(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片と一緒に前駆細胞を含む組成物であって、前記多硫酸化多糖類がペントサン多硫酸またはこれらの薬学的に許容可能な塩である、組成物。
【請求項２】
さらに、キャリア媒体を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記キャリア媒体が、培地、凍結保存培地および／または薬学的に許容可能なキャリアである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記前駆細胞が、軟骨前駆細胞である請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記前駆細胞が、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞、および／またはＳｔｒｏ−１ｂｒｉ子孫細胞である請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記多硫酸化多糖類が、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸のナトリウム塩（ＮａＰＰＳ）、ペントサン多硫酸のマグネシウム塩（ＭｇＰＰＳ）、および／またはペントサン多硫酸のカルシウム塩（ＣａＰＰＳ）から選択される請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が１０００〜１×１０１０個の細胞を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が５００ｎｇ／ｍｌ／細胞百万個〜１０ｍｇ／ｍｌ／細胞百万個の濃度の多硫酸化多糖類を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、１×１０６〜１×１０８個の前駆細胞および２５〜５０ｍｇの多硫酸化多糖類を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、以下の成分：
−  有機および／または無機塩、
−  緩衝液、
−  タンパク質、
−  成長因子およびサイトカイン、
−  動物の血清、
−  凍結保存剤、
−  凍結保護剤、
−  炭水化物、
−  ビタミン／補助因子、
−  ホルモン、
−  抗生物質、
−  接着因子、
−  アミノ酸、
−  血漿増量剤、
−  ヒトおよび他の哺乳類種の両方の血漿、
−  代用血漿、
−  ヒアルロナンおよび／またはヒアルロン酸（天然または架橋の両方）
のうちの１つ以上をさらに含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
−  前記タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはトランスフェリンであり、
−  前記成長因子およびサイトカインが、インスリン様成長因子、インスリン、線維芽細胞様成長因子、ＢＭＰ−ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＴＧＦβ、線維芽細胞成長因子ファミリー、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、またはＶＥＧＦであり、
−  前記動物の血清が、ウシ胎仔血清、新生子牛の血清、または他の哺乳類種の血清であり、
−  前記凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、スクロースおよびその他の糖、またはジメチルアセトアミドであり、あるいは、
−  前記血漿増量剤が、デキストランである、
請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＭＳＯが１〜２０％の範囲で存在する請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物がさらに、配列番号１で示される配列を含むＮＣ４、または配列番号２で示される配列を含むその生物学的に活性な断片を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前駆細胞を多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片に暴露することを含む、前駆細胞の凍結保存を向上させる方法であって、前記多硫酸化多糖類がペントサン多硫酸またはこれらの薬学的に許容可能な塩である、方法。
【請求項１５】
多硫酸化多糖類の凍結保存剤としての使用であって、前記多硫酸化多糖類がペントサン多硫酸またはこれらの薬学的に許容可能な塩である、使用。
【請求項１６】
前駆細胞の凍結保存を向上させるための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を前駆細胞に暴露することを含む、前駆細胞の増殖の調節方法であって、前記多硫酸化多糖類がペントサン多硫酸またはこれらの薬学的に許容可能な塩である、方法。
【請求項１８】
前駆細胞の増殖を調節するための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１９】
多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を前駆細胞に暴露することによって、軟骨細胞への分化、骨芽細胞への分化または脂肪細胞への分化を含む前駆細胞の分化を調節する方法であって、前記多硫酸化多糖類がペントサン多硫酸またはこれらの薬学的に許容可能な塩である、方法。
【請求項２０】
軟骨細胞への分化、骨芽細胞への分化または脂肪細胞への分化を含む前駆細胞の分化を調節するための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前駆細胞の生存率を改善する（前駆細胞の凍結保存を改善することを含む）ための、前駆細胞と組み合わせた多硫酸化多糖類の使用に関し、新規の組成物、方法および使用を提供する。また本発明は、前駆細胞の増殖および分化を調節するための多硫酸化多糖類の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト前駆細胞は、成人の体の器官および組織を構成する全ての異なるタイプの成熟細胞を生じさせる未熟細胞である。前駆細胞から、成熟し特殊化した成体細胞への変化は、分化と呼ばれる過程を経る。
【０００３】
体内の前駆細胞は、その環境からの異なる刺激に応答して異なる分化経路をとる。同様に、実験室における前駆細胞は、生化学物質の種々の組み合わせに暴露することによって、異なる経路に沿って分化するように刺激することができる。適切な刺激があれば、前駆細胞は、組織の中でも特に、血液細胞、骨、軟骨、脂肪、血管または心筋に分化することができる。このために、様々な組織および器官の修復および再成長のための処置の基礎として、前駆細胞の使用に大きな関心が向けられている。
【０００４】
前駆細胞は胚に存在し、胚の中よりもはるかに小さい相対数ではあるが、骨髄、脂肪、皮膚および歯髄などの成体組織にも存在する。２つのタイプの成体前駆細胞は、新しい骨髄および血液細胞を生じさせる造血性と、骨、心臓および軟骨などの固形器官および組織を生じさせる非造血性とである。造血タイプの成体前駆細胞は骨髄から容易に得ることができ、既に臨床的に使用されている。しかしながら、非造血タイプの成体前駆細胞に関する技術は、十分な数のこれらの細胞を得ること、そしてこれらを実験室で成長させることが困難であるために、それほど開発されていない。
【０００５】
前駆細胞を治療において使用するためには、使用の前に前駆細胞を上手に貯蔵できることが必要である。前駆細胞は、これらが有効に保存され、そしてその生存率が維持されるように貯蔵されなければならない。一般に、前駆細胞は貯蔵のために凍結保存され、使用前に解凍される。
【０００６】
細胞培養物の低温保存（−１００℃よりも低温で貯蔵）は、これらの栄養補給および世話に関連する努力および費用なしに細胞のバックアップまたは貯蔵を維持するために広く使用されている。凍結過程の成功は、４つの重要な領域、培養物の適切な取扱い、制御された凍結、適切な貯蔵、および適切な凍結保護剤に依存する。最後の点は特に重要であり、適切な薬剤は細胞の生存率を維持するのに役立つことができる。
【０００７】
臨床設定において、凍結保存の後に、細胞が生存可能であることが特に重要であり、細胞の生存率の増大があれば、処置の効果を促進し得る。
【０００８】
さらに、前駆細胞が治療的に有効であるためには、これらが所要の細胞型に分化することが必要である。従って、前駆細胞が所要の細胞型に分化することを保証するために、前駆細胞分化の有効な調節因子を開発することも必要とされている。
【０００９】
さらに、前駆細胞増殖の有効な調節因子を開発することも必要とされている。多くの場合、前駆細胞はインビトロおよびインビボの両方で増殖することが望ましい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００１】
【非特許文献１】Ａｄａｍｓ  ＲＬＰ．Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ．１９８０年，８４−９７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、凍結保存中に前駆細胞を保護し、その生存率を高め、その分化を調節し、そして／あるいはその増殖を調節することができる薬剤が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは今、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片が、前駆細胞の生存率を改善し得ることを見出した。特に、本発明者らは、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片が、前駆細胞の凍結保存を向上させ得ることを見出した。
【００１２】
また本発明者らは、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片が、前駆細胞の増殖を調節し得ることも見出した。
【００１３】
また本発明者らは、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片が、前駆細胞の分化を調節し得ることも見出した。調節は上方調節でも下方調節でもよい。多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、軟骨細胞、骨芽細胞、および脂肪細胞への分化を調節し得ることが分かった。特に、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、軟骨形成を誘発し得ることが分かった。
【００１４】
これらの知見によって、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、凍結保存後の前駆細胞の生存率を改善または向上させるために前駆細胞と組み合わせて使用することが可能であり、そして、インビトロおよびインビボの方法および使用において、前駆細胞と組み合わせて使用可能であることが示される。
【００１５】
従って、これらの予想外の知見は、多数の新しい用途において多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を使用する可能性を開く。例えば、分化、特に軟骨形成を調節することによって、軟骨および椎間板を再構築し、関節の劣化を防止し、そして無血管結合組織の修復を向上させることが特に可能である。本発明より前に、多硫酸化多糖類が前駆細胞の分化、特に軟骨形成を調節し得ることは知られていなかった。さらに、増殖を調節することによって、インビトロおよびインビボの両方において前駆細胞の産生を制御することが可能である。変形性関節症（ＯＡ）の処置自体に関連する多硫酸化多糖類の使用は発表されているが、多硫酸化多糖類が前駆細胞に関して有利な凍結保存特性を有すること、あるいはこれらが前記細胞の分化および／または細胞増殖を調節できることはこれまで知られていなかった。従って、これは、今まで考慮されなかった新しい処置手段を開発する。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「生物学的に活性な分子断片」は、全長分子の規定の活性（すなわち、一実施形態では、生存率を高める、細胞分化を調節する、そして／あるいは細胞増殖を調節することができること）を維持する本発明の分子の部分である。
【００１７】
従って、第１の実施形態では、本発明は、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片と一緒に、前駆細胞を含む組成物を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態では、本発明は、キャリア媒体と一緒に、前駆細胞および多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を含む組成物を提供する。
【００１９】
キャリア媒体は、培地、生体足場（ｂｉｏｓｃａｆｆｏｌｄ）、凍結保存培地、生理的媒体および／または薬学的に許容可能なキャリアでよい。
【００２０】
さらなる実施形態では、本発明は、凍結保存培地と一緒に、前駆細胞および多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を含む組成物を提供する。
【００２１】
組成物は、インビトロおよびインビボの両方で使用され得る。
【００２２】
組成物は、任意の数の前駆細胞を含有することができる。さらなる実施形態では、本発明は、約１０００〜約１×１０１０個の前駆細胞を含有する。さらなる実施形態では、本発明は、約１×１０５〜１×１０９個の細胞を含有する。さらなる実施形態では、本発明は、１００，０００〜約５×１０８個の前駆細胞を含有する。さらなる実施形態では、本発明は、約５００，０００〜約２×１０８個の前駆細胞、約１×１０６〜約２×１０８個の前駆細胞、または約１×１０６〜約１×１０８個の前駆細胞を含有する。またさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、または９×１０８個の前駆細胞を含有する。またさらなる実施形態では、組成物は、約１×１０８個の前駆細胞を含有する。
【００２３】
一実施形態では、組成物中の多硫酸化多糖類の濃度は、組成物中の細胞の数に依存するであろう。従って、一実施形態では、組成物中の多硫酸化多糖類の濃度は、５００ｎｇ／ｍｌ／細胞百万個〜１０ｍｇ／ｍｌ／細胞百万個、または５００ｎｇ／ｍｌ／細胞百万個〜２０００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ／ｍｌ／細胞百万個〜１０００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、または１μｇ／ｍｌ／細胞百万個〜５００μｇ／ｍｌ／細胞百万個である。
【００２４】
さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、５００ｎｇ〜１０μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜１０μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜８μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜６μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜５μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜３μｇ／ｍｌ／細胞百万個、２μｇ〜６μｇ／ｍｌ／細胞百万個、２．５μｇ〜５μｇ／ｍｌ／細胞百万個、または３μｇ〜５μｇ／ｍｌ／細胞百万個の範囲である。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、１μｇ〜１００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜５０μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜２０μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１μｇ〜１５μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１０μｇ〜１００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、２０μｇ〜１００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、または５０μｇ〜１００μｇ／ｍｌ／細胞百万個の範囲である。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、１μｇ〜１０００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１００μｇ〜８００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１００μｇ〜６００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、１００μｇ〜５００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、２００μｇ〜５００μｇ／ｍｌ／細胞百万個の範囲である。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、２５０μｇ〜５００μｇ／ｍｌ／細胞百万個の範囲である。
【００２５】
一実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、５００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１０００μｇ、１０５０μｇ、１１００μｇ、１１５０μｇ、１２００μｇ、１２５０μｇ、１３００μｇ、１３５０μｇ、１４００μｇ、１４５０μｇ、１５００μｇ、１５５０μｇ、１６００μｇ、１６５０μｇ、１７００μｇ、１７５０μｇ、１８００μｇ、１８５０μｇ、１９００μｇ、１９５０μｇ、または２０００μｇ／ｍｌ／細胞百万個を含む。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、２００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、２５０μｇ／ｍｌ／細胞百万個、３００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、４００μｇ／ｍｌ／細胞百万個、または５００μｇ／ｍｌ／細胞百万個を含む。またさらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、２５０μｇ／ｍｌ／細胞百万個または５００μｇ／ｍｌ／細胞百万個を含む。
【００２６】
あるいは、多硫酸化多糖類の濃度は、組成物中の細胞の数と無関係である。従って、本発明のさらなる実施形態では、組成物中の多硫酸化多糖類の濃度は、５００ｎｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ〜１０００μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌである。
【００２７】
さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、５００ｎｇ〜１０μｇ／ｍｌ、１μｇ〜１０μｇ／ｍｌ、１μｇ〜８μｇ／ｍｌ、１μｇ〜６μｇ／ｍｌ、１μｇ〜５μｇ／ｍｌ、１μｇ〜３μｇ／ｍｌ、２μｇ〜６μｇ／ｍｌ、２．５μｇ〜５μｇ／ｍｌ、または３μｇ〜５μｇ／ｍｌの範囲である。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、１μｇ〜１００μｇ／ｍｌ、１μｇ〜５０μｇ／ｍｌ、１μｇ〜２０μｇ／ｍｌ、１μｇ〜１５μｇ／ｍｌ、１０μｇ〜１００μｇ／ｍｌ、２０μｇ〜１００μｇ／ｍｌ、または５０μｇ〜１００μｇ／ｍｌの範囲である。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、１μｇ〜１０００μｇ／ｍｌ、１００μｇ〜８００μｇ／ｍｌ、１００μｇ〜６００μｇ／ｍｌ、１００μｇ〜５００μｇ／ｍｌ、２００μｇ〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、１ｍｇ〜１０００μｇ／ｍｌ、１００μｇ〜８００μｇ／ｍｌ、１００μｇ〜６００μｇ／ｍｌ、１００μｇ〜５００μｇ／ｍｌ、２００μｇ〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類の濃度は、２５０μｇ〜５００μｇ／ｍｌの範囲である。
【００２８】
さらなる多硫酸化多糖類の濃度は、５００ｎｇ、１μｇ、２μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ、１５μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、４５０μｇ、５００μｇ、５５０μｇ、６００μｇ、６５０μｇ、７００μｇ、７５０μｇ、８００μｇ、８５０μｇ、９００μｇ、９５０μｇ、１０００μｇ、１０５０μｇ、１１００μｇ、１１５０μｇ、１２００μｇ、１２５０μｇ、１３００μｇ、１３５０μｇ、１４００μｇ、１４５０μｇ、１５００μｇ、１５５０μｇ、１６００μｇ、１６５０μｇ、１７００μｇ、１７５０μｇ、１８００μｇ、１８５０μｇ、１９００μｇ、１９５０μｇ、または２０００μｇ／ｍｌを含む。さらなる多硫酸化多糖類の濃度は、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌを含む。さらなる多硫酸化多糖類の濃度は２５０μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌを含む。
【００２９】
さらなる組成物は、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇ、９ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇの全多硫酸化多糖類含量を含有する。さらなる組成物は、１５〜７０ｍｇ、２０〜６０ｍｇ、または２５〜５０ｍｇの全多硫酸化多糖類含量を含有する。
【００３０】
さらなる実施形態は、約１×１０６〜１×１０８個の前駆細胞および２５〜５０ｍｇの多硫酸化多糖類を含む。さらなる実施形態は、１×１０８個の前駆細胞および２５〜５０ｍｇ／ｍｌの多硫酸化多糖類を含有する。
【００３１】
さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類は、例えば、０．０１〜１００マイクログラム／ｍｌ生物学的媒体、例えば、生物学的媒体１ｍｌ当たり０．１〜５０マイクログラム、生物学的媒体１ｍｌ当たり０．１〜５０マイクログラム、生物学的媒体１ｍｌ当たり０．１〜１０マイクログラム、生物学的媒体１ｍｌ当たり１〜１０マイクログラム、生物学的媒体１ｍｌ当たり２〜８マイクログラム、生物学的媒体１ｍｌ当たり４〜６マイクログラム、あるいは生物学的媒体１ｍｌ当たり４、５、または６マイクログラムである生体区画（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中の多硫酸化多糖類濃度を生じるような量で投与することができる。
【００３２】
生体区画とは、椎間板、筋肉、滑膜関節、滑膜内組織（半月板、滑膜）、滑膜外組織（きょう膜）、腱内、腱外、心臓（ｃａｒｄｉｕｍ）、心膜、心筋、および／または脂肪内組織、靱帯内、靱帯外、皮内、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内などの体の領域を意味する。生物学的媒体は、生体区画に依存するであろう。生物学的媒体には、血液、血清、血漿、滑液、腹水、漿液、または脂肪組織が含まれる。従って、例えば、さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類は、滑液１ｍｌ当たり１〜１０マイクログラムである滑膜関節中の多硫酸化多糖類の濃度を生じるような量で投与することができる。
【００３３】
キャリア媒体
組成物はキャリア媒体を含有し得る。一実施形態では、キャリア媒体は水溶液である。媒体は、場合により、細胞の正常な生理的構造および機能を保存する（特に、その環境のモル浸透圧濃度、ｐＨ、その形質膜および細胞内小器官の完全性および流動性を維持することに関して）さらなる成分を含有してもよい。
【００３４】
本発明のために適切なキャリアには、単独または組み合わせて従来使用されているもの、例えば、水、生理食塩水、デキストロース水、ラクトース、リンゲル液、クレブス哺乳類リンゲル液、Ｅａｒｌｅｓ液、Ｇｅｙ液、Ｓｉｍｍ液、タイロード液、ヒアルロナン、生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ロッケ液、ハンクス液、ＣｌａｒｋおよびＬｕｂｓ緩衝液、緩衝液、ＭＥＳ−ＮａＯＨ、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ＴＲＩＣＩＮＥ−ＮａＯＨ、ＥＰＰＳ−ＮａＯＨ、ＢＩＣＩＮＥ−ＮａＯＨ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ、グリシン−ＮａＯＨ、重炭酸ナトリウム−ＣＯ２、炭酸ナトリウム−重炭酸塩、カコジル酸ナトリウム、マレイン酸水素ナトリウム−ＮａＯＨから構成される緩衝液、培地（イーグル培地、ダルベッコ培地または緩衝液、マッコイ培地、クリック培地、エイムス培地、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０、ＲＰＭＩ−１６４０ＣＭＲＬ  １０６６、および１４１５  ＮＣＴＣ  １３５など）、市販の専門細胞株培地（例えば、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（登録商標）およびＭｅｇａｃｅｌｌ（登録商標））、または市販の凍結保存剤（Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）など）が含まれる。
【００３５】
従って、一実施形態では、キャリア媒体は、場合により以下の成分：
−  有機および／または無機塩、
−  緩衝液、
−  ＢＳＡまたはトランスフェリンなどのタンパク質、
−  インスリン様成長因子、インスリン、線維芽細胞様成長因子、ＢＭＰ−ＴＧＦ−βスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＴＧＦβ）および線維芽細胞成長因子ファミリー、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦを含む成長因子およびサイトカイン、
−  ＦＢＳ、新生子牛、他の全ての哺乳類種を含む動物の血清、
−  Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）などの凍結保存剤、
−  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、スクロースおよびその他の糖またはジメチルアセトアミドを含む凍結保護剤、
−  炭水化物、
−  ビタミン／補助因子、
−  ホルモン、
−  抗生物質、
−  接着因子、
−  アミノ酸、
−  デキストランのような血漿増量剤、
−  ヒトおよび他の哺乳類種の両方の血漿、
−  代用血漿、
−  ヒアルロナンおよび／またはヒアルロン酸（天然または架橋の両方）
のうちの１つ以上をさらに含み得る水性媒体である。
【００３６】
従って、一実施形態では、キャリア媒体は、水、生理食塩水、デキストロース水、ラクトース、緩衝液、ヒアルロナンおよびグリコール、生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、ロッケ液、ハンクス液、最小必須培地、最小必須培地α（αＭＥＭ）、またはＤＭＥＭから選択される水性媒体を含む。一実施形態では、キャリア媒体は、αＭＥＭを含む。代替の実施形態では、キャリア媒体はＤＭＥＭを含む。代替の実施形態では、キャリア媒体はＨＡＭＳ  １２を含む。
【００３７】
キャリア媒体は、さらに、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）のような専売製剤（ｐｒｏｐｒｉｅｔｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）などの凍結保存剤を含んでもよい。
【００３８】
代替の実施形態では、キャリア媒体は、水溶液としてのＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）のような専売製剤などの凍結保存剤を含み得る。この実施形態では、組成物は、水、生理食塩水、デキストロース水、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナン、生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ロッケ液、ハンクス液、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、またはＨＡＭＳ  Ｆ１２のようなキャリアを含有せず、代わりに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、スクロースおよびその他の糖またはジメチルアセトアミドなどの１つ以上の凍結保護剤と場合により組み合わせて、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）のような専売製剤などの凍結保存剤を含む。一例として、キャリア媒体は、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）およびＤＭＳＯを含むことができる、あるいはこれらからなることができる。
【００３９】
キャリア媒体は培地としての役割を果たすことができ、インビトロで細胞の栄養要求を満たして細胞が正常に分裂および機能することを可能にする有機および／または無機塩、炭水化物、ビタミン、アミノ酸および／または他の実体が補充され得る。一実施形態では、キャリア媒体はさらに、血清および／またはタンパク質サプリメントを含む。従って、培地は、ＢＳＡまたはトランスフェリンを含むがこれらに限定されないタンパク質が補充され得る。それに加えて、あるいはその代わりに、培地は、血清、例えば、成長因子を含有する胎児または新生児の血液、例えばウシ胎仔血清が補充されてもよい。これらの培地の調製方法および使用方法は、当業者によく知られている。適切な培地は、Ａｄａｍｓ  ＲＬＰ．Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ．１９８０年，８４−９７頁および２４６−２６０頁（ＩＳＢＮ  ０−４４４−８０１９９−５）、およびＤａｗｓｏｎ  ＲＭＣ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＤＣ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＷＨおよびＪｏｎｅｓ  ＫＭ，Ｄａｔａ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（第３版），Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００２年，４１７−４４８頁（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５５２９９−８）において見出すことができ、その内容は全体が援用される。
【００４０】
一実施形態では、キャリア媒体は、凍結保存培地としての役割を果たすことができる。細胞を凍結解凍するための凍結保存培地は、本明細書に記載される水性媒体を含む（単独で、または血清タンパク質サプリメントと組み合わせて）、一般に知られているキャリアおよび／または培地の使用を含む。あるいは、キャリア媒体は、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）などの専売製剤を含むまたは含有することができる。キャリア媒体の役割を果たすために、一般に、凍結解凍の過程で形成される氷晶による損傷から細胞膜および小器官を保護する化合物が添加される。
【００４１】
従って、さらなる実施形態では、キャリア媒体はさらに、１つ以上の凍結保護剤を含む。適切な薬剤または凍結保護剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、スクロースおよびその他の糖が含まれる。適切な薬剤の例は、Ｂｒｕｄｄｅｒ  Ｓ，Ｊａｉｓｗａｌ  Ｎ，Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ  Ｓ，国際公開第９７３９１０４号パンフレット、Ｆａｒｒａｎｔ，Ｊ．１９８０年  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｍ．Ｊ．Ａｓｈｗｏｏｄ−ＳｍｉｔｈおよびＪ．Ｆａｒｒａｎｔ編  Ｌｏｗ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｉｔｍａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｋｅｎｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１−１８頁、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｖら  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ，ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｒｏｚｅｎ−ｔｈａｗｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｐｒｏｄ．２００４年，１９：９４８−５３頁、Ｐｅｇｇ  ＤＥ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００７年  ３６８：３９−５７頁において見出すことができ、その内容は参照によって援用される。従って、さらなる実施形態では、キャリア媒体はさらに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、スクロースおよびその他の糖のうちの１つ以上から選択される薬剤または凍結保護剤を含む。代替的な凍結保護剤は、グリセロール、トレハロースおよび／またはスクロースの代用としてのジメチルアセトアミドを含む。さらなる実施形態では、キャリア媒体は、場合により成長因子および／または分化因子と組み合わせて、従来の凍結保護剤を含む。適切なキャリア媒体の例は、国際公開第９８３２３３３号パンフレット、国際公開第９７３９１０４号パンフレットまたは国際公開第１９９７／０３９１０４号パンフレットにおいて見出すことができる。
【００４２】
またさらなる実施形態では、キャリア媒体はさらに、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）などの専売製剤を含む。Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅは、非動物起源の成分を含有する凍結培地として、Ｌｏｎｚａ−ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒによって販売されている。キャリア媒体は、本明細書で議論される薬剤または保護剤、特に、ＤＭＳＯ、グリセロール、スクロースおよびその他の糖、さらに、特にＤＭＳＯが補充されてもよい。特定の実施形態では、キャリア媒体は、場合によりＤＭＳＯと組み合わせて、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）ＴＭＣＤＮＡＯ凍結培地を含む。さらなる実施形態では、キャリア媒体は、αＭＥＭ、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）ＴＭＣＤＮＡＯ凍結培地およびＤＭＳＯを含む。
【００４３】
本発明は、キャリア媒体が複数の要求を満たす可能性を意図および包含する。従って、キャリア媒体は、培地および凍結保存培地の両方の役割を果たすことができる。同じように、キャリア媒体は、凍結保存培地および薬学的に許容可能なキャリアの両方の役割を果たすことができる。
【００４４】
キャリア媒体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および／またはグリセロールを含み得る。一実施形態では、キャリア媒体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む。さらなる実施形態では、組成物は、１〜２０％のＤＭＳＯを含む。またさらなる実施形態では、組成物は、１〜１５％のＤＭＳＯ、５〜１５％のＤＭＳＯ、１〜１０％のＤＭＳＯ、５％のＤＭＳＯ、７．５％のＤＭＳＯ、１０％のＤＭＳＯ、１５％のＤＭＳＯ、または２０％のＤＭＳＯを含む。特定の実施形態では、ＤＭＳＯは、高純度グレードのＤＭＳＯである。
【００４５】
いくつかの細胞は、ＤＭＳＯと長期に接触することによって悪影響を受けることがある。これは、ＤＭＳＯを４℃で細胞懸濁液に添加し、解凍時に直ちにそれを除去することによって低減または排除することができる。あるいは、より低濃度のＤＭＳＯを使用することができる。
【００４６】
さらなる可能性として、キャリア媒体は、ＤＭＳＯの代わりにグリセロールを含み得る。従って、代替の実施形態では、キャリア媒体はグリセロールを含み得る。一実施形態では、グリセロールは、１〜３０％、１〜２０％、５〜２０％、１〜１５％、５〜１５％、１〜１０％または５〜１０％の濃度で存在する。
【００４７】
一実施形態では、媒体は、ＤＭＥＭ、ＨＥＴＡ−デンプンおよび／またはヒト血清成分および／または他の増量剤と組み合わせて、ＤＭＳＯまたはグリセロールを含有する。
【００４８】
一実施形態では、キャリア媒体は注射に相応しく、細胞の機能性に影響を与えない。一実施形態では、媒体は血清を含有する。さらなる実施形態では、媒体は無血清培地である。
【００４９】
一実施形態では、キャリア媒体は血清を含有し、一実施形態では、ヒト血清成分を含有する。実施形態では、キャリア媒体はさらに、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む。一実施形態では、組成物は、１〜５０％のＦＢＳを含む。さらなる実施形態では、組成物は、１〜２０％のＦＢＳ、１〜１０％のＦＢＳ、５％のＦＢＳ、７．５％のＦＢＳ、１０％のＦＢＳ、１５％のＦＢＳまたは２０％のＦＢＳを含む。あるいは適切な血清は、同じ可能な濃度で、ＢＳＡ、トランスフェリンおよび／または卵黄タンパク質を含む。
【００５０】
血清に基づく凍結保存培地の一例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、スクロースおよびその他の糖、またはジメチルアセトアミドなどの凍結保護剤ならびに血清（例えば、ＦＢＳなど）と一緒に、リンゲル液、生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ロッケ液、ハンクス液、αＭＥＭ、ＤＭＥＭまたはＨＡＭＳ  Ｆ１２などの水溶液を含むキャリア媒体であり得る。
【００５１】
従って、血清に基づく凍結保存培地の一例は、ＤＭＥＭまたはαＭＥＭ、ＤＭＳＯおよび血清（例えば、ウシ胎仔血清を用いる）を含むキャリア媒体であり得る。
【００５２】
またキャリア媒体は無血清および／または無タンパク質であってもよく、化学的に定義された培地であり得る。無血清培地の例としては、ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭＳｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭＤ−ＭＥＭ、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）−３４  ＳＦＭが挙げられる。
【００５３】
無血清培地の一例は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、トレハロース、スクロースおよびその他の糖またはジメチルアセトアミドなどの凍結保護剤、ならびにＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）のような専売製剤などの凍結保存培地と一緒に、リンゲル液、生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ロッケ液、ハンクス液、αＭＥＭ、ＤＭＥＭまたはＨＡＭＳ  Ｆ１２などの水溶液を含むキャリア媒体であり得る。
【００５４】
従って、血清ベースの凍結保存培地の一例は、αＭＥＭ、ＤＭＳＯおよびＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）、あるいは単にＤＭＳＯおよびＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）を含むキャリア媒体であり得る。
【００５５】
一実施形態では、キャリア媒体は、Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）を含む。Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）は無血清凍結培地であり、特に、無血清培地中で増殖させた細胞を凍結保存するために配合される。この無タンパク質の非動物成分培地は天然動物タンパク質を含まず、凍結貯蔵から戻したときに高い細胞生存率を維持する。さらなる実施形態では、キャリア媒体はＤＭＳＯと一緒にＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）を含み、ＤＭＳＯは場合により７．５または１５％である。あるいは、キャリア媒体は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）を含んでもよい。
【００５６】
