(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）マイクロ流体による平面脂質二重膜アレイであって、
（ｂ）該平面脂質二重膜アレイが、
（ｉ）送液口に接続され、並列に配置されるマイクロチャネルと、
（ii）該マイクロチャネルの両側部に開口を有するマイクロチャンバーとを具備し、前記平面脂質二重膜アレイが予め水中に浸して水で飽和させたアレイであることを特徴とするマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイ。
【請求項２】
請求項１記載のマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイにおいて、該アレイはＰＤＭＳからなることを特徴とするマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイ。
【請求項３】
請求項１記載のマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイにおいて、前記マイクロチャネルの高さは７μｍ、前記マイクロチャンバーは幅１７μｍ、高さ１９μｍであることを特徴とするマイクロ流体による膜タンパク質分析用平面脂質二重膜アレイ。
【請求項４】
（ａ）マイクロ流体による平面脂質二重膜アレイを予め水中に浸して水で飽和させる工程と、
（ｂ）該水で飽和させた平面脂質二重膜アレイに並列に配置されるマイクロチャネルと、該マイクロチャネルの両側部に開口を有するマイクロチャンバーとを用いて、前記開口に前記マイクロチャンバーをシールする平面脂質二重膜を形成することを特徴とする平面脂質二重膜を用いた分析方法。
【請求項５】
請求項４記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記マイクロチャネルの両側部の開口は、該マイクロチャネルに対してジグザグに配置することを特徴とする平面脂質二重膜を用いた分析方法。
【請求項６】
請求項４記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、
（ａ）前記マイクロチャネルと前記マイクロチャンバーとに膜タンパク質及び蛍光物質入りの緩衝液を注入する工程と、
（ｂ）前記マイクロチャネルに脂質入りの有機溶媒を注入する工程と、
（ｃ）溶解物を含まない緩衝液を前記マイクロチャネルに注入する工程とを施すことを特徴とする平面脂質二重膜を用いた分析方法。
【請求項７】
請求項６記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記膜タンパク質はα−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ、前記蛍光物質はカルセイン、前記脂質がｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｏｌｉｎｅ（ＰＣ）、前記有機溶媒がｈｅｘａｄｅｃａｎｅであることを特徴とする平面脂質二重膜を用いた分析方法。
【請求項８】
請求項６記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記膜タンパク質はα−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ、前記蛍光物質はカルセイン、前記脂質がｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｏｌｉｎｅ（ＰＣ）、前記有機溶媒がｓｑｕａｌｅｎであることを特徴とする平面脂質二重膜を用いた分析方法。
【請求項９】
請求項６において作製された平面脂質二重膜を変形させ、リポソームを形成し、そのリポソームにヘモリシンを導入して脂質二重膜の透過の度合を計測することを特徴とする平面脂質二重膜を用いた分析方法。
【請求項１０】
請求項９記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記ヘモリシンとともに蛍光材料を含ませたリポソーム内の蛍光密度の減少度合を計測することを特徴とする平面脂質二重膜を用いた分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体による平面脂質二重膜アレイ及びその平面脂質二重膜を用いた分析方法に係り、特に、マイクロ流体による膜タンパク質分析用平面脂質二重膜アレイ及びそれを用いた膜タンパク質の分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
塩基配列が解読されたゲノムの数の増加に伴い、タンパク質研究の機会が増えてきている（非特許文献１参照）。ゲノム研究に革命をもたらしたＤＮＡアレイチップの完成後、タンパク質の発現及び相互作用の高いスループット分析を可能にした“タンパク質アレイチップ”は、大いに求められている（非特許文献２参照）。特に、膜タンパク質の機能性に焦点をあてた研究はそれらがセルの内外で種々の分子の移動を制御するのに不可欠であるため重要である。
【０００３】
しかしながら、イオンチャネル、ポンプ、受容体（レセプター）、輸送体（トランスポータ）のような膜タンパク質を操作することは、それらが全てのバイオ膜の基本的な構造である脂質二重膜に組み込まれる時のみ機能するようにされてきた（非特許文献３参照）。結果として、タンパク質チップの最初のターゲットは、殆ど水溶液タンパク質であった。
