(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式：
【化１Ａ】
0005542804.tif 000118
で表される化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、
［Ｎ］は、Ｎ−メチル−ピペラジノである弱塩基部分であり、そして
（スペーサー）は、２’位の酸素原子に結合するカルボニルを［Ｎ］に接続する連結基であって、該（スペーサー）は（ｉ）Ｃ１〜１０アルキレン基、（ｉｉ）Ｃ２〜１０アルキレン基であって、１つ以上のＣＨ２がＯ、ＮＨ、またはＳと置き換えられている、Ｃ２〜１０アルキレン基、および（ｉｉｉ）Ｃ２〜１０アルキレン基であって、隣接するＣ原子の対の１つ以上が、Ｅ−幾何学またはＺ−幾何学を有する二重結合となっているか、または三重結合となっている、Ｃ２〜１０アルキレン基、からなる群より選択される、化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
（スペーサー）は、Ｃ１〜１０アルキレン基である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
（スペーサー）は、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
−Ｃ（＝Ｏ）−（スペーサー）−［Ｎ］は、以下：
【化２Ａ】
0005542804.tif 000119
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
−Ｃ（＝Ｏ）−（スペーサー）−［Ｎ］は、以下：
【化４Ａ】
0005542804.tif 000120
からなる群より選択される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
以下の式：
【化５Ａ】
0005542804.tif 000121
で表される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
以下の式：
【化６Ａ】
0005542804.tif 000122
で表される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
以下の式：
【化９Ａ】
0005542804.tif 000123
で表される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
以下の式：
【化１２Ａ】
0005542804.tif 000124
で表される、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
医薬的に許容されるキャリアと一緒に混合された請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬的に許容されるキャリアは、リポソームを含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連する出願との相互参照）
本願は、米国仮特許出願第６１／０５５，９２９号(２００８年５月２３日出願)の利益を主張する。この仮特許出願は、その全体が参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、リポソームに封入されにくいか、またはリポソームに封入することができない薬物を化学的に修飾し、膜内外のｐＨ勾配またはイオン勾配を示すリポソームナノ粒子（ＬＮ）に有効に充填させることが可能な誘導体を形成する方法に関する。いくつかの好ましい局面では、この誘導体は、ＬＮから放出されると、遊離薬物に容易に変換されるプロドラッグである。また、本発明は、本発明の方法にしたがって製造した薬物誘導体、このような誘導体を含むＬＮ配合物および医薬組成物、これらを製造する方法および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
既にある多くの薬物開発戦略は、水溶性であり、生体利用可能な「新薬の開発につながる（ｄｒｕｇｇａｂｌｅ）」化合物の発見に基づいて予測されている。結果として、新しく開発された化合物のうち、溶解性が低く、バイオアベイラビリティが限定的なものは、治療性能が有望なものであっても、ほとんどが次の段階に進むことはない。
【０００４】
新薬の開発につながらない化合物の限定事項を克服するために、種々の薬物配合物および送達方法が開発されている。リポソームナノ粒子（ＬＮ）は、薬物を全身（静脈内）投与するための主要な薬物送達システムであり、多くのリポソーム薬物が現時点で上市されているか、または治験段階にある。ＬＮは、一般的に、毒性が低く、血清での半減期、バイオアベイラビリティ、浸透性などを向上させるような広範囲の有益な薬学的性質を与えるように設計することができる。ＬＮ配合物は、従来の（遊離）形態で投与すると、水溶性が低いこと、血清での半減期が短いこと、正常な組織にも病気の組織にも同様に無差別に蓄積することが原因で効能が限定されている化学療法剤と組み合わせると特に有効である。
【０００５】
長期間にわたって循環するＬＮは、典型的には、１００ｎｍ以下の直径を有しており、長期間にわたって血液循環中にとどまる。長期間にわたって循環するＬＮの寿命が長いことによって、ＬＮを、感染、炎症、腫瘍の成長部位、または他の疾患に関連する薬物標的に、またはその周囲に蓄積させることができる。この蓄積は、上述の領域の脈管の局所構造によって促進され（「漏れがある（ｌｅａｋｙ）」脈管と呼ばれ）、この構造は、リポソームが通り抜けて治療標的に到達可能な大きな穴を特徴とする（非特許文献１、非特許文献２）。したがって、化学療法剤または他の薬物と、長期間にわたって循環するＬＮとの安定な会合によって、治療標的に到達する薬物の量を増加やし、ＬＮから、治療濃度の薬物が制御（持続）放出され、標的がこれにさらされる時間が延び、健康な標的外の組織への蓄積が減り、これによって、有効性が上がり、毒性が下がる。固体腫瘍の場合、化学療法剤のＬＮ配合物は、動物モデルおよび臨床試験の両方において、治療指数、忍容性、有効性および他の性質を顕著に向上させた。
【０００６】
ＬＮの技術を目的の薬物に適用するには、薬物が、リポソームキャリアに充填され、治療標的で、または治療標的付近で適切な速度で放出されるように、薬物を修正する必要がある。薬物がリポソームに充填される性質は、薬物、リポソームの膜、リポソームの内部環境の化学的性質に依存する。一般的に、水溶性の薬物も脂溶性の薬物も、水溶性薬物と、リポソームの膜の内側に並ぶ極性リン脂質および／または水性のリポソームの内側との会合、および脂溶性薬物と脂質二重層との会合に関連する受動的な充填（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）技術を用い、リポソームに充填させることができる。しかし、多くの有用な薬物は、受動的な充填方法に修正できないような、より複雑な溶解性プロフィールを有する。
【０００７】
溶解性の低い薬物をリポソームに保持させる１つのアプローチは、受動的な充填を容易にするように、薬物を修飾することである。例えば、特許文献１および関連する刊行物に記載されているように、リポソーム配合物は、タキサンに、負の電荷を有する「加水分解促進基」（ＨＰＧ）を含有する炭化水素鎖を付加させて修飾することによって、脂質二重層への溶解性が向上した脂肪酸誘導体を形成させることが開発されている。しかし、受動的な充填方法は、一般的に、充填効率が悪く、薬物の保持性および放出性が低いリポソームが産出してしまい、得られた配合物の有用性も限定的なものとなる。
【０００８】
受動的な充填に関連する制限事項を克服するために、薬物を高い効率で充填し、とどまらせることが可能な、いくつかの能動的な充填技術が開発されている。特に有効なアプローチは、リポソームの膜を通じてｐＨ勾配を作り出し、酸性のリポソームの内側を有するリポソームと、リポソームの内側よりもｐＨが高い外側環境（例えば、中性ｐＨ）とを作り出すことによって、弱塩基性の薬物を保持させることを含む（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。弱塩基性薬物は、電荷が中性の（膜透過性の）形態および帯電した／プロトン化した（膜不透過性の）形態といった、２種類の同時に存在する（平衡状態の）形態で存在し得る。中性形態の薬物は、内側と外側の濃度が等しくなるまで、リポソーム膜を通って拡散する傾向があるだろう。しかし、酸性の内側環境によって、この中性形態がプロトン化し、それによって、この化合物が、リポソームの内側に捕捉され、取り込みが続く方向に進む。別のアプローチは、金属イオンの勾配を利用することを含む（例えば、非特許文献６）。リポソームの内側で金属イオン濃度が高く、外側環境には、金属イオンは存在しない。この保持方法は、ｐＨ勾配による技術と基本的には同じ原理による。弱塩基薬物の中性形態は、膜を通って浸透することができ、薬物−金属イオン複合体を形成することによって、リポソームの水性の内側にとどまる。この場合、薬物−金属イオン複合体の形成によって、薬物の連続的な取り込みが進む。
【０００９】
ある種の抗癌剤および抗菌剤（例えば、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン）は、ｐＨ勾配による能動的な充填技術を用い、ＬＮに簡単に保持させ、安定してとどまらせることができる（例えば、非特許文献７、非特許文献８；非特許文献９）。しかし、多くの臨床的に重要な薬物は、弱塩基ではなく、したがって、このような能動的な充填技術に合うように修正することができない（例えば、非特許文献１０）。例えば、特定のタキサン系薬物（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル）、ポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシド）を含む多くの抗癌剤は、標準的な方法を用いて、ＬＮに簡単には配合することができない。
【００１０】
タキソテール（登録商標）（ドセタキセル）およびタキソール（登録商標）（パクリタキセル）は、市場で最も広範囲に処方されている抗癌剤であり、薬物動態がきわめて変わりやすい（ドセタキセル）、薬物動態が線形ではない（パクリタキセル）、配合物のビヒクル（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ、Ｔｗｅｅｎ  ８０）と関連する重篤な過敏反応、投薬量を限定する骨髄抑制および神経毒性を含む、薬理学および毒性学での多くの懸案事項と関連がある。タキソテール（登録商標）の場合、薬物動態が非常に変わりやすいことによって、毒性および有効性に顕著な変動を生じ、結合していない薬物の全身暴露と関連する血液毒性にも顕著な変動を生じる。それに加え、タキサンの治療活性は、腫瘍細胞への薬物暴露時間に伴って増加するため、市販のタキサン配合物では、投薬量を限定する毒性のため、治療への有望性もかなり限定されてしまっている。
【００１１】
したがって、広範囲の薬物をＬＮとして配合することを可能にし、したがって、リポソーム送達技術の利点を実現することが可能な戦略が、当該技術分野で必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第６，４８２，８５０号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｊａｉｎ，Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、４：１−２３（１９９７）
【非特許文献２】Ｈｏｂｂｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：４６０７−４６１２（１９９８）
【非特許文献３】Ｍａｕｒｅｒ，Ｎ．、Ｆｅｎｓｋｅ，Ｄ．、およびＣｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．（２００１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １、９２３−４７
【非特許文献４】Ｃｕｌｌｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、１３３１：１８７−２１１（１９９７）
【非特許文献５】Ｆｅｎｓｋｅら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｖ．Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｗｅｉｓｓｉｇ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｐ．１６７−１９１（２００１）
【非特許文献６】Ｃｈｅｕｎｇ  ＢＣ、Ｓｕｎ  ＴＨ、Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓ  ＪＭ、Ｃｕｌｌｉｓ  ＰＲ：Ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎｔｏ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｂｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｍｎ２＋−ｄｒｕｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９９８）１４１４：２０５−２１６
【非特許文献７】Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、５１：６９１−７４３（１９９９）
【非特許文献８】Ｃｕｌｌｉｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．、１３３１：１８７−２１１（１９９７）
【非特許文献９】Ｓｅｍｐｌｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、９４（５）：１０２４−３８（２００５）
【非特許文献１０】Ｓｏｅｐｅｎｂｅｒｇら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、４０：６８１−６８８（２００４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一局面では、式Ｉの薬物誘導体
【００１５】
【化１】
0005542804.tif 000002
が提供され、式中、
Ｄは、薬物であり；
ｎは、１、２または３であり；
Ｚは、式ＩＩのリポソーム可溶化単位であり
【００１６】
【化２】
0005542804.tif 000003
ここで、
［Ｌ］は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
［Ｓ］は、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル（それぞれハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；シクロアルキル；−ＹＲ２からなる群より選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
−ＹＲ２で任意選択的に１箇所以上置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル
（ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり；
［Ｎ］は、一般式ＩＩＩの可溶化ドメイン
【００１７】
【化３】
0005542804.tif 000004
であり、式中、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール；プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか；または
ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。
【００１８】
ある局面では、［Ｎ］は、少なくとも約５．５のｐＫａを有する。
【００１９】
さらなる局面では、［Ｎ］は、約１２．０以下のｐＫａを有する。
【００２０】
ある局面では、薬物誘導体は、水性の内側を有するリポソームナノ粒子に能動的に充填させるのに適している。
【００２１】
さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させるのに適している。ある局面では、リポソームナノ粒子の水性の内側は、その外側媒体よりも酸性のｐＨを有している。さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側で、プロトン化されている。
【００２２】
他の局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の膜内にあるか、リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させるのに適している。これらの局面のうちいくつかでは、［Ｎ］は、式ＩＶａまたはＩＶｂの基から選択される：
【００２３】
【化４】
0005542804.tif 000005
〔式中、
Ａは、カルボニル、メチレン、ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか；または
Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
また、本明細書に提示されている薬物誘導体のリポソームナノ粒子配合物も、本明細書で提供される。ある局面では、リポソームナノ粒子配合物は、水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、薬物誘導体を能動的に充填させることによって形成される。
【００２４】
さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の膜内にある。ある局面では、リポソームナノ粒子の水性の内側は、その外側媒体よりも酸性のｐＨを有する。さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側で、プロトン化されている。
【００２５】
さらなる局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の膜内にあるか、リポソームナノ粒子の膜に安定して会合している。さらなる局面では、［Ｎ］は、式ＩＶａまたはＩＶｂの群から選択される：
【００２６】
【化５】
0005542804.tif 000006
〔式中、
Ａは、カルボニル、メチレン、ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか；または
Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
別の局面では、本明細書に提示した薬物誘導体のリポソームナノ粒子配合物と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
【００２７】
さらなる局面では、薬物をＬＮに保持させやすくするために、薬物を修飾する方法が本明細書で提供され、この方法は、式ＩＩのリポソーム可溶化単位（Ｚ）
【００２８】
【化６】
0005542804.tif 000007
〔式中、
［Ｌ］は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
［Ｓ］は、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル（それぞれハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；シクロアルキル；−ＹＲ２からなる群より選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
−ＹＲ２で任意選択的に１箇所以上置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル
（ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり；
［Ｎ］は、一般式ＩＩＩの可溶化ドメイン
【００２９】
【化７】
0005542804.tif 000008
であり、式中、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール；プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか；または
ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
を薬物に接合させる工程を含む。
【００３０】
さらに追加の局面では、薬物をリポソームナノ粒子に保持させる方法が本明細書で提供され、この方法は、式ＩＩのリポソーム可溶化単位（Ｚ）を前記薬物に接合させ、薬物誘導体を形成させる工程と；水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、前記薬物誘導体を能動的に充填させる工程とを含み、
ここで、
式ＩＩは、
【００３１】
【化８】
0005542804.tif 000009
であり、
［Ｌ］は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
［Ｓ］は、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル（それぞれハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；シクロアルキル；−ＹＲ２からなる群より選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
−ＹＲ２で任意選択的に１箇所以上置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル
（ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり；
［Ｎ］は、一般式ＩＩＩの可溶化ドメイン
【００３２】
【化９】
0005542804.tif 000010
であり、式中、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール；プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか；または
ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。
【００３３】
ある局面では、薬物誘導体を、リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させる。さらなる局面では、リポソームナノ粒子の水性の内側は、その外側媒体よりも酸性のｐＨを有する。さらなるそれ以外の局面では、薬物誘導体は、リポソームナノ粒子の水性の内側で、プロトン化されている。
【００３４】
ある局面では、薬物誘導体を、リポソームナノ粒子の膜内にあるか、リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させる。さらなる局面では、［Ｎ］は、式ＩＶａまたはＩＶｂの基である：
【００３５】
【化１０】
0005542804.tif 000011
〔式中、
Ａは、カルボニル、メチレン、ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか；または
Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
さらに別の局面では、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を、治療が必要な患者に投与する工程を含む、ある疾患または状態を治療する方法が提供される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
式Ｉの薬物誘導体：
【化１０１】
0005542804.tif 000012
〔式中、
Ｄは、薬物であり；
ｎは、１、２または３であり；
Ｚは、式ＩＩのリポソーム可溶化単位であり
【化１０２】
0005542804.tif 000013
ここで、
［Ｌ］は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
［Ｓ］は、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル（それぞれハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；シクロアルキル；−ＹＲ２からなる群より選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
−ＹＲ２で任意選択的に１箇所以上置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル
（ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり；
［Ｎ］は、一般式ＩＩＩの可溶化ドメイン
【化１０３】
0005542804.tif 000014
であり、式中、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール；プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか；または
ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
（項目２）
［Ｎ］が、少なくとも約５．５のｐＫａを有する、項目１に記載の薬物誘導体。
（項目３）
［Ｎ］が、約１２．０以下のｐＫａを有する、項目１に記載の薬物誘導体。
（項目４）
水性の内側を有するリポソームナノ粒子に能動的に充填させるのに適した、項目１に記載の薬物誘導体。
（項目５）
前記リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させるのに適した、項目４に記載の薬物誘導体。
（項目６）
前記リポソームナノ粒子の水性の内側が、その外側媒体よりも酸性のｐＨを有する、項目５に記載の薬物誘導体。
（項目７）
前記薬物誘導体が、前記リポソームナノ粒子の膜内にあるか、前記リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させるのに適した、項目４に記載の薬物誘導体。
（項目８）
［Ｎ］が、式ＩＶａまたはＩＶｂの基から選択される、項目７に記載の薬物誘導体、
【化１０４】
0005542804.tif 000015
〔式中、
Ａは、カルボニル、メチレン、ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか；または
Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
（項目９）
項目１に記載の薬物誘導体のリポソームナノ粒子配合物。
（項目１０）
水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、前記薬物誘導体を能動的に充填させることによって形成される、項目９に記載のリポソームナノ粒子配合物。
（項目１１）
前記薬物誘導体が、前記リポソームナノ粒子の水性の内側にある、項目１０に記載のリポソームナノ粒子配合物。
（項目１２）
前記リポソームナノ粒子の水性の内側が、その外側媒体よりも酸性のｐＨを有する、項目１１に記載のリポソームナノ粒子配合物。
（項目１３）
前記薬物誘導体が、前記リポソームナノ粒子の膜内にあるか、前記リポソームナノ粒子の膜に安定して会合している、項目１０に記載のリポソームナノ粒子配合物。
（項目１４）
［Ｎ］が、式ＩＶａまたはＩＶｂの基である、項目１３に記載のリポソームナノ粒子配合物、
【化１０５】
0005542804.tif 000016
〔式中、
Ａは、カルボニル、メチレン、ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか；または
Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
（項目１５）
項目９に記載のリポソームナノ粒子配合物と、医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
（項目１６）
薬物をＬＮに充填させやすくするために薬物を修飾する方法であって、該方法は、
式ＩＩのリポソーム可溶化単位（Ｚ）
【化１０６】
0005542804.tif 000017
〔式中、
［Ｌ］は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
［Ｓ］は、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル（それぞれハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；シクロアルキル；−ＹＲ２からなる群より選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
−ＹＲ２で任意選択的に１箇所以上置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル
（ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される
）；
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり；
［Ｎ］は、一般式ＩＩＩの可溶化ドメイン
【化１０７】
0005542804.tif 000018
であり、式中、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール；プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか；または
ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
を前記薬物に接合させる工程を含む、方法。
（項目１７）
