(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アウレオバシジウム プルランスに属する微生物を、炭素源０．５〜５．０質量％、窒素源０．１〜５．０質量％、及び、ビタミン類及び／又は無機質を少なくとも含む液体培地で、温度２０〜３０℃で２〜１４日間通気撹拌培養し、その培養物の１００ｇあたりβ−グルカンを５０〜３０００ｍｇ含むように培養した該培養物を有効成分として含有することを特徴とするウシの乳房炎の予防・治療用組成物。
【請求項２】
前記培養物は、前記微生物を培養する培地に乳酸菌もしくは死菌化された微生物を添加して前記微生物の栄養成分として資化されるように培養して得られた培養物である、請求項１記載のウシの乳房炎の予防・治療用組成物。
【請求項３】
ウシの飼料に添加して使用される、請求項１又は２記載のウシの乳房炎の予防・治療用組成物。
【請求項４】
アウレオバシジウム プルランスに属する微生物を、炭素源０．５〜５．０質量％、窒素源０．１〜５．０質量％、及び、ビタミン類及び／又は無機質を少なくとも含む液体培地で、温度２０〜３０℃で２〜１４日間通気撹拌培養し、その培養物の１００ｇあたりβ−グルカンを５０〜３０００ｍｇ含むように培養した該培養物を摂取させることを特徴とするウシの乳房炎の予防・治療方法。
【請求項５】
前記培養物は、前記微生物を培養する培地に乳酸菌もしくは死菌化された微生物を添加して前記微生物の栄養成分として資化されるように培養して得られた培養物である、請求項４記載のウシの乳房炎の予防・治療方法。
【請求項６】
前記培養物を添加した飼料を摂取させる、請求項４又は５記載のウシの乳房炎の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシの乳房炎の予防・治療用組成物及びウシの乳房炎の予防・治療方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
乳牛の乳房炎は、生乳生産に直接関与する疾病であり、酪農家にとって、直接的に間接的に経済的損出をきたす問題である。また羅患により、乳量の減少、乳質の低下をきたすなど生乳の品質に大きな影響を与える。出荷において、バルク乳の体細胞数が所定の値を超えるとペナルティの対象となりの経済的負担がある。また、酪農家は、搾乳の手順や順番を変えたり、別搾りを行ったりと業務の煩雑化による労働負担の増加も発生する。出荷停止の場合は、停止による損出だけではなく、生乳の廃棄にかかるコストも加算される。
【０００３】
治療した場合は、治療費の加算、さらに治療困難牛の場合は廃用費用などに、酪農家に最も大きな経済的被害を与える病気である。
【０００４】
独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構  動物衛生研究所動物衛生研究成果情報  第６号（平成１８年度）によると、北海道の酪農家での乳房炎による損出は年間100億円という試算も出ている。
【０００５】
さらに、乳房炎羅患牛は、他の疾病に罹りやすいといったウシの健康被害という問題もある。実際に、乳房炎による死廃頭数は全死廃頭数の上位を占め、また乳牛の病傷事故原因でも乳房炎は全体の約３０％を占めている。
【０００６】
したがって、酪農家にとって乳牛の乳房炎の予防・治療対策は、極めて重要な問題となっている。
【０００７】
治療方法としては、抗生剤による治療があるが、一度投与すれば抗生剤の体内残留という問題で生乳の出荷制限を受けるので、治療期間中は生乳の出荷ができない。また潜在的に罹患しているケースも多く、根本的な解決策となる治療方法は未だにない。
【０００８】
そこで、抗生剤を利用しない天然物由来の組成物を利用して乳房炎の予防・治療を行う試みもされている。例えば、特許文献１には、パン酵母生菌又はその含有物を有効成分とすることを特徴とする家畜乳房炎予防治療組成物が開示されている。しかしながら、従来の天然物由来の有効成分を利用する乳房炎の予防・治療用組成物は、その有効性が十分とはいえなかったため、一般的にはほとんど普及していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１−２２４３１７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、安全かつ副作用がない状態で、乳房炎の指標の一つである体細胞数の改善（低下）をもたらすことにより乳房炎を予防し又は治療することができる、ウシの乳房炎の予防・治療用組成物並びにウシの乳房炎の予防・治療方法を提供することにある。そして、ウシにとっては、副作用がなく安全で健康被害をもたらさない、乳質の低下防止を目的とした、天然物由来の有効成分を利用する、ウシの乳房炎の予防・治療用組成物並びにウシの乳房炎の予防・治療方法を提供することにある。また、感染後の投与でも効果を発揮する、ウシの乳房炎の予防・治療用組成物並びにウシの乳房炎の予防・治療方法を提供することにある。また、安全かつ副作用がない状態で、更には抗生剤との併用でより効果の高い、ウシの乳房炎の予防・治療用組成物並びにウシの乳房炎の予防・治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を有効成分として含有することを特徴とするウシの乳房炎の予防・治療用組成物。
