(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン覆膜細胞を含むワクチン組成物であって、前記サイトカイン覆膜細胞は選択抗原を提供し且つ細胞の表面に結合された、遺伝子工学操作により改変されたサイトカインを有し、前記遺伝子工学操作により改変されたサイトカインは、サイトカインからの第一部分とＧＰＩである第二部分とを含み、前記サイトカインは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１２受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＩＦＮ−γ受容体、ケモカイン受容体、及びＧＭ−ＣＳＦ受容体からなる群から選択される受容体のリガンドの１つである、ワクチン組成物。
【請求項２】
サイトカイン覆膜細胞と選択抗原を含むワクチン組成物であって、前記サイトカイン覆膜細胞は細胞の表面に結合された、遺伝子工学操作により改変されたサイトカインを有し、前記遺伝子工学操作により改変されたサイトカインは、サイトカインからの第一部分とＧＰＩである第二部分とを含み、前記サイトカインは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１２受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＩＦＮ−γ受容体、ケモカイン受容体、及びＧＭ−ＣＳＦ受容体からなる群から選択される受容体のリガンドの１つである、ワクチン組成物。
【請求項３】
前記ワクチン組成物はさらに、オプソニン増強細胞を含み、前記オプソニンは、マンノース結合タンパク質及びＣ３ｂのα’鎖からなる群から選択される、請求項１または２のワクチン組成物。
【請求項４】
さらにサイトカインを含む、請求項１または２のワクチン組成物。
【請求項５】
さらに前記サイトカインを発現する細胞を含む、請求項４のワクチン組成物。
【請求項６】
前記サイトカインをコードしている組換え核酸分子は、人工的に前記細胞に導入され、前記細胞は、前記核酸から前記サイトカインを発現する、請求項４のワクチン組成物。
【請求項７】
前記サイトカインは遺伝子工学操作により改変されたサイトカインである、請求項４のワクチン組成物。
【請求項８】
前記遺伝子工学操作により改変されたサイトカインはＧＰＩを含む、請求項７のワクチン組成物。
【請求項９】
前記オプソニン増強細胞のオプソニンは遺伝子工学操作により改変されたオプソニンである、請求項３のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記遺伝子工学操作により改変されたオプソニンはＧＰＩを含む、請求項９のワクチン組成物。
【請求項１１】
インビトロでＡＰＣを、選択抗原を含むサイトカイン覆膜細胞と、前記ＡＰＣによる前記選択抗原の内部移行を可能とするに十分な時間接触させることにより得られるワクチン組成物であって、前記サイトカイン覆膜細胞は選択抗原を提供し且つ細胞の表面に結合された、遺伝子工学操作により改変されたサイトカインを有し、前記遺伝子工学操作により改変されたサイトカインは、サイトカインからの第一部分とＧＰＩである第二部分とを含み、前記サイトカインは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１２受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＩＦＮ−γ受容体、ケモカイン受容体、及びＧＭ−ＣＳＦ受容体からなる群から選択される受容体のリガンドの１つである、ワクチン組成物。
【請求項１２】
インビトロでＡＰＣを、選択抗原を含むサイトカイン覆膜オプソニン増強細胞と、前記ＡＰＣによる前記選択抗原の内部移行を可能とするのに十分な時間接触させることにより得られるワクチン組成物であって、前記サイトカイン覆膜オプソニン増強細胞のサイトカインは細胞の表面に結合された、遺伝子工学操作により改変されたサイトカインであり、前記遺伝子工学操作により改変されたサイトカインは、サイトカインからの第一部分とＧＰＩである第二部分とを含み、前記サイトカインは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１２受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＩＦＮ−γ受容体、ケモカイン受容体、及びＧＭ−ＣＳＦ受容体からなる群から選択される受容体のリガンドの１つであり、前記オプソニンは、マンノース結合タンパク質及びＣ３ｂのα’鎖からなる群から選択される、ワクチン組成物。
【請求項１３】
前記サイトカイン覆膜細胞の前記細胞は病原細胞である、請求項１〜３、１１又は１２のいずれか１つのワクチン組成物。
【請求項１４】
前記病原細胞は悪性腫瘍細胞である、請求項１３のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記病原細胞は、細菌、ウイルス、真菌及び寄生虫細胞からなる群から選択される、請求項１３のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記ワクチン組成物は弱毒化されている、請求項１〜１５のいずれか１つのワクチン組成物。  
【請求項１７】
前記サイトカインはＧＭ−ＣＳＦ受容体のリガンドである、請求項１〜１６のいずれか１つのワクチン組成物。
【請求項１８】
前記ＧＭ−ＣＳＦ受容体のリガンドはＧＭ−ＣＳＦである、請求項１７のワクチン組成物。
【請求項１９】
前記サイトカインはＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１２受容体、ＴＮＦ−α受容体、ＩＦＮ−γ受容体、及びケモカイン受容体からなる群から選択される受容体のリガンドの１つである、１〜１６のいずれか１つのワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  （技術分野）
本発明は、一般に、免疫系、および特に抗原に対する免疫応答を調節する組成物および方法に関する。
【０００２】  （背景技術）
サイトカインは、白血球上の細胞表面受容体への結合により免疫および／または炎症反応を制御するポリペプチド分子である。それらは、拡散性の細胞外ホルモンとして活性であるが、いくつかのサイトカインはまたトランスメンブラン形で天然に存在する。それらは、免疫または炎症応答の性質を増大、減弱、または変化させることができる。選択サイトカインが調節できる白血球特性の例は、増殖状態、転写プロフィル、および遊走傾向を含む。
【０００３】  いくつかのサイトカインは、構造および／または機能の類似性に基づきファミリーに分類できる。該ファミリーの例は、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）を含む。サイトカインは１つ以上のファミリーに属することがある。
【０００４】  インターロイキンは、白血球により産生されるサイトカインである。インターロイキンには、「インターロイキン」または「ＩＬ」に後に命名した順番を示す番号を付して呼称されるサイトカインがある。現在までにＩＬ−１からＩＬ−１８が記載されている。さらに、ほとんどの他の既知のサイトカインが、白血球により産生され、従って、インターロイキンと考えることができる。
【０００５】  インターフェロンは、ウイルス複製阻害能に基づいて一緒に分類される。インターフェロンはインターフェロン（ＩＦＮ）α、βおよびγを含む。
【０００６】  ケモカインは、白血球の化学走性を誘導する。別の言葉で言えば、ケモカインの濃度勾配では、白血球はより高濃度に向けて移動する。ケモカインは、２つの保存システインが連続しているＣ−Ｃケモカイン、および２つの保存システインが別のアミノ酸により分離されているＣ−Ｘ−Ｃケモカインと呼称される２つのサブファミリーを含む。Ｃ−Ｃケモカインは、一般に、単球およびリンパ球を最も強力に引き付け、一方、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインは、一般に、好中球を最も強力に引き付ける。Ｃ−Ｃケモカインの例は、マクロファージ化学走性および活性化因子（ＭＣＡＦ）、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）１ａおよびｂ、およびＲＡＮＴＥＳを含む。Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインの例は、ＩＬ−８、好中球活性化タンパク質２（ＮＡＰ−２）、および血小板因子４（ＰＦ−４）を含む。
【０００７】  コロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、骨髄細胞の選択型白血球への分化促進能から一緒に分類される。ほとんどのＣＳＦはまた、成熟末梢白血球の機能も調節する。ＣＳＦの例は、マクロファージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、および顆粒球−マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）を含む。
【０００８】  サイトカインはまた、それらが結合する受容体の型に従って分類できる。該型の受容体の例は、ヘマトポイエチン受容体（クラスＩサイトカイン受容体としても知られる）、インターフェロン受容体（クラスＩＩサイトカイン受容体としても知られる）、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体、ＴＮＦ受容体、およびケモカイン受容体を含む。
【０００９】  ヘマトポイエチン受容体は、２個の保存アミノ酸モチーフをその細胞外ドメインに含む。これらの１つは、４個の位置的に保存されたシステインからなり、他方は、配列Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒからなり、ここでの「Ｘ」は、非保存アミノ酸である。このファミリーの多くの受容体が、複数のポリペプチド鎖を含み、その鎖のいくつかは該ファミリーの１つ以上のメンバーに共通である。ある共通鎖の存在は、ヘマトポイエチン受容体のサブファミリーを規定する。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の受容体を含む、ＧＭ−ＣＳＦ受容体サブファミリーのメンバーは全て、同一のシグナル伝達β鎖を含む。同様に、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ、および毛様体神経栄養性増殖因子（ＣＮＴＦ）の受容体を含む、ＩＬ−６受容体サブファミリーのメンバーは全て、ｇｐ１３０シグナル伝達鎖を含む。ＩＬ−２受容体サブファミリーは、シグナル伝達γ鎖の存在により規定される。このサブファミリーのメンバーは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９およびＩＬ−１５の受容体を含む。
【００１０】  インターフェロン受容体は、ヘマトポイエチン受容体と同様、４個の位置的に保存された細胞外システインの存在、およびＴｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒモチーフの非存在を特徴とする。このファミリーのメンバーは、インターフェロンα、β、およびγの受容体を含む。
【００１１】  免疫グロブリンスーパーファミリー受容体は、免疫グロブリン定常および可変領域の球状ドメインに相同的な球状ドメインを有する。このファミリーに属するサイトカイン受容体は、ＩＬ−１、Ｍ−ＣＳＦおよびｃ−ｋｉｔの受容体を含む。
【００１２】  ケモカイン受容体は、膜を横断する７個の疎水性αヘリックスセグメントを含むＧタンパク質共役７トランスメンブランドメイン受容体の大きな群に属する。これらの受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を介してシグナルを媒介するＧタンパク質共役受容体のスーパーファミリー内の構造相関群を形成する。
【００１３】  ＧＭ−ＣＳＦなどのいくつかのサイトカインのカルボキシ末端（Ｂｒｏｗｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９４、２２５：８７３−８８０）は、同族受容体との相互作用に重要であることが当分野で知られている。ＧＰＩ部分はタンパク質のカルボキシ末端に結合するので、当業者は、異種ＧＰＩ部分は、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインのその受容体への結合を妨害し得ると期待する。さらに、ケモカインなどの可溶性サイトカインは、濃度勾配を介してその活性を奏効することが知られているので、当業者は、該分子の膜結合型は、免疫応答の調節を補助できるとは期待しない。
【００１４】  ＣＤ４０は、Ｂ細胞、マクロファージ、および樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む、ある白血球上に発現されたトランスメンブラン細胞表面ポリペプチドである。ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）またはＣＤ１５４として知られる、ＣＤ４０の天然リガンドも、例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞上に発現されるトランスメンブラン細胞表面ポリペプチドである。ＩＬ−４存在下でのＩｇＭ発現Ｂ細胞上でのＣＤ４０の会合により、それらの細胞は、ＩｇＧおよびＩｇＥの分泌を開始できる（Ｓｐｌａｗｓｋｉら、１９９３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５０：１２７６−１２８５）。さらに、あるＡＰＣ上でのＣＤ４０の会合により、それらのＡＰＣは細胞障害性Ｔ細胞を刺激できる（Ｒｉｄｇｅら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８；Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７８−４８０；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４８０−４８３）。一方、樹状細胞上でのＣＤ４０の連結により、外来抗原の取込み能は減少する（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９５、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８２：３８９−４００；Ｒｕｅｄｌら、１９９７、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２７：１３２５−１３３０）。
【００１５】  Ｍｅｎｄｏｚａ等（１９９７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：５７７７−５７８１）は、ＣＤ４０Ｌをコードしているプラスミドを、リポーター抗原をコードしているプラスミドと共注入することにより、被検者の抗原に対する免疫応答は調節されたことを示した。Ｄｕｌｌｆｏｒｃｅ等（１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：８８−９１）は、多糖抗原と共に抗ＣＤ４０抗体を投与することにより、抗原に対するＴ細胞非依存性抗体応答が増強したことを示した。Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ等（１９９７、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：１９３５−１９４３）は、ＣＤ４０Ｌをコードしている遺伝子を腫瘍細胞に移し、これらの細胞を使用して、野生型腫瘍細胞の免疫になるようにマウスにワクチン接種した。Ｋａｔｏ等（１９９８、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０１：１１３３−１１４１）は、ＣＤ４０Ｌをコードしている遺伝子を用いてＢ細胞白血病細胞を形質導入し、形質導入細胞はインビトロでＡＰＣ機能を有することを示した。Ｃｏｕｄｅｒｃ等（１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１６３−７５）も、ＣＤ４０Ｌの遺伝子を腫瘍細胞に導入し、これらの細胞でワクチン接種すると抗腫瘍免疫応答が誘導されることを示した。
【００１６】  （発明の開示）
本発明は、少なくとも一部には、ＣＤリガンド増強細胞、すなわち、外来性ＣＤ４０リガンドと混合した細胞、または、サイトカイン覆膜細胞、すなわち、細胞表面会合サイトカインを有するように修飾された細胞は、細胞に含まれるかまたは細胞に付着した選択抗原または抗原群に対するレシピエントの免疫応答を調節するという発見に基づく。
【００１７】  それ故、本発明は、選択抗原に対して哺乳動物をワクチン接種する方法を包含し、該方法は、哺乳動物に、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を含むワクチン組成物を投与することを含み、ここでのＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞は選択抗原を含む。
【００１８】  好ましくは、ＣＤ４０リガンド増強細胞は、外来性遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドと混合する。遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドは脂質部分を含むことがさらに好ましい。脂質部分は、グリコシルホスファチジルイノシトールおよび／または脂肪酸、例えばパルミテートを含むことが好ましい。本発明はまた、短鎖、中鎖、長鎖および非常に長い鎖長の脂肪酸、飽和、単不飽和および多不飽和脂肪酸、ミリステート、ミコール酸を含む脂質、およびコレステロールを含む脂質も提供する。
【００１９】  好ましくは、サイトカイン覆膜細胞は、外来性遺伝子工学操作により改変されたサイトカインと混合する。遺伝子工学操作により改変されたサイトカインは脂質部分を含むことがさらに好ましい。脂質部分は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）および／または脂肪酸、例えばパルミテートを含むことが好ましい。
【００２０】  ＣＤ４０リガンドが、ＣＤ４０、例えば、哺乳動物ＣＤ４０分子、例えば、非げっ歯類ＣＤ４０分子、例えばヒトＣＤ４０分子に、少なくともナノモル範囲の親和性で結合することが好ましい。好ましい実施形態において、親和性は、好ましくは、約０．００５から１００ナノモル、より好ましくは０．０５から１０ナノモル、最も好ましくは０．５から１０ナノモルである。好ましい実施形態において、ＣＤ４０リガンドは、天然ＣＤ４０リガンド、すなわちＣＤ４０リガンド、すなわちＣＤ１５４の細胞外ドメインの少なくとも約１０個連続したアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、ＣＤ４０リガンドは、天然ＣＤ４０リガンド、すなわちＣＤ４０リガンド、すなわちＣＤ１５４の細胞外ドメインの少なくとも約２０個連続したアミノ酸を含む。別の好ましい実施形態において、ＣＤ４０リガンドは、天然ＣＤ４０リガンド、すなわちＣＤ４０リガンド、すなわちＣＤ１５４の細胞外ドメインの少なくとも約３０個連続したアミノ酸を含む。適切なＣＤ４０リガンドは、約５から５００、好ましくは５から１００、最も好ましくは５から５０アミノ酸のリガンドを含む。さらに別の好ましい実施形態において、ＣＤ４０リガンドは、ＣＤ４０分子に結合する抗体のイディオタイプ部分を含む。本明細書に使用した抗体の「イディオタイプ」部分は、抗体分子の超可変領域に関連した抗原性決定基を意味する。ＣＤ４０リガンドが、ＣＤ４０リガンド増強細胞を受けている被検者により発現されるＣＤ４０分子に結合することが最も好ましい。
【００２１】  本発明の好ましい方法において、ワクチン組成物はさらに、オプソニン増強細胞、すなわち、１）組換え核酸からオプソニンを発現するように修飾されるか、２）より高いレベルの内因性オプソニンを発現するように修飾されるか、または３）外来性オプソニンと混合された細胞を含む。オプソニン増強細胞を外来性オプソニンと混合する場合、オプソニンは脂質部分を含む遺伝子工学操作により改変されたオプソニンであり得る。
【００２２】  本発明の１つの実施形態において、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を用いたワクチン接種により、細胞に含まれる抗原に対する抗体により媒介される免疫応答が顕現する。本発明の別の実施形態において、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を用いたワクチン接種により、細胞に含まれる抗原を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介される免疫応答が顕現する。本発明の別の実施形態において、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を用いたワクチン接種により、細胞に含まれる抗原を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞により媒介される免疫応答が顕現する。本発明のさらに別の実施形態において、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を用いたワクチン接種により、細胞に含まれる抗原を認識するＣＤ８＋Ｔ細胞により媒介される免疫応答が顕現する。勿論、Ｔ細胞の場合、抗原は、主な組織適合性複合体分子に関連して認識される。
【００２３】  好ましくは、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞は、オプソニン増強細胞でもある。また、本発明の細胞は、各々、ＣＤ４０リガンド増強細胞、サイトカイン覆膜細胞、およびオプソニン増強細胞であることが好ましい。
【００２４】  本発明はまた、選択抗原に対して哺乳動物をワクチン接種する方法を包含し、該方法は、ＡＰＣをインビトロで、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞と、該ＡＰＣによる該選択抗原の内部移行を可能とするに十分な時間接触させ、該接触ＡＰＣを哺乳動物に投与することを含む。
【００２５】  本明細書に使用した「接触」は、インビトロで混合することを意味する。
【００２６】  本明細書に使用した「内部移行を可能とするに十分な時間」は、ＡＰＣによる選択抗原の内部移行を可能とするに十分な時間である期間を意味する（例えば、１４日間、または７日間、または５日間または３日間以内、または約２４、１２、６、３、２または１時間という短時間、またはさらには約３０、２０、１０、５または１分間という短時間）。
【００２７】  好ましくは、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞は、外来性オプソニンおよび／または遺伝子工学操作により改変されたオプソニンを含む。
【００２８】  別の好ましい実施形態において、ＣＤ４０リガンド増強細胞はサイトカインを発現する。好ましくは、サイトカインは、人工的に細胞に導入された組換え核酸配列から発現される。本明細書に使用した「人工的に導入」は、トランスフェクション、電気穿孔法、リポフェクション、直接的注入、受容体媒介ＤＮＡ取込みおよびウイルス媒介遺伝子移行を含むがこれに限定されない方法を意味する。さらに別の好ましい実施形態において、ＣＤ４０リガンド増強細胞をサイトカインと混合する。好ましくは、サイトカインは遺伝子工学操作により改変されたサイトカインである。
【００２９】  遺伝子を人工的に導入した細胞は、元の導入遺伝子のコピーを含む子孫細胞を含むものとする。
【００３０】  好ましくは、サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１０またはＴＮＦ−αの受容体のリガンドである。
【００３１】  サイトカインは「抗腫瘍サイトカイン」であることが好ましい。本発明によると、「抗腫瘍サイトカイン」は、細胞と混合するか、または動物に投与した場合に、腫瘍細胞の増殖または転移をインビトロまたはインビボで制限できるか、または腫瘍を有する動物の生存を、腫瘍を有さない対照動物に比べて延長できるサイトカインである。好ましい実施形態において、抗腫瘍サイトカインは、細胞と混合するか、または動物に投与した場合に、腫瘍細胞の増殖または転移をインビトロまたはインビボで、少なくとも５％、または少なくとも１０から５０％、または少なくとも５０から１００％または少なくとも１００％以上制限できるか、または腫瘍を有する動物の生存を、腫瘍を有さない対照動物に比べて、少なくとも５％、または少なくとも１０から５０％、または少なくとも５０から１００％または少なくとも１００％またはそれ以上延長できる。
【００３２】  さらに別の好ましい実施形態において、サイトカイン覆膜細胞は、ＣＤ４０リガンドを発現する。好ましくは、ＣＤ４０リガンドは、人工的に細胞に導入された組換え核酸配列から発現される。本明細書に使用した「発現」は、エリザ法、イムノブロット法、免疫沈降法、フローサイトメトリー法、蛍光顕微鏡法または共焦点レーザー顕微鏡法を含むがこれに限定されない方法により検出されたレベルで産生されることを意味する。好ましくは、本発明の方法および組成物において、本発明で有用なタンパク質（例えば、オプソニン、抗原、サイトカイン、またはＣＤ４０リガンド）は、天然に発現されるかまたは細胞に存在する場合に、天然形の有用なタンパク質の発現レベルの少なくとも約５％以上、好ましくは約１０から２５％以上、より好ましくは５０から１００％以上であるレベルで発現される。
【００３３】  本明細書に使用した「組換え核酸配列」は、当分野で公知であり本明細書に記載された組換えＤＮＡ法により作成された核酸配列を意味する。さらに別の好ましい実施形態において、サイトカイン覆膜細胞はＣＤ４０リガンドと混合する。好ましくは、サイトカインは遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドである。
【００３４】  好ましくは、本発明の方法および組成物において、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞は実質的にインビトロで分裂できない。「実質的にインビトロで分裂できない」は、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞は、細胞分裂を防ぐように処理されていない対応する細胞の分裂速度の約５０％未満である速度で分裂することを意味する。好ましい実施形態において、実質的にインビトロで分裂できないというのは、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞が、細胞分裂を防ぐように処理されていない対応する細胞の分裂速度の約３０から５０％未満である速度で分裂することを意味する。
【００３５】  またワクチン組成物を弱毒化することが好ましく、それ故、細胞がその病原形で引き起こす疾病を引き起こすことができない。本明細書に使用した「弱毒化」は、ワクチンを含む細胞が、例えば、電離放射線、抗増殖剤への曝露により、または固定を伴うまたは伴わない殺滅により、疾病を引き起こすことのできない状態を意味する。
【００３６】  本発明の１つの実施形態において、本発明の組成物に含まれるサイトカインは、Ｔｈ１免疫応答、すなわち、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインを発現するＴ細胞の産生を促進する。別の実施形態において、本発明の組成物に含まれるサイトカインは、Ｔｈ２免疫応答、すなわち、ＩＬ−４およびＩＬ−１０などのＴｈ２サイトカインを発現するＴ細胞の産生を促進することが好ましい。
【００３７】  サイトカインが遺伝子工学操作により改変されたサイトカインであることが好ましい。また、サイトカインは天然に膜会合形で存在しないか、または天然に脂質連結形で存在しないことが好ましい。サイトカインが生物活性であることが好ましい。サイトカインが高度に生物活性であることがさらに好ましい。サイトカインが極めて生物活性であることがさらにより好ましい。サイトカインが天然の生物活性または超生物活性であることが最も好ましい。
【００３８】  サイトカインが、そのカルボキシ末端にＧＰＩ部分を含む遺伝子工学操作により改変されたサイトカインであることが好ましく、カルボキシル末端は、サイトカインの受容体への結合および／またはそれを介したシグナリングに寄与する。カルボキシ末端の寄与は、天然または天然に存在する形の（すなわち遺伝子工学操作により改変されたされていない）サイトカインが約５から１５アミノ酸分カルボキシル末端で短縮された、組換え変異体の作成により描写できる。受容体への結合または生物活性のアッセイの解読が、非短縮天然サイトカイン、または天然に存在する形のサイトカインに比べて少なくとも約２０％減少している場合、カルボキシ末端は、サイトカイン受容体への結合および／またはそれを介したシグナリングに寄与する。別に、カルボキシ末端（すなわち約５０までのアミノ酸）に特異的なモノクローナル抗体を、受容体結合またはバイオアッセイで、サイトカインと混合する。受容体への結合または生物活性のアッセイの解読が、抗体の非存在下のサイトカインと比べて、少なくとも約２０％減少している場合、カルボキシル末端は、サイトカイン受容体への結合および／またはそれを介したシグナリングに寄与する。両方の方法論が当業者には公知である。
【００３９】  好ましくは、オプソニン増強細胞のオプソニンは、Ｃ３ｂのα’鎖またはマンノース結合タンパク質の１つである。
【００４０】  オプソニンがＣ３の断片である場合、ＣＲ２よりも高い親和性でＣＲ１に結合することが好ましい。Ｃ３の断片がＣＲ２のリガンドでないことがさらに好ましい。好ましくは、オプソニンはＣ３ｂｉでもＣ３ｄでもＣ３ｄｇでもない。
【００４１】  好ましくは、本発明の組成物の抗原は、病原細胞であり、これは悪性の腫瘍細胞であり得る。本明細書に使用した「悪性」は、周辺組織への侵入能を有する細胞を含む腫瘍由来であることを意味する。
【００４２】  本発明で有用な腫瘍細胞は、Ｂ１６細胞、およびＣＭＳ−５ネズミ線維芽細胞、および本発明に有用な腫瘍と題した章に含まれる腫瘍に由来する細胞を含むがこれに限定されない。
【００４３】  本発明はまた、選択抗原およびオプソニンをコードしている組換え核酸を含む、病原性ＣＤ４０リガンド増強細胞または病原性サイトカイン覆膜細胞を包含し、ここでの該細胞は、コードされたオプソニンを発現し、ここでのオプソニンは、ビトロネクチン、フィブロネクチン、補体成分Ｃ１ｑ、Ｃ１ｑＡ鎖、Ｃ１ｑＢ鎖、Ｃ１ｑＣ鎖、補体断片Ｃ３ｂ、Ｃ３ｂｉ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｄｇおよびＣ４ｂ、マンノース結合タンパク質、コングルチニン、表面プロテインＡおよびＤ、α−２−マクログロブリン、および免疫グロブリンおよび遺伝子工学操作により改変されたオプソニンからなる群から選択される。
【００４４】  好ましくは、病原細胞は、腫瘍細胞であり、これは悪性であり得る。
【００４５】  病原細胞は、病原細菌、病原真菌、病原ウイルス、病原寄生虫細胞、病原節足動物細胞からなる群から選択されることが好ましい。本発明が、オプソニン増強細菌病原体を含むワクチン組成物を含む場合、投与した細胞は、オプソニン増強病原細胞を含むことが好ましい。
【００４６】  本発明はまた、オプソニンをコードしている組換え核酸および抗原をコードしている組換え核酸を含有および発現している、宿主ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を包含する。本発明はまた、サイトカインをコードしている組換え核酸および抗原をコードしている組換え核酸を含有および発現している、宿主ＣＤ４０リガンド増強細胞を包含する。本発明はまた、ＣＤ４０リガンドをコードしている組換え核酸および抗原をコードしている組換え核酸を含有および発現している、宿主サイトカイン覆膜細胞を包含する。
【００４７】  好ましくは、宿主細胞は、抗原の担体として作用できる、任意のＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞であり、従って、有核細胞または原核細胞でもよい。本発明のこの態様において、宿主細胞は病原性である必要はないが、核酸が人工的に導入されるどの細胞でもよい。該細胞は、滑膜細胞などの特殊間葉細胞を含む線維外細胞；角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血球、腫瘍細胞、細菌細胞、真菌細胞、寄生虫細胞を含むがこれに限定されない。
【００４８】  本発明はまた、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドと混合した細胞を含む組成物を包含する。
【００４９】  本発明はまた、遺伝子工学操作により改変されたサイトカインと混合した細胞を含む組成物を包含する。
【００５０】  好ましくは、細胞は病原細胞である。
【００５１】  本発明の組成物がさらに、Ｓｅｇａｌ、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０５０３２に記載のようなオプソニン増強細胞を含むことが好ましく、その内容は参考として本明細書に明白に取込む。
【００５２】  好ましくは、組成物は実質的に培養培地を含まない。本明細書に使用した「培養培地」は、ウシ胎児血清などの動物血清を少なくとも２％含む細胞培養に使用される培地を意味する。
【００５３】  本発明はまた、オプソニンと混合した、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を含む組成物を包含し、ここでの細胞は実質的にインビトロで分裂できない。
【００５４】  好ましくは、組成物は実質的に培養培地を含まない。
【００５５】  本発明はまた、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞に、共有結合を介してまたは受容体リガンド結合相互作用、例えば、コレクチンオプソニンのレクチンドメインと抗原含有細胞（例えばＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞）の表面上の炭水化物の間の相互作用を介して結合できる、外来性オプソニンと混合した、異種抗原を含むＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を含む組成物を包含する。
【００５６】  好ましくは、細胞は哺乳動物宿主で分裂できない。
【００５７】  本発明はまた、本質的にＣＤ４０リガンド増強細胞およびオプソニンからなる組成物、および本質的にＣＤ４０リガンド増強細胞およびサイトカインからなる組成物を包含する。本発明はまた、本質的にサイトカイン覆膜細胞およびオプソニンからなる組成物、およびサイトカイン覆膜細胞およびＣＤ４０リガンドからなる組成物を包含する。
【００５８】  本発明の組成物はまたさらに、第二サイトカインを含み得、これは好ましくは細胞と混合するか、または細胞により発現される。また、第二サイトカインは遺伝子工学操作により改変されたサイトカインであることが好ましい。
【００５９】  本発明はまた、ＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞および医薬的に許容される担体を含むワクチン組成物を包含する。好ましくは、該組成物はさらに、オプソニン増強細胞を含む。また、ワクチン組成物がＣＤ４０リガンド増強細胞を含む場合、それはさらにサイトカインを含むことが好ましい。
【００６０】  本明細書に使用した「ワクチン接種」という用語は、例えば、ＣＤ４０リガンド増強および／またはオプソニン増強またはサイトカイン覆膜および／またはオプソニン増強またはＣＤ４０リガンド増強、オプソニン増強、サイトカイン覆膜細胞またはＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞を内部移行したＡＰＣなどの、本発明の細胞ではないことを除き、全ての点で同一である対応する細胞の複製サンプルの投与から得られる応答よりも、応答が、幾分効率的で、幾分迅速で、幾分大きく、および／または幾分容易に誘導されるような、選択抗原に対する免疫応答の調節を意味する。好ましい実施形態において、ワクチン接種は、本発明の細胞ではないことを除き、全ての点で同一である対応する細胞の複製サンプルの投与から得られた応答よりも、応答が、約５ないし１００％、またはより好ましくは約５ないし５０％、またはより好ましくは約５ないし２５％幾分効率的で、幾分迅速で、幾分大きく、および／または幾分容易に誘導されるような、選択抗原に対する免疫応答の調節を意味する。
【００６１】  本明細書に使用した「ワクチン組成物」という用語は、その投与が、被検者のワクチン接種（本明細書で定義）を構成する組成物を意味する。好ましい実施形態において、ワクチン組成物は、ＣＤ４０リガンド増強細胞；ＣＤ４０リガンド増強、オプソニン増強細胞；サイトカインと組み合わせたＣＤ４０リガンド増強細胞またはＣＤ４０リガンド増強、サイトカイン覆膜細胞；ＣＤ４０リガンド増強細胞またはＣＤ４０リガンド増強、オプソニン増強細胞と接触させたＡＰＣ細胞；サイトカイン覆膜細胞；サイトカイン覆膜、オプソニン増強細胞；ＣＤ４０リガンド増強細胞ではないという点を除いて全ての点において一致する対応する細胞の投与から得られる応答より、約５ないし１００％、または好ましくは約５ないし５０％、またはより好ましくは約５ないし２５％幾分効率的で、幾分迅速で、幾分大きく、および／または幾分容易に誘導されるような応答をする選択された抗原に対する免疫応答を調整できるサイトカイン覆膜細胞又はサイトカイン被膜オプソニン増強細胞と接触するＡＰＣ細胞；ＣＤ４０リガンド増強、オプソニン増強細胞；サイトカインと組合わせたＣＤ４０リガンド増強細胞またはＣＤ４０リガンド増強、サイトカイン覆膜細胞；ＣＤ４０リガンド増強細胞またはＣＤ４０リガンド増強、オプソニン増強細胞と接触させたＡＰＣ細胞；サイトカイン覆膜細胞；サイトカイン覆膜、オプソニン増強細胞；サイトカイン覆膜細胞またはサイトカイン覆膜、オプソニン増強細胞と接触させたＡＰＣ細胞を含む組成物を意味する。
【００６２】  「免疫応答を調節する」という用語は、選択抗原に対する免疫応答の刺激／活性化を意味し得るか、または選択抗原に対する免疫応答の抑制、排除または減弱を意味し得る。好ましい実施形態において、免疫応答を調節するという用語は、ワクチン接種を実施しない免疫応答と比べて、少なくとも約５％、または好ましくは５ないし５０％、またはより好ましくは５０ないし１００％の選択抗原に対する免疫応答の刺激および／または活性化を意味するか、またはワクチン接種を実施しない免疫応答と比べて、少なくとも５％、または好ましくは５ないし５０％、またはより好ましくは５０ないし１００％の、選択抗原に対する免疫応答の抑制、排除、または減弱を意味し得る。
【００６３】  「病原」細胞は、天然に存在する形で、疾病を引き起こすことのできる細胞、例えば腫瘍細胞、自己反応性Ｔ細胞、病原細菌、病原真菌、または病原寄生虫細胞である。本発明の目的では、病原ウイルスは病原細胞である。病原細胞は、病原細菌、真菌、寄生虫またはウイルスを弱毒化、不活性化または殺滅することにより修飾し得る。
【００６４】  「外来性オプソニン」、「抗原」、「サイトカイン」、または「ＣＤ４０リガンド」は、細胞外から導入されるか細胞外で産生される、オプソニン、抗原、サイトカイン、またはＣＤ４０リガンドを意味する。
【００６５】  「内因性オプソニン」、「抗原」、「サイトカイン」、または「ＣＤ４０リガンド」は、細胞に天然に発現されるか、または天然に存在する、天然形のオプソニン、抗原、サイトカイン、またはＣＤ４０リガンドである、オプソニン、抗原、サイトカイン、またはＣＤ４０リガンドを意味する。
【００６６】  「異種オプソニン」、「抗原」、「サイトカイン」、または「ＣＤ４０リガンド」は、細胞に天然に発現されない、オプソニン、抗原、サイトカイン、またはＣＤ４０リガンドを意味する。
【００６７】  オプソニン増強細胞のオプソニンは、細胞質分子、細胞表面分子、または分泌分子として発現され得る。しかし、オプソニンは細胞表面分子または分泌分子として発現されることが好ましい。
【００６８】  抗原およびオプソニンは同一ではないことが好ましい。また、抗原およびサイトカインは同一ではないことが好ましい。サイトカインおよびオプソニンは同一ではないことがさらに好ましい。ＣＤ４０リガンドは抗原ともオプソニンともサイトカインとも同一ではないことがさらに好ましい。
【００６９】  １つの実施形態において、ＣＤ４０リガンドは、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドである。遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドは、脂質部分、例えば脂肪酸、例えば、パルミテートを含むことが好ましく、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分を含むことがさらに好ましい。
【００７０】  別の好ましい実施形態において、サイトカインは、トランスメンブランセグメントを含む遺伝子工学操作により改変されたサイトカインである。本明細書に使用した「トランスメンブランセグメント」は、細胞膜を通過し、細胞膜二重層の内部の脂質分子の疎水性尾と相互作用するトランスメンブランタンパク質の疎水性領域を意味する。
【００７１】  別の好ましい実施形態において、サイトカインは、遺伝子工学操作により改変されたサイトカインであり、脂質を含む。さらに別の好ましい実施形態において、脂質を、グリコシルホスファチジルイノシトール部分を介してサイトカインに連結させる。
【００７２】  １つの好ましい実施形態において、オプソニンは、遺伝子工学操作により改変されたオプソニンであり、脂質を含む。さらに好ましい実施形態において、オプソニン、例えばコレクチンは、細胞に非共有結合的に結合できる。細胞は、例えば、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼで処理することにより処理して、該非共有結合を促進できる。
【００７３】  オプソニンが細胞に含まれる分子により不活性化され得、例えば、Ｃ３ｂが、ＣＤ４６により不活性化され得る場合、不活性化物質の阻害剤、例えば抗体を組成物に含めることができる。
【００７４】  「細胞様」構造、すなわち内部親水性区画を隔離する親油性膜を含む構造を、本発明の方法および組成物における細胞の代わりに、すなわちその等価体として使用できる。リポソームが特に有用な細胞様構造である。従って、本発明は、抗原を含み、脂質連結遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドまたは脂質連結遺伝子工学操作により改変されたサイトカインと混合されたリポソームを包含する。
【００７５】  「ＣＤ４０リガンド」という用語は、ＣＤ４０に、少なくともマイクロモルの範囲の親和性で結合できる分子を意味する。「遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンド」は、異種細胞膜結合部分を含むＣＤ４０リガンドである。
【００７６】  本明細書に使用した「サイトカイン」という用語は、哺乳動物細胞により天然に分泌され、白血球上の細胞表面受容体に結合し、白血球に（サイトカインの白血球受容体への単なる占有以上の）変化（例えば、増殖状態の変化、転写プロフィルの変化、または遊走傾向の変化）を誘導する、ポリペプチド分子を意味する。「変化」は、サイトカインの非存在下に比べ、少なくとも約５％の増加または減少を意味する。「サイトカイン」という用語は、本明細書で、天然に存在するサイトカインの受容体のリガンドであるポリペプチド分子を意味する。オプソニンと異なり、サイトカインは、自然に同時に抗原と細胞表面受容体に結合しない。
