(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
PCR用のプライマーであって、
鋳型DNA中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補DNA部分と、当該相補DNA部分の5’末端に連結し且つ前記増幅対象配列と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補DNA部分とから構成され、
当該非相補DNA部分の塩基配列中の少なくとも3’末端に相当する塩基がDNAポリメラーゼによるDNA複製の進行を停止させ得る保護基で修飾されている
ことを特徴とする、前記プライマー。
【請求項２】
前記保護基は、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得るものである、請求項１記載のプライマー。
【請求項３】
前記光照射処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、2-(2-ニトロフェニル)プロピル基、2-(2-ニトロフェニル)プロピルオキシメチル基、1-(2-ニトロフェニル)エチル基、6-ニトロピペロニルオキシメチル基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項４】
前記アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、イソブチリル基、ベンゾイル基又はアセトキシメチル基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項５】
前記酸処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、トリチル基又はそのメトキシ誘導体である、請求項２記載のプライマー。
【請求項６】
前記酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、アリルオキシメチル基、ジメトキシベンジルオキシメチル基又はトリメトキシベンジルオキシメチル基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項７】
前記還元処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、ベンジルオキシメチル基、又は任意の置換基により置換されたベンジルオキシメチル基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項８】
前記脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、t-ブチルジメトキシシリルオキシメチル基又はt-ブチルジフェニルシリルオキシメチル基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項９】
前記熱処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、イソシアネート基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項１０】
前記エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、アセトキシメチル基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項１１】
前記ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が、リン酸メチル基である、請求項２記載のプライマー。
【請求項１２】
前記非相補DNA部分の塩基配列中の少なくとも3’末端に相当する塩基が、チミン又はグアニンである、請求項３〜１１のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項１３】
前記非相補DNA部分の塩基長が、1〜100塩基である、請求項１記載のプライマー。
【請求項１４】
（ｉ）鋳型DNAと、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプライマーとを用いてPCR反応を行うことにより増幅DNA断片を得る工程、及び
（ｉｉ）前記増幅DNA断片に所定の処理を施すことにより当該断片中の保護基を脱離させる工程
を含む、粘着末端を有するDNA断片の調製方法。
【請求項１５】
前記所定の処理が、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得るものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記粘着末端が、制限酵素処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなる、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記粘着末端が、制限酵素処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなる、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法により得られたDNA断片と、ホストDNAとを結合させる工程を含む、遺伝子組換え方法。
【請求項１９】
前記結合が、DNA結合酵素を用いずに行うものである、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制限酵素等による処理を介さずに、直接、粘着末端（突出末端）を有する所望の２本鎖ＤＮＡ断片を調製する方法に関する。さらに、当該方法により得られたＤＮＡ断片を用いた遺伝子組換え方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、分子生物学及びバイオテクノロジー分野においては、制限酵素を用いてプラスミドＤＮＡを切断し、これをホストＤＮＡとして、リガーゼを用いて所望の遺伝子断片と結合させることでベクターを構築している。多くの場合、上記遺伝子断片は、ＰＣＲにより様々な原料（鋳型ＤＮＡ）から調製され、ＰＣＲ増幅産物の平滑末端は、プラスミドＤＮＡ（ホストＤＮＡ）と結合させるために、制限酵素で処理をして粘着末端（突出末端）に変えられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｅｄｎ．３．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。この技術により所望のベクターが得られる効率は比較的高いものであるが、例えば以下のような２つの問題がある。１つ目は、制限酵素の認識部位がいくつかの回文配列に制限されているため、目的の部位で（又はその近傍で）ＤＮＡを切断するのに適した制限酵素を見つけるのが困難なことがよくある、ということである。２つ目は、利用可能な制限酵素の多くは４〜６塩基のＤＮＡ配列を認識するものであるが、サイズの大きなＤＮＡを制限酵素処理する場合（同じ認識部位も多く存在する）、所望の部位以外にも多くの部位で切断されてしまうため、ホストＤＮＡのサイズが大きいと正確な遺伝子組換え操作ができない、ということである。
本発明者は、このような問題の解決策として、Ｃｅ４＋／ＥＤＴＡ複合体（分子ハサミ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｃｉｓｓｏｒｓ）と一組の擬似相補性ペプチド核酸（ｐｃＰＮＡ）（２本鎖ＤＮＡへの侵入と局所的１本鎖部位の作成）とを組み合わせることにより、人工的制限ＤＮＡカッター（ＡＲＣＵＴ）を作製した。これらｐｃＰＮＡを２本鎖ＤＮＡに作用させると、ｐｃＰＮＡは２本鎖ＤＮＡを部分的に解離させ、自身のターゲット配列に結合する（２本鎖ＤＮＡへの侵入）。ここで、ｐｃＰＮＡのターゲット配列を数塩基横にずらしておくと、複合体形成時にｐｃＰＮＡが結合した部分の反対側が局所的に１本鎖のまま残される。この複合体にＣｅ４＋／ＥＤＴＡを作用させると、Ｃｅ４＋／ＥＤＴＡは２本鎖ＤＮＡよりも１本鎖ＤＮＡを選択的に切断するため、ｐｃＰＮＡによって作られた１本鎖部分が選択的切断される。それぞれのＤＮＡ鎖の切断位置が横方向にずれているため、切断後には粘着末端が形成される。ＡＲＣＵＴにより形成された粘着末端は、別途調製された他の断片（例えば、制限酵素処理断片）の末端と直接的には結合しないが、これらの断片は、互いのスペースを埋めるジョイントオリゴヌクレオチドを利用することにより、見かけ上、相補的な構造を形成して、結合され得る（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７，ｐ．６７３−６７７，２００６）。しかしながら、ＡＲＣＵＴを用いた方法では、結合効率（ライゲーション効率）が低く、また精製／分離工程がより困難なものとなるという問題があった。
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、粘着末端を有する所望の２本鎖ＤＮＡ断片を、ＰＣＲ後の増幅産物（増幅断片）から制限酵素処理を介さずに直接的かつ容易に得る、ＤＮＡ断片の調製方法を提供することにある。さらに、本発明は、当該調製方法により得られたＤＮＡ断片を用いた、遺伝子組換え方法等を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ＰＣＲ用プライマーとして、特定の機能を有する保護基を有するものを使用すれば、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ＰＣＲ用のプライマーであって、鋳型ＤＮＡ中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、当該相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し且つ前記増幅対象配列と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成され、当該非相補ＤＮＡ部分の塩基配列中の少なくとも３’末端に相当する塩基がＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の進行を停止させ得る保護基で修飾されていることを特徴とする、前記プライマー。
本発明のプライマーにおいて、前記保護基としては、例えば、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得るものが挙げられる。