一実施形態では、媒体は緩衝液を含有し得る。緩衝液は、ＤＭＥＭ、リン酸緩衝液、またはＣＭＦ−ＰＢＳを含む。一般に使用される生理緩衝液は全て本発明によって包含される。緩衝液の例は、文献、例えば、Ｌｅｌｏｎｇ  ＩＨおよびＲｅｂｅｌ  Ｇ．ｐＨ  ｄｒｉｆｔ  ｏｆ“ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｕｆｆｅｒｓ”  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉａ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９８年，３９：２０３−２１０頁、Ｊｏｈｎ  Ａ  Ｂｏｎｔｅｍｐｏ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ．ｉｎ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ，ＮＹ（ＩＳＢＮ：０−８２４７−９９８１−Ｘ）：９１−１０８頁において見出すことができ、その内容は参照によって本明細書に援用される。
【００５７】
媒体は、場合により、デキストラン、トレハロース、スクロースを含む糖類またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）をさらに含んでもよい。
【００５８】
一実施形態では、組成物は、前駆細胞と、多硫酸化多糖類と、
−  水、生理食塩水、デキストロース水、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナン、グリコール、生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ロッケ液、ハンクス液、αＭＥＭ、ＤＭＥＭ、またはＨＡＭＳ  Ｆ１２から選択される水性媒体、
−  Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）またはＣｒｙｏＳｔｏｒを含む凍結保存培地、そして
−  ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および／またはグリセロールから選択される凍結保護剤
を含むキャリア媒体とを含む。一実施形態では、凍結保存培地はＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）である。一実施形態では、水性媒体はαＭＥＭまたはＤＭＥＭである。一実施形態では、凍結保護剤はＤＭＳＯである。
【００５９】
一実施形態では、水性媒体は、１〜９９％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％で存在する。
【００６０】
一実施形態では、凍結保存培地は、１〜９９％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％で存在する。
【００６１】
一実施形態では、凍結保護剤は、１〜５０％、１〜３０％、１〜１５％、１〜１０％、１〜７．５％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１２．５％、１５％、１７．５％または２０％の量で存在する。
【００６２】
さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片と一緒に約５ｍＬのＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）ＴＭＣＤＮＡＯ凍結培地、７．５％のＤＭＳＯ、および５０％のαＭＥＭ中に凍結保存された前駆細胞が提供される。凍結保存時の細胞濃度は、５ｍＬの凍結培地中、９０×１０６細胞／クライオバッグ（ｃｒｙｏｂａｇ）〜１８０×１０６細胞／クライオバッグであり得る。
【００６３】
また別の実施形態では、キャリア媒体は、支持基質を含む。支持基質は、それ以外に、バイオ基質または生体足場と呼ぶこともできる。
【００６４】
別の実施形態では、本発明は、前駆細胞を多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片に暴露することを含む、前駆細胞の凍結保存を向上させる方法を提供する。
【００６５】
別の実施形態では、本発明は、前駆細胞の凍結保存を向上させるための、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片の使用を提供する。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を前駆細胞に暴露することを含む、前駆細胞の生存率を改善する方法を提供する。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、前駆細胞の生存率を改善するための、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片の使用を提供する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、凍結保存剤としての多硫酸化多糖類の使用を提供する。
【００６９】
さらなる実施形態では、本発明は、前駆細胞の凍結保存を向上させるための、本明細書において定義されるような組成物の使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるような組成物を凍結（ｃｒｙｏｆｒｅｅｚｅ）し、その後、組成物を解凍することを含む、前駆細胞の生存率を改善する方法を提供する。
【００７０】
従って、初めて、低温貯蔵培地への多硫酸化多糖類の添加は前駆細胞に悪影響を与えず、その生存率に有害な影響を与えないことが示された。実際、低温貯蔵培地への多硫酸化多糖類の添加は、前駆細胞の生存率を高めることが示された。
【００７１】
さらに、前駆細胞への多硫酸化多糖類の添加は、本質的に前駆細胞の生存率を維持または改善することが示された。従って、さらなる実施形態では、前駆細胞の生存率を維持または改善するための、多硫酸化多糖類の使用が提供されている。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類を前駆細胞に接触させることを含む、前駆細胞の生存率を維持または改善する方法が提供されている。
【００７２】
また、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、前駆細胞の増殖を調節できることも分かった。
【００７３】
従って、別の実施形態では、本発明は、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を前駆細胞に暴露することを含む、前駆細胞の増殖を調節する方法を提供する。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、前駆細胞の増殖を調節するための、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片の使用を提供する。
【００７５】
さらなる実施形態では、本発明は、増殖を増大させるための、本明細書において定義されるような組成物の使用を提供する。従って、別の実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるような組成物を用いることを含む、前駆細胞の増殖を調節する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、前駆細胞の増殖を調節するための、本明細書において定義されるような組成物の使用を提供する。
【００７６】
一実施形態では、増殖は増大または上方調節される。
【００７７】
従って、初めて、前駆細胞と共に多硫酸化多糖類を使用すると、前駆細胞の増殖を改善できることが示された。多硫酸化多糖類は、濃度依存的に前駆細胞の増殖を刺激する。従って、細胞を増殖させることが所望される用途において多硫酸化多糖類を使用することができる。例えば、前駆細胞のインビトロ増殖は、生体工学分野の用途のためのコロニーの拡大に有用であろう。一例として、生体足場は前駆細胞のコロニーにより浸透され、多硫酸化多糖類を含有する３７℃の培地によって灌流され得る。これは増殖を促進し、さらに足場を移植および充填することにより、より機能的な代用組織を提供し得る。さらなる例として、予備成形された（管状または半球状）生体足場に自己または同種異系の前駆細胞が播種され、多硫酸化多糖類を含有する媒体によって灌流されると、最終的に、これらの軟骨を欠損した宿主に移植するための気管または関節表面を生じさせ得る。これらの使用に関するさらなる情報は、Ｃｈｅｎ  ＦＨおよびＴｕａｎ  ＲＳ．Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｈｅｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ．２００８年；０：２２３−２３９頁において見出すことができる。
【００７８】
インビボでの多硫酸化多糖類の増殖刺激は、大きい欠損（関節軟骨などにおける）または生存可能な内在性常在細胞がない区画（例えば、椎間板の中心）への移植を促進し、それにより欠損の修復および再構成に必要とされる時間を短縮するために有利であろう。前駆細胞は抗炎症性サイトカインおよび免疫抑制因子の豊富な供給源でもあるので（例えば、Ａｇｇａｒｗａｌ  ＳおよびＰｉｔｔｅｎｇｅｒ  Ａ，Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００５年；１０５：１８１５−１８２２頁、Ｔｙｎｄａｌｅ  Ａら，Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｈｅｌｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２００５年１０月３１日．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．２００７年；９：３０１−１５頁、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  Ｃら，Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．２００８年；２２：２６９  ２８４頁を参照）、注入後の炎症または抗原反応部位におけるその増殖は、これらの望ましくない細胞過程の抑制の可能性を増大し得る。
【００７９】
また、多硫酸化多糖類は前駆細胞の分化を調節できることも分かった。分化は、上方調節または下方調節することができる。
【００８０】
一実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を前駆細胞に暴露することによって前駆細胞の分化を調節する方法が提供されている。
【００８１】
さらなる実施形態では、前駆細胞の分化を調節するための、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片の使用が提供されている。
【００８２】
本発明は、前駆細胞の分化を調節する。本発明の細胞は軟骨細胞、骨芽細胞、および脂肪細胞系譜に分化することができ、一実施形態では、骨、軟骨、脂肪、筋肉、腱、および間質を含む、異なる系譜の細胞型に分化することができる。
【００８３】
特に、本発明の一実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、軟骨細胞への分化を調節することができる。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、骨芽細胞への分化を調節することができる。またさらなる実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、脂肪細胞への分化を調節することができる。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、線維軟骨細胞への分化を調節することができる。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、腱細胞への分化を調節することができる。さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、心筋細胞への分化を調節することができる。
【００８４】
特に、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片は、軟骨形成を調節および誘発できることが分かった。
【００８５】
さらなる実施形態では、本発明は、前駆細胞における軟骨細胞表現型の分化および生存を支持する軟骨形成を調節する。そのため、一態様では、本発明は、軟骨細胞または線維軟骨細胞の形成に関する。
【００８６】
さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類は分化を上方調節する。代替の実施形態では、多硫酸化多糖類は分化を下方調節する。
【００８７】
本発明の一実施形態では、多硫酸化多糖類を前駆細胞に適用することを含む、前駆細胞における軟骨形成を調節する方法が提供されている。
【００８８】
さらなる実施形態では、前駆細胞における軟骨形成を調節するための、多硫酸化多糖類の使用が提供されている。
【００８９】
さらなる実施形態では、前駆細胞における骨形成を下方調節するための、多硫酸化多糖類の使用が提供されている。
【００９０】
さらなる実施形態では、前駆細胞による骨形成を防止するための、多硫酸化多糖類の使用が提供されている。この方法または使用は、骨の産生が宿主にとって有害であり得る場合、例えば、正常機能のために柔軟性および動作を必要とする軟組織部位（例えば、筋肉（心臓）、間質、支持結合組織など）、または骨が神経繊維／根または血管を突き刺しまたは捕捉し、パラセシス（ｐａｒａｔｈｅｓｉｓ）、麻痺、虚血および潜在的な不可逆的組織傷害をもたらし得る部位などにおいて、用途を見出すことができる。
【００９１】
さらなる実施形態では、細胞を処置して軟骨形成を受けさせる方法が提供されており、細胞を刺激して分化させる時間および条件において、前駆細胞を有効量の多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片と接触させることを含む。
【００９２】
前駆細胞
「前駆細胞」という用語は、任意の多分化能細胞を包含することが意図される。従って、前駆細胞という用語は、成体および胚幹細胞を包含する。
【００９３】
一実施形態では、前駆細胞は間葉系前駆細胞である。
【００９４】
さらなる実施形態では、前駆細胞は、内在性または外来性の胚性または成体の間葉系細胞または間葉系前駆細胞である。さらなる実施形態では、前駆細胞は多分化能間質細胞である。さらなる実施形態では、細胞は成体未分化間葉系細胞である。
【００９５】
さらなる実施形態では、前駆細胞は軟骨前駆細胞である。
【００９６】
一実施形態では、前駆細胞は骨髄に由来する。あるいは、前駆細胞は、軟骨、滑膜組織、筋肉、脂肪組織、皮膚、臍帯、歯髄、または他の利用可能な源に由来する。
【００９７】
一実施形態では、前駆細胞は、内在性因子による分化から抑圧された結合組織細胞などの体細胞である。
【００９８】
さらなる実施形態では、前駆細胞は、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ、または均質（ｈｏｍｏｇｅｏｎｏｕｓ）Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞、またはＳｔｒｏ−１ｂｒｉ子孫細胞が濃縮された細胞集団である。
【００９９】
多硫酸化多糖類
多硫酸化多糖類ファミリーは、ヘパリンおよびペントサン多硫酸により例示されるように、１つ以上の硫酸エステル基が共有結合している２つ以上の糖環または炭水化物構造を含有する、天然に存在するかまたは半合成／合成の任意の多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な断片であると考えることができる。
【０１００】
一実施形態によると、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な断片は、天然に存在する高分子量ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、ペントサン多硫酸、コンドロイチン多硫酸、キトサン多硫酸、デルマタン多硫酸スロデキシド、デキストラン多硫酸、多硫酸化インスリン、硫酸化ラクトビオン酸アミド、硫酸化ビス−アルドン酸アミド、スクロース八硫酸、フコイダン−１、フコイダン−２、硫酸化β−シクロデキストリン、硫酸化γ−シクロデキストリンおよび小さい硫酸化化合物（イノシトール六硫酸を含むがこれに限定されない）から選択することができるが、これらに限定されない。
【０１０１】
さらなる実施形態では、多硫酸化多糖類は、ペントサン多硫酸、コンドロイチン多硫酸、キトサン多硫酸、デキストラン多硫酸およびヘパリン（高分子量および低分子量）を含む。
【０１０２】
またさらなる実施形態では、多硫酸化多糖類はペントサン多硫酸、デキストラン多硫酸およびヘパリンである。
【０１０３】
またさらなる実施形態では、多硫酸化多糖類は、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸のナトリウム塩（ＮａＰＰＳ）、ペントサン多硫酸のマグネシウム塩（ＭｇＰＰＳ）、および／またはペントサン多硫酸のカルシウム塩（ＣａＰＰＳ）である。
【０１０４】
１つの特定の多硫酸化多糖類は、ペントサン多硫酸（ＰＰＳ）またはそのナトリウム塩である。ペントサン多硫酸は前駆細胞の生存率を改善し、前駆細胞の凍結保存を向上させ、前駆細胞の増殖を調節し、そして／あるいは前駆細胞の分化を調節することが示された。ペントサン多硫酸は分化を上方調節する、特に、軟骨形成を誘発することが示された。
【０１０５】
代替の多硫酸化多糖類はデキストラン多硫酸である。デキストラン多硫酸は分化を下方調節または抑圧する、特に、軟骨形成を下方調節または抑圧することが示された。
【０１０６】
使用
本発明の前駆細胞は、軟骨細胞、線維軟骨細胞、骨芽細胞および脂肪細胞を含む多数の細胞型に分化することができる。
【０１０７】
前駆細胞は軟骨細胞または線維軟骨細胞に分化することができるので、これらの細胞は、細胞外基質の産生において有用である。細胞外基質は、このような処置を必要としている被験者における結合組織欠損への移植に適切であり得る。
【０１０８】
本発明は、前駆細胞と組み合わせて多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片を投与することによって、軟骨の修復、回復または基質新生を誘発し、その異化反応を減弱するために使用することができる。
【０１０９】
さらなる実施形態では、本発明の組成物は、免疫抑制剤、抗異化剤（ａｎｔｉｃａｔａｂｏｌｉｃ）または抗炎症剤としても使用することができる。一例として、本発明の組成物は、関節リュウマチの処置において使用され得る。
【０１１０】
本明細書で議論される方法は、インビボまたはインビトロで使用することができる。インビボでは、挿入された前駆細胞は、特に、軟骨を原位置で再構築することができる。さらに、関節に常在する前駆細胞も軟骨を原位置で再構築するように刺激され、従って、有効な指向性の処置を形成することができる。
【０１１１】
インビトロでは、本発明はバイオ基質内での軟骨の産生を可能にし、これは次に、患者に移植することができる。これは、損傷されているかあるいは遺伝的異常に起因し外科的矯正を必要とする、軟骨／線維軟骨組織、またはこの過程から利益を得ることができる任意の他の組織の置換のために、軟骨を産生して、連接の（ａｒｔｉｃｕｌａｔｉｎｇ）関節表面を部分的または完全に置換するために使用され得る。
【０１１２】
また本発明は、現在利用可能な医学的または外科的な処置から利益を受けることができない患者についても使用を見出す。例えば、外傷により生じる急性傷害に苦しんでいる多くのスポーツ選手または個人は、症候性である軟骨／線維軟骨欠損を有し得る。本発明は、新しい軟骨の成長を刺激して、欠損した組織を置換するために使用され得る方法を提供する。これは、原位置で関節内の前駆細胞の成長を刺激することによってインビボで、または欠損に適合するように成形された後に欠損に挿入される適切な生体足場によってインビトロで、またはインビボ法およびインビトロ法の両方によって、行うことができる。あるいは、末梢関節および脊椎の変形性関節症などの確立した関節変形がある高齢患者に使用することができ、ここで、本発明は、新しい軟骨の成長を刺激して、欠損した組織を置換し、骨棘の進行を防止し、これらの障害の症状の原因であることが多い炎症を軽減するために使用され得る。
【０１１３】
一実施形態では、本発明は、凍結保存剤および分化を調節可能な薬剤の両方の機能を果たすことができる化合物を同定した。さらなる実施形態では、本発明は、凍結保存剤および増殖を調節可能な薬剤の両方の機能を果たすことができる化合物を同定した。さらなる実施形態では、本発明は、増殖を調節し、そして分化を調節することができる化合物を同定した。さらなる実施形態では、本発明は、凍結保存剤、増殖を調節可能な薬剤および増殖を調節可能な薬剤の機能を果たすことができる化合物を同定した。このような多用途の化合物は、前駆細胞に関連してこれまでは見出されていない。
【０１１４】
本発明は、独立してまたは互いに組み合わせて、前駆細胞の凍結保存を向上させ、その細胞増殖を調節し、そしてあるいは、その分化を調節することができる分子のファミリーまたはこれらの生物学的に活性な断片を同定し、従って、これらの分子は、治療的処置において前駆細胞と組み合わせて使用することができる。
【０１１５】
特に、本発明は、前駆細胞が軟骨細胞／線維芽細胞に分化できるようにし、それにより、軟骨または線維軟骨の形成を可能にする。従って、前駆細胞および多硫酸化多糖類の使用は、変性疾患を処置し、軟骨／線維軟骨欠損を処置し、そして／あるいは変性疾患および軟骨欠損の進行を防止または最小限にするために用いることができる。
【０１１６】
本発明は、新規の組成物を同定した。この組成物は治療的使用を有し、インビボまたはインビトロにおいて有利に使用することができる。一実施形態では、方法はインビボで実行される。あるいは、方法はインビトロで実行される。
【０１１７】
従って、本発明の一実施形態では、薬剤として使用するために本明細書において記載されるような組成物が提供されている。
【０１１８】
本発明のさらなる実施形態では、筋骨格系の疾患（関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、および椎間板変性症（ＤＤ）を含む）、変性疾患を含む、軟骨の破損または減少によって影響を受ける任意の疾患の処置において使用するための本明細書において記載されるような組成物と、軟骨の修復、回復または基質新生を誘発する方法とが提供されている。
【０１１９】
本発明のさらなる実施形態では、筋骨格系の疾患（関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、および椎間板変性症（ＤＤ）を含む）、変性疾患を含む、軟骨の破損または減少によって影響を受ける任意の疾患の処置において使用するための本明細書において記載されるような組成物と、軟骨の修復、回復または基質新生を誘発する方法とが提供されている。
【０１２０】
本発明のさらなる実施形態では、骨形成を介する前駆細胞の分化が望まれない任意の疾患の処置において使用するために本明細書において記載されるような組成物が提供されている。例えば、骨の形成は、椎間板内注入などの軟組織の修復のためには望まれないことが多い。椎間板から脊柱管または隣接器官（例えば、食道）への細胞の漏出は悲惨であり得る。これの一例は、ＢＭＰ−２が椎間板空間に配置されて脊椎固定（新しい骨）を促進する場合に見られた。組換え骨形成タンパク質の使用は、気道および神経の圧迫を生じる椎間板空間に隣接する異所性骨形成のために、生命にかかわる合併症をもたらすことが分かった。
【０１２１】
本発明のさらなる実施形態では、脂肪組織の破損または減少によって影響を受ける疾患の処置において使用するために本明細書において記載されるような組成物が提供されている。
【０１２２】
本発明のさらなる実施形態では、筋骨格系の疾患（関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、および椎間板変性症（ＤＤ）を含む）、変性疾患を含む、軟骨の破損または減少によって影響を受ける任意の疾患の治療のための薬剤を製造するための本明細書において記載されるような組成物の使用と、軟骨の修復、回復または基質新生を誘発する方法とが提供されている。
【０１２３】
従って、本発明の一実施形態によると、筋骨格系の疾患（関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、および椎間板変性症（ＤＤ）を含む）、変性疾患などの軟骨の破損または減少によって影響を受ける任意の疾患を処置、軽減、低減または予防する方法と、治療的に有効な量の本明細書において定義されるような組成物を投与することを含む、軟骨の修復、回復または基質新生を誘発する方法とが提供されている。
【０１２４】
このような用途の例は、軟骨または椎間板の病変部を有する個人の関節内に、またはその他のあまり接近しやすくない部位のためには全身的に、本発明の組成物を注入することであり、調製物が組織および細胞を灌流できるようにすることによって、その独特の生物学的効果を発揮し得るようにする。用途は、臨床的に定義された疾患（多くの場合、ＯＡまたは関連の障害）を有さないかもしれないが、例えばスポーツまたは仕事関連の活動による関節組織への外傷を受けている個人を処置することを含み得る。
【０１２５】
また本発明の方法および使用は、関節鏡下手術または開放手術（軟骨または半月板の切除／壊死組織切除が必要であった場合）の後の予防方法としての機能も果たし得る。このような手術後の患者は、一般に、時間と共に進行して医学的処置を必要とする症候性ＯＡを示すことが十分に確立されている。軟骨の劣化を減少させることによって、炎症を促進する抗原の産生の低下のために症状も改善されることがあり得る。
【０１２６】
従って、患者に導入された前駆細胞の分化および／または細胞増殖を調節するための本明細書で議論される本発明の組成物の使用は、軟骨の破損または減少によって影響を受ける任意の疾患を処置、軽減、低減または予防するために用いることができる。特定の疾患には、筋骨格系の疾患（関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、および椎間板変性症（ＤＤ）を含む）、変性疾患、および軟骨の修復、回復または基質新生の誘発方法が含まれる。
【０１２７】
一実施形態では、組成物は静脈内投与される。またさらなる実施形態によると、組成物は全身的に投与される。またさらなる実施形態によると、組成物は関節内に投与される。またさらなる実施形態によると、組成物は椎間板内に投与される。またさらなる実施形態によると、組成物は全身的に投与される。
【０１２８】
一実施形態は、前駆細胞と組み合わせて多硫酸化多糖類を患者の関節に注入する方法である。多硫酸化多糖類は、前駆細胞の分化および／または増殖の調節を助ける。
【０１２９】
さらに、本発明の多硫酸化多糖類は、分化した細胞におけるヒアルロナンまたはヒアルロン酸（ＨＡ）の産生を産生、上方調節または刺激できることも分かった。ヒアルロン酸（ＨＡ）は、動物または細胞において、すなわちインビボで動物において、またはインビトロで細胞において産生され得る。
【０１３０】
この予期せぬ知見は、本発明の組成物が、通常の摩耗および断裂、変性疾患または他の急性外傷のいずれかによる関節（特に、滑液）におけるＨＡの損失を置換するために使用され得ることを意味する。滑液が変性すると、関節を保護し、そして潤滑させるその能力が低下する。これは関節をさらに劣化させ、さらなる損傷を引き起こす自己抗原の産生も刺激し得る。過去には、この問題を克服するかまたは少なくとも軽減する１つの方法は、滑液を置換することであった。
【０１３１】
しかしながら、本発明は、滑液自体を置換することを必要とせずにヒアルロナンすなわちヒアルロン酸（ＨＡ）の産生を刺激する手段を提供する。本発明の組成物は前駆細胞と接触させることができ、前駆細胞は次に間葉系細胞（例えば、軟骨細胞または線維芽細胞）に分化して、ＨＡの産生を増大させる。ＨＡは原位置で形成され、そして滑液におけるＨＡの損失を置換し、変性疾患または組織の劣化によって生じる損傷を処置、低減、または少なくとも軽減するために使用することができる。
【０１３２】
従ってさらなる実施形態によると、本発明は、ヒアルロナン（ＨＡ）の産生を産生、上方調節または刺激する方法に関し、本明細書において定義されるような組成物の投与を含む。
【０１３３】
本発明の一実施形態では、組成物、方法および使用は、関節炎または他の変性疾患を処置するために用いることができる。しかしながら、代替の実施形態では、本発明は、関節炎または他の変性疾患を処置するための方法を除外する。特に、１つの態様では、本発明は、関節炎または他の変性疾患を処置するために、前駆細胞と組み合わせて多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片の使用を含む。
【０１３４】
従って、本発明の一実施形態では、筋骨格系の疾患（関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、および椎間板変性症（ＤＤ）を含む）、変性疾患、滑膜関節の変形性関節症、眼科、手術後の腹部の癒着の予防、皮膚の処置、ならびに細胞外基質の機能の修復および回復を受けている患者を処置する方法、または軟骨の修復、回復または基質新生を誘発するための方法が提供されており、本明細書において定義されるような組成物を投与して、前駆細胞の分化および／または増殖を調節することを含む。
【０１３５】
患者または被験者は、ヒトまたは動物の患者であり得る。一実施形態では、患者は、ヒト、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、雌ウシ、または霊長類を含む哺乳類である。一実施形態では、患者はヒトである。患者は、変性疾患および／または軟骨欠損を患っていてもよい。患者は運動選手でもよいし、または関節損傷を引き起こす外傷を受けていてもよい。
【０１３６】
本発明は、多硫酸化多糖類および前駆細胞を含む処置方法を包含する。また本発明は、薬剤として使用するための多硫酸化多糖類および前駆細胞、本明細書で議論されるような処置のための薬剤の製造における多硫酸化多糖類および前駆細胞の使用、ならびに多硫酸化多糖類および前駆細胞を含有する組成物および製剤も包含する。
【０１３７】
併用療法
また本発明は、分化および細胞増殖を調節、特に、軟骨形成および細胞増殖を調節することができるポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片も初めて同定した。ポリペプチドは、αＩＸコラーゲンの非コラーゲン性ＮＣ４ドメインまたはその生物学的に活性な分子断片（以下、ＮＣ４）である。「生物学的に活性な断片」という用語は、「生物学的に活性な分子断片」という用語と同義である。
【０１３８】
驚くことに、本発明によって、２つの別々のファミリーは軟骨形成および細胞増殖の調節を独立的に発揮できるが、一緒に組み合わせられるとこれらは相乗的に作用して、その個々の効果を増大させるだけでなく、作用のより大きい特異性を提供することもできることが発見された。
【０１３９】
軟骨形成を調節することによって、特に軟骨および椎間板を再構築し、関節の劣化を予防し、無血管結合組織の修復を向上することが可能なので、これらの予想外の所見は、多数の新しい用途においてＮＣ４と組み合わせて多硫酸化多糖類を使用する可能性を開く。本発明よりも前は、多硫酸化多糖類およびＮＣ４の組み合わせが、軟骨形成および細胞増殖を調節し得ることは知られておらず、その組み合わせが相乗効果を有し得ることは確実に未知であった。
【０１４０】
従って、さらなる実施形態では、本発明は、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片およびＮＣ４すなわちその生物学的に活性な分子断片と一緒に前駆細胞を含む組成物を提供する。
【０１４１】
さらなる実施形態では、組成物はさらに、キャリア媒体、培地、凍結保存培地および／または薬学的に許容可能なキャリアを含む。
【０１４２】
従って、さらなる実施形態では、本発明は、キャリア媒体と一緒に、前駆細胞、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片、およびＮＣ４またはその生物学的に活性な分子断片を含む組成物を提供する。
【０１４３】
キャリア媒体は、培地、凍結保存培地または薬学的に許容可能なキャリアであり得る。
【０１４４】
前駆細胞および多硫酸化多糖類に関する本発明の組成物への言及はどれも、濃度、細胞の数および／または種類、ならびに更なる任意成分の量を含め、前駆細胞、多硫酸化多糖類およびＮＣ４を含有する組成物にも関する。さらに、本明細書において定義されるような組成物の方法および使用は、多硫酸化多糖類およびＮＣ４の両方を含む組成物にも関する。
【０１４５】
従って、本発明のさらなる実施形態によると、軟骨形成および／または細胞増殖を調節する方法が提供されており、前駆細胞、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片およびＮＣ４またはその生物学的に活性な分子断片を含む組成物を投与することを含む。
【０１４６】
従って、別の実施形態では、本発明は、前駆細胞の増殖を調節する方法を提供し、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片およびＮＣ４またはその生物学的に活性な分子断片を前駆細胞に暴露することを含む。
【０１４７】
従って、別の実施形態では、本発明は、多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な分子断片およびＮＣ４またはその生物学的に活性な分子断片を前駆細胞に暴露することによって、前駆細胞の分化を調節する方法を提供する。
【０１４８】
一実施形態では、ＮＣ４の生物学的に活性な分子断片は、配列番号１の断片に対して少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１４９】
さらなる実施形態では、ＮＣ４の生物学的に活性な分子断片は、配列番号２の断片に対して少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１５０】
またさらなる実施形態では、ＮＣ４の生物学的に活性な分子断片は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４の断片に対して少なくとも６５％のアミノ酸同一性を有する。
【０１５１】
さらなる実施形態では、ＮＣ４の生物学的に活性な分子断片は、上述の断片に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸同一性を有する。
【０１５２】
また、併用療法の一部として本発明の組成物を投与または使用することも可能である。例えば、本発明の多糖類は、１つ以上の他の化合物と組み合わせて投与されてもよい。これらの化合物は、構造修飾変形性関節症薬（ＳＭＯＡＤ）であってもよい。
【０１５３】
本発明は、本明細書で議論される疾患の処置で使用するための併用療法にまで及ぶ。特に、一実施例では、本発明は、種々の変性状態の処置において使用するためのさらなる薬剤と組み合わせた多硫酸化多糖類の使用にまで及ぶ。これらの薬剤が、同じ時点または異なる時点に投与され得ることは理解されるべきである。従って、併用療法は、単一の製剤または複数の製剤のいずれかで同じ時点または異なる時点に投与される、同時に投与される活性剤を含むことができる。同様に、併用療法は、異なる時間に異なる製剤で投与される活性剤を含むことができる。製剤は順次投与され得、数時間、数日、数週間および数ヶ月を含む期間によって隔てられてもよい。
【０１５４】
また本発明は、１つ以上の成長因子と組み合わせた、本明細書で議論されるような多硫酸化多糖類の使用にも及ぶ。本発明はさらに、１つ以上の成長因子と組み合わせた、本明細書で開示されるような方法、使用、製剤および／または組成物に及ぶ。可能性のある成長因子としては、インスリン様成長因子、インスリン、線維芽細胞様成長因子、ＢＭＰ−ＴＧＦ−βスーパーファミリー（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＴＧＦβ）、および線維芽細胞成長因子ファミリー、ＩＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】正常ヒトＭＳＣの凍結／解凍生存率に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の効果。ヒトＭＳＣを３７℃の水浴中で急速に解凍し、ＨＨＦ（５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清を含有するＨＢＳＳ）で２回洗浄した。その後、複数のＴ−７５フラスコに８，０００細胞／ｃｍ２で細胞を播種した。細胞を７０〜８０％コンフルエントまで成長させ、トリプシン処理し、指示される濃度のＰＰＳを補充したＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）／７．５％ＤＭＳＯ中、５０×１０６／ｍｌの細胞濃度で凍結保存した。時点＝０、３０、６０、９０および１２０分において、アンプルを液体窒素貯蔵所から取り出し、急速に解凍し、緩やかに混合し、１０ｕｌのサンプルを取り出した。それぞれの細胞サンプルに、２９０ｕｌのトリパンブルーを添加し、細胞数／生存率試験を実施した。ＰＰＳは細胞生存率に悪影響を与えなかった。
【図２】凍結−解凍サイクルを受けた後、７．５％のＤＭＳＯおよび種々の濃度のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）を含有する低温貯蔵培地中に懸濁された、異なる数のマウスＡＴＤＣ５前駆細胞の生存率を示す棒グラフである。細胞生存率は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼＭＴＴアッセイを用いて決定した。
【図３】図１に記載されるような液体窒素中の凍結保存および急速解凍の後、前駆細胞生存率に対する異なる濃度のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の効果。細胞生存率は、ミトコンドリアデヒドロゲナーゼＭＴＴアッセイを用いて決定した。図示されるデータ＝平均±ＳＤ。＊＝ｐ＜０．０５（対照値に対して）。
【図４】ヒト前駆細胞増殖に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の効果。指示される濃度のＰＰＳが補充された成長培地中で、２４ウェルプレートにおいて初代ヒト前駆細胞を培養した。種々の時間間隔（１、３、６日）で成長培地を取り出し、３７℃／５％ＣＯ２で２時間、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を含有するフェノールレッド不含培地で置き換えた。ＷＳＴ−１は、生存細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって切断され、４５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて検出可能なホルマザン色素を生じる。各時点の４５０ｎｍにおける吸光度が、ＰＰＳの全ての濃度に対して示される。１μｇ／ｍｌを超えるＰＰＳの濃度において、統計的に有意な増殖の増大が６日目に観察された（＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。
【図５】４日間のマイクロマス培養の後に巨大分子ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取込みによって決定される、ヒト前駆細胞によるＤＮＡ合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフである。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５（対照に対して）。
【図６】アポトーシス剤で処置されたヒト前駆細胞に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の効果。ヒト前駆細胞を、指示される濃度のＰＰＳが補充された無血清培地にプレーティングした。３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４および３０，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γの組み合わせの添加によって前駆細胞のアポトーシスを誘発させた。５日間の培養の後、トリプシン処理によって細胞を採取し、アネキシンＶ染色によって生存率を評価した。前駆細胞が１ｕｇ／ｍｌを超えるＰＰＳの濃度で培養される場合には、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４誘発アポトーシス（アネキシンＶ陽性細胞）の２倍の減少が観察される。
【図７】ヒト前駆細胞の分化に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の効果：石灰化アッセイ。非骨誘導性成長培地（培地対照）中、または指示される濃度のＰＰＳの存在下、骨誘導性条件（１０％のＦＣＳ、１００マイクロモルのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩、デキサメタゾン１０−７Ｍおよび３ｍＭの無機リン酸塩が補充されたαＭＥＭ）下で、９６ウェルプレートにおいて初代ヒト前駆細胞を培養した。２８日目に、クレゾールフタレインコンプレキソン法を用いて、ウェルごとの酸可溶化カルシウムの濃度を決定した。（Ａ）蛍光発生ＤＮＡ染色（Ｈｏｅｓｈｓｔ  ３３２５８）を用いて、ウェルごとのＤＮＡの総量の評価に続いて、ウェルごとのＤＮＡ１マイクログラムあたりの酸可溶化カルシウムの濃度を決定した。１ｕｇ／ｍｌおよび１００ｕｇ／ｍｌのＰＰＳの濃度を使用した場合に、石灰化基質形成の統計的に有意な減少が観察された（＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。（Ｂ）×２０倍率の石灰化培養物の位相差顕微鏡写真。
【図８】ヒト前駆細胞の分化：脂肪細胞の形成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の効果。非脂肪生成成長培地（培地対照）中、または指示される濃度のＰＰＳの存在下、脂肪生成条件（０．５ｍＭのメチルイソブチルメチルキサンチン、０．５μＭのヒドロコルチゾン、および６０μＭのインドメタシン）下で、９６ウェルプレートにおいて初代前駆細胞を培養した。２８日目に、親油性色素Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏを用いて、脂質を含んだ脂肪細胞の存在を決定した。蛍光発生ＤＮＡ染色（Ｈｏｅｓｈｓｔ  ３３２５８）を用いて、ウェルごとのＤＮＡの総量の評価に続いて、ウェルごとにＤＮＡ１μｇあたりの可溶化脂質の相対量を決定した。（Ａ）１ｕｇ／ｍｌを超えるＰＰＳの濃度で脂肪細胞の数の統計的に有意な増大が観察された（＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。（Ａ）×２０倍率のＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ標識化脂肪細胞の位相差顕微鏡写真。
