(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素数１５〜１８の高級アルコールである第１の高級アルコールと、
炭素骨格中に１つの不飽和結合を有する脂肪酸又は飽和脂肪酸を含む、炭素数１８の脂肪酸と、を少なくとも含み、
タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からタンパク質を抽出する混合液。
【請求項２】
前記第１の高級アルコールは、イソステアリルアルコール及びオレイルアルコールからなる群から選択される１種以上を含み、
前記脂肪酸は、オレイン酸及びイソステアリン酸からなる群から選択される１種以上を含む請求項１に記載の混合液。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の前記第１の高級アルコールとは異なる、炭素数２０の高級アルコールである第２の高級アルコールと、炭化水素と、を少なくとも含み、
タンパク質、水性溶媒、炭素数１５〜１８の高級アルコール、及び炭素骨格中に１つの不飽和結合を有する脂肪酸又は飽和脂肪酸を含む、炭素数１８の脂肪酸を含む抽出対象液からタンパク質を抽出する混合液。
【請求項４】
前記第２の高級アルコールは、オクチルドデカノールを含み、
前記炭化水素は、２５℃で液体である炭化水素を含む請求項３記載の混合液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質を抽出する混合液に関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中の対象物質（例えば、タンパク質等）を分離又は抽出等するための方法としてはエマルションを利用した方法が挙げられる（例えば、特許文献１及び２を参照）。
【０００３】
対象物質の分離等のためのエマルションを利用した方法としては、例えば、油層中の逆ミセル内部の水層に対象物質を分離等する方法、乳化型液膜抽出による方法、多層乳化したエマルションを転層させて対象物質を分離等する方法等が挙げられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３２１８０３１号公報
【特許文献２】特開平１０−２３１２４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、溶液中の対象物質を分離等するために使用されて来た従来の方法は、いずれも、界面活性剤の使用を前提としていた。界面活性剤を使用すると、分離等された対象物質から界面活性剤を除去する工程が必要となり、煩雑さが生じていた。従って、溶液中から対象物質を簡便に分離するための混合液が求められていた。
【０００６】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からタンパク質を簡便に分離できる混合液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、所定の高級アルコールと、脂肪酸とを少なくとも含むタンパク質抽出剤によれば上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は下記のものを提供する。
【０００８】
（１）  炭素数１５以上の高級アルコールである第１の高級アルコールと、脂肪酸と、を少なくとも含み、
タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からタンパク質を抽出する混合液。
【０００９】
（２）  前記第１の高級アルコールは、イソステアリルアルコール及びオレイルアルコールからなる群から選択される１種以上を含み、
前記脂肪酸は、炭素骨格中に１つの不飽和結合を有する脂肪酸又は飽和脂肪酸を含む（１）に記載の混合液。
【００１０】
（３）  （１）又は（２）に記載の前記第１の高級アルコールとは異なる、炭素数１８以上の高級アルコールである第２の高級アルコールと、炭化水素と、を少なくとも含み、
タンパク質、水性溶媒、炭素数１５以上の高級アルコール、及び脂肪酸を含む抽出対象液からタンパク質を抽出する混合液。
【００１１】
（４）  前記第２の高級アルコールは、オクチルドデカノールを含み、
前記炭化水素は、２５℃で液体である炭化水素を含む（３）記載の混合液。
【００１２】
（５）  水性溶媒及びタンパク質を含む抽出対象液と、炭素数１５以上の高級アルコールである第１の高級アルコール及び脂肪酸と、を接触させ、上層にタンパク質を抽出させる第１の抽出工程を含む、
タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からのタンパク質の抽出方法。
【００１３】
（６）  前記第１の高級アルコールは、イソステアリルアルコール及びオレイルアルコールからなる群から選択される１種以上を含み、
前記脂肪酸は、炭素骨格中に１つの不飽和結合を有する脂肪酸又は飽和脂肪酸を含む（５）記載のタンパク質の抽出方法。
【００１４】
（７）  前記第１の抽出工程の後に、前記上層と、前記第１の高級アルコールとは異なる、炭素数１８以上の高級アルコールである第２の高級アルコール及び炭化水素とを接触させ、下層にタンパク質を抽出させる第２の抽出工程を含む（５）又は（６）記載のタンパク質の抽出方法。
【００１５】
（８）  前記第２の高級アルコールは、オクチルドデカノールを含み、
前記炭化水素は、水酸基を有さず、２５℃で液体である炭化水素を含む（７）に記載のタンパク質の抽出方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からタンパク質を簡便に分離できる混合液、及び、タンパク質の抽出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】（Ａ）は、本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。（Ｂ）は、本発明の一実施例に係る抽出剤によって抽出されたタンパク質の観察結果である。
