(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３のアミノ酸配列を含む糖タンパク質ＶＩまたはコラーゲンに結合する活性を維持する該糖タンパク質ＶＩのフラグメントをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
コラーゲンに結合する完全なまたは部分的な糖タンパク質ＶＩをコードする部分的または完全な配列番号１の配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号１の配列からなる請求項１または２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含む糖タンパク質ＶＩをコードする請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項６】
請求項５の発現ベクターを形質転換された宿主細胞。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡによってコードされる組換えヒト糖タンパク質ＶＩ。
【請求項８】
配列番号３のアミノ酸配列またはコラーゲンに結合する該アミノ酸配列の断片を含む、請求項７に記載の組換えヒト糖タンパク質ＶＩ。
【請求項９】
配列番号２および配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項７または８に記載の組換えヒト糖タンパク質ＶＩ。
【請求項１０】
非グリコシルされた請求項７から９のいずれかに記載の組換えヒト糖タンパク質ＶＩ。
【請求項１１】
３７ｋＤａのアミノ酸質量を有する請求項１０に記載の組換えヒト糖タンパク質ＶＩ。
【請求項１２】
血小板−コラーゲン相互作用の特異的な阻害剤を検出するためのスクリーニングツールにおける、請求項７から１１のいずれかに記載の組換えヒト糖タンパク質ＶＩの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、その単離、精製および組換え製造法に関する。特に、本発明は、血栓症的疾患および心臓血管疾患などの血液凝固異常に直接的または間接的に相関する異常および病理学的事象の処置におけるＧＰＶＩ、好ましくは組換えＧＰＶＩの使用に関する。この細胞外組換えタンパク質は、血小板およびコラーゲンの相互作用を阻害するための、膜結合型ＧＰＶＩの潜在的な阻害剤を見出すスクリーニングアッセイを確立するためにも使用することができる。血小板表面のＧＰＶＩは、血小板の寿命期間中に生体内で変化を受け、従って血小板老化プロファイルのマーカーとして使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質ＶＩは、Ｆｃγの共通したサブユニットと一緒に複合体を形成する６２／６５ｋＤａ（それぞれ、非還元／還元型）の血小板膜糖タンパク質である。ＧＰＶＩサブユニットはコラーゲン結合部位を含有し、Ｆｃγサブユニットはシグナル伝達に関与している。この複合体は、コラーゲンに応じて血小板の活性化に重要な、血小板表面の主要なコラーゲン受容体の１つを形成している。コラーゲン上の認識配列は（ＧｌｙＰｒｏＨｙｐ）nの配列からなる。ＧＰＶＩの遺伝子的欠損を有する患者が日本から知られている。その患者らは軽度の出血の問題を有しており、患者の血小板は、おそらくは他の受容体を介して、コラーゲンに弱く応答するだけである。非常に多くことが、ＧＰＶＩから出発するシグナル伝達カスケードについて突き止められており、このシグナル伝達カスケードは、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体およびナチュラルキラー細胞受容体を含む免疫受容体に由来するシグナル伝達カスケードと著しく類似している。これらのカスケードには、ｐ７２SYKと同様にＦｙｎおよびＬｙｎなどのｓｒｃファミリーのチロシンキナーゼ、ならびに多くの他のチロシンキナーゼおよびホスファターゼ、およびＬＡＴなどのアダプタータンパク質が含まれる。これらのカスケードの主要な標的は、リン脂質を切断して二次メッセンジャーのジアシルグリセロールおよびＩＰ3を生じさせるホスホリパーゼＣγ２の活性化である。ＧＰＶＩは、損傷を受けた血管壁に対する血小板接着における主要な役割を有する血小板インテグリンα2β1の活性化に関与していると考えられる。Ｆｃγサブユニットが「ノックアウト」されたマウスは、コラーゲンに対する応答を依然として示す血小板を有する。このことは、α2β1の休止状態もまたＧＰＶＩ／Ｆｃγ複合体によって調節されているかもしれないことを意味している。
【０００３】
血小板のコラーゲン受容体ＧＰＶＩは、ＦｃαＲと同様に、ｐ５８ＫＡＲファミリーのナチュラルキラー活性化受容体に非常に関連している。
【０００４】
