(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患の治療剤であって、有効量の接合体を含み、
前記接合体は、
【化１】
0005547816.tif 000011
であり、式中、ｍＰＥＧは２０ｋＤの分子量を有し、ＩＦＮはインターフェロン−α２ｂ部分であり、
前記疾患は、特発性骨髄線維症、真性多血症、または本態性血小板血症である、治療剤。
【請求項２】
前記疾患は特発性骨髄線維症である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項３】
前記疾患は真性多血症である、請求項１に記載の治療剤。
【請求項４】
前記疾患は本態性血小板血症である、請求項１に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００９年１２月１０日出願の米国仮出願第６１／２８５，４１１号の利益を主張する。この米国仮出願の内容は、参照によりその全体を本願明細書に援用したものとする。
【０００２】
本発明は、種々の疾患を処置するためのタンパク質−ポリマー接合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞生物学および組み換えタンパク質技術の進歩は、タンパク質療法の開発につながった。
【０００４】
しかし、大きなハードルがまだ存在する。ほとんどのタンパク質はタンパク質分解性の分解を受け易く、それゆえ循環系において短い半減期を有する。他の不都合としては、低い水溶性および中和抗体の誘導が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に結合すると、タンパク質分解酵素がそのタンパク質の骨格に接近することが妨げられ、その結果として、タンパク質の安定性が高められる。加えて、この結合は、水溶性を改善することもし、免疫原性を最小にすることもする。ポリマーをタンパク質に結合する有効な方法についてのニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の１つの態様は、種々の疾患を処置するためのタンパク質−ポリマー接合体の使用に関する。この接合体は、少なくとも１つのポリマー部分、インターフェロン−α部分、およびリンカーを含有する。この接合体では、全分子量は２〜２００ｋＤ（好ましくは４０ｋＤ）であり、接合体中のポリマー部分の数は１０以下である。このポリマー部分（複数可）はリンカーに結合され、当該インターフェロン−α部分のＮ末端の窒素原子は、リンカーに結合され、このリンカーは、共有結合、Ｃ１〜１０アルキレン、Ｃ２〜１０アルケニレン、またはＣ２〜１０アルキニレンである。好ましくは、当該接合体は実質的に純粋であり、例えば７０％超、８０％超、または９０％超の純度を有する。この接合体によって処置することができる疾患としては、多発性硬化症、慢性ウイルス感染症（Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、およびヒトパピローマウイルス感染症など）、癌、特発性骨髄線維症、真性多血症、および本態性血小板血症が挙げられる。
【０００７】
本発明の別の態様は、上記の疾患を処置するための、下記の式Ｉのタンパク質−ポリマー接合体の使用に関し、
【化１】
0005547816.tif 000002
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜５アルキル、Ｃ２〜５アルケニル、Ｃ２〜５アルキニル、アリール、ヘテロアリール、Ｃ３〜８シクロアルキル、またはＣ３〜８ヘテロシクロアルキルであり、Ａ１およびＡ２の各々は、独立にポリマー部分であり、Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３の各々は、独立に、結合または連結官能基であり、Ｐはインターフェロン−α部分であり、ｍは０または１〜１０の整数であり、ｎは１〜１０の整数である。
【０００８】
上記の式について触れると、当該タンパク質−ポリマー接合体は以下の特徴のうちの１以上を有してもよい：Ｇ３は結合であり、Ｐはインターフェロン−α部分であり、このインターフェロン−α部分のＮ末端のアミノ基はＧ３に結合され、Ａ１およびＡ２は、２〜１００ｋＤ（好ましくは１０〜３０ｋＤ）の分子量を有するポリアルキレンオキシド部分であり、Ｇ１およびＧ２の各々は、
【化２】
0005547816.tif 000003
（式中、式Ｉに示されるように、ＯはＡ１またはＡ２に結合され、ＮＨは、炭素原子に結合される）であるか、またはＧ１およびＧ２の各々は、尿素、スルホンアミド、もしくはアミド（これらにおいて、Ｎは、式Ｉに示されるように、炭素原子に結合される）であり、ｍは４であり、ｎは２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々はＨであり、Ｐは、１〜４つのさらなるアミノ酸残基を含有する修飾されたインターフェロン−α部分である。
【０００９】
用語「アルキル」は、一価の直鎖または分枝状の炭化水素ラジカルを指す。アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、およびｎ−ペンチルが挙げられる。同様に、用語「アルケニル」または「アルキニル」は、１以上のＣ＝Ｃ二重結合または１以上のＣ≡Ｃ三重結合を含有する、一価の直鎖または分枝状の炭化水素ラジカルを指す。