【図２】（Ａ）は、本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。（Ｂ）は、本発明の一実施例に係る抽出剤によって抽出されたタンパク質の観察結果である。
【図３】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図４】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図５】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図６】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図７】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図８】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図９】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図１０】本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。
【図１１】（Ａ）は、本発明の一実施例に係る抽出剤による抽出結果を示す写真である。（Ｂ）は、本発明の一実施例に係る抽出剤によって抽出されたタンパク質の観察結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。以下、タンパク質を抽出する混合液をタンパク質抽出剤という。
【００１９】
＜第１のタンパク質抽出剤＞
本発明の第１のタンパク質抽出剤は、少なくとも第１の高級アルコールと、脂肪酸と、を含む。
【００２０】
本発明の第１のタンパク質抽出剤は、界面活性剤を含まなくともよい。また、本発明の第１のタンパク質抽出剤には、従来使用されてきた対象物質の分離等のためのエマルション等に含まれる界面活性剤よりも少ない量（例えば、タンパク質抽出剤全体に対して０〜４質量％）の界面活性剤が含まれていてもよい。なお、本発明において「界面活性剤」とは、溶媒中でミセル構造をとり得る両親媒性分子を指す。
【００２１】
第１のタンパク質抽出剤を、抽出対象物（つまり、タンパク質）と水性溶媒とを含む溶液（以下、「抽出対象液」とも言う）に添加して、適宜撹拌した後に静置すると、抽出対象液は少なくとも２層に分離する。本発明において、第１のタンパク質抽出剤によって少なくとも２層に分離したうちの、タンパク質を含む層を「第１のタンパク質含有層」と言う。通常、少なくとも２層に分離したうちの上層が第１のタンパク質含有層である。
【００２２】
本発明において、抽出対象液が少なくとも２層に分離している状態とは、層間に明確な界面が形成されている状態、及び、層間に明確な界面は形成されていないが見かけ上は少なくとも２層に分離しているように見える状態、のうちいずれも含む。本発明において、分離した各層（見かけ上の層も含む）は、公知の界面検出センサー（超音波等）によって特定できる。
【００２３】
また、抽出対象液が少なくとも２層に分離している状態とは、水層の上表面全体に油層が形成されている状態だけではなく、液滴が水層の上部中及び上表面上の一部に分布している状態も含む。
【００２４】
少なくとも２層に分離した抽出対象液のいずれかの層にタンパク質が含まれる。少なくとも２層に分離した抽出対象液のいずれの層にタンパク質が含まれるかは、タンパク質の性質（水との親和性（親水性、親油性又は両親媒性）、比重等）に応じて異なる。本発明において、タンパク質は、水との親和性等に関わらず、少なくとも２層に分離した抽出対象液のうちの上層に含まれることが多い。
【００２５】
抽出対象液の構成としては、水性溶媒中にタンパク質が混合されたものが挙げられる。水性溶媒としては、タンパク質を変性させないものであれば特に限定されず、公知の水溶性の溶媒（水、リン酸バッファ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ等）等が挙げられる。第１のタンパク質抽出剤によって抽出対象液を少なくとも２層に明瞭に分離できる点で、水性溶媒は、水が好ましい。
【００２６】
（第１の高級アルコール）
第１の高級アルコールは、後述する脂肪酸と組み合わせることにより、下記の作用によって抽出対象液からタンパク質を抽出できると考えられる。すなわち、第１の高級アルコール中の疎水基（オレイル基等）が抽出対象液中のタンパク質と結合する。次いで、水性溶媒中で形成された脂肪酸の液滴が、第１の高級アルコールと結合したタンパク質を引き寄せ、タンパク質含有層が形成され、タンパク質を水性溶媒から分離させる。その結果、タンパク質を抽出対象液から抽出できる。なお、本発明において「抽出」とは、タンパク質と水性溶媒とを分離させること（つまり、タンパク質含有層が形成されること）を指す。ただし、タンパク質含有層には水性溶媒や抽出対象液由来の物質が含まれ得る。タンパク質含有層中の水性溶媒に対するタンパク質の割合が、抽出対象液中の水性溶媒に対するタンパク質の割合よりも高ければ、抽出対象液からタンパク質が抽出されたと言える。
【００２７】
第１の高級アルコールとしては、炭素数１５以上の１価アルコールであれば特に限定されないが、炭素数が多い高級アルコールの方が、タンパク質と結合しやすく、かつ、水性溶媒中で形成される脂肪酸の液滴に引き寄せられやすいという点で好ましい。そのため、第１の高級アルコールの炭素数は、好ましくは炭素数１６以上、さらに好ましくは炭素数１９以上である。
【００２８】
他方、第１の高級アルコールの炭素数が多すぎると、後述する脂肪酸が水性溶媒中で液滴を形成し難いため好ましくない。第１の高級アルコールの炭素数は、好ましくは炭素数３０以下、さらに好ましくは炭素数２０以下である。
【００２９】
炭素数１５以上の高級アルコールとしては、イソステアリルアルコール（炭素数１８）、オレイルアルコール（炭素数１８）等が挙げられる。炭素数１５以上の高級アルコールのうち、抽出対象液中のタンパク質と結合しやすいという点で直鎖構造部分の炭素数が１５以上の高級アルコールが好ましい。
【００３０】
