(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ジャポニカ種ウナギのシトクロムｂ遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、
配列表の配列番号１に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるフォワード側プライマーと、
配列番号２に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
非ジャポニカ種ウナギのシトクロムｂ遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、
配列表の配列番号１に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるフォワード側プライマーと、
配列番号３に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
非ジャポニカ種ウナギのシトクロムｂ遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、
配列表の配列番号１に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるフォワード側プライマーと、
配列番号４に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセット。
【請求項４】
ジャポニカ種ウナギと非ジャポニカ種ウナギとを含んでなる集団から非ジャポニカ種ウナギの存在を検出する検査方法であって、
前記集団における前記非ジャポニカ種ウナギから抽出した前記非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡを、請求項１から３のいずれか1つに記載のプライマーセットを用いて増幅して検出することを特徴とする検査方法。
【請求項５】
前記集団は、所定数のウナギの頭部により構成されていることを特徴とする請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか1つに記載のプライマーセットを用いて増幅された非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡを調べることにより、前記非ジャポニカ種ウナギの種を同定することを特徴とする非ジャポニカ種ウナギの種同定方法。
【請求項７】
請求項１または３に記載のプライマーセットを用いて増幅された前記非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡを、制限酵素HinfIおよび／または制限酵素RsaIで消化し、
消化により得られる制限断片長の比較に基づいて非ジャポニカ種ウナギの種を同定することを特徴とする請求項６に記載の非ジャポニカ種ウナギの種同定方法。
【請求項８】
請求項１に記載のプライマーセットを用いて増幅された前記非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡを、制限酵素HinfIおよび／または制限酵素RsaIで消化し、
消化により得られる制限断片長の比較に基づいて非ジャポニカ種ウナギの種を同定することを特徴とする請求項６に記載の非ジャポニカ種ウナギの種同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非ジャポニカウナギ混入の検査に利用可能なプライマーセット、該プライマーセットを使用した検査方法、および該プライマーセットを使用した、非ジャポニカ種ウナギについての種の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウナギは、ウナギ目ウナギ科 Anguillidaeに属する魚類であり、日本人の食文化に欠かせない食品の1つである。そのため、日本に加えて周辺諸国でも養殖されており、我が国では、日本種ウナギのほか、外国種ウナギも流通している。このうち、日本種ウナギ（Anguilla japonica、以下、ジャポニカ種とも称す）は、我が国の消費者の間で最も人気があり、価格も高い。一方、外国種ウナギ（以下、非ジャポニカ種ウナギとも称す）は日本種ウナギと比較していずれも安価で取引されている。
【０００３】
このような値段の開きを主な原因として、近年、中国産の外国種ウナギを国産の日本種ウナギの集団の中に混入させるとともに、すべて国産日本種ウナギであると偽装表示して販売する例が後を絶たない。
【０００４】
したがって、混入された外国種ウナギの存在を検出するための方法が求められており、従来においては、ウナギの種類を１個体づつ鑑定する方法が提案されている（例えば特許文献１）。具体的に説明すると、特許文献１には、ウナギ種鑑定用プライマーセットおよび該プライマーセットを用いたウナギ種の鑑定方法が記載されている。特許文献１に記載されたプライマーセットはウナギＤＮＡの所定領域を増幅可能であり、該プライマーセットを用いて増幅したＤＮＡ領域をＰＣＲ制限断片多型法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法）等を用いて調べることで、ウナギの種を同定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１１−２７６１７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１に記載された従来の方法では、外国種ウナギであるか否かの事実を判定するために、ＤＮＡの増幅を行った後、増幅されたＤＮＡを制限酵素で消化して断片長の比較をするなど、増幅したＤＮＡ領域について調べる（分析する）必要があった。よって、従来技術による場合、その個体が外国種ウナギか否かの結論が出るまでに多くの手間と時間がかかる。
【０００７】