【００７７】  本発明の方法および組成物に有用なサイトカインの例は、以下を含むがこれに限定されない：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ヘマトポイエチン受容体リガンド、免疫グロブリンスーパーファミリー受容体リガンド、インターフェロン受容体リガンド、ＴＮＦ受容体リガンド、およびケモカイン受容体リガンド。サイトカイン受容体に対する抗体はサイトカインでもよい。
【００７８】  本明細書に記載した「遺伝子工学操作により改変されたサイトカイン」は、異種細胞膜結合部分を含むサイトカインである。
【００７９】  本明細書に使用した「オプソニン」という用語は、同時に抗原含有細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方に結合または付着することにより、抗原とＡＰＣ間の連結またはカップリング剤（アダプター）として作用でき、ＡＰＣによる抗原含有細胞のより効率的な結合、包み込みおよび内部移行を可能とする、天然に存在するおよび天然に存在しない分子を意味する。本発明で有用なオプソニンは、天然に存在するオプソニンに結合できる受容体を介してＡＰＣに結合できる、天然に存在しないオプソニンも含む。
【００８０】  本明細書に使用した「オプソニン」という用語は、処理段階または段階群の少なくとも１つの産物が、同時に抗原含有細胞とＡＰＣの両方に結合または付着することにより、連結またはカップリング剤として作用でき、ＡＰＣによる他の抗原含有細胞のより効率的な結合、包み込みおよび内部移行を可能とするように処理され得る分子を意味し得る。オプソニンは、多鎖オプソニンの任意のポリペプチド鎖であり得る。
【００８１】  本発明の方法および組成物に有用なオプソニンの例は以下を含む：ビトロネクチン、フィブロネクチン、補体成分、例えばＣ１ｑ（その成分ポリペプチド鎖Ａ、ＢおよびＣのいずれかを含む）、補体断片、例えばＣ３ｄ、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂ、マンノース結合タンパク質、コングルチニン、表面プロテインＡおよびＤ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α−２−マクログロブリン、および免疫グロブリン、例えば、免疫グロブリンのＦｃ部分。
【００８２】  「先天オプソニン」は、先天免疫系のオプソニンであり、先天免疫系の分泌ポリペプチド分子として当分野で知られており、同時に抗原とＡＰＣの表面に結合すると信じられている。従って、それらは「橋」として作用でき、この特性により、ＡＰＣによる抗原の内部移行を促進すると考えられている。オプソニンが抗原に結合する様式は、オプソニンによって異なり、共有結合的または非共有結合であり得る。一般に、先天オプソニンの抗原結合部分は、免疫グロブリンの抗原結合部分とは異なり、前者は同種のメンバー間で比較的不変であり、個体発生中に多様化を受けない。
【００８３】  天然に存在するＡＰＣ結合部分を含む分子は、それが部分を介して細胞に安定に結合または付着できる該部分を含む場合、オプソニンと考えられ、オプソニン分子がその天然抗原結合ドメインを含むか否かに関わらず、ＡＰＣ結合部分は細胞外空間に位置する。
【００８４】  本明細書に記載した「遺伝子工学操作により改変されたオプソニン」は、細胞膜結合部分が、オプソニンの天然抗原結合ドメインで置換されているか、または細胞膜結合部分が、オプソニンの天然抗原結合ドメインの修飾または除去なくオプソニンに連結されている分子を含む。
【００８５】  遺伝子工学操作により改変されたオプソニン、遺伝子工学操作により改変されたサイトカイン、または遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドの「細胞膜結合部分」、すなわち、これにより分子が安定に細胞に結合できる部分は、架橋部分および脂質部分を含むがこれに限定されない。細胞膜結合部分は、ポリペプチドとその同族細胞表面ポリペプチドの相互作用以外の手段により細胞に結合することが好ましい。細胞膜結合部分が非ポリペプチド部分であることがさらに好ましい。好ましい実施形態において、脂質部分が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分を介して遺伝子工学操作により改変された分子に連結している。別の好ましい実施形態において、脂質は、脂肪酸、例えばパルミテートを含む。さらに別の好ましい本発明の実施形態において、細胞膜結合部分は、オプソニンまたは抗原結合ドメイン短縮オプソニンに、オプソニンの抗原結合末端で連結している。別の好ましい実施形態において、遺伝子工学操作により改変されたオプソニンは、ＡＰＣに結合できる免疫グロブリンのイディオタイプ部分を含む。
【００８６】  貪食作用を引き起こし、非クロノタイプであり、従って、クロノタイプ受容体は細胞によって変化するが、細胞によって変化しない受容体に結合することが好ましい。非クロノタイプ受容体は、先天免疫に役割を果たす細胞上に存在し、例えば、非イディオタイプ受容体を含む。該受容体の例は、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４およびＣ１ｑ受容体、Ｃ１ｑ受容体の成分を含む受容体、コレクチン受容体、α２ｍ受容体、ＣＲＰ受容体、および免疫グロブリンのＦｃ受容体を含む。
【００８７】  本明細書に使用した「抗原」という用語は、抗原のレシピエントに体液性および／または細胞性免疫応答を開始できる分子を意味する。抗原は、任意の型の生物分子であり得、これは、例えば、単純な中間代謝物、糖、脂質、およびホルモン並びに巨大分子、例えば、複合炭水化物、リン脂質、核酸およびタンパク質を含む。抗原の一般的なカテゴリーは、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患に関与する抗原、アレルギーおよび移植片拒絶、および他の種々の抗原を含むがこれに限定されない。本発明の組成物および方法において、抗原がポリペプチド、例えば、少なくとも７個のアミノ酸を含むものが好ましい。
【００８８】  本発明のＣＤ４０リガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞は、例えば、細胞に含まれる抗原または抗原群に対するヒトの免疫応答を調節するために使用できる。細胞は哺乳動物、好ましくはヒトに投与され、抗原提示細胞により取り込まれるか（すなわち摂食または貪食）または他の白血球、例えばリンパ球または顆粒球に接触する。別に、細胞を、貪食作用の可能な条件下でインビトロで抗原提示細胞と接触させる。
【００８９】  本明細書に使用した「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、抗原を摂食し、抗原をＴ細胞に提示する細胞を意味する。これらの細胞は、貪食性白血球、単球、マクロファージ、および樹状細胞（例えば、皮膚のランゲルハンス細胞）、Ｂリンパ球、および内皮細胞を含む。「専門ＡＰＣ」は、構成的にＴリンパ球を活性化できるＡＰＣである。専門ＡＰＣは、典型的には、構成的にクラスＩＩ主要組織適合性分子および共刺激分子、例えばＢ７−１および／またはＢ７−２を発現する。
【００９０】  本発明のワクチン組成物は、例えば、ヒトなどの哺乳動物の免疫応答の調節に使用できる。
【００９１】  本発明はまた、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドまたは遺伝子工学操作により改変されたサイトカインをコードしている組換え核酸配列を人工的に細胞に導入して、これらの細胞がインビボで、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドまたは遺伝子工学操作により改変されたサイトカインを発現するようにした細胞を含む、トラスジェニック動物に関する。
【００９２】記載
本発明は、少なくとも一部には、「ＣＤ４０リガンド増強細胞」は、被検者に投与した場合、細胞に含まれるかまたは細胞に付着した抗原または抗原群に対する、レシピエントの免疫応答を調節するという発見に基づく。本発明によると、「ＣＤ４０リガンド増強細胞」は、外来性ＣＤ４０リガンドと混合した細胞である。「ＣＤ４０リガンド増強細胞」という用語は、天然ＣＤ４０リガンドのＣＤ１５４と混合した細胞だけでなく、任意のＣＤ４０リガンドと混合した細胞も包含することを意図する。該細胞は、例えば、形質導入遺伝子からＣＤ４０リガンドを発現している細胞よりも、本発明の細胞は調製がより簡単で、より迅速で、より労力が少ないという点で利点がある。従って、自己細胞、例えば腫瘍細胞を本発明の方法および組成物に使用する場合、本発明は疾病のより迅速な処置を可能とする。さらに、本発明は、異種細胞膜結合部分を含むＣＤ４０リガンドは、免疫調節特性を保持できることを教義する。これは、ＣＤ１５４の細胞外ドメインを含むＧＰＩ連結分子の場合には特に驚くべきことである。なぜなら、ＧＰＩ部分は、カルボキシ末端に付着し、一方、無傷の天然に存在するＣＤ１５４のトランスメンブランセグメントは、アミノ酸に向かっているからである。従って、ＧＰＩ連結ＣＤ１５４の配向は、細胞表面に関して天然ＣＤ１５４とは逆である。遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドは、被検者に投与した場合に混合細胞から拡散しない点で可溶性リガンドよりも利点がある。
【００９３】  本発明は、一部には、細胞表面サイトカインを有する細胞は、被検者に投与した場合、細胞に含まれるか細胞に付着した抗原または抗原群に対してレシピエントの免疫応答を調節できるという驚くべきおよび予測されなかった発見に基づく。従って、本発明は、該分子の膜結合型に関する。さらに、該細胞は、可溶形の同サイトカインを発現する細胞または可溶形の同サイトカインと混合した細胞よりも驚くべき利点を与える。本発明は、ＧＭ−ＣＳＦなどのいくつかのサイトカインのカルボキシ末端が、同族受容体との相互作用に重要であり、ＧＰＩ部分がタンパク質のカルボキシ末端に付着するという従来技術の教義、および、従って、異種ＧＰＩ連結タンパク質は、ＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインのその受容体への結合を妨害するだろうという期待の点で、予測されなかった結果を提供する。さらに、従来技術は、ケモカインなどの多くのサイトカインが、その活性を濃度勾配を介して奏効することを教義する。
【００９４】  膜結合サイトカインは、可溶性サイトカインに優る数個の利点を与える。膜結合サイトカインは、全身循環に可溶性サイトカインほど多く拡散せず、それ故、全身毒性の危険性は低い。さらに、混合した可溶性サイトカインに比べ、膜結合サイトカインが細胞に近いことにより、細胞に含まれる抗原に対する免疫応答のより高度な調節が可能になる。さらに、外来性遺伝子工学操作により改変されたサイトカインを含むサイトカイン覆膜細胞は、異種サイトカイン遺伝子で形質導入した細胞よりも、迅速かつ少ない労力で調製できる。
【００９５】本発明で有用なＣＤ４０リガンド
様々な種のＣＤ４０タンパク質をコードしているヌクレオチド配列が、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｙ１０５０７、Ｍ８３３１２およびＵ５７７４５により提供される。ヒトＣＤ４０は、２７７アミノ酸長のトランスメンブラン糖タンパク質（４８ｋＤａ）である。ＣＤ４０はリンタンパク質であり、ホモ二量体として発現され得る。可溶形のＣＤ４０（２８ｋＤａ）も記載されている。ＣＤ４０タンパク質は、様々な発達段階で全てのＢリンパ球、活性化Ｔ細胞および単球、濾胞樹状細胞、胸腺上皮細胞、および様々な癌細胞系に発現される。それは、ほとんどの成熟Ｂ細胞悪性腫瘍およびいくつかの初期Ｂ細胞急性リンパ性白血病に発現される。ＣＤ４０は、形質細胞悪液質患者の大半の骨髄腫細胞系および骨髄腫細胞で実証された。
【００９６】  ＣＤ４０ｍＲＮＡの誘導および一次ヒト単球の細胞表面タンパク質発現の増強が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３、またはＩＦＮ−γで処理した後に観察される。ヒトＣＤ４０遺伝子は第２０番染色体に位置する。
【００９７】  ＣＤ４０は、記憶細胞の発達に役割を果たしていると提唱されている。それはまた細胞活性化にも役割を果たし、適格因子および進行因子として機能している。ＣＤ４０抗原の（ＩＬ４およびＩＬ５などのサイトカインと組合わせた）架橋により、Ｂ細胞が増殖し、活性化Ｔ細胞の非存在下で、ＩｇＭから、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥの合成への免疫グロブリンクラスの切り替えを誘導する。ＣＤ４０は、天然Ｂ細胞のＩｇＡ分泌への傾倒に必要な必須シグナルの１つであり；ＩｇＡ誘導の機序は、ＩＬ１０とＴＧＦ−βの共同を必要とする。可溶性ＣＤ４０は、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞増殖を阻害する。
【００９８】  ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は、細胞内接着の誘導（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）を介して）、短期および長期増殖、分化並びにタンパク質のチロシンリン酸化増強を含む、Ｂリンパ球に対する様々な効果を媒介する。胚中心中心細胞は、ＣＤ４０および抗原受容体を通した活性化によりアポトーシスによる細胞死を受けることから防がれる。ヒト休止Ｂ細胞においてＣＤ４０の発現はＩＬ４により誘導される。ヒトＢ細胞をＩＬ６で処理すると、細胞内ＣＤ４０ドメインがリン酸化される。しかし、ＣＤ４０はＩＬ６の受容体としては機能しない。活性化ヒトＢ細胞において、ＩＬ６の合成は、ＣＤ４０に対して指向したモノクローナル抗体で細胞を処理することにより誘導され、これは、ＣＤ４０がＩＬ６に依存性のシグナル伝達機序に関与することを示唆する。
【００９９】  いくつかの限定された配列相同性が、神経増殖因子、ＴＮＦ−αおよびＣＤ２７の受容体に見出され、ＣＤ４０は、これらおよび他のサイトカインの生物活性の調節にも関与し得ると想定される。
【０１００】  ＣＤ４０は、非免疫細胞にも生物機能を有するが、これらは依然としてほとんど知られていない。ＣＤ４０連結は、間葉および上皮起源の形質転換細胞においてアポトーシスによる細胞死が誘導されることが示された。部分的には、これらのプロセスは、ＣＤ４０の細胞質ドメインに存在する死ドメインを通して媒介される。
【０１０１】  ＣＤ４０の特に有用なリガンドは、ＣＤ１５４である。ＣＤ１５４（「ＣＤ４０リガンド」；ヒトタンパク質２９．３ｋＤａ、２６１アミノ酸）は、ＴＮＦファミリーのタンパク質のメンバーである。ヒトタンパク質は、ネズミＥＬ４胸腺腫細胞から単離された類似タンパク質と、ｃＤＮＡおよびタンパク質レベルでそれぞれ８２．８％および７７．４％の同一性を示す。両方のタンパク質が、休止Ｂ細胞上に発現されるＣＤ４０細胞表面抗原のリガンドである。ＣＤ１５４をコードしているヒト遺伝子は、第Ｘｑ２６．３−ｑ２７番染色体に位置する。様々な種の天然ＣＤ４０リガンドをコードしているヌクレオチド配列が、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ６７８７８、Ｘ９６７１０、Ｘ６８５５０、Ｘ６５４５３、Ｚ４８４６９およびＬ０７４１４により提供される。様々な種のＣＤ１５４分子のアミノ酸配列が、例えば、Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号１７０５７１３、２３１７１８、５６０６９３、３０４７１２９、１１６０００、１５１８７０、３８４１２、１０９６３９、１０８３０１４、３８４８４および３７２７０により提供される。
【０１０２】  ＣＤ１５４は、トランスメンブランポリペプチドとして天然に合成される。それにも関わらず、ＣＤ１５４の生物学的に活性な可溶性断片が記載されている（Ｐｉｅｔｒａｖａｌｌｅら、１９９６、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：５９６５−５９６７）。Ｍａｚｚｅｉ等（１９９５、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：７０２５−７０２８）は、ＣＤ１５４の生物学的に活性な可溶性断片を、無傷トランスメンブランＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ１０８からＬｅｕ２６１からなるポリペプチドのホモ三量体として同定した。Ｇｒａｆ等（１９９５、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２５：１７４９）は、Ｍｅｔ１１３でのタンパク質分解切断により産生されたＣ末端断片からなる別の活性断片を記載する。Ａｒｕｆｆｏ等は、ＣＤ１５４の可溶形並びにインビトロでのＢ細胞の刺激におけるその使用を、米国特許第５，５４０，９２６号に開示する。本発明において、ＣＤ４０の特に有用なリガンドは、アミノ酸残基４７−２６１の、特許第‘９２６号の配列番号２に示した配列を含むポリペプチドを含む。これらの残基は、ヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインに含まれる。
【０１０３】  別の特に有用な型のＣＤ４０リガンドは、ＣＤ４０に対する抗体である。該抗体の例は、Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（インディアナポリス、インディアナ州）の製品番号ＭＣＡ１１４３およびＭＣＡ１５９０と呼称されたモノクローナル抗体；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ケネバンク、メイン州）のカタログ番号Ｐ６１６４０Ｆ（クローン１４Ｇ７により産生）、Ｐ４２３７４Ｍ（クローンＭＡＢ８９により産生）、Ｐ６１０４６Ｍ（クローンＢＬ−Ｃ４により産生）、およびＰ５４４８６Ｍ（クローンＢ−Ｂ２０により産生）と称されるモノクローナル抗体；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（プラシド湖、ニューヨーク州）のカタログ番号０５−４２２（クローン６２６．１により産生）と称されるモノクローナル抗体；Ｍａｂｔｅｃｈ（ナッカ、スウェーデン）のカタログ番号３６０１（クローンＳ２Ｃ６により産生）と称されるモノクローナル抗体；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（フランダーズ、ニュージャージー州）のカタログ番号ＲＤＩ−ＣＢＬ４８６（クローンＢＢ２０により産生）、ＲＤＩ−Ｍ１６９１ｃｌｂ（クローンＣＬＢ−１４Ｇ７により産生）、ＲＤＩ−ｍＣＤ４０−３２３（クローン３／２３により産生）と称されるモノクローナル抗体；Ｓｃｈｗａｂｅら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：２１７−２２６に記載のモノクローナル抗体；Ｂｊｏｒｃｋら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８３：４３０−４３７に記載のモノクローナル抗体；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、１９９４、Ｃｉｒｃ  Ｓｈｏｃｋ  ４４：６７−７２により記載のモノクローナル抗体Ｇ２８−５；およびＢｕｓｋｅら、１９９７、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２５：３２９−３３７に記載のモノクローナル抗体を含む。
【０１０４】本発明で有用なサイトカイン
本明細書に定義した「サイトカイン」という用語は、哺乳動物細胞により天然に分泌され、白血球上の細胞表面受容体に結合する、ポリペプチド分子を意味する。「サイトカイン」という用語はまた、本明細書で、天然に存在するサイトカインの受容体のリガンドであるポリペプチド分子を意味する。オプソニンと異なり、サイトカインは、自然に同時に抗原と細胞表面受容体に結合しない。
【０１０５】  サイトカインの受容体を有する白血球は、例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、および白血球細胞を含む。
【０１０６】  いずれか１つの機序により固めたくはないが、細胞表面会合サイトカインは、細胞へのサイトカインの安定な近位を可能とし、従って細胞の近傍のサイトカイン濃度を増加させることにより、自由な拡散性サイトカインに優る利点を与えると信じられている。
【０１０７】  好ましいサイトカインは、非げっ歯類サイトカイン、例えば、霊長類、例えばヒトサイトカインである。
【０１０８】  いくつかのサイトカインが、構造的および／または機能的特性に基づきサイトカインの１つ以上のファミリーに属すると捉えることができる。１つの該ファミリーは、インターロイキンからなる。インターロイキンは、構造的に多様であるが、白血球により発現され白血球に作用するという両方の特性を共有する。インターロイキンの例は、ＩＬ−１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ１５３３０、Ｍ２８９８３、Ｅ０４７４３、Ｍ１５１３１によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｅ０１１０８、Ｋ０２７９７によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ａ０２０４６、Ｍ１４７４３によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−４（例えば、Ｍ１３９８２、Ｍ２５８９２によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−５（例えば、Ｘ０６２７０、Ｊ０３４７８によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−６（例えば、Ｅ０２７７２、Ｍ２０５７２によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−７（例えば、Ｊ０４１５６、Ｍ２９０５４−２９０５７によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−８（例えば、Ｍ２８１３０によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−９（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．１９９１；７７：１４３６−１４４１、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９０；３１（４）：２６５−２７０に開示された配列）、ＩＬ−１０（例えば、Ｍ８４３４０、Ｕ１６７２０によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−１１（例えば、Ｐａｕｌら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９０；８７：７５１２−７５１６、Ｍｏｒｒｉｓら、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９６；２４：１３６９−１３７６に開示された配列）、ＩＬ−１２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ８６６７１、Ｓ８２４１２によりコードされるポリペプチド；Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質Ｐ２９４５９、Ｐ２９４６０）、ＩＬ−１３（例えば、Ｕ３１１２０、Ｌ１３０２８によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−１４（例えば、Ａｍｂｒｕｓら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）  １９９３；９０：６３３０−４に開示された配列）、ＩＬ−１５（例えば、ＡＦ０３１１６７、Ｕ２２３３９によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−１６（例えば、ＡＦ００６００１、Ｍ９０３９１によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−１７（例えば、Ｕ３２６５９、Ｕ４３０８８によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ−１８（例えば、Ｄ４９９４９、Ｄ４９９５０によりコードされるポリペプチド）、ＴＮＦ−α（例えば、Ｍ１６４４１、Ｙ００４６７によりコードされるポリペプチド）、およびＧＭ−ＣＳＦ（例えば、Ｘ０３０１９、Ｍ１１２２０によりコードされるポリペプチド）、および種間のその相同体を含む。相同体をコードしているヌクレオチド配列は、中程度から高度の厳密性条件下で互いにハイブリッド化する。
【０１０９】  別のファミリーは、ヘマトポイエチンからなる。このファミリーのメンバーは、ヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤとして知られる、４つのα−ヘリックス領域を含む。ヘリックスＡおよびＢ並びにヘリックスＣおよびＤは、互いにそれぞれ大体平行に走る。ヘマトポイエチンの例は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｅ０１２１９、Ｍ１３９２６によりコードされるポリペプチド）、オンコスタチンＭ（例えば、Ｍａｌｉｋら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９８９；９：２８４７−２８５３に開示された配列の、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｄ３１９４２によりコードされるポリペプチド）、ＬＩＦ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ１３９６７、Ｘ０６３８１によりコードされるポリペプチド）、ＣＮＴＦ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０５３４２、Ｘ６０５４２によりコードされるポリペプチド）、および種間のその相同体を含む。相同体をコードしているヌクレオチド配列は、中程度から高度の厳密性条件下で互いにハイブリッド化する。
【０１１０】  ヒトＩＬ２は、ｐＩが僅かに塩基性の１３３アミノ酸（１５．４ｋＤａ）のタンパク質である。ネズミおよびヒトＩＬ２は、約６５％の相同性を示す。ＩＬ２は、疎水性分泌シグナル配列として機能している、最初の２０アミノ末端アミノ酸をもつ、１５３アミノ酸の前駆タンパク質として合成される。該タンパク質は、生物活性に必須な１つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ５８／１０５位）を含む。
【０１１１】  ＩＬ２は、３位のスレオニンでＯ−グリコシル化されている。異なる分子量および荷電をもつ変種は、可変的グリコシル化に起因する。非グリコシル化ＩＬ２も生物活性である。グリコシル化は、肝細胞による因子の排泄を促進するようである。
【０１１２】  再生魚視覚神経から単離されたグルタミン転移酵素の作用により産生された、ヒトＩＬ２の二量体形は、培養液中のラット脳希突起膠細胞の細胞障害性因子であることが示された。
【０１１３】  ヒトＩＬ２遺伝子は、４つのエキソンを含む。ＩＬ２遺伝子は、ヒト第４ｑ２６−２８番染色体（ネズミ第３番染色体）に位置する。ネズミおよびヒトＩＬ２の相同性は、コード領域のヌクレオチドレベルで７２％である。
【０１１４】  ＩＬ２の生物活性は、４−１２×１０３受容体／細胞の密度で、活性化Ｔ細胞にはほぼ排他的に発現されているが、休止Ｔ細胞には発現されていない膜受容体により媒介される。活性化Ｂ細胞および休止単核白血球は稀にこの受容体を発現する。ＩＬ２受容体の発現は、ＩＬ５およびＩＬ６により調節される。異なっておよび独立的に発現される、３つの異なる型のＩＬ２受容体が識別される。高親和性ＩＬ２受容体（Ｋｄｉｓ〜１０ｐＭ）は、細胞により発現される全ＩＬ２受容体の約１０％を構成する。この受容体は、リガンド結合ドメインとしての２つのサブユニットＩＬ２Ｒ−α（ＴＡＣ抗原＝Ｔ細胞活性化抗原；ｐ５５）およびＩＬ２Ｒ−β（ｐ７５；ＣＤ１２２）並びにシグナリング成分としてのγ鎖からなる膜受容体複合体である。ｐ７５は、休止Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、および多くの他の細胞型に構成的に発現されるが、ｐ５５の発現は、通常、細胞活性化後にのみ観察される。しかし、ｐ５５は、多くの腫瘍細胞によりおよびＨＴＬＶ−１感染細胞により構成的に合成される。
【０１１５】  単球のＩＬ２受容体発現は、ＩＦＮ−γにより誘導され、よってこれらの細胞は、腫瘍細胞障害性となる。Ｔ細胞では、ｐ７５の発現は、ＩＬ３により減少できる。中間親和性ＩＬ２受容体（Ｋｄｉｓ＝１００ｐＭ）は、ｐ７５サブユニットおよびγ鎖（下記参照）からなるが、低親和性受容体（Ｋｄｉｓ＝１０ｎＭ）はｐ５５のみにより形成される。
【０１１６】  ｐ５５（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ０１０５７によりコードされるポリペプチド）は、２１９アミノ酸の細胞外ドメインと１３アミノ酸の非常に短い細胞質ドメインをもつ、２５１アミノ酸長を有する。ｐ５５遺伝子は、ヒト第１０ｐ１４からｐ１５番染色体に位置する。
【０１１７】  ｐ７５（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ２６０６２、Ｍ２８０５２によりコードされるポリペプチド）は、２１４アミノ酸の細胞外ドメインと２８６アミノ酸の細胞質ドメインをもつ、５２５アミノ酸長を有する。ｐ７５遺伝子は、１０個のエキソンを含み、約２４ｋｂの長さを有する。それは第２２ｑ１１．２−ｑ１２染色体およびネズミ第１５番染色体（バンドＥ）に位置する。
【０１１８】  γと呼称される、ＩＬ２受容体の第三の６４ｋＤａサブユニットが記載されている（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号、Ｄ１３８２１、Ｄ１１０８６によりコードされるポリペプチド）。ネズミおよびヒトの受容体のγサブユニットは、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで約７０％の配列同一性を有する。このサブユニットは、高および中親和性ＩＬ２受容体の産生に必要であるが、それ自体ではＩＬ２に結合しない。これらの２つの型の受容体は、α−β−γヘテロ三量体およびβ−γヘテロ二量体からそれぞれなる。ＩＬ２受容体のγサブユニットをコードしている遺伝子は、ヒト第Ｘｑ１３番染色体に位置し、約４．２ｋｂに及び、８個のエキソンを含む。ＩＬ２受容体のγサブユニットは、近年、ＩＬ４およびＩＬ７の受容体の成分であることが示された。それはまた、ＩＬ１３受容体の成分であるとも信じられている。
【０１１９】  ｐ７５のトランスメンブランドメインに直ぐ隣接して存在する２６７−３１７位のアミノ酸は、ＩＬ−２媒介シグナル伝達に関与している。さらに、ＩＬ２受容体は、受容体鎖のコンフォメーション変化、受容体媒介エンドサイトシス、およびさらにシグナル伝達プロセスに関与している多くの他のタンパク質（ｐ２２、ｐ４０、ｐ１００）に会合している。同定されたタンパク質の１つは、９５ｋＤａ細胞接着分子ＩＣＡＭ−１であり、これはおそらく、ＩＬ２受容体を細胞間の接触領域に集中させ、従って、例えば、ＩＬ−２媒介Ｔ細胞刺激中のパラ分泌活性を媒介し得る。ｐ７５に会合した別のタンパク質は、ｌｃｋと呼ばれる、チロシン特異的プロテインキナーゼである。ＩＬ２により誘導された細胞増殖は、ｌｃｋ陰性細胞系でプロテインチロシンキナーゼの特異的阻害剤により阻害されるという観察は、他のキナーゼもＩＬ２受容体に会合し得ることを示唆する。ｆｙｎおよびｌｙｎと呼ばれる、２つの該キナーゼが同定されている。さらに、ＩＬ２受容体シグナリングもｖａｖにより媒介され得る。
【０１２０】  活性化リンパ球は、連続的に、ＴＡＣ抗原の４２ｋＤａ断片を分泌する。この断片は、血清および血漿中を循環し、可溶性ＩＬ２受容体（ｓＩＬ２Ｒ）として機能する。この可溶性受容体の濃度は、例えば、感染、自己免疫疾患、白血病、または臓器移植後などの様々な病理状態で顕著に異なる。レベルは、１００倍まで増加し得る。ｓＩＬ２Ｒのレベルは、ＨＩＶ誘導疾患の重度に相関するようであり、他の設定の診断値にもなり得る。
【０１２１】  マウスおよびヒトＩＬ２は両方共、高効率で、相同種のＴ細胞の増殖を引き起こす。ヒトＩＬ２はまた、類似濃度でマウスＴ細胞の増殖も刺激し、一方、マウスＩＬ２は、低効率（６から１７０倍）で、ヒトＴ細胞を刺激する。
【０１２２】  ＩＬ２は、Ｔリンパ球の全亜集合の増殖因子である。それは、休止細胞の細胞周期進行を誘導する、Ｔ細胞の抗原非特異的増殖因子であり、従って、活性化Ｔリンパ球のクローン性増殖が可能となる。この効果は、プロラクチンなどのホルモンにより調節される。
【０１２３】  ＩＬ２はまた、活性化Ｂ細胞の増殖も促進し、例えばＩＬ４などの追加の因子の存在も必要とする。
【０１２４】  Ｔ細胞およびＢ細胞に対するその効果のために、ＩＬ２は、免疫応答の中心的な制御因子である。それはまた、抗炎症反応、造血および腫瘍監視にも役割を果たす。ＩＬ２は、末梢白血球のＩＦＮ−γの合成を刺激し、またＩＬ１、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βの分泌も誘導する。
【０１２５】  ＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）の増殖の活性とは別の殺腫瘍性サイトカインの分泌の誘導がおそらく、ＩＬ２の抗腫瘍活性の原因となる主な因子であると信じられている。
【０１２６】  ＩＬ２は、因子（例えば、ＡＴＨ８、ＣＴ６、ＣＴＬＬ−２、ＦＤＣＰミックス、ＨＴ−２、ＮＫＣ３、ＴＡＬＬ−３）に応答する細胞系を使用してバイオアッセイでアッセイできる。ＩＬ２の特異的エリザアッセイおよび可溶性受容体の酵素イムノアッセイも利用できる。可溶性受容体は、ビオチニル化ＩＬ２およびフローサイトメトリーまたはエリザアッセイの使用によっても検出できる。
【０１２７】  ＩＬ２は、特異的にある腫瘍を攻撃するＴ細胞の増殖およびクローン性増殖を支持するので、様々な腫瘍細胞型について有意な抗腫瘍活性を示す。ＩＬ２の、慣用的な処置には難治性の癌患者の処置における使用は増加している。全身投与ＩＬ２との併用療法により、標準的な処置のない転移性腎細胞癌患者の３０％に長期寛解が得られた。他覚的および長期生存臨床応答もまた、黒色腫または急性骨髄性白血病の一部の患者にも実証されている。
【０１２８】  高用量の全身ＩＬ２療法は、多くの望ましくない副作用にも関連している。ＩＬ２は、Ｂ細胞およびマクロファージを含む、細胞性免疫系の他の成分に対する追加の効果を有し、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、およびＴＮＦ−γを含む他の可溶性メディエータの分泌を誘導する。これらの効果は、ＩＬ２の抗腫瘍活性並びにその用量依存的毒性にも寄与し得る。
【０１２９】  ネズミ腫瘍細胞の機能的ＩＬ２遺伝子を用いた形質導入は、同系宿主による、遺伝子的に修飾された細胞の拒絶をもたらすことが示された。ＩＬ２を発現している変化した腫瘍細胞も全身免疫を増加させる。
【０１３０】  ヒトＩＬ４は、２４アミノ酸の疎水性分泌シグナル配列を含む前駆体として合成される１２９アミノ酸のタンパク質（２０ｋＤａ）である。ＩＬ４は、２つのアルギニン残基（３８および１０５位）でグリコシル化され、ジスルフィド結合形成に関与する６個のシステイン残基を含む。ジスルフィド結合は、生物活性に必須である。その生物活性の異なる、ＩＬ４のいくつかのグリコシル化変種が記載されている。ネズミおよびヒトＩＬ４の比較により、両方のタンパク質は９１から１２８位のみで異なることが示される。
【０１３１】  組換えヒトタンパク質のＴｙｒ１２４がアスパラギン酸残基により置換された、ＩＬ４変種のＹ１２４Ｄは、高い親和性でＩＬ４受容体に結合する（Ｋｄ＝３１０ｐＭ）。この変種は、ＩＬ４受容体系の強力なアンタゴニストである。検出可能なＴ細胞増殖活性は保持されておらず、ＩＬ−４依存性Ｔ細胞増殖を競合的に阻害する（Ｋ（ｉ）＝６２０ｐＭ）。この変異体の存在により、高親和性結合およびシグナル産生は、リガンドで効率的に脱共役できることが実証される。Ｙ１２４Ｄは、ＩＬ１３受容体の強力なアンタゴニストとしても作用する。
【０１３２】  ヒトＩＬ４遺伝子は、４個のエキソンを含み、約１０ｋｂの長さを有する。それは、第５ｑ２３−３１番染色体に位置する。ネズミ遺伝子は第１１番染色体に位置する。ＩＬ４遺伝子は、造血増殖因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ５）をコードしている他の遺伝子の近位にある。ＩＬ４遺伝子とＩＬ５遺伝子の間の距離は、約９０−２４０ｋｂである。
【０１３３】  ヌクレオチドレベルで、ヒトおよびネズミＩＬ４遺伝子は、約７０％の相同性を示す。ＩＬ４の５’領域は、これおよび他の遺伝子の発現を制御している転写因子の結合部位である、ＣＬＥ（保存リンホカインエレメント）と呼称される数個の配列エレメントを含む。ヒトＩＬ４遺伝子（７９から６９位）の５’領域のＰ配列（ＣＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣ）と呼ばれる配列モチーフは、Ｔ細胞活性化シグナルへの応答を媒介している、ＮＦ（Ｐ）と呼ばれる核因子の結合部位である。ＩＬ４の生物活性は、１００−５０００コピー／細胞の密度で発現される、特異的受容体（Ｋｄｉｓ＝２０−１００ｐＭ）により媒介される（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ２９８５４、Ｘ５２４２５によりコードされるポリペプチド）。ＩＬ４受容体の細胞外ドメインは、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体、ＩＬ６およびＩＬ２受容体のβ鎖に関連する。それはＣＤ１２４と称される。
【０１３４】  ネズミＩＬ４受容体のｃＤＮＡは、８１０アミノ酸のトランスメンブランドメイン（分泌シグナル配列を含む）をコードする。この受容体は、５５３アミノ酸の大細胞内ドメインを有する。ヒト受容体は、２０７アミノ酸の細胞外ドメイン、２４残基のトランスメンブランドメイン、および５６９アミノ酸の大細胞内ドメインを有する。
【０１３５】  ＩＬ４受容体は、近年、シグナリング成分としてＩＬ２受容体のγサブユニットを含むことが示された。このγサブユニットは、ＩＬ４およびＩＬ７およびおそらくＩＬ１３の受容体にも会合している。２つの形の受容体が記載され、その１つが分泌されている。分泌受容体のみが、細胞外ＩＬ４結合ドメインを含み、ＩＬ４活性を遮断できる。ＩＬ４受容体と同じ親和性でＩＬ４に結合するＩＬ４結合タンパク質（ＩＬ４−ＢＰ）も、可溶性ＩＬ４受容体変種であることが示された。これらの可溶性受容体はおそらく、受容体結合を阻害することにより、サイトカイン活性の生理学的制御因子として機能するか、または輸送タンパク質として作用する。可溶性受容体または結合タンパク質が、ＩＬ１（ＩＬ１受容体アンタゴニスト）、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＴＮＦ−α、ＩＧＦ、およびＩＦＮ−γでも記載されている。
【０１３６】  ＩＬ４の生物活性は、種特異的であり；マウスＩＬ４は、ヒト細胞に対して不活性であり、ヒトＩＬ４はネズミ細胞に対して不活性である。ＩＬ４は、活性化Ｂ細胞の増殖および分化、クラスＩＩＭＨＣ抗原の発現、および休止Ｂ細胞での低親和性ＩｇＥ受容体の発現を促進する。ＩＬ４は、Ｂ細胞上のクラスＩＩＭＨＣ抗原の発現を増強する。それは、他のＢ細胞刺激への応答能およびＴ細胞への抗原提示能を促進できる。これは、特異的Ｂ細胞のクローン性増殖を促進する１つの方法であり得、従って、免疫系は、非常に低濃度の抗原に応答できる。非Ｂ非Ｔ細胞によるＩＬ４の産生は、これらの細胞が、ＩｇＥまたはＩｇＧのそのＦｃ受容体を介して、他の細胞と相互作用する場合に刺激される。この効果はＩＬ３により増強できる。ＩＬ２およびＰＡＦ（血小板活性化因子）はＩＬ４の合成を誘導するが、ＴＧＦ−βはそれを阻害する。
【０１３７】  ＩＬ３は、Ｂ細胞のＩＬ２誘導効果に拮抗し、ＩＬ２受容体発現のゆっくりとした減少を引き起こし、従って、ＩＬ２によるヒトＢ細胞の増殖を阻害する。活性化Ｂ細胞では、ＩＬ４は、ＩｇＧ１およびＩｇＥの合成を刺激し、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの合成を阻害する。Ｂ細胞でのＩＬ４により誘導されるこのイソタイプ切り替えは、ＩＦＮ−γにより拮抗される。多発性骨髄腫の増殖は、骨髄腫増殖因子であるＩＬ６の合成を阻害するＩＬ４により抑制できる。ＩＬ４はまた、ヒト肺胞マクロファージにおけるＩＬ６の合成も阻害する。
【０１３８】  ＩＬ４でマクロファージを前処理することにより、菌体内毒素またはＩＦＮ−γによる細胞の活性化に応答した、ＩＬ１、ＴＮＦ−αおよびプロスタグランジンの産生は防がれる。
【０１３９】  ＩＬ４は、コロニー形成アッセイで顆粒球または赤血球前駆細胞を含むコロニーの産生においてＥｐｏおよびＧ−ＣＳＦ／Ｅｐｏと相乗作用する。
【０１４０】  ＩＬ４の古典的な検出法は、刺激精製Ｂ細胞の増強増殖を測定する、Ｂ細胞共刺激アッセイである。ＩＬ４は、ＩＬ４応答細胞（例えば、ＢＡＬＭ−４；ＢＣＬ１；ＣＴ．４Ｓ；ＣＴＬ４４；ＣＴＬＬ−２；Ｄａ；ＦＤＣＰミックス；ＨＴ−２；Ｌ４；Ｌ１３８．８Ａ；ＭＯ７Ｅ；ＭＣ／９；ＮＦＳ−６０；Ｒａｍｏｓ；Ｓｅｚ６２７、ＴＦ−１；ＴＳ１）を使用したバイオアッセイでも検出できる。ヒトＩＬ４の特異的検出法は、多くのＢ細胞系におけるＣＤ２３の誘導であり、ＣＤ２３は、フローサイトメトリーまたは蛍光イムノアッセイにより検出される。消費／分解を防ぐ条件下でのＩＬ４産生速度の迅速な決定を可能とするイムノアッセイは、サイトカインイムノトラップである。
【０１４１】  ＩＬ４は、結腸および哺乳動物癌の増殖を阻害する。それはＬＡＫ細胞の発達を増大させることが示された。機能的ＩＬ４遺伝子を用いたネズミ腫瘍細胞の形質導入は、同系宿主による、遺伝的に修飾された細胞の拒絶をもたらすことが示された。ＩＬ４を発現している変化した腫瘍細胞は、全身免疫を増加させる。形質導入細胞をワクチン接種したマウスは、その後の非形質導入細胞の攻撃を、およびある場合には、既存の腫瘍を拒絶する。
【０１４２】  ヒトＩＬ６は、７３および１７２位がグリコシル化された１８５アミノ酸のタンパク質である。それは、２１２アミノ酸の前駆タンパク質として合成される。単球は、分子量２１．５−２８ｋＤａをもつ、少なくとも５つの異なる分子形のＩＬ６を発現する。それらは、グリコシル化およびリン酸化などの翻訳後変化が主に異なる。
【０１４３】  様々な細胞型から単離されたＩＬ６は、そのＮ末端にいくらかの微小不均一性を示す。担体タンパク質のα−２−マクログロブリン（α２Ｍ）とおそらく複合体を形成している４２−４５ｋＤａ形が血漿中に観察されている。ネズミおよびヒトＩＬ６は、ＤＮＡレベルで６５％の配列相同性およびタンパク質レベルで４２％の相同性を示す。ＩＬ６は、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭ、ＩＬ１１およびＣＴ−１も含む、サイトカインのファミリーのメンバーである。全ての既知のＩＬ６サイトカインファミリーのメンバーが、肝急性相タンパク質発現を誘導する。
【０１４４】  Ｈ−ＩＬ６と称されるＩＬ６と可溶性ＩＬ６受容体の間の融合タンパク質からなる、安定および高度に生物活性の設計サイトカインが、ヒト造血前駆細胞増殖に使用され、細胞がＩＬ６には応答しないが、ＩＬ６および可溶性ＩＬ６受容体からなる安定な複合体を必要とする場合には有用である。
【０１４５】  ヒトＩＬ６遺伝子は、約５ｋｂの長さを有し、５個のエキソンを含む。それは、マーカーＤ７Ｓ１３５とＤ７Ｓ３７０の間のヒト第７ｐ２１からｐ１４番染色体に位置する。ネズミ遺伝子は、第５番染色体に位置する。ＩＬ６およびＧ−ＣＳＦ遺伝子のヌクレオチドは配列はある点で互いに似ており、進化の関連の可能性を示唆する。