【０００４】
パッチクランプ法〔非特許文献４参照〕及び人工の脂質二重膜〔非特許文献５参照〕実験は、膜タンパク質の基本的研究において２つの主に確立された方法であった。しかしながら、この２つの方法は、実施するための熟練した技術が求められ、高いスループット操作の欠如のために良好な再現性が実現されていないものであった。近年、いくつかの研究グループが、マイクロ流体装置において平面二重膜を生成することによってこれらの問題を克服する試みが行われてきた〔非特許文献６、７、８参照〕。集積されたマイクロ流体システムは、携帯性、分析時間の短縮、求められる試薬の少量化、及び高い再現性をもち、並行自動化といった利点がある巨大なアレイを提供している。それらの利点が膜輸送の分析に対して高いスループットと定量的な測定を引き出すことは認識されているが、そのような利点を有する単純な技術又は装置はまだ存在していない。
【非特許文献１】Ｖ．Ｓａｎｔｏｎｉ，Ｍ．Ｍｏｌｌｅｙ，Ｔ．Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ，“Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｍｉｃｓ：Ｕｎ  ａｍｏｕｒ  ｉｍｐｏｓｓｉｂｌｅ？”，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２１，１０５４−１０７０，２０００
【非特許文献２】Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ  Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄａｖｉｄ  Ｈａｌｌ，Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，“Ｇｌｏｂａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｃｈｉｐｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，Ｖｏｌ．２９３，２１０１−２１０５，２００１
【非特許文献３】Ｍ．Ｂｌｏｏｍ，Ｅ．Ｅｖａｎｓ，Ｏ．Ｇ．Ｍｏｕｒｉｔｓｅｎ，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｌｕｉｄ  Ｌｉｐｉｄ−Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｃｏｍｐｏｒｎｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：ａ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”，Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ａｕｇ；２４（３），２９３−３９７，１９９１
【非特許文献４】Ｂ．Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ；４thＥｄ．，”，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２
【非特許文献５】Ｔ．Ｉｄｅ，ａｎｄ  Ｔ．Ｙａｎａｇｉｄａ，“Ａｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｆｏｒｍｅｄ  ｏｎ  ａｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｇｌａｓｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２６５，ｐｐ．５９５−５９９，１９９９
【非特許文献６】Ｒ．Ｈｅｍｍｉｅｒ，Ｇ．Ｂｏｓｅ，Ｅ．Ｗａｇｎｅｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｐｅｔｅｒｓ，“Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｕｎｉｔａｒｙ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｅｃｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ”，ＢｉｏＰｈｙｓ．，Ｖｏｌ．８８，４０００−４００７，２００５
【非特許文献７】Ｎ．Ｍａｌｍｓｔａｄｔ，Ｍ．Ａ．Ｎａｓｈ，Ｒ．Ｆ．Ｐｕｒｎｅｌｌ，ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ−Ｂｉｌａｙｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅ”，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．９，１９６１−１９６５，２００６
