(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親インスリン分子のB鎖のN-末端アミノ酸残基のα-アミノ基またはB鎖内に存在するLys残基のε-アミノ基のいずれかにアミド結合を介して結合した側鎖を有するインスリン誘導体であって、前記側鎖は、
ａ）-NH2および-COOHから選択される基を各末端に独立して含む単分散の二官能性PEG基と；
ｂ）4〜22炭素原子を含む脂肪二酸基と；
ｃ）少なくとも１つのγ−グルタミル基と
を含むインスリン誘導体。
【請求項２】
前記単分散の二官能性PEG基が、2〜20残基のエチレングリコールを有する請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
前記単分散の二官能性PEG基が、2〜10残基のエチレングリコールを有する請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
前記単分散の二官能性PEG基が、2〜5残基のエチレングリコールを有する請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項５】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に4〜22の炭素原子を含む請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に6〜22の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に8〜20の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に8〜18の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に4〜18の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項１０】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に6〜18の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項１１】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に8〜16の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項１２】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に8〜22の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項１３】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に8〜17の炭素原子を含む請求項５に記載のインスリン誘導体。
【請求項１４】
前記脂肪二酸が、炭素鎖中に8〜15の炭素原子を含む請求項８に記載のインスリン誘導体。
【請求項１５】
親インスリンのB鎖内のLys残基が、位置B3または位置B23〜30のいずれか一つに存在する請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項１６】
以下の式で表わされる請求項１に記載のインスリン誘導体：
【化１】
0005410020.tif 000073
式中、Insは親インスリン部分であり、インスリン基のB鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基またはB鎖内に存在するLys残基のε-アミノ基が、側鎖内のCO基とアミド結合を介して結合する；
各nは、各々独立して0、1、2、3、4、5または6である； 
Q1、Q2、Q3およびQ4は互いに独立して、
・(CH2CH2O)s-; (CH2CH2CH2O)s-; (CH2CH2CH2CH2O)s-; (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s-または(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s-    式中、sは1〜20である；
・-(CH2)r-    式中、rは4〜22の整数であり；または1、2または3つの-CH=CH-基を含む二価の炭化水素鎖および4〜22の範囲内で鎖内に全ての数の炭素原子を与えるために十分な多数の-CH2-基である；
・-(CH2)t-または-(CH2OCH2)t-    式中、tは1〜6の整数である；
・-(CR1R2)q-、    式中、R1およびR2は互いに独立してH、-COOH、(CH2)1-6COOHであり得、R1およびR2は各炭素で異なり得、かつqは1〜6である；
・-((CR3R4)q1)1 -(NHCO-(CR3R4)q1-NHCO)1-2 -((CR3R4)q1)1 または-((CR3R4)q1)1 -(CONH-(CR3R4)q1-CONH)1-2 -((CR3R4)q1-)-、-((CR3R4)q1)1 -(NHCO-(CR3R4)q1-CONH)1-2 -((CR3R4)q1)1 または -((CR3R4)q1)1 -(CONH-(CR3R4)q1-NHCO)1-2 -((CR3R4)q1)1    式中、R3およびR4は互いに独立してH、-COOHであり得、かつR3およびR4は各炭素で異なり得、かつq1は1〜6である；  または
・結合；
であり得る（但し、Q1〜Q4は異なる）；
X1、X2およびX3は独立して、
・O；
・結合；  または
【化２】
0005410020.tif 000074
である
式中、Rは水素または-(CH2)p-COOH, -(CH2)p-SO3H, -(CH2)p-PO3H2, -(CH2)p-O-SO3H; -(CH2)p-O-PO3H2;または-(CH2)p-テトラゾール-5-イルである、  各ｐは互いに独立して1〜6の範囲内の整数である；  ならびに
Zは、
-COOH;
-CO-Asp;
-CO-Glu;
-CO-Gly;
-CO-Sar;
-CH(COOH)2;
-N(CH2COOH)2;
-SO3H
-OSO3H
-OPO3H2
-PO3H2  または
-テトラゾール-5-イル 
およびこれらの任意のZn2+複合体
である。
【請求項１７】
前記ｓが、２〜１２の範囲内にある請求項１６に記載のインスリン誘導体。
【請求項１８】
前記ｓが、２〜４の範囲内にある請求項１６に記載のインスリン誘導体。
【請求項１９】
前記ｓが、２〜３の範囲内にある請求項１６に記載のインスリン誘導体。
【請求項２０】
前記ｓが１である請求項１６に記載のインスリン誘導体。
【請求項２１】
前記Ｚが、-COOHである請求項１６に記載のインスリン誘導体。
【請求項２２】
前記親インスリンが、desB30ヒトインスリン類似体である請求項１〜２１のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項２３】
前記親インスリンが、ヒトインスリン； desB1ヒトインスリン； desB30ヒトインスリン； GlyA21ヒトインスリン； GlyA21 desB30ヒトインスリン； AspB28ヒトインスリン； ブタインスリン； LysB28 ProB29ヒトインスリン； GlyA21 ArgB31 ArgB32ヒトインスリン；およびLysB3 GluB29ヒトインスリンおよびAspB28 desB30ヒトインスリンからなる群から選択される請求項１〜２２のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項２４】
NεB29-(3-[2-{2-(2-[ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルタミル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピノイル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-[2-{2-(2-[ω-カルボキシ-ヘプタデカノイル-γ -グルタミル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピノイル) desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリン、NεB29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-ヘプタデカノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(9-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(9-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}-プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(2-[3-(2-(2-{2-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ}エトキシ)-エチルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]エトキシ}-エトキシ)エトキシ]エトキシ}-プロピオノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[ω -カルボキシペンタデカノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]-エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシプロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシプロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-ガンマ-γ-D-グルタミル）desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシエトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(9-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミル}desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリン、およびNεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリンからなる群から選択された、請求項１に記載のインスリン誘導体。
【請求項２５】
薬学的に許容可能なキャリアと一緒の請求項１に記載の治療学的有効量のインスリン誘導体を含む、このような治療を必要とする患者の糖尿病の治療のための薬学的組成物。
【請求項２６】
薬学的に許容可能なキャリアと一緒に、即効作用を示すインスリンまたはインスリン類似体と混合された請求項１に記載の治療学的有効量のインスリン誘導体を含む、このような治療を必要とする患者の糖尿病の治療のための薬学的組成物。
【請求項２７】
肺投与を目的とした請求項２５または２６に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、生理学的pH値で可溶性であり、かつ作用の延長されたプロファイルを有する新規なヒトインスリン誘導体に関する。本発明はまた、このような誘導体を提供する方法、これらを含む薬学的組成物、本発明のインスリン誘導体を使用して糖尿病および高血糖を治療する方法、および糖尿病および高血糖の治療におけるこのようなインスリン誘導体の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
現在、１型糖尿病および２型糖尿病の治療は、いわゆる集中的なインスリン治療に強く依存している。この措置によれば、患者は、食事と関連したインスリン要求をを補うための速効性のインスリンのボーラス注入によって補充された基礎的インスリン要求を補うために、長期作用のインスリンの毎日1または2回の複数毎のインスリン注入で治療を受ける。
【０００３】
長期作用のインスリン組成物は、当業者に周知である。従って、長期作用のインスリン組成物の一つの主要なタイプには、インスリン結晶またはアモルファスインスリンの注入可能な水性懸濁液が含まれる。これらの組成物において、典型的に利用されるインスリン化合物は、プロタミン インスリン、亜鉛インスリンまたはプロタミン亜鉛インスリンである。
【０００４】
ある短所は、インスリン懸濁液の使用と関連している。従って、正確な投与を確保するために、懸濁液の定義された容積をバイアルから取り出すかまたはカートリッジから引き抜く前に、インスリン粒子をゆるやかな振盪によって均一に縣濁しなければならない。また、インスリン懸濁液の貯蔵について、塊形成または凝集を回避するために、温度は、インスリン溶液についてよりも、より狭い範囲内に保たなければならない。
【０００５】
他のタイプの長期作用のインスリン組成物は、溶液が注入される時、pH値の上昇のためにインスリンが沈殿する生理学的pH値未満のpH値を有する溶液である。これらの溶液の短所は、注入時に組織において形成された沈殿の粒度分布、つまり、薬物の放出プロファイルが、注入部位の血流および予測不可能な様態における他のパラメーターに依存することである。さらなる短所は、インスリンの固形微粒子が注入部位の組織の炎症を引き起こす局所的な刺激剤として作用しうることである。
【０００６】
ヒトインスリンには、3つの主要なアミノ基：A鎖およびB鎖のN末端基ならびにLysB29のε-アミノ基がある。一以上のこれらの基が置換されたいくつかのインスリン誘導体が先行技術において知られている。従って、米国特許3,528,960(Eli Lilly)は、インスリン分子の１、２または３つの主要なアミノ酸基がカルボキシアロイル基を有するN-カルボキシアロイル インスリンに関する。
【０００７】
GB特許1.492.997(Nat. Res. Dev. Corp.)によれば、NεB29のカルバミル置換をもつインスリンが低血糖作用の向上したプロファイルをもつことが見出された。
【０００８】
JP公開特許出願1-254699(Kodama Co., Ltd.)は、脂肪酸がPheB1のアミノ基またはLysB29のε-アミノ基またはこれら両方に結合したインスリンを開示する。誘導の目的は、薬理学的に許容可能で安定したインスリン製剤を得るためである。
【０００９】
B30位置においてヌクレオチドのトリプレットによって必ずしもコード化することができない少なくとも5つの炭素原子を有するアミノ酸をもつインスリンが、JP公開特許出願57-067548番(Sionogi)において開示されている。このインスリン類似体は、真性糖尿病の治療において、特に、ウシまたはブタのインスリン抗体の生成によりインスリン耐性を示す患者において有用であると主張されている。
【００１０】
WO 95/07931(Novo Nordisk A/S)は、LysB29のε-アミノ基が脂肪親和性置換基を有するヒトインスリン誘導体を開示する。 これらのインスリン誘導体は、作用の延長されたプロファイルを有し、生理学的pH値で可溶性である。
【００１１】
EP 894095は、B鎖のN末端基および／または位置B28、B29またはB30のLysのε-アミノ基が式-CO-W-COOH（Wが長鎖炭化水素基になり得る）の置換基を有するインスリン誘導体を開示する。 これらのインスリン誘導体は、作用の延長されたプロファイルを示し、生理学的pH値で可溶性である。
【００１２】
不幸にも、多くの糖尿病患者は、グルコースレベルの厳密な制御を維持するために必要とされる多くの注入剤に関連した不快感のために、集中的な治療を受けたがらない。 このタイプの治療は、心理的および肉体的苦痛の両方を伴う。 経口投与では、インスリンは腸管内で急速に分解され、血流内に吸収されない。 従って、多くの研究者は、経口、直腸、経皮、および鼻経路といったインスリンを投与するための代替経路を研究してきた。これまでのところ、しかしながら、これらの投与経路は、有効なインスリン吸収を達成していない。
【００１３】
タンパク質の効率的な肺の送達は、深部肺胞上皮にタンパク質を配達する能力に依存する。 上気道上皮に堆積されたタンパク質は、十分な量まで吸収されない。 これは、およそ30〜40μm厚の粘液が堆積し、これが吸収の障壁として働くことに原因がある。さらに、この上皮上に堆積されたタンパク質は、この粘液線毛輸送機能によって気道まで流され、その後、胃腸管によって除去される。 この機構はまた、実質的にいくつかのタンパク質粒子の低吸収の一因となる。 タンパク質が吸収されず、代わりにこれらのルートによって吸収される程度は、その溶解度、そのサイズ、およびその他の影響の少ない特性に依存する。
【００１４】
しかしながら、これらの上に有機鎖状分子をグラフティングすることによってペプチドの性質を増強し得ることはよく知られている。 このようなグラフティングは、薬学的性質、例えば血清中の半減期、タンパク質分解に対する安定性、および減少した免疫原性を向上させ得る。
【００１５】
性質を増強するためにしばしば使用される有機鎖状分子は、ポリエチレングリコールに基づいたまたはポリエチレンに基づいた鎖、すなわち、反復単位-CH2CH2O-に基づいた鎖である。 以下、略語「PEG」はポリエチレングリコールのために使用される。
【００１６】
古典的PEG技術は、可溶性有機分子をポリペプチドに付着させることによって増加したサイズ（ストーク半径）をもつポリペプチドを与えることを利用する (Kochendoerfer、G., et al., Science (299) 884-, 2003)。この技術は、天然のポリペプチドと比較してホルモンポリペプチドのヒトおよび動物における減少したクリアランスを誘導する。しかしながら、この技術は、該技術にさらされたホルモンポリペプチドの減少した効力によってしばしば妨げられる(Hinds, K., et al., Bioconjugate Chem. (11), 195 -, 2000)。WO 02/20033は、十分に定義されたポリマーで修飾されたペプチドの合成のための一般的方法を開示する。
【００１７】
しかしながら、これまでに知られたインスリン誘導体よりも作用のより延長されたプロファイルを有するインスリンについての要求が依然として存在する。そして、同時に、生理学的pH値で可溶性であり、ヒトインスリンの効力に匹敵しうる効力を示すインスリンについも同様である。 さらに、肺投与に十分に適したさらなるインスリン処方についての要求がある。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、脂肪二酸の残基と組み合わせたエチレングリコール、プロピレングリコールおよび／またはブチレングリコールの一以上の残基を備えたインスリンのアシル化が、驚くべきことに、良好な生物学的利用能を示したことに基づいている。
【００１９】
性質を増強させるために使用され得る有機鎖様分子は、ポリエチレングリコールに基づいた、ポリプロピレングリコールに基づいたまたはポリブチレングリコールに基づいた鎖、すなわち、反復単位CH2CH2O-、CH2CH2CH2O-またはCH2CH2CH2CH2O-に基づいた鎖である。以下、略語「PEG」はポリエチレングリコールのために使用され、「PPG」はポリプロピレングリコールのために使用され、また、「PBG」はポリブチレングリコールのために使用される。
【００２０】
一側面において、本発明は、親インスリン分子のB鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基またはB鎖に存在するLys残基のε-アミノ基のいずれかにアミド結合を介して側鎖を結合させたインスリン誘導体に関係する。側鎖は、-NH2および-COOHから選択される基を各末端に独立して含むエチレングリコール、プロピレングリコールおよび／またはブチレングリコールの残基；4〜22の炭素原子をもつ脂肪二酸基；少なくとも一つの遊離カルボン酸基または中性pHで負に帯電する基；および任意に、前記側鎖中の個々の成分をアミド、エーテルまたはアミン結合を介して一緒に連結させることが可能なリンカー（任意には遊離のカルボン酸基を含む）を含む。
【００２１】