【０１４６】  ＩＬ６受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ２０５６６、Ｅ０３５１５によりコードされるポリペプチド）は、Ｔ細胞、マイトジェン活性化Ｂ細胞、末梢単球、並びにいくつかのマクロファージ由来およびＢ細胞由来腫瘍細胞型上に発現される。それは、休止Ｂ細胞上には発現されないが、休止Ｔ細胞上には発現される。肝細胞では、ＩＬ６受容体発現は、ＩＬ６またはＩＬ１での処理後に増強される。数個の細胞型において、ＩＬ６受容体の発現はまた、グルココルチコイドによっても増強される。ＩＬ６受容体遺伝子は、ヒト第１ｑ２１番染色体に位置する。
【０１４７】  ＩＬ６受容体は、８０ｋＤａおよび４４９アミノ酸長の強力にグリコシル化されたタンパク質である。それはＣＤ１２６と称されている。それは４６８アミノ酸の前駆体として合成される。分子構造は、受容体が、細胞外受容体ドメインのアミノ末端領域に免疫グロブリン様配列ドメインを含むという点で、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦおよびＩＬ１の受容体のそれと類似している。
【０１４８】  ＩＬ６受容体の細胞内ドメインは、約８２アミノ酸長を有し、細胞内シグナル伝達に関与する他のタンパク質とは全く相同性を示さない。異なる親和性（Ｋｄｉｓ＝１０−９および１０−１１Ｍ）でＩＬ６に結合し、同受容体タンパク質の翻訳後修飾により最も生じ易い、２つの異なる形の受容体が記載されている。ＩＬ６の生物活性は、１０−１３−１０−１５Ｍの濃度でも認められ、他の高親和性受容体コンフォメーションの存在またはより高い親和性をもつさらなる受容体分子の存在が示唆される。
【０１４９】  ＩＬ６受容体媒介シグナル伝達は、プロテインキナーゼＣおよびまたアデニル酸シクラーゼを含む。
【０１５０】  ＩＬ６とその受容体の間に形成された複合体は、シグナル伝達に関与する、トランスメンブラン糖タンパク質のｇｐ１３０（９１８アミノ酸；２７７アミノ酸の細胞質ドメイン）と会合する。ＩＬ６のその受容体への結合により、ｇｐ１３０のジスルフィド連結ホモ二量体化および関連したチロシンキナーゼ活性化が、シグナル伝達の第一段階として起こる。ｇｐ１３０は、ＩＬ６受容体を発現しない細胞でも発現される。それは、ＩＬ１１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、およびＣＮＴＦ、およびＣＴ−１を含む他の受容体の成分であることが判明した。これは、なぜＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびＩＬ６が、因子自体は互いに関連しないにも関わらず、多くの生物活性を共有しているかを説明する。ＬＩＬ因子と呼ばれる、ＳＴＡＴタンパク質に似た因子が、ＩＬ６、およびまたＩＬ１および細菌リポ多糖のシグナル経路に関与することが判明した。
【０１５１】  ｇｐ１３０とも相互作用する、可溶形のＩＬ６受容体（ＩＬ６Ｒ−ＳＵＰ（ＩＬ６受容体可溶性尿タンパク質））も記載されている。これらの可溶性受容体はおそらく、受容体結合の阻害によるサイトカイン活性の生理学的制御因子として機能するか、または輸送タンパク質として作用する。類似の可溶性受容体または結合タンパク質が、ＩＬ１（ＩＬ１ｒａ、ＩＬ１受容体アンタゴニスト）、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＴＮＦ−α、ＩＧＦ、およびＩＦＮ−γについても記載されている。
【０１５２】  造血前駆細胞および神経細胞を含む、いくつかの細胞は、ＩＬ６と可溶性ＩＬ６受容体の組合せにのみ応答性であり、ＩＬ６のみには応答性ではない。
【０１５３】  ヒトＩＬ６は、サル、ラットおよびマウスで生物活性である。ネズミＩＬ６は、ヒト細胞では活性ではない。多くの生物活性が、ＩＬ６を記載した多くの異なる頭字語により例示される。ＩＬ６は、抗原特異的免疫応答および炎症反応に影響を及ぼす多面的サイトカインである。それは、急性相反応の主な生理学的メディエータの１つである。肝細胞では、グルココルチコイドと組合わせたＩＬ６は、メタロチオネインの合成を誘導し、細胞内亜鉛レベルを増加させ、よって、ＣＣＬ４誘導肝毒性を防ぐ。
【０１５４】  ＩＬ６は、コリン作用性神経の神経栄養性因子であり、培養液中のその生存を促進する。ＩＬ６により、いくつかの神経細胞系を誘導して分化できる。
【０１５５】  ＩＬ６は、ＩＬ１と同様、下垂体のＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）の合成を刺激する。ＡＣＴＨに応答して合成されたグルココルチコイドは、ＩＬ６、ＩＬ１およびＴＮＦの産生をインビボで阻害し、従って、免疫系と神経内分泌機能の間に一種のネガティブフィードバックループを確立している。星状膠細胞では、ＩＬ６は神経成長因子（ＮＧＦ）の合成を誘導する。
【０１５６】  ＩＬ６は、インビトロおよびインビボでのＢ細胞分化因子およびＴ細胞の活性化因子である。ＩＬ２の存在下で、ＩＬ６は、成熟および非成熟Ｔ細胞の、細胞障害性Ｔ細胞への分化を誘導する。ＩＬ６はまた、胸腺細胞の増殖も誘導し、おそらく胸腺Ｔ細胞の発達に役割を果たす。
【０１５７】  ＩＬ６は、細胞がＩＬ４により前以て活性化されている場合、Ｂ細胞の、免疫グロブリン分泌形質細胞への最終的成熟を誘導できる。Ｂ細胞では、ＩＬ６は、血清ＩｇＧ１レベルが１２０から４００倍に上昇できる程度まで、抗体の分泌を刺激する。
【０１５８】  僅か０．００２ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ６は、多くのヒト骨髄腫の主な自己分泌増殖修飾因子の１つである。これらの細胞の増殖は、ＩＬ６に対して指向されたモノクローナル抗体により阻害できる。それはまた、ＩＬ６に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入により、またはＩＬ４により阻害できる。骨髄腫細胞に対するコルチコステロイドの増殖阻害効果は、おそらく、ステロイド誘導ＩＬ６発現の減少に起因する。ヒトＩＬ６依存性骨髄腫細胞の増殖は、ＩＦＮ−γによっても阻害できる。ＩＬ６はまた、他の腫瘍型の自己分泌増殖修飾因子としても機能し得、そのいくつかはＩＬ６を構成的に分泌することが判明した。ＩＬ６は、インビトロ子宮頸部腫瘍細胞増殖の自己分泌修飾因子であることが示された。その一方で、ＩＬ６は、哺乳動物癌、子宮頸部癌、ヒト肺癌細胞系、組織球リンパ腫、および黒色種などのいくつかの充実性腫瘍の増殖を阻害する。
【０１５９】  ＩＬ６およびＩＬ３は、インビトロで、多能性造血前駆細胞の増殖の促進において相乗作用する。ＩＬ６はまた、インビトロで巨核球の成熟を誘導し、インビボで血小板数を増加させるトロンボポエチンである。ネズミ骨髄培養物では、ＩＬ６はＧＭ−ＣＳＦに似た活性を示すが、ヒト骨髄培養物では示さない。
【０１６０】  形質細胞腫細胞は、ＩＬ６およびまたＩＬ６受容体も産生する。これらの細胞は、自己分泌様に刺激されることが示唆されている。１つは因子を産生し、他方は受容体を発現している、２つの異なる細胞個体群の存在に関与するパラ分泌機序も記載されている。
【０１６１】  ＩＬ６は、ＩＬ６応答性細胞系（例えば、７ＴＤ１；Ｂ９；ＣＥＳＳ、ＫＰＭＭ２、ＫＴ−３；Ｍ１、ＭＨ６０−ＢＳＦ−２、ＭＯ７Ｅ；Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ６；ＮＦＳ−６０；ＰＩＬ−６；ＳＫＷ６−Ｃｌ４；Ｔ１１６５；ＸＧ−１）を使用して、バイオアッセイで検出できる。ＩＬ６はまた、ハイブリドーマ増殖因子としてその活性によってもアッセイできる。感度の高いイムノアッセイおよび比色試験も利用できる。受容体会合ｇｐ１３０タンパク質の検出にはエリザアッセイがある。
【０１６２】  他のサイトカイン（例えばＩＬ２）と組合せて、ＩＬ６は、いくつかの腫瘍型の処置に有用であり得る。機能的ＩＬ６遺伝子を用いたネズミ腫瘍細胞の形質導入は、同系宿主による、遺伝的に修飾された細胞の拒絶をもたらすことが示された。ＩＬ６を発現している変化した腫瘍細胞は全身免疫も増加させる。形質導入細胞をワクチン接種したマウスは、その後の非形質導入細胞の攻撃を、およびある場合には、既存の腫瘍を拒絶する。
【０１６３】  ヒトＩＬ１０は、１６０アミノ酸長を有するサブユニットをもつホモ二量体タンパク質である。ヒトＩＬ１０は、ネズミＩＬ１０と７３％のアミノ酸相同性を示す。ヒトＩＬ１０は、４個のエキソンを含む。それは、エプスタイン−バーウイルスのＢＣＲＦ−１遺伝子（Ｂａｍ  ＨＩ  Ｃ断片の右側の読み枠）の産物に密接に関連する（タンパク質レベルで８４％の相同性）。これらの２つのタンパク質は、ヒトとネズミＩＬ１０よりも互いにより密接に関連している。それ故、ＢＣＲＦ−１は、ウイルスＩＬ１０（ｖＩＬ１０）と呼ばれている。ヒトＩＬ１０遺伝子は第１番染色体に位置する。ヒトＩＬ１０は、ヌクレオチドレベルで、ネズミＩＬ１０に８１％の相同性を示す。
【０１６４】  受容体が、放射標識ＩＬ１０（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ１２１２０、Ｕ００６７２によりコードされるポリペプチド）を使用することにより、ネズミおよびヒト細胞上で同定された。マウスＩＬ１０は、ヒトＩＬ１０の、マウス細胞への結合を遮断できるが、ヒト細胞への結合は遮断できない。ネズミＩＬ１０受容体がクローン化された。この受容体は、ネズミＩＬ１０に特異的に結合する約１１０ｋＤａのタンパク質である。この受容体はＩＦＮ受容体に構造的に関連している。
【０１６５】  ＩＬ１０は、Ｔ細胞のＴｈ１亜個体群におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ２およびＴＮＦ−βなどの多くのサイトカインの合成を阻害するが、Ｔｈ２細胞のは阻害しない。この活性はＩＬ４により拮抗される。ＩＦＮ−γ産生に対する阻害効果は間接的であり、補助細胞によるＩＬ１２合成の抑制の結果のようである。ヒト系において、ＩＬ１０は、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞により産生され、その機能をダウンレギュレートする。細菌リポ多糖により刺激されたマクロファージにおいて、ＩＬ１０は、とりわけ、サイトカインｍＲＮＡの分解を促進することにより、ＩＬ１、ＩＬ６およびＴＮＦ−αの合成を阻害する。それはまた、抗原提示の阻害をもたらす。ヒト単球において、ＩＦＮ−γおよびＩＬ１０は、互いの他の産生および機能を拮抗する。ＩＬ１０は、ＩＬ１２の生理学的アンタゴニストであることが示された。
【０１６６】  １Ｌ１０はまた、補助細胞の存在下でＴ細胞のマイトジェンまたは抗ＣＤ３誘導増殖を阻害し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２の産生を減少させる。外来性ＩＬ２およびＩＬ４は、増殖阻害効果を阻害するが、ＩＦＮ−γの産生には影響を及ぼさない。ＬＰＳ刺激マクロファージにおいて、ＩＦＮ−γは、ＩＬ１０の産生を阻害することによりＩＬ６の合成を増加させる。ＩＬ１０は、Ｔｈ２上清の、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン合成を阻害する能力の大半または全てに関与しているようである。
【０１６７】  ＩＬ１０は、ＩＬ５により誘導されたＴ細胞非依存性抗原によるＩｇの分泌を阻害するが、ＩＬ２により誘導されたものは阻害しない。
【０１６８】  ネズミＬｙ−１Ｂ細胞は、主なＩＬ１０源である。他のＢ細胞と比べて、Ｌｙ−１Ｂ細胞は、非常に上昇した構成的および誘導的レベルのＩＬ１０を発現する。これらの細胞はまた、連続的な自己補充という特有の特性を有する。抗ＩＬ１０抗体で新生仔マウスを連続的に処置することにより、正常な脾臓Ｂ細胞個体群は維持されるが、Ｌｙ−１Ｂ細胞は枯渇する。これらのマウスには、血清中免疫グロブリンＭレベルも非常に減少しており、特異的抗原に対するその抗体応答も損傷している。それ故、ＩＬ１０は、Ｌｙ−１Ｂ細胞発達の制御因子である。Ｌｙ−１Ｂ細胞枯渇の機序は、ＩＦＮ−γの産生増加に関与するようである。なぜなら、中和抗ＩＦＮ−γ抗体の共投与は、実質的に、これらのマウスの腹膜常在Ｌｙ−１Ｂ細胞数を回復するからである。
【０１６９】  ＩＬ１０はまた、成熟および非成熟胸腺細胞の増殖の共刺激因子であり（ＩＬ２、ＩＬ４およびＩＬ７と共に）、細胞障害性Ｔ細胞分化因子として機能し、より多くの数のＩＬ２活性化細胞障害性Ｔリンパ球前駆体が、細胞障害性エフェクター細胞に増殖および分化することを促進する。ＩＬ１０は、インビトロでＢ細胞生存能を保持し、またＢ細胞も刺激し、その分化を促進する。それは、Ｂ細胞上のＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を増強し、一方、それは単球上のＭＨＣクラスＩＩ発現を阻害する。その抗原受容体を介してまたはＣＤ４０を介して活性化されたＢ細胞において、ＩＬ１０は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭの分泌を誘導する。この効果は、ＩＬ４により相乗作用されるが、ＩＬ１０により誘導された免疫グロブリンの合成は、ＴＧＦ−βにより拮抗される。マクロファージの活性化はＩＬ１０により防ぐことができる。
【０１７０】  ヒトＩＬ１０は、ヒトＴリンパ球の強力かつ特異的な化学誘引物質であることが示された。化学走性活性は、ＣＤ８を発現している細胞には指向されるが、ＣＤ４（＋）細胞には指向されない。ＩＬ１０はまた、ＩＬ８に向けて、ＣＤ４（＋）細胞の化学走性応答は阻害するが、ＣＤ８（＋）細胞のそれは阻害しない。
【０１７１】  ＩＬ１０は、高感度エリザアッセイを用いて検出できる。ネズミ肥満細胞系Ｄ３６を使用して、ヒトＩＬ１０をバイオアッセイできる。細胞内因子も、フローサイトメトリーにより検出できる。
【０１７２】  ＩＬ１０発現ベクターのＣＨＯ細胞への導入を使用して、インビボでの局所的ＩＬ１０産生の結果を分析した。これらの変化細胞は、ヌードマウスまたは重症複合免疫不全症ＳＣＩＤマウスでもはや腫瘍原性ではなく、等数の同時注入した正常ＣＨＯ細胞の増殖も抑制した。正常ＣＨＯ腫瘍は通常、実質的にマクロファージにより浸潤されるが、ＣＨＯ−ＩＬ１０腫瘍組織内には実際上、存在しておらず、これは、ＩＬ１０が、腫瘍増殖促進活性を与え得るマクロファージの浸潤を阻害することにより、ある腫瘍の腫瘍増殖を間接的に抑制することを示唆する。
【０１７３】  ヒトＩＬ１２は、ＩＬ１２の生物活性に必須なジスルフィド結合により連結した、４０ｋＤａサブユニット（ｐ４０、３０６アミノ酸；１０％炭水化物）および３５ｋＤａサブユニット（ｐ３５、１９７アミノ酸；２０％炭水化物）からなる、ヘテロ二量体７０ｋＤａの糖タンパク質である。ｐ４０は、１０個のシステインおよびヘパリンの結合部位を含み；ｐ３５は７個のシステインを含む。
【０１７４】  ＩＬ１２の２つのサブユニットは、どの他の既知のタンパク質とも関連していない。ｐ４０は、ＩＬ６受容体の細胞外ドメインといくらかの相同性を示し、ｐ３５は、ＩＬ６の相同体のようである。
【０１７５】  単一の分子に２つのＩＬ１２サブユニットを合わせた、生物活性ネズミおよびヒトＩＬ１２融合タンパク質が記載されている。この設計サイトカインは、インビボで抗腫瘍活性を保持する。二量体組換えＩＬ１２の全ての生物学的特徴を保持している単鎖タンパク質Ｆｌｅｘｉ１２も記載されている。
【０１７６】  ＩＬ１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ１２Ｂ）をコードしている遺伝子は、他のサイトカイン遺伝子も有する同領域のヒト第５ｑ３１−ｑ３３番染色体に位置する。ＩＬ１２のｐ３５サブユニット（ＩＬ１２Ａ）をコードしている遺伝子は、ヒト第３ｐ１２−ｑ１３．２番染色体に位置する。２つの遺伝子の発現は、互いに独立的に調節されている。
【０１７７】  ＩＬ１２受容体は、約１１０ｋＤａの単一タンパク質（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０３１８７、Ｕ２３９２２、Ｕ６４１９８、Ｕ６４１９９によりコードされるポリペプチド）のようである。１細胞あたり１０００−９０００個までの高親和性ＩＬ１２受容体が、様々なＴ細胞マイトジェンによりまたはＩＬ２により活性化された末梢血単核細胞上に発現されている。ＩＬ１２受容体は、ＣＤ４およびＣＤ８を発現している活性化Ｔ細胞上および活性化ＣＤ５６陽性ナチュラルキラー細胞上に存在する。休止末梢血単核細胞、扁桃腺Ｂ細胞、または抗ＩｇＭ／Ｄｘ、抗ＩｇＭ／Ｄｘ＋ＩＬ２、またはＳＡＣ＋ＩＬ２により活性化された扁桃腺Ｂ細胞は、受容体を発現しない。高親和性ＩＬ１２受容体は、形質転換マモセットＮＫ様細胞系、ＨＶＳ．ＳＩＬＶＡ４０上に構成的に発現する。
【０１７８】  ＩＬ１２のその受容体への結合は、ｐ４０サブユニットに対して指向したモノクローナル抗体により防ぐことができ、それ故、それは結合部位を含む。ＩＬ１２のｐ４０サブユニットは、ＩＬ６受容体の細胞外ドメインと相同性を示す。ｐ４０サブユニットのウイルスのコードする相同体はＥＢＶ誘導遺伝子−３である。
【０１７９】  ヒトＩＬ１２は、ネズミリンパ球では活性でない。ネズミｐ３５およびヒトｐ４０サブユニットからなるハイブリッドヘテロ二量体は、ネズミ細胞に対する生物活性は保持するが；しかし、ヒトｐ３５とネズミｐ４０の組合せは、ネズミ細胞に対して完全に不活性である。ネズミＩＬ１２は、ネズミおよびヒトリンパ球の両方に対して活性である。ネズミＩＬ１２サブユニットｐ４０（ＩＬ１２ｐ４０）のｐ４０サブユニットは、様々なアッセイ系でＩＬ１２ヘテロ二量体の効果を特異的に拮抗し、ＩＬ１２ヘテロ二量体の内因性特異的阻害剤として機能することが示された。
【０１８０】  ＩＬ１２は、植物凝集素により活性化されたヒトリンパ芽球の増殖を刺激する。ＩＬ１２は、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞を活性化し、この活性は、ＴＮＦ−αに特異的な抗体により遮断される。ＩＬ１２は、特異的同種間ＣＴＬ反応を促進する。ＩＬ１２はまた、抗ＣＤ３抗体および混合リンパ球培養物中の同種刺激と、Ｔ細胞増殖の誘導において相乗作用する。
【０１８１】  Ｔｈ１型の末梢リンパ球において、ＩＬ１２は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２、およびＴＮＦの合成を誘導する。ＴＮＦ−αも、ナチュラルキラー細胞に対するＩＬ１２の効果の媒介に関与するようである。なぜなら、ＩＬ１２の効果は、ＴＮＦ−αに対して指向された抗体により阻害されるからである。ＩＬ１２およびＴＮＦ−αは、ＩＬ１２がＩＦＮ−γ応答を最大化する上でのＩＦＮ−γ産生の共刺激物質であり；ＩＬ１２、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−γの産生は、ＩＬ１０により阻害される。Ｔｈ２ヘルパー細胞では、ＩＬ１２はＩＬ４、ＩＬ５およびＩＬ１０の合成を減少させる。
【０１８２】  ＩＬ１２は、末梢血中の単核細胞の増殖の促進およびＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）の産生の促進において、最適以下の量のＩＬ２と相乗作用する。ピコモル濃度のＩＬ１２が、ＩＬ２によりインビボで増殖されたナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性の増大において、ナノモル濃度のＩＬと同程度に効果的である。ＩＬ１２はまた、コマイトジェンとして作用し、ＩＬ２により誘導された休止末梢細胞の増殖を増強する。
【０１８３】  ＩＬ１２は、ＳＣＦ（幹細胞因子）により誘導された原始骨髄前駆細胞の骨髄造血を増強し、コロニー刺激因子と相乗作用して増殖を誘導する。ＩＬ１２は、より拘束された骨髄前駆体に対する相乗作用も有し、ＩＬ３、ＩＬ１１またはＩＬ３とＳＣＦと相乗作用する。
【０１８４】  ＩＬ１２は、ＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化キラー細胞）の産生に必要なＩＬ２の量の減少を可能とするので、潜在的に臨床的に興味深い。ＩＬ１２は、インビボで様々な実験腫瘍の増殖を阻害し、インビボで抗血管形成効果を有することが示されたが、これは少なくとも一部には、ＩＦＮ−γにより媒介される。それ故、ＩＬ１２は、血管形成依存性悪性腫瘍の処置にも強力な候補のようである。
【０１８５】  ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバー（ＴＮＦα、ＴＮＦ−β、ＬＴβ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ９５リガンド、４１ＢＢ、ＯＸ４０リガンド、ＴＲＡＩＬ）は、共通の生物活性を共有するが、いくつかの特性は、いくつかのリガンドのみにより共有され、その他は独特である。ヒトＴＮＦ−αは、１７ｋＤａおよび１５７アミノ酸長の非グリコシル化タンパク質である。ネズミＴＮＦ−αは、Ｎ−グリコシル化されている。ＴＮＦ−βとの相同性は約３０％である。ＴＮＦ−αは、二量体および三量体を形成する。１７ｋＤａ形の因子は、２３３アミノ酸の前駆タンパク質のプロセシングにより産生される。ＴＮＦ−α変換酵素は、この変換を媒介することが示された。２６ｋＤａのトランスメンブラン形も記載されている。
【０１８６】  ＴＮＦ−αは、因子の生物活性を変化させることなく分解できる、単一のジスルフィド結合を含む。Ａｌａ８４からＶａｌおよびＶａｌ１９１からＡｌａへの変異により、因子の細胞毒性活性はほぼ完全に減少する。これらの部位は受容体結合に関与する。７Ｎ末端アミノ酸の欠失およびＰｒｏ８Ｓｅｒ９Ａｓｐ１０のＡｒｇＬｙｓＡｒｇによる置換により、約１０倍抗腫瘍活性が増強し、Ｌ−Ｍ細胞アッセイにより実証したように、受容体結合が増加し、同時に毒性が減少した、変異因子が得られる。
【０１８７】  遺伝子は、約３．６ｋｂ長を有し、４個のエキソンを含む。一次転写物は、２７６２ヌクレオチド長を有し、２３３アミノ酸の前駆タンパク質をコードする。アミノ末端７８アミノ酸は、前配列として機能する。ヒト遺伝子は、第６ｐ２３−６ｑ１２番染色体に位置する。それは、ＨＬＡ−ＢのクラスＩＨＬＡ領域と、補体因子Ｃをコードしている遺伝子の間に位置する。ＴＮＦ−βをコードしている遺伝子は、ＴＮＦ−α遺伝子の約１．２ｋｂ下流である。しかし、両方の遺伝子は独立的に調節されている。２つの遺伝子はまた、ネズミ第１７番染色体上で互いに近接して存在する。
【０１８８】  ＴＮＦ−αの約５００から１０００個の高親和性受容体（Ｋａ＝２．５×１０−９Ｍ）が、赤血球の例外を除く全ての体細胞型で発現される。５５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ１；新規呼称：ＣＤ１２０ａ）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５５３１３によりコードされるポリペプチド）および７５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ２；新規呼称：ＣＤ１２０ｂ）（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ  ＲＧ等（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １１：３０２０−６に記載）の２つの受容体が記載されている。１つの受容体は、１７１アミノ酸の細胞外ドメインおよび２２１アミノ酸の細胞質ドメインを含む４５５アミノ酸のグリコシル化タンパク質である。細胞外部分のシステインリッチドメインの配列相同性により、受容体は、低親和性ＮＧＦ受容体およびヒト細胞表面抗原ＣＤ４０に関連することが判明する。
【０１８９】  ５５ｋＤａ受容体のＴＮＦ−Ｒ１のＣ末端細胞内領域の欠失解析により、プログラム化細胞死に至るシグナルプロセスに関与する、いわゆる死ドメインの存在が判明した。ＴＮＦ−Ｒ１の死ドメインは、ＴＲＡＤＤを含む様々な他のシグナルアダプター分子およびＲＩＰと相互作用する。
【０１９０】  ２つの既知の受容体が、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βの両方に結合する。ｐ５５は、ＴＮＦの細胞毒性作用を受け易い細胞上に特に発現される。ｐ７５も、特に骨髄起源の細胞型を含む、多くの細胞型に存在する（受容体サブユニットのウイルスコード相同体は、ＥＢＶ誘導遺伝子−６である）。刺激Ｔ細胞およびＢリンパ球上で強く発現される。様々な細胞型上でのＴＮＦの異なる活性、すなわち、増殖促進および増殖阻害活性は、おそらく他の別の受容体会合タンパク質と組合せた複数の受容体の異なる発現および／または調節により媒介される。ｐ５５は、微生物およびその病原因子に対する宿主防御に重要な役割を果たすようである。
【０１９１】  第三の受容体サブタイプは、正常ヒト肝臓に発現される。それはＴＮＦ−αには結合するがＴＮＦ−βには結合しない。いくつかのウイルスは、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体と密接に相同性である、ＴＮＦ結合特性をもつ分泌タンパク質をコードしている遺伝子を含む。２つの受容体サブタイプの異なる効果が、内皮への白血球のＴＮＦ媒介接着にも見られた。ｐ５５受容体の関与は、特に、細胞接着分子ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、Ｖ−ＣＡＭ−１、およびＣＤ４４の誘導をもたらし、一方、ｐ５５およびｐ７５受容体の両方の関与は、α−２インテグリンの発現を誘導する。
【０１９２】  短縮可溶形の受容体も見出された。可溶形、特にｐ６０受容体の可溶細胞外ドメインは、ＴＮＦの抗増殖効果を遮断し、それ故、ＴＮＦの有害な効果を調節し得る。
【０１９３】  受容体密度は、ＩＬ１並びにホルボールエステルなどの腫瘍促進物質により減少する。ＴＮＦ−α受容体発現密度は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、およびＩＦＮ−γにより誘導される。
【０１９４】  ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーの細胞質ドメインに会合するシグナルトランスデューサは、ＴＲＡＦ（腫瘍壊死因子受容体会合因子）を含む。
【０１９５】  ヒトＴＮＦ−αは、僅かに減少した特異的活性をもち、ネズミ細胞上で活性である。一般に、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βは、インビトロ系で類似の生物活性スペクトルを示すが、ＴＮＦ−βは、しばしばより強度が低いか、または見かけの部分的アゴニスト活性を示す。
【０１９６】  ＴＮＦ−αは、広い生物活性スペクトルを示す。それはインビトロで多くの腫瘍細胞系の細胞溶解および細胞分裂停止を引き起こす。感受性細胞は、ピコモル濃度の因子への曝露後の数時間以内に死滅し、これは少なくとも一部には、ＴＮＦ細胞障害性および遺伝子制御シグナル経路の共通のメディエータとして働くミトコンドリア由来二次メッセンジャー分子が関与する。因子は、移植腫瘍の出血性壊死を誘導する。注入後数時間以内に、ＴＮＦ−αは、悪性腫瘍内の小血管の破壊をもたらす。因子はまた、好中球性顆粒球の貪食作用および細胞障害性を増強し、また、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ＩＬ１およびＩＬ６を含む多くの他のタンパク質の発現も調節する。
【０１９７】  ２６ｋＤａ形のＴＮＦが、活性化単球およびＴ細胞で優先的に見出される。それは生物学的にも活性であり、直接的な細胞間接触により細胞破壊を媒介する。
【０１９８】  好中球のｆＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）の化学走性特性は、ＴＮＦ−αにより増強される。ＴＮＦ−αは、ＩＰ−１０、ＪＥ、ＫＣを含む多くの化学誘引物質サイトカインの合成を、細胞型および組織特異的様式で誘導する。
【０１９９】  ＴＮＦ−αは、正常なヒト二倍体線維芽細胞の増殖因子である。それは、線維芽細胞におけるコラゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ２の合成を促進する。それはまた、インビボでヒト慢性リンパ球性白血病細胞の自己分泌増殖修飾因子として機能し得、神経芽細胞腫細胞の自己分泌増殖修飾因子であると記載されている。自己分泌増殖促進活性はＩＬ４により阻害される。
【０２００】  休止マクロファージにおいて、ＴＮＦは、ＩＬ１およびプロスタグランジンＥ２の合成を誘導する。それはまた、マクロファージの貪食作用およびスーパーオキシドジスムターゼの合成を刺激する。ＴＮＦは破骨細胞を活性化し、従って骨再吸収を誘導する。
【０２０１】  白血球およびリンパ球前駆体では、ＴＮＦは、クラスＩおよびＩＩ  ＨＬＡおよび分化抗原の発現、およびＩＬ１、コロニー刺激因子、ＩＦＮ−γの産生、およびアラキドン酸代謝を刺激する。それはまた、内皮細胞および滑膜細胞のコラゲナーゼの生合成を刺激する。
【０２０２】  ＩＬ６は菌体内毒素およびＴＮＦにより誘導されたＩＬ１の合成、および内毒素により誘導されたＴＮＦの合成を抑制する。
【０２０３】  神経伝達物質ＳＰ（サブスタンスＰ）は、マクロファージのＴＮＦおよびＩＬ１の合成を誘導する。ＩＬ１は、ＩＬ６と同様に、下垂体のＡＣＴＨ（副腎皮質ホルモン）の合成を刺激する。ＡＣＴＨに応答して合成されたグルココルチコイドは次に、ＩＬ６、ＩＬ１およびＴＮＦの合成をインビボで阻害し、従って、免疫系と神経内分泌機能の間のネガティブフィードバックループを確立する。
【０２０４】  ＴＮＦ−αは、ＩＬ２の非存在下で、様々な刺激により誘導されたＴ細胞の増殖を増強する。Ｔ細胞のいくつかの亜個体群のみが、ＴＮＦ−αの存在下でＩＬ２に応答する。ＩＬ２の存在下で、ＴＮＦ−αは、Ｂ細胞の増殖および分化を促進する。
【０２０５】  皮膚ランゲルハンス細胞の機能的能力もまたＴＮＦ−αにより影響を受ける。これらの細胞は、接触感作などの一次免疫応答を開始できない。それらは、ＧＭ−ＣＳＦおよびまたＩＬ１により免疫刺激樹状細胞に変換される。それ故、これらの細胞は、免疫学的に未熟なリンパ系樹状細胞のレザバーである。成熟ランゲルハンス細胞の抗原処理能の増強は、ＴＮＦ−αにより有意に減少する。
【０２０６】  ＴＮＦ−αはまた、正常な免疫応答に必要であるが、過剰発現は、重度の病理学的結果を有する。ＴＮＦ−αは、腫瘍患者に観察される主な悪液質のメディエータである（従って、その名称はカヘクチンである）。ＴＮＦはまた、グラム陰性敗血症のいくつかの重度な作用の原因である。
【０２０７】  ＴＮＦ−αは、それに応答する細胞系を含むバイオアッセイで検出できる（例えば、ＢＴ−２０、ＣＴ６、ＥＬ４；ＰＫ１５；Ｌ９２９；Ｌ−Ｍ；ＭＯ７Ｅ；Ｔ１１６５；ＷＥＨＩ−３Ｂ）。ＴＮＦ−αはまた、高感度サンドイッチ酵素イムノアッセイ、エリザ、免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）、およびＲＥＬＡＹ（受容体媒介標識移行アッセイ）と呼称されるアッセイにより検出できる。細胞内因子は、２色免疫蛍光フローサイトメトリーにより検出する。Ｈｉｇｕｃｈｉ等は、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βでの処置後にアポトーシスを受けている細胞からのトリチウム化チミジンの放出に基づくアッセイを記載した。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ４、ＬＩＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、このアッセイを妨害しないことが示された。
【０２０８】  化学療法薬とは対照的に、ＴＮＦは、特異的に悪性細胞を攻撃する。徹底的な前臨床試験により、皮下ヒト異種移植片およびヌードマウスでのリンパ節転移に対するＴＮＦ−αの直接的な細胞静止および細胞毒性効果、並びに、好中球、マクロファージ、およびＴ細胞を含む様々な免疫効果細胞に対する様々な免疫調節効果が実証された。１回および複数回の投与量の第Ｉ相試験により、ＴＮＦは、ショックおよび悪液質などの重度の毒性を併発することなく、抗癌効果に関連した投与量範囲で、進行した悪性腫瘍をもつ患者に安全に投与できることが確認された。しかし、全体的に臨床試験は、残念ながらこれまで癌処置の有意な改善を実証できておらず、ＴＮＦ誘導全身毒性が、大半の場合において、抗新生物剤としてのＴＮＦ使用における主な制限である。ＴＮＦと細胞障害性または免疫調節剤、特にＩＦＮ−γおよびおそらくＩＬ２の組合せ使用は、いくつかの腫瘍の処置に利点があり得る。いくつかの場合、ＴＮＦの腫瘍内適用が、腫瘍制御に利点があることが判明した。
【０２０９】  ｐ５５受容体に選択活性を有するいくつかの変異形のＴＮＦ−βが近年記載された。ｐ５５受容体の活性化は、形質転換細胞に対して細胞障害性活性を引き起こすに十分であることが示された。移植ヒト腫瘍を有するヌードマウスにその抗腫瘍活性を保持する、いくつかのこれらの変異体が記載された。
【０２１０】  ＴＮＦはまた、リンホカイン活性化キラー細胞の攻撃性を増加させるために使用できる。
【０２１１】  実験線維肉腫転移モデルを用いた研究により、ＴＮＦは、肺の転移数の有意な増加を誘導することが示された。サイトカイン療法中の低用量の内因性ＴＮＦまたはＴＮＦの投与は、循環腫瘍細胞の転移能を増強し得ることが示唆された。機能的ＴＮＦ−α遺伝子を用いたネズミ腫瘍細胞の形質導入により、同系宿主による、遺伝学的に修飾された細胞の拒絶がもたらされることが示された。
【０２１２】  インターフェロンは、標的細胞にウイルス非特異的抗ウイルス状態を誘導するサイトカインのファミリーである。インターフェロンのその受容体への結合は、新規タンパク質合成を誘導し、次いで、開始因子ｅＩＦ−２が不活性化される。不活性化は、インターフェロンにより誘導された抗ウイルス状態に寄与すると考えられる。インターフェロンはまた、ウイルスｍＲＮＡを分解する細胞内エンドヌクレアーゼを活性化する経路を誘導する。多くのインターフェロンがまた、マクロファージおよびリンパ球の活性化などの、免疫調節活性も有する。インターフェロンの例は、ＩＦＮ−α（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｋ０１９００、Ｊ００２０９、Ｍ１２３５０、Ｊ００２１３、Ｊ００２１６、Ｊ００２１４、Ｍ１１００３、Ｍ１１０２６、Ｍ３４９１３、Ｍ５４８８６、Ｘ０１９７４、Ｌ３８６９８、Ｍ１３７１０、Ｋ０１２３８、Ｍ１３６６０、Ｍ６８９４４、Ｘ０１９７２、Ｘ０１９７１、Ｘ０１９７３、Ｘ０１９６９によりコードされるポリペプチド）、ＩＦＮ−β（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ２８６２２、Ｘ１４０２９、Ｘ１４４５５、Ｋ０００２０、Ｊ００２１８、Ｅ００１７１、Ｘ０４４３０、Ａ０９３６３、Ｍ２７３２７、Ｍ１６６５６、Ｍ２５４６０、Ｋ０３１９６によりコードされるポリペプチド）、ＩＦＮ−γ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ａ３４５３２、Ｘ８７３０８、Ｅ００７５６、Ｋ０００８３によりコードされるポリペプチド）、ＩＦＮ−ω（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５８８２２、Ａ１２１４０によりコードされるポリペプチド）、ウシ栄養芽層タンパク質−１（ＩＦＮ−τ）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ３１５５６、Ｍ３１５５７、Ｍ３１５５８によりコードされるポリペプチド）、および種間のその相同体を含む。ヒトＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−γ受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｊ０３１４３、Ｍ２８２３３によりコードされるポリペプチド）とは異なる、共通の受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ６０４５９、Ｍ８９６４１によりコードされるポリペプチド）に結合すると考えられる。
【０２１３】  少なくとも２３個の異なるＩＦＮ−αの変種が知られている。個々のタンパク質が、１９−２６ｋＤａの分子量を有し、１５６から１６６および１７２アミノ酸長のタンパク質からなる。全てのＩＦＮ−αサブタイプが、アミノ酸１１５から１５１位の間に共通保存配列領域を有するが、アミノ末端は可変である。多くのＩＦＮ−αサブタイプが、僅か１または２つの位置でその配列が異なる。天然に存在する変種はまた、カルボキシ末端の１０アミノ酸が短縮されたタンパク質を含む。ジスルフィド結合が、１／９８および２９／１３８位のシステイン間に形成される。ジスルフィド結合２９／１３８は、生物活性に必須であるが、１／９８結合は、生物活性に影響を及ぼすことなく減少できる。
【０２１４】  ヒトＩＦＮ−βは、２０ｋＤａの糖タンパク質（約２０％の糖部分）であり、１６６アミノ酸長を有する。グリコシル化は、インビトロでの生物活性に必要でない。該タンパク質は、生物活性に必要なジスルフィド結合Ｃｙｓ３１／１４１を含む。ＤＮＡレベルで、ＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−β−２と３４％、他のＩＦＮ−αサブタイプと約３０％の配列相同性を示す。ＩＦＮ−γとは対照的に、ＩＦＮ−βはｐＨ２で安定である。
【０２１５】  ヒトＩＦＮ−γは、１４６アミノ酸のサブユニットをもつ二量体タンパク質である。該タンパク質は、２つの部位でグリコシル化されている。ｐＩは８．３から８．５である。ＩＦＮ−γは、２３アミノ酸の分泌シグナル配列を含む１６６アミノ酸の前駆タンパク質として合成される。２０および２５ｋＤａの生物学的に活性な２つの分子形のタンパク質が記載されている。その両方共、２５位でグリコシル化されている。２５ｋＤａ形は、９７位でもグリコシル化されている。分子量および荷電に関して、天然ＩＦＮ−γの観察された差異は、可変的グリコシル化パターンに起因する。非変性条件下で観察された４０−６０ｋＤａ形はＩＦＮ−γの二量体および三量体である。
【０２１６】  サイトカインのＣＳＦファミリーのメンバーは、軟寒天またはメチルセルロース上に固定した骨髄細胞の増殖および分化を可能とする。造血前駆細胞は、ほんの短時間、該因子の非存在下で維持できるが、その存在により、特定の因子に応じて、赤血球系細胞、好中球、好酸球、マクロファージおよび／または巨核球を含むコロニーの発達が可能となる。これらの細胞型の増殖および発達を支持しているコロニー形成を刺激している様々な活性の生化学的分析により、この種の多くの異なるおよび別個の因子が存在することが判明した。
【０２１７】  これらの因子の多くは、ＮまたはＯ−グリコシル化されている。グリコシル化は、溶解性、安定性、およびタンパク質分解酵素に対する抵抗性を増強することが示された。それは、これらの因子の完全な生物活性スペクトルには必要ではないようである。多くのヒトコロニー刺激因子をコードしている遺伝子がクローン化され、位置決定された。いくつかの遺伝子は近位にあるが、いくつかの保存領域の例外を除き互いに大きな相同性は示さない。
【０２１８】  コロニー刺激因子は、例えば、Ｂリンパ球、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、間質細胞系、Ｔリンパ球を含む、多くの異なる細胞型により産生される。それらは、約２５から３２アミノ酸の古典的疎水性分泌シグナル配列を含む前駆分子として合成される。分泌因子は、非常に低濃度（１から１００ｐＭ）で活性である極めて高い特異的生物活性を有する。これらの因子は、造血前駆細胞の増殖に絶対に必要である。単なる生存の維持に必要な濃度は、通常、細胞増殖の誘導または細胞の特異的機能活性の顕現に必要な次元よりも低い。
【０２１９】  個々の因子の名称は通常、これらの因子に応答する細胞型を示す。古典的コロニー刺激因子は、Ｍ−ＣＳＦ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｅ０３２３５、Ｍ６４５９２、Ｕ２２３８６、Ｘ０５０１０によりコードされるポリペプチド）（マクロファージ特異的）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球特異的）、ＧＭ−ＣＳＦ（マクロファージ／顆粒球特異的）、ＩＬ３（多機能性）およびＭＥＧ−ＣＳＦ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｄ８６３７０、Ｕ７０１３６によりコードされるポリペプチド）（巨核球特異的）を含む。Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦは系統特異的であるが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ３は、造血前駆細胞の分化の初期の段階に作用する多機能性造血増殖因子である。
【０２２０】  ヒトＧＭ−ＣＳＦは、２つのグリコシル化部位を有する１２７アミノ酸の単量体タンパク質である。該タンパク質は、１４４アミノ酸の前駆体として合成され、これは、アミノ末端に疎水性分泌シグナル配列を含む。糖部分は、完全な生物活性スペクトルには必要でない。非グリコシル化およびグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦは、インビトロで同じ活性を示す。完全にグリコシル化されたＧＭ−ＣＳＦは、非グリコシル化タンパク質よりもインビボでより生物学的に活性である。文献に記載の異なる分子量形のＧＭ−ＣＳＦ（１４ｋＤａ、３５ｋＤａ）は、様々なグリコシル化度の結果である。ＧＭ−ＣＳＦは、４個のシステイン残基（５４／９６および８８／１２１位）を含む。
【０２２１】  ＧＭ−ＣＳＦのタンパク質配列と、他のコロニー刺激因子の配列の比較により、それらは互いに強く相同性ではないことが判明する。ヒトおよびネズミＧＭ−ＣＳＦは、タンパク質レベルで６０％およびヌクレオチドレベルで７０％の相同性を示す。しかし、２つの因子は免疫学的に交差反応しない。ＧＭ−ＣＳＦは、ヘパリンスルフェートプロテオグリカンとの複合体として細胞の細胞外マトリックスと会合できる。これにより、生物学的に不活性な形での因子の貯蔵を可能とする。因子がこれらの貯蔵所から最終的に放出される正確な機序は不明である。
【０２２２】  ヒト遺伝子は約２．５ｋｂ長を有し、４個のエキソンを含む。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子とＩＬ３遺伝子の間の距離は、約９ｋｂである。ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、造血増殖因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５）をコードしている他の遺伝子およびＭ−ＣＳＦ受容体をコードしている遺伝子の近位の第５ｑ２２−３１番染色体に位置する。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の５’領域は、ＣＬＥ（保存リンホカインエレメント）として知られる数個の配列エレメントを含む。それらは、転写因子の結合部位として機能し、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現を調節する。
【０２２３】  ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、骨髄細胞の細胞表面上に数１００から数１０００コピー／細胞の密度で発現される。該受容体は、内皮細胞および小細胞肺癌細胞などの非造血細胞上にも発現される。受容体陽性細胞系統において、受容体密度は、成熟度の増加に伴い減少する。
