(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微速度撮影による１個以上の細胞を含む生物試料の複数の画像を解析する方法であって、
各画像をウェーブレット変換を用いて各々特定の周波数チャネルを表す複数の部分画像及び近似チャネルを表す１つの部分画像に分解し、
各画像について、デフォーカス比を近似チャネルを表す部分画像のエネルギーと中間周波数チャネルを表す部分画像のエネルギーの合計との比（ただし、エネルギーは各々の部分画像に対するウェーブレット係数の平均値として定義される。）として計算し、
各画像のデフォーカス比を所定のデフォーカス閾値と比較して、所定のデフォーカス閾値を超えるデフォーカス比の画像を焦点外れとして判定する
ことによって焦点外れの画像を検出するステップと、
焦点外れと判定されていない画像で１個以上の細胞のセグメンテーション及び追跡を実施するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ウェーブレットが、ローパスフィルタ係数ｈ（ｋ）とハイパスフィルタ係数ｇ（ｋ）＝（−１）k+1ｈ（Ｌ＋１−ｋ）（ただし、ｋ＝１．．．Ｌは分解のレベルを表し、Ｌはレベルの数である。）からなるフィルタを含む１対のフィルタを用いるものであり、
マザーウェーブレットが以下の通りスケーリング関数から構成されていて、
【数１】
0005554776.tif 000013
以下に示す１つの近似チャネルと３つの詳細チャネルとを与え、
【数２】
0005554776.tif 000014
（式中、ｉはｘインデックスであり、ｊはｙインデックスである。）
デフォーカス比が次式で計算される、請求項１記載の方法。
【数３】
0005554776.tif 000015
（式中、Ｅ（．）は次式のエネルギー演算子を表し、数字は分解のレベルを表し、小さな数字は低い周波数を表す。
【数４】
0005554776.tif 000016
（式中、ＩＪはチャネルｘにおける係数の数であり、ｘ（ｉ，ｊ）は係数の値である。））
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物試料から取得した１以上の異常画像を検出して除去するシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム配列決定プログラム及び他の広範囲にわたる機能性ゲノム研究の努力が実を結んでいるにもかかわらず、一般に、多くの遺伝子、細胞及びウィルスが人体及び他の有機生物体の中で機能する詳細なメカニズムはあまりわかっていない。従って、関連する生理環境における遺伝子機能のハイスループット検査及び解明を可能にするスクリーニング方法が必要である。
【０００３】
ハイスループット自動蛍光顕微鏡検査は、細胞に関して数十万に及ぶ遺伝子産物の機能のスクリーニング及び解析を可能にする。顕微鏡検査は他の検出方法と比べて細胞内情報を提供する能力が著しく高いので、自動撮像プラットフォームを使用して検出されかつ定量化されるスクリーン及び分析物を説明するために「ハイコンテンツ」という用語が採用されている。画像取得及び画像解析は共に自動化することができ、そうするとハイコンテンツ解析システムでのスループットを最大限にするため最適化することができる。自動化画像解析に必要とされる計算ツールの２つの主要な要素は、個々の細胞のセグメンテーション及び位置追跡である。
【０００４】
腫瘍学、免疫学及び発生生物学を含むいくつかの研究分野で非常に重要な２つの基本的な細胞の行動は、運動と分裂である。それら２つの行動はそれぞれ独自の解析条件を有するが、解析に関していくつかの重大な問題も共有している。それらの行動の検査には微速度撮影が要求される。大規模実験に際して微速度撮影を実現する場合、特定のデータセットで表現される多様な処理条件及び行動表現型に対して最適になる分析パラメータ、撮像パラメータ及び解析パラメータを発見することに関して問題が起こる。もう１つの問題は、収集画像に低コントラスト対雑音比が頻繁に現れることである。生細胞経時実験において、生細胞内のＤＮＡ複製を抑止するＤＮＡ結合などの望ましくない有害な副作用を回避するために染料濃度を慎重に減らすことにより、コントラスト対雑音比の不足の問題が起こる場合が多い。更なる問題は、高速画像収集プロトコルの要求を受けて、自動焦点メカニズムが故障する場合があるということである。通常、モデルシステムは、一般的なサーベイランスの用途で監視されるターゲット（細胞）の数よりはるかに多くのターゲットを含む。有糸分裂などの特定の生物学的事象も扱われる必要がある。
【０００５】
細胞追跡に使用されている既存の解析ルーチンは２つの主要な方式、すなわち、独立検出とその後のデータ統合、及びモデルベース追跡に大まかに分類できる。Li et alの"Online tracking of migrating and proliferating cells imaged with phase-contrast microscopy"と題する刊行物（Proc. CVPRW. (2006) pages 65-72）では、各フレームを個別にセグメンテーションすること並びにレベルセット及び確率モーションフィルタによるモデル伝播を利用するマルチターゲット追跡システムを使用することの双方によって、上記の２つの方式は組み合わされており、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。Padfield et alの"Spatio-temporal Cell Cycle Analysis using 3D level set segmentation of unstained nuclei in line scan confocal images"と題する刊行物（IEEE ISBI, Arlington, VA(April 2006)）では、時空間セグメンテーションタスクとして追跡タスクに別の方式が利用されており、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【０００６】