薬物をリポソームナノ粒子に充填させる方法であって、該方法は、
式ＩＩのリポソーム可溶化単位（Ｚ）を前記薬物に接合させ、薬物誘導体を形成させる工程と；
水性の内側を有するリポソームナノ粒子に、前記薬物誘導体を能動的に充填させる工程とを含み、
ここで、
式ＩＩは、
【化１０８】
0005542804.tif 000019
であり、
［Ｌ］は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、
［Ｓ］は、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル（それぞれハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；シクロアルキル；−ＹＲ２からなる群より選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
−ＹＲ２で任意選択的に１箇所以上置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル
（ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり；
［Ｎ］は、一般式ＩＩＩの可溶化ドメイン
【化１０９】
0005542804.tif 000020
であり、式中、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール；プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか；または
ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい、方法。
（項目１８）
前記薬物誘導体を、前記リポソームナノ粒子の水性の内側に、能動的に充填させる、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記リポソームナノ粒子の水性の内側が、その外側媒体よりも酸性のｐＨを有する、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記薬物誘導体を、前記リポソームナノ粒子の膜内にあるか、前記リポソームナノ粒子の膜に安定して会合するように、能動的に充填させる、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
［Ｎ］が、式ＩＶａまたはＩＶｂの基である、項目２０に記載の方法。
【化１１０】
0005542804.tif 000021
〔式中、
Ａは、カルボニル、メチレン、ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか；または
Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。〕
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ｐＨ７．４の水系バッファーおよびリン酸で緩衝化したマウス血漿（ｐＨ７．４）中での、３７℃でのプロドラッグの加水分解速度論を示す。
【図２】図２は、ＬＮへのドセタキセル誘導体の充填を示す。この誘導体を、ＬＮ内では、３００ｍＭ硫酸アンモニウム、外部は、ｐＨ５に緩衝化した、硫酸アンモニウムを含まない媒体にしたｐＨ（アンモニウムイオン）の勾配によって、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮ中で、６０℃でインキュベーションすることによって充填させた。（Ａ）プロドラッグ−対−脂質の比率が、０．１ｗｔ／ｗｔ（■）、０．２ｗｔ／ｗｔ（◆）、０．４ｗｔ／ｗｔ（▲）での、ドセタキセルプロドラッグＴＤ１の充填効率。（Ｂ）ドセタキセルのＣ−２’−ピペラジニルエステル（ＴＤ１〜ＴＤ３）誘導体、Ｃ−２’−ピペリジンエステル（ＴＤ７）誘導体、Ｃ−７−アミノエステル（ＴＤ１０）誘導体を、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮとともに、プロドラッグ−対−脂質の比率０．２ｗｔ／ｗｔでインキュベーションさせた場合の充填効率。
【図３】図３は、ＬＮへのプレドニゾン誘導体の保持を示す。この誘導体を、ＬＮ内では、３００ｍＭ硫酸アンモニウム、外部は、ｐＨ５に緩衝化した、硫酸アンモニウムを含まない媒体にしたｐＨ（アンモニウムイオン）の勾配によって、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮ中で、６０℃で充填させた。（Ａ）：薬物−対−脂質の比率０．１２ｗｔ／ｗｔで、親薬物の充填効率（■）と比較した、プレドニゾンのＮ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル誘導体の充填効率（◆）。プレドニゾン誘導体は、自然にはＬＮ二層に分配されなかった。したがって、硫酸アンモニウム（ｐＨ）勾配がない状態で、ＬＮキャリアと会合する誘導体の量は、測定することができなかった。（Ｂ）：６０℃で１５分間インキュベーションした後の、種々の長さのリンカーを有するプレドニゾン誘導体の充填効率。Ｎ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル（Ｂ）誘導体およびＮ−メチル−ピペラジニル酢酸エステル（Ｅ）誘導体の比較。Ｎ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル誘導体は、１００％の充填効率を示し、一方、Ｎ−メチル−ピペラジニル酢酸エステル誘導体は、約７５％の充填効率を示した。
【図４】図４は、ＬＮへのエトポシド誘導体の充填を示す。Ｎ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル誘導体を６０℃で、ＬＮ内では、３００ｍＭ硫酸アンモニウム、外部は、ｐＨ５に緩衝化した、硫酸アンモニウムを含まない媒体にしたｐＨ（アンモニウムイオン）の勾配によって、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮに保持させた。この誘導体は、薬物−対−脂質の比率０．１６ｗｔ／ｗｔで、６０℃で１５分間インキュベーションしている間、１００％の充填効率を示した。
【図５】図５は、配合物の安定性を示す。４ヶ月間にわたって冷保存（７℃）した場合の、異なる脂質組成（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ）を有するＬＮ−ドセタキセル誘導体配合物の安定性を調べた。配合物のプロドラッグ−対−脂質の比率は、０．２ｗｔ／ｗｔであった。（Ａ）プロドラッグの加水分解；親薬物（ドセタキセル）の増加を、ＵＨＰＬＣによって決定した。（Ｂ）ＬＮ内にとどまっているプロドラッグの割合。（Ｃ）動的光散乱によって測定した、ＬＮの大きさおよび多分散性。
【図６】図６は、マウスに静脈投与した後の、タキソテール（商標）（▲）、タキソテール（商標）と同様の様式で配合されたＴＤ１（エタノール／ポリソルベート８０／生理学的食塩水）（■）、ＴＤ１のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物（プロドラッグ−対−脂質の比率０．２（ｗｔ／ｗｔ））（◆）の血漿消失プロフィールを示す。雌のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに、種々の配合物を、ドセタキセルと等モル量（ドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇ）の投薬量を１回静脈注射した。血漿中のプロドラッグ濃度は、ＵＨＰＬＣ−ＭＳによって決定した。データ点は、各マウス群（ｎ＝４）について、平均値±標準偏差であらわしている。
【図７】図７は、血漿の薬物残留プロフィールを示す。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（◆）、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ（■）、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（▲）のＬＮ配合物中の、ドセタキセル誘導体ＴＤ１の残留率を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定し（Ａ）、ｉｎ  ｖｉｖｏで決定した（Ｂ）。ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮ中のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴＤ１残留率を、同じ薬物−対−脂質の比率で、マウス血漿中、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮに配合された他のドセタキセル誘導体（ＴＤ２〜３およびＴＤ７）と比較した（Ｃ）。微量の放射能標識された脂質［３Ｈ］−ＣＨＥを含むＬＮ配合物を、雌のＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに、ドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇと当量のの投薬量で静脈注射するか、または、マウス血漿中、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３７℃でインキュベーションした。所定の時間点で採取した血漿サンプルについて、それぞれ液体シンチレーション計測およびＵＨＰＬＣを用い、脂質含有量およびプロドラッグ含有量を分析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ残留率試験の場合、捕捉されていない（放出されている）薬物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０スピンカラムを用い、サイズ排除クロマトグラフィーによって血漿サンプルから除去し、その後、脂質および薬物の含有量を分析した。データ点は、平均±標準偏差であらわしている（ｎ＝４）。
【図８】図８は、抗癌効能を示す。Ｒａｇ２Ｍマウスにおける、タキソテール（商標）およびＬＮに封入されたＴＤ１での治療に対する、皮下ＭＤＡ４３５／ＬＣＣ６ヒト乳癌異種移植片の応答。（Ａ）種々のＬＮ配合物で治療し、脂質組成が有効性に及ぼす影響を決定。ＬＮ配合物（プロドラッグ−対−脂質の比率０．２ｗｔ／ｗｔ）は、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（■）、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ（▲）、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（＊）で構成されており、ドセタキセル４０ｍｇ／ｋｇと等価な投薬量で投与された。未処置のコントロールには、食塩水が注射された（◆）。（Ｂ）ドセタキセル２５（×）、４０（＊）、８８（▲）ｍｇ／ｋｇと等価な投薬量で投与された、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物（プロドラッグ−対−脂質の比率０．２ｗｔ／ｗｔ）の用量応答。未処置のコントロールには、食塩水が注射された（◆）。２５ｍｇ／ｋｇドセタキセルでのタキソテール（商標）は、比較のために含まれていた（■）。（Ｃ）タキソテール（商標）と、８８ｍｇ／ｋｇ  ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物との比較。腫瘍成長曲線は、標準的な偏差をつけて示されている。治療は、３５日目に、１回静脈ボーラス注射して開始した。点は、相対的な腫瘍容積の平均をあらわす（治療日に測定した腫瘍容積を基準とした、所与の時間点で測定した腫瘍容積の比率）。１グループあたり６匹のマウスの平均値をあらわしている。
【図９】図９は、遊離ビンクリスチン（ＶＣＲ）（２ｍｇ／ｋｇ）および１００ｎｍ卵スフィンゴミエリン／コレステロールＬＮに封入されたビンクリスチン（２ｍｇ／ｋｇ）を、Ａ４３１腫瘍をもつＳＣＩＤマウスに静脈注射した場合の、ｉｎ  ｖｉｖｏでの速度論および抗癌活性を示す。（８Ａ）時間経過にともなう、遊離ＶＣＲ（□）およびＬＮに配合されたＶＣＲ（●）の血漿濃度プロフィール。遊離ＶＣＲは、循環から迅速に除去され、一方、ＬＮに配合されたＶＣＲは、循環での半減期が長くなっている。（８Ｂ）時間経過にともなう、ＬＮ配合物からの遊離ＶＣＲ（●）の放出（％残留率）。ＬＮに配合されたＶＣＲは、循環中で、持続放出プロフィールを示す。（８Ｃ）遊離ＶＣＲ（□）およびＬＮに配合されたＶＣＲ（●）を投与した後の、時間経過にともなうＶＣＲの腫瘍濃度（μｇ／ｍｌ）。ＬＮに配合されたＶＣＲの長い半減期、持続放出プロフィールによって、時間経過にともなって、ＶＣＲの腫瘍での蓄積が増加する。（８Ｄ）食塩水コントロール（■）と比較した場合の、遊離ＶＣＲ（□）およびＬＮに配合されたＶＣＲ（●）の抗癌活性。ＬＮに配合されたＶＣＲは、遊離化合物よりも顕著に大きな抗癌活性を有する。ナノリポソーム配合物は、腫瘍成長部位に到達する薬物の量を増やし、治療に有効な量の薬物にさらされる時間を長くし、これにより、抗腫瘍活性が高くなる。
【図１０】図１０は、薬物に配置されているヒドロキシル基のエステル化に基づく、弱塩基薬物誘導体を合成するために使用される化学戦略の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「リポソーム」または「リポソームナノ粒子」または「ＬＮ」は、１つ以上の脂質二重層を含み、それぞれの層が、対向するように配列した両親媒性脂質分子を含有する２つの単分子層を含む、自己集積性の構造を指す。両親媒性脂質は、極性（親水性）の頭部基が、１個または２個またはそれ以上の非極性（疎水性）アシル鎖またはアルキル鎖に共有結合している基を含む。疎水性アシル鎖と、その周囲にある水性媒体との接触がエネルギー的に好ましくないので、両親媒性の脂質分子は、極性頭部基が二重層の表面に向かって配列し、アシル鎖が二層の内側に向かって配列するように整列し、アシル鎖が水性環境と接触するのを効果的に防ぐ。
【００３８】
本明細書に記載した方法および組成物と組み合わせて有用なリポソームは、水性の区画に取り囲まれているか、または封入されている１つの脂質二重層（単層リポソーム）または複数の脂質二重層（多重層リポソーム）を有し得る。さまざまな種類のリポソームが記載されており、例えば、Ｃｕｌｌｉｓら、  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、５５９：３９９−４２０（１９８７）に記載されている。
【００３９】
両親媒性脂質は、典型的には、リポソーム脂質ベシクルの主要な構造要素を含む。脂質の親水性の特性は、ホスファート、カルボキシル、スルファート、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、および他の同様の極性基の存在に由来する。限定されないが、１つ以上の芳香族基、脂環式基またはヘテロ環基で置換されていてもよい、飽和および不飽和の長鎖脂肪族炭化水素基を含む基を含むことによって、疎水性を付与することができる。好ましい両親媒性化合物の例は、ホスホグリセリドおよびスフィンゴ脂質であり、これらの代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール（ｐｈｏａｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンおよび卵スフィンゴミエリンが挙げられる。他の脂質（例えば、スフィンゴ脂質およびスフィンゴ糖脂質）も、本明細書に提供される方法および組成物で有用である。さらに、上述の両親媒性脂質を、トリアシルグリセロール、ステロールのような他の脂質と混合してもよい。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ１〜１０−アルキル」は、最も長い鎖が１〜１０個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素鎖を指し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ２〜１０−アルケニル」は、２〜１０個の炭素原子を有し、１つ以上の二重結合を含有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素基を意味する。Ｃ２〜１０−アルケニル基の非限定的な例としては、アリル、ホモ−アリル、ビニル、クロチル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニルなどが挙げられる。２個以上の二重結合を有するＣ２〜１０−アルケニル基の非限定的な例としては、ブタジエニル、ペンタジエニル、ヘキサジエニル、ヘプタジエニル、ヘプタトリエニル、オクタトリエニルなどの基、およびこれらの分枝形態が挙げられる。不飽和部（二重結合）の位置は、炭素鎖に沿って任意の位置であってよい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ２〜１０−アルキニル」は、２〜８個の炭素原子を有し、１つ以上の三重結合を含有する、直鎖または分枝鎖の炭化水素基を意味する。Ｃ２〜１０−アルキニル基の非限定的な例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、オクチニルなどの基、およびこれらの分枝形態が挙げられる。不飽和部（三重結合）の位置は、炭素鎖に沿って任意の位置であってよい。２個以上の結合は、「Ｃ２〜１０−アルキニル」が、ジ−インまたはエンジ−インであるように、不飽和であってもよい。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキル」は、アルカン基が、１個以上、好ましくは、１個または２個の、Ｏ、Ｓ、Ｎから選択されるヘテロ原子を含有することを示す。存在する場合、このようなヘテロ原子は、任意選択的に、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｓｉから選択されるヘテロ原子でさらに置換されているか、あるいは、ハロで任意選択的に置換されているアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基でさらに置換されている、。非限定的な例としては、（１つ以上の）エーテル基、チオエーテル基、エステル基、アミド基が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「アリール」および「シクロアルキル」は、５〜１２個の炭素原子を含む、単環および二環の環構造を指し、好ましくは、５〜６個の炭素原子を含む単環の環を指す。このような環が、Ｎ、Ｓ、Ｏから選択される１つ以上のヘテロ原子を含む場合（すなわち、ヘテロ環またはヘテロアリール環）、このような環は、合計で５〜１２個の原子を含み、さらに好ましくは、５〜６個の原子を含む。ヘテロ環式環としては、限定されないが、フリル、ピロリル、ピラゾリル、チエニル、イミダゾリル、インドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、モルホリニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イミダゾリニル、イミダゾリジニルなどが挙げられる。環は、Ｏ、Ｓ、Ｎから選択される１つ以上のヘテロ原子で置換されていてもよい。存在する場合、このようなヘテロ原子は、任意選択的に、Ｏ、Ｓ、Ｎ、Ｓｉから選択されるヘテロ原子でさらに置換されているか、あるいは、ハロで任意選択的に置換されているアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基またはヘテロアリール基でさらに置換されている。
【００４５】
置換基Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、Ｃ１〜１０アルコキシ、Ｃ１〜１０ヘテロアルキル、Ｃ１〜１０アミノアルキル、Ｃ１〜１０ハロアルキル、および／またはＣ１〜１０アルコキシカルボニルは、存在する場合、ヒドロキシル、Ｃ１〜６アルコキシ、ハロゲン、シアノ、アミノまたはニトロのうち１つ以上で置換されていてもよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「ハロゲン」または「ハロ」としては、塩素およびフッ素（これらが好ましい）、ヨウ素、臭素が挙げられる。
【００４７】
本発明は、一般的に、リポソームナノ粒子（ＬＮ）に薬物を充填させやすくするために、薬物を修飾するための医薬品化学の基本骨格に関する。いくつかの好ましい局面では、標準的な技術を用いるとリポソームに封入されにくいか、またはリポソームに封入することができない親油性／水不溶性の薬物を修飾し、リポソームの膜を通じてｐＨ勾配を示すＬＮに有効に充填させることが可能な薬物誘導体を形成させる。本発明の種々の局面は、本明細書に提示した化学療法剤、方法、組成物に関連して記載されているが、リポソーム送達が有益である任意の薬物または治療薬剤（限定されないが、確立された化学療法剤、癌、炎症状態、感染症および他の徴候を治療する薬物を含む）とともに使用可能な柔軟性のある技術の基本骨格をあらわしている。
【００４８】
また、本明細書には、膜内外のｐＨ勾配またはイオン勾配を示すＬＮに効果的に充填させることが可能な薬物誘導体、および、このような薬物誘導体を含むＬＮ配合物および医薬組成物も提供されている。種々の実施形態では、リポソームに効果的に充填させることを妨害する１つ以上の性質（例えば、限定されないが、水溶性が低いこと）を有する既知の薬物を化学的に修飾することによって、薬物誘導体が調製される。いくつかの好ましい実施形態では、薬物は、化学療法剤である。
【００４９】
ある局面では、本明細書に提示されている薬物誘導体は、薬物を、誘導体化された薬物をＬＮに充填させやすくする１つ以上の特性を有する「可溶化単位」で誘導体化することによって形成される。種々の局面では、可溶化単位は、誘導体化された薬物をＬＮに効果的に充填させやすくするように、および／または好ましい条件下、治療標的で、または治療標的の周辺で、薬物をＬＮから効果的に放出させやすくするように、物理化学的に調整される。
【００５０】
いくつかの好ましい局面では、可溶化単位は、膜内外のｐＨ勾配またはイオン勾配が存在する状態で、薬物誘導体をＬＮに能動的に充填させやすくする弱塩基性アミノ基を含む。本明細書で使用される場合、用語「弱塩基誘導体」は、本発明に提供される方法にしたがって、弱塩基性部分、例えば、一級アミン、二級アミンまたは三級アミンを含むように修飾された薬物を指す。
【００５１】
ある局面では、弱塩基部分は、イオン化可能なアミノ基であり、例えば、Ｎ−メチル−ピペラジノ基、モルホリノ基、ピペリジノ基、ビス−ピペリジノ基、またはジメチルアミノ基である。弱塩基薬物誘導体を合成するための修飾基の例としては、限定されないが、Ｎ−メチル−ピペラジノ基（例えば、抗癌剤Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）の場合）、ビス−ピペラジノ基、ビス−ピペリジノ基（例えば、抗癌剤イリノテカンの場合）、ピペリジノ基、モルホリノ基、ジメチルアミノ基、アミノメチル（グリシン）基、アミノエチル（アラニン）基、アミノブチリル基、およびプロトン化可能なアミン基を有する脂質が挙げられる。
【００５２】
ある局面では、弱塩基性アミノ基は、
【００５３】
【化１１】
0005542804.tif 000022
【００５４】
【化１２】
0005542804.tif 000023
からなる群より選択され、式中、ｎは、１〜約１０であるか、または、さらに好ましくは、１〜４である。
【００５５】
ある局面では、可溶化単位は、誘導体化の標的となる薬物に、可溶化単位を結合させやすくするリンカー単位をさらに含む。ある局面では、リンカーは、薬物上の遊離ＯＨ基と反応し、カルボキシルエステル結合を形成する反応性カルボニル基（例えば、カルボン酸部分）を含む。さらなる局面では、リンカーは、薬物上の遊離ＯＨ基と反応し、シリルエーテル結合を形成するジアルキルシリル基を含む。他の局面では、リンカーは、カルバメート基を含む。
【００５６】
種々の局面では、以下の一般構造を有する薬物誘導体が提供され、式中、Ｚは、水可溶化単位であり、Ｄは薬物であり、ｎは、１、２または３である：
【００５７】
【化１３】
0005542804.tif 000024
ある局面では、Ｚは、式ＩＩ
【００５８】
【化１４】
0005542804.tif 000025
の基を含み、式中、
波線は、式ＩＩＡを、薬物の反応性基（例えば、遊離Ｏ原子）に接続する結合をあらわし、
［Ｌ］は、カルボキシ、カルボキシアミド、アルキルシリルからなる群より選択されるリンカーであり、；
［Ｓ］は、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル（それぞれハロ；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；シクロアルキル；−ＹＲ２からなる群より選択される１つ以上の置換基で任意選択的に置換されており、
ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
−ＹＲ２で任意選択的に１箇所以上置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル
（ここで、Ｙは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉからなる群より選択されるヘテロ原子であり、
Ｒ２は、Ｈ；Ｎ、Ｏ、Ｓからなる群より選択されるヘテロ原子；Ｃ１〜Ｃ１０アルキル；それぞれハロで任意選択的に置換されたシクロアルキルからなる群より選択される）；
それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
からなる群より選択されるスペーサーであり；
［Ｎ］は、膜内外にｐＨ勾配またはイオン勾配を示すＬＮに薬物誘導体を充填させやすくする弱塩基性基を含む可溶化ドメインであり、ここで、［Ｎ］は、一般式ＩＩＩの可溶化ドメイン
【００５９】
【化１５】
0005542804.tif 000026
であり、式中、
ＲおよびＲ’は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール；プロトン化可能な窒素を含有するヘテロ環系からなる群より選択されるか；または
ＲおよびＲ’は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。
【００６０】
種々の局面では、可溶化単位は、ＬＮ内の特定の位置に薬物誘導体を能動的に充填させやすくするように調整される。例えば、ある局面では、薬物は、ＬＮの水性の内側に薬物誘導体を能動的に充填させやすくする水可溶化単位で誘導体化される。アミン基を付加することは、水溶性を高める一般的な薬物修飾戦略であり（例えば、Ｃａｐｄｅｖｉｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１：４９３−５０２（２００２）；Ｐｉｚｚｏｌａｔｏ  ａｎｄ  Ｓａｌｔｚ，Ｌａｎｃｅｔ，３６１：２２３５−２２４２（２００３））、可逆性の薬物接合体（例えば、酵素作用によって、ｉｎ  ｖｉｖｏで除去される基）を含むアミン薬物誘導体を製造するための種々の方法が当該技術分野で知られている。水溶性が高められた、アミン修飾された薬物の非限定的な例としては、抗癌剤Ｇｌｉｖｅｃ（Ｎ−メチル−ピペラジン）、イリノテカン（ビス−ピペリジン）およびトポテカン（エチルジメチルアミノ基）が挙げられる。
【００６１】
他の局面では、薬物は、薬物誘導体がリポソースの膜内にあるか、またはリポソースの膜に安定して会合するように、薬物誘導体を能動的に充填させやすくするために、脂質可溶化単位で誘導体化される。ある局面では、脂質可溶化単位は、弱塩基性基と、親油性基とを含む。親油性基は、ＬＮに薬物を能動的に充填しやすくするように、ＬＮ内での薬物の安定性を促進するように、および／または治療標的で、または治療標的の周辺で、薬物を放出しやすくするように選択されてもよい。ある局面では、親油性基は、リポソームの膜と類似の脂質組成物または相補的な脂質組成物を有する。いくつかのこのような局面では、脂質可溶化単位は、式ＩＶａまたはＩＶｂの基：
【００６２】
【化１６】
0005542804.tif 000027
から選択され、式中、
Ａは、カルボニル、メチレン、ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（Ｒは、ＨまたはＣ１〜Ｃ５アルキルである）からなる群より選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立して、直鎖または分枝鎖のＣ１〜Ｃ３０アルキル、Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３０アルキニルからなる群より選択され；
Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；それぞれハロで任意選択的に置換された、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル；それぞれハロで任意選択的に置換された、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールからなる群より選択されるか；または
Ｒ３およびＲ４は、これらが結合している窒素原子とともに、４〜５個の炭素原子を有するヘテロ環式環を形成し、環系に、複数の環の１つが含まれていてもよい。
【００６３】
弱塩基誘導体は、リポソームの膜を通じてｐＨ勾配を付与し（内側が酸性）、封入された薬物とともにリポソームをインキュベーションすることによって、ＬＮに充填させることができる。ｐＨに依存して、弱塩基誘導体は、帯電した（プロトン化した）形態（例えば、ｐＨがｐＫａよりも低い場合）または中性の形態（例えば、ｐＨが、ｐＫａ以上である場合）のいずれかで存在してもよい。中性形態の場合のみ、リポソームの膜を迅速に透過することができる。酸性のリポソームの内側に到達すると、帯電した膜不透過性の形態が選ばれ、リポソームの内側に化合物が連続的に取り込まれ、とどまるようになる。
