(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に均一な糖鎖付加全長IgG-Fcフラグメントであって、
ここで、
前記IgG-Fcフラグメントは、IgG1-Fcフラグメントであり、
前記IgG1-Fcフラグメントは、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するか、または、
IgG1-Fcフラグメント活性を保持し、かつ、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；もしくは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するIgG1-Fcフラグメント誘導体を含み、
天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置に糖鎖が付加されており、
糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1〜30位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換され；(ii)天然型ではSerでないアミノ酸のいずれか1つがSerに置換され；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換され；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換され、かつ
少なくとも1つのMetがMet以外のアミノ酸に置換されている、IgG-Fcフラグメント。
【請求項２】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の69位のAsnに糖鎖が付加されており、
59位〜68位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換されている；(ii)いずれか1つがSerに置換されている；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換されている；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換されている、
請求項１に記載のIgG-Fcフラグメント。
【請求項３】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位のGluがCysに置換されている、
請求項２に記載のIgG-Fcフラグメント。
【請求項４】
配列番号：１に記載のアミノ酸配列の130位及び200位のMetがLeuに置換されている、
請求項２又は３に記載のIgG-Fcフラグメント。
【請求項５】
前記糖鎖が、
【化１】
0005575670.tif 000030
［式中、R1及びR2は、同一又は異なって、
【化２】
0005575670.tif 000031
を示す。Acは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、
請求項１から４のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント。
【請求項６】
実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法であって、
前記IgG-Fcフラグメントの部分ペプチドであって、アミノ酸残基が3個〜50個の糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを、実質的に均一な糖鎖付加Asnを使用して固相合成法により合成する工程と、
前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりN末端側の部分ペプチド、及び、前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりC末端側の部分ペプチド、のうち、少なくとも前記C末端側の部分ペプチドを発現系により発現させ、残りを固相合成法により合成する工程と、
前記糖鎖付加ペプチドと、前記N末端側部分ペプチドと、前記C末端側部分ペプチドとをライゲーション法により連結する工程と、を含み、
前記部分ペプチドを発現系により発現させる工程は、
前記部分ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該融合タンパク質を、該精製タグを利用して精製する工程であって、ここで、発現系により発現させる前記部分ペプチドは、前記部分ペプチドに含まれる全てのMetがMet以外のアミノ酸に置換されていることを特徴とする、工程、と、
前記部分ペプチドと前記精製タグを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断する工程であって、ここで、前記強酸は１％〜２０％の濃度で加えられることを特徴とする、工程
と、を含む、
方法。
【請求項７】
前記強酸が、トリフルオロ酢酸、フッ化水素及びメタンスルホン酸からなる群より選択される、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記糖鎖付加ペプチドのN末端アミノ酸をCys又は下記式(1）に示すトレオニン誘導体に置換して合成する、
請求項６又は７に記載の方法。
【化３】
0005575670.tif 000032
【請求項９】
前記IgG-Fcフラグメントが、IgG1-Fcフラグメントであって、
前記N末端側部分ペプチドを、固相合成法により合成する場合、該N末端側部分ペプチドを合成する工程は、
前記N末端側部分ペプチドを配列番号：１に記載のアミノ酸配列の32位のThrと33位のCysの間で分けたそれぞれのペプチドを固相合成法によって合成する工程と、
合成したペプチドをライゲーション法で連結する工程と、
を含む、
請求項６から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖鎖付加ペプチドが配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位〜92位であり、前記N末端側部分ペプチドが1位〜64位であり、前記C末端側部分ペプチドが93位〜216位であって、
前記糖鎖付加ペプチドは、65位のGluをCysに置換して固相合成法で合成し、
前記N末端側部分ペプチドは、1位〜32位と33位〜64位に分けて、それぞれ固相合成法で合成し、
前記C末端側部分ペプチドは、130位及び200位のMetがLeuに置換されるように発現系により発現させる、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ライゲーション法による連結工程の後、IgG-Fcフラグメントをフォールディングさせる工程をさらに含む、
請求項６から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現系が大腸菌発現系である、
請求項６から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１から５のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント、又は、請求項６から１２のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメントの製造方法により製造されたIgG-Fcフラグメントを含むキメラ抗体。
【請求項１４】
実質的に均一な糖鎖が付加された全長IgG-Fcフラグメントを製造する方法の設計方法であって、
ここで、
前記IgG-Fcフラグメントは、IgG1-Fcフラグメントであり、
前記IgG-Fcフラグメントを、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドと、1つ以上のその他のペプチドとに分けて産生するものとし、
前記糖鎖付加ペプチドは、前記糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1〜30位のいずれかのアミノ酸をN末端とし、該糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸をC末端とし、
当該糖鎖付加ペプチドを、実質的に均一な糖鎖付加アミノ酸を用いた固相合成法によって合成するものとし、
前記その他のペプチドは、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、ここで、少なくとも前記糖鎖付加ペプチドよりC末端側の前記その他のペプチドについては、発現系により発現されるものとし、発現系により発現される前記その他のペプチドは、該ペプチドに含まれるMetをMet以外のアミノ酸に変えて発現させるものとし、
前記その他のペプチドを発現系により発現させる場合、該ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該精製タグを該特定の物質に結合させることにより精製するものとし、前記発現系により発現させるペプチドと前記精製タグとを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断するものとし、
前記糖鎖付加ペプチドと前記ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、
方法。
【請求項１５】
前記糖鎖付加ペプチドを固相合成する際、N末端のアミノ酸をCys又は下記式(1)に示すThr誘導体に置換して合成するものとする、
請求項１４に記載の方法。
【化４】
0005575670.tif 000033
【請求項１６】
前記その他のペプチドを、当該ペプチドに含まれるCys、Ser、Thr及びAlaからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸のN末端側で2以上の部分ペプチドに分け、各部分ペプチドを、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、
前記糖鎖付加ペプチドと前記部分ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、
請求項１４又は１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒトIgG-Fcフラグメント及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な標的分子に特異的に結合する種々の抗体医薬が開発されている。抗体は、Y字型を基本構造とするタンパク質である。Y字の上半分は、抗原に結合するFab領域であり、2本の軽鎖と2本の重鎖からなる。Y字型の下半分はFc領域と呼ばれる。【０００３】
Fab領域の先端に近い部分は、抗体によって異なる可変領域であり、重鎖の可変領域をVH領域、軽鎖の可変領域をVL領域と呼ぶ。可変領域以外のFab領域とFc領域は、比較的変化の少ない領域であり、一般に定常領域と呼ばれる。軽鎖の定常領域はCL領域、重鎖の定常領域をCH領域と呼び、CHのうちFab領域に該当する部分をCH1ドメイン、Fc領域に該当する部分をN末端側から順にCH2ドメイン、CH3ドメインと呼ぶ。CH1ドメインとCH2ドメインはヒンジ部で結合し、左右の重鎖はヒンジ部においてジスルフィド結合している。【０００４】
特定の抗原に対する抗体は、例えば当該抗原でマウスを免疫することによって得ることができる。しかしながら、マウスが産生する抗体は、ヒトにおいて免疫原性が高く、ヒトへの投与は制限される。また、ヒトの体内においては、マウス抗体の半減期が比較的短く、十分に効果を得られない可能性が高い。【０００５】
この問題を解決するものとして、マウス抗体の定常領域をヒト型抗体の定常領域で置き換えるキメラ抗体が開発されている。キメラ抗体は、マウス抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することが可能であり、かつ、免疫原性が低いことが予想される。そのため、キメラ抗体に利用するためのヒト型の定常領域やFc領域の製造方法が研究されており、特に、IgG、IgA、IgM、IgD、IgEの5種類に分類される免疫グロブリンのうち、ヒト免疫グロブリンの70−75％を占め、血漿中に最も多い抗体であるIgGについての研究が進められている。現在販売されている抗体医薬もほとんどがIgGである。IgGは、抗体依存性細胞障害活性（ADCC）と呼ばれる抗原破壊活性を示し、特に、IgG1とIgG3のサブクラスはこの活性が強いことが知られている。【０００６】
IgGのFcフラグメントは、ヒンジ部における共有結合とCH3ドメイン同士の非共有結合で構成されるホモ二量体であり、CH2ドメインの297残基目（配列番号：１における69位）AsnにN型糖鎖が結合している。X線結晶構造解析によれば、この糖鎖は内側を向いており、CH2ドメインのタンパク表層と複数箇所で水素結合を形成している。この糖鎖はFcフラグメントの構造形成及び維持に必要不可欠であることが示唆されている（例えば、非特許文献１を参照）。【０００７】
IgGがADCCにより抗原を破壊する過程においては、まずIgGの可変領域が標的細胞上に存在する特定のタンパク質に結合する。次いで、FcフラグメントがNK細胞などのエフェクター細胞上のFc受容体と結合し、これによって標的細胞に孔を形成するパーフォリンと呼ばれるタンパク質がエフェクター細胞から放出され、IgGが捕獲した標的細胞が破壊される。【０００８】
ADCC活性の発現には、IgG1に結合した糖鎖の構造が関与していることが見出され、これまでにグリコシル化されたFcフラグメントについて多くの研究がなされている。例えば、CHO細胞に糖転移酵素N-アセチルグルコサミン転移酵素（GNTIII）の遺伝子を導入し、非還元末端がGlcNAcである2分岐糖鎖を有する抗神経芽細胞腫抗体を当該CHO細胞から調製したことが報告されている。当該研究により、糖鎖を付加することによって、神経芽細胞腫に対するADCC活性が増強されることが示された（例えば、非特許文献２を参照）。【０００９】
また、IgG1-Fcフラグメントと、FcγRIIIの複合体結晶構造解析によって、FcフラグメントとFc受容体が結合する際、FcフラグメントのAsn297に結合したN結合型糖鎖がFcフラグメントのタンパク質と相互作用し、その構造を安定化させていることが示唆されている（例えば、非特許文献１を参照）。糖鎖が結合したFcフラグメントは、糖鎖が結合していないFcフラグメントと比較して、熱力学的にも生物学的にも安定であることも示されている（例えば、非特許文献３を参照）。【００１０】
また、糖鎖の構造が、抗体の活性に影響し得ることも知られている。例えば、糖鎖の還元末端側のGlcNAcの6位に結合したフコースが除去されたヒト型IgG1を発現させたことが報告されており、当該抗体のFcγRIIIとの結合を介したADCC活性が40-50倍増強されることが示された（例えば、非特許文献４を参照）。一方、Asn297に結合した糖鎖がシアリル化されると、IgGのin vivoでの細胞障害活性が減少すること（例えば、非特許文献５を参照）、動物モデルでIgGの抗炎症活性を高めること（例えば、非特許文献６を参照）等も確認されている。【００１１】
さらに、IgG1-Fcフラグメントを酵母で発現した後、in vitroでの酵素反応によって糖鎖構造の改変を行い、糖鎖誘導体をもつIgG1-Fcフラグメントを合成した例も報告されている（例えば、非特許文献７を参照）。しかしながら、当該方法では、N結合型糖鎖のコンセンサス配列（Asn-X-Thr又はAsn-X-Ser；Xはプロリン以外のアミノ酸である。）のAsnに糖鎖が結合するため、天然のIgG1-Fcフラグメントと異なる位置に糖鎖を付加する場合、IgG1-Fcペプチドを発現させる際に当該コンセンサス配列を導入しておかなければならない。【００１２】
このように、これまでに種々の糖鎖付加IgGが製造され、その機能が研究されてきたが、CHO細胞やヒト293T細胞、酵母などの細胞培養を利用して発現させているため、Asn297に結合した糖鎖構造は、グライコフォーム、即ち少しずつ異なった構造となっている。抗体を医薬品として用いる場合には、細胞障害活性に影響を与える糖鎖はできる限り均一なものが付加されていなければならない。また、どのような糖鎖構造が細胞障害活性に関与しているかを調べるためにも、糖鎖構造が均一なIgGが必要である。【００１３】
本発明者らは、これまでに、均一な糖鎖付加アミノ酸を得る方法を開発し、これを用いた固相合成法によって、糖鎖の構造が極めて均一な糖鎖を所望の位置に正確に付加した糖鎖付加ペプチドを合成する方法を見出した（例えば、特許文献１を参照）。当該方法は、長いペプチドを合成するのには適さないが、当該方法と発現系とを組み合わせることによって、即ち、ペプチドを分割して、それぞれを固相合成により合成し、又は発現系により発現させた後、ライゲーション法によって連結することによって、より長い糖鎖付加ペプチドを得ることができる。特に、糖鎖が付加されていないペプチドは、発現系により発現させることにより、均一なペプチドを大量に、かつ経済的に得ることができる。【００１４】
本発明者らは、この方法を利用して、糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの一部を合成した。当該方法では、IgG-Fcフラグメントの293位（GluをCysに置換）から320位のLysまで（配列番号：１の65位から92位）を固相合成法により合成し、297位のAsnを付加する際に糖鎖付加Asnを用いた。一方、そのC末端側の321位のCysから444位のSer（配列番号：１の93位から216位）は大腸菌発現系により発現させた。しかしながら、大腸菌発現系で発現させたCys321-Ser444ペプチドを安定して得ることができず、ペプチドをさらに連結してIgG-Fcフラグメント全長を得ることができなかった。IgG-Fcフラグメントをキメラ抗体に用いるためには、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントのペプチド部分をより長く伸ばし、少なくともFcレセプターと結合可能な最低限の長さまで伸長させる必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第WO2004/005330号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Sondermann, P. et al. Nature Vol. 406, 2000, pp267-
【非特許文献２】Umana, P. et al. Nature Biotechnology Vol. 17, 1999, pp176-
【非特許文献３】Mimura, Y. et al. Molecular Immunology 37(2000)697-706
【非特許文献４】Shields, R.L. et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 277, 2002, pp26733-26740
【非特許文献５】Kaneko, Y. et al. Science Vol. 313 (2006) 670-
【非特許文献６】Anthony, R.M. Science Vol. 320 (2008) 373-
【非特許文献７】Wei et al. Biochemistry Vol.47 (2008) 10294-10304
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
そこで、本発明は、実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの全長、及びこれを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、大腸菌発現系で目的とするペプチドを精製タグとの融合タンパク質として発現させた後、精製タグを切断する工程で、従来用いられていたギ酸ではなく強酸を添加し、且つ、アセトニトリル等の特定の溶剤を添加することによって、目的ペプチドを非常に安定に産生できることを見出した。そして、当該目的ペプチドを用いてライゲーションを行うことにより、従来よりも長い糖鎖付加ペプチドを得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕糖鎖付加IgG-Fcフラグメントであって、天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置に糖鎖が付加されており、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1〜30位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換され；(ii)天然型ではSerでないアミノ酸のいずれか1つがSerに置換され；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換され；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換され、少なくとも1つのMetがMet以外のアミノ酸に置換されている、IgG-Fcフラグメント；
〔２〕前記IgG-Fcフラグメントが、IgG1-Fcフラグメントであって、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の69位のAsnに糖鎖が付加されており、５９位〜６８位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換されている；(ii)いずれか1つがSerに置換されている；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換されている；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換されている、上記〔１〕に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔３〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位のGluがCysに置換されている、上記〔２〕に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔４〕配列番号：１に記載のアミノ酸配列の130位及び200位のMetがLeuに置換されている、上記〔２〕又は〔３〕に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔５〕前記糖鎖が、
