(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
前記励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部と、
共鳴角を検出する共鳴角スキャン工程、前記反応層に検体液及び試薬液を送液する送液工程および前記蛍光物質を検出する検出工程のいずれかの工程間において、異なるビーム形状となるように、前記ビーム形状変更部を制御する制御手段と、を有することを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項２】
前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御して前記励起光のビーム形状を変更することにより前記励起光の前記金属薄膜に対する照射領域の拡大縮小を行い、
前記共鳴角スキャン工程時の照射領域よりも、前記検出工程時の照射領域が広いことを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項３】
前記共鳴角スキャン工程時の照射領域は前記反応層の領域内の一部の領域であり、前記検出工程時の照射領域は前記反応層を覆う領域であることを特徴とする請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項４】
前記反応層に検体液及び蛍光物質が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は、前記送液工程において送液状態の検出を行うために照射する前記励起光の照射領域が、前記検出工程時の照射領域よりも広くなるように制御することを特徴とする請求項２又は３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項５】
前記反応層に検体液及び蛍光物質が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御することにより、
前記共鳴角スキャン工程時の照射領域を前記反応層の領域の一部とし、
前記検出工程時の照射領域を前記反応層の領域と略一致させ、
前記送液工程時の照射領域を前記反応層の領域の内部及び外部にまたがる領域にする、
ことを特徴とする請求項２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【請求項６】
前記金属薄膜上における前記励起光の照射領域の、前記励起光の前記金属薄膜への入射角度の変更に対応する変化を相殺するように、
前記入射角度の変更に合わせて前記ビーム形状変更部により前記励起光のビーム形状を変更させることにより、前記金属薄膜上の前記励起光の照射領域を一定とするように制御することを特徴とする請求項１から５の何れか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ；Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づき、例えば生体内の極微少なアナライトの検出が行われている。表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザ光（励起光）が金属薄膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ；attenuated total reflectance）する条件において、金属薄膜表面に粗密波（表面プラズモン）を発生させることによって、光源より照射したレーザ光（励起光）が有するフォトンを金属薄膜近傍に局在化させることができ、これにより金属薄膜近傍の蛍光物質を効率良く励起させることによって、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出する方法である。【０００３】
近年、このような表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）の原理に基づいた表面プラズモン増強蛍光測定装置の開発が進められており、例えば特許文献１や特許文献２などにその技術開示がなされている。【０００４】
このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図１１に示したように基本的な構造において、誘電体部材１０６の表面に金属薄膜１０２、更にその表面に反応層１０４が設けられたチップ構造体１０８を備えている。【０００５】
そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２で反射した金属薄膜反射光ｂ２を受光する受光手段１１６が備えられている。【０００６】
一方、チップ構造体１０８の反応層１０４側には、反応層１０４で捕捉されたアナライトを標識した蛍光物質が発する蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。【０００７】
なお、反応層１０４と光検出手段１２０との間には、蛍光ｂ３を効率よく集光するための集光部材１２２と、蛍光ｂ３以外に含まれる光を除去し、必要な蛍光のみを選択するフィルタ１２４が設けられている。【０００８】
