(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＭＭＲＫＬＡＩＬＳＶＳＳＦＬＦＶＥＡＬＦＱＥＹＱＣＹＧＳＳＫＭＥＫＣＳＳＶＦＮＶＶＮＳＳＩＧＬＩＭＶＬＳＦＬＦＬＮ（配列番号３８）の１個以上のコピーを含む組換え抗原性ポリペプチド。
【請求項２】
前記アミノ酸配列の多コピーが存在するとともに、ｉ）互いに直接隣接して配置されているかまたはｉｉ）前記組換え抗原性ポリペプチド内部において正統的カルボキシ末端タンパク質分解切断を可能とするスペーサーペプチドによって互いに分離されていることを特徴とする請求項１記載の組換え抗原性ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１記載の抗原性ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
前記アミノ酸配列の多コピーが存在するとともに、ｉ）互いに直接隣接して配置されているかまたはｉｉ）前記組換え抗原性ポリペプチド内部において正統的カルボキシ末端タンパク質分解切断を可能とするスペーサーペプチドによって互いに分離されていることを特徴とする請求項３記載の核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概括的には、マラリアワクチンに関する。本発明は特に、広いスペクトルのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生体種のスポロゾイド周囲タンパク質に対する細胞媒介免疫性を惹起しかつＨＬＡ対立遺伝子類の大半により認識されるポリエピトープ構築体に基づくマラリアワクチンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、アメリカ大陸、アジアおよびアフリカを含む熱帯、亜熱帯で広まっているベクター運搬感染症である。それは、毎年約６億５千万の人々に病気を起こし、百万ないし３百万人を死亡させ、それら人々の大半はサハラ砂漠以南のアフリカにおける幼い子供たちである。
【０００３】
本疾患は、属Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍの原生動物寄生体が原因である。本疾患の最も重篤な病態は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｖｉｖａｘにより惹き起こされるが、他の関連種〔Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｍａｌａｒｉａｅ、および時にはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｋｎｏｗｌｅｓｉ〕もまたヒトに感染する。
【０００４】
マラリア寄生体は、雌のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊に刺されることにより伝染し、ヒト宿主に対して前記寄生体のスポロゾイト体を運ぶ。前記スポロゾイト類は、血液により肝臓まで運ばれ、そこでそれらは肝細胞中で増殖し、ライフサイクルの次の形態すなわちメロゾイトに変化する。メロゾイト類は、感染肝細胞が破裂すると、最終的には血流中に放出される。次にメロゾイト類は赤血球に感染し、一部は、ＲＢＣ中で雄および雌の生殖母細胞になる。別の蚊が感染宿主を刺すと、それは、雄および雌の生殖母細胞を摂取し、雌の蚊の内部で融合しスポロゾイトになる。この蚊が次に刺すと、このスポロゾイト類はさらに別の宿主に伝染等する。
【０００５】
マラリア感染は、貧血に特徴的な症状（軽度頭痛、息切れ、頻脈等）やさらに発熱、悪寒、悪心、インフルエンザ様疾患のような他の一般的症状、および重篤な場合、昏睡および死亡の原因となる。マラリア伝染は、蚊帳および昆虫忌避剤により蚊に刺されないようにすることによって低下させることができるが、それらはかなり効果的ではあるものの、流通させかつ連続的に適切に使用することが必要であるという欠点を有している。他の対応策には家屋内に殺虫剤を撒くことおよび蚊が産卵している滞留水を排水することによって蚊を制御することが含まれる。残念ながら、殺虫剤の使用は環境上のリスクとなり、ある地方では、全ての滞留水を排水することは実質的に不可能である。
【０００６】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍに自然感染した後、ヒト宿主は抗Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ抗体を産生する。しかし、抗体産生だけで前記寄生体を中和する能力（体液性免疫）は、不断の、防御的免疫性としては持続しないし、あるいは十分な記憶特性を有する細胞性免疫も惹起されない。その結果として感染が何度も起こることがあり、疾患治療と予防を複雑化させている。
【０００７】
効果的な抗マラリアワクチンを産生するためにいろいろ試みられてきた。Ｈｕｉらの米国特許第６，６６０，４９８号は、ワクチン中で使用するために、バキュロウイルス系を用いて組換えメジャーメロゾイトサーフィスプロテイン（Ｍａｊｏｒ  Ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）１を産生させることを記載している；Ｋｎａｐｐらの米国特許第５，３９３，５２３号はＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの組換えヒスチジン高含量タンパク質の調製とワクチンにおける用途を記載している；Ｐａｔａｒｒｏｙｏの米国特許第４，９５７，７３８号および同第４，７３５，７９９号は、後期段階のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリアに対して抗体を誘発する合成ペプチド化合物混合物を記載している。Ａｓａｋｕｒａの米国特許第４，６４３，８９６号は、新規マラリア関連抗原ＣＲＡを開示し、それは、マラリアワクチンとして有用であると記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６，６６０，４９８号
【特許文献２】米国特許第５，３９３，５２３号
【特許文献３】米国特許第４，９５７，７３８号
【特許文献４】米国特許第４，７３５，７９９号
【特許文献５】米国特許第４，６４３，８９６号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
過去の努力にもかかわらず、マラリアに対して有効なワクチンは残念なことに現在のところ全く得られていない。特に、マラリア寄生体類の全てまたはほとんどの株に対して細胞媒介免疫性を惹起するワクチンは、全く開発されていない。その代わりに、キニーネまたはアルテミシニン誘導体のような予防薬を連続的に服用し、感染リスクを低下させなければならない。これらの予防薬による治療は、しばしば、風土病となっている地方に住んでいる多くの人々にとってあまりにも高価である。さらに、前記寄生体の薬物耐性株が、ますます頻繁に見られるようになっている。
【００１０】
前記スポロゾイト周囲タンパク質（本文でＣＳＰ）のタンパク質断片をコードするかまたはそれから構築したワクチンはヒトおよび動物モデルの両方で免疫原性およびやや限定された防御能を示している。実際的ではないが最初の成功したマラリアワクチンは、スポロゾイトを運んでいる照射蚊類から構成されていた。細胞免疫応答を惹起するように設計したアジュバント中でデリバリされるサブユニットワクチンは、ヒトにおいてＣＳＰまたはアジュバント単独よりもより高い防御を提供したことは重要である。カルボキシおよびアミノ末端両者の可変領域がさまざまなＨＬＡタイプを有するヒトにより認識されるエピトープ類を含むことが明らかになった。ＣＳＰに基づくこれまでのワクチンの大きな欠点は、ある特定のＣＳＰ配列のエピトープ類に結合するＨＬＡタイプの広さと細胞および体液性免疫応答の持続性であった。
【００１１】
先行技術は、従って、安全で有効なマラリアワクチンをこれまで提供できず、特に、前記寄生体のほとんどの株に対して持続性の細胞媒介免疫応答を効果的に惹起するワクチンを提供してこなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、さまざまなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株から公知のＩ型ＨＬＡスーパータイプを有するヒト全ての非常に多くが認識するＣＳＰのＴ細胞エピトープ類を発現するポリエピトープワクチンを設計し開発したことに基づいている。このワクチンは、世界中の感受性ヒト集団においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのほとんど全ての株由来のＣＳＰに対して有意な体液性免疫と細胞性免疫を惹起する。