［２］前記培養物は、前記微生物を培養する培地に乳酸菌もしくは死菌化された微生物を添加して前記微生物の栄養成分として資化されるように培養して得られた培養物である、上記［１］記載のウシの乳房炎の予防・治療用組成物。
［３］ウシの飼料に添加して使用される、上記［１］又は［２］記載のウシの乳房炎の予防・治療用組成物。
［４］アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を摂取させることを特徴とするウシの乳房炎の予防・治療方法。
［５］前記培養物は、前記微生物を培養する培地に乳酸菌もしくは死菌化された微生物を添加して前記微生物の栄養成分として資化されるように培養して得られた培養物である、上記［４］記載のウシの乳房炎の予防・治療方法。
［６］アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を添加した飼料を摂取させる、上記［４］又は［５］記載のウシの乳房炎の予防・治療方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のウシの乳房炎の予防・治療用組成物、並びにウシの乳房炎の予防・治療方法によれば、ウシの乳房炎を効果的に予防し、又は治療することができる。その有効成分は、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物であるので、安全性が高く、投与しても出荷に影響を与えない。また、副作用のリスクがないためウシの健康管理の観点からも安心して使用することができる。何より、体細胞数の減少により乳房炎症状を緩和することで乳量や乳質の低下を防ぎ、生産性を向上させる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】乳房炎を発症したホルスタイン種泌乳牛に対してアウレオバシジウム プルランスM-2の培養液を投与したときの乳汁中の体細胞数の変動（投与群１−６）及び乳房炎を発症していない健康なホルスタイン種泌乳牛の乳汁中の体細胞数の変動（非投与群１−１３）を測定値で示す図表である。
【図２】投与群又は非投与群の各月の平均値を標準偏差とともに示す図表である。
【図３】投与群１−６の体細胞数の変動の結果を統計処理して比較した結果を示す図表である。
【図４】非投与群１−１３の体細胞数の変動の結果を統計処理して比較した結果を示す図表である。
【図５】投与群１−６と非投与群１−１３の体細胞数を、それぞれ８月の値を１とした時の増減値を統計処理して比較した結果を示す図表である。
【図６】投与群１−６の８月と１１月の乳中の大腸菌を指数表示で示す図表である。
【図７】投与群１−６の乳中大腸菌数の変動の結果を統計処理して比較した結果を示す図表である。
【図８】投与群１−６の乳中の一般生菌数を指数表示で示す図表である。
【図９】投与群１−６の乳中の一般生菌数の変動の結果を統計処理して比較した結果を示す図表である。
【図１０】投与群１−６の血中の白血球数の推移をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図１１】投与群１−６の血中の桿状型好中球（Ｓｔ）数の推移を示す図表である。
【図１２】投与群１−６の血中の桿状型好中球（Ｓｔ）数の変動を統計処理して比較した結果を示す図表である。
【図１３】投与群１−６の血中のアルブミン量の変動をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図１４】投与群１−６の血中のγＧＴＰ値の変動をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図１５】投与群１−６の血中のＡＳＴ/ＧＯＴ値の変動をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図１６】投与群１−６の血中のＡＬＴ/ＧＰＴ値の変動をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図１７】投与群１−６の血中のクレアチニン量の変動をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図１８】投与群１−６の血中の赤血球数の推移をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図１９】投与群１−６の血中のヘモグロビン量の変動をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図２０】投与群１−６の血中の好酸球数の推移をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図２１】投与群１−６の血中の血糖値（グルコース量）の変動を示す図表である。
【図２２】投与群１−６の血中の総コレステロール値の変動をその正常範囲（横軸の太線）とともに示す図表である。
【図２３】投与群１−６の血中のＬＤＬコレステロール値の変動を示す図表である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のウシの乳房炎の予防・治療用組成物においては、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物（以下、「アウレオバシジウム由来培養組成物」という。）を有効成分として含有せしめる。また、本発明のウシの乳房炎の予防・治療方法においては、アウレオバシジウム由来培養組成物を、乳房炎に罹患したウシ、又はこれを予防しようとするウシに摂取させる。
