(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27及び配列番号28からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
患者においてグルコース代謝障害に関連する障害を治療する医薬の製造における、治療上有効量の請求項１に記載の単離ポリペプチドの使用。
【請求項３】
前記障害がＩ型またはＩＩ型糖尿病である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記障害が、インスリン欠陥に関連する病状である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記障害が、インスリン耐性に関連する病状である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記障害が、脂質異常症に関連する病状である、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記障害が、肥満に関連する病状である、請求項２に記載の使用。
【請求項８】
患者体内の膵臓β細胞の増殖または生存を増強するための医薬の製造における、治療上有効量の請求項１に記載の単離ポリペプチドの使用であって、該細胞の移植片としての該患者への投与前に、該膵臓β細胞に該単離されたポリペプチドをｅｘ  ｖｉｖｏで供することによる、上記使用。
【請求項９】
前記単離されたポリペプチドが、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、経口投与、口腔内投与、舌下投与、経鼻送達または吸入に適した形態にある、請求項２〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
配列番号６に示すアミノ酸配列からなり、かつ、環化されている、単離ポリペプチド。
【請求項１１】
リンカー部分に連結されている請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アシル化グレリン断片およびその類似体、ならびにそれらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）は、胃から単離されたペプチドであるが、膵臓内分泌部を含む他の多数の組織においても発現している。それは、１ａ型成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ）の天然リガンドとして発見された（参考文献１、２）。グレリンの３位のセリンのアシル化は、ＧＨＳ−Ｒ１ａとの結合に不可欠であり、ＧＨ放出活性、およびアシル化グレリンの摂食促進作用も仲介する。ＧＨ分泌を刺激して他の下垂体機能を調節する他に、アシル化グレリン（ＡＧ）は、食物摂取およびエネルギーバランスの中枢性制御、およびインスリン分泌およびグルコース代謝の制御等の、広範囲の生物学的作用を及ぼす。ＧＨＳ−Ｒ１ａの発現は、膵臓を含む、さまざまな、動物およびヒトの、内分泌および非内分泌、中枢および末梢組織で検出されている。特に、グレリンとインスリンとの結合は、重要な関連があると思われる。ＡＧは、高血糖性の糖尿病誘発効果を有することが示され、グレリンノックアウトマウスは、グルコース誘導性のインスリン放出の増強を示し、一方で、膵島由来のグレリンの遮断は、ラットにおいて、インスリン分泌を増強すること、および高脂肪食餌誘導性グルコースの不耐性を防止することが示されている。
【０００３】
膵臓内分泌部では、グレリンは、α細胞およびβ細胞、ならびに新たに同定されたグレリン生成膵島ε細胞に局在化することが示され、β細胞の運命および機能の制御における役割を示唆している（参考文献９、２２、１９）。β細胞の生存は、正常なグルコース代謝の維持に大変重要であり、β細胞のアポトーシスは、１型および２型両方の糖尿病での重大な事象である（参考文献１６、２１）。
【０００４】
非アシル化グレリン（Ｕｎａｃｙｌａｔｅｄ  ｇｈｒｅｌｉｎ：ＵＡＧ）は、グレリンの主な循環形態であり、長年にわたって、生理学的な濃度ではＧＨＳ−Ｒ１ａに結合せず、したがってＧＨ放出活性を欠いているため、生物学的に不活性であると考えられていた。現在、ＵＡＧは、生物活性ペプチドであることが分かっており、特に代謝レベルにおいて、米国特許公開第２００５−００８０００７号の下で、２００５年４月１４日に公開された米国特許出願第１０／４９９，３７６に記載されているように、抗糖尿病誘発効果を及ぼすことを示している。実際に、ＵＡＧは、以下のことができる。（ａ）ヒトにおけるＡＧの高血糖性効果を打ち消す（参考文献６）、（ｂ）肝細胞から排出される、基底グルコース、グルカゴン誘導性グルコースおよびアシル化グレリン刺激性グルコースをブロックすることにより直接的に肝臓レベルで糖代謝を調整する（参考文献３）、（ｃ）ＵＡＧトランスジェニック動物における、脂肪沈着、食物消費、およびグルコースレベルを減少させる（参考文献７）、（ｄ）β細胞およびヒト膵島において、増殖を刺激し、細胞死およびアポトーシスを防止する（参考文献４）。
【０００５】
近年、ＵＡＧが、増殖を刺激できること、および（ＩＦＮ）−γ／腫瘍壊死（ＴＮＦ）−α（β細胞およびヒト膵島における相乗作用）によって誘導される細胞死とアポトーシスを防止できることが実証された（参考文献４）。特筆すべきは、サイトカインの相乗作用が、１型糖尿病におけるβ細胞の破壊、および２型糖尿病におけるβ細胞の消失の主な原因であると考えられることである。さらに、この研究はまた、ＵＡＧが、ＧＨＳ−Ｒ１ａを発現しないβ細胞からの、グルコース誘導性のインスリン分泌を刺激したことも示した。
【０００６】
まとめると、これらの結果は、ＵＡＧが、糖尿病を含むがこれに限定されない、インスリン欠乏またはインスリン耐性によって特徴付けられる疾患等の、代謝疾患に関連する病状における治療的有効性を有し、ＵＡＧのβ細胞への効果は、これらの潜在的用途におけるＵＡＧの作用機序のうちの１つである、という考えを強化する。
【０００７】
近年、健常なボランティアにおけるＵＡＧの持続注入によって、血中グルコースの低下、インスリン感受性の改善、血中遊離脂肪酸の低下、およびコルチゾールレベルの低下がもたらされたことにより、ＵＡＧの治療的有効性が臨床的に実証された。
【０００８】
ＵＡＧは、２８個のアミノ酸ペプチドであり、好ましくは、その効果を発揮するために、静脈または皮下注射によって患者に投与されるが、これは患者に薬物を投与するのに好都合な方法でない。また、このサイズのペプチドは、通常、投与後に急速に分解し、それらの生体内での有効性は、しばしば、静脈、皮下、または筋肉内投与後に弱まる。
【０００９】
加えて、２８個のアミノ酸ペプチドの製造は、固相ペプチド合成による製造であっても、組み換え技術による製造であっても、時間のかかる高価なプロセスである。最後に、ＵＡＧ等の長いペプチドによる患者の長期治療は、免疫原性の形で、患者に対する安全性上のリスクを示す可能性がある。天然ペプチドに対する中和抗体の増加は、患者に対する潜在的で重大な健康リスクである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許公開第２００５−００８０００７号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K; (1999) Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature 402:656-660.
【非特許文献２】van der LeIy AJ, Tschop M, Helman ML, Ghigo E; (2004) Biological, physiological, pathophysiological, and pharmacological aspects of ghrelin. Endocr Rev 25:426-457.
【非特許文献３】Date Y, Nakazato M, Hashiguchi S, Dezaki K, Mondal MS, Hosoda H, Kojima M, Kangawa K, Arima T, Matsuo H, Yada T, Matsukura S; (2002) Ghrelin is present in pancreatic alpha-cells of humans and rats and stimulates insulin secretion. Diabetes 51:124-129.
【非特許文献４】Wierup N, Svensson H, Mulder H, Sundler F, (2002) The ghrelin cell: a novel developmentally regulated islet cell in the human pancreas. Regul Pept 107:63-69.
【非特許文献５】Prado CL, Pugh-Bernard AE, Elghazi L, Sosa-Pineda B, Sussel L; (2004) Ghrelin cells replace insulin-producing beta cells in two mouse models of pancreas development. Proc Natl Acad Sci USA 101:2924-2929.
【非特許文献６】Mandrup-Poulsen T; (2001) beta-cell apoptosis: stimuli and signaling. Diabetes 50:S58-63.
【非特許文献７】Wajchenberg BL; (2007) beta-cell failure in diabetes and preservation by clinical treatment. Endocr Rev. 28:187-218.
【非特許文献８】Broglio F, Gottero C, Prodam F, Gauna C, Muccioli G, Papotti M, Abribat T, Van Der LeIy AJ, Ghigo E; (2004) Non-acylated ghrelin counteracts the metabolic but not the neuroendocrine response to acylated ghrelin in humans. J Clin Endocrinol Metab 89:3062-3065.
【非特許文献９】Gauna C, Delhanty PJ, Hofland LJ, Janssen JA, Broglio F, Ross RJ, Ghigo E, van der LeIy AJ; (2005) Ghrelin stimulates, whereas des-octanoyl ghrelin inhibits, glucose output by primary hepatocytes. J Clin Endocrinol Metab 90:1055-1060.
【非特許文献１０】Asakawa A, Inui A, Fujimiya M et al.; (2005) Stomach regulates energy balance via acylated ghrelin and desacyl ghrelin. Gut 54:18-24.