また、当該鑑定方法は、制限酵素による消化断片パターンを判定する方法であるため、数十匹という程度以上の多数検体を同時に判定するのは困難で、ウナギ１個体づつ行う必要があった。よって、集団を構成するウナギすべてについて鑑定を行うためには、上記の核酸増幅および分析操作を各個体ごとに実行することとなり、さらに手間や時間、加えてコストも嵩むこととなる。
【０００８】
したがって、このような手間や時間、コストの問題から、特許文献１に記載される鑑定方法は、多数の個体により構成される、加工用などのウナギの集団における外国種ウナギ混入の検査に適用させることは、現実的には困難であった。
【０００９】
本発明はこのような事情に基づきなされたものであり、従来よりも簡便に外国種ウナギの存在を検出可能なプライマーセット、従来よりも簡便な外国種ウナギ混入の検査方法、および混入された外国種ウナギの種の同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以上の手間や時間、コストの問題に鑑みて、本発明者は、従来の方法の見直しを行った。その結果、外国種ウナギ由来のＤＮＡをその種に関係なく増幅することで、混入の事実を確認することを着想した。本発明者は、鋭意研究の結果、集団における日本種ウナギ由来のＤＮＡは増幅せず、外国種ウナギ由来のＤＮＡのみを増幅可能なプライマーセット、および該プライマーセットを用いた集団における外国種ウナギの一括的な検出方法を完成させ、本発明を成すに至った。
【００１１】
（１）  すなわち、本発明の1つの態様として、本発明は、非ジャポニカ種ウナギのシトクロムｂ遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるフォワード側プライマーと、配列番号２に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセットに関する。
【００１２】
（２）  また、本発明の1つの態様として、本発明は、非ジャポニカ種ウナギのシトクロムｂ遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるフォワード側プライマーと、配列番号３に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセットに関する。
【００１３】
（３）  また、本発明の1つの態様として、本発明は、非ジャポニカ種ウナギのシトクロムｂ遺伝子における所定領域にハイブリダイズ可能である、配列表の配列番号１に示される塩基配列若しくは該塩基配列に相補的な塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるフォワード側プライマーと、配列番号４に示される塩基配列（ただし、ＴはＵであってもよい）からなるリバース側プライマーと、からなることを特徴とするプライマーセットに関する。
【００１４】
（４）  さらに、本発明の他の態様として、本発明は、ジャポニカ種ウナギと非ジャポニカ種ウナギとを含んでなるウナギの集団から非ジャポニカ種ウナギの存在を検出する検査方法であって、当該集団における非ジャポニカ種ウナギから抽出した非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡを、上記（１）から（３）のいずれか1つに記載のプライマーセットを用いて増幅して検出することを特徴とする検査方法に関する。
【００１５】
（５）  さらにまた、本発明の他の態様として、本発明は、上記（１）から（３）のいずれか1つに記載のプライマーセットを用いて増幅された非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡを調べることにより、非ジャポニカ種ウナギの種を同定することを特徴とする非ジャポニカ種ウナギの種同定方法に関する。
【００１６】
なお、外国種ウナギとしては、フランス産のA. anguilla 、オーストラリア産で斑点のあるA. reinhardti 、オーストラリア産で斑点の無いA. australis australis、インドネシア産のA. celebesensis 、フィリピン産のA. marmorata、アメリカ産のA. rostrata 等が知られているが、本明細書において、外国種ウナギまたは非ジャポニカ種ウナギとは、ウナギ科に属しており、ジャポニカ種でない種をいう。本発明に係るプライマーセットは、後述するように、非ジャポニカ種であるすべてのウナギ種由来のＤＮＡを増幅するが、ジャポニカ種ウナギ由来のＤＮＡについては増幅しない。
【００１７】
また、本明細書において、集団とは、「ウナギ個体全体」によって構成される場合のほか、「ウナギの体の一部」によって構成される場合も含む概念である。したがって、本明細書において、例えば以下説明するように抽出される場合に採取されるウナギの肉片は、体全体から直接的に採取される場合と、体の一部からさらに採取されて調製される場合とがある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、個々のウナギ個体に対する種の鑑定を必要とすることなく、ウナギの集団に対する一括的な処理により、極めて簡便にウナギの集団中に存在する外国種ウナギの検出、およびその種の同定を行うことができる。したがって、従来の方法を用いた場合に想定される、手間、時間、およびコストを大きく削減して外国種ウナギ混入の検査を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本実施形態の検査方法の処理フローを示す図である。
【図２】本実施形態の検査方法に係る核酸増幅において増幅される領域の塩基配列を示す図である。
【図３】本実施形態の検査方法に係る核酸増幅において増幅される領域の塩基配列を示す図であって、図２の続きである。
【図４】本実施形態のプライマーセットによるＰＣＲ産物を制限酵素HinfIおよび／またはRsaIを用いて消化することにより得られる制限断片長を示す表である。