循環している休止血小板の血管傷害部位における接着および活性化は、止血栓に伝達される血栓が形成されるプロセスの第１段階である。コラーゲンは、血小板の活性化に関わる血管壁の主要な成分の１つである。コラーゲンには多くのタイプが存在し、これらのうちの７つが内皮下層で見出されている。コラーゲンに対するいくつかの異なる受容体が血小板において同定されているが、主要な受容体は、現在、インテグリンα2β1および非インテグリンのＧＰＶＩであると見なされている。α2β1は十分な特徴付けが行われ、そして両方のサブユニットが数年前にクローン化および配列決定されたが、ＧＰＶＩの構造は、いくつかの特徴が同定されているにもかかわらず、解明されないままである。ＧＰＶＩは、分子量が６０ｋＤａ〜６５ｋＤａの範囲にあり、酸性のｐＩを有する主要な血小板糖タンパク質であることが約２０年前に明らかにされた。推定的なコラーゲン受容体としてのその役割は、血小板がコラーゲンへの応答の特異的な欠如を示し、この受容体を有しない、軽度の出血異常患者が日本で確認された後に確立された。この患者はその不完全な受容体に対する自己抗体をも発達させていたので、この自己抗体を使用してこの分子の特徴付けがさらに行われた。より近年には、ＧＰＶＩが、複合体のシグナル伝達部として作用する共通のＦｃγサブユニットと非共有結合的に会合していることが明らかにされた。ＧＰＶＩに対するコラーゲン上の認識配列がコラーゲンの三重らせん構造内の反復したＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐトリプレットであること、そしてこの構造に基づく合成ペプチドがＧＰＶＩに対する特異的なアゴニストとして使用され得ることもまた明らかにされた。ＧＰＶＩ／Ｆｃγ複合体は、ｐ７２SYKの活性化を含み、キナーゼ／ホスファターゼ／アダプタータンパク質の相互作用のカスケードによりＰＬＣγ２を活性化させ、従って顆粒の放出および血小板の凝集に至る免疫受容体様の機構によって血小板内部にシグナル伝達することが明らかにされた。この分子を特徴付けることにおけるさらなる段階は、熱帯ガラガラヘビＣｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓから得られたヘビＣ型レクチンのコンブルキシン（ｃｏｎｖｕｌｘｉｎ）が、多量体相互作用によりＧＰＶＩをクラスター化することによって血小板を活性化し得るということが明らかにされたことであった。コンブルキシンは、ＧＰＶＩに特異的に結合することを示し、確立された方法と組み合わせてこの受容体を精製する方法を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、ＧＰＶＩは、とりわけコラーゲン−血小板の相互作用に依存する血液凝固事象に、直接的または間接的に関連する適用に関する多くの治療分野において、非常に興味深い化合物であると考えられることは先行技術から明らかである。従って、ＧＰＶＩを組換え形態で提供し、かつ直接的な治療標的としてのその効力、または小さな化合物、特に、自然のコラーゲン−血小板相互作用を阻害または阻止する能力を有する化学合成化合物または化学合成可能な化合物、をスクリーニングするためのツールとしてのその効力を示すことは本発明の目的であった。
【０００６】
本発明はまた、コラーゲンに結合する、という生物学的活性を保持しているＧＰＶＩタンパク質の一部分またはフラグメントに関する。
【０００７】
本発明は、予備的な特徴付けおよびペプチドの配列決定に十分な量のＧＰＶＩを精製することに成功した。その配列を使用して、ＤＮＡライブラリーにおける陽性配列を同定するためのＰＣＲ用プライマーを設計した。このＤＮＡ配列は、その後、ほぼ完全なｃＤＮＡ配列をライブラリーから単離するためのプローブとして使用され、そして足りない５'−配列が、血小板のｃＤＮＡライブラリーからＲＡＣＥ法を使用して得られた。
【０００８】
本発明はまた、例えば、損傷を受けた血管壁を有する患者において投与されたときに、コラーゲンに結合し、従って、膜結合型ＧＰＶＩを有する血小板が前記コラーゲンに結合しないようにし得る治療に適用可能な化合物として、組換えＧＰＶＩが使用されることを示すことにも成功した。ＧＰＶＩのこの組換え可溶性細胞外ドメインは、コラーゲン結合部位を含有し、コラーゲンによる血小板の活性化を妨げることができる。従って、このドメインは、アテローム硬化性斑破裂などの、コラーゲンにより増大した血小板活性化を含む疾患状態の処置に、あるいは不安定狭心症などの疾患において、あるいは血管壁に対する相当の損傷および血小板の大きな活性化を生じさせ、そして多くの場合には血管の再閉鎖を後で生じさせる、バルーンカテーテルの膨張によって動脈が再開通される経皮冠動脈管腔拡張術（ＰＴＣＡ）などの手術的処置のときに適用することができると考えられる。組換えＧＰＶＩフラグメントの利点は、現在の処置法と比較した場合、フラグメントが、ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａアンタゴニストによる凝集などの血小板活性化後の事象を抑制することによるのではなく、むしろ血小板の活性化を妨げるか、または血小板の活性化を低下させることによって、より早い段階で作用するということである。従って、より少ない量の血小板顆粒内容物が放出される。これには、外傷修復だけでなく、平滑筋遊走による血管壁の再構築、およびアテローム性動脈硬化症の一因であることが知られている単球などの食細胞の引き寄せにも関与している増殖因子およびケモカインが含まれる。ＧＰＶＩに対するヒト化マウスモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントは、上記のような類似する適用で血小板表面のＧＰＶＩを阻止するために類似した効果で使用することができる。
【０００９】