【図９】単層培養で成長させた場合の、マウス前駆細胞（前駆細胞Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）のプロテオグリカン（ＰＧ）の生合成およびＤＮＡ含量に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果。図示されるデータ＝平均±ＳＤ。
【図１０】巨大分子ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取込みによって決定される、単層培養で２日間成長させたマウス前駆細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）によるＤＮＡ合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフ。
【図１１】ヒト前駆細胞の２日間の単層培養の後にＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定される、プロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ＤＮＡ含量に基準化された１分あたりの減衰（ＤＰＭ）としての３５Ｓ−ＧＡＧ放射活性で表した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５、＊＊＊＝ｐ＜０．０００５。
【図１２】マウス前駆細胞（ＡＤＴＣ−５）の６日間のペレット培養において、ＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定される、プロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフ。＊＝ｐ＜０．０５（対照に対して）。
【図１３】維持培地（ＭＭ）中で種々の濃度のＰＰＳと共にインキュベートされた６日間のペレット培養におけるＩＩ型コラーゲンおよびＳｏｘ−９のＡＴＤＣ５細胞による遺伝子発現。
【図１４】マウス前駆細胞（ＡＤＴＣ−５）の６日間のペレット培養において、ＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定される、プロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対するヘパリンの濃度依存性効果の棒グラフ。ヘパリンは、この細胞株において、濃度範囲１．２５〜２０ｕｇ／ｍＬにわたって軟骨形成効果を示さない。
【図１５】マウス前駆細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１−２）の７日間のペレット培養において、ＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定される、プロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果を示す棒グラフ。
【図１６】６日間および９日間のマイクロマス培養におけるマウス前駆細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１−２）によるプロテオグリカン合成に対するＰＰＳの濃度依存性効果を示す棒グラフ。ＰＰＳは培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％のＦＣＳ）中に含まれ、４８時間毎に取り換えた。培養終了の２４時間前に３５Ｓ−ＳＯ４を添加した。合成はＤＮＡ含量に対して基準化した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５（対照に対して）。
【図１７】５日間のマイクロマス培養におけるヒト前駆細胞によるプロテオグリカン合成に対するＰＰＳの濃度依存性効果を示す棒グラフ。データは、３５Ｓ−ＧＡＧ放射活性として、対照（１００％とする）のパーセンテージで示される。＊Ｐ＜０．０５（対照に対して）。
【図１８】Ｂに示される免疫染色されたマイクロマス培養物の走査およびデジタル分析によって決定される、１０日間のマイクロマス培養におけるヒト前駆細胞によるＩＩ型コラーゲン産生のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）濃度依存性刺激を示す棒グラフ（詳細は本文を参照）。
【図１９】５日間のマイクロマス培養におけるヒト前駆細胞によるプロテオグリカン合成に対する、（Ａ）ヒアルロナン（ＳｕｐａｒｔｚＴＭ）および（Ｂ）デキストラン多硫酸の濃度依存性効果を示す棒グラフ。データは、３５Ｓ−ＧＡＧ放射活性として対照（１００％とする）のパーセンテージで、またはＤＰＭ／ｕｇＤＮＡとして示される。＊Ｐ＜０．０５（対照に対して）。
【図２０Ａ】指示される濃度のＰＰＳおよび／またはヒアルロン酸（ＳｕｐａｒｔｚＴＭ）が補充された成長培地における初代ヒト前駆細胞の培養の結果を示す。種々の時間間隔（３日および５日）で成長培地を取り出し、３７℃／５％ＣＯ２で２時間、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を含有するフェノールレッド不含培地で置き換えた。各時点の４５０ｎｍにおける吸光度が、ＰＰＳおよびＨＡの全ての濃度に対して示される。この実験は、ＨＡおよびＰＰＳが、前駆細胞増殖を刺激するために相乗的に作用しないことを示す。
【図２０Ｂ】指示される濃度のＰＰＳおよび／またはヒアルロン酸（ＳｕｐａｒｔｚＴＭ）が補充された成長培地における初代ヒト前駆細胞の培養の結果を示す。種々の時間間隔（３日および５日）で成長培地を取り出し、３７℃／５％ＣＯ２で２時間、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を含有するフェノールレッド不含培地で置き換えた。各時点の４５０ｎｍにおける吸光度が、ＰＰＳおよびＨＡの全ての濃度に対して示される。この実験は、ＨＡおよびＰＰＳが、前駆細胞増殖を刺激するために相乗的に作用しないことを示す。
【図２０Ｃ】指示される濃度のＰＰＳおよび／またはヒアルロン酸（ＳｕｐａｒｔｚＴＭ）が補充された成長培地における初代ヒト前駆細胞の培養の結果を示す。種々の時間間隔（３日および５日）で成長培地を取り出し、３７℃／５％ＣＯ２で２時間、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を含有するフェノールレッド不含培地で置き換えた。各時点の４５０ｎｍにおける吸光度が、ＰＰＳおよびＨＡの全ての濃度に対して示される。この実験は、ＨＡおよびＰＰＳが、前駆細胞増殖を刺激するために相乗的に作用しないことを示す。
【図２１】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞の３日間の培養の後にＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定される、プロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対する、インスリンの不在（維持培地、ＭＭ）およびインスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在（分化培地、ＤＭ）下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）により発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ｒｈＮＣ４を含有しない対照培養物に対する％変化として表した。Ｐ＜０．０５は、対照培養物に対して統計的に有意であった。
【図２２】ＡＴＤＣ５細胞のペレット培養におけるプロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対する、インスリンの不在（維持培地、ＭＭ）およびインスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在（分化培地、ＤＭ）下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）により発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、対照（１００％とする）に対する％変化として示される。
【図２３】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞による１日間の培養後の放射活性標識化３Ｈ−チミジンの取込みによって決定される、巨大分子ＤＮＡの生合成に対する、インスリンの不在（維持培地、ＭＭ）およびインスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在（分化培地、ＤＭ）下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）およびペントサン多硫酸（ＰＰＳ）（２マイクログラム／ｍＬ）により発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ｒｈＮＣ４を含有しない対照培養物に対する％変化として表した。Ｐ＜０．０５は、対照培養物に対して統計的に有意であった。
【図２４】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞の単層培養による３５Ｓ−ＰＧの生合成に対する、ｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）およびペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の組み合わせの濃度依存性効果の棒グラフ。データは、対照（維持培地、ＭＭ）（１００％とした）に対して表される。
【図２５】単層培養においてｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０９Ｐ）およびＰＰＳの存在下および不在下で２日間培養されたマウスＡＴＤＣ５前駆細胞によって発現される骨マーカーＲｕｎｘ２、ＭＧＰ、ＨＡＳ３、ＣＤ４４およびハウスキーピング遺伝ＮＡＤＰＨの遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ検出。
【図２６】単層培養においてｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０９Ｐ）およびＰＰＳの存在下および不在下で２日間培養されたマウスＡＴＤＣ５前駆細胞によって発現されるＲｕｎｘ２および形質導入タンパク質Ｓｍａｄ  ２およびＳｍａｄ  ４ならびにハウスキーピング遺伝子ＮＡＤＰＨの遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ検出。
【図２７】ＨＡへの３Ｈ−グルコサミンの取込みを測定することによる、前駆細胞によるヒアルロナン（ＨＡ）の生合成に対する多硫酸化多糖類の効果を示すクロマトグラフ溶出プロファイル。種々の濃度のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の存在下、マイクロマスで９日間培養されたヒト前駆細胞からの培地のＳｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ２００クロマトグラフィプロファイルが、パネルＡ〜Ｄに表示される。Ｈｙａｌａｓｅ消化の前、放射活性のプロファイルは、細胞によるＨＡおよびＰＧの両方への３Ｈ−グルコサミンの取込みを示すが、消化の後は、３Ｈ−ＰＧだけがカラムの空隙容積内に留まる。空隙容積画分における消化サンプルと消化前サンプルとのプロファイル下の面積の差異％が、指定されるＰＰＳ濃度ごとの培地内に放出された３Ｈ−ＨＡの量を表す。
【図２８】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞と共に３日間培養した後の、巨大分子ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取込みによって決定されるＤＮＡ合成に対する、インスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在下および不在下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）酵母細胞によって発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ｒｈＮＣ４を含有しない対照培養物に対する％変化で表される。Ｐ＜０．０１は、対照培養物に対して統計的に有意であった。
【図２９】インスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在下および不在下での、３日間の培養の後に血球計数器を用いて決定されるマウスＡＴＤＣ５前駆細胞の数に対する、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）酵母細胞によって発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ｒｈＮＣ４を含有しない対照培養物に対する％変化で表される。Ｐ＜０．０１は、対照培養物に対して統計的に有意であった。
【図３０】１３日間にわたって対照と比べた、ｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２００Ｐ）（５ｕｇ／ｍｌ）またはインスリン（１０ｕｇ／ｍｌ）によって誘発されるＡＴＤＣ５細胞成長の動態学の棒グラフ。０日目に（開始）、１ウェルにつき２０，０００個の細胞を播種し、４８時間毎に培地を取り換えた。インスリン処理した培養物は、６日目にコンフルエンスに達し、ＰＢＡ−１２００Ｐは９日目に達した。対照培養物も９日目にコンフルエンスに達したが、インスリンまたはＰＢＡ−１２００Ｐを含有する培養物とは対照的に、複製をしなくなった。
【図３１】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞と共に３日間培養した後、ＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定されるプロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対する、インスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在（分化培地、ＤＭ）および不在（維持培地、ＭＭ）下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）によって発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ｒｈＮＣ４を含有しない対照培養物に対する％変化で表した。Ｐ＜０．０５は、対照培養物に対して統計的に有意であった。図３１は、ｒｈＮＣ４がインスリンの存在下および不在下で、前駆細胞ＡＴＤＣ５細胞によるＰＧ合成を刺激したが、インスリンの不在下では、濃度が高いほどより有効であることを示す。
【図３２】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞と共に３日間培養した後、ＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定されるプロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対する、インスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在下におけるペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ＰＰＳを含有しない対照培養物と比べて、１分あたりのカウント（ＣＰＭ）および１分あたりの減衰（ＤＰＭ）としての３５Ｓ−ＧＡＧ放射活性で表した。Ｐ＜０．０５は、対照培養物に対して統計的に有意であった。図３２は、ＰＰＳの存在下におけるマウスＡＴＤＣ５前駆細胞によるＰＧ合成の濃度依存性刺激を示す。
【図３３】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞と共に１日培養した後、ＰＧのグリコサミノグリカン（３Ｈ−ＧＡＧ）への放射活性標識化グルコサミンの取込みによって決定されるプロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対する、インスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在（分化培地、ＤＭ）および不在（維持培地、ＭＭ）下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）およびペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウム（２マイクログラム／ｍＬ）によって発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ｒｈＮＣ４を含有しない対照培養物に対する％変化で表した。Ｐ＜０．０５は、対照培養物に対して統計的に有意であった。
【図３４】マウスＡＴＤＣ５前駆細胞と共に３日間培養した後、巨大分子ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取込みによって決定されるＤＮＡ合成（細胞複製）に対する、インスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在下でのペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフ。データは、ＰＰＳを含有しない対照培養物に対する％変化で表した。
【図３５】配列番号１−シグナルペプチドを含まない全長ヒトＮＣ４のアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【０１５６】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明らかに指示しない限り、複数形の参照も含む。例えば、「ポリペプチド（単数）」という用語は、これらの混合物を含む複数のポリペプチドも含む。
【０１５７】
本明細書において使用される場合、「ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  （に由来する）」という用語は、特定の完全体（ｉｎｔｅｇｅｒ）が特定の源から得られるが、必ずしもその源から直接的に得られるとは限らないことを示すと解釈されるべきである。
【０１５８】
「組成物」は、活性剤と、不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性の、補助剤などの別の化合物または組成物との組み合わせを意味することが意図される。
【０１５９】
文脈がそうでないことを必要としない限り、あるいは反対であることを明確に記載しない限り、単数の完全体、工程または要素として本明細書で言及される本発明の完全体、工程、または要素は、言及される完全体、工程または要素の単数形および複数系の両方を明らかに包含する。
【０１６０】
単一の実施形態に関して本明細書に記載される本発明の実施形態は、必要な変更を加えて、本明細書に記載される本発明の他の任意の実施形態に適用されると解釈されるべきである。
【０１６１】
本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」もしくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化形は、言及される工程または要素または完全体あるいは工程または要素または完全体の群を含むが、他のどの工程も要素も完全体も、あるいは要素または完全体の群も、排除しないことを暗示することは理解されるであろう。
【０１６２】
当業者は、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されるもの以外の変更および修正を受けられることを認識するであろう。本発明がこのような変更および修正を全て含むことは理解されるべきである。また本発明は、本明細書において言及または指示される工程、特徴、組成物および化合物の全てを個々にまたは集合的に含み、前記工程または特徴の任意のそして全ての組み合わせまたは任意の２つ以上を含む。
【０１６３】
本発明は、本明細書に記載される特定の実施例によってその範囲が限定されてはならない。機能的に等価な産物、組成物および方法は、明らかに、本明細書に記載される本発明の範囲内にある。
【０１６４】
本発明は、他に示されない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中のペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の従来に技法を用いて、過度の実験を行わずに実施される。このような手順は、例えば、以下のテキストに記載されており、これらは参照によって本明細書に援用される：
１．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第２版（１９８９年），Ｉ，ＩＩ，およびＩＩＩ巻全体、
２．  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５年），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，テキスト全体、
３．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４年），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、テキスト全体、そして特にその中の、Ｇａｉｔによる論文１−２２頁、Ａｔｋｉｎｓｏｎらによる論文３５−８１頁、Ｓｐｒｏａｔらによる論文８３−１１５頁、およびＷｕらによる論文１３５−１５１頁、
４．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓら編１９８５年），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，テキスト全体、
５．  Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４年）、
６．  Ｗｉｉｎｓｃｈ，Ｅ．編（１９７４年），Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｎ  ｉｎ  Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ  Ｍｅｔｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ（Ｍｉｉｌｅｒ，Ｅ．編），１５巻，第４版，パート１および２，３０  Ｔｈｉｅｍｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、
７．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６年，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。
【０１６５】
前駆細胞
本発明は前駆細胞に関する。その最も広い実施形態では、前駆細胞という用語は、多分化能細胞をどれも包含することが意図される。従って、前駆細胞という用語は、成体幹細胞および胚幹細胞を包含する。
【０１６６】
前駆細胞は間葉系前駆細胞であってもよい。
【０１６７】
前駆細胞は、内在性または外来性の胚性または成体の間葉系細胞または間葉系前駆細胞であってもよい。前駆細胞は多分化能間質細胞であってもよい。前駆細胞は成体未分化間葉系細胞であってもよい。
【０１６８】
前駆細胞は軟骨前駆細胞であってもよい。
【０１６９】
前駆細胞は、骨髄に由来し得る。あるいは、前駆細胞は、軟骨、滑膜組織、筋肉、脂肪組織、皮膚、臍帯、歯髄、または他の利用可能な源に由来し得る。
【０１７０】
前駆細胞は、内在性因子による分化から抑圧された結合組織細胞などの体細胞であってもよい。
【０１７１】
さらなる実施形態では、前駆細胞は、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ、または均質（ｈｏｍｏｇｅｏｎｏｕｓ）Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞、またはＳｔｒｏ−１ｂｒｉ子孫細胞が濃縮された細胞集団である。
【０１７２】
前駆細胞の１つのタイプは、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）である。元は骨髄に由来するが、ＭＰＣおよびＭＰＣ様細胞は多数の成体組織中に存在することが確認されており、多数の成体組織から単離することができる。ここでこれらは、正常な組織ターンオーバー、傷害、または老化のために欠損した局所細胞を置換および再生する機能を実行することが前提とされる。これらの組織は、脂肪、骨膜、滑膜、滑液（ＳＦ）、筋肉、真皮、乳歯、周皮細胞、海綿骨、膝蓋下脂肪体、および関節軟骨を含む。
【０１７３】
ＭＰＣは、表現型マーカーおよび多型潜在性分化機能特性の組み合わせを含む一群のインビトロでの特徴によって遡及的に定義され得る。
【０１７４】
プラスチック接着性は、間葉系細胞のための最も一般的に使用される簡単な単離手順としての機能を果たすが、種々の正および負の表面マーカー（例えば、Ｓｔｒｏ−１、ＣＤ１４６／メラノーマ細胞接着分子、ＣＤ２７１／低親和性神経成長因子、および段階特異的な胚性抗原−４）も、ＭＰＣ収率および均質性を濃縮するために使用されている。加えて、ＣＤ１４０ｂ（血小板誘発成長因子受容体−Ｄ）、ＣＤ３４０（ＨＥＲ−２／ｅｒｂＢ２）、およびＣＤ３４９（ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９）をＣＤ２１７と共に含むさらなる表面マーカーの一団も、ＭＰＣ濃縮のために使用することができる。
【０１７５】
さらに、前駆細胞は、細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２およびＡＴＤＣ５またはＭ１１１前駆細胞を含むマウス前駆細胞を含む。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、線維芽細胞様の形態を有するメスのＣ３Ｈ／Ｈｅマウス株の骨髄に由来する前駆幹細胞株である。ＡＴＤＣ５細胞は、上皮様の形態を有するマウス胚由来軟骨前駆細胞株である。
【０１７６】
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞株は、１４日〜１７日齢のＣ３Ｈマウス胚から１９７３年に確立された。これらの細胞は、細胞培養において線維芽細胞の形態を示し、間葉系幹細胞と機能的に類似している。５−アザシチジンによるＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるメチル化の阻害は、筋肉、脂肪、骨、または軟骨細胞の安定した形態的および生化学的特徴を生じる。この表現型の変化は、メチル化の遮断に応答する内在性遺伝子の活性化に起因することが示唆される。さらに、トランスフォーミング増殖因子β型スーパーファミリーの一員である骨形態形成タンパク質４（ＢＭＰ４）は、脂肪細胞分化プロトコールを受けたときに脂肪細胞表現型を有する細胞に発達する前脂肪細胞へのＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞の傾倒を誘発し得ることが示されている（Ｔａｎｇ  Ｑｉ−Ｑｕｎ，Ｏｔｔｏ  ＴＣ，Ｌａｎｅ  ＭＤ．Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ．ｐｒｏ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００４年，１０１：９６０７−９６１１頁）。ＡＴＤＣ５細胞株は、最初は、ＡＴ８０５奇形癌の分化培養物から単離された。ＡＴＤＣ５細胞は、成長段階で線維芽細胞表現型を発現する。ＡＴＤＣ５細胞株についてのさらなる情報は、Ａｔｓｕｍｉ  Ｔ，Ｍｉｗａ  Ｙ，Ｋｉｍａｔａ  Ｋ，Ｉｋａｗａ  Ｙ，Ａ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＡＴ８０５  ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  Ｄｅｖ．１９９０年，３０：１０９−１６頁において見出すことができる。
【０１７７】
前駆細胞は、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉが濃縮された細胞集団であってもよい。前駆細胞は、均質（ｈｏｍｏｇｅｏｎｏｕｓ）Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞、またはＳｔｒｏ−１ｂｒｉ子孫細胞であってもよい。
【０１７８】
Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨、靱帯、腱、骨格筋、真皮、および骨膜において見出される細胞であり、通常、中胚葉および／または内胚葉および／または外胚葉などの生殖系列に分化することができる。従って、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋肉組織、および繊維結合組織を含むがこれらに限定されない多数の細胞型に分化することができる。特定の分化系列への傾倒およびこれらの細胞が入る分化経路は、機械的影響および／または内在性の生物活性因子（例えば、成長因子、サイトカイン、および／または宿主組織により確立される局所的な微小環境条件など）からの種々の影響に依存する。従って、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、幹細胞または前駆細胞のいずれかである娘細胞をもたらすように分かれる非造血性前駆細胞であり、これらはやがて不可逆的に分化して、表現型細胞をもたらすであろう。
【０１７９】
さらなる実施形態では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、被験者、例えば、処置すべき被験者または関連被験者または非関連被験者（同じ種であっても異なっていても）から得られるサンプルから濃縮される。「濃縮された」、「濃縮」という用語またはその変化形は、本明細書では、１つの特定の細胞型の割合または多数の特定の細胞型の割合が未処置の集団と比べて増大された細胞集団を説明するために使用される。
【０１８０】
さらなる実施形態では、本発明において使用される細胞は、個々にまたは集合的に、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋、３Ｇ５＋またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。
【０１８１】
「個々に」とは、言及されるマーカーまたはマーカー群を本発明が別々に包含し、個々のマーカーまたはマーカー群が本明細書において別々に記載されなかったとしても、特許請求の範囲が、このようなマーカーまたはマーカー群を別々にそして互いに分離して定義し得ることを意味する。
【０１８２】
「集合的に」とは、言及されるマーカーまたはペプチド群の任意の数または組み合わせを本発明が包含し、マーカーまたはマーカー群のこのような数または組み合わせが本明細書において具体的に記載されなかったとしても、特許請求の範囲が、このような組み合わせまたは下位組み合わせ（ｓｕｂ−ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を別々に、そしてマーカーまたはマーカー群の他の組み合わせとは分離して、定義し得ることを意味する。
【０１８３】
一実施形態では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、さらに、ＴＮＡＰ＋、ＶＣＡＭ−１＋、ＴＨＹ−１＋、ＳＴＲＯ−２＋および／またはＣＤ１４６＋のうちの１つ以上である。
【０１８４】
所与のマーカーに対して「陽性」であると称される細胞は、マーカーが細胞表面に存在する程度に依存して、低い（ｌｏまたは暗い）または高い（明るい、ｂｒｉ）レベルのそのマーカーを発現することができ、この用語は、細胞の選別プロセスで使用される蛍光または他のマーカーの強度に関連する。ｌｏ（または暗いまたは鈍い）とｂｒｉとの区別は、特定の細胞集団が選別される際に使用されるマーカーとの関連で理解されるであろう。所与のマーカーに対して「陰性」であると称される細胞は、必ずしもその細胞に完全に存在しないわけではない。この用語は、その細胞によってマーカーが比較的非常に低いレベルで発現され、検出可能に標識化される場合に非常に低いシグナルを発するか、あるいは背景レベルを超えて検出できないことを意味する。
【０１８５】
「明るい（ｂｒｉｇｈｔ）」という用語は、本明細書において使用される場合、検出可能に標識化されたときに比較的高いシグナルを発生する細胞表面上のマーカーを指す。理論によって限定されることを望まないが、「明るい」細胞は、サンプル中の他の細胞よりも多くの標的マーカータンパク質（例えば、ＳＴＲＯ−１によって認識される抗原）を発現することが理解される。例えば、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）分析で決定されるように、ＦＩＴＣ−結合ＳＴＲＯ−１抗体で標識化されたときに、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞は、明るくない（ｎｏｎ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞（ＳＴＲＯ−１ｄｕｌｌ／ｄｉｍ）よりもより大きい蛍光シグナルを生じる。一実施形態では、「明るい」細胞は、出発サンプル中に含有される最も明るく標識化された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％を構成する。その他の実施形態では、「明るい」細胞は、出発サンプル中に含有される最も明るく標識化された骨髄単核細胞の少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％を構成する。さらなる実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ細胞は、「背景」、すなわちＳＴＲＯ−１−である細胞に対して、２ログ倍高いＳＴＲＯ−１表面発現の発現を有する。比較すると、ＳＴＲＯ−１ｄｉｍおよび／またはＳＴＲＯ−１ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ細胞は、２ログ倍よりも低いＳＴＲＯ−１表面発現の発現を有し、通常、約１ログまたは「背景」よりも低い。
【０１８６】
本明細書において使用される場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異性のアルカリホスファターゼの全てのアイソフォームを包含することが意図される。例えば、この用語は、肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）および腎臓アイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。さらなる実施形態では、ＴＮＡＰはＢＡＰである。さらなる実施形態では、ＴＮＡＰは、本明細書において使用される場合、ブダペスト条約の規定に基づいて寄託受入番号ＰＴＡ−７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣにより寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるＳＴＲＯ−３抗体に結合することができる分子を指す。
【０１８７】
さらに、さらなる実施形態では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、クローン原性ＣＦＵ−Ｆを生じることができる。
【０１８８】
一実施形態では、かなりの割合の多分化能細胞は、少なくとも２つの異なる生殖系列に分化することができる。多分化能細胞が傾倒され得る系列の非限定的な例としては、骨前駆細胞、肝細胞前駆細胞（胆管上皮細胞および肝細胞に対して多分化能である）、神経制限細胞（乏突起膠細胞および星状膠細胞に進行するグリア細胞前駆体を生じることができる）、神経細胞前駆体（ニューロンに進行する）、心筋および心筋細胞の前駆体、グルコース応答性インスリン分泌膵臓β細胞株が挙げられる。その他の系列としては、象牙芽細胞、象牙質産生細胞および軟骨細胞と、以下の：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトなどの皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、腎管上皮細胞、平滑筋および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱細胞、靱帯細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、髄間質細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、星状膠細胞および乏突起膠細胞の前駆細胞とが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
別の実施形態では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、培養の際に造血細胞を生じることができない。
【０１９０】
一実施形態では、細胞は処置すべき被験者から採取され、標準技法を用いてインビトロで培養され、自己または同種異系組成物として被験者に投与するための拡大細胞を得るために使用される。代替の実施形態では、１つ以上の確立されたヒト細胞株の細胞が使用される。本発明の別の有用な実施形態では、ヒトでない動物（または患者がヒトでなければ別の種から）の細胞が使用される。
【０１９１】
また本発明は、前駆細胞と組み合わせたインビトロ培養から産生されるＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞および／またはその子孫細胞（後者は、拡大細胞（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｃｅｌｌ）とも呼ばれる）から得られるか、またはこれらに由来する上清または可溶性因子の使用も意図する。本発明の拡大細胞は、培養条件（培地中の刺激性因子の数および／または種類を含む）および継代数などによって、様々な種類の表現型を有することができる。特定の実施形態では、子孫細胞は、親集団から約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０継代後に得られる。しかしながら、子孫細胞は、親集団から任意の数の継代後に得ることができる。
【０１９２】
子孫細胞は、任意の適切な培地における培養によって得ることができる。「培地」という用語は、細胞培養に関連して使用される場合、細胞を包囲する環境の成分を含む。培地は固体、液体、気体、または相および材料の混合物であり得る。培地は、液体成長培地も、細胞成長を維持しない液体培地も含む。また培地は、寒天、アガロース、ゼラチンおよびコラーゲン基質などのゼラチン状培地も含む。例示的な気体培地には、ペトリ皿または他の固体もしくは半個体の支持体の上で成長する細胞が暴露される気相が含まれる。「培地」という用語は、たとえそれが細胞とまだ接触されていなくても、細胞培養において使用することが意図される材料も指す。言い換えると、細菌培養のために調製される栄養が豊富な液体は培地である。水または他の液体と混合されたときに細胞培養に適切になる粉末混合物は、「粉末培地」と呼ぶことができる。
【０１９３】
実施形態では、本発明の方法に有用な子孫細胞は、ＳＴＲＯ−３抗体で標識化された磁性ビーズを用いてＴＮＡＰ＋ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞を骨髄から単離し、次に単離した細胞を培養拡大することによって得られる（適切な培養条件の例については、Ｇｒｏｎｔｈｏｓら，Ｂｌｏｏｄ  ８５：９２９−９４０頁，１９９５年を参照されたい）。
【０１９４】
一実施形態では、このような拡大細胞（子孫）（場合により、少なくとも５継代後）は、ＴＮＡＰ−、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３−、ＣＤ１１ａ−ｃ−、ＣＤ３１−、ＣＤ８６−、ＣＤ３４−および／またはＣＤ８０−であり得る。しかしながら、本明細書に記載されるものとは異なる培養条件下では、異なるマーカーの発現が様々に変わり得る。また、これらの表現型の細胞は拡大細胞集団において優勢であり得るが、より小さい割合の細胞がこの表現型を有さないことを意味しない（例えば、より小さいパーセンテージの拡大細胞はＣＣ９−であり得る）。一実施形態では、拡大細胞は、異なる細胞型に分化する能力をまだ有している。
【０１９５】
一実施形態では、上清もしくは可溶性因子、または細胞自体を得るために使用される拡大細胞集団は、細胞の少なくとも２５％、さらなる実施形態では少なくとも５０％がＣＣ９＋である細胞を含む。
【０１９６】
別の実施形態では、上清もしくは可溶性因子、または細胞自体を得るために使用される拡大細胞集団は、細胞の少なくとも４０％、さらなる実施形態では少なくとも４５％がＳＴＲＯ−１＋である細胞を含む。
【０１９７】
さらなる実施形態では、拡大細胞は、ＬＦＡ−３、ＴＨＹ−１、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ６−１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−Ｒ、ＩＧＦ１−Ｒ、ＮＧＦ−Ｒ、ＦＧＦ−Ｒ、レプチン−Ｒ（ＳＴＲＯ−２＝レプチン−Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔおよびＣＤ１４６またはこれらのマーカーの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上のマーカーを集合的または個々に発現し得る。
【０１９８】