一側面において、インスリン誘導体は、2〜20、2〜10または2〜5残基のエチレングリコール、プロピレングリコールまたはブチレングリコールをそれぞれ有する二官能性のPEG、PPGまたはPBG基を含む。
【００２２】
一側面において、インスリン誘導体の側鎖は、エチレングリコールの1つの単残基を含む。
【００２３】
一側面において、インスリン誘導体の側鎖は、プロピレングリコールの1つの単残基を含む。
【００２４】
一側面において、インスリン誘導体の側鎖は、ブチレングリコールの1つの単残基を含む。
【００２５】
一側面において、インスリン誘導体の側鎖は、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはブチレングリコールの単残基を単独または組み合わせて有する。
【００２６】
一側面において、インスリン誘導体の側鎖は、プロピレングリコールの1つの残基とブチレングリコールの1つの残基を有する。
【００２７】
一側面において、脂肪二酸は、炭素鎖内の4〜22の炭素原子を含む。
【００２８】
一側面において、脂肪二酸は、炭素鎖内の6〜22、8〜20、8〜18、、4〜18、6〜18、8〜16、8〜22、8〜17または8〜15の炭素原子を含む。 
一側面において、リンカーは、アミノ酸残基、2〜4アミノ酸残基のペプチド鎖であり、あるいはα-Asp；β-Asp；α-Glu；γ-Glu；α-hGlu；δ-hGlu；-N(CH2COOH)CH2CO-；-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-；-N(CH2COOH)CH2CH2CO- または -N(CH2CH2COOH)CH2CO-のモチーフを有する。
【００２９】
一側面において、B鎖におけるLys残基は、位置B3、B29または位置B23〜B30のうちの1つであろう。
【００３０】
他の側面において、本発明は、以下の式を有するインスリン誘導体に関係がある。
【化１】
0005410020.tif 000002
【００３１】
式中、Insは親インスリン部分であり、インスリン基のB鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基またはB鎖内に存在するLys残基のε-アミノ基が、側鎖内のCO基とアミド結合を介して結合する；
各nは、各々独立して0、1、2、3、4、5または6である；
Q1、Q2、Q3およびQ4は互いに独立して、
・(CH2CH2O)s-; (CH2CH2CH2O)s-; (CH2CH2CH2CH2O)s-; (CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s-または(CH2CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)s-    式中、sは1〜20である；
・-(CH2)r-    式中、rは4〜22の整数であり；または1、2または3つの-CH=CH-基を含む二価の炭化水素鎖および4〜22の範囲内で鎖内に全ての数の炭素原子を与えるために十分な多数の-CH2-基である；
・-(CH2)t-または-(CH2OCH2)t-    式中、tは1〜6の整数である；
・-(CR1R2)q-、    式中、R1およびR2は互いに独立してH、-COOH、(CH2)1-6COOHであり得、R1およびR2は各炭素で異なり得、かつqは1〜6である；
・-((CR3R4)q1)1 -(NHCO-(CR3R4)q1-NHCO)1-2 -((CR3R4)q1)1 または-((CR3R4)q1)1 -(CONH-(CR3R4)q1-CONH)1-2 -((CR3R4)q1-)-、-((CR3R4)q1)1 -(NHCO-(CR3R4)q1-CONH)1-2 -((CR3R4)q1)1 または -((CR3R4)q1)1 -(CONH-(CR3R4)q1-NHCO)1-2 -((CR3R4)q1)1    式中、R3およびR4は互いに独立してH、-COOHであり得、かつR3およびR4は各炭素で異なり得、かつq1は1〜6である；  または
・結合；
であり得る（但し、Q1〜Q4は異なる）；
X1、X2およびX3は独立して、
・O；
・結合；  または
【化２】
0005410020.tif 000003
【００３２】
である
式中、Rは水素または-(CH2)p-COOH, -(CH2)p-SO3H, -(CH2)p-PO3H2, -(CH2)p-O-SO3H; -(CH2)p-O-PO3H2;または-(CH2)p-テトラゾール-5-イルである、  各ｐは互いに独立して1〜6の範囲内の整数である；  ならびに
Zは、
-COOH;
-CO-Asp;
-CO-Glu;
-CO-Gly;
-CO-Sar;
-CH(COOH)2;
-N(CH2COOH)2;
-SO3H
-OSO3H
-OPO3H2
-PO3H2  または
-テトラゾール-5-イル
およびこれらの任意のZn2+複合体
である。
【００３３】
R1、R2、R3およびR4が各炭素で異なっていてもよいことは、R1、R2、R3およびR4がqまたはq1の各値について異なっていてもよいことを意味する。
【００３４】
一側面において、r は、6〜22、8〜20、8〜18、4〜18、6〜18、8〜16、8〜22、8〜17、8〜15である。
【００３５】
他の側面において、s は、2〜12、2〜4または2〜3の範囲内にある。
【００３６】
他の側面において、s は、1である。
【００３７】
一側面において、n は、1〜6、2〜6、2〜5、2〜4、0〜2または2〜3である。
【００３８】
一側面において、q は、1〜5、1〜4、1〜3または1〜2である。
【００３９】
一側面において、q1 は、1〜5、1〜4、1〜3または1〜2である。
【００４０】
一側面において、t は、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3または1〜2である。
【００４１】
一側面において、Z は、-COOHである。
【００４２】
一側面において、Z は、-CO-Aspである。
【００４３】
他の側面において、Z は、-CO-Gluである。
【００４４】
他の側面において、Z は、-CO-Glyである。
【００４５】
他の側面において、Z は、-CO-Sarである。
【００４６】
他の側面において、Z は、-CH(COOH)2である。
【００４７】
他の側面において、Z は、-N(CH2COOH)2である。
【００４８】
他の側面において、Z は、-SO3Hである。
【００４９】
他の側面において、Z は、-PO3Hである。
【００５０】
他の側面において、Z は、O-SO3Hである；
他の側面において、Z は、O-PO3H2である；
他の側面において、Z は、テトラゾール-5-イルである。
【００５１】
さらなる側面において、親インスリンは、desB30ヒトインスリン類似体である。
【００５２】
親インスリンの制限のない例は、ヒトインスリン；desB1ヒトインスリン；desB30ヒトインスリン；GlyA21ヒトインスリン；GlyA21 desB30ヒトインスリン；AspB28ヒトインスリン；ブタのインスリン；LysB28 ProB29ヒトインスリン；GlyA21 ArgB31 ArgB32ヒトインスリン；LysB3 GluB29ヒトインスリンまたはAspB28 desB30ヒトインスリンである。
【００５３】
さらなる側面において、インスリン誘導体は、NεB29-(3-[2-{2-(2-[(ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルタミル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピノイル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-[2-{2-(2-[ω-カルボキシ-ヘプタデカノイル-γ-グルタミル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピノイル) desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリン、NεB29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-ヘプタデカノイル-α-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-ヘプタデカノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[7-カルボキシヘプタノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]-エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[9-カルボキシノナノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]エトキシ}-プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(9-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(9-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}-プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(2-[3-(2-(2-{2-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ}エトキシ)-エチルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) desB30ヒトインスリン、NεB29- (3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]エトキシ}-エトキシ)-プロピオノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオノイル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]-エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシプロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(3-{4-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシプロピル-カルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ) エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-D-グルタミル)desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミル}desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(9-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリン、NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミル}desB30ヒトインスリン、およびNεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミル}desB30ヒトインスリンからなる群から選択される。
【００５４】
本発明によるインスリン誘導体は、本質的に亜鉛フリーの化合物の形態または亜鉛複合体の形態において提供されてもよい。本発明によるインスリン誘導体の亜鉛複合体が与えられる場合、2つのZn2+イオン、3つのZn2+イオンまたは4つのZn2+イオンが、各インスリン六量体に結合され得る。インスリン誘導体の亜鉛複合体の溶液は、このような化学種の混合液を含むであろう。
【００５５】
さらなる側面において、本発明は、薬学的に許容可能なキャリアを一緒に含む、本発明による治療学的有効量のインスリン誘導体を含む薬学的組成物に関係がある。本発明の薬学的組成物は、１型糖尿病、２型糖尿病およびこのような治療を必要とする患者における高血糖症を引き起こす他の状態の治療のために提供され得る。本発明によるインスリン誘導体は、１型糖尿病、２型糖尿病および高血糖症を引き起こす他の状態の治療における使用のための、薬学的組成物の製造のために使用され得る。 
本発明のさらなる側面において、１型糖尿病、２型糖尿病およびこのような治療を必要とする患者における高血糖症を引き起こす他の状態を治療するための薬学的組成物が与えられる。この薬学的組成物には、作用の急速な開始（即効作用）を示すインスリンまたはインスリン類似体を任意的に混合した、薬学的に許容可能なキャリアおよび添加剤と一緒の、本発明による治療学的有効量のインスリン誘導体が含まれる。
【００５６】
さらなる側面において、本発明は、１型糖尿病、２型糖尿病およびこのような治療を必要とする患者における高血糖症を引き起こす他の状態を治療するための肺適用に関する。この肺適用には、即効作用を示すインスリンまたはインスリン類似体を任意的に混合した、薬学的に許容可能なキャリアおよび添加剤と一緒の、本発明による治療学的有効量のインスリン誘導体が含まれる。
【００５７】
一側面において、本発明は、本発明によるインスリン誘導体の混合物である薬学的組成物と、AspB28ヒトインスリン；LysB28 ProB29ヒトインスリンおよびLysB3 GluB29ヒトインスリンからなる群から選択された即効作用のインスリン類似体とを提供する。
【００５８】
本発明によるインスリン誘導体および即効作用のインスリン類似体は、約90／10%；約70／30%または約50／50%の割合で混合され得る。
【００５９】
本発明のさらなる側面において、１型糖尿病、２型糖尿病およびこのような治療を必要とする患者における高血糖症を引き起こす他の状態を治療する方法が与えられる。この方法には、薬学的に許容可能なキャリアおよび薬学的許容可能な添加剤と一緒の、本発明による治療学的有効量のインスリン誘導体を患者に投与することが含まれる。 
本発明のさらなる側面において、１型糖尿病、２型糖尿病およびこのような治療を必要とする患者における高血糖症を引き起こす他の状態を治療する方法が与えられる。この方法には、薬学的に許容可能なキャリアおよび薬学的に許容可能な添加剤と一緒に、即効作用を示すインスリンまたはインスリン類似体と混合された本発明による治療学的有効量のインスリン誘導体を患者に投与することが含まれる。
【００６０】
本発明のさらなる側面において、インスリン誘導体は、B鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基または親インスリン分子のB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基のいずれかにアミド結合を介して結合する側鎖を有する。この側鎖には、-OH、-NH2および-COOHから選択される基を各末端に独立して含む単分散の、二官能性のPEG基；4〜22の炭素原子を有する脂肪二酸基；少なくとも1つの遊離カルボン酸基または中性のpHで負に帯電する基；および任意に、アミド、エーテルまたはアミン結合を介して側鎖における個々の成分を一緒に連結させることができる、任意的には遊離カルボン酸基を含むリンカーが含まれる。
【００６１】
本発明の他の側面において、インスリン誘導体のPEG基は、1〜20；1〜10または1〜5エチレン残基を有する。
【００６２】
本発明の他の側面において、インスリン誘導体は、B鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基または親インスリン分子のB鎖中に存在するLys残基のε-アミノ基のいずれかにアミド結合を介して結合する側鎖を有する。この側鎖には、-OH、-NH2および-COOHから選択される基を各末端に独立して含む単分散の、二官能性のPEG基；4〜22の炭素原子を有する脂肪二酸基；少なくとも1つの遊離カルボン酸基または中性のpHで負に帯電する基；および任意に、アミド、エーテルまたはアミン結合を介して側鎖における個々の成分を一緒に連結させることができる、任意的には遊離カルボキシ酸基を含むリンカーが含まれる。
【００６３】
本発明のさらなる側面において、インスリン誘導体は、1〜20；1〜10または1〜5エチレン単位を有する二官能性のPEG基を含む。
【００６４】
本発明のさらなる側面において、インスリン誘導体は、炭素鎖において4〜22の炭素原子を含む脂肪二酸を含む。
【００６５】
本発明のさらなる側面において、インスリン誘導体は脂肪酸を含む。脂肪二酸は、6〜22、8〜20、8〜18、4〜18、6〜18、8〜16、8〜22、8〜17、8〜15炭素原子を炭素鎖内に含む。
【００６６】
本発明のさらなる側面において、インスリン誘導体はリンカーを含む。このリンカーは、アミノ酸残基、2〜4のアミノ酸残基のペプチド鎖であり、またはモチーフα-Asp、β-Asp、α-Glu、γ-Glu、α-hGlu、δ-hGlu、-N(CH2COOH)CH2CO-、-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-、-N(CH2COOH)CH2CH2CO-または-N(CH2CH2COOH)CH2CO-を有する。
【００６７】
本発明のさらなる側面において、インスリン誘導体はLys残基を含む。このLys残基は、位置B3または位置B23〜30のいずれかにおいて親インスリンのB鎖内に存在する。本発明のさらなる側面において、インスリン誘導体は、以下の式を有する
【化３】
0005410020.tif 000004
【００６８】
式中、Insは親インスリン部分であり、インスリン基のB鎖のN末端アミノ酸残基のα-アミノ基またはB鎖内に存在するLys残基のε-アミノ基が、側鎖内のCO基とアミド結合を介して結合する；
各nは、各々独立して0、1、2、3、4、5または6である；
Q1、Q2、Q3およびQ4は互いに独立して、
・(CH2CH2O)s-    式中、sは1〜20である；
・-(CH2)r-    式中、rは4〜22の整数であり；または1、2または3つの-CH=CH-基を含む二価の炭化水素鎖および4〜22の範囲内で鎖内に全ての数の炭素原子を与えるために十分な多数の-CH2-基である；
・-(CH2)t-または-(CH2OCH2)t-    式中、tは1〜6の整数である；
・-(CR1R2)q-、    式中、R1およびR2は互いに独立してH、-COOHであり得、R1およびR2は各炭素で異なり得、かつqは1〜6である；
・-((CR3R4)q1)1 -(NHCO-(CR3R4)q1-NHCO)1-2 -((CR3R4)q1)1 または-((CR3R4)q1)1 -(CONH-(CR3R4)q1-CONH)1-2 -((CR3R4)q1-)-、    式中、R3およびR4は互いに独立してH、-COOHであり得、かつR3およびR4は各炭素で異なり得、かつq1は1〜6である；  または
・結合；
であり得る（但し、Q1〜Q4は異なる）；
X1、VおよびGは独立して、
・O；
・結合；  または
【化４】
0005410020.tif 000005
【００６９】
である
式中、Rは水素または-(CH2)p-COOH, -(CH2)p-SO3H, -(CH2)p-PO3H2, -(CH2)p-O-SO3H; -(CH2)p-O-PO3H2;または-(CH2)p-テトラゾールである、  各ｐは互いに独立して1〜6の範囲内の整数である；  ならびに
Zは、
-COOH;
-CO-Asp;
-CO-Glu;
-CO-Gly;
-CO-Sar;
-CH(COOH)2;
-N(CH2COOH)2;
-SO3H
-OSO3H
-OPO3H2
-PO3H2  または
-テトラゾールイル 
である。
【００７０】
本発明のさらなる側面において、式によるインスリン誘導体、sは、6〜22、8〜20、8〜18、4〜18、6〜18、8〜16、8〜22、8〜17または8〜15である。
【００７１】
本発明のさらなる側面において、式によるインスリン誘導体、ｓは、1〜20、1〜10または1〜5である。
【００７２】
本発明のさらなる側面において、式によるインスリン誘導体、Zは-COOHである。
【００７３】
本発明のさらなる側面において、本発明によるインスリン誘導体、親インスリンはdesB30ヒトインスリン類似体である。
【００７４】
