(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列を、前記少数標的ヌクレオチド配列が前記多数標的ヌクレオチドに対して１：１０より小さく、且つ１：１０００より大きい割合で、前記少数標的ヌクレオチド配列および前記多数標的ヌクレオチド配列を含むサンプル中で、検出する方法であって、
該方法が、
１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは、(a)少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) 少数標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する少数標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、そして、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットは標的核酸配列の相補物にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブセットを含まないものであり；
リガーゼを準備し；
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し、リガーゼ検出反応混合物を形成し；
リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、この変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、このハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、その夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、互いに連結して線形的な増幅を達成し、各セットがリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別し得るために、連結反応産物配列と一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結反応産物配列を形成し、その中で、オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結せず、そして変性処理の際に個々に分離しているものであり；
サンプル中に存在する少数標的ヌクレオチド配列の結果として産生された連結反応産物配列の存在を検出する；
ことを含む方法であって、
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：５００で、または、Ｇ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチ以外について相対比率１：２０００で識別される、方法であって、
該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
サンプル中に存在する多数標的ヌクレオチドの結果として産生した多数連結反応産物配列を検出し；
検出した多数連結反応産物配列を定量し；
検出した少数連結反応産物配列を定量する；
ことを含む、方法。
【請求項２】
特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がリガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別され得るようにユニーク長を有し、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
該検出後に、サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項３】
各セットの第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し、該検出は、アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列の存在を示し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を示す；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項４】
サンプル中に未知量で存在する多数および少数ヌクレオチド配列の相対量を定量するものであり、該方法がさらに、
該混合の前に、ポリメラーゼ連鎖反応によってサンプル中の多数および少数の標的ヌクレオチド配列を多数と少数の両方の標的ヌクレオチド配列に共通するオリゴヌクレオチドプライマーでもって増幅し；
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む１以上の配列特異的プローブセットを準備し；
マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し；
多数および少数の連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた多数および少数の連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレス可能アレイ特異的部分を有し、該方法がさらに、
異なる特定の部位で固定された相違する捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物を準備し、ここで捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補的なヌクレオチド配列を有し、
１以上のリガーゼ検出反応サイクルにリガーゼ検出反応混合物をかけた後に、該混合物を固体支持物に、連結反応産物配列を捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズさすのに効果的な条件で接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉し；
アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、特定の部位で固体支持物に固定された連結反応産物配列を定量し；
未知のサンプルから生じた捕捉連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた捕捉連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の相対レベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項４の方法。
【請求項６】
１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が１以上の単一ヌクレオチド位置における標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項４の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項４の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるレポーター標識を有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク長の産物を産生するものであり、該方法がさらに、
連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動能によって分離し；
サイズの相違する連結反応産物配列を識別する；
ことを含む、請求項４の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、検出可能なレポーター標識を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有する、請求項５の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループは単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別できるように設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含有し、各グループのオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、アドレス可能なアレイ特異的部分を有する共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、与えられた対立遺伝子またはマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能なレポーター標識を有する、請求項５の方法。
【請求項１１】
単一標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違、または多数標的ヌクレオチド配列中の２以上の近接または隣接のヌクレオチド位置における多数対立遺伝子の相違を、重複し得る部分を有するオリゴヌクレオチドプローブセットで識別する、請求項１の方法。
【請求項１２】
サンプルにおいて、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、該検出において、連結反応産物配列の標識が検出され、それによって１以上の標的ヌクレオチド配列中の１以上のヌクレオチド位置における1以上の低存在量の対立遺伝子のサンプル中の存在が示される、請求項１の方法。
【請求項１３】
サンプル中に未知量で存在する、過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を定量し、該方法がさらに、
既知量の１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列を準備し；
１以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し；
各セットは、(a)マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブおよび(b) マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分および検出可能なレポーター標識を有する第２オリゴヌクレオチドとを特徴とし、特定マーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結反応を阻止するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよび該複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置における多重対立遺伝子の相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し得、グループ内の１以上のセットが、マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブを含有して、共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブとを分かち持ち、リガーゼ検出反応混合物を形成するための該混合が、マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含み；
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知のサンプルから生じた連結反応産物配列の量を既知量のマーカー標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較して、サンプル中の１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列のレベルについて定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが変異対立遺伝子特異的プローブよりも低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
過剰の正常配列の存在下に単一標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違、または過剰の正常配列の存在下に多重標的ヌクレオチド配列中の多重の近接または隣接の位置における低存在量の多重対立遺伝子相違を識別し、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブグループを形成し、各グループが単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子の相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を除く与えられた対立遺伝子に塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、グループ内の１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブと、正常対立遺伝子を含む与えられた対立遺伝子に、塩基特異的にハイブリダイズする第２オリゴヌクレオチドプローブを分かち持ち、正常対立遺伝子特異的プローブが低い濃度でリガーゼ検出反応混合物中に存在し、および／または１以上の内部ミスマッチまたは修飾を含有し、それによって多数正常標的から生じた連結反応産物の量が既知の希釈の少数標的から推測される連結反応産物配列の量と類似であって、
連結反応産物配列を定量し；
低存在量の未知サンプルから生じた連結反応産物配列の量を高存在量の正常標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量と比較し；
低レベルの正常連結反応産物配列形成を基にして高存在量の正常標的ヌクレオチド配列の量を測定し、サンプルにおける１以上の低存在量の標的ヌクレオチド配列の、高存在量の正常標的ヌクレオチド配列に比較した比率についての定量的計測を提供する；
ことを含む、請求項１の方法。
【請求項１６】
正常対立遺伝子特異的プローブが正常塩基を３’末端に含有する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
正常対立遺伝子特異的プローブが１以上の内部ミスマッチまたは修飾を３’末端から４塩基以内に含有する、請求項１６の方法。
【請求項１８】
修飾が１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、４−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−２−カルボキサミド、２'−デオキシ−５−フルオロウリジン、２−デオキシイノシン、６−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド〔４，５−Ｃ〕〔１，２〕オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−６−メトキシアミノプリン、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−５−ニトロインドール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−１，２，４−トリアゾール、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン、５−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）イミダゾール−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ヨードピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−プロピニルピラゾール、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピロール−３−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）ピラゾン−４−カルボキサミド、１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロイミダゾールおよび１−（２'−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−ニトロピラゾールよりなる群から選ばれるヌクレオチド類似体である、請求項１５の方法。
【請求項１９】
修飾オリゴヌクレオチドプローブがチオホスフェート、ジチオホスフェート、２'−メトキシまたは３'−アミノ−２'，３'−ジデオキシ修飾をその糖ホスフェート・バックボーンに、連結反応部から４塩基の１つまたは組合せの位置に含有する、請求項１５の方法。
【請求項２０】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２１】
サンプル中で少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチ以外について相対比率１：２０００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２２】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のすべてのミスマッチについて相対比率１：１００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２３】
少数標的ヌクレオチド配列が多数標的ヌクレオチド配列と、多重の近接または隣接の位置での低存在量の多重対立遺伝子相違のために、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇ以外のミスマッチについて相対比率１：５００で、識別される、請求項１の方法。
【請求項２４】
リガーゼ検出混合物が、ミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
リガーゼ検出混合物が、多数標的ヌクレオチド配列に対するミスマッチなしで多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする識別力のあるオリゴヌクレオチドプローブを、少数標的ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの量より少量で、且つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効である量で、含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
リガーゼ検出混合物が、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在の結果として生成される連結反応産物配列の存在を検出することを妨げない、多数標的ヌクレオチド配列に相当する連結反応産物配列の量を産出するのに有効な形態で、多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする修飾オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は１９９６年７月１９日付の米国仮特許出願６０／０２２,５３５の利益を享受する。
本発明は、米国保健研究所認可番号ＧＭ４１３３７−０６による政府資金でもってなされた。米国政府が一定の権利を有し得る。
発明の分野
本発明は、リガーゼ検出反応（”ＬＤＲ”）を用いる核酸配列相違の適合性の高い検出に関する。本発明の１つの実施態様は、熱安定性リガーゼで過剰の正常鋳型の存在下における少数鋳型を識別するためのリガーゼ検出反応の使用である。本発明の他の実施態様は、リガーゼ検出反応を実施するための変異リガーゼの使用である。本発明の第３の実施態様は、リガーゼ検出反応を実施するための修飾オリゴヌクレオチドプローブの使用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多重検出
高度に多形的な座の大規模多重解析が、父親検定および法医学（Reynolds et al., Anal. Chem., 63:2-15(1991)）、臓器移植のドナーとレシピエントの組み合わせ（Buyse et al., Tissue Antigens, 41:1-14(1993) and Gyllensten et al., PCR Meth. Appl, 1:91-98(1991)）、遺伝疾患の診断、予後および出産前の相談（Chamberlain et al., Nucleic Acids Res., 16:11141-11156(1988) and L. C. Tsui, Human Mutat., 1:197-203(1992)）および発ガン変異（Hollstein et al., Science, 253:49-53(1991)）などについて個体の実際的な同定に必要である。さらに、核酸解析による感染疾患診断の費用効率はパネル試験における多重規模で直接的に変動する。これらの適用の多くは、時に密接なスペース座の多重性において単一塩基の相違の識別力に依存している。
【０００３】
多数の配列領域を含むサンプル中に１以上の選択ポリヌクレオチド配列の存在を検出するのに、様々なＤＮＡハイブリダイゼーション技法が利用される。フラグメント捕捉と標識による簡単な方法において、選択された配列含有のフラグメントが固定化プローブにハイブリダイゼーションされる。捕捉フラグメントは検出可能なレポーター部分を含有する第２プローブへのハイブリダイゼーションによって標識される。
【０００４】
広く用いられている他の方法はサザンブロット法である。この方法において、サンプル中のＤＮＡフラグメントの混合物はゲル電気泳動により分別されて、ニトロセルローズ・フィルター上に固定される。フィルターをハイブリダイゼーション条件で１以上の標識プローブと反応さすことにより、プローブ配列含有のバンドが同定される。この方法は、与えられたプローブ配列含有の制限酵素ＤＮＡ消化においてフラグメントを同定するのに、および制限フラグメント長・多形性（”ＲＦＬＰ”）を解析するのに、特に有用である。
【０００５】
ポリヌクレオチドサンプル中の、与えられた単数または複数の配列の存在を検出する他の方法に、ポリメラーゼ連鎖反応による配列の選択的増幅がある。Mullis et alの米国特許第４,６８３,２０２号およびR. K. Saiki, et al., Science 230:1350(1985)。この方法において、選択した配列の反対側の末端部分に相補的なプライマーがプライマー開始複製の連続ラウンドを熱サイクリングと共に推進するのに用いられる。増幅配列は種々の技術により容易に同定することができる。この方法は、ポリヌクレオチド含有サンプル中の低コピー配列の存在を検出するのに、例えば体液サンプル中の病原菌配列を検出するのに特に有用である。
【０００６】
さらに最近、既知の標的配列をプローブ連結方法によって同定する方法が報告されている。N. M. Whiteley et al.の米国特許第４,８８３,７５０号、D. Y. Wu et al., Genomics 4:560(1989)、U. Landegren et al., Science 241:1077(1988)およびE. Winn-Deen et al., Clin. Chem. 37:1522(1991)。オリゴヌクレオチド連結アッセイ（”ＯＬＡ”）として知られる一つの方法において、所望の標的領域にまたがる２つのプローブまたはプローブエレメントが標的領域にハイブリダイズされる。プローブエレメントが隣接の標的塩基と塩基対になると、プローブエレメントの向かい合う末端は、連結反応により、例えばリガーゼ処理により結ばれる。連結プローブエレメントは検定されて、標的配列の存在が明らかにされる。
【０００７】
この方法の修飾として、連結プローブエレメントは相補的プローブエレメント対について鋳型として働く。対のプローブエレメントの存在における変性、ハイブリダイゼーションおよび連結反応の継続的サイクルでもって、標的配列は直線的に増幅され、非常に少量の標的配列が検出および／または増幅されるのを可能とする。この方法をリガーゼ検出反応と呼ぶ。プローブエレメントの２つの相補対が使用されるとき、そのプロセスはリガーゼ連鎖反応と呼ばれ、標的配列の指数的増幅を達成する。F. Barany, ”Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-93(1991)およびF. Barany, ”The Ligase Chain Reaction (LCR) in a PCR World,” PCR Methods and Applications, 1:5-16(1991)。
【０００８】
核酸配列相違の多重検出についての他の方式はGrossman et al.の米国特許第５,４７０,７０５号に開示されている。そこでは、検出可能標識と電荷／翻訳摩擦ドラッグの顕著な比率とを有する配列特異的プローブが標的にハイブリダイズされ、そして一緒に連結される。この技法は、嚢胞性線維症・透過膜レギュレーター遺伝子の大規模多重解析についてGrossman, et al., ”High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid SequencesおよびOligonucleotide Ligation Assay and Sequence-coded Separation,” Nucl. Acids. Res. 22(21):4527-34(1994)で用いられた。
【０００９】
Jou, et al., ”Deletion Detection in Dystrophin Gene by Multiplex Gap Ligase Chain Reaction and Immunochromatographic Strip Technology,” Human Mutation 5:86-93(1995)は、いわゆる”ギャップリガーゼ連鎖反応”の利用に関し、各エクソンについてのプローブ上の相違するハプテンに特異的な抗体を有する免疫クロマトグラフィー上で読まれる増幅産物でもって、多重エクソンの同時に選択された領域を増幅する。
【００１０】
標的ポリヌクレオチドにおける多数の配列の各々の存在・不存在を検出するのに有用な方法に関して、（例えば、遺伝子スクリーニング分野において）必要性が増大している。例えば４００種もの変異が嚢胞性線維症に関連している。この疾患に対する遺伝子的前処置のためのスクリーニングにおいて、”嚢胞性線維症”の積極的な同定を行うために、対象者のゲノムＤＮＡにおける可能性のある相違する遺伝子配列変異のすべてを検査することが最適である。１回のアッセイで可能性ある変異部位のすべての存在・不存在を検査するのが理想的である。しかし、上記した先行技術は、便利な自動的な単一アッセイとして多数の選択配列を検出するのに容易に用いることができない。
【００１１】
固相ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、多数の液体処理工程を必要とし、単一ヌクレオチド・ミスマッチ識別に要するストリジェンシィを保持するために、いくつかのインキュベーションおよび洗浄温度を注意深くコントロールしなければならない。最適ハイブリダイゼーション条件がプローブ配列によって大きく変わるので、この方法の多重化は困難である。
【００１２】
等量の各ＰＣＲ産物を得る多重ＰＣＲプロセスの開発は、困難であり、労力を要する。これは、反応におけるプライマーのアニール比率の変動と与えられたＭｇ２＋濃度での各配列のポリメラーゼ伸長比率の変動によるものである。典型的には、アニール温度に加え、プライマー、Ｍｇ２＋および塩濃度は、反応におけるプライマーアニール比率とポリメラーゼ伸長比率のバランスを保つように調整される。残念ながら、各々新しいプライマーセットを反応に加えると、形成することのできる可能なアンプリコンとプライマー二量体の数が指数的に増加する。従って、各追加プライマーセットで、各々比較的等量の正確な産物を得る条件をつくりだすのがますます困難になり、時間を要することになる。
【００１３】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物は一般に同じ大きさを有し、アッセイ結果は、各反応チューブに関連するゲル・レーンでの産物バンドの存在・不存在によって計られる。Gibbs et al., Nucleic Acids Res., 17:2437-2448(1989)。この方法は、異なるプライマーの組み合わせを有する多数の反応チューブに試験サンプルを分割することを要し、アッセイ費用が増大する。ＰＣＲにおいて、１つの反応チューブ中で対立遺伝子プライマーを競合せしめるように相違する蛍光染料を付着せしめることにより、対立遺伝子を識別し得るが（F. F. Chehab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9178-9182(1989)）、多重解析へのこの経路は、現在の機器および染料化学でもっては経済的にスペクトル的に分解できる染色が比較的少ないので、規模が限られている。粗大側鎖による修飾塩基の取り込みが、その電気泳動運動性によって対立遺伝子ＰＣＲ産物を識別するのに用いられるが、この方法は、ポリメラーゼによるこれら修飾塩基の取り込みの成功性からして、およびこれらの基の唯一つによって大きさが相違する比較的大きいＰＣＲ産物を分解するための電気泳動性からして、限定されたものである。Livak et al., Nucleic Acids Res., 20:4831-4837(1989)。各ＰＣＲ産物は単一変異のみを探すのに用いられ、多重化を難しくする。
【００１４】
対立遺伝子特異的プローブの連結反応は一般的に、対立遺伝子シグナルを分解するのに、固相捕捉反応（U. Landegren et al., Science, 241:1077-1080(1988); Nickerson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8923-8927(1990)）またはサイズ依存分離法（D. Y. Wu, et al., Genomics, 4:560-569(1989) and F. Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:189-193(1991)）を用い、後者の方法は連結プローブのサイズ幅が狭いので多重規模では限定されている。さらに、多重フォーマットにおいて、リガーゼ検出反応だけでは少量の標的配列を検出および計測するのに充分な産物をつくることができない。ギャップリガーゼ連鎖反応は追加の工程、すなわちポリメラーゼ伸長を必要とする。より複雑な多重化プロセスのために電荷／翻訳摩擦ドラッグ（translational frictional drag）の明白な比率を有するプローブを用いることは、長い電気泳動時間かあるいは検出の他の形態の使用を必要とする。
【００１５】
それらの配列が低豊富であるとき、ポリヌクレオチドサンプルにおける多重選択配列の存在・不存在を検出するための迅速な単一アッセイ方式が必要である。過剰の正常細胞中に癌関連変異が存在するとき、このような検出が必要とされる。
【００１６】
ＤＮＡリガーゼ
ＤＮＡリガーゼは、二本鎖ＤＮＡにおける一本鎖の切断（ニック）にホスホジエステル結合を形成するのに触媒作用を及ぼし、ＤＮＡ復製、修復および組換えに要する。連結反応の一般的メカニズムは、ＮＡＤ＋依存性リガーゼについて下記に示された３つの可逆性工程を含む。この実施例において、ニックＤＮＡ基質は、２つの短いオリゴヌクレオチド（オリゴＡおよびＢ）を長い相補的オリゴヌクレオチドにアニールすることにより形成される。最初に、共有結合的にアデニル化された酵素中間体を、酵素中においてＮＡＤ＋のアデニレート基をリシンのｅ−ＮＨ２基へ転移することにより形成する。第２に、アデニレート部分を酵素からオリゴＢ上の５’末端リン酸塩に転移する。最後に、ホスホジエステル結合を、オリゴＢの活性化５’ホスホリル基上のオリゴＡの３’ヒドロキシル末端の求核的作用により形成する（Gumport, R.I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68:2559-63(1971); Modrich, P., et al., J. Biol. Chem., 248:7495-7501(1973); Modrich, P., et al., J. Biol. Chem., 248:7502-11(1973); Weiss, B., et al., J. Biol. Chem., 242:4270-72(1967); Weiss, B., et al., J. Biol. Chem., 243:4556-63(1968); Becker, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58:1996-2003(1967); Yudelevich, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 61:1129-36(1968); Zimmerman, S.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 57:1841-48(1967); Zimmerman, S.B., et al., J. Biol. Chem., 244:4689-95(1969);およびLehman, I.R., Science, 186:790-97(1974)）。
(i) E-(lys)-NH2 ＋ AMP〜PRN+  ⇔  E-(lys)-NH2+〜AMP ＋ NMN
(ii) E-(lys)-NH2+〜AMP ＋ ５’P-オリゴB  ⇔  AMP〜P-オリゴB ＋ E-(lys)-NH2
(iii) オリゴA-3’OH ＋ AMP〜P-オリゴB  ⇔  オリゴA- P-オリゴB＋ AMP
【００１７】
最近の１０年間において、ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼをコードする遺伝子は、バクテリオファージＴ３、Ｔ４およびＴ７（Dunn, J. J., et al., J. Mol. Biol., 148:303-30(1981); Armstrong, J., et al., Nucleic Acids Res., 11:7145-56(1983)およびSchmitt, M.P., et al., J. Mol. Biol., 193:479-95(1987)、アフリカブタ熱ウイルス（Hammond, J.M., et al., Nucleic Acids Res., 20:2667-71(1992)）、ワクシニアウイルス（Smith, G.L., et al., Nucleic Adics Res., 17:9051-62(1989)）、ショープ線維腫ウイルス（Parks, R.J., et al., Virology, 202:642-50(1994)）、高度好熱菌性archaeon Desulfurolobus ambivalens（Kletzin, A., Nucleic Adics Res., 20: 5389-96(1992)）、S. cerevisiae（ＣＤＣ９遺伝子）（Barker, D.G., et al., Mol. Gen. Genet., 200:458-62(1985)）； S. pombe（ｃｄｃ  １７＋）（Barker, D.G., et al., Eur. J. Biochem., 162:659-67(1988)）、Xiphophorus（Walter, R.B., et al., Mol. Biol. Evol., 10:1227-38(1993)）；マウス繊維芽細胞（Savini, E., et al., Gene, 144:253-57(1994)）およびホモサピエンス（ヒトＤＮＡリガーゼＩ、IIIおよびIV）（Barnes, D.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6679-83(1990); Chen, J., et al., Molec. and Cell. Biology, 15:5412-22(1995); and Wei, Y.F., et al., Molec. & Cell. Biology, 15:3206-16(1995)）からクローン化および配列決定されている。さらに、５つのＮＡＤ＋依存性細菌性ＤＮＡリガーゼもまたクローン化された：E.coli（Ishino, Y., et al., Mol. Gen. Genet., 204:1-7(1986)）、Zymomonas mobilis（Shark, K.B. et al., FEMS Microbiol. Lett., 96:19-26(1992)）、Thermus thermophilus（Barany, F., et al., Gene, 109:1-11(1991)および Lauer, G., et al., J. Bacteriol., 173:5047-53(1991)）、Rhodothermus marinus（Thorbjarnardottir, S.H., et al., Gene, 161:1-6(1995)およびThermus scotoductus（Jonsson, Z.O., et al., Gene, 151:177-80(1994)。ＡＴＰ依存性ＤＮＡリガーゼおよび哺乳類ＤＮＡリガーゼＩおよびIIは、アデニル化されるリシン残基を含む保護活性部位モチーフ、Ｋ（Ｙ／Ａ）ＤＧＸＲを含有する（Tomkinson, A.E., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:400-04(1991)およびWang, Y.C., et al., J. Biol. Chem., 269:31923-28(1994)）。ＮＡＤ＋依存性細菌性ＤＮＡリガーゼは類似の活性部位モチーフ、ＫＸＤＧを含有し、その重要性は本研究において確認される。
【００１８】
プラスミドまたは合成オリゴヌクレオチド基質を用いるインビトロ試験により、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼが緩和された特異性を示すことが明らかである；３’−または５’−ＡＰ部位（アプリンまたはアピリミジン）（Goffin, C., et al., Nucleic Acids Res., 15(21):8755-71(1987)）、一つのヌクレオチドギャップ（Goffin, C., et al., Nucleic Acids Res., 15(21):8755-71(1987)）、３’−および５’−Ａ−ＡまたはＴ−Ｔミスマッチ（Wu, D.Y., et al., Gene, 76:245-54(1989)）、５’−Ｇ−Ｔミスマッチ（Harada, K., et al., Nucleic Acids Res., 21(10): 2287-91(1993)）、３’−Ｃ−Ａ、Ｃ−Ｔ、Ｔ−Ｇ、Ｔ−Ｔ、Ｔ−Ｃ、Ａ−Ｃ、Ｇ−Ｇ、またはＧ−Ｔミスマッチ（Landegren, U., et al., Science, 241:1077-80(1988)）でニックを閉じる。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの適合性は明らかに、Ｔ−ＧまたはＧ−Ｔミスマッチ連結反応のみが検出されたスペルミジン、高い塩濃度、および非常に低いリガーゼ濃度の存在において高められる（Wu, D.Y., et al., Gene, 76:245-54(1989)およびLandeger, U., et al., Science, 241:1077-80(1988)）。Saccharomyces cerevisiaeからのＤＮＡリガーゼは、一つのヌクレオチドギャップおよび３’−Ａ−ＧまたはＴ−Ｇミスマッチにより分離された３’−ヒドロキシルおよび５’−リン酸塩末端を識別するが、５’−Ａ−Ｃ、Ｔ−Ｃ、Ｃ−ＡまたはＧ−Ａミスマッチは連結反応効率において非常にわずかな効果しかもたらさなかった（Tomkinson, A.E., et al., Biochemistry, 31:11762-71(1992)）。哺乳類ＤＮＡリガーゼＩおよびIIIは、３’Ｃ−Ｔ、Ｇ−ＴおよびＴ−Ｇミスマッチの連結において異なる効率を示す（Husain, I., et al., J. Biol. Chem., 270:9638-90(1995)）。ワクシニアＤＮＡウイルスは、一つのヌクレオチド、二つのヌクレオチドギャップおよび３’−Ｇ−Ａ，Ａ−Ａ、Ｇ−Ｇ、またはＡ−Ｇ（プリン−プリン）ミスマッチに対して効率的に識別するが、５’−Ｃ−Ｔ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｔ、Ａ−Ｃ、Ｔ−Ｃ、Ｃ−Ｃ、Ｇ−Ｇ、Ｔ−ＧまたはＡ−Ｇミスマッチおよび３’−Ｃ−Ａ、Ｃ−Ｔ、Ｇ−Ｔ、Ｔ−Ｔ、またはＴ−Ｇミスマッチ（Shuman, S., Biochem., 34:16138-47(1995)）を容易に閉じる。
【００１９】
熱安定性Thermus thermophilusＤＮＡリガーゼ（Ｔth ＤＮＡリガーゼ）は、クローン化され、感染性因子および遺伝子病の検出のためにリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）およびリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）に用いられている（Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-93(1991); Day, D., et al., Genomics, 29:152-62(1995); Eggerding, F.A., PCR Methods and Applications, 4:337-45(1995); Eggerding, F.A., et al., Human Mutation, 5:153-65(1995); Feero, W., et al., Neurology, 43:668-73(1993); Frenkel, L.M., et al., J. Clin. Micro., 33(2):342-47(1995); Grossman, P.D., et al., Nucleic Acids Res., 22:4527-34(1994); Iovannisci, D.M., et al., Mol. Cell. Probes, 7:35-43(1993); Prchal, J.T., et al., Blood, 81:269-71(1993); Ruis-Opaz, N., et al., Hypertension, 24:260-70(1994); Wiedmann, M., et al., Appl. Environ. Microbiol., 58:3443-47(1992); wiedmann, M., et al., Appl Environ Microbiol, 59(8):2743-5(1993); Winn-Deen, E., et al., Amer. J. Human Genetics, 53:1512(1993); Winn-Deen, E.S., et al., Clin. Chem., 40:1092(1994);およびZebala, J., et al., ”Detection of Leber’s Hereditary Optic Neuropathy by nonradioactive-LCR. PCR Strategies,” (Innis, M.A., Gelfand, D.H., and Sninsky, J.J., Eds.), Academic Press, San Diego(1996)）。過剰の正常ＤＮＡにおける腫瘍関連変異の同定など、これらおよび将来の疾病の検出アッセイの成功は、Ｔth ＤＮＡリガーゼの優れた適合性にかかっている。
【００２０】
癌検出
米国における死亡原因の第２位として、年間約６００,０００人が癌で死亡し、癌をすべての医療診断において最も不安なもののひとつとしている。男性および女性における進行性癌の発生に対する生命の危険性は各々、５０％および３３％である。１９９５年には、１２０万以上の新しい癌患者が米国において診断される見込みである。１９９４年の癌に対する健康管理費は約１０４０億ドルであった。しかしながら、癌が家族および社会に与えたすべての影響は、診断や治療に費やされた金額のみでは測れない。多くの人々が彼らの最も生産的な年齢で癌にかかっている。１９８５年における早死の１８％は癌が原因であり、１９９１年に９,２００人以上の米国女性が乳癌により５５歳前に死亡している。推定では、１９９５年には結腸直腸癌および乳癌について、それぞれ１４０,０００および１８３,０００近くの新しい診断がなされると予測されている。
【００２１】
現在、癌の診断は、病理学者による腫瘍組織の組織学的評価に基づいている。癌の診断の後、腫瘍の範囲または進展度により治療が最初に決定される。腫瘍進展度は臨床的、放射線学的、検査室的な方法により決められる。腫瘍の進展度診断のための標準分類システムは、癌患者の臨床情報を明確に伝えるために開発されてきた。進展度診断は重要な予後情報を提供し、新しい治療戦略を試みることを可能にする臨床試験の基礎を形づくる。初期腫瘍のサイズ、癌が発見される局部リンパ節の数および身体の他の部分への転移の存在または不存在で腫瘍を分類する進展度診断システムが開発された（ＴＮＭ進展度診断システム）。リンパ節に何の影響もなく、広い転移のない小さな癌は初期段階の癌であると考えられ、外科的切除によりしばしば治癒する。普通の予後測定は、５年生存率、一定の進展度における癌の診断後５年の生存患者の割合である。多くの癌の５年生存率が過去数十年の間に高まってきたが、５年以内またはその後においていくつかの初期段階の癌が再発するので、研究者は組織学的段階、細胞計算結果、ホルモン受容体状態および多くのほかの腫瘍マーカーを含む他の付加的予後マーカーの調査をしている。さらに最近、研究者は予後マーカーとして癌における分子的変質を使用する方法を探っている。