そして、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０の使用においては、あらかじめ金属薄膜１０２の表面上には検出対象のＤＮＡ等のアナライトに含まれる抗原に特異的に結合する１次抗体があらかじめ固定されている。金属薄膜１０２に接する反応層１０４に、アナライト及び当該アナライトに特異的に結合する２次抗体を順に送液して、２次抗体を反応層１０４で捕捉させる。アナライトとともに捕捉される２次抗体は蛍光物質で標識されている。【０００９】
捕捉された反応層１０４に光源１１２より誘電体部材１０６内に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が特定の角度（共鳴角）θ１で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになっている。なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光ｂ２の光量減少という現象が生ずる。【００１０】
受光手段１１６及び光源１１２とは対となって金属薄膜１０２の照射領域を中心として回動し、金属薄膜１０２への入射角度を変更することができる。入射角度を変化させ、その際の受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ、粗密波（表面プラズモン）が生ずる共鳴角θ１を得ることができる。【００１１】
入射角度を変化するに対応して、その際の受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）する、当該光量の減少に対応するように金属薄膜近傍で局所的に粗密波（表面プラズモン）が生ずることとなる。この際の光量が最少となる入射角度あるいは、当該入射角度付近の角度を共鳴角θ１として得ることができる。【００１２】
そして、この粗密波（表面プラズモン）を生ずる現象により、金属薄膜１０２上の反応層１０４の蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大することとなる。【００１３】
この増大した蛍光ｂ３を、集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができるようになっている。【００１４】
このように、表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、特に生体分子間などの微細な分子活動を観察可能とする高感度計測センサである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特許第３２９４６０５号公報
【特許文献２】特開２００８−１０２１１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
金属薄膜１０２への励起光の入射角を振って共鳴角θ１を求める共鳴角スキャン工程においては励起光の照射範囲は反応層１０４の反応領域の内側であることが望まれる。一方で、励起光の照射によりアナライトの検出を行う検出工程の際には、標識からの信号を感度よく捉えるためには、反応領域の全域を照射することが望まれ、これらを両立することは難しかった。【００１７】
本願発明は上記問題に鑑み、共鳴角スキャンと、標識物質の検出を共に精度よく行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記の目的は、下記に記載する発明により達成される。【００１９】
１．金属薄膜の一方側に励起光を照射し、前記金属薄膜上の電場を増強させることにより、前記金属薄膜の他方側に形成された反応層の蛍光物質を励起させ、これにより増強された蛍光を光検出手段にて検出するようにした表面プラズモン増強蛍光測定装置であって、
前記励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部と、
前記ビーム形状変更部を制御する制御手段と、を有することを特徴とする表面プラズモン増強蛍光測定装置。【００２０】
２．前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御して前記励起光のビーム形状を変更することにより前記励起光の前記金属薄膜に対する照射領域の拡大縮小を行い、
共鳴角を検出する共鳴角スキャン工程時の照射領域よりも、蛍光物質を検出する検出工程時の照射領域が広いことを特徴とする前記１に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。【００２１】
３．前記共鳴角スキャン工程時の照射領域は前記反応層の領域内の一部の領域であり、前記検出工程時の照射領域は前記反応層を覆う領域であることを特徴とする前記２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。【００２２】
４．前記反応層に検体液及び蛍光物資が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は、前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程において送液状態の検出を行うために照射する前記励起光の照射領域が、前記検出工程時の照射領域よりも広くなるように制御することを特徴とする前記２又は３に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。【００２３】
