(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体液からタンパク質結合物質を除去するための収着剤、即ち（ａ）多孔性のスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーと（ｂ）前記コポリマー上に吸着されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）層からなる収着剤であって、前記コポリマーの平均孔径が３０〜４０ｎｍであることを特徴とする収着剤。
【請求項２】
前記収着剤が前記コポリマーの微粒子を含み、前記微粒子の粒度が２０μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の収着剤。
【請求項３】
前記微粒子の粒度が８μｍ以下であることを特徴とする請求項２に記載の収着剤。
【請求項４】
前記微粒子の粒度が５μｍ以下であることを特徴とする請求項２に記載の収着剤。
【請求項５】
請求項１〜４の一項に記載の収着剤を含む吸収装置。
【請求項６】
請求項１〜４の一項に記載の収着剤の懸濁液を含む血漿循環経路。
【請求項７】
最高で１０％のヒト血清アルブミン溶液を、前記コポリマーの吸着被覆に用いることを特徴とする請求項１〜４の一項に記載の収着剤の製造方法。
【請求項８】
前記コポリマーの吸着被覆に１％のヒト血清アルブミン溶液を用いることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コポリマーの吸着被覆に１０％のヒト血清アルブミン溶液を用いることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜４の一項に記載の収着剤を含むＭＤＳ（マイクロスフェアー系無害化システム）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体液からタンパク質に結合している物質を除去するための収着剤であって、（ａ）多孔性で中性で疎水性のポリマーと（ｂ）このポリマーに吸着されたポリペプチド層とからなるものに関する。
【背景技術】
【０００２】
中心的な代謝の臓器として、肝臓は、グルコースやタンパク質、脂肪の代謝に、また炭水化物やビタミンの貯蔵、解毒、免疫防御に重要な役割を果たしている。血液中に集まる毒性物質や代謝生成物は、正常に機能する肝臓により血液から除去される。肝機能が低下した患者、急性肝不全または慢性疾患により引き起こされた肝不全の患者では、増加している毒性物質を血液から除く必要がある。除去が必要な肝臓毒素の血液中での濃縮は、腎機能不全の患者でも起こる。肝不全では、毒性物質の増加で短時間のうちに多臓器の合併症に、さらにはいろいろな臓器、例えば腎臓や肺の不全に到るため、直ちに病院での治療が必要となる。解毒治療は、人工の肝臓補助システム（「人工肝臓」、肝臓透析）を用いて行われ、これにより毒性物質が効果的に血液から除去される。このようにして、命を脅かすような肝不全の患者が、移植時期まで安定化され、命を維持される。肝臓は高い自己再生能力を持っているため、肝臓を除去する治療は、患者の肝機能の回復を引き起こすこともある。治療が成功するためには、肝臓補助システムの有効性が肝要である。
【０００３】
肝臓疾患の患者の血液中の毒性物質は、水溶性物質と水不溶性物質に分けられる。肝臓補助システムを用いて血液から除去される毒性物質の例としては、非結合ビリルビンや胆汁酸、主に芳香族であるアミノ酸、フェノール化合物、アンモニアがあげられる。水不溶性の肝臓毒素は、タンパク質に、通常は血液タンパク質アルブミンに結合した状態で血液を輸送される。ビリルビンは、ヘモグロビンや他のヘムタンパク質（ミオグロビン、シトクローム）の劣化により生成される。これは水溶性でないため、腎臓から排出されない。血液中での輸送のため、ビリルビンは、アルブミンに結合している（非結合または間接ビリルビン）。肝臓では、ビリルビンはグルクロン酸と結合する（結合または直接ビリルビン）。結合ビリルビンは水溶性であり、腸または腎臓で胆汁と共に排出できる。肝機能不全の場合は、結合ビリルビンがもはや形成されず、血液中で非結合ビリルビンが増加する。血清ビリルビンレベルが増加すると黄疸が起こって強膜や皮膚が黄変し、ビリルビンレベルがさらに上がると組織や臓器が黄変する。したがって、ビリルビンは、肝機能の障害や不全の重要なマーカーである。
【０００４】
体外肝臓補助システムは、先行技術により公知である。タンパク質結合物質の除去のために、体外肝臓補助システムは、通常、体外の血液循環経路または血漿循環経路中に設けられた血液または血漿からタンパク質結合物質を取り除く吸収装置（吸着剤）をもっている。この吸収装置は収着剤（吸着剤）を含んでいる。この吸収装置の効率または収着剤の吸収速度（特に吸着速度）が、治療の成功には、あるいは患者の、特に肝不全患者の橋渡し安定化に最も重要である。
【０００５】
血液または血漿が他の表面と接触すると接触活性化が起こり、その後、凝固やキニン類の放出、補体系の活性化が起こる。体外血液浄化方法では、血漿あるいは血液が膜や吸着剤に接触するため、同じようにこれらのプロセスが引き起こされる。したがって、体外血液浄化が必要なほとんどの患者では、血液凝固を阻害する必要がある。これらは、通常ヘパリン輸液を用いて行われる。ヘパリン投与が禁忌の患者には、クエン酸を用いて局所的な抗凝固を行うことができる。
【０００６】
アニオン交換体系の吸着剤が、体外肝臓補助システムの臨床応用で極めて頻繁に使用されている。アニオン交換体が臨床応用に利用されている既知の装置としては、肝臓透析装置ＭＡＲＳ（分子吸着剤再循環システム）とプロメテウスシステムが挙げられる。アニオン交換体を用いて、タンパク質に結合しているビリルビンなどの毒性物質を、血漿などの生体液から非常に効率的に除去することができる。特に、プロメテウスシステムは、タンパク質に結合している水溶性肝臓毒素の排出率の高さが際立っており、肝臓患者の生存率を大幅に増加させている。しかしながら、アニオン交換体は、所望のタンパク質結合物質だけでなく、生理的に重要なタンパク質または血液凝固系の因子（抗凝固剤や凝血促進剤）も非常に大量に取り除かれるという大きな欠点を有している。特に、プロテインＣやプロテインＳなどの患者に固有の凝固阻害剤が挙げられる。プロテインＣは、凝固阻害因子として特に重要である。体内のプロテインＣ濃度の低下は、重篤な凝固合併症、例えば深部静脈血栓症や肺塞栓症を引き起こす。体外の血液循環経路中への注入により追加的に添加される抗凝固薬ヘパリンも、アニオン交換体で取り除かれる。この結果、体内の凝固系の不均衡、または体外または体内血液循環経路での望ましくない抗凝固が起こる。特に肝不全や敗血症の患者などの高リスク患者にとって、これは非常に問題でありうる。最近の報告書は、アニオン交換体への血液凝固系タンパク質の望まざる結合による、体外血液浄化システムの戻りにおけるあるいは浄化した血液が戻った後の患者における閉塞性の血栓成形の重大なリスクを取り上げている［Meijers et al. 2007. Major Coagulation Disturbances During Fractionated Plasma Separation and Adsorption. Am J Transplant 7(9):2195-2199「部分血漿分離と吸着の際の主な凝固の障害」］。