【図５】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図６】核ＤＮＡ（GenBank: EU001923.1）の配列および核プライマーセットの選択領域を示す図である。
【図７】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図８】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図９】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１０】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１２】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１３】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１４】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１５】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【図１６】本実施形態のプライマーセットを用いた、アガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、図面を用いて本発明の好ましい実施形態について詳しく説明する。本実施形態は、ジャポニカ種ウナギに非ジャポニカ種ウナギが混入されて形成される集団、言い換えればジャポニカ種ウナギと非ジャポニカ種ウナギとを含んでなる集団中における非ジャポニカ種ウナギの存在を検出する方法、およびその非ジャポニカ種ウナギの種を同定する方法に関する。
【００２１】
本実施形態の非ジャポニカ種ウナギ混入の検査、および混入された非ジャポニカ種ウナギの種の同定は、図１に示すような処理フローに従って行うことができる。本実施形態においては、まず、所定数の個体により構成される、ウナギの集団を複数の小グループに分け、該小グループに由来するＤＮＡ抽出液を調製する。次に、この複数のＤＮＡ抽出液からそれぞれ一部を分離し、混合する（以下、当該混合により得られる試料を、混合ＤＮＡ試料と称す）。次いで、混合ＤＮＡ試料を用いて核酸増幅を行い、その増幅結果に基づき集団に非ジャポニカ種ウナギが存在しているか否か（すなわち、非ジャポニカ種ウナギが混入されているか否か）を判定する。そして、非ジャポニカ種ウナギが存在していると判定される場合に、増幅されたＤＮＡについてPCR−RFLP法等の分析を適用することにより、混入された非ジャポニカ種ウナギの種の同定を行う。以下、詳細に説明する。
【００２２】
まず、ステップＳ１０１において、所定数のウナギの集団を複数の小グループに分け、各小グループに由来するＤＮＡ抽出液を調製する。集団を構成するウナギ個体（またはそれに由来する体の一部）の数は特に限定されないが、例えば１０〜１０００個体分とすることができる。また、各小グループについても特に限定されず、例えば１〜１００個体とすることができる。集団を小クループに分割してＤＮＡを抽出することにより、非ジャポニカ種の混入が判明した場合に、どのグループに混入があったかをさかのぼって追跡することが比較的容易になる（さらに、非ジャポニカ種である個体を特定することも容易となる）ため、好ましい。
【００２３】
本実施形態において、集団を構成するウナギについては特に限定されるものではない。例えば、成鰻のほか、稚魚であるシラス、頭部などの体の一部のほか、蒲焼などの加工食品とすることができるが、頭部を用いることが特に好ましい。これにより、体のその他の部分は加工に用いることができるので、検査に必要なコストをさらに抑えることができる。また、集団を構成するウナギの個体数についても任意に設定できるが、例えば１０〜１０００個体、より具体的な例としては１００個体とすることができる。１００個体程度であれば、検査における処理が煩雑となるのを抑制できるため、特に好ましい。
【００２４】
また、本実施形態において行うＤＮＡ抽出方法についてはとくに限定されず、公知のいずれの方法も用いることができる。例えば、ウナギ頭部から採取した肉片を細かく砕き、STE含有バッファー中Proteinase K（（E.C. 3.4.21.64））で例えば５６℃で１時間〜２時間消化する。次に、得られた消化物について遠心分離および沈殿処理等のＤＮＡ精製処理、および酵素失活処理等を行い、ＤＮＡ抽出液を調製する。
【００２５】
次に、ステップＳ１０２において、各小グループについて調製した複数のＤＮＡ抽出液について、それぞれその一部を分離し、これらを混合して混合ＤＮＡ試料を調製する。
【００２６】
次いで、ステップＳ１０３において、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワード側プライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるリバース側プライマーからなるプライマーセット（以下、第１のプライマーセットと称す）、または、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワード側プライマーおよび配列番号３に示す塩基配列からなるリバース側プライマーからなるプライマーセット（以下、第２のプライマーセットと称す）、または配列番号１に示す塩基配列からなるフォワード側プライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるリバース側プライマーからなるプライマーセット（以下、第３のプライマーセットと称す）を用いて、混合ＤＮＡ試料中の核酸の増幅を行う。核酸増幅の方法については、特に限定されず、当業者が任意に選択して用いることができ、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とすることができる。当該ＰＣＲに用いる試薬キット、装置などは特に限定されず、市販のものから当業者が適宜選択して使用できる。また、ＰＣＲの成功を確かめることができるように、ジャポニカ種ウナギのＤＮＡの所定の領域を増幅するプライマーを、第１、第２または第３のプライマーセットに混合して用いるようにしてもよい（詳しくは後述）。なお、これらのプライマーは、常法により合成することが可能である。