５．前記反応層に検体液及び蛍光物資が含まれる試薬液を送液される流路を有し、
前記制御手段は前記ビーム形状変更部を制御することにより、
前記共鳴角スキャン工程時の照射領域を前記反応層の領域の一部とし、
前記検出工程時の照射領域を前記反応層の領域と略一致させ、
前記反応層に検体液及び試薬液が送液される送液工程時の照射領域を前記反応層の領域の内部及び外部にまたがる領域にする、
ことを特徴とする前記２に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。【００２４】
６．前記金属薄膜上における前記励起光の照射領域の、前記励起光の前記金属薄膜への入射角度の変更に対応する変化を相殺するように、
前記入射角度の変更に合わせて前記ビーム形状変更部により前記励起光のビーム形状を変更させることにより、前記金属薄膜上の前記励起光の照射領域を一定とするように制御することを特徴とする前記１から５の何れか一項に記載の表面プラズモン増強蛍光測定装置。
【発明の効果】
【００２５】
本願発明によれば、励起光のビーム形状を変更するビーム形状変更部及びこれを制御する制御手段とを備えることにより、共鳴角スキャンと、標的物質の検出を共に精度よく行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】実施形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【図２】図２（ａ）は、マイクロチップ１４周辺の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。
【図３】図３は、絞り機構を用いたビーム形状変更部１３０ａを示した模式図である。
【図４】ビームエキスパンダーを用いたビーム形状変更部１３０ｂを示す模式図である。
【図５】ズームレンズを用いたビーム形状変更部１３０ｃを示す模式図である。
【図６】制御手段１３により実行される制御フローを示す図である。
【図７】図７（ａ）は共鳴角スキャン工程における励起光ｂ１３と反応層１０４との位置関係を示す模式図であり、図７（ｂ）は同工程におけるビーム形状変更後の励起光ｂ１２の断面形状を示す模式図である。
【図８】図８（ａ）はアナライトの検出を行う検出工程における励起光ｂ１３と反応層１０４との位置関係を示す模式図であり、図８（ｂ）は同工程におけるビーム形状変更後の励起光ｂ１２の断面形状を示す模式図である。
【図９】図９（ａ）、図９（ｂ）はそれぞれ図８（ａ）、図８（ｂ）の変形例である。
【図１０】図１０（ｃ）は断面半円形の誘電体部材１０６を用いた変形例である。図１０（ａ）、図１０（ｂ）はそれぞれ、図７（ａ）、図７（ｂ）に対応した図である。
【図１１】従来の表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明を実施の形態に基づいて説明するが、本発明は該実施の形態に限られない。
【００２８】
図１、図２は、実施形態に係る表面プラズモン増強蛍光測定装置の概略図である。
【００２９】
表面プラズモン増強蛍光測定装置は、励起光を金属薄膜に照射して粗密波（表面プラズモン）を生じさせて励起された蛍光物質が生ずる蛍光を正確に検出し、検出感度を上げても超高精度に蛍光検出を行うことを可能とするものである。
【００３０】
［表面プラズモン増強蛍光測定装置１０、及び検体検出方法］
本発明の表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、図１に示したように、まず金属薄膜１０２と、金属薄膜１０２の一方側面に形成された反応層１０４と、他方側面に形成された誘電体部材１０６と、を有するチップ構造体１０８を備えている。
【００３１】
そして、チップ構造体１０８の誘電体部材１０６側には、誘電体部材１０６内に入射され、金属薄膜１０２に向かって励起光ｂ１を照射する光源１１２を備え、さらに光源１１２から照射され金属薄膜１０２に反射した金属薄膜反射光ｂ２を受光する受光手段１１６を備えている。
【００３２】
ここで光源１１２から照射される励起光ｂ１としてはレーザ光が好ましく、波長２００〜１０００ｎｍのガスレーザまたは固体レーザ、波長３８５〜８００ｎｍの半導体レーザが好適である。また、光源から照射された励起光ｂ１は、そのビーム形状をビーム形状変更部１３０により形状変更される。なお、以下においてはビーム形状変更部１３０により形状変更される前と後の励起光を区別する場合にはそれぞれ励起光ｂ１１、励起光ｂ１２と称し、誘電体部材１０６の内部を透過して金属薄膜１０２に照射する励起光を励起光ｂ１３と称す。更にこれらを総称する場合には励起光ｂ１という。また励起光ｂ１３の金属薄膜１０２上の照射範囲を照射領域ｂ１３１（図７等参照）と称す。ビーム形状変更部１３０の構成については後述する。
【００３３】
一方、チップ構造体１０８の反応層１０４側には、反応層１０４で生じた蛍光ｂ３を受光する光検出手段１２０が設けられている。
【００３４】
光検出手段１２０としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
【００３５】
制御手段１３は、ＣＰＵやメモリを備えており、メモリに記憶されているプログラムを実行することにより、光源１１２、ビーム形状変更部１３０、受光手段１１６、光検出手段１２０等の各装置を制御する。