欠陥画像の排除を可能にしかつ生物材料を含むオブジェクトのセグメンテーション及び追跡を改善するために生物材料の画像中の劣化を検出するシステム及び方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】  米国特許第６０７５９０５号明細書
【特許文献２】  米国特許第７２９８８７６号明細書
【特許文献３】  国際公開第２００７／１２１４５４号
【特許文献４】  国際公開第２００７／０２８９４４号
【特許文献５】  米国特許出願公開第２００３／００１２４２０号明細書
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、上述の技術的背景に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、生物試料から取得した劣化画像を検出するシステム及び方法を提供することである。
【０００９】
本発明の好適な一実施形態では、生物試料から取得した劣化画像を検出する方法は、１以上の細胞の１以上の画像を準備し、上記１以上の細胞の画像を所定期間にわたって生成し、上記１以上の細胞の１以上の画像が劣化を含むか否かを判定し、上記１以上の画像を複数の低周波数チャネル、複数の中間周波数チャネル及び複数の高周波数チャネルを有する複数の部分画像に分解するため、上記１以上の画像にウェーブレット変換、フーリエ変換又は他の周波数分解変換を適用し、上記複数の低周波数チャネル及び複数の中間周波数チャネルのエネルギーレベルに基づいて比を計算し、１以上の画像が劣化を含んでいれば１以上の細胞の１以上の画像を除去することを含む。
【００１０】
本発明の別の好適な実施形態では、生物試料から取得した画像中の劣化を検出するシステムが開示される。上記画像送信装置は、１以上の細胞の１以上の画像を画像受信装置へ送信するように構成される。画像受信装置は、１以上の細胞の１以上の画像を準備し、上記１以上の細胞の１以上の画像が劣化を含むか否かを判定し、上記１以上の画像を複数の低周波数チャネル、複数の中間周波数チャネル及び複数の高周波数チャネルを有する複数の部分画像に分解するため、上記１以上の画像にウェーブレット変換、フーリエ変換又は他の周波数分解変換を適用し、上記複数の低周波数チャネル及び複数の中間周波数チャネルのエネルギーレベルに基づいて比を計算し、かつ１以上の画像が劣化していた場合は１以上の細胞の１以上の画像を除去し、又は１以上の画像が劣化を含まない場合は１以上の細胞の１以上の画像の中のオブジェクトをセグメンテーションしかつ追跡するように構成される。
【００１１】
本発明のさらに別の好適な実施形態では、画像中の劣化を検出する装置が開示される。上記画像受信装置は、１以上の細胞の１以上の画像を準備し、１以上の細胞の１以上の画像が劣化しているか否かを判定し、上記１以上の画像を複数の低周波数チャネル、複数の中間周波数チャネル及び複数の高周波数チャネルを有する複数の部分画像に分解するため、上記１以上の画像にウェーブレット変換、フーリエ変換又は他の周波数分解変換を適用し、上記複数の低周波数チャネル及び複数の中間周波数チャネルのエネルギーレベルに基づいて比を計算し、かつ１以上の画像が劣化していれば１以上の細胞の１以上の画像を除去するように構成される。
【００１２】
本発明の別の好適な実施形態では、生物材料の画像中の劣化を検出するコンピュータ画像処理方法が開示される。本方法は、１以上の細胞の１以上の画像を準備し、１以上の画像が劣化を含むか否かを判定することと、上記１以上の画像を複数の低周波数チャネル、複数の中間周波数チャネル及び複数の高周波数チャネルを有する複数の部分画像に分解するため、上記１以上の画像にウェーブレット変換、フーリエ変換又は他の周波数分解変換を適用し、上記複数の低周波数チャネル及び複数の中間周波数チャネルのエネルギーレベルに基づいて比を計算し、１以上の画像が劣化を含んでいれば１以上の細胞の１以上の画像を除去することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本発明の上記の利点及び他の利点は、添付の図面と関連して以下の説明を読むことによりさらに明らかになるだろう。
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る生物材料における劣化を検出するシステムを示したブロック図である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る図１の画像受信装置を示した概略図である。
【図３】図３は、生物試料から取得した画像中の劣化の検出が本発明に従って図１のシステムを使用してどのように用いられるかを示したフローチャートである。
【図４】図４は、本発明に係る生物試料の正常画像、デフォーカス画像及び低コンテンツ対雑音比（ＣＮＲ）画像を示した図である。
【図５】図５は、本発明に係る５つのレベルのウェーブレット分解を示した図である。
