(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)の宿主細胞内で哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法であって、
宿主細胞を、哺乳動物の組み換え型タンパク質をコードする核酸で形質転換する工程であって、哺乳動物の組み換え型タンパク質をコンカタメリックな前駆体としては生産しない工程、
哺乳動物の組み換え型タンパク質の発現が可能な条件下でその細胞を培養する工程であって、哺乳動物の組み換え型タンパク質が可溶型または不溶型で宿主細胞内に存在する工程、及び
可溶性または活性型の哺乳動物の組み換え型タンパク質のレベルを測定する工程を含み、
シュードモナス・フルオレッセンス中の可溶性または活性型の哺乳動物の組み換え型タンパク質のレベルが、エシェリキア・コリ(E. coli)の発現系内で実質的に同等の条件下で発現した可溶型または活性型のタンパク質のレベルと比較したときに少なくとも２倍である方法。
【請求項２】
哺乳動物の組み換え型タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物の組み換え型タンパク質を実質的に精製する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物の組み換え型タンパク質が活性型で該宿主細胞内に存在する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物の組み換え型タンパク質がヒトのペプチドである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
哺乳動物の組み換え型タンパク質が、全細胞タンパク質の少なくとも５％となるように生産される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物の組み換え型タンパク質が、少なくとも１０ｇ／Ｌの濃度で生産される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の組み換え型タンパク質が少なくとも約１ｋＤ〜約５００ｋＤの間の質量を有する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物の組み換え型タンパク質が抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
その抗体をコードする該核酸が、少なくとも二つの発現ベクターを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも二つの該発現ベクターが、第一のプロモーター−シストロンペアと第二のプロモーター−シストロンペアとを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該第一のプロモーター−シストロンペアが免疫グロブリンの軽鎖であり、および該第二のプロモーター−シストロンペアが免疫グロブリンの重鎖である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該軽鎖および重鎖が同じプラスミド上に位置する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該第一のまたは第二のプロモーター−シストロンペアが、抗体をコードする核酸に機能するように結合した翻訳開始領域をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
該翻訳開始領域が、異なる翻訳強度を該第一のおよび第二のプロモーター−シストロンペアに提供する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該核酸が、少なくとも二つの別個の翻訳単位を含む抗体または抗体断片をコードし、そしてさらにその翻訳単位が連続的に発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
該少なくとも二つの別個の翻訳単位が軽鎖および重鎖を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該抗体が、一本鎖抗体、全鎖抗体、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）2−ロイシンジッパー、Ｆｖ、ｄｓＦｖおよび抗ＣＤ１８抗体からなる群より選択される抗体断片である、請求項１０〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
該Ｆａｂ断片が軽鎖断片および重鎖断片を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該Ｆａｂが抗原結合部位を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該抗体または抗体断片がキメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１０〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
該方法が、分泌シグナル配列を該抗体と結合させる工程をさらに含む、請求項１０〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
該抗体がＦｃ領域をさらに含む、請求項１０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
該抗体が融合タンパク質である、請求項１０〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ヒトの組み換え型ペプチドをコードする核酸を含み、該ヒトの組み換え型ペプチドをコンカタメリックな前駆体としては生産しない、シュードモナス・フルオレッセンス細胞。
【請求項２６】
該ヒトの組み換え型ペプチドを発現する、請求項２５記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（先行出願への言及）
本出願は、２００４年４月２２日に出願された、「シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)における哺乳動物タンパク質の発現」という名称の米国仮出願第６０／５６４，７９８号についての優先権、および２００４年１月１６日に出願された、「タンパク質発現系」という名称の第６０／５３７，１４８号についての優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、シュードモナス菌内、とりわけシュードモナス・フルオレッセンス生物内で発現させることによる、哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するために改良された方法に関する。本方法は、哺乳動物のタンパク質発現の生産を改良したものであり、公知の発現系を凌いでいる。
【背景技術】
【０００３】
全世界で３億２５００万人を超える人々が、米国食品医薬品局(FDA)が認可した１５５を超えるバイオテクノロジー薬剤およびワクチンによって助けられてきた。さらに現在のところ、種々のガン、アルツハイマー病、心疾患、糖尿病、多発性硬化症、ＡＩＤＳおよび関節炎を含む２００を超える疾病をターゲットとする、３７０を超えるバイオテクノロジー製剤およびワクチンが臨床試験の状態にある。古典的な化学合成を経て生産される従来の小分子での治療法とは異なり、タンパク質は通常、生きている細胞内で非効率的かつ高コストで生産される。この高コストと複雑さのせいで、タンパク質に基づく治療のための生産能力は不足している。
【０００４】
生産物を生産するために微生物の細胞を使用することには、非常に長い歴史がある。早くも１８９７年には、Ｂｕｃｈｎｅｒは酵母から抽出された酵素が糖をアルコールに効率的に変換することを発見し、微生物を利用した重要な工業用化学薬品の生産を導いた。１９４０年代までには、発酵を経たペニシリンの大規模生産が実現した。外来遺伝子を細菌内に挿入するための最初の技術は１９７０年代の前半に開発された。哺乳動物の組み換え型タンパク質の細菌による、商業的に実現可能な生産が最初に活用されたのは、ヒトインスリンの生産においてであった(Goeddel, et al., 1979a; Wong, 1997)。現在の発酵および細胞培養は、アルコール、抗生物質、生化学的物質および治療用タンパク質の工業生産の大半の基礎となっている。しかしながら、治療的に有用なタンパク質の開発および生産の大部分が、これらの外因性タンパク質を発現させるために用いられる現在の生物が制限されていることによって妨害されてきた。
【０００５】
原核生物のタンパク質発現対真核生物のタンパク質発現
多くの場合、細菌の発現系を用いて真核生物の組み換え型タンパク質を生産しているが、得られるタンパク質が、それらのオリジナルの複製物とは明らかに異なっていることが通常である。一般的に、エシェリキア・コリの発現系で真核生物の二次構造および三次構造を再現することは困難が多い。その反面、現在の真核生物の発現系で真核生物の組み換え型タンパク質の二次構造および三次構造を形成させることはより可能性は高いが、これらの系が組み換え型タンパク質を大量に生産する能力には限界がある。
【０００６】
翻訳後修飾は、原核生物のタンパク質発現と真核生物のタンパク質発現との間での最も顕著な相違点の代表である。原核生物（すなわち細菌）は極めて単純な細胞構造を有し、膜結合性の細胞小器官を持たない。真核生物においては、タンパク質が最初に生産された後で修飾を受けることが多い。多くの場合、これらの修飾は、ペプチドを機能を有する形態に転換することに必要である。従って、現存する細菌の発現系が正確な一次構造を伴うタンパク質を生産する場合でさえ、そのタンパク質が翻訳後修飾を受けないことがあり、その結果、多くの場合機能しない。一般的な修飾としては、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化およびγ−カルボキシル化が挙げられ、これらのすべてがタンパク質の折りたたみと生物活性とを制御することができる。一般的に、細菌の発現系では、真核生物のタンパク質の正確なグリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化およびγ−カルボキシル化はなされない。
【０００７】
細菌、たとえばエシェリキア・コリはジスルフィド結合を形成できるが、その結合は生物活性に必要な立体配置とは異なる状態に形成されることが多い；従って、真核生物の活性なタンパク質を生産するためには、通常は変性と再折りたたみとが必要である。それ以外のタンパク質の折りたたみを促進する分子シャペロンタンパク質は、原核生物および真核生物の両方に存在する。このようなシャペロンが存在しない場合、折りたたまれていないかまたは部分的に折りたたまれたポリペプチド鎖が細胞内で不安定に存在し、不正確な折りたたみまたは凝集して不溶性複合体となることが多い。シャペロンの結合によってこれらの折りたたまれていないポリペプチドを安定化させ、それによって不正確な折りたたみまたは凝集を防止し、そのポリペプチド鎖がその正確な立体配置をとれるような折りたたみを可能とする。しかしながら、シャペロンは細胞のそれぞれのタイプにおいて異なっており、細胞外の条件に基づいて違った形で発現され得る。
【０００８】
現在の発現系に伴う課題
エシェリキア・コリ(E. coli)は、最も広範囲にかつ日常的に用いられている、タンパク質の発現系である。エシェリキア・コリで生産することは、あまり高価ではなく、迅速でかつ十分に特徴づけられている。さらに、スケールアップと回収が可能であり、ｃＧＭＰの生産が十分に確立されている。しかしながら、エシェリキア・コリの使用には明確な制限があり、特に哺乳動物の組み換え型タンパク質の発現の際に、このことを克服することは多くの場合困難であることが分かっている。
【０００９】
上記の制限と共に、エシェリキア・コリ内での組み換え遺伝子産物の高レベル発現は多くの場合、対象タンパク質の折りたたみの間違い、細胞性プロテアーゼによるその後の分解、または封入体として知られている生物学的に不活性な凝集物への沈積が生じる。封入体で見られるタンパク質は通常、抽出され、復元されて活性を回復し、プロセスへの時間とコストとを追加されるはずである。典型的な復元方法には、高濃度の変性剤で凝集物を溶解させ、次いで希釈によってその変性剤を除去するという試みが含まれる。封入体の形成に関与すると示唆されている因子のいくつかとしては、タンパク質の局部での高濃度化；ジスルフィド結合の形成を妨害する細胞質内での環境の還元化（エシェリキア・コリの細胞質は高レベルのグルタチオンを有する）；タンパク質の溶解性を高め得る翻訳後修飾の欠如；シャペロンとインビボでの折りたたみに関与するその他の酵素との間の不適切な相互作用；ジスルフィド結合またはその他の共有結合を介する分子間架橋形成；ならびに溶解性が制限されていることによる折りたたみ中間物の凝集物の増加が挙げられる。これらの因子が組み合わさること、ならびにシャペロンの入手可能性が制限されていることもあり得、このことが封入体形成のほとんどすべてを導く。
【００１０】
酵母の発現系、たとえばサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはピチア・パストリス(Pichia pastoris)も、タンパク質の生産のために一般的に用いられる。これらの系は十分に特徴づけられており、良好な発現レベルを提供し、比較的迅速であり、そしてその他の真核生物の発現系よりも高価ではない。しかしながら、酵母は制限された翻訳後のタンパク質修飾しか達成し得ず、そのタンパク質は再折りたたみが必要となり、その細胞壁の特性によるタンパク質の回収が課題となり得る。
【００１１】
昆虫細胞の発現系も、タンパク質発現系の魅力的な代替系として浮上しつつあるが、高価である。一般的な翻訳後修飾を受けて正確に折りたたまれたタンパク質を生産することもでき、細胞外の発現も実現している。しかしながら、細菌および酵母と同程度に迅速ではなく、スケールアップも一般的に困難を伴う。
【００１２】
哺乳動物細胞の発現系、たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞が複合タンパク質の発現に用いられることは多い。この系は通常、適切な翻訳後修飾によって正確に折りたたまれたタンパク質を生産し、そのタンパク質を細胞外で発現させることもできる。しかしながら、この系は極めて高価であり、スケールアップは緩慢であり実施不可能なことも多く、得られるタンパク質はその他のあらゆる系よりも少ない。
【００１３】
シュードモナス・フルオレッセンス(P. fluorescens)
シュードモナス・フルオレッセンスは、土壌、水および植物表面の環境でコロニーを形成する一般的な非病原性の腐生菌の一群を包含する。シュードモナス・フルオレッセンスは、農業および工業上のプロセス、たとえば非哺乳動物の工業上および農業上のタンパク質の商業的生産、で広く用いられている。シュードモナス・フルオレッセンスに由来する非哺乳動物の酵素は、環境汚染を減らすための洗剤の添加物として、および立体選択的な加水分解のために用いられてきた。１９８０年代の中ごろに、Ｍｙｃｏｇｅｎ社はシュードモナス・フルオレッセンスで細菌の組み換え型タンパク質を発現させることに着手し、シュードモナス・フルオレッセンスでバチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)毒素を発現させることに関する最初の特許出願（「生物農薬の細胞内カプセル化（Cellular encapsulation of biological pesticides）」）を、１９８５年１月２２日に出願した。１９８５年〜２００４年の間では、Ｍｙｃｏｇｅｎ社、後のＤｏｗ Ａｇｒｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社ならびにその他の企業が、農薬、殺虫剤および殺線虫性毒素の生産に関する特許出願、ならびに特定の毒素配列およびこれらの発現を促進するための遺伝子操作に関する特許出願におけるシュードモナス・フルオレッセンスの農業上の利用に出資した。シュードモナス・フルオレッセンスでの細菌の組み換え型タンパク質の発現を対象とする特許出願の具体例としては、次のものが挙げられる：米国特許第３，８４４，８９３号；同第３，８７８，０９３号、同第４，１６９，０１０号；同第５，２９２，５０７号；同第５，５５８，８６２号；同第５，５５９，０１５号；同第５，６１０，０４４号；同第５，６２２，８４６号；同第５，６４３，７７４号；同第５，６６２，８９８号；同第５，６７７，１２７号；同第５，６８６，２８２号；同第３，８４４，８９３号；同第３，８７８，０９３号；同第４，１６９，０１０号；同第５，２３２，８４０号；同第５，２９２，５０７号；同第５，５５８，８６２号；同第５，５５９，０１５号；同第５，６１０，０４４号；同第５，６２２，８４６号；同第５，６４３，７７４号；同第５，６６２，８９８号；同第５，６７７，１２７号；同第５，６８６，２８２号；同第５，６８６，２８３号；同第５，６９８，４２５号；同第５，７１０，０３１号；同第５，７２８，５７４号；同第５，７３１，２８０号；同第５，７４１，６６３号；同第５，７５６，０８７号；同第５，７６６，９２６号；同第５，８２４，４７２号；同第５，８６９，０３８号；同第５，８９１，６８８号；同第５，９５２，２０８号；同第５，９５５，３４８号；同第６，０５１，３８３号；同第６，１１７，６７０号；同第６，１８４，４４０号；同第６，１９４，１９４号；同第６，２６８，５４９号；同第６，２７７，６２５号；同第６，３２９，１７２号；同第６，４４７，７７０号；並びにＰＣＴ公報第ＷＯ００／１５７６１号；同第ＷＯ００／２９６０４号；同第ＷＯ０１／２７２５８号；同第ＷＯ０２／０６８６６０号；同第ＷＯ０２／１４５５１号；同第ＷＯ０２／１６９４０号；同第ＷＯ０３／０８９４５５号；同第ＷＯ０４／００６６５７号；同第ＷＯ０４／０１１６２８号；同第ＷＯ８７／０５９３７号；���第ＷＯ８７／０５９３８号；同第ＷＯ９５／０３３９５号；同第ＷＯ９８／２４９１９号；同第ＷＯ９９／０９８３４号；および同第ＷＯ９９／５３０３５号。
【００１４】
２００３年１０月８日、Ｄｏｗ  ＡｇｒｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社は、「抗ウイルス物質、アジュバントおよびワクチン促進剤の生産および送達のために修正された組み換え細胞(ARCs)」という名称のＰＣＴ公報第０４／０８７８６４号を出願した。この出願には、ケモカインまたはサイトカインをコードする少なくとも一つの異種遺伝子を含み得る組み換え細胞、および免疫応答を促進するためにこのような細胞を宿主に投与することが記載されている。この出願では、シュードモナス・フルオレッセンスでのウシインターフェロン−αおよびインターフェロン−γの生産を実証している。
【００１５】
Ｄｏｗ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社は最近、組み換え型タンパク質を生産するためのシュードモナス・フルオレッセンスを用いる分野の係属中の特許出願を抱えている。２００３年２月１３日にＤｏｗ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により出願された、「Over-Expression of Extremozyme Genes in Pseudomonas and Closely Related Bacteria」という名称のPCT出願ＷＯ  ０３／０６８９２６号では、シュードモナス菌、特にシュードモナス・フルオレッセンスにおける発現系を、エキストレモザイム酵素を生産するための宿主細胞として用いることができることが開示されている。これらの酵素は典型的には古くからあり、原核生物、真核生物、たとえば真菌、酵母、地衣類、原生生物および原虫、藻類およびコケ類、緩歩動物ならびに魚類で見出される。この特許では、特定の好極限性(extremophilic)の真菌および酵母から酵素を導くことができるが、好極限性の細菌から導くことが通常であることが開示されている。
【００１６】
２００３年４月２２日にＤｏｗ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により出願された、「Low-Cost Production of Peptides」という名称のＰＣＴ公報ＷＯ  ０３／０８９４５５号では、シュードモナス菌、特にシュードモナス・フルオレッセンスにおいて、小ペプチド、主として抗菌性ペプチドをコンカタメリック(concatameric)な前駆体として生産する方法が記載されている。
【００１７】
Ｄｏｗ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社による、「Benzoate and Antranilate Inducible Promoters」という名称のＰＣＴ公報ＷＯ  ０４／００５２２１号からは、シュードモナス・フルオレッセンスから、新規安息香酸エステルまたはアントラニル酸エステル誘導性プロモーター、ならびに新規タンデムプロモーター、その変異型および改善された突然変異型が提供され、これらは市販の原核生物の発酵系にとって有用である。
【００１８】
Ｍｏｎｓａｎｔｏ社による米国特許第５，２３２，８４０号では、原核生物細胞内で特定のタンパク質の発現を促進するために、新規のリボゾーム結合部位を用いることが記載されている。一例においては、この細胞を用いて、いくつかの生命体、たとえばエシェリキア・コリ、シュードモナス・フルオレッセンスおよびシュードモナス・プチダ(P. putida)においてブタ成長ホルモンを発現している。このデータから、シュードモナス・フルオレッセンスは、エシェリキア・コリと比べて成長ホルモン発現の効率が低いことが示される。これとは対照的に、細菌タンパク質を発現させる場合、シュードモナス・フルオレッセンスは、同等の条件下でのエシェリキア・コリと比べて、タンパク質生産の効率がはるかに高い。実際のところ、この特許に記載されたシュードモナス・フルオレッセンス細胞は、エシェリキア・コリと比べて数倍を超える量の細菌由来のβ−ガラクトシダーゼを生産する（表４と、表１および表２との比較）。
【００１９】
商業上関心のあるタンパク質を生産することの進歩はなされてきたが、哺乳動物の組み換え型タンパク質、特にヒトタンパク質の能力と生産レベルとを改善するという強い要求も依然として残っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、本発明の目的は、治療目的のために単離し精製することができる、哺乳動物の組み換え型タンパク質、特にヒトタンパク質を生産するための方法、およびこの方法を実現させることができる細胞を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物の活性な組み換え型タンパク質、たとえば哺乳動物の複合タンパク質を生産するための改善された方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、哺乳動物の組み換え型タンパク質、特にヒトタンパク質を高レベルで生産するための改善された方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、可溶性または不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質を高い発現レベルで供給する、形質転換された生命体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
シュードモナス・フルオレッセンスが、組み換え型タンパク質、特に哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトの組み換え型タンパク質を生産するための優れた生命体であることが発見された。これらの発見に基づいて、本発明は、シュードモナス・フルオレッセンスにおいて、哺乳動物の組み換え型タンパク質または哺乳動物に由来するタンパク質を生産する方法を提供する。さらに本発明は、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するために形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンスを提供する。
【００２５】
一つの実施形態においては、本発明は、細胞あたりまたは発酵反応物１リットルあたり、同等の条件下でのエシェリキア・コリ生物よりも高いレベルまたは濃度でタンパク質が生産されるところのシュードモナス・フルオレッセンス生物で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。さらに別の実施形態においては、本発明は、組み換えエシェリキア・コリ生物の対応するバッチよりも、１リットルあたりのタンパク質をより多く生産するシュードモナス・フルオレッセンス生物でバッチ培養で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。
【００２６】
同等の条件または実質的に同等の条件とは具体的には、異なる生命体において、同様の機能するように結合した転写プロモーターおよびリボゾーム結合部位を用い、そして同じ初期誘導条件を用いることによる、組み換え型タンパク質の発現を意味する。同等の条件としては、同じベクターと関連する調節エレメント、たとえばこれらに限定されるわけではないが、エンハンサー配列、終止配列および開始又は複製配列、を用いることも含まれ得る。同等の条件としては、細胞発酵反応物が同じ総体積であることも含まれ得る。同等の条件としては、反応物１リットルあたりの総細胞濃度が同じであることも含まれ得る。一つの実施形態においては、この条件は、（測定前の）総誘導時間が同程度または同じであることも含む。しかしながら、別の実施形態においては、生命体に応じて誘導時間を変えてもよい。具体的には、エシェリキア・コリ細胞のほとんどが変化しない時点においてシュードモナス・フルオレッセンスにおけるタンパク質生産を測定できるように、シュードモナス・フルオレッセンスは、タンパク質生産を減らすこと無く、エシェリキア・コリを超えて長時間増殖する能力を有する。同等の条件を測定する一つの方法は、全細胞タンパク質あたりの組み換え型タンパク質のパーセントを比較することである。さらに同等の条件は、同一の培地を必要としない。培地を調整して、個々の生命体にとって最適な生産を確実にすることができる。
【００２７】