例えば、直鎖構造部分の炭素数が「１６」である高級アルコールとして、下式で表されるイソステアリルアルコールを例示できる。
【化１】
0005388259.tif 000002
【００３１】
第１の高級アルコールとしては、イソステアリルアルコール又はオレイルアルコールが特に好ましい。第１の高級アルコールは１種であってもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３２】
（脂肪酸）
脂肪酸としては、炭化水素の１価のカルボン酸であれば特に限定されず、直鎖脂肪酸及び分岐脂肪酸のいずれでもよい。水性溶媒中で液滴を形成してタンパク質を引き寄せやすいという点で、脂肪酸としては、脂肪酸の炭素骨格中の不飽和結合が少ないものが好ましい。具体的には、炭素骨格中に１以下の不飽和結合を有する脂肪酸が好ましい。つまり、脂肪酸としては、炭素骨格中に１以下の不飽和結合を有さない脂肪酸（つまり、飽和脂肪酸）であってもよい。リノール酸のように炭素骨格中に２以上の不飽和結合を有する脂肪酸を使用すると抽出対象液を少なくとも２層に分離しにくい可能性がある。なお、脂肪酸のみを抽出対象液と混合すると、脂肪酸を含む層と抽出対象液を含む層に分かれ、タンパク質を抽出できない。
【００３３】
炭素骨格中に１以下の不飽和結合を有する脂肪酸としては、オレイン酸、イソステアリン酸等が挙げられる。上記の脂肪酸のうち、オレイン酸、イソステアリン酸が特に好ましい。脂肪酸は１種であってもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３４】
第１のタンパク質抽出剤中の第１の高級アルコール及び脂肪酸の組み合わせとしては、抽出対象液を少なくとも２層に分離しやすいという点でイソステアリルアルコール及びオレイン酸、オレイルアルコール及びオレイン酸が特に好ましい。
【００３５】
第１のタンパク質抽出剤中の第１の高級アルコールと脂肪酸との比率は、抽出対象物であるタンパク質の量や性質に応じて適宜調整でき、例えば、質量比で第１の高級アルコール／脂肪酸＝１／１〜１／２であってもよい。
【００３６】
第１のタンパク質抽出剤には、本発明の目的を害さない限り、公知の添加剤（界面活性剤、炭素数１５未満の高級アルコール等）を添加してもよい。添加剤の添加量は得ようとする効果等に応じて適宜設定できる。
【００３７】
（第１の抽出工程）
本発明において「第１の抽出工程」とは、第１のタンパク質抽出剤と抽出対象液とを接触させる工程から、抽出対象液を少なくとも２層に分離させる工程までを指す。第１の抽出工程における温度条件は、タンパク質やタンパク質抽出剤中の成分が変性等しない限り特に限定されないが、例えば、室温（例えば、２０〜２８℃）であってもよい。
【００３８】
第１のタンパク質抽出剤と抽出対象液とを接触させる方法は、特に限定されないが、第１のタンパク質抽出剤及び抽出対象液を混合、撹拌等することで行える。第１の抽出工程における第１のタンパク質抽出剤と抽出対象液との混合比は特に限定されないが、質量比で、第１のタンパク質抽出剤／抽出対象液＝１／１〜２／３であってもよい。第１のタンパク質抽出剤と抽出対象液との混合方法は特に限定されず、公知の撹拌機や試験管の上下倒立等で混合できる。
【００３９】
第１のタンパク質抽出剤の使用方法としては、抽出対象液に添加する前に第１のタンパク質抽出剤を構成する成分を予め混合してから添加してもよいが、第１の高級アルコール又は脂肪酸のいずれか一方を先に抽出対象液に添加した後に、さらに残りを順次混合してもよい。第１の高級アルコール中の疎水基が抽出対象液中のタンパク質と結合し、次いで、水性溶媒中で形成される脂肪酸の液滴が、第１の高級アルコールと結合したタンパク質を引き寄せ、水性溶媒とタンパク質とを分離させるという本発明の効果が奏されやすい点で、第１の高級アルコールを脂肪酸よりも先に添加することが好ましい。
【００４０】
少なくとも２層に分離した抽出対象液において、タンパク質がいずれの層に存在するかは、界面検出センサー等によって特定される。通常、タンパク質は、少なくとも２層に分離したうちの上層に抽出される。タンパク質含有層は遠心分離等の方法を使用して回収できる。また、タンパク質は、クロマトグラフィー等の方法を使用して、タンパク質含有層から抽出することができる。
【００４１】
＜第２のタンパク質抽出剤＞
本発明の第２のタンパク質抽出剤は、上記第１の高級アルコールとは異なる第２の高級アルコールと、炭化水素と、を含む。本発明の第２のタンパク質抽出剤は、界面活性剤を含まなくともよい。また、本発明の第２のタンパク質抽出剤には、従来使用されてきた対象物質の分離等のためのエマルション等に含まれる界面活性剤よりも少ない量（例えば、タンパク質抽出剤全体に対して０〜４質量％）の界面活性剤が含まれていてもよい。
【００４２】
第２のタンパク質抽出剤は、第１の抽出工程後に得られたタンパク質含有層（以下、「第１のタンパク質含有層」とも言い、この層には、タンパク質、水性溶媒、炭素数１５以上の高級アルコール、及び脂肪酸が含まれ得る）に含まれ得る夾雑物（細胞膜等）を分離できるので、タンパク質をより効率的に抽出できる。
【００４３】
第２のタンパク質抽出剤を、第１のタンパク質含有層に添加して、適宜撹拌した後に静置すると、第１のタンパク質含有層は少なくとも２層に分離する。少なくとも２層に分離した第１のタンパク質含有層のうちのいずれかの層にタンパク質が含まれる。以下、少なくとも２層に分離した第１のタンパク質含有層のうち、タンパク質を含む層を「第２のタンパク質含有層」と言う。通常、少なくとも２層に分離したうちの下層が第２のタンパク質含有層である。
【００４４】
本発明において、第１のタンパク質含有層が少なくとも２層に分離している状態とは、層間に明確な界面が形成されている状態、及び、層間に明確な界面は形成されていないが見かけ上は少なくとも２層に分離しているように見える状態、のうちいずれも含む。本発明において、分離した各層（見かけ上の層も含む）は、公知の界面検出センサー（超音波等）によって特定できる。
【００４５】