【００３６】
なお、チップ構造体１０８の反応層１０４と光検出手段１２０との間には、光を効率よく集光するための集光部材１２２と、光の内で蛍光ｂ３とは異なる波長の光の透過を低減して蛍光ｂ３を選択的に透過するように形成されたフィルタ１２４が設けられている。
【００３７】
集光部材１２２としては、光検出手段１２０に蛍光シグナルを効率よく集光することを目的とするものであれば、任意の集光系で良い。簡易な集光系としては、顕微鏡などで使用されている市販の対物レンズを転用してもよい。対物レンズの倍率としては、１０〜１００倍が好ましい。
【００３８】
一方、フィルタ１２４としては、光学フィルタ、カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ、ダイアフラムレンズなどが挙げられる。さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光）、励起光（励起光の透過成分）、迷光（各所での励起光の散乱成分）、プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、プラズモン励起センサ表面上の構造体または付着物などの影響で発生する散乱光）、酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ、色フィルタなどが挙げられる。
【００３９】
そして、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０を用いたアナライト検出方法では、反応層１０４に接する側の金属薄膜１０２表面上には１次抗体を結合させたＳＡＭ膜（Self-Assembled Monolayer：「自己組織化単分子膜」ともいう）あるいは高分子材料膜が設けられている。１次抗体はＳＡＭ膜あるいは高分子材料膜の一方の面に結合されており、ＳＡＭ膜あるいは高分子材料膜の他方の面は、直接若しくは間接に金属薄膜１０２表面に固定されている。ＳＡＭ膜としては例えばＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１１−ＳＨなどの置換脂肪族チオールで形成された膜、高分子材料としては例えばポリエチレングリコール（polyethylene glycol）やＭＰＣポリマー等が挙げられる。これは使用時に調製しても、予めこれらを結合させた基板を用いてもよい。また、１次抗体に対する反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を備えたポリマーを直接基板上に固定化し、その上に１次抗体を固定化してもよい。各種反応性基を利用して抗体やポリマーを結合させる際には、スクシンイミジル化を経たアミド化縮合反応や、マレイミド化を経た付加反応等が一般的である。
【００４０】
「送液工程」では、このようにして構成した反応層１０４に標的物質としてのアナライトの抗原を含む溶液（以下、検体液ともいう）と、二次抗体を含む試薬液の送液を行う。固定化した一次抗体によって抗原を捕捉することが可能である。これに対しさらに蛍光物質で標識した二次抗体を含む試薬液を作用させることで捕捉された抗原を標識している。なお予め抗原と二次抗体とを反応させておいてから一次抗体を作用させてもよい。
【００４１】
蛍光物質で標識されたアナライトの検出を行う「検出工程」においては、アナライトが捕捉された反応層１０４に光源１１２より誘電体部材１０６に励起光ｂ１を照射し、この励起光ｂ１が金属薄膜１０２に対して特定の入射角度（共鳴角θ１）で金属薄膜１０２に入射することで、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようになる。
【００４２】
なお、金属薄膜１０２上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光ｂ１と金属薄膜１０２中の電子振動とがカップリングし、金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段１１６で受光される金属薄膜反射光ｂ２のシグナルが変化（光量が減少）して最少となる地点を見つければ良い。
【００４３】
そして、この粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１０２上の反応層１０４で生じた蛍光物質が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光ｂ３の光量が増大し、この蛍光ｂ３を集光部材１２２およびフィルタ１２４を介して光検出手段１２０で受光することで、極微量および／または極低濃度のアナライトを検出することができる。
【００４４】
なお、チップ構造体１０８の金属薄膜１０２の材質としては、好ましくは金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金から成ることである。
【００４５】
このような金属は、粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１０２に好適である。
【００４６】