本発明による組換えＧＰＶＩはまた、この相互作用を阻害することができ、かつコラーゲン−血小板相互作用の阻害剤である治療化合物を開発するために使用され得る（例えば、コンビナトリアルライブラリーの）小さな分子をスクリーニングするために、コラーゲンに対する結合アッセイにおいて使用することができる。好適な誘導体化により、これらの化合物は経口的に利用することができる。再度ではあるが、主要な目的は、ＧＰＶＩ−コラーゲンの相互作用を低下させ、従って、血小板がコラーゲンと接触する状況で血小板の活性化を低下させる化合物を調製することである。そのため、本発明において使用されているスクリーニング技術自体は、先行技術において十分に確立されている。そのようなスクリーニングアッセイにより、本発明は、血小板表面に存在する天然の膜結合型ＧＰＶＩをコラーゲンアンタゴニストとして阻害し得る新しい標的の発見および開発を可能にする。小さな化学物質分子であり得るそのような標的は、その後さらなる発明の基礎となり得る。
【００１０】
ＧＰＶＩおよびＧＰＶＩの特定ドメインを認識する試薬の別の主要な適用は、血小板の老化および機能性のマーカーとしての適用である。若い血小板は、一般に、老化した血小板よりも活性であり、かつ機能的であると考えられる。若い血小板は、ＧＰＶＩに特異的なヘビ毒液Ｃ型レクチンのコンブルキシンに結合し、かつコンブルキシンにより活性化され、そして血小板は老化するに従って、その結合および活性化度はともに低下する。これは、循環における血小板の活性化または損傷によるＧＰＶＩにおけるタンパク質分解的または立体配座的な変化あるいはＦｃγとのその会合のいずれかのためであり得る。これは、医学的に管理されている患者ならびに健常者における血小板の老化プロファイルおよび機能プロファイルを測定するための有用なパラメータであり得る。血小板の老化プロファイルは、骨髄または免疫系を冒す多くの疾患において変化し、そのより良好な決定方法が得られる場合には重要な診断基準になり得る。例えば、血小板の増大した代謝回転が関与する疾患患者はより多くの若い血小板を示し、これに対して、化学療法または放射線処置を受けている患者は一様に老化した集団を示す。従って、そのような老化プロファイルは、処置の精密なモニターリングに使用することができる。正常である健康な集団では、老化プロファイル分布について、そして健康における変化を予測するものとしてのその役割についてはほとんど知られていていない。ＧＰＶＩの変化が止血事象における血小板の部分的な関与であるかどうか、そして変化が広範囲の心臓血管疾患を有する患者でより顕著であり得るかどうかは知られていない。現在、チアゾールオレンジが、ｍＲＮＡを含有する若い網状化血小板を検出するために使用されている。このｍＲＮＡはすぐに崩壊し、このため、この方法は最も若い血小板のみに制限されている。そのようなアッセイにおいて使用され得る試薬には、コンブルキシンなどのＧＰＶＩ特異的なヘビ毒液タンパク質、あるいはＧＰＶＩのＮ末端領域を認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいは無傷の分子に存在し、かつ老化した分子には存在しない、またはその逆のＮ末端ドメインまたは特定の立体配置のタンパク質分解により露出した新しい部位または立体配置を認識するモノクローナル抗体、あるいは無傷のＧＰＶＩを特異的に認識する選択された小さな化学的実体またはその改変形態が含まれる。これらの試薬は、血小板の結合プロファイルを測定するために、蛍光マーカーで標識されるか、あるいは蛍光標識された二次抗体またはアフィニティ試薬と一緒にされてフローサイトメトリーにおいて使用される。代替可能な後者の段階では、血小板プロファイルの自動化された測定に基づくあまり手間のかからない測定技術を採用することができる。フローサイトメトリーまたは磁気ビーズによる細胞選別を使用することによって、若い血小板および老化した血小板を単離して、老化した血小板の循環からの除去に関与する因子を調べることが可能になるはずである。ＧＰＶＩの特定の形態を認識する試薬は、そのような研究にとって重要である。
【００１１】
従って、糖タンパク質ＶＩまたはその生物学的活性フラグメントをコードするＤＮＡ、特に図２の配列を提供することは本発明の目的である。
【００１２】
図１ａおよび図１ｂのアミノ酸配列を含む糖タンパク質ＶＩをコードするＤＮＡを提供することは本発明のさらなる目的である。
【００１３】
組換えＧＰＶＩを、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤と一緒に含む医薬組成物、ならびに血小板−コラーゲン間の相互作用に関連する血栓症的および心臓血管系の事象および異常の治療分野における医薬品を製造するためのその使用を提供することは本発明の別の目的である。
【００１４】
本発明の別の目的は、血小板−コラーゲン間の相互作用の特異的な阻害剤を検出するスクリーニングツールにおける組換えＧＰＶＩの使用である。
【００１５】
本発明の別の目的は、心臓血管疾患に対する血小板の老化および露出のマーカーとしてのＧＰＶＩの使用である。
【００１６】
考えられる医学的な症状および適用にはそれぞれ、例えば、不安定狭心症、ＰＴＣＡ、この分野におけるステントの使用、冠状動脈血管に対する手術、血管に対する一般的な手術、股関節手術などのより大きな血管に損傷を与え得る手術がある。さらに、血管壁と、血栓形成および血管閉塞のリスクが高い凝固系との相互作用の異常によって生じる血栓塞栓性事象に関連するすべての適応症が含まれる。
【００１７】