【００１５】
このアウレオバシジウム由来培養組成物としては、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属し、β−グルカン生産能を有する微生物（以下、「アウレオバシジウム微生物」という。）を培養した培養物そのもの、遠心分離等により菌体を分離除去した培養液、その培養液の濃縮液、その培養液の希釈液、あるいはその培養液から水分を除いた固形物等だけでなく、これらを脱塩等してβ−グルカンの含有量を高めたもの、あるいは、これらからβ−グルカンを精製したものも含まれる。また、分画していった各々の分画物を用いることもできる。
【００１６】
本発明において用いられる上記アウレオバシジウム由来培養組成物は、上記アウレオバシジウム微生物を培養することにより生産されるβ−グルカンを、該培養物の質量１００ｇに対する含有量に換算して、５０〜３，０００ｍｇ含有するものであることが好ましく、１００〜２，０００ｍｇ含有するものであることがより好ましい。
【００１７】
なお、β−グルカンの含有量の決定は、例えば次のような方法で行うことができる。すなわち、培養液にアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼ等を用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルラン等のα−グルカンを除き、エタノール沈殿を行う。更に、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンで更に洗浄し、硫酸を加え、加水分解を行う。加水分解後、中和し、そのろ液を採取して、グルコースオキシダーゼ法によりブドウ糖を定量し、下記数式１に基づいて計算した値をβ−グルカン量とする。
数式１：β−グルカン（ｇ/１００ｇ）＝ブドウ糖（ｇ/１００ｇ）×０．９
【００１８】
また、β−グルカンの含有量の決定は、いわゆる糖鎖含有高分子物質（多糖）量として決定することもできる。この場合は、培養液にアミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼ等を用いて酵素処理を施し、蛋白質や、プルラン等のα−グルカンを除き、エタノール沈殿を行う。更に、ガラスフィルターでろ過し、高分子試料を得る。このとき、単糖を含む低分子物質を除くため、８０％エタノールで充分に洗浄する。洗浄した高分子試料はアセトンで更に洗浄したものの重量を測定することで糖鎖含有高分子物質（多糖）量とする。
【００１９】
なお、このようにして定量されるβ−グルカンは、硫酸基、リン酸基等の官能基を有するものとして定量される。したがって、このように広義の糖鎖含有高分子物質（多糖）としてβ−グルカンを定量した場合には、上記アウレオバシジウム微生物を培養することにより生産されるβ−グルカンの含有量は、該培養物の質量１００ｇに対する含有量に換算して、７０〜５，０００ｍｇ含有するものであることが好ましく、１４０〜３，０００ｍｇ含有するものであることがより好ましい。
【００２０】
本発明において用いられる上記アウレオバシジウム微生物としては、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属し、β−グルカン生産能を有する微生物であればよいが、例えば、アウレオバシジウム プルランスＭ−１（Aureobasidium pullulans M-1、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号FERM BP-08615）や、アウレオバシジウム プルランスＭ−２（Aureobasidium pullulans M-2、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号FERM BP-10014）が好適に用いられる。なお、これらの菌株が産生するβ−グルカンは、ＮＭＲ測定（13CNMR :Varian社UNITY INOVA500型、1HNMR : Varian社UNITY INOVA600型）による構造解析で、グルコースがβ−１，３結合した主鎖からβ−１，６結合でグルコースが分岐した構造を有するβ−１，３−１，６−グルカンであることが明らかとなっている。
【００２１】
上記アウレオバシジウム微生物の培養は、公知の方法（特開昭５７−１４９３０１号公報等参照）に準じて行うことができる。すなわち、炭素源（ショ糖）０．５〜５．０質量％、Ｎ源０．１〜５．０質量％、その他微量物質（例えば、ビタミン類、無機質）を加えた培地（ｐＨ５．２〜６．０）に菌を接種し、温度２０〜３０℃で２〜１４日間通気培養、好ましくは通気撹拌培養すればよい。β−グルカンが生成されるにしたがって培養液の粘度が上昇し、粘性の高いジェル状になる。このようにして得られる培養液には、通常、０．６〜１０質量％の固形分が含まれており、該固形分中にはβ−グルカンが５〜８０質量％含まれている。また、β−グルカン以外にも、例えば、リン、カリウム、マグネシウム、ビタミンＣ等の他の有用成分も含まれている。
【００２２】
