(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ４をコードする導入遺伝子を含む、ヒト臍帯血または骨髄の幹細胞の単離された集団であって、該幹細胞が、ＣＸＣＲ４をコードする導入遺伝子を持たない幹細胞と比較して１マイクログラム／ｍｌ以上の高濃度のＳＤＦ−１による脱感作に抵抗性であり、５０ｎｇ／ｍｌ以下の低濃度および／または１マイクログラム／ｍｌ以上の高濃度のＳＤＦ−１に応答して改善されたＣＸＣＲ４シグナル伝達能力を示す幹細胞の単離された集団。
【請求項２】
幹細胞が、造血幹細胞である請求項１記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項３】
幹細胞が、脊髄および赤血球系統へ分化可能である請求項１記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項４】
幹細胞が、ＣＤ３４+造血幹細胞である請求項３記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項５】
幹細胞が、ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/low細胞である請求項１記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項６】
ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/low細胞が、集団の１〜５％である請求項５記載の幹細胞の単離された集団。
【請求項７】
ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/low細胞が、集団の３％以上である請求項５記載の幹細胞の単離された集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、移植に好適な幹細胞、およびそれらの調製のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床的、および実験的造血幹細胞（ＨＳＣ）移植手法は、生涯を通じて、後期胚発達および成人における安定状態造血のあいだに起こる循環から骨髄（ＢＭ）へのＨＳＣ遊走の生理学的過程を模倣している1-3。ヒトＨＳＣへの遺伝子伝達が、広い範囲の造血および遺伝子病の矯正における、見込みのあるツールとして役に立ちうる。ＨＳＣ移植は、これらの遺伝的に改変した細胞を、ＢＭに永続的に伝達するのに使用可能であり、言い換えれば、生涯を通じて、循環内へ、訂正された遺伝子を有する成熟細胞を放出する。
【０００３】
幹細胞生着の効率の増強は、臨床的な移植、ならびに遺伝子治療プロトコールの成果を改善し、幹細胞の、レシピエントＢＭへ戻すおよび再増殖（repopulate）させる能力を改変することによって達成されうる。この目的のために、これらの過程を調節する機序のよりよい理解が必要である。
【０００４】
ＣＸＣＬ１２とも呼ばれるケモカイン  ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）と、そのレセプターＣＸＣＲ４との間の相互作用が、マウス胚発達中にＢＭの幹細胞播種において重要な役割をはたす10、11。先に、本発明者らは、免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをレシピエントとして用いて、短期間のインビボ遊走（ホーミング）と、ヒトＣＤ３４+濃縮細胞による、マウス骨髄の、高レベルの多系統（multilineage）再増殖との両方が、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用に依存していることを示すことができた12~15。これらのデータの裏付けとして、ヒトＣＤ３４+細胞上の高レベルのＣＸＣＲ４発現、またはインビトロでの高ＳＤＦ−１誘導指向性運動性のいずれかが、ＣＤ３４+細胞の陽性選別での、同種異系および自己臨床移植療法におけるより早い回復と相関関係があることが示された16、17。
【０００５】
ＣＸＣＲ４発現は動的な過程であり、サイトカイン、ケモカイン、ストロマ細胞、接着分子およびタンパク質分解酵素などの環境因子によって調節される18。ヒト起源の造血幹細胞および前駆細胞において、ＣＸＣＲ４は、短時間（〜４０時間）のインビトロサイトカイン培養13、19、またはＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９などのタンパク質分解酵素による臍帯血（ＣＢ）ＣＤ３４+の刺激20によって、細胞内プールからアップレギュレートされうる。これは続いて、ＳＤＦ−１勾配に向かうそれらのインビトロ遊走13、ならびに移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤおよび連続的に移植したβ２ｍｎｕｌｌ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるそのインビボ  ホーミングおよび再増殖能を増強し、幹細胞自身の更新（renewal）と運動性を伴う発達とを連結する。最近の報告では、サイトカインカクテルでのより長い培養期間が、ヒトＣＢ  ＣＤ３４+濃縮細胞上での、細胞表面ＣＸＣＲ４発現の減少をもたらすことが実証され22、さらに、より長期間インビトロで培養したヒト前駆細胞における再増殖の減少が証明された23。近年、本発明者らは、ＣＢ  ＣＤ３４+／ＣＸＣＲ４-ソート細胞が、低レベルの細胞内ＣＸＣＲ４を有し、インビトロでの短期間サイトカイン刺激につづいて、迅速に、細胞表面上で機能的に発現され、移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＳＤＦ−１依存ホーミングおよび再増殖を仲介可能であることを示した15。
【０００６】
ヒトおよびマウス幹細胞の指向性遊走を仲介することにおける、それらの中心的な役割24に加えて、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用はまた、他の幹細胞機能にも関与する。重要なことに、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用はまた、ＢＭにおける、幹細胞および前駆細胞の保持に関与する10、32、33。この仮説はまた、マウスＢＭ空洞内に直接注入したヒトＨＳＣの固定に対するＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用の関与を示した他の研究によって確認されてきた34、35。これらの相互作用の干渉によって、ヒトおよびマウス前駆細胞の両方の、ＢＭから循環への放出／移行が誘導される。
【０００７】
そのＣＤ４+  Ｔ細胞上で、ヒトＣＤ４およびＣＸＣＲ４を過剰発現しているトランスジェニックマウスでは、そのＢＭにてこれらの細胞のレベルが増加し、循環中では、非常に低いレベルである42。したがって、ヒトＣＤ３４+前駆細胞上のＣＸＣＲ４の過剰発現が、それらのホーミングおよび再増殖の潜在能力を促進しうる。
【０００８】
レンチウイルスベクターが、非分割細胞を形質導入するそれらの固有の能力のために、ＳＣＩＤ再増殖細胞（ＳＲＣｓ）内にトランスジーンを誘導するために利用されてきた43~46。さらに、遺伝子治療における有意な臨床でのブレイクスルーが、ヒト重度複合免疫欠損（ＳＣＩＤ）−Ｘ１を患う患者で起こり、遺伝子治療が実効をあげるという条件で、疾患表現型の完全なる修正を結果としてもたらした48、49。しかしながら、新たな証拠が、レトロウイルスで形質導入したヒトＣＤ３４+細胞のホーミングの低下8および低い生着9に関して存在する。
【０００９】
低濃度のＳＤＦ−１が、他の早期に働くサイトカインとの相乗効果により、ヒトＣＤ３４+細胞ならびにマウス幹細胞および前駆細胞の増殖を増強し、前駆細胞生存におけるこのケモカインの役割を示唆しており25~29、一方、高レベルのＳＤＦ−１が、移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの連続的に再増殖できる、ヒト長期間培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）および始原ヒト胎児肝ＣＤ３４+幹細胞の増殖の停止を誘導することが十分に立証されている30、31。
【００１０】
ＢＭ移植の不都合の１つは、健康な個体と比較して、移植患者のＢＭでは、長期間培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）のような未熟な前駆細胞のレベルが長期間にわたり減少（１ｌｏｇ減少）することである。
【００１１】
長期間培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）は、骨髄（ＢＭ）ストロマ上の５〜８週間（３５〜６０日間）の培養の後、コロニー形成単位細胞（ＣＦＵ）を産生し、インビトロで容易に検出可能な前駆細胞を意味する造血前駆細胞である。ヒトＢＭまたは臍帯血由来のＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞で開始した長期間の培養は、少なくとも１００日間、すなわち、標準ＬＴＣ−ＩＣ期間を超えて、ＣＦＵを産出し続けることが可能であることが報告されてきた。臍帯血由来の単細胞培養物を、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞の亜集団が、６０日を超えてＣＦＵを産出可能であるかどうかを研究するために使用した（「超長期間培養開始細胞」またはＥＬＴＣ−ＩＣ）。ＬＴＣ−ＩＣ臍帯血と対照的に、ＥＬＴＣ−ＩＣは培養後半に増殖し、より静止した前駆細胞集団である。ＥＬＴＣ−ＩＣは、ＬＴＣ−ＩＣよりも、三倍〜四倍より多い前駆細胞を産出する（Ｐ＜．００２）。これは、長期間培養中の前駆細胞の機能的ヒエラルキーであり、それらの静止レベルと比例する（Blood. 1996 Nov 1;88(9):3306-13 Crooks GM et al.）。
【００１２】
幹細胞治療の利用がますます拡大していることを考慮すると、細胞置換治療の効率および成功率を改善するために、幹細胞の集団におけるＣＤ３４＋３８−細胞のレベルを増強することが非常に望ましい。
【発明の開示】
【００１３】
本発明は、多量の未熟な初期前駆細胞を有する幹細胞を含む細胞の集団を製造するための方法に関し、前記方法は、幹細胞を回収し、その細胞内に、ＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することを含む。
【００１４】
本発明の１つの実施態様において、細胞の集団は、低濃度のＳＤＦ−１に応答して改善されたＣＸＣＲ４シグナル伝達を示す。
【００１５】
本発明の他の実施態様において、細胞の集団は、低濃度のＳＤＦ−１に応答して改善されたＣＸＣＲ４シグナル伝達を示す。
【００１６】
本発明のさらなる実施態様において、幹細胞は、造血幹細胞、とりわけＣＤ３４＋濃縮幹細胞である。
【００１７】
本発明のさらなる実施態様において、未熟な初期前駆細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ系統のものである。
【００１８】
本発明のさらなる実施態様において、幹細胞の回収は、幹細胞動員手法の後、および／または手術手法の後に実行する。
【００１９】
本発明のさらなる実施態様において、回収の後、所定の閾値より上のＣＸＣＲ４レベルを有する幹細胞をＦＡＣＳによって単離する。
【００２０】
本発明のさらなる実施態様において、本発明の幹細胞は、脊髄および赤血球系統へ分化可能である。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様において、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ系統の未熟な初期前駆細胞は集団のおよそ１〜５％である。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様において、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ系統の未熟な初期前駆細胞は幹細胞の約３％以上である。
【００２３】
本発明のさらなる実施態様において、低濃度のＳＤＦ−１は約５０ｎｇ／ｍｌ以下である。
【００２４】
本発明のさらなる実施態様において、改善されたシグナル伝達は、低濃度のＳＤＦ−１によって仲介された細胞遊走の増強によって現れる。
【００２５】
本発明のさらなる実施態様において、高濃度のＳＤＦ−１は、約１マイクログラム／ｍｌ以上である。
【００２６】
本発明のさらなる実施態様において、改善されたシグナル伝達は、ＳＤＦ−１による脱感作の減少によって現れる。
【００２７】
１つの態様において、本発明は、多量の未熟な初期前駆細胞を含む幹細胞を含み、ＣＸＣＲ４配列を含むＤＮＡ断片を幹細胞に導入することによって製造される、低濃度および／または高濃度ＳＤＦ−１に応答して改善されたＣＸＣＲ４シグナル伝達能力を示す細胞の集団を提供する。
【００２８】
本発明の１つの実施態様において、幹細胞は造血幹細胞である。
【００２９】
本発明のさらなる実施態様において、細胞の集団は脊髄および赤血球系統へ分化可能である。
【００３０】
本発明のさらなる実施態様において、造血幹細胞はＣＤ３４＋濃縮幹細胞である。
【００３１】
本発明のさらなる実施態様において、未熟な初期前駆細胞は、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ系統のものである。
【００３２】
本発明のさらなる実施態様において、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗの量は、集団の約１〜５％である。
【００３３】