【００６４】
いくつかの好ましい局面では、本明細書に提示された弱塩基誘導体の薬物充填性は、誘導体アミン基および／または誘導体親油性基の１つ以上の性質を選択および／または改変することによって、細かく調整することができる。例えば、誘導体アミン基のｐＫａは、アミン基が、使用されるＬＮ調製物の水性の内側でプロトン化し（例えば、低いｐＨで）、外側媒体で脱プロトン化する（例えば、中性または塩基性のｐＨで）ように選択することができる。
【００６５】
ある局面では、誘導体アミン基のｐＫａは、約１２．０以下、約１１．５以下、約１１．０以下、約１０．５以下、約１０．０以下、約９．５以下、または約９．０以下である。
【００６６】
ある局面では、誘導体アミン基のｐＫａは、少なくとも約５．０、少なくとも約５．５、少なくとも約６．０、少なくとも約６．５、少なくとも約７．０、少なくとも約７．５、少なくとも約８．０、または少なくとも約８．５である。
【００６７】
弱塩基部分を含む可溶化単位は、修飾標的である薬物上にある、適切な任意の反応性官能基に結合していてもよい。このような官能基としては、特に、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、カルボキシル基が挙げられる。ある局面では、可溶化単位は、薬物上の遊離ＯＨ基を介して、例えば、カルボキシルエステル結合によって結合している。
【００６８】
ある局面では、薬物は、その誘導体の活性が、遊離薬物の活性と実質的に等価であるように、目的の治療活性にとって不可欠ではない領域で誘導体化される。例えば、ある局面では、弱塩基誘導体は、バッカチン骨格の７−ＯＨ基で誘導体化されたタキサンドセタキセルを含む。
【００６９】
【化１７】
0005542804.tif 000028
さらなる局面では、薬物は、その誘導体が、目的の治療効果を発揮するために、親化合物または別の活性形態に変換されなければならないプロドラッグであるように、活性にとって不可欠な領域で誘導体化される。例えば、ある局面では、本明細書では、ドセタキセル活性にとって不可欠である２’−ＯＨ基で誘導体化されたドセタキセル誘導体が提供される。
【００７０】
【化１８】
0005542804.tif 000029
本明細書で提供されるプロドラッグ誘導体は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＮキャリアから放出され、生理学的条件にさらされると、迅速に遊離薬物に変換される。例えば、いくつかの好ましい局面では、本明細書で提示される弱塩基誘導体の誘導体アミノ基は、薬物から迅速に除去された後、例えば、内因性酵素の作用によって、および／または自然発生的な加水分解によってリポソームから放出される。
【００７１】
したがって、ある局面では、可溶化単位は、薬物誘導体に可逆的に接合し、特定の条件下で（例えば、保持させている間、配合中、貯蔵中、および／またはＬＮ組成物を投与している間）安定なプロドラッグを形成し、治療標的で、または治療標的の周辺で、例えば、内因性酵素の作用によって、および／または特定の生理学的条件（例えば、ｐＨ、イオン強度）で、解離して遊離薬物を放出する。
【００７２】
ある局面では、弱塩基誘導体は、リポソームナノキャリアの内側で（例えば、低いｐＨで）安定であるが、リポソームから放出されると、プロドラッグが、迅速に活性形態に変換されるように、生理学的ｐＨで「自己放出」する。このことは、例えば、アミノブチリル基をドセタキセルに結合させ、プロトン化されていない形態（ｐＨ７．４）で、エステルカルボニルへの求核攻撃による放出によって反応が始まることによって達成することができる。
【００７３】
ある局面では、弱塩基誘導体のエステル結合の加水分解安定性を、以下の１つ以上の効果を有効に利用することによって調整してもよい。
【００７４】
（ｉ）誘起効果：生理学的ｐＨでの開裂について、プロテアーゼを用いるか、または自然発生的な加水分解によって、またはカルボニル中心に近い位置に可溶化アミノ基を配置することによって（不安定化）、またはカルボニル中心から離れた位置に可溶化アミノ基を配置することによって（安定化）、エステルを、安定化させるか、または不安定化させてもよい。また、アミノ基のｐＫａは、この内容で、ある目的を果たす。帯電した（プロトン化した）アミンが、生理学的条件下で、エステル加水分解を促進する。アミノ基上にあるＲ基を適切に選択することによって、エステル開裂速度が理想的な状態になるように、Ｎ−中心を調節することができる。
【００７５】
（ｉｉ）化学効果および近接効果。例えば、アミノ単位のｐＫａが約６である、４−アミノブチリル（４−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｌ）基とのエステル化によって、低いｐＨ（例えば、硫酸アンモニウムが充填されたＬＮ内部でみられるｐＨ）でプロトン化した形態で存在する部分を生じる。ＬＮキャリアからこのような誘導体が放出し、生理学的条件（例えば、ｐＨ７．４）にさらされると、遊離塩基形態の生成が促進され、遊離アミンが、エステルカルボニルへの求核攻撃によって、誘導体化単位が「自己放出」することによって反応が始まる。有利なことに、これにより、プロドラッグ誘導体が、ＬＮから放出されると、活性形態に迅速に変換される。
【００７６】
さらなる局面では、弱塩基誘導体のシリルエーテル結合の加水分解安定性を、自然発生的な加水分解を促進することによって調節してもよい。エステルリンカーとは異なり、内因性の脱シリル化酵素は存在しない。したがって、シリルエーテル結合を含む誘導体は、好ましくは、生理学的条件下で加水分解可能なリンカー基を含む。シリル基の開裂速度の主な決定因子は、Ｓｉ原子周辺の立体的なかさ高さである。この生理化学的性質の調節は、例えば、Ｍｅ、Ｅｔ、ｉ−Ｐｒ、ｔ−Ｂｕ、Ｐｈなどの系によって、ハロゲン化シリルのＲ基およびＲ’基の大きさを変えることを伴う。エステルの場合と同様に、アミノ基のｐＫａも、誘導体の安定性を決めるのにある種の役割を果たす。例えば、ｐＫａが約６のアミノ基は、生理学的ｐＨでは、大部分が遊離塩基として存在し、それによって、シリル基の解離が促進されるであろう。
【００７７】
さらなる局面では、親油性誘導体基の大きさおよび／または化学組成は、リポソームの膜中の溶解度および／またはリポソーム内での薬物の安定性を高めるように選択されてもよい（例えば、リポソームの膜に薬物を固定することによって）。
【００７８】
有利なことに、本明細書で提示される薬物の弱塩基誘導体は、遊離薬物よりも効果的に、リポソームに充填させることができる。ある局面では、本明細書に提示される弱塩基誘導体は、広範囲の薬物−対−脂質の比率にわたって（例えば、約０．０１ｍｇ／ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｍｇまで、またはそれ以上）、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、またはそれ以上の保持効率で、リポソームに保持させることができる。
【００７９】
さらなる局面では、本明細書に提示される弱塩基誘導体のＬＮ配合物は、例えば、ＬＮキャリア膜の脂質組成を改変することによって、薬物誘導体を持続放出させることによって最適化することができる。例えば、種々の局面では、本明細書で提示されるＬＮ配合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの放出半減期が、約１〜約９６時間、または約２〜約７２時間、または約４〜約４８時間である。
【００８０】
本明細書で提供される方法を用い、リポソーム配合物にとって望ましい任意の薬物または治療薬剤を修飾することができる。いくつかの好ましい局面では、薬物は、親油性であるか、および／または水溶性が低い。有益には、本明細書で提供する方法にしたがって、このような薬物を修飾することによって、溶解度が向上し、毒性が低下し、有効性が増加し、および／または、遊離薬物と比べて他の利点を有する。
【００８１】
本明細書に提供する方法にしたがって修飾され、ＬＮに充填可能な薬物の非限定的な例を、表１に示す。
【００８２】
【表１】
0005542804.tif 000030
いくつかの好ましい局面では、薬物は、化学療法剤である。本明細書で提供する方法にしたがって誘導体化が可能な、確立されている薬物または薬物分類の例としては、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）、ポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドおよびテニポシド）が挙げられる。ドセタキセル（タキソテール）およびパクリタキセル（タキソール）を含むタキサンは、臨床的な腫瘍学で広範囲の用途を有する、重要な薬物群である。ほとんどの抗癌剤と同様に、タキサンは、癌細胞に対する選択性を有しておらず、健康な細胞にも損傷を与える場合がある。タキサンは、水溶液への溶解性が低いため、典型的には、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒおよびＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０のようなビヒクルに配合されるが、これら自体が、患者に有害な反応を引き起こす。ビヒクルの副作用を最小限にするために、ステロイド系前投薬および抗アレルギー前投薬を使用することが多い。有益には、本明細書で提供されるＬＮタキサン配合物は、毒性のあるビヒクルを使用することなく、タキサンを投与することができる。さらに、ＬＮは、血流を出て、腫瘍部位での血管が「漏れがある」性質のため、大部分が腫瘍に高濃度で蓄積させることが可能であるので、ＬＮタキサン配合物は、親化合物の承認済配合物であるタキソテールと比べ、副作用が低く、優れた抗癌活性（例えば、改善した治療指数）を付与することができる。
【００８３】
ある局面では、本明細書で提供するＬＮ配合物は、腫瘍成長部位に特異的に到達する化学療法剤の量を増やし、および／または、例えば、ＬＮの血漿半減期を長くし、および／またはＬＮキャリアから化学療法剤を持続放出させることによって、腫瘍が治療に活性な濃度の薬物にさらされる時間を長くする。
【００８４】
ある局面では、薬物は、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））またはパクリタキセルであり、これらの構造を以下に示す。これら２種類の薬物は、側鎖の窒素原子に存在するアシル基のレベルが異なっており（ドセタキセルの場合、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルまたはＢＯＣ；パクリタキセルの場合、ベンゾイル）、ドセタキセルでは、Ｃ−１０  ＯＨ基が遊離しているが、パクリタキセルではアセチル化されている。
【００８５】
【化１９】
0005542804.tif 000031
本明細書で提供する方法にしたがう、ドセタキセルおよびパクリタキセルの修飾は、１つ以上の遊離ＯＨ単位を適切な基で誘導体化することを含む。ある局面では、薬物は、Ｃ−１  ＯＨで誘導体化されている。その他の好ましい局面では、薬物は、Ｃ−２’、Ｃ−７、および／またはＣ−１０のＯＨで誘導体化され、以下の誘導体を製造する。ここで、Ｃ−２’、Ｃ−７、および／またはＣ−１０のＯＨに接続しているＺ基は、独立して、Ｈであるか、または、プロトン化可能な窒素官能基を含有する残基である。任意の薬物は、遊離ＯＨ基または他の反応性官能基（天然の薬物または薬物の修飾された形態に存在し得る）で、ドセタキセルおよびパクリタキセルと同様の様式で誘導体化されていてもよい。
【００８６】
【化２０】
0005542804.tif 000032
ある局面では、本明細書で提供するＬＮ配合物は、種々の癌の治療に関し、現時点でＩＩＩ相治験段階にあるリポソームのビンクリスチン（Ｍａｒｑｉｂｏ（登録商標））の１つ以上の医薬としての性質を有する（例えば、Ｂｏｍａｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７２：８９６−９０４（１９９５）、Ｓｈａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５８（２）：２４５−５５（２００６）、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９１：４０−５７（２００５））。
【００８７】
種々の局面では、以下の一般構造を有する薬物誘導体が提供され、式中、Ｚは、水可溶化単位であり、Ｄは、薬物である：
【００８８】
【化２１】
0005542804.tif 000033
ある局面では、Ｚは、式ＩＩＡの基を含み、
【００８９】
【化２２】
0005542804.tif 000034
ここで、
（ｉ）波線は、式ＩＩＡを、薬物（例えば、上の化合物３および／または４）の反応性基（例えば、遊離Ｏ原子）に接続する結合をあらわし；
（ｉｉ）［Ｓ］は、
（ａ）（ＣＨ２）ｎ型の鎖（ｎは、１〜１０の範囲であってよい）、または
（ｂ）上述の（ＣＨ２）ｎの誘導体（１つ以上のＨ原子が、１〜１０個のＣ原子と、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉのようなヘテロ原子とを含有する、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基と置換されており、さらに、Ｈ原子；または、Ｎ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子：または、１〜１０個のＣ原子と、任意で、１つ以上のハロゲン原子、１個のハロゲン原子が組み込まれた、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基と接続していてもよい）；または
（ｃ）上述の（ＣＨ２）ｎの誘導体（１つ以上のＣＨ２は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉのようなヘテロ原子と置き換えられており、これらは、Ｈ原子；または、Ｎ、Ｏ、Ｓのようなヘテロ原子；または、１〜１０個のＣ原子と、任意で、１つ以上のハロゲン原子とが組み込まれた、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基、３〜１０個の炭素原子と、任意で、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンのような一つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とからなる環構造にさらに接続していてもよい）；または
（ｄ）上述の（ＣＨ２）ｎの誘導体（隣接するＣ原子の対の１つ以上が、Ｅ−幾何学またはＺ−幾何学を有する二重結合となっているか、または三重結合となっている）
を含む「スペーサー」である。
【００９０】
このようなスペーサー［Ｓ］の例としては、限定されないが、
【００９１】
【化２３】
0005542804.tif 000035
が挙げられる。
【００９２】
（ｉｉｉ）［Ｎ］は、膜内外のｐＨ勾配またはイオン勾配を示すＬＮに薬物誘導体を保持させやすくした、弱塩基性基を含む可溶化ドメインであり、以下のもの
から選択される。
【００９３】
（ａ）一般構造Ｒ−Ｎ−Ｒ’の置換基（ここで、Ｎ（窒素）原子が、スペーサーに接続しており、ＲおよびＲ’は、独立して：Ｈ；１〜１０個のＣ原子と、任意で、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンのような１つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とを含む、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基；または、３〜１０個の炭素原子と、任意で、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉまたはハロゲンのような１つ以上のハロゲン原子と、原子対の間にある多重結合とからなる環構造の一部分であってもよい。
【００９４】
このようなＲおよびＲ’の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００９５】
Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、
【００９６】
【化２４】
0005542804.tif 000036
（ｂ）以下の代表的であるが、限定的ではない例によって示されるような、プロトン化可能な、窒素を含有するヘテロ環系、例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピリダジン、モルホリン、チオモルホリン、キヌクリジン、イミダゾール、ピリジンなど、またはこれらの置換された改変体。ここで、波線は、ヘテロ環構造をスペーサーに接続する結合をあらわす。
【００９７】
【化２５】
0005542804.tif 000037
したがって、上の式ＩＩＡの代表的な局面としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【００９８】
【化２６】
0005542804.tif 000038
異なっていても同じであってもよい３単位までの式ＩＩＡでドセタキセルを誘導体化すると、以下に示すＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型のモノエステル、ジエステル、またはトリエステルが得られる。
【００９９】
【化２７】
0005542804.tif 000039
【０１００】
【化２８】
0005542804.tif 000040
同様の様式で、パクリタキセルを、以下に示すＨ型、Ｉ型、Ｊ型のモノエステル誘導体およびジエステル誘導体に変換してもよい。
【０１０１】
【化２９】
0005542804.tif 000041
【０１０２】
【化３０】
0005542804.tif 000042
ドセタキセルまたはパクリタキセルをこのような誘導体に加工することは、例えば、当業者によく知られている現代有機化学の標準的な技術を用い、保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、５のカルボン酸形態とをカップリングさせることを含む。
【０１０３】
ある局面では、Ｚは、式ＩＩＢの基
【０１０４】
【化３１】
0005542804.tif 000043
を含み、式中、
（ｉ）波線は、式ＩＩＢを、薬物［Ｄ］（例えば、化合物３および／または４）の適切な反応性基（例えば、Ｏ原子）に接続する結合をあらわし、
（ｉｉ）「スペーサー」［Ｓ］は、式ＩＩＡについて上に詳細に示したとおりであり、
（ｉｉｉ）可溶化単位［Ｎ］は、式ＩＩＡについて上に詳細に示したとおりであり、
（ｉｖ）Ｒ’は、Ｈであるか、または、１〜１０個のＣ原子と、任意で、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンのような１つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とを含む、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基である。
【０１０５】
このようなＲ’の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１０６】
Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル、
【０１０７】
【化３２】
0005542804.tif 000044
上の構造式ＩＩＢの代表的な局面としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１０８】
【化３３】
0005542804.tif 000045
異なっていても同じであってもよい３単位までの６型でドセタキセルを誘導体化すると、以下に示すＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型のモノカルバメート、ジカルバメート、またはトリカルバメートが得られる。
【０１０９】
【化３４】
0005542804.tif 000046
【０１１０】
【化３５】
0005542804.tif 000047
同様の様式で、パクリタキセルを、以下に示すＨ型、Ｉ型、Ｊ型のモノカルバメート誘導体およびジカルバメート誘導体に変換してもよい。
【０１１１】
【化３６】
0005542804.tif 000048
【０１１２】
【化３７】
0005542804.tif 000049
ドセタキセルまたはパクリタキセルをこのような誘導体に加工することは、例えば、当業者によく知られている現代有機化学の標準的な技術を用い、保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、６のイソシアネート形態（Ｒ”＝Ｈ）またはイミダゾリド形態（Ｒ”≠Ｈ）とをカップリングさせることを含む。
【０１１３】
ある局面では、Ｚは、一般式ＩＩＣの基
【０１１４】
【化３８】
0005542804.tif 000050
であり、式中、
（ｉ）波線は、式ＩＩＣを、薬物［Ｄ］（例えば、化合物３および／または４）の適切な反応性基（例えば、Ｏ原子）に接続する結合をあらわし；
（ｉｉ）「スペーサー」は、式ＩＩＡについて上に詳細に示したとおりであり、
（ｉｉｉ）基［Ｎ］は、式ＩＩＡについて上に詳細に示したとおりであり、
（ｉｉｉ）ＲＡおよびＲＢは、独立して、１〜１０個のＣ原子と、任意で、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｉおよびハロゲンのような１つ以上のヘテロ原子と、原子対の間にある多重結合とを含む、直鎖、分枝鎖または環状のアルキル基である。
【０１１５】
このようなＲＡおよびＲＢの例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ベンジル。
【０１１６】
上の構造式ＩＩＣの代表的な局面としては、限定されないが、以下のものが挙げられる。
【０１１７】
【化３９】
0005542804.tif 000051
異なっていても同じであってもよい３単位までの式ＩＩＣでドセタキセルを誘導体化すると、以下に示すＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型のモノ−シリルエーテル、ビス−シリルエーテル、またはトリス−シリルエーテルに変換される。
【０１１８】
【化４０】
0005542804.tif 000052
【０１１９】
【化４１】
0005542804.tif 000053
同様の様式で、パクリタキセルを、以下に示すＨ型、Ｉ型、Ｊ型のモノエステル誘導体およびジエステル誘導体に変換してもよい。
【０１２０】
【化４２】
0005542804.tif 000054
【０１２１】
【化４３】
0005542804.tif 000055
ドセタキセルまたはパクリタキセルをこのような誘導体に加工することは、例えば、当業者によく知られている現代有機化学の標準的な技術を用い、保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、式ＩＩＣの塩化物形態またはイミダゾリド形態とをカップリングさせることを含む。
【０１２２】
上に例示した、タキサンを用いる技術は、適切な固定部位（例えば、式ＩＩＡ、ＩＩＢまたは式ＩＩＣの可溶化単位［Ｚ］の場合、ＯＨ基、ＣＯＯＨ（カルボキシル）基、またはＮＨ基）を有する任意の薬物に適用可能である。
【０１２３】
ある局面では、薬物は、リンパ腫、肺癌、精巣癌の治療用に承認された、広範囲に用いられる抗癌剤であるエトポシドである。エトポシドは、水への溶解性が低く、代謝により不活性化を受け、かなり毒性の高い副作用を有する。種々の好ましい局面では、本明細書に提示するエトポシドＬＮ配合物は、実質的に毒性が低く、溶解度およびバイオアベイラビリティが向上し、有効性が上がっている。
【０１２４】
エトポシド８およびコルチコステロイドプレドニゾン９を示すために、タキサンについて上にくわしく説明したように、エステル誘導体、カルバメート誘導体、またはシリルエーテル誘導体に変換してもよい。これらの誘導体中の［Ｚ］は、タキソール群の化合物について、すでに定義したとおりである。
【０１２５】
【化４４】
0005542804.tif 000056
同様の様式で、シクロスポリン１０、アザチオプリン１１などを、リポソーム配合物に適した誘導体に変換してもよい。
【０１２６】
【化４５】
0005542804.tif 000057
ある局面では、目的の薬物を、弱塩基性アミン基と、親油性基とを含む脂質可溶化単位で誘導体化する。いくつかの好ましい局面では、可溶化単位は、リポソームの膜を含む脂質の構造と類似した構造を有する。例えば、ある局面では、薬物誘導体は、一般式：［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｓ］−［Ｎ］を有し、式中、［Ｓ］は、式ＩＩＡ〜ＩＩＣに関連して上に定義したようなスペーサーであり、以下に定義するように、［Ｎ］は、可溶化ドメインであり、［Ｌ］は、リンカーである。
【０１２７】
ある局面では、［Ｎ］は、式ＩＶＡの基（「内部」誘導体）または式ＩＶＢの基（「末端」誘導体）であり、
【０１２８】
【化４６】
0005542804.tif 000058
（ｉ）Ａは、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）；カルバモイル基（ＮＲ−Ｃ＝Ｏ、ここで、Ｒは、Ｈであるか、または１〜５個のＣ原子が組み込まれたアルキル基である）；またはメチレン基（ＣＨ２）をあらわし；
（ｉｉ）Ｒ１およびＲ２は、３０個までの炭素原子を含有し、任意で、隣接する炭素原子対の間にある多重結合が１つ以上の組み込まれた、直鎖または分枝鎖の親油性アルキル基をあらわし；
（ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４は、独立して、Ｈ；または、１〜５個のＣ原子が組み込まれたアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルなど）；または、環構造の分枝（例えば、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリンなど）をあらわし；
（ｉｉｉ）リンカー［Ｌ］は、
（ａ）カルボニル基Ｃ＝Ｏ；
（ｂ）カルバモイル基ＮＲ−Ｃ＝Ｏ（ここで、Ｒは、Ｈであるか、または１〜５個のＣ原子が組み込まれたアルキル基である）；または
（ｃ）上に定義されるようなＲＡ−Ｓｉ−ＲＢ基である。
【０１２９】
以下のものは、弱塩基性部分と親油性部分とを含む可溶化基で誘導体化し、「末端」型（式ＩＶＢ）誘導体および「内部」型（式ＩＶＡ）誘導体を形成する、臨床的に重要な多くのタキサンである。このような誘導体は、例えば、当該技術分野で知られている技術を用い、任意の保護されていない親薬物または部分的に保護された親薬物と、リンカー［Ｌ］のカルボン酸形態、アシルイミダゾリド形態、カルバモイルイミダゾリド形態、シリルクロリド形態またはシリルイミダゾリド形態とカップリングさせることによって製造することができる。得られた誘導体を、薬物がリポソームの膜内にとどまるように、ＬＮに能動的に充填させることができる。
【０１３０】
式ＩＶＡのドセタキセル誘導体としては、以下の代表的な構造を有する、エステル、カルバメート、シリルエーテルが挙げられる。
【０１３１】
【化４７】
0005542804.tif 000059
式ＩＶＡのパクリタキセル誘導体としては、以下の代表的な構造を有する、エステル、カルバメート、シリルエーテルが挙げられる。
【０１３２】
【化４８】
0005542804.tif 000060
式ＩＶＢのドセタキセル誘導体としては、すでに記載した一般的な種類を有するエステル、カルバメート、シリルエーテルであって、以下の代表的な構造を有するものが挙げられる。
【０１３３】
【化４９】
0005542804.tif 000061
式ＩＶＢのパクリタキセル誘導体としては、すでに記載した一般的な種類を有するエステル、カルバメート、シリルエーテルであって、以下の代表的な構造を有するものが挙げられる。
【０１３４】
【化５０】
0005542804.tif 000062
同様に、エトポシド８、プレドニゾン９、シクロスポリン１０、アザチオプリン１１、およびその他の薬物を、薬物を、ＬＮ膜内に能動的に充填させることが可能なように、弱塩基性基と親油性基とを含む可溶化単位で誘導体化してもよい。化合物８〜１１に関し、１３および１４は、式［Ｄ］−［Ｌ］−［Ｓ］−［Ｎ］の誘導体を指し、１５および１６は、式［Ｌ］−［Ｓ］−［Ｎ］の誘導体であり、ここで、［Ｎ］は、１３型において、式ＩＶＢにしたがっており、１４型において、式ＩＶＡにしたがっており、［Ｌ］および［Ｓ］は、上に記載したとおりである。
【０１３５】
【化５１】
0005542804.tif 000063
【０１３６】
【化５２】
0005542804.tif 000064
ある局面では、薬物は、例えば、治療への有効性、および本方法を使わない場合に薬物の医薬としての有用性を妨害するであろう１つ以上の性質（例えば、親油性および／または低い水溶性）に関し、コンビナトリアルライブラリから選択された新規化学部分（ＮＣＥ）である。
【０１３７】
さらなる局面では、薬物誘導体は、新しく開発された薬物および／または特性決定された薬物（例えば、新規化学部分（ＮＣＥ））を改変することによって調製される。しばしば、化学ライブラリスクリーニングから得られた、医薬として有望な対象物は、医薬を開発し、使用するために理想的な候補物質よりも少ないことがわかっている。例えば、溶解性の問題は、ほとんどのＮＣＥが開発段階に進まず、除外される主な理由である。本明細書に概説した化学的な基本骨格によって、既知の方法を用い、このような化合物を、ＬＮ中の配合を促進する弱塩基性化学部分で特定的に修飾することによって、このような化合物を開発し、使用することができる。本明細書に記載した医薬品化学の基本骨格を有する薬物候補物質を作製し、スクリーニングするための高スループットコンビナトリアル化学方法をくみこみ、薬物に似た性質を有する、発見された化合物で予想される既存の薬物開発戦略に置き換えることが可能な、薬物（および診断薬剤）を開発する代替的なアプローチを提供する。