【非特許文献８】Ｍ．Ｍａｙｅｒ，Ｊ．Ｋ．Ｋｒｉｅｂｅｌ，Ｍ．Ｔ．Ｔｏｓｔｅｓｏｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，“Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  Ｔｅｆｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｏｗ−Ｎｏｉｓｅ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎａｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｌａｙｅｒｓ”，ＢｉｏＰｈｙｓ．，Ｖｏｌ．８５，２６８４−２６９５，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記したように、上記の利点を有する単純な方法又はそのための装置はまだ存在していない。
本発明は、上記状況に鑑みて、携帯性、分析時間の短縮、求められる試薬の少量化、及び高い再現性をもつ並行自動化といった利点を有するマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイ及びその平面脂質二重膜を用いた分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕マイクロ流体による平面脂質二重膜アレイにおいて、この平面脂質二重膜アレイが、送液口に接続され、並列に配置されるマイクロチャネルと、このマイクロチャネルの両側部に開口を有するマイクロチャンバーとを具備し、前記平面脂質二重膜アレイが予め水中に浸して水で飽和させたアレイであることを特徴とする。
【０００７】
〔２〕上記〔１〕記載のマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイにおいて、このアレイはＰＤＭＳからなることを特徴とする。
〔３〕上記〔１〕記載のマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイにおいて、前記マイクロチャネルの高さは７μｍ、前記マイクロチャンバーは幅１７μｍ、高さ１９μｍであることを特徴とする。
【０００８】
〔４〕平面脂質二重膜を用いた分析方法において、マイクロ流体による平面脂質二重膜アレイを予め水中に浸して水で飽和させる工程と、この水で飽和させた平面脂質二重膜アレイに並列に配置されるマイクロチャネルと、このマイクロチャネルの両側部に開口を有するマイクロチャンバーとを用いて、前記開口に前記マイクロチャンバーをシールする平面脂質二重膜を形成することを特徴とする。
【０００９】
〔５〕上記〔４〕記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記マイクロチャネルの両側部の開口は、このマイクロチャネルに対してジグザグに配置することを特徴とする。
〔６〕上記〔４〕記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記マイクロチャネルと前記マイクロチャンバーとに膜タンパク質及び蛍光物質入りの緩衝液を注入する工程と、前記マイクロチャネルに脂質入りの有機溶媒を注入する工程と、溶解物を含まない緩衝液を前記マイクロチャネルに注入する工程とを施すことを特徴とする。
【００１０】
〔７〕上記〔６〕記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記膜タンパク質はα−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ、前記蛍光物質はカルセイン、前記脂質がｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｏｌｉｎｅ（ＰＣ）、前記有機溶媒がｈｅｘａｄｅｃａｎｅであることを特徴とする。
〔８〕上記〔６〕記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記膜タンパク質はα−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ、前記蛍光物質はカルセイン、前記脂質がｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｏｌｉｎｅ（ＰＣ）、前記有機溶媒がｓｑｕａｌｅｎであることを特徴とする。
【００１１】
〔９〕上記〔６〕において作製された平面脂質二重膜を変形させ、リポソームを形成し、そのリポソームにヘモリシンを導入して脂質二重膜の透過の度合を計測することを特徴とする。
〔１０〕上記〔９〕記載の平面脂質二重膜を用いた分析方法において、前記ヘモリシンとともに蛍光材料を含ませたリポソーム内の蛍光密度の減少度合を計測することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、以下のような効果を奏することができる。
（１）携帯性、分析時間の短縮、求められる試薬の少量化、及び高い再現性をもつ並行自動化などの利点を有する。