本発明の他のさらなる実施態様において、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗの量は、集団のおよそ３％以上である。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様において、低濃度のＳＤＦ−１は、約５０ｎｇ／ｍｌ以下である。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様において、高濃度のＳＤＦ−１は、約１マイクログラム／ｍｌ以上である。
【００３６】
他の態様において、本発明は、必要とする対象において標的組織への幹細胞のホーミングを増加させるための医薬の製造における本発明の細胞集団の使用を提供する。
【００３７】
また、本発明は、必要とする対象において標的組織への細胞の再増殖を増強するための医薬の製造における本発明の細胞集団の使用を提供する。
【００３８】
本発明の１つの実施態様において、標的組織は、骨髄、血管、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、神経系、皮膚、骨および骨格筋からなる群より選択される。
【００３９】
本発明の１つの実施態様において、本発明の細胞集団は移植を促進するために使用される。
【００４０】
本発明のさらなる実施態様において、移植は化学治療プロトコールにしたがう。
【００４１】
本発明の他のさらなる実施態様において、移植は自家移植である。
【００４２】
本発明の他のさらなる実施態様において、移植には自家細胞の動員を伴う。
【００４３】
本発明の他のさらなる実施態様において、移植は動員した幹細胞で実施される。
【００４４】
さらに、本発明は、対象における細胞または組織置換を必要とする疾病の治療方法を提供し、前記方法は、必要としている対象に、治療的に有効量の本発明による細胞集団を投与することを含む。
【００４５】
また、本発明は、インタクトな６Ｈ８エピトープを有するＣＸＣＲ４を発現している幹細胞を含む細胞の集団を製造するための方法を提供し、本方法は、幹細胞を回収すること、および幹細胞にＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することを含む。
【００４６】
他の態様において、本発明は、幹細胞にＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することによって製造される、インタクトなＣＸＣＲ４  ６Ｈ８エピトープを含む幹細胞を含む細胞集団、および必要とする対象における移植のための医薬の製造におけるその細胞の集団の使用を提供する。
【００４７】
本発明のさらなる態様は、細胞または組織置換を必要とする疾病を治療するための方法に関し、前記方法は、必要とする対象に、治療的に有効量の本発明による細胞集団を提供することを含む。
【００４８】
また、本発明は、幹細胞にＣＸＣＲ４の配列を含むＤＮＡ断片を導入することによって製造される、インタクトなＣＸＣＲ４  ６Ｈ８エピトープを発現している幹細胞を含む細胞集団を含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
本発明を、添付の図面を参照しながら、例示のためのみで本明細書において記載する。図面に対する詳細な以下の具体的な言及により、示される特定の内容は、例示のため、および本発明の好ましい実施形態の実例の検討を目的とするにすぎず、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解される記載と考えられるものを提供する過程において示されたことを強調する。これに関連し、本発明の構造的詳細を、本発明の基本的な理解に必要とされる以上に詳細に示す試みはしておらず、本記載内容は、図面と合わせると、本発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具現化され得るかが当業者に自明となる。
【００５０】
【図１】レンチウイルスベクター構築物の略図的表示を示す。統合プロウイルスの相当する部分のみを描写している。ＥＦ１−αプロモーターを利用して、対照ベクターにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡ（上パネル）または実験ベクターのＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰバイシストロン性カセット（下パネル）のいずれかの発現を駆動する。ＳＤ＝スプライス  ドナー、ＳＡ＝スプライス  アクセプター、ｐＡ＝ポリアデニル化シグナル、ＳＩＮ＝自己−不活性化ベクター。
【図２】レンチウイルス−形質導入ヒトＣＤ３４+細胞における、細胞表面ＣＸＣＲ４発現を示す。モック−またはレンチウイルス感染に続いて、臍帯血（ＣＢ）および動員末梢血（ＭＰＢ）ＣＤ３４+細胞を、ＧＦＰ発現のみ、または抗−ｈＣＸＣＲ４−ＰＥ抗体を用いたＣＸＣＲ４発現に付随するＧＦＰのいずれかに関して、フローサイトメトリーによって解析した。Ａ．データは、ＣＢ  ＣＤ３４+細胞の代表的なＦＡＣＳ解析を示す。数字は総ＣＤ３４+細胞の割合を示す。フォワード  スカッタード（ＦＳＣ）は細胞サイズの指標である。Ｂ．結果は、ＣＸＣＲ４を発現しているＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４+細胞の割合を示し、７回の独立した実験の平均値±ＳＥを示している。対照ＧＦＰ−感染細胞と比較して、＊ｐ＜０．０１。Ｃ．ＧＦＰ形質導入（ＧＦＰ）、ＣＸＣＲ４形質導入（ＣＸＣＲ４）またはアイソタイプ対照細胞の細胞表面（上パネル）および細胞内（下パネル）ＣＸＣＲ４発現の免疫蛍光検出。
【図３】形質導入ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞のコロニー形成前駆細胞含量を示す。レンチウイルス形質導入ＣＢ  ＣＤ３４+細胞を、半固体メチルセルロース培地中に播種した。Ａ．ＧＦＰ+コロニー形成細胞（ＣＦＣ）コロニーを、１４日目に位相差顕微鏡によって解析した。上パネルは対照ベクター形質導入細胞から得たＢＦＵ−Ｅ（ａ）およびＣＦＵ−ＧＭ（ｂ）を示す。下パネルはＣＸＣＲ４形質導入細胞から得たＢＦＵ−Ｅ（ｃ）およびＣＦＵ−ＧＭ（ｄ）を示す。代表的な実験を示す。Ｂ．データは、ＣＦＵ−ＧＭおよびＢＦＵ−Ｅコロニーの総数を示す。棒の上の数字は、総コロニーに対するＧＦＰ+コロニーの割合を示す。棒は、３回の独立した実験の平均値±ＳＥを示す。ＧＦＰ−形質導入細胞のＢＦＵ−Ｅコロニーと比較して＊ｐ＝０．００４。Ｃ．ＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を、ヒト抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ３８  ｍＡｂによって標識化した。数字は、全集団から得た陽性細胞の割合を示す。３回のうち、代表的な実験を示す。
【図４】形質導入ＣＤ３４＋細胞において発現したＣＸＣＲ４の機能を示す。Ａ．ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢ  ＣＤ３４+細胞を、示した時間ＳＤＦ−１（３００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、細胞内Ｆ−アクチン含量をＦＡＣＳによって測定した。データは、未刺激細胞と比較して、ＳＤＦ−１での刺激後にＦ−アクチン含量が倍増加したことを示唆している。データは、３回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。Ｂ．示したようにＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４＋細胞を異なるＳＤＦ−１濃度に向かうそれらの遊走に関して、トランスウェル遊走アッセイにて試験した。データはＳＤＦ−１への遊走細胞の割合を示す。棒は５回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。１２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１での対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して、＊ｐ＜０．０４（ＣＢ）、＊ｐ＝０．０３（ＭＰＢ）。１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１での対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して、＊ｐ＜０．０５（ＣＢ）、＊ｐ＜０．０５（ＭＰＢ）。
【図５】異なるＳＤＦ−１濃度に対するＣＸＣＲ４−過剰発現ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の応答を示す。Ａ．レンチウイルス形質導入ＣＢ  ＣＤ３４+細胞を、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＬＴ−３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせで、ＳＤＦ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む血清不含条件中で７日間インキュベートした。結果は、ＳＤＦ−１の存在しない状態でインキュベートした細胞と比較して、生細胞の数の倍増加として表している。結果は、二重で実施した３回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。Ｂ．レンチウイルス形質導入ＣＢ  ＣＤ３４+細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１とともに一晩インキュベートし、（ｉ）免疫染色によってＣＸＣＲ４発現を、および（ii）トランスウェル遊走系を用いてＳＤＦ−１（１２５ｎｇ／ｍｌ）誘導インビトロ中の遊走を試験した。棒は、二重で実施した２回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。未処理細胞と比較して＊ｐ＜０．０５（黒棒）。
【図６】ＣＸＣＲ４過剰発現ＳＣＩＤ再生細胞（ＳＲＣ）のインビボでの多系統分化再構築およびＧＦＰ発現を示す。ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞を、亜致死的放射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。移植の５週間後のマウスを、対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して、ヒト再増殖細胞の存在に関して試験した。Ａ．マウスＢＭ（ｉ）、脾臓（ii）および末梢血（ＰＢ）（iii）を、ヒトＣＤ４５＋細胞の％を検出するＦＡＣＳ解析によって、ヒト細胞生着に関して解析した。棒は、二重または三重で実施した９回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。対照ＧＦＰ−形質導入細胞と比較して＊ｐ＜０．００５。Ｂ．代表的なＮＯＤ／ＳＣＩＤ移植レシピエントにおけるヒトＳＲＣのリンパおよび骨髄分化を、それぞれＣＤ１９およびＣＤ３３抗体染色によって示す。数字は、総生集団に対する陽性細胞の割合を表す。Ｃ．ＢＭ細胞を、ヒト特異的パン白血球マーカーＣＤ４５およびＢ細胞系統分化マーカーＣＤ１９で染色し、ＦＡＣＳによって解析した。数字は、総ＣＤ４５集団から計算したＣＤ１９細胞の割合を示す。データは代表的な実験を示す。Ｄ／生着マウスＢＭ細胞をヒト特異的抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ３８  ｍＡｂｓで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。数字は、始原、未分化ＣＤ３４＋／３８−／ｌｏｗ細胞の割合を示す。データは代表的な実験を示す。Ｅ．濃縮、未熟ＣＤ３４＋細胞の、脾臓へのホーミングを、ヒト特異的抗−ＣＤ３４および抗−ＣＤ３８  ｍＡｂｓでの染色によって、移植１６時間（ＭＰＣ）後または２時間（ＣＢ）後に決定した。棒は二重で実施した３回の独立した実験の平均値±ＳＥを表す。対照細胞と比較して＊ｐ＜０．０５。
【図７】ＣＸＣＲ４の略図的実例を示す。
【図８】ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞におけるＣＸＣＲ４過剰発現がインビボで６Ｈ８エピトープの変質を防止することを示す。Ａ．形質導入ＣＤ３４＋細胞を亜致死的（３７５Ｒ）放射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。移植の５週間後、マウスＢＭを回収し、ＣＸＣＲ４の１２Ｇ５または６Ｈ８エピトープに対して陽性に染色されたヒト細胞の存在を解析した。数字は平均ＣＸＣＲ４蛍光を表す。Ｂ．ＧＦＰ（対照）およびＣＸＣＲ４過剰発現細胞の１２Ｇ５および６Ｈ８  ｍＡｂｓでの染色に続く、Ａのような平均ＣＸＣＲ４蛍光の代表的なヒストグラムＦＡＣＳ解析。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、未熟な初期前駆細胞を強化した幹細胞であって、低濃度および高濃度のＳＤＦ−１に応答して改善されたＣＸＣＲ４シグナル伝達を示す幹細胞、ならびにその製造方法および使用方法に関する。より具体的には、本発明の細胞は、低濃度のＳＤＦ−１に応答可能であり、高濃度のＳＤＦ−１によって脱感作されにくい。とりわけ、本発明によって、細胞または組織置換を必要とする疾病の治療が可能になる。本発明は、ＣＸＣＲ４を過剰発現しているトランスジェニック幹細胞が、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞集団のレベルの増強を示し、および／または、低濃度および高濃度のＳＤＦ−１に応答してＣＸＣＲ４シグナル伝達能力の改善を示し、かつインタクトなＣＸＣＲ４  ６Ｈ８エピトープを示すということを明示する結果に基づいている。