少なくとも２層に分離した第１のタンパク質含有層のいずれの層にタンパク質が含まれるかは、タンパク質の性質（水との親和性（親水性、親油性又は両親媒性）、比重等）に応じて異なる。本発明において、タンパク質は、水との親和性等に関わらず、少なくとも２層に分離した第１のタンパク質含有層のうちの下層に含まれることが多い。
【００４６】
第１のタンパク質含有層は、第２のタンパク質抽出剤によって抽出を行う前に、水性溶媒で適宜希釈してもよい。第１のタンパク質含有層を水性溶媒で希釈することによって、第２のタンパク質抽出剤による第１のタンパク質含有層の分離が容易になり得る。水性溶媒としては、抽出対象液におけるものと同様の水性溶媒であってもよく、水、リン酸バッファ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ等が挙げられる。
【００４７】
（第２の高級アルコール）
第２の高級アルコールは、後述する炭化水素と組み合わせることで、下記の作用によって、第１のタンパク質含有層からタンパク質を抽出できると考えられる。すなわち、第１のタンパク質含有層には、タンパク質、水性媒体、第１の高級アルコール及び脂肪酸が分散していると考えられるところ、炭化水素が加えられると、第１のタンパク質含有層中の分散状態が崩れ、水性媒体を含む層、ならびに、第１の高級アルコール及び脂肪酸を含む層に分離する。他方、第２の高級アルコール中の疎水基（オレイル基等）が第１のタンパク質含有層中のタンパク質と結合する。次いで、水性溶媒中で形成された炭化水素の液滴が、第２の高級アルコールと結合したタンパク質を引き寄せる。その結果、タンパク質以外の夾雑物の含有量がより少ない第２のタンパク質含有層が形成される。
【００４８】
第２の高級アルコールとしては、第１の高級アルコールよりも第１のタンパク質含有層中のタンパク質と結合しやすいものを使用する必要があり、第１の高級アルコールとは異なるものを使用する。具体的には、第２の高級アルコールは、炭素数１８以上の高級アルコールである。
【００４９】
他方、第２の高級アルコールの炭素数が多すぎると、後述する炭化水素が水性溶媒中で液滴を形成し難いため好ましくない。第２の高級アルコールの炭素数は、好ましくは炭素数５０以下、さらに好ましくは炭素数４０以下である。
【００５０】
第２の高級アルコールとしては、高級アルコールの炭素鎖にタンパク質が結合しやすいという点で分岐構造中に水酸基を有する炭素数１８以上の分岐状高級アルコールが好ましい。分岐構造中に水酸基を有する分岐状高級アルコールとしては、高級アルコールの炭素鎖とタンパク質との結合を阻害しないという点で分岐構造中の炭素数が少ないものが好ましい。具体的には、水酸基から分岐部分までの炭素原子数が１以下である分岐状高級アルコールが好ましい。水酸基から分岐部分までの炭素原子数が１以下である分岐状高級アルコールとしては、オクチルドデカノール（炭素数２０）等が挙げられる。
【００５１】
例えば、水酸基から分岐部分までの炭素原子数が「１」である高級アルコールとして、下式で表されるオクチルドデカノールを例示できる。
【化２】
0005388259.tif 000003
【００５２】
第２の高級アルコールとしては、オクチルドデカノールが好ましい。第２の高級アルコールは１種であってもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５３】
（炭化水素）
炭化水素としては、炭素原子及び水素原子のみからなる化合物であれば特に限定されないが、第１のタンパク質含有層の分散状態を崩し、水性媒体を含む層、ならびに、第１の高級アルコール及び脂肪酸を含む層に分離しやすいという点で、炭素数が１０以上の炭化水素が好ましい。特に、高融点の炭化水素を液化させるための熱によってタンパク質が変性することを避けるという点で、２５℃で液体である炭化水素が好ましい。２５℃で液体である炭化水素としては、具体的には、リモネン（炭素数１０）、スクアレン（炭素数３０）、スクアラン（炭素数３０）、流動パラフィン（炭素数２０以上）等が挙げられる。炭化水素は１種であってもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５４】
第２のタンパク質抽出剤中の第２の高級アルコール及び炭化水素の組み合わせとしては、第１のタンパク質含有層を少なくとも２層に分離しやすいという点でオクチルドデカノール及びリモネンが特に好ましい。
【００５５】
第２のタンパク質抽出剤中の第２の高級アルコールと炭化水素との比率は、タンパク質の量や性質に応じて適宜調整でき、例えば、質量比で第２の高級アルコール／炭化水素＝１／１〜２／３であってもよい。
【００５６】
第２のタンパク質抽出剤には、本発明の目的を害さない限り、公知の添加剤（界面活性剤、炭素数１８未満の高級アルコール等）を添加してもよい。添加剤の添加量は得ようとする効果等に応じて適宜設定できる。
【００５７】
（第２の抽出工程）
以下、第２のタンパク質抽出剤と第１のタンパク質含有層とを接触させる工程から、第１のタンパク質含有層を少なくとも２層に分離させる工程を「第２の抽出工程」と言う。第２の抽出工程における温度条件は、タンパク質やタンパク質抽出剤中の成分が変性等しない限り特に限定されないが、例えば、室温（例えば、２０〜２８℃）であってもよい。第２のタンパク質抽出剤に含まれる炭化水素として２５℃で液体である炭化水素が含まれる場合、炭化水素の液体状態を保持すると、第１のタンパク質含有層を好ましく分離できるため、第２の抽出工程における温度条件は、２４〜２６℃であることが好ましい。
【００５８】
第２のタンパク質抽出剤と第１のタンパク質含有層とを接触させる方法は、特に限定されないが、第２のタンパク質抽出剤及び第１のタンパク質含有層を混合及び撹拌等することで行える。第２のタンパク質抽出剤と第１のタンパク質含有層との混合比は特に限定されないが、質量比で、第２のタンパク質抽出剤／第１のタンパク質含有層＝１／１〜２／３であってもよい。第２のタンパク質抽出剤と第１のタンパク質含有層との混合方法は特に限定されず、公知の撹拌機や試験管の上下倒立等で混合できる。
【００５９】