また、金属薄膜１０２の形成方法としては、例えばスパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ、無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法、蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
【００４７】
さらに金属薄膜１０２の厚さとしては、金：５〜５００ｎｍ、銀：５〜５００ｎｍ、アルミニウム：５〜５００ｎｍ、銅：５〜５００ｎｍ、白金：５〜５００ｎｍ、およびそれらの合金：５〜５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
【００４８】
電場増強効果の観点からは、金：２０〜７０ｎｍ、銀：２０〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
【００４９】
金属薄膜１０２の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、このような厚さを有する金属薄膜１０２であれば、大きさ（縦×横）は特に限定されないものである。
【００５０】
図２（ａ）は、チップ構造体１０８の断面図であり、図２（ｂ）はその一部の上面図である。反応層１０４はこれらの図に示すように石英基板１４２に設けられた流路１４３の経路中の下層側であって金属薄膜１０２の表層に設けられている。石英基板１４２の経路中に設けられている。石英基板１４２は固定具１４１により支持されている。流路１４３には蛍光物質が標識された二次抗体等が含まれる試薬液や、アナライトが含まれる検体液が不図示のポンプにより送液される。
【００５１】
検体としては、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、便、体腔液（髄液、腹水、胸水等）などが挙げられる。検体中に含有されるアナライトは、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド、ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子）、タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等）、アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。）、糖質（オリゴ糖、多糖類、糖鎖等）、脂質、またはこれらの修飾分子、複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー、シグナル伝達物質、ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
【００５２】
さらに蛍光物質としては、所定の励起光ｂ１を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光ｂ３を発する物質であれば特に限定されないものである。なお本明細書でいう蛍光ｂ３とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
【００５３】
また、誘電体部材１０６としては、高屈折率材料の角度６０度等のプリズムを用いることができる。高屈折率の材料としては光学的に透明な各種の無機物、天然ポリマー、合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、光学用ポリエステル（ＯＫＰ：大阪ガスケミカル（株）製）等を用いることができる。
【００５４】
さらに、このような表面プラズモン増強蛍光測定装置１０は、光源１１２から金属薄膜１０２に照射される励起光ｂ１による表面プラズモン共鳴の最適角（共鳴角θ１）を調整するため、角度可変部（図示せず）を有している。
【００５５】
ここで、角度可変部（図示せず）は制御手段１３により制御され、「共鳴角スキャン工程」においては角度可変部のサーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段１１６と光源１１２とを同期して、照射領域を中心として回動し、４５〜８５°の範囲で角度変更を可能としている。また分解能は０．０１°以上であることが好ましい。
【００５６】
［ビーム形状変更部］
図３から図５は、ビーム形状変更部１３０の実施例を示す模式図である。本願においてビーム形状の変更とは、ビーム形状の整形、変更のみならず、ビーム径の拡大、縮小を含む概念である。ビーム形状変更部１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ（これらを総称したものがビーム形状変更部１３０である）は制御手段１３により制御される。
【００５７】
図３は、絞り機構を用いたビーム形状変更部１３０ａを示した模式図である。同図において、歯車１３１ｇは絞り部材駆動ラック１０７に形成されたラック歯車１０７Ｌと歯合している。歯車１３１ｇは、不図示の枠体に形成されたボスに軸支されている。歯車１３１ｇは、絞り開閉リング１３５の外周に形成された歯車部１３５ｇと歯合している。絞り羽１３１には軸支穴１３２が形成され、絞り羽根支持リング１３６に形成されたボスで軸支され回動可能に支持されている。また、絞り羽根１３１にはピン１３３が植設され、絞り開閉リング１３５に形成された溝部１３４に挿入されている。このような構成にして、絞り部材駆動ラック１０７の図示矢印方向の移動により、歯車１３１ｇを介して絞り開閉リング１３５が回転し、複数の絞り羽根１３１が軸支穴１３２を中心に回動し絞り動作をおこなう、虹彩絞りとしている。ビーム形状変更部１３０ａにより、光源１１２から照射された励起光ｂ１１の形状を絞ることが可能である。なお、同図に示す例では、光軸を中心として円形に絞る構成としているが、４枚あるいは２枚の絞り羽１３１により光軸を中心として矩形に絞る構成としてもよい。