ここで、当該光照射処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、２−（２−ニトロフェニル）プロピル基、２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基、１−（２−ニトロフェニル）エチル基及び６−ニトロピペロニルオキシメチル基が挙げられる。当該アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、イソブチリル基、ベンゾイル基及びアセトキシメチル基が挙げられる。当該酸処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、トリチル基又はそのメトキシ誘導体が挙げられる。当該酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、アリルオキシメチル基、ジメトキシベンジルオキシメチル基又はトリメトキシベンジルオキシメチル基が挙げられる。当該還元処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、ベンジルオキシメチル基、又は任意の置換基により置換されたベンジルオキシメチル基が挙げられる。当該脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、ｔ−ブチルジメトキシシリルオキシメチル基又はｔ−ブチルジフェニルシリルオキシメチル基が挙げられる。当該熱処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、イソシアネート基が挙げられる。当該エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、アセトキシメチル基が挙げられる。当該ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基としては、例えば、リン酸メチル基が挙げられる。
また、本発明のプライマーにおいて、前記の非相補ＤＮＡ部分の塩基配列中の少なくとも３’末端に相当する塩基としては、例えば、チミン及びグアニンが挙げられる。さらに、本発明のプライマーとしては、前記非相補ＤＮＡ部分の塩基長が、例えば１〜１００塩基であるものが挙げられる。
（２）（ｉ）鋳型ＤＮＡと、上記（１）のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行うことにより増幅ＤＮＡ断片を得る工程、及び（ｉｉ）前記増幅ＤＮＡ断片に所定の処理を施すことにより当該断片中の保護基を脱離させる工程を含む、粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製方法。
本発明の調製方法において、前記所定の処理としては、例えば、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る処理が挙げられる。
本発明の調製方法において、前記粘着末端としては、例えば、制限酵素処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなるもの、又は、制限酵素処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなるものが挙げられる。
（３）上記（２）の調製方法により得られたＤＮＡ断片と、ホストＤＮＡとを結合させる工程を含む、遺伝子組換え方法。
本発明の遺伝子組換え方法において、前記ＤＮＡ断片とホストＤＮＡとの結合は、例えば、ＤＮＡ結合酵素を用いずに行うことができる。
（４）下記式（Ｉ’）に示される化合物を含む置換基導入剤。
0005397960.tif 000002
〔式（Ｉ’）中、ＸはＣｌ、Ｉ、Ｂｒ、ｐ−トルエンスルホン酸エステル又は硫酸エステルを表す。〕
（５）２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基を有する生体分子。
本発明の生体分子としては、例えば、下記式（Ｉ）に示されるものが挙げられる。
0005397960.tif 000003
〔式（Ｉ）中、Ｒは生体分子を表す。〕
ここで、生体分子としては、例えば塩基等が挙げられ、具体的にはチミン及びグアニンが挙げられる。生体分子がチミン及びグアニンの場合、本発明の生体分子としては、下記式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）に示されるものが挙げられる。
0005397960.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明の一実施例である、ｃａｇｅｄ  ＴＮＰＰを用いたＬＡＣＥ−ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔ−ａｓｓｉｓｔｅｄ−ｃｏｈｅｓｉｖｅ−ｅｎｄｉｎｇ  ＰＣＲ）法の該略図である。
図２は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応の結果を示す電気泳動（２０％変性ＰＡＧＥ）写真である。レーン１はＣ２のみ（コントロール）、レーン２はＣ１＋Ｃ２＋Ｅｘ  Ｔａｑ（ＵＶ照射なし）、レーン３はＣ１＋Ｃ２＋Ｅｘ  Ｔａｑ（ＵＶ照射あり）である。反応条件は、［Ｃ１］＝［Ｃ２］＝４μＭ、［ｄＮＴＰｓ］＝１００μＭ、［Ｅｘ  Ｔａｑ］＝０．２Ｕ／μｌ、３７℃、３０分である。
図３は、ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法を用いた組換えベクター構築の該略図である。
図４は、ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法により調製した挿入ＤＮＡ断片の構造を示す図である。
図５は、ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動写真である。
図６は、コロニーＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
図７は、組換えベクターの塩基配列分析の結果を示す図である。
図８は、ＵＶ照射による保護基（ＮＰＰ）の脱保護化の経時変化を示すグラフである。
図９は、ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法により調製した挿入ＤＮＡ断片の構造を示す図である。
図１０は、ＵＶ照射前後における、ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法による増幅産物の電気泳動写真である。レーン１はＵＶ照射前、レーン２はＵＶ照射後である。
図１１は、コロニーＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。
図１２は、組換えベクターの塩基配列分析の結果を示す図である。（ａ）はＥｃｏＲＩ  ｓｉｔｅを結合させた組換えベクターであり、（ｂ）はＨｉｎｄ  ＩＩＩ  ｓｉｔｅを結合させた組換えベクターである。
図１３は、ＡＲＣＵＴによる標的切断部位と使用するｐｃＰＮＡの塩基配列を示す図である。ａは、ＡＲＣＵＴにより切断される標的部位周辺の塩基配列を示し、ｂは、ＡＲＣＵＴによる切断時の標的部位周辺の構造を示す。
図１４は、ａ）ＡＲＣＵＴにより切断した標的フラグメント（ベクター）の構造を示す図である。ｂ）ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法により調製した挿入ＤＮＡ断片（インサート）の構造を示す図である。
図１５は、ｐＢＲ３２２ベクター上の制限酵素サイトを示す図である。
図１６は、ａ）ＡＲＣＵＴにより切断した標的フラグメント（ベクター）の構造を示す図である。ｂ）ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法により調製した挿入ＤＮＡ断片（インサート）の構造を示す図である。
図１７は、ＥｃｏＲＩやＡＲＣＵＴによるｐＢＲ３２２ベクターの切断断片のアガロースゲル電気泳動写真である。レーン１はＥｃｏＲＩのみで切断、レーン２はＥｃｏＲＩで切断した後ＡＲＣＵＴで切断、レーンＭは１ｋｂｐラダーマーカーである。
図１８は、本実施例で使用した又は得られた各フラグメントのアガロースゲル電気泳動写真である。レーン１はＡＲＣＵＴ切断断片（２５３０ｂｐ）、レーン２はＬＡＣＥ−ＰＣＲ法による増幅産物（ＵＶ照射あり）、レーン３は組換えベクターのみ、レーン４はＥｃｏＲＩで切断した組換えベクターである。
図１９は、組換えベクターの塩基配列分析の結果を示す図である。（ａ）はＡＲＣＵＴ  ｓｉｔｅを結合させた組換えベクターであり、（ｂ）はＥｃｏ  ＲＩ  ｓｉｔｅを結合させた組換えベクターである。
図２０は、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）の形質転換体におけるＧＦＰの発光を示す写真である。
図２１は、ＧＦＰ−ＢＦＰ融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター構築の概略図である。左図はＧＦＰ遺伝子を含むｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰベクターであり、右図はＢＦＰ遺伝子を含むｐＱＢＩ  ６７ベクターである。
図２２は、ＢＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＬＡＣＥ−ＰＣＲで増幅した産物のアガロースゲル電気泳動写真である。
図２３は、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）の形質転換体におけるＧＦＰ−ＢＦＰ融合タンパク質等の発光を示す写真である。
図２４は、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）の形質転換体から回収した組換えベクターのアガロースゲル電気泳動写真である。
図２５は、ＧＦＰ−ＢＦＰ融合タンパク質の蛍光スペクトルを示す図である。
図２６は、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）形質転換体で発現しているタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００８−０６１６７８号（２００８年３月１１日出願）の明細書等の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