【００５２】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照して、よく理解されうる。
【００５３】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、以下の記述で列記され、実施例により実証された詳細に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施態様、または種々の方法で、実施または達成されうる。また、本明細書で用いられる表現および語句は、説明の目的のためであり、制限として見なされるべきではないことが理解されるべきである。
【００５４】
細胞治療の利用が急速に広がっており、徐々に種々の疾病の治療における重要な治療手法になりつつある。造血幹細胞（ＨＳＣ）（たとえば、脊髄、臍帯血または動員末梢血由来）移植は、日常的に実施される保険補償細胞治療の１つの例である。しかしながら、がんおよび感染疾患のための免疫治療、軟骨欠損のためのコンドロサイト治療、神経変性疾患のための神経細胞治療、および多数の適用のための幹細胞治療を含む多くの他の細胞治療が同様に発展している［Forbes(2002) Clinical Science 103:355-369］。
【００５５】
幹細胞治療に関する問題の１つは、標的組織において、細胞の長期にわたる生着の成功を達成することの難しさである。現在、首尾良く移植された患者は、所望の表現型を有する細胞を産生する幹細胞と未熟前駆細胞の非常に低いレベルを示す。
【００５６】
ＣＤ３４+前駆細胞の、ＨＧＦおよびＭＭＰｓなどのサイトカインでの処理は、ＣＸＣＲ４の発現をアップレギュレートし、ＳＤＦ−１に対してよりよい応答を示すことが先に示されている。しかしながら、ＳＤＦ−１の濃度が増加しているとき、ＣＸＣＲ４は内在化し、細胞はＳＤＦ−１に対する応答が低くなる。また、ＳＤＦ−１レベルの増加は、移植ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの連続再増殖を可能とする、ヒト長期間培養開始細胞（ＬＴＣＩＣ）および初期ヒト胎児肝ＣＤ３４+幹細胞の増殖の脱感作および静止を誘導する30、31。
【００５７】
ＢＭ移植の問題の１つは、健康な個体と比較して、移植患者のＢＭでは長期維持未熟前駆細胞のレベルが減少（１ｌｏｇ減少）することである。
【００５８】
本発明者らは、ＣＸＣＲ４を過剰発現しているトランスジェニック造血幹細胞が、予想しなかった高レベルのＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞集団を示すことを発見した。
【００５９】
得られた結果は、ＣＢおよびＭＢＰ  ＣＤ３４＋濃縮細胞などのトランスジェニック幹細胞が、高レベルのＣＸＣＲ４トランスジーンを発現しているレンチウイルスベクターで首尾良く形質導入されることを示す。たとえば一つの実施態様では、形質導入細胞は細胞表面ＣＸＣＲ４発現に関して８７±２．７％（ＣＢ）および８０±４％（ＭＰＢ）が陽性であり、一方でＧＦＰベクター感染したＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４+細胞の両方はたった２８±３．１％が内因性ＣＸＣＲ４を発現した。
【００６０】
ＣＸＣＲ４を過剰発現しているトランスジェニック細胞は、脊髄および赤血球系統へ分化するその能力に影響を受けないことが示されている。本発明によれば、形質導入したＣＤ３４+細胞（対照およびＣＸＣＲ４の両方）を、１４日目に位相差顕微鏡により記録し、バースト形成赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）およびコロニー形成単位顆粒球、マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）のような、ＧＦＰ+  ＣＦＣコロニーへの多系統分化を表したことが示される（図３Ａ）。
【００６１】
予期しなかったことに、ＭＰＢ  ＣＤ３４＋  ＣＸＣＲ４形質導入細胞は、対照細胞における０．５％と比較して、より高い割合（２．９％）のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ集団を示した。この効果は、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞では観察されなかった（図３Ｃ）。ＣＸＣＲ４形質導入はしたがって、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ初期集団の増殖および／または維持を支持する。
【００６２】
これも予期しなかったことに、ＣＸＣＲ４形質導入幹細胞は、幹細胞の表面においてよりインタクトなＣＸＣＲ４  ６Ｈ８エピトープを示す。
【００６３】
ＣＸＣＲ４を過剰発現しているトランスジェニック細胞は、対照ベクター−形質導入細胞と比較すると、ＳＤＦ−１仲介走化性においてＣＢでは１．５±０．０４（ｐ＜０．００１）倍、ＭＰＢでは２．３±０．３（ｐ＝０．０３）倍という、有意に増加した応答を示す（図４Ｂ）。ＣＸＣＲ４を過剰発現しているトランスジェニック細胞はさらに、アクチン重合化の増加および／またはＳＤＦ−１によって仲介された細胞運動性の増加を示す。本発明によれば、ＣＸＣＲ４を過剰発現しているＣＤ３４+細胞は、未刺激細胞と比較した場合、アクチン重合化において３±０．１１（ｐ＜０．００１）倍の増加を示し、それに対し対照細胞では１．５±０．０７（ｐ＝０．００２）倍の増加を示す（図４Ａ）。
【００６４】
したがって、ヒト前駆細胞でのＣＸＣＲ４の過剰発現がＳＤＦ−１誘導シグナル伝達を増強させ、細胞運動性およびアクチン重合化の増加を導く。
【００６５】
さらに、７日間にわたるＣＸＣＲ４過剰発現細胞の増殖の評価で、ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞がほとんどその播種した数の二倍になり、一方対照細胞数は、播種した本来の量以下に減少したことが観察された。
【００６６】
ＣＸＣＲ４−形質導入細胞は、対照細胞と比較して、ＣＢ  ＣＤ３４+細胞では４±０．０７（ｐ＝０．００１）までの生着の増加を示した（図６Ａ）。さらに、ＣＤ１９およびＣＤ３３モノクローナル抗体を用いた代表的なＦＡＣＳ染色によって、骨髄および赤血球集団への多分化造血が、それぞれＣＸＣＲ４−形質導入細胞を移植したマウスにおいて、Ｂ−細胞リンパ球産出の傾向をより強めて（図６Ｃ）、形質導入細胞で維持された（図６Ｂ）ことが示され、これはおそらく、ＳＤＦ−１がまた、Ｐｒｅ  Ｂ細胞増殖因子でもあるからである。さらに、平均３６％±１９％（幅７．５％〜７７％）のＣＤ４５+細胞がＧＦＰを発現していることがわかった（図６Ｂ）。トランスジーン発現もまた、脊髄およびリンパ集団の両方において検出された（図６Ｂ）。ＣＸＣＦ４過剰発現細胞を形質導入したマウスは、対照ベクター−形質導入細胞を注射したマウスと比較して、ＢＭにおける初期ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/low細胞集団が４倍の増加を示し（図６Ｄ）、ＣＸＣＲ４−過剰発現細胞生着レベルの高まりが、より初期の細胞集団の再増殖の増加によることを示唆している。
【００６７】
移植後２時間（ＣＢ）または１６ｈ（ＭＰＢ）で、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞は、それらの対照同等物と比較して、脾臓に対するホーミングにおいて２倍以上の増加を示したことが観察された（図６Ｅ）。しかしながら、ＢＭへのホーミング能力に関するこれらの違いは検出されなかった（データは示していない）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞が、先に示唆されたように（Papayannopoulou T. Curr Opin Hematol. 2003;10:214-219、Ref 18: Kollet O, Blood. 2001, 97:3283-3291）ＢＭを再増殖する前（移植後５週間）に、まず短期間脾臓にホームし得ることを示唆している。
【００６８】
本発見は、標的組織に対して効果的に補充され、それを再増殖させ得る幹細胞の産出を可能にし、そのようにして、肝障害の回復および肝臓または骨髄移植などの、多数の臨床適用に使用可能である。
【００６９】
したがって、本発明の１つの観点によると、「延長長期培養開始細胞（extended long-term culture-initiating cells）」すなわちＥＬＴＣ−ＩＣを得るための、または初期ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/low細胞集団を増加させる方法が提供される。本発明の他の観点にしたがって、増加したＳＤＦ−１濃度に暴露したときでさえ、ＳＤＦ−１に対して応答可能なＥＬＴＣ−ＩＣ細胞を得る方法が提供される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、語句「幹細胞」は、とりわけ特定の機能を有する他の細胞型（たとえば「完全に分化した」細胞）に分化可能な細胞を意味する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「トランスジェニック細胞」は、形質導入した遺伝子または断片を有する細胞を意味する。
【００７２】
本発明のこの観点により使用可能である幹細胞の非限定例は、任意の年齢の個体の骨髄組織から、または新生児個体の臍帯血から得られた、造血幹細胞（ＨＳＣｓ）および間葉幹細胞（ＭＳＣｓ）、妊娠期間後形成される胚性組織（たとえば胚盤胞）から得た胚幹（ＥＳ）細胞、または妊娠中の任意の時期、好ましくは妊娠の１０週より前の胎児の生殖器組織から得た胎児胚（ＥＧ）細胞である。本発明のこの観点により使用可能な幹細胞のさらなる記述を以下に要約する。
【００７３】
ＨＳＣｓ−造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、赤血球、リンパ球、マクロファージおよび巨核芽球などの造血または血液細胞の任意の特定の種類へ分化可能な、胎児肝臓、臍帯血、骨髄および末梢血中で見られる、発達多能性ブラスト細胞である。ＨＳＣｓは、典型的には骨髄内で、器官の寿命が続く限りその能力を維持し、成熟した前駆細胞の適切にバランスのとれたアウトプットを産出するために、全ての必要な因子および接着特性を支える隙間内に存在する［Whetton (1999) Trends Cell Biol 9:233-238; Weissman (2000) Cell 100:157-168; Jankowska-Wieczorek (2001) Stem Cells 19:99-107; Chan (2001) Br. J. Haematol. 112:541-557］。
【００７４】
本発明のこの観点によると、ＨＳＣｓは、好ましくはＣＤ３４＋細胞であり、より好ましくはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ細胞であり、これらは、より初期の幹細胞の集団であり、それゆえ系統制限が少なく、主要な長期ＢＭ再増殖細胞であることが示された。
【００７５】
ＭＳＣｓ−間葉幹細胞は、サイトカインのような、生物活性因子からの種々の影響に依存して、間葉性または結合組織の１つの特定の型（すなわち、脂肪、骨性、間質、軟骨性、弾性および線維性結合組織のような、特殊化した要素を支持する体の組織）へ分化可能な骨髄、血液、皮膚および骨膜中でみられる発達多能性ブラスト細胞である。
【００７６】
可塑物に接着しているヒト骨髄穿刺液細胞のおよそ３０％が、ＭＳＣｓと考えられる。これらの細胞は、インビトロで展開でき、その後分化を誘導できる。成人ＭＳＣｓはインビトロで展開可能であり、骨、軟骨、腱、筋肉または脂肪細胞を形成するように刺激できるという事実から、これらは組織エンジニアリングおよび遺伝子治療戦略にとって魅力的なものである。ＭＳＣ機能をアッセイするために、インビボアッセイが発達してきた。循環系に注射したＭＳＣｓは上述の多数の組織になることができる。とりわけ、骨格筋および心筋は、５−アザシチジンに暴露することによって誘導可能であり、培養中のラットおよびヒトＭＳＣｓの神経への分化は、β−メルカプトエタノール、ＤＭＳＯまたはブチル化ヒドロキシアニソールに暴露することによって誘導可能である［Tomita (1999) 100:11247-11256; Woodbury (2000) J.  Neurosci.  Res.  61:364-370］。さらに、ＭＳＣ−由来細胞は、末梢への注射後ならびにラット脳内へのヒトＭＳＣｓの直接の注入後、脳内に、深く統合されるようにみられ、これらは、発達上で、神経性幹細胞の遊走中に使用される経路にそって遊走し、広く分散するようになり、ＨＳＣ特殊化したマーカーを失い始める［Azizi (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3908-3913］。間葉幹細胞および系統特異的細胞の増殖を促進する方法が米国特許第６，２４８，５８７号で開示されている。
【００７７】
米国特許第５，４８６，３５９号にて記述されたＳＨ２、ＳＨ３およびＳＨ４などのヒト間葉幹細胞（ｈＭＳＣｓ）の表面上のエピトープは、たとえば骨髄中に存在するような外来細胞集団から間葉幹細胞集団を選別して捕獲するための試薬として利用可能である。本発明の本観点によれば、種々の間葉性系統に分化可能であるため、ＣＤ４５に対して陽性である前駆間葉幹細胞が使用されることが好ましい。
【００７８】
本発明の本観点によれば、好ましい幹細胞はヒト幹細胞である。
【００７９】
以下の表１は、本発明の本観点により、成体幹細胞の例を提供しており、対象の標的組織中で示された表現型を得るために使用可能である。
【００８０】
【表１】
0005547221.tif 000002
【００８１】
以上で言及したように、本発明の本観点による幹細胞は、ＣＸＣＲ４トランスジーンを高発現するレンチウイルスベクターによって、首尾良く形質導入される。