【００１３】
本発明は、新規の複数エピトープポリペプチドおよびそれらをコードする遺伝子配列をマラリアワクチンに使用するために提供する。前記ポリペプチド中における複数エピトープ類は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ・ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）に由来し、このタンパク質は、マラリアの肝段階において特に重要であることが公知である。エピトープ類をタンパク質の保存領域から選択する通常のワクチン設計に反して、本発明で使用したエピトープ類は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞エピトープ類を含むことが公知のＣＳＰ高可変領域ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞エピトープ類を含むことが公知のＣＳＰ高保存領域から選択した。さらに、選択したエピトープ類は、多くのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）群の全てにわたってヒトでＴ細胞免疫応答を惹起し、世界中のマラリア寄生体の非常に一般的な株類に典型的である。１態様において、複数エピトープポリペプチドは前記エピトープ間にスペーサーペプチド類を有するように設計することが重要で、それらは、正統的カルボキシ末端（Ｃ末）切断のほうに前記ポリペプチドのタンパク質分解を偏らせる。従って、タンパク質分解によりポリペプチドから放出されたペプチド類のアミノ酸配列は、通常は、選択したエピトープ類のアミノ酸配列に対して完全に適合したものとなっており、すなわち、前記スペーサー配列由来のアミノ酸類を含むペプチド類の産生が最小であるかまたは全く起こらない。前記エピトープ類がポリペプチド鎖に沿って直列となっている場合、スペーサーペプチド類を全く添加せず、前記エピトープ下流の“天然の”配列が、正統的カルボキシ末端切断部位を確保する。
【発明の効果】
【００１４】
安全で有効なマラリアワクチンを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、マラリアＣＳＰ由来複数のエピトープを含む新規ポリペプチド類（ポリエピトープ類）および前記ポリペプチド類をコードする遺伝子配列を、マラリアワクチンで使用するために開発したことに基づいている。ＣＳＰ由来エピトープ類は、このタンパク質がマラリアの肝段階で特に重要であることが公知であるので、選択した。Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＡｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株由来ＣＳＰのタンパク質配列を図１に示した（配列番号１４）。これまでの抗マラリアワクチンもなんらかの有効性を示したものの、これらのワクチンに対する免疫応答は主に体液性であり、持続期間および株特異性の両者においてかなり不完全である。対照的に、本ワクチンは、細胞媒介免疫性を惹起するように設計した。
【００１６】
本発明で使用するためエピトープ類を選択するプロセスは、バイオインフォーマティックスおよびデータ解析の両者を必要とした。旧来のワクチン設計では通常、ある生物の多くの株にまでワクチンの適用性を広げようとして、タンパク質配列の保存領域のみをターゲットとしている。この通常のやり方と対照的に、本発明では、ＣＳＰの高可変領域を、選択した保存配列とともに含め、これは、正しいと認められておらず直感に反する手法である。
【００１７】
前記ポリペプチドに含めるエピトープ類は、ＣＤ８細胞免疫応答を惹起することが公知であるかまたは推定されている。当業者は、ＣＤ８応答が細胞内寄生体と戦い撲滅に成功するために必要であること；体液性抗体応答が明らかに不十分であることを認識するであろう。さらに重要なこととして、選択したエピトープ類はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）群中でＣＤ８免疫応答をまとめて惹起し、ヒト集団のほとんど（約９８％）を網羅できる。従って、本ワクチンは、マラリア寄生体に暴露されそうな多くのヒトで効果的である。さらに、選択したエピトープ類は、マラリア寄生体の非常に一般的な株に典型的であり、この感染性物質の最も一般的な形態に対して広く保護する。
【００１８】
本発明の複数エピトープポリペプチドは通常エピトープ間に“スペーサー”または“リンカー”ペプチド類を有するように設計されていることが重要で、それらは、正統的なカルボキシ末端（Ｃ末）切断のほうに前記ポリペプチドのタンパク質分解を偏らせる。“スペーサー”または“リンカー”ペプチド類とは、エピトープ下流の、少なくとも３個のアミノ酸の最小ペプチド配列を意味し、それには、ペプチド切断（タンパク質分解）のための部位が含まれ、前記ペプチド類が読み取り可能に連結されるようにする。すなわち、前記エピトープ類のＣ末タンパク質分解プロセッシングに干渉しないスペーサーペプチド類を選択し、宿主細胞でこのタンパク質が処理される（タンパク質分解される）時タンパク質分解でポリペプチドから放出されたペプチド類のカルボキシ末端はＣＳＰから放出されるものと同一である。好適には、新しい偶然的カルボキシ末端がスペーサーペプチド内部での切断により全く（あるいはほとんど）産生されない。前記ペプチドエピトープ類のカルボキシ末端は真正である（すなわち、宿主細胞中におけるインビボＣＳＰ切断の結果生じるものと同一である）ので、複数エピトープポリペプチド由来ペプチド類は、ＨＬＡタンパク質類に結合しＣＤ８細胞免疫応答を惹起すると考えられる。
【００１９】
本発明での用途のために選択したエピトープ類を、表１に示した。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
この表からわかるとおり、最初の８種のエピトープ類は、ＣＳＰ可変領域由来である。さらに、前記エピトープ類のうちの７種は、ＭＨＣスーパータイプＢ４４に結合することが公知であるかまたは結合すると推定され、第８番目は、スーパータイプＡ２６に結合する。これらのエピトープ類の選択とリンカー配列の詳細な説明は、実施例１と４に示されている。簡単に述べると、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＡｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株の配列２８８−４１２に対応する可変領域を、公知のＴ細胞エピトープ類の存在について分析した。アミノ酸２２個の配列が上記エピトープ類を高濃度で含むことがわかり、それを用いて他のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株由来のＣＳＰタンパク質類配列を含むデータベータから高相同性配列を検索した。検索した配列と比較することで、全ての主要Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株由来の可変領域Ｔ細胞エピトープ類を代表する関連（すなわち高相同性）を有するが同一ではないペプチド配列を選択できた。
【００２２】