一実施形態では、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞に由来する子孫細胞は、マーカーＳｔｒｏ−１ｄｉｍに対して陽性である。これらの細胞は組織特異性傾倒細胞（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  Ｃｅｌｌ、ＴＳＣＣ）と呼ばれ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ細胞よりも分化に傾倒しており、従って、誘導因子への応答が低い。ＴＳＣＣが傾倒され得る系列の非限定的な例としては、肝細胞前駆細胞（胆管上皮細胞および肝細胞に対して多分化能である）、神経制限細胞（乏突起膠細胞および星状膠細胞に進行するグリア細胞前駆体を生じることができる）および神経細胞前駆体（ニューロンに進行する）、心筋および心筋細胞の前駆体、グルコース応答性インスリン分泌膵臓β細胞株が挙げられる。その他の傾倒される前駆細胞としては、軟骨細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、象牙質産生および軟骨細胞と、以下の：網膜色素上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイトなどの皮膚細胞、樹状細胞、毛包細胞、腎管上皮細胞、平滑筋および骨格筋細胞、精巣前駆細胞、血管内皮細胞、腱細胞、靱帯細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、髄間質細胞、破骨および造血性支持間質細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、周皮細胞、血管細胞、上皮細胞、グリア細胞、神経細胞、星状膠細胞および乏突起膠細胞の前駆細胞とが挙げられるが、これらに限定されない。前駆体には、脂肪組織、乳輪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織および繊維結合組織を特に含む結合組織を特異的にもたらすことができるものが含まれる。
【０１９９】
別の実施形態では、子孫細胞は、国際公開第２００６／０３２０９２号パンフレットにおいて定義および／または記載されるような多分化能拡大ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞子孫（ＭＥＭＰ）である。子孫が由来し得るＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞の濃縮集団の調製方法は、国際公開第０１／０４２６８号パンフレットおよび国際公開第２００４／０８５６３０号パンフレットにおいて記載されている。インビトロの状況では、ＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞は、完全に純粋な調製物として存在することはめったになく、一般に、組織特異性傾倒細胞（ＴＳＣＣ）である他の細胞と共に存在するであろう。国際公開第０１／０４２６８号パンフレットは、このような細胞を骨髄から約０．１％〜９０％の純度レベルで採取することに言及している。子孫が由来する前駆細胞を含む集団は組織源から直接採取されてもよいし、あるいはエキソビボで既に拡大された集団であってもよい。
【０２００】
例えば、子孫は、これらが存在する集団の全細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９５％を含む、実質的に精製されたＳＴＲＯ−１＋多分化能細胞の採取された非拡大集団から得ることができる。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉｇｈｔ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ−１、ＴＨＹ−１、ＣＤ１４６およびＳＴＲＯ−２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに対して陽性の細胞を個々にまたは集合的に選択することによって達成され得る。
【０２０１】
ＭＥＭＰＳは、マーカーＳＴＲＯ−１ｂｒｉに対して陽性であり、マーカーアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陰性であるという点で、新たに採取したＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞とは区別することができる。対照的に、新たに単離したＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞は、ＳＴＲＯ−１ｂｒｉおよびＡＬＰの両方に対して陽性である。本発明のさらなる実施形態では、投与した細胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が表現型ＳＴＲＯ−１ｂｒｉ、ＡＬＰ−を有する。さらなる実施形態では、ＭＥＭＰＳは、マーカーＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ−３、α３β１の１つ以上に対して陽性である。またさらなる実施形態では、ＭＥＭＰはＴＥＲＴ活性を表さず、そして／あるいはマーカーＣＤ１８に対して陰性である。
【０２０２】
Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞出発集団は、骨髄、歯髄細胞、脂肪組織および皮膚を含む、任意の１つ以上の組織型に由来することができ、あるいはおそらくより広く、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛包、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱および骨格筋に由来し得る。
【０２０３】
本発明の実施において、所与の細胞表面マーカーを保有する細胞の分離は多数の異なる方法によって達成され得るが、特定の方法が、結合剤（例えば、抗体またはその抗原結合断片）を関連のマーカーに結合した後、結合（高レベルの結合または低レベルの結合）を示すものまたは結合を示さないものを分離することに頼っていることは理解されるであろう。最も便利な結合剤は抗体または抗体に基づく分子であり、好ましくはモノクローナル抗体であるか、モノクローナル抗体に基づく。何故なら、これらの後者の薬剤は特異的だからである。抗体は両方の工程に使用することができるが、他の薬剤が使用されてもよく、従って、これらを保有する細胞、またはこれらを持たない細胞を濃縮するために、これらのマーカーのリガンドも使用され得る。
【０２０４】
抗体またはリガンドは固体支持体に取り付けられて、粗分離を可能にし得る。分離技法は、好ましくは、収集される画分の生存率の保持を最大にする。異なる効力の種々の技法を用いて、比較的粗い分離を得ることができる。使用される特定の技法は、分離効率、関連の細胞毒性、性能の容易さおよび速度、ならびに精巧な装置および／または技術的スキルの必要性に依存するであろう。分離手順は、抗体被覆磁性ビーズを用いる磁気分離、親和性クロマトグラフィ、および固体基質に取り付けられた抗体による「パニング」を含むことができるが、これらに限定されない。精密な分離を提供する技法はＦＡＣＳを含むが、これに限定されない。ＦＡＣＳを実施するための方法は、当業者には明らかであろう。
【０２０５】
本明細書に記載されるマーカーのそれぞれに対する抗体は市販されており（例えば、ＳＴＲＯ−１に対するモノクローナル抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡから市販されている）、ＡＴＣＣまたは他の寄託組織から入手可能であり、そして／あるいは当該技術分野で認識された技法を用いて生成することができる。
【０２０６】
例えば、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞を単離するための方法は、例えば、ＳＴＲＯ−１の高レベルの発現を認識する磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いる固相選別工程である第１の工程を含むことが好ましい。次に、所望されれば第２の選別工程が行われ、高レベルの前駆細胞の発現をもたらすことができる。この第２の選別工程は２つ以上のマーカーの使用を含み得る。
【０２０７】
Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞を得る方法は、既知の技法を用いて、第１の濃縮工程の前に細胞の源を回収することも含み得る。従って、組織は外科的に取り出されるであろう。次に、源の組織を含む細胞は、いわゆる単一細胞懸濁液に分離されるであろう。この分離は、物理的およびまたは酵素的な手段によって達成することができる。
【０２０８】
適切なＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞集団が得られたら、任意の適切な手段によって培養または拡大して、ＭＥＭＰを得ることができる。
【０２０９】
一実施形態では、細胞は、処置すべき被験者から採取され、標準技法を用いてインビトロで培養され、自己または同種異系組成物として被験者に投与するための上清または可溶性因子または拡大細胞を得るために使用される。代替の実施形態では、上清または可溶性因子を得るために１つ以上の確立されたヒト細胞株の細胞が使用される。本発明の別の有用な実施形態では、上清または可溶性因子を得るためにヒトでない動物（または患者がヒトでなければ別の種から）の細胞が使用される。
【０２１０】
本発明は、非ヒト霊長類細胞、有蹄動物細胞、イヌ科細胞、ネコ科細胞、ウサギ類細胞、齧歯類細胞、鳥類細胞、および魚類細胞を含むがこれらに限定されない、ヒトでない任意の動物種からの細胞を用いて実施することができる。本発明が実施され得る霊長類細胞には、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、および任意の他の新または旧世界ザルの細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明が実施され得る有蹄動物細胞には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、水牛、およびバイソンの細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明が実施され得る齧歯類細胞には、マウス、ラット、モルモット、ハムスターおよびスナネズミの細胞が含まれるが、これらに限定されない。本発明が実施され得るウサギ種の例には、飼いウサギ、ジャックラビット、ノウサギ、ワタオウサギ、カンジキウサギ、およびナキウサギが含まれる。ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）は、本発明が実施され得る鳥種の一例である。
【０２１１】
本発明の方法のために有用な細胞は、使用の前、または上清または可溶性因子を得る前は、貯蔵され得る。真核細胞、特に哺乳類細胞を保存および貯蔵するための方法およびプロトコールは、当該技術分野において知られている（例えば、Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｗ．およびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．（１９９７年）Ｂａｓｉｃ  Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２版、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（２０００年）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照）。
【０２１２】
遺伝子組換え細胞
一実施形態では、Ｓｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞および／またはその子孫細胞は、例えば、対象のタンパク質、例えば、治療的および／または予防的な利益を提供するタンパク質（例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、トリプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、膵臓リパーゼまたはアミラーゼ）、または血管新生の増強に関連するまたはその原因となるポリペプチド、または膵臓細胞または血管細胞への細胞の分化に関連するポリペプチドを発現および／または分泌するために遺伝子組換えされる。
【０２１３】
細胞を遺伝子組換えするための方法は、当業者には明らかであろう。例えば、細胞で発現され得る核酸は、細胞における発現を誘発するためのプロモーターに動作可能に結合される。例えば、核酸は、例えば、ウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ−ＩＥプロモーター）またはＳＶ−４０プロモーターなどの、被験者の様々な細胞において動作可能なプロモーターに結合される。付加的な適切なプロモーターは当該技術分野において知られており、必要な変更を加えて本発明の現在の実施形態に適用されるように考慮されるべきである。
【０２１４】
一実施形態では、核酸は、発現構築物の形態で提供される。本明細書において使用される場合、「発現構築物」という用語は、細胞中で動作可能に接続される核酸に発現を与える能力を有する核酸（例えば、レポーター遺伝子および／またはカウンター選択可能なレポーター遺伝子）を指す。本発明との関連において、発現構築物が、プラスミド、バクテリオファージ、ファージミド、コスミド、ウイルスサブゲノムもしくはゲノム断片、または発現可能なフォーマットの非相同ＤＮＡを維持および／または複製することができる他の核酸を含んでもよいし、これらであってもよいことは理解されるべきである。
【０２１５】
本発明の実施のために適切な発現構築物の構築のための方法は当業者には明らかであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＩＳＢＮ  ０４７  １５０３３８、１９８７年において）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３版、２００１年において）に記載されている。例えば、発現構築物の成分のそれぞれは、例えばＰＣＲを用いて適切なテンプレート核酸から増幅され、その後、例えばプラスミドまたはファージミドなどの適切な発現構築物にクローン化される。
【０２１６】
このような発現構築物のために適切なベクターは当該技術分野において知られており、そして／あるいは本明細書に記載されている。例えば、哺乳類細胞における本発明の方法に適した発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって供給されるｐｃＤＮＡベクタースイート（ｖｅｃｔｏｒ  ｓｕｉｔｅ）のベクター、ｐＣＩベクタースイート（Ｐｒｏｍｅｇａ）のベクター、ｐＣＭＶベクタースイート（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のベクター、ｐＭベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＶＰ１６ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、またはｐｃＤＮＡベクタースイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のベクターである。
【０２１７】
当業者は、付加的なベクターおよびこのようなベクターの供給源（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＰｒｏｍｅｇａなど）を知っているであろう。
【０２１８】
単離核酸分子またはそれを含む遺伝子構築物を発現のために細胞内に導入するための手段は当業者に知られている。所与の生物体のために使用される技法は、既知の成功した技法に依存する。組換えＤＮＡを細胞内に導入するための手段は、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランにより仲介されるトランスフェクション、リポソームにより仲介されるトランスフェクション（例えば、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）および／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）などを用いることによる）、ＰＥＧ仲介のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーションおよび微粒子衝撃（例えば、特に、ＤＮＡ被覆タングステンまたは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）などを用いることによる）を含む。
【０２１９】
あるいは、本発明の発現構築物はウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは当該技術分野において知られており、市販されている。核酸の送達およびその核酸の宿主細胞ゲノムへの組込みのための従来のウイルスに基づいた系は、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターを含む。あるいは、アデノウイルスベクターは、エピソームのままである核酸を宿主細胞内に導入するために有用である。ウイルスベクターは、標的細胞および組織における効率的で多用途の遺伝子導入方法である。さらに、多くの異なる細胞型および標的組織において高い形質導入効率が観察されている。
【０２２０】
例えば、レトロウイルスベクターは、一般に、６〜１０ｋｂまでの外来性配列のパッケージング容積を有するシス作用性の長い末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。ベクターの複製およびパッケージングのために最小のシス作用性ＬＴＲで十分であり、これは次に、ベクターを使用して、発現構築物を標的細胞内に組み込んで、長期発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳｒＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびこれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５６：２７３１−２７３９頁（１９９２年）、Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１６３５−１６４０頁（１９９２年）、Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．７６：５８−５９頁（１９９０年）、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２７４−２３１８頁（１９８９年）、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４頁（１９９１年）、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書、ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０−９９０頁，１９８９年、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：５−１４頁，１９９０年、Ｓｃａｒｐａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：８４９−８５２頁，１９９１年、Ｂｕｒｎｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７頁，１９９３年を参照されたい）。
【０２２１】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系が核酸送達のために開発されている。ＡＡＶベクターは、当該技術分野において既知の技法を用いて容易に構築することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号明細書および米国特許第５，１３９，９４１号明細書、国際公開第９２／０１０７０号パンフレットおよび国際公開第９３／０３７６９号パンフレット、Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら  Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３９８８−３９９６頁，１９８８年、Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０年）Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９０（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），Ｃａｒｔｅｒ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５：５３３−５３９頁、１９９２年、Ｍｕｚｙｃｚｋａ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９頁、１９９２年、Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１頁、１９９４年、ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１６５−１６９頁、１９９４年、ならびにＺｈｏｕら  Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５頁、１９９４年を参照されたい。
【０２２２】
本発明の発現構築物を送達するために有用な付加的なウイルスベクターには、例えば、ウイルスのポックスファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスまたはアルファウイルスなど）に由来するもの、または結合ウイルスベクターが含まれる（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５６：３１７−３２１頁，１９８９年において記載される）。
【０２２３】
さらなる実施形態では、前駆細胞は、Ｓｔｒｏ−３ｂｒｉ、または均質（ｈｏｍｏｇｅｏｎｏｕｓ）Ｓｔｒｏ−３ｂｒｉ細胞、またはＳｔｒｏ−３ｂｒｉ子孫細胞が濃縮された細胞集団である。
【０２２４】
多硫酸化多糖類
本発明は、多硫酸化多糖類化合物の使用にも関する。多硫酸化多糖類ファミリーは、ヘパリンおよびペントサン多硫酸によって例示されるように、１つ以上の硫酸エステル基が共有結合された２つ以上の糖環または炭水化物構造を含有する、天然に存在するかまたは半合成／合成の任意の多硫酸化多糖類またはその生物学的に活性な断片であると考えることができる。
【０２２５】
本発明の範囲内に入る多硫酸化多糖類の例は、天然に存在する高分子量ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、ペントサン多硫酸、コンドロイチン多硫酸、キトサン多硫酸、デルマタン多硫酸スロデキシド、デキストラン多硫酸、多硫酸化イヌリン、硫酸化ラクトビオン酸アミド、硫酸化ビス−アルドン酸アミド、スクロース八硫酸、フコイダンー１、フコイダンー２、硫酸化β−シクロデキストリン、硫酸化γ−シクロデキストリンおよび小さい硫酸化化合物（イノシトール六硫酸を含むがこれに限定されない）である。
【０２２６】
多硫酸化多糖類の特定のリストは、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウム、ペントサン多硫酸マグネシウム、ペントサン多硫酸ナトリウム、多硫酸化コンドロイチンおよびデキストラン多硫酸である。
【０２２７】
本発明に適した多糖類の更なる例には、多硫酸化多糖類、多硫酸化デキストラン、多硫酸化シクロデキストラン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒａｎ）、多硫酸化コンドロイチン、およびペントサン多硫酸が、そのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩（例えば、そのカルシウムまたはナトリウム塩）、遷移金属（例えば、銅および亜鉛）、および貴金属（例えば、白金など）として含まれる。さらなる例は、直鎖でも分岐でもよいホモ多糖類またはヘテロ多糖類の多硫酸化多糖類誘導体である。糖は、ガラクトース、マンノース、グルコース、ラムノース（ｒｈａｎｏｓｅ）、フルクトース、ソルボース、キシロース、Ｄ−アラビノース、リボース、Ｌ−アラビノース、グルクロン酸およびこれらの誘導体などのペントースまたはヘキソースに由来することができるが、これらに限定されない。
【０２２８】
本発明は、多硫酸化多糖類、または多硫酸化多糖類の類似体もしくは誘導体の生物学的に活性な分子断片も包含する。
【０２２９】
１つの多硫酸化多糖類はペントサン多硫酸（ＰＰＳ）である。ＰＰＳの基本構造は、ペントース、すなわち統計的に全ての１０番目の単位毎にグルクロン酸基を含有する（１→４）結合β−Ｄ−キシロピラノース単位からなる。
【化１】
0005542686.tif 000002
【０２３０】
ブナ材ヘミセルロース（Ｆａｇｕｓ  ｓｉｌｖａｔｉｃａ）から単離されるペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の構造式は以下に示される。この式は、ペントサン多硫酸の直鎖キシラン（ペントサン）骨格が、平均して１０番目のキシロース（ペントース）環毎に１つの、２位に結合した４−Ｏ−メチル−グルクロン酸側鎖を含有することを示す。
【０２３１】
ＰＰＳのカルシウムおよびマグネシウム誘導体（ＣａＰＰＳまたはＭｇＰＰＳ）は、Ｒ＝ＳＯ３−Ｃａ＋１／２またはＭｇ＋１／２の場合である。ナトリウム誘導体は、Ｒ＝ＳＯ３−Ｎａの場合である。
【化２】
0005542686.tif 000003
【０２３２】
そのカルシウムまたはナトリウム塩としてのペントサン多硫酸は、約５７００ダルトンの平均分子量および約１６％の硫黄含量を有する。この化合物は、１９６０年代前半から、合成ヘパリノイドおよび抗血栓剤であることが知られている。
【０２３３】
特定の錯化イオンは、アルカリ金属（例えば、Ｎａ＋、およびＫ＋）、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋）、およびＡｇ＋、Ａｕ＋、Ｐｂ２＋、Ｃｕ２＋、Ａｕ２＋、Ｐｄ２＋、Ｐｄ４＋、Ｐｔ４＋、Ｐｔ２＋、三価の金属イオン、ならびに４級アンモニウム化合物錯体からなる群から選択され得る。後者の化合物の例は、塩化ピリジニウム、塩化テトラアルキルアンモニウム、塩化コリン、塩化セチルピリジニウム、塩化Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリアルキルアンモニウム、またはこれらの誘導体である。１つの特定の実施形態では、カルシウム錯体が使用される。
【０２３４】
多硫酸多糖類−金属錯体の調製は、米国特許第５，６６８，１１６号明細書に詳細に記載されており、その全体の開示は参照によって本明細書に援用される。
【０２３５】
多硫酸多糖類およびＰＰＳに関するさらなる情報は、国際公開第０２／４１９０１号パンフレットにおいて見出すことができ、その全体の開示は参照によって本明細書に援用される。さらなる情報は、Ｓｅｍｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９９９年２月，２８（４）：２１１−６７頁、Ｇｈｏｓｈ−Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｅｎｔｏｓａｎ  ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔにおいても見出すことができ、その全体の開示は参照によって本明細書に援用される。
【０２３６】
一実施形態では、多硫酸化多糖類はペントサン多硫酸ナトリウムである。これの一例はＢｅｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙによって製造されるＳＰ５４であり、これは、硫酸でエステル化された多糖類、より具体的にはペントサン多硫酸ナトリウムである。ペントサン多硫酸ナトリウムの半合成的な産生は、規定の範囲の分子量（４０００〜６０００ダルトン）を有する一貫した再現可能な製造を保証する。
【０２３７】
さらなる多硫酸化多糖類は多硫酸化コンドロイチンである。これの一例は、大部分が多硫酸化コンドロイチンからなるＡｒｔｅｐａｒｏｎ  ＲＴＭ（Ｌｕｉｔｐｏｌｄ−Ｗｅｒｋの商標）である。これは、抗関節炎薬として使用されている。より具体的には、優勢な（約９３％）二糖類の繰り返し単位がガラクトサミンにグリコシド結合されたヘキスロン酸である、不均一な半合成グリコサミノグリカン多硫酸である。Ａｒｔｅｐａｒｏｎの二糖類繰り返し単位の遊離ヒドロキシル基のうちの約４個は硫酸基によってエステル化されて、約１３．０重量％の硫黄含量を与える。市販の調製物は、約１０，０００ダルトンの分子量を有する。
【０２３８】
多硫酸多糖類−金属錯体の調製は、米国特許第５，６６８，１１６号明細書に詳細に記載されており、その全体の開示は参照によって本明細書に援用される。
【０２３９】
多硫酸多糖類およびＰＰＳに関するさらなる情報は、国際公開第０２／４１９０１号パンフレットにおいて見出すことができ、その全体の開示は参照によって本明細書に援用される。さらなる情報は、Ｓｅｍｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．１９９９年２月；２８（４）：２１１−６７頁、Ｇｈｏｓｈ−Ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｅｎｔｏｓａｎ  ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔにおいて見出すことができ、その全体の開示は参照によって本明細書に援用される。
【０２４０】
特に、製造、単離および精製方法は、適切なキャリア組成物および製剤と一緒に本出願に援用される。
【０２４１】
さらなる情報は、Ｇｈｏｓｈ  Ｐ、Ｅｄｅｌｍａｎ  Ｊ、Ｍａｒｃｈ  ＬおよびＳｍｉｔｈ  Ｍ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｅｎｔｏｓａｎ  ｐｏｌｙｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｎｅｅ：Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ  ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５年，６６：５５２−５７１頁においても見出すことができ、これは、筋肉内注射によって与えられるＰＰＳを用いたＯＡの臨床研究についての情報を提供する。ＰＰＳおよび試行において使用される方法（投与計画および投与方法を含む）についての情報は、本出願における参照によって本明細書に援用される。
【０２４２】
αＩＸコラーゲンの非コラーゲン性ＮＣ４ドメイン
さらなる実施形態によると、選択されるポリペプチドは、αＩＸコラーゲンの非コラーゲン性ＮＣ４ドメインまたはその生物学的に活性な分子断片である。適切なＮＣ４ドメインポリペプチドについての具体的な情報は、国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００７８８号明細書において見出すことができ、その内容は全体が援用される。
【０２４３】
特に、ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００７８８号明細書は、本発明において使用することができる多数のポリペプチドおよびその配列を、ポリペプチドを発現および精製する方法と共に開示する。従って、ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００７８８号明細書は、適切なＮＣ４ドメインポリペプチドの例およびその製造方法を含み、これは、本明細書に具体的に援用される。特に、７頁２４行目〜８頁６行目に示されるアミノ酸配列は、図１〜７に示される配列と共に、本出願に具体的に援用される。さらに、９頁１０行目〜１０頁３６行目に示されるポリペプチドの回収方法は、本出願に具体的に援用される。１５頁からの詳細な説明において示される自己消化技法は、１８頁からの詳細な説明において示される分離および回収工程および特に２０〜２４頁に示されるポリペプチドと共に、本発明に援用される。最後に、図７の部分アミノ酸配列が、本出願に援用される。
【０２４４】
上述のように、ＮＣ４ドメインは、ＰＣＴ／ＡＵ２００４／０００７８８号明細書において議論されている。そこには、遺伝子配列から予測され、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）における発現によって得られる完全アミノ酸配が含まれる（表１を参照）。
【０２４５】
しかしながら、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）を用いる発現によって得られるタンパク質産物は全長ヒトＮＣ４および切断型（ＭＷ＝２４ｋＤａ）で構成され、いずれの形態もグリコシル化されていたことに注意すべきであり、これらは表１にも包含されており、その調製およびＩＤは方法セクションにおいて記載されている。Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）およびＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）発現タンパク質はいずれも動物モデルおよびインビトロアッセイにおいて評価され、それぞれコードＡＷＲ−０１およびＰＢＡ−１２００Ｐによって同定され得る。これらの実験において使用される前駆細胞は、方法セクションにおいて議論されるように、市販されているマウスＡＴＤＣ５であった。使用した分化細胞には、ヒト関節軟骨、正常なヒツジおよびブタ軟骨からの軟骨細胞、ならびに関節全置換手術を受けているＯＡ患者からの滑膜組織に由来する軟骨細胞および滑膜線維芽細胞が含まれる。
【０２４６】
特に、以下の配列も、本出願において使用するためのポリペプチドを定義する。
【０２４７】
【表１】
0005542686.tif 000004
【０２４８】
【表２】
0005542686.tif 000005
【表３】
0005542686.tif 000006
【０２４９】
ウシ、ヒト、マウスおよびニワトリのＮＣ４配列の間の保存配列は、次の通りである。
配列番号３  −  Ｋ／ＱＳＶＳ／Ｖ／Ａ／ＥＦＳＹＫＧ
配列番号４  −  ＫＩ／ＬＭＩＧ／ＳＶＥＲ／ＴＳ／Ｔ
配列番号５  −  ＫＬＧＮＮＶＤＦＲＩ
配列番号６  −  Ｒ／ＫＩ／ＶＥＳ／ＴＬＰ／ＮＩＫＰＲ／ＫＧ
配列番号７  −  ＫＨ／Ｎ／ＹＷＳ／Ｎ／ＴＩＷＱＩＱＤＳ／ＡＧＫ／Ｒ  
配列番号８  −  Ｋ／ＱＳＶＳ／ＶＦＳＹＫＧ
配列番号９  −  ＫＩＭＩＧＶＥＲＴＳ
配列番号１０  −  ＲＩＥＳＬＰＩＫＰＲＧ
配列番号１１  −  ＫＨ／ＮＷＳ／ＮＩＷＱＩＱＤＳＧＫ
配列番号１２  −  ＲＩＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱＩ／ＶＤＫＡ
配列番号１３  −  ＲＨ／ＮＬＹＰＮ／ＳＧＬＰＥＥＹＳＦＬＴＴＦＲ
配列番号１４  −  ＦＳＮＬＰ／ＳＳＬＦＤＳＱＷＨＫＩ
配列番号１５  −  ＲＳＳＡＴＬＦＶＤＣＮＲＩ
配列番号１６  −  ＫＳＶＳＦＳＹＫＧ
配列番号１７  −  ＫＩＭＩＧＶＥＲＳ
配列番号１８  −  ＫＬＧＮＮＶＤＦＲＩ
配列番号１９  −  ＲＩＥＳＬＰＩＫＰＲＧ
配列番号２０  −  ＫＨＷＳＩＷＱＩＱＤＳＳＧＫ
配列番号２１  −  ＲＩＧＱＤＤＬＰＧＦＤＬＩＳＱＦＱＩＤＫＡ
配列番号２２  −  ＲＨＬＹＰＮＧＬＰＥＥＹＳＦＬＴＴＦＲＭ
配列番号２３  −  ＦＳＮＬＰＳＬＦＤＳＱＷＨＫＩ
配列番号２４  −  ＲＳＳＡＴＬＦＶＤＣＮＲＩ
【０２５０】
凍結保存
当業者に知られている前駆細胞を凍結保存するための種々の技法が存在する。手順の一例は以下のとおりである。
【０２５１】
検査：
凍結の前、最大の健康状態および良好な回収を保証するために、細胞は活発に成長する状態に維持されなければならない。理想的には、培地は前日に替えられるべきである。倒立顕微鏡を用いて、培養物の全体的な外観を急いで検査する。微生物汚染の徴候を探す。培地−空気界面に浮遊しているかもしれず、従って顕微鏡では見えない小さい菌・カビ類コロニーを探すために、肉眼で培養物を検査することも重要である。潜在性の（隠れた）培養汚染物を明らかにする助けとするために、凍結前の少なくとも１週間、培養物は抗生物質を含まずに維持されれば最良である。
【０２５２】
細胞の採取および凍結：
採取中に損傷された細胞が、凍結および解凍の過程で起こる更なる損傷に耐え抜くことは非常に困難なので、採取中は細胞を優しく取り扱う。ほぼコンフルエントなＴ−７５フラスコから最大１．５×１０７個の細胞を得る（細胞型および集密度による）ことができるべきである。これは、２×１０６細胞／バイアルで少なくともいくつかのバイアルをセットアップするために十分な細胞のはずである。
１．  無菌ピペットを用いて、古い培地を除去および廃棄する。
２．  Ｔ−７５フラスコに対して、カルシウムもマグネシウムも含まない５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ）で細胞単層を洗浄して、ウシ胎仔血清を完璧に除去する。
３．  ４〜５ｍＬのトリプシン溶液（ＣＭＦ−ＰＢＳ中）をフラスコに添加し、細胞を少なくとも１分間インキュベートさせる（酵素４溶液の予熱は暴露期間を短くするであろう）。約３ｍＬのトリプシン溶液を取り出し、細胞が集まり、そしてほぐれるのを可能にする。
４．  倒立型位相差（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｐｈａｓｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）顕微鏡において酵素処理の進行を数分毎に検査する。細胞が全て集まったら、フラスコを穏やかにたたき、これらをプラスチック表面から剥離させる。次に、５ｍＬの成長培地を細胞懸濁液に添加し、同じピペットを用いて、残存する細胞を培養容器の底から勢いよく洗浄する。
５．  懸濁細胞を１５ｍＬの遠心管に採取し、氷上に置く。計数のためのサンプルをとり、次に、細胞ペレットを得るために１００×ｇで５分間回転させる。細胞が回転している間に、生存細胞のカウントを行い（トリパンブルー溶液による）、細胞数／ｍＬおよび全細胞数を計算する。
６．  遠心分離した細胞から上清を除去し、１０％のＤＭＳＯ（ＤＭＳＯは、１〜２×１０６細胞／ｍＬの最終細胞濃度を与えるために、ほとんどの場合、５〜１５％の最終濃度で使用される）を含有する十分な凍結保護培地中に細胞ペレットを再懸濁させる。
７．  適切な数の低温貯蔵バイアルに、細胞株および日付のラベルを付ける。次に、それぞれのバイアルに１．５〜１．８ｍＬのＤＭＳＯ含有細胞懸濁液を添加して密封する。
８．  バイアルを制御速度フリーザーに一晩入れる。２４時間後、永久貯蔵のために細胞を液体窒素フリーザーに移すべきである。
９．  細胞についての適切な情報を細胞リポジトリレコードに記録する。これらの記録には、以下の情報を全て含む培養物の貯蔵条件：培養物の同一性、継代または集団倍加レベル、凍結日時、凍結培地および使用方法、バイアルあたりの細胞数、最初に凍結したバイアルの総数および残りの数、これらの場所、これらの期待される生存率、および実施された全ての品質管理試験（無菌性、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、種、核型など）の結果を詳細に記載する。付加的な培養物情報、特にその起源、履歴、成長パラメータ、特別な特徴および用途も有用であり、可能であればいつでも含有されるべきである。
【０２５３】
細胞の解凍および回収：
１．  適切な安全装置を用いてバイアルをその貯蔵場所から取り出し、ラベルおよび貯蔵記録の両方を注意深く検査して、それが正しい培養物であることを確実にする。容器を温水に入れ、完全に解凍されるまで緩やかに攪拌する。急速解凍（３７℃で６０〜９０秒）は、ほとんどの細胞培養物に最良の回収を提供し、再水和の間の細胞内の損傷性の氷晶の形成を低減または防止する。
２．  いくつかの凍結保護剤は長期の暴露において細胞に損傷を与え得るので、できるだけ急速にかつ穏やかに薬剤を除去する。凍結保護剤および細胞特徴の両方に応じていくつかのアプローチが使用される：
ａ）ほとんどの細胞は、解凍から６〜８時間以内に培地の取替えによって凍結保護剤が除去されれば正常に回復する。アンプルまたはバイアルの内容物を、１５〜２０ｍＬの培地を含有するＴ−７５フラスコまたは他の適切な容器に移し、標準的にインキュベートする。細胞の大部分が付着したらすぐに（通常、３〜４時間）、希釈された凍結保護剤を含有する培地を除去し、新たな培地で置き換える。
ｂ）凍結保護剤に敏感な細胞については、古い培地の除去は穏やかな遠心分離によって容易に達成される。バイアルまたはアンプルの内容物を、１０ｍＬの新たな培地を含有する１５ｍＬの遠心管に移し、１００×ｇで５分間回転させる。凍結保護剤を含有する上清を廃棄し、細胞ペレットを新たな培地中に再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を適切な培養容器に移して、標準的にインキュベートする。
【０２５４】
支持基質
生物学および材料科学における最近の進歩によって、組織工学は新しい軟骨修復技法の最前線に到達した。自己細胞、特別に設計された足場、バイオリアクター、機械的刺激および成長因子の組み合わせは、軟骨組織再生のための有望な手段を提供する。
【０２５５】
生体足場の細胞外基質の模倣
現在の組織工学戦略は、細胞−足場構築物を形成するために、合成（例えば、ポリグリコール酸）材料および天然由来（例えば、コラーゲン）材料の両方から得られる足場を提供する。現在利用な組織足場製品としては、小腸粘膜下組織（ＲｅｓｔｏｒｅＴＭ、ブタＳＩＳ、ＤｅＰｕｙ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ）、（ＣｕｆｆＰａｔｃｈＴＭ、ブタＳＩＳ、Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）、（ＳＩＳ、Ｃｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、改質コラーゲン足場（３Ｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、無細胞ヒト皮膚コラーゲン基質（Ｇｒａｆｔｊａｃｋｅｔ（登録商標）、Ｗｒｉｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウシ胎仔真皮（ＴｉｓｓｕｅＭｅｎｄ（登録商標），Ｓｔｒｙｋｅｒ）、および合成ポリマー足場、主にポリエステル（例えば、ＰＧＡ、ＰＣＬ、およびＰＬＡ）が挙げられる。