別の実施形態においては、本発明は、シュードモナス・フルオレッセンス生物でタンパク質を生産する工程、および生産されたタンパク質を単離する工程によって、哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法を提供する。一つの下位実施形態においては、本方法は、タンパク質を実質的に精製する工程を含む。一つの実施形態においては、このタンパク質はヒトタンパク質に由来するか、またはヒト化されたものである。
【００２８】
本発明は、少なくとも次の実施形態におけるシュードモナス・フルオレッセンスの使用をも提供する：
（ｉ）１〜７５全細胞タンパク質パーセント（％ｔｃｐ）の間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞に存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｉｉ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に存在する、可溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｉｉｉ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に存在する、不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｉｖ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズム内にある、可溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｖ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズム内にある、不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｖｉ）少なくとも４０ｇ／Ｌの細胞密度で培養した場合における、１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞に存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｖｉｉ）細胞内に活性型で存在する、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｖｉｉｉ）活性型の哺乳動物の複数サブユニット型の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；
（ｉｘ）次いで単離され精製される、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産；および
（ｘ）復元される、哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質の生産。
【００２９】
一つの実施形態においては、哺乳動物の組み換え型タンパク質は、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択される。
【００３０】
別の実施形態においては、本発明は、次のものを包含する：
（ｉ）実質的に一致する条件下で培養した場合、対応するエシェリキア・コリ生物よりも高いレベルまたは濃度で哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｉｉ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞に存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質およびペプチドを生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｉｉｉ）細胞に活性型で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｉｖ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に可溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｖ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞の細胞質に不溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｖｉ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズムに可溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｖｉｉ）１〜７５％ｔｃｐの間の範囲、または特に少なくとも約５％ｔｃｐ、１０％ｔｃｐ、少なくとも１５％ｔｃｐ、少なくとも２０％ｔｃｐまたはそれ以上を超える範囲の量、細胞のペリプラズムに不溶性で存在する哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトタンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｖｉｉｉ）ヒトを含む哺乳動物の複数サブユニット型の組み換え型タンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物；
（ｉｘ）細胞内に活性型で存在する、ヒトを含む哺乳動物の複数サブユニット型の組み換え型タンパク質を生産するように形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物。
【００３１】
代替的な実施形態においては、以下に詳述するように、シュードモナス生物およびフルオレッセンス以外の近接する細菌を本発明における宿主細胞として用いる。一つの実施形態においては、シュードモナス属から、具体的には非病原性のシュードモナス種から、宿主細胞を一般的に選択することができる。同様に、あらゆるシュードモナス・フルオレッセンス株、たとえばこれらに限定されるわけではないがＭＢ１０１株か、または少なくとも一つのＬａｃリプレッサータンパク質をコードするｌａｃＩ導入遺伝子の、少なくとも一つの宿主細胞で発現可能な挿入されたコピーを含むように改変された株、たとえばＭＢ２１４およびＭＢ２１７を用いて、発明の所望の目的を達成することができる。このシュードモナス生物を、必要に応じて、一つ以上の遺伝子を付加または削除する遺伝子改変を行って、能力、プロセシングまたはその他の特性を改善してもよい。
【００３２】
一つの実施形態においては、シュードモナス生物は、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択される哺乳動物の組み換え型タンパク質をコードする核酸で形質転換される。一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス生物は、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択される哺乳動物の組み換え型タンパク質を発現する。
【００３３】
発現された、哺乳動物の組み換え型タンパク質またはヒトタンパク質は、典型的には少なくとも約１ｋＤの質量、そして最大で約１００、２００、３００、４００または５００ｋＤの質量を有し、多くの場合は約１０ｋＤ〜約１００ｋＤの間の質量を有し、そして通常は約３０ｋＤを超える質量を有するだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法
本発明は、方法と、哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産する、形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物とを提供する。
【００３５】
一つの実施形態においては、本発明は、シュードモナス・フルオレッセンス生物でタンパク質を生産する工程、および生産されたタンパク質を単離する工程によって、哺乳動物の組み換え型タンパク質を生産するための方法を提供する。発現後に、本技術分野において公知の技術、たとえばこれらに限定されるわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、抗体親和性、サイズ排除、またはタンパク質から細胞の残骸のほとんどの部分を取り除くその他の任意の方法によって、このタンパク質を単離することができる。一つの下位実施形態においては、この方法によって、実質的に精製されたタンパク質が提供される。単離されたタンパク質は、それが由来するところの天然のタンパク質のものと同様の活性を有することができる。このタンパク質を、天然のタンパク質のそれと近い、正確に折りたたまれた状態または立体配置で単離することができ、またはさらに復元または改変して、正確に折りたたまれた立体配置を取らせることができる。一つの下位実施形態においては、このタンパク質はヒトタンパク質に由来するか、またはヒト化されたものである。「ヒト化」タンパク質とは典型的には、ヒトに由来するタンパク質配列から部分的に成るキメラ性の哺乳動物型タンパク質である。ヒト化は抗体生産において特に有用であり、ヒト化抗体の開発は広範囲にわたって、たとえば米国特許第６，８００，７３８号に記載されている。
【００３６】
一つの実施形態においては、宿主細胞によるタンパク質の発現に続いて、タンパク質の単離を行う。別の実施形態においては、ペプチドのタンパク質を精製する。代替的な実施形態においては、タンパク質の単離の後で、そのタンパク質を精製する。活性なタンパク質を生産させるために、必要に応じて、単離されたまたは精製されたタンパク質の復元または再折りたたみを行ってもよい。
【００３７】
別の実施形態においては、本発明は、エシェリキア・コリ生物よりも高いレベルまたは濃度でタンパク質が生産されるところのシュードモナス・フルオレッセンス生物で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。シュードモナス・フルオレッセンス生物が、哺乳動物のタンパク質の高レベル生産に適しているかどうかは、従来技術においてこれらの生命体にてこのようなタンパク質の生産が成功しなかったことが理由で、予想されていなかった。本発明者らは、これらの生命体が哺乳動物のタンパク質を高レベルで生産する能力を本当に有すること、そして対応する評価法で試験した場合、エシェリキア・コリよりも高い収率すなわち高いレベルでタンパク質を発現することが通常であることを見出した。別の実施形態においては、本発明は、組み換えエシェリキア・コリ生物の対応するバッチよりも、１リットルあたりのタンパク質をより多く生産するシュードモナス・フルオレッセンス生物のバッチ培養で、哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。
【００３８】
いくつかの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンスにおいて、活性型の哺乳動物の組み換え型タンパク質、たとえばヒトの複数サブユニット型のタンパク質を生産すること；シュードモナス・フルオレッセンスにおいて、哺乳動物の組み換え型血液輸送タンパク質、たとえばヒトの血液運搬タンパク質、具体的にはトランスフェリンおよびアルブミンを生産すること；シュードモナス・フルオレッセンスにおいて、活性型の哺乳動物の組み換え型酵素、たとえば哺乳動物の組み換え型酵素を生産すること；シュードモナス・フルオレッセンスにおいて、抗体および抗体断片、たとえば一本鎖抗体およびＦａｂ断片を生産すること；ならびにシュードモナス・フルオレッセンスにおいて、哺乳動物の組み換え型、たとえばヒト転写因子を生産することを含む方法が提供される。
【００３９】
一つの実施形態においては、哺乳動物の組み換え型タンパク質を多量体として、またはコンカタメリックな前駆体で、たとえば少なくとも二つの小ペプチド（１−１５アミノ酸）単位で一列に並んだ形態で生産する。代替的な実施形態においては、哺乳動物の組み換え型タンパク質を多量体として、またはコンカタメリックな前駆体では生産しないが、その代わりに一本鎖のポリペプチドとして生産する。
【００４０】
生体分子のスクリーニング
本発明の別個の実施形態は、所望の活性または特性を示す少なくとも一つのものを特定するための哺乳動物の生体分子のスクリーニングライブラリーのプロセスに、シュードモナス・フルオレッセンス生物を提供する。シュードモナス・フルオレッセンス細胞を、試験することが望ましい哺乳動物に由来する多数の核酸で形質転換し、形質転換された宿主細胞のライブラリーを作製することができる。発現と同時に、細胞質またはその細胞からその後に回収されるもののいずれかを試験するための、少なくともいくつかの核酸でコードされたポリペプチドが生産される。その試験が行われるであろう活性および特性の例としては、次のものが挙げられる：ポリペプチドの発現レベル；ポリペプチドの安定性；および生体触媒活性および特性。生体触媒活性および特性の実例としては、次のものが挙げられる：酵素活性；タンパク質の相互作用／結合性；タンパク質安定性；基質の使用法；産物の形成；反応条件、たとえばｐＨ、塩分濃度もしくは反応温度；所定の触媒反応についての生体触媒パラメータ、たとえばＫｍおよびＶｍａｘ；ならびに安定性の挙動、たとえば熱安定性および生体触媒の寿命の半分。得られたこの試験結果を、さらなる開発のためにライブラリーのメンバーの選択に用いてもよい。
【００４１】
タンパク質の発現
本発明の重要な側面は、シュードモナス・フルオレッセンス生物における発現によって、哺乳動物、たとえばヒトの組み換え型タンパク質を、１〜７５全細胞タンパク質パーセント（％ｔｃｐ）の間の範囲という高レベルで発現することである。この発現されたタンパク質は、シュードモナス・フルオレッセンス細胞内にある時は可溶性または不溶性であり得る。このような高レベルの可溶性または不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質は、哺乳動物のタンパク質の既存の公知の発現系を凌ぐ改善であり得る。特に、大規模な発酵反応物において回収される高レベルの哺乳動物のタンパク質は、公知の技術によっては通常不可能である。
【００４２】
一つの実施形態においては、本発明は、エシェリキア・コリの発現系で見出されるそれを上回る、哺乳動物のタンパク質の発現レベルを提供する。一つの実施形態においては、それぞれの細胞における組み換え型タンパク質の濃度は、比較評価においてエシェリキア・コリで見られる濃度よりも高い。一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンスの発現系において測定される全細胞タンパク質と比較した組み換え型タンパク質のレベルは、エシェリキア・コリにおいて発現する同じ組み換え型タンパク質のそれよりも高い。別の実施形態においては、本明細書で記載されるシュードモナス・フルオレッセンスの発現系における可溶性タンパク質のレベルまたは量は、類似のエシェリキア・コリの発現系における可溶性の組み換え型タンパク質のレベルまたは量よりも高い。別の実施形態においては、活性なタンパク質の総量は、エシェリキア・コリの発現系に由来する量よりも多い。別個の実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンスの発現系において測定される全細胞タンパク質と比較した活性な組み換え型タンパク質のレベルは、エシェリキア・コリにおいて発現する同じ組み換え型タンパク質のそれよりも高い。一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンスにおいて発現するタンパク質のレベル、濃度または量は、エシェリキア・コリにおいて発現する組み換え型タンパク質の、類似の評価法でのレベル、濃度または量の少なくとも２ｘ、少なくとも３ｘ、少なくとも４ｘ、少なくとも５ｘ、少なくとも６ｘ、少なくとも７ｘ、少なくとも８ｘ、少なくとも９ｘ、少なくとも１０ｘまたはそれ以上である。
【００４３】
シュードモナス・フルオレッセンスの発現系としての利点の一つは、それらのタンパク質生産能力に否定的な影響を与えること無く、大規模な培養で細胞を培養できることである。この能力は、その他の細菌系、たとえばエシェリキア・コリにおいて見られる能力を凌いでいる。別の実施形態においては、本方法は、エシェリキア・コリのバッチ培養よりも高い総レベルで、シュードモナス・フルオレッセンスにて組み換え型タンパク質が生産されるところのバッチ培養で哺乳動物のタンパク質生産することを含む。さらに別の実施形態においては、本発明は、組み換えエシェリキア・コリ生物の対応するバッチよりも、１リットルあたりのタンパク質をより多く生産するシュードモナス・フルオレッセンス生物のバッチ培養で哺乳動物のタンパク質を生産する方法を提供する。
【００４４】
本発明は一般的に、方法と、１−７５全細胞タンパク質（ｔｃｐ）％の発現レベルを、可溶性または不溶性の哺乳動物の組み換え型タンパク質に与える能力を有する、形質転換されたシュードモナス・フルオレッセンス生物とを提供する。細胞内で発現される哺乳動物の組み換え型タンパク質は、活性型で発現され得る。その他の実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンスは、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０または７５％ｔｃｐの哺乳動物の組み換え型タンパク質を提供する。
【００４５】
これらのタンパク質は可溶性でもよく、可溶性の場合では、生産の間は、細胞の細胞質またはペリプラズム内に存在し得る。可溶性タンパク質は、たとえばこれらに限定されるわけではないが、圧力によって細胞膜を破裂させる方法（すなわち「フレンチ」プレス法）、または細胞膜のリゾチーム分解法によって、細胞から容易に放出される。界面活性剤(detergents)、たとえば非イオン性界面活性剤を用いると、通常は細胞を溶解させることもできる。可溶性のタンパク質を、緩衝液の構成要素、たとえば緩衝液のｐＨ、塩濃度またはさらなるタンパク質成分（たとえば複数サブユニット型の複合体）を調節することによって、さらに安定化させることができる。たとえば遠心分離および／またはクロマトグラフィー、具体的にはサイズ排除クロマトグラフィー、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、またはアフィニティークロマトグラフィーによって、その他のタンパク質および細胞の残骸から、可溶性タンパク質を単離または精製することができる。
【００４６】
タンパク質は不溶性でもよい。不溶性タンパク質は通常、細胞質の封入体内で見られるが、ペリプラズム内で見られることも多い。すべての不溶性タンパク質が封入体内にあるわけではなく、小タンパク質凝集物のような膜凝集物、または細胞質もしくはペリプラズム内のその他のあらゆる不溶型にも見られることがある。不溶性タンパク質は通常、たとえば還元剤、具体的には尿素または塩酸グアニジンを用いて復元することができる。たとえば遠心分離および／またはクロマトグラフィー、具体的にはサイズ排除クロマトグラフィーによって、不溶性タンパク質またはタンパク質凝集物を単離することができる。不溶性凝集物内のタンパク質は通常、たとえばVinogradov, et al. (2003) Anal Biochem. 15; 320 (2): 234-8に記載のミセルまたは逆ミセルを用いての凝集物の可溶化によって分離することができる。
【００４７】
特定の実施形態においては、無機塩培地（すなわち約４℃〜約５５℃を含む温度範囲内）で培養すると、シュードモナスの宿主細胞は、少なくとも１％ｔｃｐの発現レベルかつ少なくとも４０ｇ／Ｌの細胞密度の哺乳動物の組み換え型ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはその断片を有することができる。特定の実施形態においては、発現系はペプチドの組み換え型タンパク質、たとえば少なくとも１０リットルの発酵規模の無機塩培地（すなわち約４℃〜約５５℃を含む温度範囲内）で培養すると少なくとも５％ｔｃｐの発現レベルかつ少なくとも４０ｇ／Ｌの細胞密度の哺乳動物の組み換え型タンパク質を有するだろう。
【００４８】
本技術分野において公知の標準的な技術によって、発現レベルを測定することができる。一つの実施形態においては、タンパク質の量（グラム）は、所定のサンプルにおける全細胞タンパク質のグラムの量に匹敵する。別の実施形態においては、この測定は１リットルあたりの組み換え型タンパク質のレベルである。別の実施形態においては、公知の標準、たとえばＢＳＡコントロールに照らして、このレベルまたは量を測定することができる。たとえば精製タンパク質の吸光度を分析することによって、タンパク質（具体的には抗体親和性）についてのマーカーの親和性を公知の標準と比較して測定することによって、または活性のレベルを公知の標準（たとえば既知量の精製した活性なタンパク質）と比較して測定することによって、組み換え型タンパク質のレベルまたは量を測定することができる。
【００４９】
特定の状況においては、シュードモナス・フルオレッセンス細菌を発現用宿主細胞として用いる場合、ジスルフィド結合を含む標的ポリペプチドを活性な可溶型で回収するために、さらなるジスルフィド結合を促進しない条件または薬剤を必要とすることが分かった。従って、一つの実施形態においては、遺伝子導入ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または断片は、その天然の状態の分子内ジスルフィド結合を少なくとも一つ含む。その他の実施形態においては、タンパク質は、最大で２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８または２０を超える、その天然の状態のジスルフィド結合を有し得る。
【００５０】
いくつかの実施形態においては、精製または単離前の生産過程において、細胞のペリプラズム内でタンパク質が発現するか見出される。適切な分泌シグナル配列に融合することによって、タンパク質をペリプラズム内に分泌させることができる。一つの実施形態においては、シグナル配列は、シュードモナス・フルオレッセンスのゲノムを原産とするシグナル配列である。具体的な実施形態においては、シグナル配列は、リン酸結合タンパク質、Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質（ＬＡＯｂｐまたはＫＲＯｂｐ）分泌シグナルペプチド、外膜ポーリンＥ（ＯｐｒｅＥ）分泌シグナルペプチド、アズリン分泌シグナルペプチド、鉄（ＩＩＩ）結合タンパク質（Ｆｅ（ＩＩＩ）ｂｐ）分泌シグナルペプチドまたはリポタンパク質Ｂ（ＬｐｒＢ）分泌シグナルペプチドである。
【００５１】
一つの実施形態においては、組み換え型ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらの断片は、その活性状態で折りたたまれた分子内立体配置を有する。シュードモナス・フルオレッセンスは通常、正確に折りたたまれた立体配置の哺乳動物のタンパク質をより効率的に生産する。一つの実施形態においては、５０％を超えて発現された、遺伝子導入ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または生産されたそれらの断片を、可溶性、活性型または不溶性の状態の一本鎖ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはそれらの断片として生産できるが、細胞質内またはペリプラズム内では復元可能な形態である。別の実施形態においては、発現されたタンパク質の約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％を活性型で得ることができ、または活性型に復元することができる。
【００５２】
定義
本明細書を通して、「タンパク質」という用語は、アミノ酸のあらゆるコンカテマーまたはポリマーを含むものとして用いられる。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、相互に交換して用いることができ、その中の一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的アナログであるところのアミノ酸のポリマー、ならびに天然のアミノ酸のポリマーを含む。
【００５３】
「単離された」という用語は、細胞内の天然の状態で見られるような普通に随伴するその他の物質成分、たとえばその他の細胞内成分を実質的にまたは本質的に含まない核酸、タンパク質またはペプチドを意味する。
【００５４】
「精製された」または「実質的に精製された」という用語は、タンパク質がその他の細胞成分から分離されること、およびタンパク質との天然の複合体には存在しない細胞で見られるその他のタンパク質およびペプチドから分離されることを意味するものとして用いられる。特定の実施形態においては、精製タンパク質は、標準的なｃＧＭＰガイドラインで規定されるような治療にまたは獣医に用いることが承認された純度、またはＦＤＡによって承認された純度である。
【００５５】
「全細胞タンパク質のパーセント」（「tcp」）という用語は、凝集した細胞内タンパク質のパーセントとしての宿主細胞におけるタンパク質の量を意味する。あるいは、この用語は、その細胞によって発現された所定のタンパク質の相対量を表す全細胞タンパク質の割合の基準を意味する。
【００５６】
「機能できるように結合」という用語は、そこでの転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメント、それらの調節エレメントはコード配列の発現を導くことができる、が、そのコード配列に関連して宿主細胞内で作用するような配置で、コードする配列に共有結合しているあらゆる立体配置を意味する。
【００５７】
本明細書で用いられるように、「哺乳動物」という用語は、哺乳綱のあらゆる動物を含むまたは示すことを意味し、たとえばヒトまたは非ヒトの哺乳動物、具体的にはこれらに限定されるわけではないが、ブタ(porcine)、ヒツジ(ovine)、ウシ(bovine)、げっ歯類、有蹄類、ブタ(pigs)、ブタ(swine)、ヒツジ(sheep)、仔ヒツジ、ヤギ、ウシ(cattle)、シカ、ラバ、ウマ、サル(monkeys)、サル(apes)、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスが挙げられる。
【００５８】