上記アウレオバシジウム微生物の培養は、また、それを培養する培養液中に死菌化された微生物をを加えて、栄養成分として資化させるようにして培養してもよい。この場合、その死菌体の培養液中への配合量は、用いる菌体の種類によっても異なるが、通常、１00個/ｍＬ（培養液）〜100兆個/ｍＬ（培養液）程度であることが好ましい。微生物の死菌化は加熱殺菌等によって行うことができる。
【００２３】
上記死菌化された微生物として用いる微生物としては、窒素源等のアウレオバシジウム微生物の栄養源を含むものであれば特に制限はないが、例えば乳酸菌や酵母などが挙げられる。乳酸菌としては、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシューム（E.fecium）ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidphilus）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・マリ（L.mali）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L.casei）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.catenulatum）等のビフィドバクテリウム属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・コアグランス（B.coagulans）等のバチルス属細菌、クロストリジウム・ブチリカム（Clostoridium butilicum）等のクロストリジウム属細菌、などを用いることができる。
【００２４】
酵母としては、不完全菌類も含み、アウレオバシジウム・プルランス（Aureobasidium pullans）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・インタメディウス（Saccharomyces intemedius）、サッカロマイセス・ヴァリドウスSaccharomyces validus）、サッカロマイセス・エリプソイデウス（Saccharomyces ellipsoideus）、サッカロマイセス・マリリスラー（マリーリスラー）（Saccharomyces mali risler）、サッカロマイセス・マンシュリカス（Saccharomyces mandschuricus）サッカロマイセス・フォルデルマニ（Saccharomyces Vordermannii ）、サッカロマイセス・ペーカー（Saccharomyces Peka）、サッカロマイセス・シアシング（Saccharomyces shasshing）、サッカロマイセス・ピリフォルミス（Saccharomyces piriformis）、サッカロマイセス・アナメンシス（Saccharomyces anamensis）、サッカロマイセス・カルティラギノースス（Saccharomyces cartilaginosus）、サッカロマイセス・アワモリ（Saccharomyces Awamori）、サッカロマイセス・バタタエ（Saccharomyces Batatae）、サッカロマイセス・コレアヌス（Saccharomyces Coreanus）、サッカロマイセス・ロブストウス（Saccharomyces robustus）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Saccharomyces Carlsbergensis）、サッカロマイセス・モナセンシス（Saccharomyces Monacensis）、サッカロマイセス・マルキシアヌス（Saccharomyces Marxianus）、ザイゴサッカロマイセス（チゴサッカロマイセス）・マヨール（Zygosaccharomyces major）、サッカロマイセス・ラクティス（Saccharomyces lactis）、サッカロマイセス・ルクシー（Saccharomyces Rouxii）、ハンゼヌーラ・アノマーラ（Hansenula anomala）などを用いることができる。
【００２５】
本発明においては、上記の培養によって得られる培養物をそのまま加熱又は加圧加熱殺菌して用いてもよく、遠心分離等により菌体を分離除去した後、この培養液を殺菌して用いてもよい。また、必要に応じて濃縮したもの、更には乾燥したものを用いることもできる。更に、β−グルカンのみを抽出して用いることもできる。また、分画していった各々の分画物を用いることもできる。なお、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物は、増粘安定剤等の食品添加物として使用されているものであり安全性が高い。
【００２６】
本発明においては、乳房炎の症状を呈するウシがその適用の対象となる。乳房炎の原因には、ブドウ球菌、レンサ球菌、大腸菌などによる感染微生物や、周産期、乳期、ストレス、栄養、年齢などの影響による宿主防御機構の異常や、搾乳管理、個体管理、飼料、畜舎構造などの飼養環境要因などが挙げられ多岐にわたり、その症状の態様も、甚急性乳房炎、急性乳房炎、慢性乳房炎などが挙げられるが、本発明においてはいずれを原因又は症状とする乳房炎であっても、これに罹患したウシの症状を改善し又は治療することができる。また、本発明においては、乳房炎の症状がみられないウシであってもその適用の対象となる。すなわち、乳房炎の予防のためにも用いることができる。