本発明の実施において、本文に記載のエピトープ類をさまざまな異なる組み合わせで使用できる。例えば、本発明のいくつかの態様において、あるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍＣＳＰ（通常、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣＳＰであるが必ずしもそうではない）の可変領域から作成されたエピトープ類を構築体中で抗原性配列として単独で使用する。“ＣＳＰ可変領域”の例は、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＡｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株の残基２８８乃至４１２（図１で下線を付した対応するＣＳＰタンパク質の一次配列の部分であるが、他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種由来の相同性領域も使用できる。このようなワクチン構築体中において、前記可変領域由来の少なくとも１個のエピトープおよびある場合にはこの可変領域由来の１を超えるエピトープが含まれる。このようなエピトープは、通常は、長さがアミノ酸約５個乃至約１５個であろうし、連続アミノ酸の配列を示すであろうし、Ｔ細胞エピトープであろう。もし可変領域由来の複数エピトープ類が含まれるならば、それらは隣接し連続する配列としてポリエピトープ構築体中に存在するか、または、それらは本文に述べたようにスペーサーまたはリンカー配列で分離できるか、または、配置を混ぜ合わせることも起こりえ、すなわち、いくつかの配列が隣接し、他が連結配列で分離されている。このタイプの例示的エピトープ類は、配列番号１−８として本文に記載の配列を有するものを含む。一般的に、このようなエピトープ類の長さは、アミノ酸少なくとも約５個から約２５個であり、好適には、アミノ酸少なくとも約５個から約２０個未満もしくはそれよりはるかに少ないアミノ酸（例  ６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８、または１９個のアミノ酸）である。
【００２３】
他の態様において、ＣＳＰ保存領域由来の１個以上のＴ細胞エピトープ類（本明細書で、“保存ＣＳＰ”と称することもある）もワクチン構築体中に含まれる。特に、表１の配列番号９−１２で示したものなど保存Ｔ細胞エピトープ類はスーパータイプＡ１、Ａ２，Ａ３，Ａ２４，Ａ２６、Ｂ５８およびＢ６２への結合能を示し、これらも使用できる。このような保存エピトープ類の選択は、下記の実施例２で詳細に記載されている。簡単に述べると、バイオインフォーマティックスプログラムを用いて、複数（例  少なくとも３個）スーパータイプに結合し異なる（例  少なくとも６０種の異なる株全てにわたる）Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ株由来の複数ＣＳＰ配列全てにわたって非常に高く保存された（例  １００％保存）明確なＴ細胞エピトープ類を、選択した。従って、本発明のいくつかの態様において、可変領域由来の少なくとも１個のエピトープを、少なくとも１個の保存ＣＳＰ  Ｔ細胞エピトープと組み合わせてワクチン構築体中に含めることができる。１態様においては、表１のエピトープ類のそれぞれを単独ポリエピトープに含ませる。このようにして一緒に含ませると、本発明のエピトープ類は、ヒト集団の約９８％に反応性である。このタイプの例示的ポリエピトープを図２に示した（配列番号１３）。
【００２４】
さらに、実施例３に詳細に示したように、さらなる抗原性配列を同定した。簡単に述べると、バイオインフォーマティックス手段を用いて、ＣＳＰ配列内部で、１２スーパータイプ全てに対する９，１０、１１量体Ｔ細胞エピトープ類を高濃度で有する配列クラスターを同定した。最大数のエピトープ類を有するクラスターであるクラスター１および４は、ｉ）Ａｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株のアミノ酸１−２９（配列番号３７）とｉｉ）Ａｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株のアミノ酸３８５−４１１（配列番号３８）をそれぞれ、包含している。これらの配列のいずれかまたは両者とも、本発明のポリエピトープ構築体中に含ませることができる。１態様においては、クラスター１および４は両者ともにポリエピトープ中に存在し、単独の連続配列（例  配列番号３９；実施例３参照）として存在する。本文に記載の他のエピトープ類についてと同様に、これらの配列の単一コピーを構築体中で用いることができるし、または、これとは別に、例えば約２乃至約１０以上のコピー（例えば、２，３，４，５，６，７，８，９、１０，１１，１２またはそれ以上のコピー）のように多コピーを用いることもできる。さらに、配列番号３７−３９の配列の１個以上のコピーを、表１のエピトープ類の１個以上すなわち上記で述べた実施例１のＣＳＰ可変領域由来のエピトープ類および／または上記で述べた実施例２のＣＳＰ由来の１個以上の保存エピトープ類も含む構築体中で用いることができる。
【００２５】
本発明の１態様においては、表１のエピトープ１２種のそれぞれ少なくとも１個のコピーが、前記ポリエピトープ中に存在する。前記エピトープ１２種のそれぞれ少なくとも１個のコピーを含むポリエピトープ例（配列番号１３）を図２に示したが、それぞれのエピトープは大文字で記しかつアンダーラインを付した。当業者は、このタイプの構築体中において、前記ポリエピトープ内部のエピトープ類の他の立体構造も可能であることがわかるであろう。例えば、前記エピトープを異なる順序で並べることもできるし、１種以上のエピトープ類の多コピーが存在することもできる（例  １個乃至約１０コピー以上が存在できる）し、および／またはクラスター１（配列番号３７）及びクラスター４（配列番号３８）またはその組み合わせ（配列番号３９）のような追加の免疫原性配列も含ませることができる。一般的に、前記ポリエピトープ中のエピトープ類は、単一ポリペプチド鎖として単一プロモータから発現することもあり、もし必要ならば、（適宜）スペーサーまたはリンカー配列によって分離されている。しかし、いくつかの態様において、エピトープまたはエピトープ類グループは、別々のプロモータからすなわち別々のペプチド類またはポリペプチド類として発現できる。いくつかの態様において、（例  全エピトープ類およびエピトープ間のスペーサー配列を含む）ポリエピトープ類は、より大きなポリペプチド内部に含まれることもあり、すなわち、前記ポリエピトープがエピトープでもスペーサー配列でもないアミノ酸配列に隣接されることもある。このような隣接配列はいかなるタイプであってもよく、特定の機能を有することができ、例えば、所望の位置にポリペプチドの転座を向ける配列（例  シグナルペプチド類）；問題の分子への結合を促進する配列；特定立体構造の採用を促進する配列；ポリペプチド局在化、同定または単離に有用な配列であり得る。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明のポリエピトープの各エピトープは、直接隣接しているかまたはスペーサーまたはリンカーペプチドにより隣接エピトープ類から分離されている。このスペーサーペプチド類の機能は、ポリエピトープの正確なカルボキシ末端切断を促進し（タンパク質分解）正統的エピトープ類を放出することである（すなわち、ＣＳＰタンパク質のインビボタンパク質分解により産生されたものと同じペプチド配列）。本文に示した例示的ポリエピトープ類中のスペーサー配列に加えて、当業者は、本発明の実施において使用できる他のスペーサーペプチド類も存在することを理解するであろう。当業者はまた、タンパク質分解部位の予測および／または優先的切断部位を含むポリペプチド類設計を可能とするデータベースおよび解析プログラムを知悉している。十分量の正確に処理されたエピトープ類を放出してこのエピトープ類に対する防御性免疫応答を惹起するため生成したポリペプチドが切断される限りにおいて、いかなるスペーサーおよびリンカー配列も用いることができる。
【００２７】
１態様において、本発明は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＡｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株のスポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）可変領域由来の少なくとも１個のエピトープを含む組換え抗原性ポリペプチドを提供し、そのアミノ酸配列を図１に示し、配列番号１４として示した。その一次アミノ酸配列に基づき、このＣＳＰタンパク質は分子量約４４，３６１を有する。本発明によれば、ＣＳＰ可変領域由来のエピトープを少なくとも１個含む組換え抗原性ポリペプチドは、ＣＳＰ分子量の約３０％以下の分子量、例えば、約１３，５００ｋＤａ以下、例えば約１０００ｋＤａから約１２，０００ｋＤａを有する。
【００２８】
例えば図２に示した例としてのポリエピトープのような本発明のポリエピトープに関して、当業者はその配列を改変でき、それでもなお免疫すべき宿主内部に適切なエピトープ類を提供する結果になることがわかるであろう。例えば、適切な免疫応答が惹起される限りにおいて、他のスペーサーペプチドを用いて保存アミノ酸を置換することも可能であろう。