第２のタンパク質抽出剤の使用方法としては、第１のタンパク質含有層に添加する前に第２のタンパク質抽出剤を構成する成分を予め混合してから添加してもよいが、第２の高級アルコール又は炭化水素のいずれか一方を先に第１のタンパク質含有層に添加した後に、さらに残りを順次混合してもよい。炭化水素によって、第１のタンパク質含有層の分散状態を崩し、第２の高級アルコールと結合したタンパク質を引き寄せるという本発明の効果が奏されやすい点で、炭化水素を第２の高級アルコールよりも先に添加することが好ましい。
【００６０】
少なくとも２層に分離した第１のタンパク質含有層において、タンパク質がいずれの層に存在するかは、界面検出センサー等によって特定される。通常、タンパク質は、少なくとも２層に分離したうちの下層に抽出される。また、タンパク質は、クロマトグラフィー、遠心分離等の方法を使用して、第２のタンパク質含有層から取り出し、抽出することができる。
【００６１】
上記の通り、本発明のタンパク質抽出剤によれば、抽出対象液からタンパク質以外の成分（水性溶媒、細胞膜等の夾雑物）の割合を減らして、タンパク質を簡便に抽出できる。本発明によって得られたタンパク質から、クロマトグラフィー等によって目的のタンパク質を精製することもできる。従って、本発明は、特定のタンパク質の単離や精製の前段階の処理として有用である。例えば、本発明は、細胞液（抽出対象液に相当する）等からの膜タンパク質の抽出等において有用である。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記の試験はいずれも室温（１９℃以上２５℃以下）で行った。
【００６３】
（実施例１：第１のタンパク質抽出剤による抽出−１）
本発明の第１のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、抽出対象液から抽出対象物（タンパク質）を抽出した。
【００６４】
１．抽出対象液の構成
豆乳（株式会社紀文食品製、豆乳中にはタンパク質（不溶性）が含まれる）  １ｍｌ
リン酸バッファ（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ」）  ９ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌した後、得られた溶液にクマシーブリリアントブルーＧ２５０を加え、タンパク質を青色に着色し、抽出対象液を得た。
【００６５】
２．第１のタンパク質抽出剤の調製
イソステアリルアルコール（高級アルコール工業株式会社、商品名「イソステアリルアルコール  ＥＸ」、第１の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
オレイン酸（東京化成工業株式会社、商品名「Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」、脂肪酸に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第１のタンパク質抽出剤を調製した。
【００６６】
３．第１の抽出工程
抽出対象液（６ｍｌ）に第１のタンパク質抽出剤（４ｍｌ）を添加した後、溶液を撹拌し、２０分間静置した。なお、以下、溶液の撹拌は試験管を約２０秒間、上下倒立させることで行った。
【００６７】
４．結果
第１の抽出工程の前後の結果を図１（Ａ）に示す。図１（Ａ）の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図１（Ａ）の右側は、第１の抽出工程後の試験管内の様子である。図１（Ａ）の右側に示される通り、溶液が２層にはっきりと分離しており、タンパク質が上層に抽出されていることがわかる。なお、下層の液体はほぼ透明だった。
【００６８】
図１（Ｂ）は、図１（Ａ）の右側の試験管中の上層における液体（以下、「実施例１の上層の液体」とも言う）を光学顕微鏡（４００倍）で観察した結果である。図１（Ｂ）に示される通り、タンパク質は脂肪酸から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層である水層に存在する。
【００６９】
（実施例２：第２のタンパク質抽出剤抽出−１）
本発明の第２のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、実施例１の上層の液体からタンパク質をさらに抽出した。
【００７０】
１．第２のタンパク質抽出剤の調製
オクチルドデカノール（高級アルコール工業株式会社、商品名「リソノール  ２０ＳＰ」、第２の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
リモネン（東京化成工業、商品名「（＋）−リモネン」、炭化水素に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第２のタンパク質抽出剤を調製した。
【００７１】
２．第２の抽出工程
実施例１の上層の液体に第２のタンパク質抽出剤を添加した後、溶液を撹拌し、１時間静置した。
【００７２】
３．結果
第２の抽出工程の前後の結果を図２（Ａ）に示す。図２（Ａ）の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図２（Ａ）の右側は、第２の抽出工程後の試験管内の様子である。図２（Ａ）の右側に示される通り、溶液が２層にはっきりと分離しており、タンパク質が下層に抽出されていることがわかる。
【００７３】
図２（Ｂ）は、図２（Ａ）の右側の試験管中の下層における液体を光学顕微鏡（４００倍）で観察した結果である。図２（Ｂ）に示される通り、タンパク質は炭化水素から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層である水層に存在する。
【００７４】
（実施例３：第１のタンパク質抽出剤による抽出−２）
本発明の第１のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、抽出対象液から抽出対象物（タンパク質）を抽出した。
【００７５】
１．抽出対象液の構成
実施例１の抽出対象液と同様である。
【００７６】
２．第１のタンパク質抽出剤の調製
