかの１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含んでなるアンタゴニスト抗体が提供される。さらに別の実施態様では、前記の抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト改変抗体、ヒト抗体、一本鎖抗体または抗体フラグメントである。
【０００８】
本発明の別の実施態様では、ＣＤＲ内の少なくとも１個のアミノ酸が別の抗ＥｐｈＢ３抗体の対応するＣＤＲの対応する残基により置換された前記のアンタゴニスト抗体が提供される。別の実施態様では、ＣＤＲ内の１または２個のアミノ酸が修飾されている前記のアンタゴニスト抗体が提供される。なお別の実施態様では、アンタゴニスト抗体はＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９の抗体に対して可変軽または重鎖領域のいずれかにわたって少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を保持する。さらに別の実施態様では、アンタゴニスト抗体はヒト抗体配列の定常領域ならびにヒト抗体配列の１つ以上の重および軽鎖可変フレームワーク領域を含んでなる。なお別の実施態様では、ヒト抗体配列が個々のヒト配列、ヒトコンセンサス配列、個々のヒト生殖細胞系列の配列またはヒト生殖細胞系列のコンセンサス配列である前記のアンタゴニスト抗体が提供される。
【０００９】
なお別の実施態様では、重鎖定常領域が修飾または非修飾ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである前記のアンタゴニスト抗体が提供される。別の実施態様では、アンタゴニスト抗体はＥｐｈＢ３に対して１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０または１０−１１Ｍ以下の結合親和性を有する。さらに別の実施態様では、ＣＤＲにおける保存置換を含んでなる前記のアンタゴニスト抗体が提供される。さらに別の実施態様では、低および中リスク残基における保存または非保存変化を含んでなる前記のアンタゴニスト抗体が提供される。別の実施態様では、軽鎖定常領域が修飾または非修飾ラムダ軽鎖定常領域、カッパ軽鎖定常領域、それらのフラグメントまたはそれらの組み合わせである前記のアンタゴニスト抗体が提供される。
【００１０】
ＥｐｈＢ３活性の阻止を測定するためのインビトロアッセイが当分野において公知である。例えば細胞遊走アッセイ（例えば血管形成に関するＨＵＶＥＣ遊走アッセイ、セリアック病に関する腸管細胞遊走、脳卒中における炎症細胞）および細胞マトリックス接着アッセイ（例えばラミニン、フィブロネクチン）が企図される（Miao, H. et al., J. Biol. Chem., ２８０（２）：９２３−９３１（２００５）；Wang, Y. et al., Angiogenesis, ７：３３５−３４５（２００４）；Nakada,M et al., Cancer Res., ６６（１７）：８４９２−８５００（２００６）；およびGupta, S.K. et al., J. Leuko. Biol.  ６６（１）：１３５−１４３（１９９９））。
【００１１】
なおさらなる典型的な実施態様では、細胞増殖、例えば神経細胞増殖および／または再生を増強する前記のアンタゴニスト抗体が提供される。その他の典型的な実施態様では、例えばセリアック病における腸管細胞、または例えば血管形成における血管もしくは内皮細胞に関連するような細胞増殖を阻止するアンタゴニスト抗体が有用である。
【００１２】
本発明により非常に多くの方法が企図される。本発明の１つの実施態様では：ＥｐｈＢ３のＥＣＤを含んでなるポリペプチドを抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９の少なくとも１、２、３、４、５または６個のＣＤＲを含有する候補抗体と接触させること；候補抗体のポリペプチドに対する結合親和性を検出すること、および少なくとも１０−６Ｍの結合親和性が検出されたとき、候補抗体をＥｐｈＢ３関連疾患または障害の処置に有用なアンタゴニスト抗体として同定すること；の工程を含んでなる、ＥｐｈＢ３関連疾患または障害の処置に有用な、ＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対するアンタゴニスト抗体に関してスクリーニングする方法が提供される。さらに別の実施態様では：抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９のＣＤＲ内の１または２個のアミノ酸に対する修飾を含有する候補抗体を調製すること；ＥｐｈＢ３のＥＣＤを含んでなるポリペプチドを候補抗体と接触させること；候補抗体のポリペプチドに対する結合親和性を検出すること、および少なくとも１０−６Ｍの結合親和性が検出されたとき、候補抗体をＥｐｈＢ３関連疾患または障害の処置に有用なアンタゴニスト抗体として同定すること；の工程を含んでなる、系統的に抗体を改変し、そしてＥｐｈＢ３関連疾患または障害の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対するアンタゴニスト抗体に関してスクリーニングする方法が提供される。
【００１３】
さらに別の実施態様では：腸管、内皮または神経細胞を抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１もしくはＸＰＡ.０４.０１９の少なくとも１、２、３、４、５もしくは６個のＣＤＲを含有する候補抗体または１つ以上のＣＤＲ内に１もしくは２個のアミノ酸の修飾を含有する抗体と接触させること；細胞の増殖または生存を検出すること；および細胞増殖または生存における変化が検出されたとき、候補抗体をＥｐｈＢ３関連疾患または障害の処置に有用なアンタゴニスト抗体として同定すること；の工程を含んでなる、ＥｐｈＢ３関連疾患または障害の処置に有用なＥｐｈＢ３タンパク質の細胞外ドメインに対するアンタゴニスト抗体に関してスクリーニングする方法が提供される。
【００１４】
さらに別の実施態様では、治療上有効量の前記の抗体の１つを投与する工程を含んでなる、病理学的腸管細胞増殖に関連するセリアック病またはその他の疾患を患っている対象を処置する方法が提供される。なおさらなる実施態様では、神経変性疾患を処置する、または神経もしくは脊髄への虚血性もしくは外傷性もしくはその他の傷害の後の軸索もしくはその他の神経再生を刺激するための方法が提供される。典型的なニューロン疾患には、外傷性傷害による、脳もしくは局所血管性虚血による、毒素による、またはウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫感染を含む感染によるニューロンへの損傷、およびパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、老人性認知症、アミロイド側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、末梢ニューロパチー、脊髄性筋萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病またはＡＩＤＳ認知症が含まれる。別の実施態様では、治療上有効量の前記の抗体の１つを投与する工程を含んでなる、病理学的血管細胞増殖に関連する血管形成疾患またはその他の疾患を処置する方法が提供される。典型的な血管形成疾患には、糖尿病性網膜症もしくは早産児の網膜症、または加齢性黄斑変性症のような眼疾患、および乾癬、関節リウマチ、アテローム、動脈再狭窄、血管腫、自己免疫疾患、その他の急性もしくは慢性炎症に関連する血管形成、瘢痕もしくは癒着形成、または子宮内膜症が含まれる。なお別の実施態様では、第２の治療薬が投与される。さらに別の実施態様では、対象はその他の治療薬または手術でさらに処置される。
【００１５】
本発明のなお別の実施態様では、放射性核種またはその他の毒素と抱合された前記のアンタゴニスト抗体を投与する工程を含んでなる、ＥｐｈＢ３を発現する細胞をターゲティングする方法が提供される。なお別の実施態様では、対象が哺乳動物である前記の方法が提供される。なお別の実施態様では、対象はヒトである。
本発明の別の実施態様では、前記のアンタゴニスト抗体の重鎖または軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子が提供される。なお別の実施態様では、調節制御配列に作動可能なように連結された前記の核酸分子を含んでなる発現ベクターが提供される。さらに別の実施態様では、前記のベクターまたは前記の核酸分子を含んでなる宿主細胞が提供される。なお別の実施態様では、適当な条件下で宿主細胞を培養すること、および抗体を回収することを含んでなる、アンタゴニスト抗体を生成するために前記の宿主細胞を使用する方法が提供される。別の実施態様では、前記の方法により生成されたアンタゴニスト抗体が提供される。
【００１６】
本発明の別の実施態様では、少なくとも９５重量％の均一性まで精製された前記のアンタゴニスト抗体が提供される。なお別の実施態様では、前記のアンタゴニスト抗体および薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物が提供される。さらに別の実施態様では、治療上有効量の本発明の抗体を含んでなる前記のアンタゴニスト抗体を含んでなる、容器に包装されたキットが提供され、ここでキットは場合によっては第２の治療薬を含有し、そしてさらに容器に付着した、または容器と共に包装されたラベルを含んでなり、そのラベルは容器の内容物を記載し、そしてＥｐｈＢ３関連疾患または障害を処置するための容器の内容物の使用に関する指示および／または説明を提供する。別の実施態様では、容器がバイアルまたは瓶またはプレフィルドシリンジである前記のキットが提供される。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１はＸＰＡ.０４.０１７、ＸＰＡ.０４.０３１およびＸＰＡ.０４.０１９軽鎖および重鎖に関するリスクライン（Ｈ＝高リスク、Ｍ＝中リスク、Ｌ＝低リスク）、ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＰＡ.０４.０３１およびＸＰＡ.０４.０１９軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号：３−８）、ならびにアミノ酸配列内のＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２およびＨ３の位置を示す。
【００１８】
詳細な説明
本発明はＥｐｈＢ３特異性アンタゴニスト抗体、かかるアンタゴニスト抗体を含有する医薬組成物、アンタゴニスト抗体および医薬製剤を調製する方法、ならびに医薬製剤および化合物で患者を処置する方法を提供する。かかるアンタゴニスト抗体はリガンド（例えばエフリンＢ２、エフリンＢ１、エフリンＢ３）のＥｐｈＢ３に対する結合を阻止し、ＥｐｈＢ３二量体化を阻止し、ＥｐｈＢ３リン酸化を阻止し、リガンド誘起ＥｐｈＢ３受容体活性化を阻止し、そして／またはＥｐｈＢ３媒介の細胞−細胞接着を調整することができる。本明細書にて提供されるあるクラスのアンタゴニスト抗体はエフリンＢ２のＥｐｈＢ３受容体に対する結合を阻止し、そして競合阻害剤として作用できる。本明細書にて提供される別のクラスのアンタゴニスト抗体はＥｐｈＢ３受容体に対するエフリンＢ２結合を阻止しないが、それにもかかわらず受容体活性化の尺度であるＥｐｈＢ３リン酸化および／または二量体化のレベルを低減させる。同様に、本明細書にて提供される別のクラスのアンタゴニスト抗体はエフリンＢ１および／またはエフリンＢ３のＥｐｈＢ３受容体に対する結合を阻止し、そして競合阻害剤として作用できる。本明細書にて提供されるなお別のクラスのアンタゴニスト抗体はＥｐｈＢ３受容体に対するエフリンＢ１および／またはエフリンＢ３結合を阻止しないが、それにもかかわらずＥｐｈＢ３リン酸化および／または二量体化のレベルを低減させる。
【００１９】
いくつかの実施態様では、本発明のアンタゴニスト抗体は本明細書に開示されるエピトープまたはその一部に結合する。いくつかの実施態様では、アンタゴニスト抗体の受容体に対する結合は受容体リン酸化を阻止する。いくつかの実施態様では、アンタゴニスト抗体の受容体に対する結合はリガンドのＥｐｈＢ３に対する結合を阻止する。いくつかの実施態様では、アンタゴニスト抗体の受容体に対する結合はＥｐｈＢ３二量体化を阻止する。いくつかの実施態様では、アンタゴニスト抗体の受容体に対する結合はリガンド誘起受容体活性化を阻止する。受容体活性化（すなわちシグナリング）を当分野において公知の技術により決定できる。例えば免疫沈殿、続いてウェスタンブロット分析により受容体またはその基質のリン酸化（例えばチロシンまたはセリン／スレオニン）を検出することにより受容体活性化を決定することができる。いくつかの実施態様では、リガンド活性または受容体活性を抗体不在下の活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、７５％、７０％、６０％または５０％まで阻止するアンタゴニスト抗体が提供される。
【００２０】
いくつかの実施態様では、ＥｐｈＢ３抗体は細胞内アダプタータンパク質に対するＥｐｈＢ３結合を阻止する。
本明細書で使用される際には、「細胞内アダプタータンパク質」なる用語はシグナリング複合体の様々なセグメントを結びつけるタンパク質を指す。アダプターは酵素活性を有しても有さなくてもよい。典型的なアダプタータンパク質は当業者に公知である。例えばＧｒｂ２は固有の酵素活性を有さないアダプタータンパク質であるが、ＲａｓＧＡＰは酵素活性を有するアダプタータンパク質である。
【００２１】
インビトロアッセイにより測定されるような高い親和性および効力を有するいくつかの好ましいマウスまたはキメラ抗体はStudnickaらのHuman Engineering（登録商標）法に基づいてヒトにおいて免疫原性が低くなるように修飾される。簡単には、重鎖および軽鎖可変領域の表面に暴露されるアミノ酸残基が、抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに有害な影響を及ぼす可能性はないことが決定された位置でヒト残基に修飾されるが、ヒト環境に関してはその免疫原性を低減させる。修飾された重および／または軽鎖可変領域をコードする合成遺伝子が構築され、そしてヒトガンマ重鎖および／またはカッパ軽鎖定常領域に関するコード化配列に連結される。任意のヒト重鎖および軽鎖定常領域をHuman Engineered（登録商標）抗体可変領域と組み合わせて使用できる。ヒト重および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞に導入し、そして結果的に組換え免疫グロブリン生成物が得られ、そして特徴付けされる。
【００２２】
本発明による典型的なアンタゴニスト抗体にはＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９が含まれる。以下の抗体分泌ハイブリドーマはブダペスト条約の規定に準拠して２００６年１１月１７日にAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（１０８０１ University Blvd., Manassas, VA  ２０１１０−２２０９（USA））に寄託された：
【表１】
0005485696.tif 000002
【００２３】
以下の定義は本発明をさらに完全に理解するための助けとして提供される。
一般的定義
標的抗原ヒト「ＥｐｈＢ３」は本明細書で使用される際には、配列番号：２および天然発生のその対立遺伝子バリアントと実質的に同一のアミノ酸配列を有するヒトポリペプチドを指す。「ＥｐｈＢ３のＥＣＤ」は本明細書で使用される際には、配列番号：２のアミノ酸３７−５５８により表されるＥｐｈＢ３の細胞外部分を指す。
【００２４】
「ＥｐｈＢ３関連疾患または障害」は本明細書で使用される際には、セリアック病または病理学的腸管細胞増殖に関連するその他の疾患；血管形成疾患または病理学的血管細胞増殖に関連するその他の疾患、例えば糖尿病性網膜症もしくは早産児の網膜症、または加齢性黄斑変性症のような眼の血管形成疾患、および乾癬、関節リウマチ、アテローム、動脈再狭窄、血管腫、自己免疫疾患、その他の急性もしくは慢性炎症に関連する血管形成、瘢痕もしくは癒着形成、または子宮内膜症；例えば外傷性傷害による、脳もしくは局所血管性虚血による、毒素による、またはウイルス、細菌、真菌もしくは寄生虫感染を含む感染によるニューロン傷害；神経変性疾患、例えばパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、老人性認知症、アミロイド側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、末梢ニューロパチー、脊髄性筋萎縮症、クロイツフェルト・ヤコブ病もしくはＡＩＤＳ認知症；または癌、例えば肺、卵巣、食道、結腸もしくは乳癌を指す。
【００２５】
「処置」は障害の発達を予防するか、または病理を改変する意図を伴って実施される介入である。したがって、「処置」は治療的処置および防止または予防手段の双方を指す。処置の必要なものには既に障害を伴うもの、および障害が予防されるべきであるものが含まれる。疾患の臨床的、生化学的、放射線学的または自覚的症状を患っている患者の処置は、かかる症状のいくつかもしくは全ての軽減または疾患に対する素因の低減を含み得る。
【００２６】
処置の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭用および農場用動物、ならびに動物園、運動または愛玩動物を含む哺乳動物として分類される任意の動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される際には、「治療上有効量」なる語句は、望ましい処置レジメンにしたがって投与された場合、本発明の実施態様に適切であり、疾患のかかる症状のいくつかもしくは全ての軽減または疾患に対する素因の低減を含む望ましい治療的または予防的効果または応答を惹起する治療的または予防的抗体の量を指すと意図される。
【００２７】
抗体
「免疫特異的」または「特異的結合」なる用語は、約１０４Ｍ−１以上、好ましくは約１０５Ｍ−１以上、さらに好ましくは約１０６Ｍ−１以上のＫａで抗体がＥｐｈＢ３またはそのＥＣＤに結合することを意味する。抗体はその他の無関係の分子と比較して標的抗原に関して実質的により大きな親和性を有し得る。抗体はまたオルソログまたはホモログと比較して標的抗原に関して実質的により大きな親和性、例えば少なくとも１.５倍、２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、またはより大きい標的抗原に関する相対親和性を有し得る。これに代えて、抗体が公知のホモログまたはオルソログと交差反応するのは有用であるかもしれない。
【００２８】
本発明の抗体を少なくとも１０−４Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−４Ｍから約１０−１２Ｍ、さらに好ましくは少なくとも約１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍまたは１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、または１０−１１Ｍの親和性（ＫＤ）により特徴付けできる。抗体に関する適切な親和性は治療適用に依存して異なり得る。平衡透析による；製造者により概要を記された一般的な手順を用いてBIAcore ２０００装置を用いることによる；放射性標識された標的抗原を用いるラジオイムノアッセイによる；または当業者に公知の別の方法によるような従来の技術を用いてかかる親和性を容易に決定できる。親和性データを例えばScatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., ５１：６６０（１９４９）の方法により分析できる。
【００２９】
「アンタゴニスト抗体」とはＥｐｈＢ３の活性化を阻止することができる抗体分子を意味する。したがって「アンタゴニスト」抗ＥｐｈＢ３抗体はＥｐｈＢ３に対するリガンド結合を阻止し、リン酸化活性を低下させ、ＥｐｈＢ３オリゴマー化を低下させ、ＥｐｈＢ３内部移行を低下させ、そして／またはＥｐｈＢ３下流シグナリングを低下させることが可能である。「抗体」なる用語は最も広義で用いられ、そして完全に組み立てられた抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二特異性抗体）、抗原に結合できる抗体フラグメント（例えばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、一本鎖抗体、ダイアボディー）および望ましい生物学的活性を呈する限り、前記のものを含んでなる組換えペプチドを含む。抗体フラグメントを組換えＤＮＡ技術により、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断により生成でき、そして以下にさらに記載する。モノクローナル抗体の非限定例には、マウス、キメラ、ヒト化、ヒトおよびHuman Engineered（登録商標）免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリンから誘導される配列を有するキメラ融合タンパク質、またはそのムテインもしくは誘導体が含まれ、各々は以下にさらに記載される。化学的に誘導体化された抗体を含むインタクトな分子および／またはフラグメントの多量体または凝集体が企図される。本発明にしたがって任意のアイソタイプクラスまたはサブクラスの抗体が企図される。
【００３０】
「モノクローナル抗体」なる用語は本明細書で使用される際には実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち集団を含んでなる個々の抗体が可能な天然発生変異またはこれに代えて少量で存在し得る翻訳後修飾を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり；典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は異なる特異性および特徴を有するその他の免疫グロブリンによる夾雑がない均一な培養により合成される点で有利である。
【００３１】
修飾語「モノクローナル」は実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば本発明にしたがって用いられることになっているモノクローナル抗体を、最初にKohler et al., Nature, ２５６：４９５（１９７５）に記載されたハイブリドーマ法により作成できるか、または組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４８１６５６７号参照）により作成できる。「モノクローナル抗体」はまた例えば組換え、キメラ、ヒト化、ヒト、Human Engineered（商標）または抗体フラグメントでよい。
【００３２】
「単離された」抗体はその天然環境の構成要素から同定および単離および回収されているものである。その天然環境の夾雑構成要素は抗体に関する診断的または治療的使用と干渉する材料であり、そして酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施態様では、抗体は（１）ローリー法により決定されるように抗体の９５重量％より大きくなるまで、そして最も好ましくは９９重量％を超えるまで（２）スピニングカップシークエネーターの使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得られるのに十分な程度まで、または（３）還元もしくは非還元条件下でクーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一まで精製される。組換え細胞内の原位置の抗体は、抗体の天然環境の構成要素が１つも存在しないから、単離された抗体に含まれる。しかしながら通常単離された抗体は少なくとも１つの単離工程により調製される。
【００３３】
「免疫グロブリン」または「自然抗体」は四量体糖タンパク質である。天然発生免疫グロブリンでは、各四量体はポリペプチド鎖の２本の同一の対から構成され、各対は１本の「軽」（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は一次的に抗原認識に寄与する約１００から１１０個またはそれより多いアミノ酸の「可変」（「Ｖ」）領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は一次的にエフェクター機能に寄与する定常領域を定義する。その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。重鎖はミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）およびイプシロン（ε）として分類され、そして抗体のアイソタイプを各々ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義する。これらのうちのいくつかをさらにサブクラスまたはアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。異なるアイソタイプは異なるエフェクター機能を有する；例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ３アイソタイプは抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）活性を有する。ヒト軽鎖はカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖として分類される。軽および重鎖内では、可変および定常領域は約１２個またはそれを超えるアミノ酸の「Ｊ」領域により結合され、重鎖はまた約１０個またはそれを超えるアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。一般的にはFundamental Immunology, Ch. ７（Paul, W., ed., ２nd ed. Raven Press, N.Y.（１９８９））を参照されたい。
【００３４】
抗体の構造および作成の詳細な記載に関しては、Roth, D.B., and Craig, N.L., Cell, ９４：４１１−４１４（１９９８）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。簡単には重および軽鎖免疫グロブリン配列をコードするＤＮＡを作成するための過程は一次的にはＢ細胞の発達において生じる。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメントの再構成および結合の前にＶ、Ｄ、Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは一般に単一の染色体上の相対的に極めて接近して見出される。Ｂ細胞分化の間にＶ、Ｄ、Ｊ（または軽鎖遺伝子の場合はＶおよびＪのみ）遺伝子セグメントの適切なファミリーメンバーの各々のうちの１つは組換えられて、重および軽免疫グロブリン遺伝子の機能的に再構成された可変領域を形成する。この遺伝子セグメント再構成過程は逐次的であると思われる。最初に重鎖Ｄ−Ｊ結合が、続いて重鎖Ｖ−ＤＪ結合および軽鎖Ｖ−Ｊ結合が作成される。Ｖ、ＤおよびＪセグメントの再構成に加えて、軽鎖のＶおよびＪセグメントが結合し、そして重鎖のＤおよびＪセグメントが結合する位置での可変的な組換えにより、免疫グロブリン重および軽鎖の一次レパートリーにおいてさらなる多様性が作成される。軽鎖におけるかかるバリエーションは典型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドンおよびＪセグメントの最初のコドン内で生じる。結合における類似の不明確さはＤとＪＨセグメントの間の重鎖染色体で生じ、そして１０ヌクレオチドほどの大きさにわたり得る。さらにゲノムＤＮＡによりコードされないいくつかのヌクレオチドをＤとＪＨ遺伝子セグメントの間およびＶＨとＤ遺伝子セグメントに挿入できる。これらのヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として公知である。可変領域遺伝子セグメントにおけるかかる再構成、およびかかる結合の間に生じ得る可変的組換えの正味の効果が一次抗体レパートリーの生成である。
【００３５】
「抗体フラグメント」はインタクトな全長抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含んでなり、そして抗体フラグメントから形成された多特異性抗体を含む。抗体フラグメントの非限定例にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体フラグメント、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー、線状抗体（Zapata et al., Protein Eng.,８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；キレート化組換え抗体、トリボディー（tribodies）もしくはビボディー（bibodies）、細胞内抗体、ナノボディー、小型モジュラー免疫医薬品（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそのムテインもしくは誘導体、および抗体が望ましい生物学的活性を保持する限り、ＣＤＲ配列のようなポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。
【００３６】
抗体のパパイン消化により「Ｆａｂ」フラグメントと称される、その各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合フラグメント、およびその名称が、３５を容易に結晶化するその能力を反映する「Ｆｃ」フラグメントが生成される。ペプシン処理により、２個の「Ｆｖ」フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。「Ｆｖ」フラグメントは完全な抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は緊密な非共有結合した１個の重および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ  ＶＬ二量体の表面で相互作用して抗原結合部位を定義するのはこの立体構造である。一括して６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら単一の可変ドメインでさえも（または抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００３７】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含んでなり、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖で存在する。好ましくはＦｖポリペプチドは、Ｆｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にする、ＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含んでなる。ｓｃＦｖの概説に関してはPluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. l １３, Rosenburg and Moore eds., Springer−Verlag, New York, pp. ２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００３８】
Ｆａｂフラグメントはまた軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によりＦａｂフラグメントはＦａｂ’フラグメントと異なる。本明細書ではＦａｂ’−ＳＨはＦａｂ’に関する名称であり、ここで定常ドメインの（複数の）システイン残基は遊離チオール基を担持する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元来それらの間でヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。
【００３９】
「超可変」領域なる用語は抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」すなわちＣＤＲからのアミノ酸残基［すなわち、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, ５th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（１９９１）により記載されるように、軽鎖可変ドメインにおける残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）］および／または超可変ループからのこれらの残基（すなわち［Chothia et al., J. Mol.Biol. １９６：９０１−９１７（１９８７）］により記載されるように、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）を含んでなる。
【００４０】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は超可変領域残基以外のこれらの可変ドメイン残基である。
「定常領域」なる語句はエフェクター機能を付与する抗体分子の部分を指す。
「キメラ抗体」なる語句は本明細書で使用される際には、典型的には異なる種に由来する２つの異なる抗体から誘導された配列を含有する抗体を指す（例えば米国特許第４８１６５６７号参照）。最も典型的には、キメラ抗体はヒトおよびマウス抗体フラグメント、一般的にはヒト定常およびマウス可変領域を含んでなる。
【００４１】
「ムテイン」なる用語は可変領域または可変領域に均等な部分における少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を含有する抗体のポリペプチド配列を指すが、ただしムテインが望ましい結合親和性または生物学的活性を保持する場合である。ムテインは親抗体と実質的に相同、または実質的に同一でよい。
【００４２】
「誘導体」なる用語は本発明の抗体と組み合わせて用いられる場合、ユビキチン化、治療薬または診断薬への抱合、標識（例えば放射性核種または種々の酵素を用いて）、ペギル化（ポリエチレングリコールでの誘導体化）のような共有結合性の重合体付着および非天然アミノ酸の化学的合成による挿入または置換のような技術により、共有結合性の修飾を為された抗体を指す。本発明の誘導体は本発明の非誘導体化分子の結合特性を保持する。
【００４３】
本明細書で使用される際には、「抗体」なる用語は具体的には、ＥｐｈＢ３の細胞外に結合する能力を保持する以下のうちのいずれか１つを含む：
１）相同性決定に関して類似アミノ酸を考慮に入れて、親アミノ酸配列に対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％相同である可変重鎖アミノ酸配列を含んでなる、および／または親アミノ酸配列に対して少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％相同である可変軽鎖アミノ酸配列を含んでなるムテインを含む図１で示されるアミノ酸配列を有する親抗体のアミノ酸ムテイン；