【００２９】
本発明は、本文に記載のポリエピトープ類およびそれらをコードする（例  ＤＮＡ、ＲＮＡ等）核酸配列を包含し、それらは、通常、発現制御配列に読み取り可能に結合されている。このような核酸配列は、例えば、弱毒化マイコバクテリウムまたは他の菌株、さまざまなウイルスベクター（例  弱毒化アデノウイルスベクター）、プラスミド類、または当業者が思い浮かぶ他の適切なベクター類のようなデリバリビーヒクルまたはベクター中に存在するＤＮＡ配列であり得る。免疫すべき宿主にベクターを投与した結果宿主内部でかつこのポリエピトープの正確なタンパク質分解プロセッシングを可能とする条件下で本発明のポリエピトープ産生が起こる限り、いかなるベクターも使用できる。これとは別に、本発明のいくつかの態様において、前記ポリエピトープは、適切な組成物で直接（すなわち、ポリペプチドとして）投与する。
【００３０】
本発明は、マラリアに対する免疫応答惹起および／またはマラリアに対する個体のワクチン接種で使用するための組成物を提供する。前記組成物は、本文で記載の１種以上の実質的に精製したポリエピトープ類またはこのポリエピトープ類をコードする核酸配列および薬理学的に適切な担体を含む。ワクチンとしての用途のためのこの種の組成物の調製は、当業者に公知である。典型的には、このような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製されるが、しかし、錠剤、丸剤、粉剤等のような固体形状もまた考慮される。液体中溶液または懸濁液に適した投与前固体形状もまた、調製できる。前記調製物もまた、乳化できる。前記活性成分を、製薬上許容できかつ活性成分類に適合する賦形剤と混合することもできる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等であるかまたはそれらの組み合わせである。さらに、前記組成物は、湿潤化または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等のような助剤を少量含むことができる。さらに、前記組成物は、他のアジュバント類も含むことができる。もしこの組成物の経口形態を投与したいならば、さまざまな増粘剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤等を添加できる。本発明の組成物は、投与に適した形状で前記組成物を提供するため、追加のいかなる成分類を含むことができる。製剤中における最終的なポリエピトープまたはコードする核酸の量は、変えることができる。しかし、一般的に、製剤中の量は、約１−９９％であろう。
【００３１】
本発明はまた、マラリアに対する免疫応答を惹起する方法およびマラリアに対する哺乳類ワクチン接種方法を提供する。前記方法では、一般的に、適切なワクチン接種者を同定すること、薬理学的に許容できる担体中で本明細書に記載したポリエピトープまたはコードする核酸を含む組成物を前記接種者に投与することを含む。本発明のワクチン調製物は、当業者に周知の多くの適切な手段のいかなるものによっても投与でき、注射によって、経口的に、経鼻的に、抗原を含む食物製品摂取等を含むがそれらに限定されない。特定の態様においては、投与の様式は、皮下または筋肉内である。
【００３２】
“免疫応答を惹起する”とは、本発明のワクチン調製物の投与が特異的抗体（１乃至１×１０６、好適には１×１０３の範囲の力価、より好適には約１×１０３乃至約１×１０６の範囲、および最も好適には１×１０６を超える力価）合成および／または細胞増殖の原因となり、それらは、ＩＦＮ−γ産生を評価する細胞アッセイによりまたは３Ｈチミジン取り込み等により測定する。好適な態様において、免疫応答は防御的免疫応答であり、すなわち、免疫応答が、ワクチン接種を受けた個人がさらにマラリア寄生体に攻撃されるのを防御するが、これはいつもそうであるとは限らず、部分防御を提供する免疫応答がそれでもなお非常に有益であることもある。前記方法は、本発明の構築体を含む組成物を薬理学的に許容でき／適合性の担体中で投与することを必要とする。
【００３３】
本発明のポリエピトープ中への取り込みのための適切なエピトープ類の選択と分析は、当業者が容易に入手可能なさまざまなデータベースおよびバイオインフォーマティックス解析手段を用いて、実施できる。例（例  細胞障害性Ｔリンパ球エピトープ推定および分析）としては、ＮｅｔＣＴＬ，ＮｅｔＭＨＣ，ＥｐｉＪｅｎ、ＭＡＰＰＰ、ＭＨＣ−ｐａｔｈｗａｙ、ＷＡＡＰ、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  ＤａｔａｂａｓｅおよびＡｎａｌｙｓｉｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ＩＥＤＢ）等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
（実施例）
上述の非限定的実施例は、本発明をさらに説明するために役立つ。
【実施例１】
【００３５】
可変エピトープ類の選択：ＣＳＰ可変領域の解析
【００３６】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ３Ｄ７由来のＣＳＰタンパク質の可変領域２８８乃至４１２（図３中配列番号１５）の分析を、ＩＥＤＢデータベースによればＴ細胞エピトープ類である配列中で類似性および差を決定するために、行った。同定したＴ細胞エピトープ類を図３中で配列番号１６−２１として示した。この分析結果は、アミノ酸２２個の配列（配列番号１５の残基３６８−３８９を図３中でＣＳＰ配列内部に四角で囲んで示したが、それは、配列番号３８を有する）が、この可変領域で同定したＴ細胞エピトープ類のかなりの部分を含んでいることを示しており、それを用いてＮＣＢＩデータベースを検索して前記アミノ酸ペプチド２２個の配列（ＫＰＫＤＥＬＤＹＡＮＤＩＥＫＫＩＣＫＭＥＫＣ  配列番号３８）に高い同一性を示すアミノ酸配列を含むタンパク質を同定した。同一性の高いこれらの配列を、さらにＩＥＤＢにより解析した。結果を表２に示した。この表からわかるように、類似エピトープ類が、さまざまなＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ単離物から配列１０種中で同定され、それらは互いに高い同一性を示し、Ｔ細胞エピトープ類であると推定されたかまたは公知であった。
【００３７】
【表２】
0005573679.tif 000003
【００３８】
これらの結果に基づき、前記アミノ酸２２個の配列のアミノ末端部分を示すアミノ酸１２個の配列７種および前記アミノ酸２２個のカルボキシ末端近くの一部を示すアミノ酸９個の配列１種を選択して、本発明のポリエピトープへの導入を行った。これらの配列を上記表１に示した（配列番号１−８）。ＣＴＬエピトープ類の予測のための前記８種の配列の解析は、ＮｅｔＣＴＬバイオインフォーマティックスプログラムを用いて、実施した。このプログラムは、Ｔ細胞エピトープ類およびひとつのエピトープが結合するＨＬＡスーパータイプ（類）を同定する。この解析は、これらの配列がＢ４４およびＡ２６ＭＨＣスーパータイプのＨＬＡバインダーを含むことを明らかにした（表１参照）。
【実施例２】
【００３９】
９量体の保存エピトープ類の選択
【００４０】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＡｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株由来ＣＳＰ配列を、ＮｅｔＣＴＬバイオインフォーマティックスプログラムを用いて解析し、長さがアミノ酸９個のＴ細胞エピトープを同定した。結果を表３に示した。
【００４１】
【表３】
0005573679.tif 000004
【００４２】
この表からわかるように、総計４９種の重要エピトープ（組み合わせスコア＞０．７５）が同定された。これらの内、３６種のみが明確なエピトープを示していた。２４種のエピトープは、唯一のスーパータイプにしか結合しないと予測され、８種は２種のスーパータイプに結合すると予測され、４種は３種のスーパータイプに結合すると予測された。３種のスーパータイプ類に結合すると予測される４種のエピトープ類（下記の表４中配列番号９，１０，１１および１２）を、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｃｏｎｓｅｒｖａｎｃｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ手段、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤＢ）解析リソースを用いてさらに検討するため、選択した。ＩＥＤＢ手段を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベース由来の互いに異なる２８０種のＣＳＰ配列中エピトープ類の保存解析を実行した。結果を表４に示した。この表からわかるように、４種のエピトープ類全てが、６９を超えるＰＦ株由来ＣＳＰ配列中で１００％保存されている。