上記に示されているように、本発明によるＧＰＶＩタンパク質またはそのフラグメントは、医薬組成物および配合物における薬学的に効果的な化合物として好適である。
【００１８】
本発明による医薬配合物は必要に応じて、ヒルジンまたはヘパリンなどの抗凝固剤、あるいはプラスミノーゲン活性化因子またはヘメンチンなどの血栓溶解剤、あるいはアブシキマブ（ａｂｃｉｘｉｍａｂ）またはエプチフィバチドのようなＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａアンタゴニストなどの他の血小板受容体に対するアンタゴニスト、あるいはクロピドグレルなどのＡＤＰ受容体アンタゴニストのようなさらなる有効成分を含むことができる。
【００１９】
本発明による新規タンパク質およびその生物学的活性フラグメントは、それぞれ、任意の非毒性の有機酸または無機酸との薬学的に許容される塩を形成し得る。無機酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸、ならびにオルトリン酸一水素ナトリウムおよび硫酸水素カリウムなどの酸金属塩である。有機酸の例には、酢酸、グルコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸などのモノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸、ならびにメタンスルホン酸などのスルホン酸がある。カルボキシ末端アミノ酸残基の塩には、任意の好適な無機塩基または有機塩基によって形成される非毒性のカルボン酸塩が含まれる。これらの塩は、例えば、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属、アルミニウムを含むＩＩＩＡ族の軽金属、ならびにトリエチルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、１−エテンアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、ジヒドロアビエチルアミンおよびＮ−アルキルピペリジンを含む、トリアルキルアミンなどの、有機の第一級、第二級、および第三級アミンを含む。
【００２０】
本明細書中で使用されている用語「薬学的に許容される担体」は、活性化合物または患者と逆に反応を起こさない、不活性で非毒性の固体または液体の充填剤材料、希釈剤材料またはカプセル化材料を意味する。好ましい液体担体はこの分野ではよく知られており、例えば、滅菌水、生理食塩水、デキストロース水溶液、糖の溶液、エタノール、グリコールおよびオイル（石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のものを含み、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油およびミネラルオイル）などである。
【００２１】
本発明による配合物は、非経口投与に関して典型的な従来の非毒性の薬学的に許容される担体、希釈剤、補助剤およびビヒクルを含有する単位用量物として投与され得る。
【００２２】
用語「非経口」は、本明細書中では、皮下、静脈内、動脈内および気管内への注射技術および注入技術を含む。また、経口投与および局所適用などの他の投与法も好適である。非経口用の組成物および配合物は、最も好ましくは知られている手法により、ボーラス剤の形態でまたは一定の注入物として静脈内投与される。経口投与される錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、希釈剤、錠剤化剤、滑沢剤、崩壊剤および湿潤化剤などの従来の賦形剤を含有する。錠剤は、この分野でよく知られている方法に従ってコーティングされ得る。
【００２３】
経口用の液体調製物は、水性または油状の懸濁物、溶液、エマルション、シロップまたはエリキシル剤の形態であり得るか、あるいは使用前に水または他の好適なビヒクルで再構成される乾燥製剤として提供され得る。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤のような従来の添加剤を含有させることができる。
【００２４】
局所適用剤は、水性または油状の懸濁物、溶液、エマルション、ゼリー、または好ましくはエマルション軟膏の形態であり得る。
【００２５】
本発明による単位用量物は、本発明によるタンパク質の１日必要量、あるいは所望の用量を構成するその部分分割量を含有することができる。特定の患者（ヒトを含む哺乳動物）に対する最適な治療的に受け入れられる投薬量および投薬割合は、用いられる特定の活性物質の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間および投与経路、クリアランス速度、処置目的（すなわち、治療または予防）、ならびに処置される血栓症的疾患の性質、抗血小板活性または抗凝固活性などの様々な要因に依存する。
【００２６】
