(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの染色体遺伝子座における条件付き長距離染色体相互作用のエピジェネティックな変化をモニターする方法であって、前記長距離相互作用の様々な立体構造は、癌、心血管障害、炎症性症状(自己免疫障害及び感染性疾患に対する炎症性応答を含む)及びエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害の中から選択される症状に関連する1以上の遺伝子の発現レベルの変化又は1以上の遺伝子産物の変化と関係があり、前記方法は、
(i)少なくとも1つの染色体遺伝子座に存在する前記長距離染色体相互作用をin vitroで架橋するステップ、
(ii)前記染色体遺伝子座から架橋されたDNAを単離するステップ、
(iii)前記架橋されたDNAを、少なくとも1つの染色体遺伝子座内で少なくとも1回切断する酵素を用いて制限消化するステップ、
(iv)前記架橋され切断されたDNA末端をライゲートしてDNAループを作るステップ、
(v)前記DNAループの存在を同定するステップ、
を含むものであり、ここでDNAループの存在は特異的長距離染色体相互作用の存在を示し、且つ、前記長距離染色体相互作用は、遺伝子とその調節エレメントとの間の長距離相互作用ではない、上記方法。
【請求項２】
DNAループの存在を、PCR技法を用いて同定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
DNAループの存在が特定の生理症状の指標である改変された転写状態を示す、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エピジェネティックな変化をモニターする方法、特定の生理症状を診断する方法ならびに生理症状を治療するためのアンチセンスRNAの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核生物ゲノムは複雑な高次構造物に組織化されており；実際、抽出されたクロマチンの初期の電子顕微鏡写真は、放射状ループを形成する非ヒストンスカフォールドを示した（Earnshaw and Laemmli, 1983, J Cell Bio 96, 84-93）。哺乳動物ゲノムにおける非拘束の負の超らせんは染色体「ドメイン」が数十キロ塩基のオーダーのサイズであることを示唆する（Kramer and Sinden, 1997, Biochem 36, 3151-3158）。さらに最近、3C技法（Capturing Chromosome Conformation：染色体立体構造を捕捉する技法）を用いてさらに高次の長距離相互作用が広範な真核生物に存在することが実証されており、それにはS. cerevisiae （Dekker et al, 2002, Science 295, 1306-1311）、ハエ（Blanton et al , 2003 Genes Dev 17, 664-675）、マウス（Tolhuis et al , 2002, Mol Cell 10, 1453-1465）およびヒト（Carroll et al , 2005, Cell 122, 33-43）の細胞が含まれ、一般にサイズはキロ塩基である。哺乳動物細胞において、エンハンサーまたは遺伝子座制御領域と活性的に発現される遺伝子との結合はβ-グロビン（Tolhuis et al, 2002, Mol Cell 10, 1453- 1465）およびC反応性タンパク質（Choi et al, 2007, Nucleic Acids Res 35, 5511-5519）遺伝子座、ならびに組換え免疫グロブリン遺伝子の共ループ形成（Skok et al , 2007, Nat Immunol 8, 378-387）において示されている。哺乳動物の細胞において、進行中の転写はゲノム組織化と遺伝子ループ形成を駆動すると提案されている（Chakalova et al, 2005 Nat Rev Genet 6, 669- 677；Marenduzzo et al , 2007, Trends Genet 23, 126-133およびそれらの参考文献）、しかし最近の分析は、少なくともβ-グロビン遺伝子座について、いくつかの長距離DNA相互作用は転写が阻止された後も維持されることを示唆し（Palstra et al, 2008 PLoS ONE 3, el661）、関わったRNAポリメラーゼがクロマチンループを結ぶひもとして機能することを示唆するモデルに反論している。
【０００３】
酵母ゲノムにおいては、活性転写が「遺伝子ループ」の形成、すなわち活性遺伝子の5'と3'域を連結する長距離相互作用にとって重要であることは明らかである（Ansari and Hampsey, 2005 Genes Dev 19, 2969- 2978；O'Sullivan et al, 2004, Nat Genet 36, 1014-1018；Singh and Hampsey, 2007, Mol Cell 27, 806-816;）。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、プロモーターとターミネーターの両方におけるTF11BとRNAPIIのリン酸化型の存在を実証する。さらに、官能性TF11Bがこれらの長距離相互作用の形成に必要である（Singh and Hampsey, 2007, Mol Cell 27, 806-816）。TFIIBは非コードRNAと相互作用しうるので、非コードRNAによりTFIIBの消失が促進されるとDHFRの長距離相互作用の消失をもたらす（Martianov et al , 2007, Nature 445, 666-670）。
【０００４】
ゲノム全体に転写される高レベルの非コードRNAはオープンリーディングフレームに対するアンチセンスの転写物を含む。これらは真核生物と原核生物の両方のゲノムにおいて特徴をなす（Johnson et al, 2005, Trends Genet 21, 93-102；Kapranov et al , 2007, Nat Rev Genet 8, 413-423；Selinger et al, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 103, 4192-4197）。真核生物において、これらの転写物の多くは決してタンパク質への翻訳を予定するものでなく、いくつかはTRAMP複合体によるエキソソームが介在する分解の標的となっている。酵母ではこれらの機能未知不安定転写物（CUT：Cryptic Unstable Transcripts）がプロモーターにおいて（Berretta et al, 2008, Genes Dev 22, 615-626；Davis and Ares, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 3262- 3267）、遺伝子間領域において（Wyers et al , 2005, Cell 121, 725-737）、および遺伝子のアンチセンス（Camblong et al, 2007 Cell 131, 706-717; Uhler et al , 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104, 8011-8016）において検出される。
【０００５】
S. cerevisiae由来のRNAのプロファイルをゲノムのタイリングアレイを用いて作成する詳細な実験は、酵母ゲノムの実質的に全ての部分で転写が起こることを示している（Perocchi et al, 2007, Nucleic Acids Res 35, el28；Samanta et al , 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 4192-4197；Miura et al et al, 2006, PNAS 103, 17846-17851；Hongay et al, 2006, Cell 127, 735-745；David et al , 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 5320-5325；Havilio et al , 2005, BMC Genomics 6, 93）。これらの分析はまた、100〜370個の遺伝子が少なくとも部分的に両方向に転写され、安定なポリアデニル化センスおよびアンチセンス転写物を生じることも示す。これらの遺伝子の多くは活性因子により転写される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Earnshaw and Laemmli, 1983, J Cell Bio 96, 84-93
【非特許文献２】Kramer and Sinden, 1997, Biochem 36, 3151-3158
【非特許文献３】Dekker et al, 2002, Science 295, 1306-1311
【非特許文献４】Blanton et al , 2003 Genes Dev 17, 664-675
【非特許文献５】Tolhuis et al , 2002, Mol Cell 10, 1453-1465
【非特許文献６】Carroll et al , 2005, Cell 122, 33-43
【非特許文献７】Choi et al, 2007, Nucleic Acids Res 35, 5511-5519
【非特許文献８】Skok et al , 2007, Nat Immunol 8, 378-387
【非特許文献９】Chakalova et al, 2005 Nat Rev Genet 6, 669- 677
【非特許文献１０】Marenduzzo et al , 2007, Trends Genet 23, 126-133
【非特許文献１１】Palstra et al, 2008 PLoS ONE 3, el661
【非特許文献１２】Ansari and Hampsey, 2005 Genes Dev 19, 2969- 2978
【非特許文献１３】O'Sullivan et al, 2004, Nat Genet 36, 1014-1018
【非特許文献１４】Singh and Hampsey, 2007, Mol Cell 27, 806-816
【非特許文献１５】Martianov et al , 2007, Nature 445, 666-670
【非特許文献１６】Johnson et al, 2005, Trends Genet 21, 93-102
【非特許文献１７】Kapranov et al , 2007, Nat Rev Genet 8, 413-423
【非特許文献１８】Selinger et al, 2000, Proc Natl Acad Sci USA 103, 4192-4197
【非特許文献１９】Berretta et al, 2008, Genes Dev 22, 615-626
【非特許文献２０】Davis and Ares, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 3262- 3267
【非特許文献２１】Wyers et al , 2005, Cell 121, 725-737
【非特許文献２２】Camblong et al, 2007 Cell 131, 706-717
【非特許文献２３】Uhler et al , 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104, 8011-8016
【非特許文献２４】Perocchi et al, 2007, Nucleic Acids Res 35, el28
【非特許文献２５】Samanta et al , 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 4192-4197
【非特許文献２６】Miura et al et al, 2006, PNAS 103, 17846-17851
【非特許文献２７】Hongay et al, 2006, Cell 127, 735-745
【非特許文献２８】David et al , 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 5320-5325
【非特許文献２９】Havilio et al , 2005, BMC Genomics 6, 93