【００４３】
【表４】
0005573679.tif 000005
【００４４】
配列番号９，１０、１１および１２によって示される保存配列は、従って、ポリエピトープ中に導入するために選択した。
【実施例３】
【００４５】
９−１１量体エピトープの選択
【００４６】
全ての可能なＣＴＬ結合エピトープを示すためおよびより長いエピトープ（すなわち、実施例２の９量体類よりも長い）を導入するために、広範囲のＮｅｔＭＨＣ３．０解析手段を用いて、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＡｓｅｍｂｏ  ｂａｙ株由来ＣＳＰ配列中の全てのスーパータイプ１２種について、９，１０，および１１量体Ｔ細胞エピトープの同定に使用した。図１は、このＣＳＰ配列（配列番号１４）を示す。前記１２種のスーパータイプのいずれか一つを認識する推定上のＴ細胞エピトープ（９，１０および１１量体）の全てをグラフにマッピングし、ＣＳＰポリペプチドに沿ったそれらの分布を調べた。この種の解析は、４種の明確な“ホットスポット”（図４および５中の四角で囲んだ配列を参照）を明らかにし、ＣＴＬバインダーが最も密に分布していたのは、２種のクラスターであるクラスター１および４中であった。クラスター１は、アミノ酸１−２９を包含し、クラスター４は、アミノ酸３８５−４１１を包含する。前記２種のクラスターは、上記実施例２で述べた９量体ペプチドについてのこれまでの戦略で選択した４種の“保存”エピトープを全て含んでいる。表５に示したように、総計で、４種の“ホットスポット”が広範囲の対立遺伝子を網羅している。
【００４７】
【表５】
0005573679.tif 000006
【００４８】
従って、９，１０および１１量体ＣＴｌ結合エピトープを含む好適な構築体は、クラスター１および４のひとつまたは両者のアミノ酸配列を含むであろう。クラスター１は、アミノ酸配列１−２９（ＭＭＲＫＬＡＩＬＳＶＳＳＦＬＦＶＥＡＬＦＱＥＹＱＣＹＧＳＳ、配列番号３６）を含み、クラスター４は、アミノ酸配列３８５−４１２（ＫＭＥＫＣＳＳＶＦＮＶＶＮＳＳＩＧＬＩＭＶＬＳＦＬＦＬＮ，配列番号３７）を含む。これら２種の配列を組み合わせると、結果として下記の配列：〔ＭＭＲＫＬＡＩＬＳＶＳＳＦＬＦＶＥＡＬＦＱＥＹＱＣＹＧＳＳＫＭＥＫＣＳＳＶＦＮＶＶＮＳＳＩＧＬＩＭＶＬＳＦＬＦＬＮ〕（配列番号３８）になるであろう。この組み合わせたペプチドは、多数のスーパータイプを示すＣＴＬ結合エピトープ類を高密度の集団として含む。本発明のポリエピトープは、先にも述べたように配列番号３６，３７または３８の１種以上のコピーを含むことができる。図６は、配列番号３８を含む例示的ポリエピトープ（配列番号３９）を図示している。
【実施例４】
【００４９】
前記９量体に基づくポリエピトープのスペーサー配列の選択
【００５０】
ポリエピトープ構築のためのスペーサー配列の選択は、合理的な特別プロセスを適用することにより実行する。このプロセスにおいて、選択したエピトープ類の配列順序および最適切断に有利であろう短く特異的なアミノ酸配列（スペーサー類）の挿入の両者を、下記のように検討した。
【００５１】
第一の反復において、全ての関連ペプチドを、最適タンパク質分解に有利なアミノ酸配列を含む短いスペーサーで集合させ、正統的選択ペプチド配列を作成する。前記ポリエピトープの一次配列（図７、配列番号４０）をＮｅｔＣＴＬ解析に供し、スペーサー添加により作成されたペプチド総数を決定した。一次配列についてのこの解析結果により相対的に多数の新規エピトープを確認し、それらは、正統的選択ペプチドよりも優位であった（例  表６にも示したように、実施例において、Ｂ７スーパータイプを認識する新規エピトープ１０種を作成）。次に、スペーサー領域でアミノ酸配列を他の特異的アミノ酸で置き換えることによって、前記プロセスを再度繰り返すことが必要であった。３−４回反復し、生成したポリエピトープの予測解析によって明らかになったように、このような潜在的な競合性新規エピトープの数を半分に減らした（表７）。最適化ポリエピトープの最終バージョンのアミノ酸配列を、図２に示した（配列番号１３）。
【００５２】
【表６】
0005573679.tif 000007
【００５３】
【表７】
0005573679.tif 000008
【００５４】
前記ポリエピトープは、８種のＨＬＡスーパータイプに結合可能なエピトープ類を含む。本発明のポリエピトープ中４２種のエピトープ類により提供される集団適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）の徹底した解析を、前記８種のＭＨＣスーパータイプにより示されるＨＬＡ対立遺伝子に対して、集団適用範囲アルゴリズム（ＩＥＤＢ）により実施した。この解析の結果、平均集団適用範囲は、９７．７４％であった。下記の具体的集団クラス中における適用範囲は、オーストラリアで９７．４５％、欧州で９９．６７％、北アフリカで９９．１８％、北東アジアで９９．４３％、南東アジアで９９．８１％、サハラ砂漠以南アフリカで９８．８１％と高い。南アメリカ（ベネズエラおよび一部のブラジル人集団）については、適用範囲が７９．３４％であり、他のブラジル人集団およびキューバについては、適用範囲は９８．７９％である。
【００５５】
同様の操作を、配列番号３８（クラスター１＋クラスター４）のような他の配列をポリエピトープ中に含めた時に予測タンパク質分解を最適化しかつ新規の偽エピトープ類の産生を最小とするために、用いることができる。しかし、天然配列が存在しかつ切断部位として一般的に使用されるので、新規エピトープ類の産生は配列番号３８の場合たいした問題ではない。
【実施例５】
【００５６】
ポリエピトープ製造のための構築体設計と調製
【００５７】
下記のセクションで述べるｒＢＣＧ構築のため、制限エンドヌクレアーゼ（本文で“ＲＥｓ”）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＴａｑポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造業者の指示に従い、用いた；プラスミドＤＮＡは、小規模（Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉｐｒｅｐＲキット、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）または大規模（Ｑｉａｇｅｎ  ＭａｘｉｐｒｅｐＲキット、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）プラスミドＤＮＡ精製キットを製造業者の指示（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従い用いて、調製した；ヌクレアーゼ非含有分子生物学等級のＭｉｌｌｉ−Ｑ水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＭｇＣｌ−２、１００％（ｖ／ｖ）エタノール、超純粋アガロース、およびアガロースゲル電気泳動緩衝液は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから購入した。ＲＥ消化、ＰＣＲｓ、ＤＮＡ連結反応、およびアガロースゲル電気泳動は、周知の操作（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１，２，３；１９８９）（Ｓｔｒａｕｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．Ｍａｒ；８７（５）：１８８９−９３；１９９０）に従い実施した。下記のセクションに述べた各組換えプラスミドのＤＮＡ配列を証明するためのヌクレオチド配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動シークエンサーモデル３７３Ａを用いる従来の自動化ＤＮＡ配列決定技術により、達成した。
【００５８】