イソステアリルアルコール（高級アルコール工業株式会社、商品名「イソステアリルアルコール  ＥＸ」、第１の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
イソステアリン酸（高級アルコール工業株式会社、商品名「イソステアリン酸  ＥＸ」、脂肪酸に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第１のタンパク質抽出剤を調製した。
【００７７】
３．第１の抽出工程
実施例１と同様である。
【００７８】
４．結果
第１の抽出工程の前後の結果を図３に示す。図３の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図３の右側は、第１の抽出工程後の試験管内の様子である。図３の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が上層に抽出されていることがわかる。なお、下層の液体はほぼ透明だった。
【００７９】
図３の右側の試験管中の上層における液体（以下、「実施例３の上層の液体」とも言う）を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は脂肪酸から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【００８０】
（実施例４：第２のタンパク質抽出剤による抽出−２）
本発明の第２のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、実施例３の上層の液体からタンパク質をさらに抽出した。
【００８１】
１．第２のタンパク質抽出剤の調製
実施例２と同様である。
【００８２】
２．第２の抽出工程
実施例３の上層の液体に第２のタンパク質抽出剤を添加した後、溶液を撹拌し、１時間静置した。
【００８３】
３．結果
第２の抽出工程の前後の結果を図４に示す。図４の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図４の右側は、第２の抽出工程後の試験管内の様子である。図４の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が下層に抽出されていることがわかる。
【００８４】
図４の右側の試験管中の下層における液体を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は炭化水素から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【００８５】
（実施例５：第１のタンパク質抽出剤による抽出−３）
本発明の第１のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、抽出対象液から抽出対象物（タンパク質）を抽出した。
【００８６】
１．抽出対象液の構成
実施例１の抽出対象液と同様である。
【００８７】
２．第１のタンパク質抽出剤の調製
オレイルアルコール（東京化成工業株式会社、商品名「Ｏｌｅｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ」、第１の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
イソステアリン酸（高級アルコール工業株式会社、商品名「イソステアリン酸  ＥＸ」、脂肪酸に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第１のタンパク質抽出剤を調製した。
【００８８】
３．第１の抽出工程
実施例１と同様である。
【００８９】
４．結果
第１の抽出工程の前後の結果を図５に示す。図５の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図５の右側は、第１の抽出工程後の試験管内の様子である。図５の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が上層に抽出されていることがわかる。なお、下層の液体はほぼ透明だった。
【００９０】
図５の右側の試験管中の上層における液体（以下、「実施例５の上層の液体」とも言う）を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は脂肪酸から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【００９１】
（実施例６：第２のタンパク質抽出剤による抽出−３）
本発明の第２のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、実施例５の上層の液体からタンパク質をさらに抽出した。
【００９２】
１．第２のタンパク質抽出剤の調製
オクチルドデカノール（高級アルコール工業株式会社、商品名「リソノール  ２０ＳＰ」、第２の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
スクアレン（和光純薬工業、商品名「Ｓｑｕａｌｅｎｅ」、炭化水素に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第２のタンパク質抽出剤を調製した。
【００９３】
２．第２の抽出工程
実施例５の上層の液体に第２のタンパク質抽出剤を添加した後、溶液を撹拌し、１時間静置した。
【００９４】
３．結果
第２の抽出工程の前後の結果を図６に示す。図６の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図６の右側は、第２の抽出工程後の試験管内の様子である。図６の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が下層に抽出されていることがわかる。
【００９５】
図６の右側の試験管中の下層における液体を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は炭化水素から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【００９６】