【００１０】
用語「アルキレン」は、二価の直鎖または分枝状の炭化水素ラジカルを指す。同様に、用語「アルケニレン」または「アルキニレン」は、１以上のＣ＝Ｃ二重結合または１以上のＣ≡Ｃ三重結合を含有する、二価の直鎖または分枝状の炭化水素ラジカルを指す。
【００１１】
用語「アリール」は、少なくとも１つの芳香環を有する炭化水素環系（単環式または二環式）を指す。アリール部分の例としては、フェニル、ナフチル、およびピレニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
用語「ヘテロアリール」は、環系の一部としてＯ、Ｎ、またはＳなどの少なくとも１つのヘテロ原子を含有し、かつ残部は炭素である少なくとも１つの芳香環を有する、炭化水素環系（単環式または二環式）を指す。ヘテロアリール部分の例としては、フリル、ピロリル、チエニル、オキサゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、キナゾリニル、およびインドリルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
用語「シクロアルキル」は、炭素環原子のみを有する部分的にもしくは完全に飽和の単環式または二環式の環系を指す。例としては、シクロプロパニル、シクロペンタニル、およびシクロヘキサニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、炭素に加えて、１以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、もしくはＳ）を環原子として有する、部分的にもしくは完全に飽和の単環式または二環式の環系を指す。例としては、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、および１，４−オキサゼパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本願明細書中で言及されるアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびヘテロシクロアルキルは、置換されたものおよび非置換のものの両方を含む。置換基の例としては、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ５〜Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ２０ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、ヒドロキシ、ハロゲン、チオ、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、およびカルボン酸エステルが挙げられる。
【００１６】
用語「ポリアルキレンオキシド部分」は、線状、分枝状、または星型のポリアルキレンオキシドから誘導される一価のラジカルを指す。ポリアルキレンオキシド部分の分子量は、２〜１００ｋＤであってもよい。このポリアルキレンオキシド部分は、飽和または不飽和のいずれかである。ポリアルキレンオキシド部分の例としては、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリイソプロピレンオキシド、ポリブテニレンオキシド、およびこれらのコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、または炭水化物系ポリマーなどの他のポリマーも、それらが抗原性でないか、毒性でないか、または免疫応答を誘発しないかぎり、当該ポリアルキレンオキシド部分を置き換えるために使用することができる。このポリアルキレンオキシド部分は、置換または非置換のいずれかである。例えば、このポリアルキレンオキシド部分は、メトキシでキャップされたポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）であることができる。
【００１７】
用語「インターフェロン−α部分」は、いずれかのインターフェロン−αから誘導される一価のラジカルを指す。「インターフェロン−α」は、ウイルス複製および細胞増殖を阻害し免疫応答を調節する、高度に相同的な、種特異的なタンパク質のファミリーを指す。Ｂｏｎｎｅｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．、１９８４年、第３巻、第６号、５８０−５９８頁、およびＦｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ、１９８６年、第３巻、補遺２、Ｓ１５７−１６０頁を参照。この「インターフェロン−α」は、天然に存在する形態にあってもよいし、または修飾された形態にあってもよい。修飾されたインターフェロン−αは、例えば、インターフェロン−α、およびこのインターフェロンのＮ末端に１〜４つのさらなるアミノ酸残基を含有するタンパク質であてもよい。このような修飾されたインターフェロンの一例は、
【化３】
0005547816.tif 000004
であり、式中、ＩＦＮはインターフェロン−α２ｂ部分を表し、このインターフェロン−α２ｂ部分のＮ末端のアミノ基は、式中のカルボニル基に結合されている。
【００１８】