図１に示すようにｄＮＴＰｓと鋳型ＤＮＡとの塩基対形成を阻害するような修飾が施されていると（ＴＮＰＰ；２−（２−ニトロフェニル）プロピル基により修飾（保護）されたチミジン塩基）、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が阻害されることになり、５’突出末端を有するＤＮＡ断片を容易に作製することができる。得られたＤＮＡ断片は、上記修飾（保護）がされたままでは、遺伝子組換え操作に応用することはできないが、ＴＮＰＰの保護基である２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）は、光照射により外すことができるため、容易に遺伝子組換え技術等に利用可能なものとなる。本発明者は、この技術を、ＰＣＲの技術と組み合わせて応用することで、遺伝子組換え操作等に用い得るインサート側の５’突出末端（粘着末端）を自在に設計できる方法となることを見出し、本発明を完成した。
そこで、本発明者は、一部の塩基に前記修飾を施した様々なＰＣＲプライマーを合成し（例えば、後述する実施例１中のスキーム１に示すＣ１のプライマーを参照）、得られたＰＣＲ増幅産物を、その後制限酵素によって処理することなく、そのままインサートの断片としてベクターに挿入することで、組換えベクターの構築を行った。ところで、ＡＲＣＵＴ（人工的制限ＤＮＡカッター；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７，ｐ．６７３−６７７，２００６を参照）によるＤＮＡの切断断片は、その性質上、切断部分の塩基配列が、天然の制限酵素を用いた場合のような配列には決してならないことが知られている。そこで、ＡＲＣＵＴによってベクターを切断し、その切断部分の塩基配列に合うように、本発明の方法を用いてインサートのＤＮＡ断片を調製して、ベクターへの挿入を試みた。従来は、ＡＲＣＵＴを利用して遺伝子組換え操作を行う場合、インサート断片とベクターとをつなげる際に、互いの隙間を埋めるためのＯｌｉｇｏｊｏｉｎｔと呼ばれる断片を別途使用する必要があった。しかし、本発明の方法により調製したインサート断片を用いれば、Ｏｌｉｇｏｊｏｉｎｔを使用することなくベクターへの挿入を極めて容易に行うことができた。これまでにも、任意に所望の突出末端（粘着末端）を有するＤＮＡ断片を作製する方法は、いくつか報告されているが、それらはいずれも、ＰＣＲ後に特殊な酵素処理が必要なものであった（Ａｓｌａｎｉｄｉｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＬＩＣ−ＰＣＲ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９−６０７４．；Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）ＵＳＥＲＴＭ  ｆｒｉｅｎｄｌｙ  ＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｂｙ  ｕｒａｃｉｌ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３５，１９９２−２００２．；Ｘｉｎ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．，２５，２７３−２７７．；Ｚｈｕ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｉｎ−ＦｕｓｉｏｎＴＭ  ａｓｓｅｍｂｌｙ：ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｍｏｄｕｌａｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ，ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４３，３５４−３５９）。本発明の方法によれば、酵素としては実質的にＤＮＡポリメラーゼのみで所望の突出末端を有するＤＮＡ断片を作製することができ、種々の条件等の制限が少ないため、様々な利用及び応用が可能と考えられる。
２．粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製方法
本発明に係る粘着末端を有するＤＮＡ断片の調製方法は、下記（ｉ）及び（ｉｉ）の工程を含む方法である。
（ｉ）鋳型ＤＮＡと、所定のＰＣＲ用プライマーとを用いてＰＣＲ反応を行うことにより増幅ＤＮＡ断片を得る工程
（ｉｉ）前記増幅ＤＮＡ断片に所定の処理を施すことにより当該断片中の保護基を脱離させる工程
ここで、上記（ｉ）の工程で用いる所定のＰＣＲ用プライマーは、前記鋳型ＤＮＡの一部である当該鋳型ＤＮＡ中の増幅対象領域と相補的に結合する塩基配列からなる相補ＤＮＡ部分と、当該相補ＤＮＡ部分の５’末端に連結し且つ前記増幅対象配列と相補的に結合しない塩基配列からなる非相補ＤＮＡ部分とから構成されるものであり、当該非相補ＤＮＡ部分の塩基配列中の少なくとも３’末端に相当する塩基がＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の進行を停止させ得る保護基で修飾されていることを特徴とするプライマーである。ここで、当該プライマー中の「非相補ＤＮＡ部分」とは、あくまでも、鋳型ＤＮＡ中のＰＣＲによる増幅対象領域に対して相補的ではない塩基配列からなる部分であればよい。よって、当該「非相補ＤＮＡ部分」は、鋳型ＤＮＡ中の増幅対象領域以外の領域（例えば、増幅対象領域の５’側又は３’側に隣接する任意の長さの塩基配列領域）に対して相補的な塩基配列からなる部分であってもよく、限定はされない。
当該プライマー中、非相補ＤＮＡ部分は、最終的に得られるＤＮＡ断片の粘着末端の部分（１本鎖ＤＮＡの部分）となる部分である。ここで、当該非相補ＤＮＡ部分の塩基長は、特に限定はされないが、例えば１〜１００塩基であり、好ましくは４〜２０塩基である。特に、本発明の調製方法によれば、得られるＤＮＡ断片の粘着末端の塩基長は、通常、制限酵素処理後の粘着末端では生成されない５塩基以上にすることも容易に可能である。よって、得られるＤＮＡ断片の粘着末端は、公知の制限酵素を用いた処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなるものであってもよいが、公知の制限酵素を用いた処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなるものであってもよく、限定はされない。
当該プライマーは、上述した所定の塩基（非相補ＤＮＡ部分の塩基配列中の少なくとも３’末端に相当する塩基）に、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の進行を停止させ得る保護基を有する。当該塩基の種類としては、限定はされないが、チミン及びグアニンであることが好ましい。通常、ＰＣＲにおいては、プライマー中の非相補ＤＮＡ部分についてもＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成過程において相補鎖が合成されＤＮＡ複製が進行する。しかし、本発明においては、プライマー中の相補ＤＮＡ部分と非相補ＤＮＡ部分との境目となる塩基が、上記保護基で修飾されているため、ＰＣＲのＤＮＡ合成過程においては、非相補ＤＮＡ部分に対する相補鎖は合成されない。よって、得られたＤＮＡ断片は、非相補ＤＮＡ部分に相当する粘着末端を有するものとなる。
ここで、上記保護基としては、ＰＣＲ後に得られたＤＮＡ断片から所定の処理により脱離し得るものであればよく、限定はされず、グリーンら（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第２版、１９９１年）に記載の引用文献に従って保護する基が好ましく挙げられるが、本発明においては、例えば、光照射処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理又はホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る保護基が好ましく挙げられ、中でも、光照射処理（特にＵＶ照射処理が好ましい）、アルカリ処理、酸化処理、還元処理、脱シリル化処理等がより好ましい。よって、ここで列挙した各種処理が、上記（ｉｉ）の工程で行う所定の処理として例示できる。
前記光照射処理（特にＵＶ照射処理が好ましい）の場合は、保護基の種類にもよるが、例えば、５〜６０分照射することが好ましく、より好ましくは１５〜３０分である。
以下に、光照射処理により脱離し得る保護基を例示する。破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。
0005397960.tif 000005
前記アルカリ処理の場合は、処理試薬として、例えば、濃アンモニア水及び濃アンモニア水−メチルアミン混合溶液等が好ましく用いられ、より好ましくは濃アンモニア水である。アルカリ処理は、保護基の種類にもよるが、例えば室温で２４時間、または５５℃で８時間行うことが好ましく、より好ましくは室温で２４時間である。
以下に、アルカリ処理により脱離し得る保護基を例示する。破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。
0005397960.tif 000006
前記酸処理の場合は、処理試薬として、例えば２％〜５０％トリフルオロ酢酸水溶液、１０％〜８０％酢酸及び希塩酸等が好ましく用いられ、より好ましくは２％トリフルオロ酢酸水溶液及び８０％酢酸である。酸処理は、保護基の種類にもよるが、例えば室温で１０分間〜一晩撹拌することが好ましく、より好ましくは室温で１時間である。
酸処理により脱離し得る保護基としては、例えば、トリチル基及びそのメトキシ誘導体等が好ましく挙げられる。
前記酸化処理の場合は、処理試薬として、例えば、２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノン及びヨウ素等が好ましく用いられ、より好ましくは２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノンである。酸化処理は、保護基の種類にもよるが、例えば水溶液中で２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−ｐ−ベンゾキノンを加えて室温で１〜数日間撹拌することが好ましく、より好ましくは１０時間の撹拌である。
酸化処理により脱離し得る保護基としては、例えば、アリルオキシメチル基、ジメトキシベンジルオキシメチル基及びトリメトキシベンジルオキシメチル基等が好ましく挙げられる。