【００２２】
点変異および上記の小さな欠失など、癌における遺伝的変質が悪性細胞のマーカーとして作用し得る。
【００２３】
少数核酸配列の検出
ＰＣＲを用いて癌を検出するために多くの方法が開示されている。Sidransky, et al., ”Identification of ras Oncogene Mutations in the Stool of Patients with Curable Colorectal Tumors,” Science 256:102-05(1992)は、Ｋ−ras変異の同定により結腸癌を検出する。これは、全ＤＮＡのＰＣＲ増幅、バクテリオファージベクターへのクローニング、バクテリオファージの平板培養、いくつかの異なるＫ−ras変異に特異的な個々のオリゴヌクレオチドによる反復プローブおよび一定のプレート上の陽性プラークの割合の計算を含む。これは、便のサンプル中の野生型ＤＮＡに対する変異の割合を測定する技術的に難しい方法で、完了するのに３日かかる。Brennan, et al., ”Molecular Assessment of Histopathological Staging in Squamous-Cell Carcinoma of the Head and Neck,” N. Engl. J. Med. 332(7):429-35(1995)は、配列決定によりｐ５３変異を発見した。この特異的変異は、全ＤＮＡのＰＣＲ増幅、バクテリオファージベクターへのクローニング、バクテリオファージの平板培養、配列決定によって発見された変異に特異的な個々のオリゴヌクレオチドによるプローブおよび一定のプレート上の陽性プラーク割合の計算を用いて、周縁組織についてプローブされる。Berthelemy, et al., ”Brief Communications -- Identification of K-ras Mutations in Pancreatic Juice in the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer,” Ann. Int. Med. 123(3):188-91(1995)は、膵臓分泌物におけるＫ−ras変異を検出するためにＰＣＲ／制限酵素方法を使用する。しかし、この技法は不完全であって、変異を定量しない。同様に、Tada, et al., ”Detection of ras Gene Mutations in Pancreatic Juice and Peripheral Blood of Patients with Pancreatic Adenocarcinoma,” Cancer Res. 53:2472-74(1993)およびTada, et al., ”Clinical Application of ras Gene Mutation for Diagnosis of Pancreatic Adenocarcinoma,” Gastroent. 100:233-38(1991)は、膵臓癌の検出のためにこのようなサンプルを対立遺伝子特異的ＰＣＲにかける。これには、正常鋳型からのポリメラーゼ伸張により偽のポジティブを提供し、プライマーニ量体と識別するために産物の電気泳動分解を要し、重複プライマーの阻害により近接クラスター部位の多重化を不可能とし、小さな反復配列における単一塩基または小さな挿入および欠失の検出を不可能とし、および正常ＤＮＡの高いバックグラウンドにおける変異ＤＮＡの定量について理想的には適切でないというデメリットがある。Hayashi, et al., ”Genetic Detection Identifies Occult Lymph Node Metastases Undetectable by the Histopathological Method,” Cancer Res. 54:3853-56(1994)は、結腸癌における隠れたリンパ節転移を同定するためにＫ−rasまたはｐ５３変異を発見する対立遺伝子特異的ＰＣＲ技法を使用する。千の正常細胞において一つの腫瘍細胞という感受性が要求される；しかしながら、量の値を得るには、困難なクローニング、平板培養およびプローブ工程を要する。Mitsudomi, et al., ”Mutations of ras Genes Distinguish a Subset of Non-small-cell Lung Cencer Cell Lines from Small-cell Lung Cancer Cell Lines,” Oncogene 6:1353-62(1991)において、遺伝子ＤＮＡのＰＣＲ増幅中のミスマッチプライマーからつくられた制限フラグメント長・多型性を用いて、ヒト肺癌細胞系はＫ−、Ｈ−およびＮ−ｒａｓの点変異について検査される。このようなプライマー媒介ＲＦＬＰのデメリットには、正常ＤＮＡから変異を識別するために電気泳動分解を必要とし、制限部位に転換される部位への適用が限られ、変異の特性���決定するために追加分析を要し、および正常ＤＮＡの高いバックグラウンドにおける変異ＤＮＡ定量が難しいということがある。さらに、これらの方法は労力を要し、不正確になりがちである。
【００２４】
組み合せたＰＣＲ／連結反応プロセスは、多数ヌクレオチド配列の存在下における少数ヌクレオチド配列の検出に使用されている。ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは、Frenkel, ”Specific, Sensitive, and Rapid Assay for Human Immunodeficiency Virus Type 1 pol Mutations Associated with Resistance to Zidovudine and Didanosive,” J. Clin. Microbiol. 33(2):342-47(1995)においてＨＩＶ変異の検出に使用される。しかしながら、このアッセイは多重検出に使用できない。参照、Abravaya, et al., ”Detection of Point Mutations With a Modified Ligase Chain (Gap-LCR),” Nucl. Adics. Res. 23(4):675-82(1995)およびBalles, et al., ”Facilitated Isolation of Rare Recombinants by Ligase Chain Reaction: Selection for Intragenic Crossover Events in the Drosophila optomotor-blind Gene,” Molec. Gen. Genet. 245:734-40(1994)。
【００２５】
結腸直腸病変は、ＰＣＲ増幅およびその次のオリゴヌクレオチド連結反応アッセイを含む方法により検出される。参照、Jen, et al., ”Molecular Determinants of Dysplasia in Colorectal Lesions,” Cancer Res. 54:5523-26(1994)およびRedston, et al., ”Common Occurrence of APC and K-ras Gene Mutations in the Spectrum of Colitis-Associated Neoplasias,” Gastroenter. 108:383-92(1995)。この方法は、Powell, et al., ”Molecular Diagnosis of Familial Adenomatous Polyposis,” N. Engl. J. Med. 329(27):1982-87(1993)からの進歩として開発された。これらの技法は実施が制限され、困難な傾向がある。
【００２６】
少数ヌクレオチド配列を検出するために、他の方法が開発されている。Lu, et al., ”Quanititative Aspects of the Mutant Analysis by PCR and Restriction Enzyme Cleavage (MAPREC)” PCR Methods and Appl. 3:176-80(1993)は、ＰＣＲおよび制限酵素分解によりウイルス復帰突然変異株を検出する。ＭＡＰＲＥＣのデメリットには、正常ＤＮＡから変異を識別するために電気泳動分解を要し、制限部位に転換される部位への適用が制限され、変異の特性を決定するために追加分析を要し、および正常ＤＮＡの高いバックグラウンドにおける変異ＤＮＡの定量が困難であるということがある。Kuppuswamy, et al., ”Single Nucleotide Primer Extension to Detect Genetic Diseases: Experimental Application to Hemophilia G (Factor IX) and Cystic Fibrosis Genes,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1143-47(1991)において、ＰＣＲプロセスは、各フラグメントについて２つの反応混合物を用いて実施され、各フラグメントは正常コード配列に対応するプライマーおよび標識ヌクレオチドを含有する一つの混合物により増幅され、一方、もう一つの混合物は変異配列に対応するプライマーおよび標識ヌクレオチドを含有する。このようなミニ配列決定（例えば、ＳＮｕＰｅ）のデメリットは、変異が既知でなければならず、重複プライマーの阻害により近接クラスター部位の多重化が不可能で、小さな反復配列における単一塩基または小さな挿入および欠失の検出が不可能であり、および４つの分離反応を必要とすることである。変異原的に分割するＰＣＲプロセスが、異なる長さの対立遺伝子特異的プライマーを用いて正常および変異対立遺伝子を識別することについて、Rust, et al., ”Mutagenically Separated PCR (MS-PCR): a Highly Specific One Step Procedure for easy Mutation Detection” Nucl. Acids. Res. 21(16):3623-29(1993)に開示されている。ＭＳ−ＰＣＲのデメリットには、ポリメラーゼ伸長非正常鋳型により偽のポジティブを提供する可能性があり、プライマーニ量体から識別するために産物の電気泳動分解を要し、重複プライマーの阻害により近接クラスター部位の多重化が不可能であり、小さな反復配列における単一塩基または小さな挿入および欠失の検出が不可能であり、正常ＤＮＡの高いバックグラウンドにおける変異ＤＮＡの定量に理想的には適切でないということがある。Suzuki, et al., ”Detection of ras Gene Mutation in Human Lung Cancers by Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products,” Oncogene 5:1037-43(1990)において、ＰＣＲ相に続き増幅ＤＮＡフラグメントの一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（”ＳＳＣＰ”）を含む相を有するプロセスで、検出される。ＳＳＣＰのデメリットには、正常立体配座異性体から変異立体配座異性体を識別するために電気泳動分解を要し、可能性のある変異の３０％が検出できず、変異の特性を決定するのに追加分析を要し、および不活性多型性から変異を識別できないということがある。
【００２７】
多数配列の存在下において少数ヌクレオチド配列を検出する技法は存在するが、その方法は改善される必要がある。特に少数ヌクレオチド配列を定量できる技法の開発が望ましい。
【発明の開示】
【００２８】
発明の概要
本発明の１つの実施態様は、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列をサンプル中で検出する方法に関し、少数標的ヌクレオチド配列はサンプル中に多数配列よりも少量で存在する。
【００２９】
本方法に関する使用のために、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備する。各セットは、（ａ）標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドを含む。特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的多数配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結を阻止するミスマッチを有する。
【００３０】
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物を形成する。リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかける。変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離される。ハイブリダイゼーション処理は、オリゴヌクレオチドプローブセットを隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを含む。各セット由来のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブは互いに連結して、一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。各セットについての連結産物配列は、連結検出反応混合物中の他の核酸と識別され得る。オリゴヌクレオチドプローブセットは、夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中の隣接配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結しない。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブは、連結しないとき、変性処理の際に個々に分離する。
【００３１】
リガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけると、連結産物配列が検出される。結果として、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在が同定され得る。
【００３２】
本発明の第２の実施態様も複数の標的ヌクレオチド配列において１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している１以上の複数の配列を同定する方法に関する。上記したように、サンプルおよび１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットをリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物を形成する。リガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけて、連結産物配列の存在を検出する。しかし、ここでは熱安定性変異リガーゼが使用される。このリガーゼは、連結部で標的ヌクレオチド配列と３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結部においてミスマッチを有する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度対する、連結部で標的ヌクレオチド配列と３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間で連結部において完全マッチを有する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度として定義される忠実性比率（適合性比率）によって特徴付けられる。熱安定性変異リガーゼの忠実性比率（適合性比率）は、野生型リガーゼの忠実性比率（適合性比率）より高い。
【００３３】
本発明の第３の実施態様も複数の標的ヌクレオチド配列において１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している１以上の複数の配列を同定する方法に関する。上記したように、サンプルおよび１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットをリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物を形成する。リガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけて、連結産物配列の存在を検出する。しかし、ここでは、オリゴヌクレオチドプローブセットに関して、連結が起きる連結部で３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブが修飾される。この修飾は、標的ヌクレオチド配列と連結部で３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結部においてミスマッチを有する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度を、標的ヌクレオチド配列と連結部で３’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結部において完全マッチを有する標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結するための一定の初速度に比べて、識別できるように変化せしめる。修飾オリゴヌクレオチドプローブでの連結は、シグナル対ノイズ比率、少数および多数の標的ヌクレオチド配列についての連結産物配列量の、多数標的配列単独の同量から産生される連結反応産物配列の量に対する比率を有する。これは、修飾のないオリゴヌクレオチドプレーブを用いた連結についてのシグナル対ノイズ比率よりも大きい。
【００３４】
癌関連変異および少数標的ヌクレオチド配列の存在についての検出方法の開発において、早期に癌を診断し得る方法が必要である。それには、臨床サンプルから同定され、正確に定量される少なくとも１つのクローナル変異を要する。このタイブの理想的な試験は、多重遺伝子における数百もの共通変異を迅速に選別できるものである。正常のＤＮＡの存在における１％以下の変異ＤＮＡが正確に同定され、多重の体裁で密接に群がる多くの変異が正しく識別されねばならない。一般的に点変異について、および特定的に小さい反復配列において、小さい挿入および欠失が正確に同定されねばならない。偽のポジティブ結果に対する内部コントロールおよび高度な情報量の自動化についての適用がなければならない。本発明のＬＤＲ方法はこれらのすべての目的にかなうものである。
【００３５】
図面の簡単な説明
図１は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのＰＣＲ／ＬＣＲプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがＬＤＲ相から排除され、少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し（to avoid overwhelming signal from minority mutant target）、ＬＤＲ相にマーカーは加えられていない。
図２は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのＰＣＲ／ＬＣＲプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがＬＤＲ相から排除され、少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し（to avoid overwhelming signal from minority mutant target）、ＬＤＲ相にマーカーは加えられている。
図３は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのＰＣＲ／ＬＣＲプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが低レベルで、ＬＤＲ相において使用され、および／または修飾されて、多数標的に対応する少ない連結反応産物を製出する。これは少数変異標的からのシグナルが圧倒されるのを防ぐ。
図４は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図１のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
図５は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図２のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
【００３６】
図６は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図３のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
図７は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図１のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
図８は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図２のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
図９は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図３のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
図１０は、部位特異的変異生成を用いて、アミノ酸残基２９４でのThemus thermophilus ＤＮＡリガーゼ変異体の構築に関する。
【００３７】
図１１は、Ｔｈリガーゼのポジティブ活性部位領域の部位指向変異生成を示す。水平棒は、Ｃ末端を示す矢印と共に、完全長のＴthＤＮＡリガーゼタンパク質を表わす。黒地斜線部は、Ｔth（すなわち、Themus thermophilus）ＤＮＡリガーゼとＥ.ｃｏｌｉリガーゼとの強い相同性を有する領域を表わし、白地斜線部は、相同性の小さい領域を表わす。Ｋ１１８、Ｄ１２０、Ｋ２９４、Ｒ３３７、Ｇ３３９、Ｃ４１２、Ｃ４１５、Ｃ４２８およびＣ４３３での部位指向変異生成により産生されたアミノ酸置換が示されている。既知のＮＡＤ＋依存リガーゼ中で同一であるアミノ酸残基に下線が引かれている。
図１２Ａ−Ｂは、図１１の変異リガーゼをつくるためのプライマーを表わす。
これらのプライマーは以下の配列番号を有する：プライマーaは、配列番号：1(JL501)、および配列番号：78 (JL505)として特定される;プライマーbは、配列番号：2 (JL503R)、配列番号：79 (JL507R)、配列番号：80 (JL537R)、配列番号：81 (JL535R)、配列番号：82 (JL525R)、配列番号：83 (JL527R)、配列番号：84 (JL529R)、配列番号：85 (JL531R)、および配列番号：86 (JL533R) として特定される;プライマーcは、配列番号：3 (JL502)、配列番号：87 (JL509)、配列番号：88 (JL506)、配列番号：89 (JL536)、配列番号：90 (JL534)、配列番号：91 (JL524)、配列番号：92 (JL526)、配列番号：93 (JL528)、配列番号：94 (JL530)、および配列番号：95 (JL532)として特定される;プライマーdは、配列番号：4 (JL504R)、配列番号：96 (JL508R)、および配列番号：97 (JL518R)として特定される;プライマーb1は、配列番号：5として特定される;プライマーc1は、配列番号：6として特定される;プライマーb2は、配列番号：8として特定される;およびプライマーc2は、配列番号：7として特定される。
【００３８】
図１３Ａ−Ｃは、連結反応アッセイのために用いられたオリゴヌクレオチドの模式的表示である。プローブ配列は、ヒト真核蛋白質合成開始因子eIF-4E(Rychlik, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:945-49(1987)、出典明示により本明細書の一部とする）から誘導された。このランダム真核ＤＮＡ配列は、部分的に精製された変異ＴthＤＮＡリガーゼ製造における細菌性ＤＮＡ汚染からの偽のシグナルを回避するために選別された。プローブの融点は、最も近似の熱力学的方法（Breslauer, K. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3746-3750(1986)、出典明示により本明細書の一部とする（ＯＬＩＧＯ4.0 program, National Biosciences Inc., Plymouth, ＭＮ)を用いて、推測した。図１３Ａおよび図１３Ｂは、例として鋳型鎖の一つＡＬｇを用いてのニックＤＮＡ二重らせんの形成を表わす。図１３Ａに示すように、４つの異なるニックＤＮＡ基質が、共通の蛍光標識オリゴヌクレオチド、ｃｏｍ５Ｆ（配列番号：9）および識別 oligo（ＲＰ５’Ａ（配列番号：10）、ＲＰ５’Ｃ（配列番号：11）、ＲＰ５’Ｇ（配列番号：12）、ＲＰ５’Ｔ（配列番号：13））の一つを鋳型鎖、ＡＬｇ（配列番号：14）にアニールすることによって形成される。図１３Ｂでは４つの異なるニックＤＮＡ基質が、共通の蛍光標識オリゴヌクレオチド、ｃｏｍ３Ｆ（配列番号：15）および識別 olego（ＬＰ３’Ａ（配列番号：16）、ＬＰ３’Ｃ（配列番号：17）、ＬＰ３’Ｇ（配列番号：18）、ＬＰ３’Ｔ（配列番号：19））の一つを鋳型鎖、ＡＬｇ（配列番号：14）にアニールすることによって形成される。マッチおよびミスマッチ塩基対の全１６組合せの完全セットが、鋳型鎖としてＡＬｇ（配列番号：14）、ＧＬｇ（配列番号20：）、ＴＬｇ（配列番号：21）およびＣＬｇ（配列番号：22）（図１３Ｃに示す）を用いて、形成される。これは下線を引いた塩基で相異している。共通蛍光標識プローブへの連結反応で形成された産物は、異なる長さの”Ａ”テイルの取りこみよって変性ポリアクリルアミドゲル上のサイズによって識別することができる。
図１４は、図１３のオリゴヌクレオチドをつくるために用いられたプローブの配列を表わす。
【００３９】
図１５Ａ−Ｅは、ニックの３’側でのＴthＤＮＡリガーゼによるニック再結合の忠実性（適合性）を表わす。図１５Ａに示すように、リガーゼ基質（ニックＤＮＡ二重らせん）は、鋳型鎖上で識別オリゴヌクレオチドＬＰ３’(Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）をリン酸化共通オリゴヌクレオチド（３’−蛍光標識、ｃｏｍ３Ｆ）でアニーリングすることにより形成される。識別オリゴヌクレオチドの３’側での識別塩基”Ｎ”および鋳型鎖における”ｎ”は、変化して、塩基対の全１６の可能性ある組合せを与える。”Ａｍ”は、識別オリゴヌクレオチドの５’末端での”Ａ”テイルを表わす。反応は、１ｍＭ ＮＡＤ＋、１２.５ｎＭ（５００fmole）のニックＤＮＡ二重らせん基質および０.１２５ｎＭ（５fmole）ＴthＤＮＡリガーゼを含有する混合物４０μｌ中、６５℃で行なわれた。アリコット（５μｌ）を０、２、４、６、８および２３時間後に採取し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。データはGenescan version 1.2 ソフトウェアーを用いて解析した。結果はDeltagraph Pro3 ソフトウェアーを用いてプロットした。図１５Ｂ−Ｅは、同じ識別オリゴによるが、異なる鋳型鎖を用いて得られた結果である。パネル３’−Ａ（図１５Ｂ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ａであった。Ａ−Ｔ（◆）、Ａ−Ｃ（△）、Ａ−Ａ（▽）およびＡ−Ｇ（○）は鋳型鎖として夫々、ＴＬｇ、ＣＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル３’−Ｇ（図１５Ｄ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ａであった。Ｇ−Ｃ（◆）、Ｇ−Ｔ（△）、Ｇ−Ａ（▽）およびＧ−Ｇ（○）は、鋳型鎖として夫々、ＣＬｇ、ＴＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル３’−Ｃ（図１５Ｃ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ａであった。Ｃ−Ｇ（◆）Ｃ−Ａ（△）、Ｃ−Ｔ（▽）およびＣ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々、ＧＬｇ、ＡＬｇ、ＴＬｇおよびＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル３’−Ｔ（図１５Ｅ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ｔであった。Ｔ−Ａ（◆）、Ｔ−Ｇ（△）、Ｔ−Ｔ（▽）およびＴ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々、ＡＬｇ、ＧＬｇ、ＴＬｇまたはＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。
【００４０】
図１６Ａ−Ｅは、ニックの５’側での熱安定性ＤＮＡリガーゼによるニック再結合の忠実性（適合性）を表わす。反応条件は、異なる識別および共通オリゴヌクレオチドを用いた以外は図１５と同じである。識別塩基はニックの５’側（リン酸化オリゴヌクレオチドＲＰ５’Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）にあり、共通オリゴヌクレオチドはニックの３’側にあって、ＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン、配列決定および変異検出に用いられた蛍光塗料）で５’−標識されていた。参照、図１６Ａ。パネル５’Ａ（図１６Ｂ）において、識別オリゴヌクレオチドはＰＲ５’Ａであり、Ａ−Ｔ（◆）、Ａ−Ｃ（△）、Ａ−Ａ（▽）およびＡ−Ｇ（○）は、鋳型鎖として夫々ＴＬｇ、ＣＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル５’−Ｇ（図１６Ｄ）において、識別オリゴヌクレオチドはＰＲ５’Ｇであり、Ｇ−Ｇ（◆）、Ｇ−Ｔ（△）、Ｇ−Ａ（▽）およびＧ−Ｇ（○）は、鋳型鎖として夫々ＣＬｇ、ＴＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル５’−Ｃ（図１６Ｃ）において、識別オリゴヌクレオチドはＲＰ５’Ｃであり、Ｃ−Ｇ（◆）、Ｃ−Ａ（△）、Ｃ−Ｔ（▽）およびＣ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々ＧＬｇ、ＡＬｇ、ＴＬｇおよびＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル５’−Ｔ（図１６Ｅ）において、識別オリゴヌクレオチドはＲＰ５’Ｔであり、Ｔ−Ａ（◆）、Ｔ−Ｇ（△）、Ｔ−Ｔ（▽）およびＴ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々ＡＬｇ、ＧＬｇ、ＴＬｇまたはＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。
【００４１】
図１７Ａ−Ｃは、ニックの３’側上の第３部位での塩基類似体およびミスマッチを含有するオリゴヌクレオチドプローブを示す図である。
【００４２】
図１８は、Thermus thermophilusリガーゼの忠実性（適合性）の改善に関する表である。プローブＬＰ３’Ｃ、ＬＰ３’ＴおよびＣｏｍ３Ｆの配列は図１４に示されている。他の識別プローブの配列は下記の通り。
SLP3'C:  5' TACGTCTGCGGTGTTGCGTC 3' (配列番号：23).  
SLP3'T:  5' CGTCTGCGGTGTTGCGTT  3' (配列番号：24).  
SLP3'ATC:  5' ATGCGTCTGCGGTGTTGCATC 3' (配列番号：25).  
SLP3'ATT:  5' GCGTCTGCGGTGTTGCATT 3' (配列番号：26).  
SLP3'QTC:  5' AAATGCGTCTGCGGTGTTGCQTC 3' (配列番号：27)
SLP3'QTT:  5' ATGCGTCTGCGGTGTTGCQTT  3' (配列番号：28)
識別オリゴヌクレオチドにおける塩基“Ｎ”はＣまたはＴのいずれかである。“Ｑ”はＱ塩基類似体を示す。Ｑ塩基類似体を含有する鋳型鎖を除き、試験した全基質についての鋳型鎖はＧＬｇであり、その配列を図１４に示す。Ｑ塩基類似体を含有する基質における鋳型鎖はＧＬｇ.ｍ３Ａであり、太字体で示された単一部位でＧＬｇと相違する。連結反応の初速度（fmol/min）は、分での時間を表わすＸ軸とfmolでの産物量を表わすＹ軸との直線グラフの勾配として計算した。ＴthＤＮＡリガーゼの連結反応忠実性は、完全マッチ連結反応の初速度のミスマッチ連結反応の初速度に対する割合と定義する。
図１７は、また、プライマーＳＬＰ３’ＴＴＣＣ(配列番号：29)、ＳＬＰ３’ＴＴＴ (配列番号：30)、Com 610-3’F (配列番号：31)、GLg.m3A (配列番号：32)、GLg.m3A.Rev (配列番号：33)、ALg.m3A (配列番号：34)、ALg.m3A.Rev (配列番号：35)、GLg. (配列番号：36)、GLg．Rev (配列番号：37)、ＳＬＰ３’GTC (配列番号：38)、ＳＬＰ３’GTT (配列番号：39)、GLg．m3T (配列番号：40)、およびGLg．m3T.Rev (配列番号：41)のための配列を示す。
【００４３】
図１９は、野性型またはＫ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼのいずれかによる正常ＤＮＡ過剰における単一塩基変異の定量的検出に用いられたプライマーを示す。ＬＤＲ反応は、２５fmoleの精製野性型または変異Ｋ２９４Ｒのいずれかの酵素の存在下に、１２.５ｎＭ（２５０fmole）のミスマッチ鋳型（ＧＬｇ.ｍ３ＡおよびＧＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｓ＝正常鋳型）および０−２.５ｎＭ（５０fmole）の完全マッチ鋳型（ＡＬｇ.ｍ３ＡおよびＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ＝癌鋳型）に関する。各反応は、２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ,pH７.６; １０ｍＭ ＭｇＣｌ2; １００ｍＭ ＫＣｌ; １０ｍＭ ＤＴＴ; １ｍＭ ＮＡＤ+; ２５ｎＭ(５００ fmole)の２つの短い検出プライマーおよび鋳型混合物を含有する２０μｌの混合物中で実施された。反応混合物をＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００（Perkin Elmer）中で１５秒、９４℃で加熱し、次いで野性型または変異ＴthＤＮＡリガーゼを加えた。さらに３０秒、９４℃で酵素と共にインキュベーションした後、２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
【００４４】
図２０Ａ−Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４Ｒ ＴthのＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰におけるＴ：ＧミスマッチについてのＬＤＲオリゴヌクレオチドプレーブ（図２０Ａ）および鋳型配列（図２０Ｂ）を示す。ＧＬｇ.ｍ３ＡおよびＧＬｇｍ３Ａ.ｒｅｖはミスマッチ鋳型（正常鋳型）を表わし、ＡＡＬｇ.ｍ３ＡおよびＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖは完全なマッチ鋳型（癌鋳型）を表わす。プライマーＳＬＰ３’ＴＴＴは、完全マッチ（癌）鋳型についての正常プライマーを表わし、ＳＬＰ３’ＴＴＣはミスマッチ（正常）鋳型についての正常プライマーを表わす。同様に、Ｔ：ＧミスマッチについてのＱ類似体での実験では、マッチ（癌）鋳型についての正常プライマーとしてＳＬＰ３’Ｑ２ＴＴ(配列番号：42)およびＳＬＰ３’Ｑ１８ＴＴ(配列番号：43)を用いる。図２０についての残りの配列は、図１７について示された配列番号を有する。
【００４５】
図２１Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰における単一塩基変異（Ｔ：Ｇミスマッチ）の定量検出を示す。０、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１fmol）０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）、１.２５ｎＭ（２５fmol）および２.５ｎＭ（５０fmol）の”癌”鋳型を１２.５ｎＭ（２５０fmol）の“正常”鋳型と併用したときに、ＬＤＲ産物が形成された。反応は、２５ｎＭ（５００fmol）の正規プライマー（ＳＬＰ３’ＴＴＴおよび Com 610 ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型またはＫ２９４Ｒ変異の酵素の存在下に行なわれた。この反応に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、連結反応部で”正常”鋳型上にＴ：Ｇミスマッチを、”癌”鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。ＬＤＲ反応は各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分の２０サイクルがなされた。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００ voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２１Ｂ）はグラフ（図２１Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００４６】
図２２Ａ−Ｂは、正常ＤＮＡにおける変異鋳型の種々の濃度を有するＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を示す。単一塩基変異鋳型（“癌”）を１２.５ｎＭ（２５０fmol）の“正常”鋳型に希釈し、０.１２５ｎＭ（２５fmol）の野性型または変異Ｋ２９４Ｒ Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いて解析した。この反応に用いたオリゴヌクレオチドプローブは、連結反応部で”正常”鋳型上にＴ：Ｇミスマッチを、”正常”鋳型上にＴ：Ａマッチをつくった。シグナル対ノイズ比率は、”正常”鋳型（１２.５ｎＭ＝２５０fmol鋳型）の存在下で”癌”鋳型で形成された産物量の、正常鋳型単独での同量により形成された産物量に対する割合と定義される。表（図２２Ｂ）はグラフ（図２２Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００４７】
図２３Ａ−Ｂは、０、０.００５ｎＭ（０.１fmol）、０.０１２５ｎＭ（０.２５fmol）、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１.０fmol）、０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）および０.５ｎＭ（１０fmol）の正常鋳型（Ｇｌｇ.ｍ３Ａ and ＧＬｇ.ｍ３.Arev）を２５ｎＭ（５００fmol）の正規プライマー（ＳＬＰ３’ＴＴＣおよびＣｏｍ６１０ ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型または変異の酵素と混合したときに形成したＬＤＲ産物の量を示す。この反応に用いたプライマーは連結反応部で”正常”鋳型上にＣ：Ｇマッチをつくる。ＬＤＲ反応は各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分の２０サイクルがなされた。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００ voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２３Ｂ）はグラフ（図２３Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターを Deltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００４８】
図２４は、リガーゼの忠実性（適合性）を検定するために用いたプライマーを含有するヌクレオチド類似体を示す。典型的なＬＤＲアッセイにおける野性型および変異ＴthのＤＮＡリガーゼの忠実性（適合性）を検定するために、４つの異なる条件を用いた。各反応は、２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ、pH７.６；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＤＴＴ；１ｍＭ ＮＡＤ＋；２５ｎＭ（５００fmol）の２つの短い検出プライマーおよび１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型単独、または正常鋳型に併せて１２５ｎＭ（２.５fmol）および０.５ｎＭ（１０fmol）の癌鋳型（比率、夫々１：１００および１：２５）を含有する混合物２０μｌ中で行った。この反応において用いたオリゴヌクレオチドプローブは、連結反応部で”正常”鋳型上にＴ：Ｇミスマッチを、”癌”鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。さらに、オリゴヌクレオチドプローブＳＬＰ３’ＱＴＴは、３’末端から３番目の位置にＱ２：ＡまたはＱ１８：Ｔの対をつくる。この反応混合物は、９４℃で１５秒、Gene Amp 9600 テルモサイクラー（Perkin Elmer）中て加熱し、２５fmolの野性型および変異ＴthのＤＮＡリガーゼを加えた。さらに３０秒、９４℃で酵素と共にインキュベーションした後、２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
【００４９】
図２５Ａ−Ｄは、本発明のＰＤＲ／ＬＤＲプロセスのＬＤＲ相のためのヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチドプローブの種々の形を示す。図２５Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ中でヌクレオチドアナログＱを有するプローブは、それぞれ、指定された配列番号：44、45、46、および47である。これらの図のそれぞれにおいて、標的ＤＮＡ配列は同じであり、指定された配列番号：48である。
【００５０】
図２６は、野性型またはＫ２９４のいずれかのＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰における単一塩基変異（Ｃ：Ａミスマッチ）の定量的検出に用いられたプライマーを示す。ＬＤＲ反応は、２５fmolの精製野性型酵素または変異酵素Ｋ２９４Ｒの存在下に、１２.５ｎＭ（２５０fmole）のミスマッチ鋳型（ＧＬｇ.ｍ３Ａおよび ＧＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｓ＝正常鋳型）および０−２.５ｎＭ（５０fmole）の完全マッチ鋳型（ＡＬｇ.ｍ３ＡおよびＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ＝癌鋳型）に関する。各反応は、２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ,pH７.６; １０ｍＭ ＭｇＣｌ2; １００ｍＭ ＫＣｌ; １０ｍＭ ＤＴＴ; １ｍＭ ＮＡＤ+; ２５ｎＭ(５００ fmol)の２つの短い検出プライマーおよび鋳型混合物を含有する２０μｌの混合物中で実施された。この反応で用いたプローブは、連結反応部で正常鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、癌鋳型上にＣ：Ｇマッチをつくる。反応混合物をＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００（Perkin Elmer）中で１５秒、９４℃で加熱し、次いで野性型または変異ＴthＤＮＡリガーゼを加えた。さらに３０秒、９４℃で酵素と共にインキュベーションした後、２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００ｖｏｌｔで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
【００５１】
