(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１２ヶ月の間２℃から８℃の間の温度で安定な二つの抗狂犬病モノクローナル抗体の製剤上の調剤物であって、
（ｉ）配列番号１の重鎖および配列番号２の軽鎖を含む抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体ＣＲ５７、またはそれと配列で少なくとも９５％同一であり、ＣＲ５７により認識される標的への結合についてＣＲ５７と競合すること、および狂犬病ウイルス中和活性を有することが可能である抗体と、
（ｉｉ）配列番号３の重鎖および配列番号４の軽鎖を含む抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体ＣＲ４０９８、またはそれと配列で少なくとも９５％同一であり、ＣＲ４０９８により認識される標的への結合についてＣＲ４０９８と競合すること、および狂犬病ウイルス中和活性を有することが可能である抗体と
を含み、
調剤物は、１０ｍＭの濃度のクエン酸塩緩衝剤、１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、および０．０１から０．０３％ｗ／ｖまでの量のポリソルベート８０を含む、製剤上の調剤物。
【請求項２】
ｐＨは５．５から６．５までに及ぶ、請求項１に記載の調剤物。
【請求項３】
調剤物の重量オスモル濃度は、２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから３５０のｍＯｓｍ／ｋｇまでに及ぶ、請求項１または２に記載の調剤物。
【請求項４】
二つの抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体はそれぞれ０．１ｍｇ／ｍＬから２．０ｍｇ／ｍＬまでの量で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の調剤物。
【請求項５】
調剤物は、２５０ＩＵ／ｍＬから１５００ＩＵ／ｍＬまでに及ぶ狂犬病ウイルス中和有効性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の調剤物。
【請求項６】
二つの抗体の比率は、５：１および１：５の間である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調剤物。
【請求項７】
調剤物は滅菌されたもの（無菌）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調剤物。
【請求項８】
調剤物はエンドトキシンを含まない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の調剤物。
【請求項９】
調剤物は４０±２℃の温度および７５±５％の相対湿度で２週間貯蔵後にＨＰＳＥＣで求めて少なくとも９５％の抗体モノマーの純度を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調剤物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の調剤物の有効量を、対象体への剤形の投与を介する対象体の曝露後の予防の処置のために含む、製剤上の単位剤形。
【請求項１１】
一つの調剤物での二つの抗狂犬病モノクローナル抗体の貯蔵を改善するための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の製剤上の調剤物において抗体を調剤することを含む、方法。
【請求項１２】
調剤物は、２℃から４０℃までの温度で貯蔵される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体の副産物形成の量を減ずる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
抗体の５％またはそれ未満しか、２℃から８℃までの温度での貯蔵の１２ヶ月間以内にＨＰＳＥＣで測定されるような凝集体を形成しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１の重鎖および配列番号２の軽鎖を含む抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体ＣＲ５７、またはそれと配列で少なくとも９５％同一であり、ＣＲ５７により認識される標的への結合についてＣＲ５７と競合すること、および狂犬病ウイルス中和活性を有することが可能である抗体の製剤上の調剤物であって、調剤物は２℃から８℃までの間の温度および−６０℃および−８０℃の間の温度で少なくとも１８ヶ月の間安定であり、調剤物は、１０ｍＭの濃度のクエン酸塩緩衝剤、１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、および０．０１から０．０３％ｗ／ｖまでの量のポリソルベート８０を含む、調剤物。
【請求項１６】
配列番号３の重鎖および配列番号４の軽鎖を含む抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体ＣＲ４０９８、またはそれと配列で少なくとも９５％同一であり、ＣＲ４０９８により認識される標的への結合についてＣＲ４０９８と競合すること、および狂犬病ウイルス中和活性を有することが可能である抗体の製剤上の調剤物であって、調剤物は２℃から８℃までの間の温度および−６０℃および−８０℃の間の温度で少なくとも１８ヶ月の間安定であり、調剤物は、１０ｍＭの濃度のクエン酸塩緩衝剤、１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム、および０．０１から０．０３％ｗ／ｖまでの量のポリソルベート８０を含む、調剤物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬剤に関する。特に、本発明は特定の抗狂犬病抗体の安定した製剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
過去１０年間で、バイオテクノロジ−の進歩は多数の異なった疾患および障害の診断、予防及び治療に用いる多様な抗体を識別、開発及び生産することを可能にした。かかる抗体の例は、国際公開ＷＯ２００５／１１８６４４号に開示された抗狂犬病ウイルス抗体である。かかる２つの抗体CR５７およびCR４０９８を有する抗体カクテルが、特に好都合で、狂犬病発病後の予防に用いることができる。国際公開ＷＯ２００５／１１８６４４号では、これら抗体がPBSで調製、使用された。
【０００３】
いずれのたんぱく質でも、結合親和性または中和活性のような抗体の生物学的活性は、たんぱく質の多数の官能基を劣化から保護しながら、無傷で残存するアミノ酸の少なくともコア配列の立体配座完全性に依存する。化学的および物理的不安定性は、それぞれ抗体の劣化に関与しうる。抗体が従来の有機および無機薬剤に較べてより大きく複雑であるため、かかる抗体の製剤は特別な問題をもたらす。抗体安定性はイオン強度、pH、温度、凍結／融解反復サイクル、抗体濃度およびせん断力のような因子により影響を受けうる。活性な抗体は、変質、凝集（可溶溶および不溶性の両凝集体形成）、沈殿および吸着を含む物理的不安定性並びにごく僅かな例を挙げると、例えばラセミ化、ベ−タ放出又はジスルフィド交換、加水分解、アミド分解および酸化を含む化学的不安定性の結果として失われる場合がある。これら不安定性のすべてが、低下した生物学的活性、増加した毒性および／または増加した免疫原性を有する抗体副産物または誘導体の形成を潜在的にもたらすことができる。
【０００４】
