(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外に摘出された非ヒト哺乳動物メタネフロンからなる人工腎臓前駆体であって、該メタネフロンが生体外において凍結及び融解の処理を施されたものであり、且つ生体外にて移入された哺乳動物の間葉系幹細胞を含む、人工腎臓前駆体。
【請求項２】
該メタネフロンが、ＭＨＣの表出が未だ未熟な段階にある哺乳動物胎仔のメタネフロンである、請求項１記載の人工腎臓前駆体。
【請求項３】
哺乳動物の大網に移植されると、エリスロポエチン産生能を獲得し得る、請求項１記載の人工腎臓前駆体。
【請求項４】
以下の工程を含む、人工腎臓前駆体の製造方法：
（Ｉ）生体外に摘出された哺乳動物メタネフロンを凍結すること；
（ＩＩ）凍結された哺乳動物メタネフロンを融解すること；及び
（ＩＩＩ）（Ｉ）の凍結の前又は（ＩＩ）の融解の後に、哺乳動物の間葉系幹細胞を生体外にてメタネフロン内へ移入すること。
【請求項５】
（Ｉ）で用いられるメタネフロンが、ＭＨＣの表出が未だ未熟な段階にある哺乳動物胎仔から生体外に摘出されたメタネフロンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
人工腎臓前駆体が、哺乳動物の大網に移植されると、エリスロポエチン産生能を獲得し得る、請求項４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工腎臓前駆体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓はエリスロポエチンの主要な産生臓器であり、腎不全に伴うエリスロポエチン産生低下により腎性貧血の合併症が生じる。【０００３】
近年、この腎性貧血の次世代の治療方法として、再生医療技術によりエリスロポエチン産生能を有する人工腎臓やその前駆体を製造し、これを腎性貧血患者に移植する方法が提案されている。例えば、特許文献１には、分取した哺乳動物由来の間葉系幹細胞を妊娠哺乳動物宿主中の胎児又は妊娠哺乳動物宿主から分離した胎児に移植して該間葉系幹細胞の分化を誘導することによるエリスロポエチン産生オルガノイド（人工腎臓）前駆体の製造方法にあたり、該間葉系幹細胞の移植部位が胎児における腎形成部位であり、移植時期が宿主免疫系が未だ免疫寛容の段階であることを特徴とするエリスロポエチン産生オルガノイド前駆体の製造方法が開示されている。【０００４】
しかし、この方法では、人工腎臓前駆体を患者へ移植する直前に、妊娠哺乳動物の羊水を採取し、該前駆体の生物学的安全性を確認する必要があるため、その操作が煩雑であるという問題点がある。また、間葉系幹細胞を胎児内の将来腎臓となり得る適切な部位に注入しなければならず、この操作に熟練を要する。また、宿主免疫系が免疫寛容にある段階を見計らって間葉系幹細胞を胎児へ注入しなければならないので、治療全体のスケジュールの柔軟性に乏しい。この方法では、全胚培養を行わなければ、機能的な人工腎臓前駆体を得られ難いところ、培養によりコンタミネーションのリスクが生じ、培養後の煩雑な精製操作が必要となる。【０００５】
そこで、１）患者への移植前における、人工腎臓前駆体の生物学的安全性を容易に検査することができ、２）操作が簡易であり、３）治療全体のスケジュールの柔軟性を確保可能であり、且つ４）培養操作の不要な、人工腎臓前駆体の製造方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／００４５９８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、１）患者への移植前における、人工腎臓前駆体の生物学的安全性を容易に検査することができ、２）操作が簡易であり、３）治療全体のスケジュールの柔軟性を確保可能であり、且つ４）培養操作の不要な、人工腎臓前駆体の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、胎児から摘出されたメタネフロンを凍結・融解し、融解されたメタネフロン中に、患者由来の間葉系幹細胞を移入することにより得られる人工腎臓前駆体を用いることにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］生体外に摘出された非ヒト哺乳動物メタネフロンからなる人工腎臓前駆体であって、該メタネフロンが生体外において凍結及び融解の処理を施されたものであり、且つ生体外にて移入された哺乳動物の間葉系幹細胞を含む、人工腎臓前駆体。
［２］該メタネフロンが、ＭＨＣの表出が未だ未熟な段階にある哺乳動物胎仔のメタネフロンである、［１］記載の人工腎臓前駆体。
［３］哺乳動物の大網に移植されると、エリスロポエチン産生能を獲得し得る、［１］記載の人工腎臓前駆体。
［４］以下の工程を含む、人工腎臓前駆体の製造方法：