【０１３８】
したがって、ある局面では、目的の治療活性を有し、水溶性が低く、親油性であり、および／または、遊離化合物の使用を抑制するか、または妨害する他の性質、および／または、化合物をＬＮに有効に充填させるのを抑制する性質を有する薬物候補物質を同定する方法が本明細書で提供される。例えば、ある局面では、コンビナトリアル化学によって製造した化合物の集合をスクリーニングし、目的の治療活性を有する候補薬物を同定する工程と、この候補薬物について、１つ以上のさらなる性質をスクリーニングし、本明細書に記載した方法にしたがって誘導体化するための候補物質を同定する工程とを含む、方法が提供される。さらなる局面では、誘導体化するための候補物質を、弱塩基性基で誘導体化し、ＬＮ内に能動的に充填させ、ＬＮをスクリーニングし、所望の治療活性を有する配合物候補物質を同定する。有益には、本明細書で提供するスクリーニング方法は、標準的な方法を用いて検出されないような、ＬＮ配合物中で使用する候補薬物を同定する。
【０１３９】
本明細書で提供する方法および組成物で使用するリポソームは、標準的なベシクルを形成する脂質から作製することができ、その脂質は、一般的に、中性、負に帯電しているか、または正に帯電しているリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は、一般的に、例えば、リポソームの大きさ、血流でのリポソームの安定性、所望な放出速度、および当該技術分野で知られている他の因子を考慮することによって導かれる。
【０１４０】
ある局面では、本明細書に記載した方法および組成物で使用するリポソームの主要な脂質要素は、ホスファチジルコリンである。種々の長さの鎖と、種々の飽和度を有する種々のアシル鎖基を有するホスファチジルコリンを使用してもよい。ある局面では、Ｃ１４〜Ｃ２２の範囲の炭素鎖を有する飽和脂肪酸を含有するホスファチジルコリンが好ましい。飽和の長鎖ホスファチジルコリンは、これらの不飽和の対応物と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏで透過性が低く、安定性が高い。モノ不飽和またはジ不飽和の脂肪酸を有するホスファチジルコリン、および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合物を有するホスファチジルコリンも使用してもよい。他の適切な脂質としては、例えば、脂肪酸が、エステル結合ではなく、エーテル結合によってグリセロールに結合しているエーテル脂質が挙げられる。また、本明細書で使用するリポソームは、スフィンゴミエリンまたはコリン以外の頭部基（例えば、エタノールアミン、セリン、グリセロール、ホスファチジン酸、イノシトール）を有するリン脂質で構成されていてもよい。
【０１４１】
いくつかの好ましい局面では、リポソームは、ステロール、好ましくは、コレステロールを、モル比０．１〜１．０（コレステロール：リン脂質）で含む。好ましいリポソーム組成物の例としては、ジステアロイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン／コレステロール、ジミリストイルホスファチジルコリン／コレステロール、卵スフィンゴミエリン／コレステロールが挙げられる。
【０１４２】
他の局面では、リポソームは、負に帯電した脂質または正に帯電した脂質を含有していてもよい。有用な負に帯電した脂質の例としては、限定されないが、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈａｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイル−、ジパルミトイル−、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、これらの不飽和ジアシル鎖および混合アシル鎖の対応物、およびカルジオリピンが挙げられる。正に帯電した脂質の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタアシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）およびＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ，Ｎ’−ジオクタアシルアンモニウムクロリド（ＤＤＡＣ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、１，２−ジオレオイルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオクタデシルオキシ−３−［トリメチルアンモニオ］−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＲＩ）、例えば、Ｂ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍ．Ｓａｉｎｌｏｓ、Ａ．Ａｉｓｓａｏｕｉ、Ｎ．Ｏｕｄｒｈｉｒｉ、Ｍ．Ｈａｕｃｈｅｃｏｒｎｅ、Ｊ．−Ｐ．Ｖｉｇｎｅｒｏｎ、Ｊ．−Ｍ．ＬｅｈｎおよびＰ．Ｌｅｈｎ、Ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ２００５、１１、３７５−３９４で記載されているカチオン性脂質が挙げられる。
【０１４３】
さらなる局面では、本明細書で使用するリポソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＮの安定性を高めるために、ポリマー層でコーティングされる（例えば、立体的に安定化されたリポソーム）。例えば、ある実施形態では、ＬＮは、ポリ（エチレングリコール）に接合した脂質（ＰＥＧ−脂質）を含有するリポソームから生成され、親水性表面層を形成し、ＬＮの循環半減期を向上させ、治療標的（例えば、感染部位または腫瘍部位）に到達するＬＮの量を増やす。一般的なアプローチは、例えば、Ｗｏｒｋｉｎｇら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ、２８９：１１２８−１１３３（１９９９）；Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：２７５−２７９（１９９８）；ＡｄｌａｋｈａＨｕｔｃｈｅｏｎら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：７７５−７７９（１９９９）；および、Ｋｏｎｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４２０：１５３−１６７（１９９９）に記載されている。有用なＰＥＧ−脂質の例としては、限定されないが、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３５０］（ｍＰＥＧ  ３５０  ＰＥ）；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５５０］（ｍＰＥＧ  ５５０  ＰＥ）；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−７５０］（ｍＰＥＧ  ７５０  ＰＥ）；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−１０００］（ｍＰＥＧ  １０００  ＰＥ）；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ｍＰＥＧ  ２０００  ＰＥ）；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−３０００］（ｍＰＥＧ  ３０００  ＰＥ）；１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（ｍＰＥＧ  ５０００  ＰＥ）；Ｎ−アシル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）７５０］（ｍＰＥＧ  ７５０セラミド）；Ｎ−アシル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）２０００］（ｍＰＥＧ  ２０００セラミド）；およびＮ−アシル−スフィンゴシン−１−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）５０００］（ｍＰＥＧ  ５０００セラミド）が挙げられる。
【０１４４】
例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）；米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｍａｒｃ  Ｊ．Ｏｓｔｒｏ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８３、Ｃｈａｐｔｅｒ  １；および、Ｈｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）に記載されるように、リポソームを調製するために種々の方法が利用可能である（これらのすべてを本明細書に参考として援用する）。いくつかの好ましい局面では、リポソームは小さく、一般的に、Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、８１２：５５−６５（１９８５）（本明細書で参考として援用する）に記載されているように、水和した脂質分散物を、１００ｎｍの孔を有するフィルターを通して押し出すことによって製造される、直径が約１００ｎｍのリポソームである。
【０１４５】
ある方法では、不均一な大きさを有する多重膜ベシクルは、ベシクルを形成している脂質を、適切な有機溶媒または溶媒系に溶解させ、混合物を減圧下または不活性ガス下で乾燥させ、薄い脂質膜を形成することによって製造される。または、脂質を適切な溶媒（例えば、三級ブタノール）に溶解させ、次いで凍結乾燥させ、より均一な脂質混合物を作成する。この膜または粉末を、一価金属イオンまたは二価金属イオンの緩衝水溶液で覆い、典型的には、撹拌しながら１５〜６０分間水和させる。得られた多重膜ベシクルのサイズ分布は、撹拌条件を激しくすることによって、またはデオキシコレートのような可溶化洗浄剤を加えることによって、脂質を水和し、小さくなるようにシフトさせることができる。別の方法では、脂質を水混和性の有機溶媒（例えば、エタノール）に溶解させ、次いで、水性バッファーと混合し、多重膜リポソーム懸濁物を形成させる。または、脂質を水に混和しない有機溶媒に溶解し、水性媒体と、有機溶媒を蒸発させることによって生成したリポソームとを混合する。
【０１４６】
リポソームを所望の大きさにサイジングするために、いくつかの技術が利用可能である。１つのサイジング方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、これを、本明細書に参考として援用する。リポソーム懸濁物を、浴またはプローブによる超音波処理によって超音波処理すると、大きさが約０．０５ミクロン未満の小さな単層ベシクルになるまで、革新的にサイズが低下したものが得られる。均一化または微小溶液操作は、大きなリポソームを小さなリポソームに砕くせん断エネルギーに依存する、それ以外の方法である。典型的な均一化手順では、多重膜ベシクルを、所定のリポソーム径、典型的には、約０．１〜０．５ミクロンの径が測定されるまで、標準的な乳化ホモジナイザーで再循環させる。両方の方法では、粒径分布は、従来のレーザービームによる粒径識別法によって監視することができる。
【０１４７】
リポソームを小さな孔のポリカーボネート膜または非対称なセラミック膜を通して押出成型することは、リポソーム径を、比較的十分に規定されたサイズ分布になるまで小さくするために、非常に有効な方法である。典型的には、所望なリポソームのサイズ分布が得られるまで、懸濁物を膜に１回以上循環する。リポソームを、連続的に小さな孔の膜を通すことによって押出加工し、リポソームの大きさを徐々に小さくしてもよい。
【０１４８】
ある局面では、能動的な充填技術を用い、弱塩基誘導体をリポソームに充填させる方法が提供される。ある局面では、例えば、Ｍａｕｒｅｒ，Ｎ．、Ｆｅｎｓｋｅ，Ｄ．、およびＣｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．（２００１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １、９２３−４７；Ｎ．Ｌ．Ｂｏｍａｎ、Ｄ．Ｍａｓｉｎ、Ｌ．Ｄ．Ｍａｙｅｒ、Ｐ．Ｒ．ＣｕｌｌｉｓおよびＭ．Ｂ．Ｂａｌｌｙ（１９９４）「Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  Ｗｈｉｃｈ  Ｅｘｈｉｂｉｔｓ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ  Ｃｕｒｅｓ  Ｍｉｃｅ  Ｂｅａｒｉｎｇ  Ｐ３８８  Ｔｕｍｏｒｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４、２８３０−２８３３；Ｄ．Ｎ．Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ、Ｔ．Ｄ．Ｍａｄｄｅｎ、Ｐ．Ｒ．Ｃｕｌｌｉｓ、Ｍ．Ｂ．Ｂａｌｌｙ、Ｌ．Ｄ．Ｍａｙｅｒ、Ｍ．Ｗｅｂｂ、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３９１（２００５）４０−５７（本明細書に参考として援用する）に記載されるように、リポソームの膜を通じてｐＨ勾配を付与し（リポソームの内側が酸性である）、リポソームを、封入される薬物とともにインキュベーションすることによって、リポソームに充填する。いくつかの好ましい局面では、一般的に、Ｇ．Ｈａｒａｎ、Ｒ．Ｃｏｈｅｎ、Ｌ．Ｋ．Ｂａｒ、Ｙ．Ｂａｒｅｎｈｏｌｚ、Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｗｅａｋ  ｂａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１１５（１９９３）２０１−２１５および米国特許第５，３１６，７７１号（本明細書に参考として援用する）に記載されているように、ｐＨ勾配は、硫酸アンモニウムによる勾配である。薬物をリポソームに充填させたら、組成物を、直接的に使用してもよく、または、組成物をさらに処理し、任意の充填されていない薬物を処理除去してもよい。
【０１４９】
ｐＨによる充填技術は、一般的に、リポソーム内部のｐＨを低くしてｐＨ勾配を作り出すこと、次いで、薬物を充填させることの２工程を含む。膜内外のプロトン勾配は、種々の様式で作り出すことができる。リポソームは、ｐＨ４クエン酸バッファーのような低ｐＨのバッファー中で調製し、次いで、外側のバッファー溶液をｐＨ７．５のバッファーに交換することによって調製することができる（例えば、Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ、５３：３７−４６（１９９０））。または、イオノフォアを、カチオンの勾配（内側のカチオン濃度が高い）と組み合わせて用いることができる（例えば、Ｆｅｎｓｋｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ、１４１４：１８８−２０４（１９９８））。イオノフォア（例えば、ナイジェリシンおよびＡ２３１８７）を、それぞれ、一価カチオンまたは二価カチオンの外側への移動と、内側へのプロトンの移動と組み合わせ、これにより、リポソームの内側を酸性にする。さらに、高濃度の弱塩基（例えば、硫酸アンモニウム）存在下、リポソームを調製することができる（Ｈａｒａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１５１：２０１−２１５（１９９３））。外側のアンモニウム塩溶液を除去することによって、同じ原理にしたがってｐＨ勾配を作り出し、これもまた、その次に起こる薬物充填プロセスに関与する。硫酸アンモニウムの充填技術は、この保持プロセスが、２種類の異なるアミンの交換（薬物が中に入り、アンモニアが外に出る）によって維持され、非常に低い外部ｐＨで十分に機能するため、効果的な充填を達成するために大きなｐＨ勾配は必要ではない。このことは、例えば、この薬物が、中性ｐＨで不安定であるか、または不溶性である場合に、有益である。能動的な充填のために、ｐＨ勾配に加え、金属イオンの勾配を用いることができる（例えば、Ｃｈｅｕｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ、１４１４：２０５−２１６（１９９８））。この充填方法は、ｐＨ勾配技術と同じ基本的な原理による。弱塩基薬物の中性形態は、膜を透過することが可能であり、薬物−金属イオン複合体を形成させることにより、リポソームの水性の内側にとどまる。
【０１５０】
水溶性弱塩基薬物をＬＮに充填させるために、薬物を水溶液（例えば、３００ｍＭショ糖、または適切なｐＨの等張性緩衝溶液）に溶解し、リポソーム懸濁物と混合し、次いで、適切な温度でインキュベーションすることができる。この薬物溶液は、薬物の溶解度を上げるために、少ない（膜を透過しない）量の水混和性の有機溶媒を含んでいてもよい（例えば、＜１０％エタノール）。インキュベーションの温度および時間は、脂質の組成および薬物の性質によって変わる。典型的には、コレステロールと、長鎖の飽和脂肪酸（例えば、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮ）で構成されているリポソームは、短鎖の飽和脂質（例えば、ＤＭＰＣ／ｃｈｏｌ）または不飽和脂質から形成されたＬＮよりも透過性が低く、迅速で効率的な充填を達成するために、高い温度が必要となる。例えば、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮは、典型的には、６０℃以上の温度を必要とし、充填は、典型的には、５〜１５分後に終了するが、２時間かかる場合もある。
【０１５１】
親油性弱塩基薬物を充填させるために、薬物を脂質と同様に処理することができる。例えば、脂質および薬物を一緒に混合し、リポソームを上述のように形成することができ、次いで、親油性薬物を、リポソーム二層の２つの単一層に分配する。上述の方法を用い、膜内外のｐＨ勾配または他のイオン勾配に応答して、外側の単一層に存在する薬物を、リポソームの内側に保持させる（ＬＮ二層の内側の単一層に移動させる）。
【０１５２】
さらなる局面では、本明細書に提示されるＬＮ配合物を含む医薬組成物が提供される。また、本明細書に提示されるＬＮ組成物を投与する工程を含む、疾患または状態を治療する方法が本明細書に提供される。なおさらなるの局面では、本明細書に記載のように、本明細書に記載のＬＮ組成物と、本発明の方法論および用途を教示する指示資料とを含むキットが提供される。
【０１５３】
リポソームと本発明の化合物とを含む医薬組成物は、標準的な技術および上述の技術にしたがって調製される。好ましくは、医薬組成物は、非経口投与される。すなわち、関節内（ｉｎｔｒａａｎｉｃｕｌａｒｌｙ）投与、静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与される。さらに好ましくは、医薬組成物は、ボーラス注射または注入によって静脈内投与される。本発明で使用するために適した配合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）中に見出される。
【０１５４】
好ましくは、医薬組成物は、静脈内投与される。したがって、本発明は、許容されるキャリア、好ましくは、水性キャリアに懸濁したリポソームを含む、静脈内投与用の組成物を提供する。例えば、水、緩衝化した水、０．９％等張性食塩水などの種々の水性キャリアを使用してもよい。これらの組成物を、従来のよく知られている滅菌技術によって滅菌してもよく、または、滅菌濾過してもよい。得られた水性懸濁物を、そのまま使用するために包装してもよく、または、凍結乾燥してもよく、凍結乾燥した製剤を、投与前に滅菌水溶液と混合する。組成物は、生理学的条件に近づけることが必要な場合、医薬的に許容される補助基質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）など）を含んでいてもよい。
【０１５５】
医薬配合物中のリポソームの濃度は、さまざまであってもよく、例えば、約０．５ｍｇ／脂質ｍＬ未満、通常は、少なくとも約１０〜５０ｍｇ／脂質ｍＬから、多くは１００ｍｇ／脂質ｍＬまたはそれ以上であってもよく、選択される特定の投与態様にしたがって、主に、流体の容積、粘度、安定性、必要とされる薬物の投薬量などによって選択される。
【０１５６】
リポソームの電荷は、血管からのリポソームのクリアランスにおける重要な決定因子であり、負に帯電したリポソームの方が、網内系にすばやく取り込まれ（Ｊｕｌｉａｎｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５  １（１９７５））、したがって、血流での半減期が短くなる。循環での半減期が長くなったリポソームは、典型的には、治療用途および診断用途で望ましく、リポソームは、腫瘍のような末梢の疾患に蓄積しなければならない。例えば、循環での半減期が２時間、８時間、１２時間、または２４時間までのリポソームが、特に好ましい。
【０１５７】
さらに、リポソーム懸濁物は、脂質を遊離ラジカルから保護し、貯蔵中に脂質が過酸化物によって損傷を受けるのを防ぐ、脂質保護剤を含んでいてもよい。親油性の遊離ラジカル消失剤（例えば、α−トコフェロール）および水溶性の鉄特異的なキレート剤（例えば、フェリオキサミン）または抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）が適している。
【０１５８】
以下の実施例例証を用いて与えるが、これらは限定的なものではない。
【実施例】
【０１５９】
実施例１−化学合成方法
弱塩基誘導体および修飾されていない薬物を、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）で定量した。この装置は、光ダイオードアレイ検出器（ＰＤＡ）および三連四重極（ＴＱ）ＭＳ検出器を取り付けたＷａｔｅｒｓ（登録商標）Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）  ＵＰＬＣシステムから構成されており、Ｅｍｐｏｗｅｒ（商標）データ収集ソフトウエアバージョン２．０を用いた（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）。Ｗａｔｅｒｓ（登録商標）  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）を用い、流速０．２５ｍＬ／分で、分離を行い、移動相ＡおよびＢは、それぞれ、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水、および０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルであった。プレドニゾン誘導体およびエトポシド誘導体および修飾されていない薬物の場合、移動相は、０．１％ギ酸を含む水（Ａ）および０．１％ギ酸を含むアセトニトリル（Ｂ）からなっていた。移動相は、カラム温度２３℃で、プログラムした線形の勾配で運ばれた。
【０１６０】
ドセタキセル誘導体およびドセタキセルの場合、移動相の比率が５０：５０（Ａ：Ｂ）から分離を開始した。この比率を、線形曲線を用いて２分間かけて１０：９０（Ａ：Ｂ）まで変え、次いで、１０：９０（Ａ：Ｂ）で０．５分間維持した。次いで、移動相を０．１分かけて５０：５０（Ａ：Ｂ）に戻し、この比率を０．４分維持した後、次のサンプルを注入した。プレドニゾン誘導体およびプレドニゾンの場合、移動相の比率が８０：２０（Ａ：Ｂ）から分離を開始した。この比率を、線形曲線を用いて４分かけて４０：６０（Ａ：Ｂ）まで変え、次いで、０．１分かけて１０：９０（Ａ：Ｂ）まで変化させた。後者の比率を０．４分間維持した。次いで、移動相を０．１分かけて８０：２０（Ａ：Ｂ）まで戻し、この比率を０．９分間維持した後、次のサンプルを注入した。エトポシド誘導体およびエトポシドの場合、移動相の比率が８０：２０（Ａ：Ｂ）から分離を開始した。この比率を、線形曲線を用いて１分かけて７２．５：２７．５（Ａ：Ｂ）まで変え、次いで、３分かけて６０：４０（Ａ：Ｂ）まで変え、０．１分かけて１０：９０（Ａ：Ｂ）まで変えた。この比率を０．４分間維持した。次いで、移動相を０．１分かけて８０：２０（Ａ：Ｂ）まで戻し、この比率を０．４分間維持した後、次のサンプルを注入した。
【０１６１】
被分析物をＰＤＡおよびＴＱ−ＭＳ検出器によって、波長２３０ｎｍ（ドセタキセルおよびドセタキセル誘導体の場合）、波長２５４ｎｍ（プレドニゾンおよびエトポシド誘導体の場合）で、それぞれ、ＥＳ＋イオンモードおよびコーン電圧３０Ｖで検出した。ＬＮ配合された誘導体を、ＴＦＡまたはギ酸で酸性にしたエタノールに溶解した（０．１％ｖｏｌ．）。血液の血漿サンプル中のＬＮ配合された薬物を検出するために、血漿５０μＬを、ＴＦＡまたはギ酸で酸性にしたメタノール１５０μＬ（０．１％ｖ／ｖ）に加え、混合物を、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離処理し、沈殿したタンパク質をペレット状にした。プロドラッグを安定化させるために、メタノールを酸性にすることが必要であった。ドセタキセルおよびドセタキセル誘導体（ＴＤ−１）の場合、ＭＳ検出限界（ＬＯＤ）は、ＴＦＡで酸性にしたメタノールを使用した場合、約１〜５０ｎｇ／ｍＬであった。この限界は、ＴＦＡの代わりにギ酸を用いることが必要な場合、ｎＭ未満の濃度まで下げることが可能である。
【０１６２】
他の意味であると示されていない限り、１ＨＮＭＲスペクトルおよび１３ＣＮＭＲスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−３００型（１Ｈの場合３００ＭＨｚ、１３Ｃの場合７５ＭＨｚ）およびＡＶ−４００型（１Ｈの場合４００ＭＨｚ、１３Ｃの場合１００ＭＨｚ）で、室温で記録した。化学シフトをパーツパーミリオン（ｐｐｍ）でδスケールで報告し、カップリング定数Ｊは、ヘルツ（Ｈｚ）である。多重度は、「ｓ」（一重線）、「ｄ」（二重線）、「ｔ」（三重線）、「ｑ」（四重線）、「ｄｄ」（二重線の二重線）、「ｄｔ」（三重線の二重線）、「ｍ」（多重線）、「ｂ」（広がった）として記載する。低解像度質量分析スペクトル（ｍ／ｚ）は、電子スプレー（ＥＳＩ）モードで得た。
【０１６３】
ＬＮに配合された誘導体を、Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  ２０  ＴＷＩＮ  Ｍｋ．２  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  （ＣＤＲＤ  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を用いて行ったＣｒｙｏ−ＴＥＭによって観察した。この装置を、ｂｒｉｇｈｔ−ｆｉｅｌｄモードで、２００ｋＶで操作した。ＦＥＩ  Ｅａｇｌｅ  ４ｋ  ＨＲ  ＣＣＤカメラおよび分析ソフトウレアＦＥＩ  ＴＩＡを用いた低線量条件でデジタル画像を記録した。１〜３μｍのアンダーフォーカスを用い、画像のコントラストを高めた。サンプルの調製を、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ  Ｍａｒｋ  ＩＶ  ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｏｂｏｔ  ｏｎ  Ｌａｃｅｙ  Ｆｏｒｍｖａｒ  ３００  ｇｒｉｄｓ（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ製、番号０１８９０）で行った。
【０１６４】
すべての試薬および溶媒は、市販の製品であり、さらに精製することなく使用した。Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ２３０〜４００メッシュシリカゲルで、フラッシュクロマトグラフィーを行った。分析用ＴＬＣおよび分取用ＴＬＣを、蛍光指示薬を用い、Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０プレートで行った。ＵＶ光、ＫＭｎＯ４またはｐ−アニスアルデヒドでスポットを視覚化した。
【０１６５】
一般的な合成戦略
本明細書で提供する一般的な戦略（図１０）は、適切な固定部位（例えば、ＯＨ基またはＮＨ基）を含有する水不溶性の薬物１を、一般構造２によってあらわされる適切に調整された可溶化単位で誘導体化することを含む。また、この一般的なスキームは、親油性の弱塩基薬物誘導体の合成にも適用される。得られた水溶性接合体３を、推進力としてｐＨ勾配またはイオン勾配を用い、ＬＮに充填させることができる。誘導体３は、それ自体が活性であるか、および／または、生理学的条件下で活性な親薬物１に迅速に変換される。
【０１６６】
この技術は、例えば、（ｉ）水への溶解度；（ｉｉ）プロトン化された窒素官能基のｐＫａ；（ｉｉｉ）リポソーム充填条件下での安定性；（ｉｖ）生理学的条件下で遊離薬物の放出速度などの、３の多くの物理的性質に基づく。次に、これらの性質は、リンカー、スペーサー、２のＲ１基およびＲ２基の性質の関数である。
【０１６７】
ある局面では、可溶化単位は、カルボキシリンカー基と、スペーサー（例えば、ｎ−Ｃ１〜Ｃ４鎖）と、アミン基（例えば、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリン、ピペリジン、ピロリジン、またはジメチルアミン）とを含む。例示的な可溶化単位としては、
【０１６８】
【化５３】
0005542804.tif 000065
が挙げられ、式中、ｎは、１〜約１０であるか、またはさらに好ましくは、１〜４である。
【０１６９】
実施例２−タキサン誘導体
ドセタキセルは、Ｎ−メチル−ピペラジニルブタン酸を用い、Ｃ−２’位のヒドロキシル基で誘導体化され、以下に示すようなアミノエステルプロドラッグ（ＴＤ１）を形成する。
【０１７０】
ドセタキセルの２’−Ｏ−（Ｎ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル）誘導体（ＴＤ１）