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはGAL遺伝子座をモデル系として利用し、誘導および抑制状態を比較してアンチセンス転写物の相違とエピジェネティックな調節を観察した。本発明者らは、誘導および抑制状態の両方を制御するアンチセンス転写物がGAL遺伝子座に存在し、これらの転写物はサイズ、位置および存在量が異なることを示す。誘導された遺伝子座における非常に豊富なアンチセンス転写物は、GAL10プロモーターからのセンス転写物の産生と関係がある。さらに、アンチセンス転写物のレベルは遺伝子座に結合したHda1のレベルと強い相関があるが、ヒストンアセチル化自体とは相関がない。本発明者らはまた、Hda1は抑制されたGAL遺伝子座において長距離相互作用に必要であると思われることを同定し、抑制状態におけるアンチセンス転写物、エピジェネティックな改変および高次クロマチン構造物の間の関連を示唆する。抑制状態から誘導状態へのスイッチング時の遺伝子座の立体構造変化は、これを制御するアンチセンスRNAの関与が同定されている。本発明は、遺伝子抑制はアンチセンス転写物の産生と遺伝子座の特異的エピジェネティックな変化に関わる調節の前活性状態であるという発見に基づく。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】GAL10における条件付きアンチセンス転写物である。GAL10において、センスおよびアンチセンス特異的プローブを用いて探索した全RNAのノーザンブロットを示す。A、B：株BY4741をガラクトース（レーン1）で培養したもの、洗浄したもの（レーン2）、およびグルコースを含有する培地に移して15分（レーン3）、60分(レーン4)、120分(レーン5)、180分(レーン6)または360分(レーン7)経たもの。Bではアンチセンスシグナルの2種類の露出を示した。rRNAバンドの位置を示した。Bの左パネルとパネルAは同じ時間だけ露出した。2.25kbと2.4kb GAL10 AS（図3Bを参照）は両方とも検出可能であり、15分に活性から抑制状態へのスイッチが起こる。C：ガラクトース中で一晩培養した酵母を洗浄し、示した糖を含有する新鮮な培地に移した。この実験において、GAL10とGAL10-7融合転写物の高いレベルがガラクトース中で明らかであり、等価のアンチセンス転写物を伴う。センス露出はアンチセンスの20％である。2倍多いRNAをレーン2に負荷した*。
【図２】GAL遺伝子座における逆転写(RT)-PCRマッピング転写物である。A：センス（S）またはアンチセンス（AS）転写物の逆転写(RT)用RTプライマーおよびPCR増幅用のネストしたプライマーの位置を示す。プライマーの各セットは、GAL遺伝子座に示した部位の領域約200〜300bpを増幅するように設計した。B：3種の炭素供給源中のセンスおよびアンチセンス転写物のGAL7とGAL10にまたがるマッピング。グルコース中で調製したRNAに対するRTaseを欠く対照をレーン7に示した。C：グルコース中で増殖した細胞から調製した全RNAのGAL7およびGAL10におけるアンチセンス転写物のマッピング。対照はRTステップを省いたものと全DNAについてのPCRプライマー効率用のポジティブ対照（示してない）を含む。
【図３】鎖特異的プローブによるGAL遺伝子座における転写物のマッピングである。A：グルコース、ラフィノースまたはガラクトース中で培養して1本鎖特異的プローブ1〜7とハイブリダイズしたBY4741（レーン1）、W303-1a（レーン2）およびYMH147（レーン3）から調製した全RNAのオートラジオグラフ（全て、GAL10に関するアンチセンス転写物を検出するように設計した）。rRNA（RDN25およびRDN18）およびtRNAの位置を、24時間露出したオートラジオグラフを横切る黒色の線でマークした。B：図2および図3Aのデータの総括であり、抑制（グルコース）または誘導（ガラクトース）された遺伝子座における転写物を示す。
【図４】GAL10の3'末端の配列がセンス転写物の誘導のために必要であることを示す。A：抑制または誘導されたGAL10（WT）およびGAL10の誘導体（GAL10の3'末端における554bpの欠失を生じるpTEF：KanMX：TEFter（Mut）挿入を含有する）における主要な転写物の位置を示す模式図である。BおよびC：示した炭素供給源で培養した示された菌株から得た全RNAのノーザンブロット。Bでは、rRNAの位置を点線で示し、センスおよびアンチセンス特異的プローブを用いた。オートラジオグラフは等価の時間だけ露出した。Cでは培養を誘導し、ラフィノース（レーン1）からガラクトース（レーン2〜6）へ移した後、10分間隔にサンプルを調製した。
【図５】Hda1およびEaf3のGAL10との結合は、アンチセンス転写物のレベルと関係がある。細胞をガラクトース中で一晩培養し、ガラクトースまたはグルコースを含有する新鮮培地に20分間移し、そしてこの細胞から調製したクロマチンの免疫沈降を、GAL10のリアルタイムPCRを用いて検出した。A：無タグ対照に規準化したHda1-myc。B：無タグ対照に規準化したEaf3。C：H3K18Rと次いでヒストンH3に規準化したH3K18ac。
【図６】抑制されたGAL遺伝子座における免疫沈降による3Cを示す。A：DpnII制限酵素切断部位（垂直線）のマップであり、プライマー（矢印3'OH）の番号、位置および方向、ならびに抑制された遺伝子座において誘導されたセンス転写物とアンチセンス転写物の近似的な位置を示す。B：示した菌株（BY4741バックグラウンド）において示した部位におけるIP（Rbp1トップ3パネル、Mycボトムパネル）による3C。C：無ホルムアルデヒド架橋（-Form）、無消化（-dig）、無DNAリガーゼ、無ATP（-lig）を含む標準反応に対する対照。ゲル上には3C産物（-IPステップ）および免疫沈降（Expt）による標準3Cがある。GAL10における長距離相互作用に対するPCR産物を示した。全ての他の相互作用は類似の依存性を示した（データは示してない）。D：示した菌株（BY4741バックグラウンド）の示した部位におけるIP（Rbp1）による3C。
【図７】GAL遺伝子座における条件付き長距離相互作用を示す。A：DpnII制限酵素切断部位（垂直線）のマップであり、プライマー（矢印3'OH）の番号、位置および方向、ならびに抑制された遺伝子座において誘導されたセンス転写物とアンチセンス転写物の近似的な位置を示す。B：示した炭素供給源で増殖したBY4741細胞から単離したクロマチンからの、示した部位における3C IP（Rbp1）産物。C：3種の異なる炭素供給源中で増殖したWT菌株（BY4741バックグラウンド）におけるGAL10-7とFMP27にわたる3C IP（Rbp1）。D：抑制された遺伝子座における動的長距離相互作用に対するモデル。GAL7（示した）、GAL10および遺伝子間領域の他の非コード転写物からのアンチセンス転写物はHda1およびEaf3リシンデアセチラーゼと一緒に、長距離相互作用にとって好適な環境を作製することを提案した。グルコース中では、GAL10、GAL7およびGAL10-7にまたがる相互作用が検出可能であり、これに適応するモデルを示した。これらのRNAPIIおよびTFIIBとの結合があれば、長距離相互作用は、遺伝子座において活性転写のない、バランスのとれたしかし抑制された状態を表すようである。E：GAL遺伝子座における条件付き長距離相互作用に対するモデル。抑制された遺伝子座においては、長距離相互作用は遺伝子全体にバランスのとれた非活性状態を表すようである。グルコース抑制が除かれると（すなわち、ラフィノース中では）GAL10およびGAL7における長距離相互作用に関わる動的スイッチングの増加によってGAL10-7に対する長距離相互作用が消失しうる。活性転写の開始は発現された状態と抑制された状態の間の動的スイッチングの一因となりうる。誘導された遺伝子座におけるアンチセンス転写物の産生は2つの役割：センス転写物の産生を容易にすることおよび遺伝子が活性的に発現されないときにはEaf3およびHda1を介して抑制および長距離相互作用形成のための領域を前もって作ることと思われる。
【図８】In vivo CTCF依存性転写系を示す。a：組み込まれたルシフェラーゼレポーター遺伝子は、プロモーターの代わりに、野生型90bp CTCF-結合部位N-Myc（pN-MycLuc wt）またはCTCF結合を欠く変異体（pN-MycLuc mut）を含有する13。b：示したプライマーをもつ組み込まれた構築物の拡大マップ。N-Myc部位におけるChIPアッセイ用のプライマーを赤色で示すが、これは先に記載されている13。5'におけるプライマーを褐色で、3'におけるプライマーを青色で示し、；3Cおよび4Cアッセイで用いたプライマーを緑色で示した。これらのプライマーを、オンライン補足の「材料と方法」の項に記載した。関係するTaqI制限酵素切断部位は青色三角形で示し；それらの位置をルシフェラーゼ転写出発部位に関してマークした。c：野生型CTCF結合部位の存在はpN-MycLuc wtにおけるルシフェラーゼ発現を駆動するのに十分であり；α-アマニチンによる処理はルシフェラーゼの活性を著しく低減する。d：CTCFとPol IIはpN-MycLuc wtではN-Myc部位と結合するが、記した抗体によるChIPアッセイにより示されるように、pN-MycLuc mutでは結合しなかった。e：記した抗体によるChIPアッセイにより示されるように、α-アマニチンによる処理はPol IIを解離に導くが、CTCFをN-Myc 部位から解離しない。パネル"d"および"e"において、分析に用いたプライマーを図8bに赤色で示したが、これは先に記載されている13。
【図９】クロマチン立体構造捕捉（3C）およびChIPアッセイを示す。a：5'および3'末端（図8bの緑色矢印）は、3Cアッセイにより示されるように、pN-MycLuc wt（レーン3）に並置するが、N-MycLuc mut（レーン4）に並置しない。レーン1はライゲートしたテンプレートのポジティブ対照であり、レーン2はネガティブなライゲーション対照である。分析に用いたプライマーをオンライン補足の「材料と方法」の項に記載した。b：pN-Myc Luc wtの5'（レーン3）および3'（レーン5）部位は、抗-Pol II抗体のChIPアッセイにより示されるように、Pol IIにより占有されているが、pN-Myc Luc mutのそれら（レーン4および6）は占有されてない。レーン1-入力、レーン2-免疫前血清。c：pN-Myc Luc wtの5'（レーン3）および3'（レーン5）部位は、CTCFにより占有されているが、pN-Myc Luc mutのそれら（レーン4および6）は占有されてない。レーン1-入力、レーン2-免疫前血清。パネル「b」および「c」において、5'末端特異的プライマーは褐色で示し、3'末端特異的プライマーは青色で示した。
【図１０】抗Pol IIとCTCF抗体を用いる4Cアッセイ（ChIPと3Cアッセイの組合わせ）である。分析用に用いたプライマーを図8bにて緑色で示し、オンライン補足の「材料と方法」の項において記載した。a：Pol IIはpN-MycLuc wt（レーン3）の5'および3'に並置するが、pN-MycLuc mut（レーン4）に並置しない。α-アマニチンによる処理は、pN-MycLuc wt（レーン5）の高次クロマチン構造からPol IIは消滅させる。b：CTCFはpN-MycLuc wt（レーン3）の5'および3'に並置するが、pN-MycLuc mut（レーン4）に並置しない。CTCFはα-アマニチンによる処理後もなお、pN-MycLuc wt（レーン5）の高次クロマチン構造に関係している。
【図１１】CTCFがいかに高次クロマチン構造の転写に連結するかを示すモデルである。a：CTCFはpN-MycLuc wtの5'および3'末端の2つの部位と結合する；b：高次構造がCTCFを介してpN-MycLuc wtの5'と3'末端の間に確立される；c：Pol IIがCTCFと結合して転写を開始する；d：転写の阻害とPol IIの除去の後、残存する前記構造をCTCFとの結合によってなお検出することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の最初の態様によれば、少なくとも1つの染色体遺伝子座における条件付き長距離染色体相互作用の変化をモニターするステップを含む、エピジェネティックな変化をモニターする方法であって、前記長距離相互作用のスペクトルは特定の生理症状と関係があり、前記方法は
(i)少なくとも1つの染色体遺伝子座に存在する前記長距離染色体相互作用をin vitroで架橋するステップ、
(ii)前記染色体遺伝子座から架橋されたDNAを単離するステップ、
(iii)前記架橋されたDNAを、少なくとも1つの染色体遺伝子座内で少なくとも1回切断する酵素を用いて制限消化するステップ、
(iv)前記架橋され切断されたDNA末端をライゲートしてDNAループを作るステップ、
(v)前記DNAループの存在を同定するステップ
を含んでなり、DNAループの存在が特異的長距離染色体相互作用の存在を示すものである、前記方法を提供する。
【００１０】
条件付き長距離染色体相互作用が常にクロマチンに存在しうることは理解されるであろう。さらに、これらの相互作用は動的であって、染色体の領域の状態に依存して変わりうる、すなわち、生理症状の変化に応答して転写されるかまたは抑制されることは理解されるであろう。
【００１１】
本明細書で使用する用語「条件付き長距離相互作用」は、染色体上の遺伝子座の遠隔の領域の間の相互作用を意味し、前記相互作用は動的であって染色体の領域の状態に依存して変わるものである。
【００１２】