先行技術は、特定の抗体用の抗体製剤を作成するのに適当に使用できる多数の賦形剤の例を示す一方、特定の抗体が有しうる特定の不安定性の問題を打開するためにどの賦形剤を加えるべきか、どれだけの量を加えるべきか予測することは不可能である。さらに、特定の抗体を特定の製剤内で化学的および生物学的に安定して保持する抗体濃度、ｐH及び貯蔵温度のような最適状態を見出すことは困難である。変え得る全ての要因を考慮しても、単一モノクロ−ナル抗体の製剤用に適当な賦形剤と最適状態を見つけることは課題を含む。明らかに、単一製剤において２つの異なるモノクロ−ナル抗体の製剤用に適当な賦形剤と最適状態を発見することはさらに困難で問題を含む。特に、この技術は２つの異なる組み換え型モノクロ−ナル抗体を含有する長期間安定した医薬品を提供しない。
【０００５】
したがって、狂犬病ウイルスに対し単一モノクロ−ナル抗体だけでなく、２つの異なる特定のモノクロ−ナル抗体さえも長期間貯蔵において安定である製剤を発見する技術の必要が存在した。貯蔵安定性をまた、輸送中に作用するせん断力の場合で、かつ変性した気象条件下、特に高い温度と大気湿気で保持すべきである。さらに、製剤が所望の投与経路にふさわしく、十分に許容され、簡単な構造を有するべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、かかる製剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明目的の必要条件を満たす製剤が、驚くべきことに２つの異なるモノクロ−ナル抗体に加えて、クエン酸塩緩衝液、等張化剤及び界面活性剤とを備える水溶液の形態で発見された。リン酸塩緩衝液は、驚くべきことに特定抗体の不安定性をもたらし、この不安定性が界面活性剤の添加によっても増加することを見出した。したがって、本発明は、特定の抗狂犬病抗体CR５７およびCR４０９８用の製剤、あるいはその機能的変異体を提供する。本発明はまた、CR５７およびCR４０９８の両方を備える抗体製剤、またはその機能的変異体に関連する。本製剤は、活性成分（単一抗体または複数の抗体）のほかに、クエン酸塩緩衝液、等張化剤および界面活性剤を含有する。本発明の製剤は、−７０℃および５℃で少なくとも一年間安定である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】は、４０±２℃/７５±５%相対湿度下で０週間（白いカラム）、２週間（黒いカラム）および４週間（陰影のついたカラム）貯蔵後、HP−SECで測定した抗狂犬病ウイルス抗体CR５７のカクテルの安定性をそれぞれ示す。図の左から右に、クエン酸塩（２０ｍM、ｐH ６．０）；クエン酸塩（２０ｍM、ｐH ６．５）；リン酸塩（２０ｍM、ｐH ７．０）；及びリン酸塩（２０ｍM、０．０１％のｗ/ｖポリソルベ−ト８０、ｐH ７．０）の緩衝液システムを試験した。
【図２】は、４０±２℃/７５±５%相対湿度下で０週間（白いカラム）、２週間（黒いカラム）および４週間（陰影のついたカラム）貯蔵後、HP−SECで測定した抗狂犬病ウイルス抗体CR４０９８のカクテルの安定性をそれぞれ示す。図の左から右に、クエン酸塩（２０ｍM、ｐH ６．０）；クエン酸塩（２０ｍM、ｐH ６．５）；リン酸塩（２０ｍM、ｐH ７．０）；及びリン酸塩（２０ｍM、０．０１％のｗ/ｖポリソルベ−ト８０、ｐH ７．０）の緩衝液システムを試験した。
【図３】は、４０±２℃/７５±５%相対湿度下で０週間（白いカラム）、２週間（黒いカラム）および４週間（陰影のついたカラム）貯蔵後、HP−SECで測定した抗狂犬病ウイルス抗体CR５７およびCR４０９８のカクテルの安定性をそれぞれ示す。図の左から右に、クエン酸塩（２０ｍM、ｐH ６．０）；クエン酸塩（２０ｍM、ｐH ６．５）；リン酸塩（２０ｍM、ｐH ７．０）；及びリン酸塩（２０ｍM、０．０１％のｗ/ｖポリソルベ−ト８０、ｐH ７．０）の緩衝液システムを試験した。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の製剤は、抗体CR５７（重鎖配列番号：１および軽鎖配列番号：２）および抗体CR４０９８（重鎖配列番号：３および軽鎖配列番号：４）の少なくとも一つ、好ましくは両方を備える。抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体CR５７およびCR４０９８の同定、単離、調製および特性解析は、ここに参照して援用する国際公開ＷＯ２００５／１１８６４４号に詳細に開示されている。これら抗体の機能的変異体は、その高い類似性に基づく類似した物理化学的特性を有し得るので、本発明の範囲内にも含まれる。機能的変異体は、本発明ではCR５９またはCR４０９８に対し少なくとも９５％、好適には少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％または９９％同族であるアミノ酸配列を有する抗体として定義され、親分子（それぞれCR５９またはCR４０９８である親分子）により認識される標的と競合結合し、狂犬病ウイルス中和活性を有することが可能である。抗体の標的は抗原（本抗体にとって狂犬病ウイルス、特にそのＧたんぱく質である）であり、さらにエピト−プとして定義し得る。親分子の標的は国際公開ＷＯ２００５／１１８６４４号に開示され、標的との競合結合の決定を当業者に既知の常法により行うことができる。機能的変異体はヒト抗体であるのが好ましく、好適にはIｇG１分子である。好ましい実施態様において、機能的変異体は親抗体と少なくとも９５%、９７%、９８%または９９%一致するアミノ酸配列である。ここで用いる用語「機能的変異体」は、親モノクローナル抗体のアミノ酸配列と比較して一つ以上のアミノ酸により変化するアミノ酸配列を備えるモノクロ−ナル抗体を参照する。機能的変異体は、アミノ酸置換、追加および削除を含む貯蔵的な配列修飾を有する場合がある。アミノ酸修飾は、抗体をエンコード化する核酸における部位特異的突然変異誘発、分子クローニング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発およびランダムPCR媒介突然変異誘発のような当業界で既知の標準的な技術によって導入することができる。貯蔵的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基を類似した構造的又は化学的特性を有するアミノ酸残基で置換したものを含む。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当業界で定義された。これらファミリーには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、無極性側鎖（例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベ−タ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）を有するアミノ酸がある。上述したもの以外のアミノ酸残基ファミリーの分類も使用し得ることは当業者にとって明らかである。さらに、変異体は非貯蔵的なアミノ酸置換、例えば異なる構造的又は化学的特性を有するアミノ酸残基によるアミノ酸の置換を有する場合がある。類似した少数の変異体は、アミノ酸の削除、挿入または両方とも含みうる。免疫学的活性を無効にすることなくアミノ酸残基を置換、挿入又は削除し得ることを決定するガイダンスは、当��界で周知のコンピュータープログラムを用いて見出すことができる。とりわけ当業者に既知のギャップまたはベストフイットのようなコンピューターアルゴリズムを用いて、比較すべきアミノ酸配列を最適に整列し、また類似又は同一のアミノ酸残基を定義することができる。
【００１０】
機能的変異体は、親抗体と比較し同一または異なり、高いまたは低い結合親和性を有し得るが、まだ狂犬病ウイルスまたはそのフラグメントに特異的に結合することができ、また親抗体と同じ、高いまたは低い狂犬病ウイルス中和活性を有する場合がある。
【００１１】