（２）並列に構成された膨大な数のマイクロチャンバーをセットすることができ、膜タンパク質の分析を迅速、かつ的確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のマイクロ流体による平面脂質二重膜アレイは、送液口に接続され、並列に配置されるマイクロチャネルと、このマイクロチャネルの両側部に開口を有するマイクロチャンバーとを具備し、前記平面脂質二重膜アレイが予め水中に浸して水で飽和させたアレイである。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図１は本発明の実施例を示すＰＤＭＳ装置のマイクロチャンバーを有するマイクロチャネルの概念図である。図２はその平面脂質二重膜でシールされているマイクロチャンバーを示す図である。
これらの図において、１はＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）装置、２はＰＤＭＳ装置１に形成されたマイクロチャネル、３はマイクロチャネル２の両側部に交互に開口を有するマイクロチャンバーである。ここでは、マイクロチャネル２の両側部は、マイクロチャネルの横壁である両側壁を例に挙げているが、マイクロチャネル２の両側部は、マイクロチャネルの縦壁である天井壁と床壁であってもよい。ここで、各マイクロチャネル２の高さは７μｍであり、各マイクロチャンバー３の寸法は、例えば、幅１７μｍ、高さ１９μｍである。
【００１５】
ここで、後述するがマイクロチャンバー３の開口部に形成される平面脂質二重膜５の膜面積は小さいほど膜自体は安定化するが、比面積が大きすぎるとＰＤＭＳ装置１が有機溶媒により大きく膨潤することになり、問題が生じる。例えば、マイクロチャンバー３の幅が７μｍの場合、上記した膨潤によりマイクロチャンバー３が閉じてしまった。また、１０μｍの場合でもマイクロチャンバー３が変形し、平面脂質二重膜の形成を妨げる要因になってしまった。そこで、マイクロチャンバー３の幅は１７μｍに最適化した。
【００１６】
また、マイクロチャネル２の高さは、平面脂質二重膜５の安定化のために、マイクロチャネル２の間隔８０μｍに比べて７μｍと低くなっており、ＰＤＭＳ装置１の構造が潰れてしまうという課題が存在するが、これに対しては、マイクロチャネル２の両側部に交互に開口を有するマイクロチャンバーを配置する構成としたので、メインマイクロチャネルの中心にはＰＤＭＳの柱４が整列しており、ＰＤＭＳ装置１の構造を堅牢にしてマイクロチャネルの構造が潰れるのを防止するようにした。
【００１７】
また、このＰＤＭＳ装置１は並列に構成された膨大な数のマイクロチャンバーをセットすることができる。
さらに、この各マイクロチャンバー３の開口部は平面脂質二重膜５でシールされており、その平面脂質二重膜５に存在するナノ孔〔α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎモノマーが七量体化（ｈｅｐｔａｍｅｒｉｚｅｓ）された時に形成された〕６を通じた蛍光分子の移動が蛍光顕微鏡下で蛍光密度の変化として計測される。
【００１８】
なお、上記したアレイはＰＤＭＳが好適であるが、このＰＤＭＳに限定されることなく、ガラス、ＳＵ−８、シリコン、アクリル樹脂、ＰＥＴなど無機やプラスチック材料を用いるようにしてもよい。
この装置は、携帯性、分析時間の短縮、求められる試薬の少量化、及び高い再現性の並行自動化を図ることができる。
【００１９】
図３は本発明の実施例を示すマイクロチャンバーへ平面脂質二重膜を形成する方法を示す図であり、図３（ａ）はＰＤＭＳ装置を水に浸漬して飽和させる様子、図３（ｂ）は膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）及び蛍光物質（Ｃａｌｃｅｉｎ：カルセイン）入りの緩衝液（バッファ液）を注入する様子、図３（ｃ）は脂質溶液〔ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｏｌｉｎｅ（ＰＣ）入りの有機溶媒（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ：ヘキサデカン）〕を注入する様子、図３（ｄ）は溶解物を含まない緩衝液をマイクロチャネルに注入する（フラッシュする）様子、図３（ｅ），（ｆ）は平面脂質二重膜が形成されたマイクロチャンバーを示す図、図３（ｇ）はマイクロチャンバーに形成された脂質二重膜の拡大図である。なお、上記した有機溶媒のヘキサデカンに代えて、有機溶媒のｓｑｕａｌｅｎｅ（スクワレン）を用いることもでき、その応用を広げることができる。
【００２０】
まず、図３（ａ）に示すように、シャーレ１１に入った水１２にＰＤＭＳ装置１３を１２時間以上浸漬して飽和させる。これは実施中、水がＰＤＭＳ装置１３へ吸収されるのを防ぐためである。次いで、図３（ｂ）に示すように、水で飽和されたＰＤＭＳ装置１３のマイクロチャネル１４及びマイクロチャンバー１５に膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）及び蛍光物質（Ｃａｌｃｅｉｎ：カルセイン）入りのリン酸緩衝液（バッファ液）１６を注入する。次いで、図３（ｃ）に示すように、リン酸緩衝液（バッファ液）１６が充填されているマイクロチャンバー１５内に脂質溶液〔ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｏｌｉｎｅ（ＰＣ）入りの有機溶媒（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ：ヘキサデカン）〕１７を注入する。次いで、図３（ｄ）に示すように、溶解物を含まない緩衝液１８をマイクロチャネル１４に注入する。すると、図３（ｅ）及び（ｆ）に示すように、緩衝液１８の流れと有機溶媒がＰＤＭＳ装置に吸収されることにより、マイクロチャンバー１５を覆っている有機溶媒の膜は薄くなり、マイクロチャンバー１５の開口部が平面脂質二重膜１９でシールされる。なお、図３（ｄ）においては、平面脂質二重膜が破れたものも示されている。