【００８２】
本明細書中の語句「ポリペプチドおよびタンパク質」は互換性がある。
【００８３】
本発明はまた、本発明の上記ＣＸＣＲ４タンパク質のムテインにも関し、ムテインは本質的にＣＸＣＲ４の天然に存在する配列のみを有する、ＣＸＣＲ４タンパク質と同一の生物学的活性を維持している。そのような「ムテイン」は、この種の変異が、本質的にタンパク質それ自身に関してタンパク質変異の生物学的活性を変化させないように、それぞれ、ＣＸＣＲ４タンパク質中、約２０まで、好ましくは、１０以内のアミノ酸残基が欠損、付加または他で置換されうるものでありうる。
【００８４】
これらのムテインは、公知の合成によって、および／または部位特異的変異導入技術によって、またその他の好適な任意に公知の技術によって調製される。
【００８５】
任意のそのような突然変異導入タンパク質は好ましくは、本質的にそれと同様の活性を有するように、ＣＸＣＲ４の基礎のものの、本質的に複製であるアミノ酸配列を有する。そこで、そのようなムテインを以下の実施例で列記した生物アッセイ試験にかけることを含む所定の実験方法によって、任意の該ムテインが、本質的に本発明の基礎タンパク質と同一の活性を有するかどうかを決定可能である。
【００８６】
本発明により使用可能であるＣＸＣＲ４のムテイン、またはそれをコードしている核酸には、本明細書で示した技術およびガイダンスに基づいて、過度の実験をすることなく当業者によって日常的にえられる代用ペプチドまたはポリヌクレオチドのような本質的にＣＸＣＲ４相当配列の有限の組が含まれる。タンパク質の化学および構造の詳細な記述の代わりに、本明細書に参考文献によって組み込まれている、Schulz,G.E.et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag,New York,1978、およびCreighton,T.E. Proteins:Structure and Molecular Properties, W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983を参照のこと。コドン選択のような、ヌクレオチド配列置換の表示の代わりに、たとえば、Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publications and Wiley Interscience,New York,NY,1987-1995、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY,1989を参照のこと。
【００８７】
本発明によるムテインとして好ましい変化は、「保存的（conserative）」置換として知られるものである。本質的に天然に存在するＣＸＣＲ４配列を有するタンパク質中の、これらの保存アミノ酸置換は、群のメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保存することとなるような、十分に類似した物理化学的特性を有する、群内での同義アミノ酸を含みうる。Grantham,Science,Vol.185,pp.862-864(1974)を参照のこと。アミノ酸の挿入および欠損はまた、その機能を変更することなく上で定義した配列内で、とりわけ挿入または欠損が数個のアミノ酸、たとえば５０以下、好ましくは２０以下のＣＸＣＲ４のみを含み、さらにたとえばシステイン残基のような、機能的な配座に重要であるアミノ酸を除去または置換しない場合に作成しうることが明らかである。Anfinsen, Principles That Govern The Folding of Protein Chains, Science,Vol.181,pp.223-230(1973)参照のこと。そのような欠損および／または挿入によって生じるムテインは、本発明の範囲内に入る。好ましくは、同義のアミノ酸群は、表Ａで定義されたものである。より好ましい同義のアミノ酸群は、表Ｂで定義されたものであり、もっとも好ましい同義のアミノ酸群は、表Ｃで定義されたものである。
【００８８】
【表Ａ】
0005547221.tif 000003
【００８９】
【表Ｂ】
0005547221.tif 000004
【００９０】
【表Ｃ】
0005547221.tif 000005
【００９１】
本発明で使用するタンパク質のムテインを得るために利用できるタンパク質中のアミノ酸置換の産出の例には、Mark et alに付与された米国特許第ＲＥ３３，６５３号、第４，９５９，３１４号、第４，５８８，５８５号および第４，７３７，４６２号、Ｋｏｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．に付与された第５，１１６，９４３号、Namen et alに付与された第４，９６５，１９５号、Chong et alに付与された第４，８７９，１１１号、およびLee et alに付与された第５，０１７，６９１号で示されたような任意の公知の方法工程、および米国特許第４，９０４，５８４号（Straw et al）で示されたリジン置換タンパク質が含まれる。
【００９２】
本発明の他の好ましい実施態様において、本発明で使用するＣＸＣＲ４タンパク質の任意のムテインは、本発明の上記のＣＸＣＲ４タンパク質と、本質的に相当するアミノ酸配列を有する。語句「本質的に相当する（essentially corresponding to）」は、特にＣＸＣＲ４に対するその能力を考える限りでは、その基本的特性に影響を与えない基礎タンパク質の配列に対する軽微な変化を有するムテインを含むことを意図する。「本質的に相当する」語句内に含まれると一般的に考えられる変化の種類は、結果として、２、３の軽微な改変となる、本発明のＣＸＣＲ４タンパク質をコードしているＤＮＡの従来の変異導入技術、およびたとえば化学誘引物質に対する幹細胞の感受性を増加させるための、所望の活性に対するスクリーニングによって得られるものである。
【００９３】
本発明はまた、ＣＸＣＲ４変異体も含有する。好ましいＣＸＣＲ４変異体は、ＣＸＣＲ４アミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するものであり、より好ましくは、ＣＸＣＲ４変異体は少なくとも９０％の同一性を有するものであり、もっとも好ましい変異体は少なくとも９５％同一性を有するものである。
【００９４】
本明細書で使用するところの語句「配列同一性」は、アミノ酸配列が、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アラインメントプログラム（Thompson et al.,1994）用のウインドウズインターフェイスである、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｘプログラムを用いた低相同性領域の微調整により、Hanks and Quinn(1991)にしたがったアラインメントに基づいて比較されることを意味する。Ｃｌuｓｔａｌ−Ｘプログラムは、ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/clustalx/にてインターネット上で入手可能である。もちろん、このリンクが働かなくなっても、当業者は過度の試行をすることなく、標準的なインターネット検索技術を用いて他のリンクにより本プログラムのバージョンを見つけうることが理解されるべきである。特に言及しない限り、本願の有効出願日の時点で本明細書で引用された任意のプログラムのもっとも最近のバージョンが、本発明を実施するために利用されるものである。
【００９５】
「配列同一性」を決定する他の方法を以下に示す。配列は、（最初のギャップゼロに対して）−１２のギャップオープンペナルティー、および（ギャップ内の各さらなる連続ゼロあたり）−４のギャップ伸長ペナルティーで、デフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（値−４〜＋１１）を用いて、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ’ｓ  ＧＤＡＰ（グローバルアラインメントプログラム）のバージョン９を使用しアラインメントする。アラインメントの後、請求項に記載したアミノ酸の数の割合として、割合同一性を、適合する数を表示することによって計算する。
【００９６】
本発明におけるムテインには、ＣＸＣＲ４をコードする自然発生配列、および遺伝的コードの縮重に基づく天然由来のヌクレオチド配列とは異なる配列を本質的に全て含み、ストリンジェントな条件下でＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、そして本発明によるＣＸＣＲ４タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされたものが含まれる、すなわち、いくらか異なる核酸配列は、その縮重により、同一のアミノ酸配列をまだコードしうる。
【００９７】
本明細書で使用する場合、語句「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖を塩基対合を介して相補的な鎖と結合する任意の工程を含むべきである（Coombs J, 1994, Dictionary of Biotechnology, stokton Press, New York NY）。「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの産出として定義され、一般的には本技術分野でよく知られているポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて実施される（Dieffenbach and Dveksler, 1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY）。
【００９８】
「ストリンジェンシー」は、典型的には約Ｔｍ−５℃（プローブの融解温度より５℃低い）〜Ｔｍより約２０℃〜２５℃低い範囲でおこる。
【００９９】
語句「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄条件を意味し、当業者が「ストリンジェント」として従来言及するものである。Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications and Wiley Interscience, New York,NY,1987-1995, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989を参照のこと。
【０１００】
本明細書で使用する場合、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション実験で使用した温度、ハイブリダイゼーション溶液中の一価のカチオンのモル濃度およびホルムアミドの割合の関数である。任意の所定の組の条件に関するストリンジェンシーの程度を決定するために、まず、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度Ｔｍとして表した、１００％同一性のハイブリッドの安定性を決定するためのMeinkoth et al.(1984)の等式を利用する。
Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６（ＬｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／Ｌ
式中、Ｍは一価のカチオンのモル濃度であり、％ＧＣはＤＮＡ中のＧおよびＣヌクレオチドのパーセンテージであり、％ｆｏｒｍはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドの割合であり、Ｌは塩基対のハイブリッドの長さである。１００％同一ハイブリッドに対して計算したものよりＴｍが減少された各１Ｃについて、許容されるミスマッチの量は、約１％まで増加する。したがって、特定の塩およびホルムアミド濃度での、任意の所定のハイブリダイゼーション実験に対して使用したＴｍが、Ｍｅｉｎｋｏｔｈの等式にしたがって、１００％ハイブリッドについて計算したＴｍよりも１０Ｃ低い場合、約１０％までのミスマッチが存在する場合でさえも、ハイブリッド形成が起こる。
【０１０１】
本明細書で使用するように、「高度にストリンジェントな条件（highly stringent conditions）」は、上記式によって計算されたか、または実際測定したかのいずれかで、標的配列を有する完全な二本鎖に対して存在するＴｍよりも１０Ｃ以上低くはないＴｍを供するものである。「中程度にストリンジェントな条件」は、上記式によって計算されたか、または実際測定したかいずれかで、標的配列を有する完全な二本鎖に対して存在するＴｍよりも２０Ｃ以上低くはないＴｍを供するものである。限定はしないが、高度にストリンジェントな条件（ハイブリッドの計算された、または測定されたＴｍよりも５〜１０Ｃ低い）および中程度にストリンジェントな条件（ハイブリッドの計算された、または測定されたＴｍより１５〜２０Ｃ低い）の例では、ハイブリッドの計算されたＴｍより低い適切な温度で、２×ＳＳＣ（標準クエン酸食塩水）および０．５％  ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）の洗浄溶液を使用する。該条件の究極のストリンジェンシーは主に洗浄条件によるものであり、とりわけ、使用したハイブリッド形成条件は、安定性の低いハイブリッドを安定なハイブリッドにしたがって形成させるものである。ついで、より高度にストリンジェントな洗浄条件によって、安定性の低いハイブリッドを取り除く。上述した高度なストリンジェンシーから中程度の洗浄条件まで使用可能な一般的なハイブリダイゼーション条件は、Ｔｍよりもおよそ２０〜２５Ｃ低い温度での、６× ＳＳＣ（または６×  ＳＳＰＥ（標準リン酸食塩水−ＥＤＴＡ）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、０．５％ＳＤＳ、１００＆マイクロ；ｇ／ｍｌ変性し、断片化サケ精子ＤＮＡの溶液中でのハイブリダイゼーションである。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに塩酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を利用することが好ましい（Ausubel,1987,1999）。成体幹細胞は、骨髄吸引のような外科的手法を用いて入手可能であるか、またはＮｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡより入手できるもののような市販システムを用いて得られる。本発明で利用する幹細胞は、好ましくは、幹細胞動員手法を用いて回収（すなわち収穫）し、この方法ではＨＳＣｓを対象の循環系へ放出するために、化学治療またはサイトカイン刺激を用いる。動員が、脊髄手術よりも、より多くのＨＳＣｓおよび前駆細胞を産出することが知られているので、幹細胞は好ましくはこの手法を用いて回収する。