特定の実施態様において、本発明に係る製剤は、カッパ軽鎖を有する第一の抗狂犬病ウイルスモノクロナール抗体と、ラムダ軽鎖を有する第二の抗狂犬病ウイルスモノクロナール抗体とを備える。これは、特別な酵素免疫測定吸着法をカッパおよびラムダ軽鎖のそれぞれに対し実行しえるので、各抗体に関する抗体濃度を容易に決定することができる。
【００１２】
ここで用いる用語“モノクローナル抗体”は、単一分子組成の抗体分子の調製を参照する。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を示す。本発明に係わる製剤用の本発明のモノクローナル抗体（ＣＲ５７およびＣＲ４０９８並びにその機能的変異体）はヒト抗体であり、抗体のＩｇＧクラス、好適にはＩｇＧ１にある。
【００１３】
モノクローナル抗体の産生方法は当業界で周知であり、例えば１９８８年にハーロウ氏およびレイン氏により編集された抗体：ラボラトリーマニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨークに開示され、ここに参照のため援用する。
【００１４】
用語「特異的に結合」は、ある抗原およびそのフラグメントに対し免疫特異的に結合し、他の抗原に対し免疫特異的に結合しないことを意味する。ある抗原に対し免疫特異的に結合するモノクローナル抗体は、例えば当業界で既知の放射性免疫分析（RIA）、酵素免疫測定吸着法（ELISA）、BIACORE又は他の分析により決定されるようなより低い親和性を有する他のペプチドまたはポリペプチドと結合し得る。ある抗原に免疫特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントは関連抗原と交差反応性とすることができる。好適には、ある抗原と免疫特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントは他の抗原と交差反応しない。
【００１５】
「薬学的に許容し得る賦形剤」は、好ましい又は便利な投与形態を調製するためのモノクロ−ナル抗体のような活性分子と組合わせるあらゆる不活性物質を意味する。「薬学的に許容し得る賦形剤」は、用いる投薬量および濃度で受容者に対し非毒性の賦形剤であり、モノクロ−ナル抗体を備える製剤の他の成分と相溶性である。
【００１６】
用語「副成物」は、所定の製剤で治療／予防抗体の割合を損なうか、又は減ずる不所望な生成物を含む。典型的副成物は、例えばアミド分解又は加水分解による抗体の分解により生じた抗体の凝集体、抗体のフラグメントまたはその混合物を含む。一般に、凝集体は分子量がモノマ−抗体より大きい複合体である。抗体分解生成物は、例えばアミド分解や加水分解により生起された抗体のフラグメントを含む場合がある。一般に、分解生成物はモノマ−抗体より分子量が小さい複合体である。IｇG抗体の場合、かかる分解生成物は約１５０ｋD未満である。
【００１７】
ここで用いる「安定な／安定化した」製剤は、その中の抗体が貯蔵中その物理的的安定性／同一性／保全性および／または化学安定性／同一性／保全性および／または生物活性を本質的に保持する。たんぱく質安定性を測定するための様々な解析手法が当業界で入手し得、例えばヴィンセント・リ−編、マルセル・デカ−社、ニュ−ヨ−ク出版、ペプチドおよびたんぱく質薬物送達、第２４７〜３０１頁（１９９１年）およびジョ−ンズ著、先端的な薬物送達総説、第２９〜９０頁（１９９１年）を参照されたい。安定性は、所定の時間所定の温度及び他の貯蔵条件で測定することができる。安定性は、目視検査、SDS−PAGE、IEF、HPSEC、RFFITおよびカッパ/ラムダELISAからなる群から選択した少なくとも一つの方法により決定してもよい。モノクローナル抗体は、色および／または明快さの目視検査中、又は紫外線散乱、SDS−PAGE、高圧排除クロマトグラフィー（HPSEC）により測定して凝集、沈殿および／または変性の徴候を示さない場合に、薬学的製剤において「物理的安定性を保持する」。好適には、本発明に係る製剤を用いる際、５％以下、通常４％以下、好ましくは３％以下、より好ましくは２％以下、特に１％以下の抗体が、HPSECまたは凝集形成の測定用の任意他の適した方法により測定して凝集体を形成する。例えば、抗体モノマ−が特定の製剤においてある貯蔵条件下所定の時間後にHPSECで測定して約９０%以上、好ましくは約９５%以上、特に９８％以上の純度を有する場合、抗体が該特定の製剤において安定であると考えられる。その結果、CR５７およびCR４０９８抗体は本発明の製剤において５±３℃で少なくとも１８ヶ月間貯蔵で安定している。すなわち、HPSECクロマトグラムにおけるモノマーピークは、全ピークの合計面積の９５％以上の面積からなる（表９において主なピーク面積が９９％以上であること明らかである）。化学安定性は、タンパク質の化学変化した形態を検出、定量化することによって評価され得る。化学変化は、例えば（HP）SEC、SDS−PSGEおよび／またはマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（MALDI／TOF MS）を用いて評価し得るサイズ修正（例えばクリッピング）を含むことができる。化学変化の他のタイプは、例えばイオン交換クロマトグラフィにより評価し得る荷電変化（例えばアミド分解の結果として起こる）を含む。抗体は、該抗体の所定時間での生物活性が例えば抗原結合検定又はウイルス中和検定で決定して医薬製剤を調製する時間で示された生物活性の少なくとも約９０%（検定の誤差内で）である場合、抗体は所定時間での医薬製剤において「その生物活性を保持する」。
【００１８】
本明細書で用いる「約」は、特記しない限り±１０％を意味する。
【００１９】
第１形態において、本発明は、少なくとも好適には治療的有効量の活性成分と、少なくとも薬学的に許容し得る賦形剤とを備える医薬製剤を包含する。医薬製剤は、クエン酸塩緩衝液、等張化剤、界面活性剤、抗体が互いに異なる２つの抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体とを備えるのが好ましい。該製剤は例えば凍結または凍結乾燥した固体とすることができるが、好適には液体、例えば水溶液である。かかる製剤は、少なくとも２つの異なる抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体、特に（i） CR５７（重鎖配列番号：１および軽鎖配列番号：２のアミノ酸配列を有する抗体）またはその機能的変異体、および（ii）CR４０９８（重鎖配列番号：３および軽鎖配列番号：４のアミノ酸配列を有する抗体）またはその機能的変異体とを備えることができる。
【００２０】
特定の実施態様において、本発明に係る製剤は約２５０IU／ｍｌから約１５００IU／ｍｌ、例えば約３００IU／ｍｌから約１４００IU／ｍｌ、通常約３８０IU／ｍｌから約１５００IU／ｍｌの範囲の狂犬病ウイルス中和能力を有する。狂犬病ウイルス中和を測ることは当業者の可能な範囲である。中和は、例えばジュネ−ブの世界保健機構、F．X．メスリン、M．M．カプランおよびH． コプロスキー編（１９９６）、第４版、第１５〜１７章、狂犬病の実験室技術に記載されているように測定することができる。活性を中和するのに適当な既知検定はRFFIT検定である。
【００２１】
ある実施態様において、５±３℃で１２ヶ月の貯蔵後の本発明の製剤の狂犬病ウイルス中和能力は、貯蔵前の本発明の製剤の狂犬病ウイルス中和能力の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好適には少なくとも９８％、特に１００％である。ある実施態様において、２５±２℃で３ヵ月の貯蔵後の本発明の製剤の狂犬病ウイルス中和能力は、貯蔵前の本発明の製剤の狂犬病ウイルス中和能力の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好適には少なくとも９８％、特に１００％である。
【００２２】