【化１】
0005575670.tif 000002
［式中、R1及びR2は、同一又は異なって、
【化２】
0005575670.tif 000003
を示す。Acは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント；
〔６〕実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法であって、前記IgG-Fcフラグメントの部分ペプチドであって、アミノ酸残基が3個〜50個の糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを、実質的に均一な糖鎖付加Asnを使用して固相合成法により合成する工程と、前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりN末端側の部分ペプチド、及び、前記IgG-Fcフラグメントにおける前記糖鎖付加ペプチドよりC末端側の部分ペプチド、の少なくとも1つを発現系により発現させ、残りを固相合成法により合成する工程と、前記糖鎖付加ペプチドと、前記N末端側部分ペプチドと、前記C末端側部分ペプチドとをライゲーション法により連結する工程と、を含み、前記部分ペプチドを発現系により発現させる工程は、前記部分ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該融合タンパク質を、該精製タグを利用して精製する工程と、前記部分ペプチドと前記精製タグを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断する工程と、を含む方法；
〔７〕前記強酸が、トリフルオロ酢酸、フッ化水素及びメタンスルホン酸からなる群より選択される、上記〔６〕に記載の方法；
〔８〕前記糖鎖付加ペプチドのN末端アミノ酸をCys又は下記式(1）に示すトレオニン誘導体に置換して合成する、上記〔６〕又は〔７〕に記載の方法；
【化３】
0005575670.tif 000004
〔９〕前記部分ペプチドを発現系により発現させる工程において、該部分ペプチドに含まれるMetが、Met以外のアミノ酸に置換されるように発現させる、上記〔６〕から〔８〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕前記IgG-Fcフラグメントが、IgG1-Fcフラグメントであって、前記N末端側部分ペプチドを、固相合成法により合成する場合、該N末端側部分ペプチドを合成する工程は、前記N末端側部分ペプチドを配列番号：１に記載のアミノ酸配列の32位のThrと33位のCysの間で分けたそれぞれのペプチドを固相合成法によって合成する工程と、合成したペプチドをライゲーション法で連結する工程と、を含む、上記〔６〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１１〕前記C末端側部分ペプチドを、固相合成法により合成する場合、該C末端側部分ペプチドを合成する工程は、前記C末端側部分ペプチドを、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の138位のThrと139位のCysの間、及び／又は196位のSerと197位のCysの間で分けたそれぞれのペプチドを固相合成法によって合成する工程と、合成したペプチドをライゲーション法で連結する工程と、を含む、上記〔１０〕に記載の方法；
〔１２〕前記糖鎖付加ペプチドが配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位〜92位であり、前記N末端側部分ペプチドが1位〜64位であり、前記C末端側部分ペプチドが93位〜216位であって、前記糖鎖付加ペプチドは、65位のGluをCysに置換して固相合成法で合成し、前記N末端側部分ペプチドは、1位〜32位と33位〜64位に分けて、それぞれ固相合成法で合成し、
前記C末端側部分ペプチドは、130位及び200位のMetがLeuに置換されるように発現系により発現させる、上記〔１０〕又は〔１１〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１３〕前記ライゲーション法による連結工程の後、IgG-Fcフラグメントをフォールディングさせる工程をさらに含む、上記〔６〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１４〕前記発現系が大腸菌発現系である、上記〔６〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１５〕上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメント、又は、上記〔６〕から〔１４〕のいずれか１項に記載のIgG-Fcフラグメントの製造方法により製造されたIgG-Fcフラグメントを含むキメラ抗体；
〔１６〕均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントを製造する方法の設計方法であって、前記IgG-Fcフラグメントを、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドと、1つ以上のその他のペプチドとに分けて産生するものとし、前記糖鎖付加ペプチドは、前記糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、該糖鎖付加アミノ酸から数えて1〜30位のいずれかのアミノ酸をN末端とし、該糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸をC末端とし、当該糖鎖付加ペプチドを、均一な糖鎖付加アミノ酸を用いた固相合成法によって合成するものとし、前記その他のペプチドは、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、前記糖鎖付加ペプチドと前記ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、方法；
〔１７〕前記糖鎖付加ペプチドを固相合成する際、N末端のアミノ酸をCys又は下記式(1)に示すThr誘導体に置換して合成するものとする、上記〔１６〕に記載の方法；
【化４】
0005575670.tif 000005
〔１８〕前記その他のペプチドを、当該ペプチドに含まれるCys、Ser、Thr及びAlaからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸のN末端側で2以上の部分ペプチドに分け、各部分ペプチドを、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとし、
前記糖鎖付加ペプチドと前記部分ペプチドをライゲーション法によって連結するものとする、上記〔１６〕又は〔１７〕に記載の方法；及び
〔１９〕前記その他のペプチドを発現系により発現させる場合、該ペプチドを、Metを介して精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該精製タグを該特定の物質に結合させることにより精製するものとし、前記ペプチドと前記精製タグとを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断し、前記ペプチドに含まれるMetをMet以外のアミノ酸に変えて発現させる、上記〔１６〕から〔１８〕のいずれか１項に記載の方法、に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの全長を得られるので、これを用いて、細胞障害活性をはじめとするIgG-Fcフラグメントの糖鎖構造依存性の活性、ひいては抗体活性について精度の高い研究を行うことができる。また、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントを用いてキメラ抗体を作製すれば、医薬品としても使用可能なロット差のない品質の揃った抗体を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明にかかるヒトIgG1-Fcフラグメントの合成ルートを示す概略図である。
【図２】ヒトIgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列と、フラグメントA〜Dを示す。
【図３】フラグメントDを発現させるのに用いたプラスミドベクターpET-16bの構造を示す模式図である。
【図４】フラグメントDの発現ベクターの製造方法を示す概略図である。
【図５】フラグメントDの濃度を求めるためにLysozymeを用いて作成したLysozyme濃度と吸光度の関係を示す検量線である。
【図６】フラグメントCとフラグメントDのライゲーションを行った反応溶液のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。
【図７】フラグメントCとフラグメントDのライゲーションを行った後、SDS-PAGEで分析した結果を示す。Lane1はフラグメントC、Lane2はHisタグ＋フラグメントD(16kDa)、Lane3は反応溶液を示す。Mは分子量マーカーである。
【図８】フラグメントCとフラグメントDのライゲーション後に得られた化合物を確認するために、PNGase F処理を行った後、SDS-PAGEで分析した結果を示す。Lane1はライゲーション生成物、Lane2はPNGaseF、Lane3はフラグメントC、Lane4は反応溶液、Mは分子量マーカーを示す。
【図９】フラグメントA+BとフラグメントC+Dのライゲーション後の反応溶液をSDS-PAGEで分析した結果を示す。Lane1はフラグメントA+B、Lane2はフラグメントC+D、Lane3は反応溶液、Mは分子量マーカーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係るIgG-Fcフラグメントは、IgG免疫グロブリンのCH2及びCH3ドメインからなるペプチドをいう。IgGは、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマなどの任意の哺乳動物に由来するものを含むが、キメラ抗体に使用する場合、ヒトに由来するものが好ましい。また、IgGには、IgG1〜IgG4の4つのサブクラスがある。本発明のIgG-Fcフラグメントはいずれのサブクラスであってもよいが、強い細胞障害活性を有するIgG1が好ましい。
【００２２】
本発明に係るIgG1-Fcフラグメントは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する。また、本発明に係るIgG1-Fcフラグメントは、以下に述べる本発明の効果を奏する限り、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；IgG-Fc改変体も含み、例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するIgG1-Fcフラグメント誘導体も含む。
【００２３】
従って、以下、IgG-Fcフラグメントの配列番号：１におけるX位という場合、配列番号：１を有する天然型IgG-FcフラグメントのX位に加え、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；IgG-Fc改変体、における、配列番号：１のX位に相当する位置のアミノ酸も含まれる。
【００２４】
なお、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するIgG1-Fcフラグメントは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する天然型のIgG1-Fcフラグメントと比較して、65位のGluがCysに置換され、128位のGlnがAspに置換され、130位のMetがLeuに置換され、200位のMetがLeuに置換されている。
【００２５】
本明細書において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体及び誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α-メチルアミノ酸(α-メチルアラニンなど)、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸(2-アミノ-ヒスチジン、β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸(「ホモ」アミノ酸)及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。なお、本明細書ではアミノ酸は、原則として三文字表記を用いて記載している。
【００２６】
本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された」という場合、置換等されるアミノ酸の個数は、IgG-Fcフラグメント活性を保持する限り特に限定されないが、1〜9個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個程度であるかあるいは全体の長さの20%以内、好ましくは10%以内である。置換又は付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸又はアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。
【００２７】
本明細書において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、IgG-Fcフラグメント活性の明らかな低下又は消失を生じない置換をいう。
【００２８】
本明細書において、「IgG-Fc改変体」とは、IgG-Fcフラグメントを天然又は人工的に改変した化合物であり、そのような改変としては、例えば、IgG-Fcフラグメントの1又は複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
【００２９】
本発明に係るIgG-Fcフラグメントは、天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置に糖鎖が付加されている。天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置は、例えば、IgG1-Fcフラグメントの場合、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における69位のAsnである。
なお、本発明に係るIgG-Fcフラグメントは、天然のIgG-Fcフラグメントと同一の位置以外の位置に、さらに1本以上の糖鎖が付加されたものも含む。
【００３０】
本明細書において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖及び／又はその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類及び多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸並びにそれらの複合体及び誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解又は誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
【００３１】
また、本明細書において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸））、アミノ基又はアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基及びカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
本発明において、好ましい糖鎖は、例えば、IgG-Fcフラグメントに付加された場合に細胞障害活性を上昇させる糖鎖である。
【００３３】
本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントが生体に投与されるという観点から、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、生体内で複合糖質（糖ペプチド（又は糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であり、好ましくは、生体内で糖ペプチド（又は糖タンパク質）としてペプチド（又はタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ−結合型糖鎖、Ｏ−結合型糖鎖等である。
【００３４】
本発明で使用する糖鎖は、Ｎ結合型糖鎖である。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
【００３５】
本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、4個以上、例えば5個以上、7個以上、特に9個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。
【００３６】
本発明の好ましい一態様において、糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、5〜11個、9〜11個又は9個の糖からなる糖鎖である。
【００３７】
本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントにおける糖鎖は、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖及びジマンノース糖鎖からなる群より選択される糖鎖であり、より好ましくは、アシアロ糖鎖である。
【００３８】
本発明で使用する好ましい糖鎖としては、例えば、下記一般式
【化５】
0005575670.tif 000006
［式中、R1及びR2は、同一又は異なって、
【化６】
0005575670.tif 000007
を示す。Acはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
【００３９】
本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖(例えば、「FEBS LETTERS Vol.50, No.3, Feb. 1975」に記載の糖鎖)と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類及びそれらの結合様式が同一の糖鎖）又はこれの非還元末端から1又は複数の糖を失った糖鎖である、下記表１〜４に記載の糖鎖を挙げることができる。
【００４０】
【表１】
0005575670.tif 000008
【００４１】
【表２】
0005575670.tif 000009
【００４２】
【表３】
0005575670.tif 000010
【００４３】
【表４】
0005575670.tif 000011
【００４４】
本明細書において「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸をいう。糖鎖とアミノ酸はリンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
糖鎖が結合するアミノ酸の種類は特に限定されないが、上述したIgG-Fcフラグメントのいずれかのアミノ酸であり、好ましくはAsn又はSer、より好ましくはAsnである。
【００４５】
糖鎖とアミノ酸がリンカーを介して結合する場合、リンカーの種類は特に限定されないが、例えば、-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-（式中、aは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは0〜4の整数を示す。）、C1-10ポリメチレン、-CH2-R-（式中、Rは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基及び置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）等を挙げることができる。
【００４６】
なお、本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、どのような製造方法によって製造されたものであってもよく、例えば、糖鎖付加アミノ酸を原料として用いた固相合成法によって製造したものであってもよいし、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接又はリンカーを介して結合させることにより製造したものであってもよい。アミノ酸の結合していない糖鎖は固相合成、液相合成、発現系による発現等によって調製することができる。また、糖鎖を付加したIgG-Fcフラグメントの糖鎖に、さらに糖又は糖鎖を付加することにより糖鎖を伸長させて製造したもの、後述する固相合成法と発現系による発現を組み合わせた方法で製造したもの等、最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加IgG-Fcフラグメントに含まれる。
【００４７】
本発明の好ましい一態様において、IgG-Fcフラグメントに付加される糖鎖の構造は、実質的に均一である。本明細書において、糖鎖の構造が実質的に均一であるとは、糖鎖付加IgG-Fcフラグメント間で比較した場合に、糖鎖付加部位、糖鎖糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、及び糖間の結合様式が同一であることをいい、少なくとも90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは99%以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。糖鎖が均一である糖ペプチドは、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、HPLC、キャピラリー電気泳動、NMR、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開番号WO02/04471、WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照として組み込まれる。