【００２７】
第１のプライマーセットは、以下のような塩基配列を備える。
フォワード側プライマー：atccttacaggactattcctagcc（Ｔｍ＝６１．５）
リバース側プライマー：gaatcctagtaggtctttgtaggagaagtat（Ｔｍ＝６３．１）
【００２８】
また、第２のプライマーセットは、以下のような塩基配列を備える。
フォワード側プライマー：atccttacaggactattcctagcc（Ｔｍ＝６１．５）
リバース側プライマー：ggaagcacatatcctacgaatggt（Ｔｍ＝６６．０）
【００２９】
また、第３のプライマーセットは、以下のような塩基配列を備える。
フォワード側プライマー：atccttacaggactattcctagcc（Ｔｍ＝６１．５）
リバース側プライマー：gggggggggggaatcctagtaggtctttgtacgagaagtat（Ｔｍ=６９．７）
【００３０】
本実施形態に係るプライマーセットの設計について、具体的に説明する。ここで、図２および図３は、本実施形態の第１、第２および第３のプライマーセットによる増幅領域に係る塩基配列を示している。本実施形態に係る第１、第２および第３のプライマーセットは、非ジャポニカ種ウナギのミトコンドリアのシトクロムｂ遺伝子の所定の領域に対してハイブリダイズ可能であり、非ジャポニカ種由来の当該所定の領域については増幅するが、ジャポニカ種由来の当該所定の領域については増幅しないように設計した。
【００３１】
プライマーセットの設計に当たっては、まず、公開されているGenBank等のデータベースを用い、ウナギ科に属する種のシトクロムb領域について検討を行い、３’末端側の塩基がジャポニカ種のみ他種と異なる３つの領域を見出した（ジャポニカ種のみ塩基配列が異なる部位を、図２および図３では下線にて表している）。そして、さらに検討を重ねた結果、第１および第２のプライマーセットを設計した。第１または第２のプライマーセットを用いて核酸増幅を行ったとき、非ジャポニカ種ウナギにおいては上述の２つの領域がすべて一致しているため、増幅が進行する。一方、ジャポニカ種においては上述の２つの領域において３’末端側の塩基が異なることにより、不整合になり増幅が起こらない。したがって、第１のプライマーセットを用いた場合には、非ジャポニカ種ウナギ由来のＤＮＡを選択的に増幅する。
【００３２】
なお、本実施形態に係るプライマーセットを構成するフォワード側プライマー、およびリバース側プライマーについては、その塩基配列は、配列表の配列番号１、２および３に示したものと相補的な配列であってもよい。プライマーを構成する核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、従って、塩基配列中のTはUであってもよい。
【００３３】
また、非ジャポニカ種ウナギ混入の検査には、プライマーの塩基配列が改変されても、非ジャポニカ種ウナギＤＮＡの第１のプライマーセットまたは第２のプライマーセットを構成するそれぞれ２つのプライマーに挟まれる領域について選択的に増幅可能である限り、使用することができる。このようにプライマーセットの改変が可能であることを利用して、意図的に制限酵素部位を導入することも可能である。例えば、配列表の配列番号２に示す塩基配列について、制限酵素RsaIにより切断される部位を組み込むとともに、５’末端側に１０個のグアニンを付加した塩基配列を配列番号４に示す。第３のプライマーセットは、当該配列番号４に示す塩基配列からなるリバース側プライマーと、前述の配列番号１に示す塩基配列からなるフォワード側プライマーとからなるように設計している。第３のプライマーセットを用いてＤＮＡを増幅させたときの作用については後述する。なお、配列番号４に示す塩基配列からなるリバース側プライマーについても、その塩基配列は配列番号４に示したものの内、ＴはＵであってもよいことは、当業者には当然に理解できる。
【００３４】
処理フローの説明に戻ると、次に、ステップＳ１０４に進み、ステップＳ１０３における遺伝子増幅において、非ジャポニカ種ウナギ由来のＤＮＡが増幅されたか、判定する。
【００３５】
増幅されたか否かの判定は、例えばアガロースゲル電気泳動の結果、増幅されたＤＮＡに係る泳動バンドが確認できるか否かによって行うことができる。すなわち、集団に非ジャポニカ種ウナギが存在している場合、その種の違いに関係なく、非ジャポニカ種ウナギ由来のＤＮＡが増幅され、その泳動バンドが検出される。一方、非ジャポニカ種ウナギが存在していない場合（すなわち、集団がジャポニカ種ウナギのみで構成されている場合）、本実施形態のプライマーセットはジャポニカ種ウナギ由来のＤＮＡを増幅しないため、泳動バンドは検出されない。
【００３６】
以上のようにして確認を行った結果、ＤＮＡが増幅されていないと判定される場合は、集団に非ジャポニカ種ウナギが存在していないとして、処理を終了する。一方、ＤＮＡが増幅されていると判定される場合は、当該集団中に非ジャポニカ種ウナギが存在しているとして、ステップＳ１０５に進み、混入された非ジャポニカ種ウナギの種の同定を行う。
【００３７】
ステップＳ１０５においては、増幅したＤＮＡを調べ、混入された非ジャポニカ種ウナギの種の同定を行う。同定する方法は、図２および図３に示すように増幅される領域の塩基配列が種により異なっているため、例えば増幅領域の全塩基配列を決定することにより、種を同定するようにしてもよい。また、種ごとに塩基が異なる部位を比較することにより種を同定するようにしてもよい。
【００３８】