本明細書で使用する用語「長距離相互作用のスペクトル」は所与の染色体遺伝子座において存在しうる長距離染色体相互作用の色々な立体構造を意味する。上記の通り、これらの相互作用は動的であって遺伝子座の状態に依存して形成するまたは破壊する様々な長距離相互作用をもつことは理解されるであろう。
【００１３】
さらに、長距離相互作用はいずれかの好適な手段により架橋できることは理解されるであろう。好ましい実施形態においては、長距離染色体相互作用をホルムアルデヒドを用いて架橋する。
【００１４】
さらに、存在するDNAループは前記染色体遺伝子座の転写または抑制、あるいは、前記染色体遺伝子座からの改変された産物の発現を示すことは理解されるであろう。
【００１５】
GAL遺伝子座に関するDNAループの存在は、下記の通り、同定することができる。当業者は容易にわかることであるが、この遺伝子座に関して記載した本方法は、長距離相互作用が起こると考えられる他の遺伝子座に適合させて利用することができる。これらのループは、3C（Capturing Chromosome Conformation）アッセイなどの当技術分野で公知の技法を用いて検出することができる（Dekker, 2006, Nat Method 3, 17-21；Dekker et al , 2002, Science 295, 1306-1311；O'Sullivan et al , 2004, Nat Genet 36, 1014-1018）。
【００１６】
当業者は、目的の染色体遺伝子座内のDNAを切断するために利用できる多数の制限酵素を知るであろう。使用する特定の酵素は研究するループとそこに位置するDNAの配列に応じて決められることは明らかであろう。
【００１７】
本発明は、条件付き長距離染色体相互作用は染色体上の所与の遺伝子座に常に存在し、条件付き長距離染色体相互作用はその領域の実際の状態、その活性および生理症状に応じて変化する、すなわち、特定の長距離相互作用の存在もしくは不在はその領域の状態の指標を提供しうるという、本発明者らによる驚くべき発見に基づくものである。
【００１８】
さらに、本発明者らは、初期の遺伝子データと一致して、これらの条件付き長距離相互作用は、関連するかまたは未記載の遺伝子をコードすることが示された染色体の領域をオーバーラップし、また等しく遺伝子間領域に存在しうることを発見した。さらに注目すべきことに、本発明者らは、染色体遺伝子座の状態を決定する上で全領域の長距離相互作用が等しく重要であることを発見した。これらの長距離相互作用は遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域に必ずしも存在せず、遺伝子間領域に存在しうる。
【００１９】
当業者がさらに理解しうることとして、用語エピジェネティックな（epigenetic）変化は根底をなすDNA配列に対する変化とは別の変化により引き起こされる細胞内の遺伝機能の遺伝的変化を意味し、これらの変化は、例えば、環境因子、DNAメチル化、非コードアンチセンスRNA転写物、非変異原性発癌物質、ヒストン改変、クロマチンリモデリングおよび特定の局所的長距離DNA相互作用により引き起こされ、これらは全て、目的の領域内の遺伝子もしくは非コードRNA転写ユニットに対する規定された転写活性のための特異的環境を作製することに関係している。
【００２０】
エピジェネティックな変化は、それ自体は遺伝子産物または遺伝子発現の様式に直接影響を与えない、根底をなす核酸配列に対する変化により引き起こされてもよく、かかる変化は、例えば、遺伝子の内部および／または外部のSNP、ならびに遺伝子間DNAの遺伝子融合物および／または欠失物であってもよいことは理解されるであろう。
【００２１】
さらに明らかでありうるのは、用語「特定の生理症状」は細胞の規定された生理状態の変化が存在するいずれかの症状を意味する。これは1以上の遺伝子の発現のレベルの変化、または1以上の遺伝子産物の変化であってもよい。かかる症状の例には、癌（良性もしくは悪性増殖）、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および発症中の感染性疾患に対する炎症性応答を含む）、エピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害、および神経変性疾患が含まれる。
【００２２】
好ましくは、DNAループの存在はPCR技法を用いて同定される。ループの存在はDNAループが不在のときは不在であるPCR産物の存在により示すことができ、逆もまた同様であることは理解されるであろう。産生するPCR産物のサイズは存在する特定のDNAループの指標でありうるし、従ってこれを利用して遺伝子座の状態を同定できることは理解されるであろう。
【００２３】
一つの好ましい実施形態において、DNAループの存在は、特定の生理症状の指標である改変された転写状態を示す。
【００２４】
第二の好ましい実施形態において、DNAループの不在は、特定の生理症状の指標である改変された転写状態を示す。
【００２５】
当業者には、第一の態様による方法は染色体遺伝子座における特定の長距離染色体相互作用の存在をモニターするためだけでなく、前記染色体遺伝子座における特定の長距離染色体相互作用の不在をモニターするためにも等しく利用できることは明らかであろう。
【００２６】
好ましくは、生理症状は、癌、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および感染性疾患に対する炎症性応答を含む）、ならびにエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害の中から選択される。少なくとも1つの長距離染色体相互作用の変化をもたらす他の症状も現行の方法により同定することができる。
【００２７】
本発明のいずれの態様においても、サンプルの条件付き長距離染色体相互作用の変化は、同じ組織もしくは細胞型の異なる時点におけるある遺伝子座の長距離染色体相互作用の立体構造を比較することによりまたは公知の生理状態に対応するサンプルとの比較によりモニターできることは理解されるであろう。
【００２８】
さらに、本発明の長距離染色体相互作用は遺伝子とその調節エレメントとの間の長距離相互作用（例えば、先にChambeyron et al. , (2004) , Curr Opin Biol. 16, 256-262；de Laat et al., (20030 Chromosome res. 11, 447-459；およびDekker, (2003) , J. Trends Biochem. Sci. 28, 277-280により記載されている）と無関係であることを理解すべきである。むしろ、本発明は遺伝子活性のスイッチの指標としての、特定の遺伝子座内の長距離相互作用における条件の変化に関係する。
【００２９】
本発明の第二の態様によれば、少なくとも1つの染色体遺伝子座における条件付き長距離染色体相互作用の変化をモニターすることを含む、エピジェネティックな変化をモニターする方法であって、前記長距離相互作用のスペクトルは特定の生理症状と関係があり、前記方法は少なくとも1つの染色体遺伝子座から発現されるアンチセンスRNAプロファイルの変化を同定するステップを含むものである前記方法を提供する。
【００３０】
アンチセンスRNAプロファイルの変化はアンチセンスRNA転写物のサイズ、出発位置、および／または数の変化でありうることは当業者には明らかであろう。
【００３１】
抑制された染色体遺伝子座におけるアンチセンスRNA転写物の産生の現象は公知であるこ１とを当業者は理解するであろう。しかし、本発明者らは驚くべきことに、染色体遺伝子座から転写されたアンチセンスRNAのプロファイルはその遺伝子座が誘導または抑制されているかどうかに依存して変化すること、および産生したアンチセンスRNA転写物は特定の遺伝子座からのセンスRNA転写物の転写および（長距離相互作用を含む）遺伝子座におけるエピジェネティックな状態に中心的役割を果たすことを発見した。
【００３２】
本発明の第三の態様によれば、被験者における少なくとも1つのエピジェネティックな変化に関係する障害を診断する方法であって、被験者から単離したサンプル中の前記障害に関係する少なくとも1つの染色体遺伝子座における1以上の長距離染色体相互作用の変化を同定するステップを含むものであり；前記態様の1つまたは2つの方法を含む前記方法を提供する。
【００３３】
好ましくは、エピジェネティックな変化は染色体遺伝子座からの転写の改変をもたらす。
【００３４】
転写の改変はアップレギュレーション、抑制、または出発部位および／または終結部位が変化した代わりの転写物、またはそのスプライス変異体の産生であってもよいことは理解されるであろう。
【００３５】
エピジェネティックな変化は、ゲノムの非コード部分内の少なくとも1つの遺伝子および／または転写ユニットの発現の変化を引き起こすことは明らかであろう。
【００３６】
好ましくは、障害は癌、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および感染性疾患に対する炎症性応答を含む）およびエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害の中から選択される。少なくとも1つの長距離染色体相互作用の変化をもたらす他の症状も本発明の方法により診断することができる。
【００３７】
本発明の第四の態様によれば、改変された遺伝子発現に関係する障害のある患者における少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記少なくとも1つの遺伝子の転写を改変するために有効な量のアンチセンスRNAを前記患者に投与するステップを含むものである前記方法を提供する。
【００３８】
一実施形態において、障害は前記少なくとも1つの遺伝子の過剰発現からもたらされる。
【００３９】
障害は前記少なくとも1つの遺伝子の抑制から、または前記少なくとも1つの遺伝子からの改変された遺伝子産物の産生から等しく生じうることは当業者には明らかである。
【００４０】
好ましくは、障害は癌、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および感染性疾患に対する炎症性応答を含む）、ならびにエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害の中から選択される。
【００４１】
好ましい実施形態において、前記アンチセンスRNAは少なくとも1つのCTCF結合部位を標的化する。
【００４２】
CTCFは、以下に考察する通り、高次クロマチン構造を構築しかつ維持するのに関係する多機能因子である。
【００４３】
さらなる好ましい実施形態において、前記RNAの投与はHDAC酵素のモジュレーションをもたらす。
【００４４】
ヒストンアセチル化が転写のモジュレーションに関わることは公知である。このモジュレーションはまた、アンチセンスRNAを介して制御されることが示唆されている。
【００４５】
HDAC酵素は、配列同一性とドメイン組織によって4つのクラスに分類されている。好ましい実施形態において、前記HDAC酵素はクラスi〜ivのHDAC酵素から選択される。
【００４６】
クラスIのHDAC酵素には、HDACl、HDAC2、HDAC3、HDAC8が含まれ；クラスIIのHDAC酵素には、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAC10が含まれ；クラスIIIのHDAC酵素には、酵母Saccharomyces cerevisiaeのSir2の同族体、および哺乳動物のサーチュイン（SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7）が含まれ；クラスIVのHDAC酵素には、HDAC11が含まれる。
【００４７】
本発明の第五の態様によれば、改変された遺伝子発現に関係する障害のある患者における少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記遺伝子のモジュレーションに関係するアンチセンスRNA分子と相補的な妨害RNAを前記患者に投与するステップを含むものである前記方法を提供する。
【００４８】
障害は前記少なくとも1つの遺伝子の過剰発現または抑制からか、または前記少なくとも1つの遺伝子からの改変された遺伝子産物の産生から生じうることは当業者には明らかであろう。
【００４９】
好ましくは、障害は癌、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および感染性疾患に対する炎症性応答を含む）、ならびにエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害の中から選択される。
【００５０】
本発明の第六の態様によれば、改変された遺伝子発現に関係する障害を治療するための、前記遺伝子の転写を調節するアンチセンスRNAを提供する。
【００５１】
本発明の第七の態様によれば、改変された遺伝子発現に関係する障害を治療する医薬の製造における、前記遺伝子の転写を調節するアンチセンスRNAの使用を提供する。
【００５２】