【０１０２】
幹細胞動員は、多数の分子によって誘導可能である。実施例には、顆粒球コロニー−刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−７、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、幹細胞因子（ＳＣＦ）およびｆｌｔ−３リガンドのようなサイトカイン、ＩＬ−８、Ｍｉｐ−１α、Ｇｒｏβ、またはＳＤＦ−１のようなケモカイン、化学治療薬剤シクロホスファミド（Ｃｙ）およびパクリタキセルが含まれるが、限定されるものではない。しかしながら、これらの分子は、速度論および効果が異なることが認められるが、しかしながら、現在公知の実施態様にしたがって、Ｇ−ＣＳＦが単独でまたはシクロホスファミドとのような組み合わせで、幹細胞を動員するために、好ましく使用される。典型的には、Ｇ−ＣＳＦは５〜１０μｇ／ｋｇの用量で５〜１０日間、毎日投与する。幹細胞を動員する方法は、米国特許第６，４４７，７６６号および第６，１６２，４２７号で開示されている。ヒト胚幹細胞はヒト胚盤胞より単離可能である。ヒト胚盤胞は典型的には、ヒトのインビボでの未着床胚から、またはインビトロでの受精（ＩＶＦ）胚から得る。あるいは、単一細胞ヒト胚を胚盤胞期に広げることが可能である。ヒトＥＳ細胞の単離のために、透明帯を胚盤胞から取り除き、内部細胞塊（ＩＣＭ）を免疫手術によって単離し、そこでは、栄養外胚葉細胞を溶解し、穏やかにピペッティングすることによって無損傷のＩＣＭより除去する。ついでＩＣＭを、その増殖を可能にする適切な培養を含む組織培養フラスコ中にプレートする。９〜１５日後、機械的分解によって、または酵素的分解によってのいずれかで、増殖を誘導したＩＣＭをクランプ内に分離させ、ついで細胞を、新しい組織培地上に再プレートする。未分化形態を示しているコロニーをマイクロピペットによって個々に選別し、クランプ内に機械的に分離し、再プレートする。ついで、得られたＥＳ細胞を１〜２週間ごと定期的に分割する。ヒトＥＳ細胞の製造方法における、さらなる詳細に関しては、Thomson et al.,［米国特許第５，８４３，７８０号、Science 282:1145,1998;Curr.Top.Dev.Biol.38:133,1998;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995]、Bongso et al.,[Hum Reprod 4:706,1989]、Gardner et al.,[Fertil.Steril.69:84,1998]を参照のこと。
【０１０３】
市販されて入手可能な幹細胞はまた、本発明の本観点にしたがって使用可能であることが理解されるであろう。ヒトＥＳ細胞を、ＮＩＨヒト胚幹細胞登録（＜ｈｔｔｐ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ＞）より購入可能である。市販されて可能な幹細胞系統の非限定例は、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３およびＴＥ３２である。
【０１０４】
ヒトＥＧ細胞は、当業者に公知の研究技術を用いて妊娠の約８〜１１週のヒト胎児より得た始原生殖細胞より回収可能である。生殖堤を分離し、小さな塊に切断し、その後、機械的分離によって、細胞をバラバラにする。ついで、ＥＧ細胞を、適切な培地で、細胞培養フラスコ中で増殖させる。細胞を、ＥＧ細胞と一致した細胞形態が観察されるまで、典型的には、７〜３０日後、または１〜４継代、毎日培養液を交換して培養する。ＥＧ細胞を調製する方法における、さらなる詳細に関して、Shamblott et al.,［Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998］および米国特許第６，０９０，６２２号を参照のこと。
【０１０５】
多分化能を示している幹細胞集団の濃縮が、好ましく実施されうることが理解されるであろう。したがって、たとえば、本明細書以上で概略したように、本明細書以下でさらに記述するように、ＣＤ３４＋幹細胞はアフィニティーカラムまたはＦＡＣＳを用いて濃縮可能である。
【０１０６】
幹細胞数が、治療に利用するために少なすぎる場合に、増殖条件下で幹細胞の培養もまた達成されうる。幹細胞の培養は、米国特許第６，５１１，９５８号、第６，４３６，７０４号、第６，２８０，７１８号、第６，２５８，５９７号、第６，１８４，０３５号、第６，１３２７０８号および第５，８３７，５７３９号で記述されている。
【０１０７】
一旦幹細胞を得たならば、ＣＸＣＲ４をコードしている配列を含むＤＮＡ、またはその活性部分をトランスフェクトする。
【０１０８】
「形質導入、トランスフェクトまたはトランスジェニック」細胞を、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡによってコードされたタンパク質を発現させる可能にする、好適な条件下で培養する。
【０１０９】
幹細胞に、ＣＸＣＲ４をコードする配列を含む組換え体バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターを形質導入可能であり、レンチウイルス系が、ＣＸＣＲ４またはその活性部分を発現するために好ましく使用される。どの場合でも、形質導入細胞をＣＸＣＲ４の発現を可能にする効果的な条件下で培養する。効果的な培養条件には、限定はしないが、タンパク質産出を許容する効果的培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれる。効果的な培地とは、本発明の組換え体改変ポリペプチドを産出するために細胞を培養する任意の培地を意味する。そのような培地には、典型的に、同化炭素、窒素およびリン酸供給源を有する水溶液、およびビタミンのような、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養源が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリ皿内で培養可能である。培養は、組換え体細胞に好適な温度、ｐＨおよび酸素含量で実施可能である。そのような培養条件は当業者の技能の範囲内である。
【０１１０】
そのような場合、発現構成体には、誘導可能で増殖特異的または組織特異的条件でありうる、哺乳動物細胞（上記の例）において活性であるシス−活性調節要素を含む。
【０１１１】
細胞特異的および／または組織特異的プロモーターの例には、肝臓特異的であるアルブミン［Pinkert et al.,(1987)Genes Dev.1:268-277］、リンパ球特異的プロモーター［Calame et al.,(1988)Adv.Immunol.43:235-275］、とりわけ、Ｔ−細胞レセプターのプロモーター［Winoto et al.,(1989)EMBO J.8:729-733］および免疫グロブリン［Banerji et al.(1983)Cell 33729-740］、神経フィラメントプロモーターのようなニューロン特異的プロモーター［Byrne et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477］、膵臓−特異的プロモーター［Edlunch et al.(1985)Science 230:912-916］または乳漿プロモーターのような哺乳動物腺−特異的プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許第２６４，１６６号）のようなプロモーターが含まれる。本発明の核酸構築物はさらに、プロモーター配列に隣接可能であるか、または遠位でありうる、そして、それからの転写をアップレギュレートするように機能可能なエンハンサーを含みうる。
【０１１２】
好ましくは、誘導可能なシス−活性調節要素は、ホーミング−移植工程のあいだの幹細胞の環境の変化によって調節されうる。
【０１１３】
本発明の核酸構成は、さらにＩＲＥＳ要素、好ましくはＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含み得、これはＣＸＣＲ４遺伝子とマーカーまたは選別遺伝子配列間に存在し得、マーカーまたは選別遺伝子の翻訳をアップレギュレートする際に機能可能である。
【０１１４】
一旦ＣＸＣＲ４またはその活性部分が過剰発現したならば、幹細胞はＳＤＦ−１に対する応答の増加を示す。
【０１１５】
本発明の本観点によると、ＣＸＣＲ４を過剰発現しているそのような細胞の同定および単離は、本技術分野でよく知られている多数の細胞学的、生化学的および分子的方法を用いて達成可能である。
【０１１６】
レセプターレベルの解析は、フローサイトメトリーによって達成可能である。このアプローチは、培養液中の励起供給源を通って流れる単一細胞をスキャンする器具を使用する。この技術は、可視および蛍光発光の測定に基づく、単一の生（または死）細胞の、迅速で、定量的、多パラメータ解析を提供可能である。この基礎プロトコールは、特異的な細胞結合分子に結合する蛍光−標識抗体およびリガンドによって産出される蛍光強度を測定することに焦点を当てている。蛍光活性化細胞ソーターを用いて細胞群を単離するために、本発明の幹細胞を、Ｒ＆Ｄ，６１４  ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  ＮＥ  Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから市販されて入手可能な抗ＣＸＣＲ４と接触させる。
【０１１７】
走化性レセプター発現のレベルを定量的に評価するための他の細胞学的または生化学的方法には、限定はしないが、標識化（たとえば放射活性標識化）ケモカインを用いる結合解析、ウエスタンブロット解析、細胞−表面ビオチン化および免疫蛍光染色が含まれる。レセプター発現レベルは、ｍＲＮＡレベルによって決定することも可能であることが理解されるであろう。たとえば、ＣＸＣＲ４のｍＲＮＡは、特異的プローブとハイブリダイゼーションすることによって細胞内で検出しうる。そのようなプローブは、典型的には、インビトロでの転写によって作製するクローン化ＤＮＡまたはその断片、ＲＮＡ、または通常固相合成によって生成するオリゴヌクレオチドプローブでありうる。特定ハイブリッド形成のために好適なプローブを生成し、利用するための方法は、本技術分野でよく知られており、使用されている。ｍＲＮＡレベルの定量はまた、対象の走化性レセプターのｍＲＮＡに特異的にハイブリッド形成するプライマーを用いる増幅反応［たとえば、ＰＣＲ、［PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, San Diego, CA(1990)］を用いて実施することが可能である。
【０１１８】
ｍＲＮＡ検出アッセイにおける精度を改善するために、多様な対照を有効に利用しうる。たとえば、試料をハイブリダイゼーションの前にＲＮＡｓｅ  Ａで処理して不適切なプローブでハイブリダイズさせ、誤りのハイブリダイゼーションを評価する。
【０１１９】
機能アッセイもまた、走化性レセプター発現を決定するために利用可能である。たとえば、走化性試薬（たとえばＳＤＦ−１）の勾配を用い、走化性試薬に向かって膜を通る幹細胞遊走を追う走化性アッセイは、走化性の増加を示している幹細胞を同定し、単離するために利用可能である。細胞が十分なレベルの走化性レセプター（たとえばＣＸＣＲ４）を発現しない場合、細胞の大部分が膜上に残る。しかしながら、本発明の化学誘引物質レセプターの発現の増加に際し、細胞が膜を通って遊走し、走化性プレートのウェルの底に定着する（実施例項の実施例３を参照のこと）。機能的ホーミングアッセイもまた、本発明の方法によって利用可能であることが理解されるであろう。そのようなアッセイは、Kollet (2001) Blood 97:3283-3291で記述されている。
【０１２０】
低または高ＳＤＦ−１濃度に対する応答における、ＣＸＣＲ４シグナル伝達能力の改善を示している幹細胞、および／またはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ集団のような、未熟な初期前駆細胞のレベルの増加を示している幹細胞を、広範囲の臨床適用で使用可能である。
【０１２１】