【００５８】
図４は、ビームエキスパンダーを用いたビーム形状変更部１３０ｂを示す模式図である。図４において、ビームエキスパンダーとして機能するビーム形状変更部１３０ｂは、第１レンズＬＳ１と、正レンズと負レンズとを接合した第２レンズＬＳ２とから構成されている。同図に示すビーム形状変更部１３０ｂは不図示のレンズ移動手段により第１レンズ及び第２レンズの少なくとも一方を光軸方向に移動することによって、光源１１２から照射された励起光ｂ１１のビーム径を可変することが可能である。
【００５９】
図５は、ズームレンズを用いたビーム形状変更部１３０ｃを示す模式図である。図５において、ズームレンズとして機能するビーム形状変更部１３０ｃは、第１レンズＬＳ３と第１レンズＬＳ３よりも焦点距離の短い第２レンズＬＳ４とからなり、２つのレンズの焦点距離の比により所定の縮小率あるいは拡大率でビーム径の変更を行うことができる。なお、一方のレンズを複数のレンズ群より構成し、レンズ群中の一つのレンズを光軸方向に可動させる機構を設けて、レンズ群の焦点距離を変更することにより拡大縮小率を変更可能な構成としてもよい。
【００６０】
なお図３から図５の構成を組み合わせたものをビーム形状変更部１３０としてもよい。また図４、図５においては球面レンズを用いているが、シリドンドリンカルレンズを適用することにより、縦横の拡大縮小比率を異ならせるようにしてもよい。また、図３から図５に示したビーム形状変更部の構成は一例であり、これらに限定されない。断面積、ビーム径その他のビーム形状を変更できる構成であればよい。
【００６１】
［ビーム形状の制御フロー］
図６から図８に基づいてビーム形状変更の制御について説明する。図６は制御手段１３により実行される制御フローを示す図である。
【００６２】
［共鳴角スキャン工程におけるビーム形状］
図６のステップＳ１１では、ビーム形状変更部１３０により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光ｂ１に対して形状変更を行う。ステップＳ１２ではステップＳ１１で変更したビーム形状により、共鳴角スキャン工程を実行する。ここで、ステップＳ１１で設定されたビーム形状は共鳴角スキャン工程に最適化したビーム形状であり、以下、図７に基づいて説明する。
【００６３】
図７（ａ）は共鳴角スキャン工程における励起光ｂ１３の金属薄膜１０２上での照射領域ｂ１３１と反応層１０４との位置関係を示す模式図であり、図７（ｂ）は同工程におけるビーム形状変更後の励起光ｂ１２の断面形状を示す模式図である。ステップＳ１２で実施する共鳴角スキャン工程は前述のとおり、受光手段１１６と光源１１２とを同期させて、金属薄膜１０２への入射角度を振って、全反射減衰の発生する入射角度（受光手段１１６、光源１１２の位置）を求めるものである。
【００６４】
共鳴角θ１は金属薄膜１０２の表面の化学的な状態により変化するものである。共鳴角スキャン工程において精度良く共鳴角θ１を求めるためには、金属薄膜１０２の表面に一次抗体が固定化されている反応層１０４の領域内に対して励起光ｂ１３を照射する必要がある。励起光ｂ１３の金属薄膜１０２上の照射領域ｂ１３１の一部あるいは全部が反応層１０４の外側を照射した場合には、正確に共鳴角θ１を求めることができないからである。本実施形態においては、共鳴角スキャン工程の入射角度の変更範囲で励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１が反応層１０４の領域内部に収まるように、予めビーム形状変更部１３０により励起光ｂ１２のビーム形状の適正化を図っている。以下説明する。
【００６５】
本実施形態においては、（１）誘電体部材１０６の屈折率はｎ＝１．５１５であり、その表面上に金属薄膜１０２が形成されている。また誘電体部材１０６は、１辺が２５ｍｍの６０度プリズム形状である。反応層１０４のサイズは１．０ｍｍ（Ｙ方向）×３．０ｍｍ（Ｘ方向）である。（２）励起光ｂ１は波長６３３ｎｍのレーザ光であり、共鳴角スキャン工程における励起光ｂ１の金属薄膜１０２への入射角度のスキャン範囲は７９度±３度である。ここでいう入射角度は、誘電体部材１０６への入射による屈折がなかった場合の入射角度を意味する。以下単に入射角度という場合には当該入射角度を示す。なお入射角度７９±３度での誘電体部材１０６表面での光路の屈曲した後の励起光ｂ１３の金属薄膜１０２への入射角度は、計算上で７０．４８〜７４．３２度となる。
【００６６】
図７（ａ）においては、入射角度のスキャン範囲上下限の８２度、７６度とその中間の７９度における励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１をそれぞれｘ１、ｘ３、ｘ２で示している。図７（ａ）に示すように入射角度の変更に伴い、金属薄膜１０２表面での励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１の大きさや照射位置が変化することになる。