従って、（ｉｎ  ｖｉｖｏ）処置される患者で抗凝固剤として有用な組成物および配合物において、本発明のポリペプチドの薬学的に効果的な日用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重と１００ｍｇ／ｋｇ体重との間であり、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重と１０ｍｇ／ｋｇ体重との間である。適用形態に従って、１回の単回用量物は、０．５ｍｇと１０ｍｇとの間のコラーゲン阻害剤を含有することができる。体外の血液において抗凝固作用を達成するためには、本発明のペプチドの薬学的に効果的な量は、０．２ｍｇ／ｌ体外血液と１５０ｍｇ／ｌ体外血液との間であり、好ましくは１ｍｇ／ｌ体外血液と２０ｍｇ／ｌ体外血液との間である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＧＰＶＩのタンパク質配列（１文字表記）を示す図である。図１ａ：リーダー配列、図１ｂ：成熟タンパク質、オープンリーディングフレーム：３３９アミノ酸、アステリクス：グリコシル化部位、二重下線部：膜貫通ドメイン、下線部：配列決定定されたペプチド。
【図２】１０１７ｂｐのオープンリーディングフレームならびに３'領域および５'領域を含むＧＰＶＩヌクレオチド配列（総数：１２４９ｂｐ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
遺伝暗号における最も低い縮重度を示す７アミノ酸の２つの配列を、ＰＣＲによってＧＰＶＩのｃＤＮＡの一部を増幅するためのＤＮＡプライマーを合成するために選んだ。タンパク質内の両ペプチドの位置は全く不明であったので、そのそれぞれについて、１つのセンスと１つのアンチセンスの２つの縮重プライマーを調製した。これらのプライマーを使用して、ヒト骨髄ライブラリーを増幅した。配列ＰＡＭＫＲＳＬをコードするセンスプライマー５'ＴＹＡＴＨＣＣＮＧＣＮＡＴＧＡＡＲＭＧ３'と、ＤＱＦＡＬＹＫに対応するアンチセンスプライマー５'ＴＴＲＴＡＮＡＲＮＧＣＲＡＡＹＴＧＲＴＣ３'との組合せにより、２２１ｂｐのＤＮＡフラグメントが増幅された。選択されたペプチドに加えて、増幅されたＤＮＡは、ＬｙｓＣ／ＡｓｐＮペプチドのＤＱＬＥＬＶＡＴＧＶＦＡＫＰＳＬＳＡＱＰＧＰＡＶＳＳをコードした。これにより、この配列はＧＰＶＩのｃＤＮＡに明らかに連結された。
【００２９】
この２２１ｂｐのＤＮＡフラグメントを用いて骨髄ライブラリーから６００．０００ｐｆｕをスクリーニングすることにより、４個の陽性ｐｆｕが得られた。３つは、制限酵素ＳａｌＩまたはＥｃｏＲＩで切断しても１３５０ｂｐの挿入断片を有し、ＩｇＧスーパーファミリーに属した。４個目は、ＳａｌＩ消化による４．６ｋｂの挿入断片を有し、ＥｃｏＲＩで処理したときにそれぞれ２３００ｂｐおよび１３００ｂｐの２つのフラグメントをもたらした。そのＤＮＡは、ＧＰＶＩのアミノ酸配列決定に由来する１０個のペプチドに対する配列をコードしていたが、アミノ末端に達しないところで停止していた。開始メチオニンまたはリーダー配列を見出すことができなかったが、Ａｌｕ配列で終了する、以前に配列決定された非リーディングフレームＤＮＡの２０００ｂｐ以上が存在していた。５'末端ＲＡＣＥ実験を、それらのペプチドの配列によって裏付けられたＧＰＶＩ配列の一部分内に位置するプライマーを用いて血小板のポリＡ  ＲＮＡに対して行った。４番目のクローンの配列における２７８ｂｐを含む３４８ｂｐのフラグメント、および最初のメチオニンを含む１４アミノ酸に対応する１９８７ｂｐに由来する新しい７０ｂｐが見出され、その後、確立されたＧＰＶＩ配列に達した。従って、合計で１２４９ｂｐ、すなわち、開始コドンの上流の２５ｂｐの５'配列、リーダー配列を含み、３３９アミノ酸を有するタンパク質をコードする１０１７ｂｐのオープンリーディングフレーム、および停止コドンを含む２０７ｂｐの３'領域を含有するｃＤＮＡを配列決定することができた。
【００３０】
血小板ＧＰＶＩをコードするｃＤＮＡが、不足する５'配列を補充するための血小板ｍＲＮＡを用いたＲＡＣＥを使用して、ヒト骨髄のｃＤＮＡライブラリーからクローン化され、そして配列決定された。１０１７ｂｐのオープンリーディングフレームは３３９個のアミノ酸をコードし、非翻訳３'領域を有する。アミノ酸配列の疎水性分析により、２つの推定的な膜貫通ドメイン、推定的な２０アミノ酸シグナル配列、および成熟タンパク質の残基２４７と残基２６５との間の１９アミノ酸ドメインが存在することが明らかにされた。配列およびそのアミノ酸翻訳を図２および図１に示す。ＧｅｎＢａｎｋの検索において見出された最も類似する分子のアミノ酸配列と比較することにより、ＧＰＶＩは免疫グロブリンスーパーファミリーに属すること、およびその細胞外ドメインは、２つのジスルフィド架橋により形成された２つのＩｇＣ２ドメインループを含有することが明瞭にされる。ＧＰＶＩは、Ｎ末端を外側に有する膜横断タンパク質クラスの分子であり、膜を１回横断する。最も近縁の分子は、阻害タイプおよび活性化タイプの両方を含有するナチュラルキラー受容体クラスに属する。ＧＰＶＩは、その機能によるだけでなく、阻害クラスとは異なり、ＩＴＩＭ配列をその細胞質ドメインに含有しないために活性化サブクラスに属することは明らかである。ＧＰＶＩは、リン酸化に関与し得るチロシン残基を１つも含有しない。このドメインには数個のトレオニン残基およびセリン残基が存在するが、それらは、キナーゼのコンセンサス配列に対する基準を何ら満たさない。ＮＫ受容体の活性化クラスと同様に、ＧＰＶＩは、Ｆｃγサブユニットとの複合体形成に関与する膜横断ドメインの３番目のアミノ酸としてアルギニン残基を含有する。細胞質ドメインは、このファミリーの他のメンバーの細胞質ドメインに対する（膜のすぐ下流の領域における）わずかな類似性のみを示す５１個のアミノ酸を含有する。