（Ｉ）生体外に摘出された哺乳動物メタネフロンを凍結すること；
（ＩＩ）凍結された哺乳動物メタネフロンを融解すること；及び
（ＩＩＩ）（Ｉ）の凍結の前又は（ＩＩ）の融解の後に、哺乳動物の間葉系幹細胞を生体外にてメタネフロン内へ移入すること。
［５］（Ｉ）で用いられるメタネフロンが、ＭＨＣの表出が未だ未熟な段階にある哺乳動物胎仔から生体外に摘出されたメタネフロンである、［４］記載の方法。
［６］人工腎臓前駆体が、哺乳動物の大網に移植されると、エリスロポエチン産生能を獲得し得る、［４］記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法を用いれば、移植前に人工腎臓前駆体の生物学的安全性を容易に検査することができる。また本発明の方法を用いれば、簡易な操作で人工腎臓前駆体を製造することが可能である。また、本発明の方法を用いれば、凍結保存したメタネフロンを使用することにより、所望のタイミングで人工腎臓の前駆体を製造することができるので、治療全体のスケジュールを柔軟に設計することが出来る。更に、本発明の方法は培養操作を実質的に要しないので、コンタミネーションのリスクがなく、培養後の煩雑な精製操作が不要である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、生体外に摘出された哺乳動物メタネフロンからなる人工腎臓前駆体であって、該メタネフロンが生体外において凍結及び融解の処理を施されたものであり、且つ生体外にて移入された哺乳動物の間葉系幹細胞を含む、人工腎臓前駆体を提供するものである。
【００１２】
本発明において、「人工腎臓」とは、単一の細胞ではなく、細胞組織体であって、腎臓が本来有する機能であるエリスロポエチン産生能を有するものをいう。本発明における「人工腎臓」は、血液中の老廃物や水分を濾過し、尿を排出する機能を有していなくてもよい。人工腎臓は、その表面を除いて、各細胞が相互に三次元的に接触しており、隣接する細胞同士が様々な細胞間結合を介して情報交換をし、単にエリスロポエチンを産生するのみならず、エリスロポエチン産生調整能を有し得る。
【００１３】
「前駆体」とは、生体内におかれることにより人工腎臓へと変換される組織をいう。「前駆体」は、エリスロポエチン産生能及び産生調整能に必要な因子を有するが、環境的要因により、エリスロポエチン産生能及び産生調整能を発揮しない状態にある。人工腎臓前駆体は、哺乳動物の大網に移植されると、エリスロポエチン産生能を獲得し得る。
【００１４】
「エリスロポエチン産生調整能」とは、レシピエント（患者）の体内でエリスロポエチンが正常な状態と比較して多く必要な時（貧血時等）には、エリスロポエチンを多量（貧血を改善するのに必要な量）に産出し、レシピエント（患者）が正常な状態の時（貧血が改善された時等）には、体内の正常な状態を保つために必要な量のエリスロポエチンを産生し得る能力を意味する。即ち、本発明に係る人工腎臓は、従来のエリスロポエチン産生細胞と比較し、レシピエント（患者）に必要な量のエリスロポエチンを産生することができる点、及び大網中の血管から必要な栄養を取り込むことにより長期間継続してエリスロポエチンを産生することが出来る点で優れている。
【００１５】
本発明において、「メタネフロン」とは、哺乳動物の胎仔における腎臓発生相当部位をいう。本発明において使用されるメタネフロンは、腎臓の芽細胞が発達開始前の萌芽状態にあることが好ましい。メタネフロンは、哺乳動物胎仔の尿管芽発芽部位の周囲、より詳しくは体節と側板の間に位置する。メタネフロンは、好ましくは、後腎形成中胚葉である。
【００１６】
メタネフロンが由来する哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は好ましくはラット又はブタである。
【００１７】
メタネフロンは哺乳動物の胎仔から生体外に摘出される。該胎仔としては、ＭＨＣ（主要組織適合抗原複合体）の表出が未だ未熟なものが好適に用いられる。この時期のメタネフロンを使用することにより、レシピエントに人工腎臓前駆体を移植した際の免疫反応を回避することができる。胎仔が霊長類以外の哺乳動物の場合は、異種抗原（アルファー・ガル等の糖鎖抗原）が出るまでの期間に摘出するのが好ましい。例えば、ラットを用いた実験では、通常Ｅ（ステージ胚日）９〜１６、好ましくはＥ１０〜１５、より好ましくはＥ１１〜１４の胎仔が用いられる。その他の哺乳動物においても、同様のステージの胎仔が好適に使用できる。しかし、その前後のステージも、条件を選定することによって適用可能である。胎仔からのメタネフロンの摘出は、実体顕微鏡等を用いて、行うことが可能である。
【００１８】
