(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中に存在しうるターゲット分子を検出するための方法であって：
（ａ）第一のタグと少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティを有するアプタマーと、試験試料を接触させることによって、混合物を調製し、ここで、前記試験試料中に前記ターゲット分子が存在するならば、アプタマー・アフィニティ複合体が形成され；
（ｂ）第一の捕捉要素を含む第一の固体支持体に混合物を曝露し、そして第一のタグが第一の捕捉要素と会合するのを可能にし；
（ｃ）前記の第一の固体支持体と会合していない混合物の構成要素をすべて除去し；
（ｄ）前記の第一の固体支持体からアプタマー・アフィニティ複合体を遊離させ；
（ｅ）アプタマー・アフィニティ複合体中の前記ターゲット分子に第二のタグを付着させ；
（ｆ）遊離したアプタマー・アフィニティ複合体を、第二の捕捉要素を含む第二の固体支持体に曝露し、そして第二のタグが前記の第二の捕捉要素と会合するのを可能にし；
（ｇ）前記アプタマー・アフィニティ複合体から，複合体化されていないアプタマーを分配することによって、複合体化されていないアプタマーを前記混合物からすべて除去し；そして
（ｈ）前記アプタマー・アフィニティ複合体からアプタマーを解離し、次いで前記アプタマー・アフィニティ複合体のアプタマー部分を検出することによって、前記ターゲット分子を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２】
ａ．第一のタグが第二のタグと同じであり、そして第二のタグが（ｂ）の後および（ｆ）の前の任意の時点でターゲット分子に添加され、そして第二のタグの添加前に第一の捕捉剤をブロッキングする工程を含む、または  ｂ．第一のタグが第二のタグと異なり、そして第二のタグが（ｆ）の前の任意の時点でターゲット分子に添加される、
請求項１の方法。
【請求項３】
（ａ）の後および（ｄ）の前の任意の時点で動力学的負荷を導入する工程をさらに含み、ここで前記動力学的負荷が、アプタマー・アフィニティ複合体を含有する混合物を希釈し、及び／又はアプタマー・アフィニティ複合体を含有する混合物に競合剤を添加し、そして以下のいずれかの時間：
ａ．約３０秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、５分間以上、１０分間以上、３０分間以上、および６０分間以上からなる群より選択される時間；または
ｂ．非特異的複合体の測定レベルに対するアプタマー・アフィニティ複合体の測定レベルの比が増加するような時間；
に渡って、アプタマー・アフィニティ複合体を含有する混合物をインキュベーションする工程を含む、請求項１の方法。
【請求項４】
（ａ）の後および（ｄ）の前の任意の時点で動力学的負荷を導入する工程をさらに含み、動力学的負荷が、競合剤分子の導入を含み、そして前記競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、硫酸デキストラン、ポリアニオン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロホスフェートからなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項５】
前記アプタマー・アフィニティ複合体が緩慢な解離速度を有する、請求項１の方法。
【請求項６】
前記アプタマー・アフィニティ複合体の解離速度（ｔ１／２）が、
ａ．約３０分間以上である；
ｂ．約３０分間〜約２４０分間の間である；またはｃ．約３０分間以上、約６０分間以上、約９０分間以上、約１２０分間以上、約１５０分間以上、約１８０分間以上、約２１０分間以上、および約２４０分間以上からなる群より選択される、
請求項５の方法。
【請求項７】
Ｑ−ＰＣＲ、ＭＳ、およびハイブリダイゼーションからなる群より選択される方法を用いて、前記アプタマーを検出し、そして場合によって定量化する、請求項１の方法。
【請求項８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ、ＰＣＲプロセス中の挿入蛍光色素、またはＰＣＲプロセス中の分子ビーコンを用いて前記Ｑ−ＰＣＲを行う、請求項７の方法。
【請求項９】
アプタマーに検出可能部分を添加する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項１０】
前記検出可能部分が、色素、量子ドット、放射標識、電気化学官能基、酵素、および酵素基質からなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
ａ．前記色素が蛍光色素である、または  
ｂ．前記酵素がアルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼである、
請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記アプタマーが一本鎖核酸または二本鎖核酸である、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記アプタマーがＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡ両方を含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、
ａ．リボース位、デオキシリボース位、リン酸位、および塩基位から独立に選択される１以上の位での化学的置換である、または
ｂ．図（１６）に列挙される群より独立に選択される、
請求項１の方法。
【請求項１５】
前記ターゲット分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子および組織からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記ターゲット分子がタンパク質またはペプチドである、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記試験試料が、
ａ．生物学的試料、環境試料、化学試料、薬学的試料、食品試料、農業試料、および獣医学的試料からなる群より選択される、
ｂ．全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、血清、痰、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、糞便、組織、組織抽出物、組織生検、および脳脊髄液からなる群より選択される生物学的試料である、または
ｃ．血漿または血清である、
請求項１の方法。
【請求項１８】
ａ．前記の第一のタグおよび前記の第二のタグが各々、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、アビジン、ストレプアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ、ニュートラアビジン、金属、ヒスチジン、および任意のこれらの構造の任意の部分からなる群より独立に選択される、少なくとも１つの構成要素を含む、  ｂ．前記の第一の捕捉要素および前記の第二の捕捉要素が各々、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、アビジン、ストレプアビジン、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ、ニュートラアビジン、金属、ヒスチジン、および任意のこれらの構造の任意の部分から独立に選択される、少なくとも１つの構成要素を含む、
ｃ．前記の第一の固体支持体および第二の固体支持体が各々、ポリマービーズ、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、制御孔ビーズ、マイクロタイターウェル、シクロオレフィン・コポリマー支持体、膜、プラスチック支持体、ナイロン、ラングミュア−ボジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）膜、ガラス、ゲルマニウム支持体、シリコン支持体、シリコンウェハーチップ、フロースルーチップ、マイクロビーズ、ポリテトラフルオロエチレン支持体、ポリスチレン支持体、ガリウムヒ素支持体、金支持体、および銀支持体からなる群より独立に選択される、
請求項１の方法。
【請求項１９】
前記アプタマーを定量化することによって、前記ターゲットを定量化する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２０】
アプタマーの検出が、第三の固体支持体にアプタマーをハイブリダイズさせる工程を含み、ここで第三の固体支持体が、複数のアドレス可能特徴を含み、そして前記特徴の少なくとも１つが、アプタマー内に含有される任意の配列に相補的である、該特徴上に配置された捕捉要素を少なくとも含む、請求項１の方法。
【請求項２１】
試料中のターゲット分子の存在を検出するかまたは該分子の量を決定する方法であって：
（ｉ）ターゲット分子に複数のアプタマーを提供し、ここでアプタマーは切断可能捕捉タグと少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み；
（ｉｉ）ターゲット分子を含有する試料と、アプタマーを接触させて、アプタマー−ターゲット分子複合体を含有する混合物を形成し；
（ｉｉｉ）支持体表面に付着したプローブを有する固体支持体を提供し、ここでプローブは切断可能捕捉タグに結合可能であり；
（ｉｖ）アプタマー−ターゲット分子複合体が、切断可能捕捉タグおよびプローブの結合を通じて支持体に結合されるように、固体支持体と混合物を接触させ；
（ｖ）固体支持体に結合したアプタマー−ターゲット分子複合体を、混合物の残りから分配し；
（ｖｉ）アプタマー−ターゲット分子複合体のターゲット分子構成要素に、第二の捕捉タグを導入し；
（ｖｉｉ）切断可能捕捉タグを切断することによって、固体支持体表面からアプタマー−ターゲット分子複合体を解離させ；
（ｖｉｉｉ）支持体表面に付着したプローブを有する固体支持体を提供し、ここでプローブはターゲット分子上の第二の捕捉タグに結合可能であり；
（ｉｘ）アプタマー−ターゲット分子複合体が、第二の捕捉タグおよびプローブの結合を通じて支持体に結合されるように、（ｖｉｉｉ）由来の固体支持体と、解離したアプタマー−ターゲット分子を接触させ；
（ｘ）アプタマー−ターゲット分子複合体を解離させて、未結合（ｆｒｅｅ）アプタマーおよび支持体に結合したターゲット分子を生じ；
（ｘｉ）未結合アプタマーを検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
固体支持体表面からのアプタマー−ターゲット分子複合体解離後（ｖｉｉ）、解離したアプタマー−ターゲット分子複合体を、
ａ．過剰な競合剤分子と接触させる、及び／又は
ｂ．希釈する、
請求項２１の方法。
【請求項２３】
検出される未結合アプタマーの量を測定する工程をさらに含む、請求項２１または２２の方法。
【請求項２４】
ａ）関心対象の１以上のターゲットに特異的な少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む１以上のアプタマーであって、ここで１以上のアプタマーは第一のタグを含む；および
ｂ）１以上の固体支持体；および
ｃ）アフィニティ複合体からのアプタマーの遊離のための１以上の試薬であって、ここで１以上の試薬は高塩緩衝液、酸および塩基からなる群から選択される
を含む、キット。
【請求項２５】
ａ．関心対象の１以上のターゲットを誘導体化するための試薬、
ｂ．前記の１以上のアプタマーにおいて、切断可能部分を切断する試薬、
ｃ．動力学的負荷において使用するための試薬であって、ここで試薬は競合剤分子を含み、そして前記競合剤分子が、オリゴヌクレオチド、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、硫酸デキストラン、ポリアニオン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロホスフェートからなる群より選択される
のいずれかをさらに含む、請求項２４のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
［０００１］本出願は、２００７年７月１７日出願の米国仮出願第６０／９５０，２８１号、２００７年７月１７日出願の米国仮出願第６０／９５０，２９３号、２００７年７月１７日出願の米国仮出願第６０／９５０，２８３号、２００８年２月２６日出願の米国仮出願第６１／０３１，４２０号、および２００８年５月８日出願の米国仮出願第６１／０５１，５９４号の優先権を請求する。本出願はまた、各々、２００７年１月１６日出願の米国出願第１１／６２３，５８０号および米国出願第１１／６２３，５３５号の一部継続出願でもある。これらの参考文献は各々、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
［０００２］本発明は、一般的に、試料中のターゲット分子の検出のための方法、デバイス、試薬、およびキットに、そしてより具体的には、試験試料中に含有されうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化に関する。こうした方法は、診断適用において、ならびにバイオマーカー発見、ならびに療法剤の設計および開発において、広い有用性を有する。
【背景技術】
【０００３】
［０００３］以下の説明は、本開示に関連する情報の要約を提供し、そして本明細書に提供する情報または引用する刊行物のいずれかが、ここに請求する発明に対する先行技術であることの容認ではない。
【０００４】
［０００４］生物学的試料および他の試料中の生理学的に重要な分子の検出および定量化に向けられるアッセイは、科学的研究において、そして健康管理分野において重要なツールである。こうしたアッセイの１つのクラスは、固体支持体上に固定された１以上のアプタマーを含むマイクロアレイの使用を伴う。アプタマーは、各々、非常に特異的な方式でそして非常に高いアフィニティで、ターゲット分子に結合可能である。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい；また、例えば、米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、および米国特許第６，５０３，７１５号、各々、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ」を参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させると、アプタマーが、試料中に存在するそれぞれのターゲット分子に結合し、そしてそれによって、試料中のターゲット分子の非存在、存在、量、および／または濃度の決定が可能になる。
【０００５】
［０００５］このアッセイの変形は、アプタマーが、そのターゲット分子と共有結合するか、または「光架橋する」のを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを使用する。例えば、米国特許第６，５４４，７７６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ」を参照されたい。これらの光反応性アプタマーはまた、光アプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）とも称される。例えば、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および米国特許第６，２９１，１８４号、各々、表題「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ」を参照されたい；また、例えば、米国特許第６，４５８，５３９号、表題「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」も参照されたい。マイクロアレイを試料と接触させ、そして光アプタマーがそのターゲット分子と結合する機会を得た後、光アプタマーを光活性化し、そして固体支持体を洗浄して、いかなる非特異的結合分子も除去する。光アプタマーに結合したターゲット分子は、光アプタマー上の光活性化された官能基（単数または複数）によって生成される共有結合のために、一般的に、除去されないため、激しい洗浄条件を用いてもよい。この方式で、該アッセイは、試験試料中のターゲット分子の非存在、存在、量、および／または濃度の決定を可能にする。
【０００６】
［０００６］これらのアッセイ形式のどちらでも、試料と接触させる前に、アプタマーを固体支持体上に固定する。しかし、特定の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーの固定は、最適なアッセイを提供しない可能性もある。例えば、アプタマーをあらかじめ固定した結果、固体支持体表面上で、ターゲット分子とアプタマーが不十分にしか混合されず、これがおそらく長時間の反応時間につながり、そしてしたがって、ターゲット分子に対するアプタマーの十分な結合を可能にするためには、長時間のインキュベーション期間を要することになる可能性もある。さらに、光アプタマーをアッセイ中に使用すると、そして固体支持体として利用する物質に応じて、固体支持体は、光アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合の形成を達成するのに用いられる光を散乱させるかまたは吸収する傾向がありうる。さらに、固体支持体表面もまた、用いるいかなる標識化剤にも曝露され、そしてこれらに影響を受ける可能性もあるため、使用する方法に応じて、アプタマーに結合したターゲット分子の検出は、不正確になりやすい可能性もある。最後に、固体支持体上のアプタマーの固定は、一般的に、試料へのアプタマーの曝露前に、アプタマー調製工程（すなわち固定）を伴い、そしてこの調製工程は、アプタマーの活性または官能性に影響を及ぼしうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，４７５，０９６号
【特許文献２】米国特許第６，２４２，２４６号
【特許文献３】米国特許第６，４５８，５４３号
【特許文献４】米国特許第６，５０３，７１５号
【特許文献５】米国特許第６，５４４，７７６号
【特許文献６】米国特許第５，７６３，１７７号
【特許文献７】米国特許第６，００１，５７７号
【特許文献８】米国特許第６，２９１，１８４号
【特許文献９】米国特許第６，４５８，５３９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
［０００７］したがって、以下の１以上：（１）アプタマーの活性、（２）アプタマー−ターゲット分子複合体に関する結合平衡を達成する効率、（３）アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合（単数または複数）の形成、（４）無関係な試料構成要素および過剰なアプタマーの除去、（５）遅い解離速度のアプタマーの使用を通じて形成されるアフィニティ複合体の解離、ならびに（６）アプタマー−ターゲット分子複合体の検出に影響を及ぼす条件を最適化することによって、試験試料中のターゲット分子の検出および／または定量化のための高感度アッセイを提供する方法、デバイス、試薬、およびキットに関する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
［０００８］本開示には、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための方法、デバイス、試薬、およびキットが含まれる。より具体的には、本開示は、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）から、未結合ターゲットおよび未結合アプタマー両方を除去し、それによってアッセイにおいて、ノイズの潜在的な供給源を除去することによる、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）の精製法を開示する。本開示はまた、ターゲット分子の定量化のためのアプタマーおよび光アプタマーに基づくアッセイであって、任意の適切な核酸検出法を用いた最終検出のため、アプタマー（または光アプタマー）がアプタマー・アフィニティ複合体（または光アプタマー共有複合体）から分離可能である、前記アッセイも提供する。本開示はまた、アプタマー・アフィニティ複合体（または光アプタマー共有複合体）からのアッセイ構成要素の分離を促進し、そして検出および／または定量化のため、アプタマーの単離を可能にする、アプタマー構築物も記載する。本開示はまた、ターゲットからの解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が遅く、そして結合効率が改善されたアプタマーを使用することによって、感度および特異性の改善を提供する、方法、デバイス、キット、および試薬も記載する。本開示はまた、試験試料中の多数のターゲットを同時に検出し、そして／または定量化することも可能な、試験試料の多重化分析のための方法、デバイス、キット、および試薬も提供する。最終的に、これらの方法および試薬は、ターゲット濃度（例えば試験試料中のタンパク質ターゲット濃度）を、非常に多様な核酸検出および定量化法のいずれかによって検出しそして定量化することも可能な核酸濃度に変換することを可能にする。さらに、ターゲット濃度が、対応する核酸濃度に有効に変換されたならば、次いで、標準的な核酸増幅および検出工程を使用してシグナルを増加させることも可能である。最後に、本開示は、試験試料の多重化分析法を提供する。本開示にしたがった方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実行可能である。
【００１０】
［０００９］単回捕獲アフィニティアッセイ。１つの態様において、ターゲット分子に対する特異的アフィニティを有するアプタマーと試験試料を接触させる。試験試料がターゲット分子を含有するならば、試験試料中でアプタマー・アフィニティ複合体が形成されるであろう。１つの態様において、アプタマー・アフィニティ複合体のターゲット分子にタグを付着させる。（タグがアプタマー・アフィニティ複合体を破壊しない方式でターゲットに付着可能であるように、タグを設計することに注目されたい。）別の態様において、アプタマー・アフィニティ複合体の形成前に、タグをターゲットに付着させる。次に、タグ化アプタマー・アフィニティ複合体を固体支持体上に捕捉する。アプタマー・アフィニティ複合体と固体支持体を接触させ、そしてタグが、直接または間接的にのいずれかで、固体支持体に付着している適切な捕捉剤と会合するのを可能にすることによって、付着が達成される。固体支持体上の捕捉剤と会合しているアプタマー・アフィニティ複合体を試験試料混合物の残りから分配し、それによって未結合アプタマーをすべて除去する。アプタマー・アフィニティ複合体の解離によって、アプタマー・アフィニティ複合体中のターゲットと複合体化しているアプタマーを固体支持体から遊離させてもよい。最後に、限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、核酸チップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な核酸検出法のいずれかを用いて、遊離したアプタマーを検出し、そして／または定量化してもよい。いくつかの態様において、用いる特定の核酸検出法に応じて、なおアプタマー・アフィニティ複合体の一部のままで、アプタマーを検出してもよい。
【００１１】
［００１０］二重捕獲アフィニティアッセイ。別の態様において、遊離可能な第一のタグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティを有するアプタマーと、試験試料を接触させる。試験試料がターゲット分子を含有するならば、試験試料中でアプタマー・アフィニティ複合体が形成されるであろう。アプタマー・アフィニティ複合体が第一の固体支持体上に捕捉される。アプタマー・アフィニティ複合体と第一の固体支持体を接触させ、そしてアプタマー上に含まれる遊離可能な第一のタグが、直接または間接的にのいずれかで、第一の固体支持体に付着している適切な第一の捕捉剤と会合するのを可能にすることによって、付着が達成される。アプタマー・アフィニティ複合体に加えて、複合体化されていないアプタマーもまた、第一の固体支持体に付着するであろうことに注目されたい。次いで、固体支持体上のプローブと会合したアプタマー・アフィニティ複合体および複合体化されていないアプタマーを混合物の残りから分配し、それによって未結合ターゲットおよび試験試料中のすべての他の複合体化されていない物質を除去する。分配後、使用されている特定の遊離可能な第一のタグに適した方法を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（複合体化されていないアプタマーすべてとともに）を第一の固体支持体から遊離させる。第二のタグ（遊離可能な第一のタグと同じであってもまたは異なっていてもよい）をアプタマー・アフィニティ複合体のターゲット分子に付着させる。（第二のタグがアプタマー・アフィニティ複合体を破壊しない方式でターゲットに付着可能であるように、第二のタグを設計することに注目されたい。）第二のタグが、直接または間接的にのいずれかで、第二の固体支持体に付着している適切な第二の捕捉剤と会合するのを可能にすることによって、第二の固体支持体上にアプタマー・アフィニティ複合体が捕捉される。固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティ複合体を混合物の残りから分配し、それによって未結合アプタマーをすべて除去する。アプタマー・アフィニティ複合体の解離によって、アプタマー・アフィニティ複合体中のターゲットと複合体化しているアプタマーを固体支持体から遊離させてもよい。最後に、限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、ＤＮＡチップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な核酸法のいずれかを用いて、アプタマー・アフィニティ複合体から遊離したアプタマーを検出し、そして／または定量化してもよい。いくつかの態様において、アプタマー・アフィニティ複合体がなお第一の固体支持体に固定されているままで、ターゲットを第二のタグと反応させてもよい。分配工程後に第二のタグを添加すると、アプタマー・アフィニティ複合体の一部でないターゲット分子の標識化が排除される。いくつかの態様において、核酸検出法を用いる場合、なおアプタマー・アフィニティ複合体の一部のままで、アプタマーを検出してもよい。
【００１２】
［００１１］単回捕獲光架橋アッセイ。別の態様において（「基本単回捕獲光架橋アッセイ」）、ターゲット分子に対する特異的アフィニティを有する光アプタマーと試験試料を接触させる。試験試料がターゲット分子を含有するならば、試験試料中で光アプタマー・アフィニティ複合体が形成されるであろう。光架橋基の適切な励起によって、アプタマー・アフィニティ複合体をアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー共有複合体のターゲット分子にタグを付着させる。（タグがアプタマー共有複合体を破壊しない方式でターゲットに付着可能であるように、タグを設計することに注目されたい。）アプタマー共有複合体を固体支持体上に捕捉する。アプタマー共有複合体と固体支持体を接触させ、そしてタグが、直接または間接的にのいずれかで、固体支持体に付着している適切な捕捉剤と会合するのを可能にすることによって、付着が達成される。固体支持体上の捕捉剤と会合しているアプタマー共有複合体を試験試料混合物の残りから分配し、それによって未結合光アプタマーをすべて除去する。限定されるわけではないが、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な方法のいずれかを用いて、アプタマー共有複合体の一部である光アプタマーを、検出し、そして／または定量化してもよい（なお固体支持体に付着したままで）。
【００１３】
［００１２］別の態様において、光アプタマーの検出前に、例えばポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅工程を用いて、固体支持体に結合しているアプタマー共有複合体の一部である１以上のコピーの光アプタマーを生成するように、上述の単回捕獲光架橋アッセイを修飾する。次いで、光アプタマーのこれらのコピーを遊離させて、そして続いて、限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、ＤＮＡチップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な方法のいずれかを用いて、検出し、そして／または定量化してもよい。
【００１４】
［００１３］単回捕獲光架橋アッセイの別の態様において、切断可能リンカーを介して、光アプタマーの光架橋基をアプタマーに付着させる。１つの態様において、この切断可能リンカーは光切断可能リンカーであるが、アッセイにおける任意の所望の時点で切断されて、タグからターゲット分子を遊離させることが可能な、化学的切断可能リンカーまたは任意の他の切断可能リンカーであってもよい。この態様において、光アプタマーの検出前に、切断可能リンカーを用いて、固体支持体に結合している光アプタマー共有複合体から光アプタマーを遊離させるように、上述の基本単回捕獲光架橋アッセイを修飾する。限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、ＤＮＡチップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な方法のいずれかを用いて、遊離したアプタマーを、検出し、そして／または定量化してもよい。