本発明に係る製剤は、安定化剤としても既知の界面活性剤を含む。界面活性剤にはポリソルベ−トがあるがこれに限定するものでない。当業者は、他の界面活性剤、例えば非イオンまたはイオン洗剤が、薬学的に許容し得る、すなわちヒトへの投与に適している限り界面活性剤として使用することができることに気づいている。好適な実施態様において、本発明は、界面活性剤がポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０のようなポリソルベートであり、ポリソルベート８０が好ましい本発明に係る製剤を提供する。ある実施態様において、ポリソルベート８０は製剤中に約０．０００５%ｗ/ｖから約０．０５%ｗ/ｖ、好ましくは約０．００５%ｗ/ｖから約０．０３%ｗ/ｖ、より好ましくは約０．００８%ｗ/ｖから約０．０１５%ｗ/ｖの分量で存在する。好適な実施態様において、ポリソルベ−ト８０は約０．０１%ｗ/ｖの分量で存在する。
【００２３】
ある特定の実施態様において、本発明は、クエン酸塩緩衝液、例えば無水クエン酸ナトリウム（２．５ｍｇ/ｍｌ）／クエン酸一水和物（０．３ｍｇ/ｍｌ）緩衝液が約５ｍMから約２５ｍM、好ましくは約７ｍMから約２０ｍM、より好ましくは約８ｍMから約１５ｍM、特に約９ｍMから約１２ｍMの濃度で存在する本発明に係る製剤を提供する。好適な実施態様において、クエン酸塩緩衝液は、約１０ｍMの濃度で存在する。
【００２４】
ある特定の実施態様において、本発明は、ｐHが約５．２から約６．８、通常約５．５から約６．５、好ましくは約５．７から約６．３、より好ましくは約５．８から約６．２、特に約５．９から約６．１の範囲である本発明に係る製剤に関するものである。好適な実施態様において、ｐHは約６．０である。
【００２５】
特定の非限定的な実施態様において、等張化剤は塩化ナトリウムである。他の塩、例えば砂糖等も、当業者に既知のように薬学的に許容し得る限り、等張化剤として用いることができる。本発明のある特定の実施態様において、等張化剤は約５０ｍＭから約２５０ｍＭ、通常約７５ｍＭから約２２５ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭから約２００ｍＭ、より好ましくは約１２５ｍＭから約１７５ｍＭの濃度で存在する。好適な実施態様において、等張化剤は約１５０ｍＭの濃度で存在する。ある特定の実施態様において、本発明に係る製剤の重量オスモル濃度は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３３０／ｋｇ、より好ましくは約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、特に約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。好適な実施態様において、重量オスモル濃度は約３００ｍＯｓｍ／ｋｇである。換言すれば、当該製剤は実質的に等張性である、すなわちヒト血液と実質的に同じ浸透圧を有するのが好ましい。等張性は、例えば蒸気圧または製氷式浸透圧計を用いて測定することができる。本発明の製剤の重量オスモル濃度は、例えば一つ以上の等張化剤によって調節することができる。
【００２６】
本発明の製剤における各抗体の濃度は、約０．１ｍｇ/ｍｌから２．０ｍｇ/ｍｌ、通常約約０．１ｍｇ/ｍｌから１ｍｇ/ｍｌであるのが好ましい。ある特定の非限定的な実施態様において、各抗体の濃度は０．１５（±２０％）ｍｇ/ｍｌである。他の非限定的な実施態様において、各抗体は０．３（±２０%）ｍｇ/ｍｌ（すなわち、２つの抗体に対して合計０．６ｍｇ/ｍｌ）の濃度で存在する。
【００２７】
ある特定の実施態様において、二つの抗体の（タンパク質）比率は５：１から１：５、好ましくは２：１から１：２、特に約１：１である。
【００２８】
さらに、本発明に係る製剤は、限定されないがアミノ酸とその塩類、砂糖、たんぱく質、希釈剤、可溶化剤、pH調整剤、緩和剤、追加緩衝液、他の無機および有機塩、抗酸化剤等を含む他の賦形剤を備えることができる。しかし、本発明の製剤はクエン酸塩緩衝液、等張化剤および界面活性剤は別にして他の賦形剤を含まないのが好ましい。
【００２９】
本発明に係る製剤において、抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体CR５７およびCR４０９８は、約２℃から約８℃で少なくとも１年間、通常少なくとも約１８ヶ月間安定である。好適には、かかる抗体が約２℃から約８℃で少なくとも２年間、より好適には３年間安定である。
【００３０】
さらに、抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体は、本発明に係る製剤において２５±２℃で少なくとも約２ヵ月間安定である。加えて、抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体は、本発明に係る製剤において４０±２℃で少なくとも２週間安定である。
【００３１】
ある特定の実施態様において、当該製剤は筋肉注射での投与、経皮投与、傷への局所的皮下注射での投与またはこれらの組合せに適している。したがって、製剤は無菌であるのが好ましい。製剤を無菌にする方法は当業界で周知であり、例えば無菌ろ過膜によるろ過、または抗体を除いた製剤の成分を約１２０℃で約３０分間高圧減菌することを含む。
【００３２】
好適な実施態様において、製剤は実質上エンドトキシンを含まない。エンドトキシンは、患者への非経口投与により高熱反応をもたらし得るグラム陰性バクテリアの外側の細胞壁に付随する約１０ｋDaの低分子量複合体である。したがって、ＦＤＡは静脈内薬物適応用の単一１時間期において体重１キログラムにつき５EUの服用を上限とした（例えば、米国薬局方協会（USP）、薬局方フォ−ラム第２６巻（１）、第２２３頁、２０００年を参照）。ある特定の実施態様において、製剤は１ミリリットルにつき約５．０エンドトキシン単位（EU/ｍｌ）未満のエンドトキシン濃度（約５．０EU/ｍｌ未満の濃度をここではエンドトキシンを実質上含まないとする）、好ましくは約２．５EU/ｍｌ未満、より好ましくは約１．０EU/ｍｌ未満、さらに好適には約０．５EU /ｍｌ未満、特に約０．３０EU/ｍｌ未満の濃度を有する。ある特定の実施態様において、製剤は約０．００１EU/ｍｌから約５．０EU/ｍｌの範囲のエンドトキシン濃度を有する。エンドトキシン測定方法は当業者に既知であり、限定するものではないが、ゲルークロット検定、濁度（分光光度）検定、発色検定を含む。
【００３３】
「汚染後予防」（PEP）が、おそらく狂犬病にかかった動物に触れる人に対して示される。可能な汚染は、動物咬傷を含む咬合汚染（すなわち歯が肌を貫通する）、および非咬合汚染を含む。本発明に係る製剤を、狂犬病ウイルス感染症の予防および／または治療、例えば汚染後予防に使用するのに必要なものに投与することができる。本発明の製剤を、狂犬病ウイルスの診断、予防および／または治療に有用な他の分子とともに使用することができる。例えば、製剤を狂犬病ウイルスに対するワクチンと同時投与することができる。あるいはまた、ワクチンを本発明の製剤の投与前後に投与してもよい。ワクチンとともに本発明の製剤の投与が汚染後予防に適している。狂犬病ワクチンには限定しないが、精製ニワトリ胚細胞（PCEC）ワクチン（RabAvert、Rabipur）、ヒト２倍体細胞ワクチン（HDCV；Imovaxワクチン）、又は狂犬病吸着ワクチン（RVA）がある。本発明の製剤の単一丸塊を投与するのが好ましい。汚染後予防の投与計画は、狂犬病ウイルス対し予防接種しなかった個々体の汚染後０、３、７、１４、２８日に狂犬病ワクチンを三角筋に筋肉注射で５回投与する。本発明に係る製剤は、汚染後０日目、さもなければできる限り早く傷およびその周りにワクチンから離れた部位で筋肉注射される量を保持したまま投与されなければならない。予防接種をしていない人は抗狂犬病ウイルス抗体を投与するよう勧められる。抗体又は複数の抗体の治療に有効な量を投与し、該量が狂犬病のPEPに対し有効、または少なくとも部分的に有効である。すなわち、狂犬病ウイルスを中和する。