メタネフロンの凍結処理は、哺乳動物の組織や細胞を凍結する際に通常用いられる凍結保存液中で行われる。該凍結保存液は、通常ＤＭＳＯ、グリセリン等の凍結保護剤を含む。凍結保護剤の濃度は通常５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％の範囲内である。該保存剤は、血清を含んでいてもよい。血清の濃度は通常５〜５０重量％、好ましくは１０〜３０重量％である。好ましい凍結保存液としては、ＤＭＳＯ及びＦＣＳを含有するＥＴ−ＫＹＯＴＯ液、セルバンカー（登録商標）等を挙げることが出来る。
【００１９】
メタネフロンを凍結することにより、レシピエント（患者）に人工腎臓前駆体を移植した際の免疫反応を抑制することが出来る。
【００２０】
凍結したメタネフロンは、凍結した状態で半永久的に保存することが可能であって、必要に応じて融解・起眠して使用することができる。凍結保存時の温度は通常−８０〜−２００℃、好ましくは−１９６℃（液体窒素中）である。メタネフロンの凍結保存により、所望のタイミングで人工腎臓前駆体を製造することができるので、治療全体のスケジュールを柔軟に設計することが出来る。
【００２１】
凍結したメタネフロンは、常法に従って生理的な培養液中で融解処理に付す。融解の方法も特に限定されないが、例えば、３７℃の恒温槽中に凍結チューブを浮かべ、凍結したメタネフロンへ生理的な培養液を滴下することにより融解する。凍結保存液の混入を除去するため、好適には、融解したメタネフロンを生理的な培養液で洗浄する。
【００２２】
本発明の人工腎臓前駆体に使用されるメタネフロンは、生体外にて移入された哺乳動物の間葉系幹細胞を含む。
【００２３】
「間葉系幹細胞」とは、未分化の状態で増殖し、骨芽細胞、軟骨芽細胞及び脂肪芽細胞等の全て又はいくつかへの分化が可能な幹細胞又はその前駆細胞の集団を広義に意味する。本発明において使用される間葉系幹細胞は腎臓のエリスロポエチン産生細胞への分化能を有する。
【００２４】
間葉系幹細胞が由来する哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は好ましくはラット又はヒトである。
【００２５】
間葉系幹細胞が由来する哺乳動物は、好ましくは本発明の人工腎臓前駆体の移植が意図されるレシピエントと同一の動物種である。最も好ましくは、レシピエント本人の間葉系幹細胞が用いられる。
【００２６】
間葉系幹細胞は、哺乳動物の骨髄液、末梢血、臍帯血等から公知の一般的な方法で採取することが出来る。例えば、骨髄穿刺後の造血幹細胞等の培養、継代によりヒト間葉系幹細胞を単離することができる（Journal of Autoimmunity, 30 (2008) 163-171）。
【００２７】
生体から単離された間葉系幹細胞は、適切な培地中で接着培養することにより、その分化能を維持しながらインビトロで増幅することもできる。このようにインビトロで増幅された間葉系幹細胞も本発明の範囲内である。培地としては、例えばDMEM、EMEM、RPMI-1640、F-12、α-MEM、MSC growing medium (Bio Whittaker)等が用いられる。培養温度は通常約30〜40℃の範囲であり、好ましくは約37℃である。CO2濃度は通常約1〜10％の範囲であり、好ましくは約5％である。湿度は通常約70〜100％の範囲であり、好ましくは約95〜100％である。高い分化能を維持するため、培養は２〜５継代以上はしないことが好ましい。
【００２８】
メタネフロン内への間葉系幹細胞の移入は、メタネフロンの凍結前又は融解後に行われる。例えば、実体顕微鏡下でマイクロピペット等を使用して、間葉系幹細胞をメタネフロン内へ注入する。移入する細胞の数はメタネフロンの大きさ等に基づき適宜設定されるが、１個のラットメタネフロンにつき、通常約104〜106個（例えば、5×104個）程度の間葉系幹細胞を注入する。
【００２９】
移入に際しては、生理的な培養液に懸濁された間葉系幹細胞を用いてもよいが、凍結保存後の穿刺時における細胞内液の漏出防止の観点から、細胞外マトリクス成分（ラミニン、コラーゲンタイプＩＶ、エンタクチン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、マトリゲル（登録商標）等）を含むゲル中に封入された間葉系幹細胞が好適に用いられる。
【００３０】
本発明の人工腎臓前駆体の大きさは、エリスロポエチン産生器官である腎臓と近似の大きさである必要はなく、腎臓全体の１／５０〜１／１０の大きさで十分である。
【００３１】
本発明の人工腎臓前駆体は、以下の操作を行うことにより製造することが出来る：
（Ｉ）生体外に摘出された哺乳動物メタネフロンを凍結すること；
（ＩＩ）凍結された哺乳動物メタネフロンを融解すること；及び
（ＩＩＩ）（Ｉ）の凍結の前又は（ＩＩ）の融解の後に、哺乳動物の間葉系幹細胞を生体外にてメタネフロン内へ移入すること。
【００３２】
各用語の定義及び操作の詳細は上述の通りである。
【００３３】