（実施例７：第２のタンパク質抽出剤による抽出−４）
本発明の第２のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、実施例１の上層の液体からタンパク質をさらに抽出した。
【００９７】
１．第２のタンパク質抽出剤の調製
オクチルドデカノール（高級アルコール工業株式会社、商品名「リソノール  ２０ＳＰ」、第２の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
スクアレン（和光純薬工業、商品名「Ｓｑｕａｌｅｎｅ」、炭化水素に相当する）  ２ｍｌ
【００９８】
２．第２の抽出工程
実施例１の上層の液体に第２のタンパク質抽出剤を添加した後、溶液を撹拌し、１時間静置した。
【００９９】
３．結果
第２の抽出工程の前後の結果を図７に示す。図７の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図７の右側は、第２の抽出工程後の試験管内の様子である。図７の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が下層に抽出されていることがわかる。
【０１００】
図７の右側の試験管中の下層における液体を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は炭化水素から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【０１０１】
（実施例８：第２のタンパク質抽出剤による抽出−５）
本発明の第２のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、実施例１の上層の液体からタンパク質をさらに抽出した。
【０１０２】
１．第２のタンパク質抽出剤の調製
オクチルドデカノール（高級アルコール工業株式会社、商品名「リソノール  ２０ＳＰ」、第２の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
流動パラフィン（和光純薬工業、商品名「流動パラフィン」、炭化水素に相当する）  ２ｍｌ
【０１０３】
２．第２の抽出工程
実施例１の上層の液体に第２のタンパク質抽出剤を添加した後、溶液を撹拌し、１時間静置した。
【０１０４】
３．結果
第２の抽出工程の前後の結果を図８に示す。図８の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図８の右側は、第２の抽出工程後の試験管内の様子である。図８の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が下層に抽出されていることがわかる。
【０１０５】
図８の右側の試験管中の下層における液体を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は炭化水素から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【０１０６】
（実施例９：第１のタンパク質抽出剤による抽出−４）
本発明の第１のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、抽出対象液から抽出対象物（タンパク質）を抽出した。
【０１０７】
１．抽出対象液の構成
実施例１の抽出対象液と同様である。
【０１０８】
２．第１のタンパク質抽出剤の調製
オレイルアルコール（東京化成工業株式会社、商品名「Ｏｌｅｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ」、第１の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
オレイン酸（東京化成工業株式会社、商品名「Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」、脂肪酸に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第１のタンパク質抽出剤を調製した。
【０１０９】
３．第１の抽出工程
実施例１と同様である。
【０１１０】
４．結果
第１の抽出工程の前後の結果を図９に示す。図９の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図９の右側は、第１の抽出工程後の試験管内の様子である。図９の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が上層に抽出されていることがわかる。なお、下層の液体はほぼ透明だった。
【０１１１】
図９の右側の試験管中の上層における液体（以下、「実施例９の上層の液体」とも言う）を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は脂肪酸から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【０１１２】
（実施例１０：第２のタンパク質抽出剤による抽出−６）
本発明の第２のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、実施例９の上層の液体からタンパク質をさらに抽出した。
【０１１３】
１．第２のタンパク質抽出剤の調製
オクチルドデカノール（高級アルコール工業株式会社、商品名「リソノール  ２０ＳＰ」、第２の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
スクアラン（和光純薬工業、商品名「スクアラン」、炭化水素に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第２のタンパク質抽出剤を調製した。
【０１１４】
２．第２の抽出工程
実施例９の上層の液体に第２のタンパク質抽出剤を添加した後、溶液を撹拌し、１時間静置した。
【０１１５】
３．結果