ＰＣＲプライマーは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの商業的供給業者から購入するかまたはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡシンセサイザー（モデル３７３Ａ）を用いて合成した。ＰＣＲプライマーは濃度１５０−２５０μＭで使用し、ＰＣＲ反応のためのアニーリング温度は、クローンマネジャーソフトウェアバージョン４．１（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて決定した。ＰＣＲは、ＢｉｏＲａｄサーモサイクラー（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中で実施した。増幅用ＰＣＲプライマーは、Ｃｌｏｎｅ  ＭａｎａｇｅｒＲ（クローンマネジャー）ソフトウェアバージョン４．１（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて、設計した。その後ＲＥ消化物およびＰＣＲを、標準的操作を用いるアガロースゲル電気泳動（Ｓｔｒａｕｓら、同上１９９０；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、同上１９８９）により解析した。陽性クローンは、適切なＲＥパターンおよび／またはＰＣＲパターンを示すものとして定義する。この操作で同定したプラスミド類を、上記のように、標準的ＤＮＡ配列決定操作を用いて評価した。
【００５９】
ＤＨ５ａおよびＳｔａｂｌｅ２ＲなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し、前記組換えプラスミドの最初の宿主として役立った。組換えプラスミドを、上述のとおり（Ｓｔｒａｕｓら、同上１９９０）１００−２００Ο、１５−２５μＦおよび１．０−２．５ｋＶに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）などの高電圧電気パルス装置を用いるエレクトロポレーションによって、Ｅ．ｃｏｌｉ株中に導入した。最適なエレクトロポレーション条件は、ｍｅｇＤＮＡ／菌当たりの最大形質転換率が結果として得られる設定を決定することで、確認した。
【００６０】
Ｅ．ｃｏｌｉ株は典型的にトリプトン大豆寒天（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）上でまたはトリプトン大豆培地（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）中で増殖するが、これは、製造業者の指示に従い作製した。他に断りがなければ、全ての菌は、軽く攪拌しながら５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中３７℃で増殖させた。適切である時には、前記培地に、抗生物質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した。菌株は、典型的に、１ｍｌ当たり約１０９コロニー形成単位（本文で“ｃｆｕ”と記載）で３０％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）含有（Ｄｉｆｃｏ）中に懸濁させ−８０℃で保存した。
【００６１】
マイコバクテリウム株は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９またはＳａｕｌｔｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍのような液体培地中で、好適には３７℃で培養した。前記株は、静止または攪拌培養物として維持できる。さらに、ＢＣＧの成長速度は、オレイン酸（０．０６％ｖ／ｖ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．０１２５７）およびＴｙｌｏｘａｐｏｌ（０．０５％ｖ／ｖ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７０４００）などの界面活性剤の添加により、増強できる。ＢＣＧ培養物の純度は、リン酸緩衝生理食塩水（本文でＰＢＳと称する）中で系列希釈（例  Ｎｅａｔ−１０−８から１０倍ずつの段階）したＢＣＧ培養物のアリコット１００ｍｌをＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０のような固体培地２５−３０ｍｌ含有３．５インチプレート上に均等に伸ばすことで、評価できる。さらに、培養物純度は、チオグリコール酸培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ，カタログ番号１８９１）および大豆−カゼイン培地（ＢＤ，カタログ番号２１１７６８）などの市販の培地を用いてさらに評価できる。
【００６２】
ＢＣＧ株ＡＦＶ−１０２を発現するＰｆｏＡ染色体からポリエピトープを発現させるため、前記スペーサー配列を含むポリエピトープをコードするヌクレオチド配列（配列番号１３）を化学的に合成し、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓのｈｓｐ６０プロモータおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原８５Ｂのシグナルペプチドに読み取り可能に連結させた。この配列を、ＢＣＧ  ＡＦＶ−１０２へのエレクトロポレーションのためにプラスミドベクターｐＪＦＩＮＴへ連結させ、ＡＦＶ−１０２の染色体への組み込みを実行させた。このベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｃｏｌＥ１複製開始点、転写ターミネータｒｒｎＢＴ１、ｐＥＸ１８ｇｍのＴ２およびｒｎｈＡにより分断された３個の複数クローニング部位、バクレリオファージＬ５のａｔｔＰファージ組み込み領域およびバクテリオファージＬ５のインテグラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃Ｚ１８９４６）を含んでいる。Ｌ５配列のすぐ上流には、Ｔｎ１０由来カナマイシン耐性対立遺伝子ａｐｈＡ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＡＭ９７３４５）から構成される選択マーカーカセットおよびｓａｃＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＰ＿３９１３２５）を含ませた。このマーカーカセットは、トランスポゾンＴｎ１０００からのγ△リゾルバーゼ結合部位の直接繰り返し単位が隣接していた。このプラスミドはマイコバクテリウム種内で複製ができず、Ｌ５  ａｔｔＰ配列が、マイコバクテリウム染色体のａｔｔＢ領域との高頻度組換えを可能とし、前記染色体中へのプラスミド配列の組み込みを促進する。次に、γ△リゾルバーゼの導入と１０％ショ糖含有固体培地上でのマーカーを含まない株の選択によって、前記マーカーカセットは、インテグラント染色体から除去できる。
【００６３】
第２のヌクレオチド配列を化学的に合成し、体液性および細胞性応答を惹起するように設計した前記４個および７個のアミノ酸繰り返し単位の両者を含む改変ＣＳＰをコードする。このＣＳＰコード配列は、ＧＰＩアンカー部位下流の免疫抑制配列であるシグナルペプチド配列を欠いており、ＣＳＰタンパク質の、より少ない数（１８）のＮＡＮＰ繰り返し単位をコードする。この配列はまた、ｈｓｐ６０プロモータおよびＡｇ８５Ｂシグナルペプチドに読み取り可能に連結させた。この発現カセットを次に、ポリエピトープ発現配列も含むｐＪＦＩＮＴに連結させた。
【００６４】