図２７Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰における単一塩基変異（Ｃ：Ａミスマッチ）の定量検出を示す。０、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１fmol）０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）、１.２５ｎＭ（２５fmol）および２.５ｎＭ（５０fmol）の”癌”鋳型（すなわちＧｌｇ.ｍ３Ａ／Ｇｌｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）を１２.５ｎＭ（２５０fmol）の”正常”鋳型（すなわちＡＬｇ.ｍ３Ａ／ＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）と併用したときに、ＬＤＲ産物が形成された。反応は、２５ｎＭ（５００fmol）の正規オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＬＰ３’ＴＴＴおよび Com 610 ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型またはＫ２９４Ｒ変異の酵素の存在下に行なわれた。この反応に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、連結反応部で”正常”鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、”癌”鋳型上にＣ：Ｇマッチをつくる。ＬＤＲ反応は各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分の２０サイクルがなされた。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２６Ｂ）はグラフ（図２６Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００５２】
図２８Ａ−Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼによる０.１２５ｎＭ（２５fmol）での１２.５ｎＭ（２５０fmol）の”正常”鋳型と併用したときの種々の濃度の単一変異鋳型（”癌”）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を示す。シグナル対ノイズ比率は、１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型の存在下に種々の濃度の癌鋳型で形成された産物量と１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型単独で形成された産物の量との割合である。この反応に用いられたオリゴヌクレオチドプローブ（ＳＬｐ３’ＴＴＣおよびＣｏｍ６１０ ３’Ｆ）は、連結反応部で”正常”鋳型（ＡＬｇ.ｍ３Ａ／ＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）上にＣ：Ａミスマッチを、および”癌”鋳型（ＧＬｇ.ｍ３Ａ／ＧＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）上にＣ：Ｇマッチをつくる。表（図２８Ｂ）はグラフ（図２８Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００５３】
図２９Ａ−Ｂは、０、０.００５ｎＭ（０.１fmol）、０.０１２５ｎＭ（０.２５fmol）、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１.０fmol）、０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）および０.５ｎＭ（１０fmol）の正常鋳型（すなわち、ＡＬｇ.ｍ３Ａ／ＡＬｇ.ｍ３.Arev）単独を２５ｎＭ（５００fmol）の正規プライマー（ＳＬＰ３’ＴＴＣおよびＣｏｍ６１０ ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型または変異酵素と混合したときに形成したＬＤＲ産物の量を示す。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００volt で電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２９Ｂ）はグラフ（図２９Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は正常鋳型の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００５４】
図３０Ａ−Ｃは、Ｋ−ｒａｓのコドン１２、１３および６１における変異についてのＰＣＲ／ＬＤＣ検出を表わす。上部の図（図３０Ａ）は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含有する染色体ＤＮＡの模式図である。エクソンは斜線部であり、コドン１２、１３および６１位置が示される。これらの３コドンを両側からはさむＫ−ｒａｓＤＮＡを選択的に増幅するために、エクソン特異的プライマーを用いた。中段（図３０Ｂ）および下部（図３０Ｃ）の図は、コドン１２、１３および６１におけるすべての可能なアミノ酸変化についてのＬＤＲ検出のためのプライマー設計を表わす模式図である。例えば、コドン１２（ＧＧＴ）は、ＧＡＴ、ＧＣＴまたはＧＴＴに変異をおこす。対立遺伝子特異的ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは３’末端に識別塩基を、５’末端に蛍光標識を含む。共通オリゴヌクレオチドは５’末端リン酸化されて、３’末端にポリ−Ａテイルおよびブロック基を含有する。種々の変異がポリアクリルアミドゲル上で産物を分離することにより識別される。コドン１２で変異を検出するために用いられたＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、コドン１３で変異を検出するために用いられたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを阻止し得る。これらのプローブが他のＬＤＲプローブの存在下で変異シグナルを正しく同定し得るかどうかを実験的に決定する必要がある。
図３１Ａ−Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰下の典型的ＬＤＲ反応におけるコドン１２、１３および６１での種々の変異を検出するために使用したＫ−ｒａｓＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの名前および配列を示している。図３１Ａ−Ｂは、以下のプライマーのための配列を示す：Fam-K-ras c12.2D (配列番号：49)、Tet-K-ras c12.2A (配列番号：50)、Fam-K-ras c12.2V (配列番号：51)、K-ras c12 Com-2 (配列番号：52)、Tet-K-ras c12.1S (配列番号：53)、Fam-K-ras c12.1R (配列番号：54)、Tet-K-ras c12.1C (配列番号：55)、K-ras c12 Com-1 (配列番号：56)、Fam-K-ras c13.4D (配列番号：57)、Tet-K-ras c13.4A (配列番号：58)、Fam-K-ras c13.4V (配列番号：59)、K-ras c13 Com-4 (配列番号：60)、Tet-K-ras c13.3S (配列番号：61)、Fam-K-ras c13.3R (配列番号：62)、Tet-K-ras c13.3C (配列番号：63)、K-ras c13 Com-3 (配列番号：64)、Tet-K-ras c61.7HT (配列番号：65)、Fam-K-ras c61.7HC (配列番号：66)、K-ras Com-7 (配列番号：67)、Tet-K-ras c61.6R (配列番号：68)、Fam-K-ras c61.6P (配列番号：69)、Tet-K-ras c61.6P (配列番号：70)、K-ras Com-6 (配列番号：71)、Fam-K-ras c61.5K (配列番号：72)、Tet-K-ras c61.5E (配列番号：73)、およびK-ras Com-5 (配列番号：74)。
【００５５】
図３２および３３Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子（Ｇ１２Ｄ）のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ａｓｐ変異（Ｃ：Ａミスマッチ）の定量的検出を示す。図３２でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３２で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋｒａｓ配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーンは、夫々５nM（１００fmol）、２nM（４０fmol）、０.８nM（２０fmol）、０.４nM（８fmol）、０.２nM（４fmol）、０.１nM（２.０fmol）、０.０５nM（１fmol）および０.０２５nM（０.５fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の１つの識別オリゴヌクレオチドプローブ（Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄおよび共通プライマーＫ−ras ｃ１２Ｃom−２）および５nM（１００fmol）の野性型またＫ２９４Ｒ変異の酵素の存在下に実施された。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ａｓｐ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、Ｋ−ras鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３３Ｂ）はグラフ（図３３Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｄ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００５６】
図３４Ａ−Ｂは、５nM（１００fmol）の野性型または変異Ｋ２９４ＲのＴth ＤＮＡリガーゼを用いて、１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras鋳型と併用した単一塩基変異（Ｇ１２Ｄ）を含有する種々の濃度のＫ−ras遺伝子（０.０２５mM〔０.５fmol〕から５nM〔１００fmol〕）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を表す。この反応で用いたプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、Ｇ１２Ｄ鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。シグナル対ノイズ比率は野性型鋳型の存在（１００nMに２０００fmol鋳型）におけるＧ１２Ｄで形成された産物の量の、野性型鋳型単独の同量で形成された産物量に対する比率であると定義される。表（図３４Ｂ）はグラフ（図３４Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｄの種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００５７】
図３５および３６Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４のＴth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子（Ｇ１２Ｖ）のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異（Ｃ：Ｔミスマッチ）の定量的検出を示す。図３５でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３５で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋｒａｓ配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーン（図３５）は、夫々０.１nM（２.０fmol）、０.２nM（４fmol）、０.４nM（８fmol）、０.８nM（２０fmol）、２nM（４０fmol）、４nM（８０fmol）、５nM（１００fmol）および２０nM（２００fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の６識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ）、７５nM（１５００fmol）の２共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−２およびＫ−ras ｃ１２Ｃom−１）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４変異の酵素の存在下に行われた。Ｔetはテトラ塩化−６−カルボキシフルオロレセイン；配列決定／変異検出に用いられた蛍光染料であり、Ｃomは３’アミノ酒色Ｃ３ＣＰＧカラムを用いるオリゴヌクレオチドプローブである。このカラムは、標的オリゴヌクレオチドの３’末端に対する最初のアミンを産生する。これらの３’アミノ・修飾体の最初の使用は、診断プローブとしての次の標識のためであり、また３’エクソヌクレアーゼ活性に抵抗性のオリゴヌクレオチドを産生するためである。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２中のすべての６単塩基変異の存在を検出し得る。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ変異Ｋ−ras鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３６Ｂ）はグラフ（図３６Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｖ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００５８】
図３７Ａ−Ｂは、５nM（１００fmol）の野性型または変異Ｋ２９４ＲのＴth ＤＮＡリガーゼを用いて、１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras鋳型と併用した単一塩基変異（Ｇ１２Ｖ）を含有する種々の濃度のＫ−ras遺伝子（０.１nM〔０.２fmol〕から１０nM〔２００fmol〕）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を表す。この反応で用いたＧ１２Ｖ特異的プローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇ１２Ｖ鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。この多重反応における最も大きいバックグランドノイズは、Ｇ：Ｔミスマッチを表すＱ６１Ｒを検出するように設計されたプローブからである。これはＧ１２Ｄ、すなわちＣ：Ａミスマッチを表すように設計されたプライマーよりも、１０倍高い。他のアッセイと同様に、この多重アッセイにおけるシグナル対ノイズ比率は、野性型鋳型の存在においてＧ１２Ｖ鋳型（１００mM＝２０００fmol鋳型）で形成された産物量の、野性型鋳型単独（Ｃ：Ａミスマッチを提示する）の同量で形成されたＧ１２Ｄ ＬＤＲ産物量に対する比率であると定義される。表（図３７Ｂ）はグラフ（図３７Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００ｎＭ（２０００fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００５９】
図３８および３９Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異（Ｃ：Ｔミスマッチ）の定量的検出を示す。図３８でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３８で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋ−ras配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーンは、夫々０.１nM（２.０fmol）、０.２nM（４fmol）、０.４nM（８fmol）、０.８nM（１０fmol）、２nM（２０fmol）、４nM（４０fmol）、５nM（１００fmol）および２０nM（２００fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の１９識別プライマー（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プライマー（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異酵素の存在下に行われた。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２中のすべての６単塩基変異の存在を検出し得る。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型Ｋ−ras鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ変異Ｋ−ras鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３９Ｂ）はグラフ（図３９Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数��のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｖ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００６０】
図４０Ａ−Ｂは、５nM（１００fmol）の野性型または変異Ｋ２９４ＲのＴth ＤＮＡリガーゼを用いて、１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras鋳型と併用した単一塩基変異（Ｇ１２Ｖ）を含有する種々の濃度のＫ−ras遺伝子（０.１nM〔２fmol〕から１０nM〔２００fmol〕）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を表す。この反応で用いたＧ１２Ｖ特異的プローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、Ｇ１２Ｄ鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。この多重反応における最も大きいバックグランドノイズは、Ｇ：Ｔミスマッチを表すＱ６１Ｒを検出するように設計されたプローブからである。これはＧ１２Ｄ、すなわちＣ：Ａミスマッチを表すように設計されたプライマーよりも、１０倍高い。他のアッセイと同様に、この多重アッセイにおけるシグナル対ノイズ比率は、野性型鋳型の存在においてＧ１２Ｖ鋳型（１００mM＝２０００fmol鋳型）で形成された産物量の、野性型鋳型単独（Ｃ：Ａミスマッチを提示する）の同量で形成されたＧ１２Ｄ ＬＤＲ産物量に対する比率であると定義される。表（図４０Ｂ）はグラフ（図４０Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００ｎＭ（２０００fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【００６１】
図４１−４２は、Ｋ２９４変異Ｔth ＤＮＡリガーゼによるＫ−ras遺伝子における変異の定量的検出である。ゲル＃ｍｋ９５０５１３における第１レーンは野性型Ｋ−ras ＤＮＡを用いたネガティブ・コントロールである。第２レーン（図４１）は変異Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ Ｋ−ras ＤＮＡを含有するポジティブ・コントロールである。次の２０レーン（図４１）は、異なる変異Ｋ−ras ＤＮＡを含有する２０サンプルについてのＬＤＲ反応のブラインド試験を表す。反応は、２５nM（５００fmol）の１９識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異の酵素の存在下に行われた。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２、１３および６１中のすべて１７変異の存在を検出し得る。微切開組織をＰＣＲチューブに移し、キシレンに１０分間さらし、９５％エタノールで３回洗い、次いで乾燥した。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
データを解析し、その結果を図４２に示し（コールド変異）、ジデオキシ配列決定の結果（期待変異）と比較した。
【００６２】
図４３は、図４１−４２について上記したＰＣＲ／ＬＤＲプロセスからの１０の不一致サンプルを比較した表である。
【００６３】
図４４および４５Ａ−Ｂは、種々の量の野性型プローブを用いたとき、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる種々の量のＫ−ras正常鋳型の定量的検出を示す。ＬＤＲ量は、２５nM（５００fmol）、５０nM（１０００fmol）および１００nM（２０００fmol）の”正常”鋳型を、０.５nM（１００fmol）、２.５nM（５０fmol）および５nM（１００fmol）の野性型識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２ ＷtＧ）および共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２）に、２５nM（５００fmol）の１９識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異の酵素の存在下に、形成せしめた。２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
Ｘ軸は正常鋳型の種々の量を表し、Ｙ軸は生じたＬＤＲ産物の量を表す。（■、△、□）は、夫々０.５nM（１０fmol)、２.５nM（５０fmol)および５nM（１００fmol)の、野性型酵素と共に用いた野性型プローブを表し、（●、◆、○）は、夫々０.５nM（１０fmol)、２.５nM（５０fmol)および５nM（１００fmol)の、Ｋ２９４Ｒ変異酵素と共に用いた野性型プローブを表す。
【００６４】
発明の詳細な説明
本発明の１つの実施態様は、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により１以上の多数標的ヌクレオチド配列と相違している１以上の少数標的ヌクレオチド配列をサンプル中で検出する方法に関し、少数標的ヌクレオチド配列はサンプル中に多数配列よりも少量で存在する。
【００６５】
本方法に関する使用のために、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備する。各セットは、（ａ）標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドおよび（ｂ）標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドを含む。特定セット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応する標的多数配列上で互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒に連結するのに適するが、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに該連結を阻止するミスマッチを有する。
【００６６】
サンプル、１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物を形成する。リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかける。変性処理において、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離される。ハイブリダイゼーション処理は、オリゴヌクレオチドプローブセットを隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在していれば、夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズすることを含む。各セット由来のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブは互いに連結して、一緒に結合した標的特異的部分を含有する連結産物配列を形成する。各セットについての連結産物配列は、連結検出反応混合物中の他の核酸と識別され得る。オリゴヌクレオチドプローブセットは、夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中の隣接配列にハイブリダイズできるが、１以上のミスマッチの存在によって一緒に連結しない。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブは、連結しないとき、変性処理の際に個々に分離する。
【００６７】
リガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけると、連結産物配列が検出される。結果として、サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の存在が同定され得る。
【００６８】
検出／定量を行うについて、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスの実施には３方法があり、各々２つのホーマットのいずれかを用いて実施される。より特定的に、ＬＤＲ相は、（１）ＬＤＲ相から野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを排除して、少数変異標的からのシグナルが圧倒されることを回避し（to avoid overwhelming signal from minority mutant target）、そしてマーカーを加えないこと、（２）ＬＤＲ相から野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを排除するが、この相にマーカーを加えること、および（３）低レベルでＬＤＲ相中の野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブおよび／またはこれらのプローブの修飾型を用いて、少数変異標的由来のシグナルが圧倒されるのを防ぐ多数標的に対応する少ない連結産物を産出することによって実施される。１つの検出ホーマットには、毛管電気泳動またはゲル電気泳動と蛍光定量法が含まれる。あるいは、検出は捕捉オリゴヌクレオチドアドレスのアレイ上での捕捉と蛍光定量法により実施される。これらの方法については図１−９を参照して詳細に説明する。
【００６９】
図１は、癌関連変異の検出を表わす。ここでは野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがＬＤＲ相から排除されて、少数変異標的からのシグナルが圧倒されることが回避され、ＬＤＲ相にマーカーを加えない。工程１において、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。ＰＣＲの際に産生された伸長産物を工程２で１／２０に希釈する。工程３において、伸長産物を対立遺伝子特異的部分と共通部分を含有するオリゴヌクレオチドプローブと混合し、ＬＤＲ相の方法をホットスタート条件でＴａｑリガーゼの追加によって開始する。ＬＤＲの際に、オリゴヌクレオチドプローブはその隣接のオリゴヌクレオチドに、連結部で完全な相補性を与える標的配列の存在下でのみ、連結する。野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの不存在およびその結果の野性型特異的連結産物の不存在は、少数変異標的から生じる連結検出反応シグナルが圧倒的されるのを防止する。
【００７０】
この産物は２種のホーマットのいずれかで検出される。工程４ａのホーマットにおいて、産物は毛管ゲル電気泳動により分離され、蛍光シグナルが定量される。他方、工程４ｂのホーマットにおいて、産物は、アドレス可能アレイ上で相補的配列との特異的ハイブリダイゼーションにより検出される。
【００７１】
図２は癌関連変異を表わす。ここでは野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがＬＤＲ相から排除され、少数変異標的からのシグナルが圧倒されることが回避され、マーカーをＬＤＲ相に加える。工程１において、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａｑポリメーラーゼを用いたＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。工程３において、産物は１／１００希釈のマーカーＤＮＡ（各フラグメントにつき）でスパイクされる。このＤＮＡは、野性型ＤＮＡに相同的であるが、たゞ癌細胞に見られない変異、しかし適当なＬＤＲプローブで容易に検出され得る変異を含有している。工程４において、ＰＣＲ相からの混合ＤＮＡ産物を、対立遺伝子特異的部分および共通部分含有のＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを含む新鮮なＬＤＲ緩衝液中に２０倍に希釈する。工程５では、ＬＤＲ相がホットスタート条件下でＴａｑリガーゼを加えることにより開始する。ＬＤＲにおいて、オリゴヌクレオチドプローブは、連絡部で完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、その隣接のオリゴヌクレオチドプローブに連結する。
【００７２】
この産物は２種のホーマットのいずれかで検出される。工程６ａのホーマットにおいて、毛管またはゲル電気泳動により産物が分離され、そして蛍光シグナルが定量される。変異ピークのマーカーピークに対する割合は、元のサンプル中に存在する癌関連変異の概量を１００で除して算出される。工程６ｂのホーマットにおいて、アドレス可能アレイ上の相補的配列についての特異的ハイブリダイゼーションによって産物が検出される。マーカードットに対する変異ドット中の蛍光シグナルの割合は、元のサンプル中に存在する癌関連変異の概量を１００で除して算出される。
【００７３】
図３は追加の癌関連変異を表わす。ここでは野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが低レベルでＬＤＲ相において用いられ、および／または修飾されて多数標的に対応する少ない連結産物を産出する。工程１において、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａｑポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的オリゴヌクレオチドプライマーと共に多重エクソンをかける。ＰＣＲの際に産生した伸長産物を工程２において１／２０に希釈する。工程３において伸長産物を対立遺伝子特異的部分および共通部分含有のオリゴヌクレオチドプローブと混合し、ＬＤＲ相はホットスタートでＴａｑリガーゼの追加で開始される。ＬＤＲの際に、オリゴヌクレオチドプローブはその隣接オリゴヌクレオチドに、連結部で完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、連結する。野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの濃度および／または修飾によって、これらのプローブで生じた連結産物のレベルは、少数標的ヌクレオチド配列から生じた連結反応配列の量に匹敵する。
【００７４】
産物は２種のホーマットのいずれかから検出され得る。工程４ａのホーマットにおいて、産物は毛管またはゲル電気泳動で分離され、蛍光シグナル定量により定量される。例として、多数標的ヌクレオチド特異的の一定量（すなわち、１picomole）上で連結する低レベルおよび／または修飾野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドブローブは、多数標的ヌクレオチド配列の同量（すなわち、１picomole）中で１００倍希釈で（すなわち、１０femtomole）として存在する一定量の少数標的配列から（少数対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて）生じた同量の多数標的ヌクレオチド配列を生じる。変異ピークの野性ピークに対する割合は、元のサンプル中に存在する少数標的(癌関連変異)の概量を１００で除して算出される。工程４ｂのホーマットにおいて、産物はアドレス可能アレイ上の相補的配列との特異的ハイブリダイゼーションによって検出される。少量産物の量は上記のようにして定量される。
【００７５】
リガーゼ検出反応は、Barany et al.によるWO90/17239、 F. Barany et al., ”Cloning, Overexpression and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA Ligase-encoding Gene,” Gene, 109:1-11(1991),および F.Barany, ”Genetic Disease Detection and DNA Amplification Using Cloned Thermostable Ligase,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193(1991)（出典明示により本明細書の一部とする）に一般的に記載されている。本発明において、リガーゼ検出反応で2セットの相補的オリゴヌクレオチドが用いられる。これはリガーゼ鎖反応として知られるもので上記３引用に記載されている。他方、リガーゼ検出反応には、オリゴヌクレオチド連結反応検出法として知られる単一サイクル法もある。参照、Landegren, et al., ”A Ligase-Mediated Gene Detection Technique,” Science 241:1077-80(1988); Landegren, et al., ”DNA Diagnostics -- Molecular Techniques and Automation,” Science 242:229-37(1988); およびLandegren et al. による米国特許第4,988,617号（出典明示により本発明の一部とする）。
【００７６】
リガーゼ検出反応相において、変性処理は温度８０−１０５℃でなされ、ハイブリダイゼーションは５０−８０℃で行われる。各サイクルは変性処理と熱ハイブリダイゼーションを含み、合計で約１−５分間の長さである。典型的には、連結検出反応は変性およびハイブリダイゼーションが２−５０サイクル反復される。リガーゼ検出反応相の全時間は１−２５０分である。
オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物であり得る。
一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチド各々、ハイブリダイゼーションすなわち溶融温度（すなわち、Ｔｍ）６６−７０℃を有する。これらのオリゴヌクレオチドは長さが２０−２８ヌクレオチドである。
上記したように、オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは検出に適したレポーター標識を有する。有用な標識には、発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学的検出分子がある。
【００７７】
ポリメラーゼ連鎖反応法はH. Erlich, et. al., ”Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction,” Science 252:1643-50(1991); M. Innis, et. al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: New York(1990); およびR. Saiki, et. al., ”Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase,” Science 239:487-91（出典明示により本明細書の一部とする）に完全に記載されている。
【００７８】
本発明の特に重要な態様は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を定量できる能力である。これは、内部（すなわち、標準確立物質をサンプルと共に増幅および検出するとき）または外部（すなわち、標準確立物質を増幅せずに、サンプルと共に検出するとき）的であり得る基準を確立して、多くの方法で達成される。
【００７９】
一つの定量法に従い、レポーター標識により発生したシグナルを検出する。このシグナルは、分析するサンプルから製造された連結反応産物を捕捉して得られる。このシグナルの強度は、サンプル中の連結反応産物配列の捕捉で生じるシグナルを既知量の標的ヌクレオチド配列とを比較して目盛曲線から得られる。結果として、分析サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量が測定できる。この技法は外部標準を用いる。
【００８０】
本発明に関する別の定量法は内部標準を用いるものである。この方法では、サンプルに１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を加える。さらに、複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを加えて、リガーゼ、前記のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびサンプルと共に混合物とする。マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、（１）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブ、および（２）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプローブおよび検出可能レポーター標識を含有する。特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプローブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列が互いに隣接してハイブリダイズするときに、連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他のヌクレオチド配列または添加したマーカー配列がハイブリダイズするときに、このような連結反応を妨害するミスマッチがある。連結反応産物配列の存在は、レポーター標識の検出によって同定される。サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量は、マーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から生じた連結反応産物配列の量と他の連結反応産物配列の量を比較することにより測定される。
【００８１】
本発明の別の定量法は、複数の配列相違を有する２以上の複数の標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルの分析である。標的ヌクレオチド配列に対応する連結反応産物配列は、前記の方法により検出および識別される。サンプル中の標的ヌクレオチド配列の相対量は、発生した捕捉連結反応産物配列の相対量と比較することにより定量される。これはサンプル中の標的ヌクレオチド配列の相対レベルの定量測定を提供する。
【００８２】
本発明における他の定量法は、複数の配列相違を有する２以上の複数の標的ヌクレオチド配列を含有するサンプルの解析を含む。ここでは１以上の標的ヌクレオチド配列が他の少数標的ヌクレオチド配列に対し過剰（多数）で存在している。少数標的ヌクレオチド配列についての対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブに加えて、修飾された野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが低レベルでＬＤＲ相で用いられ、および／または修飾されて、少数標的に対応する少ない連結産物を産出する。少数標的特異的連結産物および多数標的特異的連結産物の両者の存在は、レポーター標識の検出により同定される。サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の量は、多数標的ヌクレオチド配列から生じた低収量の連結産物配列量を他の連結産物量と比較することにより測定される。
【００８３】
好ましい熱安定性リガーゼはThermus aquaticusから誘導される。この酵素は生体から単離される。M. Takahashi, et al., ”Thermophillic DNA Ligase,” J. Biol. Chem. 259:10041-47(1984)（出典明示により本明細書の一部とする）。他方、これは組換え法でもつくられる。この単離方法およびThermus aquaticusリガーゼ（Thermus themopilusリガーゼも同様）の産生は、Barany, et al.によるWO90/17239およびF.Barany, et al., ”Cloning Overexpression and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA-Ligase Encoding Gene” Gene 109:1-11(1991)（出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。
【００８４】
これらの引用には、このリガーゼおよびコードＤＮＡについての完全な配列情報が含まれている。他の適当なリガーゼにはE.coliリガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびPycoccusリガーゼがある。
【００８５】
連結検出反応混合物は担体ＤＮＡやサケ精子ＤＮＡを含み得る。
連結検出反応でのハイブリダイゼーション段階は、好ましくは熱ハイブリダイゼーション処理であり、連結反応の接合部において識別されるヌクレオチドを基にしたヌクレオチド配列の間を識別する。標的ヌクレオチド配列間の相違は、例えば、単一核酸塩基の相違、核酸欠失、核酸挿入または再配置である。１以上の塩基を含むこのような配列相違もまた検出できる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブセットは、実質的に同じハイブリダイゼーション条件下で標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、実質的に同じ長さである。結果として、本発明のプロセスは、感染性疾患、遺伝的疾患および癌の検出を可能とする。環境監視、法医学および食物科学においても有用である。
【００８６】
広範囲の感染性疾患が本発明プロセスで検出できる。典型的には、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌感染作用因子によって起きる。種々の感染作用因子の薬剤に対する耐性も本発明を用いて測定できる。
【００８７】
本発明により検出できる細菌感染作用因子は、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌、クレブシエラ、シュードモナス、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラレ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリディア、ボルデテラ・ペルツシス、バクテリア状物、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニア、Ｂ−溶血性連鎖球菌、コリネバクテリア・レジオネラ、ミコプラズマ、ウレアプラズマ、クラミジア、ナイセリア・ゴノレア、ナイセリア・メニンギティデス、ヘモフィラス・インフルエンザ、エンテロコッカス・ファエカリス、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス、ヘリコバクター・ピロリ、トレポネマ・パラジウム、ボレリア・ブルグドルフェリ、ボレリア・レクレンティス、リケッチア病原菌、ノカルディアおよびアクチノマイセテスを含む。
【００８８】