リンカー合成：４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸塩酸塩
【０１７１】
【化５４】
0005542804.tif 000066
４−ブロモブタン酸エチル（２．５ｍＬ、１７．３ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（５０ｍＬ）溶液を室温で撹拌し、これに１−メチルピペラジン（７．６８ｍＬ、７０ｍｍｏｌ、４当量）を加えた。この溶液を２５℃で１時間撹拌すると、この間に白色沈殿が発生し、次いで、油浴で１時間かけて７０℃まで加熱した。ＴＬＣ分析（ヘキサン中、２０％酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）、Ｒｆ＝０．９（出発物質）、０．１（生成物）、ヨウ素、Ｉ２で視覚化）によって、臭化物試薬が完全に消費されていることが示された。反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、分液漏斗に移し、有機相を水（１００ｍＬ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３、飽和、１００ｍＬ×２回）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥し、濃縮し、わずかに黄色の油状物を得た。この油状物を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルの栓（ヘキサン中、２０％ＥｔＯＡｃ、ＳｉＯ２  １５０ｍＬ）にロードした。所望の生成物を、徐々に極性を高めた溶出液（まず、ヘキサン中、２０％ＥｔＯＡｃ、次いで、ＥｔＯＡｃ中、５〜２５％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨを含有する）を用い、このシリカから溶出させた。
【０１７２】
所望の物質を有する画分を保存し、濃縮し、エチル−４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタノエートを得た（３．６３ｇ、定量的）。この得られた油状物を含有するフラスコに、水（２０ｍＬ）および塩酸（ＨＣｌ、１０Ｍ、２０ｍＬ、１０当量）を加えた。このフラスコに還流コンデンサを取り付け、１１０℃で３時間加熱した。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、次いで、減圧下で油状残渣のみが残るまで濃縮した。この残渣を蒸留水に再び溶解し、濃縮プロセスを繰り返した。得られたシロップ状物を、８５℃でエタノール（５０ｍＬ）に溶解した。すべての固体を溶解するために必要な少量の水（約１ｍＬ）を加えた（大量の水を加えると、収率に悪い影響を与えるであろう）。この溶液を室温で３時間放置し、次いで、冷蔵庫（５℃）に移して１６時間放置した。沈殿を濾別し、あらかじめ秤量しておいたバイアルに移し、Ｄｒｉｅｒｉｔｅを入れたデシケーターに、高減圧状態で１６時間放置し、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸塩酸塩を結晶性の非吸湿性物質として得た（３．０２ｇ、１ＨＣｌ塩を基準として８０％）。
【０１７３】
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝３．６０（ｂｒ  ｓ，８Ｈ），３．２６−３．２２（ｍ，２Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．９９−１．９１（ｍ，２Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，１００ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝１７６．５，５５．９，５０．２，４８．７，４２．８，３０．３，１８．７．
エステル化および塩形成：ＴＤ−１塩酸塩
【０１７４】
【化５５】
0005542804.tif 000067
ドセタキセル（３．９９７ｇ、４．９５ｍｍｏｌ）および４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸塩酸塩（１．２１３ｇ、５．４４ｍｍｏｌ、１．１当量）のジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２、６０ｍＬ）溶液を撹拌し、これにトリエチルアミン（ＮＥｔ３、１０．０ｍＬ、５当量）を加えた。この反応容器を氷浴で冷却し、向山試薬（２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド、１．６６７ｇ、６．５３ｍｍｏｌ、１．３２当量）を加えた。この溶液は、ピリジニウム塩が溶解するにつれて、黄色になった。３０分後にフラスコを氷浴からはずし、反応をさらに１６時間進めた。ＴＬＣによって、出発物質から所望の生成物への変換は良好ではあるが、完結してはいないことが示された（ＣＨ２Ｃｌ２中、８％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨ含有）、５％Ｈ２ＳＯ４エタノール溶液で染色）。この氷冷した溶液を撹拌しながら、さらに０．５当量の上述のピリジニウム塩（０．６３２ｇ、０．５当量）およびアミノ酸（０．１２０ｇ、０．１当量）を加えた。３時間後、反応混合物を高減圧下でロータリーエバポレーターで濃縮し、わずかに橙色の固体を得た。この固体をＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に溶解し、分液漏斗に移し、有機相と飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍＬ）とに分配した。次いで、有機相を塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、濃縮し、わずかに金色のシロップ状物を得た。このシロップ状物をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２中、４％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨ含有）、２５０ｍＬ、直径４０ｍｍ）にロードし、徐々に極性を高めた溶媒（ＣＨ２Ｃｌ２中、４〜１０％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨ含有）、増分２％、５００ｍＬ／増分）で溶出させた。
【０１７５】
所望の物質を有する画分を集め、濃縮し、化合物３．８９０９ｇ（８０．５％）を得た。この化合物の１Ｈ  ＮＭＲ分析から、純度は良好であり、位置異性体に属するピークの存在（約１０％）が示された。この物質をＣＨ２Ｃｌ２に再び溶解し、上述と同じクロマトグラフィー条件に付し、ＣＨ２Ｃｌ２中、ＭｅＯＨを５〜１０％まで１％ずつ増加させた（５００ｍＬ／増分）。純粋な物質を含む画分をＴＬＣで同定し、集め、濃縮し、きれいなＮＭＲスペクトルを有する化合物２．９６ｇを得た。
【０１７６】
この物質を２−プロパノール（４５ｍＬ）に溶解し、冷却しつつ（０℃）、ＨＣｌ（６．３ｍＬ、  ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）中１Ｍ、２．０５当量）を滴下し、塩酸塩を生成させた。懸濁物を乾燥するまで濃縮し、得られたクリーム色の固体を高減圧下で乾燥し、２−プロパノール（４５ｍＬ）にＥｔ２Ｏ（１０ｍＬ）を加えることによって再結晶化させた。ブフナー漏斗で沈殿を濾別し、高減圧下で１８時間乾燥し、約２．５ｇを得た。ドセタキセル誘導体（ＴＤ−１）をＮＭＲ、質量分析計、元素分析、ＵＨＰＬＣ−ＵＶで特性決定し、属性および純度を確認した。ＵＨＰＬＣ−ＵＶによるクロマトグラフィー純度は、９６．７％であった。
【０１７７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：  δ  （ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４３−７．３７（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．０９（ｍ，１Ｈ），５．６１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３２（ｍ，１Ｈ），５．２７−５．２４（ｍ，２Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２２−４．１３（ｍ，３Ｈ），３．８３（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６１（ｓ，１Ｈ），３．２１−３．０９（ｍ，２Ｈ），２．６７−２．３３（ｍ，６Ｈ），２．２３−２．１７（ｍ，１Ｈ），２．１２−１．９８（ｍ，２Ｈ），１．９７−１．７６（ｍ，  ５Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（１００  ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）  δ  （ｐｐｍ）＝２１１．２２，１７３．２６，１７２．４８，１７０．５７，１６７．５８，１５７．２２，１３８．７２，１３６．１３，１３４．４８，１２９．９６，１２９．２９，１２９．００，１２８．７７，１２６．９５，８４．４９，８０．８７，７８．５１，７６．５５，７５．５５，７５．０４，７４．２６，７２．６５，７１．２８，５７．３９，５５．５９，５０．３２，４８．７８，４６．２９，４２．８３，４２．６８，３５．２５，３４．７３，３０．１３，２９．８３，２９．６０，２７．５１，２５．９００，２３．６９，２２．４３，２０．７５，１８．７７，１６．７８，１３．６０，９．５５．
元素分析：ＴＤ−１＋２ＨＣｌ＋１Ｈ２Ｏに基づく計算値：Ｃ，５８．５３；Ｈ，６．９０；Ｃｌ，６．６５；Ｎ，３．９４；実測値：Ｃ，５８．５０；Ｈ，６．９７；Ｃｌ，６．５８；Ｎ，４．１３；ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９７７．４（ｍ＋Ｈ）、ＵＰＬＣ−ＵＶによる面積９６．７％。
【０１７８】
ＴＤ１類似体
ＴＤ１は、Ｏ−２’に二塩基性アミノ酸エステルを含有し、このエステルは、親化合物（ドセタキセル）が、周辺にある基の関与によって直接放出されるのに役立つと考えられる。ＴＤ１類似体群を、以下に示すように合成した。この類似体は、アミノ−アシルリンカーの鎖の長さがさまざまであり、この塩基性アミノ−アシル部分の構造は、隣接基の補助によって、エステルの加水分解を調節するように設計されており（Ｐｏｐら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３（３）：４６９−４７５（１９９６）；Ｒａｕｔｉｏら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４３（３）：１４８９−１４９４（２０００））、種々の治療用途のために、親化合物が放出される速度を、精密に調節することができる。
【０１７９】
閉環反応の場合、分子内エステル加水分解の場合のように、反応中心がｓｐ２混成である場合、３〜７員環の環遷移状態が好ましい。アミンがカルボニルに直接作用し、親薬物および活性化したアシル−アンモニウム中間体を生成するモードＡ；アミンが一般的な塩基として作用し、溶媒（この場合には水）の求核性を高め、これにより加水分解速度が上がり、双性イオン性アミノ酸を放出するモードＢの２種類の可能な加水分解モードが存在する。以下のように合成したＴＤ１類似体はすべて、モードＡによって加水分解することができる。短いアミノ酸エステル（ｎ＝１〜３）のみ、モードＢによって加水分解することができる。
【０１８０】
第１の類似体群では、弱塩基可溶化単位は、ＴＤ１と比較して長さがさまざまなアルキルリンカーを有するピペラジニルアミノ部分、を含む。この次の類似体群では、同じアルキルリンカーを用いており、アミノ部分は、さまざまであり、モルホリノ置換基およびピペリジニル置換基を含んでいた。アミノ部分は、次の順序で求核性が異なっている：Ｎ−メチルピペラジン＞モルホリン＞ピペリジン（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、７３４−７３６（１９７６）；Ｂａｌｄｗｉｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４２（２４）：３８４６−３８５２（１９７７））。塩基性は逆であり、Ｎ−メチルピペリジンは、Ｎ-−メチルピペラジンよりもｐＫａが２単位大きい。このように、Ｎ−メチルピペラジノ化合物は、モードＡの加水分解を受けやすく、低いｐＨ値でプロトン化が達成されると予想される。
【０１８１】
アミノ−エステルへのＮ−アルキル化（一般的な手順）
ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロパノエート
【０１８２】
【化５６】
0005542804.tif 000068
ｔｅｒｔ−ブチル  ３−ブロモプロピオネート（３．０ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（１５ｍＬ）溶液を０℃で撹拌し、これに４−メチルピペラジン（７．６８ｍＬ、７０ｍｍｏｌ、４当量）を加えた。この溶液を２５℃で１時間撹拌すると、この間に白色沈殿が発生し、次いで、油浴で２時間かけて５５℃まで加熱した。ＴＬＣ分析（ヘキサン中、２０％ＥｔＯＡｃ、Ｒｆ＝０．９（出発物質）、０．１（生成物））によって、臭化物試薬が完全に消費されていることが示された。反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、分液漏斗に移し、有機相を水（１００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（飽和、１００ｍＬ×２回）、塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮し、わずかに黄色の油状物を得た。この油状物を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルの栓（ヘキサン中、２０％ＥｔＯＡｃ、ＳｉＯ２  １５０ｍＬ）にロードし、所望の生成物を、徐々に極性を高めた溶出液（ヘキサン中、ＥｔＯＡｃ、２０％から開始し、２００ｍＬ容積を増分１０％で１００％まで増加させる）を用い、このシリカから溶出させた。所望の物質を有する画分を濃縮し、ｔｅｒｔ−ブチル  ３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロパノエート（４．１ｇ、定量的）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝３．４５（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ，２Ｈ），２．６４（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｂｒ  ｓ，６Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），１．４２（ｓ，９Ｈ）．
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を調製した。
【０１８３】
２−（４−メチルピペラジン−１−イル）酢酸ベンジル
【０１８４】
【化５７】
0005542804.tif 000069
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝７．３３−７．２７（ｍ，５Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），３．２５（ｓ，２Ｈ），２．６０（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），２．４８（ｂｒ  ｓ，４Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ）．
５−（４−メチルピペラジン−１−イル）ペンタン酸エチル
【０１８５】
【化５８】
0005542804.tif 000070
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝４．１０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｂｒ  ｓ，６Ｈ），２．３５−２．２８（ｍ，４Ｈ），２．２６（ｓ，３Ｈ），１．７９（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），１．６２（ｐ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．５４−１．４６（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｔ，７．２Ｈｚ）．
２−モルホリノ酢酸ベンジル
【０１８６】
【化５９】
0005542804.tif 000071
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝７．４６−７．３０（ｍ，５Ｈ），５．１６（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），３．２５（ｓ，２Ｈ），２．５８（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ）．
ｔｅｒｔ−ブチル  ３−モルホリノプロパノエート
【０１８７】
【化６０】
0005542804.tif 000072
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝３．６８（ｔ，Ｊ＝４．５，＄Ｈ），２．６３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，４Ｈ），２．３９（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．４４（ｓ，９Ｈ）．
４−モルホリノブタン酸エチル
【０１８８】
【化６１】
0005542804.tif 000073
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝４．１１（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６８（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），２．４２−２．３８（ｍ，４Ｈ），２．３７−２．３１（ｍ，４Ｈ），１．８０（ｐ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），１．２４（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
５−モルホリノペンタン酸エチル
【０１８９】
【化６２】
0005542804.tif 000074
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝４．１１（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），３．６８（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，４Ｈ），２．４２−２．３８（ｍ，４Ｈ），２．３７−２．２７（ｍ，４Ｈ），１．８０−１．７３（ｍ，２Ｈ），１．５３−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．２４（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
アミノ酸への加水分解（一般的な手順）
３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロピオン酸塩酸塩（ＴＤ１１）
【０１９０】
【化６３】
0005542804.tif 000075
丸底フラスコにｔｅｒｔ−ブチル  ３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロパノエート（４．１ｇ、１８ｍｍｏｌ）を入れ、磁気撹拌子を入れ、水（２０ｍＬ）およびＨＣｌ（１０Ｍ、２０ｍＬ、１０当量）を加えた。このフラスコに還流コンデンサを取り付け、油浴に置き、１１０℃の温度の浴で３時間加熱した。この反応物のＴＬＣ分析は行わなかった。反応物を油浴からはずし、室温まで冷却した。反応物を十分に冷却したら、油によって駆動する高減圧ポンプに接続したロータリーエバポレーターに移した。フラスコの内容物を、圧力が０．１ｍｍＨｇになるまで濃縮し、油性残渣のみが残った。次いで、このフラスコをはずし、内容物を蒸留水に再び溶解し、エバポレーションプロセスを繰り返し、この時点でシロップ状物を得て、これは、高減圧下で水を除去すると泡立った。この未精製物質が、顕著な量の残留ＨＣｌを含んでいる場合、以下の条件で結晶化を行うと、酸が再びエステル化し、収率に悪い影響を与えるであろうことを注記しておくべきである。エタノール（５０ｍＬ）および磁気撹拌子を加え、フラスコを８５℃の油浴に漬け、シロップ状になるまで溶解した。還流状態になっても、すべての物質は溶解しなかったので、すべての固体が溶解するまで、少量の水（約１ｍＬ）を滴下様式で加えた。この時点で過剰量の水を加えると、収率に悪い影響を与えるであろう。
【０１９１】
得られた溶液を油浴からはずし、室温で３時間放置した後、冷蔵庫（５℃）に移して１６時間放置した。固体を超音波処理によって懸濁させ、フラスコの側面からはがし、濾紙で覆ったブフナー漏斗で濾過した。次いで、あらかじめ秤量しておいたバイアルに結晶を移し、Ｄｒｉｅｒｉｔｅを入れたデシケーターに、高減圧状態で１６時間乾燥し、空気中で安定な、結晶性で非吸湿性の固体物質を得た（３．０７ｇ、１ＨＣｌ塩を基準として８２％）。１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝３．６（ｂｒ  ｓ，８Ｈ），３．４８（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）．
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を調製した。
【０１９２】
２−（４−メチルピペラジン−１−イル）酢酸塩酸塩（ＴＤ２）
【０１９３】
【化６４】
0005542804.tif 000076
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝３．８７（ｓ，２Ｈ），３．８５−３．３５（ｂｒ  ｍ，８Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ）．
５−（４−メチルピペラジン−１−イル）ペンタン酸塩酸塩（ＴＤ３）
【０１９４】
【化６５】
0005542804.tif 000077
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝３．５９（ｂｒ  ｓ，８Ｈ），３．２２（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），２．９３（ｓ，３Ｈ），２．３６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．７５−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．５７（ｐ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）．
４−モルホリノブタン酸塩酸塩（ＴＤ４）
【０１９５】
【化６６】
0005542804.tif 000078
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝４．０２（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．４６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．１５−３．０６（ｍ，４Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９７−１．８９（ｍ，２Ｈ）．
２−モルホリノ酢酸塩酸塩（ＴＤ５）
【０１９６】
【化６７】
0005542804.tif 000079
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝４．１０−３．７０（ｍ，６Ｈ），３．５０（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．２（ｂｒ  ｓ，２Ｈ）．
（３−モルホリノプロピオン酸塩酸塩（ＴＤ６）
【０１９７】
【化６８】
0005542804.tif 000080
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝４．０２（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．４６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１３（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）．
５−モルホリノペンタン酸塩酸塩（ＴＤ１２）
【０１９８】
【化６９】
0005542804.tif 000081
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝４．０２（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．７３（ｂｒ  ｔ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．４６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．３Ｈｚ，２Ｈ），３．１５−３．０６（ｍ，４Ｈ），２．４１（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．７２−１．６６（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．５２（ｍ，２Ｈ）．
４−（ピペリジン−１−イル）ブタン酸塩酸塩（ＴＤ７）
【０１９９】
【化７０】
0005542804.tif 000082
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝３．４３（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，２Ｈ），３．０４−２．９９（ｍ，２Ｈ），２．８８  （ｔｄ，Ｊ＝２．７，  １２．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．９５−１．８０（ｍ，４Ｈ），１．７６−１．５５（ｍ，３Ｈ），１．４５−１．３２（ｍ，１Ｈ）．
２−（ピペリジン−１−イル）酢酸塩酸塩（ＴＤ８）
【０２００】
【化７１】
0005542804.tif 000083
５−（ピペリジン−１−イル）ペンタン酸塩酸塩（ＴＤ９）
【０２０１】
【化７２】
0005542804.tif 000084
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝３．４３（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，２Ｈ），３．０４−２．９９（ｍ，２Ｈ），２．８０（ｔｄ，Ｊ＝２．７，１２．１Ｈｚ，２Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８８−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．４９（ｍ，７Ｈ），１．４５−１．３２（ｍ，１Ｈ）．
３−（ピペリジン−１−イル）プロピオン酸塩酸塩（ＴＤ１３）
【０２０２】
【化７３】
0005542804.tif 000085
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，  ４００  ＭＨｚ）  δ  （ｐｐｍ）＝３．４３（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝１２．１Ｈｚ，２Ｈ），３．２９（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｔｄ，Ｊ＝２．７，１２．１Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），１．８５−１．８０（ｍ，２Ｈ），１．７６−１．６２（ｍ，３Ｈ），１．４５−１．３２（ｍ，１Ｈ）．
２’−Ｏ−アシル化（一般的な手順）
ＴＤ４：モルホリノブタン酸エステル
【０２０３】
【化７４】
0005542804.tif 000086
２５ｍＬの丸底フラスコ中、４−モルホリノブタン酸塩酸塩（０．０９５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ、１．２当量）を、ピリジン（４ｍＬ）およびＤＢＵ（０．１４０ｍＬ、３当量）に溶かし、撹拌した溶液を氷浴で０℃で冷却し、アセトニトリル（２ｍＬ）を加え、次いで、タキソテール（登録商標）（０．３０３ｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、１当量）を加えた。１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ、０．１８０ｇ、２．５当量）を１５分かけて何回かにわけて加えた。得られた懸濁物を撹拌し、氷浴を１６時間かけて融かしながら、室温まで徐々に加温した。ＴＬＣ分析（ＥｔＯＡｃ中、３０％ヘキサン／６％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨを加えたもの））によって、この時点でほぼ完全に変換されていることがわかった。エタノール（２ｍＬ）を加え、フラスコをロータリーエバポレーターに移し、高減圧下で濃縮した。得られた油状物をエタノールに再び溶解し、再び濃縮した。乾燥した残渣を塩化メチレン（約４ｍＬ）に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム（シリカ６０ｍＬ、ＥｔＯＡｃ中、３０％ヘキサン／２％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨを加えたもの））にロードし、徐々に極性を高めた溶媒混合物（２〜８％ＭｅＯＨ、増分２％、１００ｍＬ／増分）で溶出させた。所望の物質を有する画分を集め、濃縮し、所望の化合物を得た（０．２５５ｇ、７１％）。