【非特許文献１１】Granata R, Settanni F, Biancone L, Trovato L, Nano R, Bertuzzi F, Destefanis S, Annunziata M, Martinetti M, Catapano F, Ghe C, Isgaard J, Papotti M, Ghigo E, Muccioli G; (2007) Acylated and unacylated ghrelin promote proliferation and inhibit apoptosis of pancreatic β cells and human islets involvement of CAMP/PKA, ERKl/2 and PI3K/AKT signaling. Endocrinology 148:512-529.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＵＡＧに相当する生物活性があるが、製造が容易でコストが低い、より小さいサイズのペプチドを同定することが大変望ましい。
【００１３】
ＵＡＧと比較した時に、これらの小サイズペプチドの生物学的効能が、高められることがさらに望ましい。
【００１４】
これらの小サイズペプチドの別の利点は、長期および繰り返し投与時の患者に対する免疫原性リスクがほとんど無く、したがって、より良好な安全性プロファイルを呈することである。小サイズペプチドは、どのような投与経路であってもＵＡＧよりも良好なバイオアベイラビリティを有し得、経皮、肺、鼻腔内、または経口送達等が挙げられるがこれに限定されない、より好都合な投与経路に好適であり得、または、より良好な経口バイオアベイラビリティを有するペプチド類似体またはペプチド模倣分子を設計するための出発材料を構成し得る。小サイズペプチドはまた、ポリマーに基づくデポー製剤等があるがこれに限定されない、薬物送達システムに対応し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様では、配列番号９で示されるアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸断片またはその類似体を含む単離ポリペプチドであって、（ａ）血中グルコースレベルの低下、（ｂ）インスリン分泌および／または感受性の増加、（ｃ）インスリン分泌細胞への結合、および（ｄ）インスリン分泌細胞の生存促進からなる群より選択される少なくとも１つの活性を有する、前記単離ポリペプチドが提供される。
【００１６】
本発明の一態様では、アミノ酸残基の長さが５〜２７個であり、Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌのアミノ酸配列を含む、前記単離ポリペプチドが提供される。
【００１７】
本発明の別の態様では、患者におけるグルコース代謝障害に関連する疾患を治療するための方法であって、治療上有効量の本明細書において定義されるポリペプチドを該患者に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明の別の態様では、インスリン分泌細胞の生存および／または増殖を増強するための方法であって、治療上有効量の本明細書において定義されるポリペプチドの存在下で、該細胞を培養するステップを含む方法が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様では、患者においてグルコース代謝障害に関連する疾患を治療するための医薬の製造における、治療上有効量の本明細書において定義されるペプチドの使用が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、患者においてグルコース代謝障害に関連する疾患を治療するための、治療上有効量の本明細書において定義されるペプチドの使用が提供される。
【００２１】
本発明のさらなる態様では、グルコース代謝障害に関連する代謝疾患を治療するための医薬組成物であって、治療上有効量の本明細書において定義されるポリペプチドを含む、医薬組成物が提供される。
【００２２】
本発明のさらなる態様では、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および配列番号２８からなる群より選択される、単離ポリペプチドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】非アシル化グレリンまたは示された非アシル化グレリンの断片の存在下での、無血清培地におけるＩＮＳ−１Ｅβ細胞の生存を示す図である。
【図２】ＴＮＦ−α／ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１βの存在下での、および非アシル化グレリンまたは示された非アシル化グレリンの断片の存在下での、ＩＮＳ−１Ｅβ細胞の生存を示す図である。
【図３Ａ】サイトカインを伴うかまたは伴わない、および非アシル化グレリンＵＡＧ（１−２８）、またはその断片ＵＡＧ（１−１４）（図３Ａ）またはＵＡＧ（１−１８）（図３Ｂ）のいずれかを伴う、または伴わない、無血清培地におけるＨＩＴ−Ｔ１５β細胞の生存を示す図である。
【図３Ｂ】サイトカインを伴うかまたは伴わない、および非アシル化グレリンＵＡＧ（１−２８）、またはその断片ＵＡＧ（１−１４）（図３Ａ）またはＵＡＧ（１−１８）（図３Ｂ）のいずれかを伴う、または伴わない、無血清培地におけるＨＩＴ−Ｔ１５β細胞の生存を示す図である。
【図４Ａ】サイトカインを伴うまたは伴わない、および非アシル化グレリンＵＡＧ（１−２８）、またはその断片ＵＡＧ（１−５）（図４Ａ）またはＵＡＧ（１７−２８）（図４Ｂ）のいずれかを伴う、または伴わない、無血清培地におけるＨＩＴ−Ｔ１５β細胞の生存を示す図である。
【図４Ｂ】サイトカインを伴うまたは伴わない、および非アシル化グレリンＵＡＧ（１−２８）、またはその断片ＵＡＧ（１−５）（図４Ａ）またはＵＡＧ（１７−２８）（図４Ｂ）のいずれかを伴う、または伴わない、無血清培地におけるＨＩＴ−Ｔ１５β細胞の生存を示す図である。
【図５Ａ】非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）、ＵＡＧ（８−１３）、ＵＡＧ（８−１２）、ＵＡＧ（１−１４）、ＵＡＧ（１−１８）、ＵＡＧ（１−２８）（図５Ａ）、およびＵＡＧ（８−１１）、ＵＡＧ（９−１２）、ＵＡＧ（９−１１）（図５Ｂ）の存在下での、サイトカイン処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞の生存を示す図である。
【図５Ｂ】非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）、ＵＡＧ（８−１３）、ＵＡＧ（８−１２）、ＵＡＧ（１−１４）、ＵＡＧ（１−１８）、ＵＡＧ（１−２８）（図５Ａ）、およびＵＡＧ（８−１１）、ＵＡＧ（９−１２）、ＵＡＧ（９−１１）（図５Ｂ）の存在下での、サイトカイン処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞の生存を示す図である。
【図６Ａ】非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）（図６Ａ）、ＵＡＧ（８−１３）（図６Ｂ）、およびＵＡＧ（８−１２）（図６Ｃ）の、サイトカイン処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞に対する抗アポトーシス効果を示す図である。
【図６Ｂ】非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）（図６Ａ）、ＵＡＧ（８−１３）（図６Ｂ）、およびＵＡＧ（８−１２）（図６Ｃ）の、サイトカイン処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞に対する抗アポトーシス効果を示す図である。
【図６Ｃ】非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）（図６Ａ）、ＵＡＧ（８−１３）（図６Ｂ）、およびＵＡＧ（８−１２）（図６Ｃ）の、サイトカイン処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞に対する抗アポトーシス効果を示す図である。
【図７Ａ】非アシル化グレリン（１−２８）、およびその断片ＵＡＧ（１−１４）、ＵＡＧ（１−１８）（図７Ａ）、およびＵＡＧ（１−５）およびＵＡＧ（１７−２８）（図７Ｂ）の、ヒト膵島に対する生存効果を示す図である。
【図７Ｂ】非アシル化グレリン（１−２８）、およびその断片ＵＡＧ（１−１４）、ＵＡＧ（１−１８）（図７Ａ）、およびＵＡＧ（１−５）およびＵＡＧ（１７−２８）（図７Ｂ）の、ヒト膵島に対する生存効果を示す図である。
【図８Ａ】ＵＡＧ（１−１４）（図８Ａ）、ＵＡＧ（１−１８）（図８Ｂ）、ＵＡＧ（１−２８）（図８Ｃ）、およびエキセンディン−４（図８Ｄ）の、ヒト膵島におけるインスリン分泌に対する効果を示す図である。
【図８Ｂ】ＵＡＧ（１−１４）（図８Ａ）、ＵＡＧ（１−１８）（図８Ｂ）、ＵＡＧ（１−２８）（図８Ｃ）、およびエキセンディン−４（図８Ｄ）の、ヒト膵島におけるインスリン分泌に対する効果を示す図である。
【図８Ｃ】ＵＡＧ（１−１４）（図８Ａ）、ＵＡＧ（１−１８）（図８Ｂ）、ＵＡＧ（１−２８）（図８Ｃ）、およびエキセンディン−４（図８Ｄ）の、ヒト膵島におけるインスリン分泌に対する効果を示す図である。
【図８Ｄ】ＵＡＧ（１−１４）（図８Ａ）、ＵＡＧ（１−１８）（図８Ｂ）、ＵＡＧ（１−２８）（図８Ｃ）、およびエキセンディン−４（図８Ｄ）の、ヒト膵島におけるインスリン分泌に対する効果を示す図である。
【図９Ａ】ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理動物における、動物の生存率（図９Ａ）に対する、血漿グルコースレベル（図９Ｂ）、血漿インスリンレベル（図９Ｃ）および膵臓インスリンレベル（図９Ｄ）に対する、非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す図である。
【図９Ｂ】ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理動物における、動物の生存率（図９Ａ）に対する、血漿グルコースレベル（図９Ｂ）、血漿インスリンレベル（図９Ｃ）および膵臓インスリンレベル（図９Ｄ）に対する、非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す図である。
【図９Ｃ】ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理動物における、動物の生存率（図９Ａ）に対する、血漿グルコースレベル（図９Ｂ）、血漿インスリンレベル（図９Ｃ）および膵臓インスリンレベル（図９Ｄ）に対する、非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す図である。
【図９Ｄ】ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理動物における、動物の生存率（図９Ａ）に対する、血漿グルコースレベル（図９Ｂ）、血漿インスリンレベル（図９Ｃ）および膵臓インスリンレベル（図９Ｄ）に対する、非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す図である。
【図１０Ａ】膵臓ＨＩＴ−Ｔ１５（図１０Ａ）およびＩＮＳ−１Ｅ（図１０Ｂ）β細胞受容体に対する、非アシル化グレリンおよび非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）の結合を示す図である。
【図１０Ｂ】膵臓ＨＩＴ−Ｔ１５（図１０Ａ）およびＩＮＳ−１Ｅ（図１０Ｂ）β細胞受容体に対する、非アシル化グレリンおよび非アシル化グレリン断片ＵＡＧ（６−１３）の結合を示す図である。
【図１１Ａ】血清の非存在下（図１１Ａ）およびサイトカインの存在下（図１１Ｂ）の両方における、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞での、６〜１３位でのアラニン（Ａｌａ）置換を伴うＵＡＧ（６−１３）の生存効果を示す図である。
【図１１Ｂ】血清の非存在下（図１１Ａ）およびサイトカインの存在下（図１１Ｂ）の両方における、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞での、６〜１３位でのアラニン（Ａｌａ）置換を伴うＵＡＧ（６−１３）の生存効果を示す図である。
【図１２Ａ】血清の非存在下（図１２Ａ）およびサイトカインの存在下（図１２Ｂ）の両方における、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞での、保存的置換およびＮ末端修飾を伴うＵＡＧ（６−１３）の生存効果を示す図である。
【図１２Ｂ】血清の非存在下（図１２Ａ）およびサイトカインの存在下（図１２Ｂ）の両方における、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞での、保存的置換およびＮ末端修飾を伴うＵＡＧ（６−１３）の生存効果を示す図である。
【図１３Ａ】血清の非存在下（図１３Ａ）およびサイトカインの存在下（図１３Ｂ）の両方における、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞での、環化を伴うＵＡＧ（６−１３）の生存効果を示す図である。
【図１３Ｂ】血清の非存在下（図１３Ａ）およびサイトカインの存在下（図１３Ｂ）の両方における、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞での、環化を伴うＵＡＧ（６−１３）の生存効果を示す図である。