したがって、本発明の他の観点によると、細胞または組織の置換を必要とする疾病を治療する方法が提供される。本方法は、それを必要とする対象に、治療的に有効量のＣＸＣＲ４またはその活性断片を過剰発現しているトランスジェニック幹細胞を投与すること、それによってＳＤＦ−１の濃度が増加する環境中でさえ、ＳＤＦ−１に対するよりよい応答をするＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ集団のような高レベルの未熟な初期前駆細胞を提供することによって実施され、それによって対象の細胞または組織の置換を必要とする疾病を治療する。細胞または組織の置換を必要とする疾病には、限定はしないが、リウマチ様関節炎のように、Ｔおよび／またはＢ−リンパ球のような種々の免疫不全または免疫疾病が含まれる。そのような免疫不全は、ウイルス感染、ＨＴＬＶＩ、ＨＴＬVＩＩ、ＨＴＬVＩＩＩ、放射線への重度の暴露、癌治療の結果、または他の医薬治療の結果でありうる。血液学的不全には、限定はしないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性非リンパ芽球性白血病（ＡＮＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のような、白血病が含まれる。他のそのような血液学的不全は、限定はしないが、［たとえばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損およびＸ−結合ＳCＩＤ（ＸＳＣＩＤ）のような］重度混合免疫不全（ＳＣＩＤ）症候群、大理石骨病、再生不良性貧血、ゴーシュ病、地中海性貧血および他の先天性または遺伝的に決定された造血異常でありえ、細胞または組織の置換を必要とする他の疾病には、肝不全、膵臓不全、神経学的疾病に関連するものや、変形性関節症、骨粗鬆症、骨欠損、結合組織欠損、骨格欠損または軟骨欠損のような任意の結合組織が関与する外傷性または病的状態が含まれる。
【０１２２】
本発明にしたがった好ましい個々の対象は、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、および好ましくはヒトのような哺乳動物である。
【０１２３】
本発明の本観点にしたがった幹細胞は、治療すべき対象から得ることが好ましい。しかしながら、幹細胞はまた、同系、同種異系、そしてあまり好ましくはないが、異種ドナーから得て良い。
【０１２４】
同種異系または異種幹細胞を利用する場合、レシピエント対象および／または細胞を、好ましくは、移植片対宿主、および宿主対移植片拒絶を防止するために処置することが理解されるであろう。免疫抑制プロトコールは、本技術分野で公知であり、いくつかは米国特許第６，４４７，７６５号で開示されている。
【０１２５】
本発明の幹細胞は、米国特許第５，９２８，６３８号でさらに記述されている肝炎に対する抗ウイルス薬のような、任意の治療的遺伝子を発現するために、遺伝的に改変可能である。幹細胞を、レシピエント対象に移植する。これは一般的に、本技術分野でよく知られた方法を用いて実施され、通常当業者によく知られている臨床ツールを用いて、対象内に処理した幹細胞を注射または導入することが含まれる（米国特許第６，４４７，７６５号、第６，３８３，４８１号、第６，１４３，２９２号および第６，３２６，１９８号）。
【０１２６】
たとえば、本発明の幹細胞の導入は、静脈内または動脈内投与のような血管内投与、腹腔内投与などを介して、局所または全身で実施可能である。細胞は、無菌シリンジまたは他の無菌伝達機構を用いて、５０ｍoｌ  Ｆｅｎｗａｌｌ注入バッグに注射可能である。ついで細胞をすぐに、１５分間程度の時間以上でにわたり、ＩＶ投与を介して、患者内のフリーフローＩＶライン内に注入可能である。いくつかの実施態様において、緩衝液または塩のようなさらなる試薬も同様に加えて良い。投与する組成物は、適切な無菌性および安定性を達成する標準の方法にしたがって、処方、生成および保存すべきである。
【０１２７】
幹細胞投与量は、指示された利用にしたがって決定可能である。一般的に、非経口投与の場合、レシピエントの体重１キログラムあたり、約０．０１〜約５百万細胞を投与することが通例である。使用した細胞の数はレシピエントの体重および状態に依存し、投与の回数または頻度および他の変数は当業者に公知である。
【０１２８】
ＣＸＣＲ４過剰発現系のさらなる拡大は、遺伝子治療プロトコールに続く、損なわれたホーミングおよび生着を改善するために効果的なツールとして働き得る8、9。さらに、ヒトＣＤ３４+細胞のＣＸＣＲ４過剰発現は、両方ともが低い細胞収率によって限定され得る化学治療処置に続く臨床ＣＢ  ＣＤ３４+移植の改善、ならびに自家動員ＰＢＬ  ＣＤ３４+移植を促進しうる6。さらに、間葉性幹細胞のような他の細胞型は、種々の器官へ遊走する能力を有するが、しかしながら、それらの生着のレベルは特に低い。したがって、標的器官内でのＳＤＦ−１の発現または投与の誘導とともに、細胞表面の構造性または一過性ＣＸＣＲ４発現を促進する系の発展が、インビボでの指向性遊走ならびに器官回復の一部として患者の対象の器官の種々の細胞型の長期再増殖および発達のために有益であり得る。したがって、本発明者らは、多くの臨床プロトコールの結果を改善できる幹細胞の機能および発達を調節するための普遍的な系として、ＣＸＣＲ４の過剰発現を提案する。
【０１２９】
対象へ細胞を投与した後、もし望むなら、本技術分野で公知のように治療の効果を評価し得る。治療を必要であったりまたは必要とされるように繰り返して良い。
【０１３０】
本発明のさらなる目的、利点および新規の特徴が、限定する意図はないが、以下の実施例を試みることで当業者に明らかになるであろう。さらに、本明細書の以上で記述したような、そして以下の請求項の項目で請求したような、各種々の実施態様および観点は以下の実施例において実験的支持を見いだす。
【０１３１】
実施例
ここで前記記述とともに、非限定様式にて本発明を例示する以下の実施例に対し、参考文献を作製する。
【０１３２】
一般的に、本明細書で使用される用語および本発見で利用される実験手法には、分子学的、生化学的、微生物学的および組換え体ＤＮＡ技術が含まれる。そのような技術は、文献にて、十分に説明されている。たとえば、「モレキュラークローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning:A laboratory Manual）」Sambrook et al.,(1989)；「分子生物学のカレントプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」Volumes I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel et al.,「分子生物学のカレントプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,「分子クローニングに対する実施ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）」,John Wiley &Sons,New York(1988);Watson et al.,「組換え体ＤＮＡ（Recombinant DNA）」，Scientific American Books,New York;Birren et al.(eds)「ゲノム解析：研究室マニュアルシリーズ（Genome Analysis:A Laboratory Manual Series）」,Vols.1-4,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998)；米国特許第４，６６６，８２８号、第４，６８３，２０２号、第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号で列記されたような方法論；「細胞生物学：研究室ハンドブック（Cell Biology:A Laboratory Handbook）」Volumes Ｉ-III Cellis J.E.,ed.(1994),"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E.,ed(1994);Stites et al.(eds),「基礎および臨床免疫学（Basic and Clinical Immunology）」(8th Edition)、Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell and Shiigi(eds),「細胞免疫学における選別方法（Selected Methods in Cellular Immunology）」,W.H.Freeman and Co.,New York(1980)を参照のこと。利用可能な免疫アッセイは、特許および科学的文献にて広く記述され、たとえば、米国特許第３，７９１，９３２号、第３，８３９，１５３号、第３，８５０，７５２号、第３，８５０，５７８号、第３，８５３，９８７号、第３，８６７，５１７号、第３，８７９，２６２号、第３，９０１，６５４号、第３，９３５，０７４号、第３，９８４，５３３号、第３，９９６，３４５号、第４，０３４，０７４号、第４，０９８，８７６号、第４，８７９，２１９号、第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide Synthesis）」Gait,M.J.,ed.(1984)；「核酸ハイブリッド形成（Nucleic Acid Hybridization）」Hames,B.D.,and Higgins S.J.,eds.(1985)；「転写および翻訳（Transcription and Translation）」Hames,B.D.,and Higgins S.J.,Eds.(1984)；「動物細胞培養（Animal Cell Culture）」Freshney,R.I.,ed.(1986)；「固定化細胞および酵素（Immobilized Cells and Enzymes）」IRL Press,(1986)；「分子クローニングへの実施ガイド（A Practical Guide to Molecular Cloning）」Perbal,B.,(1984)および「酵素学における方法論（Methods in Enzymology）」Vol.1-317,Academic Press；「ＰＣＲプロトコール：方法および適用へのガイド（PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications）」,Academic Press,San Diego,CA(1990);Marshak et al.,「タンパク質精製および特性化に関する戦略−研究室コースマニュアル（Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual）」CSHL Press(1996)を参照のこと。技術の全ては、本明細書で完全に列記したような参考文献に組み入れられている。他の一般的な参考文献が、本文書を通して提供される。本明細書内の手法は、本技術分野でよく知られていると信じられ、読者の利便性のために提供される。本明細書に含まれる全ての情報が、参考文献によって、本明���書に組み込まれている。
【実施例１】
【０１３３】
ＣＸＣＲ４−形質導入ヒトＣＤ３４+細胞は、表面ＣＸＣＲ４発現を増加させた
ＣＸＣＲ４を、ＨＩＶ−由来レンチウイルス遺伝子伝達系を用いて、ヒトＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４+濃縮細胞上で過剰発現させた。形質導入細胞を、ＣＸＣＲ４表面発現に関して解析した。
【０１３４】
材料および実験手法
ヒト細胞−臍帯血（ＣＢ）細胞および成人動員末梢血（ＭＰＢ）細胞を、インフォームドコンセントの後に得た。ＣＤ３４+細胞濃縮を、先に記述された［Kollet(2001)Blood 97:3283-3291］ように、磁気ビーズ分離を用いて実施した。ＣＸＣＲ４発現を、精製した抗ヒトＣＸＣＲ４（クローン１２Ｇ５、Ｒ＆Ｄ、ミネアポリス、ＭＮ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ  ＦＩＴＣの二次Ｆ（ａｂ’）２断片（ジャクソン（Jackson）、ウエストグローブ、ＰＡ）を用いた、フローサイトメトリーによって促進した。
【０１３５】
ウイルスベクター構築および生産−ヒトＣＸＣＲ４遺伝子レンチウイルス発現ベクターを、ヒトＣＢ細胞から１．２ｋｂ  ＣＸＣＲ４  ｃＤＮＡを単離し、それを、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）を介して、増強グリーンフルオレセントタンパク質（ＧＦＰ）に連結することによって構築した。ＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰを含む断片を、ＥＦ−１αプロモーターとライゲートし、ＥＦ−１α−ＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰバイシストロン性カセットを含む断片を、親切にもＤｒ．Ｄｉｄｉｅｒ  Ｔｒｏｎｏ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって提供された、ｐＨＲ’−ＳＩＮベクター骨格内に挿入された（Woods et al.Blood.2000 Dec 1;96(12):3725-33.）、自己−不活性化（ＳＩＮ）ベクターを生成した。対照ベクターは、ＣＸＣＲ４遺伝子を欠き、ＧＦＰのみを発現する（図１）。
【０１３６】