本発明で検出できる真菌感染作用因子は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ブラストミセス・デルマティティディス、ヒストプラスマ・カプスラタム、コシディオイデス・イミティス、パラコシシオイデス・ブラシリエンシス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガウトゥス、フィマイセテス(リゾプス)、スポロスリックス・シェンキー、クロモマイコシスおよびマドゥロマイコシスを含む。
本発明により検出できるウイルス感染作用因子は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトＴリンパ球好性ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルス)、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニャウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルスおよびレオウイルスを含む。
【００８９】
本発明により検出できる寄生虫作用因子は、プラスモジウム・ファルシパルム、プラスモジウム・マラリア、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オバレ、オンコベルバ・ボルブルス、レイシュマニア、トリパノソーマ種、シストソーマ種、エンタモエバ・ヒストリティカ、クリプトスポリジウム、ギアルディア種、トリコモナス種、バラチジウム・コリ、ウシェレリア・バンクロフティ、トキソプラスマ種、エンテロビウス・バーミクラリス、アスカリス・ルンブリコイデス、トリシュリス・トリシウラ、ドラクンクルス・メディネシス、吸虫類、ジフィロボスリウム・ラトゥム、タエニア種、ニューモシスティス・カリニおよびネカター・アメリカニスを含む。
本発明はまた感染作用因子による医薬耐性の検出にも有用である。例えば、バンコマイシン耐性エンテロコッカス・ファエシウム、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニアエ、多剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスおよびＡＺＴ耐性ヒト免疫不全ウイルスを本発明によりまた同定できる。
【００９０】
遺伝的疾患もまた本発明の方法により検出できる。これは染色体および遺伝的異常のための出生前スクリーニングまたは遺伝的疾患のための出生後スクリーニングにより行い得る。検出可能な遺伝的疾患の例は：２１ヒドロキシラーゼ欠損症、嚢胞線維症、フラジレＸ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ダウン症候群または他のトリソミー、心臓疾患、単一遺伝子疾患、ＨＬＡタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球性貧血、テイ・サックス病、サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピドーシス、肥満欠損、血友病、代謝の先天性異常および糖尿病を含む。
【００９１】
本発明の方法により検出できる癌は、一般的にオンコジーン、腫瘍抑制遺伝子またはＤＮＡ増幅、複製、組換えまたは修復に関与する遺伝子を含む、これらの例は：ＢＲＣＡ１遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、Her2/Neu増幅、Bcr/Abl、Ｋ−ras遺伝子、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６および１８を含む。下記の一般的なヒト癌における上記遺伝子の増幅、大きい欠失、点変異および小さい欠失／挿入を同定するために、本発明の様々な態様が用いられる。白血病、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱癌、黒色腫、肝臓癌、骨肉腫および他の骨癌、精巣および卵巣癌、頭部・頚部腫瘍および脳新生物を含む。
【００９２】
環境監視の領域で、本発明は、天然および工学的生態系ならびに都市廃棄水浄化システムおよび貯水槽中または生物改善を行っている汚染領域のような微小生態系における病原性および常在性微生物の検出、同定および追跡に使用できる。新陳代謝生体異物であり得る遺伝子を含むプラスミドの検出もまた可能であり、集団機能的研究における特異的標的微生物の追跡、または環境的および工学的植物における遺伝的に修飾された微生物の検出、同定または追跡をする。
【００９３】
本発明は、また、軍務上の人的あるいは犯罪上の検査、父親検定および家族関係解析のためのヒト同定、ＨＬＡ適合性タイプ分類、および汚染に関する血液、精液または移植臓器のスクリーニングを含む種々の領域または法医学領域で使用できる。
【００９４】
食物および飼料産業において、本発明は広範囲の適用を有する。例えば、ビール、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン等の製造のための酵母のような製造生物の同定および特徴付けのために使用できる。使用の他の領域は汚染に対する産物および処理(例えば、家畜、滅菌および肉処理)の品質コントロールおよび保証に関する。他の使用は、育種目的の植物、球根および種子の特徴付け、植物特異的病原体の同定および種々の家畜感染の検出および同定を含む。
【００９５】
望ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、連結反応の接合部における完全相補性のため、対応する標的ヌクレオチド配列と互いに隣接してハイブリダイズするとき、連結反応の接合部で互いに連結するのに適している。しかしながら、セット中のオリゴヌクレオチドプローブがサンプル内に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするとき、連結を妨害する連結反応の接合部の塩基ミスマッチがある。最も好ましくは、ミスマッチは連結反応の接合部の３’塩基に隣接した塩基である。あるいは、ミスマッチは連結反応の接合部に隣接した塩基であり得る。
【００９６】
上述のように、検出および定量は、毛管またはゲル電気泳動あるいはアレイ捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物で実施され得る。
【００９７】
図４は連結反応産物を分離するための電気泳動を用いた図１のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。より特定的に、本図は、グリシン（Ｇｌｙ）をコードするＧＧＴ配列を有するＫ−ras遺伝子のコドン１２の検出に関する。少数の細胞がＧＡＴにおけるＧからＡへの変異を含有しており、これはアスパラギン酸Ａｓｐ）をコードする。図示するように、工程１は最初のＰＣＲ増幅であり、工程２はＬＤＲ法であり、および工程３は蛍光産物の分離と定量である。あるいは、工程３は、エチジウム・ブロマイド染色または正常のオリゴヌクレオチドプローブを用いた希釈産物上の追加のＬＤＲ法の実施を含む（参照、図２３および２９）。野性型（すなわち、正常）配列についてのＬＤＲプローブは反応から欠如している。正常ＬＤＲプローブ（Ｇである識別塩基を有する）が含まれると、これは共通プローブに連結して、少数変異標的由来のシグナルを圧倒する。他方、図４に示すように、単一ヌクレオチド（Ｎ１と名付ける）にカップルした蛍光標識Ｆ１を有する４４塩基の連結反応産物配列およびＡｎティルの存在はアスパラギン酸をコードする変異の存在を表わす。この連結反応産物配列は、アルギニンおよびバリンコードの変異の存在により形成されるのと同じＦ１標識を有する。しかしこれらの配列は、相違する長さのティルおよび連結反応産物配列の残基に標識をカップルせしめるヌクレオチドＮの相違する数からくるそれらの異なる長さによって識別可能である。さらに特定的には、Ｆ１標識の４８塩基の連結反応産物配列の存在は、アルギニンコードコドンの存在を示唆し、Ｆ１標識の４８塩基の連結反応産物配列の存在はバリンコードコドンの存在を示す。これらの連結反応産物配列は、比較的低い電気泳動運動性を有する長い産物とサイズにより識別される。Ｆ２標識連結反応産物は、相違する長さのティルおよび連結反応産物配列の残基に標識をカップルせしめるヌクレオチドＮの相違する数からくるそれらの異なる長さによって識別可能である。より特定的に４９塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎ＋４ティルをカップルする２ヌクレオチドＮによる）は、システインコードコドンの存在を示唆し、４７塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎ＋４をカップルするヌクレオチドＮなしによる）は、セリンコードコドンを示し、４５塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎティルをカップルする２ヌクレオチドＮによる）は、アラニンコードコドンを示す。
【００９８】
図５は、連結反応産物を分離するための電気泳動を用いた図１のＰＣＲ／ＬＤＲを表わす模式図である。より特定的に、本図は、グリシン（Ｇｌｙ）をコードするＧＧＴ配列を有するＫ−ras遺伝子のコドン１２の検出に関する。少数の細胞がＧＡＴにおけるＧからＡへの変異を含有しており、これはアスパラギン酸Ａｓｐ）をコードする。図示するように、工程１は最初のＰＣＲ増幅であり、工程２はＬＤＲ法および工程３は蛍光産物の分離と定量である。マーカー鋳型を加えた後にＬＤＲ相にかけられ、ここでは対立遺伝子特異的およびマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブが使用される。野性型（すなわち、正常）配列についてのＬＤＲプローブは反応から欠如している。正常ＬＤＲプローブ（Ｇである識別塩基を有する）が含まれると、これは共通プローブに連結して、少数変異標的由来のシグナルを圧倒する。他方、図５に示すように、単一ヌクレオチド（Ｎ１と名付ける）にカップルした蛍光標識Ｆ１を有する４４塩基の連結反応産物配列およびＡｎティルの存在はアスパラギン酸をコードする変異の存在を表わす。この連結反応産物配列は、アルギニンおよびバリンコードの変異の存在により形成されるのと同じＦ１標識を有する。しかしこれらの配列は、相違する長さのティルおよび連結反応産物配列の残基に標識をカップルせしめるヌクレオチドＮの相違する数からくるそれらの異なる長さによって識別可能である。さらに特定的には、Ｆ１標識の４８塩基の連結反応産物配列の存在は、アルギニンコードコドンの存在を示唆し、Ｆ１標識の４８塩基の連結反応産物配列の存在はバリンコードコドンの存在を示す。これらの連結反応産物配列は、比較的低い電気泳動運動性を有する長い産物とサイズにより識別される。Ｆ２標識連結反応産物は、相違する長さのティルおよび連結反応産物配列の残基に標識をカップルせしめるヌクレオチドＮの相違する数からくるそれらの異なる長さによって識別可能である。より特定的に４９塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎ＋４ティルをカップルする２ヌクレオチドＮによる）は、システインコードコドンの存在を示唆し、４７塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎ＋４をカップルするヌクレオチドＮなしによる）は、セリンコードコドンを示し、４５塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎティルをカップルする２ヌクレオチドＮによる）はアラニンコードコドンを示す。マーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブにより形成された連結反応産物は、４３塩基であり、Ｆ２標識（標識およびＡｎティルにカップルするＯヌクレオチドＮによる）を有する。上述したように、サンプル中の少数標識ヌクレオチド配列量は、既知量のマーカー標識ヌクレオチド配列から生じた連結反応産物配列の量を他の連結反応産物配列の量と比較することにより測定される。
【００９９】
図６は連結反応産物を分離するための電気泳動を用いた図１のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。より特定的に、本図は、グリシン（Ｇｌｙ）をコードするＧＧＴ配列を有するＫ−ras遺伝子のコドン１２の検出に関する。少数の細胞がＧＡＴにおけるＧからＡへの変異を含有しており、これはアスパラギン酸Ａｓｐ）をコードする。図示するように、工程１は最初のＰＣＲ増幅であり、工程２はＬＤＲ法および工程３は蛍光産物の分離と定量である。野生型(すなわち、正常)配列についてＬＤＲプローブは、低レベルで用いられ、および／または修飾され、野生型標的ヌクレオチド配列に対応する少ない連結反応産物配列を産出する。図６に示すように、単一ヌクレオチド（Ｎ１と名付ける）にカップルした蛍光標識Ｆ１を有する４４塩基の連結反応産物配列およびＡｎティルの存在はアスパラギン酸をコードする変異の存在を表わす。この連結反応産物配列は、アルギニンおよびバリンコードの変異の存在により形成されるのと同じＦ１標識を有する。しかしこれらの配列は、相違する長さのティルおよび連結反応産物配列の残基に標識をカップルせしめるヌクレオチドＮの相違する数からくるそれらの異なる長さによって識別可能である。さらに特定的には、Ｆ１標識の４８塩基の連結反応産物配列の存在は、アルギニンコードコドンの存在を示唆し、Ｆ１標識の４８塩基の連結反応産物配列の存在はバリンコードコドンの存在を示す。これらの連結反応産物配列は、比較的低い電気泳動運動性を有する長い産物とサイズにより識別される。Ｆ２標識連結反応産物は、相違する長さのティルおよび連結反応産物配列の残基に標識をカップルせしめるヌクレオチドＮの相違する数からくるそれらの異なる長さによって識別可能である。より特定的に４９塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎ＋４ティルをカップルする２ヌクレオチドＮによる）は、システインコードコドンの存在を示唆し、４７塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎ＋４をカップルするヌクレオチドＮなしによる）は、セリンコードコドンを示し、４５塩基連結反応産物配列（標識およびＡｎティルをカップルする２ヌクレオチドＮによる）はアラニンコードコドンを示す。野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクオチドプローブにより形成された連結反応産物は４３塩基であり、Ｆ２標識（標識およびＡｎティルにカップルするＯヌクレオチドＮによる）を有する。この連結反応産物を形成する標識プローブにおいて、連結反応部から３塩基離れた場所に位置する塩基Ｎが存在し、これは、野性型標的についての通常の適切なヌクレオチド（もしこのプローブが低レベルで使用されていると）あるいはミスマッチまたはヌクレオチド塩基類似体のいずれかであり得る。ミスマッチヌクレオチド、ヌクレオチド塩基類似体および／または糖ホスフェートバックボーン中の修飾の利用は、野性型標識から離れて形成した連結反応産物の量を低下する。このように、野性型標識の存在は、少数変異標的の存在により生じた圧倒的なシグナルなしに検出することができる。サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の量は、多数標的ヌクレオチド配列から生じた低収量の連結反応産物配列の量を他の連結反応産物の量と比較することにより測定される。
【０１００】
図４〜６は、相違するオリゴヌクレオチドプローブの３末でのミスマッチを検出するためにリガーゼ検出反応を利用することに関している。他の場合、ミスマッチが３末から２番目の位置または３末から３番目の位置にあり得る。
この目的のための毛管およびゲル電気泳動の使用はよく知られている。参照、例えばGrossman, el al., ”High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid Sequences: Oligonucleotide Ligation Assay and Sequence-coded Separation”, Nucl. Acids Res. 22(21):4527-34(1994)（出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１０１】
図７は、アドレス可能アレイを用いて隣接対立遺伝子で癌関連変異を検出するための図１のＰＣＲ／ＬＣＲ法を表わす模式図である。図７は、グリシン（Ｇｌｙ）をコードする野性型ＧＧＴ配列およびアスパラギン酸をコードする少数変異ＧＡＴ配列を有するＫ−ras遺伝子のコドン１２の検出に関する。図７には、工程１の最初のＰＣＲ増幅、工程２のＬＤＲ法および工程３の固体支持物上の捕捉が含まれる。図４のように、野性型標的配列についてのＬＤＲプローブは反応から欠如しており、変異標的配列により産出された圧倒的なシグナルを回避する。本発明のこの実施態様において、図７に示すように、アスパラギン酸コードＧＡＴ配列の存在は、標識Ｆおよびアドレス可能アレイ特異的部分Ｚ４を有する連結反応産物配列を産生する。このような連結反応産物配列の存在は、標識Ｆを有し、アドレス可能アレイ特異的部分Ｚ４に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで固体支持物上のアドレスでハイブリダイズされた核酸の存在によって、明らかにされる。図７に示すように支持物は、相違するアドレス可能アレイ特異的部分Ｚ１からＺ６に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを保持するアドレスのアレイを有する。標識Ｆを有する共通オリゴヌクレオチドプローブを用いるので、それらがハイブリダイズする固体支持物上の部位を見ることにより、異なる連結反応産物配列が識別される。
【０１０２】
図８は、アドレス可能アレイを用いて隣接対立遺伝子で癌関連変異を検出するための図２のＰＣＲ／ＬＣＲ法を表わす模式図である。図８は、グリシン（Ｇｌｙ）をコードする野性型ＧＧＴ配列およびアスパラギン酸をコードする少数変異ＧＡＴ配列を有するＫ−ras遺伝子のコドン１２の検出に関する。図８には、工程１の最初のＰＣＲ増幅、工程２のＬＤＲ法および工程３の固体支持物上の捕捉が含まれる。図５のように、野性型標的配列についてのＬＤＲプローブは反応から欠如しており、変異標的配列により産出された圧倒的なシグナルを回避する。本発明のこの実施態様において、図８に示すように、アスパラギン酸コードＧＡＴ配列の存在は、標識Ｆおよびアドレス可能アレイ特異的部分Ｚ４を有する連結反応産物配列を産生する。このような連結反応産物配列の存在は、標識Ｆを有し、アドレス可能アレイ特異的部分Ｚ４に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで固体支持物上のアドレスでハイブリダイズされた核酸の存在によって、明らかにされる。図８に示すように支持物は、相違するアドレス可能アレイ特異的部分Ｚ１からＺ７に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを保持するアドレスのアレイを有する。標識Ｆを有する共通オリゴヌクレオチドプローブを用いるので、それらがハイブリダイズする固体支持物上の部位を見ることにより、異なる連結反応産物配列が識別される。マーカー特異的プローブから産生された連結反応産物配列の存在は、標識Ｆを有し、アドレス可能アレイ特異的部分Ｚ７に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで固体支持物上のアドレスでハイブリダイズされた核酸の存在で明らかにされる。サンプル中の標識ヌクレオチド配列の量は、マーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から生じた連結反応産物配列の量を他の連結反応産物配列の量と比較することにより測定される。
【０１０３】
図９は、アドレス可能アレイを用いて隣接対立遺伝子で癌関連変異を検出するための図３のＰＣＲ／ＬＣＲ法を表わす模式図である。図９は、グリシン（Ｇｌｙ）をコードする野性型ＧＧＴ配列およびアスパラギン酸をコードする少数変異ＧＡＴ配列を有するＫ−ras遺伝子のコドン１２の検出に関する。図９には、工程１の最初のＰＣＲ増幅、工程２のＬＤＲ法および工程３の固体支持物上の捕捉が含まれる。野生型(すなわち、正常)配列についてＬＤＲプローブは、低レベルで用いられ、および／または修飾され、野生型標的ヌクレオチド配列に対応する少ない連結反応産物配列を産出する。本発明のこの実施態様において、図９に示すように、アスパラギン酸コードＧＡＴ配列の存在は、標識Ｆおよびアドレス可能アレイ特異的部分Ｚ４を有する連結反応産物配列を産生する。このような連結反応産物配列の存在は、標識Ｆを有し、アドレス可能アレイ特異的部分Ｚ４に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで固体支持物上のアドレスでハイブリダイズされた核酸の存在によって、明らかにされる。図９に示すように支持物は、相違するアドレス可能アレイ特異的部分Ｚ１からＺ７に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドを保持するアドレスのアレイを有する。標識Ｆを有する共通オリゴヌクレオチドプローブを用いるので、それらがハイブリダイズする固体支持物上の部位を見ることにより、異なる連結反応産物配列が識別される。野生型対立遺伝子特異的プローブから産生された連結反応産物は、標識Ｆを有し、アドレス可能アレイ特異的部分Ｚ７に相補的な捕捉オリゴヌクレオチドで固体支持物上のアドレスでハイブリダイズされた核酸の存在で明らかにされる。この連結反応産物を形成する標識プローブにおいて、連結反応部から３塩基離れた場所に位置する塩基Ｎが存在し、これは、野性型標的についての通常のヌクレオチド（もしこのプローブが低レベルで使用されていると）あるいはミスマッチまたはヌクレオチド塩基類似体のいずれかであり得る。ミスマッチヌクレオチド、ヌクレオチド塩基類似体および／または糖ホスフェートバックボーン中の修飾の利用は、野性型標識から離れて形成した連結反応産物の量を低下する。このように、野性型標識の存在は、少数変異標的の存在により生じた圧倒的なシグナルなしに検出することができる。サンプル中の少数標的ヌクレオチド配列の量は、多数標的ヌクレオチド配列から生じた低収量の連結反応産物配列の量を他の連結反応産物の量と比較することにより測定される。
【０１０４】
捕捉オリゴヌクレオチドアレイを有する固体支持物の使用は、米国特許出願第60/011,359（出典明示により本明細書の一部とする）に完全に開示されている。このようなアレイを使用するときには、上記のＰＣＲ相およびＬＤＲ相において用いられるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブはアドレス可能アレイ特異的部分を有する。ＬＤＲ相またはＰＣＲ相が完了した後、その産物についてのアドレス可能アレイ特異的部分は、単鎖を残し、捕捉相の際に捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。C. Newton, et al.,”The Production of PCR Products With 5’ Single-Stranded Tails Using Primers That Incorporate Novel Phosphoramidite Intermediates,” Nucl. Acids Res. 21(5):1155-62(1993)（出典明示により本明細書の一部とする）。
【０１０５】
本方法の捕捉相において、混合物は固体支持物と温度４５−９０℃および６０分間までの時間で接触する。ハイブリダイゼーションはカチオン、量排除またはカオトロピック剤を加えることにより促進される。アレイが何１０から１００アドレスよりなるとき、正しい連結反応産物配列が適切なアドレスにハイブリダイズする機会を持つことが重要である。これは、用いた高温でのオリゴヌクレオチドの熱運動、アレイ表面に接触する液体の機械的運動または電場でのアレイを通るオリゴヌクレオチドの運動により達成される。ハイブリダイゼーション後、アレイを低ストリジェンシー緩衝液および高ストリジェンシー緩衝液で順次洗う。
【０１０６】
安定な状態でハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドおよびアドレス可能ヌクレオチド配列を選択することが重要である。それには、捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度で、オリゴヌクレオチドセットが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするように、オリゴヌクレオチドセットと捕捉オリゴヌクレオチドが立体配座することが必要である。このようにオリゴヌクレオチドが設計されていないと、標的にハイブリダイズする同じオリゴヌクレオチドセットからの隣接未反応オリゴヌクレオチドの捕捉によって、偽の正シグナルが起きる。
【０１０７】
捕捉オリゴヌクレオチドには、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物がある。
【０１０８】
アレイを使用するとき、本方法の検出相は、ＬＤＲまたはＰＣＲ産物が生じているかを走査および同定し、かかる産物の存在を試験サンプル中の標的ヌクレオチド配列の存在・不存在と相関せしめることを含む。走査は、走査電子顕微鏡、共焦顕微鏡、電子結合装置、走査透過電子顕微鏡、赤外線顕微鏡、原子力顕微鏡、電気的コンダクタンスおよび蛍光および燐光造影により行うことができる。相関処理はコンピューターで行う。
【０１０９】
本発明は、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチの場合、各比率(respective ratio)１：５００でサンプル中の多数ヌクレオチド配列から少数標的ヌクレオチド配列を識別するのに有用である。更に、この方法は、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチ以外の場合、各比率１：２０００でサンプル中の多数ヌクレオチド配列から少数標的ヌクレオチド配列を識別できる。
【０１１０】
近接または隣接する複数位置で低存在量複対立遺伝子の相違がある場合、本発明の方法は、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のミスマッチ全てについて、各比率１：１００で多数標的配列から少数標的ヌクレオチド配列を識別する。このような状況では、多数標的ヌクレオチド配列に対する少数標的ヌクレオチド配列の各比率は、多数標的ヌクレオチド配列とオリゴヌクレオチドプローブの１つとの間のＧ：ＴまたはＴ：Ｇミスマッチ以外の場合１：５００である。
【０１１１】
本発明の第２の態様は、また、多数の標的ヌクレオチド配列中、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している多数の配列のうち１以上を同定する方法にも関する。上記のとおり、サンプルと１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを、リガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物を形成させる。このリガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、連結反応産物の存在を検出する。しかしながら、ここでは、熱安定性変異リガーゼが利用される。このリガーゼは、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部でミスマッチを持つ標的にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数に対する、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数として定義される適合性比率(fidelity ratio)によって特性化できる。熱安定性変異リガーゼの適合性比率は、野生型リガーゼの適合性比率よりも大きい。
【０１１２】
本発明の方法による変異リガーゼの使用は、下記のように説明できる。酵素反応の特異性は、触媒定数ｋｃａｔと見かけの結合定数ＫＭにより測定し、特異性定数ｋｃａｔ/ＫＭと表す。酵素自身や基質または反応条件が変わると、ｋｃａｔまたはＫＭあるいは両方に影響し、その特異性を変えてしまう。変異酵素を用いると、完全マッチおよびミスマッチした酵素ＤＮＡ複合体の安定性に様々な度合いで影響を与え得るので、これらの連結反応においては別個のＫＭ作用を発揮させる。完全にマッチしたおよびミスマッチした基質の連結反応などの競合反応では、特異性定数の比率は、各基質に対するＫＭや起こり得るｋｃａｔ変化の結果として変わることもある。下記等式(Ｋ２９４Ｒについて示す)を満たす全ての変異酵素は、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
【数１】
0005575380.tif 000002
【０１１３】
あるいは、本発明の第２の態様では、下記のように適合性比率(即ち、３’末端での基質とミスマッチとの連結反応の初速度で割った、３’末端での基質と完全マッチとの連結反応の初速度)で表すことができる。
【数２】
0005575380.tif 000003
【０１１４】
上記等式において、[ｋ１]マッチは、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。[ｋ１]ミスマッチは、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部でミスマッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。変異熱安定性リガーゼの場合、[ｋ１]ミスマッチで割った[ｋ１]マッチ(＝適合性比率)は、野生型リガーゼの適合性比率よりも大きい。上記の等式(Ｋ２９４Ｒについて示す)を満たす全ての変異酵素は、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。このことはまた、もっと総括的に、下記のようなシグナル対ノイズ比率で述べることもできる。
【数３】
0005575380.tif 000004
【０１１５】
上記等式において、[ＬＤＲ産物]少数標的は、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが少数標的ヌクレオチド配列および連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした場合に生成する連結反応産物配列の量を表す。[ＬＤＲ産物]多数標的は、同じ第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを持つ多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合に生成する連結反応産物配列の量を表す。このリガーゼは、少数および多数標的ヌクレオチド配列の両方から生成する連結反応産物配列の量を、同じ量の多数標的ヌクレオチド配列単独から生成する連結反応産物配列の量で割った、シグナル対ノイズ比率を持つ。
【０１１６】
変異および野生型リガーゼは共に、少数変異検出用のシグナル対ノイズ比率に付随し、本発明の第２の態様では、変異リガーゼシグナル対ノイズ比率が野生型リガーゼシグナル対ノイズ比率より大きいと表現することができる。
【数４】
0005575380.tif 000005
上記等式は、次のようにもっと簡単に言い換えることもできる：
【数５】
0005575380.tif 000006
【０１１７】
変異熱安定性リガーゼの場合、そのシグナル対ノイズ比率は、野生型リガーゼのシグナル対ノイズ比率よりも大きい。上記の等式を満たす全ての変異酵素は、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
【０１１８】
本発明の第３の態様は、また、多数の標的ヌクレオチド配列中、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している多数の配列のうち１以上を同定する方法にも関する。上記のとおり、サンプルと１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを、リガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物を形成させる。このリガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ、次いで、連結反応産物の存在を検出する。しかしながら、ここでは、オリゴヌクレオチドプローブセットに関し、連結反応が起こる連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブを修飾している。この修飾により、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つヌクレオチドプローブとの連結反応部でミスマッチを持つサンプルの多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときの連結反応速度と比較して、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、少数標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つサンプル中の少数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときの連結反応速度が区別しやすいように変わる。修飾オリゴヌクレオチドプローブとの連結反応は、同量の多数標的配列単独から生成する連結反応産物配列の量に対する少数および多数標的ヌクレオチド配列の連結反応産物配列量のシグナル対ノイズ比率を持ち、これは、修飾していないオリゴヌクレオチドプローブを用いる連結反応のシグナル対ノイズ比率よりも大きい。
【０１１９】
本発明の方法による修飾オリゴヌクレオチドプローブの使用は、下記の通り説明できる：
識別性プライマーの第３位にＱ２およびＱ１８類似体を導入すると、シグナル対ノイズ比率は約２−３培に増進し、これによって、癌シグナルをバックグラウンドから識別するＬＤＲシステムの能力が増大する。このアッセイは、最も困難なケース、即ちＴ：Ａ完全マッチからＴ：Ｇミスマッチを識別するリガーゼの能力を比較するものである。プローブの３’末端から３ヌクレオチドの位置にあるＱ２またはＱ１８類似体は、３’位のミスマッチに関して存在する場合、局所融解を高め、同時に、３’末端の塩基対マッチに関して存在する場合は、ミスマッチ以上にらせん構造の保全を保護する。プローブの３’末端近くにＱ２またはＱ１８類似体を用いると、完全マッチおよびミスマッチの酵素ＤＮＡ複合体の安定性に様々な度合いで影響を及ぼすことがあり、そのため、これらの連結反応では別個のＫＭ作用を働かせる。完全にマッチしたおよびミスマッチした基質の連結反応などの競合反応では、特異性定数の比率は、各基質に対するＫＭや起こり得るｋｃａｔ変化の結果として変わることもある。下記等式(Ｑ類似体について示す)を満たす全ての修飾プローブは、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
【０１２０】
【数６】
0005575380.tif 000007
【０１２１】
あるいは、本発明の第３の態様では、下記のように適合性比率(即ち、基質と３’末端並びに３’末端のミスマッチから３ヌクレオチドの位置にある類似体との連結反応の初速度で割った、基質と３’末端並びに３’末端の完全マッチから３ヌクレオチドの位置にある類似体との連結反応の初速度)で表すことができる。
【数７】
0005575380.tif 000008
【０１２２】
上記は、もっと一般的に、他のヌクレオチド類似体または糖ホスフェート主幹修飾を含めて下記のように言い換えることができる。
【数８】
0005575380.tif 000009
【０１２３】
上記等式において、[ｋ１]修飾オリゴ,マッチは、１つのオリゴヌクレオチドプローブが修飾部分を含み、並びに標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。[ｋ１]修飾オリゴ,ミスマッチは、１つのオリゴヌクレオチドプローブが修飾部分を含み、並びに標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部でミスマッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。[ｋ１]非修飾オリゴ,マッチは、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。[ｋ１]非修飾オリゴ,ミスマッチは、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部でミスマッチを持つ標的にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。修飾オリゴヌクレオチドプローブの場合、[ｋ１]修飾オリゴ,ミスマッチで割った[ｋ１]修飾オリゴ,マッチ(＝適合性比率)は、対応する非修飾オリゴヌクレオチドプローブの適合性比率よりも大きい。上記の等式を満たす全ての修飾オリゴヌクレオチドプローブは、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
【０１２４】
上記の等式についての別の解釈は、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部でミスマッチを持つ多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときの連結反応速度と比較して、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが、少数標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つ少数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするときの連結反応速度を区別的に変える１以上の修飾部分を持つ連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブである。
【０１２５】
このことはまた、もっと総括的に、下記に定義のシグナル対ノイズ比率で述べることもできる。
【数９】
0005575380.tif 000010
【０１２６】
上記等式において、[ＬＤＲ産物]少数標的は、第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが少数標的ヌクレオチド配列および連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つ少数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした場合に生成する連結反応産物配列の量を表す。[ＬＤＲ産物]多数標的は、同じ第１および第２オリゴヌクレオチドプローブが多数標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの間の連結反応部でミスマッチを持つ多数標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合に生成する連結反応産物配列の量を表す。このリガーゼは、修飾または非修飾オリゴヌクレオチドプローブのいずれかを用いて、少数および多数標的ヌクレオチド配列の両方から生成する連結反応産物配列の量を、同じ量の多数標的ヌクレオチド配列単独から生成する連結反応産物配列の量で割った、シグナル対ノイズ比率を持つ。
修飾および非修飾オリゴヌクレオチドプローブを持つ熱安定性リガーゼを用いる場合、少数変異検出用の各プローブに付随するシグナル対ノイズ比率があり、本発明の第３の態様では、修飾オリゴヌクレオチドプローブを用いて得られるシグナル対ノイズ比率は、非修飾オリゴヌクレオチドプローブを用いて得られるシグナル対ノイズ比率より大きいと表現することができる。
【０１２７】
【数１０】
0005575380.tif 000011
上記等式は、次のようにもっと簡単に言い直すこともできる：
【数１１】
0005575380.tif 000012
【０１２８】
修飾オリゴヌクレオチドプローブを用いる連結反応は、多数および少数標的ヌクレオチド配列の両方から生成するＬＤＲ産物量の、同量の多数標的ヌクレオチド配列単独から生成するＬＤＲ産物量に対するシグナル対ノイズ比率を有し、これは修飾していないオリゴヌクレオチドプローブを用いる連結反応のシグナル対ノイズ比率よりも大きい。上記の等式を満たす全ての修飾オリゴヌクレオチドプローブは、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
【０１２９】
適切な修飾には、ヌクレオチド類似体の使用があり、例えば、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)イミダゾール−４−カルボキサミド、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−３−ニトロピロール、４−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)イミダゾール−２−カルボキサミド、２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、２’−デオキシイノシン、６−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−６Ｈ,８Ｈ−３,４−ジヒドロピリミド[４,５−ｃ][１,２]オキサジン−７−オン、２−アミノ−７−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−６−メトキシアミノプリン、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−５−ニトロインドール、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)ピラゾール−４−カルボキサミド、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−１,２,４−トリアゾール−３−カルボキサミド、３−アミノ−１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−１,２,４−トリアゾール、５−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−２−ピリミジノン、５−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−２−チオピリミジン、５−アミノ−１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)イミダゾール−４−カルボキサミド、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−３−ニトロピラゾール、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−４−ヨードピラゾール、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−４−プロピニルピラゾール、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)ピロール−３−カルボキサミド、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)ピラゾン−４−カルボキサミド、１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−４−ニトロイミダゾール、または１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)−４−ニトロピラゾールである。あるいは、修飾オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブの糖ホスフェート主幹にチオホスフェート、ジチオホスフェート、２’−メトキシ、または３’−アミノ−２’,３’−ジデオキシ−修飾を含有する。この修飾は、連結反応を受ける位置、隣接位置または連結反応を受ける第３の位置のいずれかにある。
【実施例】
【０１３０】
実施例
実施例１−部位特異的突然変異誘発法を用いたアミノ酸残基２９４位でのThermus thermophilusＤＮＡリガーゼ変異の構築
