(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、８または１０に記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
小麦から単離された、または組換え生成された請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号１、７または９に記載のヌクレオチド配列を有する請求項３記載の核酸分子。
【請求項５】
アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断に用いる請求項１もしくは２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＩｇＥ媒介アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断に用いる請求項１もしくは２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号２、４、６、８もしくは１０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製されたアレルゲン成分を含む組成物に添加する工程を含むことを特徴とする、アレルゲン組成物の生成方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法で得られたアレルゲン組成物。
【請求項９】
−  ＩｇＥ媒介アレルギーを有することが疑われる哺乳動物から得た体液試料を、配列番号２、４、６、８もしくは１０に記載のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのポリペプチドと接触させ；次いで
−  該ポリペプチドまたは複数の該ポリペプチドに特異的に結合しているＩｇＥ抗体のその試料中での存在を検出する
工程を含み、ここに、該ポリペプチドまたは複数の該ポリペプチドに特異的に結合しているかかる抗体の存在は、ＩｇＥ媒介アレルギーを示すことを特徴とする、ＩｇＥ媒介アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法。
【請求項１０】
ＩｇＥ媒介アレルギーが、小麦粉に対する呼吸アレルギーであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号２、４、６、８もしくは１０に記載のアミノ酸を含むポリペプチドを含む、請求項９または１０に記載の方法を行なうための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＥ媒介アレルギー、特に、パン屋喘息のごとき職業性喘息の技術分野に関する。より詳細には、本発明は、新規な小麦アレルゲンの同定、ならびにその治療および診断におけるその使用に関する。また、本発明は、哺乳動物におけるＩｇＥ媒介アレルギーの診断および治療のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
小麦（トリーティクム・アエスティウム（Triticum aestivum））からのアレルゲンは、３つの区別されるＩｇＥ媒介アレルギー、すなわち、小麦粉の吸入による呼吸アレルギー、小麦製品の摂取による食物アレルギー、および草花粉アレルギーの群に属する小麦花粉アレルギーを惹起しかねない。小麦粉成分に対するアレルギー感作は、職業性喘息の最も頻繁な原因の１つであり、パン職人の約１〜１０％が発症し、従って、それはパン屋喘息と呼ばれる。これらのパン職人は、小麦粉アレルゲンに対するＩｇＥ抗体、ならびに小麦粉誘発喘息および／または鼻炎を発生する。パン屋喘息が真の職業病であるという仮説の支持は、パン関連アレルゲンに対する感作の有病率が、小麦粉曝露がない対照集団に比較して、小麦粉で曝露した人において、約１０倍高いという所見によってもたらされる。さらに、感作した人において気管支喘息を惹起することが知られている小麦粉についての閾値を確立することが可能であった。小麦粉アレルギーに対する最初の体系的調査は、Ｂａｇｇｏｅによって既に１９３３年に実施された。他の早期の報告は、パン屋喘息のケースの記載に注目し、作用機序的研究がパン屋喘息におけるＩｇＥ媒介メカニズムの重要性を示した。それ以来、いくつかの試みが、免疫化学的方法、ＲＡＳＴ技術、免疫ブロット法および、最近では、分子クローニング技術によって疾病を誘発する小麦粉アレルゲンを特徴付けるためになされた。
【０００３】
トリーティクム・アエスティウムはイネ科の重要なメンバーである。すべてのアレルギーの個人の４０％までが、草花粉アレルゲンと反応する血清ＩｇＥ抗体を保有する。いくつかの研究は、小麦粉および草花粉のタンパク質中の共通のＩｇＥエピトープにより小麦粉および草花粉間の交差反応性を報告している。草花粉アレルゲンおよび小麦種子アレルゲン間の交差反応性が記載され、パン屋喘息および小麦に対するＩｇＥ媒介食物アレルギーに苦しむ患者が、パン屋喘息、小麦粉に対する食物アレルギーおよび草花粉アレルギーの鑑別診断に用い得る異なるアレルゲンを認識し得るという証拠が存在する。しかしながら、可溶性の小麦粉アレルゲンの大多数はまだ同定されていない。今日、ほんの少数の小麦粉アレルゲンが同定および特徴付けられ、それらは、アルファアミラーゼインヒビターファミリー、アシルＣｏＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フルクトル（fructore）−二リン酸アルドラーゼおよび、最近ではチオレドキシンのメンバーを含む。
【０００４】
小麦粉抽出物に基づいた診断は、小麦に対する呼吸アレルギーまたは食物アレルギーに苦しむ患者を区別しない。従って、正確な診断は、依然として、小麦粉に対する呼吸アレルギーの場合には特定の吸入負荷、および食物アレルギーが疑われる場合には二重盲検プラセボ比較の食物負荷（ＤＢＰＣＦＣ）に依拠し、パン屋喘息、食物アレルギーおよび花粉症のごときアレルギーの種々の小麦誘発の徴候の選択的な診断および治療に用いることができるアレルゲンを同定することが可能であるかどうかの質問は、確定してない。かくして、呼吸アレルギーに苦しむ患者と、食物アレルギーおよび／または草花粉アレルギーに苦しむ患者とを識別するために、新規な小麦アレルゲンを同定し、かつ呼吸アレルギー、例えば、パン屋喘息のごときＩｇＥ媒介アレルギーに苦しむ患者を特に同定する方法および診断テストを確立するための必要性が存在する。さらに、かかる新規な小麦アレルゲンを、ＩｇＥ媒介アレルギーの治療における使用に用いる必要性が存在する。本発明は、新規な小麦アレルゲン、および治療および診断におけるその使用を提供することにより、これらの必要性に対処する。さらに、本発明は、治療および診断における公知のペプチドおよびタンパク質の使用を提供する。これらのペプチドのうちのいくらかは、Ｇｅｎｎａｒｏ  Ｓ．Ｄ．ら、Biological Chemistry, April 2005, 386:383-389；ＵＮＩＰＲＯＴ受入番号Ｐ８２９７７；ＵＮＩＰＲＯＴ受入番号Ｑ６Ｗ８Ｑ２；米国第７，２１４，７８６号および米国２００６／０１０７３４５号から知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記のごとく、同定および特徴付けされたわずかな小麦粉アレルゲンは、アルファアミラーゼインヒビターファミリー、アシルＣｏＡオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フルクトル−二リン酸アルドラーゼおよびチオレドキシンのメンバーを含む。これまで、パン屋喘息、食物アレルギーおよび花粉症のごときアレルギーの種々の小麦誘発の徴候の選択的な診断および治療に用いることができるアレルゲンは同定されていない。これは、本発明者に、さらなる、まだ同定されてない小麦アレルゲンを探索させる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、哺乳動物におけるＩｇＥ媒介アレルギーの診断および治療のための新規な小麦アレルゲンおよび方法を提供することにより、先行技術の必要性を少なくとも部分的に満たす。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、小麦から単離されたかまたは組換え生成された新規な小麦アレルゲン、あるいは抗体についてのエピトープを共有する断片または変異体を表わすポリペプチドに関する。単離されたポリペプチドは、クローン番号１０、番号１１２もしくは番号１２６のアミノ酸配列を含む。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸に関し、その核酸は、クローン番号１０、番号１１２もしくは番号１２６のヌクレオチド配列を有する。
【０００９】
もう一つの態様において、本発明は、治療または診断、好ましくは、小麦粉に対する呼吸アレルギー、例えば、パン屋喘息のごときＩｇＥ媒介アレルギーの治療および診断に用いられる、クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２もしくは番号１２６を有するポリペプチドに関する。さらに、本発明は、治療または診断、好ましくは、小麦粉に対する呼吸アレルギー、例えば、パン屋喘息のごときＩｇＥ媒介アレルギーの治療および診断に用いられるクローン番号３７のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドに関する。
【００１０】
なおもう一つの態様において、本発明は、クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチド、またはそのＩｇＥ結合応答を抑止もしくは減弱するように改変された低アレルギー性形態、ならびに所望により、医薬上許容される賦形剤、担体、緩衝剤および／または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチドの低アレルギー性形態は、分子の断片化、トランケーションまたはタンデム化、内部セグメントの欠失、ドメイン再構成、アミノ酸残基の置換、ジスルフィド架橋の崩壊によって改変し得る。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチドを「添加した」アレルゲン組成物に関する。かかるアレルゲン組成物は、アレルゲン抽出物であっても、あるいは本発明のポリペプチドを有しないかまたはその低含量を有する精製または組換えアレルゲン成分の混合物であってもよく、そのポリペプチドは、ＩｇＥがその組成物中の他のアレルゲン成分に結合しないかまたは貧弱に結合する患者からのＩｇＥを結合するように添加される。また、本発明のこの態様は、かかる組成物を生成する方法に関し、その方法は、クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチドを、アレルゲン抽出物（所望により、他の成分を添加してもよい）または精製された天然のもしくは組換えアレルゲンの成分の混合物のごときアレルゲン組成物に添加する工程を含む。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は前記方法によって入手できるアレルゲン組成物に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチドに接触させて、小麦粉に対する呼吸アレルギー、例えば、パン屋喘息のごときＩｇＥ媒介アレルギーを有することが疑われる哺乳動物から血液、血漿または血清試料のごとき体液試料をもたらし、次いで、本発明のポリペプチドに特異的に結合するＩｇＥ抗体の試料中の存在を検出する工程を含む、ＩｇＥ媒介アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断のための方法に関する。クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチドに特異的に結合するかかる抗体の存在は、ＩｇＥ媒介アレルギーを示す。かかる方法の１つの具体例は、マイクロアレイ分析によってその方法を実施することを含む。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、小麦粉に対する呼吸アレルギー、例えば、パン屋喘息のごときＩｇＥ媒介アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法を行なうための診断キットを提供し、該キットは、クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチド、および固体支持体のごとき該ポリペプチドに結合するＩｇＥを検出するための手段、例えば、それに結合したクローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を含むポリペプチドを有するニトロセルロース膜またはマイクロアレイを含む。