また、増幅したＤＮＡについて、簡便、迅速に行うことができるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を適用し、種を同定するようにしてもよい。ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を適用する場合には、例えば、ステップＳ１０３にて増幅したＤＮＡについて制限酵素を用いて消化を行い、該消化産物をゲル電気泳動にかけ、紫外線を照射して、泳動バンド（ＤＮＡ断片）を検出する。そして、検出された泳動バンドの長さの比較を行うことにより、種を同定する。使用する制限酵素については、第１または第３のプライマーセットを用いて核酸増幅を行った場合、例えば制限酵素HinfI、RsaIとすることができる。第１のプライマーセットを用いたときのPCR産物のHinfI、RsaIによる切断パターンを図４に示す。
【００３９】
ここで、現時点の国内市場においては、非ジャポニカ種ウナギのうち、A.anguilla、A.rostrata、A.marmorata、A.celebensesis、A.reinhardti、A.australis australis、およびA.mossambicaの７種が流通している。図４から明らかなように、制限酵素HinfI、RsaIを併用することにより、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法によってこれらの種を同定することが十分に可能である。また、混入された種の組み合わせによっては、制限酵素HinfIのみ、またはRsaIのみの使用によっても、その種を同定することは可能である。
【００４０】
ここで、図４から理解されるように、第１のプライマーセットを用いて核酸増幅を行った場合、A.anguilla種については制限酵素RsaIにより切断されないため、増幅されたＤＮＡがA.anguilla種に由来するのか（混入された種がA.anguilla種であるのか）、それとも制限酵素RsaIが失活しているのか区別することができない場合がある。
【００４１】
そのため、制限酵素RsaIを用いた種の同定を行うことが予め想定される場合には、ステップＳ１０３において第３のプライマーセットを用いて核酸増幅を行うことが好ましい。上述のとおり、第３のプライマーセットは、制限酵素RsaIにより切断される部位が組み込まれるとともに、５’末端側に１０個のグアニンが付加された、配列番号４の塩基配列からなるリバース側プライマーを備える。よって、当該第３のプライマーセットを用いることにより、A.anguilla種混入の場合にも制限酵素RsaIによる消化によりＤＮＡ断片が生じるようになる。また、電気泳動において、当該ＤＮＡ断片に基づく泳動バンドは、未消化物のバンド（５８８ｂｐ）とは３０ｂｐ離れた５５８ｂｐに出現するので、未消化物に基づく泳動バンドとの区別が容易である。
【００４２】
なお、ステップＳ１０５における混入した種の同定については、以上に例示したような分析方法を単独で適用してもよく、また２つ以上の分析方法を併用して種を同定するようにしてもよい。
【００４３】
以上、本発明の1つの実施形態について説明した。本発明によれば、集団を構成するウナギ全体に対する一括的な処理により、個々のウナギ個体に対する種の鑑定を必要とすることなく、非ジャポニカ種ウナギ混入の検出、および混入された種の同定を行うことができる。
【００４４】
より具体的に説明すると、従来技術において提案されているウナギの種の鑑定方法は、非ジャポニカ種ウナギか否か判定するために、抽出したＤＮＡを増幅し、増幅した該ＤＮＡについてＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等の分析を実行する必要があった。また、当該作業は、上述のとおり、１個体づつしか行うことができなかった。そのため、ウナギの集団への非ジャポニカ種ウナギの混入を検査するためには、集団を構成する１個体づつに対して、核酸増幅処理および増幅したＤＮＡの分析処理を実行する必要があった。
【００４５】
これに対し、本実施形態によれば、集団を構成するウナギ（またはウナギの体の一部）全体から抽出したＤＮＡに対する一括的な処理により、非ジャポニカ種ウナギ混入の検出、および混入された種の同定を行うことができる。しかも、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等の分析処理は、ＤＮＡの増幅が確認された場合のみ行えばよい。
【００４６】
よって、本実施形態によれば、従来の方法を用いた場合に想定される、手間、時間、およびコストを大きく削減して非ジャポニカ種ウナギ混入の検査を実現することができる。具体的には、１００個体の集団について検査を行う場合、検査を行う者の熟練の度合いや使用する装置の性能によって多少のばらつきはあるが、ＤＮＡサンプル（混合被検試料）を用意するまでに約５時間、遺伝子増幅と核酸増幅の確認に３時間の、計およそ８時間程度の一営業時間内で非ジャポニカ種ウナギの混入を検査できる。したがって、混入された種の同定を行った場合（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法による場合、約２時間）でも、およそ１０時間程度の時間で全過程を終了することができる。
【００４７】
以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、他の実施形態とすることも可能である。
【００４８】
例えば、本実施形態においては１つの集団を複数の小グループに分割し、それぞれでＤＮＡ抽出を行った後、その一部を混合して試料を調製し、該試料を用いて核酸増幅を行うことにより外国種ウナギ混入の有無を検出している。しかしながら、これに限定されるものではなく、他の態様としてもよい。例えば、集団を複数の小グループに分割することなく、まとめてＤＮＡを抽出し、核酸増幅に供するようにしてもよい。また、複数の集団由来のＤＮＡを混合して核酸増幅に供するようにしてもよく、この場合には、複数の集団に対する混入の検査に必要な手間等をさらに削減することも可能である。さらに、本実施形態においてはＤＮＡ抽出過程を含む場合を説明したが、持ち込まれたＤＮＡ抽出物を用いて、そのＤＮＡ抽出物が由来する集団における非ジャポニカ種ウナギの存在の検出、およびその種の同定を行うような態様としてもよい。