【０００７】
アニオン交換体が上記の欠点をもつため、中性で疎水性のポリマーの使用が提案されている。このポリマーは、物質が吸着される孔を有している。選ばれるポリマーの孔径は、最も重要な因子である。５〜６ｎｍを超える孔のみが、タンパク質に強く結合しているビリルビンなどの物質に、接近可能であることがわかっている。平均孔径が＞７．５ｎｍのときに、好ましいビリルビン吸着が起こった［Weber et al. 2008. Neutral styrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins in liver failure. Biomacromolecules 9(4):1322-1328「肝不全におけるトキシン吸着用の中性スチレンジビニルベンゼンコポリマー」］。孔径が大きな場合は孔への接近が改善されるため、タンパク質結合物質の吸着がよくなる。しかしながら、孔径が増大するとポリマーの内表面積が減少するため、過度に大きな孔径を選ぶと吸着剤の容量また吸着性能が減少する。
【０００８】
また、中性で疎水性のポリマーでは、上記のアニオン交換体とは対照的に、ほんの少量のヘパリンが結合することがわかっている。また、トロンビン−アンチトロンビン複合体の形成も大幅に減少した。しかしながら、平均孔径が＞７．５ｎｍである中性で疎水性のポリマーのため、多量のプロテインＣの吸着もまた起こるのは好ましくない。他の同じような分子量の重要なタンパク質、例えばプロテインＳもまた吸着されると考えるべきである。小さな孔径（＜５〜６ｎｍ）では、強くタンパク質に結合した物質に接近できないため、プロテインＣは吸着されないであろう。
【０００９】
アニオン交換体に代えて中性で疎水性のポリマーを使用することで、ヘパリン吸着を大きく減少させたり阻害することができるため、少なくとも部分的に選択的である収着剤を得ることができる。しかしながら、中性で疎水性のポリマーによるプロテインＣの吸着がまだ十分に大きいため上記の凝固の問題が発生することとなる。特にヘパリン投与が禁忌である患者の場合にこの危険が存在する。プロテインＣの吸着が不可能な小さな孔径のポリマーの使用は、タンパク質結合物質の除去が効率的ではないため推奨できない。上に強調したように、タンパク質結合物質の吸着効率は、肝不全の場合には重要な生存因子であると考えられる。
【００１０】
特にタンパク質結合物質の除去において高性能なシステムは、マイクロスフェアー系の無害化システム（ＭＤＳ）であり、これは、EP0776223B1とUS5855782に記載されている。中性で疎水性のポリマー（スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー、平均孔径：＞１００ｎｍ）から生産されたマイクロスフェアー吸着剤粒子（平均粒度：５μｍ）についての報告が最近なされた［Falkenhagen D., Vienken J., The Prometheus-System. Technical Background and Clinical Experience. ASAIO 54th Annual Conference, 19-21 June 2008「プロメテウス−システム、背景技術と臨床的な経験」］。
【００１１】
また、タンパク質結合物質の除去用の天然樹脂類が、WO2005/082504A2に開示されている。WO2005/082504A2には、活性炭と、少なくとも一種の、平均孔径が３０ｎｍである非イオン性樹脂（ポリスチレンジビニルベンゼン樹脂、アンバークロムＧＣ３００Ｃ）または４５ｎｍの非イオン性樹脂（脂肪族のエステル系樹脂、アンバーライトＸＡＤ−７ＨＰ）を含む無害化装置が記載されている。中性で疎水性のポリマーの上記の問題は、これらの中性樹脂吸着剤にもあてはまる。
【００１２】
収着剤と最初に述べた種類の収着剤の製造方法が、すでに１９７０年代終わりに開示されている。［Ton et al. 1979. Adsorption of Human Serum Albumin to Amberlite XAD-7 Resin. J Biomed Mater Res 13:407-422「ヒト血清アルブミンのアンバーライトＸＡＤ−７樹脂への吸着］、［Hughes et al. 1978. The use of an in vitro haemoperfusion circuit to evaluate the blood compatibility of albumin-coated Amberlite XAD-7 resin. Int J Artif Organs l(3):129-34「アルブミン被覆のアンバーライトＸＡＤ−７樹脂の血液親和性を評価するためのインビトロ血液灌流回路の利用」］、［Ton H. Y. et al. 1979. Albumin-coated Amberlite XAD-7 resin for hemoperfusion in acute liver failure. Part I: adsorption studies. Artif Organs 3(l):20-22「急性肝不全における血液灌流用のアルブミン被覆のアンバーライトＸＡＤ−７樹脂、第Ｉ部：吸着試験」］、［Hughes R. et al. 1979. Albumin-coated Amberlite XAD-7 resin for hemoperfusion in acute liver failure. Part II: in vivo evaluation. Artif Organs. 3(l):23-26「急性肝不全における血液灌流用のアルブミン被覆のアンバーライトＸＡＤ−７樹脂、第II部：インビボ評価」］、［Falkenhagen et al. 1981. Optimization of albumin coatingfor resins. Artif Organs 5 (Suppl):195-199「樹脂のアルブミン被覆の最適化」］。中性で疎水性の樹脂の、例えばアンバーライトＸＡＤ−７（平均孔径：９ｎｍ）またはＹ５６（平均孔径：８ｎｍ）のポリペプチド層（アルブミン）での吸着被覆は、血液灌流の際の血小板の吸着剤への結合とそれに伴う血小板の減少を減らすことを目的としている。