Thermus thermophilus (”Ｔth”)ＤＮＡリガーゼ変異は、２段階ＰＣＲ法(Horton et al.,”Engineering Hybrid Genes Without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension”, Gene, 77: 61-68 (1989)、出典明示により本明細書の一部とする)を用いて作製した。プラスミドｐＤＺ１５(ＨindIIIによって鎖状にした)を鋳型として第１ラウンドのＰＣＲ反応に用いた。図１０の上部図に、クローン化Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＤＺ１５(Barany, F., et al., ”Cloning, Overexpression, and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA Ligase Gene”, Gene, 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)を、ＰstＩ部位で開裂させた場合のおおよそに拡大して描いた遺伝子の略図として示す。ｐＤＺ１５では、Ｔth リガーゼ遺伝子とその方向を太い斜め平行線を引いた矢印で表し、ベクターＡｐＲ(bla)遺伝子は、点描(灰色)矢印で、非機能性ＴaqＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の切形(truncated)末端は細い斜め平行線を引いた矢印で、ｐＢＲ複製起点は白塗りバーで表した。phoＡおよびＴ７プロモーターは右角矢印で、その転写方向は矢先で示す。制限部位は、Ａｖ、ＡvrII；Ｂｍ、ＢamＨＩ；Ｂｇ、ＢglII；(Ｂｇ/Ｂｍ再結合部位は、ＢamＨIまたはＢglIIのいずれかでは切断不能である；)Ｈｄ、ＨindIII；ＲＩ、ＥcoＲＩ；Ｐｓ、ＰstＩ、Ｐｖ、ＰvuIIである。ｐＴＺ１８Ｒ由来のポリリンカー領域は、列挙した外部制限部位のみで３本足付き三角で示す。下記の構築に使用するＥscherichia coli宿主株は、次から得られた：Ｎ３０９８(ligts７；(Wilson, G.G., et al.,”Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene From the Bacteriophage T4.I. Characterization of the Recombinants”, J. Mol. Biol., 132: 471-491 (1979)、出典明示により本明細書の一部とする)、N. Murrayから)；ＪＨ１３２(mrr−，Ｔn１０；(Heitman, J., et al., ”Site-Specific Methylases Induce the SOS DNA Repair Response in Escherichia coli”, J. Bacteriol., 169: 3243-3250 (1987)、出典明示により本明細書の一部とする)、J. Heitmanから)；ＭＮ２９４(endＡ−、hsdＲ−、hsdＭ＋、thi−１、supＥ４４；(Miller, J. H., ”Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-205 (1972)、出典明示により本明細書の一部とする)、我々のコレクションから)。ＡＫ５３株(mrrＢ−、ＭＭ２９４)およびＡＫ７６(mrrＢ−、Ｎ３０９８)は、上記ＪＨ１３２からmrrＢ−表現型を形質導入することにより構築した(Miller, J. H., ”Experiments in Molecular Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 201-205 (1972)、出典明示により本明細書の一部とする)。mrrＢ−表現型の存在は、プラスミドｐＦＢＴ７１上に存在するＴaq ＭＴアーゼ−コード遺伝子に対するこれらの株の耐性により確認した(Barany, F.,”A Genetic System for Isolation and Characterization of TaqI Restriction Endonuclease Mutants”, Gene, 56: 13-27 (1987)およびBarany, F., et al.,”Cloning and Sequencing of the ＴthHB8I DNA Restriction and Modification Enzymes, and Comparison With the Isoschizomeric TaqI Enzymes”, Gene, 112: 3-12 (1992)、出典明示により本明細書の一部とする)。
【０１３１】
図１０の下部図に、Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子とその転写方向を斜め平行線を引いた矢印で示す。Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子中の幾つかの制限エンドヌクレアーゼ切断部位は、太線で示す。ＰＣＲ反応に使用したオリゴヌクレオチドプライマーのおおよその位置は、Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子上に矢印とプライマー名で示す。アミノ酸残基Ｋ２９４の変異部位も示す。
【０１３２】
残基Ｋ２９４位置での部位指向性突然変異誘発法は下記のように実施した：(１)鋳型としてＨindIII−鎖状化ｐＤＺ１５を用いる場合、２つの独立したＰＣＲ反応を実施した。１つの反応管には、ＰＣＲ緩衝液１００μl中、プライマーＪＬ５０５とＪＬ５０７Ｒ ４００ngを、dＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰおよびdＴＴＰそれぞれ５０μmolesとＡmplitaqＴＭ２.５ユニットを含有するＨindIII消化ｐＤＺ１５ ２００ngに加え、(Saiki, R. K., et al., ”Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA With a Thermostable DNA Polymerase”, Science, 239: 487-491 (1988)、出典明示により本明細書の一部とする)；Perkin-Elmer Cetus Instruments, Emoryville CA.)に記載のようにしてＰＣＲサイクルにかける。第２の反応管には、同じ反応緩衝液中、プライマーＪＬ５０６とＪＬ５０８Ｒ ４００ng、ＨindIII消化したｐＤＺ１５ ２００ngおよびＡmplitaqＴＭ２.５ユニットを入れ、上記のようにインキュベーションした。(２)次いで、第３のＰＣＲ反応は、２つの初期反応から得られた生成物１μl、プライマーＪＬ５０５とＪＬ５０８Ｒ ４００ngおよびＡmplitaqＴＭ２.５ユニットを含有するＰＣＲ緩衝液１００μlにて実施し、上記のようにインキュベーションした。ＡmplitaqＴＭを除去後、大きい方のＰＣＲ産物フラグメントをＡvrIIとＢamＨＩで消化し、低融点アガロースで電気泳動した。４３６ｂｐのＡvrII−ＢamＨＩフラグメントをゲルから削り取り、既に報告(Barany, F., ”Overproduction, Purification, and Crystallization of TaqI Restriction Endonuclease”, Gene, 63: 167-177 (1988)、出典明示により本明細書の一部とする)のようにして精製した。更に、プラスミドｐＤＺ１５もまた、ＡvrIIとＢamＨＩで消化し、低融点アガロースで電気泳動した。ｐＤＺ１５から４３６ｂｐのＡvrII−ＢamＨＩフラグメントを引いたものに相当する大きい方のフラグメントを削り取り、精製した。この大きいフラグメントを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下、第３ＰＣＲ反応産物から精製した４３６ｂｐのＡvrII−ＢamＨＩフラグメントと共に１４℃で１６時間インキュベーションンした。この連結反応混合物を、既に報告(Hanahan, D., ”Studies on Transformation of E. coli With Plasmids”, J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)、出典明示により本明細書の一部とする)のようにＥ.コリ株ＡＫ７６(ts lig)に形質転換させた。プラスミド担持細胞を、高濃度のホスフェート(１０mＭＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.６)または低濃度のホスフェート(０.２mＭＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.６)のいずれかを補足した栄養強化ブロス(Fortified Broth)プレート上でレプリカプレーティングし、３２℃および４２℃で増殖させて、ts lig宿主に対する変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子の相補性能力を試験した。独立したクローンをＦＢ−高ホスフェートプレートから拾い、１０mＭＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.６を補足した液体栄養強化ブロス中で増殖させる。Promega社のマジック・ミニプレップ・キット(Magic Miniprep kit)を用いてプラスミド・ミニプレップを作り、Perkin-Elmer CorporationのApplied Biosystems Divisionからのプリズム染料デオキシ・ターミネーター・サイクル・シーケンシングキット(Prism Dye Deoxy Terminator Cycle sequencing kit)とＤＮＡシーケンサー３７３Ａを用いてＡvrII−ＢamＨＩ領域を配列決定し、Ｋ２９４位の部位特異的変異を確認した。
【０１３３】
実施例２−Ｔth ＤＮＡリガーゼ変異Ｋ２９４ＲおよびＫ２９４Ｐの構築
図１１の変異リガーゼは、下記のように図１２Ａ−Ｂのオリゴヌクレオチドを用いて調製した。Ｋ２９４部位で複数の部位特異的変異を作るためにＰＣＲ反応用の４つのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。それらの配列は次のとおりである：プライマーa (JL505) (配列番号：78): 5'CAG AAC CTC CTC ACC ATC 3'; プライマーb (JL507R) (配列番号：79): 5'CTC GTC CAG (G,C) (T, G, C, A) G CAC CAC CAC CCC GTC 3';プライマーc (JL506) (配列番号：88): 5' TGG TGG TGC (A, C, G, T) (C, G) C TGG ACG AGC TTG CCC T 3';およびプライマーd (JL508R) (配列番号：96): 5' CTC TAT GTA GCT CTC GTT GTG 3'。プライマーｂとｃは、変異部位で縮重コドンを含有する重複プライマーである。これらのプライマーは、各種試薬とPerkin-Elmer Corporation, Foster City, CAのApplied Biosystems Divisionからの３９４自動ＤＮＡ合成機を用いて合成した。合成後、プライマーを３０％水酸化アンモニウム中、５５℃で１２時間脱保護し、高速真空乾燥し、ddＨ２Ｏ(即ち、二重蒸留水)１００μlに再懸濁し、エタノール沈殿により精製した。ペレットをddＨ２Ｏ２００μlに再懸濁し、その濃度を分光測光法によりＯＤ２６０で測定した。次いで、プライマーを等分し、使用まで−２０℃で冷凍庫に貯蔵した。
【０１３４】
Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子(Ｔth lig)における部位特異的突然変異誘発法は、既に報告されている(Ho et al., Gene 77: 51-59 (1989)、出典明示により本明細書の一部とする)２段階ＰＣＲベースの重複伸長法を用いて実施した。プラスミドｐＤＺ１５、Ｔth ＤＮＡリガーゼの発現プラスミド(Barany, et al., Gene 109: 1-11 (1991)およびHorton, et al.,”Engineering Hybrid Genes Without the Use of Restriction Enzymes: Gene Splicing by Overlap Extension”, Gene 77: 61-68 (1989)、出典明示により本明細書の一部とする)を制限エンドヌクレオアーゼＨindIIIで鎖状化し、第１ラウンドのＰＣＲ反応の鋳型として使用した。プライマーａ(ＪＬ５０５)とｂ(ＪＬ５０７Ｒ)またはプライマーｃ(ＪＬ５０６)とｄ(ＪＬ５０８Ｒ)をそれぞれ用いて、第１ラウンドのＰＣＲ反応を２つ別個に実施した。第１ラウンドＰＣＲ反応それぞれの産物１マイクロリットルをプライマーａ(ＪＬ５０５)とｄ(ＪＬ５０８Ｒ)による第２ラウンドＰＣＲ反応の鋳型として使用した。得られた産物を制限エンドヌクレアーゼＡvrIIとＢamＨＩで消化し、シープラーク(SeePlaque)低融点アガロースゲルで分離した。変異部位を含むと予想されるＤＮＡフラグメントを低融点アガロースゲルから切り取り、フェノール抽出により精製し、その後、ＡvrIIおよびＢamＨＩ消化によりｐＤＺ１５から作った大きいほうのフラグメントに連結させた。連結反応は、１４℃で１６時間実施した。得られた連結反応混合物は、細菌染色体上のリガーゼ遺伝子中に温度致死変異を含有する細菌株、ＡＫ７６(lig ts7株、Barany, et al., Gene 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)を形質転換させるのに使用した。５０μg/mlアンピシリンを含有するＴＹプレート上で形質転換体を増殖させることにより、ポジティブ形質転換体を選択した。プラスミドＤＮＡミニプレップは、Promega社のマジック・ミニプレップカラムを用いて形質転換体から作製した。Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CAのApplied Biosystems Divisionからのプリズム染料デオキシ・ターミネーター・サイクル・シーケンシングキット(Prism Dye Deoxy Terminator Cycle sequencing kit)とＤＮＡシーケンサー３７３Ａを用いてＰＣＲ反応中で増幅される領域を配列決定し、その変異を確認した。
【０１３５】
実施例３−Ｅ.コリ中の変異Ｔth ＤＮＡリガーゼの発現
phoＡプロモーターの制御下で変異Ｔth ＤＮＡリガーゼを含有するプラスミドを形質転換によりＥ.コリ株ＡＫ５３に導入した。変異Ｔth ＤＮＡリガーゼタンパク質を３０℃で１５時間、０.２mＭ Ｋ２ＨＰＯ４と７５μg/mlアンピシリンを含有するＭＯＰＳ培地(Neidhardt, et al., J. Bacteriol., 119: 736-47 (1974)、出典明示により本明細書の一部とする)中で過剰発現させた(F. Barany, et al., Gene 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)。細胞を遠心して集め、ＶＷＲ社のソニファイヤー３５０細胞破壊機(Sonifier 350 cell disruptor)にてマイクロプローブと共に３×１０秒間超音波処理したＴＥ(１０mＭトリス、ｐＨ８.５、１ｍＭＥＤＴＡ)４００μlに懸濁し、４℃で１０分間遠心した。上清を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２および０.５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴおよび２ｍＭ２−メルカプトエタノールに順応させた。６４℃で２５分間インキュベーション後、濁った懸濁液を４℃で１５分間遠心して透明化した。クマシー・ブリリアント・ブルーと共に０.１％ＳＤＳを含有する７.５％ポリアクリルアミドゲルの染色により測定したところ、得られた透明懸濁液中総タンパク質の７０％以上がＴth ＤＮＡリガーゼであった。およそ２００μgのＴth ＤＮＡリガーゼを培養物６mlから単離した。いずれの変異Ｔth ＤＮＡリガーゼも、ＡＫ５３中で過剰発現し、６５℃で熱処理後も可溶性のままであった。
【０１３６】
実施例４−相補性アッセイ
変異したＴth ＤＮＡリガーゼ遺伝子を含有するプラスミドを温度感受性リガーゼ欠損Ｅ.コリ株ＡＫ７６(lig ts7 株)(F. Barany, et al., Gene 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)に形質転換により導入した。個々の形質転換体を、高ホスフェートプレート(０.６％ＮａＣｌ、２.５％バクト−トリプトン、０.７５％酵母エキス、０.１％デキストロースおよび１０mＭＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.６および５０μg/mlアンピシリン)および低ホスフェートプレート(０.２mＭＫ２ＨＰＯ４)(Neidhardt, et al., J. Bacteriol., 119: 736-47 (1974)、出典明示により本明細書の一部とする)上でレプリカプレーティングし、許容(３２℃)および非許容(４２℃)温度でそれぞれ一晩インキュベーションした。Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子は、低ホスフェート濃度でのみ誘導される。プラスミドによりコードされた活性酵素は、低ホスフェートプレート上４２℃で温度感受性宿主を増殖させることができる。
【０１３７】
実施例５−アデニレーション(adenylation)アッセイ
アデニレーションは、野生型と上記で調製した変異のＴth ＤＮＡリガーゼおよそ８μg(１００fmoles)を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、０.５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＮＡＤ＋、１ｍＭＤＴＴ、２ｍＭ２−メルカプトエタノールを含有する反応緩衝液１００μl中６５℃で２５分間インキュベーションすることによりアッセイした。これらの条件下、野生型リガーゼは全て、事実上、アデニル化(adenylated)形態で見られた。１２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、０.０２％ブロモフェノールブルー、および３００ｍＭ２−メルカプトエタノールを含有する等容量の２×サンプル緩衝液の添加により反応を止めた。サンプルを５分間沸騰させ、７.５％ポリアクリルアミド−０.１％ＳＤＳゲル上に５０μlを充填することにより分析した。アデニル化酵素は、脱アデニル化形態(７８Ｋｄ)よりも見かけの分子量が高い(８１Ｋｄ)ので識別できる。
幾つかの変異ではアデニレーション後も移動度が変わらないという可能性を除外するために、放射性[３２Ｐ]ＮＡＤ＋を用いる実験も実施した。この場合、反応は、３.３μＣi[３２Ｐ]ＮＡＤ＋(８００Ｃi/mmol、NEN-DuPont Company, Chadds Ford, PA)を使用する以外は上記と同じ条件下、反応混合物２５μl中で実施した。６５℃で１５分インキュベーション後、非放射性ＮＡＤ＋１.５pmolesを反応混合物に加え、５分以上インキュベーションさせてアデニレーション反応をほぼ完了するまで進める。２×サンプル緩衝液２５μlを添加して反応を止める。得られた混合物を１００℃で５分間沸騰させ、その後７.５％ポリアクリルアミド−０.１％ＳＤＳゲルにて分析した。このゲルを室温で３時間、コダックＸＡＲ−５フィルム対してオートラジオグラフィーにかけた。各レーンのタンパク質サンプルを確かめるために、次いで、ゲルをクマシー・ブリリアント・ブルーで染色した。
【０１３８】
実施例６−脱アデニレーション(deadenylation)アッセイ
脱アデニレーション活性(酵素からＤＮＡ基質へのアデニル基の転移)についてアッセイするために、鮭精子ＤＮＡ(Sigma, St. Louis)を膵臓ＤＮase Ｉ(Barany et al., Gene 109: 1-11 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)とインキュベーションすることにより調製したニック形成鮭精子ＤＮＡ５μgを１ｍＭＮＡＤ＋の代わりに使用した以外はアデニレーション実験と同じ条件を使用した。脱アデニル化酵素は、７.５％ポリアクリルアミド−０.１％ＳＤＳゲルでの電気泳動により分離した場合、高速移動バンド(７８Ｋｄ)として認識された。
【０１３９】
実施例７−[γ−３２Ｐ]ＡＴＰによるオリゴヌクレオチドプローブの５’−標識
オリゴヌクレオチドプローブＪＬ５１４を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、[γ−３２Ｐ]ＡＴＰ(６０００Ｃｉ/mmol、NEN-DuPont Company)４５pmole、ゲル精製オリゴヌクレオチド１５pmoleおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を含有する反応物１０μl中、３７℃で４５分間インキュベーション後、５’標識した。１０mＭＡＴＰ １μlを反応混合物に加え、インキュベーションを２分以上続けた。６０ｍＭＥＤＴＡを加えて反応を止めた。キナーゼを６４℃で２０分間インキュベーションすることにより熱不活性化した。リン酸化オリゴヌクレオチドをＴＥ緩衝液中で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムにて分離した。リン酸化オリゴヌクレオチドを含有するフラクションを集め合わせ、使用まで等分ずつ−２０℃で貯蔵した。リン酸化オリゴヌクレオチドＪＬ５１４の比放射能は、９×１０６cpm/pmolであった。
【０１４０】
実施例８−ニック−閉鎖(closure)活性についてのアッセイ
２つの短いオリゴヌクレオチドプローブ(ＪＬ５３８およびＪＬ５１４)をより長い相補性オリゴヌクレオチド標的(ＪＬ５３９)にアニーリングすることによりニック形成ＤＮＡ二本鎖基質を形成させた。これらのヌクレオチド配列は：JL538 (配列番号：75): 5' AAC CAC AGG CTG CTG CGG ATG CCG GTC GGA G 3'; JL514 (配列番号：76): 5' AGA GCC GCC ACC CTC AGA ACC GCC ACC CTC 3'; JL539配列番号：77): 5' GAG GGT GGC GGT TCT- GAG GGT GGC GGC TCT CTC CGA CCG GCA TCC GCA GCA GCC TGT GGT T 3'である。
反応は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＮＡＤ＋とニック形成ＤＮＡ二本鎖基質６０fmolを含有する緩衝液４０μl中で実施した。ＤＮＡプローブと標的は、反応混合物を９４℃で２分間インキュベーションして変性させ、６５℃で２分間再度アニーリングした。連結反応は、Ｔth ＤＮＡリガーゼの添加により開始し、６５℃で３０分間実施した。停止溶液(８３％ホルムアミド、８.３ｍＭＥＤＴＡおよび０.１７％ブルーデキストラン)４０μlを添加して反応を止めた。サンプルを９３℃で２分間変性させ、迅速に氷で冷却し、その後、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲル上に２０μlを充填した。電気泳動後、ゲルをホスホリメジャースクリーン(phosphorimager screen)に２０分間さらした。放射性標識連結反応産物をMolecular Dynamics Phosphorimager (Sunnyvale, CA)にて分析し、Image-Quant ソフトトウェアを用いて定量した。
【０１４１】
Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子のアミノ酸配列は、２つの短い配列、Ｋ１１８ＶＤＧとＤＧＶＶＶＫ２９４を含み、これらは、ヒトＤＮＡリガーゼＩの活性部位配列(ＫＹＤＧＱＲ)に似ている。ヒトＤＮＡリガーゼＩはコファクターとしてＡＴＰを必要とするのに対し、Ｔth ＤＮＡリガーゼではその代わりにＮＡＤ＋を使用し、酵素アデニレート(enzyme-adenylate)形成に対するそれらの活性部位が異なることもあり得る。配列Ｋ１１８ＶＤＧは、配列ＤＧＶＶＶＫ２９４以上にヒトＤＮＡリガーゼＩ、IIIおよびＩＶの活性部位配列(ＫＹ/ＬＤＧＸＲ)に似ており、アデニレーションについて両方の配列を試験した。
【０１４２】
部位特異的変異は、３つのアミノ酸部位Ｋ１１８、Ｄ１２０およびＫ２９４(図１１)で構築した。側鎖変更領域を暴露するために各部位に少なくとも４つの異なる単一アミノ酸置換を施した(図１１)。変異Ｔth ＤＮＡリガーゼをＡＫ５３細胞中で過剰発現させ、部分的に精製し、７.５％ポリアクリルアミド−０.１％ＳＤＳゲルで分析した(Barany, et al.,”Cloning, Overexpression, and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA Ligase Gene”, Gene 109:1-11(1991)、出典明示により本明細書の一部とする)。Ｔth ＤＮＡリガーゼ遺伝子を欠くプラスミドベクターで形質転換させたＥ.コリ細胞は、Ｔth ＤＮＡリガーゼの分子量範囲(７６−８１Ｋｄ)にはなんのタンパク質も示さなかったが、宿主細菌由来の熱耐性不純物が若干認識できる。野生型Ｔth ＤＮＡリガーゼおよびＫ２９４でアミノ酸置換した変異リガーゼは、電気泳動の際、二重バンドとして移動する。見かけの分子量が８１Ｋｄの上側のバンドは、アデニル化形態であるのに対し、下側の７８Ｋｄのバンドは、脱アデニル化形態である。同上。Ｋ１１８とＤ１２０の１０の変異リガーゼのうち９つは、単一バンドとして移動した。例外はＤ１２０Ｅであり、その大多数がアデニル化形態として発現されたが、脱アデニル化形態も非常に少量見られた。
部分精製した変異Ｔth ＤＮＡリガーゼを、ＮＡＤ＋の存在下でアデニレーションについて、また、ニック形成鮭精子ＤＮＡの存在下で脱アデニレーションについてアッセイした。試験した野生型酵素も全Ｋ２９４変異もＮＡＤ＋の存在下でアデニル化され、ニック形成鮭精子ＤＮＡと共にインキュベーションすると脱アデニル化される。
【０１４３】
【表１】
0005575380.tif 000013
【０１４４】
Ｋ１１８部位での変異体は全て、ＮＡＤ＋またはニック形成鮭精子ＤＮＡのいずれかで処理しても変化せず、これは、アデニレーションまたは脱アデニレーション反応における欠失の可能性を示す。同様に、変異体Ｄ１２０Ｖもまた、アデニレーションまたは脱アデニレーションにおける欠失を示した(表１)。変異体Ｄ１２０Ａ、Ｄ１２０Ｇ、Ｄ１２０ＹおよびＤ１２０Ｎは、アデニレーションを受けた(下記参照)が、移動度変化は変異体の幾つかでは識別困難であった。Ｅ.コリ細胞から単離した場合、変異体Ｄ１２０Ｅタンパク質の殆どはアデニル化形態のままであり、これは、脱アデニレーション段階の際の欠失の可能性を示す。変異体Ｄ１２０Ｅと野生型酵素５μgをニック形成鮭精子ＤＮＡ２.５μgと共にインキュベーションすると、野生型酵素は完全に脱アデニル化され、Ｄ１２０Ｅの殆どはアデニル化形態として残った(データ示さず)。しかしながら、変異体Ｄ１２０Ｅは、ニック形成鮭精子ＤＮＡ量を２５μg以上に上げると、実質的に脱アデニル化された。反応混合物にはβ−ニコチンアミドモノヌクレオチド(ＮＭＮ)を添加していないので、この変更がアデニレーション段階の反転によるとは考えられない。よって、変異体Ｄ１２０Ｅは、ＤＮＡ基質に対する親和性が低いか、またはＡＭＰ部分をＤＮＡ基質の５’ホスフェートに転移する速度が低いかのいずれかである。
【０１４５】
幾つかの変異体がＳＤＳゲル上での移動度を変えずにアデニル化され得るという可能性を除外するために、[３２Ｐ]ＮＡＤ＋を用いるアデニレーションも実施した。放射性基質でアッセイすると、Ｋ１１８変異体はどれもアデニル化されなかったが、野生型酵素からは強い放射性アデニル化酵素のバンドが得られた。このことは、Ｋ１１８が酵素アデニレート形成のためには必須であることを示す。Ｄ１２０部位での変異体はＤ１２０Ｖ以外は全て、野生型酵素の場合に匹敵する量の放射性ＡＭＰを取り込んでいた。しかしながら、オートラジオグラフィー後、ゲルをクマシー・ブルーで染色すると、変異体タンパク質Ｄ１２０ＹとＤ１２０Ｇは部分アデニレーションのみを示し、これは、放射性アッセイの感受性がより高いことを示す。変異体Ｄ１２０Ａは、その電気泳動移動度を変えることなく、酵素アデニレートを形成したのに対し、変異体Ｋ１１８Ｐ１とＫ１１８Ｐ２はアデニレーションの結果としてではなく、リジンをプロリンに置換することにより生じたコンホーメーション変化によって移動度を変えた。よって、首尾よいアデニレーションでは、普通、コンホーメーション変化(ＳＤＳゲルでの移動度の変化により証明される)が観察されるが、酵素アデニレート複合体の形成を止める同一変異の幾つかによっても達成され得る。
【０１４６】
Ｔth ＤＮＡリガーゼの全活性に対するＫ１１８、Ｄ１２０およびＫ２９４でのアミノ酸置換の効果を、相補性アッセイおよびインビトロ連結反応アッセイ(表１)によって試験した。このインビトロアッセイでは、様々な濃度の野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼをニック形成ＤＮＡ二本鎖基質(合成標的にハイブリダイズした２つのプローブから構成される)と共にインキュベーションし、連結反応産物を変性ゲルにて分離した。野生型Ｔth ＤＮＡリガーゼは、Ｅ.コリlig ts7宿主と相補であったが、Ｋ１１８とＤ１２０の変異は相補でなかった。Ｋ１１８変異体も全て、インビトロ連結反応活性を欠失していたが、予想外にも、幾つかのＤ１２０変異は、若干のインビトロ活性を保持した(表１)。変異体Ｄ１２０ＥとＤ１２０Ｎは、それぞれ６.２％と８.５％の活性を有したのに対し、Ｄ１２０Ｙ、Ｄ１２０ＧおよびＤ１２０Ａは全て、０.５％活性以下であった。Ｄ１２０Ｖではインビトロ活性はなんら検出されなかった。Ｋ２９４変異体は、二重変異Ｋ２９４P/Ｇ３３９Ｅ１つを除いて全て、４２℃でのＥ.コリ lig ts7宿主増殖を支持し、並びに、顕著なインビトロ酵素活性を保持した。異常型クローンは、Ｅ.コリ lig ts7宿主と相補でなかったが、アデニレーションおよび脱アデニレーションに対して正常活性を示した。このクローンの配列決定により、Ｋ２９４Ｐに加えて第２変異のＧ３３９Ｅが明らかになった。更に、ホスホジエステル結合の形成にＧ３３９が関連する可能性を研究し、下記に論じる。
【０１４７】
Ｋ１１８、Ｄ１２０およびＫ２９４の単一アミノ酸置換に関する結果は、酵素アデニレート形成にとって重要であり、Ｄ１２０は脱アデニレーションを促進し、よって、Ｋ１１８ＶＤＧがＴth ＤＮＡリガーゼアデニレート(adenylate)形成部位であることが推論される。このことは、ＫＸＤＧがＮＡＤ＋依存性ＤＮＡリガーゼの活性部位であり得るという配列アラインメントからの予想を支持するものである。同様の結果が、部位指向性突然変異誘発法を用いて、ＡＴＰ−依存性ヒトＤＮＡリガーゼＩ(Kodama, K., et al., Nucleic Acids Res., 19: 6093-99 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)や、ワクシニアＤＮＡリガーゼ(Cong, P., et al., J. Biol.Chem., 268: 7256-60 (1993)およびShuman, S., et al., Virology, 211: 73-83 (1995)、出典明示により本明細書の一部とする)についても報告された。ヒトＤＮＡリガーゼＩにおけるＨisまたはＡrgによる活性部位Ｌys(Ｋ５６８)の置換、およびワクシニアＤＮＡリガーゼにおけるＡsnまたはＡrgによるＫ２３１の置換は、アデニレーション活性の損失を引き起こした。ヒトＤＮＡリガーゼＩにおける保存Ａsp(Ｄ５７０)位でのＡsn、ＧluおよびＧlnへの変異は、酵素アデニレート形成を低減させ、インビボ相補性の損失を引き起こした(Kodama, K., et al., Nucleic Acids Res., 19: 6093-99 (1991)、出典明示により本明細書の一部とする)。ＫＥＤＧモチーフは、アデニル化ペプチドの質量分析(Thogersen, H.C., et al., Eur. J. Biochem., 14-: 325-29 (1985)、出典明示により本明細書の一部とする)と部位指向性突然変異誘発研究(Heaphy, S., et al., Biochemistry, 26: 1688-96 (1987)、出典明示により本明細書の一部とする)に基づき、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの活性部位として同定された。この酵素では、保存Ａsp(Ｄ１０１)のＡsn、ＳerまたはＧluによる置換は、酵素アデニレート形成に対して十分に許容されるのに対し、脱アデニレーションおよびホスホジエステル結合形成段階は、各変異により完全に保護されている。このＡsp残基は置換３’−ＯＨ末端またはアデニレート基よりもむしろ置換５’−ホスフェート末端と相互作用することが示唆された。我々のＤ１２０置換も全て、相補性活性の損失を引き起こしたが(インビボ、４２℃でアッセイ)、Ｄ１２０ＥやＤ１２０Ｎは依然として、インビトロ連結反応活性を保持した(６５℃でアッセイ、表１参照)。故に、Ｄ１２０は明らかにＴth ＤＮＡリガーゼにおける脱アデニレーションを促進するが、連結反応にとってはそれほど必須のものではない。この事実は、キャップ形成酵素とＡＴＰ依存性リガーゼの研究に基づくShumanとSchwerによる同様の結論の確証となる(Shuman, S., et al., Molec. Microbiol., 17:; 405-10 (1995)、出典明示により本明細書の一部とする)。
【０１４８】
ＫＴＤＧモチーフは、酵素グアニル酸形成に対する、ワクシニアウイルス(Cong, P., et al., J. Biol. Chem., 268: 7256-60 (1993)、出典明示により本明細書の一部とする)、Ｓ.cerevisiae（Fresco, L. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 6624-28 (1994))およびSschwer, B., et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 4328-32 (1994)、出典明示により本明細書の一部とする)およびＳ. pombe（Shuman, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12046-50 (1994)、出典明示により本明細書の一部とする)のｍＲＮＡキャップ形成酵素の活性部位であることが論理的に導き出された。酵母ｔＲＮＡリガーゼでは、アデニル化ペプチドを配列決定することによりアミノ酸配列ＫＡＮＧが同定された(Xu, Q., et al., Biochemistry, 29: 6132-38 (1990)、出典明示により本明細書の一部とする)。５種のキャップ形成酵素と１４種のＡＴＰ依存性ＤＮＡおよびＲＮＡリガーゼを比較すると、ＲＮＡまたはＤＮＡ基質に対するヌクレオチジル結合および転移において役割を果たす５種の進化論的保存モチーフのスーパーファミリーが示唆される(Shuman, S., et al., Mole. Microbiol., 17: 405-10 (1995); Shuman, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12046-50 (1994)およびCong, P., et al., Molec. Cell. Biol., 15:6222-31 (1995)、出典明示により本明細書の一部とする)。これらの初期研究から、ＮＡＤ＋要求リガーゼでの本研究に加えて、ＫＸＤ/ＮＧは、核酸基質において共有ホスホジエステル結合を形成するためのエネルギーを提供する、荷電酵素ヌクレオチド複合体を作るための普遍的な活性部位モチーフとしてみなすことができる。
【０１４９】
二重変異(Ｋ２９４/Ｇ３３９Ｅ)がリガーゼ活性を損失するという観察は、Ｇ３３９が連結反応の第３段階、即ち、ホスホジエステル結合の形成に重要であることを示す。この作用がＧ３３９部位での１つの変異により引き起こされるのであり、２つの変異の付加作用によるものではないことを確認するために、部位指向性突然変異誘発法によりＧ３３９位に単一アミノ酸置換を施した。部位特異的突然変異は、Ｇ３３９近くの保存陽性荷電アミノ酸であるＲ３３７位、およびＣ４１２、Ｃ４１５、Ｃ４２８およびＣ４３３にも施した(図１１)。Ｔth ＤＮＡリガーゼには４つのＣys残基のみがあり、配列決定した５種のＮＡＤ＋−依存性細菌リガーゼの中で全て保存されていた。これらの４つのＣys残基は、亜鉛結合部位を形成でき、細菌ＤＮＡリガーゼとＤＮＡ基質との相互作用に関与し得る(Thorbjarnardottir, S. H., et al., Gene, 161:1-6 (1995)、出典明示により本明細書の一部とする)。
【０１５０】
これら６部位で構築したＴth ＤＮＡリガーゼ変異体は全て、ＮＡＤ＋の存在下で酵素アデニレート複合体を形成でき、ニック形成鮭精子ＤＮＡの存在下で脱アデニル化された(表２)。全体的なリガーゼ活性に対する作用は、各変異毎に変わったが、インビボ活性とインビトロ活性を比較したところ、全体的に一定であった(表２)。
【表２】
0005575380.tif 000014
【０１５１】
変異体Ｒ３３７ＱおよびＲ３３７Ｅは活性を損失し、イー・コリlig  ts7宿主と相補的ではなかったが、変異体Ｒ３３７Ｋは部分的インビトロ活性および相補性を維持した。Ｇ３３９のＡｌａ、ＡｓｐまたはＧｌｕによる置換は、総てインビボおよびインビトロの両方で酵素を不活性化した。Ｃ４１２において、Ａｌａによる置換はインビボおよびインビトロの両方で効果を有しなかったが、Ｖａｌ、ＴｈｒおよびＭｅｔによる置換は、総ての酵素活性の損失をもたらした。同様の結果がまたＣ４２８でも見られた。Ｃ４１５部位の４つの変異のうち３つ(Ｃ４１５Ａ、Ｃ４１５ＶおよびＣ４１５Ｔ)、総てが相補性および酵素活性を保持した。変異が酵素熱不安定性を付与し得るが、Ｃ４１５Ｍがこのような乏しい酵素活性(６５℃でアッセイ)で相補性活性(４２℃でアッセイ)を保持するか、理由は明らかではない。比較して、Ｃ４３３部位(Ｃ４４３Ａ、Ｃ４４３Ｖ、Ｃ４４３ＴまたはＣ４４３Ｍ)での総ての変異は相補性および酵素活性の両方の損失をもたらした。
【０１５２】
多くのＤＮＡリガーゼのアデニレーション活性部位が十分定義されているが、ホスホジエステル結合の形成の可能性の有る部位はあまり理解されていないままである。残基Ｇ３３９およびＣ４３３は、連結反応のこの第３段階に関与し得る。なぜなら、両方の部位での保存的変異が最初の２つの段階であるアデニル化および脱アデニル化に作用することなく総ての酵素活性を失わせるためである。残基Ｇ３３９は酵素活性に重大な局所構造を可能にし得るか、またはペプチド骨格を介して、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＡｓｐ置換と不適合である方法でＤＮＡ基質と相互作用する。グリシン残基は、これらの変異が酵素−グアニレート形成により妨害されるが、ｍＲＮＡキャッピング酵素において必須の役割をになう(出典明示により本明細書の一部とするShuman, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12046-50 (1994)およびCong, P. et al., Molec. Cell. Biol., 15:6222-31 (1995))。残基Ｒ３３７、Ｃ４１２およびＣ４２８は、連結反応の第３段階で、非保存的変異のみがこの段階で活性の損失をもたらすため、間接的であるが、必須ではない役割を担う。これらの５つの残基での総ての変異に関して、ＮＡＤ＋存在下での酵素−アデニレート複合体を形成する能力、およびニックＤＮＡ基質存在下での脱アデニル化の能力により示されるようなこれらの変異体による劇的な広い構造の変化はなかった。連結反応の第３段階の活性部位は、最初の２つの段階と十分区別し得る。これらの活性部位は互いに無関係に機能し、一つの部位での障害が他の活性に影響し得ない。
【０１５３】
要約として、部位特異的変異誘発実験を、ＴthＤＮＡリガーゼの活性部位の同定のために行った。ＴthＤＮＡリガーゼのアデニル化活性部位および促進された脱アデニル化部位はモチーフＫ１１８ＶＤＧのＬｙｓおよびＡｓｐ残基として同定された。これらの結果は、ＤＮＡリガーゼ(出典明示により本明細書の一部とするKodama, K., et al., Nucleic Acids Res., 19:6093-99 (1991);Cong, P., et al., J. Biol. Chem., 268:7256-60 (1993)およびShuman, S., et al., Virology, 211:73-83 (1995))、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ(出展明示により本明細書に包含させるHeaphy, S., et al., Biochemistry, 26:1688-96 (1987))およびｍＲＮＡキャッピング酵素(出典明示により本明細書の一部とするCong, P., et al., J. Biol. Chem., 268:7256-60 (1993);Fresco, L. D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6624-28 (1994);Schwer, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4328-32 (1994);Shuman, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12046-50 (1994);およびCong, P., et al., Molec. Cell. Biol., 6222-31 (1955))の活性部位における他の変異誘発実験と一致する。共に、ＫＸＤ／ＮＧが酵素−ヌクレオチド複合体の形成の活性部位モチーフであるという考えを支持する。残基Ｇ３３９およびＣ４３３での変異はアデニル化および脱アデニル化を阻害しなかったが、総ての活性を無くし、これらの二つのアミノ酸残基が連結反応の第３段階であるホスホジエステル結合の形成に関与し得ることを示す。
【０１５４】
実施例９  −  オリゴヌクレオチドプローブの合成
オリゴヌクレオチドプローブは、Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation (Foster City, CA)の試薬およびモデル３９４自動ＤＮＡ合成装置を使用して合成した。フルオレッセント標識を６−ＦＡＭ(６−カルボキシフルオレッセイン)アミデイトを使用してオリゴヌクレオチドの５’末端に結合したか、またはApplied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation Applied Biosystems DivisionのＮＨＳ−ＦＡＭ(ＦＡＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル)を使用して、３’−アミノ基(Glen ResearchのＣ３−ＣＰＧカラム(Sterling, VA))に結合した。一般的ヌクレオチド同族体であり、本明細書でＱと呼ぶ１−(２’−デオキシ−ｂ−Ｄ−リボフラノシル)−３−ニトロピロールを、記載(出典明示により本明細書の一部とするBergstrom, D. E., et al., JACS, 117:1201-1209 (1995))のように合成し、ホスホロアミデイトに形質転換し、オリゴヌクレオチド合成した。本実験で使用した総てのオリゴヌクレオチドをポリアクリルアミドゲル電気泳動で、ＤＮＡのゲルスライスからの回収をWaters Division of Millipore (Bedford, MA)のＣ１８−Sep-Pak Cartridgesを使用して行った。
【０１５５】
実施例１０  −  オリゴヌクレオチドプローブの５’−リン酸化
ゲル精製オリゴヌクレオチド１nmoleを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰおよび１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を含む２５μl反応物中で、３７℃で４５分、リン酸化した。反応を０.５Ｍ  ＥＴＤＡ  ０.５μlの添加により停止させ、キナーゼを６４℃で２０分インキュベートすることにより熱不活性化した。リン酸化オリゴヌクレオチドを使用まで５μl量で−２０℃で貯蔵した。
【０１５６】
実施例１１  −  野生型および変異ＴthＤＮＡリガーゼの精製
野生型ＴthＤＮＡリガーゼを、ｐｈｏＡプロモーターコントロール下にＴthリガーゼ遺伝子を含むイー・コリ株から、いくつか修飾しながら記載(出典明示により本明細書の一部とするBarany, F., et al., Gene, 109:1-11 (1991))のように精製した。簡単に、細胞を一晩３０℃で低リン酸(誘導)培地で生育させ、回収し、融解緩衝液(２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８.５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０.１５Ｍ  ＰＭＳＦ)に再懸濁し、超音波処理(出典明示により本明細書の一部とするBarany, F., et al, Gene, 109:1-11 (1991))した。細胞残骸の除去後、上清を２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８.５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴおよび２ｍＭ  ２−メルカプトエタノールに調節し、６５℃で３０分インキュベートし、４℃で遠心することにより浄化した。上清を等量の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡで希釈し、濾過し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％グリセロールで平衡化した１０ml  Red-Sepharoseカラム(Pharmacia)に充填した。タンパク質を、PharmaciaのＦＰＬＣ装置を使用して、５０ｍＭから１Ｍ  ＫＣｌの３０ml直線塩勾配で溶出した(出典明示により本明細書の一部とするTakahaski, M., et al., Agric. Bio. Chem., 50:1333-1334 (1986))。ＴthＤＮＡリガーゼは０.４−０.８Ｍ  ＫＣｌの間で溶出し、純粋Ｔthリガーゼ(クーマシー染色７.５％ポリアクリルアミド−０.１％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでアデニル化および脱アデニル化形のダブレットとして見られる)を含むＤＮＡフラクションをプールした。酵素を等量の飽和硫酸アンモニウムで沈殿し、ペレットを１.５ml  ｄＨ２Ｏに溶解し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０.２mg／ml  ＢＳＡおよび５０％グリセロール含有貯蔵緩衝液５００mlに対して４℃で透析した。タンパク質濃度をブラッドフォード法(出典明示により本明細書の一部とするBradford, M.M., Anal. Biochem., 72:248-254 (1976))により測定した。約４mgのＴthＤＮＡリガーゼを４５０mlの培養から得た。変異体ＴthＤＮＡリガーゼを先に記載のように部分的に精製した。