好ましくは、第五または第六の態様による障害は、癌、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および感染性疾患に対する炎症性応答を含む）、ならびにエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害の中から選択される。
【００５３】
第一の好ましい実施形態において、前記RNAは前記遺伝子の転写を抑制する。
【００５４】
第二の好ましい実施形態において、前記RNAは前記遺伝子の転写を誘導する。
【００５５】
好ましい実施形態において、前記アンチセンスRNAは少なくとも1つのCTCF結合部位を標的化する。
【００５６】
さらなる好ましい実施形態において、前記アンチセンスRNAはHDAC酵素をモジュレートする。
【００５７】
上記医薬は、希釈剤、フィラー、塩、バッファー、安定剤、可溶化剤などの好適な製薬上許容される担体と一緒に医薬投与剤形に製剤化しうることは当業者には明らかであろう。投与剤形は、pH、浸透圧、食味、粘度、無菌性、親油性、溶解度などの条件を改変するために、他の製薬上許容される賦形剤を含有してもよい。
【００５８】
好適な投与剤形には、固体投与剤形、例えば、錠剤、カプセル、散剤、分散性顆粒、カシェ剤および座薬が含まれ、持続放出および遅延放出剤形が含まれる。散剤および錠剤は一般に約5％〜約7％の活性成分を含む。好適な固体担体および賦形剤は当技術分野では公知であり、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトースなどが含まれる。錠剤、散剤、カシェ剤およびカプセルは全て経口投与用の好適な投与剤形である。
【００５９】
液剤形には溶液、懸濁液および乳濁液が含まれる。液剤形調製物は、静脈内、脳内、腹腔内、非経口または筋肉内の注射または注入により投与することができる。無菌注射剤形は、無毒、製薬上許容される希釈剤または溶媒中の活性薬の無菌溶液または懸濁液を含みうる。好適な希釈剤および溶媒には、無菌水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液などが含まれる。液投与剤形にはまた、鼻腔内投与用の溶液またはスプレーも含まれる。
【００６０】
吸入用に好適なエアロゾル調製物には溶液および粉末状の固体が含まれ、これらは製薬上許容される担体、例えば不活性圧縮ガスとの組み合わせであってもよい。
【００６１】
また、クリーム、ローション、エアロゾルおよび／またはエマルジョンを含む経皮投与用の投与剤形も包含される。これらの投与剤形は、マトリックスまたは貯蔵型の経皮パッチに含まれるものでよく、当技術分野では公知である。
【００６２】
医薬調製物は好都合なように医薬製剤の標準手順に従って単位投与剤形で調製してもよい。単位用量当たりの活性化合物の量は活性化合物の性質および意図する投与計画によって変化しうる。
【００６３】
活性薬はヒト被験者に「治療上有効な量」だけ投与され、これは医学上の所望の結果を患者に与えるのに十分な用量を意味する。治療上有効な量の投与の正確な用量と頻度は、活性物質の性質、投与剤形および投与経路に応じて変化しうる。
【００６４】
本発明の第八の態様によれば、染色体遺伝子座の転写状態を同定する方法であって、前記染色体遺伝子座から発現されるアンチセンスRNA転写プロファイルを同定するステップ；および前記プロファイルを既知の状態における前記染色体遺伝子座のアンチセンスRNA転写プロファイルと比較するステップを含む前記方法を提供する。
【００６５】
好ましくは、前記染色体遺伝子座は少なくとも1つの遺伝子を含む。
【００６６】
好ましくは、前記遺伝子は既知であるかまた特定の生理症状に関わると疑われる遺伝子である。
【００６７】
前記症状はエピジェネティックな変化、例えば、癌、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および感染性疾患に対する炎症性応答を含む）、ならびにエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害に関係するいずれかの症状であってもよいことは理解されるであろう。
【００６８】
好ましくは、前記方法はin vitroで実施される。疑義を生じないために述べると、本発明の一態様に関係して記載した特徴は本発明の全ての他の態様に等しく応用可能である。さらに、いくつもの特徴がオプションとして示される場合、それぞれの個々の特徴を個々にまたはその応用に記載された他の特徴と組合わせて応用可能であると考えられる。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）少なくとも1つの染色体遺伝子座における条件付き長距離染色体相互作用の変化をモニターすることを含む、エピジェネティックな変化をモニターする方法であって、前記長距離相互作用のスペクトルは特定の生理症状と関係があり、前記方法は
(i)少なくとも1つの染色体遺伝子座に存在する前記長距離染色体相互作用をin vitroで架橋するステップ、
(ii)前記染色体遺伝子座から架橋されたDNAを単離するステップ、
(iii)前記架橋されたDNAを、少なくとも1つの染色体遺伝子座内で少なくとも1回切断する酵素を用いて制限消化するステップ、
(iv)前記架橋され切断されたDNA末端をライゲートしてDNAループを作るステップ、
(v)前記DNAループの存在を同定するステップ
を含むものであり、ここでDNAループの存在は特異的長距離染色体相互作用の存在を示す、上記方法。
（２）DNAループの存在をPCR技法を用いて同定する、（１）に記載の方法。
（３）DNAループの存在が特定の生理症状の指標である改変された転写状態を示す、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記生理症状が癌、心血管障害、炎症性症状（自己免疫障害および感染性疾患に対する炎症性応答を含む）およびエピジェネティックな機構によりモジュレートされる遺伝障害のなかから選択される、（１）〜（４）のいずれか１に記載の方法。
（５）少なくとも1つの染色体遺伝子座における条件付き長距離染色体相互作用の変化をモニターするステップを含む、エピジェネティックな変化をモニターする方法であって、前記長距離相互作用のスペクトルは特定の生理症状と関係があり、前記方法は少なくとも1つの染色体遺伝子座から発現されるアンチセンスRNAプロファイルの変化を同定するステップを含むものである、上記方法。
（６）アンチセンスRNAプロファイルの変化がアンチセンスRNA転写物のサイズ、出発位置、および／または数の変化である、（５）に記載の方法。
（７）被験者における少なくとも1つのエピジェネティックな変化に関係する障害を診断する方法であって、先に被験者から単離したサンプルにおいて前記障害に関係する少なくとも1つの染色体遺伝子座における1以上の長距離染色体相互作用の変化を同定するステップを含むものであり、（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法を含む、上記方法。
（８）エピジェネティックな変化が染色体遺伝子座から改変された転写をもたらす、（７）に記載の方法。
（９）改変された転写の変化がアップレギュレーション、抑制、または代わりの転写物の産生である、（７）に記載の方法。
（１０）エピジェネティックな変化が少なくとも1つの遺伝子の発現の変化を引き起こす、（７）〜（９）のいずれか１に記載の方法。
（１１）改変された遺伝子発現に関係する障害を罹患する患者における少なくとも1つの遺伝子の転写を調節する方法であって、前記少なくとも1つの遺伝子の転写を改変するために有効な量のアンチセンスRNAを前記患者に投与するステップを含む、上記方法。
（１２）前記障害が前記遺伝子の過剰発現から生じる、（１１）に記載の方法。
（１３）前記障害が前記遺伝子の抑制から生じる、（１１）に記載の方法。
（１４）前記障害が改変された遺伝子産物の産生から生じる、（１１）に記載の方法。
（１５）前記アンチセンスRNAが少なくとも1つのCTCF結合部位を標的とする、（１１）〜（１４）のいずれか１による方法。
（１６）前記アンチセンスRNAがHDAC酵素のモジュレーションをもたらす、（１１）〜（１５）のいずれか１による方法。
（１７）改変された遺伝子発現に関係する障害の治療に使用するアンチセンスRNAであって、前記遺伝子の転写を調節する、上記アンチセンスRNA。
（１８）前記遺伝子の転写を抑制する、（１７）に記載のアンチセンスRNA。
（１９）前記遺伝子の転写を誘導する、（１７）に記載のアンチセンスRNA。
（２０）染色体遺伝子座の転写状態を同定する方法であって、前記染色体遺伝子座から発現されるアンチセンスRNA転写プロファイルを同定するステップ；および前記プロファイルを既知の状態における前記染色体遺伝子座のアンチセンスRNA転写プロファイルと比較するステップを含む、上記方法。
（２１）in vitroで実施する、（２０）に記載の方法。
【００６９】
本発明をここでさらに以下の実施例および図を参照して記載する。
【実施例】
【００７０】
（実施例１）  GAL遺伝子座のエピジェネティックな制御
GAL10における条件付きアンチセンス転写物
ガラクトース中で増殖する細胞の培養にグルコースを加えると、転写の迅速な阻害が生じる。予想されるように、グルコース添加の15分以内に2.25kb GAL10転写物とそれより長い4.1kb GAL10-7融合転写物の両方のレベル（Greger and Proudfoot, 1998, Embo J 17, 4771-4779；St. John and Davis, 1981, J Mol Biol 152, 285-315）は著しく低下する（図1A）。1つのアンチセンス転写物が、抑制されたGAL10遺伝子において報じられている（Perocchi et al , 2007, Nucleic Acids Res 35, el28；Samanta et al, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 4192-4197；David et al, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 5320-5325；Miura et al, 2006, PNAS 103, 17846-17851）。本発明者らは複数のアンチセンス転写物がGAL10遺伝子の一般的特徴であるかどうか、もしそうであれば、これらの転写物がいつ現れるかを研究した。
【００７１】
誘導された培養において、3つのアンチセンス転写物が観察され（図1B）、そのうちの2つのサイズは誘導されたGAL遺伝子座（図1A）における2.25kbと4.1kbセンス転写物に類似する。第3の検出可能なアンチセンス転写物はもっと小さく、約1.5kbである。図1Aと1Bのオートラジオグラフを類似した特異的活性のプローブとハイブリダイズして類似した長さの時間露出すると、活性GAL10遺伝子においてアンチセンス転写物は全RNAのかなりの比率になることを示唆した。さらに、両方の遺伝子にまたがって伸びる内因性4.1kb GAL10-7転写物（図1A、C）も等価のアンチセンス転写物（図1B、C）と整合した。
【００７２】
グルコース抑制の間、GAL10アンチセンス転写物の存在量はかなり低下する（図1B）。そこで、明確にするため、図1Bでは2つの露出条件のノーザンブロットを示した。図1のデータは抑制された遺伝子座においてアンチセンス転写物のサイズも変化することを示す。動力学的研究は、グルコースを培養に加えて15分後に、4.1kb、2.25kbおよび1.5kbアンチセンス転写物から3種の転写物、約3.5kb、2.4kbおよび1.5kbへのスイッチが観察されることを示す。グルコース添加後15分に、2.25kbと2.4kbの両方の転写物を検出することができる。従って、GAL10におけるアンチセンス転写物の存在量とサイズは、遺伝子が誘導されるかまたは抑制されるかどうかを反映し、アンチセンス転写物がGAL遺伝子座において両方の条件で調節の役割を果たしうるという興味深い可能性を生じる。
【００７３】
RT-PCRを用いる、GAL10周りの転写物のマッピング
PCRと組合わせた鎖特異的プライマーによる逆転写（RT）を用いて、グルコース、ラフィノースおよびガラクトースで培養した細胞のGAL10周りのセンスおよびアンチセンス転写物の位置を決定した（図2）。ここで用いた計画は、およそ200bpの産物を得るセンス（S）またはアンチセンス（AS）転写物のどちらかを検出する特異的なRTプライマーおよびネスト化PCRプライマー（図2A）を使用した。最初に、2.25kb GAL10センス転写物とその等価アンチセンスを分析した。これらはRT-PCRによるマッピングに受け入れられる比較的豊富な転写物である（図2B）。GAL10センス転写物は、GAL10コード領域を横切って位置するプライマーセット6S〜8Sを用いると、ガラクトースで培養した細胞から調製したサンプルにおいてだけ検出することができる（図2B、レーン2）。アンチセンス転写物を逆転写して増幅するように設計したプライマーセット6AS〜8ASからのシグナルも、細胞をガラクトースで培養したときだけ明らかである（図2B、レーン5）。これは、誘導されたGAL10におけるセンスおよびアンチセンス転写物が同じ領域にまたがって伸びることを示唆する。