複製−欠損、自己−不活性化ＨＩＶ−由来レンチウイルスベクターを、３プラスミド系：運搬ベクター、ＣＤ３４＋細胞に対してｐＨＲ’−ＥＦ１ａ−ＧＦＰ−ＳＩＮ（対照ベクター）またはｐＨＲ’−ＥＦ１ａ−ＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ−ＳＩＮ、ｈＭＳＣｓに対してｐＨＲ’−ＣＭＶ−ＧＦＰ（対照ベクター）またはｐＨＲ’−ＣＭＶ−ＣＸＣＲ４−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（実験ベクター）、エンベロープコードプラスミドｐＭＤ．Ｇおよびパッケージング構築物ｐＣＭＶＲ８．９１（Zufferey R,Nat.Biotechnol.1997;15:871-875, Naldini L,Science.1996;272:263-267）を用いて、ＦｕＧＥＮＥ  ６トランスフェクション試薬（ロッシュ  ダイアグノスティックス（Roche Diagnostics）、ミュンヘン  ドイツ）の方法により、２９３Ｔパッケージング細胞株の一過性トランスフェクションにて産出した。トランスフェクション２４時間後に、ウイルス上清を、２％ＢＳＡ（シグマ（Sigma）、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）、１０ｍｇ／ｍｌ  インスリン（バイオロジカル  インダストリーズ（Biological Industries）、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、２００ｍｇ／ｍｌ  トランスフェリン（シグマ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（バイオロジカル  インダストリーズ）、１００ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（バイオロジカル  インダストリーズ）、および１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（バイオロジカル  インダストリーズ）を含む血清不含培地で置換した。２４時間後、ウイルス上清を回収し、濾過し（０．４５μＭ  Ｍｉｎｉｓａｒｔフィルター、サルトリウス（Sartorius）、ＡＧ、ドイツ）、標的細胞の形質導入のために利用した。
【０１３７】
ＣＤ３４+細胞の形質導入−ＣＤ３４+細胞の形質導入を、ＨＳＣ中の二重形質導入プロトコール50を用いて実施した。ＣＤ３４+細胞（ウェルあたり４×１０5まで）を、１２−ウェルプレート中で２４時間、４００μｌの血清不含培地中、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）で前刺激した。ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＬＴ−３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ）（ともにＲ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮから）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ；インターファーム  ラボラトリーズ（Interpharm Laboratories）、アレス−セロノグループ（Ares-Serono Group）、Ｎｅｓｓ  Ｚｉｏｎａ、イスラエル）を補足したウイルス上清（１．６ｍｌ／３５ｍｍウェル）を、２×１０7ＴＵ／ｍｌ程のウイルス負荷で、細胞に加えた（一次感染）。形質導入を２４時間後に繰り返した（二次感染）。感染効率を、形質導入７２時間後、フローサイトメトリー解析（Kollet 2002 Blood vol100、２７７８ページ）（FACSCａｌｉｂｕｒ、ベクトン  ディッキンソン（Becton Dickinson）（ＢＤ）、サンジョゼ、ＣＡ）によって、特異的抗ヒトＣＸＣＲ４−ＰＥ（１２Ｇ５、ＢＤ  ファーミンゲン（Pharmingen）、サンディエゴ，ＣＡ）およびＧＦＰ（ＦＬ１チャンネル）を用いて、ＣＸＣＲ４の細胞発現により決定した。モック細胞を、レンチウイルスベクターへの暴露なしに、形質導入細胞と同様の条件で培養した。
【０１３８】
ＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４+細胞両方が、フローサイトメトリーによって記録したところ、高い形質導入効果を示し、ＧＦＰベクター（対照）形質導入細胞では７０％  ＧＦＰ陽性細胞に、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞では５０％に達した（図２Ａ−上パネル）。さらに、ＣＸＣＲ４−感染ＣＤ３４+細胞は、細胞表面ＣＸＣＲ４発現に関して、８７±２．７％（ＣＢ）および８０±４％（ＭＰＢ）陽性であり、一方で、ＧＦＰベクターに感染したＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４+細胞両方では２８±３．１％のみが内因性ＣＸＣＲ４を発現しており、非形質導入細胞（モック細胞）のレベルに類似していた（図２Ａ−下パネル（それぞれ）およびＢ）。興味深いことに、ＣＸＣＲ４形質導入細胞は、ＧＦＰベクター形質導入細胞の１０．２と比較して、８９．４のより高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示した（図２Ｃ）。しかしながら、それらの細胞内ＣＸＣＲ４発現は、それらの対照（ＧＦＰ）対応物より低かった（図２Ｃ）。とりわけ、ＣＸＣＲ４ベクターを形質導入した細胞は、ＧＦＰ+細胞が少なく、ＩＲＥＳから下流に位置する遺伝子の発現レベルの減少を示している、先の報告51と一致する。
【０１３９】
これらの結果は、ＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４＋細胞の両方が、ＣＸＣＲ４トランスジーンを高発現するレンチウイルスベクターを用いて、首尾良く形質導入できることを示している。
【実施例２】
【０１４０】
ＣＸＣＲ４−過剰発現ヒトＣＤ３４+細胞は、インビトロでの分化可能性およびトランスジーン発現を維持する
幹細胞および前駆細胞は、適切なサイトカインカクテルを供した場合に、骨髄および赤血球系統にインビトロで多系統分化が可能である（ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ１９７７  ｖｏｌ６１  ページ１でのＭｅｔｃａｌｆ  ｄの最近の結果）。したがって、本発明者らは、分化した系統における、形質導入細胞の、インビトロでの分化する能力に対する、トランスジーン発現の効果を評価した。
【０１４１】
実験手法
ＣＦＵアッセイ−エクソビボ培養中の形質導入後の、ヒト前駆細胞のレベルならびにトランスジーン発現の維持を検出するために、半固体培養を、先に記述された52ように実施した。簡単に記すと、ＣＢ  ＣＤ３４+形質導入細胞（３×１０3細胞／ｍｌ）を、０．９％  メチルセルロース（シグマ）、３０％ＦＣＳ、５×１０-5Ｍ  ２ＭＥ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３、５ｎｇ／ｍｌ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）、および２ｕ／ｍｌ  エリスロポエチン（オルソ  バイオ  テック（Ｏｒｔｏ  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈ）、Ｄｏｎ  Ｍｉｌｌｓ，Ｃａｎａｄａ）中にプレートした。培養物を、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中、３７℃にてインキュベートし、１４日後、ＧＦＰ+に関しては、位相差顕微鏡を用いて、ならびに形態基準を用いて、骨髄または赤血球コロニーを記録した。
【０１４２】
トランスジーン発現が、細胞の、骨髄および赤血球系統への分化能力に影響を与えないことがわかった。形質導入ＣＤ３４+細胞（対照およびＣＸＣＲ４両方）は、１４日目に位相差顕微鏡によって記録し、バースト−形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）およびコロニー−形成ユニット−顆粒球、マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）のようなＧＦＰ+  ＣＦＣコロニーへの多分化能分化を示した（図３Ａ）。対照ベクターを形質導入したＧＦＰ+  ＣＦＣコロニーの数は、ＣＸＣＲ４ベクターを形質導入したＧＦＰ+  ＣＦＣコロニーより２倍多く、本ベクターでの形質導入の後のＧＦＰ+細胞のより低い割合と一致する（図３Ｂ）。興味深いことに、対照ならびにＣＸＣＲ４−形質導入細胞両方が、同数のＣＦＵ−ＧＭコロニーを産出する一方で、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞より産出されるＢＦＵ−Ｅコロニーが、２５％（ｐ＝０．００４）減少し（図３Ｂ）、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４相互作用が、赤血球系統分化を抑制することを示したＧｉｂｅｌｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌの先の発見53を証明している。さらに、ＭＰＢ  ＣＤ３４＋  ＣＸＣＲ４形質導入細胞は、対照細胞での０．５％と比較して、より高い割合（２．９％）のＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ集団を示した。この効果は、ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞では観察されなかった（図３Ｃ）。ＣＸＣＲ４形質導入はしたがって、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ｌｏｗ始原集団をより保存および／または拡大しうる。
【実施例３】
【０１４３】
形質導入ＣＤ３４+細胞で発現したＣＸＣＲ４は機能的である
ケモカインは、細胞骨格配置、とりわけアクチン重合化を導く細胞内事象のカスケードを活性化することによって、細胞運動性を誘導する54。挿入したレセプターの機能性を決定するための方法として、本発明者らは、運動性機構のＳＤＦ−１誘導活性化に対するＣＸＣＲ４過剰発現の効果を試験した。
【０１４４】
実験手法
アクチン重合化アッセイ−形質導入細胞を、示した時間、３７℃にて、血清−不含ＲＰＭＩ中で、ＳＤＦ−１α（３００ｎｇ／ｍｌ、ペプロテック（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）で刺激した。反応を、ＲＴにて１０分間、３容量の３．７％パラホルムアルデヒドを加えることによって停止させ、続いて、ＰＢＳで洗浄し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｈｅｐｅｓ（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭサッカロース、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ）で、２分間、氷上にて透過化処理をした。ついで細胞を、ＲＴにて３０分間、ＦＩＴＣ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（２ｍｇ／ｍｌ、シグマ）で染色し、洗浄し、フローサイトメトリーによって解析した。
【０１４５】
遊走アッセイ−１２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１αを含む、１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ（６００μｌ）を、Ｃｏｓｔａｒ  ２４−ウェルトランスウェル（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）（ポアサイズ５μｍ）、ＮＹ）の下部チャンバーに加えた。１００μｌの培地中の１×１０5形質導入ＣＤ３４+細胞を、上部チャンバーにのせ、３７℃にて４時間遊走をさせた。遊走している細胞を、下部チャンバーより回収し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて、３０秒間計数した。対照自発遊走は、ＳＤＦ−１αなしで、下部チャンバーで実施した。
【０１４６】
本発明者らは、ＣＢ  ＣＤ３４+細胞が、ＳＤＦ−１での３０秒の刺激後に、アクチン重合化のピークを示したことを発見した（図４Ａ）。この時点で、刺激していない細胞と比較した場合、ＣＸＣＲ４過剰発現細胞はアクチン重合化において、３±０．１１（ｐ＜０．００１）倍増加、対して対照細胞において、１．５±０．０７（ｐ＝０．００２）倍増加を示した（図４Ａ）。これらの結果を踏まえ、本発明者らは、トランスウェル遊走アッセイにて、ＳＤＦ−１（１２５ｎｇ／ｍｌ）の勾配に対する、ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢおよびＭＰＢ  ＣＤ３４+細胞の遊走潜在能力を調査した。ＣＸＣＲ４を過剰発現している細胞は、対照ベクター−形質導入細胞と比較した場合、ＣＢについて１．５±０．０４（ｐ＜０．００１）倍、およびＭＰＢについて２．３±０．３（ｐ＝０．０３）倍の、ＳＤＦ−１仲介走化への応答の有意な増加を示した（図４Ｂ）。全てこれらのデータは、ヒト濃縮ＣＤ３４+前駆細胞上のＣＸＣＲ４の過剰発現が、ＳＤＦ−１誘導シグナル伝達の増強を示し、細胞運動性の増加を導くことを示唆している。
【実施例４】
【０１４７】
ＣＸＣＲ４形質導入ＣＤ３４+細胞は、低ＳＤＦ−１濃度に対して、より応答しやすい
ＣＤ３４+細胞上のＣＸＣＲ４の過剰発現が、低ＳＤＦ−１濃度に対して、それらをより応答しやすくしうることが仮定された。これを検証するために、形質導入細胞のインビトロ遊走を、異なるＳＤＦ−１濃度に対して実施した。さらに、サイトカインとの相乗効果での低濃度のケモカインＳＤＦ−１が、ヒトＣＤ３４+細胞の増殖、ならびにヒトおよびマウス両方の前駆細胞の生存を増強することが示された25-28。したがって、ＣＸＣＲ４過剰発現細胞の増殖における、低濃度でのＳＤＦ−１の効果をモニタした。
【０１４８】
実験手法
遊走アッセイ−先に記述したのと同様（１２）。簡単に記すと、１０ng/mlまたは１２５ｎｇ／ｍｌのいずれかのＳＤＦ−１αを含む、１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ（６００μｌ）を、Ｃｏｓｔａｒ  ２４−ウェルトランスウェル（コーニング（ポアサイズ５μｍ）、ＮＹ）の下部チャンバーに加えた。１００μｌの培地中の１×１０5形質導入ＣＤ３４+細胞を上部チャンバーにのせ、３７℃にて４時間遊走をさせた。遊走している細胞を下部チャンバーより回収し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて、３０秒間計数した。対照自発遊走は、ＳＤＦ−１αなしで下部チャンバーで実施した。