多くのタイプのインターフェロン−αタンパク質が市販されており、例としては、シェリング・コーポレーション（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニュージャージー州ケニルワース（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ）によって提供されているイントロン（Ｉｎｔｒｏｎ）−Ａ  インターフェロン、ホフマン・ラ・ロッシュ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）、ニュージャージー州ナットリー（Ｎｕｔｌｅｙ）によって提供されているロフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ）  インターフェロン、ベーリンガー・インゲルハイム・ファーマシューティカル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、コネチカット州リッジフィールド（Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ）によって提供されているベロフォー（Ｂｅｒｏｆｏｒ）  α２インターフェロン、住友（Ｓｕｍｉｔｏｍｏ）、日本によって提供されているスミフェロン（Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ）、およびグラクソウェルカム（Ｇｌａｘｏ−Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｌｔｄ．）、英国ロンドンによって提供されているウェルフェロン（Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ）  インターフェロン  α−ｎ１（ＩＮＳ）が挙げられる。
【００１９】
下に列挙するのは、前駆体形態または成熟形態のいずれかにある５つの例示的なヒトのインターフェロン−αタンパク質のアミノ酸配列である。
ｍａｌｔｆａｌｌｖａ  ｌｌｖｌｓｃｋｓｓｃ  ｓｖｇｃｄｌｐｑｔｈ  ｓｌｇｓｒｒｔｌｍｌ  ｌａｑｍｒｒｉｓｌｆ  ｓｃｌｋｄｒｈｄｆｇ  ｆｐｑｅｅｆｇｎｑｆ  ｑｋａｅｔｉｐｖｌｈ  ｅｍｉｑｑｉｆｎｌｆ  ｓｔｋｄｓｓａａｗｄ  ｅｔｌｌｄｋｆｙｔｅ  ｌｙｑｑｌｎｄｌｅａ  ｃｖｉｑｇｖｇｖｔｅ  ｔｐｌｍｋｅｄｓｉｌ  ａｖｒｋｙｆｑｒｉｔ  ｌｙｌｋｅｋｋｙｓｐ  ｃａｗｅｖｖｒａｅｉ  ｍｒｓｆｓｌｓｔｎｌ  ｑｅｓｌｒｓｋｅ  配列番号：１
（Ｋｒａｓａｇａｋｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．、２００８年、第２６巻、第６号、５６２−５６８頁を参照）
ｃｄｌｐｑｔｈｓｌｇ  ｓｒｒｔｌｍｌｌａｑ  ｍｒｋｉｓｌｆｓｃｌ  ｋｄｒｈｄｆｇｆｐｑ  ｅｅｆｇｎｑｆｑｋａ  ｅｔｉｐｖｌｈｅｍｉ  ｑｑｉｆｎｌｆｓｔｋ  ｄｓｓａａｗｄｅｔｌ  ｌｄｋｆｙｔｅｌｙｑ  ｑｌｎｄｌｅａｃｖｉ  ｑｇｖｇｖｔｅｔｐｌ  ｍｋｅｄｓｉｌａｖｒ  ｋｙｆｑｒｉｔｌｙｌ  ｋｅｋｋｙｓｐｃａｗ  ｅｖｖｒａｅｉｍｒｓ  ｆｓｌｓｔｎｌｑｅｓ  ｌｒｓｋｅ  配列番号：２
（Ｋｌａｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、第２７４巻、第４号、６６１−６７５頁を参照）
ｍｃｄｌｐｑｔｈｓｌ  ｇｓｒｒｔｌｍｌｌａ  ｑｍｒｒｉｓｌｆｓｃ  ｌｋｄｒｈｄｆｇｆｐ  ｑｅｅｆｇｎｑｆｑｋ  ａｅｔｉｐｖｌｈｅｍ  ｉｑｑｉｆｎｌｆｓｔ  ｋｄｓｓａａｗｄｅｔ  ｌｌｄｋｆｙｔｅｌｙ  ｑｑｌｎｄｌｅａｃｖ  ｉｑｇｖｇｖｔｅｔｐ  ｌｍｋｅｄｓｉｌａｖ  ｒｋｙｆｑｒｉｔｌｙ  ｌｋｅｋｋｙｓｐｃａ  ｗｅｖｖｒａｅｉｍｒ  ｓｆｓｌｓｔｎｌｑｅ  ｓｌｒｓｋｅ  配列番号：３
（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号  ＡＡＰ２００９９、２００３年４月３０日版を参照）
ｍａｌｌｆｐｌｌａａ  ｌｖｍｔｓｙｓｐｖｇ  ｓｌｇｃｄｌｐｑｎｈ  ｇｌｌｓｒｎｔｌｖｌ  ｌｈｑｍｒｒｉｓｐｆ  ｌｃｌｋｄｒｒｄｆｒ  ｆｐｑｅｍｖｋｇｓｑ  ｌｑｋａｈｖｍｓｖｌ  ｈｅｍｌｑｑｉｆｓｌ  ｆｈｔｅｒｓｓａａｗ  ｎｍｔｌｌｄｑｌｈｔ  ｅｌｈｑｑｌｑｈｌｅ  ｔｃｌｌｑｖｖｇｅｇ  ｅｓａｇａｉｓｓｐａ  ｌｔｌｒｒｙｆｑｇｉ  ｒｖｙｌｋｅｋｋｙｓ  ｄｃａｗｅｖｖｒｍｅ  ｉｍｋｓｌｆｌｓｔｎ  ｍｑｅｒｌｒｓｋｄｒ  ｄｌｇｓｓ  配列番号：４
（Ｃａｐｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８５年、第５巻、第４号、７６８−７７９頁を参照）
ｌｓｙｋｓｉｃｓｌｇ  ｃｄｌｐｑｔｈｓｌｇ  ｎｒｒａｌｉｌｌａｑ  ｍｇｒｉｓｐｆｓｃｌ  ｋｄｒｈｄｆｇｌｐｑ  ｅｅｆｄｇｎｑｆｑｋ  ｔｑａｉｓｖｌｈｅｍ  ｉｑｑｔｆｎｌｆｓｔ  ｅｄｓｓａａｗｅｑｓ  ｌｌｅｋｆｓｔｅｌｙ  ｑｑｌｎｎｌｅａｃｖ  ｉｑｅｖｇｍｅｅｔｐ  ｌｍｎｅｄｓｉｌａｖ  ｒｋｙｆｑｒｉｔｌｙ  ｌｔｅｋｋｙｓｐｃａ  ｗｅｖｖｒａｅｉｍｒ  ｓｌｓｆｓｔｎｌｑｋ  ｒｌｒｒｋｄ  配列番号：５
（Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．、１９８５年、第５巻、第２号、２２９−２３８頁を参照）。
【００２０】
１つの例では、本発明の接合体を作製するために使用されるインターフェロン−αタンパク質は、上に列挙されたアミノ酸配列のうちの１つと、または成熟したインターフェロンαに相当するその断片と少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％）同一のアミノ酸配列を有する。
【００２１】
２つのアミノ酸配列の「％同一性」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０年、第８７巻、２２６４−６８頁のアルゴリズムを使用し、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、５８７３−７７頁にあるように変更して、決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０年、第２１５巻、４０３−１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いてＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年、第２５巻、第１７号、３３８９−３４０２頁に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【００２２】
用語「連結官能基」は、一方の末端が当該ポリマー部分に連結されており他端がタンパク質部分に連結されている二価の官能基を指す。例としては、−Ｏ−、−Ｓ−、カルボン酸エステル、カルボニル、カーボネート、アミド、カルバメート、尿素、スルホニル、スルフィニル、アミノ、イミノ、ヒドロキシアミノ、ホスホネート、またはホスフェート基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
上記のタンパク質−ポリマー接合体は、遊離形態に、または適宜塩の形態にあってもよい。塩は、例えば、アニオンと本発明のタンパク質−ポリマー接合体上の正に帯電した基（例えば、アミノ）との間で形成されうる。好適なアニオンとしては、塩化物アニオン、臭化物アニオン、ヨウ化物アニオン、硫酸アニオン、硝酸アニオン、リン酸アニオン、クエン酸アニオン、メタンスルホン酸アニオン、トリフルオロ酢酸アニオン、および酢酸アニオンが挙げられる。同様に、塩は、カチオンと、本発明のタンパク質−ポリマー接合体上の負に帯電した基（例えば、カルボン酸アニオン）との間でも形成されうる。好適なカチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、およびアンモニウムカチオン（テトラメチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。
【００２４】
加えて、当該タンパク質−ポリマー接合体は、１以上の二重結合、または１以上の不斉中心を有してもよい。このような接合体は、ラセミ化合物、ラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、およびｃｉｓ−もしくはｔｒａｎｓ−またはＥ−もしくはＺ−二重結合異性体として現れる可能性がある。
【００２５】
本発明のタンパク質−ポリマー接合体の一例が下に示される。
【化４】
0005547816.tif 000005
式中、ｍＰＥＧは２０ｋＤの分子量を有し、ＩＦＮはインターフェロン−α２ｂ部分である。
【００２６】
上記の障害のうちの１つを処置するための医薬の製造のための当該接合体の使用も本発明の範囲内にある。
【００２７】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、下記の説明で示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、下記の説明からおよび特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明を実施するために使用されるタンパク質−ポリマー接合体は、化学分野で周知の合成方法、例えば、米国特許出願第１２／１９２，４８５号明細書に記載される方法によって調製することができる。スキーム１は、本発明のタンパク質−ポリマー接合体を調製する一例を示す。アセタール基を含有するジアミン化合物１がＮ−ヒドロキシスクシンイミジルカーボネートｍＰＥＧ（すなわち、化合物２）と反応に供され、ジペグ（ＰＥＧ）化された化合物３が形成され、この化合物３は、その後アルデヒド４へと変換される。このアルデヒド化合物は、還元的アルキル化を介する、遊離アミノ基を有するタンパク質との反応に供され、本発明のタンパク質−ポリマー接合体が得られる。
【化５】
0005547816.tif 000006
【００２９】
このように合成されたタンパク質−ポリマー接合体は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動、透析、限外濾過、または超遠心分離法などの方法によってさらに精製することができる。
【００３０】