【００１５】
［００１４］単回捕獲光架橋アッセイのさらに別の態様において、切断可能リンカーを介して、ターゲット分子に付着するタグを付着させる。１つの態様において、この切断可能リンカーは光切断可能リンカーである。このアッセイの他の態様において、アッセイにおける任意の所望の時点で切断されて、タグからターゲット分子を遊離させることが可能な、化学的切断可能リンカーまたは任意の他の適切な切断可能リンカーを介して、タグが付着する。この態様において、光アプタマーの検出前に、切断可能リンカーを用いて、固体支持体からアプタマー共有複合体を遊離させるように、上述の単回捕獲光架橋アッセイを修飾する。限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、ＤＮＡチップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な方法のいずれかを用いて、遊離したアプタマー共有複合体を、検出し、そして／または定量化してもよい。
【００１６】
［００１５］二重捕獲光架橋アッセイ。別の態様において（「基本二重捕獲光架橋アッセイ」）、第一の遊離可能タグを含有し、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティを有する光アプタマーと、試験試料を接触させる。試験試料がターゲット分子を含有するならば、試験試料中で光アプタマー・アフィニティ複合体が形成されるであろう。光架橋基の適切な励起によって、光アプタマー・アフィニティ複合体をアプタマー共有複合体に変換する。アプタマー共有複合体が第一の固体支持体上に捕捉される。アプタマー共有複合体と第一の固体支持体を接触させ、そして光アプタマー上に含まれる遊離可能な第一のタグが、直接または間接的にのいずれかで、第一の固体支持体に付着している適切な第一の捕捉剤と会合するのを可能にすることによって、付着が達成される。光アプタマー共有複合体に加えて、複合体化されていない光アプタマーもまた、固体支持体に付着してもよいことに注目されたい。固体支持体上のプローブと会合したアプタマー共有複合体および複合体化されていないアプタマーを混合物の残りから分配し、それによって未結合ターゲットおよび試験試料中のすべての他の複合体化されていない物質を除去する。分配後、使用されている特定の遊離可能な第一のタグに適した方法を用いて、光アプタマー共有複合体（複合体化されていない光アプタマーすべてとともに）を固体支持体から遊離させる。第二のタグをアプタマー共有複合体のターゲット分子に付着させる。（第二のタグがアプタマー共有複合体を破壊しない方式でターゲットに付着可能であるように、第二のタグを設計することに注目されたい。）第二の固体支持体上にアプタマー共有複合体が捕捉される。アプタマー共有複合体と第二の固体支持体を接触させ、そして第二のタグが、直接または間接的にのいずれかで、第二の固体支持体に付着している適切な第二の捕捉剤と会合するのを可能にすることによって、付着が達成される。固体支持体上の第二の捕捉剤と会合しているアプタマー共有複合体を混合物の残りから分配し、それによって未結合光アプタマーをすべて除去する。限定されるわけではないが、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な方法のいずれかを用いて、アプタマー共有複合体の一部である光アプタマーを検出し、そして／または定量化してもよい（なお固体支持体に付着したままで）。
【００１７】
［００１６］別の態様において、検出前に、例えばポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅工程を用いて、固体支持体に結合しているアプタマー共有複合体の一部である１以上のコピーの光アプタマーを生成するように、上述の二重捕獲光架橋アッセイを修飾する。光アプタマーのこれらのコピーを遊離させて、そして続いて、限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、ＤＮＡチップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な方法のいずれかを用いて、検出し、そして／または定量化してもよい。
【００１８】
［００１７］別の態様において、切断可能リンカーを介して、光アプタマーの光架橋基をアプタマーに付着させるように、上述の二重捕獲光架橋アッセイを修飾する。１つの態様において、この切断可能リンカーは光切断可能リンカーである。このアッセイの他の態様において、光アプタマーの光架橋基は、アッセイにおける任意の所望の時点で切断されて、光アプタマー共有複合体から光架橋基を遊離させることが可能な、化学的切断可能リンカーまたは任意の他の適切な切断可能リンカーを介して、アプタマーに付着する。この態様において、光アプタマーの検出前に、切断可能リンカーを用いて、固体支持体に結合している光アプタマー共有複合体から光アプタマーを遊離させるように、上述の二重捕獲光架橋アッセイを修飾する。限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、ＤＮＡチップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な方法のいずれかを用いて、遊離した光アプタマーを、検出し、そして／または定量化してもよい。
【００１９】
［００１８］二重捕獲光架橋アッセイのさらに別の態様において、切断可能リンカーを介して、ターゲット分子に付着するタグを付着させる。１つの態様において、この切断可能リンカーは光切断可能リンカーである。このアッセイの他の態様において、アッセイにおける任意の所望の時点で切断されて、タグからターゲット分子を遊離させることが可能な、化学的切断可能リンカーまたは任意の他の適切な切断可能リンカーを介して、タグが付着する。この態様において、光アプタマーの検出前に、切断可能リンカーを用いて、固体支持体から光アプタマー共有複合体を遊離させるように、上述の二重捕獲光架橋アッセイを修飾する。限定されるわけではないが、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ法、ＤＮＡチップ、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）等を含む、多様な適切な方法のいずれかを用いて、遊離した光アプタマー共有複合体を、検出し、そして／または定量化してもよい。
【００２０】
［００１９］動力学的負荷。別の態様において、動力学的負荷を用いて、本明細書に開示するアッセイの特異性および感度を増加させてもよい。各々、２００７年１月１６日に出願され、そしてどちらの内容もその全体が本明細書に援用される、米国出願第１１／６２３，５８０号および米国出願第１１／６２３，５３５号に最初に記載された、動力学的負荷は、非特異的複合体に比較して比較的長い、特異的アプタマーターゲット複合体の解離速度を用いて、特定のアッセイの特異性の増加を提供する。さらに、本明細書にその全体が援用される、２００８年７月１７日出願の米国出願第１２／１７５，４３４号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」は、ＳＥＬＥＸプロセス中に遅い解離速度の濃縮プロセスを使用することによって、そして／または特定の修飾ヌクレオチドを用いることによって、遅い解離速度のアプタマーが同定可能であることを開示する（本明細書にその全体が援用される、２００８年７月１７日出願の米国出願第１２／１７５，３８８号、表題「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰｈｏｔｏＳＥＬＥＸ」を参照されたい）。
【００２１】
［００２０］動力学的負荷の取り込みによって、上述のアッセイ（単回捕獲アフィニティアッセイ、二重捕獲アフィニティアッセイ、単回捕獲光架橋アッセイ、および二重捕獲光架橋アッセイ）を各々、改善してもよい。例示のみの目的のため、以下は、二重捕獲アフィニティアッセイおよび二重捕獲光架橋アッセイの選択された態様に、どのように動力学的負荷を付加することが可能であるかを記載する。類似の方式で、本明細書記載の任意の他のアッセイおよび方法に、動力学的負荷を付加してもよいことを理解すべきである。本明細書記載の多様な態様に示される箇所（工程）に加えて、記載する任意のアッセイおよび方法の任意の適切な時点で、動力学的負荷を付加してもよいことをさらに理解すべきである。
【００２２】
［００２１］１つの態様において、二重捕捉アフィニティアッセイ内で、第一の固体支持体上のプローブと会合しているアプタマー・アフィニティ複合体および複合体化されていないアプタマーを混合物の残りから分配する工程の後、ならびにアプタマー・アフィニティ複合体中のアプタマーを遊離させるかあるいは直接検出するかまたは定量化する工程の前に、動力学的負荷を挿入する。１つの態様において、アプタマー・アフィニティ複合体を第一の固体支持体から遊離させた後、動力学的負荷を実行する。この態様において、アプタマー・アフィニティ複合体を、高濃度の競合剤を含有する緩衝液内に遊離させ、そして続いて、アプタマー・アフィニティ複合体の解離半減期以下の時間に渡って、競合剤溶液中でアプタマー・アフィニティ複合体をインキュベーションすることによって、動力学的負荷を実行する。
【００２３】
［００２２］別の態様において、二重捕捉光架橋アッセイ内で、アプタマー・アフィニティ複合体形成後および架橋工程前に、動力学的負荷を挿入する。１つの態様において、アプタマー・アフィニティ複合体を含有する混合物に競合剤を添加し、そして続いて、アプタマー・アフィニティ複合体の解離半減期以下の時間に渡って、競合剤溶液中でアプタマー・アフィニティ複合体をインキュベーションすることによって、動力学的負荷を実行する。
【００２４】
［００２３］検出および定量化法。上述のように、質量分析、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、ＤＮＡチップ、定量的ＰＣＲ法等を含む、いくつかの異なる核酸検出技術を使用することによって、アプタマー・アフィニティ複合体（または光架橋アッセイの場合、アプタマー共有複合体）を検出することが可能である。
【００２５】
［００２４］１つの態様において、ＤＮＡチップを用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。本態様において、固体支持体に会合したアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を溶出させ、そしてＤＮＡチップ上にプリントされている相補的プローブ配列にハイブリダイズさせる。１つの態様において、相補的プローブ配列は、アプタマー全体に相補的である。別の態様において、相補的プローブ配列は、アプタマーの部分にのみ相補的である。別の態様において、プローブは、ハイブリダイゼーションの目的のためにアプタマーに付加された配列に相補的である。ＤＮＡチップ上のハイブリダイズしたアプタマー（または光アプタマー）を検出するため、標識を導入してもよい。１つの態様において、アプタマー（または光アプタマー）を合成する時点で、標識がアプタマー内に取り込まれる。例えば、化学的に（または酵素的に）合成されたアプタマー内に、蛍光色素を取り込んでもよい。１つの態様において、アプタマーの合成中に、標識をアプタマーに添加する。他の態様において、アッセイ前、アッセイ中またはアッセイ後の任意の時点で、標識をアプタマーに添加する。別の態様において、ＰＣＲなどの核酸増幅技術を用いて、アプタマー（または光アプタマー）集団を増幅してもよい。この場合、また、増幅工程の一部として標識を取り込んでもよい。
【００２６】
［００２５］別の態様において、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。この態様において、固体支持体と会合しているアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を溶出させ、そしてターゲット分子を同定し、そしてしたがって検出するのに使用可能なピークのスペクトルを生じる質量分析を用いて分析する。ターゲット分子が検出されたならば、場合によって、これをまた、任意の適切な技術によって定量化してもよい。１つの態様において、ターゲット分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、質量分析を用いてアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を分析する前に、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を、例えばプロテイナーゼＫまたはトリプシンなどのプロテアーゼ酵素で消化して、結合したターゲット分子の断片を産生して、これを用いてターゲット分子を同定し、そしてそれによってターゲット分子の検出および場合による定量化を可能にしてもよい。
【００２７】
［００２６］別の態様において、Ｑ−ＰＣＲを用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。上述のように、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を固体支持体に付着させたまま、または固体支持体から遊離させた後のいずれかで、これを行ってもよい。ＰＣＲを行い、そして試験試料中のターゲット分子に結合しているアプタマーの量または濃度を直接または間接的にのいずれかで決定することによって、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を定量化する。試験試料中のターゲット分子の量または濃度は、一般的に、Ｑ−ＰＣＲを用いることによって定量化されるアプタマーの量または濃度に正比例する。この方式でアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を定量化するために使用可能な例示的な方法は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  カリフォルニア州フォスターシティ；米国特許第５，２１０，０１５号も参照されたい）である。
【００２８】
［００２７］別の態様において、場合によって、検出および／または定量化の前に、対応するターゲット分子からアプタマーを解離させる。核酸の検出および／または定量化に適した任意の既知の方法を用いて、未結合アプタマーを検出しそして測定してもよい。
【００２９】
［００２８］多重化アッセイ。別の態様において、上述のアッセイおよび方法を用いて、２以上のターゲットを検出し、そして／または定量化する。１つの態様において、二重捕捉アフィニティアッセイにおいて、多数のアプタマーを用いて、多数のターゲットを定量化し、そして／または検出する。アプタマー・アフィニティ複合体からのアプタマーの最終的な遊離後、次いで、核酸の多重化検出に適した方法を用いて、各アプタマーを検出してもよい。１つの方法において、多重化ＤＮＡチップを用いて、アプタマーを検出し、そして／または定量化する。本明細書に開示するアッセイのいずれかを多重化方式で実行して、多数のターゲットを検出してもよい。多重化のスケールに本質的な制限はないため、これらの多重化アッセイを用いて、例えば２以上のターゲット、１０以上のターゲット、２５以上のターゲット、５０以上のターゲット、１００以上のターゲット、２５０以上のターゲット、５００以上のターゲット、または１０００以上のターゲットを検出してもよい。
【００３０】
［００２９］試薬およびキット。１つの態様において、本明細書開示の方法に基づいて、限定なしに、診断キット、バイオマーカー発見キット、環境試験キット、バイオハザードまたは生物兵器検出キット、ならびに生命科学および分析化学適用におけるターゲットを検出するためのキットを含む、多様な検出適用のためのキットを調製してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】［００３０］図１Ａおよび１Ｂは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための例示的な方法を例示する。
【図１Ｂ】［００３０］図１Ａおよび１Ｂは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための例示的な方法を例示する。
【図２Ａ】［００３１］図２Ａおよび２Ｂは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための例示的な方法を例示する。
【図２Ｂ】［００３１］図２Ａおよび２Ｂは、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための例示的な方法を例示する。
【図３−１】［００３２］図３Ａ〜Ｌは、本明細書記載のアッセイで使用するための例示的なアプタマー構築物を例示する。
【図３−２】［００３２］図３Ａ〜Ｌは、本明細書記載のアッセイで使用するための例示的なアプタマー構築物を例示する。
【図３−３】［００３２］図３Ａ〜Ｌは、本明細書記載のアッセイで使用するための例示的なアプタマー構築物を例示する。
【図４−１】［００３３］図４は、アプタマーが産生されている５００を超えるターゲットのリストを提示する。これらのアプタマーの多くは、それぞれのターゲットからの遅い解離速度を有するように設計されてきている。
【図４−２】［００３３］図４は、アプタマーが産生されている５００を超えるターゲットのリストを提示する。これらのアプタマーの多くは、それぞれのターゲットからの遅い解離速度を有するように設計されてきている。
【図５Ａ】［００３４］図５Ａは、ハイブリダイゼーションタグの例を例示する。図５Ｂ〜５Ｄは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を例示する。
【図５Ｂ】［００３４］図５Ａは、ハイブリダイゼーションタグの例を例示する。図５Ｂ〜５Ｄは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を例示する。
【図５Ｃ】［００３４］図５Ａは、ハイブリダイゼーションタグの例を例示する。図５Ｂ〜５Ｄは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を例示する。
【図５Ｄ】［００３４］図５Ａは、ハイブリダイゼーションタグの例を例示する。図５Ｂ〜５Ｄは、切断可能または遊離可能要素、タグ（例えばビオチン）、スペーサー、および標識（例えばＣｙ３）を含むアプタマー構築物の例を例示する。
【図６】［００３５］図６は、本開示に記載するアッセイ法で使用するアプタマーおよびプライマー構築物を例示する。Ｃｙ３はシアニン３色素、Ｂはビオチン、ＰＣは光切断可能リンカー、ＡＮＡは光反応性架橋基、（ＡＢ）２はｄＡ残基によって分離されたビオチン残基対、そして（Ｔ）８はポリｄＴリンカーを表す。プライマー構築物は、アプタマー構築物の完全３’固定領域に相補的である。図６Ａ。単回捕獲アフィニティアッセイプロトコルで用いるアプタマー構築物。図６Ｂ。二重捕獲アフィニティアッセイプロトコルで用いるアプタマー構築物。図６Ｃ。単回捕獲架橋アッセイプロトコルで用いるアプタマー構築物。図６Ｄ。二重捕獲架橋アッセイプロトコルで用いるアプタマー構築物。
【図７Ａ】［００３６］図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、マイクロアレイ検出を伴うアフィニティアッセイプロトコルを用いた、緩衝液中のターゲットタンパク質の検出に関する用量反応曲線（対数投入ターゲットタンパク質濃度に対するＲＦＵ）を例示する。複製タンパク質不含対照値をｙ軸フレーム上にプロットする。実線は、データポイントに沿ったシグモイド適合を表す。点線は、複製タンパク質不含値の２つの標準偏差を表す。図７Ａ。ｂＦＧＦターゲットタンパク質。図７Ｂ。ＦＧＦ７ターゲットタンパク質。図７Ｃ。リンホタクチン・ターゲットタンパク質。
【図７Ｂ】［００３６］図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、マイクロアレイ検出を伴うアフィニティアッセイプロトコルを用いた、緩衝液中のターゲットタンパク質の検出に関する用量反応曲線（対数投入ターゲットタンパク質濃度に対するＲＦＵ）を例示する。複製タンパク質不含対照値をｙ軸フレーム上にプロットする。実線は、データポイントに沿ったシグモイド適合を表す。点線は、複製タンパク質不含値の２つの標準偏差を表す。図７Ａ。ｂＦＧＦターゲットタンパク質。図７Ｂ。ＦＧＦ７ターゲットタンパク質。図７Ｃ。リンホタクチン・ターゲットタンパク質。
【図７Ｃ】［００３６］図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、マイクロアレイ検出を伴うアフィニティアッセイプロトコルを用いた、緩衝液中のターゲットタンパク質の検出に関する用量反応曲線（対数投入ターゲットタンパク質濃度に対するＲＦＵ）を例示する。複製タンパク質不含対照値をｙ軸フレーム上にプロットする。実線は、データポイントに沿ったシグモイド適合を表す。点線は、複製タンパク質不含値の２つの標準偏差を表す。図７Ａ。ｂＦＧＦターゲットタンパク質。図７Ｂ。ＦＧＦ７ターゲットタンパク質。図７Ｃ。リンホタクチン・ターゲットタンパク質。
【図８】［００３７］図８は、マイクロアレイ検出を伴うアフィニティアッセイプロトコルを用いた、緩衝液中のターゲットタンパク質リンホタクチンの３回の反復測定に関する用量反応曲線を例示する。複製タンパク質不含対照値をｙ軸フレーム上にプロットする。実線は、３つの反復各々に関するデータポイントに沿ったシグモイド適合を表す。
【図９】［００３８］図９は、アフィニティアッセイプロトコルおよびマイクロアレイ検出を用いた、１０％ヒト血漿中のターゲットタンパク質リンホタクチンの検出に関する用量反応曲線（対数投入ターゲットタンパク質濃度に対するＲＦＵ）を例示する。複製タンパク質不含対照値をｙ軸フレーム上にプロットし、そして円で囲む。実線は、データポイントに沿ったシグモイド適合を表す。
【図１０】［００３９］図１０は、アフィニティアッセイプロトコルおよびマイクロアレイ検出を用いた、１０％ヒト全血中のターゲットタンパク質リンホタクチンの検出に関する用量反応曲線（対数投入ターゲットタンパク質濃度に対するＲＦＵ）を例示する。複製タンパク質不含対照値をｙ軸フレーム上にプロットし、そして円で囲む。実線は、データポイントに沿ったシグモイド適合を表す。
【図１１】［００４０］図１１は、マイクロアレイ検出とともに光架橋アッセイプロトコルを用いた、緩衝液中のターゲットタンパク質アンジオゲニンの検出に関する用量反応曲線（対数投入ターゲットタンパク質濃度に対するＲＦＵ）を例示する。実線は、データポイントに沿ったシグモイド適合を表す。４つの複製タンパク質不含データを円で囲む。
【図１２】［００４１］図１２は、ＱＰＣＲ検出とともにアフィニティアッセイプロトコルを用いた、緩衝液中のアンジオゲニンの検出に関する用量反応曲線（投入ターゲットタンパク質濃度に対する検出アプタマー濃度）を例示する。４つの複製タンパク質不含測定値を白抜きの円としてｙ軸上に示す。
【図１３Ａ】［００４２］図１３Ａ〜１３Ｃは、３つの異なるターゲットに対する伝統的なアプタマーに対する遅い解離速度のアプタマーに関する用量反応曲線を例示する。
【図１３Ｂ】［００４２］図１３Ａ〜１３Ｃは、３つの異なるターゲットに対する伝統的なアプタマーに対する遅い解離速度のアプタマーに関する用量反応曲線を例示する。
【図１３Ｃ】［００４２］図１３Ａ〜１３Ｃは、３つの異なるターゲットに対する伝統的なアプタマーに対する遅い解離速度のアプタマーに関する用量反応曲線を例示する。
【図１４】［００４３］図１４は、アッセイ再現性研究用の試料レイアウトを例示する。
【図１５】［００４４］図１５は、プールしたおよびプールしない試料研究のＣＶを例示する。
【図１６−１】［００４５］図１６は、本開示に論じるヌクレオチドの塩基修飾を示す。ヌクレオチド付着点およびＲ基の間で使用可能なリンカー（Ｘ）に加えて、使用可能なＲ基を記載する。ヌクレオチドの修飾のための位もまた示す。
【図１６−２】［００４５］図１６は、本開示に論じるヌクレオチドの塩基修飾を示す。ヌクレオチド付着点およびＲ基の間で使用可能なリンカー（Ｘ）に加えて、使用可能なＲ基を記載する。ヌクレオチドの修飾のための位もまた示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
［００４６］本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術レベル内の化学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の慣用法を使用する。こうした技術は文献に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（現行版）；  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ｖｏｌ．  ＩおよびＩＩ（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ監修）；  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ監修、現行版）；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ監修、現行版）；  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ監修、現行版）を参照されたい。
【００３３】
［００４７］本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、本発明が属する当該技術分野（単数または複数）の技術のレベルを示す。本明細書に引用するすべての刊行物、公開特許文書、および特許出願は、各々の個々の刊行物、公開特許文書、または特許出願が、具体的に、そして個々に、本明細書に援用されると示されるのと同じ度合いまで、本明細書に援用される。
【００３４】
［００４８］本開示には、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のための改善された方法、デバイス、試薬、およびキットが含まれる。開示する方法、デバイス、試薬、およびキットは、（１）アプタマーの活性、（２）アプタマー−ターゲット分子複合体に関する結合平衡を達成する効率、（３）アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合（単数または複数）の形成、（４）過剰な試薬および試料構成要素の除去、（５）遅い解離速度のアプタマーの使用、（６）望ましいアプタマー構築物、ならびに（７）アプタマー−ターゲット分子複合体の検出の１以上に影響を及ぼす条件を最適化することによって、試験試料中のターゲット分子の検出および／または定量化のための高感度アッセイを提供する。
【００３５】
［００４９］特定の態様に別に明記しない限り、本明細書記載のターゲット分子の検出法および／または定量化法が、工程が記載される特定の順序からは独立であることは注目に値する。例示の目的のため、工程の特定の順序として方法を記載する；が、記載される特定のアッセイの目的が達成される限り、工程の特定の順序のいかなる数の置換も可能であることが理解されるものとする。言い換えれば、開示する方法のいずれかに列挙する工程を任意の適切な順序で実行してもよく、そして本発明の方法は、記載する態様、実施例、または付随する請求項のいずれかに提示される特定の順序いずれにも限定されない。さらに、提示を好適にそして容易にするため、単一ターゲット分子および単一アプタマーに関連して、多様な方法を記載する。しかし、記載する方法はいずれも、例えば、各々、特定のターゲット分子に対する特異的アフィニティを有する多数のアプタマーと試験試料を接触させることによって、試験試料中の多数のターゲット分子を検出しそして／または定量化することが可能である（すなわち多重化形式）ように、多数のアプタマーを用いて、多数のターゲットを同時に検出および／または定量化可能な多重化形式で、記載する方法のいずれも実行可能であることが理解されるものとする。
【００３６】
［００５０］図１Ａおよび１Ｂと関連して、ターゲット分子に対する特異的アフィニティを有するアプタマーと試験試料をまず接触させることによって、試験試料中のターゲット分子の存在を検出し、そして／または定量化する。対応する数の特異的アプタマーを使用する、すなわち多重化形式によって、いくつかの特異的ターゲットの検出および／または定量化に、方法を適用してもよい。単一ターゲットの議論は、提示を簡単にするためのみに提示される。試験試料がターゲット分子を含有するならば、ターゲット分子にアプタマーが結合することによって、アプタマー・アフィニティ複合体が形成される。使用しているアプタマーに適した方法を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体を、アプタマーがターゲット分子に共有結合している、アプタマー共有複合体に、場合によって変換する。次いで、分配工程を使用して、未結合アプタマーを除去する。アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を検出し、そして／または定量化する。いくつかの異なる検出法、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、質量分析、またはＱＰＣＲを用いて、アプタマー・アフィニティ複合体を検出してもよい。