【００１３】
最初に述べた種類の収着剤に関するさらに最近の刊行物においては、ビリルビンが、アルブミン層を用いて被覆された中性の樹脂上より、非被覆の中性樹脂（ポリスチレンジビニルベンゼン、孔径５〜１０ｍｎ）上によりよく吸着されることが報告されている［Annesini et al., 2005. Bilirubin removal from albumin-containing Solution by adsorption on polymer resin. The International Journal of Artificial Organs. VoI 28, Nr. 7: 686-693「アルブミン含有溶液からのポリマー樹脂への吸着によるビリルビンの除去」］。したがって、中性の樹脂に吸着されたアルブミン層は、ビリルビン吸着に、またこのため吸着効率に負の効果を持つ。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】EP0776223B1
【特許文献２】US5855782
【特許文献３】WO2005/082504A2
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Meijers et al. 2007. Major Coagulation Disturbances During Fractionated Plasma Separation and Adsorption. Am J Transplant 7(9):2195-2199
【非特許文献２】Weber et al. 2008. Neutral styrene divinylbenzene copolymersfor adsorption of toxins in liver failure. Biomacromolecules 9(4):1322-1328
【非特許文献３】Falkenhagen D., Vienken J., The Prometheus-System. Technical Background and Clinical Experience. ASAIO 54th Annual Conference, 19-21 June 2008
【非特許文献４】Ton et al. 1979. Adsorption of Human Serum Albumin to Amberlite XAD-7 Resin. J Biomed Mater Res 13:407-422
【非特許文献５】Hughes et al. 1978. The use of an in vitro haemoperfusion circuit to evaluate the blood compatibility of albumin-coated Amberlite XAD-7 resin. Int J Artif Organs l(3):129-34
【非特許文献６】Ton H. Y. et al. 1979. Albumin-coated Amberlite XAD-7 resin for hemoperfusion in acute liver failure. Part I: adsorption studies. Artif Organs 3(l):20-22
【非特許文献７】Hughes R. et al. 1979. Albumin-coated Amberlite XAD-7 resin for hemoperfusion in acute liver failure. Part II: in vivo evaluation. Artif Organs. 3(l):23-26
【非特許文献８】Falkenhagen et al. 1981. Optimization of albumin coating for resins. Artif Organs 5 (Suppl):195-199
【非特許文献９】Annesini et al., 2005. Bilirubin removal from albumin-containing Solution by adsorption on polymer resin. The International Journal of Artificial Organs. VoI 28, Nr. 7: 686-693
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の目的は、改善された収着剤を提供することである。生体液からタンパク質結合物質を除去するための収着剤で、先行技術に既知の収着剤と比べて選択性がかなり改善されたものを提供する。この改善された収着剤は、肝臓患者の血液中のタンパク質結合物質を効率よく取り除くが、血液凝固に関係するタンパク質は、特にプロテインＣやプロテインＳなどの重要な生理学的凝固阻害因子は、その生体液中に留まる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本目的は、最初に述べた種類の収着剤により、即ち平均孔径が少なくとも１５ｎｍである中性で疎水性のポリマーにより達成される。
【００１８】
本発明により、かなり選択性が改善された収着剤が提供され、これにより、一方ではタンパク質結合物質の高効率な除去を保証し、他方では中性で疎水性のポリマーに係る凝固の問題を避けることができる。本発明の収着剤により、一方で重篤な肝機能の障害やまたは肝不全の患者の血液から効率よくタンパク質結合物質を除去し、他方で重い凝固合併症を減らし患者の安全を改善する可能性が初めて提供される。
【００１９】
本発明者等は、ポリペプチド層で被覆前の中性で疎水性のポリマーの平均孔径が少なくとも１５ｎｍであるとき、本発明の収着剤とプロテインＣとの結合が、非被覆の中性で疎水性のポリマーと比べてかなり低いという驚くべき状況を見出した。
【００２０】
血漿中に存在するビタミンＫ依存タンパク質であるプロテインＣは、血液凝固シークエンスの重要な調整剤であり、抗凝固薬効果がある。したがって、先行技術から知られているように、非被覆の中性で疎水性のポリマーへのプロテインＣの望まざる結合は、凝固合併症（深部静脈血栓症、肺塞栓症）を引き起こす。プロテインＳ（６２，０００Ｄａ）はプロテインＣ（６９，０００Ｄａ）に近い相対分子量を持つため、プロテインＳの結合もまた本発明の収着剤によりかなりの減少させられる可能性が極めて高いと考えられる。同じ考えが、類似の分子量の凝固因子（例えば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子）に当てはまる。
【００２１】