【００３４】
他の形態において、本発明は、被験者への投与により該被験者の汚染後予防治療用の本発明に係る製剤の有効量を備えた医薬品単位服用形態を付与する。好適な実施態様において、被験者はヒトである。ヒトは大人または幼児とすることができる。ここで用いる用語「医薬品単位服用形態」は、治療すべき被験者に対し単一投与量として適した物理的に不連続な単位を意味し、各単位が所望の治療的／予防的効果を生むように計算した所定量の活性化合物を所要の医薬担体、希釈剤又は賦形剤と共に含む。
【００３５】
医薬品単位服用形態は、製剤を備える容器とすることができる。適当な容器としては、限定するものではないが、密閉アンプル、バイアル、ビン、注射器および試験管がある。かかる容器は、ガラスまたはプラスチックのような様々な材料から形成することができ、減菌点検口を有する場合がある（例えば、容器は皮下注射針により貫通し得るストッパ−を有するバイアルとすることができる）。好適な実施態様において、容器はバイアルである。かかるバイアルは約０．３ｍｌから約３ｍｌの容積を有するのが好ましい。バイアルは、約０．１ｍｇから約２．０ｍｇの量の抗狂犬病ウイルス抗体を含有するのが好ましい。ある実施態様において、バイアルは、一バイアル当たり合計７５０〜２０００IUの狂犬病ウイルス中和モノクロ−ナル抗体を含有する。このタイプのバイアルを大人への投与用に適切に用いることができる一方、一バイアル当たり合計２５０〜７５０IUの狂犬病ウイルス中和モノクロ−ナル抗体を含有するバイアルを幼児への投与用に適切に用いることができる。本抗体は、通常本発明の製剤において治療に有効な量で処方される。投与計画を調整して最適な所望の応答（例えば治療的な応答）を提供することができる。適当な投薬量範囲は、例えば約２０IU/体重１ｋｇのような体重１ｋｇ当たり１０〜３０IUとすることができる。
【００３６】
医薬品単位服用形態は、さらに使用説明書を備えるキットで存在することができる。該キットは、薬学的に許容し得る賦形剤を備えるより多くの容器をさらに備え、フィルタ、針、注射器を含む商業的および使用者見地から望ましい他の材料を含むことができる。かかるキットに付随する取扱説明書は、治療、予防又は診断生産物のコマーシャル・パッケージに通常含まれる説明書とすることができ、これは例えばかかる治療、予防又は診断生産物の使用に関連する兆候、用法、投薬量、製造法、管理、非適応および／または警告についての情報を含む。ある特定の実施態様において、キットは約５IU/ｋｇから約４０IU/ｋｇ、例えば２０IU/ｋｇの投薬量を達成するのに必要な最適容量を用いるための取扱説明書を備える。
【００３７】
さらに、本発明は、２つの抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体を本発明に係る液体の薬学的製剤において処方することにより該抗体（CR５７およびCR４０９８またはその機能的変異体）の貯蔵を一つ、例えば単一の製剤において改善する方法に関する。該製剤を約２℃から約４０℃の温度、例えば約２℃から８℃の間で貯蔵することができる。しかしながら、製剤を２℃以下の温度、例えば約−２０℃、−７０℃等で貯蔵してもよい。本発明に係る特定の製剤において抗体を貯蔵することによって、抗体の副産物形成の量を減ずる。実用的な理由から、個々の抗体CR５７およびCR４０９８を混合する前に、これらを例えば−７０±１０℃で凍結貯蔵することが好ましく、一方最終生産物（CR５７およびCR４０９８のカクテル）を５±３℃で液体状で貯蔵するのが好ましい。
【００３８】
更なる形態において、本発明はまた、単一の抗狂犬病ウイルスモノクロ−ナル抗体、すなわちCR５７若しくはCR４０９８またはその一つの機能的変異体を備える液体の薬学的製剤に関する。かかる製剤は、上述したような全ての特性および賦形剤を備えるのが好ましい。従って、好適な実施態様において、かかる製剤はクエン酸塩緩衝液（５〜２５ｍM）を含み、５．５から６．５、例えば６．０のｐHを有するか；等張化剤（例えば塩化ナトリウム、５０〜２５０ｍM、例えば約１５０ｍM）を含むか；界面活性剤、例えばポリソルベ−ト８０（０．０００５%〜０．０５%、例えば約０．０１%）を備え、好適には実質上等張性で、無菌で、実質上エンドトキシンを含んでいない。二つの異なる抗狂犬病ウイルスモノクローナル抗体を備える製剤に関し上述したものとは異なりうる特性および賦形剤は以下に記載する。
【００３９】
ある特定の実施態様において、本発明に係る製剤は単一の抗狂犬病モノクローナル抗体を約０．１ｍｇ/ｍｌから約６．０ｍｇ/ｍｌ、通常約１．０ｍｇ/ｍｌから約４．０ｍｇ/ｍｌ、例えば約２．０ｍｇ/ｍｌから約３．０ｍｇ/ｍｌの量で備えることができる。特定の実施態様において、製剤は約３００IU/ｍｇから約１６００IU/ｍｇ、例えば約５００IU/ｍｇから約１２５０IU/ｍｇの狂犬病ウイルス中和能力を有する。上記のような単一抗体を備える製剤を互いに組み合わせ/混合して２つの抗体、すなわち抗体カクテルを備える本発明の製剤を得ることができる。
【実施例】
【００４０】
本発明を説明するために以下の例を提供する。これら例は、どんな形であれ本発明の範囲を制限することを意図しない。一般に、本発明の実行は、特に明記しない限り、例えばサンブロック、フリッチュおよびマニアティスの分子クローニング：コ−ルド・スプリング・ハ−バ−研究所出版、１９８９年；抗体工学プロトコル（分子生物学における方法）、第５１巻、ポ−ル編、フマナ出版、１９９６年；抗体工学：実践的なアプローチ（実践的なアプローチシリーズ、１６９）、マッカファティ等編、フマナ出版、１９９６年；抗体：研究所マニュアル、ハ−ロ−およびレ−ン著、コ−ルド・スプリング・ハ−バ−研究所出版、１９９９年；分子生物学の現在のプロトコル、オ−スベル等編、ジョン・ワイリ−＆ソンズ、１９９２年に記述されたような抗体テクノロジーおよびポリペプチド製剤の標準技術のような化学、分子生物学、組み換えＤＮＡ技術、免疫学の従来の技術を用いる。
【００４１】
CR５７およびCR４０９８抗体のアミノ酸配列を表１０に示す。これら中和抗狂犬病ウイルス抗体の識別、クロ−ニング、調製および特性解析は、国際公開ＷＯ２００５／１１８６４４号に詳細に開示されている。抗体を基本的に類似した方法で大規模に製造した。抗狂犬病ウイルス抗体を安定して発現するPER．C６細胞の出発培養液を融解し、細胞を培養し、そして培地を拡大、使用してバイオリアクタ−を接種した。該バイオリアクタ−をまずバッチモ−ド、続いて流加モ−ドで操作した。各抗体を含む媒体を採取し、遠心分離によって浄化し、さらなる後処理プロセスの前にろ過した。後処理精製プロセスは、標準的なクロマトグラフィおよびろ過工程からなり、続いてポリソルベ−ト８０のない処方緩衝液に対する緩衝液交換と、所望抗体濃度を得るための濃縮とを行った。ポリソルベ−ト８０の添加とろ過の後、得られた薬物（抗体CR５７または抗体CR４０９８）を更に使用するまで−８０℃で貯蔵した。製剤品の製造のために、前記薬物を処方緩衝液で希釈し、抗体濃度を測定し、両方の抗体希釈液を最終充填の前に混合し、ろ過した。
【００４２】
安定性研究のために、薬物（単一抗体）と製剤品（抗体のカクテル）の種々の製剤を調製し、分析した。かかる種々の製剤のサンプルを、当業界で周知の様々な分析法を用いて異なる時点と温度で分析した。
【００４３】
HPSEC、SDS−PAGE（還元および非還元）、たんぱく質濃度（A２８０）、IEF、外観、pHおよび重量オスモル濃度を用いてCR５７抗体、CR４０９８抗体およびその混合抗体に対する種々の処方緩衝液の安定化効果を評価した。
【００４４】