本発明のさらなる側面において、本発明によるインスリン誘導体、親インスリンは、ヒトインスリン；desB1ヒトインスリン；desB30ヒトインスリン；GlyA21ヒトインスリン；GlyA21 desB30ヒトインスリン；AspB28ヒトインスリン；ブタインスリン；LysB28ProB29ヒトインスリン；GlyA21ArgB31ArgB32ヒトインスリン；およびLysB3GluB29ヒトインスリンからなる群から選択される。
【００７５】
本発明のさらなる側面において、本発明によるインスリン誘導体は、NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)14CO)-γ-L-Glu-HN(CH2CH2O)4CH2CH2CO) desB30ヒトインスリン；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2)16CO)-γ-L-Glu-HN(CH2CH2O)4CH2CH2CO) des(B30) ヒトインスリン；NεB29-(Nα-(HOOC(CH2CH2O)4CH2CH2NH-OC(CH2)16CO)-α-L-Glu-) des(B30) ヒトインスリン；NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-ガンマ-Glu desB30インスリン；および NεB29-3-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)- エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-Glu desB30インスリンからなる群から選択される。
【００７６】
本発明のさらなる側面において、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に本発明による治療学的有効量のインスリン誘導体を含む、このような治療を必要とする患者における糖尿病の治療のための薬学的組成物が与えられる。
【００７７】
本発明のさらなる側面において、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に即効作用を示すインスリンまたはインスリン類似体と混合された本発明による治療学的有効量のインスリン誘導体を含む、このような治療を必要とする患者の糖尿病の治療のための薬学的組成物が与えられる。
【００７８】
本発明のさらなる側面において、肺投与を目的とした本発明による薬学的組成物が与えられる。
【００７９】
発明のさらなる側面において、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に、請求項１に記載の治療学的有効量のインスリン誘導体を患者に投与することを含む、このような治療を必要とする患者の糖尿病を治療する方法が与えられる。
【００８０】
本発明のさらなる側面において、薬学的に許容可能なキャリアと一緒に、即効作用を示すインスリンまたはインスリン類似体と混合された請求項１に記載の治療学的有効量のインスリン誘導体を患者に投与することを含む、このような治療を必要とする患者の糖尿病を治療する方法が与えられる。
【発明の詳細な説明】
【００８１】
本発明のインスリン誘導体は、親インスリン分子のB鎖内のLys基またはB鎖内のN末端アミノ基に結合した側鎖を有することによって特徴づけられる。この側鎖には、エチレングリコール、プロピレングリコールおよび／またはブチレングリコールおよび脂肪二酸基が含まれる。
【００８２】
本発明によるインスリン誘導体は、側鎖において少なくとも1つの遊離カルボン酸基を有することでさらに特徴づけられる。この側鎖には、2、3または4までの遊離カルボン酸基または中性pHで負に帯電した基が含まれ得る。
【００８３】
インスリン誘導体は、１つのリシン残基のみを含むであろう。このリシン残基は、ヒトインスリンと同様、位置B29に存在しても、あるいは位置B3、B30またはB23〜B28のいずれか一つに存在していてもよい。
【００８４】
エチレングリコール、プロピレングリコールおよび／またはブチレングリコールの残基は、各末端に３つの基-OH；-NH2および-COOHの任意の組み合わせを有するであろう。エチレングリコール、プロピレングリコールおよび／またはブチレングリコールの残基は、典型的にはブチレングリコール残基によって追従されたエチレングリコール残基の形態であるか、あるいは約200〜800の分子量に対応する2〜20のPEG、PPGまたはPBG残基の鎖長を有するであろう。
【００８５】
エチレングリコール、プロピレングリコールおよび／またはブチレングリコールの残基は、典型的にはブチレン残基によって追従されたエチレングリコール残基の形態-(CH2CH2OCH2CH2CH2CH2O)m（mは1〜20）になるであろう。
【００８６】
二官能性のPEGまたはPPGまたはPBGは、各末端に3つの基 -OH；-NH2および-COOHの任意の組み合わせを有し、かつ典型的には約200〜1000の分子量に対応する1〜20のPEG残基の鎖長を有するであろう。
【００８７】
アミノPEG基の制限のない例は、H2N-(CH2)u-(OCH2CH2)m-O(CH2)u-COOH および H2N-(CH2)v-NH-CO-(CH2)u-(OCH2CH2)m-(CH2)u-COOH（uは独立して1〜6、mは2〜20およびvは1〜6である）である。
【００８８】
アミノPPG基の制限のない例は、H2N-(CH2)u-(OCH2CH2CH2)m-O(CH2)u-COOHおよびH2N-(CH2)v-NH-CO-(CH2)u-(OCH2CH2CH2)m-(CH2)u-COOH（uは独立して1〜6、mは2〜20およびvは1〜6である）である。
【００８９】
アミノPBG基の制限のない例は、H2N-(CH2)u-(OCH2CH2CH2CH2)m-O(CH2)u-COOH and H2N-(CH2)v-NH-CO-(CH2)u-(OCH2CH2CH2CH2)m-(CH2)u-COOH（uは独立して1〜6、mは2〜20およびvは1〜6である）である。
【００９０】
脂肪二酸は、典型的には炭素鎖において4〜22、6〜22、8〜20、8〜18、4〜18、6〜18、8〜16、8〜22、8〜12、8〜10、8〜17または8〜15の炭素原子を典型的には含むであろう。
【００９１】
脂肪二酸基の制限のない例は、式HOOC-(CH2)r1-COOH（r1は4〜22である）をもつ二酸である。脂肪二酸の例は、コハク酸、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸またはオクタデカンデジオニック酸(octadecandedioic acid)である。
【００９２】
親インスリンまたは本発明によるインスリン誘導体として参照された本発明におけるインスリン部分はまた、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリンまたはブタインスリンになり得る。代わりに、親インスリンは、インスリン類似体になり得る。
【００９３】
親インスリン類似体の1つの基において、位置A21のアミノ酸残基はAsnである。
【００９４】
親インスリン類似体の他の基において、位置B1のアミノ酸残基は削除された。親インスリン類似体のこの基からの特定の例は、desB1ヒトインスリンである。
【００９５】
親インスリン類似体の他の基において、位置B30のアミノ酸残基は削除された。親インスリン類似体のこの基からの特定の例はdesB30ヒトインスリンである。
【００９６】
親インスリン類似体の他の基において、位置B28のアミノ酸残基はAspである。親インスリン類似体のこの基からの特定の例は、AspB28ヒトインスリンである。
【００９７】
親インスリン類似体の他の基において、位置B28のアミノ酸残基はLysであり、位置B29のアミノ酸残基はProである。親インスリン類似体のこの基からの特定の例は、LysB28 ProB29ヒトインスリンである。
【００９８】
親インスリン類似体の他の基において、位置B30のアミノ酸残基はLysであり、かつ位置B29のアミノ酸残基はCys、ArgおよびLysを除く任意のコード可能なアミノ酸である。一例は、位置B29のアミノ酸残基がThrであり、かつ位置B30のアミノ酸残基がLysであるインスリン類似体である。親インスリン類似体のこの基からの特定の例は、ThrB29 LysB30ヒトインスリンである。
【００９９】
インスリン類似体の他の基において、位置B3のアミノ酸残基はLysであり、かつ位置B29のアミノ酸残基はGluである。親インスリン類似体のこの基からの特定の例は、LysB3 GluB29ヒトインスリンである。
【０１００】
リンカーは、典型的にはアミノ酸残基または4つまでのアミノ酸を含むアミノ酸残基の鎖になるであろう。従って、リンカーは、α-Asp；β-Asp；α-Glu；γ-Glu；α-hGlu；δ-hGlu；-N(CH2COOH)CH2CO-、-N(CH2CH2COOH)CH2CH2CO-；-N(CH2COOH)CH2CH2CO-または-N(CH2CH2COOH)CH2CO-からなる群から選択され得る。
【０１０１】
さらなる側面において、リンカーは、二つのアミノ酸残基で構成された鎖とすることができる。前記残基において、一方が4〜10の炭素原子を有し、かつ側鎖においてカルボン酸基を有し、他方が2〜11の炭素原子を有するが、遊離のカルボン酸基を有さない。遊離のカルボン酸基をもたないアミノ酸残基は、中性、コード可能なα-アミノ酸残基とすることができる。このようなリンカーの例は以下のとおりである：α-Asp-Gly；Gly-α-Asp；β-Asp-Gly；Gly-β-Asp；α-Glu-Gly；Gly-α-Glu；γ-Glu-Gly；Gly-γ-Glu；α-hGlu-Gly；Gly-α-hGlu；δ-hGlu-Gly；および Gly-δ-hGlu。
【０１０２】
さらなる側面において、リンカーは、それぞれ独立して4〜10の炭素原子を有し、かつ両方ともに側鎖においてカルボン酸基を有する二つのアミノ酸残基で構成された鎖である。このようなリンカーの例は以下のとおりである：α-Asp-α-Asp；α-Asp-α-Glu；α-Asp-α-hGlu；α-Asp-β-Asp；α-Asp-γ-Glu；α-Asp-δ-hGlu；β-Asp-α-Asp；β-Asp-α-Glu；β-Asp-α-hGlu；β-Asp-β-Asp；β-Asp-γ-Glu ;β-Asp-δ-hGlu；α-Glu-α-Asp；α-Glu-α-Glu；α-Glu-α-hGlu；α-Glu-β-Asp；α-Glu-γ-Glu；α-Glu-δ-hGlu；γ-Glu-α-Asp；γ-Glu-α-Glu；γ-Glu-α-hGlu；γ-Glu-β-Asp；γ-Glu-γ-Glu；γ-Glu-δ-hGlu；α-hGlu-α-Asp；α-hGlu-α-Glu；α-hGlu-α-hGlu；α-hGlu-β-Asp；α-hGlu-γ-Glu；α-hGlu-δ-hGlu；δ-hGlu-α-Asp；δ-hGlu-α-Glu；δ-hGlu-α-hGlu；δ-hGlu-β-Asp；δ-hGlu-γ-Glu；および δ-hGlu-δ-hGlu。
【０１０３】
さらなる側面において、リンカーは、3つのアミノ酸残基で構成された鎖である。各残基は、それぞれ独立して4〜10の炭素原子を有し、鎖のアミノ酸残基は中性の側鎖を有する残基および側鎖内にカルボン酸基を有する残基の群から選択され、前記鎖は、側鎖においてカルボン酸基を有する少なくとも一つの残基を有する。一側面において、アミノ酸残基はコード可能な残基である。
【０１０４】
さらなる側面において、リンカーは、4つのアミノ酸残基で構成された鎖である。各残基は、それぞれ独立して4〜10の炭素原子を有し、鎖のアミノ酸残基は中性の側鎖を有する残基および側鎖内にカルボン酸基を有する残基の群から選択され、前記鎖は、側鎖においてカルボン酸基を有する少なくとも一つの残基を有する。一側面において、アミノ酸残基はコード可能な残基である。
【０１０５】
本発明によるインスリン誘導体の例は、以下の化合物である：
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}、エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニルdesB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン； 
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル] プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) ヒトインスリン；
N (B29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29- (3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29- (3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29- (3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) ヒトインスリン； 
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル)ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29- (3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29- (3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29- (3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29- (3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル)B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル-プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28Dヒトインスリン； 
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28Dヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル、B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル)B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(3-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル)B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘキサデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシペンタデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン；および
NεB29-(3-[3-(2-{2-[3-(ω-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル]プロピオニル) B28D、desB30ヒトインスリン。
【０１０６】
代表的な式は次のとおりである：
【化５】
0005410020.tif 000006
【化６】
0005410020.tif 000007
【化７】
0005410020.tif 000008
【化８】
0005410020.tif 000009
【化９】
0005410020.tif 000010
【化１０】
0005410020.tif 000011
【化１１】
0005410020.tif 000012
【０１０７】
さらなる側面において、本発明は、ヒトインスリンの疎水性に本質的に類似する全体的疎水性を有するインスリン誘導体に関する。
【０１０８】
さらなる側面において、本発明のインスリン誘導体は、約0.02〜約10、約0.1〜約5；約0.5〜約5；約0.2〜約2；約0.2〜約1；約0.1〜約2；または約0.5〜約2の範囲内にある疎水性インデックス(k'rel)を有する。
【０１０９】
本発明の一側面によれば、インスリン誘導体には、少なくとも一つの遊離カルボン酸基を有する上記に定義した一般式（I）の側鎖が含まれるであろう。そして、さらなる側面によれば、側鎖は任意的には一以上の遊離カルボン酸基をもつであろう。
【０１１０】
ヒトインスリンと比較した本発明のインスリン誘導体の疎水性(疎水性インデックス)、k'relは、40℃で定組成溶離によってLiChrosorb RP18(5μm、250×4 mm) HPLCカラム上で測定された。このとき、溶離液としてA) 10%アセトニトリルを含むpH 7.3の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液と、B) 水中の50%アセトニトリルとの混合物を使用した。溶離は、214nmでの溶離液のUV吸収をとらえることによってモニターされた。ボイド時間 t0 は、0.1mM 硝酸ナトリウムを注入することによって見出された。ヒトインスリンについての保持時間 tヒト は、AおよびB溶液間の割合 k'rel=(t誘導体 - t0)/(tヒト - t0) を変化させることによって少なくとも2t0に調整された。
【０１１１】
他の側面において、本発明は、生理学的pH値で可溶性を示す本発明によるインスリン誘導体を含む薬学的組成物に関する。
【０１１２】
他の側面において、本発明は、約6.5〜約8.5の区間内のpH値で可溶性を示す本発明によるインスリン誘導体を含む薬学的組成物に関する。
【０１１３】
他の側面において、本発明は、本発明によるインスリン誘導体を含む作用の延長されたプロファイルを示す薬学的組成物に関する。
【０１１４】
他の側面において、本発明は、約120 nmol/ml〜約2400 nmol/ml、約400 nmol/ml〜約2400 nmol/ml、約400 nmol/ml〜約1200 nmol ml、約600 nmol/ml〜約2400 nmol ml、または約600 nmol/ml〜約1200 nmol/mlの本発明によるインスリン誘導体または本発明によるインスリン誘導体と即効作用のインスリン類似体との混合物を含む溶液である薬学的組成物に関する。
【０１１５】
アシル化のための開始生成物、親インスリンまたはインスリン類似体またはこれらの前駆体は、適切な形質転換された微生物内において周知のペプチド合成または周知の組み換え産生のいずれかによって生成され得る。インスリン開始生成物は、ペプチドの発現を開始可能な条件下においてポリペプチドをコードするDNA配列を含む宿主細胞を培養し、かつ適切な栄養培地内においてポリペプチドを発現させることができ、その後に得られたペプチドが培養液から回収されることを含む方法によって産生され得る。
【０１１６】
例として、desB30ヒトインスリンは、米国特許番号4916212において開示された宿主において産生されるヒトインスリン前駆体B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)から産生され得る。このインスリン前駆体は、Ala-Ala-Lysペプチド鎖のALP開裂によってdesB30ヒトインスリンに転換され得、その後に本発明のインスリンを与えるためにアシル化され得るdesB30ヒトインスリンを与える。
【０１１７】
細胞を培養するために使用される培養液は、宿主細胞を増殖させるために適した任意の従来の培養液、例えば適切な補足物質を含む最小または複合培地であってもよい。適切な培養液は商業的な供給者から利用可能であるか、あるいは刊行された処方によって調製され得る（例えば、アメリカン タイプ カルチャー コレクションのカタログにおいて）。細胞によって生成されたペプチドは、対象のペプチドのタイプに依存して、遠心またはろ過によって培養液から宿主細胞を分離し、上清のタンパク質成分を沈殿させるかまたは塩類、例えば硫酸アンモニウムによってろ過し、様々なクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはこれらに類するものによる精製を含む従来の手順によって培養液から回収され得る。
【０１１８】