第２の抽出工程の前後の結果を図１０に示す。図１０の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図１０の右側は、第２の抽出工程後の試験管内の様子である。図１０の右側に示される通り、溶液が２層に分離しており、タンパク質が下層に抽出されていることがわかる。
【０１１６】
図１０の右側の試験管中の下層における液体を光学顕微鏡（４００倍）で観察したところ、タンパク質は炭化水素から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層の水層に存在していた。
【０１１７】
（実施例１１：第１のタンパク質抽出剤による抽出−５）
本発明の第１のタンパク質抽出剤を使用して、以下の通り、抽出対象液から抽出対象物（タンパク質）を抽出した。
【０１１８】
１．抽出対象液の構成
卵白（タンパク質（水溶性）に相当する）  １ｍｌ
リン酸バッファ（ＳＩＧＭＡ社製、商品名「Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ」）  １０ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌した後、得られた溶液にクマシーブリリアントブルーＧ２５０を加え、タンパク質を青色に着色し、抽出対象液を得た。
【０１１９】
２．第１のタンパク質抽出剤の調製
下記の２種類の抽出剤を調製した。
［第１のタンパク質抽出剤−１］
イソステアリルアルコール（高級アルコール工業株式会社、商品名「イソステアリルアルコール  ＥＸ」、第１の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
オレイン酸（東京化成工業株式会社、商品名「Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」、脂肪酸に相当する）  ２ｍｌ
［第１のタンパク質抽出剤−２］
オレイルアルコール（東京化成工業株式会社、商品名「Ｏｌｅｙｌ  Ａｌｃｏｈｏｌ」、第１の高級アルコールに相当する）  ２ｍｌ
オレイン酸（東京化成工業株式会社、商品名「Ｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ」、脂肪酸に相当する）  ２ｍｌ
上記を試験管内で混合及び撹拌して第１のタンパク質抽出剤を調製した。
【０１２０】
３．第１の抽出工程
抽出対象液（６ｍｌ）に２種類のうちいずれかの第１のタンパク質抽出剤（４ｍｌ）を添加した後、溶液を撹拌し、２０分間静置した。
【０１２１】
４．結果
第１の抽出工程の前後の結果を図１１（Ａ）に示す。図１１（Ａ）の左側は、第１のタンパク質抽出剤を添加していない（つまり第１の抽出工程前の）抽出対象液を含む試験管内の様子である。図１１（Ａ）の中央（［第１のタンパク質抽出剤−１］を使用した結果）及び右側（［第１のタンパク質抽出剤−２］を使用した結果）は、第１の抽出工程後の試験管内の様子である。図１１（Ａ）の中央及び右側に示される通り、溶液が２層にはっきりと分離しており、タンパク質が上層に抽出されていることがわかる。なお、下層の液体は、いずれもほぼ透明だった。
【０１２２】
図１１（Ｂ）は、図１１（Ａ）の右側の試験管中の上層における液体を光学顕微鏡（４００倍）で観察した結果である。図１１（Ｂ）に示される通り、タンパク質は脂肪酸から構成される液滴の内部に取り込まれず、連続層である水層に存在する。
【０１２３】
（実施例のまとめ）
上記の実施例の結果をまとめ、表１及び２に示した。なお、表中の「結果」における記号の意味は下記の通りである。
◎：タンパク質が非常に良好に分離された
○：タンパク質が良好に分離された
△：タンパク質が分離された
【０１２４】
【表１】
0005388259.tif 000004
【０１２５】
【表２】
0005388259.tif 000005
【０１２６】
上記の通り、本発明のタンパク質抽出剤によれば、タンパク質が良好に分離されることがわかる。特に、第１のタンパク質抽出剤中の第１の高級アルコール及び脂肪酸として、イソステアリルアルコール又はオレイルアルコールと、オレイン酸とを組み合わせるとタンパク質が良好に分離された。さらに、第２のタンパク質抽出剤中の第２の高級アルコール及び炭化水素として、オクチルドデカノールとリモネンとを組み合わせるとタンパク質がさらに良好に分離された。
【要約】
【課題】タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からタンパク質を簡便に分離できるタンパク質を抽出する混合液を提供すること。
【解決手段】本発明は、炭素数１５以上の高級アルコールである第１の高級アルコールと、脂肪酸と、を少なくとも含み、タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からタンパク質を抽出する混合液を提供する。また、本発明は、水性溶媒及びタンパク質を含む抽出対象液と、炭素数１５以上の高級アルコールである第１の高級アルコール及び脂肪酸と、を接触させ、上層にタンパク質を抽出させる第１の抽出工程を含む、タンパク質と水性溶媒とを含む抽出対象液からのタンパク質の抽出方法を提供する。
【選択図】図１【図１Ａ】
0005388259.tif 000006
【図１Ｂ】
0005388259.tif 000007
【図２Ａ】
0005388259.tif 000008
【図２Ｂ】
0005388259.tif 000009
【図３】
0005388259.tif 000010
【図４】
0005388259.tif 000011
【図５】
0005388259.tif 000012
【図６】
0005388259.tif 000013
【図７】
0005388259.tif 000014
【図８】
0005388259.tif 000015
【図９】
0005388259.tif 000016
【図１０】
0005388259.tif 000017
【図１１Ａ】
0005388259.tif 000018
【図１１Ｂ】
0005388259.tif 000019