【００３７】
［００５１］上に論じるように、本明細書記載のアッセイは、例示の目的のため、４つのカテゴリーに分類されてきている：単回捕獲アフィニティアッセイ；二重捕獲アフィニティアッセイ；単回捕獲光架橋アッセイ；および二重捕獲光架橋アッセイ。しかし、他の分類、組み合わせ、および工程の順序が意図され、そしてすべて本発明の開示の範囲内に属することを理解しなければならない。４つのアッセイカテゴリーは、タンパク質（ターゲット）を捕捉する分配工程によって、アプタマー−ターゲット複合体を未結合アプタマー（または未結合光アプタマー）から分離する共通の工程を共有する。この分配工程を、本明細書において、「捕獲２」分配と称する。２つの「二重捕獲」アッセイは、アプタマーを捕捉する分配工程によって、アプタマー−ターゲット複合体を未結合ターゲットから分離する、さらなる共通点を共有する。この後者の分配工程を、本明細書において、「捕獲１」分配と称する。これらの工程各々を実行するための方法を以下に詳述する。
【００３８】
［００５２］これらのアッセイカテゴリー各々における動力学的負荷の使用をさらに開示する。伝統的には、２つの捕捉試薬を用いるサンドイッチアッセイの使用を通じて、所望のターゲットの検出における特異性が改善されてきた。驚くべきことに、アプタマーを使用する検出法に動力学的負荷を適用すると、第二の捕捉試薬を導入することによって特異性を増進する必要性が排除されることが観察されてきている。動力学的負荷が導入されたならば、アプタマーおよびいかなる非ターゲット分子間の非特異的複合体も、解離後に再形成される可能性は低い。非特異的複合体は、一般的に、アプタマー・アフィニティ複合体より迅速に解離するため、動力学的負荷は、アプタマーが非ターゲットとの非特異的複合体中に含まれる可能性を減少させる。有効な動力学的負荷は、最初のアプタマー結合事象および続く共有相互作用のいずれよりも、アッセイにさらなる特異性を提供しうる。したがって、動力学的負荷は、これらの検出法において、特異性の第二の決定要因を提供する。動力学的負荷を実行するための方法を以下に詳述する。
【００３９】
［００５３］図２Ａ（二重工程アフィニティアッセイ）および２Ｂ（二重工程架橋アッセイ）と関連して、試験試料中に存在しうるターゲット分子の検出および／または定量化のための例示的な方法において、第一のタグを含み、そしてターゲット分子に対する特異的アフィニティを有するアプタマー（または光アプタマー）と試験試料を接触させる。試験試料がターゲット分子を含有する場合、ターゲット分子に結合したアプタマー（または光アプタマー）を含むアプタマー・アフィニティ複合体の形成を可能にする。光架橋例（２Ｂ）において、使用しているアプタマーに適した方法を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体を、光アプタマーがターゲット分子に共有結合しているアプタマー共有複合体に変換する。第一の捕捉要素を介して、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を第一の固体支持体に付着させる。第一の固体支持体をアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）と接触させ、そしてアプタマー上に含まれているタグが、直接または間接的にのいずれかで、第一の固体支持体に付着している第一の捕捉要素と会合するのを可能にすることによって、付着が達成される。第一の固体支持体上の第一の捕捉要素と会合しているアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を混合物の残りから分配する。分配後、使用している特定のタグに適した方法を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を第一の固体支持体から遊離させる。あるいは、切断可能部分を介してタグをアプタマーに付着させてもよく、この場合、こうした切断可能部分をここで切断して、第一の固体支持体からアプタマー・アフィニティ（またはアプタマー共有複合体）を遊離させる。第二のタグ（第一のタグと同じであってもまたは異なってもよい）をアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）のターゲット分子に付着させる。場合によって、動力学的負荷を実行して、アッセイ特異性を増加させ、そしてバックグラウンドシグナルを減少させてもよい。アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を第二の固体支持体に付着させる。第二の固体支持体をアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）と接触させ、そしてターゲット上に含まれている第二のタグが、直接または間接的にのいずれかで、第二の固体支持体に付着している第二の捕捉要素と会合するのを可能にすることによって、付着が達成される。第二の固体支持体上の第二の捕捉要素と会合しているアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を混合物の残りから分配する。アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を検出し、そして場合によって定量化する。
【００４０】
［００５４］別の態様において、アプタマー（または光アプタマー）をまずそれぞれのターゲット分子から解離させて、そして未結合アプタマー（または光アプタマー）を検出し、そして場合によって定量化する。
【００４１】
［００５５］ハイブリダイゼーション、ＱＰＣＲ、ＭＳ等の任意の適切な核酸検出技術を利用することによって、アプタマー・アフィニティ複合体を検出してもよい。どの技術を使用するかに応じて、アプタマーを設計し、そして標識を含むように修飾してもよい。合成時（酵素的または化学的のいずれかで）に、あるいはアッセイ中の任意の時点で（すなわち検出前の任意の時点で）、これを達成してもよい。
【００４２】
［００５６］本明細書に開示する方法は、アッセイから溶出した未結合アプタマーを検出することによって、ターゲット分子の存在および量の検出を可能にする。これは、核酸の検出、定量化、および増幅が比較的単純であることから、ターゲット分子の好適な検出および定量化を可能にし、そして非常に好ましいシグナル対ノイズ比を有するターゲット検出アッセイを提供する。
【００４３】
［００５７］アフィニティアッセイ
［００５８］単回捕獲（捕獲２のみ）アフィニティアッセイ
［００５９］１つの態様において、捕獲２分配を用いて、単回捕獲アフィニティアッセイを実行する。この方法は、試料マトリックスがそれほど複雑でなく、試料中の他の構成要素がタグに関して競合しない場合によく働く。これはまた、ターゲットが高いコピー数または濃度で存在する試料に関してよく働く。
【００４４】
［００６０］ターゲット分子に対する高いアフィニティおよび特異性を有するアプタマーを提供する。１つの態様において、図６Ａに例示するアプタマー構築物を用いる。この態様において、ターゲット分子を含有しうる試料とアプタマーを接触させて、アプタマー、ターゲット分子、および場合によって非ターゲット分子を含有する混合物を形成する。ターゲット分子が試料中に存在する場合、アプタマー・アフィニティ複合体が形成される。場合によって、ターゲット分子へのアプタマーの平衡結合を達成するのに十分な期間（例えば、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間）、混合物をインキュベーションしてもよい。
【００４５】
［００６１］１つの態様において、場合によって、混合物を動力学的負荷に供してもよい。動力学的負荷は、アプタマーおよび試料中に存在する非ターゲット分子いずれの間のいかなる非特異的結合も減少させるのを補助する。１つの態様において、１０ｍＭ硫酸デキストランを添加して、そして混合物を約１５分間インキュベーションする。動力学的負荷のこの態様および他の態様を以下にさらに詳細に記載する。
【００４６】
［００６２］１つの態様において、捕獲２分配を実行して、未結合アプタマーを除去する。１つの態様において、アプタマー・アフィニティ複合体を含有する混合物を、アプタマー・アフィニティ複合体のターゲット分子構成要素に捕捉タグを導入する剤で処理する。他の態様において、試験混合物とアプタマーを接触させる前、平衡結合前または動力学的負荷前のいずれかに、タグを導入する。１つの態様において、ターゲットはタンパク質またはペプチドであり、そしてＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンで処理することによって、ビオチンタグをターゲット分子に付着させる。（このタグ化法および他のタグ化法を以下に詳細に記載する。）次いで、ターゲット捕捉タグに結合可能である捕捉要素が表面に付着した固体支持体と混合物を接触させる。この態様において、典型的には、高いアフィニティおよび特異性でターゲット捕捉タグに結合するように、固体支持体上の捕捉要素を選択する。１つの態様において、固体支持体は、マイクロタイタープレートのウェル内に含有される磁気ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１など）であり、そして捕捉要素はストレプトアビジンである。磁気ビーズは、混合物の分配された構成要素の分離のための好適な方法を提供する。（これらのおよび他の固体支持体および捕捉要素を以下に詳細に記載する。）それによって、ターゲット捕捉タグおよび捕捉要素の結合相互作用を通じて、混合物中に含有されるアプタマー・アフィニティ複合体を固体支持体に結合させる。次いで、例えば支持体を洗浄して複合体化されていないアプタマーを除去することによって、アプタマー・アフィニティ複合体を混合物の残りから分配する。１つの態様において、次いで、１以上の以下の処理：高塩、高ｐＨ、低ｐＨまたは上昇した温度によって、さらなるプロセシングのため、アプタマー・アフィニティ複合体からアプタマーを遊離させてもよい。この捕獲２分配および他の捕獲２分配を以下にさらに詳細に記載する。
【００４７】
［００６３］別の態様において、例えばＤＮＡチップハイブリダイゼーション、ＱＰＲＣ、質量分析等の任意の適切な核酸検出法によって、捕獲２分配から遊離したアプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。これらの検出法を以下にさらに詳細に記載する。別の態様において、なお固体支持体と接触させながら、アプタマー・アフィニティ複合体中のアプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。１つの態様において、アプタマーは、この検出工程を容易にする検出可能部分を含む。使用しようとする検出法に基づいて、検出可能部分を選択する。１つの態様において、合成中またはアッセイ前に、検出可能部分または標識をアプタマーに添加する。別の態様において、アッセイ中または検出中のいずれかに、検出可能部分をアプタマーに添加する。次いで、検出されたアプタマーを、元来の試験試料中のターゲットの量または濃度と相関させてもよい。
【００４８】
［００６４］二重捕獲（捕獲１および２）アフィニティアッセイ
［００６５］二重捕獲アフィニティアッセイは、単回捕獲アフィニティアッセイと類似であり、さらなる分配工程が付加されている。このさらなる分配工程は、一般的に、さらなる感度および特異性を提供する。
【００４９】
［００６６］１つの態様において、ターゲット分子に対する高いアフィニティおよび特異性を有し、そして第一の遊離可能タグを有するアプタマーを提供する。別の態様において、捕獲１分配前のアッセイ中の任意の時点で、第一の遊離可能タグを添加する。１つの態様において、第一の遊離可能タグは光切断可能ビオチンである。１つの態様において、図６Ｂに例示するアプタマー構築物を用いる。これらのおよび他のタグおよび切断可能部分、ならびにこうしたタグおよび切断可能部分を含有するアプタマーを以下にさらに詳細に記載する。ターゲット分子を含有しうる試料とアプタマーを接触させて、アプタマー、ターゲット分子、および場合によって非ターゲット分子を含有する混合物を形成する。ターゲット分子が試料中に存在する場合、アプタマー−ターゲット分子複合体（アプタマー・アフィニティ複合体）が形成される。場合によって、ターゲット分子へのアプタマーの平衡結合を達成するのに十分な期間（例えば、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間）、混合物をインキュベーションしてもよい。
【００５０】
［００６７］１つの態様において、捕獲１分配を実行して、いかなる未結合ターゲットも除去する。好ましくは高いアフィニティおよび特異性でアプタマー捕捉タグに結合可能である捕捉要素が表面に付着した第一の固体支持体と混合物を接触させる。１つの態様において、第一の遊離可能タグは光切断可能ビオチンであり、第一の固体支持体は、カラム中のアガロースビーズであり、そして捕捉要素はストレプトアビジンである。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ固定ストレプトアビジンビーズを用いてもよい。これらのおよび他の固体支持体および捕捉要素を以下に詳細に記載する。それによって、第一の遊離可能タグおよび第一の捕捉要素の結合相互作用を通じて、混合物中に含有されるアプタマー・アフィニティ複合体を第一の固体支持体に結合させる。例えば第一の固体支持体を洗浄して非結合分子を除去することによって、アプタマー・アフィニティ複合体を混合物の残りから分配する。
【００５１】
［００６８］１つの態様において、次いで、固体支持体に結合したままであるアプタマー・アフィニティ複合体を、アプタマー・アフィニティ複合体のターゲット分子構成要素に第二のタグを導入する剤で処理する。１つの態様において、ターゲットはタンパク質またはペプチドであり、そしてＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンで処理することによって、ターゲットをビオチン化する。ターゲット分子に導入される第二のタグは、アプタマー捕捉タグと同じであってもまたは異なってもよい。第二のタグが第一のタグ、またはアプタマー捕捉タグと同じである場合、このタグ化工程の開始前に、第一の固体支持体上の未結合捕捉部位をブロッキングしてもよい。この例示的な態様において、ターゲットタグ化の開始前に、未結合ビオチンで第一の固体支持体を洗浄する。タグ化法、そして特にペプチドおよびタンパク質などのターゲットのタグ化を以下に詳細に記載する。他の態様において、捕獲２分配開始前のアッセイにおける任意の他の時点で、ターゲットのタグ化を実行する（同じタグ化部分を用いる場合、捕獲１分配の捕捉工程が実行された後に、ターゲットをタグ化する。）
［００６９］次いで、第一の固体支持体からアプタマー・アフィニティ複合体を遊離させることによって、捕獲１分配を完了する。１つの態様において、第一の遊離可能タグは、第一の遊離可能タグの約９０％以上を切断する条件下で、ＵＶランプの照射によって切断される光切断可能部分である。他の態様において、第一の遊離可能タグ中の選択される遊離可能部分に適した方法によって、遊離を達成する。アッセイ中でさらに使用するため、アプタマー・アフィニティ複合体を溶出させ、そして収集してもよいし、または別の固体支持体と接触させて、以下に記載するアッセイの残りの工程を実行してもよい。
【００５２】
［００７０］１つの態様において、場合によって、混合物を動力学的負荷に曝露してもよい。動力学的負荷は、アプタマーおよび非ターゲット分子間のいかなる非特異的結合も減少させるのを補助する。１つの態様において、１０ｍＭ硫酸デキストランをアプタマー・アフィニティ複合体に添加し、そして混合物を約１５分間インキュベーションする。別の態様において、１０ｍＭ硫酸デキストランの存在下で、捕獲１溶出を実行することによって、動力学的負荷を開始する。他の態様において、平衡結合工程後および捕獲２分配前に、動力学的負荷を実行する。動力学的負荷のこれらの態様および他の態様を以下にさらに詳細に記載する。
【００５３】
［００７１］１つの態様において、捕獲２分配を実行して、未結合アプタマーを除去する。上述のように、１つの態様において、アプタマー・アフィニティ複合体をなお捕獲１分配で用いた固体支持体と接触させたままで、捕獲２分配で用いる第二のタグをターゲットに添加してもよい。他の態様において、捕獲２分配開始前のアッセイ中の別の時点で、第二のタグをターゲットに添加してもよい。次いで、好ましくは高いアフィニティおよび特異性でターゲット捕捉タグに結合可能である捕捉要素が表面に付着した固体支持体と混合物を接触させる。１つの態様において、固体支持体は、マイクロタイタープレートのウェル内に含有される磁気ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１など）であり、そして捕捉要素はストレプトアビジンである。磁気ビーズは、混合物の分配された構成要素の分離のための好適な方法を提供する。（これらのおよび他の固体支持体および捕捉要素を以下に詳細に記載する。）それによって、ターゲット捕捉タグおよび固体支持体上の捕捉要素の結合相互作用を通じて、混合物中に含有されるアプタマー・アフィニティ複合体を固体支持体に結合させる。次いで、例えば支持体を洗浄して複合体化されていないアプタマーを除去することによって、アプタマー・アフィニティ複合体を混合物の残りから分配する。１つの態様において、次いで、１以上の以下の処理：高塩、高ｐＨ、低ｐＨまたは上昇した温度によって、さらなるプロセシングのため、アプタマー・アフィニティ複合体からアプタマーを遊離させてもよい。この捕獲２分配および他の捕獲２分配を以下にさらに詳細に記載する。
【００５４】
［００７２］別の態様において、例えばＤＮＡチップハイブリダイゼーション、ＱＰＲＣ、質量分析等の任意の適切な核酸検出法によって、捕獲２分配から遊離したアプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。これらの検出法を以下にさらに詳細に記載する。別の態様において、なお固体支持体と接触させながら、アプタマー・アフィニティ複合体中のアプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。１つの態様において、アプタマーは、この検出工程を容易にする検出可能部分を含む。使用しようとする検出法に基づいて、検出可能部分を選択する。１つの態様において、合成中またはアッセイ前に、検出可能部分（標識）をアプタマーに添加する。別の態様において、アッセイ中または検出中のいずれかに、検出可能部分をアプタマーに添加する。検出されたアプタマーを、試験試料中のターゲットの量または濃度と相関させてもよい。
【００５５】
［００７３］架橋アッセイ
［００７４］単回捕獲（捕獲２のみ）架橋アッセイ
［００７５］１つの態様において、捕獲２分配を用いて、単回捕獲架橋アッセイを実行する。この方法は、試料マトリックスがそれほど複雑でなく、試料中の他の構成要素がタグに関して競合しない場合によく働く。これはまた、ターゲットが高いコピー数または濃度で存在する試料に関してよく働く。いくつかの場合、架橋が実行された後の工程において、よりストリンジェントな洗浄が可能になりうるため、光アプタマーおよびターゲット間の共有結合によって、さらなる利益が提供される。
【００５６】
［００７６］ターゲット分子に対する高いアフィニティおよび特異性を有する光アプタマーを提供する。１つの態様において、切断可能リンカーを介して、光アプタマーの架橋部分をアプタマーに連結させる。１つの態様において、架橋基はＡＮＡ（４−アジド−２−ニトロ−アニリン）であり、そして光切断可能基はＰＣリンカーである。１つの態様において、図６Ｃに例示するアプタマー構築物を用いる。ターゲット分子を含有しうる試料と光アプタマーを接触させて、アプタマー、ターゲット分子、および場合によって非ターゲット分子を含有する混合物を形成する。ターゲット分子が試料中に存在する場合、（光）アプタマー・アフィニティ複合体が形成される。場合によって、アプタマーおよびターゲット分子の平衡結合を達成するのに十分な期間（例えば、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、または少なくとも約３０分間）、混合物をインキュベーションしてもよい。
【００５７】
［００７７］１つの態様において、場合によって、混合物を動力学的負荷に供してもよい。動力学的負荷は、光アプタマーおよび非ターゲット分子間のいかなる非特異的結合も減少させるのを補助する。１つの態様において、１０ｍＭ硫酸デキストランを添加して、そして混合物を約１５分間インキュベーションする。動力学的負荷のこの態様および他の態様を以下にさらに詳細に記載する。
【００５８】
［００７８］適切な波長の光を照射することによって、（光）アプタマー・アフィニティ複合体をアプタマー共有複合体に変換する。例えば、約４７０ｎＭの照射を用いて、ＡＮＡ含有光アプタマーをタンパク質またはペプチドターゲットに架橋してもよい。
【００５９】
［００７９］１つの態様において、捕獲２分配を実行して、未結合光アプタマーを除去する。１つの態様において、アプタマー共有複合体を含有する混合物を、アプタマー共有複合体のターゲット分子構成要素に捕捉タグを導入する剤で処理する。他の態様において、試験試料とアプタマーを接触させる前、平衡結合前または動力学的負荷前に、タグを導入する。１つの態様において、ターゲットはタンパク質またはペプチドであり、そしてＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンで処理することによって、ビオチンタグをターゲット分子に付着させる。（このタグ化法および他のタグ化法を以下に詳細に記載する。）次いで、好ましくは高いアフィニティおよび特異性でターゲット捕捉タグに結合可能である捕捉要素が表面に付着した固体支持体と混合物を接触させる。１つの態様において、固体支持体は、マイクロタイタープレートのウェル内に含有される磁気ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１など）であり、そして捕捉要素はストレプトアビジンである。磁気ビーズは、混合物の分配された構成要素の分離のための好適な方法を提供する。（これらのおよび他の固体支持体および捕捉要素を以下に詳細に記載する。）それによって、ターゲット捕捉タグおよび捕捉要素の結合相互作用を通じて、混合物中に含有されるアプタマー共有複合体を固体支持体に結合させる。次いで、例えば支持体を洗浄して複合体化されていないアプタマーを除去することによって、アプタマー共有複合体を混合物の残りから分配する。１つの態様において、次いで、切断可能部分に適した方法によって、さらなるプロセシングのため、アプタマー共有複合体から光アプタマーを遊離させてもよい。例えば、ＰＣリンカーを切断するため、混合物にＵＶランプを約２０分間照射する。この捕獲２分配および他の捕獲２分配を以下にさらに詳細に記載する。
【００６０】
［００８０］別の態様において、例えばＤＮＡチップハイブリダイゼーション、ＱＰＲＣ、質量分析等の任意の適切な核酸検出法によって、捕獲２分配から遊離した光アプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。これらの検出法を以下にさらに詳細に記載する。別の態様において、なお固体支持体と接触させながら、アプタマー共有複合体中の光アプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。検出された光アプタマーを、元来の試験試料中のターゲットの量または濃度と相関させてもよい。
【００６１】
［００８１］二重捕獲（捕獲１および２）光架橋アッセイ
［００８２］二重捕獲光架橋アッセイは、単回捕獲光架橋アッセイと類似であり、さらなる分配工程が付加されている。このさらなる分配工程は、一般的に、さらなる感度および特異性を提供する。
【００６２】
［００８３］ターゲット分子に対する高いアフィニティおよび特異性を有する光アプタマーを提供する。１つの態様において、切断可能リンカーを介して、光アプタマーの架橋部分をアプタマーに連結させる。１つの態様において、架橋基はＡＮＡ（４−アジド−２−ニトロ−アニリン）であり、そして光切断可能基はＰＣリンカーである。１つの態様において、光アプタマーはまた、第一の遊離可能タグも含む。別の態様において、捕獲１分配前のアッセイ中の任意の時点で、第一の遊離可能タグを添加する。１つの態様において、第一の遊離可能タグ部分はビオチンであり、そして遊離可能要素はハイブリダイゼーションリンカーである。１つの態様において、図６Ｄに例示する光アプタマー構築物を用いる。ターゲット分子を含有しうる試料と光アプタマーを接触させて、アプタマー、ターゲット分子、および場合によって非ターゲット分子を含有する混合物を形成する。ターゲット分子が試料中に存在する場合、（光）アプタマー・アフィニティ複合体が形成される。場合によって、アプタマーおよびターゲット分子の平衡結合を達成するのに十分な期間（例えば、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、または少なくとも約３０分間）、混合物をインキュベーションしてもよい。
【００６３】
［００８４］１つの態様において、場合によって、混合物を動力学的負荷に供してもよい。動力学的負荷は、光アプタマーおよび非ターゲット分子間のいかなる非特異的結合も減少させるのを補助する。１つの特定の態様において、１０ｍＭ硫酸デキストランを添加して、そして混合物を約１５分間インキュベーションする。動力学的負荷のこの態様および他の態様を以下にさらに詳細に記載する。
【００６４】
［００８５］適切な波長の光を照射することによって、（光）アプタマー・アフィニティ複合体をアプタマー共有複合体に変換する。例えば、約４７０ｎＭの照射を用いて、ＡＮＡ含有光アプタマーをタンパク質ターゲットに架橋してもよい。
【００６５】
［００８６］１つの態様において、捕獲１分配を実行して、未結合ターゲットを除去する。好ましくは高いアフィニティおよび特異性でアプタマー捕捉タグに結合可能である捕捉要素が表面に付着した第一の固体支持体と混合物を接触させる。１つの態様において、第一の遊離可能タグはビオチンであるタグ部分を含み、第一の固体支持体は、カラム中のアガロースビーズであり、そして捕捉要素はストレプトアビジンである。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ固定ストレプトアビジンビーズを用いてもよい。これらのおよび他の固体支持体および捕捉要素を以下に詳細に記載する。それによって、第一の遊離可能タグおよび第一の捕捉要素の結合相互作用を通じて、混合物中に含有されるアプタマー共有複合体を第一の固体支持体に結合させる。例えば第一の固体支持体を洗浄して非結合分子を除去することによって、アプタマー共有複合体を混合物の残りから分配する。
【００６６】
［００８７］１つの態様において、次いで、固体支持体に結合したままであるアプタマー共有複合体を、アプタマー・アフィニティ複合体のターゲット分子構成要素に第二のタグを導入する剤で処理する。例えばＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンで処理することによる、タンパク質またはペプチドのビオチン化。ターゲット分子に導入される第二のタグは、第一のタグと同じであってもまたは異なってもよい。第二のタグが第一のタグと同じである場合、このタグ化工程の開始前に、第一の固体支持体上の未結合捕捉部位をブロッキングしてもよい。この１つの態様において、ターゲットタグ化の開始前に、未結合ビオチンで第一の固体支持体を洗浄する。タグ化法、そして特にペプチドおよびタンパク質などのターゲットのタグ化を以下に詳細に記載する。他の態様において、捕獲２分配開始前のアッセイにおける任意の他の時点で、ターゲットのタグ化を実行する（同じタグ化部分を用いる場合、捕獲１分配の捕捉工程が実行された後に、ターゲットをタグ化する。）
［００８８］次いで、第一の固体支持体からアプタマー共有複合体を遊離させることによって、捕獲１分配を完了する。１つの態様において、第一の遊離可能タグは、高いｐＨなどの、ハイブリダイゼーションリンカーを破壊する条件で混合物を処理することによって切断される。１つの態様において、２０ｍＭ  ＮａＯＨを混合物に添加する。他の態様において、第一の遊離可能タグ中の遊離可能部分に適した任意の方法によって、アプタマー共有複合体の遊離を達成する。アッセイ中でさらに使用するため、アプタマー共有複合体を溶出させ、そして収集してもよいし、またはアッセイの残りの工程を実行するため、さらなる固体支持体と接触させてもよい。
【００６７】
［００８９］１つの態様において、捕獲２分配を実行して、未結合光アプタマーを除去する。好ましくは高いアフィニティおよび特異性で第二の捕捉タグに結合可能である捕捉要素が表面に付着した固体支持体と混合物を接触させる。１つの態様において、固体支持体は、マイクロタイタープレートのウェル内に含有される磁気ビーズ（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１など）であり、そして捕捉要素はストレプトアビジンである。磁気ビーズは、混合物の分配された構成要素の分離のための好適な方法を提供する。（これらのおよび他の固体支持体および捕捉要素を以下に詳細に記載する。）それによって、ターゲット捕捉タグおよび捕捉要素の結合相互作用を通じて、混合物中に含有されるアプタマー共有複合体を固体支持体に結合させる。次いで、例えば支持体を洗浄して複合体化されていないアプタマーを除去することによって、アプタマー共有複合体を混合物の残りから分配する。１つの態様において、次いで、切断可能部分に適した方法によって、さらなるプロセシングのため、アプタマー共有複合体から光アプタマーを遊離させてもよい。例えば、ＰＣリンカーを切断するため、混合物にＵＶランプを約２０分間照射する。この捕獲２分配および他の捕獲２分配を以下にさらに詳細に記載する。