【００７４】
しかし、グルコースとラフノースにおいて、アンチセンス特異的プライマーセット7ASと8ASによるシグナルは検出されたが、センス転写物に対する同等のプライマーのいずれによっても検出されなかった。これは、抑制条件において3'末端から約500bpのGAL10コード領域内に生じる転写物を示すグローバルマイクロアレイマッピングと一致する（Perocchi et al、2007、Nucleic Acids Res 35、el28；David et al、2006、Proc Natl Acad Sci USA 103、5320-5325）。これは誘導および抑制状態に対応するGAL10にまたがる2つの別のアンチセンス転写物が存在することを示唆する。もし抑制された遺伝子座の2.4kbアンチセンス転写物がGAL10コード領域内でスタートすれば、GAL10遺伝子間領域中におそらく伸びると思われ、これはプライマーセット9および10からのシグナルによって確認された（図2C）。
【００７５】
GAL10-7にまたがって位置するプライマーセットの5Sおよび5ASははるかに弱く、センスおよびアンチセンス転写物の大部分はこの領域内で、それぞれ、終結するかまたは開始することを示唆する。注目すべきは、GAL7領域に対するセンスおよびアンチセンス特異的プライマーはまた、センスおよびアンチセンス転写物に対する確証も表した（図2C）。この場合、ORFの末端と3'領域に広がるプライマーセット3Sおよび3ASはセンス転写物を検出することはできたが、アンチセンスを検出することはできず、アンチセンス転写物はさらに上流でプロモートされたことを示唆する。データは転写物がお互いに相殺しうることを示す。GAL10とGAL7は、細胞がガラクトースにより誘導されるとセンスとアンチセンスの両方の転写物を産生し、それらの転写物は類似のサイズであると結論した。
【００７６】
ノーザンブロットを用いる、GAL10周りのアンチセンス転写物のマッピング
鎖特異的プローブによるノーザンブロットを用いて、3種の異なる菌株バックグラウンドから、グルコース、ラフィノースおよびガラクトースで培養した細胞中のアンチセンス転写物の、GAL10周りの近似的位置を同定した（図3）。ノーザンブロットは、転写物のサイズをGAL遺伝子座におけるその位置と関係付けることができるという利点を有する。プローブ2および3は通常、高いバックグラウンドシグナルを伴ってハイブリダイゼーションが乏しく、長い転写物を識別することが難しい。
【００７７】
誘導された培養において、GAL7とGAL10に対する高レベルのアンチセンスRNA（プローブ2と4）は明らかであり、図2のRT-PCRデータが確認された。誘導されたGAL10の2.25kbアンチセンスはプローブ3とわずかなハイブリダイゼーションを示すが、プローブ5とは示さず、主にGAL10のORF領域に限定されることを示す。プローブ6は、GAL1がWatson鎖上にあるので、GAL1センス転写物とハイブリダイズする。2つの別の転写物は誘導された細胞中でだけ産生する。これらは両方ともGAL1内で生じ、GAL1ターミネーターを介してセンス鎖上でFUR4中に伸びる。1つの転写物はおよそ＞5kbであり、第2の転写物はそれよりもっと大きい。
【００７８】
抑制された培養において、2.4kb（GAL10）アンチセンス転写物は、GAL10〜1遺伝子間領域の短いプローブと強いハイブリダイゼーションを示し、GAL1プローブとはそれほど強くないハイブリダイゼーションを示した。これらのプローブとのハイブリダイゼーションは、ガラクトース中で培養した細胞から調製したRNAでは見られず、図2のPCRマッピングと一致する。これは、抑制された遺伝子座におけるこのGAL10アンチセンス転写物はGAL10 ORFの3'末端から約500bpに生じ、GAL10〜1遺伝子間領域にわたって伸びることを示唆する。同様に、より長い3.5kbアンチセンスGAL10転写物もこれらのプローブとの強いハイブリダイゼーションを示し、GAL10〜1遺伝子間領域を横切り、GAL1中へ伸びることを示唆する（図3A）。
【００７９】
4つの小さい非コード転写物が、抑制および誘導条件において培養した細胞において明らかである（図3A）。注目すべきは、これらの転写物は主に遺伝子座における遺伝子間領域をまたがって存在する。第1の転写物はlkbであって、GAL7〜10遺伝子間領域において、GAL10とGAL1転写物に対してアンチセンス方向のプローブ（プローブ3）によって検出可能である。第2の転写物はおよそ600bpの転写物であって、GAL1ターミネーターに対してセンス方向プローブ（プローブ7）とハイブリダイズする。
【００８０】
第3の転写物は約1.7kbであって、KAP104の5'領域からGAL7ターミネーター領域を通ってアンチセンスに伸びる（プローブ1）。第4の転写物は約1.5kbであって、GAL10内に始まりGAL10〜1遺伝子間領域に伸びる（プローブ5）。
【００８１】
この分析において、RNAは3つの異なる菌株バックグラウンドから調製した。BY4741（レーン1）とW303-1a（レーン2）菌株は3種の炭素供給源の全てにおいて類似したプロファイルを生じる。しかし、YMH147菌株（レーン3）において、GAL遺伝子座の発現はラフィノースで抑制されるのが見られる。いくつかの領域で、この菌株の転写物プロファイルはグルコースまたはガラクトースにおけるそれと異なる（プローブ3、6および7によりハイブリダイズした3種の炭素供給源における、例えば、レーン1および3を比較のこと）。
【００８２】
（図1〜3からの）マッピングデータの総括を図3Bに示す。3つの注目される点がある。第1は、細胞がガラクトース（GAL10、GAL7およびGAL10-7）により誘導された時、センス転写物のそれぞれに対するアンチセンス転写物が比較的高いレベルである。誘導された遺伝子座におけるセンスとアンチセンス転写物は対でかつ相乗的であると思われる。第2は、抑制（グルコース中の）時のアンチセンス転写物のサイズの変化とそれに結合したGAL10における予測される開始部位と終結部位の変化である。第3は、抑制された遺伝子座と誘導された遺伝子座の両方における遺伝子間領域（GAL7ターミネーター；GAL10〜7遺伝子間領域；GAL10〜1遺伝子間領域；GAL1ターミネーター）にまたがる転写物の存在である。
【００８３】
GAL10の3'領域における配列がセンス転写物の誘導に必要である。
データは、GAL10にまたがるアンチセンス転写物の位置が遺伝子が抑制されるかまたは誘導されるかどうかを反映することを示唆する。これらの転写物は色々な部位で始まるようである（図4A）。本発明者らは、3'隣接領域を主遺伝子から分離することにより、誘導されるアンチセンス転写（GAL10の3'隣接配列においてまたは近くで生じるようである）に必要な配列を同定する実験を設計した。この構築物は推定プロモーターの試験とセンス転写物の誘導に与えるその影響の検証を可能にした。塩基2453〜3007の間の554bpを欠失し、GAL10 ORFの3'末端の92bpと3'に隣接する配列を無傷で残した。欠失した領域はまた、GAL10発現と同じ方向の発現カセットにより置換えた。細胞をラフィノースで培養し、ガラクトースへ15および60分間移し、センス転写物を十分強く誘導しかつ誘導された野生型の2.3kbアンチセンス転写物を発現させ、そしてRNAをこの細胞から調製した（図4Bのレーン5および7）。GAL10の3'末端における挿入は、2.4kbおよび3.5kb GAL10アンチセンス転写物の両方の発現を損なうのに十分である（図4B、レーン6および8）。重要なのは、これらのサンプル中のセンス転写物のレベルが非常に低かったことである（図4B、レーン6および8）。従って、センス転写に対するプロモーター領域が無傷であるにも関わらず、GAL10の3'末端における挿入によってこれらの菌株におけるセンスRNAの産生が損なわれた。これは、アンチセンス転写物がGAL10プロモーターからの転写に必要である可能性を生じる。GAL7およびGAL1における誘導プロファイル（図4C）も、変異菌株で検証した。GALクラスタにおける抑制されたレベルに与える明らかな影響は観察されなかった。さらに、GAL7またはGAL1における転写物の誘導に与える、この挿入の効果は少ししかなかった。
【００８４】
従って、GAL10の3'末端の配列は、誘導されたアンチセンス転写物の産生（次いで誘導されたセンス転写物の効率的な転写に関係する）に必要である。この事は、誘導された遺伝子の5'末端と3'末端の間の事象の協調を示唆する。
【００８５】
GAL10の3'領域の配列は、抑制された遺伝子座のアンチセンス転写にとって不要である。
抑制された遺伝子座では、アンチセンス転写物はGAL10 ORF内の色々な位置で開始するようである（図4A）。GAL10の3'末端に挿入することにより、誘導された遺伝子座におけるのと類似の配列が、抑制された遺伝子座におけるアンチセンス転写に必要であるかどうかを尋ねることができた（図4B）。驚くべきことに、WTと比較して、変異体中の2つのアンチセンス転写物のサイズにわずかな低下しか認めなかった。長いアンチセンスと短いアンチセンスの間のレベルと相対的サイズ差は、WTのそれと非常に類似したままであった。この知見は、これらの転写物は通常開始する場所の配列が3'末端挿入により欠失または破壊されたことおよび両方の転写物がGAL10の5'領域に僅かに近い新しい部位で開始することを示唆する。このことは、これらの通常の開始部位が除去されたのであれば、転写物がいかにしてプロモートされるかという疑問を生じる。一つの説明は、挿入された発現カセット中の配列である。しかしこれらの新しい転写物は誘導された条件では存在しないので、挿入されたカセット内の配列からプロモートされるとは考え難い。従って、誘導されたアンチセンス転写物および抑制された遺伝子座におけるアンチセンスのための異なる配列要件が存在する。
【００８６】
GAL10へのHda1補充はアンチセンス転写物のレベルを反映するが、H3K18acのレベルを反映しない。
GAL10が誘導されると、抑制された状態と比較して有意に多くのアンチセンス転写物が産生するので、GAL10におけるHda1結合がアンチセンスRNAのレベルを反映するか、または遺伝子の発現が誘導もしくは抑制されるかどうかを確かめる実験を行った。GAL10とのHda1-myc結合はChIPにより、誘導または抑制された細胞から調製したクロマチンを用いて評価した（図5A）。Eaf3（Rpd3SリシンデアセチラーゼとNuA4リシンアセチルトランスフェラーゼの両方の一成分）（Allard et al 、1999、EMBO J 18、5108-5119）を対照として用いた。Eaf3を欠く菌株は、プロモーターでおよび遺伝子のコード領域内で高いヒストンアセチル化のレベルを示し、プロモーターで高いレベルを示すがコード領域内で低下する通常のプロファイルと異なり、特にEaf3消失のRpd3S複合体に与える大きい効果を示唆した（Reid et al 、2004、Mol Cell Biol 24、757-764）。
【００８７】
Hda1-mycは、誘導された細胞のGAL10の5'およびthe3'領域の両方に結合する。Hda1-mycのシグナルは抑制されたクロマチンでは約5倍低下する。この差は、抑制または誘導条件で培養された細胞におけるHda1-mycのレベルの差によるのではない（データは示してない）。このデータは誘導された細胞中の高いアンチセンス転写物のレベルの存在およびGAL10全体の高いHda1のレベルと一致する。Eaf3は同様な値を示すが、それほど顕著でない傾向があり、抑制時のプロモーターおよびGAL10の3'末端との結合のレベルは両方とも低い（図5B）。
【００８８】
Hda1結合と抑制および誘導されたGAL10 H3K18ac（Hda1に対する公知の基質）のヒストンアセチル化との間に関係があるかを同定する試験を行った。抑制された遺伝子におけるH3K18acのレベルは低く、H3K18R菌株のレベルに類似し、Hda1による活性的な脱アセチル化と一致する。誘導された細胞においては、誘導された菌株中のHda1のレベルが高いにも関わらず、H3K18acのレベルは抑制された細胞におけるより有意に高い（図5C）。この差は、GAL10における活性転写に伴うヌクレオソーム消失を考慮に入れかつH3K18acシグナルをH3レベルに規準化しても、なお存在する。この事実は、Hda1結合とGAL10におけるH3K18acの間に直接の相関がないことを示す。もし、Camblong et al, 2007 Cell 131、706-717が提案するように、Hda1活性がアンチセンス転写物と関係すれば、誘導された遺伝子上の、特に5'領域におけるH3K18acの高いレベルは、転写活性化とセンス転写物の伸長を伴うヒストンアセチル化により説明することができる。アセチル化と脱アセチル化のバランスがシフトし、誘導された遺伝子上のH3K18acの正味の増加をもたらしうる。
【００８９】
GAL遺伝子座における長距離クロマチン相互作用