生成したプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉＳｔａｂｌｅ２中で増殖させ、カナマイシン耐性クローンのプラスミド配列を確認した。このプラスミドを、１００ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ培養物から単離し、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１のｐｆｏ発現誘導体中にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ＯＡＤＣおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ添加７Ｈ９培地中で一晩培養し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン含有７Ｈ１０寒天上に塗布した。プラスミドはマイコバクテリウム複製開始点をコードしないので、全ての試験したコロニー中のカナマイシン耐性は、ＢＣＧゲノムのａｔｔＢ部位へのプラスミド組み込みによって付与された。各コロニーをＰＣＲ分析のために取り出し、抗原発現分析のため１０％（ｖ／ｖ）ＯＡＤＣおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ添加７Ｈ９培地中に接種した。カナマイシン耐性コロニーのＰＣＲ特性解析は、ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰと命名した組換えＢＣＧの染色体中全プラスミド配列の存在を明らかにした。ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰ培養物を７Ｈ９で洗浄し、これを用いてタンパク質非含有７Ｈ９Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ培養物を接種した。ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰ培養物上清を遠心分離で採取し、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ３Ｄ７（ＡＴＣＣ／ＭＲ４）のＣＳＰタンパク質に対するウサギポリクローナル抗血清によりイムノブロッティングした。イムノブロッティングは、大きな改変ＣＳＰとポリエピトープの両者の存在を明らかにした。
【００６５】
このワクチン構築を完成させヒトでの使用に適したものとするため、組み込まれたプラスミドのマーカーカセットを、次に除去した。エレクトロコンピタントＡＥＲＡＳ−ＣＳＰ細胞は、Ｔｎ１０００のγ△リゾルバーゼをコードするプラスミドｐＹＵＢ８７０ｈｙｇ、ｓａｃＢ対立遺伝子およびハイグロマイシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＃ＡＢＤ６４３６６）によりエレクトロポレーションした。カナマイシンおよびハイグロマイシンの両者に耐性の形質転換体を７Ｈ１０培地で選択し、１０％（ｖ／ｖ）ＯＡＤＣおよび０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｙｌｏｘａｐｏｌを有するが抗生物質を全く含まない７Ｈ９液体培地に接種した。７日間増殖させた後、これらの液体培養物の希釈物を１０％ショ糖含有７Ｈ１０に塗布し、ａｐｈＡ−ｓａｃＢマーカーを切り出しかつｐＹＵＢ８７０ｈｙｇプラスミドを希釈とｓａｃＢ対立遺伝子に対する選択により欠失した組換え体を選択した。
【００６６】
ショ糖耐性形質転換体を、組み込み抗原カセット類のＰＣＲ分析のために取り出し、前のようにイムノブロット分析用７Ｈ９液体培地に接種した。ＰＣＲ分析は、この抗原発現カセット類が前記染色体中にまだ存在していることおよびハイグロマイシン耐性マーカーおよびｓａｃＢ遺伝子が切り出されたことを明らかにした。ＣＳＰ抗血清による上清と細胞ペレットのイムノブロッティングは、前記カセットの除去がＣＳＰポリエピトープまたは改変ＣＳＰの発現を行わないことを明らかにした。
【実施例６】
【００６７】
上述のＣＳＰポリエピトープを発現するｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰによるヒトＭＨＣ対立遺伝子保有トランスジェニックマウスのワクチン接種により惹起された免疫性
【００６８】
ＭＨＣ  Ｉ対立遺伝子欠失を有しかつポリエピトープ中でコードされたペプチド類に対応する前記８種の主要ヒトスーパータイプＨＬＡ対立遺伝子類Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ２４，Ａ２６，Ｂ４４，Ｂ５８およびＢ６２のひとつを発現するトランスジェニックＳＪＬ／Ｊマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入する。マウスを、３２匹の４群に分け、各群に８ＨＬＡタイプのそれぞれについて４匹を含めるようにする。１−４群は、下記のようにワクチン接種する：１群には、皮下でＰＢＳ１００μｌを投与し、２群には、親ＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−４０１を皮下で５×１０５ｃｆｕを投与し、３群には、ｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰを皮下で５×１０５ｃｆｕ投与し、４群には、皮下でＡＥＲＡＳ−ＣＳＰを５×１０５ｃｆｕ投与し、８週後、ＣＭＶプロモータ制御下でＣＳＰポリエピトープをコードするＤＮＡワクチンを筋肉内に１００μｇ、投与する。
【００６９】
ワクチン接種１０週後マウス全部を屠殺し、各ＨＬＡタイプの各群から脾臓を採取しプールする。単細胞懸濁液は、この脾臓を７０μｍのセルストレーナー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で加圧ろ過することにより、調製する。脾臓細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（Ｒ１０；１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ−１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ））、５５μＭ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に再懸濁し、５２０×ｇで５分間、４℃で遠心分離する。脾臓１個につき室温で２分間、１ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｃｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により赤血球を溶解させた後、細胞を洗浄しＲ１０中に再懸濁させる。計数する前に７０μｍのセルストレーナーにより再度単細胞懸濁液をろ過し、細胞濃度を１５×１０６細胞／ｍｌに調整する。ポリエピトープ中に含ませたものに適合する配列を有するそれぞれのＣＳＰ由来ペプチドを、合成した（ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）。前記ペプチドをＲ１０培地で最終濃度それぞれ１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌに希釈する。サイトカイン発現分析のため、脾臓細胞を３重に２．５×１０５細胞／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに塗布し、抗原とともにまたは抗原なしで７２時間培養した。３日間刺激した後上清を採取し、ＩＦＮ−γを、ＯｐｔＥＩＡＴＭＥＬＩＳＡキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いるＥＬＩＳＡによって製造業者の指示に従い決定する。
【００７０】