また、本発明の収着剤の、除去しようとするタンパク質結合物質（例えば、ビリルビン）に係る吸着性能が、非被覆ポリマーと比べて、ほんのわずかにしか、あるいはまったく損なわれないことが明らかとなった。したがって、本発明の収着剤はまた、この点において先行技術から知られる上記の収着剤より利点を有している［Annesini et al., 2005. Bilirubin removal from albumin-containing Solution by adsorption on polymer resin. The International Journal of Artificial Organs. VoI 28, Nr. 7: 686-693「アルブミン含有溶液からのポリマー樹脂への吸着によるビリルビンの除去」］。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
理解を深めるため、以下に使用する用語のいくつかを詳細に説明する。
【００２３】
本明細書中の「収着剤」は、吸収を、好ましくは吸着（即ち、生体液中にある分子を収着剤の表面力で固定すること）を行うための試薬である。本明細書においては、「収着剤」という用語に代えて「吸着剤」が用いられることもある。
【００２４】
本発明の範囲内で用いられる「生体液」は、無細胞液、特に血漿に関し、あるいは細胞含有液、特に血液に関する。また、人工的な肝臓補助の過程で、他の液体を、例えば凝固阻害剤を含む溶液（ヘパリン溶液、クエン酸溶液）または置換溶液（電解液、液体減少を補充するための液体）を体外の血液循環経路または血漿循環経路に導入する必要があるため、生体液はまた、希釈した血液または希釈した血漿をも含むものとする。本発明は、主にヒト医学の分野を対照とするものであり、このため主にヒトの体液に関係する。しかしながら、本発明が獣医学の分野に不適というわけではない。
【００２５】
「多孔性で中性で疎水性のポリマー」という表現は、明確な平均孔径をもつ多孔性で水不溶性の固体をさす。このポリマーは、ホモポリマーであってもヘテロポリマーであってもよい。このポリマーは、中性で疎水性の外表面と内表面を持つ。「中性」とは、非イオン性であることを意味する。「疎水性の」とは、これらが撥水性材料構造であることを意味するものとする。「ポリマーの平均孔径」の意味するもの、また空隙率または平均孔径をどのように設定するかについては、当業者には既知であるが、明確とするために、この用語を簡単に説明する。平均孔径は、孔の平均径に関する。ガウシアン型の孔径分布の場合は、平均孔径は分布曲線の最大値に相当する孔径である。この平均孔径は、例えば、窒素吸着［Weber et al. 2008. Neutral styrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins in liver failure. Biomacromolecules 9(4):1322-1328に記載されるように］、または水銀圧入により決めることができる。この孔径は、関係するモノマー、溶媒、または調整剤の濃度の変化により設定される。ポリマーの孔を小さくすればするほど、吸収に、特に吸着に用いられるポリマーの内表面積が大きくなる。孔が大きいほど大きな分子が孔に接近しやすくなる。本発明に使用しうる明確な孔径をもつポリマーの製造方法が、例えば、ウェーバら［Weber et al. 2008. Neutral styrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins in liver failure. Biomacromolecules 9(4):1322-1328］により記載されている。本発明は、主に粒子状のポリマーに関するものである。吸着剤がメンブランフィルターの形をとることも考えられる。
【００２６】
多孔性の中性で疎水性のポリマーの外表面と内表面はポリペプチドの層で被覆されているが、このポリペプチド層は、ポリマーの表面にポリペプチド分子が吸着されたものである。この「ポリペプチド」は、疎水性ではあるが親水性の側鎖または領域をもつポリペプチドまたはタンパク質である。この「ポリペプチド」は、特に、１０個を超える数のアミノ酸から合成されるポリペプチドに関するものである。ただし、ポリペプチド分子を合成するアミノ酸数に上限はない。特に、この「ポリペプチド」はタンパク質である。中性で疎水性のポリマーにポリペプチド溶液を塗布する際に、ポリペプチド（またはタンパク質）の、疎水性側鎖または領域が疎水性相互作用のためポリマーの中性で疎水性の表面と相互作用する。この疎水性相互作用は大きな生化学的意味をもつ。これは疎水性分子が、極性環境では会合しやすいという現象に基づくものである。したがって、疎水性相互作用はそれ自体では力ではないが、極性環境により引き起こされる。ポリペプチドの親水性側鎖は外向きに、ポリマーの疎水性の表面から離れる方向に配向する。このポリマーは、その外表面と内表面をポリペプチド層でライニングすることで親水化される。通常、ポリペプチドの単一層が形成される。特に、ポリペプチド層が機能的に不活性であることが好ましい。「機能的に不活性」とは、ポリペプチド層と生体液中に存在する分子（例えば、血漿タンパク質等）との間に特異的な相互作用がないことを意味するものとする。また、このポリペプチド層が、生体液中に存在する分子に非特異的に相互作用しないことが好ましい。あるポリペプチドが本発明に適するかどうかは、当業者により簡単な試験で決められる。
【００２７】
この生体液が十分な時間（１５分間を超えて）、平均孔径が１５〜２０ｎｍである本発明収着剤に接触されると、この収着剤によりプロテインＣが生体液から一定時刻後に除去されることが明らかとなった。しかし、本発明の収着剤とは対照的に、プロテインＣは非被覆の中性で疎水性のポリマーで直ちに取り除かれる。平均孔径が１５〜２０ｎｍであるポリマーは、それでも、強くタンパク質に結合している物質に対して高い吸着速度をもつ肝臓補助システム、例えばマイクロスフェアー系無害化システム（ＭＤＳ）に非常に好適である。ＭＤＳでは、生体液が収着剤と接触する時間を十分に短くでき（５分未満）、またプロテインＣを、生理的に適正な量で生体液中に残存させることができる。孔径が１５〜２０ｎｍであることの利点は、内表面積が大きいことと、またそのためにタンパク質結合物質に対する吸収性能がよいことである。
【００２８】