上記の化学反応は、溶媒、試薬、触媒、保護基および脱保護基試薬、および特定の反応条件を使用することを含む。上記の化学反応は、本願明細書に具体的に記載される工程の前または後のいずれかに、タンパク質−ポリマー接合体の合成を最終的に可能にするために、好適な保護基を付加または除去するための工程をさらに含んでもよい。加えて、所望のタンパク質−ポリマー接合体を与えるために、種々の合成工程は、別の順序または順番で実施されてもよい。適用できるタンパク質−ポリマー接合体を合成する上で有用な合成化学的変換および保護基の方法論（保護および脱保護）は当該技術分野で公知であり、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ、「Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ編、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）ならびにこれらの後続版に記載されているものが挙げられる。
【００３１】
本発明の接合体は、非常に高い純度を有することができる。つまり、接合体分子の６０％以上（例えば、７０％、８０％、または９０％）が、タンパク質部分の配列およびポリマー部分へのそのタンパク質部分の結合位置を含めてすべての面において同一である。
【００３２】
本発明の接合体は、接合体の形態で薬学的に活性である可能性がある。あるいは、本発明の接合体は、タンパク質部分とポリマー部分との間の連結部分を酵素によって切断することにより、薬学的に活性なインターフェロン−αをインビボで（例えば、加水分解を通して）放出することができる。インビボで連結部分を切断することに関与する酵素の例としては、酸化酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、またはデヒドロゲナーゼ）、還元酵素（例えば、ケトレダクターゼ）、および加水分解酵素（例えば、プロテアーゼ、エステラーゼ、スルファターゼ、またはホスファターゼ）が挙げられる。
【００３３】
本発明の接合体は、多発性硬化症、慢性ウイルス感染症（Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、およびヒトパピローマウイルス感染症など）、癌、特発性骨髄線維症、真性多血症、および本態性血小板血症を処置するために使用することができる。本発明の接合体は、予想外に長いインビボ半減期、低下した薬物用量、および／または長期の投与期間を有する。
【００３４】
本願明細書で使用する場合、用語「処置すること」または「処置」は、障害、その障害の症候、その障害の続発性の疾患もしくは障害、またはその障害に対する素因を有する対象（ヒトまたは動物）への、その障害、その障害の症候、その障害の続発性の疾患もしくは障害、またはその障害に対する素因を治癒させ、緩和し、軽減し、治療し、または寛解させる目的をもった、タンパク質−ポリマー接合体を含む組成物の施用または投与として定義される。「有効量」は、処置された対象に治療効果をもたらす、タンパク質−ポリマー接合体の量を指す。この治療効果は、客観的（すなわち、いくつかの試験またはマーカーによって測定可能）であってもよいし、または主観的（すなわち、対象が効果の徴候を与えるかまたは効果を感じる）であってもよい。
【００３５】
有効量の上記のタンパク質−ポリマー接合体のうちの少なくとも１つと、薬学的に許容できる担体とを含有する医薬組成物も、本発明の範囲内にある。さらに、本発明は、有効量の当該タンパク質−ポリマー接合体のうちの１以上を、１以上の疾患を有する患者に投与する方法を含む。有効用量は、当業者が認識するとおり、例えば、タンパク質−ポリマー接合体の加水分解の速度、処置するべき疾患のタイプ、投与経路、賦形剤の使用、および他の治療的処置との同時使用の可能性に応じて、変わることになろう。
【００３６】
本発明の方法を実施するために、上記の化合物のうちの１以上を有する組成物は、非経口投与、経口投与、鼻内投与、直腸投与、局所投与、または口腔内投与されてもよい。本願明細書で使用する場合の用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病巣内、腹腔内、気管内または頭蓋内の注射、ならびにいずれかの好適な輸液手法を指す。
【００３７】
滅菌注射用組成物は、無毒な非経口的に許容できる希釈剤または溶媒中の溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であることができる。用いることができる許容できる媒質および溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来から用いられる（例えば、合成のモノグリセリドまたはジグリセリド）。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体など脂肪酸は、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容できる油（とりわけそれらのポリオキシエチル化体において）の場合と同様に、注射剤の調製において有用である。これらの油性の溶液または懸濁液は、長鎖アルコールの希釈剤もしくは分散剤、またはカルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤も含有することができる。ＴｗｅｅｎもしくはＳｐａｎなどの他の一般に使用される界面活性剤、または薬学的に許容できる固体、液体、もしくは他の剤形の製造において一般に使用される他の類似の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティー向上剤も、製剤化の目的で使用することができる。