【００１５】
なおさらなる態様において、本発明は、呼吸アレルギー、例えば、パン屋喘息のごとき哺乳動物におけるＩｇＥ媒介アレルギーの治療のための方法を提供する。１つの具体例において、その方法は、クローン識別番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２６もしくは番号３７を有するポリペプチド、または抗体についてのエピトープを共有するその断片または変異体をかかる治療に感受性の個体に投与することを含む。もう一つの具体例において、その方法はかかる治療に感受性の個体に先の態様による医薬組成物を投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、クローン１０由来アレルゲン（配列番号：１）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、精製されたセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンのキャラクタリゼーションを示す。
【図３】図３は、パン屋喘息、花粉アレルギーおよび食物アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥ反応性を示す。
【図４】図４は、クローン１０由来アレルゲンに対するＩｇＧサブクラス反応性のボックスプロット表示である。
【図５】図５は、クローン１０由来アレルゲンのアレルゲン活性を示す。
【図６】図６は種子成熟の間の種子中のセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの発現を示す。
【図７】図７は、小麦花粉および種子抽出物中でのクローン１０由来アレルゲンの同定を示す。
【図８】図８は、小麦種子、米、トウモロコシ、豆およびジャガイモからの抽出物中のセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの検出を示す。
【図９】図９は、小麦種子中の透過型免疫金電子顕微鏡検査によってクローン１０由来アレルゲンの局在を示す。
【図１０】図１０．パン屋喘息に苦しむ患者のＩｇＥドットブロット。
【図１１】図１１．小麦に対する食物アレルギーおよび花粉アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥドットブロット。
【図１２】図１２．アレルゲンマイクロアレイ。Ａ、マイクロ配置されたタンパク質および小麦花粉抽出物の適用スキーム。
【図１３】図１３．小麦種子タンパク質、小麦花粉抽出物および草花粉アレルゲンに対するＩｇＥ反応性の有病率。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（定義）
【００１８】
【表１】
0005542685.tif 000002
【００１９】
本発明のポリペプチドの変異体および断片は、少なくとも１０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２５個、さらにより好ましくは少なくとも５０または７５個のアミノ酸残基の長さ、および少なくとも５０％、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える該ペプチドに対する配列同一性を持つタンパク質またはペプチドを意味すると解釈されるべきである。
【００２０】
改変されたポリペプチドは、本発明の文脈において、化学的または遺伝子的に改変して、例えば、本発明の免疫療法の態様に関連して例示されたその免疫学的特性を変更したポリペプチドを意味すると解釈されるべきである。
【００２１】
当該ポリペプチドと抗体用エピトープを共有するポリペプチドの変異体および断片は、本発明のポリペプチドで感作された代表的な患者の血清試料からのＩｇＥ抗体の結合がそのポリペプチドによりかなり阻害できるそれらの断片および変異体であると解釈されるべきである。かかる阻害アッセイは、例えば、実施例４に開示されたプロトコールによって行ない得る。
【００２２】
低アレルギー性の改変ポリペプチドまたはポリペプチドの変異体もしくは断片は、例えば、実施例１によるプロトコールにより決定される代表的なポリペプチド感作患者の血清試料からの該ポリペプチドに反応性のＩｇＥ抗体を結合できないか、あるいは好塩基性のヒスタミン放出アッセイのごとき細胞活性化により決定される生物学的アレルゲン活性がないことを示すかまたはかなり低下した生物学的アレルゲン活性を示す、改変されたポリペプチドまたはポリペプチドの変異体もしくは断片であると解釈されるべきである。
【００２３】
（表および図の簡単な説明）
テーブルＩは、パン屋喘息に苦しむ患者の個体群統計学的、臨床的および血清学的特徴を示す。
【００２４】
テーブルＩＩは、小麦に対する食物アレルギーに苦しむ患者（Ｆ１〜Ｆ４）および草花粉アレルギーに苦しむ患者（Ｇ１〜Ｇ４）の個体群統計学的、臨床的および血清学的特徴を示す。
【００２５】
テーブルＩＩＩは、クローン１０由来アレルゲンおよび相同蛋白質の間の百分率アミノ酸配列同一性を示し、ここに、１〜３０と番号付けされたタンパク質は下記のとおりである：１．ｇｉ｜１２２０６５２３７（トリーティクム・アエスティウム）、２．ｇｉ｜６６３５６２７８（トリーティクム・アエスティウム）、３．ｇｉ｜１２４１２２（オオムギ亜種ｖｕｌｇａｒｅ（Hordeum vulgare subsp. vulgare））、４．ｇｉ｜４８０９３３６０（ブタモロコシ（Zea diploperennis））、５．ｇｉ｜４８０９３４１８（イースタンガマグラス（Tripsacum dactyloides））、６．ｇｉ｜７５９９４１６１（トウモロコシ（Zea mays subsp. parviglumis））、７．ｇｉ｜５８３９６９４５（イネ・日本晴（Oryza sativa [japonica cultivar-group]））、８．ｇｉ｜１１５６４９１３２（ムラサキウニ(Strongylocentrotus purpuratus)）、９．ｇｉ｜３７９０４３９２（ミナトカモジグサ (Brachypodium distachyon)）、１０．ｇｉ｜２６２２４７４４（グレープフルーツ(Citrus x paradise)）、１１．ｇｉ｜２２４４４７（ソラマメ(Vicia faba)）、１２．ｇｉ｜１２４３９５８６２（ヨツヒメゾウリムシ (Paramecium tetraurelia)）、１３．ｇｉ｜５０２６２２１３（西洋カボチャ (Cucurbita maxima)）、１４．ｇｉ｜５４７７４３（ニコチアナ・シルベストリス (Nicotiana sylvestris)）、１５．ｇｉ｜５４６１０７１３（ミミズ(Lumbricus terrestris)）、１６．ｇｉ｜１６９４９１（ジャガイモ(Solanum tuberosum)）、１７．ｇｉ｜２１８２９０（キダチタバコ×ニコチアナ・ラングスドルフィ (Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii)）、１８．ｇｉ｜１２４１２１（アズキ(Vigna angularis)）、１９．ｇｉ｜６０３８９０（セイヨウニワトコ(Sambucus nigra)）、２０．ｇｉ｜１４７１８４４５（サツマイモ(Ipomoea batatas)）、２１．ｇｉ｜１１４９５０（ニガウリ(Momordica charantia)）、２２．ｇｉ｜１０９１３８５５４（ソバ(Fagopyrum esculentum)）、２３．ｇｉ｜１８４０４８８３（シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、２４．ｇｉ｜２７７３４４０８（ハマナタマメ (Canavalia lineate)）、２５．ｇｉ｜３７９０１１０３（パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)）、２６．ｇｉ｜９２８７４８４２（タルウマゴヤシ (Medicago truncatula)）、２７．ｇｉ｜１３９５９３８３（アマ(Linum usitatissimum)）、２８．ｇｉ｜２２７５９７２３（ヒャクニチソウ (Zinnia elegans)）、２９．ｇｉ｜３７３５９３４５（ブドウ(Vitis vinifera)）および３０．ｇｉ｜６４５３２８７（アマランサス (Amaranthus hypochondriacus)）。
【００２６】
テーブルＩＶは、実施例２のパン屋喘息患者についての臨床データを示す。
【００２７】
テーブルＶは、実施例２の食物および草花粉アレルギーの患者についての臨床データを示す。
【００２８】
テーブルＶＩは、クローン番号１０、番号３８、番号１１２、番号１２３、番号１２６および番号３７についてのｃＤＮＡの増幅に用いたＰＣＲプライマーを示す。
【００２９】
テーブルＶＩＩ．パン屋喘息に苦しむ患者の個体群統計学的、臨床的および血清学的特徴。
【００３０】
テーブルＶＩＩＩ．草花粉アレルギーに苦しむ患者の個体群統計学的、臨床的および血清学的特徴。
【００３１】
テーブルＩＸ．小麦に対する食物アレルギーに苦しむ患者の個体群統計学的、臨床的および血清学的特徴。
【００３２】
図１は、クローン１０由来アレルゲン（配列番号：１）のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。コードおよび非コード領域は、各々、上部および下部の文字列にあり、開始（ＡＴＧ）および停止コドンが下線強調される。ジャガイモインヒビターＩファミリーサイン（potato inhibitor I family signature）のアミノ酸は灰色背景で印刷される。左側の数は、ヌクレオチドについてのもので、右側の数は、アミノ酸についてのものである。その配列は受入番号（ＥＵ０５１８２４）下、ＧｅｎＢａｎｋに提出した。
【００３３】