【００４８】
本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、糖鎖付加アミノ酸のN末端側において、該糖鎖付加アミノ酸から1アミノ酸〜30アミノ酸の位置にあるアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換され；(ii)天然型ではSerでないアミノ酸のいずれか1つがSerに置換され；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸のいずれか1つがThrに置換され；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸のいずれか1つがAlaに置換されている。好ましくは、糖鎖付加アミノ酸から1アミノ酸〜20アミノ酸、さらに好ましくは1アミノ酸〜10アミノ酸の位置である。例えば、IgG1-Fcフラグメントの場合、好ましくは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における59位〜68位のアミノ酸の(i)いずれか1つがCysに置換されているか；(ii)いずれか1つがSerに置換されているか；(iii)天然型ではThrでないアミノ酸（61位以外のアミノ酸）のいずれか1つがThrに置換されている；又は、(iv)天然型ではAlaでないアミノ酸（59位以外のアミノ酸）のいずれか1つがAlaに置換されており、最も好ましくは65位のGluがCysに置換されている。
CysをN末端に有するペプチドは、ライゲーション法に好ましく用いられる。本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、後述するように、例えば、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを固相合成し、これを他の部分のペプチドとライゲーションすることによって得ることができる。糖鎖付加ペプチドを合成する際、そのN末端は糖鎖付加アミノ酸のN末端側1アミノ酸〜30アミノ酸の範囲にあることが好ましい。そうすると、糖鎖付加ペプチドのN末端をCysとすれば、ライゲーション後、糖鎖付加アミノ酸のN末端側1アミノ酸〜30アミノ酸の領域にCysへの置換が生じる((i)に対応)。
Cysは、後述するとおり、ライゲーション後にSer又はAlaに変換可能である（(ii)又は(iv)に対応）。一方、糖鎖付加ペプチドのN末端を後述するトレオニン誘導体(1)としてもライゲーション反応を好ましく行うことができ、ライゲーション後、Thrに変換可能である（(iii)に対応）。
後述する本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントの製造方法によれば、このように糖鎖付加アミノ酸のN末端側1アミノ酸〜30アミノ酸の領域にCys、Ser、Ala、Thrによる置換を入れることができるので、天然型と異なる位置にCys、Ser、Ala又はThrを有する変異体も合成することができ、こうして得られる糖鎖付加IgG-Fcフラグメントも本発明に包含される。
【００４９】
また、本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは、少なくとも1つのMetが、Met以外のアミノ酸に置換されている。本明細書において「Met以外のアミノ酸」は特に限定されないが、例えば、中性アミノ酸が好ましく、比較的Metと構造の近いLeu等が好ましく用いられる。例えば、IgG1-Fcフラグメントの場合、配列番号：１に記載のアミノ酸配列における130位及び200位のMetがLeuに置換されていることが好ましい。
【００５０】
本発明の好ましい一態様において、糖鎖付加IgG-Fcフラグメントは所定の立体構造を有する。所定の立体構造とは、例えば、天然のIgG-Fcフラグメントと同様の構造を有することをいう。IgG1-Fcフラグメントの場合は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の33位Cysと93位Cysの間、及び139位のCysと197位のCysの間にジスルフィド結合が形成されている。IgG-Fcフラグメントが、所定の立体構造を有するか否かは、たとえば、ジスルフィドマッピング法、立体構造エピトープに特異的な抗体への結合性の評価、X線解析などにより確認することができる。
【００５１】
（IgG-Fcフラグメントの製造方法）
次に、本発明に係る、実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法について説明する。
（糖鎖付加ペプチドの固相合成）
本発明に係る実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法は、まず、IgG-Fcフラグメントの部分ペプチドであって、アミノ酸残基が3個〜50個の糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドを、実質的に均一な糖鎖付加Asnを使用して固相合成法により合成する工程を含む。
【００５２】
固相合成法は、公知の方法又はそれに準ずる方法に従って行うことができる。例えば、国際公開第WO2004/005330に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【００５３】
具体的には、先ず、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシル基をエステル化反応させる。この場合アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンの水酸基とアミノ酸のカルボキシル基が反応してエステル化が起こる。
次に（２）上記で得られたエステルの脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（５）上記（３）及び（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）次に、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギン（糖鎖付加アスパラギン）のアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させ、
（７）更に上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、
（８）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とアミド化反応させ、
（９）上記（７）及び（８）の工程を１回以上繰り返し、
（１０）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させることにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有し、中間に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドが得られる。
（１１）そして、酸で樹脂（レジン）を切断することにより、糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
【００５４】
更に、上記（６）の脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基と上記遊離アミノ基をアミド化反応させる工程を、適宜追加することにより少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。またこの時、異なる糖鎖アスパラギンを用いることにより２種以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することもできる。
【００５５】
また、この糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の端部に導入することもできる。
【００５６】
水酸基を有する樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する水酸基を有する樹脂（レジン）であればよく、例えば、Ａｍｉｎｏ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ−ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。固相合成の後にチオエステル化するという観点からは、ＨＭＰＢ−ＰＥＧＡレジンが好ましい。
【００５７】
アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
【００５８】
脂溶性保護基としては、例えば９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系又はアミド系の保護基等を挙げることができる。脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９−フルオレニルメチル−Ｎ−スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１〜５時間程度行うのが良い。
【００５９】
脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、上記のアミノ酸を上記の方法で製造することができる。また、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−ＡＩａ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏを挙げることができる。
【００６０】
エステル化触媒として、例えば１−メシチレンスルホニル−３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１〜１０重量部、好ましくは２〜５重量部である。
【００６１】
エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２−プロパノール、塩化メチレン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。エステル化反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０分〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。
【００６２】
この時固相上の未反応の水酸基を無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
【００６３】
脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
【００６４】
遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシル基とのアミド化反応は、活性化剤及び溶媒の存在下行うのが好ましい。
【００６５】
活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ−ＯＨ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロジ−４−オキサ−１，２，３−ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
【００６６】
活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１〜２０当量、好ましくは１〜１０当量、さらに好ましくは、１〜５当量とするのが好ましい。
【００６７】
溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、塩化メチレン等を挙げることができる。反応は０〜５０℃、好ましくは室温で、約１０〜３０時間程度、好ましくは１５分〜２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
【００６８】
樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
【００６９】
上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、適宜追加することにより、少なくとも２以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖の任意の位置に有する糖ペプチドを製造することができる。
【００７０】
また上記（６）の、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基とアミド化反応させ、（７）の、上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる工程を、最終工程で行うことにより、少なくとも１以上の糖鎖アスパラギンをペプチド鎖に有する糖ペプチドを製造することができる。
【００７１】
また上記（６）の工程に代えて、あるいは（６）の工程に加えて、（１）水酸基を有する樹脂（レジン）の水酸基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖アスパラギンのアスパラギン部分のカルボキシル基をエステル化反応させることにより、端部に糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドを製造することができる。
【００７２】
このようにして、IgG-Fcフラグメントのうち、糖鎖付加ペプチドを得ることができる。
なお、上述のとおり、上記固相合成に用いられる実質的に均一な糖鎖付加Asnは、例えば、国際公開番号WO02/04471、WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【００７３】
上記糖鎖付加ペプチドは、そのN末端アミノ酸をCysとしておくことが好ましい。N末端をこのアミノ酸としておくことにより、後述するNCL法等のライゲーション法に好ましく適用することができる。なお、Cys残基は、ライゲーション後にAla又はSerに変換することができる。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端を配列番号：１に記載のアミノ酸配列の39位又は59位とすれば、ライゲーション後にCys残基をAla又はSerに変換することにより、天然型と同じアミノ酸配列とすることができる。Cys残基をAla又はSerに変換する方法については後述する。
【００７４】
また、糖鎖付加ペプチドは、そのN末端アミノ酸を下記式(1)で表わされるトレオニン誘導体（以下、「トレオニン誘導体(1)」という。）としてもよい。N末端にトレオニン誘導体(1)を有する糖鎖付加ペプチドもライゲーション法に好ましく適用することができる。なお、トレオニン誘導体(1)は、ライゲーション後にThrに変換することができる。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端を、例えば配列番号：１に記載のアミノ酸配列の61位とすれば、ライゲーション後にトレオニン誘導体(1)をThrに変換することにより、天然型と同じアミノ酸配列とすることができる。トレオニン誘導体(1)をThrに変換する方法については後述する。
【化７】
0005575670.tif 000012
【００７５】
また、糖鎖付加ペプチドは、固相合成法により合成することから、５０アミノ酸以下であることが好ましく、４０アミノ酸以下であることがさらに好ましい。また、糖鎖付加ペプチドは、３アミノ酸以上であることが好ましく、６アミノ酸以上であることがさらに好ましい。
また、固相合成法で合成する際、糖鎖付加アミノ酸を結合させた後は、あまり多くのアミノ酸を結合させることが望ましくないことから、糖鎖付加ペプチドのN末端は、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で３０アミノ酸〜１アミノ酸以内の位置であることが好ましい。より好ましくは２０アミノ酸〜１アミノ酸以内、さらに好ましくは１０アミノ酸〜１アミノ酸以内の位置である。
【００７６】
また、上記糖鎖付加ペプチドのC末端は、当該糖鎖付加ペプチドのC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸とすることが好ましい。これにより、糖鎖付加ペプチドのC末端側部分ペプチドは、N末端にCys、Ser、Thr又はAlaを有することになる。C末端側部分ペプチドは、そのN末端がCysであれば、そのままライゲーションに供することができ、ライゲーション後のアミノ酸配列は天然型と同一となる。C末端側部分ペプチドのN末端がSer又はAlaの場合は、C末端側部分ペプチドを製造する際、そのN末端をCysとし、ライゲーション後、CysをSer又はAlaに変換することによって、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。C末端側部分ペプチドのN末端がThrの場合は、C末端側部分ペプチドを製造する際、そのN末端をトレオニン誘導体(1)とし、ライゲーション後にトレオニン誘導体(1)をThrに変換することによって、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
【００７７】
また、本発明に係るIgG-Fcフラグメントの製造方法は、IgG-Fcフラグメントにおける上述した糖鎖付加ペプチドよりN末端側の部分ペプチド（N末端側部分ペプチド）、及び、糖鎖付加ペプチドよりC末端側の部分ペプチド（C末端側部分ペプチド）の、少なくとも一方を発現系により発現させ、残りを固相合成法により合成する工程を含む。
発現系により発現させる方法は、その効率的な発現システムを構築することができれば固相合成法よりも安価に効率よくポリペプチドを産生させることができるので、糖鎖を含まない比較的長い部分ペプチドの産生に特に好適に用いられる。一方、固相合成は、正確なアミノ酸配列を有するポリペプチドを産生することができ、また翻訳後修飾によって、余分な糖鎖が付加されたりするのを防ぐことができる。当業者は、N末端側部分ペプチド及びC末端側部分ペプチドを、それぞれの長さや特徴に従って、発現系により発現させるべきか、固相合成法により合成すべきか、適宜判断することができる。
【００７８】
なお、N末端側部分ペプチド及びC末端側部分ペプチドは、その長さによってはさらに分割し、それぞれを発現系により発現させるか、固相合成法によって合成した後、ライゲーション法に供してもよい。さらに分割する際、そのN末端がCys、Ser、Thr又はAlaとなるように設計して分割することにより、続くライゲーション法に好ましく適用することができる。Cys残基は、ライゲーション後にSer又はAlaに変換することが可能である。従って、Ser又はAlaも部分ペプチドのN末端アミノ酸として採用することができる。
【００７９】
なお、Cys残基をSerに変換する方法は、例えば、国際公開第WO2009/17154号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。より具体的には、例えば、  (a)Cys残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、Ser残基に変換する工程、を含む方法が挙げられる。
また、Cys残基をAlaに変換する方法は、例えばWan et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 45, 9248-9252に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
【００８０】
また、N末端がトレオニン誘導体(1)であるペプチドも、ライゲーションに好適に適用することができる。
このトレオニン誘導体(1)は、ライゲーション後にThrに変換することが可能である。従って、Thrも部分ペプチドのN末端アミノ酸として採用することができる。Thr誘導体をThrに変換する方法は、例えば、国際公開第WO2009/17154号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。より具体的には、例えば、
(a)ペプチド中のトレオニン誘導体(1)残基の-SH基とメチル化剤とを反応させることにより、前記-SH基を-SMe基に変換する工程；
(b)工程(a)で得られた-SMe基とシアン化剤とを反応させることにより、反応中間体を生成する工程；及び
(c)工程(b)と比較してより塩基性条件下、工程(b)で得られた反応中間体を、トレオニン残基を含むペプチドに変換する工程、を含む方法が挙げられる。
【００８１】
（発現系による発現）
本明細書における発現系は、細菌等の微生物や動植物の細胞を宿主細胞として用いる発現系である。発現系によるポリペプチド鎖の調製方法は当業者によく知られているが、典型的には、発現させる部分ペプチドをコードする核酸分子を調製する工程、調製した核酸分子を発現系の宿主細胞に導入する工程、導入により得た形質転換体を培養して増殖させ、所望の部分ペプチドを発現させる工程、および必要に応じて産生されたポリペプチド鎖を精製する工程を含む。
【００８２】
発現させるポリペプチド鎖をコードする核酸分子の調製方法は、当該技術分野で既知の任意の手法を用いることができる。例えば、目的のポリペプチド鎖を発現する細胞のmRNAなどからRT-PCRなどによりcDNAを作製し、これを鋳型に適切なプライマーでPCRなどの核酸増幅法を行う方法が挙げられる。得られた核酸分子は、種々のベクターにクローニングして保存することができる。所定の宿主に適合する具体的なベクターは当業者によく知られており、その多くは市販されている。
【００８３】