２）図１で示されるアミノ酸配列を有する親抗体の１個またはそれより多い相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなる、好ましくは重鎖の少なくともＣＤＲ３を含んでなる、および好ましくは２個もしくはそれより多い、または３個もしくはそれより多い、または４個もしくはそれより多い、または５個もしくはそれより多い、または６個全てのＣＤＲを含んでなるＥｐｈＢ３結合ポリペプチド；
【００４４】
３）低、中および高リスク残基を同定するためにKabat番号付けを用いて、Studnickaら、米国特許第５７６６８８６号および本明細書の実施例８にて示される方法にしたがって親配列を改変することにより作成されたHuman Engineered（商標）抗体；かかる抗体は以下の重鎖の少なくとも１つおよび以下の軽鎖の少なくとも１つを含んでなる：（ａ）ヒト参照免疫グロブリン配列における対応する残基と異なる低リスクげっ歯類残基の全てがヒト参照免疫グロブリン配列におけるヒト残基と同一になるように修飾されている重鎖、または（ｂ）低および中リスクげっ歯類残基の全てが、必要によりヒト参照免疫グロブリン配列におけるのと同一の残基になるように修飾されている重鎖、（ｃ）低リスク残基の全てが、必要によりヒト参照免疫グロブリン配列におけるのと同一の残基になるように修飾されている軽鎖、または（ｄ）低および中リスク残基の全てが、必要によりヒト参照免疫グロブリン配列におけるのと同一の残基になるように修飾されている軽鎖；
【００４５】
４）元来のげっ歯類軽鎖と少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％同一を含むアミノ酸配列同一性を有する重または軽鎖を含んでなる前項（３）における前記の抗体のムテイン；
【００４６】
５）げっ歯類抗体の１個以上のＣＤＲの高リスク残基を含んでなる、および好ましくは２個以上、または３個以上、または４個以上、または５個以上、または６個全てのＣＤＲの高リスク残基を含んでなる、および場合によっては低または中リスク残基で１つ以上の変化を含んでなる；
例えば低リスク残基で１つ以上の変化および中リスク残基で保存置換を含んでなるか、または
例えば中および高リスクアミノ酸残基を保持し、そして低リスク残基で１つ以上の変化を含んでなるＥｐｈＢ３結合ポリペプチド；
ここで変化は挿入、欠失または置換を含み、そして保存置換でよいか、またはヒト軽鎖もしくは重鎖配列、ヒト生殖細胞系列の軽鎖もしくは重鎖配列、コンセンサスヒト軽鎖もしくは重鎖配列、またはコンセンサスヒト生殖細胞系列の軽鎖もしくは重鎖配列と配列においてより近くなるように改変抗体を引き起こすことができる。かかる企図された変化は以下のような配列形式でも提示され得る。ＡＫＫＬＶＨＴＰＹＳＦＫＥＤＦの仮想配列（ここでStudnickaら、米国特許第５７６６８８６号にしたがって各残基に割り当てられた各々のリスクはＨＭＬＨＭＬＨＭＬＨＭＬＨＭＬ（Ｈ＝高、Ｍ＝中、Ｌ＝低）である）では、仮想配列の低リスク残基に対する典型的な変化を：ＡＫＸＬＶＸＴＰＸＳＦＸＥＤＸ（ここでＸは任意のアミノ酸であるか、またはこれに代えてここでＸはその位置での元来の残基の保存置換である）として提示でき、そして低および中リスク残基に対する典型的な変化を同様に例えば：ＡＹＸＬＹＸＴＹＸＳＹＸＥＹＸ（ここでＸは任意のアミノ酸であり、そしてＹはその位置での元来の残基の保存置換である）として提示することができる。
【００４７】
「競合抗体」なる用語には：
１）例えばＸ線結晶学により決定されるように、抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９と同一のＥｐｈＢ３のエピトープに結合するモノクローナル抗体；および
２）抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０３１またはＸＰＡ.０４.０１９と７５％を超えて、８０％を超えて、または８１％を超えて、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％を超えて競合するモノクローナル抗体；
が含まれる。
【００４８】
本発明の抗体は、好ましくはＥｐｈＢ３のＥＣＤと少なくとも１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０または１０−１１Ｍ以下の親和性ＫＤで結合し、そして好ましくは受容体リン酸化、シグナリング、リガンド結合、ＥｐｈＢ３二量体化、リガンド誘起受容体活性化および／またはＥｐｈＢ３媒介の細胞−細胞接着を阻止する。
場合によっては本明細書の出願日の前に公に開示された、または本明細書の出願日の前に出願された出願に開示された任意のキメラ、ヒトまたはヒト化抗体は本発明の範囲から排除される。
【００４９】
「非げっ歯類」モノクローナル抗体は、げっ歯類ハイブリドーマにより作成された完全にインタクトなげっ歯類モノクローナル抗体ではない本明細書で広義に定義されたような任意の抗体である。故に具体的には、非げっ歯類抗体には限定するものではないが、げっ歯類抗体のムテイン、げっ歯類抗体フラグメント、線状抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Human Engineered（商標）抗体および、トランスジェニック動物からまたはファージディスプレイテクノロジーにより生成されたヒト抗体を含むヒト抗体が含まれる。同様に非マウス抗体には限定するものではないが、マウス抗体のムテイン、マウス抗体フラグメント、線状抗体、キメラ、ヒト化、Human Engineered（商標）およびヒト抗体が含まれる。
【００５０】
標的抗原
抗体の生成のために用いられることになっている標的抗原は、場合によってはそのエピトープがその自然の立体構造で提示されることを可能にする別のポリペプチドに融合された、例えばＥｐｈＢ３の細胞外部分、または望ましいエピトープを保持する、それらのフラグメントでよい。これに代えて、細胞の表面で発現されたインタクトなＥｐｈＢ３を用いて抗体を作成することができる。かかる細胞を形質転換してＥｐｈＢ３を発現させることができるか、またはかかる細胞はＥｐｈＢ３を発現するその他の天然発生細胞でよい。抗体を作成するために有用なＥｐｈＢ３ポリペプチドのその他の形態は当業者には明白である。
【００５１】
ＥｐｈＢ３の種々のドメインにはリガンド結合ドメイン（配列番号：２のアミノ酸残基３９−２１２）、ＴＮＦＲドメイン（配列番号：２のアミノ酸残基２５６−３３１）、第１フィブロネクチンドメイン（配列番号：２のアミノ酸残基３４０−４３５）、および第２フィブロネクチンドメイン（配列番号：２のアミノ酸残基４５３−５３５）が含まれる。ＥｐｈＢ３のリガンド結合ドメインの典型的なエピトープは配列番号：９−１４３からなる群から選択される。ＥｐｈＢ３のＴＮＦＲドメインの典型的なエピトープは配列番号：１５９−２５７からなる群から選択される。ＥｐｈＢ３の第１フィブロネクチンドメインの典型的なエピトープは配列番号：２５７−２９９からなる群から選択される。ＥｐｈＢ３の第２フィブロネクチンドメインの典型的なエピトープは配列番号：３７８−４１９からなる群から選択される。
【００５２】
以下の表１は抗ＥｐｈＢ３抗体による認識に適当な線状エピトープとして同定されているＥｐｈＢ３の領域（配列番号：２）を提供する。
【００５３】
表１
【表２】
0005485696.tif 000003
【表３】
0005485696.tif 000004
【００５４】
【表４】
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【表５】
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【００５５】
【表６】
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【表７】
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【００５６】
【表８】
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【表９】
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【００５７】
【表１０】
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【００５８】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を、好ましくは動物において関連性のある抗原およびアジュバントの複数回皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により上昇させる。抗体応答性の改善は、二機能性または誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する抱合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸または当分野において公知のその他の薬剤を用いて関連性のある抗原を、免疫されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンまたは大豆トリプシン阻害剤に抱合させることにより得ることができる。
【００５９】
例えばタンパク質または抱合体１００μｇまたは５μｇ（各々ウサギまたはマウスに関して）を３容量のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、そして溶液を多部位で皮内注射することにより、動物を抗原、免疫原性抱合体または誘導体に対して免疫する。１か月後、フロイントの完全アジュバント中の元来の量に対して１／５｛割合（１／１０）｝のペプチドまたは抱合体で多部位の皮下注射により動物をブーストする。ブースター注射後７−１４日に、動物を出血させ、そして抗体力価に関して血清を検定する。力価プラトーまで動物をブーストする。好ましくは同一抗原のものであるが、異なるタンパク質に対しておよび／または異なる架橋反応剤を介して抱合された抱合体で動物をブーストする。組換え細胞培養でタンパク質融合として抱合体を作成することもできる。またミョウバンのような凝集剤を適当に用いて免疫応答を増強する。
【００６０】
モノクローナル抗体
最初にKohler et al., Nature, ２５６：４９５（１９７５）により記載されたハイブリドーマ法を用いてモノクローナル抗体を作成できるか、または組換えＤＮＡ法により作成できる。
ハイブリドーマ法ではマウスまたは、ハムスターもしくはマカクザルのようなその他の適切な宿主動物を本明細書に記載されるように免役して、免疫に用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を生成するかまたは生成することが可能であるリンパ球を惹起する。これに代えて、リンパ球をインビトロで免疫できる。次いでポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する（Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.５９−１０３（Academic Press, １９８６））。
【００６１】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻止する１つ以上の物質を含有する適当な培地に播種し、そして増殖させる。例えば親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如する場合、ハイブリドーマ用の培養培地は典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、その物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を予防する。
【００６２】
好ましい骨髄腫細胞は効率的に融合して、選択された抗体生成細胞により安定した高レベルの抗体生成を支持し、そして培地に感受性であるものである。ヒトモノクローナル抗体の生成のためにヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もまた記載されている（Kozbor, J. Immunol., １３３：３００１（１９８４）；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. ５１−６３（Marcel Dekker, Inc., New York, １９８７））。典型的なマウス骨髄腫系には、Salk Institute Cell Distribution Center（San Diego, Calif. USA）から入手可能なＭＯＰ−２１およびＭ．Ｃ．−１１マウス腫瘍、ならびにAmerican Type Culture Collection（Rockville, Md. USA）から入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞が含まれる。
【００６３】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対して指向するモノクローナル抗体の生成に関して検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞により生成されたモノクローナル抗体の結合特異性を免疫沈殿により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような結合アッセイにより決定する。モノクローナル抗体の結合親和性を、例えばスキャッチャード分析（Munson et al., Anal. Biochem., １０７：２２０（１９８０））により決定することができる。
【００６４】
望ましい特異性、親和性および／または活性の抗体を生成するハイブリドーマ細胞を同定した後、限界希釈によりサブクローン化し、そして標準的な方法により増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies：Principles and Practice, pp.５９−１０３（Academic Press, １９８６））。この目的のための適当な培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。加えてハイブリドーマ細胞を動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は培養培地、腹水または血清から、例えばプロテインＡセファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製手順により適当に分離される。
【００６５】
従来の手順を用いて（例えばモノクローナル抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）ハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離し、そしてシークエンシングすることができる。配列決定は一般的には目的の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部の単離を必要とするであろう。通常これはモノクローナル抗体をコードするＤＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡ（すなわちｃＤＮＡ）をクローニングすることを必要とする。標準的な技術（例えばSambrook et al.（１９８９）Molecular Cloning：A Laboratory Guide, Vols １−３, Cold Spring Harbor Press（出典明示により本明細書の一部とする））を用いてクローニングを実施する。例えばｃＤＮＡライブラリーをポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは膜随伴ｍＲＮＡの逆転写により構築でき、そしてヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてライブラリーをスクリーニングできる。しかしながら好ましい実施態様では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、目的の免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば軽鎖可変セグメント）をコードするｃＤＮＡ（または全長ｃＤＮＡの部分）を増幅する。増幅された配列を任意の適当なベクター、例えば発現ベクター、ミニ遺伝子ベクターまたはファージディスプレイベクターに容易にクローン化することができる。目的の免疫グロブリンポリペプチドのある部分の配列を決定することが可能である限り、用いられるクローニングの特定の方法が重大な意味を持つわけではないことは理解されよう。本明細書で使用される際には、「単離された」核酸分子または「単離された」核酸配列は（１）同定され、そして核酸の天然の供給源では通常随伴される少なくとも１つの夾雑核酸分子からおよび分離される；または（２）目的の核酸の配列を決定できるように、クローニング、増幅、タグ化、またはそうでなければバックグラウンド核酸から区別される、いずれかの核酸分子であり、単離されていると考えられる。単離された核酸分子は天然に見出される形態または設定以外である。それ故に単離された核酸分子はそれが天然細胞に存在するような核酸分子とは区別される。しかしながら単離された核酸分子には、例えば核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色体位置にある、通常抗体を発現する細胞に含有される核酸分子が含まれる。
【００６６】
クローニングおよびシークエンシングに用いられるＲＮＡに関する１つの供給源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を入手すること、およびＢ細胞を不死化細胞に融合することにより生成されるハイブリドーマである。ハイブリドーマの使用の利点は、それらを容易にスクリーニングし、そして目的のヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを選択することができるという点である。これに代えて免疫された動物のＢ細胞（または全脾臓）からＲＮＡを単離することができる。ハイブリドーマ以外の供給源を用いる場合、免疫グロブリンまたは特異的結合特性を有する免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列に関してスクリーニングするのが望ましいかもしれない。かかるスクリーニングのための１つの方法はファージディスプレイテクノロジーの使用である。ファージディスプレイは例えばDowerら、ＷＯ９１／１７２７１、McCaffertyら、ＷＯ９２／０１０４７およびCaton and Koprowski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８７：６４５０−６４５４（１９９０）（その各々を出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。ファージディスプレイテクノロジーを用いる１つの実施態様では、免疫されたトランスジェニックマウスからｃＤＮＡ（例えば全部の脾臓ｃＤＮＡ）を単離し、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えばＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡ配列を増幅し、そして増幅された配列をファージベクターに挿入する。目的のペプチド、例えば望ましい結合特徴を有する可変領域ペプチドをコードするｃＤＮＡをパニングのような標準的な技術により同定する。
【００６７】
次いで増幅されたまたはクローン化された核酸の配列を決定する。典型的には免疫グロブリンポリペプチドの全可変領域をコードする配列を決定するが、しかしながら時に可変領域の一部、例えばＣＤＲコード化部分のみをシークエンシングすることで十分である。典型的にはシークエンシングされた部分は少なくとも３０塩基長であり、さらにしばしば可変領域の少なくとも約３分の１または少なくとも約２分の１の長さをコードする塩基である。
【００６８】
ｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンに関して、またはＰＣＲを用いる場合、増幅された配列をサブクローニングした後、または増幅されたセグメントの直接ＰＣＲシークエンシングによりシークエンシングを実施することができる。標準的な技術を用いてシークエンシングを実施する（例えばSambrook et al.（１９８９）Molecular Cloning：A Laboratory Guide, Vols １−３, Cold Spring Harbor Press、およびSanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７４：５４６３−５４６７（１９７７）（出典明示により本明細書の一部とする））。クローン化された核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公開された配列と比較することにより、当業者はシークエンシングされた領域に依存して、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のアイソタイプを含む）の生殖細胞系列利用；および（ｉｉ）Ｎ領域付加および体細胞変異の過程の結果得られた配列を含む重および軽鎖可変領域の配列；を容易に決定できる。免疫グロブリン遺伝子配列情報の１つの供給源はNational Center for Biotechnology Information、国立医学図書館、国立衛生研究所（Bethesda, Md）である。
【００６９】
抗体フラグメント
前記で記したように、抗体フラグメントはインタクトな全長抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含んでなり、そして抗体フラグメントから形成された線状抗体および多特異性抗体を含む。抗体フラグメントの非限定例にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）フラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体フラグメント、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、ミニボディー、線状抗体；キレート化組換え抗体、トリボディー（tribodies）もしくはビボディー（bibodies）、細胞内抗体、ナノボディー、小型モジュラー免疫医薬品（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、抗原結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質、ラクダ化抗体、ＶＨＨ含有抗体、またはそのムテインもしくは誘導体、および抗体が望ましい生物学的活性を保持する限り、ＣＤＲ配列のようなポリペプチドに特異的な抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドが含まれる。かかる抗原フラグメントを全抗体の修飾により生成できるか、または組換えＤＮＡテクノロジーもしくはペプチド合成を用いてデノボ合成できる。
【００７０】
「ダイアボディー」なる用語は２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを指し、それらのフラグメントは同一ポリペプチド鎖（ＶＨ  ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結びつけられた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間で対形成させることができないリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を創成する。ダイアボディーは例えば欧州特許第４０４０９７号；ＷＯ９３／１１１６１；および３０ Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてさらに十分に記載される。
【００７１】
「一本鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含んでなり、ここでこれらのドメインは単一のポリペプチド鎖で存在し、そして場合によってはＶＨおよびＶＬドメインの間に、Ｆｖが抗原結合に関して望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含んでなる（Bird et al., Science ２４２：４２３−４２６（１９８８）およびHuston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：５８７９−５８８３（１９８８））。ＦｄフラグメントはＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる。
【００７２】
さらなる抗体フラグメントにはＶＨドメインからなるドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., Nature ３４１：５４４−５４６（１９８９））が含まれる。
「線状抗体」は抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含んでなる。線状抗体は二特異性または一特異性（Zapata et al. Protein Eng. ８：１０５７−６２（１９９５））にできる。
ペプチドリンカー（ヒンジなし）を介して、またはＩｇＧヒンジを介してＣＨ３に融合されたｓｃＦｖからなる「ミニボディー」はOlafsen, et al., Protein Eng Des Sel.,；１７（４）：３１５−２３（２００４ Apr）に記載されている。
【００７３】
軽鎖を欠いている機能的重鎖抗体はナースシャーク（Greenberg et al., Nature ３７４：１６８−７３（１９９５））、オオセザメ（Nuttall et al., Mol Immunol. ３８：３１３−２６（２００１））ならびにラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびラマのようなラクダ科（Hamers−Casterman et al., Nature ３６３：４４６−８（１９９３）；Nguyen et al., J. Mol. Biol. ２７５：４１３（１９９８））において天然発生する。これらの動物において抗原結合部位は単一のドメイン、ＶＨＨドメインにまで減少する。これらの抗体は重鎖可変領域のみを用いて抗原結合部位を形成する、すなわちこれらの機能的抗体はＨ２Ｌ２構造のみを有する重鎖のホモ二量体である（「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」と称される）。報告によればラクダ化ＶＨＨはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有し、そしてＣＨ１ドメインを欠如するＩｇＧ２およびＩｇＧ３定常領域で組み換えられ（Hamers−Casterman et al., supra）。例えばラマＩｇＧ１は従来の（Ｈ２Ｌ２）抗体アイソタイプであり、ここでＶＨはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する定常領域で組み換えられ、一方ラマＩｇＧ２およびＩｇＧ３はＣＨ１ドメインを欠如し、そして軽鎖を含有しない重鎖のみのアイソタイプである。古典的なＶＨのみのフラグメントは可溶性形態で生成するのが困難であるが、フレームワーク残基をさらにＶＨＨ様に改変すると、溶解性および特異的結合の改善を得ることができる。（例えばReichman, et al., J Immunol Methods, ２３１：２５−３８（１９９９））。ラクダ化ＶＨＨドメインは抗原に対して高い親和性で結合することが見出されており（Desmyter et al., J. Biol. Chem. ２７６：２６２８５−９０（２００１））、そして溶液中で高い安定性を有する（Ewert et al., Biochemistry ４１：３６２８−３６（２００２））。ラクダ化重鎖を作成するための方法は例えば米国特許出願公開第２００５０１３６０４９号および第２００５００３７４２１号に記載される。
【００７４】
重鎖抗体の可変ドメインはたった１５ｋＤａの分子量を有する最も小型の十分に機能的な抗原結合フラグメントであり、この実体をナノボディーと称する（Cortez−Retamozo et al., Cancer Research ６４：２８５３−５７（２００４））。Conrath et al.,（Antimicrob Agents Chemother ４５：２８０７−１２（２００１））に記載されるように免疫されたヒトコブラクダから、または記載されるような組換え方法を用いてナノボディーライブラリーを作成できる。
【００７５】
細胞内抗体は細胞内で発現されることが実証され、そして細胞内タンパク質機能を操作できる一本鎖抗体である（Biocca, et al., EMBO J. ９：１０１−１０８（１９９０）；Colby et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １０１：１７６１６−２１（２００４））。細胞内領域で抗体構築物を保持する、細胞シグナル配列を含んでなる細胞内抗体をMhashilkar et al（EMBO J １４：１５４２−５１（１９９５））およびWheeler et al.（FASEB J. １７：１７３３−５（２００３））に記載されるように生成できる。トランスボディー（transbodies）はタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）が一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体に融合された細胞透過性抗体である（Heng et al., Med Hypotheses. ６４：１１０５−８（２００５））。
ＳＭＩＰすなわち標的タンパク質に特異的な結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である抗体がさらに企図される。これらの構築物は抗体エフェクター機能を実行するのに必要な免疫グロブリンドメインに融合された抗原結合ドメインを含んでなる一本鎖ポリペプチドである。例えばＷＯ０３／０４１６００、米国特許出願公開第２００３０１３３９３９号および米国特許出願公開第２００３０１１８５９２号を参照されたい。
【００７６】
多価抗体
いくつかの実施態様では、多価またはさらには多特異性（例えば二特異性、三特異性等）モノクローナル抗体を作成するのが望ましいかもしれない。かかる抗体は標的抗原の少なくとも２つの異なるエピトープに関して結合特異性を有し得るか、またはこれに代えてそれは２つの異なる分子、例えば標的抗原および細胞表面タンパク質または受容体に結合し得る。例えば二特異性抗体は細胞防衛メカニズムを標的発現細胞に集中させるために、標的に結合するアームおよびＴ受容体分子（例えばＣＤ２またはＣＤ３）のような白血球上のトリガー分子、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のようなＩｇＧに関するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）に結合する別のアームを含み得る。別の例としては二特異性抗体を用いて細胞毒性剤を、標的抗原を発現する細胞に局在させることができる。これらの抗体は標的結合アームおよび細胞毒性剤（例えばサポリン、抗インターフェロン−６０、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。多特異性抗体を全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
【００７７】
二特異性抗体には架橋または「ヘテロ抱合」抗体が含まれる。例えばヘテロ抱合体の抗体の一方をアビジンと、他方をビオチンと結合させることができる。任意の都合のよい架橋方法を用いてヘテロ抱合抗体を作成できる。適当な架橋剤は当分野において周知であり、そして多くの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号にて開示される。
二特異性抗体を作成するための別の研究法にしたがって、抗体分子の対の間のインターフェースを操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にすることができる。好ましいインターフェースは抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含んでなる。この方法では、第１の抗体分子のインターフェースからの１つ以上の小型アミノ酸側鎖をより大型の側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）と置き換える。第２の抗体分子のインターフェース上で、大型のアミノ酸側鎖をより小型のもの（例えばアラニンまたはスレオニン）と置き換えることにより、（複数の）大型の側鎖と同一または類似した大きさの代償性「空洞」を創成する。これにより、ホモ二量体のようなその他の好ましくない最終生成物よりもヘテロ二量体の収量を増加させるためのメカニズムが提供される。１９９６年９月６日公開のＷＯ９６／２７０１１を参照されたい。
【００７８】
抗体フラグメントから二特異性抗体を作成するための技術もまた文献に記載されている。例えば化学的結合を用いて二特異性抗体を調製することができる。Brennan et al., Science ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体をタンパク質分解により切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを作成する手順を記載する。これらのフラグメントをジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して近接するジチオールを安定化し、そして分子間ジスルフィド形成を防御する。次いで作成されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いでＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再変換し、そして等モル量のその他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二特異性抗体を形成する。生成された二特異性抗体を酵素の選択的固定のための薬剤として使用することができる。Better et al., Science ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）は細菌からの機能的抗体フラグメントの分泌を開示している（例えばBetter et al., Skerra et al. Science ２４０：１０３８−１０４１（１９８８）を参照）。例えばＦａｂ’−ＳＨフラグメントを直接大腸菌から回収し、そして化学的に結合させて二特異性抗体を形成することができる（Carter et al., Bio／Technology １０：１６３−１６７（１９９２）；Shalaby et al., J. Exp. Med. １７５：２１７−２２５（１９９２））。
【００７９】
Shalaby et al., J. Exp. Med. １７５：２１７−２２５（１９９２）は十分にヒト化された二特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、そしてインビトロで定方向性の化学的結合に供されて二特異性抗体を形成した。故に形成された二特異性抗体はＨＥＲ２受容体および正常なヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合し、そしてヒト乳癌標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘発することができる。