【００６８】
［００９０］別の態様において、例えばＤＮＡチップハイブリダイゼーション、ＱＰＲＣ、質量分析等の任意の適切な核酸検出法によって、捕獲２分配から遊離した光アプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。これらの検出法を以下にさらに詳細に記載する。別の態様において、なお固体支持体と接触させながら、アプタマー共有複合体中の光アプタマーを検出し、そして場合によって定量化する。検出された光アプタマーを、元来の試験試料中のターゲットの量または濃度と相関させてもよい。
【００６９】
［００９１］変形
［００９２］変形：希釈セット
［００９３］本明細書に開示する任意の方法において、試験試料を試験試料の２以上の希釈として調製してもよく、これは本明細書に開示する方法によるターゲット検出のダイナミックレンジを増加させうる。個々の希釈試験試料を、アプタマー（または共有）複合体形成までそしてそれを含めて別個にアッセイし、その後、希釈試験試料を残りのアッセイのためにプールし、そして同時に単一の固体支持体上で検出してもよい。１つの態様において、各希釈試験試料には、ユニークなアプタマーが含まれ、それによって、対応するターゲットの単回測定が可能になる。別の態様において、各々、特定のターゲットに関する別個のタグ化アプタマーを接触させる２以上の希釈に、アプタマーを添加して、単一の固体支持体上で、各々、異なる希釈試料に関して特異的なアプタマーシグナルの検出を可能にしてもよい。この方式で希釈した試料をともにつなぐと、多くの桁に渡って、単一のターゲット分子に関するダイナミックレンジが拡張可能となり、そして定量化領域が重複して単一のターゲット濃度の多数の測定が導かれる場合は、正確さが加算される。
【００７０】
［００９４］別の態様において、複合体化されていないターゲットおよび試験試料を含有する上清を廃棄した後に、ビーズを懸濁する工程までそしてそれを含めて、上に概略したようにアッセイを行う。未結合アプタマーおよびアプタマー（または共有）複合体をビーズから溶出させる前に、アプタマー（または共有）複合体を標識化剤と接触させ、その後、ターゲット分子の検出および／または定量化のために、アプタマー（または共有）複合体と固体支持体を接触させる前に、ペレット化および洗浄を反復して、非反応性標識化剤を除去してもよい。
【００７１】
［００９５］１つの態様において、連続希釈として試験試料セットを調製して、そこにターゲット分子に対する特異的アフィニティを持つタグ化アプタマー（またはタグ化光アプタマー）を導入する。各試験試料希釈に、異なるタグを持つ同じアプタマーを添加してもよい。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティ複合体の形成（またはアプタマー共有複合体への場合による変換）後、個々の試験試料をプールし、そしてアプタマー（または共有）複合体を固体支持体に付着させる前または後のいずれかで、標識化剤と接触させてもよい。ターゲット分子が試験試料中に存在する場合、アプタマー（または共有）複合体上の標識化剤を検出することによって、ターゲット分子を検出しそして／または定量化する。異なるタグを有する各アプタマーに関して検出された、生じたシグナルを合わせて、元来の試験試料中のターゲット分子の量または濃度を正確に定量化してもよい。例えば、第一の希釈は、ターゲットに関する最大シグナルを生じ、半定量的な情報のみを生じる一方、第二の希釈は、飽和未満のシグナルを生じ、元来の試験試料中のターゲットの正確な定量化を可能にしてもよい。
【００７２】
［００９６］別の態様において、連続希釈として試験試料セットを調製して、そこにターゲット分子に対する特異的アフィニティを持つタグ化アプタマー（またはタグ化光アプタマー）を導入する。各試料希釈に、ユニークなタグを有する異なるアプタマーを添加してもよい。本明細書にさらに記載するように、アプタマー・アフィニティ複合体の形成（またはアプタマー共有複合体への場合による変換）後、個々の試験試料をプールし、そしてアプタマー（または共有）複合体を固体支持体に付着させる前または後のいずれかで、標識化剤と接触させてもよい。アプタマー（または共有）複合体上の標識化剤を検出することによって、試験試料中に存在するターゲット分子を検出しそして／または定量化する。元来の試料の異なる連続希釈に応じて、多くの桁数に渡って、ターゲット範囲に関して生じたシグナルを定量化してもよい。
【００７３】
［００９７］変形：参照試料
［００９８］本明細書に開示する任意の方法において、試験試料を参照試料に比較してもよい。「参照試料」は、本明細書において、複数の分子を含有し、そして少なくとも１つのターゲット分子を含むことが知られる、任意の物質、溶液、または混合物を指す。参照試料中に存在する任意のターゲット分子の正確な量または濃度を知ることもまた可能である。用語、参照試料には、本明細書に定義するような、生物学的試料、ならびに、例えば汚染されたかまたは潜在的に汚染されている水および産業廃水などの、環境または毒性試験に使用可能な試料が含まれる。参照試料はまた、準備プロセス、例えば製造プロセスの最終産物、中間産物、または副産物であってもよい。参照試料には、生物から、またはいくつかの他の供給源（例えば環境または産業供給源）から得られた、物質、溶液、または混合物に添加されている、任意の適切なアッセイ培地、緩衝液、または希釈剤が含まれてもよい。
【００７４】
［００９９］１つの態様において、２つの異なるプローブを持つアプタマーを調製する。例えば、一方のアプタマーはＣＹ３色素を有し、そして他方はＣＹ５色素を有してもよい。例として二重捕捉架橋アッセイを用いて、参照試料を一方のアプタマーに曝露し、そして試験試料を他方に曝露する。架橋工程までそしてそれを含めて、各試料を同一の方式で別個に処理する。架橋後、試料を等しく混合し、そしてアッセイの残りの工程を実行してもよい。各標識化剤からのシグナルを別個に測定することによって、参照試料および試験試料間のいかなる示差発現（すなわち試料中のターゲットの示差量または示差濃度）の直接比較も可能である。この方法が、本明細書記載の他のいかなるアッセイ内に取り込まれてもよいことを理解すべきである。さらに、蛍光色素の使用を含めて、異なる色素を用いることに加えて、他のタグまたは標識を使用して、異なるアプタマー各々からのシグナルを差別化してもよい。例えば、別の態様において、試料各々で用いるアプタマーは、異なる配列タグを有してもよい。この方法は、例えば、読み取りがＱＰＣＲまたはＤＮＡハイブリダイゼーションアレイである場合に有用である。
【００７５】
［００１００］１つの態様において、参照試料は、対照群に相当するプールした生物学的試料であってもよい。別の態様において、参照試料は、個体から最初に収集して得た生物学的試料であってもよく、そして試験試料を同じ個体から、しかし２回目に収集して得てもよく、それによって長期に渡って個体によって提供される多数の生物学的試料における１以上のターゲット分子の量または濃度のいかなる変化も測定し、そして評価することによって、個体の長期研究を容易にしてもよい。
【００７６】
［００１０１］変形：多重化
［００１０２］本明細書記載の任意の方法を用いて、試験試料の多重化分析を行ってもよい。こうした多重化分析には、例えば生物学的試料などの試験試料中の同数のターゲット分子を同時にアッセイするための、少なくとも２つ、少なくとも数十、少なくとも数百または少なくとも数千のアプタマーの使用も含まれてもよい。これらの態様において、各々、異なる分析物を認識しそして場合によってこれに架橋する、複数のアプタマー（またはタグ化光アプタマー）を、試験試料に導入し、そして上述の任意のアッセイを実行してもよい。アプタマーの遊離後、任意の適切な多重化核酸検出法を使用して、遊離している異なるアプタマーを測定してもよい。１つの態様において、固体表面上に別個に配置されている相補的プローブへのハイブリダイゼーションによって、これを達成してもよい。別の態様において、質量分析を用いて、分子量に基づいて、異なるアプタマー各々を検出してもよい。さらに別の態様において、例えばキャピラリー電気泳動における、ゲルにおける、または液体クロマトグラフィーによるなどの電気泳動移動度に基づいて、異なるアプタマー各々を検出してもよい。別の態様において、ユニークなＰＣＲプローブを用い、ＱＰＣＲを用いて、異なるアプタマー各々を定量化してもよい。別の態様において、質量分析を用いて、分子量に基づいて、異なるアプタマー各々を検出してもよい。
【００７７】
［００１０３］変形：競合剤とのプレインキュベーション
［００１０４］本明細書に開示するアッセイ各々において、動力学的負荷を用いて、アッセイの特異性を増加させ、そして非特異的結合を減少させる。本明細書記載のアッセイ各々において、場合によって使用してもよい１つの態様において、試験試料と競合剤のプレインキュベーションによるか、または平衡結合中の混合物への競合剤の添加によるかのいずれかで、非特異的結合のさらなる減少を達成してもよい。１つの態様において、４μＭのＺ−ブロック競合剤オリゴヌクレオチド（５’−（ＡＣＺＺ）２８ＡＣ−３’、式中、Ｚ＝５−ベンジル−ｄＵＴＰ）を試験混合物と約５分間プレインキュベーションする。
【００７８】
［００１０５］キット
［００１０６］本開示の別の側面は、試験試料を分析するために、本明細書に開示する任意の方法を好適に実行するのに有用なキットに関する。開示する方法の多用途性を増進するため、試薬の比が、方法およびアッセイの実質的な最適化を提供するように、同じまたは別個の容器中、パッケージングされた組み合わせで、試薬を提供してもよい。試薬の交差反応性および安定性に応じて、試薬は各々、別個の容器中にあってもよいし、または多様な試薬が１以上の容器中で組み合わされてもよい。
【００７９】
［００１０７］キットは、パッケージングされた組み合わせ中、少なくとも１つのタグ化アプタマー、および各々、少なくとも１つの捕捉剤を含む１以上の固体支持体を含む。キットにはまた、試料希釈のための緩衝水性媒体などの洗浄溶液、ならびにアレイ洗浄液、試料調製試薬等も含まれてもよい。キットはさらに、一般的にはターゲットの修飾を通じて、第二のタグを導入する際に有用な試薬をさらに含有してもよい。さらに、キットは、分析法中に所望の動力学的負荷を実行するのに適した試薬を含有してもよい。キット中の多様な試薬の相対量を広く変化させて、アッセイ中に起こる必要がある反応を実質的に最適化し、そしてさらにアッセイ感度を実質的に最適化する、試薬濃度を提供してもよい。適切な状況下で、キット中の１以上の試薬を、賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供してもよく、このキットは、溶解に際して、本開示にしたがった方法またはアッセイを実行するのに適した濃度を有する試薬溶液を提供するであろう。キットにはさらに、本明細書に記載するような、任意の方法にしたがった方法の書面の説明が含まれてもよい。
【００８０】
［００１０８］１つの態様において、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のためのキットには、ターゲット分子に対する特異的アフィニティを有し、そしてタグを含む、少なくとも１つのアプタマー；および固体支持体であって、該固体支持体上に配置された少なくとも１つの捕捉剤が含まれ、そして捕捉要素が、アプタマー上のタグと会合可能である、前記固体支持体が含まれる。
【００８１】
［００１０９］別の態様において、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のためのキットには、ターゲット分子に対する特異的アフィニティを有し、そしてタグおよび標識を含む、少なくとも１つのアプタマー；および固体支持体であって、該固体支持体上に配置された少なくとも１つの捕捉剤が含まれ、そして捕捉要素が、アプタマー上のタグと会合可能である、前記固体支持体が含まれる。
【００８２】
［００１１０］別の態様において、試験試料中に存在しうる１以上のターゲット分子の検出および／または定量化のためのキットには、ターゲット分子に対する特異的アフィニティを有し、そして遊離可能タグおよび標識を含む、少なくとも１つのアプタマー；および固体支持体であって、該固体支持体上に配置された少なくとも１つの捕捉剤が含まれ、そして捕捉要素は、アプタマー上のタグと会合可能である、前記固体支持体が含まれる。
【００８３】
［００１１１］さらに、上述の任意のキットは、キットの検出法中の動力学的負荷の実行のための試薬および材料を含有してもよい。
［００１１２］方法
［００１１３］Ｉ．オリゴヌクレオチド
［００１１４］オリゴヌクレオチド：修飾塩基
［００１１５］本明細書において、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、そしてこうしたヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／または類似体、あるいは化学的に修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドが含まれてもよい。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、および「核酸」には、二本鎖または一本鎖分子、ならびに三重らせん分子が含まれる。
【００８４】
［００１１６］存在する場合、ヌクレオチドの化学的修飾には、単独でまたは任意の組み合わせで、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾（例えば、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３イル）エチル］カルボキサミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキサミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン、５−（イミダゾリルエチル）−２’−デオキシウリジン、および５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキサミド）−２’−デオキシウリジン）、８位プリン修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジンおよびイソグアニジンなどの異常な塩基対形成の組み合わせ等が含まれてもよい。修飾には、キャッピングなどの３’および５’修飾もまた含まれてもよい。他の修飾には、類似体での１以上の天然存在ヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結での修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および荷電連結での修飾（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラレンなど）での修飾、キレート剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、および修飾連結での修飾（例えばアルファ・アノマー核酸など）が含まれてもよい。さらに、糖に通常存在する任意のヒドロキシル基を、ホスホン酸基またはリン酸基によって置換するか；任意の適切な保護基によって保護するか；あるいはさらなるヌクレオチドまたは固体支持体へのさらなる連結に備えて活性化してもよい。５’および３’末端ＯＨ基をリン酸化するか、あるいは、アミン、約１〜約２０炭素原子の有機キャッピング基部分、または約１〜約２０のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーまたは他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーの有機キャッピング基部分で置換してもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾を、ポリマーの組み立て前または後に行ってもよい。非ヌクレオチド構成要素によって、ヌクレオチド配列を中断してもよい。標識化構成要素とのコンジュゲート化によるなどで、重合後にポリヌクレオチドをさらに修飾してもよい。
【００８５】
［００１１７］ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野に一般的に知られるリボースまたはデオキシリボース糖の類似体型も含有してもよく、これらには、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、無環類似体および脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上に記載するように、１以上のホスホジエステル連結を、別の連結基によって置換してもよい。これらの別の連結基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換されている態様が含まれ、式中、各ＲまたはＲ’は、独立に、Ｈ、あるいはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を場合によって含有する、置換または非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。糖、プリン、およびピリミジンの類似型の置換は、最終産物の設計に好都合である可能性もあり、例えばポリアミド主鎖のような別の主鎖構造も好都合でありうる。
【００８６】
［００１１８］１つの態様において、アプタマー構築物には、アプタマーの多様な領域中に、ターゲットからのアプタマーの解離速度を有効に遅延させる、１以上のＣ５修飾ヌクレオチドが含まれてもよい。アプタマーの可変領域の産生において用いるヌクレオチドの塩基修飾は、それぞれのターゲットから非常に遅い解離速度を有するアプタマーを生じることが示されてきている。例えば、図１６に例示するもののいずれかなどの５位修飾ピリミジンを含有するアプタマーは、そのターゲットからの遅い解離速度を有するという証拠がある。いくつかの態様において、この方式で修飾されているヌクレオチドを含むアプタマーを、動力学的負荷を含むアッセイ法で使用すると、ターゲットの検出において増進した感度および特異性が生じる。図５に示すように、今日までに、５００を超えるターゲットに対するアプタマーが産生されてきている。これらのアプタマーの多くは、遅い解離速度特性を有する。
【００８７】
［００１１９］１つの態様において、アプタマーの可変領域には、修飾塩基を有するヌクレオチドが含まれる。これらのアプタマーを、本明細書に記載する任意の方法、デバイス、およびキットで用いてもよい。これらの修飾ヌクレオチドが、ターゲットに対する高いアフィニティを維持しつつ、それぞれのターゲットからの非常に遅い解離速度を有するアプタマーの同定につながりうる証拠がある。１つの態様において、ピリミジン塩基のＣ５位を修飾してもよい。他の態様において、アプタマー中のプリンまたはピリミジンのいくつかまたはすべてが、塩基修飾ヌクレオチドであってもよい。さらに他の態様において、修飾プリンおよび修飾ピリミジンの両方の組み合わせもまた用いてもよい。修飾塩基を含むヌクレオチドを含有するアプタマーは、非修飾ヌクレオチド（すなわち天然存在ヌクレオチド）のみを含有するアプタマーとは異なる、いくつかの特性を有する。１つの態様において、ヌクレオチドの修飾法は、カルボキサミド連結を通じる。しかし、他の修飾法が適切でありうる。驚くべきことに、同定される、遅い解離速度のアプタマーの構造が、塩基対形成モデルによって予測される構造と一致しないようであることが観察された。これは、アプタマーの測定融解温度が、モデルが予測しうるものではないという事実によって裏付けられる。本明細書に示すように、測定および予測融解温度間には、ほとんどまたはまったく相関はないようである。さらに、平均して、計算Ｔｍは測定Ｔｍより６℃低い。測定融解温度は、これらの修飾ヌクレオチドを含むアプタマーが、予測されうるよりも安定であり、そして潜在的に、新規二次構造を所持することを示す。遅い解離速度のアプタマーの同定はまた、最初のライブラリーまたは候補混合物の産生中に修飾ヌクレオチドを用いた場合に、より可能性が高い。
【００８８】
［００１２０］特定の５位ピリミジン修飾には、米国特許第５，７１９，２７３号および第５，９４５，５２７号に記載するもの、特に図１９に示すものが含まれる。本明細書において、「修飾核酸」は、ＳＥＬＥＸ法に適合する１以上の修飾ヌクレオチドを含有する核酸配列を指す。
【００８９】
［００１２１］本開示の別の態様において、アプタマーがターゲットに対して約１００ｎＭ以下のＫｄを有し、ターゲットからのアプタマーの解離速度（ｔ１／２）が約３０分間より長く、そしてアプタマーの核酸配列中の１つ、いくつかまたはすべてのピリミジンが、塩基の５位で修飾されている、アプタマーおよびターゲットの非共有複合体を提供する。図１９に示す化合物群より修飾を選択してもよい。所望の塩基修飾ヌクレオチドの任意の組み合わせを用いて、アプタマーを設計してもよい。
【００９０】
［００１２２］ＩＩ．ＳＥＬＥＸおよびアプタマー
［００１２３］本明細書において、「アプタマー」および「核酸リガンド」は、交換可能に用いられ、ターゲット分子に対する特異的結合アフィニティを有する核酸を指す。アフィニティ相互作用は、程度の問題であることが認識される；が、この文脈では、ターゲットに対するアプタマーの「特異的結合アフィニティ」は、一般的に、試験試料中の他の構成要素に結合するよりも、はるかにより高い度合いのアフィニティで、アプタマーがそのターゲットに結合することを意味する。（単数の）「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つのタイプまたは種のコピーセットである。アプタマーには、いかなる適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。「（複数の）アプタマー」はこうした分子セットの１より多くを指す。異なるアプタマーは、同数かまたは異なる数か、いずれのヌクレオチドを有してもよい。本明細書に開示するいかなる方法にも、１以上のアプタマーの使用が含まれてもよい。本明細書に開示するいかなる方法にも、また、同じターゲット分子に特異的に結合する２以上のアプタマーの使用も含まれてもよい。以下にさらに記載するように、アプタマーにはタグが含まれてもよい。アプタマーにタグが含まれる場合、アプタマーのすべてのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーに、各々、タグが含まれる場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれを有してもよい。
【００９１】
［００１２４］ＳＥＬＥＸ法を含む、いかなる既知の方法を用いて、アプタマーを同定してもよい。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい。同定されたならば、化学的合成法および酵素的合成法を含めて、いかなる既知の方法にしたがって、アプタマーを調製するかまたは合成してもよい。
【００９２】
［００１２５］用語「ＳＥＬＥＸ」および「ＳＥＬＥＸ法」は、本明細書において交換可能に用いられ、一般的に、（１）望ましい方式でターゲット分子と相互作用する、例えばタンパク質に高いアフィニティで結合する、核酸の選択と、（２）これらの選択された核酸の増幅の組み合わせを指す。例えば、米国特許第５，４７５，０９６号、表題「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」を参照されたい。ＳＥＬＥＸ法を用いて、ターゲットと共有結合するアプタマー、ならびにターゲットに非共有的に結合するアプタマーを生成してもよい。例えば、米国特許第５，７０５，３３７号、表題「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」を参照されたい。ＳＥＬＥＸ法はまた、本出願と同時に出願され、そしてその全体が本明細書に援用される、米国出願第１２／１７５，４３４号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」に記載されるような、改善された解離速度を持つアプタマーを生成するためにも使用可能である。
【００９３】
［００１２６］本明細書において、用語「アプタマー・アフィニティ複合体」または「アプタマー複合体」は、アプタマーとそのターゲット分子との相互作用によって形成される非共有複合体を指す。（単数の）「アプタマー・アフィニティ複合体」または「アプタマー複合体」は、対応するターゲット分子に結合したアプタマーによって形成される１つのタイプまたは種の複合体のコピーセットである。「（複数の）アプタマー・アフィニティ複合体」または「（複数の）アプタマー複合体」は、１より多いこうした複合体セットを指す。アプタマー・アフィニティ複合体またはアプタマー複合体は、一般的に、環境条件の変化、例えば温度増加、塩濃度増加、または変性剤添加によって逆転するかまたは解離することも可能である。
【００９４】
［００１２７］本明細書において、「非特異的複合体」は、アプタマーおよびそのターゲット分子以外の２以上の分子間の非共有結合を指す。非特異的複合体は、構成要素分子間のアフィニティ相互作用に基づいては選択されずに、分子クラス間の相互作用に相当するため、非特異的複合体において会合する分子は、平均して、互いに対してはるかに低いアフィニティを示し、そしてアプタマーおよびそのターゲット分子よりもそれに対応して高い解離速度を有するであろう。非特異的複合体には、アプタマーおよび非ターゲット分子、競合剤および非ターゲット分子、競合剤およびターゲット分子、ならびにターゲット分子および非ターゲット分子間で形成される複合体が含まれる。
【００９５】
［００１２８］ＳＥＬＥＸ法は、一般的に、異なる配列の核酸の候補混合物の調製とともに始まる。候補混合物には、一般的に、２つの固定領域（すなわち候補混合物メンバー各々が、同じ位置に同じ配列を含有する）および可変領域を含む核酸配列が含まれる。典型的には、これらが以下に記載する増幅工程を補助するか、または候補混合物中の核酸の所定の構造配置の潜在能力を増進するような、固定配列領域を選択する。可変領域は、典型的には、候補混合物中の各核酸のターゲット結合領域を提供し、そしてこの可変領域は、完全にランダム化（すなわちいかなる位でも塩基が４つのうち１つであることを見出すことが可能）されていてもまたは部分的にのみランダム化（例えば、塩基を見出す可能性が、いかなる部位でも０〜１００パーセントの間の任意のレベルで選択可能である）されていてもよい。ターゲットおよび候補混合物メンバー間で結合が生じるのを支持する条件下で、調製された候補混合物を、選択されたターゲットと接触させる。これらの条件下で、ターゲットおよび候補混合物の核酸間の相互作用は、一般的に、対のメンバー間の最強の相対的アフィニティを有する核酸−ターゲット対を形成する。ターゲットに対する最高のアフィニティを持つ核酸を、ターゲットに対するより低いアフィニティを持つ核酸から分配する。高アフィニティ候補を最大数で保持する方式で、分配プロセスを実行する。ターゲットに対して比較的高いアフィニティを有するとして、分配中に選択された核酸を増幅して、ターゲットに対して比較的高いアフィニティを有する核酸が濃縮された、新規候補混合物を生成する。上記の分配および増幅工程を反復することによって、新規に形成される候補混合物は、より少ないユニークな配列を含有し、そしてターゲットに対する核酸混合物のアフィニティの平均の度合いは、一般的に増加する。極端に言えば、ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット分子に対する最高のアフィニティを有する元来の候補混合物由来の核酸に相当するユニークな核酸を１つまたは非常に少数含有する、候補混合物を生じるであろう。
【００９６】
［００１２９］ＩＩＩ．光ＳＥＬＥＸ
［００１３０］光アプタマー定義
［００１３１］架橋法
［００１３２］本明細書において、「光アプタマー」、「光反応性核酸リガンド」、および「光反応性アプタマー」は交換可能に用いられ、ターゲット分子に共有結合するかまたは該分子と「架橋する」ことも可能な、１以上の光反応性官能基を含有するアプタマーを指す。例えば、天然存在核酸残基を修飾して、適切な波長の照射供給源に対する曝露に際して核酸残基に光反応性を与える、化学的官能基を含ませてもよい。いかなる既知の方法を用いて、光アプタマーを同定し、そして／または調製してもよい。いくつかの態様において、光ＳＥＬＥＸ法を用いて、光反応性アプタマーを同定する。例えば、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、および米国特許第６，２９１，１８４号、各々、表題「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ」を参照されたい；また、例えば、米国特許第６，４５８，５３９号、表題「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、および本出願と同時に出願され、そしてその全体が本明細書に援用される、米国出願第１２／１７５，３８８号、表題「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」も参照されたい。
【００９７】