【００２７】
投与すべき量は、症状の強弱、ウシの体調、年齢、投与方法・投与回数・投与時期などによって適宜決定することができる。一般的な有効投与量を例示すれば、例えば、アウレオバシジウム由来培養組成物の内容物の一つであるβ−グルカンの量で換算すると、１日およそ０．０２〜２００ｍｇ/ｋｇ（体重）の量で摂取する。また長期間摂取させるようにし、効果を持続的に発揮させることが好ましい。更に抗生剤との併用など従来知られた乳房炎の処置方法と併用することもできる。
【００２８】
本発明においては、その一形態として、上記アウレオバシジウム由来培養組成物をウシの飼料に添加して使用し、摂取させることもできる。これによれば、ウシに給与するための特別な作業時間を割くことなく、長期間継続的に使用し、摂取させる場合にも、作業性よく行うことができる。
【実施例】
【００２９】
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
［製造例１］  
下記のようにしてアウレオバシジウム プルランス M-2（Aureobasidium pullulans M-2）（FERM BP-10014）の培養液を調製した。
前培養液を、ショ糖１％、アスコルビン酸０．１％、米糠０．１％を含む液体培地（ｐＨ５．３）に適量接種して、２５℃、７２〜９６時間（製造バッチによって異なる）、通気撹拌培養を行った。培養終了後、この培養液を１２１℃、１５分間殺菌した。得られた殺菌後の培養液は、固形分およそ１．２質量％を含み、該固形分１００ｇ中のβ−グルカン含量は３２．５ｇであった。また、培養液そのものの質量１００ｇ中に含まれる含有量に換算して、０．３９ｇ/１００ｇ含有するものであった。この培養液を以下の試験に用いた。
【００３１】
［実施例１］  
乳汁中の白血球および脱落した乳腺上皮細胞を総称して体細胞というが、乳房炎の病原菌に侵されると体細胞数が増加する。通常、個体の体細胞数の目標値は３０万個/ｍＬ以下、正常値は１０万個/ｍＬ以下とされており、３０万個/ｍＬ以上の場合には乳房炎に感染している可能性が高い。そこで、乳房炎のウシの体細胞数の数字が低くなると細菌汚染の状況が改善され乳房炎の症状が改善されたとみることができるので、アウレオバシジウム培養液の経口投与が、乳房炎のウシ乳汁中の体細胞数の改善に有効かどうかを調べた。
【００３２】
そのために、飼養されているホルスタイン種泌乳牛中、牛群検定成績表の体細胞数成績が３０万個/ｍＬ以上の個体、６頭を供試牛とした（投与群１−６）。製造例１で調製したアウレオバシジウム培養液３００ｍＬを、直接経口投与にて１日１回午前または午後に３ヶ月間与え続けた。なお、試験は２０１０年８月から１１月にかけて実施した。試験開始時と、試験開始１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月後の乳汁を採取し、その体細胞数をフローサイトメトリ―を利用した自動分析装置（「フォソマチックＦＣ（Fossomatic TM FC）」FOSS社）を用いて測定した。
【００３３】
その結果を表１に示す。また、図１には、後述する比較例１の非投与群の値とともに表したグラフを示し、図２には、その各月の平均値を標準偏差とともに表したグラフを示す。図３では、投与群１−６の体細胞数の変動の結果を統計処理して比較した結果を示す。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
その結果、表１及び図１，２に示されるように、これら投与群では乳汁中の体細胞数の減少傾向が認められた。すなわち、投与群６頭の平均で投与開始時は、１８８３×１０３個/ｍＬ、投与１ヶ月後には、７４７．２×１０３個/ｍＬ、投与２ヶ月後には、６６４．２×１０３個/ｍＬ、投与３ヶ月後には、４７１．８×１０３個/ｍＬと、投与開始時の値と比較すると４分の１にまで減少していた。（表１）また個別にみると、投与群４は投与開始時には、５２２１×１０３個/ｍＬあったものが１ヶ月後には、７４８×１０３個/ｍＬと８６％の減少を示した。（表１）
尚、図３に示されるように、投与群において投与開始時と３ヶ月後の体細胞数をＴ検定にかけるとＰ<0.05の棄権率で有意差が認められた。すなわち、投与群では、体細胞数の減少が、有意差をもって認められた。（図２）
これにより、農場ではバルク乳の体細胞数の平均値が３０万個/ｍＬの値を超え、ペナルティを毎月３０万円程度支払っていたが、ペナルティの支払いがなくなった。
【００３６】
［比較例１］  
乳房炎を発症していない健康なホルスタイン種泌乳牛の乳汁中の体細胞数の変動を、アウレオバシジウム培養液を与えない供試牛１３頭について（非投与群１−１３）、実施例１と同様にして調べた。
【００３７】
その結果を表２に示す。また、図１には、前述した比較例１の投与群の値とともに表したグラフを示し、図２には、その各月の平均値を標準偏差とともに表したグラフを示す。
図４では、非投与群１−１３の体細胞数の変動の結果を統計処理して比較した結果を示す。図５では、投与群１−６と非投与群１−１３の体細胞数を、それぞれ試験開始時の値を１とした時の増減値を統計処理して比較した結果を示す図表である。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