図２は、精製されたセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンのキャラクタリゼーションを示す。Ａ、精製されたクローン１０由来アレルゲンを含有するクーマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ。分子量マーカー（ｋＤａ）は左側に示される。Ｂ、精製されたクローン１０由来アレルゲンの質量分析（ＭＳ）。質量／電荷比はＸ軸に示され、強度は、調べた質量範囲内で得られた最も強いシグナルの百分率としてＹ軸に表示される。Ｃ、精製されたクローン１０由来アレルゲンの遠紫外線円偏光二色性（ＣＤ、Far-ultraviolet circular dichroism）分析。スペクトルは、平均残基楕円率（θ、mean residue ellipticities）（Ｙ軸）として表現され、所与の波長（Ｘ軸）での２５℃（太線）、９５℃（通常の線）および冷却後の２５℃（点線）で表されている。
【００３４】
図３は、パン屋喘息、花粉アレルギーおよび食物アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥ反応性を示す。精製されたクローン１０由来アレルゲン、ＨＳＡ、ｒＰｈｌ ｐ １、ｒＰｈｌ ｐ ５、ｒＰｈｌ ｐ ７、ｒＰｈｌ ｐ １２、小麦花粉抽出物および小麦種子抽出物をニトロセルロースの膜片上に点在させて、２２名のパン屋喘息患者（１〜２２）、４名の草花粉アレルギーの患者血清（Ｇ１〜Ｇ４）、小麦に対する食物アレルギーに苦しむ患者からの４血清（Ｆ１〜Ｆ４）、非アレルギー性の個体からの１血清（ＮＣ）、および血清添加のない緩衝液（Ｂ）とインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体は１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体で検出し、オートラジオグラフィによって視覚化した。
【００３５】
図４は、クローン１０由来アレルゲンに対するＩｇＧサブクラス反応性のボックスプロット表示である。クローン１０由来アレルゲンに対するＩｇＧ１−４サブクラス反応性をパン屋喘息に苦しむ患者（ｎ＝２２）につきＥＬＩＳＡによって決定し、５０％の値がボックス内にあり、非外れ値は、バー間にあるボックスプロットとして表示されている。そのボックス内の線は中央値を示し、円は外れ値、星印は極値を示す。
【００３６】
図５は、クローン１０由来アレルゲンのアレルゲン活性を示す。３名のパン屋喘息患者（番号２、番号４、番号１２）からの血清ＩｇＥまたは非アレルギー性の患者（ＮＣ）の血清をＲＢＬ細胞に負荷し、次いで、組換えクローン１０由来アレルゲンまたはオオアワガエリ花粉アレルゲンｒＰｈｌ ｐ １を負荷した。平均β−ヘキソサミニダーゼ放出を自発的放出についての百分率の減算後の合計放出の百分率としてＹ軸に示す。
【００３７】
図６は種子成熟の間の種子中のセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの発現を示す。未成熟（第７、１０、１５、２０、２５、３０および３５日）および成熟（Ｍ）の小麦種子からのニトロセルロース−ブロットした小麦抽出物をクローン１０由来アレルゲンに特異的なウサギ抗体で、また、対照目的で、対応する前免疫血清で調査した。分子量はキロダルトン（ｋＤａ）で左側に示す。
【００３８】
図７は、小麦花粉および種子抽出物中でのクローン１０由来アレルゲンの同定を示す。ニトロセルロース−ブロットした抽出物を、クローン１０由来アレルゲンに特異的なウサギ抗体（２０）、小麦プロフィリン（Ｉ 番号１２３）に特異的な抗体、ダニアレルゲン（ＮＣ）に特異的な抗体、またはウサギ抗体の添加がない緩衝液（Ｂ）で調査した。対応する前免疫血清は、Ｐ番号１０およびＰ番号１２３として各々参照される。結合したＩｇＧ抗体は１２５Ｉ標識したロバ抗ウサギ抗体で検出し、オートラジオグラフィによって視覚化した。分子量マーカー（ｋＤａ単位）は左側に示される。
【００３９】
図８は、小麦種子、米、トウモロコシ、豆およびジャガイモからの抽出物中のセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの検出を示す。Ａ、小麦（Ｗ）、米（Ｒ）およびトウモロコシ（Ｍ）、一般的な豆（Ｂ）およびジャガイモ（Ｐ）からの抽出物を含有するクマシーブルー染色ゲル。Ｂ、ニトロセルロース−ブロットした抽出物をウサギ前免疫血清に、およびＣ、クローン１０由来アレルゲンに特異的なウサギ抗体に曝露した。分子量（ｋＤａ）は左側に示される。
【００４０】
図９は、小麦種子中の透過型免疫金電子顕微鏡検査によってクローン１０由来アレルゲンの局在を示す。ＡおよびＢ、低倍率（Ａ）および高倍率（Ｂ）の小麦粒の断面。Ａは、果実および種皮（Ｃ）、デンプン層（ＡＬ）およびデンプン質胚乳（ＳＥ）の始まりを示す。Ａにおける長方形は、Ｂに示される領域に匹敵する面積、すなわち、デンプン層およびデンプン質胚乳間の境界を示す。Ｂにおける長方形は、Ｃ、ＤおよびＥ、Ｆにおいて高倍率で各々示される領域を示す。ＣおよびＤ、ウサギ抗クローン１０由来Ｉｇ（Ｃ）または免疫前Ｉｇ（Ｄ）で調査された小麦種子デンプン細胞の詳細。ＥおよびＦ、ウサギ抗クローン１０由来Ｉｇ（Ｅ）または免疫前Ｉｇ（Ｆ）で小麦タンパク質１０の免疫金局在化後のデンプン質胚乳の高倍率顕微鏡写真。結合したウサギ抗体は、金標識したヤギ抗ウサギＩｇ抗血清で検出した（金粒子＝黒色ドット）。矢印はコロイド状金粒子を示す。バーは、Ａ、２０μｍ；Ｂ、５μｍ；Ｃ〜Ｆ、０．５μｍを示す。ＡＧ、デンプン粒；ＡＬ、デンプン層；Ｃ、多層の果実および種皮；ＣＹ、細胞質物質；Ｌ、脂肪体；Ｍ、糸粒体；ＳＥ、デンプン質胚乳；ＳＧ、デンプン粒；Ｗ、細胞壁。
【００４１】
図１０．パン屋喘息に苦しむ患者のＩｇＥドットブロット。
【００４２】
図１１．小麦に対する食物アレルギーおよび花粉アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥドットブロット。
【００４３】
図１２．アレルゲンマイクロアレイ。Ａ、マイクロ配置されたタンパク質および小麦花粉抽出物の適用スキーム。組換え小麦タンパク質は、１０、３７、３８、１１２、１２３、１２６と指定され；ＷＰ：小麦花粉抽出物；組換えオオアワガエリ花粉アレルゲン：Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ７およびＰｈｌ ｐ １２と指定される。底部のボックス中の数は、位置マークを示す。ＢおよびＣ、血清でのインキュベーション後のマイクロアレイの画像、およびフルオロフォア標識した抗ＩｇＥ抗体でのＩｇＥ反応性スポットの検出。Ｂ、非アレルギー患者からの血清でインキュベーション後の画像。Ｃ、パン屋喘息（１：Ｂ４）、小麦誘発食物アレルギー（２：Ｆ２６）、草花粉アレルギー（３：Ｇ１６）に苦しむ代表的な患者からの血清とのインキュベーション後の画像。スライドの底部のドットは、フルオロフォア標識した抗ＩｇＥ抗体で検出した精製ＩｇＥ抗体である位置マークを示す。
【００４４】
図１３．小麦種子タンパク質、小麦花粉抽出物および草花粉アレルゲンに対するＩｇＥ反応性の有病率。ＩｇＥ反応性の患者の百分率を、Ｙ軸にパン屋喘息（Ａ）（ｎ＝２３）、小麦に対する食物アレルギー（Ｂ）（ｎ＝３８）および草花粉アレルギー（Ｃ）（ｎ＝１７）につき示す。Ｘ軸は、テストされた組換え小麦タンパク質番号１０、番号３７、番号３８、番号１１２、番号１２３および番号１２６、小麦花粉抽出物、組換え草花粉アレルゲンＰｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ７およびＰｈｌ ｐ １２、全ての組換え小麦タンパク質を含む「小麦ミックス」、ＩｇＥ反応性を測定するために用いた小麦粉およびオオアワガエリＣＡＰを示す。
【００４５】
（発明の詳細な記載）
下記の実施例は、本発明のポリペプチドの単離および使用を含む本発明を例示する。その実施例は単に例示であり、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の制限と考えられるべきでない。実施例に言及したクローン番号１２３は、例えば、米国第７，２１４，７８６号から公知のプロフィリンである。
【００４６】
実施例１：新規な小麦アレルゲンクローン番号１０
実施例１は、他のプロテアーゼインヒビターと一緒に、病変形成関連タンパク質（ＰＲ）のファミリーＰＲ６と呼ばれるセリンプロテアーゼインヒビターのあるファミリーのジャガイモインヒビターファミリーに属する、新規な小麦種子アレルゲンのクローン番号１０の同定およびキャラクタリゼーションを示す。クローン番号１０は、ＰＲ６ファミリーにつき同定および記載された最初のアレルゲンである。さらに、実施例１は、組換えクローン１０由来アレルゲンの発現および精製を示す。
【００４７】
クローン番号１０は、パン屋喘息の患者から血清ＩｇＥによって特異的に認識されたが、小麦に対する食物アレルギー、セリアック病または草花粉アレルギーに苦しむ患者からの血清でテストされた場合にＩｇＥ反応性を示さなかった。従って、クローン１０由来アレルゲンを他の小麦アレルゲンと一緒に用いて、ＩｇＥ媒介パン屋喘息に苦しむ患者を特異的に同定し、かつこれらの患者と食物または花粉アレルギーのアレルギー患者とを識別することを可能にする診断テストを確立し得る。
【００４８】
技術
生体物質、患者の血清および抗体
トリーティクム・アエスティウム栽培品種マイケルからの小麦種子をOsterreichische Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit GmbHから得て、温室で植えた。未成熟種子は、受粉開始７、１０、１５、２０、２５、３０および３５日後に直接的に液体窒素に収集し、使用まで−８０℃で貯蔵した。小麦花粉はAllergon (Valinge, Sweden)から得た。米、トウモロコシ、豆およびジャガイモは地方市場で購入した。組換えＰｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ７およびＰｈｌ ｐ １２は、BIOMAY (Vienna, Austria)から、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、Behring (Marburg, Germany)から購入した。血清はパン屋喘息に苦しむ２２名の患者から得た。パン屋喘息は、陽性の病歴、ＣＡＰ−ＦＥＩＡ  Ｓｙｓｔｅｍ  (Phadia, Uppsala, Sweden)による小麦およびライ麦粉に特異的なＩｇＥ、および臨床的に関連する感作の確認のために含まれた特定の吸入負荷試験に基づいて診断された（１）。これらの患者の個体群統計学的、臨床的によび血清学的データをテーブルＩに要約する。加えて、非アレルギー性の個体からの血清、小麦に対する食物アレルギーに苦しむ４名の患者からの血清、およびパン屋喘息はないが、小麦およびライ麦粉に対する血清ＩｇＥがある４名の草花粉アレルギー患者からの血清を実験に含んだ（テーブルＩＩ）。草花粉アレルギー患者からの血清をCAP-FEIA System (Phadia)により合計の血清ＩｇＥレベルおよびＩｇＥ特異的オオアワガエリ花粉につき分析し、小麦に対する食物アレルギーを持つ患者を従前に記載されたように特徴付けした（２）。パン屋喘息についてのクローン１０由来アレルゲンの特異性は、セリアック病患者からのさらなる２０の血清、食物アレルギーの患者からの１１９、草花粉アレルギー患者からの２３の血清、およびパン屋喘息患者からの２５の血清をチップ分析（Constantinら、未発表）によりテストすることにより確認した。クローン１０由来アレルゲンに対する特異的なウサギ抗体は、１回のフロイト完全アジュバントおよび２回のＩＦＡ(Charles River, Kisslegg, Germany)を用いて、精製したクローン１０由来アレルゲン（１注入当たり２００μｇ）で毎月の間隔でウサギの免疫処置により産生させた。前免疫血清は免疫処置前にウサギから得た。対照目的では、イエダニ・アレルゲンに特異的なウサギ免疫血清、および小麦プロフィリンに特異的なウサギ抗血清を用いた。