【０２５６】
コラーゲン足場、軟骨細胞（ｃｈｒｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）が播種された足場、関節軟骨細胞が播種されたＩＩ型コラーゲン−ＧＡＧ足場［Ｖｉｃｋｅｒｓら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００６年５月；１２（５）：１３４５−５５頁］、ならびにポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）およびキトサンを含む複合足場［Ｋｕｏ  ＹＣら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．２００８年１１月３日］、Ｎｅｔｔｌｅｓ  ＤＬらにより記載される代替形態［Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  ｐａｒｔ  Ａ  ２００８年７月；１４（７）：１１３３−４０頁］を含む、最近記載された組織工学的な足場は、軟骨基質の修復に適用するための注入可能で架橋可能なエラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）ゲルである。
【０２５７】
基質材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械特性、美容的外観および界面特性に基づく。組成物のために可能性のある基質は、生分解性で化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であり得る。その他の可能性のある材料は生分解性で生物学的に明確に定義された、骨または皮膚コラーゲンなどである。さらなる基質は、純粋なタンパク質または細胞外基質成分で構成される。その他の可能性のある基質は非生分解性で化学的に定義された、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックなどである。基質は、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなどの上述のタイプの材料の任意の組み合わせで構成されてもよい。バイオセラミックスは、例えばカルシウム−アルミン酸−リン酸などにおけるように、組成が改変されてもよく、そしてポアサイズ、粒径、粒子形状、および生分解性を改変するために処理してもよい。
【０２５８】
一実施形態では、足場は合成材料から得られる。別の実施形態では、足場は天然由来材料から得られる。あるいは、足場は、合成材料および天然由来材料の組み合わせである。
【０２５９】
一実施形態では、そして実施例において記載されるように、支持基質はコラーゲンスポンジである。場合によりＮＣ４ポリペプチドと組み合わせて細胞、ペントサン多硫酸を含む本発明の組成物は、スポンジ内に、移植または注入または灌流することができる。スポンジは移植に対して繊細であり得るので、場合により、スポンジは吸収性ケージに挿入される。
【０２６０】
組成物
全ての場合において、本明細書で議論される組成物および製剤は、本発明の多糖類および／またはポリペプチドに適している。特に、組成物および製剤は多硫酸化多糖類に適しており、一実施形態では、単体のペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウム、ペントサン多硫酸マグネシウム、および／またはペントサン多硫酸ナトリウムに適している。組成物および製剤は、本明細書で議論される化合物の組み合わせ、例えば、多糖類および／またはポリペプチドの組み合わせ、特にＮＣ４ドメインポリペプチドおよびペントサン多硫酸およびその塩の組み合わせにも適している。
【０２６１】
本発明によると、本明細書に開示される多糖類および／またはポリペプチドを含む組成物、特に、場合によりＮＣ４ドメインと共に多硫酸化多糖類を含む組成物、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウムまたは断片もしくは切断型を含む組成物は、人間医学および獣医学におけるヒトまたは動物使用に適しており、通常、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤のいずれか１つ以上を含むであろう。治療的使用のための許容可能なキャリアまたは希釈剤は製薬技術分野においてよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編  １９８５年）に記載されている。医薬品キャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬業の慣例に即して選択することができる。組成物は、キャリア、賦形剤または希釈剤として、あるいはこれらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤（リポソーム）、コーティング剤、または可溶化剤を含んでもよい。
【０２６２】
異なる送達系に依存して、異なる組成物／製剤要件が存在し得ることは、当該技術分野においてよく知られている。例えば、ＮＣ４ドメインを含む多糖類および／またはタンパク質は、生理食塩水中に溶解することができる。あるいは、これらの化合物は、液体−粉末の２つの部分を備えた溶液において構成し、使用の前に混合することができる。
【０２６３】
埋め込み型（皮下）の持続放出カプセルは、多くの場合、ＩｍｐｌａｎｏｎＴＭまたはＤｅｐｏ−ＰｒｏｖｅｒａＴＭ注射薬のような避妊薬のために使用され、本発明の組成物の投与のために有用であり得る。
【０２６４】
別の実施例では、本発明の組成物は、埋め込まれたミニポンプを用いて送達されるように配合され、組成物は通常、持続点滴によって所望の位置に投与される。
【０２６５】
代替の実施形態では、本発明の組成物は、非経口的、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、関節内、椎間板内または皮内に注射するか、あるいは移植することができる。さらなる実施形態では、製剤は、皮下、皮内または関節内に投与される。
【０２６６】
皮下および皮内製剤は、例えば、軟組織充填物質、リドカイン（局所麻酔薬）、基質メタロプロテイナーゼ阻害薬、酸化防止剤および抗炎症剤（副腎皮質ステロイド）などの１つ以上の付加的な薬剤も含有することができる。
【０２６７】
薬物の皮内送達のための種々の製剤は、以下の成分：アルブミン、緩衝液、緩衝食塩水、緩衝塩溶液、および麻酔薬（好ましくは局所）の１つ以上を含んでもよい。
【０２６８】
本発明は、本明細書で議論される疾患の処置で使用するための併用療法にまで及ぶ。特に、一実施例では、本発明は、種々の変性状態の処置において使用するための多硫酸化多糖類およびポリペプチドの使用にまで及ぶ。これらの薬剤が、同じ時点または異なる時点に投与され得ることは理解されるべきである。従って、併用療法は、単一の製剤または複数の製剤のいずれかで同じ時点または異なる時点に投与される、同時に投与される活性剤を含むことができる。同様に、併用療法は、異なる時間に異なる製剤で投与される活性剤を含むことができる。製剤は順次投与され得、数時間、数日、数週間および数ヶ月を含む期間によって隔てられてもよい。
【０２６９】
例えば皮内、皮下または筋肉内での動物への注射に適した製剤の例は以下を含む：
１）  前駆細胞と一緒に無菌水中に溶解された多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
２）  前駆細胞と一緒に、０．９％の無菌生理食塩水（１５０ｍＭのＮａＣｌ）、＋／−ヒトアルブミン（０．０１％〜０．５％）、＋／−局所麻酔薬、例えば、ブピバカイン塩酸塩（１．２５〜５ｍｇ／ｍｌ）、＋／−アドレナリン酸タルトラート（ａｄｒｅｎａｌｉｎｅ  ａｃｉｄ  ｔａｒｔｒａｔｅ）（０．００４５〜０．００９１ｍｇ／ｍｌ）、＋／−リドカイン（０．５〜２％）、＋／−エピネフリン（１：１００，０００〜１：２００，０００）中に溶解された多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
３）  前駆細胞と一緒に、リン酸緩衝食塩水、＋／−ヒトアルブミン（０．０１〜０．５％）、＋／−局所麻酔薬、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのリン酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４中に溶解された多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
４）  前駆細胞と一緒に、リン酸−クエン酸緩衝液（５０ｍＭ）＋／−過ホウ酸ナトリウム（０．０３％）、＋／−ヒトアルブミン（０．０１〜０．５％）、＋／−局所麻酔薬中に溶解された多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
５）  前駆細胞と一緒に、カルボキシメチルセルロース（２．７％）およびマンニトールを含有する無菌水溶液中に溶解された多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
６）  前駆細胞と一緒に、生体適合性のポリアルキルイミドヒドロゲル（例えば、Ｐｏｌｙｍｅｋｏｎ  Ｓ．ｒ．ｌ．（Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）により製造されるＢｉｏ−Ａｌｃａｍｉｄ（登録商標））内に取り込まれた多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
７）  前駆細胞と一緒に、ハイランＢゲル（例えば、Ｈｙｌａｆｏｒｍ（登録商標）Ｐｌｕｓ）内に取り込まれた多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
８）  前駆細胞と一緒に、安定化ヒアルロン酸ゲル（例えば、Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ（登録商標））内に取り込まれた多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
９）  前駆細胞と一緒に、ポリ−Ｌ−乳酸溶液（例えば、Ｓｃｕｌｐｔｒａ（登録商標））内に取り込まれた多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム、
１０）  前駆細胞と一緒に、ＮａＣｌを１１８．１ｍＭ、ＫＣｌを３．４ｍＭ、ＣａＣｌ２を２．５ｍＭ、ＭｇＳＯ４を０．８ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４を１．２ｍ、ＮａＨＣＯ３を２５．０ｍＭ、グルコース１１．１ｍＭを含有するクレブス−リンゲル溶液の溶液中に溶解されて取り込まれた多硫酸化多糖類、一実施形態では、ペントサン多硫酸、ペントサン多硫酸カルシウムおよび／またはペントサン多硫酸ナトリウム。
【０２７０】
本発明の製剤はさらに、以下の：ステロイド系抗炎症薬（副腎皮質ステロイド）、カルシニューリン阻害薬（例えば、ピメクロリムス、タクロリムス）、ホスホジエステラーゼ阻害薬、抗ヒスタミン薬、抗菌剤、抗生物質、抗菌薬、セレミド（ｃｅｒｅｍｉｄｅ）、成長因子（例えば、トランスフォーミング増殖因子β１−３、血小板由来成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子Ｉ  ＆  ＩＩ、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、神経成長因子）、分裂促進剤、基質メタロプロテイナーゼ阻害薬（例えば、ＴＩＭＰ、バチマスタット、マリマスタット、およびマトリスタチンＢ）、プロテアーゼ阻害薬、ＥＣＭタンパク質、トレチノイン（ビタミンＡ）、酸化防止剤（ビタミンＥおよびＣ）、植物サイトカイニン（キネラーゼ）、銅−ペプチド錯体、ならびに多数の植物、動物およびミネラル抽出物（すなわち、コールタール抽出物）のいずれか１つ以上も含む。
【０２７１】
本発明の特定の製剤は、ステロイド系抗炎症薬との組み合わせを含む。別の組成物は、カルシニューリン阻害薬を含む。別の組成物は、抗ヒスタミン薬を含む。別の組成物は、抗菌剤を含む。別の組成物は、成長因子を含む。別の組成物は、プロテアーゼ阻害薬を含む。
【０２７２】
投与のための組成物の調製
リポソーム
リポソーム内へのタンパク質の封入は、例えば、米国特許第５，６６２，９３１号明細書、米国特許第５，８５３，７５５号明細書、米国特許第４，４８５，０５４号明細書、米国特許第５，７８０，０５４号明細書、米国特許第５，６５３，９７４号明細書、米国特許第６，０１９，９９９号明細書、米国特許第６，０２７，７２６号明細書、米国特許第５，７３９，２７３号明細書、米国特許第５，２６４，２２１号明細書、米国特許第５，４１３，８０４号明細書、米国特許第５，３７４，７１５号明細書において詳述される。
【０２７３】
ポリマー
本発明の多糖類および／またはポリペプチドは、制御放出のために生分解性合成ポリマー（または誘導体）内に封入することができる。これらのポリマー（および誘導体）としては、例えば、ポリ（エステル）（例としては、ポリ（ε−カプロラクトン）ＰＣＬ、ポリ（グリコール酸）ＰＧＡ、ポリ（Ｌ−乳酸）ＰＬＡ、ポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ、ポリ（エチレンオキシド）ＰＥＯがある）と、ポリ（エステル）誘導体（ポリ（エステル）コポリマー、ポリ（オルトエステル）を含む）と、ポリ（エステル）コポリマー（例としてはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ＰＬＧＡ、ポリ（Ｄ−乳酸）ＰＤＬＡ、ポリ（Ｌ−乳酸）ＰＬＬＡ、ＰＬＡ−ＰＥＧ、ジブロックＰＬＡ／ＰＥＧ、トリブロックＰＬＡ／ＰＥＧ／ＰＬＡがある）と、ポリ（オルトエステル）（例としては、３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）ベースのポリ（オルトエステル）がある）と、ポリ（酸無水物）（例としては、セバシン酸（ＳＡ）、ｐ−（カルボキシフェノキシ）プロパン（ＣＰＰ）、ｐ−（カルボキシフェノキシ）ヘキサン（ＣＰＨ）、ＳＡ／ＣＰＰコポリマー、ポリ（脂肪酸二量体−セバシン酸）、ポリ（酸無水物−イミド）、ポリ（酸無水物−エステル）がある）と、ポリ（アミド）（例としては、ポリ（アミノ酸）、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−リジン）ＰＬＡＬ、ポリ［Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）−Ｌ−グルタミン］、ポリ（イミノカーボネート）、チロシン誘導ポリ（カーボネート）がある）と、リン含有ポリマー、すなわちポリ（ホスファゼン）、ポリ（ジクロロホスファゼン）、ポリ（オルガノホスファゼン）、ポリ［ビス（カルボキシラトフェノキシ）−ホスファゼン］、ポリ（ホスホエステル）、ポリ（ウレタン）、ヒアルロナンキャリアとが挙げられる。
【０２７４】
カップリング
ポリペプチドおよび／または多糖類は、投与のためにコラーゲン基質にカップリングさせることができる。コラーゲン基質は、カップリングされた薬物を一定の有効な濃度で放出することができる。従って、コラーゲンおよび他のＥＣＭタンパク質基質は、ポリペプチドおよび／または多糖類を、例えばそれを必要としている組織または空間にインビボで投与するために有効に使用することができる。一実施形態では、架橋コラーゲン基質が皮下に投与される。
【０２７５】
一般論
一般に、本発明は、本明細書で議論される組成物の治療的に有効な量および／または予防的に有効な量に関し、そして／あるいはこれらを使用する。
【０２７６】
「治療的に有効な量」は、所望の効果を達成するために必要な投与および期間において有効な量を指す。
【０２７７】
「予防的に有効な量」は、細胞アポトーシスまたは組織損傷の防止また阻害などの予防的効果を達成するために必要な投与および期間において有効な量を指す。
【０２７８】
ポリペプチド
本明細書における「ポリペプチド」への言及は、単一のポリペプチド、ポリペプチドの混合物を含み、そして生物学的に活性なポリペプチド断片も含む。
【０２７９】
「実質的に精製されたポリペプチド」とは、それがその天然状態で付随される脂質、核酸、他のポリペプチド、および他の汚染分子から、少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。一実施形態では、実質的に精製されたポリペプチドは、天然に付随される他の成分が少なくとも６０％存在しない。さらなる実施形態では、実質的に精製されたポリペプチドは、天然に付随される他の成分が少なくとも７５％存在しない。さらなる実施形態では、実質的に精製されたポリペプチドは、天然に付随される他の成分が少なくとも９０％存在しない。さらに、「ポリペプチド」という用語は、本明細書において「タンパク質」という用語と同義的に使用される。
【０２８０】
ポリペプチドの％同一性は、ギャップ形成ペナルティ＝５、およびギャップ伸長ペナルティ＝０．３を用いるＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年）分析（ＧＣＧプログラム）によって決定される。他に記載されない限り、クエリー配列は少なくとも１５アミノ酸の長さであり、ＧＡＰ分析は、少なくとも１５アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。クエリー配列は少なくとも５０アミノ酸の長さでもよく、ＧＡＰ分析は、少なくとも５０アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。クエリー配列は少なくとも１００アミノ酸の長さでもよく、ＧＡＰ分析は、少なくとも１００アミノ酸の領域にわたって２つの配列を整列させる。
【０２８１】
規定のポリペプチド／酵素に関して、上述で提供されるものよりも高い同一性％の数字が、実施形態を包含し得ることは認識されるであろう。従って、適用できる場合には、最小の同一性％の数字を考慮すると、ポリペプチドは、関連の指定配列番号に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、７６％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。
【０２８２】
本明細書において使用される場合、「生物学的に活性な断片」という用語は、抗関節炎または抗炎症性活性（どちらか関連するほう）をまだ維持している規定のポリペプチドの一部を指す。このような生物学的に活性な断片は、全長タンパク質の連続的な欠失部分、および得られる断片の活性の試験によって容易に決定することができる。
【０２８３】
本明細書で定義されるポリペプチド／酵素のアミノ酸配列変異体／変異形は、ポリペプチドをコードする核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、あるいは所望のポリペプチドのインビトロ合成によって調製することができる。このような変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換を含む。欠失、挿入および置換の組み合わせを行って、最終タンパク質産物が所望の特徴を有すれば、最終構築物に到達することができる。
【０２８４】
アミノ酸配列変異体の設計において、変異部位の場所および変異の性質は、改変される特徴に依存するであろう。例えば、変異部位は、（１）まず保存的アミノ酸選択で置換し、次に、得られた結果に応じてより過激な選択で置換する、（２）標的残基を欠失させる、あるいは（３）所定の部位に隣接して他の残基を挿入することによって、個々に改変することもできるし、あるいは連続して改変することもできる。
【０２８５】
アミノ酸配列の欠失は、通常、約１〜３０残基、約１〜１０残基そして通常は約１〜５の連続残基の範囲である。
【０２８６】
置換変異体は、ポリペプチド分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。置換型の変異誘発のために最も重要性の高い部位は、活性または結合部位であると同定された部位を含む。その他の重要性の高い部位は、種々の株または種から得られた特定の残基が同一である部位である。これらの位置は、生物活性のために重要であり得る。これらの部位、特に、配列内に他にも少なくとも３つの同一に保存された部位を有する部位は、比較的保存的な形で置換され得る。このような保存的置換が表Ａに示される。
【０２８７】
さらに、所望される場合には、天然にはないアミノ酸すなわち化学的アミノ酸類似体が、本発明のポリペプチドへの置換または付加として導入され得る。このようなアミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、Ｄ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、６−アミノへキサン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、Ｄ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、デザイナーアミノ酸（例えば、Ｄ−メチルアミノ酸、Ｃ−メチルアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸など）、および概してアミノ酸類似体が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８８】
【表４】
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【０２８９】
また、例えば、ビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、抗体分子または他の細胞リガンドへの結合などによって、合成中または合成後に差別的に改変される本発明のポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。これらの改変は、本発明のポリペプチドの安定性および／または生物活性を増大させる働きをすることができる。
【０２９０】
本発明のポリペプチドは、天然タンパク質の産生および回収、組換えのタンパク質の産生および回収、ならびにタンパク質の化学合成を含む様々な方法で製造することができる。一実施形態では、本発明の単離ポリペプチドは、ポリペプチドを産生するのに有効な条件下でポリペプチドを発現することができる細胞を培養し、ポリペプチドを回収することによって産生される。培養するための１つの細胞は、本発明の組換え細胞である。有効な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする有効培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。有効培地は、本発明のポリペプチドを産生するために細胞が培養される任意の培地を指す。このような培地は、通常、同化可能な炭素、窒素およびリン酸源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養（ビタミンなど）を有する水性培地を含む。本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター皿、およびペトリ皿（ｐｅｔｒｉ  ｐｌａｔｅ）において培養することができる。培養は、組換え細胞のために適切な温度、ｐＨおよび酸素含量で実行することができる。このような培養条件は、当業者の技能の範囲内である。
【０２９１】
遺伝子治療
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、「遺伝子治療」と呼ばれることも多い処置様式においてこのようなポリペプチドを発現させることにより、本発明に従って使用され得る。従って、例えば、患者からの細胞は、エキソビボでポリペプチドをコード化するためにＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドによって操作され得る。次に、操作された細胞を、ポリペプチドとともに処置すべき患者に提供することができる。この実施形態では、細胞は、例えば、本発明の方法のために有用なポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターの使用によって、前記細胞を形質転換するためにエキソビボで操作され得る。このような方法は当該技術分野においてよく知られており、本発明におけるその使用は、本明細書における教示から明らかであろう。
【０２９２】
さらに、細胞は、当該技術分野において既知の手順によって、インビボでポリペプチドを発現するためにインビボで操作され得る。例えば、本発明の方法のために有用なポリヌクレオチドは、複製欠損レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターまたは他のベクター（例えば、ポックスウイルスベクター）において、発現のために操作され得る。次に、発現構築物は単離される。本発明の方法のために有用なポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞が形質導入され、パッケージング細胞はここで、対象の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生する。これらの産生細胞を患者に投与すると、細胞をインビボで操作し、ポリペプチドをインビボで発現させることができる。本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかなはずである。
【０２９３】
上述のレトロウイルスプラスミドベクターが由来し得るレトロウイルスにとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫（Ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｓａｒｃｏｍａ）ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスに由来する。
【０２９４】
このようなベクターは、ポリペプチドを発現するための１つ以上のプロモーターを含むであろう。使用され得る適切なプロモーターとしては、レトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞プロモーター（ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを含むがこれらに限定されない）などの細胞プロモーターも使用することができる。使用され得る付加的なウイルスプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含有される教示から当業者には明らかであろう。
【０２９５】
本発明の方法のために有用なポリペプチドをコードする核酸配列は、適切なプロモーターの制御下に置かれるであろう。使用され得る適切なプロモーターとしては、アデノウイルスプロモーター（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーターなど）、または非相同プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど）、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーターなど）、ヒートショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、ウイルスチミジンキナーゼプロモーター（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど）、レトロウイルスＬＴＲ（上述に記載される改変レトロウイルスＬＴＲを含む）、β−アクチンプロモーター、およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。またプロモーターは、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する天然プロモーターであってもよい。
【０２９６】
レトロウイルスプラスミドベクターは、パッケージング細胞株を形質導入して産生細胞株を形成するために使用される。形質移入され得るパッケージング細胞の例としては、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０年）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１：５−１４に記載されるように、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｙ−２、Ｙ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＹＣＲＥ、ＹＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
ベクターは、当該技術分野において既知の任意の手段によって、パッケージング細胞内に形質導入され得る。このような手段には、エレクトロポレーション、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈殿が含まれるが、これらに限定されない。１つの代替例では、レトロウイルスプラスミドベクターはリポソーム内に封入されてもよいし、あるいは脂質に結合されてもよく、その後、宿主に投与され得る。
【０２９８】
産生細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を生じるであろう。このようなレトロウイルスベクター粒子は、次に、インビトロまたはインビボのいずれかで真核細胞を形質導入するために使用され得る。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現するであろう。形質導入され得る真核細胞としては、間葉系細胞、軟骨細胞、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および気管支上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９９】
本発明に従う遺伝子治療は、遺伝子治療ポリヌクレオチドが患者内に一時的に（仮に）存在することを含んでもよいし、あるいはポリヌクレオチドが患者に永久的に導入されることを含んでもよい。
【０３００】
本発明に従う上述の薬剤の直接投与のような遺伝子治療は単独で使用されてもよいし、他の治療様式と共に使用されてもよい。
【０３０１】
医薬品組成物の調製および投与
場合によりポリペプチドと共に投与される多糖類の量は、個人の病状、年齢、性別、および体重などの因子に従って変わり得る。投与計画は、最適な治療反応を提供するように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与されてもよいし、数回の分割用量が時間をかけて投与されてもよいし、あるいは治療状況の緊急性により指示されるときには用量を比例的に減少または増大してもよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために非経口組成物を単位剤形において配合することが有利であるかもしれない。「単位剤形」は、本明細書において使用される場合、処置すべき被験者のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、それぞれの単位は、必要とされる医薬品キャリアと関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含有する。
【０３０２】
場合によりポリペプチドを伴う多糖類が、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む組成物の形態で投与され得ることは認識されるであろう。
【０３０３】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容可能なキャリア」または「賦形剤」は、生理学的に適合性である任意の全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌薬および抗菌・カビ類剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。一実施形態では、キャリアは非経口投与に適している。あるいは、キャリアは、静脈内、腹腔内、筋肉内、舌下または経口投与に適していてもよい。薬学的に許容可能なキャリアには、無菌水溶液または分散液、および注入可能な無菌溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合性でない場合を除いて、本発明の医薬品組成物においてその使用が意図される。補助的な活性化合物も組成物中に取り入れることができる。
【０３０４】
治療組成物は、通常、製造および貯蔵条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、ミクロエマルジョン、リポソーム、または他の規則的な構造で配合することができる。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれることが好ましいであろう。注入可能な組成物の長期にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含有させることによってもたらすことができる。さらに、多糖類および／またはポリペプチドは、持続放出製剤、例えば遅延放出ポリマーを含む組成物において投与されてもよい。活性化合物は、植込錠およびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、急速な放出に対して化合物を保護し得るキャリアと共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸、およびポリ乳酸、ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧ）などの分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。このような製剤を調製するための多くの方法は特許が取得されているか、あるいは一般に当業者に知られている。
【０３０５】
場合によりポリペプチドを伴う多糖類は、例えば、骨、軟骨、筋肉、神経、表皮および／または他の結合組織の成長のための表面を提供するために、適切な基質と組み合わせて投与されてもよい。基質は、伝統的な基質バイオマテリアルの形態であり得る。基質は、細胞、上清または可溶性因子の遅延放出を提供することができる。
【０３０６】
基質材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械特性、美容的外観および界面特性に基づく。組成物のために可能性のある基質は、生分解性で化学的に定義された硫酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ酸無水物であり得る。その他の可能性のある材料は生分解性で生物学的に明確に定義された、骨または皮膚コラーゲンなどである。さらなる基質は、純粋なタンパク質または細胞外基質成分で構成される。その他の可能性のある基質は非生分解性で化学的に定義された、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸塩、または他のセラミックなどである。基質は、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三カルシウムなどの上述のタイプの材料の任意の組み合わせで構成されてもよい。バイオセラミックスは、例えばカルシウム−アルミン酸−リン酸などにおけるように、組成が改変されてもよく、そしてポアサイズ、粒径、粒子形状、および生分解性を改変するために処理してもよい。
【０３０７】
本発明の組成物は、１つ以上の多糖類および／またはポリペプチドから調製することができる。付加的な多糖類および／またはポリペプチド断片またはペプチドは、本明細書、特許請求の範囲および図面を考慮すれば、日常的な実験によって同定することができる。刺激活性を有するペプチド断片を同定するための方法は、例えば米国特許第５，３９９，３４２号明細書に記載されている。
【０３０８】
医薬品組成物は人間医学および獣医学におけるヒトまたは動物使用のためのものでよく、通常、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアまたは賦形剤のいずれか１つ以上を含むであろう。治療的使用のための許容可能なキャリアまたは希釈剤は製薬技術分野においてよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編  １９８５年）に記載されている。医薬品キャリア、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な薬業の慣例に即して選択することができる。医薬品組成物は、キャリア、賦形剤または希釈剤として、あるいはこれらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、コーティング剤、または可溶化剤を含んでもよい。
【０３０９】
異なる送達系に依存して、異なる組成物／製剤の要件が存在し得ることは、当該技術分野においてよく知られている。
【０３１０】
本発明によると、非侵襲性製剤も包含される。例えば、前駆細胞は非経口的に、例えば関節内に投与される可能性が高いが、多硫酸化多糖類は、吸入によって、経口的または鼻腔内に、坐薬またはペッサリーの形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または散布粉末の形態で局所的に、皮膚パッチの使用によって、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、あるいはカプセル、咀嚼錠または小卵（ｏｖｕｌｅ）（単独で、または賦形剤と混合して）において、あるいは風味剤または着色剤を含有するエリキシル剤、溶液、シロップまたは懸濁液の形態で、投与することができる。
【０３１１】
頬側のまたは舌下投与のために、組成物は、例えば、従来の方法で配合することができる錠剤またはロゼンジの形態で投与され得る。
【０３１２】
経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤または粉末の形態を取ることができ、１０％〜９５％、特に２５％〜７０％の活性成分を含有する。患者への経口投与のためのカプセル、錠剤および丸薬には、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｓ」、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶コーティングが提供されてもよい。
【０３１３】
鼻腔内製剤は記載されており、ラースリティック（ｌａｒｔｈｒｙｔｉｃ）コラーゲンＩＩ型およびラースリティック（ｌａｒｔｈｒｙｔｉｃ）コラーゲンＩＸ型の投与は、例えば、Ｌｕら（１９９９年）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＸ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｓｔａｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９０巻  １１９−１２７頁（１９９９年）に記載されている。
【０３１４】
別の実施例では、本発明の医薬品組成物は、例えば、経鼻スプレーまたは吸入用エアロゾルまたは摂取可能な溶液として、ミニポンプを用いるかあるいは粘膜経路によって送達されるように配合される。
【０３１５】
薬剤は、胃腸粘膜を通って粘膜で送達される場合、胃腸管を通過する間、安定なままであることができなければならず、例えば、タンパク質分解、安定な制酸剤、ｐＨに耐性であり、胆汁の洗浄効果（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ）に耐性でなければならない。
【０３１６】
一実施形態では、本発明の多硫酸化多糖類は、非侵襲性の経路によって投与される。さらなる実施形態では、非侵襲性の経路は、経口投与または経腸投与、経鼻投与または吸入による投与を含む。
【０３１７】
代替の実施形態では、本発明の組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内または皮下に注入することができる。
【０３１８】
非経口投与のために、組成物は、他の物質、例えば血液と等張の溶液を作るのに充分な塩または単糖を含有し得る無菌水溶液の形態において使用されるのが最適であり得る。調製物は乳化されてもよく、あるいはリポソーム内に封入されてもよい。
【０３１９】
配合した後、免疫保護組成物は、無菌容器内に取り込むことができ、これは次に、密封されて低温、例えば４℃で貯蔵されるか、あるいは凍結乾燥され得る。凍結乾燥は、安定した形態で長期間の貯蔵を可能にする。
【０３２０】
本発明の一実施形態では、前駆細胞、特に軟骨前駆細胞、さらにより特別にはＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞および／またはその子孫細胞が、組成物の形態で投与される。一実施形態では、このような組成物は、薬学的に許容可能なキャリアおよび／または賦形剤を含む。
【０３２１】
「キャリア」および「賦形剤」という用語は、活性化合物の貯蔵、投与、および／または生物活性を促進するために当該技術分野において従来使用されている物質の組成物を指す（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８０年）を参照）。キャリアは、活性化合物の好ましくない副作用を低減することもできる。適切なキャリアは、例えば安定であり、例えば、キャリア内の他の成分と反応することができない。一実施例では、キャリアは、処置のために使用される投与量および濃度においてレシピエントに局所的または全身的な著しい悪影響を生じない。
【０３２２】
本発明のために適切なキャリアは従来使用されるものを含み、例えば、水、生理食塩水、デキストロース水、ラクトース、リンゲル液、緩衝液、ヒアルロナンおよびグリコールは、特に（等張の場合）溶液のために好ましい液体キャリアである。適切な医薬品キャリアおよび賦形剤としては、デンプン、セルロース、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク（ｃｈａｌｋ）、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。