【００８０】
組換え細胞培養物から直接二特異性抗体フラグメントを作成および単離するための種々の技術もまた記載されている。例えば二特異性抗体はロイシンジッパー、例えばＧＣＮ４を用いて生成されている。（一般的にはKostelny et al., J. Immunol. １４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により異なる２つの抗体のＦａｂ’部分に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、そして次に再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を利用して抗体ホモ二量体を生成することもできる。
【００８１】
「ダイアボディー」なる用語は２つの抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントを指し、それらのフラグメントは同一ポリペプチド鎖（ＶＨ  ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結びつけられた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間で対形成させることができないリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、そして２つの抗原結合部位を創成する。例えばHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。
一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用により二特異性抗体フラグメントを作成するための別の計画もまた報告されているGruber et al., J. Immunol. １５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。
【００８２】
これに代えて、二特異性抗体はZapata et al. Protein Eng. ８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）において記載されるように生成された「線状抗体」でよい。簡単にはこれらの抗体は、抗原結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含んでなる。線状抗体は二特異性または一特異性にできる。
２価を超える抗体もまた企図される。例えば三特異性抗体を調製することができる。（Tutt et al., J. Immunol. １４７：６０（１９９１））。
【００８３】
「キレート化組換え抗体」は標的抗原の、隣接し、そして重複しないエピトープを認識する二特異性抗体であり、そして双方のエピトープを同時に結合するのに十分可動性である（Neri et al., J Mol Biol. ２４６：３６７−７３（１９９５））。
二特異性Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（「ビボディー」）および三特異性Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）（２）（「トリボディー」）の生成はSchoonjans et al., J Immunol. １６５：７０５０−５７（２０００）およびWillems et al. , J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. ７８６：１６１−７６（２００３）に記載されている。ビボディーまたはトリボディーのために、ｓｃＦｖ分子をＶＬ−ＣＬ（Ｌ）およびＶＨ−ＣＨ１（Ｆｄ）鎖の１つまたは双方に融合し、例えばトリボディーを生成するために２つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合するが、一方ビボディーでは、１つのｓｃＦｖをＦａｂのＣ末端に融合する。
【００８４】
抗体の組換え生成
当分野において周知の抗体発現系の１つを用いて組換えＤＮＡ方法論により抗体を生成できる（例えばHarlow and Lane, Antibodies：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory（１９８８）を参照）。
本発明の抗体をコードするＤＮＡを発現ベクターに入れ、それを次いで、それがなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない大腸菌、サルＣＯＳ細胞、ヒト胚性腎２９３細胞（例えば２９３Ｅ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を会得する。抗体の組換え生成は当分野において周知である。抗体フラグメントはインタクトな抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されている（例えばMorimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods ２４：１０７−１１７（１９９２）およびBrennan et al., Science ２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながらこれらのフラグメントを今は組換え宿主細胞により直接生成することができる。ペプチド合成および共有結合を含む抗体フラグメントの生成のためのその他の技術は当業者に明白である。
【００８５】
発現制御配列とは特定の宿主生物において作動可能なように連結されたコード化配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適当である制御配列には、例えばプロモーター、場合によってはオペレーター配列およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、別の核酸配列との機能的関係に置かれた場合に作動可能なように連結されている。例えばプレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能なように連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード化配列に作動可能なように連結されている；またはリボソーム結合部位は翻訳を促進するように位置する場合、コード化配列に作動可能なように連結されている。一般的には作動可能なように連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が近接しており、そして分泌リーダーの場合、近接し、そして読み取り相にあることを意味する。しかしながらエンハンサーは近接している必要はない。連結は都合のよい制限部位でのライゲーションにより達成される。かかる部位が存在しない場合、従来の実施方法にしたがって合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
【００８６】
細胞、細胞系および細胞培養はしばしば互換的に用いられ、そして本明細書ではかかる名称は全て子孫を含む。形質転換体および形質転換された細胞には、移行の数にこだわらず、一次対象細胞およびそこから誘導された培養物が含まれる。全ての子孫は計画的または偶発的な変異のために、ＤＮＡ含量が正確に同一ではないかもしれないことも理解される。元来の形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。名称の区別が意図される場合、その局面から明白である。
【００８７】
代替えの実施態様では、目的の免疫グロブリンのアミノ酸配列を直接的なタンパク質シークエンシングにより決定できる。ユニバーサルコドン表にしたがって適当なコード化ヌクレオチド配列を設計することができる。
適切なヌクレオチド変化をコード化ＤＮＡに導入することにより、またはペプチド合成により望ましい抗体のアミノ酸配列ムテインを調製できる。かかるムテインには、例えば抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれへの挿入および／またはそれの置換が含まれる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを作成して、最終構築物が望ましい特徴を保有すれば、最終構築物に到達する。アミノ酸変化はまたグリコシル化部位の数または位置の変化のような、モノクローナル、ヒト、ヒト化、Human Engineered（商標）またはムテイン抗体の翻訳後プロセシングをも改変し得る。
【００８８】
抗体のアミノ酸配列ムテインをコードする核酸分子を当分野において公知の種々の方法により調製する。これらの方法には、限定するものではないが天然の供給源からの単離（天然発生アミノ酸配列ムテインの場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および抗体の早期に調製されたムテインもしくは非ムテイン型のカセット変異誘発による調製が含まれる。
本発明はまた本発明の抗体をコードする、場合によっては宿主細胞、ベクターおよび核酸を含んでなる宿主細胞により認識される制御配列に作動可能なように連結された、単離された核酸、ならびに核酸が発現されるように宿主細胞を培養すること、および場合によっては宿主細胞培養または培養培地から抗体を回収することを含んでなることができる、抗体を生成するための組換え技術をも提供する。
【００８９】
抗体の組換え生成のために、それをコードする核酸を単離し、そしてさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入する。従来の手順を用いて（例えば抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドヌクレオチドプローブを使用することにより）モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離し、そしてシークエンシングする。多くのベクターが利用可能である。ベクター構成要素には一般的には、限定するものではないが１つ以上の以下のものが含まれる：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列。
【００９０】
（１）シグナル配列構成要素
本発明の抗体を直接的のみならず、好ましくは成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端で特的切断部位を有するシグナル配列またはその他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても組換えにより生成できる。選択されるシグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。原核生物性宿主細胞が自然抗体シグナル配列を認識およびプロセシングしない場合、シグナル配列を例えばペクチン酸リアーゼ（例えばｐｅｌＢ）、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択されるシグナル配列により置換することができる。酵母分泌のために、自然のシグナル配列を例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセスおよびクルイベロマイセスα因子リーダーを含む）、または酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンスグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載されるシグナルにより置換できる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
かかる前駆領域に関するＤＮＡを、抗体をコードするＤＮＡに読み枠内でライゲートする。
【００９１】
（２）複製起点構成要素
発現およびクローニング双方のベクターは１つ以上の選択された宿主細胞においてベクターを複製可能にする核酸配列を含有する。一般的には、クローニングベクターではこの配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立してベクターを複製可能にするものであり、そして複製起点または自己複製配列を含む。かかる配列は種々の細菌、酵母およびウイルスに関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はたいていのグラム陰性細菌に適当であり、２μプラスミド起点は酵母に適当であり、そして種々のウイルス起点は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に複製起点構成要素は哺乳動物発現ベクターに必要ではない（典型的にはそれが初期プロモーターを含有するという理由だけでＳＶ４０起点を使用できる）。
【００９２】
（３）選択マーカー構成要素
発現およびクローニングベクターは選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有できる。典型的な選択遺伝子は（ａ）抗生物質またはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、テトラサイクリン、Ｇ４１８、ジェネテシン、ヒスチジノールまたはミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する；（ｂ）栄養要求性欠損を補完する；または（ｃ）複合培地から利用できない必須栄養を供給する；タンパク質をコードし、例えば桿菌に関するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【００９３】
選択スキームの一例は宿主細胞の増殖を停止させる薬物を利用する。異種性遺伝子で成功裏に形質転換されたこれらの細胞は薬物抵抗性を付与するタンパク質を生成し、そして故に選択レジメンを生き抜く。かかる優性選択の例は薬物メトトレキサート、ネオマイシン、ヒスチジノール、ピューロマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞のための適当な選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−ＩおよびＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等のような抗体コード化核酸を取り込む能力のある細胞を同定することを可能にするものである。
【００９４】
例えばＤＨＦＲの競合アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で全ての形質転換体を培養することにより、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞を最初に同定する。適切な宿主細胞は、野生型ＤＨＦＲを用いる場合、ＤＨＦＲ活性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系である。
これに代えて、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のような別の選択可能マーカーで形質転換または同時形質転換された宿主細胞（とりわけ内因性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）を、アミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８のような選択可能マーカーに関する選択剤を含有する培地中での細胞増殖により選択することができる。例えば米国特許第４９６５１９９号を参照されたい。
【００９５】
酵母において使用するための適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, ２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子はトリプトファン中で増殖する能力を欠如する酵母の変異株のための選択マーカーを提供する（例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４−１）。Jones, Genetics, ８５：１２（１９７７）。酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１破壊の存在は、次いでトリプトファン不在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）はＬｅｕ２遺伝子を担持する公知のプラスミドにより補完される。Ｕｒａ３欠損酵母株はｕｒａ３遺伝子を担持するプラスミドにより補完される。
【００９６】
加えて、１.６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されたベクターをクルイベロマイセス酵母の形質転換に使用できる。これに代えて組換え仔ウシキモシンの大規模生成のための発現系がクルイベロマイセス・ラクチスに関して報告された。Van den Berg, Bio／Technology, ８：１３５（１９９０）。クルイベロマイセスの工業用菌株による組換え成熟ヒト血清アルブミンの分泌に適当な多コピー発現ベクターもまた開示されている。Fleer et al, Bio／Technology, ９：９６８−９７５（１９９１）。
【００９７】
（４）プロモーター構成要素
発現およびクローニングベクターは通常宿主生物により認識され、そして抗体コード化核酸に作動可能なように連結されたプロモーターを含有する。原核生物宿主での使用に適当なプロモーターにはアラビノース（例えばａｒａＢ）プロモーター、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリ性ホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。しかしながらその他の公知の細菌プロモーターは適当である。細菌系での使用のためのプロモーターはまた本発明の抗体をコードするＤＮＡに作動可能なように連結されたシャイン・ダルガノ（Ｓ．Ｄ．）配列もまた含有するであろう。
【００９８】
真核生物のためのプロモーティング配列は公知である。実質的に全ての真核生物遺伝子は転写が開始される部位からおよそ２５から３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の出発から７０から８０塩基上流に見出される別の配列はＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは任意のヌクレオチドでよい。たいていの真核生物遺伝子の３’末端はＡＡＴＡＡＡ配列であり、それはコード化配列の３’末端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全ては真核生物性発現ベクターに適当に挿入される。
【００９９】
酵母宿主での使用に適当なプロモーター配列の例にはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼのような３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の解糖系酵素のためのプロモーターが含まれる。
【０１００】
その他の酵母プロモーターは増殖条件により制御されるさらなる転写の利点を有する誘導プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼならびにマルトースおよびガラクトース利用に寄与する酵素のためのプロモーター領域である。酵母発現での使用に適当なベクターおよびプロモーターはさらに欧州特許第７３６５７号において記載される。酵母エンハンサーもまた酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０１０１】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、プロモーターが宿主細胞系と適合するという条件で、例えばエーベルソン白血病ウイルス、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御される。
【０１０２】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターはＳＶ４０ウイルス複製起点をも含有するＳＶ４０制限フラグメントとして都合良く得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限フラグメントとして都合よく得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いて哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は米国特許第４４１９４４６号に開示される。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８号に記載される。単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関してはReyes et al., Nature ２９７：５９８−６０１（１９８２）もまた参照されたい。これに代えてラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１０３】
（５）エンハンサーエレメント構成要素
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写はしばしばエンハンサー配列をベクターに挿入することにより増大する。今は哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）からの多くのエンハンサー配列が公知である。しかしながら典型的には、真核細胞性ウイルスからのエンハンサーが使用される。例には複製起点の後期側（late side）（１００−２７０塩基対）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物性プロモーターの活性化のためのエレメントエンハンシングに関してはYaniv, Nature ２９７：１７−１８（１９８２）もまた参照されたい。エンハンサーは抗体コード化配列に対して５’または３’位置でベクターにスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。
【０１０４】
（６）  転写終止構成要素
真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたはその他の多細胞生物からの有核細胞）において用いられる発現ベクターもまた転写の終止のために、およびｍＲＮＡを安定化するために必要な配列を含有するであろう。かかる配列は一般的に真核生物性またはウイルス性ＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時折３’未翻訳領域から利用可能である。これらの領域は抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。１つの有用な転写終止構成要素はウシ増殖ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに開示される発現ベクターを参照されたい。もう１つのものはマウス免疫グロブリン軽鎖転写ターミネーターである。
【０１０５】
（７）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するための適当な宿主細胞は前記された原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的に適当な原核生物には、グラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌、例えばエシェリキア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば霊菌および赤痢菌のような腸内細菌科、ならびに枯草菌およびバチルス・リケニホルミスのような桿菌（例えば１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されるバチルス・リケニホルミス４１Ｐ）、緑膿菌のようなシュードモナス、およびストレプトマイセスが含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のようなその他の株は適当である。これらの例は限定的よりむしろ説明的である。
【０１０６】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核生物性微生物が抗体コード化ベクターに適当なクローニングまたは発現宿主である。出芽酵母または一般的なパン酵母が下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら分裂酵母；例えばクルイベロマイセス・ラクチス、クルイベロマイセス・フラギリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、クルイベロマイセス・ブルガリカス（ＡＴＣＣ１６０４５）、クルイベロマイセス・ウィッケルハミ（ＡＴＣＣ２４１７８）、クルイベロマイセス・ワルチ（ＡＴＣＣ５６５００）、クルイベロマイセス・ドロソリフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、クルイベロマイセス・サーモトレランスおよびクルイベロマイセス・マルキシアヌスのようなクルイベロマイセス宿主；ヤロウイア（欧州特許第４０２２２６号）；ピキア・パストリス（欧州特許第１８３０７０号）；カンジダ；トリコデルマ・リーゼイ（欧州特許第２４４２３４号）；アカパンカビ；シュワニオマイセス・オクシデンタリスのようなシュワニオマイセス；ならびに例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウムのような糸状菌、およびアスペルギルス・ニデュランスおよびクロコウジカビのようなアスペルギルスのような多くのその他の属、種および株が一般的に利用可能であり、そして本明細書で有用である。
【０１０７】
グリコシル化抗体の発現に適当な宿主細胞を多細胞生物から誘導する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。非常に多くのバキュロウイルス株およびバリアント、ならびにヨトウガ（イモムシ）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ジョウショウバエ）およびカイコのような宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えばオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１バリアントおよびカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公に利用可能であり、そしてかかるウイルスを本発明にしたがって本明細書のウイルスとして、とりわけヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用できる。
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、タバコ、アオウキクサおよびその他の植物細胞もまた宿主として利用することができる。
【０１０８】
しかしながら脊椎動物細胞における関心が最も高く、そして培養中の脊椎動物細胞の繁殖（組織培養）は日常的な手順になりつつある。有用な哺乳動物宿主細胞系の例はＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４およびチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣細胞；ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓系（浮遊培養中での増殖のためにサブクローン化された２９３または２９３細胞［Graham et al., J. Gen Virol. ３６：５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. ２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. ３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１０９】
宿主細胞を前記された発現またはクローニングベクターで抗体生成のために形質転換またはトランスフェクトし、そしてプロモーターを誘導する、形質転換体を選択する、または望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地中で培養する。加えて新規ベクターおよび、選択マーカーにより分離された転写ユニットの多コピーでトランスフェクトされた細胞系がとりわけ有用であり、そして抗体の発現に好ましい。
【０１１０】
（８）宿主細胞の培養
本発明の抗体を生成するために使用される宿主細胞を種々の培地中で培養できる。ハムＦ１０（Sigma）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Sigma）、ＲＰＭＩ−１６４０（Sigma）、およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Sigma）のような市販により入手可能である培地が宿主細胞を培養するのに適当である。加えてHam et al., Meth. Enz. ５８：４４（１９７９）、Barnes et al., Anal. Biochem. １０２：２５５（１９８０）、米国特許第４７６７７０４号；第４６５７８６６号；第４９２７７６２号；第４５６０６５５号；または第５１２２４６９号；ＷＯ９０１０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国特許Ｒｅ．第３０９８５号に記載されるいずれかの培地を宿主細胞のための培養培地として使用できる。これらの培地のいずれかを必要によりホルモンおよび／またはその他の増殖因子（例えばインスリン、トランスフェリンまたは表皮増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、バッファー（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタマイシン（商標）薬物）、微量元素（通常マイクロモル濃度の範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは均等なエネルギー供給源で補充できる。当業者に公知であろう任意のその他の必要な補充物を適切な濃度で含むこともできる。温度、ｐＨ等のような培養条件は発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者には明白であろう。
【０１１１】
（９）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体を細胞内で、細胞膜周辺腔で生成するか、または微生物培養からを含む培地に直接分泌することができる。抗体を細胞内で生成する場合、最初の工程として、粒子性のデブリ、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかを例えば遠心または限外ろ過により除去する。Better et al. Science ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ICSU Short Reports １０：１０５（１９９０）；およびProc. Natl. Acad. Sci. USA ９０：４５７−４６１（１９９３）は大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順を記載する（［Carter et al., Bio／Technology １０：１６３−１６７（１９９２）］をも参照されたい）。
【０１１２】
微生物または哺乳動物細胞から調製された抗体組成物を例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、カチオンまたはアニオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの安定性は抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いてヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Lindmark et al., J. Immunol. Meth. ６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨されている（Guss et al., EMBO J. ５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが付着するマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、その他のマトリックスが利用可能である。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような力学的に安定なマトリックスにより、アガロースで達成できるよりもより速い流速およびより短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含んでなる場合、Bakerbond ABX（商標）樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（商標）でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー（例えばポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿のようなタンパク質精製のためのその他の技術もまた回収される抗体に依存して利用可能である。
【０１１３】
キメラ抗体
ヒトにおける単独でまたは抱合体としてのいずれかでのインビボ反復投与でげっ歯類抗体はレシピエントにおいてげっ歯類抗体に対する免疫応答；いわゆるＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）をもたらす。ＨＡＭＡ応答は反復投与を必要とする場合、医薬品の有効性を制限し得る。ポリエチレングリコールのような親水性重合体で抗体を化学的修飾することにより、または抗体構造をさらにヒト様に、例えばキメラ、ヒト化、ヒトまたはHuman Engineered（商標）抗体にする遺伝子操作法を用いることにより抗体の免疫原性を低減できる。かかる操作された抗体が親マウスモノクローナル抗体よりもヒトにおいて低免疫原性であるので、アラフィラキシーの危険性がかなり低いそれらをヒトの処置に使用することができる。故にこれらの抗体はヒトへのインビボ投与を伴う治療適用に好ましいかもしれない。
【０１１４】
当分野において公知の標準的な手順を用いてマウスモノクローナル抗体の可変Ｉｇドメインがヒトヒト定常Ｉｇドメインに融合されているキメラモノクローナル抗体を作成することができる（Morrison, S. L., et al.「キメラヒト抗体分子；ヒト定常領域ドメインを伴うマウス抗原結合ドメイン」 Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８１；６８４１−６８５５（１９８４）；およびBoulianne, G. L., et al, Nature ３１２：６４３−６４６（１９８４）参照）。例えばＣＥＡに結合するげっ歯類抗体の可変ドメインに関する遺伝子配列をヒト骨髄腫タンパク質の可変ドメインと置き換え、故に組換えキメラ抗体を生成することができる。これらの手順は欧州特許第１９４２７６号、欧州特許第０１２０６９４号、欧州特許第０１２５０２３号、欧州特許第０１７１４９６号、欧州特許第０１７３４９４号およびＷＯ８６／０１５３３に詳記される。いくつかのキメラモノクローナル抗体はヒトにおいて低免疫原性であることが判明しているが、マウス可変Ｉｇドメインは依然有意なヒト抗マウス応答を導くことができる。