【０１５７】
実施例１２  −  ＴthＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の適合性アッセイ
各反応を、ニックＤＮＡ二本鎖基質で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＤＴＴ；１ｍＭ  ＮＡＤ＋；および１２.５ｎＭ(１００fmoles)を含む緩衝液４０μl中で行った。ＤＮＡプローブを変性(９４℃で２時間)し、再アニール(６５℃で２分)し、０.１２ｎＭ(５fmoles)ＴthＤＮＡリガーゼの添加により連結反応を開始し、６５℃で行った。５μl量を０時間、２時間、４時間、６時間、８時間および２３時間に取り、停止溶液(８３％ホルムアミド、８３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１７％ブルー・デキストラン)１８μlと混合した。この混合物５μlに、レーン内標準で蛍光標識したＲＯＸ−１０００  ０.５μlを添加した。サンプルを９３℃で２分変性し、氷で急速に凍結させ、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに充填し、モデル３７３Ａ自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation)で１４００Ｖ(一定ボルト数)で電気泳動した。電気泳動条件は、製造者の指示通りであった。ゲルを１.２×ＴＢＥ(５４ｍＭトリス−ホウ酸および１.２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０)中で重合化し、０.６×ＴＢＥ(２７ｍＭトリス−ホウ酸および０.６ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８.０)の流動緩衝液で、３０分、サンプルの正常流と逆の電極極性で予め流し、サンプルを充填した。予め流し、サンプルを充填した後、ゲルを正常の頂上から下の方向で２.５時間流した。蛍光標識した連結反応産物を分析し、Genescan 372 ヴァージョン１.２ソフトウエア(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation)を使用して定量し、結果をDeltaGraph Pro3ソフトウエア(DeltaPoint, Inc. Monterey, CA)を使用してプロットした。
【０１５８】
実施例１３  −  ＴthＤＮＡリガーゼによる完全マッチおよびミスマッチ連結反応の初速度の測定
これらの実験の条件は、図面の簡単な説明に示すように異なる量のＴthＤＮＡリガーゼおよび異なるプローブを使用する以外、適合性アッセイと同じであった。反応を１２.５ｎＭ(２pmoles)のニックＤＮＡ二本鎖基質含有反応緩衝液１６０μl中、６５℃で行った。ＤＮＡプローブおよび標的を反応混合物を９４℃で２分インキュベートすることにより変性し、６５℃で２分再アニールした。連結反応をＴthＤＮＡリガーゼの添加により開始した。一定量(１０μl)をミスマッチ基質含有反応については０、２、４、６、８および１０時間に：およびマッチ基質含有反応については０、１０、２０、３０、４０、５０、６０および７０秒に回収した。マッチ基質を使用したアッセイのために、２.５μlサンプルを２.５μl充填緩衝液、０.５μl  ＲＯＸ−１０００と混合し、ゲル電気泳動をした。３７３ＡＤＮＡシークエンサーでのフルオレッセントサンプルの直線検出範囲が０.１fmolから１０fmolの範囲であるため、１％より少ない収率のミスマッチ連結反応の産物を正確な定量のためにエタノール沈殿により濃縮した。１０μl量から、９.５μlをＴＥ緩衝液(１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ)で２００μlとし、担体としての酵母ｔＲＮＡ  ４μgとエタノール沈殿させた。ペレットを５μl充填緩衝液および０.５μl  ＲＯＸ−１０００に再懸濁し、ゲル電気泳動した。未反応フルオレッセントプローブの量を、１０μl量の０.５μlを４.５μl充填緩衝液と０.５μl  ＲＯＸ−１０００で希釈することにより測定した。サンプルを変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、得られたものを上記のように分析した。初速度をｘ軸が時間、ｙ軸が産物の収率であるグラフの直線の傾斜から計算した。
【０１５９】
実施例１４  塩基同族体およびニックの３’側の３位にミスマッチを含むオリゴヌクレオチドプローブの製造
塩基同族体またはニックの３’側の３位にミスマッチを挿入することにより、ＴthＤＮＡリガーゼを使用したＬＤＲ反応の適合性を改善する可能性を試験するために、オリゴヌクレオチドプローブを設計した。これらの１０個の識別したプローブを５つの対に分けた。各対の二つのプローブは３’末端の一つの塩基が異なる(”Ｃ”または”Ｔ”)。３’末端に”Ｃ”を有するプローブは、”Ｔ”プローブより５’末端に二つ多い塩基を有し、配列決定ゲルにおける連結反応産物の区別を可能にする。３’末端から３位の塩基同族体”Ｑ”および他の塩基は下線を引く。ニックＤＮＡ二本鎖基質を左側プローブの一端 (例えば、ＳＬＰ３’ＴＴＴ)、および共通蛍光標識プローブCom610-3’Fを鋳型プローブ(例えば、GLg.m3A)にアニールすることにより形成する。この基質はニックの３’側にＴ−Ｇミスマッチを含む。ミスマッチおよび完全マッチ連結反応産物の正確な定量は、Genescanプログラムを使用した蛍光標識産物の走査により達成できる。完全マッチ連結反応の、ミスマッチ連結反応を超える初速度は、ＬＤＲ反応のマッチ性を示す。余分のミスマッチまたは塩基同族体を、適合性を改善するためにニックの３’側の３位に挿入した。図１７Ａにおいて、プローブＳＬＰ３’Ｑ２ＴＣ、ＳＬＰ３’Ｑ２ＴＴ、ＳＬＰ３’ＴＴＣおよびＳＬＰ３’ＴＴＴを標的GLg.m3Aで使用し、３’側から３位のＴ：Ａマッチと比較して増加したマッチ性におけるＱ２：Ａの寄与を試験した。ＳＬＰ３’ＴＴＣおよびＳＬＰ３’ＴＴＴプローブを標的Glg.m3AおよびAlg.m3Aの組み合わせで使用し、共通標的(正常ＤＮＡ)の過剰における、少ない標的(癌変異)の検出の試験をした。図１３Ｂにおいて、プローブＳＬＰ３’ＡＴＣおよびＳＬＰ３’ＡＴＴを標的GLgに使用し、３’側の３位におけるＧ：Ｃマッチと比較して改善されたマッチ性におけるＡ：Ｃの寄与を試験した。図１７Ｃにおいて、プローブＳＬＰ３’Ｑ２ＴＣ、ＳＬＰ３’Ｑ２ＴＴ、ＳＬＰ３’Ｑ１８ＴＣ、ＳＬＰ３’Ｑ１８ＴＴ、ＳＬＰ３’ＧＴＣおよびＳＬＰ３’ＧＴＴを標的GLg.m3Tに使用し、３’側から３位のＴ：Ａマッチと比較して増加した適合性におけるＱ２：Ｔ、Ｑ１８：ＴまたはＧ：Ｔの寄与を試験した。
【０１６０】
実施例１５  −  フルオレッセントアッセイ
図１３Ａ−Ｃに示されるように、４つの長さＧＬｇ、ＡＬｇ、ＴＬｇまたはＣｌｇの一つ(図１３Ｃに示す)を、下線塩基で変化する鋳型標準として使用した。図１３Ａ−Ｂは、鋳型鎖の一つ、例としてＡＬｇを使用したニックＤＮＡ二本鎖の形成を示す。図１３Ａに示すように４つの異なるニックＤＮＡ基質は、共通蛍光標識オリゴ、com5Fおよび識別したオリゴ(ＲＰ５’Ａ,ＲＰ５’Ｃ、ＲＰ５’Ｇ、ＲＰ５’Ｔ)を鋳型鎖ＡＬｇにアニールすることにより形成する。図１３Ｂにおいて。４つの異なるＤＮＡ基質を、蛍光標識オリゴcom3Fおよび識別したオリゴ(ＬＰ３’Ａ、ＬＰ３’Ｃ、ＬＰ３’Ｇ、ＬＰ３’Ｔ)を鋳型鎖ＡＬｇにアニールすることにより形成する。ニックＤＮＡ二本鎖のマトリックスは、ＡＬｇが以下の鋳型鎖、ＧＬｇ、ＴＬｇおよびＣＬｇで置き換わった場合、ニックの３’および５’側マッチおよび三つマッチ塩基対の可能な総ての組み合わせで形成する。共通蛍光標識への連結反応により形成された産物は、異なる長さの”Ａ”テイルの取りこみにより、変性ポリアクリルアミドでのサイズにより識別できる。
これらのプローブ(図１４に示す)は、ヒト真核成分タンパク質合成開始因子ｅＩＦ−４Ｅ(出典明示により本明細書の一部とするRychlik, W., et al., ”Amino Acid Sequence of the mRNA Cap-Binding Protein From Human Tissue”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:945-949 (1987))から由来する。真核生物源由来のランダムＤＮＡ配列をＴthＤＮＡリガーゼ調製物における可能性のある細菌ＤＮＡ汚染に起因する誤シグナルを避けるために選択する。プローブの融解温度は、最も近い近接熱力学法を使用して予測した(出典明示により本明細書の一部とするBreslauer, K. J., et al., ”Predicting DNA Duplex Stability From the Base Sequence”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3746-3750 (1986))。National Biosciences Inc., Plymouth, MN由来のＯＬＩＧＯ４.０プログラムを、可能性の有るヘアピン構造、反復配列および誤プライミングを除外するために使用した。このアッセイのための鋳型および検出オリゴヌクレオチドは、融解温度がアッセイ(６５℃)で使用する温度よりも十分高いように設計し、連結反応作用におけるプローブの融解温度の作用を最小とする。
【０１６１】
総てのオリゴヌクレオチドプローブを、Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CAの試薬および３９４自動ＤＮＡ合成装置を使用して合成した。５’末端に結合した蛍光色素である６−ＦＡＭ(６−カルボキシフルオレッセイン)を有するオリゴヌクレオチドの合成を、Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corporation由来の６−ＦＡＭアミデイトを使用して行った。最初のＤＮＡ合成のために３’ＦＡＭを有するオリゴヌクレオチドを、Glen Research (Sterling, VA)からの３’−アミノ変更遺伝子c３-ＣＰＧカラムを使用して製造し、次いでＦＡＭ基を、Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer CorporationからのＮＨＳ−ＦＡＭ(ＦＡＭのＮ−ヒドロキシルスクシンイミドエステル)を使用して３’−アミノ基を介して結合させた。本実験に使用した総てのオリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製し、Waters Division of MilliporeのC-18 Sep Pak Caridgesを使用して、ゲルスライスからＤＮＡをゲルから回収した。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドプローブＲＰ５’Ａ、ＲＰ５’Ｃ、ＲＰ５’Ｇ、ＲＰ５’ＴおよびＣｏｍ３’Ｆは、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ、１nmoleのゲル精製オリゴヌクレオチドおよび１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)含有溶液中、３７℃で４５分、５’−リン酸化した。反応を０.５μｌの０.５Ｍ  ＥＤＴＡの添加により停止させ、キナーゼを６４℃で２０分、インキュベーションすることにより熱不活性化した。リン酸化オリゴヌクレオチドを−２０℃で、一定量で使用まで貯蔵した。
【０１６３】
ＴthＤＮＡリガーゼのフルオレッセント適合性アッセイは、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ  ＫＣｌ；１０ｍＭ  ＤＴＴ；１ｍＭ  ＮＡＤ＋；そして５００fmol(１２.５nＭ)のニック二本鎖基質含有緩衝液４０μl中で行った。ＤＮＡプローブを反応混合物を９４℃で２分インキュベートすることにより変性し、６５℃で２分、再アニールした。連結反応を５fmolの熱安定リガーゼの添加により開始し、６５℃で行った。５μl量を０時間、２時間、４時間、６時間、８時間および２３時間に回収し、停止溶液(８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０.１７％ブルー・デキストラン)１８μｌと混合した。この混合物５μｌを９３℃で２分変性させ、氷で急速に冷凍し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに充填し、Applied Biosystem Division of Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CAの３７３Ａ自動ＤＮＡシークエンサーで電気泳動した。蛍光標識連結反応産物を、Genescan 672ソフトウエア(Applied Biosystem Division of Perkin-Elmer Corporation, Foster City, CA)を使用して分析および定量した。Genescan 672ソフトウエアは、ゲルイメージならびに各レーンの各ピークのピーク高およびピーク領域を含む表の形で分析データを提供する。典型的に２つのバンドが各反応を代表する各レーンで見られた。低部は遊離フルオレッセント共通オリゴヌクレオチド、上部は連結反応産物の上部鎖であった。パーセントで示す産物の収率は、産物割る総ての最初の基質×１００で計算した。産物の量は適当な連結反応産物のピーク領域として計算した。最初の基質の量は、産物ピークのピーク領域に遊離フルオレッセントオリゴヌクレオチドピークのものを足して計算した。結果はＸ軸が時間およびＹ軸が収率として、DeltaGraph Pro3ソフトウエア(DeltaPoint, Inc. Monterey, CA)を使用してプロットした。
【０１６４】
野生型Ｔthリガーゼ適合性の試験の方法
ニック基質を使用したフルオレッセントアッセイは、ＴthＤＮＡリガーゼ適合性を試験するために開発された。ニック二本鎖基質を二つの隣接オリゴヌクレオチドプローブ(その一つはフルオレッセント色素ＦＡＭを含む)を長い相補的鋳型(底)鎖(配列は図１３参照)にアニールすることにより製造した。明瞭にするために、蛍光標識ラベルプローブを共通オリゴヌクレオチドと定義し、一方その末端に試験塩基を含むプローブを識別オリゴヌクレオチドと呼ぶ。１４オリゴヌクレオチド(図１４)のセットを、ニックの３’および５`位に異なる１塩基対マッチおよびミスマッチの可能性の有る総ての組み合わせを製造するために使用した。両方の共通および識別オリゴヌクレオチドは、その融点が、アッセイ温度(６５℃)よりも少なくとも１０℃高いように設計した。これは、恐らく連結反応能率におけるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの相違の効果を最小とする。連結反応時間は２３時間まで延び、ミスマッチ連結反応産物の正確な定量を可能とする。二つの隣接オリゴヌクレオチドの連結反応は、長いフルオレッセント産物を形成し、これを変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、分析した。
野生型ＴthＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の適合性
識別塩基がニックの３’側に存在する場合、ＴthＤＮＡリガーゼによるニック閉鎖の時間経過を表３に記載し、図１５に示す。
【０１６５】
【表３】
0005575380.tif 000015
【０１６６】
図15における各パネルは、同一の識別オリゴヌクレオチドと共通オリゴヌクレチドが単塩基で異なる4個の鋳型鎖にアニール化して得られる産物の収率を示す。すべての完全にマッチした基質は２時間以内に80％を超える産物を与えた(図15）。ニックの３’側で試験された12のミスマッチの内、Ｔ‐ＧおよびＧ−Ｔミスマッチは識別性で劣り、2時間後に約2％の収率、23時間のインキュベイションで約15%の蓄積を示した（図15）。Ｔth DNAリガーゼによる種々の３’側ミスマッチの識別化のこれらの結果はT4 DNAリガーゼでの報告と似ている（Landegren, U., et al., Science, 241:1077-1080(1988)、引用により本明細書の一部とする）。しかし、Ｔth DNAリガーゼはミスマッチ連結を抑制するために高濃度の塩、スペルミジンまたは非常に低い酵素濃度を必要としない（Wu, D.Y., et al., Gene, 76:245-254(1989)およびLandegren, U., et al., Science, 241:1077-1080 (1988)、引用により本明細書の一部とする）。
【０１６７】
ミスマッチがニックの５’側に位置するときは、酵素はＡ−Ｇ、Ｃ−Ｃ、Ｇ−ＧおよびＴ−Ｃミスマッチに対してなお厳密な識別化を示す。この実験の結果は表４に記録され、図16にプロットされている。
【０１６８】
【表４】
0005575380.tif 000016
【０１６９】
Ａ−Ｃ、Ａ−Ａ、Ｃ−Ａ、Ｇ−ＡおよびＴ−Ｔミスマッチの連結反応収率は、ニックの３’側に置かれたとき延長されたインキュベイション（23時間）後に僅かに検出できる程度であるが、ニックの５’側に置かれたときはかなり顕著となる。等電子（isosteric)ミスマッチ基質、Ｇ−ＡとＡ−ＧあるいはＣ−ＴとＴ−Ｃの間で観察される異なった連結反応比は、これらの比が、他の要因、多分隣接する塩基との重積相互作用によって影響されることを示唆している。結局、これらの結果は、Ｔth DNAリガーゼが、ニックの３’側のすべてのミスマッチを、ニックの５’側のミスマッチよりも効果的に識別することを示す。
【０１７０】
もし連結反応適合性が結合近隣の塩基対の累積安定性に主として依存するのであれば、内部安定性は、ニックの３’側よりはニックの５’側のDNA配列で高く予測されたであろう。内部安定性は５個の連続する塩基の自由エネルギーの和として計算され、ニックの５’側でより低いことが分かった（National Biosciences Inc., Plymouth, MNのOligo 4.0 Programを用いて計算）。従って、Ｔth DNAリガーゼによるニック３’側のミスマッチに対して観察されたより高い適合性は識別性オリゴヌクレオチド内の特定の配列によって生じたものではなく、この酵素によって認識されるニック構造の特定の要求によったものである。
【０１７１】
ニックの５’側のものに比してニックの３’側に位置するミスマッチの改善された識別は、バクテリオファージT4 DNAリガーゼを用いてＡ−ＡおよびＴ−Ｔミスマッチに関して報告されている(Wu,D.Y., et al., Gene, 76:245-254(1989)、引用によって本明細書の一部とする）。この相違は、(i)５’側に使用した14量体プローブよりも３’側で使用した８量体プローブのアニール化を不安定化した単塩基ミスマッチか、（ii) T4 DNAリガーゼの本質的な特徴によるものとされた(Wu,D.Y., et al., Gene, 76:245-254(1989)、引用によって本明細書の一部とする）。これらの結果は、このアッセイに使用したオリゴヌクレオチドが長さおよび融解温度で類似していたから、第2の仮説を支持する。ワクシニア・ウイルス・リガーゼの詳細な解析は、５’側の全てのミスマッチは３’側のミスマッチよりも効率的に連結されることを示した(Sheman, S., Biochem.,34:16138-16147(1955)、引用によって本明細書の一部とする）。同様の結果が、サッカロミセス・セレヴィシエからのDNAリガーゼでも示されているが、ニックの５’側で試験されたミスマッチはニックの３’側のそれと同じではなかった(Tomkinson, A.E., et al., Biochemistry, 31:11762-11771(1992)、引用によって本明細書の一部とする）。また、ニックの３’側ＡＰ領域はニックの５’側ＡＰ領域に比して、より効率悪く連結した(Goffin, C., ert al., Nucleic Acids Res., 15(21):8755-8771(1987)、引用によって本明細書の一部とする）。従って、ニックの５’側に比して、ニックの３’側では正準構造に対するより厳格な要求が全てのDNAリガーゼに対して一般的のようである。
【０１７２】
ＴthおよびT4 DNAリガーゼによる３’側のＴ−ＧまたはＧ−Ｔミスマッチに対するより低い適合性は、DNAポリメラーゼの適合性を反映している。DNAポリメラーゼの誤挿入よって形成される最も共通のミスペアはＴと対をなすＧを含むが、DNAポリメラーゼ、アッセイ法および検討された特定の領域によって本質的な変動が見られる(Echols, H., et al., Annu. Rev. Biochem., 60:477-511(1991)、引用によって本明細書の一部とする）。Ｇ−Ｔ、Ａ−ＣおよびＧ−Ａミスペアが大腸菌pol IIIによって許容される最も頻繁なものであることが、インビボでも(Schaaper, R.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8126-8130 (1988)、引用によって本明細書の一部とする）、インビトロでも(Sloane, D.I., et al., Nucleic Acids Res., 16:6465-6475 (1988)、引用により本明細書の一部とする）示されている。さらに、３’ミスマッチプライマーのTaqDNAポリメラーゼ伸延反応は、低dNTP濃度で他のミスマッチよりＴ−ＧおよびＧ−Ｔミスマッチでより効率的であった(Kwok, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:999-1005 (1990)、引用により本明細書の一部とする）。二重DNAオリゴヌクレオチドにおける変形塩基対の構造についてのＮＭＲおよびＸ線結晶回折分析は、Ｇ−Ｔ、Ａ−ＣおよびＧ−Ａペアが正常のワトソンークリック塩基対から僅かな規模で異なる”揺らぎ”（wobble)構造として存在することを示した(Hunter, W.N., et al., Nature, 320:552-555 (1986)およびPatel, D.J., et al., Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol., 43:2663-2670 (1984)、共に引用により本明細書の一部とする）。よく重積した揺らぎ対は、ワトソンークリックモデルにより近似して、重積不充分の塩基対より安定な構造をもたらすことが示唆された。細菌性および哺乳類のDNAリガーゼは共に、３’側のＧ−ＡまたはＡ−Ｇミスマッチを含む全てのプリンープリンミスマッチに対して非常に高い適合性を持ち(Landegren,U., et al., Science, 241:1077-1080 (1988); Husain, I., et al., J. Biol. Chem., 270:9683-9690 (1995) およびShuman, S., Biochem., 34:16138-16147 (1995)、すべて引用により本明細書の一部とする）、塩基対の安定性はリガーゼの適合性に影響する優先的要因ではないことを示唆する。さらにまた、関連するワクシニア・ウイルス・リガーゼおよび哺乳類リガーゼIIIは共に、Ｇ−ＴミスマッチよりＣ−Ｔミスマッチに対してさらにより低い適合性を示すが(Husain, I., et al., J. Biol. Chem., 270:9683-9690 (1995)およびShu,am, S., Biochem., 34:16138-16147 (1995)、引用により本明細書の一部とする）、ＴthおよびT4 DNAリガーゼはＧ−Ｔミスマッチに対してより低い適合性を持ち(Landegren,U., et al., Science, 241:1077-1080 (1988)、T4リガーゼに関して引用により本明細書の一部とする）、Ｔth DNAリガーゼは３’側Ｃ−Ｔミスマッチに対して事実上誤連結を行わない。このように、リガーゼの適合性は、ミスマッチ塩基対の増大した安定性と減少したヘリックスのひずみとの間の総和によるばかりでなく、個々のリガーゼ蛋白の特異的構造因子よって影響される。
【０１７３】
Ｔth DNAリガーゼの適合性改善
T4 DNAリガーゼの適合性は特異性比として表されてきたが、これは１単位の酵素で30℃において100nＭの鋳型の存在下、マッチ対ミスマッチの鋳型で生成する連結産物の比として定義される(Wu, D.Y., et al., Gene, 76:245-254 (1989)、引用により本明細書の一部とされる）。高い塩濃度（200mM）では、Ｔ−Ｔミスマッチに対する特異性比は６から60に、Ａ−Ａミスマッチに対しては1.5から40に、増加した。このより厳しい条件は、またKmを４倍に増加させ、Vmaxを凡そ30倍に減少させる(Wu,D.Y., et al., Gene, 76:245-254 (1989)、引用によって本明細書の一部とする）。S.セレヴィシエのDNAリガーゼＩの適合性は３ないし900ngの酵素の存在下、20℃で30分間、完全マッチ対ミスマッチを含む基質での連結反応効率として定義される(Tomkinson, A.E., et al., Biochemistry, 31:11762-11771 (1992)、引用によって本明細書の一部とする）。このDNAリガーゼの効率は、ニックの3’側にＴ−Ｇミスマッチが存在するときは50倍減少することが見出された。その連結反応効率は、ニックの３’側にＣ−Ｔミスマッチが、そして同じ基質の５’側にＴ−Ｃミスマッチが存在するときは100倍以上減少した。異なったDNAリガーゼ適合性を上記二つの条件で比較することは、異なったインキュベイション時間および基質の使用によって変化するので、困難である。
【０１７４】
異なった基質および酵素での比較を標準化するために、Ｔth DNAリガーゼの適合性を、ミスマッチ連結反応の初速度に対するマッチ連結反応の初速度の比として定義する。ニックの３’側にミスマッチを含む基質の内、Ｔ−ＧまたはＧ−Ｔミスマッチは最も識別困難であり、そのためＴth DNAリガーゼの適合性比を決定する標準的アッセイとして使用された。65℃におけるＴ−Ｃミスマッチ連結反応に対するＣ−Ｇ完全マッチ連結反応の初速比はＴth DNAリガーゼによる適合性比4.5x10２を与えた（図18、１列）。より短い識別プローブの使用は（Tm凡そ65℃）完全マッチ連結反応を劇的には変えず、ミスマッチ連結反応を減少させた。こうして、ミスマッチプローブの不安定化は適合性比を凡そ3倍、1.5x10３に改善した（図18、2列）。このＴth DNAリガーゼの適合性比は、T4 DNAリガーゼについて報告されているよりは、ここで使用されているＧ−Ｔミスマッチよりは遥かに識別し易いＧ−Ｔミスマッチについて、少なくと24倍高い(Wu, D.Y., et al., Gene, 76:245-254 (1989)、引用により本明細書の一部とされる）、図１５参照。
Ｔth DNAリガーゼの優れた特異性は、変異対立遺伝子（Ａ−Ｔマッチ）を野生型配列（Ｇ−Ｔミスマッチ）の200倍モル過剰の存在下に検出するためのリガーゼ連鎖反応（すなわちＬＣＲ）で利用された(Balles, J., et al., Mol. Gen. Genet., 245:734-40 (1994)、引用によって本明細書の一部とする）。いくつかの医学的DNA検出にはさらに大きな特異性が要求されるであろう。酵素−基質相互反応を不安定化することによってＴth DNAリガーゼの適合性比を改善する二つの方法が、下に述べるように考案された。
【０１７５】
DNA基質の修飾によるＴth DNAリガーゼの適合性の改善
対立遺伝子特異的PCRのための優れた方法は、識別３’塩基に隣接する意図的ミスマッチを持つプライマーの使用に基づいている(Cha, R.S., et al., PCR Methods and Applications, 2:14-20 (1992)およびRust, S., et al., Nucleic Acids Res., 21(16):3623-3629 (1993)、引用によって本明細書の一部とする）。この不安定化ミスマッチは正しい標的対立遺伝子のTaqポリメラーゼ伸延を劇的には阻害しなかったが、他の対立遺伝子の二重ミスマッチのため不正対立遺伝子の伸延効率を100ないし1000倍の因数で減少させた(Cha, R.S., et al., PCR Methods and Applications, 2:14-20 (1992)、引用によって本明細書の一部とする）。
【０１７６】
この方法は、ニックの３’側の第3位にＡ−Ｃミスマッチを意図的に導入することによる連結反応での使用に適合された（図18、３列  完全マッチおよびミスマッチDNA両基質で太字で示されている）。当初の完全マッチの基質はここでは1個のミスマッチを持ち、当初のミスマッチ基質はここでは2個のミスマッチを有する（1個はニックの３’側の右に、他は同じプローブの３’側の３塩基に）。３位のこのＡ−Ｃミスマッチは、５fmolのＴth DNAリガーゼを用いる３’マッチ（Ｃ−Ｇ）基質の連結反応効率を殆ど10倍減少させる（データは示していない）。正常な完全マッチ連結反応のそれに対応する初速度を得るために酵素の量を50 fmolに増量した。リガーゼ適合性比はさらなるミスマッチを導入することによって約４倍（5.8x103まで)増大した（図18、3列）。内部ミスマッチは、ニックに完全マッチを含むプローブより、ニックに３’ミスマッチを含むプローブに対して、ニック近隣の構造へのより大きい不安定化効果を示す。それゆえに、リガーゼの全適合性は改善された。同様の結果（4倍増）はまた、Ｔ−ＧまたはＧ−Ｔミスマッチがニックの３’側の同じ3位に導入されたときにも得られた（データは示していない）。もしさらなるミスマッチ（Ｃ−Ａ）がニックの３’側の2位に導入されると、Ｔth DNAリガーゼによるニックの３’側の完全マッチの連結反応は強く阻害された（2位にミスマッチがない場合により175倍低下）。反対に、TaqDNAポリメラーゼはプライマーの３’末端の2位でのさらなるミスマッチよって影響されなかった(Cha, R.S., et al., PCR Methods and Applications, 2:14-20 (1992)、引用によって本明細書の一部とする）。PCRとLCRの重要な相違は、隣接するミスマッチは初期のPCRサイクルの間標的からの伸延に影響するだけであるのに、LCRでは標的および産物上での連結反応はLCR反応の各サイクルを通じて影響される点にある。
【０１７７】
ミスマッチ塩基対に代わるものとして、ユニバーサルヌクレオシド類似体は、近隣のミスマッチをなお不安定化するが、完全マッチの基質でDNAヘリックスの完全性を維持し、従ってさらに連結反応適合性を改善する。天然ヌクレオチドの代わりに多くの場所にヌクレオチド同族体である３−ニトロピロールデオキシリボヌクレオチド（Ｑ）を含むオリゴヌクレオチドが配列決定およびPCRプライマーとして効果的に機能することが示されている(Bergstrom, D.E., et al., JACS., 117:1201-1209 (1995)およびNichols, R., et al., Nature, 369:492-493 (1994)、引用によって本明細書の一部とする）。３−ニトロピロールは、4種の天然塩基の何れに対しても適合できるのに充分なほどに小さく、かつ高度に極性化したパイ電子構造のために高度の重積可能性を有しているので、ヘリックス状態の保存を可能にすると推定される。オリゴヌクレオチドを含むＱに関するTmの研究はＱ塩基対が比較的小さい小さい識別性（ΔTm＝3℃）を持つことを示すが、Ｑ−Ａ（最も安定）、Ｑ−Ｔ、Ｑ−ＣおよびＱ−Ｇ（最も不安定）の安定性はＡ−ＴまたはＣ−Ｇ塩基対のそれより有意に低い。従って、Ｑは、もしそれが３’末端から３塩基の位置に存在するなら、あたかも３’位のミスマッチと関連して存在するかの様に部分的融解を著しく増大するが、同時に３’末端の塩基対マッチと関連して存在するミスマッチよりもヘリックス状態に保存的である。配列SLP3’QTCおよびSLP3’QTTをＴth DNAリガーゼの連結反応基質として試験すると、さらに良好な適合性比（９倍増加）が得られた（図18、４列）。鋳型ストランド上の塩基がＣからＡに変わっていることに注意。完全マッチ連結反応の初速度からわかるように、Ｑ塩基同族体は、ＡおよびＴと同等に良く、Ｃとはそれより劣るが良く、Ｇとは極めて低く、ペアを形成するようである。Ｑが種々の塩基とペアを形成するとき得られる初速度の比は、T:A:C:G=23:16:5:1である。上記C/Aミスマッチで見られるように、Ｑ同族体が２位に位置するとき、連結反応速度はまた強く抑制される（２位に同族体が存在しない場合に比して55倍低い）。
モデル研究(QUANTA/CHARMM）に基づけば、Ｑはヘリックス構造への最小限の影響でＴおよびＡの両方に対して適合する(Bergstrom, D.E., et al., JACS, 117:1201-1209 (1995)、引用によって本明細書の一部とする）。ある場合には、Ｑはアンチ配座（Ｑ−Ｔ）を採り、他の場合にはシン配座（Ｑ−Ａ）を採る。それでも、進行中の研究は、３−ニトロピロール−天然塩基相互作用には水素結合は限られた役割しか演じていないことを示唆している。
【０１７８】
リガーゼ蛋白質の領域指向的変異誘発によるＴth DNAリガーゼの適合性の改善
DNAポリメラーゼの適合性は、プライマー−鋳型結合に係わるモチーフ（HIVポリメラーゼ）(Bead, W.A., et al., J. Biol. Chem., 269:28091-28097 (1994) 、引用によって、本明細書の一部とする）、またはPhi29 DNAポリメラーゼ(Soengas, M.D., et al., The EMBO J., 11(11):4227-4237 (1992)、引用によって本明細書の一部とする）、T4 DNAポリメラーゼ(Reha-Krantz, L.J., et al., J. Virol., 67(1):60-66 (1993) およびReah-Krantz, L.J., et al., J. Biol. Chem., 269:5635-5643 (1994)、共に引用により本明細書の一部とする）またはヒトDNAポリメラーゼ・アルファ(Dong, Q., et al., J. Biol. Chem., 268:24163-24174 (1993)、引用により本明細書の一部とする）のexoIIIモチーフの領域指向的変異誘発によって減少する。時に、この同じexoIIIモチーフまたはモチーフ”A”は”アンチミューテイター”ストレインとしても知られる適合性増大変異物を与えるが、これは全体の適合性を調整しているこれらの酵素のポリメリゼイションと3’-5’エキソヌクレアーゼ活性との間の複雑な相互作用を反映する(Reha-Krantz, L.J., et al., J. Virol., 67(1):60-66 (1993)、Reah-Krantz, L.J., et al., J. Biol. Chem., 269:5635-5643 (1994)、Dong, Q., et al., J. Biol. Chem., 268:24163-24174 (1993)およびCopeland, W.C., et al., J. Biol. Chem., 268:11041-11049 (1993)、すべて引用によって本明細書の一部とする）。
【０１７９】
野生型に近いニック閉鎖活性（nick-closing acitivity)を維持しているＴth DNAリガーゼ変異体を、適合性の変化についてアッセイした。二つの変異体リガーゼ、K294RおよびK294Pが増大した適合性比を持つことが示された（図18、５−８列）。通常の基質について、適合性はK294Rで凡そ4倍、K295Pで11倍増大した。Ｑ塩基同族体が変異体Ｔth DNAリガーゼと共に用いられたとき、変異体リガーゼの高濃度が必要ではあったが、連結反応の適合性は殆ど200倍増大した(K294RおよびK294P）。続く実験(下記表５参照）もまたK294RおよびK294Pが増大した適合性比を持つことを示した。
【０１８０】
要約すると、Ｔth DNAリガーゼの適合性の分析のために定量的蛍光アッセイが開発された。この酵素は、ニックの５’側のそれに比して、ニックの３’側のすべての単塩基ミスマッチに対し有意に大きい識別性を示す。ニックの３’側の12の可能性ある単塩基ミスマッチの中で、Ｔ−ＧおよびＧ−Ｔミスマッチだけが延長されたインキュベイション時間の後に定量的な量の連結反応産物を生成させた。Ｔth DNAリガーゼの適合性は、ニックの３’側の３位に意図的ミスマッチまたはヌクレオシド同族体を導入することによって連結反応温度65℃に近い融解温度値を持つ識別性オリゴヌクレオチドをデザインすることおよび／またはＴth DNAリガーゼ変異体を使用することによってさらに改善される。
【０１８１】
多くの医学的問題は鋭敏な単塩基識別を要求する。たとえば、多くの正常細胞の中の僅かな癌細胞の発見、正常菌叢中の病原性微生物の識別、混合感染中の癌原性HPV株の同定、薬剤耐性生物発生の検知などである。これらのモデル検討は純粋なミスマッチまたはマッチした標的基質に限られていたが、ヌクレオシド同族体および変異体Ｔth DNAリガーゼが正しくない標的の混合物中の僅かな正しい標的の識別を改善するために用いられた。これは、生物学的試料中のDNA検出をより近く再現するものである。
【０１８２】
実施例１６−オリゴヌクレオチドの合成と精製
全てのオリゴヌクレオチドはABI 394 DNA Synthesizer (Applied Biosystems Inc., Foster, CA)で合成された。FAM（Com 610 3’F)で標識されたオリゴヌクレオチドには、蛍光CPG(Glen Research) カラムが、オリゴヌクレオチドの３’末端に蛍光分子を導入するために使用された。オリゴヌクレオチドの、30%(重量／容量）水酸化アンモニウムによる支持体からの開裂には室温で２時間を要した。オリゴヌクレオチドはその後、55℃で４時間脱保護処理された。LDRに使用した全ての他のオリゴヌクレオチドは10%アクリルアミド／7M尿素ゲル上で、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製された。電気泳動後、オリゴヌクレオチドは光ｓクリーンに対してUVシャドウ化することによって視覚化し、ゲルから剥ぎ取った(Applied Biosystems Inc., 1992)。それらは、500mM NaClおよび5mM EDTAを含むTNE緩衝液（100mM Trus/HCl pH 8.0)により64℃で一夜溶出し、Sec Pakカートリッジ(Millipore Corp, Milfford, MA)を業者の指示書に従って用いて回収した。
オリゴヌクレオチドは100μlのTEに溶解した。ストック溶液の一般的な濃度は凡そ1mMである。LDR用には、ゲル精製ストック溶液は約100μM＝100 pmoles/μであった。
【０１８３】
実施例１７−オリゴCom 610-3’Fの化学的リン酸化
下流の共通のオリゴヌクレオチドは、化学的リン酸化試薬(Glen Research)を用いて５’末端をリン酸化した。この試薬の使用は、酵素によるオリゴヌクレオチドのリン酸化に代わるもので、リン酸化効率を決められと言う利点がある。化学的リン酸化試薬は、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化の迅速で簡便な方法であることを証明した。化合物は4℃で乾燥保存した。ABI394機器での合成は、0.1M溶液を、化合物100μモル当たり無水アセトニトリル1mlを加えることによって調製した。この液を完全な溶解を確実にするため時々振り混ぜながら約５分間放置した。オリゴヌクレオチドの合成は、業者の指示した合成サイクルに修飾を加えて実施した。たとえば、DMTグループは、カップリング効率を決定するために標準的な脱保護法により合成機上で除いた。
【０１８４】
野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼの使用による、過剰の正常鋳型の存在下における、単一塩基変異(Ｔ：Ｇミスマッチ)を含む標的の定量的検出
正常ＤＮＡの過剰存在下に低存在量配列(癌変異)を定量することが出来るアッセイ法が開発された。ＬＤＲアッセイにおける野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼを使用して、正常および癌ＤＮＡ混合物中の癌ＤＮＡのフラクションを定量することが出来た。検出限界を決定するために使用したプローブを図１９に示し、その配列を図２０に示す。２種のオリゴヌクレオチドを標的に対して、上流プローブ(ＳＬＰ３’ＴＴＴ)の３’末端が下流プローブ(Ｃom６１０−３’Ｆ)の５’末端に直ちに隣接するようにハイブリダイズさせた。接合部におけるヌクレオチドが標的鎖と正しく塩基対を構成する場合には、Ｔth ＤＮＡリガーゼで二つの隣接するオリゴヌクレオチドを接合することが出来る。この反応で使用したプローブは、連結反応部において、”正常”鋳型の上にＴ：Ｇミスマッチを、”癌”鋳型の上にＴ：Ａマッチを作り出す。精製野生型酵素および変異酵素Ｋ２９４Ｒ(図２１参照)の２５fmoleの存在下、完全にマッチした鋳型(“癌”；ＡＬg.m３ＡおよびＡlg.m３Ａrev)の０−２.５ｎＭ(５０fmole)を含むＴ：Ｇミスマッチ鋳型(“正常”；ＧＬg.m３ＡおよびＧlg.m３Ａrev)の１２.５ｎＭ(２５０fmole)を使用して、ＬＤＲ実験を３回に亙って行なった。産物をＡＢＩ３７３ＡＤＮＡ配列決定用装置上で分離し、蛍光シグナルを定量する。収量が産物／(産物＋プローブ)で定義されるのであれば、収量は過負荷プローブシグナルの停止により、人為的に高いものとなる。従って、希釈した産物標準を用いて検量数(１fmole＝６００ピーク面積単位)を発生させた。与えられたサンプル中の産物の量(fmole)は、産物の全ピーク面積を６００で割ることによって算出した。この方法は、レーン当たり５μｌ以下の連結反応混合物を負荷させる場合、産物形成を過小に評価することになろう。両酵素共殆ど同量の産物を発生させたが、変異Ｋ２９４Ｒ酵素はより少ないバックグラウンドミスマッチ連結反応を与えた。従って、シグナル対ノイズ比率は野生型リガーゼに比較して変異酵素に対してほぼ２倍であった(図２２参照)。Ｋ２９４Ｒ変異酵素の場合、シグナル対ノイズ比率は５００の“正常”鋳型中、１個の”癌”鋳型を区別する場合、３.３であり、２５０の”正常”鋳型中、１個を区別する場合、５.４に増加した(図２２の数値および表５に記載した類似の実験参照)。このアッセイを最も困難な場合、Ｔ：Ａ完全マッチからＴ：Ｇミスマッチを区別するリガーゼの能力と比較する。
【０１８５】
図２１と図２２に示した結果は過剰のミスマッチ基質(“正常”)の存在下に完全マッチ基質(“癌”変異)の存在を区別するＴth ＤＮＡリガーゼの能力を証明する。
”癌”鋳型の量を正確に定量するためには、存在する”正常”鋳型の量を決定することが必要であり、これは二つの方法で行なうことが出来る。最も簡単な方法は、もとのＰＣＲ混合物中に少量比の蛍光標識プローブを含有させ、毛細管電気泳動または自動ＤＮＡ配列決定装置を用いて、生成した産物の量を定量することである。第２の方法は、結合反応の定量的性質を利用して、もとの産物濃度を決定することである。図２３は、接合部に完全にマッチしたプローブ（ＳＬＰ3’ＴＴＣおよびＣom６１０−３’Ｆ）を使用して、０.００５ｎＭ（０.１fmol)−０.５ｎＭ（１０fmol）の“正常”鋳型（ＧＬg.m３ＡおよびＧlg.m３Ａrev）から発生したＬＤＲ産物の量を示す。Ｋ２９４Ｒ変異酵素を使用した場合、シグナル対ノイズ比率は、０.００５ｎＭ（０.１fmol）の”正常”鋳型を検出する場合、４.５であり、０.０１２５nＭ（０.２５fmol）の“正常”鋳型を検出する場合、７.４に改善された（データを示さず）。未知サンプルからのＬＤＲ産物の量を検量曲線と比較することにより、サンプル中の全ＤＮＡを定量することが出来る。これは、１００attomole（５００nＭ）から１０femtomole（０.５nＭ）量の未希釈サンプルを直接試験することにより、またはより大量／高濃度のＤＮＡを使用した場合には、希釈サンプルを試験することにより、達成することが出来る。これらの結果は、未知量のサンプル中に存在する特異的ＤＮＡの量や、単一塩基（“癌”）変異を含む割合（量）を決定することが出来ることを証明するものである。
【０１８６】
野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼを使用する、過剰の正常鋳型の存在下、単一塩基変異を含む標的の検出