［００１３３］光アプタマー内に取り込んでもよい例示的な光反応性官能基には、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−ヨードビニルウラシル、５−アジドウラシル、４−チオウラシル、５−チオウラシル、４−チオシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−ブロモビニルシトシン、５−ヨードビニルシトシン、５−アジドシトシン、８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン、８−ヨードアデニン、８−アジドグアニン、８−ブロモグアニン、８−ヨードグアニン、８−アジドヒポキサンチン、８−ブロモヒポキサンチン、８−ヨードヒポキサンチン、８−アジドキサンチン、８−ブロモキサンチン、８−ヨードキサンチン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］シトシン、５−［（４−アジドフェナシル）チオ］ウラシル、７−デアザ−７−ヨードアデニン、７−デアザ−７−ヨードグアニン、７−デアザ−７−ブロモアデニン、および７−デアザ−７−ブロモグアニンが含まれる。
【００９８】
［００１３４］これらのヌクレオシドに基づく例示的な光反応性官能基に加えて、適切なリンカー分子を通じてアプタマーの末端に添加可能な他の光反応性官能基を用いてもよい。こうした光反応性官能基には、ベンゾフェノン、アントラキノン、４−アジド−２−ニトロ−アニリン、ソラレン、これらのいずれかの誘導体等が含まれる。
【００９９】
［００１３５］いかなる適切な方法によって、光アプタマー内に取り込まれる光反応性官能基を活性化してもよい。１つの態様において、光アプタマー・アフィニティ複合体を、電磁放射線の線源に曝露することによって、光反応性官能基を含有する光アプタマーをそのターゲットに架橋する。適切なタイプの電磁放射線には、紫外光、可視光、Ｘ線、およびガンマ線が含まれる。適切な放射線源には、単色光またはフィルター処理した多色光のいずれかを利用する供給源が含まれる。
【０１００】
［００１３６］本明細書において、用語「アプタマー共有複合体」は、アプタマーがそのターゲット分子と共有結合を形成するように誘導されているかまたは別の方式でターゲット分子との共有結合を形成しているアプタマー・アフィニティ複合体を指す。（単数の）「アプタマー共有複合体」は、対応するターゲット分子に共有結合しているアプタマーによって形成される複合体の１つのタイプまたは種のコピーセットである。「（複数の）アプタマー共有複合体」は、１より多いこうした複合体セットを指す。光アプタマーに関して上述する部分を含めて、アプタマー上の化学的部分の光活性化によって、アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合または連結を誘導してもよい。アプタマーおよびそのターゲット分子間の共有結合または連結を化学的に誘導してもよい。アプタマー中に含まれてもよく、そしてターゲットとの共有連結を誘導するのに使用可能な化学基には、限定されるわけではないが、アルデヒド、マレイミド、アクリリル誘導体、ジアゾニウム誘導体、チオール等が含まれる。いくつかの態様において、例えばマレイミドまたはジアゾニウム塩などの化学的架橋基は、単に、特異的でそして十分に増進された化学的反応性が生じるために必要な、適切な環境および反応基の並置を提供することによって、アプタマー・アフィニティ複合体をアプタマー共有複合体に変換可能である。他の態様において、化学的架橋剤、例えばアルデヒド基は、アプタマー・アフィニティ複合体を、安定な不可逆的アプタマー共有複合体に変換するために、別の構成要素、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加を必要としうる。さらに他の態様において、こうした化学的架橋剤はアプタマー中にまったく含まれず；第三の試薬を用いて、アプタマーおよびそのターゲット間の共有結合を促進することによって、アプタマー・アフィニティ複合体をアプタマー共有複合体に変換する。例えば、アミン反応性部分（例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、アルデヒド、またはイミデート）およびヌクレオシド反応基（例えばヨードアセトアミドまたは活性化アルデヒド）の両方を含有するホモまたはヘテロ二重官能性試薬は、アプタマー・アフィニティ複合体、例えばアプタマーおよびターゲットタンパク質によって形成されるアフィニティ複合体の共有複合体化を誘導可能である。
【０１０１】
［００１３７］アフィニティ・アプタマーをまず同定し、そして１以上の光反応性ヌクレオチド残基において置換することによって、光アプタマーを同定してもよい。あるいは、以下の工程を含むＳＥＬＥＸ法によって光アプタマーを同定してもよい：（ａ）各々、（ｉ）少なくとも１つの非光反応性位置維持（ｐｌａｃｅｈｏｌｄｉｎｇ）ピリミジンおよび（ｉｉ）少なくとも１つの修飾ピリミジンを含む核酸の候補混合物を調製し；（ｂ）ターゲットと候補混合物を接触させ、ここで候補混合物に比較して、ターゲットに対する増加したアフィニティを有する核酸を、候補混合物の残りから分配してもよく；（ｃ）候補混合物の残りからアフィニティが増加した核酸を分配し；（ｄ）アフィニティが増加した核酸を増幅して、核酸の核酸リガンド濃縮混合物を生じ、それによってターゲット化合物に対するアプタマーを同定してもよく；（ｅ）望ましいように、（ｂ）〜（ｄ）を反復し；（ｆ）（ｄ）の核酸リガンド濃縮混合物の各核酸において、１以上の非光反応性位置維持ピリミジンを光反応性ピリミジンで置換することによって、候補光アプタマーを産生し；（ｇ）候補光アプタマーをターゲットと接触させ、ここで候補光アプタマー−ターゲット複合体を形成し；（ｈ）前記候補光アプタマー−ターゲット複合体に照射し；（ｉ）前記候補光アプタマー−ターゲット複合体が光架橋されているかどうかを決定し；（ｊ）望ましいように、（ｆ）〜（ｉ）を反復し；そして（ｋ）ターゲットに対する少なくとも１つの光アプタマーを同定する。
【０１０２】
［００１３８］ＩＶ．試験試料およびターゲット分子
［００１３９］用語「試験試料」は、本明細書において、複数の分子を含有し、そして少なくとも１つのターゲット分子を含みうる、任意の物質、溶液、または混合物を指す。用語、試験試料には、以下に定義するような生物学的試料、ならびに例えば汚染されたかまたは潜在的に汚染された水および産業廃水などの、環境または毒性試験に使用可能な試料が含まれる。試験試料はまた、準備プロセス、例えば製造プロセスの最終産物、中間産物、または副産物であってもよい。試験試料には、生物から、またはいくつかの他の供給源（例えば環境または産業供給源）から得られた、物質、溶液、または混合物に添加されている、任意の適切なアッセイ培地、緩衝液、または希釈剤が含まれてもよい。
【０１０３】
［００１４０］用語「生物学的試料」は、生物から得られた任意の物質、溶液、または混合物を指す。これには、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、血漿、および血清を含む）、痰、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、および脳脊髄液が含まれる。これにはまた、前述のすべての実験的に分離された分画も含まれる。用語「生物学的試料」にはまた、例えば糞便試料、組織試料、または組織生検由来のものなどの、ホモジナイズした固形物質を含有する、物質、溶液、または混合物も含まれる。用語「生物学的試料」にはまた、組織培養、細胞培養、細菌培養、またはウイルス培養由来の物質、溶液、または混合物も含まれる。
【０１０４】
［００１４１］本明細書において、「ターゲット分子」および「ターゲット」は交換可能に用いられ、アプタマーが高いアフィニティおよび特異性で結合可能であり、そして試験試料中に存在しうる、関心対象のいかなる分子も指す。「関心対象の分子」には、特定の分子のいかなる重要でない変動も含まれ、例えば、タンパク質の場合、例えばアミノ酸配列の重要でない変動、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾のいずれか、例えば分子の同一性を実質的に改変しない標識化構成要素とのコンジュゲート化が含まれる。（単数の）「ターゲット分子」または「ターゲット」は、アプタマーに結合可能な分子または多分子構造の１つのタイプまたは種のコピーセットである。「（複数の）ターゲット分子」または「（複数の）ターゲット」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。例示的なターゲット分子には、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬剤、色素、栄養物、増殖因子、細胞、組織、および前述の任意のものの任意の断片または部分が含まれる。任意のサイズの実質的に任意の化学的または生物学的分子に関してアプタマーを同定してもよく、そしてしたがって、任意のサイズの実質的に任意の化学的または生物学的分子も適切なターゲットでありうる。また、ターゲットを修飾して、ターゲットおよびアプタマー間の相互作用の可能性または強度を増進してもよい。また、上に定義するように、タグを含むようにターゲットを修飾してもよい。例示的な態様において、ターゲット分子はタンパク質である。ＳＥＬＥＸターゲットがペプチドである方法に関しては、米国特許第６，３７６，１９０号、表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」を参照されたい。
【０１０５】
［００１４２］「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは直鎖でもまたは分枝鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、そして非アミノ酸によって中断されてもよい。該用語はまた、天然にまたは介入によって；例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、あるいは他の操作または修飾のいずれか、例えば標識化構成要素とのコンジュゲート化によって修飾されているアミノ酸ポリマーも含む。定義内にやはり含まれるのは、例えば、アミノ酸の１以上の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）、ならびに当該技術分野に知られる他の修飾を含有するポリペプチドである。ポリペプチドは一本鎖または会合鎖であってもよい。
【０１０６】
［００１４３］本明細書において、「非ターゲット分子」および「非ターゲット」は、交換可能に用いられ、アプタマーと非特異的複合体を形成しうる、試験試料中に含有される分子を指す。（単数の）「非ターゲット分子」または「非ターゲット」は、アプタマーに結合可能な分子または多分子構造の１つのタイプまたは種のコピーセットである。「（複数の）非ターゲット分子」または「（複数の）非ターゲット」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。第一のアプタマーに関して非ターゲットである分子が、第二のアプタマーに関してターゲットであってもよいことが認識されるであろう。同様に、第一のアプタマーに関してターゲットである分子は、第二のアプタマーに関して非ターゲットであってもよい。
【０１０７】
［００１４４］Ｖ：捕獲１−アプタマーに基づく分配
［００１４５］本明細書において、用語「分配」は、試験試料からの１以上の分子種の分離または除去を指す。分配を用いて、感度を増加させそして／またはバックグラウンドを減少させることも可能である。分配は、アプタマー（または共有）複合体形成後、またはアプタマー・アフィニティ複合体が架橋中に導入された共有結合のために不可逆的となった際に、最も有効である。アプタマー・アフィニティ複合体が固定されている任意の工程後、またはすべての工程後に、分配工程を導入してもよい。分配はまた、サイズ示差またはアプタマー・アフィニティ複合体および試験試料の他の構成要素間に示差的に存在する他の特異的特性に頼ってもよい。分配はまた、アプタマーまたはターゲットとの特異的相互作用を通じても達成可能である。分配はまた、アプタマー、ターゲット、アプタマー・アフィニティ複合体またはアプタマー共有複合体の物理的または生化学的特性に基づいても達成可能である。
【０１０８】
［００１４６］本明細書において、「捕獲１」は、アプタマーの捕捉に基づく、アプタマー・アフィニティ複合体またはアプタマー共有複合体の分配を指す。捕獲１工程の目的は、アプタマーと会合していない試験試料中の実質的にすべての構成要素を除去することである。一般的に、こうした構成要素を大部分除去すると、捕獲２捕捉に用いたターゲットタグ化工程から非ターゲット分子を除去することによって、ターゲットタグ化効率が改善され、そしてより低いアッセイバックグラウンドが導かれうる。１つの態様において、アッセイ前、アッセイ調製中、またはアッセイ中のいずれかに、アプタマーにタグを付け加えることによって、タグをアプタマーに付着させる。１つの態様において、タグは遊離可能タグである。１つの態様において、遊離可能タグは、切断可能リンカーおよびタグを含む。上述のように、タグ化アプタマーを固体支持体上に捕捉してもよく、この場合、固体支持体はタグに適した捕捉要素を含む。次いで、固体支持体を洗浄して、アプタマーと会合していない、試験混合物中のいかなる物質も除去してもよい。
【０１０９】
［００１４７］多様な態様において、アプタマー内に取り込まれた捕捉タグ（アプタマータグ）を用いて、アプタマー・アフィニティ（または共有）複合体を固体支持体上に捕捉するかまたは固定する。例えば、上述のように、アプタマー上の捕捉タグがビオチンである場合、表面上にアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ等を有するビーズを用いて、アプタマー・アフィニティ（または共有）複合体を捕捉してもよい。ビーズを洗浄して、いかなる未結合（非複合体化）ターゲットおよび他の試料マトリックス構成要素も除去する。
【０１１０】
［００１４８］別の態様において、タグは、第一の固体支持体上に固定されたプローブに相補的なハイブリダイゼーションタグである。この場合の固体支持体には、マイクロビーズ（例えば常磁性ビーズ）、本明細書に記載する任意の他の適切な固体支持体等が含まれてもよい。ハイブリダイゼーションタグは、アプタマーに付加されるユニークな配列タグであってもよいし、またはアプタマー配列の部分であってもよいし、または全アプタマー配列であってもよい。ハイブリダイゼーションによって、アプタマーを固体支持体と会合させた後、試験試料を洗浄して、アプタマーと会合していないいかなる物質も除去してもよい。１つの態様において、ハイブリダイゼーションを逆転させる任意の適切な方法、例えば高塩、低または高ｐＨ、高温またはこれらのいずれかの組み合わせを用いて、アプタマー共有複合体および未結合アプタマーを固体支持体から遊離させてもよい。捕獲１中のハイブリダイゼーションタグの遊離は、一般的に、アプタマー・アフィニティ複合体を保持することと適合しないが、これはタグ−プローブ・ハイブリダイゼーションの破壊を導く条件が、一般的に、アプタマー構造の変性を導き、アプタマー・アフィニティ複合体の解離を生じるためである。
【０１１１】
［００１４９］別の態様において、明確なアプタマータグおよび第一の固体支持体よりむしろ、物理的技術を用いて、アプタマーと会合していない構成要素の除去を達成可能である。１つの態様において、未結合および複合体化両方のアプタマーを試験試料から沈殿させ、ターゲットタグ化剤と反応可能な他の分子を、廃棄される上清中に残すことによって、これを達成する。この方法は、光架橋アッセイで使用するために設計されることに注目されたい。セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＤＴＡＢ）、および例えばエタノールなどの有機溶媒を含む試薬で、こうした核酸沈殿を達成してもよい。
【０１１２】
［００１５０］ＶＩ：捕獲２−タンパク質に基づく分配
［００１５１］本明細書において、「捕獲２」は、ターゲット分子の捕捉に基づくアプタマー・アフィニティ複合体またはアプタマー共有複合体の分配を指す。捕獲２工程の目的は、検出および場合による定量化の前に、未結合または非複合体化アプタマーを試験試料から除去することである。未結合アプタマーを試料から除去すると、任意の適切な核酸検出技術によって、アプタマー・アフィニティまたはアプタマー共有複合体の検出が可能になる。検出および場合による定量化のためにＱＰＣＲを用いる場合、ターゲット分子の正確な検出および定量化のため、未結合アプタマーの除去が必要である。
【０１１３】
［００１５２］１つの態様において、ターゲット分子は、タンパク質またはペプチドであり、そして未結合アプタマーは、タンパク質（およびペプチド）およびタンパク質（またはペプチド）を含む複合体、例えばアプタマー・アフィニティ（または共有）複合体内に取り込まれうる試薬を用いて、アプタマー・アフィニティ（または共有）複合体（および試験試料の残り）から分配される。タグ化タンパク質（またはペプチド）およびアプタマー・アフィニティ（または共有）複合体を固体支持体上に固定し、未結合アプタマーからのタンパク質（またはペプチド）およびアプタマー・アフィニティ（または共有）複合体の分配を可能にしてもよい。こうしたタグ化には、例えば、タンパク質またはペプチド内に取り込まれうるビオチン部分が含まれてもよい。
【０１１４】
［００１５３］１つの態様において、アッセイ前、アッセイ調製中、またはアッセイ中のいずれかで、ターゲットにタグを化学的に付着させることによって、捕獲２タグをタンパク質（またはペプチド）に付着させる。１つの態様において、捕獲２タグは遊離可能タグである。１つの態様において、遊離可能タグは、切断可能リンカーおよびタグを含む。必ずしもではないが一般的に、捕獲２固体支持体からタンパク質（またはペプチド）が遊離する。上述のように、ターゲットタグに適した捕捉要素を含む第二の固体支持体上に、タグ化ターゲットを捕捉してもよい。次いで、固体支持体を洗浄して、溶液から未結合アプタマーを除去してもよい。
【０１１５】
［００１５４］１つの態様において、捕獲２のために導入されるターゲットタグは、捕獲１のために用いられるアプタマー上のものと同じタグである。この態様において、捕獲１工程後および捕獲２固体支持体の導入前に、ターゲットタグ化を実行する。１つの態様において、捕獲１支持体上にありつつターゲットタグ化が行われる場合、ターゲットタグ化前に、捕獲１支持体上のアプタマーで占められていない部位をブロッキングしてもよい。
【０１１６】
［００１５５］別の態様において、アプタマー・アフィニティ複合体またはアプタマー共有複合体を、第二の固体支持体上の捕捉試薬との会合を通じて、直接、第二の固体支持体上に捕捉してもよい。この態様において、明確なターゲットタグ化は必要ではない。１つの態様において、第二の固体支持体は、ターゲット分子に結合する抗体を含有する。別の態様において、支持体は、ターゲット分子に結合するＦｃ断片を含有する。別の態様において、ターゲット分子がＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＥである場合、支持体は、ターゲットタンパク質に結合するため、プロテインＡを含有してもよい。捕獲２工程のため、アプタマー・アフィニティまたはアプタマー共有複合体中のターゲット分子に結合する任意の捕捉試薬を用いてもよい。
【０１１７】
［００１５６］別の態様において、明確なターゲットタグおよび第二の固体支持体よりむしろ、物理的技術を用いて、未結合アプタマーの除去を達成してもよい。１つの態様において、ターゲット分子がタンパク質またはペプチドである場合、アプタマー共有複合体を沈殿させ、そして未結合アプタマーを廃棄される上清中に残すことによって、これを達成する［これは共有複合体に関してのみ有効であることに注目されたい］。こうしたタンパク質またはペプチド沈殿は、例えば、ＳＤＳおよび高塩、通常Ｋ＋で達成可能である。ＳＤＳ−Ｋ＋沈殿後、定量化のために、アプタマー共有複合体を回収してもよい。
【０１１８】
［００１５７］第二の固体支持体を洗浄することによって未結合アプタマーを除去した後、次いで、複合体が破壊されて、未結合アプタマーを生じる一方、ターゲット分子は、一般的に、プローブおよびターゲット捕捉タグの結合相互作用を通じて、固体支持体に結合したままである解離工程に、アプタマー・アフィニティ複合体を供する。アプタマーまたはターゲットのいずれかの構造を破壊する任意の方法によって、アプタマー・アフィニティ複合体からアプタマーを遊離させてもよい。非共有結合アプタマー−ターゲット複合体を解離させる高塩緩衝液中で、支持体に結合したアプタマー・アフィニティ複合体を洗浄することを通じて、これを達成してもよい。溶出した未結合アプタマーを収集し、そして検出する。別の態様において、高または低ｐＨを用いて、アプタマー・アフィニティ複合体を破壊する。別の態様において、高温を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体を解離させる。別の態様において、上記方法の任意の組み合わせが使用可能である。
【０１１９】
［００１５８］アプタマー共有複合体の場合、アプタマー構築物中の切断可能リンカーを用いて、続く定量化のために、アプタマーの遊離を達成する。別の態様において、ターゲットタグ中の切断可能リンカーは、アプタマー共有複合体の遊離を生じるであろう。
【０１２０】
［００１５９］競合剤を用いた動力学的負荷
［００１６０］本明細書において、「競合剤分子」および「競合剤」は、交換可能に用いられ、非ターゲット分子と非特異的複合体を形成して、例えば非ターゲット分子がアプタマーに非特異的に再結合するのを防止しうる任意の分子を指す。（単数の）「競合剤分子」または「競合剤」は、分子の１つのタイプまたは種のコピーセットである。「（複数の）競合剤分子」または「（複数の）競合剤」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。競合剤分子には、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えば、ヘパリン、一本鎖サケ精子ＤＮＡ、およびポリデキストラン（例えば硫酸デキストラン））、脱塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、およびピロホスフェートが含まれる。競合剤を用いる動力学的負荷の場合、競合剤はまた、未結合アプタマーと非特異的複合体を形成して、例えばそのアプタマーが非ターゲット分子に非特異的に再結合するのを防止しうる任意の分子であってもよい。こうした競合剤分子には、ポリカチオン（例えば、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、およびポリアルギニン）およびアミノ酸（例えばアルギニンおよびリジン）が含まれる。動力学的負荷として競合剤を用いる場合、試料中に存在する総タンパク質または総アプタマーの予期される濃度に比較して、かなり高い濃度を利用する。１つの態様において、動力学的負荷において、競合剤として、１０ｍＭ硫酸デキストランを用いる。
【０１２１】
［００１６１］希釈を用いた動力学的負荷
［００１６２］いくつかの態様において、結合緩衝液またはアプタマー・アフィニティ複合体の解離天然速度を有意に増加させない任意の他の溶液で、試験試料を希釈することによって、動力学的負荷を実行する。希釈は、約２Ｘ、約３Ｘ、約４Ｘ、約５Ｘ、または任意の適切なより大きい希釈であってもよい。より大きい希釈は、希釈後、総タンパク質およびアプタマーの濃度を減少させ、そしてしたがってその再会合速度を減少させることによって、より有効な動力学的負荷を提供する。動力学的負荷を導入するために希釈を用いる場合、アプタマー・アフィニティ複合体を含有する続く試験試料混合物を、さらなるプロセシング前に濃縮してもよい。適用可能な場合、試験試料からのすべての未結合アプタマーの場合による分配および／またはタグ化剤と反応しうる試験試料の他の構成要素の場合による除去に関して、本明細書に記載する方法を用いて、この濃縮を達成してもよい。希釈を動力学的負荷として用いる場合、最初の試験試料体積、および複合体の有意な喪失を招くことなく、最終（希釈）体積からアプタマー・アフィニティ複合体を回収する望ましさの両方を考慮して、出来るだけ高いように希釈量を選択する。
【０１２２】
［００１６３］希釈および競合剤を用いた動力学的負荷
［００１６４］いくつかの態様において、試料希釈効果および競合剤導入効果が同時に達成される方式で、動力学的負荷を実行する。例えば、試験試料を大量の競合剤で希釈してもよい。これらの２つの動力学的負荷戦略を合わせると、１つの戦略を用いて達成されうるより有効な動力学的負荷が提供されうる。１つの態様において、希釈は、約２Ｘ、約３Ｘ、約４Ｘ、約５Ｘ、または任意の適切なより大きい希釈であってもよく、そして競合剤は、１０ｍＭ硫酸デキストランである。
【０１２３】
［００１６５］ＶＩＩＩ．捕捉要素、タグおよびプローブ
［００１６６］多様な態様において、アプタマー内に取り込まれたタグ（アプタマータグ）またはターゲットに付着したタグを用いて、固体支持体上にアプタマー・アフィニティ（または共有）複合体を捕捉するかまたは固定する。例えば、アプタマー上のタグがビオチンである場合、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ等の捕捉要素を有するビーズを用いて、アプタマー・アフィニティ（または共有）複合体を捕捉してもよい。ビーズを洗浄して、いかなる未結合（非複合体化）ターゲットも除去する。
【０１２４】
［００１６７］タグ組成物
［００１６８］本明細書に開示するように、アプタマーは、「タグ」をさらに含んでもよく、タグは、固体支持体にアプタマーを（およびそれに結合したいかなるターゲット分子も）付着させるかまたは固定するための手段を提供する構成要素を指す。（単数の）「タグ」は、「捕捉要素」と会合可能な構成要素の１つのタイプまたは種のコピーセットである。「（複数の）タグ」または「（複数の）捕捉要素」は、構成要素のこうしたセットの１より多くを指す。任意の適切な方法によって、タグをアプタマーに付着させてもよいし、またはタグがアプタマーに含まれてもよい。一般的に、タグは、アプタマーが、固体支持体に付着した捕捉要素または受容体と、直接または間接的にのいずれかで会合することを可能にする。捕捉要素は、典型的には、タグと非常に特異的に相互作用し、そして続くプロセシング工程または方法中、その会合が保持されるように選択（または設計）される。タグは、固体支持体上の空間的に定義されたアドレスに、アプタマー・アフィニティ複合体（または共有アプタマー・アフィニティ複合体）を局在させることを可能にしうる。したがって、異なるタグは、固体支持体上の空間的に定義された異なるアドレスに、異なるアプタマー共有複合体を局在させることを可能にしうる。タグは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、ポリヒスチジン、あるいはこれらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいは捕捉要素（または以下に記載するようなリンカー分子）が、特異性を持って結合するかまたは別の方式で会合するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造であってもよい。一般的に、タグは、分子内で、それ自体と、あるいはそのタグが付着しているかまたはそのタグが一部となっているアプタマーと相互作用しないように設定される。ＳＥＬＥＸを用いてアプタマーを同定する場合、ＳＥＬＥＸ前またはＳＥＬＥＸ後のいずれかで、タグをアプタマーに添加してもよい。１つの態様において、ＳＥＬＥＸ後、アプタマーの５’端上にタグが含まれる。別の態様において、ＳＥＬＥＸ後、アプタマーの３’端上にタグが含まれる。さらに別の態様において、タグは、ＳＥＬＥＸ後修飾プロセスにおいて、アプタマーの３’および５’端上の両方に含まれてもよい。別の態様において、タグは、アプタマーの内部であってもよい。
【０１２５】
［００１６９］１つの態様において、タグはビオチン基であり、そして捕捉要素はアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎなどのビオチン結合性タンパク質である。ビオチンは、合成中に容易にアプタマー内に取り込まれ、そしてストレプトアビジンビーズは容易に入手可能であるため、この組み合わせは、多様な態様において好適に使用可能である。
【０１２６】
［００１７０］１つの態様において、タグはポリヒスチジンであり、そして捕捉要素は、ニッケル、コバルト、鉄、またはＮＴＡでキレートした際にポリヒスチジンと配位化合物を形成可能な任意の他の金属イオンでキレートしたニトロロ三酢酸（ｎｉｔｏｒｏｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（ＮＴＡ）である。
【０１２７】
［００１７１］１つの態様において、タグは、相補的ポリヌクレオチド配列を含有する捕捉要素と直接ハイブリダイズするように設計されたポリヌクレオチドである。この場合、タグはときに、「配列タグ」と呼ばれ、そして捕捉要素は、一般的に、「プローブ」と呼ばれる。この態様において、タグは一般的に設定され、そしてタグが完全な相補体であるプローブ以外のプローブとはタグがハイブリダイズしない条件下でハイブリダイゼーション反応を実行する。これによって、各タグ／プローブ組み合わせがユニークな配列を有しうるため、多重化アッセイ形式の設計が可能になる。
【０１２８】