【０１１５】
ヒト化抗体
例えば：（１）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワークおよび定常領域にグラフティング(grafting)すること（当分野で「ＣＤＲグラフティング」によるヒト化と称される過程）、またはこれに代えて（２）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、それを表面残基の置き換えによりヒト様表面で「覆う」こと（当分野で「ベニアリング（veneering）と称される過程）を含む種々の方法によりヒト化抗体を達成できる。本発明では「ヒト化」および「ベニアリングされた」抗体の双方がヒト化抗体に含まれるであろう。これらの方法は例えばJones et al., Nature ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., ８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Morrison and Oi, Adv. Immunol., ４４：６５−９２（１９８８）；Verhoeyer et al., Science ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Padlan, Molec. Immun. ２８：４８９−４９８（１９９１）；Padlan, Molec. Immunol. ３１（３）：１６９−２１７（１９９４）；およびKettleborough, C.A. et al., Protein Eng. ４（７）：７７３−８３（１９９１）（その各々を出典明示により本明細書の一部とする）にて開示される。
【０１１６】
例えばげっ歯類抗体のＣＤＲの遺伝子配列を単離するかまたは合成し、そして相同なヒト抗体遺伝子の対応する配列領域で置換して元来のげっ歯類抗体の特異性を有するヒト抗体を生成できる。これらの手順は欧州特許第０２３９４０号、ＷＯ９０／０７８６１およびＷＯ９１／０９９６７に記載される。
【０１１７】
ＣＤＲグラフティングはマウス重および軽鎖可変Ｉｇドメインからの６個のＣＤＲのうちの１個以上をヒト可変Ｉｇドメインの適切な４つのフレームワーク領域に導入することを伴い、ＣＤＲグラフティングとも称される。この技術（Riechmann, L., et al., Nature ３３２：３２３（１９８８））は保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１−ＦＲ４）を足場として利用して一次的に抗原と接触するＣＤＲループを支持する。しかしながらＣＤＲグラフティングの不都合は、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原結合に寄与するため、およびＣＤＲループのアミノ酸が２つの可変Ｉｇドメインの会合に影響し得るために、それが元来のマウス抗体よりも実質的に低い結合親和性を有するヒト化抗体に至り得るという点である。ヒト化モノクローナル抗体の親和性を維持するために、元来のマウス抗体のフレームワーク領域に最も極めて類似するヒトフレームワーク領域を選択することにより、および抗原結合部位のコンピューターモデリングを援用するフレームワークまたはＣＤＲ内の単一のアミノ酸の部位特異的変異誘発によりＣＤＲグラフティング技術を改善することができる（例えばCo, M. S., et al., J. Immunol. １５２：２９６８−２９７６（１９９４））。
【０１１８】
抗体をヒト化する１つの方法は非ヒト重および軽鎖配列をヒト重および軽鎖配列に対してアラインすること、かかるアラインメントに基づいて非ヒトフレームワークを選択し、そしてヒトフレームワークで置き換えること、ヒト化配列の立体構造を予測するために分子モデリングすること、および親抗体の立体構造と比較することを含んでなる。この過程に続いてＣＤＲ領域における残基の復帰変異が反復され、ヒト化配列モデルの予測される立体構造が親非ヒト抗体の非ヒトＣＤＲの立体構造に極めて近似するまで、それはＣＤＲの構造を妨害する。かかるヒト化抗体をさらに誘導体化して、例えばアシュウェル受容体を介する取り込みおよび排除を促進できる（例えば米国特許第５５３０１０１号および第５５８５０８９号（出典明示により本明細書の一部とする））。
合理的な設計による多くのマウスモノクローナル抗体のヒト化が報告されている（例えば２００２年７月１１日公開の第２００２００９１２４０号、ＷＯ９２／１１０１８および米国特許第５６９３７６２号、米国特許第５７６６８６６号を参照されたい）。
【０１１９】
Human Engineered（商標）抗体
「Human Engineered（商標）抗体」なる語句は非ヒト抗体から誘導された抗体、典型的にはマウスモノクローナル抗体を指す。これに代えてHuman Engineered（商標）抗体を親、非ヒト抗体の抗原結合特異性を保持するかまたは実質的に保持するが、それはヒトに投与された場合に親抗体と比較して減弱された免疫原性を呈するキメラ抗体から誘導できる。
【０１２０】
抗体可変ドメインのHuman Engineered（商標）はStudnickaにより抗体分子の結合活性を維持するが免疫原性を低減するための方法として記載される［例えばStudnickaら、米国特許第５７６６８８６号；Studnicka et al. Protein Engineering ７：８０５−８１４（１９９４）を参照されたい］。その方法によれば、各可変領域アミノ酸は置換のリスクが割り当てられている。アミノ酸置換は３つのリスクカテゴリーのうちの１つにより区別される：（１）低リスク変化は免疫原性を低減させる可能性が最も高く、抗原結合を乱す確率が最も低いものである；（２）中リスク変化はさらに免疫原性を低減させるであろうが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす確率がより高いものである；（３）高リスク残基は結合または抗体構造の維持に重要であり、そして抗原結合またはタンパク質フォールディングが影響を受けるリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造の役割のために、プロリンでの修飾は、その位置が典型的には低リスク位置であったとしても、一般的に少なくとも中リスク変化になると考えられる。
【０１２１】
以下のように抗原結合またはタンパク質フォールディングのいずれかに悪影響を及ぼす可能性がないが、ヒト環境で免疫原性を低減させる可能性があると決定された位置でヒトアミノ酸を置換するためのげっ歯類抗体の軽および重鎖の可変領域はHuman Engineered（商標）である。「低リスク」位置にあり、そしてその方法による修飾の候補であるアミノ酸残基は、げっ歯類可変領域のアミノ酸配列をヒト可変領域配列とアラインすることにより同定される。個々のＶＨもしくはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列または個々のもしくはコンセンサスヒト生殖細胞系配列を含む任意のヒト可変領域を使用することができる。任意の数の低リスク位置でまたは全ての低リスク位置でアミノ酸残基を変化させることができる。例えばアラインされたマウスおよびヒトアミノ酸残基が異なる各々の低リスク位置で、げっ歯類残基をヒト残基で置き換えるアミノ酸修飾を導入する。これに代えて、全ての低リスク位置で、および任意の数の中リスク位置でアミノ酸残基を変化させることができる。理想的には最も低い免疫原性を達成するために、全ての低および中リスク位置をげっ歯類からヒト配列に変化させる。
【０１２２】
修飾された重および／または軽鎖可変領域を含有する合成遺伝子を構築し、そしてヒトγ重鎖および／またはカッパ軽鎖定常領域に連結させる。任意のヒト重鎖および軽鎖定常領域を、ＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２のような任意のサブクラスの）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のような任意のサブクラスの）またはＩｇＭを含むHuman Engineered（商標）抗体可変領域と組み合わせて使用できる。ヒト重および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞のような宿主細胞に導入し、そして結果的に組換え免疫グロブリン生成物が得られ、そして特徴付けされる。
【０１２３】
トランスジェニック動物からのヒト抗体
内因性免疫グロブリン生成を行わず、そしてヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように操作されたトランスジェニック動物を用いて抗原を標的とするヒト抗体を生成することもできる。例えばＷＯ９８／２４８９３は、内因性重および軽鎖遺伝子座の不活化のために動物が機能的な内因性免疫グロブリンを生成しない、ヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック動物を開示する。ＷＯ９１／１０７４１はまた、抗体が霊長類定常および／または可変領域を有し、そして遺伝子座をコードする内因性免疫グロブリンが置換されたかまたは不活化された、免疫原に対して免疫応答を開始することができるトランスジェニック非霊長類哺乳動物宿主を開示する。ＷＯ９６／３０４９８は、例えば定常または可変領域の全てまたは一部を置き換えて修飾された抗体分子を形成するために、哺乳動物における免疫グロブリン遺伝子座を修飾するためのＣｒｅ／Ｌｏｘ系の使用を開示する。ＷＯ９４／０２６０２は不活化された内因性Ｉｇ遺伝子座および機能的ヒトＩｇ遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物宿主を開示する。米国特許第５９３９５９８号は、内因性重鎖を欠如し、そして１つ以上の異種定常領域を含んでなる外因性免疫グロブリン遺伝子座を発現するトランスジェニックマウスを作成する方法を開示する。
【０１２４】
前記されたトランスジェニック動物を使用すると、選択された抗原性分子に対して免疫応答を生むことができ、そして抗体生成細胞を動物から取り出し、そしてヒトモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを生成するために使用することができる。免疫プロトコール、アジュバント等は当分野において公知であり、そして例えばＷＯ９６／３３７３５に記載されるようなトランスジェニックマウスの免疫に使用される。この公開公報はＩＬ６、ＩＬ８、ＴＮＦａ、ヒトＣＤ４、Ｌセレクチン、ｇｐ３９および破傷風毒素を含む種々の抗原性分子に対するモノクローナル抗体を開示する。モノクローナル抗体を、対応するタンパク質の生物学的活性または生理学的影響を阻止または中和する能力に関して試験することができる。ＷＯ９６／３３７３５は、ＩＬ−８で免疫されたトランスジェニックマウスの免疫細胞から誘導されたＩＬ−８に対するモノクローナル抗体が、ＩＬ−８誘起の好中球の機能を遮断したことを開示する。トランスジェニック動物を免疫するために用いられた抗原に関して特異性を有するヒトモノクローナル抗体もまたＷＯ９６／３４０９６および米国特許出願第２００３０１９４４０４号；ならびに米国特許出願第２００３００３１６６７号に開示される。Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９０：２５５１（１９９３）；Jakobovits et al., Nature, ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Bruggermann et al., Year in Immuno., ７：３３（１９９３）；ならびに米国特許第５５９１６６９号、米国特許第５５８９３６９号、米国特許第５５４５８０７号；ならびに米国特許出願第２００２０１９９２１３号、ＷＯ９６／３４０９６および米国特許出願第２００３０１９４４０４号；ならびに米国特許出願第２００３００３１６６７号もまた参照されたい。
【０１２５】
モノクローナル抗体を作成するために有用なさらなるトランスジェニック動物には、米国特許第５７７０４２９号およびFishwild, et al., Nat. Biotechnol. １４：８４５−８５１（１９９６）に記載される、ヒト抗体の重および軽鎖をコードする再構成されたヒト抗体遺伝子からの遺伝子配列を含有するMedarex HuMAb−MOUSE（登録商標）が含まれる。HuMAb−MOUSE（登録商標）の免疫により、標的タンパク質に対するモノクローナル抗体の生成が可能になる。
またIshida et al., Cloning Stem Cells. ４：９１−１０２（２００２）により、メガベースの大きさのヒトＤＮＡのセグメントを含んでなり、そして全ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ）遺伝子座を組み込むトランスクロモマウス（TCMOUSE（商標））が記載される。TCMOUSEはＩｇＧの全てのサブクラス（ＩｇＧ１−Ｇ４）を含む十分に多様なレパートリーのｈＩｇを有する。TC Mouseの種々のヒト抗原での免疫はヒト抗体を含んでなる抗体応答を生む。
米国特許出願第２００３００９２１２５号により、望ましいエピトープに対して動物の免疫応答を偏らせるための方法が記載される。インビトロ活性化されたＢ細胞によりヒト抗体を作成することもできる（米国特許第５５６７６１０号および第５２２９２７５号参照）。
【０１２６】
ファージディスプレイテクノロジーからの抗体
組換えヒト抗体遺伝子のレパートリーおよび糸状バクテリオファージの表面でのコード化抗体フラグメントの提示を作成するためのテクノロジーの開発はヒト抗体を直接作成および選択するための組換え手段を提供しており、それをヒト化、キメラ、マウスまたはムテイン抗体にも適用できる。ファージテクノロジーにより生成された抗体は細菌における抗原結合フラグメント、通常ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして生成され、そして故にエフェクター機能を欠如する。２つの計画のうちの１つによりエフェクター機能を導入することができる：フラグメントを哺乳動物細胞における発現のための完全抗体か、またはエフェクター機能を誘発することができる第２の結合部位を伴う二特異性抗体フラグメントのいずれかに操作することができる。
【０１２７】
典型的には、抗体のＦｄフラグメント（ＶＨ−ＣＨ１）および軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）をＰＣＲにより別個にクローン化し、そしてコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーで無作為に組み換え、次いでそれを特定の抗原に対する結合に関して選択することができる。Ｆａｂフラグメントはファージ表面で発現され、すなわちそれらをコードする遺伝子と物理的に連結される。故に抗原結合によるＦａｂの選択は、Ｆａｂコード化配列に関して同時選択し、それを逐次的に増幅することができる。数ラウンドの抗原結合および再増幅（パニングと称される手順）により抗原に特異的なＦａｂが富化され、そして最終的に単離される。
【０１２８】
１９９４年には、「ガイド選択（guided selection）」と称される抗体のヒト化のための研究法が記載された。ガイド選択はマウスモノクローナル抗体のヒト化のためのファージディスプレイ技術の力を利用する（Jespers, L. S., et al., Bio／Technology １２, ８９９−９０３（１９９４）参照）。これのために、マウスモノクローナル抗体のＦｄフラグメントをヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示することができ、そして次に得られたハイブリッドＦａｂライブラリーを抗原で選択できる。それによりマウスＦｄフラグメントは選択をガイドする鋳型を提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖をヒトＦｄフラグメントライブラリーと組み合わせる。得られたライブラリーの選択により全ヒトＦａｂを生じる。
【０１２９】
ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を誘導するための種々の手順が記載されている（例えばHoogenboom et al., J. Mol. Biol., ２２７：３８１（１９９１）；Marks et al., J. Mol. Biol, ２２２：５８１−５９７（１９９１）；米国特許第５５６５３３２号および第５５７３９０５号；Clackson, T., and Wells, J. A., TIBTECH １２, １７３−１８４（１９９４）を参照されたい）。とりわけファージディスプレイライブラリーから誘導される抗体のインビトロ選択および発展は有力な道具になりつつある（Burton, D. R., and Barbas III, C. F., Adv. Immunol. ５７, １９１−２８０（１９９４）；ならびにWinter, G., et al., Annu. Rev. Immunol. １２, ４３３−４５５（１９９４）；米国特許出願第２００２０００４２１５号およびＷＯ９２／０１０４７；２００３年１０月９日公開の米国特許出願第２００３０１９０３１７号および米国特許第６０５４２８７号；米国特許第５８７７２９３号参照）。
【０１３０】
Watkins, 「捕捉リフトによるファージ発現抗体ライブラリーのスクリーニング」Methods in Molecular Biology, Antibody Phage Display：Methods and Protocols １７８：１８７−１９３、および２００３年３月６日公開の米国特許出願第２００１２００３００４４７７２号では、固体支持体上での候補結合分子の固定を伴う、ファージ発現された抗体ライブラリーまたはその他の結合分子を捕捉リフト（capture lift）によりスクリーニングするための方法が記載される。
本明細書の「スクリーニング方法」と題されたセクションで記載されるようなアッセイを用いて、または当分野において公知の任意の適当なアッセイを用いて、抗体生成物を本発明の処置方法における活性および安定性に関してスクリーニングできる。
【０１３１】
アミノ酸配列ムテイン
本発明の抗体は、ＣＤＲ内を含む可変領域または可変領域に均等な部分における少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失または挿入により親抗体のポリペプチド配列が改変されている、親抗体のムテインを含むが、ただしそのムテインは望ましい結合親和性または生物学的活性を保持する。ムテインは親抗体に対して実質的に相同または実質的に同一、例えば少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一または相同でよい。この配列に関する同一性または相同性は本明細書では、必要により最大配列同一性パーセントを達成するために配列をアラインし、そしてギャップを導入した後、そして任意の保存置換を配列同一性の一部として考えないで、候補配列における親配列と同一であるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部伸長、欠失または挿入には配列同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきものはない。故に２つのポリペプチドのアミノ酸の位置における類似性を比較するために一般的に用いられる標準的な方法により配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータープログラムを用いて２つのポリペプチドをその各々のアミノ酸の最適な照合のために（１つもしくは双方の配列の全長に沿って、または１つもしくは双方の配列の予め決定された部分に沿ってのいずれかで）アラインする。プログラムはデフォルトオープニングペナルティーおよびデフォルトギャップペナルティーを提供し、そしてＰＡＭ２５０のようなスコアリングマトリックス［標準的なスコアリングマトリックス；Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. ５, supp. ３（１９７８）参照］をコンピュータープログラムと連動させて使用することができる。例えば次に同一性パーセントを以下のように計算することができる：同一の照合の全数を１００倍し、そして次に照合された範囲内のより長い配列の長さおよび２つの配列をアラインするためにより長い配列に導入されたギャップの数の合計により除する。
【０１３２】
本発明の抗体はまた定常領域のポリペプチド配列における改変を含むことができ、それは結合親和性に影響しないが、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）または排除および取り込み（および結果的に半減期に及ぼす影響）のようなエフェクター機能を改変し得る。
【０１３３】
挿入
アミノ酸配列挿入には１個の残基から１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数の、例えば２個、３個またはそれより多いアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体またはエピトープタグもしくはサルベージ受容体エピトープに融合された抗体（抗体フラグメントを含む）が含まれる。抗体分子のその他の挿入ムテインには、グリコシル化部位の付加、分子内もしくは分子間結合のためのシステインの付加、または例えばＮ末端もしくはＣ末端での抗体の血清半減期を増大されるポリペプチドへの融合が含まれる。例えば（複数の）システイン結合を抗体に付加してその安定性を改善することができる（とりわけ抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
【０１３４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ連結またはＯ連結のいずれかである。Ｎ連結は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の付着を指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸはプロリン以外の任意のアミノ酸である）はアスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的付着のための認識配列である。ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は潜在的なグリコシル化部位を創成する。故に抗体がこれらのトリペプチド配列のうちの１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより、Ｎ連結グリコシル化部位を抗体に付加できる。Ｏ連結グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの付着を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用できる。１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を元来の抗体の配列に挿入または置換することにより、Ｏ連結グリコシル化部位を抗体に付加できる。
【０１３５】
「エピトープタグ化」なる用語はエピトープタグに融合された抗体を指す。エピトープタグポリペプチドは、そこで対して抗体を作成できるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、抗体の活性を干渉しないほどに十分短い。好ましくは、エピトープタグは十分に独特であり、そこで対する抗体はその他のエピトープと実質的に交差反応しない。適当なタグポリペプチドは一般的には少なくとも６個のアミノ酸残基、および通常約８−５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは約９−３０個の間の残基）を有する。例にはインフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol. Cell. Biol. ８：２１５９−２１６５（１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体［Evan et al., Mol. Cell. Biol. ５（１２）：３６１０−３６１６（１９８５）］；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering ３（６）：５４７−５５３（１９９０）］が含まれる。その他の典型的なタグはポリヒスチジン配列、一般的にはほぼ６個のヒスチジン残基であり、ニッケルキレート化を用いてそのように標識された化合物の単離が可能になる。FLAG（登録商標）タグ（Eastman Kodak, Rochester, NY）のようなその他の標識およびタグは周知であり、そして当分野において日常的に用いられ、本発明に包含される。
本明細書で使用される際には「サルベージ受容体結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指し、それはＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増大させるのに寄与する。
【０１３６】
欠失
アミノ酸配列欠失には、結果的に標的抗原に関する結合親和性を保持するフラグメントに至る、１個から１００個以上の残基までの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端欠失、ならびに単一または複数の、例えば２個、３個またはそれより多いアミノ酸残基の配列内欠失が含まれる。例えばグリコシル化部位を欠失するか、またはトリペプチドもしくはグリコシル化に関するその他の認識配列の一部または全てを欠失することにより、異なる位置に移動させることができる。
【０１３７】
置換
ムテインの別の型はアミノ酸置換ムテインである。これらのムテインは抗体分子内に除去された少なくとも１個のアミノ酸残基およびその場所に挿入された異なる残基を有する。いずれかの超可変もしくはＣＤＲ領域またはフレームワーク領域内の置換による変異原性が企図される。保存置換を表２に示す。最も保存された置換は「好ましい置換」の表題の下に見出される。かかる置換が結果的に生物学的活性を変化しない場合、次いで表１の「典型的な置換」と称される、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載されるようにさらなる置換変化を導入し、そして生成物をスクリーニングできる。
【０１３８】
表２
【表１１】
0005485696.tif 000012
【０１３９】
（ａ）例えばシートもしくはらせん立体構造のような、置換の領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積；の維持に及ぼすその影響において有意に異なる置換を選択することにより、抗体の生物学的特性における実質的な修飾を達成する。天然発生残基を共通する側鎖特性に基づいて群分けする：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）側鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１４０】
保存置換はアミノ酸をそのクラスの別のメンバーと置き換えることを伴う。非保存置換はこれらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと置き換えることを伴う。
抗体の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を、一般的にセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、そして異常な架橋を防御することもできる。
親和性成熟は一般的に親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体ムテインを調製およびスクリーニングし、そして親抗体と相対して結合親和性のような生物学的特性が改善されているムテインを選択することを伴う。かかる置換ムテインを作成するための都合のよい方式はファージディスプレイを用いる親和性成熟である。簡単には、いくつかの超可変領域部位（例えば６−７部位）を変異させて各部位で全ての可能なアミノ置換体を作成する。このように作成された抗体ムテインは一価の様式で糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物に対する融合体として提示される。次いでファージディスプレイムテインをその生物学的活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。例えばＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９３／１１２３６６、ＷＯ９５／１５３８８およびＷＯ９３／１９１７２を参照されたい。
【０１４１】
現在の抗体親和性成熟法は確率論的および非確率論的の２つの変異誘発カテゴリーに属する。誤りがちなＰＣＲ、ミューテーター細菌株（Low et al., J. Mol. Biol. ２６０：３５９−６８（１９９６））および飽和変異誘発（Nishimiya et al.,. J. Biol. Chem. ２７５：１２８１３−２０（２０００）；Chowdhury, P. S. Methods Mol. Biol. １７８：２６９−８５（２００２））は典型的な確率論的変異誘発法の典型的な例である（Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １０２：８４６６−７１（２００５））。非確率論的技術はしばしばアラニンスキャニングまたは部位特異的変異誘発を用いて、具体的なムテインの限定的な収集物を作成する。いくつかの方法を以下にさらに詳記する。
【０１４２】
パニング法による親和性成熟
漸減量の抗原の存在下で候補抗体を数ラウンドパニングすることにより組換え抗体の親和性成熟を実施する。ラウンドあたりの漸減量の抗原は、抗原に対して最も高い親和性を有する抗体を選択し、それにより出発材料の大きなプールから高親和性の抗体を生じる。パニングによる親和性成熟は当分野において周知であり、例えばHuls et al., Cancer Immunol Immunother. ５０：１６３−７１（２００１）に記載される。ファージディスプレイテクノロジーを用いる親和性成熟の方法は本明細書の他の箇所でも記載され、そして当分野において公知である（例えばDaugherty et al., Proc Natl Acad Sci U S A. ９７：２０２９−３４（２０００）参照）。
【０１４３】
ルックスルー変異誘発（Look−through mutagenesis）
ルックスルー変異誘発（ＬＴＭ）（Rajpal et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １０２：８４６６−７１（２００５））は抗体結合部位を迅速に位置決定するための方法を提供する。ＬＴＭに関しては、抗体の６個のＣＤＲ全てにおいて各位置で結合への機能的側鎖の寄与を精査するために、２０個の天然アミノ酸により提供される主要な側鎖化学の代表である９個のアミノ酸を選択する。ＬＴＭはＣＤＲ内で位置的に一連の単一変異を作成し、ここで各「野生型」残基は９個の選択されたアミノ酸のうちの１個により系統的に置換される。変異したＣＤＲは組み合わされて、複雑度およびサイズが増大するが、全てのムテインの量的提示を抑制することにはならないコンビナトリアル一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）ライブラリーを作成する。陽性選択の後、結合が改善されたクローンをシークエンシングし、そして有利な変異を位置決定する。
【０１４４】
誤りがちなＰＣＲ
誤りがちなＰＣＲは様々な選択ラウンドの間の核酸の無作為化を伴う。使用されたポリメラーゼの固有の誤り率により無作為化は低率で生じるが、転写の間に高い固有の誤り率を有するポリメラーゼを用いる誤りがちなＰＣＲ（Zaccolo et al., J. Mol. Biol. ２８５：７７５−７８３（１９９９））により増強され得る（Hawkins et al., J Mol Biol. ２２６：８８９−９６（１９９２））。変異サイクルの後、抗原に関する親和性が改善されたクローンを当分野では日常的な方法を用いて選択する。
【０１４５】
ＤＮＡシャッフリング
核酸シャッフリングはバリアントポリヌクレオチドを生成するためのより短いまたはより小型のポリヌクレオチドのプールのインビトロまたはインビボ相同組換えのための方法である。ＤＮＡシャッフリングは米国特許第６６０５４４９号、米国特許第６４８９１４５号、ＷＯ０２／０９２７８０およびStemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ９１：１０７４７−５１（１９９４）に記載されている。一般的に、ＤＮＡシャッフリングは：シャッフルされることになっている遺伝子のＤＮＡｓｅ１でのフラグメント化、フラグメントの無作為ハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼの存在下でＰＣＲ（セクシャルＰＣＲ）によるフラグメント化された遺伝子の再構築またはフィルイン、ならびに従来のＰＣＲによる再構築された生成物の増幅；の３つの工程からなる。
【０１４６】
ＤＮＡシャッフリングは、それが逆鎖反応であるという点で誤りがちなＰＣＲとは異なっている。誤りがちなＰＣＲでは、ポリメラーゼ出発部位の数および分子の数は指数関数的に増える。対照的に核酸の再構築または無作為ポリヌクレオチドのシャッフリングでは、出発部位の数および無作為ポリヌクレオチドの数（大きさではない）は経時的に減少する。
抗体の場合、ＤＮＡシャッフリングにより、例えば全てのＣＤＲ１の全てのＣＤＲ２との全てのＣＤＲ３との自由なコンビナトリアルな会合が可能になる。配列の複数のファミリーを同一の反応においてシャッフリングできることが企図される。さらに一般的にはシャッフリングは相対的な順序を保存し、例えばＣＤＲ１はＣＤＲ２の位置には見出されないであろう。稀少なシャッフラント（shufflant）が多数の最良の（例えば最も親和性の高い）ＣＤＲを含有し、そしてこれらの稀少なシャッフラントをその優れた親和性に基づいて選択できる。
【０１４７】
ＤＮＡシャッフリングで使用できる鋳型ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡでよい。それは遺伝子の大きさまたは組み換えられるもしくは再構築されることになっているより短いもしくはより小型のポリヌクレオチドの大きさに依存して種々の長さのものでよい。好ましくは鋳型ポリヌクレオチドは５０塩基対から５０キロ塩基対である。鋳型ポリヌクレオチドはしばしば二本鎖であるべきである。
鋳型ポリヌクレオチドに同一の領域および鋳型ポリヌクレオチドに相同な領域を有する一本鎖または二本鎖核酸ポリヌクレオチドを遺伝子選択の最初の工程の間に鋳型ポリヌクレオチドに添加できることが企図される。２つの異なるが関連するポリヌクレオチド鋳型を最初の工程の間に混合できることもまた企図される。
【０１４８】
アラニンスキャニング
抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するためにアラニンスキャニング変異誘発を実施することができる。Cunningham and Wells, Science ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）。標的残基の１つの残基または群を同定し（例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電残基）、そして中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置き換えて、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。置換に対する機能的感受性を実証するこれらのアミノ酸位置を、次いでさらなるもしくはその他のミューテーションサット（mutationsat）を導入することにより、または置換の部位のために精緻化する。故にアミノ酸配列変化を導入するための部位は予め決定されているが、変異の性質はそれ自体、予め決定されている必要はない。例えば所定の部位での変異の性能を分析するために、標的コドンまたは領域でアラニンスキャニングまたは無作為変異誘発を行い、そして発現された抗体ムテインを望ましい活性に関してスクリーニングする。
【０１４９】
コンピューター援用設計
これに代えて、または加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析すること、またはかかる接触点をモデル化するコンピューターソフトウェアを使用することは有利であり得る。かかる接触残基および近隣の残基は本明細書で詳細に説明される技術による置換の候補である。一度かかるムテインが作成されると、ムテインの一団は本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、そして１つ以上の関連性のあるアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択できる。
【０１５０】
親和性成熟は親抗体のＣＤＲ内に置換を有する抗体ムテインを調製およびスクリーニングし、そして親抗体と相対して結合親和性のような生物学的特性が改善されているムテインを選択することを伴う。かかる置換ムテインを作成するための都合のよい方式はファージディスプレイを用いる親和性成熟である。簡単には、いくつかの超可変領域部位（例えば６−７部位）を変異させて各部位で全ての可能なアミノ置換体を作成する。このように作成された抗体ムテインは一価の様式で糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物に対する融合体として提示される。次いでファージディスプレイムテインをその生物学的活性（例えば結合親和性）に関してスクリーニングする。
【０１５１】
抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定するためにアラニンスキャニング変異誘発を実施することができる。これに代えて、または加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するために抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することは有利であり得る。かかる接触残基および近隣の残基は本明細書で詳細に説明される技術による置換の候補である。一度かかるムテインが作成されると、ムテインの一団は本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、そして１つ以上の関連性のあるアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択できる。
【０１５２】
改変されたエフェクター機能
抗体のその他の修飾が企図される。例えばＥｐｈＢ３関連疾患または障害の処置において抗体の有効性を増強するために、例えばエフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾するのが望ましいかもしれない。例えば（複数の）システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。このように作成されたホモ二量体抗体は内部移行能力が改善され、そして／または補体媒介の細胞死滅および抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増大し得る。Caron et al., J. Exp Med. １７６：１１９１−１１９５（１９９２）およびShopes, B. J. Immunol. １４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照されたい。Wolff et al., Cancer Research ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるように、ヘテロ二機能性架橋剤を用いて、活性が増強されたホモ二量体抗体を調製することもできる。これに代えて、二重Ｆｃ領域を有する抗体を操作することができ、そしてそれにより補体溶解およびＡＤＣＣ能力が増強され得る。Stevenson et al., Anti−Cancer Drug Design ３：２１９−２３０（１９８９）を参照されたい。加えて、ＣＤＲ内の配列が抗体をＭＨＣクラスＩＩに結合させ、そして望ましくないヘルパーＴ細胞応答を誘発することができることが示されている。保存置換により抗体が結合活性を保持し、しかも望ましくないＴ細胞応答を誘発するその能力を失わせることを可能にできる。マウス可変領域がヒトガンマ１、ガンマ２、ガンマ３およびガンマ４定常領域と結合したキメラ抗体を記載するSteplewski et al., Proc Natl Acad Sci U S A. １９８８；８５（１３）：４８５２−６（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）もまた参照されたい。
【０１５３】
本発明の特定の実施態様では、インタクトな抗体よりむしろ抗体フラグメントを使用するのが望ましいかもしれない。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体フラグメントを修飾するのが望ましいかもしれず、例えばＰＥＧまたは多糖類重合体を含むその他の水溶性重合体のような分子を抗体フラグメントに添加して半減期を増大させる。これを例えばサルベージ受容体結合エピトープを抗体フラグメントに組み込むことにより（例えば抗体フラグメントにおける適切な領域の変異により、またはエピトープをペプチドタグに組み込み、次いで、例えばＤＮＡもしくはペプチド合成によりそのタグを末端もしくは中ほどのいずれかで抗体フラグメントに融合することにより）達成することもできる（例えばＷＯ９６／３２４７８を参照）。
【０１５４】
サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくはＦｃドメインの１個または２個のループからの任意の１個以上のアミノ酸残基が抗体フラグメントの類似の位置に移動されている領域を構成する。なおさらに好ましくは、Ｆｃドメインの１個または２個のループからの３個またはそれより多い残基が移動されている。またさらに好ましくは、エピトープは（例えばＩｇＧの）Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、そして抗体のＣＨ１、ＣＨ３もしくはＶＨ領域または１を超えるかかる領域に移動される。これに代えて、エピトープはＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、そして抗体フラグメントのＣＬ領域もしくはＶＬ領域または双方に移動される。Ｆｃバリアントおよびそのサルベージ受容体との相互作用を記載する国際出願ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８を参照されたい。
【０１５５】
故に本発明の抗体はヒトＦｃ部分、ヒトコンセンサスＦｃ部分、またはＦｃサルベージ受容体と相互作用する能力を保持するそのムテインを含んでなることができ、ジスルフィド結合に関与するシステインが修飾されるかもしくは除去されている、ならびに／またはＮ末端でｍｅｔが付加されており、そして／または１個以上のＮ末端の２０個のアミノ酸が除去されている、および／またはＣ１ｑ結合部位のような補体の相互作用する領域が除去されている、および／またはＡＤＣＣ部位が除去されているムテインが含まれる［例えばMolec. Immunol. ２９（５）：６３３−９（１９９２）参照］。ＩｇＧクラスの抗体はまた異なる定常領域を含むこともでき、例えばＩｇＧ２抗体を修飾してＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域を提示することができる。
【０１５６】
ＩｇＧ１の場合、定常領域、とりわけヒンジまたはＣＨ２領域に対する修飾はＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ活性を含むエフェクター機能を増大または低下させることができる。その他の実施態様では、ＩｇＧ２定常領域を修飾して抗体−抗原凝集形成を低減させることができる。ＩｇＧ４の場合、定常領域、とりわけヒンジ領域に対する修飾は半抗体の形成を低減させることができる。具体的な典型的な実施態様では、ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓのＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの変異が提供される。
【０１５７】
以前の研究により、ヒトおよびマウスＩｇＧにおけるＦｃＲに関する結合部位が最初にＩｇＧ残基２３３−２３９からなるヒンジ下部（lower hinge）領域に位置決定された。その他の研究によりさらに広いセグメント、例えばヒトＦｃ受容体Ｉに関してＧｌｙ３１６−Ｌｙｓ３３８、ヒトＦｃ受容体ＩＩＩに関するＬｙｓ２７４−Ａｒｇ３０１およびＴｙｒ４０７−Ａｒｇ４１６が提唱され、または下部ヒンジの外側のいくつかの具体的な残基、例えばマウスＦｃ受容体ＩＩと相互作用するマウスＩｇＧ２ｂに関してＡｓｎ２９７およびＧｌｕ３１８が見出された。ヒトＦｃ受容体ＩＩＩＡを伴うヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントの３.２Å結晶構造の報告により、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡに対する結合に関与するＩｇＧ１残基Ｌｅｕ２３４−Ｓｅｒ２３９、Ａｓｐ２６５−Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７−Ｔｈｒ２９９およびＡｌａ３２７−Ｉｌｅ３３２が描かれた。結晶構造に基づいて、下部ヒンジ（Ｌｅｕ２３４−Ｇｌｙ２３７）に加えて、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインループＦＧ（残基３２６−３３０）およびＢＣ（残基２６５−２７１）における残基がＦｃ受容体ＩＩＡに対する結合において役割を果たし得る。Shields et al., J. Biol. Chem., ２７６（９）：６５９１−６６０４（２００１）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。Ｆｃ受容体結合部位内の残基の変異はＡＤＣＣもしくはＣＤＣ活性の改変、または半減期の改変のようなエフェクター機能の改変を招き得る。前記されたように、潜在的変異には１つ以上の残基の挿入、欠失、またはアラニンでの置換、保存置換、非保存置換、もしくは異なるＩｇＧサブクラスからの同一位置での対応するアミノ酸残基で置き換え（例えばＩｇＧ１残基をその位置で対応するＩｇＧ２残基で置き換える）を含む置換が含まれる。
【０１５８】
Shieldsらにより、全てのヒトＦｃ受容体に対する結合に関与するＩｇＧ１残基がヒンジに近位のＣＨ２ドメインに位置し、そして以下のような２つのカテゴリーに入ることが報告された：１）全てのＦｃＲと直接相互作用し得る位置にはＬｅｕ２３４−Ｐｒｏ２３８、Ａｌａ３２７およびＰｒｏ３２９（および恐らくＡｓｐ２６５）が含まれる；２）炭水化物の性質または位置に影響を及ぼす位置にはＡｓｐ２６５およびＡｓｎ２９７が含まれる。Ｆｃ受容体ＩＩに対する結合に影響するさらなるＩｇＧ１残基は以下のとおりである：（最大効果）Ａｒｇ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５８、Ｓｅｒ２６７、Ａｓｐ２７０、Ｇｌｕ２７２、Ａｓｐ２８０、Ａｒｇ２９２、Ｓｅｒ２９８および（低い効果）Ｈｉｓ２６８、Ａｓｎ２７６、Ｈｉｓ２８５、Ａｓｎ２８６、Ｌｙｓ２９０、Ｇｌｎ２９５、Ａｒｇ３０１、Ｔｈｒ３０７、Ｌｅｕ３０９、Ａｓｎ３１５、Ｌｙｓ３２２、Ｌｙｓ３２６、Ｐｒｏ３３１、Ｓｅｒ３３７、Ａｌａ３３９、Ａｌａ３７８およびＬｙｓ４１４。Ａ３２７Ｑ、Ａ３２７Ｓ、Ｐ３２９Ａ、Ｄ２６５ＡおよびＤ２７０Ａは結合を低減させた。全てのＦｃＲに関して前記で同定された残基に加えて、Ｆｃ受容体ＩＩＩＡに対する結合を４０％以上まで低減させるさらなるＩｇＧ１残基は以下のとおりである：Ｓｅｒ２３９、Ｓｅｒ２６７（Ｇｌｙのみ）、Ｈｉｓ２６８、Ｇｌｕ２９３、Ｇｌｎ２９５、Ｔｙｒ２９６、Ａｒｇ３０１、Ｖａｌ３０３、Ｌｙｓ３３８およびＡｓｐ３７６。ＦｃＲＩＩＩＡに対する結合を改善したムテインには、Ｔ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４ＡおよびＡ３３９Ｔが含まれる。Ｌｙｓ４１４はＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＢに関する結合において４０％の低減、Ａｒｇ４１６はＦｃＲＩＩＡおよびＦｃＲＩＩＩＡに関して３０％の低減、Ｇｌｎ４１９はＦｃＲＩＩＡに対して３０％およびＦｃＲＩＩＢに対して４０％の低減、そしてＬｙｓ３６０はＦｃＲＩＩＩＡに対して２３％の改善を示した。Presta et al., Biochem. Soc. Trans.３０, ４８７−４９０（２００１）もまた参照されたい。
【０１５９】
例えば米国特許第６１９４５５１号（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域においてアミノ酸位置３２９、３３１または３２２（Kabatナンバリングを使用）で変異を含有する、改変されたエフェクター機能を伴うムテインを記載し、そのムテインのうちのいくつかは低減されたＣ１ｑ結合またはＣＤＣ活性を提示する。別の実例として、米国特許第６７３７０５６号（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域においてアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９（Kabatナンバリングを使用）で変異を含有する、改変されたエフェクターまたはＦｃガンマ受容体結合を伴うムテインを記載し、そのムテインのうちのいくつかはＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性の低減に関連する受容体結合プロフィールを提示する。これらのうち、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、３２７または３２９での変異はＦｃＲＩに対する結合を低減させると記載され、アミノ酸位置２３８、２６５、２６９、２７０、２９２、２９４、２９５、２９８、３０３、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３７３、３７６、４１４、４１６、４１９、４３５、４３８または４３９での変異はＦｃＲＩＩに対する結合を低減させると記載され、そしてアミノ酸位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９３、２９４、２９５、２９６、３０１、３０３、３２２、３２７、３２９、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１６、４３４、４３５または４３７での変異はＦｃＲＩＩＩに対する結合を低減させると記載される。
【０１６０】
米国特許第５６２４８２１号（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）により、重鎖のアミノ酸残基３１８、３２０または３２２を変異させることによりマウス抗体のＣｌｑ結合活性を改変でき、そして残基２９７（Ａｓｎ）を置き換えることにより溶解活性の除去を招くことが報告される。
米国特許出願第２００４０１３２１０１号（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）は、アミノ酸位置２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８または３３２（Kabatナンバリングを使用）または位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０または３３２（Kabatナンバリングを使用）での変異を伴うムテインを記載し、そのうちの位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０または３３２での変異はＡＤＣＣ活性を低減させるかまたはＦｃガンマ受容体に対する結合を低減させ得る。
【０１６１】
Chappel et al., Proc Natl Acad Sci U S A.８８（２０）：９０３６−４０（１９９１）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）により、ＩｇＧ１の細胞親和性活性がその重鎖ＣＨ２ドメインの固有の特性であることが報告される。ＩｇＧ１のアミノ酸残基２３４−２３７のいずれかでの単一点変異はその活性を有意に低下させるかまたは無効にした。十分な結合活性を回復するために、全てのＩｇＧ１残基２３４−２３７（ＬＬＧＧ）のＩｇＧ２およびＩｇＧ４への置換が必要とされた。全ＥＬＬＧＧＰ配列（残基２３３−２３８）を含有するＩｇＧ２抗体は野生型ＩｇＧ１よりもさらに活性であることが観察された。
Isaacs et al., J Immunol. １６１（８）：３８６２−９（１９９８）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）により、ＦｃガンマＲ結合に必須のモチーフ内の変異（グルタミン酸２３３がプロリンに、ロイシン／フェニルアラニン２３４がバリンに、およびロイシン２３５がアラニンに）が標的細胞の枯渇を完全に防御したことを報告する。グルタミン酸３１８のアラニンへの変異はマウスＩｇＧ２ｂのエフェクター機能を排除し、そしてまたヒトＩｇＧ４の効力を低減させた。
【０１６２】
Armour et al., Mol Immunol. ４０（９）：５８５−９３（２００３）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）は、野生型ＩｇＧ１よりも少なくとも１０倍効果が弱いが、阻止受容体ＦｃガンマＲＩＩｂに対するその結合は４倍しか低減されない、活性化受容体ＦｃガンマＲＩＩａと反応するＩｇＧ１ムテインを同定した。変異はアミノ酸２３３−２３６および／またはアミノ酸位置３２７、３３０および３３１の領域において作成された。ＷＯ９９／５８５７２（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）もまた参照されたい。
Xu et al., J Biol Chem. ２６９（５）：３４６９−７４（１９９４）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）により、ＩｇＧ１  Ｐｒｏ３３１のＳｅｒへの変異はＣ１ｑ結合活性を著明に低下させ、そして溶解活性を実質的に排除したことが報告される。対照的にＩｇＧ４におけるＳｅｒ３３１のＰｒｏでの置換によりＩｇＧ４  Ｐｒｏ３３１ムテインに部分的溶解活性（４０％）が付与された。
【０１６３】
Schuurman et al,. Mol Immunol. ３８（１）：１−８（２００１）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）により、ヒンジシステインの１つを変異することは、重鎖間結合形成に関与し、Ｃｙｓ２２６からセリンへによりさらに安定な重鎖間連結を招くことが報告される。ＩｇＧ４ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＣｙｓのＩｇＧ１ヒンジ配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓへの変異もまた重鎖間の共有結合性相互作用を著明に安定化する。
Angal et al., Mol Immunol. ３０（１）：１０５−８（１９９３）（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）により、ＩｇＧ４におけるアミノ酸位置２４１でセリンをプロリン（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ではその位置に見出される）に変異させることにより、元来のキメラＩｇＧ４と比較して、均一な抗体の生成ならびに血清半減期の延長および組織分布の改善に至ることが報告される。
【０１６４】
本発明はまた、ＡＤＣＣ活性の改善を呈するフコシル化が不在であるかまたは低減されている抗体分子を含む、結果的にエフェクター活性の改変を招く、改変された炭水化物構造を伴う抗体分子の生成をも企図する。これを達成するための種々の方式が当分野において公知である。例えばＡＤＣＣエフェクター活性は抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合により媒介され、それはＣＨ２ドメインのＡｓｎ−２９７でのＮ連結グリコシル化の炭水化物構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は高い親和性でこの受容体と結合し、そして自然のフコシル化抗体よりもさらに効率的にＦｃγＲＩＩＩ媒介のエフェクター機能を誘発する。例えばアルファ−１,６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え生成は、結果的にＡＤＣＣ活性が１００倍増大している抗体を招く［Yamane−Ohnuki et al., Biotechnol Bioeng. ８７（５）：６１４−２２（２００４ Sep ５）］。フコシル化経路におけるこのまたはその他の酵素の活性を低下させることにより、例えばｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ処理、細胞系を（複数の）酵素をノックアウトするように操作すること、または選択的なグリコシル化阻害剤と共に培養することにより類似の効果を達成することができる［Rothman et al., Mol Immunol. ２６（１２）：１１１３−２３（１９８９ Dec）］。いくつかの宿主細胞株、例えばＬｅｃ１３またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞系はフコシル化レベルがより低い抗体を天然に生成する。Shields et al., J Biol Chem. ２７７（３０）：２６７３３−４０（２００２ Jul ２６）；Shinkawa et al., J Biol Chem. ２７８（５）：３４６６−７３（２００３ Jan ３１）。例えばＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換えにより生成することによる、二分された炭水化物のレベルの増大もまたＡＤＣＣ活性を増大させることが決定されている。Umana et al., Nat Biotechnol. １７（２）：１７６−８０（１９９９ Feb）。２つのフコース残基のうちの１つのみの不在は、ＡＤＣＣ活性を増大させるのに十分であり得ると予測されている［Ferrara et al., J Biol Chem. ２００５ Dec ５］。
【０１６５】
その他の共有結合性修飾
抗体の共有結合性修飾もまた本発明の範囲内に含まれる。それらを、適用可能な場合、化学合成により、または抗体の酵素的もしくは化学的切断により作成できる。抗体の標的とされるアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることにより、抗体のその他の型の共有結合性修飾を分子に導入する。
最も一般的にはシステイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα−ハロアセタート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。またシステイニル残基をブロモトリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−塩化第二水銀安息香酸、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾールとの反応により誘導体化する。
【０１６６】
ヒスチジル残基をｐＨ５.５−７.０でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化するが、この反応剤は相対的にヒスチジル側鎖に特異的であるためである。臭化パラブロモフェナシルもまた有用である；好ましくは反応を０.１Ｍカコジル酸ナトリウム中ｐＨ６.０で実施する。
リジニルおよびアミノ末端残基をコハク酸またはその他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの薬剤との誘導体化はリジニル残基の変化を逆転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するためのその他の適当な反応剤には、ピコリンイミド酸メチル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２,４−ペンタンジオンおよびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０１６７】
アルギニル残基を１つまたはいくつかの従来の反応剤、とりわけフェニルグリオキサール、２,３−ブタンジオン、１,２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応により修飾する。グアニジン官能基のｐＫａが高いので、アルギニン残基の誘導体化には、アルカリ性条件下で反応を実施することが要求される。さらにこれらの反応剤はリジンの基およびアルギニンイプシロン−アミノ基と反応できる。
芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心をはらって、チロシル残基の特異的な修飾を行うことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、各々Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨード化してラジオイムノアッセイにおいて使用するための標識タンパク質を調製する。
【０１６８】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）をカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（ここでＲおよびＲ’は１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４,４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのような異なるアルキル基である）との反応により選択的に修飾する。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基をアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換する。
【０１６９】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は各々対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に頻繁に脱アミド化される。これらの残基を中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に入る。
その他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のアルファ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins：Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. ７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１７０】
別の型の共有結合性修飾はグリコシドの抗体への化学的または酵素的結合を伴う。これらの手順は、Ｎ−またはＯ−連結グリコシル化のためのグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の生成を必要としないという点で有利である。用いられる結合様式に依存して、（複数の）糖を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばシステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えばセリン、スレオニンもしくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシンもしくはトリプトファンのもの、または（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０およびAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. ２５９−３０６（１９８１）に記載される。
【０１７１】
抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去を化学的または酵素的に達成できる。化学的脱グリコシル化は化合物トリフルオロメタンスルホン酸または均等な化合物への抗体の暴露を必要とする。この処置の結果、糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）連結以外のたいていまたは全ての糖の切断を招くが、抗体はインタクトなままである。化学的脱グリコシルはHakimuddin, et al. Arch. Biochem. Biophys. ２５９：５２（１９８７）およびEdge et al. Anal. Biochem., １１８：１３１（１９８１）により記載される。Thotakura et al. Meth. Enzymol. １３８：３５０（１９８７）に記載されるように、抗体上の炭水化物部分の酵素的切断を種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
【０１７２】
抗体の別の型の共有結合性修飾は、種々の非タンパク質性重合体、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール、ポリオキシアルキレン、またはデキストランのような多糖類重合体の１つに対する抗体の連結を含んでなる。かかる方法は当分野において公知であり、例えば米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号、第４１７９３３７号、第４７６６１０６号、第４１７９３３７号、第４４９５２８５号、第４６０９５４６号、または欧州特許第３１５４５６号を参照されたい。
【０１７３】
各抗体分子を１つ以上の（すなわち１、２、３、４、５またはそれより多い）重合体分子に付着させることができる。重合体分子を好ましくはリンカー分子により抗体に付着させる。一般的に重合体は合成または天然発生重合体、例えば場合によっては置換された直鎖もしくは分岐鎖ポリアルケン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレン重合体または直鎖もしくは分岐鎖多糖類、例えばホモもしくはヘテロ多糖類でよい。好ましい重合体はポリオキシエチレンポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは室温で水溶性であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒ（式中、Ｒは水素またはアルキルまたはアルカノール基のような保護基でよい）を有する。好ましくは、保護基は１個と８個の間の炭素を有し、さらに好ましくは、それはメチルである。記号ｎは正の整数、好ましくは１と１０００の間、さらに好ましくは２と５００の間である。ＰＥＧは１０００と４００００の間、さらに好ましくは２０００と２００００の間、最も好ましくは３０００と１２０００の間の好ましい平均分子量を有する。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１個のヒドロキシ基を有し、さらに好ましくは、それは末端ヒドロキシ基である。阻害剤の遊離のアミノ基と反応するために活性化されるのが好ましいのはこのヒドロキシ基である。しかしながら共有結合により抱合された本発明のＰＥＧ／抗体を達成するために、反応基の型および量が異なり得ることは理解されよう。好ましい重合体およびそれらをペプチドに付着させる方法は米国特許第４７６６１０６号；第４１７９３３７号；第４４９５２８５号；および第４６０９５４６号（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）にて示される。
【０１７４】
遺伝子治療
物理的ＤＮＡ移入法（例えばリポソームまたは化学的処理）の使用またはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルス）の使用によることを含む当分野において公知の任意の適当な研究法の使用により、エキソビボ、インサイチュまたはインビボでの遺伝子治療を介して治療用抗体の適切な細胞への送達を行うことができる。例えばインビボ治療のために、望ましい抗体をコードする核酸を単独で、またはベクター、リポソームもしくは沈殿と組み合わせて、対象に直接注射することができ、そしていくつかの実施態様では、抗体化合物の発現が望まれる部位で注射することができる。エキソビボ処置のために、対象の細胞を取り出し、核酸をこれらの細胞に導入し、そして修飾された細胞を直接的にか、または例えば多孔性膜内に封入して、それを患者に移植するかのいずれかで対象に戻す。例えば米国特許第４８９２５３８号および第５２８３１８７号を参照されたい。核酸を生存細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。その技術は、核酸がインビトロで培養細胞に、またはインビボで意図される宿主の細胞中に移入されるかに依存して異なる。インビトロで核酸を哺乳動物細胞に移入するのに適当な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランおよびリン酸カルシウム沈殿が含まれる。核酸をエキソビボで送達するために一般的に用いられるベクターはレトロウイルスである。
【０１７５】