【００６７】
本実施形態においては、入射角度のスキャン範囲において励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１が反応層１０４の領域内部（１．０ｍｍ×３．０ｍｍ）に収まるためには、励起光ｂ１２はφ０．３ｍｍの円形が適正であるというのが予め算出できる。ステップＳ１１ではこのような形状となるように、制御手段１３ではビーム形状変更部１３０により形状変更を行うように制御している。ちなみにφ０．３ｍｍの励起光ｂ１２に対して、励起光ｂ１３の金属薄膜１０２表面での照射領域ｂ１３１の大きさはｘ１（８２度）で１．１６１ｍｍ（Ｘ方向直径）、ｘ３（７６度）で０．９１８ｍｍ（Ｘ方向直径）となる。
【００６８】
［他の実施形態］
また、前述のように励起光の入射角度の変更に対応して、金属薄膜表面での励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１の大きさ及び照射位置が変化する。他の実施形態においては、このうちの大きさの変化を相殺するように当該入射角度の変更に合わせてビーム形状変更部１３０により励起光ｂ１２のビーム形状を変更させることにより、金属薄膜１０２上の励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１の大きさを一定とするように制御することが可能である。例えば、ｘ１（８２度）からｘ３（７６度）の範囲で照射角度を変更させた場合であってもｘ方向直径は一定の０．９０ｍｍとなるように、入射角度の変更に合わせて励起光ｂ１２のビーム形状を変更する。
【００６９】
このようにすることにより、常に同じ面積を照射することにより、照射面積の大小による蛍光ｂ３の光量への影響を避けることができる。
【００７０】
［送液工程におけるビーム形状］
送液工程においては、前述のように反応層１０４に検体液と蛍光標識されている二次抗体を含む試薬液の送液を行う。前述のとおり反応層１０４に接している金属薄膜１０２には、一次抗体が固定化されているので、検体液と試薬液を送液することにより一次抗体に特異的に反応する検体液に含まれる抗原が捕捉され、されに当該抗原に特異的に反応する二次抗体が捕捉されることになる。
【００７１】
図６のステップＳ２１では、ビーム形状変更部１３０により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光ｂ１に対して形状変更を行う。ステップＳ２２ではステップＳ２１で変更したビーム形状により、送液工程時における送液管理を行う。送液管理とは、検体液と試薬液が正常に送液されているかの送液状態を検出（観察）するものである。送液管理では、例えば液体が正常に送液されているかあるいは、気泡が流路中に発生していないかを検出する。
【００７２】
送液管理においては、反応層１０４のみならず、その周辺の流路１４３も観察する必要がある。送液管理における照射領域は少なくとも反応層１０４の全域を覆うあるいは反応層１０４の内部及び外部にまたがるようなビーム形状の設定がなされている。そのため後述の検出工程（ステップＳ３２）の（金属薄膜１０２表面における）照射領域よりも、当該送液管理（ステップＳ２２）における照射領域の方が広くなるようにビーム形状の設定がなされている（ステップＳ２１）。このようにすることにより、反応層１０４のみならずその周辺の流路１４３での液体の送液状態を管理することができる。
【００７３】
なお、送液管理時においては、必ずしも金属薄膜１０２表面における表面プラズモンにより発生する蛍光ｂ３により検出する必要はなく、金属薄膜１０２表面における反射光や散乱光を受光手段１１６により検出するようにしてもよい。その場合は、励起光ｂ１を共鳴角θ１で入射する必要はない。また検出時以外で蛍光物質に強いエネルギーを与えることによる色素の褪色が感度および定量精度の低下を引き起こすという問題が懸念されるので、表面プラズモンにより増強された電場で検出（観察）するよりも反射光や散乱光で検出する方が好ましい。また、励起光ｂ１の強度あるいは波長を変更するようにしてもよい。
【００７４】
［検出工程におけるビーム形状］
図６のステップＳ３１では、ビーム形状変更部１３０により、予め設定されているビーム形状となるよう励起光ｂ１に対して形状変更を行う。ステップＳ３２ではステップＳ３１で変更したビーム形状により、検出工程を実行する。ここで、ステップＳ３１で設定されたビーム形状は検出工程に最適化したビーム形状であり、以下、図８に基づいて説明する。
【００７５】
図８（ａ）はアナライトの検出を行う検出工程における励起光ｂ１３の金属薄膜１０２上の照射領域ｂ１３１と反応層１０４との位置関係を示す模式図であり、図８（ｂ）は同工程におけるビーム形状変更後の励起光ｂ１２の断面形状を示す模式図である。
【００７６】
前述のように共鳴角スキャン工程においては、励起光ｂ１３が反応層１０４の外側を照射しないようにそのサイズを絞る必要があった。一方で、検出工程においては、反応層１０４の全域に渡って捕捉されたアナライトに標識した蛍光物質の検出を行うためには、励起光ｂ１３は反応層１０４のなるべく広い領域に渡って照射することが好ましい。
【００７７】