【図６】図６（ａ）及び図６（ｂ）は、本発明に係るデフォーカス検出画像及び低ＣＮＲ検出画像の統計結果を示したグラフである。
【図７】図７は、本発明に係る時空間ツリーを示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図面を参照して、本発明の現時点で好適な実施形態を説明する。図面中、同じ構成要素は同一の図中符号により示される。以下の好適な実施形態の説明は単なる例であり、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００１５】
図１は、生物材料の画像中の劣化を検出するシステムを含む典型的なデジタル顕微鏡システムの基本構成要素を示したブロック図である。自動デジタル顕微鏡システム１００は、光源１０５、伝播／ビーム整形光学系（光送出）１０１、ビームフォールディング光学系１０９、対物レンズ１２３を保持する対物レンズタレット１０２、試料１１５、試料位置決め段１１３、通信リンク１１７、結像光学系（チューブレンズ）１０８、光学検出器１０７及び任意に設けられるコンピュータ１０３を含む。
【００１６】
光源１０５は、ランプ、１つのレーザー、複数のレーザー、１つの発光ダイオード（ＬＥＤ）、複数のＬＥＤ又はビーム１０６を発生する当業者には周知である任意の種類の光源であってもよい。試料１１５を照明するために、伝播／ビーム整形光学系１０１、ビームフォールディング光学系１０９及び対物レンズ１２３によりビーム１０６の方向が規定される。試料１１５は、細胞、タンパク質、小分子、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、酵素、抗体など）、組織標本、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び他の通常の生物材料などの生物材料を含む。試料１１５からの光信号は、対物レンズ１２３及び結像光学系１０８により集束され、光学検出器１０７に画像を形成する。光学検出器１０７は、光電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤＤ）、相補形金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）画像検出器又は当業者には周知である任意の光学検出器であってもよい。光学検出器１０７は、通信リンク１１７によりコンピュータ１０３に電気的に接続されるか又は無線接続される。別の実施形態では、標本の詳細を観察できるように中間画像をさらに拡大するために、対物レンズタレット１０２に装着された対物レンズと協働する通常の顕微鏡接眼レンズが光学検出器１０７の代わりに使用されてもよい。通常のマイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、マイクロウェルプレート、チップ、ガラス板、ペトリ皿、プラスチック、シリコン又は任意の種類の通常のホルダと呼ばれてもよい試料ホルダ１２１に試料１１５は収納される。マイクロウェルプレートは、当業者には周知である任意の高さ、幅、長さ、底面積、ウェル直径、ウェル深さを有するマイクロウェル板に９６個のウェル、３８４個のウェル、１５３４個のウェル又は任意の典型的な数のウェルを有してもよい。試料ホルダ１２１は２以上あってもよい。
【００１７】
別の実施形態では、顕微鏡システム１００は通常のリンク１１７により従来のコンピュータ１０３に電気的に接続されるか又は無線接続されてもよい。通信リンク１１７は、ローカルアクセスネットワーク（ＬＡＮ）、無線ローカルネットワーク、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、ユニバーサルサービスバス（ＵＳＢ）、イーサネットリンク、光ファイバのような、自動顕微鏡システム１００とコンピュータ１０３との間のデータの転送を容易にすることが可能な任意のネットワークであってもよい。顕微鏡は複数の対物レンズ１２３をさらに有してもよい。コンピュータ１０３は画像受信装置１０３又は画像検出装置１０３と呼ばれてもよい。本発明の別の実施形態では、画像受信装置１０３は画像送信装置１００の中に配置されてもよい。画像受信装置１０３は、光学検出器１０７から試料１１５の画像を受信可能な典型的なコンピュータとして動作し、その後、画像受信装置１０３は、標準画像処理ソフトウェアプログラム、解析ルーチン、アルゴリズム又は式を利用することにより画像を表示、セーブ又は処理することが可能である。また、コンピュータ１０３は、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、ラップトップコンピュータ、ノートブックコンピュータ、移動電話、ハードドライブ系装置又は通信リンク１１７を介して情報を受信し、送出しかつ格納することが可能な任意の装置であってもよい。本発明において１つのコンピュータが用いられるが、コンピュータ１０３の代わりに複数のコンピュータを利用してもよい。
【００１８】
図１において、顕微鏡システム１００は、基本構成要素のみを強調して概略的に示される。ブロック図が対物レンズを使用するすべての顕微鏡を説明していることは、当業者には自明だろう。実施例は、従来の広視域顕微鏡、蛍光顕微鏡、従来の共焦点顕微鏡、線走査共焦点顕微鏡を含むが、それらに限定されない。ハイスループットスクリーニングなどの種々の用途に対応するために、それらの種類の顕微鏡に自動化機器を追加してもよい。しかし、それらは本発明の範囲を妨げるものではない。さらに、顕微鏡システム１００は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）製のＩＮＣＥＬＬ（商標）  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００又は３０００であってもよい。