【図１４Ａ】肥満に関連する糖尿病の動物モデルであるｏｂ／ｏｂマウスにおける、処理の２週間後および４週間後の血漿グルコースレベルに対する、ＵＡＧ（６−１３）のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す図である。図１４Ａは、給餌時血漿グルコースレベルを示し、図１４Ｂは、絶食時血漿グルコースレベルを示す。
【図１４Ｂ】肥満に関連する糖尿病の動物モデルであるｏｂ／ｏｂマウスにおける、処理の２週間後および４週間後の血漿グルコースレベルに対する、ＵＡＧ（６−１３）のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を示す図である。図１４Ａは、給餌時血漿グルコースレベルを示し、図１４Ｂは、絶食時血漿グルコースレベルを示す。
【図１５】肥満に関連する糖尿病の動物モデルであるｏｂ／ｏｂマウスにおける、ＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）による処理の２週間後および４週間後の絶食時インスリンレベルを示す図である。
【図１６】肥満に関連する糖尿病の動物モデルであるｏｂ／ｏｂマウスにおける、体重パーセントとしての生殖腺脂肪に対する、ＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）の効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２５】
ＵＡＧ断片およびその類似体
本発明に用いられる用語は、以下のように定義される。
【００２６】
本出願において、「グレリン」および「アシル化グレリン」または「ＡＧ」という用語は、同義的に使用され、同じ意味を有する。
【００２７】
「非アシル化グレリン」または「ＵＡＧ」という用語は、配列番号１（１−ＮＨ２Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−２８；配列番号１）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドを意味するものと意図される。ＵＡＧはまた、ＵＡＧ（１−２８）とも称され得る。
【００２８】
非アシル化グレリンの天然に存在する変異は、コード化グレリン遺伝子またはその対立遺伝子のヌクレオチド配列の個別変化によって、または転写ＲＮＡの選択的スプライシングによって生じる、１つもしくは複数のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含むペプチドを包含する。該変化は、非アシル化グレリン変異体の性質、薬理学的および生物学的特性には、実質的に影響を及ぼさないものと理解されたい。それらのペプチドは、塩の形態であり得る。特に、該分子の酸性官能基は、トリフルオロ酢酸塩等が挙げられるがこれに限定されない、その塩誘導体に置換し得る。
【００２９】
本明細書で使用する場合、配列番号９は、ＵＡＧ（配列番号１）の６〜１８位の残基からなるアミノ酸配列、すなわち６−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−１８を指す。
【００３０】
「ペプチド」「ポリペプチド」、「タンパク質」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、または化学修飾に関係なく、あらゆるアミノ酸の鎖を意味し、あるいはＤ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノアジピン酸等の非天然または異常アミノ酸を含む。この用語は、本出願において同義的に使用される。
【００３１】
「断片」または「その断片」という用語は、非アシル化グレリン等のペプチドのアミノ酸断片を指す。非アシル化グレリンの断片は、２８アミノ酸残基よりも短い。したがって、非アシル化グレリンの断片は、長さが２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、または４個のアミノ酸残基となり得る。
【００３２】
本発明の一部の態様では、該ポリペプチドは、「精製した」、「単離した」、または「実質的に純粋な」形態で使用される。該ポリペプチドは、必然的にそれらを伴う成分からそれらが分離された時には、「精製されている」または「単離されている」または「実質的に純粋」である。一般的に、化合物は、試料内の総材料の少なくとも６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％、９６重量％、９７重量％、９８重量％、または９９重量％である時に実質的に純粋である。
【００３３】
「非アシル化グレリンの類似体」または「非アシル化グレリン断片の類似体」または「その類似体」という用語は、非アシル化グレリンまたはその断片の構造的かつ機能的な類似体を指し、これらは、とりわけ、グレリンの末梢作用または機能に拮抗する際に非アシル化グレリンを置き換えることができ、または、β細胞株における増殖の刺激および／またはアポトーシスの抑制、血中グルコースレベルの低下、インスリン感受性および／または分泌の改善、コルチゾールレベルの低下、ヒトの脂質状態の改善等が挙げられるがこれに限定されない、非アシル化グレリンの他の生物学的作用を置き換えることができ、したがって、例えばインスリン耐性、インスリン欠乏、脂質異常症、またはコルチゾール過剰に関連するもの等の、代謝疾患の治療に対して潜在的な用途を有する。
【００３４】
単純な構造的類似体は、配列番号１に記載の非アシル化グレリンとの相同性、またはいずれかのその断片との相同性を示すペプチドを含む。例えば、グレリン−２８（配列番号１）のアイソフォーム、デスＧｌｎ−１４グレリン（ｎ−オクタン酸による３位のセリン修飾を有する２７アミノ酸ペプチド）は、胃に存在することが示されている。それは、同様の結合親和性を伴いＧＨＳＲ−１ａに結合する、クローン化細胞でのＣａ２＋流を引き出す、またグレリン−２８と同様の効力でＧＨ分泌を誘発する、という点でグレリンと機能的に同一である。ＵＡＧも、ＵＡＧと機能的に同一であるデスＧｌｎ−１４ＵＡＧを有するものと予想される。
【００３５】
ＵＡＧの好適な類似体およびＵＡＧ断片の好適な類似体は、保存的アミノ酸置換（すなわち、１つの残基を、特性が類似する別の残基と置換するもの）によって、天然ＵＡＧの配列から、または天然ＵＡＧ断片の配列から異なるものである。代表的な置換には、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの間のもの、ＳｅｒとＴｈｒとの間のもの、酸性残基ＡｓｐとＧｌｕとの間のもの、ＡｓｎとＧｌｎとの間でのもの、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇとの間のもの、および芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒとの間のものが挙げられる。特に好適な類似体は、複数の、例えば、５〜１０個、１〜５個、または１〜２個が挙げられるがこれに限定されない、いくつかのアミノ酸が、あらゆる組み合わせで、置換、欠失、または付加されている類似体である。例えば、ＵＡＧの類似体は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のアミノ酸置換（好ましくは保存的置換）、欠失、または付加、あるいはそれらの組み合わせによって、ＵＡＧとは配列が異なり得る。
【００３６】
本明細書では、本発明の類似体が提供され、該類似体は、その長さにわたって、本明細書に記載されているアミノ酸配列と、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有し、ＵＡＧの代謝的効果または生物活性のうちの少なくとも１つを共有する。当業者は、非アシル化グレリンの類似体配列、または非アシル化グレリンの断片の類似体配列を容易に同定するであろう。
【００３７】
さらなる一態様では、ＵＡＧの類似体またはその断片は、例えば、アラニン走査によって、Ｄ−アミノ酸または合成アミノ酸との置換によって、またはペプチドの環化によって得られる類似体である。ＵＡＧの類似体またはその断片は、非天然コード化アミノ酸を含んでもよく、該非天然コード化アミノ酸は、通常のアミノ酸またはピロリジンもしくはセレノシステインのうちの１つではないアミノ酸、または天然コード化アミノ酸（２０個の通常アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインが挙げられるが、これに限定されるものではない）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるが、それら自体は、翻訳複合体によって成長ポリペプチド鎖内に組み込まれないアミノ酸を指す。このような天然に存在しないアミノ酸の例には、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「修飾される」という用語は、ポリペプチドの長さ、ポリペプチドのアミノ酸配列、化学的な構造、翻訳時修飾、または翻訳後修飾に対する変化等の、所与のポリペプチドに行われるあらゆる変化を指す。
【００３９】
「翻訳後修飾」という用語は、ポリペプチド鎖内に組み込まれた後に、そのようなアミノ酸に生じる、天然または非天然アミノ酸のあらゆる修飾を指す。該用語は、ほんの一例として、ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳時修飾、（無細胞翻訳系等における）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳時修飾、ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳後修飾、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳後修飾を包含する。翻訳後修飾の例には、グリコシル化、アセチル化、アシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、塩、アミド、またはエステル、特にＣ末端エステルの付加、および本発明のペプチドのＮ−アシル誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。翻訳後修飾のタイプは、周知である。
【００４０】
本発明による一部のペプチドはまた、Ｎ末端またはＣ末端が、直接的に、またはリンカー部分の挿入を通じて頭−尾結合されているような環化形態であってもよく、そのような部分自体は、概して、非環化形態に対してペプチドの三次元構造を変化させないような方法で主鎖を結合するように、必要に応じて１つもしくは複数のアミノ酸残基を含む。このようなペプチド誘導体は、非環化ペプチドと比較して、安定性およびバイオアベイラビリティが改善されているかもしれない。ペプチドを環化するための方法は、当技術分野において周知である。
【００４１】
環化は、２つの側鎖官能基の間のジスルフィド結合の形成によって、または１つの側鎖官能基と主鎖αアミノまたはカルボキシル官能基との間のエステル結合の形成によって、２つの側鎖官能基の間のアミドまたはエステル結合の形成によって、または主鎖αアミノとカルボキシル官能基との間のアミド結合の形成によって、達成され得る。これらの環化反応は、従来、高希釈溶液中で行われていた。環化は、一般的にはペプチドが樹脂に結合している状態で達成される。固体支持体上で環状ペプチドを合成する最も一般的な方法のうちの１つは、アミノ酸の側鎖を樹脂に結合させることである。適切な保護戦略を使用することで、Ｃ末端およびＮ末端を、鎖アセンブリの後に、選択的に脱保護して該樹脂上で環化することができる。この戦略は、広く使用されており、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、または９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）プロトコルのいずれかに対応する。しかしながら、それは、固体支持体に結合するのに適切な側鎖官能基を含有するペプチドに制限される。環状ペプチドの効率的な合成を達成するには、いくつかの手法が使用され得る。環状ペプチドを合成するための１つの手順は、樹脂からの同時開裂を伴う環化に基づいている。適切なペプチド配列が、固相合成によって樹脂上に組み立てられた後に、または線形配列が樹脂に追加された後に、脱保護アミノ基は、その固着活性リンケージ（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  ｌｉｎｋａｇｅ）と反応して、保護環状ペプチドを生成することができる。一般に、標的環状ペプチドを生じさせるのに、最終的な脱保護ステップが必要である。環状ペプチドを合成するための手順は、当技術分野において周知である。
【００４２】
例えば、環化の一形態であるラクタム化を行って、Ｆｍｏｃ合成を使用してラクタム架橋を形成してもよく、βエステル（またはグルタミン酸の場合はγエステル）においてアリルエステルで保護されたアスパラギン酸（またはグルタミン酸）の、およびＮ−εにおいてアリルオキシカルバメートで保護されたリシン等が挙げられるがこれに限定されない、異なる保護基を伴うアミノ酸を側鎖に導入してもよい。該合成の終了時に、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ、またはＡｌｌｏｃとは異なる他の保護基で保護されたペプチドのＮ末端に関して、アスパラギン酸およびリジンのアリルおよびａｌｌｏｃ保護基は、例えば、パラジウム（０）で脱保護することができ、その後に、ＰｙＡＯＰ（７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ピロリジノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート）を使用して環化を行って、ラクタム架橋を生成する。
【００４３】