癌検出における野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼの使用をさらに探求するため、連結検出反応が過剰の正常細胞中の癌細胞を区別する生物学的問題をより密接に類似する競合アッセイにおいて、効果的に使用された。この型のアッセイは、リガーゼが正しい配列をシールすることのみならず、多くの酵素が正しくない基質に結合する場合、特にそうでなければならないことを要する。それ故、先のアッセイの場合よりもより高い濃度が要求されるが、このようなより高い濃度は、バックグラウンド（ミスマッチ）連結反応を上昇させる可能性がある。２種のオリゴヌクレオチド（ＳＬＰ３’ＴＴＴおよびＣom６１０ ３’Ｆ）を変性標的に対して、１つのオリゴヌクレオチドの３’末端が蛍光標識オリゴヌクレオチドの５’末端に隣接しているようにハイブリダイズさせる（図１９参照）。リガーゼは、次いで２つの隣接するオリゴヌクレオチドを、当該ヌクレオチドが連結反応部におい標的鎖と正しく塩基対を形成する場合、連結させることが出来る。ＬＤＲについての初期実験を、２５fmolの精製野生型および変異酵素Ｋ２９４ＲおよびＫ２９４Ｌの存在下、ミスマッチ鋳型(”正常”)および完全マッチ鋳型(”癌”）を独立して、またはお互いを一緒にして使用し、３回にわたって実施した(表５)。
【０１８７】
【表５】
0005575380.tif 000017
【０１８８】
(Ｋ２９４Ｐ変異は、熱安定性を損なうから、その後の研究には使用されなかった。）ミスマッチ鋳型上変異Ｋ２９４Ｒにより発生させたＬＤＲ産物の量(０.５６fmol)は、野生型酵素（１.４５fmol）に比較して、２倍以上低かった。ＬＤＲはまた、それぞれ１：２５および１：１００の比率で、完全マッチおよびミスマッチ鋳型と共に行われた。野生型および変異酵素の両方に対して、ミスマッチ鋳型の存在下に発生した産物は、完全マッチ鋳型単独の存在下に発生した産物よりも少量であった。Ｋ２９４Ｒの使用は、１.７５−３倍高いシグナル対ノイズ比率を与える。Ｋ２９４Ｌ変異体ではバックグラウンドが検出されなかったので、シグナル対ノイズ比率を計算することは出来なかった。これらの結果は、変異体Ｋ２９４Ｒが野生型酵素についてミスマッチを区別する点でより高い適合性を示すことを支持するものである。この高められた適合性は、恐らくこの変異熱安定性酵素の特異性定数の変化によるものであろう。酵素反応の特異性は、触媒定数ｋｃａｔと見掛けの結合定数ＫＭによって決定され、特異性定数ｋｃａｔ／ＫＭとして表される。ｋｃａｔまたはＫＭもしくはそれら両者に影響を与える、酵素それ自身、基質または反応条件について行われた修飾は、特異性を変化させるであろう。変異酵素の使用は、完全マッチおよびミスマッチ酵素−ＤＮＡ複合体の安定性に種々の度合いで影響を及ぼすので、別々のＫＭ効果がこれらの連結反応に発揮される。完全マッチおよびミスマッチ基質の連結反応のような競合反応において、特異性定数比は、ＫＭの結果として変化することが出来、可能なｋｃａｔは各基質に対して変化する。下に示す式（Ｋ２９４Ｒについて示す）を満足するすべての変異酵素は、過剰の正常ＤＮＡの存在下、癌関連変異の区別をより高めるであろう。
【０１８９】
【数１２】
0005575380.tif 000018
【０１９０】
また、本発明の第２の態様は、適合性比率（すなわち、基質を３’末端において完全マッチと連結させる場合の初期速度を、基質を３’末端においてミスマッチと連結させる場合の初期速度で割った値）で、次のように表すことが出来る：
【０１９１】
【数１３】
0005575380.tif 000019
【０１９２】
上記等式において、[ｋ１]マッチは、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部で完全マッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。[ｋ１]ミスマッチは、標的ヌクレオチド配列と連結反応部にその３’末端を持つオリゴヌクレオチドプローブとの連結反応部でミスマッチを持つ標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズした第１および第２オリゴヌクレオチドプローブを連結する場合の初速度定数を表す。変異熱安定性リガーゼの場合、[ｋ１]ミスマッチで割った[ｋ１]マッチ (＝適合性比率)は、野生型リガーゼの適合性比率よりも大きい。上記の等式(Ｋ２９４Ｒについて示す)を満たす全ての変異酵素は、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
【０１９３】
ヌクレオチド類似体含有プローブを使用する、過剰の正常鋳型存在下における単一塩基変異を含む標的の検出
リガーゼ適合性比率を高めることを意図して、識別プローブの３’末端から第３位にＱ２またはＱ８（１−(２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル)ピロール−３−カルボキシアミド)ヌクレオチド類似体を含むプローブを合成した（図２４参照）。これらの実験において、プローブ類似体に対立する鋳型塩基は、ＡまたはTであり、より好ましいＱ２：Ａ、Ｑ２：ＡおよびＱ１８：Ｔ対のアッセイを可能にする。これらの類似体プローブを使用して、ミスマッチ連結反応から生ずる産物は、正規のプライマーに比較して、約２〜３倍減少した（表６）。
【０１９４】
図２４は、リガーゼ適合性比率アッセイのために使用されたヌクレオチド類似体含有プローブを示す。表６に示した典型的ＬＤＲアッセイにおいて、野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼの適合性を評価するために、４つの異なった条件が使用された。各反応は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.６；１０ｍＭＭgＣl２；１００ｍＭＫＣｌ；１０ｍＭＤＴＴ；１ｍＭＮＡＤ＋；２種の短い検出プローブの１２.５ｎＭ（５００fmol）および単独使用の場合、正常鋳型１２.５ｎＭ（２５０fmol）を、また、それぞれ１：１００および１：２５の割合で正常鋳型とともに使用する場合、癌鋳型の１２５ｎＭ（２.５fmol）および０.５ｎＭ（１０fmol）を含む２０μｌ混合物中で実施した。この反応で使用されたプローブは、”正常”鋳型上にＴ：Ｇミスマッチを、連結反応部において”癌”鋳型上にＴ：Ａマッチを作る。加えて、プローブＳＬＰ３’ＱＴＴは、３’末端から第３位に、Ｑ２：ＡまたはＱ１８：Ｔ対を形成する。反応混合物は、野生型Ｔth ＤＮＡリガーゼ２５fmolを添加する前に、ＧeneＡmp９６００サーモサイクラー（Perkin Elmer）中で９４℃に１.５秒間加熱した。酵素と更に３０秒間培養した後、ＬＤＲ反応を、９４℃で１５秒間およびサイクル当たり６５℃で４分間、２０サイクルにわたって実施した。エタノール−ドライアイス浴中で管を冷却し、０.５ｍＭＥＤＴＡ０.５μｌを添加して、反応を完全に停止させた。反応物２.５μｌを増量緩衝液２.５μｌ（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭＥＤＴＡおよび０.１７％ブルー・デキストラン）およびＧene Ｓcan Ｒox−１０００分子量マーカー０.５μｌと混合し、９４℃で２分間変性させ、氷上で素早く冷却し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルにかけ、ＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列決定機上で電気泳動を行う。蛍光標識連結反応産物を、ＡＢＩ Ｇene Ｓcan６７２ソフトウエアを用いて、分析、定量した。
【０１９５】
図２５Ａ−Ｄは、本発明のＰＣＲ／ＬＤＲ法のＬＤＲ相に対するヌクレオチド類似体を持ったオリゴヌクレオチドプローブの種々の形を示す。図２５Ａにおいて、１つのオリゴヌクレオチドプローブは、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、そのプローブはその３’末端(即ち、連結反応結合部)で識別性塩基と、連結反応部から第３位にヌクレオチド類似体を持つ。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、いくらか不安定であるが、その３’末端が、ハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補性であるので、依然、連結反応を受けるであろう。図２５Ｂは、その３’末端が、ハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補性であるので、連結反応が起こらない以外は、図２５Ａに類似である。図２５Ｃでは、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブは、その３’末端(即ち、連結反応部)並びに２つの隣接位置で識別性塩基を持つ。連結反応部から４、５および６塩基位置には、ヌクレオチド類似体がある。結果として、図２５Ｃでは、３つのオリゴヌクレオチド類似体の存在がオリゴヌクレオチドプローブを不安定にしているが、連結反応部に最も近い３つの位置に完全な相補性があるため、連結反応は依然として起こるであろう。一方、図２５Ｄに示したように、連結反応部に最も近い３つの位置の１つ以上にミスマッチがある場合、連結反応は起こらない。図２５Ａ−Ｂの操作に使用したオリゴヌクレオチドプローブと図２５Ｃ−Ｄで使用したものとを比較すると、前者は、連結反応部に最も近い３つの位置に潜在的不安定性ゾーンを持つが、後者は連結反応部に最も近い６つの位置に潜在的不安定性ゾーンを持つことが明らかである。不安定性３位置ゾーンに代わる不安定性６位置ゾーンの使用は、このようなより大きい不安定性ゾーンは、連結反応産物がその連結反応部でのミスマッチの存在にかかわらず形成されるという可能性を低下させるため、ＬＤＲ適合性を向上する可能性を持つ。
【０１９６】
【表６】
0005575380.tif 000020
【０１９７】
しかしながら、完全マッチ連結反応から生じたシグナル量は、比較的一定を維持した。より高い酵素濃度(例えば、１０ｎＭ(２００fmol))は、ヌクレオチド類似体との完全マッチ鋳型の飽和状態を導くので、より多くの酵素が自由にミスマッチ鋳型と結合する。結果として、高い酵素濃度でより高いミスマッチシグナルが観察された。完全マッチおよびミスマッチ鋳型(１：２５および１：１００)の存在下、完全マッチから生じる絶対シグナルは、非修飾プローブとＱ２またはＱ１８ヌクレオチド類似体含有プローブの両方について、完全マッチ単独から生じるものよりも低かった。より低いミスマッチ連結反応により、類似体プローブにではより高いシグナル対ノイズ比率が達成された。Ｑ２類似体の場合、シグナル対比率は、酵素濃度５ｎＭ(１００fmol)まではレギュラープローブよりも一貫して高いようである。更に、Ｑ１８類似体の場合、酵素濃度１０ｎＭ(２００fmol)まではより高いシグナル対ノイズ比率が維持され、これは、酵素濃度の変化を許容する点ではＱ１８がＱ２よりも適し得ることを示す。
【０１９８】
識別性プローブの第３位にＱ２およびＱ１８類似体を導入すると、シグナル対ノイズ比率は約２−３培に向上し、これによって、癌シグナルをバックグラウンドから識別するＬＤＲシステムの能力が増大する。このアッセイは、最も困難なケース、即ちＴ：Ａ完全マッチからＴ：Ｇミスマッチを識別するリガーゼの能力を比較するものである。プローブの３’末端から３ヌクレオチドの位置にあるＱ２またはＱ１８類似体は、３’位のミスマッチに関して存在する場合、局所融解を高め、同時に、３’末端の塩基対マッチに関して存在する場合は、ミスマッチ以上にらせん構造の保全を保護する。プローブの３’末端近くにＱ２またはＱ１８類似体を用いると、完全マッチおよびミスマッチした酵素ＤＮＡ複合体の安定性に様々な度合いで影響を及ぼすことがあり、そのため、これらの連結反応では別個のＫＭ作用を発揮させる。完全にマッチしたおよびミスマッチした基質の連結反応などの競合反応では、特異性定数の比率は、各基質に対するＫＭや起こり得るｋｃａｔ変化の結果として変わることもある。下記等式(Ｑ類似体について示す)を満たす全ての修飾プローブは、過剰の正常ＤＮＡ存在下の癌関連変異の識別力を増すものである。
【０１９９】
【数１４】
0005575380.tif 000021
【０２００】
あるいは、本発明の第３の態様では、下記のように適合性比率(即ち、基質と３’末端並びに３’末端のミスマッチから３ヌクレオチドの位置にある類似体との連結反応の初速度で割った、基質と３’末端並びに３’末端の完全マッチから３ヌクレオチドの位置にある類似体との連結反応の初速度)で表すことができる。
【０２０１】
【数１５】
0005575380.tif 000022
【０２０２】
野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いる正常鋳型過剰存在下でのＣ：Ａミスマッチ含有標的の検出
このアッセイは、正常ＤＮＡの過剰存在下に低存在量配列(癌変異)を定量できるものであり、過剰のＣ：Ａミスマッチの存在下でのＣ：Ｇマッチ検出限界を測定するのにも応用された。ＬＤＲアッセイにおいて野生型および変異Ｔth ＤＮＡリガーゼを使用して、正常および癌ＤＮＡ混合物中の“癌”ＤＮＡのフラクションを定量した。検出限界を決定するために使用したプローブは図２６に、配列は表７に示す。
【０２０３】
【表７】
0005575380.tif 000023
【０２０４】
２種のオリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズさせて、上流プローブ(ＳＬＰ３’ＴＴＣ)の３’末端が下流プローブ(Ｃom６１０−３’Ｆ)の５’末端に直ちに隣接するようにした。この反応で使用したプローブは、連結反応部において、“正常”鋳型の上にＣ：Ａミスマッチを、“癌”鋳型の上にＣ：Ｇマッチを作り出す。精製野生型酵素および変異酵素Ｋ２９４Ｒの２５fmoleの存在下、完全マッチ鋳型(“癌”；ＧＬg.m３ＡおよびＧlg.m３Ａ.rev)の０から２.５ｎＭ(５０fmole)を含むＣ：Ａミスマッチ鋳型(”正常”；ＡＬg.m３ＡおよびＡlg.m３Ａrev)の１２.５ｎＭ(２５０fmole)を使用して、ＬＤＲ実験を３回に亙って行なった(図２７参照)。両酵素共殆ど同量の産物を発生させ、変異Ｋ２９４Ｒ酵素はより少ないバックグラウンドミスマッチ連結反応を与えた。従って、シグナル対ノイズ比率は野生型リガーゼに比較して変異酵素に対して僅かに向上しただけであった(図２８参照)。Ｋ２９４Ｒ変異酵素の場合、シグナル対ノイズ比は５００の“正常”鋳型中、１の“癌”鋳型を区別する場合、２.２であり、２５０の“正常”鋳型中、１の“癌”鋳型を区別する場合、５.４に増加した(図２８および表８に記載した類似の実験参照)。
【０２０５】
【表８】
0005575380.tif 000024
【０２０６】
Ｃ：Ａミスマッチを区別するにあたり、変異Ｋ２９４Ｒ酵素が野生型酵素に勝る条件を見出すことは出来るか？  ＬＤＲについての初期実験が、ミスマッチ(”正常”)鋳型と完全マッチ（“癌”）鋳型を独立してまたは組み合わせて、精製野生型酵素および変異酵素Ｋ２９４Ｒの２５および５０fmolの存在下、３回にわたって行われた（表８）。Ｃ：Ａミスマッチで得られた結果は、２５fmolの酵素を使用して、Ｔ：Ｇミスマッチで得られた結果に匹敵するものであった。しかしながら、より高い酵素量（５０fmol）を使用する場合、ミスマッチ鋳型上、野生型酵素によって産生されたＬＤＲ産物の量は、変異酵素によって産生された量の少なくとも１.８倍であった。ＬＤＲはまた、完全マッチおよびミスマッチ鋳型をそれぞれ１：２５および１：１００の比で一緒に使用しても行われた。野生型および変異酵素に対して、ミスマッチ鋳型の存在下に産生された産物は、完全マッチ鋳型単独により産生した産物よりも少なかった。変異体Ｋ２９４Ｒは、同一条件下で野生型酵素よりも僅かに少ない産物を産生し、正常鋳型からのより低いバックグラウンドシグナルと結合したが、Ｋ２９４Ｒの使用により、約１.５から２倍高いシグナル対ノイズ比率を生じる。ここで、これらの結果は、我々の先の結果と関連しており、変異体Ｋ２９４Ｒは野生型酵素についてミスマッチを識別する点でより高い適合性を示すという先の発見を支持するものである。我々はまた、５０fmolの酵素が、Ｑ類似体を含むプローブを使用した場合に、最善のシグナル対ノイズ比率を与えた点に注目する。
【０２０７】
実施例１８−過剰の正常鋳型の存在下、野生型および変異Ｔthリガーゼを使用する単一塩基変異を含む標的の定量的検出
アッセイは、与えられたサンプル中の癌変異の量を定量するために開発された。ＬＤＲアッセイにおいて、野生型および変異Ｔthリガーゼを使用して、正常および癌ＤＮＡの混合物中における癌ＤＮＡのフラクションを定量した。検出限界を決定するために使用されたプローブを第３０図に示す。二つのオリゴヌクレオチドを標的に対して上流プローブの３’末端が下流プローブの５’末端に隣接するようにハイブリダイズさせた。Ｔth ＤＮＡリガーゼは、接合部におけるヌクレオチドが標的鎖と正しく塩基対を形成する場合には、二つの隣接するオリゴヌクレオチドを接合することが出来る。ＬＤＲ実験は、２５fmolの精製野生型および変異酵素Ｋ２９４Ｒの存在下、０から２.５ｎＭ（５０fmolｅ）完全マッチ鋳型(“癌”)を含む１２.５ｎＭ(２５０fmole)のミスマッチ鋳型(“正常”）を用いて、３度にわたり行われた(図２１参照)。両酵素はほぼ同量の産物を発生させたが、変異Ｋ２９４Ｒ酵素はより少ないバックグラウンドミスマッチ連結反応を与える。従って、シグナル対ノイズ比率は、野生型リガーゼに比較して変異酵素に対して多少ともより良好であった(約１.５倍）(図２２）。Ｋ２９４Ｒ変異酵素により、シグナル対ノイズ比率は、５００の“正常”鋳型中１個の“癌”鋳型を区別する場合３.３であり、２５０の”正常”鋳型中１個を区別する場合は５.４に増加した。このアッセイは、最も困難な場合のＧ：ＴミスマッチをＡ：Ｔ完全マッチから識別するためのリガーゼの能力を比較するものである。Ｔth ＤＮＡリガーゼはＣ：Ａミスマッチ（第２の最も困難なケース）をＧ：Ｔミスマッチに比較して区別する場合に５倍以上の適合性を示すので、変異酵素は他のすべての他のミスマッチを２,５００中１またはそれ以上で区別するものと推定される。
【０２０８】
Ｃ：Ａミスマッチを発生させる合成基質を使用して実験を行い(表７参照）、検出限界とシグナル対ノイズ値を決定した(図２７および図２９)。正常ＤＮＡの量を定量するための対照連結反応は、前と定量的に類似の結果を与えた(図２８参照）。これらの基質について、野生型と変異酵素の間に有意な差異はなかった。Ｋ２９４Ｒ変異酵素の場合、シグナル対ノイズ比率は、“５００”の正常鋳型中、１個の”癌”鋳型を識別する場合２.２であったが、２５０の“正常”鋳型中、１個を区別する場合３.１に増加した。合成基質の結果は、Ｇ：ＴミスマッチをＣ：Ａミスマッチから識別する点に基本的な差異が無いことを示唆するが、Ｋ−ras遺伝子を含む天然ＰＣＲ産物による実験は、より有意に良好な識別はＧ：ＴミスマッチよりもＣ：Ａミスマッチにより達成されることを暗示する。
【０２０９】
実施例１９−Ｋ−ras癌遺伝子のコドン１２、１３および６１におけるすべての可能な変異を検出するためのＬＤＲプローブの設計と合成
Ｋ−ras遺伝子は、変異検出技術に対する二つの有意な試みを提供する。Ｈ−、Ｎ−およびＫ−ras遺伝子の間の広範な配列ホモロジーは、正しい遺伝子を選択的に増幅するために、１次エクソン特異性ＰＣＲ反応を必要とする。その後の対立遺伝子特異的ＰＣＲは、個々のＫ−ras変異を検出するために用いられたが、すべての変異を検出するための複合ＰＣＲは、コドン１２とコドン１３変異の近接によって複雑化される。
【０２１０】
Ｋ-ras遺伝子のコドン１２、１３及び６１において同時に変異をアッセイするための方法は、図３０に示される。ＰＣＲがコドン１２と１３および６１の周囲の領域におけるＫ-ras遺伝子を正しく増幅する二つの独立したＰＣＲプライマー対が合成された。これらのコドンに対するすべての可能なＬＤＲプローブを設計し、合成した(図３１Ａ−Ｂ）。識別性オリゴヌクレトチドは約６６℃のＴｍ値を計算し、その３’末端に識別性塩基を含む。これらのオリゴヌクレオチドは、自動ＡＢＩ３７３Ａ ＤＮＡ配列決定機上で分離されたとき、ＦＡＭ−またはＴＥＴ−蛍光ピークを交互にすることにより区別された産物を生成する。共通のオリゴヌクレオチドは、約６９℃のＴｍ値を計算し、その３’末端にスペーサーＣ３ブロッキンググループを持つポリ−Ａテイルを含む。ブロッキンググループは、ＬＤＲプライマーの残留ポリメラーゼ延長を阻止し、ポリ−ＡテイルはＬＤＲ産物を配列決定ゲル上で分離させる。共通のプローブは、その５’末端で化学的にリン酸化された。
ＬＤＲプローブは、最も共通の変異が一般により小さな連結反応産物を提供するように設計される。結腸癌における７つの最も共通のＫ−ras変異に対して、産物はＧ１２Ｄ（ＧＡＴ）に対して４４bp、Ｇ１２Ａ(ＧＣＴ)に対して４５bp、Ｇ１２Ｖ(ＧＴＴ)に対して４６bp、Ｇ１２Ｓ(ＡＧＴ)に対して４７bp、Ｇ１２Ｒ(ＣＧＴ)に対して４８bp、Ｇ１２Ｃ(ＴＧＴ)に対して４９bpおよびＧ１３Ｄ(ＧＡＣ)に対して５１bpである。野生型ＤＮＡに対して特異的なプローブは、また、変異ＤＮＡの検出に先立って、PCR産物の量を定量するために設計された。ＰＣＲ産物は、３％アガロースゲル中、エチジウムブロマイド染色により評価される。
【０２１１】
実施例２０−複合型におけるＫ-rasコドン１２、１３および６１を同定するためのＰＣＲ／ＬＤＲを試験する
この実験は、すべてのＬＤＲプローブを複合して、Ｋ−rasのコドン１２、１３および６１における変異を検出出来ることを証明する。ＤＮＡは、コドン１２および１３(ＳＷ６２０，Ｇ１２Ｖ；ＳＷ１１１６，Ｇ１２Ａ；ＬＳ１８０，Ｇ１２Ｄ；ＤＬＤ１，Ｇ１３Ｄ）における既知変異により、セルラインから製造された。特定の変異に相補的な個々のプローブを使用するＰＣＲ／ＬＤＲにより、正しい連結反応産物が産生された。更に、正常ＤＮＡ過剰における別の変異（Ｇ１２ＤおよびＧ１２Ｖ）を含む２種のＤＮＡ標的の等量混合物は、おおよそ等モル量の両ＬＤＲ産物を与えた。
【０２１２】
ＰＣＲ/ＬＤＲの感度は、野生型ＤＮＡにおけるセルラインから誘導された種々の希釈度の変異ＤＮＡを含むサンプルを再構築することによって決定された。サンプルは、独立して増幅されたＰＣＲであり、混合して、種々の条件の試験に付した。予備的実験は、正常および変異ＤＮＡの全量(２０μｌの反応中、２，０００fmol全量）、蛍光標識識別プローブ（それぞれ５００fmol）、共通プローブ（それぞれ５００−１,５００fmolｅから）および最終的にＴth ＤＮＡリガーゼ（野生型またはＫ２９４Ｒ変異酵素の１００fmol）の効果的活用を可能にした。標準ＰＣＲ／ＬＤＲ反応には、３０ＰＣＲサイクルと２０ＬＤＲサイクルが含まれていた。
【０２１３】
初期実験において、Ｇ１２Ｄ変異を含むＰＣＲ増幅ＤＮＡの０.０２５ｎＭ（０.５fmol）から５ｎＭ（１００fmol）を、野生型ＰＣＲ増幅ＤＮＡの１００ｎＭ（２０００fmol）中に希釈した。野生型またはＫ２９４Ｒ変異酵素で形成されたＬＤＲ産物の量は、類似のシグナル対ノイズ値と殆ど同じであった(図３３および図３４参照）。Ｋ２９４Ｒ変異酵素により、シグナル対ノイズ比率は、２,０００の野生型鋳型中で１個のＧ１２Ｄ鋳型を区別する場合は１.７であり、１,０００の野生型鋳型中で１個を区別する場合は３.２に増加した。
【０２１４】
プローブセットを合わさせて、複合ＬＤＲ反応でＫ−rasコドン１２における６種の可能な単一塩基変異すべてを試験する場合、最大のバックグラウンドノイズは、Ｇ１２Ｄ（すなわち、Ｃ：Ａミスマッチを表す）を検出するために設計されたプローブから得られた。それ故、複合アッセイでシグナル対ノイズ値を決定するため、Ｇ１２Ｖ変異体を使用し、“シグナル”(Ｇ１２Ｖから）および“ノイズ”(野生型鋳型についてのＧ１２ＤプローブからのＣ：Ａミス連結反応）を同じ反応で定量することが出来た。６個のプローブセットに対して、類似量の産物が両方の酵素で形成され、Ｋ２９４変異体はわずかにより良好なシグナル対ノイズ値を証明した（図３５−３８参照）。しかしながら、野生型ＤＮＡの２０００fmol中、癌鋳型の２０fmol、４０fmol、８０fmol、１００fmolおよび２００fmolでは、ｗ/Ｋ２９４で得られたシグナル対ノイズ比率は、野生型リガーゼで得られたものよりも有意に高かった。Ｋ２９４Ｒ変異酵素により、シグナル対ノイズ比率は、１０００の野生型鋳型中、１個のＧ１２Ｖ鋳型を区別する場合、３.２であり、５００の野生型中、１個を区別する場合は５.５に上昇した。驚くべきことに、ハイブリダイゼーションの間の干渉に対する潜在性にもかかわらず、６個の複合反応で得られたシグナル対ノイズ値は、最低希釈濃度で単一プローブで得られた値に匹敵する。より高い癌ＤＮＡ濃度において、重複するプローブ間の干渉は、８プローブまたは単一セットのプローブの使用に比較して２６プローブの全ての全補体を使用した場合、より少ないシグナルの発生により明白となる。
【０２１５】
複合ＬＤＲ反応中で、Ｋ-rasコドン１２、１３および６１における１９可能性単一塩基変異を試験するために、２６プローブすべての全相補物を使用した。Ｑ６１Ｒ、すなわちＧ：Ｔミスマッチを表すものを検出するために設計されたプローブに対するバックグラウンドノイズは、Ｇ１２Ｄ、すなわちＣ：Ａミスマッチを検出するために設計されたプローブに対して観察されたものよりも約１０倍高かった。プローブは、対立する鎖配列を使用することにより、Ｇ：Ｔミスマッチを避けるために設計されてもよい。６プローブセットよりは明らかに少量であったが、２６プローブセットに対して、産物の類似量を両方の酵素で形成させた(図３９−４０参照）。Ｋ２９４Ｒ変異酵素により、シグナル対ノイズ比率（Ｇ１２ＤＣ：Ａミス連結反応に比較して）は、５００の野生型鋳型中、１個のＧ１２Ｖ鋳型を区別する場合３.２であり、２５０の野生型鋳型中１個を区別する場合、７.２に増加した。コドン１２と１３にハイブリダイズする１６個の重複プローブを使用すると、全シグナルもシグナル対ノイズも減少するが、なお５００中の１個の変異を区別することが出来る。他の研究者らは、Ｔ４リガーゼを使用してコドン１２における３つの変異を１％の感度で検出し(ブロッキングオリゴヌクレオチドと高い塩を野生型鋳型に対するミス連結反応を抑制するために必要とする）、熱安定性酵素はコドン１２および１３中、１２の変異すべてをより高い感度で同時に検出出来ることを報告している（Powellet.al., N.E.J.Med.329:1982-87(1993), Jen,et.al., CancerRes. 54:5523-26(1994), Redston,et.,al.,Gastroent.108:383-92(1995)、出典明示により本明細書の一部とする）。
【０２１６】
微細切された組織からのＰＣＲ増幅鋳型で使用されたが、それに対しては既にＫ-ras変異が直接の配列決定法を用いて決定された。ブラインド試験において、多くがＫ−ras変異を含む１４８コードサンプルを、どの変異が存在するかをＰＣＲ／ＬＤＲを使用して決定するために提供した。単一の変異の存在は、与えられた長さで移動する単一バンドの出現によって明らかに示された(図４１−４２参照）。観察された長さを期待されたＬＤＲ産物の長さと比較することにより、変異が決定された(表９および図４０）。
【０２１７】
【表９】
0005575380.tif 000025
【０２１８】
試験された１４８の未知のサンプルと１０の既知のサンプルのうち、既知のサンプルのすべておよび１３８の未知のサンプルについて一致が認められた。図４３は、１０の調和しないサンプルを比較する表である。複合ＰＣＲ／ＬＤＲによって得られた結果は、変異に特異的なＬＤＲプローブセットのみを用いてＰＣＲ／ＬＤＲにより確認された。１０の調和しないサンプルのうち９は、配列決定によって見出された単一の非常に稀な二重変異のみを逸するＰＣＲ／ＬＤＲによって正確にタイプされた。他の実験において、変異の検出は、微細切された癌対正常および癌組織を含む全パラフィン断片において比較された。複合ＰＣＲ／ＬＤＲは、微細切に対する必要性なしでもすべての公知の変異を検出した。
すなわち、セルラインから誘導されたサンプル、微細切癌およびパラフィン包埋組織についての複合ＰＣＲ／ＬＤＲの利用が示された。この技術は、非常に正確であり（９９.３％）、高い感度を示す(すなわち、５００正常配列中、１つの変異が検出される）。
【０２１９】
実施例２１−サンプル中の全正常ＤＮＡを定量する低濃度ＬＤＲ産物を提供するための低濃度正常プローブの使用
ＬＤＲ反応を９４℃で１５秒およびサイクル当たり６５℃で４分を２０サイクル行った。管をエタノール−ドライアイス浴中で冷却し、０.５mＭＥＤＴＡの０.５μｌを添加することにより、反応を完全に停止させた。反応産物の２.５μｌの溶液を、２.５μlの増量緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭＥＤＴＡおよび０.１７％ブルー・デキストラン）および０.５μｌＧene Ｓcan ＴＡＭＲＡ３５０分子量マーカーと混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急速に冷却し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲル上に加え、ＡＢＩ３７３ＤＮＡ配列決定機上１４００ボルトで電気泳動を行った。蛍光連結反応産物を分析し、指数方程式のパラメターをＤeltagraph Ｐro３.５ソフトウエアを用いてデータに適合させた。
【０２２０】
図４４−４５は、種々変化させた野生型プローブの量が野生型またはＫ２９４ＲＴth ＤＮＡリガーゼによって使用された場合の、種々の量のＫ−ras正常鋳型の量的検出を示す。ＬＤＲ産物の量は、２５ｎＭ(５００fmol)，５０ｎＭ(１０００fmol)及び１００ｎＭ（２０００fmol）の”正常”鋳型を、２５ｎＭ（５００fmol）の１９種の識別プローブ(Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ，Ｔet−Ｋ−ras１３.３Ｃ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ，Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ，Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−５）、５０ｎｍ（１０００fmol）の２種の共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２Ｃom−５）および７５ｎｍ（１５００fmol）の５種の共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−２，Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−１，Ｋ−ras ｃ１３Ｃom−４，Ｋ−ras ｃ１３およびＫ−rasｃ６１Ｃom−６）ならびに５ｎｍ（１００fmol）の野生型またはＫ２９４Ｒ変異酵素の存在下、０.５ｎＭ（１０fmol），２.５ｎＭ（５０fmol）および５ｎＭ（１００fmol）の野生型識別プローブ(Ｔet-Ｋ-ras ｃｌ２.２ＷｔＧ）および共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−２）を反応させた場合に形成されたものである。Ｘ軸は正常鋳型の量、Ｙ軸は生成したＬＤＲ産物の量を示す。(■、△、□）はそれぞれ野生型酵素と共に使用された野生型プローブの０.５ｎＭ(１０fmol)、２.５ｎＭ(５０fmol)および５ｎＭ(１００fmol)を表し、(●、◆、○）はそれぞれＫ２９４Ｒ変異酵素と共に使用された野生型プローブの０.５ｎｍ（１０fmol）、２.５ｎＭ（５０fmol）および５ｎＭ(１００fmol)を表す。
【０２２１】
本発明について、説明の目的で詳細な記載が行われたが、このような詳細な記載は単に当該目的の為に行われたものであり、以下の特許請求の範囲によって定義される発明の範囲の精神から逸脱することなく種々の変化が当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのＰＣＲ／ＬＣＲプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがＬＤＲ相から排除され、少数変異標的から圧倒的なシグナルを回避し、ＬＤＲ相にマーカーは加えられていない。
【図２】図２は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのＰＣＲ／ＬＣＲプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブがＬＤＲ相から排除され、少数変異標的から圧倒的なシグナルを回避し、ＬＤＲ相にマーカーは加えられている。
【図３】図３は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出のためのＰＣＲ／ＬＣＲプロセスを表わす流れ図である。ここでは、野性型対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが低レベルで、ＬＤＲ相において使用され、および／または修飾されて、多数標的に対応する少ない連結反応産物を製出する。これは少数変異標的からのシグナルが圧倒されるのを防ぐ。
【図４】図４は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図１のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
【図５】図５は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図２のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
【０２２３】
【図６】図６は、連結反応産物を分離するために電気泳動を用いる図３のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
【図７】図７は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図１のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
【図８】図８は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図２のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
【図９】図９は、連結反応産物を分離するためにアドレス可能アレイを用いる図３のＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表わす模式図である。
【図１０】図１０は、部位特異的変異生成を用いて、アミノ酸残基２９４でのThemus thermophilus ＤＮＡリガーゼ変異体の構築に関する。
【０２２４】
【図１１】図１１は、Ｔｈリガーゼのポジティブ活性部位領域の部位指向変異生成を示す。水平棒は、Ｃ末端を示す矢印と共に、完全長のＴthＤＮＡリガーゼタンパク質を表わす。黒地斜線部は、Ｔth（すなわち、Themus thermophilus）ＤＮＡリガーゼとＥ.ｃｏｌｉリガーゼとの強い相同性を有する領域を表わし、白地斜線部は、相同性の小さい領域を表わす。Ｋ１１８、Ｄ１２０、Ｋ２９４、Ｒ３３７、Ｇ３３９、Ｃ４１２、Ｃ４１５、Ｃ４２８およびＣ４３３での部位指向変異生成により産生されたアミノ酸置換が示されている。既知のＮＡＤ＋依存リガーゼ中で同一であるアミノ酸残基に下線が引かれている。
【図１２Ａ】図１２Ａは、図１１の変異リガーゼをつくるためのプライマーを表わす。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、図１１の変異リガーゼをつくるためのプライマーを表わす。
【０２２５】
【図１３】図１３Ａ−Ｃは、連結反応アッセイのために用いられたオリゴヌクレオチドの模式的表示である。プローブ配列は、ヒト真核の多数合成因子eIF-4E(Rychlik, W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:945-49(1987)、出典明示により本明細書の一部とする）から誘導された。このランダム真核ＤＮＡ配列は選別されて、部分的に精製された変異ＴthＤＮＡリガーゼ製造における細菌性ＤＮＡ汚染からの偽のシグナルを回避された。プローブの融点は、最も近似の熱力学的方法（Breslauer, K. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3746-3750(1986)、出典明示により本明細書の一部とする（ＯＬＩＧＯ4.0 program, National Biosciences Inc., Plymouth, ＭＮ)を用いて、推測した。図１３Ａおよび図１３Ｂは、例として鋳型鎖の一つＡＬｇを用いてのニックＤＮＡ二重らせんの形成を表わす。図１３Ａに示すように、４種のニックＤＮＡ基質が、共通の蛍光標識オリゴヌクレオチド、ｃｏｍ３Ｆおよび識別 oligo（ＲＰ５’Ａ、ＲＰ５’Ｃ、ＲＰ５’Ｇ、ＲＰ５’Ｔ）の一つを鋳型鎖、ＡＬｇにアニールすることによって形成される。図１３Ｂでは４種のニックＤＮＡ基質が、共通の蛍光標識オリゴヌクレオチド、ｃｏｍ３Ｆおよび識別 olego（ＬＰ３’Ａ、ＬＰ３’Ｃ、ＬＰ３’Ｇ、ＬＰ３’Ｔ）の一つを鋳型鎖、ＡＬｇにアニールすることによって形成される。マッチおよびミスマッチ塩基対の全１６組合せの完全セットが、鋳型鎖としてＡＬｇ、ＧＬｇ、ＴＬｇおよびＣＬｇ（図１３Ｃに示す）を用いて、形成される。これは下線を引いた塩基で相異している。共通蛍光標識プローブへの連結反応で形成された産物は、異なる長さの”Ａ”テイルの取りこみよって変性ポリアクリルアミドゲル上のサイズによって識別することができる。
【図１４】図１４は、図１３のオリゴヌクレオチドをつくるために用いられたプローブの配列を表わす。
【０２２６】
【図１５】図１５Ａ−Ｅは、ニックの３’側でのＴthＤＮＡリガーゼによるニック再結合の適合性を表わす。図１５Ａに示すように、リガーゼ基質（ニックＤＮＡ二重らせん）は、鋳型鎖上で識別オリゴヌクレオチドＬＰ３’(Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）をリン酸化共通オリゴヌクレオチド（３’−蛍光標識、ｃｏｍ３Ｆ）でアニーリングすることにより形成される。識別オリゴヌクレオチドの３’側での識別塩基”Ｎ”および鋳型鎖における”ｎ”は、変化して、塩基対の全１６の可能性ある組合せを与える。”Ａｍ”は、識別オリゴヌクレオチドの５’末端での”Ａ”テイルを表わす。反応は、１ｍＭ ＮＡＤ＋、１２.５ｎＭ（５００fmole）のニックＤＮＡ二重らせん基質および０.１２５ｎＭ（５fmole）ＴthＤＮＡリガーゼを含有する混合物４０μｌ中、６５℃で行なわれた。アリコット（５μｌ）を０、２、４、６、８および２３時間後に採取し、変性ポリアクリルアミドゲル上で分離した。データはGenescan version 1.2 ソフトウェアーを用いて解析した。結果はDeltagraph Pro3 ソフトウェアーを用いてプロットした。図１５Ｂ−Ｅは、同じ識別オリゴによるが、異なる鋳型鎖を用いて得られた結果である。パネル３’−Ａ（図１５Ｂ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ａであった。Ａ−Ｔ（◆）、Ａ−Ｃ（△）、Ａ−Ａ（▽）およびＡ−Ｇ（○）は鋳型鎖として夫々、ＴＬｇ、ＣＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル３’−Ｇ（図１５Ｄ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ａであった。Ｇ−Ｃ（◆）、Ｇ−Ｔ（△）、Ｇ−Ａ（▽）およびＧ−Ｇ（○）は、鋳型鎖として夫々、ＣＬｇ、ＴＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル３’−Ｃ（図１５Ｃ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ａであった。Ｃ−Ｇ（◆）Ｃ−Ａ（△）、Ｃ−Ｔ（▽）およびＣ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々、ＧＬｇ、ＡＬｇ、ＴＬｇおよびＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル３’−Ｔ（図１５Ｅ）において、識別オリゴヌクレオチドはＬＰ３’Ｔであった。Ｔ−Ａ（◆）、Ｔ−Ｇ（△）、Ｔ−Ｔ（▽）およびＴ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々、ＡＬｇ、ＧＬｇ、ＴＬｇまたはＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。
【０２２７】
【図１６】図１６Ａ−Ｅは、ニックの５’側での熱安定性ＤＮＡリガーゼによるニック再結合の適合性を表わす。反応条件は、異なる識別および共通オリゴヌクレオチドを用いた以外は図１５と同じである。識別塩基はニックの５’側（リン酸化オリゴヌクレオチドＲＰ５’Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）にあり、共通オリゴヌクレオチドはニックの３’側にあって、ＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン、配列決定および変異検出に用いられた蛍光塗料）で５’−標識されていた。参照、図１６Ａ。パネル５’Ａ（図１６Ｂ）において、識別オリゴヌクレオチドはＰＲ５’Ａであり、Ａ−Ｔ（◆）、Ａ−Ｃ（△）、Ａ−Ａ（▽）およびＡ−Ｇ（○）は、鋳型鎖として夫々ＴＬｇ、ＣＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル５’−Ｇ（図１６Ｄ）において、識別オリゴヌクレオチドはＰＲ５’Ｇであり、Ｇ−Ｇ（◆）、Ｇ−Ｔ（△）、Ｇ−Ａ（▽）およびＧ−Ｇ（○）は、鋳型鎖として夫々ＣＬｇ、ＴＬｇ、ＡＬｇおよびＧＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル５’−Ｃ（図１６Ｃ）において、識別オリゴヌクレオチドはＲＰ５’Ｃであり、Ｃ−Ｇ（◆）、Ｃ−Ａ（△）、Ｃ−Ｔ（▽）およびＣ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々ＧＬｇ、ＡＬｇ、ＴＬｇおよびＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。パネル５’−Ｔ（図１６Ｅ）において、識別オリゴヌクレオチドはＲＰ５’Ｔであり、Ｔ−Ａ（◆）、Ｔ−Ｇ（△）、Ｔ−Ｔ（▽）およびＴ−Ｃ（○）は、鋳型鎖として夫々ＡＬｇ、ＧＬｇ、ＴＬｇまたはＣＬｇを含有するＤＮＡ基質を表わす。
【０２２８】
【図１７】図１７Ａ−Ｃは、ニックの３’側上の第３部位での塩基類似体およびミスマッチを含有するオリゴヌクレオチドプローブを示す図である。
【０２２９】
【図１８】図１８は、Thermus thermophilusリガーゼの適合性の改善に関する表である。プローブＬＰ３’Ｃ、ＬＰ３’ＴおよびＣｏｍ３Ｆの配列は図１４に示されている。他の識別プローブの配列は下記の通り。 SLP3’C: 5’TACGTCTGCGGTGTTGCGTC 3’  SLP3’T: 5’CGTCTGCGGTGTTGCGTT 3’SLP3’ATC: 5’ATGCGTCTGCGGTGTTGCATC 3’  SLP3’ATT: 5’GCGTCTGCGGTGTTGCATT 3’ SLP3’QTC: 5’AAATGCGTCTGCGGTGTTGCQTC 3’  SLP3’QTT: 5’ATGCGTCTGCGGTGTTGCQTT 3’識別オリゴヌクレオチドにおける塩基”Ｎ”はＣまたはＴのいずれかである。”Ｑ”はＱ塩基類似体を示す。Ｑ塩基類似体を含有する鋳型鎖を除き、試験した全基質についての鋳型鎖はＧＬｇであり、その配列を図１４に示す。Ｑ塩基類似体を含有する基質における鋳型鎖はＧＬｇ.ｍ３Ａであり、太字体で示された単一部位でＧＬｇと相違する。連結反応の初速度（fmol/min）は、分での時間を表わすＸ軸とfmolでの産物量を表わすＹ軸との直線グラフの勾配として計算した。ＴthＤＮＡリガーゼの連結反応適合性は、完全マッチ連結反応の初速度のミスマッチ連結反応の初速度に対する割合と定義する。
【０２３０】
【図１９】図１９は、野性型またはＫ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼのいずれかによる正常ＤＮＡ過剰における単一塩基変異の定量的検出に用いられたプライマーを示す。ＬＤＲ反応は、２５fmoleの精製野性型または変異Ｋ２９４Ｒのいずれかの酵素の存在下に、１２.５ｎＭ（２５０fmole）のミスマッチ鋳型（ＧＬｇ.ｍ３ＡおよびＧＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｓ＝正常鋳型）および０−２.５ｎＭ（５０fmole）の完全マッチ鋳型（ＡＬｇ.ｍ３ＡおよびＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ＝癌鋳型）に関する。各反応は、２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ,pH７.６; １０ｍＭ ＭｇＣｌ2; １００ｍＭ ＫＣｌ; １０ｍＭ ＤＴＴ; １ｍＭ ＮＡＤ+; ２５ｎＭ(５００ fmole)の２つの短い検出プライマーおよび鋳型混合物を含有する２０μｌの混合物中で実施された。反応混合物をＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００（Perkin Elmer）中で１５秒、９４℃で加熱し、次いで野性型または変異ＴthＤＮＡリガーゼを加えた。さらに３０秒、９４℃で酵素と共にインキュベーションした後、２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