【０３２３】
別の実施例では、キャリアは、例えば、細胞が成長または懸濁される培地組成物である。更なる実施例では、このような培地組成物は、投与される被験者において悪影響を誘発しない。
【０３２４】
好ましいキャリアおよび賦形剤は、細胞の生存率に悪影響を与えない。
【０３２５】
一実施例では、キャリアまたは賦形剤は緩衝活性を提供して、細胞および／または可溶性因子を適切なｐＨに維持し、それにより生物活性を発揮する。例えば、キャリアまたは賦形剤はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。ＰＢＳは、細胞および因子と最小限にしか相互作用をせず、細胞および因子の急速な放出を可能にするので、本発明の組成物が、例えば注射によって、血流、または組織もしくは組織を包囲するか組織に隣接する領域内に直接適用するための液体として製造され得る場合、魅力的なキャリアまたは賦形剤の代表である。
【０３２６】
前駆細胞、特に軟骨前駆細胞、さらにより特別にはＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞および／またはその子孫細胞を、レシピエント適合性であり、そしてレシピエントに有害でない産物に分解するような足場内に取り込むか、または移植することもできる。これらの足場は、レシピエント被験者に移植され得る細胞に支持および保護を提供する。天然および／または合成の生分解性足場はこのような足場の例である。
【０３２７】
本発明の実施において、様々な異なる足場を上手に使用することができる。足場には、生物学的に分解可能な足場が含まれるが、これに限定されない。天然生分解性足場は、コラーゲン、フィブロネクチン、およびラミニン足場を含む。細胞移植足場のための適切な合成材料は、広範な細胞成長および細胞機能を支持することができるべきである。このような足場は吸収性でもあり得る。適切な足場は、例えば、Ｖａｃａｎｔｉら  Ｊ．Ｐｅｄ．Ｓｕｒｇ．２３：３−９頁、１９８８年、Ｃｉｍａら  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：１４５頁、１９９１年、Ｖａｃａｎｔｉら  Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．８８：７５３−９頁、１９９１年に記載されるようなポリグリコール酸足場、またはポリ酸無水物、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの合成ポリマーを含む。
【０３２８】
別の実施例では、細胞は、ゲル足場（例えば、Ｕｐｊｏｈｎ  ＣｏｍｐａｎｙからのＧｅｌｆｏａｍなど）において投与され得る。
【０３２９】
本発明のために有用な細胞組成物は単独で、あるいは他の細胞との混合物として投与され得る。本発明の組成物と共に投与され得る細胞には、その他の多分化能または多能性の細胞または幹細胞、または骨髄細胞が含まれるが、これらに限定されない。異なる型の細胞は、投与の直前または少し前に本発明の組成物と混合されてもよいし、投与前のしばらくの間、一緒に同時培養されてもよい。
【０３３０】
一実施形態では、組成物は、有効量または治療的もしくは予防的に有効な量の細胞を含む。例えば、組成物は、約１×１０５個のＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞／ｋｇ〜約１×１０７個のＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞／ｋｇ、または約１×１０６個のＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞／ｋｇ〜約５×１０６個のＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞／ｋｇを含む。投与すべき細胞の正確な量は、患者の年齢、体重、性別、ならびに膵臓機能障害の範囲および重症度を含む様々な因子に依存する。同じ値は、本質的に、前駆細胞および軟骨前駆細胞にも適用可能である。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、細胞はチャンバ内に含有され、細胞が被験者の循環内へ出て行くことは許されないが、細胞により分泌される因子は循環に入ることが許される。この方法では、被験者の循環に入る可溶性因子を細胞が分泌できるようにすることによって、因子が被験者に投与され得る。可溶性因子の局所レベルを増大するためにこのようなチャンバを被験者の部位に同様に埋め込むことができる。例えば、移植された器官の中または近くに埋め込むことができる。
【０３３２】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞組成物による治療の開始前に患者の免疫を抑制することが必要でないか、または望ましくないことがある。従って、いくつかの例では、同種異系さらには異種のＳｔｒｏ−１ｂｒｉ細胞またはその子孫による移植が耐容性を示し得る。
【０３３３】
しかしながら、他の例では、細胞治療を開始する前に薬理学的に患者の免疫を抑制することが望ましいか、または適切であり得る。これは、全身的または局所的な免疫抑制剤の使用によって達成されてもよいし、あるいはデバイス内に細胞を封入して送達することによって達成されてもよい。細胞は、細胞および治療因子が必要とする栄養物および酸素に対して透過性のカプセル内に封入され得る（細胞は免疫性の体液因子および細胞に対してまだ透過性でない）。カプセルの材料は低アレルギー性であってもよく、標的組織内に容易にそして安定して配置され、埋め込み構造に付加的な保護を提供する。移植細胞への免疫反応を低減または排除するためのこれらの手段および他の手段は、当該技術分野において知られている。代替案として、細胞は、その免疫原性を低減するように遺伝子組換えされ得る。
【０３３４】
使用および処置方法
本発明の方法、組成物、および使用は、関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）および椎間板変性症（ＤＤ）などの筋骨格系の疾患の処置および／または予防のために有用である。これらは、軟骨の再生および修復に関しても有用に使用することができる。
【０３３５】
本発明の方法、組成物、および使用は、これらが軟骨形成および細胞増殖を調節でき、ヒアルロナン（ＨＡ）の産生を産生、上方調節または刺激するために使用することができるという点でも有用である。これらの使用は、関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）、および椎間板変性症（ＤＤ）を含む筋骨格系の疾患の処置、またはＨＡの産生の増大から利益を得る状態（例えば、滑膜関節の変形性関節症など）の処置、眼科、手術後の腹部の癒着の予防、皮膚の処置、ならびに細胞外基質の機能の修復および回復、または軟骨の修復、回復または基質新生の誘発においても使用することができる。
【０３３６】
更なる使用は、このような処置を必要としている被験者における結合組織の欠損への移植に適した細胞外基質を産生することを含む。
【０３３７】
本発明の方法は、従って、上述の多数の疾患から患者、いくつかの実施形態ではヒト患者を処置するために使用することができる。方法は、予防的に、これらの疾患の発症を防止するためまたは最低限にするために使用することもできる。
【０３３８】
また本発明は、関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）および椎間板変性症（ＤＤ）などの筋骨格系の疾患の処置および／または予防において使用するための本明細書で議論される組成物にまで及ぶ。これらは、軟骨の再生および修復、またはＨＡの産生の増大から利益を得る状態（例えば、滑膜関節の変形性関節症など）の処置、眼科、手術後の腹部の癒着の予防、皮膚の処置、ならびに細胞外基質の機能の修復および回復、または軟骨の修復、回復または基質新生の誘発に関しても有用に使用することができる。
【０３３９】
本明細書で議論される組成物は、このような処置を必要としている被験者における結合組織の欠損への移植に適した細胞外基質の産生においても使用することができ、軟骨形成および細胞増殖を調節するためそして／あるいはヒアルロナン（ＨＡ）の産生を産生、上方調節または刺激するためにも使用することができる。
【０３４０】
また本発明は、関節リュウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ）および椎間板変性症（ＤＤ）などの筋骨格系の疾患の処置および／または予防のための薬剤の製造における、本明細書で議論される組成物の使用にまで及ぶ。また使用は、軟骨の再生および修復、またはＨＡの産生の増大から利益を得る状態（例えば、滑膜関節の変形性関節症など）の処置、眼科、手術後の腹部の癒着の予防、皮膚の処置、ならびに細胞外基質の機能の修復および回復、または軟骨の修復、回復または基質新生の誘発にまで及ぶ。
【０３４１】
本明細書で議論される組成物の使用は、このような処置を必要としている被験者における結合組織の欠損への移植に適した細胞外基質を産生するため、そして軟骨形成および細胞増殖を調節し、そして／あるいはヒアルロナン（ＨＡ）の産生を産生、上方調節または刺激するための薬剤の製造にまで及ぶ。
【０３４２】
本発明によって、前駆細胞を患者に移植するための本発明の組成物の投与が可能になり、これが次に誘発されて、ＨＡ産生を増大させ、そして／あるいは軟骨形成表現型へと形質転換される。
【０３４３】
このような用途の例は、軟骨または椎間板の病変部を有する個人の関節内に、またはその他のあまり接近しやすくない部位のためには全身的に、本発明の組成物を注入することであり、調製物が組織および細胞を灌流できるようにすることによって、その独特の生物学的効果を発揮し得るようにする。用途は、臨床的に定義された疾患（多くの場合、ＯＡまたは関連の障害）を有さないかもしれないが、スポーツまたは仕事関連の活動による関節組織への外傷を受けている個人の任意の治療を含み得る。
【０３４４】
ＯＡまたは関連の障害を有する高齢患者では、関節内ＨＡ治療（関節内補充療法）の代わりにこの形の処置が使用されるであろう。
【０３４５】
また、関節鏡下手術または開放手術（軟骨または半月板の切除／壊死組織切除が必要であった場合）の後の予防方法としての機能も果たし得る。このような手術後の患者は、一般に、時間と共に進行して医学的処置を必要とする症候性ＯＡを示すことが十分に確立されている。軟骨の劣化を減少させることによって、炎症を促進する軟骨由来の自己抗原の産生の低下のために症状も改善されることがあり得る。
【０３４６】
活性を有することが示されている本発明に従う組成物は、さらに、他の動物モデルにおいて安全性および効力について試験され、所望される場合には、次に、ヒトにおける臨床試験に進む。当然、獣医学用途については、ヒトにおける臨床試験は必要とされない。動物またはヒトにおいて安全で効果的である組成物は、本明細書で議論される疾患を処置するため、あるいはそれに対して保護するために適切な被験者に投与することができる。「処置および保護」は、本明細書で議論される疾患の開始および出現を防止するための予防的および治療的な手段の両方を含む。
【０３４７】
本明細書における処置方法は、本発明のポリペプチドを含む医薬品組成物を投与しない場合と比べた、症状に対する防御または阻害、症状の出現の遅延、症状の進展の重症度の低減、および／または個人が患う症状の数または種類の低減を指す。従って、本発明による処置に従って筋骨格変性状態の症状を１つでも臨床的または統計的に有意に減弱することが本発明の範囲内にあることが、この説明全体を通して、理解されるであろう。
【０３４８】
以下の実施例は本発明の態様をさらに説明する。しかしながら、決して本明細書に記載される本発明の教示または開示の限定ではない。
【０３４９】
結果および考察
本発明は、多数および少数の両方の前駆細胞を含有するＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）および７．５％のＤＭＳＯなどの低温貯蔵培地に広い濃度範囲にわたる多硫酸化多糖類を添加することが、その後、液体窒素蒸気相中で凍結し、周囲温度または３７℃で解凍しても、その生存率に対して有害な影響を与えないことを示した。これは、図１〜３から分かる。実際、これらの実験から生存率の向上が見られ、特に図３、および図４において、多硫酸化多糖類を含有しない凍結保存培地中で凍結された前駆細胞と比べて、前駆細胞生存率が高められたことが示される。
【０３５０】
図６は、アポトーシスの既知のメディエーターであるＩＬ−４およびＩＦＮ−γと共にヒト前駆細胞をインキュベートしたときに、１マイクログラム／ｍＬよりも高い濃度の多硫酸化多糖類がこれらの細胞におけるアポトーシスを約５０％低減することを明確に示す。
【０３５１】
また、多硫酸化多糖類が前駆細胞の増殖を濃度依存的に刺激することも示された。ＷＳＴ−１ミトコンドリアデヒドロゲナーゼ切断アッセイで測定される、細胞分裂の顕著な刺激が図４において見られ、ヒト前駆細胞の単層およびマイクロマス培養において１〜５マイクログラム／ｍＬの範囲にわたって実証された図５における３Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取込み、そして図１０のマウス前駆細胞株における取込みから分かる。
【０３５２】
骨形成培地で培養したときに前駆細胞の骨芽細胞への分化を促進する、ＢＭＰ−ＴＧＦ−βスーパーファミリーのいくつかのメンバー（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８）および線維芽細胞成長因子ファミリーとは対照的に、多硫酸化多糖類は、この細胞表現型への前駆細胞の分化を抑制することが初めて分かった。これは図７において見られ、骨形成に関する前駆細胞の下方調節が示される。
【０３５３】
他方で、多硫酸化多糖類の存在下、脂肪生成培地中で培養された前駆細胞は、脂肪細胞への分化を示した。従って、多硫酸化多糖類は、脂肪細胞への前駆細胞の分化の制御因子の役割をする。これは図８において見ることができる。
【０３５４】
通常の非選択的培養条件下での、前駆細胞との多硫酸化多糖類のインキュベーションは、プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲン合成の増大によって実証されるように、常に軟骨形成経路に沿った分化を好んだ。プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンは軟骨細胞の生合成産物と認識され、ヒアリン軟骨の表現型マーカーとして使用される。多硫酸化多糖類の軟骨形成促進効果は、単層で培養される場合に、図９ではマウスＭＳＣ細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２において、そして図１１ではヒト前駆細胞において示された。
【０３５５】
付加的な支持が、マウスＡＴＤＣ５細胞株を用いるペレット培養において提供され、図１２では、２マイクログラム／ｍＬにおいて、対照培養（多硫酸化多糖類を含まない）と比較してプロテオグリカン（ＰＧ）合成の２５％の増大が観察された。
【０３５６】
多硫酸化多糖類が軟骨形成および軟骨形成を促進する付加的な証拠は６日間のペレット培養後のこれらの細胞による遺伝子発現の検査によって提供され、ＩＩ型コラーゲンの発現が多硫酸化多糖類によって濃度依存的に上方調節された。これは、図１３において見ることができる。
【０３５７】
興味深いことに、天然に存在する多硫酸化多糖類のヘパリンは、検査した全ての濃度について、ペレット培養でプロテオグリカン合成を有意に刺激することができなかった。これは、図１４において見ることができる。ヘパリンは２．５マイクログラム／ｍＬの濃度では活性をほとんど示さないが、より高い濃度では阻害を引き起こし得る。
【０３５８】
７日間のペレット培養でマウスＭＳＣ株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を用いると、多硫酸化多糖類は、１０マイクログラム／ｍＬで、プロテオグリカンの合成を対照値の８０％よりも多く増大させることが実証された。これは、図１５において見ることができる。この所見は、６日間にわたるマイクロマス培養でマウスＭＳＣ株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２を用いて得られる結果（図１６において見ることができる）と一致した。前駆細胞を培養するこの方法は、最初に、Ｄｅｎｋｅｒら（Ａｎｄｒｅｗ  Ｅ．Ｄｅｎｋｅｒ  ＡＥ，Ｈａａｓ  ＡＲ，Ｎｉｃｏｌｌ  ＳＢ，Ｔｕａｎ  ＲＳ．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｉ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  （１９９９年）６４：６７−７６頁、１９９９年）によって記載された。
【０３５９】
さらに、９日間のマイクロマス培養の後、１マイクログラム／ｍＬの多硫酸化多糖類で１００％の刺激が得られ、これも図１６に示される。ヒト前駆細胞は、多硫酸化多糖類の存在下でインキュベートしたときに、マイクロマス培養で軟骨細胞にも分化した。しかしながら、５日間の培養では、図１７に示されるように、２．５マイクログラム／ｍＬの多硫酸化多糖類濃度で３０％のＰＧ合成の最大刺激が得られた。Ｄｅｎｋｅｒら（Ａｎｄｒｅｗ  Ｅ．Ｄｅｎｋｅｒ  ＡＥ，Ｈａａｓ  ＡＲ，Ｎｉｃｏｌｌ  ＳＢ，Ｔｕａｎ  ＲＳ．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｉ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｉｎ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  （１９９９年）６４：６７−７６頁、１９９９年）によって記載される免疫染色技法を用いて、これらのマイクロマス培養において、ＰＧとＩＩ型コラーゲンの同時産生を確認した。
【０３６０】
図１８から明らかであるように、多硫酸化多糖類の存在下で１〜１０マイクログラム／ｍＬの濃度範囲にわたって１０日間維持したヒト前駆細胞のマイクロマス培養は、強いＩＩ型コラーゲン染色を提供し、５マイクログラム／ｍＬの多硫酸化多糖類で最大レベルが達成された。
【０３６１】
ヒト前駆細胞およびヒアルロナン（ＨＡ）で行われた同様のマイクロマス培養では、図１９Ａにおいて、ＰＧへの低レベルの３５ＳＯ４の取込みが観察された。しかしながら、高度に負に帯電したデキストラン硫酸（ＤＳ）は、１〜２０マイクログラム／ｍＬの範囲にわたってＰＧ合成を阻害した（図１９Ｂ）。ＤＳは多硫酸化多糖類と同様の分子量および電荷密度を有し、従って前駆細胞における同様の活性を実証することが期待されたので、これは驚くべき結果であった。有効な受容体結合およびタンパク質相互作用のために重要な分子配座およびその他の因子が役割を果たし得ると考えられる。
【０３６２】
ヒアルロナンは、アルギン酸ビーズ培養において前駆細胞に対する軟骨形成効果を発揮することが報告されている（Ｋａｖａｌｋｏｖｉｃｈ  ＫＷ，Ｂｏｙｎｔｏｎ  ＲＥ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＪＭ，Ｂａｒｒｙ  Ｆ．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａｎ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｌａｙｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ−Ａｎｉｍａｌ．３８：４５７−４６６頁、２００２年）。図２０には、ヒト前駆細胞増殖に対するペントサン多硫酸の単独の効果およびヒアルロナン（ＳｕｐａｒｔｚＴＭ）と組み合わせた効果が、ＷＳＴ−１アッセイを用いて、３日目および５日目の培養物について示されている。この実験の結果は、ＨＡだけによる前駆細胞増殖に対する有意の刺激効果が存在しないことを確認し、多硫酸化多糖類との組み合わせの相乗剤効果が存在しないことも実証する。従って、多硫酸化多糖類はＨＡよりも優れた軟骨形成剤であることが分かる。さらに、ＮＣ４とは対照的に、ＨＡは、多硫酸化多糖類と相乗的に組み合わせられない。
【０３６３】
また、ＩＸ型コラーゲンのα−１鎖の非コラーゲン性ドメインの組換えヒト調製物ｒｈＮＣ４も、前駆細胞による軟骨形成およびＰＧ産生を誘発することが分かった。図２１から明らかであるように、ＰＧ合成の濃度依存性刺激は、ＡＴＤＣ５細胞において、インスリンの不在（維持培地）下およびインスリンの存在（分化培地）下の両方で観察され、最大効果は１マイクログラム／ｍＬで生じた。ｒｈＮＣ４のこの刺激性効果は、ＡＴＤＣ５細胞のペレット培養においても実証されたが、維持培地中では、最適効果は０．５マイクログラム／ｍＬの濃度で生じた。
【０３６４】
マウスＡＤＴＣ５細胞におけるｒｈＮＣ４の軟骨形成および分裂促進効果は、図２３および２４において分かるように、タンパク質が多硫酸化多糖類と共に同時培養される場合に増強されることが観察された。１マイクログラム／ｍＬのｒｈＮＣ４および２マイクログラム／ｍＬの多硫酸化多糖類濃度の分化培地における３Ｈ−ＤＮＡ合成の４５０％の刺激によって示されるように、ｒｈＮＣ４および多硫酸化多糖類の組み合わせは、ＨＡおよび多硫酸化多糖類とは対照的に相乗的であった（図２３）。ＰＧ合成の刺激に関して、５マイクログラムの多硫酸化多糖類を伴う１〜５マイクログラム／ｍＬのｒｈＮＣ４は、最も有効な組み合わせであると思われた（図２４）。
【０３６５】
図２１、３３および２３は、成長因子（この場合、インスリン）を含有する前駆細胞（ＡＴＤＣ５）のための分化培地（ＤＭ）、および成長因子を含有しない維持培地（ＭＭ）の両方を用いた実験結果を示す。図２１はＮＣ４だけの使用を示すが、図３３および２３は、ポリペプチドおよび多硫酸化多糖類の組み合わせの効果を示す。本発明の化合物は成長因子の不在下で軟骨形成を促進したが、成長因子の存在下では軟骨形成の速度に対するプラスの効果も有したことが分かる。そのため、本発明の化合物は、他の成長因子を用いずに使用することができるが、他の成長因子と共に使用して、軟骨形成をさらに促進することもできる。
【０３６６】
ｒｈＮＣ４および多硫酸化多糖類の存在下で培養されたＡＴＤＣ５細胞によるＲｕｎｘ２遺伝子の発現の研究は、濃度の増大と共に進行するこの骨マーカーの下方調節を示した（図２５および２６）。対照的に、ＨＡ合成のための遺伝子の１つ（ＨＡＳ３）およびＨＡの受容体（ＣＤ４４）はいずれもこれらの化合物によって上方調節された（図２５および２６）。特に重要なのは、ＰＧ合成を刺激すると図示された濃度における多硫酸化多糖類のみ、および多硫酸化多糖類＋ｒｈＮＣ４によるＳｍａｄ２およびＳｍａｄ４の上方調節の発見であった。Ｓｍａｄ４は、これらの細胞がＢＭＰによって活性化される場合に、前駆細胞におけるＩＩ型コラーゲンプロモーターのトランス活性化のための主要な細胞内タンパク質であることが報告されている（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  Ｙら，Ｓｍａｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  ＡＭ．８５Ａ  Ｓｕｐｐｌ  ３，１３−８頁、２００３年、Ｃｈｅｎ  Ｄ，Ｚｈａｏ  Ｍ，Ｍｕｎｄａｙ  ＧＲ，Ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，２２：２３３−４１頁、２００４年）。理論により束縛されることは望まないが、従って、多硫酸化多糖類およびＮＣ４の前駆細胞における軟骨形成／増殖効果がＢＭＰの作用によって仲介され、そのレベルが、単独または組み合わせて使用したときのこれらの２つの化合物の存在下で上昇することが可能である。
【０３６７】
実験方法およびプロトコール
ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイを用いるサンプルタンパク質含量の決定
全てのサンプルのタンパク質含量は、ＢＣＡアッセイを用いて決定した（Ｓｍｉｔｈ  ＰＫ，Ｋｒｏｈｎ  ＲＩ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ＧＴ，Ｍａｌｌｉａ  ＡＫ，Ｇａｒｔｎｅｒ  ＦＨ，Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ  ＭＤ，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ＥＫ，Ｇｏｅｋｅ  ＮＭ，Ｏｌｓｏｎ  ＢＪおよびＫｌｅｎｋ  ＤＣ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０，７６−８５頁、１９８５年）。凍結乾燥したタンパク質サンプルをＨ２Ｏ中に直接溶解し、２．０ｍｇ／ｍｌの溶液を提供した。２０μｌのそれぞれのサンプル溶液を９６ウェルプレートのウェルに添加した。アッセイの直前に、５０部の試薬１（０．４％のＮａＯＨ、１．７％のＮａ２ＣＯ３、０．９５％のＮａＨＣＯ３、１．０％のビシンコニン酸、０．１６％のＮａ２−酒石酸）を試薬２（４％のＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ）と混合した。２００μｌのこの作用試薬をサンプル溶液に添加した。３７℃で６０分間のインキュベーションの後、Ｔｈｅｒｍｏｍａｘマイクロプレートリーダーを用いて吸光度Ａ５６２を読み取った。０〜１０μｇ／ウェルのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または高度に精製したゼラチン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて標準曲線を作成した。この標準曲線からサンプルのタンパク質含量を決定した。
【０３６８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によるタンパク質の分析
使用される方法は、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ  ＵＫ．Ｃｌｅｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．Ｎａｔｕｒｅ．１９７０年；２２７：６８０−６８５頁）によって記載される方法に基づく。簡単に述べると、サンプルを２×サンプルローディング緩衝液（０．０７ＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１．５％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、０．２ＭのＤＴＴおよび０．１％のＢＰＢ）と１：１で混合して、４．０〜２０ｍｇ／ｍｌの間の最終濃度を達成した。混合物を水浴中で５分間沸騰させた。８〜１６％のプレキャストＴｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｒｖｅｘ）のウェルに２０μｌの溶液をロードした。あらかじめＳｅｅＢｌｕｅ染色された低分子量範囲のタンパク質マーカー（Ｎｏｒｖｅｘ）をゲルの左側でウェルにロードし、１２５Ｖで２時間電気泳動法を実施した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  Ｒ２５０溶液（４０％のエタノール、１０％の酢酸および０．２％のＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒ２５０）中で３０分間、ゲルを染色し、１０％のエタノールおよび７．５％の酢酸を含有する溶液中で１６時間、脱染した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｌａｉｒ乾燥器においてゲルを乾燥させた。
【０３６９】
ＤＭＭＢ色素を用いる硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）アッセイ
サンプル中の硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）濃度は、Ｆａｒｎｄａｌｅら（Ｆａｒｎｄａｌｅ  ＲＷ，Ｂｕｔｔｌｅ  ＤＪ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＡＪ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９８６年、８８３：１７３−１７７頁）によって記載されるものから修正された比色色素結合アッセイを用いて決定した。このアッセイは、サンプルまたは標準溶液中で、１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）および硫酸化ＧＡＧの混合物の間で複合体が形成された場合の、吸収最大値の６９０ｎｍから５３５ｎｍへの異染性シフトに基づく。ｐＨ３．５の全容積１リットルにおいて、１６ｍｇの１，９−ジメチルメチレンブルーを５ｍｌのエタノールへ添加し、２ｇのギ酸ナトリウムおよび２ｍｌのギ酸に添加することによって色素溶液を作った。コンドロイチン−６−硫酸（ＣＳ−Ｃ）標準物（０〜１５および０〜４０μｇ／ｍｌ：５０μｌ）またはサンプル（５０μｌ）をマイクロタイタープレートに移した。色素溶液（２００μｌ）を各ウェルに直ちに添加し、放置しておくと沈殿が生じ得るので、直ぐに５４０ｎｍで吸光度を測定した。既知のＣＳ−Ｃ濃度のサンプルの吸収およびプレートリーダーソフトウェアを用いて標準曲線をプロットした。未知のサンプル中のＳ−ＧＡＧの濃度は、ＣＳ−Ｃ標準曲線から決定した。
【０３７０】
ヒアルロナン（ＨＡ）ＥＬＩＳＡ
コーティング緩衝液に溶解された臍帯ＨＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）（１００μｌ／ウェル）を用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、Ｎｕｎｃ）を４℃で一晩被覆した。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを１５０μｌ／ウェル用いて、２５℃で６０分間非被覆領域をブロックした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、評価される１００μｌのサンプルまたは標準競合物（ＨＡ  Ｈｅａｌｏｎ（登録商標）：範囲１９．５３〜１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を、ビオチン結合−ＨＡ−結合タンパク質（１：２００）と一緒に添加した。２５℃で６０分間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、次にペルオキシダーゼ−マウスモノクローナル抗ビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１００μｌ／ウェル、１：４，０００）を添加し、混合物を２５℃で６０分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、次に、ペルオキシダーゼ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１００μｌ／ウェル）を添加し、３７℃で１０〜２０分間インキュベートして、発色を可能にした。５０μｌの４ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。Ｔｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｍ３４０マルチプレートリーダーを用いて４９２／６９０ｎｍにおける吸光度比を測定した。
【０３７１】
半定量的ＲＴ−ＰＣＲｍＲＮＡ
Ａｕｒｕｍ全ＲＮＡミニキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）についての製造業者の使用説明書に従って、前駆細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを逆転写した。表２  １および２は、ＰＣＲのためのプライマー配列および使用条件を示す。ＰＣＲ産物をアガロースゲルに移し、臭化エチジウム染色によって可視化し、Ｓｃｉｏｎ画像分析ソフトウェアを用いて集積密度を計算し、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して基準化し、ｍＲＮＡレベルにおける半定量的比較を可能にした（Ｌ．Ｍａｒｃｈｕｋ，Ｐ．Ｓｃｉｏｒｅ，Ｃ．Ｒｅｎｏ，Ｃ．Ｂ．Ｆｒａｎｋ，Ｄ．Ａ．Ｈａｒｔ．Ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒａｂｂｉｔ  ｌｉｇａｍｅｎｔ，ｔｅｎｄｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１３７９（１９９８年）１７１−１７７頁。Ｒ．Ｂｏｙｋｉｗ，Ｐ．Ｓｃｉｏｒｅ，Ｃ．Ｒｅｎｏ，Ｌ．Ｍａｒｃｈｕｋ，Ｃ．Ｂ．Ｆｒａｎｋ，Ｄ．Ａ．Ｈａｒｔ．Ａｌｔｅｒｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｒａｂｂｉｔ  ｌｉｇａｍｅｎｔｓ，Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１７（１９９８年）３７１−３７８頁）。
【０３７２】
【表５】
0005542686.tif 000008
【０３７３】
【表６】
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【０３７４】
【表７】
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【０３７５】
【表８】
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【０３７６】
【表９】
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【０３７７】
Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＣ３カチオン交換樹脂を用いるＰｅｐｔａｃａｎタンパク質／ポリペプチドの分離
４％のＨＣｌを用いて２４時間にわたって、Ｄｏｗｅｘ  ＭＡＣ３樹脂（１００グラム）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ）を水素形態で再生した。焼結ガラスフィルタを用いて、樹脂を十分に洗浄し（３×２ＬのＨ２Ｏ）、次に、ｐＨ４．５に調整した０．１Ｍの酢酸カルシウムを用いて平衡にした。０．１Ｍの酢酸カルシウム（ｐＨ４．５）中に５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰｅｐｔａｃａｎ（１０グラム）を溶解し、次に樹脂と混合し、１時間穏やかに攪拌した。非結合Ｓ−ＧＡＧおよびタンパク質を含有する溶液をろ過によって樹脂から分離し、Ｆａｒｎｄａｌｅらのアッセイを用いてＳ−ＧＡＧを検出できなくなるまで樹脂をローディング緩衝液（１０×樹脂容積）で洗浄した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で樹脂をさらに数回洗浄し、次に、０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４を用いて平衡にした。ＮａＯＨでｐＨ１０．５に調整した０．２ＭのＮａ２ＨＰＯ４溶液によって、樹脂に結合したタンパク質を放出させた。焼結ガラスブフナー漏斗（Ｂｕｃｈｎｅｒ  ｆｕｎｎｅｌ）によるろ過によって樹脂をもう一度分離し、ろ液を集め、１ＫＤａのＴＦＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて透析ろ過し、次に凍結乾燥した。
【０３７８】
塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）沈殿法を用いるＰｅｐｔａｃａｎタンパク質／ポリペプチドの分離
塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）は水溶性の界面活性剤であり、その正に帯電したピリジニウムイオンと、Ｐｅｐｔａｃａｎの硫酸化グリコサミノグリカン（Ｓ−ＧＡＧ）成分に存在する負に帯電した硫酸基との間に水に非常に不溶性の複合体を形成する。
【０３７９】
これらの水に不溶性のＣＰＣ−Ｓ−ＧＡＧ複合体は、Ｓ−ＧＡＧを生物学的組織または流体の抽出物から分離および精製するために、ここ４０年間にわたって多くの研究者により広範に使用されている。しかしながら、ＣＰＣ−Ｓ−ＧＡＧ複合体の沈殿および除去の後にＰｅｐｔａｃａｎタンパク質はろ液中に残存し得るので、我々は、この原理がＰｅｐｔａｃａｎ中に存在するタンパク質／ポリペプチドを単離するためにも使用され得ると論断した。ＣＰＣ−Ｓ−ＧＡＧの沈殿工程のために使用される手順は、ＯｅｇｅｍａおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ（Ｏｅｇｅｍａ  ＴＲおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＲＣ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ−ｄｅｒｍａｔａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  ｄｅｄｉｆｆｅｒｔｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２５６：１０１５−１０２２頁、１９８１年）によって記載される方法を基準としたが、ＧＡＧ−ＣＰＣ複合体を解離させるために２Ｍの塩化カルシウムを用い、４×水性エタノール容積（ａｑｕｅｏｕｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｅｔｈａｎｏｌ）でＳ−ＧＡＧを水溶液から沈殿させることによって修正した。ＣＰＣ−Ｓ−ＧＡＧ複合体を除去した後、Ｐｅｐｔａｃａｎタンパク質／ポリペプチドを含有する水溶液を、１０００Ｄａカットオフの限外ろ過膜（ＹＣ１０）または同様のＭＷカットオフの接線流（ｔａｎｇｅｎｔａｌ  ｆｌｏｗ）限外ろ過（ＴＦＦ）カートリッジ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて広範囲に透析ろ過した。しかしながら、透析ろ過の最終段階では、タンパク質の沈殿を回避するために透析溶液を０．００１Ｍの酢酸で置換した。透析ろ過した溶液を凍結乾燥し、タンパク質／ポリペプチドが白色粉末で得られた。
【０３８０】
細菌系を用いるｒｈＮＣ４の調製
既に記載されている方法（Ｐｉｈｌａｊａｍａ  Ｔら  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＮＣ４  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＸ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年、２７９：２４２６５−２４２７３頁）に基づいて、ＧＳＴ融合タグのための配列を有するｐＧＡＴ−２細菌発現ベクターにおいて２３シグナルペプチドのないヒトコラーゲンＩＸのＮＣ４の遺伝子をインフレームで構築した。組換えヒトＮＣ４（ｒｈＮＣ４）構築物をエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞株内に移した。１００マイクログラム／ｍｌのアンピシリンが補充された所望の最終容積のＬＢ培地に細胞株を播種する（１：１００）ことによって、振とうフラスコ内で融合タンパク質を発現させた。６００ｎｍにおける吸光度が０．６の値に達するまで細胞を３７℃で成長させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって発現を誘発し、０．５ｍＭの最終濃度を得た。３７℃で４〜６時間または１６時間インキュベーションを継続した。遠心分離に続いて、１×ＰＢＳによって細胞ペレットを３回洗浄し、均質化緩衝液［０．３ＭのＮａＣｌ、０．２％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｙｄｎｅｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）、０．２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム］により再懸濁させ、次に凍結貯蔵し、その後で超音波処理により氷上で均質化した。１７，０００ｇで４℃において４０分間、遠心分離によって不溶性材料を除去した。硫酸アンモニウムを３０％の飽和まで添加することによって、上清から融合タンパク質を沈殿させた。２３，０００ｇで４℃において３０分間、遠心分離によって沈殿物を集め、１×ＰＢＳ（１％のＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０を有する）中に溶解させた。２３，０００ｇで４℃において３０分間、遠心分離により溶液を透明にし、流速２５０μｌ／分の４℃のグルタチオン−セファロース４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のカラムに適用した。エンドトキシンを除去するために、５０カラム容積（ＣＶ）の１×ＰＢＳ（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を含有する）を適用して、非結合材料を除去した後、２０ＣＶの１×ＰＢＳ（無菌）で洗浄した（Ｒｅｉｃｈｅｌｔ  Ｐ，Ｓｃｈｗａｒｚ  ＣおよびＤｏｎｚｅａｕ  Ｍ．Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｔｏ  ｐｕｒｉｆｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４６：４８３−４８８頁、２００６年）。１０ＣＶの因子Ｘａ切断緩衝液（無菌）で平衡にした後、室温での因子Ｘａプロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＰｒｏｍｅｇａ）による一晩の消化によって組換えＮＣ４（ｒＮＣ４）を融合ＧＳＴから切断した。ベンズアミジ���セファロース４ＦＦ結合緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の溶出によりグルタチオン−セファロースのカラムを通してｒｈＮＣ４溶液を移動させ、ベンズアミジンセファロース４ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてさらなる精製を行った。フロースルーｒｈＮＣ４を濃縮し、５Ｋカットオフ濃縮器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてｄＨ２Ｏで洗浄することにより脱塩した。最後の精製は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ−２００カラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィによって達成した。産物のサイズおよび純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスタンブロッティングによって決定した。精製したｒｈＮＣ４の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）またはＢＣＡタンパク質アッセイを用いて決定した。