特に明記しない限り、本明細書に挙げられるアミノ酸とは、Ｌ型を指す。アミノ酸の記述に使用される、当技術分野において認識されている略語には、左旋性アミノ酸（Ｌ−アミノ酸、またはＬ、あるいはＬ型）および右旋性アミノ酸（Ｄ−アミノ酸、またはＤ、あるいはＤ型）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）が挙げられる。天然ペプチド配列の範囲内のＬ−アミノ酸残基は、一般にタンパク質中に見出される２０個のＬ−アミノ酸のうちのいずれか１つ、または、対応するＤ−アミノ酸、４−ヒドロキシプロリンまたはヒドロキシリシンが挙げられるがこれに限定されない、希少アミノ酸、またはＰ−アラニンまたはホモセリン等の非タンパク性アミノ酸のうちのいずれか１つに変化させてもよい。
【００４４】
ＵＡＧの生物活性を保つ、他のあらゆるＵＡＧの類似体またはその断片、または他のあらゆる修飾ＵＡＧまたはその類似体は、本発明によって包含される。
【００４５】
ＵＡＧの機能的および構造的類似体またはその断片を提供する際に使用される全般的な方法および合成戦略は、当技術分野において一般的に使用され、周知であり、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．３５、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ．、１９９４において、Ｍ．Ｗ．ＰｅｎｎｉｇｔｏｎおよびＢ，Ｍ．Ｄｕｎｎが共著した「Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」等の刊行物に記載されている。
【００４６】
「相同性」という用語は、２つのペプチド間に配列の類似性があり、同等の生物活性を維持していることを指す。相同性は、整列配列における各位置を比較することによって決定することができる。アミノ酸配列間の相同性の程度は、配列によって共有される位置において同一の、または整合するアミノ酸の数の関数であるので、「相同配列」とは、相同性および同等の機能または生物活性を共有する配列を指す。相同性パーセントの評価は、当業者に公知である。
【００４７】
ペプチドの同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定する好適なコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の情報源から公的に入手可能である。同一性の決定には、周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも使用できる。
【００４８】
ポリペプチド配列比較のための好適なパラメータには、以下のものが挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）、
比較マトリクス：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２、
ギャップペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４。
【００４９】
これらのパラメータを有する有用なプログラムは、「ギャップ」プログラムとして、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から、公的に入手可能である。上述のパラメータは、（エンドギャップに対するペナルティが無いことに加えて）アミノ酸配列比較のデフォルトパラメータである。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、当技術分野において公知であるあらゆる好適な様態で調製できる。このようなポリペプチドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組み換え的に生成されたポリペプチド、合成的に生成されたポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせによって生成されるポリペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドを調製するための手段および方法は、当技術分野において周知である。
【００５１】
本発明の特定の態様は、ＵＡＧポリヌクレオチドを使用する。これらは、本明細書に定義されるＵＡＧポリペプチド、断片、および類似体をコードする、単離ポリヌクレオチドを含む。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオシドサブユニットからなる分子を指す。該ヌクレオシドサブユニット間の結合は、ホスフェート、ホスホネート、ホスホアミデート、ホスホロチオエート等によって、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）に利用されるペプトイド型結合等の、当技術分野において公知である非リン酸基によって提供することができる。該連結基は、キラルまたはアキラルとすることができる。該オリゴヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドは、２ヌクレオシドサブユニット長から、数百または数千ヌクレオシドサブユニット長の範囲とすることができる。オリゴヌクレオチドは、好ましくは５〜１００サブユニット長、より好ましくは５〜６０サブユニット長であるが、ポリヌクレオチドの長さは、さらに長く（例えば、最長で１００）することができる。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＲＮＡのうちのいずれであってもよい。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞または組織に由来するｃＤＮＡ、および合成ＤＮＡといった、いかなる形態のものであってもよい。さらに、本発明は、一部の態様では、バクテリオファージまたはプラスミドまたはコスミドまたはファージミドを含む、ベクターを使用できる。
【００５３】
ＵＡＧ断片およびその類似体の生存効果
本発明の一態様では、ＩＮＳ−１Ｅβ細胞株、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞株、およびヒト膵島での、ＵＡＧと比較してのＵＡＧ断片およびその類似体の増殖および抗アポトーシス効果を調査した。
【００５４】
増殖を刺激する、および／またはこれらの細胞株のアポトーシスを抑制するＵＡＧ断片およびその類似体はまた、血中グルコースレベルの低下、インスリン感受性の改善、コルチゾールレベルの低下、ヒトの脂質状態の改善が挙げられるがこれに限定されない、ＵＡＧの他の代謝特性も有し、したがって、例えばインスリン耐性、インスリン欠陥、脂質異常症、またはコルチゾール過剰に関連する、代謝疾患の治療に対する潜在的用途を有する。
【００５５】
本発明の一態様では、以下の表１に記載のいくつかのヒトＵＡＧ断片の生存効果を解析した。
【表１】
0005485876.tif 000002
【００５６】
以下の表２に記載のＵＡＧ断片も解析した。
【表２】
0005485876.tif 000003
【００５７】
ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）は、無血清状態およびサイトカインによる処理後のいずれにおいても、ＩＮＳ−１Ｅβ細胞およびＨＩＴ−Ｔ１５β細胞両者の細胞生存を強く増加させた（ＩＮＳ−１Ｅ細胞については図１〜２、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞については図３Ａ、３Ｂ、４Ａ、および４Ｂ）。これらの効果は、完全長分子ＵＡＧ（１−２８）によって示されたものと同様であった。ＵＡＧ（１−１４）は、ＩＮＳ−１Ｅ細胞におけるサイトカイン誘導性アポトーシスに対する保護として、天然ＵＡＧよりもさらに強力でさえあると示された。ＵＡＧ（１−５）およびＵＡＧ（１７−２８）は、ＩＮＳ−１Ｅ細胞ではわずかな効果しか及ぼさず（図１〜２）、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞ではほとんど効果を及ぼさなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。驚くべきことに、短い断片のＵＡＧ（６−１３）、ＵＡＧ（８−１３）、およびＵＡＧ（８−１２）は、全てが、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞のサイトカイン誘導性アポトーシスにおける生存の増加に非常に有効であった。実際に、ペプチドＵＡＧ（８−１２）およびＵＡＧ（８−１３）は、少なくともＵＡＧ（１−１４）と同じくらい強力であり、一方で、ペプチドＵＡＧ（６−１３）は、明らかに優れていた。ＵＡＧ（１−５）およびＵＡＧ（１７−２８）は、ほんの少しだけ効果的であった。
【００５８】
ＵＡＧ（６−１３）、ＵＡＧ（８−１２）、およびＵＡＧ（８−１３）は、サイトカインで処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞で最も強い抗アポトーシス効果を及ぼすことを示した（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）。
【００５９】
本明細書に示されているデータは、ＵＡＧ断片が、細胞生存を強力に増加させること、および完全長ＵＡＧ自体のそれにほぼ匹敵するかそれ以上の効力で、β細胞株における細胞死を防止することを実証している。ＵＡＧ（１−１４）は、完全長ＵＡＧ自体より良くはないとしても、同等の効力を呈し、一方で、５アミノ酸ペプチドの（８−１２）断片は、全ての生物活性を維持し、ＵＡＧ（６−１３）は、さらに強力であった。
【００６０】
本発明の他の態様では、本明細書に示されているデータは、ヒト膵島におけるＵＡＧ断片の生存効果も実証している（図７Ａおよび７Ｂ）。ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）は、ＵＡＧ（１−２８）によって示される保護効果と同等の、無血清状態における保護効果を及ぼす。一方では、ヒト膵島におけるＵＡＧ（１−５）およびＵＡＧ（１７−２８）の保護効果は、試験を行った実験条件において減少しているか、または見られない。
【００６１】
ＵＡＧ断片またはその類似体のインスリン分泌に対する効果
ヒト膵島におけるＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）のインスリン分泌に対する効果も調査した。ＵＡＧ（１−１４）は、ＵＡＧ（１−２８）およびエキセンディン−４と同様に、ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞（データ記載せず）およびヒト膵島（図８Ａ〜８Ｄ）の両者において、グルコース誘導性インスリン分泌を大幅に増加させた。
【００６２】
ＵＡＧ断片およびその類似体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで糖尿病を減少させる
さらなる一態様では、本明細書に示されているデータは、ＵＡＧ断片、例えばＵＡＧ（６−１３）が、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理した動物の生存率を増加させることも示している（図９Ａ）。ＵＡＧ断片はまた、ＳＴＺ誘導性血漿グルコースを減少させ（図９Ｂ）、ＳＴＺ誘導性糖尿病ラットの血漿および膵臓インスリンレベルの両方を改善する（図９Ｃおよび９Ｄ）。本明細書に示されているデータは、ＵＡＧ断片、例えばＵＡＧ（６−１３）が、血漿グルコースレベルを抑制し、生体内でインスリン感受性を増強して糖尿病を調節し（図１４Ａ、１４Ｂ、および１５）、体脂肪重量を減少させる（図１６）ことを実証している。
【００６３】
ＵＡＧ断片およびその類似体のβ細胞への結合
さらなる一態様では、本明細書に示されているデータは、ＵＡＧ（６−１３）、ＵＡＧ（１−１４）、およびＵＡＧ（１−１３）がＵＡＧ受容体を認識して、ＨＩＴ−Ｔ１５およびＩＮＳ−１Ｅ膵臓β細胞上でこれに結合したことを実証している。これらの中で、ＵＡＧ（６−１３）は、最も高い結合活性を示し、天然に存在するＵＡＧの結合活性に非常に近い結合親和性を有していた。この発見は、天然ＵＡＧと同様に、ＵＡＧ（６−１３）がＨＩＴ−Ｔ１５細胞に生存促進効果を及ぼすことを示す機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に関連して、ＵＡＧ（６−１３）が、潜在的抗糖尿病活性を有する強力なＵＡＧ作用物質であることを示している。
【００６４】
したがって、代謝効果を得るためのＵＡＧの活性配列は、８〜１２位残基を含む領域内に存在すると思われる。この観察は、ＵＡＧとアシル化グレリンとの構造活性相関を明確に区別しており、活性の少ない配列はグレリン（１−５）であり、３位のセリン残基がオクタノイル化される。これは、ＵＡＧが、ＧＨＳ−Ｒ１ａ以外の１つまたは複数の受容体を通じて、その代謝効果を及ぼし、該受容体が、成長ホルモン分泌に対するアシル化グレリンの効果を媒介する、という仮説をさらに強化している。
【００６５】
したがって、また非常に驚くべきことに、これらの結果は、ＵＡＧがβ細胞およびヒト膵島に対して生物効果を生じるために、完全長のＵＡＧ配列が不要であることを示している。ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）は、少なくとも天然ＵＡＧと同程度に強力である。さらに驚くべきことに、ＵＡＧ（８−１２）およびＵＡＧ（８−１３）は、完全長ＵＡＧの全ての生物活性を維持し、ＵＡＧ（６−１３）は、ＵＡＧ（１−１４）よりもさらに強力であった。
【００６６】
該結果は、アミド化されているかどうかに関わらず、ＵＡＧ（８−１２）またはこの５アミノ酸配列を含むあらゆるペプチドが、あるいは例えばＵＡＧ（６−１３）またはＵＡＧ（８−１２）またはＵＡＧ（８−１３）のいずれかの類似体を含むあらゆるペプチドが、ＵＡＧ自体と同じ代謝または生物効果を共有することを示している。ＵＡＧの６〜１８位残基を含むアミノ酸配列のうちの、少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個のアミノ酸残基の断片を含むあらゆるペプチド、および少なくともアミノ酸配列ＵＡＧ（８−１２）を含むあらゆるペプチドも好適である。