本実施形態においては、共鳴角スキャン工程時の照射領域よりも検出工程時の照射領域が広くなるように制御手段１３によりビーム形状変更部１３０の制御を行っている。具体的には、共鳴角スキャン工程では反応層１０４の一部の領域を照射するようにし、当該共鳴角スキャン工程で決定した金属薄膜１０２への入射角度（共鳴角）において検出工程時に励起光ｂ１３による照射領域ｂ１３１が、反応層１０４の概ね全域あるいは略一致する領域となるように、励起光ｂ１２の形状を決定している。図８（ｂ）においてはビーム形状変更部１３０により励起光ｂ１２の断面形状をφ１．０ｍｍの円形にしている。このような形状とすることにより、図８（ａ）に示すように励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１は、反応層１０４の大部分を照射していることがわかる。なお、共鳴角スキャン工程で決定した入射角度（共鳴角）の値により照射領域の位置が異なることになるが、入射角度のスキャン範囲の上下限でも反応層１０４の大部分を照射するようなビーム形状としている。また、図１に示した位置調整機構１４によりチップ構造体１０８をＺ軸方向に移動可能な構成とし、位置調整機構１４で共鳴角θ１に応じたＺ軸方向の調整をすることで、共鳴角θ１で入射した励起光の照射領域の中心と反応層１０４の中心を一致させることが望ましい。
【００７８】
本実施形態によれば、ビーム形状変更部１３０を制御手段１３が制御して励起光のビーム形状の変更を適切に行うことにより、共鳴角スキャンと、標的物質の検出を共に精度よく行うことが可能となる。
【００７９】
［変形例］
図９は、図８の変形例である。図９に示す実施形態においては、ビーム形状変更部１３０は図３に示したような絞り機構であって、且つ、ビーム形状を矩形に整形することができるものである。図９（ｂ）に示す例においてはビーム形状変更部１３０により励起光ｂ１２の断面形状を１．０ｍｍ角の正方形にしている。このようにすることにより、図９（ａ）に示すように反応層１０４（反応領域）が矩形形状である場合には、その形状に近似したビーム形状とすることにより、検出工程時の励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１は反応層１０４の全域を容易に覆うことができ、図８よりも更に広範囲の蛍光物質からの信号を余すことなく捉えることが可能となる。
【００８０】
［その他の実施形態］
図１０は変形例として断面が半円形の誘電体部材１０６を用いた実施形態である。図１０に示す実施形態においては、以下説明するように、入射角度によらず励起光ｂ１３の金属薄膜１０２上の照射位置を固定化することができる。
【００８１】
図１０（ｃ）に示すように半円形の誘電体部材１０６を用いた場合には、共鳴角スキャン工程において光源１１２、受光手段１１６を移動させて入射角度を変更させた場合であっても励起光ｂ１を誘電体部材１０６の半円の中心に向けて照射するようにすることにより、誘電体部材１０６表面で励起光ｂ１は常に法線方向から照射することになる。このような構成とすることにより誘電体部材１０６表面での光路の屈曲が生じないので、図１０（ａ）に示すように入射角度を変更することにより照射領域ｂ１３１がｘ１〜ｘ３のように変化しても反応層１０４における励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１の中心は常に一定となる。
【００８２】
図７（ａ）においては、入射角度の変更による、励起光ｂ１３の照射位置の変化と照射領域における大きさの変化の双方を考慮して、ビーム形状の設定を行っていたが、図１０に示す実施形態においては、照射領域における大きさの変化のみを考慮すればよい。その結果、ビーム形状変更部１３０により変更するビーム形状は図１０（ｂ）に示すように図７（ｂ）に比較してＸ方向の長さを拡大したφ０．８ｍｍ程度（誘電体部材１０６入射位置）の円形に設定することができる。但し半円形の誘電体部材１０６を用いた場合には、誘電体部材１０６内部の入射光（励起光ｂ１３）が平行光になるように、励起光ｂ１２は発散光とする必要がある。
【００８３】
また、図１に示すような三角形状の誘電体部材１０６を用いた実施形態においても、共鳴角スキャン工程において位置調整機構１４により入射角と誘電体のサイズ・屈折率から計算される位置にチップ構造体１０８を連動させれば、入射角により移動する照射領域を反応場（反応層１０４）中心に維持することができ、入射角による励起光照射領域の面積変化のみを考慮したビーム形状に制御することが可能である。
【００８４】
更に、その他の実施形態と、前述の他の実施形態のように励起光の入射角度の変更に合わせてビーム形状変更部１３０により励起光ｂ１２のビーム形状を変更させる構成を適用することにより、金属薄膜１０２上の励起光ｂ１３の照射領域ｂ１３１の中心の位置及び大きさを一定とするように制御することが可能である。
【符号の説明】
【００８５】
１０  増強蛍光測定装置
１３  制御手段
１４  位置調整機構
１３０、１３０ａ、１３０ｂ、１３０ｃ  ビーム形状変更部
ｂ１、ｂ１１、ｂ１２、ｂ１３  励起光
ｂ１３１  照射領域
ｂ２  金属薄膜反射光
ｂ３  蛍光
１０２  金属薄膜
１０４  反応層
１０６  誘電体部材
１０８  チップ構造体
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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