長距離クロマチン相互作用（遺伝子ループとしても知られる）は限られた数の活性酵母遺伝子において記載されている（Ansari and Hampsey, 2005, Genes Dev 19、2969- 2978；O'Sullivan et al, 2004, Nat Genet 36, 1014-1018；Singh and Hampsey, 2007, Mol Cell 21, 806-816）。これらの相互作用は酵母遺伝子の5'と3'領域の並置を表し、RNAPII、TFIIBおよびCPF転写終結機構に関係する。抑制されたGAL遺伝子座における活性アンチセンス転写、ならびに、誘導されたGAL遺伝子座における3'〜5'末端連絡を示すデータを得て、長距離相互作用がGAL発現のアンチセンス調節に関係するかどうかを確認する研究に着手した。GAL遺伝子座を長距離相互作用の存在について、ならびに、免疫沈降ステップを含めることにより、これらの相互作用がRNAPIIおよびTFIIBに関係があるかどうかを分析した。
【００９０】
グルコース、ラフィノースおよびガラクトース中で培養した細胞からのGAL10の5'と3'領域、GAL7の5'と3'領域、およびGAL10の5'領域とGAL7の3'領域の間の相互作用を、染色体立体構造を捕捉する3C（capturing chromosome conformation）技法（Dekker, 2006, Nat Methods 3, 17-21；Dekker et al , 2002, Science 295, 1306- 1311；O'Sullivan et al , 2004, Nat Genet 36, 1014-1018）の改変法を用いてモニターした（図6A）。対照として、RNAPIIに関係しかつ3つの増殖条件の全てに存在する、先に検出されたFMP27における長距離相互作用を用いた（図7Cを参照）。
【００９１】
抑制されたGAL遺伝子座における長距離相互作用
長距離相互作用はグルコースで培養した細胞において、GAL10、GAL7、およびGAL10の5'領域とGAL7の3'領域との間（GAL10-7）にまたがって検出することができる（図6B）。さらに、これらの相互作用は、その3C相互作用がRbp1に対する抗体により免疫沈降できるのでRNAPIIと関係がある。GAL10とGAL10-7相互作用に対する対照は、PCR産物が特異的であって、ホルムアルデヒド架橋、DpnIIによるクロマチン消化、ライゲーション反応、およびテンプレートのPCR反応への付加に応じるものである（図6C）。いくつかの反応物では、1以上のPCR産物が観察された。これらのPCR産物をゲルで単離し、その配列をDpnII接合点全体について分析した。この結果から次が明らかになった；例えば、GAL10-1遺伝子間領域のDpnII部位に隣接するプライマーセット6は架橋したクロマチン調製物に部分保護され、GAL10全体の長距離相互作用に対して予想される260bp産物だけでなく、約550bpの産物をもたらす。3つの長距離相互作用部位における同様な分析は、観察されたPCR産物のそれぞれがホルムアルデヒド架橋に依存するものであり、遠隔配列の並置を示す真の長距離相互作用と一致することを確認した。
【００９２】
今まで記載された限られた数の長距離相互作用は、活性転写された遺伝子で観察されている。本明細書に記載した相互作用はGAL発現が抑制された遺伝子座で起こるが、アンチセンス転写物の存在は遺伝子座が転写活性を持つことを示唆する。次の段階は、抑制された遺伝子座においてループ形成を駆動する機構が活性遺伝子の機構と類似するかどうかを検証することであった。長距離相互作用はsua.7-1対立遺伝子を保持する菌株で低下し、E62K（グルタミン酸62リシン）置換をもつTFIIBのバージョンを発現する（Singh and Hampsey, 2007, Mol Cell 27, 806-816）。この変異は活性遺伝子の3'領域における相互作用では欠如するが、5'領域では欠如しない。抑制された条件において、GAL10、GAL7、GAL10-7および対照FMP27長距離相互作用は全て機能性TFIIBへの依存を示し、抑制された遺伝子座のループは活性遺伝子のそれと同じ要件を有することを示唆する（図6D）。さらにGAL10とGAL7（GAL10-7はそうでないが）の長距離相互作用は、無タグ菌株と比較してTFIIB-mycを発現する菌株からの免疫沈降物に濃縮することができる（図6B）。これは、TFIIB-mycがGAL10とGAL7における長距離相互作用を示すクロマチン領域と密接に結合していることを示唆する。GAL10とGAL7にまたがる長距離相互作用に関係するTFIIBを検出できない理由は、機能性TFIIBが相互作用に必要であるので、明らかでない。一つの可能性は、エピトープタグがこの相互作用にアクセスできないことである。従って、長距離相互作用は抑制されたQAL遺伝子座において検出することができ、これらの相互作用は活性遺伝子上の遺伝子ループと同じ要件を示す。
【００９３】
GAL遺伝子座における条件付き長距離相互作用
GAL10とGAL7に対する長距離相互作用はまた、遺伝子が発現される場合、ラフィノース（抑制性成長培地）においておよびガラクトースにおいて観察される（図7B）。両方共に、相互作用はRNAPIIに関係している。しかし、GAL10の5'領域とGAL7の3'領域の間（GAL10-7）の長距離相互作用は増殖培地中の炭素源に依存する（図7B、C）。最も重要なこととして、この長距離相互作用は誘導条件（ガラクトース）においておよびさらにグルコース抑制が除かれた場合（ラフィノース中）においても失われる。従って長距離相互作用の崩壊を単純に誘導条件下で観察される高レベルのセンス転写によって説明できるとは思われない。むしろ、GAL10-7長距離相互作用の条件はグルコース抑制の消失に関係するようである。
【００９４】
GAL遺伝子座における長距離相互作用はリシンデアセチラーゼにより影響される。
非コード転写物と長距離相互作用は抑制性と誘導性条件の両方のGAL遺伝子座において存在する。非コード転写物の存在が長距離相互作用に関係することは研究されている。アンチセンス転写物はHda1リシンデアセチラーゼと結合している（図5）（Camblong et al、2007 Cell 131, 706-717）。抑制されたおよび誘導されたGAL10遺伝子座において、Hda1と結合したクロマチンのレベルはアンチセンス転写物のレベルと相関がある。Hda1とEaf3がGAL遺伝子座におけるおよびFMP27における長距離相互作用にとって必要であるかどうかを調べた。
【００９５】
Hda1の消失は抑制された細胞におけるGAL10、GAL1およびGAL10-7にまたがる長距離相互作用に対して著しい効果を与える（図6B）。FMP27に対する効果ははるかに小さい。対照的にEaf3は、FMP27およびGAL10における長距離相互作用に必要であるが、GAL7またはGAL10-7においてはこの因子の必要性は小さい。いくつかの遺伝子座、例えばFMP27およびGAL7は一つのまたは他の複合体に対して特異性を示す一方、GAL10などの遺伝子座は両方の活性を必要とするようである。このデータはリシンデアセチラーゼ、Hda1およびRpd3Sを直接または間接に長距離相互作用の形成に結び付けて、これがアンチセンス転写物と関係しうることを示唆する。
【００９６】
考察
本発明者らはGAL遺伝子座をモデル系に用いてこの系における誘導性と抑制性状態を比較し、アンチセンス転写物およびエピジェネティックな調節における差異を観察した。本発明者らは、遺伝子抑制が遺伝子座に対するエピジェネティックな変化に関係するアンチセンス転写物産生の調節に関わる前活性状態であることを示す。
【００９７】
GAL遺伝子座における非コード転写物マップは複雑であり条件次第である。遺伝子間領域にまたがる比較的短い転写物の存在は、酵母遺伝子、例えばSER3（Martens et al, 2004, Trends Genet 23, 126-133）、IMD2、LEU4（Davis and Ares, 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103, 3262-3267）およびTy1（Berretta et al , 2008 Genes Dev 22, 615-626）または哺乳動物遺伝子、例えばDHFR（Martianov et al, 2007, Nature 445, 666-670）に関係する転写物と結合したプロモーターを想起させる。これらは誘導されたおよび抑制されたGAL遺伝子座の両方に存在するので、活性化および抑制に直接関係する調節機能を有するとは思われないが、遺伝子座トポロジーの他の態様に影響しうる。
【００９８】
GAL10における非コードアンチセンス転写物のサイズと位置は増殖条件によって変化する。誘導された遺伝子座においては一つの豊富なアンチセンス転写物が存在し、そのレベルはセンス転写物と相乗的に上昇および下降する。データは、GAL10の3'隣接領域の配列がこの転写物の発現を促進するために必要であることを示唆する。Gal4制御因子に対する結合部位（この領域もGAL7に対するプロモーターを含有する）だけでなく、Reb1結合部位もこの領域に存在する。これは条件転写物であるので、GAL7転写物とGAL10アンチセンスの両方を活性化する上でのGal4の二重の役割が可能である。しかし、本発明者らはまた、誘導されたGAL7の3'領域に生じる高レベルのアンチセンス転写物もマップしたが、この領域にGal4結合部位は存在しない。GAL10アンチセンス転写物の消失がGAL10センス転写物の低レベルおよびGAL10とGAL7の3'および5'領域の間の長距離相互作用の実証に関係しているとすれば、代わりの可能性は、プロモーター配列がアンチセンス転写物をin trans活性化するある役割を果たすことである。
【００９９】
誘導されたGAL10におけるアンチセンス転写物は、アンチセンスRNAに関係すると先に示された2つの遺伝子と特性を共有する。PHO5（Uhler et al , 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104, 8011-8016）のように、誘導されたGAL10におけるアンチセンス転写物はセンス転写物の転写と連結している。GAL10転写物はPHO5のそれと異なり、プロモーター領域中に伸びてないと思われ、従ってPHO5について提案されたプロモータークロマチンのリモデリングによる方法により機能するとは思われない。PHO84（Camblong et al, 2007 Cell 131, 706-717）のように、アンチセンス転写物の存在はHda1リシンデアセチラーゼ（KDAC）のクロマチンとの結合と相関がある。リシンデアセチラーゼは遺伝子発現の活性化と抑制の両方に関係するが（Bernstein et al , 2000, Proc Natl Acad Sci USA 91, 13708-13713）、PHO84においてHda1はアンチセンス転写物と共に機能してセンスプロモーターを抑制する（Camblong et al, 2007 Cell 131, 706-717）。逆説的に、高レベルのH3K18acが活性化GAL10遺伝子全体で維持され、センス転写に関係するアセチル化は動的バランスをアセチル化に向けてシフトする。このシフトの根底にあるのは、KDACおよびアンチセンス転写物を通しての活性抑制のグランドの状態である。本発明者らはこのグランドの状態は部分的にGAL10とGAL7にまたがる長距離相互作用により表されることを示唆する（図7E）。このモデルにおいて長距離相互作用は、RNAPIIおよびTFIIBに関係しているが、先に記載されたバランスのとれた活性でない転写を表しうる（Ansari and Hampsey, 2005, Genes Dev 19, 2969-2978；O'Sullivan et al , 2004, Nat Genet 36, 1014- 1018；Singh and Hampsey, 2007, Mol Cell 27, 806-816）。酵母、ハエおよび哺乳動物において、多数の遺伝子は安定したバランスのとれた状態で存在し、従事するRNAPIIおよびそのプロモーターに関係するエピジェネティックな改変をもつ（Guenther et al, 2007, Cell 130, 77-88；Radonj ic et al, 2005, Mol Cell 18, 171-18；Zeitlinger et al, 2007, Nat Genet 39, 1512-1516）。
【０１００】
誘導されたGAL遺伝子座においては、アンチセンス転写はセンス転写と同じ一般領域にまたがって伸びる。抑制時には、開始部位のスイッチおよびアンチセンス転写を促進するために必要な配列の性質に変化がある。さらに、アンチセンス転写物が支配的になる。しかし、ノーザンブロットを長期露出すると、非常に低いレベルの同一サイズのセンス転写物を表し、センスとアンチセンス転写の間の関係は抑制された遺伝子でなお維持されることを示唆する。これが「活性の」抑制の考えを強固なものとし、抑制された状態は活性化で起こる事象のバリエーションであることを支持する。支配的アンチセンス転写物の一つの自然の結果は、Hda1およびEaf3などのKDACを介する活性の抑制である。抑制された遺伝子座において、アンチセンス転写物がPHO84におけるエキソームで調節されたアンチセンス転写物と同様な方法でGAL10-1遺伝子間領域にわたって伸長することは興味深い（Camblong et al, 2007, Cell 131, 706-717769）。この領域および他の遺伝子間領域にわたる脱アセチル化は遺伝子座における長距離相互作用、例えばGAL10-7にわたる相互作用を促進または安定化しうる。