このことは、ＧＰＶＩにおけるこのドメインは、それ以外のファミリーメンバーとは異なるタイプの細胞質分子と会合し得ることを示唆している。ＧＰＶＩは、１個の推定的なＮ−グリコシル化部位をＡｓｎ６９に含有するだけである。しかし、Ｉｇドメインのβシートが終了した後の膜のすぐ上流のドメインは、ＧＰＩｂαおよびＧＰＶにおいて見出されているようなＯ−グリコシル化部位を提供し得るトレオニン残基およびセリン残基が多い。このＯ−グリコシル化の主要な機能は、その嵩張ったリガンドとの相互作用を容易にするために血小板表面から十分に広がった受容体構造体を提供することであると考えられる。ＧＰＶＩはシアロ糖タンパク質としてより以前には明らかにされていたので、理論的なアミノ酸質量（３７ｋＤａ）とゲル電気泳動で決定された質量（６５ｋＤａ、還元）との分子量の差は、このグリコシル化のためであるに違いない。
【００３１】
この２つのドメインタイプのナチュラルキラー受容体の構造が、Ｘ線結晶学研究によって明らかにされ、そして２つのＩｇドメインが、ひじ部の外側に位置するペプチド保有ＨＬＡ抗原の受容体部位とともに鋭角を形成していることが示された。ＨＬＡペプチド結合部位の構造をコラーゲンの構造と直接比較することにより、それが含有するＨＬＡ結合部位およびペプチドの多数のα−らせん構造がコラーゲンの三重らせん構造に非常に類似しているので、直ちに、なぜこれらの受容体が共通の起源を有するかが示唆される。ナチュラルキラー受容体は、ナチュラルキラー細胞が調べている細胞における２つの離れたＨＬＡ部位を認識する２つの受容体による二量体化機構によって作用することが推定される。おそらくは、この二量体化は、受容体のクラスに依存した活性化機構または失活化機構の一部である。ＧＰＶＩの場合、２つのＧＰＶＩ分子が１つのＦｃγと会合する可能性があり得る。これは、Ｆｃγダイマーの各モノマーが認識部位を有するからである。しかしながら、化学量論は未だ知られておらず、そしてコラーゲンの構造、ＧＰＶＩおよびコンブルキシンを介して作用するコラーゲン様ペプチドとの構造に基づいて、シグナルの強さが、一緒にクラスター化しているＧＰＶＩ／Ｆｃγ複合体の数に関連することは確からしい。このＩｇファミリーに属する他の血小板受容体には、ＩＣＡＭ−２（ＣＤ１０２）およびＰＥＣＡＭ（ＣＤ３１）が含まれる。
【００３２】
請求された発明に関連して直接的に明細書中に記載されていない微生物、細胞株、発現システム、発現宿主、プラスミド、プロモーター、耐性マーカー、複製起源、ベクターの制限部位あるいは他のフラグメントまたは部分は、すべて市販されているか、そうでなければ、一般に手に入れることができる。他の示唆が与えられていない場合、それらは例として使用されるだけであり、本発明に関して必須ではなく、従って他の好適なツールおよび生物学的材料によりそれぞれ置き換えることができる。
【００３３】
本発明により必須である技術は、下記および上記に詳しく記載されている。詳しく記載されていない他の技術は、当業者によく知られている、知られた標準的な方法に対応しているか、あるいは引用された参考文献および特許明細書に、そして標準的な文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ；Ｈａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）にさらに詳しく記載されている。
【実施例】
【００３４】
実施例１：材料−プロテインＡ−セファロース、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体およびペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体、ウシ血清アルブミン、Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓ  ｔｅｒｒｉｆｉｃｕｓ毒液、コムギ胚芽凝集素（ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ；ＷＧＡ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルクロロホルマート活性化架橋４％ビーズ状アガロースならびにトリトンＸ−１１４をＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＯＮＭＧ）およびノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＮＮＭＧ）をＯｘｙｌ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｂｏｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）から入手した。
【００３５】