ＣＳＰポリエピトープペプチド特異は、フローサイトメトリによりＩＦＮ−γについて細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により特性解析する。簡単に述べると、上記のように調製した脾臓細胞を陰性対照としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により刺激し、前記ポリエピトープ対応ペプチドプール（ＳｙｎＰｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）は、１μｇ／ｍｌのａＣＤ２８およびａＣＤ４９ｄ  ｍＡｂｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）含有Ｒ１０培地で前希釈する。ホルボール−１２−ミリステート−アセテート（０．１μｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（４μｇ／ｍｌ）（ＰＭＡ／Ｉ）、（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ））で処理した細胞は、陽性対照として使用した。細胞刺激のため、上記溶液１００μｌプラス各細胞懸濁液１００μｌを９６ウェルの丸底培養プレート中に添加し、３７℃で１時間、５％ＣＯ２で培養した。最終懸濁液中のペプチド濃度は１．２μＭ／ペプチドである。１０μｇ／ｍｌ  Ｇｏｌｇｉ−Ｐｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）添加後、プレートをさらに４−５時間インキュベーションする。インキュベーション後、プレートを細胞内サイトカイン染色のために処理する。細胞をＰＢＳで洗浄し、１μｌのＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＵＳ）を含むＰＢＦ（ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ）５０μｌ中に再懸濁させ、氷上で１０分間インキュベーションする。細胞をその後、力価検定済みａＣＤ８−ＰＣ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）抗体で染色する。Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて、細胞の透過性を上げる。細胞内サイトカイン染色のため、ａＩＦＮ−γ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８を用いる。インキュベーションおよび洗浄段階の後、細胞ペレットを、１％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を用いて固定した。サンプルを、ＣｙＦｌｏｗ  ＭＬ（Ｐａｒｔｅｃ，Ｍｕｅｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）フローサイトメーターを用いて各サンプルから１０５標的細胞イベントを採取することによって、分析する。全てのデータ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）により行い、刺激後のＩＦＮ−γ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、ＤＭＳＯ単独で刺激した細胞の百分率に対して、計算した。
【００７１】
親株のマウスはこれらのエピトープ類全てを認識しかつ提示するために必要なＭＨＣ分子類を欠失しているので、３群および４群のマウス由来脾臓細胞によるＩＦＮ−γ産生が１群および２群で検出されたバックグラウンドレベルを上回ることは、これらの動物が適切に処理され、ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰによりコードされたポリエピトープを認識することおよび所望の免疫応答がワクチン接種により惹起されたことを示唆するであろう。
【実施例７】
【００７２】
上述のＣＳＰポリエピトープを発現するｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰによるワクチン接種に対する免疫応答の評価
【００７３】
実施例６の場合と同様に、前記ポリエピトープ中でコードされたペプチドに対応する前記８種の主要ヒトスーパータイプＨＬＡ対立遺伝子Ａ１，Ａ２，Ａ３，Ａ２４，Ａ２６，Ｂ４４，Ｂ５８およびＢ６２のひとつを発現するトランスジェニックＳＪＬ／Ｊマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から購入する。マウスを、３２匹ずつの４群に分け、各群に８ＨＬＡタイプのそれぞれについて４匹の動物を含めるようにする。１−４群は、下記のようにワクチン接種する：１群には、皮下でＰＢＳ１００μｌを投与し、２群には、親ＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−４０１を皮下で５×１０５ｃｆｕを投与し、３群には、ｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰを皮下で５×１０５ｃｆｕ投与し、４群には、皮下でｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰを５×１０５ｃｆｕ投与し、８週後、ＣＭＶプロモータ制御下でＣＳＰポリエピトープをコードするＤＮＡワクチンを筋肉内に１００μｇ投与する。
【００７４】
ワクチン接種２週後マウス全部に少なくとも１０回、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣＳＰ発現ハイブリッドＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイドに感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｄｕｒｅｍｉ蚊に刺させることでチャレンジする。ハイブリッドスポロゾイトの構築およびワクチン奏効性研究におけるそれらの用途は、当業者に公知である。ｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰを投与した３群および４群のトランスジェニック動物ではマラリアが予防され、一方、１群および２群の動物は、貧血、臓器損傷およびＰ．ｂｅｒｇｈｅｉマラリア関連脳病理を発症するであろう。
【実施例８】
【００７５】
上述のＣＳＰポリエピトープを発現するｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰをワクチン接種した霊長類の防御
【００７６】
アカゲザル１０匹に対して、生理食塩水１００μｌを皮内に（４）、ｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−４０１  ５×１０５ｃｆｕを皮内（４）に、ｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰ  ５×１０５ｃｆｕを皮内（８）にワクチン接種する。ワクチン接種２週後、実験的に、動物全てに対して少なくとも１００回、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍＣＳタンパク質発現ハイブリッドＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｋｎｏｗｌｅｓｉマラリア寄生体類に感染したＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｈａｃｋｅｒｉ蚊に刺させてチャレンジする。ハイブリッドスポロゾイトの構築およびワクチン奏効性研究におけるそれらの用途は、当業者に公知である。ｒＢＣＧ  ＡＥＲＡＳ−ＣＳＰを投与した全動物はマラリアが予防され、一方、前記ポリエピトープワクチンを投与されなかった１群および２群の動物は、マラリアを発症し、防御されないであろう。
【００７７】
本発明を好適な実施の態様について上に述べてきたが、当業者は、付属の請求の範囲の真意と範囲を逸脱することなく変形を加えて実施できることを理解するであろう。従って、本発明は、上述の実施の態様に限定されず、本文に示した明細書の真意と範囲に含まれるあらゆる変形やその均等物を含む。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
毎年世界で６億人以上が罹患し数百万人が死亡するマラリア感染症の征圧に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのＡｓｅｍｂｏ  Ｂａｙ株由来ＣＳＰのタンパク質配列（配列番号１４）。
【図２】例示的最終反復ポリエピトープのアミノ酸配列（配列番号１３）を大略図示したもの。
【図３】ＣＳＰタンパク質の可変領域中Ｔ細胞エピトープ類。
【図４】前記１２種のスーパータイプのいずれかを認識する推定９、１０および１１量体ペプチド類をＣＳＰポリペプチドに沿ってマッピングしたもの。
【図５】“ホットスポット”クラスター類１−４のグラフ表示。
【図６】クラスター１およびクラスター４の両者の配列を含む例示的ポリエピトープのアミノ酸配列（配列番号３９）。
【図７】例示的第一反復ポリエピトープのアミノ酸配列（配列番号４０）。
【図８】図７に示した例示的第一反復ポリエピトープをコードする核酸配列（配列番号４１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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