その他のインビボ核酸移入技術には、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ随伴ウイルス）および脂質基盤の系でのトランスフェクションが含まれる。核酸およびトランスフェクション剤は場合によっては微粒子に随伴される。トランスフェクション剤の実例には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、第四級アンモニウム両親媒性ＤＯＴＭＡ（GIBCO−BRLによりLipofectinとして市販される臭化（ジオレオイルオキシプロピル）トリメチルアンモニウム））（Felgner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Malone et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA ８６：６０７７−６０８１（１９８９））；懸垂型トリメチルアンモニウム頭部を有する親油性グルタミン酸ジエステル（Ito et al., Biochem. Biophys. Acta １０２３：１２４−１３２（１９９０））；カチオン性脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ、Transfectam、Promega）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）（J. P. Behr, Tetrahedron Lett. ２７：５８６１−５８６４（１９８６）；J. P. Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８６：６９８２−６９８６（１９８９））のような代謝可能な親脂質；代謝可能な第四級アンモニウム塩（ＤＯＴＢ、メチル硫酸Ｎ−（１−［２,３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）（Boehringer Mannheim）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジオレオイルエステル、ＣｈｏＴＢ、ＣｈｏＳＣ、ＤＯＳＣ）（Leventis et al., Biochim. Inter. ２２：２３５−２４１（１９９０））；３ベータ［Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）／３ベータ［Ｎ−（Ｎ’,Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールＤＣ−Ｃｈｏｌの１対１混合物（Gao et al., Biochim. Biophys. Acta １０６５：８−１４（１９９１））、スペルミン、スペルミジン、リポポリアミン（Behr et al., Bioconjugate Chem, ５：３８２−３８９（１９９４））、親油性ポリリジン（ＬＰＬＬ）（Zhou et al., Biochim. Biophys. Acta ９３９：８−１８（１９９１））、過剰のホスファチジルコリン／コレステロールを伴う水酸化［［（１,１,３,３−テトラメチルブチル）クレ−ソキシ］エトキシ］エチル］ジメチルベンジルアンモニウム（水酸化ＤＥＢＤＡ）（Ballas et al., Biochim. Biophys. Acta ９３９：８−１８（１９８８））、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）／ＤＯＰＥ混合物（Pinnaduwage et al, Biochim. Biophys. Acta ９８５：３３−３７（１９８９））、ホスファチジルエタノールアミン中ＤＯＰＥ、ＣＴＡＢ、ＤＥＢＤＡ、臭化ジドデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）およびステアリルアミンとグルタミン酸との親油性のジエステル（ＴＭＡＧ）（Rose et al., Biotechnique １０：５２０−５２５（１９９１））、ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ（TransfectACE, GIBCO BRL）ならびにオリゴガラクトース担持脂質が含まれる。移入の効率を増大させるトランスフェクションエンハンサー薬剤の実例には、例えばＤＥＡＥ−デキストラン、ポリブレン、リソソーム破壊ペプチド（Ohmori N I et al, Biochem Biophys Res Commun, ��３５（３）：７２６−９（Jun. ２７：１９９７））、コンドロイタン基盤のプロテオグリカン、硫酸プロテオグリカン、ポリエチレンイミン、ポリリジン（Pollard H et al. J Biol Chem, ２７３（１３）：７５０７−１１（１９９８））、インテグリン結合ペプチドＣＹＧＧＲＧＤＴＰ、直鎖デキストラン九糖類、グリセロール、オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオシド間連結で繋留されたコレステリル基（Letsinger, R. L. , Proc Natl Acad Sci USA ８６（１７）：６５５３−６（１９８９））、リゾホスファチド、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミルならびに１−オレオイルリゾホスファチジルコリンが含まれる。
【０１７６】
いくつかの状況では、核酸含有ベクターを標的細胞に指向させる薬剤と共に核酸を送達するのが望ましい場合もある。かかる「ターゲティング」分子には標的細胞上の細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体、または標的細胞上の受容体に関するリガンドが含まれる。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質をターゲティングに使用して、そして／または取り込みを促すことができる。かかるタンパク質の例には、特定の細胞型を指向するカプシドタンパク質またはそれらのフラグメント、サイクリングで内部移行を行うタンパク質に関する抗体、ならびに細胞内局在化を標的とし、そして細胞内半減期を増強するタンパク質が含まれる。その他の実施態様では、受容体媒介のエンドサイトーシスを用いることができる。かかる方法は例えばWu et al., （１９８７）またはWagner et al., （１９９０）に記載される。現在の公知の遺伝子マーキングおよび遺伝子治療プロトコールの概説に関しては、Anderson（１９９２）を参照されたい。ＷＯ９３／２５６７３およびそこに引用される参照文献もまた参照のこと。遺伝子治療テクノロジーのさらなる概説に関しては、Friedmann, Science, ２４４：１２７５−１２８１（１９８９）；Anderson, Nature, supplement to vol. ３９２, no ６６７９, pp. ２５−３０（１９９８）；Verma, Scientific American：６８−８４（１９９０）；およびMiller, Nature, ３５７：４５５４６０（１９９２）を参照されたい。
【０１７７】
スクリーニング方法
本発明の別の態様はＥｐｈＢ３を抗体と接触させること、およびその抗体がＥｐｈＢ３の活性を修飾するかどうかを決定することを含んでなるＥｐｈＢ３の活性を低下させる抗体を同定する方法を志向する。被験抗体の存在下での活性を被験抗体の不在下での活性と比較する。被験抗体を含有する試料の活性が被験抗体を欠如する試料中の活性よりも低い場合、その抗体は活性を不活化または低下させたのであろう。有効な治療は有意な毒性を欠く有効な薬剤を同定することに依存する。当分野において公知の方法により抗体を結合親和性に関してスクリーニングすることができる。例えばゲルシフトアッセイ、ウェスタンブロット、放射性標識競合アッセイ、クロマトグラフィーによる同時分別、共沈、架橋、ＥＬＩＳＡ等を用いることができ、それらは例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（１９９９）John Wiley & Sons, NY（その全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
【０１７８】
標的抗原上の望ましいエピトープに結合する抗体に関して最初にスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane（１９８８）に記載されるもののような日常的な交差遮断（cross-blocking）アッセイを実施することができる。日常的な競合結合アッセイを用いることもでき、ここで未知の抗体は本発明の標的特異性抗体に対する標的の結合を阻止するその能力により特徴付けされる。インタクトな抗原、細胞外ドメインのようなそれらのフラグメント、または直線状エピトープを使用することができる。エピトープの位置決定はChampe et al., J. Biol. Chem. ２７０：１３８８−１３９４（１９９５）に記載される。
【０１７９】
インビトロ結合アッセイの１つの変法では、本発明は（ａ）固定されたＥｐｈＢ３を候補抗体と接触させること、および（ｂ）ＥｐｈＢ３に対する候補抗体の結合を検出することの工程を含んでなる方法を提供する。代替えの実施態様では、候補抗体を固定し、そしてＥｐｈＢ３の結合を検出する。支持体であるビーズもしくはクロマトグラフィー樹脂への共有結合、および抗体結合のような非共有結合性高親和性相互作用、または固定された化合物がビオチン部分を含むストレプトアビジン／ビオチン結合の使用を含む当分野において周知のいずれかの方法を用いて固定を達成する。結合の検出を（ｉ）固定されていない化合物上の放射活性標識を用いて、（ｉｉ）固定されていない化合物上の蛍光標識を用いて、（ｉｉｉ）固定されていない化合物に免疫特異的な抗体を用いて、（ｉｖ）固定された化合物に付着した蛍光支持体を励起する固定されていない化合物上の標識および当分野において周知であり、そして日常的に実施されるその他の技術を用いて達成することができる。
【０１８０】
候補抗体を標的抗原（または標的抗原を発現する細胞）と共にインキュベートし、そして標的抗原の活性または発現に及ぼす候補抗体の影響を決定することにより標的抗原の活性を低下させる抗体を同定できる。被験抗体の存在下での活性を被験抗体の不在下での活性と比較する。被験抗体を含有する試料の活性が被験抗体を欠如する試料中の活性よりも低い場合、その抗体は活性を低下させたのであろう。標的抗原ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調整する抗体の選択性を、標的抗原に及ぼすその効果をその他の関連する化合物に及ぼすその効果と比較することにより評価することができる。
【０１８１】
特定の典型的な実施態様では、抗体を培養細胞系におけるその影響に関して試験して受容体リン酸化、シグナリング、リガンド結合、ＥｐｈＢ３二量体化、リガンド誘起受容体活性化および／またはＥｐｈＢ３媒介細胞−細胞接着を阻止するその能力を決定する。加えて、本明細書に記載されるような増殖アッセイ、軟寒天アッセイおよび／または細胞毒性アッセイを含む細胞アッセイを用いて特定のＥｐｈＢ３抗体を評価することができる。
適当な動物モデルを用いて特定の抗体または抗体の組み合わせの生物学的活性をインビボで評価することができる。例えば成体ラット脊髄のトランスフェクションならびにＥｐｈＢ３の上方調節およびリガンド発現のモニタリングが企図される。（Cell Transplant., １２（３）：２７９−９０（２００３））。
【０１８２】
本発明はまた標的抗原の生物学的活性と相互作用するかまたはそれを阻止する（すなわちリン酸化、二量体化、リガンド誘起の受容体活性化または細胞内シグナリング等を阻止する）抗体を同定するためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイもまた包含する。ＨＴＳアッセイにより効率的な様式で多数の化合物のスクリーニングが可能になる。細胞基盤のＨＴＳ系は標的抗原とその結合パートナーとの間の相互作用を調査するために企図される。ＨＴＳアッセイは望ましい特性を有する「ヒット」または「リード化合物」を同定するために設計され、それから望ましい特性を改善するために修飾を設計することができる。
本発明の別の実施態様では、標的抗原ポリペプチドに対して適当な結合親和性を有するＣＤＲ内のアミノ酸に１つ、２つ、３つまたはそれより多い修飾を有する抗体フラグメントまたはＣＤＲに関するハイスループットスクリーニングを用いる。
【０１８３】
組み合わせ治療
動物モデルにおいて有効である１を超える抗体が同定されていると、２つまたはそれより多いかかる抗体を一緒に（同一または異なる標的抗原に結合する）混合してさらに改善された有効性を提供することがさらに有利であり得る。１つ以上の抗体を含んでなる組成物をＥｐｈＢ３関連疾患または障害を患っているかまたは患う傾向のあるヒトまたは哺乳動物に投与できる。２つの治療薬の同時投与は、薬剤がその治療効果を奏する期間に重複がある限り、薬剤が同時に、または同一経路により投与されることを必要としない。異なる日または週に投与されるような併用または逐次的投与が企図される。
【０１８４】
本発明の方法は単一の抗体および異なる抗体の組み合わせまたは「カクテル」の投与を企図する。かかる抗体カクテルは異なるエフェクターメカニズムを活用する抗体を含有するか、または細胞毒性抗体を免疫エフェクター機能性に依存する抗体と直接的に組み合わせるので、特定の利点を有し得る。組み合わせにおけるかかる抗体は相乗的な治療効果を奏し得る。
本発明の方法はさらに、処置されている特定の疾患または障害のための医学的に認識された標準的治療と組み合わされた単一の抗体または抗体カクテルの投与をさらに企図する。
【０１８５】
細胞毒性剤とは細胞の機能を阻止もしくは防御する、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。その用語は放射活性同位元素（例えばＩ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０およびＲｅ１８６）、化学療法剤および細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素または合成毒素、またはそれらのフラグメントのような毒素を含むと意図される。非細胞毒性剤とは細胞の機能を阻止もしくは防御しない、および／または細胞の破壊を引き起こさない物質を指す。非細胞毒性剤には活性化されて細胞毒性になり得る薬剤が含まれ得る。非細胞毒性剤にはビーズ、リポソーム、マトリックスまたは粒子が含まれ得る（例えば米国特許公開第２００３／００２８０７１号および第２００３／００３２９９５号（出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい）。かかる薬剤を本発明による抗体と抱合、結合、連結または会合させることができる。
【０１８６】
投与および調製
本発明の抗体を望ましい送達方法に適当な担体を含んでなる医薬組成物に製剤化することができる。適当な担体には、抗体と組み合わせた場合に抗体の望ましい活性を保持し、そして対象の免疫系と非反応性である任意の材料が含まれる。例には、限定するものではないが滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水、静菌水等のような多くの標準的な医薬用担体のいずれかが含まれる。種々の水性担体、例えば水、緩衝水、０.４％生理食塩水、０.３％グリシン等が使用され、そしてアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等のような安定性強化のために軽度の化学的修飾等に供されたその他のタンパク質を含み得る。
【０１８７】
望ましい程度の純度を有する抗体を場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤または安定剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences １６th edition, Osol, A. Ed.（１９８０））と混合することにより保存用に抗体の治療用製剤を凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製する。許容される担体、賦形剤または安定剤は用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒性であり、そしてリン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールのような糖；ナトリウムのような塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を含む。
【０１８８】
本明細書の製剤はまた処置されている特定の適応症に必要な場合、１を超える活性化合物、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含有することもできる。かかる分子は意図される目的のために有効である量で組み合わせ中に存在するのが適当である。
例えばコアセルベーション技術により、もしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセル中に、各々コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）で、またはマクロエマルジョン中に活性成分を封入することもできる。かかる技術はRemington’s Pharmaceutical Sciences １６th edition, Osol, A. Ed.（１９８０）に開示される。
【０１８９】
インビボ投与のために用いられることになっている製剤は滅菌性でなければならない。これは滅菌ろ過膜を通すろ過により容易に達成される。
非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内、および所望により局所処置のために病巣内投与を含む任意の適当な手段により抗体を投与する。非経口的注入には静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下投与が含まれる。加えて、とりわけ漸減用量の抗体でパルス注入により抗体を適当に投与する。好ましくは注射により、最も好ましくは静脈内または皮下注射により投与を行う。局所、とりわけ経皮、経粘膜、直腸、経口または例えば望ましい部位の近くに配置されたカテーテルを介する限局的な投与を含むその他の投与方法が企図される。
【０１９０】
鼻腔内投与用の医薬製剤および医薬品は適切な（複数の）溶媒および場合によっては、限定するものではないが安定剤、抗菌剤、抗酸化剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティー調整剤およびこれらの組み合わせのようなその他の化合物を含有するスプレーまたはエアロゾルでよい。エアロゾル製剤のための噴霧剤には圧縮空気、窒素、二酸化炭素または低沸点溶媒基盤の炭化水素が含まれ得る。
注射用投薬形態には一般的には適当な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて調製され得る水性懸濁液または油性懸濁液が含まれる。注射用形態は溶媒または希釈剤で調製される溶液相で、または懸濁液の形態でよい。許容される溶媒またはベヒクルには滅菌水、リンガー溶液または等張生理食塩水が含まれる。
【０１９１】
注射用の医薬製剤および／または医薬品は前記されるような適切な溶液での再構成に適当な粉末でよい。これらの例には限定するものではないが凍結乾燥、ロータリー乾燥もしくはスプレー乾燥粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物または微粒子が含まれる。注射用の製剤は場合によっては安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティー調整剤およびこれらの組み合わせを含有できる。
【０１９２】
徐放調製物を調製することができる。徐放調製物の適当な実例には抗体を含有する固体疎水性重合体の半透過性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは成型品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放マトリックスの実例にはポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびｙエチル−Ｌ−グルタマートの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセタート、Lupron Depot（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体およびロイプロリドアセタートから構成される注射用マイクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−ビニルアセタートおよび乳酸−グリコール酸のような重合体は１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルはより短い期間でタンパク質を放出する。カプセルに封入された抗体が体内で長時間留まる場合、３７℃で水分に暴露された結果として、それらは変性するかまたは凝集して生物学的活性の喪失および免疫原性の変化の可能性に至り得る。関与するメカニズムに依存して、安定化のための合理的な計画を考案することができる。例えば凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが見出される場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含量を制御し、適切な添加剤を使用し、そして具体的な重合体マトリックス組成物を開発することにより安定化を達成できる。当分野において公知のその他の計画を用いることができる。
【０１９３】
本発明の製剤を本明細書で記載されるように短時間作用型、即時放出型、長時間作用型、または徐放型に設計することができる。故に医薬製剤を放出制御または放出遅延用に製剤化することもできる。
本組成物はまた例えばミセルもしくはリポソームまたはいくつかのその他の封入された形態を含んでなることもできるか、または延長された保存および／または送達効果を提供するための持続放出形態で投与され得る。それ故に、医薬製剤および医薬品をペレットまたは円筒形に圧縮し、そしてデポー注射としてまたはステントのような移植物として筋肉内または皮下に移植できる。かかる移植物はシリコンおよび生分解性重合体のような公知の不活性材料を用いることができる。
【０１９４】
前記されたようなこれらの代表的な投薬形態に加えて、薬学的に許容される賦形剤および担体は一般的に当業者に公知であり、そして故に本発明に含まれる。かかる賦形剤および担体は例えば「Remingtons Pharmaceutical Sciences」 Mack Pub. Co., New Jersey（１９９１）（出典明示により本明細書の一部とする）に記載される。
具体的な投薬量を対象の疾患の状態、年齢、体重、一般的な健康状態、遺伝子型、性別および食事、薬物の投与間隔、投与経路、排出速度、および組み合わせに依存して調整できる。有効量を含有する前記の投薬形態のいずれかは十分に日常的な実験の範囲内であり、そしてそれ故に十分に本発明の範囲内である。
【０１９５】
本発明の抗体はしばしばその他の天然発生免疫グロブリンまたはその他の生物学的分子を実質的に含まないで調製されるであろう。好ましい抗体はまたＥｐｈＢ３関連疾患または障害に苦しむ、またはそれを患う傾向のある哺乳動物に投与する場合、最低限の毒性しか呈さないであろう。
本発明の組成物を従来の周知の滅菌技術により滅菌することができる。得られた溶液を無菌条件下で使用するために包装するかまたはろ過し、そして凍結乾燥し、投与前に凍結乾燥された調製物を滅菌溶液と組み合わせることができる。組成物はｐＨ調整剤および緩衝化剤、等張化剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび安定剤（例えば１２０％マルトース等）のような生理学的状態に近づけるために必要とされるような、薬学的に許容される補助物質を含有できる。
【０１９６】
薬物（例えば本明細書に開示される抗体、および場合によっては化学療法剤）の送達に有用である種々の型の脂質および／またはリン脂質および／または界面活性剤から構成される小型小胞であるリポソームを介して本発明の抗体を投与することもできる。リポソームはエマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、リン脂質分散剤、ラメラ層等を含み、そして抗体を特定の組織に向け、そして組成物の半減期を増大させるためのベヒクルとして提供され得る。例えば米国特許第４８３７０２８号および第５０１９３６９号（出典明示により本明細書の一部とする）に記載されるような種々の方法がリポソームの調製のために利用可能である。
【０１９７】
Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８２：３６８８（１９８５）；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA ７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４４８５０４５号および第４５４４５４５号に記載されるような当分野において公知の方法により抗体を含有するリポソームを調製する。循環時間が増強されたリポソームが米国特許第５０１３５５６号に開示される。ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含んでなる脂質組成物を用いて逆相蒸発法によりとりわけ有用なリポソームを作成することができる。規定の孔径のフィルターを通してリポソームを押し出して、望ましい直径を有するリポソームを生じる。Martin et al., J. Biol. Chem. ２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようにジスルフィド交換反応を介して本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントをリポソームに抱合させることができる。化学療法剤（例えばドキソルビシン）は場合によってはリポソーム内に含有される［例えばGabizon et al., J. National Cancer Inst. ８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照されたい］。
【０１９８】
これらの組成物中の抗体の濃度は広く、すなわち約１０重量％未満、通常少なくとも約２５重量％から７５重量％または９０重量％ほどにも変動でき、そして選択される特定の投与の様式にしたがって液体容量、粘度等により一次的に選択されるであろう。経口、局所および非経口投与できる組成物を調製するための実際の方法は当業者に公知または明白であり、そして例えばRemington’s Pharmaceutical Science, １９th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA（１９９５）（出典明示により本明細書の一部とする）に詳記される。
【０１９９】
患者における疾患を処置するために当分野において周知である標準的な経験的な方法により本発明の組成物の有効量の決定を達成できる。これを達成するのに十分な量は「治療上有効量」として定義される。抗体の有効量は変動し、そして疾患の重篤度ならびに処置されている患者の体重および一般状態に依存するが、一般的には約１.０μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。典型的な用量は適用あたり約１０μｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、または約０.１ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲でよい。抗体を身体の表面部分に投与することもできる（例えば４.５ｇ／ｍ２まで）。抗体の用量のその他の実例には単回投与で全部で８ｇまでが含まれる（体重８０ｋｇまたは身体表面部分１.８ｍ２と仮定）。
【０２００】
投与は当分野において公知の任意の手段によってよい。例えば抗体を１つ以上の別個のボーラス投与により、または例えば５、１０、１５、３０、６０、９０、１２０分もしくはそれより長い時間をかけて短時間もしくは長時間注入により投与することができる。最初の処置期間に続いて、ならびに患者の応答および治療の耐用性に依存して、患者の応答を維持するために必要に応じて維持用量を例えば毎週、週２回、３週毎、４週毎、毎月、月２回、３か月毎、または６か月毎に投与することができる。疾患の症状の望ましい抑制が生じるまで、さらに頻繁な投薬が必要とされるかもしれず、そして必要により投薬量を調整できる。この治療の進展は従来の技術およびアッセイにより容易にモニタリングされる。治療は規定の期間でよいか、または長期間で、そして疾患の進行または死亡まで何年もの間持続され得る。
【０２０１】
処置を行っている医師により選択されている用量レベルおよびパターンで組成物の単回または複数回投与を実施することができる。疾患の予防または処置のために、抗体の適切な投薬量は、前記で定義されたような処置されることになっている疾患の型、疾患の重篤度および経過、抗体が投与されるのは予防目的かまたは治療目的か、以前の治療、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存するであろう。抗体は患者に一度でまたは一連の処置にわたって適当に投与される。
いずれにしても、製剤は望ましい生物学的活性を奏する、例えばＥｐｈＢ３関連疾患または障害を防御するかまたはその重篤度最小限にするのに十分である時間にわたって、ある量の治療用抗体を提供すべきである。本発明の組成物を単独で、またはかかる疾患の処置のために当分野において公知のその他の治療と組み合わせた補助療法として投与できる。
【０２０２】
抗体組成物は良好な医療行為に合致した様式で処方、調薬、および投与されるであろう。この局面で考慮されるための因子には処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュールの決定、および医師に公知のその他の因子が含まれる。投与されることになっている抗体の治療上有効量はかかる考慮により支配され、そして標的媒介の疾患、症状または障害を予防する、寛解させる、または処置するために必要な最小量である。かかる量は宿主に対して毒性であるか、または宿主をさらに有意に感染しやすくする量を下回るのが好ましい。
【０２０３】
抗体は必ずしもではないが、場合によっては問題の障害を予防または処置するために現在用いられる１つ以上の薬剤と共に処方される。かかるその他の薬剤の有効量は疾患、症状もしくは障害の型または処置、および前記で論じられたその他の因子に依存する。これらは一般的には本明細書前記で用いられたのと同一の投薬量で、および投与経路で、またはこれまで用いられた投薬量の１から９９％で用いられる。
【０２０４】
本発明の別の実施態様では、望ましい症状の処置に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は容器およびラベルを含んでなる。適当な容器には、例えば瓶、バイアル、シリンジおよび試験管が含まれる。容器はガラスまたはプラスチックのような種々の材料から形成され得る。容器は症状を処置するために有効である組成物を収め、そして滅菌された口を有し得る（例えば容器は静注液バッグまたは皮下注射針を刺すことができるストッパーを有するバイアルでよい）。組成物中の活性薬剤は本発明の抗体である。容器上の、またはそれに随伴されるラベルは、組成物が選択された症状を処置するために用いられることを示す。製品はさらに第２の治療薬（本明細書で論じられたまたは当分野において公知の疾患のためのいずれかの第２の治療薬を含む）を含有する第２の容器を含んでなることができる。製品はさらにリン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液またはデキストロース溶液のような凍結乾燥された抗体製剤を再構成するための薬学的に許容されるバッファーを含有する別の溶液を含んでなることができる。それはさらにその他のバッファー、希釈剤、充填剤、針、シリンジおよび使用のための説明を伴う添付文書を含む市販のおよび使用者の観点から望ましいその他の材料を含むことができる。
【０２０５】
免疫療法
ＥｐｈＢ３関連疾患または障害を有する患者を処置するのに有用な抗体には、ＥｐｈＢ３を発現する細胞に対して、強力な免疫応答を開始することができるかまたは細胞毒性になることができるものが含まれ得る。細胞毒性剤と抱合された抗体を用いて細胞毒性剤を、ＥｐｈＢ３を発現する組織に向けることができる。これに代えて、抗体は補体媒介または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）メカニズムのいずれかにより細胞溶解を惹起でき、その双方はエフェクター細胞Ｆｃ受容体部位または補体タンパク質との相互作用のために、免疫グロブリン分子のインタクトなＦｃ部分を必要とする。加えて細胞増殖に直接的な生物学的影響を奏する抗体は本発明の実施に有用である。
【０２０６】
抗ＥｐｈＢ３抗体をその「ネイキッド」もしくは未抱合形態で投与できるか、またはその他の治療薬もしくは診断薬に直接抱合させることができるか、またはかかるその他の治療薬もしくは診断薬を含んでなる担体重合体に間接的に抱合させることができる。
放射性同位元素、アフィニティー標識（例えばビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等）、蛍光または発光もしくは生物発光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等の使用により抗体を検出可能に標識することができる。かかる標識を達成するための手順は当分野において周知である；例えば（Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. １８：３１５（１９７０）；Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. ６２：３０８（１９７９）；Engval, E. et al., Immunol. １０９：１２９（１９７２）；Goding, J.W. J. Immunol. Meth. １３：２１５（１９７６））参照。
【０２０７】
抗体部分の抱合は米国特許第６３０６３９３号に記載される。一般的な技術はShih et al., Int. J. Cancer ４１：８３２−８３９（１９８８）；Shih et al., Int. J. Cancer ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびShihら、米国特許第５０５７３１３号にも記載される。この一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体構成要素を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、そして複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物またはその他の治療薬を負荷された担体重合体と反応させることを伴う。この反応は結果的に最初のシッフ塩基（イミン）結合に至り、それを第二級アミンへの還元により安定化して最終的な抱合体を形成することができる。
【０２０８】
担体重合体は例えばアミノデキストランまたは少なくとも５０個のアミノ酸残基のポリペプチドでよい。薬物またはその他の薬剤を担体重合体と抱合させる種々の技術は当分野において公知である。アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を使用できるが、ポリペプチド担体は鎖に少なくとも５０個のアミノ酸残基、好ましくは１００−５０００個のアミノ酸残基を有するべきである。アミノ酸の少なくともいくつかはリジン残基またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リジン残基の懸垂アミンならびにグルタミン酸およびアスパラギン酸の懸垂カルボン酸は薬物、毒素、免疫モジュレーター、キレート剤、ホウ素付加物またはその他の治療薬を付着するのに都合がよい。得られた負荷された担体および抱合体に望ましい溶解特性を付与するために、適当なポリペプチド担体の例には、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、その共重合体、ならびにこれらのアミノ酸およびその他のもの、例えばセリンの混合重合体が含まれる。