【００２１】
このように、本発明によれば、膜タンパク質分析用平面脂質二重膜１９が容易に作製され、膜タンパク質の分析を迅速、かつ的確に行うことができる。
図４は本発明の実施例を示す膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）が形成したナノ孔を通じてマイクロチャネルへ蛍光物質（カルセイン）が分散するためにマイクロチャンバー内の蛍光密度が急激に減少する様子を示す図である。
【００２２】
図５（ａ）はマイクロチャンバー内の蛍光密度の経過を示す図であり、膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）がない場合、蛍光密度の減少は光退色によるものだけである。一方、膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）がある場合には、形成されたナノ孔から蛍光物質が分散していくため、その減少は急速であることが分かる。
図５（ｂ）は図５（ａ）に基づいて計算した移動比ｋを示す図である。ここで、（ｄｆ／ｄｔ＝−ｋｆ）、つまり、移動比ｋは含まれる膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）の数の占める割合である。
【００２３】
このように、イオンチャネル、ポンプ、受容体（レセプター）、輸送体（トランスポータ）のような膜タンパク質を操作することができる。
図６は本発明の実施例を示す送液口からマイクロ流体による膜タンパク質分析用平面脂質二重膜アレイ（ＰＤＭＳ装置）までの構造を示す模式図、図７は実験システムを示す図である。
【００２４】
図３に示した溶解物を含まない緩衝液１８の流速が大きい場合、マイクロチャンバーの開口部に残った脂質を含んだ有機溶媒（脂質溶液１７）の膜に、緩衝液１８の流れによる過度の力学的ストレスがかかり、平面膜質二重膜が作製される前に割れてしまうといった問題が生じる。これを防止するために、図６に示すように、送液口２１から液体を注入する時の流路２２，２３，２４，２５を並列化することにより、低速度の送液を可能とした。流速を低減させることで、脂質を含む有機溶媒膜に緩衝液１８の流れにより加わる力学的ストレスを減少させるようにした。これにより、平面脂質二重膜の作製前に割れてしまう確立を抑えることができた。
【００２５】
次に、実験システムについて説明する。
本発明において平面脂質二重膜の作製方法を行う場合には、上記したように、緩衝液／脂質溶液／溶解物を含まない緩衝液が混ざることなく、かつ連続にマイクロチャネル内に送液されねばならない。しかし、溶液ごとにシリンジを入れ替えていては、空気の混入などでミセル状の汚れが大量に発生するという問題があった。
【００２６】
本発明では、一本のシリンジを用いて、一つのチューブに連続して溶液を充填することで、間に空気が入ることなくそれぞれのプロセスを行えるようにした。
なお、上記実施例では、送液のためにはシリンジが好適であるが、これに限定されるものではなく、他のポンプやピペットを用いて手操作で送液を行うことも可能である。
図７において、３１はマイクロシリンジ、３２はこのマイクロシリンジ３１に接続されるチューブである。このチューブ３２には溶解物を含まない緩衝液（バッファ液）３３と脂質溶液３４と蛍光物質（Ｃａｌｃｅｉｎ：カルセイン）及び膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）を含むリン酸緩衝液（バッファ液）３５が入れられている。３６は上述したＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）装置（膜タンパク質分析用平面脂質二重膜アレイ）である。
【００２７】
このように構成することにより、一本のマイクロシリンジ３１を用いて、一つのチューブ３２に連続してリン酸緩衝液３５／脂質溶液３４／溶解物を含まない緩衝液３３の液体を充填することができ、間に空気が入ることなく、膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の作製プロセスを実施することができた。
図８は本発明の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜を用いたリポソームの形成による膜透過を計測する様子を示す図である。
【００２８】
まず、水で飽和されたＰＤＭＳを数時間大気中に放置した後、図８（ａ）に示すように、α−ヘモリシン無しで膜タンパク質分析用平面脂質二重膜が形成された。次いで、図８（ｂ）に示すように、ＰＤＭＳへ緩衝液が吸収されると、膜タンパク質分析用平面脂質二重膜がチャンバー内に引き込まれ、図８（ｃ）に示すように、リポソームが得られる。図８（ｄ）に示すように、α−ヘモリシン及びｃａｌｃｅｉｎ（蛍光材料）を含む緩衝液が導入されると、図８（ｅ）に示すように、リポソーム内にｃａｌｃｅｉｎが分散される。図８（ｆ）に示すように、外部緩衝液が交換されると、ｃａｌｃｅｉｎがα−ヘモリシンを通じてリポソームの外へと分散される。そのことは、図８（ｇ）に示すように、リポソーム内の蛍光密度が減ることで観察できた。