前記還元処理の場合は、処理試薬として、例えば、水素ガスと組み合わせる触媒としてパラジウム炭素、ラネー触媒、アダムス触媒及びリンドラー触媒等が好ましく用いられ、より好ましくはパラジウム炭素である。また、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムも単独で好ましく用いられる。還元処理は、保護基の種類にもよるが、例えば触媒と水素ガスを添加した後室温で一晩から数日反応することが好ましく、より好ましくは一晩の反応である。
還元処理により脱離し得る保護基としては、例えば、ベンジルオキシメチル基、及び任意の置換基により置換されたベンジルオキシメチル基等が好ましく挙げられる。任意の置換基としては、例えば、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、アシル基及び複素環基等の置換基に含まれる公知の各種置換基が挙げられる。
前記脱シリル化処理の場合は、処理試薬として、例えば、１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドＴＨＦ溶液及びトリエチルアミン三フッ化水素酸塩等が好ましく用いられ、より好ましくは１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドＴＨＦ溶液である。脱シリル化処理は、１ＭテトラブチルアンモニウムフルオリドＴＨＦ溶液を試料溶液に添加した後、室温で一晩〜数日反応することが好ましく、より好ましくは一晩の反応である。
脱シリル化処理により脱離し得る保護基としては、例えば、以下のものが挙げられ、破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。
0005397960.tif 000007
前記熱処理は、保護基の種類にもよるが、例えば、６０〜９０℃の温度で１０分〜３６０分加熱することが好ましく、より好ましくは６０℃で１０分間である。
熱処理により脱離し得る保護基としては、例えば、イソシアネート基（特開２００６−２４８９３１参照）等が好ましく挙げられる。
前記エステラーゼ処理は、保護基の種類にもよるが、例えば、豚肝臓エステラーゼと３７℃で１時間または一晩反応することが好ましく、より好ましくは３７℃で１時間の反応である。
エステラーゼ処理により脱離し得る保護基としては、例えば、以下のものが挙げられ、破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。
0005397960.tif 000008
前記ホスファターゼ処理は、保護基の種類にもよるが、例えば、アルカリホスファターゼと３７℃で１時間または一晩反応することが好ましく、より好ましくは３７℃で１時間の反応である。
ホスファターゼ処理により脱離し得る保護基としては、例えば、以下のものが挙げられ、破線で囲まれた基が、当該保護基の部分である。
0005397960.tif 000009
本発明において、上述した各種保護基を有するＰＣＲ用プライマーの調製方法は、公知の方法を用いればよく、限定されない。例えば、上述した各種保護基による所望の塩基の保護化は、５’及び３’水酸基をアセチル基で保護したチミジンをトシル化合物で活性化し、保護基のアルコール体を作用させる、もしくは、５’及び３’水酸基をアセチル基で保護したチミジンにクロロメチル体として活性化した保護基を作用させて行うことができる。
上記（ｉ）の工程において、前述した以外のＰＣＲの条件、例えば、反応組成液（鋳型濃度、プライマー濃度、バッファーの種類・濃度、ＤＮＡポリメラーゼの種類・酵素量等）並びに反応条件（熱変性、アニーリング及び伸長の各反応時間・温度、合計サイクル数等）については、公知の知見及び技術常識により適宜任意に設定することができる。
上記（ｉｉ）の工程においても、脱保護化のための所定の処理は、前述した以外、公知の方法及び条件に基づいて行うことができる。
本発明の調製方法は、上記（ｉ）及び（ｉｉ）の工程以外に、他の任意の工程を含むものであってもよく、特に限定はされない。
また、本発明においては、前述した保護基としての置換基を導入するための置換基導入剤（すなわち当該置換基となり得る化合物を含む置換基導入剤）を提供することができ、さらには、当該置換基を有する生体分子（すなわち保護化生体分子）を提供することもできる。
具体的には、本発明の置換基導入剤の一態様としては、下記式（Ｉ’）：
0005397960.tif 000010
に示される化合物を含むものが好ましく挙げられる。ここで、式（Ｉ’）中、Ｘは、限定はされないが、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、ｐ−トルエンスルホン酸エステル及び硫酸エステルが好ましく挙げられ、中でも、下記式：
0005397960.tif 000011
に示されるＸがＣｌである化合物（すなわち、２−［（２−ニトロフェニル）−クロロメトキシ］−プロパン（ＮＰＰＯＭ−Ｃｌ））がより好ましい。ここで、ＮＰＰＯＭ−Ｃｌは、例えば、後述する実施例３に記載の方法（スキーム２参照）に従って合成することができ、さらにＮＰＰＯＭ−Ｃｌを用いた置換基の形成についても同スキーム等に従って行うことができる。また、式（Ｉ’）中のＸがＣｌ以外の場合の化合物の合成及び置換基の形成についても、ＮＰＰＯＭ−Ｃｌの場合を参照し、当業者の技術常識等を用いて実施することができる。上記式（Ｉ’）の化合物により形成される置換基（当該化合物由来の置換基）は、例えば、下記式のように表すことができる（具体的には２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基である。）。
0005397960.tif 000012
また、本発明の生体分子としては、２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基（上記式（Ｉ’））を有する生体分子（すなわち、当該基により置換された生体分子）が挙げられ、具体的には、下記式（Ｉ）：
0005397960.tif 000013
に示されるものが好ましく挙げられる。ここで、式（Ｉ）中、Ｒは任意の生体分子を表す。生体分子（Ｒ）としては、低分子（塩基、アミノ酸等）及び高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等）のいずれであってもよく、また人工的に調製された生体適合分子（ＰＮＡ等）であってもよいが、例えば、塩基が好ましい。塩基としては、限定はされないが、例えばチミン及びグアニンが好ましく挙げられる。生体分子（Ｒ）がチミン又はグアニンの場合、本発明の生体分子としては、例えば、下記式（ＩＩ）：
0005397960.tif 000014
に示されるもの（すなわち、チミンが２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基により置換された（保護化された）もの）、又は、下記式（ＩＩＩ）：
0005397960.tif 000015
に示されるもの（すなわち、グアニンが２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基により置換された（保護化された）もの）が好ましく挙げられる。
３．遺伝子組換え方法
本発明の遺伝子組換え方法は、上述の本発明の調製方法により得られたＤＮＡ断片と、ホストＤＮＡとを結合させる工程を含む方法である。
ここで、ホストＤＮＡとしては、特に限定はされず、各種ベクター（発現ベクター、ウイルスベクター、ファージベクター等）や各種生物ゲノムＤＮＡ等、任意のＤＮＡを用いることができる。
前述したように、本発明の調製方法により得られるＤＮＡ断片としては、所望により、制限酵素処理では生成し得ない長い塩基長の粘着末端とすることができる。この場合、当該ＤＮＡ断片とホストＤＮＡとの結合は、長い塩基長の粘着末端どうしの結合となるため、リガーゼ等のＤＮＡ結合酵素を特に用いなくても、特異性及び結合効率が高く、両者を混合するだけで結合させることが可能となる。よって、本発明は、簡便性、経済性、実用性に優れた遺伝子組換え方法を提供することもできる。
本発明の遺伝子組換え方法は、上述した結合工程以外に、他の任意の工程を含むものであってもよく、特に限定はされない。
本発明の遺伝子組換え方法は、例えば、遺伝子治療やｉＰＳ細胞関連で利用されるレトロウイルス及びアデノウイルスベクター等の遺伝子組換えに好適に用いることができる。当該アデノウイルス等は、ゲノムＤＮＡサイズが大きいため、従来の方法では遺伝子組換えに過剰の手間と時間を要していたが、本発明の遺伝子組換え方法によれば、ゲノム全体を適当なサイズに区分けし、それぞれの部位を個別にＰＣＲで増幅して本発明により作製した粘着末端を介してつなぎ合わせることで、容易に遺伝子組換えを行うことができる。
また本発明は、前述した本発明の調製方法により得られたＤＮＡ断片を備えた遺伝子組換え用キットを提供することもできる。当該キットは、任意の他の構成要素を含むものであってもよく、例えば、発現ベクター等の各種ベクターや、各種バッファー、滅菌水、保存液、防腐剤、各種反応用容器、使用マニュアル（使用説明書）などが挙げられる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜ＬＡＣＥ−ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔ−ａｓｓｉｓｔｅｄ−ｃｏｈｅｓｉｖｅ−ｅｎｄｉｎｇ  ＰＣＲ）法の開発とＡＲＣＵＴへの応用＞
１．ＴＮＰＰによるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応の阻害
図１に示すように、ＤＮＡポリメラーゼ（以下、本実施例では、単にポリメラーゼと言う）による伸長反応が阻害されることを確認するために、下記スキーム１中に示すＣ１及びＣ２を用いたポリメラーゼの伸長反応を確認した。なお、スキーム１中のＣ１〜Ｃ６の塩基配列は、それぞれ順に、配列番号１〜６に示されるものである。
0005397960.tif 000016
ここで、Ｃ１は、ＰＣＲプライマーとして使用するＣ２のテンプレート（鋳型ＤＮＡ）となっており、ＴＮＰＰを１つだけ有する。ＴＮＰＰを有するプライマーの合成法は、先に述べた通りである。Ｃ２の５’末端はＦＡＭでラベルした。様々なポリメラーゼを用いたが、中でも最も結果が明確であったＥｘ  Ｔａｑを用いた反応による結果を図２に示した。図２中、レーン３においてＣ１は反応開始前に光照射（ＵＶ照射）されたものを用いているが、レーン１と比較すると伸長反応は２４ｍｅｒまで進んでいることが分かった。しかし、レーン２において、伸長反応はレーン３ほどは進んでおらず、目的の２０ｍｅｒのところで止まっていることが確認できた。Ｃ４とＣ６による伸長反応の阻害も、同様に、目的の部分で伸長反応が止まっていることを確認した（データは示さず）。これらのことから、２つのことが結論づけられた。１つ目は、目的のＴＮＰＰのところでポリメラーゼによる伸長反応を止めることができるということ、２つ目は、ＴＮＰＰのｃａｇｅｄ保護（すなわちＮＰＰ基によるＤＮＡポリメラーゼ伸長反応からの保護（伸長反応阻害））がＵＶ照射によって効率よく外れるということであった。また、当該伸長反応を止めるためにはＴＮＰＰは１つ含まれていれば十分であるということも分かった。