本明細書で用いられるように、「哺乳動物の組み換え型タンパク質」またはペプチドという用語は、哺乳動物の天然のタンパク質配列に由来するタンパク質または哺乳動物の天然の核酸配列に由来するもしくはそれから生じるタンパク質を含むことを意味する。哺乳動物の天然のｍＲＮＡに実質的に一致する核酸配列から、またはｃＤＮＡまたはその断片に実質的に一致する核酸配列から、このような組み換え型タンパク質を生産することができる。本技術分野において用途が知られている特定の宿主細胞のコドンに従って、この配列を調節することができる。
【００５９】
二つの核酸またはポリペプチドに照らして、「実質的に一致する」というフレーズは、タンパク質のドメイン全体にわたって最も一致するように揃えて、本技術分野において公知のアルゴリズムを用いて測定した場合に、二つの配列において、残基が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超える同一性を有することを意味する。比較のために配列を最大限揃えることを、本技術分野において公知のアルゴリズム（たとえばSmith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 ; Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 (BLAST)）によって、これらのアルゴリズムをコンピュータで実施することによって(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr. , Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または検査によって実施することができる。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、全国バイオテクノロジー情報センター(http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/)を通して公に利用することができる。
【００６０】
「断片」という用語は、ヌクレオチド、タンパク質またはペプチドの配列の一部の配列または部分配列を意味する。
【００６１】
本明細書で用いられるように、「可溶性」という用語は、生理学的条件下の緩衝液で１０−３０分間回転させた場合において、約５，０００×重力〜２０，０００×重力の間での遠心分離によって、タンパク質が沈殿しないことを意味する。可溶性タンパク質は、封入体またはその他の沈殿物の一部分ではない。
【００６２】
本明細書で用いられるように、「不溶性」という用語は、生理学的条件下の緩衝液で１０−３０分間回転させた場合において、５，０００×重力〜２０，０００×重力の間での遠心分離によって沈殿し得るタンパク質を意味する。不溶性タンパク質は、封入体またはその他の沈殿物の一部分であり得る。
【００６３】
「封入体」という用語は、細胞内に含まれる任意の細胞内の物体であって、タンパク質の封鎖された凝集物を包含することを意味する。
【００６４】
本明細書で用いられるように、「相同」という用語は、ｉ）所定のオリジナルのタンパク質の配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５または９８％類似したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、オリジナルのタンパク質の所望の機能を保持するものか、またはｉｉ）所定の核酸の配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５または９８％類似した配列を有する核酸であって、オリジナルの核酸配列の所望の機能を保持するもの、のいずれかを意味する。本発明および開示のすべての実施形態においては、開示された任意のタンパク質、ペプチドまたは核酸を、所望の機能を保持する、相同または実質的に相同なタンパク質、ペプチドまたは核酸と置換することができる。本発明および開示のすべての実施形態において、任意の核酸が開示される場合、本発明は、その開示される核酸にハイブリッド形成するすべての核酸をも包含するものとみなされるべきである。
【００６５】
一つの制限されない実施形態においては、相同なポリペプチドの同一ではないアミノ酸配列は、表１に示される１５の保存的または半保存的な基のいずれか一つの一員であるアミノ酸であり得る。
【表１】
0005602336.tif 000002
【００６６】
生産された哺乳動物のタンパク質のタイプ
一般的に、哺乳動物の組み換え型タンパク質は、そのアミノ酸配列が、公知のあらゆる哺乳動物のタンパク質、またはアミノ酸配列が推定されるあらゆる推定される哺乳動物タンパク質又は哺乳動物に由来するタンパク質であり得る。このタンパク質を、複数サブユニット型のタンパク質、血液運搬タンパク質、酵素、全長抗体、抗体断片または転写因子からなる群より選択することができる。
【００６７】
タンパク質のアミノ酸配列を改変して、所望の特質に調節すること、たとえば相互作用の特定のタイプを保証することができる。この配列を調節して、たとえばその免疫反応性を調節して小さくしたり、または吸光度を高めたり、排出を抑制したり、さもなければ生命体、具体的には哺乳動物におけるバイオアベイラビリティを促進することができる。従って、このタンパク質のアミノ酸配列を調節して、特定の翻訳後修飾またはタンパク質の立体配置を保証することができる。
【００６８】
一つの実施形態においては、哺乳動物のタンパク質はケモカインまたはサイトカインである。別の実施形態においては、哺乳動物のタンパク質は、次のタンパク質のいずれか一つである：ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｅｌａｓｔｉ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＶＩＰ、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＭＳＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；たとえばａＦＧＦ（ＦＧＦ−１）、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６またはＦＧＦ−７）、インスリン様増殖因子（たとえばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）；腫瘍壊死因子（たとえばＴＮＦ、リンホトキシン）、神経成長因子（たとえばＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；インターフェロン（たとえばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；オンコスタチンＭ；幹細胞因子（ＳＣＦ）；トランスフォーミング増殖因子（たとえばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１）；ＴＮＦスーパーファミリー（たとえばＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＳＴＡＬＬ−ｌ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＬｙ５、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ）、ＴＮＦアルファ／ＴＮＦＳＦ２およびＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２）；またはケモカイン（ＢＣＡ−１／ＢＬＣ−１、ＢＲＡＫ／Ｋｅｃ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ３、ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ、エオタキシン−１、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、エクソダス−２／ＳＬＣ、フラクタルカイン／ニューロタクチン、ＧＲＯアルファ／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−１、Ｉ−ＴＡＣ、リンフォタクチン／ＡＴＡＣ／ＳＣＭ、ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ／ＳＴＣＰ−１／ＡＢＣＤ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２α／ＧＲＯβ、ＭＩＰ−３α／エクソダス／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３α／エクソダス−３／ＥＬＣ、ＭＩＰ−４／ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＫ１、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＴＡＲＣまたはＴＥＣＫ）。
【００６９】
あるいは、このタンパク質はケモカインまたはサイトカインではない。別の実施形態においては、哺乳動物のタンパク質は、次のタンパク質の一つではない：ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｅｌａｓｔｉ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＶＩＰ、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＭＳＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＥＧＦ、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；たとえばａＦＧＦ（ＦＧＦ−１）、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６またはＦＧＦ−７）、インスリン様増殖因子（たとえばＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）；腫瘍壊死因子（たとえばＴＮＦ、リンホトキシン）、神経成長因子（たとえばＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；インターフェロン（たとえばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ）；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）；オンコスタチンＭ；幹細胞因子（ＳＣＦ）；トランスフォーミング増殖因子（たとえばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１）；ＴＮＦスーパーファミリー（たとえばＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＳＴＡＬＬ−１／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＬｙ５、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ）、ＴＮＦアルファ／ＴＮＦＳＦ２およびＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２）；またはケモカイン（ＢＣＡ−１／ＢＬＣ−１、ＢＲＡＫ／Ｋｅｃ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ３、ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ、エオタキシン−１、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、エクソダス−２／ＳＬＣ、フラクタルカイン／ニューロタクチン、ＧＲＯアルファ／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−１、Ｉ−ＴＡＣ、リンフォタクチン／ＡＴＡＣ／ＳＣＭ、ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ／ＳＴＣＰ−ｌ／ＡＢＣＤ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２α／ＧＲＯβ、ＭＩＰ−３α／エクソダス／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３α／エクソダス−３／ＥＬＣ、ＭＩＰ−４／ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＫ１、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＴＡＲＣまたはＴＥＣＫ）。一つの実施形態においては、このタンパク質はブタタンパク質ではなく、特にブタ増殖因子ではない。
【００７０】
現時点での本開示のさらなる実施形態では、哺乳動物の組み換え型タンパク質、それらの断片またはその他の誘導体またはそれらのアナログは抗体であり得る。これらの抗体としては、たとえば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明のこの側面としては、キメラ性の抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂ断片またはＦａｂ発現ライブラリーの産物も挙げられる。
【００７１】
複数サブユニット型のタンパク質の生産
本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス種の宿主細胞による、哺乳動物の組み換え型の複数サブユニット型タンパク質の生産が提供される。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型の複数サブユニット型タンパク質を発現するように形質転換されたシュードモナス種の宿主細胞が提供される。一つの実施形態においては、複数サブユニット型のタンパク質、たとえば哺乳動物またはヒトの組み換え型タンパク質、がシュードモナスの宿主細胞内で発現する。一つの実施形態においては、宿主細胞による複数サブユニット型のタンパク質の発現の後、複数サブユニット型のタンパク質が単離される。別の実施形態においては、ペプチドの複数サブユニット型のタンパク質が精製される。このタンパク質は、精製もしくは単離前の細胞によって会合することができ、または単離もしくは精製の間もしくは後で、さらに会合することができる。必要に応じて、このタンパク質またはその任意の一部の復元または再折りたたみを行って、活性なタンパク質を生産することができる。
【００７２】
種々のベクターおよび発現系のあらゆるものを用いて、宿主細胞内で複数サブユニット型のタンパク質を発現させることができる。この複数サブユニットを単一のベクター上に位置させてもよく、必要に応じて種々のプロモーターに機能するように結合させてもよく、必要に応じてポリシストロン配列内に位置させてもよい。それぞれのサブユニットが異なるベクター上にあってもよい。複数のベクターを用いることができる。それぞれのサブユニットが、一つ以上の選択マーカーの制御下にあってもよい。調節エレメントをベクター上、たとえばペリプラズムの分泌シグナル配列、インターナルリボゾームエントリーサイト、アクチベーター配列、プロモーターおよび終止シグナル上に含めてもよい。
【００７３】
一つの実施形態においては、２００４年１１月１９日にＤｏｗ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から出願された米国特許出願第１０／９９４，１３８号に記載されているように、栄養素要求性選択マーカーを伴う発現系を用いて、シュードモナス内で複数サブユニット型のタンパク質が発現される。この出願では、サブユニットをコードするそれぞれの核酸の制御が、栄養素要求性選択マーカーの制御下にある。発現することが可能な複数サブユニット型のタンパク質としては、ホモメリックタンパク質およびヘテロメリックタンパク質が挙げられる。複数サブユニット型のタンパク質は二以上のサブユニットを含んでもよく、サブユニットは同一でも異なっていてもよい。たとえば、このタンパク質は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるサブユニットを含むホモメリックタンパク質であってもよい。このタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはそれを超えるサブユニットを含むヘテロメリックタンパク質であってもよい。
【００７４】
哺乳動物の複数サブユニット型のタンパク質の具体例としては：レセプター、たとえばイオンチャネルレセプター；シグナルタンパク質、たとえばキナーゼ、ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰアーゼ；膜貫通型タンパク質；細胞外マトリックスタンパク質、たとえばコンドロイチン；コラーゲン；免疫調整剤、たとえばＭＨＣタンパク質、全鎖抗体および抗体断片；酵素、たとえばＲＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼ；ならびに膜タンパク質が挙げられる。
【００７５】
血液タンパク質の生産
本発明の一つの実施形態においては、哺乳動物の組み換え型血液タンパク質を生産することが提供される。一つの実施形態においては、宿主細胞による血液タンパク質の発現に続けて、血液タンパク質が単離される。別の実施形態においては、血液タンパク質が精製される。別の実施形態においては、血液タンパク質を単離した後、血液タンパク質が精製される。必要に応じて、このタンパク質の復元または再折りたたみを行って、活性なタンパク質を生産することができる。一般的に、適切な宿主細胞、たとえばシュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞を、血液タンパク質をコードする核酸構築物で形質転換する工程、形質転換された宿主細胞を、発現に適した条件下で培養する工程、そして任意に、その細胞によって発現された組み換え型血液タンパク質を単離し、または単離して精製する工程によって、本発明の組み換え型血液タンパク質を生産する。
【００７６】
別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型血液タンパク質を発現するように、提供される対象の血液タンパク質の発現に適切な遺伝子および調節エレメントを含むベクターで形質転換された、シュードモナスシュードモナス種の宿主細胞が提供される。
【００７７】
発現することができる血液タンパク質としては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、運搬タンパク質、たとえばアルブミン、具体的にはヒトアルブミン（配列番号：１、表２）およびウシアルブミン；トランスフェリン、たとえばヒトトランスフェリン（配列番号：２、表２）、ウシトランスフェリン、ラットトランスフェリン、組み換え型トランスフェリン、組み換え型トランスフェリンの半分子、特性が改変された組み換え型トランスフェリンの半分子；ハプトグロビン；フィブリノーゲンおよびその他の凝固因子；補体成分；免疫グロブリン；酵素インヒビター；基質前駆体、たとえばアンギオテンシンおよびブラジキニン；インスリン；エンドセリン；グロブリン、たとえばアルファ、ベータおよびガンマ−グロブリン；ならびに哺乳動物の血中に主に見られるその他のタイプのタンパク質、ペプチドおよびそれらの断片が挙げられる。多数の血液タンパク質について、アミノ酸配列が報告されており（S. S. Baldwin (1993) Comp. Biochem Physiol. 106b: 203-218を参照すること）、たとえば、ヒト血清アルブミン(Lawn, L. M., et al. (1981) Nucleic Acids Research 9: 22; pp 6103-6114)およびヒト血清トランスフェリン(Yang, F. el al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81; pp. 2752-2756)についてのアミノ酸配列が挙げられる。
【００７８】
具体的な実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス内でのアルブミンの生産が提供され、アルブミンの発現のための単数または複数の核酸配列と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、アルブミンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程、およびシュードモナス・フルオレッセンスによって発現されたアルブミンを回収する工程を含む。この実施形態によると、発現されるアルブミンは、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、ウサギアルブミン、ニワトリアルブミン、ラットアルブミンおよびマウスアルブミンからなる群より選択される。別の実施形態においては、アルブミンを治療的に活性なポリペプチドと融合することができ、このポリペプチドは、哺乳動物起源でも、または非哺乳動物起源でもよい。
【００７９】
さらに具体的な実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス内でのトランスフェリンの生産が提供され、トランスフェリンの発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、トランスフェリンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。別の実施形態においては、トランスフェリンの発現後、および一つの実施形態においてはタンパク質を単離する工程。さらなる実施形態においては、単離後にトランスフェリンを精製することができる。発現されるトランスフェリンは、ヒト血清トランスフェリン、グリコシル化ヒトトランスフェリン、非グリコシル化ヒトトランスフェリン、ヒトトランスフェリンのN末端の半分子、ウシトランスフェリン、ラットトランスフェリン、マウストランスフェリン、霊長類のトランスフェリン、組み換え型トランスフェリン、組み換え型トランスフェリンの半分子、特性が改変された組み換え型トランスフェリンの半分子、トランスフェリンポリヌクレオチド、トランスフェリンポリペプチドにコードされたトランスフェリンポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド、トランスフェリン抗体、トランスフェリン断片および治療的に活性なポリペプチドに融合したトランスフェリンからなる群より選択される。
【００８０】
さらに別の実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス内でのグロブリンの生産が提供され、グロブリンの発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、グロブリンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてタンパク質を単離する工程を含む。さらなる実施形態においては、発現の後にグロブリンを単離し、宿主細胞から精製される。発現されるグロブリンは、ヒトグロブリン、ウシグロブリン、ウサギグロブリン、ラットグロブリン、マウスグロブリン、ヒツジグロブリン、サルグロブリン、ステロイド結合グロブリンおよび治療的に活性なポリペプチドと融合したグロブリンからなる群より選択される。
【００８１】
さらなる実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス内でのインスリンの生産が提供され、インスリンの発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、インスリンの発現に適した条件下で宿主細胞を培養する工程、および任意にタンパク質を単離する工程を含む。さらなる実施形態においては、宿主細胞によってインスリンを生産した後、インスリンを単離し精製することができる。発現されるインスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン、マウスインスリン、ラットインスリン、ブタインスリン、サルインスリンおよび治療的に活性なポリペプチドと融合したインスリンからなる群より選択される。ヒトインスリンの遺伝子についての受入番号はＪ００２６５であり、合成されたヒトインスリンの遺伝子についての受入番号はＪ０２５４７である。
【００８２】
組み換え型血液タンパク質を生産するための全長ＤＮＡ、または血液タンパク質またはその部分のアミノ末端部もしくはカルボキシ末端部のいずれかをコードする切断型ＤＮＡを、利用可能な源から得ることができるか、または標準的な手法による公知の配列に従って合成することができる。
【表２】
0005602336.tif 000003
【００８３】
酵素の生産
本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス種の宿主細胞による哺乳動物の組み換え型酵素またはコファクターの生産が提供される。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型酵素またはコファクターを発現するように形質転換されたシュードモナス種の宿主細胞が提供される。
【００８４】
本実施形態において発現される酵素およびコファクターとしては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、アルドラーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスパルターゼ、Ｂ12依存性酵素、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシエステラーゼ、カルボキシリアーゼ、ケモトリプシン、ＣｏＡ要求性酵素、シアノヒドリンシンテターゼ、シスタチオンシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、ジアフォラーゼ、ジオキシゲナーゼ、エノアートレダクターゼ、エポキシドヒドラーゼ、フメラーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ニトリルヒドラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、オキシドレダクターゼ、オキシニチラーゼ、ペプチダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼおよび治療的に活性なポリペプチドに融合した酵素が挙げられる。