ＨＰＳＥＣを用いて凝集またはタンパク質分解による抗体の分解生成物の存在を評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて無傷の抗体の完全性と、不純物および潜在的分解産物の存在を評価した。たんぱく質濃度を測定して製剤のたんぱく質濃度の保持を許容範囲内で評価した。ＩＥＦを用いて製剤中に存在し得る抗体イソ型の存在および完全性を評価し、またアミド分解またはシアル酸の欠如により生起し得る変化を評価するために長期間にわたって観測した。製剤の外観は、明快さ、色および微粒子の存在に対する目視検査に基づき行われた。ｐＨを測定して製剤のｐＨの維持を約５．５から約６．５の許容範囲内で評価した。重量オスモル濃度を測定して製剤の重量オスモル濃度の維持を約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇから約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの許容範囲内で評価した。
【００４５】
第一の研究では、異なる緩衝液システムを試験した。そのために、クエン酸塩緩衝液中で処方した抗狂犬病ウイルス抗体製剤を、リン酸塩緩衝液中で処方した抗狂犬病ウイルス抗体製剤と比較した。２０ｍMのクエン酸塩緩衝液（pH ６．０）または２０ｍMのクエン酸塩緩衝液（pH ６．５）にCR５７（０．１ｍｇ/ｍｌ）、CR４０９８（０．１５ｍｇ/ｍｌ）又はCR５７（０．１ｍｇ/ｍｌ）およびCR４０９８（０．１５ｍｇ/ｍｌ）の混合物/カクテル（１：１．５混合物）のいずれかを備える製剤は、HPSEC分析で示されるように、５±３℃/大気相対湿度、２５±２℃/６０±５％相対湿度および４０±２℃/７５±５％相対湿度で４週間までの貯蔵に対し安定していた。かかる製剤のすべてが、HPSECで求められて９６%以上の抗体モノマ−純度（面積％）を有した（図１〜３参照）。２０ｍMのリン酸塩緩衝液（pH ７．０）にCR５７（０．１ｍｇ/ｍｌ）、CR４０９８（０．１５ｍｇ/ｍｌ）、又はCR５７（０．１ｍｇ/ｍｌ）およびCR４０９８（０．１５ｍｇ/ｍｌ）の混合物（１：１．５混合物）のいずれかを備える製剤は、４０±２℃/７５±５％相対湿度で４週間までの貯蔵に対し、同一期間および温度条件下のクエン酸塩緩衝液中の製剤と比較して著しく低い抗体モノマー純度を有した（図１〜３参照）。ポリソルベ−ト８０（０．０１%ｗ/ｖ）をリン酸塩緩衝液に添加した場合、抗体モノマー純度が、４０±２℃/７５±５％相対湿度で４週間までの貯蔵に対しCR４０９８では約７０％、またCR５７および混合物では約８５％の値まで減少した（図１〜３参照）。かかる結果は、個々の抗体並びに抗体の混合物の安定性がリン酸塩緩衝液と比較してクエン酸塩緩衝液で優れていることを明白に示す。リン酸塩緩衝液では、抗体が断片化により分解される。抗体は、pH ６．０およびpH ６．５のクエン酸塩緩衝液を備える製剤において等しく安定であった。さらに、リン酸塩緩衝液におけるポリソルベ−ト８０の添加が追加の抗体不純物をもたらすと結論づけた。HPSECでの結果は、IEFおよびSDS−PAGE（還元および非還元）を含む他の分析法により確かめられた（デ−タでは示されていない）。かかる研究に基づき、クエン酸塩を緩衝液システムとして用いた。
【００４６】
製剤の最適界面活性剤濃度を決定するために、異なるポリソルベ−ト８０濃度を有するクエン酸塩系製剤を分析した（表１参照）。製剤を以下の通りに調製した。抗体CR５７およびCR４０９８（薬物）を基本的には上述したように調製した。これらを０．１μｍフィルターでろ過した。たんぱく質濃度は、A２８０たんぱく質濃度決定により測定してろ過の前後で同一であった。CR５７の濃度は２．５ｍｇ/ｍｌであり、CR４０９８の濃度は１．０ｍｇ/ｍｌであった。次に、１０ｍMのクエン酸塩（pH ６．０）と５０ｍMの塩化ナトリウムとを含有する緩衝液と、１０ｍMのクエン酸塩（pH ６．０）、５０ｍMの塩化ナトリウムと５%のポリソルベ−ト８０トを含有する緩衝液を調製した。製剤を表２に記載されたように調製した。最終的な容量を１０ｍMのクエン酸塩（pH ６．０）および５０ｍMの塩化ナトリウムを含有する緩衝液で得た。すべての製剤の重量オスモル濃度を求め、塩化ナトリウムを添加して製剤を約３００ｍOｓｍ/ｋｇの重量オスモル濃度にした。すなわち、製剤中の最終的な塩化ナトリウム濃度は１５０ｍMである。最後に、すべての製剤を０．２２でμｍフィルタ−でろ過し、外観試験、振動研究およびｐH分析を除くすべての試験に関しては２ｍｌのエッペンドルフ・カップに充填（４００μｌ）し、これを用いて２０ｍｍストッパーで覆い、アルミニウムキャップで封鎖した５ｍｌ注射バイアル（２ｍｌのサンプル入り）を作成した。製剤を安定性キャビネット内に５±３℃/環境相対湿度、２５±２℃/６０±５%相対湿度又は４０±２℃/７５±５%相対湿度で貯蔵した。指示された時点で、２つのサンプルを取り出し、表３に示すようなスケジュールに従ってin monoploで分析した。
【００４７】
上述したように、短パン質濃度はA２８０たんぱく質濃度決定でより測定してろ過の前後で同一であった。
【００４８】
HPSEC分析の結果を表４に示す。たんぱく質成分の分離は、該たんぱく質成分の迅速な分析と高解像度を可能にし、優れた再現性を有するイソクラテイック溶離法を用いるHPSECにより行った。結果は、ｔ＝０週のすべての製剤がHPSECにより求めて９８〜１００%純度を有することを示す。すべての製剤は、５±３℃/大気相対湿度（すなわち２から８℃/大気相対湿度）でｔ＝１３週（およびｔ＝０週とｔ＝１３週との間の全中間時点）でｔ＝０週に匹敵し得る純度を示し、この温度で少なくとも１３週間安定性を示した。製剤２のみの純度がｔ＝８とｔ＝１３週でちょうど９８%以下であった。さらに、２５±２℃/６０±５%相対湿度で、全製剤がすべての時点で９５%以上の純度を示し、これは抗体もこの温度で少なくとも１３週間安定であることを示すと表４から結論付けた。４０±２℃/７５±５%相対湿度のより高い温度で、すべての製剤が最初の２週で９５%以上の純度を示し、抗体がこの高温度で少なくとも２週間安定なことを示した。２週を越えた全時点では、すべての製剤が約９０%を超える純度を示し、抗体がこの高温度で少なくとも１３週間比較的安定なことを示した。この方法で見つかる不純物は、抗体モノマ−の凝集体と断片を含んでいた。かかる結果は、０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０を有する製剤が０．０３%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０を有する類似の製剤よりも高い純度を有する（製剤１と２、製剤３と４、および製剤５と６の純度の比較）ことをさらに示した。同じ不純物が両方のポリソルベ−ト濃度に対し観察された。
【００４９】
SDS−PAGE分析結果は、HPSECで観測されたデ−タと一致していた。非還元および還元SDS−PAGE分析に基づいて、５±３℃/大気相対湿度および２５±２℃/６０±５%相対湿度で貯蔵された製剤が、参照標準物と比較してすべての時点で相当な劣化の兆候を示さないが、わずかな劣化が４０±２℃/７５±５%相対湿度で貯蔵された製剤の異なる時点において観察された（データでは示されていない）。すべての製剤に対する違いが種々のポリソルベ−ト８０濃度の間で全く観察されなかった。
【００５０】
SDS−PAGEによる抗体サンプルの識別は抗体の完全性のみを確かめるが、その初期状態又は変性状態を示さない。IEF は抗体のｐIを示し、また抗体の配座微小異型遺伝子性を示すのにも有用である。SDS−PAGEとIEFの組合せは、抗体構造と特性のわずかな違いを検出するための強力な道具である。IEFの結果に基づいて、すべての製剤に対する顕著な相違が異なるポリソルベ−ト８０濃度の間で全く観察されなかった（デ−タでは示されていない）。製剤を４０±２℃/７５±５%相対湿度で貯蔵したとき、軽微な分解（最もアミド分解による）がｔ＝６週の時点で観察された。
【００５１】