【００３８】
経口投与のための組成物は、カプセル、錠剤、エマルション、ならびに水性の懸濁液、分散液、および溶液などのいずれの経口的に許容できる剤形であってもよい。錠剤の場合には、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も、典型的に添加される。カプセル剤形態での経口投与のために、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性の懸濁液またはエマルションが経口投与されるとき、有効成分は、乳化剤または懸濁剤と組み合わされて、油相に懸濁または溶解させることができる。所望に応じて、特定の甘味剤、矯味矯臭剤、または着色剤が添加されてもよい。
【００３９】
鼻内エアロゾルまたは吸入組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の手法に従って調製することができる。例えば、このような組成物は、ベンジルアルコールまたは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティーを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または当該技術分野で公知の他の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製することができる。上記の化合物のうちの１以上を有する組成物は、直腸投与のために、座薬の形態で投与することもできる。
【００４０】
薬学的に許容できる担体は、１以上の活性な上記の化合物とともに、通例的に使用される。医薬組成物におけるこの担体は、その担体が、組成物の有効成分と相溶性であり（そして、好ましくは、その有効成分を安定化することができ）かつ処置されるべき対象にとって有害でないという意味で、「許容できる」ものでなければならない。上記の化合物の送達のために、１以上の溶解補助剤を、薬学的賦形剤として利用することができる。他の担体の例としては、コロイド状の酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、およびＤ＆Ｃ  Ｙｅｌｌｏｗ  ＃  １０が挙げられる。
【００４１】
好適なアッセイを使用して、種々の疾患を処置する上での上記の接合体の有効性を予備的に評価することができる。例えば、真性多血症および本態性血小板血症を処置する上での当該接合体の有効性は、それぞれＫｉｌａｄｊｉａｎら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、第１１２巻、第８号、３０６５−７２頁およびＬａｎｇｅｒら、Ｈａｅｔａｔｏｌｏｇｉｃａ、２００５年、第９０巻、１３３３−１３３８頁に記載される方法に従って評価することができる。
【００４２】
下記の実施例は、単に例示に過ぎないと解釈されるべきであり、いかなる意味でも本開示の他の記載を限定するものではないと解釈されるべきである。さらなる詳細な検討がなくても、本願明細書中の記載に基づいて、当業者は本発明を完全に利用することができると考えられる。本願明細書中で引用したすべての刊行物は、参照によりその全体を本願明細書に援用したものとする。
【実施例】
【００４３】
ジ−ＰＥＧアルデヒドの調製
【化６】
0005547816.tif 000007
２０ｋＤ  ＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕを、サンバイオ（（ＳｕｎＢｉｏ  Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州）から購入した２０ｋＤ  ｍＰＥＧＯＨから、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、１９９３年、第４巻、５６８−５６９頁に記載される方法に従って調製した。
【００４４】
ジクロロメタン中の６−（１，３−ジオキソラン−２−イル）ヘキサン−１，５−ジアミンの溶液（９．０３ｍｇのジアミン、４７．８μｍｏｌを含有する１１．９７ｇの溶液）を、２０ｋＤ  ＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕ（１．７２ｇ、８６．０μｍｏｌ）を含有するフラスコに加えた。ＰＥＧＯ（Ｃ＝Ｏ）ＯＳｕが完全に溶解した後、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７９μｍｏｌ、４７８μｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で２４時間撹拌し、次いでメチルｔ−ブチルエーテル（２００ｍＬ）を撹拌しながら滴下した。得られた沈殿物を集め、真空下で乾燥し、ジ−ＰＥＧアセタール（１．６９ｇ、９８％）を白色固体として得た。
【００４５】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ  ７．１６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１０−３．９５（ｍ，４Ｈ），１．８０−１．６５（ｍ，１Ｈ），１．６５−１．５０（ｍ，１Ｈ），１．４８−１．１０（ｍ，６Ｈ）。