生体液が本発明の収着剤と接触する時間が長い（１５分を超える）方法では、平均孔径が１５〜２０ｎｍより大きなポリマーの使用が推奨される。プロテインＣのこのポリマーへの結合が平均孔径の増加と共に減少することが明らかとなった。また、孔径が大きい（≧３０ｎｍ）と、タンパク質Ｃ濃度が生理的な限界値に減少することなく、生体液を本発明の収着剤に非常に長時間接触させることができる。平均孔径が８０〜１００ｎｍと非常に大きいと、プロテインＣが吸着されにくくなる。この観測を基に、被覆される中性で疎水性のポリマーの平均孔径を、少なくとも１５ｎｍで、好ましくはそれ以上（≧３０ｎｍ）で選ぶべきである。ビリルビンなどのタンパク質結合物質は、孔径が１５ｎｍ以上で非常によく吸着される。
【００２９】
８ｎｍまたは９ｎｍと小さな平均孔径をもつアルブミン被覆のポリマー（上記の先行技術を参照）を使用すると、血液灌流中における血小板の吸着剤への結合の低下に関して生体親和性を増加させるが、望ましくないプロテインＣ結合の低下に関して満足できる溶液を与えることができない。現在まで、既知のアルブミン被覆ポリマーは、プロテインＣに関する凝集の問題につながっていない。また、すでに先行技術に記載されているように、平均孔径が５〜１０ｎｍであるアルブミン被覆ポリマーでは、不都合にも未被覆ポリマーと比較してビリルビン吸着の減少が認められている。
【００３０】
孔径増による収着剤とプロテインＣの結合の低下に対する一つの可能性のある説明は、次のとおりである。ポリペプチド層を用いての、小さな平均孔径（１５−２０ｎｍ）をもつポリマーの、特にポリマーの内表面の吸着被覆は、用いるポリペプチド（例えば、アルブミン）の大きさのため、不完全となる可能性がある。したがって、比較的小さなプロテインＣが孔の中に入り込み、残留している疎水性表面上で吸着される可能性がある。平均孔径が大きい（≧３０ｎｍ）と、ポリペプチドに対する親和性が良好で、このため、より好ましいポリマー表面の親水性ライニングがもたらされる。このため、疎水性表面がもはやプロテインＣ用には残っていない。また、このプロテインＣは、ポリペプチド層の親水性の側鎖または領域により反撥される。タンパク質結合物質の吸収性能はポリペプチド被覆により悪影響を受けないため、大孔径（≧３０ｎｍ）の被覆ポリマー上のタンパク質結合物質結合用の内表面上には、疎水性表面が（プロテインＣに近づくことはできないが）まだ十分な量で残っていると考えられる。このタンパク質層は、個々のポリペプチド分子間に極めて小さな孔（ピコ孔）をもつ単一層を形成し、ビリルビンなどのタンパク質結合物質は、ポリペプチド被覆にも係らず、この孔を通過して吸着されると考えられる。
【００３１】
非被覆ポリマーの平均孔径を小さくしてプロテインＣの結合を小さくすることができるが、臨床応用のためには平均孔径が８０ｎｍ以下であることが好ましい。そうでないと、ポリマーの内表面積が小さくなりすぎるであろう。この結果、強くタンパク質に結合している物質の吸収効率（吸着効率）の低下がおこる。高リスクの肝不全患者では、平均孔径を４０ｎｍ以下とすることが推奨される。
【００３２】
特に好ましい実施様態では、この非被覆の中性で疎水性のポリマーの平均孔径が３０〜４０ｎｍである。この実施様態では、生体液を収着剤に長時間接触させても、ごく少量のタンパク質Ｃのみが吸着されることが明らかとなった。また、ポリマーの内表面積は、この孔径でも十分に大きく、高効率なタンパク質結合物質の吸着が保証される。
【００３３】
すでに臨床使用で確立されている中性で疎水性のポリマーが有利に用いられる。スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーが特に好ましく用いられる。スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーが肝不全や腎不全の毒素の吸着に有効であることはすでに実証済みであり、これは、生体親和性のよいこと、毒性がないこと、安定性に優れ、滅菌可能であることを特徴としている。また、容易かつ信頼性高く孔径を設定可能である。また、非常に小さな粒度に設定することも可能である。しかしながら、スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーに似た構造を有する中性で疎水性のポリマーを使用することもできる。ただし、これらはスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーに似た作用を示す必要がある。当業者は、ある中性で疎水性のポリマーが本発明の実施に適当かどうかを、数回の簡単な試験で決めることができる。
【００３４】
中性で疎水性のポリマーをポリペプチド層で被覆するのには、相対分子量が４０，０００〜８０，０００Ｄａで及び／又は大きさが約１０ｎｍ×１０ｎｍ×１０ｎｍであるポリペプチドが好まし用いられる。
【００３５】
このポリペプチド層は少なくとも一種のポリペプチドを含み、この少なくとも一種のポリペプチドは、アルブミン、特にヒトアルブミン、及びアルブミン様ポリペプチドから選ばれる。アルブミン様ポリペプチドは、構造がアルブミンに似ており及び／またはアルブミン様の性質を持つ。アルブミン様ポリペプチドは、特にプレアルブミンなどのアルブミンの亜種から選ばれる。アルブミン様ポリペプチドは天然物であっても合成物であってもよい。このポリペプチド層は、単一種のポリペプチドを含んでいてもよいし、二種以上のポリペプチドの混合物を含んでいてもよい。このポリペプチドは天然物であっても組み替えによって合成されたものであってもよい。あるポリペプチドまたは二種以上のポリペプチドの混合物の本発明の性能に対する適性は、当業者により簡単な試験で決定される。
【００３６】
中性で疎水性のポリマーの内表面と外表面上でのポリペプチド層の形成は、用いるポリペプチドまたはタンパク質の疎水性側鎖とポリマーの疎水性表面の間の疎水性相互作用によるものであることが、ここで再度わかるであろう。
【００３７】
極めて生体親和性に優れ、また高純度で入手可能であるためヒトアルブミン（ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）を、ポリマーの被覆に用いることが特に好ましい。
【００３８】
本発明はまた、中性で疎水性のポリマーをポリペプチド層で吸着被覆するのに１０％までのポリペプチド溶液を使用する本発明の収着剤の製造方法に関する。
【００３９】
ある特に好ましい実施様態では、このポリペプチド溶液がヒトアルブミン溶液である。すでに詳述したように、さらに有利なポリペプチドが、アルブミン、特にヒトアルブミンとアルブミン様ポリペプチドから選択される。また、このポリペプチド溶液は、複数のポリペプチドを含むこともできる。
【００４０】
１％のポリペプチド溶液でも十分に本発明の性質をもつ収着剤を与えることが示された。より高濃縮されたポリペプチド溶液（５〜１０％）を用いても、プロテインＣの結合に対して大きな差異または改善をもたらさない。したがって、経済的な理由のため（高純度ポリペプチド溶液は高価である）、本発明の第一の有利な実施様態では、１％のポリペプチド溶液が、中性で疎水性のポリマーの被覆に用いられる。