【０２０４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７１−７．４８（ｍ，３Ｈ），７．４８−７．３１（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．０９（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４０−５．１６（ｍ，３Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２８−４．１３（ｍ，３Ｈ），３．８６（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｍ，４Ｈ），２．６７−２．１０（ｍ，１４Ｈ），１．９９−１．７２（ｍ，７Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．
この物質をＥｔＯＡｃ／ヘキサンから再結晶化させ、生物学的試験および溶解度試験に使用した。再結晶化させた後、ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９６３．２（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９９．８％。
【０２０５】
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を生成させた。
【０２０６】
ＴＤ２：Ｎ−メチル−ピペラジニル酢酸エステル
【０２０７】
【化７５】
0005542804.tif 000087
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．０８（ｍ，１Ｈ），５．６２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｄ，２Ｈ），５．２７（ｓ，１Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２９−４．１３（ｍ，３Ｈ），３．８５（ｂｒ  ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４２−３．３３（ｍ，３Ｈ），２．７１−２．２７（ｍ，１６Ｈ），２．０３（ｑ，１Ｈ），１．９２（ｓ，３Ｈ），１．８９−１．７９（ｍ，１Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９４９．４（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９５％。
【０２０８】
ＴＤ３：Ｎ−メチル−ピペラジニルペンタン酸エステル
【０２０９】
【化７６】
0005542804.tif 000088
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４１（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．０８（ｍ，１Ｈ），５．６２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３７−５．１８（ｍ，３Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２９−４．１３（ｍ，３Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ  １Ｈ），３．６３−３．４８（ｍ，５Ｈ），２．８０−２．２７（ｍ，２４Ｈ），２．２７−２．１３（ｍ，１Ｈ），２．０３（ｑ，２Ｈ），１．９７−１．５４（ｍ，１９Ｈ），１．５７−１．４９（ｂｒ  ｍ，Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９９０．６（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９６％。
【０２１０】
ＴＤ５：モルホリノ酢酸エステル
【０２１１】
【化７７】
0005542804.tif 000089
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１２（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６４（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５９−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４４−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．３２−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．１６（ｍ，１Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｂｒ  ｄ，２Ｈ），５．２７（ｓ，１Ｈ），５．０１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２７−４．１５（ｍ，３Ｈ），３．８９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７１−３．５８（ｍ，４Ｈ），３．３８（ｄ，１Ｈ），２．５４−２．２６（ｍ，９Ｈ），２．１２−２．０１（ｍ，１Ｈ），１．９２（ｓ，３Ｈ），１．８７−１．７６（ｍ，１Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９３６．１（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９８％。
【０２１２】
ＴＤ６：モルホリノプロピオン酸エステル
【０２１３】
【化７８】
0005542804.tif 000090
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６１−７．５０（ｍ，２Ｈ），７．４５-７．３３（ｍ，４Ｈ），７．３０-７．２０（ｍ，１Ｈ），６．０９（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３９−５．１６（ｍ，３Ｈ），５．００（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２７−４．１３（ｍ，３Ｈ），３．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．７０−３．５４（ｍ，４Ｈ），２．７２−２．５６（ｍ，４Ｈ），２．５２−２．２９（ｍ，８Ｈ），２．２９−２．１４（ｍ，１Ｈ），１．９９−１．８６（ｍ，４Ｈ），１．８６-１．７５（ｍ，２Ｈ），１．６８（ｍ，１３Ｈ），１．３９（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９５０．９（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９４％。
【０２１４】
ＴＤ８：ピペリジニル酢酸エステル
【０２１５】
【化７９】
0005542804.tif 000091
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４４−７．３４（ｍ，４Ｈ），７．２７（ｍ，１Ｈ），６．１７（ｍ，１Ｈ），５．６５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．４９−５．３８（ｍ，２Ｈ），５．２８（ｓ，１Ｈ），５．０１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２４−４．１５（ｍ，３Ｈ），３．９０（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．３６−３．３２（ｍ，１Ｈ），３．１９−３．１１（ｍ，１Ｈ），２．５７−２．２５（ｍ，９Ｈ），２．１６−２．０６（ｍ，１Ｈ），１．９２（ｓ，３Ｈ），１．８７−１．７６（ｍ，１Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．６５−１．５０（ｍ，４Ｈ），１．４０−１．２２（ｍ，１１Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９３３．８（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９４％。
【０２１６】
ＴＤ７：ピペリジニルブタン酸エステル
【０２１７】
【化８０】
0005542804.tif 000092
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４４−７．３３（ｍ，４Ｈ），７．２９−７．２０（ｍ，１Ｈ），６．０９（ｍ，１Ｈ），５．６３（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３６−５．３０（ｍ，１Ｈ），５．２９−５．２６（ｍ，２Ｈ），５．０３−４．９５（ｍ，１Ｈ），４．２７−４．１４（ｍ，３Ｈ），３．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５９−２．１６（ｍ，１５Ｈ），２．０１−１．７５（ｍ，８Ｈ），１．６８（ｓ，３Ｈ），１．６４−１．５４（ｍ，５Ｈ），１．４７（ｍ，３Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９６２．５（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９４％。
【０２１８】
ＴＤ９：ピペリジニルペンタン酸エステル
【０２１９】
【化８１】
0005542804.tif 000093
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４５−７．３３（ｍ，４Ｈ），７．２５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），６．０８（ｍ，１Ｈ），５．６２（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３１（ｍ，１Ｈ），５．２８−５．１８（ｍ，２Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．２７−４．１５（ｍ，３Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），２．５１−２．１８（ｍ，１７Ｈ），１．９７−１．７５（ｍ，５Ｈ），１．７５−１．４６（ｍ，２０Ｈ），１．４３−１．３８（ｍ，１０Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９７６．２（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積９６％。
【０２２０】
７−ＯＨアシル化（一般的な手順）
保護：ＧＣＷ００００６−０９
【０２２１】
【化８２】
0005542804.tif 000094
ドセタキセル（０．７４６ｇ、０．９２３ｍｍｏｌ）を、塩化メチレン（２０ｍＬ）およびピリジン（１．６ｍＬ）に溶解し、撹拌し、冷却した（−４５℃）溶液に、クロロギ酸トリクロロエチル（Ｔｒｏｃ−Ｃｌ、０．１３７ｍＬ、１．０１ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下様式で加えた。反応物を低温で１時間撹拌し、第２の等しい量のＴｒｏｃ−Ｃｌ（０．１３７ｍＬ、１．０１ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下様式で加えた。次の１６時間、反応物を撹拌しつつ、室温まで徐々に加温した。この時点で、ＴＬＣ分析（ヘキサン中、３０％ＥｔＯＡｃ）によって、少量の出発物質が残っており、２’，１０−ジ−Ｔｒｏｃ保護された化合物、２’，７−ジ−Ｔｒｏｃ保護された化合物、２’，７，１０−トリ−Ｔｒｏｃ保護された化合物であると予想される３種類の新しいスポットが生成していることが示された。反応物を最小限の量のエタノールで希釈し、取り付けたロータリーエバポレーターで高減圧で乾燥するまで濃縮した。次いで、残渣を最小限の量のＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム（３ｃｍ×２０ｃｍ、ヘキサン中、２０％ＥｔＯＡｃ）にロードした。徐々に極性を高めた溶媒混合物（ヘキサン中、２０〜６０％ＥｔＯＡｃ、容積１００ｍＬ、増分５％）を用い、所望の生成物をカラムから注意深く溶出させ、集め、透明画分を濃縮し、所望の異性体をアモルファス白色固体として得た（０．４３３ｇ、４０％）。
【０２２２】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  （ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，２Ｈ），７．６１（ｔ，１Ｈ），７．５１（ｔ，２Ｈ），７．４５−７．３３（ｍ，５Ｈ），６．２９（ｍ，１Ｈ），６．１６（ｓ，１Ｈ），５．６９（ｄ，１Ｈ），５．５９−５．５６（ｍ，１Ｈ），５．５５−５．４２（ｍ，２Ｈ），５．３５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），４．９６（ｂｒ  ｄ，１Ｈ），４．８９（ｄ，１Ｈ），４．７６（ｑ，２Ｈ），４．６９（ｄ，１Ｈ），４．４１−４．３７（ｍ，１Ｈ），４．３２（ｄ，１Ｈ），４．１８（ｄ，１Ｈ），３．９６−３．９１（ｍ，３Ｈ），３．７８（ｄ，１Ｈ），２．６１−２．５３（ｍ，１Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ），２．３９−２．１８（ｍ，３Ｈ），２．１１−１．７６（ｍ，１１Ｈ），１．７３（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），１．６９（ｓ，３Ｈ），１．３２（ｓ，９Ｈ），１．２８−１．１７（ｍ，６Ｈ）．
同じ一般的な手順を用い、以下の類似体を作成した。
【０２２３】
エステル化：ＧＣＷ００００６−１０
【０２２４】
【化８３】
0005542804.tif 000095
丸底フラスコに４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸塩酸塩（０．５８ｇ、２．６１ｍｍｏｌ）と磁気撹拌子を入れ、これに、塩化チオニル（１５ｍＬ）を加えた。得られた溶液を加熱して１．５時間還流させ、室温まで冷却し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、無水トルエン（１０ｍＬ）で懸濁させ、ロータリーエバポレーターで再び濃縮して白色固体を得て、高減圧ラインで、一定重量になり、塩化チオニルまたは塩酸の臭気がしなくなるまで３時間乾燥した。
【０２２５】
ＧＣＷ００００６−０９（０．４３３ｇ、０．３７５ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（Ｄｒｉ−Ｓｏｌｖｅ、８ｍＬ）溶液に、磁気撹拌子を入れておき、これにＮ，Ｎ−ジメチルアミノ−ピリジン（ＤＭＡＰ、０．２２９ｇ、５当量）を加えた。この溶液を０℃まで冷却し、上述のアミノアシルクロリド塩酸塩（０．１００ｇ、１．１当量）を数分間にわたって何回かにわけて加えた。ＤＭＡＰは、モノアミノアシル化された化合物と一緒に溶出される傾向があるため、出発物質の消費についてＴＬＣ分析にもとづいて反応を追跡した。２時間後、ある程度出発物質がまだ残っていることがＴＬＣによって観察され、さらなるアミノ−アシルクロリド塩酸塩（０．０５ｇ、０．５５当量）を加えた。室温でさらに１時間撹拌した後、ＴＬＣによって、出発物質がほぼ完全に消費されたことが示された。反応物をロータリーエバポレーターで濃縮して油状物を得て、これを少量のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカカラム（３ｃｍ×２０ｃｍ、４：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン）にロードし、フラッシュクロマトグラフィー（４：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン、１−１０％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨを含有する）を含む）に付した。所望の物質を含む画分を集め、濃縮して無色ガラス状物を得た（０．２８４ｇ、５７％）。
【０２２６】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ  （ｐｐｍ）＝８．１１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４３−７．３９（ｍ，４Ｈ），７．２８−７．２６（ｍ，１Ｈ），６．１３−６．０５（ｍ，２Ｈ），５．６４（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６０−５．５６（ｍ，１Ｈ），５．５５−５．４２（ｍ，２Ｈ），５．３６−５．３４（ｍ，１Ｈ），４．９９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１９（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１９．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），２．６７−２．２２（ｍ，２０Ｈ），２．０５−１．８９（ｍ，４Ｈ），１．８２−１．７１（ｍ，６Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１１（ｓ，３Ｈ）．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；１３２５．７（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積８３％（１０％メチルカーボネートが混入していた（ｍ／ｚ＝１２１０．４））。
【０２２７】
ＴＤ１０を生成する脱保護：７−Ｏ−（Ｎ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル）
【０２２８】
【化８４】
0005542804.tif 000096
ＧＣＷ００００６−１０（０．２７６ｇ、０．２ｍｍｏｌ）をメタノールおよび酢酸（５０ｍＬ、１０％ＡｃＯＨ）に溶かし、この溶液を激しく撹拌し、亜鉛元素粉末（約０．１ｇ）を加えた。反応をＴＬＣで監視し、１時間以内に出発物質はすべて消費され、１種類の移動距離が小さなスポットに変換された（ＣＨ２Ｃｌ２中、１０％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨ含））。反応物をＭｅＯＨ（５０ｍＬ）で希釈し、濾紙で覆ったブフナー漏斗で濾過した。得られた溶液を、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで濃縮し、固いシロップ状物を得て、これをＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解し、あらかじめ平衡状態にしておいたシリカゲルカラム（３ｃｍ×１５ｃｍ、ＣＨ２Ｃｌ２中、２％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨ含））にロードし、徐々に極性を高めた溶媒（ＣＨ２Ｃｌ２中、２〜１０％ＭｅＯＨ（５％ＮＨ４ＯＨ含）、増分２％、１５０ｍＬ／増分）で溶出させた。ＴＬＣで決定したように、透明物質を含有する画分を集め、濃縮し、白色固体（０．０７６４、３９％）を得た。ＨＰＬＣ／ＭＳから、位置は決定されないが、親化合物にメチルカーボネート置換基を含む少量の混入物質（約１０％）が含まれていることが示されている。
【０２２９】
（ｍ／ｚ＝１０３５．３）１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ  （ｐｐｍ）＝８．１２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４３−７．３９（ｍ，４Ｈ），７．２８−７．２６（ｍ，１Ｈ），６．１３−６．０５（ｍ，２Ｈ），５．６７（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．６０−５．５６（ｍ，１Ｈ），５．３８（ｓ，１Ｈ），５．１４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），５．０１（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．９８（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），２．６７−２．２２（ｍ，１８Ｈ），２．１０−１．７１（ｍ，１０Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ），１．１２（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）  δ  （ｐｐｍ）＝２０９．３２，１７３．０４，１７２．３０，１７０．６１，１６６．２５，１５６．３６，１４５．９２，１３９．２７，１３８．２７，１３６．４０，１３３．２０，１２９．９８，１２９．７８，１２８．３１，１２８．１９，１２７．３８，１２６．８３，８３．７０，８０．４６，７９．３２，７７．７５，７６．１２，７４．８６，７４．２４，７４．０３，７１．６８，７１．００，５７．１６，５７．００，５６．１４，５４．１８，５２．１４，４６．０６，４４．５１，４２．９８，３７．９７，３５．４１，３２．９８，３１．３３，３１．１９，２７．３０，２５．３９，２１．６９，２１．４３，２１．２８，２０．１７．ＨＰＬＣ／ＭＳ（ｍ／ｚ）；９７７．１（ｍ＋Ｈ）ＵＶによる面積８５％。
【０２３０】
実施例３−水溶性プレドニゾン誘導体
Ｎ−メチル−ピペラジニル−ブタン酸エステル
リンカー合成
【０２３１】
【化８５】
0005542804.tif 000097
４−ブロモブタン酸エチル（５．７５ｇ、２９．５ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎｏ．１６７１１８）、１−メチルピペラジン（３．５５ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎｏ．１３０００１）、無水Ｋ２ＣＯ３（４．５ｇ、３２．５ｍｍｏｌ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｎｏ．Ｐ２０８）をアセトニトリル（ＭｅＣＮ、１５０ｍＬ）中で混合し、１８時間還流させた後、減圧下で濃縮した。次いで、有機層を分離し、水層をジクロロメタンで抽出した（ＤＣＭ、１５０ｍＬ×３回）。有機抽出物を合わせ、水（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮し、４−（４−メチルピペリジン−１−イル）ブタン酸エチル（６．０１ｇ、９６％）を黄色油状物として得た。
【０２３２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：４．０３（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１５  Ｈｚ），２．２９−２．４４（ｍ，７Ｈ），２．２１−２．２８（ｍ，５Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），１．６７−１．７５（ｍ，２Ｈ），１．１８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１４  Ｈｚ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１７４．４，６１．１，５８．５，５６．１，５４．０，４７．０，３３．２，２３．１，１５．２
ＥＳＩ−ＭＳ：２１５．１［Ｍ＋Ｈ］＋；２３７．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
【０２３３】
【化８６】
0005542804.tif 000098
４−４（メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸エチル（６．０１ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１５０ｍＬ）溶液に、ＮａＯＨ（１．２０ｇ、３０ｍｍｏｌ）の水（１５０ｍＬ）溶液を加えた。混合物を室温で１８時間撹拌した後、乾燥するまで濃縮し、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸ナトリウム（６．０６ｇ、定量的）を白色粉末として得た。
【０２３４】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）：  １８１．０，５８．２，５４．２，５２．４，４４．８，３５．７，２３．２
ＥＳＩ−ＭＳ：１８７．３［Ｍ＋Ｈ］＋；２０９．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
エステル化
【０２３５】
【化８７】
0005542804.tif 000099
４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸ナトリウム（１２８ｍｇ、０．６１５ｍｍｏｌ）、プレドニゾン（２００ｍｇ、０．５５９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（ＭｅＣＮ、１０ｍＬ）懸濁物に、２−クロロ−１−メチル−ピリジニウムヨージド（２３５ｍｇ、０．９２２ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎｏ．１９８００５）を加えた。得られた懸濁物を室温で１８時間撹拌した後、水（３０ｍＬ）を加えて反応を停止させた。次いで、生成物を酢酸エチルで抽出し（ＥｔＯＡｃ、２０ｍＬ×４回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し（２０ｍＬ×３回）、塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。さらに、シリカゲルカラム（溶媒：１％ＮＨ４ＯＨ、１０％ＭｅＯＨ、８９％ジクロロメタン）で精製し、誘導体化されたプレドニゾンの遊離塩基（１０８ｍｇ、３６％）を白色固体として得た。
【０２３６】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４０），６．０８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４０，１．９０），６．０６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．９０），５．０６（ＡＢｑ，２Ｈ，Ｊ＝９４．７８，１７．８１），２．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．３２），２．６５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１２．５７），２．５６−１．０６（ＣＭ，３２Ｈ），２．１６（ｓ，３Ｈ），１．３４（ｓ，３Ｈ），０．５７（ｓ，３Ｈ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２０９．１７，２０５．０５，１８６．６１，１７２．８６，１６７．４４，１５５．９３，１２７．２９，１２４．３１，８８．１８，６７．７８，６０．０５，５７．３０，５４．９２，５２．７３，５１．２８，４９．９７，４９．５６，４５．８９，４２．４７，３６．００，３４．４７，３３．６４，３２．２３，３１．６３，２３．２１，２１．９３，１８．６８，１５．３０
ＭＳ：５２７．４［Ｍ＋Ｈ］＋
Ｎ−メチル−ピペラジニル酢酸エステル
リンカー合成
【０２３７】
【化８８】
0005542804.tif 000100
２−ブロモ酢酸エチル（４．９３ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）、１−メチルピペラジン（３．５５ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎｏ．１３０００１）、Ｋ-２ＣＯ３（４．５ｇ、３２．５ｍｍｏｌ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｎｏ．Ｐ２０８）をＣＨ３ＣＮ（１５０ｍＬ）中で混合し、１８時間還流させた後、減圧下で濃縮した。次いで、有機層を分離し、水層をＤＣＭで抽出した（１５０ｍＬ×３回）。有機抽出物を合わせ、水（１５０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮し、４−（４−メチルピペリジン−１−イル）酢酸エチル（５．２６ｇ、９６％）を黄色油状物として得た。
【０２３８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：３．７６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ），２．７６（ｓ，３Ｈ），２．３０−１．９０（ｂｒ，４Ｈ），０．８５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１６９．５５，５９．９０，５８．９３，５４．４４，５３．２６，５２．４７，４５．５９，１３．８４