【００４９】
また、本実施形態においては、電気泳動に供することにより核酸の増幅を検出しているが、他の方法とすることももちろん可能であり、当業者が任意に選択することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ法により増幅を行い、蛍光検出によって核酸増幅を判定するようにしてもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をより詳しく説明する。しかしながら、本実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【００５１】
（実施例１）
まず、常法により合成した本実施形態の第１のプライマーセットを用いて、A.anguilla種、およびA.australis australis種由来のＤＮＡの増幅を行った。また、対照として、ジャポニカ種ウナギ（A. japonica）についても、第１のプライマーセットを用いた核酸増幅を試みた。
【００５２】
A.anguilla種、およびA.australis australis種からのＤＮＡ抽出作業は以下のようにして行った。まず、１．５ｍｌチューブに細かく砕いたそれぞれの肉片０．１ｇを秤量した。次に、タンパク分解及び酵素失活を行う為、サンプルの入った各チューブにSTE Buffer 1ml・ProteinaseK（20mg/ml）40μlを加え、５６℃の恒温槽で2時間インキュベートした。次いで、高速遠心分離にて沈殿物を沈殿させた後、サンプルの上澄み５００μｌにＰＣＩ（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール）を等量加え、液液抽出した。続いて、高速遠心分離機にて分離させた上層５００μｌを分離し、１００％冷エタノールを１ｍｌ、５ＭのＮａＣｌを３０μｌ加え、−８０℃で１時間インキュベートし、ＤＮＡを沈殿させた。そして、沈殿させたＤＮＡについて７０％冷エタノールを用いてさらに精製処理を行った後、上澄みを除去してｄＨ２Ｏを５０μｌ添加し、そのまま３０分室温でインキュベートしてＤＮＡ水溶液とした。
【００５３】
また、ジャポニカ種ウナギについては、１００個体に由来するＤＮＡを抽出した。具体的には、以下のようにＤＮＡ抽出作業を行った。まず、ウナギ頭部から４ｍｍのコルクボーラーを使用し、肉片を筒状でくり抜き出した。１匹につき０．０１ｇ採取し、１０匹分を１つのチューブにまとめた。各チューブに入れた肉片それぞれについて、上で説明したのと同様の方法でＤＮＡ水溶液を調製した後、各１０個体相当分のＤＮＡ水溶液から各１０μｌを秤量し、これを１つのチューブにまとめ、１００個体に由来するＤＮＡ水溶液を調製した。
【００５４】
次に、調製したジャポニカ種ウナギ、A.anguilla種、およびA.australis australis種のＤＮＡ水溶液をＰＣＲに供した。ＰＣＲ条件を以下に示す。
【００５５】
PCR  Master Mix
10×PCR  Buffer                              10.0μl
1×ｄNTP mix                              8.0μl
第１のプライマーセット（5 pmol/μl）      4.0μl
ｄＨ２Ｏ                                  72.5μl
Taq ポリメラーゼ                          0.3μl
ＤＮＡ水溶液                              5.0μl
同時にＤＮＡ水溶液の代わりに滅菌水５．０μｌを加えたネガティブコントロールを作成した。
【００５６】
反応は９５℃にて８分間前加熱後、９４℃１分変性・５６℃１分アニーリング・７３℃１分伸長からなるサイクルを３５回行い、その後４℃に冷却した。なお、以下の実施例においては、特に明示しない限り、ＰＣＲの条件はいずれも実施例１と同じである。
【００５７】
得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで３０分泳動し、増幅されたか否かの確認を行った。結果を図５に示す。図５から明らかなように、A.anguillaおよびA.australis australisでは５５８ｂｐの泳動バンドが出現するが、ジャポニカ種ウナギでは該泳動バンドは出現しない。
【００５８】
（実施例２）
実施例１と同様の手順で、ジャポニカ種ウナギ（１００個体分）、A.anguillaおよびA.australis australisのＤＮＡを抽出してＤＮＡ水溶液とした。また、抽出したＤＮＡから一部を分離し、ジャポニカ種ウナギのＤＮＡ１００質量部に対し、A.anguillaのＤＮＡが１質量部（１０μｇに対し１００ng）、０．１質量部（１０μｇに対し１０ng）、および０．０１質量部（１００μｇに対し１０ng）で含まれるＤＮＡ水溶液を調製した。次に、これらＤＮＡ水溶液を常法により合成した第３のプライマーセット（２０ｐmol）を用いたＰＣＲに供し、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで３０分泳動した。
【００５９】
また、実施例２では、配列番号５に示す塩基配列からなるフォワード側プライマーおよび配列番号６に示す塩基配列からなるリバース側プライマーからなる、ジャポニカ種ウナギの核ＤＮＡ中の領域を増幅するプライマーセット（以下、核プライマーセットと称す）を第３のプライマーセットに混合してＰＣＲを行っている。
【００６０】
核プライマーセットは、以下のような塩基配列を有する。
フォワード側：tgatgttaatcaccaacaacccgt（Ｔｍ＝６７．９）
リバース側：tctgtggcgatcagttcctctgagt（Ｔｍ＝７１．１）
【００６１】