その結果、表２及び図１，２に示されるように、これら非投与群では乳汁中の体細胞数の増加傾向が認められた。すなわち、非投与群１３頭の平均で試験開始時期には、平均値１６９×１０３個/ｍＬだったものが、３ヶ月後には、５５７×１０３個/ｍＬと増加している。個別にみても、非投与群４は、開始時の６３×１０３個/ｍＬが３ヶ月後には１０４８×１０３個/ｍＬと１６．６倍の増加。非投与群８は、開始時の３２９×１０３個/ｍＬが１５０４×１０３個/ｍＬと４．５倍の増加。非投与群１０は開始時の３４×１０３個/ｍＬがの３ヶ月後には、１２７６×１０３個/ｍＬと３７．５倍の増加となった。（表２）
また、図４に示されるように、非投与群において試験開始時と３ヶ月後の試験終了時の体細胞数をＴ検定にかけるとＰ＜０．０１の棄権率で有意差が認められた。すなわち、非投与群では、体細胞数の増加が有意差を持って認められた。（図４）
図５では、投与群１−６と非投与群１−１３の体細胞数について、それぞれ試験開始時の値を１とした時の増減値を、マンホイットニーのＵ検定を用いて、投与群と非投与群を比較している。その結果、Ｐ＜０．０５の棄権率で有意差が認められた。すなわち、非投与群の体細胞数の増加は、投与群と比較して有意に高いことがわかった。（図５）
一般的に、夏から秋にかけての環境の要因は、自然に改善され、体細胞数の改善がみられるが、ここではほぼ全てのウシで悪化する傾向にあり、当該比較例の試験期間の環境要因が非常に厳しいものであったことが推察された。
【００４０】
［試験例１］
上記実施例１の投与群１−６について、投与開始前と投与３ヶ月後に、乳汁中の大腸菌数を食品衛生法指針に基づきＥＣ培地発酵管法で測定した。その結果を、表３及び図６に示す。また、図７に投与群１−６の乳中大腸菌数の変動の結果を、統計処理を用いて比較した。
【００４１】
【表３】
0005554221.tif 000004
【００４２】
その結果、投与開始時には６群の平均値は、７８１,４７６ＣＦＵ/１００ｍＬであったが、３ヶ月後には、７７８ＣＦＵ/１００ｍＬと減少していた。投与群１、投与群２、投与群４は、投与３ヶ月後の値が検出限界以下まで減少していた。（表３）
また、Ｔ検定の結果、投与群の投与３ヶ月後の大腸菌数は、開始時の大腸菌数と比較して、Ｐ＜０．０５の棄権率で有意差が認められた。すなわち、投与群において、大腸菌数は有意差をもって減少していた。（図７）
【００４３】
［試験例２］
上記実施例１の投与群１−６について、投与開始前と投与３ヶ月後に、乳汁中の一般生菌数を食品衛生法指針に基づき標準寒天平板培養法で測定した。その結果を、表４及び図８に示す。また、図９に投与群１−６の乳中一般生菌数の変動の結果を、統計処理を用いて比較した。
【００４４】
【表４】
0005554221.tif 000005
【００４５】
その結果、投与開始時には６群の平均値９,８７５,２８０ＣＦＵ/ｍＬだったものが、投与３ヶ月後には、３３０,６５０ＣＦＵ/ｍＬと減少していた。(表４)
また、Ｔ検定の結果、投与群の１１月の一般生菌数は、８月の一般生菌数と比較して、Ｐ＜０．０５の棄権率で有意差が認められた。すなわち、投与群において、一般生菌数は有意差をもって減少していた。(図９)
【００４６】
［試験例３］
上記実施例１の投与群１−６についてその試験期間中の１ヶ月ごとに、白血球数と、白血球のうち、炎症により数値が上昇するといわれている血中の桿状型好中球（Ｓｔ）を測定した。白血球数は、ＤＣ検出法にて測定した。その結果を表５と図１０に示す。桿状型好中球（Ｓｔ）は、自動血球分類装置及び鏡検法により調べた。その結果を表６と図１１に示す。
また、図１２には、投与群１−６の血中の桿状型好中球（Ｓｔ）数の変動を統計処理して比較した結果を示す。
【００４７】
【表５】
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【００４８】
【表６】
0005554221.tif 000007
【００４９】
表５、図１０は、投与群１−６の白血球数の変動を示している。正常範囲は、５．８７〜９．７５×１０３/μＬであり、各月の平均値は、投与開始時には７．２×１０３/μＬ、投与1ヶ月後は７．７×１０３/μＬ、投与２ヶ月後は７．１×１０３/μＬ、投与３ヶ月後は６．９×１０３/μＬと正常範囲内で推移していた。（図１０）
表６、図１１に示されるように、炎症により数値が上昇するといわれている桿状型好中球（Ｓｔ）数は、投与開始時には、平均値５５８×１０３個/μＬであったが、投与３ヶ月後には、平均値２８９×１０３個/ｍＬに下がっていた。（表６）
また、Ｔ検定の結果、投与群の投与３ヶ月後での桿状型好中球（Ｓｔ）数は、投与開始時の値と比較して、Ｐ＜０．０５の棄権率で有意差が認められた。すなわち、投与群において、桿状型好中球（Ｓｔ）数は有意差をもって減少していた。（図１２）
尚、図１０に示されているように、白血球総数の減少は見られず、白血球の中でも、炎症の影響で数値が上昇する桿状型好中球（Ｓｔ）数が減少していた。（図１０、図１１）
【００５０】
[試験例４]