【００４９】
小麦種子からのλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーの構築
総ＲＮＡを小麦種子からＹｅｈ（３）により抽出し、受粉開始２５日後に収集して−８０℃で貯蔵した。次いで、ＲＮＡペレットをイソチオシアン酸グアニジニウム緩衝液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、０．８３％ｖ／ｖ  ３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ  ６、１１ｍＭ β−メルカプトエタノール）に溶解し、塩化セシウム密度勾配超遠心（４）によって精製した。ポリＡ＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロース・アフィニティークロマトグラフィー(Nucleo Trap mRNA; Machery-Nagel)によって単離し、二本鎖ｃＤＮＡをｃＤＮＡ合成キット(cDNA synthesis System; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)で合成した。ＥｃｏＲＩメチラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)でメチル化後、ＥｃｏＲＩリンカー(New England Biolabs)をｃＤＮＡに加えた。リンカーｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ(Roche Diagnostics)で消化した。消化したリンカーをＮｉｃｋカラム(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)で取り出し、そのｃＤＮＡをλｇｔ１１アーム(Stratagene, La Jolla, CA, USA)に連結した。連結反応生成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏにて充填し(Gigapack III Gold Cloning Kit, Stratagene)、その結果、２．４３×１０６ＰＦＵでλｇｔ１１発現ｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００５０】
小麦種子ｃＤＮＡライブラリーからのＩｇＥ反応性クローンの単離およびキャラクタリゼーション
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０９０を、組換えファージの７×１０５ ＰＦＵに感染させ、記載のごとく、パン屋喘息に苦しむ４名の患者（番号１、番号２、番号４、番号１２）の血清ＩｇＥで免疫スクリーニングした（５）。１５個のＩｇＥ反応性のファージクローンをさらなる再クローニングのために選択し、それらのＤＮＡをλｇｔ１１プライマーでPlatinum PCR Supermix (Invitrogen, Life Technolgies)を用いてＰＣＲ増幅し、配列決定(MWG, Ebersberg, Germany)した。得られた配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI, National Center for Biotechnology Information)のＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出された配列と比較した。複数配列アラインメントをＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いて行なった。アミノ酸配列同一性について、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの複数配列ツールを用いた。モチーフ探索はＥｘＰＡＳｙプロテオミクスサーバーのＰＲＯＳＩＴＥツールで行い、アミノ酸組成については、ＥｘＰＡＳｙのＰｒｏｔＰａｒａｍツールを用いた。溶媒露出度および二次構造の予測は、コロンビア大学バイオインフォマティクス・センター（Columbia University Bioinformatics Center）からのＰＲＯＴソフトウェアを用いて計算した。系統樹は、分子遺伝学用のMax Planck Institute for Molecular Geneticsによって提供された「Multiple Alignment and Phylogenetic Tree Reconstruction」ソフトウェアを用いて、クローン１０由来アレルゲンおよび相同蛋白質のアミノ酸配列に基づいて再構築した。
【００５１】
クローン１０由来組換えアレルゲンの発現および精製
クローン１０ｃＤＮＡのコード領域を以下のプライマー対：
【００５２】
0005542685.tif 000003
【００５３】
を用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物は、ＮｄｅＩ（斜体）、ＥｃｏＲＩ（下線強調）制限部位およびヘキサヒスチジンタグコード配列（太字）を含んでいた。ＰＣＲ生成物は、AccepTor Vector (Novagen, Madison, WI)にサブクローンし、再び配列決定(MWG)した。次いで、挿入断片を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ(Roche Diagnostics)でAccepTor Vectorから切り取られ、ゲル精製(Promega, Madison, WI, USA)し、発現プラスミドｐＥＴ １７ｂ(Novagen)にサブクローンした。ＤＮＡ配列は双方のＤＮＡ鎖を配列決定することにより確認した(Microsynth, Balgach, CH)。ｐＥＴ １７ｂ−クローン１０構築体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）(Stratagene)に形質転換し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（１７）培地中で０．８〜１のＯＤ（６００ｎｍ）まで３７℃で増殖させた。タンパク質発現は、０．５ｍＭの最終濃度までのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導し、次いで、さらに３時間細菌を増殖させた。細菌は遠心によって収集し、Ultraturrax (IKA, Stauffen, Germany)で、２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００中でホモジナイズした。ＤＮＡをDNase Iの添加により消化し、２０℃にてさらに１０分間撹拌し、その反応を２００μｌの５Ｍ ＮａＣｌで停止させ、次いで、４℃（６０００×ｇ、２０分間）で遠心した。クローン１０由来アレルゲンの大部分は、細菌抽出物の不溶性画分中で見い出された。クローン１０由来アレルゲンは、QIAexpressionist handbook (QIAGEN, Hilden, Germany)に従い、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂アフィニティカラムを用いて、変性条件下、封入体含有ペレットから精製した。組換えアレルゲンを含有する画分をプールし、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．５に対して透析した。タンパク濃度は、Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)で測定した。
【００５４】
ＥＬＩＳＡ
クローン１０由来アレルゲンを、５μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶解し、ＥＬＩＳＡプレート(Nunc Maxisorb, Roskilde, Denkmark)上に被覆した。ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）中の１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡでブロックした後、プレートは、（６）記載のごとく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の測定のために、ＰＢＳＴ、０．５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ中で１：５０に希釈した血清とインキュベートした。従前に（２）記載のごとく、結合した抗体を、最初にＰＢＳＴ、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で１：１０００に希釈したモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧサブクラス抗体(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ)で、次いで、ＰＢＳＴ、０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ中で１：２０００に希釈したホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウス抗血清(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)でインキュベートすることにより検出した。全ての測定は、２連として行い、結果を平均値として示す。
【００５５】
タンパク質抽出物、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット
成熟および未成熟小麦種子、米(Oryza sativa)、トウモロコシ(Zea mays)、一般的な豆(Phaseolus vulgaris)およびジャガイモ(Solanum tuberosum)からのＳＤＳタンパク質抽出物を３２ｍｌの試料緩衝液（６）中の３グラムの組織のホモジナイズ、引き続いて、１０分間煮沸により調製した。不溶性粒子を除去するために、抽出物を４℃にて１０分間１０，０００×ｇで遠心し、上清を−２０℃のアリコートとして貯蔵した。加えて、小麦種子からのＰＢＳタンパク質抽出物を従前に（２）記載のごとく調製した。トリーティクム・アエスティウム花粉（５００ｍｇ）を５ｍｌのＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ中で一晩４℃で抽出した。１３，０００×ｇ、４℃の１時間の遠心後、上清のタンパク濃度をMicro BCA Protein Assay Kit (Pierce)で測定し、アリコートを使用まで−２０℃で貯蔵した。等量のＳＤＳタンパク質抽出物を１４％分取用ＳＤＳポリアクリルアミドゲルによって分離した（７）。タンパク質分子量マーカー(Rainbow Marker, GE Healthcare; Precision Plus Protein Standard, BioRad, Herkules, CA; Page Ruler Pre-stained Protein Ladder, Fermentas, Burlington, Ontario)を標準として用いた。電気泳動分離の後、タンパク質をクーマシーブリリアントブルーで染色するか、またはニトロセルロース膜(Schleich & Schuell, Dassel, Germany)）上にブロットした（８）。膜を緩衝液Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４、０．５％ｗ／ｖ ＢＳＡ、０．５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ−２０、０．０５％ｗ／ｖ  ＮａＮ３）中で１０分間で２回および３０分間で１回ブロックし、クローン１０由来アレルゲンに特異的なウサギ抗血清、対応する前免疫血清、および対照目的のために、無関係の抗原に特異的なウサギ血清または緩衝液単独と４℃にて一晩インキュベートした。ウサギ血清を緩衝液Ａ中で１：５０，０００に希釈した。結合した抗体を、緩衝液Ａ中で１:２０００に希釈した１２５Ｉ標識したロバからの抗ウサギ抗体(GE Healthcare)で２時間室温にて検出し、−７０℃で増感紙(Kodak, Heidelberg, Germany)でKodak XOMATフィルムに視覚化した。
【００５６】
ＩｇＥドットブロット実験について、１００ｎｇの組換えクローン１０由来アレルゲンおよび組換え草花粉アレルゲン、Ｐｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ７およびＰｈｌ ｐ １２、ならびに３μｇの小麦花粉抽出物および２μｇの成熟した小麦種子ＰＢＳ抽出物をニトロセルロース膜上に点在させた。ニトロセルロース片を緩衝液Ａでブロックし、４℃にて一晩緩衝液Ａ中で１：１０希釈の患者血清に曝露した。結合したＩｇＥ抗体は、緩衝液Ａ中で１：２０に希釈した１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体 (RAST RIA, Demeditec Diagnostics, Germany) で室温にて一晩検出し、−７０℃にて増感紙 (Kodak) を含む Kodak XOMATフィルムを用いてオートラジオグラフィによって視覚化した。
【００５７】
組換えクローン１０のＭＳおよびＣＤ分析
レーザー脱離質量スペクトルは、TOF Compact MALDI II instrument (Kratos, Manchester, UK; piCHEM, Research and Development, Graz, Austria)で線形モードで取得した。試料を１０％アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸）に溶解し、α−シアノ−４ヒドロキシ桂皮酸（６０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸に溶解した）をマトリックスとして用いた。試料調製のために、タンパク質およびマトリックス溶液の１／１の混合物を標的上に沈着させ、空気乾燥した。
【００５８】
ＣＤ測定は、０．２ｃｍの路長の長方形水晶キュベットを用いた、Jasco J-810分光偏光計（Tokyo, Japan）で、０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の精製したクローン１０由来アレルゲン（Ｈ２Ｏ中）で行った。遠紫外線ＣＤスペクトルは、５０ｎｍ／分間の走査速度で０．５ｎｍの分解能で１９０ｎｍ〜２６０ｎｍで記録し、３つの走査の平均に起因した。結果は所与の波長で平均残基楕円率（θ）として表す。温度走査は逐次走査手順によって行い、ここで、試料は２℃／分の加熱速度で２５℃から９５℃まで加熱し、同一速度にて２５℃に戻し冷却した。５℃毎に、連続的な波長スペクトルを指定したパラメーターで記録した。加えて、温度走査を０．５℃のステップレゾリューションで２１５ｎｍにて記録した。結果を所与の波長でのモル平均残基楕円率（θＭＲＥ）として表した。最終スペクトルは同一条件下で得た対応するベースラインスペクトルを減じることにより修正した。クローン１０由来アレルゲンの二次構造量を二次構造評価プログラムＣＤＳＳＴＲ（９）を用いて計算した。
【００５９】
ヒト・ラット好塩基性白血病（ｈｕＲＢＬ）アッセイ
ＩｇＥ Ａｂ媒介即時型反応の定量化のために、ｈｕＲＢＬ細胞媒介物質放出アッセイを行った。ヒトＦｃεＲＩ（１０）でトランスフェクトしたＲＢＬ細胞（クローンＲＢＬ−７０３／２１）を、５％ ＦＣＳ、４ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩を補足したＲＰＭＩ １６４０中で培養した。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡでインキュベーション後に収集し、洗浄し、培地に再懸濁させ、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍｌに調節した。細胞溶液の５０μｌのアリコートを、９６ウェルの平底マイクロプレートのウェルに添加した（細胞密度／ウェルは１×１０５細胞であった）。ヒト血清を培地中で１：１０に希釈し、細胞に添加し、３７℃、７％ ＣＯ２、９５％相対湿度で一晩インキュベートした。培地を除去し、プレートをタイロード緩衝液＋０.１％ ＢＳＡの２００μｌ／ウェルで３回洗浄した。ＩｇＥ架橋では、５０％のＤ２Ｏおよび０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含有するタイロード緩衝液中で希釈した１００μｌのクローン１０由来アレルゲンまたはｒＰｈｌ ｐ １（０．３μｇ／ｍｌ）を細胞に添加した。自発的な放出のために、タンパク質を含まないタイロード緩衝液をウェルに添加した。合計の放出は、１０％トリトンＸ−１００を含有するタイロード緩衝液の添加によって決定した。３７℃、７％ ＣＯ２、９５％相対湿度での１時間のインキュベーション後に、細胞を遠心により収集し、５０μｌの上清を新しいプレートに移し、ウェル当たり５０μｌのアッセイ溶液（０．１Ｍクエン酸またはクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．５および１６０μＭ  ４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドグルコサミニド）を添加した。さらにもう１時間のインキュベーション後、反応は、各ウェルに１００μｌグリシン緩衝液（０．２Ｍグリシン、０．２％ ＮａＣｌ、ｐＨ１０．７）を添加することにより停止させた。蛍光をλｅｘ：３６０／λｅｍ：４６５で蛍光マイクロプレート・リーダで測定した。自発的な放出をトリトンＸ−１００により溶解しなかった対照ウェルから決定した。特定の放出は、式：（試料−自発的／合計−自発的）×１００を用いて計算した。
【００６０】
免疫金電子顕微鏡検査
小麦の乾燥粒を鋭いカミソリ刀を用いて小片（約０．５ｍｍサイズの立方体）に切った。細胞の乾燥状態を保存するために、その立方体をアクロレイン蒸気中で室温にて５日間無水的に固定した。それらは、いずれの残存する水も除去するために室温にて１日ジメトキシプロパン（ＤＭＰ）に移し、中間体段階として、上昇系列のＤＭＰ：エタノールおよびエタノール：単量体Ｌｏｗｉｃｒｙｌ Ｋ４Ｍを用いて、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ Ｋ４Ｍ樹脂に組み込んだ。重合は−３５℃で行った。
【００６１】
超薄切片は、辺縁および中央の穀粒組織からカットし、免疫標識手順のための銀グリッドに配置した。
【００６２】
クローン１０由来アレルゲンについての標識は、以下のとおり室温にて湿室（ＰＢＳ緩衝液＋１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４、トリス緩衝液＋１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ８．２）で行った：ＰＢＳ緩衝液中の１．５％ （ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１５分間；２．ＰＢＳ緩衝液中で１:３５に希釈したウサギ抗小麦タンパク質１０抗体および前免疫抗体、２時間；３．ＰＢＳ緩衝液、５分間、トリス緩衝液、２×５分間；４．トリス緩衝液中で１:２０に希釈した１０ｎｍのサイズのコロイド状金粒子(BioCell, Plano, Wetzlar, Germany)に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体；５．トリス緩衝液、１×５分間、蒸留水、２×５分間。
切片は、酢酸ウラニル（５分間）およびクエン酸鉛（１０秒間）を用いて染色した。
試料は、透過電顕ＥＭ ４１０(FEI, Eindhoven, The Netherlands)において分析した。
【００６３】
結果
セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンをコードする小麦ｃＤＮＡの単離およびキャラクタリゼーション
小麦種子ｃＤＮＡ発現ライブラリーをパン屋喘息に苦しむ４名の患者からのＩｇＥ抗体でスクリーニングした。ＩｇＥ反応性クローン１０のｃＤＮＡの読み取り枠は、８４個のアミノ酸のポリペプチドをコードする２６２個のヌクレオチドを含んでいた（図１）。９．４ｋＤａの分子量および６．０８の等電点（ｐＩ）が、クローン１０由来アレルゲンにつき推定されたアミノ酸配列によって計算された。アミノ酸組成の分析は、高含量のバリン残基（１５．５％）およびシステイン残基の不存在を示した。コンピューター支援二次構造分析により、クローン１０由来アレルゲンは、主として、ランダムコイルおよびベータシート、および１つのアルファヘリックス領域から成る。溶媒露出度計算によれば、ほぼ８０％のアミノ酸が溶媒露出される。配列モチーフの検索は、１つの潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位（アミノ酸３２）、２つのＮ末端ミリストイル化部位（アミノ酸１１および５５）および１つのジャガイモインヒビターＩファミリーサイン（図１：アミノ酸２５〜３６が箱で囲まれる）の存在を明らかにした。
【００６４】
ＮＣＢＩデータベースに寄託された配列とのクローン１０由来アミノ酸配列の比較は、そのアレルゲンが、トリーティクム・アエスティウムサブチリシン−キモトリプシンインヒビターＷＳＣＩ前駆体（受入番号ｇｉ│１２２０６５２３７）およびＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍ ＷＳＣＩプロテイナーゼインヒビター（受入番号ｇｉ│６６３５６２７８）にほぼ同一であることを示し、動植物に生じるある群のセリンプロテイナーゼインヒビターとかなりの配列相同性を示す。これらのセリンプロテイナーゼインヒビターは、ジャガイモインヒビターＩと指定されたファミリーを構成し、それらのタンパク質の各々に保存される典型的なコンセンサス配列パターンにより特徴付けられる。ジャガイモインヒビターＩファミリーに属するセリンプロテイナーゼインヒビターは、ジスルフィド結合を欠く６０〜９０個のアミノ酸の小さなタンパク質であり、単一の阻害部位だけを含んでいる。小麦セリンプロテイナーゼインヒビターの配列は、大麦(Hordeum vulgare)、トウモロコシ(Zea mays, Zea diploperennis)、ガマグラス（gamma grass）(Tripsacum dactyloides)および米(Oryza sativa)のごとき他の単子葉植物、双子葉植物および虫のプロテイナーゼインヒビターに対して、かなりの程度の配列保存を示す（テーブルＩＩＩ）。テーブルＩＩＩは、セリンプロテイナーゼインヒビターの各々の間の配列同一性の百分率を表示する。