ＥＳＩ−ＭＳ：１８７［Ｍ＋Ｈ］＋
【０２３９】
【化８９】
0005542804.tif 000101
２−４（メチルピペラジン−１−イル）酢酸エチル（５．２６ｇ、２８．３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）溶液に、ＮａＯＨ（１．２０ｇ、３０ｍｍｏｌ）の水（１５０ｍＬ）溶液を加えた。混合物を室温で１８時間撹拌した後、乾燥するまで濃縮し、４−（４−メチルピペラジン−１−イル）酢酸ナトリウム（５．２４ｇ、定量的）を白色粉末として得た。
【０２４０】
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ４）：１６９．５５，５９．９０，５８．９３，５４．４４，５２．４７，４５．５９
ＥＳＩ−ＭＳ：１８７．３［Ｍ＋Ｈ］＋；２０９．２［Ｍ＋Ｎａ］＋
エステル化
【０２４１】
【化９０】
0005542804.tif 000102
２−（４−メチルピペラジン−１−イル）酢酸ナトリウム（１１１ｍｇ、０．６１５ｍｍｏｌ）、プレドニゾン（２００ｍｇ、０．５５９ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）懸濁物に、２−クロロ−１−メチル−ピリジニウムヨージド（２３５ｍｇ、０．９２２ｍｍｏｌ；Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｎｏ．１９８００５）を加えた。得られた懸濁物を室温で１８時間撹拌した後、水（３０ｍＬ）を加えて反応を停止させた。次いで、生成物をＥｔＯＡｃで抽出し（２０ｍＬ×４回）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し（２０ｍＬ×３回）、塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で濃縮した。さらに、シリカカラム（溶媒：１％ＮＨ４ＯＨ、１０％ＭｅＯＨ、８９％ＤＣＭ）で精製し、誘導体化されたプレドニゾン（１５４ｍｇ、３８％）を白色固体として得た。
【０２４２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：７．７１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．２８），６．１９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．２４，１．９６），６．０７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．９３），４．９３（ＡＢｑ，２Ｈ，Ｊ＝１２４．４５，１７．５６），３．３３（ｓ，１Ｈ），２．８９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１３．３６），２．８４−１．１７（ＣＭ，３２Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），１．４３（ｓ，３Ｈ），０．６６（ｓ，３Ｈ）
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：２０８．８８，２０４．５８，１８６．５８，１６９．８５，１６７．０６，１５５．６８，１２７．４９，１２４．５０，８８．３８，６７．９６，６０．２２，５９．０１，５４．７３，５３．４２，５２．７１，５１．４３，４９．６７，４９．５６，４６．００，４２．４５，３６．０６，３４．７９，３３．７３，３２．２５，２３．２６，１８．７５，１５．４５
ＭＳ：４４９．３［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例４−親油性プレドニゾン誘導体
内部リノレイルリンカー
１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−（ジメチルアミノ）プロパン−２−オール
３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（９８％、１．００ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）、イミダゾール（０．５７ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）の乾燥ジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液を、アルゴン下、０℃で１５分間撹拌した。この混合物に、固体のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（１．２６ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）を加え、得られた物質を０℃で２時間撹拌した。次いで、混合物をジクロロメタン２０ｍＬで希釈し、脱イオン水（１５ｍＬ）に注いだ。有機層を分離し、水層をジクロロメタン（２０ｍＬ）でさらに２回抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮し、未精製の１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−（ジメチルアミノ）プロパン−２−オールを粘性透明油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
【０２４３】
【化９１】
0005542804.tif 000103
１Ｈ  ＮＭＲ：３．７２−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．６３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．１９），２．３４−２．４６（ｍ，２Ｈ），２．３３（ｓ，６Ｈ），０．９１（２，９Ｈ），０．０８（ｓ，６Ｈ）
３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−アミン
未精製の１−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−３−（ジメチルアミノ）プロパン−２−オール（１．０ｇ、４．２９ｍｍｏｌ、１．０当量）のトルエン（１０ｍＬ）溶液を、アルゴン下、０℃でＮａＨ（６０％、０．１７ｇ、４．２９ｍｍｏｌ、１．０当量）のトルエン懸濁物（５ｍＬ）に注意深く滴下し、得られた物質を１５分間撹拌した。この撹拌した混合物に、リノレイルメタンスルホネート（１．４７ｇ、４．２９ｍｍｏｌ、１．０当量）のトルエン溶液（５ｍＬ）を滴下し、次いで、反応物を９０℃で１８時間撹拌した。次いで、混合物を室温まで冷却し、エタノール（１０ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止させた。次いで、混合物を濃縮し、残渣を脱イオン水（１５ｍＬ）に入れ、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で３回抽出した。有機抽出物を合わせ、脱イオン水（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（クロロホルム中、０〜５％ＭｅＯＨ）で精製し、３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−アミンを粘性透明油状物として１０９ｍｇ（収率５３％）得た。
【０２４４】
【化９２】
0005542804.tif 000104
１Ｈ  ＮＭＲ：５．２８−５．４２（ｍ，４Ｈ），３．４７−３．６２（ｍ，４Ｈ），３．３７−３．４２（ｍ，１Ｈ），２．７７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．９４），２．２８−２．４７（ｍ，２Ｈ），２．２５（ｓ，６Ｈ），２．０１−２．０９（ｍ，５Ｈ），１．５０−１．５８（ｍ，２Ｈ），１．３０  （ｂｒ，  １８Ｈ），０．０９（ｓ，９Ｈ），０．０６（ｓ，６Ｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ：１３０．２２，１３０．０１，１２７．９８，１２７．８８，７０．１６，６３．０７，３７．３５，３２．７９，３１．５２，２９．５９，２９．４９，２９．３９，２９．３４，２９．３２，２９．２３，２９．１５，２９．１１，２９．００，２７．１９，２５．７２，２５．６２，２５．４０，２２．５７，１４．０７．
３−（ジメチルアミノ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−オール
３−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−アミン（０．２ｇ、０．４２ｍｍｏｌ、１．０当量）の乾燥ＴＨＦ（１００μＬ）溶液に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中１．０Ｍ、０．５ｍＬ、０．５０ｍｍｏｌ、１．２当量）を一度に加え、混合物を室温で２時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１５ｍＬ）と飽和塩化アンモニウム水溶液（１０ｍＬ）とに分配した。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）でさらに２回抽出した。抽出物を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮し、未精製３−（ジメチルアミノ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−オールを粘性ベージュ色油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
【０２４５】
【化９３】
0005542804.tif 000105
１Ｈ  ＮＭＲ：５．２９−５．４３（ｍ，４Ｈ），３．７７−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．４２−３．５１（ｍ，３Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．９７），２．５４−２．５７（ｍ，２Ｈ），２．３０（ｓ，６Ｈ），２．０２−２．０９（ｍ，４Ｈ），１．５０−１．５７（ｍ，２Ｈ），１．３０（ｂｒ，１５Ｈ），０．８７−０．９２（ｍ，４Ｈ）．
４−（３−（ジメチルアミノ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロポキシ）−４−オキソブタン酸
３−（ジメチルアミノ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロパン−１−オール（２．０ｇ、５．４５ｍｍｏｌ、１．０当量）の乾燥ＴＨＦ（１１ｍＬ）溶液に、無水コハク酸（０．６０ｇ、５．９９ｍｍｏｌ、１．１当量）を一度に加え、得られた物質をアルゴン下で１８時間還流させた。混合物を濃縮し、次いで、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解し、脱イオン水（２０ｍＬ）に注いだ。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）でさらに２回抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮し、未精製４−（３−（ジメチルアミノ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロポキシ）−４−オキソブタン酸を粘性黄色油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
【０２４６】
【化９４】
0005542804.tif 000106
１Ｈ  ＮＭＲ：５．２９−５．４３（ｍ，４Ｈ），４．２８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．２５），３．９２−３．９８（ｍ，１Ｈ），３．８４（ｂｒ，１Ｈ），３．６０−３．６７（ｍ，１Ｈ），３．４３−３．５０（ｍ，１Ｈ），３．１１−３．１５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４５），２．７５−２．７９（ｍ，２Ｈ），２．６７（ｓ，６Ｈ），２．５３−２．６５（ｍ，５Ｈ），２．０１−２．０８（ｍ，４Ｈ），１．５３−１．５７（ｍ，２Ｈ），１．２９−１．３０（ｂｒ，１８Ｈ），０．８７−０．９１（ｍ，３Ｈ）．
１３Ｃ  ＮＭＲ：１７６．６３，１７２．５５，１３０．０９，１２９．９８，１２７．９１，１２７．８４，７３．９０，６９．９０，６７．８５，６２．５４，５９．０８，４４．１１，３１．４４，３０．５３，２９．９７，２９．９３，２９．５８，２９．４２，２９．３６，２９．２７，２９．２０，２７．１４，２７．１１，２６．０４，２５．５５，２２．５０，１４．０１．
外部リノレイルリンカー
１−（ジメチルアミノ）−４−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）ブタン−２−オール
３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（９８％、１．００ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、１．０当量））のトルエン（１０ｍＬ）溶液を、アルゴン下、０℃でＮａＨ（６０％、０．３４ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）のトルエン懸濁物（５ｍＬ）に注意深く滴下し、得られた物質を１５分間撹拌した。この撹拌した混合物に、リノレイルメタンスルホネート（２．８７ｇ、８．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）のトルエン溶液（５ｍＬ）を滴下し、次いで、反応物を９０℃で１８時間撹拌した。次いで、混合物を室温まで冷却し、エタノール（１０ｍＬ）をゆっくりと加えて反応を停止させた。混合物を濃縮し、残渣を脱イオン水（２０ｍＬ）に入れ、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で３回抽出した。有機抽出物を合わせ、脱イオン水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（クロロホルム中、０〜５％ＭｅＯＨ）で精製し、１−（ジメチルアミノ）−４−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）ブタン−２−オールを粘性の透明油状物として得た。
【０２４７】
【化９５】
0005542804.tif 000107
４−（１−（ジメチルアミノ）−４−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）ブタン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸
１−（ジメチルアミノ）−４−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）ブタン−２−オール（２．０ｇ、５．４５ｍｍｏｌ、１．０当量）の乾燥ＴＨＦ（１１ｍＬ）溶液に、無水コハク酸（０．６０ｇ、５．９９ｍｍｏｌ、１．１当量）を一度に加え、得られた物質をアルゴン下で１８時間還流させた。混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）と脱イオン水（２０ｍＬ）とに分配した。層を分離させ、水層をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）でさらに２回抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮し、未精製４−（１−（ジメチルアミノ）−４−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）ブタン−２−イルオキシ）−４−オキソブタン酸を粘性黄色油状物として得て、これをさらに精製することなく使用した。
【０２４８】
【化９６】
0005542804.tif 000108
内部リンカーを用いたプレドニゾンのエステル化
４−（３−（ジメチルアミノ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニルオキシ）プロポキシ）−４−オキソブタン酸の乾燥ジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）に、ＮＥｔ３（１００μＬ、０．７４ｍｍｏｌ、１．０当量）を滴下し、得られた物質をアルゴン下、室温で１５分間撹拌した。ＰｙＢＯＰ（０．４８ｇ、０．９３ｍｍｏｌ、１．２５当量）を一度に加え、得られた物質を１０分間撹拌した。この混合物にプレドニゾン（０．３２ｇ、０．８９ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、得られた物質を室温で１８時間撹拌し、次いで、濃縮し、粘性の黄色油状物を得た（純度９０％）。フラッシュカラムクロマトグラフィー（クロロホルム中、５〜１５％ＭｅＯＨ、次いでＥｔＯＡｃ中、０〜１５％ＭｅＯＨ）で精製し、所望の生成物を得た。
【０２４９】
【化９７】
0005542804.tif 000109
１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：７．６８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．２３），６．２０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１０．２３，Ｊ２＝１．８６），６．０７（ｓ，１Ｈ），５．２７−５．４２（ｍ，４Ｈ），４．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１７．７０，Ｊ２＝５．６１），４．０９−４．３６（ｍ，３Ｈ），３．５４−３．６９（ｍ，３Ｈ），３．３４（ｍ，１Ｈ），３．０７−３．２２（ｍ，１Ｈ），２．９４−２．９８（ｍ，１Ｈ），２．８８（ｓ，６Ｈ），２．７４−２．７８（ｍ，３Ｈ），２．６５−２．６８（ｍ，３Ｈ），２．３７−２．５０（ｍ，３Ｈ），２．２５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１２．２４，Ｊ１＝２．３１），２．００−２．０５（ｍ，８Ｈ），１．４２（ｓ，３Ｈ），１．３０（ｂｒ，１８Ｈ），０．８９（ｍ，３Ｈ），０．６４（ｓ，３Ｈ）．
ＭＳ：８０８．８［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２５０】
実施例５−エトポシド誘導体
４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸二塩酸塩（４、２０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ２（０．５ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌した。ＳＯＣｌ２を蒸発させ、さらに精製することなく、未精製の酸塩化物を、アルゴン雰囲気下、乾燥ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解した。この溶液を０℃まで冷却し、エトポシド（６、５０ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解し、滴下し、次いで、トリエチルアミン（１０μＬ）を加えた。反応をＴＬＣで監視しつつ、撹拌を２時間続けた。次いで、この溶液を減圧下で濃縮し、この未精製の生成物を水に入れ、酢酸エチルで抽出した（１０ｍＬ×３回）。有機抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この未精製の生成物をシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５〜１０％ＭｅＯＨの勾配）で精製し、エトポシド誘導体７の所望な遊離塩基３０ｍｇを白色固体として得た。
【０２５１】
【化９８】
0005542804.tif 000110
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：６．８３（ｓ，１Ｈ），６．５５（ｓ，１Ｈ），６．２７（ｓ，２Ｈ），５．９８−６．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ），４．９１−４．９０（ｄ，２Ｈ），４．７３−４．７８（ｑ，１Ｈ），４．６３−４．６７（ｔ，２Ｈ），４．４０−４．４６（ｔ，１Ｈ），４．１５−４．２６（ｍ，２Ｈ），３．７５−３．７８（ｔ，２Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），３．５５−３．６２（ｍ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．２５−３．４７（ｍ），２．８１−２．９３（ｍ），２．４４−２．６４（ｍ），２．３１（ｓ，３Ｈ），１．８７−１．９７（ｍ），１．３９−１．４０（ｄ，３Ｈ）．
ＥＳＩ−ＭＳ：７５７．５［Ｍ＋Ｈ］＋．
実施例６−タクロリムス誘導体
４−（４−メチルピペラジン−１−イル）ブタン酸塩酸塩（４、２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をＳＯＣｌ２（０．５ｍＬ）に溶解し、アルゴン雰囲気下、室温で３時間撹拌し、次いで、ＳＯＣｌ２を蒸発させ、さらに精製することなく、アルゴン雰囲気下、化合物５を乾燥ＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解した。この溶液を０℃まで冷却し、次いで、タクロリムス（８．８０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１ｍＬ）に溶解したものを加え、次いで、トリエチルアミン（１０μＬ）を加えた。撹拌を２時間続け、次いで、溶液を減圧下で濃縮した。この未精製の生成物を水に入れ、酢酸エチルで抽出した（１５ｍＬ×３回）。有機抽出物を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。この未精製の生成物をシリカゲル（２３０〜４００メッシュ）カラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２中、５〜１０％ＭｅＯＨの勾配）で精製し、タクロリムス誘導体９の所望の遊離塩基４５ｍｇを白色固体として得た。
【０２５２】
【化９９】
0005542804.tif 000111
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：５．６３（ｍ，１Ｈ），５．２０−５．３２（ｍ，２Ｈ），６．２７（ｓ，２Ｈ），４．９８−５．１０（ｍ），４．８０（ｄ，１Ｈ），４．６３−４．６３（ｄ，１Ｈ），４．４１−４．４６（ｄ，１Ｈ），４．２５（ｓ），３．８７−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．６７−３．７５（ｍ），３．５６−３．６０（ｍ），３．３０−３．４４（ｍ），２．９７−３．０６（ｂｒ  ｍ），２．３０−２．７５（ｂｒ  ｍ），０．８１−２．２８（広がって連続した多重線）（スペクトルが結合したもの）
ＥＳＩ−ＭＳ：９７３．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２５３】
実施例７−シクロスポリンおよびアザチオプリン誘導体
シクロスポリンおよびアザチオプリン誘導体（例えば、以下に示す誘導体）は、親薬物と酸塩化物との反応を含む、タクロリムスで記載した方法に本質的にしたがって調製されるであろう。アザチオプリンは、求電子剤を用い、Ｎ−９で選択的に反応することが十分に確立されている（Ｍｉｓｈｒａら、Ｉｎｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，Ｓｅｃ．Ｂ，２６Ｂ：８４７−５０（１９８７））。したがって、ある局面では、本明細書に提示するアザチオプリン誘導体は、Ｎ−９で誘導体化されるであろう。
【０２５４】
【化１００】
0005542804.tif 000112
実施例８−弱塩基性誘導体の溶解度
ドセタキセル誘導体の溶解度を、ＬＮに能動的に充填させるのに使用するｐＨ５の酢酸バッファー中で決定した。化合物を５０ｍｇ／ｍｌでエタノールに溶解した（但し、ＴＤ２は、２５ｍｇ／ｍｌで溶解した）。一定分量を１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５）で１０倍に希釈し、ｐＨを確認し、必要な場合、ｐＨ５に再び調節した。または、それぞれの化合物１０ｍｇをガラスバイアル内で秤量し、この化合物に１０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ５）２ｍＬを加え、次いで、懸濁物を１０分間超音波処理した。次いで、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＭＹ１００フィルター（ＭＷのカットオフ値１００，０００Ｄａ）を用いて析出物を除去し、濾液の薬物含有量をＵＰＬＣ−ＵＶで分析した。測定した溶解度は、平衡状態ではない条件下で決定した、動力学的溶解度（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）である。
【０２５５】
充填中の水溶性を上げるために、場合により、少ない（膜を透過しない）量のエタノールを用いてもよい。したがって、バッファーおよび１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含有するバッファーの両方で、溶解度データを作成した。ドセタキセル誘導体の水への溶解度（表２）は、顕著に異なっており、この値は、ドセタキセルの値の約２０〜５００倍大きい（Ｄｕら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１５：６３２３−３０（２００７））。溶解度は、Ｎ−メチルピペラジノ＞ピペラジノ＞＞モルホリノの順序で低下していた。モルホリノ誘導体の溶解度は、ピペラジノ誘導体およびピペリジノ誘導体の溶解度よりもかなり低かった。
【０２５６】
【表２】
0005542804.tif 000113
ＴＤ１のアミノ基のｐＫａは、酸−塩基滴定によって７．７であると決定され、この値は、ＬＮに充填させるｐＨ勾配として十分に適している。予想どおり、ＴＤ１塩酸塩の水への溶解度は、ｐＨを上げるにつれて低下した（ｐＨ４で２．８ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５で１．７ｍｇ／ｍｌ）。
【０２５７】
実施例９−弱塩基誘導体の安定性
異なるｐＨ値および温度の水溶液中で、および生物学的媒体（マウス血漿）中で、ドセタキセル誘導体の化学安定性を決定した。ドセタキセル誘導体をアセトニトリルと混合したものを一定分量に分け、テフロン（登録商標）に覆われたふたで密閉した１ｍＬのガラス製ＨＰＬＣサンプルバイアル中、ｐＨ４．０および７．５でクエン酸緩衝液／ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ／１０ｍＭ）溶液と混合するか、または、マウス血漿と混合した（最終容積０．２５ｍＬ、ドセタキセル誘導体の最終濃度５０μｇ／ｍｌ）。３７℃でインキュベーションして１時間後、４時間後、２４時間後に、ＵＰＬＣ−ＵＶによって薬物安定性を決定した。所定の時間点で、このサンプルに３倍過剰のメタノール／０．１％ＴＦＡを加えた。クエン酸／ＨＥＰＥＳで緩衝化したサンプルを、上述のようにＵＨＰＬＣで分析した。血漿サンプルの場合、メタノール／０．１％ＴＦＡを加えてタンパク質を沈殿させ、１４，０００×ｇで遠心分離処理することによってペレット状にし、薬物誘導体について上澄みを分析した。ヘパリン化したマウス血漿を、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーを用いて５０％になるまで希釈し、実験の間、ｐＨを一定に保った。
【０２５８】
ＬＮ中の配合物に適するには、誘導体は、ｐＨ４で安定でなければならない（ＬＮキャリア内部のｐＨ）。それに加え、プロドラッグ誘導体は、ＬＮから放出されると、生理学的条件下（例えば、、ｐＨ７．４、および／または内因性酵素存在下）で、容易に活性な薬物を生成すべきである。表３は、ｐＨ４、ｐＨ７．４で、およびマウス血漿中、３７℃で２４時間インキュベーションした後の、ドセタキセル誘導体の加水分解安定性を示す。Ｃ−２’アミノエステルドセタキセル誘導体の中で、ＴＤ１〜４、ＴＤ７、ＴＤ９は、ｐＨ４で十分な安定性を有していた。ＴＤ４は、水への溶解度がきわめて低く、血漿中でインキュベーションしても、ＴＤ９になんら影響を与えないようであった。ＬＮに充填させるのに、ＴＤ１〜３およびＴＤ７が選ばれ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物放出について、このようなＬＮを試験した。
【０２５９】
結果（表３および図１）から、この誘導体が、ＬＮ内部でみられる低いｐＨ（ｐＨ４付近）で安定であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＮキャリアから放出された後、迅速に活性薬物へと変換することができることが示された。活性薬物への変換は、ｐＨに依存し（高いｐＨほど速い）、血漿のような生体液に存在する加水分解酵素存在下では顕著に促進される。
【０２６０】
【表３】
0005542804.tif 000114
実施例１０−保持効率