上記実施例１の投与群１−６について、副作用の有無を確認するため、その試験期間中の１ヶ月ごとに、血液中の生化学検査項目について調べた。アルブミンはＢＣＧ法で測定した。γＧＴＰ、ＡＳＴ/ＧＯＴ、ＡＬＴ/ＧＰＴはＪＣＣＬＳ-ＳＯＰ法で測定した。クレアチニンはＪａｆｆｅ変法及び酵素法で測定した。赤血球は電気抵抗検出法で測定した。ヘモグロビンはＳＬＳ−Ｈｂ法で測定した。好酸球はＤＣ法で測定した。血糖価（グルコース量）は酵素法で測定した。総コレステロール、ＬＤＬコレステロールは酵素法で測定した。その結果を図１３〜２１に示す。各測定値の正常範囲は、「家畜共済における臨床病理検査要領」（農林水産省経営局）での値を参考にした。
【００５１】
下記表７及び図１３には、投与群１−６の血中のアルブミンの値を示す。
【００５２】
【表７】
0005554221.tif 000008
【００５３】
下記表８及び図１４には、投与群１−６の血中γＧＴＰの値を示す。
【００５４】
【表８】
0005554221.tif 000009
【００５５】
下記表９及び図１５には、投与群１−６の血中ＡＳＴ/ＧＯＴの値を示す。
【００５６】
【表９】
0005554221.tif 000010
【００５７】
下記表１０及び図１６には、投与群１−６の血中ＡＬＴ/ＧＰＴの値を示す。
【００５８】
【表１０】
0005554221.tif 000011
【００５９】
下記表１１及び図１７には、投与群１−６の血中クレアチニンの値を示す。
【００６０】
【表１１】
0005554221.tif 000012
【００６１】
下記表１２及び図１８には、投与群１−６の血中赤血球の値を示す。
【００６２】
【表１２】
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【００６３】
下記表１３及び図１９には、投与群１−６の血中ヘモグロビンの値を示す。
【００６４】
【表１３】
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【００６５】
下記表１４及び図２０には、投与群１−６の血中好酸球の値を示す。
【００６６】
【表１４】
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【００６７】
下記表１５及び図２１には、投与群１−６の血中グルコースの値を示す。
【００６８】
【表１５】
0005554221.tif 000016
【００６９】
下記表１６及び図２２には、投与群１−６の総コレステロールの値を示す。
【００７０】
【表１６】
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【００７１】
下記表１７及び図２３には、投与群１−６のＬＤＬコレステロールの値を示す。
【００７２】
【表１７】
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【００７３】
表７、表８、表９、表１０、図１３、図１４、図１５、図１６では、それぞれ投与群１−６について、主に肝機能を反映しているアルブミン、γＧＴＰ、ＡＳＴ/ＧＯＴ、ＡＬＴ/ＧＰＴ値の変動を示している。
【００７４】
表７、図１３は、投与群１−６のアルブミン量を示している。アルブミン量の正常値は３．２〜３．４ｇ/ｄＬである。投与群１−６のアルブミン量の平均値は、投与開始時には、３．７ｇ/ｄＬ、投与１ヶ月後には、３．５ｇ/ｄＬと正常範囲より高い値であったが、投与２ヶ月後には３．４ｇ/ｄＬ、３ヶ月後は３．２ｇ/ｄＬと正常範囲に変動している。（表７）
表８、図１４は、投与群１−６のγＧＴＰの値を示している。γＧＴＰの正常値は、６．１〜１７．４Ｕ/Ｌである。投与群１−６の平均値は、投与開始時は３１．２ＩＵ/Ｌであり、投与１ヶ月後は２７．７ＩＵ/Ｌ、投与２ヶ月後は２７．０ＩＵ/Ｌ、投与３ヶ月後は２９．０ＩＵ/Ｌであった。（表８）
表９、図１５は、投与群１−６ＡＳＴ/ＧＯＴの値を示している。ＡＳＴ/ＧＯＴは、７８〜１３２Ｕ/Ｌが正常範囲とされており、投与開始時には投与群６以外は正常範囲を下回わった。この時の投与群１−６の平均値は６５．０ＩＵ/Ｌであった。また、投与１ヶ月後の平均値は６７．３ＩＵ/Ｌ、投与２ヶ月後の平均値は６９．８ＩＵ/Ｌ、投与３ヶ月後の平均値は６８．３ＩＵ/Ｌであった。投与３ヶ月後の時点では、投与群４が正常範囲であった。（表９）
表１０、図１６では、ＡＬＴ/ＧＰＴの値を示している。ＡＬＴ/ＧＰＴは、正常範囲が１４〜３８ＩＵ/Ｌである。（図１６）投与群１−６のＡＬＴ/ＧＰＴの平均値は、投与開始時２６．８ＩＵ/Ｌ、投与１ヶ月後は２３．７ＩＵ/Ｌ、投与２ヶ月は２２．２ＩＵ/Ｌ、投与３ヶ月後には、２５．８ＩＵ/Ｌであり、開始から投与開始後のいずれも正常範囲であった。（表１０）
表１１、図１７では、腎機能を反映しているクレアチニン値の変動を示している。表１１、図１７に示されるように、投与群１−６のクレアチニンの平均値は、投与開始時は０．８８ｍｇ/ｄＬ、投与１ヶ月後は０．９３ｍｇ/ｄＬ、投与２カ月後は０．９３ｍｇ/ｄＬ、投与３ヵ月後は０．９２ｍｇ/ｄＬであった。（表１１）
【００７５】
表１２、表１３、表１４、図１８、図１９、図２０では、血液の主要成分である赤血球、ヘモグロビン、好酸球値の変動を示している。
【００７６】
表１２、図１８では、投与群１-６の赤血球数が示されている。赤血球は、正常範囲が５４６〜６７４個×１０４/μＬである。投与群１-６の赤血球の平均値は、投与開始時が５４０．２×１０４/μＬと正常範囲を下回っていたが、投与１ヶ月後に５４６．３×１０４/μＬ、投与２ヵ月後には５６０．７×１０４/μＬ、投与３ヵ月後には５７３．２×１０４/μＬと平均値では正常範囲内を推移した。（表１２）