【００１９】
図２は、図１の劣化検出システムの画像受信装置を示した概略図である。画像受信装置又は撮像受信装置１０３は、従来のコンピュータと関連する通常の構成要素を含む。画像受信装置１０３は画像送信システム１００に格納されてもよい。画像受信装置１０３は、プロセッサ１０３ａ、入出力（Ｉ／Ｏ）コントローラ１０３ｂ、大容量記憶装置１０３ｃ、メモリ１０３ｄ、ビデオアダプタ１０３ｅ、接続インタフェース１０３ｆ及びシステム構成要素１０３ｂ〜１０３ｆをプロセッサ１０３ａに動作可能に結合するか、電気的に結合するか又は無線結合するシステムバス１０３ｇを含む。さらに、システムバス１０３ｇは、通常のコンピュータシステム構成要素とプロセッサ１０３ａを電気的に結合するか又は無線結合するか、動作可能に結合する。プロセッサ１０３ａは、処理装置、中央処理装置（ＣＰＵ）、複数の処理装置又は並列処理装置と呼ばれてもよい。システムバス１０３ｇは従来のコンピュータと関連する通常のバスであってもよい。メモリ１０３ｄは読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含む。ＲＯＭは、始動時にコンピュータの構成要素間の情報の転送を補助する基本ルーチンを含む通常の入出力システムを含む。
【００２０】
入出力コントローラ１０３ｂはバス１０３ｇによりプロセッサ１０３ａに接続される。入出力コントローラ１０３ｂは、オプションのグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）などの自動劣化検出手段並びにキーボード及びポインティングデバイスなどの入力装置１０４を介してユーザがコンピュータに指令及び情報を入力することを可能にするインタフェースとして動作する。用いられる典型的なポインティングデバイスは、ジョイスティック、マウス、ゲームパッドなどである。ディスプレイ１０６は、ビデオアダプタ１０３ｅによりシステムバス１０３ｇに電気的に接続されるか又は無線接続される。ディスプレイ１０６は、通常のコンピュータモニタ、プラズマテレビ、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）又はコンピュータ１０３により生成される文字及び／又は静止画像を表示可能な任意の装置であってもよい。コンピュータ１０３のビデオアダプタ１０３ｅに接続インタフェース１０３ｆが併設される。接続インタフェース１０３ｆは、ネットワークインタフェースと呼ばれてもよく、前述のように、通信リンク１１７により光学検出器１０７に接続される。画像受信装置１０３は、画像受信装置１０３を他のコンピュータに結合可能にするネットワークアダプタ又はモデムをさらに含んでもよい。
【００２１】
メモリ１０３ｄの上位に大容量記憶装置１０３ｃがあり、大容量記憶装置１０３ｃは、１．ハードディスクに対する読み取り及び書き込みを実行するハードディスクドライブコンポーネント（図示せず）及びハードディスクドライブインタフェース（図示せず）、２．磁気ディスクドライブ（図示せず）及び磁気ディスクドライブインタフェース（図示せず）並びに３．ＣＤ‐ＲＯＭ又は他の光媒体などの取り出し可能光ディスクに対する読み取り又は書き込みを実行する光ディスクドライブ（図示せず）及び光ディスクドライブインタフェース（図示せず）を含む。ここで挙げたドライブ及び関連するコンピュータ可読媒体は、コンピュータ１０３に対してコンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール及び他のデータの不揮発性記憶装置を構成する。上述のドライブは、以下に図３のフローチャートに関して説明するように生物材料の画像に劣化又は問題が存在するか否かを判定するためのアルゴリズム、解析ルーチン、ソフトウェア又は式を有するという技術的効果をさらに含む。本出願において使用される場合の劣化、問題又は欠陥という用語は、画像がデフォーカスであるか又は画像のコントラスト対雑音比が低く、そのためにセグメンテーション／追跡に支障を引き起こす可能性があることを示す。
【００２２】
ソフトウェアは劣化検出グラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）を有する。劣化検出グラフィカルユーザインタフェースは、コンピュータのユーザがコンピュータ１０３と容易に対話できるように設計されたソフトウェアプログラムである通常のＧＵＩと同一の機能性のうち一部を有する特別にプログラムされたＧＵＩである。
【００２３】
図３は、ソフトウェアアプリケーションにおいて生物試料の画像の劣化がどのようにして検出されるかを示したフローチャートである。１個の細胞の画像に関連して説明するが、以下の説明は、顕微鏡システム１００により検出される１個の細胞の複数の画像又は複数の細胞の複数の画像にも同様に適用される。ユーザは生物試料（例えば、１以上の細胞）を顕微鏡システム１００に挿入する。試料の画像は、接続インタフェース１０３ｆ（図２）により通信リンク１１７を介して光学検出器１０７へ転送され、ブロック３０１において、画像は画像受信装置１０３により受信される。
【００２４】