【００６５】
セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの発現、精製および物理化学的キャラクタリゼーション
クローン１０由来アレルゲンは、Ｃ末端ヘキサヒスチジンタグを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現した。セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの約２５ｍｇ／Ｌの液体培養物をニッケルクロマトグラフィーによって精製できた（図２Ａ）。精製した組換えタンパク質１０のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、９９７０．８Ｄａの質量ピークを生じた（図２Ｂ）。精製した組換えクローン１０由来アレルゲンの遠紫外線ＣＤスペクトル（図２Ｃ）は、タンパク質が折り畳まれ、相当な量のβ−シートおよび低いα−ヘリックス含量を含むことを示す。そのスペクトルは、２０４ｎｍでの極小および１９０ｎｍでの極大により特徴付けられる。参照データセット７でプログラムＣＤＳＳＴＲを用いる二次構造分析は、８％のα−ヘリックス、２３％のβ−シート、１４％のβ−折返しおよび５３％のランダムコイルを与えた。０．０３３のＮＲＭＳＤ値は、計算したものと実験的に誘導したスペクトル間の良好な適合を示した。９５℃への加熱に際して、極小のＣＤスペクトルのわずかなシフト（２０４ｎｍから２０１ｎｍまで）を観察し、これは、タンパク質の部分変性を示す。２５℃への冷却に際して、タンパク質は再び折り畳まれた（図２Ｃ）。しかしながら、２０４ｎｍの極小は加熱前より低く、これは、β−シート−の転位を示唆する。要約すると、温度走査中に観察されたスペクトルは、クローン１０由来アレルゲンの高い熱安定性を示す。
【００６６】
組換えクローン１０由来アレルゲンは小麦からの新規なセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンである
精製したクローン１０由来アレルゲンを、ドットブロット分析によってパン屋喘息、草花粉アレルギーおよび小麦に対する食物アレルギーに苦しむ患者からの血清を用いて、ＩｇＥ反応性につきテストした（図３）。組換えクローン１０由来アレルゲンは、パン屋喘息に苦しむ２２名の患者のうち３名の患者（番号１、番号４、番号１２）（１３．６％）からのＩｇＥ抗体と反応した。主な小麦アレルゲン、アルファアミラーゼインヒビターに特異的なＩｇＥの低レベルだけを有した患者番号１は、セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンに対する強力なＩｇＥ反応性を示した。注目すべきことには、クローン１０由来アレルゲンは、パン屋喘息の患者からのＩｇＥ抗体によって専ら認識されたが、小麦に対するＩｇＥ媒介食物アレルギーに苦しむ患者または草花粉アレルギーに苦しむ患者からのものでは認識されなかった。３つの各患者群からのいくつかの血清は、草花粉に対する共同感作により組換えオオアワガエリ花粉アレルゲンに対するＩｇＥ反応性を示した。パン屋喘息患者によるクローン１０由来アレルゲンの特異的なＩｇＥ反応性は、セリアック病患者からのさらなる２０の血清、食物アレルギーの患者からの１１９の血清、草花粉アレルギーの患者からの２３の血清、およびパン屋喘息患者からの２５の血清を用いて、チップ分析で確認した（Constantinら、未発表、データを示さず）。
【００６７】
パン屋喘息患者の群におけるクローン１０由来アレルゲンに対するＩｇＧサブクラス反応性の分析は、Ｔｈ２応答を示す、アレルゲン特異的なＩｇＧ１の存在および低い範囲のアレルゲン特異的なＩｇＧ４レベルを示したが、そのクローン１０由来アレルゲンに特異的な関連するＩｇＧ２およびＩｇＧ３の反応性は検出されなかった（図４）。
【００６８】
セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体のアレルギーの活性を試験するために、特異的なＩｇＥ抗体を持つおよび持たない患者からの血清ＩｇＥをヒトＦｃεＲＩを発現するＲＢＬ細胞に負荷し、引き続いて、そのアレルゲンに曝露させた（図５）。患者番号１からの血清ＩｇＥを負荷したＲＢＬ細胞は、アレルゲン曝露に際して最も強い脱顆粒を示した（５１％の合計のβ−ヘキソサミニダーゼ放出）。より低い脱顆粒は、患者番号４および１２（各々、２２％および１９％）からのＩｇＥを負荷したＲＢＬ細胞で得、それはドットブロットにおけるＩｇＥ認識の強度と対応した（図３）。ＲＢＬ細胞に非アレルギー性の人からの血清（図５：ＮＣ）が負荷される場合、ほとんど脱顆粒は観察されなかった。主要なオオアワガエリ花粉アレルゲンｒＰｈｌ ｐ １は、患者番号１２からの血清ＩｇＥを負荷したＲＢＬ細胞中で強力な脱顆粒を誘導し、ＲＢＬ細胞に患者番号１および４からの血清を負荷した場合には、穏やかな脱顆粒が誘導された（図５）。また、実際には、患者番号１、番号４および番号１２は花粉アレルギーに苦しんだ（テーブルＩ）。
【００６９】
セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンは成熟中に小麦種子に蓄積する
クローン１０由来アレルゲンに特異的なウサギ抗体を用いて、小麦種子成熟中のタンパク質の発現を調べた（図６）。種子成熟の異なる時点で採取された小麦種子からの抽出物を含有するニトロセルロースシートを、特異的なウサギ抗体および前免疫Ｉｇで探索した。クローン１０−特異抗体は、セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの四量体を表わす４０ｋＤａのタンパク質と反応した（図６）（１１）。そのタンパク質の発現は、１５日齢の種子において検出できるようになり、種子のさらなる成熟中に増加し続けた（図６）。ブロットが、同じウサギからの前免疫Ｉｇとインキュベートされた場合には、免疫反応性は見い出されなかった（図６）。
【００７０】
セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンは、小麦種子において優先的に検出される
花粉および種子を比較した場合、発明者らはセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンが、種子中で優先的に発現される（図７）が、弱いシグナルだけが小麦花粉抽出物中の約６５ｋＤａにて得られることを見い出した。汎アレルゲンプロフィリンは、小麦種子および花粉中のウサギ抗小麦種子プロフィリン抗体で検出した（図７：番号１２３）。前免疫Ｉｇで反応性は見い出されなかった（図７）。
【００７１】
次に、発明者らは、セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲン特異抗体を用いて、相同タンパク質が、５０％（豆）、４９％（トウモロコシ、米）および３３％（ジャガイモ）の配列同一性と記載されている米、トウモロコシ、一般的な豆およびジャガイモにおける交差反応性の構造を探索した（テーブルＩＩＩ）。セリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンは、小麦種子において四量体として再び検出し、比較可能な量の各抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した（図８Ａ）が、約２３ｋＤａのバンドは米において検出し、しかしながら、トウモロコシ、一般的な豆またはジャガイモにおいて反応性は見い出されなかった（図８Ｃ）。ブロットを前免疫Ｉｇとインキュベートした場合、反応性は観察されなかった（図８Ｂ）。
【００７２】
免疫金電子顕微鏡検査による小麦穀粒のデンプン層中およびデンプン粒間のセリンプロテイナーゼインヒビター様アレルゲンの局在
図９Ａは、透過型電子顕微鏡における低倍率での小麦穀粒を介する超薄切片を示す。穀粒の主要な３つの形態成分：穀粒の外部の多層の果実および種皮（Ｃ）、デンプン層（ＡＬ）および多数の内部の始まり、デンプン質胚乳（ＳＥ）が明らかである。長方形は、Ｂ中に示された領域に匹敵する領域をマークする。図９Ｂは、より高倍率でのデンプン細胞および隣接するデンプン質胚乳の間の境界を示す。デンプン細胞は、小さな脂質小胞（Ｌ）に囲まれたデンプン穀粒（ＡＧ）（タンパク質液胞）で満たされる。双方の成分は細胞の細胞質基質に埋め込まれている。デンプン質胚乳は、無定形の細胞質物質の小さな間隙をまさに残して緊密に充填された可変サイズのデンプン穀粒から成る。長方形は、各々、Ｃ、ＤおよびＥ、Ｆにおける高倍率で示された領域を示す。図９Ｃは、小麦タンパク質１０に対して産生されたＡｂｓを用いてデンプン細胞中のクローン１０由来アレルゲンの局在を示す。金粒子（矢印）は、細胞小器官間の細胞マトリックス中であるが、脂質小胞（Ｌ）の末梢部中での小麦タンパク質１０の存在を主に示す。デンプン領域において、小麦タンパク質１０は、デンプン粒（ＳＧ）間の無定形の細胞質物質（ＣＹ）と関連する（図９Ｅ）。免疫前Ａｂｓでの対照実験は、非常に低い程度の非特異性の標識化を示した（図９、ＤおよびＦ）。
【００７３】
実施例２：組換えアレルゲンの発現および精製
実施例２は、クローン番号１０、番号３７、番号３８、番号１１２、番号１２３および番号１２６と命名された６種のＩｇＥの反応性小麦種子アレルゲンの同定およびキャラクタリゼーションを示す。さらに、実施例２は、前記のクローンの組換えアレルゲンの発現および精製のための方法を示す。
【００７４】
生体物質、患者血清
トリーティクム・アエスティウム栽培品種マイケルからの小麦種子をOsterreichische Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit GmbHから得て、温室で植えた。未成熟種子を受粉開始までの２５日の期間の後に直接的に液体窒素に収集し、使用まで−８０℃で貯蔵した。血清は、パン屋喘息に苦しむ２４名の患者から得た（テーブルＩＶ）。パン屋喘息は、ＣＡＰ−ＦＥＩＡシステム(Phadia, Uppsala, Sweden) により、特定の吸入負荷試験（１）後に、病歴、合計の血清ＩｇＥレベル、小麦およびライ麦に特異的なＩｇＥに基づき診断した（図１０）。草花粉アレルギー患者からの血清をＣＡＰ−ＦＥＩＡシステム(Phadia)による合計血清ＩｇＥレベルおよびＩｇＥ特異的なオオアワガエリ花粉につき分析し、小麦に対する食物アレルギー患者を従前に記載のごとく特徴付けした（２）（図１１）。これらの患者の臨床データをテーブルＶにまとめる。対照目的のために、非アレルギー性の個体からの血清を実験に含めた。
【００７５】
小麦種子からのλｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリーの構築