親インスリンをコードするDNA配列は、適切にはゲノムまたはcDNA起源であってもよく、例えばゲノムまたはcDNAライブラリを調製し、かつ標準的技術に従って合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによる全てまたは一部のポリペプチドをコードするDNA配列をスクリーニングすることによって得られる（例えば、Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照)。親インスリンをコードするDNA配列はまた、確立された標準的方法、例えばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869によって記載されたホスホアミダイト方法またはMatthes et al., EMBO Journal 3 (1984), 801-805によって記載された方法によって合成的に調製され得る。DNA配列はまた、例えば、US 4,683,202またはSaiki et al., Science 239 (1988), 487-491において記載されたように、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応法によって調製され得る。 
DNA配列は、組換えDNA手続きに都合よくさらされ得る任意のベクターに挿入され得、かつベクターの選択はしばしばそれが導入されるべき宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自立的に複製するベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクターであり得、その複製は染色体の複製から独立している(例えばプラスミド)。代わりに、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、宿主細胞ゲノムに統合され、それが統合される染色体と一緒に複製され得る。
【０１１９】
ベクターは、親インスリンをコードするDNA配列がプロモータのようなDNAの転写に必要とされるさらなる断片に機能的に連結される。プロモータは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であってもよく、かつ宿主細胞に対して相同または異種である遺伝子をコードするタンパク質から誘導され得る。種々の宿主細胞において親インスリンをコードするDNAの転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、当業者において周知である（例えばSambrook et al., supra）。
【０１２０】
親インスリンをコードするDNA配列はまた、必要な場合、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、および翻訳エンハンサー配列に機能的に連結される。本発明の組換えベクターは、ベクターが対象の宿主細胞内で複製することができるDNA配列をさらに含んでいてもよい。
【０１２１】
ベクターはまた、選択可能なマーカー、例えば遺伝子を含んでいてもよい。この遺伝子の生成物は、薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシン、メトトレキサートに対する耐性を与える宿主細胞における欠損を補完する。
【０１２２】
宿主細胞の分泌経路に本発明のペプチドを導くために、分泌シグナル配列(またはリーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列として知られた)は、組換えベクターにおいて提供され得る。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠においてペプチドをコードするDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、ペプチドをコードするDNA配列の5'位に共通して位置する。分泌シグナル配列は、そのペプチドに正常に付随したものであってもよいし、あるいは他の分泌されたタンパク質をコードする遺伝子に由来してもよい。
【０１２３】
親インスリン、プロモーターおよび任意的にはターミネーターおよび／または分泌性シグナル配列それぞれをコードするDNA配列をライゲートするために使用される手順、ならびに複製のために必要な情報を含む適切なベクターにこれらを挿入するために使用される手順は、当業者にとって周知である（例えば、Sambrook et al., supra.）。
【０１２４】
DNA配列または組換えベクターが導入される宿主細胞は、親ペプチドを産生することができる任意の細胞であってもよく、バクテリア、酵母、菌類および高等真核細胞が含まれ得る。周知かつ当該技術分野において使用される適切な宿主細胞の例には、これらに限定されないが、大腸菌、酵母または哺乳動物BHKまたはCHO細胞系統が含まれる。
【０１２５】
親インスリン分子はその後、B1位置またはB鎖内において選択されたLys位置のいずれかにおいて関連のある側鎖を導入することによって本発明のインスリン誘導体に転換される。側鎖は、任意の簡便な方法によって導入され得、かつ多くの方法が、アミノ基のアシル化のための当該技術において開示される。より詳細には、以下の例から明らかであろう。
【薬学的組成物】
【０１２６】
クレームされた式の本発明のインスリン誘導体は、例えば、皮下、経口または肺に投与され得る。
【０１２７】
皮下投与について、式の化合物は、既知のインスリンの処方と同様に処方される。さらに、皮下投与について、式の化合物は、既知のインスリンの投与と同様に投与される。一般的には、医師はこの手順に精通している。
【０１２８】
本発明のインスリン誘導体は、線量において吸入によって投与されるかもしれない、循環するインスリンレベルを増加させるための、および／または循環するグルコースレベルを低下させるための、投与の有効な手法における吸入によって投与され得る。このような投与は、糖尿病または高血糖のような疾患を治療するために有効となり得る。インスリンの有効な投与量を達成するためには、約0.5μg/kg以上、約50μg/kgまでの本発明のインスリン誘導体の吸入量の投与を必要とする。治療学的有効量は、知識豊富な医療従事者によって決定され得る。この医療従事者は、インスリンレベル、血中グルコースレベル、患者の健康状態、患者の肺の状態などを含む因子を考慮に入れるだろう。
【０１２９】
本発明によれば、本発明のインスリン誘導体は、作用の延長された期間を達成するために吸入によって送達されてもよい。 吸入による投与は、インスリンの皮下投与に匹敵しうる薬物動態をもたらしうる。異なる吸入装置は、典型的には類似の粒径サイズおよび肺沈着の類似のレベルが比較されるとき、類似の薬物動態を与える。
【０１３０】
本発明によれば、本発明のインスリン誘導体は、吸入による治療学的薬剤の投与のために当該技術において既知の任意の種々の吸入装置によって送達され得る。これらの装置には、計量式吸入器、ネブライザ、乾燥粉ジェネレーター、噴霧器などが含まれる。好ましくは、本発明のインスリン誘導体は、乾燥粉吸入器または噴霧器によって送達される。本発明のインスリン誘導体を投与するための吸入装置のいくつかの望ましい特徴がある。例えば、吸入装置による送達は優位に信頼性があり、再現可能であり、かつ正確である。この吸入装置は、良好な呼吸適合性のために、小さな粒子、例えば約10未満μm、例えば約1〜5μmの粒子を送達すべきである。本発明の診療に適した商業的に利用可能な吸入装置のいくつかの特定の例には、TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler（登録商標）(Glaxo)、Diskus（登録商標）(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、吸入治療学によって商業化された装置、AERxTM(Aradigm)、Ultravent（登録商標）ネブライザ(Mallinckrodt)、Acorn II（登録商標）ネブライザ(Marquest Medical Products)、Ventolin（登録商標）計量式吸入器(Glaxo)、Spinhaler（登録商標）粉末吸入器(Fisons)、またはこれらに類するものがある。
【０１３１】
当業者が認識するであろうとき、本発明のインスリン誘導体の処方、送達された処方の量、および一回量の投与の期間は、使用された吸入装置のタイプに依存する。ネブライザのようないくつかのエアロゾル送達系について、システムが活性化される投与の頻度および時間の長さは、エアロゾルのインスリン抱合体の濃度に主に依存するであろう。例えば、より短い期間の投与では、ネブライザ溶液内のインスリン抱合体はより高い濃度で使用され得る。測定投与吸入器のような装置は、より高いエアロゾル濃度を産生することができ、かつ所望の量のインスリン抱合体を送達するのにより短期間で操作され得る。粉末吸入器のような装置は、薬剤の所与の装填が装置から放出されるまで活性薬剤を送達する。このタイプの吸入器において、粉末の所与の量における本発明のインスリン誘導体の量は、一投与において送達される投与量を決定する。
【０１３２】
吸入装置によって送達される処方における本発明のインスリン誘導体の粒子サイズは、これを肺、好ましくはより狭い気管または肺胞に送るためのインスリンの能力に関して重要である。好ましくは、本発明のインスリン誘導体は、送達されるインスリン抱合体の少なくとも約10％が肺内に堆積され、好ましくは約10〜約20％またはそれ以上に堆積されるように処方される。口呼吸するヒトについての肺堆積の最大の効果は、約2μm〜約3μmの粒径で得られることが知られている。粒径が約5μmを超えるとき、肺への堆積は実質的に減少する。また、約1μm未満の粒径は肺への堆積を減少させ、治療学的に有効である十分な量で粒子を送達することは困難になる。従って、吸入によって送達されるインスリン誘導体の粒子は、好ましくは約10μm未満の粒径を有し、より好ましくは約1μm〜約5μmの範囲内の粒径を有する。インスリン誘導体の処方は、選択された吸入装置において所望の粒径を産出するように選択される。
【０１３３】
優位には、乾燥粉末としての投与のために、本発明のインスリン誘導体は、約10μm未満、好ましくは約1〜5μmの粒径をもつ微粒子形態において調製される。好ましい粒径は、患者の肺の肺胞への送達にとって有効である。好ましくは、乾燥粉末は、粒子の大半が所望の範囲における大きさを有するように産生された粒子で大半が構成されている。優位には、乾燥粉末の少なくとも約50％が、約10μm未満の直径を有する粒子で作られる。このような処方は、インスリン抱合体および他の所望の成分を含む溶液の噴霧乾燥、製粉、または臨界点濃縮によって達成され得る。本発明に有用な粒子を生成するのに適した他の方法がまた、当該技術分野において知られている。
【０１３４】
粒子は通常、容器内の乾燥粉末処方から分離され、キャリア空気流を介して患者の肺に送達される。典型的には、現在の乾燥粉末吸入器において、固体を解体するための力は、もっぱら患者の吸入によって与えられる。他のタイプの吸入器において、患者の吸入によって生成される空気流は、粒子を非塊にするインペラー モーターを活性化する。
【０１３５】
乾燥粉末吸入器からの投与のための本発明のインスリン誘導体の処方は典型的には、誘導体を含む細分された乾燥粉末を含むが、粉末はまた、充填剤、キャリア、賦形剤、他の添加剤などを含む。添加剤は、例えば、特定の粉末吸入器から送達のために必要とされた粉末を稀釈するために、処方に有利な粉体物性を提供するために、吸入装置からの粉末の分散を促進するために、処方を安定化するために（例えば、酸化防止剤または緩衝液）、処方に対する味覚を提供するために、等々、インスリン抱合体の乾燥粉末処方において含まれ得る。有利には、添加剤は、患者の気管に悪影響を与えない。インスリン誘導体は、分子レベルで添加剤に混合され得るか、あるいは固形処方は、添加剤の粒子と混合されるかまたはコートされたインスリン抱合体の粒子を含み得る。典型的な添加剤には、モノ-、ジ-、および多糖；糖アルコールおよび他のポリオール、例えば、ラクトース、グルコース、ラフィノース、メレチトース、ラクチトール、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、スターチ、またはこれらの組み合わせ；界面活性剤、例えばソルビトール、ジホスファチジルコリンまたはレシチン；またはこれらに類似するものが含まれる。典型的には、添加剤、例えば充填剤は、上述した目的のための有効量、しばしば処方の約50%〜約90%重量において存在する。タンパク質、例えばインスリン類似体タンパク質の処方のために当該技術において知られた添加剤はまた、処方において含まれ得る。
【０１３６】
本発明のインスリン誘導体を含むスプレーは、圧力下のノズルを通したインスリン抱合体の懸濁液または溶液をもたらすことによって生成され得る。ノズル寸法および配置、印加圧および液体流入速度は、所望の出力および粒径を達成するために選択され得る。エレクトロスプレーは、例えば、キャピラリーまたはノズル送りと結びついて、電場によって生成され得る。有利には、噴霧器によって送達されたインスリン抱合体の粒子は、約10μｍ未満、好ましくは約1μm〜約5μmの範囲内の粒径を有する。
【０１３７】
噴霧器を備えた使用に適している本発明のインスリン誘導体の処方には、溶液のml当たり約1mg〜約20mgのインスリン抱合体の濃度での水溶液中のインスリン誘導体が含まれるであろう。その処方には、薬剤、例えば、賦形剤、緩衝液、等張剤、保存剤、界面活性剤および好ましくは亜鉛が含まれ得る。処方にはまた、賦形剤またはインスリン誘導体の安定化のための薬剤、例えば緩衝液、還元剤、バルクタンパク質または炭水化物が含まれ得る。インスリン誘導体を処方するのに有用なバルクタンパク質は、アルブミン、プロタミンまたはこれらに類似するものが含まれる。典型的には、インスリン抱合体を処方するのに有用な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース、またはこれらに類するものが含まれる。インスリン誘導体処方にはまた、エアロゾルを形成する溶液の微粒化によって引き起こされるインスリン抱合体の表面誘導凝集を減少または防止することができる、界面活性剤が含まれ得る。様々な従来の界面活性剤には、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびアルコール、およびポリオキシエチレン ソルビトール脂肪酸エステルが使用され得る。その量は処方の約0.001〜約4重量%の範囲になるであろう。
【０１３８】
本発明によるインスリン誘導体を含む薬学的組成物はまた、このような治療を必要とする患者に非経口的に投与されてもよい。非経口的投与は、シリンジ、任意的にはペン様シリンジによって、皮下内、筋肉内または静脈内注入によって行われ得る。代わりに、非経口投与は、輸液ポンプによって行うことができる。さらなるオプションは、目的に適うよう具体的に設計された、好ましくは組成物、粉末または液体内においてインスリンを経鼻または肺内投与することである。
【０１３９】
本発明のインスリン誘導体の注入可能な組成物は、所望の最終生成物を与えるのに適した成分を溶解および混合することを含む製薬産業の従来技術を使用して調製され得る。従って、一つの手順に従って、本発明によるインスリン誘導体は、調製されるべき組成物の最終容積よりも幾分少ない大量の水に溶解される。等張剤、保存剤および緩衝液が必要量添加され、かつ溶液のpH値が、必要であれば、酸(例えば塩酸)または塩基(例えば水酸化ナトリウム水溶液)を必要量だけ使用して調節される。最後に、成分の所望の濃度を与えるために、溶液の容積が水で調節される。
【０１４０】
本発明のさらなる側面において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸またはこれらの混合物から選択される。これらの特定の緩衝液の各々は、本発明の代替の側面を構成する。
【０１４１】
本発明のさらなる側面において、処方には、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、メチルp-ヒドロキシベンゾアート、プロピルp-ヒドロキシベンゾアート、2-フェノキシエタノール、ブチルp-ヒドロキシベンゾアート、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、およびチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、ナトリウムデヒドロアセタート、クロロクレゾール、エチルp-ヒドロキシベンゾアート、ベンゼトニウムクロリド、クロルフェネシン（3p-クロルフェノキシプロパン-1,2-ジオール）およびこれらの混合物からなる群から選択され得る、薬学的に許容可能な保存剤がさらに含まれる。本発明のさらなる側面において、保存剤は0.1mg/ml〜20mg/mlの濃度内にある。本発明のさらなる側面において、保存剤は0.1mg/ml〜5mg/mlの濃度内にある。本発明のさらなる側面において、保存剤は5mg/ml〜10mg/mlの濃度内にある。本発明のさらなる側面において、保存剤は10mg/ml〜20mg/mlの濃度内にある。これらの特定の保存剤の各々は、本発明の代替の側面を構成する。薬学的組成物における保存剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995. を参照されたい。
【０１４２】
本発明のさらなる側面において、処方には、塩 (例えば塩化ナトリウム)、糖または糖アルコール、アミノ酸 (例えばL-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール) ポリエチレングリコール (例えばPEG400)、またはこれらの混合物からなる群から選択され得る等張剤がさらに含まれる。任意の糖、例えば、モノ-、ジ-または多糖または水溶性グルカン、例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性スターチ、ヒドロキシエチルスターチおよびカルボキシメチルセルロース-Naが使用され得る。一側面において、糖添加剤はスクロースである。 糖アルコールには、少なくとも1つのOH基を有するC4-C8炭化水素として定義され、かつ例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトールおよびアラビトールが含まれる。一側面において、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖または糖アルコールは、個々にまたは組み合わせて使用され得る。糖または糖アルコールが液体製剤中に可溶である限り、そして、本発明の方法を使用して達成された安定した効果を悪影響を与えない限り、使用される量に制限はない。一側面において、糖または糖アルコール濃度は、約1mg/ml〜約150mg/mlである。本発明のさらなる側面において、等張剤は、1mg/ml〜50mg/mlの濃度内にある。本発明のさらなる側面において、等張剤は、1mg/ml〜7mg/mlの濃度内にある。本発明のさらなる側面において、等張剤は、8mg/ml〜24mg/mlの濃度内にある。本発明のさらなる側面において、等張剤は、25mg/ml〜50mg/mlの濃度内にある。これらの特定の等張剤の各々は、本発明の代替の側面を構成する。薬学的組成物における等張剤の使用は、当業者にとって周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995. を参照されたい。
【０１４３】
典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホンおよびグリセロールである。また、典型的な保存剤は、フェノール、m-クレゾール、メチルp-オキシ安息香酸エステルおよびベンジルアルコールである。
【０１４４】
適切な緩衝液の例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)およびリン酸ナトリウムである。
【０１４５】
本発明によるインスリン誘導体の経鼻投与のための組成物は、欧州特許第272097号公報(Novo Nordisk A/Sに対して)に記載されたように調製され得る。
【０１４６】