ブロック３０３において、ユーザは、ポインティングデバイス１０４を使用して、ある期間にわたって１個以上の細胞からなる個体群の１以上の画像を生成する。通常の分析において、検出システムに応じて１つの画像の露光時間は１〜１００ミリ秒の範囲であってもよいだろう。通常の生細胞経過時間検定において、定義された期間にわたって指定の間隔で一連の画像が収集される。この期間は１〜１００ミリ秒から数日の範囲であってもよいだろう。収集された細胞のデータは、１個の細胞の１つの画像又は複数の画像を有する複数の細胞を含んでもよいだろう。ブロック３０５において、ユーザは、劣化検出グラフィカルユーザインタフェースのポインティングデバイス１０４を利用して、例えば、ＳＴＡＲＴを示すアイコンを指示する。これにより、生物材料又は細胞の画像が劣化しているか否かの判定を開始できる。前述のように、この劣化検出グラフィカルユーザインタフェース及びソフトウェアは、画像受信装置１０３のプロセッサにある。画像が劣化を示さない場合、処理はブロック３０７の正常セグメンテーション及び細胞追跡の手続きを実行し、次にブロック３０１に戻り、別の画像が順次受信される。しかし、劣化画像が存在すると判定された場合、その画像は放棄され、次の画像が処理される。
【００２５】
図４は、正常画像、デフォーカス画像及び低コンテンツ対雑音（ＣＮＲ）画像を示した図である。デフォーカス画像（ｂ）及び低ＣＮＲ画像（ｃ）は、セグメンテーション及び追跡ルーチンの失敗を引き起こす可能性がある。デフォーカス画像は、顕微鏡のアルゴリズムに関して問題があることを示す。デフォーカス画像は焦点外れの画像である。簡単に言えば、焦点は、撮像される試料又は試料の特徴の弁別性又は鮮明度が最大である状態として定義できる。デフォーカス画像は、画像平面が関心試料と同一の平面に位置していないためにぼやけて見えるか又はピントが外れて見える画像である。低コントラスト対雑音比画像は、顕微鏡のプロトコル又はレンズに問題があることを示す。造影剤（例えば、蛍光プローブ）の濃度が低いこと、造影剤又はそのターゲットが劣化していること、焦点が適正ではないこと、試料からの背景信号が高いこと（例えば、プローブが取り入れられていない場合）、露光時間の不足、露光過度、レンズ収差、レンズの汚れ、試料支持台の汚れ（例えば、プレート底面の指紋）、真正信号を妨害する試料中のアーチファクト（例えば、塵芥）などを含めて、低ＣＮＲには多くの原因がある。基本的には、低ＣＮＲを引き起こす要因は、系全体、例えば、プローブ、試料、試料支持台、収集条件、検出システムを含む種々の要素に由来すると考えてよい。セグメンテーション及び追跡の失敗を防ぐために、セグメンテーション及び追跡の実行に先立って異常な画像を解析から除外できるように、図３で説明される関連アルゴリズム、ルーチン、ソフトウェア又は式は、異常な画像を解析から除外できるようにデフォーカスであるか又は低いＣＮＲを有する画像を自動的に検出するために用いられる。また、アルゴリズムは、ＣＮＲが低くはないが、以降の処理を実行するには低すぎることを発見する。
【００２６】
図３に戻ると、ブロック３０５において、１以上の細胞の画像にウェーブレット変換、フーリエ変換又は他の標準周波数分解変換が適用される。ウェーブレットは、ローパスフィルタ係数ｈ（ｋ）及びハイパスフィルタ係数ｇ（ｋ）＝（−１）k+1ｈ（Ｌ＋１−ｋ）から構成されるフィルタを含む１対のフィルタを使用する。尚、ｋ＝１．．．Ｌは分解のレベルを示し、Ｌはレベルの数である。これらの関数は、空間領域及び周波数領域の双方に局在化する単一のマザーウェーブレットを平行移動しかつ膨張することにより構成される。マザーウェーブレットは次のスケーリング関数から構成される。
【００２７】
【数１】
0005554776.tif 000002
このウェーブレット分解を２Ｄ信号に適用するために、式１のスケーリング関数を使用して逐次１Ｄフィルタリングから分離可能２Ｄフィルタを得ることができる。そのような演算の結果、以下の式に示すような１つの近似チャネル及び３つの詳細チャネルが得られる。
【００２８】
【数２】
0005554776.tif 000003
式中、ｉはｘインデックスであり、ｊはｙインデックスである。ψはｘ及びｙの双方でローパスフィルタリングを実行することによりオリジナルの平滑バージョンに至り、Ψ1はｘでローパスフィルタリングを実行しかつｙでハイパスフィルタリングを実行することにより水平エッジに至り、Ψ2は垂直エッジに至りかつΨ3は対角エッジに至ることが式２の演算の直観的認識である。分解を逐次反復することにより、ローパス画像は４つのチャネルにさらに分解され、その結果、各レベルの画像は１０分割されるか又は２でサブサンプリングされることになる。ウェーブレット分解の一実施例が図５に示される。この場合、各Ψの添え字は分解のレベルを表す。図５の場合、ウェーブレット分解のレベルは５つであり、ウェーブレットは複数の部分画像として示される。複数の部分画像は、第１の複数の部分画像及び第２の複数の部分画像に対して複数の低周波数チャネルを有し、第３の複数の部分画像及び第４の複数の部分画像に対して複数の中間周波数チャネルを有しかつ第５の複数の部分画像に対して複数の高周波数チャネルを有する。本発明の別の実施形態では、６以上又は４以下のレベルのウェーブレット又は複数の部分画像を分解してもよい。各チャネルは近似チャネル（Φ）又は詳細チャネル（Ψ）のいずれかとして識別される。各詳細チャネルは、式２において定義される添え字及び分解のレベルを示す数字により示され、値が小さいほど周波数は低くなる。近似チャネルは１つしかない。