当該核プライマーセットは、核ＤＮＡ（GenBank: EU001923.1）中の所定領域を増幅するように設計されており、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供したときに、１００ｂｐの泳動バンドが出現する。当該核プライマーセットを用いることで、サンプル中にジャポニカ種ウナギ由来のＤＮＡが含まれており、その増幅に成功していることを証明することができる。さらに、当該核プライマーセットは、制限酵素HinfI、RsaIで消化を行ったときにその泳動バンドが出現しないように、HinfIとRsaI認証サイトを挟んで100塩基増幅でき尚且つ第３のプライマーセットとTm値が近くなるように設計されている（詳しくは実施例４にて示す）。核ＤＮＡ（GenBank: EU001923.1）の配列および核プライマーセットの選択領域を図６に示す。実施例２では、第３のプライマーセットに混合する核プライマーセットの割合も併せて検討を行っている。
【００６２】
実施例２におけるPCR  Master Mixを以下に示す。
核プライマーセット：２０ｐmol
10×PCR  Buffer                            10.0μl
1×ｄNTP mix                                8.0μl
第３のプライマーセット（5 pmol/μl）        4.0μl
核ＤＮＡプライマーセット（5 pmol/μl）       4.0μl
ｄＨ２Ｏ                                     72.5μl
Taq ポリメラーゼ                            0.3μl
ＤＮＡ水溶液                                 個々に濃度調整
【００６３】
核プライマーセット：１０ｐmol
10×PCR  Buffer                            10.0μl
1×ｄNTP mix                                8.0μl
第３のプライマーセット（5 pmol/μl）        4.0μl
核ＤＮＡプライマーセット（5 pmol/μl）        2.0μl
ｄＨ２Ｏ                                     72.5μl
Taq ポリメラーゼ                            0.3μl
ＤＮＡ水溶液                                  個々に濃度調整
【００６４】
核プライマーセット：５ｐmol
10×PCR  Buffer                            10.0μl
1×ｄNTP mix                                8.0μl
第３のプライマーセット（5 pmol/μl）        4.0μl
核ＤＮＡプライマーセット（5 pmol/μl）      1.0μl
ｄＨ２Ｏ                                     72.5μl
Taq ポリメラーゼ                            0.3μl
ＤＮＡ水溶液                                  個々に濃度調整
【００６５】
核プライマーセット：２ｐmol
10×PCR  Buffer                            10.0μl
1×ｄNTP mix                                8.0μl
第３のプライマーセット（5 pmol/μl）        4.0μl
核ＤＮＡプライマーセット（5 pmol/μl）      0.5μl
ｄＨ２Ｏ                                     72.5μl
Taq ポリメラーゼ                            0.3μl
ＤＮＡ水溶液                                  個々に濃度調整
【００６６】
核プライマーセット：１ｐmol
10×PCR  Buffer                            10.0μl
1×ｄNTP mix                                8.0μl
第３のプライマーセット（5 pmol/μl）        4.0μl
核ＤＮＡプライマーセット（1 pmol/μl）       1.0μl
ｄＨ２Ｏ                                     72.5μl
Taq ポリメラーゼ                            0.3μl
ＤＮＡ水溶液                                  個々に濃度調整
【００６７】
実施例２の結果を図７〜１１に示す。これらから、ジャポニカ種ウナギと非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡが混ざっている場合でも、第３のプライマーセットを用いた増幅が可能であることが確認できる。そして、ＤＮＡを混合させて得た以上の結果から、ジャポニカ種ウナギの個体と非ジャポニカ種ウナギの個体から得られた肉片を混合しＤＮＡを抽出した場合でも同様の結果が得られることは、当業者は十分に理解することができる。加えて、当該結果から、第３のプライマーセットと相同性が高く、同じ領域を増幅する第１のプライマーセットを用いる場合においても、ジャポニカ種ウナギと非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡが混ざっている状態で同様に増幅が可能であることは、当業者にとって、容易に理解できる。
【００６８】
また、図７〜図１１に示すように、ジャポニカ種ウナギのＤＮＡ１００質量部に対し０．１質量部の割合でA.anguilla種のＤＮＡが含まれる試料においても、当該A.anguilla種のＤＮＡの増幅が確認された。よって、ジャポニカ種ウナギ１０００個体に対し非ジャポニカ種ウナギ１個体の割合で混入されている場合でもその混入の事実を検出することができる。また、本実施形態の検査方法にあっては、ＤＮＡの抽出および精製作業が煩雑となるのを防止する観点から、１００個体からなる集団に対して検査を実施することが好ましい。当該実施例２においては、ジャポニカ種ウナギと考えられる１０００個体中に非ジャポニカ種ウナギ１個体の混入でも検出できることが示されており、したがって１００個体に対して実施したときには非常に高い信頼性を備えていることが理解される。