【０２０９】
これに代えて、抗体構成要素を治療薬と直接抱合させることにより抱合抗体を調製することができる。一般的な手順は、治療薬を酸化された抗体構成要素に直接付着させること以外は間接的な抱合方法に類似する。例えば抗体の炭水化物部分をポリエチレングリコールに付着させて半減期を延長させることができる。
【０２１０】
これに代えてジスルフィド結合形成を介して、またはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二機能性架橋剤を用いて治療薬を還元型抗体構成要素のヒンジ領域で付着させることができる。Yu et al., Int. J. Cancer５６：２４４（１９９４）。かかる抱合のための一般的な技術は当分野において周知である。例えばWong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross−Linking（CRC Press １９９１）；Upeslacis et al., 「化学的方法による抗体の修飾」Monoclonal Antibodies：Principles and Applications, Birch et al.（eds.）, pages １８７−２３０（Wiley−Liss, Inc. １９９５）；Price, 「合成ペプチド由来抗体の生成および特徴付け」Monoclonal Antibodies：Production, Enineering and Clinical Application, Ritter et al.（eds.）, pages ６０−８４（Cambridge University Press １９９５）を参照されたい。Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば２,６−ジイソシアン酸トルエン（tolyene））およびビス−活性フッ素化合物（例えば１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）のような種々の二機能性タンパク質結合剤が当分野において公知である。
【０２１１】
最後に、１つ以上の抗ＥｐｈＢ３抗体部分および別のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質を構築することができる。抗体融合タンパク質を作成する方法は当分野において周知である。例えば米国特許第６３０６３９３号を参照されたい。インターロイキン−２部分を含んでなる抗体融合タンパク質はBoleti et al., Ann. Oncol. ６：９４５（１９９５）、Nicolet et al., Cancer Gene Ther. ２：１６１（１９９５）、Becker et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA ９３：７８２６（１９９６）、Hank et al., Clin. Cancer Res. ２：１９５１（１９９６）、およびHu et al., Cancer Res. ５６：４９９８（１９９６）に記載される。
【０２１２】
本発明の抗体をその「ネイキッド」もしくは未抱合形態で投与できるか、またはその他の治療薬をそれに抱合させることができる。
本発明はさらに前記された抗体を検出可能に標識された形態で提供する。放射性同位元素、アフィニティー標識（例えばビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等）、蛍光または発光もしくは生物発光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等の使用により抗体を検出可能に標識することができる。かかる標識を達成するための手順は当分野において周知である；例えば（Sternberger, L.A. et al., J. Histochem. Cytochem. １８：３１５（１９７０）；Bayer, E.A. et al., Meth. Enzym. ６２：３０８（１９７９）；Engval, E. et al., Immunol. １０９：１２９（１９７２）；Goding, J.W. J. Immunol. Meth. １３：２１５（１９７６））参照。
【０２１３】
「標識」とは抗体に直接的または間接的と抱合された検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自体単独で検出可能でよい（例えば放射性同位体標識または蛍光標識）か、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学的改変を触媒できる。これに代えて、標識はそれ自体は検出可能でなくてよいが、検出可能である別の薬剤（例えばエピトープタグまたはビオチン−アビジンのような結合パートナー対の１つ等）に結合したエレメントでよい。故に抗体はその単離を促進する標識またはタグを含んでなることができ、そして抗体を同定するための本発明の方法には、標識またはタグとの相互作用により抗体を単離する工程が含まれる。
【０２１４】
免疫抱合体の生成は米国特許第６３０６３９３号に記載される。治療薬を抗体構成要素に間接的に抱合させることにより免疫抱合体を調製することができる。一般的な技術はShih et al., Int. J. Cancer ４１：８３２−８３９（１９８８）；Shih et al., Int. J. Cancer ４６：１１０１−１１０６（１９９０）；およびShihら、米国特許第５０５７３１３号に記載される。一般的な方法は、酸化された炭水化物部分を有する抗体構成要素を、少なくとも１つの遊離アミン官能基を有し、そして複数の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物またはその他の治療薬を負荷された担体重合体と反応させることを伴う。この反応は結果的に最初のシッフ塩基（イミン）結合に至り、それを第二級アミンへの還元により安定化して最終的な抱合体を形成することができる。
【０２１５】
担体重合体はアミノデキストランまたは少なくとも５０個のアミノ酸残基のポリペプチドであるのが好ましいが、その他の実質的に均等な重合体担体を使用することもできる。好ましくは、最終的な免疫抱合体は、治療で使用するための投与の容易さおよび有効なターゲティングのために、哺乳動物血清のような水性溶液に可溶性である。故に担体重合体に及ぼす可溶化機能は最終免疫抱合体の血清溶解性を増強するであろう。とりわけアミノデキストランが好ましい。
【０２１６】
アミノデキストラン担体との免疫抱合体を調製するための方法は、典型的にはデキストラン重合体で、有利には平均分子量約１００００−１０００００のデキストランで開始する。デキストランを酸化剤と反応させてその炭水化物環の部分の制御された酸化に影響を及ぼしてアルデヒド基を作成する。従来の手順にしたがってＮａＩＯ４のような糖分解性の化学的反応剤で酸化を都合よく行う。
次いで酸化デキストランをポリアミン、好ましくはジアミン、およびさらに好ましくはモノまたはポリヒドロキシジアミンと反応させる。適当なアミンにはエチレンジアミン、プロピレンジアミン、またはその他の類似のポリメチレンジアミン、ジエチレントリアミンもしくは類似のポリアミン、１,３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、またはその他の類似の水酸化ジアミンもしくはポリアミン等が含まれる。デキストランのアルデヒド基に相対して過剰のアミンを用いて、アルデヒド官能基のシッフ塩基への実質的に完全な変換を確実にする。
【０２１７】
ＮａＢＨ４、ＮａＢＨ３ＣＮ等のような還元剤を用いて、得られたシッフ塩基中間物質の還元的安定化を行う。得られた付加物を、従来のサイジングカラムを通過させることにより精製して架橋されたデキストランを除去することができる。
デキストランを誘導体化してアミン官能基を導入するその他の従来の方法、例えば臭化シアンとの反応、続いてジアミンとの反応を用いることもできる。
次いで従来の手段により、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはその水溶性変種を用いて調製された活性化形態の、付加されることになっている特定の薬物、毒素、キレート剤、免疫モジュレーター、ホウ素付加物またはその他の治療薬の誘導体、好ましくはカルボキシル活性化誘導体とアミノデキストランを反応させて、中間付加物を形成する。
【０２１８】
これに代えてグルタルアルデヒド縮合により、またはタンパク質上の活性化されたカルボキシル基とアミノデキストラン上のアミンとの反応により、ポリペプチドをアミノデキストランに結合させることができる。
放射性金属のためのキレート剤または磁気共鳴エンハンサーが当分野において周知である。典型的なものはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体である。これらのキレート剤は、典型的には側鎖を有し、それによりキレート剤を担体に付着させることができる。かかる基には、例えばベンジルイソチオシアナートが含まれ、それによりＤＴＰＡまたはＥＤＴＡを担体のアミン基に結合させることができる。これに代えて全て当分野において周知の手段による、活性化または事前の誘導体化、そして次に結合により、キレート剤のカルボキシル基またはアミン基を担体に結合させることができる。
【０２１９】
従来の方法によりカルボランのようなホウ素付加物を抗体構成要素に付着させることができる。例えば当分野において周知であるように、懸垂側鎖のカルボキシル官能基でカルボランを調製することができる。かかるカルボランの担体、例えばアミノデキストランへの付着を、カルボランのカルボキシル基の活性化および担体上のアミンとの縮合により達成して、中間抱合体を生成することができる。かかる中間抱合体を次いで抗体構成要素に付着させて、以下に記載されるような治療上有用な免疫抱合体を生成する。
【０２２０】
アミノデキストランの代わりにポリペプチド担体を使用できるが、ポリペプチド担体は鎖に少なくとも５０個のアミノ酸残基、好ましくは１００−５０００個のアミノ酸残基を有するべきである。アミノ酸の少なくともいくつかはリジン残基またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基であるべきである。リジン残基の懸垂アミンまたはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸の懸垂カルボン酸は薬物、毒素、免疫モジュレーター、キレート剤、ホウ素付加物またはその他の治療薬を付着するのに都合がよい。得られた負荷された担体および免疫抱合体に望ましい溶解特性を付与するために適当なポリペプチド担体の実例には、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、その共重合体、ならびにこれらのアミノ酸およびその他のもの、例えばセリンの混合重合体が含まれる。
【０２２１】
抗体構成要素の炭水化物部分を酸化すること、および得られたアルデヒド（およびケトン）カルボニルを、薬物、毒素、キレート剤、免疫モジュレーター、ホウ素付加物またはその他の治療薬を負荷した後に担体に残るアミン基と反応させることにより、中間抱合体の抗体構成要素との抱合を行う。これに代えて、治療薬を負荷した後に中間抱合体に導入されているアミン基を介して、酸化された抗体構成要素に中間抱合体を付着させることができる。酸化は化学的、例えばＮａＩＯ４もしくはその他の糖分解性反応剤で、または酵素的に、例えばノイラミニダーゼおよびガラクトースオキシダーゼのいずれかで都合よく行う。アミノデキストラン担体の場合、典型的にはアミノデキストランの全てのアミンが治療薬の負荷に用いられるわけではない。アミノデキストランの残りのアミンは酸化された抗体構成要素と縮合してシッフ塩基付加物を形成し、次いでそれを通常ホウ化水素還元剤で還元的に安定化する。
【０２２２】
類似の手順を用いて本発明によるその他の免疫抱合体を生成する。負荷されたポリペプチド担体は好ましくは抗体構成要素の酸化された炭水化物部分との縮合に関して残った遊離リジン残基を有する。ポリペプチド担体上のカルボキシルを必要により、例えばＤＣＣでの活性化および過剰にジアミンとの反応によりアミンに変換することができる。
Sephacryl  Ｓ−３００のサイジングクロマトグラフィーまたは１つ以上のＣＤ８４Ｈｙエピトープを用いるアフィニティークロマトグラフィーのような従来の技術を用いて最終的な免疫抱合体を精製する。
【０２２３】
これに代えて抗体構成要素を治療薬と直接抱合させることにより免疫抱合体を調製することができる。一般的な手順は、治療薬を酸化された抗体構成要素に直接付着させること以外は間接的な抱合の方法に類似する。
さらなる説明として、治療薬をジスルフィド結合形成を介して還元された抗体構成要素のヒンジ領域に付着させることができる。例えばペプチドを抗体構成要素に付着させるために用いられる単一のシステイン残基を用いて破傷風トキソイドペプチドを構築することができる。代替えとして、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二機能性架橋剤を用いてかかるペプチドを抗体構成要素に付着させることができる。Yu et al., Int. J. Cancer５６：２４４（１９９４）。かかる抱合のための一般的な技術は当分野において周知である。例えばWong, Chemistry Of Protein Conjugation and Cross−Linking（CRC Press １９９１）；Upeslacis et al., 「化学的方法による抗体の修飾」Monoclonal Antibodies：Principles and Applications, Birch et al.（eds.）, pages １８７−２３０（Wiley−Liss, Inc. １９９５）；Price, 「合成ペプチド由来抗体の生成および特徴付け」Monoclonal Antibodies：Production, Enineering and Clinical Application, Ritter et al.（eds.）, pages ６０−８４（Cambridge University Press １９９５）を参照されたい。
【０２２４】
Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（例えばアジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば２,６−ジイソシアン酸トルエン（tolyene））およびビス−活性フッ素化合物（例えば１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）のような種々の二機能性タンパク質結合剤を用いて抗体および細胞毒性剤の抱合を行う。例えばVitetta et al., Science ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるようにペプチド抱合体を調製することができる。炭素−１４−標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジメチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）はキレート剤抱合体の実例である（例えばＷＯ９４／１１０２６参照）。
【０２２５】
前記されるように、抗体のＦｃ領域の炭水化物部分を用いて治療薬を抱合させることができる。しかしながら、抗体フラグメントを免疫抱合体の抗体構成要素として用いる場合、Ｆｃ領域が不在であるかもしれない。それにもかかわらず、炭水化物部分を抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域に導入することが可能である。例えばLeung et al., J. Immunol. １５４：５９１９（１９９５）；Hansenら、米国特許第５４４３９５３号を参照されたい。次いで操作された炭水化物部分を用いて治療薬を付着させる。
加えて抱合方法の非常に多くの可能な変法が当業者には認識されよう。例えば血液、リンパ液またはその他の細胞外液中でインタクトな抗体またはその抗原結合フラグメントの半減期を延長させるために、炭水化物部分を用いてポリエチレングリコールを付着させることができる。さらに治療薬を炭水化物部分に、および遊離スルフヒドリル基に付着させることにより「二価免疫抱合体」を構築することが可能である。かかる遊離スルフヒドリル基を抗体構成要素のヒンジ領域に配置することができる。
【０２２６】
抗体融合タンパク質
本発明は１つ以上の抗体部分および免疫モジュレーターまたはその他の治療薬のような別のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質を企図する。抗体融合タンパク質を作成する方法は当分野において周知である。例えば米国特許第６３０６３９３号を参照されたい。インターロイキン−２部分を含んでなる抗体融合タンパク質はBoleti et al., Ann. Oncol. ６：９４５（１９９５）、Nicolet et al., Cancer Gene Ther. ２：１６１（１９９５）、Becker et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA ９３：７８２６（１９９６）、Hank et al., Clin. Cancer Res. ２：１９５１（１９９６）、およびHu et al., Cancer Res. ５６：４９９８（１９９６）に記載される。加えてYang et al., Hum. Antibodies Hybridomas ６：１２９（１９９５）はＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび腫瘍壊死因子アルファ部分を含む融合タンパク質を記載する。
【０２２７】
組換え分子が１つ以上の抗体構成要素および別の治療薬を含んでなる融合タンパク質を作成する方法もまた当業者に公知である。例えばChaudhary et al., Nature ３３９：３９４（１９８９）、Brinkmann et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA ８８：８６１６（１９９１）、Batra et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA ８９：５８６７（１９９２）、Friedman et al., J. Immunol. １５０：３０５４（１９９３）、Wels et al., Int. J. Can. ６０：１３７（１９９５）、Fominaya et al., J. Biol. Chem. ２７１：１０５６０（１９９６）、Kuan et al., Biochemistry ３５：２８７２（１９９６）、およびSchmidt et al., Int. J. Can. ６５：５３８（１９９６）；Kreitman et al., Leukemia ７：５５３（１９９３）、Nicholls et al., J. Biol. Chem. ２６８：５３０２（１９９３）、Thompson et al., J. Biol. Chem. ２７０：２８０３７（１９９５）、およびVallera et al., Blood ８８：２３４２（１９９６）； Deonarain et al., Tumor Targeting １：１７７（１９９５）、Linardou et al., Cell Biophys. ２４−２５：２４３（１９９４）、Wang et al., Abstracts of the ２０９th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., Apr. ２−６, １９９５, Part １, BIOT００５；Dohlsten et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA ９１：８９４５（１９９４）を参照されたい。
【０２２８】
本発明の方法に有用である酵素には、限定するものではないが、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用であるセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えばカテプシンＢおよびＬ）のようなプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのような炭水化物切断酵素；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；ならびにそのアミン窒素でフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基を用いて誘導体化された薬物を各々遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼが含まれる。これに代えて、酵素活性を有する抗体もまたアブザイムとして当分野において公知であり、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換するために用いることができる（例えばMassey, Nature ３２８：４５７−４５８（１９８７）参照）。アブザイムを望ましい細胞集団に送達するための抗体−アブザイム抱合体を本明細書に記載されるように調製することができる。
【０２２９】
前記で論じられたヘテロ二機能性架橋反応剤の使用のような当分野において周知の技術により本発明の酵素を抗体に共有結合させることができる。これに代えて本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含んでなる融合タンパク質を当分野において周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えばNeuberger et al., Nature ３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）。
【０２３０】
非治療的使用
標的抗原のためのアフィニティー精製薬剤として、または標的抗原のための診断アッセイ、例えば具体的な細胞、組織もしくは血清におけるその発現の検出において本発明の抗体を使用できる。抗体をインビボ診断アッセイのために使用することもできる。一般的にこれらの目的のために抗体を放射性核種（例えば１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐまたは３５Ｓ）で標識し、免疫シンチグラフィーを用いて部位を特定することができる。
本発明の抗体を競合結合アッセイ、ＥＬＩＳＡのような直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈殿アッセイのような任意の公知のアッセイ方法で用いることができる。Zola, Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques, pp.１４７−１５８（CRC Press, Inc. １９８７）。当分野において公知の方法を用いて抗体を免疫組織化学のために使用して細胞試料を標識することもできる。
【０２３１】
便宜上、本発明の抗体をキット、すなわち予め決定された量の薬剤を、診断アッセイを実施するための説明書と共に包装された組み合わせで提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、キットは基質および酵素に必要な補助因子（例えば検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含むであろう。加えて、安定剤、バッファー（例えば遮断バッファーまたは溶解バッファー）等のようなその他の添加剤を含むことができる。種々の薬剤の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する薬剤の溶液中の濃度を提供するために大きく異なり得る。とりわけ通常凍結乾燥された乾燥粉末として薬剤提供でき、溶解時に適切な濃度を有する薬剤溶液を提供するであろう賦形剤を含む。
【実施例】
【０２３２】
以下の実施例により本発明を説明するが、それは決して本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
ＥｐｈＢ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の調製
ＥｐｈＢ３のＥＣＤの組換え発現のために最初にネステッドＰＣＲ研究法に取り組み、タグを組み込み、そして発現ベクターへの組み込みのために調製物におけるコード化領域の末端を操作した。使用したプライマーは以下のとおりであった（全て５’から３’への配列として記載される）：
正方向＃１：
TCGTATACATTTCTTACATCTATGCGCTGGAAGAGACCCTCATGGACACAAA
（配列番号：４２０）
正方向＃２：
GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACGAAGGAGATATACATATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCCTTGTTTTTATGGTCGTATACATTTCTTACATCTATGCG
（配列番号：４２１）
逆方向＃１：
CGGGTCGTCGAGGTCCTCGTCGAAGGGCCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCT
（配列番号：４２２）
逆方向＃２：
CCTCGTGTAGTGGTAGTGGTAGTGCCTCGAATTTGGGTCGAAAGAACATGTTTCACCAGGG
（配列番号：４２３）
【０２３３】
PfuUltra（商標）Hotstart PCR Master Mix（Stratagene）を用いて製造者の推奨にしたがってＰＣＲ増幅を実施した。増幅に使用した鋳型はｐＤＯＮＯＲ２０１中にクローン化されたＥｐｈＢ３  ＥＣＤフラグメントであった。トポイソメラーゼクローニング計画を用いてＥＣＤ  ＰＣＲ生成物をｐＢｌｕｅＢａｃ４．５ＧＷにクローン化した。最終的に選択されたクローンを二本鎖シークエンシングにより確認した。各クローンを表すＤＮＡ１０−２０μｇを昆虫トランスフェクションのために調製した。
【０２３４】
組換え構築物を用いて以下のように昆虫細胞においてＥｐｈＢ３  ＥＣＤを発現させた。ＥｐｈＢ３の細胞外ドメインをコードするプラスミドＤＮＡとSapphire（商標）ゲノムオートグラファ・カリフォルニカＤＮＡとの同時トランスフェクションのプラーク精製によりバキュロウイルスを単離した。組換えウイルスを増幅し、そして１０ｌ（作業容量）ウェーブバイオリアクター中ｍｌあたり１−１.５×１０６セルの範囲の密度、２−１０の範囲の感染の多重度（ｍｏｉ）でＴｎ５昆虫細胞を感染するために使用した。感染の４８時間後、細胞および上澄を収集および遠心し、そして上澄を濃縮するために調製した。上澄を０.４５μｍ中空ファイバーカートリッジで清澄化し、その後接線流１０ｋＤａ分子量カットオフ膜で８倍に濃縮した。タンパク質精製の前に上澄を１ｌ、０.２μｍ孔真空フラスコで滅菌ろ過した。
【０２３５】
ＥｐｈＢ３  ＥＣＤを以下のとおりに精製した。ＥｐｈＢ３  ＥＣＤを含有する昆虫細胞培養上澄をバッファーＡ（ＰＢＳ／０.３５Ｍ  ＮａＣｌ／５ｍＭイミダゾール）で平衡にした２５ｍｌ  Ｎｉキレートカラム（G.E. resin、カタログ番号１７−５３１８−０３）に流速１３ｍｌ／分で通過させた。ＥｐｈＢ３  ＥＣＤを含有する結合タンパク質をバッファーＡからバッファーＢ（ＰＢＳ／０.３５Ｍ  ＮａＣｌ／２５０ｍＭイミダゾール）の３０カラム容量グラジエントを用いて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画を試験し、そして望ましい純度でＥｐｈＢ３  ＥＣＤを含有するものをプールした。プールをバッファーＡに対して透析し、そして２×５ｍｌ  HisTrap（G.E.）カラムに通過させた。HisTrapカラムを最初のＮｉキレートカラムと同一の様式で溶出した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験し、そして望ましい純度でＥｐｈＢ３  ＥＣＤタンパク質を含有するものをプールした。最後のプールをＰＢＳ／０.１Ｍアルギニンに対して透析した。Ｎ末端シークエンシングならびに還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色およびウェスタン分析）により同一性および純度に関して最終材料を分析した。
【０２３６】
実施例２
マウスハイブリドーマにより分泌された標的特異性抗体の同定
ハイブリドーマ作成のために用いられた免疫原はヒトＥｐｈＢ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（配列番号：２のアミノ酸３７−５５８に対応）の組換え体であり、それをバキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いて作成した。免疫のためにＥＣＤを均等な容量のアジュバントと混合し、そして混合物を後肢足蹠の腹面に皮下注射した。種々の免疫スケジュールにしたがってマウスに免疫原を３−１４日毎に注射して強力な免疫応答を生成した。次いで良好な免疫応答を示すマウスを剖検し、リンパ節を回収し、そしてリンパ節中のＢ細胞を収集した。次いで当分野において周知の技術にしたがってＢ細胞を骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを生成し、そしてＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳアッセイでＥｐｈＢ３タンパク質を認識する抗体を生成するものに関してハイブリドーマをスクリーニングした。
【０２３７】
実施例３
ファージディスプレイによる標的特異性抗体の同定
抗体のスクリーニング
抗ＥｐｈＢ３抗体のパネルを単離するために、ＥｐｈＢ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）で超免疫されたマウスから作成されたOmniclonalファージディスプレイライブラリー（Buechlerら、特許第６０５７０９８号）をスクリーニングした。
米国特許第６０５７０９８号のプロトコールにしたがってOmniclonalライブラリーから得られた単一のコロニーをＥＬＩＳＡアッセイにおいて結合活性に関してスクリーニングした。簡単には、ミクロ培養をＯＤ６００＝０.６まで増殖させ、その時点で０.２重量／容量％アラビノースを添加し、続いてシェーカーインキュベーター中３０℃で一晩培養することにより可溶性抗体フラグメントの発現を誘起した。細菌を沈降させ、そして周辺質抽出物を調製し、そしてそれを用いてNunc MaxiSorp（商標）マイクロプレートに固定されたＥｐｈＢ３−ＥＣＤに対する抗体結合活性を、マイクロプレート製造者により提供された標準ＥＬＩＳＡプロトコールにしたがって検出した。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析を用いてＣＨＯ−Ｋ１−ＥｐｈＢ３発現細胞に対する結合を測定することにより抗体結合をも評価した。
【０２３８】
ファージディスプレイにより同定された抗体候補の完全ＩｇＧへの変換
最初のスクリーニングからのリード候補結合剤を抗体重および軽鎖定常領域を含んでなる抗体に変換するために、結合剤の重および軽鎖の双方の可変領域に関するコード化配列をカッパ（κ）およびガンマ−１（γ１）定常領域遺伝子をコードする専有される哺乳動物発現ベクター（ＷＯ２００４／０３３６９３）にクローン化した。
Handa et al.,（２００４） American Society of Cancer Biology Poster #１９３７に記載されるように、抗体は２９３Ｅ細胞中で一過性に発現された。トランスフェクトされた細胞の上澄を培養の６日目に回収し、そしてプロテインＡ  Sepharose（GE HEalthcare）を用いて製造者のプロトコールにしたがってＩｇＧを精製した。
【０２３９】
実施例４
ＥｐｈＢ３抗体エピトープのビニング(binning)
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）テクノロジーを用いる連続競合アッセイ計画により抗ＥｐｈＢ３抗体をエピトープビンに割り当てた。この研究法では、１つの抗体を直接的にかまたは捕捉剤を介してのいずれかでセンサーチップに固定し、そして固定された抗体上に注射されたときにリガンド（ＥｐｈＢ３  ＥＣＤ）を結合させた。第２の被験抗体を続いて注射し、そして第１の抗体により捕捉されたリガンドを結合するその能力を決定した。リガンド上の空間的に分離されたエピトープに抗体が結合する場合、第２抗体はまたリガンド／第１抗体複合体にも結合できるはずである。リガンドの同一分子に同時に結合する２つの異なる抗体の能力は対形成と称される。
【０２４０】
１．  第１シリーズの実験は全てのフローセル上の高密度のウサギ抗マウスＦｃ特異性抗体（ＲＡＭ−Ｆｃ）でコーティングされたＣＭ５センサーチップを利用した。
ａ．  ランニングバッファーはＨＢＳ−ＥＰ（Biacore（登録商標）, Inc.）であり、温度を２５℃に設定し、そして流速は１０μｌ／分であった。
ｂ．  １−１０μｇ／ｍｌ希釈物を１−３分間注射することにより各フローセル上の異なる抗体を捕捉し、捕捉レベルは２００−１０００ＲＵに至った。
ｃ．  次いでＨＢＳ−ＥＰ中１００μｇ／ｍｌマウスＩｇＧを３０分間注射することにより表面を遮断した。
ｄ．  対形成に関して試験されることになっている抗体を１μｇ／ｍｌで注射して、チップが有効に遮断されたことを確認し、そして抗体のバックグラウンド結合レベルを決定した。
ｅ．  リガンドを２−１０μｇ／ｍｌで２−４分間注射した。
ｆ．  対形成されることになっている抗体を再度前記の工程１ｄのように注射した。この注射の間に抗体が結合した場合、２つの抗体は対を形成し、そしてそれ故に別個のエピトープビンに入れられる。第２抗体が結合しなかった場合、それは結合に関して第１抗体と競合し、そしてそれらは同一のまたは重複するエピトープビンに入れられる。
ｇ．  自己対形成に関する対照として、捕捉された抗体の各々をそれ自体との対形成に関して試験した。
【０２４１】
２．  一度いくつかのエピトープビン、または対形成しない抗体の独特なセットを解明すると、これらの抗体を用いてさらなる抗体をさらに調査した。一度に４つの抗体を用いて連続した様式で抗体を調べた。４つのフローセルの各々に関する異なるエピトープビンからのハイブリドーマ抗体を捕捉し、続いて一度に４つ全てにわたって前記された対形成プロトコールを実施することにより、多量の試料のセットを調べた。
３．ＲＡＭ−Ｆｃ表面はヒトＦａｂを捕捉しないので、１００μｇ／ｍｌマウスＩｇＧを使用する遮断工程を用いない修飾を伴ってこの方法を用いてヒト抗体Ｆａｂフラグメントを同様に評価した。
【０２４２】
実施例５
フローサイトメトリー基盤のアッセイを用いるアンタゴニストＥｐｈＢ３抗体の選択ならびにＥｐｈＢ３リン酸化および分解の検出
ＥｐｈＢ３を標的とするアンタゴニスト抗体を同定するために、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）基盤のアッセイを開発して、受容体活性化の下流の影響をモニタリングした（例えばシグナリング経路の活性化の測定として、全細胞ホスホチロシン（ｐＹ）アッセイ）。
全細胞チロシンリン酸化
全細胞ｐＹアッセイは高レベルの受容体を発現する、浮遊適応性の、安定してトランスフェクトされるＣＨＯ細胞系を用いた。このアッセイを用いてハイブリドーマ上澄をスクリーニングし、ハイブリドーマ由来の抗体を精製し、そして完全ＩｇＧ再編成されたファージディスプレイ由来の抗体を精製した。
【０２４３】