ポリメラーゼの伸長反応がＴＴダイマーによって抑制されるということは、従来から知られていることであり、このことを利用し、修飾塩基を２つ並べたテンプレートを用意して伸長反応を阻害し、光照射によって片方が外れることで伸長反応が促進されたという報告がある（Ｔａｎｇ，Ｘ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｐｈｏｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ（Ｋｌｅｎｏｗ）ｗｉｔｈ  ｃａｇｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１５，５３０３−５３０６．）。そのため、２つ連続して導入した方が、阻害効率が高まると考えてＣ３のプライマーにはＴＮＰＰを２つ導入した。
本発明の方法によれば、所望の５’突出末端を有するＤＮＡ断片の作製が可能となったので、実際に、所望の合成プライマーとＰＣＲを用いて様々な挿入ＤＮＡ断片（インサート）を調製し、一般的な方法でインサートをベクターに挿入した。本実施例では、制限酵素（ＥｃｏＲＩ）やＡＲＣＵＴにより切断したベクターを用いた場合の方法について、その概要を図３に示した。なお、ＡＲＣＵＴ（人工的制限ＤＮＡカッター）については“Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．７，ｐ．６７３−６７７，２００６”を参照することができる。
２．ＥｃｏＲＩによる１ヶ所切断部位への挿入
２−１．ＥｃｏＲＩ  ＬＡＣＥ−プライマーの設計及び合成
ベクター（ｐＵＣ１８）をＥｃｏＲＩで切断し、そこに調製したインサートを挿入するために、スキーム１に示すＣ３及びＣ４のＰＣＲプライマーを合成した。Ｃ３及びＣ４は、ｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ；５１１５ｂｐ（配列番号９））のＧＦＰ遺伝子及びＴ７プロモーター配列を共に含む塩基配列領域（１２１〜１１７０ｂｐ）を増幅でき、増幅産物として得られるインサートはＥｃｏＲＩ切断断片と相補的な５’突出末端を持つように設計した（図４）。なお、図４に示したインサートの配列中、Ｔ７−ＧＦＰと表示した部分の塩基配列（ＧＦＰ遺伝子及びＴ７プロモーター配列を含む；計１０３１ｂｐ：配列番号９の塩基配列中の第１３１番目〜第１１６１番目の塩基からなる）は、配列番号１０に示した（図９、図１４ｂ及び図１６ｂにおいても同じ）。上で述べた通り、阻害効率を高めるためにＴＮＰＰはそれぞれ２つずつ導入した。以後、ＬＡＣＥ−ＰＣＲに用いたプライマーをＬＡＣＥ−プライマーとした。
２−２．ＬＡＣＥ−ＰＣＲ産物のベクターへの挿入（組換えベクターの作製）
ベクター（ｐＵＣ１８）側の調製は、公知の一般的な方法で行った。プラスミドＤＮＡの自己環化を防ぐためにホスファターゼによって脱リン酸を行った。インサートを調製する際には、正確性の高いＫＯＤ−ＰｌｕｓをＰＣＲのポリメラーゼとして用いた。図５中のＰＣＲ後の産物を見ると、１ｋｂｐのところにバンドが見え、問題なくＰＣＲが行い得たことが分かった。その後、光照射により保護基を外し、キナーゼによるリン酸化を行った。この段階で脱保護を行わないとキナーゼがうまく働かない可能性が考えられた。なお、プライマーに初めから５’末端がリン酸化されたものを用いた場合、この作業は省略可能である。調製したベクターとインサートをライゲーションさせ、形質転換させたところ、形質転換体のコロニーが認められたので、コロニーＰＣＲによって陽性（ポジティブ）コロニーを選択した。その結果を図６に示した。
図６中、レーン２及びレーン１５のポジティブコロニーのプラスミドＤＮＡを抽出して塩基配列を読んだところ、目的の形でインサートが挿入されていることが確認できた（図７）。１ヶ所切断で導入した場合、インサートの入り方が２通りあり、レーン２はインサートが所望の向きに挿入されたもの、レーン１５はインサートが逆向きに挿入されたものとなっていることが分かった。また、片側ではＧＡＡＴＴＧという配列で挿入されておりＥｃｏＲＩにより認識される切断部位が１ヶ所つぶれたことが分かった。制限酵素サイトをつぶすことができることも、この方法の特徴であり、有用性及び実用性に優れたものである。
このことから、ＬＡＣＥ−ＰＣＲによって調製したインサートをベクターに正確に挿入し、組換えベクターが作製できることが示された。
３．ＨＰＬＣによるＬＡＣＥ−プライマーの評価
ＵＶ照射によってどれくらいｃａｇｅｄ化合物（ＮＰＰ基によって保護された塩基（Ｔ）を有するＤＮＡ）が脱保護されるかを評価するため、Ｃ３及びＣ４をＵＶ照射し、それぞれをＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。その結果を図８に示した。この際、検出波長を２６０ｎｍとしていたため、保護基であるＮＰＰが外れたものと、外れていないものとで、吸光係数が異なるので存在比とピーク面積比がずれる可能性が考えられた。しかし、ＵＶ照射前後での総ピーク面積がそれほど違わなかったため、吸光係数の違いは無視できる範囲であると考えて割合を算出した。図８のグラフから、１ｈのＵＶ照射によって９０％以上のＮＰＰが脱保護されたことが分かった。これにより、１ｈのＵＶ照射によって十分量のｃａｇｅｄ脱保護が進んだと考えられる。２つの脱保護が９０％進んだと仮定すると、８０％は目的のものができたと考えられる。
ＰＣＲの条件は、９０℃に加熱するなど比較的過激な条件となっているため、ＮＰＰが熱によって脱離される可能性があった。そこで、Ｃ３をＰＣＲと同条件でインキュベーションした後、ＨＰＬＣで分析したところ、保護基であるＮＰＰが２つとも脱離されたものが７．７％、１つ脱離されたものが１８．９％、脱保護されなかったものが７３．４％となっている。つまり、３’側のＮＰＰが脱離せずに残ったものは、約８５％と考えられた。ＰＣＲではプライマーを２つ用いるので、目的の位置の塩基がｃａｇｅｄ保護されている確率は７０％であった。
以上の２つの要素から、ＮＰＰ保護を用いた場合、目的の５’突出末端を持ったＰＣＲ産物が得られる確率は、５０〜６０％程度と考えられた。
４．ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩによる２ヶ所切断部位への挿入
４−１．ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＬＡＣＥ−プライマーの設計及び合成
前述の通り、１ヶ所切断の系では遺伝子組換え操作を成功したので、次に２ヶ所切断の系も挿入できるかどうかを試みた。基本的には、１ヶ所切断の系と同様の方法で行った。ＬＡＣＥ−プライマーとしてＣ１を用いてＨｉｎｄＩＩＩ突出末端を持つようにした。また、ＥｃｏＲＩ突出末端を得るためＣ３を用いた。このとき、ＬＡＣＥ−プライマーの中には１つしかｃａｇｅｄ保護がないが、これにより、ＰＣＲの条件下において、１つのｃａｇｅｄ保護によってポリメラーゼ伸長反応が止まるかどうかについても同時に調べた。目的の通りに反応が成功すると、図９に示すようなインサートが得られる。
４−２．ＬＡＣＥ−ＰＣＲ産物のベクターへの挿入（組換えベクターの作製）
基本的な手順は前記２．項の記載と同様にして行った。ｐＵＣ１８をＨｉｎｄＩＩＩによって３７℃、４ｈ反応させた後、さらにＥｃｏＲＩによって３７℃、１６ｈ反応させて２ヶ所切断したベクター側を調製した。Ｃ１とＣ３をＬＡＣＥ−ＰＣＲのプライマーに用いることで、インサート側を調製した（図１０，レーン２）。また、レーン１より調製したインサートはＵＶ照射によって切断のような目に見える損傷は起こっていないことが確認できた。調製したインサートとベクターとをライゲーションし、形質転換をしたところ、確認された形質転換体のコロニーは６個と少なかったが、そのうち２個のコロニーがコロニーＰＣＲでポジティブであった（図１１のレーン２，３）。ポジティブであった形質転換体のプラスミドＤＮＡを抽出して塩基配列を確認したところ、目的の形でインサートが挿入できていたことが分かった（図１２）。これにより、２ヶ所切断の系においても、十分応用可能であることが確認できた。また、このＰＣＲの条件において、ｃａｇｅｄ保護は１つで十分であるということも示された。
５．ＡＲＣＵＴによる１カ所切断部位への挿入
５−１．ＡＲＣＵＴ  ＬＡＣＥ−プライマーの設計及び合成
前述の通り、天然の制限酵素でベクターを切断した系に関しては１カ所切断及び２ヶ所切断の両方の系において、ＬＡＣＥ−ＰＣＲで調製したインサートを導入することに成功した。この方法による最大の特徴として好きな配列を持った突出末端を作ることができるということで、ＡＲＣＵＴ切断後に生じる天然には存在しない突出末端と直接ライゲーションすることができるのではないかと考えた。そこで、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ株式会社；４３６１ｂｐ（配列番号７）：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０１７４９）をＡＲＣＵＴで一カ所切断した系にインサートを直接挿入することを試みた。図１３ａに示すようにＡＲＣＵＴの標的切断部位はｐＢＲ３２２の１８３０ｂｐ付近にした。使用したｐｃＰＮＡ（擬似相補性ペプチド核酸）も同様に図１３ａに示した。ＡＲＣＵＴによるベクターの切断は、図１３ｂ中に示す矢印のところのいずれかで起こるが、今回は青い矢印（両鎖とも、図１３ｂに示された５本の矢印のうち右から２番目の矢印）のところで起こった切断によって生じるベクター断片（図１４ａ）をターゲットとした。なお、図１４ａに示したベクター断片中、中間のｐＢＲ３２２と表示した部分の塩基配列（計２５０１ｂｐ：配列番号７の塩基配列中の第１８５０番目〜第４３５０番目の塩基からなる）は、配列番号８に示した（図１６ａにおいても同じ）。そこで、図１４ｂに示す突出末端を持つようなインサート断片を作製するように、前記スキーム１のＣ５及びＣ６のＰＣＲプライマーを設計し、前述の２−１．項の方法と同様に、ｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰを鋳型としてＰＣＲ、及び光照射を行い、所望のインサート断片（図１４ｂ）を合成、精製した。ここで、プライマーの設計に非常に重要な点を一つ述べる。ＡＲＣＵＴの突出末端は非常に長いため、ＬＡＣＥ−ＰＣＲで用いるプライマーもそれに応じて長くなる。このとき２つのプライマーは相補的な配列を含むことになり、プライマーダイマーを形成しやすくなる。そこで、Ｃ５及びＣ６のように、互いに相補的な部分にあえてＴＮＰＰを導入することでプライマーどうしの相互作用を阻害し、プライマーダイマーを形成しないように設計を行った。