本発明のインスリン誘導体を含む組成物は、インスリンに過敏である状態の治療において使用され得る。従って、これらは、ひどく傷ついた人や大きな手術を受けた人において時折見られるような、１型糖尿病、２型糖尿病および高血糖症の治療において使用され得る。任意の患者についての最適な投与レベルは、使用される特定のインスリン誘導体の効力を含む様々な因子、例えば患者の年齢、体重、肉体活動および食事や、他の薬剤とのとり得る可能性、および治療されるべき状態の重症度に依存するであろう。本発明のインスリン誘導体の日単位の投与が、既知のインスリン組成物について決定されるのと同じように、当業者によって個々の患者について決定されることが推奨される。
【０１４７】
好都合なところで、本発明のインスリン誘導体は、インスリン、例えば、より即効作用を示すインスリン類似体の他のタイプと混合して使用され得る。このようなインスリン類似体の例は、例えば、公開番号EP214826(Novo Nordisk A/S)、EP375437(Novo Nordisk A/S)およびEP383472(Eli Lilly & Co)を有する欧州特許出願において記載されている。
【０１４８】
本発明のさらなる側面において、本発明の化合物は、任意の適切な割合において一以上のさらなる活性物質と組み合わせて投与される。このようなさらなる活性剤は、抗糖尿病剤、抗高脂肪剤、抗肥満剤、抗高血圧剤、および糖尿から生じるまたは関連した合併症の治療のための薬剤から選択され得る。 
適切な抗糖尿病剤には、インスリン、WO 98/08871(Novo Nordisk A/S)に開示されたようなGLP-1(グルカゴン様ペプチド-1)誘導体（参照によって本明細書中に組み込まれる）、および経口活性血糖降下剤が含まれる。
【０１４９】
適切な経口的に活性な血糖降下剤には、好ましくは、イミダゾリン、スルホニル尿素、ビグアニド、メグリチニド、オキサジアゾリジンジオン、チアゾリジンジオン、インスリン感作物質、α-グルコシダーゼ阻害剤、膵臓のβ細胞のATP依存型カリウムチャネルに作用する薬剤、例えば、WO 97/26265、WO 99/03861およびWO 00/37474(Novo Nordisk A/S)に開示された薬剤のようなカリウムチャネル開口剤（参照によって本明細書中に組み込まれる）、カリウムチャネル開口剤、例えばオルミチグリニド、カリウムチャネル遮断剤、例えばナテグリニドまたはBTS-67582、グルカゴンアンタゴニスト、例えばWO 99/01423およびWO 00/39088 (Novo Nordisk A/SおよびAgouron Pharmaceuticals, Inc.) において開示されたもの（参照によって本明細書中に組み込まれる）、GLP-1アゴニスト、例えばWO 00/42026 (Novo Nordisk A/SおよびAgouron Pharmaceuticals.Inc)において開示されたもの（参照によって本明細書中に組み込まれる）、DPP-IV(ジペプチジルペプチダーゼ-IV) 阻害剤、PTPase（タンパク質チロシンホスファターゼ）阻害剤、糖新生および／またはグリコーゲン分解の刺激に関与した肝臓酵素の阻害剤、グルコース取り込み修飾因子、GSK-3（グリコーゲン シンターゼ キナーゼ-3）阻害剤、脂質代謝を修飾する化合物、例えば、抗高脂血症剤および抗脂血剤、食物摂取量を低下させる化合物、およびPPAR（ペルオキシソーム増殖因子に活性化された受容体）およびRXR（レチノイドX受容体）アゴニスト、例えばALRT-268、LG-1268またはLG-1069に含まれる。
【０１５０】
定義
「desB30インスリン」、「desB30ヒトインスリン」は、B30アミノ酸残基を欠く天然のインスリンまたはその類似体を意味する。同様に、「desB29desB30インスリン」または「desB29desB30ヒトインスリン」は、B29およびB30アミノ酸残基を欠く天然のインスリンまたはその類似体を意味する。
【０１５１】
「B(1-29)」は、B30アミノ酸残基を欠く天然のインスリンB鎖またはその類似体を意味する。「A(1-21)」は、天然のインスリンA鎖またはその類似体を意味する。
【０１５２】
「B1」、「A1」などは、それぞれインスリンのB鎖における位置1(N末端側から数えて)のアミノ酸残基、およびインスリンのA鎖における位置1(N末端側から数えて)のアミノ酸残基を意味する。特定の位置におけるアミノ酸残基はまた、位置B1のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であることを意味する、例えばPheB1として表わされることもある。
【０１５３】
本明細書中に使用された「インスリン」とは、CysA7とCysB7との間、およびCysA20とCysB19との間にジスルフィド架橋をもち、かつCysA6とCysA11との間に内部ジスルフィド架橋をもつヒトインスリン、ブタインスリンならびにウシインスリンを意味する。
【０１５４】
本明細書中で使用された「インスリン類似体」とは、天然に生じるインスリンの構造、例えばヒトインスリンの構造から、天然のインスリンにおいて生じる少なくとも1つのアミノ酸残基を欠失および／または置換することによって、および／または少なくとも1つのアミノ酸残基を付加することによって、正式に誘導され得る分子構造を有するポリペプチドを意味する。付加および／または置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基または他の天然に生じるアミノ酸残基または純粋に合成されたアミノ酸残基のいずれにもなり得る。
【０１５５】
インスリン類似体は、B鎖の位置28が天然のPro残基からAsp, LysまたはIleの一つに修飾されたものであってもよい。他の側面において、位置B29のLysは、Proに修飾される。一つの側面において、B30はLysであってもよく、B29はCys、Met、ArgおよびLysを除く任意のコード可能なアミノ酸であってもよい。また、位置A21のAsnは、Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、TyrまたはVal、特にGly、Ala、Ser、またはThrおよび好ましくはGlyに修飾されてもよい。さらに、位置B3のAsnは、LysまたはAspに修飾されてもよい。インスリン類似体のさらなる例は、desB30ヒトインスリン、desB30ヒトインスリン類似体、B1およびB2の一つまたは両方が欠失したインスリン類似体、A鎖および／またはB鎖がN末端の伸長を有するインスリン類似体、ならびにA鎖および／またはB鎖がC末端の伸長を有するインスリン類似体である。さらなるインスリン類似体はこのようなものである、従って、1つまたは2つのArgが位置B1に付加されてもよい。また、一以上のB26〜B30が削除されてもよい。 
本明細書中で使用された「インスリン誘導体」は、例えば、インスリンバックボーンの一以上の位置に側鎖を導入することによって、あるいはインスリン内のアミノ酸残基の群を酸化または還元させることによって、あるいは遊離のカルボキシル基をエステル基に転換することによって、あるいは遊離のアミノ基またはヒドロキシ基をアシル化することによって、化学的に修飾された天然に生じるインスリンまたはインスリン類似体を意味する。
【０１５６】
表現「コード可能なアミノ酸」または「コード可能なアミノ酸残基」は、ヌクレオチドのトリプレット(「コドン」)によってコード化され得るアミノ酸またはアミノ酸残基を示すために使用される。
【０１５７】
α-Aspは、-HNCH(CO-)CH2COOHのL型である。
【０１５８】
β-Aspは、-HNCH(COOH)CH2CO-のL型である。
【０１５９】
α-Gluは、-HNCH(CO-)CH2CH2COOHのL型である。
【０１６０】
γ-Gluは、-HNCH(COOH)CH2CH2CO-のL型である。
【０１６１】
表現「側鎖においてカルボン酸基をもつアミノ酸残基」は、Asp、GluおよびhGluのようなアミノ酸残基を意味する。アミノ酸はL-またはD-配置のいずれであってもよい。何も指定されない場合、アミノ酸残基はL配置にあると理解される。
【０１６２】
表現「中性の側鎖を有するアミノ酸残基」は、Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro、Ser、Thr、Cys、Met、Tyr、AsnおよびGlnのようなアミノ酸残基を意味する。
【０１６３】
本発明によるインスリン誘導体が「生理学的pH値で可溶性」であると述べられるとき、それは、インスリン誘導体が生理学的pH値で完全に溶解されるインスリン組成物を調製するために使用され得ることを意味する。このような優れた溶解性は、インスリン誘導体単独の固有の特性であっても、あるいはインスリン誘導体とビヒクル内に含まれる一以上の成分との間の有効な相互作用の結果であってもよい。
【０１６４】
以下の略語が、明細書および例において使用された：
Aad: アルファ-アミノ-アジピン酸 (ホモグルタミン酸) 
Bzl=Bn: ベンジル 
CN: アルファ-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 
DIEA: N,N-ジイソプロピルエチルアミン 
DMF: N,N-ジメチルホルムアミド 
IDA: イミノ二酢酸 
Sar: サルコシン(N-メチル-グリシン)
tBu: tert-ブチル 
TSTU: O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
THF: テトラヒドロフラン
EtOAc: 酢酸エチル
DIPEA: N,N-ジイソプロピルエチルアミン
HOAt: 1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール
TEA: トリエチルアミン
SA: シナピン酸
Su: スクシンイミジル=2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル
TFA: トリフルオル酢酸
DCM: ジクロロメタン
DMSO: ジメチルスルホキシド
PEG: ポリエチレングリコール
PBG: ポリ-1,4-ブチレングリコール
PPG: ポリ-1,3-プロピレングリコール
TLC: 薄層クロマトグラフィー
RT: 室温
「脂肪二酸」は、少なくとも2つの炭素原子を有する、飽和または不飽和の直鎖または枝分れしたジカルボン酸を意味する。脂肪二酸の制限のない例は、コハク酸、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸およびオクタデカン二酸である。
【０１６５】
本明細書中に引用された公開、特許出願、および特許を含む全ての参照文献は、参照によって明細書中にその全体が組み込まれる。また、同じ程度に、各参照文献は、参照によって組み込まれるために個別かつ具体的に示され、本明細書中にその全体において示された（法律によって認められた最大限まで）。 
見出しおよび副見出しが便宜的に本明細書中で使用されるが、多少なりとも本発明を制限するように解釈されるべきではない。
【０１６６】
任意かつ全ての例の使用、または本明細書中に与えられた例示的文言（「例えば」、「のような」等々）は、単によりよく本発明を照らすためのものであって、別の項でクレームされない限り本発明の範囲の制限をもたらすものではない。明細書中の文言は、本発明の実施に必要なものとして、あらゆるクレームされていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。 
特許文献の引用および組み込みが便宜的に行われるが、これらの特許文献の妥当性、特許性および／または強制可能性のあらゆる視点を反映しない。
【０１６７】
本発明には、準拠法によって認められるように本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題事項の全ての修飾物および等価物が含まれる。
【例】
【０１６８】
以下の例および一般的手順は、明細書中および合成手順の中で同定された中間体化合物および最終生産物を意味する。本発明の化合物の調製は、以下の例を使用して詳細に記載されるが、記載された化学反応は、本発明の化合物の調製に対するその一般的適用可能性の観点において開示される。時には、本反応は、本発明の開示された範囲内に含まれた各化合物に記載されたように適用されなくてもよい。これが起こる化合物は当業者によって容易に理解されるであろう。これらの場合において、反応は、当業者に周知の従来の修飾、すなわち、干渉基の適切な保護によって、他の従来試薬への変更によって、あるいは反応条件の日常的修飾によってうまく行われ得る。代わりに、本明細書中に開示された他の反応またはその他の従来法が本発明の対応する化合物の調製に適用可能であろう。全ての調製的方法において、全ての開始物質は既知であるか、または既知の開始物質から容易に調製され得る。全ての温度は摂氏で示され、かつ他に示されない限り、全ての部およびパーセンテージは、収量に言及するときには重量割合であり、溶剤および溶出液に言及するときには体積割合である。
【０１６９】
本発明の化合物は、当該技術内で典型的である一以上の以下の手順を使用することによって精製され得る。これらの手順は、必要であれば、勾配、pH、塩、濃度、流速、カラムなどに関して修飾され得る。対象のインスリンの不純物プロファイル、溶解度などといった因子に依存して、これらの修飾は容易に認識され得、かつ当業者によって作成され得る。
【０１７０】
酸性HPLCまたは脱塩後、化合物は純粋な画分の凍結乾燥によって単離される。
【０１７１】
中性HPLCまたは陰イオン交換クロマトグラフィーの後、化合物は、脱塩されるか、等電的pHで沈殿されるか、または酸性HPLCによって精製される。
【０１７２】
典型的な精製手順：
HPLCシステムは、以下のModel 215 Liquid handler、Model 322-H2 Pump および Model 155 UV DectorからなるGilsonシステムである。検出は、典型的には210nmおよび280nmである。
【０１７３】
Akta Purifier FPLC システム (Amersham Biosciences) は、以下のModel P-900 Pump、Model UV-900 UV 検出器、Model pH/C-900 pH および導電率検出器、Model Frac-950 Frctionコレクターからなる。UV 検出は、典型的には214 nm、254 nmおよび276 nmである。
【０１７４】
酸性 HPLC：
カラム：            Macherey-Nagel SP 250/21 Nucleusil 300-7 C4
流速：              8 ml/分
緩衝液 A：          アセトニトリル中0.1% TFA 
緩衝液 B：          水中0.1% TFA
勾配：              0.0〜5.0分：        10% A
5.00〜30.0分：      10% A〜90% A
30.0〜35.0分：      90% A
35.0〜40.0分：      100% A
中性 HPLC：
カラム：            Phenomenex, Jupiter, C4 5μm 250×10.00 mm, 300Å
流速：              6 ml/分
緩衝液 A：          5 mM TRIS, 7.5 mM (NH4)2SO4, pH=7.3, 20% CH3CN
緩衝液 B：          60% CH3CN, 40% 水
勾配：              0〜5分：10% B
5〜35分：10〜60% B
35〜39分：60% B
39〜40分：70% B
40〜43.5分：70% B
陰イオン交換クロマトグラフィー：
カラム：            RessourceQ, 1 ml
流速：              6 ml/分
緩衝液 A：          0.09% NH4HCO3, 0.25% NH4OAc, 42.5% エタノール pH 8.4
緩衝液 B：          0.09% NH4HCO3, 2.5% NH4OAc, 42.5% エタノール pH 8.4
勾配：              30カラム体積中100% A〜100% B
脱塩：
カラム：            HiPrep 26/10
流速：              10 ml/分, 6カラム体積
緩衝液：            10 mM NH4HCO3
分析手段：
方法１：
Two Waters 510 HPLC ポンプ
Waters 2487 Dual λ吸光度検出器
緩衝液 A：              アセトニトリル中0.1% TFA
緩衝液 B：              水中0.1% TFA
流速：                  1.5 ml/分
勾配：                  1〜17分： 25% B〜85% B、17〜22分：85% B、22〜23分： 85% B〜25% B、23〜30分 25% B、30〜31分 25%B流速：0.15 ml/分。
【０１７５】
カラム：                C4 5μ  150×4.60 mm Phenomenex (Jupiter)
検出：                  UV 214 nm.
方法２：
Two Waters 510 HPLC ポンプ
Waters 2487 Dual λ吸光度検出器
緩衝液 A：              0.1% TFA, 10% CH3CN, 89.9%水.
緩衝液 B：              0.1% TFA, 80% CH3CN, 19.9%水
流速：                  1.5 ml/分.
勾配：                  0〜17分：20%〜90%B、17〜21分 90%B.
カラム：                C4 5μ 150×4.60mm Phenomenex (Jupiter), 40℃で維持.
検出：                  UV 214 nm.
方法３：Two Waters 510 HPLC ポンプ
Waters 486 整調可能な吸光度検出器
Waters 717 自動サンプラー
カラム：                C4 5μ  150×4_60mm Phenomenex (Jupiter).
注入：                  20μl.
緩衝液 A：              80% 0,0125 M Tris, 0,0187 M (NH4)2SO4 pH=7, 20% CH3CN.
緩衝液 B：              80% CH3CN, 20%水.
流速：                  1.5 ml/分.
勾配：                  0分 5% B → 20分 55% B → 22分 80% B → 24分 80% B → 25分 5% B 32分 5% B.
検出：                  UV 214 nm.
方法４：
Two Waters 510 HPLC ポンプ
Waters 2487 Dual λ吸光度検出器
カラム：                C4 5μ  150×4.60mm Phenomenex (Jupiter).
注入：                  20 μl
緩衝液 A：              80% 0,0125 M Tris, 0,0187 M (NH4)2SO4 pH=7,  20% CH3CN
緩衝液 B：              80% CH3CN, 20%水
流速：                  1.5 ml/分
勾配：                  0分 10% B → 20分 50% B → 22分 60% B → 23分 10% B → 30分 10% B → 31分 10% B 流速 0.15分
検出：                  214 nm
方法５：
Waters 2695 分離モジュール
Waters 996 光ダイオードアレイ検出器
カラム：                C4 5μ  150×4.60mm Phenomenex (Jupiter).
注入：                  25μl
緩衝液 A：              80% 0.01 M Tris, 0.015 M (NH4)2SO4 pH=7.3; 20% CH3CN
緩衝液 B：              20%水; 80% CH3CN
流速：                  1.5 ml/分
勾配：                  1〜20分： 5〜50% B, 20〜22分： 50〜60% B, 22〜23分： 60〜5% B, 23〜30分 0%B 30〜31分 0〜5%B, 流速：0.15 ml/分.