実施例２：血小板からのＧＰＶＩの単離−膜糖タンパク質を、以前に記載されたようにして血小板から単離した。簡単に記載すると、血小板（４０の軟膜に由来）を洗浄し、プロテアーゼ阻害剤の存在下、２％トリトンＸ−１１４中で溶解した。トリトンＸ−１１４および水相を分離し、界面活性剤相を、セファロース４Ｂに結合させたコムギ胚芽凝集素のカラムに負荷した。血小板糖タンパク質を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＯＮＭＧ）および２％Ｎ−アセチルグルコサミンにおいて溶出した。透析および濃縮を行った後、糖タンパク質の溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミジル−ｐ−ニトロフェニルクロロホルマート活性化架橋４％ビーズ状アガロースに結合させたコンブルキシンのカラム（１ｍｇ／ｍｌ）に負荷した。カラムを、４容量の１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＮＮＭＧ）で洗浄し、次いで４容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、３０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２％ＮＮＭＧで洗浄した。ＧＰＶＩを、０．０８％ＳＤＳを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で溶出した。溶液を濃縮し、４９１型Ｐｒｅｐ  Ｃｅｌｌ（ＢｉｏＲａｄ、ＣＡ）を使用する８．５％ポリアクリルアミドの調製用ゲルに負荷した。調製用電気泳動を製造者の説明書に従って非還元条件下で行った。ＧＰＶＩは６５ｋＤａの単一バンドとして溶出した。この画分をまとめ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で濃縮し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）および０．１％ＯＮＭＧに再懸濁した。
【００３６】
実施例３：ＧＰＶＩのアミノ酸分析−ＧＰＶＩをエンドプロテイナーゼＬｙｓＣおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐＮ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で消化した。得られた１０個のペプチドを逆相ＨＰＬＣで分離し、１２０Ａ型オンラインフェニルチオヒダントインアミノ酸分析計を備えたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社の４７７Ａ型パルス液相タンパク質シーケンサで配列決定した。
【００３７】
実施例４：ＧＰＶＩの一部をコードする２２１ｂｐフラグメントのλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーからの増幅−
ヒト骨髄ライブラリー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）に由来するサンプル（１０10ｐｆｕ）（プラーク形成単位）を、４つの縮重プライマーの２つの組合せを使用して増幅した。プライマーの最終濃度は２μＭであり、ｄＮＴＰ濃度は２００μＭであり、２Ｕ／１００μｌ反応物のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、スイス）を使用した。ＰＣＲ条件は、３７℃での５サイクル、その後、４４℃での３０サイクルであった。５'ＴＹＡＴＨＣＣＮＧＣＮＡＴＧＡＡＲＭＧ３'のセンス１９ｍｅｒおよび５'ＴＴＲＴＡＮＡＲＮＧＣＲＡＡＹＴＧＲＴＣ３'のアンチセンス２０ｍｅｒにより、２２１ｂｐのフラグメントが増幅され、これをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）にサブクローン化し、Ｔ７Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、スイス）を使用して配列決定した。
【００３８】
実施例５：２２１ｂｐのＧＰＶＩプローブを用いたλｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング−２２１ｂｐのフラグメントをプラスミドから切断し、清浄化し、Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、スイス）を使用してα32Ｐ−ＡＴＰ（２０ＭＢｑ／５０μｌ、Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ａｎａｌｙｔｉｋ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）で標識した。ヒト骨髄ライブラリーを製造者の説明書に従ってスクリーニングした。陽性ファージを増殖させ、そのＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ部位またはＳａｌＩ部位のいずれかを使用してＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにサブクローン化し、配列決定した。配列決定を、ＲＡＣＥのＡＢＳシステムを用いて行った。血小板のポリＡ  ＲＮＡを、以前に記載されたようにして調製した（Ｐｏｗｅｒ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、７、４７９〜４８２、１９９５）。逆転写（３０μｌ）を、５μｇのポリＡ  ＲＮＡを、プライマー５'ＴＧＡＡＴＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＧＴＴＣＡＧＣ３'（２０μＭ）、ｄＮＴＰ（１ｍＭ）、ＲＮＡｓｉｎ（４０Ｕ）、１Ｘ  ＡＭＶ緩衝液、および２０ＵのＡＭＶ逆転写酵素とともに使用して４５℃で２０分間行い、その後、５２℃で２０分間行った。