ＥｐｈＢ３を過剰発現する浮遊適応性ＣＨＯ−Ｋ１細胞を丸底９６ウェルプレートに２×１０５セル／ウェルで播種した。次いでＥｐｈＢ３に対する抗体を１：１０で各試料ウェルに直接希釈した。試料を３７℃で４０−４５分間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２％ホルムアルデヒドで、室温で２０分間固定した。次いで細胞を透過化バッファーで２回洗浄し、そしてＰＥ抱合マウス抗ホスホチロシン抗体（ＰＹ２０）を含有する透過化バッファーに再懸濁した。細胞を４℃で１時間インキュベートし、透過化バッファーで２回洗浄し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。
【０２４４】
およそ２４％の被験抗体はｐＹアッセイにおいてアゴニスト活性を示した。３つの抗体（ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＨＡ.０５.１７２およびＸＨＡ.０５.８４９）は１.５倍のオーダーでＦＡＣＳホスホチロシン染色における低減を引き起こし、そしてこれらの抗体のうちの２つ（ＸＰＡ.０４.０１７およびＸＨＡ.０５.１７２）はアゴニスト抗体に相対して別個のエピトープビンに位置決定され、それはこれらの２つの抗体がＥｐｈＢ３アンタゴニスト効果に関連する独特のエピトープを同定することを示している。最低のアゴニスト活性を示した２つの抗体（ＸＰＡ.０４.０１９およびＸＰＡ.０４.０３１）はエフリンＢ２の結合を防御した（以下でさらに記載する）。
【０２４５】
実施例６
エフリンＢ２結合競合アッセイおよびエピトープ競合アッセイ
Ａ．  Flexchipセンサーチップ調製
Flexchipアッセイプラットフォーム（Biacore, Uppsala Sweden）を用いて３つの同定された抗ＥｐｈＢ３アンタゴニスト抗体を、その他の７つの同定されたエピトープビンからの代表との結合競合に関して迅速に試験し、そしてまたその他の７つのビンからのアンタゴニストおよびアゴニスト抗体がＥｐｈＢ３−ＥＣＤに対する結合に関してエフリンＢ２リガンドと競合するかどうかをも決定した。
精製された抗体を金がむき出しになったFlexchipスライドに希釈せずに２５μｌピペットチップを用いて２検体ずつでスポットした。組換えＥｐｈＢ３−ＥＣＤおよびプロテインＡ／Ｇを３検体ずつでスポットした。タンパク質濃度を表４にまとめる。スポットした後、チップを湿度８５％のチャンバー中に１.５時間置き、次いで４℃で一晩置いた。
【０２４６】
表４  Flexchipセンサーチップ表面上にスポットされた薬剤
【表１２】
0005485696.tif 000013
チップにスポットした後、FlexchipをＰＢＳＴ（０.０５％Tween２０を伴うリン酸塩緩衝生理食塩水）ランニングバッファーで平衡にした。チップをドッキングし、そして１倍のFlexchip遮断溶液（Biacore）を用いて遮断を実施した。
【０２４７】
Ｂ．エフリンＢ２競合アッセイ
ランニングバッファー中２μｇ／ｍｌのエフリンＢ２を５００μｌ／分で５分間注射して、固定された抗体に対する非特異的結合がないことを確認し、そしてまたそれはスポットされたＥｐｈＢ３−ＥＣＤに結合していることを確認した。これに続いてランニングバッファー中２μｇ／ｍｌのＥｐｈＢ３−ＥＣＤを５分間注射し、直後にエフリンＢ２をさらに５分間注射した。ＸＨＡ.０５.８４９はこの試験で有効に評価されるほど十分な量のＥＣＤに結合しなかった。その他の抗体は全て有意なレベルのＥｐｈＢ３−ＥＣＤに結合し、そしてＸＰＡ.０４.０３１およびＸＰＡ.０４.０１９を除いて全てがエフリンＢ２の、抗体に捕捉されたＥＣＤに対する結合を可能にした（以下の表５を参照されたい）。ＸＰＡ.０４.０３１およびＸＰＡ.０４.０１９により捕捉された組換えＥｐｈＢ３−ＥＣＤに対するエフリンＢ２の結合は検出されなかった。
【０２４８】
表５  エフリンＢ２およびＥｐｈＢ３−ＥＣＤのスポットされた抗体に対する結合
【表１３】
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Ｃ．エピトープ競合アッセイ
特記しない場合全ての注射は５００μｌ／分で５分間であり、そして全ての試料をＰＢＳＴランニングバッファーで希釈した。ＥｐｈＢ３−ＥＣＤを１μｇ／ｍｌで注射し、直後に被験抗体を２μｇ／ｍｌで注射した。各抗体競合試験の次に１０ｍＭグリシン、ｐＨ２.５を３０秒間注射し、続いて５分間のバッファーを流し、そして次に１０分間遮断バッファーを流す工程、続いてさらに５分間バッファーを流すことによりチップを再生した。Flexchip評価ソフトウェアのレポート点特徴を用いてエピトープ競合データを分析し、ここで開始、中間および終局と指定された領域が選択され、そして選択された領域にわたる平均応答を表にする。
抗体ＸＨＡ.０５.１７２、ＸＨＡ.０５.８４９、ＸＰＡ.０４.０１７およびアゴニスト抗体を注射試料として使用して、スポットされた抗体の全てに対して試験した。エピトープ競合アッセイサイクルの各々からのデータを以下の表６−８に示す。
【０２４９】
表６  Flexchipアッセイにおけるスポットされた抗体とのＥｐｈＢ３−ＥＣＤ結合競合に関するＸＨＡ.０５.１７２の試験
【表１４】
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【０２５０】
表７  Flexchipアッセイにおけるスポットされた抗体とのＥｐｈＢ３−ＥＣＤ結合競合に関するＸＰＡ.０４.０１７の試験
【表１５】
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【０２５１】
表８  Flexchipアッセイにおけるスポットされた抗体とのＥｐｈＢ３−ＥＣＤ結合競合に関するＸＨＡ.０５.８４９の試験
【表１６】
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【０２５２】
Ｄ．結論
アンタゴニスト抗体および各アゴニストビンからの代表を試験してＥｐｈＢ３細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するその結合がＥＣＤに対するエフリンＢ２リガンドの結合を防御するかどうかを決定した。前記で示したように、ＥｐｈＢ３アンタゴニスト抗体のうちの２つ、ＸＰＡ.０４.０１７およびＸＨＡ.０５.１７２はいずれのアゴニストビンとも異なった独特なビンを作り上げた。互いに競合し、そしてその他の７つのビンからのその他の抗体のいずれとも競合しない２つの抗体の能力により、この新たなビンを定義した。２つの抗体ＸＰＡ.０４.０１７およびＸＨＡ.０５.１７２はまた捕捉されたＥＣＤをエフリンＢ２リガンドに対する結合から防御しなかった。このデータにより、本明細書にて同定され、そして記載された抗体がアンタゴニスト活性を有し、アゴニスト抗体のものとは異なるエピトープに結合し、そしてエフリンＢ２リガンドの直接的競合以外の作用のメカニズムを有することが確認される。２つの抗体、ＸＰＡ.０４.０１９およびＸＰＡ.０４.０３１は最低のアゴニスト活性を有したが、捕捉されたＥＣＤに対するエフリンＢ２の結合を防御し（すなわちリガンド競合）、そして故にアンタゴニストとして特徴付けされ得る。かかるリガンド結合競合を実証したアゴニスト抗体はなかった。
【０２５３】
実施例７
マウス抗体のヒト化
この実施例はマウス抗ＥｐｈＢ３抗体のヒト化のための手順を示す。
ヒト化ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＰＡ.０４.０３１およびＸＰＡ.０４.０１９軽および重鎖に関する遺伝子の設計
マウス抗体ＸＰＡ.０４.０１７、ＸＰＡ.０４.０３１およびＸＰＡ.０４.０１９に関する軽鎖および重鎖可変領域アミノ酸配列を図１に示す。National Biomedical Foundation Protein Identification Resourceまたは類似のデータベースを用いて同定されたヒト抗体の配列を用いてヒト抗体のフレームワークを提供する。ヒト化重鎖の配列を選択するために、マウス重鎖配列をヒト抗体重鎖の配列とアラインする。各位置でヒト抗体アミノ酸をヒト化配列のために選択するが、その位置が以下で定義される４つのカテゴリーのうちのいずれか１つに入る場合は除き、その場合はマウスアミノ酸が選択される：
（１）Kabat, J. Immunol., １２５：９６１−９６９（１９８０）により定義されるように、位置が相補性決定領域（ＣＤＲ）内に入る；
（２）ヒト抗体アミノ酸がその位置でヒト重鎖に関しては稀であるが、マウスアミノ酸はその位置でヒト重鎖に関して一般的である；
（３）その位置がマウス重鎖のアミノ酸配列におけるＣＤＲに直ぐ隣接する；または
（４）マウス抗体の三次元モデリングにより、アミノ酸が抗体結合領域に物理的に近い。
【０２５４】
ヒト化軽鎖の配列を選択するために、マウス軽鎖配列をヒト抗体経鎖の配列とアラインする。各位置でヒト抗体アミノ酸をヒト化配列のために選択するが、その位置が再度前記された、および以下に繰り返すカテゴリーの１つに入る場合は除く：
（１）ＣＤＲのもの；
（２）ヒト抗体よりもさらに典型的なマウスアミノ酸；
（３）ＣＤＲのものに隣接する；または
（４）結合領域に三次元的に近位する可能性がある。
【０２５５】
重および軽鎖遺伝子の実際のヌクレオチド配列を以下のように選択する：
（１）前記されたように選択されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（２）これらのコード化配列の５’で、ヌクレオチド配列はリーダー（シグナル）配列をコードする。これらのリーダー配列は典型的な抗体として選択された；
（３）コード化配列の３’で、ヌクレオチド配列はマウス軽鎖Ｊ５セグメントおよびマウス重鎖Ｊ２セグメントに続く配列であり、それはマウス配列の一部である。これらの配列はスプライシングドナーシグナルを含有するので含まれる；および
（４）Ｘｂａ  Ｉ部位での切断およびベクターのＸｂａ  Ｉ部位へのクローニングを可能にするために配列の各末端はＸｂａ  Ｉ部位である。
【０２５６】
ヒト化軽および重鎖遺伝子
重鎖を合成するために、Applied Biosystems ３８０Ｂ  ＤＮＡ合成器を用いて４つのオリゴヌクレオチドを合成する。オリゴヌクレオチドうちの２つは重鎖の各鎖の一部であり、そして各オリゴヌクレオチドはアニーリングを可能にするために約２０ヌクレオチドまで次のものと重複する。そのオリゴヌクレオチドは一緒に全ヒト化重鎖可変領域に及び、Ｘｂａ  Ｉ部位での切断を可能にするために各末端でいくつかの余分なヌクレオチドを伴う。オリゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲルから精製される。
【０２５７】
各オリゴヌクレオチドはＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標準的な手順（Maniatis et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, ２nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.（１９８９））によりリン酸化される。リン酸化されたオリゴヌクレオチドをアニーリングするために、それらを一緒にＴＡ（３３ｍＭ  酢酸Tris、ｐＨ７.９、６６ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム）４０μｌ中、各々約３.７５μＭの濃度で懸濁し、９５℃まで４分間加熱し、そして４℃まで緩徐に冷却する。各オリゴヌクレオチドの反対の鎖を合成することによりオリゴヌクレオチドから完全な遺伝子を合成するために、以下の構成要素を最終容量１００μｌで添加する：
１０μｌ             アニーリングされたオリゴヌクレオチド
０.１６ｍＭ          各デオキシリボヌクレオチド
０.５ｍＭ            ＡＴＰ
０.５ｍＭ            ＤＴＴ
１００μｇ／ｍｌ     ＢＳＡ
３.５μｇ／ｍｌ      Ｔ４ｇ４３タンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）
２５μｇ／ｍｌ       Ｔ４ｇ４４／６２タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）
２５μｇ／ｍｌ       ４５タンパク質（ポリメラーゼアクセサリータンパク質）
【０２５８】
混合物を３７℃で３０分間インキュベートする。次いでＴ４  ＤＮＡリガーゼ１０単位を添加し、そして３７℃でのインキュベーションを３０分間再開する。ポリメラーゼおよびリガーゼを７０℃で１５分間のインキュベーションにより不活化する。遺伝子をＸｂａ  Ｉで消化するために、２００μｇ／ｍｌの２倍ＴＡ含有ＢＳＡおよび１ｍＭのＤＴＴ５０μｌ、水４３μｌならびに５μｌ中５０単位のＸｂａ  Ｉを反応物に添加する。反応物を３７℃で３時間インキュベートし、そして次にゲル上で精製する。標準的な方法によりＸｂａ  Ｉフラグメントをゲルから精製し、そしてプラスミドｐＵＣ１９のＸｂａ  Ｉ部位にクローン化する。標準的な技術を用いてプラスミドを精製し、そしてジデオキシ法を用いてシークエンシングする。
ヒト化軽および重鎖を発現するためのプラスミドの構築を、軽および重鎖Ｘｂａ  Ｉフラグメントをそれが挿入されていたｐＵＣ１９プラスミドから単離すること、そして次にそれを適切な宿主細胞にトランスフェクトされた場合に高レベルの完全な重鎖を発現するであろう適切な発現ベクターのＸｂａ  Ｉ部位に挿入することにより達成する。
【０２５９】
ヒト化抗体の合成および親和性
発現ベクターをマウスＳｐ２／０細胞にトランスフェクトし、そして標準的な方法によりプラスミドを組み込む細胞を、発現ベクターにより付与された（複数の）選択可能マーカーに基づいて選択する。これらの細胞がＥｐｈＢ３に結合する抗体を分泌したことを確認するために、細胞からの上澄を、ＥｐｈＢ３を発現することが分かっている細胞と共にインキュベートする。洗浄した後、細胞をフルオレセイン抱合ヤギ抗ヒト抗体と共にインキュベートし、洗浄し、そしてＦＡＣＳＣＡＮサイトフルオロメーターで蛍光に関して分析する。
次の実験のために、ヒト化抗体を生成する細胞をマウスに注射し、そして得られた腹水を収集する。標準的な技術にしたがってAffigel−１０支持体（Bio−Rad Laboratories, Inc., Richmond, Calif.）上に調製されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン抗体のアフィニティーカラムを通過させることにより、腹水からヒト化抗体を実質的に均一になるまで精製する。元来のマウス抗体に相対したヒト化抗体の親和性を当分野において公知の技術にしたがって決定する。
【０２６０】
実施例８
マウス抗体のヒト改変
この実施例はHuman Engineered（商標）抗体のクローニングおよび発現、ならびにかかる抗体の精製および結合活性に関する試験を記載する。
Human Engineered（商標）配列の設計
抗体可変ドメインのHuman Engineered（商標）は免疫原性を低減させるが、抗体分子の結合活性を維持するための方法としてStudnicka［例えばStudnickaら、米国特許第５７６６８８６号；Studnicka et al. Protein Engineering ７：８０５−８１４（１９９４）を参照されたい］により記載されている。本発明の方法にしたがって、各可変領域アミノ酸を置換のリスクに割り当てている。アミノ酸置換は３つのリスクカテゴリーのうちの１つにより区別される：（１）低リスク変化は免疫原性を低減させる可能性が最も高く、抗原結合を乱す確率が最も低いものである；（２）中リスク変化はさらに免疫原性を低減させるが、抗原結合またはタンパク質フォールディングに影響を及ぼす確率がより高いものである；（３）高リスク残基は結合または抗体構造の維持に重要であり、そして抗原結合またはタンパク質フォールディングが影響を受けるであろうリスクが最も高いものである。プロリンの三次元構造の役割のために、プロリンでの修飾は、その位置が典型的には低リスク位置であったとしても、一般的に少なくとも中リスク変化になると考えられる。置換変化が好ましいが、挿入および欠失もまた可能である。図７は高、中または低リスク変化として分類されるＸＰＡ.０４.０１７、ＸＰＡ.０４.０３１およびＸＰＡ.０４.０１９軽および重鎖の各アミノ酸残基に関するリスク割り当てを示す。
【０２６１】
マウス抗体の軽および重鎖の可変領域はこの方法を用いるHuman Engineered（商標）である。低リスク位置でその方法による修飾のための候補であるアミノ酸残基を、マウス可変領域のアミノ酸配列をヒト可変領域配列とアラインすることにより同定する。個々のＶＨもしくはＶＬ配列またはヒトコンセンサスＶＨもしくはＶＬ配列を含む任意のヒト可変領域を使用することができる。低リスク位置の任意の数の、または低リスク位置の全てのアミノ酸残基を変化させることができる。
同様にマウス可変領域のアミノ酸配列をヒト可変領域配列とアラインすることにより、全ての低および中リスク位置でその方法による修飾のための候補であるアミノ酸残基を同定する。低もしくは中リスク位置の任意の数の、または低もしくは中リスク位置の全てのアミノ酸残基変化させることができる。
【０２６２】
永久細胞系開発のための発現ベクターの調製
合成ヌクレオチド合成を用いて前記された重および軽鎖Ｖ領域配列の各々をコードするＤＮＡフラグメントを抗体由来のシグナル配列と一緒に構築する。前記された軽鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトカッパ軽鎖定常領域を含有するベクターｐＭＸＰ１０に挿入する。前記された重鎖Ｖ領域アミノ酸配列の各々をコードするＤＮＡを、ヒトガンマ−１、２、３または４重鎖定常領域を含有するベクターｐＭＸＰ６に挿入する。これらのベクターは全てｈＣＭＶプロモーターおよびマウスカッパ軽鎖３’非翻訳領域、ならびにＧ４１８−またはヒスチジノール抵抗性トランスフェクタントの各々の選択のためのｎｅｏまたはｈｉｓのような選択可能マーカー遺伝子を含有する。
【０２６３】
一過性の発現のための発現ベクターの調製
一過性のトランスフェクションのために前記された軽または重鎖遺伝子のいずれかを含有するベクターをも構築する。これらのベクターは、ｎｅｏまたはｈｉｓ遺伝子の代わりに、エプスタイン・バーウイルス由来核抗原を発現するＨＥＫ２９３細胞における複製のためにエプスタイン・バーウイルスｏｒｉＰを含有する以外は永久トランスフェクションのために前記されたものに類似する。
ＨＥＫ２９３Ｅ細胞におけるHuman Engineered抗ＥｐｈＢ３抗体の一過性発現
各々エプスタイン・バーウイルスからのｏｒｉＰおよび前記された軽鎖または重鎖遺伝子を含有する別個のベクターをＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一過性にトランスフェクトする。一過性にトランスフェクトされた細胞を１０日までインキュベートを可能にし、その後上澄を回収し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーを用いて抗体を精製する。
【０２６４】
永久的にトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の開発
軽および重鎖遺伝子の各々１コピーを含有する前記されたベクターを一緒にＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２適応ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトする。Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地中の浮遊増殖に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞を典型的には直線化ベクター４０μｇでエレクトロポレートする。これに代えて直線化ＤＮＡを線状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で複合化し、そしてトランスフェクションに使用することができる。１％ＦＢＳおよびＧ４１８を補充したＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地の入った９６ウェルプレートに細胞を蒔く。９６ウェルプレートにおいてクローンをスクリーニングし、そして各々のトランスフェクションから、上層〜１０％のクローンをＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地の入った２４ウェルプレートに移す。
【０２６５】
２４ウェルプレートにおいてＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地中、培養物増殖に関して７および１４日間生産性試験を実施し、そのときにＩｇＧに関する免疫グロブリンＥＬＩＳＡアッセイにより、分泌された抗体のレベルに関して培養上澄を試験する。
上層クローンをＥｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地の入った振盪フラスコに移す。細胞が浮遊増殖に適応するとすぐに、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ３０２培地中のこれらのクローンで振盪フラスコ試験を実施する。２５ｍｌ培地の入った１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中細胞を１０日まで増殖させる。インキュベーション期間の少なくとも隔日にフラスコを開けて気体交換を可能にし、そしてインキュベーション期間の終わりに培養培地中の免疫グロブリンポリペプチドのレベルをＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより決定する。２つまたは３つの多ユニット転写ベクターでの同一細胞系の多重連続トランスフェクションの結果、好ましくは３００μｇ／ｍｌ以上までの免疫グロブリン生成のレベルのさらなる増大を呈するクローンおよび細胞系に至る。
【０２６６】
精製
本発明にしたがってベクターおよび全ての系からの免疫グロブリンポリペプチドの精製のための過程を設計することができる。例えば当分野において周知の方法にしたがって、終了後にろ過により細胞を除去する。ろ液をプロテインＡカラムに負荷する（必要により複数回通過）。カラムを洗浄し、そして次に発現され、そして分泌された免疫グロブリンポリペプチドをカラムから溶出する。抗体生成物の調製のために、ウイルス不活化工程としてプロテインＡプールを低ｐＨで維持する（ｐＨ３で最低３０分間、最大１時間）。次に吸着性カチオン交換工程を用いて生成物をさらに精製する。吸着分離カラムからの溶出液をウイルス保持フィルターに通過させて潜在的ウイルス粒子をさらに清浄する。生成物が結合しないアニオン交換カラムを通過させることによりろ液をさらに精製する。最後に生成物を透析により処方バッファーに移すことにより精製過程を完了する。リテンテート（retentate）を少なくとも１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整し、そして安定剤を添加する。
【０２６７】
結合活性
組換えHuman Engineered（商標）抗体のＥｐｈＢ３結合活性を評価する。プロテインＡカラムの通過により振盪フラスコ培養上澄からタンパク質を精製し、続いてＡ２８０による濃度決定する。その他の実施例にて記載されるように結合アッセイを実施する。
【０２６８】
実施例９
配列
配列番号：１（ＥｐｈＢ３のヌクレオチド配列）
cgtgagcggcgcagcaagatcccagctcggaccccggacggcgcgcgcccccgaagccccggatcccagtcgggcccgcagctgaccgccagattactgtgcatcccgaatcacgaccacctgcaccctcctgccccggcccgccccccaagtcctcaggcacccagctccccggcgccccggatcctcctggaccggtccgtccagattcccgcgggaccgacctgtccgcatccccaggaccgccgggctcggtgcaccgcctcggtcccggagccgcccgcctggattgcattccctcctctcctggatctcctgggacccgacgcgagcctgccccggagcccgccgagcgcaccctctctcgggtgcctgcagccccgccggcgcggcccggcccggcgcggcccggctcggctcctagagctgccacggccatggccagagcccgcccgccgccgccgccgtcgccgccgccggggcttctgccgctgctccctccgctgctgctgctgccgctgctgctgctgcccgccggctgccgggcgctggaagagaccctcatggacacaaaatgggtaacatctgagttggcgtggacatctcatccagaaagtgggtgggaagaggtgagtggctacgatgaggccatgaatcccatccgcacataccaggtgtgtaatgtgcgcgagtcaagccagaacaactggcttcgcacggggttcatctggcggcgggatgtgcagcgggtctacgtggagctcaagttcactgtgcgtgactgcaacagcatccccaacatccccggctcctgcaaggagaccttcaacctcttctactacgaggctgacagcgatgtggcctcagcctcctcccccttctggatggagaacccctacgtgaaagtggacaccattgcacccgatgagagcttctcgcggctggatgccggccgtgtcaacaccaaggtgcgcagctttgggccactttccaaggctggcttctacctggccttccaggaccagggcgcctgcatgtcgctcatctccgtgcgcgccttctacaagaagtgtgcatccaccaccgcaggcttcgcactcttccccgagaccctcactggggcggagcccacctcgctggtcattgctcctggcacctgcatccctaacgccgtggaggtgtcggtgccactcaagctctactgcaacggcgatggggagtggatggtgcctgtgggtgcctgcacctgtgccaccggccatgagccagctgccaaggagtcccagtgccgcccctgtccccctgggagctacaaggcgaagcagggagaggggccctgcctcccatgtccccccaacagccgtaccacctccccagccgccagcatctgcacctgccacaataacttctaccgtgcagactcggactctgcggacagtgcctgtaccaccgtgccatctccaccccgaggtgtgatctccaatgtgaatgaaacctcactgatcctcgagtggagtgagccccgggacctgggtggccgggatgacctcctgtacaatgtcatctgcaagaagtgccatggggctggaggggcctcagcctgctcacgctgtgatgacaacgtggagtttgtgcctcggcagctgggcctgacggagcgccgggtccacatcagccatctgctggcccacacgcgctacacctttgaggtgcaggcggtcaacggtgtctcgggcaagagccctctgccgcctcgttatgcggccgtgaatatcaccacaaaccaggctgccccgtctgaagtgcccacactacgcctgcacagcagctcaggcagcagcctcaccctatcctgggcacccccagagcggcccaacggagtcatcctggactacgagatgaagtactttgagaagagcgagggcatcgcctccacagtgaccagccagatgaactccgtgcagctggacgggcttcggcctgacgcccgctatgtggtccaggtccgtgcccgcacagtagctggctatgggcagtacagccgccctgccgagtttgagaccacaagtgagagaggctctggggcccagcagctccaggagcagcttcccctcatcgtgggctccgctacagctgggcttgtcttcgtggtggctgtcgtggtcatcgctatcgtctgcctcaggaagcagcgacacggctctgattcggagtacacggagaagctgcagcagtacattgctcctggaatgaaggtttatattgacccttttacctacgaggaccctaatgaggctgttcgggagtttgccaaggagatcgacgtgtcctgcgtcaagatcgaggaggtgatcggagctggggaatttggggaagtgtgccgtggtcgactgaaacagcctggccgccgagaggtgtttgtggccatcaagacgctgaaggtgggctacaccgagaggcagcggcgggacttcctaagcgaggcctccatcatgggtcagtttgatcaccccaatataatccggctcgagggcgtggtcaccaaaagtcggccagttatgatcctcactgagttcatggaaaactgcgccctggactccttcctccggctcaacgatgggcagttcacggtcatccagctggtgggcatgttgcggggcattgctgccggcatgaagtacctgtccgagatgaactatgtgcaccgcgacctggctgctcgcaacatccttgtcaacagcaacctggtctgcaaagtctcagactttggcctctcccgcttcctggaggatgacccctccgatcctacctacaccagttccctgggcgggaagatccccatccgctggactgccccagaggccatagcctatcggaagttcacttctgctagtgatgtctggagctacggaattgtcatgtgggaggtcatgagctatggagagcgaccctactgggacatgagcaaccaggatgtcatcaatgccgtggagcaggattaccggctgccaccacccatggactgtcccacagcactgcaccagctcatgctggactgctgggtgcgggaccggaacctcaggcccaaattctcccagattgtcaataccctggacaagctcatccgcaatgctgccagcctcaaggtcattgccagcgctcagtctggcatgtcacagcccctcctggaccgcacggtcccagattacacaaccttcacgacagttggtgattggctggatgccatcaagatggggcggtacaaggagagcttcgtcagtgcggggtttgcatcttttgacctggtggcccagatgacggcagaagacctgctccgtattggggtcaccctggccggccaccagaagaagatcctgagcagtatccaggacatgcggctgcagatgaaccagacgctgcctgtgcaggtctgacaccggctcccacggggaccctgaggaccgtgcagggatgccaagcagccggctggactttcggactcttggacttttggatgcctggccttaggctgtggcccagaagctggaagtttgggaaaggcccaagctgggacttctccaggcctgtgttccctccccaggaagtgcgccccaaacctcttcatattgaagatggattaggagagggggtgatgacccctccccaagcccctcagggcccagaccttcctgctctccagcaggggatccccacaacctcacacttgtctgttcttcagtgctggaggtcctggcagggtcaggctggggtaagccggggttccacagggcccagccctggcaggggtctggccccccaggtaggcggagagcagtccctccctcaggaactggaggaggggactccaggaatggggaaatgtgacaccaccatcctgaagccagcttgcacctccagtttgcacagggatttgttctgggggctgagggccctgtccccacccccgcccttggtgctgtcataaaagggcaggcaggggcaggctgaggagttgccctttgccccccagagactgactctcagagccagagatgggatgtgtgagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgcgcgcgcgcgcgcgtgtgtgtgtgcacgcactggcctgcacagagagcatgggtgagcgtgtaaaagcttggccctgtgccctacaatggggccagctgggccgacagcagaataaaggcaataagatgaaaaaaaaaaaaaaa
【０２６９】
配列番号：２（ＥｐｈＢ３のタンパク質配列）
MARARPPPPPSPPPGLLPLLPPLLLLPLLLLPAGCRALEETLMDTKWVTSELAWTSHPESGWEEVSGYDEAMNPIRTYQVCNVRESSQNNWLRTGFIWRRDVQRVYVELKFTVRDCNSIPNIPGSCKETFNLFYYEADSDVASASSPFWMENPYVKVDTIAPDESFSRLDAGRVNTKVRSFGPLSKAGFYLAFQDQGACMSLISVRAFYKKCASTTAGFALFPETLTGAEPTSLVIAPGTCIPNAVEVSVPLKLYCNGDGEWMVPVGACTCATGHEPAAKESQCRPCPPGSYKAKQGEGPCLPCPPNSRTTSPAASICTCHNNFYRADSDSADSACTTVPSPPRGVISNVNETSLILEWSEPRDLGGRDDLLYNVICKKCHGAGGASACSRCDDNVEFVPRQLGLTERRVHISHLLAHTRYTFEVQAVNGVSGKSPLPPRYAAVNITTNQAAPSEVPTLRLHSSSGSSLTLSWAPPERPNGVILDYEMKYFEKSEGIASTVTSQMNSVQLDGLRPDARYVVQVRARTVAGYGQYSRPAEFETTSERGSGAQQLQEQLPLIVGSATAGLVFVVAVVVIAIVCLRKQRHGSDSEYTEKLQQYIAPGMKVYIDPFTYEDPNEAVREFAKEIDVSCVKIEEVIGAGEFGEVCRGRLKQPGRREVFVAIKTLKVGYTERQRRDFLSEASIMGQFDHPNIIRLEGVVTKSRPVMILTEFMENCALDSFLRLNDGQFTVIQLVGMLRGIAAGMKYLSEMNYVHRDLAARNILVNSNLVCKVSDFGLSRFLEDDPSDPTYTSSLGGKIPIRWTAPEAIAYRKFTSASDVWSYGIVMWEVMSYGERPYWDMSNQDVINAVEQDYRLPPPMDCPTALHQLMLDCWVRDRNLRPKFSQIVNTLDKLIRNAASLKVIASAQSGMSQPLLDRTVPDYTTFTTVGDWLDAIKMGRYKESFVSAGFASFDLVAQMTAEDLLRIGVTLAGHQKKILSSIQDMRLQMNQTLPVQV
【０２７０】
本明細書にて言及され、および／または出願データシートに列挙された全ての前記の米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許文献はその全てにおいて出典明示により本明細書の一部とする。
本発明の具体的な実施態様は説明の目的のために本明細書にて記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を行い得ることは前記から明白である。
【配列表】
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