【００６７】
さらなる一態様では、本発明は、β細胞の増殖の刺激、β細胞の生存率の改善および／または死滅の抑制、血漿グルコースレベルの低下、インスリン分泌および／または感受性の増加、遊離脂肪酸およびトリグリセリド等の血中脂質の減少、コルチゾール分泌の減少、例えばグルコース代謝障害、インスリン代謝障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病に関連する疾患の治療に対してそれらを有用にする、β細胞への結合、および／または移植片のｅｘ  ｖｉｖｏでの処理によるか、または患者への投与によるかに関わらない膵島の移植の改善、といった性質を有する、ＵＡＧ（８−１２）、またはＵＡＧ（８−１３）、またはＵＡＧ（６−１３）、またはいずれかのそれらの類似体を含むペプチドを提供する。該ペプチドは、インスリン耐性、インスリン欠陥、血中グルコース低下に関連する病状の治療にも有用であり、糖尿病、肥満、および脂質異常症の治療にも有用である。本発明のポリペプチドの性質を測定するためのアッセイ、およびこれらのアッセイを行うための手順は、当技術分野において周知である。
【００６８】
さらなる一態様では、本発明は、ＵＡＧの生物活性を維持する、ＵＡＧ断片の類似体を提供する。このような類似体の例には、Ｅ（Ｇｌｕ）がＤ（Ａｓｐ）によって置換され、ＵＡＧ（６−１３）と同程度の活性である、（Ａｓｐ）８ＵＡＧ（６−１３）が挙げられるが、これに限定されるものではない。この類似体の活性は、別の酸性残基による酸性アミノ酸の置換が、ＵＡＧ（６−１３）の生物活性を保つことを示している。Ｒ（Ａｒｇ）がＫ（Ｌｙｓ）によって置換されている、（Ｌｙｓ）１１ＵＡＧ（６−１３）も、ＵＡＧ（６−１３）と同程度の活性であり、別の塩基性残基による塩基性アミノ酸の置換がＵＡＧ（６−１３）の生物活性を保つという事実を示す。Ｓ（Ｓｅｒ）がＧ（Ｇｌｙ）によって置換されている、（Ｇｌｙ）６ＵＡＧ（６−１３）も、ＵＡＧ（６−１３）と同程度の活性であり、サイズに基づいた置換が該ＵＡＧ（６−１３）の生物活性を保つという事実を示す。全体的に、これらのＵＡＧ（６−１３）の類似体は、保存的置換がＵＡＧ（６−１３）の生物活性を保つことを実証している。
【００６９】
さらに、ＵＡＧ（６−１３）の６位（Ｎ末端）におけるＳｅｒのアセチル化は、ＵＡＧ（６−１３）の生物活性を保ち、また、Ｎ末端のアセチル化と、例えばＤ−Ｐｒｏ（ＰｒｏのＤ型）によるＰｒｏ７の置換との組み合わせは、同じく生物活性を呈する類似体をもたらす。したがって、例えばエキソペプチダーゼおよびエンドペプチターゼ（例えば、ＤＰＰ  ＩＶが挙げられるが、これに限定されるものではない）による分解に対するその耐性を改善するための、ＵＡＧ（６−１３）のＮ末端の安定化を目的とする戦略は、なおもＵＡＧ（６−１３）の生物活性を呈するペプチドをもたらし、それらをｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に有用なものとする。
【００７０】
ペプチドの類似体を含む本発明のペプチドは、従来の技術に従って、遺伝子操作された宿主細胞内で産生させることができる。好適な宿主細胞は、外来性ＤＮＡによって形質転換またはトランスフェクトして、培養によって増殖させることができる細胞タイプであり、細菌、真菌細胞、および培養高等真核細胞が挙げられる。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローニングしたＤＮＡ分子を操作して、外来性ＤＮＡを様々な宿主細胞内に導入するための技術は、少なくとも、Ｓａｍｂｒｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７に記載されている。
【００７１】
一般に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、概して転写プロモーターおよびターミネーターを発現ベクター内に含む、その発現に必要な他の遺伝的エレメントに機能的に連結される。ベクターはまた、一般に、１以上の選択可能なマーカーおよび１つ以上の複製起源を有するが、当業者は、一部の系では、選択可能なマーカーを、別個のベクター上に提供することができ、また、外来性ＤＮＡの複製は、宿主細胞のゲノム内へ組み込むことによって提供し得ることを認識するであろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクター、および他のエレメントの選択は、当業者の通常の技能の範囲内での日常的な設計事項である。多数のこのようなエレメントは、文献に記載されており、商業的供給業者から入手可能である。
【００７２】
ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に導くために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列、またはプレ配列としても知られる）を、発現ベクター内に挿入することができる。分泌シグナル配列は、適切な読み枠内のＤＮＡ配列に結合される。分泌シグナル配列は、一般に、対象となるプロペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’末端側に配置されるが、一部のシグナル配列は、対象となるＤＮＡ配列内の他の場所に配置され得る（例えば、Ｗｅｌｃｈ他の米国特許第５，０３７，７４３号、Ｈｏｌｌａｎｄ他の米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。本発明のポリペプチドを生成および／または製造する方法は、当技術分野において周知であり、また十分に実施されている。
【００７３】
本発明のペプチドは、固相合成によって合成し得る。固相合成は、ペプチドを合成する一般的な方法である。基本的に、本手法において、分子は、ビーズに結合されて、反応溶液中で段階的に合成されるが、これは、液体状態での通常の合成と比較して、生成物からの過剰な反応物または副生物の除去がより容易である。この方法では、構成要素は、全ての反応性官能基において保護されている。溶液中およびビーズ上の構成要素間の所望の反応に加わることができる２つの官能基は、脱保護の順序によって制御することができる。
【００７４】
基本的な固相合成法では、２つの官能基を有する構成要素が使用される。構成要素の官能基のうちの１つは、通常、保護基によって保護されている。出発材料は、構成要素に結合するビーズである。最初に、このビーズを保護構成要素の溶液中に添加して、撹拌する。ビーズと保護構成要素との反応が完了した後に、溶液を除去して、ビーズを洗浄する。次いで、該保護基を除去し、上記のステップを繰り返す。全てのステップが完了した後に、合成された化合物をビーズから切り離す。
【００７５】
３種類以上の構成要素を含有する化合物を合成する場合、ビーズに結合している構成要素を脱保護する前に、ステップを１つ追加する。ビーズ上にあり、かつ添加した構成要素と反応しなかった官能基は、構成要素の脱保護条件では除去されない別の保護基によって保護しなければならない。このステップの中で構成要素が不足する副生物だけが、このステップによって阻害される。加えて、このステップは、ビーズから切り離した後の、合成化合物の精製を容易にする。
【００７６】
通常、ペプチドは、この方法で鎖から合成されるが、ペプチドは、細胞内では逆の順序で合成される。アミノ保護アミノ酸は、ビーズ（樹脂）に結合し、カルボニル基と樹脂との間に共有結合を形成させる。次いで、そのアミノ基は脱保護されて、次のアミノ保護アミノ酸のカルボニル基と反応する。この時点で、ビーズは、２つのアミノ酸を有している。このサイクルを、所望のペプチド鎖が形成されるまで繰り返す。全ての反応が完了した後に、合成ペプチドをビーズから切り離す。
【００７７】
主にこのペプチド合成に使用されるアミノ基の保護基には、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）およびｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。Ｆｍｏｃ基は、塩基によってアミノ末端から除去され、一方で、Ｂｏｃ基は、酸よって除去される。本発明に関係する全ての当業者は、ペプチドの固相合成の技術に精通しているであろう。
【００７８】
他の手法を使用して、本発明のペプチドを合成し得る。本発明のペプチドを生成および取得するための手法は、当技術分野において既知である。
【００７９】
本発明のペプチドは、分画法および／または従来の精製法、および媒体を使用して精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、および酸またはカオトロープ抽出が、試料の分画に使用できる。例示的な精製ステップには、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：高速タンパク質液体クロマトグラフィー）、および逆相高速液体クロマトグラフィーが挙げられる。好適な陰イオン交換媒体には、誘導体化デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ等が挙げられる。ＰＥＩ、ＤＥＡＥ、ＱＡＥ、およびＱ誘導体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が使用可能である。例示的なクロマトグラフィ媒体には、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｂｕｔｙｌ６５０（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、Ｐａ．）、Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の、フェニル、ブチル、またはオクチル基によって誘導体化した媒体、またはＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ７１（Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ）等のポリアクリル酸樹脂が挙げられる。好適な固体支持体には、ガラスビーズ、シリカに基づく樹脂、セルロース樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂等が挙げられる。これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基、および／または炭化水素部分によって、タンパク質を結合させることができるようにする、反応基によって修飾できる。カップリング化学反応の例には、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクジンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化、ヒドラジド活性化、およびカルボジイミドカップリング化学反応のためのカルボキシルおよびアミノ誘導体によるものが挙げられる。これらの、および他の固体媒体は、当技術分野において周知であり、また広く使用されており、商業的供給業者から入手可能である。
【００８０】
アミノ酸残基１−５、１−１４、１−１８、６−１３、８−１２、８−１３、８−１１、９−１１、９−１２、１７−２８を含むＵＡＧ断片、およびＵＡＧ断片の類似体が合成されたが、本発明はまた、完全長ＵＡＧの生物活性のうちの少なくとも１つを維持している、配列番号１の他のいずれかの断片およびその類似体も提供する。本発明の知識を有する当業者は、特定のＵＡＧまたはその類似体が、期待される生物活性を有するかどうかを、容易に判断するであろう。
【００８１】
治療的使用および治療
「疾患または障害を治療する」という表現は、疾患に関連する症状を改善するか、重篤性を緩和するか、または疾患を治癒する、あるいは疾患の発生を予防するのに有効な治療剤を投与することを指す。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、治療的処置、ならびに予防的および防止的対策の両者を指す。治療を必要とする人には、既に疾患または障害を有する人、症状または病状にある人、ならびに疾患、障害、症状、または病状を防止すべき人が挙げられる。また、治療を必要とする人には、障害、疾患、症状、または病状が生じており、後遺症または傷が残っている人も挙げられる。治療はまた、疾患、障害、症状、または病状に関連する症状を向上または改善させる、疾患、障害、症状、または病状の重篤性を緩和または治癒する、あるいは疾患、障害、または症状の発生を防止するのに有効な治療剤を投与することも指す。
【００８３】
「代謝疾患」という用語は、炭水化物代謝疾患、アミノ酸代謝疾患、有機酸代謝（有機酸性尿）疾患、脂肪酸酸化およびミトコンドリア代謝疾患、ポルフィリン代謝疾患、プリン代謝疾患またはピリミジン代謝疾患、ステロイド代謝疾患、ミトコンドリア機能疾患、ペルオキシソーム機能疾患、およびリソソーム貯蔵疾患を指すが、これに限定されるものではない。
【００８４】
「代謝症候群」という用語は、その人の心臓血管系疾患および／または糖尿病のリスクを増加させる、臨床障害の組み合わせを指す。
【００８５】
したがって、非アシル化グレリンの断片およびその類似体、ならびにそれらを含むペプチドは、非アシル化グレリンがグルコースの低下効果（アシル化グレリンの高血糖効果を防止するため）、インスリンの高感受性化効果、インスリンの分泌増強効果、体脂肪重量の低下効果、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）およびコルチゾールの低下効果を有し、このことが脂質異常症に対する非アシル化グレリンの断片の効果を示すということは、本発明の一態様である。これらの性質に加えて、非アシル化グレリンの断片およびその類似体は、膵臓β細胞等のインスリン分泌細胞の増殖および生存を刺激すること、および死滅を抑制することができる。