５−２．ｐＢＲ３２２のＡＲＣＵＴによる１ヶ所切断、及び切断断片の精製
スーパーコイルのｐＢＲ３２２をＡＲＣＵＴにより切断した断片を、ゲル精製し、線状化された断片を得た。さらにＰＮＡと相補的なｏｌｉｇｏＤＮＡを過剰に加えてＰＮＡ除去を行い、その後、ホスファターゼ処理を行って脱リン酸化した。
５−３．ＬＡＣＥ−ＰＣＲ産物のベクターへの挿入（組換えベクターの作製）
設計した通りにＬＡＣＥ−ＰＣＲでインサートが増幅されたことが確認されたので、ｃａｇｅｄ脱保護後にキナーゼ処理をし、ＡＲＣＵＴにより線状化したベクターへの挿入を試みたが、結論から言うとこの系は全てうまくいかなかった。その主な原因として挙げられるのは突出末端が長いために、制限酵素で１カ所だけ切断した系と比較すると自己環化が起きやすくなっているからだと考えられる。インサートの量をベクターの５０当量から２００当量まで増やしてライゲーションを行ったが、いずれの場合にもコロニーＰＣＲでポジティブのものは得られてこなかった。また、ライゲーション反応無しで大腸菌に形質転換した場合もコロニーが増えてきたことから、この系はライゲーション反応無しでも十分挿入することが可能であると考えられた。
６．ＥｃｏＲＩ−ＡＲＣＵＴによる２ヶ所切断部位への挿入
６−１．ＥｃｏＲＩ−ＡＲＣＵＴ  ＬＡＣＥ−プライマーの設計
ＥｃｏＲＩにより線状化したｐＢＲ３２２を１８３０ｂｐ付近でＡＲＣＵＴによって切断することで、１８３０ｂｐと２５３０ｂｐの２つの断片が得られる。このうち２５３０ｂｐの断片は、薬剤耐性遺伝子（Ａｍｐ）と複製起点（ｏｒｉ）を持っているためベクターとしての働きを有するものであった（図１５）。そこで、これまでに合成したＣ３とＣ６をＬＡＣＥ−プライマーとして用いることで、図１６ｂに示すような突出末端を有する断片を作製し、図１６ａに示すＡＲＣＵＴ切断断片にインサートを挿入することを行った。
６−２．ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩとＡＲＣＵＴによる２ヶ所切断、及び切断断片の精製
ＥｃｏＲＩにより線状化したｐＢＲ３２２を、さらにＡＲＣＵＴによって切断し、前記４−２．項と同様にして精製した。図１７に、ｐＢＲ３２２の切断後の電気泳動の結果を示した（レーン１：ＥｃｏＲＩのみで切断、レーン２：ＥｃｏＲＩ及びＡＲＣＵＴで切断）。
６−３．ＬＡＣＥ−ＰＣＲ産物のベクターへの挿入（組換えベクターの作製）
設計した通りにＬＡＣＥ−ＰＣＲでインサートが増幅されたことが確認されたので、ｃａｇｅｄ脱保護後にキナーゼ処理をし、前記５−２．項で調製したベクター側とインサートとを、１：４０の比となるように混合し、ライゲーションした後に、ＤＨ５αに導入して形質転換した。コロニーの生成が確認されたので、これまでと同様にコロニーＰＣＲを行い、ポジティブコロニーのプラスミドＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで１カ所切断し抽出してきたプラスミドＤＮＡの大きさを確認した（図１８，レーン４）。
前述した方法と同様にして当該プラスミドＤＮＡの塩基配列を確認したところ、図１９に示した通り、ＥｃｏＲＩにより切断した部分もＡＲＣＵＴにより切断した部分も、目的の位置でライゲーションが行えたことが分かった。
さらに、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを持ったＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に当該プラスミドを導入して形質転換させたところ、ＧＦＰが発現することも確認できた（図２０）。
７．まとめ及び考察
本実施例をまとめると、ポリメラーゼは、ｃａｇｅｄ保護したＤＮＡをテンプレートとしたときに、保護基がついた塩基より先には伸長反応（相補鎖合成反応）を起こすことはできず、任意の５’末端突出構造が形成された。ｃａｇｅｄ保護はＵＶ照射によって容易に脱保護することができるため、遺伝子組換え技術にもこのことを応用し、ｃａｇｅｄ保護されたＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことで自由に５’突出末端を調製することに成功した（ＬＡＣＥ−ＰＣＲ）。ＬＡＣＥ−ＰＣＲによって調製したインサートを制限酵素処理したベクター及びＡＲＣＵＴ処理したベクターに挿入することに成功した。このことにより、ＡＲＣＵＴの挿入断片にＯｌｉｇｏｊｏｉｎｔを用いることなく目的の位置でライゲーションを行うことに成功した。この技術の確立により、例えばＡＲＣＵＴを用いた遺伝子工学への応用が可能と考えられた。また、近年、細菌のゲノムを一から化学合成することに成功したが、この際にも特定の突出末端を作製するという点が一つのキーポイントとなっていた。本発明の方法を応用することで遺伝子合成、ＤＮＡ−ｏｖｅｒｈａｎｇ  ｃｌｏｎｉｎｇ（ＤＯＣ）などが可能になると考えられた。
【実施例２】
【０００７】
＜ＬＡＣＥ−ＰＣＲ法を利用したリガーゼを用いない遺伝子組換え（Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）＞
１．ＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドへの挿入によるＧＦＰ−ＢＦＰ遺伝子の作製
粘着末端がある程度長い断片同士を用いた場合、大腸菌の修復機構を利用してライゲーション無しに形質転換を行うことができることが知られている。１０塩基前後の長い粘着末端を有するＬＡＣＥ−ＰＣＲで増幅した、ｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰベクター（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ；５１１５ｂｐ（配列番号９）；図２１左）の全長と、同じくＬＡＣＥ−ＰＣＲで増幅した、ｐＱＢＩ  ６７ベクター（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ；６３６１ｂｐ；図２１右）中のＢＦＰ断片とを結合し、ＧＦＰ−ＢＦＰ融合タンパク質をコードする新たなベクターを構築した（図２１参照）。
２．ＬＡＣＥ−プライマーの設計及び合成
２−１．ｐＱＢＩ−Ｔ７  ＧＦＰベクター増幅用プライマー
ｐＱＢＩ−Ｔ７  ＧＦＰベクターの全長をＬＡＣＥ−ＰＣＲで増幅するため、以下に示すＣ７及びＣ８のＰＣＲプライマーを合成した。
0005397960.tif 000017
Ｃ７及びＣ８は、ｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰベクターのうちの第３１４番目〜第３２８番目の塩基を除いた塩基配列全領域を増幅するプライマーである。この除かれる領域にＧＦＰ遺伝子の終止コドンが含まれているため、外来タンパク質の遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されるとＧＦＰとの融合タンパク質が翻訳（生成）される。ＬＡＣＥ−ＰＣＲにより粘着末端となるプライマーのＴＮＰＰより５’側には、グリシンリンカーをコードする９塩基（Ｃ７）又はｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰの第３１５番目〜第３２４番目の塩基と同一の１０塩基（Ｃ８）を付加した。
２−２．ＢＦＰ遺伝子増幅用プライマー
ｐＱＢＩ  ６７ベクターにコードされたＢＦＰ遺伝子をＬＡＣＥ−ＰＣＲで増幅するため、以下に示すＣ９及びＣ１０のＰＣＲプライマーを合成した。
0005397960.tif 000018
Ｃ９及びＣ１０は、ｐＱＢＩ  ６７ベクターのうち第３３５番目〜第１０３５番目の塩基からなるＢＦＰ本体をコードする塩基配列領域（７０１ｂｐ；配列番号１５）を増幅するプライマーである。ＬＡＣＥ−ＰＣＲにより粘着末端となるプライマーのＴＮＰＰより５’側には、グリシンリンカーをコードする９塩基（Ｃ１０）又はｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰの第３１５番目〜第３２４番目の塩基と同一の１０塩基（Ｃ９）を付加した。
２−３．ＬＡＣＥ−ＰＣＲ
前記プライマーを用いたＬＡＣＥ−ＰＣＲを行った。Ｃ７及びＣ８を用いたベクター断片の増幅には市販されているＰｆｕ  ｕｌｔｒａ、Ｃ９及びＣ１０を用いたＢＦＰインサートの増幅にはＰｆｕ  ｔｕｒｂｏをＰＣＲのポリメラーゼとして使用した。ＰＣＲ後、メチル化されたＤＮＡを消化するＤｐｎ  Ｉで３７℃一晩処理した後、市販のキットを用いて増幅された断片を簡易精製し、それぞれの断片の水溶液（ＴＥ緩衝液）を得た。次いで、ＵＶ照射により、ＮＰＰ保護基の脱保護を行った。増幅した断片のアガロース電気泳動結果を図２２に示した。レーン１に流した増幅断片は、２００ｂｐごとのラダーの６００ｂｐの断片と８００ｂｐの断片との間にバンドが観察され、設計通り７１０ｂｐの断片が増幅していることが確認された。
２−４．ＬＡＣＥ−ＰＣＲ産物を用いた大腸菌の形質転換
ベクター断片５０ｎｇ、ＢＦＰインサート２４ｎｇ（ｍｏｌｅ換算で約３当量。全量２μＬ）に相当するそれぞれの溶液を混合した後、３７℃で１ｈ保温し、ライゲーション反応を行わずにＪＭ１０９大腸菌株の溶液に加え形質転換を行った。この大腸菌液をカルベニシリン５０μｇのプレートで一晩培養した結果、６個のコロニーを得た。コロニーＰＣＲを行い、５個のコロニーが目的の組換え体であることを確認した。それぞれを液体培養してプラスミドを抽出した後、これらをＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。カルベニシリン５０μｇプレートで培養した結果、生えたコロニーは暗緑色蛍光を発した。図２３にこの大腸菌の蛍光の色を示した。「ＵＴ」の二文字が本実施例で作製した組換え体の蛍光であり、蛍光の色はＧＦＰ遺伝子のみをもつ「Ｌ」の文字、ＢＦＰの遺伝子のみをもつ「ＡＣＥ」の文字のどちらとも異なるものであった。
２−５．組換えベクターが設計通り構築されているかどうかの確認