【０１０１】
一つの遺伝子から他の遺伝子へ伸長する長い転写物もマップ上で顕著である。これらの転写物、例えば誘導された遺伝子座におけるGAL1:FUR4の長い転写物または抑制された遺伝子座におけるGAL10-1アンチセンス転写物は条件次第である。長い非コード転写物は哺乳動物細胞のβ-グロビン遺伝子座に観察され、条件スイッチに関わりうる（Gribnau et al、2000、Mol Cell 5、377-386）。酵母において、これらの転写物は単に乏しい転写物プロセシングを反映するかも知れない。あるいは、これらは酵母遺伝子の高次の組織化を駆動または破壊する2つの異なる型式の転写事象（抑制的または活性化）の最初の指標であるかも知れない。
【０１０２】
実験手順
菌株
3種の異なる菌株バックグラウンドを本研究に用いた：BY4741（MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15ΔO ura3Δ0）、W303-1a（MATa、ura3-52、leu2-3-112、his3-ll、ade2-1、can1-100、trp1Δ2）およびYMH14（MATα、cyc1-5000、cyc7-67、ura3-52、leu2-3-112、cyh2）。sua7-l対立遺伝子はYMH14バックグラウンドにある（Pinto et al, 1994, J Biol Chem 269, 30569-30573）。エピトープタグ付き誘導体、末端切断体および遺伝子欠失を含む菌株は、PCRで作製したDNA断片を用いて1ステップの遺伝子置換により構築した（Longtine et al , 1998, Yeast 14, 953-961）。pTEF:KanMX:TEFterをGAL10の3'領域中に挿入し、ATGに対して残基2453および3007を消失した。選択マーカーの転写はGAL10センス転写と同じ方向である。SUA7をBY4741のmycエピトープをもつC末端にタグ付けした。hdalΔおよびeaf3Δ欠失体はBY4741バックグラウンドで構築した。
【０１０３】
培地と培養条件
増殖培地は標準方法を用いて2％グルコース、ラフィノースまたはガラクトースを必要なだけ補充したYEにおいて調製した。酵母を新鮮なプレートから取り、50〜100ml中で0.6〜0.8のOD 600まで増殖した。酵母を遠心分離により収穫し、H2Oで洗浄した後、新鮮な培地へ移した。
【０１０４】
クロマチン免疫沈降プロトコル
クロマチン免疫沈降は記載に従って実施した（Meluh and Broach, 1999, Nature 445, 666-670；Morillon et al, 2005, Mol Cell 18, 723-734）。要約すると、ChIPは50ml培養を用いて行い、1％ホルムアルデヒドで15分間固定し、次いでグリシンを加えて最終的に0.25mMにした。酵母細胞をMagnaLyser（Roche）でガラスビーズを用いて破壊し、固定したクロマチンをbioruptor（Diagenode）を用いて超音波処理により剪断した。平均DNA断片長は150〜300bpであった。遠心分離（30分間10K、4℃）の後、可溶クロマチンを、次のエピトープに対する抗体：5μlのH3（Abeam）、5μlのH3K18ac（Upstate）、20μlのEaf3（Abeam）、10μのY80（SantaCruz）および10μlのmyc（Sigma）と共に1.5mlシリコン処理したエッペンドルフ中で4℃にて15〜20時間インキュベートし、そしてプロテインAセファロースを用いて90分間室温にて免疫沈降した。洗浄後、クロマチンをビーズから65℃で30分間溶出した。架橋を65℃にて6〜20時間インキュベーションにより逆転し、プロテアーゼとRNase Aによって処理した。DNAをQiagen PCRミニカラムを用いて精製し、100μlの水に溶出した。IPサンプルおよび対照、例えば無抗体、無タグ物を生のまま使う一方、対照DNA（入力）を適宜に希釈した。サンプルを、Corbett RotorgeneおよびSybr緑色ミックス（Sensymix、Quantace）を用いてリアルタイムPCRで処理した。リアルタイムPCRを用いてGAL10の示した領域に対応する領域を増幅した。データを計算し（IP-No 抗体）/TOT、入力のパーセントとして表現した。誤差バーは色々な実験（n＝2〜4）で得た平均シグナルの標準偏差を反映する。
【０１０５】
鎖特異的プローブの作製
PCRを用いて、T7プロモーターをDNAの特異的領域の末端に組み込んだ。T7 RNAポリメラーゼを用いて、32P αUTPおよびAmbion MAXIscript(登録商標)キット（Cat #AM1308-AM1326）を使い、DNAのセンスまたはアンチセンス鎖に対して特異性をもつ1本鎖プローブを作製した。
【０１０６】
ノーザンブロット
高温フェノール：クロロホルムとガラスビーズを用いて細胞から調製した全RNAの15μgを1.1％ホルムアルデヒドゲル上で分離し、Magnaナイロン膜へ移し、80℃で2時間ベーキングし、次いで一晩PerfectHyb Plus （Sigma）中で64℃にてハイブリダイズし、1XSSC/O 0.1％SDS中で2回、0.2XSSC 0.1％SDS中で2回、20分間それぞれ洗浄した。膜は、特に断らない限り、典型的には24時間露出した。負荷した全RNAのレベルはrRNA種によりモニターした（示さなければ、全サンプルで等しい）。
【０１０７】
逆転写-PCR
図2のGAL10-7にまたがる10位置のそれぞれについて、センス転写物用のRTプライマー（GAL10発現の方向に対して）、アンチセンス転写物用のRTプライマー、増幅用の2つの交互の第1ラウンドPCRに対するプライマーおよび2つの交互のネストしたプライマーがある。プライマーの詳細は補表1に与えた。第1鎖合成は、ABgene Versoc DNAキットを使い、センスまたはアンチセンス転写物に特異的なプライマーにより行なった。標準反応は2μlのRNA；プライマー（25μM）1μl；H2O 9μlに設定し、70℃へ5分間加熱して二次構造を除去し、そして直ぐ氷上に置いた。次いで、バッファー4μl、dNTP 2μl、RT 1μlおよびRTエンハンサー1μlを加え、反応物を52℃にて50分間、次いで2分間95℃にてインキュベートした。RT対照では、逆転写酵素を反応物に加えなかった。PCR増幅は次の反応物にTakaRa DNA ポリメラーゼを用いるネストした反応であった：2X バッファーI、25μl；dNTP（2.5mM）、8μl；cDNA、2μl；プライマー（25μM）、フォワード1μl、リバース1μl；TakaRa LA Taq ポリメラーゼ、0.5μl；H2O 12.5μl、94℃-5分、（94℃-1分、55℃-45秒、72℃-30秒および72℃-5分間）の24サイクル。第2ラウンドについては、上記反応で、第1ラウンド産物をネストしたプライマーとともに用いた：94℃-5分、（94℃-45秒、54℃-30秒、72℃-20秒）の18サイクル、そして最後に72℃-5分のインキュベーション。
【０１０８】
免疫沈降による、染色体立体構造の捕捉（3CIP）
核は、適当な培地で光学密度A600＝0.2に増殖した100mlのサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）培養物から抽出した。ホルムアルデヒドを1％（41％の2.44ml）まで加え、10分間振とうした。グリシンを0.125M（2.5Mの5ml）まで加えることにより、ホルムアルデヒドをクエンチした。細胞ペレットをMg/Kバッファー（0.1M K2HPO4/KH2PO4（35：65比）、5mM MgCl2、pH 6.5）で2回洗浄し、スフェロプラスト化バッファー（Mg/Kバッファー中の1.2Mソルビトール、500U酵母溶解酵素および25mM DTT）中で室温にて15分間再懸濁した。スフェロプラストを1回、MESバッファー（0.1M MES、1.2Mソルビトール、1mM EDTA、0.5mM MgC12；NaOHを用いてpH 6.4に調節したもの）で4℃にて洗浄し、10ml MES溶解バッファー（0.1M MES、1mM EDTA、0.5mM MgC12 pH 6.4）中に再懸濁した。ホモジェナイザーを保持した手で10回ストロークを与え、スフェロプラストを溶解した。溶菌液をスクロース勾配（Corexチューブ中のMES溶解液中の5ml 1.8Mスクロース、10ml 1.1Mスクロース）上に積層し、BeckmanローターJA-17に入れて10分間、10,000 RPMで遠心分離した。核ペレットはガラス壁上の界面に位置した。チューブのボトムのペレットを水洗浄を用いて除去し、廃棄した。核ペレットをガラスからCSKバッファー（100mM NaCl、30OmM スクロース、10mM PIPES、3mM MgCl2、1mM EGTA、0.5％ Triton X-100、10Mロイペプチン、1：1000 AEBSF）を用いて4℃にて洗浄し、再び洗浄し、そして1mlのCSKバッファーに再懸濁し、20分間氷上に置いた。その核をペレット化し、上清の全てを、ほぼ100μlを除いて、除去した。40μlの5M NaClを加え、10分間氷上でインキュベートした。粘性混合物を1.2ml H2Oを用いて希釈した。抗体を加え、その混合物を4℃にて一晩回転した。ほぼ40μlのプロテインG-セファローススラリー（20〜30μlのビーズ）を、H2Oで2回、および1mlの制限洗浄バッファー（5OmM Tris-HCl（pH＝8.1）、10OmM NaCl、10mM MgCl2）で1回洗浄することにより調製し、2000rpmにて3分間遠心分離してビーズを回収した。クロマチン混合物を60分間回転してインキュベートし、ビーズを1000rpmにて3分間の遠心分離により回収し、1mlの制限洗浄バッファーを用いて4℃にて5分間回転することにより洗浄し、2000rpmにて3分間スピンした。10μlの10Xバッファー3、50U制限酵素および水（100μlまで）およびクロマチンを一晩、DpnIIについては37℃にて、CviQIについては25℃で消化し、次いで65℃にて10分間制限酵素を不活化した。熱非感受性の酵素、例えばCviQIは、ビーズを制限洗浄バッファーを用いて2回洗浄することにより除去した。混合物を希釈し、410μlのH2O、60μlの10Xライゲーションバッファー30μl（12000 U）T4リガーゼを用いてライゲートし、16℃にて4時間インキュベートした。混合物を一晩65℃にてインキュベートして脱架橋した。1μlの1mg/ml RNAase Aを加え、37℃にて30分間インキュベートし、次いで60μlの20mg/mlプロテイナーゼKを加え42℃にて1時間インキュベートした。DNAを660μlフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールを用いて抽出し、そして5M NaCl、0.5μl 10mg/mlグリコーゲンおよび1ml冷エタノールを用いて沈降し、そして-80℃にて1時間インキュベートした。ペレットを回収し、洗浄し、そして20μl H2Oに再懸濁した。次の対照が推奨されるプロトコルに含まれた（Dekker, 2006, Nat Method 3, 17-21）。免疫沈降ステップはストレートな3Cを行うために排除した。3Cおよび3CIP、RNAseまたはプロテイナーゼK処理はライゲーションステップ前に含まれ、RNAまたはタンパク質への依存を実証した。このプロトコルはホルムアルデヒド処理ステップなしに単離した核で実施した。免疫沈降ステップは制限酵素切断およびライゲーションステップ後に、標準 ChIPプロトコル（上記参照）を用いて行った。反応の産物は、50μl反応においてTakaRaポリメラーゼを用いるネストしたPCRを用いて検出した。プライマーストックは25μMであった。第1の反応物は25μlのGCバッファーI、8μl dNTP溶液（各1.25mM）、1μlテンプレート、1μlの各プライマー、13.5μl H2O、0.5μl TakaRa DNAポリメラーゼ（5U/μl）、25サイクル用（94℃ 5分-[94℃ 45秒、60℃ 30秒、72℃ 20秒]-72℃ 5分）を含有した。第2の反応物は25μlのGCバッファーI、8μl dNTP溶液（各1.25mM）、第1の反応からの2μlテンプレート、1μの各プライマー、12.5μl H2O、0.5μl TakaRa DNAポリメラーゼ（5U/μl）、18サイクル用（94℃ 5分-[94℃ 45秒、61℃ 30秒、72℃ 20秒]-72℃ 5分）を含有した。4つの長距離相互作用のそれぞれに対して可能な産物が存在するので、フォワード：フォワードを除いて、プライマーの全ての組合わせが最初の分析に含まれた。1つのプライマー組合わせについてのデータだけを示す。プライマー方向（フォワード＝F；リバース＝R）はORFの方向に対して与えた。各セットを、内側（i）と外側（o）プライマーを用いてネストした（表2を参照）。PCR反応はテンプレートまたはDNAポリメラーゼを省いたものを対照とした。プライマー効率について対照にするテンプレートはDpnII制限酵素切断したゲノムDNAをライゲートすることにより調製した。対照テンプレートと実験テンプレートを滴定して増幅の鎖領域を確認し、この領域の等価産物を1つだけ、各サンプルについて示した。