【０２２４】  該受容体は、ＩＬ２−β、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、Ｅｐｏ、およびプロラクチン受容体を含む、造血増殖因子の他の受容体と有意な相同性を示す。１つのクローン化されたＧＭ−ＣＳＦ受容体サブユニット（ＧＭ−Ｒα、４５ｋＤａ）は、低い親和性でＧＭ−ＣＳＦに結合する（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＳＥＧ＿ＨＵＭＧＲＡＳによりコードされるポリペプチド）。第二サブユニット（ＧＭ−Ｒβ、１２０ｋＤａ）は、ＧＭ−ＣＳＦに結合しない。ＧＭ−Ｒαは、５４アミノ酸の短い細胞質ドメインのみを含む４００アミノ酸のタンパク質である。高親和性ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、２つの受容体サブユニットの凝集により形成される。受容体のＧＭ−Ｒβサブユニット（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＳＥＧ＿ＭＵＳＡＩＣ２Ｂ、Ｍ５９９４１によりコードされるポリペプチド）もまた、他のサイトカイン受容体系の構成成分である。それは、ＩＬ３およびＩＬ５の高親和性受容体の一成分であり、その両方共、サイトカイン特異的サブユニット（ＡＩＣ２Ａ）も含む。
【０２２５】  ヒトＧＭ−ＣＳＦは、ネズミ細胞に対して活性でなく、その逆もそうである。ＧＭ−ＣＳＦは、軟寒天培養液中でマクロファージ／顆粒球含有コロニーの増殖を刺激する因子として初めて単離された（コロニー形成アッセイ）。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球およびマクロファージ前駆細胞の増殖および発達には不可欠である。それは、骨髄芽球および単芽球を刺激し、これらの細胞の不可逆的分化を引き起こす。ＧＭ−ＣＳＦは、赤血球系および巨核球系前駆細胞の増殖においてＥｐｏと相乗作用する。別のコロニー刺激因子のＭ−ＣＳＦと組合せて、相乗的抑制現象、すなわちこれらの２つの因子の組合せにより、マクロファージ含有細胞コロニーの産生の部分的抑制がもたらされることが観察される。
【０２２６】  急性骨髄性白血病患者由来のいくつかの型の芽細胞において、ＧＭ−ＣＳＦは、増殖の自己分泌メディエータとして作用する。ＧＭ−ＣＳＦは、強力な好中球の化学誘発物質である。それは、殺菌活性、酸化的代謝、並びに好中球およびマクロファージの貪食活性を増強する。これらの細胞の細胞障害性も高める。
【０２２７】  ＧＭ−ＣＳＦは、例えばＧ−ＣＳＦよりも顕著ではない特異性を示す。それは、好中球、好酸球および単球系統の増殖および分化を刺激する。それはまた、対応する成熟形を機能的に活性化し、例えば、ある細胞表面接着タンパク質（ＣＤ−１１Ａ、ＣＤ−１１Ｃ）の発現を増強する。これらのタンパク質の過剰発現は、炎症部位に顆粒球の局所的蓄積が観察される１つの説明となり得る。さらに、ＧＭ−ＣＳＦはまた、好中球活性の刺激物質である、ｆＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）の受容体の発現を増強する。
【０２２８】  ピコからナノモル濃度のＧＭ−ＣＳＦは、好酸球に化学走性であり、また、他の化学走性因子に応答したこれらの細胞の化学走性挙動にも影響を及ぼす。
【０２２９】  顆粒球では、ＧＭ−ＣＳＦは、アラキドン酸代謝物の放出および反応性酸素種の産生増加を刺激する。Ｎａ＋／Ｈ＋対向輸送系の活性化により、サイトゾルが迅速にアルカリ化される。好中球顆粒球の貪食活性および好酸球の細胞障害性も、ＧＭ−ＣＳＦによりかなり増強される。ＧＭ−ＣＳＦは、炎症応答部位に存在する細胞（Ｔリンパ球、組織マクロファージ、内皮細胞、肥満細胞）により産生されるので、それは炎症反応に重要なメディエータであると推定できる。
【０２３０】  皮膚のランゲルハンス細胞の機能的状態も、ＧＭ−ＣＳＦにより影響を受ける。これらの細胞は、例えば接触感作などの一次免疫応答を開始することができない。それらは、ＧＭ−ＣＳＦ（およびまたＩＬ１）により非常に強力な免疫刺激樹状細胞に変換される。それ故、ランゲルハンス細胞は、免疫学的に未熟なリンパ系樹状細胞のインサイツレザバーを形成する。抗原処理能の増加として見られるこれらの細胞の成熟は、ＴＮＦ−αによりダウンレギュレートできる。
【０２３１】  ナノモル濃度で、ＧＭ−ＣＳＦは、好塩基球上の補体Ｃ３ａ受容体の発現を誘導する。通常Ｃ３ａに応答せず、ＧＭ−ＣＳＦにより活性化された細胞は、Ｃ３ａ刺激に応答して脱顆粒する。これは、ヒスタミンおよびロイコトリエンＣ４の放出を伴う。このプロセスは、炎症応答（Ｔリンパ球、組織マクロファージ、内皮細胞、肥満細胞）に関連した過敏症反応に意義があり得る。ＧＭ−ＣＳＦはまた、栄養芽層インターフェロン（ＴＰ−１）の強力な誘導物質であることが示された。
【０２３２】  ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ１、ＩＬ３およびＧ−ＣＳＦを含む、いくつかの他のサイトカインと相乗作用する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦは、インビトロでの好中球含有コロニーの発達を可能とするために協奏的に作用しなければならない。
【０２３３】  ＩＬ３自体は、ほんの僅か循環血液細胞数を増大させるが；続くＧＭ−ＣＳＦ投与量は、細胞数を有意に増加させ、これはおそらく、ＩＬ３が最初に、ＧＭ−ＣＳＦに応答できる細胞を増殖させるためである。ほとんどのＩＬ３依存性細胞系がＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４の存在下でも増殖でき、数個の相乗効果が、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ４の間に観察されるという観察により、これらの３つの因子は、細胞増殖の制御に類似の機能を実施することが示唆される。シグナル伝達機序は、少なくともいくつかの共通因子を含むという指摘がある。
【０２３４】  発癌遺伝子によりコードされるチロシン特異的プロテインキナーゼを用いた実験により、因子依存性細胞でのこのキナーゼ活性の発現は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３およびＩＬ４に対するその依存性を消失させることが示された。これらの因子が細胞の増殖および分化を調節する正確な機序は依然として不明である。
【０２３５】  ＧＭ−ＣＳＦの調節解除発現の結果は、構成的にＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝子を有するトランスジェニックマウスで研究した。ＧＭ−ＣＳＦをコードしているトランスジーンの過剰発現は、網膜の病理学的変化をもたらし、失明を引き起こし、また筋肉の劣化を引き起こす。これらのマウスは、活性化マクロファージの非常に顕著な増加を特徴とする。さらに、ＧＭ−ＣＳＦの過剰発現により、大量のＩＬ１およびＴＮＦを分泌している成熟マクロファージの活性化が起こり、これはこれらのサイトカインは、トランスジェニックマウス疾病のいくつかの態様に関与し得ることを示唆する。
【０２３６】  組織病理学的検査により、単球系統の前駆細胞の個体群の顕著な増加が実証される。ＧＭ−ＣＳＦトランスジェニック動物は、通常、これらの因子の過剰発現から生じる広範囲の組織傷害から数ヶ月以内に死亡する。類似の結果が、適切なレトロウイルスベクターを用いた形質転換によりＧＭ−ＣＳＦを過剰発現するように操作した骨髄を有するマウスで得られた。しかし、これらの知見は、臨床的な意義はないようである。ＧＭ−ＣＳＦでの霊長類およびマウスの長期処置により、生命に危険を及ぼす合併症は起こらないことが示された。
【０２３７】  ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子破壊の生物学的結果を、標的化遺伝子欠失を有するＥＳ細胞から産生したマウスで研究した。標的化ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子破壊にホモ接合性のマウスは、損なわれていない定常状態の造血を特徴とし、これは、ＧＭ−ＣＳＦが、血液、骨髄、および脾臓における主要な型の成熟造血細胞およびその前駆体の正常レベルの維持に必須ではないことを実証する。
【０２３８】  ほとんどのＧＭ−ＣＳＦ欠損マウスは表面的には健康および繁殖性であるが、異常な肺を発達させる。ＧＭ−ＣＳＦ欠損マウスに、特発性ヒト疾患肺胞蛋白症を規定する特徴である、肺胞腔に界面活性物質脂質およびタンパク質の進行的蓄積が生じる。肺気道および血管に関連した広範なリンパ性過形成も認められる。これらの結果は、肺恒常性におけるＧＭ−ＣＳＦの予測されなかった重要な役割を実証する。
【０２３９】  ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３、およびＩＬ５受容体複合体の共通βサブユニット（βＣ）をコードしている遺伝子のヌル変異にホモ接合性のトランスジェニックマウスは、正常な発達を示し、若年成体生存期間を生き延びた。それらは、肺胞蛋白症に似た肺気管支肺胞周囲リンパ浸潤および領域を発達させる。ホモ接合型欠失変異体の末梢血および骨髄の好酸球数は減少したが、他の血液学的パラメータは正常である。ホモ接合型欠失変異体由来の骨髄細胞は、ＧＭ−ＣＳＦの高親和性結合を示さないが、ヘテロ接合型動物由来の細胞は、中間の高親和性受容体数を示す。ホモ接合型欠失変異体由来の骨髄細胞のクローン培養物は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ５が高濃度であっても、コロニー形成アッセイのコロニー形成を刺激しない。変異体と野生型同腹仔の間の全身クリアランスおよびＧＭ−ＣＳＦ分布の差異は観察されない。
【０２４０】  Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａ等は、β−ｃ変異体マウスを、ＩＬ３の欠失したマウスと交差させた。全てのＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ５機能を欠失した二重変異マウスは見かけ上正常な生殖性である。動物は、β−ｃ変異体マウスと同数の好酸球の減少および寄生虫に対する好酸球応答の欠失を示す。リステリア単球遺伝子に対する二重変異体マウスの免疫応答は正常である。フルオロウラシル処置後の造血回復も正常である。これらの知見は、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ５の存在に依存しない別の血球産生機序の存在を示唆する。
【０２４１】  ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ、好中球、好酸球、および巨核球を含むコロニーの発達によりコロニー形成アッセイでアッセイできる。ＧＭ−ＣＳＦは、ＧＭ−ＣＳＦの存在にその増殖を依存するか、またはこの因子に応答する細胞系（例えば、ＡＭＬ−１９３；Ｂ６ＳＵｔ−Ａ；ＢＡＣ１．２Ｆ５；ＢＣＬ１；Ｄａ；ＦＤＣＰ１；ＧＦ−Ｄ８；ＧＭ／ＳＯ：ＩＣ−２；ＭＯ７Ｅ；ＮＦＳ−６０；ＰＴ−１８；ＴＡＬＬ−１０３；ＴＦ−１；ＵＴ−７）を用いて特異的バイオアッセイでも検出される。
【０２４２】  ＧＭ−ＣＳＦは、血球の異常成熟または白血球の産生減少を特徴とする全疾病における造血の生理学的再構成に使用できる。ＧＭ−ＣＳＦの主要および最も重要な臨床適用は、おそらく、化学療法および／または放射線療法後の生命に危険を及ぼす好中球減少の処置であり、これは、ＧＭ−ＣＳＦ処置下で顕著に減少する。ＧＭ−ＣＳＦは、化学療法誘導血球減少を修正し、感染および出血への血球減少関連素因に対抗するために使用できる。
【０２４３】  ＧＭ−ＣＳＦ投与後の合併症の危険性を回避するために、注意深い臨床監視が、ある患者群、例えば、脊髄形成異常症候群、急性骨髄性白血病、炎症疾患、自己免疫血小板減少症または免疫応答機能不全患者に必要である。
【０２４４】  数個の研究により、ＧＭ−ＣＳＦの使用は、細胞障害性薬物処置に対する許容度を増強させ、細胞障害性薬物処置の副作用により必要とされる用量の減少を防ぐために使用できることが実証された。ＧＭ−ＣＳＦ処置により、頻繁に、１クールあたりの細胞障害性薬物用量の増加が可能となる。これらの研究により、ＧＭ−ＣＳＦ処置下で罹患率も有意に減少することが判明した。
【０２４５】  機能的ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を用いたネズミ腫瘍細胞の形質導入は、同系宿主による、遺伝学的に修飾された細胞の拒絶をもたらすことが示された。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入腫瘍細胞をワクチン接種することにより、その後の野生型同系腫瘍細胞の種菌の増殖を防ぐ。
【０２４６】  サイトカインのケモカインファミリーは、白血球に化学走性を誘導する、比較的小さく、構造的に類似したポリペプチドからなる。ケモカインは、８−１０ｋＤａの分子量を有し、タンパク質レベルで、互いに約２０から５０％の配列相同性を示す。タンパク質はまた、共通の遺伝子構造および三次構造を共有する。全ケモカインが、細胞内ジスルフィド結合形成に関与する多くの保存システイン残基を有する。
【０２４７】  個々の遺伝子の染色体位置に従って、２つの異なるケモカインのサブファミリーを識別する。α−ケモカインのメンバーは、４ｑケモカインファミリーとも呼ばれる。なぜなら、このファミリーのメンバーをコードしている遺伝子は、ヒト第４ｑ１２−２１番染色体に位置しているからである。このファミリーのメンバーの最初の２つのシステイン残基は、１つのアミノ酸により分離され、それ故、これらのタンパク質はＣ−Ｘ−Ｃケモカインとも呼ばれる。このサブファミリーは、９Ｅ３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質Ｐ０８３１７）、ＡＭＣＦ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ９９３６７、Ｍ９９３６８によりコードされるポリペプチド）、β−トロンボグロブリン（例えば、Ｂｅｇｇ  ＧＳ等（１９７８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１７３９−４４に開示）、ＣＩＮＣファミリーメンバー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｄ２１０９５によりコードされるポリペプチド）、ＥＮＡ−７８（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ７８６８６によりコードされるポリペプチド）、エオタキシン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ４６５７２、Ｕ４０６７２によりコードされるポリペプチド）、ＧＣＰ−２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｙ０８７７０、Ｕ８３３０３によりコードされるポリペプチド）、ＩＬ８、ＩＰ−１０（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ０７４１７、Ｘ０２５３０によりコードされるポリペプチド）、ＫＣ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｊ０４５９６によりコードされるポリペプチド）、ＬＩＸ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ２７２６７によりコードされるポリペプチド）、ｍｉｇ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ３４８１５、Ｚ２４７２５によりコードされるポリペプチド）、ＭＧＳＡ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ１２５１０によりコードされるポリペプチド）、ｍｏｂ−１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ１７０３５によりコードされるポリペプチド）、ＮＡＰ−２（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ  Ｉ等（１９９１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３１２８−３５、Ｃｏｈｅｎ  ＡＢ等（１９９２）  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２６３：Ｌ２４９−５６に記載）、ＮＡＰ−３（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＪＭ等（１９９１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７１：１０９１−１００に記載）、ＮＡＰ−４（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  ＪＭ等（１９９０）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  １７２：８９８−９０４に記載）、ＰＢＳＦ（ＳＤＦ）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｄ２１０７２、Ｕ１６７５２、Ｄ５０６４５によりコードされるポリペプチド）、およびＰＦ４（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ２５８９７によりコードされるポリペプチド）を含む。
【０２４８】  ＩＬ８、ＭＧＳＡ、マウスＫＣ、ＭＩＰ−２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ６５６４７によりコードされるポリペプチド、およびＢｌｕｍ  Ｓら、幹細胞増殖の阻害剤をコードしているネズミ遺伝子の３つのヒト相同体、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：５８９−６０２（１９９０）；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ＪＭら、酵母で発現されたＭＩＰ−１αの生物学的および構造的特性、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ４：７６−８２（１９９２）；Ｄｅｖａｔｅｌｉｓ  Ｇら、炎症およびケモキネシス特性をもつ新規モノカインである、ネズミマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）のｃＤＮＡのクローニングおよび特徴付け、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６７：１９３９−４４（１９８８）（ｅｒｒａｔｕｍ、ＪＥＭ  １７０：２１８９（１９８９））；Ｆａｒｂｅｒ  ＪＭ、γ−インタフェロンにより選択的に誘導されるマクロファージｍＲＮＡは、サイトカインの血小板因子４ファミリーのメンバーをコードする、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）８７：５２３８−４２（１９９０）；Ｈａｓｋｉｌｌ  Ｓら、サイトカイン機能をコードしている３つの関連したヒトＧＲＯ遺伝子の同定、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）８７：７７３２−６（１９９０）；Ｐｏｌｔｏｒａｋ  ＡＮ等（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ４５（３）：２０７−１９；Ｒｏｓｓｉ  ＤＬ等（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５８（３）：１０３３−１０３６；Ｓｈｅｒｒｙ  Ｂ等（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６８：２２５１−９；Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ  Ｐ等（１９９０）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７２：９１１−９；Ｗｏｌｐｅ  ＳＤ等（１９８９）  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｄａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）  ８６：６１２−１６；Ｗｏｌｐｅ  ＳＤ等（１９８９）  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３：２５６５−７３に記載）、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、およびＧＣＰ−２は、アミノ末端近くの最初のシステイン残基直前の保存ＥＬＲ配列モチーフ（グルタミン酸−ロイシン−アルギニン）により規定されるヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカインの亜群を含む。ＥＬＲ配列モチーフを含むケモカインが、初期に好中球を化学誘引および活性化することが判明した。ＥＬＲ配列モチーフを含まないケモカインは、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、好塩基球、好酸球を化学誘引および活性化するようである。
【０２４９】  β−ケモカインまたは１７ｑケモカインファミリーのメンバーは、ヒト第１７ｑ１１−３２番染色体（ネズミ第１１番染色体）に位置する。最初の２つのシステイン残基は隣接しており、それ故、これらのタンパク質はＣ−Ｃケモカインとも呼ばれる。このサブファミリーは、ＡＣＴ−２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｊ０４１３０によりコードされるポリペプチド）、Ｃ１０（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ等（１９９３）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２：８３９−４７；Ｂｅｒｇｅｒ  ＭＳ等（１９９６）８：４３９−４４７に記載）、ＣＣＦ１８（例えば、Ｈａｒａ  Ｔ等（１９９５）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：５３５２−８に記載）、ＤＣ−ＣＫ１（例えば、Ａｄｅｍａ  ＧＪ等（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：７１３−７１７に記載）、ＥＬＣ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＢ０００８８７、ＡＦ０５９２０８によりコードされるポリペプチド）、エオタキシン−２（例えば、Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ  Ｕ等（１９９７）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １８５：２１７１−２１７６に記載）、エキソダス（Ｅｘｏｄｕｓ）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ６４１９７，Ｕ８８３２０、Ｕ８８３２１、Ｕ８８３２２によりコードされるポリペプチド）、ＦＩＣ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ０４６９４によりコードされるポリペプチド）、ＧＤＣＦおよびＧＤＣＦ−２（例えば、Ｋｕｒａｔｓｕ  Ｊ等（１９８９）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ８１：３４７−５１；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ等（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６９：１４４９−５９；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ等（１９８９）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４２：１９５６−６２に記載）、ＨＣ−２１（例えば、Ｃｈａｎｇ  ＨＣ＆Ｒｅｉｎｈｅｒｚ  ＥＬ（１９８９）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９：１０４５−１０５１に記載）、ＨＣＣ−１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｚ４９２７０によりコードされるポリペプチド）、Ｉ−３０９（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ５７５０２によりコードされるポリペプチド）、ＪＥ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ０５８７８６、Ｍ２８２２６によりコードされるポリペプチド）、ＬＡＧ−１（リンパ球活性化遺伝子−１）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ５３６８３によりコードされるポリペプチド）、ＬＡＲＣ  Ｄ８６９９５）、ＬＤ７８  Ｅ０３１３０、Ｅ０３１３１、ＭＡＲＣ（例えば、Ｔｈｉｒｉｏｎ  Ｓ等（１９９４）Ｂｌｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２０１：４９３−４９９に記載）、ＭＣＡＦ  Ｍ２４５４５およびＡｐｅｌｌａ  Ｅ等（１９９０）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３４９：４０５−１７）、ＭＣＰ−１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ１４７６８によりコードされるポリペプチド）、ＭＣＰ−２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｙ１６６４５によりコードされるポリペプチド）、ＭＣＰ−３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ７２３０８、Ｓ７１２５１によりコードされるポリペプチド）、ＭＣＰ−４（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ９８３０６によりコードされるポリペプチド）、ＭＣＰ−５（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ５０７１２によりコードされるポリペプチド）、ＭＩＰ（マクロファージ炎症タンパク質）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ７７１８０、Ｕ７７０３５、Ｕ４９５１３、Ｍ３５５９０によりコードされるポリペプチド）、ＭＲＰ−２（例えば、Ｙｏｕｎ  ＢＳ等（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５５：２６６１−７に記載）、ＲＡＮＴＥＳ  ＳＤＦ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ２１１２１、Ｍ７７７４７によりコードされるポリペプチド）、ＴＡＲＣ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｑ９２５８３）を含む。
【０２５０】  さらに、ケモカインに関連しているが、２つのケモカイン群の１つに依然として割り当てられていないか、または２つのケモカイン群（例えば、ＡＴＡＣ（例えばＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ８６４７４によりコードされるポリペプチド）、Ｌｔｎ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ１５６０７、Ｕ２３７７２によりコードされるポリペプチド）、ＳＣＭ−１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｄ６３７８９、Ｄ６３７９０、Ｄ４３７６９によりコードされるポリペプチド）のいずれかの古典的特徴を有さない数個の他の因子が存在する。これらは、Ｃ型ケモカインまたはγ−ケモカインと呼ばれる。
【０２５１】  ニューロタクチン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＦ０１０５８６によりコードされるポリペプチド）を含むさらに別のケモカイン群が同定され、これはＣＸ（３）Ｃシステインサインモチーフを特徴とする。構造的および機能的特性を基礎にしたケモカインの明確に定義された亜群の存在は、生体中の白血球の移動の調節における化学誘引物質の多様性の重要性を示す。
【０２５２】  ケモカインの生物活性は、特異的受容体によりおよびまた数個のこれらのタンパク質に結合する重複したリガンド特異性をもつ受容体より媒介され、常にＣ−ＣケモカインまたはＣ−Ｘ−Ｃケモカイン群のいずれかに属する。ケモカイン受容体は、膜を横断する７個の疎水性αヘリックスセグメントを含む、Ｇタンパク質共役７トランスメンブランドメイン受容体の大きな群に属する。これらの受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を介してシグナルを媒介するＧタンパク質共役受容体のサブファミリー内の構造関連群を形成する。
【０２５３】  Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインに結合する受容体は、ＣＸＣＲの後に数字を付して称されるが（例えば、ＣＸＣＲ−１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ１９５９１によりコードされるポリペプチド）、ＣＸＣＲ−２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ９４５８２によりコードされるポリペプチド）、ＣＸＣＲ−３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ９５８７６によりコードされるポリペプチド）、ＣＸＣＲ−４（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｄ８７７４７、ＡＦ０２５３７５によりコードされるポリペプチド））、Ｃ−Ｃケモカインに結合している受容体は、ＣＣＲの後に数字を付して称される（例えば、ＣＣＲ−１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ０９２３０、Ｕ２９６７８によりコードされるポリペプチド）、ＣＣＲ−２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ２９６７７、Ｕ９５６２６によりコードされるポリペプチド）、ＣＣＲ−３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ５１２４１によりコードされるポリペプチド）、ＣＣＲ−４（例えば、Ｘ９０８６２、Ｘ８５７４０によりコードされるポリペプチド）、ＣＣＲ−５（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ５４９９４、Ｕ８３３２７によりコードされるポリペプチド）、ＣＣＲ−６（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ９５６２６によりコードされるポリペプチド）、ＣＣＲ−７（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ３１５８１によりコードされるポリペプチド）、ＣＣＲ−８（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｚ９８２０６、Ｕ４５９８３によりコードされるポリペプチド）。ウイルスケモカイン受容体相同体は、ＥＣＲＦ−３、ＥＢＩ−１（ＥＢＶ誘導遺伝子−１）、およびＵＳ２８を含む。
【０２５４】  複数のケモカインと他のメディエータの組合せ効果が、炎症部位での細胞組成物に関与すると現在想定されている。さらに、多くのケモカインが直接細胞を活性化する。あるケモカインは、顆粒球および／または単球を活性化し、呼吸性バースト、脱顆粒、およびリソソーム酵素の放出を引き起こす。他のケモカインは、免疫細胞を感作して、最適以下の量の他の炎症メディエータに応答させる。さらに別のものは、好塩基球の強力なヒスタミン放出因子であることが示された。その乱交雑なケモカイン受容体を介して赤血球は、ケモカインネットワークの調節に重要な役割を果たすことが提唱された。赤血球受容体に結合したケモカインは、その正常標的細胞に接近できないことが知られている。これは、余分のケモカインのシンクを提供するようであり、炎症部位で起こる局所的プロセスを破壊することなく、これらのメディエータの全身効果を制限するのに役立ち得る。
【０２５５】  あるＣ−Ｃケモカインは、単なる化学走性以外の生物活性を示す。いくつかのケモカインが、ＩＬ２により活性化される細胞に類似した、ＣＨＡＫ（Ｃ−Ｃケモカイン活性化キラー）として知られる、キラー細胞の増殖および活性化を誘導できることが示された。
【０２５６】  本発明の別の特に有用なサイトカインは、ｆｌｔ−３リガンド（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ０４８０６、Ｕ０４８０７、Ｕ０３８５８、Ｌ２３６３６、Ｕ２９８７４、Ｕ２９８７５、Ｕ４４０２４によりコードされるポリペプチド）である。このサイトカインは、ｆｌｔ−３チロシンキナーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｚ２６６５２、Ｘ５９３９８によりコードされるポリペプチド）に結合する。ヒトｆｌｔ−３リガンドはまた、ネズミｆｌｔ−３受容体を発現している細胞の増殖も刺激する。
【０２５７】  ｆｌｔ−３リガンドの効果は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＰＩＸＹ−３２１、およびＳＣＦの共発現により相乗される。ＳＣＦとＩＬ３の組合せで、ｆｌｔ−３リガンドは、マーカースペクトルＣＤ３４（＋）ＣＤ３８（−）をもつ細胞の増殖を引き起こすことができる。ｆｌｔ−３リガンドのみが、血液形成細胞、例えばＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ、および非常に原始的な高増殖能コロニー形成細胞の系統の前駆細胞型の生存を支持する。ｆｌｔ−３リガンドのみが、赤血球および巨核球前駆細胞に対して辺縁効果を有する。
【０２５８】  マウスでは、ｆｌｔ−３リガンドは、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１１、ＩＬ１２およびＳＣＦと相乗して、様々な型の前駆体／前駆細胞の増殖を強力に増強する。ｆｌｔ−３リガンドは、ＬＴＣ−ＩＣ（長期培養開始細胞）の増殖を支持する。ｆｌｔ−３リガンドの造血前駆細胞生存促進能は、ＴＧＦ−βにより抑止され、ＴＮＦ−αにより対抗される。
【０２５９】  機能的ｆｌｔ−３受容体の発現およびＡＭＬ（急性骨髄性白血病）およびＡＬＬ（急性リンパ性白血病）におけるリガンドに対する応答の研究により、かなりの不均一性が示される。特にＢＣＰ−ＡＬＬは、ｆｌｔ−３リガンドの存在下、表面ｆｌｔ−３受容体の強力な発現にも関わらず増殖できない。
【０２６０】  再生不良性貧血患者並びに化学療法誘導一過性造血抑制癌患者において、ｆｌｔ−３リガンドの血清中レベルは、骨髄不全度に反比例して変動する。ｆｌｔ−３リガンドの血清中レベルは、再生不良性貧血患者由来の骨髄前駆体のインビトロでのコロニー形成能と逆相関する。同系線維肉腫細胞で攻撃したマウスのｆｌｔ−３リガンド処置は、完全な腫瘍減退および腫瘍増殖速度の減少をもたらすことが示された。
【０２６１】  抗腫瘍サイトカインは、特に、本発明の方法および組成物に有用である。本発明によると、「抗腫瘍サイトカイン」は、細胞と混合するか、または動物に投与した場合に、腫瘍細胞の増殖または転移をインビトロまたはインビボで制限できるか、または腫瘍を有する動物の生存を延長できるサイトカインである。サイトカインは、ＰＢＳなどの生物学的に適合性の緩衝液中に溶液として製剤化でき、腫瘍細胞とインビトロで混合できる。サイトカインの濃度は、約ピコモル範囲から約マイクロモル範囲までであり得る。抗腫瘍サイトカインは、例えば、細胞の増殖速度を、例えば、緩衝液のみに比べて少なくとも１０％減少させるか、または細胞の転移特性を阻害し、これは、例えば、細胞接着性の増加または人工規定膜などの細胞外マトリックス基質への侵入能の減少により証明され得る。別に、抗腫瘍サイトカインは、腫瘍の増殖または転移をインビボで阻害し得るか、または腫瘍を有する動物の生存を延長し得る。サイトカインのインビボ抗腫瘍効果を評価するために、サイトカインは、医薬的に許容される担体に製剤化し得、静脈内、腫瘍内、または腹腔内注入などにより投与し得る。サイトカインはまた、サイトカインを発現するか、またはサイトカインで覆膜された腫瘍細胞などの細胞と共に投与し得る。
【０２６２】生物活性のアッセイ
本発明によると、サイトカインは、「生物活性」、「高度に生物活性」、「極度に生物活性」、「天然の生物活性」、または「超生物活性」であることが好ましい。異なるレベルの生物活性は、白血球に（サイトカインの白血球受容体への単なる占有以上の）変化を誘導する能力に関する。本発明によると、全ての天然に存在するサイトカインは、天然の生物活性である。多くの型のアッセイが、天然に存在しないサイトカインの生物活性を実証できる。例えば、サイトカインは、特定の細胞型の生存および／または増殖を誘導することが示され得る。別の例として、サイトカインは、ｃＡＭＰ、アラキドン酸、カルシウムイオン、またはイノシトール三リン酸などの、細胞内二次メッセンジャーの濃度を変化させ得る。以下は、生物活性のアッセイの例である：
アッセイ１
１つ以上の６０ウェルＬｕｘマイクロタイタートレーの各ウェルに、最終濃度１０％新生仔ウシ血清の１０μｌダルベッコ修飾イーグル培地中の２００ＦＤＣ−Ｐ１細胞を添加する。最大でマイクロモル範囲の濃度のサイトカインを、容量５μｌで各ウェルに加える。トレーを、４８時間、３７℃で、１０％ＣＯ２中インキュベートする。生存細胞数計測を実施する。生存細胞平均数／ウェルを計測する。このアッセイは、例えば、ネズミＧＭ−ＣＳＦ受容体を介して媒介される生物活性の同定に有用である。
【０２６３】アッセイ２
サイトカインサンプルおよび天然に存在するサイトカインに同一の組換え標準物質を、９６ウェル平底マイクロタイタープレートの完全ＲＰＭＩ−１０中で各々連続希釈する。各希釈液を三重に蒔く。活発なｌｏｇ増殖期のＣＴ．４Ｓ細胞を集め、少なくとも２回、完全ＲＰＭＩ−１０中で洗浄し、完全ＲＰＭＩ−１０に１×１０５細胞／ｍｌで再度懸濁する。５０μｌの細胞懸濁液を、プレートの各ウェルに加え、次いで、２４時間、３７℃で、５％ＣＯ２中インキュベートする。トリチウム化チミジンを各ウェルに加え、プレートをさらに２４時間インキュベートする。次いで、細胞を収集し、トリチウム取込みを液体シンチレーション計測により測定する。このアッセイは、例えば、ＩＬ−４受容体を介して媒介される生物活性の同定に有用である。
【０２６４】アッセイ３（コロニー形成アッセイ）
寒天（４％ｗ／ｖ）を、３分間煮沸することにより滅菌水中で融解する。次いで、寒天を４２℃に冷却し、４２℃ＲＰＭＩ−１５に最終濃度が０．４％となるまで加える。溶液を４２℃で維持する。大腿を、無菌技術を使用して若年マウスから取り出す。髄を、２３Ｇ針を具備したシリンジを使用して、骨の開放端を、無菌ハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で流すことにより集める。髄を、１５ｍｌ組織培養チューブに入れ、ボルテックスをかけ、細胞懸濁液とする。骨断片を５分間静置し、上清懸濁液を除去する。懸濁液を、７．５×１０６有核細胞／ｍｌに調整し、０．４％寒天含有４２℃ＲＰＭＩを添加することにより１：１００に希釈する。サイトカインの２倍連続希釈液を、容量＜＝０．２ｍｌで３５ｍｍ組織培養皿に加える。対照皿にはサイトカインを添加しない。１ｍｌの温細胞懸濁液を各皿に加え、寒天を室温に設定する。培養物を５−７日間、３７℃で、５％ＣＯ２中インキュベートする。次いで、コロニー形成を、顕教鏡で評価する。サイトカインプレート上のある型のコロニーの平均数（またはある異なる型のコロニーの凝集数）および対照プレート上の平均数を計測する。このアッセイは、例えば、ＣＳＦ受容体を介して媒介される生物活性の同定に有用である。
【０２６５】アッセイ４
サイトカインを、ＲＰＭＩ１６４０／２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１％ＢＳＡ中に連続希釈する。２５μｌの各希釈液を、三重に、マルチウェル化学走性チャンバー底に蒔く。培地のみを含むウェルは、陰性対照として使用し、化学走性誘導性の天然に存在するサイトカインを含むウェルは、陽性対照として使用する。ポリカーボネート膜を、チャンバー底上に配置し、チャンバーを構築する。ＲＰＭＩ／ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ中１．５×１０６細胞／ｍｌの５０μｌの末梢血単核細胞を、チャンバーの各上部ウェルに加える。チャンバーを、９０分間、３７℃で、５％ＣＯ２中インキュベートする。膜を取り出し、洗浄し、染色する。各ウェルの３−５個のランダムな視野の移動細胞を顕微鏡により計測する。
【０２６６】アッセイ５
天然に存在するサイトカイン基準標準物質を、補充培地を使用して１７×１００ｍｍチューブ中で２ｎｇ／ｍｌに希釈する。３さらに５倍の連続希釈液も調製する。サイトカインの連続希釈液を、２ｎｇ／ｍｌから２０ｐｇ／ｍｌまで、１７×１００ｍｍチューブに調製する。補充培地中５０μｌのＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球４×１０５細胞／ｍｌを、９６ウェル平底マイクロタイタープレートの各ウェルに加える。各基準標準物質またはサイトカインの希釈液５０μｌを、三重にウェルに加える。陰性対照ウェルには、５０μｌの補充培地のみを加える。プレートを、４８時間、３７℃で、５％ＣＯ２中インキュベートし、細胞をトリチウム化チミジンで標識する。取込みは、液体シンチレーション計測により測定する。このアッセイは、例えば、ＩＬ−１２受容体を介して媒介される生物活性の同定に有用である。
【０２６７】アッセイ６
生物活性の別のアッセイで、免疫適格性動物に、１０４−１０８の次元の照射サイトカイン形質導入またはサイトカイン覆膜腫瘍細胞を用いてワクチン接種し、１０４−１０８の次元の生野生型腫瘍細胞（任意の一時的順序）で攻撃する。アッセイの解読は、生存、腫瘍開始、または転移数である。