【００２９】
このように、上記した方法によって作製された膜タンパク質分析用平面脂質二重膜を変形させ、リポソームを形成し、そのリポソームにヘモリシンを導入して膜タンパク質分析用平面脂質二重膜の透過の度合を計測することができる。
これにより、膜タンパク質の分析を行うことができる。
本発明によれば、上記したように、
（１）実施中に水がＰＤＭＳへ吸収されるのを防ぐために、水中にＰＤＭＳ装置（膜タンパク質分析用脂質二重膜アレイ）を１２時間以上漬け、飽和しておくようにした。
【００３０】
（２）膨大な数のマイクロチャンバーを有するマイクロチャネル内に順次リン酸緩衝液／脂質溶液／溶解物を含まない緩衝液を注入することで、各マイクロチャンバーは膜タンパク質を含む平面脂質二重膜によってシールされる。そのマイクロチャンバー（２ｐｌ）は小さい容積であるため、蛍光密度の変化を良好に観察して、蛍光分子の膜透過を観察することができる。つまり、膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）が形成したナノ孔を通じて蛍光物質（Ｃａｌｃｅｉｎ：カルセイン）の透過の量的測定を良好に行うことができる。
【００３１】
また、一分子レベルで、定量的な膜タンパク質の解析実験を可能にした。
すなわち、並列マイクロチャネルに沿って、マイクロチャンバーが高密度に配列された構造とした高集積化により、一視野に多数のマイクロチャンバー（２０倍光学レンズで１７６個）が測定可能になるため、膨大な数の定量的な生化学実験解析が可能になった。
また、マイクロチャンバーを利用することで、一分子レベルでの膜タンパク質の活性が系のパラメータに大きな変化（蛍光輝度変化）を及ぼすため精確な検出が可能になった。
【００３２】
なお、平面脂質二重膜を張って、膜タンパク質なしで、例えば、環境の汚染度を計測するようにすることもできる。すなわち、平面脂質二重膜に蛍光分子を入れて、その光具合で環境の汚染度を計測することができる。つまり、膜タンパク質を使わなくても、温度応答性の平面脂質二重膜を使用することにより、物質を通過したり、止めたりすることもできる。
【００３３】
また、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のマイクロ流体による膜タンパク質分析用平面脂質二重膜アレイは、並列に構成された膨大な数のマイクロチャンバーと組み合わせることにより、膜タンパク質の分析に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の実施例を示すＰＤＭＳ装置のマイクロチャンバーを有するマイクロチャネルの概念図である。
【図２】本発明の実施例を示す平面脂質二重膜でシールされているマイクロチャンバーを示す図である。
【図３】本発明の実施例を示すマイクロチャンバーへ平面脂質二重膜を形成する方法を示す図である。
【図４】本発明の実施例を示す膜タンパク膜質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）が形成されたナノ孔を通じてマイクロチャネルへ蛍光物質（カルセイン）が分散するためにマイクロチャンバー内の蛍光密度が急激に減少する様子を示す図である。
【図５】本発明の実施例を示すマイクロチャンバー内の蛍光密度の変化の特性を示す図である。
【図６】本発明の実施例を示す送液口からマイクロ流体による膜タンパク質分析用平面脂質二重膜アレイ（ＰＤＭＳ装置）までの構造を示す模式図である。
【図７】本発明の実験システムを示す図である。
【図８】本発明の膜タンパク質分析用平面脂質二重膜を用いたリポソームの形成による膜透過を計測する様子を示す図である。
【符号の説明】
【００３６】
１，１３，３６    ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）装置
２，１４    マイクロチャネル
３，１５    マイクロチャンバー
４    ＰＤＭＳの柱
５    平面脂質二重膜
６    ナノ孔
１１    シャーレ
１２    水
１６，３５    膜タンパク質（α−Ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）及び蛍光物質（Ｃａｌｃｅｉｎ：カルセイン）入りのリン酸緩衝液（バッファ液）
１７，３４    脂質溶液〔ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｃｏｌｉｎｅ（ＰＣ）入りの有機溶媒（ｈｅｘａｄｅｃａｎｅ）〕
１８，３３    溶解物を含まない緩衝液
１９    平面脂質二重膜
２１    送液口
２２，２３，２４，２５    並列化された流路
３１    マイクロシリンジ
３２    チューブ
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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