表１３、図１９では、投与群１-６のヘモグロビン量が示されている。ヘモグロビンの正常値は、８.０〜１２．６ｇ/ｄＬである。投与群１-６のヘモグロビンの平均値は、投与開始時が９．１ｇ/ｄＬ、投与１ヶ月後に９．３ｇ/ｄＬ、投与２ヵ月後には９．４ｇ/ｄＬ、投与３ヵ月後には９．５ｇ/ｄＬと正常範囲内を推移した。（表１３）
表１４、図２０には、投与群１-６の好酸球数が示されている。好酸球数は、正常範囲が０〜２，４００個/μＬである。投与群１−６の好酸球数の平均値は、投与開始時には、１，０００個/μＬであり、投与１ヶ月後には、７６０個/μＬ、投与２ヶ月後には、６０８個/μＬ、投与３ヶ月後には５３８個/μＬであった。いずれも正常範囲内で減少していた。（表１４）
【００７７】
表１５、図２１では、投与群１−６の血中のグルコース濃度（血糖値）が示されている。投与群１−６のグルコース濃度の平均値は、投与開始時には、６０．８ｍｇ/ｄＬ、投与１ヶ月後には６３．５ｍｇ/ｄＬ、投与２ヶ月後には６２．０ｍｇ/ｄＬ、投与３ヶ月後には６１．０ｍｇ/ｄＬであった。（表１５）
【００７８】
表１６、表１７、図２２、図２３は脂質代謝を反映する総コレステロールとＬＤＬコレステロールの値を示している。
【００７９】
表１６、図２２では、投与群１−６の血中の総コレステロール値の変動を示している。正常範囲は、８０〜３００ｍｇ/ｄＬであり、投与開始時の投与群１−６の平均値は１３９.０ｍｇ/ｄＬであった。投与１ヶ月後には１３８.０ｍｇ/ｄＬ、投与２ヶ月後には１５０.８ｍｇ/ｄＬ、投与３ヶ月後には１５３.０ｍｇ/ｄＬであった。いずれも正常範囲であった。（表１６）
表１７、図２３では、投与群１−６の血中ＬＤＬ-コレステロール値の変動を示している。ＬＤＬ-コレステロールは、泌乳後期で高くなる傾向がある。投与開始時の投与群１−６の平均値は８.８ｍｇ/ｄＬであった。投与１ヶ月後には７.５ｍｇ/ｄＬ、投与２ヶ月後には８.８ｍｇ/ｄＬ、投与３ヶ月後には９.７ｍｇ/ｄＬであった。（表１７）
【００８０】
[結果のまとめ］  
上記の試験環境をとりまく状況をいえば、試験期間である２０１０年の夏は猛暑であり、環境的にも厳しい状況であった。２０１０年９月３日に農林水産省がまとめた猛暑による全国の畜産被害状況（２０１０年７月〜８月）でも、熱中症で死亡、廃棄した家畜は乳牛で９５９頭に上る。同じ牛舎内では、体細胞数が正常範囲で推移していたにも関わらず、熱中症で倒れ、そのまま廃牛になったウシも１頭いた。また、廃牛にならないまでも、抗生剤治療を施す必要が出たウシもいた。このような環境の影響で、上記比較例１のように、乳房炎を発症していない健康なホルスタイン種泌乳牛の乳汁中の体細胞数が増加する傾向を示したものと考えられた。即ち、乳房炎に影響を与える環境要因が、季節の推移により改善されていないことが示唆された。
【００８１】
一方、そのように環境的には厳しい状況であったにもかかわらず、アウレオバシジウム培養液投与群においては、上記実施例１で示されたように、乳汁中の体細胞数の改善がみられた。また、上記試験例１で示されたように、乳房炎のウシの乳汁中の大腸菌による汚染は、アウレオバシジウム培養液投与によって、減少する傾向が認められた。更に、上記試験例２で示されたように、乳房炎のウシの乳汁中の一般生菌による汚染も、アウレオバシジウム培養液投与によって、減少する傾向が認められた。即ち、何らかの炎症が改善され、乳房炎が改善されたことを示唆された。
【００８２】
試験例３では、乳房炎のウシの血中白血球総数には、大きな変化がないにも関わらず、炎症により数値が上昇するといわれている桿状型好中球（Ｓｔ）数が、アウレオバシジウム培養液投与によって、減少する傾向が認められた。
【００８３】
さらに、試験例４では、乳房炎のウシの血液成分を確認したところ、生化学検査の結果、肝機能に関与するアルブミン、γＧＴＰ、ＡＳＴ/ＧＯＴ、ＡＬＴ/ＧＰＴ、腎臓機能を反映しているクレアチニン、血液の主用成分である赤血球、ヘモグロビン、好酸球、その他にも健康状態の指標となるグルコース（血糖値）、また脂質代謝の指標となる総コレステロール、ＬＤＬ-コレステロールのいずれも、アウレオバシジウム培養液投与により正常範囲を大きく外れるものはなく、正常範囲に収束していくことが確認された。
【００８４】
よって、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物のウシへの経口投与による副作用的な悪影響は少ないものと推察された。
【００８５】
以上から、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物が、ウシの乳房炎の予防・治療において、副作用をもたらすことなく改善効果を発揮することが明らかとなった。
【００８６】
上記投与群はいずれも体細胞数３０万個/ｍＬ以上のウシへの投与であり、羅患後の投与で効果を発揮することが解った。本発明は、ウシの乳房炎の予防・治療において有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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