［００１７２］いくつかの態様において、タグはアプタマー自体の一部であるヌクレオチドを含む。例えば、ＳＥＬＥＸを用いてアプタマーを同定する場合、アプタマーには、一般的に、アプタマーに応じて多様であるヌクレオチド配列、すなわち可変領域によって、３’固定端から分離された５’固定端が含まれる。１つの態様において、タグは、アプタマーの固定端に含まれる任意の適切な数のヌクレオチド、例えば、固定端全体または固定端の任意の一部を含んでもよく、固定端より内部のヌクレオチドを含んでもよい。別の態様において、タグは、アプタマーの可変領域内に含まれる任意の適切な数のヌクレオチドを含んでもよいし、例えば、可変領域全体または可変領域の任意の一部を含んでもよい。さらなる態様において、タグは、可変領域および一方の固定端の両方に重なり合う任意の適切な数のヌクレオチドを含んでもよく、すなわち、タグは、可変領域の任意の部分（すべてを含む）および固定端の任意の部分（すべてを含む）を含んでもよい。
【０１２９】
［００１７３］別の態様において、タグは直接プローブと会合し、そしてプローブに共有結合して、それによって、固体支持体表面にアプタマーを共有結合させてもよい。この態様において、タグおよびプローブには、プローブとタグとの会合に際して、互いに十分に近接して、共有結合を生じる化学反応を経る、適切な反応基が含まれてもよい。反応は、自発的に起きてもよいし、あるいは活性化、例えば光活性化または化学的活性化を必要としてもよい。１つの態様において、タグにはジエン部分が含まれ、そしてプローブには求ジエン（ｄｉｅｎｏｐｈｉｌｅ）が含まれて、そして共有結合形成は、ジエンおよび求ジエンの自発的なディールス−アルダー・コンジュゲート化反応から生じる。例えば、Ｎ−マンニッヒ反応、ジスルフィド形成、カーティス反応、アルドール縮重、シッフ塩基形成、およびマイケル付加などの任意の適切な補完的化学反応を用いてもよい。
【０１３０】
［００１７４］別の態様において、以下にさらに記載するように、タグは、例えばリンカー分子を通じて、プローブと間接的に会合する。この態様において、タグには、リンカー分子の特定の領域または構成要素に相補的なポリヌクレオチド配列が含まれてもよい。タグは一般的に設定され、そしてリンカー分子中に含まれるポリヌクレオチド配列以外のポリヌクレオチド配列とタグがハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション反応が行われる。
【０１３１】
［００１７５］タグにポリヌクレオチドが含まれる場合、ポリヌクレオチドには、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。１つの態様において、タグには、少なくとも約１０ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、タグには、約１０〜約４５ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、タグには、少なくとも約３０ヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドが含まれる、異なるタグには、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかが含まれてもよい。
【０１３２】
［００１７６］いくつかの態様において、タグ構成要素は二重官能性であり、これには、固体支持体上の捕捉要素との特異的相互作用に関する官能性または以下に定義するような「プローブ」（プローブ会合構成要素）、および付着している分子をタグのプローブ会合構成要素から解離させるための官能性が含まれる。タグのプローブ会合構成要素を解離させるための手段には、化学的手段、光化学的手段または使用される特定のタグに応じる他の手段が含まれる。
【０１３３】
［００１７７］いくつかの態様において、タグをアプタマーに付着させる。他の態様において、タグをターゲット分子に付着させる。アプタマー結合工程の前に、ターゲット分子にタグを付着させてもよいし、あるいは結合平衡（または光架橋）が達成された後、ターゲット分子またはアプタマー・アフィニティ（または光）複合体に付着させてもよい。
【０１３４】
［００１７８］捕捉要素組成物
［００１７９］本明細書において、「捕捉要素」、「プローブ」または「受容体」は、タグと直接または間接的にのいずれかで会合するように設定された分子を指す。（単数の）「捕捉要素」、「プローブ」または「受容体」は、タグと直接または間接的にのいずれかで会合することによって、タグが付着する部分を固体支持体に固定することが可能な、分子の１つのタイプまたは多分子構造の１つのタイプのコピーセットである。「（複数の）捕捉要素」、「（複数の）プローブ」または「（複数の）受容体」は、分子のこうしたセットの１より多くを指す。捕捉要素、プローブまたは受容体は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、ポリヒスチジン、あるいはこれらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいはタグ（またはリンカー分子）が、特異性を持って結合するかまたは別の方式で会合するように設計されるかまたは設定されうる任意の他の構造であってもよい。任意の適切な方法によって、捕捉要素、プローブまたは受容体を共有的または非共有的のいずれかで、固体支持体に付着させてもよい。
【０１３５】
［００１８０］用語「捕捉要素」、「プローブ」および「受容体」は、交換可能に用いられるが、プローブは、一般的に、ポリヌクレオチド配列を指す。１つの態様において、プローブには、ポリヌクレオチドタグ配列に相補的な配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。この態様において、プローブ配列は一般的に設定され、そしてプローブが相補配列を含むタグ以外のヌクレオチド配列にはプローブがハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる（すなわち、プローブは一般的に設定され、そして異なるタグまたはアプタマーとプローブがハイブリダイズしないような条件下で、ハイブリダイゼーション反応が行われる）。
【０１３６】
［００１８１］別の態様において、プローブは、タグと間接的に、例えばリンカー分子を通じて会合する。この態様において、プローブには、リンカー分子の特定の領域または構成要素に相補的なポリヌクレオチド配列が含まれてもよい。プローブは一般的に設定され、そしてリンカー分子中に含まれるポリヌクレオチド配列以外のポリヌクレオチド配列とプローブがハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション反応が行われる。
【０１３７】
［００１８２］プローブにポリヌクレオチドが含まれる場合、ポリヌクレオチドには、任意の適切な数のヌクレオチドが含まれてもよい。１つの態様において、プローブには、少なくとも約１０ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、プローブには、約１０〜約４５ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、プローブには、少なくとも約３０ヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドが含まれる、異なるプローブには、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかが含まれてもよい。
【０１３８】
［００１８３］いくつかの態様において、捕捉プローブは二重官能性であり、これには、ポリヌクレオチドタグとの特異的相互作用のための官能性、ならびにプローブおよびアプタマーが同時に遊離するように、固体支持体からプローブを解離させるための官能性が含まれる。固体支持体からプローブを解離させるための手段には、化学的手段、光化学的手段または使用される特定の捕捉プローブに応じる他の手段が含まれる。
【０１３９】
［００１８４］特定のタグおよび捕捉要素対間の相互作用の相反性のため、１つの態様におけるタグを別の態様における捕捉要素として使用可能であり、そして１つの態様における捕捉要素を別の態様におけるタグとして使用可能である。例えば、１つの態様において、ビオチンタグを含むアプタマーを、固体支持体に付着したストレプトアビジンで捕捉してもよく、一方、別の態様において、ストレプトアビジンタグを含むアプタマーを、固体支持体に付着したビオチンで捕捉してもよい。
【０１４０】
［００１８５］ターゲットタグ化
［００１８６］いくつかの態様において、アプタマー・アフィニティ（または共有）複合体を固体支持体に固定して、アプタマー・アフィニティ（または共有）複合体の単離を可能にし、そして未結合アプタマーを除去することが望ましい。１つの態様において、ターゲット分子と非常に反応性であり、そしてアプタマーと弱く反応性である（または理想的には非反応性である）試薬を用いて、アフィニティ（または共有）複合体のターゲット分子にタグを付加する。この態様において、例えばアフィニティ相互作用と適合するｐＨおよびイオン強度で、アプタマー・アフィニティ複合体のターゲットタグ化がアフィニティ複合体をほとんどまたはまったく解離させずに達成され、そしてターゲットまたはアプタマーのコンホメーションを変化させず、そしてタグ化の度合いは、アプタマーとの相互作用に影響を及ぼすほど各ターゲット分子上に多数のタグを導入しないように、タグが設計される。アプタマー共有複合体のターゲットタグ化は、これらの制限を共有せず、そして効率的なタグ化に適した任意の条件下で達成可能である。
【０１４１】
［００１８７］いくつかの態様において、タグ化試薬が、試験試料中に存在するすべてでないとしても大部分のタンパク質をタグ化するが、核酸または固体支持体などのアッセイの他の構成要素をタグ化しないかまたは最小限にしかタグ化しない傾向があることを確実にすることが重要でありうる。タンパク質上に見られるいかなる反応性化学基も共有結合部位として働きうるが、核酸または支持体表面上に見られるものはこうした部位として働かない。例示的な反応性化学基には、一級アミン（例えばリジン残基上）、チオール（例えばシステイン上、ジスルフィド連結の還元によって生じうる）、アルコール（例えばセリン、スレオニン、チロシン、および糖タンパク質上の糖部分上（こうした糖の上のシス−ジオールの酸化産物を含む））、およびカルボキシレート（例えばグルタミン酸およびアスパラギン酸上）が含まれる。１つの態様において、タグ化試薬は、タンパク質およびペプチド上のリジン残基と優先的に反応する、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化タグを含む。
【０１４２】
［０１８８］異なるアプタマー・アフィニティ（または光）複合体をタグ化するのに最適な条件は異なる可能性もあり、そして通常、方法の感度を最適化するために、経験的に決定される。１つの態様において、タグ化剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約１％を検出するのに十分である。別の態様において、標識化剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約１０％を検出するのに十分である。さらなる態様において、タグ化剤の濃度は、通常、ターゲット分子の少なくとも約９０％を検出するのに十分である。
【０１４３】
［００１８９］１つの態様において、ターゲットはタンパク質またはペプチドであり、そしてタグは、例えばＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンなどのタンパク質ビオチン化のための標準的な試薬を用いてターゲットに付着したビオチンである。他の適切な試薬には、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、ＰＦＰ−ビオチン、ＴＦＰ−ＰＥＯ３−ビオチン、またはタンパク質にタグを付着させるのに使用可能な任意の他の適切な試薬が含まれる。
【０１４４】
［００１９０］ＩＸ．リンカーおよび切断可能リンカー
［００１９１］本明細書において、リンカーは、２つの官能基または分子構造を連結するのに用いられる分子構造である。本明細書において、「間隔リンカー」またはより簡潔に「スペーサー」は、アプタマー内の２つの異なる官能基間に分離または間隔を提供する、害がない（ｂｅｎｉｇｎ）原子群を指す。本明細書において、「遊離可能」または「切断可能」要素、部分、またはリンカーは、破壊されて、２つの別個の構成要素を産生することが可能な分子構造を指す。遊離可能（または切断可能）要素は、化学結合が破壊可能である単一分子を含む（本明細書において、「インライン切断可能リンカー」と称する）か、あるいは非共有相互作用が破壊または中断可能である２以上の分子を含んでもよい（本明細書において、「ハイブリダイゼーションリンカー」と称する）。
【０１４５】
［００１９２］間隔リンカー
［００１９３］いくつかの態様において、個々の官能性との干渉を防止するため、特定の官能基を他の官能基から空間的に分離することが必要である。例えば、特定の光の波長を吸収する標識が光切断可能基に近接して存在すると、光切断の効率に干渉しうる。したがって、例えば、こうした基を、光切断の完全な活性を回復するのに十分な空間的分離を提供する非干渉部分で分離することが望ましい。いくつかの態様において、「間隔リンカー」は、標識および光切断官能性の両方とともに、アプタマー内に導入されている。
【０１４６】
［００１９４］１つの態様において、間隔リンカーは、合成中にアプタマー内に導入され、そしてしたがって、いくつかのホスホロアミダイトスペーサーで構成されることも可能であり、これには、限定されるわけではないが、長さ３、６、９、１２および１８炭素原子の脂肪族炭素鎖、長さ１、３、および９エチレングリコール単位のポリエチレングリコール鎖、もしくはテトラヒドロフラン部分（ｄＳｐａｃｅｒと名付けられている（Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ））または前述のものの任意の組み合わせ、あるいはホスホジエステル主鎖に沿って長さを付け加えるように設計または設定可能である、任意の他の構造または化学的構成要素が含まれる。別の態様において、間隔リンカーには、ポリｄＴ、ｄＡ、ｄＧ、もしくはｄＣ、またはポリＵ、Ａ、Ｇ、もしくはＣ、あるいは前述のものの任意の組み合わせなどのポリヌクレオチドが含まれる。別の態様において、スペーサーには、１以上の脱塩基性リボースまたはデオキシリボース部分が含まれる。こうした配列は、アプタマーの構造または機能に干渉しないように設計されることに注目されたい。
【０１４７】
［００１９５］インライン切断可能リンカー
［００１９６］本明細書において、「インライン切断可能リンカー」は、遊離可能または切断可能要素を含有する原子群を指す。いくつかの態様において、インライン切断可能リンカーを用いて、タグにアプタマーを連結し、それによって遊離可能タグを形成する。例えば、任意の記載するアッセイにおいて、インライン遊離可能リンカーを利用して、アプタマーおよびビオチン間の遊離可能連結を生成する（例えばアフィニティアッセイおよび架橋アッセイにおいて）か、またはアプタマーおよび光架橋基間の遊離可能連結を生成してもよい（例えば架橋アッセイにおいて）。
【０１４８】
［００１９７］１つの態様において、インライン切断可能リンカーは、適切な波長の光で遊離可能要素を照射することによって切断可能な結合を含む点で、光切断可能であってもよい。別の態様において、インライン切断可能リンカーは、適切な化学または酵素試薬で処理することによって切断可能な結合を含む点で、化学的に切断可能であってもよい。別の態様において、遊離可能要素には、結合を破壊する還元剤で処理することによって切断可能な、ジスルフィド結合が含まれる。
【０１４９】
［００１９８］ハイブリダイゼーションリンカー
［００１９９］本明細書において、「ハイブリダイゼーションリンカー」は、非共有相互作用が化学的または物理的方法を通じて破壊または中断されうる、２以上の分子を含むリンカーを指す。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションリンカーを用いて、アプタマーをタグに連結し、それによって遊離可能タグを形成する。例えば、任意の記載するアッセイにおいて、ハイブリダイゼーションリンカーを利用して、アプタマーおよびビオチン間の遊離可能連結を生成する（例えばアフィニティアッセイおよび架橋アッセイにおいて）か、またはアプタマーおよび光架橋基間の遊離可能連結を生成してもよい（例えば架橋アッセイにおいて）。
【０１５０】
［００２００］１つの態様において、ハイブリダイゼーションリンカーは、ハイブリダイズして非共有結合を形成する２つの核酸を含む。１つの態様において、ハイブリダイゼーション連結を形成する核酸の一方は、アプタマー自体の領域であってもよいし、そして他方の核酸は、その領域に相補的な核酸であってもよい。核酸二重鎖を破壊する（一方、なおアッセイとの適合性を維持する）のに適した任意の機構によって、遊離を達成してもよい。１つの態様において、二重捕獲光架橋アッセイにおいて、２０ｍＭ  ＮａＯＨを用いて、ハイブリダイゼーションリンカーを破壊する。ハイブリダイゼーションリンカー分子は、任意の適切な立体配置を有してもよく、そして任意の適切な構成要素を含んでもよく、１以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロック核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣体または断片、受容体、リガンド、脂質、これらの構造の任意の断片または誘導体、前述のものの任意の組み合わせ、あるいは遊離可能構造を形成するように設計または配置可能な任意の他の構造または化学的構成要素が含まれる。
【０１５１】
［００２０１］１つの態様において、遊離可能タグは、適切な数のヌクレオチドからなる少なくとも１つのポリヌクレオチドからなる。１つの態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、少なくとも約１０ヌクレオチドが含まれる。別の態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、約１０〜約４５ヌクレオチドが含まれる。さらに別の態様において、リンカー分子のポリヌクレオチド構成要素には、少なくとも約３０ヌクレオチドが含まれる。本明細書に開示する任意の方法で用いるリンカー分子には、同じ数のヌクレオチドまたは異なる数のヌクレオチドのいずれかを有するポリヌクレオチド構成要素が含まれてもよい。
【０１５２】
［００２０２］Ｘ．捕獲１および捕獲２で使用するための固体支持体
［００２０３］「固体支持体」は、共有または非共有結合いずれかを通じて、直接または間接的に分子が付着可能な表面を有する、任意の支持体を指す。固体支持体には、表面に付着する捕捉要素またはプローブのために物理的支持を提供可能ないかなる支持体物質も含まれてもよい。物質は、一般的に、表面への捕捉要素またはプローブの付着、およびアッセイの実行中に出会う、いかなる続く処理、取り扱い、またはプロセシングに関連する条件にも耐えることが可能である。物質は、天然存在、合成、または天然存在物質の修飾であってもよい。適切な固体支持体物質には、それのみで、または他の物質と組み合わせて用いられるかいずれかの、シリコン、グラファイト、鏡面、ラミネート、セラミックス、プラスチック（例えばポリ（塩化ビニル）、シクロ−オレフィン・コポリマー、アガロースゲル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（テレフタル酸エチレン）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはテフロン（登録商標））、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル））、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、金、銀等が含まれてもよい。シリカを含み、そしてさらに例えばＢｉｏｇｌａｓｓとして入手可能なガラスを含む、ガラスなどの、さらなる堅い物質を考慮してもよい。使用してもよい他の物質には、例えば、調節孔ガラスビーズ、架橋ビーズ化セファロースまたはアガロース樹脂、あるいは架橋ビスアクリルアミドおよびアザラクトンのコポリマーなどの多孔物質が含まれる。表面上に取り込まれた、１以上の官能基、例えば任意のアミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基などを有することが可能な、当該技術分野に知られる任意の他の物質もまた、意図される。
【０１５３】
［００２０４］固体支持体に用いる物質は、単純から複雑の範囲に渡る、多様な立体配置のいずれをとってもよい。固体支持体は、ストリップ、プレート、ディスク、ロッド、ビーズを含む粒子、試験管、ウェル等を含む、いくつかの形状のいずれか１つであってもよい。固体支持体は、多孔または非多孔、磁性、常磁性、または非磁性、多分散または単分散、親水性または疎水性であってもよい。固体支持体はまた、緊密に充填された（カラムマトリックスにおけるように）または緩やかに充填された粒子のゲルまたはスラリーの形であってもよい。
【０１５４】
［００２０５］１つの態様において、捕捉要素が付着した固体支持体を用いて、タグ化アプタマー・アフィニティ複合体またはアプタマー共有複合体を試験混合物から捕捉する。１つの特定の例において、タグがビオチン部分である場合、固体支持体は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトアビジン・アガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）、ストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂、ＭａｇｎａＢｉｎｄストレプトアビジンビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢｉｏＭａｇストレプトアビジン、ＰｒｏＭａｇストレプトアビジン、シリカストレプトアビジン（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ストレプトアビジン・セファロース高性能（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ストレプトアビジン・ポリスチレン微小球体（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ストレプトアビジン・コーティング・ポリスチレン粒子（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）、またはビオチンタグ化分子を捕捉するのに当業者に一般的に用いられる任意の他のストレプトアビジン・コーティング・ビーズまたは樹脂などの、ストレプトアビジン・コーティング・ビーズまたは樹脂であってもよい。
【０１５５】
［００２０６］ＸＩ．検出法
［００２０７］上記に記載してきたように、本発明の１つの目的は、タンパク質シグナルをアプタマーシグナルに変換することである。その結果、収集／検出されたアプタマーの量は、結合したターゲット分子の量および試料中のターゲット分子の量の指標となり、そしてこうした量に正比例しうる。捕獲２分配後、第二の固体支持体からアプタマー・アフィニティまたはアプタマー共有複合体を溶出させることなく、いくつかの検出スキームが使用可能である。検出法の以下の態様に加えて、他の検出法が当業者に知られる。
【０１５６】
［００２０８］検出：標識およびアプタマーの標識化
［００２０９］多くの検出法は、検出前にアプタマー内に取り込まれるべき明確な標識を必要とする。核酸合成のための標準的技術を用いて、合成中または合成後のいずれかで、蛍光または化学発光色素などのいくつかの標識をアプタマー内に取り込んでもよい。適切な試薬とともに、標準的酵素反応を用いて、合成中または合成後のいずれかで、放射性標識を取り込んでもよい。標識化はまた、当業者に知られる多様な酵素技術を用いることによって、捕獲２分配および溶出後に行ってもよい。例えば、上述の標識を含むプライマーを用いると、ＰＣＲは溶出したアプタマーの増幅産物内に標識を取り込むであろう。また、定量化のためにゲル技術を用いると、ＰＣＲを用いて異なるサイズの質量標識が取り込まれうる。これらの質量標識はまた、さらなる多重化能のために、異なる蛍光または化学発光色素も取り込み可能である。合成中または合成後のいずれかで、アプタマー内に取り込まれた特異的タグを用いて、そして次いで、タグと会合し、そして標識を所持するプローブを添加することによって、標識を間接的にアプタマーに添加してもよい。この標識には、上記のもの、ならびに例えば、比色読み取りのための標準的アッセイにおいて用いられる酵素が含まれる。
【０１５７】
［００２１０］検出：単一アプタマー検出
［００２１１］例えば試験試料と接触させる前に、３２Ｐなどの放射性同位体で、アプタマーを上述のように標識してもよい。４つの基本的アッセイ、および上に論じるようなその変形の任意の１つを使用して、アッセイ終了時、第二の固体支持体上の放射能を定量化することによって、アプタマー検出を簡潔に達成しうる。放射能のカウントは、元来の試験試料中のターゲットの量に正比例するであろう。同様に、試験試料と接触させる前に、アプタマーを上述のように蛍光色素で標識すると、第二の固体支持体上で、直接、単純な蛍光読み取りが可能になる。同様に、アプタマー溶出を必要とせずに、第二の固体支持体からの直接読み取りのため、化学発光標識または量子ドットを使用してもよい。
【０１５８】
［００２１２］第二の固体支持体からアプタマーを溶出させるかまたは光アプタマー共有複合体を遊離させることによって、上述のものに加えて、さらなる検出スキームが使用可能である。例えば、遊離したアプタマー、光アプタマーまたは光アプタマー共有複合体をＰＡＧＥゲル上で泳動して、そしてＳＹＢＲゴールドなどの核酸染色剤で検出し、そして場合によって定量化してもよい。あるいは、上述のようにアプタマー中に取り込まれた蛍光標識を用いて、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を用いて、遊離したアプタマー、光アプタマーまたは光アプタマー共有複合体を検出し、そして定量化してもよい。別の検出スキームは定量的ＰＣＲを使用して、例えばＳＹＢＲグリーンを用いて、溶出したアプタマーを検出し、そして定量化する。あるいは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ＤＮＡアッセイを使用して、溶出したアプタマーを検出し、そして定量化してもよい。
【０１５９】
［００２１３］別の態様において、複製プロセス中、「分子ビーコン」を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）の量または濃度を決定する（例えば、Ｔｙａｇｉら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １６：４９  ５３，  １９９８；米国特許第５，９２５，５１７号を参照されたい）。分子ビーコンは、フォールディングしてヘアピンループを形成し、そしてヘアピンが形成された際には、蛍光によってほとんどまたはまったくシグナルが生じないように、ヘアピン構造の一端に蛍光を、そしてもう一端に消光剤を含有する、特異的核酸プローブである。ループ配列は、ターゲットポリヌクレオチド配列に特異的であり、そしてアプタマー配列にハイブリダイズした際、ヘアピンがアンフォールディングし、そしてそれによって蛍光シグナルが生じる。
【０１６０】
［００２１４］検出：少数の分析物に関する多重化アプタマー検出
［００２１５］第二の固体支持体になお結合している少数のアプタマーの多重化検出のため、異なる励起／発光スペクトルを持つ蛍光色素を使用して、２つ、または３つ、または５つ、または１０までの個々のアプタマーを検出し、そして定量化してもよい。同様に、多重化読み取りのため、異なるサイズの量子ドットを使用してもよい。第二の固体支持体から未結合アプタマーを分配した後、量子ドットを導入してもよい。ユニークな量子ドットに付着したアプタマー特異的ハイブリダイゼーション配列を用いることによって、２、３、５、および１０までのアプタマーのための多重化読み取りを実行可能である。また、異なるアプタマーを、個々に検出可能な異なる放射性同位体、例えば３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３Ｃ、および３５Ｓで標識すると、限定された多重化読み取りに使用可能である。
【０１６１】
［００２１６］検出：大規模多重化アプタマー検出
［００２１７］捕獲２の第二の固体支持体から遊離したアプタマーの多重化検出のため、上述のように、各アプタマー内に取り込まれた単一の蛍光色素を、アプタマーレベルの定量化を伴って、アプタマー配列の同定を可能にする定量化法とともに用いてもよい。方法には、限定されるわけではないが、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション、マイクロビーズハイブリダイゼーション、およびＣＧＥ分析が含まれる。
【０１６２】
［００２１８］検出：ＤＮＡハイブリダイゼーションチップ