【００８５】
別の実施形態においては、酵素は中温性酵素のポリペプチド、たとえばヒトおよび／または獣医上の治療および／または診断用途に適したものでもよい。このような治療用の中温性酵素の例としては、たとえば、組織プラスミノゲンアクチベータ；ウロキナーゼ、レプチラーゼ、ストレプトキナーゼ；カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ；ＤＮアーゼ、アミノ酸ヒドロラーゼ（たとえばアスパラギナーゼ、アミドヒドロラーゼ)；カルボキシペプチダーゼ；プロテアーゼ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、コラゲナーゼ；ノイラミニダーゼ；ラクターゼ、マルターゼ、スクラーゼおよびアラビノフラノシダーゼが挙げられる。
【００８６】
さらに別の実施形態では、組み換え型酵素代替物の発現のための核酸と調節エレメントとを含む発現ベクターで、シュードモナス・フルオレッセンス宿主細胞を形質転換する工程、および組み換え型酵素代替物の発現に適した条件下でその細胞を培養する工程による、シュードモナス・フルオレッセンス細胞内での組み換え型酵素代替物の生産が提供される。宿主細胞内で発現される組み換え型酵素代替物は、アルガシダーゼ・ベータ、ラロニダーゼおよび治療的に活性なポリペプチドに融合した組み換え型酵素代替物からなる群より選択される。
【００８７】
哺乳動物の抗体および抗体断片の生産
本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス種の宿主細胞による、哺乳動物の組み換え型の一本鎖、Ｆａｂ断片および／または全鎖抗体またはそれらの断片もしくは部分の生産が提供される。一つの実施形態においては、タンパク質の発現の後、そのタンパク質を単離することができ、任意に精製することができる。必要に応じて、このタンパク質を復元して、活性なタンパク質を生産することができる。生産の間に、この抗体または抗体断片を、任意に、細胞内での標的としての分泌シグナル配列に結合する。
【００８８】
別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型の一本鎖、Ｆａｂ断片および／または全鎖抗体またはそれらの断片もしくは部分を発現するように形質転換された、シュードモナス種の宿主細胞が提供される。
【００８９】
一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス細胞は、一本鎖抗体またはそれらの断片もしくは部分を生産することができる。一本鎖抗体には、安定的に折りたたまれた単一のポリペプチド鎖上の、抗体の抗原結合領域が含まれ得る。一本鎖抗体は、伝統的な免疫グロブリンよりもそのサイズが小さいが、抗体の抗原特異的結合特性を保持することができる。一本鎖抗体を治療、たとえば「むき出しの」一本鎖抗体、二重特異性抗体バインダー、放射性複合体、またはエフェクタードメインとの融合体、診断薬、たとえば腫瘍の画像化もしくはインビボもしくはエクスビボのガンマーカーアッセイ、研究道具、たとえばタンパク質精製および検出、具体的には新規の治療用標的の同定およびキャラクタライゼーション、抗体マイクロアレイ、表示技術および／または遺伝子もしくは薬物送達のための媒体に用いることができる。
【００９０】
別の実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス細胞は、Ｆａｂ断片またはその部分を生産する。Ｆａｂ断片は特定の抗体の一部でもよい。Ｆａｂ断片は抗原結合部位を含むことができる。Ｆａｂ断片は２本の鎖：軽鎖断片および重鎖断片を含むことができる。これらの断片を、リンカーまたはジスルフィド結合を解して結合することができる。
【００９１】
本発明のその他の実施形態においては、全鎖抗体を、シュードモナス・フルオレッセンス内、およびその他のシュードモナス種内で発現させることができる。Ｆｃ領域を含むインタクトな抗体はインビボでの分解およびクリアランスに対してより強く抵抗することができ、それによって、血液循環においてより長い生物学的半減期を有する。このような抗体を、継続した治療が必要な疾患のための治療剤として用いることができる。
【００９２】
一つの実施形態においては、別個のシストロン配列またはポリシストロン配列を含む発現ベクターを提供することによる、シュードモナス種内で機能を有する抗体またはその断片を生産する方法が提供される。別個のシストロン発現ベクターは、軽鎖および重鎖の発現が、別個のプロモーターによって独立して制御されるように、免疫グロブリンの軽鎖を発現させるための第一のプロモーター−シストロンペアと、免疫グロブリンの重鎖を発現させるための第二のプロモーター−シストロンペアとを含むことができる。発現カセットのポリヌクレオチド内のそれぞれのシストロンは、全長抗体の軽鎖または重鎖をコードする核酸配列に機能するように結合した翻訳開始領域（ＴＩＲ）を含み得る。一つの実施形態においては、ＴＩＲ配列を操作して、軽鎖および重鎖についての異なる翻訳強度の組み合わせを提供することができる。代替的な実施形態においては、重鎖コード配列は、軽鎖コード配列と同じプラスミド上に位置することができる。代替的な実施形態においては、重鎖配列および軽鎖配列は、単一のプラスミド内におけるポリシストロン配列に見られるか、または宿主のゲノム内にコードされる。
【００９３】
別の実施形態においては、機能を有する抗体の軽鎖および重鎖をそれぞれコードする二つの別個の翻訳単位で形質転換された宿主細胞内で、その抗体またはその断片を生産するための方法が提供される。一つの実施形態においては、この方法は次の工程を含む：ａ）軽鎖および重鎖が逐次的に発現するように、それに適する条件下で宿主細胞を培養し、それによって軽鎖および重鎖の生産を時間的に分ける工程；ならびにｂ）軽鎖および重鎖を会合させて、機能を有する抗体またはその断片を形成させる工程。
【００９４】
さらなる実施形態においては、シュードモナスの発現系は、治療用のヒト一本鎖、Ｆａｂ断片もしくは全鎖抗体またはそれらの部分、たとえばこれらに限定されるわけではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）2−ロイシンジッパー、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、抗ＣＤ１８抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または以下の表３に記載されたもの、を発現することができる。
【表３】
0005602336.tif 000004
0005602336.tif 000005
0005602336.tif 000006
【００９５】
転写因子の生産
本発明の一つの実施形態においては、シュードモナス・フルオレッセンス種の宿主細胞による哺乳動物の組み換え型転写因子の生産が提供される。一つの実施形態においては、タンパク質発現の後、そのタンパク質を単離することができる。別の実施形態においては、そのタンパク質を精製することができる。必要に応じて、このタンパク質を復元して、活性なタンパク質を生産させることができる。別の実施形態においては、哺乳動物の組み換え型転写因子を発現するように形質転換された、シュードモナス種の宿主細胞が提供される。
【００９６】
本発明の発現系内への挿入に適する転写因子としては、ヘリックス・ターン・ヘリックス・ファミリーおよびＰａｃファミリーのメンバー、ならびに本技術分野において公知のその他の転写因子ファミリーのものが挙げられる。本発明での使用に適するこれらのファミリーのメンバーとしては、哺乳動物および哺乳動物のホモログおよびアナログ：転写レギュレータ；ＡＳＮＣファミリーの転写因子、たとえばＡＳＮＣ＿ｔｒａｎｓ＿ｒｅｇ、推定される転写レギュレータ；ｌｕｘＲファミリーの細菌調節タンパク質；細菌調節ヘリックス・ターン・ヘリックス転写因子；ａｒｓＲファミリーの細菌調節タンパク質；ヘリックス・ターン・ヘリックスドメインの転写因子、特にｒｐｉＲファミリー；細菌調節タンパク質転写因子、細菌調節ヘリックス・ターン・ヘリックス転写因子；ＤＮＡ結合ドメイン転写因子；転写因子のＭａｒＲファミリー；転写因子のＲＯＫファミリー；調節タンパク質のＭｅｒＲファミリー；アルギニンリプレッサー転写因子；フィルミキュート転写因子；鉄取り込み調節転写因子；シグマ転写因子；応答調節レシーバー転写因子；トリプトファンＲＮＡ結合アテニュエータータンパク質転写因子；推定される糖結合ドメイン転写因子；ＰＲＤドメイン転写因子；窒素調節タンパク質転写因子；遺伝能力のネガティブレギュレータ、たとえばＭｅｃＡ；ネガティブ転写レギュレータ転写因子；細菌転写レギュレータ転写因子；グリセロール−３−リン酸反応性転写因子；鉄依存性リプレッサー転写因子；および転写レギュレータ転写因子に特異的な多数の種が挙げられる。
【００９７】
シュードモナス種によって発現される転写因子を、診断用、治療用および研究用に利用することができる。
【００９８】
ベクターの調製
ポリヌクレオチド
哺乳動物の組み換え型タンパク質およびペプチドを、そこから宿主細胞がそのタンパク質を発現させることができるところの機能遺伝子を形成する転写調節エレメントおよび翻訳調節エレメントに、その中の標的ポリペプチドのコード配列が機能するように結合したポリヌクレオチドから発現させることができる。このコード配列は、入手できるのであれば、標的ポリペプチドについての天然のコード配列であり得るが、選択された発現用宿主細胞で用いるために：たとえば、シュードモナス種、たとえばシュードモナス・フルオレッセンスのコドン使用頻度(bias)を反映した遺伝子を合成することによって、選択された、改良されたまたは最適化されたコード配列を用いることもできる。結果として生じるこれらの遺伝子は、一つ以上のベクター内に構築されるか、またはそのベクター内に挿入されることになり、次いで発現用の宿主細胞内に形質転換されるだろう。「発現可能な型」で提供されると言われる核酸またはポリヌクレオチドとは、選択された細菌の発現用宿主細胞によって発現され得る少なくとも一つの遺伝子を含む核酸またはポリヌクレオチドを意味する。
【００９９】
調節エレメント
本明細書で用いられる調節エレメントは、遺伝子をコードする標的の哺乳動物の組み換え型タンパク質に、機能するように結合することができる。本明細書で用いられるタンパク質をコードする遺伝子コード配列は、成熟したポリペプチドのコード配列および転写調節エレメントに加えて、さらにコード化エレメント、たとえば一つ以上のペプチドタグ、プレペプチド、プロペプチド、プレプロペプチドについてのコード配列、または選択された発現用宿主細胞内で機能する分泌シグナルペプチド以外の、本技術分野において公知のその他の一般的に利用されるコード化エレメントを含むことができる。
【０１００】
本明細書で用いられるように、「機能するように結合した」という用語は、転写調節エレメントおよび任意の翻訳調節エレメントがその中で、コード配列に関連して、調節エレメントがコード配列を直接発現させることができるような配置でコード配列と共有結合しているところの任意の立体配置を意味する。一つの実施形態においては、調節エレメントは宿主細胞内に形質転換される前の全遺伝子の一部であろう；しかしながら、その他の実施形態においては、調節エレメントは別の遺伝子の一部であり、その遺伝子は、宿主のゲノムの一部、別の生命体のゲノムの一部、またはそれらに由来するものであり得る。
【０１０１】
プロモーターおよびアクセサリーエレメント
本発明により使用されるプロモーターは構成的プロモーターでもよく、または調節プロモーターでもよい。有用な調節プロモーターの一般的な例としては、ｌａｃプロモーター（すなわちｌａｃＺプロモーター）に由来するファミリーのもの、特にＤｅＢｏｅｒによる米国特許第４，５５１，４３３号に記載のｔａｃプロモーターおよびｔｒｃプロモーター、ならびにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５およびＴ７ｌａｃプロモーターが挙げられる。
【０１０２】
本発明による発現系に有用な非ｌａｃ型プロモーターの一般的な例としては、たとえば、表４に列挙されたものが挙げられる。
【表４】
0005602336.tif 000007
【０１０３】
たとえば、次のものを参照すること：J. Sanchez-Romero and V. De Lorenzo (1999) Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology (A. Demain and J. Davies, eds.) pp.460-74 (ASM Press, Washington, D.C.); H. Schweizer (2001) Current Opinion in Biotechnology, 12:439-445; and R. Slater and R. Williams (2000) Molecular Biology and Biotechnology (J. Walker and R. Rapley, eds.) pp.125-54。選択された細菌の宿主細胞を起源とするプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーターを用いて、ターゲットポリペプチド、たとえばシュードモナスのアントラニル酸塩または安息香酸塩オペロンプロモーター（Ｐａｎｔ，Ｐｂｅｎ）をコードする導入遺伝子の発現をコントロールしてもよい。配列が同一か否かにもかかわらず、その中で二つ以上のプロモーターが別のものと共有結合しているタンデムプロモーター、たとえば、Ｐａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター（プロモーター間のハイブリッド）またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーターを用いてもよい。
【０１０４】
調節プロモーターは、プロモーターがその一部である遺伝子の転写をコントロールするために、プロモーター調節タンパク質を利用する。本明細書で調節プロモーターを用いる場合、対応するプロモーター調節タンパク質も本発明による発現系の一部となるだろう。プロモーター制御タンパク質の例としては：アクチベータタンパク質たとえばエシェリキア・コリのカタボライトアクチベータタンパク質、ＭａｌＴタンパク質；ＡｒａＣファミリー転写活性化因子；リプレッサータンパク質、たとえばエシェリキア・コリのＬａｃＩタンパク質；および二重機能制御タンパク質、たとえばエシェリキア・コリのＮａｇＣタンパク質が挙げられる。多数の調節プロモーター／プロモーター制御タンパク質のペアが本技術分野において知られている。
【０１０５】
プロモーター制御タンパク質は、プロモーターのコントロール下で、遺伝子の少なくとも一つのＤＮＡ転写制御領域から離れるかまたは結合することができるように、エフェクター化合物、すなわちその制御タンパク質と可逆的にまたは不可逆的に結合する化合物と相互作用する。それによって、遺伝子の転写を開始する際に、転写酵素の作用を可能にしたりまたは阻止する。エフェクター化合物はインデューサーまたはコリプレッサーのいずれかとして分類され、これらの化合物は天然のエフェクター化合物および無償性のインデューサー化合物を含む。多数の調節プロモーター／プロモーター制御タンパク質／エフェクター化合物のトリオが本技術分野において知られている。細胞培養または発酵の間を通してエフェクター化合物を用いることができるが、調節プロモーターを用いる一つの実施形態においては、宿主細胞の生物体量が所望の量または密度にまで培養した後、適切なエフェクター化合物を順番に直接的にまたは間接的に培養液に添加し、その結果、所望の単数（または複数）のターゲット遺伝子を発現させる。
【０１０６】
一例として、ｌａｃプロモーターのファミリーを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子が系内に存在してもよい。このｌａｃＩ遺伝子、（通常は）構成的に発現された遺伝子である、は、これらのプロモーターのｌａｃオペレーターと結合するＬａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＩタンパク質）をコードする。従って、ｌａｃプロモーターのファミリーを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子をその発現系内に含ませてその中で発現させることができる。ｌａｃプロモーターのファミリーの一員、たとえばｔａｃプロモーターの場合においては、エフェクター化合物はインデューサーであり、好ましくは無償性のインデューサー、たとえばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、「イソプロピルチオガラクトシド」とも称される）である。
【０１０７】
その他のエレメント
その他の調節エレメントは、発現構築物内に含まれてもよい。このようなエレメントとしては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、その他のプロモーター、アクチベータ、翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナル、転写ターミネーター、シストロニックレギュレーター、ポリシストロニックレギュレーター、タグ配列、たとえばヌクレオチド配列の「タグ」および「タグ」ペプチドコード配列、であって、発現されたポリペプチドの同定、分離、精製または単離を促進させるものが挙げられる。
【０１０８】
本発明によるタンパク質をコードする遺伝子は少なくとも、哺乳動物のタンパク質のコード配列に加えて、機能できるように結合した次の調節エレメント：プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、転写ターミネーター、翻訳開始シグナルおよび翻訳終止シグナルを含むことができる。発現系において宿主細胞として有用な種のいずれかから、たとえば選択された宿主細胞から、有用なＲＢＳを得ることができる。多くの種および種々のコンセンサスＲＢＳが知られており、たとえば、D. Frishmanら(1999)、Gene 234(2):257-65；およびB.E. Suzekら(2001)、Bioinformatics 17(12): 1123-30に記載され引用されるものである。さらに、天然のまたは合成のいずれかのRBSを用いてもよく、たとえば  ＥＰ  ０２０７４５９号（合成ＲＢＳ）；O. Ikehata et al.（１９８９）、Eur. J. Biochem. 181(3):563-70 （天然のＲＢＳ配列のＡＡＧＧＡＡＧ）に記載のものである。本発明において有用な方法、ベクターおよび翻訳エレメントおよび転写エレメント、ならびにその他のエレメントのさらなる例は、たとえば、Ｇｉｌｒｏｙらによる米国特許第５，０５５，２９４号および第５，１２８，１３０号；Ｒａｍｍｌｅｒらによる第５，２８１，５３２号；Ｂａｒｎｅｓらによる第４，６９５，４５５号および第４，８６１，５９５号；Ｇｒａｙらによる第４，７５５，４６５号；ならびにＷｉｌｃｏｘによる第５，１６９，７６０号に記載されている。
【０１０９】
ベクター
本発明の酵素をコードするＤＮＡのシュードモナスによる転写を、エンハンサー配列をベクターまたはプラスミド内に挿入することによって促進させる。典型的なエンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を促進させる、通常約１０から３００ｂｐのサイズのシス作用性ＤＮＡエレメントである。例としては、本明細書の他の箇所に記載されたような種々のシュードモナスのエンハンサーが挙げられる。
【０１１０】
一般的に、組み換え発現ベクターは、シュードモナスの宿主細胞の形質転換を可能とする複製起点および選択マーカー、たとえばシュードモナス・フルオレッセンスの抗生物質を含まない耐性遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を導くための高度に発現された遺伝子に由来するプロモーターを含むだろう。このようなプロモーターは、酵素、たとえば３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、酸性ホスファターゼまたは特に熱ショックタンパク質をコードするオペロンに由来するものでもよい。適切な段階で、翻訳開始配列および翻訳終止配列、そして一つの実施形態においては翻訳後の酵素の分泌を導くことが可能なリーダー配列を伴う異種構造配列が集合する。任意に、この異種配列が、所望の特性、たとえば安定性または発現された組み換え型生産物を容易に精製できることを付与するＮ−末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードしてもよい。
【０１１１】
酵素の発現の際にシュードモナス・フルオレッセンスで用いるのに有用な発現ベクターを、所望のタンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を適切な翻訳開始シグナルおよび終止シグナルと共に、機能的プロモータを有する読み取り可能なリーディング相に挿入することによって構築する。このベクターは、一つ以上の表現型選択マーカーおよびベクターの維持を確かにするための複製起点を含むことになり、必要であれば、宿主内での増幅能が付与される。
【０１１２】
本技術分野において、ベクターは、宿主細胞内で組み換え型タンパク質を発現させるために有用なものとして知られており、それらのいずれかを、本発明による遺伝子を発現させるために用いてもよい。このようなベクターとしては、たとえばプラスミド、コスミドおよびファージ発現ベクターが挙げられる。有用なプラスミドベクターの例としては、たとえばこれらに限定されるわけではないが、発現プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ、ｐＤＳＫ５１９、ｐＫＴ２４０、ｐＭＬ１２２、ｐＰＳ１０、ＲＫ２、ＲＫ６、ｐＲＯ１６００およびＲＳＦ１０１０が挙げられる。このような有用なベクターのその他の例としては、たとえば：N. Hayase (1994) Appl. Envir. Microbiol. 60(9):3336-42; A.A. Lushnikov et al. (1985) Basic Life Sci. 30:657-62; S. Graupner and W. Wackernagel (2000) Biomolec. Eng. 17(1):11-16.; H.P. Sctiweizer (2001) Curr. Opin. Biotech. 12(5):439-45; M. Bagdasarian and K.N. Timmis (1982) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:47-67; T. Ishii et al. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 116(3):307-13; I.N. Olekhnovich and Y.K. Fomichev (1994) Gene 140(1):63-65; M. Tsuda and T. Nakazawa (1993) Gene 136(1-2):257-62; C. Nieto et al. (1990) Gene 87(1):145-49 ; J.D. Jones and N. Gutterson (1987) Gene 61(3):299-306; M. Bagdasarian et al. (1981) Gene 16(1-3):237-47 ; H.P. Schweizer et al. (2001) Genet. Eng. (NY) 23:69-81; P. Mukhopadhyay et al. (1990) J. Bact. 172(l):477-80; D.O. Wood et al. (1981) J. Bact. 145(3):1448-51 ;およびR. Holtwick et al. (2001) Microbiology 147(Pt 2):337-44 に記載されたものが挙げられる。
【０１１３】
シュードモナスの宿主細胞において有用となり得る発現ベクターのさらなる例としては、示されたレプリコンに由来するような、表５に列挙されたものが挙げられる。
【表５】
0005602336.tif 000008
【０１１４】
発現プラスミドのＲＳＦ１０１０は、たとえばF. Heffron et al. (1975) Proc. Natl Acad. Sci. USA 72(9):3623-27、およびK. Nagahari and K. Sakaguchi (1978) J. Bact. 133(3):1527-29に記載されている。プラスミドＲＳＦ１０１０およびその派生物は、本発明において特に有用なベクターである。典型的には、本技術分野において知られているＲＳＦ１０１０の有用な派生物としては、たとえばｐＫＴ２１２、ｐＫＴ２１４、ｐＫＴ２３１および関連するプラスミド、ならびにｐＭＹＣ１０５０および関連するプラスミド（たとえばＴｈｏｍｐｓｏｎらによる米国特許第５，５２７，８８３号および第５，８４０，５５４号を参照すること）が挙げられ、例えばｐＭＹＣ１８０３がある。プラスミドｐＭＹＣ１８０３はＲＳＦ１０１０に基づくプラスミドｐＴＪＳ２６０（Ｗｉｌｃｏｘによる米国特許第５，１６９，７６０号を参照すること）に由来するものであり、これは制御されたテトラサイクリン耐性マーカーならびにＲＳＦ１０１０プラスミドに由来する複製座および移動座を保持している。その他の典型的な有用なベクターとしては、Ｐｕｈｌｅｒらによる米国特許第４，６８０，２６４号に記載されたものが挙げられる。
【０１１５】
一つの実施形態においては、発現プラスミドを発現ベクターとして用いる。別の実施形態においては、ＲＳＦ１０１０またはその派生物を発現ベクターとして用いる。さらに別の実施形態においては、ｐＭＹＣ１０５０もしくはその派生物、またはｐＭＹＣ１８０３もしくはその派生物を、発現ベクターとして用いる。
【０１１６】
選択マーカー遺伝子を用いて、宿主細胞内にプラスミドを維持することができ、プラスミド内に存在させることもできる。これは単数（または複数）の抗生物質耐性遺伝子でもよく、この場合において対応する単数（または複数）の抗生物質は発酵培地に添加されることになり、あるいは、本技術分野において有用であると知られている選択マーカー遺伝子のその他の任意のタイプのもの、たとえばプロトトロフィー復元遺伝子でもよく、この場合においてプラスミドは対応する形質、具体的には生体触媒性の形質、たとえばアミノ酸生合成もしくはヌクレオチドを生合成する形質または炭素源を利用する形質、についての栄養素要求株である宿主細胞内で用いられることになる。