検出：                  214 nm
方法６：
Waters 2795 分離モジュール
Waters 2996 光ダイオードアレイ検出器
Waters Micromass ZQ 4000 エレクトロスプレー質量分光計
LC-方法：
カラム：                Phenomenex, Jupiter 5μ C4 300Å 50×4.60 mm
緩衝液 A：              水中0.1% TFA
緩衝液 B：              CH3CN
流速：                  1 ml/分
勾配：                  0〜7.5分： 10〜90% B
7.5〜8.5分： 90〜10%B
8.5〜9.5分 10% B
9.5〜10.00分    10% B, 流速：0.1 ml/分
MS 方法：                Mw：500〜2000 ES+
Cone Voltage 60V
Scantime 1
Interscan delay： 0.1
方法７：
Agilent 1100 シリーズ
カラム：                GraceVydac Protein C4, 5μm 4.6×250mm (Cat# 214TP54)
緩衝液 A：              10 mM Tris, 15 mM (NH4)2SO4, 水中20% CH3CN  pH 7.3
緩衝液 B：              CH3CN中20%水
流速：                  1.5 ml/分
勾配：                  1〜20分： 10% B〜50% B, 20〜22分：50% B〜60% B、22〜23分：60% B〜10% B、23〜30分 10% B 30〜31分 10%B, 流速 0,15 ml/分
検出：                  214 nm
方法８： HPLC-MS
以下の装置が使用される：
・Hewlett Packardシリーズ1100 G1312A Bin Pump
・Hewlett Packardシリーズ1100 G13 15A DADダイオードアレイ検出器
・Sciex3000 トリプルクオドロポール(triplequadropole)質量分光計
・Gilson 215マイクロ注入器
・Sedex55蒸発光散乱検出器
Pumpおよび検出器は、マッキントッシュ(登録商標)G3コンピューター上で作動するMassChrom 1.1.1ソフトウェアによって制御される。Gilson Unipoint Version 1.90は、自動注入器を制御する。
【０１７６】
HPLCポンプは、以下のものを含む二つの溶出貯蔵容器に接続される：
A：      水中0.01% TFA
B：      アセトニトリル中0.01% TFA
その分析は、適切な体積のサンプル（好ましくは10μl）をカラム上に注入することによって、室温で行なわれる（サンプルはアセトニトリルの勾配で溶出される）。カラムからの溶出液は、フロースプリッターに合うUV検出器を通過したカラムからの溶出液は、API 3000スペクトロメータのAPI Turboイオンスプレーインターフェースを通して約30μl/分(1/50)を通過した。残りの1.48ml/分(49/50)は、ELS検出器を通過する。
【０１７７】
HPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定は、次の表に与えられる。
【表１】
0005410020.tif 000013
【０１７８】
方法９：HPLC-MS
・Hewlett Packardシリーズ1100 G1312A Bin Pump
・Hewlett Packardシリーズ1100カラムコンパートメント
・Hewlett Packardシリーズ1100 G1315A DAD ダイオードアレイ検出器 
・Hewlett Packardシリーズ1100 MSD
・Sedere 75 蒸発光散乱検出器
装置は、HP Chemstationソフトウェアによって制御された。
【０１７９】
HPLCポンプは、以下のものを含む二つの溶出貯蔵容器に接続される。 
A： 水中0.01%TFA
B： アセトニトリル中0.01%TFA
分析は、アセトニトリルの勾配で溶出されるカラム上に適切な体積のサンプル(好ましくは1μl)を注入することによって40℃で行われる。
【０１８０】
使用されるHPLC条件、検出器の設定および質量分析計の設定は、以下に与えられる。
【０１８１】
カラム：            Waters Xterra MS C-18×3mm id、5μm
勾配：              1.5ml/分で7.5分間にわたる5％〜100%線形のアセトニトリル
検出：              210nm (DADからの類似出力)
ELS (ELSからの類似出力)
DAD後、流れを分岐させ、ELSに約1ml/分およびMSに0.5ml/分を与える。
【０１８２】
MALDI-TOF-MSスペクトルは、シンナピン酸のマトリックス、窒素レーザーおよび陽イオン検出器を使用して、線形モードのBruker Autoflex II TOF/TOFオペレーティング上で記録された。加速電圧：20kV。
【０１８３】
例１
NεB29-(3-[2-{2-(2-[ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルタミル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}エトキシ]-プロピノイル) desB30ヒトインスリンの合成
【化１２】
0005410020.tif 000014
【０１８４】
DesB30ヒトインスリンを(400mg、0.070 mmol)、室温で100 mM Na2CO3(5ml、pH 10.2)中に溶解した。スクシンイミジル 3-[2-{2-(2-[ω-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルタミル-α-tert-ブチル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピノイル(72mg、0.084 mmol、下記に記載されたように調製)を、アセトニトリル(5ml)に溶解させ、続いてインスリン溶液に加えた。30分後、0.2Mメチルアミン(0.5ml)を加えた。pHを、HClで5.5に調節した。また、等電の沈殿物を遠心分離によって収集し、in vacuoで乾燥させ、345mgを得た。カップリング収量は64%(RP-HPLC、C4カラム；緩衝液A：0.1%TFA水中10％MeCN、  緩衝液B：0.1%TFA水中80% MeCN；  16分間の勾配20%〜90%B)。保護生成物をTFA(10ml)中に溶解し、30分間にわたって放置し、in vacuoで蒸発させた。粗生成物を水中で溶解し、凍結乾燥した。
【０１８５】
NεB29-(3-[2-{2-(2-[ω-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルタミル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-プロピノイル) desB30ヒトを、C4カラム上のRP-HPLCによって精製し（緩衝液A：20% EtOH＋0.1%TFA、  緩衝液B：80% EtOH＋0.1%TFA；  勾配15〜60% B）、  続けてC4カラム上のHPLCによって精製した（緩衝液A：10 mM Tris＋20%EtOH中15 mM硫酸アンモニウム、pH 7.3、緩衝液B：80% EtOH、勾配15〜60%B）。収集画分を、70%アセトニトリル＋0.1%TFAを含むSepPak上で脱塩させ、アンモニアの付加によって中和後、凍結乾燥した。最適化されていない収量は60mg、13％であった。HPLCによって評価された純度は98%以上であった。MALDI-TOF-MS 6349、C285H432N66O86S6は6351を必要とする。
【０１８６】
スクシンミジル 3-[2-{2-(2-[ω-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グリタミル-α-tert-ブチル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-プロピオニル）の調製。
【０１８７】
ヘキサデカン二酸(40.0g、140 mmol)をトルエン(250ml)中で縣濁し、混合液を加熱して還流させた。N,N-ジメチルホルムアミドジ-tert-ブチルアセタール(76.3g、375 mmol)を、4時間かけて滴下した。混合液を終夜還流させた。溶媒を50℃でin vacuoで除去し、粗製物質をDCM/AcOEt(500ml、1：1)に縣濁させ、15分間撹拌した。固形物をDCM(200ml)でろ過および粉砕して収集した。ろ過液をin vacuoで蒸発させ、粗製のモノ-tert-ブチルヘキサデカンジオアート、30グラムを得た。この物質をDCM（50ml）中に縣濁し、10分間にわたって氷上で冷却、ろ過した。溶媒をin vacuoで除去し、25グラムの粗製のモノ-tert-ブチルヘキサデカンジオアートを放出させ、ヘプタン(200ml)から再結晶化させ、モノ-tert -ブチルヘキサデカンジオアート、15.9g(33%)を得た。再結晶化に代えて、モノエステルを、AcOEt/ヘプタン内のシリカクロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１８８】
1H-NMR(CDCl3)δ:2.35 (t, 2H), 2.20 (t, 2H), 1.65-1.55 (m, 4H), 1.44 (s, 9H), 1.34-1.20 (m, 20H). 
モノtert-ブチルエステル(2g、5.8 mmol)を、THF(20ml)中に溶解し、TSTU(2.1g、7.0 mmol)およびDIEA(1.2ml、7.0 mmol)で処理し、終夜撹拌した。混合液をろ過し、ろ液をin vacuoで蒸発させた。残留物をAcOEt中に溶解させ、冷却された0.1M HClおよび水で２回洗浄した。MgSO4での乾燥およびIn vacuoでの蒸発によって、スクシンイミジルtert-ブチルヘキサデカンジオアート、2.02g (79%)を得た。
【０１８９】
1H-NMR (CDCl3) δ: 2.84 (s, 4H), 2.60 (t, 2H), 2.20 (t, 2H), 1.74 (p, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.40 (m, 2H), 1.30-1.20 (m, 18H)。
【０１９０】
スクシンイミジルtert-ブチルヘキサデカンジオアート(1g、2.27 mmol)を、DMF(15ml)中に溶解し、L-Glu-OtBu(0.51g、2.5 mmol)およびDIEA(0.58ml、3.41 mmol)で処理し、混合液を終夜撹拌した。溶媒をin vacuoで蒸発し、粗生成物をAcOEt中に溶解させ、水およびかん水とともに0.2M HClで２回洗浄した。MgSO4での乾燥およびin vacuoでの蒸発は、ω-tert-ブチルカルボキシ-ペンタデカノイル-L-グルタミル-α-tert-ブチルエステル、1.2g(100%)を得た。
【０１９１】
1H-NMR (CDCl3)δ： 6.25 (d, 1H), 4.53 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.21 (m, 4H), 1.92 (m, 1H), 1.58 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.43-1.22 (m, 18H)。
【０１９２】
15-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカニル-L-グルタミル-α-tert-ブチルエステル(1.2g、2.27 mmol)をTHF(15ml)中で溶解し、TSTU(0.82g、2.72 mmol)およびDIEA(0.47ml、2.72 mmol)で処理し、終夜撹拌した。混合液をろ過し、ろ液をin vacuoで蒸発させた。残留物をAcOEt中で溶解させ、冷却された0.1M HClおよび水で２回洗浄した。MgSO4での乾燥およびin vacuoでの蒸発によって、スクシンイミジルω-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカニル-L-グルムタイル-α-tert-ブチルエステル、1.30g(92%)を得た。
【０１９３】
1H-NMR (CDCl3) δ： 6.17 (d, 1H), 4.60 (m, 1H), 2.84 (s, 4H), 2.72 (m, 1H), 2.64 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.20 (m, 4H), 2.08 (m, 1H), 1.6 (m, 4H), 1.47 (s, 9H), 1.43 (s, 9H), 1.33-1.21 (m, 20 H)。
【０１９４】
スクシンイミジル15-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカニル-L-グルムタイル-α-tert-ブチルエステル(109mg、0.17 mmol)を、DCM(2ml)中に溶解し、3-(2-{2-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオン酸(51mg、0.19 mmol、Quanta Biodesign, OH, USA)およびDIEA(45μL、0.26 mmol)で処理した。混合液を終夜撹拌し、かつin vacuoで蒸発させた。残留液をAcOEt中に溶解し、冷却された0.2M HCl、水およびかん水で２回洗浄した。MgSO4での乾燥およびin vacuoでの蒸発によって、3-[2-{2-(2-[ω-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルムタイル-α-tert-ブチル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピオン酸、119mg(88%)を得た。
【０１９５】
1H-NMR (CDCl3) δ： 7.01 (t, 1H), 6.58 (d, 1H), 4.42 (m, 1H), 3.76 (d, 2H), 3.62 (m, 16H), 3.55 (t, 2H), 3.42 (m, 1H), 2.58 (t, 2H), 2.28 (m, 2H), 2.17 (m, 2H), 2.11 (m, 1H), 1.94 (m, 1H), 1.57 (m, 4H), 1.43 (s, 9H), 1.42 (s, 9H), 1.22 (m, 20 H)。
【０１９６】
3-[2-{2-(2-[ω-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルムタイル-α-tert-ブチル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピオン酸(119mg、0.15 mmol)をTHF(2ml)中に溶解し、TSTU(55mg、018 mmol)およびDIEA(31μL、0.18 mmol)で処理し、終夜にわたって撹拌した。混合液をろ過し、ろ液をin vacuoで蒸発させた。残留液をAcOEtに溶解し、冷却された0.1M HClおよび水で２回洗浄した。MgSO4での乾燥およびin vacuoでの蒸発によって、スクシンイミジル 3-[2-{2-(2-[ω-tert-ブチル-カルボキシ-ペンタデカノイル-γ-グルタミル-α-tert-ブチル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]プロピノイル、123mg(92%)を得た。
【０１９７】
1H-NMR (CDCl3)TM : 6.64 (t, 1H), 6.54 (d, 1H), 4.35 (m, 1H), 3.80 (d, 2H), 3.59 (m, 16H), 3.51 (t, 2H), 3.39 (m, 1H), 2.85 (t, 2H), 2.79 (s, 4H), 2.22 (m, 2H), 2.15 (m, 2H), 2.08 (m, 1H), 1.90 (m, 1H), 1.55 (m, 4H), 1.41 (s, 9H), 1.39 (s, 9H), 1.20 (m, 20 H).
例２
NεB29-(3-[2-{2-(2-[ω-カルボキシ-ヘプタデカノイル-γ-グルタミル-(2-アミノ-エトキシ)]-エトキシ)-エトキシ}-エトキシ]-プロピノイル) desB30ヒトインスリンの合成
【化１３】
0005410020.tif 000015
【０１９８】
この化合物を、L-GluOtBuとtert-ブチルスクシンイミジルオクタデカンジオアートとの反応を介して例１でのアナロジーにおいて調製後、TSTUでの活性化、TSTUでの活性化、3-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオン酸との反応、TSTUでの活性化、DesB30ヒトインスリンとのカップリングおよびTFAによる脱保護。
【０１９９】
MALDI-TOF-MS 6380、計算値6379．
例３
NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミル desB30ヒトインスリンの合成
【化１４】
0005410020.tif 000016
【０２００】
工程１：ω-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-ペンタデカン酸tert-ブチルエステル
【化１５】
0005410020.tif 000017
【０２０１】
ヘキサデカン二酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル(0.12g、0.283 mmol)をDMF(2.5ml)中に溶解させ、3-(2-{2-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオン酸(75mg、0.283 mmol)を加え、混合液を16時間にわたってrtで撹拌した。反応混合液を、0.038mmolスケール上で行なわれた他の反応液と混合した。AcOEt(25ml)を加え、溶液を酸性水(15ml＋300μlの0.1N HCl)および水(3×15ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、真空下で濃縮して、いくつかのDCMを加え、再び2回濃縮させ、白色の脂を含んだ残留物(0.15g、79%)を得た。
【０２０２】
HPLC-MSm/z： 590(M+1)、Rt=5.24分.
1H-NMR(CDCl3、400 MHz)δ6.48(br、1H)、3.79(t、2H)、3.6-3.7(m、14H)、3.47(m、2H)、2.60(t、2H)、2.17-2.22(m、4H)、1.57-1.64(m、4H)、1.44(s、9H)、1.2-1.3(m、20H)。
【０２０３】
工程２：2-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-tert-ブトキシカルボニルペンタデカノイルアミノ)エトキシ]-エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニルアミノ}ペンタン二酸 5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステル
【化１６】
0005410020.tif 000018
【０２０４】
ヘキサデカン酸tert-ブチルエステル(0.15g、0.254 mmol)をDMF(2.5ml)中に溶解させ、HOBt(48mg、0.356 mmol)およびEDAC(63mg、0.331 mmol)を加えた。溶液を30分にわたってrtで撹拌し、H-Glu-(OBzl)-OtBu(117mg、0.356 mmol)を加えた。反応液を16時間にわたってrtで撹拌し、AcOEt(25ml)を加えた。溶液を、水(10ml)、0.2N HCl(3×10ml)、1：1塩、NaCl/水(3×10ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濃縮して油(0.24g)を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(シリカ、95：5 DCM/メタノール)によって精製し、油0.2gを得た。
【０２０５】
HPLC-MS(方法9)： m/z： 866(M+1)、Rt=6.99-7.09分
1H-NMR(CDCl3、400MHz)(7.34-7.38(m、5H)、6.83(d、1H)、6.10(br、1H)、5.11(s、2H)、4.50-4.55(m、1H)、3.71-3.75(m、2H)、3.60-3.65(m、12H)、3.55(t、2H)、3.36-3.42(m、2H)、2.36-2.51(m、4H)、) 2.14-2.24(m、5H)、1.93-2.00(m、1H)、1.57-1.63(m、4H)、1.46(s、9H)、1.44(s、9H)、1.2-1.3(m、20H)。
【０２０６】
工程３：2-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-tert-ブトキシカルボニル-ペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニルアミノ}ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル
【化１７】
0005410020.tif 000019
【０２０７】
2-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-tert-ブトキシカルボニルペンタデカノイルアミノ)エトキシ]-エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニルアミノ}ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステル(0.2g、0.23 mmol)を、THF中で溶解させた。フラスコをN2で充填させ、パラジウム(0.3g、炭素上10％、50%水)を加えた。フラスコはH2で充填したバルーンを備えている。その混合液を16時間にわたってrtで撹拌し、セライトを通してろ過し、THFで洗浄した。ろ液を濃縮して油(0.16g、89%)を得た。
【０２０８】
HPLC-MS(方法9) m/z： 775(M+1)、Rt=5.46分。
【０２０９】
工程４：2-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-tert-ブトキシカルボニル-ペンタデカノイルアミノ)エトキシ]-エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニルアミノ}ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル
【化１８】
0005410020.tif 000020
【０２１０】
2-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-tert-ブトキシカルボニル-ペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニルアミノ}ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(0.16g、0.21 mmol)を、DMF(2ml)中に溶解させ、THF(4ml)およびDIEA(42μl(0.25 mmol))を加えた。前記溶液を0℃で冷却し、TSTU(74mg、0.21 mmol)を加えた。反応液をrtで終夜撹拌した。溶媒を真空下で取り除き、AcOEt(25ml)を加えた。前記混合液を0.2N HCl(3×10ml)、塩NaHCO3(3×10ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、真空下で濃縮して油(0.16g)を得た。生成物をフラッシュクロマトグラフィー(silica, 95:5 DCM/メタノール)によって精製し、油（0.11g, 61%）を得た。
【０２１１】
HPLC-MS(方法9) m/z： 872(M+1)、Rt=5.67分。
【０２１２】
工程５：NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリン；
【化１９】
0005410020.tif 000021
【０２１３】
2-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-tert-ブトキシカルボニル-ペンタデカノイルアミノ)エトキシ]-エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニルアミノ}ペンタン二酸α-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステルを、例１において記載されたのと同様の態様においてdesB30インスリンにカップリングさせた。中間生成物をTFAで処理する前に調製用HPLC(C18-5cm直径)によって精製した。最終生産物を調製用HPLC(C4、2cm直径)その後(C4、1cm直径)(20〜60% アセトニトリル)によって精製した。
【０２１４】
MALDI-TOF-MS： 6355、計算値：6351
例４
NεB29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-ヘプタデカノイル-α-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成
【化２０】
0005410020.tif 000022
【０２１５】
この化合物を、H2N(CH2CH2O)4CH2CH2COOtBu(Quanta Biodesign, OH, USA)とモノ-スクシンイミジルオクタデカンジオエートとの反応、続いて、TSTUでの活性化、L-Glu-OtBuとの反応、TSTUでの活性化、DesB30ヒトインスリンとのカップリング、およびTFAによる脱保護を介して例１でのアナロジーにおいて調製した。
【０２１６】
LCMS 6380(方法6)は6379を計算した。
【０２１７】
例５
NεB29-(ω-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-ヘプタデカノイル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成
【化２１】
0005410020.tif 000023
【０２１８】
この化合物を、H2N(CH2CH2O)4CH2CH2COOtBu(Quanta Biodesign, OH, USA)とモノ-スクシンイミジルオクタデカンジオエートとの反応、続いて、TSTUでの活性化、L-Glu-OtBuとの反応、TSTUでの活性化、DesB30ヒトインスリンとのカップリング、およびTFAによる脱保護を介して例１でのアナロジーにおいて調製した。
【０２１９】
LCMS 6378.4、方法６、計算値6379.4. 
例６
NεB29-3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ヘプタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミルdesB30ヒトインスリン
【化２２】
0005410020.tif 000024
【０２２０】
前記化合物を、開始物質としてオクタデカン二酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルを使用して、NεB29-3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニル-γ-グルタミルdesB30インスリンと同じ手法において調製した。
【０２２１】
工程１：ω-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシ-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-ヘプタデカン酸tert-ブチルエステル
【化２３】
0005410020.tif 000025
HPLC-MS(方法9)m/z： 618(M+1)、Rt=5.92分.