【００２９】
ウェーブレット分解を使用して、各チャネルのエネルギーにより画像のテクスチャを判別できる。本出願に参考として取り入れられているＰｏｒｔｅｒ  Ｒ．、Ｃａｎａｇａｒａｊａｈ  Ｃ．Ｎ．の文献に記載されるように、平滑な画像はエネルギーの大半を低周波数チャネルに集中するが、テクスチャを含む画像のウェーブレット分解は全チャネルに拡散されたエネルギーを示す。Porter R. Canagarajah, C.N., which is hereby incorporated by reference.  Porter, R., Canagaraja, C.N.: A Robust Automatic Clustering Scheme for Image Segmentation using Wavelets. IEEE Transactions on Image processing 5(4) (1996) pages 662-665。デフォーカス画像への適用の場合、高周波数雑音は依然として存在しており、従って、判別情報はわずかしか提供されない。しかし、合焦点画像と比較して中間周波数は減衰される。ブロック３０５においてこの情報を使用して、低周波数チャネルと中間周波数チャネルとのデフォーカス比Ｒdを次のように計算する。
【００３０】
【数３】
0005554776.tif 000004
式中、Ｅ（．）はエネルギー演算子を示し、数字は分解のレベルを示す。数字が小さいほど、周波数は低くなる。エネルギーは、そのサブバンドに対するウェーブレット係数の平均値であるとして定義される。
【００２１】
【数４】
0005554776.tif 000005
式中、ＩＪはチャネルｘにおける係数の数であり、ｘ（ｉ，ｊ）は係数の値である。このデフォーカス比を使用して、合焦点画像とデフォーカス画像とを識別可能である。デフォーカス画像の場合、比は大きく、合焦点画像では比は小さい。
【００３２】
有用な副次効果として、デフォーカス比は低コントラスト対雑音比画像の発見に役立つ。これは、低コントラスト対雑音比画像では中間周波数エネルギーも低周波数エネルギーと比較して低いからである。低コントラスト対雑音比画像も同様に発見することが望ましいのであるが、それらの画像をデフォーカス画像から分離できると、ユーザに対して、可能であれば顕微鏡に対して追加フィードバックが提供されるので有効である。ブロック３０５において、低コントラスト画像の輝度分布は高コントラスト画像の分布より一様であるので、それらの画像を分離するために情報エントロピーＨ（Ｘ）値が用いられる。
【００３３】
【数５】
0005554776.tif 000006
この場合、Ｘは、画像輝度の標準確率密度関数のビンに対応して可能な値（ｘ1，．．．ｘn）をとりうる離散ランダム変数である。コントラスト対雑音比の低い画像にはランダム性があるため、デフォーカス画像であっても、低コントラスト対雑音比画像は高コントラスト対雑音比画像と比較して低いエントロピーを有する。次に、ブロック３０５において、計算されたエントロピーの値及びデフォーカス比は、プロセッサに格納されていてもよい所定の試験値と比較される。この比較に基づいて、画像が劣化しているか否かが示される。低コントラスト対雑音比画像がデフォーカス画像から分離された後、ブロック３０９において、処理はその画像を放棄又は除去し、次に処理はブロック３０１に戻り、次の画像が順次受信される。
【００３４】
要するに、ウェーブレットエネルギースコアは正常画像をデフォーカス画像から分離するために使用される。次に、エントロピー尺度を使用して、デフォーカス画像は、真にデフォーカスである画像と、低コントラスト対雑音比の画像とに分離される。このシーケンスは図３のフローチャートに見られる。それらの試験に合格した画像は、ブロック３０５のセグメンテーション段階及び追跡段階でさらに処理される。
【００３５】
図３で説明した細胞追跡システムの前処理モジュールとして、デフォーカス検出アルゴリズム及び低ＣＮＲ検出アルゴリズムが使用された。種々の実験機器構成及び種々の細胞処理条件の下で収集されかつデフォーカス画像と低ＣＮＲの画像との混合から構成される４３８４の画像を１組として、上述のアルゴリズムが実行された。各画像は、デフォーカス画像であるか、低いＣＮＲを有するか又は正常画像であるかに関して手動操作で注釈を付けられる。合わせて１９０のデフォーカス画像、１００の低ＣＮＲ画像及び４０９４の正常画像があった。
【００３６】
図６（ａ）は、デフォーカス画像及び正常画像のデフォーカススコアを比較して示したボックスプロットである。アルゴリズムは２つのクラスを明確に分離する。すなわち、閾値を２にした結果、検出ミスは１回であり（０．０３％の誤差）かつ偽肯定は２１（５％未満の誤差）である。図６（ｂ）は、デフォーカス画像及び低ＣＮＲ画像のエントロピー尺度を比較して示したボックスプロットである。アルゴリズムは２つのクラスを有効に分離し、２．５の閾値に対して完璧な分離が実行された。
【００３７】
それらのアルゴリズムを組み合わせることにより、４３８４の画像すべてに対してデフォーカス及び低ＣＮＲは有効に検出される。さらに、異なる顕微鏡を使用して異なる方式で収集されたデータセットに対してアルゴリズムが試験された。それらの位相‐コントラスト画像は、場合によってデフォーカスドリフトを示した。この実験において上記と同一のパラメータを使用して、アルゴリズムは３００の画像のすべてを正しい合焦点／デフォーカスクラスに分離することができた。
【００３８】