【０２６８】  サイトカインアッセイのさらなる例は、例えば、Ｃａｌｌａｒｄ  ＲＥら、ヒトＢ細胞増殖および分化因子のアッセイ、Ｃｌｅｍｅｎｓ  ＭＪ等（編）リンホカインおよびインターフェロン、実践的アプローチ、ｐ．３４５−６４、ＩＲＬ出版、オックスフォード１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎ  ＪＥら、免疫学の現在のプロトコル、Ｇｒｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク１９９１）；Ｄｏｔｓｉｋａ  ＥＮ、細胞性免疫機能に影響を及ぼすメディエータのアッセイ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：９３２−５（１９８９）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｍら、サイトカインアッセイ：自己免疫の病原の評価における役割、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １１９：１０５−１２３（１９９１）；Ｇｕｉｇｕｅｔ  Ｍら、認識されていない相互作用成分に起因するサイトカイン含有調製物の生物活性の誤解釈、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７（２）：４４１−４４２（１９９７）；Ｈａｍｂｌｉｎ  ＡＳ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ  Ａ、インターロイキンおよび他の関連因子のアッセイ、リンパ球、実践的なアプローチ、Ｋｌａｕｓ  ＧＧＢ（編）、ｐ．２０９−２８、ＩＲＬ出版、オックスフォード、（１９８７）；Ｌａｓｋａ  ＥＭ＆Ｍｅｉｓｎｅｒ  ＭＪ、バイオアッセイの統計学的方法および適用、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２７：３８５−９７（１９８７）；Ｍｏｓｍａｎ  ＴＲ＆Ｆｏｎｇ  ＴＡＴ、Ｔ細胞によるサイトカイン産生の特異的アッセイ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１６：１５１−８（１９８９）；Ｎｅｗｔｏｎ  ＲＣ＆Ｕｈ１  Ｊ、サイトカインおよびその阻害剤の検出および定量に関連したアッセイ、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：８３−９９（１９８９）；Ｔｈｏｒｐｅ  Ｒら、サイトカインの検出および測定、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．６：１３３−４８（１９９２）；ｖａｎ  Ｚｏｅｌｅｎ  ＥＪ  、ポリペプチド増殖因子の検出用の生物学的アッセイの使用、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２：１３１−５２（１９９０）；Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙ  ＦＰ、サイトカインバイオアッセイ、Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  Ｇ等（編）腫瘍免疫生物学、実践的なアプローチ、オックスフォード大学出版、ｐ．１７９−３０３（１９９３）；Ｗａｄｈａ  Ｍら、個々のサイトカインの定量的生物学的アッセイ、Ｂａｌｋｗｉｌｌ  ＲＦ（編）サイトカイン、実践的なアプローチ、オックスフォード大学出版、ｐ．３０９−３３０（１９９１）にも見出すことができる。
【０２６９】  本発明により、天然に存在しないサイトカインが、等モル量の天然に存在するサイトカイン（後者はアッセイで陽性の結果を与える）により生じた解読の少なくとも１０％、しかし２９％以下（最も近い１％）である生物活性アッセイの解読を与える場合、その天然に存在しないサイトカインは「生物活性」である。本発明によると、天然に存在しないサイトカインが、等モル量の天然に存在するサイトカイン（後者はアッセイで陽性の結果を与える）により生じた解読の少なくとも３０％、しかし４９％以下（最も近い１％）である生物活性アッセイの解読を与える場合、その天然に存在しないサイトカインは「高度に生物活性」である。本発明によると、天然に存在しないサイトカインが、等モル量の天然に存在するサイトカイン（後者はアッセイで陽性の結果を与える）により生じた解読の少なくとも５０％、しかし６９％以下（最も近い１％）である生物活性アッセイの解読を与える場合、その天然に存在しないサイトカインは「極度に生物活性」である。本発明によると、天然に存在しないサイトカインが、等モル量の天然に存在するサイトカイン（後者はアッセイで陽性の結果を与える）により生じた解読の少なくとも７０％、しかし１００％以下（最も近い１％）である生物活性アッセイの解読を与える場合、その天然に存在しないサイトカインは「天然の生物活性」である。本発明によると、天然に存在しないサイトカインが、等モル量の天然に存在するサイトカイン（後者はアッセイで陽性の結果を与える）により生じた解読の１００％以上である生物活性アッセイの解読を与える場合、その天然に存在しないサイトカインは「超生物活性」である。
【０２７０】本発明で有用なオプソニン
本明細書に定義した「オプソニン」は、例えば、貪食性白血球（単球およびマクロファージを含む）、樹状細胞（例えば、皮膚のランゲルハンス細胞）、Ｂリンパ球、および、ヒトでの内皮細胞などの、抗原および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方に結合する天然に存在する分子および天然に存在しない分子、またはプロセス段階または段階群の少なくとも１つの産物が、例えば、貪食性白血球、樹状細胞、Ｂリンパ球、およびヒトでの内皮細胞などの抗原および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方に結合できるように処理され得る分子を意味する。
【０２７１】  いずれか１つの作用機序に固めず、オプソニン増強細胞は、本明細書に有益な効果を与えると信じられている。なぜなら、オプソニン部分は、抗原とＡＰＣ間の連結またはカップリング剤として作用し、抗原のより効率的な結合、包み込みおよび内部移行を可能とするからである。さらに、オプソニン自体が、抗原と共に内部移行できる。「内部移行」は、細胞質または細胞の細胞質内の区画にもたらされる、分子による細胞取込みを意味する。貪食作用は、分子が細胞により内部移行されるプロセスである。
【０２７２】  好ましいオプソニンは、例えば霊長類オプソニン、例えばヒトオプソニンなどの、非げっ歯類オプソニンである。本発明で有用なオプソニンは、本明細書に記載したような、先天免疫に役割を果たす細胞上の受容体などのＡＰＣ上の受容体（例えば、貪食性白血球、例えば、マクロファージおよび貪食系の他の細胞）に結合する。
【０２７３】  いくつかのセットのオプソニンが、構造的および機能的に類似であると考えられる。例えば、１つのファミリーは、補体成分Ｃ３およびＣ４の断片を含む。これらの２つの成分は、高度に構造的に相同性であり、各々、ペプチド（それぞれＣ３ａまたはＣ４ａ）が天然分子からタンパク質分解的に切断されると破壊される分子内チオールエステル結合を有する。チオールエステルの崩壊により、抗原とエステル連結を形成できる化学構造が利用できる。このエステル結合が存するＣ３部分、すなわち、非Ｃ３ａ部分は、Ｃ３ｂと称され、Ｃ４ｂは、Ｃ４切断の類似産物である。Ｃ３ｂは、さらに、Ｉ因子などのタンパク質によりタンパク質分解でき、エステル結合を介して抗原に連結したままの、Ｃ３ｂｉおよびＣ３ｄなどの断片が生じる。
【０２７４】  生物学的に活性で膜に結合したＣ３および／Ｃ４の断片の高親和性受容体として機能することが知られる４つの構造的に独特のタンパク質がある。ＣＲ１は、Ｃ３のＣ３ｂ断片およびＣ４のＣ４ｂ断片の主な受容体である。それは他の細胞型の中でも、単球および単球由来ＡＰＣ上に発現される。ＣＲ２は、Ｃ３ｄとして知られるＣ３の断片の主な受容体であり、例えば、成熟Ｂリンパ球上に発現されるが、単球系統の細胞上には発現されない。Ｂリンパ球上でのＣＲ２の主な役割は、その同族抗原と協奏したＢ細胞の直接的共刺激であると信じられている。
【０２７５】  ＣＲ３は、好中球および単球により主に発現され、また、ＦＤＣ、クッパー細胞、およびＮＫ細胞にも発現される。ＣＲ３は、Ｃ３ｂｉに主な特異性をもつＣ３断片受容体である。ＣＲ３は、貪食作用などのプロセス中での接着相互作用および膜再構成に必要な細胞骨格事象の重要な形成体として提唱されている。
【０２７６】  ＣＲ４は、β２インテグリンファミリーのメンバーであり、そのα鎖は、ＣＲ３およびＬＦＡ−１のα鎖に構造的に類似している。その主な生理学的リガンドは、Ｃ３ｄおよびＣ３ｄ，ｇであると信じられているが；その生物活性は、ＣＲ３ほど解明されていない。
【０２７７】  先天オプソニンのファミリーの別の例は、補体成分Ｃ１ｑ、マンノース結合タンパク質、界面活性物質プロテインＡおよびＤ、およびコングルチニンを含む、コラーゲン性Ｃ型レクチンの群である、コレクチンである。各分子は、抗原に結合できるレクチンドメイン、並びに、Ｃ１ｑ受容体に全体的または部分的に同一の受容体を含む、貪食性単核細胞上の受容体に結合できるコラーゲン性ドメインを含む（Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：１１‘９−２９；Ｔｅｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：４８５−９３；Ｇｕａｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：４００５−１６；Ｇｅｅｒｔｓｍａら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２６７：Ｌ５７８−８４；Ｍｉｙａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３００：２３７−４２；Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７２：９５５−９；Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２９３：１５−１９）。大半の既知のコレクチンは、一部、ヒドロキシプロリンとヒドロキシリジン残基の共有結合的架橋により、翻訳後に構築された、ある場合にはホモマーの、別の場合にはヘテロマーの、複数のポリペプチド鎖を含む。コレクチンは、例えば、Ｐｉｋａａｒら、Ｊ  Ｉｎｆｅｓｔ  Ｄｉｓ  １７２：４８１−９；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６１：３６６４−７２；Ｋｕｈｌｍａｎら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９：１７３３−４５；およびＧｅｅｒｔｓｍａら、上記でオプソニンであることが実証される。
【０２７８】  本発明で有用な他の先天オプソニンには、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α−２マクログロブリン、およびフィブロネクチンがある。ペントラキシンファミリーの分子のメンバーであるＣＲＰは、単球系統の細胞上の受容体に結合し、オプソニンであることが示された（ＴｅｂｏおよびＭｏｒｔｅｎｓｏｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４４：２３１−８；Ｈｏｌｚｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：１４２４−３０）。α−２マクログロブリンは、Ｃ３およびＣ４と同様、分子をタンパク質分解した時に崩壊できる、内部チオールエステル結合を含む。該崩壊により、分子の抗原への共有結合が可能となり、α−２マクログロブリンのＡＰＣへの結合は、コンジュゲートの取込みを促進できる。フィブロネクチンは、α５β１インテグリンに結合し、また、様々な抗原にも結合でき、それはオプソニンとして機能することが可能となる（Ｃｏｓｉｏ、Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １０３：６１３−９；ＣｚｏｐおよびＡｕｓｔｅｎ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２９：２６７８−８１）。
【０２７９】  免疫グロブリン（抗体）は、その可変領域を介して抗原に、およびその定常領域を介してＡＰＣに結合することにより、オプソニンとして機能できる。典型的には、免疫グロブリンは、互いに共有結合し、その各々が１つの軽鎖に結合した、２つの重鎖を含む。これらのヘテロ四重体はさらに、ＩｇＭの五量体などの、より高次構造へと構築できる。重鎖および軽鎖の両方の可変領域が、抗原結合部位の構造に寄与でき、一方、ＡＰＣ結合部位は、重鎖定常領域上に位置する。組換え単鎖抗体も記載されている。免疫グロブリンのＡＰＣ受容体は、Ｆｃα、Ｆｃγ、Ｆｃε、並びに、それぞれＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＭのＦｃ  ｍｕ受容体を含む。
【０２８０】  多細胞真核生物により天然に発現されるオプソニンが分泌される。後者の特徴は、接着分子からオプソニンを識別する。天然に存在するＡＰＣ結合部分を含む天然に存在しない分子は、該分子が天然に存在する抗原の抗原結合部分を含むか否かに関わらず、ＡＰＣ結合部分が細胞外空間に位置するように、部分を介して細胞に安定に結合または付着できる該部分を含む場合にオプソニンと考える。部分を介して分子が細胞に安定に結合できる該部分は、架橋部分、トランスメンブラン配列、および脂質部分を含む。これらの配列または部分を含むタンパク質の調製は、当業者には公知である。
【０２８１】  「オプソニンのＡＰＣ結合部分」は、キメラ分子に含まれた場合に、少なくともナノモル範囲の親和性で、ＡＰＣ上に生理学的に発現される受容体へのキメラ分子の結合を可能とする、オプソニンの配列またはドメインである。
【０２８２】  ＡＰＣ結合部分を含むオプソニン断片の例は多い。該断片は、ＡＰＣ結合機能を保持する限りどの長さでもよく；例えば、約４０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸、５００アミノ酸、８００アミノ酸、またはさらには３０００アミノ酸であり得る。例えば、Ｌａｓ  Ｈｏｌｔｅｔら、１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３４４：２４２は、高い親和性でα２ｍ受容体に結合する、ヒトα２ｍのカルボキシ末端断片（ｖａｌ１２９９−ａｌａ１４５１）を記載する。ヒトα２ｍのアミノ酸１３１４−１４５１を含む断片および対応するラットα２ｍのドメインも、天然α２ｍの親和性の１から２％であるが、α２ｍ受容体に結合する（Ｖａｎ  Ｌｅｕｖｅｎら、１９８６、Ｊ  Ｂｉｏｌ  ｃｈｅｍ  ２６１：１１３６９；Ｅｎｇｈｉｌｄら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：１４０６；Ｓａｌｖｅｓｅｎら、１９９２、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３１３：１９８；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら、１９８６、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２０５：２０）。
【０２８３】  ＢｅｃｈｅｒｅｒおよびＬａｍｂｒｉｓ、１９８８、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：１４５８６は、ＣＲ１に結合するＣ３ｂの断片、例えばＣ３ｃ、エラスターゼ処理により生成し、Ｃ３ｂのα’鎖のＮ末端を含むＣ３の断片、およびＣ３ｂα’鎖の４２Ｎ末端アミノ酸を含む合成ペプチドを記載する。ＣＲ３へのＣ３の結合配列も記載されている（Ｗｒｉｇｈｔら、１９８７、ＰＮＡＳ  ８４：４２３５）。
【０２８４】  ペプシン消化により得られたＮ末端断片である、Ｃ１ｑの「コラーゲン柄」は、Ｃ１ｑ受容体に結合する（Ｒｅｉｄ、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ８０：１６；Ｍａｌｈｏｔｒａら、１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２９３：１５）。Ｍａｌｈｏｔｒａら、同上は、コングルチニンのＡＰＣ結合部分は、その５５Ｎ末端アミノ酸に含まれるという証拠も提供する。Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ（米国特許第５，２７０，１９９号）は、特許’１９９号の図２のヌクレオチド３７０−４３８からなる、ヒトマンノース結合タンパク質の推定ＡＰＣ結合部位を与える。さらに、コングルチニンとの相同性により、特許第‘１９９号に開示されたエキソン１は、ＡＰＣ結合部分を含み得る。
【０２８５】  ＩｇＧのＡＰＣ結合部分は、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７３：１４８３−９１；Ｌｕｎｄら、１９９１、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：２６５７−６２；およびＳａｒｍａｙら、１９９２、Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２９：６３３−９に記載のように、残基２３４−２３７を含む、ＣＨ２ドメインおよび低ヒンジ領域を含む。
【０２８６】  本発明の組成物および方法に使用できるオプソニンの例は、フィブロネクチン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ０２７６１、Ｋ００７９９、Ｋ０２２７３、Ｘ８２４０２、Ｘ００３０７、Ｘ００７３９）、ＣＲＰ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ１７４９６、Ｍ１１８８０、Ｍ１１８８１、Ｍ１１８８２）、Ｃ１ｑなどの補体成分（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ６６２９５、Ｍ２２５３１、Ｘ０３０８４、Ｘ５８８６１、およびスイスプロット寄託番号Ｐ０２７４７、Ｐ０２７４５）、Ｃ３ｂおよびＣ３ｄなどの補体断片（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｋ０２７８２、Ｋ０２７６５）、マンノース結合タンパク質（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｓ４２２９２、Ｓ４２２９４、Ｘ１５４２２）、コングルチニン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ７１７７４）、α−２−マクログロブリン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ９３２６４、Ｍ１１３１３）、および界面活性物質プロテインＡ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ６８５１９、Ｓ４８７６８）およびＤ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ４０１５６、Ｘ６５０１８、Ｓ３８９８１）、免疫グロブリン、および種間のその相同体を含む。
【０２８７】
【表１】
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本発明によるオプソニン性の決定
ある天然に存在するオプソニンは、１つ以上の以下のアッセイでオプソニン性を有すると決定され、それが分泌分子である場合、本発明で有用であると考えられる。
【０２８８】アッセイ１
Ｏ’ＲｅａｒおよびＲｏｓｓ、免疫学の現在のプロトコル、１９９４、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｐ．１３．４．５−９に記載のような、１つのオプソニン性のアッセイにおいて、候補オプソニン分子に生理学的に生じた連結を介して結合したＳＲＢＣが得られる。候補オプソニンが天然である種由来のＡＰＣを、ＢＳＡの１％（ｗ／ｖ）Ｃｏｈｎ画分を含む氷冷ＨＢＳＳ中に４×１０６／ｍｌで懸濁する。候補オプソニンがＣ３断片である場合、ＡＰＣは新しく得た非培養末梢血単球である。候補オプソニンに連結したＳＲＢＣまたは対照ＳＲＢＣ（前者と同一であるが、候補オプソニンには連結していない）を、同溶液に２×１０８／ｍｌで懸濁する。１００μｌのＳＲＢＣ懸濁液および１００μｌのＡＰＣ懸濁液を、１０×７５ｍｍプラスチックチューブに混合する。チューブを、４０ｒｐｍで３７℃で２−２０分間回転させる。少量の懸濁液を、スライド上にのせ、カバーガラスで覆い、５−１０分間静置する。過剰な液体は、カバーガラス上に圧力をかけて除去でき、カバーガラスは、例えば、マニュキア除光液などでスライドに密閉できる。スライドを顕微鏡で調べ、４つ以上のＳＲＢＣに目に見えて接着したＡＰＣの比率を決定する。４×１０４個以下の候補オプソニン分子／ＳＲＢＣが存在する時に比率が５０％以上である場合、候補オプソニンはオプソニンであり得る。
【０２８９】アッセイ２（プロテアーゼ活性化候補オプソニン）
候補オプソニンまたは放射標識候補オプソニンを、１．５−３倍モル過剰のプロテアーゼ（０．０５Ｍトリエタノールアミン−０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、室温で一晩）で処理する。このアッセイで、プロテアーゼは、抗原として役立ち得るか、または過剰の別の抗原を添加できる。結合研究の前に、候補オプソニン−抗原複合体を、ＨＢＳＳ（４℃）に対して透析する。
【０２９０】  単球に結合している候補オプソニン−抗原複合体を、１．０Ｍ以下の濃度の標識リガンドを、氷上で２００ｍｌ容量中の（１．５−４．０）×１０６単球と共にインキュベートすることにより測定する。放射標識リガンドの非特異的結合を、１００倍モル過剰の標識候補オプソニン−抗原複合体の存在下で決定する。非結合リガンドを細胞および細胞結合リガンドから、ガラス線維フィルター上での迅速な真空ろ過により分離する。研究を、氷上で実施し、エンドサイトーシスに起因する複雑化の可能性を回避する。結合定数および１細胞あたりの部位数を、分析によりおよび非線形曲線の当てはめにより決定する。単球結合部位への候補オプソニン−抗原複合体親和性が、少なくともナノモル範囲である場合、候補オプソニンはオプソニンである。
【０２９１】アッセイ３
第Ｉ部
候補オプソニンがＰ．ｃａｒｉｎｉｉの表面に結合するかを直接評価するために、免疫電子顕微鏡法を実施する。Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを、１ｍＭカルシウムを含むＴＢＳを使用して瀕死感染ラットの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）から単離して、表面結合候補オプソニンを保存する。単離生物を、過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド緩衝液中に固定し、ロウアクリルマウンティング培地（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ社、レディング、カリフォルニア州）に包埋する。超薄切片を得、正常ヤギ血清（２％）で１時間遮断し、ウサギ抗候補オプソニンまたは非免疫ウサギＩｇＧ（２５ｍｇ／ｍｌ）と共に一晩インキュベートする。洗浄後、切片を、続いて、１５ｎＭコロイド状金（アマシャム社、アーリントンハイツ、イリノイ州）にコンジュゲートさせたヤギおよびウサギＩｇＧと共にインキュベートする。切片を再度洗浄し、透過型電子顕微鏡（モデル６４００：ＪＥＯＬ  ＵＳＡ社、ピーボーイ、マサチューセッツ州）で調べる。
【０２９２】第ＩＩ部
候補オプソニンに対する抗体の存在下または非存在下で、または精製候補を添加して、Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉの培養肺胞マクロファージへの付着を以下のように定量する。Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉの肺胞マクロファージへの粘着は、生物を５１Ｃｒ標識することによりアッセイする。Ｐ．ｃａｒｉｎｎｉは、１ｍＭカルシウムを含むＴＢＳを用いて感染ラットから単離し、表面結合候補オプソニンの損失を防ぐ。該生物は、２０％ＦＣＳおよび２００ｍＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ）を含む２ｍｌ  ＤＭＥ中３７℃で８時間インキュベートすることにより放射標識される。正常肺胞マクロファージを、健康ラットから洗浄し、マクロファージの堅い粘着を確かにするために、正常ラットＩｇＧ（１００ｍｇ／ｍｌ×６０分間）で前以て覆膜した組織培養プレート（１×１０５細胞／ウェル）に蒔く。１時間後、マクロファージを穏やかにＨＢＳＳで洗浄し、非粘着細胞を除去する。＞９５％のマクロファージが、この洗浄後に粘着する。表面会合候補オプソニンを含む５１Ｃｒ−Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ（１×１０６）をマクロファージに加え、３７℃でさらに１時間インキュベートする。続いて、非粘着Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを洗浄により除去する。粘着Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを含むマクロファージ単層を、１Ｎ  ＮａＯＨに可溶化し、定量する。Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉの粘着は、粘着の比率＝（Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００（ただしＡ＝単層に会合した５１Ｃｒ−Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ、およびＢ＝非付着５１Ｃｒ−Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ）として定義する。培養液中でのＰ．ｃａｒｉｎｉｉの肺胞マクロファージ肺細胞への付着に対する候補オプソニンの効果を評価するために、Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ粘着アッセイを、候補オプソニン（１００ｍｇ／ｍｌ）に対して産生されたポリクローナルウサギ抗体の存在下または非存在下で実施する。
【０２９３】  Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉへの候補オプソニンの結合が、第Ｉ部で明らかである場合、および第ＩＩ部で、粘着％が、Ｐ＜０．０５の統計学的有意性で抗候補オプソニンの存在下で減少する場合、候補オプソニンはオプソニンである。
【０２９４】アッセイ４
細菌と粘着単球の会合は以下の通り測定する。使用した修飾ＰＢＳおよび全緩衝液中の内毒素レベルは、カブトガニアッセイにより決定すると５０ｐｇ／ｍｌ以下である。修飾ＰＢＳ中５×１０３単球を、２時間３７℃で、テラサキプレートのウェルに粘着させる。非粘着細胞をＰＢＳで３回洗浄して除去した後、１０−５０μｇ／ｍｌの候補オプソニンを含むまたは含まない緩衝液０．５ｍｌ中５×１０４ＦＩＴＣ標識細菌を加える。１０：１から５０：１までの細菌と単球の比を使用する。３０分間３７℃で暗闇中インキュベートした後、非粘着細菌を、温ＰＢＳで５回洗浄することにより除去する。アッセイを、４重に実施し；各ウェルで、３１００単球に会合した細菌数を、×４００倍率を使用して蛍光顕微鏡下で計測する。結果は、１００単球に会合した細菌数として表現する。候補オプソニンを有するこの数が、候補オプソニンを有さない数の少なくとも２倍である場合、候補オプソニンはオプソニンである。
【０２９５】アッセイ５
第Ｉ部
１ｍｌあたり約１×１０７から６×１０７細菌を、全容量０．７ｍｌのＰＢＳアリコート中１０ｍｃｇ／ｍｌの１２５Ｉ−候補オプソニンと共にインキュベート（２０分間、０℃）し、１００ｍｌの反応混合物を１５０ｍｌの油クッション（６０％フタル酸ジブチル、４０％フタル酸ジオクチル［Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社、ロチェスター、ニューヨーク］）に重層し、混合物を遠心分離（１０，０００×ｇ、６０秒、４℃）する。細胞ペレットを含むチューブの先端をモーツァルトかみそり刃で切断し、放射活性を計測する。
【０２９６】第ＩＩ部
ＡＰＣを、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に、２×１０５細胞／ｍｌで、使用前の夕方に蒔く。２×１０６細菌／ウェル（０．１ｍｌ／ウェル）を、１００ｍｃｇ／ｍｌの候補オプソニンを含むまたは含まない培養プレートに加える。次いで、プレートを、１，０００×ｇで７分間遠心分離する。１５分間３７℃で細菌の取込みを行わせた後、冷ＰＢＳで数回洗浄することにより遊離細菌を除去する。次いで、それらを、ＲＭＰＩ１６４０と、４５分間培養液に存在すると全ての細胞外細菌を殺滅する量の抗生物質中でインキュベート（４５分間、３７℃）する。このインキュベート期間の終了を時間０と考える。単層を、ハンク平衡食塩水で３回洗浄し、同量のＲＰＭＩ１６４０（Ｒ０）を加える。細胞を、数サイクルの凍結および解凍を使用して溶解する。生菌数（ＣＦＵ）／ウェルを、インキュベートの２４時間後に、血液寒天プレート（コロンビア血液寒天；ベクトンディキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州）上での定量的プレート計測により決定する。各結果は、３回の測定の平均として示す。
【０２９７】  第Ｉ部で、候補オプソニン処理細菌ペレットが、＞７５ＫＣＰＭを有し、この取込みが、非標識候補オプソニンにより阻害できる場合、および第ＩＩ部で、候補オプソニンを有するＣＦＵが、それを有さないものよりも大きい場合（Ｐ＜０．０５）、候補オプソニンは、オプソニンであり得る。
【０２９８】アッセイ６
１０７細菌を含む、２００μｌのＧＨＢＳＳ（ハンク平衡塩溶液）＋１０ｍｍｏｌＣａＣｌ２を含む０．１％ゼラチン）を調製する。次いで、細菌を４℃で２０−１００μｇ／ｍｌの候補オプソニンと共にインキュベートする。結合アッセイを、競合的阻害剤の存在下または非存在下で実施する。３０分間インキュベートした後、細菌を、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌＣａＣｌ２中、室温で、微量遠心管中、１，３００ｇで３分間洗浄する。その後、１：１，０００希釈のウサギ抗候補オプソニン抗血清を、細菌と共に１時間、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳおよび１０ｍｍｌＣａＣｌ２中でインキュベートし、次いで、細菌を、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌＣａＣｌ２と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄する。抗血清の細菌への結合は、ローダミン（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、オレンジバーグ、ニューヨーク）にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧの１：１，０００希釈液により検出する。インキュベート後、細菌を、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌＣａＣｌ２と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で５回洗浄し、ガラススライド上に塗り、空気乾燥させる。その後、細菌を１００％氷冷メタノールで５分間固定する。陰性対照は、候補オプソニンおよび第一段階抗体を含まない。三重アッセイの多くの視野を蛍光顕微鏡により調べる。
【０２９９】第ＩＩ部  放射標識細菌と細胞の会合
１０７個の放射標識細菌を、２００μｌのＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌＣａＣｌ２中に再度懸濁し、２μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌの範囲の候補オプソニンの存在下または非存在下で４℃で３０分間インキュベートする。次いで、細菌を、３回、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌＣａＣｌ２中３分間室温で、微量遠心管中、１，３００ｇで洗浄し、５０μｌのＧＨＢＳＳに再度懸濁し、１０６の次元のＡＰＣ（ＧＨＢＳＳ）を含む１ｍｌ懸濁液に加える。細菌およびＡＰＣを、穏やかに、３７℃で２０分間振盪し、その後、付着していない細菌を、微量遠心管中８２ｇで分画遠心分離を使用して５回洗浄することにより除去する。最後の洗浄前に、各サンプルのアリコートを、ラブテックスライド上に置き、細胞を１０分間付着させ、メタノールで固定し、ギームザで染色し、光学顕微鏡法により評価する。ラブテックスライド上に配置された細胞を評価するために、少なくとも４００個の細胞を計測する。貪食係数は、１００ＰＭＮあたりの付着または摂取粒子の数を示した。細胞および放射標識細菌を含む上記由来のペレットを、次いで、１００μｌＰＢＳ＋０．５％トリトンＸ−１００に溶解し、放射活性をシンチレーションカウンターで測定する。第Ｉ部で、候補オプソニンの細菌への特異的結合が明らかである場合、および第ＩＩ部で、ｃｐｍでの細菌の特異的取込みが、候補オプソニン非存在下よりも存在下の方が３倍より高い場合、候補オプソニンはオプソニンであり得る。
【０３００】アッセイ７
第Ｉ部
Ｌ  ｄｏｎｏｖａｎｉ  ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅｓへの結合を調べるために、培養物を、５×１０５寄生虫ｍｌ−１で接種する。９日間以内の一定の時間点で、寄生虫画分を計測し、洗浄し、１％ＢＳＡ、０．５ｍＭ  Ｃａ２＋、０．０５％ＮａＮ３、トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）、（１０ｍＭトリスＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）（希釈）を２×１０５ｍｌ−１まで再度懸濁する。次いで、この懸濁液の１５μｌを、１５０μｌのフタル酸ジノニル／フタル酸ジブチル（４０：６０ｖ／ｖ）油混合物に重層しておいた、ＥＤＴＡ非含有希釈液中５μｇ／ｍｌ放射標識候補オプソニン（０．１２μＣｉ／μｇ）７０μｌを含む２００μｌマイクロチューブに加える。寄生虫を１時間インキュベートし、油層を通して遠心分離し、細胞ペレットを削除し、会合した候補をγ計測により検出する。各アッセイは三重に実施する。前鞭毛虫への候補の結合の濃度依存性も、０．０４５μＣｉ／μｇの活性および６０−０．０１５μｇ／ｍｌ候補までの２倍希釈シリーズを使用して、上記のように測定する。
【０３０１】第ＩＩ部
ＡＰＣを、２４ウェル組織培養プレートのカバーガラス上に１×１０６細胞／ウェルで蒔く。細胞を、１０％ＰＣＳ、１ｍＭグルタミン、２００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（ライフテクノロジーズ）中で、加湿インキュベーター中３７℃でインキュベートする。２４時間後、非粘着細胞を除去し、残りの細胞を６日後に使用する。前鞭毛虫を、候補物質の存在下または非存在下、３０μｇ／ｍｌでＲＰＭＩ１６４０中１時間インキュベートし、次いで、ＡＰＣ培養物に１０６／ウェルで加える前に３回洗浄する。前鞭毛虫に、１時間ＡＰＣを感染させ、次いで、細胞を洗浄し、メタノールで固定し、ギームザ染色（ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、ドーセット、英国）し、計測する。感染したＡＰＣの比率および寄生虫数／１００マクロファージを、四通りの培養物から決定する。
【０３０２】  第Ｉ部で、寄生虫への候補オプソニンの親和性が、少なくともナノモル範囲であり、第ＩＩ部で、１００ＡＰＣあたりに拾い上げられる寄生虫数が、候補オプソニンの存在下で、候補オプソニン非存在下での少なくとも２倍である場合、候補オプソニンはオプソニンであり得る。
【０３０３】アッセイ８
第Ｉ部
５％ウシ胎児血清を含む［３５Ｓ］メチオニン標識培養培地の一部（０．５ｍｌ）および候補オプソニンを、３０分間室温で、１０％の微生物の懸濁液０．１ｍｌまたは０．２ｍｌと共にインキュベートする。試験した微生物は、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含み得る。結合したタンパク質は、２％ＳＤＳおよび０．１Ｍジチオトレイトールを含む緩衝液中で煮沸することにより放出し、５％ＳＤＳゲル上で分析する。
【０３０４】第ＩＩ部
［３Ｈ］チミジンで標識した、固定細菌（０．１ｍｌ；１０容量％；１０１０生物／ｍｌ）を、候補オプソニンを枯渇させて、または枯渇させずに、０．１ｍｌ血清と共にインキュベートする。ＰＢＳで洗浄した後、細菌を、二価カチオンを含む０．９ｍｌＰＢＳの最終容量中で１×１０７の次元のＡＰＣと共にインキュベートする。時折０．２ｍｌを、Ｎ−エチルマレイミド（２ｍＭ）を含む氷冷ＰＢＳに取り出し、さらなるエンドサイトーシスを遮断し、細胞を洗浄する（約１００ｇで１０秒間）。
【０３０５】  第Ｉａ部で、候補オプソニンに対応するバンドが明らかである場合、および第ＩＩ部で、インキュベートの６−１０分後にＣＰＭが、血清の枯渇したサンプルよりも血清の枯渇していないサンプルの方が少なくとも３倍高い場合、候補オプソニンはオプソニンであり得る。
【０３０６】  結果がアッセイ３、５、６、７、８の第Ｉ部を形成する代わりに、アッセイの第ＩＩ部を満たす候補オプソニンは、それが、少なくともナノモル範囲の親和性でアッセイの抗原と結合できる場合にオプソニンであり得る。
【０３０７】アッセイ９
Ｃ３断片の少なくとも１．２×１０４分子／細胞で覆膜したＳＲＢＣを、Ｏ’ＲｅａｒおよびＲｏｓｓ、免疫学の現在のプロトコル、１９９４、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ｐ．１３．４．５−９に記載の通りに調製する。１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩの２×１０５細胞／ｍｌの単球２５０μｌを、８ウェルガラス組織培養プレートの各ウェルに加え、３７℃で、５％ＣＯ２で３時間インキュベートする。単球をＨＢＳＳで２回洗浄し、１．５×１０８／ｍｌのＤＶＢＳ２＋の５０μｌのＳＲＢＣを各ウェルに加える。プレートを、５０ｇで５分間遠心分離し、次いで、３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートする。壁をＨＢＳＳで２回洗浄し、０．５％グルタルアルデヒドで固定し、ギームザ染色で染色する。＞４０％の単球が、光学顕微鏡により測定して、少なくとも１つのＳＲＢＣとロゼットを形成する場合、候補はオプソニンであり得る。
【０３０８】遺伝子工学操作により改変されたオプソニン、サイトカイン、または脂質を含むＣＤ４０リガンド
長鎖脂肪酸などの脂質の、ポリペプチドなどの分子への付着により、複合体を細胞と混合した場合に、複合体は、形質膜と安定に会合できるようになる（Ｎａｇａｒａｊａｎら、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：２４１−５１；ＭｃＨｕｇｈら、１９９５、ＰＮＡＳ  ９２：８０５９−６３；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、１９９５、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１３１：６６９−７７）。これは、脂質の膜への挿入により起こると信じられている。脂質会合ポリペプチドを製造する簡便な方法は、適切な宿主細胞中で、一部、ＧＰＩ部分の翻訳後付加を指示するシグナル配列をコードしている核酸を発現させることを含む。組換えＤＮＡ技術を使用して、天然非ＧＰＩ連結タンパク質を、異種ＧＰＩシグナル配列に連結したタンパク質をコードする核酸を構築することにより、ＧＰＩ連結タンパク質として発現できる。この目的に有用なＧＰＩシグナル配列をコードしているヌクレオチド配列は、例えば、減衰加速因子（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２２」をコードしている配列；Ｃａｒａｓら、米国特許第５，１０９，１１３号に開示されたシグナル配列をコードしている配列）；ブレビカン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｘ８６４０６のｎｔ１９８２−２０４７）、メソセリン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｕ４０４３４のｎｔ１８５８−１９８３）、コクシジオイデスイミティス抗原２（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号１２５６４４４のアミノ酸１７２−１９４をコードしている配列、Ｚｈｕら、１９９６、Ｇｅｎｅ  １８１、１２１−５）、アセチルコリンエステラーゼ（例えば、Ｄｕｖａｌら、１９９２、ＥＭＢＯ  Ｊ  １１：３２５５−６１に記載のペプチド「ＨＣ」をコードしている配列；（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１９」をコードしている配列））、ヒト葉酸受容体αおよびβ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号１８２４１６のアミノ酸２３０−２５７またはＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号１６５５５９２のアミノ酸２２８−２５５をコードしている配列、ＹａｎおよびＲａｔｎａｍ、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１４５９４−６００）、５’ヌクレオチダーゼ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号４０４５０２のアミノ酸５４７−５７０または５４７−５７４をコードしている配列、Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１９０：２７３−８；（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「５」または「６」をコードしている配列））、ＣＤ５９（例えば、ＧｅｎｂａｎｋＵ４８２５５のｎｔ３９３−４７３によりコード；ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２０」をコードしている配列；Ｐｏｗｅｌｌら、１９９７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：１６９２−１７０２の図２のアミノ酸７４−１０１をコードしている配列）、Ｔ−カドヘリン（例えば、ＫｏｌｌｅｒおよびＲａｎｓｃｈｔ、１９９６、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：３００６１−７により記載のニワトリＴカドヘリンの７６Ｃ末端アミノ酸をコードしている配列）、アミノペプチダーゼＰ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号１５１７９４２のアミノ酸６４９−６７３をコードしている配列、Ｈｙｄｅら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３１９：１９７−２０１）、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ１６Ｂ、Ｔｈｙ１、炭酸脱水酵素ＩＶ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号１７９７９１のアミノ酸２８４−３１２をコードしている配列、Ｏｋｕｙａｍａら、１９９５、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３２０：３１５−２２）、胎盤アルカリホスファターゼ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース寄託番号１７８４６４のアミノ酸４９８−５２９をコードしている配列、Ｏｄａら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０１：５７７−８３）、神経糖タンパク質Ｆ３、癌胎児抗原（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２８」をコードしている配列）、ＭＲＣ−ＯＸ４５（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２」をコードしている配列）、ＲＴ６．２（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「３」をコードしている配列）、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプレスポア特異的抗原（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「４」をコードしている配列）、ミクロソームジペプチダーゼ（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、ＢｉｏＣｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「８」をコードしている配列）、ＣＡＭＰＡＴＨ−１（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「９」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＰＡＲＰ（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１０」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＶＳＧ  Ｍｉｔ１１８ａ（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１１」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＶＳＧ  Ｍｉｔ１１７ａ（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌ��ａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１２」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＶＳＧ  ＭＩＴａｔ１．１０００ＢＣ（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１３」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＶＳＧＭＩＴａｔ１．５ｂ（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１４」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＶＳＧ  ＩＬＴａｔ１．１（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１５」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＶＳＧＴｘＴａｔ１（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１６」をコードしている配列）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉＶＳＧＭｉｔ２２１（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１７」をコードしている配列）、プリオンタンパク質（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「１８」をコードしている配列）、ウロキナーゼ受容体（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２１」をコードしている配列）、Ｔ．ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅＶＳＧ  ＹＮａｔ１．１（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２３」をコードしている配列）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅＧＡＳ−１（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２４」をコードしている配列）、Ｔｈｙ−１（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２５」または「２６」をコードしている配列）、Ｌ．ｍａｊｏｒＰＳＰ（例えば、ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２９２：２２３−３２の表１のアミノ酸配列「２９」をコードしている配列）、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ接触部位Ａ糖タンパク質（例えば、Ｂａｒｔｈら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３１７：５３３−４０に記載の２５Ｃ末端アミノ酸をコードしている配列）、ＣＤ２４、および合成配列（例えば、Ｃｏｙｎｅら、１９９３、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：６６８９−９３により記載）により含まれるものを含む。