1H-NMR(CDCl3、300MHz)δ6.46(br、1H)、3.79(t、2H)、3.61-3.69(m、14H)、3.44-3.49(m、2H)、2.60(t、2H)、2.16-2.22(m、4H)、1.51-1.68(m、4H)、1.44(s、9H)、1.19-1.36(m、24H)。
【０２２２】
工程２：2-{3-[2-(2-{2-[2-(17-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]-エトキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピオニルアミノ}ペンタン二酸5-ベンジルエステル1-tert-ブチルエステル
【化２４】
0005410020.tif 000026
【０２２３】
HPLC-MS(方法9)m/z： 894(M+1)、Rt=7.82〜7.89分.
1H-NMR(CDCl3、300MHz)δ7.29-7.42(m、5H)、6.83(d、1H)、6.13(br、1H)、5.11(s、2H)、4.46-4.59(m、1H)、3.68-3.81(m、2H)、3.57-3.68(m、12H)、3.55(t、2H)、3.39-3.49(m、2H)、2.32-2.55(m、4H)、) 2.12-2.28(m、5H)、1.86-2.07(m、1H)、1.51-1.68(m、4H)、1.46(s、9H)、1.44(s、9H)、1.17-1.36(m、24H)。
【０２２４】
工程３：2-{3-[2-(2-{2-[2-(17-tert-ブトキシカルボニルヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]-エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニルアミノ}ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル
【化２５】
0005410020.tif 000027
【０２２５】
HPLC-MS(方法9)m/z： 804(M+1)、Rt=5.81分.
工程４：2-{3-[2-(2-{2-[2-((-tert-ブトキシカルボニル-ヘプタデカノイルアミノ)エトキシ]-エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニルアミノ}ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル
【化２６】
0005410020.tif 000028
【０２２６】
HPLC-MS(方法9)m/z： 901(M+1)、Rt=6.00分.
1H-NMR(CDCl3、300MHz)δ6.94(d、1H)、6.15(br、1H)、4.55-4.62(m、1H)、3.71-3.79(m、2H)、3.59-3.71(m、12H)、3.55(t、2H)、3.42-3.47(m、2H)、2.84(s、4H)、2.58-2.79(m、2H)、2.52(t、2H)、)、2.24-2.41(m、1H)、2.13-2.24(m、4H)、2.04-2.10(m、1H)、1.51-1.70(m、4H)、1.48(s、9H)、1.44(s、9H)1.19-1.37(m、24H)。
【０２２７】
工程５：NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(17-カルボキシ-ヘプタンデカイノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルγ-グルタミル desB30ヒトインスリン。
【０２２８】
最終生成物を、HPLC(C18-5cm直径)によって精製した。  
HPLC-MS(方法9)m/z：1596.4(M+4/4)、計算値6379、Rt=4.05分。
【０２２９】
例７
NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[7-カルボキシヘプタノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]-エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリンの合成。
【化２７】
0005410020.tif 000029
【０２３０】
この化合物を、例１の合成について報告されたように同じ合成ステップを使用して調製した。
【０２３１】
工程１．N-(3-{2-[2-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピル)スクシンアミド酸
【化２８】
0005410020.tif 000030
【０２３２】
1-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-4,7,10 -トリオキサ-13-トリデカンアミン(5g)および無水コハク酸(1.98)からの調製によって、7gの粗生成物を与えた。 LCMS(方法6)： Rt 3.34分；m/z(M+1)421 計算値：421。
【０２３３】
工程２．7-[3-(2-{2-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)-プロポキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピルカルバモイル]-ヘプタン酸tert-ブチルエステル。
【化２９】
0005410020.tif 000031
【０２３４】
この化合物を、TFAによるN-(3-{2-[2-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-エトキシ]エトキシ}プロピル)スクシンアミド酸(1.56 mmol)の脱保護によって調製し、続いて、例８ 工程３に記載されたようにオクタン二酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(1.56 mmol)との反応を行った。 
粗生成物を、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)上で酸性HPLCを使用するGilson上で精製した。
【０２３５】
勾配：0.0〜4.0 分 20%A；4.0〜11.0分 20〜90% A；11〜16分 90%A。
【０２３６】
生成物を、15.0〜17.0分の画分において収集した。組み合わされた画分を蒸発させ、所望の生成物(0.78g)を得た。
【０２３７】
LCMS(方法9)： Rt 4.03分；m/z(M+1)533、計算値：533。
【０２３８】
工程３．7-{3-[2-(2-{3-[3-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニル)-プロピオニルアミノ]-プロポキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピルカルバモイル}-ヘプタン酸tert-ブチルエステル。
【化３０】
0005410020.tif 000032
【０２３９】
7-[3-(2-{2-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)-プロポキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピルカルバモイル]-ヘプタン酸tert-ブチルエステル(0.78g、1.46 mmol)を、例８ 工程４において記載されたようにTSTUによって活性化し、未精製の収量360mg、LCMS  方法6： Rt 4.40分；m/z(M+1)630；計算値：630．化合物をさらなる精製を行わずに使用した。
【０２４０】
工程４．NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[7-カルボキシヘプタノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]-エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン。
【化３１】
0005410020.tif 000033
【０２４１】
例８の工程６に続く調製によって、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225mm)上で酸性HPLCを使用するGilson上での精製後に0.78gの標的生成物をもたらした。勾配：0.0〜1.0分：30% CH3CN, 1.00〜15.0分：30〜50% CH3CN, 15.0〜20.0分：50% CH3CN： 流速：10ml/分。Rt=14.5〜16.0分。 
MALDI-TOF-MS(matrix SA)： m/z 6167；計算値6165． 
HPLC(方法5)；Rt 3.973分
例８
NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル)desB30ヒトインスリンの合成
【化３２】
0005410020.tif 000034
【０２４２】
工程１： N-{3-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-ブトキシ]-プロピル}スクシンアミド酸。
【化３３】
0005410020.tif 000035
【０２４３】
1-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-4,9-ジオキサ-12-ドデカンアミン (5.0g、16.45 mmol) を、THF(30 mL)中に溶解し、アセトニトリル(10 mL)中の無水コハク酸(1.81g、18.1 mmol)を加え、混合液を4時間にわたって60℃まで加熱し、続いてRTで終夜撹拌した。
【０２４４】
混合液を乾燥するまで蒸発させ、EtAc(50 mL)を加えた。
【０２４５】
EtAc相は、HCl(0.1M)で3回洗浄し、MgSO4で乾燥させ、続いて有機相を乾燥するまで蒸発させ、5.86g(88%)の高粘度の油を得た。
【０２４６】
LCMS(方法6)： Rt 2.86分；m/z(M+1)405．計算値：405.
この生成物を、さらなる精製を行わずに使用した。
【０２４７】
工程２．オクタン二酸酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル
【化３４】
0005410020.tif 000036
【０２４８】
オクタン二酸モノ-tert-ブチルエステル(3.14g、13.63 mmol)を、THF(100 mL)中に溶解させた。 TSTU(4.9g、16.3 mmol)を加え、pHをDIPEA(2.85 mL)で8.5に調節した。
【０２４９】
混合液を、窒素下で終夜撹拌し、乾燥するまで蒸発させ、EtAc(50 mL)中に溶解させ、続いてHCL(0.1M)で2回抽出した。有機相をMgSO4で乾燥させ、ろ過および蒸発させ、黄色味がかった油(5g、少量の溶剤を含む)を得た。
【０２５０】
LCMS(方法6)： Rt 6.56分；m/z(M+1)328．計算値：328。
【０２５１】
工程３： 7-(3-{4-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)ヘプタン酸tert-ブチルエステル
【化３５】
0005410020.tif 000037
【０２５２】
N-{3-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-ブトキシ]-プロピル}スクシンアミド酸(4.60g、11.37 mmol)を、RTで60分間にわたってTFA(20 mL)とともに撹拌し、蒸発後に残留物をDCM(30mL×2)とともに撹拌し、乾燥するまで蒸発させた。 
得られた油を、アセトニトリル(30 mL)中に溶解させ、かつDMF(20 mL)中のオクタン二酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(4.46g、13.6 mmol)を加えた。
【０２５３】
pHをDIPEAで8.5に調節し、混合液を窒素下で終夜撹拌した。混合液を乾燥するまで蒸発させ、EtAc(50 mL)中に再溶解させた。EtAc相を、HCl(0.1M)で3回抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過および蒸発させて(ろ過されて、わずかに黄色味がかった結晶油を得た(6.5g、溶媒残留物の含有)。
【０２５４】
LCMS(方法6)： Rt 4.31分；m/z(M+1)517．計算値：517．
粗生成物を、さらなる精製を行わずにさらなる反応のために使用した。
【０２５５】
工程４．2-[3-(3-{4-[3-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}-プロピルカルバモイル)-プロピオニルアミノ]ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル)。
【化３６】
0005410020.tif 000038
【０２５６】
7-(3-{4-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)ヘプタン酸tert-ブチルエステル(5.9g)、上述したものからの粗生成物を、THF(20 mL)中に溶解させ、TSTU(4.13g、13.7 mmol)をDMF(6 mL)と一緒に加え、pHをDIPEA(2.6 mL)で8.2に調節した。混合液を、窒素下で終夜撹拌した。
【０２５７】
混合液を蒸発させ、残留物をEtAc中に溶解させ、HCl(0.1M)で3回抽出した。 
有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、ろ液を蒸発させて油を得た。
【０２５８】
LCMS(方法6)： Rt 4.57分； m/z 614は活性化された酸に相当する。
【０２５９】
これをTHF(30 mL)中に溶解させ、pHをDIPEA(0.4 mL)で8.2に調節させ、H-glu-OtBu(1.7g、4.9 mmol)をDMF(10 mL)と一緒に加えた。
【０２６０】
混合液をRTで3時間にわたって撹拌し、ろ過後に蒸発を行い、高粘度の黄色油を得た。 
これを、上記に報告したようにEtAcおよびHCl(0.1M)の間で抽出し、得られた乾燥EtAc層は、蒸発させて3.5gの粗生成物を与えた。LCMS(方法6)： Rt 4.77分；m/z(M+1)702．
粗生成物を、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)上で酸性HPLCを使用してGilson上で精製した。
【０２６１】
勾配： 0.0〜10.0分 35%A；10.0〜25.0分 35〜80%A；25〜30分90%A；30〜35分100%A。
【０２６２】
生成物を、21〜22.5分の画分中に収集した。組み合わされた画分を蒸発させ、所望の生成物を得た(1.8g)。
【０２６３】
LCMS(方法6)： Rt 4.77分；m/z(M+1)702、計算値702。
【０２６４】
工程５：2-[3-(3-{4-[3-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニルアミノ]ペンタン2酸5-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル。
【化３７】
0005410020.tif 000039
【０２６５】
2-[3-(3-{4-[3-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}-プロピルカルバモイル)-プロピオニルアミノ]ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(1.5g、2.14 mmol)を、THF(20 mL)中に溶解し、pHはDIPEA(0.9 mL)で8.5に調節し、TSTU(0.83g、2.77 mmol)をDMF(5 mL)中に加えた。混合液を窒素下で終夜撹拌し、続いて蒸発させ、上述したようにEtAcとHClとの間で抽出し、1.75gの粗生成物を得た。
【０２６６】
LCMS(方法6)： Rt 5.10分；m/z(M+1)800、計算値：800。
【０２６７】
工程６．NεB29-(3-(3-{4-[3-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グリタミル) desB30ヒトインスリン：
【化３８】
0005410020.tif 000040
【０２６８】
2-[3-(3-{4-[3-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)-プロピオニルアミノ]ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル(0.255g、0.319 mmol)を、アセトニトリル(10 mL)中に溶解させ、Na2CO3溶液(10 mL、pH 10.3)中に溶解されたdesB30ヒトインスリン(1.82g)の溶液に添加し、pHをNaOH(0, 1M)で10.1に調節した。当該混合液を２時間にわたってRTで撹拌し、その後、pHをHCl(2M、3 mL)によって5.5に調節し、油性の結晶塊の沈殿物を得た。 
これを単離して水酢酸(1M)に溶解させ、凍結乾燥させた。
【０２６９】
得られた生成物を水中に溶解させ、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)上で酸性HPLCを使用するGilson上で精製した。 
勾配： 0.0〜5.0分 35%A；5.0〜25.0分 35〜80%A；25〜30分 90%A； 30〜35分 100%A. Rt 15分前後の画分を収集、混合および蒸発させた。 
生成物を、１時間にわたってRTで撹拌してTFA/DCM 1/1(20 mL)で処理し、続いて乾燥させるために蒸発させ、DCM 40 mL×2で逆抽出(stripping)させ、水中で溶解されかつ凍結乾燥された脱保護された生成物をもたらし、540mgの所望の生成物を与えた。
【０２７０】
MALDI.TOF-MS： m/z 6276.66；計算値6276．
HPLC(方法5)；Rt 10.19分.
例９
NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[9-カルボキシノナノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]エトキシ}-プロピルカルバモイル)プロピオニル) desB30ヒトインスリンの合成。
【化３９】
0005410020.tif 000041
【０２７１】
例７からの手順に従いつつ、二酸の部分を交換することによって生成物を与えた。
【０２７２】
0.114 mmolのdesB30インスリンを使用する例８における以下の工程６の調製は、0.96gの保護された化合物をもたらした。 
C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)上で酸性HPLCを使用するGilson精製。勾配：0.0〜1.0 分： 35%のCH3CN、1.00〜15.0分： 35〜55% CH3CN、15.0〜20.0分： 55% CH3CN  フロー： 10ml/分。Rt=12.5〜14.0分。 
脱保護 TFAの我々の手段は、凍結乾燥後に0.141gの無色の化合物を与えた。
【０２７３】
MALDI-TOF-MS(マトリックスSA)： m/z 6195；計算値6186 
HPLC(方法5)： Rt；4.094分.
デカンニ酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル。
【化４０】
0005410020.tif 000042
【０２７４】
例８の工程２において記載された調製は、さらなる精製を行わずに使用された5.57gの粗生成物を与えた。LCMS(方法6)： Rt 5.82分；m/z(M+1)356、計算値：355。
【０２７５】
例１０
NεB29-(3-(2-{2-[2-(9-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成。
【化４１】
0005410020.tif 000043
【０２７６】
調製は、例８において記載された方法論を使用して行われた。
【０２７７】
(S)-2-[3-(2-{2-[2-(9-tert-ブトキシカルボニルノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)-エチルカルバモイル)プロピオニルアミノ]ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(0.59g、0.876 mmol)を、TSTU、0.132g(0.171 mmol)で活性化させ、例８に記載されたように粗反応生成物をdesB30インスリン(0.154 mmol)と反応させた。
【０２７８】
これは、凍結乾燥され、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)上で酸性HPLCを使用するGilson上で精製された740 mgの油性沈殿物をもたらした。
【０２７９】
勾配： 0.0〜5.0 分 30%A；5.0〜20.0分 35〜50%A。
【０２８０】
105mgの標的化合物を単離した。MALDI.TOF-MS(マトリックス Cyano)： m/z 6245.9；計算値6243．
HPLC(方法5)；Rt 8.759分。
【０２８１】
N-{2-[2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-エトキシ]-エチル}-スクシンアミド酸。
【化４２】
0005410020.tif 000044
【０２８２】
1-(t-ブチルオキシカルボニルアミノ)-3,6-ジオキサ-8-オクタンアミン（5g, 20.16 mmol）および無水コハク酸(2.218g、22,18 mmol)からの調製は、著しく結晶化した高粘度の黄色油を与えた(6.5 g、収量98%)。LCMS(方法6)： Rt 2.99分；m/z(M+1)349；計算値：349。
【０２８３】
9-(2-{2-[2-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)ノナン酸tert-ブチルエステル
【化４３】
0005410020.tif 000045
【０２８４】
例８の工程３において記載されたように、デカン二酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(1.13g、3.45 mmol)およびN-{2-[2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-エトキシ]-エチル}-スクシンアミド酸(1g、2.84 mmol)の調製は、さらなる精製を行わずに使用された1.68gの粗生成物を与えた。 LCMS(方法6)： Rt 3.86分；m/z(M+1)489；計算値：489．
(S)-2-[3-(2-{2-[2-(9-tert-ブトキシカルボニルノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)-エチルカルバモイル)プロピオニルアミノ]ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル。
【化４４】
0005410020.tif 000046
【０２８５】
例８の工程４に記載された方法に従った9-(2-{2-[2-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)エトキシ]エトキシ}-エチルカルバモイル)ノナン酸tert-ブチルエステル(1.4g、2.86 mmol)およびglu-OtBu(0.87g、4.29 mmol)からの調製は、1.8gの粗生成物を与えた。 LCMS(方法6)： Rt 5.1分；m/z(M+1)674；計算値：674．
C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)上で酸性HPLCを使用するGilson精製、勾配：0.0〜10.0分： 35% CH3CN、10.00〜25.0分：35〜90% CH3CN、流速：10ml/分。Rt=20.0〜25.0分のフラクションを収集および乾燥させるために蒸発させ、0.590gの黄色油を得た。LCMS(方法6)： Rt 5.1分；m/z(M+1)674；計算値：674．
例１１
NεB29-(3-(3-{4-[3-(9-カルボキシノナノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}-プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成。
【化４５】
0005410020.tif 000047
【０２８６】
(S)-2-[3-(3-{4-[3-(9-tert-ブトキシカルボニルノナノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}-プロピルカルバモイル)プロピオニルアミノ]ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル(0.06g、0.073 mmol)およびdesB30インスリン(0.065 mmol)を、例８に記載されたように反応させた。TFA処理された生成物を、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm )上で酸性HPLCを使用するGilson上で精製した。
【０２８７】
勾配： 0.0〜5.0分 30%A；5.0〜20.0分35〜50％A。Rt 16.0分〜17.5分の画分を収集および蒸発させ、続いて凍結乾燥させた。収量34mg。
【０２８８】
MALDI.TOF-MS： m/z 6305.69；計算値6299．
HPLC 方法5；Rt 8.850分.