【００４１】
本方法のより好ましい実施様態においては、１０％ポリペプチド溶液が用いられる。より高濃縮されたポリペプチド溶液（１０％）を用いるポリマーの吸着被覆は、望まざるプロテインＣの収着剤への結合とフィブリノーゲンの結合を大きく低下させるという長所を有している。
【００４２】
ポリペプチド溶液のｐＨは、７．４０に設定することが好ましい。これは、血液の生理的なｐＨに相当するｐＨが、すでに担体（ポリマー）のポリペプチドでの吸着被覆に使用されるという長所を持つ。これは、患者の安全面での利点（アシドーシスまたはアルカローシスの防止）だけでなく、生理的なｐＨ（収着剤は通常懸濁液の形で提供される）に設定するための面倒な洗浄処理が必要でないため、製造上の利点をも持っている。
【００４３】
このｐＨを、ポリペプチドの等電点に近く選ぶことが好ましいことがわかる。ｐＨを変えることで、ポリマー上でのポリペプチドの占有密度が変動することが知られている［Ton et al. 1979. Adsorption of Human Serum Albumin to Amberlite XAD-7 Resin. J Biomed Mater Res 13:407-422］。ｐＨを最適化することによりこのポリペプチド溶液の濃度を非常に低く抑えることができ、製造コストを抑えることができる。ｐＨの最適化は、簡単な試験の範囲で実施可能である。
【００４４】
ポリマー表面の物理化学的な性質と平均孔径に加えて、ポリマーの粒度が、吸着処理である一定の役割を果たす。粒子径は、吸着の動力学に影響を与える。吸着は、実質的には拡散時間（また、したがって拡散速度）の関数であり、拡散時間は距離の二乗に比例する。選ばれる粒度が小さい場合は拡散経路が非常に短くなるため、消失速度は粒度に反比例する。また、粒度が小さいと表面積／体積比が大きくなる。強固にタンパク質に結合している物質の吸収速度と吸収容量をできる限り大きくするためには、収着剤が、粒度が２０μｍ以下の微粒子であることが好ましい。
【００４５】
この微粒子は、特にＭＤＳ（マイクロスフェアー系の無害化システム）で用いられるが、このことはすでに先行技術に記載されている。この微粒子は、メンブランフィルターのろ液側の浄化経路（血漿循環経路）中で懸濁物質として循環する。しかしながら、メンブランフィルターに漏れが出てくると、微粒子が体外血液循環経路に至り、さらに患者の体内に到って、肺塞栓を引き起こす危険が存在する。このため、特に有利な実施様態においては、この微粒子の粒度が８μｍ以下、理想的には５μｍ以下である。これは、このような小さな粒度では肺塞栓の危険を避けることができるためである。
【００４６】
また、本発明の収着剤は、吸着カラムなどの吸収装置に好適な充填材である。
【００４７】
また、本発明は、タンパク質結合物質を含む生体液を本発明の収着剤に接触させてタンパク質結合物質を生体液から除去する方法に関する。とりわけ、上記収着剤を用いてタンパク質結合物質から血液または血漿が浄化される体外肝臓補助の範囲内で、この方法が実施される。体外肝臓補助は、肝不全または肝機能の低下した患者や腎機能不全の患者中で使用される。上述のように、生体液がこの収着剤を含む吸収装置内を流れる。しかしながら、この収着剤をＭＤＳの場合のように生体液中に懸濁させてもよい。
【００４８】
また本発明は、本発明の収着剤の、生体液からタンパク質結合物質を除去する選択的収着剤としての利用に関する。なお、このタンパク質結合物質は、特にビリルビン、芳香族アミノ酸、胆汁酸、フェノール、メルカプタンであってもよい。「タンパク質結合物質」とは、主に肝臓の機能障害または肝不全の患者の血液中で増加するタンパク質結合毒性物質（いわゆる肝臓毒素）に関する。本発明の収着剤の改善された選択特性は、非被覆ポリマーと比べて本発明の収着剤では、タンパク質結合物質の吸収性能が低下していないにも関わらず、プロテインＣへの結合に大きな低下があるためである。
【００４９】
本発明はまた、本発明の収着剤の、無細胞の生体液、特に血漿からタンパク質結合物質を除去する選択的収着剤としての利用に関する。
【００５０】
さらに、本発明は、本発明の収着剤の、細胞を含む生体液、特に血液からタンパク質結合物質を除去する選択的収着剤としての利用に関する。
【００５１】
以下、本発明を、非制限的な実施例を参照しながらより詳細に説明する。
【実施例１】
【００５２】
「アルブミン被覆のスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーの製造」
被覆に用いたいろいろな平均孔径のスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーを表１に示す。粒度は、５μｍ±３〜４μｍであった。
【００５３】
【表１】
0005546554.tif 000002
【００５４】
まず、生理食塩水中で、明確な平均孔径をもつスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーの５０％懸濁液を調整する。バッチ量の倍量を、ピペットで１５ｍＬのグライナーチューブに入れ、遠心分離する。上澄液を抜き出す。残りのスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーが、バッチ体積に相当する。
【００５５】
次いで、このコポリマーの外表面と内表面に、ヒトアルブミン溶液からヒトアルブミンを吸着させて、スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーにヒトアルブミン層を形成する。１ｍＬのポリマー溶液と５ｍＬのヒトアルブミン溶液（ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）（ヒトアルブミンオクタファーマ２０％溶液、ロット：Ｂ１７Ｂ６３３１）を含むチューブを、各ダブルバッチに置く。ヒトアルブミン溶液の濃度は１〜１０％であってよい。これらのチューブを、振とう機（エンビロゲニー（Ｒ））中、１０℃で振とう周波数２５：５０で２１時間培養する。コントロールとして、コポリマーと０．９％ＮａＣｌ溶液を含むチューブを使用する。コポリマーを含まず、スパイク血漿（２．２．１節を参照）のみを含むチューブを負のコントロールとして用いる。振とう機内での培養時間（２１時間）の終了後、チューブを遠心分離して、上澄液を捨てる。
【実施例２】
【００５６】
「非被覆のスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーと比較しての、いろいろな孔径のヒト−アルブミン被覆スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーへのタンパク質結合物質の吸着とプロテインＣの吸着の試験」