【０３０９】  ＧＰＩ連結ポリペプチドは、以下の方法を使用して細胞から抽出できる。５×１０６細胞を遠心沈殿し、−８０℃で凍結する。ペレットを、１４ｍｌの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス７．４／０．１ｍＭプリマキン／２％ＴｒｉｔｏＸ−１１４中で撹拌しながら０℃で１時間解凍し、次いで、８８００ｇで０℃で１０分間遠心分離する。上清を−２０℃で一晩維持し、室温で解凍し、次いで、３２℃で１２分間放置する。次いで、３０００ｇで３分間３２℃で遠心分離する。上層をデカントし、１１ｍｌの冷緩衝液Ａ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス７．４／０．１ｍＭプリマキン／０．０６％トリトンＸ−１１４）を底層に加える。これを氷上で１０分間インキュベートする。１２分間３２℃のインキュベート、３２℃で３０００ｇの遠心分離、上層のデカント、および１１ｍｌ冷緩衝液Ａの底層への添加を反復する。この溶液を１８０００ｇで１０分間０℃で遠心分離する。１２分間３２℃のインキュベート、３２℃で３０００ｇの遠心分離、および上層のデカントを反復する。３容量の冷アセトンを、最終底層に加える。溶液を１２，０００ＲＰＭで３０分間遠心分離し、上清を除去し、ＧＰＩ画分を含むタンパク質ペレットを真空下で乾燥させる。特異的タンパク質は、イムノアフィニティー精製などの当業者に公知の方法により精製できる。
【０３１０】  脂質連結遺伝子工学操作により改変されたサイトカイン、オプソニン、またはＣＤ４０リガンドを製造する別の方法は、パルミテートなどの脂肪酸にポリペプチドを化学的に連結させることである。１．５ｍｇ／ｍｌのポリペプチドを、０．３％デオキシコール酸、０．１％重炭酸ナトリウム、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ、ｐＨ７．８に懸濁する。溶液の最適最終ｐＨは、７．６−８．０である。混合物を３７℃に加温し、パルミチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ、クリーブランド、オハイオ）を最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌとなるまで加える。溶液を一晩室温でインキュベートする。ポリペプチドを、ＰＢＳ、ｐＨ７．６中０．１５％デオキシコール酸で平衡化した１６×２５０ｍｍのセファデックスＧ−７５クロマトグラフィーカラムを通過させて精製する。
【０３１１】本発明で有用な架橋部分
ＣＤ４０リガンド、サイトカイン、またはオプソニンを、細胞または細胞様構造に連結させる別の簡便な方法は、架橋剤を使用することである。「架橋剤」は、少なくとも２つの他の分子、例えば、２つのポリペプチドまたはポリペプチドと脂質上の官能基と反応できる化学実体であり、架橋剤との反応時に２つの分子は共有結合的に連結される。従って、ＣＤ４０リガンドは、細胞の表面上の分子に架橋できる。
【０３１２】  二官能性および多官能性の両方の多種多様な架橋剤が、当分野で公知であり、例えばシグマ（セントルイス、ミズーリ州）などから市販で入手できる。これらは、例えば、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｓ−アセチルチオプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アジピン酸ジヒドラジド、４−アジド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンジルオキシ）スクシンイミド、６−（４−アジド−２−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−アジドフェナシルブロミド、Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）フタルイミド、４−アジドサリチル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、プロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、カルボニル−ビス（Ｌ−メチオニンｐ−ニトロフェニルエステル）、２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸ｐ−ニトロフェニルエステル、ジエチルマロンイミデート、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、ジメチルアジピミデート、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート、ジメチルピメリミデート、ジメチルスベリミデート、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、ジチオビス（プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、エチレングリコールビス−（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、ビス−（４−フルオロ−３−ニトロフェニル）スルホン、ｐ−ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド、２−イミノチオラン、６−（ヨードアセトアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−マレイミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（Ｎ−マレミド）ベンゾフェノン、γ−マレミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ε−マレミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（Ｎ−マレミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（Ｎ−マレミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、β−マレミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−マレミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジアミン、１，４−フェニレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレミド、Ｎ，Ｎ’−ｐ−フェニレンジマレミド、ポリオキシエチレンビス（グリシジルエーテル）、ビス（ポリオキシエチレンビス（グリシジルエーテル））、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ビス（ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル））、ポリオキシエチレンビス（ｐ−ニトロフェニルカーボネート）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、���ベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、コハク酸マレミドエチルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、１，５ビス（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）−ペンタン、およびビス（Ｎ−スクシニミジル）カーボネートを含む。
【０３１３】本発明による、ＧＰＩ結合オプソニン、サイトカイン、またはＣＤ４０リガンドの細胞への結合の決定
本発明のある実施形態において、オプソニン、サイトカイン、またはＣＤ４０リガンドを、脂質を含むＧＰＩまたはＧＰＩ部分を含むように遺伝子工学操作により改変されたして、脂質基の細胞の形質膜への挿入を介して、修飾ポリペプチドを細胞に結合させることが可能となる。多少なりとも慣用的なＧＰＩからなるＧＰＩ部分では、当業者は該部分がポリペプチドの細胞膜への結合を可能とするかを容易に決定できる。以下のアッセイは、ＧＰＩ連結分子が細胞に結合できるかを決定するのに有用である。
【０３１４】  取込みを定量するために、ＧＰＩ連結ポリペプチドを、最初に、１２５Ｉで標識する。セファデックスＧ−２５カラムに、１ｍｌＰＢＳ中０．１ｍｇの関連タンパク質、次いで２０−３０ｍｌＰＢＳを添加する。２ｍＣｉ  Ｎａ［１２５Ｉ］およびＰＢＳ中１０μＭラクトペルオキシダーゼ２０μｌを、１ｍｇ／ｍｌの関連タンパク質ＰＢＳ溶液２ｍｌに加える。０．０２５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中、４μｌの０．０３％過酸化水素を、タンパク質溶液中に撹拌する。過酸化水素の添加は、１分間隔でさらに３回反復する。ＰＢＳ中１５ｎＭ  ＮａＩ  １ｍｌを加える。溶液をセファデックスカラムに重層し、２０ｍｌ  ＰＢＳで溶出する。溶出液をガイガー計数管により監視し、標識タンパク質を含む、最初の放射活性ピークを集める。比活性は、γ計測（回収率１００％と想定）により決定する。タンパク質溶液を４０μｇ／ｍｌに希釈し、下記した形質膜取込み手順に使用する。洗浄後、１μｌのアリコートの細胞をγ計測する。会合がＧＰＩ部分を介するかを決定するために、細胞をＢと共にインキュベートする。Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（シグマ）を３７℃で３時間遠心分離し、計測前に洗浄する。この放出は細胞表面からＧＰＩ連結タンパク質を放出する。
【０３１５】本発明で有用な抗原
１．ウイルス抗原
ウイルス抗原の例は、レトロウイルス抗原、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原由来のレトロウイルス抗原、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素、および他のＨＩＶタンパク質；肝炎ウイルス抗原、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ、ＭおよびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、および他の肝炎、例えばＡ型、Ｂ型、およびＣ型肝炎のウイルス成分、例えばＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼなどのインフルエンザウイルス抗原および他のインフルエンザウイルス成分；麻疹ウイルス融合タンパク質などの麻疹ウイルス抗原および他の麻疹ウイルス成分；タンパク質Ｅ１およびＥ２などの風疹ウイルス抗原および他の風疹ウイルス成分；ＶＰ７ｓｃなどのロタウイルス抗原および他のロタウイルス成分；外被糖タンパク質Ｂなどのサイトメガロウイルスおよび他のサイトメガロウイルス抗原成分；ＲＳＶ融合タンパク質などの呼吸器合胞体ウイルス抗原、Ｍ２タンパク質、および他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分；最初期タンパク質などの単純ヘルペスウイルス抗原、糖タンパク質Ｄ、および他の単純ヘルペスウイルス抗原成分；ｇｐＩ、ｇｐＩＩなどの水痘帯状疱疹ウイルス抗原および他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分；プロテインＥ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ１、ＮＳ１、ＮＳ１−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅなどの日本脳炎ウイルス抗原および他の日本脳炎ウイルス抗原成分；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質などの狂犬病ウイルス抗原および他の狂犬病ウイルス抗原成分を含むがこれに限定されない。ウイルス抗原の追加の例については、基礎ウイルス学、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．およびＫｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．編（Ｒａｖｅｎ出版、ニューヨーク、１９９１）参照。
【０３１６】  ２．細菌抗原
本発明の組成物および方法に使用できる細菌抗原は、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、ペルタクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼなどの百日咳菌抗原および他の百日咳菌抗原成分；ジフテリア毒素またはトキソイドなどのジフテリア菌抗原および他のジフテリア菌抗原成分；破傷風毒素またはトキソイドなどの破傷風菌抗原および他の破傷風菌抗原成分；Ｍタンパク質などの連鎖球菌抗原および他の連鎖球菌抗原成分；リポ多糖などのグラム陰性桿菌細菌抗原および他のグラム陰性細菌抗原成分；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａ主分泌タンパク質、抗原８５Ａなどのマイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原および他のマイコバクテリア抗原成分；ヘリコバクター・ピロリ細菌抗原成分；プノイモリシン、肺炎球菌莢膜多糖などの肺炎球菌細菌抗原および他の肺炎球菌細菌抗原成分；莢膜多糖などのヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原および他のヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原成分；炭疽保護抗原などの炭疽細菌抗原および他の炭疽細菌抗原成分；ロンプ（ｒｏｍｐ）などのリケッチア細菌抗原および他のリケッチア細菌抗原成分を含むがこれに限定されない。また、任意の他の細菌、マイコバクテリア、マイコプラズマ、リケッチア、またはクラミジア抗原も本明細書に記載の細菌抗原に含まれる。
【０３１７】  ３．真菌抗原
本発明の組成物および方法に使用できる真菌抗原は、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）などのヒストプラスマ真菌抗原および他のヒストプラスマ真菌抗原成分；莢膜多糖などのクリプトコックス真菌抗原および他のクリプトコックス真菌抗原成分；球状体抗原などのコクシジオイデス真菌抗原および他のコクシジオイデス真菌抗原成分；およびトリコフィチンなどの白癬真菌抗原および他のコクシジオイデス真菌抗原成分を含むがこれに限定されない。
【０３１８】  ４．寄生虫抗原
原虫および他の寄生虫抗原の例は、メルゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、配偶子嚢胞／配偶子表面抗原、血液段階抗原ｐｆ１  ５５／ＲＥＳＡなどの熱帯熱マラリア原虫抗原および他のマラリア原虫抗原成分；ＳＡＧ−１、ｐ３０などのトキソプラズマ抗原および他のトキソプラズマ抗原成分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシンなどの住血吸虫抗原および他の住血吸虫抗原成分；ｇｐ６３、リポホスホグリカンおよびその会合タンパク質などの大リーシュマニアおよび他のリーシュマニア抗原および他のリーシュマニア抗原成分；および７５−７７ｋＤａ抗原、５６ｋＤａ抗原などのトリパノソーマ・クルージ抗原および他のトリパノソーマ抗原成分を含むがこれに限定されない。
【０３１９】  ５．腫瘍抗原
本発明の組成物および方法に使用できる腫瘍抗原は、テロメラーゼ成分；Ｐ−糖タンパク質などの多剤耐性タンパク質；ＭＡＧＥ−１、α胎児性タンパク質、癌胎児性抗原、変異体ｐ５３、パピローマウイルス抗原、ガングリオシドまたは黒色腫または他の腫瘍細胞の他の炭水化物含有成分を含むがこれに限定されない。任意の型の腫瘍細胞由来の抗原を、本明細書に記載の組成物および方法に使用できると本発明により考えられる。
【０３２０】  ６．自己免疫に関する抗原
自己免疫疾病、アレルギー、および移植片拒絶に関与する抗原を、本発明の組成物および方法に使用できる。例えば、任意の１つ以上の以下の自己免疫疾病または疾患に関与する抗原を本発明に使用できる：糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および浮腫性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群に続発性の乾性結膜炎を含む、シェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物咬創反応によるアレルギー応答、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚性エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、癩病反転反応、結節性紅斑癩病、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側進行性感覚神経聴力損失、再生不良性貧血、真性赤血球系貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーヴス眼病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後ブドウ膜炎、および腸肺線維症。自己免疫疾病に関与する抗原の例は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、チログロブリンおよび甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体を含む。アレルギーに関与する抗原の例は、日本ヒマラヤスギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原などの花粉抗原、塵ダニ抗原およびネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合性抗原、およびペニシリンおよび他の治療薬を含む。移植片拒絶に関与する抗原の例は、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓などの、移植レシピエントに移植する移植片の抗原性成分、および神経移植片成分を含む。抗原は、自己免疫疾病の処置に有用な変化したペプチドリガンドでもよい。
【０３２１】  本発明の組成物および方法で使用できる種々の抗原の例は、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチンなどの内因性ホルモン、および他のホルモン、コカインおよびヘロインなどの耽溺薬物、および抗レプチン受容体抗体のＦａｂ含有部分などの抗原受容体のイディオタイプ断片を含む。
【０３２２】本発明による組換え核酸を含む細胞の調製
細胞を、本明細書で教義したように、当分野で公知の慣用的な方法を介してトランスフェクトする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（分子クローニング：実験マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（１９８９））、および他の実験マニュアルに見出すことができる。ＣＤ４０リガンド、サイトカイン、またはオプソニンをコードしている核酸分子を導入する方法の追加例を下記する。例えば、オプソニン、サイトカイン、ＣＤ４０リガンド、および／または抗原をコードしている導入核酸分子を含む細胞それ自体を、例えばワクチン組成物で、本発明の方法に従って、被検者に（抗原として）投与できる。
【０３２３】Ａ．裸核酸の細胞への導入
１．ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション：裸核酸は、核酸とＤＥＡＥ−デキストランの混合物を形成し、該混合物を細胞と共にインキュベートすることにより細胞に導入できる。ジメチルスルホキシドまたはクロロキンショック段階を追加して、核酸取込み量を増加させることができる。ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションは、インビトロの細胞修飾にのみ適用可能であり、一過性に核酸を細胞に導入するのに使用できるが、安定なトランスフェクト細胞の創製には好ましくない。従って、この方法は、短期間の遺伝子産物の産生には使用できるが、長期の遺伝子産物の産生に選択される方法ではない。ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションのプロトコルは、分子生物学の現存のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．２章、および分子クローニング：実験マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（１９８９）、第１６．４１から１６．４６章または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。
【０３２４】  ２．電気穿孔法：裸核酸はまた、適切な緩衝液中で細胞および核酸を共にインキュベートし、細胞を高電圧電気パルスにかけることにより細胞に導入できる。核酸が電気穿孔法により導入される効率は、印加した電場の強度、電気パルスの長さ、温度、核酸のコンフォメーションおよび濃度、および培地のイオン組成により影響を受ける。電気穿孔法を使用して、安定（または一過性）に多種多様の細胞型をトランスフェクトでき、インビトロでの細胞の修飾にのみ適用可能である。細胞を電気穿孔するプロトコルは、分子生物学の現在のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．３章、および分子クローニング：実験マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（１９８９）、第１６．５４−１６．５５章または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。
【０３２５】  ３．リポソーム媒介トランスフェクション（「リポフェクション」）：裸核酸は、核酸を、カチオン性脂質含有リポソーム懸濁液と混合することにより細胞に導入できる。次いで、核酸／リポソーム複合体を細胞と共にインキュベートする。リポソーム媒介トランスフェクションを使用して、安定（または一過性）にインビトロで培養液中の細胞をトランスフェクトできる。プロトコルは、分子生物学の現在のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．４章、および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。さらに、インビボでの遺伝子送達は、リポソームを使用して達成できる。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６；ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＳＡ８４：７８５１−７８５Ｓ；Ｂｒｉｇｈａｍ等（１９８９）  Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８；およびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ等（１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８４：４２９−４３８参照。
【０３２６】  ４．直接的注入：裸核酸は、核酸を細胞に直接注入することにより細胞に導入できる。インビトロでの細胞培養では、核酸は、微量注入により導入できる。各細胞を個々に微量注入するので、このアプローチは、大量の細胞を修飾する場合には非常に多くの労力がかかる。しかし、微量注入が選択される方法である状況は、トランスジェニック動物の産生においてである（以下でより詳細に議論する）。この状況では、核酸は、安定に受精卵母細胞に導入され、次いで、動物に発達させる。得られた動物は、卵母細胞に導入された核酸を有する細胞を含む。直接注入はまた、裸核酸をインビボで細胞に導入するのにも使用されてきた（例えば、Ａｃｓａｄｉ等（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：８１５−８１８；Ｗｏｌｆｆ等（１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８参照）。インビボでＤＮＡを細胞に注入するための送達装置（例えば、「遺伝子銃」）を使用できる。該装置は市販で入手できる（例えばバイオラッドから）。
【０３２７】  ５．受容体媒介ＤＮＡ取込み：裸核酸はまた、細胞表面受容体のリガンドに連結させた、ポリリジンなどのカチオンと核酸を複合体形成させることにより導入できる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎ等（１９９２）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７；および米国特許第５，１６６，３２０号参照）。核酸−リガンド複合体の受容体への結合は、受容体媒介エンドサイトーシスにより核酸の取込みを容易にする。核酸−リガンド複合体が標的化する受容体は、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体を含む。エンドソームを自然に破壊し、よって細胞質に物質を放出するアデノウイルスキャプシドに連結した核酸−リガンド複合体を使用して、細胞内リソソームによる複合体の分解を防ぐことができる（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ等（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ等（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：２１２２−２１２６参照）。受容体媒介核酸取込みを、インビトロまたはインビボでの細胞への核酸の導入に使用でき、さらに、目的の標的細胞上に選択的に発現される受容体に結合するリガンドの使用により、核酸を特定の細胞型に選択的に標的化できる特徴を追加した。
【０３２８】  一般に、裸核酸を培養液中の細胞に導入する場合（例えば、上記のトランスフェクション技術の１つにより）、ほんの僅かな細胞（１０５中約１）が典型的には、トランスフェクトされた核酸を、そのゲノムに組込む（すなわち、核酸は、細胞にエピソーム様に維持される）。従って、外来性核酸を取り込んだ細胞を同定するために、選択マーカーをコードしている核酸を、目的の核酸（群）と共に、細胞にトランスフェクトすることが有利である。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、目的の遺伝子（群）と同じプラスミドに導入しても、または別々のプラスド上に導入してもよい。
【０３２９】Ｂ．ウイルス媒介遺伝子移行
遺伝子産物をコードしている核酸を細胞に導入する好ましいアプローチは、遺伝子産物をコードしている核酸、例えばｃＤＮＡを含むウイルスベクターの使用による。細胞のウイルスベクターでの感染は、大量の細胞が核酸を受容し、核酸を受容した細胞を選択する必要がないという利点を有する。さらに、例えば、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡにより、ウイルスベクター内にコードされた分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞で効率的に発現され、ウイルスベクター系はインビトロまたはインビボで使用できる。
【０３３０】  １．レトロウイルス：欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法目的の遺伝子移行での使用のために十分に特徴づけられている（論評については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）  Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１参照）。レトロウイルスゲノムに挿入された目的の遺伝子産物をコードしている核酸を有する、組換えレトロウイルスを作成できる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去して、レトロウイルス複製欠陥にできる。次いで、複製欠陥レトロウイルスを、ビリオンにパッケージングし、これは、標準的な技術によりヘルパーウイルスの使用を通じて標的細胞の感染に使用できる。組換えレトロウイルスの産生およびインビトロまたはインビボでの該ウイルスでの細胞の感染プロトコルは、分子生物学の現在のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．１０−９．１４章、および他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。適切なレトロウイルスの例は、ｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭを含み、これは当業者には公知である。適切なパッケージングウイルス系の例は、ψＣｒｉｐ、ψＣｒｅ、＿２、および＿Ａｍを含む。レトロウイルスは、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞を含む、多くの異なる細胞型への、様々な遺伝子のインビトロおよび／またはインビボでの導入に使用できる（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ等（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎ等（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ等（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ等（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙ等（１９９１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ等（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１０８２−１８０５；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ等（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ等（１９９２）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：６４１−６４７；Ｄａｉ等（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ等（１９９３）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；およびＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（およびそれに挿入される外来核酸）が宿主ゲノムに組込まれて核酸を細胞に安定に導入するために、標的細胞分裂を必要とする。従って、標的細胞の複製の刺激が必要であり得る。
【０３３１】  ２．アデノウイルス：アデノウイルスゲノムは、目的の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常溶解ウイルス生活環での複製能の点では不活性化されているように操作できる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ等（１９８８）  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等（１９９１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ等（１９９２）  Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５参照。アデノウイルス株Ａｄ５ｄｌ３２４型または他の株のアデノウイルス（例えば、Ａｄｚ、Ａｄ３、Ａｄ７等）由来の適切なアデノウイルスベクターは当業者には公知である。組換えアデノウイルスは、分裂細胞が効果的な遺伝子送達ベヒクルである必要はないという点で有利であり、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等（１９９２）上記引用）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ等（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４８２−６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２８１２−２８１６）、および筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎ等（１９９２）    Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：２５８１−２５８４）を含む、多種多様な細胞型の感染に使用できる。さらに、導入アデノウイルス核酸（およびそれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組込まれないが、依然としてエピソーム性であり、よって、導入核酸が宿主ゲノム（例えばレトロウイルスＤＮＡ）に組込まれる状況での挿入的変異誘発の結果として起こり得る潜在的な問題を回避する。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ保有能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８ｋｂまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記引用；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されているほとんどの複製欠陥アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルス遺伝子物質の８０％を保持する。
【０３３２】  ３．アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および増殖性生活環のために、ヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする、天然欠陥ウイルスである（論評については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９）。それは、そのＤＮＡを非分裂細胞に組込み得、高頻度の安定な組込みを示す、数個のウイルスの１つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ等（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ等（１９８９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１９８９）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６２：１９６３−１９７３参照）。ＡＡＶの３００という少ない塩基対を含むベクターをパッケージングし、組込むことができる。外来性核酸の空間は、約４．５ｋｂに制限されている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０に記載のようなＡＡＶベクターを使用して、核酸を細胞に導入できる。様々な核酸が、ＡＡＶベクターを使用して異なる細胞型に導入された（例えば、Ｈｅｒｍｏｎａｔ等（１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８５）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ等（１９８８）  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ等（１９８４）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅ等（１９９３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０参照）。
【０３３３】  特定の発現ベクター系の効力および核酸を細胞に導入する方法は、当分野で慣用的に使用される標準的なアプローチにより評価できる。例えば、細胞に導入された核酸は、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えばサザンブロット）により検出でき、導入核酸の転写により産生されたＲＮＡは、例えば、ノザンブロット、ＲＮアーゼ保護または逆転写酵素−複製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出できる。遺伝子産物は、適切なアッセイにより、例えば、特異的抗体を用いた、産生タンパク質の免疫学的検出により、または、酵素アッセイなどの遺伝子産物の機能的活性を検出する機能的アッセイにより検出できる。細胞により発現される目的の遺伝子産物が、容易にアッセイできない場合、調節エレメントに連結したリポーター遺伝子および使用したベクターを使用して最初に発現系を最適化できる。リポーター遺伝子は、容易に検出できる遺伝子産物をコードし、従って、系の効力の評価に使用できる。当分野で使用される標準的なリポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、およびヒト成長ホルモンをコードしている遺伝子を含む。
【０３３４】本発明で有用な細胞
本発明は、ＣＤ４０リガンド増強細胞およびサイトカイン覆膜細胞を提供する。ＣＤ４０リガンド増強細胞およびサイトカイン覆膜細胞の調製に有用な細胞は、以下を含むがこれに限定されない。
【０３３５】  ＣＤ４０リガンド増強細胞およびサイトカイン覆膜細胞は、本発明に従って宿主細胞から調製でき、ここでの宿主細胞は、本発明により抗原の担体として作用できる任意の細胞であり得、従って、核酸を人工的に導入できる、有核細胞または原核細胞であり得る。本発明で有用な原核細胞は、細菌細胞および酵母を含む。本発明で有用な真核（有核）細胞は、真菌細胞、寄生虫細胞および哺乳動物細胞を含む。本発明で有用な哺乳動物細胞は、滑膜細胞などの特殊間葉細胞を含む線維芽細胞、角化細胞、上皮細胞、内皮細胞、白血球および腫瘍細胞を含むがこれに限定されない。