【０１１７】
分子遺伝学および遺伝子操作技術に必要な多数の配列情報は、広く公に利用可能である。哺乳動物ならびにヒトの完全なヌクレオチド配列、遺伝子、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびゲノムにアクセスすることは、ＵＲＬアドレスhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/EntrezにおけるＧｅｎＢａｎｋから実行できる。Weizmann Institute of Science Genome and Bioinformatics(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)から、遺伝子およびそれらの生産物についての情報ならびに生物医学的な応用について統合された電子百科事典であるGeneCardsから、さらなる情報を得ることもできる。ヌクレオチド配列の情報も、EMBL Nucleotide Sequenceデータベース(http://www.ebi.ac.uk/embl/)またはＤＮＡ  Ｄａｔａｂａｎｋまたは日本(DDBJ,http://www.ddbi.nig.ac.jp/)から入手することができる；アミノ酸配列についての情報のさらなるサイトには、Georgetown's protein information resource website(http://www-nbrf.georgetown.edu/pir/)およびSwiss-Prot(http://au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)が挙げられる。
【０１１８】
形質転換
本技術分野において公知の形質転換の任意の方法を利用して、シュードモナス宿主細胞を単数（または複数）のベクターで形質転換してもよく、その細菌の宿主細胞をインタクトな細胞として、またはプロトプラスト（すなわち細胞質体を含む)として形質転換してもよい。典型的な形質転換の方法としては、ポレーションの方法、たとえばエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌の接合および二価カチオンによる処理、たとえば塩化カルシウム処理すなわちＣａＣｌ／Ｍｇ2+処理、または本技術分野におけるその他の周知の方法が挙げられる。たとえば、Morrison (1977) J. Bact, 132:349-351; Clark-Curtiss and Curtiss (1983) Methods in Enzymology, 101:347-362, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed.); Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual; and Ausubel et al., eds., (1994) Current Protocols in Molecular Biologyを参照すること。
【０１１９】
シュードモナス生物
本明細書での主要な発明はシュードモナス・フルオレッセンスを用いることであるが、その他のシュードモナス生物および近接する細菌も有用であり得る。シュードモナスおよび近接するbacteriaは一般的に、「グラム(-)プロテオバクテリアのサブグループ1」すなわち「Gram-Negative Aerobic Rods and Cocci」(Buchanan and Gibbons (eds.) (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp. 217-289)として定義されるグループの一部である。
【表６】
0005602336.tif 000009
【０１２０】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１」は、この分類に用いられる基準に従って、この表題に分類されるであろうプロテオバクテリアをも含む。この表題は、この欄に既に分類された群をも含むが、もはや、たとえばアシドボラクス(Acidovorax)属、ブレブンジモナス(Brevundimonas)属、ブルクホルデリア(Burkholderia)属、ヒドロジェノファーガ(Hydrogenophaga)属、オシアニモナス(Oceanimonas)属、ラルストニア(Ralstonia)属およびストエノトロフォモナス(Stenotrophomonas)属、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属（およびそれに由来するブラストモナス(Blastomonas)属)、キサントモナス属（の種であると既に呼ばれているもの)に属する生物を再編することで生じたもの、アシドモナス(Acidomonas)属、アセトバクター属に属する生物を再編することで生じたもの、のような、Bergey (1974)に定義されたようなものではない。さらに、宿主は、シュードモナス属、シュードモナス・エナリア(enalia)(ATCC 14393)、シュードモナス・ニグリファシエンス(nigrifaciens)(ATCC 19375)およびシュードモナス・プトレファシエンス(putrefaciens)(ATCC 8071)に由来する細胞を含むことができ、これらはそれぞれアルテロモナス・ハロプランクティス(Alteromonas haloplanktis)、アルテロモナス・ニグリファシエンス(nigrifaciens)およびアルテロモナス・プトレファシエンス(putrefaciens)として再分類されている。同様に、たとえばシュードモナス・アシドボランス(acidovorans)(ATCC 15668)およびシュードモナス・テストステロニ(testosteroni)(ATCC 11996)は、それぞれコマモナス(Comamonas)・アシドボランスおよびコマモナス・テストステロニとして再分類されており、ならびにシュードモナス・ニグリファシエンス(ATCC 19375)およびシュードモナス・ピシシダ(piscicida)(ATCC 15057)は、それぞれシュードアルテロモナス・ニグリファシエンス(Pseudoalteromonas nigrifaciens)およびシュードアルテロモナス・ピシシダとして再分類されている。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ1」は、シュードモナダセアエ科、アゾトボアクテラセアエ(Azotoboacteraceae)科（現在ではしばしはシュードモナダセアエ科の「アゾトバクターグループ」の異名で呼ばれている)、リゾビアセアエ科およびメチロモナダセアエ科（現在ではしばしは「メチロコッカセアエ(Methylococcaceae)科」の異名で呼ばれている)：の科のいずれかに属するものとして分類されているプロテオバクテリアをも含む。その結果、これらの属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１」に含まれる、ここに記載されたもの以外のさらなるプロテオバクテリア属としては：１）アゾトバクターグループのアゾリゾフィルス(Azorhizophilus)属の細菌；２）シュードモナダセアエ科のセルビブリオ(Cellvibrio)属、オリジェラ(Oligella)属およびテレジニバクター(Teredinibacter)属の細菌；３）リゾビアセアエ科のケラトバクター(Chelatobacter)属、エンシフェラ(Ensifer)属、リベリバクター(Liberibacter)属（「カンジダタス(Candidatus)・リベリバクター」とも呼ばれる)およびシノリゾビウム(Sinorhizobium)属の細菌；ならびに４）メチロコッカセアエ科のメチロバクター(Methylobacter)属、メチロカルダム(Methylocaldum)属、メチロミクロビウム(Methylomicrobium)属、メチロサルシナ(Methylosarcina)属およびメチロスファエラ(Methylosphaera)属の細菌が挙げられる。
【０１２１】
別の実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ２」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ２」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される（丸括弧内に、目録に列挙され、公に利用可能な状態で寄託されたその株の総数を示し、別記がない限り、すべてがＡＴＣＣに寄託されている)：アシドモナス(Acidomonas)（２）；アセトバクター（９３）；グルコノバクター（３７）；ブレブンジモナス（２３）；ベイジェリンキア（１３）；デルキシア（２）；ブルセラ（４）；アグロバクテリウム（７９）；ケラトバクター（２）；エンシフェラ（３）；リゾビウム（１４４）；シノリゾビウム（２４）；ブラストモナス（１）；スフィンゴモナス（２７）；アルカリゲンス（８８）；ボルデテラ（４３）；ブルクホルデリア（７３）；ラルストニア（３３）；アシドボラクス（２０）；ヒドロジェノファーガ（９）；ズーグロエア（９）；メチロバクター（２）；メチロカルダム（ＮＣＩＭＢにおいて１）；メチロコッカス（２）；メチロミクロビウム（２）；メチロモナス（９）；メチロサルシナ（１）；メチロスファエラ；アゾモナス（９）；アゾリゾフィルス（５）；アゾトバクター（６４）；セルビブリオ（３）；オリジェラ（５）；シュードモナス（１１３９）；フランシセラ（４）；キサントモナス（２２９）；ストエノトロフォモナス（５０）；およびオシアニモナス（４）。
【０１２２】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ２」の典型的な宿主細胞の種としては、次の細菌（丸括弧内に単数（または複数）のその典型的な株のＡＴＣＣ番号またはその他の寄託番号を示す）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない：アシドモナス・メタノリサ(methanolica)(ATCC 43581)；アセトバクター・アセチ(aceti)(ATCC 15973)；グルコノバクター・オキシダンス(oxydans)(ATCC 19357)；ブレブンジモナス・ジミニュータ(diminuta)(ATCC 11568)；ベイジェリンキア・インディカ(indica)(ATCC 9039およびATCC 19361)；デルキシア・グモーサ(gummosa)(ATCC 15994)；ブルセラ・メリテンシス(melitensis)(ATCC 23456)、ブルセラ・アボラタス(abortus)(ATCC 23448)；アグロバクテリウム・チューメファシエンス(tumefaciens)(ATCC 23308)、アグロバクテリウム・ラジオバクター(radiobacter)(ATCC 19358)、アグロバクテリウム・リゾーゲネス(rhizogenes)(ATCC 11325)；ケラトバクター・ヘインチ(heintzii)(ATCC 29600)；エンシフェラ・アドヘエレンス(adhaerens)(ATCC 33212)；リゾビウム・レグミノザラム(leguminosarum)(ATCC 10004)；シノリゾビウム・フレンジ(fredii)(ATCC 35423)；ブラストモナス・ナタトリア(natatoria)(ATCC 35951)；スフィンゴモナス・パウチモビリス(paucimobilis)(ATCC 29837)；アルカリゲンス・フェイシャリス(faecalis)(ATCC 8750)；ボルデテラ・パーツシス(pertussis)(ATCC 9797)；ブルクホルデリア・セパシア(cepacia)(ATCC 25416)；ラルストニア・ピケッチ(pickettii)(ATCC 27511)；アシドボラクス・ファシリス(facilis)(ATCC 11228)；ヒドロジェノファーガ・フラバ(flava)(ATCC 33667)；ズーグロエア・ラミジェラ(ramigera)(ATCC 19544)；メチロバクター・ルーテウス(luteus)(ATCC 49878)；メチロカルダム・グラシーレ(gracile)(NCIMB 11912)；メチロコッカス・カプスラタス(capsulatus)(ATCC 19069)；メチロミクロビウム・アギール(agile)(ATCC 35068)；メチロモナス・メタニカ(methanica)(ATCC 35067)；メチロサルシナ・フィブラータ(fibrata)(ATCC 700909)；メチロスファエラ・ハンソニイ(hansonii)(ACAM 549)；アゾモナス・アギリス(agilis)(ATCC 7494)；アゾリゾフィルス・パスパリ(paspali)(ATCC 23833)；アゾトバクター・クロオコクム(chroococcum)(ATCC 9043)；セルビブリオ・ミクタス(mixtus)(UQM 2601)；オリジェラ・ウレサラリス(urethralis)(ATCC 17960)；シュードモナス・アエルギノーサ(ATCC 10145)、シュードモナス・フルオレッセンス(ATCC 35858)；フランシセラ・ツラレンシス(tularensis)(ATCC 6223)；ストエノトロフォモナス・マルトフィア(maltophilia)(ATCC 13637)；キサントモナス・カンペストリス(campestris)(ATCC 33913)；およびオシアニモナス・ドウドロッフィ(doudoroffii)(ATCC 27123)。
【０１２３】
別の実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ３」から宿主細胞を選択する。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ３」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；アグロバクテリウム；リゾビウム；シノリゾビウム；ブラストモナス；スフィンゴモナス；アルカリゲンス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスファエラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ストエノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１２４】
別の実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ４」から宿主細胞を選択する。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ４」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスファエラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ストエノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１２５】
一つの実施形態においては、「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ５」から宿主細胞を選択する。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ５」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：メチロバクター；メチロカルダム；メチロコッカス；メチロミクロビウム；メチロモナス；メチロサルシナ；メチロスファエラ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；フランシセラ；ストエノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１２６】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ６」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ６」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；ストエノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１２７】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ７」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ７」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：アゾモナス；アゾリゾフィルス；アゾトバクター；セルビブリオ；オリジェラ；シュードモナス；テレジニバクター；ストエノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１２８】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ８」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ８」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブラストモナス；スフィンゴモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；シュードモナス；ストエノトロフォモナス；キサントモナス；およびオシアニモナス。
【０１２９】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ９」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ９」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブレブンジモナス；ブルクホルデリア；ラルストニア；アシドボラクス；ヒドロジェノファーガ；シュードモナス；ストエノトロフォモナス；およびオシアニモナス。
【０１３０】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１０」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１０」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；ストエノトロフォモナス；およびキサントモナス。
【０１３１】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１１」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１１」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス；ストエノトロフォモナス；およびキサントモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１２」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１２」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１３」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１３」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：ブルクホルデリア；ラルストニア；シュードモナス；およびキサントモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１４」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１４」は、次の属のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナスおよびキサントモナス。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１５」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１５」は、シュードモナス属のプロテオバクテリアの群と定義される。
【０１３２】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１６」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１６」は、次のシュードモナス種（丸括弧内に単数（または複数）の典型的な株のＡＴＣＣ番号またはその他の寄託番号を示す）のプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス・アビエタニフィラ(abietaniphila)(ATCC 700689)；シュードモナス・アエルギノーサ(ATCC 10145)；シュードモナス・アルカリゲンス(ATCC 14909)；シュードモナス・アングリセプチサ(anguilliseptica)(ATCC 33660)；シュードモナス・シトロネロリス(citronellolis)(ATCC 13674)；シュードモナス・フラベセンス(flavescens)(ATCC 51555)；シュードモナス・メンドシナ(ATCC 25411)；シュードモナス・ニトロレデュセンス(nitroreducens)(ATCC 33634)；シュードモナス・オレオボランス(oleovorans)(ATCC 8062)；シュードモナス・シュードアルカリゲネス(pseudoalcaligenes)(ATCC 17440)；シュードモナス・レジノボランス(resinovorans)(ATCC 14235)；シュードモナス・ストラミネア(straminea)(ATCC 33636)；シュードモナス・アガリシ(agarici)(ATCC 25941)；シュードモナス・アルカリフィラ(alcaliphila)；シュードモナス・アルギノボラ(alginovora)；シュードモナス・アンデルソニイ(andersonii)；シュードモナス・アスプレニ(asplenii)(ATCC 23835)；シュードモナス・アゼラシア(azelaica)(ATCC 27162)；シュードモナス・ベイジェリンキ(beijerinckii)(ATCC 19372)；シュードモナス・ボレアリス(borealis)；シュードモナス・ボレオポリス(boreopolis)(ATCC 33662)；シュードモナス・ブラシカセラム(brassicacearum)；シュードモナス・ブタノボラ(butanovora)(ATCC 43655)；シュードモナス・セルローサ(cellulosa)(ATCC 55703)；シュードモナス・アウランチアカ(aurantiaca)(ATCC 33663)；シュードモナス・クロロラフィス(chlororaphis)(ATCC 9446、ATCC 13985、ATCC 17418、ATCC 17461)；シュードモナス・フラジ(fragi)(ATCC 4973)；シュードモナス・ルンデンシス(lundensis)(ATCC 49968)；シュードモナス・タエトロレンス(taetrolens)(ATCC 4683)；シュードモナス・シッシコラ(cissicola)(ATCC 33616)；シュードモナス・コロナファシエンス(coronafaciens)；シュードモナス・ジテルペニフィラ(diterpeniphila)；シュードモナス・エロンガータ(elongata)(ATCC 10144)；シュードモナス・フレクテンス(flectens)(ATCC 12775)；シュードモナス・アゾトフォルマンス(azotoformans)；シュードモナス・ブレンネリ(brenneri)；シュードモナス・セドレラ(cedrella)；シュードモナス・コルガータ(corrugata)(ATCC 29736)；シュードモナス・エクストレモリエンタリス(extremorientalis)；シュードモナス・フルオレッセンス(ATCC 35858)；シュードモナス・ゲッサルジ(gessardii)；シュードモナス・リバネンシス(libanensis)；シュードモナス・マンデリイ(mandelii)(ATCC 700871)；シュードモナス・マルジナリス(marginalis)(ATCC 10844)；シュードモナス・ミグラエ(migulae)；シュードモナス・ムシドレンス(mucidolens)(ATCC 4685)；シュードモナス・オリエンタリス(orientalis)；シュードモナス・ローデシアエ(rhodesiae)；シュードモナス・シンカンサ(synxantha)(ATCC 9890)；シュードモナス・トラーシ(tolaasii)(ATCC 33618)；シュードモナス・ベローニ(veronii)(ATCC 700474)；シュードモナス・フレデリクスベルゲンシス(frederiksbergensis)；シュードモナス・ゲニクラタ(geniculata)(ATCC 19374)；シュードモナス・ジンゲリ(gingeri)；シュードモナス・グラミニス(graminis)；シュードモナス・グリモンティ(grimontii)；シュードモナス・ハロデニトリフィカンス(halodenitrificans)；シュードモナス・ハロフィリア(halophila)；シュードモナス・ヒビスキコラ(hibiscicola)(ATCC 19867)；シュードモナス・フッチエンシス(huttiensis)(ATCC 14670)；シュードモナス・ハイドロゲノボラ(hydrogenovora)；シュードモナス・ジェッセンイ(jessenii)(ATCC 700870)；シュードモナス・キロネンシス(kilonensis)；シュードモナス・ランセオラタ(lanceolata)(ATCC 14669)；シュードモナス・リニ(lini)；シュードモナス・マルギナタ(marginata)(ATCC 25417)；シュードモナス・メフィチサ(mephitica)(ATCC 33665)；シュードモナス・デニトリフィカンス(denitrificans)(ATCC 19244)；シュードモナス・ペルツシノゲナ(pertucinogena)(ATCC 190)；シュードモナス・ピクトラム(pictorum)(ATCC 23328)；シュードモナス・サイクロフィラ(psychrophila)；シュードモナス・フルバ(fulva)(ATCC 31418)；シュードモナス・モンテイリ(monteilii)(ATCC 700476)；シュードモナス・モッセリイ(mosselii)；シュードモナス・オリジハビタンス(oryzihabitans)(ATCC 43272)；シュードモナス・プレコグロッシシダ(plecoglossicida)(ATCC 700383)；シュードモナス・プチダ(ATCC 12633)；シュードモナス・レアクタンス(reactans)；シュードモナス・スピノサ(spinosa)(ATCC 14606)；シュードモナス・バレアリカ(balearica)；シュードモナス・ルテオラ(luteola)(ATCC 43273)；シュードモナス・スツッツェリ(stutzeri)(ATCC 17588)；シュードモナス・アミグダリ(amygdali)(ATCC 33614)；シュードモナス・アバラナエ(avellanae)(ATCC 700331)；シュードモナス・カリカパパヤエ(caricapapayae)(ATCC 33615)；シュードモナス・シッコリ(cichorii)(ATCC 10857)；シュードモナス・フィクセレクタエ(ficuserectae)(ATCC 35104)；シュードモナス・フソコバギナエ(fuscovaginae)；シュードモナス・メリアエ(meliae)(ATCC 33050)；シュードモナス・シリンジャエ(syringae)(ATCC 19310)；シュードモナス・ビルジフラバ(viridiflava)(ATCC 13223)；シュードモナス・サーモカルオキシドボランス(thermocarhoxydovorans)(ATCC 35961)；シュードモナス・サーモトレランス(thermotolerans)；シュードモナス・チベルバレンシス(thivervalensis)；シュードモナス・バンコウベレンシス(vancouverensis)(ATCC 700688)；シュードモナス・ウィスコンシネンシス(wisconsinensis)；およびシュードモナス・キアメンシス(xiamenensis)。