２．１．吸着剤
まず、いろいろな孔径のスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーを準備した。これらのスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーの粒度は、５μｍ±３〜４μｍであった。次いで実施例１の製造手順により、これらのスチレン／ジビニルベンゼンコポリマーを、１０％ヒトアルブミン溶液（ＨＳＡ）を用いて被覆させた。吸着剤を表２に示す。
【００５７】
【表２】
0005546554.tif 000003
【００５８】
「ＨＳＡ被覆」は、アルブミンを用いて被覆された吸着剤を示し、「ＨＳＡ非被覆］は、それぞれの非被覆の吸着剤（＝ＨＳＡ被覆のないスチレン／ジビニルベンゼンコポリマー）を示す。
【００５９】
２．２．バッチ試験
上に示した吸着剤のタンパク質結合物質の吸着とヒト血漿からのプロテインＣの吸着についての性質を、バッチ試験で検討した。これらの試験のために、吸着剤をスパイク血漿（２．２．１節を参照）で被覆した。
【００６０】
２．２．１．血漿スパイクの製造
血漿スパイクの製造のために、健康な供与者からの血漿を、明確な濃度の肝臓毒素を用いてスパイクした。１００ｍＬの肝臓毒素を含むスパイク後の血漿は、３００μＭのビリルビンと、１００μＭのコール酸、１００μＭのトリプトファン、２ｍＭフェノールを含んでいた。
【００６１】
肝臓毒素は、次のように処理した。
【００６２】
ビリルビンバッチには、０．０１７５ｇのビリルビンを評量し、２ｍＬの０．３Ｎ−ＮａＯＨに溶解した。
【００６３】
混合トキシンバッチには、０．０２０４３ｇのコール酸と、０．０１０２ｇのトリプトファンと、０．０９４０ｇのフェノールを評量し、一緒に攪拌して、５ｍＬの０．３Ｎ−ＮａＯＨ溶液とした。
【００６４】
１００ｍＬのスパイク血漿には、２ｍＬの上記ビリルビンバッチと１ｍＬの上記混合トキシンバッチを、９６ｍＬの血漿に加え、光から保護しながらゆっくりと６０分間攪拌した。６０分後、３ｍＬの０．３Ｎ−ＨＣｌを加えた。
【００６５】
１ｍＬの吸着剤を、９ｍＬのスパイク血漿と混合して、試験管中で表２に示す吸着剤をスパイク血漿を用いて被覆した。これは、１０％吸着剤バッチに相当する。負のコントロールとして、スパイク血漿を含み吸着剤を含まない試験管を用いた。試験管を、エンビロゲニー（Ｒ）振とう機で３７℃で１時間培養した。振とう周波数は２５：５０であった。
【００６６】
２．２．２．試料の捕集
５分、１５分、３０分、６０分後に、各試験管から１ｍＬを抜き出し、直ちに１１，０００ｇで１０分間遠心分離した。上澄液を直ちにエッペンドルフ反応容器に移した。吸着剤を含まない負のコントロール（「コントロール血漿」と呼ぶ）を、０分の時点での測定に用いた。試料は−２０℃で保存し、分析までは光から保護した。
【００６７】
２．２．３．分析
加えた肝臓毒素（ビリルビン、コール酸、トリプトファン、フェノール）と血漿中に存在するタンパク質（アルブミンとプロテインＣ）の吸着の両方を分析した。
ビリルビン、キットロット：１４６５２７００  （ロシュ社）
コール酸、ロット：Ｒ２８４０６７  （ロシュ社）
トリプトファンキットロット：６８５１２５−０１  （ロシュ社）
フェノール：ＨＰＬＣクロマトグラフィー
アルブミンキットロット：６８８２７１−０１  （ロシュ社）
プロテインＣ  ＥＬＩＳＡキットロット：１２０２１２２８  （テクノクローン社）
分析は、日立９０２（ＶＴ）で行った。
【００６８】
２．３．試験結果
試験結果を、グラフの形式で数字で示す。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２２と＃１８２４と比較のための各非被覆吸着剤＃１８２２と＃１８２４によるビリルビン吸着（上澄みのビリルビン濃度：ｍｇ／ｄＬ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図１Ｂ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２５と比較のための非被覆吸着剤＃１８２５によるビリルビン吸着（上澄みのビリルビン濃度：ｍｇ／ｄＬ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図２Ａ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２２と＃１８２４と比較のための各非被覆吸着剤＃１８２２と＃１８２４によるコール酸吸着（上澄みのコール酸濃度μｍｏｌ／Ｌ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図２Ｂ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２５と比較のための非被覆吸着剤＃１８２５によるコール酸吸着（上澄みのコール酸濃度：μｍｏｌ／Ｌ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図３Ａ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２２と＃１８２４と比較のための各非被覆吸着剤＃１８２２と＃１８２４によるトリプトファン吸着（上澄みのトリプトファン濃度μｍｏｌ／Ｌ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図３Ｂ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２５と比較のための非被覆吸着剤＃１８２５によるトリプトファン吸着（上澄みのトリプトファン濃度：μｍｏｌ／Ｌ）の時間曲線［分］である。
【図４Ａ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２２と＃１８２４と比較のための各非被覆吸着剤＃１８２２と＃１８２４によるフェノール吸着（上澄みのフェノール濃度：ｍｍｏｌ／Ｌ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図４Ｂ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２５と比較のための非被覆吸着剤＃１８２５によるフェノール吸着（上澄みのフェノール濃度：ｍｍｏｌ／Ｌ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図５Ａ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２２と＃１８２４と比較のための各非被覆吸着剤＃１８２２と＃１８２４による血漿タンパク質アルブミン吸着（上澄みのアルブミン濃度ｇ／ｄＬ）の時間曲線［分］である。