ドセタキセルのピペラジニルエステル（ＴＤ１〜ＴＤ３）誘導体、ドセタキセルのピペリジンエステル（ＴＤ７）誘導体、ドセタキセルのＣ−７アミノエステル（ＴＤ１０）誘導体、プレドニゾンのＮ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル誘導体および酢酸エステル誘導体、エトポシドのＮ−メチル−ピペラジニルブタン酸エステル誘導体を、ＬＮに充填させる効率について試験した。
【０２６１】
ＬＮの調製
Ｂｏｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．；５４：２８３０−２８３３（１９９４）に記載されているエタノール手順に基づいて、ＬＮを調製した。簡単に言うと、脂質（リン脂質／Ｃｈｏｌ、モル比５５／４５）をエタノールに溶解し、６０℃で、３５０ｍＭ硫酸アンモニウムを含有する水溶液にゆっくりと加え、微量の脂質マーカー［３Ｈ］ＣＨＥ（０．１５μＣｉ／全脂質ｍｇ）を、エタノール中の他の脂質と一緒に溶解し、放出試験のためのＬＮを調製した。最終的なエタノール濃度は、１５％（ｖ／ｖ）であった。Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ；８１２：５５−６５（１９８５）に記載されているように、得られたＬＮ分散物を、６０℃で、加熱したｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ型押出成形機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を用い、２枚の重ね合わせた１００ｎｍポリカーボネートフィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を通して押出成形した。残留エタノールおよび外側の硫酸アンモニウムを、室温で、接線流による透析濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって除去し、Ｍｉｄｇｅｅ（商標）  ＨＯＯＰ（商標）限外濾過カートリッジ（ＭＷのカットオフ値１０００００；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、３００ｍＭショ糖溶液と置き換えた。準弾性光散乱法（ＱＥＬＳ）を用い、ＮＩＣＯＭＰ３７０型サブミクロン粒子サイジング機（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を用い、押出成形したＬＮのサイズ分布を評価した（目的サイズ１００±２０ｎｍ）。
【０２６２】
（薬物の充填）
ドセタキセル誘導体、エトポシド誘導体、プレドニゾン誘導体を、Ｈａｒａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ；１１５１：２０１−１５（１９９３）に記載されている硫酸アンモニウムによる遠隔充填方法を用い、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）ＬＮに充填させた。簡単に言うと、ＴＤ１を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムで緩衝化した３００ｍＭショ糖（ｐＨ５）で２ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、エトポシド誘導体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムで緩衝化した３００ｍＭショ糖（ｐＨ５）で２．５ｍｇ／ｍＬになるように溶解し、プレドニゾン誘導体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．３）で７ｍｇ／ｍＬになるように溶解した。この溶解した誘導体を、あらかじめ加熱しておいた（６０℃）ＬＮ懸濁物に加え、混合物を撹拌しつつ、６０℃で所定時間（典型的には３０分間）、インキュベーションした。ＬＮ配合物を、典型的には、脂質濃度５〜１０ｍｇ／ｍｌ、薬物−対−脂質の重量比０．１〜０．４ｍｇ／ｍｇで調製する。封入されていないドセタキセル誘導体を、Ｍｉｄｇｅｅ（商標）  ＨＯＯＰ（商標）限外濾過カートリッジ（ＭＷのカットオフ値１０００００；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはサイズ排除クロマトグラフィーを用い、接線流による透析濾過によって除去した。外側の溶液を、緩衝化していない生理食塩水溶液と交換し、必要な場合、サンプルを濃縮した。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験用の、薬物を保持させたＬＮ配合物を、０．２μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を用いた濾過によって滅菌し、次いで、４℃で保存した。また、ＴＤ−１を、ＤＰＰＣ／ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）およびＤＭＰＣ／ｃｈｏｌ（５５：４５ｍｏｌ％）で構成されるＬＮに充填させた。
【０２６３】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０スピンカラムでサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、外側の（封入されていない）プロドラッグを、ＬＮに封入されているプロドラッグから分離する前と後で、プロドラッグ濃度および脂質濃度を定量し、それぞれのプロドラッグ／脂質の比率を比較することによって、充填効率を決定した。ＦｉｓｋｅおよびＳｕｂｂａｒｏｗ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；６６：３７５−３７９（１９２５）のリンアッセイによって、リン脂質の濃度を決定し、酵素比色アッセイ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）によってコレステロール濃度を定量した。本明細書に記載するように、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）によって誘導体の濃度を決定した。充填させている間の、プロドラッグから親薬物への変換も、同様に監視した。結果を、図２（ドセタキセル誘導体）、図３（プレドニゾン誘導体）、図４（エトポシド誘導体）に示す。
【０２６４】
実施例１１−ＬＮ配合物の安定性
異なる脂質組成（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、それぞれ、５５／４５ｍｏｌ％、誘導体／脂質の比率は０．２ｗｔ／ｗｔ）を有するＬＮ−誘導体配合物を、０．９％生理食塩水中、誘導体濃度３ｍｇ／ｍｌで調製した。このＬＮ配合物を滅菌濾過し、５ｍＬのガラス製バイアルに滅菌状態で充填し、このバイアルにストッパーを取り付け、ふたをして、７℃で保存した。種々の時間点（最初の１ヶ月は週に１回、その後は月に１回）で、４ヶ月間にわたって、ＬＮの大きさ（ＱＥＬＳ）、誘導体の保持率（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラム法）および誘導体の完全性について、配合物を分析した。結果を図５Ａ〜Ｃにまとめている。３種類すべての配合物は、きわめて安定であり、プロドラッグの放出は検出されず（図５Ｂ）、ＬＮ配合物の平均サイズおよびサイズ分布は、変化しておらず（図５Ｃ）、プロドラッグの加水分解は、４％未満であった（３．５〜３．８％、図５Ａ）。他の分解生成物も観察されなかった。このデータは、ＬＮ配合物を開発する実現可能性を示している。配合物の凍結は、別の代替法である。
【０２６５】
硫酸アンモニウムの勾配による技術を用いて調製したＬＮは、ベシクル内のｐＨが約４．０である（Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｐｕｒｅｊら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４１６：１−１０（１９９９））。この誘導体が、ｐＨ７．４と比較して、ｐＨ４ではかなり安定性が増すという観点から（上の表２を参照）、ＬＮに封入することによって、水溶液中の誘導体と比較して、捕捉された誘導体の加水分解安定性が大きく向上する。例えば、ｐＨ４で、ＴＤ１は、加水分解半減期が約４９日（つまり７週間）であった。これとは対照的に、封入されたＴＤ１は、４ヶ月間（１６週間）で、ドセタキセルに変換されたのは３％未満であった。Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ顕微鏡法から、このプロドラッグが、ＬＮの内側に析出しており、その結果、顕著に高い安定性を有することがわかった。
【０２６６】
ＴＤ１（タキソテール（商標）と同じ様式で、ＬＮ中に配合されたもの）およびタキソテール（商標）が、血液循環から除去される速度を、Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに配合物を静脈投与した後に観察した。マウスに、等モル量の投薬量（２０ｍｇ／ｋｇ  ドセタキセル）の配合物を、１回、静脈にボーラス注射し、ＴＤ１およびドセタキセルの血漿濃度をＵＨＰＬＣ−ＭＳで決定した。結果を図５に示す。ドセタキセル／タキソテール（商標）およびその誘導体は、両方とも、血漿循環での半減期が数分間であり、血漿濃度は２時間で検出限界未満になった（図６）。これとは対照的に、この誘導体のＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物は、循環での半減期が、数分から１０〜１２時間に延び、血漿濃度は２桁高くなった（図６）。１６時間の時点で、注射された投薬量の約２４％が循環内にとどまっていた。ＬＮに配合された誘導体の排出は、主に、ＬＮキャリアの排出速度によって決定づけられると考えられる。このデータは、この誘導体のＬＮ配合物が、循環内で安定であり、治療標的に有効に薬物を蓄積させるのに好ましい循環での半減期を達成することができることを示す。
【０２６７】
実施例１２−ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、ＬＮからの薬物誘導体の放出
ＬＮに基づく薬物の活性は、キャリアから薬物が放出される速度に大きく依存する。例えば、薬物がＬＮキャリアから迅速に漏れ出してしまう場合、ＬＮが疾患部位に到達しても、薬物をほとんど運ばないか、まったく運ばず、遊離薬物と比較して、治療上の利点はごくわずかであろう。一方、薬物が、ＬＮから放出されるのが遅すぎる場合、疾患部位に到達する薬物の量は、決して治療濃度に達することはないであろう。薬物の残留／放出の主な決定因子は、ＬＮキャリアの脂質組成、ベシクル内での薬物の形態である。不飽和脂質、または短いアシル鎖を有する脂質を用いると、薬物の放出が速くなる。ＬＮ内に薬物を析出させることにより、薬物の残留率を高くすることができる。薬物誘導体がＬＮ内に析出するか否かは、ｃｒｙｏ−ＴＥＭおよび／または当該技術で知られている他の方法を用い、ＬＮ配合物を観察することによって決定することができる。
【０２６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＬＮからのドセタキセル誘導体の放出を、マウス血漿中で評価した。初期のプロドラッグ−対−脂質の比率と、異なる時間点でみられるプロドラッグ−対−脂質の比率を比較することによって、薬物残留率を決定した。ドセタキセル誘導体を、微量の放射能標識された脂質マーカー３Ｈ−コレステリルヘキサデシルエーテル（３Ｈ−ＣＨＥ）を含む、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮ、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ（５５：４５ｍｏｌ％）に封入した。ＬＮ配合物を、最終的な脂質濃度０．７５ｍｇ／ｍｌでマウス血漿と混合した後、３７℃でインキュベーションした。種々の時間点で、一定分量を採取し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０スピンカラムを動かし、封入されていないプロドラッグを除去した（Ｐｉｃｋ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２１２：１８６−１９４（１９８１））。溶出物中の誘導体濃度および脂質濃度を、それぞれＵＨＰＬＣおよび液体シンチレーション計測によって決定した。
【０２６９】
図７Ａは、ＴＤ１がＬＮ内に残留する率を示し、この残留率は、所定時間点で、サンプル中に見られる誘導体／脂質（またはプロドラッグ／脂質）の比率を、初期の薬物−対−脂質の比率で割ったものであると定義される。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮも、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮも、一連の１６時間の実験にわたって、まったく放出しないか、ほとんど放出しないことが示されている。ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮは、注射１６時間後に、約６時間の半減期でプロドラッグが放出され、捕捉されたプロドラッグの１６％が残っていた。０．１ｍｇ／ｍｇおよび０．２ｍｇ／ｍｇで充填させたＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物の残留プロフィールの比較から、薬物の残留率は、プロドラッグ−対−脂質の比率に依存しないことが示されている。マウス血漿で行ったｉｎ  ｖｉｔｒｏ放出試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験とよく一致していた（図７Ｂ）。ＤＳＰＣ  ＬＮおよびＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮと比較して、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮで放出の増加がみられることは、最も短いアシル鎖（Ｃ１４）から長い鎖の脂質を有するＤＭＰＣにおける、膜透過性の低下と一致している。図７Ｃは、同じプロドラッグ−対−脂質の比率で、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌに配合された他のドセタキセル誘導体（ＴＤ２〜３およびＴＤ７）と比較して、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮ中のＴＤ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ残留率を示す。すべての誘導体は、効果的に残留していた。ＴＤ７は、ＴＤ１と同じ速度で放出され、一方、ＴＤ２およびＴＤ３は、わずかに速い速度で放出された（放出率は、１００−残留率であると定義される）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータは、弱塩基誘導体が、ＬＮ内に有効に残留し、ＬＮキャリアの脂質組成を変えることによって、放出速度を調節することができることを示している。
【０２７０】
実施例１３−薬物動態およびｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物放出
ＬＮに封入されたドセタキセル誘導体の薬物動態（ＰＫ）を、タキソテール（商標）、市販のドセタキセル配合物、タキソテール（商標）と同様の様式で配合された誘導体のＰＫと比較した。タキソテール（商標）および同様に配合された誘導体は、薬物を溶解させるために、エタノール／ポリソルベート８０／生理学的食塩水溶液を用い、タキソテール（商標）に関する処方箋情報で記載されているように配合した（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｕ．Ｓ．）。ドセタキセル誘導体を、硫酸アンモニウムによる充填技術を用い、薬物−対−脂質の比率０．２ｗｔ／ｗｔで、ＤＳＰＣ／ｃｈｏｌ  ＬＮ、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ（５５：４５ｍｏｌ％）に封入した。脂質要素は、微量（０．１５μＣｉ／脂質ｍｇ）の脂質マーカー［３Ｈ］ＣＨＥを含んでおり、これにより、プロドラッグおよびＬＮキャリアの両方が、循環から排出されるのを監視することができる。
【０２７１】
ＰＫ試験およびｉｎ  ｖｉｖｏ放出試験は、４つの時間点（１時間、４時間、８時間、１６時間）に基づいており、各時間点あたり、マウス４匹に基づいていた。すべての配合物を、ドセタキセル（またはドセタキセルに等価）の投薬量２０ｍｇ／ｋｇで、被検体の体重に基づく容積（１０ｍＬ／ｋｇ）で、尾の側面の静脈に静脈投与した。種々の時間に、マウスをケタミン／キシラジンで麻酔し、心穿刺によって血液を集め、ＥＤＴＡマイクロタイター管に入れた。血液を採取したら、すぐに動物をと殺した。１，０００ｇで１０分間遠心分離処理することによって、全血から血漿を分離した。血漿タンパク質は、０．１％ＴＦＡで酸性にした１５０μｌの氷冷したメタノールを血漿５０μｌに加えることによって沈殿させた。このメタノール溶液を、４℃、１５，０００×ｇで３０分間遠心分離処理し、タンパク質をペレット状にし、ドセタキセルおよび薬物誘導体について、上澄みをＵＨＰＬＣによって分析した。ＬＮ配合物の場合、血漿２５〜５０μｌをシンチレーション液（ＰｉｃｏＦｌｕｏｒ  ４０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に加え、シンチレーション計測によって脂質の濃度を分析した（［３Ｈ］−ＣＨＥ放射能活性）。血漿サンプル中にみられるプロドラッグ／脂質の比率を、注射したＬＮ配合物の比率を１００％として割ることによって、ＬＮ内に残ったプロドラッグの割合（薬物残留率）を算出した。結果を図７Ｂに示す。遊離ドセタキセルおよびドセタキセル誘導体は、ＬＮに封入された形態よりもかなり速く排出されるため、血漿サンプルから回収したプロドラッグ／脂質の比率は、ＬＮに封入されたプロドラッグのうち、残っている量の直接的な指標であると考えることができる。
【０２７２】
実施例１４−ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗癌活性
誘導体が、活性薬物を生成する（生体変換）能力を、親化合物（ドセタキセル）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗癌活性と比較して、ＴＤ１の抗癌活性を測定することによって、さらに観察した。卵巣癌細胞株ＥＳ−２、前立腺癌細胞株ＰＣ３、乳癌細胞株ＭＤＡ４３５／ＬＣＣ６を含む３つのヒト癌細胞株について、抗癌活性を評価した（ＢＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．、１１：４８−５０（１９９３）；Ｎａｋａｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０４：２０５−２０８（１９９７））。薬物に７２時間暴露した後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅアッセイを用い、細胞毒性を決定した。簡単に説明すると、種々の量のＴＤ１または親薬物（ＤＭＳＯに溶解）存在下、細胞を９６ウェルプレート中、３７℃で７２時間インキュベーションし、インキュベーションが終了したら、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ溶液をすべてのウェルに加えた（２０μｌ／ウェル、培養容積の１０％）。プレートをインキュベーターに４時間戻し、λｅｘ＝５３０ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍでサンプルの蛍光を決定した。生存率を以下の式にしたがって算出した：細胞生存率（％）＝（Ｆｐｌｕｓ  ｄｒｕｇ−Ｆｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）／（Ｆｍｉｎｕｓ  ｄｒｕｇ−Ｆｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）×１００、式中、Ｆｐｌｕｓ  ｄｒｕｇは、薬物存在下での蛍光の読みであり、Ｆｍｉｎｕｓ  ｄｒｕｇは、薬物が存在しない状態の細胞コントロールであり、Ｆｂａｃｋｇｒｏｕｎｄは、バックグラウンド蛍光である（培地のみ）。Ｓ字型曲線を濃度−生存率プロットにフィッティングさせることによってＩＣ５０値（ｎＭ）を算出し、これを表４に示す。ＴＤ１は、ドセタキセルと同様に活性であり、このことは、このプロドラッグが、活性化合物へと容易に変換されたことを示している。
【０２７３】
【表４】
0005542804.tif 000115
実施例１５−ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗癌活性
ＬＮ−ドセタキセル誘導体配合物の抗癌効能を、ヒト乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＬＣＣ６）の皮下異種移植モデルに１回ボーラス注射した後、評価した。マウスＭＤＡ−ＭＢ−４３５／ＬＣＣ６細胞を、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２環境で培養した。雌のＲＡＧ２−Ｍマウスに５×１０６（５０μＬ）の細胞を、右の後ろ側の脇に皮下接種した。腫瘍の大きさが１００〜１５０ｍｍ３に到達したら、動物を無作為にグループ分けし（１グループあたり６匹の動物）、タキソテール（商標）を投薬量２５ｍｇ／ｋｇ、またはＴＤ１のＬＮ配合物（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ、５５：４５ｍｏｌ％、プロドラッグ／脂質の重量比０．２ｗｔ／ｗｔ）を３種類の異なる投薬量（３１．２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１１０ｍｇ／ｋｇ、ドセタキセル２５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、８８ｍｇ／ｋｇに対応する）で、１回静脈ボーラス注射した。腫瘍の成長および動物の体重を３日ごとに測定した。腫瘍の成長は、デジタルカリパスで腫瘍の寸法を測定することによって監視し、腫瘍の容積は、長さ×（幅２）÷２の式にしたがって算出し、長さ（ｍｍ）は、腫瘍の長いほうの軸である。腫瘍が最大で７００ｍｍ３まで到達したら動物をと殺し、腫瘍に潰瘍を生じた動物はと殺した。
【０２７４】
腫瘍成長阻害（最適な％Ｔ／Ｃ）；腫瘍成長の遅れ（Ｔ−Ｃ）；治療された腫瘍と、コントロール腫瘍とで、大きさが２倍になるまでにかかる時間の差；ＮＣＩスコアを含む、抗癌活性の確立されたパラメーターを比較することによって、治療の有効性を評価した（Ｐｌｏｗｍａｎ  Ｊ、Ｄｙｋｅｓ  ＤＪ、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｈｅａｄ  Ｍ、Ｓｉｍｐｓｏｎ−Ｈｅｒｒｅｎ  Ｌ、Ａｌｌｅｙ  ＭＣ．１９９７．Ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ＮＣＩ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｎ：Ｔｅｉｃｈｅｒ  ＢＡ  ｅｄｉｔｏｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｇｕｉｄｅ：  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ，ａｎｄ  ａｐｐｒｏｖａｌ．Ｔｏｔｏｗａ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ｐｐ１０１−１２５）。これに加えて、任意の薬物に関連する死（最後の投薬から１５日以内で、腫瘍による負荷が低い）、最大体重減少（グループの平均）が報告されている。％Ｔ／Ｃ値およびＮＣＩスコアは、以下のように算出した。各治療群（Ｔ）およびコントロール群（Ｃ）において、腫瘍について、毎日、特定の観察日の腫瘍容積の中央値から、１回目の処置の日の腫瘍容積の中央値を引くことによって測定し、腫瘍容積の変化を算出した。得られた値を用い、％Ｔ／Ｃ＝（ΔＴ／ΔＣ）×１００にしたがって、Ｔ／Ｃ率を算出した。最適な（最少）値を用い、抗腫瘍活性を定量した。ＮＣＩスコア０は、最適％Ｔ／Ｃ＞４２に割り当てられ、その治療が有効ではないことを意味する。スコア１は、最適％Ｔ／Ｃ値１〜４２に割り当てられ、腫瘍の成長が阻害されていることを示す（Ｃａｐｄｅｖｉｌｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、１：４９３−５０２（２００２））。
【０２７５】
ＬＮキャリアの脂質組成が、封入されたＴＤ１の有効性に及ぼす影響を図８Ａに示している。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物（ＴＤ１−対−脂質の比率０．２ｗｔ／ｗｔ）を、ドセタキセル４０ｍｇ／ｋｇに等価な投薬量で投与した。ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ配合物は、腫瘍の成長を最も効果的に阻害し、ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ、ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ（最も活性が低い）配合物と続いた。抗腫瘍効能は、放出速度と大きく相関しており、最も遅い放出速度を示す配合物が、最も活性である。
【０２７６】
ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ配合物（ＴＤ１−対−脂質の比率０．２ｗｔ／ｗｔ）の治療活性を、２５ｍｇ／ｋｇ  タキソテール（商標）／ドセタキセルと比較し、３種類の異なる投薬量（ドセタキセル２５、４０、８８ｍｇ／ｋｇ）で決定した。等モル量の投薬量（２５ｍｇ／ｋｇ  ドセタキセル）のタキソテール（商標）は、ＬＮ配合物よりもわずかに有効であった。しかし、ＬＮ配合物は、タキソテール（商標）のＭＴＤよりもずっと高い投薬量で投与することができる。これらの投薬量では、ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ＬＮ配合物は、顕著に有効性が高かった（図８Ｂ）。最も顕著な腫瘍成長の抑制は、８８ｍｇ／ｋｇ  ドセタキセルで観察され、最適％Ｔ／Ｃ値は５％であり、腫瘍成長の遅れ（Ｔ−Ｃ）は、タキソテール（商標）では９日であったのに対し、２９日であった（表５）。この結果は、ＬＮ配合物が、タキソテール（商標）よりもずっと潜在的に有効であることを示す。
【０２７７】
【表５】
0005542804.tif 000116
実施例１６−忍容性試験
忍容性試験は、有効性試験で使用する最大耐量（ＭＴＤ）および投薬量範囲を確立することを目的としていた（有効性試験は、１回の静脈注射によるものであった）。１回の投薬によるＭＴＤ試験は、ＬＮに封入されたＴＤ１、ドセタキセルと同様の様式でタキソテール（商標）に配合されたＴＤ１、タキソテール（商標）を用い、免疫力を低下させたＳＣＩＤ／Ｒａｇ２−Ｍマウス（有効性試験でも用いた）で行った。この試験は、１回の投薬量を投与し、マウス３匹／群によるものであり、誘導体およびタキソテールについて３種類の投薬量、ＬＮ配合物（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ５５：４５ｍｏｌ％、プロドラッグ／脂質の重量比０．２ｍｇ／ｍｇ）について５種類の投薬量で、用量漸増戦略によるものである。すべての配合物を、容積２００μｌ／マウス２０ｇで、尾の側面の静脈に静脈投与した。
【０２７８】
薬物を投与してから１４日間、毒性の徴候についてマウスを毎日監視した。体重変化および行動パラメーターの変化によって、忍容性を評価した。ＭＴＤは、体重が約１５％減少するが、死に至らない投薬量であると定義される。個々のマウスの体重は、試験期間中、２日ごとに測定した。体重減少が、忍容性の良好な予測材料とならない場合、毒性のために、動物を殺す必要がなくなる投薬量を使用した。
【０２７９】
結果を表６にまとめている。タキソテール（商標）の１回の投薬によるＭＴＤは、２９ｍｇ／ｋｇであり、一方、ＴＤ１のＭＴＤは、１６ｍｇ／ｋｇであった（ドセタキセル等価物のＭＴＤは、２０ｍｇ／ｋｇ  プロドラッグに対応する）。ＴＤ１は、ドセタキセル２０ｍｇ／ｋｇと等価の投薬量で、急性毒性（致死）を示した。急性毒性は、注射後に薬物が蓄積することと関係があると考えられる。これとは対照的に、ＬＮに封入されたＴＤ１（ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ  ５５：４５ｍｏｌ％  ＬＮ、プロドラッグ／脂質の重量比０．２ｍｇ／ｍｇ）は、なんら毒性の徴候を示すことなく、ドセタキセル８８ｍｇ／ｋｇと等価の投薬量まで高くなっても、十分に忍容性であった（顕著な体重の変化や、行動パラメーターの変化がみられなかった）（表６）。ＬＮ配合物のＭＴＤは、タキソテール（商標）のＭＴＤ（２９ｍｇ／ｋｇ）よりも少なくとも３倍大きく、このことは、忍容性がかなり高く（毒性がほとんどなく）、したがって、より高く、効果的な投薬量で投与することができることを示している。ビヒクル（ポリソルベート８０／生理学的食塩水）単独では、有害な影響はみられなかった。
【０２８０】
【表６】
0005542804.tif 000117
本発明をこのように記載してきたが、これらを多くの様式で変更してもよいことは明らかであろう。このような変更は、本発明の精神および範囲から逸脱するとはみなされず、当業者に明らかなこのようなすべての改変は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
0005542804.tif 000125
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005542804.tif 000131
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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