５±３℃/大気相対湿度、２５±２℃/６０±５%相対湿度および４０±２℃/７５±５%相対湿度で貯蔵された全ての製剤の明確さおよび色の目視検査は、これら製剤がｔ＝１３週まで事実上粒子がなく、より高温度で貯蔵した際に粒子を含有する製剤の量がわずかに増加したことが観察されたことを示した。CR５７およびCR４０９８と、０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０とを備える製剤は、CR５７およびCR４０９８と、０．０３%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０トを備える製剤と比較して、より少ない粒子を含有した。振動研究は、外観に関してそれぞれの製剤間に相違がないことを示した。すべての製剤のpH値は、指示された温度と時間での貯蔵の間実質上変化しなかった。
【００５２】
すべての製剤の重量オスモル濃度値は、２５±２℃/６０±５%相対湿度および４０±２℃/７５±５%相対湿度で貯蔵した際の安定性研究の間極めてわずかな増加を示した。０．０３%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０を具える製剤と、０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０を備える製剤との間で顕著な相違はなかった。
【００５３】
全体として、かかる研究による結果は、単一の抗狂犬病ウイルス抗体並びに抗狂犬病ウイルス抗体の混合物／カクテルが０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０を備えたクエン酸塩系の製剤において５±３℃/大気相対湿度、２５±２℃/６０±５%相対湿度および４０±２℃/７５±５%相対湿度で１３週後に最高の安定性を有することを示す。
【００５４】
更なる研究では、クエン酸塩（１０ｍM、pH ６．０）、塩化ナトリウム（１５０ｍM）、０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０および単一の抗体CR５７（１．２ｍｇ/ｍｌ）またはCR４０９８（１．２ｍｇ/ｍｌ）を備える製剤を、下記の２つの温度、５±３℃および−７０±１０℃下で貯蔵した際に研究した。製剤をIEF、SDS−PAGE（還元および非還元）およびHPSEC分析用に１．２ｍｌのチューブに充填（２５０μｌ）した。pHおよび外観分析のために、２ｍｌの製剤で満した２ｍｌのチュ−ブを用いた。これら製剤を５±３℃または７０±１０℃で安定性キャビネット内に貯蔵した。指示された時点（１、２、３ヵ月）で、サンプルを取り出し、分析した。かかる研究の結果は、表５と表６で見ることができる。
【００５５】
前記両温度でのCR５７およびCR４０９８製剤のSDS−PAGE分析（還元および非還元）は、追加の分解バンドがｔ＝０週と比較して観察されないので、抗体の完全性が少なくとも３ヶ月間無傷のまま保持していることを示す。これらの結果は、５±３℃/大気相対湿度または−７０±１０℃で３ヵ月後の抗体構造と凝集レベルがそれぞれｔ＝０ヶ月のものと異ならないことを示すIEF分析およびHPSEC分析により確認された。加えて、たんぱく質濃度とpHは有意に時間とともに変化しなかった。各製剤の目視検査は無色透明の液体を示し、実質的に粒子がないことを示した。
【００５６】
−７０±１０℃で１ヶ月または３ヶ月貯蔵後の追加凍結／融解サイクルを施した製剤の分析は、上述した検定、すなわちSDS−PAGE（還元および非還元）、HPSEC、IEF、外観、OD２８０およびｐHに基づきｔ＝０ヶ月と比較しても相違がないことを示した（データでは示されてない）。
【００５７】
要約すると、かかる結果は、クエン酸塩緩衝液（１０ｍM、pH ６．０）、ポリソルベ−ト８０（０．０１%ｗ/ｖ）および塩化ナトリウム（１５０ｍM）を備えた製剤における抗体CR５７および抗体CR４０９８が５±３℃/大気相対湿度および−７０±１０℃で安定なことを示し、それによって前述した結果を確認した。加えて、抗体サンプルの−７０±１０℃での長期貯蔵（ｔ＝１ヶ月またはｔ＝３ヶ月）後の追加凍結／融解サイクルは、抗体CR５７または抗体４０９８の安定性に影響をあたえない。
【００５８】
類似の安定性研究において、クエン酸塩（１０ｍM、pH ６．０）、塩化ナトリウム（１５０ｍM）、０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０および単一の抗体CR５７（２．４７ｍｇ/ｍｌ）またはCR４０９８（２．４８ｍｇ/ｍｌ）を備える製剤を、２つの異なる温度、すなわち５±３℃および−７０±１０℃で３ヵ月以上の長期間貯蔵して研究した。かかる製剤を０．２２μｍフィルターでろ過し、ポリプロピレン・チュ−ブ（４ｍｌ）に充填した。加えて、たんぱく質含有量（各抗体０．３ｍｇ/ｍｌで、０．６ｍｇ/ｍｌの全体的なたんぱく質濃度）に基づく１：１比率のCR５７およびCR４０９８の組合せを、２つの異なる温度、すなわち５±３℃および−７０±１０℃で６ヵ月までの間貯蔵して研究した。抗体カクテル／混合物を備えた製剤を０．２２μｍフィルターでろ過し、ガラスバイアル（２．６ｍｌ）に充填した。かかる製剤を、以下の分析法：SDS−PAGE（還元および非還元）、IEF、HPSEC、RFFIT、外観、pHを用いて試験した（表７および表８参照）。CR５７／CR４０９８組合せを有する製剤もまた、カッパ／ラムダELISAおよび重量オスモル濃度によって試験した（表９参照）。さらに、単一抗体または抗体カクテルを備えた製剤のエンドトキシンレベルをｔ＝０ヶ月で求めた。エンドトキシンレベルは、ゲルー塊技術を用いるリムルム変異体細胞溶解物（LAL）検定で評価された。CR５７を備えた製剤は０．３０EU/ｍｌ以下、C R４０９８を備えた製剤は０．３０EU/ｍｌ以下、両抗体のカクテルを備えた製剤は０．２４ EU/ｍｌ以下である。製剤を−７０±１０℃、５±３℃、２５±２℃又は４０±２℃で指示された期間安定性キャビネット内に貯蔵した。
【００５９】
単一抗体を含有する製剤を６ヵ月間にわたって分析し、ｔ＝０ヶ月で得た初期の結果と比較した。−７０±１０℃および５±３℃で１、２、３および６ヶ月間貯蔵したCR５７およびCR４０９８製剤のIEFおよびSDS−PAGEのバンドパターンは、それぞれｔ＝０ヶ月におけるCR５７およびCR４０９８製剤のバンドパタ−ンに匹敵した（表７および表８参照）。追加のバンドは検出されていない。−７０±１０℃および５±３℃で６ヵ月間貯蔵した両抗体のHPSECパターンは、ｔ＝０ヶ月の貯蔵したものによく匹敵した。「９５%以上の主ピ−ク面積」の標的仕様がすべてのケ−スで満たされた。二量体ピ−クが１％未満（表面積）に留まり、分解ピ−クは試験したサンプルのすべてで検出されなかった。
【００６０】
これら３つの方法で得た結果に基づき、CR５７およびCR４０９８両方の分解が−７０±１０℃および５±３℃で６ヵ月間の貯蔵中指定の製剤において起こらないという結論を下した。
【００６１】
さらに、CR５７およびCR４０９８のたんぱく質含有量およびpHは、−７０±１０℃および５±３℃で６ヵ月の試験期間にわたる製剤において安定であった。有効性の分析（RFFIT検定）は、両抗体に関する有効性値が両試験条件（すなわち、−７０±１０℃および５±３℃）下でのｔ＝０ヶ月およびｔ＝１ヶ月の時点と比較し、２、３および６ヶ月時点で増加したことを示した。この有効性の明らかな増加は、検定における肯定的な言及として用いた不安定SRIF対照サンプルによりもたらされた（メスリン、カプランおよびコプロスキー編、狂犬病の研究所技術（１９９６）、第４版、第１５〜１７章、世界保健機構、ジュネ−ブを参照）。この作用は、結果を５０％中和終点力価（デ−タでは示されていない）として表現することによって排除された。これらの結果に基づき、CR５７およびCR４０９８は安定な終点力価を示し、従って指示された製剤において両貯蔵条件で少なくとも６ヶ月間まで安定した有効性を示すと結論付けた。
【００６２】