上記操作により得られた本発明の人工腎臓前駆体を、器官培養に付してもよいが、コンタミネーションのリスクがなく、培養後の煩雑な精製操作が不要であることから、器官培養は行わない方が好ましい。本発明の人工腎臓前駆体は、このような器官培養の操作を行わなくても、哺乳動物内に移植された場合に、十分なエリスロポエチン産生能及び産生調整能を獲得し得る点で優れている。尚、器官培養は、人工腎臓前駆体をフィルター上におき、その下のディッシュに適切な培地を加え、ディッシュをインキュベーター内に静置することにより行うことができる。
【００３４】
本発明の人工腎臓前駆体をレシピエント哺乳動物の生体内に移植すると、該前駆体はレシピエントの体内に生着し、該前駆体内に含まれる間葉系幹細胞が増殖し、腎臓のエリスロポエチン産生細胞へと分化する。この結果、人工腎臓前駆体がエリスロポエチン産生能及び産生調整能を有する人工腎臓へと分化し、血管から必要な栄養を取り込むことにより、長期間継続して生体内にてエリスロポエチンを産生し得る。従って、本発明の人工腎臓前駆体は、エリスロポエチン関連疾患の治療用として有用である。本発明の人工腎臓前駆体を哺乳動物に移植することにより、該哺乳動物におけるエリスロポエチン関連疾患を治療し得る。
【００３５】
本発明において、「エリスロポエチン関連疾患」とは、腎不全、糖尿病、潰瘍、癌、感染、透析、手術および化学療法に関連した貧血を含む、エリスロポエチン産生量の低下に関連する疾患である。特に、慢性腎不全による貧血の場合は、進行性の腎実質及び肝機能破壊のためエリスロポエチンが産生され得ず、循環中のエリスロポエチン濃度が増加しないので大きな問題となっている。
【００３６】
レシピエント哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。レシピエント哺乳動物は好ましくはラット又はヒトである。
【００３７】
本発明の人工腎臓前駆体を哺乳動物に移植する方法は、該前駆体がレシピエントの体内に生着し、該前駆体がエリスロポエチン産生能及び産生調整能を獲得し得る限り特に限定されないが、好ましくは本発明の人工腎臓前駆体は、レシピエント哺乳動物の大網に移植される。大網への移植は通常の外科的処方により行うことができるが、例えば、鋭利な鑷子で移植する組織をつまみ、鑷子の先で大網の脂肪組織の表面にわずかに切り口を作り、その中に組織を埋め込む方法を挙げることが出来る。また、内視鏡を利用して大網に移植することが出来る。
【００３８】
本発明の人工腎臓前駆体の投与量は、投与対象、対象疾患、症状などにより差異はあるが、通常、成人の腎性貧血患者（体重６０ｋｇとして）にブタのメタネフロンから製造された人工腎臓前駆体を移植する場合、１回の手術において１０個程度のメタネフロンを移植し患者の貧血の程度を見ながら必要があれば段階的に移植する個数を増やすのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を移植することができる。
【００３９】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４０】
妊娠１４日目ラット胎児からメタネフロンを摘出後、ET-Kyoto + 10% DMSO + 20% FCS中で凍結保存した。直径は２ｍｍ程度であった。
２日間凍結保存後、凍結メタネフロンを融解した。ラット間葉系幹細胞はマトリゲルで包み、１つのメタネフロンに１×１０４個を打ち込んだ。その後、同系ラットの大網へメタネフロンを移植した。
移植から７日後、メタネフロンを移植したラットから成長したメタネフロンを摘出した。移植個体は２匹で、それぞれ成長したメタネフロンは７個中３個、６個であった。メタネフロンは直径６〜８ｍｍに成長した。発育した人工腎臓前駆体からTransplantation VOL85,No11,June 15 2008と同様の方法、即ちエリスロポエチン産生細胞の免疫染色及び遺伝子解析によってエリスロポエチン産生を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明の方法を用いれば、移植前に人工腎臓前駆体の生物学的安全性を容易に検査することができる。また本発明の方法を用いれば、簡易な操作で人工腎臓前駆体を製造することが可能である。また、本発明の方法を用いれば、凍結保存したメタネフロンを使用することにより、所望のタイミングで人工腎臓の前駆体を製造することができるので、治療全体のスケジュールを柔軟に設計することが出来る。更に、本発明の方法は培養操作を実質的に要しないので、コンタミネーションのリスクがなく、培養後の煩雑な精製操作が不要である。
本出願は日本で出願された特願２００８−１７３９３５（出願日：２００８年７月２日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。