抽出したプラスミドを制限酵素で切断し、長さが正しいことを確認した。アガロースゲル電気泳動の結果を図２４に示す。Ｅｃｏ  ＲＩで処理して直鎖にした抽出したプラスミド（レーン２）は、明らかにＬＡＣＥ−ＰＣＲで増幅したベクター断片（レーン１，５１２５ｂｐ）よりも泳動度が遅く、正しくＢＦＰ断片が挿入されていることがわかる。このことはＥｃｏ  ＲＩに加えてＮｈｅ  Ｉの２カ所で切断したレーン３でも予想される１８６２ｂｐ及び３９７５ｂｐのバンドが明瞭に観察されることでも確認できた。
２−６．組換えベクターにより発現されるタンパク質の確認
組換えベクターにより発現したタンパク質が正しくＧＦＰ−ＢＦＰ融合タンパク質であることを確認するため、形質転換した大腸菌を液体培養した後、溶菌処理を行った。溶菌液の蛍光を測定した結果、ＢＦＰに由来する４４８ｎｍ及びＧＦＰに由来する５０４ｎｍの両方の蛍光ピークが確認された（図２５）。また、溶菌液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析したところ、ＢＦＰ（２６．９ｋＤａ）ともＧＦＰ（２６．９ｋＤａ）とも異なる５０ｋＤａ前後の新たなタンパク質（ＧＦＰ−ＢＦＰ融合タンパク質；Ｆｕｓｉｏｎ）が強く発現していることが確認された（図２６）。
【実施例３】
【０００８】
＜２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基で保護したチミン及びアミダイトモノマーの合成＞
２−（２−ニトロフェニル）プロピルオキシメチル基で保護したチミン導入用のアミダイトモノマーは、下記スキーム２に従って合成した。
0005397960.tif 000019
スキーム２中の各化合物（化合物２〜９）の合成は、具体的には、以下のようにして行った。
２−（２−ニトロフェニル）プロパノール（化合物２）の合成
ＴｒｉｔｏｎＢ（４０％  ＭｅＯＨ溶液）（１７ｇ）の中に、化合物１の２−エチルニトロベンゼン（６．０ｇ，４０ｍｍｏｌ）と（ＨＣＨＯ）ｎ（１．５ｇ，４０ｍｍｏｌ）を加え、７時間加熱還留させた。溶媒を留去させた後、酢酸エチルに再溶解し、有機層を５％塩酸で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、シリカゲルクロマトグラフィでヘキサン：酢酸エチル（３：１）を展開溶媒として精製し、赤紫色の油状の目的物（化合物２）を１．９５ｇ（１０．７ｍｍｏｌ，収率２７％）得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ＝１．３４（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），３．５０−３．５８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），３．７７−３．８６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），７．３６（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．５０（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．５８（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）
２−［（２−ニトロフェニル）−（メチルチオ）メトキシ］−プロパン（化合物３）の合成
化合物２（１．９５ｇ  １０．７ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＴＨＦに溶解し、窒素雰囲気下、０℃で冷却、撹拌しながら水素化ナトリウム（６０％）（０．６ｇ）を加えた。４５分間撹拌した後、ヨウ化ナトリウム（１．６２ｇ，１０．７ｍｍｏｌ）を加え、次いでクロロメチルメチルスルフィド（ＣｌＣＨ２ＳＣＨ３；１．２９ｇ，１３．３５ｍｍｏｌ）を加えた。４時間氷冷しながら撹拌した後、室温に戻し、次いで溶媒を留去した。３０ｍＬの水を加え、エーテルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、シリカゲルクロマトグラフィでジクロロメタンを展開溶媒として精製し、茶色油状の目的物（化合物３）を１．３２ｇ（５．４３ｍｍｏｌ，収率５０％）得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ＝１．３６（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），２．００（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），３．６３−３．７６（３Ｈ，ｍ，ＣＨ，ＣＨ２），４．５８（２Ｈ，ｄ，ＣＨ２），７．３４（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．５２（２Ｈ，ｍ，Ａｒ−Ｈ），７．７５（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）
２−［（２−ニトロフェニル）−クロロメトキシ］−プロパン（化合物４）の合成
化合物３（１．３２ｇ，５．４３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン２０ｍＬに溶解し、窒素雰囲気下０℃で撹拌しながらＳＯ２Ｃｌ２（０．９４ｇ，６．９６ｍｍｏｌ）を加えた。４時間氷冷化で撹拌し、室温に戻した後に過剰のＳＯ２Ｃｌ２を減圧留去した。反応は定量的で、得られた化合物（化合物４）はこのまま精製せずに次の反応に用いた。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ＝１．３７（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），３．６６（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），３．８１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），５．４３（２Ｈ，ｑ，ＣＨ２），７．３６（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．４８（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．５７（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．７６（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）
チミジンアセテート（化合物５）の合成
窒素雰囲気下、チミジン（２．９３ｇ，１２．１ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（４０ｍｇ，０．３２７ｍｍｏｌ）を６０ｍＬの無水酢酸に溶解し、３０ｍＬの乾燥ピリジンを加えて室温で一晩撹拌した。ピリジンおよび無水酢酸を減圧留去し、１００ｍＬのクロロホルムを加え、有機層を水１００ｍＬで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、シリカゲルクロマトグラフィでヘキサン：酢酸エチル（１：３）を展開溶媒として精製し、２．８２ｇ（８．６４ｍｍｏｌ，収率７１％）の目的物（化合物５）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ＝１．９４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３），２．１０−２．２２（８Ｈ，ｍ，２×ＣＨ３，ＣＨ２），２．４６（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），４．３６（２Ｈ，ｄｄ，ＣＨ２），５．２２（１Ｈ，ｄ，ＣＨ），６．３２（１Ｈ，ｑ，ＣＨ），７．２９（１Ｈ，ｓ，ＣＨ），８．６５（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）
３−Ｎ−［２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシメチル］チミジンアセテート（化合物６）の合成
化合物５を２０ｍＬのＤＭＦに溶解し、炭酸セシウムを加えて室温で１時間撹拌した。次いで溶液を氷冷してＤＭＦに溶かした化合物４（１．２６ｇ，５．４７ｍｍｏｌ）を滴下した。溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルを加えた。有機層を３０ｍＬの水で２回、飽和炭酸水素ナトリウム水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧留去し、シリカゲルクロマトグラフィでヘキサン：酢酸エチル（１：２）を展開溶媒として精製し、１．５０ｇ（２．８９ｍｍｏｌ，収率５２％）の目的物（化合物６）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ＝１．３１（３Ｈ，ｄｄ，ＣＨ３），１．９３（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），２．１１（８Ｈ，ｍ，２×ＣＨ３，ＣＨ２），３．５７（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），３．７４−３．８８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），４．２５（１Ｈ，ｓ，ＣＨ），４．３４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），５．２１（１Ｈ，ｄ，ＣＨ），５．３６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），７．２８（１Ｈ，ｓ，ＣＨ），７．３１（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．４６（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．５１（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．７１（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ）
３−Ｎ−［２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシメチル］チミジン（化合物７）の合成