【００８６】
したがって、本発明は、例えば、糖尿病、グルコースまたはインスリン代謝障害、インスリン欠陥または耐性、脂質異常症、肥満、代謝症候群に関連する他の病状の治療、および膵臓β細胞等のインスリン分泌細胞の治療における、非アシル化グレリンの断片およびその類似体の治療的有効性を提供する。
【００８７】
さらなる態様であるが、本発明は、ＵＡＧ自体と同じ潜在的治療指標を共有する、本発明のペプチドのうちの少なくとも１つを組み込んでいる、いずれかの医薬組成物を提供する。
【００８８】
本発明のペプチドは、例えば、グルコース代謝障害、インスリン代謝障害、脂質代謝障害、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、脂質異常症、アテローム性動脈硬化、心臓血管系の疾患、インスリン分泌細胞の増殖障害またはインスリン耐性に関連する代謝症候群疾患に関連する障害または病状（必ずしもこれに限定されない）の予防、軽減、および／または治療に使用される医薬組成物に使用することができ、また、これに組み込むことができる。
【００８９】
治療的および／または製薬上の使用について、本発明のペプチドは、例えば、従来の方法による、静脈内、皮下、経皮、経口、口腔、舌下、経鼻、吸入、肺、または非経口送達（必ずしもこれらに限定されない）に対して製剤化できる。静脈内注射は、従来の期間にわたるボーラスまたは注入によるものであってもよい。本発明のペプチドはまた、ポリマーに基づくデポー製剤が挙げられるがこれに限定されない、薬物送達システムに対応し得る。
【００９０】
懸濁液として経口投与される活性成分は、薬学的製剤化の分野において周知である手法に従って調製することができ、懸濁化剤としてバルクのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウムを与えるための微結晶性セルロース、増粘剤としてのメチルセルロース、および甘味料／着香剤（必ずしもこれらに限定されない）を含有してもよい。即時放出錠として、これらの組成物は、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、および乳糖、および／または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、および潤滑剤（必ずしもこれらに限定されない）を含有してもよい。
【００９１】
経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与する製剤は、例えば、ベンジルアルコールまたは他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを増強する吸収促進剤を用いた、フルオロカーボンを用いた、および／または他の可溶化剤または分散剤を用いた、生理食塩水中溶液として調製されてもよい。
【００９２】
本発明のペプチドは、静脈内（ボーラスおよび注入）、腹膜内、皮下、閉鎖の有無に関わらない局所、または筋肉内の形態で投与されてもよい。注射によって投与する時には、注射可能な溶液または懸濁液を、当技術分野において周知の、好適な非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒を使用して製剤化してもよい。
【００９３】
一般に、医薬組成物は、当業者に周知であろう製薬上許容される担体とともに、本発明のペプチドのうちの少なくとも１つを含む。該組成物は、利用する投薬形態に応じて、例えば、当技術分野において周知である、１以上の好適な賦形剤、希釈剤、充填剤、可溶化剤、保存剤、塩、緩衝剤、および他の材料をさらに含んでもよい。組成方法は、当技術分野において周知である。
【００９４】
この文脈において、「製薬上許容される担体」という用語は、実質的に、それ自体がいかなる治療的および／または予防的効果も持たないという意味において不活性である、あらゆる材料を示すことを意図している。製薬上許容される担体は、許容可能な技術的性質を有する医薬組成物を得ることを可能にするという目的で、本発明のペプチドに追加されてもよい。
【００９５】
本発明の治療用量範囲は、概して、約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。この範囲外にあるが所望の治療効果を有する治療用量も、本発明によって包含される。
【００９６】
好適な投与計画は、好ましくは、被験体の年齢、体重、性別、および病状、投与経路、被験体の腎機能および肝機能、所望の効果、および用いられる特定の化合物が挙げられるがこれに限定されない、投与される被験体のタイプを含む、当技術分野において周知である要因を考慮して決定される。
【００９７】
例えば、本発明のペプチド（本明細書では、「活性化合物」とも称される）の治療上有効量は、いくつかの変化の中でも特に、血中グルコースレベルの低下、インスリン感受性および／または分泌の改善、血中遊離脂肪酸レベルの減少、体脂肪重量の低下、コルチゾールレベルの減少、および／またはインスリン分泌細胞の生存の増加において、臨床的に有意な変化をもたらすのに十分な量である。このようなパラメータを測定するための試験は、当業者に公知である。
【００９８】
本発明のペプチドは、キットで提供することができる。このようなキットは、一般的に、投与のための投薬形態の活性化合物を含む。投薬形態は、所望の効果を得ることができる程度の、十分な量の活性化合物を含む。好ましくは、キットは、所望の効果を達成するための投薬形態の使用、および指定された期間にわたって行う投薬形態の量を示す説明書を含む。
【実施例】
【００９９】
実験およびデータ分析
ＵＡＧ断片はＩＮＳ−１Ｅβ細胞の生存を促進する
単独の、またはＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α／ＩＬ−１β（その相乗作用が１型および２型糖尿病の両者におけるβ細胞の死滅に関与することが示されている）を伴う無血清培地中で、完全長のヒトＵＡＧ（１−２８）またはＵＡＧ（１−１４）、ＵＡＧ（１−１８）、ＵＡＧ（１−５）、およびＵＡＧ（１７−２８）のいずれかと共にインキュベートしたＩＮＳ−１Ｅラットβ細胞におけるＭＴＴアッセイによって、細胞生存を評価した（参考文献１６）。該ペプチドは、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で濃度を増加させて試験を行った。無血清条件では、ＵＡＧ（１−１４）および（１−１８）は、ＵＡＧ（１−２８）に匹敵する、顕著な生存効果を示した。同じ条件下で、ＵＡＧ（１−５）およびＵＡＧ（１７−２８）は、顕著ではあったが、低下した生存作用を示した（図１）。サイトカインの存在下では、全てのペプチドは、試験を行った全ての濃度で、細胞生存を顕著に増加させた（図２）。しかしながら、無血清条件と同様に、ＵＡＧ（１−５）およびＵＡＧ（１７−２８）は、低下した効果を示した。興味深いことに、ＵＡＧ（１−１４）だけでなく、ＵＡＧ（１−１８）も、完全長ＵＡＧ（１−２８）よりも強力であることを示した（図２）。これらの結果は、ＵＡＧ断片、特にＵＡＧ（１−１４）および（１−１８）は、完全長ＵＡＧ（１−２８）と同様に、血清欠乏、またはサイトカインによる処理のいずれかによって誘導されるβ細胞の死滅を抑制できることを示している。
【０１００】
ＵＡＧ断片はＨＩＴ−Ｔ１５β細胞の生存を促進する
ＭＴＴ実験は、単独の、またはＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α／ＩＬ−１βを伴う無血清培地中での、ＵＡＧ（１−２８）の、またはその断片ＵＡＧ（１−１４）、ＵＡＧ（１−１８）、ＵＡＧ（１−５）、およびＵＡＧ（１７−２８）の生存効果を試験するために、ハムスターＨＩＴ−Ｔ１５β細胞においても行った。ＩＮＳ−１Ｅβ細胞に対して行った実験と同様に、該ペプチドは、０．１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲で濃度を増加させて試験を行った。ＩＮＳ−１Ｅに関して、ＨＩＴ−Ｔ１５細胞において、該ペプチドは、血清欠乏およびサイトカイン誘発性細胞死の両者に対して異なる保護効果を示した。実際に、ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）が、両方の実験条件下で顕著に細胞生存率を増加させたのに対して（図３Ａおよび３Ｂ）、ＵＡＧ（１−５）は、サイトカイン処理した細胞においてのみ、わずかに細胞生存を増加させ、一方で、ＵＡＧ（１７−２８）は、検討したいずれの条件においても顕著な効果は無かった（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０１０１】
ＵＡＧ（６−１３）、ＵＡＧ（８−１３）、ＵＡＧ（８−１２）、ＵＡＧ（８−１１）、ＵＡＧ（９−１２）、およびＵＡＧ（９−１１）の生存効果を、サイトカイン処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞において評価した。予想通りに、サイトカイン（ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α／ＩＬ−１β）は、通常の培養条件（血清含有培地）に対して、細胞生存を大幅に減少させた。ＵＡＧ（６−１３）は、試験を行った全ての濃度（１ｎＭ〜１００ｎＭ）において、特に１００ｎＭにおいて、血清の存在下で観察したものと同等の、またはそれを超える値まで細胞生存を増加させることによって、サイトカイン誘導性細胞死を強力に抑制した。興味深いことに、ＵＡＧ（６−１３）の生存効果は、完全長ＵＡＧ（１−２８）のそれと同程度であった（図５Ａ）。
【０１０２】
同じ実験条件下で、ＵＡＧ（８−１３）は、ＵＡＧ（６−１３）未満ではあったが、検討した全ての濃度において、顕著な保護効果を示したが、一方で、ＵＡＧ（８−１２）は、１０ｎＭおよび１００ｎＭにおいてのみ、低下しているが顕著な保護効果を示した。ペプチドＵＡＧ（８−１３）およびＵＡＧ（８−１２）の保護効果は、ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）と同様であることが分かった。ＵＡＧ（１−１４）の逆配列で作製し、ＵＡＧ（１４−１）と名付けたペプチドを、これらの実験の陰性対照として使用した（図５Ａ）。ＵＡＧ（８−１１）、ＵＡＧ（９−１２）、およびＵＡＧ（９−１１）に関して（図５Ｂ）、ＭＴＴの結果は、ＵＡＧ（８−１１）が、１００ｎＭにおいてのみ顕著な生存効果を及ぼし、ＵＡＧ（９−１２）は、試験を行った両方の濃度（１ｎＭおよび１００ｎＭ）において細胞生存を顕著に増加させたことを示した。しかしながら、これらの効果は、ＵＡＧ（６−１３）のものよりも低かった（図５Ｂ）。ＵＡＧ（９−１１）は、試験を行った両方の濃度において、顕著な効果を有しなかった（図５Ｂ）。
【０１０３】
ＵＡＧ断片はＨＩＴ−Ｔ１５β細胞において抗アポトーシス効果を及ぼす
ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞は、単独の、またはＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α／ＩＬ−１βを伴う無血清培地中で２４時間培養した。両方の細胞株において、血清欠乏単独に対して、サイトカイン処理の下でアポトーシスが増加した。ＵＡＧ（６−１３）は、サイトカイン条件に対して、細胞数を増加させ、細胞の大型化、および膵島形成を誘導した（データは示していない）。さらに、ＵＡＧ（６−１３）は、１ｎＭ、１０ｎＭ、特に、１００ｎＭの濃度において、サイトカイン誘導性アポトーシスを顕著に減少させ、１００ｎＭではＵＡＧ（１−２８）によって示されたものよりも抗アポトーシス効果が強かった（図６Ａ）。ＵＡＧ（８−１３）は、ＵＡＧ（６−１３）未満ではあるが、１０ｎＭおよび１００ｎＭにおいてアポトーシスを顕著に抑制し、一方で、ＵＡＧ（８−１２）は、１００ｎＭにおいてのみいくらかの保護効果を示した（それぞれ、図６Ｂおよび６Ｃ）。各実験において、ＵＡＧ（１−１４）の逆配列であるＵＡＧ（１４−１）を陰性対照として使用し、ＵＡＧ（１−２８）を陽性対照として使用した。これらの結果は、ＵＡＧ（８−１３）およびＵＡＧ（８−１２）に対して、細胞生存について得られた結果と同様に、ＵＡＧ（６−１３）は、サイトカイン処理したＨＩＴ−Ｔ１５β細胞において、最も強い抗アポトーシス効果を及ぼすことを示している。
【０１０４】
ヒト膵島におけるＵＡＧ断片の生存効果
完全長ＵＡＧ（１−２８）の生存効果に対する、ＵＡＧ（１−１４）、ＵＡＧ（１−１８）、ＵＡＧ（１−５）、およびＵＡＧ（１７−２８）の生存効果を、ＭＴＴによってヒト膵島において評価した。該ペプチドは、単独の、またはＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α／ＩＬ−１β（それぞれ５ｎｇ／ｍｌ）を伴う無血清培地中で培養した膵島細胞内で試験を行った。
【０１０５】
ＵＡＧ（１−１４）は、１０ｎＭおよび１００ｎＭにおいて、無血清培地中の細胞生存を顕著に増加させ、一方、サイトカインの存在下では、１００ｎＭにおいて細胞死を防止した（図７Ａ）。ＵＡＧ（１−１８）は、１ｎＭおよび１０ｎＭにおいて、細胞生存を顕著に増加させた（図７Ａ）。ＵＡＧ（１−５）は、無血清培地中では１０ｎＭにおいて顕著であるがわずかなな生存作用を示したものの、サイトカインの添加後は、試験を行ったいずれの濃度（１ｎＭ〜１００ｎＭ）においても、いかなる細胞保護も示さなかった（図７Ｂ）。ＵＡＧ（１７−２８）は、１０ｎＭおよび１００ｎＭにおいて無血清培地中で培養した膵島の生存を顕著に増加させたが、サイトカインの存在下では、効果を有しなかった（図７Ｂ）。全体で、これらの結果は、ヒト膵島において、ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）は、無血清条件において、ＵＡＧ（１−２８）によって示されたものと同様の保護効果を及ぼし、一方で、それらの生存能力は、ＵＡＧ（１−２８）の効果が依然として明白であるサイトカイン処理した細胞において、少なくとも部分的に失われることを示している。