［００２１９］１つの態様において、標準的ＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、またはチップを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔアレイ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ、またはＮｉｍｂｌｅＧｅｎアレイなどのスライドまたはチップ上に固定された、ユニークなまたは一連のユニークなプローブに、各アプタマーまたは光アプタマーをハイブリダイズさせる。ユニークなプローブは各々、アプタマー上の配列に相補的である。相補的配列は、アプタマー中に取り込まれたユニークなハイブリダイゼーションタグ、またはアプタマー配列の部分、または全アプタマー配列であってもよい。捕獲２固体支持体から遊離したアプタマーを適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加し、そして標準的ハイブリダイゼーション法を用いてプロセシングする。例えば、アプタマー溶液をＤＮＡハイブリダイゼーションアレイとともに、約６０℃で１２時間インキュベーションして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確実にする。アレイを洗浄し、そして次いで、蛍光スライドスキャナでスキャンし、アレイの各特徴上にアプタマーハイブリダイゼーション強度の画像を生じる。ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎなどの画像プロセシングソフトウェアを用いて、画像セグメント化および定量化を達成する。１つの態様において、最大２５アプタマー、最大５０アプタマー、最大１００アプタマー、最大２００アプタマー、最大５００アプタマー、最大１０００アプタマー、および最大１０，０００アプタマーを用いて、多重化アプタマーアッセイを検出しうる。
【０１６３】
［００２２０］検出：Ｌｕｍｉｎｅｘ型ハイブリダイゼーション
［００２２１］１つの態様において、上述のようなアプタマーに相補的なユニークなＤＮＡプローブを有するアドレス可能マイクロビーズをハイブリダイゼーションに用いる。マイクロビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ技術などのユニークな蛍光色素を用いてアドレス可能であるし、あるいはＩｌｌｕｍｉｎａ  ＶｅｒａＣｏｄｅ技術におけるようにバーコード標識を、またはレーザー装備トランスポンダーを用いてもよい。１つの態様において、捕獲２固体支持体から遊離したアプタマーを適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加して、そして標準的マイクロビーズハイブリダイゼーション法を用いてプロセシングする。例えば、アプタマー溶液をマイクロビーズセットとともに約６０℃で２時間インキュベーションして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確実にする。次いで、溶液をＬｕｍｉｎｅｘ装置上でプロセシングし、該装置は、個々のビーズタイプをカウントし、そしてアプタマー蛍光シグナルを定量化する。別の態様において、ＶｅｒａＣｏｄｅビーズをアプタマー溶液と接触させ、そして約６０℃で２時間ハイブリダイズさせ、そして次いで、グリッド入り表面上に沈着させ、そして同定および蛍光定量化のため、スライドスキャナを用いてスキャンする。別の態様において、トランスポンダー・マイクロビーズをアプタマー試料と約６０℃でインキュベーションし、そして次いでトランスポンダー・マイクロビーズに適したデバイスを用いて定量化する。１つの態様において、最大２５アプタマー、最大５０アプタマー、最大１００アプタマー、最大２００アプタマー、および最大５００アプタマーを用いたマイクロビーズへのハイブリダイゼーションによって、多重化アプタマーアッセイを検出してもよい。
【０１６４】
［００２２２］検出：キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）
［００２２３］溶出したアプタマーを含有する試料をプロセシングして、上述のような蛍光標識とともにユニークな質量タグを取り込んでもよい。次いで、質量標識アプタマーを、本質的にはＤＮＡ配列決定装置であるＣＧＥ装置内に注入して、そしてユニークな質量によって、アプタマーを同定し、そして標識化反応中に取り込まれる色素由来の蛍光を用いて定量化する。この技術の１つの例示的な例が、Ａｌｔｈｅａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって開発されてきている。
【０１６５】
［００２２４］検出：検出前の増幅
［００２２５］上述の方法の多くにおいて、アプタマー溶液を増幅し、そして場合によって定量化前にタグ化してもよい。捕獲２固体支持体から溶出したアプタマーの溶液とともに標準的ＰＣＲ増幅を用いてもよい。ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション、マイクロビーズハイブリダイゼーション、およびＣＧＥ読み取り前に、こうした増幅を用いてもよい。
【０１６６】
［００２２６］検出：ＰＣＲに基づく他の方法
［００２２７］別の態様において、Ｑ−ＰＣＲを用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を検出しそして／または定量化する。本明細書において、「Ｑ−ＰＣＲ」は、アッセイの結果が定量的である、すなわち、アッセイが、試験試料中に存在するアプタマーの量または濃度を定量化可能であるような方式で、そしてそのように調節された条件下で行う、ＰＣＲ反応を指す。
【０１６７】
［００２２８］１つの態様において、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを用いて、試験試料中のアプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）の量または濃度を決定する。この技術は、一般的に、オリゴヌクレオチド複製酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に頼って、ターゲット配列からのシグナルを生じる。定量化しようとするアプタマーの配列に基づいて、ＴａｑＭａｎプローブを選択し、そしてこれには、一般的には、例えば６−カルボキシフルオレセインなどの５’端蛍光、および例えば６−カルボキシテトラメチルフルオレセインなどの３’端消光剤が含まれ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてアプタマー配列が増幅されるにつれて、シグナルが生じる。ポリメラーゼがアプタマー配列をコピーするにつれ、ＰＣＲプライマーより下流にアニーリングするプローブから、エキソヌクレアーゼ活性が蛍光を遊離させ、それによってシグナルを生じる。複製産物が産生されるにつれて、シグナルが増加する。ＰＣＲ産物の量は、行った複製周期の数ならびにアプタマーの出発濃度の両方に応じる。
【０１６８】
［００２２９］別の態様において、複製プロセス中に挿入蛍光色素を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）の量または濃度を決定する。例えばＳＹＢＲ（登録商標）グリーンなどの挿入色素は、一本鎖ＤＮＡの存在下で生じる蛍光シグナルに比較した際、二本鎖ＤＮＡの存在下で、大きな蛍光シグナルを生じる。ＰＣＲ中に二本鎖ＤＮＡ産物が形成されるにつれて、色素によって生じるシグナルは増加する。生じるシグナルの度合いは、ＰＣＲ周期数およびアプタマーの出発濃度の両方に依存する。
【０１６９】
［００２３０］検出：質量分析
［００２３１］別の態様において、質量分析を用いて、アプタマー・アフィニティ複合体（またはアプタマー共有複合体）を検出しそして／または定量化する。上述の酵素技術を用いて、ユニークな質量タグを導入してもよい。質量分析読み取りのため、検出標識はまったく必要なく、むしろ質量自体を用いて同定し、そして当業者に一般的に用いられる技術を用いて、質量分析中に生じる質量ピークの位置およびピーク下の面積に基づいて定量化を行う。質量分析を用いる例は、Ｓｅｑｕｉｎｏｍによって開発されたＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）系である。
【０１７０】
［００２３２］ＸＩＩ．アプタマー組成
［００２３３］異なる組込み官能性を含むアプタマー構築物を提供する。これらの官能性には、固定のためのタグ、検出のための標識、光反応性基、分離を促進するかまたは調節する手段等が含まれてもよい。１つの態様において、アプタマーには、アプタマー配列中に切断可能または遊離可能部分（要素または構成要素としても記載される）が含まれる。これらのさらなる構成要素または要素は、アプタマー内にさらなる官能性を導入する構造的要素または構成要素であり、そしてしたがって、官能性要素または構成要素である。他の態様において、アプタマーには、１以上の以下のさらなる構成要素が含まれる（官能性または構造的要素または構成要素または部分としても記載される）：標識または検出可能構成要素、スペーサー構成要素、切断可能要素、および特異的結合タグまたは固定化要素または構成要素。例えば、光架橋アプタマーの１つの態様において、アプタマーには、図３Ｌに示すような、切断可能部分を介してアプタマーに連結されるタグ、標識、標識および切断可能部分を分離するスペーサー構成要素、ならびに光架橋部分が含まれる。
【０１７１】
［００２３４］標準的ホスホロアミダイト化学反応を用いて、すべてのアプタマー構築物を合成してもよい。代表的なアプタマー構築物を図３Ａ〜図３Ｌに示す。官能性は５’端および３’端の間に分割されていてもよいし、またはいずれかの端に組み合わされていてもよい。光切断可能部分に加えて、化学的または酵素的切断可能部分を含めて、他の切断可能部分を用いてもよい。多様なスペーサー部分を用いてもよく、そして１以上のビオチン部分が含まれてもよい。ビオチン以外のタグ（また、固定化または特異的結合性要素または構成要素とも呼ばれる）もまた取り込み可能である。適切な構築物試薬には、ビオチン・ホスホロアミダイト、ＰＣリンカー（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＮ  １０−４９２０−０２）；  ＰＣビオチン・ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＮ  １０−４９５０−０２）；  ｄＳｐａｃｅｒ  ＣＥホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＮ  １０−１９１４−０２）；  Ｃｙ３ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＮ  １０−５９１３−０２）；およびＡｒｍ２６−Ａｃｈスペーサーアミダイト（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＮ  ＳＰ２６Ａｃｈ−０５）が含まれる。図３Ｋに例示するように、蛍光色素（Ｃｙ３など）、スペーサー、光切断可能およびビオチン部分を、アプタマーの末端に付加してもよい。１つの態様において、光切断可能部分および色素間の潜在的相互作用のため、これらの２つの部分間にスペーサーが挿入される。
【０１７２】
［００２３５］１つの態様において、図３Ｉ〜３Ｋに例示するように、タグをアプタマーに共有結合させる。別の態様において、図３Ｅ〜３Ｈに例示するように、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド配列の形で、タグをアプタマーに間接的に付着させ、該ポリヌクレオチド配列はアプタマー配列の部分に相補的であり、共有結合したタグを有する。
【０１７３】
［００２３６］１つの態様において、架橋基およびアプタマー内のユニークな配列の間に位置する第一の切断可能部分が含まれるように、アプタマーをさらに修飾してもよい。この第一の切断可能部分は、例えば、使用する切断可能部分に応じて、化学的、光化学的またはイオン的を含む、多様な異なる手段によって切断可能であってもよい。１つの態様において、アプタマーは図３Ｂに示す構造を有する。例えば、光架橋基は、４−アジド−２−ニトロ−アニリンであってもよく、そして光切断可能基、または遊離可能部分は、ホスホロアミダイト（−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−（２−ニトロフェニル）−プロパン−１−イル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト）としてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能なＰＣリンカーであってもよい。
【０１７４】
［００２３７］他の態様において、アプタマーには、遊離可能基を通じてアプタマーに連結される捕捉タグが含まれる。例えば、図３Ｆに例示するように、アプタマーにハイブリダイズする第二のオリゴヌクレオチドを介して、ビオチン捕捉タグをアプタマーに付着させてもよい。他の態様において、他の捕捉タグまたは切断可能要素を同じアプタマーに付着させてもよい。例えば、第二の化学的または光切断可能部分を介して、ポリＨｉｓタグをアプタマーに付着させてもよい。このアプタマー構築物の利点は、２つの異なるプロセシング工程を適用して、アプタマー・アフィニティ（または共有）複合体を試験試料中の他の構成要素から分離可能であることである。これらの分離工程を所望の任意の配列で用いてもよい。
【０１７５】
［００２３８］別の態様において、図３Ｃに例示するように、検出標識もまた、アプタマー内に含まれてもよい。この検出標識は、上に詳述するように、アッセイの最終工程中の未結合アプタマーの検出および／または定量化を提供する。例えば、蛍光検出のため、Ｃｙ３またはＣｙ５色素などの蛍光色素をアプタマー内に取り込んでもよい。Ｇｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈからのＣｙ３ホスホロアミダイト（［３−（４−モノメトキシトリチルオキシ）プロピル］−１’−［３−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミジチル］プロピル］−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンクロリド）を用いてＣｙ３を導入してもよいが、任意の適切な標識がアプタマー中に含まれてもよい。
【０１７６】
［００２３９］ＸＩＩＩ．一般的な定義
［００２４０］付随する請求項を含めて、本明細書で用いる際、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容が明らかに別に指示しない限り、複数の言及も含まれ、そして「少なくとも１つ」および「１以上」と交換可能に用いられる。したがって、「単数のアプタマー（ａｎ  ａｐｔａｍｅｒ）」への言及には、アプタマーの混合物が含まれ、「単数のプローブ（ａ  ｐｒｏｂｅ）」への言及には、プローブの混合物が含まれるなどである。
【０１７７】
［００２４１］本明細書において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、およびそれらの任意の変形は、非包括的包含を含むと意図され、したがって、要素または要素のリストを含むか、該要素が含まれるか、または該要素を含有する、問題のプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物には、これらの要素のみが含まれるのでなく、問題のこうしたプロセス、方法、プロセスによる産物、または組成物に明確に列挙されていないかまたは本質的でない、他の要素もまた、含まれてもよい。
【０１７８】
［００２４２］本明細書において、用語「約」は、数値が関連する項目の基本的な機能が不変であるような、数値の重要でない修飾または変動を示す。
［００２４３］本明細書において、「会合する（ａｓｓｏｃｉａｔｅ、ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）」およびその任意の変形は、所定の複合体化または反応条件下で、タグ−プローブ複合体から、「非会合」または非結合物質、例えば試験試料の非結合構成要素を分離することを可能にするように、十分に安定な複合体を生じる、タグおよびプローブ間の相互作用または複合体化を指す。特異性を持って互いに相互作用して、そして結合することによって、タグおよびプローブは、互いに直接会合しうる。タグおよびプローブはまた、その複合体化がリンカー分子によって仲介される際などに、互いに間接的に会合しうる。
【０１７９】
［０２４４］コンピュータプログラムを利用して、本明細書に開示する方法のいずれかの１以上の工程を行ってもよい。本開示の別の側面は、コンピュータプログラムが記憶された、コンピュータ読み取り可能記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品であり、これをコンピュータに読み込むと、このプログラムが、本明細書開示のいかなる方法の実行も行うかまたは補助する。
【０１８０】
［００２４５］本開示の１つの側面は、本明細書に開示する任意の方法の産物、すなわちアッセイ結果であり、これを試験場所で評価してもよいし、または望ましい場合、評価および通信のために、離れた場所の関係者に送ってもよい。本明細書において、「離れた場所」は、結果を得た場所と物理的に異なる場所を指す。したがって、結果を、異なる部屋、異なる建物、町の異なる場所、異なる町等に送ってもよい。例えばファクシミリ、郵便、翌日配達便、ｅ−メール、ｆｔｐ、ボイスメール等などの任意の適切な手段によって、データを送ってもよい。
【０１８１】
［００２４６］情報の「通信」は、適切な通信チャネル（例えば民間または公的ネットワーク）を通した、電子シグナルとしての、その情報を表すデータの伝達を指す。項目を「送る」は、その項目の物理的輸送であれ、または別の方式であれ（可能な場合）、その項目を１つの場所から次の場所に移動させる任意の手段を指し、そしてこれには、少なくともデータの場合、データを所持するかまたはデータを通信する媒体を物理的に輸送することが含まれる。
【実施例】
【０１８２】
［００２４７］以下の実施例は、例示目的のみのために提供され、そして付随する請求項中に定義するような本発明の範囲を限定することを意図しない。
［００２４８］前述の説明は、多様な態様および実施例に関して、本開示を説明する。特定の態様、実施例、あるいは特定の態様または実施例の要素は、いずれも、請求項のいずれかの決定的な、必要な、または本質的な要素または特徴とは見なされないものとする。
【０１８３】
［００２４９］以下の請求項に示すような本開示の範囲から逸脱することなく、開示する態様に多様な修飾および置換を行ってもよいことが認識されるであろう。図および実施例を含む明細書は、制限するのではなく、例示すると見なされるものとし、そしてすべてのこうした修飾および置換は、本開示の範囲内に含まれると意図される。したがって、本開示の範囲は、実施例によるのではなく、付随する請求項およびその法的な同等物によって決定されなければならない。例えば、方法またはプロセスの請求項いずれかに列挙する工程を、実行可能な任意の順で遂行してもよく、そしてこうした工程は、態様、実施例、または請求項のいずれに提示される順にも限定されない。
【０１８４】
［００２５０］実施例１ アプタマーおよびプライマー構築物
［００２５１］異なる５’末端官能基を持つアプタマーおよびビオチン化プライマー構築物を産生し、そして図６に相違を示す。アプタマーは、５’末端にＣｙ３蛍光色素（Ｇｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈからのＣｙ３ホスホロアミダイト（−［３−（４−モノメトキシトリチルオキシ）プロピル］−１’−［３−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミジチル］プロピル］−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンクロリド））を含有し、そしてプライマーは、２つのビオチン残基（（ＡＢ）２）、（Ｔ）８リンカー、および光切断可能部分（ホスホロアミダイト（−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１−（２−ニトロフェニル）−プロパン−１−イル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト）としてＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手可能なＰＣリンカー）を含有した。図６に記載する方法では、アプタマーは、５’末端に、ＡＮＡ（４−アジド−２−ニトロ−アニリン）として本明細書に言及される光反応性架橋基、光切断可能部分（ＰＣリンカー）、およびＣｙ３色素を含有し、そしてプライマーは、２つのビオチン残基および（Ｔ）８リンカーを含有した。
【０１８５】
［００２５２］実施例２ アフィニティ結合法（２捕獲法）
［００２５３］ａ）緩衝液
［００２５４］３０μＬのＣｙ３アプタマー混合物（２ｎＭの各アプタマー）を、ＳＢ１７Ｔ中、３０μＬの（ＡＢ）２−Ｔ８−ＰＣプライマー混合物（各プライマーに関して６ｎＭ）と合わせて、そして９５℃で４分間、３７℃で１３分間インキュベーションした。別個の反応において、６０μＬのターゲットタンパク質混合物を調製した（ＳＢ１７Ｔ中、２Ｘ濃度）。５５μＬのターゲットタンパク質混合物を、９６ウェルプレート（Ｏｍｎｉ−Ｔｕｂｅプレート、Ａｂｇｅｎｅ＃ＡＢ０４０７）中で５５μＬのアプタマー／プライマー混合物と合わせ、そして３７℃で１５分間インキュベーションして、結合平衡を達成した。別に示さない限り、以下の工程すべてを、室温で行った。
【０１８６】
［００２５５］ｂ）血漿、血清または全血
［００２５６］３０μＬのＣｙ３−アプタマー混合物（２ｎＭの各アプタマー）を、ＳＢ１７Ｔ中、３０μＬの（ＡＢ）２−Ｔ８−ＰＣプライマー混合物（各プライマーに関して６ｎＭ）と合わせて、そして９５℃で４分間、３７℃で１３分間インキュベーションした。別個の反応において、３０μＬの１ｘ〜２．５ｘ希釈の複雑な生物学的タンパク質混合物（血漿、血清、全血）を、Ｚ−ブロック競合剤オリゴヌクレオチド（５’−（ＡＣＺＺ）７ＡＣ−３’、式中、Ｚ＝５−ベンジル−ｄＵＴＰ、４μＭ）を含有する希釈剤中で調製し、そして５分間インキュベーションした。複雑な生物学的タンパク質混合物を、３０μＬのターゲットタンパク質混合物（ＳＢ１７Ｔ中、４Ｘ濃度）と合わせた。５５μＬのターゲットタンパク質／生物学的マトリックス混合物を、５５μＬのアプタマー／プライマー混合物と合わせ、そして３７℃で１５分間インキュベーションして、結合平衡を達成した。別に示さない限り、以下の工程すべてを、室温で行った。
【０１８７】
［００２５７］ｃ）ビオチン化アプタマー捕捉および未結合タンパク質除去
［００２５８］１３３μＬのストレプトアビジン−アガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ固定ストレプトアビジン、＃２０３５３、７．５％水性スラリー）を、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＶ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＭＡＨＶＮ４５５０）を通じた真空ろ過によって、２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで２回洗浄した。１００μＬのアプタマー：タンパク質混合物を、洗浄した樹脂に添加し、そして１５分間混合する。真空ろ過によって、１０μＭビオチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．＃Ｂ４５０１−１Ｇ）を含有する２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、そして２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄した。
【０１８８】
［００２５９］ｄ）タンパク質タグ化およびアプタマー遊離
［００２６０］１．２ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１３２９）を含有する１００μＬのＳＢ１７Ｔを、洗浄した樹脂に添加し、そして２０分間混合した。真空ろ過によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで５回、そして遠心分離によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄し、１０ｍＭ硫酸デキストラン（Ｍｒ〜５０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃３１４０４）を含有する７５μｌ  ＳＢ１７Ｔ中に再懸濁し、そして混合しながら、ＵＶランプ（２つのＳｙｌｖａｎｉａ  ３５０  Ｂｌａｃｋｌｉｇｈｔ電球、１５Ｗ、試料は電源から５ｃｍ）を５分間照射した。Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜を通じて遠心分離によって樹脂を除去し、そして１５０μＬ  ＳＢ１７Ｔ＋１０ｍＭ硫酸デキストランを含有する１．１ｍＬ  ９６ウェルプレート（１．１ｍＬ深底プレート、Ｍａｒｓｈ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＃ＤＷ９６１１）中に、遊離したアプタマー：タンパク質複合体を含む溶出物を収集した。
【０１８９】
［００２６１］ｅ）タンパク質捕捉および未結合アプタマー除去
［００２６２］５０μＬのストレプトアビジン樹脂（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃６５０−０３、ＳＢ１７Ｔ中、１０ｍｇ／ｍＬ）をＤｕｒａｐｏｒｅ膜に添加した。２２５μＬのアプタマー：タンパク質混合物を樹脂に添加し、そして１５分間混合した。１０ｍＭ硫酸デキストランを含有する２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで２回、真空ろ過によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、そして遠心分離によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄した。
【０１９０】
［００２６３］ｆ）複合体化アプタマー遊離
［００２６４］樹脂を９０μＬ溶出緩衝液（２ｍＭ  ＮａＯＨ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）中に再懸濁し、そして５分間混合した。この間、アプタマーはタンパク質：アプタマー複合体から遊離する。遠心分離によって樹脂を除去し、そして遊離したアプタマーを含む溶出物を収集した。８０μＬの溶出物を中和し、そして２０μＬ中和緩衝液（８ｍＭ  ＨＣｌ、０．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）で緩衝した。実施例４に記載するようにアプタマーを検出した。
【０１９１】
［００２６５］ｇ）結果
［００２６６］１１のタンパク質分析物（ｂＦＧＦ、エオタキシン−２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ−１６、ＧＤＮＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２０、リンホタクチン、ＴＡＲＣ、ｔＰＡ、ＶＥＧＦ）に関して、各分析物の１０ｎＭまたは３ｎＭ（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ７、ｔＰＡ、リンホタクチン）濃度から始めて、そして半対数希釈で（３．１６２３の希釈係数）３３ｆＭまで連続希釈して、緩衝液中の１２点の希釈シリーズを生成した。２つのタンパク質不含対照を含めて、総数１４試料を生じた。Ｃｙ３アプタマー混合物は、希釈シリーズ中に、ターゲットタンパク質に対する１１のアプタマー、ならびにターゲットタンパク質が存在しない２８の対照アプタマーを含有した。３つの複製希釈シリーズを調製した。結果を図７〜１０に示す。
【０１９２】
［００２６７］図７Ａ〜Ｃは、緩衝液中の１１のターゲットタンパク質のうち３つに関する、濃度に対する相対的蛍光単位（ＲＦＵ）プロット（対数−対数用量反応曲線）を示す。タンパク質不含値の平均に加えて２つの標準偏差に等しいシグナルを生じるタンパク質濃度として、各タンパク質に関して検出値限界（ＬＯＤ）を計算した。３つのタンパク質に関するＬＯＤは、６３０ｆＭ（ｂＦＧＦ）、９０ｆＭ（ＦＧＦ７）および５３０ｆＭ（リンホタクチン）であった。アフィニティアッセイは、ピコモル未満のレベルで緩衝液中でタンパク質を検出可能である。
【０１９３】
［００２６８］図８は、緩衝液中のターゲットタンパク質リンホタクチンに関する３つの反復測定値に関する、濃度に対する相対的蛍光単位（ＲＦＵ）プロットを示す。３つの線は、３つの複製物各々に関する用量反応曲線を示す。複製物曲線は、互いに非常によく一致し、アフィニティアッセイプロトコルが高レベルの再現性を持つことが示される。
【０１９４】
［００２６９］また、５つのタンパク質分析物（ｂＦＧＦ、エオタキシン−２、リンホタクチン、ｔＰＡおよびＶＥＧＦ）に関して、各分析物の１０ｎＭ（ＶＥＧＦおよびエオタキシン−２）または３ｎＭ（ｂＦＧＦ、ｔＰＡ、リンホタクチン）濃度から始めて、そして２．５倍希釈で、４２０ｆＭまたは１２６ｆＭまで連続希釈して、１０％血漿中の１２点の希釈シリーズも実行した。２つのタンパク質不含対照を含めて、総数１４試料を生じ、これを続いて、マイクロアレイスライド上でハイブリダイズさせた。Ｃｙ３アプタマー混合物は、希釈シリーズ中に、ターゲットタンパク質に対する５つのアプタマー、ならびにターゲットタンパク質が存在しない５つの対照アプタマーを含有した。以下の例外を伴って、上述のようにアッセイを実行した。１００％  ＰＰＴ−血漿（プールしたヒト血漿）を、０．５ｘＳＢ１８、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０中、５μＭ  Ｚ−ブロックで１対２に希釈した。この５０％血漿溶液４０μＬを、最終濃度３．３３ｘで、６０μＬのタンパク質混合物と混合した。５０μＬの血漿／タンパク質混合物を、５０μＬのアプタマー／プライマー混合物（３ｎＭアプタマー、９ｎＭプライマー）と合わせた。平衡結合反応を３７℃で１５分間実行した。（１００μＬではなく）４０μＬの全血−タンパク質−アプタマー混合物をストレプトアビジン−アガロース樹脂に添加し、そして１５分間混合した。