【００４６】
【化７】
0005547816.tif 000008
ジ−ＰＥＧアセタール（４．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ｐＨ  ２．０バッファー（クエン酸、４０ｍＬ）に懸濁させた。この反応混合物を３５℃で２４時間撹拌し、次いでジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮し、次いでジクロロメタン（２０ｍＬ）に再溶解させた。この溶液を、メチルｔ−ブチルエーテル（４００ｍＬ）に撹拌しながら滴下した。得られた沈殿物を集め、減圧で乾燥し、ジ−ＰＥＧアルデヒド（３．８ｇ、９５％）を白色固体として得た。
【００４７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）  δ  ９．６０（ｓ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１０−３．９５（ｍ，４Ｈ），３．９５−３．８０（ｍ，１Ｈ），３．００−２．８５（ｍ，２Ｈ），２．５８−２．３６（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．１５（ｍ，６Ｈ）。
【００４８】
修飾されたインターフェロンの調製
【化８】
0005547816.tif 000009
修飾された組み換えヒトインターフェロン−α２ｂをヒドゲノムＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲ方法によってクローン化した。オリゴヌクレオチドは、ヒトインターフェロン−α２ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｊ００２０７、２００８年１月８日）の隣接配列（ｆｌａｎｋｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に基づいて合成した。誘導されたＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にサブクローニングした。このＩＦＮバリアントをｐＧＥＭ−Ｔクローンによって再度ＰＣＲ増幅し、その後、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター駆動のベクターであるタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に、ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩをクローニング部位として使用して、サブクローニングした。次いでベクターｐＥＴ−２４ａを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ  ３）−ＲＩＬ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））株へと形質転換した。形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ  ３）−ＲＩＬをカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍＬ）の存在下で維持することにより、高発現クローンを選択した。
【００４９】
１０００ｍＬのフラスコの中でのＰｒｏ−ＩＦＮ遺伝子を有するＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ  ３）−ＲＩＬの増殖のために、テリフィック培地（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＢＤ、２００ｍＬ）を用いた。このフラスコを３７℃で、２３０ｒｐｍで１６時間振盪した。回分発酵および半回分発酵を、５リットルのジャーファーメンター（Ｂｉｏｆｌｏ  ３０００；ニュー・ブランズウィック・サイエンティフィック（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．）、ニュージャージー州エジソン（Ｅｄｉｓｏｎ））で実施した。この回分発酵では、１５０ｍＬの一晩予め培養した接種物、ならびにカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍＬ）、０．４％  グリセロール、および０．５％（ｖ／ｖ）  微量元素（１０ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、０．８４ｇ／ＬのＥＤＴＡ、５０ｍｌ／ＬのＨＣｌ）を含む３Ｌのテリフィック培地を使用した。溶存酸素濃度を３５％に制御し、５Ｎ  ＮａＯＨ水溶液を加えることによりｐＨを７．２に保った。６００ｇ／Ｌのグルコースおよび２０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有する栄養液を調製した。ｐＨが設定値よりも高い値にまで上昇したとき、適切な量のこの栄養液を、培地中のグルコース濃度を上昇させるために加えた。Ｐｒｏ−ＩＦＮ遺伝子の発現を、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度まで加えることにより誘導し、３時間インキュベーションした後に、培地を回収した。
【００５０】