デフォーカス画像及び低ＣＮＲ画像が除去された後、データセットに細胞セグメンテーションアルゴリズム及び細胞追跡アルゴリズムが適用された。アルゴリズムは４つのデータセット、すなわち、未処理の２つのデータセット（対照）及びＲｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅで処理した２つのデータセットに対して適用された。識別を助けるために、相対的に低濃度の核ＤＮＡ染色剤Ｈｏｅｃｈｓｔ（商標）３３３４２によって細胞核を染色した。
【００３９】
図７は、それらのアルゴリズムにより抽出された時空間ツリーのいくつかの実例を示す。上述のアルゴリズムはセグメンテーション及び追跡に関連する。細胞は複数のクラスタをなして移動し、互いに接触しかつ有糸分裂するが、アルゴリズムはそれらのクラスタを個々のトラックに適切に分離可能である。図７の各図は、アルゴリズムがトラックのみならず、時間の経過に伴う細胞の形状をも抽出できることを示す。実施された実験のうち１つの実験の細胞ごとに、手動操作により規定された重心から自動的に分割された細胞の重心までの距離が計算された。平均距離は５．５μｍであり、標準偏差は６．８μｍであった。これらの実験における平均細胞直径は約３５μｍであった。手動操作により識別された細胞の総数は６１５７であり、自動的に検出されたのは５７５８個であったので、セグメンテーションされなかった細胞はわずか６％であった。
【００４０】
先にブロック３０７に関して説明したように画像の雑音を除去しかつ細胞をセグメンテーションするために、標準細胞セグメンテーションアルゴリズムが用いられる。例えば、画像のシフト不変ウェーブレットフレーム変換並びに非突出ウェーブレット係数のフィルタリングに基づくアルゴリズムが用いられる。
【００４１】
本出願に参考として取り入れられているＧｅｎｅｖｅｓｉｏ他及びＯｌｉｖｉｏ−Ｍａｒｉｎ  Ｊ．による文献に記載される生物医学データに関する従来の研究によれば、Ａ  Ｔｒｏｕｓ（穴を有する）ウェーブレット変換は局所雑音変化に対して頑健でありかつ背景中の低周波数オブジェクトを放棄することが実証されている。Genovesio, A., Liedl, T., Emiliani, V., Parak, W.J., Coppey-Moisan, M., Olivo-MainJ.: Multiple particle tracking in 3-d+t microscopy: method and application to the tracking of endocytosed quantum dots. IEEE Trans. Image Proc. 15(5) (2006) pages 1062-1070及びOlivo-Marin, J.: Automatic detection of spots in biological images by a wavelet-based selective filtering technique.  In ICIP (1996)I: pages 311-314。分解は次のように表現される。
【００４２】
【数６】
0005554776.tif 000007
式中、Ｉiは各スケールｉにおける近似画像を示しかつＷiは各スケールｉにおける詳細画像を示し、ｈ（ｍ，ｎ）はスケーリング関数を示す。
【００４３】
画像雑音が加法的雑音であると仮定すると、対応するウェーブレット変換の結果、基礎信号ＷIにより生成される係数及び画像雑音ＷNに対応する係数が得られる。信号項を近似するために、スケールｉ及び位置（ｘ，ｙ）に対してジェフリーズ無情報事前分布を使用して振幅‐スケール‐不変ベイズ推定量（ＡＢＥ）によって画像スタックを閾値処理する。
【００４４】
【数７】
0005554776.tif 000008
式中、σi2は所定のスケールでの推定雑音分散である。雑音をさらに低減して複数の解像度にまたがって延在するオブジェクトを改善するために、相関スタックＣs（ｘ、ｙ）を計算するが、これは所定のスケールに対応する雑音除去ウェーブレット係数のサブセットの乗算である。
【００４５】
【数８】
0005554776.tif 000009
次に、相関スタック中の接続された領域の抽出としてセグメンテーションが得られる。図８は、低線量Ｈｏｅｃｈｓｔ染色部分のセグメンテーションの一実施例を示し、コントラスト対雑音比が非常に低い場合であってもセグメンテーション方法の精度が高いことを実証している。これは、いくつかの低ＣＮＲ画像が低ＣＮＲ検出アルゴリズムによって合格となった場合でも、セグメンテーションの結果は高いＣＮＲを有する画像ほど一般に明瞭ではないが、低ＣＮＲ画像をセグメンテーションモジュールにより処理可能であることを示す。次に、セグメンテーション済み時空間ボリュームは３Ｄでラベル付けされる。その結果、時間の経過に伴って移動する細胞に対応するセグメンテーション「チューブ」の３Ｄセットが得られる。
【００４６】
３Ｄラベル付けされた「チューブ」は２種類のトラック、すなわち、１つずつの細胞に対応するトラック（シングルトラック）と、クラスタ化された複数の細胞に対応するトラック（マルチトラック）とを含む。時空間クラスタセグメンテーションステップの目標は、学習済みオブジェクト記述子を利用することによりマルチトラックを個別のトラックにセグメンテーションすることである。細胞の外観ｆit（ｉは細胞番号であり、ｔは時間スライスである）を捕捉する学習済み特徴の分布ｐはシングルトラックから容易に習得できる。あるいは、データセット中にシングルトラックがほとんど存在しない場合、実験条件が一定に保持されていると仮定して、他のデータセットからそれらの特徴を習得可能である。