【００６９】
なお、図７〜図１１からは、核プライマーセットについて、その使用する量が少なくなるごとに第３のプライマーセットによるＰＣＲ産物のバンド（５８８ｂｐ）が濃くなることも理解される。ここで、当然ではあるが、１００個体の集団に混入が行われる場合、その混入される非ジャポニカ種の個体数は最低で１個体である。したがって、１００個体の集団に対し検査を実施する場合、核プライマーセットの混合量は、１個体の非ジャポニカ種ウナギが混入されているときにその非ジャポニカ種ウナギのバンドをより容易に確認でき、なお且つ核プライマーセットによる増幅産物のバンドも確認可能である量とすることが好ましい。
【００７０】
そこで、１００個体の集団に対して検査を実施する場合の、好ましい核プライマーセットの混合量を決定するために、核プライマーセットがそれぞれ異なる量で混合された場合の電気泳動の結果を図１２および図１３に示す。
【００７１】
ここで、図１２からは、ジャポニカ種ウナギＤＮＡ１００質量部に対し非ジャポニカ種ウナギＤＮＡ１質量部を混合させた場合において、核プライマーセットを１ｐmol使用したときに、他の場合と比較して、非ジャポニカ種のバンドがよりはっきりと出現していることが理解できる。また、当該核プライマーは、ＰＣＲの成功を確認するためのプライマーであるが、その増幅産物の検出は、１ｐmolの場合も十分可能であることが、ジャポニカ種ウナギ由来のＤＮＡのみを増幅させた場合を示す図１３から理解される。したがって、実施例２からは、１００個体の集団に対して本実施形態の検査を行う場合の核プライマーセットの使用量は、第２のプライマーセット２０ｐmoｌに対し、１ｐmoｌとするのが好ましいことが確認された。
【００７２】
（実施例３）
実施例１と同様の手順で、ジャポニカ種ウナギ（１００個体分）、A.anguillaのＤＮＡを抽出してＤＮＡ水溶液とした。また、実施例２と同様に、抽出したＤＮＡから一部を分離し、ジャポニカ種ウナギのＤＮＡ１００質量部に対し、A.anguillaのＤＮＡが１０質量部（１０μｇに対し１μｇ）および１質量部（１０μｇに対し１００ng）で含まれるＤＮＡ水溶液を調製した。次に、これらＤＮＡ水溶液を第２のプライマーセット（２０ｐmol）を用いて実施例１と同じ条件でＰＣＲに供し、得られたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで３０分泳動した。
【００７３】
結果を図１４に示す。図１４に示すように、第２のプライマーセットを用いた場合でも、非ジャポニカ種であるA.anguillaでは２６９ｂｐの泳動バンドが出現するが、ジャポニカ種ウナギでは該泳動バンドは出現しない。また、実施例２の場合と同様に、ジャポニカ種ウナギと非ジャポニカ種ウナギのＤＮＡが混ざっている場合でも、第２のプライマーセットを用いた増幅が可能であることが確認できる。
【００７４】
（実施例４）
A. marmorata、A. obscura、A. celebensis、A. interioris、A. bicolorpacifica、A. reinhardtii、A. rostrata、A. bengalensislabiata、A. nebulosaneb、A. megastoma、A. mossambica、A. bicolorbic、A. malgumora、A. Anguilla、およびA. australis australisについて実施例１に記載したのと同じ方法でＤＮＡを抽出し、第１のプライマーセットを用いてＰＣＲに供した。
【００７５】
各ＰＣＲ産物を精製した後、それぞれ２つに分離し、一方にはHigh Bufferに分散させた制限酵素HinfI（2000 unit、和光純薬工業株式会社）を、また、他方にはM Bufferに分散させたRsaI（800 unit、和光純薬工業株式会社）を添加した。これらを恒温槽中に３７℃で１時間放置した後、得られたＤＮＡ断片を3％アガロースゲルで40分泳動した。その結果、図４に示すような断片パターンが得られた。
【００７６】
（実施例５）
A.anguillaおよびA.australis australisについて、実施例１と同様の手順でＤＮＡ水溶液を調製した。
【００７７】
このうち、A.anguillaのＤＮＡ水溶液を、第３のプライマーセットを用いたＰＣＲに供した。得られたＰＣＲ産物を実施例３と同様に制限酵素RsaIで処理した後、生じたＤＮＡ断片を3％アガロースゲルで４０分泳動した。結果を図１５に示す。
【００７８】
また、A.anguillaおよびA.australis australisのＤＮＡ水溶液を、常法により合成した第３のプライマーセット（５ pmol/μl）および核プライマーセット（１ pmol/μl）を混合して用いたＰＣＲに供した。得られたＰＣＲ産物を実施例４と同様に制限酵素HinfI、RsaIで処理した後、生じたＤＮＡ断片を3％アガロースゲルで４０分泳動した。結果を図１６に示す。
【００７９】
図１５より、第３のプライマーセットを用いることで、増幅されたA.anguilla由来のＤＮＡを制限酵素RsaIで処理したときに、ＰＣＲ産物（５８８ｂｐ）とは明らかに異なる５５８ｂｐの泳動バンドが確認できる。したがって、制限酵素RsaIが失活しているときとの区別が容易となる。また、図１６に示すように、制限酵素HinfI、RsaIで処理することにより、核プライマーセットのＰＣＲ産物由来のバンドは判定を妨害する位置には出現しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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