なお、本発明においては、発現したポリペプチドの回収を容易にするために、特定の物質と結合性を有するポリペプチドからなる精製タグを、目的ポリペプチドとの融合タンパク質として発現させる。精製タグは、その機能を果たす限り特に限定されないが、例えば、Hisタグ、GSTタグ、Sタグ、T7タグなどを挙げることができ、さらに、本発明では、これらのタグの目的ポリペプチドと結合する末端にMetが含まれるようにする。そのため、目的タンパク質をコードする核酸分子に、Met及び精製タグをコードする核酸分子を連結して、ベクターにクローニングする。
【００８４】
発現された精製タグと目的ポリペプチドとの融合タンパク質は、精製タグを上記特定の物質に結合させることで精製することができる。ここで、精製タグがMetを介して目的ポリペプチドに結合していれば、例えば、CNBrでMetを分解することにより、精製タグと目的ポリペプチドを切断することが可能である。
【００８５】
この切断工程を行う場合、強酸とアセトニトリル等の水混和性溶剤を添加することが好ましく、これにより目的ポリペプチドの産生率を向上させることが可能である。なお、精製タグを切り離す際、目的ポリペプチドに含まれるMetも分解されるので、発現系により発現させるポリペプチドに含まれるMetは、あらかじめ他のアミノ酸（例えばLeu等が挙げられるがこれに限定されない。）に置換されるように、目的タンパク質をコードする核酸分子を設計することが好ましい。
【００８６】
調製した核酸分子を発現系の微生物や宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野で既知の任意の手法を用いることができ、例えば、該遺伝子をウイルスベクターに組み込み、該ベクターを間葉系細胞に感染させて導入する方法や、リン酸カルシウムトランスフェクション法、DEAE-デキストラントランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔（エレクトロポレーション）、リポソーム融合、ポリブレンによるトランスフェクションおよび細胞膜のレーザー微穿孔による遺伝子の直接的な送達を包含する、周知の多数の技法が挙げられる。当業者はまた、前記遺伝子を細胞のゲノムに組み込み、当該遺伝子の発現を可能にするように細胞内に適切に導入することのできる上記以外のいかなる技術をも本発明に用いることができる。
発現系による調製には任意の微生物や、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の細胞を用いることができるが、産生効率や取扱いの容易性から細菌、特に大腸菌が好ましい。本発明の製造方法の一態様においては、同一構造の糖鎖を合成的に結合させるため、ポリペプチド鎖に糖鎖が付加されない発現系、例えば、細菌発現系が好ましい。
【００８７】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆かすおよび大豆かす加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
【００８８】
大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主とする形質転換体の培養は、通常振とう培養または深部通気撹拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常16時間〜7日間である。培養中のpHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。たとえば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、インドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００８９】
培養している形質転換体は、自然にまたは誘導によりポリペプチドを発現し、培養物中に生成蓄積することができる。ポリペプチドの発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞該に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
【００９０】
ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたポリペプチドは、例えばポリペプチドが、細胞内に溶解した状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セファロース、ダイヤイオン（登録商標）HPA等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、セファロースFF等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独であるいは組み合わせて用い、ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【００９１】
目的のポリペプチドを含む上記無細胞抽出液は、上記精製工程の前または後、好ましくは精製工程後に、生物由来物を不活性化または除去する工程に供することができる。かかる工程は、限定することなく、熱処理、ろ過、有機溶剤処理、カラム等を用いた精製、ソラレン誘導体等を用いた光処理、オゾン処理など、当業者に既知の任意の手法を含む。熱処理は、例えば、フィブリノゲン、アルブミン製剤等の処理に用いられている、60〜65℃、10〜144時間の温度・時間条件で行うことができる。
【００９２】
ポリペプチドが、細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【００９３】
ポリペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいはその誘導体を回収することができる。すなわち、該培養物を遠心分離等の方法により処理することによって可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
【００９４】
上述の通り、本発明の方法では、目的ポリペプチドと精製タグがMetを介して融合して発現される。この融合タンパク質を、精製タグが親和性を有する物質に結合させることで精製した後、強酸と水混和性溶剤の存在下で、CNBr等で処理することによって、Metが分解され、目的ポリペプチドを精製タグから切り離す。
【００９５】
本明細書において、強酸とは、ギ酸、酢酸などの弱酸を含まない酸をいう。ギ酸はポリペプチド鎖をホルミル化し、酢酸はポリペプチド鎖をアセチル化する場合があり、目的タンパク質の産生率を低下させ得る。本発明において、強酸は、このようなホルミル化を生じない限り、一般に強酸と称される酸よりも弱い酸も含む。好ましい強酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸（TFA）、フッ化水素、メタンスルホン酸を挙げることができるがこれらに限定されない。
強酸は、0.1％〜50％の濃度で加えることが好ましく、より好ましくは1％〜20％、さらに好ましくは1％〜5％である。
【００９６】
また本発明において水混和性溶剤は、水混和性を有する溶剤である限り特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、トリフルオロエタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（DMSO）、塩化メチレン等を挙げることができ、中でも、アセトニトリル、トリフルオロエタノール、ジメチルホルムアミドが好ましい。
溶剤は、1％〜70％の濃度で加えることが好ましく、より好ましくは20％〜60％、さらに好ましくは、35％〜50％である。
このように、強酸と水混和性溶剤の存在下で切断することにより、目的ポリペプチドのホルミル化等を生じさせることなく、目的ポリペプチドの産生率を上昇させることが可能である。
【００９７】
本発明に係る製造方法において、IgG-Fcフラグメントから、糖鎖付加ペプチド及び発現系により発現させる部分ペプチドを除いた部分は、適宜固相合成法によって正確に合成することができる。固相合成は、糖鎖付加アミノ酸を使用することを除き、上述した糖鎖ペプチドの固相合成法による合成に従って行うことができる。
【００９８】
（ライゲーション法による連結工程）
次に、本発明に係るIgG-Fcフラグメントの製造方法では、糖鎖付加ペプチドと、発現系により発現させた部分ペプチドと、固相合成法により合成した部分ペプチドと、をライゲーション法により連結する。
なお、本明細書における「ライゲーション法」としては、例えば、天然型化学的ライゲーション法(Native Chemical Ligation、NCL法)や、Kinetically Controlled Ligation法（KCL法）が挙げられる。NCL法は、例えば国際公開WO96/34878号パンフレットに記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、KCL法は、Kentが報告したもので、反応速度論的制御をしたNCL法である（Kent et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3985-3988）。
【００９９】
ライゲーション法を用いた連結は、ペプチド-ペプチド間、ペプチド-糖ペプチド間、糖ペプチド-糖ペプチド間の、いずれにおいても行うことができる。
ライゲーション法に用いる、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)は、国際公開WO96/34878号パンフレットに記載のように、当業者に公知の手法を用いて製造することができる。
【０１００】
例えば、後述の実施例に記載のように、固相合成法によって、アミノ酸側鎖とN末端のアミノ基が保護された保護ペプチド(又は糖ペプチド)を得て、このC末端側のカルボキシル基を、液相中において縮合剤にPyBOP(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate)/DIPEAを用いてベンジルチオールと縮合させ、その後、95%TFA溶液を用いてアミノ酸の鎖を脱保護することで、C末端にα-カルボキシチオエステル部分を有するようにしたペプチド(又は糖ペプチド)を得ることができる。
【０１０１】
ライゲーション法は、国際公開WO96/34878号パンフレットに記載のような当業者に公知の手法を用いて、また、後述の実施例の記載を参照して実施することができる。例えば、C末端に-C(=O)-SRにより表されるα-カルボキシチオエステル部分を有するようにした第1のペプチドと、N末端に-SH基を有するアミノ酸残基を有する第2のペプチドとを国際公開WO96/34878号パンフレットを参照して用意する。なお、第1のペプチドにおいて、Rはチオール交換反応を阻害せず、カルボニル炭素への求核置換反応において脱離基となる基であれば特に限定されないが、好ましくはベンジルメルカプタン等のベンジル型、チオフェノール、4-(カルボキシメチル)-チオフェノール等のアリール型、2-メルカプトエタンスルホン酸塩、3-メルカプトプロピオン酸アミド等のアルキル型等から選択することができる。また、第2のペプチドのN末端の-SH基は、所望により保護基により保護されていてもよいが、この保護基は以下のライゲーション反応までの所望の時点で脱保護し、N末端に-SH基を有する第2のペプチドが、第1のペプチドと反応する。例えばジスルフィド基等、ライゲーションが起こる条件において自然に脱保護される保護基であれば、保護基により保護した第2のペプチドをそのまま以下のライゲーション反応に用いることもできる。ジスルフィド基は、その後のライゲーション法の反応条件下で容易に脱保護される。
【０１０２】
これらの2つのペプチドを、必要に応じ、4-メルカプトフェニル酢酸、ベンジルメルカプタン、チオフェノール等の触媒チオールの存在下、100mMリン酸緩衝溶液等の溶液中で混合する。好ましくは、第1のペプチド1当量に対し第2のペプチドを0.5〜2当量及び触媒チオールを5当量程度の割合で反応を行う。反応はpH6.5〜7.5程度、20〜40℃程度の条件下、約1〜30時間程度行うのが望ましい。反応の進行は、HPLC、MS等を組み合わせた公知の手法を用いて確認することができる。
【０１０３】
これに、トリス2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩(TCEP)のような還元剤を加えて副反応を抑制し、所望により精製することで、第1のペプチドと第2のペプチドとを連結することができる。
【０１０４】
なお、C末端にカルボキシチオエステル部分(-C=O-SR)を有するようにしたペプチドにおいて、R基の異なるペプチドが存在する場合、ライゲーション反応の順序を操作することが可能であり(Protein Science (2007), 16:2056-2064等参照)、複数回のライゲーションを行う場合にはこれを考慮することができる。例えば、Rとしてアリール基、ベンジル基及びアルキル基が存在する場合には、一般に、この順に、連結反応が進行するため、C末端に-C=O-SR(式中、Rは、アリール基である)を有するペプチドaと、C末端に-C=O-SR(式中、Rは、ベンジル基である)を有しN末端にSH基を有するペプチドbとの間でライゲーション反応を行う場合には、ペプチドaのC末端とペプチドbのN末端との間でまずライゲーションが起こり、得られたC末端に-C=O-SR(式中、Rは、ベンジル基である)を有するペプチドa+bを、更にN末端にSH基を有する別のペプチドcとのライゲーション反応に用いることができる。
【０１０５】
（フォールディング工程）
ライゲーション法によって、IgG-Fcフラグメントの全長を連結した後、フォールディング工程を行うことによって、IgG-Fcフラグメントが適切な高次構造をとるように処理することができる。
フォールディング工程は、種々の公知の方法を用いることができるが、たとえば、フォールディングバッファー中での透析によって行うことができる。フォールディングバッファーは、たとえば、グアニジン等のグアニジノ基を有する化合物又はその塩を含み、pHは6.0〜9.0であってもよい。透析は、複数回行ってもよく、その場合各透析処理のバッファーの組成やpHは同一であっても異なっていてもよい。
ポリペプチドがフォールディングしたことは、ポリペプチドの立体構造を解析する任意の方法で確認することができ、例えば、ジスルフィドマッピング法、立体構造エピトープに特異的な抗体への結合性の評価、X線解析などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０６】
（IgG1-Fcフラグメントの場合）
本発明は又、IgG1-Fcフラグメントの製造方法を提供する。ここで、IgG1-Fcフラグメントは、上述のとおり配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるIgG1-Fcフラグメントのほか、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたペプチド；配列番号：１に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたペプチド；IgG-Fc改変体も含む。
【０１０７】
IgG1-Fcフラグメントを製造する場合、糖鎖付加ペプチドのN末端は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の39位〜68位とすることが好ましく、より好ましくは49位〜68位であり、さらに好ましくは59位〜68位であり、例えば65位とすることができる。また、C末端は、C末端側の最も近い93位Cysの手前まで、即ち92位Lysまでとすることが好ましい。この長さであれば、固相合成で問題なく合成することが可能であり、固相合成において69位の糖鎖アスパラギンを結合させた後は4つのアミノ酸を結合させるのみなので、糖鎖への影響も少ない。
【０１０８】
糖鎖付加ペプチドのN末端を65位とする場合、65位のGluをCysに置換して合成すれば、糖鎖付加ペプチドをライゲーション法に好適に供することができる。
また、糖鎖付加ペプチドのN末端は、例えば、39位のSer、59位のAla、61位のThrとすることもできる。N末端が39位又は59位の場合、当該N末端をCysに置換して合成し、ライゲーション後にこれをSer又はAlaに変換することによって、天然型と同じアミノ酸配列を得ることができる。N末端が61位の場合は、当該N末端をトレオニン誘導体(1)に置換して合成し、ライゲーション後にこれをThrに変換することによって、天然型と同じアミノ酸配列を得ることができる。
【０１０９】
なお、糖鎖付加ペプチドのC末端は、最も近いSer、Ala又はThrの手前としてもよい。これにより、C末端側部分ペプチドのN末端をCys又は上述のトレオニン誘導体(1)とし、ライゲーション後にそれぞれSer、Ala又はThrに変換することによって、天然型と同じアミノ酸配列を得ることができる。
【０１１０】
糖鎖付加ペプチドを65位〜92位とする場合、N末端側部分ペプチドは、1位〜64位、C末端側部分ペプチドは93位〜216位となる。それぞれ固相合成法による合成、又は、発現系による発現によって得ることができるが、より小さい部分ペプチドに分けてそれぞれ製造し、ライゲーション法によって連結してもよい。より小さい部分ペプチドに分ける場合、Cys、Ser、Ala又はThrのN末端側で分けることが好ましい。これにより、部分ペプチドのN末端をCys、Ser、Ala又はThrとすることができるので、N末端をライゲーション法に適したCys又はトレオニン誘導体(1)として部分ペプチドを合成し、Cysの場合はそのまま、Ser、Ala又はThrの場合は変換して、結合部位を天然型と同一のアミノ酸配列にすることができる。
【０１１１】
中でも、変換の必要性がないことからCysが好ましい。例えば、N末端側部分ペプチドを32位Thrと33位Cysの間でさらに分割し、それぞれを固相合成法により合成してもよい。このように分割すれば、33位〜64位の部分ペプチドもN末端がCysとなるので、ライゲーション法に供しやすく、ライゲーション部位においても天然型のIgG1-Fcフラグメントと同一のアミノ酸配列とすることができる。同様に、C末端側部分ペプチドも、138位Thrと139位Cysの間、及び／又は196位Serと197位Cysの間で分割し、それぞれ固相合成法により合成してもよい。これにより、各ペプチドのN末端をCysとすることができる。
【０１１２】
また、C末端側部分ペプチドは、発現系により全長を発現させてもよい。この方法によれば、比較的長いC末端側部分ペプチドを大量かつ安価に効率よく産生することが可能である。この場合、C末端側部分ペプチドに含まれる130位及び200位のMetは、精製タグ切断の際に分解されないよう、Leu等に置換して発現されるように設計することが好ましい。
【０１１３】
（キメラ抗体）
本発明に係るキメラ抗体は、ヒトIgG-Fcフラグメントを含むキメラ抗体である。キメラ抗体においては、抗原に対して特異的に結合する限り、できるだけヒト型抗体部分が多いほうが好ましい。
本発明のキメラ抗体は、例えば、IgG-Fc以外のポリペプチド部分をインテイン法を用いてチオエステルとして発現させることにより、本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメント、及び本発明に係る実質的に均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントの製造方法により製造された糖鎖付加IgG-Fcフラグメントと、ライゲーション法により連結することにより得ることができる。特に、IgG-Fcフラグメントは、そのN末端がCysであるので、ライゲーション法に好ましく供することができる。
本発明に係るキメラ抗体は、アミノ酸配列、糖鎖構造、糖鎖付加位置及び高次構造が均一でロット差がなく、医薬品やリサーチツールとして有用である。
【０１１４】
（IgG-Fcフラグメントを製造する方法の設計方法）
本発明は、均一な糖鎖が付加されたIgG-Fcフラグメントを製造する方法を設計する方法も提供する。
当該設計方法は、IgG-Fcフラグメントを、糖鎖付加アミノ酸を含む糖鎖付加ペプチドと、1つ以上のその他のペプチドとに分けて作製するものとし、糖鎖付加ペプチドは、前記糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、糖鎖付加アミノ酸から数えて1〜30位のいずれかのアミノ酸をN末端とし、該糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCys、Ser、Thr又はAlaのN末端側に隣接するアミノ酸をC末端とし、糖鎖付加ペプチドを、均一な糖鎖付加アミノ酸を用いた固相合成法によって合成するものとする。
【０１１５】
糖鎖付加ペプチドを、糖鎖付加アミノ酸を含む比較的短い糖鎖付加ペプチドとして合成することによって、固相合成法により好適に合成することが可能となる。ここで、固相合成の場合、ペプチドはC末端からN末端の方向に合成されていく。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端を、糖鎖付加アミノ酸のN末端側で、糖鎖付加アミノ酸から数えて1〜30位、好ましくは1〜20位、より好ましくは1〜10位の範囲とすることにより、糖鎖付加アミノ酸を結合させた後に結合させるアミノ酸数を限定することができ、合成による糖鎖への影響を抑えることができる。糖鎖付加ペプチドのN末端は、糖鎖付加アミノ酸のN末端側5アミノ酸〜1アミノ酸の範囲内とすることが、さらに好ましい。
【０１１６】
糖鎖付加アミノ酸のN末端側1〜30アミノ酸の範囲内にCysが存在する場合は、CysをN末端とすることで、合成した糖鎖付加ペプチドをそのままライゲーションに供することができ、ライゲーション後も天然型と同一のアミノ酸配列となる。IgG1-Fcのように糖鎖付加アミノ酸のN末端側1〜30アミノ酸の範囲内にCysが存在しない場合には、糖鎖付加ペプチドを合成する際にN末端とするアミノ酸をCysに置換して合成すればよい。
また、Cysは、ライゲーション後にAla又はSerに変換することができる。従って、糖鎖付加ペプチドのN末端に配列番号：１に記載のアミノ酸配列における39位や、59位を採用すれば、糖鎖付加ペプチドのN末端をCysに置換して合成し、ライゲーションした後でSer又はAlaに変換することにより、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