【００４７】
マルチトラックが識別された後、細胞を分割するための最良の方法を判定するために時間文脈を利用することにより、細胞クラスタはセグメンテーションされる。１つのオブジェクトが個々の細胞に分割されるか又は１つの細胞を形成するためにオブジェクトのセットを併合するかの判定が実行される。尤度の高い細胞セグメンテーションを尤度の低いスライスへ伝播することにより、時間情報は用いられる。どのセグメンテーションオブジェクトが複数のスライスにまたがって伝播されるかを判定するために統計試験が組み込まれており、また、複数のスライスにまたがって細胞領域の相対面積が保持されるように最良のセグメンテーションを発見する曲線展開アルゴリズムが使用される。
【００４８】
所定のマルチトラックに対して、アルゴリズムは、多数のオブジェクトを有するスライスからオブジェクトの数の少ないスライスへとセグメンテーションオブジェクトを伝播する。曲線展開の終了時に、隣接するフレームにおけるオブジェクトの数は基準フレームのオブジェクトの数と同一になり、１以上のオブジェクトがセグメンテーションされている。次に、各分割セグメントの特徴ｆitを使用し、習得された分布パラメータμ及びΣを使用して、そのセグメントが細胞様であるか否かの尤度が計算される。
【００４９】
【数９】
0005554776.tif 000010
曲線展開が実行され、尤度が与えられかつ基準フレームが隣接フレームより多くのオブジェクトを有するという事実があるため、オブジェクト全体の尤度をそのオブジェクトの各部分の平均と比較することにより、基準フレームのラベルを併合するか又は隣接フレームのラベルを分割するかを判定できる。
【００５０】
【数１０】
0005554776.tif 000011
式中、Ｏは基準フレームからのオフセットであり、Ｉは併合／分割のために考慮されるラベルのセットである。Ｌmerge＞Ｌsplitである場合、基準フレームでラベルが併合されるが、そうでない場合には隣接フレームでラベルが分割される。基準フレームにおける組み合わせラベルが個々のラベルより高い尤度を有する場合、Ｌmergeが高く、隣接フレームにおける個々のラベルが組み合わせ状況よりも高い尤度を有する場合、Ｌsplitが高い。一方が正であれば、他方は負であり、最終決定は双方の尺度を組み合わせる。
【００５１】
有糸分裂では、１つの細胞は１つのフレームでは１つのオブジェクトであり、次のフレームでは２つになるので、この処理において有糸分裂は特殊なケースである。先行フレームにおける細胞を分割すること及び次のフレームにおいて細胞を併合することの双方により尤度が低くなる場合に領域を不変のままにすることにより、このケースは暗黙に処理される。この場合、細胞は時間の経過に伴って分割することはありうるが、併合されることはありえないので、因果関係も考慮に入れられる。
【００５２】
フレームにまたがって細胞を正しく関連付けるためにクラスタ中の細胞を番号付けし直すステップは、シングルトラックから習得された分布のパラメータμd、Σdを使用して実行される。次のスライスの全細胞のｊ＝１：Ｌである特徴ｆjt+1をｉ＝１：Ｌである現在のスライスにおける各細胞の特徴ｆitとμd及びΣdを用いて比較する。
【００５３】
【数１１】
0005554776.tif 000012
フレームにまたがった細胞からの最適割り当てを規定するハンガリアンアルゴリズムからの割り当てを使用して、スライス間で細胞ラベルが整合される。
【００５４】
本発明は、画像中に異常が存在するか否かをユーザにより判定可能にするシステム及び方法を提供する。画像中に異常が存在する場合、ユーザは、どの型の劣化が画像中にあるかを判定可能である。ユーザは、画像が細胞セグメンテーション及び追跡アルゴリズムの処理を受ける前に異常画像を除去するために異常画像の有無を迅速に判定可能である。ユーザは、画像が劣化を含むか否かを迅速に判定しかつその画像を除去することにより、細胞の画像を観察するための撮像条件を容易に最適化できる。従って、本発明は、実験のための撮像条件を容易に最適化するための手段をユーザに提供する。
【００５５】
以上、特定の実施形態に関して本発明を説明したが、当業者には自明なように、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神及び範囲から逸脱することなく本発明の多くの変更及び変形を実施可能である。
【符号の説明】
【００５６】
１００  自動デジタル顕微鏡システム（画像送信装置、画像送信システム）
１０１  伝播／ビーム整形光学系
１０２  レンズタレット
１０３  コンピュータ（画像受信装置）
１０３ａ  プロセッサ
１０３ｂ  入出力コントローラ
１０３ｃ  大容量記憶装置
１０３ｄ  メモリ
１０３ｅ  ビデオアダプタ
１０３ｆ  接続インタフェース
１０３ｇ  システムバス
１０４  入力装置
１０５  光源
１０６  ディスプレイ
１０６  ビーム
１０７  光学検出器
１０８  結像光学系
１０９  ビームフォールディング光学系
１１３  試料位置決め段
１１５  試料
１１７  通信リンク
１２１  試料ホルダ
１２３  対物レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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