【０１０６】
ヒト膵島におけるインスリン分泌に対するＵＡＧ断片の効果
ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）を、両者とも１００ｎＭで使用して、ヒト膵島におけるインスリン分泌について検討した。図８Ａは、ＵＡＧ（１−１４）が、ＵＡＧ（１−２８）（図８Ｃ）およびエキセンディン−４（図８Ｄ）と同様に、グルコースの非存在下および存在下（２〜２５ｍＭ）の両方でインスリン分泌を顕著に増加させ、一方で、ＵＡＧ（１−１８）は、７．５ｍＭのグルコースにおいて顕著な効果を示したことを示している（図８Ｂ）。ＵＡＧ（１−２８）およびエキセンディン−４を陽性対照として使用した（図８Ｃおよび８Ｄ）。これらの結果は、ヒト膵島において、ＵＡＧ（１−１４）およびＵＡＧ（１−１８）が、グルコース誘導性のインスリン分泌を刺激することを示している。
【０１０７】
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理した動物に対するＵＡＧ断片のｉｎ  ｖｉｖｏ効果
新生ラットにおけるストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与が、糖尿病を生じさせることはよく知られている（参考文献２４、２５、２６）。本明細書では、ＵＡＧ（６−１３）の長期的な効果を調査した（ＳＴＺ投与後の１週間の処理、生後１日目にＳＴＺを投与した新生ラットにおけるＵＡＧの効果に対する、ＳＴＺ投与後７０日目の効果を評価）。ＵＡＧ（６−１３）は、ＵＡＧの濃度に等しい（３０ｎｍｏｌ／ｌ）か、それよりも高い濃度（１００ｎｍｏｌ／ｌ）で試験を行った。興味深いことに、ＳＴＺの注射後９日目に、対照群に関してはＳＴＺによって低下した動物の生存率（約５２％）は、ＵＡＧによって強く上昇（約７２％）し、また両方のＵＡＧ（６−１３）濃度によっても強く上昇（それぞれ、３０ｎｍｏｌ／ｌの場合は約７２％、１００ｎｍｏｌ／ｌの場合は約８９％）した（図９Ａ）。７０日目に、ＳＴＺ群における血漿グルコースは、対照群に対して１５０％（Ｐ＜０．０１）と、有意に上昇した。予想通りに、ＵＡＧは、グルコースレベルを低下させる（約２１％低下）ことによって、ＳＴＺの効果を打ち消した。３０ｎｍｏｌ／ｌおよび１００ｎｍｏｌ／ｌ両方ののＵＡＧ（６−１３）によって、同様の効果が得られた（それぞれ、ＳＴＺ群に対して３１％および１４％の低下）。興味深いことに、ＵＡＧ（６−１３）は、等しい濃度において、ＵＡＧよりも強い効果を示した（図９Ｂ）。ＳＴＺ処理した動物は、血漿インスリンレベルの顕著な低下を示し、ＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）は、両方の濃度において、ＳＴＺ処理したラットにおけるインスリンレベルを増加させることによって、この効果を顕著に低下させた（図９Ｃ）。膵臓インスリン分泌に関して、同様の結果が得られた（図９Ｄ）。これらの結果は、ＳＴＺ投与の７０日後に、ＵＡＧ（６−１３）が、ＵＡＧと同等またはそれ以上に、ＳＴＺ誘導性の血漿グルコース増加を減少させること、および血漿および膵臓インスリンレベルの両方を改善できることを示している。
【０１０８】
ＵＡＧ断片は、肥満およびインスリン耐性に関連する糖尿病の遺伝的モデル、すなわちｏｂ／ｏｂマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏの血漿グルコースレベル、インスリン感受性、および生殖腺脂肪重量を変化させる
ベースラインの尾部静脈血漿試料を、Ｋ２ＥＤＴＡコーティング毛細管（Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ＣＢ３００  Ｋ２Ｅ；Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内にポンプ注入する７日前および６日前に、自由給餌および１６時間絶食させたｏｂ／ｏｂマウスから採取した。次いで、該マウスを、ほぼ等しい重量の範囲によって３つの群に分けた。１０週目のマウスに麻酔を施し、充填Ａｌｚｅｔ１００４ポンプを、送達ポータルを最初に、腹腔内に挿入した。次いで、結節縫合（Ｖｉｃｒｙｌ  ５．０  ＦＳ−２吸収性縫合糸）を使用して筋腹膜および皮層を閉じた。マウスは、生理食塩水、１０ｍｇ／ｍｌのＵＡＧ、または３．５ｍｇ／ｍｌのＵＡＧ（６−１３）（群あたりｎ＝８）のいずれかを含有するポンプに供された。Ａｌｚｅｔ１００４ポンプは、１２μｌ／日で送達し、３０μｇのｈＵＡＧ／動物／日（約６００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）、および１０μｇのＵＡＧ（６−１３）／動物／日（約２００μｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を注入した。
【０１０９】
血液試料（９時〜１０時時点）は、ＥＤＴＡ  Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ試験管内へ、尾部静脈を介して、２週目および４週目に、給餌および絶食させたマウスから採取した。尾部静脈血中のグルコースレベルは、グルコメーターを使用して直接測定した。投与の最終日に、ベースライン（絶食）血液試料を採取した。
【０１１０】
投与期間中に、給餌時血漿グルコースレベルには、いかなる統計的に有意な効果も観察されなかったが（ＲＭ−ＡＮＯＶＡ：反復分散分析）、ＵＡＧ（６−１３）は、生理食塩水の対照と比較して、一貫した抑制効果を示し、４週目までに、ＵＡＧも、対照と比較して、グルコースレベルを抑制した（図１４Ａ）。対照的に、絶食時グルコース濃度は、２週目でＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）投与によって、生理食塩水を投与した対照から２５〜３０％と、顕著に抑制された（図１４Ｂ）。この効果は、４週目の時点で保たれていた（図１４Ｂ）。予想通りに、ｏｂ／ｏｂマウスは、約１２週でピーク高血糖に到達するので、対照の空腹時および給餌時両者のグルコースレベルは、処理期間中に上昇した（参考文献２７）。
【０１１１】
絶食時血漿インスリンレベルは、生理食塩水の対照と比較して、２週目にＵＡＧによって顕著に抑制された（図１５）。しかし、投与４週目までに、絶食時インスリンレベルは、ベースラインを超えて、また、生理食塩水の対照と比較して、顕著に増加した。
【０１１２】
処理期間中に、ＵＡＧ（６−１３）て処理したｏｂ／ｏｂ動物において、生殖腺脂肪体重量は、生理食塩水で処理した対照と比較して、約７％減少した（傾向ｐ＜０．０６）（図１６）。ＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）は、グレリン投与によって観察されているように、処理期間にわたって生殖腺脂肪重量の増加を生じさせなかった。脂肪重量の減少に向かう傾向は、ＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）へのより長い曝露が、脂肪重量の減少を生じさせる脂肪分解性作用を及ぼすことを示唆し、したがって、インスリン感受性に対する有益な効果を伴って、肥満の有望な治療を構成し得る（例えば、参考文献２８、２９）。
【０１１３】
この長期的な投与プロトコルからの知見は、ＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）が、どちらも、生理食塩水の対照動物と比較して、処理の２週間後および４週間後に、絶食動物の血漿グルコースレベルを抑制した、というものであった。ＵＡＧ（６−１３）は、給餌動物の血漿グルコースレベルに対しても、３０〜４０％の抑制効果があることが分かった。
【０１１４】
２週間の処理後に観察した絶食時グルコースに対するＵＡＧの効果は、顕著に低下したインスリンレベルに対応し、インスリン感受性が改善されたことを示している。
【０１１５】
膵臓β細胞受容体へのＵＡＧ断片の結合
ＨＩＴ−Ｔ１５（図１０Ａ）およびＩＮＳ−１Ｅ（図１０Ｂ）結合部位について、濃度依存的に［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧと競合する断片ＵＡＧ（６−１３）の能力をアッセイした。図１０Ａおよび１０Ｂに示されているように、非標識ＵＡＧ（１−２８）およびＵＡＧ（６−１３）は、両方の細胞株でのそのような結合部位に対する［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧと、同様の有効性を有して、濃度依存的に競合した。競合結合曲線から算出されるＩＣ５０の値（全てｎＭ濃度）は、それぞれ、ＨＩＴ−Ｔ１５およびＩＮＳ−１Ｅにおいて、ＵＡＧ（１−２８）について２．６±０．５および２．０±０．２、ＵＡＧ（６−１３）について３．８±０．３および２．４±０．３であった。
【０１１６】
ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞に対するアラニン置換を伴うＵＡＧ断片の生存効果
異なるアミノ酸位置（６〜１３）でのアラニン（Ａｌａ）置換を伴うＵＡＧ断片を、ＨＩＴ−Ｔ１５ハムスターβ細胞におけるそれらの生存効果に関して試験した。該細胞は、単独の、またはＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−α／ＩＬ−１βを伴う無血清培地中で培養した。該ペプチドは、１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度で試験した。無血清条件（血清存在下に対して生存率が約４０％低下した）において、ＵＡＧ（６−１３）は、予想通りに、細胞生存を顕著に増加させた（１ｎＭおよび１００ｎＭにおいて、それぞれ、約１８％および約３０％）。Ａｌａ６−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ７−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ８−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ９−ＵＡＧ（６−１３）、および特にＡｌａ１２−ＵＡＧ（６−１３）ならびにＡｌａ１３−ＵＡＧ（６−１３）は、両方の濃度において同様の効果を示した。対照的に、１０位および１１位におけるＡｌａ置換に関しては、非常に低い生存効果が示された（図１１Ａ）。サイトカインによる処理のもと（血清欠乏条件に対して細胞生存が約１８％減少した）で、１０位および１１位を除く全てのＡｌａ置換は、細胞死を完全に食い止め、また、１ｎＭおよび１００ｎＭの両方の濃度において、無血清条件下にあるものよりもさらに高い生存率レベルをもたらした。これらの効果は、元のペプチドＵＡＧ（６−１３）によって引き起こされたものと同様であった（図１１Ｂ）。ＵＡＧ（６−１３）の６〜９位および１２〜１３位でのＡｌａ置換は、ペプチド生存効果に影響を及ぼさず、一方で、１０位（Ｑ）および１１位（Ｒ）におけるアミノ酸の側鎖は、重要な役割を果たしているようである。
【０１１７】
ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞に対する保存的置換およびＮ末端修飾を伴うＵＡＧ断片の生存効果
無血清条件（血清存在下に対して生存率が約３５％減少した）において、ＵＡＧ（６−１３）は、予想通りに、細胞生存を顕著に増加させた（１ｎＭおよび１００ｎＭにおいて、それぞれ、約１８％および約３０％）。Ａｓｐ８−ＵＡＧ（６−１３）、Ｌｙｓ１１−ＵＡＧ（６−１３）、Ｇｌｙ６−ＵＡＧ（６−１３）、ならびにＡｃＳｅｒ６−ＵＡＧ（６−１３）およびＡｃＳｅｒ６−（Ｄ）Ｐｒｏ７−ＵＡＧ（６−１３）は、両方の濃度において同様の効果を示した（図１２Ａ）。サイトカインによる処理のもと（細胞生存が約２０％減少した）で、全てのペプチドは、細胞生存を顕著に減少させた。特に、Ｇｌｙ６−ＵＡＧ（６−１３）によって最良の効果が及ぼされ、一方で、最低の効果は、ＡｃＳｅｒ６−ＵＡＧ（６−１３）およびＡｃＳｅｒ６−（Ｄ）Ｐｒｏ７−ＵＡＧ（６−１３）を使用した時に見られた（図１２Ｂ）。
【０１１８】
ＨＩＴ−Ｔ１５β細胞に対する環化ＵＡＧ断片の生存効果
無血清条件（血清存在下に対して生存率が約５８％低下した）において、ＵＡＧ（６−１３）は、予想通りに、細胞生存を顕著に増加させた（１ｎＭおよび１００ｎＭにおいて、それぞれ、約１６％および約６０％）。シクロ６，１３ＵＡＧ（６−１３）、シクロ（８，１１）、アセチル−Ｓｅｒ６，Ｌｙｓ１１，ＵＡＧ（６−１３）アミド、およびアセチル−Ｓｅｒ６，Ｌｙｓ１１，ＵＡＧ（６−１３）ＮＨ２は、同様の効果を示した（図１３Ａ）。同様の結果は、サイトカインによる処理のもとでも見られた（図１３Ｂ）。
【０１１９】
材料および技術的プロトコル
ヒトＵＡＧおよびＵＡＧ断片（１−１４）、（１−１８）、（１−５）、および（１７−２８）、ならびにエキセンディン−４は、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）から入手した。他の断片（６−１３）、（８−１３）、（８−１２）、（８−１１）、（９−１２）、（９−１１）は、Ｔｉｂ  ＭｏｌＢｉｏｌ（Ｇｅｎｏｖａ、Ｉｔａｌｙ）から入手した。細胞培養試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）から入手した。アラニン（Ａｌａ）を有するヒトＵＡＧ（６−１３）である、Ａｌａ６−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ７−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ８−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ９−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ１０−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ１１−ＵＡＧ（６−１３）、Ａｌａ１２−ＵＡＧ（６−１３）、およびＡｌａ１３−ＵＡＧ（６−１３）は、Ｔｉｂ  ＭｏｌＢｉｏｌ（Ｇｅｎｏｖａ、Ｉｔａｌｙ）によって合成された。