【０１３３】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１７」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１７」は、たとえば次のシュードモナス種に属するものを含む「蛍光性シュードモナス」として本技術分野において知られているプロテオバクテリアの群と定義される：シュードモナス・アゾトフォルマンス；シュードモナス・ブレンネリ；シュードモナス・セドレラ；シュードモナス・コルガータ；シュードモナス・エクストレモリエンタリス；シュードモナス・フルオレッセンス；シュードモナス・ゲッサルジ；シュードモナス・リバネンシス；シュードモナス・マンデリイ；シュードモナス・マルジナリス；シュードモナス・ミグラエ；シュードモナス・ムシドレンス；シュードモナス・オリエンタリス；シュードモナス・ローデシアエ；シュードモナス・シンカンサ；シュードモナス・トラーシ；およびシュードモナス・ベローニ。
【０１３４】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１８」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１８」は、シュードモナス・フルオレッセンス種の亜種、変種、株およびその他の特定の下位のユニットのすべての群と定義され、たとえば、（丸括弧内に示された代表的な株のＡＴＣＣまたはその他の受託番号を伴った）次のもの属するものが挙げられる：シュードモナス・フルオレッセンス・バイオタイプＡ、次亜種１すなわち次亜種Ｉ(ATCC 13525)とも呼ばれる；シュードモナス・フルオレッセンス・バイオタイプＢ、次亜種２すなわち次亜種ＩＩ(ATCC 17816)とも呼ばれる；シュードモナス・フルオレッセンス・バイオタイプＣ、次亜種３すなわち次亜種ＩＩＩ(ATCC 17400)とも呼ばれる；シュードモナス・フルオレッセンス・バイオタイプＦ、次亜種４すなわち次亜種ＩＶ(ATCC 12983)とも呼ばれる；シュードモナス・フルオレッセンス・バイオタイプＧ、次亜種５すなわち次亜種Ｖ(ATCC 17518)とも呼ばれる；シュードモナス・フルオレッセンス次亜種ＶＩ；シュードモナス・フルオレッセンスＰｆ０−１；シュードモナス・フルオレッセンスＰｆ−５(ATCC BAA-477)；シュードモナス・フルオレッセンスＳＢＷ２５；ならびにシュードモナス・フルオレッセンス・サブスピーシーズ・セルロサ(NCIMB 10462)。
【０１３５】
「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１９」から宿主細胞を選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリアのサブグループ１９」は、シュードモナス・フルオレッセンス・バイオタイプＡのすべての株の群と定義される。このバイオタイプの特定の株は、シュードモナス・フルオレッセンスＭＢ１０１株（Ｗｉｌｃｏｘによる米国特許第５，１６９，７６０号を参照すること）、およびその誘導体である。その誘導体の例は、シュードモナス・フルオレッセンスＭＢ２１４株であり、ＭＢ１０１染色体のａｓｄ（アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）座内、天然のエシェリキア・コリのＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡ構築物（すなわちその中ではＰｌａｃＺが欠失していた）に挿入することによって構築される。
【０１３６】
一つの実施形態においては、宿主細胞は、シュードモナダレス目のプロテオバクテリアの任意のものである。特定の実施形態においては、宿主細胞は、シュードモナダセアエ科のプロテオバクテリアの任意のものである。
【０１３７】
本発明において用いることができるさらなるシュードモナス・フルオレッセンス株としては、シュードモナス・フルオレッセンス・ミグラおよびシュードモナス・フルオレッセンス・ロイトキトクが挙げられ、次のようなＡＴＣＣが指定されている：（ＮＣＩＢ８２８６）；ＮＲＲＬＢ−１２４４；ＮＣＩＢ８８６５株ＣＯ１；ＮＣＩＢ８８６６株ＣＯ２；１２９１（ＡＴＣＣ１７４５８；ＩＦＯ１５８３７；ＮＣＩＢ８９１７；ＬＡ；ＮＲＲＬ  Ｂ−１８６４；ピロリジン；ＰＷ２（ＩＣＭＰ３９６６；ＮＣＰＰＢ９６７；ＮＲＲＬ  Ｂ−８９９）；１３４７５；ＮＣＴＣ１００３８；ＮＲＲＬ  Ｂ−１６０３（６；ＩＦＯ１５８４０）；５２−１Ｃ；ＣＣＥＢ４８８−Ａ（ＢＵ１４０）；ＣＣＥＢ５５３（ＩＥＭ１５／４７）；ＩＡＭ１００８（ＡＨＨ−２７）；ＩＡＭ１０５５（ＡＨＨ−２３）；１（ＩＦＯ１５８４２）；１２（ＡＴＣＣ２５３２３；ＮＩＨ１１；ｄｅｎ  Ｄｏｏｒｅｎ  ｄｅ  Ｊｏｎｇ２１６）；１８（ＩＦＯ１５８３３；ＷＲＲＬ  Ｐ−７）；９３（ＴＲ−１０）；１０８（５２−２２；ＩＦＯ１５８３２）；１４３（ＩＦＯ１５８３６；ＰＬ）；１４９（２−４０−４０；ＩＦＯ１５８３８）；１８２（ＩＦＯ３０８１；ＰＪ７３）；１８４（ＩＦＯ１５８３０）；１８５（Ｗ２Ｌ−１）；１８６（ＩＦＯ１５８２９；ＰＪ７９）；１８７（ＮＣＰＰＢ２６３）；１８８（ＮＣＰＰＢ３１６）；１８９（ＰＪ２２７；１２０８）；１９１（ＩＦＯ１５８３４；ＰＪ２３６；２２／１）；１９４（Ｋｌｉｎｇｅ  Ｒ−６０；ＰＪ２５３）；１９６（ＰＪ２８８）；１９７（ＰＪ２９０）；１９８（ＰＪ３０２）；２０１（ＰＪ３６８）；２０２（ＰＪ３７２）；２０３（ＰＪ３７６）；２０４（ＩＦＯ１５８３５；ＰＪ６８２）；２０５（ＰＪ６８６）；２０６（ＰＪ６９２）；２０７（ＰＪ６９３）；２０８（ＰＪ７２２）；２１２（ＰＪ８３２）；２１５（ＰＪ８４９）；２１６（ＰＪ８８５）；２６７（Ｂ−９）；２７１（Ｂ−１６１２）；４０１（Ｃ７１Ａ；ＩＦＯ１５８３１；ＰＪ１８７）；ＮＲＲＬＢ−３１７８（４；ＩＦＯ１５８４１）；ＫＹ８５２１；３０８１；３０−２１；（ＩＦＯ３０８１）；Ｎ；ＰＹＲ；ＰＷ；Ｄ９４６−Ｂ８３（ＢＵ２１８３；ＦＥＲＭ−Ｐ３３２８）；Ｐ−２５６３（ＦＥＲＭ−Ｐ２８９４；ＩＦＯ１３６５８）；ＩＡＭ−１１２６（４３Ｆ）；Ｍ−１；Ａ５０６（Ａ５−０６）；Ａ５０５（Ａ５−０５−１）；Ａ５２６（Ａ５−２６）；Ｂ６９；７２；ＮＲＲＬＢ−４２９０；ＰＭＷ６（ＮＣＩＢ１１６１５）；ＳＣ１２９３６；Ａ１（ＩＦＯ１５８３９）；Ｆ１８４７（ＣＤＣ−ＥＢ）；Ｆ１８４８（ＣＤＣ９３）；ＮＣＩＢ１０５８６；Ｐ１７；Ｆ−１２；ＡｍＭＳ２５７；ＰＲＡ２５；６１３３Ｄ０２；６５１９Ｅ０１；Ｎ１；ＳＣ１５２０８；ＢＮＬ−ＷＶＣ；ＮＣＴＣ２５８３（ＮＣＩＢ８１９４）；Ｈ１３；１０１３（ＡＴＣＣ１１２５１；ＣＣＥＢ２９５）；ＩＦＯ３９０３；１０６２；またはＰｆ−５。
【０１３８】
発酵
「発酵」という用語は、文字通りの発酵が用いられる実施形態およびその他の非発酵性の培養モードが用いられる実施形態の両方を含む。発酵は任意の規模で実施してもよい。一つの実施形態においては、発酵培地をリッチな培地、最少培地および無機塩培地の中から選択してもよい；リッチな培地を用いても良いが、避けたほうが好ましい。別の実施形態においては、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。さらに別の実施形態においては最少培地が選択される。
【０１３９】
無機塩培地は、無機塩、および炭素源、たとえばグルコース、ショ糖またはグリセロールからなる。無機塩培地の具体例としては、たとえば、Ｍ９培地、シュードモナス用培地（ＡＴＣＣ  １７９）、Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｍｉｎｇｉｏｌｉ培地（BD Davis and ES Mingioli (1950) in J. Bact. 60:17-28を参照すること）が挙げられる。無機塩培地を作製するために用いられる無機塩としては、たとえばリン酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは塩化アンモニウム、硫酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムならびに微量元素、たとえば塩化カルシウム、鉄、銅、マンガンおよび亜鉛のホウ酸塩および硫酸塩から選択されるものが挙げられる。典型的には、無機塩培地には、有機窒素源、たとえばペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母エキスは含まれない。その代わりとして無機窒素源を用い、これは、たとえばアンモニウム塩、アンモニア水およびアンモニアガスの中から選択すればよい。典型的な無機塩培地は、グルコースを炭素源として含むものであろう。無機塩培地と比較すれば、最少培地は無機塩および炭素源を含むことができるが、たとえば低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたはその他の成分を追加することができるが、それらの追加は極めて微量のレベルである。
【０１４０】
一つの実施形態においては、以下の表７に列挙された成分を用いて培地を調製することができる。これらの成分を次の順序で添加することができる：最初に（ＮＨ4）ＨＰＯ4、ＫＨ2ＰＯ4およびクエン酸を約３０リットルの蒸留水に溶解すればよい；次いで、微量元素の溶液を添加し、次いで消泡剤、たとえばＵｃｏｌｕｂ  Ｎ  １１５を添加することができる。次いで、（たとえば約１２１℃で）加熱滅菌した後、グルコース、ＭｇＳＯ4およびチアミン塩酸塩の滅菌溶液を添加すればよい。アンモニア水を用いてｐＨを約６．８にコントロールすることができる。次いで、滅菌蒸留水を添加して、最初の体積を３７１からグリセロールストック分（１２３ｍＬ）引いたものに調整することができる。薬品は種々の供給業者、たとえばＭｅｒｃｋ社から市販されている。この培地によって、シュードモナス種および類縁の細菌の高い細胞密度での培養(HCDC)が可能となる。バッチプロセスとしてＨＣＤＣを開始することができ、次いで、二相供給式バッチ培養とする。バッチ部における無制限の培養の後、生物体量の濃度が数倍に高まり得る時間であるところの3倍化する時間にわたって、培養をコントロールして培養の比速度を低下させることができる。このような培養手段についてのさらに詳細な点は、Riesenberg, D et al. (1991) 「High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate」 J Biotechnol: 20(1) 17-27に記載されている。
【表７】
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【０１４１】
本発明による発現系を任意の発酵形式で培養することができる。本明細書では、たとえばバッチ発酵モード、フェドバッチ発酵モード、半連続発酵モードおよび連続発酵モードを採用してもよい。
【０１４２】
本発明による発現系は、任意の規模（すなわち体積）の発酵における導入遺伝子の発現にとって有用である。従って、たとえばマイクロリットルスケール、センチリットルスケールおよびデシリットルスケールの発酵体積を採用すればよい；そして１リットルスケールおよびより大きな発酵体積を採用することができる。一つの実施形態においては、発酵体積は１リットルかまたはそれを超えたものとなるだろう。別の実施形態においては、発酵体積は、５リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、５０リットル、７５リットル、１００リットル、２００リットル、５００リットル、１，０００リットル、２，０００リットル、５，０００リットル、１０，０００リットルもしくは５０，０００リットルかまたはそれを超えたものとなるだろう。
【０１４３】
本発明においては、形質転換された宿主細胞の増殖、培養および／または発酵を、宿主細胞が生存可能な温度範囲、たとえば約４℃から約５５℃の範囲内の温度で行う。さらに、「増殖(growth)」は、活発な細胞分裂および／または拡張の生物学的状態、ならびに分裂していない細胞および／または非拡張性の細胞が代謝を維持している生物学的状態の両方を示すために用いられ、後者の使用は「維持(maintenance)」という用語と同義である。
【０１４４】
細胞密度
哺乳動物の組み換え型タンパク質を発現させる際にシュードモナス・フルオレッセンスを用いることのさらなる利点には、シュードモナス・フルオレッセンスが、エシェリキア・コリまたはその他の細菌の発現系に比較して高い細胞密度で培養できるという能力が含まれる。このために、本発明によるシュードモナス・フルオレッセンスの発現系は、約２０ｇ／Ｌ以上の細胞密度を提供することができる。本発明によるシュードモナス・フルオレッセンスの発現系も同様に、体積あたりの生物体量に関して述べられたように、少なくとも約７０ｇ／Ｌの細胞密度を提供することができる。ここでこの生物体量は乾燥細胞重量として測定される。
【０１４５】
一つの実施形態においては、細胞密度は少なくとも２０ｇ／Ｌとなるだろう。別の実施形態においては、細胞密度は少なくとも２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１１０ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１３０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌまたは少なくとも１５０ｇ／Ｌとなるだろう。
【０１４６】
別の実施形態においては、誘導時の細胞密度は、２０ｇ／Ｌと１５０ｇ／Ｌとの間；２０ｇ／Ｌと１２０ｇ／Ｌとの間；２０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；２５ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；３０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；３５ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；４０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；４５ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；５０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間；５０ｇ／Ｌと７５ｇ／Ｌとの間；５０ｇ／Ｌと７０ｇ／Ｌとの間；４０ｇ／Ｌと８０ｇ／Ｌとの間となるだろう。
【０１４７】
単離および精製
本発明のタンパク質を単離し、本技術分野において周知の標準的な技術によって、実質的に純粋となるまで精製してもよい。かかる技術としては、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、調製用電気泳動、界面活性剤による可溶化、カラムクロマトグラフィーのような基質を伴う選択的な沈降、免疫精製法およびその他の方法が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。たとえば、分子付着性が立証されているタンパク質を、逆にリガンドと融合させてもよい。適切なリガンドと共に、タンパク質を精製用カラムに選択的に吸着させて、次いで比較的純粋な形態でカラムから放つことができる。次いで、酵素活性によって融合タンパク質を除去する。さらに、免疫アフィニティーカラムまたはＮｉ−ＮＴＡカラムを用いてタンパク質を精製することができる。一般的な技術は、たとえば、R. Scopes (1982) Protein Purification: Principles and Practice, Springer- Verlag: N.Y.; Deutscher (1990) Guide to Protein Purification, Academic Press;米国特許第４，５１１，５０３号; S. Roe (2001) Protein Purification Techniques: A Practical Approach, Oxford Press; D. Bollag, et al. (1996) Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc.; AK Patra et al. (2000) Protein Expr Purif, 18(2): 182-92;およびR. Mukhija, et al. (1995) Gene 165(2): p. 303-6にさらに記載されている。さらに、たとえばDeutscher (1990) 「Guide to Protein Purification,」 Methods in Enzymology vol. 182,およびこのシリーズのその他の巻； Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY；ならびにタンパク質精製生産に使用する際の製造業者の文献、たとえばPharmacia, Piscataway, NJ., or Bio-Rad, Richmond, Calif. 組み換え技術を組み合わせることによって、適切なセグメント、たとえばＦＬＡＧ配列との融合またはプロテアーゼにより切断可能な配列を介して融合可能なそれに匹敵する配列との融合が可能になる、も参照すること。さらに、たとえば、Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) 「Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent」in Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12:87-98, Plenum Press, NY; and Crowe, et al. (1992) QIAexpress: The High Level Expression and Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, Califも参照すること。
【０１４８】
本技術分野において公知の方法によって発現されたタンパク質の検出を行い、たとえばラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング技術または免疫沈降が挙げられる。
【０１４９】
遺伝子組み換えによって生産され発現した酵素を、数え切れないほど多くの方法によって組み換え細胞培養液から回収し精製することができる。たとえば高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を、必要に応じて最終的な精製工程で採用することができる。
【０１５０】
本発明において発現された特定のタンパク質は不溶性凝集物（「封入体」）を形成してもよい。いくつかのプロトコールが、封入体からのタンパク質の精製に適している。たとえば、封入体の精製は通常、たとえば、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ  ｐＨ  ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦの緩衝液でインキュベーションを行うことによる宿主細胞の破壊によって、封入体の抽出、分離および／または精製が必要である。通常、加圧型細胞破壊装置(French Press)を介して２−３回通過させることを利用して、細胞懸濁液を溶解させる。Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｒｎａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて、または氷上で音波処理を行って、細胞懸濁液をホモジナイズしてもよい。細菌を溶解する別の方法は、当業者にとって自明である（たとえばSambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis eds. (1989) 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al , eds. (1994) Current Protocols in Molecular Biologyを参照すること）。
【０１５１】
必要に応じて、封入体を可溶化してもよく、典型的にはその溶解した細胞懸濁液を遠心分離に付して不要な不溶性物を除去してもよい。封入体を形成したタンパク質を、適合性を有する緩衝液で希釈または透析を行うことによって再生してもよい。適切な溶媒としては、（約４Ｍから約８Ｍの）尿素、（体積／体積ベースで少なくとも約８０％の）ホルムアミドおよび（約４Ｍから約８Ｍの）グアニジン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。グアニジン塩酸塩および類似の薬剤は変性剤ではあるが、この変性は不可逆的ではなく、（たとえば透析による）変性剤の除去または希釈によって再生するだろう。このことによって、免疫学的におよび／または生物学的に活性なタンパク質の再構成が可能となる。その他の適切な緩衝液は、当業者にとって公知である。
【０１５２】
あるいは、宿主のペリプラズムから組み換え型タンパク質を精製することも可能である。組み換え型タンパク質が宿主細胞のペリプラズム内に移動した場合、宿主細胞を溶解した後では、低温浸透圧ショックを本技術分野において公知のその他の方法に付加することによって、細菌のペリプラスム画分を単離することができる。ペリプラズムから組み換え型タンパク質を単離するためには、たとえば、細菌細胞を遠心分離に付してペレットを形成させればよい。このペレットを、２０％ショ糖を含む緩衝液に再懸濁させてもよい。この細胞を溶解するために、細菌を遠心分離に付して、ペレットを氷冷の５ｍＭ  ＭｇＳＯ4に再懸濁させ、氷浴内で約１０分間維持してもよい。細胞懸濁液を遠心分離に付して、その上清についてデカンテーションを行って保存してもよい。上清内に存在する組み換え型タンパク質を、当業者が周知の標準的な分離技術によって、宿主のタンパク質から分離することができる。
【０１５３】
初期の塩の分画化によって、関心対象の組み換え型タンパク質から、多数の不要な宿主細胞のタンパク質（または細胞の培地に由来するタンパク質）を分離することができる。このようなものの一例は、硫酸アンモニウムであろう。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物内の水分量を効果的に減少させることによって、タンパク質を沈殿させる。次いで、タンパク質がそれらの溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質の疎水性がより強ければ、より低濃度の硫酸アンモニウムで沈殿すると思われる。典型的なプロトコールとしては、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が２０−３０％の間となるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加することが挙げられる。この濃度では、ほとんどの疎水性タンパク質が沈殿するだろう。次いで（関心対象のタンパク質が疎水性でない限り）沈殿を廃棄し、関心対象のタンパク質が沈殿することが分かっている濃度にまで硫酸アンモニウムをその上清に添加する。次いで、沈殿を緩衝液で可溶化し、必要に応じて、透析またはダイアフィルトレーションのいずれかによって過剰の塩を除去する。タンパク質の溶解性を利用するその他の方法、たとえば冷エタノール沈殿、は当業者にとって周知であり、タンパク質複合体混合物を分画するために用いることができる。
【０１５４】
組み換え型タンパク質の分子量を利用して、より大きなサイズまたはより小さなサイズのタンパク質からそれを単離することができ、異なる孔径の膜（たとえばＡｍｉｃｏｎ社またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社の膜）を介する限外ろ過を用いて行う。第一工程としては、関心対象のタンパク質の分子量よりも低分子量のものを遮断する孔径の膜を介して、タンパク質混合物の限外ろ過を行えばよい。次いで、限外ろ過の残留液の限外ろ過を、関心対象のタンパク質の分子量よりも大きい分子量のものを遮断する膜に対して行えばよい。組み換え型タンパク質はその膜を通過して、ろ液内に移るだろう。次いで、このろ液を下記のようなクロマトグラフィーに付せばよい。
【０１５５】
そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性およびリガンドに対するアフィニティーに基づいて、組み換え型タンパク質をその他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して惹起された抗体をカラムの基質に結合させて、タンパク質を免疫精製することもできる。これらの方法のすべては本技術分野において周知である。当業者にとって、クロマトグラフィーの技術を、任意の規模でかつ多数の異なる製造業者（たとえばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）からの装置を用いて実施できることは自明であろう。
【０１５６】
再生および再度の折りたたみ
不溶性タンパク質を再生または再度折りたたんで、タンパク質の二次構造および三次構造の配置を生み出すことができる。組み換え型生産物の配置を完成させる際に、必要に応じてタンパク質の再折りたたみ工程を利用することができる。本技術分野において公知の、タンパク質の解離／会合を促進させるための薬剤を利用して、再折りたたみおよび再生を完成することができる。たとえば、タンパク質をジチオスレイトールと共にインキュベートし、次いで酸化型グルタチオンのニナトリウム塩と共にインキュベートし、次いで再度折りたたむための薬剤、たとえば尿素を含む緩衝液と共にインキュベートすることができる。
【０１５７】
たとえば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）かまたは５０ｍＭ  Ｎａ−酢酸、ｐＨ６緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析することによって、組み換え型タンパク質も再生することができる。あるいは、カラム、たとえばＮｉ  ＮＴＡカラム上で固定化している間に、プロテアーゼインヒビターを含む５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４の液で、６Ｍ−１Ｍの尿素の直線勾配を利用することによって、タンパク質を再度折りたたむことができる。１．５時間以上をかけて、再生を実施することができる。再生後、２５０ｍＭイミダゾールを添加することによってタンパク質を溶出することができる。ＰＢＳかまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６の緩衝液＋２００ｍＭ  ＮａＣｌの液に対する最後の透析工程で、イミダゾールを除くことができる。精製されたタンパク質を４℃で貯蔵するか、または−８０℃で凍結させることができる。
【０１５８】
その他の方法としては、たとえば、MH Lee et al. (2002) Protein Expr. Purif., 25(1): p. 166-73, W.K. Cho et al. (2000) J. Biotechnology, 77(2-3): p. 169-78; Deutscher (1990) 「Guide to Protein Purification」, Methods in Enzymology vol. 182,およびこのシリーズの他の巻、Coligan, et al. (1996 and periodic Supplements) Current Protocols in Protein Science Wiley/Greene, NY; S. Roe (2001) Protein Purification Techniques: A Practical Approach, Oxford Press; D. Bollag, et al. (1996) Protein Methods, Wiley-Lisa, Inc.に記載されたものが挙げられる。
【０１５９】
活性なタンパク質またはペプチドの分析
典型的には、「活性」なタンパク質には、対応する天然のタンパク質に匹敵する生物学的機能または生物学的作用を有するタンパク質が含まれる。タンパク質との関連において、典型的にはこのことは、標準的なパラメータとして用いる対応する天然のタンパク質と比較して、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生物学的機能または生物学的作用が少なくとも約２０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％または１００％の活性であることを意味する。特定のタンパク質についてのアッセイであって、対応する標準の、目標とされる生物学的な比較アッセイを利用して、タンパク質の活性測定を行うことができる。組み換え型タンパク質の生物学的機能または生物学的作用が、組み換え型ポリペプチドが天然のポリペプチドと免疫学的に交差反応するという一つの指摘。
【０１６０】
活性なタンパク質は、哺乳動物の天然のタンパク質の比活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％の比活性を持つことが典型的である。さらに、基質特異性（ｋcat／Ｋm）は、必要に応じて哺乳動物の天然のタンパク質と実質的に同じでよい。典型的には、ｋcat／Ｋmは、天然のタンパク質のそれの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％であろう。タンパク質およびペプチドの活性ならびに基質特異性（ｋcat／Ｋm）をアッセイする方法および定量する方法は、当業者にとって周知である。
【０１６１】
哺乳動物の組み換え型タンパク質の活性を、任意のタンパク質に特異的な、本技術分野において公知の従来のすなわち標準的なインビトロアッセイまたはインビボアッセイによって測定することができる。シュードモナスが生産した哺乳動物の組み換え型タンパク質の活性を、対応する哺乳動物の天然のタンパク質の活性と比較することができ、同じか類似の生理学的条件下で一般的に見られる天然のタンパク質の活性に対して、哺乳動物の組み換え型タンパク質が、実質的に同等または等価の活性を示すかどうかを決定することができる。
【０１６２】
組み換え型タンパク質の活性を、既に明らかにされた天然のタンパク質の標準的な活性と比較することができる。あるいは、組み換え型タンパク質の活性を、天然のタンパク質との同時の、または実質的に同時の比較アッセイにて測定することができる。たとえば、インビトロアッセイを用いて、組み換え型タンパク質と、ターゲットとの間、たとえば発現された酵素と基質との間、発現されたホルモンおよびホルモンレセプターとの間、発現された抗体と抗原との間などにある、検出可能なあらゆる相互作用を測定することができる。このような検出としては、比色の変化の測定、増殖の変化の測定、細胞死の測定、細胞の反発性の測定、放射能の変化の測定、溶解性の変化の測定、ゲル電気泳動および／またはゲル排除方法によって測定される分子量の変化の測定、リン酸化能力の測定、抗体特異性のアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡアッセイなどを挙げることができる。さらに、インビボアッセイとしては、天然のタンパク質の生理学的影響、たとえば重量の増加、電解質のバランスの変化、血液凝固時間の変化、血栓分解の変化および抗原による応答の誘導と比較しての、シュードモナスが生産したタンパク質の生理学的影響を検出するためのアッセイが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。一般的に、あらゆるインビトロアッセイまたはインビボアッセイを用いて、シュードモナスが生産する哺乳動物の組み換え型タンパク質の活動的な性質を測定することができ、そのような活性がアッセイ可能である限り、天然のタンパク質に対する比較分析が可能となる。あるいは、タンパク質と、通常はタンパク質と相互作用する分子、たとえば天然のタンパク質が通常総合作用するようなシグナル経路の基質または成分、との間の相互作用を促進するかまたは阻害する能力について、本発明において生産されるタンパク質をアッセイすることができる。典型的には、このようなアッセイは、タンパク質がターゲット分子と相互作用し、そしてタンパク質とターゲット分子とによる相互作用の生化学的な影響を検出できる条件下で、タンパク質を基質分子と結合させる工程を含んでもよい。
【０１６３】
タンパク質の活性を測定するために利用することができるアッセイは、たとえば、Ralph, P. J., et al. (1984) J. Immunol. 132:1858; Saiki et al. (1981) J. Immunol. 127:1044, .Steward, W. E. II (1980) The Interferon Systems. Springer-Verlag, Vienna and New York, Broxmeyer, H. E., et al. (1982) Blood 60:595; Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis eds. (1989) 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; Berger, S.L. and A.R. Kimmel eds. (1987) 「Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques」 Academic Press; AK Patra et al. (2000) Protein Expr Purif, 18(2): 182-92, Kodama et al. (1986) J. Biochem. 99: 1465-1472; Stewart et al. (1993) Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 5209-5213; Lombillo et al. (1995) J. Cell Biol. 128:107-115; Vale et al. (1985) Cell 42:39-50に記載されている。
【０１６４】
＜実施例＞
細菌株および培養条件
別に明記しない限り、シュードモナス発現のすべての試験で用いた株のすべては、シュードモナス・フルオレッセンスＭＢ１０１株を基礎とした。エシェリキア・コリＪＭ１０９株（Ｐｒｏｍｅｇａ社）、ＸＬ２  Ｂｌｕｅ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）またはＴｏｐ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、一般的なクローニングに用いた。エシェリキア・コリ発現の研究のために、ＢＬ２１  （ＤＥ３）  Ｇｏｌｄを用いた。シュードモナス・フルオレッセンス株を、必要に応じて１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンおよび３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを追加した、ＬＢ培地または最小塩類培地のいずれかで、３０℃で培養した。必要に応じて３０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび／または１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールもしくは１５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを追加したＬＢで、エシェリキア・コリ株を３７℃で培養した。増殖期に達した後、細胞を０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。
【０１６５】
タンパク質活性の検出（ＥＬＩＳＡアッセイ）
ＰＢＳ（ｐＨ７．６）中で１０μｇ／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ溶液の２００μＬをマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに添加して、プレートをコーティングした。プレートを室温で１６時間インキュベートし、次いで２００μＬのＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した。一次抗体を２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含むＰＢＳで希釈した。２００μＬの希釈抗体をそれぞれのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。このプレートを次いで２００μＬのＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。二次抗体も２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含むＰＢＳで希釈し、それぞれのウェルに２００μＬを添加し、室温で１．５−２時間インキュベートした。このプレートを次いでＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。三次抗体を用いてｓｃＦｖ抗体：アルカリホスファターゼ結合ヒツジ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ、カタログ番号Ａ５３２４）を検出した。それぞれの所望のウェルに２００μＬの希釈抗体溶液（またはＰＢＳ−Ｔ）を添加し、室温で１．５時間インキュベートした。このプレートを次いでＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。それぞれのウェルに２００μＬの新しく調製したＳｉｇｍａ  Ｆａｓｔ  ｐＮＰＰ基質（Ｓｉｇｍａ社カタログ番号Ｒ−２７７０）を添加した。３０分後に、５０μＬの３Ｍ  ＮａＯＨをそれぞれのウェルに添加してこの反応を停止させ、４０５ｎｍでの吸光度を読み取った。
【０１６６】
発酵
シュードモナス・フルオレッセンスについての発酵槽での培養のための接種材料を、６００ｍＬの化学的に規定された、酵母抽出物およびデキストロースを追加した培地を含む振盪フラスコに接種することによって作製する。典型的には、テトラサイクリンを添加して、一晩のインキュベートの間でのスターターカルチャーにおいて、ならびに発酵槽において、組み換えプラスミドが確実に維持できるようにする。次いで、振盪フラスコ培養物を、酵母抽出物を添加せずに高バイオマスを支持するように設計された、化学的に規定された培地を含む２０Ｌの発酵槽に無菌で移す。気流を発酵槽内への気流と撹拌器の撹拌速度とを調節すること；アンモニア水を添加してｐＨが６．０を超えるように維持することによって、液体培養内での酸素は陽性レベルを維持する。フェドバッチ高密度発酵プロセスは、約２４時間の初期の増殖期と、インデューサを添加して組み換え遺伝子の発現を開始させる遺伝子発現（誘導）期とに分けられる。制限された濃度で、発酵プロセスの全体を通して、グルコースをコーンシロップの形態で供給する。誘導期を開始させる標的細胞密度は通常、５７５ｎｍにて１５０ＯＤ単位である。発酵の誘導期は通常、約４５〜５５時間まで達することが可能である。この期の間、種々の分析のために発酵槽からサンプルを回収し、標的遺伝子発現、細胞密度のレベルなどを測定する。
【０１６７】
エシェリキア・コリについてのそれぞれの発酵実験のために、凍結したグリセロールストックを−８０℃の貯蔵庫から取り出し、カナマイシンを添加した６００ｍＬのＬＢ培地を含む振盪フラスコに接種する前に解凍し、希釈する。振盪フラスコ培養物を３００ｒｐｍで振盪させながら一晩、３７℃でインキュベートし、次いで、複合培地を含む２０Ｌの発酵槽に無菌で移す。発酵槽内の温度を３７℃に維持し、アンモニア水およびリン酸を添加してｐＨを７とし、そして２０％を超えるように酸素を溶解させる。短時間の初期バッチ期の後、速度を段階的に高めてグリセロールを供給して過剰の炭素を維持する。６００ｎｍでの細胞密度が２４−２８ＯＤ単位に達した時点で、インデューサ、たとえばイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を添加することによって、組み換え発現を実施する。発酵の誘導期は通常、発酵槽の容積に達する時まで、または増殖速度が顕著に低下し始める時まで、約３〜５時間継続する。この期の間、種々の分析のために発酵槽からサンプルを回収し、標的遺伝子発現、細胞密度のレベルなどを測定する。
【０１６８】
細胞分画およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
サンプルをＡ５７５＝３０に標準化し、１ｍＬの標準化培養物をペレット化する。細胞を１ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ塩基；２００ｍＭのＮａＣｌ；５％ｖ／ｖのグリセロール；２０ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム塩；０．５％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１ｍＭのＤＴＴ）で再懸濁させる。細菌溶解物に特異的なプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ社＃Ｐ８４６５）を１Ｘ濃度で添加する。再懸濁させた細胞を、０．１ｍｍのガラスビーズと一緒に、２ｍｌのネジ込み式マイクロフュージチューブの全体の約３／４まで添加し、最も強い設定でＢｉｏＳｐｅｃビーズミルにて４，１分間のインキュベートを用いて細胞を機械的に溶解させる。インキュベートの間、細胞を氷上に置く。約１００μＬの溶解細胞溶液をビーズから取り除き、新しいチューブに移してペレット化する。その上清（可溶性画分）を新しいチューブに移す。そのペレット（不溶性画分）を等量の溶解緩衝液＋プロテアーゼインヒビター（１００μＬ）で再懸濁する。それぞれのサンプルの５μＬを５μＬの２Ｘ  ＬＤＳ負荷緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に添加し、４−１２％または１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上に負荷し、示されるように１Ｘ  ＭＥＳ緩衝液または１Ｘ  ＭＯＰＳ緩衝液のいずれかで稼動させる。
【実施例１】
【０１６９】
実施例１：細胞質におけるｓｃＦＶの発現
一本鎖抗体断片（ｓｃＦＶ）が診断薬および治療剤としての使用が増加していることが分かっている。これらの比較的小さいタンパク質は、免疫グロブリンの可変性の軽鎖および重鎖をコードする互いの遺伝子を融合することによって作られる。
【０１７０】
Ｇａｌｌ３  ｓｃＦｖのクローニング
ファージディスプレイベクターｐＣＡＮＴＡＢ６内にクローニングされたＧａｌｌ３  ｓｃＦｖ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ２３８２９０）(P Martineau et al. (1998) J. Mol. Biol. 280 (1): 117-27を参照すること）を、774塩基対の産物を増幅するための鋳型として用いた。続いてこれをｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）内にクローニングした。ＳｐｅＩ制限酵素およびＳａｌＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）で、ＴＯＰＯベクターからｓｃＦｖ遺伝子を切り出し、シュードモナス・フルオレッセンスベクターｐＭＹＣ１８０３のＳｐｅＩ部位ＸｈｏＩ部位内、Ｐｔａｃプロモーターの下流、にクローニングして、ｐＤＯＷ１１１７を生産した。得られたプラスミドをシュードモナス・フルオレッセンス内にエレクトロポレートした。ＳａｌＩ部位およびＮｃｏＩ部位がコード配列に隣接するように、増幅した後、Ｇａｌ１３遺伝子をｐＥＴ２４ｄ＋発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）内にクローニングした。このＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＮｃｏＩで消化して、ｐＥＴ２４ｄ＋ベクターのＴ７プロモーターの下流の同じ部位内にクローニングした。次いで、新たに形成された構築物を用いて、ＸＬ２  Ｂｌｕｅコンピテント細胞を形質転換した。配列を確認すると、すぐにそのＤＮＡ構築物を用いてＢＬ２１  （ＤＥ３）  Ｇｏｌｄ  （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を発現用に形質転換した。
【０１７１】
エシェリキア・コリおよびシュードモナス・フルオレッセンスにおける一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）の発現
エシェリキア・コリおよびシュードモナス・フルオレッセンスの両方で、ｓｃＦｖ分子を発現させた。これらの中で、ｓｃＦｖはエシェリキア・コリタンパク質のβ−ガラクトシダーゼ一本鎖抗体ｇａｌ１３(P. Martineau et al. ,「Expression of an antibody fragment at high level in the bacterial cytoplasm」 J. Mol. Biol. 280 (1) : 117-27 (1998))への結合活性を有する。シュードモナス・フルオレッセンスは、２０Ｌの発酵の間に、エシェリキア・コリの約６倍を超えてタンパク質を発現し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびデンシトメトリーで測定されるように、シュードモナス・フルオレッセンスにおいては３．１  ｇ／Ｌの収量、およびエシェリキア・コリにおいては０．５ｇ／Ｌの収量であった（表８を参照すること）。シュードモナス・フルオレッセンスは、約９６％の可溶性タンパク質を発現したのに対して、エシェリキア・コリはわずかに４８％の可溶性タンパク質を発現した。
【表８】
0005602336.tif 000011
図２に示されるように、両者の発現系から精製された成分が、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって活性であることが分かった。両方の株の溶解物から、等量のわずかの溶解物の可溶性画分からも、アフィニティークロマトグラフィーを用いて成分を精製した。最後に、シュードモナス・フルオレッセンスについての全体量の回収プロセスは、エシェリキア・コリについてのそれよりも約２０倍を超えて効率的であり、１．３４ｇ／Ｌ対０．０７ｇ／Ｌであった。
【実施例２】
【０１７２】
実施例２：細胞質内でのヒトγ−ＩＦＮの発現
ヒトガンマ−インターフェロンのクローニング
PW Gray et al. (1982) Nature 298 : 859-63に記載のＭｅｔ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏから始まる組み換え型γ−ＩＦＮのＮ末端を伴う天然の分泌シグナルが欠如するように、ヒトガンマ−インターフェロン（ｈｕ−γＩＦＮ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ１３２７４）を、ヒト脾臓のｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ；カタログ番号１０４２５−０１５）から増幅した。得られた産物をｐＣＲ２．１  ＴＯＰＯベクター内にクローニングし、その配列を確認した。ＳｐｅＩ制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素でｈｕ−γＩＦＮ遺伝子をＴＯＰＯベクターから切り出し、ｐＭＹＣ１８０３の同じ部位内にクローニングした。別個の反応において、ＡｆｌＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位がコード配列に隣接するように、ｈｕ−γＩＦＮを増幅した。得られた断片をＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内にクローニングし、化学的にコンピテント化されたエシェリキア・コリＪＭ１０９細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）内に形質転換した。ＡｆｌＩＩＩおよびＸｈｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化することによってこの遺伝子を単離し、ｐＥＴ２４ｄ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）のＴ７プロモーターの下流のＮｃｏＩ部位およびＸｈｏＩ部位内にクローニングし、ＪＭ１０９内に形質転換した。陽性クローンをエシェリキア・コリＢＬ２１  （ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ社）内に形質転換し、発現について試験した。
【０１７３】
ヒトガンマ−インターフェロンの精製
シュードモナス・フルオレッセンス培養物からの凍結した細胞ペーストを解凍し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸、カタログ番号ＢＰＩＩ８−５００、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡ）、１ｍＭのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフロリド、カタログ番号Ｐ−７６２６、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１ｍＭのジチオスレイトール（カタログ番号Ｄ−０６３２、Ｓｉｇｍａ社）、および１ｍＭのベンズアミジン（カタログ番号Ｂ−６５０６、Ｓｉｇｍａ社）を含む５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．２）で、２ｍＬの溶解緩衝液あたり約１グラムの細胞ペーストの割合で再懸濁した。マイクロフリューダイザ（モデル１１０Ｙ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）に３回通すことによって、細胞を破壊した。細胞の残骸および破壊されなかった細胞を、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ遠心分離装置；モデルＪＡ  ２５．５０，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡを用いて４℃、２３，７０８ｘｇで６０分間）によって除去した。得られた上清（細胞を含まない抽出物）を、１０％ｗ／ｖの珪藻土（セライト産物、Ｗｏｒｌｄ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加して清澄にし、得られたものを減圧ろ過にて、ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  １、カタログ番号１００１−１５０、  Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｐｅｒ  Ｌｔｄ．，Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ，Ｋｅｎｔ，ＵＫ）に通した。