【０１９５】
［００２７０］図９は、１０％ヒト血漿中のターゲットタンパク質リンホタクチンに関する、濃度に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）プロットを示す。この曲線は、緩衝液中の用量反応曲線と形状および反応が類似である。これは、アフィニティアッセイプロトコルが１０％血漿溶液で実行可能であるが、これに限定されないことを示す。
【０１９６】
［００２７１］図１０は、１０％ヒト全血中のターゲットタンパク質リンホタクチンに関する、濃度に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）プロットを示す。この曲線は、１０％ヒト血漿中の用量反応曲線（図９）と形状および反応が類似であり、そして複雑な生物学的マトリックス中のアフィニティアッセイプロトコルの実行が、いかなる明らかなマトリックス効果も伴わないことを示す。
【０１９７】
［００２７２］実施例３ 光架橋アッセイプロトコル
［００２７３］このプロトコルのすべての工程を最小限の光曝露で実行して、光アプタマーの光活性化を防止した。
【０１９８】
［００２７４］ａ）タンパク質結合
［００２７５］３０μＬのＡＮＡ−ＰＣ−Ｃｙ３−アプタマー混合物（２ｎＭの各アプタマー）を、ＳＢ１７Ｔ緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０）中、３０μＬの（ＡＢ）２−Ｔ８−ＰＣプライマー混合物（各プライマーに関して６ｎＭ）と合わせて、そして９５℃で４分間、３７℃で１３分間インキュベーションした。別個の反応において、６０μＬのタンパク質混合物を２Ｘ濃度で調製した。５５μＬのターゲットタンパク質混合物を、９６ウェルプレート（Ｏｍｎｉ−Ｔｕｂｅプレート、Ａｂｇｅｎｅ＃ＡＢ０４０７）中で５５μＬのアプタマー／プライマー混合物と合わせ、そして３７℃で１５分間インキュベーションして、結合平衡を達成した。別に示さない限り、以下の工程すべてを、室温で行った。
【０１９９】
［００２７６］ｂ）動力学的負荷および光架橋
［００２７７］１００μＬの平衡化試料を、１０ｍＭ硫酸デキストラン（Ｍｒ〜５０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃３１４０４）を含有する１４００μＬ  ＳＢ１７Ｔに添加し、そして３７℃で１５分間インキュベーションした。１．５ｍＬ試料に４７０ｎｍ光（Ｃｕｓｔｏｍ  ＬＥＤアレイ）を３７℃で１０分間照射して、結合したタンパク質を光アプタマーに共有的に架橋した。
【０２００】
［００２７８］ｃ）ビオチン化アプタマー捕捉および未結合タンパク質除去
［００２７９］４０μＬのストレプトアビジン樹脂（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃６５０−０３、ＳＢ１７Ｔ中、１０ｍｇ／ｍＬ）を１．５ｍＬ試料に添加し、そして混合しながら２５℃で３０分間インキュベーションした。遠心分離によって樹脂をペレットにし、そして１．４ｍＬの上清を除去した。樹脂および残った上清をＤｕｒａｐｏｒｅ膜（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＨＶ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃ＭＡＨＶＮ４５５０）に移し、そして真空ろ過によって上清を除去した。真空ろ過によって、１０μＭビオチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．＃Ｂ４５０１−１Ｇ）を含有する２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで２回、そして２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄した。
【０２０１】
［００２８０］ｄ）タンパク質タグ化およびアプタマー（未結合および複合体化）遊離
［００２８１］１．２ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２１３２９）を含有する１００μＬのＳＢ１７Ｔを、洗浄した樹脂に添加し、そして２０分間混合した。真空ろ過によって、２００μＬグアニジン洗浄緩衝液（３Ｍグアニジン、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０、１ｍＭ  ＴＲＯＬＯＸ）で３回、そして２００μＬ  ＨＥＰＥＳ洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０、１ｍＭ  ＴＲＯＬＯＸ）で２回、樹脂を洗浄した。１１０μＬ  ２０ｍＭ  ＮａＯＨ中に樹脂を再懸濁し、そして５分間混合した。遠心分離によって樹脂を除去し、そして遊離したアプタマー：タンパク質複合体を含むＮａＯＨ溶出物を収集した。１００μＬの溶出物を２５μＬ  ８０ｍＭ  ＨＣｌで中和し、そして２Ｍ  ＮａＣｌおよび１％ＴＷＥＥＮ−２０を含有する１０μＬ  ５５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で緩衝した。
【０２０２】
［００２８２］ｅ）タンパク質捕捉および未結合アプタマー除去
［００２８３］１３３μＬのストレプトアビジン樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ固定ストレプトアビジン、＃２０３４７、１０％水性スラリー）を、Ｄｕｒａｐｏｒｅ  ＰＶＤＦ膜を通じた真空ろ過によって、２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで２回洗浄した。１３５μＬのアプタマー：タンパク質混合物を、洗浄した樹脂に添加し、そして２０分間混合した。混合しながら５０℃で１０分間、２００μＬグアニジン洗浄緩衝液で１回、混合しながら２分間、２００μＬの２０ｍＭ  ＮａＯＨで１回、真空ろ過によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで２回、そして遠心分離によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄した。
【０２０３】
［００２８４］ｆ）光架橋アプタマー遊離
［００２８５］１００μＬ  ＳＢ１７Ｔ中に樹脂を再懸濁し、そして混合しながら、ＵＶランプ（２つのＳｙｌｖａｎｉａ  ３５０  Ｂｌａｃｋｌｉｇｈｔ電球、１５Ｗ、試料は電源から５ｃｍ）を２０分間照射した。この間に、タンパク質に光架橋されたアプタマーは光切断によって遊離する。Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜を通じた遠心分離によって樹脂を除去し、そして遊離したアプタマーを含む溶出物を収集した。
【０２０４】
［００２８６］実施例４ マイクロアレイ検出プロトコル
［００２８７］ａ）試料調製
［００２８８］３０μＬの４Ｘハイブリダイゼーション緩衝液（３．６３８Ｍ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、１ｎＭコーナーマーカーオリゴ、４ｍＭ  ＴＲＯＬＯＸ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）を９０μＬのアッセイ試料（実施例２の工程ｅまたは実施例３の工程ｆの産物）に添加した。
【０２０５】
［００２８９］ｂ）マイクロアレイスライド
［００２９０］ＰｒｏＰｌａｔｅスライドモジュール（ＣＳＷ  Ｇａｓｋｅｔ、ＦＬＣ接着；  Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ、＃２０４８１１）を、９ｍｍ間隔で１４（７ｘ２）アレイを含有するマイクロアレイスライドを含めて組み立てた。各アレイは、アプタマーのランダム領域に相補的な９６アミン修飾オリゴヌクレオチドの３つの複製物からなった。社内で、私有の３’ｘ１’ポリマースライド上、コンタクトプリンターを用いて、オリゴヌクレオチドをスポッティングした。
【０２０６】
［００２９１］ｃ）マイクロアレイブロッキング
［００２９２］１００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中のブロッカー・カゼイン、Ｐｉｅｒｃｅ  ＃３７５２８、１ｍＭ  ＴＲＯＬＯＸ）をＰｒｏＰｌａｔｅスライドモジュールのウェルに添加し、そして６５℃で１５〜３０分間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液を除去した。
【０２０７】
［００２９３］ｄ）ハイブリダイゼーションおよび洗浄
［００２９４］１１０μＬのアッセイ試料をマイクロアレイに添加して、そして３ｘ１ｘ０．１２５インチのアルミニウムブロックをＰｒｏＰｌａｔｅスライドモジュールの最上部に置いた。アセンブリーをアルミホイルで巻いて、そして加湿チャンバー中、混合せずに６５℃で１６時間インキュベーションした。アルミホイルおよびアルミニウムブロックをアッセイ試料とともに除去し、そしてマイクロアレイを６５℃にあらかじめ加熱した２００μＬの洗浄緩衝液１（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）で１回リンスした。洗浄緩衝液１を除去し、そしてＰｒｏＰｌａｔｅスライドモジュールを分解した。２５ｍＬ洗浄緩衝液１（６５℃にあらかじめ加熱）を含有するパップ瓶（ｐａｐ  ｊａｒ）中にマイクロアレイスライドを入れ、そして混合しながら６５℃で１５分間インキュベーションした。２５ｍＬ洗浄緩衝液２（５０ｍＭ  Ｎａ−リン酸、ｐＨ７．５、６５℃にあらかじめ加熱）を含有する第二のパップ瓶にマイクロアレイスライドを移し、そして混合しながら６５℃で５分間インキュベーションした。２５ｍＬ洗浄緩衝液２を含有する第三のパップ瓶にマイクロアレイスライドを移し、そして混合しながら６５℃で５分間インキュベーションした。洗浄緩衝液２からマイクロアレイスライドを除去し、そして乾燥窒素流中で直ちに乾燥させた。
【０２０８】
［００２９５］ｅ）検出
［００２９６］マイクロアレイスライドをＴＥＣＡＮ  ＬＳ３００  Ｒｅｌｏａｄｅｄ蛍光レーザースキャナでスキャンし、そしてソフトウェアパッケージＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ（８．０  Ｒｅｖ  ３．０、Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．）を用いて各特徴上の蛍光シグナルを定量化した。セグメント化および多様なスポット形状とともに、主な手段として密度を用いて、蛍光シグナルを定量化した。さらなるデータ分析のため、ｘｍｌエクスポートファイルをデータベース内にインポートした。
【０２０９】
［００２９７］ｆ）定量的ＰＣＲ検出プロトコル
［００２９８］プライマー設計
［００２９９］プライマーＴｍ最小値＝６０℃、最適値＝６５℃、および最大値＝７０℃、ならびに産物サイズ範囲＝５０〜１００ｂｐを除いて、デフォルトパラメーター設定で、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、各アプタマーに関する増幅プライマーを選択した。次いで、内部ヘアピン、ホモ二量体、およびヘテロ二量体３’端相補性に関して、オリゴ濃度＝０．２μＭを除いて、デフォルトパラメーター設定で、ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ  ３．０（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、候補プライマーを分析した。３’端相補性ΔＧ≦−３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌの場合、候補を却下した。
【０２１０】
［００３００］定量的ＰＣＲ反応
［００３０１］５μＬの中和アッセイ試料（アフィニティアッセイプロトコル（実施例２）の工程５または光架橋アッセイプロトコル（実施例３）の工程６を参照されたい）を、９５μＬ  ｄＨ２Ｏで２０Ｘ希釈した。５μＬの希釈アッセイ試料および１Ｘ  ＫＯＤ緩衝液（Ｎｏｖａｇｅｎ＃）、０．２ｍＭ各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、１Ｘ  ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃）、０．２μＭ各５’および３’プライマー、および０．０２５Ｕ／μＬ  ＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ＃）を用いて、２０μＬ増幅反応を調製した。混入物不含試薬を用いて、バイオフード中で試料を調製した。１つのアプタマーの定量化に関して、各反応中、１対のプライマーを用いた。標準曲線を生成するため、既知の量のアプタマーを含む試料もまた調製した。９５℃で２分間インキュベーションし、９５℃１５秒間、その後、７２℃６０秒間で４０回サイクリングすることによって、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒ中で試料を増幅した。
【０２１１】
［００３０２］データ分析
［００３０３］各アプタマーに関して、増幅プロットから、各試料に関して閾値サイクル（Ｃｔ）値を決定し、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒとともに供給されるデータ分析ソフトウェアを用いて、各アプタマーに関する標準曲線を生成した。標準曲線を用いて、各アッセイ試料中の各アプタマーのコピー数を決定し、そして希釈係数および試料体積に関して調整した後、アプタマー濃度に変換した。投入タンパク質濃度の関数として、各アッセイ試料中のアプタマー濃度をプロットした。
【０２１２】
［００３０４］実施例５ 光架橋アッセイプロトコルおよびアレイ検出を用いた、緩衝液中のタンパク質検出
［００３０５］１３のタンパク質分析物（アンジオゲニン、ＢＬＣ、Ｃ３ａ、凝固因子Ｖ、凝固因子ＸＩ、ＣＴＡＣＫ、エンドスタチン、ＦＧＦ７、ＩＧＦＢＰ−３、プレカリクレイン、ＰＳＡ−ＡＣＴ、ＴＩＭＰ−１、およびｔＰＡ）に関して、各分析物の１０ｎＭ濃度から始めて、そして半対数希釈で（３．１６２３の希釈係数）３３０ｆＭまで連続希釈して、緩衝液中の１０点の希釈シリーズを生成した。４つのタンパク質不含対照を含めて、総数１４試料を生じた。Ｃｙ３アプタマー混合物は、ターゲットタンパク質が存在しない１４の対照アプタマーとともに、希釈シリーズ中に、ターゲットタンパク質に対する１３のアプタマーを含有した。光架橋アッセイプロトコル（実施例３）を用いて試料をプロセシングし、そして実施例４に記載するようなマイクロアレイ検出で定量化した。結果を図１１に示し、この図は、緩衝液中のターゲットタンパク質アンジオゲニンに関する、濃度に対する相対蛍光単位（ＲＦＵ）プロットを示す。
【０２１３】
［００３０６］実施例６ アフィニティアッセイプロトコルおよびＱＰＣＲを用いた、緩衝液中のタンパク質検出
［００３０７］１２のタンパク質分析物（アンジオゲニン、Ｃ１ｑ、Ｃ５ｂ，６複合体、ＣＭＰ−ＳＡＳ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＩＰ−１０、ＰＡＩ−１、ＰＤＧＦ−ＢＢ、プロトロンビン、Ｅ−セレクチン、ｔＰＡ、およびｖＷＦ）に関して、各分析物の１０ｎＭ濃度から始めて、そして半対数希釈で（３．１６２３の希釈係数）３３０ｆＭまで連続希釈して、緩衝液中の１０点の希釈シリーズを生成した。４つのタンパク質不含対照を含めて、総数１４試料を生じた。Ｃｙ３アプタマー混合物は、希釈シリーズ中に、ターゲットタンパク質に対する１２のアプタマーを含有した。アフィニティアッセイプロトコル（実施例２）を用いて試料をプロセシングし、そしてＱＰＣＲ（実施例４）によって定量化した。アッセイ試料中のアンジオゲニンアプタマー２１７５−４７の定量化のため、プライマー２１７５−４７−Ｆ３（５’−ＧＡＧＴＧＴＧＴＧＡＣＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧ−３’）（配列番号＿＿＿）および２１７５−４７−Ｒ３（５’−ＴＣＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＡＣＧＣＣＣＧ−３’）（配列番号：＿＿＿）を用いた。結果を図１２に示し、この図は、アンジオゲニンの投入タンパク質濃度に対して検出されたアプタマー濃度の対数プロットを示す。
【０２１４】
［００３０８］実施例７ 遅い解離速度のアプタマーによって、試験試料中のタンパク質測定が可能になる
［００３０９］アプタマー／プライマー混合物および試験試料の調製
［００３１０］ビオチンＣｙ３検出標識（各４ｎＭ）を、１ＸＳＢ１７Ｔ中、３Ｘ過剰の捕捉プローブ（ビオチンタグおよび光切断可能要素を含有するアプタマーの３’固定領域に相補的なオリゴヌクレオチド）と混合し、そして９５℃で４分間、次いで３７℃で１３分間加熱し、そして１ｘＳＢ１７Ｔ中、１：４に希釈する。５５μＬのアプタマー／プライマー混合物を、マイクロタイタープレート（Ｈｙｂａｉｄ  ＃ＡＢ−０４０７）に添加し、そしてホイルで密封する。ＳＢ１７Ｔ中で既知の濃度のタンパク質分析物を混合し、そしてＳＢ１７Ｔで連続希釈することによって、マイクロタイタープレート中で試験試料を調製する。
【０２１５】
［００３１１］試料平衡化
［００３１２］５５μＬのアプタマー／プライマー混合物を、５５μＬの試験試料に添加し、そしてホイルで密封したマイクロタイタープレート中、３７℃で１５分間インキュベーションする。平衡混合物中の各アプタマーの最終濃度は０．５ｎＭである。別に記載しない限り、平衡化後、この方法のすべての続く工程を室温で実行する。
【０２１６】
［００３１３］アプタマー捕捉および未結合タンパク質除去
［００３１４］ＤｕｒａＰｏｒｅろ過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＨＶカタログ＃ＭＡＨＶＮ４５５０）を真空ろ過によって１００μＬの１ＸＳＢ１７Ｔで１回洗浄し、１３３．３μＬの７．５％ストレプトアビジン−アガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）を各ウェルに添加し、そして２００μＬの１ＸＳＢ１７Ｔで２回洗浄する。１００μＬの平衡化試料を、ストレプトアビジン−アガロース樹脂を含有するＤｕｒａｐｏｒｅプレートに移し、そして熱ミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上、８００ｒｐｍで５分間インキュベーションする。２００μＬ  １ＸＳＢ１７Ｔ＋１００μＭビオチンで１回、そして２００μＬ  １ＸＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄する。
【０２１７】
［００３１５］ビオチンでのタンパク質タグ化
［００３１６］使用直前に調製した、ＳＢ１７Ｔ中の１００μＬの１．２ｍＭ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンを、捕捉アプタマーおよびアプタマー：タンパク質複合体とともに樹脂に添加し、そして熱ミキサー上、８００ｒｐｍで２０分間インキュベーションする。真空ろ過によって、２００μＬ  １ＸＳＢ１７Ｔで樹脂を５回洗浄する。
【０２１８】
［００３１７］遅い解離速度の濃縮プロセスおよび光切断
［００３１８］ＤｕｒａＰｏｒｅプレートの底面から水滴誘導装置（ｄｒｉｐ  ｄｉｒｅｃｔｏｒ）を除去し、そしてプレートを１ｍＬマイクロタイター収集プレート上に乗せる。１０００ｘｇで３０秒間遠心分離することによって、２００μＬ  １ＸＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄する。８０μＬの１ＸＳＢ１７Ｔ＋１０ｍＭ  ＤｘＳＯ４を樹脂に添加し、そして熱ミキサー上、８００ｒｐｍで１０分間、ＢｌａｃｋＲａｙ水銀ランプを照射する。ＤｕｒａＰｏｒｅプレートを新しい１ｍＬ深底プレートに移し、そして１０００ｘｇで３０秒間遠心分離して、光切断されたアプタマーおよびタンパク質：アプタマー複合体を収集する。
【０２１９】
［００３１９］タンパク質捕捉および未結合アプタマー除去
［００３２０］５０μＬのＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１常磁性ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１ＸＳＢ１７Ｔ中、１０ｍｇ／ｍＬ）をマイクロタイタープレートに添加する。磁石で６０秒間ビーズを分離し、そして上清を除去する。２２５μＬの光切断混合物をビーズに添加し、そして５分間混合する。磁気ビーズを分離し、そして洗浄緩衝液を交換することによって、２００μＬ  １ＸＳＢ１７Ｔで４回、ビーズを洗浄する。最終洗浄緩衝液を除去する。
【０２２０】
［００３２１］アプタマー溶出
［００３２２］１００μＬのリン酸ナトリウム溶出緩衝液（１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ１１）をビーズに添加し、そして５分間混合する。９０μＬの溶出物をマイクロタイタープレートに移し、そして１０μＬのリン酸ナトリウム中和緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ５）で中和する。
【０２２１】
［００３２３］マイクロアレイに対するアプタマーハイブリダイゼーション
［００３２４］カスタム顕微鏡スライド支持体上に固定された各アプタマーの可変領域の相補配列で構成されるオリゴヌクレオチドを用いて、ＤＮＡアレイを調製する。多数のアレイ（サブアレイ）が各スライド上に存在し、そしてサブアレイは、試料適用のため、ガスケット（Ｇｒａｃｅ）を取り付けることによって、物理的に分離される。アレイを１００μＬブロッキング緩衝液で前処理し、そして熱ミキサー上、６５℃で１５分間インキュベーションする。３０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液を、マイクロタイタープレート中、９０μＬの中和アプタマー溶出物に添加し、熱サイクラー中で９５℃で５分間インキュベーションし、そして０．１℃／秒で６５℃に冷却する。ブロッキング緩衝液をアレイから除去し、そして１１０μＬのアプタマー試料をアレイに添加し、そして加湿チャンバー中、６５℃で２０時間インキュベーションする。
【０２２２】
［００３２５］アレイ洗浄
［００３２６］アプタマー試料をアレイから除去し、そしてアレイを２００μＬのリン酸ナトリウムＴｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液で、ガスケットを適所にして６５℃で１回洗浄し、そしてガスケットを除去してパップ瓶中、６５℃で、２５ｍＬリン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液を用いて、３回洗浄する。アレイを窒素銃で乾燥させる。
【０２２３】
［００３２７］アレイ上のシグナルを定量化する
［００３２８］アレイスライドをＴＥＣＡＮ  ＬＳ３００  Ｒｅｌｏａｄｅｄ上、適切なチャネル中で、Ｃｙ３検出のためにスキャンし、そして各アレイ特徴上のＣｙ３シグナルを定量化する。
【０２２４】
［００３２９］
［００３３０］結果：
［００３３１］伝統的なＳＥＬＥＸ法および材料を用いて、３つの異なるターゲット（ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、およびミエロペルオキシダーゼ）に特異的なアプタマーを産生した。５位修飾ヌクレオチドを用いて、ターゲットの同じセットに特異的なアプタマーの第二のセットを作製し、そしてそれぞれのターゲットに対する非常に遅い解離速度に関して選択した。伝統的なプロセスで作製されたアプタマーは、５分未満の解離速度と測定された。修飾ヌクレオチドを含んで、そして選択中に、遅い解離速度の濃縮プロセスを用いて作製されたアプタマーは、２０分より長い解離速度を有した。２つの異なる方法によって、各ターゲットに関して２セットのアプタマーを作製して、各ターゲットに関して総数４の異なるアプタマー集団を得た。ターゲット濃度のある範囲に渡って、上述のように、これらのアプタマー集団が試験試料中で分析物濃度を測定する能力を評価した。ＤＮＡチップ検出からの相対的シグナルを、投入ターゲット濃度に対してプロットした。図１３Ａ〜１３Ｃを参照されたい。伝統的なアプタマーの反応曲線は非常に平坦であり、そして検出感度はかなり低い。遅い解離速度のアプタマーとそれぞれのターゲットの検出感度は、非常に優れている。このデータは、分析性能を最大にするため、遅い解離速度のアプタマーを用いる必要性があることを裏付ける。
【０２２５】
［００３３２］実施例８ 遅い解離速度のアプタマーを用いた再現性
［００３３３］実施例７の方法を用いて、１つの血漿試料を６８の異なるアリコットに分けた。６８試料各々に対して、実施例７のアッセイを実行した。試料のうち３４を合わせ、そして再び分けた。残りの３４の試料を単純に再試験した。この方式で、アッセイ内およびアッセイ間の一貫性に関して、アッセイの再現性を試験してもよい。試料レイアウトおよび検出スキームを図１４に示す。図１５は、図１４に示すすべての試料の測定値における％ＣＶを示す。プールしていないおよびプールした試料は同じＣＶを有する。
【０２２６】
［００３３４］実施例９ １捕獲アフィニティ結合法
［００３３５］ａ）血漿、血清、または全血とアプタマーの平衡化
［００３３６］３０μｌのＣｙ３アプタマー混合物（２０ｎＭの各アプタマー）を、ＳＢ１７Ｔ中、３０μＬの（ＡＢ）２−Ｔ８−ＰＣプライマー混合物（各プライマーに関して６０ｎＭ）と合わせて、そして９５℃で４分間、そして３７℃で１３分間インキュベーションする。ＳＢ１７Ｔ中で１：１０００に希釈した５５μＬの複雑な生物学的タンパク質混合物（血漿、血清、または全血）を、５５μＬのアプタマー／プライマー混合物と合わせ、そして３７℃で１５分間インキュベーションして、結合平衡を達成する。別に示さない限り、以下の工程すべてを、室温で行う。
【０２２７】
［００３３７］ｂ）タンパク質タグ化およびアプタマー遊離
［００３３８］１００μＬのアプタマー：タンパク質混合物を、５００μＭ  ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ＃２１３２９）を含有する１０μＬのＳＢ１７Ｔと合わせ、そして３７℃で２０分間インキュベーションする。反応混合物に１０μＬの２００ｍＭ  ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を添加し、そして３７℃で１０分間インキュベーションすることによって、過剰なＮＨＳ試薬を反応停止する。
【０２２８】
［００３３９］ｃ）タンパク質捕捉および未結合アプタマー除去
［００３４０］１００μＬのストレプトアビジン樹脂（ＤｙｎａＢｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃６５０−０３、ＳＢ１７Ｔ中、１０ｍｇ／ｍＬ）をＤｕｒａｐｏｒｅ膜に添加して、アプタマー／タンパク質複合体を捕捉する。１００μＬのアプタマー：タンパク質混合物を樹脂に添加し、１５分間混合し、そして真空ろ過して、未結合アプタマーを除去する。真空ろ過によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで３回、そして遠心分離によって２００μＬ  ＳＢ１７Ｔで１回、樹脂を洗浄する。
【０２２９】
［００３４１］ｄ）複合体化アプタマー遊離
［００３４２］樹脂を９０μＬ溶出緩衝液（２ｍＭ  ＮａＯＨ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）中に再懸濁し、そして５分間混合して、アプタマー／タンパク質複合体からアプタマーを遊離させる。遠心分離によって樹脂を除去し、そして遊離したアプタマーを含有する溶出物を収集する。８０μＬの溶出物を中和し、そして２０μＬ中和緩衝液（８ｍＭ  ＨＣｌ、０．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）で緩衝する。実施例４に記載するようにアプタマーを検出する。
【０２３０】
［００３４３］いくつかの特許、特許出願刊行物、および科学的刊行物が、説明全体に引用され、そして／または最後に列挙される。これらの各々は、その全体が本明細書に援用される。同様に、援用される刊行物中に言及されるすべての刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
【０２３１】
［００３４４］引用される刊行物およびこれに関連する制限の例は、例示であり、そして独占的ではないと意図される。引用される刊行物の他の制限は、明細書を読み、そして図を検討すると、当業者には明らかであろう。
【０２３２】
［００３４５］単語「含む」（「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、独占的ではなく、包括的と解釈されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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