【０３３６】  本発明で有用な細胞系は、Ｂ１６、ＣＭＳ−５、線維肉腫細胞、Ｃｏｓ１細胞およびＣＨＯ細胞、ＴＳ／Ａ、ルイス肺癌、ＲＥＮＣＡ、ダニングラット前立腺癌、および米国細胞培養銀行協会（マナッサス、バージニア州）のカタログに含まれる細胞系を含むがこれに限定されない。
【０３３７】  ＣＤ４０リガンド増強細胞およびサイトカイン覆膜細胞は、本発明に従って病原細胞から調製できる。病原細胞は、腫瘍細胞（例えば、Ｂ１６細胞、ＣＭＳ−５線維肉腫細胞、および「本発明に有用な腫瘍」と題した章に含まれる腫瘍由来の細胞）、および病原細菌、病原真菌、病原ウイルス、病原寄生虫、または病原節足動物由来の細胞を含む。
【０３３８】  本発明はまた、哺乳動物宿主で分裂できない、ＣＤ４０リガンド増強またはサイトカイン覆膜細胞を提供する。
【０３３９】本発明によるサイトカイン、オプソニン、またはＣＤ４０リガンドと混合した細胞の調製
本発明はまた、ＣＤ４０リガンド、並びにサイトカインおよび／またはオプソニンと混合した細胞の調製物を考える。それ故、細胞は、すでに、抗原、例えば、腫瘍細胞抗原（内因性発現抗原または異種抗原）を発現し得、上記に定義したように、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドまたは遺伝子工学操作により改変されたサイトカインと混合し得、調製物は、本発明により、それぞれ、「ＣＤ４０リガンド増強細胞」または「サイトカイン覆膜細胞」と考えられる。この混合物で、調製物は、慣用的な生理学的塩緩衝液中で１μｇ−１００μｇ／ｍｌリガンドと混合した約１０４から１０８細胞からなる。
【０３４０】  本発明が、サイトカイン、オプソニン、またはＣＤ４０リガンドと混合した細胞の調製を包含する場合、サイトカイン、オプソニンまたはＣＤ４０リガンドを、最初に慣用的な手段に従って調製し、次いで細胞と混合する。サイトカイン、オプソニン、またはＣＤ４０リガンドは、宿主細胞株または系のトランスフェクションを介した組換えＤＮＡ技術および組換えタンパク質の単離を介して調製し得る。
【０３４１】  培養液中の真核宿主細胞などの、本発明の宿主細胞を使用して、本発明のポリペプチドを産生（すなわち発現）できる。例えば、トランスフェクトした宿主細胞（これに本発明のポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターを導入する）を、ポリペプチドが産生されるまで、適切な培地中で培養し、培地または宿主細胞から単離し得る。
【０３４２】  ＣａＰＯ４により媒介されるトランスフェクション：裸核酸は、核酸およびリン酸カルシウムを含む沈殿物を形成することにより、細胞に導入できる。例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を、塩化カルシウムおよび核酸を含む溶液と混合して、沈殿物を形成し得、次いで、該沈殿物を細胞と共にインキュベートする。グリセロールまたはジメチルスルホキシドショック段階を加えて、ある細胞により取り込まれる核酸の量を増加できる。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションを使用して、安定（または一過性）に細胞をトランスフェクトでき、インビトロでの細胞修飾にのみ適用可能である。ＣａＰＯ４媒介トランスフェクションのプロトコルは、分子生物学の現在のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等（編）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．１章、および分子クローニング：実験マニュアル第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（１９８９）、第１６．３２−１６．４０章または他の標準的な実験マニュアルに見出すことができる。
【０３４３】人工的に導入した組換え核酸配列からの発現を検出する方法
本発明は、人工的に細胞に導入された、組換え核酸分子から発現されたタンパク質（例えば、本発明によるによる遺伝子工学操作により改変されたＣＤリガンド、サイトカイン、またはオプソニン）を検出する方法を提供する。
【０３４４】抗体の調製
本発明で有用なタンパク質に特異的な抗体（例えば、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンド、サイトカイン、またはオプソニン）は、タンパク質精製に、および、これらのタンパク質を発現している組換え核酸分子を人工的に導入した細胞からのこれらのタンパク質の発現の検出に有用である。抗体により、我々は、該抗体の結合（可変）領域、および他の抗体修飾を使用した作成物を含む。従って、本発明で有用な抗体は、全抗体、抗体断片、多機能性抗体凝集物、または一般に抗体由来の１つ以上の特異的結合部位を含む物質を含み得る。抗体断片は、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片またはその誘導体、例えば、単鎖Ｆｖ断片などの断片であり得る。抗体または抗体断片は、非組換え、組換えまたはヒト化であり得る。抗体は、免疫グロブリンアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ等であり得る。さらに、免疫グロブリンまたはその断片の、凝集物、ポリマー、誘導体およびコンジュゲートを適宜使用できる。
【０３４５】  抗体の産生に有用な本発明に記載のタンパク質（例えば、本発明の遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンド、サイトカインまたはオプソニン）のタンパク質産物（またはその断片またはオリゴペプチド）は生物活性を必要としないが、抗原性でなければならない。特異的抗体の誘導に使用したペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸および好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、それらは天然タンパク質の領域と同一であり、小さな天然に存在する分子の全アミノ酸配列を含み得る。本発明に有用なタンパク質（例えば、本発明の遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンド、サイトカインまたはオプソニン）をコードしている組換え核酸のタンパク質産物に対応するアミノ酸の短伸長は、キーホールリムペットヘモシアニンまたはＧＳＴなどの別のタンパク質由来のアミノ酸と融合させ得、抗体は、キメラ分子に対して産生される。当分野で公知の手順を、本発明の組換え核酸のタンパク質産物に対する抗体の産生に使用できる。
【０３４６】  抗体の産生のために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む、様々な宿主に、本発明で有用なタンパク質（例えば、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンド、サイトカインまたはオプソニン）をコードしている組換え核酸分子のタンパク質産物（または免疫原性特性を保持するその任意の部分、断片、またはオリゴヌクレオチド）を注入することにより免疫化し得る。宿主種に応じて、様々なアジュバントを使用して、免疫応答を増加させ得る。該アジュバントは、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、およびリゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリムペットヘモシアニン、およびニトロフェノールを含むがこれに限定されない。ＢＣＧ（カルメット−ゲランの桿菌）およびコリネバクテリウム・パビウムは、潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０３４７】１．ポリクローナル抗体
抗原タンパク質は、その免疫原性を高めるために、慣用的な担体にコンジュゲートさせ得、ペプチド−担体コンジュゲートに対する抗血清が生じる。ペプチドの担体タンパク質への結合および免疫化は、記載の通りに実施し得る（Ｄｙｍｅｃｋｉら、、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：４８１５）。血清は、エリザ（下記）により、または別にドットまたはスポットブロットによりタンパク質抗原に対して滴定できる（ＢｏｅｒｓｍａおよびＶａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ、１９９４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５１：３１７）。同時に、抗血清を、記載のように調製した組織切片に使用し得る。有用な血清は、例えば、Ｇｒｅｅｎら、、１９８２、Ｃｅｌｌ、２８：４７７の手順に従って、エリザにより適切なペプチドと強力に反応する。
【０３４８】２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を調製する技術は公知であり、モノクローナル抗体は、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９４；２７８により記載のように、そのレベルを測定するか、または不活性化またはアフィニティー精製する、好ましくは担体に結合した、候補抗原を使用して調製し得る。
【０３４９】  モノクローナル抗体は、典型的には、ハイブリドーマ組織培養物から、またはハイブリドーマ組織を導入した動物から得られた腹水から得られる。
【０３５０】  モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（またはポリクローナル血清）は、標的タンパク質への抗体の結合についてスクリーニングできる。
【０３５１】３．抗体検出法
特に好ましい免疫学的試験は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用に依拠し、酵素結合免疫測定法（エリザ）、免疫ブロット法および免疫沈降法（Ｖｏｌｌｅｒ、１９７８、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ、２：１、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、ウォルカースビル、メリーランド州；Ｖｏｌｌｅｒら、、１９７８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、３１：５０７；米国再発行特許第３１，００６号；英国特許第２，０１９，４０８号；Ｂｕｔｌｅｒ、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：４８２；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ（編）、１９８０、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ出版、ボーカラトーン、フロリダ州参照）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、ラジオイムノアッセイの原理、放射リガンドアッセイの７番目のトレーニングコース、Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月、ｐ．１−５、４６−４９および６８−７８）を含む。本発明で有用なタンパク質（例えば、遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンド、サイトカインまたはオプソニン）をコードしている組換え核酸により産生されるタンパク質の存在または非存在について組織を分析するために、免疫組織化学技術を使用し得る。抗体分子は、標的タンパク質の容易な検出を促進するため標識され得ることは当業者には明らかである。抗体分子を標識する技術は、当業者には公知である（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８９、抗体、コールドスプリングハーバーラボラトリー参照）。
【０３５２】免疫応答が本発明に従って調節されるかの決定
細胞に含まれる抗原または抗原群に対する、哺乳動物、好ましくはヒトの免疫応答を調節するために、ＣＤ４０リガンド増強細胞およびサイトカイン覆膜細胞が本発明で有用である。細胞が投与され、抗原提示細胞により取り込まれる（すなわち摂取または貪食）。別に、細胞を、貪食作用を可能とする条件下でインビトロで抗原提示細胞と接触させる。
【０３５３】  「免疫応答」は、免疫系に関与する選択応答の刺激／活性化、または選択応答の抑制、排除、または減弱を意味する。好ましい実施形態において、免疫応答は、ＣＤリガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞ではない対照細胞と比べて、少なくとも約５％、または好ましくは５ないし５０％、またはより好ましくは５０ないし１００％、または少なくとも１００％またはそれ以上の、免疫系に関与する選択応答の刺激／活性化、または、少なくとも約５％、または好ましくは５ないし５０％、またはより好ましくは５０ないし１００％、または少なくとも１００％またはそれ以上の、選択応答の抑制、排除、または減弱を意味する。従って、免疫応答の調節は、ＣＤリガンド増強細胞またはサイトカイン覆膜細胞ではないことを除き全ての点で同一の細胞を同一の様式で投与する場合に、所望の応答が、より効率的、より迅速、より大きく、および／またはより容易に誘導されることを意味する。被検者における異なる免疫応答は、様々に調節され得、例えば、細胞性免疫応答は選択的に増強され得るが、体液性応答は選択的に減弱され得、その逆もある。
【０３５４】  以下のインビトロおよびインビボアッセイは、免疫応答が本発明に従って調節されたかを決定するのに有用である。詳細に下記したアッセイは、抗原に対する細胞性または体液性免疫応答の刺激または抑制を測定する。以下のアッセイで言及した抗原は代表的なものである。本発明で有用な選択抗原に対する免疫応答を、その抗原にアッセイを適合させることにより、１つ以上の以下のアッセイを使用して測定し得ることは当業者には明らかである。
【０３５５】Ｉ．貪食作用の増加の検出
以下のアッセイは、オプソニン増強細胞、サイトカイン覆膜細胞、またはＣＤ４０リガンド増強細胞が、抗原提示細胞による貪食作用を刺激するかを決定するために使用し得る。
【０３５６】  貪食作用は、ＦＣＳを添加していないＲＰＭＩ中３７℃で３０分間粘着させた単球を使用して調べる。ヒツジ赤血球を、オプソニン、ＣＤ４０リガンド、サイトカイン、またはその前駆体と共に、平均して３００以下の該分子が各赤血球に沈着するような条件下でインキュベートする。前駆体を使用する場合、次いで、覆膜赤血球を処理して、全前駆体を実際の候補分子に変換する（例えば、Ｃａｒｌｏら、、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：５２３−８（１９７９）参照）。新鮮な単球を被検者から単離し、５×１０４−１×１０５のこれらの細胞を、１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地０．２５−０．５ｍｌに懸濁する。このアリコートを、組織培養ウェルに入れ、３０分間３７℃でインキュベートする。１．２×１０８細胞／ｍｌで懸濁した過剰の覆膜赤血球を、単球にのせ、プレートを５分間５０ｇで遠心分離し、３０分間３７℃でインキュベートする。非摂取物質を、氷冷溶解緩衝液を使用して２つの低張溶解段階で除去し、粘着細胞を固定および染色し、細胞を光学顕微鏡で調べる。貪食作用を、１つ以上の標的細胞を摂取した１００単球の比率を決定することにより定量し、摂取Ｅ／１００単球（ＰＩ）の全数を記録する。本発明での貪食作用の刺激は、４０と等しいかそれ以上の貪食係数により示される。
【０３５７】ＩＩ．免疫応答の増幅は、通常、普通休止状態である特定の亜個体群のリンパ系細胞の増殖を含む
増殖アッセイは、臨床試験で以下の適用を有する：（１）マイトジェンまたは抗ＣＤ３抗体などの多クローン性増殖シグナルへの応答能に現れる、Ｔ細胞またはＢ細胞の全体的な免疫学的適合性の評価。増殖欠陥は、基本的な細胞性免疫欠陥の指標であり得る。低増殖がしばしば、慢性疾病の非特異的二次効果として見られる。（２）特異的抗原に対する個体の評価、ここでの低い応答は、一般的または特異的免疫欠陥の指標である。（３）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によるＭＨＣ適合性の決定。
【０３５８】  さらに、増殖アッセイは、リンホカイン産生の推定、シグナル伝達の調査、およびＴまたはＢ細胞の増殖因子要求（例えばリンホカイン）の評価に有用である。ここに概略を述べた手順は、細胞増殖と通常よく相関する、［３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの取込みを測定し、細胞数の変化により測定される。しかし、活性化刺激が、イオノマイシンとホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）などの化学活性化物質のように、毒性である場合、活性化後の新規ＤＮＡ合成の発生は、生細胞の正味の増加を伴わないことがあり、事実、細胞数の減少が観察され得る。この場合、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン取込みは、細胞数の推定よりも初期細胞刺激の指標となる。さらに、［３Ｈ］チミジン取込みは、個々の細胞ではなく細胞個体群に関する情報を提供する。フローサイトメトリーなどの別の方法を、その種類の情報を必要とする研究に使用し得る。
【０３５９】抗原誘導Ｔ細胞増殖アッセイ
このプロトコルは、特異的抗原−破傷風毒素に応答したＴ細胞の増殖を試験するために設計される。それは、任意のタンパク質または多糖抗原に応答したＴ細胞増殖を試験するために修飾できる。材料：（Ｔ細胞懸濁液、自己抗原提示細胞懸濁液（非Ｔ細胞）、破傷風溶液（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  ｏｒ  Ｓｔａｔｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）。（１）Ｔ細胞を計測し、完全ＲＰＭＩ−１０ＡＢで１×１０６細胞／ｍｌに調整する。（２）一方向ＭＬＲプロトコルの段階２のように、抗原提示細胞を、マイトマイシンＣで処理（または２５００ｒａｄで照射）する。抗原提示細胞の濃度を２×１０５細胞／ｍｌに調整。抗原提示細胞は、自己非Ｔ細胞または自己単球／マクロファージからなり得る。（３）１００μｌのＴ細胞懸濁液および５０μｌの抗原提示細胞個体群をウェルに加え；分配前に混合する。（４）５０μｌの破傷風毒素を加え、最終濃度を０、１、５、１０および２０μｇ／ｍｌとする。各希釈について３つのウェルを調製する。（５）加湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６日間インキュベートする。（６）［３Ｈ］チミジンでパルスし、支持プロトコルに記載の通り収集する。
【０３６０】リンホカイン依存性細胞増殖アッセイ
このプロトコルは、リンホカイン依存性リンパ球個体群の増殖、この場合は、ＩＬ依存性Ｂ細胞の増殖をアッセイする。材料：（扁桃腺Ｂ細胞懸濁液、セファロースビーズ（バイオ−ラッド）に架橋した抗ＩｇＭ、完全ＲＰＭＩ中の１０，０００Ｕ／ｍｌのヒトｒＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ））。（１）扁桃腺Ｂ細胞を計測し、濃度を完全ＲＰＭＩ−１０を用いて１×１０６細胞／ｍｌに調整。（２）１００μｌの扁桃腺Ｂ細胞を各ウェルに分配する。各実験条件について３つのウェルを調製する。（３）１０，０００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−４溶液を、１：１０、１：１００および１：１０００に希釈する。２０μｌの原液または希釈液を適切なウェルに加え、１０００Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌ、および１Ｕ／ｍｌを得る。ｒＩＬ−４を含まない対照ウェルを含める。（４）抗ＩｇＭビーズを適切なウェルにピペットする。
【０３６１】  試験的な実験を用いて最適なビーズ濃度を決定する。最適用量を「定める」ために各実験に数個のビーズ濃度を含めるのが最善である。扁桃腺Ｂ細胞およびＩＬ−４希釈液のみ、抗ＩｇＭビーズのみ、培養培地のみ、およびＩＬ−４および抗ＩｇＭビーズ希釈液の全ての組合せでウェルを調製する。（５）各ウェルの容量を、必要であれば完全ＲＰＭＩ−１０を用いて２００μｌに増加する。（６）加湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で５日間培養する。（７）［３Ｈ］チミジンでパルスし、支持プロトコルに記載の通り収集する。
【０３６２】［３Ｈ］チミジンパルスおよび細胞培養物の収集
このプロトコルを、先行プロトコルと共に使用して、［３Ｈ］チミジン取込みアッセイを完全にする。（１）２０μｌの５０μＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］チミジンを各培養物（１．０μＣｉ）に一定時間に加え、培養を終了する（通常６または１８時間）。（２）細胞を吸引し、細胞を溶解し、ＤＮＡをろ紙上に移す自動マルチウェル収集器を使用して細胞培養物を収集し、一方、非取り込み［３Ｈ］チミジンを洗い流す。各列のマイクロタイタープレートを１０回充填および吸引し、完全な細胞移行および完全な非取り込みチミジンの除去を確実にする。各ろ紙片を１００％エタノールで洗浄し乾燥し易くする。シンチレーションバイアルに移す。半自動収集器用には、各ウェルのフィルタードットを、シンチレーションカウントバイアルに移す。手動移行用には、ランプ下でフィルターを乾燥させ、ピンセットでシンチレーションバイアルに移す。シンチレーション液を各バイアルに移す。（３）標準誤差が２％以下となるまで、シンチレーションカウンターでサンプルを計測する。バックグラウンド培養物および各実験状態の平均ｃｐｍを計算する。複製培養物の変動は２０％以下とする。
【０３６３】ＩＩＩ．インビトロ抗体応答の誘導および測定
タンパク質または多糖抗原でインビボ免疫化した後に抗体応答を引き起こすヒト免疫系の能力は、免疫系のＢおよびＴ細胞アームの両方の全体的な完全性を表す指標である。従って、インビボ免疫化と続く抗体応答の測定は、様々な後天性および先天性免疫不全症、並びに、免疫系に影響を及ぼす他の状態の宿主における免疫機能の適切な試験である。以下の手順は、インビボ免疫化およびエリザ技術を使用した続く免疫応答の測定用である。
【０３６４】ＮＩＰ−およびＨＲＰＯ−標識抗体を使用したサイトカインについての免疫酵素アッセイ
このプロトコルは、マイクロタイタープレートに結合させた覆膜抗体によりサイトカインが固定される、異種非競合的イムノアッセイ反応を使用した、サイトカインについての免疫酵素アッセイを記載する。非結合物質を洗い流し、ハプテンニトロヨードフェニル（ＮＩＰ）で標識した異なる抗サイトカイン抗体を使用して検出を行う。これは、次いで、色素生産性基質ＡＢＴＳで現れる、抗ＮＩＰ抗体のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲートにより検出される。この非競合的イムノアッセイで、イムノアッセイシグナル（Ａ４０５）は、サンプルに存在するサイトカインの量の直接的な関数として増加する。抗体は、免疫学の現在のプロトコル、１９９５、６．２０．２−６．２０．１０に記載の通り調製する。
【０３６５】  アッセイプレートの覆膜。（１）多チャネルピペッターを使用して、１００μｌの適切な覆膜抗体の希釈液を、使用するアッセイプレートの全ウェルに移す。（２）プレートを、マイクロタイタープレートシールまたはパラフィンで封をし、２時間３７℃でインキュベートする。調製プレートにサンプルおよび標準液を調製する。（３）アッセイする各サンプル（またはならし培地のアリコート）を等量のイムノアッセイ希釈液で希釈する。（４）１ｍｌまたはそれ以下のアッセイする各希釈サンプルを、別々のスピン−Ｘ微量ろ過装置の上チャンバーにピペットする。５分間１０，０００ｒｐｍで微量遠心し、低チャンバーに集まる濾液を保持する。（５）６５μｌの各希釈サンプルを、調製プレート（すなわち、９６ウェルマイクロタータープレート）の適切なウェルに加える。（６）室温でサイトカイン標準液のアリコートを解凍し、確実に十分に混合する。１３０μｌを、標準曲線の最高濃度を示す調製プレートのウェルにピペットする。このウェルから６５μｌを次に移し、次いで、標準曲線に提示される各濃度６５μｌが、調製プレートの適切なウェルに配置するように、イムノアッセイ希釈液で１：１の希釈の実施を続ける。（７）室温でカリブレーターのアリコートを解凍する（使用する場合）。等量のイムノアッセイ希釈液で希釈し、次いで、６５μｌの希釈カリブレーターを、調製プレートの適切なウェルまたはウェル群にピペットする。
【０３６６】  覆膜抗体と共にインキュベートする。（８）インキュベーターから覆膜アッセイプレートを取り出す。１×洗浄緩衝液で充填した２リットルビーカーに浸漬し、次いで、シンク上で反転させ振り液体を除去する。さらに２回反復し、ペーパータオル上に叩き乾燥させる。（９）多チャネルピペッターを使用して、調製プレートの各ウェルから５０μｌの溶液を、対応するアッセイプレートのウェルに移す。（１０）プレートを、マイクロタイタープレートシールまたはパラフィンで封をし、２時間室温でインキュベートする。
【０３６７】  検出抗体と共にインキュベートする。（１１）目的のサイトカインに特異的なＮＩＰ標識検出抗体を、検出緩衝液で１μｇ／ｍｌに希釈する。（１２）段階８のようにアッセイプレートを洗浄する。（１３）段階１１からの７５μｌ希釈検出抗体を、未使用の外ウェルを含む、アッセイプレートの全ウェルに加える。（１４）プレートを、マイクロタイタープレートシールまたはパラフィンで再度封をし、１時間室温でインキュベートする。
【０３６８】  ＨＲＰＯコンジュゲート抗ＮＩＰ抗体と共にインキュベートする。（１５）ＨＲＰＯコンジュゲート抗ＮＩＰＭａｂを検出緩衝液で１：３０００に希釈する。（１６）段階８のようにアッセイプレートを洗浄する。（１７）段階１５からの希釈ＨＲＰＯ標識抗ＮＩＰ抗体を、アッセイプレートの全ウェルに加える。（１８）プレートを、マイクロタイタープレートシールまたはパラフィンで再度封をし、１時間室温でインキュベートする。
【０３６９】  色素生産性基質と共にインキュベートする。（１９）段階８のようにアッセイプレートを洗浄する。（２０）１００μｌのＡＢＴＳ基質作用溶液を、アッセイプレートの全ウェルに加える。プレートを覆い、発色が所望のレベル（一般に、最も高い濃度の標準液を含むウェルのＡ４０５が１．５ないし２となるまで）に到達するまで、室温でインキュベートする。このプロトコルは通常、３０−６０分後に解読できるアッセイを提供する。
【０３７０】  プレートを解読し、データを分析する。（２１）コンピューターインターフェースを有するマイクロタイタープレート解読器を使用して、単波長モードで４０５ｎｍでまたは二波長モードで４０５および６５０ｎｍで全ウェルの吸光度を測定する。（２２）カーブフィッティングソフトウェアを使用して、一度（線形）、二度（二次）または四パラメーター（非線形）数学的機能により記載された曲線に標準データを当てはめる。（２３）未知のサイトカインサンプルからの吸光度データを、当てはめた標準曲線に補間し、サイトカイン濃度を計算する。
【０３７１】ＩＶ．インビボ抗体応答の誘導は、免疫系の全体的な完全性の評価に対するアプローチを提供する
ここに提示したプロトコルでは、ジフテリアおよび破傷風毒素は、代表的なタンパク質抗原として使用され、肺炎球菌多糖は、その安全性および利用性から代表的な多糖抗原として使用される。しかし、これらの抗原により顕現される応答は、過去のワクチン接種および自然曝露のために二次応答であるようである。一次応答を得るために、キーホールリムペットヘモシアニンなどの珍しい抗原を使用する。
【０３７２】  抗原を、ここにあるように、筋肉内または皮下経路により投与する場合、「全身」免疫応答が誘導され、循環抗体の測定が最も適切である。しかし、時に「局所」または粘膜免疫応答の評価に関心のある場合がある。この場合、抗原は、呼吸器リンパ組織を刺激するために鼻腔内に、または胃腸管リンパ組織を刺激するために経口的に投与され、血液よりむしろ、気管支洗浄液または腸液を抗体含量についてアッセイし；さらに、局所／粘膜応答の刺激により適切な抗原を使用する（すなわち、呼吸器応答ではインフルエンザウイルス抗原および胃腸管応答ではコレラ毒素）。
【０３７３】  インビボ抗体応答のアッセイにおいて、タンパク質および多糖抗原の両方に対する応答を決定することが重要である。なぜなら、これらの抗原は免疫系の異なる成分を刺激するからである。これに関して、タンパク質抗原に対する主要な抗体応答は、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３サブクラス抗体からなり、一方、多糖抗原に対する主要な抗体応答はＩｇＧ２サブクラス抗体からなる。
【０３７４】  様々なイムノアッセイ技術が、インビボ免疫化後に得られた材料における抗体応答の測定に使用されている。これらの中で、エリザアッセイは、安定で、容易に測定でき、再現性で、安全な解読が得られることから、おそらく最も有用である。
【０３７５】タンパク質／多糖抗原に対するインビボ抗体応答の誘導
このプロトコルでは、抗原を、筋肉内または皮下経路により投与し、血清を応答の測定のために集める。（１）前以て免疫化した血液サンプルを引き出し、血液を凝血させ、血塊から遠心分離により血清を分離する。血清を適切に標識したプラスチックチューブ中−２０℃から−７０℃で貯蔵する。（２）適切に調製した筋肉内部位（三角筋または大腿）に０．５ｍｌのトキソイド混合物を注入し、物質を静脈内注入しないように注意する。（３）適切に調製した皮下部位に０．５ｍｌの高価肺炎球菌ワクチンを注入し、物質を静脈内注入しないように注意する。（４）所望の間隔で、通常１、２、および３週間間隔で免疫化後の血液サンプルを引き出す。血清を分離し、−２０℃から−７０℃に貯蔵する。（５）全ての血清サンプルを集めた後、サンプルを、エリザを使用して抗体の存在についてアッセイする。
【０３７６】  エリザは、破傷風およびジフテリアブースターおよび多価肺炎球菌多糖ワクチンでワクチン接種した個体から得られた血清中のタンパク質および多糖抗原を含む、様々な抗原に対するインビボ抗体応答を測定するための、迅速で、感度が高く、再現性で、非放射活性の方法を提供する。破傷風、ジフテリアおよび肺炎球菌多糖Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型に特異的なアッセイは、免疫学の現在のプロトコル、１９９５、第６および７巻に詳述されている。
【０３７７】腫瘍拒絶を使用したアッセイ
免疫調節の別のアッセイで、免疫適合性動物に、１０４−１０８の次元の照射サイトカイン覆膜またはＣＤ４０リガンド増強腫瘍細胞をワクチン接種し、１０４−１０８の次元の生野生型腫瘍細胞で攻撃する（任意の一時的順序）。これらの細胞の生存または腫瘍開始が、サイトカイン覆膜またはＣＤ４０リガンド増強細胞の代わりに照射非サイトカイン覆膜／非ＣＤ４０リガンド増強細胞を、同一パラメータを使用して、ワクチン接種した動物のそれとは異なる場合、免疫調節が生じた。例えば、試験群の少なくとも１０％の動物が、対照群の平均生存よりも１００％長く生存する場合、試験は陽性である。別の例として、２０％の試験動物の腫瘍の開始が、対照動物の平均開始よりも５０％遅くあり得る。
【０３７８】用途
本発明を適用可能な腫瘍
本発明は、以下を含むがこれに限定されない腫瘍の処置を考える：黒色腫、扁平上皮細胞腫瘍、基底細胞癌、星状腫、神経膠腫、多形グリア芽腫、多形（ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、髄膜腫、脳室上衣腫、シュワン腫、神経芽腫、網膜芽腫、髄膜腫、グロムス腫瘍、例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、滑膜細胞肉腫、線維肉腫、紡錘細胞腫瘍、血管肉腫、原始神経外胚葉細胞腫瘍、およびカポジ肉腫を含む肉腫、リンパ腫、急性および慢性白血病、頭頸部腫瘍、鼻咽頭癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、胸腺腫、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸および直腸癌、中皮腫、腺癌、扁平上皮癌、気管支肺胞癌および小細胞癌を含む肺癌、膵臓癌、島細胞および非島細胞腫瘍、乳癌、心粘液腫、下垂体腫瘍、カルチノイド腫瘍、肝細胞腫、胆管癌、肝芽腫、腎細胞癌、腎芽腫、ウィルムス腫瘍、副腎癌、クロム親和芽細胞腫、胚細胞腫瘍、絨毛癌、卵巣癌、精巣癌、精上皮癌、子宮体腫瘍、前立腺癌、精嚢癌、膣腫瘍、陰茎癌、胞状奇胎、胆嚢癌、および膀胱癌。
【０３７９】本発明でのトランスジェニック動物
本明細書に記載した遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドまたは遺伝子工学操作により改変されたサイトカインをコードしている核酸分子は、非ヒトトランスジェニック動物の産生に使用でき、該トランスジェニック動物の細胞を単離して、動物またはヒトワクチン接種のワクチン製剤に使用できる。
【０３８０】  例えば、１つの実施形態において、核酸分子を、受精卵母細胞または胚幹細胞に導入する。次いで、該細胞を使用して、本発明のポリペプチドをコードしている外来性核酸分子をそのゲノムに導入した非ヒトトランスジェニック動物、または内因性核酸分子を変化させた相同的組換え動物を創製できる。該動物は、本発明の分子の機能および／または活性の研究に、および本発明の分子の活性の修飾因子の同定および／または評価に有用である。本明細書に使用した「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、動物の１つ以上の細胞がトランスジーンを含む。トランスジーンは、細胞のゲノムに取り込まれ、それからトランスジェニック動物が発達し、成熟動物のゲノムに存続し、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織でコードされた遺伝子産物の発現を支持する、外来性核酸である。
【０３８１】  本発明のトランスジェニック動物は、本明細書に記載のポリペプチドをコードしている核酸分子を、受精卵母細胞の雄性前核に、例えば微量注入により導入し、卵母細胞を偽妊娠雌育成動物に発達させることにより創製できる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、トランスジーンに含めて、トランスジーンの発現の効率を増加できる。組織特異的調節配列（群）をトランスジーンに機能的に連結させて、本発明のポリペプチドの発現を特定の細胞に指向できる。胚操作および微量注入を介してトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作成する方法は、当分野では慣用的となり、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および４，８７０，００９号（これは両方共Ｌｅｄｅｒ等による）、Ｗａｇｎｅｒ等による米国特許第４，８７３，１９１号およびＨｏｇａｎ，Ｂ、マウス胚の操作（コールドスプリングハーバーラボラトリー出版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８６）に記載されている。類似の方法を、他のトランスジェニック動物の産生にも使用する。トランスジェニック確立動物は、本発明の核酸分子の存在、例えば、そのゲノム内でのトランスジーンおよび／または動物の組織または細胞のトランスジーンｍＲＮＡの発現に基づき同定できる。次いで、トランスジェニック確立動物を使用して、トランスジーンを有するさらなる動物を繁殖できる。さらに、本発明のポリペプチドをコードしているトランスジーンを有するトランスジェニック動物はさらに、他のトランスジーンを有する他のトランスジェニック動物に繁殖できる。
【０３８２】  本発明はさらに、以下の例証により説明され、これはさらなる制限として捉えるべきでない。
【０３８３】例証
遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドの作成
実施例１
ヒトＣＤ１５４−ＧＰＩの作成
ヒトＣＤ１５４−ＧＰＩ作成物は、下記したＰＣＲパラメータおよびオリゴヌクレオチドを使用して複製連鎖反応（ＰＣＲ）法により調製する。
【０３８４】以下のオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞全ｃＤＮＡからＣＤ１５４の２つの部分のいずれかを増幅する：
上流オリゴヌクレオチド：
５’ｐＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＧＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＡＧＡＡ３，
または
５’ｐＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧ３’；
下流オリゴヌクレオチド；
５’ｐＴＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＧＧＡＣＧ３’ＰＣＲパラメータ：変性９４℃で１分間
アニーリング６５℃で１分間
伸長７２℃で１分間
維持７２℃で１０分間（最終サイクル）。
【０３８５】  ＰＣＲは、アガロースゲル上に可視バンドを生じる最少数のサイクルでＰｆｕポリメラーゼを使用して実施する。ＰＣＲの完了後、反応液を４℃で１０分間冷却させる。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルを通して電気泳動した後に精製する。ＤＮＡバンドを切出し、ＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎから購入したキットを使用して精製する。
【０３８６】  精製ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ１で消化する。消化後、反応混液をフェノール：クロロホルム（１：１）で、次いでクロロホルムで抽出する。水層を０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２に調整し、ＤＮＡを２容量のエタノールで−８０℃で２時間沈殿させる。
【０３８７】  ＤＮＡを遠心分離によりペレット化し、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで濯ぐ。ペレットを真空下で乾燥させる。
【０３８８】  ＤＮＡを滅菌水に再度懸濁し、前以てＥｃｏＲＩ−ＮｇｏＭＩで消化しておいたｐＵＣ１９−ＧＰＩ２１（下記）にライゲートする。ライゲートは、１時間室温で行う。増幅ＤＮＡにライゲートしたＰＵＣ１９ＧＰＩ２１を使用して、コンピテントＡＧ−１細胞を形質転換する。形質転換ＡＧ−１細胞を、アンピシリンを含むＬＢプレート上で選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、下記のように分析する。制限消化を行い、ｐＵＣ１９ＣＤ１５４−ＧＰＩ２１キメラ作成物を確認する。陽性クローンからのＤＮＡを単離し、シークエンスしてその実体を確認する。
【０３８９】実施例２
マウスＣＤ１５４−ＧＰＩの作成
ネズミＣＤ１５４−ＧＰＩ作成物を、下記のＰＣＲパラメータおよびオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲ法により調製する。
【０３９０】  以下のオリゴヌクレオチドを使用して、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞全ｃＤＮＡからＣＤ１５４の２つの部分のいずれかを増幅する：上流オリゴヌクレオチド
５’ｐＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧＡＴＡＡＧＧＴＣＧＡ３’、
または
５’ｐＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡ３’；
下流オリゴヌクレオチド：
５’ｐＴＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧ３’ＰＣＲパラメータ：変性９４℃で１分間、アニーリング６５℃で１分間、伸長７２℃で１分間、維持７２℃で１０分間（最終サイクル）。
【０３９１】  ＰＣＲは、アガロースゲル電気泳動上に可視バンドを生じる最少数のサイクルでＰｆｕポリメラーゼを使用して実施する。ＰＣＲ後、反応液を４℃で１０分間冷却させる。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルを通して電気泳動した後に精製する。ＤＮＡバンドを切出し、ＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎから購入したキットを使用して精製する。
【０３９２】  精製ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ１で消化する。消化後、反応混液をフェノール：クロロホルム（１：１）で、次いでクロロホルムで抽出する。水層を０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２に調整し、ＤＮＡを
２容量のエタノールで−８０℃で２時間沈殿させる。
【０３９３】  ＤＮＡを遠心分離によりペレット化し、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで濯ぐ。ペレットを真空下で乾燥させる。
【０３９４】  ＤＮＡを滅菌水に再度懸濁し、前以てＥｃｏＲＩ−ＮｇｏＭＩで消化しておいたｐＵＣ１９−ＧＰＩ２１（下記）にライゲートする。ライゲートは、１時間室温で行う。増幅ＤＮＡにライゲートしたＰＵＣ１９ＧＰＩ２１を使用して、コンピテントＡＧ−１細胞を形質転換する。形質転換ＡＧ−１細胞を、アンピシリンを含むＬＢプレート上で選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、下記のように分析する。制限消化を行い、ｐＵＣ１９ＣＤ１５４−ＧＰＩ２１キメラ作成物を確認する。陽性クローンからのＤＮＡを単離し、シークエンスしてその実体を確認する。キメラタンパク質の発現を測定するために、ＣＤ１５４断片と共に枠内に、およびその直ぐ上流に、分泌シグナル配列、例えばマウスＩＬ−２のものを配置する断片を発現ベクターにクローン化する。
【０３９５】潰伝子工学操作により改変されたサイトカインの作成
実施例３
ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰ１の作成
ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ作成物は、下記の通り調製する。
【０３９６】  以下の２つのオリゴヌクレオチドは、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミッドランド、テキサス州）から購入した：ＧＴＸ−５
５’ｐＡＡＴＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴＧＣＴＣＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣＴＧＧＴＣＡＡＧＴＧＴＧＡＧＧＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＡＡＣＡＣＣＴＣＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＧＴＡＣ３’
ＧＴＸ−５は：
ａ．ＥｃｏＲＩ部位（塩基１−５）にライゲートするに適した５’末端の配列  ｂ．インフレームキメラコード配列（塩基９−１４）を創製するためのＮｇｏＭ１部位