Ｙｅｈ［３］に従い、総ＲＮＡを−８０℃で貯蔵した小麦種子から抽出した。次いで、ＲＮＡペレットをイソチオシアン酸グアニジニウム緩衝液（４Ｍイソチオシアン酸グアニジニウム、０．８３％ｖ／ｖ ３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６、０．１１Ｍβ−メルカプトエタノール）に溶解し、塩化セシウム密度勾配超遠心によって精製した。ポリＡ＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロース・アフィニティークロマトグラフィー(Nucleo Trap mRNA; Machery-Nagel)によって分離し、二本鎖ｃＤＮＡはｃＤＮＡ合成キット(cDNA synthesis System; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を介して合成した。ＥｃｏＲＩメチラーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)でのメチル化の後、ＥｃｏＲＩリンカー(New England Biolabs)をｃＤＮＡで消化した。リンカーｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩ（Roch Diagnostics）で消化した。消化したリンカーは、Ｎｉｃｋカラム(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)で取り出し、ｃＤＮＡをλｇｔ１１アーム(Stratagene, La Jolla, CA, USA)に連結した。連結反応生成物をｉｎ ｖｉｔｒｏにて充填し(Gigapack III Gold Cloning Kit, Stratagene)、その結果、２．４３×１０６ＰＦＵ（プラーク形成単位）のλｇｔ１１発現ｃＤＮＡライブラリーを得た。
【００７６】
小麦種子ｃＤＮＡライブラリーからのＩｇＥ反応性クローンの単離およびキャラクタリゼーション
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｙ１０９０を組換えファージの７×１０５ＰＦＵで感染させ、記載のごとくパン屋喘息に苦しむ４名の患者（番号１、番号２、番号５、番号１３）の血清ＩｇＥで免疫スクリーニングした［５］。６つのＩｇＥ反応性ファージクローンをさらなる再クローニングのために選択し、それらのＤＮＡをλｇｔ１１プライマーでのPlatinum PCR Supermix (Invitrogen, Life Technolgies)を用いてＰＣＲ増幅し、配列決定した(MWG, Ebersberg, Germany)。得られた配列は、全米バイオテクノロジー情報センター (NCBI)でのＧｅｎＢａｎｋデータベースに提出された配列と比較した。
【００７７】
組換えアレルゲンの発現および精製
そのクローンのコード領域は、テーブルＶＩにリストしたプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物は、AccepTor Vector (Novagen, Madison, WI) にサブクローンし、再度で配列決定した（ＭＷＧ）。次いで、挿入断片を含むAccepTorベクターをＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩ(Roche Diagnostics)で消化し、挿入断片をゲル精製(Promega, Madison, WI, USA)し、発現プラスミドｐＥＴ １７ｂ(Novagen)にサブクローンした。ＤＮＡ配列は双方のＤＮＡ鎖を配列決定することにより確認した(Microsynth, Balgach, CH)。ｐＥＴ １７ｂ−挿入断片構築体をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）(Stratagene)に形質転換し、０．８〜１のＯＤ（６００ｎｍ）まで、３７℃で１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含有するLuria Broth (LB)培地中で増殖させた。タンパク質発現は０．５ｍＭの最終濃度までイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加によって誘導し、さらに３時間細菌を増殖させた。次いで、細菌を遠心分離によって収集し、Ultraturrax (IKA, Stauffen, Germany)で２５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５、０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００中でホモジナイズした。ＤＮＡはＤＮアーゼＩの添加によって消化し、２０℃でさらに１０分間撹拌し、２００μｌの５Ｍ ＮａＣｌで停止し、次いで、４℃（６０００ｇ、２０分間）で遠心した。クローン１０由来アレルゲンは、QIAexpressionist handbook, protocol 17 (QIAGEN, Hilden, Germany)によるＮｉ−ＮＴＡ樹脂アフィニティカムでの変性条件下、封入体含有ペレットから精製した。組換えアレルゲンを含む画分をプールし、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．５に対して透析した。組換えタンパク質番号３７、番号３８、番号１１２、番号１２３および番号１２６を、QIAexpressionist handbook, protocol 12 (QIAGEN)によるＮｉ−ＮＴＡ樹脂アフィニティカムでの在来条件下で細菌可溶化液のペレットから精製した。組換えタンパク質を含有する画分をプールし、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４ ｐＨ７．５に対して透析した。タンパク質試料は１４％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上での純度につき分析し、クーマシーブリリアントブルー染色によって視覚化した。タンパク濃度は Micro BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)で決定した。
【００７８】
実施例３：アレルゲンアッセイ
実施例３は、実施例２に記載のごとく調製したその組換え小麦種子アレルゲンを明らかにするアレルゲンマイクロアッセイが、パン屋喘息患者からの血清ＩｇＥによって特異的に認識されるが、小麦に対する食物アレルギーまたは草花粉アレルギーの患者からのものでは特異的に認識されないことを示す。従って、組換えアレルゲンは小麦粉に対する呼吸アレルギーに特異的である。さらに、実施例３は、呼吸アレルギーのｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の改良のための配列におけるオオアワガエリ花粉のマーカーアレルゲンｐｈｌ ｐ１およびＰｈｌ ｐ ５および小麦花粉の使用を示す、
【００７９】
技術
患者および血清
血清は、パン屋喘息に苦しむスペイン人患者（Ｂ１〜Ｂ２３）、小麦誘発食物アレルギーに苦しむオーストリア人患者（Ｆ１〜Ｆ２６）およびドイツ人患者（Ｆ２７〜Ｆ３８）ならびに草花粉アレルギーに苦しむオーストリア人患者（Ｇ１〜Ｇ１７）から得た。患者は、陽性の病歴、パン屋喘息のケースにおける臨床的に関連する感作の確認のための特異的吸入負荷試験（１）、ならびに小麦に対する食物アレルギーの幼児患者における二重盲検プラセーボコントロールされた食物負荷（ＤＢＰＣＦＣ）によって選択した。すべての患者からの血清は、ＣＡＰ−ＦＥＩＡシステム(Phadia, Uppsala, Sweden)による合計の血清ＩｇＥレベルならびに小麦粉およびオオアワガエリ花粉に特異的なＩｇＥにつき分析した。これらの患者の個体群統計学的、臨床的および血清学的なデータをテーブルＶＩＩ、ＶＩＩＩおよびＩＸに要約する。対照目的については、健康な個体からの血清をすべての実験に含めた。
【００８０】
生体物質
パン屋喘息患者からの血清でスクリーニングすることにより、ｃＤＮＡライブラリーから誘導された組換え小麦タンパク質番号１０、番号３７、番号３８、番号１１２、番号１２３および番号１２６をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、記載のごとく精製した（１２）。小麦花粉は、Allergon (Vallinge, Sweden)から購入し、組換えＰｈｌ ｐ １、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ７、Ｐｈｌ ｐ １２は、BIOMAY (Vienna, Austria)から購入した。
【００８１】
タンパク質抽出物
トリーティクム・アエスティウム花粉（５００ｍｇ）は５ｍｌ ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＰＭＳＦ中で４℃にて一晩抽出した。１３，０００×ｇ ４℃にて１時間遠心分離後、上清のタンパク濃度をMicro BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL)で測定し、アリコートは使用まで−２０℃で貯蔵した。
【００８２】
アレルゲンマイクロアレイ分析
小麦花粉抽出物、１〜１．５ｎｇ／スポット、組換えでかつ精製した小麦タンパク質および組換え草花粉アレルゲン、０．１〜０．１５ｎｇ／スポットを、記載のごとく、顕微鏡スライドガラスに付けられたニトロセルロース膜上のNano Plotter NP2(Gesellschaft fuer Silizium-Mikrosysteme mbH, GroBerkmannsdorf, Germany)で点在させた（１３）。精製したヒトＩｇＥは、位置マーカーとして用いた（１４）。点在させたマイクロアレイは、３０μｌのアッセイ緩衝液（弱リン酸緩衝液、ｐＨ７．５）で予め洗浄させ、アレルギー患者または対照からの３０μｌの希釈されていない血清とインキュベートした。３０μｌのアッセイ緩衝液での洗浄後、結合したＩｇＥ抗体を２０μｌのフルオロフォア結合抗ＩｇＥ抗体で検出し、蛍光強度（ＦＩ）を６３５ｎｍ(GenePix 4000B fran Axon)の波長にて測定した。カットオフレベルは、ヒト血清アルブミンで得られた値に基づいてＦＩ＝３００にセットした。
【００８３】
結果
患者の記載
発明者らは、パン屋喘息、小麦誘発食物アレルギーまたは草花粉アレルギーに苦しむ患者を分析した。パン屋喘息患者の群は、小麦粉に職業的に曝露する２３名（４名の女性、１９名の男性：平均年齢３９歳、２２〜６０歳の範囲）から成った。パン屋喘息患者の９１パーセントは、小麦粉の吸入による喘息に苦しみ、９４％は鼻結膜炎の症状を訴えた。他の呼吸アレルゲン源（例えば、ネコ、ゴキブリ、イヌ、草花粉、ウマ、イエダニ、カビおよび／またはオリーブ花粉）に対する感作は、パン屋喘息患者の７０％および草花粉アレルギーに苦しむ患者の４８％に判明した（テーブルＶＩＩ）。注目すべきことには、食物に対するアレルギーを示すパン屋喘息患者はなく、症状は呼吸徴候に制限された。
【００８４】