反応混合物を２μｌの６Ｎ  ＮａＯＨで６５℃において３０分間処理し、２μｌの６Ｎ酢酸で中和して、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。アンカーをＡｐｔｅｓおよびＳｉｅｂｅｒｔのプロトコル（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１５：８９０〜８９３、１９９３）に従って第１鎖ＤＮＡに連結した。ネスティッドＰＣＲを、アンカーに相補的なプライマーおよびプライマー５'ＴＴＧＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＴＴＧＧＴＣ３'を使用して行い（３５サイクル、５５℃）、その後、プライマー５'ＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＣＣＧＴＴＣＴＧ３'を使用して行った（５３℃で３０サイクル）。最も大きなバンド（３５０ｂｐ）を、それよりも小さいバンドからアガロース電気泳動で分離し、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔにサブクローン化して、配列決定した。
【００３９】
実施例６：抗ＧＰＶＩＦａｂおよびＦ（ａｂ'）2の調製−ヒトＧＰＶＩに対するポリクローナル抗血清をウサギにおいて生成させた。ＩｇＧを、ウサギ抗ＧＰＶＩ抗血清から、記載されたようにして精製した。Ｆａｂフラグメントを生成させるための固定化パパイン（Ｐｉｅｒｃｅ）によるＩｇＧの消化を供給者の標準的なプロトコルに従って行った。Ｆａｂフラグメントを、固定化プロテインＡ（Ｓｉｇｍａ）カラムを使用して未消化ＩｇＧおよびＦｃフラグメントから分離した。素通り部分を透析チューブに移し、固体のポリエチレングリコール２０，０００を使用して濃縮し、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４に対して徹底的に透析し、そして使用するまで４℃で保存した。Ｆ（ａｂ'）2フラグメントを、０．５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．０）中における３７℃で１８時間にわたるＩｇＧのペプシン消化（１：５０の酵素対基質比（ｗ／ｗ））によって調製した。ｐＨを希ＮａＯＨで７．４に調節し、サンプルを２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．４）に対して透析し、その後、Ｆ（ａｂ'）2フラグメントを、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して未消化ＩｇＧおよびＦｃフラグメントから分離した。素通り部分を透析チューブに移し、固体のポリエチレングリコール２０，０００を使用して濃縮し、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４に対して徹底的に透析し、小分けして−２０℃で保存した。洗浄した血小板をトリトンＸ−１１４中で溶解し、相分離を可溶物に対して行い、その後、トリトンＸ−１１４相と会合した膜糖タンパク質を、以前に記載されたようにしてコムギ胚芽凝集素−セファロース４Ｂでのアフィニティークロマトグラフィーで分離した。ＧＰＶＩは血小板膜糖タンパク質プールの非常に小さな画分を示すので、本発明者らは、この受容体を分離するために、ヘビＣ型レクチンのコンブルキシンの特異性を使用した。セファロース４Ｂに結合させたコンブルキシンでのアフィニティークロマトグラフィーにより、６５ｋＤａのタンパク質が主生成物として得られた。しかし、それよりも大きなＭｒおよびそれよりも小さなＭｒの両方の特徴付けられない物質がＧＰＶＩと同時に溶出し、これらはカラムの徹底的な洗浄で除去できなかった。８．５％ポリアクリルアミドでの調製用ゲル電気泳動を精製の最終ステップとして加えた。ＧＰＶＩを含有する画分をまとめ、これは再分析で単一バンドを示した。精製ＧＰＶＩを、コラーゲンによる血小板凝集を阻止するその能力について試験した。わずかな阻害作用が、ＧＰＶＩ溶液の一部を血小板懸濁液に加えたときに認められた。しかし、混合物を血小板懸濁物に加える前にＧＰＶＩをコラーゲンとプレインキュベーションすることによって、凝集は用量依存的に阻害された。これらの血小板は、新たなコラーゲンが添加されたときにもやはり凝集した。非還元条件下において、この単離されたタンパク質は６２ｋＤａのＭｒを有し、還元条件下ではわずかに大きなＭｒ（６５ｋＤａ）に変化した。ＧＰＶＩのアミノ末端はブロックされていることが見出されたので、タンパク質を、配列が得られる４個のペプチドおよび６個のペプチドをそれぞれもたらす酵素ＬｙｓＣおよび酵素ＬｙｓＣ／ＡｓｐＮで消化した。これらのペプチドをＣ４カラムでの逆相ＨＰＬＣで分離し、エドマン法を使用して配列決定した。これらのペプチドのアミノ酸配列には、翻訳されたｃＤＮＡ配列（図１）において下線が引かれている。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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