要約すると、前記結果に基づき、CR５７およびCR４０９８は、クエン酸塩（１０ｍM、pH ６．０）、塩化ナトリウム（１５０ｍM）および０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０を備えた製剤において−７０±１０℃の実際の貯蔵条件で少なくとも６ヵ月間並びに５±３℃の促進条件で少なくとも６ヵ月間安定であると考えられる。
【００６３】
安定性を長期間の貯蔵後分析した。SDS−PAGE（NR+R）、IEF、HP−SEC、RFFITおよびOD２８０で得た安定性結果に基づき、CR５７およびCR４０９８は、クエン酸塩（１０ｍM、pH ６．０）、塩化ナトリウム（１５０ｍM）および０．０１%（ｗ/ｖ）のポリソルベ−ト８０を備えた製剤において−７０±１０℃の貯蔵条件で少なくとも１８ヵ月間並びに５±３℃の促進条件で少なくとも１２ヶ月間（同様の結果が９ヶ月間後に観測された、デ−タでは示されていない）安定であると結論付けた。
【００６４】
CR５７およびCR４０９８のカクテルを含有する製剤を６ヵ月間にわたって分析し、ｔ＝０ヶ月で得た初期の結果と比較した。６ヵ月後、５±３℃および２５±２℃で貯蔵したカクテルの外観は標的仕様内に留まる、すなわちカクテル／混合物が無色透明の液体で、実際に粒子が含まれていなかった（表９参照）。さらに、抗体カクテルは、４０±２℃で３ヵ月間まで貯蔵した際に標的仕様内に留まることが観察された。
【００６５】
pHと重量オスモル濃度を、５±３℃および２５±２℃でｔ＝０ヶ月とｔ＝６ヶ月、また４０℃±２℃での研究に対しては１ヶ月および３ヶ月の時点でモニタ−した。
【００６６】
さらに、抗体カクテルは、５±３℃および２５±２℃で６ヵ月間まで安定した有効性を示した（表９参照）。わずかに低い有効性値が、４０±２℃で３ヵ月間後に得られた。すべてのデ−タは、約３８０〜約１３５０IU/ｍｌの標的仕様内にあった。
【００６７】
OD２８０で求めた抗体カクテルに存在する全たんぱく質の量は、４０±２℃で３ヵ月、また５±３℃および２５±２℃で６ヶ月の試験時点にわたり安定であった。
【００６８】
IｇGカッパおよびラムダELISA結果（すなわち、抗体カクテル内の両抗体の比率として表わす）は、５±３℃および２５±２℃で６ヵ月間まで、また４０±２℃で３ヵ月間まで標的仕様内に留まった。これらの結果に基づき、抗体カクテル中のCR５７およびCR４０９８含有量が５±３℃および２５±２℃で６ヵ月間、また４０±２℃で３ヵ月間にわたって変化しないと結論付けた。５±３℃で６ヵ月間貯蔵した抗体カクテルのIEFジェルパタ−ンはｔ＝０ヶ月のものに匹敵した（表９参照）。追加のバンドが２５±２℃で貯蔵したサンプルの３ヶ月および６ヵ月後に観察され、またいくつかの追加バンドが４０±２℃で貯蔵したサンプルの１ヶ月および３ヵ月後に観察された（表９参照）。より高い貯蔵温度で得られたこれら追加バンドは分解の最初の徴候であるかもしれない。
【００６９】
５±３℃で貯蔵した６ヵ月後の抗体カクテルのSDS−PAGE（還元および非還元）バンドパターンはｔ＝０ヶ月でのバンドパタ−ンに匹敵した（表９参照）。追加のバンドは検出されなかった。２５±２℃で３ヵ月間まで貯蔵した抗体カクテルは、還元SDS−PAGE条件下でｔ＝０ヶ月のバンドパターンと一致するバンドパターンを示した。非還元条件下では、約４３kＤａのサイズを有する弱いバンドが２５±２℃で３ヵ月間の貯蔵後に観察された。２５±２℃で６ヶ月間の貯蔵後、還元および非還元のSDS−PAGE分析は４０ｋＤａまでの弱いバンドを示した。同様の結果が、４０±２℃で貯蔵した抗体カクテルに対するSDS−PAGE分析（還元および非還元）により得られた。さらに、１０〜１５ｋDａのサイズを有するより小さいバンドが、この貯蔵条件下で検出された。これらの結果に基づき、２５±２℃および４０±２℃で貯蔵したCR５７および CR４０９８の重鎖および／または軽鎖のいくらかの分解が時間とともに生起し得ると結論した。
【００７０】
５±３℃および２５±２℃で６ヵ月間まで貯蔵した抗体カクテルのHPSECパタ−ンは、ｔ＝０ヶ月のパタ−ンによく匹敵する。「９５%以上の主ピ−ク面積」の標的仕様がすべてのケ−スで満たされた（表９参照）。二量体ピ−クは１%未満（表面積）に留まり、分解ピ−クは試験したサンプルの全てで検出されなかった。４０±２℃で貯蔵した抗体カクテルは、前記２つの低温度で貯蔵した抗体カクテルと比較し、３ヵ月後のわずかな分解並びにわずかに増加したニ量体ピーク（２．６％（表面積））とを示した。しかしながら、４０±２℃でさえ、「９５%以上の主ピ−ク面積」の標的仕様が、試験したすべての貯蔵時間で満たされた（表９参照）。
【００７１】
三つの後者の方法で得た結果に基づき、抗体カクテルにおける抗体の著しい分解は、５±３℃または２５±２℃で６ヶ月間の貯蔵中に起こらないが、わずかな凝集および分解が４０±２℃で３ヵ月間までの貯蔵後に観察されたと結論した。
【００７２】
要約すると、抗体カクテルは５±３℃および２５±２℃の貯蔵条件で少なくとも６ヶ月間、また４０±２℃の貯蔵条件で少なくとも３ヶ月間安定であると結論した。
【００７３】
SDS−PAGE（NR+R）、IEF、HP−SEC、RFFIT、カッパ／ラムダELISAで得た１２ヵ月後の結果（類似した結果が９ヵ月後に得られ、デ−タでは示されていない）に基づき、抗体カクテルが５±３℃の貯蔵条件で少なくとも１２ヶ月間安定であると結論した。
【００７４】
分析検定（SDS−PAGE、IEF、HP−SEC、ＥＬＩＳＡ；デ−タでは示されていない）で得た１８ヵ月後の結果に基づき、抗体カクテルが５±３℃の貯蔵条件で少なくとも１８ヵ月間安定であると結論した。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
【表２】
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【００７７】
【表３】
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【００７８】
【表４】
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【００７９】
【表５】
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【００８０】
【表６】
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【００８１】
【表７】
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【００８２】
【表８】
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【００８３】
【表９】
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【００８４】
＋１：無色透明な液体、＞１０粒子／ｍｌ
＋２：バンドパターンはＷＳ＃に匹敵し、約４３ｋＤａのサイズを有する弱い追加の不純物バンドを含む
＋３：バンドパターンはＷＳ＃に匹敵し、約１０，１５および４３ｋＤａのサイズを有する弱い追加の不純物バンドを含む
＋４：逸脱、弱いバンドが４３ｋＤａの周りに出現
＋５：バンドパターンはＷＳ＃に匹敵し、約１０ｋＤａ，１５ｋＤａおよび２５−５０ｋＤａのサイズを有する弱い追加の不純物バンドを含む
＋６：バンドパターンはＷＳ＃で確認、８．０−８．５ｐＩ−面積にバンドのより高い汚染強度
＋７：逸脱、弱いバンドがｐＩ７．５以下に出現、８．０−８．５ｐＩ−面積に異なる汚染強度
＋８：バンドパターンはＷＳ＃で確認、弱い追加バンド（ｐＩ７．２，７．３，８．６）
＋９：バンドパターンはＷＳ＃で確認、弱い追加バンド（ｐＩ範囲６．３−７．４およびｐＩ８．６）
【００８５】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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