集めた細胞ペレットを、およそ１：１０（湿重量ｇ／ｍＬ）の比のＴＥＮバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再懸濁させ、マイクロフルイダイザーによって微細化し、次いで１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。封入体（ＩＢ）を含有するペレットをＴＥＮバッファーで２回洗浄し、上記のとおりに遠心分離した。次いで、ＩＢを含有するペレットを１５０ｍＬの４ＭグアニジウムＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）水溶液に懸濁させ、２０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。次いでこのＩＢを５０ｍＬの６Ｍ  ＧｕＨＣｌ溶液に溶解させた。このＧｕＨＣｌで可溶化した物質を２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。リフォールディング（再折りたたみ）を、変性したＩＢを１．５Ｌの新しく調製したリフォールディングバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）（これは、添加の際だけ撹拌した）で希釈することにより開始した。リフォールディング反応混合物を、４８時間、撹拌せずにインキュベーションした。リフォールディングした組み換えヒトインターフェロン−α２ｂ（すなわち、Ｐｒｏ−ＩＦＮ）を、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムクロマトグラフィーによるさらなる精製のために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ尿素を含む、ｐＨ  ７．０）に対して透析した。
【００５１】
リフォールディングした組み換えヒトタンパク質Ｐｒｏ−ＩＦＮを、Ｑ−セファロースカラム（ジーイー・アマシャム・ファルマシア（ＧＥ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ペンシルベニア州ピッツバーグ）にロードした。このカラムを予め平衡化し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ  ７．０）で洗浄した。生成物を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ  ７．０）および２００ｍＭ  ＮａＣｌの混合物を用いて溶出した。Ｐｒｏ−ＩＦＮを含有する分画を、２８０ｎｍでのその吸光度に基づいて集めた。Ｐｒｏ−ＩＦＮの濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用するタンパク質アッセイキット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード）によって測定した。
【００５２】
タンパク質−ポリマー接合体の調製
【化９】
0005547816.tif 000010
水（７２ｍＬ）中の上で調製したジ−ＰＥＧアルデヒド（１．２ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、２Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ  ４．０、５ｍＬ）およびＰｒｏ−ＩＦＮ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有するｐＨ  ７．０バッファー２２．２ｍＬ中に２００ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム水溶液（４００ｍＭ、１．２５ｍＬ、０．５ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を暗所で１６時間撹拌し、ＳＰ  ＸＬ  セファロースクロマトグラフィーによって精製した。所望のポリマー−タンパク質接合体を含有する分画を、保持時間および２８０ｎｍでの吸光度に基づいて集めた。接合体の濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を使用するタンパク質アッセイキット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）、イリノイ州ロックフォード）によって測定した。この接合体の単離収率は、およそ４０％かまたはこれよりも高かった。
【００５３】
他の実施形態
本願明細書に開示される特徴のすべては、いずれの組み合わせで組み合わされてよい。本願明細書に開示される各特徴は、同じ、等価なまたは同様の目的を果たす別の特徴によって置き換えられてもよい。従って、明示的に特段の記載がない限り、開示された各特徴は、等価なまたは類似の特徴の系列全体の一例にすぎない。
【００５４】
上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に把握することができ、本発明を種々の使用法および条件に適合させるために、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、本発明の種々の変更および改変をなすことができる。従って、他の実施形態も以下の特許請求の範囲の中に含まれる。