【０２３１】
【図２０】図２０Ａ−Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４Ｒ ＴthのＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰におけるＴ：ＧミスマッチについてのＬＤＲオリゴヌクレオチドプレーブ（図２０Ａ）および鋳型配列（図２０Ｂ）を示す。ＧＬｇ.ｍ３ＡおよびＧＬｇｍ３Ａ.ｒｅｖはミスマッチ鋳型（正常鋳型）を表わし、ＡＡＬｇ.ｍ３ＡおよびＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖは完全なマッチ鋳型（癌鋳型）を表わす。プライマーＳＬＰ３’ＴＴＴは、完全マッチ（癌）鋳型についての正常プライマーを表わし、ＳＬＰ３’ＴＴＣはミスマッチ（正常）鋳型についての正常プライマーを表わす。同様に、Ｔ：ＧミスマッチについてのＱ類似体での実験では、マッチ（癌）鋳型についての正常プライマーとしてＳＬＰ３’Ｑ２ＴＴおよびＳＬＰ３’Ｑ１８ＴＴを用いる。
【０２３２】
【図２１】図２１Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰における単一塩基変異（Ｔ：Ｇミスマッチ）の定量検出を示す。０、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１fmol）０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）、１.２５ｎＭ（２５fmol）および２.５ｎＭ（５０fmol）の”癌”鋳型を１２.５ｎＭ（２５０fmol）の”正常”鋳型と併用したときに、ＬＤＲ産物が形成された。反応は、２５ｎＭ（５００fmol）の正規プライマー（ＳＬＰ３’ＴＴＴおよび Com 610 ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型またはＫ２９４Ｒ変異の酵素の存在下に行なわれた。この反応に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、連結反応部で”正常”鋳型上にＴ：Ｇミスマッチを、”癌”鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。ＬＤＲ反応は各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分の２０サイクルがなされた。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００ voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２１Ｂ）はグラフ（図２１Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２３３】
【図２２】図２２Ａ−Ｂは、正常ＤＮＡにおける変異鋳型の種々の濃度を有するＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を示す。単一塩基変異鋳型（”癌”）を１２.５ｎＭ（２５０fmol）の”正常”鋳型に希釈し、０.１２５ｎＭ（２５fmol）の野性型または変異Ｋ２９４Ｒ Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いて解析した。この反応に用いたオリゴヌクレオチドプローブは、連結反応部で”正常”鋳型上にＴ：Ｇミスマッチを、”正常”鋳型上にＴ：Ａマッチをつくった。シグナル対ノイズ比率は、”正常”鋳型（１２.５ｎＭ＝２５０fmol鋳型）の存在下で”癌”鋳型で形成された産物量の、正常鋳型単独での同量により形成された産物量に対する割合と定義される。表（図２２Ｂ）はグラフ（図２２Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２３４】
【図２３】図２３Ａ−Ｂは、０、０.００５ｎＭ（０.１fmol）、０.０１２５ｎＭ（０.２５fmol）、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１.０fmol）、０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）および０.５ｎＭ（１０fmol）の正常鋳型（Ｇｌｇ.ｍ３Ａ and ＧＬｇ.ｍ３.Arev）を２５ｎＭ（５００fmol）の正規プライマー（ＳＬＰ３’ＴＴＣおよびＣｏｍ６１０ ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型または変異の酵素と混合したときに形成したＬＤＲ産物の量を示す。この反応に用いたプライマーは連結反応部で”正常”鋳型上にＣ：Ｇマッチをつくる。ＬＤＲ反応は各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分の２０サイクルがなされた。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００ voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２３Ｂ）はグラフ（図２３Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターを Deltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２３５】
【図２４】図２４は、リガーゼの適合性を検定するために用いたプライマーを含有するヌクレオチド類似体を示す。典型的なＬＤＲアッセイにおける野性型および変異ＴthのＤＮＡリガーゼの適合性を検定するために、４つの異なる条件を用いた。各反応は、２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ、pH７.６；１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；１００ｍＭ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＤＴＴ；１ｍＭ ＮＡＤ＋；２５ｎＭ（５００fmol）の２つの短い検出プライマーおよび１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型単独、または正常鋳型に併せて１２５ｎＭ（２.５fmol）および０.５ｎＭ（１０fmol）の癌鋳型（比率、夫々１：１００および１：２５）を含有する混合物２０μｌ中で行った。この反応において用いたオリゴヌクレオチドプローブは、連結反応部で”正常”鋳型上にＴ：Ｇミスマッチを、”癌”鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。さらに、オリゴヌクレオチドプローブＳＬＰ３’ＱＴＴは、３’末端から３番目の位置にＱ２：ＡまたはＱ１８：Ｔの対をつくる。この反応混合物は、９４℃で１５秒、Gene Amp 9600 テルモサイクラー（Perkin Elmer）中て加熱し、２５fmolの野性型および変異ＴthのＤＮＡリガーゼを加えた。さらに３０秒、９４℃で酵素と共にインキュベーションした後、２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
【０２３６】
【図２５】図２５Ａ−Ｄは、本発明のＰＤＲ／ＬＤＲプロセスのＬＤＲ相のためのヌクレオチド類似体を有するオリゴヌクレオチドプローブの種々の形を示す。
【０２３７】
【図２６】図２６は、野性型またはＫ２９４のいずれかのＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰における単一塩基変異（Ｃ：Ａミスマッチ）の定量的検出に用いられたプライマーを示す。ＬＤＲ反応は、２５fmolの精製野性型酵素または変異酵素Ｋ２９４Ｒの存在下に、１２.５ｎＭ（２５０fmole）のミスマッチ鋳型（ＧＬｇ.ｍ３Ａおよび ＧＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｓ＝正常鋳型）および０−２.５ｎＭ（５０fmole）の完全マッチ鋳型（ＡＬｇ.ｍ３ＡおよびＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ＝癌鋳型）に関する。各反応は、２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ,pH７.６; １０ｍＭ ＭｇＣｌ2; １００ｍＭ ＫＣｌ; １０ｍＭ ＤＴＴ; １ｍＭ ＮＡＤ+; ２５ｎＭ(５００ fmol)の２つの短い検出プライマーおよび鋳型混合物を含有する２０μｌの混合物中で実施された。この反応で用いたプローブは、連結反応部で正常鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、癌鋳型上にＣ：Ｇマッチをつくる。反応混合物をＧｅｎｅ  Ａｍｐ９６００（Perkin Elmer）中で１５秒、９４℃で加熱し、次いで野性型または変異ＴthＤＮＡリガーゼを加えた。さらに３０秒、９４℃で酵素と共にインキュベーションした後、２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００ｖｏｌｔで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。
【０２３８】
【図２７】図２７Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰における単一塩基変異（Ｃ：Ａミスマッチ）の定量検出を示す。０、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１fmol）０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）、１.２５ｎＭ（２５fmol）および２.５ｎＭ（５０fmol）の”癌”鋳型（すなわちＧｌｇ.ｍ３Ａ／Ｇｌｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）を１２.５ｎＭ（２５０fmol）の”正常”鋳型（すなわちＡＬｇ.ｍ３Ａ／ＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）と併用したときに、ＬＤＲ産物が形成された。反応は、２５ｎＭ（５００fmol）の正規オリゴヌクレオチドプローブ（ＳＬＰ３’ＴＴＴおよび Com 610 ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型またはＫ２９４Ｒ変異の酵素の存在下に行なわれた。この反応に用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、連結反応部で”正常”鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、”癌”鋳型上にＣ：Ｇマッチをつくる。ＬＤＲ反応は各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分の２０サイクルがなされた。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２６Ｂ）はグラフ（図２６Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２３９】
【図２８】図２８Ａ−Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４Ｒ ＴthＤＮＡリガーゼによる０.１２５ｎＭ（２５fmol）での１２.５ｎＭ（２５０fmol）の”正常”鋳型と併用したときの種々の濃度の単一変異鋳型（”癌”）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を示す。シグナル対ノイズ比率は、１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型の存在下に種々の濃度の癌鋳型で形成された産物量と１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型単独で形成された産物の量との割合である。この反応に用いられたオリゴヌクレオチドプローブ（ＳＬｐ３’ＴＴＣおよびＣｏｍ６１０ ３’Ｆ）は、連結反応部で”正常”鋳型（ＡＬｇ.ｍ３Ａ／ＡＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）上にＣ：Ａミスマッチを、および”癌”鋳型（ＧＬｇ.ｍ３Ａ／ＧＬｇ.ｍ３Ａ.ｒｅｖ）上にＣ：Ｇマッチをつくる。表（図２８Ｂ）はグラフ（図２８Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１２.５ｎＭ（２５０fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４０】
【図２９】図２９Ａ−Ｂは、０、０.００５ｎＭ（０.１fmol）、０.０１２５ｎＭ（０.２５fmol）、０.０２５ｎＭ（０.５fmol）、０.０５ｎＭ（１.０fmol）、０.１２５ｎＭ（２.５fmol）０.２５ｎＭ（５fmol）および０.５ｎＭ（１０fmol）の正常鋳型（すなわち、ＡＬｇ.ｍ３Ａ／ＡＬｇ.ｍ３.Arev）単独を２５ｎＭ（５００fmol）の正規プライマー（ＳＬＰ３’ＴＴＣおよびＣｏｍ６１０ ３’Ｆ）および１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型または変異酵素と混合したときに形成したＬＤＲ産物の量を示す。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００volt で電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図２９Ｂ）はグラフ（図２９Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は正常鋳型の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は１.２５ｎＭ（２５fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は１.２５ｎＭ（２５ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４１】
【図３０】図３０Ａ−Ｃは、Ｋ−ｒａｓのコドン１２、１３および６１における変異についてのＰＣＲ／ＬＤＣ検出を表わす。上部の図（図３０Ａ）は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子を含有する染色体ＤＮＡの模式図である。エクソンは斜線部であり、コドン１２、１３および６１位置が示される。これらの３コドンを両側からはさむＫ−ｒａｓＤＮＡを選択的に増幅するために、エクソン特異的プライマーを用いた。中段（図３０Ｂ）および下部（図３０Ｃ）の図は、コドン１２、１３および６１におけるすべての可能なアミノ酸変化についてのＬＤＲ検出のためのプライマー設計を表わす模式図である。例えば、コドン１２（ＧＧＴ）は、ＧＡＴ、ＧＣＴまたはＧＴＴに変異をおこす。対立遺伝子特異的ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは３’末端に識別塩基を、５’末端に蛍光標識を含む。共通オリゴヌクレオチドは５’末端リン酸化されて、３’末端にポリ−Ａテイルおよびブロック基を含有する。種々の変異がポリアクリルアミドゲル上で産物を分離することにより識別される。コドン１２で変異を検出するために用いられたＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、コドン１３で変異を検出するために用いられたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを阻止し得る。これらのプローブが他のＬＤＲプローブの存在下で変異シグナルを正しく同定し得るかどうかを実験的に決定する必要がある。
【０２４２】
【図３１Ａ】図３１Ａは、野性型または変異Ｋ２９４ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰下の典型的ＬＤＲ反応におけるコドン１２、１３および６１での種々の変異を検出するために使用したＫ−ｒａｓＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの名前および配列を示している。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、野性型または変異Ｋ２９４ ＴthＤＮＡリガーゼによる正常ＤＮＡの過剰下の典型的ＬＤＲ反応におけるコドン１２、１３および６１での種々の変異を検出するために使用したＫ−ｒａｓＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの名前および配列を示している。
【０２４３】
【図３２】図３２および３３Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子（Ｇ１２Ｄ）のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ａｓｐ変異（Ｃ：Ａミスマッチ）の定量的検出を示す。図３２でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３２で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋｒａｓ配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーンは、夫々５nM（１００fmol）、２nM（４０fmol）、０.８nM（２０fmol）、０.４nM（８fmol）、０.２nM（４fmol）、０.１nM（２.０fmol）、０.０５nM（１fmol）および０.０２５nM（０.５fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の１つの識別オリゴヌクレオチドプローブ（Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄおよび共通プライマーＫ−ras ｃ１２Ｃom−２）および５nM（１００fmol）の野性型またＫ２９４Ｒ変異の酵素の存在下に実施された。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ａｓｐ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、Ｋ−ras鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３３Ｂ）はグラフ（図３３Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｄ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４４】
【図３３】図３２および３３Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子（Ｇ１２Ｄ）のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ａｓｐ変異（Ｃ：Ａミスマッチ）の定量的検出を示す。図３２でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３２で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋｒａｓ配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーンは、夫々５nM（１００fmol）、２nM（４０fmol）、０.８nM（２０fmol）、０.４nM（８fmol）、０.２nM（４fmol）、０.１nM（２.０fmol）、０.０５nM（１fmol）および０.０２５nM（０.５fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の１つの識別オリゴヌクレオチドプローブ（Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄおよび共通プライマーＫ−ras ｃ１２Ｃom−２）および５nM（１００fmol）の野性型またＫ２９４Ｒ変異の酵素の存在下に実施された。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ａｓｐ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、Ｋ−ras鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３３Ｂ）はグラフ（図３３Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｄ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４５】
【図３４】図３４Ａ−Ｂは、５nM（１００fmol）の野性型または変異Ｋ２９４ＲのＴth ＤＮＡリガーゼを用いて、１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras鋳型と併用した単一塩基変異（Ｇ１２Ｄ）を含有する種々の濃度のＫ−ras遺伝子（０.０２５mM〔０.５fmol〕から５nM〔１００fmol〕）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を表す。この反応で用いたプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、Ｇ１２Ｄ鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。シグナル対ノイズ比率は野性型鋳型の存在（１００nMに２０００fmol鋳型）におけるＧ１２Ｄで形成された産物の量の、野性型鋳型単独の同量で形成された産物量に対する比率であると定義される。表（図３４Ｂ）はグラフ（図３４Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｄの種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４６】
【図３５】図３５および３６Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４のＴth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子（Ｇ１２Ｖ）のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異（Ｃ：Ｔミスマッチ）の定量的検出を示す。図３５でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３５で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋｒａｓ配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーン（図３５）は、夫々０.１nM（２.０fmol）、０.２nM（４fmol）、０.４nM（８fmol）、０.８nM（２０fmol）、２nM（４０fmol）、４nM（８０fmol）、５nM（１００fmol）および２０nM（２００fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の６識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ）、７５nM（１５００fmol）の２共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−２およびＫ−ras ｃ１２Ｃom−１）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４変異の酵素の存在下に行われた。Ｔetはテトラ塩化−６−カルボキシフルオロレセイン；配列決定／変異検出に用いられた蛍光染料であり、Ｃomは３’アミノ酒色Ｃ３ＣＰＧカラムを用いるオリゴヌクレオチドプローブである。このカラムは、標的オリゴヌクレオチドの３’末端に対する最初のアミンを産生する。これらの３’アミノ・修飾体の最初の使用は、診断プローブとしての次の標識のためであり、また３’エクソヌクレアーゼ活性に抵抗性のオリゴヌクレオチドを産生するためである。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２中のすべての６単塩基変異の存在を検出し得る。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ変異Ｋ−ras鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３６Ｂ）はグラフ（図３６Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｖ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４７】
【図３６】図３５および３６Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４のＴth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子（Ｇ１２Ｖ）のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異（Ｃ：Ｔミスマッチ）の定量的検出を示す。図３５でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３５で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋｒａｓ配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーン（図３５）は、夫々０.１nM（２.０fmol）、０.２nM（４fmol）、０.４nM（８fmol）、０.８nM（２０fmol）、２nM（４０fmol）、４nM（８０fmol）、５nM（１００fmol）および２０nM（２００fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の６識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ）、７５nM（１５００fmol）の２共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２Ｃom−２およびＫ−ras ｃ１２Ｃom−１）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４変異の酵素の存在下に行われた。Ｔetはテトラ塩化−６−カルボキシフルオロレセイン；配列決定／変異検出に用いられた蛍光染料であり、Ｃomは３’アミノ酒色Ｃ３ＣＰＧカラムを用いるオリゴヌクレオチドプローブである。このカラムは、標的オリゴヌクレオチドの３’末端に対する最初のアミンを産生する。これらの３’アミノ・修飾体の最初の使用は、診断プローブとしての次の標識のためであり、また３’エクソヌクレアーゼ活性に抵抗性のオリゴヌクレオチドを産生するためである。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２中のすべての６単塩基変異の存在を検出し得る。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ変異Ｋ−ras鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３６Ｂ）はグラフ（図３６Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｖ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４８】
【図３７】図３７Ａ−Ｂは、５nM（１００fmol）の野性型または変異Ｋ２９４ＲのＴth ＤＮＡリガーゼを用いて、１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras鋳型と併用した単一塩基変異（Ｇ１２Ｖ）を含有する種々の濃度のＫ−ras遺伝子（０.１nM〔０.２fmol〕から１０nM〔２００fmol〕）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を表す。この反応で用いたＧ１２Ｖ特異的プローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇ１２Ｖ鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。この多重反応における最も大きいバックグランドノイズは、Ｇ：Ｔミスマッチを表すＱ６１Ｒを検出するように設計されたプローブからである。これはＧ１２Ｄ、すなわちＣ：Ａミスマッチを表すように設計されたプライマーよりも、１０倍高い。他のアッセイと同様に、この多重アッセイにおけるシグナル対ノイズ比率は、野性型鋳型の存在においてＧ１２Ｖ鋳型（１００mM＝２０００fmol鋳型）で形成された産物量の、野性型鋳型単独（Ｃ：Ａミスマッチを提示する）の同量で形成されたＧ１２Ｄ ＬＤＲ産物量に対する比率であると定義される。表（図３７Ｂ）はグラフ（図３７Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００ｎＭ（２０００fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２４９】
【図３８】図３８および３９Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異（Ｃ：Ｔミスマッチ）の定量的検出を示す。図３８でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３８で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋ−ras配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーンは、夫々０.１nM（２.０fmol）、０.２nM（４fmol）、０.４nM（８fmol）、０.８nM（１０fmol）、２nM（２０fmol）、４nM（４０fmol）、５nM（１００fmol）および２０nM（２００fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の１９識別プライマー（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プライマー（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異酵素の存在下に行われた。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２中のすべての６単塩基変異の存在を検出し得る。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型Ｋ−ras鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ変異Ｋ−ras鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３９Ｂ）はグラフ（図３９Ａ）についての元のデータを記述する。データを解��し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｖ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２５０】
【図３９】図３８および３９Ａ−Ｂは、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる正常Ｋ−ras配列の過剰下でＫ−ras遺伝子のコドン１２におけるＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異（Ｃ：Ｔミスマッチ）の定量的検出を示す。図３８でゲル＃ｍｋ９６０４２３（＃１−１１）についての左側１１レーンは、野性型Ｔth ＤＮＡリガーゼを用いたときに得られたデータを表し、図３８で右側（＃１３−２３）の１１レーンは変異Ｔth ＤＮＡリガーゼ、Ｋ２９４Ｒを用いたときに得られたデータを表す。各々の場合における最初の３レーンは変異Ｋ−ras配列の加えられていないネガティブ・コントロールである。次の８レーンは、夫々０.１nM（２.０fmol）、０.２nM（４fmol）、０.４nM（８fmol）、０.８nM（１０fmol）、２nM（２０fmol）、４nM（４０fmol）、５nM（１００fmol）および２０nM（２００fmol）の変異Ｋ−ras鋳型を１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras ＤＮＡと併用したとき形成されたＬＤＲ産物の量を示す。反応は、２５nM（５００fmol）の１９識別プライマー（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プライマー（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異酵素の存在下に行われた。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２中のすべての６単塩基変異の存在を検出し得る。この反応で用いられたＧｌｙ−＞Ｖａｌ変異を検出するためのＬＤＲプローブは、連結反応部で野性型Ｋ−ras鋳型上にＣ：Ｔミスマッチを、Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ変異Ｋ−ras鋳型上にＡ：Ｔマッチをつくる。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。表（図３９Ｂ）はグラフ（図３９Ａ）についての元のデータを記述する。データを解��し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００nM（２０００fmol）の野性型鋳型におけるＧ１２Ｖ鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２５１】
【図４０】図４０Ａ−Ｂは、５nM（１００fmol）の野性型または変異Ｋ２９４ＲのＴth ＤＮＡリガーゼを用いて、１００nM（２０００fmol）の野性型Ｋ−ras鋳型と併用した単一塩基変異（Ｇ１２Ｖ）を含有する種々の濃度のＫ−ras遺伝子（０.１nM〔２fmol〕から１０nM〔２００fmol〕）でのＬＤＲ産物のシグナル対ノイズ比率を表す。この反応で用いたＧ１２Ｖ特異的プローブは、連結反応部で野性型鋳型上にＣ：Ａミスマッチを、Ｇ１２Ｄ鋳型上にＴ：Ａマッチをつくる。この多重反応における最も大きいバックグランドノイズは、Ｇ：Ｔミスマッチを表すＱ６１Ｒを検出するように設計されたプローブからである。これはＧ１２Ｄ、すなわちＣ：Ａミスマッチを表すように設計されたプライマーよりも、１０倍高い。他のアッセイと同様に、この多重アッセイにおけるシグナル対ノイズ比率は、野性型鋳型の存在においてＧ１２Ｖ鋳型（１００mM＝２０００fmol鋳型）で形成された産物量の、野性型鋳型単独（Ｃ：Ａミスマッチを提示する）の同量で形成されたＧ１２Ｄ ＬＤＲ産物量に対する比率であると定義される。表（図４０Ｂ）はグラフ（図４０Ａ）についての元のデータを記述する。データを解析し、指数式のパラメーターをDeltagraph Pro 3.5 ソフトウェアーを用いてデータに適用せしめた。Ｘ軸は１００ｎＭ（２０００fmol）の正常鋳型における癌鋳型の種々の量を表わし、Ｙ軸は、生じたＬＤＲ産物の量を表わす。（■）は５ｎＭ（１００fmol）の野性型酵素を表わし、（●）は５ｎＭ（１００ｍｏｌ）の変異Ｋ２９４Ｒ酵素を表わす。
【０２５２】
【図４１】図４１−４２は、Ｋ２９４変異Ｔth ＤＮＡリガーゼによるＫ−ras遺伝子における変異の定量的検出である。ゲル＃ｍｋ９５０５１３における第１レーンは野性型Ｋ−ras ＤＮＡを用いたネガティブ・コントロールである。第２レーン（図４１）は変異Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ Ｋ−ras ＤＮＡを含有するポジティブ・コントロールである。次の２０レーン（図４１）は、異なる変異Ｋ−ras ＤＮＡを含有する２０サンプルについてのＬＤＲ反応のブラインド試験を表す。反応は、２５nM（５００fmol）の１９識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異の酵素の存在下に行われた。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２、１３および６１中のすべて１７変異の存在を検出し得る。微切開組織をＰＣＲチューブに移し、キシレンに１０分間さらし、９５％エタノールで３回洗い、次いで乾燥した。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。データを解析し、その結果を図４２に示し（コールド変異）、ジデオキシ配列決定の結果（期待変異）と比較した。
【０２５３】
【図４２】図４１−４２は、Ｋ２９４変異Ｔth ＤＮＡリガーゼによるＫ−ras遺伝子における変異の定量的検出である。ゲル＃ｍｋ９５０５１３における第１レーンは野性型Ｋ−ras ＤＮＡを用いたネガティブ・コントロールである。第２レーン（図４１）は変異Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ Ｋ−ras ＤＮＡを含有するポジティブ・コントロールである。次の２０レーン（図４１）は、異なる変異Ｋ−ras ＤＮＡを含有する２０サンプルについてのＬＤＲ反応のブラインド試験を表す。反応は、２５nM（５００fmol）の１９識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異の酵素の存在下に行われた。このセットのプローブは、多重反応においてＫ−ras遺伝子のコドン１２、１３および６１中のすべて１７変異の存在を検出し得る。微切開組織をＰＣＲチューブに移し、キシレンに１０分間さらし、９５％エタノールで３回洗い、次いで乾燥した。ＰＣＲ反応を３０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒、５５℃で１分および７２℃で１分間（＋３秒／サイクル）行った。ＬＤＲ反応を２０サイクル、各サイクルにつき９４℃で１５秒および６５℃で４分間行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。データを解析し、その結果を図４２に示し（コールド変異）、ジデオキシ配列決定の結果（期待変異）と比較した。
【０２５４】
【図４３】図４３は、図４１−４２について上記したＰＣＲ／ＬＤＲプロセスからの１０の不一致サンプルを比較した表である。
【０２５５】
【図４４】図４４および４５Ａ−Ｂは、種々の量の野性型プローブを用いたとき、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる種々の量のＫ−ras正常鋳型の定量的検出を示す。ＬＤＲ量は、２５nM（５００fmol）、５０nM（１０００fmol）および１００nM（２０００fmol）の”正常”鋳型を、０.５nM（１００fmol）、２.５nM（５０fmol）および５nM（１００fmol）の野性型識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２ ＷtＧ）および共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２）に、２５nM（５００fmol）の１９識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異の酵素の存在下に、形成せしめた。２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。Ｘ軸は正常鋳型の種々の量を表し、Ｙ軸は生じたＬＤＲ産物の量を表す。（■、△、□）は、夫々０.５nM（１０fmol)、２.５nM（５０fmol)および５nM（１００fmol)の、野性型酵素と共に用いた野性型プローブを表し、（●、◆、○）は、夫々０.５nM（１０fmol)、２.５nM（５０fmol)および５nM（１００fmol)の、Ｋ２９４Ｒ変異酵素と共に用いた野性型プローブを表す。
【０２５６】
【図４５】図４４および４５Ａ−Ｂは、種々の量の野性型プローブを用いたとき、野性型またはＫ２９４ Ｔth ＤＮＡリガーゼによる種々の量のＫ−ras正常鋳型の定量的検出を示す。ＬＤＲ量は、２５nM（５００fmol）、５０nM（１０００fmol）および１００nM（２０００fmol）の”正常”鋳型を、０.５nM（１００fmol）、２.５nM（５０fmol）および５nM（１００fmol）の野性型識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２ ＷtＧ）および共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２）に、２５nM（５００fmol）の１９識別プローブ（Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.２Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.４Ａ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｓ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｃ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＴ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｒ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ、Ｔet−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｐ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.１Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１２.２Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｄ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.４Ｖ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ１３.３Ｒ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.７ＨＣ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.６Ｌ、Ｆam−Ｋ−ras ｃ６１.５Ｋ）；５０nM（１０００fmol）の２つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ６１ Ｃom−７およびＫ−ras ｃ１２ Ｃom−５）；および７５nM（１５００fmol）の５つの共通プローブ（Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−２、Ｋ−ras ｃ１２ Ｃom−１、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−４、Ｋ−ras ｃ１３ Ｃom−３およびＫ−ras ｃ６１ Ｃom−６）および５nM（１００fmol）の野性型またはＫ２９４の変異の酵素の存在下に、形成せしめた。２０サイクルを各サイクルつき１５秒９４℃および４分６５℃で、ＬＤＲ反応を行った。反応は、エタノールドライアイス浴中でチューブを冷やし、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ０.５μｌを加えて、完全に停止せしめた。アリコットの反応産物２.５μｌを負荷緩衝液（８３％ホルムアミド、８.３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１７％ Bleu  Dextram）２.５μｌおよび Gene Scan Rox-1000 分子量マーカー０.５μｌに混合し、９４℃で２分間変性し、氷上で急冷し、８Ｍ尿素−１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、ＡＢＩ ３７３ＤＮＡシクエンサーで１４００voltで電気泳動した。ＡＢＩ Gene Scan ６７２ソフトウェアを用いて、蛍光連結反応産物を分析し、定量した。Ｘ軸は正常鋳型の種々の量を表し、Ｙ軸は生じたＬＤＲ産物の量を表す。（■、△、□）は、夫々０.５nM（１０fmol)、２.５nM（５０fmol)および５nM（１００fmol)の、野性型酵素と共に用いた野性型プローブを表し、（●、◆、○）は、夫々０.５nM（１０fmol)、２.５nM（５０fmol)および５nM（１００fmol)の、Ｋ２９４Ｒ変異酵素と共に用いた野性型プローブを表す。
【図１】
0005575380.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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