【図５Ｂ】ＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２５と比較のための非被覆吸着剤＃１８２５による血漿タンパク質アルブミン吸着（上澄みのアルブミン濃度：ｇ／ｄＬ）の時間曲線［分］を示すグラフである。
【図６】本発明のＨＳＡで被覆された吸着剤＃１８２２と＃１８２４と＃１８２５、比較のための各非被覆吸着剤＃１８２２と＃１８２４と＃１８２５による０、５、１５及び６０分間培養後の凝固タンパク質プロテインＣ吸着（％）を示すグラフである。
【図７】いろいろなヒトアルブミン溶液（１％、５％、および１０％）を用いて被覆した吸着剤による凝固タンパク質であるプロテインＣの吸着（％）を、時間の関数として示すグラフである。
【００７０】
〔結果の要約〕
２．４．バッチ試験からの結果の要約
バッチ試験の結果より、吸着剤のアルブミン被覆で生体親和性をかなり改善できること、特に天然の抗凝固剤であるプロテインＣの吸着が阻害されるか大きく低下することがわかる。したがって、これがプロテインＳにも当てはまると考えるべきである。これは、敗血症または肝不全の患者に大きな意味を持つ。これらの患者の血液の凝固能力が攪乱されており、さらにこれを悪化させてはならないからである。また、肝不全と腎不全の主たる毒素の吸着に対する吸着剤の特性（図１Ａ、図１Ｂ、図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、および図４Ｂを参照）がＨＳＡタンパク質の被覆により影響を受けず、それらの吸着容量と吸着速度がほぼ維持されている。
【００７１】
少量のアルブミンの脱着（図５Ａと図５Ｂを参照）は、被覆処理の際に必要以上のアルブミンがポリマーに結合し、このため二重層または多重層が形成することにより説明できる。特定状況下では過剰のアルブミンが再び脱着する。いずれの場合でも維持されるアルブミン単一層が、上記のアルブミン層の有利な機能に関与している。
【００７２】
図６から明らかなように、スチレン／ジビニルベンゼンコポリマーをヒトアルブミン層で吸着被覆することにより、プロテインＣの吸着を大きく低下させることができる。小さな平均孔径（１５〜２０ｎｍ、３０〜４０ｎｍ）をもつ非被覆ポリマーでは、プロテインＣが血漿から完全に取り除かれるが、大きな平均孔径（ＨＳＡ被覆のない＃１８２５、孔径：８０〜１００ｎｍ）では、プロテインＣの一部が血漿中に残留する。孔径が８０ｎｍより大きな吸着剤は、内表面積が小さいため、例えば命を脅かす恐れのない肝機能障害の患者への臨床応用には適合性が限られている。非被覆吸着剤とは対照的に、プロテインＣ吸着の大きな低下が、ＨＳＡで被覆された吸着剤を用いて孔径が１５〜２０ｎｍですでに確立されている。ＨＳＡで被覆された吸着剤のプロテインＣの吸着は、孔径が大きくなるとさらに低下する。ＨＳＡで被覆された吸着剤が３０〜４０ｎｍの孔径を持つことが特に好ましい。これは、一方ではこの孔径ではプロテインＣがほとんど取り除かれず、他方では吸着剤の内表面積がタンパク質結合物質の高効率な除去に依然として十分なほど大きいためである。明らかなように、大きな孔径（８０〜１００ｎｍ）ではプロテインＣがほとんど吸着されないが、タンパク質結合物質の吸着性能もかなり小さくなる。
【実施例３】
【００７３】
「ヒトアルブミン溶液の濃度の関数としてのタンパク質結合物質とプロテインＣの吸着の試験」
タンパク質結合物質とプロテインＣの吸着への、中性で疎水性のスチレン／ジビニルコポリマーの被覆に用いられるヒトアルブミン溶液（実施例１の手順を参照）の濃度の影響を調べた。この試験の目的は、コポリマーの被覆のために理想的なヒトアルブミン溶液の濃度を試験することである。
【００７４】
実施例１の非被覆吸着剤＃１８２４（平均孔径３０〜４０ｎｍ）を、実施例１の手順に記載のヒトアルブミンを、ヒトアルブミン溶液の３つの異なる濃度で（１％ＨＳＡ、５％ＨＳＡ、および１０％ＨＳＡ）用いて被覆した。２．２節の手順に記載のバッチ試験において、ＨＳＡで被覆された吸着剤をスパイク血漿を用いて被覆した。比較のために、非被覆吸着剤をもつチューブを用いた。また、スパイク血漿のみを有し吸着剤を含まないチューブを、負のコントロールとして用いた。分析はまた、２．２節にのべた手順で行った。
【００７５】
このバッチ試験に用いたいろいろなバッチを表３に示す。
【００７６】
【表３】
0005546554.tif 000004
【００７７】
〔結果の要約〕
バッチ試験の結果の要約
ＨＳＡ溶液の濃度は、ビリルビン、コール酸、アルブミンおよびフェノールの吸着に影響を及ぼさない。これらの曲線は、実質的に同じである。
【００７８】
ＨＳＡ濃度が１０％のときに、ＨＳＡ濃度が１％または５％のときよりわずかに優れたトリプトファン吸着が得られる。
【００７９】
いろいろなヒトアルブミン溶液（１％、５％、および１０％）を用いて被覆した吸着剤による凝固タンパク質であるプロテインＣの吸着（％）が、時間の関数として（０、５、１５、３０、および６０分間の培養）図７に示されている。
【００８０】
プロテインＣの吸着は、被覆に用いるヒトアルブミン溶液の濃度でほとんど影響を受けない。ヒトアルブミン溶液の濃度が上昇すると、プロテインＣ吸着のわずかな低下が認められた。この結果より、ポリマーの被覆用の１％ヒトアルブミン溶液は、プロテインＣの吸着を大きく低下させるのにまったく十分である。
【００８１】
経済的な理由からは１％ヒトアルブミン溶液が好ましいが、被覆に１０％ヒトアルブミン溶液を使用することは、フィブリノーゲンの吸着にはメリットがある。フィブリノーゲンは、１％ＨＳＡと５％ＨＳＡでは数分後に血漿から完全に取り除かれたが、１０％のＨＳＡで被覆された吸着剤を使用すると吸着がかなり低下された。
【図１Ａ】
0005546554.tif 000005
【図１Ｂ】
0005546554.tif 000006
【図２Ａ】
0005546554.tif 000007
【図２Ｂ】
0005546554.tif 000008
【図３Ａ】
0005546554.tif 000009
【図３Ｂ】
0005546554.tif 000010
【図４Ａ】
0005546554.tif 000011
【図４Ｂ】
0005546554.tif 000012
【図５Ａ】
0005546554.tif 000013
【図５Ｂ】
0005546554.tif 000014
【図６】
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【図７】
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