【０１４９】
増殖アッセイ−９６時間の形質導入プロトコールの後、ＣＢ  ＣＤ３４+細胞を、ＳＤＦ−１  ５０ｎｇ／ｍｌの存在下、または非存在下で、ＳＣＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、ＦＬＴ−３Ｌ  ５０ｎｇ／ｍｌおよびＩＬ−６  ５０ｎｇ／ｍｌを含む血清不含培地中で、二重に、７日間培養した。細胞を毎日計数し、生存を、トリパンブルー排除によって評価した。
【０１５０】
すでに、低濃度のＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）にて、ＣＢ  ＣＸＣＲ４−形質導入細胞の遊走は、高ＳＤＦ−１濃度（１２５ｎｇ／ｍｌ）でのこれらの細胞の遊走と同様に、２５％のピークレベルに達することが見出された。図４Ｂで示すように、低濃度のＳＤＦ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）で、ヒトＣＢから単離したＣＸＣＲ４−感染細胞が、それらの対照ベクター−形質導入同等物に比べて、遊走において２．５倍（ｐ＜０．０５）までの増加を示し、一方で高ＳＤＦ−１濃度（１２５ｎｇ／ｍｌ）ではこの増加は有意性が低かった（１．５倍）。同様に、遊走細胞の割合がＣＢ  ＣＤ３４＋細胞に関してよりも非常に低かったにも関わらず、ＣＸＣＲ４−形質導入ＭＰＢ  ＣＤ３４＋細胞は、１２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１に対する２倍増加と比較して、１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１に対して、遊走に関して、２．６（ｐ＝０．０５）倍の増加を示した（図４Ｂ）。さらに、７日にわたりＣＸＣＲ４過剰発現細胞の増殖を評価したところ、ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢ  ＣＤ３４+細胞が、播種後４８時間ですでに、その播種した量のほとんど二倍になることが観察され（ｐ＜０．０５）、この効果は培養中７日までの間見られうる（ｐ＝０．００１）。しかしながら、対照細胞は５日目に１．２±０．０５倍までその細胞数が増加しただけで、７日までに、播種した本来の量以下にその数が減少した（図５Ａ）。特に、このＣＸＣＲ４過剰発現細胞の増殖効果の増強は、より高い（１００ｎｇ／ｍｌ）ＳＤＦ−１濃度では検出されなかった（データは示していない）。長期の培養が細胞分化を導き、レンチウイルス形質導入に続く細胞形質転換の可能性を除外する。総合すると、本発明者らの結果は、対照細胞と比較した場合に、ＣＤ３４+細胞上のＣＸＣＲ４の過剰発現が、低ＳＤＦ−１濃度に対するそれらの応答を増強し、それらの運動性および増殖／生存の両方を増加させ、高濃度にはあまり応答しないことを示している。
【実施例５】
【０１５１】
ＣＸＣＲ４過剰発現細胞は、ＳＤＦ−１誘導脱感作に対する応答性は低い
ＳＤＦ−１は高濃度（１μｇ／ｍｌおよびそれ以上）で最終的に細胞表面へ再循環されうる細胞表面ＣＸＣＲ４分子のエンドサイトーシスを介した脱感作および内部化を誘導することが記述されてきた55。したがって、本発明者らは、ＣＸＣＲ４を過剰発現している細胞における高ＳＤＦ−１濃度の効果を試験した。
【０１５２】
実験手法
ＣＸＣＲ４細胞表面発現−ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢ  ＣＤ３４+細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１とともに一晩インキュベートした。細胞表面ＣＸＣＲ４発現を、細胞を抗ヒトＣＸＣＲ４−ＰＥ（１２Ｇ５、ＢＤ  ファーミンゲン、サンディエゴ、ＣＡ）で標識することにより特定し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ベクトン  ディッキンソン（ＢＤ）、サンジョゼ、ＣＡ）によって解析した。
【０１５３】
遊走アッセイ−１２５ｎｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１αを含む、１０％  ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ（６００μｌ）を、Ｃｏｓｔａｒ  ２４−ウェルトランスウェル（コーニング（ポアサイズ５μｍ）、ＮＹ）の下部チャンバーに加えた。１００μｌの培地中の１×１０5形質導入ＣＤ３４+細胞を、上部チャンバーにのせ、３７℃にて４時間遊走をさせた。遊走している細胞を、下部チャンバーより回収し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いて、３０秒間計数した。対照自発遊走はＳＤＦ−１αなしで下部チャンバーで実施した。
【０１５４】
ＣＸＣＲ４−形質導入ＣＢ  ＣＤ３４+細胞を、１μｇ／ｍｌ  ＳＤＦ−１を加えて一晩インキュベートし、ＣＸＣＲ４細胞表面発現に関して解析した。予想外にも、ＣＸＣＲ４過剰発現細胞では、細胞表面レセプター発現が４０％（ｐ＜０．０５）減少しただけで、一方対照細胞では、９０％（ｐ＜０．０５）までレセプターが内部化した（図５Ｂｉ）。この脱感作につづき、細胞をＳＤＦ−１（１２５ｎｇ／ｍｌ）勾配に向かう指向性遊走に関して、インビトロで同様にアッセイした。対照細胞はＳＤＦ−１仲介遊走の有意な（ｐ＜０．０５）減少を示し、一方でＣＸＣＲ４−形質導入細胞の遊走はほとんど影響を受けなかった（図５Ｂii）。このことは、ＣＸＣＲ４の内部化が、継続して機能的であるレセプターの持続的過剰発現によって補償されることを示唆している。
【実施例６】
【０１５５】
ＣＸＣＲ４過剰発現は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＳＲＣ生着を改善する
ヒトＣＢ  ＣＤ３４+細胞のＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４−依存生着におけるＣＸＣＲ４過剰発現の効果を評価するために、形質導入前駆細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した。
【０１５６】
実験手法
マウス  ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスを、先に１８に記述したように、交配し、維持した。すべての実験はワイズマン  インスティチュート（Weizmann Institute）の動物ケア委員会によって許可された。８〜１０週齢のマウスに亜致死的放射をし（３７５ｃＧｙ、６０Ｃｏ供給源より）、放射２４時間後に、示した［２×１０5細胞／マウス（生着）および５×１０5細胞／マウス（ホーミング）］ように、ヒト細胞を移植した。
【０１５７】
ヒト細胞生着およびホーミング−マウスを、移植後５週間後あたりで犠牲死させ、骨髄および脾臓細胞を回収し、単一細胞懸濁液に再懸濁させた。ヒト細胞生着を、特異的抗ヒトＣＤ４５−ＡＰＣ  ｍＡｂ（ＢＤ  ファーミンゲン）を用いて、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）によってアッセイした。系統解析は抗−ＣＤ１９−ＰＥ（ＢＤ  ファーミンゲン）または抗−ＣＤ３３−ＰＥ（ＢＤ）で染色することによって実施した。より前駆的な細胞集団を、抗−ＣＤ３８−ＰＥ（ＢＤ）と一緒にＣＤ３４−ＡＰＣ  ｍＡｂ（ＢＤ  ファーミンゲン）を用いて解析した。ヒト細胞もまた、ＧＦＰ発現（ＦＬ１チャネル）に関して解析した。ヒト血漿およびマウスＩｇＧを使用して、Ｆｃレセプターをブロックした。アイソタイプ対照抗体、および移植を受けなかったマウスから得た細胞を、陰性対照として使用し、ヒトＣＢ  ＣＤ３４+細胞を陽性対照として使用した。
【０１５８】
本発明者らは、対照細胞と比較した場合、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞が、ＣＢ  ＣＤ３４+細胞に関して、４±０．７（ｐ＝０．００１）倍までのマウスＢＭにおけるヒト細胞の生着の増加を示したことを発見した（図６Ａｉ）。同様に、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞は、脾臓の再増殖を２．７±０．８（ｐ＝０．０５）倍増加することを示した（図６Ａii）。興味深いことに、対照またはＣＸＣＲ４−形質導入細胞を移植したマウスにおいて、循環ヒト細胞の数に有意差は観察されなかった（図６Ａiii）。さらに、ＣＤ１９およびＣＤ３３モノクローナル抗体での代表的なＦＡＣＳ染色により、それぞれリンパ球および骨髄集団への多系統造血が、もっともおそらく、ＳＤＦ−１はＰｒｅＢ細胞増殖因子でもあるので、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞を移植したマウスで、よりＢ−細胞リンパ造血の傾向を有して（図６Ｃ）、マウスＢＭ中で維持される（図６Ｂ）ことを示している。さらに、ＣＤ４５+細胞の平均３６％±１９％（範囲７．５％〜７７％）がＧＦＰを発現することがわかった（図６Ｂ）。トランスジーン発現もまた、骨髄およびリンパ集団の両方で検出された（図６Ｂ）。ＣＸＣＲ４過剰発現細胞を移植したマウスは、対照ベクター−形質導入細胞を注射したマウスと比較して、前駆ＣＤ３４+／ＣＤ３８-/low細胞集団の４倍の増加を示し（図６Ｄ）、これはＣＸＣＲ４−過剰発現細胞のより高い生着レベルがより前駆的な細胞集団の再増殖の増加によることを示唆している。
【０１５９】
未熟ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−／ｌｏｗＣＸＣＲ４＋細胞の、マウスＢＭおよび脾臓へのホーミングは、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１相互作用に依存することが先に示された18。したがって、ヒトＣＤ３４＋細胞上のＣＸＣＲ４の過剰発現が、亜致死的放射ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの、ＢＭおよび脾臓へのそれらのホーミングを改善できるかどうかをさらに試験した。移植２時間（ＣＢ）および１６ｈ（ＭＰＢ）後のＣＸＣＲ４−形質導入細胞が、それらの対照同等物と比較して、脾臓へのホーミングにおいて２倍以上の増加を示した（図６Ｅ）。しかしながら、これらの差は、ＢＭへのそれらのホーミング能力では検出されなかった（データは示していない）。これらの結果は、先に示唆されたように18、ＣＸＣＲ４−形質導入細胞がＢＭの再増殖前に短期間で脾臓にホーミングすることを示唆している（移植後５週間）。
【実施例７】
【０１６０】
過剰発現ＣＸＣＲ４の抗原決定基
最初の一組の実験で、本発明者らは、対照ＧＦＰ形質導入臍帯血ＣＤ３４＋細胞、またはＣＸＣＲ４過剰発現ＣＤ４３＋細胞のいずれかに対して、ＣＸＣＲ４の最初のＮ−末端細胞外ドメイン内に局在する（図７）、ヒトＣＸＣＲ４−ａ位の残基２２〜２５に特異的なｍＡｂ  ６Ｈ８の結合を解析した。本発明者らは、内因性ＣＸＣＲ４のみを発現しているＧＦＰ（対照）形質導入ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞が、ヒトＣＸＣＲ４の第二細胞外ドメインに結合するｍＡｂ  １２Ｇ５に結合する（データは示していない）にもかかわらず、ｍＡｂ  ６Ｈ８に結合せず、一方でＣＸＣＲ４過剰発現ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞は、抗体１２Ｇ５および６Ｈ８の両方で陽性に染色されたことを発見した。これらのデータは、ＣＸＣＲ４の過剰発現が、ＣＸＣＲ４走化性機能において部分的に役割を果たすことが示された６Ｈ８エピトープの変質または開裂を妨げることを示唆している（Brelot et al, J Biol.Chem.275:23736-23744）。
【０１６１】
第二組の実験では、本発明者らは、対照またはＣＸＣＲ４過剰発現ＣＢ  ＣＤ３４＋細胞いずれかを移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＢＭから単離したヒト細胞への６Ｈ８および１２Ｇ５  ｍＡｂｓの結合を追った（図８）。本発明者らは、ヒトＣＸＣＲ４過剰発現細胞を有するキメラマウスＢＭから単離したヒト細胞が、ヒト対照細胞を有するキメラマウスＢＭにおいてよりも、６Ｈ８および１２Ｇ５の両方に関してより高い割合の陽性細胞を示したことを発見した。さらに、対照ＧＦＰを有する細胞が６Ｈ８エピトープの明らかな変質を示した一方で、ＧＦＰを有するＣＸＣＲ４過剰発現細胞において変質は見られず、これは過剰発現細胞中の６Ｈ８エピトープのインビボにおける変質も少ないことを示唆している。
【０１６２】
本発明はその特定の実施態様に関連して記述されてきているが、多くの変更、改変および変化が当業者に理解されるであろうことが明らかである。したがって、付随する請求項の精神および広い目的の範囲内である、すべてのこれらの変更、改変および変化が包含されることが意図されている。本明細書内で言及されたすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願が、参考文献によって本明細書に組込まれていると具体的におよび個々に示唆されたのと同様の程度で、本明細書内の参考文献によって、そのすべてがここに組込まれている。さらに、本明細書内の任意の参考文献の引用または同定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることを承認したとして解釈されるべきではない。
【０１６３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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