また、糖鎖付加ペプチドのN末端をトレオニン誘導体(1)に置換しておけば、ライゲーション後にThrに変換できるので、糖鎖付加ペプチドのN末端は配列番号：１に記載のアミノ酸配列における61位とすることも好ましい。
【０１１７】
また、糖鎖付加ペプチドのC末端は、糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いCysのN末端側に隣接するアミノ酸とすることが好ましい。こうすることにより、糖鎖付加ペプチドのC末端側部分ペプチドのN末端をCysとすることができるので、続くライゲーション工程に供しやすく、ライゲーション部位において天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
【０１１８】
また、糖鎖付加ペプチドのC末端は、糖鎖付加アミノ酸のC末端側の最も近いSer、Ala又はThrのN末端側に隣接するアミノ酸としてもよい。この場合、C末端側部分ペプチドのN末端をCys又はトレオニン誘導体(1)として合成し、ライゲーション後に、Sel、Ala又はThrに変換することにより、天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
【０１１９】
また、本発明に係る設計方法では、糖鎖付加ペプチド以外のペプチドは、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するものとする。
当業者は、そのペプチドの長さや特徴により、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するか適宜決定することができる。また、ポリペプチドが長い場合は、そのポリペプチドに含まれるCys、Ser、Ala又はThrのN末端側で2以上の部分ペプチドに分割し、各部分ペプチドを、発現系により発現させるか、固相合成法により合成するか決定してもよい。これにより、各部分ペプチドをライゲーション法によって連結しやすくなり、且つ、ライゲーション後のアミノ酸配列を天然型と同一のアミノ酸配列を得ることができる。
【０１２０】
本発明に係る設計方法では、その他のペプチドを発現系により発現させる場合、該ペプチドを、特定の物質に親和性を有しMetを含む精製タグとの融合タンパク質として発現させ、該精製タグを該特定の物質に結合させることにより精製するものとし、該ペプチドと精製タグとを、強酸と水混和性溶剤の存在下でMetを分解することにより切断する。
強酸と水混和性溶剤とを添加することによって、目的ペプチドのホルミル化等を生じることなく、目的ポリペプチドの産生率を向上させることが可能である。
この際、目的ペプチドに含まれるMetをMet以外のアミノ酸に変えて発現させる。これにより精製タグを切り離すときに目的ペプチドが分解されるのを防ぐことができる。
【０１２１】
なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【０１２２】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【０１２３】
本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、 例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
【０１２４】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【０１２５】
本発明に係る糖鎖付加IgG-Fcフラグメントとして、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるヒトIgG1-Fcフラグメントを合成した。このヒトIgG1-Fcフラグメントは、ペプチド鎖において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の65位のGluがCysに、130位及び200位のMetがLeuに置換されている。また、128位のGlnがAspに置換されている。【０１２６】
合成の概要を図１に、IgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列を図２に示す。配列番号：２における1位Cysから32位のThrをフラグメントA、33位Cysから64位ArgをフラグメントB、65位Cysから92位LysをフラグメントC、93位Cysから216位SerをフラグメントDとした。フラグメントA及びBがN末端側部分ペプチド、フラグメントCが糖鎖付加ペプチド、フラグメントDがC末端側部分ペプチドに該当する。フラグメントA〜Cは化学的に合成し、フラグメントDは大腸菌発現法により調製した。【０１２７】
次いで、フラグメントAとBをKCL法によって連結してフラグメントA+Bとし、フラグメントCとDをNCL法により連結してフラグメントC+Dとした後、両者をNCL法によって連結した。
また、糖鎖は、フラグメントCの固相合成の際、以下に示すアシアロ糖鎖結合Asnを用いることによって、配列番号：２の69位Asnに結合させた。
【化８】
0005575670.tif 000013
【０１２８】
以下に、実験の手順を詳細に説明する。
なお、RP-HPLC分析装置はWaters社製のものを、UV検出器はWaters製のWaters486と photodiode array detector (Waters 2996) を、カラムはCadenza column (Imtakt Corp., 3 μm, 75 × 4.6 mm), Vydac C-18 (5μm, 4.6 × 250 mm, 10 × 250 mm) およびSuperdex 75TM 10/300 GL を使用した。ESI mass測定器はBruker Daltonics社製のEsquire3000 plusを用いた。【０１２９】
<Fmoc法による固相合成法を用いたペプチドチオエステル体の合成>
1-1.フラグメントA保護ペプチド1の合成
ペプチドの伸張は一般的なFmoc法による固相合成法を用いた。まず、固相合成用チューブにAmino PEGA resin (2g, 100μmol) を入れ、DCM(Dichloromethane)、DMF(N,N-Dimethylformamide)で十分に洗浄した後、DMFでよく膨潤して用いた。HMPB(4-(4-Hydroxymethyl-3-metoxyphenoxy-butyric acid) 2.5等量 (60.0mg, 0.25mmol）、TBTU 2.5等量 (80.2mg, 0.25mmol) 、N-Ethylmorpholine (31.6μl, 0.25mmol）をDMF (2ml) に溶解させ、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で2時間撹拌した。樹脂をDMF、DCMで十分に洗浄し、HMPB-PEGA resinを得た。【０１３０】
この樹脂を固相合成に用いた。固相への最初のアミノ酸の導入は以下の通りである。
Fmoc-Thr(But)-OH 5等量 (198.8mg, 0.5mmol) 、MSNT 5等量 (148mg, 0.5mmol) 、N-methylimidazole 3.75等量 (29.8μl, 0.38mmol) をDCM (2ml, 250mM) に溶解させ、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で2時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCMとDMFを用いて洗浄した。Fmoc基を20分20％ piperidine/DMF溶液 (1ml) を用いて脱保護した。DMFで洗浄後、Kaiser Testにより反応を確認し、次のアミノ酸と縮合させた。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。
Fmoc-Val-COOH 5等量 (169.7mg, 0.5mmol) 、HOBt(N-Hydroxybenzotriazole)・H2O 5等量 (67.6mg, 0.5mmol)、DIPCDI 5等量 (77μl, 0.5mmol) をDMF溶媒250mM (2ml) に混ぜて15分間活性化させた後、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で１時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。【０１３１】
このようにして、32残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Arg(Pbf) (324.4mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Ile (176.7mg, 0.5mmol) , Met (185.8mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Phe (193.7mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Phe (193.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Ala (155.7mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Boc-L-thiazolidine-4-carboxylic acid (116.6mg, 0.5mmol)【０１３２】
次に、縮合が終了したペプチド50μmol分の樹脂をDMF、DCMでよく洗浄し、この樹脂にAcOH：TFE＝1：1の溶液7mlを加えて24時間撹拌し、樹脂から保護ペプチドを切り出した。ヘキサンを入れたナスフラスコを用意し、そこに保護ペプチドが溶解している液を滴下し、樹脂をMeOHで洗った。これを室温で減圧濃縮し、酢酸とベンゼンで共沸した。HPLCで精製することで目的物である側鎖の保護されたペプチド1を得た。【０１３３】
1-2.フラグメントAペプチドチオエステル体3の合成
保護ペプチド1 (50μmol) とMS4A (10mg) 、チオフェノール (153μl, 1.5mmol) をDMF溶媒中 (6.75ml) Ar気流下-20℃で1時間半攪拌した後、PyBOP (130mg, 0.25mmol) 、DIPEA (42.5μl, 0.25mmol) を加え3時間攪拌した。その後、氷上にて反応溶液にジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物を回収し、DTTを含んだ95％TFA水溶液を加えて室温で2時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、HPLCで精製することで目的物であるペプチドチオエステル体3を得た。
HPLC分析：Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液  B：0.1%TFA  アセトニトリル：水＝90：10  グラジエントA：B=95：5→25：75  15分  流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 10 × 250 mm) グラジエントA：B=70：30→30：70 30分  流速4.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C165H257N37O43S3 : [M+2H]2+ 1772.6 , [M+3H]3+ 1182.1 , [M+4H]4+ 886.8 , found 1772.5 , 1182.0 , 886.8
上述したフラグメントA保護ペプチド1〜フラグメントAペプチドチオエステル体3の合成スキームを以下に示す。
【化９】
0005575670.tif 000014
【０１３４】
2-1.フラグメントB保護ペプチド4の合成
フラグメントAと同様に、樹脂はHMPB-PEGA resin (0.1mmol) を用い、アミノ酸の縮合はFmoc法を用いて行った。Fmoc-Arg(Pbf)-OH (324.4mg, 0.5mmol)、MSNT(1-(Mesitylene-2-sulfonyl)-3-nitro-1H1,2,4-triazole) 5等量 (148mg, 0.5mmol) 、N-methylimidazole 3.75等量 (29.8μl, 0.38mmol) をDCM (2ml, 250mM) に溶解させ、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で2時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCMとDMFを用いて洗浄した。Fmoc基を20分20％ piperidine/DMF溶液 (1ml) を用いて脱保護した。DMFで洗浄後、Kaiser Testにより反応を確認し、次のアミノ酸と縮合させた。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１３５】
Fmoc-Pro-COOH 5等量 (168.7mg, 0.5mmol) 、HOBt・H2O 5等量 (67.6mg, 0.5mmol)、DIPCDI 5等量 (77μl, 0.5mmol) をDMF溶媒250mM (2ml) に混ぜて15分間活性化させた後、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で1時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。
このようにして、32残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Ala (155.7mg, 0.5mmol) , Asn(Trt) (298.4mg, 0.5mmol) , His(Trt) (309.9mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Gln (184.2mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Tyr (229.8mg, 0.5mmol) , Trp(Boc) (263.3mg, 0.5mmol) , Asn (177.2mg, 0.5mmol) , Phe (193.7mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Gln (184.2mg, 0.5mmol) , Pro (168.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , His(Trt) (309.9mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Cys(Trt) (292.9mg, 0.5mmol)【０１３６】
ここで、32残基目CysのFmoc基を脱保護した後、樹脂に対して10等量 (1mmol) のDi-tert-butyl dicarbonateをDMF溶媒5mlに混ぜ2時間撹拌し、Cysのアミノ基をBoc保護した。なお、Fmocの脱保護後Kaiser Test(+)により遊離のアミノ基を確認し、Boc化はKaiser Test(-)により反応終了とした。【０１３７】
次に、縮合が終了したペプチド50μmol分の樹脂をDMF、DCMでよく洗浄し、この樹脂にAcOH：TFE＝1：1の溶液7mlを加えて24時間撹拌し、樹脂から保護ペプチドを切り出した。ヘキサンを入れたナスフラスコを用意し、そこに保護ペプチドが溶解している液を滴下し、樹脂をMeOHで洗った。これを室温で減圧濃縮し、酢酸をベンゼンで共沸した。HPLCで精製することで目的物である側鎖の保護されたペプチド4を得た。【０１３８】
2-2.フラグメントBペプチドチオエステル体6の合成
保護ペプチド４ (50μmol) とMS4A (10mg) 、1-Propanethiol (136μl, 1.5mmol) をDMF溶媒中 (6.75ml) Ar気流下-20℃で1時間半攪拌した後、PyBOP (Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium)(130mg, 0.25mmol) 、DIPEA (42.5μl, 0.25mmol) を加え3時間攪拌した。その後、氷上にて反応溶液にジエチルエーテルを加え化合物を沈殿させた。ろ過した後に沈殿物を回収し、95％TFA水溶液を加えて室温で2時間攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、HPLCで精製することで目的物であるペプチドチオエステル体6を得た。
HPLC分析：Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液  B：0.1%TFA  アセトニトリル：水＝90：10  グラジエントA：B=95：5→25：75  15分  流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 10 × 250 mm) グラジエントA：B=75：25→55：45 30分  流速4.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C168H259N47O47S2: [M+2H]2+ 1877.6, [M+3H]3+ 1252.1, [M+4H]4+ 939.3, [M+5H]5+ 751.6, found 1878.3, 1252.6, 939.8, 752.0
上述したフラグメントB保護ペプチド4〜フラグメントBペプチドチオエステル体6の合成スキームを以下に示す。
【化１０】
0005575670.tif 000015
【０１３９】
3-1.アシアロ糖鎖7を有するフラグメントC保護糖ペプチド8の合成
フラグメントAおよびフラグメントBと同様に、樹脂はHMPB-PEGA resin (0.1mmol) を用い、アミノ酸の縮合はFmoc法を用いて行った。Fmoc-Lys(Boc)-OH (234mg, 0.5mmol)、MSNT 5等量 (148mg, 0.5mmol) 、N-methylimidazole 3.75等量 (29.8μl, 0.38mmol) をDCM (2ml, 250mM) に溶解させ、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で2時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCMとDMFを用いて洗浄した。Fmoc基を20分20％ piperidine/DMF溶液 (1ml) を用いて脱保護した。DMFで洗浄後、Kaiser Testにより反応を確認し、次のアミノ酸と縮合させた。その後のペプチド鎖の伸長は以下に示す方法を用いて、順次アミノ酸を縮合させた。【０１４０】
Fmoc-Tyr(But)-OH 5等量 (229.8mg, 0.5mmol) 、HOBt・H2O 5等量 (67.6mg, 0.5mmol)、DIPCDI 5等量 (77μl, 0.5mmol) をDMF溶媒250mM (2ml) に混ぜて15分間活性化させた後、樹脂の入ったチューブに入れ、室温で1時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。【０１４１】
このようにして、23残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Glu(But) (212.8mg, 0.5mmol) , Lys(Boc) (234.3mg, 0.5mmol) , Gly (148.7mg, 0.5mmol) , Asp(But) (205.8mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Trp(Boc) (263.3mg, 0.5mmol) , Asn (177.2mg, 0.5mmol) , Gln (184.2mg, 0.5mmol) , His(Trt) (309.9mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Leu (176.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Val (169.7mg, 0.5mmol) , Arg(Pbf) (324.4mg, 0.5mmol) , Tyr (229.8mg, 0.5mmol) , Thr(But) (198.8mg, 0.5mmol) , Ser(But) (191.8mg, 0.5mmol) 【０１４２】
次に、この23残基のペプチド3μmol分の樹脂をエッペンチューブに移し、アシアロ糖鎖Asnを縮合した。アシアロ糖鎖Asn 2等量 (12mg, 6μmol) とDEPBT(3-(diethoxyphosphoryloxy)-1,2,3-benzotriazin-4(3H)-one)3等量 (3mg, 9μmol) をDMF：DMSO=4：1溶液 (201μl, 30mM) に溶解させ、樹脂の入ったエッペンチューブに入れた。その後、DIPEA(N,N’-Diisopropylethyamine)2等量 (1.02μl, 6μmol) を加え、室温で22時間撹拌した。樹脂を固相合成用チューブに移し、DMFで洗浄した後に、20％ piperidine/DMF溶液を用いてこれまでと同様の方法によりFmoc基を脱保護した。Fmoc-アシアロ糖鎖7の構造を以下に示す。
【化１１】
0005575670.tif 000016
【０１４３】
このアシアロ糖鎖ペプチドにさらに順次アミノ酸を縮合した。Fmoc-Tyr(But)-OH 5等量 (6.9mg, 15μmol) とHOBt 5等量 (2.0mg, 15μmol) 、DIPCI(N,N’-Diisopropylcarbodiimide) 5等量 (2.3μl, 15μmol) をDMF (375μl, 40mM) に溶解させ15分間活性化させた後、樹脂の入った固相合成用チューブに入れ、室温で1時間撹拌した。撹拌後、樹脂をDCM、DMFを用いて洗浄した。その後はじめのアミノ酸と同様の方法でFmoc基を脱保護した。【０１４４】
このようにして、28残基目までの縮合と脱保護を行った。用いたアミノ酸は以下の通りである。
Gln (5.5mg, 15μmol), Gln (5.5mg, 15μmol), Boc-L-thiazolidine-4-carboxylic acid (3.5mg, 0.5mmol)【０１４５】