【表１】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【表２】
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【０１１１】
DpnII:プライマー対4+6、5+3および3+6はGAL10を横切る長距離相互作用を検出しうる。プライマー対2+4、3+1および1+4はGAL7を横切る相互作用を検出しうる。プライマー対6+2および5+1および1+6はGAL10-7を横切る相互作用を検出しうる。図5に示した分析については、各相互作用に対するプライマー組合わせの最後のものだけを示した。
【０１１２】
表3は、長距離相互作用が起こる可能性をもつ染色体のGAL遺伝子座を横切る位置を示す。染色体の各領域について、1セットのフォワードとリバースプライマーを設計した。Gal遺伝子座における長距離相互作用は、染色体の各領域に対して設計されたプライマー間の3C分析によりモニターした。例えば、Gal7とGal10領域の間の相互作用をモニターするためには、列3（274081-87）と列5（278016-19）のプライマーを利用しうる。もし他の領域における相互作用をモニターするのであれば、プライマーの他の組合わせを利用しうる。
【表３】
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【０１１３】
この系は、長距離相互作用が起こると思われる他の染色体の遺伝子座に対しても等しく適用可能である。その領域が同定されると、特定の生理症状を示す特定化された長距離相互作用の存在または非存在を同定するようにプライマーを設計することができる。
【０１１４】
実施例２  CTCFによる長距離相互作用の制御
いくつかの転写因子は長距離DNA相互作用と転写の両方に役割を果たすことが示されており、それ故にこれらのプロセスを結び付ける良い候補でありうる。例としては、基本転写因子、酵母でいくつかの遺伝子のループ作製を組織化することが示されているTFIIB（Mol Cell, 27, 806-16）およびβ-グロビン遺伝子で長距離DNA相互作用に関わる転写因子EKLF、GATA-1およびFOG-1（Drissen et al, 2004, Genes Dev, 18, 2485-90; Vakoc, et al , 2005, Mol Cell, 17, 453-62）が挙げられる。
【０１１５】
本発明者らは、これらの機能をゲノム全体にわたって遂行する他の候補因子としてCCCTC結合タンパク質（CTCF）を同定した。CTCFは、転写および高次立体構造の染色体内および染色体間構造の形成の両方に関係する（Klenova, 2002, Semin Cancer Biol, 12, 399-414；Kurukuti et al, 2006, Proc Natl Acad Sci USA, 103, 10684-9；Zhao et al , 2006, Nat Genet, 38, 1341-7；Splinter et al, 2006, Genes Dev, 20, 2349-54）。ゲノム中に15,000のCTCF結合部位が存在すると見積もられた（Kim et al, 2007, Cell, 128, 1231-45）、しかしかかる部位の実数はおそらく＞30,000と思われる(Vetchinova et al, 2006, Anal Biochem, 354, 85-93）。転写において、CTCFは古典的転写因子として作用しうる；最近の報告は、CTCFがそのRNAポリメラーゼII（Pol II）との相互作用を通して転写を直接制御できることを実証している（Chernukhin et al, 2007, Mol Cell Biol, 27, 1631-48）。活性遺伝子のゲノム全体の転写開始部位（TSS）におけるCTCF-Pol II共局在は、この可能性をさらに強める（Birney et al, 2007 , Nature, 447, 799-816）。最後に、CTCFはDNAループの組織化に重要でありうる二量体を形成することができる（Pant et al , 2004, Mol Cell Biol, 24, 3497-504）。
【０１１６】
CTCFのユニークな特性に興味を抱いて、本発明者らはCTCFが高次染色体構造の形成と転写を、おそらくはPol IIとの関係を介して機械論的に連結できるかどうかの研究を始めた。この極小のin vivo転写を研究するために、2つの遺伝的に改変されたNIH3T3細胞株に基づく細胞系を用いた。これらの細胞株は、プロモーターの無いルシフェラーゼレポーター遺伝子と融合した、安定して組み込まれたCTCF結合部位を含有する発現ベクターおよびCTCF結合を欠くその変異体（pN-MycLuc wtおよびpN-MycLuc mut；図 8a、b）を保持する。
【０１１７】
野生型単一部位はレポータールシフェラーゼ遺伝子からの発現を駆動するのに十分であったが、変異体はそうでなかった（図8c）（Chernukhin et al, 2007, Mol Cell Biol, 27, 1631-48）。野生型にはCTCFとPol IIが存在したが、変異体にはCTCF結合部位が存在しなかった（図8d）、従って、内因性プロモーターが不在の際にCTCFがPol IIを補充するのを助ける初期のモデルを支持した。
【０１１８】
この系においては、転写プロセスは特に組み込まれたDNA pN-MycLuc wtの5'と3'領域の間の高次DNA構造の形成に関わりうる。高次立体構造は、in vivoで染色体のDNA上の遠隔部位の近接を検出する染色体立体構造捕捉（3C）アッセイによりモニターすることができる。本発明者らは3C分析を、組み込まれたpN-MycLuc wtおよびpN-MycLuc mut遺伝子座に適用した。5'位置と3'位置の2つの部位（図8b）は3Cアッセイにおいて、pN-MycLuc wtでは並置が同定されたが、pN-MycLuc mutでは同定されなかった（図9a）。
【０１１９】
CTCF相互作用とPol IIとの共局在についての初期の研究に基づいて、本発明者らはCTCFとPol IIが連結して、転写されるpN-MycLuc wt遺伝子の高次構造の形成に関係しているという仮説を立てた。これを研究するために、両方の因子が新しく同定した並置部位に存在するかどうかを同定する研究を試みた（図9a）。クロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイは、pN-MycLuc wtでは実にCTCFとPol IIの両方が5'と3'部位に存在して並置するが、pN-MycLuc mutではそうでないことを示した（図9b、c）。
【０１２０】
N-Mycは公知のCTCF標的部位であり、CTCF結合に関わるN-Myc内の配列の特徴は従来研究されている（Chernukhin et al, 2007, Mol Cell Biol, 27, 1631-48；Lutz et al, 2003, Embo J, 22, 1579-87）。ゲノム中のCTCF結合部位の存在は高頻度であるので、本発明者らはルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたpN-MycLucwtの3'末端（図9c）に他の潜在的CTCF標的部位が存在しうるという仮説を立てた。配列からCTCF結合を予測することは困難であるので、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）とフットプリント分析を用いて、CTCFが同定した配列と直接結合できるかを研究した。実際、その結合は、標識した3'配列を含有するプローブと組換え体CTCFを用いてEMSAにより実証された。この配列のフットプリント分析は、組換え体CTCFによりDNaseI消化から保護された領域を示した。従って、併せて考えると、ChIP、EMSAおよびフットプリントデータはCTCFが実際3'部位と結合できることを確認した。それ故に、2つの部位に結合した2つのCTCF分子は並置の形成に関わることができると考えうる。
【０１２１】
高次構造の確立におけるCTCFとPol IIの関与をさらに確認するために、4Cアッセイ（3Cのあとの抗-Pol IIまたは抗-CTCF抗体のどちらかによるChIPアッセイ）を実施した。Pol II 4CおよびCTCF 4C分析は、pN-MycLuc wtにおける並置の間、5'と3'部位におけるPol IIとCTCFの存在を実証したが、pN-MycLuc mutではそうでなかった（図10a、b）。これらの実験から、野生型活性構築物、pN-MycLuc wtの5'および3'領域の間の並置の確立は、同定された部位におけるCTCFおよびPol IIの存在とまた、構築物の野生型状態とも関連すると結論した。
【０１２２】
観察された現象の転写への依存性のさらなる分析を行った。この目的のために、細胞を転写インヒビター、α-アマニチンを用いて処理した。この処理によりpN-MycLuc wtおよびpN- MycLuc mutの活性が消滅し（図8c）、Pol IIは消えたが、CTCFはN-myc部位から消えなかった（図8e）。処理した細胞の抗Pol II抗体を用いて実施したPol II 4Cアッセイは5'および3'部位の間に並置するPol IIの存在を示さなかった。しかしこの並置は抗-CTCF抗体を用いると検出された（図10a、b）。α-アマニチンで処理した細胞の3C分析は構造の存在を確認した（図9a）。
【０１２３】
本発明者らはまた、組換え体CTCFを直鎖の裸のプラスミドDNA、pN-MycLuc wtとin vitroで混合した場合、in vivoで検出された並置を形成するのに十分であるかどうかを試験した。4Cアッセイ（3Cと組合わせたChIPアッセイ）を用いると、in vivoで形成した構造に類似した構造がこの基本系に検出された。有意に弱いシグナルが、対照として用いたpN-MycLuc mut構築物に観察され、従って、検出された構造は2つの無傷のCTCF部位に依存することを示した。pN-MycLuc wtにおけるCTCF結合の存在は、5'および3'部位の両方に対するChIPアッセイにより確認された。
【０１２４】
併せ考えると、データは、転写プロセスが高次構造の形成を必要とする、しかし報じられたCTCFに依存する事例では、高次構造は進行中の転写なしに存在することを示唆する。これらの知見は、β-グロビン遺伝子における長距離DNA相互作用が転写の阻害後に維持されるという観察を支持する（Palstra et al , 2008, PLoS ONE 3, el661）。
【０１２５】
本発明者らは、pN-MycLuc wtの5'および3'末端の間の高次構造の確立はCTCFに依存するというモデル（図11）を提案する。このモデルでは、2つの遠隔部位に位置する2つのCTCF分子間の相互作用がCTCF二量体の形成およびDNAループの確立に導く（Klenova et al, 2005, Cell Cycle, 4, 96-101）。転写プロセスは、この立体構造の確立後に開始しうる。転写の阻害およびPol IIの除去後、この近接構造は、ほぼ間違いなくそのCTCFによる結合によってなお検出することができる。
【０１２６】
この例は非常に単純な転写系を利用している。この系において、プロモーターの無いルシフェラーゼ構築物からの転写が、Pol IIと相互作用するCTCFによりCTCF結合部位のN-Mycを介して駆動された（Chernukhin et al, 2007, Mol Cell Biol, 27, 1631-48）。転写プロセスは5'N-Mycとルシフェラーゼ遺伝子の3'末端との並置に依存することが発見され；第2のCTCF結合部位は並置した3'末端内に同定された。多数の一時的な相互作用が、DNAにcisおよびtransに結合したCTCF分子の間で連続的に起こると結論した。かかる準安定高次染色体結合の安定化は調節されたプロセスであり得て；CTCFのポリADP-リボシル化はかかる調節に関わりうる（Klenova et al, 2005, Cell Cycle, 4, 96-101；Yu et al , 2004, Nat Genet, 36, 1105-10）。高次構造の形成の結果の1つは転写プロセスの開始でありうる。
【０１２７】
極く小さい転写系を用いて、CTCFが高次クロマチン構造の構築と維持に関わり、この構造が順にRNAポリメラーゼIIによる進行中の転写に必要であることが同定された。
【０１２８】
本明細書に引用した全ての参照はその実体に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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