【０３８１】
酵母Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）におけるヒトＮＣ４の発現
（ｉ）コラーゲンα１（ＩＸ）ＮＣ４ドメイン遺伝子の単離
２３シグナルペプチドのないヒトコラーゲンＩＸのＮＣ４の遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  受入番号ＮＭ＿００１８５１）を、関節軟骨からのヒト軟骨細胞から抽出したＲＮＡによる逆転写ＰＣＲによって入手した。１０％のＦＣＳが補充されたα−ＭＥＭ培地内にヒト軟骨細胞を播種した。細胞がコンフルエントになったらトリプシン処理し、遠心分離によって細胞ペレットとして収集した。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱｉａＧｅｎ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて細胞ペレットから全ＲＮＡを抽出した。製造業者の使用説明書に従って、白金Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲによって逆転写ＰＣＲを実施した。上流および下流プライマーはそれぞれ、ＫＬ−ＮＣ４５１およびＫＬ−ＮＣ４３１であった（表１）。５５℃で３０分間の１サイクルを用いてｃＤＮＡ合成を行った後、２分間の９４℃の前変性、および４０サイクルのＰＣＲ増幅（変性：９４℃で３０秒間、アニール：５５℃で３０秒間、拡張：７２℃で１分間）を行った。０．８％のアガロースゲルによりＲＴ−ＰＣＲ産物を分離し、ＳＮＡＰＴＭゲル精製（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により精製した。
【０３８２】
（ｉｉ）酵母においてコラーゲンα１（ＩＸ）ＮＣ４ドメインを発現するためのベクターの構築
Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）発現系（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，ＵＳＡ）を適用して、酵母クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）におけるヒトα１（ＩＸ）コラーゲン（ｈＮＣ４）のＮＣ４ドメインの発現のためのＤＮＡ構築物を生成した。２３−アミノ酸シグナルペプチドを取り除いた全長ｈＮＣ４（ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１８４２）のアミノ酸の断片２４−２６８を増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーの群（表１）を設計した。
【０３８３】
【表１０】
0005542686.tif 000013
【０３８４】
５’−プライマーＫＬ−ＮＣ４５１は操作されたＸｈｏ  Ｉ切断部位を含有し、３’−プライマーＫＬ−ＮＣ４３１は操作されたＢｇｌ  ＩＩ切断部位を含有した。これらの２つのプライマーを用いて、逆転写ＰＣＲによってシグナルペプチドを含まないｈＮＣ４断片を増幅した。
【０３８５】
５’−プライマーＫＬ−ＮＣ４５４および３’−プライマーＫＬ−ＮＣ４３３はそれぞれ、操作されたＸｈｏ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩ切断部位を含有した。プライマーＫＬ−ＮＣ４５１およびプライマーＫＬ−ＮＣ４３１とは違って、ＫＬ−ＮＣ４５４およびＫＬ−ＮＣ４３３は、酵母Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）の好ましいコドンに従って、ｈＮＣ４遺伝子を変化させるがｈＮＣ４タンパク質配列を未変化に保存する多数の遺伝子変異を提供した。
【０３８６】
ｈＮＣ４のＰＣＲ産物を制限酵素により消化し、多重クローニング部位Ｘｈｏ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩにおいてｐＫＬＡＣ１発現ベクター（図１）に連結した。積極的に挿入された組換え体を配列決定して、ＮＣ４遺伝子の挿入が正確であることを確認した。正確な組換え体を制限酵素Ｓａｃ  ＩＩにより消化し、コンピテントなＫ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＧＧ７９９細胞に形質転換した。窒素源として５ｍＭのアセトアミドを含有する酵母炭素ベース（ＹＣＢ）培地を選択培地として使用した。標的のＮＣ４遺伝子およびａｍｄＳ遺伝子（ａｍｄＳ遺伝子はｐＫＬＡＣ１に存在する）を有する組換え体のＳａｃ  ＩＩ断片が酵母染色体ＤＮＡに組み込まれた後にだけ、細胞はこの選択ＹＣＢ培地中で生存した。
【０３８７】
５’−プライマーＧＡＴ２−ＧＳＴ５３および３’−プライマーＧＡＴ２−ＧＳＴ３３は、酵母Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）における発現のためのいくつかの変異を有する細菌ベクターｐＧＡＴ−２からグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子を得るように設計された。３’−末端に３つのＳＴＯＰ翻訳コドンを有するこのＧＳＴ遺伝子は、ベクターｐＫＬＡＣ１多重クローニング部位Ｂｇｌ  ＩＩおよびＳａｌ  ＩにおいてｐＫＬＡＣ１−ＧＳＴを形成するように構築された。
【０３８８】
５’−プライマーＫＬ−ＮＣ４５４および３’−プライマーＫＬ−ＮＣ４３８は、Ｇｌｕ２６７をＧｌｙに変える変異を有する組換えｈＮＣ４のために設計された。この変異は、ｈＮＣ４のＣ−末端にトロンビン切断部位を提供した。Ｎ−末端のＧＳＴ融合タンパク質が得られるように、組換えｈＮＣ４をクローニング部位Ｘｈｏ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩでベクターｐＫＬＡＣ１−ＧＳＴに連結した。ＤＮＡ配列の確認の後、ＮＣ４−ＧＳＴ融合タンパク質遺伝子を有する組換え体をＳａｃ  ＩＩで消化し、酵母Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＧＧ７９９細胞の染色体ＤＮＡに挿入し、次に、組込みＮＣ４およびａｍｄＳ遺伝子を有する生存コロニーを、ＹＣＢ選択培地によって選別した。
【０３８９】
（ｉｉｉ）酵母Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＧＧ７９９細胞におけるコラーゲンα１（ＩＸ）ＮＣ４ドメインの発現
無菌トゥースピックまたはピペットチップによりかき集めることによって、組込み発現ｈＮＣ４を含有する各コロニーからの細胞を約２ｍｍ２の領域から採取し、無菌培養管において、これらを２ｍｌのＹＰＧａｌ培地（１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのＢａｃｔｏＴＭペプトン、２％のガラクトース）中に再懸濁させた。３０℃で最低でも２日間の成長の間、振とう（約２５０ｒ．ｐ．ｍ．）させながら、培養物をインキュベートした。培養上清の分析を毎日実施して、ＮＣ４の最大の分泌を達成するために最適な成長時間を決定した。タンパク質精製のために、より大きい培養物（例えば、≧１Ｌ）を３０℃で一晩成長させたスターター培養物とともに、１：１００で播種した。サンプル（１ｍｌの各培養物）を１０，０００ｇで１分間遠心分離し、細胞をペレットにした。培養上清を新しい微量遠心管に移し、氷上に貯蔵した。３０μｌの未濃縮培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ  ４〜１２％Ｔｒｉｓ−Ｂｉｓゲル、ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に適用した後、クーマシー染色（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））および／またはウエスタンブロッティングを行った。
【０３９０】
（ｉｖ）酵母Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＧＧ７９９から発現されたｒｈＮＣ４タンパク質の部分的な精製
１Ｌよりも大きい容積を有する３日間の培養物（タンパク質精製のために使用され得る）をＣｅｌｉｔｅ−５１２でろ過し、細胞および残骸を除去した。透明な水性ろ液を透析ろ過し、１０ＫＤａカットオフのＴａｎｇｅｎｔｉａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（ＴＦＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）へ適用することによって濃縮した。２×５容積の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）の透析ろ過の後、培地溶液を１〜２Ｌに濃縮し、４℃で一晩貯蔵するか、またはすぐに（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿処理した。固体（ＮＨ４）２ＳＯ４を８０％の飽和になるまで培地溶液に添加した（０℃）。１４，０００ｇで４℃において３０分間の遠心分離によって沈殿物を集め、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させた。ＢｒａｄｆｏｒｄまたはＢＣＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）アッセイを用いて、精製したｈＮＣ４のタンパク質濃度を決定した。この材料の付加的な精製は、Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）から調製されたｒｈＮＣ４のために本明細書に記載されているのと同じ方法を用いて行った。
【０３９１】
種々の濃度のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の存在下での前駆細胞の凍結保存
細胞を採取し、５．０〜２０．０×１０６細胞／ｍｌで冷たい無血清培地中に再懸濁させた。等しい容積の冷却した完全Ｐｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）−ＣＤＭ培地を、０、１０、２０、５０および１００マイクログラム／ｍＬのＰＰＳを含有する冷却した細胞懸濁液に添加した。得られた最終ＤＭＳＯ濃度は７．５％であり、ＰＰＳ濃度は０、５、１０、２５および５０マイクログラム／ｍＬであり、最終細胞濃度は約２．５〜１０×１０６細胞／ｍｌであった。細胞混合物を凍結保存アンプル（Ｎｕｎｃ，Ｉｎｔｅｒｍｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に分注し、Ｃ１５６凍結容器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，２１  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）において、−１℃／分の制御された冷却速度で−８０℃に凍結保存した。次に、アンプルを液体窒素貯蔵所（−１９６℃）に移した。
【０３９２】
凍結保存サンプルの解凍
３７℃の水浴中で1分間、凍結保存細胞を急速に解凍し、１０ｍＬのポリプロピレン管に移した。約３ｍＬの適切な培地を細胞に液滴状で添加し、絶えず混合しながら１０ｍＬの最終容積にした。４００×ｇで４℃において５分間、遠心分離によって細胞をペレットにし、上清を吸引した。残留ＤＭＳＯの除去を保証するために、培地中で細胞を洗浄し、上述のように遠心分離した。細胞を１０ｍＬの最終容積で再懸濁させ、７５ｃｍ２のフラスコ中に播種した後、３７℃の加湿インキュベータ内で、５％のＣＯ２の存在下でインキュベーションを行った。
【０３９３】
種々の濃度のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の存在下における凍結保存の後の細胞の計数
ＰＰＳ含有凍結保存バイアルから前駆細胞を解凍した後に得られる単一の細胞懸濁液のアリコートを、等容積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中０．４％（ｗ／ｖ）トリパンブルーで希釈した。血球計算器（Ｎｅｕｂａｕｅｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ，Ａｓｓｉｓｔａｎｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫＸ４１，Ｊａｐａｎ）を用いて、細胞数を決定した。
【０３９４】
この実験の結果は図１に示される。一般に、ＰＰＳの添加は、前駆細胞の凍結保存に対して悪影響を有さないことが分かる。
【０３９５】
３０分を除いて、５０μｇ／ｍｌのＰＰＳの使用は、全ての時点で前駆細胞の生存率を高めた。２５μｇ／ｍｌのＰＰＳの使用は、３０分を除く全ての時点で、生存率を高めるか、前駆細胞の生存率に悪影響を与えないかのいずれかであった。１０μｇ／ｍｌのＰＰＳの使用は、０そして６０および９０分の時点で有益な効果を有した。５μｇ／ｍｌのＰＰＳの使用は、６０分の時点で生存率に対して有益な効果を有した。
【０３９６】
全体として、ＰＰＳの添加は一般に悪影響を有さず、前駆細胞の凍結保存を向上し得ることが分かる。値のわずかな違いは、細胞をカウントするために使用した方法に起因し得る。前駆細胞は凝集し易いので、誤差を導くことがあり、凝集がよく見られた５マイクログラムのＰＰＳ見かけ上の低い値の原因であり得る。
【０３９７】
ＭＴＴアッセイを用いた、凍結保存および解凍後の前駆細胞の生存率に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度決定効果
ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から購入したマウス前駆細胞（細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＡＴＤＣ５）またはヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、１．６８×１０５〜１．０×１０６個の細胞の範囲にわたる種々の細胞密度でＤＭＥＭ＋１０％のＦＢＳを含有する２ｍＬのスクリューキャップ付遠心管内に播種した。別々の管に、ＤＭＥＭ＋２０％のＦＢＳおよび１５％のＤＭＳＯ中に溶解された２×所要濃度のＰＰＳを含有するストック溶液を調製した。ＰＰＳの最終濃度がストック濃度の半分であり、ＦＢＳが１０％およびＤＭＳＯが７．７％であるように、これらのストック溶液を細胞培養物に添加した。いくつかの独立した実験に関して、最終溶液中のＰＰＳの最終濃度は０．０〜１００ｕｇ／ｍｌの範囲であった（詳細については図面を参照）。使用したＰＰＳの全ての濃度は３重に試験した。細胞とＰＰＳを含有する凍結保存溶液とを穏やかに５分間混合し、液体窒素中で所蔵した。３日後、液体窒素から管を取り出し、３７℃の水浴中で解凍し、周囲温度で約１５分間放置した。細胞を２００ｇで５分間、下方に遠心分離し、上清を廃棄した。フェノールレッドを含まない９００ｕｌのＤＭＥＭで細胞を洗浄し、次に２００ｇで５分間、下方に遠心分離した。ＤＭＥＭ中１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ溶液５００ｕｌ中に細胞を再懸濁させ、３７℃で３時間インキュベートし、次に、６０００ｇで５分間遠心分離した。３００ｕｌのＤＭＳＯを各管に添加して、色素の結晶を溶解させた。９０ｕｌ×３を各管から９６ウェルプレートに写し、５４０ｎｍにおける吸光度を決定した。
【０３９８】
図２は、凍結−解凍サイクルを受けた後、７．５％のＤＭＳＯおよび種々の濃度のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）を含有する低温貯蔵培地中に懸濁された、異なる数のマウスＡＴＤＣ５前駆細胞の生存率を示す棒グラフを示す。細胞生存率は、ＭＴＴアッセイを用いて決定した。
【０３９９】
図２は、前駆細胞の生存率が、全ての濃度のＰＰＳの存在によって高められたことを示す。１００μｇ／ｍｌのＰＰＳでは、２５万個、５０万個および１００万個の細胞数において、生存率が高められた。２５０μｇ／ｍｌのＰＰＳについても、同じことが見られる。５００μｇ／ｍｌのＰＰＳの場合は、２５万個および５０万個の細胞に対して向上が見られる。１００万個の細胞では、５００μｇ／ｍｌのＰＰＳの濃度は生存率を高めないようであるが、生存率に対して有害ではなかった。
【０４００】
これらのデータの外挿によって、適切な凍結保護培地中で凍結−解凍サイクルを受けた場合に２５〜５０ｍｇのＰＰＳと一緒に１億個の軟骨前駆細胞を投与すると、細胞の生存率はこのような治療を必要としている患者への容認できる投与レベルに維持され得ると仮定することができる。
【０４０１】
図３は、ＭＴＴアッセイを用いて決定される、−１８０℃での凍結保存および解凍した後のヒト前駆細胞生存率に対する異なる濃度のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの効果を示す。図示されるデータ＝平均±ＳＤ、＊＝ｐ＜０．０５（対照値に対して）。
【０４０２】
１６８，０００個の細胞を凍結保存する場合、特に、１および２．５μｇ／ｍｌのＰＰＳにおいて、ＰＰＳの存在は細胞の生存率を改善した。３５０，０００個の細胞では、一般に、前駆細胞の生存率はＰＰＳの存在によって悪影響を受けないことが分かる。いくつかの場合には、細胞の生存率は解凍後に高められる。
【０４０３】
これらのデータの外挿によって、適切な凍結保護培地中で凍結−解凍サイクルを受けた場合に３０ｍｇのＰＰＳと一緒に１億個の軟骨前駆細胞を投与すると、細胞の生存率はこのような治療を必要としている患者への容認できる投与レベルに維持され得ると仮定することができる。
【０４０４】
フローサイトメトリーにより決定される、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γの組み合わせの添加によって誘発されるヒト前駆細胞のアポトーシスに対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の効果
ヒト前駆細胞を、０、１、２、５および１０マイクログラム／ｍＬの濃度のＰＰＳが補充された無血清培地にプレーティングした。３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４、３０，０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγの組み合わせの添加によって前駆細胞のアポトーシスを誘発させた。５日間の培養の後、トリプシン処理によって細胞を採取し、既に記載されているようなアネキシンＶ染色によって生存率を評価した（Ｋｏｒｔｅｓｉｄｉｓ  Ａ，Ａ  Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ，Ｓ  Ｉｓｅｎｍａｎｎ，Ｓ  Ｓｈｉ，Ｔ  ＬａｐｉｄｏｔおよびＳ  Ｇｒｏｎｔｈｏｓ．（２００５年）．Ｓｔｒｏｍａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  １０５：３７９３−３８０１頁）。
【０４０５】
この実験の結果は図６に示される。細胞アポトーシスは全ての濃度のＰＰＳに対して低減され、最良の結果は１０μｇ／ｍｌの場合に見られることが分かる。これらの結果は、凍結保存培地へのＰＰＳの添加が解凍時のアポトーシスを低減し得ることを示す。
【０４０６】
５０，０００個の前駆細胞／ウェルを含有する９６ウェルプレートにおいて実験を行った。理論により束縛されることは望まないが、ストレスタンパク質カスケードのアポトーシスおよび活性化は細胞凍結−解凍において連続して起こるものと認識され、従って、このプロセスを著しく低減するＰＰＳの能力は、ほとんどの細胞ベースの医療処置において必要とされるような凍結保存および解凍後のこれらの細胞の使用に有益なはずである。
【０４０７】
単層培養で成長された前駆細胞によるプロテオグリカンの生合成（３５Ｓ−ＧＡＧで測定）に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの単独またはｒｈＮＣ４と組み合わせた効果
ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から購入したマウス前駆細胞（細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＡＴＤＣ５）またはヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）が補充された１：１の高グルコースＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する５０ｍＬのプラスチック培養物フラスコ内に播種し、５％のＣＯ２中で３７℃でインキュベートした。コンフルエンスに達したら、トリプシン処理によって前駆細胞を放出させ、遠心分離により採取した。ウェルあたり３×１０４の細胞密度または２×１０５の細胞密度で細胞を９６ウェルまたは２４ウェルプレートに播種した。３７℃、５％のＣＯ２で４８時間のインキュベーションの後、コンフルエントな単層が正常に達成された。次に培地を、異なる濃度のＰＰＳを含有する（ｒｈＮＣ４および５μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−Ｈ２ＳＯ４（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を含むまたは含まない）規定の培地に変えた。以下に記載されるように３５ＳＯ４のグリコサミノグリカンへの取込み（３５Ｓ−ＧＡＧ）を測定することによってプロテオグリカン生合成を決定する場合には、通常、４８時間のインキュベーションの後に実験を終了した。
【０４０８】
（Ａ）９６ウェルプレート：培養物はパパインによるタンパク質消化を受け、グリコサミノグリカンを放出した。使用したパパインストック溶液は、パパイン消化緩衝液（０．１ＭのＮａＡｃ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中に２．５ｍｇ／ｍｌのパパイン（Ｓｉｇｍａ）、７．９ｍｇ／ｍｌのシステイン−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）を含有した。５０μｌのパパインストック溶液を各ウェルに添加した。プラスチックシートを用いてプレートを密封し、６５℃で２時間インキュベートした。終了時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８色素を用いるＤＮＡ蛍光定量アッセイ、およびＫｉｍら（Ｋｉｍ  ＹＪ，Ｓａｈ  ＲＬＹ，Ｄｏｏｎｇ  Ｊ−ＹＨ，Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ  ＡＪ，Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３５８．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１９８８年；１７４：１６８−１７６頁）によって記載される方法のために、ウェル当たり５０μｌの消化溶液のアリコートを採取した。塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて、残りの溶液（２００ｕｌ）中の３５ＳＯ４−ＧＡＧを沈殿させた。簡単に述べると、各ウェルに２０μｌの５％のＣＰＣを添加した後、共沈殿剤として１０μｌの１ｍｇ／ｍｌのコンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ、Ｓｉｇｍａ）を添加した。細胞採取器（Ｓｋａｔｒｏｎ  ７０２１）を用いる真空ろ過によって３５Ｓ−ＧＡＧ−ＣＰＣ複合体を集めた。次にフィルタを空気乾燥させ、ディスクをシンチレーションバイアル内に押し込んだ。３ｍｌのシンチレーション液を添加しボルテックスした後、サンプル中の３５Ｓ−ＧＡＧ−ＣＰＣ複合体の放射活性を、シンチレーション測定（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）によって測定し、ＤＰＭ／サンプルとして記録した。次に、データをＤＮＡに対して基準化し、３５−Ｓ−ＧＡＧ／μｇＤＮＡで表した。
【０４０９】
（Ｂ）２４ウェルプレート：規定の倍地中の４８時間のインキュベーションの後、ウェルごとの培地（可溶性３５Ｓ−標識化プロテオグリカンを含有）を細胞から分離し、２．０ｍｌのマイクロチューブに移した。ウェル内に残存する単層細胞をトリプシン処理により剥がし、次に、３５０ｇで５分間の遠心分離によって上清（基質プロテオグリカンを含有する）から分離した。上清を収集し、培地と合わせた。２００μｌの培地および上清混合物を９６ウェルプレートに移し、パパイン消化を受けさせて、グリコサミノグリカンを放出させた。パパイン消化の後、２０μｌの５％のＣＰＣを各ウェルに添加し、３５Ｓ−ＧＡＧを沈殿させた後、１０μｌの１ｍｇ／ｍｌのＣＳＡをキャリアとして添加した。繊維フィルタにより３５Ｓ−ＧＡＧ−ＣＰＣ複合体を収集し、上述の液体シンチレーション分析を用いて３５Ｓ−ＧＡＧの放射活性を測定した。ＲＮＡ試薬を用いて細胞を抽出し、アリコートを用いて遺伝子発現を決定し、そして／あるいは蛍光定量アッセイによってＤＮＡ含量を測定し、結果を３５−Ｓ−ＧＡＧ／μｇＤＮＡで表した。
【０４１０】
図４は、ヒト前駆細胞増殖に対するペントサン多硫酸の効果を示す。
【０４１１】
指示される濃度でＰＰＳが補充された成長培地中で、２４ウェルプレートにおいて初代ヒト前駆細胞を培養した。種々の時間間隔（１、３、６日）で成長培地を取り出し、３７℃／５％ＣＯ２で２時間、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１を含有するフェノールレッド不含培地で置き換えた。ＷＳＴ−１は、生存細胞中のミトコンドリアデヒドロゲナーゼによって切断され、４５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて検出可能なホルマザン色素を生じる。各時点の４５０ｎｍにおける吸光度が、ＰＰＳの全ての濃度に対して示される。１μｇ／ｍｌを超えるＰＰＳの濃度で、統計的に有意な増殖の増大が６日目に観察された（＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。図４は、多硫酸化多糖類を含有しない凍結保存培地中で凍結された前駆細胞と比べて、前駆細胞の生存率が高められたことを示す。
【０４１２】
図９は、単層培養で成長させた場合の、マウス前駆細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２）のプロテオグリカン（ＰＧ）の生合成およびＤＮＡ含量に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの濃度依存性効果を示す。図示されるデータは平均±ＳＤである。
【０４１３】
ＰＰＳの全ての濃度において、プロテオグリカンの生合成が増大されることが分かる。これは、多硫酸化多糖類の使用が全ての濃度範囲で分化、特に軟骨形成を誘発し得ることを示す。５〜１０μｌ／ｍｌの場合に最良の結果が見られ、ＰＧ合成に関しては１０μｌ／ｍｌが最良であり、ＤＮＡ含量に関しては５μｌ／ｍｌおよび１０μｌ／ｍｌが最良である。
【０４１４】
図１０は、巨大分子ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取込みによって決定される、単層培養で２日間成長させたマウス前駆細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞）によるＤＮＡ合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフを示す。
【０４１５】
図１１は、ヒト前駆細胞の２日間の単層培養の後にＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定される、プロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の濃度依存性効果の棒グラフを示す。データは、ＤＮＡ含量に基準化された１分あたりの減衰（ＤＰＭ）としての３５Ｓ−ＧＡＧ放射活性として表した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．００５、＊＊＊＝ｐ＜０．０００５。
【０４１６】
図２１は、マウスＡＴＤＣ５前駆細胞の３日間の培養の後にＰＧの硫酸化グリコサミノグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧ）への放射活性標識化硫酸の取込みによって決定される、プロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対する、インスリンの不在（維持培地、ＭＭ）およびインスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在（分化培地、ＤＭ）下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）により発現されるｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフを示す。データは、ｒｈＮＣ４を含有しない対照培養物に対する％変化として表した。Ｐ＜０．０５は、対照培養物に対して統計的に有意であった。
【０４１７】
図２４は、ＰＰＳおよびＮＣ４の組み合わせについての結果を示す。ＰＰＳの効果は濃度と共に増大することが分かる。またこの結果は、増大する濃度のＮＣ４の存在下で高められることも分かる。
【０４１８】
０．５μｌ／ｍｌのＮＣ４および５μｌのＰＰＳの組み合わせは、プロテオグリカン合成の統計的に有意な増大を示した。さらに、１μｌ／ｍｌのＮＣ４および２μｌ／ｍｌおよび５μｌ／ｍｌのＰＰＳの組み合わせは、プロテオグリカン合成の統計的に有意な増大を示した。さらに、２μｌ／ｍｌのＮＣ４と１μｌ／ｍｌ、２μｌ／ｍｌもしくは５μｌ／ｍｌのＰＰＳとの組み合わせ、または５μｌ／ｍｌのＮＣ４と１μｌ／ｍｌ、２μｌ／ｍｌもしくは５μｌ／ｍｌのＰＰＳとの組み合わせは全て、プロテオグリカン合成の統計的に有意な増大を示した。
【０４１９】
５μｌ／ｍｌのＮＣ４または５μｌ／ｍｌのＰＰＳの使用は最良の結果を示し、５μｌ／ｍｌのＮＣ４および５μｌ／ｍｌのＰＰＳの組み合わせは最良であった。
【０４２０】
ペレット培養で成長された前駆細胞によるプロテオグリカンの生合成（３５Ｓ−ＧＡＧで測定される）に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの単独またはｒｈＮＣ４と組み合わせた効果
ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から購入したマウス前駆細胞（細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＡＴＤＣ５）またはヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を２ｍＬのスクリューキャップ付無菌遠心管内に播種し、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ−高グルコース培地を用いて全容積を１ｍｌにした。次に、室温のスイングアウトローターにおいて５００ｇで１０分間前駆細胞を遠心分離した。スクリューキャップを緩め、５％ＣＯ２／９５％湿潤空気の雰囲気中で遠心管を３７℃のインキュベータに入れた。通常、ペレットは２４時間以内に形成された。最初の２日間は培地を毎日取り換え、その後は２〜３日毎に１回取り換えた。５日目に培地を除去し、１０％のＦＢＳ、５．０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−Ｈ２ＳＯ４および種々の濃度のＰＰＳ（０、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、２０．０μｇ／ｍｌ）（図１２〜１５）またはｒｈＮＣ４（０、０．１、０．５、１．０、２．０μｇ／ｍｌ）（図２２）を含有する１ｍｌのＤＭＥＭ−高グルコース培地を各管に添加した。全ての濃度の薬物に対して３重の培養物を用いた。スクリューキャップを緩め、５％ＣＯ２／９５％湿潤空気の雰囲気中で遠心管を、３日間３７℃のインキュベータに入れた。６日目に、２００μｌのストックパパイン溶液［パパイン緩衝液（０．１ＭのＮａＡＣ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中の２．５ｍｇ／ｍｌのパパイン、７．９ｍｇ／ｍｌのＬ−システイン］を各管に添加した。管にきつくキャップをし、６５℃で２時間インキュベートした。パパイン消化の後、４回の再現したパパイン消化溶液２００μｌを別々に９６ウェルマイクロタイタープレート（２００μｌ／ウェル）に移した。残りの溶液は、上述のように３重に行われるＤＮＡ蛍光定量アッセイのために使用した。単層培養について記載されるように３５Ｓ−ＧＡＧの生合成を決定し、結果を３５−Ｓ−ＧＡＧ／μｇＤＮＡで表した。
【０４２１】
図２２は、ＡＴＤＣ５細胞のペレット培養におけるプロテオグリカン（ＰＧ）の生合成に対する、インスリンの不在（維持培地、ＭＭ）およびインスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）の存在（分化培地、ＤＭ）下での、Ｋ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）により発現されたｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２Ｐ）の濃度依存性効果の棒グラフを示す。データは、対照（１００％とする）の％として示される。
【０４２２】
ＰＰＳの代わりにヘパリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて同様の実験を行った。これらの結果は図１４において見られる。ヘパリンは、前駆細胞の軟骨形成を抑制することによって分化を調節する。
【０４２３】
６日間のペレット培養で成長される前駆細胞による生合成ＤＮＡ（３Ｈ−チミジンの取込みとして測定）に対する、ペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの単独またはｒｈＮＣ４と組み合わせた効果
ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から購入したマウス前駆細胞（細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＡＴＤＣ５）またはヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を、３×１０５の細胞密度で２ｍＬのスクリューキャップ付遠心管に播種し、ＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ（＋１０％のＦＢＳ）により１ｍｌ以下にした。室温でスイングアウト遠心分離機において細胞を５００ｇで１０分間下方に遠心分離し次に、５％ＣＯ２／９５％空気の湿潤雰囲気中で２４時間、３７℃でインキュベートした。ペレットはこの間に確立されることが観察された。最初の２日間は培地を毎日取り換え、その後は２〜３日毎に１回取り換えた。３日目に培地を除去し、６４０ｍｉｃｒｏＬのＤＭＥＭ（＋１０％のＦＢＳ）中の、８０ｍｉｃｒｏＬの５０ｍＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンおよび８０ｍｉｃｒｏＬのｒｈＮＣ４（０、１、２．５、５、１０、２５マイクログラム／ｍｌ）を各管に添加した（図２３）。
【０４２４】
全てのアッセイを３重に行った。３日（６６時間）後、上清培地を除去し、ＨＡ  ＥＬＩＳＡ用に取り置いた。１００ｍｉｃｒｏＬの１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（ＤＭＥＭ培地に溶解）を各ペレット管に添加した。振とう器において１８０〜２００ｒｐｍで３．５時間、管を３７℃でインキュベートした。各管の内容物が４つのウェルに分割されるように、コラゲナーゼ消化物を９６ウェルプレートに移した。各ウェルに２００ｍｉｃｒｏＬのｄＨ２Ｏを添加し、後で分析するためにプレートを−２０℃で貯蔵した。コラゲナーゼ消化物を解凍し、細胞採取器を用いてＤＮＡを集め、フィルタディスクをシンチレーション管に入れた。シンチレーション混合液（３ｍＬ）を添加し、約１分間ボルテックスした。β−シンチレーションカウンタを用いて、これらのサンプル中の３Ｈ−ＤＮＡの放射活性を決定した。
【０４２５】
マイクロマス培養で成長された前駆細胞によるプロテオグリカンの生合成（３５Ｓ−ＧＡＧとして測定）に対する、ペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの単独またはｒｈＮＣ４と組み合わせた効果
使用した技法は、（Ｄｅｎｋｅｒ  ＡＥ，Ｈａａｓ  ＡＲ，Ｎｉｃｏｌｌ  ＳＢおよびＴｕａｎ  ＲＳ．Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：Ｉ．Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（１９９９年）、６４：６７−７６頁）によって記載されるものを基準とした。簡単に、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から購入したマウス前駆細胞（細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＡＴＤＣ５）またはヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）。前駆細胞の１０マイクロリットル（１０μｌ）の懸濁液（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地＋１０％のＦＢＳ中１×１０７細胞／ｍｌ）を２４ウェルプレートの個々のウェルに適用した。５％ＣＯ２／９５％空気の湿潤雰囲気中で２〜３時間、３７℃でのインキュベーションの後、９００μｌのＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地（１０％のＦＢＳ）および１００μｌのＰＰＳ溶液（同じ培地中）をウェルにゆっくり添加して、０、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、２０．０μｇ／ｍｌのそれぞれのＰＰＳの最終濃度を、単独またはｒｈＮＣ４（０、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、２５．０μｇ／ｍｌ）と組み合わせて提供した。各薬物の濃度を３重に繰り返した。細胞を最大１０日間培養物中に維持した。薬物を含有する培地／含有しない培地を３日毎に取り換えたが、実験終了の２４時間前に、８０μｌの５０μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−Ｈ２ＳＯ４を添加して、５μＣｉ／ｍｌの最終３５ＳＯ４濃度を達成した。次の日、プレートの１つの細胞を１５０μｌ／ウェルの２．５％のトリプシンでトリプシン処理し、８００ｇで１０分間の遠心分離によって培地から分離し、５００μｌの１×ＰＢＳで洗浄し、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ抽出および分析のために液体窒素中に貯蔵した。使用したＰＰＳのそれぞれの濃度について培地および上清を１つの管内で合わせた。２００μｌの５×パパイン溶液［パパイン緩衝液（０．１ＭのＮａＡＣ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）中の２．５ｍｇ／ｍｌのパパイン、７．９ｍｇ／ｍｌのＬ−システイン］を管に添加し、６５℃で２時間溶液をインキュベートした。パパイン消化の後、２００μｌの消化溶液の４つのアリコートを９６ウェルプレート（２００μｌ／ウェル）に移した。３００ｒｐｍ、室温で２０〜３０分間、穏やかに振とうさせながら２０μｌの５％のＣＰＣおよび１０μｌの１ｍｇ／ｍｌのＣＳＡを添加して３５Ｓ−ＧＡＧ−ＣＰＣ複合体を沈殿させることによって、消化工程により放出される３５Ｓ−ＧＡＧを遊離３５ＳＯ４から分離した。細胞採取器を用いてガラス繊維フィルタによるろ過を行うことによって沈殿物を収集した。次に、フィルタを空気乾燥させて、ディスクをシンチレーションバイアル内に押し込んだ。３ｍｌ／バイアルのシンチレーション混合液を添加し、３０〜４５秒間ボルテックスした。３���Ｓ−ＧＡＧ−ＣＰＣ複合体に取り込まれた３５Ｓ−ＳＯ４の放射活性をシンチレーション測定によって測定した。
【０４２６】
ＩＩ型コラーゲンについての前駆細胞のマイクロマス培養物の免疫化学染色
上述のような種々の濃度のペントサン多硫酸を含有する／含有しない１ｍｌのＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）中、８×１０４細胞／マイクロマスの出発密度で、２４ウェル培養プレートにおいて前駆細胞のマイクロマス培養を確立した。培養の５日目および１０日目に培地を取り出し、Ｈｉｓｔｏｃｈｏｉｃｅ  ＭＢ（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ，ＵＳＡ）により培養物を室温で２０〜３０分間固定した。固定した培養物をＰＢＳ（１回につき５分間）中で２回洗浄し、ｐをＰＢＳ中で２回（１回につき５分間）洗浄し、ｂｌｆｏｒを室温で２０分間、次にＰＢＳ中で５分間洗浄した。次に、プレートをインキュベートした。まずＰＢＳの穏やかな流れですすいだ後、ＰＢＳで３回（１回につき５分間）洗浄し、ウェルをＰ５分で遮断した。ＩｇＧを除去する（ｄｅＩｇＧ）ために穏やかなＰＢＳの流れですすぎ、次に３回のＰＢＳでの洗浄し（１回につき５分間）、各マイクロマス培養物に２００μｌの１×（ＢＣＩＰ／緩衝液＋ＮＢＴ）を添加し、プレートをインキュベートし、流水中で洗浄することによりその切片で紫色が最初に確立されたときに反応を停止した。次に、プレートおよびウェルをデジタルカメラで写真に撮り、パーソナルコンピュータでＩｍａｇｅ  Ｊ（登録商標）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて画像を分析した。