次に、縮合が終了した糖ペプチド3μmol分の樹脂をDMF、DCMでよく洗浄し、この樹脂にAcOH：TFE＝1：1の溶液3mlを加えて22時間撹拌し、樹脂から保護糖ペプチドを切り出した。ヘキサンを入れたナスフラスコを用意し、そこに保護ペプチドが溶解している液を滴下し、樹脂をMeOHで洗った。これを室温で減圧濃縮し、酢酸とベンゼンで共沸した。HPLCで精製することで目的物である側鎖の保護された糖ペプチド8を得た。【０１４６】
3-2.フラグメントC糖ペプチドチオエステル体10の合成
上記のようにして合成したフラグメントC保護糖ペプチド8 (3μmol) を真空ラインにより十分に乾燥させた。これをAr気流下DMF (7.4 mM, 405μl) に溶解させ、更にMS4A (10mg) 、ベンジルメルカプタン30等量 (10.7μl ,90μmol)  を加え、-20℃で1時間半撹拌した。つづいてPyBOP  5等量 (7.8mg, 15μmol) 、DIPEA  5等量 (2.5μl, 15μmol) を加え、アルゴン気流下5時間半反応させてチオエステル化を行った。反応終了後、氷上にてジエチルエーテルを加えて化合物を沈殿させ、ろ過した後に沈殿物をDMFで回収した。減圧濃縮して得られた固形物9に対し、95％TFA水溶液を加えて2時間撹拌した。減圧濃縮後、HPLCを用いて純度を確認し、質量分析により目的である糖ペプチドチオエステル体10を確認した。
HPLC分析：Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液  B：0.1%TFA  アセトニトリル：水＝90：10  グラジエントA：B=95：5→25：75  15分  流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 10 × 250 mm) グラジエントA：B=70：30→40：60 30分  流速4.0ml/min
ESI-MS： m/z calcd for C221H339N45O89S2: [M+3H]3+ 1706.1, [M+4H]4+ 1279.9, found 1705.8, 1279.6 【０１４７】
上述したフラグメントC保護ペプチド8〜フラグメントCペプチドチオエステル体10の合成スキームを以下に示す。
【化１２】
0005575670.tif 000017
【０１４８】
<大腸菌発現法を用いたペプチドフラグメントの合成>
大腸菌発現法によるフラグメントDの調製及び精製は、基本的に、Macmillanら（Macmillan  et al., J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 9530-9531）の方法に従って行った。
フラグメントDはHisタグ（精製タグ）との融合タンパク質として発現させたので、発現ベクターとしては、予めHisタグを発現する配列を有するpET-16ｂ（図４の14）を使用した。pET-16bの模式図を図３に示す。発現ベクターの設計の概略を、図４示す。【０１４９】
一方、フラグメントDをコードするDNAは、既に構造が解かれ、プラスミドベクターpBluescript SK(+)（図４の11）に組み込まれているIgFc(PDB accession no.1L6X)を使用した。IgFc (1L6X) はそれぞれAsp356、Leu358であるのに対し、フラグメントDはヒト型抗体のバリアントであり、それぞれGln356、Met358（それぞれ、配列番号：１における128位と130位に相当）である。しかしながら、IL6XのAsp356及びLeu358はそのままにし、さらに、フラグメントDのCNBr処理の都合上、Met428をLeuとするmutationを加えた。結果として、フラグメントDのMet358（配列番号：１における130位に相当）とMet428（配列番号：１における200位に相当）をLeuに変換するmutationを導入したことになる。mutationの導入にはinverse PCR法を用いた。結果として得られるアミノ酸配列を、配列番号：２に示す。【０１５０】
また、フラグメントDは、そのN末端側にMetを有し、さらにHisが10個列なったHisタグと呼ばれる精製タグペプチドが付加した融合タンパク質として大腸菌現法により発現させた。融合タンパク質を以下に示す。
【化１３】
0005575670.tif 000018
【０１５１】
1.遺伝子へのMutationの導入
上述のとおり、IgFcにMetをLeuに変えるための2ヶ所のmutationを導入した。
1-1.試薬
(1)QuikChange  II Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE, Cat# 200523-5)
10xReaction Buffer
DpnI 10U/μl
dNTP mix
PfuUltra DNA polymerase 2.5U/μl
XL1-Blue supercompitent cells
(2)1M MgCl2 (per 10 ml)
15 ml FALCON チューブに塩化マグネシウム六水和物 (Wako, Cat# 135−00165) を2.03 g量り取って、10 mlのMilliQに溶解し、フィルター滅菌を行なった。
(3)1M MgSO4 (per 10 ml)  
15 mlFALCON チューブに硫酸マグネシウム七水和物 (Wako, Cat# 131-00405)を2.46 g量り取って、10 mlのMilliQに溶解し、フィルター滅菌を行なった。        
(4)20% (w/v) grucose
(5)NZY+ Broth (per 100 ml)
NZ amine Type A (Wako, Cat# 541-00241) 1.0 g、yeast extract (DIFCO, Lot#  3346143)0.5 g、NaCl (Wako, Cat# 191-01665) 0.5 gにMilliQを加え、100 mlにメスアップした後、5N NaOH (Wako) により pHを7.5に調製。オートクレーブを行なった。
【表５】
0005575670.tif 000019
使用前に、フィルター滅菌を行なった1M MgCl2(12.5 μl/ml)、1M MgSO4(12.5 μl/ml)、20% (w/v) glucose (20 μl/ml)を加えた。
【表６】
0005575670.tif 000020
(6)Agarose,HT (AMRESCO,Cat#:9012-36-8)
(7)DNAマーカー：
・1kb DNA ladder (BIONEER, Cat# D-1040)
・100bp DNA ladder (BIONEER, Cat# D1030)
・25/100bp Mixed DNA ladder (BIONEER, Cat# D1020)
(8)IPTG (Wako, Cat# 095-02531)
−30℃Freezerに保管されていた100mM IPTG
(9)X-gal (Wako, Cat# 023-07851)
−30℃Freezerに保管されていた12% X-gal
(10)Transformation試薬
「8.IgG Fc（Cys321-Ser444）/pET-16bのTransformation」を参照
・LB plate
・2×YT
(11)Plasmid調製試薬
「5.カラム法による大腸菌からのpET-16b調製、制限酵素処理」を参照【０１５２】
1-2.機器と消耗品
(1)Thermal Cycler (GeneAmp PCR System2700, Applied Biosystems, Part#:4322620)
(2)振とう培養機 (THOMAS, AT24S)
(3)Incubator (SANYO MIR-262)
(4)サブマリン型電気泳動槽Mupid-α (株式会社アドバンス)
(5)PCR用200μlチューブ (ABgene, Cat#:AB-0337)
(6)14mlポリプロピレンラウンドチューブ (FALCON, Cat# 352059)
(7)100 mm Petri dish (FALCON, Cat#:351001)
(8)シリンジフィルター (MILLIPORE, Cat# SLGV 025 LS)【０１５３】
1-3.実験の手順
<Primerの作製>
(1)Mutationを挿入したい部分を特定し、その前後にそれぞれ15bp程度のtemplateと同配列に相補的なPrimerを設計した。
(2)Forward Primer（配列番号：３）, Reverse Primer（配列番号：４）をそれぞれ100 ng/μlに調製した。
(3)Templateを5 μg /μlに調製した。
(4)QuikChange  II Site-Directed Mutagenesis Kitのdata sheetを元に以下の条件でPCRを行なった。
【表７】
0005575670.tif 000021
【表８】
0005575670.tif 000022
【表９】
0005575670.tif 000023
(5)PCR終了後、5μlを泳動してバンドを確認した。
(6)PCR産物に1μlのDpn Iを加え、37℃、1hrで反応させた。
(7)泳動し、バンドパターンの変化を確認した。
(8)FALCON 2059tubeを氷上で冷やしておき、Dpn I処理したPCR産物を1μl分注した。
(9)氷上で溶解した50 μlのXL-1 Blueを分取し、タッピングにより混合した。
(10)氷上で30分静置した。
(11)待ち時間の間にNZY brothに1M MgCl2、1M Mg SO4、20％(w/v) glucoseを加えて42℃に温めておいた。
(12)42℃の温浴で45秒間静置した。
(13)氷上で2分静置した。
(14)(11)で温めておいたNZY Brothを500 μl加えた。
(15)37℃で1時間振とうした。
(16)待ち時間の間に、LBプレートに10 μlの100mM IPTG、100 μlの12％ X-galを塗り、インキュベータ内で乾かしておいた。
(17)1hrの振とうが終了したsampleを250μlで2枚Platingした。
(18)37℃、16hr 静置培養した。
(19)2.5 mlの2×YTにコロニーピックした。
(20)37℃、16時間 振とう培養した。
(21)Mini prepを行ない、Plasmidを抽出した (「5.カラム法による大腸菌からのpET-16b調製、制限酵素処理」を参照)。
制限酵素によるmappingを行なった(「7.pET-16bへのcDNAの挿入」参照)。
(22)Sequenceを行った。【０１５４】
2.PCRによるcDNA fragmentの調製
2-1.試薬
(1)Primer mix:sense primerとanti-sense primerを各々4μMになるように混合したもの
(2)PCR反応液
Ex Taq DNA polymerase (5 U/μl ,TAKARA, cat#RR001B) 
10×Ex Taq buffer (TAKARA, cat#RR001B)
2.5 mM dNTP Mix (TAKARA, cat#RR001B)
(3)1%アガロースゲル
(4)TAE
(5)Loding buffer (TAKARA)
(6)EtBr (Nippon Gene,cat#315-90051)【０１５５】
2-2.機器
(1)0.2 ml Thermo-Tube (ABgene, cat#AB-0337)
(2)Thermal cycler
・Mastercycler gradient (eppendorf No.5331 01088)
・2720 Thermal Cycler(Applied Biosystems,partNo.4359659,serialNo.272S4101291)
(3)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plusADVANCE)
(4)トランスイルミネーター (ATTA,No.270022)
(5)ImageMaster VDS:Pharmacia Biotech【０１５６】
2-3.実験手順
(1)氷上でDNA polymerase以外のPCR反応液を調製した。
template (188ng/μl) 5.3μl
10×buffer 5μl
Primer Mix (50μM) 2μl
dNTPs 4μl
water 33.4
total 50μl
(2)PCR反応液をPCR用0.2 mlチューブに50μlずつ分注した。
(3)DNA polymerase (Ex Tag) 0.3μlを加えた。
(4)0.2 mlチューブをThermal Cyclerにセットし、プログラム(注)をスタートさせた。
(注)プログラム：372bp
1.熱変性        94℃、1：00
2.熱変性        94℃、0：45
3.アニーリング  55℃、0：45
4.伸長反応      72℃、0：30
5.最終伸長反応  72℃、10：00
2〜4を35サイクル行った。
(5)PCR反応終了後、1％アガロースゲル電気泳動によりPCR産物の増幅を確認した。
Sample：PCR産物 1μl
滅菌MQ  4μl
6×Loading dye 1μl【０１５７】
3.PCR産物のフィルター精製
3-1.試薬
(1)エタノール
(2)アガロースゲル
(3)Membrane wash solution
(4)滅MilliQ【０１５８】
3-2.機器
(1)1.5mlチューブ
(2)SV Minicolumn
(3)遠心分離機
(4)ブロックインキュベーター
(5)Nano Drop(スペクトロフォトメーター)【０１５９】
3-3.実験手順
(1)PCR溶液150μlに対して等量のMembrane wash solutionを加えた。
(2)カラムに全量をアプライし、1分間静置した後、13,000rpmで1分間遠心した。
(3)廃液を捨て、カラムにMembrane wash bufferを500μl加え、13,000rpmで5分間遠心した。
(4)カラムを1.5mlチューブに移し、70℃の滅MilliQを50μl加え、13,000rpmで1分間遠心した。
(5)Nano DropにてOD260を測定した。【０１６０】
4.PCR産物の制限酵素処理
5’側と3’側に、設計時に付加された調整分の3merを切除するため、制限酵素NdeIとBamHIによる処理を行った。これにより、フラグメントDをコードする372bpの5’側にNdeIサイトの6mer、3’側にBamHIの6merが付加されたDNAを得ることができる。処理後、電気泳動により目的物が得られたことを確認した。【０１６１】
4-1.試薬
(1)Nde I (2)BamH I
(3)10×H
(4)water【０１６２】
4-2.機器
(1)恒温槽
(2)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plusADVANCE)
(3)トランスイルミネーター (ATTA,No.270022)
(4)ImageMaster VDS:Pharmacia Biotech【０１６３】
4-3.実験手順
(1)氷上で制限酵素以外を調製した。
DNA (1μg) 3.74μl
10×H   2.5μl
water 16.76μl
(2)氷上で制限酵素を1μlずつ加えた。
(3)恒温槽で37℃、2時間反応させた。
(4)反応系1μlの電気泳動を行った。【０１６４】
5.カラム法による大腸菌からのpET-16b調製、制限酵素処理（図４の１４〜１６）
プラスミドベクターpET-16ｂをもつ大腸菌BL21(DE3)の細胞壁をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で破壊し、プラスミドベクターを抽出した後、NdeIとBamHIによる制限酵素処理を行った。処理後、電気泳動により目的物が得られたことを確認した。
5-1.試薬
(1)Wizard（登録商標）Plus SV Minipreps DNA Purification System; Promega, Cat# A1492X
・Wizard（登録商標） Plus SV Cell Resuspension Solution; Part# A711N, ( RNase A混合済)
・Wizard（登録商標） Plus SV Cell Lysis Solution; Part# A712N
・Alkaline Phosphatase Solution; Part# A144B
・Wizard（登録商標） Plus SV Neutralization Solution; Part# A148C
・Wizard（登録商標） Plus SV Column Wash Solution;Part# A131C (使用する都度、溶液：100%EtOH=10：17で調製する。)
・Wizard（登録商標） SV Mini columns; Part# A129B
・Collection Tubes ( 2 ml ); Part# A130B
・Nuclease-Free Water; Part# P119C
(2)Ethanol ( 99.5 ) ; C2H5OH ( 46.07 ) , Wako, Cat# 057-00456【０１６５】
5-2.機器
(1)High Speed Micro Centrifuge; HITACHI, himac CF.15R, No.090464
(2)1.5ml エッペンチューブ
(3)Nano Drop (スペクトロフォトメーター)【０１６６】
5-3.実験手順
(1)目的のplasmid DNAを保有する大腸菌の培養液1.5 mlをマイクロチューブに分取した。
(2)15,000rpm, 室温にて30秒遠心した。
(3)上清を完全に除去した。
(4)250 μl のResuspension bufferを加え、まずはピペッティング、次いでボルテックスで大腸菌を懸濁した。
(5)250 μl のAlkaline Lysis bufferを添加し、4〜6回穏やかに転倒混和した。
(6)氷上にて5分間静置した。(時間厳守)
(7)Lysis buffer添加後1分で10 μl のAlkaline protease Solutionを添加し、4回穏やかに転倒混和した。
(8)Lysis buffer添加後5分で350 μl のNeutralization bufferを添加し、5回転倒混和した。
(9)13,000rpm, 室温にて10分遠心し、目的のplasmid DNAを上清に得た。
(10)10分の遠心の間に必要量のColumn Wash Solutionを調製した。( 1 ml / sample )
(11)カラムをcollection tubeに設置した。
(12)上清をカラムにapplyし1分静置した。
(13)13,000 rpm,室温にて1分遠心した。
(14)collection tubeの廃液を捨て、750 μlのColumn Wash Solutionをカラムに添加した。
(15)13,000 rpm,室温にて1分遠心した。
(16)collection tubeの廃液を捨て、250 μlの Column Wash Solutionをカラムに添加した。
(17)13,000 rpm,室温にて2分遠心した。
(18)カラムを新しい1.5 mlマイクロチューブに移した。
(19)100 μlのNuclease-Free Waterをカラムに添加した。
(20)1min室温で静置した。
(21)13,000 rpm,室温にて1分遠心し、DNAを溶出させた。
(22)ナノドロップによって、得られたDNA溶液濃度、purityの測定を行った。
Sample1:54.4ng/μl, Sample2:48.2 ng/μl , Sample3:40.6 ng/μl , Sample4:29.9 ng/μl
(23)Sample2を用いて、氷上で制限酵素以外を調製した。
DNA (3μg) 62.2μl
10×H   8μl
water 3.8μl
(24)氷上で制限酵素を3μlずつ加えた。
(25)恒温槽で37℃、2時間反応させた。
(26)反応系6μlの電気泳動を行った。【０１６７】
6.PCR産物、pET-16bのゲル精製
DNA挿入断片（図４の13）と、発現ベクター（図４の16）を、それぞれ電気泳動後のゲルから切り取って回収することにより、精製した。切り取ったゲルを加熱し、アガロースを遠心分離で取り除いた後、電気泳動を行ったところ、発現ベクター及びDNA挿入断片のバンドが確認された。
6-1.試薬
(1)Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega,cat#A9282)
・Membrane binding Solution (Part#A9303)
・Wash buffer: Membrane wash Solution (Promega, cat#A9282) をEtOH (Wako, cat#057-00456) で6倍希釈
・Wizard SV mini columns (Promega,part#A129B)
・Collection Tubes (Promega,part#A130B)
(2)1％アガロースゲル
(3)EtBr Solution (Nippon Gene,cat#315-90051)
(4)10×Loding buffer (TAKARA)【０１６８】
6-2.機器
(1)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plus,ADVANCE)
(2)トランスイルミネーター (ATTO,No.270022)
(3)電子天秤 (Development Production Testing, Mettler Toledo,AG64,No.26210132-6)
(4)ヒートブロック (Dry Thermo Unit,TAITEC,DTU-1B,No.8032267)
(5)メス (FEATHER,SURGIAL,No.11,14)
(6)マイクロ遠心機 (HITACHI, himac CF 15R) 
(7)遠心エバポレーター【０１６９】
6-3.実験手順
(1)制限酵素処理したcDNA fragmentの溶液、pET-16bの溶液それぞれ9 μlに対して、10×Loding bufferを1μl加え、アプライし、泳動を行った。
(2)1.5 mlチューブの重さを測定した。
(3)電気泳動終了後、ゲルをサランラップに載せた。
(4)トランスイルミネーター上にゲルを載せ、UVを点けた。
(5)目的のPCR産物、pET-16bのバンドにメスで印をつけた。
(6)ゲルを実験台の上に移し、そこでゲルを切り出した。
(7)切り出した後、トランスイルミネーター上で正確に切り出せているかを確認した。