ｃ．ヒトＴｎｙ−１のＧＰＩ修飾配列のコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ１１７４９）（塩基１５−１３７）
ｄ．終止コドン（塩基１３８−１４０）
ｅ．ＫｐｎＩ部位へのライゲート用の３’末端の配列（塩基１４４−１４８）を含む。
【０３９７】  ＧＴＸ−６（以下）と呼ばれる、ねじれ末端を除き、ＧＴＸ−５に相補的なオリゴヌクレオチドも購入した。
【０３９８】ＧＴＸ−６：
５’ｐＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＧＧＡＣＡＴＧＡＡＡＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＴＧＴＴＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＴＧＣＣＣＴＣＡＣＡＣＴＴＧＡＣＣＡＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＴＧＣＣＧＧＣＧＣＧＧ３’。
【０３９９】  ＧＴＸ−５およびＧＴＸ−６を最終濃度１μｇ／λで個々のチューブの滅菌水に溶解した。ＧＴＸ−５およびＧＴＸ−６は、最終濃度１００ｎｇ／λで混合し、６０分間室温でアニールさせた。
【０４００】  次いで、ＧＴＸ−５：ＧＴＸ−６二本鎖オリゴヌクレオチド（Ｔｈｙ−ＧＰＩ）をプラスミドｐＵＣ１９にクローン化した。４μｇのｐＵＣ１９ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した。電気泳動後、線形ＤＮＡを製造業者により提供された指示に従ってＱｉａｇｅｎ（サンタカタリナ、カリフォルニア州）ゲル精製キットを使用して０．７％アガロースゲルから精製した。１００ｎｇのＧＴＸ−５：ＧＴＸ−６オリゴヌクレオチドを、室温で６０分間、最終容量２０μ１中、２００ｎｇのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ消化ｐＵＣ１９にライゲートした。
【０４０１】  プラスミドを、ストラタジーンから購入した、コンピテントＡＧ−１細胞に形質転換した。形質転換Ｅ．コリをＬＢ−ａｍｐプレートに接種した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢプレート上で増殖している細菌コロニーを拾い、１ｍｌのａｍｐ含有ＬＢに接種し、一晩３７゜で撹拌しながら増殖させた。
【０４０２】  プラスミドＤＮＡを標準的なアルカリ溶解ミニプレッププロトコルを使用して単離した。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した。ＤＮＡを、臭化エチジウムで染色した１．６％アガロースゲル上で電気泳動し、約１４８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片を含むコロニーをかくして同定した。陽性コロニーを１００ｍｌのアンピシリン含有ＬＢに接種し、一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎから購入したキットを使用して精製した。
【０４０３】  今回ｐＵＣ−ＧＰＩ２１と称した、Ｔｈｙ−ＧＰＩ陽性クローンのヌクレオチド配列をシークエンスして、その実体を確認した。
【０４０４】  ＧＭ−ＣＳＦコード配列を、クロンテック（パロアルト、カリフォルニア）から購入したマウス肺ｃＤＮＡライブラリーから増幅した。ＰＣＲプライマーを以下の通りであった：
上流オリゴヌクレオチド：
５’ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＴＧＴＧＧＴＣＴＡＣ３’
下流オリゴヌクレオチド：
５’ＣＡＧＣＣＧＧＣＴＴＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＡＴＣＡＧＴＣＡＧ３’
ＰＣＲパラメータ：変性９０℃で１分間
アニーリング６０℃で１分間
伸長７２℃で１分間。
【０４０５】  ＰＣＲは、Ｔａｑポリメラーゼを使用して３０サイクル実施した。ＰＣＲ完了後、反応液を４℃で１０分間冷却させた。
【０４０６】  ＧＭ−ＣＳＦ  ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルを通して電気泳動した後に精製した。ＤＮＡバンドを切出し、ＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎから購入したキットを使用して精製した。
【０４０７】  次いで、精製ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭＩで消化した。消化後、反応混液をフェノール：クロロホルム（１：１）で、次いでクロロホルムで抽出する。水層を０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２に調整し、ＤＮＡを２容量のエタノールで−８０℃で２時間沈殿させる。ＤＮＡを遠心分離によりペレット化し、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで濯ぐ。ペレットを真空下で乾燥させる。
【０４０８】  ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡを滅菌水に再度懸濁し、ＥｃｏＲＩ−ＮｇｏＭＩで消化しておいたｐＵＣ１９−ＧＰＩ２１にライゲートした。ライゲートは、１時間室温で行った。ＧＭ−ＣＳＦにライゲートしたＰＵＣ１９−ＧＰＩ２１を使用してコンピテントＡＧ−１細胞を形質転換した。形質転換ＡＧ−１細胞をＬＢ−ａｍｐプレート上に接種した。形質転換したコロニーを個々に、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ１ｍｌに接種した。プラスミドＤＮＡを迅速なアルカリ溶解法により単離した。制限消化を実施して、ｐＵＣ１９  ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ２１キメラ作成物を確認した。陽性クローンからのＤＮＡを単離し、シークエンスしてその実体を確認した。
【０４０９】実施例４
ＩＬ−４−ＧＰＩの作成
ＧＰＩ連結ネズミＩＬ−４をコードしているプラスミドを以下の通り作成する。ネズミＩＬ−４（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ２５８９２）をコードしているｃＤＮＡを、以下のプライマーを使用してマウス脾臓ライブラリーからＰＣＲ（上記）により増幅する：
上流プライマー：
５’ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＣＣＣＣＣＡＧＣＴ３’
下流プライマー：
５’ＣＡＧＣＣＧＧＣＣＧＡＧＴＡＡＴＣＣＡＴＴＴＧＣＡＴＧＡＴＧ３’。
【０４１０】  ＰＣＲ産物は上記のようにアガロースゲル電気泳動から単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ１で消化し、上記のように精製する。ｃＤＮＡをｐＵＣ−ＧＰＩ２１にライゲートし、プラスミドをコンピテントＥ．コリ細胞に形質転換する。陽性プラスミドクローンを上記のように単離する。キメラ遺伝子を、下記のように発現ベクターにクローン化する。
【０４１１】実施例５
ＩＬ−１２ｐ４０−ＧＰＩの作成
ＧＰＩ連結ネズミＩＬ−１２ｐ４０サブユニットをコードしているプラスミドは以下のように作成する。ネズミＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをコードしているｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ８６６７１）を、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲ（上記）によりマウス脾臓ライブラリーから増幅する。
【０４１２】上流プライマー：
５’ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＴＡＡＣＣＡ３’
下流プライマー：
５’ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＡＴＣＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＡ３’。
【０４１３】  ＰＣＲ産物は上記のようにアガロースゲル電気泳動から単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ１で消化し、上記のように精製する。ｃＤＮＡをｐＵＣ−ＧＰＩ２１にライゲートし、プラスミドをコンピテントＥ．コリに形質転換する。陽性プラスミドクローンを上記のように単離する。キメラ遺伝子を、下記のように発現ベクターにクローン化する。
【０４１４】実施例６
ＩＬ−１２ｐ３５−ＧＰＩの作成
ＧＰＩ連結ネズミＩＬ−１２ｐ３５サブユニットをコードしているプラスミドは以下のように作成する。ネズミＩＬ−１２のｐ３５サブユニットをコードしているｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ８６６７２）を、以下のプライマーを使用して、マウス脾臓ライブラリーから増幅する。
【０４１５】上流プライマー：
５’ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＣＡＡＴＣＡＣＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴ３’
下流プライマー：
５’ＣＡＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＧＣＣＣＡＴＣ３’。
【０４１６】  ＰＣＲ産物は上記のようにアガロースゲル電気泳動から単離し、ＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ１で消化し、上記のように精製する。ｃＤＮＡをｐＵＣ−ＧＰＩ２１にライゲートし、プラスミドをコンピテントＥ．コリに形質転換する。陽性プラスミドクローンを上記のように単離する。キメラ遺伝子を、下記のように発現ベクターにクローン化する。
【０４１７】  ＧＰＩ連結ＩＬ−１２ｐ３５およびｐ４０は、宿主細胞で共発現できるか、またはＧＰＩ連結作成物は、他の作成物の非ＧＰＩ連結型と共発現できる。
【０４１８】ＧＰＩキメラタンパク質の哺乳動物細胞発現ベクターへのクローニング
実施例７
ＰＵＣ１９ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ２１を、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ２１ＤＮＡ断片を放出させた。ＤＮＡ断片を製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎから購入したキットを使用してアガロースゲル電気泳動後、精製した。
【０４１９】  Ｃｏｓ１細胞での一過性発現のために、キメラＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ遺伝子を、哺乳動物発現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシアバイオテック、ピスカタクォー、ニュージャージー州）にクローン化した。ネズミ腫瘍細胞およびＣＨＯ細胞での安定な発現のために、遺伝子を、ｐＣＩ哺乳動物発現ベクター（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）にクローン化した。どちらの場合共、ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化しておいたプラスミドにライゲートした。
【０４２０】  各ライゲート混液を使用して、ＡＧ−１細胞を形質転換した。形質転換細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレート上での増殖により選択した。形質転換コロニーを拾い、１ｍｌのアンピシリン含有ＬＢに接種した。プラスミドＤＮＡを迅速なアルカリ溶解法により単離した。プラスミドＤＮＡを制限酵素で消化して、挿入断片の存在を確認した。ｐＳＶＫ３  ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩおよびｐＣＩ  ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩを含むクローンを選択した。各クローンの１００ｍｌ培養物からのプラスミドＤＮＡを、Ｃｏｓ１細胞、Ｂ１６ネズミ黒色腫またはＣＨＯ細胞への電気穿孔用に単離した。
【０４２１】Ｃｏｓ１、Ｂ１６またはＣＨＯ細胞へのＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩの電気穿孔
実施例８
Ｃｏｓ−１細胞での一過性発現
Ｃｏｓ１細胞を、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中で増殖させた。約７５％の集密度の細胞をトリプシン処理により収集した。トリプシン処理した細胞を、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中に希釈し、１５００ｒｐｍ（約１５００ｇ）で３分間、Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｂｉｏｆｕｇｅ１５Ｒ遠心機で遠心分離することによりペレット化した。上清を除去し、細胞をＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳ中に、最終濃度約６×１０６細胞／ｍｌで再度懸濁した。
【０４２２】  電気穿孔用に、０．６ｍｌの再度懸濁した細胞を、１０μｇ（１μｇ／μｌ）のｐＳＶＫ３ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ２１で電気穿孔した。
【０４２３】  電気穿孔は、バイオラッドジーンパルサーを使用して実施した。条件は製造業者により推奨された通りであった。電気穿孔後、細胞をＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｐ−Ｓ）を含むＤＭＥＭ−１０％ＦＢＳで濯ぎ、組織培養フラスコに蒔いた。
【０４２４】  細胞を４８時間後に収集した。培地を除去し、細胞を無菌ＰＢＳで濯いだ。次いで、細胞を組織培養フラスコから出し、細胞を４分間室温で微量遠心分離することによりペレット化した。
【０４２５】Ｂ１６黒色腫細胞でのＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩの安定な発現
プラスミドｐＣＩ  ＧＭＣＳＦ−ＧＰＩを、制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩで線形化した。Ｂ１６黒色腫細胞へのＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩの安定な組込みを選択するために、ｐＣＩ  ＧＭＣＳＦ−ＧＰＩを、Ｂ１６細胞に、Ｇ４１８（ｎｅｏｒ）に対する耐性を付与する遺伝子と共に、それぞれモル比２０：１で電気穿孔した。電気穿孔条件は、２５０Ｖ、７５０μＦ、０．４ｃｍ電極ギャップキュベット中、キャパシタンス・イクステンダー・プラスとバイオラッド・ジーンパルサーＩＩを使用するものであった。電気穿孔後、細胞を２日間ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、Ｐ−Ｓ中、Ｇ４１８の非存在下で増殖させた。２日後、細胞に、２ｍｇ／ｍｌＧ４１８（クロンテック）を補充した、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、Ｐ−Ｓを加えた。選択後、ｐＣＩ  ＧＭＣＳＦ−ＧＰＩで電気穿孔しておいたＧ４１８耐性Ｂ１６細胞を、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８を補充した、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、Ｐ−Ｓ中で増殖させた。
【０４２６】ＣＨＯ細胞でのＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩの安定な発現
プラスミドｐＣＩＧＭＣＳＦ−ＧＰＩを、制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩで線形化した。ＣＨＯ細胞でのＧＭＣＳＦ−ＧＰＩの安定な発現を選択するために、ｐＣＩＧＭＣＳＦ−ＧＰＩを、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の遺伝子と共に細胞に電気穿孔した。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（コロンビア大学のＣｈａｓｉｎ博士から得る）を、ｐＣＩＧＭＣＳＦ−ＧＰＩで、ＥｃｏＲＩ消化ｐＳＶ２  ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ）と共にそれぞれモル比２０：１で電気穿孔した。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞の電気穿孔条件は、２５０Ｖ、１０５０μＦ、０．４ｃｍ電極ギャップキュベット中、キャパシタンス・イクステンダー・プラスとバイオラッド・ジーンパルサーＩＩを使用するものであった。細胞を２日間、ＨＴ補充（ギブコＢＲＬ）を含むＭＥＭアルファ培地（ギブコＢＲＬ）、７％透析ＦＣＳ中増殖させた。２日後、細胞を、ＨＴ補充を含まないＭＥＭアルファ培地、７％透析ＦＣＳを含む選択培地に入れた。トランスフェクトした細胞の安定なプールを維持した。ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ配列を増幅するために、トランスフェクトした細胞を段階的に増加させた（０．０２μＭ、０．１μＭ、０．５μＭ、および１．０μＭ）メトトレキサート中増殖した。ｐＣＩ  ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ（およびｐＳＶ２  ＤＨＦＲ）で電気穿孔し、１．０μＭメトトレキサートに耐性なＣＨＯ細胞のプールを増殖した。
【０４２７】サイトカイン覆膜またはＣＤ４０リガンド増強細胞を使用したワクチン接種およびサイトカイン覆膜またはＣＤ４０リガンド増強細胞の効力の実証
実施例９
サイトカイン覆膜細胞を使用したワクチン接種
ｐＣＩ−ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩおよびｎｅｏｒでトランスフェクトしたＢ１６細胞の、腫瘍細胞に対する予防ワクチンとして作用する能力を、対照細胞、すなわち「空」ｐＣＩ（すなわち挿入断片を含まないプラスミド）およびｎｅｏｒでのみトランスフェクトしたＢ１６細胞のそれと比較した。４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５照射（３５００ｒａｄ）対照細胞を腹部の皮下にワクチン接種し、５匹のマウスに、５×１０５照射ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ細胞をワクチン接種した。数日後、全マウスに、頸部に皮下注入した１×１０６野生型生細胞で攻撃した。腫瘍が、攻撃の７、１１（２匹のマウス）、および１５日後に、対照のマウスのセットに検出された。腫瘍が、攻撃の１１、１２、１５（２匹のマウス）、および１６日後に、ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩのマウスのセットに検出された。結果は、１５（２匹のマウス）、１６、および２０日までの対照のマウスのセットの生存期間；およびＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ処置マウスのかなり長い生存期間、すなわち１６、１９、２１（２匹のマウス）、および３２日を実証した。
【０４２８】実施例１０
ＣＤ４０リガンド増強細胞を使用したワクチン接種
Ｂ１６腫瘍細胞を照射し、下記した手順を使用してＧＰＩ連結ネズミＣＤ１５４で覆膜した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５照射ＣＤ１５４−ＧＰＩ覆膜細胞を、鼠径部ヒダにワクチン接種した。対照マウスに、ＣＤ１５４で覆膜していない照射細胞の複製サンプルを注入した。１週間後、マウスに、頸部への注入により、１×１０６非照射、非ＣＤ１５４増強野生型Ｂ１６細胞で攻撃した。ＣＤ１５４増強細胞をワクチン接種したマウスは、対照マウスの生存期間より少なくとも２０％多い、平均６０日間の生存期間を有するか、または攻撃段階（上記）の６０日後に、対照マウスと比較して少なくとも２０％多い、ＣＤ１５４−ＧＰＩ覆膜細胞を受容したマウスが生存する。
【０４２９】実施例１１
ＧＰＩ−オプソニンキメラの作成およびＣＤ１４０リガンド増強、オプソニン増強細胞を使用したワクチン接種
ネズミマンノース結合タンパク質（ＭＢＰ）コード配列を、クロンテックから購入したマウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーは以下の通りであった：
上流プライマー：
５’ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＣＡＴＴＡＣＴＣＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧ３’
下流プライマー：
５’ＴＡＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＡＡＣＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＧＡ３’
ＰＣＲパラメータ：変性９５℃で１分間
アニーリング６４℃で１分間、伸長７２℃で１分間
維持７２℃で５分間（最終サイクル）。
【０４３０】  ＰＣＲは、ベント・ポリメラーゼを使用して３０サイクル実施した。ＰＣＲ完了後、反応液を４℃で１０分間冷却させた。ＭＢＰ  ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルを通して電気泳動した後に精製した。ＤＮＡバンドを切出し、ＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎから購入したキットを使用して精製した。
【０４３１】ＭＢＰ−ＧＰＩ２１キメラの作成
精製ＭＢＰ  ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ１で消化した。消化後、反応混液をフェノール：クロロホルム（１：１）で、次いでクロロホルムで抽出した。水層を０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２に調整し、ＤＮＡを２容量のエタノールで−８０℃で２時間沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離によりペレット化し、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで濯いだ。ペレットを真空下で乾燥させた。
【０４３２】  ＭＢＰ  ＤＮＡを滅菌水に再度懸濁し、ＥｃｏＲＩ−ＮｇｏＭＩで消化しておいたｐＵＣ１９−ＧＰＩ２１にライゲートした。ライゲートは、１時間室温で行った。ＭＢＰにライゲートしたＰＵＣ１９ＧＰＩ２１を使用して、コンピテントＡＧ−１細胞を形質転換した。プラスミドＤＮＡを単離し、上記のように分析した。陽性クローンからのＤＮＡを単離し、シークエンスしてその実体を確認した。
【０４３３】Ｃ３ｂα鎖−ＧＰＩ２１キメラの作成
Ｃ３ｂα鎖コード配列を、クロンテックから購入したマウス肝臓ｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲプライマーは以下の通りであった：
上流プライマー：
５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣＴＡＧＧＡＧＴＧＡＡＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴＣ３’
下流プライマー：
５’ＴＡＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＧＧＡＣＡＡＣＣＡＴＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣ３’
ＰＣＲパラメータ：変性９４℃で１分間
アニーリング６５℃で１分間
伸長７２℃で１分間
維持７２℃で１０分間（最終サイクル）。
【０４３４】  ＰＣＲはＰｆｕポリメラーゼを使用して３５サイクル実施した。ＰＣＲ完了後、反応液を４℃で１０分間冷却させた。
【０４３５】  Ｃ３ｂα鎖ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルを通して電気泳動した後に精製した。ＤＮＡバンドを切出し、ＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎから購入したキットを使用して精製した。
【０４３６】  精製したＣ３ｂα鎖ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ１で消化した。消化後、反応混液をフェノール：クロロホルム（１：１）で、次いでクロロホルムで抽出した。水層を０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２に調整し、ＤＮＡを２容量のエタノールで−８０℃で２時間沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離によりペレット化し、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールで濯いだ。ペレットを真空下で乾燥させた。
【０４３７】  Ｃ３ｂα鎖ＤＮＡを再度滅菌水に懸濁し、ＥｃｏＲＩ−ＮｇｏＭＩで消化しておいたｐＵＣ１９−ＧＰＩ２１にライゲートした。ライゲートは、１時間室温で行った。Ｃ３ｂα鎖ＤＮＡにライゲートしたＰＵＣ１９ＧＰＩ２１を使用して、コンピテントＡＧ−１細胞を形質転換した。形質転換ＡＧ−１細胞をアンピシリン含有ＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、上記のように分析した。制限消化を実施して、ｐＵＣ１９Ｃ３ｂα鎖−ＧＰＩ２１キメラ作成物を確認した。陽性クローンからのＤＮＡを単離し、シークエンスしてその実体を確認した。
【０４３８】  これらの作成物は、宿主細胞に人工的に導入でき、組換えタンパク質は、当分野で公知の方法、例えばイムノアフィニティー精製により精製できる。
【０４３９】ＣＤ１５４増強、オプソニン増強細胞を使用したワクチン接種
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６非照射、非増強野生型Ｂ１６細胞で頸部の後を攻撃した。１週間後、マウスに、下記したように、ＧＰＩ連結ネズミＣＤ１５４およびＧＰＩ連結オプソニン、例えばＣ３ｂα’鎖またはＭＢＰと混合した、５×１０５照射Ｂ１６細胞でワクチン接種した。対照マウスに、ＧＰＩ−ＣＤ１５４またはＧＰＩ連結オプソニンで増強していない同一細胞でワクチン接種した。ＣＤ１５４増強／オプソニン増強細胞でワクチン接種したマウスは、対照マウスの生存期間より少なくとも２０％多い、平均６０日間の生存期間を有するか、または攻撃段階（上記）の６０日後に、対照マウスと比較して少なくとも２０％多い、ＧＰＩ連結ＣＤ１５４およびＧＰＩ連結オプソニンと混合した照射Ｂ１６細胞を受容したマウスが生存する。
【０４４０】実施例１２
ＣＤ４０ｍＡｂ増強細胞またはＣＤ４０ｍＡｂ増強、オプソニン増強細胞を使用したワクチン接種
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体をパルミテートに結合させる（Ｃｏｌｓｋｙら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１２４：１７９−８７）。次いで、脂質連結抗体をＧＰＩ−ＣＤ１５４の代わりに実施例１０および１１（上記）に記載のワクチン接種および方法に使用する。
【０４４１】ＣＤ１５４およびＩＬ−４で増強した細胞を使用したワクチン接種
実施例１３
ＧＰＩ連結ＩＬ−４を、実施例４に記載の通りに調製し、実施例１０に記載のワクチン接種法を、ＧＰＩ連結ＩＬ−４をＧＰＩ−ＣＤ１５４覆膜ワクチンに加えて実施する。
【０４４２】実施例１４
ＧＭＣＳＦ覆膜細胞を使用したワクチン接種
Ｂ１６腫瘍細胞を照射し、下記した手順を使用してＧＰＩ連結ＧＭ−ＣＳＦで覆膜する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５×１０５ＧＰＩ−ＧＭＣＳＦ覆膜細胞を、鼠径部ヒダにワクチン接種する。対照マウスに、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦで覆膜していない同一細胞を注入する。１週間後、マウスに、頸部の後への注入により、１×１０６非照射、非覆膜野生型Ｂ１６細胞で攻撃する。サイトカイン覆膜細胞をワクチン接種したマウスは、対照マウスの生存期間より少なくとも２０％多い、平均６０日間の生存期間を有するか、または攻撃段階（上記）の６０日後に、対照マウスと比較して少なくとも２０％多い、ＧＰＩ−ＧＭＣＳＦ覆膜細胞を受容したマウスが生存する。
【０４４３】実施例１５
ＧＰＩ−ＧＭＣＳＦ、ＧＰＩ−オプソニン増強細胞を使用したワクチン接種
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６非照射、非覆膜野生型Ｂ１６細胞で、頸部の後に注入することにより攻撃する。１週間後、マウスに、ＧＰＩ連結ＧＭ−ＣＳＦおよびＧＰＩ連結オプソニン、例えばＣ３ｂα’鎖またはＭＢＰで覆膜した、５×１０５照射Ｂ１６細胞でワクチン接種する。対照マウスに、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＰＩ連結オプソニンで覆膜していない照射細胞の複製サンプルでワクチン接種する。サイトカイン覆膜細胞をワクチン接種したマウスは、対照マウスの生存期間より少なくとも２０％多い、平均６０日間の生存期間を有するか、または攻撃段階（上記）の６０日後に、対照マウスと比較して少なくとも２０％多い、ＧＭＣＳＦおよびオプソニン覆膜細胞を受容したマウスが生存する。
【０４４４】実施例１６
組換えＩＬ−１２を、上記のプロトコルを使用してパルミテートに結合させる。次いで、脂質連結ＩＬ−１２を、実施例１４および１５に記載のワクチンおよび方法に加えるか、または該実施例のＧＭ−ＣＳＦと置換する。
【０４４５】実施例１７
実施例１５および１６の方法は、ＧＰＩ連結ＩＬ−４（実施例４に記載の通り調製）をＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ覆膜ワクチンに加えて実施する。
【０４４６】トランスメンブラン遺伝子工学操作により改変されたオプソニンの調製
実施例１８
別の実施例で、Ｃ３ｂのＡＰＣ結合部分を含むトランスメンブラン遺伝子工学操作により改変されたオプソニンを調製する。ネズミ補体Ｃ３のＣ３ｂ断片の一部を、ＰＣＲにより、マウス肝臓ｃＤＮＡから、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｋ０２７８２を含む配列のヌクレオチド２３０４−２３２４に対応する上流プライマーと５’「ＡＴＧ」およびＧｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｋ０２７８２を含む配列のｎｔ２４２９−２４５３に相補的な下流プライマーを使用して増幅する。マウスＩｇＧ３のトランスメンブラン領域を、マウス脾臓ｃＤＮＡから、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｖ０１５２６を含む配列のヌクレオチド１００−１２５に対応し、Ｃ３ｂ断片のアンチセンス鎖の５’末端に相補的な５’末端の１２塩基を含む上流プライマー、および、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｖ０１５２６を含む配列のヌクレオチド８２３−８４６を補完し、下流停止コドンと、適切な制限部位を含む伸長部位を取り込んだ下流プライマーを使用して増幅する。両方のＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動（両方共１．２％アガロース）により単離し、ガラスビーズ（ジーンクリーン・ガラスビーズ、製造業者の指示、Ｂｉｏ１０１社、ビスタ、カリフォルニア州）を使用して切出したアガロースバンドから溶出し、分光測定法により定量した。２つの増幅配列を、重複ＰＣＲ法を使用して互いにインフレーム融合する（Ｈｏｒｔｏｎら、１９８９、Ｇｅｎｅ、７７：６１−８）。簡潔には、等モル量の２つの断片を、過剰量の上流Ｃ３ｂプライマーおよび下流ＩｇＧ３プライマーと共にＰＣＲ反応に使用する。
【０４４７】  上記の産物を適切な発現ベクターに、必要であれば上流分泌シグナルの存在下または非存在下でクローン化でき、適切な抗原含有細胞、例えば悪性腫瘍細胞に発現できる。トランスフェクトされた細胞は、脂質連結遺伝子工学操作により改変されたＣＤ４０リガンドおよび／または脂質連結遺伝子工学操作により改変されたサイトカインと混合でき、細胞により含まれる抗原に対するワクチンとして使用できる。
【０４４８】増強細胞を調製するための遺伝子工学操作により改変された分子の使用
実施例１９
サイトカイン覆膜、ＣＤ４０リガンド増強、オプソニン増強細胞を、遺伝子工学操作により改変されたサイトカイン、ＣＤ４０リガンド、またはオプソニンをコードしている核酸を、上記のように細胞に導入することにより調製できる。脂質連結遺伝子工学操作により改変されたサイトカイン、ＣＤ４０リガンド、またはオプソニンを使用して、以下の手順を使用して、ＣＤ４０リガンド増強、サイトカイン覆膜またはオプソニン増強細胞を調製できる（ＭｃＨｕｇｈら、前記）。細胞を適切な緩衝液、例えばＨＢＳＳ、リン酸緩衝食塩水、または細胞培養培地に、１×１０５から１×１０８細胞／ｍｌの次元の濃度で懸濁する。脂質連結分子、例えばＧＰＩ連結ＣＤ１５４またはパルミテート連結ＧＭ−ＣＳＦを、１０−２００μｇ／ｍｌの次元で加え、混合物を３７℃で２ないし２０時間インキュベートする。細胞を使用前に３回緩衝液中で洗浄する。
【０４４９】  別に、パルミテート連結分子に特に有用な方法では、細胞を、５×１０６／ｍｌ血清非含有ＤＭＥＭで懸濁する。次いで、０．９ｍｌの細胞混液のアリコートを、１５ｍｌコニカルチューブに分配する。ＰＢＳ／０．１５％デオキコレート／０．１％重炭酸ナトリウム／ｐＨ７．８中０．１ｍｇ／ｍｌ−１ｍｇ／ｍｌの０．１ｍｌの遺伝子工学操作により改変されたタンパク質を各チューブに加える。チューブを氷浴中スタイロフォームホールダーに傾斜させて置き、４時間振盪した。細胞を遠心沈殿させ、ＰＢＳで２回洗浄し、使用のために再度懸濁する。
【０４５０】実施例２０
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、全血から勾配遠心分離により単離し、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０中に再度懸濁し、５％ＣＯ２中３７℃で２時間プラスチック皿に置く。次いで、非粘着細胞を廃棄し、粘着細胞を７日間、８００Ｕ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍｌヒトＩＬ−４と共に培養する。次いで、約１×１０４から１×１０８のこれらの細胞を集め、培養器から出し、癌被検者から収集した細胞、例えば、ＴＮＦ−α受容体リガンドおよび／またはＩＬ−１２受容体リガンドを含むサイトカイン覆膜悪性腫瘍細胞を含む、約１×１０４から１×１０８のサイトカイン覆膜またはＣＤ４０リガンド増強細胞と混合する。この混合物を３７℃で約５分から６時間インキュベートする。次いで、約１×１０４から１×１０８のＡＰＣを被検者に、例えば皮下注入により投与する。
【０４５１】実施例２１
ネズミ骨髄マクロファージを収集する。次いで、約１×１０４から１×１０８のこれらの細胞を集め、培養器から出し、約１×１０４から１×１０８のサイトカイン覆膜またはＣＤ４０リガンド増強Ｂ１６黒色腫細胞、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ受容体リガンドおよび／またはＩＬ−１２受容体リガンドを含むサイトカイン覆膜Ｂ１６細胞を含むサイトカイン覆膜Ｂ１６細胞と混合する。この混合物を３７℃で約５分から６時間インキュベートする。次いで、約１×１０４から１×１０８のＡＰＣをＢ１６腫瘍を有するマウスに、例えば皮下注入により投与する。
【０４５２】投与の用量、形態および医薬製剤
本発明は、選択抗原に対する哺乳動物の免疫応答を調節する方法を包含し、該方法は、哺乳動物に、治療量のＣＤ４０リガンド増強細胞、サイトカイン覆膜および／またはオプソニン増強細胞を投与するか、または、ＣＤ４０リガンド増強細胞、サイトカイン覆膜細胞および／またはオプソニン増強細胞とインビトロで接触させた治療量のＡＰＣを投与することを含む。
【０４５３】  本明細書に記載した細胞は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注入液として；感染前に液体中溶液または懸濁液に適した固体形も調製できる。調製物はまた乳化できるか、または細胞をリポソーム中にカプセル化できる。活性免疫原性成分はしばしば、医薬的に許容され、活性成分と適合性の担体と混合する。「医薬的に許容される担体」という用語は、アレルギー反応または他の不適当な作用を、投与する被検者に引き起こさない担体を意味する。適切な医薬的に許容される担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、またはその他の１つ以上およびその組合せを含む。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはワクチンの効力を増強するアジュバントなどの、少量の補助物質を含むことができる。効果的であり得るアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＯＰ）１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、および、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中、細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩを含むがこれに限定されない。他のアジュバントの例は、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、フロイント完全および不完全アジュバントおよびＱｕｉｌＡを含む。さらに、リンホカイン（例えばＩＦＮ−、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）などの免疫調節物質またはポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−誘導物質を、本明細書に記載したアジュバントと組合せて使用できる。
【０４５４】  本発明の細胞は、非経口的に、注入により、例えば皮下または筋肉内に投与できる。他の投与形態に適切なさらなる製剤は、坐剤、およびある場合では、経口製剤またはエアゾールとしての分配に適した製剤を含む。経口製剤の場合には、アジュバント、抗原パッケージング、または個々のサイトカインの様々な製剤への添加を使用するＴ細胞サブセットの操作により、最適な免疫応答をもつ改良された経口ワクチンが得ることができる。坐剤では、伝統的な結合剤および担体は、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み得；該坐剤は、０．５％−１０％、好ましくは１％−２％の範囲で活性成分を含む混合物から形成し得る。経口製剤は、かかる普通使用される添加剤、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤または散剤の形をとり、１０％−９５％、好ましくは２７−７０％の活性成分を含む。
【０４５５】  本発明の細胞は、中性または塩形としてワクチン組成物を製剤化できる。医薬的に許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基により形成）を含み、これは無機酸、例えば、塩酸またはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸等と形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄などの無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の該有機塩基から誘導できる。
【０４５６】  該ワクチン組成物の任意の細胞成分は、該組成物の封入体の調製において、例えば、細胞分裂を阻害できる電離放射線への曝露、シクロホスファミド、サイトカラシンＤ、またはコルヒチンなどの抗増殖剤、または固定を伴うまたは伴わない殺滅を含む、ワクチンの細胞の弱毒化または不活性化を含む処置にかけることができる。
【０４５７】  細胞を、投与量製剤に適合性の様式で、予防的および／または治療的に効果的な量で投与する。投与する量は、例えば、被検者の免疫系の抗体産生能を含む処置する被検者並びに所望する保護の程度に依存する。適切な投与量範囲は、１回のワクチン接種あたり、数百μｇの次元であり、好ましい範囲は、約０．１μｇから１０００μｇ、例えば約１μｇから３００μｇの範囲であり、好ましくは約１０μｇから５０μｇの範囲である。初回投与およびブースター注射に適切な治療法も可変的であるが、初回投与に続き次の接種または他の投与が典型的である。必要な正確な活性成分の投与量は、医者の判断に依存し、各被験者に固有であり得る。治療有効量の本発明の細胞は、とりわけ、投与計画、投与する抗原の単位量、細胞を他の治療物質と組合せて投与するかどうか、レシピエントの免疫状態および健康、並びに特定の組成物の治療活性に依存することは、当業者には明らかである。
【０４５８】  細胞は、１回投与量の計画で、または複数回の投与量計画で投与してもよい。複数回の投与量計画は、ワクチン接種の初期クールが、１から１０の別々の用量を含み得、続いて、免疫応答の維持および／または補強に必要なその後の時間間隔で投与する他の用量、例えば、２回目の投与量は１から４ヵ月後、および必要であればその後の投与量（群）は数ヵ月後というものである。１から５年間、通常３年間の間隔の周期的ブースターが、所望のレベルの保護免疫を維持するのに好ましい。免疫化のクールの後に、ＥＳＡＴ６またはＳＴ−ＣＦと共培養した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のインビトロ増殖アッセイ、および、感作リンパ球からのＩＦＮ放出レベルの測定が続き得る。アッセイは、慣用的な標識、例えば放射性核種、酵素、蛍光標識等を使用して実施できる。これらの技術は当業者には公知であり、米国特許第３，７９１，９３２号、第４，１７４，３８４号および第３，９４９，０６４号に見出すことができ、これは参考として本明細書に取込む。
【０４５９】他の実施形態
前記の実施例は、本発明の作成および実行において、本発明者により実施され考えられた実験を実証する。これらの実施例は、本発明の実践技術の通知およびその有用性の実証の両方に役立つ技術の開示を含むと信じられている。本明細書に開示した技術および実施形態は好ましい実施形態であり、一般的な数多くの等価な方法および技術を同結果の達成のために使用し得ることが当業者により理解されるだろう。
【０４６０】  本明細書の上記に同定した全参考文献は、本発明の１つ以上の実施形態の実践に重要であり得る組成物および／または方法の基礎を記載、提示、提供するかまたは可能にする程度で、参考としてここで本明細書に明白に取込む。