9-(3-{4-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)ノナン酸tert-ブチルエステル。
【化４６】
0005410020.tif 000048
【０２８９】
例８に記載されたような、デカンニ酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(0.88g、2.47 mmol)およびN-{3-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノプロポキシ)-ブトキシ]-プロピル}スクシンアミド酸(1g、2.47 mmol)からの調製は、精製後に150 mgの化合物を与えた。 
LCMS(方法6)： Rt 4.31分；m/z(M+1)545；計算値：545．
(S)-2-[3-(3-{4-[3-(9-tert-ブトキシカルボニルノナノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニルアミノ]ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル。
【化４７】
0005410020.tif 000049
【０２９０】
9-(3-{4-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)プロポキシ]ブトキシ}プロピルカルバモイル)ノナン酸tert-ブチルエステル(0.15g、0.276 mmol)をTSTUで活性化させ、得られたOSu誘導体を上述したようにH-Glu-OtBu(0.076g、0.37 mmol)と反応させた。その後、得られた油を、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm )上で酸性HPLCを使用するGilson上で精製した。
【０２９１】
勾配： 0.0〜5.0 分 20%A；5.0〜20.0分 20〜90％A。Rt 24.5〜25.5分の画分を収集・蒸発させ、続けて凍結乾燥させた。収量50mg。LCMS方法6： Rt 5.43分；m/z(M+1)730；計算値：730。
【０２９２】
この化合物はTSTUで活性化され、60mgの粗製の(S)-2-[3-(3-{4-[3-(9-tert-ブトキシカルボニルノナノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシ)(プロピルカルバモイル)プロピオニルアミノ]-ペンタン二酸 5-tert-ブチルエステル 1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステルをもたらす。
【化４８】
0005410020.tif 000050
【０２９３】
LCMS 方法6： Rt 5.79分；m/z (M+Na)850；計算値：850．
粗生成物をさらなる精製を行わずに使用した。
【０２９４】
例１２
NεB29-(2-[3-(2-(2-{2-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ}エトキシ)-エチルカルバモイル]プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン。
【化４９】
0005410020.tif 000051
【０２９５】
(S)-2-[3-(2-{2-[2-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)エチルカルバモイル)-プロピオニルアミノ]ペンタン二酸 5-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル(0.126g、0.17 mmol)を、上述したようにdesB30インスリン(0.153 mmol)と反応させた。TFA処理後(0.750mg)の粗生成物を、C18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm )上で酸性HPLCを使用するGilson上で2回にわたって精製した。
【０２９６】
勾配： 0.0〜5.0分 25% A； 5.0〜20.0分 20〜50%。Rt 21.0〜22.0分からの画分を収集および蒸発させ、13mgの化合物を得た。
【０２９７】
MALDI.TOF-MS(マトリックスSA)： m/z 6221.15；計算値6215．
LCMS(方法6)： Rt 3.53分；m/z(M+4/4)1556；計算値：1554.
7-(2-{2-[2-(3-カルボキシ-プロピオニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-ヘプタン酸tert-ブチルエステル。
【化５０】
0005410020.tif 000052
【０２９８】
オクタン二酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル エステル(1.13g、3.45 mmol)およびN-{2-[2-(2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-エトキシ)-エトキシ]-エチル}-スクシンアミド酸(1g、2.874 mmol)を、上述したように反応させた。1.75g粗生成物を単離し、さらなる精製を行わずに使用した。LCMS(方法6)： Rt 3.86分； m/z(M+1)461；計算値：461．
(S)-2-[3-(2-{2-[2-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)-エチルカルバモイル)プロピオニルアミノ]ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル。
【化５１】
0005410020.tif 000053
【０２９９】
7-(2-{2-[2-(3-カルボキシ-プロピオニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-ヘプタン酸tert-ブチルエステル(1.3g、2.83 mmol)をTSTUで活性化し、続いて粗生成物をH-glu-OtBu(0.86g、4.2 mmol)と反応させた。例8において記載された方法の使用する作業の後、生成物をC18カラム(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm )上で酸性HPLCを使用するGIlson上でさらに精製した。
【０３００】
勾配： 0.0〜10.0分 30%A；10.0〜25.0分 30〜90%A、Rt 20〜25分の画分を収集および蒸発させ、下記に記載されたTSTU活性化のために使用された600 mgの生成物を得た。LCMS(方法6)： Rt 4.51分；m/z(M+1)646；計算値：646．
(S)-2-[3-(2-{2-[2-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)-エチルカルバモイル)プロピオニルアミノ]ペンタン二酸5-tert-ブチルエステル1-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)エステル。
【化５２】
0005410020.tif 000054
【０３０１】
(S)-2-[3-(2-{2-[2-(7-tert-ブトキシカルボニルヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ)-エチルカルバモイル)プロピオニルアミノ]ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(0.6g、0.93 mmol)を、上述した手順を使用してTSTUで活性化した。
【０３０２】
これは、さらなる精製を行わずに使用された0.75 g粗化合物をもたらした。 
LCMS(方法6)： Rt 4.81分；m/z(M+1)743；計算値.:743.
例１３
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル)) desB30ヒトインスリンの合成
【化５３】
0005410020.tif 000055
【０３０３】
この化合物を、例４において記載されたのと同様に調製した。中間体15-[2-(2-{2-[2-(2-カルボキシエトキシ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル]ペンタデカン酸tert-ブチルエステルを、TSTUを使用し、desB30ヒトインスリンにカップリングさせてOSuエステルに活性化させた。TFAを使用する脱保護は、表題の化合物を与えた。
【０３０４】
MALDI-TOF MS： m/z=6222． 計算値：6222
HPLC(方法1)： Rt=11.12分 
HPLC(方法5)： Rt=12.03分 
例１４
NεB29-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオノイル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成；
【化５４】
0005410020.tif 000056
【０３０５】
この化合物を、H2N(CH2CH2O)12CH2CH2COOH (Quanta Biodesign, OH, USA)とtert-ブチルO-スクシンイミジルテトラデカンジオエートとの反応、続いてTSTUでの活性化、L-Glu-OtBuとの反応、TSTUでの活性化、DesB30ヒトインスリンとのカップリングおよびTFAによる脱保護を介して例１のアナロジーにおいて調製した。
【０３０６】
LCMS 6676.0, 方法6, 計算値6675.8.
例１５
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオノイル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成；
【化５５】
0005410020.tif 000057
【０３０７】
この化合物を、H2N(CH2CH2O)4CH2CH2COOH(Quanta Biodesign, OH, USA)とtert-ブチルO-スクシンイミジルテトラデカンジオエートとの反応、続いてTSTUでの活性化、L-Glu-OtBuとの反応、TSTUでの活性化、DesB30ヒトインスリンとのカップリングおよびTFAによる脱保護を介して例１のアナロジーにおいて調製した。
【０３０８】
LCMS 6323.2, (方法6) 計算値6323.3.
例１６
NεB29-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ) エトキシ]-エトキシ}-プロピオノイル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成
【化５６】
0005410020.tif 000058
【０３０９】
この化合物は、H2N(CH2CH2O)8CH2CH2COOH(Quanta Biodesign, OH, USA)とtert-ブチルO-スクシンイミジルテトラデカンジオアートとの反応、これに後続するTSTUでの活性化、L-Glu-OtBuとの反応、TSTUでの活性化、Des(B30)ヒトインスリンとのカップリングおよびTFAによる脱保護を介した例１とのアナロジーにおいて調製した。
【０３１０】
LCMS 6498.8、方法6、計算値6499.6.
例１７
NεB29-(3-(2-{2-[2-(15-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-エチルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成
【化５７】
0005410020.tif 000059
【０３１１】
MALDI-TOF MS(マトリックス： SA)： m/z=6336．計算値：6334 
HPLC(方法1)： Rt=11.71分.
HPLC(方法5)： Rt=9.37分.
例１８
NεB29-(3-(3-{2-[2-(3-[15-カルボキシペンタデカノイルアミノ]プロポキシ)エトキシ]-エトキシ}プロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成
【化５８】
0005410020.tif 000060
【０３１２】
上述したようなdesB30インスリン(0.132mmol)と反応させた15-{3-[2-(2-{3-[3-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシカルボニル)プロピオニルアミノ]プロポキシ}エトキシ)エトキシ]-プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸tert-ブチルエステル(粗生成物0.196g、0.264 mmol)は、Gilson 精製された400mgの沈殿物をもたらす。勾配：0.0〜5.0分 40%A；5.0〜15.0分40〜80%A、Rt 15.5〜16.0分の画分を収集し、乾燥するまで蒸発させた。
【０３１３】
得られた物質を、カルボキシ基を脱保護するためにTFA/DCM 1/1(100mL)で続けて処理した。蒸発後、得られた生成物を、C18カラム上のGilson HPLC(Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)で3回にわたって精製した。
【０３１４】
勾配： 0.0〜5.0分 35%A；5.0〜20.0分 20〜90%。Rt 15.0〜16.0分からの画分を収集および蒸発させ、23mgの化合物を得た。
【０３１５】
MALDI-TOF-MS： m/z 6277.15；計算値.6270． 
HPLC(方法5)： Rt 9.50分.
ω-{3-[2-(2-{3-[3-(2,5-ジオキソピロリドン-1-イルカルボニル)プロピオニルアミノ]プロポキシ}エトキシ)-エトキシ]プロピルカルバモイル}ペンタデカン酸tert-ブチルエステル。
【化５９】
0005410020.tif 000061
【０３１６】
ω-[3-(2-{2-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)プロピルカルバモイル-]ペンタデカン酸tert-ブチルエステル(0.17g、0.264 mmol)およびTSTUからの調製は、さらなる精製なしで使用される196mg粗生成物を与えた。 LCMS方法6：Rt 7.36分; m/z(M+1)742; Calcd.:742.
ω-([3-(2-{2-[3-(3-カルボキシプロピオニルアミノ)プロポキシ]エトキシ}エトキシ)-プロピルカルバモイル]ペンタデカン酸tert-ブチルエステル。
【化６０】
0005410020.tif 000062
【０３１７】
ヘキサデカン二酸tert-ブチルエステル2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル エステル(0.5g、1.13 mmol)およびN-(3-{2-[2-(3-アミノプロポキシ)エトキシ]エトキシ}プロピル)スクシンアミド酸 (0.36g、1.13 mmol)を、上述したように反応させた。
【０３１８】
C18カラム上のGilson HPLC (Jones, Kromasil RP18 5μm 15×225 mm)での粗生成物の精製。  勾配：0.0〜1.0分 50%A； 1.0〜30.0分 50〜90%。Rt 24.0〜26.0分の画分を終出および蒸発させ、170 mgのターゲット生成物を得た。
【０３１９】
LCMS(方法6)： Rt 7.06分；m/z(M+1)645；計算値：645．
例１９
NεB29-(3-(3-{4-[3-(ω-カルボキシウンデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシプロピルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリンの合成
【化６１】
0005410020.tif 000063
【０３２０】
この化合物を、ドデカン酸モノtert-ブチルエステルを使用して例8に記載されたのと同様に調製した。
【０３２１】
表題化合物についてのデータ：
MALDI-TOF-MS： m/z=6332．計算値：6334 
HPLC(方法1)： Rt=9.57分.
HPLC(方法5)： Rt=7.50分.
HPLC(方法6)： Rt=4.11分；m/z： 1584/(M+4)/4．計算値：1584.
例２０
NεB29-(3-(3-{4-[3-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)プロポキシ]ブトキシプロピルカルバモイル)-プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン：
【化６２】
0005410020.tif 000064
【０３２２】
例２１
NεB29-(3-(2-{2-[2-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン
【化６３】
0005410020.tif 000065
【０３２３】
例２２
NεB29-(3-(2-{2-[2-(ω-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エチルカルバモイル)プロピオニル-γ-グルタミル) desB30ヒトインスリン：
【化６４】
0005410020.tif 000066
【０３２４】
例２３
NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(ω-カルボキシ-ペンタデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-D-グルタミル) desB30ヒトインスリン：
【化６５】
0005410020.tif 000067
【０３２５】
例２４
NεB29-{3-[2-(2-2-[2-(7-カルボキシヘプタノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリン
【化６６】
0005410020.tif 000068
【０３２６】
例２５
NεB29-{3-[2-(2-2-[2-(9-カルボキシノナノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリン
【化６７】
0005410020.tif 000069
【０３２７】
例２６
NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(11-カルボキシウンデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリン
【化６８】
0005410020.tif 000070
【０３２８】
例２７
NεB29-{3-[2-(2-{2-[2-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)エトキシ]エトキシ}エトキシ)エトキシ]プロピオニル-γ-グルタミル} desB30ヒトインスリン
【化６９】
0005410020.tif 000071
【０３２９】
例２８ 
本発明のインスリン誘導体のインスリン受容体結合性
ヒトインスリン受容体に対する本発明のインスリン類似体の親和性を、SPAアッセイ(Scintillation Proximity Assay) マイクロタイタープレート抗体補足アッセイによって決定した。SPA-PVT抗体結合ビーズ、抗マウス試薬(Amersham Biosciences, Cat No. PRNQ0017)を、25 mlの結合緩衝液(100 M HEPES pH 7.8；100 mM塩化ナトリウム、10 mM MgSO4、0.025% Tween-20)と混合した。一つのPackard Optiplate (Packard No. 6005190)の試薬混合液は、2.4μlの1：5000稀釈の精製組み換えヒトインスリン受容体−エキソン11、100μlの試薬混合液当たり5000cpmに対応するA14 Tyr[125I]-ヒトインスリンのストック溶液、12μlの1：1000稀釈のF12抗体、3mlのSPAビーズおよび合計12mlまでの結合緩衝液で構成される。合計100μlをその後に加え、稀釈シリーズを適切なサンプルから作製する。稀釈シリーズに100μlの試薬混合液およびサンプルを追加し、ゆるやかに撹拌しながら16時間にわたってインキュベートした。その後に相(phases)を1分間にわたる遠心分離によって分離し、プレートをTopcounterで数えた。結合のデータを、GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego, CA)における非線形回帰アルゴリズムを使用して適合させた。
【０３３０】
ヒト血清アルブミン親和性試験
Minileak粒子上に固定化され、かつ23℃で測定されたヒト血清アルブミンに対する125l-TyrA14類似体の相対的な結合定数(デテミル(detemir)＝生理食塩緩衝液中１)。
【表２】
0005410020.tif 000072
【０３３１】
例２９
ラットに対するインスリン誘導体の肺送達
試験物質を点滴注入法によって肺投与する。オスのWistarラット(約250g)を、約60ml フェンタニル/デヒドロデンズペリドール/ドルミカムで麻酔するに際し、6.6 ml/kg sc初回刺激として与えた後、30分間隔で3.3 ml/kg scの3回維持投与を行う。麻酔誘導の10分後、基礎試料を、試験物質の投与(t=0)の直前に、尾部静脈から得る(t= -20分)。t=0で、試験物質を、一方の肺に気管を介して投与する。円形の先端部を備えた特殊なカニューレを、200μl空気および試験物質(1 ml/kg)を含むシリンジに差し込む。開口部を介して、カニューレを気管内に導入し、主要な気管支の一つに進め入れる（分岐を通過させる）。挿入中、外から頸部を触診し、気管内位置を確かめる。シリンジの内容物を注入した後、2秒間静止させる。その後、カニューレをゆっくりと引き出す。ラットは試験中(4時間以内の血液サンプル)麻酔下におき、実験終了後に安楽死させる。