【０１７４】
清澄化した細胞抽出物を、緩衝液Ａにて０．５ｍＬ／分の流速で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ  （６％の架橋アガロースビーズ成分；カタログ番号１７−０７０９−１０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）の３．２ｃｍｘ１３．５ｃｍのクロマトグラフィーカラムに添加した。緩衝液Ａの組成は次の通りであった：５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８（すなわちＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン）Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号ＢＰ−３１０−１００から）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０２％のアジ化ナトリウム（カタログ番号７１２８９、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）。負荷後、このカラムをカラム体積の３倍量（カラム体積＝１０８ｍＬ）の緩衝液Ａと、カラム体積の５倍量の０．４ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａとで洗浄した。さらに、２ｍＬ／ｍｉｎの流速で合計カラム体積の７倍分の、同じ緩衝液の０．４Ｍ〜１Ｍの勾配を付けたＮａＣｌを添加して、カラムを展開した。次いで、純粋なＩＦＮ−γを含む画分を集めて、１Ｘ  ＰＢＳ（リン酸緩衝化塩類溶液、ｐＨ７．２）に対して４℃で透析した。限外ろ過（ＹＭ３０限外ろ過膜を使用；カタログ番号１３７２２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ  ＵＳＡより）によって、タンパク質を濃縮した。次いで、液体窒素で凍結させて８０℃で貯蔵した。
【０１７５】
エシェリキア・コリおよびシュードモナス・フルオレッセンスにおけるヒトγ−インターフェロンの発現
γ−ＩＦＮ遺伝子を発現するエシェリキア・コリの発酵によって、ヒトγ−インターフェロンを商業的に生産する。このタンパク質を不溶型および不活性型の状態で、細胞質内で発現させる。組み換え体ポリペプチドを活性な医薬成分として生産するために、インターフェロンを回収し、溶解させ、再折りたたみさせ、次いで精製しなければならない。これらの単位操作のすべては、タンパク質の原価(COG)をかなり上昇させる。ヒト脾臓のｃＤＮＡライブラリーを、天然のシグナル配列を含まないγＩＦＮ  ｃＤＮＡを増幅するための鋳型として用い、エシェリキア・コリの発現ベクターおよびシュードモナス・フルオレッセンスの発現ベクター内にクローニングする。典型的な２０Ｌの発酵反応の間に、シュードモナス・フルオレッセンス構築物は約４ｇ／ＬのγＩＦＮタンパク質を生産した。可溶性画分および不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析から、タンパク質の大部分（９５％）が可溶性画分内に存在することが示される。図１は、シュードモナス・フルオレッセンスサンプルの可溶性画分から精製されたｈｕ−γ−ＩＦＮが、市販の標準に匹敵する活性を示すことを示す。図５および表９は、エシェリキア・コリの発現系とシュードモナス・フルオレッセンスの発現系との間でのγ−ＩＦＮの発現の比較を示す。
【表９】
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【０１７６】
ヒトガンマ−インターフェロン活性の評価
セルラインおよび培地：Ｈｅｌａ細胞（カタログ番号ＣＣＬ−２）および脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ、カタログ番号ＶＲ−１２９Ｂ）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。１０％ウシ胎血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を有するイーグル改変必須培地（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＥＭＥＭ，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｄｏｎ，ＶＡ，ＵＳＡ）で、３７℃／５％のＣＯ2にて、ＨｅＬａ細胞を維持した。
【０１７７】
既述のウイルス阻害アッセイ(JA Lewis (1987) in Lymphokines and Interferons : A Practical Approach MJ Clemens et al. (eds.) （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて、精製ｈｕ−γＩＦＮの活性を評価した。概略を言えば、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり３Ｘ１０4で播種した。２４時間後、シュードモナス・フルオレッセンスから単離された精製ｈｕ−γＩＦＮ、またはエシェリキア・コリ組み換え体ｈｕ−γＩＦＮ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓより、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を、ウェルあたり０、０．０１または０．０５ｎｇにて三通り、ウェルに添加した。ｈｕ−γＩＦＮと共に細胞を２４時間のプレインキュベートした後、ＥＣＭＶを種々の希釈率で添加して、三通りのウェルを設定した。細胞を５日間インキュベートし、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（カタログ番号１６４７２２９、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）の取り込みを監視する細胞増殖ＥＬＩＳＡを利用して、その後細胞の生存性を測定した。活発に分裂する（生きている）細胞数の存在がより多いことによって、吸光度がより大きくなるという吸光単位として結果を表す。
【実施例３】
【０１７８】
実施例３：細胞質内でのｈＧＨの発現
ヒトｃＤＮＡライブラリーからヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を増幅するようなプライマーを設計した。この研究のために、製造業者のプロトコールに従ってＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用い、鋳型としての上記のプラスミドと、プライマーＥＬＶＩｒｅｖおよびｈｇｈ−ｓｉｇを用い、そして９５℃で２分間（９５℃で６０秒間・４２℃で１２０秒間・７２℃で３分間）を２５回行うＰＣＲサイクリングプロフィールによってｈＧＨを増幅した。Ｗｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、ＳｐｅＩ制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で消化して、得られた産物を精製し、ｐＭＹＣ１８０３の同じ部位内にクローニングした（図３）。増幅されたｈＧＨで見つかった変異体を、ＥＬＶＩｒｅｖを伴うｈｇｈ−ｓｉｇｃｏｒｒプライマーと、ＰＣＲおよびクローニング手法を繰り返し利用して集めた。
【表１０】
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【０１７９】
ｈＧＨの精製
２０Ｌの発酵の後、０．２５ＭのＮａＣｌ工程の代わりにＤＥＡＥ  ＦＦ溶出と０〜０．５ＭのＮａＣｌ勾配を用いた間を除いて、エシェリキア・コリ細胞およびシュードモナス・フルオレッセンス細胞の不溶性画分から、ｈＧＨを精製した。
【０１８０】
エシェリキア・コリ内対シュードモナス・フルオレッセンス内のヒト成長ホルモンの発現
ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーから、ヒト成長ホルモンをコードするｃＤＮＡを増幅した。細菌による発現のために、天然の分泌シグナル配列を除去し、Ｎ末端のメチオニンを改変して構築物内とした。エシェリキア・コリの発現のために、ｈＧＨ遺伝子を含むｐＥＴ２５ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）内に形質転換した。これは、ｈＧＨの転写に必須の組み込まれたＴ７ポリメラーゼ遺伝子を含む。シュードモナス・フルオレッセンスの発現の研究はＭＢ２１４株にて行った。これは、Ｐｔａｃプロモーターからの発現を制御するための、組み込まれたｌａｃＩ遺伝子を含む。２０Ｌの発酵規模で、両方の発現系を評価した。表１０に示されるように、１グラムの乾燥生物体量あたりの生産されたタンパク質の量において、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｆ）はエシェリキア・コリ（ＥＣ）より高効率であった（１．６倍に等しい）。
【表１１】
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細胞分画化およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、両方の発現系（図４）において、ｈＧＨが不溶性画分に見出されることが示される。驚くべきことに、乾燥生物体量１グラムあたりのタンパク質生産はわずかに１．６倍の違いしかないにも関わらず、エシェリキア・コリと比較して、約７Ｘを超えるｈＧＨモノマーを、シュードモナス・フルオレッセンスから精製した。
【表１２】
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【実施例４】
【０１８１】
実施例４：ペリプラズム内でのタンパク質の発現
分泌シグナルペプチドのキャラクタライゼーション
アルカリホスファターゼ(phoA)コード配列−ゲノムＤＮＡ融合体の形成および発現によって、シュードモナス・フルオレッセンスの分泌シグナルペプチドを発見した。そしてこのペプチドは、２００４年１１月２２日に出願された米国出願第１０／９９６，００７号により詳細に記載されている。発現された融合体のうちの六つを、さらに次のように特徴づけた。
【０１８２】
ｐｈｏＡ融合体として特定された、分泌された遺伝子についてのシグナル配列の切断部位を、その他のシュードモナス菌からの相同なタンパク質と、ＳＰＳｃａｎプログラム(Menne et al, 2000)によって比較することで推定した。推定されるリポタンパク質の切断部位を、シグナルペプチダーゼＩＩモチーフと比較することで推定した；シグナルペプチダーゼＩＩは特異的にリポタンパク質のシグナル配列を切断する。六つのシグナルペプチドのすべてを、ＳｉｇｎａｌＰ（推定されるシグナルペプチドの分析のためのソフトウェアプログラム；Center for Biological Sequence Analysis of the Technical University of Denmarkより、http://www.cbs.dtu.dklservices/SignalP/にて利用可能）を用いて分析した。さらに、Nielson et al. (1997) Protein Engineering 10: 1-6を参照すること。いくつかの場合において、追加された供給源を用いてシグナルペプチドの同一性をさらに特徴づけた。この情報を表１２に提示する。
【表１３】
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【０１８３】
融合タンパク質を検出するためのｐｈｏＡ融合タンパク質のウエスタン分析
融合タンパク質が生産されたかどうかを分析するために、遠心分離によって全細胞画分（細胞質およびペリプラズム）と細胞を含まない培地画分とに分けられた培養物に関して、アルカリホスファターゼに対する抗体を用いたウエスタン分析を実施した。挿入部位が決定された５株のうち、４つ（推定されるアズリン、推定されるリン酸結合タンパク質、推定されるペリプラズムのリポタンパク質Ｂ、推定されるＦｅ（ＩＩＩ）結合タンパク質）が、予想されたサイズの融合タンパク質を生産し、そして一つ（推定されるｏｐｒＥタンパク質）が予想よりも約４０ｋＤ小さいタンパク質を生産した。そして一つ（推定されるＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｏｒｎ結合タンパク質）が予想よりも約２０ｋＤ小さいタンパク質を生産した。
【０１８４】
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｘｃｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋＴＭ  Ｍｉｎｉ−ＣｅｌｌおよびＸＣｅｌｌ  ＩＩ  ＴＭ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｄｕｌｅ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、４０Ｖで一時間かけて、ニトロセルロース膜に移した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  ＨｉｓＰｒｏｂｅＴＭ  Ｋｉｔ  （Ｐｉｅｒｃｅ社）から提供の説明書を用いて、ウエスタン実験を実施した。
【０１８５】
ｐｂｐ−ｈＧＨ融合体の構築、発現および特徴付け
シュードモナス・フルオレッセンスのリン酸結合タンパク質分泌リーダーを、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の成熟したドメインのＮ末端と融合させ、発現および分泌について試験した。
【０１８６】
シュードモナス・フルオレッセンスのクローンから、ｐｂｐシグナル配列を鋳型として、そしてsig_pbp for(gctctagaggaggtaacttatgaaactgaaacg)プライマーおよびpbp_hgh (gggaatggttgggaaggccaccgcgttggc)プライマーを用いて、ｐｂｐシグナル配列コード領域をＰＣＲ増幅し、次いでゲルで精製した。これによって、結果的にｐｂｐシグナルペプチドＣＤＳおよびｈＧＨの成熟したドメインの５’末端についてのコード配列を含むオリゴヌクレオチド断片が生産された。
【０１８７】
プライマーELVIfor(agagaactagtaaaaaggagaaatccatggctacaggctcccggacgtcc)およびELVIrev(agagactcgagtcattagaagccacagctgccctccac)を用いて、ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ  ＣＡ）から、ヒト成長ホルモンをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。これらのプライマーは、ｈＧＨの成熟したドメインのみを増幅し、ｐＭＹＣｌ  ８０３／ＳｐｅＩ  ＸｈｏＩ内にクローニングしてｐＤＯＷ２４００を形成するように設計されていた。プライマーpbp_hgh_revcomp(gccaacgcggtggccttcccaaccattccc)およびhgh_rev(agagactcgagtcattagaagccacagctgccctccacagagcggcac)を用いて、ｐＤＯＷ２４００からこの成熟したｈＧＨ遺伝子を増幅した。次いで、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）で精製してプライマーおよびその他の反応成分を除去した。ｐｂｐ−ｈＧＨ融合体をコードするポリヌクレオチドを作製するために、二つのＰＣＲ反応物を混ぜ合わせて、二つの断片を結合させるために、ｓｉｇ＿ｐｂｐ  ｆｏｒおよびｈｇｈ＿ｒｅｖを用いて再び増幅した。予想された６８１ｂｐ断片を、上記のようなＳｔｒａｔａｐｒｅｐを用いて精製し、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで制限消化し、脱リン酸化ｐＤＯＷ１２６９／ＸｈｏＩＳｐｅＩと連結してｐＤＯＷ  １３２３−１０を形成させ、ｐＭＹＣ１８０３に類似のベクター内にてｔａｃプロモーターの制御下にｐｂｐ−ｈＧＨを置いたが、ｔｅｔＲテトラサイクリン耐性マーカー遺伝子に代えてｐｙｒＦ選択マーカーを用いた。連結混合物をＭＢ１０１  ｐｙｒＦ  ｐｒｏＣ  ｌａｃＩQ1内に形質転換した。Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙのものによって、上記の方法を利用して挿入物の配列を決定した。この融合体のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、（図１０）および（図１１）にそれぞれ提示する。
【０１８８】
得られた株をまず振盪フラスコ規模で試験した。プロセシングされたまたはプロセシングされなかったものの予想されたサイズの誘導されたバンド（それぞれ２２．２ｋＤａおよび２４．５ｋＤａ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。タンパク質のほぼ半分がプロセシングされ（ペリプラズムに局在化していることを示す）、そしてプロセシングされたものの約半分が可溶性画分に、半分が不溶性画分にあった。発現の研究を２０Ｌのバイオリアクターにスケールアップした。クーマシーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリーから、生産された総ｈＧＨの１８％がプロセシングされて可溶性となったことが示された。この株はすべての型のｈＧＨを３．２ｇ／Ｌ生産した；プロセシングされて可溶性となったものは０．６ｇ／Ｌであった。
【０１８９】
ｐｂｐ−ｓｃＦｖ融合体の構築、発現および特徴付け
リン酸結合タンパク質（すなわちＭｅｔ１など）の推定される２４アミノ酸のシグナル配列を、＋２アミノ酸（Ａｌａ）の位置で、ｇａｌ２のｓｃＦｖ遺伝子（ｇａｌ２）のオープンリーディングフレームと融合した。図８および図９を参照すること。このシグナル配列はプロセシングを受けているように思われ、ペリプラズムに分泌されたことが示唆される。さらに、細胞を含まない培養上清内でタンパク質が検出されたことから、培地への分泌も存在する。驚くべきことに、リン酸結合タンパク質のシグナル配列に融合することは、シュードモナス・フルオレッセンス内でのｇａｌ２  ｓｃＦｖの発現を改善するようである。アミノ末端で融合された分泌シグナルなしでは、ｇａｌ２  ｓｃＦｖの発現が検出できなかった。
【０１９０】
Ｇａｌ２のクローニング
プライマーsig_pbp for（上記）およびpbp_gal2SOE rev(ctgcacctgggcggccaccgcgtt)、これはpbp_gal2SOE for(aaccgcggtggccgcccaggtgcag)の逆相補鎖を含む、を用い、そしてシュードモナス・フルオレッセンスのpbp分泌シグナルペプチドをコードするプラスミドを鋳型としてを用いてＰＣＲを実施した。これによって、結果的に、ｐｂｐシグナルペプチドコード配列（ＣＤＳ）およびｇａｌ２一本鎖抗体（ｓｃＡｂまたはｓｃＦｖ）の５’末端についてのＣＤＳを含むオリゴヌクレオチド断片が生産された。
【０１９１】
プライマーpbp_gal2SOE forおよびscFv2rev(acgcgtcgacttattaatggtg atgatggtgatgtgcggccgcacgtttgatc)を用い、そしてｇａｌ２をコードするポリヌクレオチドを鋳型として用いてＰＣＲを実施した。これによって、結果的に、ｐｂｐシグナルペプチドの３’末端をコードするＣＤＳと、オープンリーディングフレーム（ＯＲＥ）をコードするｇａｌ２とを含むポリヌクレオチド断片が生産された。
【０１９２】
反応産物を精製した。それぞれ約１５ｎｇを、プライマーｓｉｇ＿ｐｂｐ＿ｆｏｒおよびｓｃＦｖ２ｒｅｖを用いてのさらなるＰＣＲ反応における「鋳型」ＤＮＡとして用いた。これによって、結果的に、ｇａｌ２コード配列に融合したｐｂｐシグナルペプチドＣＤＳを伴う核酸断片が生産された。
【０１９３】
予想された、シグナル配列の−１アミノ酸（これは切断部位がプロポーズされる前の最後のアミノ酸）を、ｇａｌ２  ｓｃＦｖ（Ａｌａ）の＋２アミノ酸と融合した。得られた融合体を、Ｐｔａｃプロモーターの制御下のシュードモナス・フルオレッセンスベクターｐＭＹＣ１８０３内にクローニングし、プラスミドおよびｐＤＯＷ１１２３（ｐｂｐ：ｇａｌ２）を生産させた。このプラスミドを、プラスミドｐＣＮ５１−ｌａｃＩ（２００４年１１月１９日に出願された米国出願第１０／９９４，１３８号に記載されている）を保持するシュードモナス・フルオレッセンスＭＢ１０１株内に形質転換した。
【０１９４】
推定されるリン酸結合タンパク質のシグナル配列のｇａｌ２  ｓｃＦｖとの融合
リン酸結合タンパク質のシグナル配列を一本鎖抗体遺伝子と融合し、ペリプラズムおよび／または培養上清への分泌について試験した。
【表１４】
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【０１９５】
得られた株をまず振盪フラスコ規模で試験した。不溶性タンパク質画分内で、プロセシングされたまたはプロセシングされなかったｇａｌ２の予想されたサイズの誘導されたバンド（２９ｋＤａおよび２７ｋＤａ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した（データは示さず）。発現の研究を２０Ｌの発酵にスケールアップした。再度のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、誘導されたタンパク質の大部分が不溶性タンパク質画分に見られることが示された。
【０１９６】
ウエスタン分析から、いくらかのプロセシングされたｇａｌ２が、ｐｂｐ：ｇａｌ２（ｐＤＯＷ１１２３）についての可溶性タンパク質画分に存在することも示された。（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ細胞膜キットを用いての）ｐＤＯＷ１１２３を保持する株から調製されたペリプラズム画分のウエスタン分析から、可溶性ｇａｌ２タンパク質が存在することが示された。
【０１９７】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉ−ＮＴＡプロトコールを利用して、組み換え体ｇａｌ２  ｓｃＦｖを、振盪フラスコ実験の細胞抽出物から単離し、次いでP. Martineau et al. , J Mol. Biol. 280 : 117-127 (1998)に記載のように再折りたたみを行わせた。この抗体は、ELISAアッセイにおいて、β−ガラクトシダーゼに対して活性を持つことが分かった。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、シュードモナス・フルオレッセンスサンプルの可溶性画分から精製されたｈｕ−γ−ＩＦＮが、市販の標準と同等の活性を示すことを示すグラフである。
【図２】図２は、シュードモナス・フルオレッセンスおよびエシェリキア・コリ内における、精製されたＧａｌ１３の活性を示すＥＬＩＳＡの図である。
【図３】図３は、ヒト成長ホルモン発現構築物を表す。その天然の分泌シグナル配列を欠くヒト成長ホルモンのアミノ酸配列をＡに示す。シュードモナス・フルオレッセンスにおける発現のためのプラスミド構築物（ｐＤＯＷ２４００）およびエシェリキア・コリのそれ（４１２−００１．ｈＧＨ）をＢに示す。
【図４】図４は、シュードモナス・フルオレッセンスおよびエシェリキア・コリで発現したｈＧＨの可溶性および不溶性画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の図である。誘導後の時間を、Ｉ０、Ｉ２４、Ｉ４８、０または３で示す。大きな矢印は、２１ｋＤａのｈＧＨタンパク質の位置を示す。
【図５】図５は、エシェリキア・コリ細胞対シュードモナス・フルオレッセンス細胞におけるγ−ＩＦＮの発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。誘導から０、３、２４および４８時間後に取り出した（Ｉ０など）サンプルの可溶性画分（Ｓ）および不溶性画分（Ｉ）を溶解させた。γ−ＩＦＮを発現したエシェリキア・コリをパネルＡに、γ−ＩＦＮを発現したシュードモナス・フルオレッセンスをパネルＢに示す。５μＬのＡ５７５−２０サンプルを１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル上に負荷し、１Ｘ  ＭＥＳで溶解させた。矢印は、組み換え型タンパク質の位置を示す。ウエスタン分析を、パネルＣ（エシェリキア・コリ）およびＤ（シュードモナス・フルオレッセンス）に示す。
【図６】図６は、ｐＭＹＣ１８０３のＳｐｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位において、ＢＧＩ遺伝子でＢｕｉＢｕｉ毒素遺伝子を置換することを示す。
【図７】図７は、挿入されたＤＮＡの配列を決定して検証したように、選択されたすべての形質転換体が所望のインターフェロン挿入物を有したことを示す。
【図８】図８は、リン酸結合タンパク質−ｇａｌ２一本鎖抗体融合体タンパク質についてのヌクレオチド配列を表す。
【図９】図９は、リン酸結合タンパク質−ｇａｌ２一本鎖抗体融合体タンパク質についてのアミノ酸配列を表す。
【図１０】図１０は、リン酸結合タンパク質−ヒト成長ホルモン融合体タンパク質についてのヌクレオチド配列を表す。
【図１１】図１１は、リン酸結合タンパク質−ヒト成長ホルモン融合体タンパク質についてのアミノ酸配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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