【０１２０】
本明細書に定義される大部分のペプチドは、以下の機器上で同時多重ペプチド合成によって合成した：ＰＳＳＭ−８、ＳＨＩＭＡＤＺＵ、Ｊａｐａｎ、ＳＨＥＰＰＡＲＤによるＦｍｏｃ／Ｂｕｔ（Ｇ．Ｓｃｈｎｏｒｒｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，４５：７７５９、１９８９）戦略を使用（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｍｏｃ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ、１９８９）。カップリングは、Ｔｅｎｔａｇｅｌ  ＨＬ  ＲＡＭ樹脂上で、３〜６当量のＦｍｏｃ−アミノ酸／ＨＯＢｔ／ＴＢＴＵ、および６−１２当量のＮ−メチルモルホリンを使用して行った。該ペプチドは、ＨＰＬＣ機器ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−８Ａによって精製した。該ペプチドは、脱保護して、ＴＦＡ／水によって樹脂から切り離し、ＭＡＬＤＩ  ２  ＤＥ機器を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって特性決定した。最後に、該ペプチドは、ＴＦＡ塩の形態で凍結乾燥させた。
【０１２１】
細胞培養：報告されているようにハムスターＨＩＴ−Ｔ１５インスリン分泌β細胞を採取して、培養した（参考文献１４、４）。ＩＮＳ−１Ｅラットβ細胞は、Ｃｌａｅｓ  Ｂ．Ｗｏｌｌｈｅｉｍ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））より快く提供していただき、報告されているように培養した（参考文献１４、４）。細胞培養試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）から入手した。サイトカインは、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｔａｌｙ）から入手した。
【０１２２】
ヒト膵島の単離：ヒト膵島は、報告されているように、多臓器ドナーの膵臓から採取した（参考文献４）。移植には適さない、純度７０％超の膵島の調製物は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（ＥＣＩＴ）、「Ｉｓｌｅｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ」、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｕｎｉｔ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ、Ｖｉｔａ−Ｓａｌｕｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｍｉｌａｎによって提供された。膵島（１０，０００個）は、１０％のＦＢＳを有するＣＭＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。
【０１２３】
細胞生存アッセイ：細胞生存は、以前に報告されているように、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）によって評価した（参考文献４）。細胞は、９６−ウエルプレートに５×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。処理後、細胞は、約１時間、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴと共にインキュベートした。培地を吸引して、ホルマザン生成物を１００μｌのＤＭＳＯに溶解した。生存率は、９６−ウエルプレートリーダーを使用して、５７０ｎｍの吸光度で、分光測光法によって評価した。
【０１２４】
インスリン分泌：ＨＩＴ−Ｔ１５細胞は、１００ｍｍディッシュに５×１０５の細胞密度で播種し、２４時間にわたって血清を欠乏させ、１．２５ｍＭのグルコースとともに０．５％のＢＳＡを含有する、ＨＥＰＥＳ緩衝Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ炭酸水素塩バッファー（ＫＢＲＨ）中で、３７℃で１時間インキュベートした。培地を交換し、細胞を、１．２５ｍＭ、または７．５ｍＭ、または１５ｍＭのグルコースを含有するＫＲＢＨ／０．５％ＢＳＡ中で、再び１時間インキュベートした。ホルモンの酸性エタノール抽出に続いて、分泌されたインスリンを、ヒトインスリンを認識し、ラットインスリンと交差反応する、放射免疫アッセイキット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｂｏｄｉａ，Ｙｅｎｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって定量した。
【０１２５】
動物：妊娠雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝１０、妊娠１４日目〜１５日目）をＨａｒｌａｎ  Ｓｒｌ（Ｉｔａｌｙ）より購入し、自由に摂水できるようにケージに入れ、標準的なラット用のペレット状の餌を与えた。６〜７日後に自然分娩が起きた。次の５つの実験群を調査した：（１）対照群：新生ラットは、クエン酸塩バッファー（０．０５ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ４．５）の単回腹腔内注射を受けた；（２）ＳＴＺ群：生後１日目に、クエン酸塩緩衝液中に新たに溶解したＳＴＺ（１００ｍｇ／ｋｇ体重）の単回腹腔内注射を受けた；（３）ＳＴＺ＋ＵＡＧ群：ＳＴＺの単回腹腔内注射を受けた後に、生後７日間（２日目から８日目まで）にわたってＵＡＧの注射（１日２回、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下注射）を受けた；（４）ＳＴＺ＋ＵＡＧ（６−１３）群：ＳＴＺの単回腹腔内注射を受けた後に、生後７日間（２日目から８日目まで）にわたってＵＡＧ（６−１３）の注射（１日２回、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下注射）を受けた；（５）ＳＴＺ＋ＵＡＧ（６−１３）群：ＳＴＺの単回腹腔内注射を受けた後に、生後７日間（２日目から８日目まで）にわたってＵＡＧ（６−１３）の注射（１日２回、１００ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下注射）を受けた。雌親は、５つの群にランダムに割り当て、同胎子は、同じ群に割り当てた。４つの群のそれぞれの雌親の数は、１１（対照）、１１（ＳＴＺ）、１６（ＳＴＺ＋ＵＡＧ）、および２１（ＳＴＺ＋ＵＡＧ（６−１３）、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ならびに１５（ＳＴＺ＋ＵＡＧ（６−１３）、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）であった。仔は、それらの親とともに残した。全ての新生ラットは、Ａｃｃｕ−ｃｈｅｋコンパクトプラス（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、２日目に糖尿の試験を行った。生後２日目において糖尿であった動物だけを、ＳＴＺモデル群に含めた。糖尿を確認した後に、ＵＡＧおよびＵＡＧ（６−１３）による処理を開始した。動物は、生後７０日目に、断頭によって屠殺した。血液試料は、断頭後に採取し、すぐに４℃で２分間、２０，０００×ｇで遠心分離を行い、アッセイを行うまで−２０℃で保存した。
【０１２６】
図１４Ａ、１４Ｂ、１５、および１６に示されている実験データについて、動物は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａａｓｒｔｉｃｈｅ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。動物（Ｂ６．Ｖ−Ｌｅｐｏｂ／Ｊ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｅｌｇｉａｎ  ｃｏｌｏｎｙ）は、８週齢のものを動物施設に受け入れ、処理を開始する前の２週間にわたって個々のケージ内で順応させた。動物は、標準的な１２：１２時間の明暗条件で、２１℃に維持し、自由に摂水摂餌できるようにした。動物はまた、血液採取に使用される方法に慣らすように、毎日取り扱った。ペプチドは、無菌で非発熱性の０．９％の生理食塩水（Ｂａｘｔｅｒ  ＢＶ、Ｕｔｒｅｃｈｅ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中に溶解した。Ｄ−グルコースは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＢＶ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手し、０．９％の生理食塩水中に４００ｍｇ／ｍｌで溶解した。Ａｌｚｅｔポンプ（モデル１００４）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。ポンプは、無菌条件下で、０．９％の生理食塩水、ＵＡＧ、またはＵＡＧ（６−１３）を充填し、流れが起こるように、３７℃で、少なくとも４８時間にわたって、０．９％の生理食塩水中で予めインキュベートした。血中グルコースレベルは、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅミニグルコメーターおよび試験紙（ＡＲＴ０５２１４  Ｒｅｖ．Ａ；Ａｂｂｏｔ、Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、尾部静脈の切り口から直接測定した。血漿インスリンレベルは、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｕｓｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ（カタログ番号１０−１１５０−１０；Ｍｅｒｃｏｄｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）によってアッセイした。
【０１２７】
膵臓の摘出および処理：切除後、膵臓を取り出して計量した。インスリン量を決定するために、膵臓（３５〜５０ｍｇ）を５ｍｌの酸性エタノール（７５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］のエタノール中に０．１５ｍｏｌ／ｌのＨＣｌ）中でホモジナイズし、１，０００ｇで２０分間、遠心分離し、上清を−８０℃で保存した。免疫組織化学のために、追加の膵臓を、２４時間、４％のパラホルムアルデヒド固定液で固定し、パラフィン中に包埋した。
【０１２８】
分析手法：血漿グルコースレベルは、グルコース分析器を使用して決定した。インスリンは、以前に報告されているように、ＲＩＡによって膵臓から、または血漿から測定した（参考文献１５）。
【０１２９】
結合アッセイ：ハムスターＨＩＴ−Ｔ１５およびラットＩＮＳ−１Ｅ膵臓β細胞から膜を調製して、［１２５Ｉ−Ｔｙｒ４］−ＵＡＧ結合の存在についてアッセイを行った。このような結合部位について放射性リガンドと競合するＵＡＧ断片の能力は、以前に報告されているのように評価した（参考文献４）。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【０１３０】
統計分析：結果は、平均±ＳＥとして表される。統計分析は、スチューデントｔ検定または一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して行った。Ｐが０．０５未満の時に有意であるとした。
【０１３１】
本明細書において報告されているデータは、本発明を例証するためにのみ与えられたものであり、その制限を構成するものと見なされないことを理解されたい。
【０１３２】
本発明を、その特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる変更を行うことができ、本出願は、全般に、本発明の原理に従い、また、本発明が関係する技術分野の範囲内で公知または慣用となり、かつ上述した基本的な特徴に適用され得る、添付の特許請求の範囲に従うこと本開示の発展を含む、本発明のあらゆる変形、使用、改作を包含することを意図していることを理解されるであろう。
【０１３３】
上述の明細書において言及した全ての刊行物は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３４】
参考文献
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0005485876.tif 000005
0005485876.tif 000006
0005485876.tif 000007
0005485876.tif 000008
【図１】
0005485876.tif 000009
【図２】
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【図３Ａ】
0005485876.tif 000011
【図３Ｂ】
0005485876.tif 000012
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0005485876.tif 000014
【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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