(8)ゲル断片を1.5 mlチューブに入れ、重さを測定した。
(9)ゲル断片と等量のBinding bufferを加え、65℃、15 分間温めた。この時、2〜3分毎にタッピングをして混ぜた。
(10)カラムに全量をアプライし、1 分間静置した。
(11)静置後、13000 rpm、1 分間遠心した。
(12)廃液を捨て、カラムにWash buffer (Wash：EtOH=1：5) を700 μl加え、13000 rpm、1 分間遠心した。
(13)廃液を捨て、カラムにWash bufferを500 μl を加え、13000 rpm、5 分間遠心した。
(14)1.5 mlチューブにカラムを移し、そのカラムに70℃に温めた滅MiliQを50 μl加え、5 分間静置した。
(15)13000 rpm、1 分間遠心した。
(16)反応系が15μlになるまで遠心エバポレーターで濃縮した。
(17)濃縮した反応系1μlを電気泳動し、ゲル精製の確認を行った。【０１７０】
7.pET-16bへのcDNAの挿入（図４の18）
DNA挿入断片を発現ベクターに挿入した。
7-1.試薬
(1)10×Loding buffer (TAKARA)
(2)1 kbp DNA Ladder (BioNEER, 130ng/ μl, cat#D-1040)
(3)100 bp DNA Ladder (Bioneer, 135ng/ μl , cat# D-1030)
(4)AGAROSE (AMRESCO, cat#9012-36-6)
(5)EtBr Solution (Nippon Gene, cat#315-90051)
(6)Phenol / Chloroform / Isoamyl alcohol (25:24:1) (Nippon Gene, cat#311-90151)
(7)Chloroform (CH3Cl(119.38),Wako,cat#038-02606 )
(8)3M Sodium Acetate pH5.2(Nippon Gene,cat# 316-90081)
(9)Ethanol (99.5) (C2H5OH(46.05),Wako,cat#057-00456 )
(10)Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega,cat#A9282) Ligation high (TOYOBO, cat# LGK-101)
(11)Competent Cell (Competent high E.coli DH5α,TOYOBO, cat# DNA-901)
(12)2×YTLBプレートBacto Trypton (BD,cat#211705)
(13)Bacto Yeast Extract (BD,cat#212750)
(14)Sodium Chloride (NaCl (58.44),Wako,cat#191-01665)
(15)Bacto Agar (BD,cat#214010)
(16)Ampicillin (Wako,cat#010-10371)
(17)rTaq DNA polymerase (5 U/μl ,TOYOBO, cat#TAP-201)
(18)10×rTaq buffer (TOYOBO, cat#TAP-201)
(19)2 mM dNTP Mix (TOYOBO, cat#TAP-201)
(20)MgCl2 (TOYOBO, cat#TAP-201)
(21)SV Mini 1000preps+SV Gel&PCR 500preps (Promega,cat#A1492X)
(22)Glycerol (Wako, cat#075-00616)
(23)High Purity Plasmid Midiprep System (MARLIGEN,cat#11451-010)
(24)Isopropyl Alcohol (Wako,cat#166-04836)【０１７１】
7-2.機器
(1)温浴 (Iuchi,型式TR-1,No.1807043)
(2)Program Temp Control System (ASTEC, 型式PC-700,No.PN7921205)
(3)サブマリン型電気泳動槽 (Mupid-2plusADVANCE)
(4)トランスイルミネーター (ATTO,No.270022)
(5)Image Master VDS ( Pharmacia Biotech)
(6)Thermal cycler 
(7)電子天秤 (Development Production Testing, Mettler Toledo,AG64,No.26210132-6)
(8)ヒートブロック (Dry Thermo Unit,TAITEC,DTU-1B,No.8032267)
(9)ND-1000スペクトロフォトメーター (Nano Drop Technologies,Inc)
(10)メス (FEATHER,SURGIAL,No.11,14)
(11)マイクロ遠心機 (HITACHI, himac CF 15R)
(12)Electronic balance (AND,No.5031522)
(13)温浴 (TAITEC,No.91071110)
(14)Petri Dish 100×15mm Style (FALCON,Lot# 3209832)
(15)14 ml polypropylene Round-Bottom tube (FALCON,Lot# 4017517)
(16)Thermostatic Shaking Incubator (THOMAS,No.007280)
(17)Centrifuge (SAKUMA,No.30025)
(18)Automatic High Speed Refrigerated Centrifuge;HITACHI,SCR20B,No.38677
(19)Cell strainer 40μm;FALCONS  Gel and PCR Clean-Up System【０１７２】
7-3.実験手順
7-3-1.制限酵素反応 (その１)
(1)氷上で、1.5 mlチューブに下記の反応系を調製した。
【表１０】
0005575670.tif 000024
(2)37℃、1時間制限酵素反応を行った。
(3)制限酵素反応終了後、1 μlをサンプリングし、電気泳動でバンドを確認した。【０１７３】
7-3-2.フェノール・クロロホルム処理
(4)制限酵素反応液に150 μlのTEを加えた。
(5)フェノール・クロロホルムを200 μl加え、30 秒間激しく振った。
(6)15000 rpm、3 分間遠心し、上清を新しいチューブに分取した。
(7)フェノール・クロロホルムを200 μl加え、30 秒間激しく振った。
(8)15000 rpm、3 分間遠心し、上清を新しいチューブに分取した。
(9)クロロホルムを200 μl加え、30 秒間激しく振った。
(10)15000 rpm、3 分間遠心し、上清を新しいチューブに分取した。
(11)上清の1/ 10量の3MSodium acetateと2.5倍量のEtOHを加え、−30℃、10 分間静置した。
(12)15000 rpm、10 分間遠心した。
(13)上清を取り除き、70%EtOHを1 ml加えた。
(14)15000 rpm、10 分間遠心した。
(15)上清を除去し、デシケーターを用いて3 分間静置した。
(16)20 μlのTEを加え、溶解させた。【０１７４】
7-3-3.制限酵素反応（その2）
(17)氷上で下記の反応系を調製した。
【表１１】
0005575670.tif 000025
(18)タッピングで混ぜ、37℃、1 時間反応させた。
(19)4.4 μlの10×Loding bufferを加え、アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った。【０１７５】
7-3-4.ゲルからの切り出し・精製
(20)アガロースゲルからの切り出しは、上記「PCR産物、pET-16bのゲル精製」と同様にして行った。
7-3-5.Ligation反応
(21)0.5 mlチューブにインサート：ベクターのmol比が3：1となるように2つの溶液を加えた。
(22)2つの溶液と等量のLigation Highを加えた。【０１７６】
8.IgG Fc (Cys321-Ser444) / pET-16bのTransformation
DNA挿入断片が発現ベクターに正しく挿入されたかどうかを確認するため、発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に取り込ませて培養した。【０１７７】
8-1.細胞/ plasmid
(1)Competent Cell (Competent high E.coli DH5α) ; TOYOBO, code# DNA-903
・Competent Cell
・SOC medium
(2)Plasmid DNA【０１７８】
8-2.試薬
(1)LB-amp plate
(2)Ethanol (99.5) ; C2H5OH (46.05), Wako, Cat# 057-00456【０１７９】
8-3.機器
(1)14 ml polypropylene Round-Bottom tube; FALCON, Cat# 352059
(2)温浴 (42℃)
(3)コンラージ棒
(4)Thermostatic Shaking Incubator; THOMAS, No.007280【０１８０】
8-4.実験の手順
(1)温浴を42℃に温め始めた。
(2)ディープフリーザーに保存してあるCompetent CellとSOC mediumを氷上で溶かした。
(3)氷上で冷やした14 mlポリプロピレンラウンドチューブに0.1 pg〜10 ngのplasmid DNAを分注した。
(4)10〜50 μlのCompetent Cellを14 mlチューブに加えた。
(5)氷上にて20分間静置した。
(6)42℃の温浴に45秒間浸したのち、氷上に戻し2分間冷却した。
(7)90〜450μlのSOC medium を加え、37℃, 140 rpmで1時間振蘯した。
(8)振蘯中にLB-amp plateを37℃インキュベーターで温め、10分ほどベンチで乾燥させた。
(9)選択培地plateに2〜3つの濃度で大腸菌培養液を塗布した。
(10)Plateを逆さにして、37℃のインキュベーターで一晩培養した。
(11)翌日コロニー数をカウントし、いくつかの単一コロニーを拾い、2×YT培地1.5 mlで振蘯培養した。【０１８１】
9.アルカリMiniprep
次の制限酵素マッピングに供するため、培養した大腸菌をSDS処理して発現ベクターを抽出した。
9-1.試薬
(1)RNase
(2)Solution (I，II，III)
(3)フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25：24：1)
(4)3M NaOAc
(5)100％エタノール
(6)70％エタノール
(7)滅MilliQ【０１８２】
9-2.機器
(1)1.5mlエッペンチューブ
(2)遠心分離機
(3)デシケーター
(4)エッペンシェイカー【０１８３】
9-3.実験手順
(1)o/nでインキュベートした培養液を1.5mlエッペンチューブに移した。
(2)15,000rpmで30秒、4℃で遠心した。
(3)上清（sup）を除去した。
(4)RNase4μlをSolution I(Sol I：RNase=1.7：3.4) に加えた。
(5)氷上で4)を100μl 、3)の沈殿物 (pellet) に加えた。
(6)Solution II(5×NaOH：20％SDS：MilliQ=0.136：0.17：3.094) を200μl加え、穏やかに転倒混和した。その後5分間氷上に静置した。
(7)Solution III (5M KoAc：AcOH：MilliQ=60：11.5：28.5) を150μl加え、穏やかに転倒混和した。その後5分間氷上に静置した。
(8)15,000rpmで10分、4℃で遠心した。この間にエッペンを用意し、エッペン1本あたり450μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール (25：24：1) 液を採った。
(9)(8)で用意したエッペンにsupを加え、30秒間shakeした。
(10)15,000rpmで3分、4℃で遠心した。
(11)supを新しいエッペンに採り、3M NaOAcを40μlずつ加えた。
(12)100％エタノールを1mlずつ加え、穏やかに転倒混和した。その後-30℃で10分間静置した。
(13)15,000rpmで10分、4℃で遠心した。
(14)70％エタノールを700μlずつ加え、ボルテックスした。
(15)15,000rpmで10分、4℃で遠心した。
(16)supを除去し、3分間デシケーターで乾燥させた。
(17)滅MilliQを100μl加え、3分間エッペンシェイカーにかけた。【０１８４】
10.IgG Fc (Cys321-Ser444) / pET-16bの酵素処理
大腸菌から抽出した発現ベクターに対して2種類の制限酵素を用いて制限酵素マッピングを行った。制限酵素処理後に電気泳動を行い、DNA挿入断片が発現ベクターに正しく挿入されていることが確認された。
10-1.試薬
(1)Nde I
(2)BamH I
(3)EcoR V
(4)10×H
(5)water【０１８５】
10-2.機器
上記「PCR産物の制限酵素処理」と同様【０１８６】
10-3.実験手順
(1)氷上で制限酵素以外を調製した。
DNA   2μl
10×H   1μl
water   6.5μl (EcoR Vの場合は6.75μl)
(2)氷上で制限酵素を0.25μlずつ加えた。
(3)恒温槽で37℃、45分間反応させた。
(4)反応系1μlの電気泳動を行った。【０１８７】
11.BL21(DE3)に対するIgG Fc (Cys321-Ser444) / pET-16bのTransformation
発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に取り込ませ、HisタグとフラグメントDの融合タンパク質を発現させた。【０１８８】
11-1.コンピテントセルの作成
実験手順
(1)フラクションにLB培地を3mlずつ採った。
(2)o/nで培養していた大腸菌のフラクションをVORTEXした。
(3)培地の入ったフラクションに、培養していた大腸菌を30μlずつ植え継ぎ、37℃  160min-1  でインキュベートした。(o/n)
(4)フラクションにLB培地を5mlずつ採った。
(5)o/nで培養していた大腸菌のフラクションをVORTEXした。
(6)培地の入ったフラクションに、培養していた大腸菌を50μlずつ植え継ぎ、OD550が0.4になるまで37℃  160min-1  でインキュベートした。
この間に15mlの遠心チューブを冷やした。
(7)1時間20分後OD測定  OD550＝0.349
(8)氷上で冷しておいた15mlの遠心チューブに培養液を移した。
(9)2,000rpm (0℃) 、20分間遠心した。
(10)上清を捨て、coldの0.1M MgCl2を3ml加えてwashした。
(11)2,000rpm (0℃) 、20分間遠心した。
(12)上清を捨て、coldの0.1M CaCl2を3ml加えてwashした。
(13)20分間氷上保存した。
(14)2,000rpm (0℃) 、20分間遠心した。
(15)上清を捨て、coldの0.1M CaCl2を0.5ml加えてVORTEXした。
2057チューブを冷やしておいた。【０１８９】
11-2.Transformation
(1)2057チューブにコンピテントセルを移した。
(2)プラスミドDNA 溶液1μlをコンピテントセルが入ったチューブに静かに移し、氷上で1時間保存した。
(1)42℃で3分間恒温槽に浸けた。
(2)サンプルを速やかに氷上に移し、1分間放置した。
(3)サンプルに5mlのLB培地を加え、37℃で45分間shakeした。
(4)3,000rpm (r,t) 、10分間遠心した。
(5)上清を除去し、pelletにLB培地を1ml加えてVORTEXした。
(6)各々のサンプルを100μl (＊1)と900μlに分けた。
(7)900μlのサンプルを7,000rpm (r,t) で4分間遠心した。
(8)デカントで上清を除去し、pelletにLB培地を100μl加えてVORTEXした。(＊2)
(9)(＊1) と (＊2) を各々100μl platingした。
(10)37℃で一晩培養した。【０１９０】
12.タンパク誘導・精製
大腸菌BL21(DE3)の培地にIsopropyl-β-D-thiogalactopyranoside（IPTG）を添加して発現を誘導した。培養後、大腸菌を集菌し、超音波で細胞壁を破砕した後、Ni-NTA樹脂カラムに大腸菌破砕液を流してHisタグ-フラグメントD融合タンパク質を吸着させた。次に、イミダゾールを含む洗浄用緩衝液を流して融合タンパク質を溶出した。溶出した融合タンパク質は、HPLC分析と質量分析により、目的とする物質であることを確認した。
続いて、溶出物を凍結乾燥したところ、白色の固形物が得られた。この固形物に対してCNBr処理を行い、フラグメントDからHisタグを除去した。CNBr処理は、40％アセトニトリル及び2％TFA存在下で行った。【０１９１】
12-1.実験手順 (500ml培養)
(1)  LB-amp培地を5mlずつフラクションに採った。
(2)  菌の生えたプレートから1コロニーをpick upした。
(3) pick upした菌をLB-ampに良く懸濁した。
(4) 37℃  160min-1  でインキュベートした。(o/n)
(5)  2×YT-amp 500mlに4)のculture液を加え、OD600が0.6に達するまで37℃  160min-1  でインキュベートした。
(6)  4時間後 OD600＝0.963
(7)  培地を室温に戻し、5mlの100mM IPTGを加え (最終濃度1mM) 、16℃でインキュベートした。
(8)  24時間後、誘導を止めて培養液を50ml遠沈管に移し、3,500rpm (r,t) で10分間遠心した。
(9)  上清を除去し、PBS(-)を加えて懸濁させ、50ml遠沈管に分けた。
(10) 3,500rpm (r,t) で10分間遠心した。
(11) supを除去し、-20℃で保存した。
(12) 37℃の恒温槽でサンプルを解凍した後、50mlのLysis Buffer (100mM NaH2PO4, 10mM Tris・HCl, 8M urea, 5mM Imidazole, pH8.0) を加え、超音波をかけた。
(13) 超音波による破砕後、サンプルをシェイカーにかけた。この間に、Ni-NTA resin 1.5mlをLysis Bufferで平衡化した。
(14) Ni-NTA resinカラムにサンプルをloadし、10回吸着させた。
(15) Wash Buffer (100mM NaH2PO4, 10mM Tris・HCl, 8M urea, 50mM Imidazole, pH8.0) で樹脂を十分洗った。CBBGテスト (5μlのwash液に対して800μlのCBBを加え、OD595を測定) により、洗浄の程度を測定した。
(16) Elution Buffer (100mM NaH2PO4, 10mM Tris・HCl, 8M urea, 400mM Imidazole, pH8.0) で溶出させた。この際、上記同様CBBGテストを行い、回収するフラクションを決めた。【０１９２】
12-2-1.確認電気泳動
(17) フラクション中の溶出液10μlに、アセトン：MeOH=1：1液を300μl加えた。(stand on ice for 0.5h )
(18) 13,000rpm (4℃)で10分間遠心した。
(19) 上清を除去し、デシケーターで乾燥させた。
(20) 1×Sample Bufferを25μlずつ加え、95℃で5分間ボイルした。
(21) SDS-PAGEを行った。【０１９３】
12-2-2.HPLCおよび質量分析による確認
(22) 溶出液100μl に対して10mM DTTを100μl加え、37℃の恒温槽に30分間浸けた。
Cadenza CD-18 (3 μm, 4.6 × 75 mm), 展開溶媒A：0.1％TFA水溶液  B：0.1％TFA  CH3CN：H2O＝90：10 , グラジエントA：B=95：5→25：75 15分 , 流速1.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C724H1110N212O216S5: [M+23H]23+ 714.2, [M+22H]22+ 746.6, [M+21H]21+ 782.1, [M+20H]20+ 821.2, [M+19H]19+ 864.4, [M+18H]18+ 912.3, [M+17H]17+ 965.9, [M+16H]16+ 1026.3, [M+15H]15+ 1094.6, [M+14H]14+ 1172.7, [M+13H]13+ 1262.9, found 714.4, 746.8, 782.3, 821.4, 864.5, 912.6, 966.2, 1026.4, 1094.7, 1172.8, 1263.0【０１９４】
12-2-3.CNBr処理前の透析
(23) 溶出液を透析チューブ (Spectra/Por（登録商標） Membrane MW:3,500, Flat Width.:54mm, Diameter.:34mm, Vol/Length.:9.3ml/cm, Length.:15m/50 ft) に移し、5Lの蒸留水を外液とし, 4℃の下で撹拌した。(o/n)
(24) 透析チューブ内のサンプルを回収し、凍結乾燥した。
収率:40mg/L culture【０１９５】
12-2-4.CNBr処理
(25) 24)で得た白色の固形物10mgを40％CH3CN水溶液, 2％TFA水溶液5mlに溶かし、Ar気流/遮光下で0.1mgのCNBrを加え静置した。
(26) 減圧濃縮し、Buffer (100mM NaCl, 50mM Tris・HCl, 6M urea, 1mM DTT, pH8.0) を100μ加え、37℃の恒温槽に１時間浸けた。
(27) HPLCで脱塩した後、ゲルろ過クロマトグラフィーで目的であるフラグメントDを精製した。
Gel filtration on Superdex 75TM 10/300 GL. The column (10×300mm) was equilibrated and operated as follows: 10% (v/v) formic acid, flow rate of 0.4 mL min-1.