小麦誘発された食物アレルギーに苦しむ患者の群は、３８名の個人（２５名の女性、１３名の男性：平均年齢１３歳、０．５〜６５歳の範囲）より成った（テーブルＶＩＩＩ）。再度、発明者らは、他の呼吸アレルゲン源（例えば、シラカバ花粉、草花粉、イエダニおよびヨモギ花粉）に７１％が感作され、５８％は、食物アレルゲン（例えば、ニンジン、牛乳、ヘーゼルナッツ、鶏卵、麦芽、ナッツ、オレンジ、プラム、米、大豆、セロリ、シーフード、エビおよび／または香辛料）に感作されたことを見出した（テーブルＶＩＩＩ）。草花粉に対するＩｇＥ媒介感作は、これらの患者の５５％で見出された。これらの患者の症状は、呼吸器症状（例えば、喘息、気管支炎、咳、結膜炎、呼吸困難、鼻閉、鼻漏、鼻結膜炎）ないし胃腸症状（例えば、腹痛、下痢、鼓腸、咽喉痛および嘔吐）および皮膚症状（例えば、湿疹、そう痒症および蕁麻疹）（テーブルＶＩＩＩ）で変化した。
【００８５】
草花粉アレルギーの患者の群は、１７名の患者（５名の女性、１２名の男性：平均年齢１３歳、０．５〜６５歳の範囲）から成った。また、これらの患者の７１パーセントは他の呼吸アレルゲン源（例えば、シラカバ花粉、ネコ、イヌ、イエダニ、ウサギおよびヨモギ花粉）に対するアレルギーに苦しんだ（テーブルＩＸ）。血清学によれば、６５％は小麦粉に対するＩｇＥ反応性を示し、２３％は、他の食物アレルゲンに対するＩｇＥを含んでいた。しかしながら、１名の患者だけが蕁麻疹に苦しみ、食物アレルギーの症状は、これらの患者につき記録することができなかった。喘息、結膜炎、呼吸困難、鼻結膜炎および鼻炎のごとき呼吸器症状は、草花粉でアレルギーの患者において優勢であった。
【００８６】
アレルゲンアレイの構成
番号１０、番号３７、番号３８、番号１１２、番号１２３および番号１２６として指定した６つの組換え小麦種子アレルゲンを、ニトロセルロースをコーティングしたスライドガラスに点在させた（図１２、Ａ）。組換え小麦タンパク質は、記載のごときパン屋喘息患者からの血清で小麦種子ｃＤＮＡライブラリーから分離したｃＤＮＡに基づいた大腸菌中で発現させた（１５）。ＮＣＢＩデータベースに配置した配列との相同性によれば、小麦アレルゲンは以下のように記載できる：番号１０は、トリーティクム・アエスティウムサブチリシン−キモトリプシンインヒビターＷＳＣＩ前駆体（受入番号ｇｉ│１２２０６５２３７）に対して９６％の相同性を有し、番号３７はＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍチオレドキシンＨ（受入番号ｇｉ│２７４６１１４０）であり、番号３８はＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍグルタチオントランスフェラーゼ（受入番号ｇｉ│２００６７４１９）であり、番号１１２は、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ １−Ｃｙｓ−ペロキシレドキシン（受入番号ｇｉ│３４５３９７８２）と９９％の相同性を有し、番号１２３はＴ．ａｅｓｔｉｖｕｍプロフィリン（受入番号ｇｉ│１３４６８０３）と９６％の相同性を有し、番号１２６は、オオムギデヒドリン（Hordeum vulgare dehydrin）１１（受入番号ｇｉ│４１０５１０１）と６９％の相同性を有する。
【００８７】
また、組換え小麦アレルゲンに加えて、小麦花粉抽出物、組換えオオアワガエリ花粉アレルゲン（ｒＰｈｌ ｐ １、ｒＰｈｌ ｐ ５、ｒＰｈｌ ｐ ７およびｒＰｈｌ ｐ １２）（１６〜１９）およびＩｇＥをスライド上に点在させた（図１２、Ａ）。血清とのインキュベーション後のアレルゲンマイクロアレイの代表的な画像を図１２、Ｂ〜Ｃに示す。非アレルギー性の人からの血清で探索したチップ上では、いずれのアレルゲンとの反応性も検出できなく、点在したＩｇＥマーカーだけが、抗ＩｇＥ結合で検出したことが示された（図１２、Ｂ）。図１２において、Ｃは、パン屋喘息患者（１）、小麦誘発食物アレルギー患者（２）および草花粉アレルギー患者（３）からの血清とインキュベートしたマイクロアレイチップの代表的画像を示す。パン屋喘息患者（１：テーブルＩ：Ｂ４）は、組換え小麦アレルゲン番号１０に強力なＩｇＥ反応性を示し、番号１２６および番号１１２に弱い反応性を示す。食物アレルギー患者（２：テーブルＶＩＩＩ：Ｆ２６）については、小麦番号１２３およびオオアワガエリ花粉ｒＰｈｌ ｐ １２からの組換えプロフィリンに対する強いＩｇＥ結合、ならびに小麦花粉抽出物およびｒＰｈｌ ｐ １に対する弱い結合を観察した。花粉アレルギー患者（３：Ｇ１６）からのチップの画像は、ｒＰｈｌ ｐ ５およびｒＰｈｌ ｐ １２に強いシグナルを示し、小麦プロフィリン番号１２３、小麦花粉抽出物およびｒＰｈｌ ｐ １でより弱いシグナルを示す。
【００８８】
パン屋喘息患者からのＩｇＥ抗体によって特異的に認識された小麦種子アレルゲンの同定
パン屋喘息患者の９１パーセントは、小麦粉ＣＡＰにおいて陽性であった（テーブルＶＩＩ）。点在した小麦アレルゲンを用いて、パン屋喘息患者の６２％についてのＩｇＥ反応性プロフィールを確立した。アレルゲン番号１２６（３０％）、番号１０（２６％）、番号１２３（２２％）および番号１２２（１７％）は、最も頻繁に検出した成分であったが、番号３７および番号３８は血清の４％だけで反応した（図１３、Ａ）。注目すべきことには、小麦粉ＣＡＰにおいて陰性であった２名の患者（Ｂ５、Ｂ１８：テーブルＶＩＩ）は、アレルゲン番号１２６と反応した。パン屋喘息患者の４８パーセントはオオアワガエリ花粉抽出物に対するＩｇＥ反応性を示し、また、これらの患者の各々を点在したｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５の組合せで診断した。組換えＰｈｌ ｐ １２（３５％）は常により強く、小麦プロフィリン番号１２３（２２％）よりもよりしばしば認識された。交差反応性の花粉アレルゲンｒＰｈｌ ｐ ７は１３％の血清と反応した。
【００８９】
パン屋喘息患者によって認識した組換え小麦種子アレルゲンは、小麦誘発食物アレルギーに苦しむ患者のＩｇＥ抗体についての標的ではない
小麦に対する食物アレルギーの患者のすべては小麦粉ＣＡＰにおいて陽性であるが、組換え小麦タンパク質は、ほとんど認識されなかった（５％）（図１３、Ｂ）。また、交差反応性のオオアワガエリ花粉プロフィリンに陽性であった２名の患者は、マイクロアレイにおける小麦プロフィリン番号１２３に対して陽性のシグナルを有した。小麦誘発食物アレルギーの患者の５５パーセントは、Ｐｈｌｅｕｍ ＣＡＰにおいてＩｇＥ反応性を示し、まさに１８％はそのチップ上の小麦花粉抽出物に陽性であり、点在させたｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５の組合せ中では２６％が陽性であった。点在させたｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５単独は、各々、血清の１８％および１６％だけ認識され、交差反応性アレルゲンｒＰｈｌ ｐ ７およびｒＰｈｌ ｐ １２は、血清の１３％および２６％で反応した。
【００９０】
ｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５は、草花粉アレルギーについての診断マーカー・アレルゲンであるが、プロフィリンはパン屋喘息および小麦食物アレルギーの患者によって認識される。
草花粉アレルギー患者の６５パーセントが小麦粉ＣＡＰに陽性であった。マイクロアレイ中でテストした組換え小麦タンパク質のうち、組換え小麦タンパク質番号１２３だけが２３．５％の患者によって認識された（図１３、Ｃ）。また、これらの各患者は、交差反応性オオアワガエリ花粉プロフィリンｒＰｈｌ ｐ １２に陽性であった。しかし、ｒＰｈｌ ｐ １２は常により強力であり、番号１２３よりもしばしば（３５％）認識された。花粉アレルギーに苦しむすべての患者は、オオアワガエリ花粉ＣＡＰに対して、および点在したｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５の組合せにおいて陽性であった。組換えＰｈｌ ｐ １単独は、花粉アレルギーの患者によるｒＰｈｌ ｐ ５（８８％）よりもよりしばしば認識された（９４％）。小麦花粉抽出物は、８２％の血清と、交差反応性ｒＰｈｌ ｐ ７は、血清の２９％と反応した。
【００９１】
草花粉アレルギー患者および草花粉アレルギーのパン屋喘息患者のすべてが、マイクロアレイにおけるｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５の組合せおよびＰｈｌｅｕｍ ＣＡＰにおいて陽性であった（図１３、Ａ；Ｃ）。これらの所見は、草花粉アレルギーをｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５に対するＩｇＥ反応性によって診断できることを示す以前に公開されたデータに一致している（２０、２１）。しかしながら、小麦誘発食物アレルギーの患者のうち、２６％だけが、マイクロアレイ中のｒＰｈｌ ｐ １およびｒＰｈｌ ｐ ５と反応したが、２倍を超える多数（５５％）が、Phleum CAPにおいて陽性であった（図１３、Ｂ）。さらに、ＣＡＰシステムにおける草花粉抽出物およびマイクロアレイ中のオオアワガエリ花粉プロフィリン（ｒＰｈｌ ｐ １２）と反応するそれらの患者も、植物プロフィリン（２３）の交差反応性により小麦プロフィリン（２２）に陽性であった。しかしながら、ＩｇＥ認識の頻度および強度は、小麦プロフィリン（２２）に対してよりもｒＰｈｌ ｐ １２に常により強力であった。
【００９２】
実施例４
分析物は、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ(Phadia, Uppsala, Sweden)のごとき固体担体に固定する。アレルゲンに感作され、そのアレルゲンにＩｇＥ反応性を示す少なくとも３つの代表的なヒト患者からの血清試料を、１００μｇ／ｍＬの最終濃度のアレルゲンと、ならびに平行して陰性対照として、緩衝液単独および大腸菌の非アレルギー性のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と、室温にて３時間インキュベートする。  次いで、試料を固定化分析物を運ぶImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)テストに対するＩｇＥ結合につき分析して、アレルゲンとの予めのインキュベーションがＩｇＥ結合を特異的に抑制するか、またはＩｇＥを有意に低下させるかを試験する。
【００９３】
【表２】
0005542685.tif 000004
【００９４】
【表３】
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【００９５】
【表４】
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【００９６】
【表５】
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【００９７】
【表６】
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【００９８】
【表７】
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【００９９】
【表８】
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【０１００】
【表９】
0005542685.tif 000011
【０１０１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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