化合物６（１．５０ｇ，２．８９ｍｍｏｌ）をメタノール２０ｍＬに溶解し、濃アンモニア水８ｍＬを加え、室温で１時間撹拌した。溶媒を減圧留去し、目的物（化合物７）を定量的に得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ＝１．３１（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），１．９０（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），２．３１−２．４２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．５５−３．６５（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），３．７５−３．９５（４Ｈ，ｍ，２×ＣＨ２），３．９７（１Ｈ，ｑ，ＣＨ），４．５５（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），５．３４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），７．３１（１Ｈ，ｔ，ＣＨ），７．４３（２Ｈ，ｔ，２×Ａｒ−Ｈ），７．５２（１Ｈ，ｔ，Ａｒ−Ｈ），７．７０（１Ｈ，ｄｄ，Ａｒ−Ｈ）
３−Ｎ−［２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシメチル］チミジン  ジメトキシトリチルエーテル（化合物８）の合成
化合物７（１．２６ｇ，２．８９ｍｍｏｌ）と塩化ジメトキシトリチル（１．１９ｇ，３．５１ｍｍｏｌ）をピリジン２０ｍＬに溶解し、窒素雰囲気下、室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧留去し、残渣を酢酸エチル３０ｍＬに溶解した。飽和食塩水で有機層を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。シリカゲルクロマトグラフィで３％トリエチルアミン含有ヘキサン：酢酸エチル（１：１）を展開溶媒として精製し、１．３１ｇ（１．７７ｍｍｏｌ，収率６１％）の目的物（化合物８）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）  δ＝１．３１（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），１．９２（３Ｈ，ｄ，ＣＨ３），２．２８−２．５０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），３．５６（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），３．７６−３．９０（１０Ｈ，ｍ，２×ＣＨ２，２×ＣＨ３），３．９２（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），４．５６（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），５．３７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２），６．１６（１Ｈ，ｄ，ＣＨ），６．８４（４Ｈ，ｄ，４×Ａｒ−Ｈ），７．１７（３Ｈ，ｄ，３×Ａｒ−Ｈ），７．２７−７．３６（７Ｈ，ｍ，６×Ａｒ−Ｈ，ＣＨ），７．３６（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ），７．５１（１Ｈ，ｑ，Ａｒ−Ｈ），７．７１（１Ｈ，ｄ，Ａｒ−Ｈ）
ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋  ｍ／ｚ＝７６０．８
３−Ｎ−［２−（２−ニトロフェニル）−プロピルオキシメチル］チミジン  ホスホルアミダイト（化合物９）の合成
化合物８（０．３０ｇ，０．４０６ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で２ｍＬの乾燥アセトニトリルに溶解した。ジイソプロピルエチルアミン、２−シアノエチル−ジイソプロピル−クロロホスホルアミド（２００μＬ，０．９１２ｍｍｏｌ）を加え室温で、１時間半撹拌した。溶媒を減圧留去し、飽和炭酸水素ナトリウム水と酢酸エチルを加えて有機層に抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を減圧留去した。３％トリエチルアミン含有クロロホルム：メタノール（２０：１）を展開溶媒としてシリカゲルクロマトグラフィで精製し、０．２５ｇ（０．２６ｍｍｏｌ，収率６５％）の目的物（化合物９）を得た。
ＥＳＩ−ＭＳ［Ｍ＋Ｎａ］＋  ｍ／ｚ＝９６１．７
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明によれば、粘着末端を有する所望の２本鎖ＤＮＡ断片が、ＰＣＲ後の増幅産物（増幅断片）から制限酵素処理を介さずに直接的かつ容易に得られる、ＤＮＡ断片の調製方法提供することができる。また、本発明によれば、当該調製方法に用い得る新規なＰＣＲプライマーを提供することができる。さらに、本発明によれば、当該調製方法により得られるＤＮＡ断片を用いた、遺伝子組換え方法を提供することができる。
本発明の調製方法によれば、粘着末端を有する２本鎖ＤＮＡ断片として、制限酵素処理により得られる粘着末端と同一の塩基配列からなる粘着末端を有するＤＮＡ断片であっても、制限酵素処理により得られる粘着末端とは異なる塩基配列からなる粘着末端を有するＤＮＡ断片であっても、いずれも容易に得ることができる。ここで、後者のＤＮＡ断片としては、粘着末端部分（１本鎖ＤＮＡの部分）の塩基長は、ＰＣＲプライマー中の鋳型ＤＮＡと結合しない部分の塩基長を任意に設計することで、所望の長さとすることができ、特に制限がない。そのため、ホストＤＮＡとの結合に関し、特異性や結合効率を所望のレベルに向上させたＤＮＡ断片を調製することも容易に可能である。また、例えば、粘着末端部分の塩基長の長いＤＮＡ断片を遺伝子組換えに用いた場合、ホストＤＮＡとの結合に際し、従来のようにリガーゼ等のＤＮＡ結合酵素を使用しなくても、当該ＤＮＡ断片とホストＤＮＡとを混合するだけで互いに結合し得る反応を行うこともできる。よって、本発明は、簡便性、経済性、実用性に優れた遺伝子組換え方法を提供することもできる。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号１：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置４）。
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号３：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置３）。
配列番号３：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置４）。
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号４：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置３）。
配列番号４：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置４）。
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号５：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置９）。
配列番号５：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１６）。
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号６：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置８）。
配列番号６：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１６）。
配列番号７：クローニングベクターｐＢＲ３２２
配列番号８：クローニングベクターｐＢＲ３２２
配列番号９：クローニングベクターｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰ
配列番号１０：クローニングベクターｐＱＢＩ  Ｔ７−ＧＦＰ
配列番号１１：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１０）。
配列番号１１：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１０）。
配列番号１２：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１１）。
配列番号１２：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１１）。
配列番号１３：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１１）。
配列番号１３：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１１）。
配列番号１４：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１０）。
配列番号１４：ｔは２−（２−ニトロフェニル）プロピル基（ＮＰＰ基）基で修飾されている（存在位置１０）。
配列番号１５：クローニングベクターｐＱＢＩ６７（ＢＦＰ遺伝子）
［配列表］
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【図８】
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【図２５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005397960.tif 000042
【図６】
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【図７】
0005397960.tif 000044
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
0005397960.tif 000049
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２６】
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