ESI-MS：m/z calcd for C619H966N166O191S3: [M+18H]18+ 772.4, [M+17H]17+ 817.8, [M+16H]16+ 868.9, [M+15H]15+ 926.7, [M+14H]14+ 992.8, [M+13H]13+ 1069.1, [M+12H]12+ 1158.1, [M+11H]11+ 1263.3, [M+10H]10+ 1389.6, [M+9H]9+ 1543.9, [M+8H]8+ 1736.7, [M+7H]7+ 1984.7, found 772.7, 821.3, 869.0, 927.0, 993.1, 1069.4, 1158.4, 1263.7, 1389.8, 1544.2, 1737.2, 1985.0【０１９６】
13.アガロースゲル電気泳動
反応系を減圧濃縮、脱塩処理し、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、目的とするフラグメントDを得た。ODSカラムによる分析、質量分析及びSDS-PAGEにより、フラグメントDであることを確認した。
13-1.試薬
(1)  50×TAE (Tris-Acetate-EDTA)
トリス塩基 (Wako) 、酢酸 (Wako Cat#:017-00256) 、0.5M EDTA (pH=8.0) を下記に従ってはかり取り、MilliQで1 Lにメスアップした。
【表１２】
0005575670.tif 000026
(2)  1×TAE
50×TAE (2M トリス塩基, 1M CH3COOH, 50 mM EDTA) をMilliQで50倍希釈した。
(3)0.5 g/ml EtBr (Ethidium bromide)
10 g/ml EtBr (Wako, Code#315-90051;-4℃で保存)を1×TAEで20倍希釈した。
(4)Agarose,HT (AMRESCO,  Cas#  9012-36-8)
(5)1kb DNA ladder (BIONEER, Cat#  d-1040)
(6)100bp DNA ladder (BIONEER, Cat#  D1030)【０１９７】
13-2.機器と消耗品
(1) サブマリン型電気泳動槽Mupid-α (株式会社アドバンス)
(2) ゲルメーカースタンド (株式会社アドバンス)
(3) ゲルトレイ (株式会社アドバンス)
(4) コーム (株式会社アドバンス)
(5) ゲル撮影装置 (Pharmacia)【０１９８】
13-3.実験手順
13-3-1.アガロースゲルの作製 (ゲルメーカースタンド1枚分の作製法を記す。)
(1)三角フラスコに1.2 gのアガロースをはかり取り、MilliQ 117.6 mlを加えた。
(2)三角フラスコの口にサランラップをまき、電子レンジで温め、アガロースを溶解した。
(3)室温に放置し、60℃程度まで下がるのを待った。
(4)ゲルを冷ましている間に、ゲルメーカースタンド、ゲルトレイの用意を済ませておいた。
(5)ゲルが60℃程度になったところで、50×TAE 2.4 ml、10 mg / ml EtBr 6 μlを添加し、混合した。
(6)あらかじめ用意しておいたゲルメーカースタンドにゲルを注ぎ込んだ。
(7)ゲルが固まらないうちに、ゲル表面の泡をブルーチップなどを用いて除去した。
(8)泡を取り終わったところで、コームを差し込んだ。
(9)約30分程度室温に放置し、ゲルを固まらせた。【０１９９】
13-3-2.泳動バッファーの調製  (350ml分の作成法を記す。)
(1)500 mlメスシリンダーに7 mlの50×TAEをはかり取った。
(2)MilliQで350 mlにメスアップした。
(3)メスシリンダーの口をパラフィルムで覆い、インバートにより混合した。
(4)泳動槽に注ぎ込んだ。
(5)10 mg/ml EtBrを17.5 μl添加した。
(6)ブルーチップやピンセットを用いて泳動バッファーを均一に撹拌した。【０２００】
13-3-3.泳動方法
(1)泳動バッファーをピンセットやブルーチップで混合し、液を均一に撹拌した。
(2)泳動するSampleとLoading dyeをピペッティングによりよく混合した。
(3)Sampleをウェルにアプライした。
(4)目的にあったDNA ladder (マーカー) をアプライした。
(5)電源を入れ、Voltageを選択し、泳動を開始した。
(6)泳動が終わったら電源を切り、ピンセットでゲルトレイをつまんで、サランラップの上にのせた。
(7)サランラップ上でゲルをゲルトレイからはずした。
(8)ゲル撮影装置で写真を撮影した。【０２０１】
14.その他試薬類
(1)LB；Bacto-tryptone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, Agar 15g/ 1L H2O
(2)LBが入ったシャーレ；Bacto tryptone 10g、Yeast Extract 5g、NaCl 5g、Glucose 5g、/ 1L H2Oを混ぜ、1.5％Agar 15g/Lを加え、20分オートクレーブにかけ、50-60℃に冷えたところで100mgのアンピシリンを加え、30mlずつシャーレにプレーティングしたもの。
(3)LB-amp；LB：10％アンピシリン＝1000:1
(4)アルカリSDS溶液；0.2N NaOH、1％SDS
(5)4％ポリアクリルアミドゲル；30％アクリル溶液1.995 ml、10×TBE(注1) 1.5ml、10％APS(注2) 75μl、TEMED 10μl / H2O 15ml 
注1  10×TBE；Trisma base 108g、Broic acid 55g、0.25M EDTA 80ml / 1L H2O
注2  10％APS；ammmonium persulfater 0.1g / H2O 1ml
(6)  2×YT；Bacto-trypton 16g、Bacto Yeast Extract 10g、NaCl 5g、アンピシリン100mg、aH2O 1L
(7)2×YT-amp；2×YT：10％アンピシリン＝1000:1
(8)1×SB；0.5M Tris-HCl (pH6.8) 1ml、10％SDS 2ml、βメルカプトエタノール 0.6ml、グリセロール 1ml、H2O 5.4ml、1％BTB  液が紺色になるまで数滴加える。
(9)12.5％アクリルアミドゲル；
※Upper gell；aH2O 5ml、Lower gell Buffer 3.75ml、30％アクリルアミド  6.25ml、10％APS 75μl、TEMED 10μl
※Lower gell；aH2O 3ml、Upper gell Buffer 1.25ml、30％アクリルアミド0.75ml、10％APS 17.5μl、TEMED 5μl
(10)1×SDS-PAGE buffer；Tris(hydroxymethyl)aminometane 1.51g、Glycine 7.2g、Sodium ULauryl Sulfate (SDS) 500mg / aH2O 500ml
(11)脱色液；MeOH 25％、AcOH 10％、H2O 65％【０２０２】
<フラグメントAとフラグメントBのKinetically Controlled Ligation>
KCL法は、フラグメントAのC末端のチオエステルをフラグメントBのチオエステルよりも脱離能が高いチオエステルとして用意し、2つのフラグメントの反応速度の違いを利用してNCL法によって連結する方法である。この方法によって、フラグメントBのC末端にはチオエステルを残したままペプチド鎖を連結することが可能となる。【０２０３】
フラグメントAペプチドチオエステル体(2mg, 0.56μmol) をエッペンチューブに移し、pH6.8に調節した6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEPを加えて溶かした。あらかじめ緩衝溶液 (300μl) に溶かしてあったフラグメントBペプチドチオエステル体(2mg, 0.53μmol)をフラグメントAペプチドチオエステル体の入ったエッペンチューブに加え、2時間反応させた。HPLCにより精製することでフラグメントA+Bを得た。なお反応の追跡はHPLCを用いて行った。
HPLC：Cadenza CD-18 ( 3 μm, 4.6 × 75 mm) 展開溶媒A：0.1%TFA水溶液  B：0.1%TFA  アセトニトリル：水＝90：10  グラジエントA：B=95：5→25：75  15分  流速1.0ml/min
HPLC精製：Vydac C-18 (5μm, 4.6 × 250 mm) グラジエントA：B=70：30→40：60 20分  流速1.0ml/min
ESI-MS：m/z calcd for C327H510N84O90S4: [M+4H]4+ 1797.6, [M+5H]5+ 1438.3, [M+6H]6+ 1198.7, [M+7H]7+ 1027.6, [M+8H]8+ 899.2, [M+9H]9+ 799.5, found 1797.6, 1438.3, 1198.7, 1027.7, 899.5, 799.6【０２０４】
<糖ペプチドフラグメントCとフラグメントDのNative Chemical Ligation>
はじめに、Ligationバッファー内でのフラグメントDの濃度の目安を調べるため、モデルタンパクとしてLysozyme (MW:14,000) を用いた検量線の作成を行った。Lyzozymeの濃度が10μl, 5μl, 2.5μlのときの吸光度を280nmで測定し、それぞれの濃度を3回ずつ測定し、測定値を平均したものをその濃度における吸光度とした。その結果を下表及び図５にその結果を示す。
【表１３】
0005575670.tif 000027
【０２０５】
なお、Lysozymeを溶かした溶液は、フラグメントCとフラグメントDのNCLに用いるLigationバッファー (pH7.5に調節した8M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEP, 25mM MPAA) からMPAAを除いたバッファーである。
次に、「13.アガロースゲル電気泳動」の項目で行ったゲルろ過で用いた溶媒は10％formic acid水溶液であったため、当該溶媒をUltracel Amicon（登録商標）YM-10で濃縮すると同時に、10％formic acid水溶液をろ過した。つづいて、pH7.5に調節した8M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEP へとバッファー交換した。全体量が500μlほどになったところで280nmでの吸光度を測定した。その結果、測定値は0.14であった。この結果と図５の検量線から、濃縮したこの溶液中のフラグメントDの濃度は、約1mMと求められた。【０２０６】
フラグメントDの濃度を上げるため遠心による濃縮操作を続け、溶液量が125μlほどになったところで回収した。フラグメントDが溶けたこの溶液15μlを、Ligationバッファー (pH7.5に調節した8M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 40mM TCEP, 25mM MPAA) に溶かしたフラグメントCが入ったシリコナイズドチューブに加え、室温で反応させた。反応溶液中のフラグメントCとフラグメントDの最終濃度は、フラグメントCが2mM、フラグメントDが1mMである。15時間後、反応溶液に最終濃度が50mMとなるようにDTTを加え、37℃で30分間還元した。その後ゲルろ過クロマトグラフィーを行った。ゲルろ過クロマトグラフィーは、Superdex 75TM 10/300 GLを用い、10％(v/v)のギ酸を流速0.4ｍL/minで送液してカラムを平衡化し操作を行った。結果を図６に示す。図６の各ピークを分取し、質量分析を行った。【０２０７】
その結果、(b)は原料のフラグメントDのピークであり、(c)は原料のフラグメントCのピークであることが確認された。なお、(c)のピークは、フラグメントCの分子分子内のLysの側鎖がチオエステルに攻撃をし、チオエステルが取れて環化した以下の化合物P又はQと考えられる質量数であった。
【化１４】
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【化１５】
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【０２０８】
ピーク(a)には、原料であるフラグメントDとは異なる質量数の生成物をわずかな強度で確認したが、質量分析では、目的物であるフラグメントC+Dであるとは確認できなかった。
この反応の経過をSDS-PAGEで分析した結果を図７に示す。Lane1はフラグメントC、Lane2はHisタグ＋フラグメントD(16kDa)、Lane3は反応溶液を示す。Mは分子量マーカーである。Lane3の最も高分子のバンド（生成物(d)）が目的物であるものと考えられた。質量分析でピークが確認できなかったのは、ペプチド鎖が多様な3次元構造を形成した混合物となり、それら各化合物の溶液中の濃度が低いため、ESIマスにおけるイオン強度が低くなったことが原因と考えられる。【０２０９】
ここで、フラグメントCとフラグメントDがNCL法で正確に連結されたとすると、生成物の質量数は約19kDaとなるところ、電気泳動によるピークは25kDa付近であった。これはペプチド鎖に糖鎖が付加されていることによる現象と考えられるが、より確実に目的物の生成を確認するため、PNGase Fによる酵素処理を行った。目的物にN型糖鎖が結合している場合、PNGase Fで処理すると、糖鎖が結合しているAsnの位置で糖鎖とペプチドの結合が特異的に切断される。従って、これを電気泳動で確認すると、糖鎖の分子量だけ小さくなったペプチドのバンドが確認できると予想される。【０２１０】
具体的には、ゲルろ過クロマトグラフィーのピーク(a)を含むフラクションを遠心濃縮すると同時に、溶液をpH7.5に調節した0.5M リン酸緩衝溶液に置換した。この間に、10×Glycoprotein Denaturing Buffer (SDS 2.5mg, DTT 30.8mg / 500μl) と10×G7 Reaction Buffer (pH7.5に調節した0.5M リン酸緩衝溶液) を調製した。次に、濃縮したピーク(a)を含む溶液27μlに対して3μlの10×Glycoprotein Denaturing Bufferを加え、110℃で加熱した。25分間加熱した後、3.3μlの10×G7 Reaction Bufferと3.3μlの10％NP-40及び5μlのPNGase Fを加え、37℃で2時間加熱した。これと同様にしてPNGaseを加えない反応をcontrol実験として行った。SDS-PAGEで確認した。
結果を図８に示す。Lane1はライゲーション生成物、Lane2はPNGaseF、Lane3はフラグメントC、Lane4は反応溶液、Mは分子量マーカーを示す。Lane4に、生成物(d)よりも分子量の小さな位置に新たな生成物(e)が確認された。糖鎖加水分解が特異的におこる酵素を用いた処理によってバンドの位置が変化したことから、生成物(d)にはN型糖鎖が結合していたことが示唆された。
以上の結果より、フラグメントC及びDは、NCL法により連結でき、生成物(d)は目的物であるフラグメントC+Dであるものと判断された。【０２１１】
<IgG1-Fcフラグメントの全合成を目指した、フラグメントA＋BとフラグメントC＋DのNative Chemical Ligation>
図６の(a)で示したピークを分取し、生成物(d)のN末端のチアゾリンをシステインへと変換した。生成物(d)をゲルろ過カラムを用いて精製したときの溶出溶液は10％formic acid溶液であるため、まず、Ultracel Amicon（登録商標）YM-10を用いてフラクション内の10％formic acid溶液をpH7.5に調節した6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液 へと遠心ろ過で交換した。つづいてこの系中に0.2Mメトキシアミン塩酸塩をpH4.0になるまで加えた。室温で5時間半撹拌したところで、6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 0.5M NaOH を反応溶液がpH7.0を示すまで注意深く加え、反応溶液を先ほどと同様にしてUltracel Amicon（登録商標）YM-10でを用いて遠心ろ過しながら濃縮した。反応溶液量がおよそ20μlほどになったところで、pH7.0に調節した6M GnHCl, 0.2M リン酸緩衝溶液, 80mM TCEP, 0.1M MPAA 20μlを用意し、これにフラグメントA＋Bを溶解させ、メトキシアミンで処理したフラグメントC＋D溶液に加えた。原料となる2つのペプチドが溶液に溶けたことでNCLを開始した。そして、反応開始から15時間後、SDS-PAGEによってこのLigation反応の経過を調べた。【０２１２】
結果を図９に示す。Lane 1（フラグメントA+B）及びLane 2（フラグメントC+D）で見られるバンド以外に、生成物(f)が確認され、目的物であるIgG1-Fcフラグメントであるものと認められた。フラグメントA+BとフラグメントC+DがNCL法により連結されると、分子量は約25kDaである。生成物fのバンドは35kDa付近に見られたが、糖鎖付加のために起こる現象と考えられる。
【配列表フリーテキスト】
【０２１３】
配列番号１は、ヒトIgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、本発明に係る製造方法で製造されるヒトIgG1-Fcフラグメントのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、IgFcクローニングのためのセンスプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４は、IgFcクローニングのためのアンチセンスプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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