【０４２７】
図１６は、６日間および９日間のマイクロマス培養におけるマウス前駆細胞（Ｃ３Ｈ１０Ｔ１−２）によるプロテオグリカン合成に対するＰＰＳの濃度依存性効果を示す棒グラフを示す。ＰＰＳは培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２＋１０％のＦＣＳ）中に含まれ、４８時間毎に取り換えた。培養終了の２４時間前に３５Ｓ−ＳＯ４を添加した。合成はＤＮＡ含量に対して基準化した。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．０００５。
【０４２８】
この細胞株では、１〜２０マイクログラム／ｍＬの濃度範囲にわたって、新しく合成されたＰＧへの３５Ｓの取込みの非常に大きい刺激が観察された（図１６）。さらに、９日間のマイクロマス培養の後、１マイクログラム／ｍＬのＰＰＳにおいて１００％の刺激が得られた（図１６）。
【０４２９】
図１７は、５日間のマイクロマス培養におけるヒト前駆細胞によるプロテオグリカン合成に対するＰＰＳの濃度依存性効果を示す棒グラフを示す。データは、３５Ｓ−ＧＡＧ放射活性として、対照（１００％とする）のパーセンテージで示される。＊Ｐ＜０．０５（対照に対して）。０．５〜１０μｇ／ｍｌの間の濃度範囲でプロテオグリカン合成の増大が見られた。
【０４３０】
ヒト前駆細胞も、ＰＰＳの存在下でインキュベートしたときにマイクロマス培養において軟骨細胞に分化した。しかしながら、５日間の培養では、２．５マイクログラム／ｍＬのＰＰＳ濃度で、３０％のＰＧ合成の最大の刺激が得られた（図１７）。
【０４３１】
図１８は、Ｂで示される免疫染色されたマイクロマス培養物の走査および分析によって決定される、１０日間のマイクロマス培養におけるヒト前駆細胞によるＩＩ型コラーゲン産生のペントサン多硫酸（ＰＰＳ）濃度依存性刺激を示す棒グラフを示す。ＩＩ型コラーゲン産生の増大は０．５〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲において見られ、最良の結果は５μｇ／ｍｌで見られる。
【０４３２】
これらの結果は、プロテオグリカンおよびＩＩ型コラーゲンの両方の合成の増大により証明されるように、ＰＰＳが前駆細胞を軟骨細胞に分化させることを示す。
【０４３３】
ＰＰＳの代わりにヒアルロン酸（ＳｕｐｅｒＡｒｔｚ（ＳＫＫ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））およびデキストラン多硫酸（ＭＷ＝５０００）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いて同様の実験を行った。これらの結果は、５日間のマイクロマス培養におけるヒト前駆細胞によるプロテオグリカン合成に対する、（Ａ）ヒアルロナン（ＨＡ）（ＳｕｐａｒｔｚＴＭ）および（Ｂ）デキストラン多硫酸の濃度依存性効果を示す棒グラフを示す図１９に示されている。データは、３５Ｓ−ＧＡＧ放射活性として対照（１００％とする）のパーセンテージで、またはＤＰＭ／ｕｇＤＮＡとして示される。＊Ｐ＜０．０５（対照に対して）。ＨＡはプロテオグリカンの合成を増大するようであるが、強力ではないことが分かる。対照的に、プロテオグリカンの産生の濃度依存性の低下によって証明されるように、デキストラン硫酸は前駆細胞の分化を下方調節した。
【０４３４】
８日間のマイクロマス培養で成長される前駆細胞による生合成ＤＮＡ（３Ｈ−チミジンの取込みとして測定）に対する、ペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの濃度効果
２４ウェル培養プレートの各ウェルに１０μｌの前駆細胞（７×１０６細胞／ｍｌ）を播種した。湿った５％ＣＯ２／９５％空気中で２〜３時間、３７℃におけるインキュベーションの後、９００μｌのＤＭＥＭ−高培地（＋１０％のＦＢＳ）、およびＤＭＥＭ−高培地中に溶解した、指示される濃度のＰＰＳをウェルにゆっくり添加した。最終ＰＰＳ濃度はそれぞれ、０、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、２０．０μｇ／ｍｌであった。全てのＰＰＳ濃度を３重に確立した。培養を３日間進行させた。４日目に２４ウェルプレートの各ウェルに、６４０μｌのＤＭＥＭ−高（＋１０％のＦＢＳ）、８０μｌの１０×ＰＰＳ溶液および８０μｌの１０μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジン溶液を添加し、１μＣｉ／ｍｌの最終３Ｈ−チミジン濃度および指示される最終ＰＰＳ濃度を生じた。次に、培養物を３７℃、５％のＣＯ２中でさらに２２時間インキュベートし、培地を除去し、２００μｌの１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液［コラゲナーゼ緩衝液：６６．７ｍＭのＮａＣｌ、６．７ｍＭのＫＣｌ、４．８ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）］を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で２．５時間インキュベートして、細胞を放出した。３０分毎に、手で穏やかにプレートを振とうさせた。コラゲナーゼ消化の後、細胞および消化溶液を５００ｇで５分間遠心分離した。上清を除去した。細胞を２００μｌのＴＥ緩衝液と穏やかに混合し、凍結−解凍により２回溶解した。溶解後、２００μｌ以上のＴＥ緩衝液を混合しながら細胞に添加した。細胞ライセートのアリコートを９６ウェルプレートに４回繰り返して適用した（各ウェルにつき１００μｌ）。ガラス繊維フィルタおよび細胞採取器を用いて、細胞ライセート中の３Ｈ−ＤＮＡを収集した。次に、フィルタを空気乾燥させ、シンチレーションバイアル内に押し込んだ。３ｍｌ／バイアルのシンチレーション混合液を添加し、３０〜４０秒間ボルテックスした。増殖性細胞のＤＮＡに取り込まれた３Ｈの放射活性をシンチレーション測定で測定した。
【０４３５】
結果は、ＰＰＳと組み合わせた前駆細胞の増殖の増大を示す図５に示される。全ての濃度のＰＰＳは増殖を増大したことが分かり、最良の結果は１および２．５μｇ／ｍｌの濃度で見られる。
【０４３６】
３Ｈ−グルコサミンのＨＡへの取込みを測定することによる、前駆細胞によるヒアルロナン（ＨＡ）の生合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの濃度効果
上述の方法を用いるが、前駆細胞を７×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、２４ウェルプレートにおいてヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）をマイクロマス培養で確立した。２４時間の培養後に培地を取替え、１０％のＦＣＳおよび２５μｇ／ｍｌのゲンタマイシン含有ＰＰＳ（Ｂｅｎｅ−Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する０．２２μｍフィルタにより滅菌した（０．０、０．５、１．０、２．５マイクログラム／ｍＬ）の濃度のＤＭＥＭ培地で置換した。培養物を３７℃で８日間、５％ＣＯ２／９５％湿潤空気中でインキュベートし、３日毎に指示される濃度のＰＰＳを含む培地と交換した。８日目に３Ｈ−グルコサミンを、指示される濃度のＰＰＳを含有する培地に添加して、１．０μＣｉ／ｍｌを含有する溶液を提供し、これを各ウェルに添加した。プレートをさらに２４時間インキュベートした。９日目に培養を終了させ、培地を５ｍｌのキャップ付管に収集し、以下のサイズ排除クロマトグラフィまで４℃で貯蔵した。
【０４３７】
ゲルろ過クロマトグラフィを用いる培地中の３Ｈ−ヒアルロナン（３Ｈ−ＨＡ）の単離および定量化
各培地サンプルからの０．５ｍｌの２つのアリコートをＡおよびＢで標識化した。２０μｌの１Ｍの酢酸（ｐＨ６．０）を全てのアリコートに添加した。５０μｌの反応緩衝液（２０ｍＭの酢酸Ｎａおよび０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）をアリコートＡに添加し、５０μｌの反応緩衝液中のＴＲＵストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ヒアルロニダーゼ（ＨＹＡＬＡＳＥ）をアリコートＢに添加した。全てのサンプルを６０℃で３時間インキュベートし、その後５分間沸騰させて、添加したヒアルロニダーゼを不活性化した。ゲルろ過までサンプルを−２０℃で貯蔵した。
【０４３８】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ２００が充填されたゲルろ過カラムを用いて、培地中の３Ｈ−ＨＡおよび３Ｈ−ＰＧを単離および同定した。カラムにロードする直前に、培地サンプルをベンチマイクロヒュージ（ｂｅｎｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）において高速で１０分間、ルーチン的に遠心分離した。サンプル（それぞれ２００μｌ）を、サンプルループを通してカラムに注入し、ＰＢＳ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５ＭのＮａ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）を用いて０．２ｍｌ／１分の流速でカラムを溶出させた。１．０ｍｌ／画分において全部で１８６個の画分でカラム溶出液を収集し、β−シンチレーションカウンタを用いて放射活性を決定した。
【０４３９】
これらの結果は図２７に示される。ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ヒアルロニダーゼ（ＨＹＡＬＡＳＥ）による消化の前後の、ＰＰＳを含有しない対照培養物についてのクロマトグラフィプロファイル下の面積の分析によって、１４．３％の３Ｈ−グルコサミンがＨＡに取り込まれ、８５．７％がＰＧサブユニットに取り込まれることが示された。２７Ａに示されるプロファイルから明らかであるように、ＰＧ−ＨＡアグリカン複合体の分子サイズは、ＨＡが消化されるときに遊離するＰＧモノマーよりも大きかった。試験したＰＰＳの濃度のうち、０．１マイクログラム／ｍＬおよび１．０マイクログラム／ｍＬのみが、培地中で新しく合成された３Ｈ−ＨＡのレベルの実質的な増大を示した。ＰＧモノマーの消化後空隙容積画分中に存在する放射活性の割合は５０．４％であり、１マイクログラム／ｍＬでは４９．６％がＨＡに取り込まれ（図２７Ｃ）、０．１マイクログラム／ｍＬでは３５．５％である（プロファイルは図示せず）ことが示される。より低い濃度のＰＰＳ（図２７Ｂ）では、ＨＡ画分中に１５．１％の放射活性が見出されたが、２．５マイクログラム／ｍＬのより高い濃度では、約１１％の３Ｈ−グルコサミンしかＨＡに取り込まれなかった。これらのデータは、マイクロマス培養における前駆細胞によるＨＡの最大合成が１．０マイクログラム／ｍＬのＰＰＳ濃度で生じたことを示唆するが、マイクロマス細胞外基質中に残存する３Ｈ−ＨＡレベルはまだ決定されていない。本明細書に記載される平衡研究によって、ＰＰＳが前駆細胞の軟骨形成分化および軟骨プロテオグリカンの形成を刺激することが示されたので、細胞を包囲する細胞外基質は、ＰＧアグリカン複合体の成分の形で、新しく合成されるＨＡのより豊富な源を表し得る。それにもかかわらず、これは、培養した前駆細胞によるＨＡの生合成をＰＰＳが刺激することを実証する最初の報告である。
【０４４０】
３Ｈ−グルコサミンのＨＡへの取込みを測定することによる、前駆細胞によるヒアルロナン（ＨＡ）の生合成に対するｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２ｐ）の単独およびペントサン多硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）と組み合わせた濃度効果
ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から購入したマウス前駆細胞（細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＡＴＤＣ５）またはヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）は、上述のようにマイクロマス培養において確立されるか、あるいは６ウェル培養プレートに１．５×１０５細胞／ウェルで播種され、化合物を添加する前に２４時間付着させられる。種々の濃度のｒｈＮＣ４調製物は単独またはＰＰＳ（Ｂｅｎｅ−Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせて、１０％のＦＣＳおよび５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（培養で必要とされる２倍の濃度）を含有するＤＭＥＭ培地で調製され、０．２２μｍフィルタにより滅菌され、次に連続的に希釈されて、各実験に必要とされる最終濃度の薬物が与えられる。試験溶液のそれぞれのアリコートは２４ウェル培養プレートの各ウェルに添加される。ストック３Ｈ−グルコサミンは培地に希釈されて１．０μＣｉ／ｍｌの溶液が得られ、これは直ちに各ウェルに添加される。プレートはさらに２４時間インキュベートされる。培養が終了したら培地は５ｍｌのキャップ付管に収集され、３Ｈ−ＨＡ分析のために−２０℃で貯蔵される。細胞はトリプシン処理によって放出され、洗浄物と共に遠心分離される。トリプシンに動員される放射活性標識化ＨＡおよび洗浄物は培地に関して分析され、次に、以下に記載されるように、ＲＮＡの抽出および遺伝子発現の評価のために細胞を使用した。
【０４４１】
ゲルろ過クロマトグラフィを用いる培養物中の３Ｈ−ヒアルロナン（３Ｈ−ＨＡ）の単離および定量化
各培地サンプルからの０．５ｍｌの２つのアリコートがＡおよびＢで標識化される。２０μｌの１Ｍの酢酸（ｐＨ６．０）が全てのアリコートに添加される。５０μｌの反応緩衝液（２０ｍＭの酢酸Ｎａおよび０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）がアリコートＡに添加され、５０μｌの反応緩衝液中の５ＴＲＵストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）ヒアルロニダーゼがアリコートＢに添加される。全てのサンプルは、６０℃で３時間インキュベートされた後、添加したヒアルロニダーゼを不活性化するために５分間沸騰される。サンプルはゲルろ過まで−２０℃で貯蔵される。
【０４４２】
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６またはＳｕｐｅｒｄｅｘ−Ｓ２００のいずれかが充填されたゲルろ過カラムが、培地中の３Ｈ−ＨＡを単離および同定するために使用される。カラムにロードする直前に、培地サンプルは、ベンチマイクロヒュージ（ｂｅｎｃｈ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）において高速で１０分間、ルーチン的に遠心分離される。サンプル（それぞれ２００μｌ）はサンプルループを通してカラムに注入され、カラムは、ＰＢＳ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５ＭのＮａ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）を用いて０．２ｍｌ／１分の流速で溶出される。カラム溶出液は０．５ｍｌ／画分において全部で４６個の画分で収集され、放射活性はβ−シンチレーションカウンタを用いて決定される。
【０４４３】
この実験は、１〜５マイクログラム／ｍＬのＰＰＳ（単独の場合）および５〜２５マイクログラム／ｍＬのｒｈＮＣ４の範囲にわたって最適な効果を有するＨＡ合成の濃度依存性刺激を示すであろう。２マイクログラム／ｍＬを５〜２５マイクログラム／ｍＬのｒｈＮＣ４と組み合わせると相乗効果を示すであろう。
【０４４４】
ＥＬＩＳＡを用いた、前駆細胞によるヒアルロナン（ＨＡ）の生合成に対するｒｈＮＣ４（バッチＰＢＡ−１２０２ｐ）の単独およびペントサン多硫酸ナトリウム（ＰＰＳ）と組み合わせた濃度効果
ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ（Ｔｓｕｋｕｂａ，Ｊａｐａｎ）から購入したマウス前駆細胞（細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２またはＡＴＤＣ５）、またはヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が２４ウェル培養プレートに２×１０５細胞／ウェルで播種され、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）が補充された１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持され、細胞が８０％コンフルエンスに達するまで５％ＣＯ２／９５％湿潤空気の雰囲気中３７℃でインキュベートされる。次に、培地は、種々の濃度のｒｈＮＣ４調製物を単独およびペントサン多硫酸（Ｂｅｎｅ−Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせて含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２で置換され、培養物は５％ＣＯ２中３７℃でさらに２４時間維持される。各ウェル内の培地は細胞から分離され、２．０ｍｌのマイクロヒュージ管に移される。ウェルに残存する単層細胞はトリプシン処理によって剥離され、次に、３５０ｇで５分間の遠心分離によって上清から分離される。上清は収集され、培地と合わせられる。合わせた培地および上清混合物（２００μｌ）は、上述のようなＨＡ−ＥＬＩＳＡを用いてヒアルロナン含量についてアッセイされる。細胞トリプシン処理からの上清は、酵素を変性および不活性化するために沸騰され、同様にＥＬＩＳＡを用いてＨＡ含量についてアッセイされる。これらの画分のＨＡは、細胞外基質（ＥＣＭ）のＨＡ含量を表すと考えられるであろう。
【０４４５】
この実験の結果は、図２７で見出される結果を確認するであろう。ＥＬＩＳＡは、低用量（１〜５マイクログラム／ｍｌを含む）の多硫酸化多糖類の存在下の前駆細胞によるＨＡ産生を実証し得る。
【０４４６】
インビトロの石灰化アッセイを用いる、骨形成培地中のヒト前駆細胞の分化に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの効果
インビトロで石灰化骨基質を発生するためのヒト前駆細胞の誘発に必要な条件は、既に記載されている（Ｇｒｏｎｔｈｏｓ  Ｓ，ＡＣ  Ｚａｎｎｅｔｔｉｎｏ，ＳＪ  Ｈａｙ，Ｓ  Ｓｈｉ，ＳＥ  Ｇｒａｖｅｓ，Ａ  Ｋｏｒｔｅｓｉｄｉｓ  ａｎｄ  ＰＪ  Ｓｉｍｍｏｎｓ．（２００３年）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１６：１８２７−１８３５頁）。骨誘導培地は、２％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０−７リン酸デキサメタゾンナトリウムホスファート、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００μＭのＬ−アスコルビン酸２−リン酸、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液が補充されたα−ＭＥＭ培地からなる。
【０４４７】
ヒト前駆細胞を８×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、指定される濃度のＰＰＳ（０．０、１．０、５．０、１０マイクログラム／ｍＬ）を含有する骨誘導培地の添加の前に、９０％以上のコンフルエンスに到達させた。５％ＣＯ２の存在下で指示される期間、３７℃で細胞を培養した。新たな化合物を含有する骨誘導培地を週２回、４週間取り換えた。
【０４４８】
この実験からの結果は、図７Ａにおいて見ることができる。これは、特に１および１０マイクログラムのＰＰＳ／ｍＬにおいて、ＰＰＳの存在が骨細胞への分化を抑制したことを示す。
【０４４９】
骨形成培地におけるヒト前駆細胞の分化に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの効果−インビトロのミネラル含量の分析
各ウェル内の全ＤＮＡあたりのカルシウムレベルを測定することによって、上述の培地中の全ミネラル含量／ウェルを評価した。Ｃａ＋もＭｇ＋も含まないＰＢＳで細胞培養物を３回洗浄し、０．６Ｍの塩酸（１００μＬ／ウェル）中で一晩可溶化させた。新しい９６ウェルプレートに酸可溶化ミネラル２３を移し、ｏ−クレゾール−フタレイン−コンプレキソン（ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ）（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）と反応させて、ＥＬ  ８０８  Ｕｌｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒを用いて５７０ｎｍで測定される紫色素を形成した。紫色素の強度は、各ウェル内のカルシウム濃度に正比例する。絶対的なカルシウム濃度は、製造業者の推奨に従ってカルシウム標準曲線から外挿した。これに続いて、酸可溶化培養物をＣａ２＋もＭｇ２＋も含まないＰＢＳで３回すすぎ、１００μＬの１００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫの溶液中、３７℃で２時間インキュベートした。消化したサンプルを勢いよくピペットで取り、ＤＮＡアッセイ緩衝液（２ＭのＮａＣｌおよび５０ｍＭのリン酸ナトリウム）中に希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（２μｇ／ｍＬ）を１５０μＬ含有する非蛍光アッセイプレートのウェルに、各ウェルからの５０μＬを移した。ＬＳ５５  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により３５０ｎｍで一連のＤＮＡ標準物に対して測定することによって、絶対吸光度を決定した。
【０４５０】
この実験からの結果は、図７Ｂにおいて見ることができる。ＰＰＳ培養物が全て培地と同じに見えるという事実は、石灰化沈着物が存在しないことを示す。通常、石灰化沈着物はＡｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ試薬で陽染され、骨誘導性条件下での前駆細胞の培養の４週間以内に形成される。
【０４５１】
インビトロの脂肪生成アッセイを用いる、脂肪生成培地におけるヒト前駆細胞の分化に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの効果
インビトロでヒト骨髄間質細胞からの脂質の発生に必要とされる条件は、既に記載されている（Ｇｉｍｂｌｅ  Ｊ．Ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｉｎ：Ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．ＪＮ  Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄ，Ｏｗｅｎ，Ｍ．Ｅ編．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，６７−８７頁（１９９８年））。簡単に述べると、ヒト前駆細胞を完全α−ＭＥＭ成長培地中８×１０３細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、誘導培地の添加の前に、９０％よりも高いコンフルエンスに到達させた。用量設定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）のＰＰＳ（０．０、１．０、５．０、１０マイクログラム／ｍＬ）の存在下、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）、６０ｍｉｃｒｏＭのインドメタシン、および０．５ｍｉｃｒｏＭのヒドロコルチゾンが補充された完全α−ＭＥＭで構成される脂肪生成誘導培地において細胞を培養した。誘導培地を週２回、４週間取り換えた。Ｏｉｌ  Ｒｅｄ「Ｏ」を用いて脂質の存在のために細胞を染色した。
【０４５２】
脂質のＯｉｌ  Ｒｅｄ「Ｏ」染色
細胞を上述のように培養し、細胞単層の破壊を回避するために１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で穏やかにすすいだ。リン酸緩衝ホルマリン中、室温で１５分間細胞を固定した。次に、固定液を除去し、１００ｍｉｃｒｏＬの新たにろ過したＯｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ（３ｍｇ／ｍＬ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を添加することによって、室温で２時間以上脂質を染色した。細胞をＲＯ水で３回すすぎ、Ｍａｙｅｒ’ｓ  Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｌｉｌｌｉｅ変性）で対比染色した。Ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ染料を吸引し、水で置換し、Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ陽性脂肪細胞を光学顕微鏡下で検査し、ＤＰ２０−５６  Ｏｌｙｍｐｕｓカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）で写真に撮った。
【０４５３】
これらの結果は図８ＡおよびＢに示される。前駆細胞の脂肪細胞への分化をＰＰＳが調節し、全ての濃度において上方調節が見られることが分かる。
【０４５４】
コラーゲンスポンジ内で成長された前駆細胞によるプロテオグリカン（３５Ｓ−ＧＡＧとして測定）生合成に対するペントサン多硫酸（ＰＰＳ）ナトリウムの効果
１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）が補充された１００ｍｉｃｒｏＬの１：１高グルコースＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に平均１００，０００個の細胞を含有する懸濁液として調製されたヒト免疫選択Ｓｔｒｏ−１＋前駆細胞（Ｍｅｓｏｂｌａｓｔ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が、マイクロピペットを用いて、２４ウェル培養物プレートのウェルに入れられた調製コラーゲンスポンジのブロックの中心に注入される。コラーゲンスポンジは、処置前に予め０．５ｃｍ３の立方体に切断された無菌Ｇｅｌｆｏａｍｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏ．，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）であり得る。各ウェルは２ｍＬの培地＋ＦＢＳが添加され、プレートは、５％ＣＯ２／９５％空気中で４８時間、３７℃でインキュベートされる。次に培地は、さらに４８時間、種々の濃度のＰＰＳ（０、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、２５．０μｇ／ｍｌ）を含有する１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）が補充された１：１高グルコースＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置換される。全てのＰＰＳ濃度は３重に培養されるであろう。次に培地は、指示される濃度のＰＰＳおよび５μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−Ｈ２ＳＯ４（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を含有する規定の培地に取り替えられる。実験は、培地に放出される（３５Ｓ−ＧＡＧ）としてＰＧへの３５ＳＯ４の取込みを測定することによってＰＧ生合成が決定され得る場合にはインキュベーションの４８時間後に、そして上述のようなスポンジのコラゲナーゼ消化の後に終了されるであろう。
【０４５５】
この実験は、インビトロで示され、そして本明細書に記載されるものと同様の濃度で、スポンジ内の軟骨形成が多硫酸化多糖類の存在下で向上されることを実証するであろう。実験は、５０〜１０万個の前駆細胞の用量が適切な細胞数であり、１〜１０マイクログラム／ｍｌの濃度の多硫酸化多糖類は有益な効果を提供することを確認するであろう。
【０４５６】
前駆細胞およびペントサン多硫酸（ＰＰＳ）の製剤を用いる、椎間板再生および軟骨修復の動物モデルにおける新規の軟骨製剤の評価
動物プロトコール
２レベルの脊髄手術が、ランダムに２つの６匹のグループに分けられる１２匹の成体メリノ／レスター雌羊の頸部Ｃ３／４およびＣ４／５脊髄レベルで行われる。手順は、椎間板がこれらのレベルから外科的に除去され、これまで椎間板によって占められていた椎体の間に、前駆細胞を含有するコラーゲンスポンジ足場によって充填された生分解性の移植片が移植されることを必要とする。スポンジ内に注入される、異なる細胞は別として、研究の設計における唯一の他の変数は、移植片の挿入前に軟骨終板（ＣＥＰ）が機械的に穿孔されるかどうかである。研究の期間は、移植のときから屠殺するまでの１２週間である。
【０４５７】
グループＡ（Ｎ＝６）
無菌Ｇｅｌｆｏａｍ  Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｓｐｏｎｇｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏ．，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ，ＵＳＡ）は、予め形成されたテンプレートを用いてサイズに切断され、次に、マイクロピペットを用いて１００マイクロリットルのＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）溶液が注入される。ロードされたスポンジは、次に、特異的に変性された生分解性ケージに挿入され、これは指示されるレベルの外科的に切除された頸部椎間板空間内に固定され得る。ケージは市販の椎骨プレートによって定位置に固定され得る。
【０４５８】
グループＢ（Ｎ＝６）
無菌Ｇｅｌｆｏａｍ  Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｓｐｏｎｇｅは、予め形成されたテンプレートを用いてサイズに切断され、前駆細胞（１００万個のヒツジ前駆細胞）＋１０マイクログラムのＰＰＳを含有する１００マイクロリットルのＰｒｏｆｒｅｅｚｅ（登録商標）溶液がロードされる。ロードされたスポンジは、次に生分解性ケージに挿入され、これは指示されるレベルの外科的に切除された頸部椎間板空間内に固定され得る。ケージは市販の椎骨プレートによって定位置に固定され得る。
【０４５９】
実験結果の評価
以下の時点：ベースライン、手術、試験物質の移植の１、２および３ヵ月後において、麻酔導入下で全ての頸部脊椎の側面Ｘ線写真が撮られ、表３に示されるスコアリングを用いて骨形成についてスコア化される。
【０４６０】
【表１１】
0005542686.tif 000014
【０４６１】
また動物は、表４に示されるスケジュールを用いて、長期的に処理を受けたヒツジのケアのための動物倫理ガイドラインに従って研究中ずっと監視される。
【０４６２】
【表１２】
0005542686.tif 000015
【０４６３】
組織学的分析
屠殺の後、インタクトな頸部脊椎が動物から切開され、Ｃ３／４およびＣ４／５運動分節が帯のこ（ｂａｎｄ  ｓａｗ）を用いて脊椎の残りの部分から切断される。次に、これらの２つの分節は、矢状面（ｓａｇｉｔａｌ  ｐｌａｎｅ）で２つの切片に切断され、１０％の通常の緩衝ホルマリン中で貯蔵される。これらの切片は、３ｍｍの上位椎体および下位椎体を両側に有するケージを含有し得る。次にこれらはギ酸を用いて脱灰され、そして攪拌下、上昇濃度のエタノール中で脱水される。キシレン中で洗浄した後、組織はパラフィンに埋め込まれ、切断され、そしてＨ＆Ｅ、Ａｌｃｉａｎ  Ｂｌｕｅ、Ｔｏｌｕｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ，Ｍａｓｓｏｎｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅで染色される。Ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  Ｂｌｕｅ染色切片は、定量的画像分析を用いる組織形態計測的分析のために使用され、パーソナルコンピュータでＩｍａｇｅ  Ｊ（登録商標）ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いてプロテオグリカン分布の光学濃度および基質寸法が決定される。
【０４６４】
また非染色パラフィン切片は、基質成分の免疫組織化学的分析のために使用される。これらは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ８．０）中のコンドロイチナーゼＡＢＣ（０．２５Ｕ／ｍｌ）により３７℃で１時間、リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）中、ウシ精巣ヒアルロニダーゼ１０００Ｕ／ｍｌにより３７℃で１時間の組み合わせで前消化された後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．５ＭのＮａＣｌ（ＴＢＳ）またはプロテイナーゼ−Ｋ（ＤＡＫＯ  Ｓ３０２０）中、室温で６分間、３回洗浄されて、抗原性エピトープを露出させる。次に、組織は２０％の正常ブタ血清中で１時間遮断され、大型および小型プロテオグリカンおよびコラーゲンに対する多数の一次抗体で探索される（表５）。また負の対照切片は、一次抗体を省略するか、あるいは対象となる標準一次抗体に対して無関係のアイソタイプ一致型一次抗体で置換して処理される。市販の（ＤＡＫＯ）アイソタイプ一致型マウスＩｇＧ（ＤＡＫＯ  Ｃｏｄｅ  Ｘ９３１）またはＩｇＭ（ＤＡＫＯ  Ｃｏｄｅ  Ｘ９４２）対照抗体（適切な場合）が、この工程のために使用され得る。ＤＡＫＯ製品Ｘ９３１およびＸ９４２は、哺乳類組織において存在もしないし誘発もできない酵素のアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼに対するマウスモノクローナルＩｇＧ１（クローンＤＡＫ−ＧＯ１）およびモノクローナルＩｇＭ（クローンＤＡＫ−ＧＯ８）抗体である。ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ結合型二次抗体は、ＴＢＳ中の０．０５％の３，３’−ジアミノベンジデン二塩酸塩および０．０３％のＨ２Ｏ２、Ｎｏｖａ  ＲＥＤ、ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）またはＮｅｗ  Ｆｕｃｈｓｉｎを基質として用いる検出のために使用され得る。染色されたスライドは明視野顕微鏡法によって検査され、Ｌｅｉｃａ  ＭＰＳ  ６０顕微鏡撮影デジタルカメラシステムを用いて写真が撮られる。
【０４６５】
【表１３】
0005542686.tif 000016
【０４６６】
（ａ）Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｃ．Ｂ．＆Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５６，１４９−１５７（１９９８年）。Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．＆Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  ｏｖｉｎｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ａｎａｔ  １９７（Ｐｔ  ２），１８９−１９８頁（２０００）。
（ｂ）Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．＆Ｔａｙｌｏｒ，Ｔ．Ｋ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｂｅａｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６８，１３７−１４６頁（２００１年）。
（ｃ）Ｓｈｅｎ，Ｂ．，Ｍｅｌｒｏｓｅ，Ｊ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｐ．＆Ｔａｙｌｏｒ，Ｆ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２  ａｎｄ  −３  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｏｖｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｃｅｌｌｓ  ｇｒｏｗｎ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ｂｅｔａ：ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  １２，６６−７５頁（２００３年）。
（ｄ）Ｙｅ，Ｘ．Ｊ．，Ｔｅｒａｔｏ，Ｋ．，Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｈ．，Ｃｒｅｍｅｒ，Ｍ．Ａ．＆Ｙｏｏ，Ｔ．Ｊ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔｙｐｅ  ＩＸ  ｃｏｌｌａｇｅｎ（ＬＭＷ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ３９，２６５−２７１頁（１９９１年）。
【０４６７】
統計学
スチューデントｔ検定は、表示されるようなペアごとの比較のために使用される。統計的有意性は、Ｐが０．０５未満において与えられる。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、表示されるような多重比較のために使用される。グループ間の統計的有意性は、フィッシャーの最小有意差法（Ｆｉｓｈｅｒ  ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ  ｌｅａｓｔ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｅｓｔ）を用いて０．０５未満のＰで決定される。
【０４６８】
この実験は、対照に比べて、多硫酸化多糖類および前駆細胞の使用が、椎間板空間におけるより大きい（より大量の）軟骨の産生をもたらすことを実証し得る。
【０４６９】
さらに、前駆細胞およびＰＰＳを含有するコラーゲンスポンジとの相互作用手段を有する穿刺した軟骨終板を含有した、椎間板の切除された空間において、機械的に生じさせた軟骨欠損のより完全な治癒を伴う内在性血液由来の前駆細胞の浸潤の増強が観察され得る。
【０４７０】
特定の実施形態で示されるように、広範に記載される本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく本発明には多数の変化および／または修正が行われ得ることは当業者によって認識されるであろう。従って、本発明の実施形態は、全ての点で、例示的であって限定的ではないと考えられるべきである。
【図１】
0005542686.tif 000017
【図２】
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【図３】
0005542686.tif 000019
【図４】
0005542686.tif 000020
【図５】
0005542686.tif 000021
【図６】
0005542686.tif 000022
【図２０Ｃ】
0005542686.tif 000023
【図２１】
0005542686.tif 000024
【図２２】
0005542686.tif 000025
【図２３】
0005542686.tif 000026
【図２８】
0005542686.tif 000027
【図２９】
0005542686.tif 000028
【図３０】
0005542686.tif 000029
【図３１】
0005542686.tif 000030
【図３２】
0005542686.tif 000031
【図３３】
0005542686.tif 000032
【図３４】
0005542686.tif 000033
【図３５】
0005542686.tif 000034
【図７】
0005542686.tif 000035
【図８】
0005542686.tif 000036
【図９】
0005542686.tif 000037
【図１０】
0005542686.tif 000038
【図１１】
0005542686.tif 000039
【図１２】
0005542686.tif 000040
【図１３】
0005542686.tif 000041
【図１４】
0005542686.tif 000042
【図１５】
0005542686.tif 000043
【図１６】
0005542686.tif 000044
【図１７】
0005542686.tif 000045
【図１８】
0005542686.tif 000046
【図１９】
0005542686.tif 000047
【図２０Ａ】
0005542686.tif 000048
【図２０Ｂ】
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【図２４】
0005542686.tif 000050
【図２５】
0005542686.tif 000051
【図２６】
0005542686.tif 000052
【図２７】
0005542686.tif 000053
【配列表】
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